(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中で、癌に対する素因又はその発生を検出するための方法、とりわけ、糞便試料及び血液ベースの試料からヒトＤＮＡ構成成分を単離し、分析することに方法の提供。【解決手段】ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出し、癌、特に、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌などの胃腸癌を同定、診断、ステージづけ、又は特徴づけるための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中で、癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌に対する素因又はその発生を示す方法。
【請求項２】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験試料は糞便試験試料である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、前記遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、癌若しくは癌に対する素因又は進行腺腫を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子発現が決定され、前記遺伝子の発現の低下は、結腸癌及び／若しくは胃癌又は結腸癌及び／若しくは胃癌に対する素因、又は進行腺腫を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子メチル化状態が決定され、前記遺伝子のメチル化は、結腸癌及び／若しくは胃癌又は結腸癌及び／若しくは胃癌に対する素因、又は進行腺腫を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
癌は結腸直腸癌であり、試料は血液試料又はその誘導体であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
癌は結腸直腸癌であり、試料は組織試料であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネルであり、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
癌は胃腸癌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
胃腸癌は、結腸直腸癌、胃癌、胃の癌、及び／又は食道癌を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
胃腸癌は結腸直腸癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
食道癌は食道腺癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
胃の癌は胃のびまん型癌腫及び／又は腸管型癌腫を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの遺伝子はＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子はＮＤＲＧ４遺伝子を含む又はＮＤＲＧ４遺伝子からなる、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、癌に対する素因又はその発生を示す、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子のパネルは、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４及びＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、ＡＰＣ及びＳＦＲＰ２、ＡＰＣ及びＯＳＭＲ、ＡＰＣ及びＧＡＴＡ４、ＡＰＣ及びＮＤＲＧ４、ＭＧＭＴ及びＯＳＭＲ、ＭＧＭＴ及びＧＡＴＡ４、ＭＧＭＴ及びＮＤＲＧ４、ＭＧＭＴ及びＳＦＲＰ２、ＭＧＭＴ及びＡＰＣ、ＳＦＲＰ１及びＭＧＭＴ、ＳＦＲＰ１及びＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１及びＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ１及びＮＤＲＧ４、ＳＦＲＰ１及びＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ１及びＡＰＣ、ＧＡＴＡ５及びＳＦＲＰ１、ＧＡＴＡ５及びＭＧＭＴ、ＧＡＴＡ５及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５及びＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５及びＳＦＲＰ２、又はＧＡＴＡ５及びＡＰＣを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ４、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２及びＡＰＣ、ＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＡＰＣ、又はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２からなる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子のパネルは、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ４、及びＭＧＭＴを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡＪ、及びＡＤＡＭ２３から選択される遺伝子を有する３つの遺伝子のパネルである、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３、又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子のパネルのそれぞれのエピジェネティックな変化の検出は単一反応で実行される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
試料は、組織試料及び／又は体液試料を含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
体液試料は糞便試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される並びに／又はＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組織試料は、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
体液試料は血液試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
血液試料又はその誘導体は血漿試料又は血清試料を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、ＪＰＨ３、及びＪＡＭ３から選択される、請求項３２又は３４に記載の方法。
【請求項３５】
血漿試料は、全血の遠心分離によって得られる、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
血漿試料を得るために、複数の遠心分離ステップが用いられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
血漿試料を得るために、２回の遠心分離ステップが用いられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
２ｍｌ未満の容量の血漿試料は除外される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
癌は結腸直腸癌であり、結腸直腸癌は早期ステージの結腸直腸癌を含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
早期ステージの結腸直腸癌はステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
エピジェネティックな変化はメチル化である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
遺伝子（複数可）のプロモーター領域の過剰メチル化が検出される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
メチル化は、メチル化特異的ＰＣＲ／増幅を使用して決定される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
メチル化特異的ＰＣＲ／増幅はリアルタイムで又はエンドポイントで実行される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
メチル化は、参照遺伝子のメチル化に対して定量される、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択されるプライマーを利用する、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４７】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプローブから選択されるプローブを利用する、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するために、試料中でのＤＮＡ完全性の検出若しくは少なくとも１つのＤＮＡ癌遺伝子突然変異の検出、又はＤＮＡ完全性の検出と少なくとも１つのＤＮＡ癌遺伝子突然変異の検出の両方の組合せと組み合わせて使用される、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
配列番号５２４及び／又は配列番号５２５として記載のヌクレオチド配列を含むＣｐＧアイランドのメチル化状態が決定される、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
エピジェネティックな変化は、遺伝子発現のレベルでのその効果の決定によって検出される、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
遺伝子発現はタンパク質レベルで決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
遺伝子発現はＲＮＡレベルで決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
リアルタイム検出又はエンドポイント検出が用いられる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
試料中で、癌、特に胃腸癌の組織病理学的ステージを決定するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌の組織病理学的ステージを示す方法。
【請求項５５】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
試験試料は糞便試料である、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
腺腫及び／又は結腸直腸癌の組織病理学的ステージを決定するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、癌の組織病理学的ステージに相関する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
血液試料又はその誘導体中で、結腸直腸癌の組織病理学的ステージを決定するための方法であって、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌の組織病理学的ステージを示す、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
組織試料中で、結腸直腸癌の組織病理学的ステージを決定するための方法であって、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌の組織病理学的ステージを示す、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
腺腫の癌腫への進行を予測する又はモニターするための方法であって、適した試験試料中で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、メチル化のレベルの上昇又は増加は、メチル化のレベルが低い場合よりも、腺腫が癌腫に進行する可能性が高いことを示す方法。
【請求項６１】
ＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態が決定される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
表２に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーのプライマー結合部位の間の及びそれを含む領域のＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態が決定される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
胃腸癌の進行を予測する又はモニターするための方法であって、適した試験試料中で、ＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、転写開始部位に対するメチル化のレベルの上昇又は増加は、メチル化のレベルが低い場合よりも、癌がより進行していることを示す方法。
【請求項６４】
胃腸癌は結腸直腸癌である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いて、癌、特に胃腸癌の治療の成功の見込みを予測するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、治療の成功の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも高いことを示す方法。
【請求項６６】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
試験試料は糞便試料である、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子がメチル化されている、特に過剰メチル化されている場合、治療の成功の見込みは、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子がメチル化されていない又はより程度は小さいがメチル化されている場合よりも高い、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、発現のレベルの低下は、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子がより高いレベルで発現される場合よりも、癌の治療の成功の見込みが高いことを示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択され並びに／又はＴＦＰＩ１、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択され、試料は血液試料又はその誘導体である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
癌は結腸直腸癌であり、組織試料中で、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、治療の成功の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも高いことを示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いて、癌、特に胃腸癌の治療に対する抵抗性の見込みを予測するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、治療に対する抵抗性の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも低いことを示す方法。
【請求項７３】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
試験試料は糞便試料である、請求項７２又は７３に記載の方法。
【請求項７５】
対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子がメチル化されていない又はより程度は小さいがメチル化されている場合、治療に対する抵抗性の見込みは、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子がメチル化されている又は過剰メチル化されている場合よりも高い、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、より高いレベルの発現は、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子が低下したレベルで発現される場合よりも、癌の治療に対する抵抗性の見込みが高いことを示す、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択され並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択され、試料は血液試料又はその誘導体である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
癌は結腸直腸癌であり、組織試料中で、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、治療の成功の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも高いことを示す、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
癌、特に胃腸癌に適した治療レジメンを選択するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化を検出することにより、治療のためにＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が選択され、エピジェネティックな変化が検出されない場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子は治療のために選択されない方法。
【請求項８０】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
試料は糞便試料である、請求項７９又は８０に記載の方法。
【請求項８２】
対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するステップを含み、遺伝子が、エピジェネティックにサイレンシングされている、特に過剰メチル化されている又は発現が低下している場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が治療のために選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
癌若しくは癌に対する素因又は進行腺腫に適した治療レジメンを選択するための方法であって、対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のメチル化状態及び／又は発現レベルを決定するステップを含み、遺伝子が、メチル化されていない又はより高度に発現している場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いる治療は禁忌となる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
癌は結腸直腸癌であり、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択され並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択され、試料は血液試料又はその誘導体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
癌は結腸直腸癌であり、組織試料中で、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化を検出することにより、治療のためにＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が選択され、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化が検出されない場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が治療に選択されない、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法の特徴によってさらに特徴づけられる、請求項５４〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
対象の癌を治療するための方法であって、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＨＤＡＣ阻害因子及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子を投与するステップを含み、対象は、先の請求項のいずれかに記載の方法に基づいて治療について選択された方法。
【請求項８８】
対象は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子プロモーターのメチル化状態、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子の発現レベル、又はその組合せを測定することに基づいて治療について選択された、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
癌は胃腸癌を含む、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項９０】
胃腸癌は、結腸直腸癌、胃癌、胃の癌、及び／又は食道癌、特に結腸直腸癌を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
食道癌は食道腺癌である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
胃の癌は、胃のびまん型癌腫及び／又は腸管型癌腫を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
（ａ）ＤＮＡ傷害剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いる、癌の治療の成功の見込み及び／又は癌の治療に対する抵抗性の見込みを予測し、
（ｂ）癌に適した治療レジメンを選択し、
（ｃ）癌又は癌に対する素因を診断するためのキットであって、
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＥＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を検出するのに使用されるプライマーのセットをその中に含有するキャリアー手段を含むキット。
【請求項９４】
少なくとも１つの遺伝子はＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子である、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子はＮＤＲＧ４である、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬をさらに含む、請求項９３〜９５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９７】
試薬は重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ）試薬を含む、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
重亜硫酸塩試薬は重亜硫酸ナトリウム塩を含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
試料中で、胃腸癌、特に結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するためのキットであって、
（ａ）ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するための手段、
（ｂ）糞便試料を処理するための手段を含むキット。
【請求項１００】
少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される、請求項９３〜９９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０１】
少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２から選択される、請求項９３に記載のキット。
【請求項１０２】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネルのエピジェネティックな変化を検出するための手段を含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を示す、請求項９３〜１０１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０３】
遺伝子のパネルは、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０４】
遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４及びＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、又はＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含む、請求項１０２又は１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ４、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、又はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含む、請求項１０２〜１０４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０６】
遺伝子から選択される３つ又は４つの遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２からなる、請求項１０２〜１０５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０７】
遺伝子のパネルは、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、及びＭＧＭＴを含む、請求項１０２又は１０３に記載のキット。
【請求項１０８】
糞便試料を処理するための手段は、糞便試料の収集のための密封可能な容器を含む、請求項９９〜１０７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０９】
糞便試料を処理するための手段はホモジナイゼーションバッファーを含む、請求項９９〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１０】
糞便試料を処理するための手段は、ＤＮＡの抽出／単離／濃縮／精製のための試薬を含む、請求項９９〜１０９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１１】
糞便試料を処理するための手段は、試料中でのＤＮＡの増幅を誘導するためのプライマーを含む、請求項９９〜１１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１２】
試料中で、胃腸癌、特に結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するためのキットであって、
（ａ）ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するための手段、  （ｂ）血液試料又はその誘導体を処理するための手段を含むキット。
【請求項１１３】
少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
血液試料又はその誘導体は血漿試料又は血清試料を含む、請求項１１２又は１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される、請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１６】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネルのエピジェネティックな変化を検出するための手段を含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を示す、請求項１１２〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
遺伝子のパネルは、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む、請求項１１６に記載のキット。
【請求項１１８】
遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３からなる、請求項１１６又は１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
結腸直腸癌は早期ステージの結腸直腸癌を含む、請求項１１２〜１１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２０】
早期ステージの結腸直腸癌はステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を含む、請求項１１９に記載のキット。
【請求項１２１】
血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、血液試料の収集のための密封可能な容器を含む、請求項１１２〜１２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２２】
血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、血液試料又はその誘導体からのＤＮＡの抽出／単離／濃縮／精製のための試薬を含む、請求項１１２〜１２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２３】
血液試料又はその誘導体からのＤＮＡの抽出／単離／濃縮／精製のための試薬は、表１のキットから選択される、請求項１２２に記載のキット。
【請求項１２４】
血液試料又はその誘導体を処理するための手段は安定剤を含む、請求項１１２〜１２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２５】
試料中で、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するためのキットであって、
（ａ）ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出する手段、
（ｂ）結腸組織試料、直腸組織試料、又は虫垂組織試料を処理するための手段を含むキット。
【請求項１２６】
遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するための手段は、検出を単一反応で実行させることができる、請求項９３〜１２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２７】
エピジェネティックな変化はメチル化である、請求項９３〜１２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２８】
遺伝子（複数可）のプロモーター領域の過剰メチル化が検出される、請求項１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
メチル化を検出するための手段は、メチル化特異的ＰＣＲプライマーを含む、請求項１２７又は１２８に記載のキット。
【請求項１３０】
メチル化特異的ＰＣＲをリアルタイムで又はエンドポイントで実行するための手段をさらに含む、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３１】
メチル化特異的ＰＣＲプライマーは、表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択される、請求項１２９又は１３０に記載のキット。
【請求項１３２】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプローブから選択されるプローブを含む、請求項１３０又は１３１に記載のキット。
【請求項１３３】
糞便試料又は血液試料若しくはその誘導体又は組織試料を処理するための手段は、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を含む、請求項９９〜１３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３４】
試薬は重亜硫酸塩試薬を含む、請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３５】
重亜硫酸塩試薬は重亜硫酸ナトリウムを含む、請求項１３４に記載のキット。
【請求項１３６】
血漿試料又は血清試料中で、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するための方法であって、
（ａ）血漿試料又は血清試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために処理された単離ＤＮＡを増幅するステップであって、０．０７〜０．７２ｍｌの血漿試料又は血清試料に相当するＤＮＡが増幅反応当たりに使用されることを特徴とするステップとを含む方法。
【請求項１３７】
血漿試料又は血清試料は血漿試料である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
血漿試料は、全血の遠心分離によって得られる、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
血漿試料を得るために、複数の遠心分離ステップが用いられる、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
血漿試料を得るために、２回の遠心分離ステップが用いられる、請求項１３８１に記載の方法。
【請求項１４１】
２ｍｌ未満の血漿容量を有する試料は、ＤＮＡの単離に先立って除外される、請求項１３６〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
試薬は重亜硫酸塩試薬を含む、請求項１３６〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
血液試料又はその誘導体の容量は約１０ｍｌである、請求項１３６〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
ステップ（ｂ）に続いて、処理された単離ＤＮＡを増幅に先立って濃縮するステップをさらに含む、請求項１３６〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
安定剤を用いる血漿試料又は血清試料を安定化するステップをさらに含む、請求項１３６〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される、請求項１３６〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む遺伝子のパネルの一部を形成し、遺伝子のそれぞれのメチル化状態が決定される、請求項１３６〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
遺伝子のパネルは、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３からなる、請求項１４９又は１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
遺伝子のパネルのそれぞれのメチル化状態の決定は単一反応で実行される、請求項１４９〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
増幅するステップはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５４】
ＰＣＲはメチル化特異的ＰＣＲである、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
メチル化特異的ＰＣＲはリアルタイム又はエンドポイントで実行される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びプローブから選択されるプライマー及び／又はプローブを用いて、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定する、請求項１３６〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態は疾患の発生と相関しており、疾患に対する素因又はその発生を検出するために使用される、請求項１３６〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
疾患は細胞増殖性の障害を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
細胞増殖性の障害は癌を含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
癌は胃腸癌を含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
胃腸癌は、結腸直腸癌を含む、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
結腸直腸癌は早期ステージの結腸直腸癌を含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
早期ステージの結腸直腸癌はステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
糞便試料中で、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するのに使用するために、糞便試料を処理してＤＮＡを単離し、調製するための方法であって、
（ａ）糞便試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）１回の増幅反応当たり必要とされる、少なくとも２．５μｇの単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）処理された単離ＤＮＡを増幅するステップとを含む方法。
【請求項１６５】
ステップ（ａ）に先立って、糞便試料にホモジナイゼーションバッファーを添加するステップを含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
試薬は重亜硫酸塩試薬を含む、請求項１６４又は１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
重亜硫酸塩試薬は重亜硫酸ナトリウムを含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
ステップ（ｂ）の後、ステップ（ｃ）に先立って、処理された単離ＤＮＡが濃縮される、請求項５１６４〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
糞便試料は少なくとも４ｇの重量である、請求項１６４〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
増幅された処理ＤＮＡに請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法を実行するステップをさらに含む、請求項１６４〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー対から選択されるプライマー対。
【請求項１７２】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプローブから選択されるプローブ。
【請求項１７３】
請求項１７１に記載のプライマー対及び請求項１７２に記載の対応するプローブを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、癌を同定し、診断するための方法及びキットであって、いくつかの遺伝子のうちの任意の１つ又は複数についての、メチル化状態の変化若しくは発現レベルの変化又はその組合せなどのエピジェネティックな変化を検出するステップを含む、方法及びキットに関する。癌に適した治療レジメンを決定するための遺伝薬理学的方法、及び本発明の方法による患者の選択に基づいて、癌患者を治療するための方法もまた記載される。本発明はまた、試料、特に体液試料を収集し、処理し、分析するための改良された方法に関する。より具体的には、本発明は、体液試料中のエピジェネティックな変化を同定するための方法に関する。これらの方法は、様々な疾患を診断する、ステージを決定する、又はその他の場合では特徴づけるのに有用であり得る。本発明はまた、癌、特に、結腸直腸癌、胃癌、及び食道癌などの胃腸癌を同定する、診断する、ステージを決定する、又はその他の場合では特徴づけるための方法にも関する。本発明の方法は、とりわけ、糞便試料及び血液ベースの試料からヒトＤＮＡ構成成分を単離し、分析することに関する。
【０００２】
［発明の背景］
ほとんどの癌は、それらの最も早期のステージでは臨床的にサイレントである。患者の診断法は、感度及び正確度を頻繁に欠く侵襲的手法を典型的に含む。非常に信頼できる非侵襲的スクリーニング方法は、より容易な患者のスクリーニング、診断、及び予後の評価を可能にすると思われる。
【０００３】
腫瘍由来のマーカーは、悪性腫瘍によって普通生成される生物学的物質である。理想的には、腫瘍由来のマーカーは、腫瘍特異的であるべきであり、腫瘍量の指標を提供するべきであり、軽度の疾患の検出を可能にするのに十分な量で生成されるべきである。臨床的診療で使用されるほとんどの腫瘍由来のマーカーは、生化学的アッセイによって検出される腫瘍抗原、酵素、ホルモン、受容体、及び成長因子である。突然変異、欠失、及びエピジェネティックな修飾などのＤＮＡの変化の検出（Ｂａｙｌｉｎら、２０００年）は、癌を同定するための他の手段を提供する。
【０００４】
エピジェネティックな修飾は、遺伝子の一次ヌクレオチド配列の変化以外のメカニズムによって媒介される、発達及び細胞増殖の間に起こる遺伝子発現の可能性の安定的な変化として記載することができる。遺伝的な変化及びエピジェネティックな変化の両方が遺伝子サイレンシング及び細胞の機能障害をもたらし得ることは現在一般常識となっている。これらの２つのプロセスの間の相乗作用は腫瘍の進行及び悪性化の動因となる。遺伝子発現の変化を引き起こす、３つの関連するメカニズムが認識されている：ＤＮＡメチル化、ヒストンコードの変化、及びＲＮＡ干渉。
【０００５】
ＤＮＡの過剰メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、ＤＮＡの特定のシトシンにメチル基（ＣＨ３）を付加することによって遺伝子活性が制御される、エピジェネティックな修飾である。特に、メチル化は、ヒト遺伝子中のプロモーター領域及びイントロン中に集中するＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧアイランド）のシトシンに生じる（Ｐ．Ａ．Ｊｏｎｅｓら、２００２年；Ｐ．Ｗ．Ｌａｉｒｄら、２００３年）。メチル化は、遺伝子サイレンシングと関連する。ＤＮＡの過剰メチル化は、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、及びさらに結腸直腸癌を含む多種多様の癌に関与することが分かった。癌細胞からのＤＮＡのメチル化パターンは、正常細胞のパターンとは著しく異なる。したがって、癌細胞の、適切に選択された遺伝子中のメチル化パターンの検出により、正常細胞と癌細胞を区別し、それによって、癌の早期検出へのアプローチを提供することができる。
【０００６】
ＤＮＡ腫瘍マーカー、特にＤＮＡメチル化マーカーは、他の生化学的マーカーと比較した場合に、ある利点がある。重要な利点は、ＤＮＡの変化が、明らかな悪性の変化に先行することが多く、したがって、癌の早期診断に役に立ち得ることである。ＤＮＡは、はるかにより安定であり、タンパク質と異なり、感度の増加に有力な増幅ベースの技術によって増幅することができるので、それは、腫瘍ＤＮＡが乏しい又は過剰な正常ＤＮＡによって希釈される場合などの、感度のよい検出が必要である状況に適用性がある（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら、１９９７年）。体液は、癌検出のための、費用対効果が高い、早期の非侵襲的手法を提供する。これに関連して、糞便ベースの癌試験は、１つの調査領域となってきた。
【０００７】
ヒト結腸直腸癌は、最適な、糞便ベースの診断上のスクリーニング試験として、ＤＮＡ癌マーカーを採用することができるかどうかを調査するための好都合なモデルを提供してきた。糞便ベースの結腸直腸癌試験の中心となるのは、特異的で感度のよい癌由来マーカーの同定であった。
【０００８】
Ｎ−Ｍｙｃ下流調節遺伝子（ＮＤＲＧ）ファミリーは４つのファミリーメンバーを含む：ＮＤＲＧ１（ＮＤＲＧファミリーメンバー１）、ＮＤＲＧ２（ＮＤＲＧファミリーメンバー２）、ＮＤＲＧ３（ＮＤＲＧファミリーメンバー３）、及びＮＤＲＧ４（ＮＤＲＧファミリーメンバー４）。ヒトＮＤＲＧ１及びＮＤＲＧ３は一方のサブファミリーに属し、ＮＤＲＧ２及びＮＤＲＧ４は他方のサブファミリーに属する。アミノ酸（ａａ）レベルでは、４つのメンバーは、５３〜６５％の同一性を共有する。４つのタンパク質は、ヒトリソソーム酸性リパーゼでのようなアルファ／ベータ加水分解酵素フォールドを含有するが、別個の組織中で異なる特異的な機能を示すことが示唆されている。
【０００９】
ＮＤＲＧ１は、ストレス応答、ホルモン応答、細胞成長、及び細胞分化に関与すると考えられる、細胞質タンパク質をコードする。ＮＤＲＧ１は、細胞分化の間にアップレギュレートされ、胚細胞中で、Ｎ−ｍｙｃ及びｃ−ｍｙｃによって抑圧され、いくつかの腫瘍細胞中で抑制されることが実証されてきた（Ｑｕ  Ｘら、２００２年；Ｇｕａｎら、２０００年）。
【００１０】
ＮＤＲＧ３は、精巣、前立腺、及び卵巣中で高度に発現されるので、精子形成に役割を果たすと考えられている（Ｚｈａｏ  Ｗら、２００１年）。脳癌の発達へのその関与もまた示唆されてきた（Ｑｕ  Ｘら、２００２年）。
【００１１】
ＮＤＲＧ２は、神経突起伸長及び膠芽腫発癌に関与するように思われる細胞質タンパク質をコードする（Ｄｅｎｇ  Ｙら、２００３年）。それは、アルツハイマー病の脳で、ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方でアップレギュレートされ（Ｍｉｔｃｈｅｌｍｏｒｅ  Ｃら、２００４年）、脳癌（Ｑｕ  Ｘら、２００２年）、膵臓癌、及び肝臓癌（Ｈｕ  ＸＬら、２００４年）の発達に重要な役割を果たすことが示唆されてきた。
【００１２】
ＮＤＲＧ４細胞質タンパク質は、血管平滑筋細胞中の分裂促進性のシグナル伝達の調節に関与する（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｓら）。ＮＤＲＧ４遺伝子は１７個のエキソンを含有し、この遺伝子の、いくつかの、選択的にスプライシングされた転写変異体が記載されている。ＮＤＲＧ４もまた脳癌の発達に関与し得る（Ｑｕ  Ｘら、２００２年）。
【００１３】
ＮＤＲＧファミリー遺伝子の発現の抑制は、多くの腫瘍で実証されており（Ｑｕ  Ｘら、２００２年）、ＤＮＡプロモーターの過剰メチル化の関与は、脳腫瘍中のＮＤＲＧ２メチル化の報告に限られている（Ｌｕｓｉｓら、２００５年）。
【００１４】
最初に、糞便ベースのＤＮＡアッセイにより、結腸直腸癌を検出するための特異的な点突然変異マーカーの有用性が調査された。後に、糞便試料中のＤＮＡ完全性は有用なマーカーとなることが分かった（Ｂｏｙｎｔｏｎら、２００３年）。最後に、ＤＮＡの変化に基づく糞便試験は、次第に、特異的な点突然変異マーカー、マイクロサテライト不安定性マーカー、及びＤＮＡ完全性のためのマーカーを使用する多標的ＤＮＡアッセイの開発に発展した。最近では、エピジェネティックな変化を標的とする糞便ＤＮＡ試験の可能性が調査されてきており（Ｍｕｌｌｅｒら、２００４年、Ｃｈｅｎら、２００５年）、多標的ＤＮＡアッセイに加えられてきた。健常対象からの対照試料に対して、結腸癌患者からの糞便ＤＮＡ中で追跡可能な変化したメチル化状態を有する遺伝子が発見された（Ｂｅｌｓｈａｗら、２００４年；Ｐｅｔｋｏら、２００５年；Ｌｅｎｈａｒｄら、２００５年；Ｍuｌｌｅｒら、２００４年；Ｃｈｅｎら、２００５年、及びＬｕｅｎｇら、２００４年）。
【００１５】
選択マーカーの感度に影響を及ぼす可能性がある要因は、試料処理手順及びＤＮＡ単離及び抽出プロトコールである。結腸直腸癌を調査する研究者らが直面した１つの難題は便試料中に存在するＤＮＡの多様性である。糞便試料から回収されたほとんどのＤＮＡは細菌由来のものであり、非常にごく少数のみに相当するヒトＤＮＡ構成成分を有する。結腸粘膜から脱落した細胞からのヒトＤＮＡは、便から回収可能な全ＤＮＡのわずか０．１〜０．０１％に相当する。加えて、回収されたヒトＤＮＡは高度に異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）である。正常細胞は、ほんの少量の腫瘍細胞（脱落した細胞の約１％）と共に結腸内腔の中に脱落する。したがって、興味のあるＤＮＡは、便から単離された全ＤＮＡの非常にわずかなパーセンテージのみに相当する。そのため、適したＤＮＡマーカーの探索と共に、糞便試料からのヒトＤＮＡ構成成分のＤＮＡ単離及び濃縮のための改良された技術が、より感度のよい癌検出のために開発されてきた。
【００１６】
最初のＤＮＡ単離技術は、典型的に、１０ｇ〜４ｇの便からＤＮＡを回収し、より便利なように、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを使用してヒトＤＮＡ構成成分を精製した（Ｄｏｎｇら、２００１年；Ａｈｌｑｕｉｓｔら、２０００年）。便からの標的ヒトＤＮＡの回収でのさらなる改良は、アクリルアミドゲル中に固定されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用する、標的ＤＮＡ配列の、電気泳動で駆動される分離を含んだ（Ｗｈｉｔｎｅｙら、２００４）。後に、ＤＮＡ完全性が適したマーカーであると分かった時、試料を取り扱っている間に分解を予防することもまた重要となった。結果の改良は、収集の後に可能な限り急速に凍結させた便試料を用いて得られた。その代わりに、安定化バッファーが、引き続きの運搬の前に便試料に添加された（Ｏｌｓｏｎら、２００５年）。最近の改良は、糞便細菌ＤＮＡの高いバックグラウンド中でメチル化ヒトＤＮＡを抽出するためのＭＢＤカラムの使用を含む（Ｚｏｕら、２００７年）。しかしながら、これらの進歩にもかかわらず、糞便試料中での癌検出のための現在のツールはまだ不満足なものである。
【００１７】
その早期ステージの癌は、アポトーシス、ネクローシス、又は局所的な血管新生によって、血液の中にその細胞又は遊離ＤＮＡを放出でき、これは、血液ベースの癌試験の基礎を確立する。血清及び血漿中で結腸直腸癌を検出するためのＤＮＡメチル化マーカーの有用性が実証されてきた（Ｇｒａｄｙら、２００１年、Ｌｅｕｎｇら、２００５年；Ｎａｋａｙａｍａら、２００７年）。しかしながら、癌検出のための、血清及び血漿の可能性として考えられる使用は、血漿試料及び血清試料から収集された全ＤＮＡ中に存在するメチル化ＤＮＡの限られたレベルによって妨害される（Ｚｏｕら（２００２年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８８〜９１頁）。さらなる弱点は、ＤＮＡメチル化をモニターする多くの技術によって必要とされる処理ステップのひとつである、重亜硫酸塩処理によって、メチル化ＤＮＡが部分的に分解することである。
【００１８】
血液及び体液を使用する、早期結腸直腸癌又は前癌状態の検出のための方法及び組成物が記載された。
【００１９】
国際公開第２００６／１１３７７０号パンフレットは、反応当たりのＤＮＡ投入量を最大限にするために、試料をプールし、濃縮する方法を記載する。４５ｍｌの血液の最初の処理は、３．８６ｎｇ／ｍｌ血漿のＤＮＡ回収中央値を可能にした。これは、セプチン９遺伝子がメチル化されたかどうかを検出するための特異的なリアルタイムアッセイを使用して、結腸直腸癌の検出について５７％の感度及び９６％の特異性をもたらすことが示された。重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ）処理は、大容量処理及び最大限の変換を達成することに焦点を置いた。
【００２０】
Ｌｏｆｔｏｎ−Ｄａｙら（ＡＡＣＲ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ２００７年４月、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＵＳＡ）は、結腸直腸癌の検出の改良について言及し、同じマーカー（セプチン９）を用いて、７０％の感度及び９０％の特異性を得た。提唱された方法は、４回の採血（４０ｍｌの血液）及び血漿回収のための二重遠心分離を利用し、試験される各試料について４回のＰＣＲ反応を実行することを必要とした。４回の反応のうちの３回は、ＰＣＲ反応当たり、２ｍｌの血漿に相当する投入ＤＮＡを使用した。４回目の反応は、この投入ＤＮＡの１／１０希釈液を使用した。したがって、繰り返しのアッセイが必要とされ（少なくとも４回）、最終結果を決定するためにアルゴリズムが利用された。２ｍｌの血漿に相当する投入ＤＮＡを用いた３回の反応のうちの２回の反応又は希釈した測定のどちらかがセプチン９アッセイについて陽性であった場合に、試料は陽性であると見なされた。希釈試料を使用することによる感度の改良は、方法に阻害因子が存在することを示す。この現象はまた、Ｎａｋａｙａｍａら（２００７年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２７（３Ｂ）：１４５９〜６３頁）によっても記載されている。
【００２１】
より少量の血液の処理が同様に記載されているが（米国特許出願公開第２００７０１４１５８２号、Ｈｏｎｇ−Ｚｈｉ  Ｚｏｕら及びＳａｔｏｒｕ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉら）、すべて、低レベルのメチル化修飾ＤＮＡの検出をもたらす。
【００２２】
したがって、現在の血液ベースのスクリーニング方法は感度を欠いている。
【００２３】
［発明の概要］
本発明は、請求項に述べられるように、ＮＤＲＧ４／２サブファミリー遺伝子は、ヒト癌細胞、特に結腸癌細胞中でＣｐＧアイランドプロモーターメチル化関連遺伝子サイレンシングを受ける、という発見に基づくものである。特にプロモーター領域中の、ＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２などのＮＤＲＧファミリー遺伝子の過剰メチル化はその、発現の損失をもたらす。重要なことには、ＮＤＲＧ４／２サブファミリー遺伝子プロモーターでの異常なメチル化の存在は、予後値を有する。ＮＤＲＧ４／２機能のエピジェネティックな損失は、ＤＮＡ脱メチル化剤の使用によって救出することができ、したがって、治療のための方法を提供する。これらの発見は、ＮＤＲＧ４／２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングの、癌発達での１つの重要なステップとしての重要性を強調し、患者の治療にとって重要な臨床上の影響力を有している可能性がある。
【００２４】
本発明はまた、メチル化状態が、結腸直腸癌などの胃腸癌の発生又はそれに対する素因に関連づけられる特異的な遺伝子及び遺伝子のパネルの発見にも基づく。それぞれ、特に、適切な組織試料若しくは糞便（便）試料又は適切な血液試料（若しくはその誘導体）のコンテクストでの、結腸直腸癌などの胃腸癌の検出のためのこれらの遺伝子の使用は、非常に感度のよい、特異的な結果をもたらすことが示された。本発明はまた、糞便試料から、量が増加したＤＮＡを単離するための方法をも提供し、これは、糞便試料中での、結腸直腸癌の検出の感度の改良をもたらす。
【００２５】
本発明はまた、血液ベースの試料中で、興味のある遺伝子のメチル化状態を決定するための方法をも提供し、これは、特異的で感度のよい結果を得るのに等価な、低容量の血液試料のみを必要とする。これは、より少量の血液試料をテスト下の対象から得ることを可能にするので有利となる。
【００２６】
したがって、第１の態様では、本発明は、試料中で、癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌に対する素因又はその発生を示す方法を提供する。
【００２７】
本発明のすべての態様及び実施形態についての遺伝子のサブセットは、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴ並びにＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３をそれぞれ含む。各サブセットは、本明細書に論じられるように、便試料及び血漿試料などの体液試料に特に適用し得る。
【００２８】
「エピジェネティックな変化」によって、例えばメチル化状態又はヒストンアセチル化の変化などのエピジェネティックなメカニズムによって引き起こされた遺伝子の修飾が意味される。頻繁に、エピジェネティックな変化は、エピジェネティックな変化の指標として検出され得る遺伝子の発現のレベル（必要に応じてＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで）の変化をもたらすであろう。エピジェネティックな変化は、本明細書で「エピジェネティックなサイレンシング」と呼ばれる、遺伝子のサイレンシング又はダウンレギュレーションをもたらすことが多い。本発明の方法で最も頻繁に調査されたエピジェネティックな変化は、遺伝子のメチル化状態を決定することを含み、メチル化のレベルの増加が、典型的に、関係のある癌と関連する（メチル化が、遺伝子発現のダウンレギュレーションを引き起こし得るので）。
【００２９】
関連する態様では、本発明は、癌又は癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、癌又は癌に対する素因を示す方法を提供する。
【００３０】
ＮＤＲＧファミリー遺伝子は当技術分野で特徴づけられており（例えばＱｕ  Ｘら、２００２年及びそこに引用される参考文献を参照されたい）、それらのエピジェネティックなサイレンシングは、ＤＮＡメチル化状態又はそれらのメチル化状態によって決定されるような発現レベルによって評価することができる。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、癌又は癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のメチル化状態の決定によって検出され、遺伝子のメチル化は、癌又は癌に対する素因を示す方法を提供する。
【００３２】
ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のメチル化は、遺伝子の発現の低下で現われるので、本発明はまた、癌又は癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、その遺伝子の発現レベルの測定によって決定され、遺伝子の発現の低下は、癌又は癌に対する素因を示す方法をも提供する。
【００３３】
関連する態様では、本発明は、癌又は癌に対する素因の予後予測のための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、癌発達又は癌に対する素因を示す方法を提供する。好ましくは、エピジェネティックなサイレンシングは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のメチル化状態の決定及び／又はその発現レベルの測定によって検出される。
【００３４】
本発明はまた、試料中で、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴ並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を示す方法をも提供する。糞便試験試料が利用される場合（ある実施形態では血漿）、遺伝子のこれらのサブセットは特に有用であり得る。
【００３５】
関連する態様では、本発明はまた、試料中、特に血液試料又はその誘導体中で、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子（そのあらゆる適したサブセット又はパネルと共に）のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を示す方法をも提供する。
【００３６】
「ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子」によって、ＮＤＲＧ４及びＮＤＲＧ２が属するサブファミリーから得られ、本発明のすべての態様に従ってＮＤＲＧ２及びＮＤＲＧ４を含むあらゆる遺伝子が意味される。「ＮＤＲＧ１、ＮＤＲＧ２、ＮＤＲＧ３、及びＮＤＲＧ４」は、各記号が唯一のものであることを確実にするために、ＮＤＲＧファミリー遺伝子についてｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎによって承認された標準命名法によるものであることに注意されたい。これらの遺伝子についてリストされた受託番号は、ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅで知ることができる。
【００３７】
ＮＤＲＧファミリー遺伝子は、公的に入手可能なデータベースエントリーに認められる特定の配列を包含するだけではなく、これらの配列の転写変異体をも包含する。コードタンパク質の変異体形態は、翻訳後修飾を含んでいてもよく、スプライシングされたメッセージに起因してもよい、等である。ＮＤＲＧ４は、受託番号ＮＭ＿０２０４６５及びＮＭ＿０２２９１０を有する転写変異体を有する。ＮＤＲＧ２は、受託番号ＮＭ＿２０１５３５、ＮＭ＿２０１５３６、ＮＭ＿２０１５３７、ＮＭ＿２０１５３８、ＮＭ＿２０１５３９、ＮＭ＿２０１５４０、ＮＭ＿２０１５４０１、及びＮＭ＿０１６２５０を有するいくつかの転写変異体を有する。変異体配列は、データベースエントリー又は配列リストの配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有し得る。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ５）を含む、同一性パーセントを決定するためのコンピュータプログラムは当技術分野で入手可能である。
【００３８】
ＧＡＴＡ４は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第８染色体（位置ｐ２３．１〜ｐ２２）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＫ０９７０６０、ＮＭ＿００２０５２、及びＥＮＳＧ０００００１３６５７４でリストされている。この遺伝子は、ＧＡＴＡ結合タンパク質４をコードする。
【００３９】
ＯＳＭＲはＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第５染色体（位置ｐ１３．２）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号Ｕ６０８０５、ＮＭ＿００３９９９、及びＥＮＳＧ０００００１４５６２３でリストされている。この遺伝子は、オンコスタチンＭ受容体をコードする。
【００４０】
ＮＤＲＧ４は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第１６染色体（位置ｑ２１〜ｑ２２．３）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＢ０４４９４７及びＥＮＳＧ０００００１０３０３４でリストされている。この遺伝子は、ＮＤＲＧファミリーメンバー４をコードする。
【００４１】
ＧＡＴＡ５は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第２０染色体上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＥＮＳＧ０００００１３０７００でリストされている。この遺伝子は、ＧＡＴＡ結合タンパク質５をコードする。
【００４２】
ＳＦＲＰ１は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第８染色体（位置ｐ１１．２１）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＦ０１７９８７、ＮＭ＿００３０１２、及びＥＮＳＧ０００００１０４３３２でリストされている。この遺伝子は、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１をコードする。
【００４３】
ＡＤＡＭ２３は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第２染色体（位置ｑ３３）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＢ００９６７２及びＥＮＳＧ０００００１１４９４８でリストされている。この遺伝子は、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン２３をコードする。
【００４４】
ＪＰＨ３は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第１６染色体（位置ｑ２４．３）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＢ０４２６３６及びＥＮＳＧ０００００１５４１１８でリストされている。この遺伝子は、ジャンクトフィリン３をコードする。
【００４５】
ＳＦＲＰ２は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第４染色体（位置ｑ３１．３）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＦ０１７９８６及びＥＮＳＧ０００００１４５４２３でリストされている。この遺伝子は、分泌型ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２をコードする。
【００４６】
ＡＰＣは、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第５染色体（位置ｑ２１〜ｑ２２）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号Ｍ７４０８８及びＥＮＳＧ０００００１３４９８２でリストされている。この遺伝子は、腺腫性大腸ポリポーシスをコードする。
【００４７】
ＭＧＭＴ遺伝子は、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）をコードし、これは、グアニンのＯ６位でのアルキル化（例えばメチル化）を迅速に逆行させる細胞内ＤＮＡ修復タンパク質であり、それによって、テモゾロミド（ＴＭＺ）及びカルムスチン（１〜３）などのアルキル化剤の細胞毒性効果を中和する。ＭＧＭＴは、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第１０染色体（位置１０ｑ２６）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号Ｍ２９９７１、ＮＭ＿００２４１２、及びＥＮＳＧ０００００１７０４３０でリストされている。
【００４８】
ＢＮＩＰ３は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第１０染色体（位置１０ｑ２６．３）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号Ｕ１５１７４及びＥＮＳＧ０００００１７６１７１でリストされている。この遺伝子は、ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ  １９ｋＤａ相互作用タンパク質３をコードする。
【００４９】
ＦＯＸＥ１は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第９染色体（位置９ｑ２２）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号Ｕ８９９９５及びＥＮＳＧ０００００１７８９１９でリストされている。この遺伝子は、フォークヘッドボックスＥ１（甲状腺転写因子２）をコードする。
【００５０】
ＪＡＭ３は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第１１染色体（位置１１ｑ２５）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＦ３５６５１８、ＮＭ＿０３２８０１、及びＥＮＳＧ０００００１６６０８６でリストされている。この遺伝子は、接合部接着分子３をコードする。
【００５１】
ＰＨＡＣＴＲ３は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第２０染色体（位置２０ｑ１３．３２）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＪ３１１１２２、ＮＭ＿０８０６７２、及びＥＮＳＧ００００００８７４９５でリストされている。この遺伝子は、ホスファターゼ及びアクチン調節因子３をコードする。
【００５２】
ＴＦＰＩ２は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第７染色体（位置７ｑ２２）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号Ｌ２７６２４及びＥＮＳＧ０００００１０５８２５でリストされている。この遺伝子は、組織因子経路阻害因子２をコードする。
【００５３】
ＳＯＸ１７は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第８染色体（位置８ｑ１１．２３）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＢ０７３９８８及びＥＮＳＧ０００００１６４７３６でリストされている。この遺伝子は、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス１７をコードする。
【００５４】
ＳＹＮＥ１は、ＨＵＧＯ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された遺伝子記号である。この遺伝子は、第６染色体（位置６ｑ２５）上に位置し、遺伝子配列は、受託番号ＡＢ０１８３３９及びＥＮＳＧ０００００１３１０１８でリストされている。この遺伝子は、スペクトリンリピート含有核膜１をコードする。
【００５５】
もちろん、必要に応じて、当業者は、遺伝子配列のそれぞれの機能的に関係のある変異体もまた本発明の方法に従って検出され得ることを十分に理解すると思われる。例えば、多くのスプライス変異体のメチル化状態は、本発明の方法に従って決定されてもよい。変異体配列は、好ましくはデータベースエントリーのヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能なＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を含む、ヌクレオチド配列同一性パーセンテージを決定するためのコンピュータプログラムは当技術分野で入手可能である。
【００５６】
本発明の方法は、一般に、試験試料、特に単離試験試料に対して実行されるエクスビボ又はインビトロの方法である。方法は、あらゆる適した種類の癌を診断するために使用することができる。癌は、一実施形態では、胃腸癌などの胃腸管の腫瘍症を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。特定の実施形態では、本発明の方法は、結腸直腸癌、胃癌、及び／又は食道癌に適用される。特定の実施形態では、方法は、結腸直腸癌を診断するために、より具体的には、遺伝性非ポリープ性大腸癌及び／又は散発性結腸直腸癌を診断するために使用される。その代わりに、方法は、胃癌の診断を目的とする。好ましくは、方法は、結腸直腸癌及び／又は胃癌を診断するために使用される。方法は、癌腫又は腺腫、特に進行腺腫を検出するために使用されてもよい。方法は、特にＮＤＲＧ４のメチル化状態が決定される場合に、胃のびまん型癌腫及び腸管型癌腫の両方の診断に用いられてもよい。一実施形態では、方法はまた、試料を得るためのステップを含んでいてもよい。
【００５７】
特定の一実施形態では、方法は、食道腺癌を診断するために使用される。特に、ＮＤＲＧ４遺伝子（プロモーター）のメチル化状態は、高い感度及び特異性で、この特定の癌の種類の発生に関連づけられることが本明細書で初めて示された。食道腺癌は、これに基づいて、食道扁平上皮細胞癌腫と区別され得る。
【００５８】
「試験試料」は、あらゆる組織試料又は体液とすることができる。好ましくは、試験試料はヒト対象から得られる。特定の実施形態では、試料は胃腸管から採取される。試料は、対象からの結腸直腸組織試料又は結腸組織試料、直腸組織試料、食道組織試料、胃組織試料、若しくは虫垂組織試料又は糞便ベースの試料若しくは血液ベースの試料であってもよい。糞便試料については、方法は、本明細書に論じられるように、結腸直腸癌などの胃腸癌の検出に関して好ましくは使用されるが、危険な可能性のある腺腫を同定するのにも有用であり得る。異なるマーカー及びマーカーのパネルは、本明細書に詳細に論じられるように、組織試料、血液ベースの試料、又は糞便試料などの特定の試料の種類で最も有用であり得る。
【００５９】
したがって、例えば、一実施形態では、本発明の方法は、糞便試験試料中でエピジェネティックな変化を検出するステップ、特に、（少なくとも）ＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、エピジェネティックな変化、特に、ＮＤＲＧ４遺伝子（プロモーター）の（過剰）メチル化の検出は、胃腸腫瘍症／癌、特に腺腫及び癌腫などの結腸直腸癌、胃癌及び胃腸管の他の腺癌（食道腺癌など）、並びに／又は胃のびまん型癌腫及び腸管型癌腫を示す。
【００６０】
対象は、腫瘍形成性であることを疑われてもよい。より具体的には、対象は、本明細書に論じられるように、胃腸癌、特に結腸直腸癌などの癌に罹患していることを疑われてもよい。しかしながら、本発明の１つ又は複数の適切な遺伝子、例えばＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングが、癌の存在を示すために決定することができる、あらゆる他の適した試験試料は本発明の範囲内に含まれる。本明細書に論じられるように、組織試料、糞便試料、及び血漿試料などの適切な試料に基づいた、結腸直腸癌などの胃腸癌の早期ステージの検出を含む、感度のよい、特異的な診断を提供する、遺伝子の好ましいパネル及びサブセットは、本明細書に提示される。したがって、組織試料が利用される実施形態では、本発明の方法は、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中で、エピジェネティックな変化を検出するステップを含んでいてもよく、本質的にそれからなっていてもよく、又はそれからなっていてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を示す。組織試料は、例えば、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【００６１】
本発明の方法で使用されてもよい、他のＤＮＡ含有試料は、診断上の、予後の、又は個別化医療の使用のための試料を含む。これらの試料は、例えば、生検材料若しくは細針吸引液などの外科的な試料から、パラフィン包埋組織から、凍結腫瘍組織試料から、新鮮な腫瘍組織試料から、又は新鮮な体液若しくは凍結体液から得られてもよい。非限定的な例は、全血又はその部分／画分、骨髄、脳脊髄液、腹水、胸水、リンパ液、血清、血漿、尿、乳び、精液、痰、乳頭吸引液、唾液、スワブ被検物、結腸洗浄被検物、及びブラシ被検物を含む。組織及び体液は、あらゆる適した方法を使用して収集することができ、多くのそのような方法は当技術分野で十分に知られている。パラフィン包埋被検物の評価は直接又は組織切片上で行うことができる。組織試料は、腫瘍形成性であることが疑われる組織から一般に採取される。
【００６２】
特定の実施形態では、試験試料は血液試料である。あらゆる血液試料又はその誘導体が利用されてもよい。血液試料又はその誘導体は、全血又はそのあらゆる適したＤＮＡ含有部分／画分を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい。特定の実施形態では、血液試料又はその誘導体は、血清又は血漿を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。血液試料は、あらゆる適した方法を使用して収集されてもよく、多くのそのような方法は当技術分野で十分に知られている。一実施形態では、本発明の方法はまた、血液試料を得るためのステップをも組み込む。あらゆる適切な血液試料が本発明の方法で利用されてもよい。但し、血液試料が十分なＤＮＡを含有していることを条件とする。特定の実施形態では、方法で利用される血液試料又はその誘導体の容量は、約５〜１５ｍｌ、例えば１０ｍｌである。
【００６３】
血液試料又はその誘導体は、一度得られたら、本発明の方法での使用に先立って保存されてもよい。それらは、例えば、約−８０℃などの適した温度で凍結されてもよい。
【００６４】
血液試料又はその誘導体は、血漿試料又は血清試料を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなることが好ましい。血漿は、あらゆる適した手段によって全血から誘導してもよい。一実施形態では、血漿試料は、全血の遠心分離によって得られる。遠心分離は、当業者によって決定され得るように、あらゆる適した速度で及びあらゆる適した期間及びあらゆる適した条件下で実行されてもよい。例えば、遠心分離は、約１０００〜３０００ｇの間で実行されてもよい。遠心分離は、例えば、約１、２、３、４、又は５〜１０、１１、１２、１３、１４、又は１５分間の間で実行されてもよい。遠心分離は、試料の完全性を維持するために、約０〜５℃の間、例えば４℃などの低温で実行されてもよい。血漿試料を得るために複数回の遠心分離ステップが用いられてもよい。特定の実施形態では、血漿試料を得るために２回の遠心分離ステップが用いられる。
【００６５】
血液、特に血漿試料又は血清試料が利用される実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択されてもよい。下記に示されるように、これらの遺伝子は、血漿試料中で結腸直腸癌を診断するための、感度のよい、特異的な方法を提供する。このコンテクストにおいて適したパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。血漿ベースの又は血清ベースの方法で用いられてもよいさらなる遺伝子はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３を含む。
【００６６】
「診断」は、疾患又は疾患の前兆をスクリーニングすること、疾患又は疾患の前兆を同定すること、病期（ステージ）分類並びにその疾患の状態及び進行をモニターすること、治療に続いて、疾患の再発を検査すること、並びに特定の治療の結果をモニターすることを含むように本明細書に定義される。本発明の方法はまた、予後値を有してもよく、これは、用語「診断」の定義内に含まれる。本発明の方法の予後値は、例えば、結腸直腸癌などの多くの胃腸癌に対する、可能性として考えられる罹患性のマーカーとして又は腺腫から癌への進行についてのマーカーとして使用されてもよい。したがって、疾患が、患者で同定可能な症状によって現われる機会を有する前に、危険性のある患者は同定され得る。
【００６７】
本発明の方法は、精製ＤＮＡ含有試料又は未精製ＤＮＡ含有試料に対して実行されてもよい。しかしながら、特定の実施形態では、ＤＮＡは、試料から単離され／抽出され／精製される。あらゆる適したＤＮＡ単離技術が利用されてもよい。精製技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌなどの標準的なテキストで見出されてもよい（特にその中の付録８及び第５章を参照されたい）。一実施形態では、精製は、ＤＮＡのアルコール沈澱を含む。好ましいアルコールは、エタノール及びイソプロパノールを含む。適した精製技術はまた塩ベースの沈澱法をも含む。したがって、特定の一実施形態では、ＤＮＡ精製技術は、混入物を沈澱させるために、高濃度の塩の使用を含む。塩は、例えば、酢酸カリウム及び／又は酢酸アンモニウムを含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。方法は、沈澱させた混入物の除去、その後、アルコール沈澱によるＤＮＡの回収のステップをさらに含んでいてもよい。
【００６８】
代替の実施形態では、ＤＮＡ精製技術は、細胞溶解物から混入物を抽出するための有機溶媒の使用に基づくものである。したがって、一実施形態では、方法は、ＤＮＡを抽出するために、フェノール、クロロホルム、及びイソアミルアルコールの使用を含む。適した条件は、混入物が有機相の中に分離し、ＤＮＡが水相に残ることを確実にするために用いられる。
【００６９】
これらの精製技術の特定の実施形態では、抽出されたＤＮＡは、エタノール沈澱又はイソプロパノール沈澱などのアルコール沈澱によって回収される。
【００７０】
自然源からのＤＮＡの増幅（ＰＣＲを使用）は、同時精製された混入物によって阻害されることが多く、環境試料からのＤＮＡ抽出のために採用される様々な方法は入手可能であり、本発明の特定の実施形態に従って糞便試料又は血液ベースの試料からＤＮＡを単離するための代替物を提供する。例えば、ＱＩＡＧＥＮからのＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔは、ＩｎｈｉｂｉｔＥＸによって、試料中に存在するＤＮＡを損傷する物質及びＰＣＲ阻害因子を吸着する。特に糞便試料に適用するための他の例は、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（商標）（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）、及びＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌによって製造された核酸精製キットを含む。
【００７１】
試験試料が血液ベースの試料である、特定の実施形態では、フェノール−クロロホルム抽出は、試料からの、特に高いレベルのＤＮＡ回収を提供することが示されたので、ＤＮＡは、フェノール−クロロホルム抽出によって単離されてもよい。
【００７２】
血液ベースの試験試料が用いられる場合、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ手法が例えば利用されてもよい。
【００７３】
血液試料からＤＮＡを単離するための適した方法及びキットは市販で入手可能である。それぞれ本発明の方法で利用されてもよい例は下記の表に提供される。
【００７４】
【表１】
2015154775.tif 000002
【００７５】
Ｑｉａｇｅｎから入手可能なＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ  ｇＤＮＡ  ｋｉｔは、共に、出発物質として血漿又は血清を利用する。
【００７６】
したがって、表１から推論することができるように、ＤＮＡ単離は、例えばシリカ膜ベースの方法、イソプロパノールベースの方法、又は磁気ビーズベースの方法を使用して実行されてもよい。
【００７７】
本発明の方法はまた、必要に応じて、試料中の単離／抽出／精製ＤＮＡの定量を組み込んでもよい。試料中のＤＮＡの定量はあらゆる適した手段を使用して達成されてもよい。核酸の定量化は、例えば、分光光度計、蛍光光度計、又はＵＶトランスイルミネーターの使用に基づくものであってもよい。適した技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌなどの標準的なテキストに記載される（特にその中の付録８を参照されたい）。一実施形態では、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なピコグリーン（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）（登録商標）ｄＳＤＮＡ定量化キットなどのキットは、ＤＮＡを定量するために用いられてもよい。
【００７８】
「癌」は、腫瘍症を含むように本明細書に定義される。腫瘍症は、異常性の新生物を指し、したがって、腫瘍と同じものを意味し、これは良性であってもよい又は悪性であってもよい。本発明に従って関係のある特定の癌の種類は上記に論じられ、胃腸管の腫瘍症から選択される種類を含む。特定の例は、結腸直腸癌、食道癌、胃の癌、及び胃癌を含む。
【００７９】
結腸癌又は腸癌とも呼ばれる「結腸直腸癌」は、結腸、直腸、及び虫垂中の癌腫を含むように定義される。特定のマーカー及びマーカーのパネルは、非常に詳しく本明細書に記載の通り、ある種の癌の種類に特に適用可能であり得る。
【００８０】
本発明の特定の実施形態（しかしすべてではない）で関係のある可能性がある他の癌の種類は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、及び甲状腺癌を含む。
【００８１】
「エピジェネティックなサイレンシング」は、遺伝子の一次ヌクレオチド配列の変化以外のメカニズムによって媒介される遺伝子発現量の低減をもたらす、ＤＮＡ中のあらゆる変化を含むように本明細書に定義される。エピジェネティックな修飾は、ある種の環境では、安定な遺伝性の形質であり得る。遺伝子発現量の変化を引き起こす、多くの関連するメカニズムが認識されており、ＤＮＡメチル化、クロマチンリモデリングをもたらし得るヒストン変化（例えばヒストンアセチル化の変化）、及びＲＮＡ干渉を含む。多くの場合では、ＤＮＡの過剰メチル化は、不正確に、重大な遺伝子のスイッチを切り、癌が発達し、進行するのを可能にする。
【００８２】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシング又はそのメチル化などのエピジェネティックな変化は、異常性の新生物／癌が観察可能となる前に現われ得る。対象は、通例のスクリーニングを受けていてもよく、結腸腫瘍症などの疾患を有することを必ずしも疑われていなくてもよい。そのような対象の腺腫中での１つ又は複数の遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングの検出は、腺腫の可能性の高い経過が癌腫への発達であり、したがって、腫瘍症に対する素因があることを示し得る。そのような場合、予防的治療は、推奨され、進行腺腫の切除を含んでいてもよい。これらの方法は、本明細書に論じられるように、特にプライマーセット１を使用する、ＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化の検出を有利には含んでいてもよい。
【００８３】
「進行腺腫」は、結腸直腸癌に関連づけられる遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックなサイレンシングが観察され、好ましくは、本発明の１つ又は複数の遺伝子（ＮＤＲＧ４など）のメチル化などのエピジェネティックなサイレンシングが検出される腺腫を指す。
【００８４】
検出されるＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の最も好ましいエピジェネティックな変化は、メチル化を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。特に、１つ又は複数の遺伝子の、過剰メチル化と呼ばれてもよい異常なメチル化が検出される。典型的に、メチル化状態は、遺伝子（複数可）のプロモーター領域に認められることが多い、適したＣｐＧアイランドで決定される。用語「メチル化」、「メチル化状況」、又は「メチル化状態」は、ＤＮＡ配列内の、１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の存在又は不在を指す。ＣｐＧジヌクレオチドは、ヒト遺伝子のプロモーター領域及びエキソンに典型的に集中する。
【００８５】
遺伝子発現量の低減は、遺伝子のメチル化状態によって決定されるように、ＤＮＡメチル化状態によって又は発現レベルによって評価することができる。エピジェネティックなサイレンシングを検出するための１つの方法は、正常細胞中で発現される遺伝子が、腫瘍細胞中でそれほど発現されない又は発現されないことを決定することである。したがって、本発明は、癌又は癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、その遺伝子の発現レベルの測定によって決定され、遺伝子の発現の低下は、癌又は癌に対する素因を示す方法を提供する。本発明はまた、試料中で、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４（若しくは他のＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリーメンバー）、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することによって決定され、少なくとも１つの遺伝子の発現の低レベル、レベルの低下、又は欠乏は、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を示す方法をも提供する。
【００８６】
血液、特に血漿試料又は血清試料が利用される実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。これらの遺伝子はまた、糞便試験試料が用いられる場合にも有用である。ＴＦＰＩ２は特に有用なマーカーとなり得る。血漿試料が用いられる場合、ＴＰＦ１２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７から選択される遺伝子などの特定の遺伝子は、最も有用となり得る。便試料については、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＯＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴなどの遺伝子並びにさらにＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される遺伝子は有用に用いられ得る。下記に示されるように、これらの遺伝子は、血漿試料中で結腸直腸癌を診断するための、感度のよい、特異的な方法を提供する。このコンテクストにおいて適したパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。さらなるパネルは下記に論じられる。これは、早期ステージの結腸直腸癌、特にステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を診断するために利用されてもよい。
【００８７】
組織試料が利用される実施形態では、方法は、好ましくは、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を示す。組織試料は、例えば、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【００８８】
特定の実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のタンパク質発現量の全体的な損失は、本明細書に記載の通り、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌の診断若しくは癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因を結論づけるために又は本発明の他の方法に従って治療の最も好都合な方針を決定するために試料中で観察される（この説明は必要な変更を加えて本明細書に適用される）。しかしながら、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の部分的な発現の損失もまた関係のある１つ又は複数の遺伝子のメチル化により、関係のあるものとなり得る。
【００８９】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルの減少は、必要に応じて、それが試料中で統計的に有意かどうかを決定するために測定されてもよい。これは、本発明の方法に信頼できる検定を提供するのに役立つ。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが有意に低下したかどうかを決定するためのあらゆる方法が利用されてもよい。そのような方法は、当技術分野で十分に知られており、ルーチン的に用いられる。例えば、統計分析が行われてもよい。１つの例は、分散分析検定を含む。相対的な発現量又は活性が統計的に有意であるかどうかを決定する場合、そのような方法で使用される典型的なＰ値は、＜０．０５又は０．０１又は０．００１のＰ値であろう。例えば少なくとも１０％の減少がある場合、発現量の変化は有意であると見なされてもよい。検定は、統計的に有意であると考えられるために、例えば少なくとも１５％  ２０％  ２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％に変化させることによって、より選択的なものとしてもよい。
【００９０】
本発明の方法の特定の実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現又は活性のレベルの減少は、対照試料に関連して決定される。この対照試料は、対象の正常（つまり非腫瘍形成性）組織から好ましくは採取され、対応する１つ又は複数の遺伝子の発現は正常である。それに加えて又はその代わりに、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が欠乏していることが知られている対照試料もまた利用されてもよい。
【００９１】
試験試料及び対照試料の両方の適した参照遺伝子の発現又は活性のレベルを測定することなどのように、試験が正しく進んでいることを確実にするために、適したさらなる対照もまた含まれていてもよい。本発明に適した参照遺伝子は、ベータ−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、１８ＳリボソームＲＮＡなどのリボソームＲＮＡ遺伝子、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ遺伝子を含む（Ｒａｄｏｎｉｃ  Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００４年１月２３日；３１３（４）：８５６〜６２頁）。特定の実施形態では、参照遺伝子はベータ−アクチンである。
【００９２】
核酸の発現量は、ＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで測定することができる。試験試料中の細胞は溶解することができ、溶解物又は溶解物から精製された若しくは半精製されたＲＮＡ中のｍＲＮＡレベルが決定される。その代わりに、方法は、溶解されていない組織又は細胞懸濁液に使用することができる。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現をＲＮＡレベルで決定するための適した方法は、当技術分野で十分に知られており、本明細書に記載される。
【００９３】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の関係のある転写物（複数可）に対する核酸プローブハイブリダイゼーションを用いる方法は、それぞれのｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを測定するために用いられてもよい。そのような方法は当技術分野で十分に知られており、核酸プローブアレイ（マイクロアレイ技術）及びノーザンブロットの使用を含む。ゲノム技術の進歩は、多くが、特異的なプローブ−標的ハイブリダイゼーションという同じ概念に基づくものであるが、現在、何千もの遺伝子の同時分析を可能にしている。配列決定ベースの方法は代替物となる。これらの方法は、発現配列タグ（ＥＳＴ）の使用から始められ、現在、連続的遺伝子発現分析（ＳＡＧＥ）及び大量並行サイン配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）などの、短いタグに基づく方法を含む。ディファレンシャルディスプレイ技術は、遺伝子発現を分析するための他の手段を提供する。このファミリーの技術は、制限消化によって生成されたｃＤＮＡ断片の無作為な増幅に基づき、２つの組織の間で異なるバンドが興味のあるｃＤＮＡを同定する。
【００９４】
ある種の実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現のレベルは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される。ＲＴ−ＰＣＲは、当技術分野で十分に知られている技術であり、ＲＴ−ＰＣＲは、酵素である逆転写酵素に依存し、ｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを形成し、これは、次いで、標準的なＰＣＲ反応で増幅することができる。ＲＴ−ＰＣＲを実行するためのプロトコール及びキットは、当業者らに極めて十分に知られており、市販で入手可能である。
【００９５】
一実施形態では、ＮＤＲＧ４遺伝子に対して実行されるＲＴ−ＰＣＲで有用なプライマーが提供される。これらのプライマーは、以下の配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【００９６】
配列番号１  ５’−ｃｃｔｇａｇｇａｇａａｇｃｃｇｃｔｇ−３’（フォワード）
配列番号２  ５’−ａｔｇｔｃａｔｇｔｔｃｃｔｔｃｃａｇｔｃｔｇｔ−３’（リバース）
配列番号３  ５’−ＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＴＡＧＴＧＡＴＣＣＧ−３’（フォワード）
配列番号４  ５’−ＧＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＣＴＣＧ−３’（リバース）
【００９７】
これらのプライマーの変異体は、本明細書に定義されるように、本発明の範囲内に含まれ、この定義は必要な変更を加えて適用される。
【００９８】
ＲＴ−ＰＣＲは非定量的方式で実行することができる。エンドポイントＲＴ−ＰＣＲは、３つの異なる方法：相対的、競合的、及び比較的を使用して、発現レベルの変化を測定する。これらの伝統的方法は当技術分野で十分に知られている。その代わりに、ＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイム方式及び／又は定量的方式で実行される。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲは文献に詳細に記載されており（技術の早期の例に関してはＧｉｂｓｏｎらを参照されたい）、多種多様の技術が可能である。例として、加水分解性プローブ（Ｔａｑｍａｎ）、ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）、ＦＲＥＴプローブ対（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ））、プライマーに付けられたヘアピンプローブ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、ヘアピンプライマー（Ｐｌｅｘｏｒ及びＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ＤｚｙＮＡ、並びにオリゴヌクレオチドブロッカーシステムの使用を含む。これらのシステムはすべて市販で入手可能であり、十分に特徴づけられており、多重化（即ち単一の試料中の複数の遺伝子の発現の決定）を可能にし得る。
【００９９】
ＴＡＱＭＡＮは、最も早期の入手可能なリアルタイムＰＣＲ技術のうちの１つであり、ＰＣＲ反応中に、上流プライマー結合部位及び下流プライマー結合部位の間に結合するプローブに依存する。ＴＡＱＭＡＮプローブは、５’蛍光体及び３’消光剤部分を含有する。したがって、ＤＮＡ上のその結合部位に結合すると、プローブは、蛍光体に近接した消光剤の存在により蛍光発光しない。増幅の間に、プローブが増幅されている鎖に結合した場合、Ｔａｑなどの適したポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がプローブを消化する。プローブのこの消化は蛍光体の移動を引き起こす。蛍光体の放出は、蛍光体がもはや消光剤部分に近接していないことを意味し、そのため、これにより、蛍光体が蛍光発光することが可能になる。結果として生じる蛍光は測定されてもよく、増幅されている標的配列の量に正比例する。これらのプローブは、時に、加水分解性プローブと総称的に呼ばれる。
【０１００】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓシステムでは、プローブは、なおまた、プライマー結合部位の間に結合するように設計されている。しかしながら、ここで、プローブはヘアピン状プローブである。その標的配列に結合していない場合のプローブ中のヘアピンは、プローブの一方の端に付けられた蛍光体及びプローブの他方の端に付けられた消光剤が近接しており、そのため、内部での消光が生じることを意味する。プローブの標的配列がＰＣＲ増幅の間に形成される場合のみ、プローブは開き、この配列に結合する。プローブのループ部分はプローブ自体として作用するが、ステムは、相補的なアーム配列によって形成されている（そのそれぞれの端に蛍光体部分及び消光剤部分が付けられている）。ｂｅａｃｏｎプローブがその標的を検出すると、プローブはコンホメーション変化を受けて、ステムが離れて、これにより蛍光体及び消光剤が分離する。これは、引き離されることとなる消光剤へのエネルギー移動を引き起こす。そのため、蛍光が復活する。
【０１０１】
変性ステップの間、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓはランダムコイル構造をとり、蛍光発光する。プライマーのアニーリングを可能にするように温度を下げるにつれて、ステムハイブリッドが迅速に生じて、蛍光を予防する。しかしながら、アニーリング温度では、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓはまたアンプリコンにも結合し、コンホメーションの再編成を受けて、蛍光をもたらす。温度が上げられて、プライマー伸長を可能にすると、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓはそれらの標的から解離し、重合に干渉しなくなる。新たなハイブリダイゼーションがサイクル毎のアニーリングステップで起こり、結果として生じる蛍光の強度は、蓄積されたアンプリコンの量を示す。
【０１０２】
ＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓと同じ原理に基づく。しかしながら、ここで、プローブは、増幅プライマーに結合し、増幅プライマーが一体化した部分を形成する。プローブは、その５’端にブロック基を有し、プローブ配列による増幅を予防する。増幅の１ラウンドがこのプライマーによって誘導された後、プローブの標的配列が生成され、これにプローブが結合する。したがって、名称「ｓｃｏｒｐｉｏｎ」は、増幅産物の一部としてのプローブがその標的配列に内部でハイブリダイズして、したがって尾型構造を形成する事実から生じたものである。プローブ−標的結合は鎖内の二次構造より動力学的に有利である。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、論文「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７、８０４〜８０７頁（１９９９年））に最初に記載され、基本的なテーマに基づいた多数の変形体がその後に生成された。
【０１０３】
Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーに類似した様式で、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマーは、プライマーへのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ型プローブの組み込みに依存する。なおまた、プローブのヘアピン構造は、増幅プライマー自体の一部を形成する。しかしながら、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ型プライマーとは対照的に、プローブの５’端に、プローブが増幅され、増幅産物の一部を形成するのを予防するためのブロックはない。したがって、プライマーは鋳型鎖に結合し、相補鎖の合成を誘導する。そのため、プライマーは、増幅の第１のラウンドの増幅産物の一部になる。相補鎖が合成される場合、増幅がヘアピン構造によって生じる。これにより、蛍光体分子及び消光剤分子が分離し、したがって、増幅が進むにつれて、蛍光の生成をもたらす。
【０１０４】
ＤｚｙＮＡプライマーは、１０〜２３ヌクレオチドＤＮＡｚｙｍｅの相補的／アンチセンス配列を組み込む。増幅の間に、反応混合物中に含まれるレポーター基質を切断する、ＤＮＡｚｙｍｅの活性（センス）コピーを含有するアンプリコンが生成される。ＰＣＲ／増幅の間のアンプリコンの蓄積は、レポーター基質内のＤＮＡｚｙｍｅ切断部位の両側に組み込まれた蛍光体分子及び消光剤色素分子の分離によって生成された蛍光の変化によってリアルタイムでモニターすることができる。ＤＮＡｚｙｍｅ及びレポーター基質の配列は汎用的なものとなり得、したがって、様々な遺伝子又は転写物を標的とするプライマーセットを用いる使用に適し得る（Ｔｏｄｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６；５、６２５〜６３０頁（２０００年））。
【０１０５】
プレキソール（Ｐｌｅｘｏｒ）（商標）ｑＰＣＲ  ａｎｄ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、２つの修飾ヌクレオチドの間の特異的な相互作用を利用して、定量的ＰＣＲ分析を達成する。ＰＣＲプライマーのうちの一方は、５’末端に、ｉｓｏ−ｄＣ残基に隣接した蛍光標識を含有する。第２のＰＣＲプライマーは非標識である。反応ミックスは、デオキシヌクレオチド及び消光剤ｄａｂｃｙｌを用いて修飾されたｉｓｏ−ｄＧＴＰを含む。ｄａｂｃｙｌ−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは、ｉｓｏ−ｄＣ残基に対して相補的な位置に優先的に組み込まれる。この位置でのｄａｂｃｙｌ−ｉｓｏ−ｄＧＴＰの組み込みは、相補鎖上の蛍光色素の消光及び蛍光の低下をもたらし、これは、増幅の間の定量化を可能にする。これらの多重反応については、異なる蛍光体を有するプライマー対が各標的配列に使用される。
【０１０６】
本発明で使用されるリアルタイム定量的技術は、継続的にモニターすることができる蛍光性の読み取り値を一般にもたらす。蛍光シグナルは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのような、二本鎖ＤＮＡに特異的な色素によって又は配列特異的蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマー若しくはプローブによって生成される。プライマー又はプローブのそれぞれは、異なる蛍光体を用いて標識することができ、特異的な検出を可能にする。これらのリアルタイム定量的技術は、「単一のチューブ」中で反応を続けるので有利である。これは、結果を得るための下流の分析の必要がないことを意味し、より迅速に結果が得られる。そのうえ、「単一のチューブ」の環境で反応を続けることは相互汚染の危険性を低下させ、本発明の方法からの定量的な出力を可能にする。これは、本発明の臨床上のセットで特に重要であり得る。
【０１０７】
ＰＣＲは、好ましい増幅方法であるが、ネステッドＰＣＲなどの基本的な技術に基づいた変形体を含むために、等価物もまた本発明の範囲内に含まれてもよいことに注意されたい。例として、限定を伴うことなく、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ、及び三重増幅（ｔｒｉａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの等温増幅技術を含み、これらのすべては、当技術分野で十分に知られており、市販で入手可能である。他の適した増幅方法は、限定を伴うことなく、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０年）、ＭＬＰＡ、標的ポリヌクレオチド配列の選択的な増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、インベーダー技術（ｉｎｖａｄｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、鎖移動技術（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（国際公開第９０／０６９９５号パンフレット）、及びニック移動増幅（ｎｉｃｋ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（国際公開第２００４／０６７７２６号パンフレット）を含む。
【０１０８】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現をタンパク質レベルで決定するための適した方法もまた、当業者に十分に知られている。例として、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色及び免疫局在性、免疫蛍光法、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、凝集反応、放射免疫アッセイ、フローサイトメトリー、マススペクトロフォトメトリー、並びに平衡透析法を含む。これらの方法は、一般に、適切な遺伝子産物の同定に特異的な試薬に依存する。レクチン、受容体、核酸、抗体などのあらゆる適した試薬が利用されてもよい。試薬は好ましくは抗体であり、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含んでいてもよい。断片及び誘導体化された抗体もまた利用されてもよく、限定を伴うことなく、遺伝子産物結合機能を保持するＦａｂ断片、ＳｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ナノ抗体、重鎖抗体、アプタマーなどを含む。あらゆる検出方法が本発明に従って用いられてもよい。タンパク質は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びアミノ酸配列決定を含む一連の方法によって、電荷、極性、アミノ酸配列などに基づいて同定されてもよい。試薬が、適切な遺伝子産物を特異的に同定することができなければならないという点を除いて、試薬の性質は制限されない。
【０１０９】
もちろん、癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌の陽性の診断の症例では、関係のあるタンパク質のレベルが低下するであろう、また、おそらくタンパク質はまったくないであろう。一実施形態では、タンパク質特異的試薬が野生型タンパク質又は完全長タンパク質に結合する試薬である場合、これは陰性の結果を提示するであろう。この場合、適した対照の使用は、例えば、分解した試薬又は非特異的試薬によって引き起こされる誤診は成されないであろうということを確実にする。したがって、同じ試薬を、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子がタンパク質レベルで発現されることが知られている試料で試験することができる。この対照試料の陽性の結果は、試験試料の陰性の結果と組み合わせて、癌の確信的な診断を提供し、試薬の品質に対するあらゆる疑いを取り除く。
【０１１０】
サイレンシングのメカニズムは、例えば体細胞の突然変異によって遺伝的なものとなり得るので、遺伝子の発現の測定自体、必ずしも、確証的に、サイレンシングがエピジェネティックなものであることを示し得ない。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、エピジェネティックなサイレンシングを逆行させるように設計された適切な再発現アッセイを組み込む。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＭＴ）阻害因子などの脱メチル化剤を使用する試料の適切な処理は、関係のある遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを逆行させ得る。適した試薬は、ＤＡＣ（５’−デアザシチジン）、ＴＳＡ、又は細胞株中に存在するエピジェネティックなメカニズムに影響を与えるあらゆる他の処理を含むが、これらに限定されない。適した試薬は、本発明の遺伝薬理学的態様及び処理の態様に関して本明細書に論じられ、この議論は必要な変更を加えて適用される。典型的に、発現は、そのような試薬を用いる処理に際して再活性化される又は逆行し、サイレンシングがエピジェネティックなものであることを示す。
【０１１１】
実験の部で論じられるように、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子の発現の低減をもたらすエピジェネティックなサイレンシングは、結腸直腸癌及び胃癌などの一連の胃腸癌で示されてきた。したがって、一実施形態では、本発明は、結腸直腸癌及び／又は胃癌又は本明細書に定義されるような他の胃腸癌、結腸直腸癌及び／又は胃癌又は本明細書に定義されるような他の胃腸癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、その遺伝子の発現レベルの測定によって決定され、遺伝子の発現の低下は、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌若しくは本明細書に定義されるような他の胃腸癌、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌若しくは本明細書に定義されるような他の胃腸癌に対する素因、又は腺腫の癌腫への進行を示す方法を提供する。好ましくは、遺伝子は、ＮＤＲＧ２、ＮＤＲＧ４、又はＮＤＲＧ２及びＮＤＲＧ４の組合せである。
【０１１２】
実験の部で例示されるように、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の低減をもたらすエピジェネティックなサイレンシングは、胃腸癌、特に結腸直腸癌の発生と、感度よく、特異的に関連づけられることが示された。したがって、さらなる実施形態では、本発明は、胃腸癌、特に結腸直腸癌又は胃腸癌、特に結腸直腸癌に対する素因を診断するための方法であって、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、その遺伝子の発現レベルの測定によって決定され、その遺伝子の発現の低下は、胃腸癌、特に結腸直腸癌、胃腸癌、特に結腸直腸癌に対する素因、又は腺腫の癌腫への進行を示す方法を提供する。糞便試験試料が利用される場合、これらのマーカーは有用に用いられてもよい。
【０１１３】
実験の部でも論じられるように、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の低減をもたらすエピジェネティックなサイレンシングは、特異的な組織並びに糞便試料及び血液ベースの試料などの体液中で、結腸直腸癌の発生と感度よく、特異的に関連づけられることが示された。したがって、特定の一実施形態では、本発明は、胃腸癌、特に結腸直腸癌又は胃腸癌、特に結腸直腸癌に対する素因を診断するための方法であって、組織試料、糞便試料、又は血液（血漿若しくは血清）試料若しくはその誘導体中で、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、その遺伝子の発現レベルの測定によって決定され、その遺伝子の発現の低下は、胃腸癌、特に結腸直腸癌、胃腸癌、特に結腸直腸癌に対する素因、又は腺腫の癌腫への進行を示す方法を提供する。上記に論じられるように、血漿試料又は血清試料が利用される場合、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択されてもよい。
【０１１４】
代替の及び補足的な実施形態では、特に、糞便試料及び血漿試料などの体液が利用される場合、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。パネルは、本明細書で所望され、論じられるように、これらの遺伝子及び本発明の他の遺伝子から選択されてもよい。便試料及び血漿試料中でのこれらの遺伝子のメチル化は、結腸直腸癌に関連づけられることが本明細書で初めて示された。具体的には、血漿試料及び糞便試料の両方で好都合なレベルの感度及び特異性を与える有用なマーカーは、ＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３を含む。ＴＦＰＩ２は特に有用であり得る。血漿試料を試験する場合、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７から選択される遺伝子などのある種の遺伝子は、最も有用であることが明らかになってもよい。この議論は、必要に応じて、本発明のすべての態様に対して適用される。
【０１１５】
さらなる遺伝子の発現もまた本発明の方法を補うために決定されてもよいことに注意されたい。実際に、本明細書に定義されるような癌、特に、結腸直腸癌、胃癌、及び／又は食道癌などの胃腸癌の確立に関与するあらゆる遺伝子は、本明細書の方法で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子と組み合わせて利用されてもよい。ある種の実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルは、癌の確立に関与する少なくとも１つの他の遺伝子と組み合わせて分析される。一実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子は、癌の確立に関与する少なくとも２つの他の遺伝子と組み合わせられる。さらなる実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子並びに癌の確立に関与する少なくとも３つ、４つ、５つ、又は６つの他の遺伝子が組み合わせられる。（結腸直腸）癌の確立に関与する他の遺伝子は、ＣＨＦＲ、ｐ１６、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｐ１４、ＲＡＳＳＦｌａ、ＲＡＢ３２、ＳＥＰＴＩＮ−９、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＭＥＦＦ２、ＮＧＦＲ、及びＳＭＡＲＣＡ３からなる群から選択されてもよい。
【０１１６】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、遺伝子のメチル化で現われるので、本発明の方法は、遺伝子メチル化を検出するステップを好ましくは含む。したがって、本発明は、癌又は癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の決定によって検出され、少なくとも１つの遺伝子のメチル化は、癌又は上記に定義されるような癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因を示す方法を提供する。
【０１１７】
血液、特に血漿試料又は血清試料が利用される実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択されてもよい。下記に示されるように、これらの遺伝子は、血漿試料中で結腸直腸癌を診断するための、感度のよい、特異的な方法を提供する。このコンテクストにおいて適したパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。これは、早期ステージの結腸直腸癌、特にステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を診断するために利用されてもよい。それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。
【０１１８】
組織試料が利用される実施形態では、方法は、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含んでいてもよく、本質的にそれからなっていてもよく、又はそれからなっていてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を示す。組織試料は、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【０１１９】
糞便試料が用いられる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＥＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択されてもよい。それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＺ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。これらの遺伝子から選択される２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つなどの遺伝子のパネルもまた本発明で想定される。
【０１２０】
メチル化を受けやすいＣｐＧジヌクレオチドは、ヒト遺伝子のプロモーター領域、エキソン、及びイントロンに典型的に集中する。プロモーター領域、エキソン領域、及びイントロン領域はメチル化について評価することができる。一実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が決定される。「プロモーター」は、転写開始部位から約１ｋｂ、５００ｂｐ、又は１５０〜３００ｂｐ上流の間に典型的にわたる領域である。頻繁に、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写開始部位のあたりを囲む又はそのあたりに位置するＣｐＧアイランドは、そのメチル化状態を決定するために分析される。その代わりに、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエキソン領域及び／又はイントロン領域のメチル化状態は、必要に応じて決定されてもよい。
【０１２１】
本発明の方法の一実施形態では、ＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が分析される。他の実施形態では、ＮＤＲＧ２遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態が分析される。その代わりに、ＮＤＲＧ２及びＮＤＲＧ４のプロモーター領域が同時に分析される。
【０１２２】
一実施形態では、配列番号５２４（図３ａ）として記載されるようなＮＤＲＧ４のヌクレオチド配列及び／又は配列番号５２５（図３ｂ）として記載されるようなＮＤＲＧ２のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子の領域は、そのメチル化状態を決定するために分析される。
【０１２３】
様々なメチル化アッセイ手法は当技術分野で知られており、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイは２つの別個のアプローチに依存する：重亜硫酸塩変換ベースのアプローチ及び非重亜硫酸塩ベースのアプローチ。ＤＮＡメチル化の分析のための非重亜硫酸塩ベースの方法は、メチル化感受性酵素が、それらの制限部位でメチル化シトシンを切断することができないことに依存する。重亜硫酸塩変換は、非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸ナトリウムを用いたＤＮＡ試料の処理に依存するが、メチル化シトシンは維持される（Ｆｕｒｕｉｃｈｉら、１９７０年）。この変換は、元々のＤＮＡの配列の変化をもたらす。ＤＮＡメチル化分析は、配列決定、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳ−ＰＣＲ）、融解曲線メチル化特異的ＰＣＲ（ＭｃＭＳ−ＰＣＲ）、重亜硫酸塩処理を用いる又は用いないＭＬＰＡ、ＱＡＭＡ（Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋら、２００４年）、ＭＳＲＥ−ＰＣＲ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖら、２００５年）、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ（Ｅａｄｓら、２０００年）、ＣｏｎＬｉｇｈｔ−ＭＳＰ（Ｒａｎｄら、２００２年）、重亜硫酸塩変換特異的メチル化特異的ＰＣＲ（ＢＳ−ＭＳＰ）（Ｓａｓａｋｉら、２００３年）、ＣＯＢＲＡ（重亜硫酸ナトリウム処理ＤＮＡのＰＣＲ産物中で、メチル化依存性の配列差異を明らかにするために制限酵素の使用に依存する）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長コンホメーション（ＭＳ−ＳＮｕＰＥ）、メチル化感受性一本鎖コンホメーション分析（ＭＳ−ＳＳＣＡ）、融解曲線を組み合わせた重亜硫酸塩制限部位分析（ＭｃＣＯＢＲＡ）（Ａｋｅｙら、２００２年）、ＰｙｒｏＭｅｔｈＡ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（Ｃｏｔｔｒｅｌｌら、２００４年）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、メチル化対立遺伝子の定量的分析（ＱＡＭＡ）、酵素領域メチル化アッセイ（ＥＲＭＡ）、ＱＢＳＵＰＴ、ＭｅｔｈｙｌＱｕａｎｔ、定量的ＰＣＲ配列決定及びオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイシステム、パイロシーケンス、Ｍｅｔｈ−ＤＯＰ−ＰＣＲを含む多くの技術を用いて行われ、成功してきた。いくつかの有用な技術の総論は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８年、第２６巻、第１０号、２２５５〜２２６４頁、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００３年、第３巻、２５３〜２６６頁；Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００６年、第４２巻、５〜１３頁に提供され、これらの参考文献はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの技術のうちのいずれも、必要に応じて、本発明に従って利用されてもよい。
【０１２４】
メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの同定のためのさらなる方法は、ＭｅＣＰ２タンパク質のメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）がメチル化ＤＮＡ配列に選択的に結合する能力を利用する（Ｃｒｏｓｓら、１９９４年；Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、１９９９年）。その代わりに、ＭＢＤは、ＭＢＰ、ＭＢＰ２、ＭＢＰ４、又はポリＭＢＤから得られてもよい（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、２００６年）。ある方法では、制限エキソヌクレアーゼに消化されたゲノムＤＮＡは、固体マトリックスに固定され、分離用のカラムクロマトグラフイーに使用される、発現Ｈｉｓタグつきメチル−ＣｐＧ結合ドメインに装填されて、高度にメチル化されたＤＮＡ配列を単離する。そのようなメチル化ＤＮＡ濃縮ステップにより本発明の方法を補ってもよい。メチル化されたＣｐＧアイランドを検出するためのいくつかの他の方法は、当技術分野で十分に知られており、中でもメチル化ＣｐＧアイランド回収アッセイ（ＭＩＲＡ）を含む。これらの方法のうちのいずれも、所望される場合、本発明で用いられてもよい。
【０１２５】
特定の実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子（又は本明細書に論じられるように、その部分、とりわけＣｐＧアイランド）のメチル化状態は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）又は等価な増幅技術を使用して決定される。当業者はＭＳＰ技術に精通しているであろう。ＭＳＰアプローチでは、ＤＮＡは、重亜硫酸ナトリウム処理の結果としての配列差異を利用することによって、非メチル化ＤＮＡからメチル化ＤＮＡを区別するために設計されたプライマー対を使用して増幅されてもよい（Ｈｅｒｍａｎら、１９９６年及び国際公開第９７／４６７０５号パンフレット）。
【０１２６】
ＭＳＰ技術の特定の例は、リアルタイム定量的ＭＳＰ（ＱＭＳＰ）と呼ばれ、リアルタイムでのメチル化ＤＮＡの信頼できる定量を可能にする。これらの方法は、一般に、増幅手法の継続的な、光学的モニタリングに基づき、蛍光標識試薬を利用し、その試薬の産物中への組み込みを定量することができ、その試薬の定量により鋳型中のその配列のコピー数を示す。あるそのような試薬は、優先的に二本鎖ＤＮＡに結合し、蛍光が二本鎖ＤＮＡの結合によって大いに増強されるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉと呼ばれる蛍光色素である。その代わりに、標識プライマー及び／又は標識プローブを使用することができる。それらは、本明細書により詳細に記載の通り、加水分解性プローブ（タックマン（ＴＡＱＭＡＮ）（登録商標））、ヘアピンプローブ（モレキュラービーコンズ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＥＡＣＯＮＳ）（登録商標））、ヘアピンプライマー（アンプリフルオール（ＡＭＰＬＩＦＬＵＯＲ）（登録商標））、プライマーの中に統合されたヘアピンプローブ（スコーピオン（ＳＣＯＲＰＩＯＮ）（登録商標））、オリゴヌクレオチドブロッカー（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ技術など）及びＤＮＡｚｙｍｅの相補的配列を組み込むプライマー（ディジーＮＡ（ＤｚｙＮＡ）（登録商標））、２つの修飾ヌクレオチドの間の特異的な相互作用（プレキソール（商標））などの、十分に知られており、市販で入手可能なリアルタイム増幅技術の特定の適用を示す。これらのリアルタイム方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と共に使用されることが多い。例えば国際公開第０２／０７２８８０号パンフレットに記載されるＨｅａｖｙｍｅｔｈｙｌでは、プライミングはメチル化特異的であるが、非伸長性オリゴヌクレオチドブロッカーが、プライマー自体の代わりにこの特異性を提供する。ブロッカーは、メチル化特異的な方式で重亜硫酸塩処理ＤＮＡに結合し、それらの結合部位はプライマー結合部位と重複する。ブロッカーが結合すると、プライマーは結合することができず、そのため、アンプリコンは生成されない。Ｈｅａｖｙｍｅｔｈｙｌは、本発明の方法でのリアルタイムの又はエンドポイントでの検出と組み合わせて使用することができる。
【０１２７】
したがって、特定の実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態は、メチル化特異的ＰＣＲ／増幅、好ましくはリアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ／増幅によって決定される。特定の実施形態では、リアルタイムＰＣＲ／増幅は、ヘアピンプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）／ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）／加水分解性プローブ（Ｔａｑｍａｎ）／ＦＲＥＴプローブ対（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）／ヘアピンプローブを組み込むプライマー（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）／反応混合物中に含まれるレポーター基質を切断するＤＮＡｚｙｍｅの相補的な配列を組み込むプライマー、（ＤｚｙＮＡ（登録商標））／蛍光色素（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなど）／オリゴヌクレオチドブロッカー／２つの修飾ヌクレオチドの間の特異的な相互作用（Ｐｌｅｘｏｒ）の使用を含む。プライマー及び／又はプローブは、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を調査するために使用することができる。
【０１２８】
リアルタイムＰＣＲは、反応の間にアンプリコンの蓄積を検出する。しかしながら、リアルタイム方法を利用する必要はない。多くの適用が定量を必要とせず、リアルタイムＰＣＲは、便利な結果の提示及び記憶を得るために及び同時にＰＣＲ後の取り扱いを避けるためのツールとして主に使用される。分析は、標的ＤＮＡが試料中に存在するかどうかを知るためにだけ行うことができる。増幅反応が終了した後、エンドポイントでの検証が行われる。この知識は、患者で、癌に対する素因又はその発生を検出するために医療診断の研究所で使用することができる。そのような症例の大多数では、ＤＮＡ鋳型の定量はあまり重要ではない。増幅産物は、アガロースゲルなどの適したゲル上を単に走らせて、予想されるサイズの産物が存在するかどうかを決定されてもよい。これは、例えば、臭化エチジウム染色の使用及びＵＶイルミネーター下でのＤＮＡバンドの視覚化を含んでいてもよい。その代わりに、蛍光又はエネルギー移動を、メチル化ＤＮＡの存在を決定するために測定することができる。エンドポイントＰＣＲ蛍光検出技術は、リアルタイムＰＣＲ：ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒなどに広く使用されるのと同じアプローチを使用することができる。例えば、＜＜遺伝子＞＞検出器は、直接ＰＣＲチューブ中での蛍光の測定を可能にする。
【０１２９】
リアルタイム実施形態では、定量化は、絶対的な基準に基づいたものであってもよい又は構成的にメチル化されたＤＮＡ標準に対するものであってもよい又は非メチル化ＤＮＡ標準に対するものであってもよい。メチル化状態は、調査下のマーカーのシグナル及びメチル化状態が知られている（例えばβ−アクチンなど）参照遺伝子のシグナルの間の比を使用することによって又はメチル化マーカー並びにメチル化マーカー及びメチル化されていないマーカーの合計の間の比を使用することによって決定されてもよい。その代わりに、メチル化マーカー遺伝子の絶対的なコピー数を決定することができる。本発明に適した参照遺伝子は、ベータ−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、１８ＳリボソームＲＮＡなどのリボソームＲＮＡ遺伝子、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩ遺伝子を含む。（Ｒａｄｏｎｉｃ  Ａ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００４年１月２３日；３１３（４）：８５６〜６２頁）。特に好ましい実施形態では、参照遺伝子はベータ−アクチンである。
【０１３０】
一実施形態では、各臨床試料はデュプリケートで測定され、両方のＣｔ値（増幅曲線が、関係のあるソフトウェアによって自動的にセットされる閾値と交差するサイクル）について、コピー数が計算される。両方のコピー数（各遺伝子について）の平均は結果の分類に使用される。各試料の最終結果を定量するために、２つの標準曲線、参照遺伝子（例えばβ−アクチン又はメチル化されていないマーカー）のための標準曲線及びマーカーのメチル化バージョンのための標準曲線が使用される。すべての臨床試料の結果（ｍ−遺伝子が検出可能であった場合）は、「ｍ−遺伝子コピー」／「参照遺伝子コピー」又は「ｍ−遺伝子コピー」／「ｕ−遺伝子＋ｍ−遺伝子のコピー」の比の１０００倍として表現され、次いで適宜分類される（メチル化、メチル化されていない、無効）（ｕ＝非メチル化；ｍ＝メチル化）。
【０１３１】
一実施形態では、ＮＤＲＧ４遺伝子のプロモーター領域に対して実行されるＭＳＰで有用なプライマーが提供される。これらのプライマーは、以下の配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０１３２】
【表２】
2015154775.tif 000003
【０１３３】
プライマーセット１は、腺腫の進行を予測するための特定の適用に有用である。両方のプライマーセットが明らかに有用であるが、プライマーセット２はわずかに、より感度のよい結果を提供し得る。
【０１３４】
さらなる実施形態では、ＮＤＲＧ４遺伝子（のプロモーター領域）に対して実行される定量的ＭＳＰで有用なプライマー及びプローブが提供される。これらのプライマー及びプローブは、以下の配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０１３５】
配列番号１７  ５’−ＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣ−３’（フォワードプライマー）
配列番号１８  ５’−ＡＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣ−３’（リバースプライマー）、及び
配列番号１９  ５’−ＦＡＭ−ＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＧ−３’−ＤＡＢＣＹＬ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎプローブ）
【０１３６】
これらのプライマー及びプローブのさらなる特性は実験の部分に要約される。
【０１３７】
さらなる実施形態では、ＮＤＲＧ２遺伝子のプロモーター領域に対して実行されるＭＳＰで有用なプライマーが提供される。これらのプライマーは、以下の配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０１３８】
フランキングプライマー：
配列番号２０  ５’−ＹＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＹＧＧＴＴＴＴＴ−３’（フランク上流）
配列番号２１  ５’−ＴＣＣＴＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＡＣ−３’（フランク下流）
非メチル化ＮＤＲＧ２特異的プライマー：
配列番号２２  ５’−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴ−３’（センス）
配列番号２３  ５’−ＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＡ−３’（アンチセンス）
メチル化ＮＤＲＧ２特異的プライマー：
配列番号２４  ５’−ＴＴＴＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＴＣ−３’（センス）
配列番号２５  ５’−ＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＴＡＣＧＴＣＣＣＧＡＣＧ−３’（アンチセンス）。
【０１３９】
一実施形態では、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するのに有用なプライマー及び／又はプローブ（ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモーター領域に対して実行される）が提供される。これらのプライマー及び／又はプローブは、以下の配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０１４０】
【表３】
2015154775.tif 000004
【０１４１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために、下記の表４に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びプローブから選択されるプライマー及び／又はプローブを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、メチル化状態が本発明の方法に従って決定されてもよいある種の好ましい遺伝子に特異的なプライマー及びプローブの組合せを提示する。
【０１４２】
【表４】
2015154775.tif 000005
【０１４３】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＮＤＲＧ４のメチル化状態を決定するために、下記の表５に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択されるプライマー及び／又はプローブを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマー及び特異的プローブの組合せを提示し、プライマー対及び対応するプローブは表に従って選択されてもよい。
【０１４４】
【表５−１】
2015154775.tif 000006
【表５−２】
2015154775.tif 000007
【０１４５】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＧＡＴＡ５のメチル化状態を決定するために、下記の表６及び７に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。表６はまた、ＧＡＴＡ５のメチル化状態の（定量的）検出を促進するために利用されてもよい特異的プローブをも記載し、表７は、プライマーがヘアピンプライマーとして作用することを可能にし、したがって定量的な検出を促進するＡｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ配列を組み込む（本明細書に詳細に論じられるように）。
【０１４６】
【表６−１】
2015154775.tif 000008
【表６−２】
2015154775.tif 000009
【表６−３】
2015154775.tif 000010
【表６−４】
2015154775.tif 000011
【０１４７】
【表７−１】
2015154775.tif 000012
【表７−２】
2015154775.tif 000013
【０１４８】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＯＳＭＲのメチル化状態を決定するために、下記の表８及び９に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。表８はまた、ＯＳＭＲのメチル化状態の（定量的）検出を促進するために利用されてもよい特異的プローブをも記載し、表９は、プライマーがヘアピンプライマーとして作用することを可能にし、したがって定量的な検出を促進するＡｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ配列を組み込む（本明細書に詳細に論じられるように）。
【０１４９】
【表８−１】
2015154775.tif 000014
【表８−２】
2015154775.tif 000015
【０１５０】
【表９】
2015154775.tif 000016
【０１５１】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＡＤＡＭ２３のメチル化状態を決定するために、下記の表１０に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。表６はまた、ＡＤＡＭ２３のメチル化状態の（定量的）検出を促進するために利用されてもよい特異的プローブをも記載する。
【０１５２】
【表１０−１】
2015154775.tif 000017
【表１０−２】
2015154775.tif 000018
【０１５３】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＪＰＨ３のメチル化状態を決定するために、下記の表１１に記載のヌクレオチド配列を含むプライマーから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。表１１はまた、ＪＰＨ３のメチル化状態の（定量的）検出を促進するために利用されてもよい特異的プローブをも記載する。
【０１５４】
【表１１−１】
2015154775.tif 000019
【表１１−２】
2015154775.tif 000020
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために、下記の表１２に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びプローブから選択されるプライマー及び／又はプローブを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、メチル化状態が本発明の方法に従って決定されてもよいある種の好ましい遺伝子に特異的なプライマー及びプローブの組合せを提示する。
【０１５６】
【表１２】
2015154775.tif 000021
【０１５７】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＢＮＩＰ３のメチル化状態を決定するために、下記の表１３に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びｂｅａｃｏｎから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。
【０１５８】
【表１３】
2015154775.tif 000022
【０１５９】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＦＯＸＥ１のメチル化状態を決定するために、下記の表１４に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びｂｅａｃｏｎから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。
【０１６０】
【表１４−１】
2015154775.tif 000023
【表１４−２】
2015154775.tif 000024
【０１６１】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＪＡＭ３のメチル化状態を決定するために、下記の表１５に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びｂｅａｃｏｎから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。
【０１６２】
【表１５】
2015154775.tif 000025
【０１６３】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＰＨＡＣＴＲ３のメチル化状態を決定するために、下記の表１６に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びｂｅａｃｏｎから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。
【０１６４】
【表１６−１】
2015154775.tif 000026
【表１６−２】
2015154775.tif 000027
【０１６５】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＴＦＰＩ２のメチル化状態を決定するために、下記の表１７に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びｂｅａｃｏｎから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。
【０１６６】
【表１７】
2015154775.tif 000028
【０１６７】
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、ＳＯＸ１７のメチル化状態を決定するために、下記の表１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びｂｅａｃｏｎから選択されるプライマーを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、この遺伝子のメチル化状態を決定するための特異的プライマーの組合せを提示し、プライマー対は表に従って選択されてもよい。
【０１６８】
【表１８】
2015154775.tif 000029
【０１６９】
これらのプライマー及びプローブのそれぞれすべてが本発明の別個の態様を形成する。特に、本発明は、表のものを含む、本明細書に示されるプライマー対から選択されるプライマー対に関する（リストされた基本的な配列に加えてさらなる配列を含んでいてもよい）。これらのプライマーのさらなる特性は下記の詳細な説明（実験の部分）に要約される。これらの配列の変形体が本発明で利用されてもよいことに注意されたい。特に、さらなる配列特異的フランキング配列は、必要に応じて、例えば結合特異性を改良するために添加されてもよい。変異体配列は、好ましくは表２、３、４、５、又は６のいずれかに記載されるプライマー及び／又はプローブのヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。プライマー及びプローブ（ヘアピンを含む）構造物は、必要に応じて、合成ヌクレオチド類似体を組み込んでいてもよい又は例えばＲＮＡベース若しくはＰＮＡベース又はその混合物であってもよい。同様に、代替の蛍光性のドナー部分及びアクセプター部分／ＦＲＥＴ対が必要に応じて利用されてもよい。蛍光性のドナー部分及びアクセプター部分を用いて標識することに加えて、プライマーは、修飾オリゴヌクレオチド並びに他の追加の基及び標識を含んでいてもよい。但し、本発明の方法でのプライマーとしての機能性が損なわれないことを条件とする。同様に、代替の蛍光性のドナー部分及びアクセプター部分／ＦＲＥＴ対が必要に応じて利用されてもよい。ＦＲＥＴで共通して使用される分子は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、及び５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含む。蛍光体がドナー又はアクセプターであるかは、その励起スペクトル及び発光スペクトル並びに対になる蛍光体によって定義される。例えば、ＦＡＭは、４８８ｎｍの波長を有する光によって最も効率的に励起し、５００〜６５０ｎｍのスペクトルで光を発し、発光最大値は５２５ｎｍである。ＦＡＭは、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸとの使用に適したドナー蛍光体である（これらのすべては５１４ｎｍでそれらの励起最大値を有する）。
【０１７０】
したがって、一実施形態では、上述のドナー部分及び上述のアクセプター部分は、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、Ｍａｌａｃｈｉｔｅグリーン、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４、ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン、ピレンブチラート、エオシンニトロチロシン、エチジウム、及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄから選択される。さらなる実施形態では、上述のドナー部分は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ローダミン、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、アントラニルアミド、クマリン、テルビウムキレート誘導体、Ｍａｌａｃｈｉｔｅグリーン、及びＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４から選択され、上述のアクセプター部分は、ＤＡＢＣＹＬ、ローダミン、テトラメチルローダミン、ピレンブチラート、エオシンニトロチロシン、エチジウム、及びＴｅｘａｓ  Ｒｅｄから選択される。
【０１７１】
特定の一実施形態では、上述のドナー部分は、フルオレセイン又はその誘導体であり、上述のアクセプター部分はＤＡＢＣＹＬである。特定の実施形態では、フルオレセイン誘導体は、６−カルボキシフルオレセインを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０１７２】
本発明のすべての態様及び実施形態について、プライマー、特に、ステムループ／ヘアピン構造物及び／若しくはプローブ（用いられる検出の形態の必要に応じて）は、プライマー若しくはプローブの化学合成の間に、ドナー部分及びアクセプター部分を用いて標識されてもよい又は標識は、あらゆる適した方法を使用して合成に続いて付けられてもよい。多くのそのような方法は入手可能であり、当技術分野で十分に特徴づけられている。
【０１７３】
特異的な、例示されるプローブ型（表７及び９に用いられるヘアピンプローブ型など）は、必要に応じて、異なるプローブ（又はプライマー）型と必要に応じて交換してもよいことに注意されたい。等価物は、本明細書に論じられ、必要に応じて利用されてもよい。
【０１７４】
さらなる実施形態では、重亜硫酸塩配列決定は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために利用される。プライマーは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子中の重要なＣｐＧアイランドの配列決定に使用するために設計されてもよい。したがって、プライマーは、関係のある１つ又は複数の遺伝子のプロモーター領域の直接配列決定のために、センス配向及びアンチセンス配向の両方で設計されてもよい。
【０１７５】
ＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子を配列決定する一実施形態では、重亜硫酸塩配列決定は、以下の配列を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、また、両鎖を配列決定するために、単独で又は組み合わせて使用されてもよい配列決定プライマーの使用によって実行されてもよい；
【０１７６】
ＮＤＲＧ４プライマー
配列番号５７０  ５’−ｇａｔｙｇｇｇｇｔｇｔｔｔｔｔｔａｇｇｔｔｔ−３’（フォワード）
「Ｙ」は、ピリミジンヌクレオチドに相当する。
配列番号６  ５’−ｃｒａａｃａａｃｃａａａａａｃｃｃｃｔｃ−３’（リバース）
「ｒ」は、プリンヌクレオチドに相当する。
ＮＤＲＧ２プライマー
配列番号５２２  ５’−ｔｔｔｇｔｔｇｇｔｔａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔａｔｔｔｔｔ−３’（フォワード）
配列番号５２３  ５’−ｃｃｃｃｃａａａｃｔｃａａｔａａｔａａａａａｃ−３’（リバース）
【０１７７】
これらの配列決定プライマーは、本発明のさらなる態様を形成し、適した変形体は、本発明の範囲内に含まれる（この議論は本明細書で必要な変更を加えて適用される）。
【０１７８】
ＰＣＲに加えての他の核酸増幅技術（そのリアルタイムバージョン及びネステッドＰＣＲなどの変形体を含む）もまた、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を検出するために必要に応じて利用されてもよい。そのような増幅技術は当技術分野で十分に知られており、ＮＡＳＢＡ（Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９９１年）、３ＳＲ（Ｆａｈｙら、１９９１年）、及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）などの方法を含む。他の適した増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０年）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的な増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応（国際公開第９０／０６９９５号パンフレット）、インベーダー技術、鎖移動技術、及びニック移動増幅（国際公開第２００４／０６７７２６号パンフレット）を含む。このリストは、網羅的なものとして意図されない；あらゆる核酸増幅技術もまた使用されてもよい。但し、適切な核酸産物が特異的に増幅されることを条件とする。したがって、これらの増幅技術は、例えばＭＳＰ及び／又は重亜硫酸塩配列決定技術につなげられてもよい。
【０１７９】
元々のゲノムＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を反映する配列変異はプライマー設計に対する２つのアプローチを与える。両方のプライマー型は、本発明の方法で、単独で又は組み合わせて利用されてもよい。第１に、それら自体、ＤＮＡメチル化の、あらゆる可能性として考えられる部位を包含しないプライマーが設計されてもよい。メチル化異なる部位の配列変異は２つのプライマーの間に位置する。そのようなプライマーは、例えば重亜硫酸塩ゲノム配列決定、ＣＯＢＲＡ、及びＭｓ−ＳｎｕＰＥで使用される。第２に、変換された配列のメチル化バージョン又は非メチル化バージョンと特異的にアニールするプライマーが設計されてもよい。標的に対して相補的な十分な領域、例えば１２、１５、１８、又は２０ヌクレオチドがある場合、プライマーはまた、ハイブリダイゼーションに干渉しないが、他の操作に有用である可能性があるさらなるヌクレオチド残基をも含有していてもよい。そのような他の残基の例は、制限エンドヌクレアーゼ切断のための、リガンド結合のための、若しくは因子結合のための部位又はリンカー又はリピートであってもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは、修飾メチル化残基に特異的なものであってもよい又はそうでなくてもよい。
【０１８０】
修飾ＤＮＡ及び未修飾ＤＮＡを区別するための１つの方法は、ＤＮＡの一方の形態又は他方の形態に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズすることである。ハイブリダイゼーションの後に、増幅反応を行い、増幅産物をアッセイすることができる。増幅産物の存在は、試料がプライマーにハイブリダイズしたことを示す。プライマーの特異性は、ＤＮＡが修飾されたかどうかを示し、これは、順番に、ＤＮＡがメチル化されたかどうかを示す。
【０１８１】
修飾ＤＮＡ及び未修飾ＤＮＡを区別するための他の方法は、ある種の産物にも特異的であってもよいオリゴヌクレオチドプローブを使用することである。そのようなプローブは、修飾ＤＮＡ又は修飾ＤＮＡの増幅産物に直接ハイブリダイズしてもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で知られているあらゆる検出システムを使用して標識することができる。これらは、蛍光部分、放射性同位体標識部分、生物発光部分、発光部分、化学発光部分、酵素、基質、受容体、又はリガンドを含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
ＭＳＰ技術では、増幅は、メチル化状態が評価されることとなる遺伝子の配列に特異的であるプライマーを使用して達成される。核酸分子に対する特異性を提供するために、その配列の適した領域に対応するプライマー結合部位が選択されてもよい。核酸分子はまた、遺伝子のメチル化状態の検出に必要とされる、プライマー結合部位以外の配列をも含んでいてもよく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位又はプロモーター配列は、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、及びＴＭＡなどの等温増幅技術に必要とされてもよいことを熟練した読者は十分に理解するであろう。
【０１８３】
ＴＭＡ（Ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．）は、反応を駆動するための２つの酵素、即ちＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を使用するＲＮＡ転写増幅システムである。ＴＭＡ反応は等温であり、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを増幅して、ＲＮＡ増幅最終産物を生成することができる。ＴＭＡは、単一のチューブ中での産物の検出を可能にするために、Ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅのＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＨＰＡ）検出技術と組み合わせてもよい。そのような単一のチューブでの検出は本発明を実行するための好ましい方法である。
【０１８４】
本発明の遺伝子（特にプロモーター）は、正常組織中でメチル化されていないように思われ、したがって、これらの遺伝子中でのメチル化（又は実際のメチル化の欠乏）の検出は、癌診断によって有意であるとして並びにまた適した治療レジメンを選択するのに及び治療の成功の見込み若しくはある種の抗癌剤などを用いる治療に対する抵抗性を決定するためなどに容易に検出可能であるが、メチル化状態を決定する場合、このパラメーターを評価するために選ばれた方法が正確に及び確実に進んでいることを確実にするために、適した対照を含むことは有益であり得る。例えば、適した対照は、メチル化されることが知られている遺伝子のメチル化状態を評価することを含んでいてもよい。この実験は、陽性対照としての役割を果たして、偽陰性の結果（つまり、たとえ、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子が実際にメチル化されている可能性があっても、メチル化の欠乏の結論が成される）が得られないことを確実にする。その遺伝子は、調査下の試料中でメチル化されていることが知られている遺伝子であってもよい又はその遺伝子は、例えばＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼなどの適したメチルトランスフェラーゼ酵素を使用することによって人工的にメチル化されてもよい。特定の一実施形態では、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、好ましくはＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子は、陽性対照として、ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼを用いる処理を施した正常なリンパ球中で評価されてもよい。
【０１８５】
それに加えて又はその代わりに、適した陰性対照は本発明の方法と共に用いられてもよい。ここで、適した対照は、メチル化されていないことが知られている遺伝子のメチル化状態を評価すること又はＤＮＡの不在下で（例えば、水のみの試料を使用することによって）増幅を実行することを含んでいてもよい。前の実験は、陰性対照としての役割を果たして、偽陽性の結果（つまり、たとえ、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（特定の一実施形態でＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される少なくとも１つの遺伝子などの、本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子が実際にメチル化されていない可能性があっても、メチル化の結論が成される）が得られないことを確実にする。その遺伝子は、調査下の試料中でメチル化されていないことが知られている遺伝子であってもよい又はその遺伝子は、例えば、下記により詳細に論じられるものなどの適したＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子を使用することによって人工的に脱メチル化されてもよい。特定の一実施形態では、ＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子は、正常組織中でメチル化されていないことが本明細書に初めて示されたので、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、特にＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子は、陰性対照として、正常なリンパ球中で評価されてもよい。
【０１８６】
収集された液体、特に便の中に放出される、極めて少量の、異常にメチル化されたＤＮＡに対する本発明の方法の適用は、あらゆる特異的な遺伝子のメチル化について試験する前に、ＤＮＡライブラリーの生成及び増幅を必要としてもよい。全ゲノム増幅及びそのような増幅のためのライブラリー生成に適した方法（例えばＭｅｔｈｙｌｐｌｅｘ技術及びＥｎｚｙｐｌｅｘ技術、Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）は、米国特許出願公開第２００３／０１４３５９９号、国際公開第２００４／０８１２２５号パンフレット、及び国際公開第２００４／０８１１８３号パンフレットに例えば記載される。加えて、国際公開第２００５／０９０５０７号パンフレットは、重亜硫酸塩変換ベースの適用又は非重亜硫酸塩ベースの適用のいずれかを必要とするライブラリー生成方法／増幅方法を記載する。重亜硫酸塩処理は、ライブラリー構築の前に又はその後に生じさせてもよく、重亜硫酸塩変換に抵抗性のアダプターの使用を必要としてもよい。Ｍｅｔｈ−ＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｄｉ  Ｖｉｎｃｉら、２００６年）、ＭＳＰと組み合わせられる修飾縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ増幅（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＤＯＰ−ＰＣＲ）は、少量のＤＮＡのメチル化の特異的な検出に適した他の方法を提供する。患者のケアの管理の改良は、本発明の方法を補うためのこれらの既存の方法及び技術を必要としてもよい。
【０１８７】
実験の部で論じられるように、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のメチル化をもたらすエピジェネティックなサイレンシングは、結腸直腸癌及び／又は胃癌、胃の癌、並びに食道癌、特に食道癌腫などの多くの胃腸癌で示されてきた。したがって、特定の実施形態では、本発明は、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌又は結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌に対する素因を診断するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子のメチル化状態を検出するステップを含み、遺伝子のメチル化は、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌又は結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌に対する素因を示す。好ましくは、遺伝子は、ＮＤＲＧ２若しくはＮＤＲＧ４又はＮＤＲＧ２及びＮＤＲＧ４の組合せである。
【０１８８】
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子などの、本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のいずれかのエピジェネティックな変化、特にメチル化状態は、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌又はそれに対する素因を診断するために決定されてもよい。特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、特に糞便試料が利用される場合、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２から選択されてもよい。これらの遺伝子中のエピジェネティックな変化、特にメチル化を検出することは、特に感度のよい、特異的な診断方法をもたらす。さらなる実施形態では、血漿試料又は血清試料が利用される場合、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択されてもよく、特に、血漿試料又は血清試料が利用される場合、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から特に選択されてもよい。これらの遺伝子中のエピジェネティックな変化、特にメチル化を検出することは、特に感度のよい、特異的な診断方法をもたらす。
【０１８９】
それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。
【０１９０】
組織試料が利用される実施形態では、方法は、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含んでいてもよく、本質的にそれからなっていてもよく、又はそれからなっていてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を示す。組織試料は、本明細書で上記に論じられるように、例えば、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【０１９１】
糞便試料が用いられる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＥＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択されてもよい。それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＺ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。
【０１９２】
さらに、本発明の方法の感度を改良するために、方法は、遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含んでいてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、癌、特に、結腸直腸癌などの本明細書に定義されるような胃腸癌に対する素因又はその発生を示す。遺伝子のパネルは、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含んでいてもよい／本質的にそれからなっていてもよい又はそれからなっていてもよい。
【０１９３】
遺伝子のある種のパネルは、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌−とりわけ結腸直腸癌又はそれに対する素因を検出するための特に感度のよい方法をもたらすことが分かってきた。したがって、一実施形態では、遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４及びＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、ＡＰＣ及びＳＦＲＰ２、ＡＰＣ及びＯＳＭＲ、ＡＰＣ及びＧＡＴＡ４、ＡＰＣ及びＮＤＲＧ４、ＭＧＭＴ及びＯＳＭＲ、ＭＧＭＴ及びＧＡＴＡ４、ＭＧＭＴ及びＮＤＲＧ４、ＭＧＭＴ及びＳＦＲＰ２、ＭＧＭＴ及びＡＰＣ、ＳＦＲＰ１及びＭＧＭＴ、ＳＦＲＰ１及びＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１及びＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ１及びＮＤＲＧ４、ＳＦＲＰ１及びＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ１及びＡＰＣ、ＧＡＴＡ５及びＳＦＲＰ１、ＧＡＴＡ５及びＭＧＭＴ、ＧＡＴＡ５及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５及びＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５及びＳＦＲＰ２、又はＧＡＴＡ５及びＡＰＣを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。ＡＤＡＭ２３及び／又はＪＰＨ３などの他の遺伝子を組み込む適したパネルもまた本発明で想定される。これらの実施形態は、糞便試験試料に対する特定の適用である。
【０１９４】
遺伝子のさらに有用なパネルは、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣ又はＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ、及びＡＰＣを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。遺伝子のさらなるパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ４、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、又はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。ある特定の４つの遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２からなる。少なくとも６つの遺伝子のある特定のパネルは、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、及びＭＧＭＴを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。これらのパネルは、ある実施形態で、糞便試験試料に有用に適用されてもよい。
【０１９５】
さらに特定の実施形態では、遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。この実施形態は、特に組織試料に適用され、この試料は、本明細書に論じられるように、例えば直腸試料、結腸試料、又は虫垂試料であってもよい。
【０１９６】
ある実施形態では、遺伝子のパネルは、血液ベースの試料、特に血漿試料又は血清試料が利用される場合、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０１９７】
したがって、本発明は、血液試料又は血漿試料若しくは血清試料などのその誘導体（好ましくは血漿試料）中で、早期ステージの結腸直腸癌、特にステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される少なくとも１つの遺伝子中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、早期ステージの結腸直腸癌、特に、ステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌に対する素因又はその発生を示す。この方法は、これらの４つの遺伝子からなるパネルに適用されてもよい。
【０１９８】
各遺伝子について、同じ遺伝子内の複数の位置で、エピジェネティックな変化、特に遺伝子のメチル化を検出することが可能であり得ることに注意されたい。したがって、例えば、遺伝子は、１つを超えるＣｐＧアイランドを組み込んでいてもよい又は同じＣｐＧアイランド内の複数の部位が必要に応じて調査されてもよい。下記の詳細な説明（実験の部分）に示されるように、例えば、ＯＳＭＲは、２つの別々の位置で評価することができ、共に、有用な、診断上関係のある結果を提供する。それぞれの標的は、ＯＳＭＲ３及びＯＳＭＲ４として本明細書で呼ばれる。一実施形態では、遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ３及びＯＳＭＲ４の両方を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。本明細書でＯＳＭＲについて言及される場合、他のすべての遺伝子についてのように、結腸直腸癌に関係のあるエピジェネティックな変化、特にメチル化の調査が言及される。したがって、本発明の遺伝子のパネルは、同じ遺伝子内の複数の部位の評価を必要に応じて組み込んでいてもよい。同じ遺伝子内の複数の部位を調査するプライマーは、上記の表に記載され、特に表２〜１８（並びにとりわけ表５〜１１及び１３〜１８）を参照されたい。
【０１９９】
非常に詳しく本明細書に論じられるように、遺伝子のパネルのそれぞれのエピジェネティックな変化の検出は、単一反応で実行されてもよい。多重化を可能にする多くの適した技術が入手可能であり、本発明で利用されてもよい。大部分は、識別可能な発光スペクトルを有する適した蛍光分子の使用に依存する。当業者は、多重化環境でどれを使用することができるのかを決定するために、入手可能な多くの蛍光体から容易に選択することができる。
【０２００】
一実施形態では、一般的な消光剤は、それぞれ識別可能な発光波長最大値を有する適した蛍光体ドナーと共に利用される。特に有用な消光剤はＤＡＢＣＹＬである。ＤＡＢＣＹＬなどの適した消光剤と共に、以下の蛍光体が、それぞれ、多重化を可能にするために利用されてもよい：クマリン（４７５ｎｍの発光最大値）、ＥＤＡＮＳ（４９１ｍｎ）、フルオレセイン（５１５ｎｍ）、Ｌｕｃｉｆｅｒイエロー（５２３ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（５２５ｎｍ）、Ｅｏｓｉｎｅ（５４３ｎｍ）、テトラメチルローダミン（５７５ｎｍ）、及びテキサスレッド（６１５ｎｍ）（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、１９９８年１月；４９〜５３頁）。
【０２０１】
さらなる遺伝子のメチル化状態もまた本発明の方法を補うために決定されてもよいことに注意されたい。すべての類似した腫瘍で、エピジェネティックにサイレンシングされる遺伝子は認められていない。この理由から、高い率の腫瘍検出を実現するために、複数のＤＮＡの変化を標的とすることは有利である可能性がある。したがって、本発明の方法の一実施形態では、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態が、癌の確立に関与する少なくとも１つの他の遺伝子のメチル化状態と組み合わせて分析される。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子は、癌の確立に関与する少なくとも２つの他の遺伝子と組み合わせられてもよい。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子は、癌の確立に関与する少なくとも３つ、４つ、５つ、又は６つの他の遺伝子と組み合わせられてもよい。結腸直腸癌については、癌の確立に関与する他の遺伝子は、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−５、ＣＨＦＲ、ＡＰＣ（２）、ＭＧＭＴ、ｐ１６、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｐ１４、ＲＡＳＳＦｌａ、ＲＡＢ３２、ＳＥＰＴＩＮ−９、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＭＥＦＦ２、ＮＧＦＲ、又はＳＭＡＲＣＡ３からなる群から選択されてもよい。しかしながら、結腸直腸癌の確立に関与するあらゆる遺伝子は、本明細書の方法で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子と組み合わせて利用されてもよい。
【０２０２】
発癌のプロセスの早期にメチル化されるようになる遺伝子は、スクリーニングの目的に理想的なものであるだけではなく、早期癌検出のための及び癌の進行又は転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）をモニターするための興味のある標的である。さらなる態様では、本発明は、癌予後予測（癌に対する予後予測）の方法であって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを検出するステップを含み、遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングは、癌発達を示す方法を提供する。好ましくは、エピジェネティックなサイレンシングは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の決定及び／又はその発現レベルの測定によって検出される。一実施形態では、対象は、進行腺腫に罹患している又はＡＪＣＣステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶの癌を発達させる危険性がある。他の実施形態では、転帰は、外科的切除、例えば非治癒的又は治癒的な外科的切除の後の対象の生存である。
【０２０３】
１つ又は複数の遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングの早期検出は、悪性化と関連する分子的特徴を有するが、病理学的又は臨床上の特徴をまだすべて有してはいない患者のより決定的な経過観察を正当化し得る。癌がまだ局所的であり、容易に治療可能であるうちの、その最も早期のステージでの癌の同定は、患者の臨床上の転帰を改良する可能性がある。予後値を用いる方法は、腫瘍の特異的な検出を可能にし、（良性）腺腫を検出せず、したがって、進行腺腫対良性腺腫の間の特異な診断を提供するはずである。詳細な説明（実験の部分）に示されるように、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の遺伝子プロモーター過剰メチル化は、結腸直腸癌を有していなかった患者からの腺腫と比較した場合に、同時発生している結腸直腸癌を有する腺腫でより高い頻度で観察された。この予後値は診断の定義内に含まれる。
【０２０４】
関連する態様では、本発明は、試料中で、癌、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌の組織病理学的ステージを決定するための方法であって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、例えば結腸直腸癌などの癌の組織病理学的ステージを示す。本発明の方法の実施形態はすべて、必要に応じて、これによって組み込まれ、簡潔さの理由から繰り返されない。エピジェネティックな変化は、一般に、遺伝子サイレンシングを引き起こす変化である。好ましくは、エピジェネティックなサイレンシングは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の決定及び／又はその発現レベルの測定によって検出され、１つ又は複数の遺伝子のメチル化状態及び／又は発現レベルは癌の組織病理学的ステージに相互に関連する。この方法では、試料は、例えば結腸直腸癌などの、本発明に従う、あらゆる適切な癌に罹患している又は罹患していることが疑われる対象から得られる。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化レベル、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベル、又はその組合せは、決定され、癌の組織病理学的ステージに相互に関連する。癌の「ステージ」は、癌がどれくらい広がったかのデスクリプター（普通、番号Ｉ〜ＩＶ）である。ステージは、腫瘍のサイズ、腫瘍がどれくらい深く侵入したか、腫瘍が隣接した器官に浸潤したか、腫瘍がリンパ節に転移したかどうか及び腫瘍がどれだけ多くのリンパ節に転移したか、並びに腫瘍が離れた器官に広がったかどうかを考慮に入れることが多い。診断時のステージが生存の最も大事な予測因子となり、処理がステージに基づいて変更されることが多いので、癌をステージづけることは重要である。前述のように、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するための適した方法の説明は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用され、単に簡潔さの理由からここで繰り返されない。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明は、組織試料若しくは血液試料又は血漿試料若しくは血清試料などのその誘導体中で、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの、胃腸癌の組織病理学的ステージ又はそれに対する素因を決定するための方法を提供する。最も適した遺伝子及び遺伝子の組合せが、これらの特定の試験試料について上文に記載され（例えば血液試料については、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される少なくとも１つの遺伝子）、簡潔さの理由から繰り返されない。
【０２０６】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、特に、結腸直腸癌などの胃腸癌の環境で、腺腫（から癌腫への）の進行を予測する又はモニターするための方法であって、適した試験試料中で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子、特にＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、メチル化のレベルの上昇又は増加は、腺腫が癌腫に進行する可能性が高いことを示す（メチル化のレベルがより低い場合よりも）。この実施形態は、特に、上記の表２に述べられるようなプライマーセット１を使用して増幅されるＮＤＲＧ４遺伝子の領域に適用される。したがって、一実施形態では、これらの方法は、ＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態を決定するためにプライマーセット１を用いる。下記に論じられるように、プライマー対１は、進行しないであろう腺腫と癌に進行する腺腫を区別することを可能にする。これは、癌スクリーニングにとって非常に重要である。試験試料は、上記に広範囲に論じられるように、あらゆる適した試料であってもよい。しかしながら、試料は、一般に、適した組織試料、特に腺腫試料である。
【０２０７】
関連する実施形態では、ＮＤＲＧ４遺伝子の転写開始部位へのメチル化のレベルの増加を検出することもまた、癌、特に結腸直腸癌（ＣＲＣ）などの胃腸癌の進行をモニターするのに有用であり得る。本明細書に示されるように、得られた結果に基づいて、プロモーターのより５’領域から転写開始部位へのメチル化の広がりは癌進行（例えば腺腫から癌腫へ）と相互に関連することが予測される。したがって、本発明は、ＣＲＣなどの胃腸癌の進行を予測する又はモニターするための方法であって、適した試験試料中で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、転写開始部位へのメチル化のレベルの上昇又は増加は、メチル化のレベルがより低い場合よりも、癌がより進行することを示す。転写開始部位及びプロモーター配列は、公開されている遺伝子配列情報から分かる。本明細書に定義されるようなプライマーセット１及び２は、これらの方法で必要に応じて利用されてもよい。プライマーセット１は、プライマーセット２よりも転写開始部位に近いＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態を決定するために使用される。したがって、そのような結果の比較はこれらの方法で有用である可能性がある。
【０２０８】
本明細書に述べられるように、診断上の、予後の、又は個別化医療のケアのための本発明の方法は、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌などの胃腸癌に関して優先的に使用される。多くの技術が、結腸直腸癌の検出のために現在入手可能である。これらは、  −  便潜血試験（Ｇｕａｉａｃ及び免疫化学）
−  結腸内視鏡検査法及び／又はＳ状結腸内視鏡検査法
−  二重造影バリウム注腸の後のＸ線又はＣＴ−コロノグラフィ
−  糞便ＤＮＡ試験（プレゲン−プラス（ＰｒｅＧｅｎ−Ｐｌｕｓ）（登録商標））
を含む。より精密なスクリーニング、危険性がより高い患者のサーベイランス、及び患者のケアの管理の改良は、本発明の方法を補うためのこれらの既存の方法及び技術を有利に用いてもよい。
【０２０９】
糞便ＤＮＡ試験は、結腸直腸癌をスクリーニングする際の、新生の技術である。前悪性腺腫及び癌は、消化プロセスの間に分解されず、便中で安定性のままであるＤＮＡマーカーをそれらの細胞から脱落させる。例えばポリメラーゼ連鎖反応を使用する増幅が後続する捕捉により、アッセイで検出可能なレベルまでＤＮＡを増幅する。糞便ＤＮＡ完全性アッセイは、結腸直腸癌の検出のための有用なツールとして提唱された。便中の高い分子重量のＤＮＡ断片の存在は結腸直腸癌と関連し、増殖及びアポトーシスの調節での疾患関連性の差異に関連し得る。その代わりに、ＤＮＡについて便を試験することによって結腸直腸癌を検出することは、便中の剥離上皮細胞中で検出可能である、結腸直腸腫瘍症の特徴である癌遺伝子突然変異を同定することに基づくものであってもよい。腫瘍性の出血は間欠性であるが、上皮の脱落は、継続的であり、便ベースのＤＮＡ試験（糞便ＤＮＡ［ｆ−ＤＮＡ］試験としても知られている）を他の方法よりも可能性として感度のよいものにする。結腸直腸癌のための市販で入手可能な便ベースのＤＮＡ試験は、ＢＡＴ−２６の突然変異を含む、ＣＲＣと関連することが知られている２３個の異なるマイクロサテライト（ＭＳＩ）突然変異の存在を同定する単一試験であるプレゲン−プラス（商標）（ＥＸＡＣＴ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ  ０１７５２  ＵＳＡ）を含む。加えて、ＣＲＣと関連する他の遺伝子の２１個の他の点突然変異がこの試験に含まれる：大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、Ｋ−ｒａｓ、及び分子サイズ５３，０００ダルトンのタンパク質（ｐ５３）。この試験はまた、長いＤＮＡ断片を検出するために設計され、これは、特異的に、ＣＲＣで共通している非アポトーシス結腸細胞と呼ばれる細胞と関連してきた。
【０２１０】
したがって、癌遺伝子突然変異及び／又はＤＮＡ完全性に焦点を置いた、糞便試料の分子的スクリーニングは、本発明の方法を補完してもよい。特定の実施形態では、本発明の方法は、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するために、試料中で、ＤＮＡ完全性の検出又は少なくとも１つのＤＮＡ癌遺伝子突然変異又はＤＮＡ完全性の検出及び少なくとも１つのＤＮＡ癌遺伝子突然変異の組合せと組み合わせて使用される。方法は、糞便試料に対して実行されてもよい。一実施形態では、方法はまた、試料を得る及び／又は処理するステップを含んでいてもよい。
【０２１１】
試験は、診断上又は治療レジメンと併せて行うことができる。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能のエピジェネティックな損失は、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子の使用によって救出することができる。試験は、どの治療レジメン又は予防レジメンを、患者に用いるか及び治療レジメンの効力をモニターするために使用するかを決定するために使用することができる。
【０２１２】
したがって、本発明はまた、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いて、本明細書に定義されるような癌、特に、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌などの胃腸癌の治療の成功の見込みを予測するための方法であって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、治療の成功の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも高いことを示す方法を提供する。その代わりに、方法は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの測定を含み、発現のレベルの低下は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子が、より高いレベルで発現される場合よりも、癌の治療の成功の見込みが高いことを示す。疑いを回避するために、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するための適した方法の説明（試料の種類、癌の種類、遺伝子のパネルなど）は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用され、単に簡潔さの理由からここで繰り返されないことが述べられる。
【０２１３】
逆のシナリオでは、本発明は、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いて、結腸直腸癌の治療に対する抵抗性の見込みを予測するための方法であって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、治療に対する抵抗性の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも低いことを示す方法を提供する。
【０２１４】
その代わりに、方法は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの測定を含み、より高いレベルの発現は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子が、低下したレベルで発現される場合よりも、癌の治療に対する抵抗性の見込みが高いことを示す。
【０２１５】
したがって、患者集団は、対応する遺伝子の遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらす、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（組織又は体液、特に、糞便試料又は血液ベースの試料、特に、血漿試料が利用される場合に、少なくとも１つの遺伝子が、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２から選択される又はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される場合などの、本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される関係のある少なくとも１つの遺伝子に関してのそれらのメチル化状態に基づいて治療について選択されてもよい。これは、非常に集中的な、個別化された、医療の形態をもたらし、したがって、患者が、効果的である可能性が最も高い薬剤を用いて治療されるので、成功率の改良をもたらす。ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するための適した方法の説明は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用され、単に簡潔さの理由からここで繰り返されない。
【０２１６】
ある態様では、腺腫中でのＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の機能のエピジェネティックな損失は、治療の必要性を同定することができる。結腸腫瘍症などの疾患を有する対象は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化についてアッセイされてもよい。その代わりに、対象は、通例のスクリーニングを受けていてもよく、結腸腫瘍症などの疾患を有することを必ずしも疑われていなくてもよい。腺腫中での、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化の検出は、結腸腫瘍症を検出するための感度及び／又は特異性を改良するために使用することができる、というのはそのような進行腺腫は、腺腫の可能性の高い経過が癌腫への発達であることを示す可能性があるからである。そのような症例では、予防的治療は、推奨され、腺腫の切除を含んでいてもよい。
【０２１７】
したがって、本発明は、対象から得られた腺腫の適した治療を予測するための方法であって、腺腫中で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子がメチル化されている、特に過剰メチル化されている場合、腺腫の治療の必要性が同定される方法を提供する。好ましくは、治療は、腺腫の切除を含む。
【０２１８】
逆のシナリオでは、本発明は、対象から得られた腺腫の適した治療を予測するための方法であって、腺腫中で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子がメチル化されていない又はより程度は小さいがメチル化されている場合、腺腫の切除の必要性がないことが決定される方法を提供する。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するための適した方法の説明は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用され、単に簡潔さの理由からここで繰り返されない。腺腫は、ある実施形態では、典型的に結腸由来のものである。
【０２１９】
本発明は、癌又は癌に対する素因のための適した治療レジメンを選択するための方法であって、対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するステップを含み、遺伝子が、エピジェネティックにサイレンシングされている、特に過剰メチル化されている又は発現が低下している場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が治療について選択される方法をさらに提供する。
【０２２０】
逆のシナリオでは、本発明は、癌又は癌に対する素因に適した治療レジメンを選択するための方法であって、対象から得られた試料中で、ＮＤＲＧ４／２ファミリー遺伝子のメチル化状態及び／又は発現レベルを決定するステップを含み、遺伝子が、メチル化されていない又はより高度に発現している場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いる治療は禁忌となる方法を提供する。したがって、代替の治療が探究されるべきである。
【０２２１】
関連する態様では、本発明はまた、癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌（本明細書に定義されるような）に適した治療レジメンを選択するための方法であって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出により、治療のためのＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が選択され、エピジェネティックな変化が検出されない場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が治療について選択されない方法をも提供する。エピジェネティックな変化が検出されない場合（例えば、遺伝子発現の検出又は他の適した方法によって）、代替の治療が探究されるべきである。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するための適した方法の説明は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用され、単に簡潔さの理由からここで繰り返されない。血液、特に血漿試料又は血清試料が利用される実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択されてもよい。これに関連する適したパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。
【０２２２】
糞便試料が用いられる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＥＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択されてもよい。それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＺ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。例えばＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、及びＳＦＲＰ２を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるパネル等のような、本明細書に定義されるような適したパネルもまた想定される。
【０２２３】
組織試料が利用される実施形態では、方法は、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。組織試料は、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【０２２４】
他の態様では、本発明は、対象の癌、特に結腸直腸癌を治療するための方法であって、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＨＤＡＣ阻害因子及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子を投与するステップを含み、対象は、本発明の方法に基づいて、治療について選択された方法を提供する。したがって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを決定するための適した方法の説明は、必要な変更を加えて、本発明のこれらの態様に適用され、単に簡潔さの理由からここで繰り返されない。したがって、血液、特に、血漿試料又は血清試料が利用される実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択されてもよい。これに関連する適したパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０２２５】
それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。
【０２２６】
糞便試料が用いられる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＥＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択されてもよい。それに加えて又はその代わりに、少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＺ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３、特にＴＦＰＩ２からなどのように、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択されてもよい。例えばＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、及びＳＦＲＰ２を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるパネル等のような、本明細書に定義されるような適したパネルもまた想定される。
【０２２７】
組織試料が利用される実施形態では、方法は、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。組織試料は、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【０２２８】
したがって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子がメチル化されており、これにより遺伝子発現の減少がもたらされる患者集団については、この種類の治療が推奨される。この方法は、以後、本発明の「治療の方法」の態様と称される。
【０２２９】
関連する態様では、本発明はまた、対象の癌、特に、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌などの胃腸癌を治療する際の、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子の使用であって（使用のための医薬の製造での）、対象は、本発明の方法に基づいて治療について選択された使用をも提供する。同様に、本発明は、対象の癌、特に、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌などの胃腸癌を治療に使用するためのＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を提供し、対象は、本発明の方法に基づいて治療について選択された。
【０２３０】
本発明の関係のある方法（遺伝薬理学的方法、治療レジメンの方法、及び治療の方法）のすべてについて、ＤＮＡ脱メチル化剤は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの−ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される少なくとも１つの遺伝子などの）から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写をアップレギュレートすることができるあらゆる作用物質であってもよい。好ましいＤＮＡ脱メチル化剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子は、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの−ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される少なくとも１つの遺伝子などの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化がある状態の癌を治療するのに適している、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのあらゆる適した阻害因子であってもよい。下記の実験の部に示されるように、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される少なくとも１つの遺伝子などの、本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化は、結腸直腸癌に関連づけられ、そのため、このメチル化の予防は、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌などの胃腸癌を治療するのに役立つことが予測される。
【０２３１】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子は、一実施形態では、例えば適したアンチセンス分子又はＲＮＡｉを媒介するｓｉＲＮＡ分子などの、ＤＮＭＴ遺伝子の発現を低下させる阻害因子であってもよい。適したｓｉＲＮＡ分子の設計は当業者の能力の範囲内にあり、適した分子は、商業団体によってオーダーメイドすることができる（例えばｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍを参照されたい）。実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子は（ヒト）ＤＮＭＴ１である。
【０２３２】
その代わりに、作用物質は、ＤＮＭＴの直接的な阻害因子であってもよい。例として、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド（Ｖｉｌｌａｒ−Ｇａｒｅａ，Ａ．及びＥｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ：ｗｈｉｃｈ，ｈｏｗ  ａｎｄ  ｗｈｙ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００３年、第４巻、１１〜３１頁の図６）並びにシチジン類似体などのヌクレオシド及びヌクレオチドを含む。シチジン類似体の適した例は、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、プソイドイソシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−アザシトシン（ファザバリン（ｆａｚａｂａｒｉｎｅ）として知られている）を含む（Ｖｉｌｌａｒ−Ｇａｒｅａ，Ａ．及びＥｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ：ｗｈｉｃｈ，ｈｏｗ  ａｎｄ  ｗｈｙ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００３年、第４巻、１１〜３１頁の図４を参照されたい）。
【０２３３】
他の実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子はＤｅｃｉｔａｂｉｎｅを含む。この薬剤の全詳細は、例えばｗｗｗ．ｓｕｐｅｒｇｅｎ．ｃｏｍで見出すことができる。
【０２３４】
さらなるＤＮＭＴ阻害因子は、Ｌ−エチオニンなどのエチル基ドナー並びにＳ−アデノシル−ホモシステイン（ＳＡＨ）、シネファンギン、（Ｓ）−６−メチル−６−デアミノシネファンギン、６−デアミノシネファンギン、Ｎ４−アデノシル−Ｎ４−メチル−２，４−ジアミノブタン酸、５’−メチルチオ−５’−デオキシアデノシン（ＭＴＡ）、及び５’−アミノ−５’−デオキシアデノシンなどの非アルキル化剤のようなＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）関連化合物を含む（Ｖｉｌｌａｒ−Ｇａｒｅａ，Ａ．及びＥｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ：ｗｈｉｃｈ，ｈｏｗ  ａｎｄ  ｗｈｙ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００３年、第４巻、１１〜３１頁）。
【０２３５】
ＤＮＡメチル化を変化させ、そのため、本発明の組成物に有用である可能性があるさらなる作用物質は、クロロホルムなどの有機ハロゲン化化合物、プロカインアミド、マイトマイシンＣ、４−アミノビフェニルなどの挿入剤、ヒ素及びセレンといった無機塩類、並びにカナマイシン、ヒグロマイシン、及びセフォタキシムなどの抗生物質を含む（Ｖｉｌｌａｒ−Ｇａｒｅａ，Ａ．及びＥｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．ＤＮＡ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ：ｗｈｉｃｈ，ｈｏｗ  ａｎｄ  ｗｈｙ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２００３年、第４巻、１１〜３１頁）。
【０２３６】
本発明の有用なＤＮＭＴ阻害因子は、５−アザシチジン及び／又はゼブラリンを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０２３７】
上記に論じられるように、結腸直腸癌を調査する研究者らが直面した１つの難題は便試料中に存在するＤＮＡの多様性である。興味のあるＤＮＡは、便から単離された全ＤＮＡの非常にわずかなパーセンテージのみに相当する。そのため、適したＤＮＡマーカーの探索と共に、糞便試料からのヒトＤＮＡ構成成分のＤＮＡ単離の改良及び濃縮のための技術が、より感度のよい癌検出のために必要とされる。
【０２３８】
糞便試料からの癌検出の感度の改良のための技術のほとんどは、全ＤＮＡからの標的ヒトＤＮＡの回収の改良に焦点を置く。本発明者らは、検出反応で使用されるＤＮＡの量を増加させることによって、糞便試料の結腸直腸癌の検出の感度の改良に成功した。検出反応のＤＮＡの量の増加には、ＤＮＡと共に同時精製された物質の増加が付随する。不純物の量の増加はＰＣＲ阻害をもたらすことが予想される可能性があり、そのため、検出反応での投入ＤＮＡのレベルの増加は、糞便試料中での癌検出の感度の改良について以前に探究されていなかった。
【０２３９】
したがって、さらなる態様では、糞便試料中で、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するのに使用するために、本発明は、糞便試料を処理して、ＤＮＡを単離し、調製するための方法であって、
（ａ）糞便試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）必要とされる、増幅反応当たり少なくとも２．５μｇの単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）処理された単離ＤＮＡを増幅するステップとを含む方法を提供する。
【０２４０】
したがって、本発明者らは、すべての下流の増幅のための試薬処理ステップ中に、必要とされる少なくとも２．５μｇの単離ＤＮＡを含むことによって、便試料を使用する検出方法の改良が達成されることを見出した。複数の並行反応が同じ試料に対して実行されることを可能にするために特に必要とされるＤＮＡの量が、増幅反応当たりに表される。例えば、次いで、試験試料及び対照試料は並行して実行することができる。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化、好ましくはメチル化の検出が同じ反応で実行されない場合（例えば適切な蛍光体の使用によって）、遺伝子のパネルのそれぞれは別個の反応で評価されてもよい。したがって、単一の出発試料は、必要に応じて、複数のサブ試料に分けられる必要がある可能性がある。これは、試料間の変動を最小限にすることよって、得られる結果の正確度を改良する。増幅反応当たりの単離ＤＮＡの量は、感度を改良するために少なくとも約２．５μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇなどとし、最も好ましくは約２．５μｇとする。
【０２４１】
一実施形態では、方法は、好ましくは試料からのＤＮＡの単離に先立って、糞便試料にホモジナイゼーションバッファーを添加するステップをさらに含む。あらゆる適したバッファーが利用されてもよい。有用なバッファーは、例えばＡｍｒｅｓｃｏから市販で入手可能である。
【０２４２】
試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬は、好ましくは、重亜硫酸塩試薬を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。適した試薬は本明細書に論じられ、この議論は必要な変更を加えて適用される。特定の実施形態では、重亜硫酸塩試薬は、重亜硫酸ナトリウムを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０２４３】
特定の実施形態では、試薬を用いる単離ＤＮＡの処理及び処理された単離ＤＮＡの増幅の間に、処理された単離ＤＮＡは濃縮される。あらゆる適したＤＮＡ濃縮方法が利用されてもよい。例えば、ＤＮＡ結合試薬は、試料からＤＮＡを濃縮するために利用されてもよい。ＤＮＡ結合試薬は、ＤＮＡ結合バッファー、ＤＮＡ結合フィルター、ＤＮＡ結合カラムなどから選択されてもよく、遠心分離ステップの使用を必要としてもよい。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能なＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ及びＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔなどの適したキットは市販で入手可能である。
【０２４４】
糞便試料からのＤＮＡの必要な回収率を達成するために、糞便試料は少なくとも約４ｇの重量であってもよい。糞便試料は、約２ｇから１０ｇのあたりの重量であってもよく、最も好ましくは約４ｇの重量である。
【０２４５】
したがって、本発明の方法は、次のものなどのステップを含んでいてもよい：
−  試験下の対象から便試料を得て、処理するステップであって、好ましくは、約（少なくとも）４ｇの便が得られるステップ
−  排便の後に、ホモジナイゼーションバッファーを、好ましくは直接添加するステップ（対象がこれをそれら自体に添加してもよい）。バッファーは、例えば１：７でなどの、あらゆる適した比で添加されてもよい
−  便試料からＤＮＡを単離するステップ。上記に言及されるように、あらゆる適したＤＮＡ単離技術が用いられてもよい。これは、（二重）低速度遠心分離を含んでいてもよい。単離は、ＲＮアーゼＡ及びプロテイナーゼＫの処理、その後、例えばフェノール／クロロホルム抽出によるＤＮＡ抽出を必要としてもよい。本明細書に論じられるように他のＤＮＡ精製技術を使用することができる。
−  行われることとなる各ＰＣＲ反応のために、少なくとも１８〜３２μｇ  ＤＮＡを重亜硫酸塩変換にさらす又は少なくとも２．５μｇ  ＤＮＡを重亜硫酸塩変換にさらすなどの、得られたＤＮＡを重亜硫酸塩変換にさらすステップ（前に論じられるように多重化の理由からＰＣＲ反応当たりに表される投入量）
−  少なくとも１８〜３２μｇ未処理ＤＮＡから得られた重亜硫酸塩処理ＤＮＡの量を濃縮するステップ
−  重亜硫酸塩変換ＤＮＡの量を増幅するステップ。増幅されることとなる量は１０〜２．５μｇ未変換ＤＮＡと等価であってもよい（これは、４マーカーパネルから単一マーカーの使用までの量と等しい）。
【０２４６】
糞便試料を処理するための方法の感度は、糞便試料からＤＮＡを単離するための知られている方法とそれらを組み合わせることによってさらに改良され得る。例えば、ヒトＤＮＡ構成成分は、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを使用して便試料から精製されてもよい（Ｄｏｎｇら、２００１年；Ａｈｌｑｕｉｓｔら、２０００年）。さらなる実施形態では、アクリルアミドゲル中に固定されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用する、標的ＤＮＡ配列の、電気泳動で駆動される分離（Ｗｈｉｔｎｅｙら、２００４年）は、便試料からヒトＤＮＡを精製するために利用されてもよい。前の実施形態と代替で又はそれと組み合わせて使用されてもよいさらなる実施形態では、糞便試料は、ＤＮＡ完全性を保つために収集の後に可能な限り急速に凍結されてもよい。上記に論じられるように、ＤＮＡ完全性もまた、結腸直腸癌の診断によって有用に試験されてもよい。それに加えて又はその代わりに、安定化バッファーが、試料の運搬の前に糞便試料に添加されてもよい（Ｏｌｓｏｎら、２００５年）。さらに補足的な実施形態では、試料中のメチル化ＤＮＡマーカーを検出するための感度を特に改良するために、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質が、糞便試料からのメチル化ヒトＤＮＡを豊富にするために利用されてもよい（Ｚｏｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００７年９月；５３（９）：１６４６〜５１頁）。
【０２４７】
特定の態様では、本発明に従って糞便試料を処理するための方法は、結腸直腸癌の診断、組織病理学的分析、薬理ゲノム分析などの改良を提供するために、本発明の他の方法と組み合わせられる。したがって、本発明の方法の実施形態はすべて必要な変更を加えて適用される。したがって、本発明の方法は、増幅された処理ＤＮＡに対して行い、例えば結腸直腸癌に関する特に感度のよい方法を提供することができる。
【０２４８】
さらなる態様では、本発明は、血液試料、特に、血漿試料又は血清試料中で、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するための方法であって、
（ａ）血漿試料又は血清試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために処理された単離ＤＮＡを増幅するステップであって、ＤＮＡの、０．０７〜０．７２ｍｌの血漿試料又は血清試料の等価物が増幅反応当たりに使用されるステップとを含む方法を提供する。
【０２４９】
したがって、方法は、増幅反応に少容量を利用するが、なお検出の高度な感度及び特異性を維持する。したがって、本明細書に論じられるように、単一の血液試料は、一実施形態で、遺伝子のパネルのメチル化状態を決定するために有利に利用されてもよい。容量は、増幅反応当たり、ＤＮＡの、約０．０７から約０．７２ｍｌ当たりの血漿等価物又は血清等価物、以下に論じられるように好ましくは血漿等価物であってもよい。特定の実施形態では、０．０７及び０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、又は０．１９ｍｌの間などの約０．０７、０．１０、０．１５及び０．５０、０．６０、０．７０ｍｌの間の、ＤＮＡの血漿等価物又は血清等価物が、増幅反応当たりに使用される。特定の実施形態では、本質的に同じである選択された容量の、ＤＮＡの等価物である血漿試料又は血清試料が、行われる各増幅反応のために使用される。したがって、複数の増幅が、対象から採取された単一の血液試料に基づいて実行される場合、各増幅は、０．０７〜０．７２ｍｌの、ＤＮＡの等価物である血漿試料又は血清試料を利用するであろう。
【０２５０】
血漿試料又は血清試料は、必要に応じて、全血又はその部分／画分を含有するあらゆる適した血漿又は血清から誘導してもよい。特定の実施形態では、血漿試料又は血清試料は、血漿を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。血漿又は血清が誘導される血液試料は、あらゆる適した方法を使用して収集されてもよい。多くのそのような方法が当技術分野で十分に知られている。一実施形態では、本発明の方法はまた、血液試料及び／又は全血からの血漿試料若しくは血清試料を得るためのステップをも組み込む。あらゆる適切な血液試料が本発明の方法で利用されてもよい。但し、血液試料が十分な（遊離浮遊）ＤＮＡを含有していることを条件とする。特定の実施形態では、方法で利用される血液試料又はその誘導体の容量は、１０ｍｌなどの約５〜１５ｍｌである。
【０２５１】
血液試料又はその誘導体、特に、血漿試料又は血清試料は、一度得られたら、本発明の方法での使用に先立って保存されてもよい。それらは、例えば、適した温度で凍結されてもよい。適した温度は、約−８０℃などの、約０℃、−１℃、−２℃、−３℃、−４℃及び−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃などの間であってもよい。それらはまた、それらの形態に依存して、４℃又は室温などの他の温度で保存されてもよい。特定の一実施形態では、血漿又は血清は、不凍性の温度での保管を可能にするために乾燥される。乾燥は、例えば凍結乾燥を含んでいてもよいが、他の脱水技術が用いられてもよい。血漿又は血清が、凍結されるよりも高い（つまり、より暖かい）、特に−８０℃よりも高い温度で保存される場合、抗生物質などの抗菌剤が、腐敗を予防するために試料に添加されてもよい。
【０２５２】
一実施形態では、安定剤が、血液試料又はその誘導体、特に血清又は血漿に添加される。これは、試料が凍結されない場合、特に関係がある。特定の一実施形態では、試料が血清である場合、ＥＤＴＡ及び／又はクエン酸及び／又はヘパリンから選択される安定剤などの安定剤が用いられる。さらなる実施形態では、試料が血漿である場合、クエン酸及び／又はヘパリンから選択される安定剤などの安定剤が利用されてもよい。
【０２５３】
血漿試料又は血清試料は、血漿試料を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなることが好ましい。血漿は、あらゆる適した手段によって全血から誘導してもよい。一実施形態では、血漿試料は、全血の遠心分離によって得られる。遠心分離は、当業者によって決定されてもよいように、あらゆる適した速度で及びあらゆる適した期間及びあらゆる適した条件下で実行されてもよい。例えば、遠心分離は、約１０００及び３０００ｇの間で実行されてもよい。遠心分離は、例えば、約１、２、３、４、又は５及び１０、１１、１２、１３、１４、又は１５分間の間で実行されてもよい。遠心分離は、試料の完全性を維持するために、約０及び５℃の間、例えば４℃などの低温で実行されてもよい。血漿試料を得るために複数回の遠心分離ステップが用いられてもよい。特定の実施形態では、血漿試料を得るために２回の遠心分離ステップが用いられる。
【０２５４】
ＤＮＡを単離するのに先立って、約１〜３ｍｌ未満、特に約２ｍｌ（１．５〜２．５ｍｌなど）の血漿（又は血清）の容量を有する試料を除外することによって本発明の方法の感度が改良されることが示された。したがって、方法は、ＤＮＡ単離に先立って血液試料から得られた血漿（又は血清）の容量を決定するステップを含んでいてもよい。血液試料から得られた血漿（又は血清）の容量が、約１〜３ｍｌ未満、特に約２ｍｌ（１．５〜２．５ｍｌなど）である場合、試料は、さらなる評価から除外される。
【０２５５】
本明細書に述べられるように、方法は、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するのに有用である。「メチル化状態を決定すること」によって、少なくとも１つの遺伝子のＤＮＡ配列内の１つ又は複数の（機能的に関係のある）ＣｐＧジヌクレオチドでの５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の存在又は不在を決定することを意味する。特に、少なくとも１つの遺伝子の、過剰メチル化と呼ばれてもよい異常なメチル化が検出されてもよい。典型的に、メチル化状態は、少なくとも１つの遺伝子中の１つ又は複数のＣｐＧアイランドで決定される。これらのＣｐＧアイランドは、遺伝子（複数可）のプロモーター領域に認められることが多い。したがって、ＣｐＧジヌクレオチドは、ヒト遺伝子のプロモーター領域及びエキソン中に典型的に集中し、これらのＣｐＧ残基のメチル化状態は、少なくとも１つの遺伝子が発現するかどうかことにとって機能的に重要である。メチル化を受けやすいＣｐＧジヌクレオチドは、ヒト遺伝子のプロモーター領域、エキソン、及びイントロンに典型的に集中するので、プロモーター領域、エキソン領域、及びイントロン領域は少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために評価されてもよい。「プロモーター」は、転写開始部位から約１ｋｂ、５００ｂｐ、又は１５０〜３００ｂｐ上流の間に典型的にわたる領域である。ＣｐＧアイランドは、少なくとも１つの遺伝子の転写開始部位を囲むものであってもよい又はそのあたりに位置していてもよい。
【０２５６】
本発明の方法は、血漿試料又は血清試料からＤＮＡを単離する／抽出する／精製するステップを含む。本明細書に論じられるように、あらゆる適したＤＮＡ単離技術が利用されてもよく、この議論は必要な変更を加えて本明細書で適用される。同様に、市販で入手可能である、血液試料からＤＮＡを単離するための適した方法及びキットが本明細書に論じられ、例示され、この議論は必要な変更を加えてここに適用される（表１を参照されたい）。したがって、表から推論することができるように、ＤＮＡ単離は、例えばシリカ膜ベースの方法、イソプロパノールベースの方法、又は磁気ビーズベースの方法を使用して実行されてもよい。
【０２５７】
本発明の方法はまた、必要に応じて、試料中の単離／抽出／精製ＤＮＡの定量を組み込んでもよい。試料中のＤＮＡの定量はあらゆる適した手段を使用して達成されてもよい。核酸の定量化は、例えば、分光光度計、蛍光光度計、又はＵＶトランスイルミネーターの使用に基づくものであってもよい。適した技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌなどの標準的なテキストに記載される（特にその中の付録８を参照されたい）。一実施形態では、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なピコグリーン（登録商標）ｄＳＤＮＡ定量化キットなどのキットは、ＤＮＡを定量するために用いられてもよい。
【０２５８】
本発明のこの態様（及びある種類のメチル化検出を含む本発明の他の態様）の方法は、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬に依存する。あらゆる適した試薬が本発明の方法で利用されてもよい。例として、重亜硫酸塩試薬、重亜硫酸塩試薬、及び二亜硫酸塩試薬並びにその適した混合物を含む。本発明の実施形態では、試薬は、重亜硫酸塩試薬を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。特に、試薬は、重亜硫酸ナトリウムを含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。
【０２５９】
特定の実施形態では、試薬を用いる単離ＤＮＡの処理に続いて及び好ましくは試薬を用いる単離ＤＮＡの処理及び処理された単離ＤＮＡの増幅の間に、処理された単離ＤＮＡは濃縮される。あらゆる適したＤＮＡ濃縮方法が利用されてもよい。例えば、ＤＮＡ結合試薬は、試料からＤＮＡを濃縮するために利用されてもよい。ＤＮＡ結合試薬は、ＤＮＡ結合バッファー、ＤＮＡ結合フィルター、ＤＮＡ結合カラムなどから選択されてもよく、遠心分離ステップの使用を必要としてもよい。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能なＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ及びＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔなどの適したキットは市販で入手可能である。
【０２６０】
特定の一実施形態では、メチル化状態が決定される少なくとも１つの遺伝子は、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される。本明細書に詳細に論じられるように、血漿試料又は血清試料中のこれらの遺伝子のメチル化状態は、癌、特に結腸直腸癌の発生と関連している。これらの遺伝子の詳細は本明細書に提供され、この議論は必要な変更を加えてこの態様に適用される。
【０２６１】
特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される、というのはこれら４つの遺伝子が、血液由来試料、特に血漿試料を使用して、結腸直腸癌の発生に特に確実に関連づけられることが示されたからである。
【０２６２】
さらに、これらの遺伝子は、早期ステージの結腸直腸癌に関連づけられることが示された。したがって、本発明は、血液試料、特に、血漿試料又は血清試料中で、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するための方法であって、
（ａ）血漿試料又は血清試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために、処理された単離ＤＮＡを増幅するステップであって、ＤＮＡの、０．０７〜０．７２ｍｌの血漿試料又は血清試料の等価物が増幅反応当たりに使用されるステップとを含む方法を提供する。この方法は、早期ステージの結腸直腸癌、特にステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を診断するために利用されてもよい。それはまた、結腸直腸癌をステージを決定するために使用されてもよく−メチル化された１つ又は複数の遺伝子の検出は早期ステージの癌を示す。対応する方法及びキットもまた想定される。これらの方法は、それに加えて又はその代わりに、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＴＮＥ１、及びＳＯＸ１７、特にＴＦＰＩ２からなどの、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために有用に適用されてもよい。
【０２６３】
さらに、本発明の方法の感度を改良するために、方法は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ（の）遺伝子を含む遺伝子のパネルのメチル化状態を決定するステップを含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む遺伝子のパネルの一部を形成し、遺伝子のそれぞれのメチル化状態が決定される。遺伝子のパネルは、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。適したパネルは、本発明の他の態様に関して本明細書に論じられる。その議論及びそれらの実施形態は必要な変更を加えてここで適用される。
【０２６４】
特定の実施形態では、遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。このパネルは、ステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌などの早期ステージの結腸直腸癌の診断に有用であり得る。
【０２６５】
各遺伝子について、同じ遺伝子内の複数の位置で、遺伝子のメチル化状態を決定することが可能であり得ることに注意されたい（本明細書に論じられるように）。したがって、例えば、遺伝子は、１つを超えるＣｐＧアイランドを組み込んでいてもよい又は同じＣｐＧアイランド内の複数の部位が必要に応じて調査されてもよい。
【０２６６】
非常に詳しく本明細書に論じられるように、遺伝子のパネルのそれぞれのメチル化状態の決定は、単一反応で実行されてもよい。多重化を可能にする多くの適した技術が入手可能であり、本発明で利用されてもよい。大部分は、識別可能な発光スペクトルを有する適した蛍光分子の使用に依存する。当業者は、多重化環境でどれを使用することができるのかを決定するために、入手可能な多くの蛍光体から容易に選択することができる。
【０２６７】
一実施形態では、一般的な消光剤は、それぞれ識別可能な発光波長最大値を有する適した蛍光体ドナーと共に利用される。ある適した消光剤はＤＡＢＣＹＬである。ＤＡＢＣＹＬなどの適した消光剤と共に、以下の蛍光体が、それぞれ、多重化を可能にするために利用されてもよい：クマリン（４７５ｎｍの発光最大値）、ＥＤＡＮＳ（４９１ｎｍ）、フルオレセイン（５１５ｎｍ）、Ｌｕｃｉｆｅｒイエロー（５２３ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（５２５ｎｍ）、Ｅｏｓｉｎｅ（５４３ｎｍ）、テトラメチルローダミン（５７５ｎｍ）、及びテキサスレッド（６１５ｎｍ）（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻、１９９８年１月；４９〜５３頁）。
【０２６８】
上記に論じられるように、さらなる遺伝子のメチル化状態もまた本発明の方法を補うために決定されてもよい。結腸直腸癌の確立に関与する他の遺伝子は、ＣＨＦＲ、ＭＧＭＴ、ｐ１６、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｐ１４、ＲＡＳＳＦｌａ、ＲＡＢ３２、ＳＥＰＴＩＮ−９、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＡＬＸ４、及びＳＭＡＲＣＡ３からなる群から選択されてもよい。
【０２６９】
本発明の方法の最終ステップは、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために処理された単離ＤＮＡを増幅するステップを含む。上記に論じられるように、この増幅は、増幅反応当たり、ＤＮＡの、０．０７〜０．７２ｍｌの血漿試料又は血清試料の等価物を利用する。あらゆる適した増幅技術が利用されてもよい。特定の実施形態では、増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。ＰＣＲは、好ましい増幅方法であるが、ネステッドＰＣＲなどの基本的な技術に基づいた変形体を含むために、等価物もまた本発明の範囲内に含まれてもよいことに注意されたい。例として、限定を伴うことなく、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ、及び三重増幅などの等温増幅技術を含み、これらのすべては、当技術分野で十分に知られており、市販で入手可能である。他の適した増幅方法は、限定を伴うことなく、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０年）、ＭＬＰＡ、標的ポリヌクレオチド配列の選択的な増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，４３７，９７５号）、インベーダー技術（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、鎖移動技術、任意プライムドポリメラーゼ連鎖反応（国際公開第９０／０６９９５号パンフレット）、及びニック移動増幅（国際公開第２００４／０６７７２６号パンフレット）を含む。
【０２７０】
少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するための様々な増幅ベースのアッセイは、当技術分野で知られており、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイ（メチル化特異的ＰＣＲなどの技術を含む）は、非常に詳しく本明細書に記載され、この記載は必要な変更を加えて本明細書に適用され、単に簡潔さの理由から繰り返されない。
【０２７１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために、上記の関係のある表（表２〜１８、特に表４〜１０）に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及びプローブから選択されるプライマー及び／又はプローブを用いる又はそれに依存する又はそれを利用する。表は、メチル化状態が本発明の方法に従って決定されてもよいある種の好ましい遺伝子に特異的なプライマー及びプローブの組合せを提示する。
【０２７２】
元々のゲノムＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を反映する配列変異はプライマー設計に対する２つのアプローチを与える。両方のプライマー型は、本明細書に詳細に論じられるように、本発明の方法で利用されてもよく、この議論はここで必要な変更を加えて適用される。本明細書に記載の通り、適したプローブもまた用いられてもよい。
【０２７３】
メチル化状態を決定する場合、このパラメーターを評価するために選ばれた方法が正確に及び確実に進んでいることを確実にするために、適した対照を含むことは有益である可能性がある。適した（陽性及び陰性）対照は本明細書に詳細に論じられ、この議論は必要な変更を加えて適用される。
【０２７４】
議論及び実施例から本明細書で推論することができるように、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態は、特異的な遺伝子についての疾患及び特異的な疾患の発生と相互に関連し得る。したがって、本発明の方法は、遺伝子のメチル化が役割を果たすあらゆる疾患に対する素因又はその発生を検出するために使用されてもよい。特定の実施形態では、原則として、あらゆる疾患がこれらの方法に従って診断されてもよいが、疾患は細胞増殖性の障害を含む。但し、適切な血漿試料又は血清試料中で遺伝子のメチル化を決定することができることを条件とする。細胞増殖性の障害は、例えば癌を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。特に、癌は、例えば結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。さらなる特異的な胃腸癌は上記に論じられ、それぞれは本発明の方法に適用可能であり得る。本明細書に論じられるように、方法は、ステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌などの早期ステージの結腸直腸癌に対する特定の適用を有していてもよい。
【０２７５】
本発明はまた、本発明の方法を実行するために使用されてもよいキットを提供する。キットは、上記の本発明の様々な方法（及び使用）に関して言及される様々な特徴、態様、及び実施形態のいずれかを組み込んでいてもよい。
【０２７６】
したがって、キットは、
（ａ）癌（本明細書に定義されるような）、特に、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌の治療の成功の見込み並びに／又はＤＮＡ傷害剤及び／若しくはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／若しくはＨＤＡＣ阻害因子を用いて、癌、特に、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌の治療に対する抵抗性の見込みを予測する並びに／又は
（ｂ）癌、特に、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌に適した治療レジメンを選択する並びに／又は
（ｃ）癌、特に、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌又はそれに対する素因を診断する並びに／又は
（ｄ）試料中で、癌、特に、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌などの胃腸癌又はそれに対する素因の組織病理学的ステージを決定するためのキットであって、
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるような、特に本発明の方法に関してのパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の検出で使用されるプライマーのセットをその中に含有するキャリアー手段を含むキットが提供される。例えば、特定の一実施形態では、キットは、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の検出で使用されるプライマーのセットをその中に含有するキャリアー手段を含む。ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子のいずれかが本発明のキットを使用して評価されてもよい。ファミリーメンバーのより詳細な議論は上記に提供される。
【０２７７】
したがって、キットは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子、好ましくはＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子がメチル化されているかどうかを決定するための適したプライマーを含んでいてもよい。これらのプライマーは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子、好ましくはＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子のメチル化状態を決定するために用いられてもよい、本発明の様々な方法に関して詳細に議論されるプライマーのいずれかを含んでいてもよい。したがって、キット中のプライマーは、メチル化ＤＮＡ又は非メチル化ＤＮＡを増幅する（重亜硫酸塩処理に続いて）目的のためのプライマーを含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。一実施形態では、キット中のプライマーは、重亜硫酸塩処理に続いて、メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡを増幅することができるプライマーを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、このＤＮＡは、配列番号５２４及び／又は配列番号５２５として記載のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０２７８】
キットは、その代わりに又は加えて、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子、特にＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子のメチル化状態を決定するために、重亜硫酸塩配列決定を用いてもよい。したがって、キットは、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子、特にＮＤＲＧ４及び／又はＮＤＲＧ２遺伝子中の重要なＣｐＧアイランドの配列決定に使用されるプライマーを含んでいてもよい。したがって、プライマーは、遺伝子のプロモーター領域の配列決定を誘導するために、センス配向及びアンチセンス配向の両方で設計されてもよい。一実施形態では、キット中のプライマーは、重亜硫酸塩処理に続いて、ＤＮＡを配列決定することができるプライマーを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなり、このＤＮＡは、配列番号５２４及び／又は配列番号５２５として記載のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。適したプライマーは本明細書に非常に詳細に論じられる。
【０２７９】
同様に、本発明は、試料中で、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を検出するためのキットであって、
（ａ）ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するための手段
（ｂ）糞便試料を処理するための手段を含むキットを提供する。
【０２８０】
上記により詳細に論じられるように、少なくとも１つの遺伝子はＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２から選択されてもよい、というのは、これらの遺伝子は結腸直腸癌の特に感度のよい指標を提供するからである。少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３、特にＴＦＰＩ２から選択されてもよい。
【０２８１】
キットは、遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するための手段を含んでいてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因若しくはその発生を示す又は上記に論じられるような他の適用の１つに使用される。一実施形態では、遺伝子のパネルは２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む。
【０２８２】
特定の実施形態では、遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４及びＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、又はＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。特定の実施形態では、遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ４、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、又はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。さらなるパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、及びＳＦＲＰ２を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０２８３】
遺伝子の代替のパネルは、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、及びＭＧＭＴを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。当業者は、本発明の方法に関して論じられるように、他の組合せ及び順列が必要に応じて形成されてもよいことを十分に理解すると思われる。
【０２８４】
一実施形態では、糞便試料を処理するための手段は、糞便試料の収集のための密封可能な容器を含む。それに加えて又はその代わりに、キット中の、糞便試料を処理するための手段は、ホモジナイゼーションバッファーを含む。糞便試料を処理するための手段は、さらに又はその代わりに、ＤＮＡの抽出／単離／濃縮／精製のための試薬を含んでいてもよい。適した試薬は、当技術分野で知られており、ＤＮＡの沈澱のためのエタノール及びイソプロパノールなどのアルコールを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。塩ベースの沈澱は、混入物を沈澱させるために、高い濃度の塩を必要としてもよい。塩は、例えば、酢酸カリウム及び／又は酢酸アンモニウムを含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。有機溶媒もまた、細胞溶解物から混入物を抽出するためにキット中に含まれていてもよい。したがって、一実施形態では、糞便試料を処理するための手段は、ＤＮＡを抽出するためのフェノール、クロロホルム、及びイソアミルアルコールを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。試薬の適した組合せは必要に応じて想定される。
【０２８５】
本明細書に論じられるように、この議論は必要な変更を加えて適用されるが、検出の感度は、試料中のＤＮＡの分量を増加させることによって改良されてもよい。したがって、一実施形態では、糞便試料を処理するための手段は、試料中のＤＮＡの増幅を誘導するためのプライマーを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子を増幅するあらゆる適したプライマーが利用されてもよい。プライマーは、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを識別しなくてもよく（つまり、プライマー結合部位はＣｐＧアイランドの外側に位置する）、したがって、１つ又は複数の遺伝子のメチル化形態が試料中に存在するかどうかを決定することに先立って、ＤＮＡの量の全般的な増加を提供する。
【０２８６】
同様に、本発明は、試料中で、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又は発生を検出するためのキットであって、
（ａ）ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するための手段
（ｂ）血液試料又はその誘導体を処理するための手段を含むキットを提供する。
【０２８７】
上記により詳細に論じられるように、少なくとも１つの遺伝子はＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４  ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択されてもよい、というのは、これらの遺伝子は、血液試料又はその誘導体、特に血漿中で結腸直腸癌の特に感度のよい指標を提供するからである。少なくとも１つの遺伝子は、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７、特にＴＦＰＩ２から選択されてもよい。
【０２８８】
キットは、遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するための手段を含んでいてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌に対する素因若しくはその発生を示す又は上記に論じられるような他の適用の１つに使用される。一実施形態では、遺伝子のパネルは２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む。
【０２８９】
一実施形態では、遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。このキットは、早期ステージの結腸直腸癌、特にステージ０〜ＩＩの結腸直腸癌を診断するために使用されてもよい。
【０２９０】
一実施形態では、血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、血液試料の収集のための密封可能な容器を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、さらに又はその代わりに、ＤＮＡの抽出／単離／濃縮／精製のための試薬を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。適した試薬は、当技術分野で知られており、ＤＮＡの沈澱のためのエタノール及びイソプロパノールなどのアルコールを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。塩ベースの沈澱は、混入物を沈澱させるために、高い濃度の塩を必要としてもよい。塩は、例えば、酢酸カリウム及び／又は酢酸アンモニウムを含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。有機溶媒もまた、細胞溶解物から混入物を抽出するためにキット中に含まれていてもよい。したがって、一実施形態では、血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、ＤＮＡを抽出するためのフェノール、クロロホルム、及びイソアミルアルコールを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。試薬の適した組合せは必要に応じて想定される。血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、ＤＮＡを単離するためのイソプロパノール、磁気ビーズ、又はシリカベースの膜を含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。血液試料又はその誘導体を処理するための手段は、表１に示されるようなキットを含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。
【０２９１】
血液試料又はその誘導体、特に血漿試料又は血清試料を処理するための手段は、１つ又は複数の安定剤を含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。一実施形態では、血液試料又はその誘導体に添加されることとなる安定剤がキット中に含まれる。これは、試料が凍結されない場合、特に関係がある。特定の一実施形態では、試料が血清である場合、ＥＤＴＡ及び／又はクエン酸及び／又はヘパリンから選択される安定剤などの安定剤が含まれる。さらなる実施形態では、試料が血漿である場合、クエン酸及び／又はヘパリンから選択される安定剤などの安定剤が含まれてもよい。抗生物質などの抗菌剤もまた、腐敗（血清試料及び血漿試料の）を予防するために本発明のキット中に含まれていてもよい。
【０２９２】
同様に、本発明は、試料中で、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を検出するためのキットであって、
（ａ）ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するための手段
（ｂ）組織試料、特に結腸試料、直腸試料、又は虫垂試料を処理するための手段を提供する。
【０２９３】
キットは、遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するための手段を含んでいてもよく、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌に対する素因又はその発生を示す又は上記に論じられるような他の適用の１つに使用される。一実施形態では、遺伝子のパネルは２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む。
【０２９４】
特定の実施形態では、遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＡＤＡＭ２３又はＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【０２９５】
これらのキットはまた、本発明の方法に関して論じられるように、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌の治療の成功の見込み並びに／又はＤＮＡ傷害剤及び／若しくはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／若しくはＨＤＡＣ阻害因子を用いて、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌の治療に対する抵抗性の見込みを予測するのにも並びに／又は結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌に適した治療レジメンを選択するのにも並びに／又は試料中で、結腸直腸癌及び／若しくは胃癌及び／若しくは食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌の組織病理学的ステージを決定するのにも有用であり得る（議論は必要な変更を加えて適用される）。
【０２９６】
本発明のすべての関係のあるキットに適用可能であるさらなる実施形態では、遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するための手段は、検出を単一反応で実行させることができる。多重化は、例えば、区別可能な発光スペクトルを有する適切な蛍光体の使用によって可能になる。本明細書に論じられるようなＴａｑＭａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎなどは、異なる発光スペクトルを有する蛍光色素が異なるプローブに付けられてもよいので、複数のマーカーを同じ試料中で測定することを可能にする（多重ＰＣＲ）。したがって、適宜に標識されたプローブ及びプライマーは本発明のキットによって含まれる。
【０２９７】
特に好ましい実施形態では、本発明のキットを使用して検出されるエピジェネティックな変化はメチル化である。メチル化検出のための多くの適した試薬は当技術分野で知られており、本明細書に論じられる（この議論は必要な変更を加えてここで適用される）。特に、遺伝子（複数可）のプロモーター領域の過剰メチル化は本発明のキットを使用して検出されてもよい。したがって、メチル化を検出するための手段はメチル化特異的ＰＣＲプライマーを含んでいてもよい。適したプライマーは、キット及び関係のある１つ又は複数の遺伝子に依存して、必要に応じて、表２〜１８のいずれか１つに提示されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるプライマーから選択されてもよい。
【０２９８】
キットはまた、リアルタイムで又はエンドポイントでメチル化特異的ＰＣＲを実行するための手段を含んでいてもよい。リアルタイム又はエンドポイントでメチル化特異的ＰＣＲ／増幅を実行するための手段は、例えば、ヘアピンプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）、ヘアピンプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）、加水分解性プローブ（Ｔａｑｍａｎ）、ＦＲＥＴプローブ対（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）、ヘアピンプローブを組み込むプライマー（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、蛍光色素（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなど）、ＤｚｙＮＡプライマー、又はオリゴヌクレオチドブロッカーを含んでいてもよい。適したプローブは、それぞれの遺伝子について、必要に応じて、表２〜１８に提示されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるプローブから選択されてもよい。適切な組合せはすべて本発明によって想定される。ベータ−アクチンなどの適した参照遺伝子を検出するためのプライマー及びプローブはこれらの表のいくつか（３及び４）に示される。
【０２９９】
エンドポイントＰＣＲ蛍光検出技術は、リアルタイムＰＣＲ−ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎなどに広く使用されるアプローチと同じアプローチを使用することができる。したがって、本発明のキットは、ある実施形態では、エンドポイントメチル化特異的ＰＣＲを実行するための手段を含んでいてもよい。エンドポイントメチル化特異的ＰＣＲ／増幅を実行するための手段は、リアルタイムでのＰＣＲ／増幅について説明されるようなプライマー及び／又はプローブを含んでいてもよい。
【０３００】
リアルタイム検出及びエンドポイント検出の実施形態では、増幅産物の検出のためのプローブは、リアルタイムで増幅反応の進行をモニターするために単に使用されてもよい並びに／又はそれらは、それら自体、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定する役割を有していてもよい。したがって、プローブは、適切なシトシン残基（ＣｐＧジヌクレオチドに認められる）のメチル化状態に依存して、重亜硫酸ナトリウムなどの適した試薬を用いる処理に続く配列差異を利用するために、プライマーとほぼ同じような様式で設計されてもよい。
【０３０１】
プローブは、上記に論じられるように、増幅産物のリアルタイム検出に適したあらゆるプローブ型を含んでいてもよい。しかしながら、特に、ＡＭＰＬＩＦＬＵＯＲ及びＳＣＯＲＰＩＯＮの実施形態では、プローブは、利用されるプライマーが一体化した部分である。プローブは典型的に蛍光標識されるが、他の標識型が必要に応じて利用されてもよい（質量標識又は放射性同位元素標識など）。これらのプローブはまたエンドポイント検出にも適している。
【０３０２】
本発明のキットは、ＭＳＰ、特に、ＭＳＰのリアルタイム検出バージョン又はエンドポイント検出バージョンで使用するためのキットであってもよい。
【０３０３】
本発明のキットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なピコグリーン（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量化キットに認められる試薬などの、ＤＮＡの定量のための試薬を組み込んでいてもよい。
【０３０４】
本発明のキットは、それに加えて又はその代わりに、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を含んでいてもよい、それから本質的になっていてもよい、又はそれからなってもいてもよい。試薬は、好ましくは、重亜硫酸塩試薬を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。重亜硫酸塩試薬は、最も好ましくは重亜硫酸ナトリウムを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。この試薬は非メチル化シトシン残基をウラシルに変換することができるのに対して、メチル化シトシンは変換されないままである。残基のこの差異は、シトシン及びウラシルを区別するプライマーを使用する、ＰＣＲなどの下流プロセスでメチル化核酸及び非メチル化核酸を区別するために利用されてもよい（シトシンはグアニンと対になるのに対して、ウラシルはアデニンと対になる）。試薬は、当キットに依存して、糞便試料を処理するための手段又は血液試料若しくはその誘導体を処理するための手段として組み込まれていてもよい。
【０３０５】
本発明の方法に関して論じられるように、適した対照は、方法の精度管理として役割を果たすために利用されてもよい。したがって、一実施形態では、本発明のキットは、メチル化状態が知られている１つ又は複数の対照核酸分子をさらに含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。これらの（１つ又は複数の）対照核酸分子は、メチル化されていることが知られている若しくはメチル化されるように処理される核酸及び／又はメチル化されていないことが知られている若しくはメチル化されないように処理される核酸分子の両方を含んでいてもよい。一般にメチル化されていないが、メチル化されるように処理されてもよい適した内部参照遺伝子の１つの例は、β−アクチンである。
【０３０６】
そのうえ、本発明のキットは、対照核酸の増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。これらのプライマーは、特定の実施形態では、試験試料中のメチル化をモニターするために利用されるプライマーと同じプライマーであってもよい。したがって、対照核酸は、例えば、メチル化されていないことが知られている正常組織から採取される、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子を含んでいてもよい。対照核酸は、加えて、例えば、ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼなどのメチルトランスフェラーゼ酵素によってメチル化されるような、メチル化形態の、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子を含んでいてもよい。
【０３０７】
対照核酸分子のメチル化状態を決定するのに使用される適したプローブ及び／又はオリゴヌクレオチドブロッカーもまた本発明のキットに組み込まれてもよい。プローブは、増幅産物のリアルタイム検出にあらゆる適したプローブ型を含んでいてもよい。上記に提供される議論は必要な変更を加えて適用される。
【０３０８】
本発明のキットは、加えて、本発明の請求される方法を実行するための適したバッファー及び他の試薬を含んでいてもよい。したがって、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子（特にＮＤＲＧ４）、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３（本明細書に論じられるようなパネルを含むすべての順列及び組合せの）から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の決定のための必要条件について本発明の方法に関して提供される議論は必要な変更を加えてここで適用される。
【０３０９】
特定の実施形態では、本発明のキットは、核酸増幅バッファーをさらに含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。適した試薬は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、ＭｇＣｌ２、β−メルカプトエタノール、及びｄＮＴＰのストック溶液から選択されてもよい。試薬は、あらゆる適した濃度で供給されてもよい。
【０３１０】
キットはまた、加えて、核酸増幅を触媒するための酵素を含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。したがって、キットはまた、加えて、核酸増幅に適したポリメラーゼを含んでいてもよい、本質的にそれからなっていてもよい、又はそれからなっていてもよい。例として、Ｔａｑ（市販で入手可能なＪｕｍｐｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑポリメラーゼなど）、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔなどの、ファミリーＡ型ポリメラーゼ及びファミリーＢ型ポリメラーゼの両方からのポリメラーゼを含む。
【０３１１】
キットの様々な構成成分は、別個のコンパートメント中に別々に包装されていてもよい又は例えば、適宜、一緒に保存されてもよい。
【０３１２】
キットはまた、使用に適した説明書を組み込んでいてもよく、説明書は、例えば、別個のシート上に印刷されていてもよい又はキットの包装の中に組み込まれていてもよい。
【０３１３】
特定の一態様では、本発明の方法及びキットは、結腸直腸癌及び／又は胃癌及び／又は食道癌、特に結腸直腸癌などの胃腸癌の診断、組織病理学的分析、ゲノム薬理学的分析の改良などを提供するために、本発明の他の方法及びキットと組み合わせられてもよい。したがって、本発明の方法及びキットの実施形態はすべて、本発明のそれぞれの態様に必要な変更を加えて適用される。
【０３１４】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例に関して記載されることとなる。
［発明の詳細な説明］
【図面の簡単な説明】
【０３１５】
【図１ａ】ＮＤＲＧ４；結腸直腸癌組織（Ｔ）、正常結腸粘膜（Ｎ）、メチル化結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）、及び非メチル化細胞株ＳＷ４８０の重亜硫酸塩配列決定。白色の正方形及び黒色の正方形は、それぞれ、ＮＤＲＧ４中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチド及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに相当する。各列は、単一のクローンに相当する。ＣｐＧの位置は、転写開始部位に対するものとする。ＭＳＰプライマーの位置は、それぞれ、位置２０〜２３及び３１〜３４である。
【図１ｂ】ＮＤＲＧ２：結腸癌腫細胞株（ＲＫＯ及びＬＳ１７４Ｔ）の重亜硫酸塩配列決定。白色の正方形及び黒色の正方形は、それぞれ、ＮＤＲＧ２Ｂ中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチド及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに相当する。
【図２】未処理細胞株と比較した、ＤＡＣ及びＴＳＡを用いる処理の後のＮＤＲＧ４の相対的な発現量。シクロフィリンは、参照遺伝子として、発現量の正規化のために使用した。
【図３ａ】メチル化ＮＤＲＧ４配列（配列番号５２４）（ＮＭ＿０２０４６５：ＴＳＳに関して−１０００〜＋１０００）。中間の灰色の重亜硫酸塩配列決定プライマー；ネステッドＭＳＰのためのフランクプライマーに下線を引く；明るい灰色のメチル化ＭＳＰプライマー；濃い灰色及び明るい灰色の非メチル化プライマー
【図３ｂ】メチル化ＮＤＲＧ２配列（配列番号５２５）。中間の灰色の重亜硫酸塩配列決定プライマー；ネステッドＭＳＰのためのフランクプライマーに下線を引く；明るい灰色のメチル化ＭＳＰプライマー；濃い灰色及び明るい灰色の非メチル化プライマー
【図４】１００％の特異性での、異なるマーカーの感度。Ｘ軸＝：リアルタイムＱＭＳＰでの陽性％；Ｙ軸＝：異なるマーカー。症例：ｎ＝６５  癌腫；対照：ｎ＝３３  組織学的に正常な切除端
【図５】図５は、臨床試料（リアルタイムＭＳＰ）中での、結腸直腸癌に関連づけられる興味のある遺伝子のメチル化状態の決定のための意志決定樹図を示す。
【図６】図６は、３４個の結腸癌腫組織試料、１６個の結腸腺腫組織試料、並びに６３個の乳癌試料（２０）、肺癌試料（２１）、及び膀胱癌試料（２２）について、９つの異なる遺伝子に対して実行されたリアルタイムＭＳＰの結果を示す。各遺伝子についての感度の性能が示され、分析のカットオフは、１００％の特異性となるようにセットした（非癌対照に基づいて）。
【図７】図７は、３４個の結腸癌腫組織試料、１６個の結腸腺腫組織試料、及びＣＲＣ以外の癌を有する患者からの５９個の試料について、１０個の異なる遺伝子に対して実行されたリアルタイムＭＳＰの結果を示す。各遺伝子についての感度の性能が示され、分析のカットオフは、９５％の特異性が得られたＪＰＨ３を除いて、１００％の特異性となるようにセットした（非癌対照に基づいて）。
【図８】図８は、血漿トレーニングセット１について８つの異なる遺伝子に対して実行された及び血漿トレーニングセット２について５つの異なる遺伝子に対して実行されたリアルタイムＭＳＰの結果を示す。血漿トレーニングセット１は、疑わしい発見のない３４個の試料、結腸以外の癌を有する患者からの２５個の試料、及びＣＲＣのすべてのステージを包含し、８１％が疾患のステージＩ〜ＩＩＩに相当する患者からの４２個の試料を含む。血漿トレーニングセット２は、疑わしい発見のない６４個の試料、４９個の腺腫、結腸癌以外の癌を有する患者からの２５個の試料、及びＣＲＣのすべてのステージを包含し、７６％が疾患のステージＩ〜ＩＩＩに相当する患者からの７８個の試料に対して試験した。
【図９】図９は、調査された患者群を示す、ＮＤＲＧ４研究の全体図を示す。
【図１０】ＮＤＲＧ４のプロモーター領域の模式図。転写開始部位（ＴＳＳ）（屈曲した矢印によって示される）に対する−５５６〜＋８６９の高密度なＣｐＧアイランドが示される。ＣｐＧジヌクレオチド（｜によって示される）の位置、ＯＲＦ  ＮＤＲＧ４（灰色の四角形を用いて示される）、並びにメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）プライマー、定量的ＭＳＰ（ｑＭＳＰ）プライマー、及び重亜硫酸塩配列決定（ＢＳ）プライマーによって同定される過剰メチル化断片の領域が示される。
【図１１ａ】８つの異なるＣＲＣ細胞株中でＤＮＡメチル化を検出するためのプライマー対２を用いるメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）の結果。
【図１１ｂ】２つのＣＲＣ細胞株、即ちＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０の重亜硫酸塩配列決定。６つの異なるクローンを配列決定した。各列は、重亜硫酸ナトリウムＤＮＡ修飾に続いて配列決定した、個々のクローニングした対立遺伝子に相当する。各ボックスはＣｐＧジヌクレオチドを示す（黒色のボックス；メチル化ＣｐＧ部位、白色のボックス；非メチル化ＣｐＧ部位）。
【図１１ｃ】メチル化阻害因子５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ）を用いる処理の後の、結腸癌細胞株（ＲＫＯ及びＨＣＴ１１６）中でのＮＤＲＧ４発現量。
【図１２ａ】癌（Ｔ）及びそれらの対応する正常な非悪性粘膜組織（Ｎ）の３つの症例の重亜硫酸塩配列決定。異なる６つのクローンを配列決定した。
【図１２ｂ】３人の異なる人についての結腸癌組織（Ｔで標識）及び対応する正常な結腸組織試料（Ｎで標識）中の、リアルタイムＰＣＲによって測定されたＮＤＲＧ４転写物の発現量のレベル。各患者について、正常な粘膜組織中のＮＤＲＧ４発現量のレベルを１に等しくなるようにセットした。実験は３回行った。
【図１２ｃ】ＮＤＲＧ４発現の局在性。正常な粘膜及び結腸腫瘍中のＮＤＲＧ４の免疫組織化学染色により、癌細胞は染色されないことを示すが、正常な上皮細胞の核は明確に染色されることを示す。
【０３１６】
［実験の部］
１）ＮＤＲＧ実験
細胞培養
結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＲＫＯ、ＣａＣｏ２、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ４８、及びＳＷ４８０を、ＭＳＰ、重亜硫酸塩配列決定、及びリアルタイム（再発現）ＲＴ−ＰＣＲのために使用した（１ＭＭ  ＤＡＣ及び３００ｎＭ  ＴＳＡ）。
【０３１７】
研究集団
５０歳を超える結腸直腸癌患者及び対照のホルマリン固定パラフィン包埋結腸粘膜組織を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔの病理学部のアーカイブから遡及的に収集した。承認は、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＭＥＣ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔによって得た。正常組織及び腺腫組織が存在する場合、これらの組織もまたこれらの症例から収集した。対照群は、非特異的な腹部の病訴のために内視鏡検査を受けている患者からの、組織学的に正常な生検材料、５〜１０年以内に結腸直腸癌を発達させなかった患者からの腺腫生検材料からなる。結腸直腸癌患者及び対照は、非黒色腫皮膚癌以外の癌とさらに診断された場合、除外した。
【０３１８】
メチル化特異的ＰＣＲ
遺伝子プロモーターのＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化は、ＭＳＰが後続する、重亜硫酸ナトリウムを用いるゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩処理によって決定した。手短に言えば、ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩修飾はＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して実行した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織から回収したＤＮＡに対するＭＳＰ分析は、重亜硫酸塩修飾ＤＮＡを増幅するが、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを区別しないフランキングＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡを最初に増幅することによって促進した。このＰＣＲ産物は、ＭＳＰ反応のための鋳型として使用した。ＰＣＲはすべて、非メチル化ＤＮＡ（正常なリンパ球からのＤＮＡ）の対照、メチル化ＤＮＡ（ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてインビトロで処理された正常なリンパ球ＤＮＡ）の対照、及びＤＮＡを有していない対照を用いて行った。１０μｌの各ＭＳＰ反応物を、ＵＶ照明下で視覚化した２％アガロース上に直接ロードした。プライマー配列及びＰＣＲ条件を表１９に明示する。
代替としては、ＤＮＡメチル化をＱＭＳＰによって決定した。
【０３１９】
【表１９】
2015154775.tif 000030
【０３２０】
重亜硫酸塩ゲノム配列決定
ゲノムＤＮＡは、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して単離した。ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩修飾はＥＺ  ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して実行した。ＰＣＲ産物は、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｒｅｄａ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してサブクローニングし、単一コロニーを選択し、配列決定した。プライマー配列及びＰＣＲ条件を表２０に明示する。
【０３２１】
【表２０】
2015154775.tif 000031
【０３２２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡの単離は、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の使用によって単離し、ｃＤＮＡ合成は、Ｉｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。定量的リアルタイム逆転写−ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｉｅｕｗｅｋｅｒｋ  ａ／ｄ  ＩＪｓｓｅｌ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して行った。プライマー及びＰＣＲ条件を表２１に明示する。
【０３２３】
【表２１】
2015154775.tif 000032
【０３２４】
ＮＤＲＧ４の発現量分析
ＮＤＲＧ４遺伝子の発現量は、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。ＮＤＲＧ４遺伝子は、正常な結腸細胞株中で十分に発現することが分かったのに対して、ＮＤＲＧ４遺伝子は、結腸癌細胞株中では発現しなかった。これ自体、サイレンシングがエピジェネティックであることを示すものではなかったので、ＲＫＯ細胞株及びＨＣＴ１１６細胞株を、試薬ＤＡＣ（５’デアザシチジン）及びＴＳＡを用いて処理した。ＤＡＣ及びＴＳＡを用いた処理の後のＮＤＲＧ４の相対的な発現量を未処理細胞株と比較した。シクロフィリンは、参照遺伝子として、発現量正規化のために使用した。図２は、処理が、ＮＤＲＧ４発現の再活性化をもたらしたことを示し、結腸癌細胞の遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングの証拠を提供する。
【０３２５】
ＮＤＲＧ４及びＮＤＲＧ２のＣｐＧアイランドメチル化状態分析
ＮＤＲＧ４発現のサイレンシングはＤＡＣ及びＴＳＡを用いた処理の後に逆行したことが観察されたので、転写不活性化及び推定上のエピジェネティックな異常の間の関連性をさらに調査した。ＮＤＲＧ  ＣｐＧアイランドメチル化状態は、明示されるような手法を使用して、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンのウラシルへの化学的変換を誘発する重亜硫酸塩によって修飾されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって確立した。表Ｖは、ＭＳＰによって分析したＮＤＲＧ４  ＣｐＧアイランドメチル化が、癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＲＫＯ、ＣａＣＯ２、及びＳＷ４８中で観察されたのに対して、それは、非メチル化細胞株ＳＷ４８０中で不在であったことを示す。
【０３２６】
同様に、異なるプライマーセット（ａ〜ｄ）を用いてＭＳＰによって分析したＮＤＲＧ２  ＣｐＧアイランドメチル化はほとんどの癌細胞株中で観察された。すべての癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＲＫＯ、ＣａＣＯ２、及びＳＷ４８中で、ＮＤＲＧ２  ＣｐＧアイランドメチル化は、表１９のプライマーセットｂを用いて観察された。
【０３２７】
【表２２】
2015154775.tif 000033
【０３２８】
癌細胞株のＮＤＲＧ４の機能のエピジェネティックな損失の実証に続けて、本発明者らは、癌患者のＮＤＲＧ４  ＣｐＧアイランドプロモーター過剰メチル化の蔓延性を評価した。予想通り、ＮＤＲＧ４  ＣｐＧアイランドプロモーター過剰メチル化は、癌を有していない患者からの正常な粘膜中で不在であった。表２３に示されるように、ＮＤＲＧ４  ＣｐＧアイランドプロモーター過剰メチル化は、新生物の各分類の間で異なる頻度で観察された。ＮＤＲＧ４は、８８個の調査した癌腫組織の７６％で及び同時発生している結腸直腸癌を有する５７個の腺腫の５７％でメチル化されていた。結腸直腸癌を有していなかった患者からの腺腫（軽度の形成異常非進行性腺腫）中では、ＮＤＲＧ４メチル化は有意に低く（１４％）、これは、結腸直腸癌の発達へのこのＮＤＲＧ４メチル化の予後値を示す。
【０３２９】
【表２３】
2015154775.tif 000034
【０３３０】
他のマーカーのメチル化と比較したＮＤＲＧ４メチル化
切除された腫瘍及び組織学的に正常な切除物からの試料を１３個の遺伝子の過剰メチル化について試験した。代表的な結果を図４に示す。最も高いメチル化は、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ５について得られた。すべて、１００％の特異性に対して感度＞４０％を示した。本発明者らは、結腸直腸癌を検出するメチル化マーカーの能力に基づいて選択された多くのメチル化マーカーを用いる癌検出の感度を改良するために、ＮＤＲＧ４メチル化マーカーの能力を試験した。他の遺伝子は、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−５、ＣＨＦＲ、ＡＰＣ（２）、ＭＧＭＴ、ｐ１６、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｐ１４、ＲＡＳＳＦｌａ、及びＲＡＢ３２からなる群から選択した。第１に、ＳＦＲＰ１を補完するＮＤＲＧ４の能力を分析した。ＳＦＲＰ１が過剰メチル化されなかった結腸癌腫試料の３０％（ｎ＝１８）は、ＮＤＲＧ４について過剰メチル化を示した（ｎ＝６）。同様に、ＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ４、又はＧＡＴＡ５のメチル化分析によって検出されなかった癌腫試料はＮＤＲＧ４について過剰メチル化を示した。実際に、図４からのメチル化マーカーのいずれかとのＮＤＲＧ４の組合せは癌の診断を改良した。
【０３３１】
他の癌の種類（メチル化された癌）についてのＮＤＲＧ−４  ＭＳＰ
ＮＤＲＧ−４メチル化を、ある種の遺伝子の過剰メチル化を示す他の癌の種類について評価した。これらの癌の種類は、黒色腫、明細胞腎臓癌、卵巣癌腫、前立腺癌、乳癌、及び胃癌を含んだ。結果は以下の通りであった：
黒色腫：８つの試料のうちの０個の試料がＮＤＲＧ４についてメチル化されていた。
明細胞腎臓癌：１０個の試料のうちの１つの試料だけがＮＤＲＧ４についてメチル化されていた。
卵巣癌腫：２０個の試料のうちの０個の試料がＮＤＲＧ４についてメチル化されていた。
前立腺癌：１０個の試料のうちの０個の試料がＮＤＲＧ４についてメチル化されていた。
乳癌：０／７の小葉癌及び０／９の腺管癌がＮＤＲＧ４についてメチル化されていた。
【０３３２】
これらの結果とは対照的に、試験した６つの胃癌のすべてで、ＮＤＲＧ４についてのメチル化が観察された。これは、ＮＤＲＧ４が、種類に特異的な癌メチル化マーカーであり、結腸癌及び／又は胃癌を検出するために好ましくは使用されることを示すように思われる。
【０３３３】
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【０３３４】
２）糞便ＤＮＡについての実験
【０３３５】
実施例１
糞便ＤＮＡに関しての材料及び方法
【０３３６】
試料収集及び処理
標準化された、複数の医療センターにまたがるスクリーニングの試行（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が２００６年に始められた。この試行では、５０歳以上の無症状の対象が、結腸内視鏡検査、ＦＯＢＴ、並びに便及び血液からのＤＮＡを使用するリアルタイムＭＳＰを用いてスクリーニングされる。加えて、複数のセンター（Ｇｅｒｍａｎｙ及びＴｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からの、先を見越して収集された便試料が使用された。これらの試行では、胃腸科クリニックに通院し、最終的にＣＲＣと診断された、症状のある患者がリアルタイムＭＳＰで使用するための便試料を提供した。進行中の試行から、１４７個の便試料が本発明の研究のために入手可能となった。３つの主なカテゴリーの便試料：疑わしい発見のない６７個の試料、５８個の腺腫、及びＣＲＣのすべてのステージを包含し、９０％が早期ステージの疾患に相当する患者からの２２個の試料を使用した。
【０３３７】
特殊なバケツへの排便の後に、患者は、２５０ｍｌの便ホモジナイゼーションバッファー（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）を試料に添加した。試料は研究所に輸送され、排便の後の７２時間以内にさらに処理した。便ホモジナイゼーションバッファーは比１：７で添加され、試料はホモジナイズし、３２ｍｌの部分に等分した。
【０３３８】
便からのＤＮＡ抽出
単一のアリコート（４ｇの便の等価物を含有する３２ｍｌ）を２０℃、２５４０ｒｃｆで５分間遠心分離した。上清を保持し、２回目の遠心分離をした（４℃、１６５００ｒｃｆで１０分間）。２回目の遠心分離ステップに続いて得られた２２ｍｌの上清を、３７℃で６０分間、５μｌ  ＲｎアーゼＡと共にインキュベートした。全ＤＮＡは、次いで、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）−イソプロパノール沈澱し、７０％エタノールを用いて洗浄した。ＤＮＡを、４ｍｌ  １×ＴＥ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。４００μｌ  １０×バッファー（２４０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）、７５０ｍＭ  ＮａＣ）、４００μｌ  １０％ＳＤＳ、及び２０μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、試料は、一定の振盪（２２５ＲＰＭ）で、一晩、４８℃でインキュベートした。遠心分離（室温で３０秒間、３０００ＲＣＦ）の後に、５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、容量／容量；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、２２５ＲＰＭで振盪させながら室温で１０分間インキュベートし、３０００ＲＣＦで５分間遠心分離した。水層を、５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを含有する新たなチューブに移動した。なおまた、試料を、２２５ＲＰＭで振盪させながら室温で１０分間インキュベートし、室温で、３０００ＲＣＦで５分間遠心分離した。水層を新たなチューブに移動し、ＤＮＡは、５００μｌ  ７．５Ｍ酢酸アンモニウム、５μｌグリコーゲン、及び１０ｍｌの冷１００％エタノール（−２０℃）を添加することによって沈澱させ、少なくとも１時間、−２０℃でさらにインキュベートし、４℃で３０分間、１５０００ＲＣＦで遠心分離した。ペレットは、３．５ｍｌの新たに調製した７０％エタノールを用いて洗浄し、風乾した。ペレットは、最後に、２ｍｌのＬｏＴＥ  ｐＨ８．０に再懸濁させ、さらなる処理まで−８０℃で保存した。ＤＮＡの平均収量は４６２μｇであった（４６〜２１２７μｇの範囲；ＳＤ４２０）。
【０３３９】
ＤＮＡ修飾
高品質のＤＮＡ修飾ステップを、３２μｇの得られたＤＮＡに適用した。２μｇのＤＮＡの１６のアリコートを、メーカーのプロトコールに従って、ＥＺ−９６ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ピペッティングロボット（Ｔｅｃａｎ）上の９６−ウェルフォーマット中で重亜硫酸塩修飾にさらした。基本的に、４５μｌのアリコートを５μｌのＭ−希釈バッファーと混合し、１１００ｒｐｍで振盪させながら１５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、１００μｌの希釈ＣＴ変換試薬を添加し、試料を、暗中、１１００ｒｐｍで振盪させながら、３時間７０℃でインキュベートした。変換の後、試料は、１０分間の氷上でのインキュベーション及び４００μｌのＭ−結合バッファーの添加によって脱塩した。試料を、収集チューブ中のＺｙｍｏ−Ｓｐｉｎ  Ｉ  Ｃｏｌｕｍｎに装填し、遠心分離の後に、２００μｌのＭ−洗浄バッファーを用いて洗浄した。２００μｌのＭ−脱スルホン化バッファーをカラムに注ぎ、１５分間、室温でインキュベートした。カラムの遠心分離の後に、それらを、２００μｌのＭ−洗浄バッファーを用いて２回洗浄した。最後に、ＤＮＡは、５０μｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １ｍＭ  ｐＨ８．０中でカラムから洗い流し、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０３４０】
ＤＮＡ濃縮
重亜硫酸塩処理ＤＮＡは、ＺＹＭＯ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して濃縮する。ＤＮＡの各アリコートに、１００μｌのＤＮＡ結合バッファーを添加した。約６μｇのＤＮＡの等価物（重亜硫酸塩処理の前に定量）を、収集チューブ中のザイモ−スピン（Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ）（商標）Ｃｏｌｕｍｎに移動した（試料当たり、重亜硫酸塩処理ＤＮＡを有する１６ウェルを５つのザイモ−スピン（商標）ｃｏｌｕｍｎに分割する）。チューブは、３０秒間、≧１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、２００μｌの洗浄バッファーを用いて２回洗浄した。ＤＮＡは、６μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０を添加することによってカラムから溶出し、１分間インキュベートし、３０秒間、≧１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。同じ試料を用いたカラムの溶出液をプールした。結果として生じる化学的処理ＤＮＡはリアルタイムＭＳＰのための鋳型として使用した。
【０３４１】
ＤＮＡ増幅
リアルタイムＭＳＰは、７９００ＨＴ  ｆａｓｔ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に適用した。２．４μｌの修飾ＤＮＡ（２．５μｇ非変換ＤＮＡと等価）を、バッファー（１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、ｄＮＴＰ（５ｍＭ）、フォワードプライマー（６ｎｇ）、リバースプライマー（１８ｎｇ）、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ（０．１６μＭ）、ＢＳＡ（０．１μｇ）、及びＪｕｍｐｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（０．４ユニット；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＣＲミックス（全容量１２μｌ）に添加した。遺伝子のそれぞれに使用したプライマー配列及びｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ配列を表１に要約する。使用したサイクルプログラムは以下の通りとした：５分間９５℃、その後、３０秒間９５℃、３０秒間５７℃（ＡＰＣについては５１℃）、及び３０秒間７２℃の４５サイクル、その後、５分間７２℃。標準曲線に対する未知試料のＣｔ値の補間によって、未知試料のコピー数を決定するために、標準曲線（２×１０６−２０コピー）を含めた。
【０３４２】
結果
結腸組織試料中のマーカーの同定及び確認
【０３４３】
組織及び便でのアッセイ有効率：２３０個のＦＦＰＥ試料及び１４７個の便試料をリアルタイムＭＳＰを使用して処理した。リアルタイムＭＳＰアッセイは、ＦＦＰＥ試料及び便試料の９９％で有効な結果をもたらした。
【０３４４】
結腸組織中でのマーカー選択：再発現に基づいて、１４５個の遺伝子プロモーターに相当する２２４回の異なる遺伝子アッセイをＢａｓｅ５メチル化プロファイリングプラットフォームで試験した（データ示さず、詳細は参考文献１を参照されたい）。２９個の遺伝子プロモーターを評価する、３７個の最も特異的にメチル化された遺伝子配列を、６５人の結腸直腸癌患者（すべてのステージ）及び７４個の遠位の切除端（組織病理学的に正常）から遡及的に収集した腫瘍についてリアルタイムＭＳＰを使用して確認した。いくつかのマーカーはそれらの組織試料中でＣＲＣを確実に検出した（データ示さず）。３９個の組織対照（非癌）、３４個の癌腫、及び１６個の腺腫を含有する独立した試験セットについて結果を確証した。試験されたマーカーのいくつかの組合せは、高い特異性及び感度でＣＲＣを確実に検出した。
【０３４５】
１０個の最も機能するマーカーＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＪＰＨ３、及びＡＤＡＭ２３は、表２４に明示されるようなプライマーセット及びｂｅａｃｏｎプローブを用いて確認した。結腸試験遺伝子に加えて、無関係な参照遺伝子β−アクチン（ＡＣＴ）もまた測定した。結腸試験遺伝子及びＡＣＴの間の比を計算し、これをアッセイの試験結果とする。試料は、図５に示される意志決定樹図に基づいて、メチル化されている、メチル化されていない、又は無効と分類した。
【０３４６】
１０個のマーカーの個々の性能を表２５に示す。適用されるカットオフに依存して、異なる感度を、個々のマーカーについて得た。マーカーの１００％の特異性に対して、感度（％）は、ＧＡＴＡ５について５６〜６６、７８〜８２のＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ１について８４〜９２、ＳＦＲＰ２について７２〜８４、ＡＰＣについて４０〜４６、ＭＧＭＴについて４４、ＮＤＲＧ４について６４〜６６、ＯＳＭＲについて８８、ＪＰＨ３について８２、及びＡＤＡＭ２３について５０の範囲であった。
【０３４７】
【表２４】
2015154775.tif 000035
【０３４８】
【表２５】
2015154775.tif 000036
【０３４９】
マーカーの相補性
異なるマーカーをそれらの相補性について試験した。試験したマーカーの、いくつかの組合せは、高い特異性及び感度で確実にＣＲＣを検出した。結果を表２６に要約する。１００％の特異性に対して、感度（％）は、２つのマーカーの組合せについて９０〜９８の間の範囲であった。１００％の感度が、３つのマーカーの組合せＳＦＲＰ１＋ＳＦＲＰ２＋ＡＰＣ及びＳＦＲＰ２＋ＯＳＭＲ＋ＡＰＣについて得られた。
【０３５０】
【表２６】
2015154775.tif 000037
【０３５１】
腺腫及び癌腫の組織試料についてのマーカーの性能
早期癌検出にとって重要なのは早期ステージの癌に対するマーカーの性能である。そのため、試験セットからの５０の癌の症例を２つの診断群：癌腫及び腺腫にさらに分割した。結果を表２７及び２８に要約する。癌腫の感度は、結腸直腸癌の検出について３５％〜８８％の範囲であったのに対して、腺腫の感度は３１％〜８８％の範囲であり、共に、対応する特異性は１００％であった。これらの結果は、遺伝子の選択されたセットは、結腸直腸癌について高度に特異的であり、いくつかの有望な早期ステージの検出マーカーを含むことを示す。
【０３５２】
【表２７】
2015154775.tif 000038
【０３５３】
【表２８】
2015154775.tif 000039
【０３５４】
糞便試料中でのマーカーの性能
組織中で最も機能するメチル化マーカーの９つ（ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４、ＡＰＣ、ＡＤＡＭ２３、ＯＳＭＲ３、及びＪＰＨ３）を糞便試料中で評価するために選んだ。β−アクチンコピー数もまた、試料品質及びＤＮＡ収量についての対照として定量した。
【０３５５】
これらの遺伝子のメチル化されたコピーを、７９００ＨＴ  ｆａｓｔ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＭＳＰによってすべての入手可能な便試料中で定量した。
【０３５６】
腺腫及び結腸直腸癌からの糞便試料中の９つの遺伝子（アクチン、ＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ４、ＡＰＣ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ３、及びＡＤＡＭ２３）の個々の性能を表２９に示す。１００％の特異性は、ＳＦＲＰ２を除いてほとんどの遺伝子について得られた。ＣＲＣを有する患者からの糞便試料中の最も機能する遺伝子は、７３％の感度を有するＧＡＴＡ４、６７％の感度を有するＳＦＲＰ１、６７％の感度を有するＯＳＭＲ３、及び６０％の感度を有するＮＤＲＧ４と一致し、対応する特異性はすべて１００％であった。
【０３５７】
【表２９】
2015154775.tif 000040
【０３５８】
糞便試料中のマーカー組合せパネルの性能
４つの候補メチル化マーカーが、便試料中で最も好都合な感度及び特異性をもたらすことが分かった：ＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ。β−アクチンコピー数もまた、試料品質及びＤＮＡ収量についての対照として定量した。これらの４つのメチル化マーカーの組合せパネルの性能を調査した。これらの遺伝子のメチル化されたコピーを、７９００ＨＴ  ｆａｓｔ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でリアルタイムＭＳＰによってすべての入手可能な便試料中で定量した。表３０は、結果を示し、適用されたカットオフ（コピー）をリストする。例えば、最も感度のよいマーカー組合せパネルＳＦＲＰ２＋ＧＡＴＡ４＋ＮＤＲＧ４＋ＯＳＭＲについては、個々のマーカーのカットオフ値はＳＦＲＰ２＝２、ＧＡＴＡ４＝４、ＮＤＲＧ４＝０．１、及びＯＳＭＲ＝１０とした。この組合せパネルは、９５％の特異性、ＣＲＣについての８７％の感度、及び腺腫についての４６％の感度を有した。好ましい２つのマーカーの組合せＮＤＲＧ４＋ＧＡＴＡ４は、１００％の特異性、ＣＲＣについての７３％の感度、及び腺腫についての３３％の感度を有した。
【０３５９】
【表３０】
2015154775.tif 000041
【０３６０】
最も感度のよいマーカー組合せパネルＳＦＲＰ２＋ＧＡＴＡ４＋ＮＤＲＧ４＋ＯＳＭＲの性能を異なるＵＩＣＣステージについて評価した。結果を表３１に要約する。
【０３６１】
【表３１】
2015154775.tif 000042
【０３６２】
実施例２
再発現に基づいて、１４５個の遺伝子プロモーターに相当する２２４回の異なる遺伝子アッセイをＢａｓｅ５メチル化プロファイリングプラットフォームで試験した（データ示さず、詳細は参考文献２を参照されたい）。２９個の遺伝子プロモーターを評価する、３７個の最も特異的にメチル化された遺伝子配列を、６５人の結腸直腸癌患者（すべてのステージ）及び７４個の遠位の切除端（組織病理学的に正常）から遡及的に収集した腫瘍についてリアルタイムＭＳＰを使用して確認した。いくつかのマーカーはそれらの組織試料中でＣＲＣを確実に検出した（データ示さず）。ＣＲＣ以外の癌を有する患者からの５９個の試料（ステージＩ〜ＩＩＩを包含する２０個の乳癌試料、２１個の肺癌試料、及び２２個の膀胱癌試料）、３９個の非癌対照、３４個の癌腫、並びに１６個の腺腫を含有する独立した試験セットについて結果を確証した。非ＣＲＣ組織試料を試験した後、４つが無効であったので、本発明者らの結果は５９個であった。分析のカットオフを、１００％の特異性となるようにセットした（３９個の非癌対照に基づいて）場合の９つの最も機能する組織マーカーの個々の性能を図２に示す。最も組織特異的なマーカーは、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、及びＭＧＭＴを含む。
【０３６３】
参考文献
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【０３６４】
３）血漿ＤＮＡについての実験
血漿ＤＮＡに関しての材料及び方法
【０３６５】
試料収集及び処理
血漿試料は、ドイツ、オランダ、及びベルギーの複数のセンターから収集した。
【０３６６】
１０ｍｌの血液を、ＥＤＴＡ  バキュテイナー（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（商標）チューブを使用して個体当たりに得た。結腸内視鏡検査に基づく、疑わしい発見のない、腺腫を有する、又は癌腫を有する個人を本発明の研究に登録した。採血から４時間以内に、血漿画分を、１５分間、１５００ｇでの遠心分離（４℃）によって細胞画分から分離した。血漿を新たなチューブに移動し、もう一度遠心分離し（１５００ｇ、１５分間、４℃）、この後、上清を新たなチューブに移動し、さらに使用するまで−８０℃で保存した。試料はドライアイス上で輸送した。
【０３６７】
以下の群に属する結腸直腸癌のステージＩ〜ＩＶを有する患者及び異なる対照からの血漿試料を本研究に登録した。表３２及び３３は収集された試料セットの全体図を示す。
−  結腸直腸癌群：ステージＩ〜ＩＶ（ＵＩＣＣのステージグルーピングに従って）を有する、病理学的に確証された結腸直腸癌を有する患者
−  腺腫
−  非癌対照：癌疾患を有していない患者
−  癌対照：結腸直腸癌以外の癌腫を有する患者
【０３６８】
【表３２】
2015154775.tif 000043
【０３６９】
【表３３】
2015154775.tif 000044
【０３７０】
血漿試料からのＤＮＡ単離
血漿試料（１．２〜６ｍｌ）からのＤＮＡ単離は、１５ｍｌのＨｅａｖｙ  Ｐｈａｓｅ  ｌｏｃｋ  Ｇｅｌチューブ（ＰＬＧチューブ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ｃａｔ＃  ００３２  ００５．１５２）又はその代わりに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのチャージスイッチ（ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ）（登録商標）ｇＤＮＡ  １ｍｌ  ｓｅｒｕｍ  キット（ｃａｔ＃  ＣＳ１１０４０）を使用する高品質のフェノール−クロロホルムＤＮＡ単離方法を使用して行った。
【０３７１】
フェノール−クロロホルム手法
血漿試料を解凍し、１／１０容量の１０×バッファー（２４０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、１／１０容量の１０％ＳＤＳ、及び１ｍｌの試料当たり５μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌストック溶液）（例えば３ｍｌの試料について１５μｌ）を各血漿試料に添加した。この混合物を、一定の振盪（２００ＲＰＭ）で４８℃で一晩、インキュベートした。
【０３７２】
その後に、ＰＬＧチューブを３分間、２５００ＲＣＦで遠心分離し、試料混合物及びおよそ同じ容量のフェノール／クロロホルム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃  １５５９３０４９）をそれに添加した。この溶液をしばらくの間ボルテックスし、室温で、チューブロッカーを使用して１０分間混合し、２５００ＲＣＦで５分間、遠心分離した。回収した試料容量が≦４ｍｌであった場合、等容量のフェノール／クロロホルムを添加した。上部の水層を、２回、フェノール／クロロホルム処理した。
【０３７３】
ＤＮＡは、５μｌグリコーゲン、１／１０容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウム、及び２〜２．５容量の冷（−２０℃）１００％エタノールを添加することによって上部の水層から沈澱させた。チューブは、静かに逆さにし、少なくとも１時間、−２０℃でインキュベートし、その後、３０分間、１７０００ＲＣＦで遠心分離ステップ（４℃）を続けた。エタノールは、ピペッティングによって注意深く取り除いた。ペレットは、２ｍｌの新たに調製した７０％エタノールを用いて洗浄し、軽くボルテックスし、４℃での１５分間の１７０００ＲＣＦでの遠心分離ステップにかけた。残るエタノールを注意深く除去した後に、ペレットを風乾し、４５μｌのＬｏＴＥ  ｐＨ８．０中に再懸濁させた。単離ＤＮＡはさらなる処理まで−８０℃で保存する。この方法は、１ｍｌの血漿当たり≒１２０ｎｇの平均ＤＮＡ回収率を可能にした。
【０３７４】
チャージスイッチ（登録商標）ｇＤＮＡ  １ｍｌ  ｓｅｒｕｍ  キット
血漿試料を解凍し、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃａｔ＃  Ｖ３４７１）からのマグナボット（ＭａｇｎａＢｏｔ）（登録商標）大容量磁気分離デバイスを使用して、大きな試料容量について手法を高品質なものとすることを除いて、ＤＮＡは、メーカーの説明書に従って、チャージスイッチ（登録商標）ｇＤＮＡ  １ｍｌ  ｓｅｒｕｍ  キットを使用して単離する。結果を表４１に提示する。
【０３７５】
ＤＮＡ修飾
上記の手法で単離したＤＮＡの完全な内容物は、ピペッティングロボット（Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯＩＩ、Ｒｏｍａ、Ｌｉｈａ、Ｍｃａ、Ｔｅ−Ｖａｃｓ）上で行われるＺｙｍｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈからのＥＺ−９６  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｄ５００３）を使用して、重亜硫酸ナトリウム処理（ＢＴ）にさらした。手短に言えば、４５μｌの血漿ＤＮＡ試料を５μｌのＭ−希釈バッファー（キットに提供される）と混合し、１１００ＲＰＭで１５分間振盪させながら３７℃でインキュベートした。この混合物を、３時間７０℃で振盪させながら、１００μｌの希釈ＣＴ変換試薬（キットに提供される）と共にさらにインキュベートした（光から保護）。その後に、修飾ＤＮＡは、メーカーの説明書に従って脱塩し、脱スルホン化し、適用される濃縮手法に依存して、４０μｌ又は２０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １ｍＭ  ｐＨ８．０中で溶出した。溶出した材料は、さらなる処理まで−８０℃で保存した。
【０３７６】
ＤＮＡ増幅
リアルタイムＭＳＰは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの７９００ＨＴ  ｆａｓｔ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅｒで行った。
【０３７７】
２．４μｌの修飾ＤＮＡを、手製のバッファー溶液（最終濃度を要約する：１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、ｄＮＴＰ（５ｍＭ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｃａｔ＃  ２７−２０３５−０２）、メチル化特異的フォワードプライマー（６ｎｇ）、メチル化特異的リバースプライマー（１８ｎｇ）、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ（０．１６μＭ）、及びＪｕｍｐｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（０．４ユニット；Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ＃  Ｄ９３０７）を含有するＰＣＲミックス（全容量１２μｌ）に添加した。
【０３７８】
サイクリング条件を表３４に明示する。
【０３７９】
標準曲線に対する未知試料のＣｔ値の補間によって、未知試料のコピー数を決定するために、標準曲線（９．６×１０５−９．６コピー）を含めた。
【０３８０】
【表３４】
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【０３８１】
結果
組織試料及び血漿試料中のマーカーの同定及び確認
【０３８２】
組織及び血漿でのアッセイ有効率：
２９３個のＦＦＰＥ試料及び３１７個の血漿試料をリアルタイムＭＳＰを使用して処理した（表３５）。リアルタイムＭＳＰアッセイは、９８％のＦＦＰＥ試料で及び１００％の血漿試料で有効な結果をもたらした。
【０３８３】
【表３５】
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【０３８４】
マーカーの同定
結腸癌細胞株の再発現プロファイルを使用して、候補遺伝子を同定し、最も有望なマーカー（１４５個の遺伝子プロモーターに相当する２２４回の異なる遺伝子アッセイ）を、Ｂａｓｅ５メチル化プロファイリングプラットフォームを使用して組織上で試験した（データ示さず、詳細はＳｔｒａｕｂ，Ｊ．らを参照されたい）。プロモーター配列は、エピジェネティックサイレンス遺伝子を同定するために遺伝子発現と関連づけられた。エピジェネティックに標的とされる遺伝子の再発現分析のための確立された薬理的アンマスキング戦略（５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ）及びトリコスタチンＡ（ＴＳＡ））を、プロモーターメチル化の傾向のある遺伝子を同定するために、知的財産権によって保護されている高度なバイオインフォマティクスツールと組み合わせた。
【０３８５】
結腸組織中でのマーカー選択
再発現によって同定したマーカー候補を、３７回のリアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ（リアルタイムＭＳＰ）アッセイを使用してスクリーニングした。これらのアッセイは、様々なクリニックから収集した２９３個のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料中の２９個の遺伝子プロモーターのメチル化状態を評価するために使用した。試料は、様々なステージの９９の癌腫、１６個の腺腫、ＣＲＣ以外の癌を有する患者からの６３個の試料（２０個の乳癌［ステージＩ〜ＩＩＩ］、２２個の膀胱癌［ステージＩ〜ＩＩＩ］、２１個の肺［ステージＩ及びＩＩ］）、癌の証拠を有していない患者からの３９個の試料、並びにＣＲＣ患者からの７６個の遠位の切除端（組織病理学的に正常）を含んだ。これらの試料を、トレーニングセット及び独立した試験セットに分割し、最も、癌試料及び非癌試料を識別することができる遺伝子メチル化アッセイを選択するために使用した。トレーニングセットは、６５人の結腸直腸癌患者（すべてのステージ）から遡及的に収集した腫瘍及び７４個の遠位の切除端を含んだ。１０個の最も機能する遺伝子を使用して、ＣＲＣ以外の癌を有する患者からの５９個の試料、３９個の非癌対照、並びに５０の癌の症例（３４個の癌腫及び１６個の腺腫）を含有する独立した試験セットについて結果を確証した。９５％の特異性が得られたＪＰＨ３を除いて、分析のカットオフを１００％の特異性となるようにセットした（３９個の非癌対照に基づいて）場合の１０個の最も機能する組織マーカーＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、ＭＧＭＴ、ＡＰＣ、及びＪＰＨ３の個々の性能を図７に示す。対応するプライマー及びｂｅａｃｏｎ配列を表３（上記）に要約する。結腸試験遺伝子に加えて、無関係な参照遺伝子５−アクチン（ＡＣＴ）もまた測定した。結腸試験遺伝子及びＡＣＴの間の比を計算し、これをアッセイの試験結果とする。試料は、図５に示される意志決定樹図に基づいて、メチル化されている、メチル化されていない、又は無効と分類した。
【０３８６】
マーカーの相補性
異なるマーカーをそれらの相補性について試験した。いくつかのマーカーの組合せは、高い特異性及び感度でＣＲＣを確実に検出した。最も好都合な２つの、マーカーの組合せの結果を表３６に要約する。１００％の特異性に対して、感度は９４及び１００％の間の範囲であった。
【０３８７】
【表３６】
2015154775.tif 000047
【０３８８】
血漿中でのマーカー試験
組織中で最も機能するマーカーの８つを、複数のセンターからの１０１個の入手可能な血漿試料で評価した（ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、及びＡＰＣ）（血漿トレーニングセット１：表３２）。血漿試料は、疑わしい発見のない３４個の試料、結腸癌以外の癌を有する患者からの２５個の試料、及びＣＲＣのすべてのステージを包含し、８１％が疾患のステージＩ〜ＩＩＩに相当する患者からの４２個の試料を含んだ。
【０３８９】
ＤＮＡは、高品質のフェノール−クロロホルム手法に従って単離し、その後に、全ＤＮＡ試料を上記に記載の通り修飾した。血漿トレーニングセット１を４０μｌのＢＴ溶出容量で溶出し、その２．４μｌをリアルタイムＭＳＰにかけた。２．４μｌの溶出ＤＮＡは、０．０７〜０．３６ｍｌの、単離手法に投入された元々の血漿試料の等価物に相当する（＝ＰＣＲ当たりＤＮＡの０．０７〜０．３６血漿等価物）。
【０３９０】
血漿試料中での８つの遺伝子アッセイの個々の性能（％感度）を図８に示す。感度値は１４〜３３％の範囲である。対応する特異性値を表３７に示す。得られた特異性値は９７〜１００％の範囲であった。
【０３９１】
トレーニングセット１で最も機能するマーカーの５つを、複数のセンターから先を見越して収集したさらなる独立した試料セットを用いてさらに研究した（血漿トレーニングセット２：表３３）。８から５に遺伝子アッセイの数を低下させると、試料当たりアッセイが少なくなったので、より大きなアリコートの、ＤＮＡの血漿等価物をＰＣＲ反応当たりに添加した。試料セット２からの修飾ＤＮＡは、４０μｌのＢＴ溶出容量の代わりに２０μｌ中で溶出することによってより濃縮した。試料セット２からの２．４μｌ溶出ＤＮＡをリアルタイムＭＳＰによってさらに処理した。これは、ＤＮＡ単離に先立っての血漿容量に依存して、ＰＣＲ当たり、ＤＮＡの０．１６〜０．７２ｍｌ血漿等価物に相当する。
【０３９２】
トレーニングセット２の血漿試料は、疑わしい発見のない６４個の試料、４９個の腺腫、結腸癌以外の癌を有する患者からの２５個の試料、及びＣＲＣのすべてのステージを包含し、７６％が疾患のステージＩ〜ＩＩＩに相当する患者からの７８個の試料を含んだ。５つの遺伝子アッセイの個々の性能（％感度）を図８に示し、対応する特異性値を表３７に示す。特異性値は９６〜９９％の範囲であり、感度は２３〜４７％の範囲であった。
【０３９３】
４つのメチル化マーカー候補が、血漿試料中で最も好都合な感度及び特異性をもたらすことが分かった：ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３。この血漿パネルの性能を表３８に示す。４つのメチル化遺伝子のこのパネルの性能特性（ステージＩ〜ＩＩＩ  ＣＲＣ）は、感度について最適化した場合に７３％の感度及び９２％の特異性を実証したのに対して、特異性について最適化した場合に６４％の感度及び９８％の特異性が得られた。２ｍｌ未満の血漿容量を有する試料をＤＮＡ単離に先立って分析から除外する場合、感度はさらに改良することができる（６４％〜６８％）。結果を表３９に提示する。
【０３９４】
【表３７】
2015154775.tif 000048
【０３９５】
【表３８】
2015154775.tif 000049
【０３９６】
【表３９】
2015154775.tif 000050
【０３９７】
血漿試料からの平均ＤＮＡ回収収量
結腸直腸癌患者からの血漿ＤＮＡ（二重遠心分離ステップの後に収集）は、フェノール／クロロホルム手法に従って単離し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量化キットを使用して定量した。平均血漿ＤＮＡ回収収量は１１７ｎｇ／ｍｌ血漿であり、４１〜３８４ｎｇ／ｍｌの範囲であった（データは２５人の患者から得た）。
【０３９８】
【表４０】
2015154775.tif 000051
【０３９９】
血漿試料を使用するフェノール／クロロホルム手法対チャージスイッチ（登録商標）
本実験は、本発明の方法の使用による血漿からのＤＮＡの単離を示すために実行した。２．５〜６ｍｌの範囲の血漿容量を、上記に論じられる高品質のフェノール／クロロホルム単離手法及びチャージスイッチ（登録商標）単離手法に従って処理した。卵巣、前立腺、及び結腸の血液試料に由来する血漿を調査した。目的は、ＤＮＡを単離すること（両方の方法に従って）及び重亜硫酸塩処理及びβ−アクチンリアルタイムＭＳＰによって並行して試料をさらに処理し、試料品質及びＤＮＡ収量を検討することである。両方の単離手法についての対応するβ−アクチンコピーを表１６に要約する。
【０４００】
【表４１】
2015154775.tif 000052
【０４０１】
血漿トレーニングセット２についての最新の結果。
訂正された情報を、血漿トレーニングセット２に関してクリニックから受け取った。血漿トレーニングセット２については、癌症例は、同じままであり、新たなカテゴリー「未知」が作成され、対照の数は５２（前の６４の代わりに）であり、腺腫症例は３９（前の４９の代わりに）であった。これにより、表４２に提供されるように試料の種類を再分類した。訂正された情報により、多くの未知の癌症例（対照）が早期ステージの癌として分類されたので、早期ステージの癌の検出についてのさらなる結論を引き出すことができる可能性がある。表４３に示されるように、血漿パネルは、早期ステージの試料の非常に感度のよい検出（７０％）を可能にした。２ｍｌ未満の血漿容量を有する試料を除外することによって、検出の改良を得ることができる可能性がある（表４４）。
【０４０２】
【表４２】
2015154775.tif 000053
【０４０３】
【表４３】
2015154775.tif 000054
【０４０４】
【表４４】
2015154775.tif 000055
【０４０５】
参考文献
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【０４０６】
４）Ｎ−Ｍｙｃ下流調節遺伝子４（ＮＤＲＧ４）プロモーターのメチル化は結腸直腸癌についての感度のよい特異的なバイオマーカーである
【０４０７】
要約
背景及び目的：細胞分化及び神経突起形成に関与する遺伝子であるＮ−Ｍｙｃ下流調節遺伝子４（ＮＤＲＧ４）は、ＮＤＲＧファミリーの４つのメンバーのうちの１つである。ここで、本発明者らは、ＣＲＣ（ＣＲＣ）でのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化の役割を検討する。
【０４０８】
方法：ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）及び重亜硫酸塩配列決定を使用して、ＣＲＣ細胞株、正常結腸粘膜、結腸直腸腺腫、癌腫、及び他の腫瘍症の十分に特徴づけられたシリーズで分析した。ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化はまた、定量的ＭＳＰを使用して、ＣＲＣ患者及び対照の糞便ＤＮＡでも分析した。ＮＤＲＧ４座のヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）のマッピング並びにエキソン及びそれらのフランキングイントロン領域をコードするＮＤＲＧ４の直接的な配列決定を使用する突然変異分析を行った。ＮＤＲＧ４  ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学をそれぞれ使用して研究した。
【０４０９】
結果：ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化は７／８ＣＲＣ細胞株中で観察される。ＣＲＣ組織中のＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化の蔓延性は、正常結腸粘膜での４％（２／４８）と比較して、８６％（７１／８３）である。第２の独立した、ＣＲＣのシリーズは、ＮＤＲＧ４メチル化の高い蔓延性（６９％、１２７／１８３）を確証した。ＮＤＲＧ４メチル化はまた、食道の腺癌の８１％（１３／１６）及び胃癌の７７％（１７／２２）で観察されたが、メチル化は、皮膚癌（０／８）、腎臓癌（１／１０）、卵巣癌（０／２０）、前立腺癌（０／１０）、乳癌（０／１６）、及び食道扁平上皮細胞癌（０／１２）でほとんど又はまったく観察されなかった。ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化は、ＣＲＣ患者の７６％（１６／２１）の糞便ＤＮＡで検出することができるが、わずか３％の対照患者のみ（２／６７）が試験で陽性となり、７６％の感度及び９７％の特異性がもたらされた。突然変異は認められず、腫瘍の３０．５％がＮＤＲＧ４座でＬＯＨを示した。正常組織と比較した場合、ＮＤＲＧ４の発現は、ＣＲＣで、ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで減少する。
【０４１０】
結論：ＮＤＲＧ４は、ＣＲＣ細胞株、結腸直腸腺腫及び結腸直腸癌腫、並びに胃腸管の他の腺癌で頻繁にメチル化されている。糞便ＤＮＡのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化は、ＣＲＣの検出のための、感度のよい、特異的なバイオマーカーとして使用することができる。
【０４１１】
序論
腫瘍内皮細胞中でエピジェネティックに調節される遺伝子を同定するための前のマイクロアレイ実験は、腫瘍内皮細胞中でダウンレギュレートされ、５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＡＣ）及びトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）の処理の後に再発現する８１個の遺伝子を明らかにした。腫瘍内皮細胞中のこれらの遺伝子のサイレンシングは、プロモーターヒストンＨ３脱アセチル化及びＨ３リシン４メチル化の損失と関連したが、プロモーターＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化を含まなかった。興味深いことには、これらの８１個の遺伝子のうちの２１個（２６％）が様々な腫瘍種類中で過剰メチル化されており、サイレンシングされていることが報告され、同定された遺伝子プロモーターの多くが、腫瘍細胞中でプロモーターのメチル化によって調節される可能性を有することを示唆した（Ｈｅｌｌｅｂｒｅｋｅｒｓ，Ｍｅｌｏｔｔｅら、２００７年）。同定されたＣｐＧアイランド含有遺伝子の中に、Ｓｍａｐ−８及びＢｄｍ１としても知られているＮ−ｍｙｃダウンレギュレート遺伝子−４（ＮＤＲＧ４）がある。ＮＤＲＧ４は、５７〜６５％のアミノ酸配列相同性を有する４つのメンバー、ＮＤＲＧ１、−２、−３、及び−４からなるＮＤＲＧファミリーの一部である（Ｚｈｏｕ，Ｋｏｋａｍｅら、２００１年；Ｑｕ，Ｚｈａｉら、２００２年）。系統学的分析により、一方はＮＤＲＧ１及び−３からなり、他方はＮＤＲＧ−２及び−４からなる２つのサブファミリーを立証した（Ｑｕ，Ｚｈａｉら、２００２年）。ＮＤＲＧ１は、ＮＤＲＧファミリーの最も広範囲に研究されたメンバーである。ＮＤＲＧ１の発現は癌細胞中でダウンレギュレートされることが多く（ｖａｎ  Ｂｅｌｚｅｎ，Ｄｉｎｊｅｎｓら、１９９７年；Ｋｕｒｄｉｓｔａｎｉ，Ａｒｉｚｔｉら、１９９８年；Ｇｕａｎ，Ｆｏｒｄら、２０００年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐａｉら、２００３年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐａｉら、２００４年；Ｓｈａｈ，Ｋｅｍｅｎｙら、２００５年）、ＤＡＣ処理によってアップレギュレートされる（Ｇｕａｎ，Ｆｏｒｄら、２０００年；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐａｉら、２００４年）。加えて、ＮＤＲＧ２もまた候補癌抑制遺伝子として記載され（Ｄｅｎｇ，Ｙａｏら、２００３年；Ｌｕｓｉｓ，Ｗａｔｓｏｎら、２００５年）、髄膜腫（Ｌｕｓｉｓ，Ｗａｔｓｏｎら、２００５年）及び異なる癌細胞株（Ｌｉｕ，Ｗａｎｇら、２００７年）でメチル化されることが報告された。これまでのところ、癌でのＮＤＲＧ３及びＮＤＲＧ４の機能は検討されていない。ＮＤＲＧ４遺伝子は、第１６染色体ｑ２１〜ｑ２２．３上に位置し、２６ｋｂにわたり、３つのｃＤＮＡアイソフォーム、ＮＤＲＧ４−Ｂ、ＮＤＲＧ４−Ｂｖａｒ、及びＮＤＲＧ４−Ｈの全配列を包含する１７個のエキソンを含有する。ＮＤＲＧ４  ｍＲＮＡは細胞質中に主に存在する。現在、ＮＤＲＧ４の発現は、ノーザンブロット分析を使用して脳及び心臓で記載されているのみである。ＮＤＲＧ４の分子的キャラクタリゼーション及び神経系のこのタンパク質の役割はラットで主として調査されてきた（Ｎａｋａｄａ，Ｈｏｎｇｏら、２００２年；Ｏｈｋｉ，Ｈｏｎｇｏら、２００２年；Ｍａｅｄａ，Ｈｏｎｇｏら、２０��４年；Ｈｏｎｇｏ，Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６年）。ＮＤＲＧ４タンパク質は、細胞分化及び神経突起形成をもたらすプロセスに関与している可能性がある（Ｏｈｋｉ，Ｈｏｎｇｏら、２００２年）。
【０４１２】
ここで、本発明者らは、ＮＤＲＧ４が正常結腸粘膜で発現され、結腸癌組織中でダウンレギュレートされることを報告する。加えて、ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化、ヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）、及び突然変異性の不活性化を検査した。本発明者らは、ＣＲＣ及び胃腸管の他の腫瘍症で頻繁にメチル化されているものとしてＮＤＲＧ４プロモーターを同定し、ＣＲＣ患者及び対照の便のバイオマーカーとしてのその可能性を調査した。
【０４１３】
材料及び方法
細胞株、研究集団、及び組織
ＣＲＣ細胞株ＨＴ２９、ＳＷ４８０、Ｃａｃｏ２、Ｃｏｌｏ２０５、ＲＫＯ、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ１１６及び、ＳＷ４８０を、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害に続くＮＤＲＧ４の再発現を調査するために、ＨＣＴ１１６及びＲＫＯを１μＭ  ＤＡＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。
【０４１４】
ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化は、結腸直腸癌腫、腺腫、及び対照の十分に特徴づけられたシリーズで調査した（図９）。第１のシリーズは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔの病理学部のアーカイブから遡及的に収集された５０歳を超える患者のホルマリン固定パラフィン包埋ＣＲＣ（ｎ＝９０）からなる。正常組織（ｎ＝７９）及び腺腫組織（ｎ＝６０）が存在する場合、これらの組織もまたこれらの患者から収集した。非特異的腹部の病訴のために内視鏡検査を受けている患者からの組織学的に正常な生検材料（ｎ＝５１）、１０年以内にＣＲＣを発達させなかった患者からの腺腫生検材料（ｎ＝２２）、及び様々な炎症性の腸の状態を有する患者の切除された結腸粘膜（ｎ＝３３）を対照組織として選択した。この最後の群は、クローン病（ｎ＝１）、潰瘍性大腸炎（ｎ＝６）、非特異的炎症（ｎ＝９）、及び憩室炎（ｎ＝１８）を含む。第２の独立したシリーズのＣＲＣ（ｎ＝２００）は、詳細に別記されている、食事及び癌についての前向きＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ（ＮＬＣＳ）から無作為に選択した（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒａｎｄｔ，Ｇｏｌｄｂｏｈｍら、１９９０年；Ｂｒｉｎｋ，ｄｅ  Ｇｏｅｉｊら、２００３年）。シリーズ特性は補足の表１に示される。加えて、アーカイブホルマリン固定パラフィン包埋皮膚癌組織（ｎ＝８）、腎臓癌組織（ｎ＝１０）、卵巣癌組織（ｎ＝１０）、前立腺癌組織（ｎ＝１０）、乳癌組織（ｎ＝１５）、胃の癌組織（ｎ＝２２）、及び食道癌組織（ｎ＝２８）をＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化について分析した。本研究は、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＭＥＣ）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔによって承認された。
【０４１５】
【表４５】
2015154775.tif 000056
【０４１６】
組織及び細胞株からのＤＮＡ単離
各組織ブロックの５μｍ切片は、病理学者によって、ヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色され、再分類された（ＡｄＢ）。２０μｍの５つの切片をＤＮＡ単離に先立って脱パラフィンした。ＤＮＡは、メーカー説明書に従ってピュアジーン（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）（登録商標）ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、これらの組織試料及び細胞株から抽出した。手短に言えば、細胞溶解溶液及びプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）を組織試料に添加し、５５℃で一晩インキュベートした。その後に、ＤＮＡを３７℃で７２時間抽出し、タンパク質を取り除き、ＤＮＡを、１００％  ２−プロパノールを使用して沈澱した。最後に、ＤＮＡを水和バッファー中で再水和した。
【０４１７】
糞便ＤＮＡの収集及び調製
結腸内視鏡検査法陰性対照便試料（ｎ＝６７）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔでの職場ベースのコミュニティーのＣＲＣスクリーニング研究の構成内でスクリーニングされている５０歳を超える健常対象の集団から得た。Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＭＥＣ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、及びＤｕｔｃｈ  ‘Ｗｅｔ  ｏｐ  Ｂｅｖｏｌｋｉｎｇｓｏｎｄｅｒｚｏｅｋ’（ＷＢＯ）はこのスクリーニング研究を承認している。すべてのＣＲＣステージを包含する、結腸内視鏡検査法で確証したＣＲＣ患者（ｎ＝２１）からの便試料は、ＡｍｓｔｅｒｄａｍのＦｒｅｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで収集した。ヒトＤＮＡの回収については、全便試料を、７過剰容量の便ホモジナイゼーションバッファー中でホモジナイズし（Ｅｘａｃｔ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、４ｇの便の等価物をそれぞれ含有する３２ｍｌの部分に等分した。単一のアリコートを遠心分離し、上清を、３７℃で６０分間、ＲＮアーゼＡ１ｍｌ当たり８０ユニットと共にインキュベートした。次いで、全ＤＮＡを、酢酸ナトリウムイソプロパノール（ＰＨ  ５．２）を使用して沈澱し、７０％エタノールを用いて洗浄し、４ｍｌ  １×ＴＥ（ｐＨ７．４）中で再懸濁させた。４００μｌ  １０×バッファー（２４０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、７５０ｍＭ  ＮａＣ）、４００μｌ  １０％ＳＤＳ、及び２０μｌプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、試料は、一定の振盪で４８℃で一晩インキュベートし、翌日に遠心分離した。加えて、５ｍｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールを添加し、試料を、遠心分離の前にＲＴで１０分間インキュベートした。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出を繰り返し、その後に水層を新たなチューブに移動し、ＤＮＡを沈澱し、洗浄し、ペレットは、２ｍｌのＬｏＴＥ（ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。
【０４１８】
重亜硫酸ナトリウム変換、メチル化特異的ＰＣＲ、及び重亜硫酸ナトリウム配列決定
５００ｎｇゲノムＤＮＡの重亜硫酸ナトリウム修飾は、メーカーの説明書に従って、ＥＺ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎメチル化キット（ＺＹＭＯ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏ．、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を使用して行った。細胞株及びホルマリン固定パラフィン包埋組織から回収された重亜硫酸塩処理ＤＮＡについてのＮＤＲＧ４  ＭＳＰ分析は、重亜硫酸塩修飾ＤＮＡを増幅するが、メチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡを識別しないフランキングＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡを最初に増幅することによって促進した。このＰＣＲ産物は、ＭＳＰ反応のための鋳型として使用した（Ｈｅｒｍａｎ，Ｇｒａｆｆら、１９９６年；ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌａｎｄ，Ｗｅｉｊｅｎｂｅｒｇら、２００３年）。フランクプライマー、ＭＳＰプライマー、及びＰＣＲ条件を表２にリストする（上記を参照されたい）。ＰＣＲはすべて、非メチル化ＤＮＡ（正常なリンパ球からのＤＮＡ）の対照、メチル化ＤＮＡ（ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてインビトロで処理された正常なリンパ球ＤＮＡ）の対照、及びＤＮＡを有していない対照を用いて行った。１０μｌの各ＭＳＰ反応物を、２％アガロースゲル上に直接装填し、ＵＶ照明下で視覚化した。重亜硫酸ナトリウム変換ＤＮＡの配列決定については、ＰＣＲ産物を増幅し、ＴＯＰＯ−ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｒｅｄａ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してクローニングした。単一コロニーを選び、自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して配列決定した。使用したプライマー配列は配列番号５７０  ５’−ＧＡＴＹＧＧＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴ−３’（センスプライマー）及び配列番号６  ５’−ＣＲＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣ−３’（アンチセンスプライマー）である。
【０４１９】
定量的ＭＳＰ
定量的リアルタイムＭＳＰは、７９００ＨＴ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。２．４μｌの修飾ＤＮＡ（２．５μｇ非変換ＤＮＡと等価）を、バッファー（１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、ｄＮＴＰ（５ｍＭ）、フォワードプライマー（６ｎｇ）、リバースプライマー（１８ｎｇ）、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ（０．１６μＭ）、ＢＳＡ（０．１μｇ）、及びＪｕｍｐｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（０．４ユニット；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＣＲミックス（全容量１２μｌ）に添加した。ＰＣＲプログラムは以下の通りとした：５分間９５℃、その後、３０秒間９５℃、３０秒間５７℃、及び３０秒間７２℃の４５サイクル、その後、５分間７２℃。使用したプライマー配列は、配列番号１７  ５’−ＧＴＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣ−３’（フォワードプライマー）、配列番号１８  ５’−ＡＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣ−３’（リバースプライマー）、及び配列番号１９  ５’−ＦＡＭ−ＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＣＧＡＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＧ−３’−ＤＡＢＣＹＬ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）である。標準曲線に対する未知試料のＣｔ値の補間によって、未知試料のコピー数を決定するために、標準曲線（２×１０６−２０コピー）を含めた。
【０４２０】
ヘテロ接合性の損失分析
対立遺伝子状態は、多型マイクロサテライト座の側面に位置する特異的なプライマー対を用いてＰＣＲ増幅によって分析した。１６ｑ２１〜２２に位置する蛍光色素標識マイクロサテライトマーカーＤＳ１６Ｓ３０８９（フォワードプライマー：配列番号５２６  ＡＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡ；リバースプライマー：配列番号５２７  ＴＧＴＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＣＣＡＡ）及びＤＳ１６Ｓ３０７１（フォワードプライマー：配列番号５２８  ＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＴＧ；リバースプライマー：配列番号５２９  ＴＧＧＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＴ）はゲノム公共データベースから選択した。ＤＳ１６Ｓ３０８９は、ＮＤＲＧ４の１．９Ｍｂ下流に位置し、ＤＳ１６Ｓ３０７１は、ＮＤＲＧ４の１．８Ｍｂ上流に位置する。対応する腫瘍／正常ＤＮＡ試料を、鋳型として５０ｎｇ  ＤＮＡを使用して、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．３μＭプライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．０４ユニット  Ｔａｑポリメラーゼ（プラチナ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１５μｌ容量でＰＣＲによって増幅した。反応混合物を、９５℃での３分間の変性並びに１分間９５℃、１分間６０℃アニーリング温度、及び１分間７２℃の３０サイクル、その後、１０分間７２℃での最終伸長ステップにかけた。ＰＣＲ産物は、自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して配列決定し、Ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒソフトウェアバージョン４．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。２つの異なるサイズ、つまりヘテロ接合性ＭＳ対立遺伝子を実証する遺伝子型のみを、対立遺伝子状態を評価するために使用した。対立遺伝子の比は、腫瘍（Ｔ）対立遺伝子対正常（Ｎ）対立遺伝子の面積値の比についての（Ｎ１／Ｎ２）／（Ｔ１／Ｔ２）として計算した。ＬＯＨは、１．３５を超える及び０．６７未満の対立遺伝子の比として定義した。
【０４２１】
突然変異分析
エキソン及びそれらのフランキングイントロン領域をコードするＮＤＲＧ４は、パラフィン包埋結腸腺癌組織から抽出したゲノムＤＮＡを使用して個々に増幅した。突然変異分析は、ネステッドＰＣＲアプローチを使用して検査した。外部ＰＣＲは、１２５ｎｇゲノムＤＮＡ、５０  ｐｍｏｌの各フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに１ユニットのＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＤＮＡ増幅は、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆａｓｔ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用してサーマルサイクラー上で行い、３分間、９５℃での最初の変性ステップから始めて、その後、３０秒間の９５℃での変性、３０秒間の、各プライマーに特異的な温度を用いるアニーリング、及び３０秒間の７２℃での伸長の３５サイクルを続けた。５分間の７２℃でのさらなる最終的な伸長を添加した。外部ＰＣＲに続いて、内部ＰＣＲは、外部ＰＣＲと同じ条件を使用して行った。イントロン−エキソン境界域を含む、各エキソンについてのＰＣＲプライマーセットは補足の表３に詳細に提供する。ＤＮＡは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して精製した。ＰＣＲ産物は、ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを使用して増幅し、増幅した産物は、ＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して配列決定した。
【０４２２】
【表４６】
2015154775.tif 000057
【０４２３】
定量的逆転写酵素ＰＣＲ
細胞株、正常な粘膜、及び腫瘍組織からの全ＲＮＡは、メーカー説明書に従ってＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。可能性として考えられるゲノムＤＮＡの混入は、ＲＮアーゼなしのＤＮアーゼセット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮアーゼ処理によって取り除いた。Ｉｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するｃＤＮＡ合成を行った。定量的リアルタイム（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックスを使用して行った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｉｅｕｗｅｋｅｒｋ  ａ／ｄ  ＩＪｓｓｅｌ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲミックスは、反応当たり、１×ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、４００ｎＭの、フォワードプライマー（配列番号３  ５’−ＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＧＴＡＧＴＧＡＴＣＣＧ−３’）及びリバースプライマー（配列番号４  ５’−ＧＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＴＣＣＴＣＧ−３’）、並びに３０ｎｇ全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡから構成された。標準的な対照として、シクロフィリンＡを標的とするプライマーを使用した。反応は、６０℃のＴｍで４０サイクル、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実行した。比較Ｃｔ法は、ｍＲＮＡ発現の差異を計算するために使用した。そのために、各試料のＣｔ値は参照遺伝子に正規化した（［デルタ］Ｃｔ＝Ｃｔ，試料−Ｃｔ，シクロフィリン）。次に、発現の、差異の倍数は、［デルタ］［デルタ］Ｃｔ＝［デルタ］Ｃｔ，試料−［デルタ］Ｃｔ，対照を用いて、２−［デルタ］［デルタ］Ｃｔとして計算した。
【０４２４】
免疫組織化学
免疫組織化学は、正常結腸粘膜及びＣＲＣ組織のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（５μｍ）で行った。切片は、キシレン中で脱パラフィンし、再水和し、内在性ペルオキシダーゼを不活性化するために３０分間、１％メタノールと共にインキュベートした。ブロッキングの後に、切片は、０．１％Ｔｗｅｅｎ及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＴｒｉｓバッファー生理食塩水（ＴＢＳ）中で１：６０００希釈したＮＤＲＧ４モノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて染色し、６０分間インキュベートした。切片は、二次抗体ポリ−ＨＲＰ−ＧＡＭ／Ｒ／Ｒ  ＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ、Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートし、染色は、ＤＡＢ基質色素原（Ｄａｋｏ）を使用して褐色の沈澱物として視覚化し、その後、ヘマトキシリン対比染色を続けた。一次抗体なしでインキュベートした切片は陰性対照として果たした。
【０４２５】
データ分析
本発明者らは、ノンパラメトリックデータ及びカテゴリーデータをそれぞれ比較するために、適宜、Ｐｅａｒｓｏｎのχ２検定若しくはＦｉｓｈｅｒの直接確率検定及び一元配置ＡＮＯＶＡ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、又はＭａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ検定を使用した。症例の群内の対になった試料は、ノンパラメトリックデータ及びカテゴリーデータをそれぞれ比較するために、ＭｃＮｅｍａｒ検定及び対応のあるｔ検定を使用して分析した。年齢及び異なる組織の位置の有意差がＣＲＣ症例及び対照の間で観察されたので、ロジスティック回帰分析は、年齢及び組織の位置について調整したカテゴリーデータを比較するために使用した。示すｐ値はすべて両側であり、ｐ値０．０５以下は統計的に有意であると考えられた。統計的検定はすべて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用して多重比較のために修正した。データ分析はＳＰＳＳソフトウェア（バージョン１２．０．１）を使用して行った。
【０４２６】
結果
ＣＲＣ細胞株中でのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化及び発現
ＮＤＲＧ４遺伝子の構造物は、図１０に示されるように、転写開始部位に相対的な−５５６〜＋８６９に位置する高密度なＣｐＧアイランド（ＧＣ含量＞６０％、観察されたＣｐＧ／予想されるＣｐＧの比＞０．６、並びに最小長２００ｂｐ（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ及びＦｒｏｍｍｅｒ  １９８７年））を示す。可能性として考えられるメチル化についてこの領域をアッセイするために、本発明者らは、ＣｐＧアイランドの重複する断片を増幅する２つの異なるＭＳＰプライマー対（１及び２）を設計した。これらのプライマーはＤＮＡメチル化について８つのＣＲＣ細胞株（ＬＳ１７４、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＲＫＯ、ＣＡＣＯ２、ＣＯＬＯ２、ＳＷ４８、及びＳＷ４８０）を調査するために最初に使用した。図１１ａに示されるように、両方のプライマー対を使用するＭＳＰによって分析されるように、ＳＷ４８０以外の細胞株がすべてメチル化されていた。ＣｐＧアイランドメチル化のパターンをさらに調査するために、本発明者らは、ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０の重亜硫酸ナトリウム配列決定を行った。３９個のＣｐＧ部位にわたるプロモーター領域は、重亜硫酸ナトリウム修飾ゲノムＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ増幅し、各細胞株の６つのクローンを配列決定した。ＨＣＴ１１６が、図１１ｂに表されるように３９個の部位でほぼ完全なメチル化を示したのに対して、ＳＷ４８０はメチル化ＣｐＧ部位をほとんど示さなかった点で、重亜硫酸塩配列決定はＭＳＰデータを確証した。ＣＲＣ細胞株ＨＣＴ１１６及びＲＫＯの内在性ＮＤＲＧ４  ｍＲＮＡレベルは、ＤＡＣを用いる処理の後に有意に増加した（図１１ｃ）。
【０４２７】
正常組織及びＣＲＣ組織中のＮＤＲＧ４のメチル化
ＮＤＲＧ４のメチル化は、重亜硫酸ナトリウム配列決定によって、３対の原発腫瘍及び対応する正常な結腸粘膜で確証された。図１２ａに表す結果は、３つの腫瘍試料の高密度なメチル化を示すが、正常結腸粘膜でメチル化はほとんど観察されなかった。興味深いことには、メチル化の密度は、図１２ａに示されるように、より下流領域と比較した場合、ＮＤＲＧ４  ＣｐＧアイランドの上流領域でより高かった。
【０４２８】
その後に、ＮＤＲＧ４のメチル化状態は、２つの異なるプライマー対（１及び２）を使用して、結腸直腸癌腫、結腸直腸腺腫、及び正常な結腸直腸粘膜で調査した。両方のプライマー対を使用するメチル化頻度を表４７に表す。有意差（表４７、ｐ＝０．０４２  １０−７）は、プライマー対２を使用して、ＣＲＣ患者の癌組織（７１／８３（８６％））と比較して、対照群の正常な粘膜のメチル化頻度（２／４８（４％））で観察された。加えて、本発明者らは、ＣＲＣ患者の、隣接した正常な粘膜組織（９／７８（１２％））及び非癌患者の正常な粘膜（２／４８（４％））のＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化を比較したが、これらの２つの群の間で有意差は認められなかった（表４７）。そのうえ、前悪性病変でのＮＤＲＧ４のメチル化を調査するために、本発明者らは、同期的に又は異時性に腫瘍に発達した、ＣＲＣ患者から得られた腺腫及び１０年間の経過観察の後にＣＲＣを発達しなかった患者から得られた腺腫を比較した。本発明者らは、ＣＲＣ患者からの腺腫中でのより高い蔓延性のＮＤＲＧ４のメチル化を観察したが、これらの差異は統計的有意差に達しなかった（表４７）。
【０４２９】
【表４７】
2015154775.tif 000058
【０４３０】
ＣＲＣのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化の高い蔓延性を確証するために、本発明者らは、第２の独立したシリーズの１８３個のＣＲＣ試料を分析した。第１の研究のシリーズの結果に匹敵して、本発明者らは、ＣＲＣ患者の７０％（１２７／１８３）がＮＤＲＧ４メチル化を呈したことを観察した。
【０４３１】
ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化に関する、原発ＣＲＣを有する患者の臨床病理学的な特徴のさらなる分析は、プライマー２を使用する両方の独立したシリーズについて、診断時の年齢、性別、腫瘍の位置、又はＴＮＭステージとのあらゆる関連性を明らかにしなかった（表４９）。
【０４３２】
癌進行の間のＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化を調査するために、本発明者らは、３つの組織すべてが入手可能であった患者の正常な粘膜から腺腫組織及び癌腫組織までのメチル化の頻度を比較した（表４８）。本発明者らの結果は、ＮＤＲＧ４が、腫瘍に隣接した正常な粘膜（１６％）と比較して、癌腫（８４％）中で有意に（表４８、ｐ＜０．０２  １０−２）より頻繁にメチル化されていることを示す。癌腫に加えて、ＣＲＣ患者からの腺腫試料もまた、正常な結腸試料（１４％）と比較して、有意に（表４８、ｐ＜０．０３  １０−３）より高いＮＤＲＧ４メチル化頻度（６１％）を示す。最後に、ＮＤＲＧ４メチル化は、腺腫試料（６３％）と比較して、癌腫組織（８１％）中で増加したが、この増強は有意ではなかった（プライマー対２、表４８）。
【０４３３】
【表４８】
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【０４３４】
異なるシリーズは、図１０に表されるように、ＣｐＧアイランドの重複する断片を増幅する２つの異なるプライマー対１及び２を使用して分析した。プライマー対１を使用すると、本発明者らは、プライマー対２と比較して全体的に同じ結果を観察したが、本発明者らは、プライマー対１と比較して、プライマー対２を使用するすべての亜群についてＮＤＲＧ４メチル化が増加していることを見出した。興味深いことには、本発明者らは、プライマー対２を使用して観察されなかった、癌腫（５５／７７（７１％））と比較したＣＲＣ患者の腺腫（５５／７７（４１％））中のプロモーターのメチル化の有意差（表２、ｐ＝０．０１２）を見出した。加えて、同期的に又は異時性に腫瘍に発達した、ＣＲＣ患者から得られた腺腫（２４／５８（４１％））及びＣＲＣを発達しなかった患者から得られた腺腫（４／３１（１３％））のＮＤＲＧ４メチル化状態を比較すると、本発明者らは、プライマー対１を使用して、ＣＲＣ患者からの腺腫のＮＤＲＧ４メチル化の非常に大きな増加を観察したが、これらの差異もまた統計的有意差に達しなかった。両方の独立したシリーズについてのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化に関する、原発ＣＲＣを有する患者の臨床病理学的な特徴のさらなる分析は、診断時の年齢、性別、又はＴＮＭステージとの関連性を明らかにしなかった。しかしながら、本発明者らは、プライマー対１を使用して、プロモーターメチル化及び腫瘍の位置の間に有意な相関関係を見出した（表４９、ｐ＝０．０３４）。
【０４３５】
【表４９】
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【０４３６】
他の腫瘍症のＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化
次に、本発明者らは、ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化が他の腫瘍組織中に存在するかどうかを調べた。そのため、７つの異なる腫瘍の種類を包含する１１９個の原発腫瘍被検物をＭＳＰプライマー対２を使用して分析した。メチル化は、皮膚癌腫（０／８、０％）、腎臓癌腫（１／１０、１０％）、卵巣癌腫（０／２０、０％）、前立腺癌腫（０／１０、０％）、及び乳癌腫（小葉（０／７、０％）及び腺管（０／９、０％））中でほとんど又はまったく認められなかった。対照的に、ＮＤＲＧ４プロモーターは、食道の腺癌（１３／１６、８１％）中で頻繁にメチル化されていたが、メチル化は、食道扁平上皮癌（０／１２、０％）中では認められなかった。胃のびまん型癌腫（８／１１、７３％）及び腸管型癌腫（９／１１、８２％）の両方は頻繁にメチル化されていたが、胃の正常な粘膜はいかなるメチル化も示さなかった（０／５、０％）。
【０４３７】
糞便ＤＮＡのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化
ＣＲＣのＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化の高い蔓延性及び正常結腸粘膜中のメチル化の不在は、ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化はＣＲＣの非侵襲的検出にとって感度のよい特異的なバイオマーカーとなり得ることを示唆する。そのため、本発明者らは、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ技術を使用して定量的ＭＳＰアッセイを開発し、２１人のＣＲＣ患者及び６７人の健常対照の糞便ＤＮＡを分析した。ＮＤＧＲ４プロモーターのメチル化は、１６／２１のＣＲＣ患者で検出することができ、ＣＲＣの検出について７６％の感度をもたらした。わずか２／６７（３％）の健常対照のみがＮＤＲＧ４メチル化について、試験で陽性となり、これは、９７％の、アッセイについての臨床上の特異性をもたらした。便試料は、異なるＴＮＭステージをすべて包含するＣＲＣ患者から得られた。アッセイは、早期ステージの結腸癌（ステージＩ及びＩＩ）を有するＣＲＣ患者の間で７５％の感度を有し、後期ステージの患者（ステージＩＩＩ及びＩＶ）の間で８０％の感度を有した。
【０４３８】
ＮＤＲＧ４  ＲＮＡ及びタンパク質発現
ＮＤＲＧ４のプロモーターＣｐＧアイランドのメチル化が遺伝子サイレンシングと関連するかどうかを分析するために、本発明者らは、ＣＲＣ細胞株、３対のＣＲＣ組織及び対応する正常結腸粘膜中のＮＤＲＧ４のｍＲＮＡ発現を調査した。３つのすべてのＣＲＣで、ｍＲＮＡレベルは、正常結腸粘膜と比較した場合、有意にダウンレギュレートされた（それぞれ９７、７０％、及び９８％）（図１２ｂ）。
【０４３９】
正常結腸粘膜及び結腸癌の両方でのＮＤＲＧ４のタンパク質発現を調査するために、本発明者らはＮＤＲＧ４免疫組織化学的検査を行い、正常結腸粘膜の細胞質中のＮＤＲＧ４タンパク質発現の存在を実証したが、タンパク質発現はＣＲＣの半分で失われている（図１２ｃ）。その後に、本発明者らは、１９個のＣＲＣ試料についてＮＤＲＧ４発現の免疫組織化学的分析を行った。これらの患者の１１人はメチル化ＮＤＲＧ４プロモーターを有した。しかしながら、本発明者らは、ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化及びＮＤＲＧ４発現の間に有意な関連性を見出すことができなかった（データ示さず）。この観察は、他のメカニズムがＮＤＲＧ４不活性化をもたらす可能性があることを示唆する。
【０４４０】
ＣＲＣのＮＤＲＧ４遺伝子のヘテロ接合性の損失及び突然変異分析
８６人のＣＲＣ患者のマクロダイセクションＣＲＣ組織及び対応する正常組織をマイクロサテライトマーカーＤＳ１６Ｓ３０８９及びＤＳ１６Ｓ３０７１を使用して分析した。２つのマーカーは、７７．４％及び３５．４％のヘテロ接合性をそれぞれ示した。これらのうち、５９の症例が情報価値のあるものであった。１８個の腫瘍（３０．５％）が、第１６染色体ｑ上の少なくとも１つのマーカーでＬＯＨを示した。
【０４４１】
１２個の原発ＣＲＣ並びにＣＲＣ細胞株ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０をＮＤＲＧ４突然変異について分析した。ＮＤＲＧ４遺伝子のコード領域内の不活性化突然変異は１２個の結腸直腸癌腫中で検出されなかった。しかしながら、本発明者らは、ＳＷ４８０細胞株中で１つの新規な非同義突然変異を見出した（４０６６２Ａ→ＡＧ  Ｉｌｅ６５Ｖａｌ）。突然変異性の分析の一部として、２つの以前に報告されたＳＮＰ（ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベース）を検出した。第１のＳＮＰは１／１２のＣＲＣ患者で観察された（４３７６０Ｇ→ＧＧ  Ｖａｌ２２４Ｖａｌ  ｒｅｆＳＮＰ  ｒｓ  １７８２１５４３）。第２のＳＮＰは９／１２のＣＲＣ患者で観察された（４８３１１Ａ→ＡＧ  Ｓｅｒ３５４Ｓｅｒ  ｒｅｆＳＮＰ  ｒｓ  ４２９４５）。
【０４４２】
考察
小さな良性の結腸直腸腺腫からより大きくより形成異常の病変までのＣＲＣの進行は数十年間かかり、早期ステージの同定はこの疾患の管理及び治療を改良すると思われる（Ｂｒｅｎｎｅｒ及びＲｅｎｎｅｒｔ  ２００５年）。結腸鏡検査法は、現在、５０歳以降のＣＲＣ又はその前駆病変の検出のための最も好都合な技術となっている。結腸鏡検査法に対する予選択としての、便潜血の存在についての試験（ＦＯＢＴ）は、有効性が証明されている唯一の非侵襲的スクリーニング方法であり、プログラムで使用された場合に、ＣＲＣからの死亡の発生及びその危険性の両方を低下させる。
【０４４３】
しかしながら、ＦＯＢＴの感度及び特異性の両方は低く、そのため、より感度のよい、より特異的な非侵襲的スクリーニング試験の緊急の必要性がある。有望な選択肢は、血液及び組織中のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質などの癌特異的分子（の発現）を分析することである。遺伝的変化を検出する第１の試みは有望である（Ｄｏｎｇ，Ｔｒａｖｅｒｓｏら、２００１年；Ｔｒａｖｅｒｓｏ，Ｓｈｕｂｅｒら、２００２年）が、なお改良を必要とする。好ましいマーカーは、ＴＰ５３、Ｋ−ｒａｓ、及びＡＰＣ突然変異並びに加えてＢＡＴ−２６不安定性及び長いＤＮＡ（上皮の結腸細胞の非アポトーシス脱落についてのマーカー）であった。最近では、ＣｐＧアイランド過剰メチル化もまた、異なる生物学的試料中でのＣＲＣの非侵襲的検出のために（予後）マーカーとして使用することができる（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  ２００３年；Ｃｈｅｎ，Ｈａｎら、２００５年；Ｅｂｅｒｔ，Ｍｏｄｅｌら、２００６年）。過去数年間、いくつかの遺伝子が、異なる技術を使用して、ＣＲＣでメチル化されることが記載されてきた。
【０４４４】
ここで、本発明者らは、結腸直腸癌及び他の胃腸癌の早期検出のためのバイオマーカーとしてＮＤＲＧ４を分析するためのＭＳＰ、定量的ＭＳＰ、及び重亜硫酸塩配列決定を使用した。（ＡＲＲＡＹ）ＮＤＲＧ４プロモーターＣｐＧアイランドは、ＣＲＣ症例の２つの独立した大きなシリーズでメチル化されることが実証された。第１のシリーズでは、本発明者らは、ＣＲＣ患者からの正常な粘膜が腫瘍と同じ腸セグメント内に位置しており、悪性細胞が混入し得る又は電界効果が、ＭＧＭＴについて記載の通り、この細胞の分子的サインを変化させることができたので、非癌患者の正常な粘膜を含めた（ｉｓｓａ、２００５年）。しかしながら、統計分析を行うことによって、本発明者らは、これらの２つの群の間にメチル化の有意ないかなる差異をも見出すことができなかった。慢性炎症は、以前に、正常組織のＤＮＡメチル化を加速することが示された（Ｉｓｓａ，Ａｂｕｊａら、２００１年）。そのため、炎症結腸粘膜を用いるさらなるスクリーニングがスクリーニングセットで期待される。本発明者らの研究集団では、対照患者の正常な粘膜に炎症粘膜を含ませると、ＮＤＲＧ４の特異性が９６％から９４％にわずかに低下した。本発明者らは、重亜硫酸塩配列決定によって、ＮＤＲＧ４のプロモーターエリア中のメチル化の密度の差異を見出したので、本発明者らは、２つの異なるプライマーセットを使用して、ＮＤＲＧ４のメチル化状態を調査した。興味深いことには、プライマー対２を使用して、本発明者らは、癌腫組織中で８６％のメチル化を見出したが、わずか７１％しかプライマー対１の使用によって観察されなかった。プライマー対２を使用するメチル化の検出のこの増加は、表４７に示されるように、このシリーズのすべての亜群について観察された。プライマー対２は、遺伝子のより５’領域に位置している。メチル化の頻度は転写開始部位の近くでより低かった。本発明者らは、ＲＵＮＸ３についても観察されたように、ＮＤＲＧ４過剰メチル化が、ＮＤＲＧ４  ＣｐＧアイランドの５’端に最初に生じ、ＮＤＲＧ４  ｍＲＮＡ発現を最終的にシャットダウンする前に転写開始部位に向けて広がる仮説を立てる（Ｔｕｒｋｅｙ  ２００２年；Ｈｏｍｍａ，Ｔａｍｕｒａら、２００６年）。加えて、本発明者らは、ＣＲＣの群内の腺腫組織及び癌腫組織の間で、プライマー対１を使用して、メチル化頻度で有意差（ｐ＝０．０１２）を見出した。そのため、本発明者らは、ＮＤＲＧ４のプロモーターエリアのＤＮＡメチル化の転写開始部位に向けての広がりが癌進行の間に生じると推測した。
【０４４５】
注目すべきことには、プライマー対１を使用すると、過剰メチル化は、ＣＲＣ患者の非進行性腺腫（１３％）と比較した場合、ＣＲＣ患者からの進行性腺腫中でより頻繁に存在した（４１％）。進行しないであろう腺腫と癌に進行する腺腫を区別する能力はＣＲＣスクリーニングにとって非常に重要である（Ｈｅｒｍｓｅｎ，Ｐｏｓｔｍａら、２００２年）。この差異を肉眼で見えるようにすることができないのに対して、腺腫をすべて検出し、取り除くことを目的とする内視鏡的なスクリーニング戦略は本質的に具体化されていないであろう。取り除かれた大多数の腺腫は、これらの良性の前駆病変のわずかなパーセンテージのみが癌腫に進行するので、癌に進行しないと思われる（Ｌｅｎｇａｕｅｒ，Ｋｉｎｚｌｅｒら、１９９８年）。これらのデータは、腺腫組織中（本発明者らが調査した領域中）のＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化が結腸腫瘍を発達させる、可能性として考えられる危険因子であることを示す可能性がある。
【０４４６】
最近では、血液、尿、又は便などの体液中でプロモーターのメチル化を検出することができることが報告され、ＣＲＣを含む様々な癌の早期診断を可能にする可能性がある。いくつかの研究は、糞便ＤＮＡメチル化検出のためのスクリーニング方法として１つの遺伝子プロモーターのメチル化を使用することができることを示した。例えば、ＳＦＲ２、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、及びＨＩＣ１のプロモーターのメチル化は、それぞれ７７％、４３％、及び４２％の感度並びにそれぞれ７７％、９０％、及び９５％の特異性で、ＣＲＣ患者の糞便ＤＮＡ中で検出することができる（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｏｂｅｒｗａｌｄｅｒら、２００４年；Ｃｈｅｎ，Ｈａｎら、２００５年；Ｌｅｎｈａｒｄ，Ｂｏｍｍｅｒら、２００５年）。単一マーカーとしての糞便ＤＮＡのＮＤＲＧ４のメチル化は、７６％の感度及び９７％の特異性で癌と対照を見分けることができる。
【０４４７】
ＣＲＣについての特異的なバイオマーカーとするために、組織特異性の分析を行い、本発明者らは、胃腸管の他の腫瘍、即ち食道癌及び胃癌中にＮＤＲＧ４のメチル化を見出した。このデータは、ＮＤＲＧ４のメチル化が、同様に、他の胃腸腫瘍についてのマーカーとして果たす可能性があることを示す。
【０４４８】
本発明者らは、次に、ＮＤＲＧ４のメチル化が、ＮＤＲＧ４  ＲＮＡ及びタンパク質発現のダウンレギュレーションと関連するかどうかを研究した。これまでのところ、ＮＤＲＧ４の発現は、ノーザンブロッティングの使用によって脳及び心臓で立証されているのみである。本発明者らは、正常な結腸組織中でのＮＤＲＧ４の発現及び３つの腫瘍組織すべてでのダウンレギュレーションを観察した。その後に、本発明者らは、パラフィン包埋組織が入手可能であったＣＲＣ患者からの１９個のＣＲＣ試料についてのＮＤＲＧ４発現の免疫組織化学的分析を行った。これらの患者の１１人はメチル化ＮＤＲＧ４プロモーターを有した。しかしながら、本発明者らは、ＮＤＲＧ４プロモーターのメチル化及びＮＤＲＧ４発現の間の有意な関連性を見出すことができなかった。いくつかの腫瘍はメチル化ＮＤＲＧ４プロモーターを有したが、なおＮＤＲＧ４タンパク質を発現した。本発明者らがＭＳＰを使用して検出したメチル化は、ほんの少数の癌細胞のメチル化又は２つのＮＤＲＧ４対立遺伝子のうちの一方のみのメチル化（及び他方でのメチル化の不在）を反映する可能性がある。しかしながら、いくつかの腫瘍はＮＤＲＧ４タンパク質の発現を欠くが、プロモーターメチル化は観察されなかった。この観察は、他のメカニズムがＮＤＲＧ４不活性化をもたらす可能性があることを示唆する。突然変異は認められず、ＮＤＲＧ４遺伝子の突然変異性の不活性化が、ＣＲＣで主要な役割を果たさない可能性があることを示す。本発明者らの結果は、ＮＤＲＧ４突然変異研究についての従来のデータを確証した（Ｓｊｏｂｌｏｍ，Ｊｏｎｅｓら、２００６年）。しかしながら、１６ｑのＬＯＨはＣＲＣ症例の約３０％で見られる。１６ｑの頻繁なＬＯＨは、乳腫瘍（Ｒａｋｈａ，Ｇｒｅｅｎら、２００６年）、肝臓腫瘍（Ｓａｋａｉ，Ｎａｇａｈａｒａら、１９９２年；Ｂａｎｄｏ，Ｎａｇａｉら、２０００年）、前立腺腫瘍（Ｅｌｏ，Ｈａｒｋｏｎｅｎら、１９９７年）、卵巣腫瘍（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓｔａｕｂら、１９９９年）、及びウィルムス腫瘍（Ｍａｓｏｎ，Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗら、２０００年）のような種々様々の固形腫瘍の種類で以前に記載されたが、今まで、それはＣＲＣで記載されていない。ＮＤＲＧ４は、正常結腸上皮細胞と比較して、ほとんどの結腸癌細胞中でダウンレギュレートされているので、本発明者らは、ＮＤＲＧ４が癌中で腫瘍抑制機能を有する仮説を立てる。
【０４４９】
結論として、本発明者らは、癌でのＮＤＲＧ４についての役割を記載した第１の群であり、本発明者らのデータは、ＮＤＲＧ４が、それぞれ７６％及び１００％の非常に高度な感度及び特異性を有する、ＣＲＣについての、可能性として考えられる新規なマーカーであることを示す。単独のマーカーとしてのＮＤＲＧ４の感度及び特異性は既に非常に高いが、ＮＤＲＧ４の診断上の正確度は、ＣＲＣを有する患者で同様に分析される他のマーカーの添加によって増強されてもよい。これは、多重パネルメチル化ベース診断試験で癌を有する患者を同定するための能力を増大する可能性がある。
【０４５０】
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【０４５１】
５）ＮＤＲＧ４遺伝子及びＯＳＭＲ遺伝子についてプラスミド材料上で試験したさらなるリアルタイムＭＳＰアッセイ
ＮＤＲＧ４遺伝子及びＯＳＭＲ遺伝子のプロモーター領域に対応するプラスミド材料を、さらなるアッセイの設計について試験するために使用した。標準曲線のためのプラスミドは以下のように生成した：プライマーによって範囲が確定されるプロモーター配列をＰＣＲ増幅し、クローニングする（適した、単離重亜硫酸塩修飾細胞株ＤＮＡを使用）。配列は配列決定によって立証し、公開プロモーター配列と比較する。ＮＤＲＧ４プラスミド材料又はＯＳＭＲプラスミド材料のいずれかの階段希釈物（２×１０６〜２×１０１コピー／５μｌ）を二通り装填した。５μｌのプラスミド希釈液又はバッファー（非鋳型対照）を、以前に記載の通り、明示されるプライマー及びｂｅａｃｏｎ検出配列を含有する２０μｌ  ＰＣＲミックスに添加した。結果は、自動的なベースライン及び閾値のセットを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＳＤＳ  ２．２ソフトウェアを使用して生成した。データはＣｔ値（増幅曲線が、ソフトウェアによって自動的にセットされる閾値と交差するサイクル数）としてエクスポートした。
【０４５２】
ＮＤＲＧ４
２つの異なるＮＤＲＧ４アッセイの設計についての最初のリアルタイム結果を表５０及び５１に提示する。それぞれのアッセイＮＤＲＧ４＿１ａ及びＮＤＲＧ４＿１ｂに使用したプライマー及びｂｅａｃｏｎの組合せは前に記載した。下線１ａ及び１ｂは、ＮＤＲＧ４遺伝子のメチル化状態を評価するために使用した異なるプライマー及び／又はｂｅａｃｏｎの組合せを反映する。ＮＤＲＧ４＿１ａは、好ましいＮＤＲＧ４アッセイの設計に相当し、単にＮＤＲＧ４と呼ばれる（表４を参照されたい）。比較可能な結果が、両方のアッセイの設計について得られた。本発明に提供される臨床試料データは好ましいＮＤＲＧ４アッセイの設計（＝ＮＤＲＧ４＝ＮＤＲＧ４＿１ａ）を使用して生成される。
【０４５３】
【表５０】
2015154775.tif 000061
【０４５４】
【表５１】
2015154775.tif 000062
【０４５５】
ＯＳＭＲ
３つの異なるＯＳＭＲアッセイの設計についての最初のリアルタイム結果を下記の表５２〜５４に提示する。それぞれのアッセイＯＳＭＲ＿１、ＯＳＭＲ＿３［＝ＯＭＳＲ（３）］、及びＯＳＭＲ＿４［＝ＯＳＭＲ（４）］に使用したプライマー及びｂｅａｃｏｎの組合せは前に記載した。下線１、３、及び４は、ＯＳＭＲ遺伝子のメチル化状態を評価するために使用した異なるプライマー及び／又はｂｅａｃｏｎの組合せを反映する。比較可能な結果が、３つすべてのアッセイの設計について得られた。
【０４５６】
【表５２】
2015154775.tif 000063
【０４５７】
【表５３】
2015154775.tif 000064
【０４５８】
【表５４】
2015154775.tif 000065
【０４５９】
６）体液試験試料中のさらなるＣＲＣマーカーの試験及び確認
新たなマーカーの添加：ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＪＡＭ３、ＰＨＡＣＴＲ３、ＴＰＦＩ２、ＳＯＸ１７、及びＳＹＮＥ１（並びにさらにＪＰＨ３便データ）。これらの遺伝子のメチル化状態を決定するための適したプライマー及びプローブは上記の表１２（及び１３〜１８）に記載される。
【０４６０】
方法及び結果
臨床試料
試料はドイツ及びオランダのセンターから収集した。
【０４６１】
【表５５】
2015154775.tif 000066
【０４６２】
【表５６】
2015154775.tif 000067
【０４６３】
臨床試料についてのマーカー試験
実験は、前に記載の通り行った。手短に言えば、ＤＮＡは、便及び／又は血漿から抽出し、その後、重亜硫酸塩処理を続けた。試料は、１２μｌの最終容量で、３８４ウェルプレートを使用してリアルタイムＭＳＰアッセイによって試験した。鋳型容量は、９．６μｌの混合容量で、２．４μｌとする。結果は、ＳＤＳ  ２．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して生成し、Ｃｔ値（増幅曲線が、ソフトウェアによって自動的にセットされる閾値と交差するサイクル数）としてエクスポートした。コピー数は標準曲線を使用して推定する。
【０４６４】
血漿試料及び便試料中の８つの遺伝子アッセイＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、ＪＡＭ３、及びＪＰＨ３の個々の性能を表ＸＶに示す（ＪＰＨ３：便データのみを除く）。血漿及び便についての感度値は、それぞれ３０〜７０％及び０〜５７％の範囲であり、対応する特異性は１００％であった。感度について最適化した場合に、ＴＦＰＩ２について８０％の感度及びＰＨＡＣＴＲ３について５０％の感度が血漿試料中で得られ、対応する特異性は９０％である。いくつかのマーカー（ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、及びＳＯＸ１７）について、結腸直腸癌検出の感度は、便試料と比較して、血漿試料を使用する場合に、より高いことが観察される。
【０４６５】
【表５７】
2015154775.tif 000068
【０４６６】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、本発明の様々な修飾は、本明細書に記載の修飾に加えて、先の説明及び添付の図から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、添付された、請求項の範囲内にあることが意図される。さらに、本明細書に記載の実施形態はすべて、広く適用可能であり、必要に応じて、任意の及び他のすべての一致する実施形態と組合せ可能であると考えられる。
【０４６７】
様々な刊行物が本明細書に引用され、それらの開示はそれらの全体が参照によって組み込まれる。
【図１ａ】
2015154775.tif 000069
【図１ｂ】
2015154775.tif 000070
【図２】
2015154775.tif 000071
【図３ａ】
2015154775.tif 000072
【図４】
2015154775.tif 000073
【図５】
2015154775.tif 000074
【図６】
2015154775.tif 000075
【図７】
2015154775.tif 000076
【図８】
2015154775.tif 000077
【図９】
2015154775.tif 000078
【図１０】
2015154775.tif 000079
【図１１ａ】
2015154775.tif 000080
【図１１ｂ】
2015154775.tif 000081
【図１１ｃ】
2015154775.tif 000082
【図１２ａ】
2015154775.tif 000083
【図１２ｂ】
2015154775.tif 000084
【図１２ｃ】
2015154775.tif 000085
【図３ｂ−１】
2015154775.tif 000086
【図３ｂ】
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【配列表】
2015154775000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月23日(2015.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中で、癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌に対する素因又はその発生を示す方法。
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月24日(2015.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中で、癌に対する素因又はその発生を検出するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌に対する素因又はその発生を示す方法。
【請求項２】
癌は胃腸癌を含み、胃腸癌は、結腸直腸癌、胃癌、胃の癌、及び／又は食道癌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む遺伝子のパネル中のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、パネル中の遺伝子の少なくとも１つのエピジェネティックな変化の検出は、癌に対する素因又はその発生を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ４及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ４及びＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、ＡＰＣ及びＳＦＲＰ２、ＡＰＣ及びＯＳＭＲ、ＡＰＣ及びＧＡＴＡ４、ＡＰＣ及びＮＤＲＧ４、ＭＧＭＴ及びＯＳＭＲ、ＭＧＭＴ及びＧＡＴＡ４、ＭＧＭＴ及びＮＤＲＧ４、ＭＧＭＴ及びＳＦＲＰ２、ＭＧＭＴ及びＡＰＣ、ＳＦＲＰ１及びＭＧＭＴ、ＳＦＲＰ１及びＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１及びＧＡＴＡ４、ＳＦＲＰ１及びＮＤＲＧ４、ＳＦＲＰ１及びＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ１及びＡＰＣ、ＧＡＴＡ５及びＳＦＲＰ１、ＧＡＴＡ５及びＭＧＭＴ、ＧＡＴＡ５及びＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５及びＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ５及びＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５及びＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ５及びＡＰＣ、若しくはＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＮＤＲＧ４を含むか、
（ｂ）遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ及びＳＦＲＰ２、ＧＡＴＡ４、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２及びＡＰＣ、ＳＦＲＰ２、ＯＳＭＲ及びＡＰＣ、若しくはＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２を含むか、
（ｃ）遺伝子のパネルは、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４及びＳＦＲＰ２からなるか、
（ｄ）遺伝子のパネルは、ＮＤＲＧ４、ＯＳＭＲ、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＧＡＴＡ５、ＧＡＴＡ４及びＭＧＭＴを含むか、
（ｅ）遺伝子のパネルは、ＮＤＲＧ４と、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、及びＡＤＡＭ２３から選択される２つの遺伝子とを有する３つの遺伝子のパネルであるか、又は
（ｆ）遺伝子のパネルは、ＯＳＭＲ、ＮＤＲＧ４、ＧＡＴＡ５及びＡＤＡＭ２３からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料は、組織試料及び／又は体液試料を含み、体液試料は糞便試料又は血液試料を含み、組織試料は、結腸試料及び／又は直腸試料及び／又は虫垂試料を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
エピジェネティックな変化はメチル化であり、必要に応じて遺伝子（複数可）のプロモーター領域の過剰メチル化が検出される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー及び／又はプローブから選択されるプライマー及び／又はプローブを利用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料中で、癌、特に胃腸癌の組織病理学的ステージを決定するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、癌の組織病理学的ステージを示す方法。
【請求項９】
腺腫の癌腫への進行を予測する又はモニターするための方法であって、適した試験試料中で、ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４サブファミリー遺伝子のメチル化状態を決定するステップを含み、メチル化のレベルの上昇又は増加は、メチル化のレベルが低い場合よりも、腺腫が癌腫に進行する可能性が高いことを示す方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いて、癌、特に胃腸癌の治療の成功の見込みを予測するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化の検出は、治療の成功の見込みが、エピジェネティックな修飾が検出されない場合よりも高いことを示す方法。
【請求項１１】
癌、特に胃腸癌に適した治療レジメンを選択するための方法であって、ＮＤＲＧ４／ＮＤＲＧ２サブファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＦＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、ＭＧＭＴ、ＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するステップを含み、エピジェネティックな変化を検出することにより、治療のためにＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子が選択され、エピジェネティックな変化が検出されない場合、ＤＮＡ脱メチル化剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子は治療のために選択されない方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法の特徴によってさらに特徴づけられる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ＤＮＡ傷害剤及び／又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害因子及び／又はＨＤＡＣ阻害因子を用いる、癌の治療の成功の見込み及び／又は癌の治療に対する抵抗性の見込みを予測し、
（ｂ）癌に適した治療レジメンを選択し、
（ｃ）癌又は癌に対する素因を診断するためのキットであって、
ＮＤＲＧ２／ＮＤＲＧ４ファミリー遺伝子、ＧＡＴＡ４、ＯＳＭＲ、ＧＡＴＡ５、ＳＥＲＰ１、ＡＤＡＭ２３、ＪＰＨ３、ＳＦＲＰ２、ＡＰＣ、及びＭＧＭＴから選択される少なくとも１つの遺伝子並びに／又はＴＦＰＩ２、ＢＮＩＰ３、ＦＯＸＥ１、ＳＹＮＥ１、ＳＯＸ１７、ＰＨＡＣＴＲ３、及びＪＡＭ３から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を検出するプライマーのセットをその中に含有するキャリアー手段を含むキット。
【請求項１４】
（ａ）試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬、及び／又は
（ｂ）糞便試料を処理するためのホモジナイゼーションバッファー、及び／又は
（ｃ）血液試料又はその誘導体からＤＮＡを単離するのに適したキット、及び／又は血液試料又はその誘導体を安定化する安定剤
をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
血漿試料又は血清試料中で、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するための方法であって、
（ａ）血漿試料又は血清試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために処理された単離ＤＮＡを増幅するステップであって、０．０７〜０．７２ｍｌの血漿試料又は血清試料に相当するＤＮＡが増幅反応当たりに使用されることを特徴とするステップとを含む方法。
【請求項１６】
糞便試料中で、結腸直腸癌に対する素因又はその発生を検出するのに使用するために、糞便試料を処理してＤＮＡを単離し、調製するための方法であって、
（ａ）糞便試料からＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）１回の増幅反応当たり必要とされる、少なくとも２．５μｇの単離ＤＮＡを、試料中に含有されるＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して、検出可能な修飾残基を生成するが、メチル化シトシン残基を修飾しない試薬を用いる処理にさらすステップと、
（ｃ）処理された単離ＤＮＡを増幅するステップとを含む方法。
【請求項１７】
必要に応じてキットとして一緒に提供される、表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプライマー対から選択されるプライマー対、及び／又は表２〜１８に記載のヌクレオチド配列を含むプローブから選択されるプローブ。
【外国語明細書】
2015154775000001.pdf