(57)【要約】      （修正有）【課題】生体分子を構成する単分子を高精度で識別することができる生体分子シーケンシング装置用電極を提供する。【解決手段】試料５０に含まれる少なくとも１種類以上の単分子５２が連結した生体分子が対向位置を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対１２ａ、１２ｂを備え、前記対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた生体分子シーケンシング装置用電極。【選択図】図１
2015154750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる少なくとも１種類以上の単分子が連結した生体分子が対向位置を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対を備え、
前記対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項２】
前記上流側の上流側流路の形状が、前記対向位置から前記上流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であると共に、前記下流側の下流側流路の形状が、前記対向位置から前記下流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であり、前記下流側流路の拡がり角度が、前記上流側流路の拡がり角度よりも小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
請求項１記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項３】
前記電極対の対向方向と直交する直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さよりも長くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
請求項２記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項４】
前記直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さの２倍以上で且つ４倍以下である
請求項３記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項５】
前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする円と前記下流側の下流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さが、前記円と前記上流側の上流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さより短くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
請求項１〜４の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項６】
前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする予め定めた範囲に含まれる前記下流側の下流側流路の面積が、前記予め定めた範囲に含まれる前記上流側の上流側流路の面積より小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせた
請求項１〜５の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項７】
前記電極対を、電極間距離が各々異なる複数の電極対とした
請求項１〜６の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極と、
前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定する測定部と、
前記測定部により測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する識別部と、
を備えた生体分子シーケンシング装置。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極を備えた生体分子シーケンシング装置において実行される生体分子シーケンシング方法であって、
前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定し、
測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する
生体分子シーケンシング方法。
【請求項１０】
コンピュータを、
請求項８記載の生体分子シーケンシング装置の測定部及び識別部として機能させるための生体分子シーケンシングプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質を構成するアミノ酸の配列、核酸を構成するヌクレオチドの配列、糖鎖を構成する単糖の配列など、生体分子、特に生体高分子を構成する単分子の配列をシーケンシングにより決定することが行われている。例えば、酵素分解法によるＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）法、質量分析、Ｘ線結晶構造解析、エドマン分解法等を用いて、タンパク質の配列を決定することが行われている。
【０００３】
また、電極間距離を１ｎｍ以下に固定したナノギャップ電極を用いて、１分子を流れるトンネル電流を測定することにより、単分子識別を行うシーケンシング技術が提案されている。また、このような技術において、試料が流れる流路に関して様々な技術が提案されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２２７７３５号公報
【特許文献２】特開２０１２−１１０２５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
トンネル電流による単分子識別を行う単分子電気計測法は、試料分子の電子エネルギー状態を直接計測することによって単分子識別が可能となる方法である。従来の単分子電気計測法における試料分子の導入方法では、熱揺らぎによるブラウン運動による偶発的確率事象を利用しているため、分子がセンシング電極間を通過する頻度が低頻度であり且つ分子の検出精度が低精度である、という問題があった。
【０００６】
溶液中の試料分子の導入方法としては、ポンプ圧や電気浸透流を用いた方法があるが、何れも分子スケールで制御できる定常流を誘起させることはできないため、分子がセンシング電極間を通過する頻度が低頻度となるのを解決するには不十分である。このため、従来のトンネル電流による単分子電気計測法では、高濃度の純粋試料溶液を用いるような限定的な条件におけるリシーケンシングを目的とする場合しか適用できない、という問題があった。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、生体分子を構成する単分子を高精度で識別することができる生体分子シーケンシング装置用電極、生体分子シーケンシング装置、方法、及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明に係る生体分子シーケンシング装置用電極は、試料に含まれる少なくとも１種類以上の単分子が連結した生体分子が対向位置を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対を備え、前記対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせている。
【０００９】
この発明によれば、電極対の対向位置より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、前記対向位置より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、電極対の上流側の形状と下流側の形状とを異ならせている。すなわち、電極対の形状が、生体分子の導入側である上流側と、生体分子の排出側である下流側とで非対称となっている。これにより、試料の生体分子の電気泳動力を促進して安定的な定常流を誘起することができ、生体分子を安定的に電気泳動させることができるため、単分子を高精度で識別することができる。
【００１０】
なお、請求項２に記載したように、前記上流側の上流側流路の形状が、前記対向位置から前記上流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であると共に、前記下流側の下流側流路の形状が、前記対向位置から前記下流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であり、前記下流側流路の拡がり角度が、前記上流側流路の拡がり角度よりも小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
【００１１】
また、請求項３に記載したように、前記電極対の対向方向と直交する直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さよりも長くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
【００１２】
また、請求項４に記載したように、前記直交方向における前記下流側流路の長さが、前記直交方向における前記上流側流路の長さの２倍以上で且つ４倍以下であることが好ましい。
【００１３】
また、請求項５に記載したように、前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする円と前記下流側の下流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さが、前記円と前記上流側の上流側流路の端部とが交わって形成される円弧の長さより短くなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
【００１４】
また、請求項６に記載したように、前記電極対の最も狭い電極間の中心を中心とする予め定めた範囲に含まれる前記下流側の下流側流路の面積が、前記予め定めた範囲に含まれる前記上流側の上流側流路の面積より小さくなるように、前記電極対の前記上流側の形状と前記下流側の形状とを異ならせてもよい。
【００１５】
また、請求項７に記載したように、前記電極対を、電極間距離が各々異なる複数の電極対としてもよい。
【００１６】
請求項８記載の発明の生体分子シーケンシング装置は、請求項１〜７の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極と、前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定する測定部と、前記測定部により測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する識別部と、を備える。
【００１７】
請求項９記載の発明の生体分子シーケンシング方法は、請求項１〜７の何れか１項に記載の生体分子シーケンシング装置用電極を備えた生体分子シーケンシング装置において実行される生体分子シーケンシング方法であって、前記生体分子が前記生体分子シーケンシング装置用電極の電極対の対向位置を通過したときに生じるトンネル電流を測定し、測定されたトンネル電流から得られた検出物理量に基づいて、前記生体分子を構成する少なくとも１種類の単分子の種類を識別する。
【００１８】
請求項１０記載の生体分子シーケンシングプログラムは、コンピュータを、請求項８記載の生体分子シーケンシング装置の測定部及び識別部として機能させる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生体分子を構成する単分子を高精度に識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置の構成を示す概略図である。
【図２】第１の実施の形態におけるナノギャップ電極対の周辺の拡大図である。
【図３】図３の一部拡大図である。
【図４】ナノギャップ電極対に電圧が印加されることにより発生する電界について説明するための図である。
【図５】ナノギャップ電極対の上流側流路の長さと下流側流路の長さとの比が１：１の場合におけるリード時間の測定結果を示す図である。
【図６】ナノギャップ電極対の上流側流路の長さと下流側流路の長さとの比が１：２の場合におけるリード時間の測定結果を示す図である。
【図７】ナノギャップ電極対の上流側流路の長さと下流側流路の長さとの比が１：４の場合におけるリード時間の測定結果を示す図である。
【図８】ナノギャップ電極対の上流側流路の長さに対する下流側流路の長さとリード時間との関係の測定結果を示す図である。
【図９】第１の実施の形態における制御部の機能的構成を示すブロック図である。
【図１０】第１の実施の形態における生体分子シーケンシング処理を示すフローチャートである。
【図１１】読み取る塩基の長さ毎にリード数を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】リード転換の回数に対する正常にリードできた回数の割合毎にリード数を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置の構成を示す概略図である。
【図１４】第２の実施の形態における制御部の機能的構成を示すブロック図である。
【図１５】第２の実施の形態における生体分子シーケンシング処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。以下の実施の形態では、電極間を単分子が通過した際に流れるトンネル電流を測定することにより生体分子をシーケンシングする場合について説明する。
【００２２】
＜第１の実施の形態＞
【００２３】
図１に示すように、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置１０は、生体分子シーケンシング装置用電極としてのナノギャップ電極対１２（１２ａ、１２ｂ）、測定用電源１８、電流計２４、及び制御部２６を含んで構成されている。以下に、各構成について説明する。
【００２４】
ナノギャップ電極対１２は、対向する２つのナノギャップ電極１２ａ、１２ｂにより構成されている。ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂは、試料５０に含まれる生体分子を構成する単分子５２が図１における矢印Ａ方向に流れて電極間を通過する際に、トンネル電流が流れるような距離を隔てて配置されている。ここで、生体分子には、生体高分子であるタンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖等が含まれる。また、生体分子を構成する単分子には、タンパク質またはペプチドを構成するアミノ酸、核酸を構成するヌクレオチド、糖鎖を構成する単糖等が含まれるが、これらに限られるものではない。
【００２５】
電極間距離が、単分子５２の分子直径よりも長すぎると、ナノギャップ電極対１２の電極間にトンネル電流が流れ難くなったり、２つ以上の単分子５２が、同時にナノギャップ電極対１２の間に入り込んだりする。反対に、電極間距離が単分子５２の分子直径よりも短すぎると、ナノギャップ電極対１２の電極間に単分子５２が入り込めなくなる。
【００２６】
電極間距離が、単分子５２の分子直径よりも長すぎたり、短すぎたりすると、単分子５２を介したトンネル電流を検出することが困難になる。よって、電極間距離は、単分子５２の分子直径よりも少し短いか、等しいか、または、それよりも少し長い程度であることが好ましい。例えば、電極間距離は、単分子５２の分子直径の０．５倍〜２倍の長さであり、１倍〜１．５倍の長さであることが好ましく、１倍〜１．２倍の長さであることがより好ましい。
【００２７】
ナノギャップ電極対１２の具体的な作製方法は特に限定されない。以下に、作製方法の一例を示す。
【００２８】
上述したナノギャップ電極対１２は、公知のナノ加工機械的破断接合法（nanofabricated mechanically-controllable break junctions)を用いることによって作製することができる。このナノ加工機械的破断接合法は、ピコメーター以下の分解能にて、機械的安定性に優れた電極間距離を制御することができる優れた方法である。ナノ加工機械的破断接合法を用いた電極対の作製方法は、例えば、J. M. van Ruitenbeek, A. Alvarez, I. Pineyro, C. Grahmann, P. Joyez, M. H. Devoret, D. Esteve, C. Urbina, Rev. Sci. Instrum. 67. 108 (1996）またはM. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008）に記載されている。電極の材料としては、金などの任意の金属が挙げられる。
【００２９】
例えば、以下に示す手順によってナノギャップ電極対１２を作製することができる。
【００３０】
まず、ナノスケールの金の接合を、電子線描画装置（日本電子社製、カタログ番号：ＪＳＭ６５００Ｆ）を用いて、公知の電子ビームリソグラフィー及びリフトオフ技術によって、ポリイミドでコーティングされた可撓性の金属基板上にパターン成形する。次いで、この接合の下にあるポリイミドを、反応性イオンエッチング装置（サムコ社製、カタログ番号：１０ＮＲ）を用いて、公知のエッチング法（反応性イオンエッチング法など）に基づくエッチングによって取り除く。
【００３１】
そして、基板を折り曲げることによって、３点にて折り曲げられた構造のナノスケールの金のブリッジを作製する。この場合、ピエゾアクチュエータ（CEDRAT社製、カタログ番号：ＡＰＡ１５０Ｍ）を用いて基板の折曲げを精密に操作することによって、電極対の電極間距離をピコメーター以下の分解能にて制御することができる。
【００３２】
次いで、作製したこのブリッジを引っ張り、ブリッジの一部を破断させる。さらにブリッジを引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が目的の単分子５２の長さになるように設定する。例えば単分子５２が、生体高分子であるタンパク質を適当な長さに分解したペプチドを構成するアミノ酸分子である場合、その長さは約１ｎｍである。この場合、自己破断技術を利用してブリッジの引っ張りを調節することによって電極対の電極間距離を正確に制御することができる（M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 (2008）、及びM. Tsutsui. M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 (2008）参照）。
【００３３】
具体的には、データ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ社製、カタログ番号：NIPCIe-6321）を用いて、レジスタンスフィードバック法（M. Tsutsui, K. Shoji, M. Taniguchi, T. Kawai, Nano Lett. 8, 345 （2008）、及びM. Tsutsui, M. Taniguchi, T. Kawai, Appl. Phys. Lett. 93, 163115 （2008）参照）によって、プログラミングされた接合の引き延ばし速度の下で、１０ｋΩの直列の抵抗を用いて、０．１ＶのＤＣバイアス電圧（Ｖｂ）をこのブリッジに印加して、金のナノ接合を引っ張り、ブリッジを破断させる。そして、ブリッジをさらに引っ張り、破断によって生じたギャップの大きさ（電極間距離）が、目的の長さになるように設定する。このようにして、ナノギャップ電極対１２を形成する。
【００３４】
測定用電源１８は、ナノギャップ電極対１２に対して電圧を印加する。測定用電源１８によってナノギャップ電極対１２に印加する電圧の大きさは特に限定されず、例えば、０．２５Ｖ〜０．７５Ｖとすることができる。測定用電源１８の具体的な構成は特に限定されず、適宜、公知の電源装置を用いることが可能である。
【００３５】
電流計２４は、測定用電源１８により電圧が印加されたナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２が通過した際に生じるトンネル電流を測定する。電流計２４の具体的な構成は特に限定されず、適宜、周知の電流測定装置を用いればよい。
【００３６】
次に、生体分子シーケンシング装置１０のナノギャップ電極対１２周辺の具体的な構成について説明する。
【００３７】
図２には、ナノギャップ電極対１２の電極間周辺の拡大平面図を示した。図２に示すように、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂは左右対称の形状であり、各々先端部が細くなっている。
【００３８】
図３には、図２の破線で示した領域６０の拡大平面図を示した。ナノギャップ電極対１２の電極間距離ｄは、前述したように、単分子５２の分子直径よりも少し短いか、等しいか、または、それよりも少し長い程度であることが好ましく、例えば数百ｐｍ〜１．０ｎｍである。
【００３９】
また、図３に示すように、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂの先端部は左右対称の形状であり、電極間が最も狭くなる対向位置６４より下流側に予め定めた距離だけ離間した位置における電界の強さが、対向位置６４より上流側に前記距離だけ離間した位置における電界の強さより強くなるように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを異ならせている。ここで、上流側の形状とは、対向位置６４よりも図３において上側の形状をいい、下流側の形状とは、対向位置６４よりも図３において下側の形状をいう。
【００４０】
具体的には、試料５０が流れる流路のうち上流側の上流側流路６２Ａの形状が、対向位置６４から上流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であると共に、下流側の下流側流路６２Ｂの形状が、対向位置６４から下流側へ離間するに従って徐々に拡がる形状であり、下流側流路６２Ｂの拡がり角度が、上流側流路６２Ａの拡がり角度よりも小さくなるように、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂの上流側の形状と下流側の形状とを異ならせている。
【００４１】
これにより、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂに電圧が印加された際に上流側流路６２Ａに形成される電界の電気力線の密度よりも、下流側流路６２Ｂに形成される電界の電気力線の密度の方が高くなる。
【００４２】
従って、図４に示すように、対向位置６４より下流側に予め定めた距離ｃだけ離間した位置６８Ｂにおける電界の強さは、対向位置６４より上流側に同じ距離ｃだけ離間した位置６８Ａにおける電界の強さより強くなる。これにより、試料５０に含まれる生体分子の電気泳動力を促進して安定的な定常流を誘起することができ、生体分子を安定的に電気泳動させることができるため、単分子５２を高精度で識別することができる。
【００４３】
なお、ナノギャップ電極対１２の形状は、対向位置６４より下流側に予め定めた距離ｃだけ離間した位置６８Ｂにおける電界の強さが、対向位置６４より上流側に同じ距離ｃだけ離間した位置６８Ａにおける電界の強さより強くなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせたものであれば、図３、４に示した形状に限られるものではない。
【００４４】
また、図４に示すナノギャップ電極対１２は、最も狭い電極間の中心７０を中心とする円と下流側流路６２Ｂの端部（ナノギャップ電極対１２の下流側の端部）とが交わって形成される円弧の長さが、前記円と上流側流路６２Ａの端部（ナノギャップ電極対１２の上流側の端部）とが交わって形成される円弧の長さより短くなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせたものということもできる。
【００４５】
また、図４に示すナノギャップ電極対１２は、最も狭い電極間の中心７０を中心とする予め定めた範囲に含まれる下流側流路６２Ｂの面積が、前記予め定めた範囲に含まれる上流側流路６２Ａの面積より小さくなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせたものということもできる。ここで、予め定めた範囲は、例えば円、正方形、長方形等の対称な形状で表される。
【００４６】
また、図３に示すように、ナノギャップ電極対１２は、ナノギャップ電極１２ａ、１２ｂの対向方向Ｂと直交する直交方向Ａにおける下流側流路６２Ｂの長さｂが、前記直交方向における上流側流路６２Ａの長さａよりも長くなるように、上流側と下流側とで形状を異ならせている。ここで、上流側流路６２Ａの長さａは、対向位置６４からナノギャップ電極対１２の上流側の端部７２Ａまでの距離であり、下流側流路６２Ｂの長さは、対向位置６４からナノギャップ電極対１２の下流側の端部７２Ｂまでの距離である。
【００４７】
そして、直交方向Ａにおける下流側流路６２Ｂの長さｂが、直交方向Ａにおける上流側流路６２Ａの長さａの２倍以上であることが好ましい。
【００４８】
図５には、従来のように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とが同一の場合、すなわち上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比が１：１の場合における塩基のリード時間のグラフを示した。グラフ中の太線８０は、塩基のリード時間の理想を表す直線であり、１塩基当たり約１ｍｓである。また、グラフ中の複数の細線８２は、各塩基のリード時間を表しており、破線８４は、複数の細線８２の平均値を表す。ここで、複数の細線８２が破線８４に近づくほどリード時間のばらつきが小さいと言え、破線８４が太線８０に近づくほど理想のリード時間に近いと言えるが、図５に示すように、従来構成の場合は、複数の細線８２のばらつきが大きく且つ破線８４は太線８０から離れている。
【００４９】
図６には、本実施形態に係るナノギャップ電極対１２のように、上流側の形状と下流側の形状とを異ならせた場合における塩基のリード時間のグラフを示した。図６は、上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比が１：２の場合における塩基のリード時間のグラフを示した。図６に示すように、図５の従来構成の場合と比較すると、複数の細線８２が破線８４により近づいており、リード時間のばらつきが小さいと言える。
【００５０】
また、図７には、上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比が１：４の場合における塩基のリード時間のグラフを示した。図７に示すように、図５の従来構成の場合と比較すると、複数の細線８２が破線８４に近づいており、リード時間のばらつきが小さいと言える。また、破線８４が太線８０に近づいており、リード時間が理想の時間に近いと言える。
【００５１】
また、図８には、上流側流路６２Ａの長さａと下流側流路６２Ｂの長さｂとの比を１：Ｒａｔｉｏとした場合における核酸塩基鎖のリード時間（ｍｓ）を測定した結果を示した。なお、図８の測定結果は、トンネル電流に応じたシグナルの計測取得速度を１０ｋＨｚとして測定した結果である。また、図中のＰＲａｔｉｏは、Ｒａｔｉｏ及びリード時間の各々の平均値を表す位置にプロットされている。また、ＰＲａｔｉｏを中心とした縦線ＶＬは、測定したリード時間の範囲（ばらつき）を示し、ＰＲａｔｉｏを中心とした横線ＨＬは、測定したＲａｔｉｏの範囲（ばらつき）を示している。リード時間は、１ｍｓ付近にばらつきが小さくなることが理想的であるが、図８に示すように、Ｒａｔｉｏ＝２〜４の場合がリード時間の平均値が１ｍｓに近く且つばらつきが小さいため好ましい。
【００５２】
以上より、下流側流路６２Ｂの長さｂは、直交方向Ａにおける上流側流路６２Ａの長さａの２倍以上で且つ４倍以下であることが好ましい。
【００５３】
制御部２６は、生体分子シーケンシング装置１０の各構成を制御すると共に、測定されたトンネル電流に応じたシグナルに基づいて、単分子５２の種類を識別する。
【００５４】
制御部２６は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、及び後述する生体分子シーケンシングプログラムが格納されたＲＯＭ（Read Only Memory）等を備えたコンピュータで構成することができる。このコンピュータで構成される制御部２６は、機能的には、図９に示すように、測定制御部３２及び識別部３４を含んだ構成で表すことができる。以下、各部について詳述する。
【００５５】
測定制御部３２は、ナノギャップ電極対１２の電極間に流れるトンネル電流を測定するように電流計２４を制御する。トンネル電流の測定時間は限定されないが、例えば、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間とすることができる。測定時間は、単分子５２の長さに応じて適宜設定すればよい。
【００５６】
また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流の電流値を取得し、取得した電流値からコンダクタンスを計算し、コンダクタンス−時間プロファイルを作成する。コンダクタンスは、トンネル電流を測定した際にナノギャップ電極対１２に印加されていた電圧Ｖで、トンネル電流の電流値を除することにより、計算することができる。コンダクタンスを用いることにより、ナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値が測定毎に異なる場合でも、統一された基準のプロファイルを得ることができる。なお、測定毎にナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値を一定とした場合には、トンネル電流の電流値とコンダクタンスとは、同等に扱うことができる。
【００５７】
また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流を、電流増幅器を用いて一旦増幅してから取得するようにしてもよい。電流増幅器を用いることによって、微弱なトンネル電流の値を増幅することができるため、トンネル電流を高感度に測定することが可能となる。電流増幅器としては、例えば、市販の可変高速電流アンプ(Femto社製、カタログ番号：ＤＨＰＣＡ−１００）を用いることができる。
【００５８】
識別部３４は、測定制御部３２により作成されたコンダクタンス−時間プロファイルから得られる検出物理量と、相対コンダクタンステーブル３６に格納された、種類が既知の単分子５２についての相対コンダクタンスとを比較することにより、単分子５２の種類を識別する。本実施の形態では、検出物理量は、測定制御部３２により作成されたコンダクタンス−時間プロファイルの測定点毎のコンダクタンスである。ここで、相対コンダクタンスは、種類が既知の単分子５２から測定した、単分子５２の種類毎の相対コンダクタンスであり、単分子５２の種類毎に測定したコンダクタンスの最大値で、単分子５２それぞれの１分子のコンダクタンスを除することにより算出したものである。
【００５９】
次に、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置１０の作用について説明する。
【００６０】
まず、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。溶液は、特に限定されない。例えば、超純水を用いることができる。超純水は、例えば、ミリポア社のMilli-Q Integral 3 （装置名）（Milli-Q Integral 3/5/10/15 （カタログ番号））を用いることによって作製することができる。溶液中の単分子５２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜１．０μＭとすることができる。
【００６１】
そして、試料中にナノギャップ電極対１２を配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極対１２に電圧を印加する。そして、制御部２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された生体分子シーケンシングプログラムを読み出して実行することにより、生体分子シーケンシング装置１０により、図１０に示す生体分子シーケンシング処理が行われる。
【００６２】
ステップＳ１０では、測定制御部３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。
【００６３】
次に、ステップＳ１２で、測定制御部３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、コンダクタンス−時間プロファイルを作成する。
【００６４】
次に、ステップＳ１４で、識別部３４が、相対コンダクタンステーブル３６から、識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。
【００６５】
次に、ステップＳ１６で、識別部３４が、上記ステップＳ１２で作成されたコンダクタンス−時間プロファイルと、上記ステップＳ１４で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。次に、ステップＳ１８で、識別部３４が、識別結果を出力して、単分子識別処理を終了する。
【００６６】
以上説明したように、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置によれば、  対向位置６４より下流側の電界の強さが上流側の電界の強さより強くなるように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを異ならせているので、試料５０に含まれる生体分子の電気泳動力を促進して安定的な定常流を誘起することができ、生体分子を安定的に電気泳動させることができるため、単分子５２を高精度で識別することができる。
【００６７】
図１１には、従来のようにナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを対称にした場合（Ｓｉｍ）と、本実施形態のように、ナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを非対称にした場合（Ｕｓｉｍ）と、の各々について、読み取る塩基の長さ毎にリード数を測定した結果を示した。図１１に示すように、本実施形態のようにナノギャップ電極対１２の上流側の形状と下流側の形状とを非対称にした方が、全体的にリード数が増加しているのが判る。
【００６８】
また、図１２には、上記と同様にナノギャップ電極対１２が従来構成の場合（Ｓｉｍ）と本実施形態の場合（Ｕｓｉｍ）との各々について、塩基の泳動方向が転換してしまうリード転換の回数に対する正常にリードできた回数の割合毎に、リード数を測定した結果を示した。図１２に示すように、横軸の数値が大きいほどリード転換の発生頻度が少ないことを示すが、従来構成と比較して本発明の方がリード転換が減少し、正常のリードできる頻度が高いことが判る。
【００６９】
このように、本実施形態に係るナノギャップ電極対１２のように、上流側の形状と下流側の形状とを非対称にすることにより、リード数を増加させることができると共に、リード転換を減少させることができることが判った。
【００７０】
＜第２の実施の形態＞
【００７１】
次に、第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置１０と同一の部分については、同一符号を付して詳細な説明を省略する。
【００７２】
図１３に示すように、第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置２１０は、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、測定用電源１８、電流計２４、及び制御部２２６を含んで構成されている。
【００７３】
ナノギャップ電極１２ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の構成は、第１の実施の形態におけるナノギャップ電極対１２と同様である。ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々は、各電極間の中心が同一軸上に並ぶように、絶縁体１４を介して積層されている。すなわち、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により、単分子５２が通過する一つの通路を形成している。ナノギャップ電極１２ａの電極間距離はｄ１、ナノギャップ電極対１２Ｂの電極間距離はｄ２、ナノギャップ電極対１２Ｃの電極間距離はｄ３で各々異なる。図１３の例では、ｄ１＞ｄ２＞ｄ３である。例えば、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、ｄ３＝０．５ｎｍとすることができる。
【００７４】
制御部２２６は、図１４に示すように、測定制御部２３２及び識別部２３４を備えた構成で表すことができる。
【００７５】
測定制御部２３２は、ナノギャップ電極１２ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間で生じたトンネル電流を、各々測定するように電流計２４を制御する。また、測定制御部２３２は、電流計２４で測定された電極間距離毎のトンネル電流の電流値を取得してコンダクタンスを計算し、電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルを作成する。
【００７６】
識別部２３４は、測定制御部３２により作成された電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルから得られる検出物理量と、相対コンダクタンステーブル２３６に格納された、種類が既知の単分子５２についての相対コンダクタンスとを比較することにより、単分子５２の種類を識別する。
【００７７】
次に、第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置２１０を用いて行われる生体分子シーケンシング方法について説明する。
【００７８】
まず、第１の実施の形態と同様に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。そして、試料中にナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々に電圧を印加する。そして、制御部２２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された生体分子シーケンシングプログラムを読み出して実行することにより、生体分子シーケンシング装置２１０により、図１５に示す生体分子シーケンシング処理が行われる。
【００７９】
ステップＳ２０では、測定制御部２３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により形成された一つの通路を、単分子５２が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。
【００８０】
次に、ステップＳ２２で、測定制御部２３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、コンダクタンス−時間プロファイルを、電極間距離毎に作成する。
【００８１】
次に、ステップＳ２４で、識別部２３４が、変数ｉに１を設定する。
【００８２】
次に、ステップＳ２６で、識別部２３４が、相対コンダクタンステーブル２３６から、電極間距離ｄｉに対応した単分子５２の相対コンダクタンス、すなわち、電極間距離ｄｉで識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。
【００８３】
次に、ステップＳ２８で、識別部２３４が、上記ステップＳ２２で作成された電極間距離ｄｉのコンダクタンス−時間プロファイルと、上記ステップＳ２６で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。
【００８４】
次に、ステップＳ３０で、識別部２３４が、全ての電極間距離ｄｉについて処理を終了したか否かを判定する。未処理の電極間距離ｄｉが存在する場合には、ステップＳ３２へ移行して、ｉを１インクリメントして、ステップＳ２６へ戻る。全ての電極間距離ｄｉについて処理が終了した場合には、ステップＳ３４へ移行して、識別部２３４が、識別結果を出力して、生体分子シーケンシング処理を終了する。
【００８５】
以上説明したように、第２の実施の形態に係る生体分子シーケンシング装置によれば、複数の電極間距離のナノギャップ電極間で生じたトンネル電流から得られたコンダクタンスを用いることで、第１の実施の形態の効果に加え、より精度の高い識別を行うことができる。
【００８６】
また、第２の実施の形態では、電極間距離が異なる複数のナノギャップ電極対を設ける場合について説明したが、１つのナノギャップ電極対の電極間距離を変更する機構を設けた構成としてもよい。例えば、てこの原理を利用して、力点、支点、及び作用点の幾何学的配置を調整することで、電極間距離を変更する構成とすることができる。より具体的には、ピエゾ素子によりナノギャップ電極対の一部を押し上げることにより、作用点となる電極端部を移動させて、電極間距離を変更する構成とすることができる。この場合、ピエゾ素子の押し上げ距離と電極間距離との対応関係に基づいて、所望の電極間距離に設定することができる。
【００８７】
また、本発明は、上記各実施形態で説明した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８８】
また、本願明細書中において、プログラムが予めインストールされている実施の形態として説明したが、外部の記憶装置や記録媒体等に格納されたプログラムを随時読み込んで、またインターネットを介してダウンロードして実行するようにしてもよい。また、当該プログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して提供することも可能である。
【符号の説明】
【００８９】
１０、２１０  生体分子シーケンシング装置
１２、１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ       ナノギャップ電極対
１８   測定用電源
２４   電流計
２６、２２６  制御部
３２、２３２  測定制御部
３４、２３４  識別部
３６、２３６  相対コンダクタンステーブル
５０   試料
５２   単分子
【図１】
2015154750.tif 000003
【図２】
2015154750.tif 000004
【図３】
2015154750.tif 000005
【図４】
2015154750.tif 000006
【図５】
2015154750.tif 000007
【図６】
2015154750.tif 000008
【図７】
2015154750.tif 000009
【図８】
2015154750.tif 000010
【図９】
2015154750.tif 000011
【図１０】
2015154750.tif 000012
【図１３】
2015154750.tif 000013
【図１４】
2015154750.tif 000014
【図１５】
2015154750.tif 000015
【図１１】
2015154750.tif 000016
【図１２】
2015154750.tif 000017