(57)【要約】      （修正有）【課題】標的遺伝子発現のみを的確に制御し、増殖には必須だが、物質生産と競合する代謝経路を任意のタイミングでオンからオフに制御する人工遺伝子回路の提供。【解決手段】第一のプロモーター領域、第一のプロモーターの制御下にある、酵素をコードする遺伝子領域、第二のプロモーター領域、及び第二のプロモーターの制御下にある第一のリプレッサー領域を含む遺伝子回路であって、第一のリプレッサーにより第一のプロモーターからの転写がオフになり、第二のリプレッサーにより第二のプロモーターからの転写がオフになるものであり、第二のリプレッサーの機能を抑制することにより、前記酵素をコードする遺伝子の発現が抑制され、そして該遺伝子の発現の調節により、宿主細胞の増殖及び／又は目的物質の生産を調節可能である、遺伝子回路。【選択図】図１−１
2015154768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター１領域、プロモーター１の制御下にある遺伝子Ａ領域、プロモーター２領域、およびプロモーター２の制御下にあるリプレッサー１領域を含む遺伝子回路であって；
リプレッサー１によりプロモーター１からの転写がオフになり、リプレッサー２によりプロモーター２からの転写がオフになるものであり；
リプレッサー２の機能を抑制することにより、遺伝子Ａの発現が抑制され；そして
遺伝子Ａの発現の調節により、宿主細胞の増殖および／または目的物質Ｐの生産を調節可能である、遺伝子回路。
【請求項２】
遺伝子Ａが、クエン酸合成酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、F型ATPアーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼI、ホスホグリセリン酸ムターゼIII、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、またはグルコースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子である、[１]に記載の遺伝子回路。
【請求項３】
遺伝子Ａが、gltA(2.3.3.1)、gapA(1.2.1.12)、pykA, pykF(2.7.1.40）、aceE(1.2.4.1)、icd(1.1.1.42)、sucAB(2.3.1.61, 1.2.4.2)、sdhABCD(1.3.5.1, 1.3.5.4)、fumABC (4.2.1.2)、mdh(1.1.1.37)、atpA(3.6.3.14)、gldA(1.1.1.6）、gpmA(5.4.2.11)、gpmM, ytjC(5.4.2.12)、dhaL(2.7.1.29)、またはpgi(5.3.1.9)をコードする遺伝子である、[１]または[２]に記載の遺伝子回路。
【請求項４】
宿主細胞が、工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、またはシアノバクテリア）の細胞、植物細胞または動物細胞であり、細胞内において遺伝子Ａの発現をオン／オフ切り替えするためのものである、請求項３に記載の遺伝子回路。
【請求項５】
目的物質Ｐが、イソプロパノール、1-ブタノール、カダベリン、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、1-プロパノール、1-ペンタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、γ-アミノ酪酸、1,2-プロパンジオール、アスパラギン、リジン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アルギニン、シトルリン、ヒスチジン、フラビン、3-メチル-１-ブタノール、ブタン酸、アジピン酸、Putrescine、Glutaconic acid、4-Hydroxy butyric acid、プロピオン酸、エチレングリコール、エチレン、エリレンオキシド、1,5-pentadiol、3-hydroxyvaleric acid、イタコン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、レオニン、L-セリン、D-セリン、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、オキサロ酢酸、またはエタノールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子回路。
【請求項６】
下記(1)および(2)を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子回路：
(1) プロモーター３領域、プロモーター３の制御下にあるリプレッサー２領域を含む、リプレッサー供給用コンストラクト；および
(2)プロモーター１領域、プロモーター１の制御下にある遺伝子Ａ領域、プロモーター２領域、およびプロモーター２の制御下にあるリプレッサー１領域を含むプラスミド。
【請求項７】
リプレッサー２が、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）により機能を抑制されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子回路。
【請求項８】
リプレッサー１がTetRであり、リプレッサー２がLacIである、請求項１〜７のいずれか１項記載の遺伝子回路。
【請求項９】
上流より、プロモーター２領域、リプレッサー１領域、プロモーター１領域、および遺伝子Ａ領域の順で配置されている、請求項１〜８のいずれか１項記載の遺伝子回路。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子回路が導入されている、目的物質Ｐを産生可能な細胞を準備し；
第１の段階では遺伝子Ａの発現をオンにする条件で細胞を培養し；そして
第２の段階では遺伝子Ａの発現をオフにする条件で細胞を培養する、目的物質Ｐの製造方法。
【請求項１１】
目的物質Ｐを産生可能な細胞が、工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、またはシアノバクテリア）の細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
目的物質Ｐが、イソプロパノール、1-ブタノール、カダベリン、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、1-プロパノール、1-ペンタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、γ-アミノ酪酸、1,2-プロパンジオール、アスパラギン、リジン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アルギニン、シトルリン、ヒスチジン、フラビン、3-メチル-１-ブタノール、ブタン酸、アジピン酸、Putrescine、Glutaconic acid、4-Hydroxy butyric acid、プロピオン酸、エチレングリコール、エチレン、エリレンオキシド、1,5-pentadiol、3-hydroxyvaleric acid、イタコン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、レオニン、L-セリン、D-セリン、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、オキサロ酢酸、またはエタノールである、請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
第１の段階が細胞を増殖させるための期であり、第２の段階が目的物質生産のための期である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な人工遺伝子回路に関する。本発明の人工遺伝子回路は、トグルスイッチを含み、細胞内代謝制御による目的物質の生産性向上のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、物質生産に用いられる微生物の代謝工学的改良は、生産系遺伝子の過剰発現と競合系関連遺伝子の欠損によって行われてきた。生産系遺伝子の過剰発現では、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside、IPTG）などによる生産系遺伝子の発現誘導時期の調節や、プロモーター強度、RBS強度、遺伝子間領域配列などの最適化による発現量調整によって、有毒性の中間代謝物の蓄積や過剰な酵素の発現が菌体増殖に及ぼす悪影響を最小限に抑えて生産性功向上が図られてきた (非特許文献1:Lee at al., 2009)。また、ホスト菌体内在性の代謝物を出発物質として、異種遺伝子を組み合わせて構成される合成代謝経路によって新たに生産可能な化合物が拡大している (非特許文献2:Jang et al., 2012)。一方、ホスト内在性の競合経路の複数削除 (combinatorial disruption)は、培養期間に遺伝子発現制御を行うものではなく、ゲノム上から標的遺伝子を削除する方法で行われ、さまざまな有用化合物生産の生産性向上に寄与してきた (非特許文献3:Clomburg and Gonzalez, 2011; 非特許文献4, 5:Astumi et al., 2008a, 2008b; 非特許文献6:Balzer et al., 2013)。
従来は代謝ネットワークに関する知識と実験的試行錯誤に依存していた改変対象遺伝子の選定であるが、現在は数値解析によって予測・評価する試みも行われ、標的経路の選定技術も発展を見せている (非特許文献7:Matsuda et al., 2011; 非特許文献8:Lee et al., 2005)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Lee, S. Y., Kim, H. U., Park, J. H., Park, J. M., Kim, T. Y., 2009. Metabolic engineering of microorganisms: general strategies and drug production. Drug. Discov. Today. 14, 78-88.
【非特許文献２】Jang, Y.S., Kim, B., Shin, J.H., Choi, Y.J., Choi, S., Song, C.W., Lee, J., Park, H.G., Lee, S.Y., 2012. Bio-based production of C2-C6 platform chemicals. Biotechnol. Bioeng. 109, 2437-2459.
【非特許文献３】Dellomonaco, C., Clomburg, J. M., Miller, E. N., Gonzalez, R., 2011. Engineered reversal of the β-oxidation cycle for the synthesis of fuels and chemicals. Nature 10, 355-359.
【非特許文献４】Atsumi, S., Cann, A. F., Connor, M. R., Shen, C. R., Smith, K. M., Brynildsen, M. P., Chou, K. J., Hanai, T., Liao, J. C., 2008a. Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production. Metab. Eng. 10, 305-311.
【非特許文献５】Atsumi, S., Hanai, T., Liao, JC., 2008b. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. Jan 3;451(7174):86-9.
【非特許文献６】Balzer, G. J., Thakker, C., Bennett, G. N., San, K. Y., 2013. Metabolic engineering of Escherichia coli to minimize byproduct formate and improving succinate productivity through increasing NADH availability by heterologous expression of NAD+-dependent formate dehydrogenase. Metab. Eng. 20, 1-8
【非特許文献７】Matsuda, F., Furusawa, C., Kondo, T., Ishii, J., Shimizu, H., Kondo, A., 2011.  Engineering strategy of yeast metabolism for higher alcohol production. Microb. Cell. Fact. 10, 70.
【非特許文献８】Lee, S. J., Lee, D.Y., Kim, T. Y., Kim, B.H., Lee, J., Lee, S. Y., 2005. Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7880-7887.
【非特許文献９】Luedeking, R., Piret, E. L., 2000. A kinetic study of the lactic acid fermentation. Batch process at controlled pH. Biotechnol. Bioeng. 67, 636-644.
【非特許文献１０】Stricker, J., Cookson, S., Bennett, M. R., Mather, W. H., Tsimring, L. S., Hasty, J., 2008. A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Nature 27, 516-519.
【非特許文献１１】Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J.J., 2000. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature 20, 339-342.
【非特許文献１２】Slusarczyk, A. L., Lin, A., Weiss, R., 2012. Foundations for the design and implementation of synthetic genetic circuits. Nat. Rev. Genet. 18, 406-420.
【非特許文献１３】Zhang, F., Carothers, J. M., Keasling, J. D., 2012. Design of a dynamic sensor-regulator system for production of chemicals and fuels derived from fatty acids. Nat. Biotechnol. 25, 354-359.
【非特許文献１４】Callura, J. M., Cantor, C. R., Collins, J.J., 2012. Genetic switchboard for synthetic biology applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 10, 5850-5855.
【非特許文献１５】Nakamura, C.E., Whited, G.M., 2003. Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol. Curr. Opin. Biotechnol. 14, 454-9.
【非特許文献１６】Hanai, T., Atsumi, S., Liao, J.C., 2007. Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 73, 7814-8. doi:10.1128/AEM.01140-07
【非特許文献１７】Liao, J. C., Chang, P., 2010. Genetically modified microorganisms for producing itaconic acid with high yields. Industrial Technology Research Institute, Assignee. United States patent US 2010/0285546 A1.
【非特許文献１８】Qian, Z. G., Xia, X. X., Lee, S. Y., 2009. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of putrescine: a four carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 104, 651-62.
【非特許文献１９】Qian, Z.G., Xia, X. X., Lee, S. Y., 2010. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: a five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108, 93-103.
【非特許文献２０】Zhang, X., Jantama, K., Moore, J. C., Shanmugam, K. T., Ingram, L. O., 2007. Production of L -alanine by metabolically engineered Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77, 355-366.
【非特許文献２１】Zhou, L., Tian, K.-M., Niu, D.-D., Shen, W., Shi, G.-Y., Singh, S., Wang, Z.-X., 2012. Improvement of D-lactate productivity in recombinant Escherichia coli by coupling production with growth. Biotechnol. Lett. 34, 1123-30. doi:10.1007/s10529-012-0883-x
【非特許文献２２】Jiang, M., Liu, S.W., Ma, J.F., Chen, K.Q., Yu, L., Yue, F.F., Xu, B., Wei, P., 2010. Effect of growth phase feeding strategies on succinate production by metabolically engineered Escherichia coli. Appl
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
競合経路の破壊によって生産性の向上を図る場合、菌体増殖と菌体あたりの物質生産性の積が最大となる遺伝子改変が生産性を最大とする改変方策と評価されるため、競合経路の破壊は菌体増殖への影響が許容される範囲内であることが前提となる(非特許文献9: Luedeking and Piret, 1959)。そのため、理論的には菌体あたりの生産性を最大とするような標的遺伝子だとしても、その欠損が菌体増殖に不利な影響が大きい場合や致死性を示す場合は、実用化(実装、実験的検証)の対象にすることは難しい。一方で、理論的には培養期間の任意のタイミングにおいて遺伝子発現をオンからオフに制御出来れば、十分な菌体を得た後に、不要な競合経路への代謝流束を制限し、生産性の向上を図ることが可能である。
【０００５】
この様な課題を解決するためには、合成生物学分野における人工遺伝子回路を用いた直接的な遺伝子発現制御が有用であると考えられる。これまでの人工遺伝子回路は、シアノバクテリアなどにみられる概日リズムのような振動現象やλファージに見られるトグルスイッチの様な遺伝子発現制御システムを模倣することで、望みの動特性の実現とその数理的解析を主な研究テーマとしてきた(非特許文献10:Stricker et al., 2008; 非特許文献11:Gardner et al., 2000)。近年では、回路の複雑化、大規模化、多様化が進むとともに、その化学、医学、工学的応用が期待されるようになっている(非特許文献12:Slusarczyk et al., 2012)。代謝工学の分野においては、大腸菌における脂肪酸エステル生産において、人工遺伝子回路を用いた細胞内代謝制御による目的物質の生産性向上が試みられ、その有用性が示されている(非特許文献13:Zhang et al., 2012)。この研究では、生産系遺伝子発現を中間代謝物依存で制御し、細胞毒性を示す中間代謝物の不要な蓄積や過剰な酵素発現を抑えることで、生産性、収率の向上がなされている。しかし、物質生産経路への代謝流束を劇的に向上させるためには、より代謝流束の大きい解糖系、PP回路、TCA回路などの中央代謝経路の代謝物濃度を向上させることが重要である。中央代謝経路の代謝流束を制御する試みも既に報告されてはいるが、この研究では、具体的な物質生産に適用されていないため、物質生産性向上に対する効果は未だに評価されていない(非特許文献14:Callura et al., 2012)。
【０００６】
上述した通り、合成代謝経路は中央代謝経路を主とするホスト菌体内在性の代謝物を出発物質として構成されている 様々な合成代謝経路が、それぞれに適した様々なホスト微生物に合わせて構築されている。なかでも、好気的菌体増殖速度が速く、遺伝子組み換え技術が確立されている大腸菌においては、Phosphoenolpyruvate、Pyruvate、Acetyl-CoAといった解糖系とTCA回路の中間に位置し、菌体増殖にとって重要な代謝物を出発物質として 1,3-propanediol(非特許文献15:Nakamura and Whited, 2003)、1-butanol (非特許文献3:Dellomonaco et al., 2011)、Isobutanol(非特許文献4:Atsumi et al., 2008a)、1-propanol (非特許文献5:Atsumi and Liao, 2008b)、Isopropanol(非特許文献16:Hanai et al., 2007)、Itaconate(非特許文献17:Liao et al., 2010)、Putrescine (非特許文献18:Qian, 2009), Cadaverine(非特許文献19:Qian et al., 2010)等が構築されている。
Phosphoenolpyruvate、Pyruvate、Acetyl-CoAは、好気的菌体増殖速度に重要なTCA回路の前駆体であるため、TCA回路が物質生産の重大な競合経路となり、生産性の低下を引き起こす。TCA回路に依存した好気的菌体増殖と物質生産経路がトレードオフの関係にある場合、従来は培養工学的な手法として、好気的な菌体増殖期の後、嫌気的な物質生産期へと移行することで、TCA回路活性の段階的な制御が行われてきた(非特許文献20:Zhang et al., 2007; 非特許文献21:Zhou et al., 2012;非特許文献22:Jiang et al., 2010)。
【０００７】
しかし、標的遺伝子発現のみを的確に制御し、細胞内代謝を菌体増殖期、物質生産期それぞれに最適化するには、遺伝子発現状態にグローバルな影響を与える培養条件の変更ではなく、局所的・直接的な遺伝子発現・代謝流束制御が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで我々は、菌体増殖期と物質生産期におけるTCA回路への代謝流束を通気度非依存的に制御する新たな試みとして、TCA回路の起点のとなるCitrate Synthaseに注目した。Citrate synthase(CS)(EC 2.3.3.1)は、１分子のAcetyl-CoAと１分子のOxaloacetateから１分子のCitrateを生成するTCA回路の初発反応を触媒することから、TCA回路全体の代謝流束の律速段階となる(Davis and Gilvarg, 1956)。CSは大腸菌においてgltA（クエン酸合成酵素遺伝子）によってコードされる。ΔgltA株はTCA回路活性を持たず、Glucoseを基質とした最少培地での好気培養においてほとんど生育を見せないことから、従来、代謝工学的改変の対象として扱えなかった。このgltAを人工遺伝子回路の制御対象とし、菌体増殖期ではgltA発現をオンにし、十分な菌体を得た後の物質生産期においてはgltA発現をオフにすることができれば、TCA回路への代謝流束を局所的・直接的に制御できる。我々は、このような目的を達成するために、gltAの発現制御を目的とした人工的な遺伝子トグルスイッチを構築に取り組んだ(図1)。トグルスイッチとはλファージに見られるオン-オフ制御機構であり、人工的な遺伝子回路としていち早くその再構築と数理的解析が報告された遺伝子発現システムである(Gardner et al., 2000)。
【０００９】
本研究では、これまでの代謝工学では行われなかった新規な試みとして、増殖には必須だが、物質生産と競合する代謝経路を任意のタイミングでオンからオフに制御するための人工遺伝子回路の開発に取り組んだ。特に、目的物質生産の生産性向上にクリティカルな影響を期待し、生育に必須な中央謝経路の中でも生産系との競合が大きいTCA回路を制御対象とした。我々はTCA回路への代謝流束を人為的に制御するためのgltAトグルスイッチを新たに構築し、発酵過程の任意のタイミングでgltA発現をオンからオフに制御するとともに、合成代謝経路をオフからオンに同時に制御することで、菌体増殖と物質生産への代謝流束を人為的・直接的に制御することを目的とした。Acetyl-CoAを前駆体として構築されているIsopropanol合成代謝経路を有する大腸菌での遺伝子発現制御をモデルケースとして、上記の戦略の有用性を検証した。Isopropanolは燃料やプラスチックの原料としてバイオマス由来の生産が期待されているアルコールであり、Acetyl-CoAを起点とした合成代謝経路によって大腸菌で生産が可能な有用代謝物である(Hanai et al., 2007)。生物物質生産への人工遺伝子回路の応用による生産性向上を試みた研究は、未だその報告例が多くないチャレンジングなテーマである。本研究は、直接的な代謝流束制御を可能とする人工遺伝子回路の開発と、そのアプリケーションのデモンストレーションであり、Acetyl-CoAを起点とするあらゆる合成代謝経路の生産性を向上させるために応用が可能である。さらに、本研究は、TCA回路以外の代謝経路の代謝流束制御にも応用可能な汎用性の高い新規な代謝工学的手法の確立に寄与することが期待される。
【００１０】
本発明は、以下を提供する。
[１]  プロモーター１領域、プロモーター１の制御下にある遺伝子Ａ領域、プロモーター２領域、およびプロモーター２の制御下にあるリプレッサー１領域を含む遺伝子回路であって；
リプレッサー１によりプロモーター１からの転写がオフになり、リプレッサー２によりプロモーター２からの転写がオフになるものであり；
リプレッサー２の機能を抑制することにより、遺伝子Ａの発現が抑制され；そして
遺伝子Ａの発現の調節により、宿主細胞の増殖および／または目的物質Ｐの生産を調節可能である、遺伝子回路。
[２]  遺伝子Ａが、クエン酸合成酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ 、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、F型ATPアーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、またはグルコースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子である、[１]に記載の遺伝子回路、または
遺伝子Ａが、クエン酸合成酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、F型ATPアーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼI、ホスホグリセリン酸ムターゼIII、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、またはグルコースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子である、[１]に記載の遺伝子回路。
[３]  遺伝子Ａが、gltA (2.3.3.1)、gapA (1.2.1.12)、 pykA、pykF (2.7.1.40）、aceE (1.2.4.1)、icd (1.1.1.42)、gpmAM、ytjC (5.4.2.11, 12)、fumABC (4.2.1.2)、sdhABCD (1.3.99.1)、frdABCD (1.3.99.1)、sucAB (2.3.1.61, 1.2.4.2)、atpA (3.6.3.14)、gldA (1.1.1.6, 1.11.156)、dhaKL (2.7.1.29)、またはpgi (5.3.1.9) をコードする遺伝子である、[１]または[２]に記載の遺伝子回路、または
遺伝子Ａが、gltA (2.3.3.1)、gapA (1.2.1.12)、 pykA, pykF (2.7.1.40）、aceE (1.2.4.1)、icd (1.1.1.42)、sucAB (2.3.1.61, 1.2.4.2)、sdhABCD (1.3.5.1, 1.3.5.4)、fumABC (4.2.1.2)、mdh (1.1.1.37)、atpA (3.6.3.14)、gldA (1.1.1.6）、gpmA (5.4.2.11)、gpmM, ytjC (5.4.2.12)、dhaL (2.7.1.29)、またはpgi (5.3.1.9)  をコードする遺伝子である、[１]または[２]に記載の遺伝子回路。
[４]  宿主細胞が工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、またはシアノバクテリア）の細胞、植物細胞または動物細胞であり、細胞内において遺伝子Ａの発現をオン／オフ切り替えするためのものである、[３]に記載の遺伝子回路。
[５]  目的物質Ｐが、イソプロパノール、1-ブタノール、カダベリン、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、1-プロパノール、1-ペンタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、γ-アミノ酪酸、1,2-プロパンジオール、アスパラギン、リジン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アルギニン、シトルリン、ヒスチジン、フラビン、3-メチル-１-ブタノール、ブタン酸、アジピン酸、Putrescine、Glutaconic acid、4-Hydroxy butyric acid、プロピオン酸、エチレングリコール、エチレン、エリレンオキシド、1,5-pentadiol、3-hydroxyvaleric acid、イタコン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、レオニン、L-セリン、D-セリン、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、オキサロ酢酸、またはエタノールである、[２]〜[４]のいずれか一に記載の遺伝子回路。
[６]  下記(1)および(2)を含む、[１]〜[５]のいずれか一に記載の遺伝子回路：
(1) プロモーター３領域、プロモーター３の制御下にあるリプレッサー２領域を含む、リプレッサー供給用コンストラクト；および
(2)プロモーター１領域、プロモーター１の制御下にある遺伝子Ａ領域、プロモーター２領域、およびプロモーター２の制御下にあるリプレッサー１領域を含むプラスミド。
[７]  リプレッサー２が、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）により機能を抑制されるものである、[１]〜[７]のいずれか一に記載の遺伝子回路。
[８]  リプレッサー１がTetRであり、リプレッサー２がLacIである、[１]〜[８]のいずれか一記載の遺伝子回路。
[９]  上流より、プロモーター２領域、リプレッサー１領域、プロモーター１領域、および遺伝子Ａ領域の順で配置されている、[１]〜[８]のいずれか一記載の遺伝子回路。
[１０]  [１]〜[９]のいずれか一に記載の遺伝子回路が導入されている、目的物質Ｐを産生可能な細胞を準備し；
第１の段階では遺伝子Ａの発現をオンにする条件で細胞を培養し；そして
第２の段階では遺伝子Ａの発現をオフにする条件で細胞を培養する、目的物質Ｐの製造方法。
[１１]  目的物質Ｐを産生可能な細胞が、工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、またはシアノバクテリア）の細胞、植物細胞または動物細胞である、[１０]に記載の製造方法。
[１２]  目的物質Ｐが、イソプロパノール、1-ブタノール、カダベリン、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、1-プロパノール、1-ペンタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、γ-アミノ酪酸、1,2-プロパンジオール、アスパラギン、リジン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アルギニン、シトルリン、ヒスチジン、フラビン、3-メチル-１-ブタノール、ブタン酸、アジピン酸、Putrescine、Glutaconic acid、4-Hydroxy butyric acid、プロピオン酸、エチレングリコール、エチレン、エリレンオキシド、1,5-pentadiol、3-hydroxyvaleric acid、イタコン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、レオニン、L-セリン、D-セリン、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、オキサロ酢酸、またはエタノールである、[１０]または[１１]に記載の製造方法。
[１３]  第１の段階が細胞を増殖させるための期であり、第２の段階が目的物質生産のための期である、[１０]〜[１２]のいずれか一に記載の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】合成遺伝子gltAトグルスイッチを用いる代謝流れ変更（metabolic flux redirection）のための条件切り替え戦略。(A) 合成産生経路およびTCAサイクル依存性細菌増殖の間の競合的関係。TCA周期の過剰な活性は、産生経路への流れが不十分になるため、生産性およびターゲット産物収量の減少を引き起こす（cases）。(B) 合成gltAトグルスイッチのデザイン。新規遺伝子トグルスイッチのコンストラクトは、リプレッサーソース（"Repressor source" (Rs)）= pTA216および切り替えプラスミド（"Switching plasmid" (Swp)）と名付けられた2つの部分に分けられた。pTA216からのLacIリプレッサーはSwpのPLlacO1 プロモーターを阻害する。IPTGの添加により、PLlacO1プロモーターからの転写が誘導されると、tetRの発現が促進され、そしてTetRリプレッサーにより、PLtetO1 プロモーター下のgltAの発現が阻害される。
【図１−２】gltA オフ切り替えによる条件的クエン酸シンターゼ活性。(A) 10 g L-1glucoseを含有するM9培地中での細菌増殖。(B)クエン酸シンターゼ活性の時間経過。白抜きの円は、TA1414のデータを示す。白抜きの正方形は、IPTGの非存在下でのTA1357のデータを示す。黒塗りの正方形は、9hでgltA オフ切り替えされたTA1357のデータを示す。
【図１−３】菌体増殖、Glucose資化性、Acetate 生産に及ぼす gltA オフ切り替えの効果。 (A) 10 g L-1glucoseを含有するM9培地中の好気性増殖。(B) glucose消費。 (C) Acetate産生。
【図１−４】LC-MS分析によりモニターされる細胞内代謝物中央代謝経路における細胞内代謝産物の濃度をLC-MS分析によって監視した。各グラフは、TA1414、gltA オフ切り替えされないTA1357、およびgltA オフ切り替えされるTA1357の間の細胞内代謝産物濃度の比較を示す。黒いバーは各々、9hでgltA オフ切り替えを行ったTA1357における各代謝産物の濃度を示す。グレーのバーは各々、gltA オフ切り替えされないTA1357における各代謝産物の濃度を示す。白いバーは各々、TA1414における各代謝産物の濃度を示す。水平軸の各数値（praphs）は、試料採取時点を示し、そして縦軸は、細胞内代謝産物濃度を示す。
【図１−５】菌体増殖、Glucose資化性、Acetate 生産に及ぼす gltA オフ切り替えの効果。(A) 10 g L-1glucoseを含有するM9培地中の好気性増殖。(B) glucose消費。 (C) Acetate産生。
【図２−１】遺伝子トグルスイッチを用いた代謝流束制御。Isobutanol生産大腸菌として、Pyruvateを起点にalsS, ilvC, ilvD, kivd, yqhDの酵素遺伝子が触媒する5段階の合成代謝経路。
【図２−２】Δpta株におけるgltA発現制御によるPyruvate蓄積量の増大。ptaをノックアウトした菌株において、遺伝子トグルスイッチによりgltAを発現制御することで、Pyruvate蓄積量が増加するかを確認した。菌体増殖について、CtrlであるTA2367では最終菌体密度がOD600=6.5であったのに対し、ptaをノックアウトしたTA2368およびTA2370ではOD600=5.6付近と最終菌体密度の減少が見られた(図2-2-A)。また、Glucose消費速度は、各菌株間に顕著な差は見られなかった(図2-2-B)。細胞外Pyruvate濃度は、培養開始15時間後以降濃度が一定となり、培養開始27時間後においてTA2367_IPTG3hが3.8 mM、TA2368_IPTG3hが57.1 mM、TA2370_IPTG3hが76.3 mM、TA2370_IPTG(-)が48.5 mMであった(図2-2-C)。特に、TA2370_IPTG3hでは、Pyruvateの蓄積がTA2368_IPTG3hに比べ34%、TA2370_IPTG(-)に比べ57%増加していることが確認された。このことより、Δpta株においてgltAの発現を動的に制御することで、Pyruvateの蓄積量の増加が可能であることが確認された。一方で細胞外Acetate濃度は、TA2370_IPTG3hにおいて培養開始9時間後以降から顕著に増加し、培養開始27時間後において88.6 mMであり、これはTA2368_IPTG3h (53.3 mM)に比べ66%増加していた (図2-2-D)。
【図２−３】Δpta-gltA発現制御株におけるIsobutanol生産性の向上。Pyruvateを利用した物質生産のテストケースとして、同化合物を起点として生産可能なIsobutanolを生産する合成代謝経路を保持するプラスミド (pTA1339) を導入し、その生産性を比較した。菌体増殖について、CtrlであるTA2790_IPTG3hのみ最終菌体密度がOD600=5.7とほかの2株のOD600=6.2に対して多少の最終菌体密度の減少が見られた(図2-3-A)。Glucose消費速度は、各菌株間に顕著な差は見られなかった(図2-3-B)。細胞外Pyruvate濃度は、培養開始3時間後にTA2925_IPTG3hにおいて10 mM程度の蓄積が見られたが、その後は速やかに再資化され、各菌株において細胞外に蓄積は見られなかった(図2-3-C)。Acetate濃度は、CtrlであるTA2790_IPTG3hでは培養開始27時間後において31.0 mM蓄積が見られたが、その他の菌株については10 mMであった(図2-3-D)。Isobutanol生産量は、TA2788_IPTG3hでは80.9 mM、TA2925_IPTG3hでは94.4 mM、TA2790_IPTG3hでは104.3 mMであった(図2-3-E)
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、増殖には必須だが、物質生産と競合する代謝経路を任意のタイミングでオンからオフに制御するための人工遺伝子回路に関する。
【００１３】
遺伝子回路は、遺伝子相互の制御関係を利用し、それらの遺伝子を人工的に組み合わせることで、複雑な遺伝子発現を実現する。本発明の遺伝子回路は、プロモーター領域とそれに対応するリプレッサーをコードする領域を含む核酸または核酸の組み合わせである。プロモーター領域とそれに対応するリプレッサーをコードする領域との組み合わせは、複数存在してもよい。遺伝子回路は、プロモーター領域とそれに対応するリプレッサーをコードする領域を、リプレッサーの機能を阻害すれば目的の遺伝子発現がオンになるスイッチとして利用する。遺伝子回路は、宿主細胞に導入可能なベクターの形態、好ましくは発現ベクターの形態である。
【００１４】
プロモーター（領域）は遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するDNA上の領域をいい、RNAポリメラーゼの結合により転写を開始する核酸配列である。プロモーターは、使用する宿主細胞の種によって適宜選択して使用される。細菌を宿主として使用する場合、プロモーターとして、大腸菌などの宿主細胞中で機能できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、λPRプロモーター、PLプロモーター、trpプロモーター、およびlacプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターを例示できる。tacプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターを使用してもよい。酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、およびAOX1プロモーターなどを例示できる。動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、RNAスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、およびCMVプロモーターなどを使用することができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーターなどを使用してもよい。
【００１５】
リプレッサーは、プロモーターに作用し、特定の遺伝子の転写を抑制するタンパク質である。転写調節因子の一つであり、転写抑制因子と称されることもある。転写調節因子は、リプレッサーとアクチベーター（転写活性化因子）に大別することができる。より具体的にはリプレッサーは、プロモーター領域に作用して遺伝子の転写を抑制し、遺伝子の発現量を低減させる。本発明では、リプレッサーとして、公知の因子を使用することができる。好ましい例として、CIタンパク質を例示できる。CIタンパク質は、プロモーターPLおよびプロモーターPRの各プロモーター領域（すなわちOLおよびOR）に結合して、各プロモーターからの転写の開始を強力に阻止する。リプレッサーは、インデューサーの結合により、その機能を抑制されうる。すなわち、インデューサーの存在により、リプレッサーのプロモーター領域への作用が抑制され、その結果、目的の遺伝子の発現が誘導される方向に調節されうる。
【００１６】
発現ベクターは、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するDNA、言い換えればベクターDNAであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るDNAをいう。ベクターDNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターDNAは、天然に存在するDNAを抽出して得られたベクターDNAの他、複製に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているベクターDNAでもよい。代表的なベクターDNAとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターDNAを挙げることができる。プラスミドDNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを例示できる。バクテリオファージDNAとして、λファージなどが挙げられる。ウイルス由来のベクターDNAとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、SV40、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを挙げることができる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターDNAなどを例示できる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターDNA、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターDNA（コスミドやファージミドなど）を例示できる。ベクターDNAには、目的遺伝子が発現されるように目的遺伝子を組み込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子と調節DNAエレメント、例えばプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組み合わせて自体公知の方法によりベクターDNAに組み込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネータ、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）を例示できる。これらから選択した1種類または複数種類の遺伝子配列をベクターDNAに組み込むことができる。
【００１７】
ベクターDNAに所望の核酸を組み込む方法は、自体公知の遺伝子工学的技術を適用できる。例えば、所望の核酸を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても所望のベクターDNAが得られる。
【００１８】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、宿主細胞にベクターDNAを導入して宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得る導入方法であれば特に限定されず、宿主細胞の種により適宜選択した公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを例示できる。
【００１９】
本発明はより具体的には、遺伝子スイッチ発現配列、および該遺伝子スイッチ発現配列によりコードされる遺伝子スイッチにより発現が誘導される転写調節因子をコードする遺伝子配列を有する遺伝子回路を保持する発現ベクター、並びに、該転写調節因子により発現調節される遺伝子配列を有する発現ベクターを導入した細胞を使用し、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して該細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収すること、および／または、該遺伝子スイッチを活性化する化合物の存在下または非存在下で、該発現調節される遺伝子配列の非発現下で細胞死を誘導し得る化合物を添加して細胞をインキュベーションした後に生細胞を回収することを含む、遺伝子スイッチおよび遺伝子回路の選択方法に関する。
【００２０】
本発明において、遺伝子配列（遺伝子Ａ領域）を発現調節するために利用される遺伝子回路は、プロモーター１領域、プロモーター１の制御下にある遺伝子Ａ領域、プロモーター２領域、およびプロモーター２の制御下にあるリプレッサー１領域を含む発現ベクターまたは発現ベクターおよび恒常的に発現するプロモーター３の制御下にあるリプレッサー２領域の組み合わせであり得る。リプレッサー１によりプロモーター１からの転写がオフになり、リプレッサー２によりプロモーター２からの転写がオフになり、リプレッサー２の機能を抑制することにより、遺伝子Ａの発現が抑制されるように構成される。そして、宿主細胞として、目的物質Ｐの生産が可能なものを用い、遺伝子Ａの発現の調節により、宿主細胞の増殖および／または目的物質Ｐの生産を調節可能であるように設計される。
【００２１】
本発明の遺伝子回路は、２以上の異なるプロモーターを利用したトグルスイッチである。プロモーター１の下流には遺伝子Ａ領域を、プロモーター２の下流にはリプレッサー１領域を配置する。また、恒常的に発現するプロモーター３の下流にはリプレッサー２領域を配置する。初期条件では，リプレッサー２によりプロモーター２が阻害され、リプレッサー１の発現が抑制される条件とすると、プロモーター１が機能し、遺伝子Ａの発現が誘導される。遺伝子Ａの発現により目的が達成された後、リプレッサー２の機能を抑制する条件とすると、プロモーター２が機能し、リプレッサー１が発現され、遺伝子Ａの発現が阻害される。遺伝子Ａは、後述するように、宿主細胞の増殖には必須だが、目的物質Ｐの生産とは競合する代謝経路におけるタンパク質をコードする遺伝子であるので、遺伝子Ａの発現の阻害は、目的物質Ｐの生産にとって好ましい。
【００２２】
本発明において使用される、リプレッサー２の機能を抑制することにより発現が抑制される遺伝子Ａは、宿主細胞の増殖には必須だが、目的物質Ｐの生産とは競合する代謝経路におけるタンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子Ａの例は、クエン酸合成酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、F型ATPアーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼI、ホスホグリセリン酸ムターゼIII、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、またはグルコースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子である。遺伝子Ａは、これら例示に限らず、宿主細胞の増殖には必須だが、目的物質Ｐの生産とは競合する代謝経路におけるタンパク質をコードする遺伝子である限りにおいていずれの遺伝子配列も使用できる。
【００２３】
目的物質Ｐの例は、イソプロパノール、1-ブタノール、カダベリン、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、1-プロパノール、1-ペンタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、γ-アミノ酪酸、1,2-プロパンジオール、アスパラギン、リジン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アルギニン、シトルリン、ヒスチジン、フラビン、3-メチル-１-ブタノール、ブタン酸、アジピン酸、Putrescine、Glutaconic acid、4-Hydroxy butyric acid、プロピオン酸、エチレングリコール、エチレン、エリレンオキシド、1,5-pentadiol、3-hydroxyvaleric acid、イタコン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、レオニン、L-セリン、D-セリン、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、オキサロ酢酸、またはエタノールである。
【００２４】
好ましい態様においては、遺伝子Ａを発現調節するために利用される遺伝子回路は、さらに下記(1)および(2)を含む：
(1) プロモーター３領域、プロモーター３の制御下にあるリプレッサー２領域を含む、リプレッサー供給用コンストラクト；および
(2)プロモーター１領域、プロモーター１の制御下にある遺伝子Ａ領域、プロモーター２領域、およびプロモーター２の制御下にあるリプレッサー１領域を含むプラスミド。
【００２５】
また、好ましい態様においては、リプレッサー２が、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）により機能を抑制されるものである。
【００２６】
好ましい態様においては、リプレッサー１がTetRであり、リプレッサー２がLacIである。
【００２７】
好ましい態様においては、遺伝子回路では、上流より、プロモーター２領域、リプレッサー１領域、プロモーター１領域、および遺伝子Ａ領域の順で配置される。
【００２８】
目的物質Ｐの生産のために、遺伝子回路が導入される宿主として用いられる細胞は、生物体の構造上・機能上の基本単位であり、遺伝情報を担う核酸分子を有し、外界を隔離する膜構造およびその内部の細胞質から成る生活体を意味する。本発明において使用される細胞は、原核細胞および単離された真核細胞のいずれであってもよい。好ましくは、工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、またはシアノバクテリア）の細胞、植物細胞または動物細胞である。
【００２９】
好ましい態様においては、目的物質Ｐの製造方法が提供される。この製造方法は、下記の工程を含む：
上述の遺伝子回路が導入されている、目的物質Ｐを産生可能な細胞を準備し；
第１の段階では遺伝子Ａの発現をオンにする条件で細胞を培養して細胞を増殖させ；そして
第２の段階では遺伝子Ａの発現をオフにする条件で細胞を培養する。
【００３０】
目的物質Ｐの製造方法としての好ましい態様においては、目的物質Ｐを産生可能な細胞は、工業用微生物（好ましくは大腸菌、コリネ菌、バチルス、またはシアノバクテリア）の細胞、植物細胞または動物細胞であり、目的物質Ｐは、イソプロパノール、1-ブタノール、カダベリン、1,3-プロパンジオール、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、1-プロパノール、1-ペンタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、γ-アミノ酪酸、1,2-プロパンジオール、アスパラギン、リジン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、アルギニン、シトルリン、ヒスチジン、フラビン、3-メチル-１-ブタノール、ブタン酸、アジピン酸、Putrescine、Glutaconic acid、4-Hydroxy butyric acid、プロピオン酸、エチレングリコール、エチレン、エリレンオキシド、1,5-pentadiol、3-hydroxyvaleric acid、イタコン酸、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、レオニン、L-セリン、D-セリン、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、オキサロ酢酸、またはエタノールである。
【００３１】
目的物質Ｐの製造方法としての好ましい態様においては、第１の段階は宿主細胞を増殖させるための期であり、ここで目的物質生産のためも宿主細胞は、生産を効率的に行うために十分な程度にまで、増殖させる。第２の段階は、目的物質Ｐの生産のための期であり、遺伝子Ａの発現抑制により、宿主細胞の増殖は抑制され、代わりに目的物質Ｐの生産性が向上しうる。
【００３２】
以上説明してきたように、本発明により、増殖には必須だが、物質生産と競合する代謝経路を任意のタイミングでオンからオフに制御するための人工遺伝子回路が提供される。
【００３３】
微生物を用いたAcetyl-CoA、Pyruvate、PEPを起点とした好気的な物質生産においては、TCA回路は菌体増殖に必須でありながら、最大の競合経路となるホスト内在性の代謝経路である。このような菌体増殖に重要な競合経路は従来のセオリーでは削除対象としては選定できなかった。本発明により、本来は欠損困難な遺伝子のコンディショナルなオフ制御を実現することができる。制御対象となりうる好適な例の一つは、TCA回路の第一ステップ反応に関わるgltAである。
【００３４】
本発明者らの検討によると、ΔgltA株は、10 ｇ/Lのglucoseを含むM9最少培地において生育を見せないが、構築したgltAトグルスイッチを用いてその発現を補完した結果、IPTG非添加時において元株と同等の生育を示す一方、IPTG添加に応答して速やかなCS活性の低下を示し、その結果、IPTG添加後の比増殖速度は明らかに低下した。このことから、gltA発現制御を介してglucose資化時のTCA回路活性を人為的に抑制し、菌体増殖を抑えられることが立証された。
さらにTA1357(gltA発現制御株)では、IPTG添加によるgltA発現停止に伴い、細胞内でのTCA回路へのAcetyl-CoAの利用が低減し、過度の菌体増殖を抑えるとともに、これによって生じた余剰のAcetyl-CoAはAcetate生産に利用され、Acetate生産量が増大することが分かった。すなわち、構築した回路を用いた制御を介して、細胞内代謝レベルでTCA回路への代謝流束を制御し、物質生産に利用可能な細胞内Ace-CoA濃度を向上させることができた。
発明者らはさらに、TCA回路への代謝流束制御によって増大した細胞内Acetyl-CoAが物質生産の生産性向上に応用可能であることを実証するため、Isopropanol生産大腸菌に上記のシステムを導入した。Isopropanol生産系遺伝子群はIPTGによって発現誘導される。試験したすべての株がIPTG添加に伴ってIsopropanolを生産した。Acetate生産時とは異なり、IPTG添加によってIsopropanol生産経路が誘導されるため、gltA発現制御によるTCA回路の遮断は、対数増殖期におけるIsopropanol生産性増大とともに、菌体増殖が停止した定常期においてもその効果が大きいことが明らかになった。
【００３５】
本発明の実施により確実にいえるのは、Acetyl-CoAとPyruvateの濃度が上昇することであり、本発明は、これらを利用した物質生産において有用である。すなわち本発明により、Acetate生産、isopropanol生産の例のように、細胞を用いたAcetyl-CoA等を起点とした好気的な物質生産において、細胞増殖に必須でありながら最大の競合経路となるホスト内在性の代謝経路のオフ制御が可能となり、目的生産物を増大させることが期待できる。
【００３６】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。実施例を示す前に、本発明者らが既に開発し、本発明において利用するヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ(hsvTK)をセレクタとして使用する遺伝子スイッチや遺伝子回路の選択方法を実験例1-7に示す。本発明は以下に示す実施例や実験例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
〔材料および方法〕
1. 化学薬品および試薬
別に明記しない限り、すべての化学薬品を、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)または和光純薬工業株式会社（日本・大阪）、MP Biomedicals(オハイオ州ソロン)より購入した。
【００３８】
2. 培地および培養条件
プラスミド調製のため、大腸菌（E. coli）株を、試験管中の3 mL ルリア−ベルタニ(LB)培地中、回転振盪装置(250 rpm)上、37℃でインキュベーションすることによって、培養した。すべての振盪フラスコ培養を、回転振盪装置(250 rpm)中、振盪しながら37℃で一晩培養した10 g/L D-glucoseおよび10 ppmチアミン塩酸塩を含有する3 mLの修飾M9最少培地からの1% (v/v)接種によって開始した。Isopropanol生産を除く全てのフラスコスケールでの培養には、10 g/L D-glucoseを含有する20 mL M9最少培地を300 ｍLのバッフル付三角フラスコ内に用意し、これを振盪培養装置内で、250 rpm, 30℃で振盪培養した。Isopropanol産生培養に関しては、20 g/L D-glucoseを含有するM9最少培地を用い、そして回転振盪装置(250 rpm)中、30℃で振盪した。
【００３９】
3. 株およびプラスミド
用いたすべての大腸菌株およびプラスミドを表1-1に列挙する。すべてのプラスミドの調製には、大腸菌DH5アルファZ1 (EXPRESSYS)を用いた。すべての大腸菌株は、BW25113およびJW0336(ΔlacI)およびJW0710(ΔgltA)に基づいて構築された。プラスミドpCP20(Dastenko and Wanner, 2000)を用いて、JW0336からカナマイシンマーカーを除去することによって、株TA1015を得た。ドナー株としてJW0710を用いて、P1形質導入によってTA1015のgltA遺伝子ノックアウトを行い、そしてTA1116と名付けた。プラスミドpCP20(Dastenko and Wanner, 2000)を用いて、TA1116からカナマイシンマーカーを除去することによって、TA1184を得た。プライマーT329(5'gccatcctcgagcgttgacaccatcgaatggtgcaaaacc)（配列番号1）およびT330(5'gccatcggatcctcactgcccgctttccagtcg)（配列番号２）を用いて、pZS4INT-laci/tetRからPlacIq::lacIを増幅し、そしてXhoIおよびBamHIによって消化し、そしてpZS*24MCSのXhoIおよびBamHI部位に、PlacIq::lacIを挿入することによって、pTA216を構築した。PlacIqからのlacIの恒常的発現のため、pTA216をTA1015およびTA1184内に導入し、そしてそれぞれ、TA1041およびTA1334と名付けた。プライマーT417(5'gccatcaagcttagcccgcctaatgagcgggctttttttttctagatccctatcagtgatagagattgacatccct)（配列番号3）およびT349 (5'gcCATCGGATCCTTTCTCCTCTTTAATGAATTCGGTCAGTGC)（配列番号4）を用いて、pZA31-luc (EXPRESSYS)から増幅したTtrp-PLtetO1断片を、HindIIIおよびBamHIで消化し、そしてpZE22-MCSのHindIIIおよびBamHI部位に挿入し、そしてpTA646と名付けた。プライマーT939(5'gccatcggtaccatggctggttctcgcagaaagaaac)（配列番号5）およびT940(5'gccatcgggcccttaagacccactttcacatttaagttgtttttc)（配列番号6）を用いて、pZS4INT-laci/tetRからtetRを増幅し、そしてAcc65IおよびApaIによって消化した。pTA646のAcc65IおよびApaI部位内にtetRを挿入することによって、pTA649を構築した。プライマーT1042(5'gccatcggatccatggctgatacaaaagcaaaactcacc)（配列番号7）およびT1045(5'gccatcacgcgtttaagctgctaaagcgtagttttcgtcgtttgctgcacgcttgatatcgcttttaaagtcgc)（配列番号8）を用いて、BW25113ゲノムから増幅し、そしてBamHIおよびMluIによって消化したgltA.LAAを、pTA649中、PLtetO1プロモーター下のBamHIおよびMluI 部位に挿入し、そしてpTA659と名付けた。pTA669の構築のため、AatIIおよびSucIを用いて、pZA22-MCSから消化したp15Aで、pTA659のColE1を置換した。TA1334および1041内に、pTA669を導入し、そしてそれぞれ、TA1357および1414と名付けた。Isopropanol産生のため、TA1357およびTA1414内にpTA147を導入し、そしてそれぞれ、TA1415およびTA1424と名付けた。
【００４０】
【表１−１】
2015154768.tif 000003
【００４１】
4. クエン酸シンターゼアッセイ
5000xg、10分間の遠心分離によって、細胞を採取した。1 mM EDTA, 10 mM MgCl2および0.1 M KClを含有する4 mの120 mM Tris/HCl、pH 8.0中に、ペレットを懸濁した。3s間隔/1sバーストで、6 pm振幅で1 分間、MSE soniprep 150を用いて、細胞を超音波処理した。25000xgで15分間遠心分離した後、上清分画を酵素活性に関してアッセイした(Bloxham, 1986)。クエン酸シンターゼアッセイキット(Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス)を用いて、100 mM Tris-HCl (pH 7.5)中、0.3 mM アセチル-CoA, 0.5 mM オキサロ酢酸 (OAA)および0.1 mM 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)を用いて、gltA遺伝子産物であるクエン酸シンターゼ活性を決定した。DTNBと補酵素Aの反応によって、酵素反応を監視し、そして1単位のクエン酸シンターゼは、１分あたり1.0μmolのDTNBを遊離させ、そしてTNBにする(Srere et al., 1963)。96ウェルプレート読み取り装置Infinity 200 pro (TECAN、スイス・メンネドルフ)を用いて、412 nmの吸光度を監視した。96ウェルプレートを用いて、各190 μLの反応混合物(1x アッセイ緩衝液中、0.3 mM アセチル-CoA, 0.1 mM DTNB、および>8.0 μgのタンパク質を含有する細胞抽出物溶液)に、10 μLの50 mM OAAを添加して、反応を開始した。
【００４２】
5. ブロス培養上清中の代謝産物検出(ditedction)
96ウェルプレート読み取り装置SpectraMax M2KS（Molecular Devices、米国)を用いて、細菌培養の600 nmでの光学密度(OD600)を測定し、そしてOD600から、乾燥細胞重量(DCW)を計算した(OD600=0.453 g DCW L-1)。細胞外代謝産物を定量化するため、細菌培養ブロスを微量遠心分離装置中、13,000xgで1分間遠心分離して、そして次いで、HPLCおよびGC分析のため、0.2μmシリンジフィルターを通して、上清を濾過した。先に記載されるように(Atsumi et al., 2008)、水素炎イオン化を装備したガスクロマトグラフィ(GC)を用いて、産生されたアルコール化合物を定量化した。イオン排除クロマトグラフィカラム(Showdex RSpak KC-811, 昭和電工株式会社、日本・東京)、伝導率検出装置(Shimadzu CCD-10A vp)を装備した島津製作所 (日本・京都)のHPLC系を用いて、発酵副産物(アルファ−ケトグルタレート、ピルベート、サイトレート、ラクテート、アセテート、フォルメート、フマレート、マレート、スクシネート)を定量化した。1.0 mM/分の流速の5.0 mM p-ニトロフェニルホスフェート溶液の可動相を用いて、そしてカラムを40℃で操作した。リガンド交換クロマトグラフィカラム(Showdex SP0810, 昭和電工株式会社、日本・東京)、示差屈折計(Shimadzu CCD-10A vp)を装備した島津製作所 (日本・京都)のHPLC系を用いて、細胞外D-glucoseを定量化した。1.0 mM/分の流速のMilliQ水を可動相として用いて、そしてカラムを80℃で操作した。Acetate収量を、消費された1 mol D-glucoseあたりに産生された1 mol Acetateとして定義した。Isopropanol収量を、消費された2 mol D-glucoseあたりに産生された1 mol Acetateとして定義した。
【００４３】
6 大腸菌株における代謝産物検出
10 g L-1glucoseおよび10 ppmチアミン塩酸塩を含有する20 mL M9培地中、回転振盪装置(250 rpm)中、37℃で大腸菌株を培養した。9 hで0.1 mM IPTGを添加し、TA1357中でgltA オフ切り替えを誘導した。膜フィルター(Omnipore, 0.45μM, 25mm直径のポリテトラフルオロエチレン, Millipore, マサチューセッツ)を用い、迅速真空濾過によって、3 hおよび23 hに、細胞を収集した。各フィルターを15 mL corning試験管内に移し、そして直ちに液体窒素で急冷し、そして代謝産物抽出まで、-80℃で保存した。代謝産物抽出のため、クロロホルム−メタノール−水法を用いて、各凍結乾燥細胞をすべて抽出した(Hasunuma et al., 2011)。抽出物の水相(300μL)を真空下で乾燥させ、そして分析まで、-80℃で保存した。乾燥させた抽出物を、50μL MilliQ水中に溶解し、そしてMassHunter Workstation Data Acquisitionソフトウェア v. B. 04.01 (Agilent Technologies)によって制御されるLC-QqQ-MS 系(高性能液体クロマトグラフィ: Agilent 1200 シリーズ、MS: Agilent 6460 with Jet Stream Technology, Agilent Technologies, ドイツ・ヴァルトブロン)のために調製した。先の報告(Kato et al., 2012)に記載される条件下で、LC-QqQ-MS分析を行った。
【００４４】
〔実験結果〕
1. 遺伝子トグルスイッチの構築とgltA発現制御
本研究では、全ての実験を10 g/Lもしくは20 g/Lglucoseを含む M9 最少培地を用いたフラスコ培養において行った。上記の条件下では、ΔgltA株はほとんど生育を見せなかった。ΔgltA株(TA1115)は1% Casamino酸を含む上記の培地、LB培地ではTA1414と同等の生育を示すが、その菌体を用いてCS活性を測定したところ、活性は見られなかった。構築したgltA発現制御用遺伝子トグルスイッチをΔgltA株に導入し(TA1357)、CS活性測定実験を行った結果を図1-2に示す。構築した回路では、IPTGの添加に伴いPLlacO1下流のtetRの発現が誘導され、それに伴いPLtetO1下流のgltAの発現が抑制される。IPTGを添加しない場合、p15Aを複製起点とするミディアムコピープラスミド上に構築したトグルスイッチからgltAを供給しているTA1357(gltA発現制御株)のCS活性は、ゲノム上のgltAのみを有するTA1414に比べて2.77倍高かった。この際、IPTG非添加時のgltA発現誘導株はTA1414と同等の生育を示した(TA1414=0.27±0.01, TA1357=0.28±0.01 g gDCW-1 h-1)。フラスコ培養開始後、9hにIPTGを添加したところ、TA1357(gltA発現制御株)のCS活性は2ｈ以内に82%減少し、最終的にIPTGを添加しない場合に比べ93%活性が低下した(13h)。CS活性の低下に伴い、対数増殖期後期(11-13h)におけるTA1357(gltA発現制御株)の比増殖速度はTA1414の63%まで低下した(TA1414 = 0.12±0.01, TA1357(IPTG-) = 0.13±0.01, TA1357 (IPTG+) = 0.08±0.00 g gDCW-1 h-1)。IPTGを添加しないgltA制御株のではCitrate synthase活性が対数増殖期後期にあたる培養21hまで維持された。TA1414でも同様にCS活性が維持された。
【００４５】
2. gltA発現の動的制御が菌体増殖、Glucose資化性、Acetate生産におよぼす影響
gltA発現制御とそのタイミングが菌体増殖およびGlucose代謝に及ぼす影響を確認した。TA1357(gltA発現制御株)はIPTGを添加しない場合、TA1414と同等の菌体増殖を示した(図1-3-A)。一方で、TA1357(gltA発現制御株)に対してIPTGを0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 hの時点で添加したところ、IPTG添加のタイミングが早い物ほど、最終菌体密度が低下した（図1-3-A、表1-2）。なお、IPTGを3, 6 hに添加した場合と15,18hに添加した場合はそれぞれ結果がほぼ同じであったので省略する。この際、IPTG添加のタイミングが早く、より比増殖速度が低下した物ほど多くのAcetateを生産し、特に、対数増殖期初期にあたる0, 6 hにIPTGを添加した場合で生産量の向上が著しく、最も多いもの(IPTG添加：0 h)でTA1414の2.9倍の61.4 mMのAcetateを生産した（TA1414 = 21.4 mM）(図1-3-C)。対数増殖期中期にあたる9 h以降でIPTGを加えたものは、IPTG添加時間が遅延するほど生産量が低下し、IPTGを添加しないgltA制御株のAcetate生産量はTA1414と同等の21.2 mMであった。Glucose資化量に対するAcetate生産収率は、IPTG添加時間の早いgltA制御株ほど高く、最大で73%(IPTG=0 h)であった(表1-2)。IPTGを添加したTA1357(gltA発現制御株)ではIPTG添加後から、Acetate以外に培養液中から少量のPyruvateが検出された(Data not shown)。特に、対数増殖期初期〜中期にIPTGを添加した場合(0, 3, 6, 9 ｈ)ではIPTG添加直後からPyruvateの蓄積が見られ、最大で10-20 mMが蓄積した。このPyruvateは対数増殖期終了後速やかに再資化された(Data not shown)。一方、TA1414株ではPyruvateは検出されず、TCA回路前半に位置する代謝物であるalpha-KGが定常期以降に検出され、最大で9.7 mMの蓄積が見られた(46 h)(Data not shown)。alpha-KGはgltA発現株ではIPTGの添加の有無にかかわらずほとんど検出されなかった(Data not shown)。
【００４６】
【表１−２】
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【００４７】
3. gltA発現制御にともなう細胞内代謝状態の変動
gltA発現制御に伴う細胞内代謝状態の変化を確認するため、LC-MS分析によって細胞内の解糖系、TCA回路周辺の細胞内代謝物濃度を測定した。gltA発現制御誘導は培養開始後9 hにおいて実施し、その前後にあたる3 hと23 hにおける細胞内代謝物濃度を図1-4に示した。TA1414、TA1357_IPTG(-)、TA1357_IPTG(+)の全てにおいて、解糖系準備期経路における代謝物G6P、F6P、F1,6P、G3P、DHAPの細胞内濃度は、3 hと23 hの間において大きな変動は見られず、各条件間でも顕著な差異は見られなかった。一方で、CS反応周辺の解糖系報酬期およびTCA回路の代謝物濃度は、gltA発現制御の前後において著しい変化が確認された。TA1414およびTA1357_IPTG(-)では、培養3-23 hにかけてCitrate濃度がそれぞれ2.3倍、5.5倍に上昇した。一方で、gltA発現制御を実施したTA1357_IPTG(+)ではCitrate濃度が89%減少した。23 hにおけるTA1357_IPTG(+)のCitrate濃度はTA1414の3.1%であった。Citrateに続くTCA回路の代謝物であるalpha-KGでの同様の傾向が見られ、23 hにおけるTA1357_IPTG(+)のalpha-KG濃度はTA1414の4.5%まで減少した。gltA発現制御を実施したTA1357_IPTG(+)において、Citrateの前駆体であるAcetyl-CoAの23 hにおける細胞内濃度は、TA1414の1.6倍まで向上した。TA1357_IPTG(+)のCitrate濃度がTA1414の1/32まで減少した一方で、Acetyl-CoA濃度上昇が1.6倍であったのは、余剰のAcetyl-CoAがAcetate生産に利用されたためと考えられる。また、Acetyl-CoAの前駆体であるPyruvateは、A1414、TA1357_IPTG(-)、TA1357_IPTG (+)の全てにおいて、培養進行に伴い増加傾向を示した。TA1357_IPTG(+)のPyruvate蓄積が著しく、16 hではTA1414の9.8倍ものPyruvate蓄積が確認された。以上の結果から、構築したgltAトグルスイッチを用いたCS活性のオフ制御によって、TCA回路への代謝流束を制限可能であることが細胞内代謝レベルで確認された。TCA回路遮断によって得られた余剰のAcetyl-CoAはAcetate生産量の向上に寄与したものと考えられる。
【００４８】
4. gltA発現制御によるIsopropanol生産性の向上
gltA発現性御によって、TCA回路への過剰の代謝流束を抑え、Acetyl-CoAを前駆体として生産されるAcetateの生産量を向上させることに成功した。そこで我々は、gltA発現制御株にAcetyl-CoAを前駆体として生産されるIsopropanol生産経路(pTA147)を導入することで、Isopropanol生産性向上が可能であると考えた。TA1357(gltA発現制御株)にIsopropanol生産系を導入しTA1415とし、フラスコ培養でgltA発現制御を伴うIsopropanol生産実験を行った(図1-5)。この際、培養開始後、0, 6, 9, 12, 15 h においてIPTGを添加し、gltA発現制御のタイミングを変化させた。Acetate生産の際と同様に、IPTG添加のタイミングが早いものほど比増殖速度の低下が確認されたが、0 hにIPTGを添加したものを除いては22 h以内に最大菌体密度(定常期)に到達した(図1-5-A)。0 hにIPTGを添加した場合は、特に著しく比増殖速度が低下し、最大菌体密度(OD600＝4.4)に到達するまでにその他の2.23倍にあたる49 hを要した。
【００４９】
2 g/LのGlucsoeを含むM9最少培地におけるTA1424(Ctrl, TA1414/pTA147)のIsopropanol生産量は69 hで13.7 mMであり、その際の最大生産速度は0.70±0.11 mM h-1であった (表1-2)。Acetate生産の際と同様に、gltA発現停止に伴うTCA回路の遮断はTA1415(TA1357/pTA147)のIsopropanol生産性の向上に寄与した。対数増殖期初期にあたる0, 6, 9 hにTCA回路を遮断した場合、その効果は大きく、それぞれ69 hで45.7±1.4、48.3±0.1、50.9±1.5 mMのIsopropanolを生産した。これはTA1414の3.3〜3.7倍に相当する。0, 6, 9 hに誘導を実施した場合の最大生産速度は、それぞれ1.82±0.07、1.88±0.12、1.59±0.11 mM h-1であった。これは、Ctrlの2.3-2.6倍であった。さらに、対数増殖期中期にあたる12 hにTCA回路を遮断した場合でも、TA1414の2.8倍にあたる38.1±4.2 mMまで生産量が向上したが、この際の最大生産速度は1.02±0.31 mM h-1であり、TA1414の1.5倍であった。対数増殖期後期にあたる15 hでTCA回路を遮断した場合のIsopropanol生産量と最大生産速度は20.5±1.9 mM、0.98±0.30 mM h-1であり、それぞれTA1414の1.5、1.4倍であった。対glucose収率は、表1-2に示すように、gltA発現制御を対数増殖期の初期(0, 6, 9)に実施した際が高く、TA1414の2.8-3.0倍に向上した。
【００５０】
【表１−３】
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【００５１】
〔考察〕
微生物を用いた物質生産において、菌体増殖および維持エネルギーと物質生産経路の競合による生産性、生産収率の低下は回避し難い課題である。特に、Acetyl-CoA、Pyruvate、PEPを起点とした好気的な物質生産においては、TCA回路は菌体増殖に必須でありながら、最大の競合経路となるホスト内在性の代謝経路である。このような菌体増殖に重要な競合経路は従来のセオリーでは削除対象として選定できなかった。本研究では、合成遺伝子トグルスイッチを用いることで、本来は欠損困難な遺伝子のコンディショナルなオフ制御を実現し、この問題の解決に取り組んだ。
【００５２】
制御対象としたgltAはTCA回路の第一ステップ反応であり、TCA回路の反応速度を調節するクエン酸合成反応を触媒するCSをコードする遺伝子である。ΔgltA株は、10 ｇ/Lのglucoseを含むM9最少培地において生育を見せないが、構築したgltAトグルスイッチを用いてその発現を補完した結果、IPTG非添加時においてTA1414と同等の生育を示した。構築したgltAスイッチは当初の設計通り、IPTG添加に応答して速やかなCS活性の低下を示し、その結果、IPTG添加後の比増殖速度はTA1414およびIPTG非添加時の同株の63%まで低下した。IPTGの添加のタイミングを検討した結果、対数増殖期初期〜中期(0-9 h)でgltA発現を停止した場合、対数増殖期における比増殖速度がTA1414の最大で49-45%まで低下した。このことから、gltA発現制御を介してglucose資化時のTCA回路活性を人為的に抑制し、菌体増殖を抑えることが出来ると立証された。ただし、gltA活性はIPTG非添加時の8%程度残存しており、これはTA1414の15%程度におよぶ。CSによるTCA回路への代謝流束を完全にシャットアウトするためには、細胞内のCS活性をより速やかに、完全に抑制するための改善が必要と言える。従来の人工遺伝子回路に関する研究に倣い、本研究ではgltAのC末端にAANDENYALAA分解タグを付加した(Prindle et al., 2012; Keiler et al., 1996)。しかし、個別の酵素に関して分解タグの影響が調査されているわけではないので、その効果については更に詳しく検証する必要がある。
【００５３】
速やかな菌体増殖とそれに続く物質生産過程での無駄のない効率的な基質利用を両立することを目的に、gltA発現制御を介したCS活性の制御が細胞内代謝に与える影響を精査した。当初の狙い通り、TA1357(gltA発現制御株)では、IPTG添加によるgltA発現停止に伴い、細胞内でのTCA回路へのAcetyl-CoAの利用が低減し、過度の菌体増殖を抑えるとともに、これによって生じた余剰のAcetyl-CoAはAcetate生産に利用され、Acetate生産量が増大した。特に、gltA発現抑制を0-9 hの対数増殖期初期〜中期で実施した場合、Acetate生産量の向上は著しく、TA1414の2.4-2.9倍にも及んだ。この際、対数増殖期初期の0-6 hにおいてIPTGを添加した場合では、定常期以降においてTA1414の4.5-5.3倍の比生産速度を示した(表1-3)。gltA発現抑制によるTCA回路遮断は菌体増殖が落ち着いた定常期以降においてその効果が期待されることが明らかになった。また、TA1414では定常期において培養液からalpha-KGが検出されたが、gltA発現抑制株では確認されなかった。これらの結果から、好気的増殖条件では、定常期以降もTCA回路活性がある程度維持されていると考えられる。
【００５４】
gltA発現制御に伴う細胞内代謝状態の変化を確認するため、GC-MS、LC-MS分析によって、細胞内の解糖系、TCA回路周辺の細胞内代謝物濃度を測定した。その結果、TA1357(gltA発現制御株)は、IPTG非添加時においてはTA1414と同様の細胞内代謝状態を示したが、IPTG添加によってgltA発現を停止したところ、ITG添加後7 h後にはTCA回路前半に位置するCitrateがTA1414の1.1%、alpha-KGが4.5%まで減少し、これらの上流に位置するAcetyl-CoA、PyruvateがそれぞれTA1414の159%、981%まで向上した。このことから、構築したgltAトグルスイッチを用いたCS活性制御を介して細胞内代謝レベルでTCA回路への代謝流束を制御し、物質生産に利用可能な細胞内Ace-CoA濃度を向上させることに成功したと考えられる。また、TA1414では、定常期に達した23 hにおいてもCitrateおよびalpha-KGが検出されたことから、常期以降もCS活性およびそれに続くTCA回路活性が維持されていることが示唆された。CSは細胞内のNADHによってアロステリック的にその活性が抑制される(Nguyen et al., 2001, Duckworth, 1976)が、クエン酸合成反応が23 hにおいても維持されていることから、NADHによる十分な阻害がかかるほどのNADHが蓄積していないと考えられる。また、解糖系の一部の酵素はATP/ADP比に比例してアロステリック的に活性が抑制される(Kotlarz et al., 1975; Babul, 1978)。TA1414は培養の進行に伴いCitrate、alpha-KG濃度が上昇し、Glucose資化速度が低下していったことから、TCAおよび電子伝達系において十分なATPを得たものと考えられる。一方で、gltA発現制御を実施したTA1357_IPTG(+)は、培養開始からglucose枯渇までの間、TA1414よりも高いglucose資化速度を示した(表1-2)。TCA回路の遮断は細胞内ATP/ADP比を低下させ、これによりATP要求性が増加し、解糖系へのアロステリック阻害が引き起こされず、glucose資化速度の維持を引き起こしたと考えらえる。gltA発現制御に伴ってAcetete生産性が増強されたのは、また、1分子のAcetate生産に伴い１分子のATPが生成されることに起因すると考えられる。このようなglucose資化性とAcetate生産性の向上は、電子伝達系でのATP生産を担うF1-ATPase活性を欠損させたΔatpA株においても確認されている(Noda et al., 2006)。
【００５５】
TCA回路への代謝流束制御によって増大した細胞内Acetyl-CoAが物質生産の生産性向上に応用可能であることを実証するため、Isopropanol生産大腸菌に上記のシステムを導入した。IsopropanolはAcetyl-CoAを前駆体として、大腸菌内に構築した合成代謝経路によって生産可能なアルコールである(Hanai, 2008)。Isopropanol生産系遺伝子群はIPTGによって発現誘導される。すべての株がIPTG添加に伴ってIsopropanolを生産した。Acetate生産の場合と同様に、IPTGを対数増殖期初期(0, 6, 9)に添加した場合、Isopropanol生産量は増大し、TA1424の3.3-3.7倍に達した。対数増殖期中期 (12 h)にIPTGを添加した場合もIsopropanol生産量は向上したが、最終生産量はTA1414の2.2倍(30.7 mM)にとどまった。IPTG添加を対数増殖期後期(15 h)に行った場合では、Isopropanol生産系遺伝子群の発現誘導がTA1414より9 h遅れたにもかかわらず、最終生産量はTA1424と同等(1.1倍、15.2 mM)であり、対glucose収率はTA1414の2.8倍に達した。Acetate生産の場合と異なり、0 hでIPTGを添加した場合のIsopropanol生産株の対数増殖期における比増殖速度は、著しく低下した(3-29hにおいて0.088 g g DCW-1 h-1 ,TA1414比=25%)。その他のgltA発現制御をともうIsopropanol生産株TA1415 (TA1357/pTA147)の比増殖速度はTA1424(TA1414/pTA147)比で98-108%であり、比増殖速度への影響はほとんど見られなかった(表1-3)。Isopropanol比生産速度はTA1424に比べて向上しており、対数増殖期初期の6,9 hにIPTGを添加した場合では、対数増殖期(6-22h)における比生産速度はTA1414の2.6-2.9倍に向上し、定常期(22-56 h)においてもTA1414比3.7-4.2倍に向上した(表1-3)。対数増殖期初期であるが、0 hからIPTGを添加した場合は増殖速度の低下が大きく、0-22 hではIsopropanol生産がほとんど見られなかったが、それ以降は菌体密度が増加し、22-56 hにおける比生産速度はTA1414の7.2倍にまで向上した(表1-3)。Acetate生産時とは異なり、IPTG添加によってIsopropanol生産経路が誘導させるため、最少培地では、これらの酵素の発現が生育にとって負担になったものと考えられる。以上の結果から、gltA発現制御によるTCA回路の遮断は対数増殖期におけるIsopropanol生産性増大とともに、菌体増殖が停止した定常期においてもその効果が大きいことが明らかになった。
【００５６】
従来、代謝工学的では、競合経路に関わる遺伝子をゲノム上から取り除き、同時に生産経路に関わる遺伝子発現をアップレギュレートすることで、生産性向上が図られてきた。競合経路の削除は、ゲノム上から完全に関連遺伝子を欠損させるものであり、培養状況に応じて標的遺伝子の発現状態を最適化できるものではなかった。そのため、本研究で対象としたgltAのように、その欠損が菌体増殖に不利な遺伝子は、たとえ生産性向上に寄与することが理論的に明らかであっても、遺伝子改変を実用化することはできなかった。一方で、生産経路に関わる遺伝子のアップレギュレートは、IPTGの添加などによって培養期間の任意のタイミングで誘導することで、中間代謝物や酵素の発現が菌体増殖に及ぼす悪影響を最小限に抑えられてきた。生産経路関連遺伝子のようなオフからオンへの発現制御と同様に、遺伝子発現のオンからオフへの発現制御が可能であれば、十分な菌体を得るまでは遺伝子発現を維持し、その後生産に競合する経路としてその発現を抑えることが出来る。これを実現するため、我々は人工遺伝子回路を用いた生育必須遺伝子のオン-オフ制御に取り組んだ。
【００５７】
近年、合成生物学分野において研究が盛んである人工遺伝子回路は、振動やトグルスイッチのような生物本来の遺伝子発現制御システムに倣って設計された、標的遺伝子の発現動態の人為的制御ツールとして注目されており、代謝工学分野への応用も期待されている。生産関連遺伝子の発現制御に関しては、既に組換え大腸菌を用いた脂肪酸エステル生産において、Fatty Acyl CoAを対象としたセンサーシステムと制御モジュールを統合した人工遺伝子回路を用いて、生産性の向上がなされている(Zhang et al., 2012)。また、中央代謝経路を対象として遺伝子発現のオン-オフ制御を試みた人工遺伝子回路の報告もあるが、これは実際の物質生産経路に適用されていない(Callura et al., 2012)。中央代謝経路の代謝流束をドラスティックに切り替える試みは、代謝流束(炭素の流れ)を物質生産に集中させ生産性を向上させるために有用な手段だと考えられるが、未だその効果は検証されていなかった。特に我々は、菌体増殖期以降において余剰となる中央代謝経路の代謝流束を物質生産経路へと集中させることが出来れば、様々な物質生産系において幅広く応用可能な全く新しい戦略を確立できることから、そのインパクトは非常に大きいと考えた。本研究では、TCA回路への代謝流束制御に取り組み、菌体増殖系と物質生産系のトレードオフ関係を代謝レベルで適切にマネージメント(切り替え)することによって、Acetyl-CoAを前駆体とするIsopropanol生産の生産性を飛躍的に向上させるに成功した。これまで、菌体増殖と物質生産経路のトレードオフ関係を解消するため、遺伝子発現制御を介した代謝の最適制御を実現する試みはなされていなかった。本研究は、従来大規模な培養条件変更に依存していた物質生産期における菌体増殖の抑制を、人工遺伝子回路を用いた直接的・局所的・動的な制御によって実現した先鋭的な取り組みである。今後は最適なgltA発現量、CS活性などのチューニングや回路の応答性を強化することで、更なる生産性の向上が期待される。
【００５８】
代謝流速制御に向けた合成生物学的ツールは、その開発が多様化しており、sRNAを用いた遺伝子発現サイレンシング(Na et al., 2013)、ネガティブフィードバック機構を応用したダイナミックメタボリックバルブ(Solomon et al., 2012)、特定の代謝物に応答する転写制御因子の開発など(Zhang et al., 2012)、次々に新たな取り組みが報告されている。今後は、こういった技術の発展が生物物質生産実現のカギとなると考えられるが、実際の培養条件下における長期生産試験や特定の標的生産物の生産性向上に実際に適用していかなければ、実問題に適したパラメータのチューニングが達成されない。工学的応用に向けた人工遺伝子回路の開発には、これまでの人工遺伝子回路の開発とは異なるスタンスでの取り組みが求められる。本研究は、人工遺伝子回路を介した代謝流束制御を目的物質生産の生産性向上に適用(実装)し、実際の物質生産条件下での長期培養においてその有用性を検証した数少ない研究例である。また、本研究は、TCA回路以外の中央代謝経路の代謝流束制御にも応用可能な汎用性の高い新規な代謝工学的手法であり、他の重要な標的代謝物生産においてもその応用が期待される。
【００５９】
〔参考文献〕
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Atsumi, S., Liao, J. C., 2008b. Directed evolution of Methanococcus jannaschii citramalate synthase for biosynthesis of 1-propanol and 1-butanol by Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7802-7808.
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【００６０】
［実施例２：遺伝子トグルスイッチを用いたgltA発現制御株におけるIsobutanol生産性の向上］
〔本実施例の目的〕
本研究において、遺伝子トグルスイッチを用いて培養途中にgltAの発現をオンからオフに制御したTA1357_IPTG(+)では、Ctrl (TA1414)に比べてTCA回路の初発反応であるCS活性の低下と細胞内Citrate濃度の減少が確認された(Soma et al, 2014)。一方でこのTA1357_IPTG(+)では、TCA回路の上流に位置するPyruvateおよびAcetyl-CoAが細胞内に蓄積し、Acetyl-CoA濃度上昇に伴い細胞外にAcetateの蓄積が見られた。そこで本実施例では、Acetyl-CoAをAcetateに変換する酵素遺伝子であるptaをノックアウトすることで、Acetyl-CoAからAcetateを生産する余分な代謝流束を遮断し、さらなるPyruvateの蓄積を目的とした。また、Pyruvateの蓄積が同化合物を起点として様々な有用化合物を生産する上で有用であることを実証するため、上記のシステムをIsobutanol生産大腸菌に導入しIsobutanol生産性を評価することで、遺伝子トグルスイッチを用いた代謝流束制御の有用性を検証した(図2-1)。
【００６１】
〔方法〕
1. 培養条件
菌体の培養には、M9培地(6.0 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 1.0 g/L NH4Cl, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2) を使用し、36 g/L Glucose, 5 g/L Yeast extract, 1 ml/L A5 trace metals mix (2.9 g/L H3BO3, 1.8 g/L MnCl2・4H2O, 0.22 g/L ZnSO4・7H2O, 0.39 g/L Na2MoO4・2H2O, 0.079 g/L CuSO4・5H2O, 0.050 g/L CO(NO3)2・6H2O), 100μg/mL Ampicillin, 40μg/mL Chloramphenicol, 100μg/mL Spectinomycinをそれぞれ添加した。前培養ではM9培地を3 mL加えた試験管に菌株を添加し、37℃、250 rpmで振とう培養した。本培養では、M9培地を20 mL加えた300mLスクリューキャップ式三角フラスコに前培養液を1 % (v/v) で継代し、37℃、250 rpmで振とう培養した。培養開始3時間後において、0.1 mM IPTGを添加し、以降は30℃、250 rpmで振とう培養した。pHは、10 N KOHを使用し6.8付近に調整した。
【００６２】
2. 菌株およびプラスミド
構築した菌株およびプラスミドを表2に示す。Wild TypeにはBW25113 (Datsenko and Wanner, 2000)を使用し、プラスミドを保持するケミカルコンピテントセルには、プラスミドがSpectinomycin耐性遺伝子を持つ場合にはXL10-Gold(Agilent technologies, Santa Clara, USA)、その他のプラスミドにはDH5alphaZ1(Lutz and Bujard, 1997)を使用した。BW25113 ΔlacI ΔgltA Δpta株の構築にあたって、gltAとptaの両遺伝子破壊による致死を防ぐため、まずBW25113 ΔlacI株であるTA1015およびBW25113 ΔlacI ΔgltA株であるTA1184に、LacI Repressor source(pTA216)とSwitching Plasmid (pTA1065, pTA965) を導入したTA2115, TA1979を構築した。この際、Switching Plasmidの耐性遺伝子を従来のKanamycin耐性遺伝子から、Spectinomycin耐性遺伝子に変更した。次にこれらをJW2294(Baba et al, 2006)を用いたP1 transduction(Datsenko and Wanner, 2000)によりゲノム上のptaを破壊したTA2122, TA1988を構築した。そして、pCP20を用いたFLP-promoted recombination(Datsenko and Wanner, 2000)により、P1 transductionの際に目的遺伝子の代わりに導入されるKanamycin耐性遺伝子を取り除き、TA2155, TA2012を構築した。
【００６３】
【表２】
2015154768.tif 000006
【００６４】
本実施例において用いたプラスミドについて、pTA965, pTA1065は、pZS4Int-lacIからSpectinomycin耐性遺伝子を制限酵素サイトSacIとAatIIにより断片化し、これを制限酵素サイトSacIとAatIIによりそれぞれpTA669, pTA695に導入して作製した。pTA1167は、pZE12lucからAmpicillin耐性遺伝子を制限酵素サイトSacIとAatIIにより断片化し、これを制限酵素サイトSacIとAatIIによりpZE21-MCSに導入して作製した。これまでIsobutanol生産大腸菌として、Pyruvateを起点にalsS, ilvC, ilvD, kivd, yqhDの酵素遺伝子が触媒する5段階の合成代謝経路(図2-1) によりIsobutanolを生産した例が報告されている(Atsumi et al, 2010)。そこで、本実施例では、これらの遺伝子を含むハイコピープラスミドを構築し、IPTG添加によりIsobutanol生産系遺伝子をオフからオンに制御した。このプラスミドの構築にあたりpTA1327は、pSA150からプライマーT2134 (5'-GCCAT CGGTA CCATG TATAC AGTAG GAGAT TACCT ATTAG ACCGA TTACA CG-3')（配列番号9）とT1634(5'- ATTGG ATCCT TAGCG GGCGG CTTCG TATAT ACG-3')（配列番号10）を用いたKOD PCRによりkivd, yqhDを増幅し、これを制限酵素サイトAcc65IとBamHIによりpTA1167に導入して作製した。pTA1339は、pSA126からプライマーT2136 (5'-GCCAT CGGAT CCATT AAAGA GGAGA AAGGT ACCAT GTTGA CAAAA-3')（配列番号11）とT2137 (5'-GCCAT CACGC GTTTA ACCCC CCAGT TTC-3')（配列番号12）を用いたKOD PCRによりalsS, ilvC, ilvDを増幅し、これを制限酵素サイトBamHIとMluIによりpTA1327に導入して作製した。
【００６５】
〔実験結果〕
1. Δpta株におけるgltA発現制御によるPyruvate蓄積量の増大
ptaをノックアウトした菌株において、遺伝子トグルスイッチによりgltAを発現制御することで、Pyruvate蓄積量が増加するかを確認した。菌株にはCtrlであるTA2367、Δpta株であるTA2368、Δpta株においてgltAを発現制御したTA2370を用い、これらをM9培地において回分培養した。その際、本培養において培養開始3時間後にIPTGを添加し (TA2370においてはIPTGを添加しないものも実施)、菌体増殖、Glucose消費、細胞外PyruvateおよびAcetate濃度を測定した。菌体増殖について、CtrlであるTA2367では最終菌体密度がOD600=6.5であったのに対し、ptaをノックアウトしたTA2368およびTA2370ではOD600=5.6付近と最終菌体密度の減少が見られた (図2-2-A)。また、Glucose消費速度は、各菌株間に顕著な差は見られなかった(図2-2-B)。細胞外Pyruvate濃度は、培養開始15時間後以降濃度が一定となり、培養開始27時間後においてTA2367_IPTG3hが3.8 mM、TA2368_IPTG3hが57.1 mM、TA2370_IPTG3hが76.3 mM、TA2370_IPTG(-)が48.5 mMであった(図2-2-C)。特に、TA2370_IPTG3hでは、Pyruvateの蓄積がTA2368_IPTG3hに比べ34%、TA2370_IPTG(-)に比べ57%増加していることが確認された。このことより、Δpta株においてgltAの発現を動的に制御することで、Pyruvateの蓄積量の増加が可能であることが確認された。一方で細胞外Acetate濃度は、TA2370_IPTG3hにおいて培養開始9時間後以降から顕著に増加し、培養開始27時間後において88.6 mMであり、これはTA2368_IPTG3h(53.3 mM) に比べ66%増加していた(図2-2-D)。このAcetateは、余剰のPyruvateを利用し、大腸菌の内在性の酵素反応により生産されているのではないかと考えられる。これより、このAcetateの蓄積を解消することで、Pyruvateのさらなる蓄積が期待される。
【００６６】
2. Δpta-gltA発現制御株におけるIsobutanol生産性の向上
Δpta株においてgltAの発現を動的に制御することで、Pyruvateの蓄積量を増加させることに成功した。そこで、このPyruvateを利用した物質生産のテストケースとして、同化合物を起点として生産可能なIsobutanolを生産する合成代謝経路を保持するプラスミド(pTA1339) を導入し、その生産性を比較した。菌株には、CtrlであるTA2788、Δpta株であるTA2925、Δpta株においてgltAを発現制御したTA2790を用い、これらをM9培地において回分培養し、Isobutanol生産実験を行った。その際、本培養において培養開始3時間後にIPTGを添加し、菌体増殖、Glucose消費、細胞外PyruvateおよびAcetate濃度、Isobutanol濃度を測定した。菌体増殖について、CtrlであるTA2790_IPTG3hのみ最終菌体密度がOD600=5.7とほかの2株のOD600=6.2に対して多少の最終菌体密度の減少が見られた(図2-3-A)。Glucose消費速度は、各菌株間に顕著な差は見られなかった(図2-3-B)。細胞外Pyruvate濃度は、培養開始3時間後にTA2925_IPTG3hにおいて10 mM程度の蓄積が見られたが、その後は速やかに再資化され、各菌株において細胞外に蓄積は見られなかった (図2-3-C)。Acetate濃度は、CtrlであるTA2790_IPTG3hでは培養開始27時間後において31.0 mM蓄積が見られたが、その他の菌株については10 mMであった(図2-3-D)。Isobutanol生産量は、TA2788_IPTG3hでは80.9 mM、TA2925_IPTG3hでは94.4 mM、TA2790_IPTG3hでは104.3 mMであった(図2-3-E)。特に、TA2790_IPTG3hでは、TA2925_IPTG3hよりもIsobutanol生産量が10%増加し、その増加分は9.9 mMであった。これは、Isobutanol生産系を持たないΔpta-gltA発現制御株 (TA2370) とΔpta株(TA2368)とのPyruvateの蓄積量の差 (19.2 mM) を、2分子のPyruvateから1分子のIsobutanolが生産される物質収支の関係から半分にした9.6 mMとほぼ同等である。これより、Δpta株におけるgltAの発現の動的制御により蓄積するPyruvateを利用することでIsobutanolの生産量が向上し、遺伝子トグルスイッチを用いた代謝流束制御による物質生産性の向上の可能性が示された。
【００６７】
〔参考文献〕
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【００６８】
［実施例３］
トグルスイッチを用いて中央代謝経路への代謝流束を抑え、物質生産経路への代謝流束を向上させる例として、gltA制御によるIsopropanol生産に加え、gapA制御による3-ヒドロキシプロピオン酸の生産を行った。3-ヒドロキシプロピオン酸（3-HP）はグリセロール→3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド→3-HPといった2つの反応によって生成される。グリセロールは、グリセロール→グリセロール3-リン酸→ジヒドロキシアセトンリン酸→グリセルアルデヒド3-リン酸となり解糖系へと入る。そこで、グリセルアルデヒド3-リン酸から1,3-ビスホスホグリセリン酸への反応を触媒するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（gapA）の発現を培養途中から抑えることで、グリセロールを基質とした大腸菌による3-ヒドロキシプロピオン酸の生産性が向上するかを確認した。
【００６９】
〔材料及び方法〕
1. 培地および増殖条件
E. coli株は100 mM glycerol, 0.05% (w/v) yeast extractおよび10 ppm thiamin hydrochlorideを含むM9 最小限培地で増殖させた。前培養は37℃、rotary shaker (250 rpm)で行い、メイン培養は37℃、rotary shaker(150 rpm)、暗条件、24時間行った。一晩経過した前培養を、600 nm(OD600)での初期濁度が0.05となるように、新鮮M9培地25mlを含む300ml buffled flaskへ希釈した。0.1 mM IPTGおよび2 uM cyanocobalaminを所定の時刻(0, 3, 6 or 9 h)に加えた。すべての培地に適切な抗生物質が補填された。
【００７０】
2. 株およびプラスミド
Plasmid pTA695(表3-1)の抗生物質耐性遺伝子をkanamycinからspectinomycinへ入れ替えた。PZS4Int-laci/tetR(表3-1)からの、AvrIIおよびSacIで消化したSpectinomycinをコードするフラグメントをpTA695へライゲートし（坑性物質耐性遺伝子なし）、これをAvrIIおよびSacIで消化して、ゲルで純化し、プラスミドpTA1065とした。gapAをE. coli BW25113 ゲノムからプライマーセットT1551(5’ GCCATCGGATCCATGACTATCAAAGTAGGTATCAACGGTTTTG)（配列番号13）-T1704 (GCCATCACGCGTTTAAGCTGCTAAAGCGTAGTTTTCGTCGTTTGCTGCTTTGGAGATGTGAGCGATCAGGTC)（配列番号14）を用い、PCRで増幅した。C末端にLAAを付加してタグ化し、BamHIおよび MluIで消化し、pTA695へクローン化し、プラスミドpTA958とした。pTA1065の場合と同様にpTA958の抗生物質耐性遺伝子をkanamycinからspectinomycinへ入れ替え、プラスミドpTA1335とした。
【００７１】
pTA839は次のように構築した。dhaB1, dhaB2およびdhaB3(Genbank: AB859215.1)ならびにgdrAおよびgdrB(Genbank: U30903.1)をE. coliにとってコドンが最適化されるように化学合成した(Epoch Biolabs, Missouri City, TX)。dhaB2およびdhaB3は2つの遺伝子によって配されたRBSで単一のフラグメント(dhaB2+3)として合成した。クローンdhaB1, dhaB2+3, gdrAおよびgdrBに対し、pTA43中のAcc65I-SalI(dhaB1), SalI-ClaI(dhaB2+3), ClaI-HindIII(gdrA)およびHindIII-BamHI(gdrB)認識配列を使用した。dhaB1を、PCRによりプライマーT811 (5’ GCCAT  CGGTA CCATG AAACG TAGCA AACGC TTCGC)（配列番号15）およびT812 (5’ GCCAT CGTCG ACTTA TTCGA TGGTG TCCGG CTGC) （配列番号16）を用いて増幅した。PCR産物をAcc65IおよびSalIで消化した。dhaB2+3を、PCRにより、プライマーT1123 (5’ GGGGC CATCG TCGAC GAAGG AGATA TACAA TGCAA CAAAC GACCC AAATC CAACC)（配列番号17）およびT1124(5' CCCAT CGATT CAGGA GCCCT TGCGC AACTT GTG)（配列番号18）を用いて増幅した。PCR産物をSalIおよびClaIで消化した。gdrAを、PCRにより、プライマーT815(5' GCCAT CATCG ATGAA GGAGA TATAC ATATG CCACT GATTG CTGGT ATTGA CAT)（配列番号19）およびT816(5' GCCAT CAAGC TTTTA GTTTG CCTGA CCAGC CAGC)（配列番号20）を用いて増幅した。PCR産物を、ClaIおよびHindIIIで消化した。gdrBを、PCRにより、プライマーT817(5' GCCAT CAAGC TTGAA GGAGA TATAC ATATG TCTCT GTCTC CACCA GGTGT TCG)（配列番号21）およびT1261(5' CCCGG ATCCT TAGTT ACGTT CGCTC AGTGG CAGTA CC)（配列番号22）を用いて増幅した。
【００７２】
pTA867は、次のように構築した。araE(GenBank: AB241137)をE. coliにとってコドンが最適化されるように化学合成した (DNA2.0, Menlo Park, CA)。araE、PCRによりプライマーT1549(5' GCCAT CGGAT CCGAA GGAGA TATAC ATATG GCGAA CGTGA CCTAC ACCG)（配列番号23）およびT1550(5' GCCAT CACGC GTTTA TACTG CCATG ACCGT CACGC T) （配列番号24）を用いて増幅した。PCR産物を、BamHIおよびMluIで消化し、クローニングのため、pTA839のBamHI-MluIサイトへ挿入した。PCR産物をHindIIIおよびBamHIで消化した。BamHI siteのpTA867へTtrp-pLlacO1をインサートするため、フラグメントをプライマーT1856(5' GCCATCGGATCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTGACATTG)（配列番号25）およびT2008(5' GCCATCGGATCCGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCTTGTTATCCGCTCACAATGTCAATTGTTATCCGCTCACA)（配列番号26）を用いて増幅した。10 pmolのプライマーをアニールし、そしてDNAポリメラーゼで伸長した。得られたフラグメントをBamHIで消化し、そして同様にBamHIで消化したpTA867にクローン化し、プラスミドpTA1196とした。
【００７３】
菌株はDr. Nakahigashiから贈与されたBW25113 ΔgapA(TA367)およびJW0336(ΔlacI)により構築した。plasmid pCP20(TA386)を用い、TA367のkanamycin耐性遺伝子を除去した。pTA1335およびpTA216を、gapA(TA2732)発現のためTA386へ導入した。TA2732のlacI 遺伝子除去をJW0336をドナー株として用いたP1 transductionにより実施した。得られた株のkanamycin耐性遺伝子をTA367の場合と同様に除去し、TA2814株を得た。
【００７４】
3. 分析方法
細胞密度は、Infinite M200 PRO(TECAN, Mannedorf, Switzerland)を用い、600 nm(OD600)での吸光度を測定することにより決定した。Glycerolおよび1,3-propanediol(1,3-PDO) は、糖化合物分析のためのHPLCにより定量した。3-HPおよびAcetateは、上述した有機酸化合物分析のためのHPLCを用いて定量した。
【００７５】
【表３−１】
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【００７６】
〔実験結果〕
1. gapA発現制御による3-ヒドロキシプロピオン酸生産性の向上
gapA発現制御とそのタイミングが菌体増殖およびグリセロール代謝に及ぼす影響を確認した（表3-2）。3-HP生産プラスミドを導入したgapA発現制御株（TA2821）をフラスコにて培養し、培養開始後0, 3, 6, 9 hにIPTGを添加し、gapAの発現抑制のタイミングを変化させた。0 hにIPTGを添加したものでは顕著な菌体密度と比増殖速度の低下が確認され、3 hに添加したものでも低下が見られた。9 hに添加したものではgapAの発現制御を行わないコントロール株（TA2463）とほぼ同等であったが、6 hに添加したものは菌体密度、比増殖速度ともコントロールと比べて10%程度の上昇が見られた。コントロール株の3-HP生産量は22.1±2.3 mMであったが、培養初期の0 h, 3 hにIPTGを添加したものではそれぞれ6.58±0.18 、18.8±0.90 mMとコントロール株を下回った。これらは収率ではコントロール株や6 h, 9 hにIPTGを添加したものを上回るものの、菌体密度が低く、グリセロール消費量も少ないため、生産量が伸びなかったと考えられる。一方、6 h, 9 hにIPTGを添加した場合は3-HP生産量がそれぞれ28.7±0.95、31.6±0.41 mMとコントロールと比べて1.3、1.4倍となった。特に9 hに添加した場合は菌体密度と比増殖速度がコントロールとほぼ同等であるにもかかわらず収率、最大生産速度がそれぞれコントロールの1.3、1.5倍となった。
【表３−２】
2015154768.tif 000008
【図１−１】
2015154768.tif 000009
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
2015154768.tif 000013
【図２−１】
2015154768.tif 000014
【図２−２】
2015154768.tif 000015
【図２−３】
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【配列表】
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