(57)【要約】【課題】高い水分散性を有するコルチゾール・アルブミン結合体及びその製造方法、並びに測定の再現性が良好であるコルチゾールの測定方法及びコルチゾール測定用基板及びキットを提供すること。【解決手段】コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物と、縮合剤及びカルボン酸活性化試薬とを反応させて、コルチゾール活性エステル体を製造する工程（１）と、アルブミンとコルチゾール活性エステル体とを反応させる工程（２）、とを含む、アルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体を製造する方法であって、アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比が１５〜３０であり、アルブミンに対する縮合剤のモル比が７０〜１５０である、コルチゾール・アルブミン結合体の製造方法、及び製造方法により製造されるコルチゾール・アルブミン結合体、コルチゾール・アルブミン結合体を用いたコルチゾールの測定方法、並びに、コルチゾール測定用基板及びコルチゾール測定用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物と、縮合剤及びカルボン酸活性化試薬とを反応させて、コルチゾール活性エステル体を製造する工程（１）と、
アルブミンと前記コルチゾール活性エステル体とを反応させる工程（２）、
とを含む、アルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体を製造する方法であって、
前記アルブミンに対する前記コルチゾール活性エステル体のモル比が１５〜３０であり、前記アルブミンに対する前記縮合剤のモル比が７０〜１５０である、コルチゾール・アルブミン結合体の製造方法。
【請求項２】
前記コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物が一般式（１） で表わされる化合物である、請求項１に記載の製造方法。
【化１】
2015163865.tif 000011
式中、Ｌ１は連結基を表す。 
【請求項３】
アルブミンに対するコルチゾールの結合数が８〜１３である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アルブミンに対する前記縮合剤のモル比が９０〜１３０である、請求項１から３の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記アルブミンに対する前記コルチゾール活性エステル体のモル比が２０〜２５である、請求項１から４の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記縮合剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド又はその塩酸塩である、請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記カルボン酸活性化試薬がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載の方法で製造される、コルチゾール・アルブミン結合体。
【請求項９】
５ｍｇのコルチゾール・アルブミン結合体を１ｍＬのリン酸緩衝液に溶解した場合の分散度が９０％以上である、請求項８に記載のコルチゾール・アルブミン結合体。
【請求項１０】
表面に金属膜を有し、金属膜上に請求項８又は９に記載のコルチゾール・アルブミン結合体が固定化されている、コルチゾール測定用基板。
【請求項１１】
請求項１０に記載のコルチゾール測定用基板、及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を含む、コルチゾール測定用キット。
【請求項１２】
請求項１０に記載のコルチゾール測定用基板に、コルチゾールを含む被検試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を接触させ、抗原抗体反応により抗コルチゾール抗体と、コルチゾール・アルブミン結合体のコルチゾールとを結合させる工程（３）、及び
基板に結合した抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子に基づく蛍光を測定する工程（４）、
とを含む、被検試料中のコルチゾールを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾールの免疫測定に用いることができる、コルチゾール・アルブミン結合体の製造方法および同製造方法で得られるコルチゾール・アルブミン結合体に関し、更に、結合体を用いたコルチゾール測定用基板および同キット並びにコルチゾールの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、酵素及び無機化合物等を定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する被検物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって被検物質の存在を確認する方法である。また、被検物質が蛍光体でない場合には、蛍光色素で標識されて被検物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合、即ち被検物質の存在を確認することも広くなされている。
【０００３】
このような蛍光検出法において、検出の感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させる。励起光の照射により金属層に表面プラズモンが発生し、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上することとなる。このような表面プラズモン励起による蛍光検出法（以下、「ＳＰＦ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」とする）に対して、約１０倍の信号増強度が得られ、高感度に測定することができる。
【０００４】
副腎皮質ホルモンの一種であるコルチゾールは、炭水化物、脂肪、およびタンパク代謝を制御する糖質コルチコイドの一種である。３種の糖質コルチコイドの中でも、コルチゾールは生体内の量が最も多い。コルチゾールはストレスによっても分泌が上昇することが知られており、その分泌量によっては、血圧や血糖値の上昇又は免疫機能の低下などの作用が生じる場合がある。また、コルチゾール（ヒドロコルチゾンとも称する）は、ステロイド系抗炎症薬として臨床的に使用されており、例えば、急性炎症、慢性炎症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、ショック、痛風、急性白血病、移植片拒絶反応などの治療に使用される場合がある。コルチゾールの免疫学的測定方法としては、前述のプラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
低分子化合物であるコルチゾールを測定する際には、カルボキシル基を活性化する試薬を用いたアミド化反応によるアミンカップリングを利用することによって、コルチゾールとアルブミンとを結合させたコルチゾール・アルブミン結合体を調製することが行われている。
【０００６】
例えば、特許文献２には、縮合剤として、コルチゾール−２１−ヘミサクシネートナトリウム塩にイソブチルクロロフォルメートを用いて牛血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を、縮合剤／コルチゾールのモル比が、０．６で結合させることが記載されている。特許文献３には、コルチゾール類似化合物である１７α−ヒドロキシプロゲステロン−１１−ヘミサクシネートに対してイソブチルクロロカーボネートを使用して、１７α−ヒドロキシプロゲステロン−１１−ヘミサクシネート−ＢＳＡを製造することが記載されている。特許文献４には、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルの形態で活性化させたコルチゾール−３−カルボキシメチルオキシム異性体にＢＳＡを反応させて結合させることが記載されている。特許文献５には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ：Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｉｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とを用いて、コルチゾール−３−カルボキシメチルオキシムにＢＳＡを結合させることが記載され、縮合剤／コルチゾールのモル比が、１．６の結合体が記載されている。
【０００７】
特許文献６には、コルチゾールを高感度で免疫学的に測定する方法が記載されている。特許文献６では、先ず、ＮＨＳ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド試薬を用いたアミド化反応によるアミンカップリングを利用することによって、コルチゾールとアルブミンとを一定の割合で結合させたコルチゾール・アルブミン結合体が調製される。得られたコルチゾール・アルブミン結合体を固定化した基板に対して、抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子と、被検物質であるコルチゾールとを接触させることによって、抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子に対して、基板上のコルチゾール（コルチゾール／アルブミン結合体中のコルチゾール）と被検物質であるコルチゾールとを競合的に結合させる。この後、基板に結合した抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子に基づく蛍光を測定することによって、臨床的に意義のあるコルチゾール濃度領域（即ち、２〜３０μｇ／ｄＬ）においてコルチゾールを高感度で免疫学的に測定することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１９０８８０号公報
【特許文献２】特開昭５９−８８４２８号公報
【特許文献３】特開平３−１５０４６４号公報
【特許文献４】特開平８−３３３３９８号公報
【特許文献５】特開２０１１−１４８８２１号公報
【特許文献６】特開２０１３−８３６３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の通り、低分子化合物を生体高分子（例えば、ＢＳＡ）に標識するための一般的な手法としてアミンカップリング法が知られており、例えばＮＨＳ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド試薬を用いたアミド化反応が使用されている。このアミド化反応は、水中で行うため、アミド結合形成とＮＨＳ活性エステルの加水分解反応が競合するため、通常は過剰量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びＮＨＳを添加する態様で反応させている。しかし、上記のような条件下では、目的のポリハプテンであるコルチゾール・アルブミン結合体の生成と同時に、生体高分子（例えば、ＢＳＡ）間を架橋する反応も競合し、難水溶解性の凝集物も同時に生成し、コルチゾール・アルブミン結合体の水への分散性が悪化してしまうため、製造収率を高めるために、この難水溶解性凝集物の生成を回避して、水への分散性の良好なコルチゾール・アルブミン結合体を高収率で生成する方法が望まれている。また、簡易で高感度にコルチゾールを測定する方法として、表面プラズモン励起による蛍光検出法が知られているが、特に再現性の高い測定方法が望まれている。
【００１０】
本発明は、高い水分散性を有するコルチゾール・アルブミン結合体及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、測定の再現性が良好であるコルチゾールの測定方法及びコルチゾール測定用基板並びに同キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アルブミンに対して縮合剤およびコルチゾール活性エステル体をそれぞれ所定の範囲のモル比で使用して反応させることによって、特定のコルチゾール・アルブミン比を有し、高い水分散性を有するコルチゾール・アルブミン結合体を製造できること、そして本発明のコルチゾール・アルブミン結合体を用いてコルチゾールの測定を行うことで、測定の再現性が良好であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明によれば、
コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物と、縮合剤及びカルボン酸活性化試薬とを反応させて、コルチゾール活性エステル体を製造する工程（１）と、
アルブミンとコルチゾール活性エステル体とを反応させる工程（２）、
とを含む、アルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体を製造する方法であって、
アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比が１５〜３０であり、アルブミンに対する縮合剤のモル比が７０〜１５０である、コルチゾール・アルブミン結合体の製造方法、が提供される。
【００１３】
好ましくは、コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物が一般式（１）で表わされる化合物である。
【００１４】
【化１】
2015163865.tif 000002
【００１５】
式中、Ｌ１は連結基 を表す。
【００１６】
好ましくは、アルブミンに対するコルチゾールの結合数は８〜１３である。
好ましくは、アルブミンに対する縮合剤のモル比は９０〜１３０である。
好ましくは、アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比は２０〜２５である。
好ましくは、縮合剤が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはその塩酸塩である。
好ましくは、カルボン酸活性化試薬がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【００１７】
さらに本発明によれば、本発明の方法で製造される、コルチゾール・アルブミン結合体が提供される。
本発明のコルチゾール・アルブミン結合体は、好ましくは、５ｍｇのコルチゾール・アルブミン結合体を１ｍＬのリン酸緩衝液に溶解した場合の分散度が９０％以上である。本発明における分散度とは、水へ分散させた場合に沈降が生じないコルチゾール・アルブミン結合体５ｍｇを１ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ、和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５、ｐＨ７．１〜７．３）に溶解し、遠心分離した後の上澄み液を採取して２５℃の条件で、２８０ｎｍの吸光度を分光光度計を用いて測定する。この吸光度に対して、同様にして各々作製したコルチゾール・アルブミン結合体の分光光度計で測定した吸光度の百分率で表した値を分散度として定義する。
【００１８】
さらに本発明によれば、表面に金属膜を有し、金属膜上に本発明のコルチゾール・アルブミン結合体が固定化された、コルチゾール測定用基板が提供される。
さらに本発明によれば、表面に金属膜を有し、金属膜上に本発明のコルチゾール・アルブミン結合体が固定化された基板、及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子、を含む、コルチゾール測定用キットが提供される。
さらに本発明によれば、表面に金属膜を有し、金属膜上に本発明のコルチゾール・アルブミン結合体が固定化されたコルチゾール測定用基板に、コルチゾールを含む被検試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を接触させ、抗原抗体反応により抗コルチゾール抗体と、コルチゾール・アルブミン結合体のコルチゾールとを結合させる工程（３）、及び
基板に結合した抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子に基づく蛍光を測定する工程（４）、
とを含む、被検試料中のコルチゾールを測定する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の製造方法によれば、高い水分散性を有するコルチゾール・アルブミン結合体を製造することができる。本発明の製造方法により製造されるコルチゾール・アルブミン結合体を用いることによって、再現性が良好であるコルチゾールの測定方法及びコルチゾール測定用基板及びコルチゾール測定用キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、コルチゾール・ＢＳＡ結合体の粒度分布の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は、下記の工程（１）及び（２）を含む、アルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体を製造する方法であって、アルブミンに対する縮合剤のモル比が７０〜１５０であり、アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比が１５〜３０である方法に関する。
コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物と、縮合剤及びカルボン酸活性化試薬とを反応させて、コルチゾール活性エステル体を製造する工程（１）；及び
アルブミンとコルチゾール活性エステル体とを反応させる工程（２）。
【００２２】
（コルチゾール）
コルチゾールは、以下の構造を有する糖質コルチコイドである。
【００２３】
【化２】
2015163865.tif 000003
【００２４】
（アルブミン）
本発明で用いるアルブミンの種類は特に限定されないが、例えば、動物（ウシ、ヒトなど）に由来するアルブミン、好ましくは動物（ウシ、ヒトなど）に由来する血清アルブミン、特に好ましくは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などを使用することができる。
【００２５】
（活性エステル）
本発明においては、コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物と、縮合剤及びカルボン酸活性化試薬とを反応させて、コルチゾール活性エステル体を製造する。コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物としては、好ましくは一般式（１）で示される化合物である。
【００２６】
式中、Ｌ１は連結基を表す。Ｌ１は、例えば、−Ｌ１１−Ｎ＝で示される連結基であり、−Ｌ１１−は、炭素数１から６のアルキレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−又はそれらの組み合わせからなる基を表す。
【００２７】
本発明においては、例えば、コルチゾールを、下記の化学式で示される（アミノオキシ）酢酸ヘミ塩酸塩等と反応させることにより、コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物であるコルチゾールオキシム誘導体を製造することができ、その後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）などの縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などのカルボン酸活性化試薬とを用いて、活性エステルを作製することができる。活性エステルとは、コルチゾールとＥＤＣなどの縮合剤やＮＨＳが反応した中間体を表しており、この中間体ができるアミド化反応は水中で進行するため、アミド結合形成とＮＨＳ活性エステルの加水分解反応が競合することになる。そのため通常は、ＥＤＣ等の縮合剤や、ＮＨＳ等のカルボン酸活性化試薬を大過剰に使用するが、コルチゾール・アルブミン結合体の生成反応と競合する架橋反応により生体高分子であるアルブミン同士の結合によって難水溶解性凝集物が生成してしまう。この凝集物の生成を抑制するために、アルブミンに対する縮合剤のモル比が７０〜１５０の比で、好ましくは９０〜１３０の比で反応を行うものである。縮合剤とアルブミンのモル比が、１５０以下であると、出来上がったコルチゾール・アルブミン結合体の比が１４以下となり、難水溶解性凝集物の生成が抑えられる結果、良好な水への分散性を確保することが可能となる。縮合剤とアルブミンのモル比が７０以上であると、コルチゾール・アルブミン結合体の比が７以上となり免疫アッセイ感度を維持することが可能となる。
【００２８】
【化３】
2015163865.tif 000004
【００２９】
なお、アルブミンに対する縮合剤のモル比が７０〜１５０であり、アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比が１５〜３０であることから、コルチゾール活性エステル体に対する縮合剤のモル比は、７／３〜１０／１の範囲内になる。
【００３０】
（縮合剤）
縮合剤は、付加脱離反応によってカルボン酸誘導体を合成するための反応試剤である。縮合剤として好ましく用いられる化合物としては、水溶性カルボジイミドが使用できる。水溶性カルボジイミドとしては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）又はその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネート等を挙げることができるが、ＥＤＣ又はＥＤＣ・ＨＣｌを使用することが好ましい。
【００３１】
（カルボン酸活性化試薬）
カルボン酸活性化試薬としては、ＮＨＳを使用することが好ましいが、ＮＨＳ以外にも例えば、特開２００８−０９６４１２号公報の段落番号００５６〜００７５に記載の含窒素化合物、又は特開２００８−０９６４１２号公報の段落番号００７６〜００７７に記載の電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することもできる。
【００３２】
（コルチゾール・アルブミン結合体）
コルチゾールの免疫測定の性能を維持し、かつ、水や有機溶媒への分散性を確保して、高い再現性を得るために、本発明では、アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比を１５〜３０に調整して混合し、コルチゾール・アルブミン結合体を作製するものである。アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比は、好ましくは２０〜２５である。この反応過程では、活性エステルの加水分解と、コルチゾール・アルブミン結合体の形成が同時に起こり、最終的に作製されるコルチゾール・アルブミン結合体のコルチゾール／アルブミン比は、アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比よりも低下する。アルブミンに対するコルチゾール活性エステル体のモル比が、３０以下であると、出来上がったコルチゾール・アルブミン結合体の比が１４以下となり、良好な水への分散性を確保することが可能となる。アルブミンに対する活性エステルのコルチゾールのモル比が１５以上であると、コルチゾール・アルブミン結合体の比が７以上となり免疫アッセイ感度を維持することが可能となる。
【００３３】
本発明では、最終的なコルチゾール・アルブミン結合体におけるアルブミンに対するコルチゾールの結合数は、７〜１４であり、好ましくは８〜１３であり、より好ましくは９〜１３である。アルブミンに対するコルチゾールの結合数を１４以下とすることにより、水あるいは有機溶媒への分散性を確保することができ、アルブミンに対するコルチゾールの結合数を７以上とすることにより、免疫測定の性能を維持することができる。
【００３４】
アルブミンに対するコルチゾールの結合数とは、分子数（モル数）の比を意味し、ＢＳＡ等のアルブミン１分子に対して結合しているコルチゾールの分子の数を意味する。アルブミンに対するコルチゾールの結合数は、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより決定することができ、具体的な測定手順は以下の通りであり、ここでは、アルブミンとしてＢＳＡを用いた場合について測定手順を記載する。コルチゾール・ＢＳＡ結合体サンプルを０．１質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液:アセトニトリル＝２／１(容量比)に溶解し、コルチゾール・ＢＳＡ結合体の濃度として、１ｍｇ／ｍＬに調整する。マトリックス（ＳＡ；シナピン酸）４μＬとサンプル１μＬを混ぜて、金プレート上に、１μＬ×４点着する。その後、サンプルを自然乾燥する。マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）型質量分析装置(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置)（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社品Ｖｏｙａｇｅｒ）に金プレート
を挿入し、１スポットごとに積算９００ショットを行い質量情報となるデータを取得（Ｎ＝４）する。コルチゾール・ＢＳＡ結合体に対応するピークの、ピーク強度の最大の値の５０％以上の強度を有する部分の面積の重心から垂直に降ろした位置をコルチゾール・ＢＳＡ結合体の分子量と見なして、Ｎ＝４の平均値をとり、（コルチゾール・ＢＳＡ結合体の分子量−ｎａｉｖｅ ＢＳＡの分子量）/ コルチゾール誘導体の分子量（４３５−１８＝４１７）でＢＳＡに対するコルチゾールの個数を計算する。
【００３５】
なお、市販のコルチゾール・アルブミン結合体としては、ＳＩＧＭＡ社のカタログ番号：Ｈ−２３８４  ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＩＳＯＮＥ  ３−（Ｏ−ＣＡＬＢＯＸＹ−ＭＥＴＨＹＬ）ＯＸＹＭＥ：ＢＳＡ（２６ｍｏｌ  ｓｔｅｒｏｉｄ／ｍｏｌ  ＢＳＡ）が市販されているが、コルチゾール／アルブミン比は２６であり、水や有機溶媒への分散性が低く、本発明の測定では、再現性の良い結果を得ることができなかった。
【００３６】
上記した本発明の製造方法で製造される、アルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体の分散度は９０％以上であることが好ましい。ここで、分散度とは、以下のように測定される。即ち、水へ分散させた場合に沈降が生じないコルチゾール・アルブミン結合体５ｍｇを１ｍＬのリン酸緩衝液(ＰＢＳ、和光純薬工業（株）製品、カタログ番号:１６６−２３５５５、ｐＨ７．１〜７．３)に溶解し、遠心分離した後の上澄み液を採取して、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製（島津製作所）紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０を用いて、２５℃において２８０ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度を基準とし、各々作製したコルチゾール・アルブミン結合体に対して同様に測定した吸光度の比として百分率で表した値を分散度として求める。好ましいコルチゾール・アルブミン結合体の分散度は９０％以上であり、更には、９５％〜１００％が好ましい。
【００３７】
本発明のコルチゾール・アルブミン結合体としては、コルチゾールとアルブミンとが直接結合しているものでもよいし、適当な連結基を介して結合しているものでもよいが、好ましくは、適当な連結基を介して結合しているものをあげることができる。例えば、後述の実施例に示すように、コルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物を製造し、このカルボキシル基をＥＤＣとＮＨＳなどを用いて活性化し、アルブミンのアミノ基と結合させることにより、コルチゾール・アルブミン結合体を製造することができる。
【００３８】
（粒度分布の測定方法）
本発明のコルチゾール・アルブミン結合体の粒度分布は、コルチゾール・アルブミン結合体の平均粒子径と標準偏差から、標準偏差を平均粒子径で割った変動係数として評価することができる。変動係数を測定する装置としては、粒径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を用いることが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株）製）、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所製）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株）製）、ＺＥＴＡ  ＳＩＺＥＲ（マルバーン社製）等が挙げられる。本発明では、ＺＥＴＡ
ＳＩＺＥＲ（マルバーン社製）を用いて、アルブミン濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように
ＰＢＳ（８００μＬ  和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５、ｐＨ７．２）で希釈し、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（ｄ＝５０）から、平均粒子径と標準偏差を測定し、その結果より変動係数を計算する。本発明のコルチゾール・アルブミン結合体に関しては、変動係数が小さいことが好ましく、具体的には、１．０以下であることが好ましい。
【００３９】
（被検試料中のコルチゾールの測定方法）
本発明によれば、上記した本発明のコルチゾール・アルブミン結合体が固定化されているコルチゾール測定用基板に、コルチゾールを含む被検試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を接触させ、抗原抗体反応により抗コルチゾール抗体と、コルチゾール・アルブミン結合体のコルチゾールとを結合させる工程（３）、及び
基板に結合した抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子に基づく蛍光を測定する工程（４）、
とを含む、被検試料中のコルチゾールを測定する方法が提供される。
【００４０】
（基板）
本発明によれば、上記のアルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体を、基板に固定化することによって、コルチゾール免疫測定用の基板が提供される。基板の種類としては、表面プラズモン蛍光測定を行うことができるものであれば特に限定されず任意の基板を使用することができるが、後述するように、基板の表面に形成した金属膜の、基板とは反対側の表面上にコルチゾール・アルブミン結合体を固定化することによって、表面プラズモン蛍光検出に使用するコルチゾール免疫測定用の基板とすることが可能となる。コルチゾール・アルブミン結合体は、緩衝液に分散させて、基板上、好ましくは基板上に形成した金属膜上に点着し、一定時間放置した後に上澄み液を吸引し、その後、乾燥させる、等の方法で基板、好ましくは基板上に形成した金属膜に結合させることが可能となる。
【００４１】
表面プラズモン蛍光測定を行う場合における基板としては、表面に金属膜を有している基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、好ましくは表面プラズモン共鳴が生じ得るような金属であり、具体的には金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられるが、その中で特に金が好ましい。これらの金属は単独で使用することも、また、組み合わせて使用することも可能である。ここでの金属膜の膜厚は表面プラズモンを生じ得る膜厚で使用することが好ましい。具体的には、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲にあることが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下である態様が更に好ましい。５００ｎｍ以下であれば、媒質の表面プラズモン現象を十分に検出することが可能となる。また、基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を、上記金属膜に生じる表面プラズモン共鳴に影響しない厚さの範囲内で設けることも可能である。クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下の範囲にあることが好ましい。
【００４２】
金属膜の形成は常法によって行うことが可能であり、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。これらのなかで、金属膜が接触する基板、あるいは介在層の材質との良好な密着性を実現するためには、スパッタ法により金属膜を形成することが好ましい。
【００４３】
本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサーへの利用を考えた場合、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用可能である。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００４４】
ＳＰＦ検出のための基板の一例としては、ＰＭＭＡに金膜をスパッタ法で設けた基板等を具体的な態様として挙げることができる。
【００４５】
（蛍光粒子）
本発明においては、上記したコルチゾール免疫測定用基板に、コルチゾールを含む被検試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を接触させ、次いで基板のコルチゾール・アルブミン結合体に結合した抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子に起因する蛍光を測定することによって、被検試料中のコルチゾールを測定することができる。
【００４６】
本発明で用いることが可能な蛍光粒子としては、蛍光着色粒子を使用することが好ましく、例えば、蛍光ポリスチレンビーズなどの蛍光高分子粒子、蛍光ガラスビーズ等の蛍光ガラス粒子を用いることができる。蛍光粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子または、２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子粉末があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
【００４７】
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
【００４８】
重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより製造できる。
【００４９】
蛍光色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も蛍光粒子として使用することができる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０〜３５６ｎｍ／４１５〜４４０ｎｍ）、赤（５３５〜５８０ｎｍ／５７５〜６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能であり、同社においてＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）の商品名で市販されている。
【００５０】
（蛍光粒子の平均粒径の測定方法）
蛍光粒子の平均粒径は、粒子の材質や被検物質を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１〜１０μｍ（より好ましくは０．００１〜１μｍ）の範囲が好ましい。本発明に用いることが可能な蛍光粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を用いて蛍光粒子の平均粒径を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子（株））等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めるものとする。
【００５１】
（抗コルチゾール抗体）
蛍光粒子に結合させる抗コルチゾール抗体としては、コルチゾールに対して特異性を有する抗体を使用することができる。抗コルチゾール抗体としては、例えば、コルチゾールによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、コルチゾールによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
【００５２】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
【００５３】
抗体や抗原などの結合性物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合性物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【００５４】
抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が０．１〜１０質量％になるよう水に分散させた液に、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体水溶液を添加して、混合する。水分散液の温度４〜５０℃の条件下で５分間〜４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液中に残存する、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、緩衝液を用いて粒子を洗浄する操作を０〜１０回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ブロックエース（登録商標）、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。
【００５５】
抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加することができる。安定化剤とは、ショ糖や多糖類などの合成あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）などの市販のものも使用可能である
【００５６】
（測定方法）
本発明の測定方法は、コルチゾールの存在の有無の検出やコルチゾールの量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としては競合法が挙げられる。
【００５７】
競合法では、先ず、アルブミンに対するコルチゾールの結合数が７〜１４であるコルチゾール・アルブミン結合体が固定化されているコルチゾール免疫測定用基板に、コルチゾールを含む被検試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を接触させる。その被検試料中にコルチゾールが存在しない場合には、抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子と、基板上のコルチゾール（即ち、コルチゾール・アルブミン結合体中のコルチゾール）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、被検試料中にコルチゾールが存在する場合には、被検試料中のコルチゾールと抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子と、基板上のコルチゾール（即ち、コルチゾール・アルブミン結合体中のコルチゾール）との間の抗原抗体反応は阻害される。上記の反応が終了した後、上記の基板上のアルブミンに結合しなかった抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子と、基板上のコルチゾール・アルブミン結合体中のコルチゾールとの複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、被検試料中のコルチゾールの濃度などを測定することができる。
【００５８】
競合法では、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよいが、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、コルチゾール濃度が異なるコルチゾール量既知の試料を複数用意し、この試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、コルチゾール・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。コルチゾール・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号を測定する。この複数の蛍光信号から、各コルチゾール濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、コルチゾール濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するコルチゾール濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、被検試料に含まれるコルチゾール量を定量することができる。
【００５９】
競合法による測定は、短時間で結果が得られ、好ましい測定方法である。また、コルチゾール・アルブミン結合体が固定化されている領域に予め混合した被検試料及び抗コルチゾール抗体標識蛍光粒子を接触させてから、被検試料に含まれるコルチゾール量を定量するまでの測定時間は、１０分以内であることが好ましく、８分以内、更には６分以内がより好ましい。
【００６０】
（表面プラズモン蛍光測定）
蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ）に使用されるバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ）は、落射蛍光法よりも高感度に測定することができるため、更に好ましい測定方法である。
【００６１】
上記の表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ）に用いられるバイオセンサーとしては、例えば、特開２００８−２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、光ビームを光導波路に通し、光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段を備えたセンサーを用いることができる。
【００６２】
蛍光粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ）は、基板上の金属薄膜上に固定化された被検物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法である。この方法は、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法は、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと検体中の抗原が抗体反応により結合し凝集する性質を利用して、時間と共に増大する凝集の大きさを、近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化として測定することで抗原濃度を定量化する方式である。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ）は、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便で高感度な被検物質の検出方法を提供できる。
【００６３】
（コルチゾール測定用基板およびキット）
本発明によれば、本発明のコルチゾール・アルブミン結合体を含む、コルチゾール測定用キットが提供される。本発明のキットは、コルチゾールを測定する方法に用いられるものであり、本発明の製造方法で作製したコルチゾール・アルブミン結合体を使用したコルチゾール測定用基板とそれを用いたコルチゾール測定用キットである。本発明において、コルチゾール測定を実施するに当たり、コルチゾール・アルブミン結合体を固定した基板、蛍光粒子を保持した部材を含み、表面プラズモン励起装置、蛍光測定デバイスなどの、コルチゾールを測定する上で使用される各種器材、資材又は装置などを含めることもできる。さらに、キットのひとつの要素として、被検物質量が既知の被検試料、取扱説明書などの必要な材料一式を含んでいてもよい。
【００６４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（１）コルチゾール・ＢＳＡ結合体の調製
（１−１）コルチゾール−オキシム誘導体１の合成
文献（ＳＴＥＲＯＩＤＳ、１９７４、Ｊａｎ．４９−６４）に従い、コルチゾールをエナミン化し、ヒドロキシルアミン誘導体と反応させることでコルチゾール−オキシム誘導体１を得た。下記に反応経路を示した。
【００６６】
【化４】
2015163865.tif 000005
【００６７】
コルチゾール（１ｇ、和光純薬工業（株）社製）のメタノール（５ｍＬ）懸濁液に対してピロリジン（和光純薬工業（株）社製）を１当量滴下し、室温で５分間攪拌した。反応系中でエナミンが生じ、溶液が赤変した。その後、１当量のピロリジン、上記に化学式で示した（アミノオキシ）酢酸ヘミ塩酸塩（０．６６g、和光純薬工業（株）社製）を加え、反応温度を５５℃にて５分間攪拌し、オキシム化を行った。溶液は徐々に消色しながらオキシム化は進行し、コルチゾール−オキシム誘導体１（１．１ｇ：８４％。本発明のコルチゾールにカルボキシル基を導入することにより得られる化合物。）が得られた。
【００６８】
（１−２）コルチゾール・ＢＳＡ結合体−１の調製
水を含まない脱水ＤＭＦ（脱水Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド、１．２ｍＬ、和光純薬工業（株）社製）に、（１−１）で作製したコルチゾール−オキシム誘導体１（５０ｍｇ）とＮＨＳ（６７ｍｇ、和光純薬工業（株）社製）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ、１１０ｍｇ和光純薬工業（株）社製）を溶解し、反応させて、活性エステル化したコルチゾール−オキシム誘導体２を得た。その後、アルブミンの１種であるＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、和光純薬工業（株）社製、３２２ｍｇ）のリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ、和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５、ｐＨ７．１〜７．３）６５ｍＬに活性エステル化したコルチゾールオキシム誘導体２を全量滴下した。反応終了後、アセトニトリル（和光純薬工業（株）社製）／水＝１／１（容量比）（水に、０．１質量％ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（和光純薬工業（株）社製）含有）の溶液１Ｌを用いて透析により精製を行った。透析による精製の後に、凍結乾燥し、白色固体のコルチゾール・ＢＳＡ結合体−１を得た。
【００６９】
【化５】
2015163865.tif 000006
【００７０】
（１−３）コルチゾール・ＢＳＡ結合体−２の調製
水を含まない脱水ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、９ｍＬ、和光純薬工業（株）社製）に、（１−１）で作製したコルチゾール−オキシム誘導体１（３８９ｍｇ）とＮＨＳ（５２３ｍｇ、和光純薬工業（株）社製）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ、８５５ｍｇ、和光純薬工業（株）社製）を溶解し、反応させて、活性エステル化したコルチゾール−オキシム誘導体を得た。その後、アルブミンの１種であるＢＳＡ(ウシ血清アルブミン、和光純薬工業（株）社製、２．８５ｇ）のＰＢＳ（和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５）５７０ｍＬに活性エステル化したコルチゾールオキシム誘導体を全量滴下した。反応終了後、アセトニトリル（和光純薬工業（株）社製）／水＝１／１（容量比、水に、０．１質量％ＴＦＡ（和光純薬工業（株）社製）含有）の溶液１Ｌを用いて透析により精製を行った。透析による精製の後に、凍結乾燥し、白色固体のコルチゾール・ＢＳＡ結合体−２を得た。
【００７１】
（１−４）コルチゾール・ＢＳＡ結合体−３の調製
水を含まない脱水ＤＭＦ（９ｍＬ）に、（１−１）で作製したコルチゾール−オキシム誘導体１（３８９ｍｇ）とＮＨＳ（５２３ｍｇ）及び １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤ
Ｃ・ＨＣｌ、８５５ｍｇ）を溶解し、反応させて、活性エステル化したコルチゾール−オキシム誘導体を得た。その後、アルブミンの１種であるＢＳＡ(１．５ｇ）のＰＢＳ  ５７０ｍＬに活性エステル化したコルチゾールオキシム誘導体を全量滴下した。反応終了後、アセトニトリル／水＝１／１（容量比、水に、０．１質量％ ＴＦＡ含有）の溶液１Ｌを用いて透析により精製を行った。透析による精製の後に、凍結乾燥し、白色固体のコルチゾール・ＢＳＡ結合体−３を得た。
【００７２】
（１−５）コルチゾール・ＢＳＡ結合体−４〜７の調製
コルチゾール・ＢＳＡ結合体−３の調製と同様にして、ＥＤＣ／ＢＳＡのモル比を３０、６０、２４０、３００となるように使用するＥＤＣ・ＨＣｌとＢＳＡの比を変更して、コルチゾール・ＢＳＡ結合体−４〜７を調製した。
【００７３】
（１−６）ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ−ＭＳによるアルブミン（ＢＳＡ）に対するコルチゾールの結合数の測定
（測定手順）
（１−２）から（１−５）で調製したコルチゾール・ＢＳＡ結合体−１〜５を０．１質量％ＴＦＡ：アセトニトリル＝２／１（容量比）の溶液に溶解し、１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した。この溶液１μＬと、マトリックス（ＳＡ；シナピン酸）４μＬとを混合し、得られた混合液を金プレート上に１μＬを４回点着した。自然乾燥した後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社品Ｖｏｙｇｅｒ）に金プレートを挿入し、１スポットごとに積算９００ショットを行い質量情報となるデータを取得（Ｎ＝４）した。このデータを用いて、コルチゾール・ＢＳＡ結合体に対応するピークの、ピーク強度の最大の値の５０％強度での分子量中心値をＢＳＡ結合体のピークとして採用し、このピーク値から垂直に降ろした位置をコルチゾール・ＢＳＡ結合体の分子量と見なして、Ｎ＝４の平均値を取得した。（コルチゾール・ＢＳＡ結合体の分子量−ｎａｔｉｖｅＢＳＡの分子量）／コルチゾール誘導体の分子量（４３５−１８＝４１７）を用いて、ＢＳＡに対するコルチゾールの結合数を計算した。得られた結合体−１、２、３のコルチゾール／ＢＳＡ比を表１に示した。
【００７４】
【表１】
2015163865.tif 000007
【００７５】
（１−７）コルチゾール・ＢＳＡ結合体−１〜７の水への分散度の測定
（１−２）から（１−５）で調製したコルチゾール・ＢＳＡ結合体−１〜７の白色の固体を５ｍｇ測り取り、１ｍＬのＰＢＳ（和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５）に溶解した。ボルテックスミキサーで２０分間振動を与えて溶解し、その後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を用いて、不溶解物を沈降させ、上澄み液をサンプリングした。サンプリングした上澄み液を１ｃｍ石英セルに入れ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製（島津製作所）紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０を使用して吸光度を測定した。
標準サンプルとして、コルチゾール・ＢＳＡ結合体−１を用いて、サンプリングした１ｍｇを１ｍＬのＰＢＳに溶解し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を用いて、不溶解物を沈降させ、上澄み液をサンプリングした。サンプリングした上澄み液を１ｃｍ石英セルに入れて吸光度を測定した。これらのデータから、２８０ｎｍの吸光度が０．７２のとき、コルチゾール・ＢＳＡ結合体が１ｍｇ／１ｍＬと定義し、コルチゾール
・ＢＳＡ結合体−２〜７の上清中のコルチゾール・ＢＳＡ結合体濃度を算出し、以下の式に従って分散度を算出した。
分散度：(上清中のコルチゾール・ＢＳＡ結合体濃度ｍｇ／ｍＬ（吸光度から定量）／５ )×１００
【００７６】
【表２】
2015163865.tif 000008
【００７７】
（１−８）コルチゾール・ＢＳＡ結合体の粒度分布の測定
（１−７）で取得したコルチゾール・ＢＳＡ結合体−１、−３の上清液および、結合していないＢＳＡに関して、ＺＥＴＡ  ＳＩＺＥＲ（マルバーン社製）Ｎａｎｏ  ｓｅｒｉｅｓで粒度分布を測定した。サンプルは、ＢＳＡ濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（８００μＬ  和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５）で希釈して２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ、水の屈折率１．３３０の条件で測定した。測定結果を図１に示す。
図１の結果から、コルチゾール・ＢＳＡ結合体−１の分散性が良好で、コルチゾール・ＢＳＡ結合体−３の粒度分布が広く凝集を起こしていることがわかる。
【００７８】
（２）抗コルチゾール抗体で標識した蛍光粒子の調製
抗コルチゾール抗体で標識した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）２５０μＬに、５０ｍｍｏｌ／Ｌの２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ、和光純薬工業（株）社製）バッファー(ｐＨ６．０)溶液２５０μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗コルチゾールモノクローナル抗体（Ｈｙｔｅｓｔ社製；Ａｎｔｉ−Ｃｏｒｔｉｓｏｌ
ＭＡｂ  ＸＭ２１０）１００μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ・ＨＣｌ水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬工業（株）社製）水溶液２５μＬを添加して３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後、上清を取り除き、ＰＢＳ(和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５)５００μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ(和光純薬工業（株）製品カタログ番号:１６６−２３５５５)５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗コルチゾール抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％分散液を調製した。
【００７９】
（３）流路型センサチップの作製
（３−１）基板の作製
ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)の基体（三菱レイヨン（株）社製、アクリペットＶＨ）を用意し、マグネトロンスパッタ法により、厚さ４０ｎｍの金膜を基板の片面に幅４ｍｍとなるように作製して基板を構成するためのチップを作製した。このチップの金膜面上に、コルチゾール・ＢＳＡ結合体−１（実施例）、コルチゾール・ＢＳＡ結合体−２（実施例２）、又はコルチゾール・ＢＳＡ結合体−３（比較例１）を含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ ｉｎ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液 ｐＨ６、 １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）を点着し、乾燥させて、それぞれの結合体を固定化した基板１〜３を複数作製した。
【００８０】
（３−２）基板の洗浄
このように調製した３種類の複数の基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬工業（株）社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．１〜７．３））３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。
【００８１】
（３−３）流路型センサチップの作製
特開２０１０−１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した３種類の複数の基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。
【００８２】
（４）全自動免疫化学発光測定装置での測定
免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるシーメンス社ＩＭＭＵＬＹＺＥ１０００全自動免疫化学発光測定装置を用いて、取り扱い説明書に従って、被検物質が既知の被検試料の測定を行い、被検物質の測定値を得た。
【００８３】
（５）蛍光粒子を用いたコルチゾールの免疫測定
（４）で使用した被検物質が既知の被検試料を、（２）で調製した抗コルチゾール抗体で標識した蛍光粒子と予め１０分間攪拌しながら混合した。次に、（３−３）で作製した基板１〜３を封入した流路型センサチップにそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で混合液を流下させ、コルチゾール・ＢＳＡ結合体を固定した金膜面上に接触させてから１．５分間継続して蛍光強度を測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。また、コルチゾール濃度が０の試料を用意して同様にして求めた蛍光シグナル値をＢ０とし、コルチゾールを含む各試料のシグナル値をＢとしたときに、Ｂ／Ｂ０を求めることによってシグナル値を規格化した。
【００８４】
（６）検量線の作成
（５）で求めた、被検物質が既知の被検試料の蛍光シグナル値と（４）で求めた被検物質の測定値を用いて、（１−２）から（１−４）で調製したコルチゾール・ＢＳＡ結合体―１〜３を用いた基板に対して、それぞれ検量線を作成した。
【００８５】
（７）再現性の確認
（１−２）から（１−４）で調製したコルチゾール・ＢＳＡ結合体―１〜３を用いた基板に対して、被検物質量が既知の被検試料Ｍ及びＨ（Ｍは、コルチゾール濃度が６．０〜１７．０μｇ／ｄＬ。Ｈは、コルチゾール濃度が１７．０〜３０．０μｇ／ｄＬであるものから選択した。これらの値は、対照機ＩＭＭＵＬＹＺＥ１０００で決定した）を用いて、それぞれ１０枚の基板を用意し、１０回、同じ測定を繰り返すことで再現性を確認した。それぞれの結果の標準偏差（ＣＶ）を、百分率で表した。結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
2015163865.tif 000009
【００８７】
本発明のコルチゾール・ＢＳＡ結合体−１又は−２を固定化した流路型センサチップで測定した場合の繰り返し再現性が優れ、コルチゾール測定の精度が高いことがわかり、本発明の効果が確認された。
【００８８】
（実施例２）
（８）被検試料の準備
イヌ血清は、北山ラベス（株）社から購入した東洋ビーグル犬の血清を使用し、被検試料を２検体準備し、Ｎｏ. １、２と表記した。
【００８９】
（９）蛍光粒子を用いたコルチゾールの免疫測定
（８）で準備した被検試料（イヌ血清）Ｎｏ１、２それぞれについて、血清２０μＬを小分けし、生理食塩水８０μＬで希釈し、塩化マグネシウム５０μｍｏｌ を充分に混合して、混合試料１、２を複数調製した。この混合試料に対して、実施例１の（２）で調製した抗コルチゾール抗体で標識した蛍光粒子と１０分間攪拌しながら混合した。次に、実施例１の（３−３）で作製した基板１〜３を封入した流路型センサチップにそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／ｍｉｎの速度で混合液を流下させ、コルチゾール・ＢＳＡ結合体を固定した金膜面上に接触させてから１．５分間継続して蛍光強度を測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。また、コルチゾール濃度が０の試料を用意して同様にして求めた蛍光シグナル値をＢ０とし、コルチゾールを含む各試料のシグナル値をＢとしたときに、Ｂ／Ｂ０を求めることによってシグナル値を規格化した。実施例１と同様にして、希釈率を考慮して検量線を作成し、犬血清中に含まれるコルチゾール量を求めた。実施例１と同様に、これらの測定を１０回繰り返し、再現性を確認した。結果を表４に示した。 
【００９０】
【表４】
2015163865.tif 000010
【００９１】
実施例１と同様に、犬の血清を用いた測定においても、本発明のコルチゾール・ＢＳＡ結合体−１又は−２を固定化した流路型センサチップで測定した場合の繰り返し再現性が優れ、コルチゾール測定の精度が高いことがわかり、本発明の効果が確認された。
【図１】
2015163865.tif 000012