(57)【要約】【課題】  顕微鏡下の微細物質の３次元方位をリアルタイムで検出する方法及び装置を提供すること。【解決手段】  試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置において、照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを設ける。【選択図】  図２
2015197493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置において、
照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、
照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、
受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備える
ことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
円偏光化変換部材が、
照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、９０°単位で回転をする
請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
円偏光化変換部材及び直線偏光化変換部材が、１／４波長板である
請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
偏向部材が、プリズムである
請求項１ないし３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
偏向部材が、ガラス基板である
請求項１ないし３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、
照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、
受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備え、
試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置を用い、
直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射し、
試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて、偏向部材を回転することで、試料面からの画像を回転させて、試料のリアルタイムでの観察を可能にする
ことを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項７】
照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、
照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、
受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備え、
試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置を用い、
直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射して、ｓ偏光による信号を受光し、
円偏光化変換部材を回転させ、直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｐ偏光の光を照射して、ｐ偏光による信号を受光し、
得られたｓ偏光による信号とｐ偏光による信号とから、試料の試料面に平行な向き及び垂直な向きを測定する
ことを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項８】
円偏光化変換部材を９０°単位で連続的に回転させることで、ｓ偏光による信号とｐ偏光による信号とを取得する
請求項７に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項９】
ｓ偏光及びｐ偏光による画像信号強度を、それぞれ下記式によって表し、
試料の試料面に対する傾斜角Φを算出する
【数１】
2015197493.tif 000009
【数２】
2015197493.tif 000010
（ただし、
【数３】
2015197493.tif 000011
ｒ，θ＝極座標、α＝試料の試料面に平行な方位角、ＩSO＝ｓ偏光による蛍光物質の明るさを示す指数、ＩPO＝ｐ偏光による蛍光物質の明るさを示す指数、ｐ＝偏光度を示す指数、Ｒ＝信号画像の半径、ｓ＝信号画像の広がりを示す指数）
請求項７または８に記載の顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡下の微細物質の３次元方位をリアルタイムで検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光学顕微鏡に関する技術の発展はめざましく、現在は水溶液中の１個の蛋白質を対象に研究ができる段階にまで到達している。この発展を可能にしたのは、全反射照明など光学系の新技術、様々なタイプの高感度カメラの開発、光学フィルターの特性の向上などである。数多くの実験的手法があみ出され、今や「１分子生理学」という新しい流れが生まれつつある。
例えば、分子モーターや蛋白質分解酵素は、基質の結合によりダイナミックな構造変化を伴い、それが機能に密接に関係すると考えられている。
このような１個の生体分子の中で起こる構造変化を、分子レベルで生きたままリアルタイムで可視化できるようにする技術が求められている。特に、顕微鏡下で運動する原子分子の３次元位置情報が得られれば、蛋白質１分子の動態の解明など、飛躍的な進歩が望める。
【０００３】
蛋白質１分子を観察するには、蛋白質を蛍光色素分子等の蛍光物質で特異的にラベルし、その１個の蛍光物質からの信号を蛍光顕微鏡でとらえられる。蛍光顕微鏡は、ある特定の波長の光が当たると、その光の波長より長い波長の光を出す色素を利用し、蛍光物質を光らせるための励起光を照射するための光学系と、それにより発生した蛍光を観察する光学顕微鏡とを組み合わせた構成を備える。観察したい細胞内の構造に蛍光物質を有する試薬を結合させ、所定波長の光をその蛍光物質に照射すると、目的の細胞内の構造が暗黒を背景にして蛍光を発する。
【０００４】
蛍光物質１個の観察のためには、エバネッセント場による照明が有用である。対象試料を含む水溶液とガラスとの境界面に対して、ガラス側から全反射角以上の角度でレーザー光を全反射照明し、境界面近傍に発生する非伝播光であるエバネッセント場によって対象試料を照明することで、蛍光物質に蛍光を発生させる。
エバネッセント場は、境界面に垂直な方向に対して指数関数的に減衰し、その減衰度合は屈折率とレーザー光の入射角に依存している。そのため、エバネッセント場は、境界面から水溶液中約１５０ｎｍの深さの局所領域のみを照明することになるので、全反射照明は、通常光による照明と比較して、背景光が極端に少ない利点がある。
また、試料水溶液中に多数の蛍光物質が存在するような条件下でも、境界面近傍の水溶液側に蛍光物質が存在する確率は小さいので、境界面上に固定されている１個の標的蛍光物質以外から発せられる蛍光は少ない。そのため、背景光や他の蛍光物質の蛍光によるノイズが極端に少ないので、所望の標的蛍光物質１個からの蛍光を観察することが可能となる。
【０００５】
全反射照明による１分子観察では、例えば、蛍光物質で標的した蛋白質や、ＤＮＡ、基質のＡＴＰなどの生体分子をガラス面に結合させ、１個１個の分子を独立した輝点として観察する。蛍光物質を励起する場合、色素分子の振動面と励起光の偏光方向が一致していることが必要である。
【０００６】
しかし、従来の全反射照明では、色素分子の振動面と励起光の偏光方向が一致した分子は明るくて観察できるが、一致しない分子は暗くて観察できないという問題点があった。
また、１分子からの微弱な信号を、２次元の映像として画像化するためには、イメージインテンシファイアーやクールドＣＣＤなどの高感度カメラが用いられる。これらのカメラは、ビデオ信号、もしくはそれより遅いデジタルの信号を出力するため、データの時間分解能は、ビデオの時間分解能の数十ミリ秒を超えることはできない。この時間分解能の上限が、１分子レベルでの研究を進めるうえで障害となっている。
【０００７】
このような状況において、本発明者は、１個の生体分子の特定部分の構造変化をリアルタイムで検出するために、独自の全反射型蛍光顕微鏡を作製し観察を行っている。
特許文献１は、偏光を回転させることにより蛍光物質１個の向きをその明滅の位相として検出する全反射型蛍光顕微鏡に関し、特許文献２は、蛍光物質と結合した試料の振動モーメントの方向によらず、その対象色素分子を観察できる全反射蛍光顕微鏡に関し、特許文献３は、受像側の映像を偏光と同期させて回転させることにより、蛍光物質１個の向きをリング状のパターンとして検出する全反射型蛍光顕微鏡に関する。
【０００８】
図１は、特許文献３による全反射型蛍光顕微鏡の要部構成を示す説明図である。
照射するレーザー光を直線偏光の光に変換する偏光変換部材と、蛍光物質からの輝点信号の進行方向を変える回転可能な偏向部材とを備え、その偏向部材の回転により、蛍光物質からの輝点信号を受像面上で２次元的にスキャンすることで時間分解能を上げている。
【０００９】
しかし、特許文献１〜３においては、蛍光物質1個の向きとして検出可能なのは、試料面に平行な向きまでであり、試料面に垂直な向きはわからず、また、リアルタイムでの検出はできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許３５７７５１４号「全反射型蛍光顕微鏡」
【特許文献２】特許第３６７１２２７号「全反射型蛍光顕微鏡および照明光学系」
【特許文献３】特許第４４４８４７１号「全反射型蛍光顕微鏡」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は、顕微鏡下の微細物質の３次元方位をリアルタイムで検出する方法と、それを実施する装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の顕微鏡装置は、試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置において、照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備えることを特徴とする。なお、蛍光物質としては、蛍光色素分子や量子ドットなど、蛍光を発する微小な単一物質が使用可能である。
【００１３】
ここで、円偏光化変換部材を、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、９０°単位で回転をする構成にしてもよい。
【００１４】
円偏光化変換部材及び直線偏光化変換部材としては、１／４波長板が好適である。
【００１５】
偏向部材としては、プリズムが簡便で好適である。
【００１６】
偏向部材に、ガラス基板を用いて、受像面での回転半径縮小に寄与させてもよい。
【００１７】
本発明の顕微鏡観察方法は、照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備え、試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置を用い、直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射し、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて、偏向部材を回転することで、試料面からの画像を回転させて、試料のリアルタイムでの観察を可能にすることを特徴とする。
【００１８】
同様に、本発明の顕微鏡観察方法は、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備え、試料面に配置される蛍光物質にレーザー光を照射し、その蛍光物質からの輝点信号を受光することで、蛍光物質またはそれに結合した組織を観察する顕微鏡装置を用い、直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射して、ｓ偏光による信号を受光し、円偏光化変換部材を回転させ、直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｐ偏光の光を照射して、ｐ偏光による信号を受光し、得られたｓ偏光による信号とｐ偏光による信号とから、試料の試料面に平行な向き及び垂直な向きを測定することを特徴とする。
【００１９】
円偏光化変換部材を９０°単位で連続的に回転させることで、ｓ偏光による信号とｐ偏光による信号とを取得してもよい。
【００２０】
ｓ偏光及びｐ偏光による画像信号強度を、それぞれ下記式によって表し、試料の試料面に対する傾斜角Φを算出してもよい。
【００２１】
【数１】
2015197493.tif 000003
【００２２】
【数２】
2015197493.tif 000004
【００２３】
（ただし、
【数３】
2015197493.tif 000005
ｒ，θ＝極座標、α＝試料の試料面に平行な方位角、ＩSO＝ｓ偏光による蛍光物質の明るさを示す指数、ＩPO＝ｐ偏光による蛍光物質の明るさを示す指数、ｐ＝偏光度を示す指数、Ｒ＝信号画像の半径、ｓ＝信号画像の広がりを示す指数）
【発明の効果】
【００２４】
本発明によると、顕微鏡下の微細物質の３次元方位をリアルタイムで検出することができ、微細物質の動態の解明に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】先行技術による全反射型蛍光顕微鏡の要部構成を示す説明図
【図２】本発明による顕微鏡装置の要部構成を示す説明図
【図３】コーヒー豆状の画像写真
【図４】偏光のスイッチングを行う様態を示す説明図
【図５】偏光度を示す画像写真
【図６】試料面に平行及び垂直な方位での分解能を評価した結果を示す写真及びグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、図面を基に本発明の実施形態を説明する。
ここでは、観察対象としてF1-ATPaseを挙げて説明するが、任意の微細物質を対象とすることができる。また、実施形態は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、上記従来技術など従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。
【００２７】
ATP合成酵素は分子量約５０万の蛋白質複合体であり、その膜中に存在するFo部分(a1b２c1０−１４)と、膜外に存在するF1部分(α３β３γ1δ1ε1 )とから成る。水素イオンがFo部分を通過する際のエネルギーを利用して、F1部分がATPを合成し、また可逆的に、F1部分でのATPの加水分解により、Fo部分で水素イオンを駆動するポンプとして作用する。
F1-ATPaseは、３つのαサブユニットと３つのβサブユニットとが交互に並んでリング状の構造をとり、棒状のγサブユニットを囲んだ形状をし、大きさ約１０ｎｍである。ATPの加水分解はβサブユニットで行われ、α３β３γ1のみでATP加水分解活性を有する。
【００２８】
本発明者は、上記特許文献の技術を利用して、F1-ATPaseの化学状態に対応した構造の変化を確認している。
γにビーズを付け、ビーズの方位を観察することで、βの化学状態を検知した。すなわち、βがATPが付いたclosedの状態か、ATPが付いていないopenの状態か、それとも、すでにADPとリン酸に分解した後かが、ビーズの方位からわかる。
βの構造変化は、βに蛍光物質を付け偏光したレーザー光を照射して、蛍光顕微鏡で明滅を観察することで検知できた。図１に示した装置を利用し、レーザー光を１／４波長板で円偏光の光にし、再度１／４波長板を通して直線偏光の光にする際に、１／４波長板をプリズムと一緒に回転させることによって、一定速度で回るs偏光の光を形成して、すべての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する。これによって、構造変化に伴う蛍光物質の方位変化がわかる。
【００２９】
この研究の発展として、試料面（xy）に垂直な方位（Z）での変化を、リアルタイムで観察するために、装置に改良を加えた。
図２は、本発明による顕微鏡装置の要部構成を示す説明図である。
本装置は、従来の蛍光顕微鏡等の顕微鏡装置に、１／４波長板等の偏光変換部材と、プリズムやガラス基板等の偏向部材と、ＣＣＤカメラ等の受光素子での入力画像データ処理する画像処理手段と、画像処理手段から出力される立体視用画像データを表示する表示装置などを組み込むことによって構成される。
【００３０】
詳しくは、照射するレーザー光を円偏光の光に変換する円偏光化変換部材と、照射するレーザー光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、円偏光化変換部材からの円偏光の光を直線偏光の光に変換すると共に、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射する直線偏光化変換部材及び偏向部材と、受像部の前に、試料面からの受光の光軸を回転軸として回転可能に設けられ、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて試料面からの画像を回転させる偏向部材とを備える。
これによって、直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転することで、全ての角度から試料面にｓ偏光の光を照射し、次いで、試料面に照射した光のｓ偏光の回転に同期させて偏向部材を回転することで、試料面からの画像を回転させて、試料のリアルタイムでの観察が可能になる。
すなわち、明滅している画像が回転によって、図３の写真に示すように、コーヒー豆状の静止画像になり、そのコーヒー豆状の濃淡の方位によって、蛍光物質の方位が表される。そのため、コーヒー豆状の画像の動きによって、試料の変化がリアルタイムで検知できる。なお、図３において、αは試料面（xy）における方位角を表す。
【００３１】
円偏光化変換部材及び直線偏光化変換部材としては、１／４波長板が好適に使用でき、偏向部材としては、プリズムやガラス基板が好適に使用できる。
また、偏向部材は、輝点信号の進行方向を変える作用を有するものであればよく、プリズムやガラス基板の代わりに、ミラーや、光の方向を電磁気的に制御する素子も利用できる。
また、円偏光化変換部材や直線偏光化変換部材や偏向部材は、中空モーターに取り付けて、光の光軸を回転軸として回転可能に設置してもよい。
【００３２】
図４は、偏光のスイッチングを行う様態を示す説明図である。
円偏光化変換部材を回転させ、直線偏光化変換部材と偏向部材とを同期させて回転すると、全ての角度から試料面にｐ偏光の光が照射され、ｐ偏光による信号が受光される。
そのため、円偏光化変換部材を９０°単位で連続的に回転させると、ｓ偏光とｐ偏光とがスイッチングされ、ｓ偏光による信号とｐ偏光による信号とを取得できる。
ｐ偏光の光による信号画像は、Z方向の蛍光物質の射影が映るため、一定の明るさのドーナッツ状の静止画像になる。
xy方向の射影であるコーヒー豆状の画像と、z方向の射影であるドーナッツ状の画像を比較すると、試料の試料面に垂直な向きも測定できる。
【００３３】
ｓ偏光の光によるxy方向の射影であるコーヒー豆状の画像信号強度を、下記式によってフィットさせ、
【００３４】
【数１】
2015197493.tif 000006
【００３５】
ｐ偏光によるz方向の射影であるドーナッツ状の画像信号強度を、下記式によってフィットさせると、
【００３６】
【数２】
2015197493.tif 000007
【００３７】
試料の試料面に対する傾斜角Φを、下記式によって算出できる。
【００３８】
【数３】
2015197493.tif 000008
【００３９】
上式において、ｒ，θは極座標、αは試料の試料面に平行な方位角、ＩSOはｓ偏光による蛍光物質の明るさを示す指数、ＩPOはｐ偏光による蛍光物質の明るさを示す指数、ｐは偏光度を示す指数、Ｒは信号画像の半径、ｓは信号画像の広がりを示す指数である。偏光度ｐは、０≦ｐ≦１の値をとり、図５の写真に示すように、値が小さいほどワブルが激しいことを示す。
【００４０】
本発明装置の分解能を評価した。
KOH処理したガラスに、蛍光ラベルを付けたF1-ATPaseのβ（EDKCDC-BSR）をまき、褪色防止剤を含んだ溶液を流し、532nm、500μW/(10mW)2のレーザーを照射し、試料面に当てる光の偏光を100及び500msおきにｓ偏光とｐ偏光を切り替えて観察した（Nikon TE2000-E、Nikon×100 NA1.49）。
【００４１】
図６は、βの試料面に対する傾斜角50°、露光時間500msでの測定結果であり、上のグラフにおける丸が、試料面に平行な方位、下のグラフにおける三角が、試料面に垂直な方位での測定値を示す。
試料面に平行な方位も、試料面に垂直な方位も、６°の精度で観測できたため、２０°程度回転するβに対して十分な分解能が認められた。なお、露光時間100msでは、試料面に平行な方位は３°の精度で観測できた。
【００４２】
本評価試験では、受像部の前の偏向部材に、厚さ１ｍｍのガラス基板を用いた。
ガラス基板によると、受像面での回転半径を極端に小さくすることができる。本実施例では、像の回転半径は約５０μｍであった。
なお、ガラス基板の厚さは、特に限定されず０．１〜１０ｍｍ程度のものが使用でき、ガラス基板にプリズムを接合させた部材も使用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によると、従来の装置を利用し、それに改変を加えるのみで、微細物質の３次元動態をリアルタイムで観測できる。そのため、例えば、微生物個体や器官の３次元動態観察、外乱を加えた時の３次元微細構造の変化観察、光ピンセットと組み合わせた３次元ナノマニピュレーション技術、感染や発症のメカニズム解明、タンパク質の動作メカニズム解明による創薬など、様々な用途があり、産業上非常に有用である。
【図１】
2015197493.tif 000012
【図２】
2015197493.tif 000013
【図３】
2015197493.tif 000014
【図４】
2015197493.tif 000015
【図５】
2015197493.tif 000016
【図６】
2015197493.tif 000017