(57)【要約】【課題】牛乳房炎原因微生物を特異的に検出する方法、それに使用されるプライマーセットおよびアッセイキットを提供する。【解決手段】牛乳房炎原因微生物を検出する方法は、特定のＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを用いて、試料中の核酸をＬＡＭＰ法により増幅することと、得られた増幅産物を特定の核酸プローブセットと反応させることと、得られたハイブリダイズ信号に基づいて、試料中の牛乳房炎原因微生物の有無および／または量を判定することとを含む。【選択図】図１
2015100282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（i）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１のプライマーセット、
（ii）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第２のプライマーセット、
（iii）配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第３のプライマーセット、
（iv）配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第４のプライマーセット、
（v）配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第５のプライマーセット、
（vi）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０および配列番号１３２によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第６のプライマーセット、
（vii）配列番号１４９、配列番号５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３および配列番号１５４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第７のプライマーセット、
（viii）配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第８のプライマーセット
（ix）配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８および配列番号２２９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第９のプライマーセット、
（x）配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３および配列番号２３４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１０のプライマーセット、
（xi）配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４および配列番号２６５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１１のプライマーセット、
（xii）配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８および配列番号３０９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１２のプライマーセット、並びに
（xiii）配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１および配列番号３２２によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１３のプライマーセット、
を含むＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを用いて、試料中の核酸をＬＡＭＰ法により増幅することと、
（２）（１）の全てのプライマーセットにより得られた増幅産物を含む増幅産物混合物を、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、配列番号９２、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１７０、配列番号１７５、配列番号１８０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１４、配列番号３３３、配列番号３６８、配列番号３６９および配列番号３８６によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む核酸プローブセットと反応させることと、
（３）（２）の反応後に得られたハイブリダイズ信号の有無および／または大きさに基づいて、前記試料に含まれる牛乳房炎原因微生物の有無および／または量を判定することと、
を含む牛乳房炎原因微生物を検出する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーの全てが、前記配列番号のそれぞれによりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなり、前記核酸プローブの全てが、前記配列番号のそれぞれによりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなる方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、（３）において得られた前記ハイブリダイズ信号が、（２）の前記核酸プローブセットに含まれる何れの配列番号を有する核酸プローブにおける反応の結果であるのかに基づいて、前記試料に含まれる牛乳房炎原因微生物を分類することを更に含む方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記核酸プローブセットが基体に固定化されている方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法により得られた結果に基づいて、前記試料の源であるヒト以外の動物個体が乳房炎であるか、否かを診断する方法。
【請求項６】
（i）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１のプライマーセット、
（ii）配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第２のプライマーセット、
（iii）配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第３のプライマーセット、
（iv）配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第４のプライマーセット、
（v）配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第５のプライマーセット、
（vi）配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０および配列番号１３２によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第６のプライマーセット、
（vii）配列番号１４９、配列番号５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３および配列番号１５４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第７のプライマーセット、
（viii）配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第８のプライマーセット、
（ix）配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８および配列番号２２９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第９のプライマーセット、
（x）配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３および配列番号２３４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１０のプライマーセット、
（xi）配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４および配列番号２６５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１１のプライマーセット、
（xii）配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８および配列番号３０９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１２のプライマーセット、並びに
（xiii）配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１および配列番号３２２によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーからなる第１３のプライマーセット、
を含む、牛乳房炎原因微生物を検出するためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセット。
【請求項７】
請求項６に記載のＬＡＭＰ増幅用プライマーセットであって、前記プライマーの全てが、前記配列番号のそれぞれによりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなるＬＡＭＰ増幅用プライマーセット。
【請求項８】
請求項６または７に記載のＬＡＭＰ増幅用プライマーセットと、
配列番号６、配列番号９、配列番号１５、配列番号９２、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１７０、配列番号１７５、配列番号１８０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１５、配列番号３３３、配列番号３６８、配列番号３６９および配列番号３８６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む、牛乳房炎原因微生物を検出するための核酸プローブセットと
を含む、牛乳房炎原因微生物を検出するためのアッセイキット。
【請求項９】
請求項８に記載のアッセイキットであって、前記核酸プローブの全てが、前記配列番号のそれぞれによりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなるアッセイキット。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のアッセイキットであって、前記核酸プローブセットが基体に固定化されているアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、牛乳房炎原因微生物を検出する方法、それに使用されるプライマーセットおよびアッセイキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
牛乳房炎とは、牛の乳腺組織に起こる感染性の炎症の総称である。その直接の原因は、細菌やカビの感染である。牛乳房炎は、臨床型乳房炎と潜在型乳房炎とに大きく分けられる。臨床型乳房炎は、臨床症状を伴うものである。臨床型乳房炎に罹患した個体では、乳房が赤く腫れて熱をおびる、痛みがある、および／または乳汁中にブツが混じるなどの肉眼的な異常が認められる。潜在型乳房炎に罹患した個体では、臨床型乳房炎でみられるような肉眼的異常は見られない。潜在型乳房炎に罹患した個体において、乳腺に生じた炎症は、乳汁検査を行ってはじめて明らかにされる。
【０００３】
乳牛が乳房炎になった場合、酪農家は、治療のための費用の発生のみならず、生産乳量や乳品質の低下、淘汰更新費用、更には出荷制限に伴う出荷量の低下および生乳の廃棄などによる様々な経済損失を被る。国内の臨床型乳房炎を対象にした試算では、その損失は、１頭あたり年間５０，０００円〜８０，０００円、１農場あたりの平均では約１５０万円、日本全体では８００億円にも上ると言われている。
【０００４】
感染拡大による経済損失を最小限に抑えるためには、症状を示していない潜在感染個体を含む全ての感染個体を迅速に特定し、適切な処置を施すことが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１８６７８１号公報
【特許文献２】特開２０１２−６０９２５号公報
【特許文献３】特開２００５−９５０４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、牛乳房炎原因微生物を特異的に検出する方法、それに使用されるプライマーセットおよびアッセイキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、牛乳房炎原因微生物を検出する方法は、特定のＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを用いて、試料中の核酸をＬＡＭＰ法により増幅することと、得られた増幅産物を特定の核酸プローブセットと反応させることと、得られたハイブリダイズ信号に基づいて、試料中の牛乳房炎原因微生物の有無および／または量を判定することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に従うＬＡＭＰ法により増幅されるべき鋳型配列とプライマーとの関係を示す図。
【図２】本実施形態に従うＬＡＭＰ法による増幅によって得られる増幅産物の構成を示す図。
【図３】本実施形態に従う増幅産物の１例を示す模式図。
【図４】本実施形態に従う核酸プローブ固定化基体の模式図。
【図５】本実施形態に従う核酸プローブ固定化基体の模式図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、実施の形態について、詳細に説明する。
【００１０】
実施形態によれば、牛乳房炎原因微生物を特異的に検出することが可能である。まず、牛乳房炎原因微生物を特異的に検出するためには、以下の細菌類、マイコプラズマ、藻類および酵母様真菌類が検出および／または定量されればよい。これらの牛乳房原因微生物を特異的に検出することにより、動物個体における乳房炎の存在を迅速に特定することが可能である。
【００１１】
１．牛乳房炎原因微生物
＜ブドウ球菌属＞（Staphylococcus属）
ブドウ球菌の中で、黄色ブドウ球菌（Staphyrococcus aureus、SA）は感染性の菌である。この菌由来の乳房炎は、難治性である上、感染初期に症状が乏しい。そのために、早期発見が困難であり、抗生物質投与による効果的な排除も望めない。黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌は、血漿を凝固させるコアグラーゼを産生しないという意味でCoagulase-negative staphylococcus (CNS)と呼ばれ、環境性の菌であり、皮膚に常在する菌である。これまで２次的な乳房炎起因菌とされてきたが、敷材などから乳房内感染を起こしている牛が多く見られることから、厳密な乳房炎防除の観点からすれば無視できない菌である。
【００１２】
＜連鎖球菌属＞（Streptococcus属）
乳房炎原因微生物の連鎖球菌の中で、最も悪性度の高い菌種は、Streptococcus agalactiae(SAG)である。このSAG以外をOther Streptococcus (OS)とひと括りにして区別できるぐらい、SAGは突出している。SAGは、その臨床症状から無乳性連鎖球菌とも呼ばれる。この菌による乳房炎は、高い感染性を特徴としており、炎症の程度を示す乳汁中の体細胞数は、感染初期から長期に亘り高いまま持続する。しかし、抗生物質への感受性が高く、乾乳期に使用する効果的な軟膏も存在することから、次第にその数が減ってきている。SAG以外で、乳房炎原因微生物としての連鎖球菌として特筆すべきものは、Streptococcus uberisであり、これは他の連鎖球菌よりも再発しやすく、慢性乳房炎を引き起こす。
【００１３】
＜コリネバクテリウム属＞（Coprynebacterium属）
放線菌の一種で、ヒトの生活環境において様々な所に分布する常在菌である。主に夏に発生する乳房炎の原因になる。乳房炎の原因菌としては、伝染性および／または環境性であり、ハエ等によっても伝播される。
【００１４】
＜腸内細菌科（大腸菌群）＞（Enterobacteria科）
Enterobacteria科の菌は、一般的に、腸内細菌科または大腸菌群とも分類される。ウシの体表、糞便、床の敷材などの環境中に存在し、乳頭口より侵入して感染する環境性の原因菌である。気温が高くなる時期に増加する菌である。この菌に感染した個体は、症状を呈さない潜在型となるケース、自然治癒するケースもあるが、悪化するケースもある。悪化した場合には全身症状を伴う急性乳房炎を引き起こし、死亡または廃用となることもある。悪化の原因は、腸内細菌科の細菌が死滅するときに排出する毒素が原因だと言われている。
【００１５】
＜マイコプラズマ属＞（Mycoplasma属）
マイコプラズマは、細菌でもウイルスでもなく、その中間の大きさの微生物である。通常の培養検査による発見が難しく、抗生剤も効果がない。マイコプラズマ性乳房炎は、非常に感染力が高く、経済的被害が甚大である。感染は、他の細菌のように乳頭口から進入するだけでなく、牛の体内から（例えば肺炎などから）血液を介して乳腺に感染する場合もある。
【００１６】
＜藻類＞
藻類の中で、牛乳房炎の原因となる主なものは、プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）である。プロトテカの細胞壁は三層構造で、強力な加水分解耐性を持つ。その強固な細胞壁のおかげで、強い薬剤耐性を持つ。プロトテカによる乳房炎は、牛群内で散発的に発生し、多くは複数分房の感染となり、淘汰されることが多い。
【００１７】
＜酵母様真菌＞（Candida属）
カンジダは、酵母様真菌の仲間で、抗生剤への感受性はなく難治性乳房炎を引き起こす。菌交代現象や日和見感染症との関係が報告されている。この菌による乳房炎の発症には、夏場の飼育環境や搾乳のストレスなど、免疫能が低下する環境が影響していると考えられている。
【００１８】
２．牛乳房炎原因微生物を検出する方法
これらの牛乳房炎原因微生物を特異的に検出するための方法は、特定のＬＡＭＰ増幅用プライマーセットを用いて、試料中の核酸をＬＡＭＰ法により増幅することと、得られた増幅産物を特定の核酸プローブセットと反応させることと、得られたハイブリダイズ信号に基づいて、試料中の牛乳房炎原因微生物の存在について判定することとを含む。
【００１９】
試料は、哺乳類またはヒトを除く哺乳類、例えば、牛、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシおよびネズミイルカなどの乳汁、体液、組織、細胞または便であってもよい。或いは、試料は、環境物質、例えば、水、湖水、川水、海水および土壌などの環境に存在する何れかの物質、例えば、試料の源である動物個体の生活環境物質であってもよい。或いは、当該試料は、牛乳房炎原因微生物に分類される微生物あるいはその遺伝子が含まれている可能性の疑われる物質であってよい。例えば、培養液のようなものでもよい。そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。そのような前処理の例は、ホモジネート、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去および／または精製などを含んでよい。
【００２０】
また、試料についての牛乳房炎原因微生物の検出の結果に基づいて、試料の源である動物個体、例えば、牛、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシおよびネズミイルカなどが、乳房炎になる可能性が高いかまたは低いか、乳房炎である可能性が高いかまたは低いか、乳房炎であるか否か、予後が良好であるか否か、などを判定することが可能である。
【００２１】
３．ＬＡＭＰ増幅
「ＬＡＭＰ法」は核酸の増幅法である。これらは、等温遺伝子増幅法とも称される。ＬＡＭＰ法によりＤＮＡを鋳型にして核酸を増幅する場合、ＬＡＭＰ法は、２種のプライマー若しくは鋳型核酸の４つの領域に対応するプライマー、または４種のプライマー若しくは鋳型核酸の６つの領域に対応するプライマーを用いる。
【００２２】
ここで、ＬＡＭＰ法による増幅における鋳型核酸とプライマーとの関係を、図１を用いて説明する。ＬＡＭＰ法による増幅は、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの何れの核酸からも開始することが可能である。しかしながら、１例として、図１においては二本鎖ＤＮＡから増幅を開始する場合について説明する。
【００２３】
増幅されるべき二本鎖ＤＮＡ１は、互いに相補的な第１の鋳型核酸２と第２の鋳型核酸３とを含む。第１の鋳型核酸２は、３’側から、Ｆ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域およびＦ１ｃ領域を有し、５’側からＢ３領域、Ｂ２領域およびＢ１領域を有する。第２の鋳型核酸３は、５’側からＦ３領域、Ｆ２領域およびＦ１領域を有し、３’側からＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域およびＢ１ｃ領域を有する。「Ｆ１領域」と「Ｆ１ｃ領域」、それらの配列である「Ｆ１配列」と「Ｆ１ｃ配列」、「Ｆ２領域」と「Ｆ２ｃ領域」、それらの配列である「Ｆ２配列」と「Ｆ２ｃ配列」、「Ｆ３領域」と「Ｆ３ｃ領域」、それらの配列である「Ｆ３配列」と「Ｆ３ｃ配列」、「Ｂ１領域」と「Ｂ１ｃ領域」、それらの配列である「Ｂ１配列」と「Ｂ１ｃ配列」、「Ｂ２領域」と「Ｂ２ｃ領域」、それらの配列である「Ｂ２配列」と「Ｂ２ｃ配列」、「Ｂ３領域」と「Ｂ３ｃ領域」、それらの配列である「Ｂ３配列」と「Ｂ３ｃ配列」は、何れの組み合わせについても、互いに相補的であることを示している。
【００２４】
この二本鎖ＤＮＡ１についてＬＡＭＰ法による増幅を行う場合、基本的にＦＩＰプライマー４、Ｆ３プライマー５、ＢＩＰプライマー６およびＢ３プライマーの４つのプライマーからなるプライマーセットが使用される。
【００２５】
ＦＩＰプライマー４は、５’側にＦ１ｃ配列を有し、３’側にＦ２配列を有する。Ｆ３プライマー５は、Ｆ３配列を有する。ＢＩＰプライマー６は、５’側にＢ１ｃ配列を有し、３’側にＢ２配列を有する。Ｂ３プライマーは、Ｂ３配列を有する。
【００２６】
当該プライマーセットを用いて、二本鎖ＤＮＡ１についてＬＡＭＰ法による増幅を行うと、第１の鋳型核酸２および第２の鋳型核酸３から、例えば、図２（１）および（２）にそれぞれに示す、ステム・アンド・ループ構造を有するダンベル型の第１の増幅産物８および第２の増幅産物９が得られる。
【００２７】
増幅産物８は、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列を、３’または５’末端からこの順番で有する。Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、並びにＢ１配列とＢ１ｃ配列はそれぞれ互いに結合している。Ｆ１配列とＦ１ｃ配列とに挟まれ、且つＦ２ｃ配列を含む部分は一本鎖である。Ｂ１配列とＢ１ｃ配列との間とに挟まれ、且つＢ２配列を含む部分は一本鎖である。これらの一本鎖の部分を、その形状からループ部分と呼ぶ。他方、Ｆ１ｃ配列とＢ１配列とに挟まれた部分も一本鎖である。
【００２８】
増幅産物９は、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列を３’または５’末端からこの順番で有する。Ｆ１ｃ配列とＦ１配列、およびＢ１配列とＢ１ｃ配列はそれぞれ互いに結合している。Ｆ１ｃ配列とＦ１配列とに挟まれ、且つＦ２配列を含む部分は一本鎖である。Ｂ１配列とＢ１ｃ配列との間とに挟まれ、且つＢ２ｃ配列を含む部分は一本鎖である。これらの一本鎖の部分を、その形状からループ部分と呼ぶ。他方、Ｆ１配列とＢ１ｃ配列とに挟まれた部分も一本鎖である。
【００２９】
ＬＡＭＰ法による増幅を行った場合、第１の増幅産物８および／または第２の増幅産物９をそれぞれ１単位として繰り返して含む増幅産物、および/または第１の増幅産物８および／または第２の増幅産物９を含む増幅産物、少なくとも１つのループ部分を含む第１の増幅産物８および／または第２の増幅産物９の一部分を含む増幅産物が得られる。ＬＡＭＰ法による増幅の増幅機構などについては、例えば、特開２００２−１８６７８１号公報に記載されている。
【００３０】
当該プライマーセットは、上述した４種類のプライマーに加えて、更にループプライマーを含んでもよい。ループプライマーは、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーであってよい。ＬＦプライマーは、第１の増幅産物８のＦ１ｃ領域とＦ２ｃ領域とに挟まれた領域に相補的な配列、または第２の増幅産物９のＦ１領域とＦ２領域とに挟まれた領域に相補的な配列を有すればよい。ＬＢプライマーは、第１の増幅産物８のＢ１領域とＢ２領域とに挟まれた領域に相補的な配列、または第２の増幅産物９のＢ１ｃ領域とＢ２ｃ領域とに挟まれた領域に相補的な配列に相補的な配列を有すればよい。
【００３１】
例えば、乳房炎原因微生物の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを含む。ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、更に任意にＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。
【００３２】
例えば、上記増幅反応は、１反応場当たり、１プライマーセットで行ってもよい。或いは、１反応場において、各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数の乳房炎原因微生物種を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。「増幅反応場」とは、そこにおいて反応が行われる場であり、例えば、増幅反応場は、そこにおいて反応が可能な容器の内部、その上において反応を行うことが可能な基板の上部、その内部で反応を行う流路の内部の一部区間などであればよい。容器の例は、例えば、チューブ、マイクロチューブ、ビーカー、マルチウェルプレート、反応流路を備えた基体などであってよいが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
包括的に乳房炎原因微生物核酸を増幅するためには、それぞれ複数の種類のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プラマーおよびＢ３プライマーを使用することがより好ましい。特定の種の乳房炎原因微生物核酸を増幅するためには、特定の種に特異的なヌクレオチドを有する配列を使用すればよい。より確実に包括的に増幅するためには、少なくとも種に特異的な変異部位に関してユニバーサルヌクレオチドまたはミックス塩基となるようにプライマーを設計および使用することが好ましい。
【００３４】
ユニバーサルヌクレオチドは、ユニバーサル塩基とも称され、４種類の天然塩基を区別することなく塩基対を形成することが可能なヌクレオチドである。使用できるユニバーサルヌクレオチドは、４種類の天然塩基を区別することなく塩基対を形成する、それ自身公知の何れのヌクレオチドであってもよい。
【００３５】
ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Glen  Research社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００３６】
「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基をそれぞれ「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」に設計した核酸プローブを２以上または全て混合して使用することをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。ミックス塩基は、１つの反応場において１つの位置の塩基についてのミックス塩基として使用されてもよく、複数の位置の塩基について全て対応するようなミックス塩基として使用されてもよい。ミックス塩基の表示については、問題となる部位に存在する塩基を、例えば、変異部位のための複数種類の塩基を同時に表す、次のような記号を用いて示してよい；グアニンまたはアデニンを表す「ｒ」、チミンまたはシトシンを表す「ｙ」、アデニンまたはシトシンを表す「ｍ」、グアニンまたはチミンを表す「ｋ」、グアニンまたはシトシンを表す「ｓ」、アデニンまたはチミンを表す「ｗ」、グアニンまたはシトシンまたはチミンを表す「ｂ」、アデニンまたはグアニンまたはチミンを表す「ｄ」、アデニンまたはシトシンまたはチミンを表す「ｈ」、アデニンまたはグアニンまたはシトシンを表す「ｖ」、アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンを表す「ｎ」。
【００３７】
１つのプライマーに含まれる各領域の間またはプライマーの末端に、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列が、例えば、スペーサーとして更に含まれていてもよい。また、そのような配列の具体的な配列は、鋳型核酸および各プライマー配列と同一ではない、または相補的ではない配列であればよく、例えば、スペーサーとして一般的に使用される配列であってよい。
【００３８】
ループの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００３９】
上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、以下に示すような組成のバッファー中で行ってよい：
ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣＬ
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１６Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。
【００４０】
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー  ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー  ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー      ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー      ５ｐｍｏＬ
必要な場合には、
ＬＦプライマー    ２０ｐｍｏＬ
ＬＢプライマー    ２０ｐｍｏＬ。
【００４１】
ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べて、増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。
【００４２】
４．増幅産物の検出
上述のようなＬＡＰＭ法により試料中の核酸を増幅して得られた増幅産物を検出および／または定量することにより、牛乳房炎原因微生物を特異的に検出できる。
【００４３】
増幅産物の検出および／または定量は、例えば、核酸プローブとのハイブリダイズを検出する、濁度を測定すること、吸光度を測定すること、もしくは電気泳動により行われてもよい。好ましくは、増幅産物の検出は、核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションを検出することにより行われてよい。「特異的ハイブリダイゼーション」とは、クロスハイブリダイズを生じることなく、増幅産物と核酸プローブとがハイブリダイズすることをいう。好ましくは、特異的ハイブリダイゼーションでは、一塩基多型(Single  Nucleotide  PolymorpHisms:SNPs)または変異が存在する場合には、その僅かの違いも検出することが可能である。
【００４４】
試料中の核酸をＬＡＭＰ法により増幅した後に、得られた増幅産物を核酸プローブセットにより検出するための１つの例について以下に説明する。増幅産物は、牛乳房炎原因微生物の特異的な増幅により得られたものであるので、増幅産物を特異的に検出することにより、試料中の牛乳房炎原因微生物を特異的に検出することが可能である。
【００４５】
増幅産物８および／または増幅産物９の検出は、それらに含まれるターゲット配列に相補的な配列を含む核酸プローブを用いて行えばよい。即ち、ターゲット配列は、核酸プローブとハイブリダイズさせるべき配列である。増幅産物８および９におけるターゲット配列の位置および配列は、プライマーセットを設計する際に決定されてよい。
【００４６】
例えば、ターゲット配列は、増幅産物８および／または増幅産物９の一本鎖の部分、好ましくはループ部分にターゲット配列が位置されるように設計されてよい。即ち、ターゲット配列は、図２（１）の増幅産物８のＦ１ｃ領域とＢ１領域とに挟まれた領域の配列、Ｆ１ｃ領域とＦ１領域とに挟まれたループ部分の配列、および／またはＢ１領域とＢ１ｃ領域とに挟まれたループ部分の配列、またはこれらの配列の一部分の配列であってよい。同様に、ターゲット配列は、図２（２）の増幅産物９のＦ１領域とＢ１ｃ領域とに挟まれた領域の配列、Ｆ１領域とＦ１ｃ領域とに挟まれたループ部分の配列、および／またはＢ１ｃ領域とＢ１領域とに挟まれたループ部分の配列、またはこれらの配列の一部分の配列であってよい。好ましいターゲット配列は、ループ部分の配列の一部分を含む。また、ターゲット配列として選択される領域は、少なくとも１か所の一本鎖の部分、好ましくはループ部分であってよい。
【００４７】
鋳型核酸の配列に対して設計されるべきターゲット配列の１例について図１を用いて説明する。ターゲット配列は、図１に示すＦＰ領域、ＦＰｃ領域、ＢＰ領域若しくはＢＰｃ領域の配列であってもよく、またはその一部分の配列であってもよい。第１の鋳型核酸２について、ターゲット配列は、Ｆ１ｃ領域とＦ２ｃ領域とに挟まれた領域であってもよく、Ｆ１ｃ領域とＦ２ｃ領域とに挟まれた領域にＦ２ｃ領域若しくはＦ２ｃ領域の一部分の配列を加えた領域であってもよい。或いは、ターゲット配列は、Ｂ１領域とＢ２領域とに挟まれた領域であってもよく、Ｂ１領域とＢ２領域とに挟まれた領域にＢ２領域若しくはＢ２領域の一部分を加えた領域であってもよい。第２の鋳型核酸３について、ターゲット配列は、Ｆ１領域とＦ２領域とに挟まれた領域であってもよく、Ｆ１領域とＦ２領域とに挟まれた領域にＦ２領域若しくはＦ２領域の一部分を加えた領域であってもよい。或いは、ターゲット配列は、Ｂ１ｃ領域とＢ２ｃ領域とに挟まれた領域であってもよく、Ｂ１ｃ領域とＢ２ｃ領域とに挟まれた領域にＢ２ｃ領域若しくはＢ２ｃ領域の一部分の配列を加えた領域であってもよい。
【００４８】
ターゲット配列がループ部分に含まれるようにプライマーセットを設定したときに得られうる増幅産物と、ターゲット配列を含む核酸プローブとを反応場においてハイブリダイズさせてよい。それにより生じるハイブリダイズ信号を検出すれば、増幅産物の存在または不在を判定できる。その結果に基づいて、試料中の牛乳房炎微生物が検出できる。
【００４９】
ターゲット配列であるＦＰ領域、ＦＰｃ領域、ＢＰ領域、ＢＰｃ領域が、それぞれＦ１領域とＦ２領域とに挟まれた領域内、Ｆ１ｃ領域とＦ２ｃ領域とに挟まれた領域内、Ｂ１領域とＢ２領域とに挟まれた領域内、およびＢ１ｃ領域とＢ２ｃ領域とに挟まれた領域内に設計されたときに得られる増幅産物のループ部分の例を図３に示す。
【００５０】
図３（１）に示されるループ部分は、Ｆ１ｃ領域と、ＦＰｃ領域と、Ｆ２ｃ領域と、Ｆ１領域とを５’端から３’端に向けてこの順番で含む。Ｆ１ｃ領域とＦ１領域とは互いに相補的であり、互いに結合し、ループ部分を形成している。ＦＰｃ領域がターゲット配列である。このループ部分を有する増幅産物の検出は、ＦＰｃ領域のＦＰｃ配列に相補的な配列であるＦＰ配列を含む核酸プローブが使用される。核酸プローブは、ＦＰｃ領域に対してハイブリダイズする。図３（２）に示されるループ部分は、Ｆ１ｃ領域、Ｆ２領域、ＦＰ領域およびＦ１領域を５’端から３’端に向けてこの順番で含む。これを含む増幅産物は、ターゲット配列であるＦＰ領域のＦＰ配列に相補的な核酸プローブにより検出される。図３（３）に示されるループ部分は、Ｂ１ｃ領域、ＢＰＣ領域、Ｂ２ｃ領域およびＢ１領域を５’端から３’端に向けてこの順番で含む。これを含む増幅産物は、ターゲット配列であるＢＰｃ領域のＢＰｃ配列に相補的な核酸プローブにより検出される。図３（４）に示されるループ部分は、Ｂ１ｃ領域、Ｂ２領域、ＢＰ領域およびＢ１領域を５’端から３’端に向けてこの順番で含む。これを含む増幅産物は、ターゲット配列であるＢＰ領域のＢＰ配列に相補的な核酸プローブにより検出される。増幅産物におけるループ部分は、常に一本鎖の状態が維持されるために、変性操作を行う異なる各ターゲット配列に対して、簡便に核酸プローブを結合させることが可能である。
【００５１】
核酸プローブは、ターゲット配列に加えて更なる配列を含んでもよい。更なる配列は、例えば、核酸プローブを固定化する場合などに必要に応じてスペーサーとして使用される配列であってよい。また、核酸プローブは、それを検出可能にする他の標識物質を含んでもよい。
【００５２】
ターゲット配列は、好ましくは、約１５〜約３０塩基長、約３１〜約８０塩基長などであればよく、ＬＡＭＰ反応の効率を阻害しない長さであればよい。核酸プローブは、好ましくは、約１０〜約６０塩基長、約１２〜約４０塩基長などであればよい。
【００５３】
乳房炎原因微生物に由来する核酸を包括的に検出するための核酸プローブであってもよく、所望の種を特異的に検出するための核酸プローブであってもよい。
【００５４】
核酸プローブの構造は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸および／またはその他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これら何れかの核酸のキメラ核酸でもよい。
【００５５】
核酸プローブまたは核酸プローブ群においては、乳房炎原因微生物に由来する核酸を特異的に検出できる限り、変異塩基および／または変異配列が含まれてもよい。「特異的に検出できる限り」とは、分類学的に乳房炎原因微生物と同定されるために必ずしも必要ではない部位または配列に変異が存在してもよいことをいう。例えば、上述した核酸プローブは、何れも上記の配列番号により示される配列の任意の位置の塩基が１つまたは数個置換、欠失または付与されていてもよい。核酸プローブは、検出しようとする乳房炎原因微生物の株および／または種の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化してもよく、上記の配列番号により示される配列の任意の位置または部位において、１つまたは数個の塩基が置換、欠失または付与された配列であってもよい。このような変異部位を含み、且つ変異部位の塩基が互いに異なるように設計された複数種類の核酸プローブを１つの反応場に同時に存在させて増幅産物を検出してもよい。その場合、以下に具体的に記載する何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよく、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。或いは、変異部位に存在する可能性のある塩基をそれぞれに含み、且つ変異部位以外の配列については同一の配列を有する複数の核酸プローブからなるミックス塩基で設計された核酸プローブ群を使用してもよい。
【００５６】
核酸プローブは、固相、例えば、基体表面に固定化されたものであってもよく、液相において使用されてもよい。
【００５７】
例えば、核酸プローブは、基体に固定化されて使用される場合、典型的にはＤＮＡチップに固定化された核酸プローブとして用いられてよく、他のマイクロアレイを構成する核酸プローブとして用いられてもよい。当該増幅産物を検出するための核酸プローブは、検出する微生物株または種の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。
【００５８】
上述した何れの核酸プローブも、１つの反応場において１種類で使用されても、複数種類で使用されてもよい。また、核酸プローブは、基体表面に固定化されて使用される場合、当該基体における１信号を得るための１領域内において、１種類が単独で使用されてもよく、複数種類が一緒に使用されてもよい。複数種類で使用される場合、２種類、２種類以上、例えば、３種類、４種類または所望する配列を有する全ての核酸プローブが１信号を得るために一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れか１つ以上の塩基がミックス塩基となるように設計されてもよい。
【００５９】
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイズを検出するための手段は、これらに特に限定されるものではないが、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用してよい。
【００６０】
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイズを検出するための手段として核酸プローブ固定化チップを使用することが可能である。核酸プローブ固定化チップは、上述の核酸プローブを固相である基体に固定化した装置である。これは、一般的にマイクロアレイまたはＤＮＡチップとも称される。
【００６１】
核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例を模式図として図４に示す。核酸プローブ固定化チップ４１は、基体４２に固定化領域４３を具備する。核酸プローブ４４は該固定化領域４３に固定化される。このような核酸プローブ固定化チップ４１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体４２に配置される固定化領域４３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このような核酸プローブ固定化チップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域４３には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６２】
核酸プローブ固定化チップの更なる非限定的な１例を図５に示す。図５の核酸プローブ固定化チップ５１は、基体５２に固定化領域としての電極５３を具備する。核酸プローブ５４は電極５３に固定化される。電極５３は、パット５５に接続される。電極５３からの電気的情報はパット５５を介して取得される。このような核酸プローブ固定化チップ５１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体５２に配置される電極５３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例の核酸プローブ固定化チップ５１は、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。１つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６３】
核酸プローブを固相に固定化する場合は、上述した核酸プローブの末端にアミノ基、チオール基およびビオチンなどの官能基を導入してもよい。更に、官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入してもよい。ここで用いられるスペーサーの種類は特に限定されないが、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。また、核酸プローブの一部の塩基がユニバーサルなヌクレオチドに置換されてもよい。使用可能なユニバーサルなヌクレオチドの例は、deoxyinosine(dI)や、Gren Research社の3-Nitropyrrole、5-Nitroindole、deoxyribofuranosyl (dP)、deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl(dK)などを含む。
【００６４】
核酸プローブを固定化するための基体は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などであってよい。
【００６５】
５．プライマーセットおよび核酸プローブ
牛乳房炎原因微生物を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、ブドウ球菌属（Staphylococcus属）、連鎖球菌属（Streptococcus属）、コリネバクテリウム属（Coprynebacterium属）、腸内細菌科（Enterobacteria科）、マイコプラズマ属（Mycoplasma属）、藻類および酵母様真菌（Candida属）をそれぞれ特異的に増幅できるプライマーセットを含む。更にＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、前記微生物の特定の種を特定するためのプライマーセットを含んでもよい。
【００６６】
（１）＜ブドウ球菌属＞（Staphylococcus属）
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺から頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となるブドウ球菌として、S.hominis、S.simulans、S.equorum、S.intermediusを選択した。これらの微生物を検出することにより牛乳房炎原因微生物としてのブドウ球菌を特異的に検出することが可能である。
【００６７】
（１−１）ブドウ球菌属（Staphylococcus属）
ブドウ球菌属（Staphylococcus属）を特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第１のプライマーセットであってよい。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＢプライマーのための配列である。好ましい第１のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＢプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第１のプライマーセットは、ブドウ球菌属の微生物を特異的に増幅することに特に優れている。
【００６８】
第１のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号６、配列番号９および配列番号１５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む第１の核酸プローブ群であってよい。好ましい第１の核酸プローブ群に含まれるそれぞれの核酸プローブは、配列番号６、配列番号９および配列番号１５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。第１の核酸プローブ群は、ブドウ球菌属の微生物を包括的且つ特異的に検出することに特に優れている。
【００６９】
（２）＜連鎖球菌属＞（Enterococcus属、Streptococcus属、S.agalactiae、S. ubelis）
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となる連鎖球菌として、Streptococcus属およびEnterococcus属を選択した。更に、特に強い病原性をもつ菌種として、S.agalactiaeおよびS. ubelisをそれぞれ選択した。これらの微生物を検出することにより牛乳房炎原因微生物としての連鎖球菌を特異的に検出することが可能であり、且つ牛乳房炎の症状および予後についても予測することが可能となる。
【００７０】
連鎖球菌属および特定の連鎖球菌を特異的に増幅するためのプライマーセットは、以下のような第２のプライマーセット、第３のプライマーセット、第４のプライマーセットおよび／または第５のプライマーセットを含んでよい。
【００７１】
（２−１）Enterococcus属
Enterococcus属を特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第２のプライマーセットであってよい。配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４は、それぞれＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢプライマーのための配列である。好ましい第２のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなる。第２のプライマーセットは、Enterococcus属の微生物を特異的に増幅することに特に優れている。
【００７２】
（２−２）Streptococcus属
Streptococcus属を特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第３のプライマーセットであってよい。配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１は、それぞれＦ３プライマー、第１のＦＩＰプライマー、第２のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー、ＬＢｃプライマーのための配列である。好ましくは、第３のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、第１のＦＩＰプライマー、第２のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー、ＬＢｃプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。
【００７３】
（２−３）S. agalactiae
S. agalactiaeを特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第４のプライマーセットであってよい。配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマーのための配列である。好ましくは、第４のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。
【００７４】
（２−４）S. uberis
S. uberisを特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第５のプライマーセットであってよい。配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３および配列番号８４は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマーのための配列である。好ましくは、第５のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＦプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。
【００７５】
（２−５）核酸プローブ
第２のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号９２および配列番号９５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブ核酸プローブは、配列番号９２および配列番号９５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００７６】
第３のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号９９および配列番号１０１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号９９および配列番号１０１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００７７】
第４のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号１０６により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号１０６により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００７８】
第５のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号１１０により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号１０６により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００７９】
また、連鎖球菌属の微生物を検出するために使用する核酸プローブ群は、配列番号９２、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０６および配列番号１１０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む第２の核酸プローブ群であってよい。好ましい第２の核酸プローブ群に含まれるそれぞれの核酸プローブは、配列番号９２、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０６および配列番号１１０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。第２の核酸プローブ群は、ブドウ球菌属の微生物を特異的に検出することに特に優れている。第２の核酸プローブ群のうち、配列番号９２、配列番号９５、配列番号９９および配列番号１０１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブは、連鎖球菌属の微生物を包括的且つ特異的に検出するために特に優れている。また、配列番号１０６および配列番号１１０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブは、乳房炎の予後を予測するために特に有用な核酸プローブである。配列番号１０６により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブおよび/または配列番号１１０により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブについて検出シグナルが検出された場合には、試料の源である個体における乳房炎は、例えば、重症になる可能性がある、治療が難しい、および／または予後が良好または不良、と判定することが可能である。
【００８０】
（３）＜腸内細菌科（大腸菌群）＞（Enterobacteria科、E.coli、Klebsiella）
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となる腸内細菌科の微生物として、E.cloacae、E.fergusonii、E.vulneris、E.coliを選択した。これらの微生物を検出することにより牛乳房炎原因微生物としての腸内細菌科の微生物を特異的に検出することが可能である。また、特に牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、E.coliおよびKlebsiellaを選択した。E.coliおよびKlebsiellaを特異的に検出することにより、大腸菌群陽性個体の中でも特に注意して経過観察すべき個体を予測することが可能となる。
【００８１】
（３−１）Enterobacteria科
Enterobacteria科の微生物を増幅するためのプライマーセットは、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０および配列番号１３２によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第６のプライマーセットであってよい。配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０および配列番号１３２は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＢプライマーのための配列である。好ましい第６のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＢプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第６のプライマーセットは、腸内細菌科の微生物を特異的に増幅することに特に優れている。
【００８２】
（３−２）E.coli
E.coliを特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３および配列番号１５４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第７のプライマーセットであってよい。配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３および配列番号１５４は、それぞれ第１のＦ３プライマー、第２のＦ３プライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＢプライマー、ＦＩＰプライマーおよびＢ３プライマーのための配列である。好ましい第７のプライマーセットに含まれる第１のＦ３プライマー、第２のＦ３プライマー、ＢＩＰプライマー、ＬＢプライマー、ＦＩＰプライマーおよびＢ３プライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第７のプライマーセットは、E.coliを特異的に増幅することに特に優れている。
【００８３】
（３−３）Klebsiella
Klebsiellaを特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第８のプライマーセットであってよい。配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７および配列番号１６８は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、第１のＢＩＰプライマー、ＬＢプライマー、第２のＢＩＰプライマーのための配列である。好ましい第８のプライマーセットに含まれる第１のＢＩＰプライマー、ＬＢプライマー、第２のＢＩＰプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第８のプライマーセットは、Klebsiellaを特異的に増幅することに特に優れている。
【００８４】
（３−４）核酸プローブ
第６のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号１７０により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号１７０により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００８５】
第７のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号１８０により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号１８０により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００８６】
第８のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号１７５により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号１７５により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００８７】
また、腸内細菌科の微生物を検出するために使用する核酸プローブ群は、配列番号１７０、配列番号１７５および配列番号１８０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む第３の核酸プローブ群であってよい。好ましい第３の核酸プローブ群に含まれるそれぞれの核酸プローブは、配列番号１７０、配列番号１７５および配列番号１８０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。第３の核酸プローブ群は、腸内細菌科の微生物を特異的に検出することに特に優れている。第３の核酸プローブ群のうち、配列番号１７０で示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブは、腸内細菌科の微生物を包括的且つ特異的に検出するために特に優れている。また、配列番号１７５および配列番号１８０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブは、乳房炎の予後を予測するために特に有用な核酸プローブである。配列番号１７５および配列番号１８０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブについて検出シグナルが検出された場合には、試料の源である個体における乳房炎は、例えば、「その個体の乳房炎は重症化する」、「他の個体への感染を防がなくてはならない」、「場合によっては採取した乳汁を廃棄しなくてはならない」、ものであると判定することが可能である。
【００８８】
（４）＜コリネバクテリウム属＞（Coprynebacterium属）
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となるコリネバクテリウム属の微生物として、Corynebacterium bovisおよびCorynebacterium pyogenes（Arcanobacterium pyogenes）を選択した。これらの微生物を検出することにより牛乳房炎原因微生物としてコリネバクテリウム属の微生物を特異的に検出することが可能である。
【００８９】
（４−１）Corynebacterium bovis
Corynebacterium bovisを増幅するためのプライマーセットは、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８および配列番号２２９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第９のプライマーセットであってよい。配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８および配列番号２２９は、それぞれＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＦｃプライマーのための配列である。好ましい第９のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＦｃプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第９のプライマーセットは、Corynebacterium bovisを特異的に増幅することに特に優れている。
【００９０】
（４−２）Corynebacterium pyogenes（Arcanobacterium pyogenes）
Corynebacterium pyogenesは、Arcanobacterium pyogenesとも称される。Corynebacterium pyogenesを特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３および配列番号２３４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第１０のプライマーセットであってよい。配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３および配列番号２３４は、それぞれＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢｃプライマーのための配列である。好ましい第１０のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢｃプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第１０のプライマーセットは、Corynebacterium pyogenesを特異的に増幅することに特に優れている。
【００９１】
（４−３）核酸プローブ
第９のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号２５２により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号２５２により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００９２】
第１０のプライマーセットを用いた増幅によって得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号２５４により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号２５４により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００９３】
また、コリネバクテリウム属の微生物を検出するために使用する核酸プローブ群は、配列番号２５２および配列番号２５４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む第４の核酸プローブ群であってよい。好ましい第４の核酸プローブ群に含まれるそれぞれの核酸プローブは、配列番号２５２および２５４によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。第４の核酸プローブ群は、コリネバクテリウム属の微生物を包括的且つ特異的に検出するために特に優れている。
【００９４】
（５）マイコプラズマ属（Mycoplasma属）
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となるマイコプラズマ属の微生物として、Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma canadense, Mycoplasma arginini、Mycoplasma bovisを選択した。これらの微生物を検出することにより牛乳房炎原因微生物としてのマイコプラズマ属の微生物を特異的に検出することが可能である。また、Mycoplasma canadense、Mycoplasma argininiは、アルギニンを分解する能力を持つ。アルギニンが分解されて細胞から欠如すれば、完全な免疫反応を維持することが出来なくなり、乳房炎が重症化する。よって、Mycoplasmaの中でアルギニン分解性の株を特定することは、重症化する可能性がある乳房炎を見分けることにつながる。
【００９５】
（５−１）マイコプラズマ属
マイコプラズマ属（Mycoplasma属）を包括的且つ特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５および配列番号２６６によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第１１のプライマーセットであってよい。配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５および配列番号２６６は、それぞれ、第１のＦ３プライマー、第２のＦ３プライマー、第１のＦＩＰプライマー、第２のＦＩＰプライマー、第１のＢＩＰプライマー、第２のＢＩＰプライマー、第１のＢ３プライマー、第２のＢ３プライマー、第１のＬＦｃプライマーおよび第２のＬＦｃプライマーのための配列である。好ましい第１１のプライマーセットに含まれる第１のＦ３プライマー、第２のＦ３プライマー、第１のＦＩＰプライマー、第２のＦＩＰプライマー、第１のＢＩＰプライマー、第２のＢＩＰプライマー、第１のＢ３プライマー、第２のＢ３プライマー、第１のＬＦｃプライマーおよび第２のＬＦｃプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第１１のプライマーセットは、マイコプラズマ属の微生物を包括的且つ特異的に増幅することに特に優れている。
【００９６】
（５−２）アルギニン分解性マイコプラズマ
アルギニン分解性マイコプラズマ（Mycoplasma）を特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９および配列番号３１０によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第１２のプライマーセットであってよい。配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９および配列番号３１０は、それぞれＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーのための配列である。好ましい第１２のプライマーセットに含まれるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってもよい。第１２のプライマーセットは、アルギニン分解性マイコプラズマを特異的に増幅することに特に優れている。
【００９７】
（５−３）核酸プローブ
第１１のプライマーセットを用いた増幅により得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号３１１および配列番号３１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号３１１および配列番号３１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからそれぞれなる核酸プローブであってよい。
【００９８】
第１２のプライマーセットを用いた増幅により得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号３１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号３１５により示されるポリヌクレオチドからなってよい。
【００９９】
また、マイコプラズマ属の微生物を検出するために使用する核酸プローブ群は、配列番号３１１、配列番号３１２および配列番号３１５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む第５の核酸プローブ群であってよい。好ましい第５の核酸プローブ群に含まれるそれぞれの核酸プローブは、配列番号３１１、配列番号３１２および配列番号３１５によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。第５の核酸プローブ群は、マイコプラズマ属の微生物を特異的に検出することに特に優れている。第５の核酸プローブ群のうち、配列番号３１１および配列番号３１２でそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブは、マイコプラズマ属の微生物を包括的且つ特異的に検出するために特に優れている。また、配列番号３１５により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブは、乳房炎の予後を予測するために特に有用な核酸プローブである。配列番号３１５により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブについて検出シグナルが検出された場合には、試料の源である個体における乳房炎は、例えば、予後が悪い乳房炎であるか否か、感染性が強い乳房炎であるか否か、感染個体の廃用を検討しなければならない乳房炎であるか否か、ということを判定することが可能である。
【０１００】
（６）藻類
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となる藻類として、プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）を選択した。これらの微生物を検出することにより牛乳房炎原因微生物としての藻類を特異的に検出することが可能である。
【０１０１】
（６−１）プライマーセット
プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）を包括的且つ特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２および配列番号３２３によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドを含むプライマーを含む第１３のプライマーセットであってよい。配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１、配列番号３２２および配列番号３２３は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＦプライマーのための配列である。好ましい第１３のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＦプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなってよい。第１３のプライマーセットは、プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）を包括的且つ特異的に増幅することに特に優れている。
【０１０２】
（６−２）核酸プローブ
第１３のプライマーセットを用いた増幅により得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号３３４により示されるポリヌクレオチドを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号３３４により示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブであってよい。
【０１０３】
また、プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）を検出するために使用する核酸プローブは、配列番号３３４により示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブを含む第６の核酸プローブ群であってよく、配列番号３３４により示されるポリヌクレオチドを含む第６の核酸プローブであってもよい。
【０１０４】
第６の核酸プローブ群または第６の核酸プローブは、プロトテカ・ゾフィ（Prototheca zopfii）を包括的且つ特異的に検出することに特に優れている。
【０１０５】
（７）＜酵母様真菌＞（Candida属、Cryptococcus属）
牛乳房炎に罹患した個体の乳腺で頻繁に検出される菌であることから、牛乳房炎の原因となる酵母様真菌として、Candida属およびCryptococcus属を選択した。これらの微生物を検出することにより、牛乳房炎原因微生物としての酵母様真菌を特異的に検出することが可能である。
【０１０６】
酵母様真菌を特異的に増幅するためのプライマーセットは、第１４のプライマーセットおよび第１５のプライマーセットを含んでよい。
【０１０７】
（７−１）Candida属
Candida属を特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４８および配列番号３４９によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第１４のプライマーセットであってよい。配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４８および配列番号３４９は、それぞれＦ３プライマー、第１のＢ３プライマー、第２のＢ３プライマー、第１のＦＩＰプライマー、第２のＦＩＰプライマー、第１のＢＩＰプライマー、第２のＢＩＰプライマー、第１のＬＢプライマーおよび第２のＬＢプライマーのための配列である。好ましい第１４のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、第１のＢ３プライマー、第２のＢ３プライマー、第１のＦＩＰプライマー、第２のＦＩＰプライマー、第１のＢＩＰプライマー、第２のＢＩＰプライマー、第１のＬＢプライマーおよび第２のＬＢプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなる。第１４のプライマーセットは、Candida属の微生物を特異的に増幅することに特に優れている。
【０１０８】
（７−２）Cryptococcus属
Cryptococcus属を特異的に増幅するためのプライマーセットは、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１および配列番号３６２によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含むプライマーを含む第１５のプライマーセットであってよい。配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１および配列番号３６２は、それぞれＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＢプライマーのための配列である。好ましい第１５のプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＬＢプライマーは、前記それぞれの配列番号により示されるポリヌクレオチドからなる。第１５のプライマーセットは、Cryptococcus属の微生物を特異的に増幅することに特に優れている。
【０１０９】
（７−３）核酸プローブ
第１４のプライマーセットを用いた増幅により得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号３７０および配列番号３７１によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含んでよい。
【０１１０】
第１５のプライマーセットを用いた増幅により得られた増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブは、配列番号３８８により示されるポリヌクレオチドを含んでよい。好ましい核酸プローブは、配列番号３８８により示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブであってよい。
【０１１１】
また、Candida属およびCryptococcus属を検出するために使用する核酸プローブ群は、配列番号３７０、配列番号３７１および配列番号３８８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドをそれぞれに含む核酸プローブを含む第７の核酸プローブ群であってよい。好ましい第７の核酸プローブ群に含まれるそれぞれの核酸プローブは、配列番号３７０、配列番号３７１および３８８によりそれぞれに示されるポリヌクレオチドからなってよい。第７の核酸プローブ群は、Candida属およびCryptococcus属の微生物を包括的且つ特異的に検出するために特に優れている。
【０１１２】
７．アッセイキット
１つの態様に従うと、乳房炎原因微生物の検出および／または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。更なる態様に従うと、乳房炎原因微生物の遺伝子型分類および／または種分類を行うためのアッセイキットが提供されてもよい。
【０１１３】
アッセイキットは、上述のプライマー若しくはプライマーセット、および/または核酸プローブ若しくは核酸プローブ群若しくは核酸プローブセットを含めばよい。好ましくは、アッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットと、核酸プローブまたは核酸プローブ群または核酸プローブセットとを含めばよい。アッセイキットは、プライマー若しくはプライマーセット、および/または核酸プローブ若しくは核酸プローブ群若しくは核酸プローブセットに加えて、ＬＡＭＰ法による増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれる核酸プローブは上述したような基体に固定化されて提供されてもよく、当該アッセイキットが、固定化のための基体を更に含んで提供されてもよい。
【０１１４】
アッセイキットに含まれるプライマーセットは、第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、第３のプライマーセット、第４のプライマーセット、第５のプライマーセット、第６のプライマーセット、第７のプライマーセット、第８のプライマーセット、第９のプライマーセット、第１０のプライマーセット、第１１のプライマーセット、第１２のプライマーセット、第１３のプライマーセット、第１４のプライマーセットおよび第１５のプライマーセットを全て含んでもよく、これらのプライマーセットの少なくとも１を含んでもよく、これらのプライマーセットの何れかの組み合わせを含んでもよい。
【０１１５】
アッセイキットに含まれる核酸プローブセットは、検出されるべき増幅産物に応じて選択された核酸プローブまたは核酸プローブ群を含んでよい。核酸プローブセットは、第１の核酸プローブ群、第２の核酸プローブ群、第３の核酸プローブ群、第４の核酸プローブ群、第５の核酸プローブ群、第６の核酸プローブおよび第７の核酸プローブ群を含んでもよく、これらの核酸プローブ群若しくは核酸プローブの少なくとも１を含んでもよく、これらの核酸プローブ群若しくは核酸プローブの何れかの組み合わせを含んでもよい。
【０１１６】
本態様によれば、簡便、安価、高速に乳房炎原因微生物属に分類される微生物の検出および科レベル、属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【０１１７】
上述のようなプライマーセットを用いて試料中の核酸を増幅することにより、簡便、安価、高速に、特異的に乳房炎原因微生物核酸を増幅することが可能である。このようなプライマーセットを用いて、試料に含まれる核酸をＬＡＭＰ法により増幅し、その結果生じた増幅産物の有無および／または量を判定することにより、試料に含まれる乳房炎原因微生物由来の核酸を特異的に検出することが可能である。更に、その結果から、試料の源である動物個体について、乳房炎であるか否か、および／または乳房炎の予後が良好か悪いか、個体を隔離しなければならない乳房炎か否か、個体を廃用にしなければならない乳房炎か否か、などの診断を行うことが可能である。
【０１１８】
従来の方法では、特異性を配列検出の際の特異性は、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出している。この場合、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く、検出感度が悪い。そのような方法において、従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するなどの方法も行われている。このような場合では、酵素の使用および磁気ビーズの使用などによって、ワーキングコストが高額となったり、操作が煩雑になったりする。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【０１１９】
これまで、迅速診断法としては特徴的な配列を含む領域をＰＣＲ法で増幅し、電気泳動法により検出する方法などが使用されている。しかしながら、ＰＣＲ法を利用する診断方法には、種々の不利益、例えば、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性などに問題がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をする可能性がある。また実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。本態様に従うプライマーセットを使用することにより、より簡便に、より正確に、より迅速に、より広い検出レンジで、特異的に乳房炎原因微生物由来の核酸を増幅することが可能である。
【０１２０】
環境中の微生物嚢の研究などでも、乳房炎原因微生物に特徴的な遺伝子配列の存在の検出と迅速な同定を行うことが可能な方法の開発が求められているが、このような要求も本態様によって満たされる。
【０１２１】
［例］
以下に、牛乳房炎原因微生物の核酸を検出するための具体的な方法を例として説明する。
【０１２２】
［例１］ブドウ球菌の検出
牛乳房炎の原因となるブドウ球菌のうち、S.hominis、S.simulans、S.equorum、S.intermediusを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１に示すプライマーが候補として選定された。
【表１】
2015100282.tif 000003
【０１２３】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号１、２、３、４および５でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表２に示す候補を設計した。
【表２】
2015100282.tif 000004
【０１２４】
S.hominis、S.simulans、S.equorumおよびS.intermediusを鋳型として得られた増幅産物の検出は、配列番号６、９および１５でそれぞれ示される核酸プローブにより特異的に行うことが可能であった。
【０１２５】
[例２]  連鎖球菌の検出
牛乳房炎の原因となる連鎖球菌のうち、Streptococcus属とEnterococcus属を検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表３に示すプライマーが候補として選定された。
【表３】
2015100282.tif 000005
【０１２６】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、Streptococcus属は配列番号４６、４７、４８、４９および５０でそれぞれに示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表４に示す候補を設計した。Streptococcus属からの増幅産物の検出は、配列番号９９および１０１でそれぞれ示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【表４】
2015100282.tif 000006
【０１２７】
Enterococcus属は、配列番号３０、３１、３２、３３および３４でそれぞれに示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表５に示す候補を設計した。Enterococcus属からの増幅産物の検出は、配列番号９２および９５でそれぞれ示される核酸プローブによって特異的に行うことができた。
【表５】
2015100282.tif 000007
【０１２８】
S.agalactiaeおよびS.ubelisを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。ｒｅｃＮ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表６および表７に示すプライマーが候補として選定された。
【表６】
2015100282.tif 000008
【０１２９】
【表７】
2015100282.tif 000009
【０１３０】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、S.agalactiaeは、配列番号６５、６６、６７、６８および６９でそれぞれ示されるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表５に示す候補を設計した。S.agalactiaeおよびS.ubelisからの増幅産物の検出は、配列番号１０６で示される核酸プローブにより特異的に行うことが可能であった。
【０１３１】
S.ubelisは、配列番号８０、８１、８２、８３および８４でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表５に示す候補を設計した。S.ubelisからの増幅産物の検出は、配列番号１１０で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１３２】
[例３]  大腸菌群の検出
牛乳房炎の原因となる大腸菌群を検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。ｒｐｏＡ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表５に示すプライマーが候補として選定された。
【表８】
2015100282.tif 000010
【０１３３】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号１２７、１２８、１２、１３０および１３２でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表９に示す候補を設計した。
【表９】
2015100282.tif 000011
【０１３４】
大腸菌群からの増幅産物の検出は、配列番号１７０で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１３５】
E.coliを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。ｕｖｒＣＡ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１０に示すプライマーが候補として選定された。ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７および１６８でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表９に示す候補を設計した。
【表１０】
2015100282.tif 000012
【０１３６】
E.coliからの増幅産物の検出は、配列番号１８０で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１３７】
Klebsiellaを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。ｍｅｔＧ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１０に示すプライマーが候補として選定された。ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３および１５４でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表９に示す候補を設計した。Klebsiellaからの増幅産物の検出は、配列番号１７５で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１３８】
[例４]  コリネバクテリウムの検出
牛乳房炎の原因となるC.bovisを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。ｒｐｏＢ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１１、即ち、表１１−１および表１１−２に示すプライマーが候補として選定された。
【表１１−１】
2015100282.tif 000013
【０１３９】
【表１１−２】
2015100282.tif 000014
【０１４０】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号２２４、２２５、２２６、２２７および２２８でそれぞれに示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表１２に示す候補を設計した。
【表１２】
2015100282.tif 000015
【０１４１】
C.bovisからの増幅産物の検出は、配列番号２５１で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１４２】
C.pyogenes(即ち、A.pyogenes)を検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１１−２に示すプライマーが候補として選定された。ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号２２９、２３０、２３１、２３２および２３３でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表１２に示す候補を設計した。T.pyogenesからの増幅産物の検出は、配列番号２５３で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１４３】
[例５]  マイコプラズマの検出
牛乳房炎の原因となるマイコプラズマのうち、M.bovis、M.californicum、M.bovigenitalium、M.canadense、M.argininiを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。１６Ｓ−ｒＤＮＡ遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１３、即ち、表１３−１、表１３−２および表１３−３に示すプライマーが候補として選定された。
【表１３−１】
2015100282.tif 000016
【０１４４】
【表１３−２】
2015100282.tif 000017
【０１４５】
【表１３−３】
2015100282.tif 000018
【０１４６】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４および２６５でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表１４に示す候補を設計し、配列番号３１０、３１１で特異的な検出が可能であった。
【表１４】
2015100282.tif 000019
【０１４７】
アルギニン分解性マイコプラズマについては、配列番号３０４、３０５、３０６、３０７、３０８および３０９でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合にアルギニン分解性マイコプラズマからの核酸を鋳型核酸として特異的に増幅した。アルギニン分解性マイコプラズマからの増幅産物の検出は、配列番号３１４で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１４８】
[例６]  藻類の検出
牛乳房炎の原因となる藻類のうち、Prototheca zopfiiを検出するためのLAMP増幅プライマーの設計を行った。NL1-NL4遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１５に示すプライマーが候補として選定された。
【表１５】
2015100282.tif 000020
【０１４９】
ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号３１８、３１９、３２０、３２１および３２２でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。核酸プローブについては、表１６に示す候補を設計した。
【表１６】
2015100282.tif 000021
【０１５０】
Prototheca zopfiiからの増幅産物の検出は、配列番号３３３で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１５１】
[例７]  酵母様真菌の検出
牛乳房炎の原因となる酵母様真菌のCandidaとCryptococcusを検出するためのＬＡＭＰ増幅プライマーの設計を行った。ＮＬ１−ＮＬ４遺伝子をターゲット領域に選定し、アライメントの結果、表１７に示すプライマーが候補として選定された。
【表１７】
2015100282.tif 000022
【０１５２】
CandidaについてＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した結果、配列番号３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４７および３４８でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。プローブについては、表１８に示す候補を設計した。
【表１８】
2015100282.tif 000023
【０１５３】
配列番号３６８、３６９で特異的な検出が可能であった。
【０１５４】
Cryptococcusについては、アライメントの結果、表１７に示すプライマーが候補として選定された。ＬＡＭＰ増幅反応の特性を濁度の立ち上がり時間で評価した。その結果、Cryptococcusについては、配列番号３５７、３５８、３５９、３６０および３６１でそれぞれ示されるプライマーからなるプライマーセットを用いた場合に、増幅時間が最も短くなることが分かった。即ち、Cryptococcusは、これらの配列により特異的に且つ効率よく増幅された。Cryptococcusからの増幅産物を特異的に検出するための核酸プローブとして、表１４に示す候補を設計した。Cryptococcusからの増幅産物の検出は、配列番号３８６で示される核酸プローブによって特異的に行うことが可能であった。
【０１５５】
［例８］
野外検体を用いて、牛乳房炎原因菌検査の従来法である細菌培養法と実施形態に従うＤＮＡチップを用いた方法によって、それぞれ検査を行い、その結果を比較した。
【０１５６】
（１）実験の目的
従来法である細菌培養法に比して実施形態に従うＤＮＡチップ法は、どのような点で優れているかを示すために、実際に検体を用いて解析した。
【０１５７】
（２）材料
実験は、北海道十勝地方のＡ農場で飼育されている牛４０頭を対象に行った。牛１頭には分房が４つあり、それぞれから採取したサンプルを個別に測定するため、試験数は頭数に分房数の４を乗じた数となった。サンプル毎、分房毎に絞った乳汁を、そのまま冷蔵保存状態で東京近郊の実験施設に輸送した。採取した翌日から細菌培養検査を開始した。同じ乳汁は、培養検査開始からさらに１日間長く冷蔵状態で保管されたあと、ＤＮＡチップ検査に供した。
【０１５８】
＜細菌培養法＞
細菌培養は、乳汁を１０〜５０μＬずつ、然るべき培地に塗布し、３７℃の恒温機内で静置することで行った。培地とは、期待される感染細菌別にそれぞれ選ばれるものであり、酵素基質培地「クロモアガーオリエンタシオン」、血液寒天培地、ＤＨＬ寒天培地、マンニット食塩培地、等から選択された。それらの培地を用いて行われる一次培養は、３７℃で行われ、培養時間は２４〜７２時間を必要とした。培養を終えた後、例えば「クロモアガーオリエンタシオン」の場合は、出現したコロニーの色で、大まかな菌の同定を行った。
【０１５９】
同定基準
同定基準は次の通りとした：
淡黄色：黄色ブドウ球菌（ＳＡ），ブドウ球菌（ＣＮＳ）
白〜青緑色：Streptococcus属、Enterococcus属
ピンク色  ：  E.coli
メタル青色  ：  Klebsiella、Enterobacteria
茶褐色：Proteus
白〜無色：Pseudomonas。
【０１６０】
大まかに同定された菌について、さらにBD BBL CRYSTALキット（日本べクトン・ディッキンソン社）などを用いて精密に同定した。ここで、さらに３７℃の培養が１８〜２０時間必要となった。
【０１６１】
＜ＤＮＡチップ法＞
（１）核酸抽出法
乳汁からの核酸抽出は、FAST-ID DNA抽出キット（日本認証サービス株式会社製）の製造元が推奨方法に準じて行った。具体的には、推奨される抽出工程に加えて、更に次の工程を追加して行った。即ち、推奨される抽出工程の加えて、固形物および脂肪分、並びに菌の外殻を破壊するためにビーズビーティング処理を行い、さらにタンパク質と脂質を更に除去するために、硫酸アンモニウムと酢酸とによる沈殿処理を行った。乳汁は、１検査あたり、２００μＬ〜４００μＬを使用した。抽出後の核酸は、６０μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。抽出後のサンプルは、その後の増幅反応に供するまで、−２０℃にて保管した。
【０１６２】
（１）ＬＡＭＰ増幅反応
ＬＡＭＰ法による増幅を行うために使用したＬＡＭＰ反応液の組成は、下記の通りであった；
ＬＡＭＰ反応液組成：
２０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．８）
１０ｍＭ    ＫＣｌ
８ｍＭ      ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ    （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％    Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ    Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰｓ
Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ    ８ｕｎｉｔ。
【０１６３】
この組成の反応液に、下記の濃度で必要なプライマーを持ち込んだ。
【０１６４】
primer 添加量：
ＦＩＰ          ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰ          ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３              ５ｐｍｏＬ
Ｂ３              ５ｐｍｏＬ
Ｌｏｏｐ        ２０ｐｍｏＬ。
【０１６５】
反応は、それぞれの菌種毎に個別の反応チューブ内で、２５μＬの反応スケールで行った。抽出産物は、９５℃の３分間の熱処理を施したものを急冷した。その後、それをそれぞれの反応チューブに２μＬずつ添加し、反応を６１℃にて１時間行った。増幅終了した産物は、８０〜９５℃で３分間加温処理して、酵素失活を行った。
【０１６６】
（２）ＤＮＡチップ測定
ＤＮＡチップは、配列番号６、９、１５、９２、９５、９９、１０１、１０６、１１０、１７０、１７５、１８０、２５２、２５４、３１０、３１１、３１４、３３３、３６８、３６９および３８６でそれぞれ示される核酸プローブを、ガラス基板の表面にそれぞれ１信号を得るための各領域に種類毎に固定化して作製した。このようなＤＮＡチップを用いて、増幅産物を１反応あたり２μＬずつ添加して測定した。測定装置は、ジェネライザー２Ｃ６００装置を用いた。使用した反応条件を表２９に示す。
【表１９】
2015100282.tif 000024
【０１６７】
（３）結果
測定結果のうち、１０頭の結果を表２０−１および表２０−２に示した。
【表２０−１】
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【０１６８】
【表２０−２】
2015100282.tif 000026
【０１６９】
表２０−１および表２０−２は、左から個体番号（個体Ｎｏ．）、各分房（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）、１次培養で判明した菌数（cuf/ml）を示し、その後から１次培養での大まかな同定結果がＳＡ（黄色ブドウ球菌）、ＳＡＧ(Streptococcus agalactiae)、ＣＮＳ（ブドウ球菌）、ＯＳ（ＳＡＧ以外の連鎖球菌）、ＣＯ（大腸菌群）、Coryne. Spp（コリネバクテリウム属）に欄を分けて、検出された菌について黒丸を記した。その右側の「体細胞数」は、乳汁中に存在する好中性多角白血球、リンパ球およびマクロファージなどの混在数を示す数値であり、炎症の度合いを示す指標である。およそ１０万個／ｍＬ以下は正常分房と考えられている。その次の欄には、ＢＤ  ＢＢＤキットによる精密同定結果を表記した。その欄の右側の数値は、同定結果の信頼性を示す数値である。数値が高い方が信頼性が高いことを示す。表の一番右側には、実施形態に従う牛乳房炎用ＤＮＡチップを用いて行った検査の結果を示した。陽性と判定された菌種に黒丸を付した。
【０１７０】
例えば、Ｎｏ．１、個体Ｎｏ．３４７の分房Ａの結果では、体細胞数が１０万個を超えているため、乳房炎に罹患した分房であることが分かった。その培養結果では、ブドウ球菌が陽性となっており、ＢＤ  ＢＢＤクリスタルキットでの精密同定結果からも、ブドウ球菌の中の種が明らかになっている。しかし、ＤＮＡチップで検査すると、ブドウ球菌以外に、Streptococcus属、Enterococcus属の連鎖球菌と、Enterobacteria科が陽性であることがわかった。すなわち、培養法に比べると、ＤＮＡチップを使用することで、連鎖球菌と大腸菌群の陽性が発見できたことになる。同様に、Ｂ分房の結果では、体細胞数が１０万個を超えているため、この分房も乳房炎に罹患していることがわかった。その培養結果では、Ａ分房と同じくブドウ球菌が陽性となっており、ＢＤ  ＢＢＤクリスタルキットでの精密同定結果からも、ブドウ球菌の中の陽性種名が明らかになっている。ところが、ＤＮＡチップで検査すると、ブドウ球菌以外に、Streptococcus属、Enterococcus属の連鎖球菌と、Enterobacteria科、E.coli、そしてCandida属が陽性であることがわかった。これらのことから、培養法に比して、ＤＮＡチップの方が微細な混在菌種を陽性と判定する能力が優れていることがわかった。他の個体、分房においても、総じて同様の現象が認められた。
【０１７１】
表２１に、４０頭の４分房すべての検査結果を、培養法とＤＮＡチップ法との結果の違いの観点でまとめた。
【表２１】
2015100282.tif 000027
【０１７２】
表２１の結果から、表右端に示した陽性一致率と陰性一致率では、概ね高い数字を示しており、ＤＮＡチップ検査が培養法と大きく異なる結果を示していないことがわかる。しかし、陰性一致率が低いブドウ球菌、E.coli、緑膿菌においては、培養法で陰性であったがＤＮＡチップで陽性であったものが多く、ＤＮＡチップの感度の優位性が現れている。特に、緑膿菌などは培養が難しく、菌が存在したとしても必ずしもコロニーを形成するわけではないような菌種に関しては、陰性一致率が低くなることは予測されたことであるが、実際に実験を行った結果にといても予測が正しいことが裏付けられた。また、コロニー形成能が低いわけではないブドウ球菌やE.coliであっても、培養開始までに冷蔵環境で２４時間程度経過してしまうと、菌は存在するのだがコロニーを形成できるほどの活性が保てていない状態になり、陰性一致率が低くなる考えられる。これらのことから、培養法が持つ不安定性を補って、しかも高感度に検出することが可能なＤＮＡチップは、牛乳房炎の原因菌検査にとって有用な技術であると言える。また、培養法では精密な同定結果を得るまでに、培養開始から２〜４日間という時間が必要であるのに対し、ＤＮＡチップ法であれば３．５時間程度で結果を得ることができる点でも、早期治療開始、個体隔離施行などの臨床的観点から有用であると考えられた。
【０１７３】
これらの実験結果から、実施形態に従う方法により、乳房炎原因微生物を特徴的に且つ迅速に検出および同定することが可能であることが証明された。
【図１】
2015100282.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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