(57)【要約】【課題】MS2分析を実行することなくMALDI-ISD分析により得られたマススペクトルに基づくペプチド同定の精度を向上させる。【解決手段】解析対象であるペプチドに標準物質を加えマトリクスにより調製したサンプルと、同じ標準物質のみをマトリクスにより調製した参照サンプルとをそれぞれMALDI-ISD分析する。そして、標準物質及びマトリクスのイオンピークの位置とそれら物質の既知の質量を用いて、各ISDマススペクトルに対する質量校正を行う（S1-S6）。そのあと、サンプルのISDマススペクトルから参照サンプルのISDマススペクトルを差し引いて差分マススペクトルを求める（S7）。標準物質及びマトリクス由来のイオンピークが除去されるので、解析対象化合物のフラグメントイオンピークが観測され易くなり、これらピーク情報をデータベース検索に供することでペプチドを同定する（S8-S9）と同定精度が向上する。【選択図】図２
2015121500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ脱離イオン化法によるイオン源を搭載した質量分析装置を用いて高分子化合物の解析を行うための質量分析方法であって、
a)解析対象である化合物を含む試料に所定の標準物質を加えてサンプルを調製するサンプル調製ステップと、
b)前記標準物質による参照サンプルを調製する参照サンプル調製ステップと、
c)前記サンプル及び前記参照サンプルに対し、前記質量分析装置によりインソース分解を利用した質量分析を実施してそれぞれマススペクトルを取得するマススペクトル取得ステップと、
d)前記サンプル及び前記参照サンプルに対するマススペクトルに現れている標準物質由来のイオンピークの位置と標準物質の既知の質量電荷比とに基づいて、それぞれのマススペクトルにおける質量電荷比のずれを補正する質量校正ステップと、
e)前記質量校正ステップにおいて質量電荷比ずれが補正された、サンプルに対するマススペクトルから、同じく前記質量校正ステップにおいて質量電荷比ずれが補正された、参照サンプルに対するマススペクトルを差し引く減算処理ステップと、
f)前記減算処理ステップにおいて得られた差分マススペクトルに基づいて前記解析対象化合物の解析を実施する解析処理ステップと、
を有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析方法であって、
前記標準物質として、プロリンのポリマー構造体を含むタンパク質又はペプチドを用いることを特徴とする質量分析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の質量分析方法であって、
前記質量分析装置として、飽和耐性検出器を備えたレーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置を用いることを特徴とする質量分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析方法に用いられる、レーザ脱離イオン化法によるイオン源を具備する質量分析装置において、
a)解析対象である化合物を含む試料に所定の標準物質を加えて調製されたサンプル、及び、前記標準物質から調製された参照サンプルに対し、インソース分解を利用した質量分析を実施してそれぞれマススペクトルを取得する測定実行部と、
b)前記サンプル及び前記参照サンプルに対するマススペクトルに現れている標準物質由来のイオンピークの位置と標準物質の既知の質量電荷比とに基づいて、それぞれのマススペクトルにおける質量電荷比のずれを補正する質量校正部と、
c)前記質量校正部により質量電荷比ずれが補正された、サンプルに対するマススペクトルから、同じく前記質量校正部により質量電荷比ずれが補正された、参照サンプルに対するマススペクトルを差し引く減算処理部と、
d)前記減算処理部で得られた差分マススペクトルに基づいて前記解析対象化合物の解析を実施する解析処理部と、
を備えることを特徴とする質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization）法によるイオン源を備えた質量分析装置を用いた質量分析方法、及び該方法を実施するための質量分析装置に関し、さらに詳しくは、タンパク質やペプチドの同定や構造解析に好適な質量分析方法及び質量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質やペプチド、糖鎖、核酸などの生体由来の高分子化合物の同定や構造解析に、イオンに対する解離操作を伴う質量分析の手法が盛んに利用されている。イオンを解離させる手法としては、イオントラップやコリジョンセルを用いた衝突誘起解離（ＣＩＤ＝Collision Induced Dissociation）がよく用いられているが、イオン源の種類によっては、インソース分解（ＩＳＤ＝In-Source Decay）と呼ばれる手法が用いられることがある。インソース分解はイオン化と同時に又はイオン化の直後にイオン化室内等で生じる開裂のことであり、よく知られているのは、電子イオン化法（ＥＩ）によるイオン化の際の分子イオンの開裂である。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ法によるイオン化は一般にソフトなイオン化であると言われ、イオン化に際して開裂を起こしにくいが、例えば試料に照射するレーザ光のパワーを強める等、イオン化の際のエネルギを高めることで、生成されたイオンの開裂が促進されることが知られている。特にタンパク質やペプチドを対象とした、ＭＡＬＤＩイオン源におけるインソース分解では、レーザ光の照射によってマトリクスから発生した水素ラジカルによりペプチド主鎖のＮ-Ｃα結合の開裂が誘起され、ｃ系列イオンやｚ系列イオンが主に生成することが知られている。こうした現象を利用して、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）においてインソース分解で得られたマススペクトルを解析することにより、ペプチドのアミノ酸配列を推定するといった解析が行われている。
なお、以下の説明では、ＭＡＬＤＩイオン源におけるインソース分解を利用した質量分析方法をＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析と称す。また、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析により得られたマススペクトルをＩＳＤマススペクトルと称す。
【０００４】
上述したようにＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析は、分子量が大きなタンパク質やペプチドなどの同定や構造解析に有用な分析手法であるものの、一般にインソース分解で生じるイオンが多く現れる低質量電荷比範囲にはマトリクスなどの夾雑物由来のイオンも多く現れ、そのままでは解析が困難であることも多い。そこで、特許文献１に記載の装置では、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析で出現したイオンの一つをプリカーサイオンとして選定し、該イオンに対するＭＳ2分析を実行している。そうして得られたＭＳ2スペクトルでは、マトリクスなどの夾雑物由来のピークが除去される一方、低質量電荷比範囲にアミノ酸配列を反映したイオンピーク列が出現するから、そうしたピーク情報をデータベース検索に供することでペプチドのアミノ酸配列を推定することができる。
【０００５】
しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析により出現するイオンの強度は一般に低いため、これをプリカーサイオンとしてＭＳ2分析を行うためには、或る程度十分なイオン強度が得られるように試料の濃度を高くしておく必要がある。また、夾雑物由来のイオンの影響を排除したとしても、ＭＳ2スペクトルにおいて低質量電荷比範囲に現れるフラグメントイオンピークの強度はかなり低いため、これからアミノ酸配列情報を取得するのは必ずしも容易ではない。
【０００６】
また、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析で出現するイオン種はｃ系列、ｚ系列が主であるのに対し、ＭＳ2分析により出現するフラグメントイオン種は主としてｂ系列、ｙ系列イオンであるというようにイオン系列が相違する。そのため、アミノ酸配列を推定するために、両マススペクトルを統合して所定のデータ解析手法を適用するといった方法を採ることができず、それぞれのマススペクトルについて独立にデータ解析を行った結果を統合する必要があって、解析作業が煩雑である。
【０００７】
また、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析を行ったあとにさらにＭＳ2分析を行う必要があるため、測定作業に時間が掛かる。それに加え、ＭＳ2分析を実施するには、リニアＴＯＦＭＳよりも高価なリフレクトロンＴＯＦＭＳ（少なくともリフレクトロンモードでの飛行時間型質量分析が可能である装置）が必要であり、こうした装置を用意しないと上述したような解析を行うことができない。
【０００８】
また、こうした事情は、ＭＡＬＤＩイオン源を用いた質量分析装置のみならず、同様にレーザ光を利用したイオン化を行う、表面支援レーザ脱離イオン化（ＳＡＬＤＩ＝Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization）法など、他のレーザ脱離イオン化法を利用した質量分析装置でも同じである。ＳＡＬＤＩ法は、レーザ光のエネルギを吸収する、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）など無機ナノ粒子が塗布されたプレート上にサンプルを調製し、これにレーザ光を照射することによって、サンプル中の成分をイオン化させるイオン化法である。ＳＡＬＤＩ法ではマトリクスを使用しないものの、ＳＡＬＤＩプレート表面に起因する夾雑物由来のピークが低質量電荷比範囲に検出されることがしばしばあり、これがＩＳＤマススペクトルの解析を困難にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７３９６６８６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「次世代質量分析システム開発と創薬・診断への貢献  公開ソフトウェア  Mass++(Ver.2)」、最先端研究開発支援プログラム、［平成２５年１１月１９日検索］、インターネット＜URL: http://www.first-ms3d.jp/achievement/software＞
【非特許文献２】アサカワ（Daiki Asakawa）、ほか３名、「イン-ソース・ディケイ・デュアリング・マトリクス-アシステッド・レーザ・デソープション/イオナイゼイション・コンバインド・ウィズ・ザ・コリージョナル・プロセス・イン・アン・エフティーアイシーアール・マス・スペクトロメータ（In-Source Decay during Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Combined with the Collisional Process in an FTICR Mass Spectrometer）」、Analytical Chemistry、Vol.85(16)、2013年、pp.7809?7817
【非特許文献３】「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の検出器として何が適切か？」、株式会社島津製作所所、［平成２５年１２月１３日検索］、インターネット＜URL:  http://www.first-ms3d.jp/files/MALDI-MS_TechRep/MALDI_TechRepV3.0_05.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ペプチドやタンパク質の同定や構造解析を行うに際し、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析やＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析などおいて出現するイオンをプリカーサイオンとしたＭＳ2分析を実行することなく、ＩＳＤマススペクトルを利用してペプチドのアミノ酸配列を高い精度で推定することができる質量分析方法、及び該方法を実施するための質量分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析方法は、レーザ脱離イオン化法によるイオン源を搭載した質量分析装置を用いて高分子化合物の解析を行うための質量分析方法であって、
a)解析対象である化合物を含む試料に所定の標準物質を加えてサンプルを調製するサンプル調製ステップと、
b)前記標準物質による参照サンプルを調製する参照サンプル調製ステップと、
c)前記サンプル及び前記参照サンプルに対し、前記質量分析装置によりインソース分解を利用した質量分析を実施してそれぞれマススペクトルを取得するマススペクトル取得ステップと、
d)前記サンプル及び前記参照サンプルに対するマススペクトルに現れている標準物質由来のイオンピークの位置と標準物質の既知の質量電荷比とに基づいて、それぞれのマススペクトルにおける質量電荷比のずれを補正する質量校正ステップと、
e)前記質量校正ステップにおいて質量電荷比ずれが補正された、サンプルに対するマススペクトルから、同じく前記質量校正ステップにおいて質量電荷比ずれが補正された、参照サンプルに対するマススペクトルを差し引く減算処理ステップと、
f)前記減算処理ステップにおいて得られた差分マススペクトルに基づいて前記解析対象化合物の解析を実施する解析処理ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１３】
また上記課題を解決するために成された本発明に係る質量分析装置は、上記本発明に係る質量分析方法に用いられる質量分析装置であって、レーザ脱離イオン化法によるイオン源を具備する質量分析装置において、
a)解析対象である化合物を含む試料に所定の標準物質を加えて調製されたサンプル、及び、前記標準物質から調製された参照サンプルに対し、インソース分解を利用した質量分析を実施してそれぞれマススペクトルを取得する測定実行部と、
b)前記サンプル及び前記参照サンプルに対するマススペクトルに現れている標準物質由来のイオンピークの位置と標準物質の既知の質量電荷比とに基づいて、それぞれのマススペクトルにおける質量電荷比のずれを補正する質量校正部と、
c)前記質量校正部により質量電荷比ずれが補正された、サンプルに対するマススペクトルから、同じく前記質量校正部により質量電荷比ずれが補正された、参照サンプルに対するマススペクトルを差し引く減算処理部と、
d)前記減算処理部で得られた差分マススペクトルに基づいて前記解析対象化合物の解析を実施する解析処理部と、
を備えることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る質量分析方法及び質量分析装置において、レーザ脱離イオン化法としては例えば、マトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、又は、表面支援レーザ脱離イオン化法、を用いることができる。ＭＡＬＤＩ法を用いる場合、サンプル及び参照サンプルを調製する際に、適宜のマトリクスが用いられる。
【００１５】
本発明に係る質量分析方法及び質量分析装置において、解析対象化合物は典型的にはタンパク質又はペプチドである。その場合、本発明に係る質量分析方法における解析処理ステップでは、デノボ（de novo）シーケシングやＭＳ／ＭＳイオンサーチなどのデータベース検索などの手法により、タンパク質又はペプチドの同定や構造解析を実施する。
【００１６】
本発明に係る質量分析方法において、ＭＡＬＤＩイオン源を搭載した質量分析装置を使用する場合、サンプルと参照サンプルとは同じ標準物質とマトリクスを含む一方、サンプルは解析対象化合物を含み参照サンプルは解析対象化合物を含まない。したがって、サンプルをＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析することで得られたマススペクトルには、解析対象化合物がインソース分解されて生成されたフラグメントイオンのピーク、標準物質由来のイオンのピーク、マトリクス由来のイオンのピークが現れる。一方、参照サンプルをＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析することで得られたマススペクトルには、標準物質由来のイオンのピーク、マトリクス由来のイオンのピークが現れる。質量校正ステップにおいて各マススペクトルの質量校正が行われることにより、両マススペクトルにおいて同種のイオンピークの質量電荷比はほぼ等しくなる。そのため、減算処理ステップにおいて、サンプルに対する質量校正済みのマススペクトルから、参照サンプルに対する質量校正済みのマススペクトルを差し引くと、両マススペクトルに共通する標準物質由来のイオンピークやマトリクス由来のイオンピーク、つまりは解析対象化合物とは関係のない夾雑物由来のピークが除去される。
【００１７】
特にマトリクス由来のイオンピークは低質量電荷比範囲に高い信号強度で以て現れることが多く、解析対象化合物のフラグメントイオンのピークの質量電荷比範囲と重なり易いが、こうした不所望のピークが除去されることで、比較的信号強度の低い解析対象化合物のフラグメントイオンピークも明瞭に観測できるようになる。それによって、解析対象化合物が開裂して生じた各種断片の正確な質量情報をデータベース検索などの解析に供することができ、高い確度で以て解析対象化合物を同定したりその構造を推定したりすることができる。
【００１８】
また、上述したように、ＳＡＬＤＩイオン源を搭載した質量分析装置ではＳＡＬＤＩプレート表面に起因する夾雑物由来のピークが低質量電荷比範囲に検出されることがあるが、本発明に係る質量分析方法では、こうしたサンプルプレート表面に起因する不所望のピークも除去することができ、それによって解析対象化合物のフラグメントイオンピークが明瞭に観測できるようになる。
【００１９】
本発明に係る質量分析方法では、解析対象化合物のフラグメントイオンのピークを観測したいわけであるが、標準物質がインソース分解により開裂し易い化合物であると、標準物質由来のイオンピークの位置を利用した質量校正に支障をきたすとともに、標準物質由来のフラグメントイオンピークが解析対象化合物のフラグメントイオンピークに重なってしまって、標準物質由来のフラグメントイオンピークを十分に除去できないおそれもある。そこで、好ましくは、ＭＡＬＤＩ法などのレーザ脱離イオン化法によるフラグメントイオンが出現しないペプチド鎖を標準物質として利用するとよい。具体的には、プロリン残基のＮ末端側ではレーザ脱離イオン化法による開裂が生じにくい傾向にあるという点を利用し、プロリン残基の連なったポリマー構造を含む合成ペプチドを標準物質として利用するとよい。
【００２０】
また、ＭＡＬＤＩ等のレーザ脱離イオン源では、イオンの生成効率はレーザ光照射毎にばらつくことが多い。そのために、通常、パルス状のレーザ光の照射を多数回繰り返し、そのレーザ光照射毎に得られたイオン強度を積算することで最終的な測定結果を得る。ただし、こうした積算処理を行ったとしても、サンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析（又はＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析）と参照サンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析（又はＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析）とを同一のレーザ光パワーで実施した場合には、マススペクトルにおいて同一種のイオンに対するピークの強度が同じになるとは限らず、減算処理を実施してもマトリクス由来のイオンピークや標準物質由来のイオンピークが完全には除去されずに残ってしまうことがある。
【００２１】
そこで本発明に係る質量分析方法では、参照サンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析（又はＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析）実行時のイオン化効率をサンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析（又はＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析）実行時のイオン化効率よりも高くするために、参照サンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析（又はＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析）の実行時にサンプルに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析（又はＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析）の実行時よりもレーザ光パワーを高くするようにしてもよい。もちろん、レーザ光パワーを高くしすぎると試料の損傷が大きくなるだけでイオンの生成効率は却って低下する場合があるため、レーザ光パワーの適切な増加量を予め調べておくことが望ましい。これにより、例えばマトリクス由来のイオンピークや標準物質由来のイオンピークを十分に除去したマススペクトル（ＩＳＤマススペクトル）を確実に得ることができる。
【００２２】
また、例えばデータベース検索などによるペプチドの同定等のためには、高い精度の質量情報をデータベース検索に供する必要がある。また、低質量電荷比範囲を含む幅広い質量電荷比範囲のイオンを検出する必要がある。そのため、本発明に係る質量分析方法に使用される質量分析装置としては、飽和耐性検出器を備えたレーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置、例えばＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）を用いることが好ましい。
【００２３】
イオントラップを利用したＭＡＬＤＩ四重極イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ）や四重極マスフィルタを搭載したＭＡＬＤＩ四重極飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦＭＳ）では、イオントラップや四重極マスフィルタにおける質量電荷比範囲の制約から、タンパク質等の高質量分子のＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析は困難である。これに対し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳでは測定可能な質量電荷比範囲が非常に広いため、解析に適した良好なＩＳＤマススペクトルを取得することができる。
【００２４】
また本発明に係る質量分析方法においては、標準物質由来のイオンピークを利用して質量校正を行うが、ＭＡＬＤＩ法を用いる場合には、マトリクス由来のイオンピークも質量校正に利用することができる。即ち、本発明に係る質量分析方法の好ましい一態様として、ＭＡＬＤＩイオン源を搭載した質量分析装置を用いた場合において、上記質量校正ステップでは、サンプルに対するマススペクトルに現れている標準物質由来のイオンピーク及びマトリクス由来のイオンピークの位置と標準物質及びマトリクスの既知の質量電荷比とに基づいて、各マススペクトルにおける質量電荷比のずれを補正してもよい。これにより、一層精度の高い質量校正が行える。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る質量分析方法及び質量分析装置によれば、ＩＳＤマススペクトルの特に低質量電荷比範囲において解析対象化合物とは関係のない夾雑物由来のピークが除去されるので、インソース分解により生成される解析対象化合物由来のフラグメントイオンピークが明瞭に観測可能となる。それにより、解析対象化合物の各種断片の精度のよい質量情報を同定や構造解析のための処理に供することができるので、そうした解析の精度を向上させることができる。また、解析対象化合物由来のフラグメントイオンの信号強度が比較的低くても、それらイオンピークの情報を精度よく取得できるので、試料の濃度をあえて高くしておく必要もない。
【００２６】
また、従来のようにＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析やＳＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析の実行後に改めてＭＳ2分析を行う必要がないので、測定に要する時間が短くて済み、分析のスループットが向上する。また、ＣＩＤ等によるイオンの開裂操作が不要であるので、イオントラップやコリジョンセルを具備しない比較的安価であるＭＡＬＤＩ−リニアＴＯＦＭＳなどの質量分析装置で十分な解析が行える。さらにまた、ＩＳＤマススペクトルに基づく解析結果とＭＳ2スペクトルに基づく解析結果とを統合する必要もないので、解析処理自体も容易である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る質量分析方法を実施するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの一実施例の概略構成図。
【図２】本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いたペプチド同定の手順の一例を示すフローチャート。
【図３】図２に示したペプチド同定を説明するためのマススペクトルの概略図。
【図４】標準物質（ペプチドＰ１４Ｒ）及び解析対象化合物（ＡＣＴＨ１８−３９）の実測によるＩＳＤマススペクトルを示す図。
【図５】バックグラウンド減算処理実行前のＡＣＴＨ１８−３９のＩＳＤマススペクトル（ａ）及びバックグラウンド減算処理実行後のＡＣＴＨ１８−３９のＩＳＤマススペクトル（ｂ）。
【図６】バックグラウンド減算処理実行前のＩＳＤマススペクトルに基づくＭＳ／ＭＳイオンサーチ実行結果を示す図。
【図７】バックグラウンド減算処理実行後のＩＳＤマススペクトルに基づくＭＳ／ＭＳイオンサーチ実行結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明に係る質量分析方法及び該質量分析方法を実施するためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの一実施例について、添付図面を参照しつつ説明する。
図１は本実施例によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの概略構成図である。まず、このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの構成と基本的な動作について説明する。
【００２９】
ＭＡＬＤＩイオン源１は、その上面にサンプルプレート１０がセットされるステージ１１と、引き出し電極１３と、加速電極１４と、レーザ照射部１５と、反射鏡１６と、を含む。サンプルプレート１０上には、解析対象化合物と所定の内部標準物質とを含み、所定のマトリクスを用いて調製されたサンプル１２ａと、同じ内部標準物質を含み、同じマトリクスを用いて調製された参照サンプル１２ｂと、が保持されている。ここでは、解析対象化合物はペプチド又はタンパク質である。
【００３０】
制御部３の制御の下で、レーザ照射部１５からパルス状に出射されたレーザ光は、反射鏡１６を経て所定の測定位置に在るサンプル１２ａ上の微小領域に集光される。このレーザ光のエネルギによりサンプル１２ａからマトリクスとともに解析対象化合物や内部標準物質が気化し、その際に解析対象化合物及び内部標準物質はイオン化される。ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析を行う場合には、通常の分析（つまりはインソース分解を行わない分析）時よりもレーザ光のパワーを高め、解析対象化合物がイオン化されると同時に又はその直後にイオンの開裂を促進させる。
なお、図１では、レーザ光が当たる測定位置にサンプル１２ａが位置しているが、ステージ１１は図示しない駆動部により図１中のＸ軸、Ｙ軸の二軸方向に移動可能であり、参照サンプル１２ｂを測定位置に移動させることで、参照サンプル１２ｂにレーザ光を照射して該参照サンプル１２ｂの測定を行うことができる。
【００３１】
レーザ光照射によってサンプル１２ａ（又は参照サンプル１２ｂ）の表面近傍で生成された各種イオンは、図示しない電圧源から引き出し電極１３とサンプルプレート１０とにそれぞれ印加される電圧によって、その両者の間の空間に形成される電場の作用により引き出される。そして、引き出されたイオンは、引き出し電極１３と加速電極１４とにそれぞれ印加される電圧によってその両者の間の空間に形成される加速電場により、それぞれ加速エネルギを付与されて飛行し始める。
【００３２】
ＴＯＦ部２は、フライトチューブ２０の内部に形成される飛行空間２１と、イオンを検出してイオン量に応じた検出信号を出力する検出器２３と、を含む。検出器２３は飽和耐性を有する電子増倍管を用いたものである。本発明に係る質量分析方法及び装置においては、良好なＩＳＤマススペクトルを得るために低質量電荷比側のイオンが十分な感度で検出できることが望ましい。そこで、検出器としては飽和耐性を有する電子増倍管を使用することが好ましい。飽和耐性を有する電子増倍管としては、例えばＳＧＥ社製のMagne TOFなどのマグネティック型イオン検出器や、非特許文献３などに記載された、或る閾値以上の運動エネルギを持った粒子が衝突することにより電子を放出する第１のダイノードと、放出された電子が衝突することにより二次電子を放出し且つ増倍する第２のダイノードとの組み合わせからなる改良型の二次電子増倍管などを用いることができる。
【００３３】
上述したようにＭＡＬＤＩイオン源１で加速されてＴＯＦ部２へと送り込まれた各種イオンは、飛行空間２１中を略直線状に飛行し検出器２３に到達する。ＴＯＦ部２へ導入される時点で各イオンはその質量電荷比に応じた飛行速度を有しており、質量電荷比が小さなイオンほど早く検出器２３に到達する。なお、この例では、ＴＯＦ部２はリニア型であるが、リフレクトロン型、マルチターン型などでもよい。
【００３４】
検出器２３から出力された信号は図示しないアナログデジタル変換器でデジタルデータに変換され、データ処理部４に入力される。データ処理部４は、スペクトル作成部４１、質量校正部４２、減算処理部４３、ペプチド同定部４４などの機能ブロックを含む。制御部３はサンプル１２ａ、１２ｂに対する質量分析を実行するために各部を制御する機能と、付設された入力部５及び表示部６を通したユーザインターフェイスの機能とを有する。なお、この制御部３及びデータ処理部４の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、その機能が達成される構成とすることができる。
【００３５】
次に、本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いた質量分析方法の一つであるペプチド同定方法について、図２、図３を参照しつつ説明する。図２はこのペプチド同定の手順の一例を示すフローチャート、図３はこのペプチド同定におけるデータ処理を説明するための模式図である。
【００３６】
まずユーザは、解析対象化合物であるペプチド（又はタンパク質）の溶液を、内部標準物質を加えたマトリクス溶液と混合し、サンプルプレート１０上の所定のウェルに滴下して乾固させることで、サンプル１２ａを調製する（ステップＳ１）。また、ユーザは、同じ内部標準物質のみを加えたマトリクス溶液を、同じサンプルプレート１０上の別のウェルに滴下して乾固させることで、参照サンプル１２ｂを調製する（ステップＳ２）。内部標準物質としては、後述する理由により、プロリン残基のポリマー構造を含む合成ペプチドを用いることが好ましく、ここではＰ１４Ｒを使用するものとする。また、マトリクスとしてはＤＨＢ（2,5-dihydroxybenzoic acid）を使用するものとする。
【００３７】
そのあと、ユーザは、サンプル１２ａ及び参照サンプル１２ｂが形成されたサンプルプレート１０をステージ１１にセットし、入力部５で所定の操作を行う。この操作を受けて、制御部３はレーザ照射部１５等を駆動し、サンプルプレート１０上のサンプル１２ａに対してＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析を実行する。即ち、レーザ照射部１５から出射したパルス状のレーザ光をサンプル１２ａに照射し、サンプル１２ａから発生した各種イオンを加速したあとに飛行空間２１に導入して飛行させる。データ処理部４においてスペクトル作成部４１は検出器２３で得られた検出信号をデジタル化したデータを受領し、飛行時間と信号強度との関係を示す飛行時間スペクトルを作成し、さらに予め求めておいた校正情報に基づいて飛行時間を質量電荷比に換算することで、図３（ａ）に示すようなマススペクトルを作成する（ステップＳ３）。
【００３８】
このとき、イオン化のためのレーザ光のパワーを通常の質量分析よりも若干高くすることにより、ＭＡＬＤＩイオン源１におけるインソース分解を促進させる。そのため、解析対象化合物であるペプチドはＭＡＬＤＩイオン源１において開裂を生じ、フラグメントイオンが多数発生する。一方、内部標準物質として使用されているＰ１４Ｒはプロリン残基のポリマー構造を含むペプチドであり、プロリン残基のＮ末端側ではインソース分解によるフラグメントイオンが発生しにくいことが知られている。そのため、内部標準物質由来のフラグメントイオンは殆ど発生せず、ステップＳ３において得られるＩＳＤマススペクトルには、主として、解析対象化合物由来のフラグメントイオンピーク、内部標準物質由来の分子イオンピーク、マトリクス由来の分子イオンピークなどが現れる。
【００３９】
質量校正部４２は、得られたＩＳＤマススペクトルに現れている、マトリクスであるＤＨＢの分子イオンピーク（m/z 154）及び内部標準物質であるＰ１４Ｒの分子イオンピーク（m/z1534）をそれぞれ抽出する。そして、それらピークの位置（つまりは実測質量電荷比）とマトリクス及び内部標準物質の既知の質量電荷比とから質量電荷比のずれを求め、このずれを補正するように質量校正を行う。それにより、図３（ｂ）に示すような、解析対象化合物を含むサンプル１２ａについて、より正確な質量電荷比軸を有するＩＳＤマススペクトルが得られる（ステップＳ４）。インソース分解によって内部標準物質が開裂を生じてしまうと、内部標準物質の分子イオンピークを的確に捉えられず、正確な質量校正に支障をきたす。それに対し、本ペプチド同定方法では、インソース分解が起こりにくい化合物、つまりは分子イオンがそのままの状態で観測され易い化合物を内部標準物質としているので、質量校正を精度よく行うことができる。また、マトリクスの分子イオンピークの情報も質量校正に利用することで、添加する内部標準物質が１種類であっても、幅広い質量電荷比範囲に亘る正確な質量校正が可能となる。
【００４０】
次に、ステージ１１が移動されて参照サンプル１２ｂが測定位置にセットされると、制御部３は再びレーザ照射部１５等を駆動し、サンプルプレート１０上のサンプル１２ｂに対してＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析を実行する。これにより、スペクトル作成部４１は参照サンプル１２ｂに対するＩＳＤマススペクトルを取得する（ステップＳ５）。参照サンプル１２ｂに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析の際には、ステップＳ３におけるサンプル１２ａに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析の際よりもイオン化のためのレーザ光パワーを少し高く設定する。これにより、サンプル１２ａに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析時よりもイオンの生成効率が向上し、得られるイオン強度は全体的に高くなる。
【００４１】
質量校正部４２は、ステップＳ４と同様に、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析により得られたＩＳＤマススペクトルに現れているマトリクスの分子イオンピーク及び内部標準物質の分子イオンピークをそれぞれ抽出し、それらピークの位置とマトリクス及び内部標準物質の既知の質量電荷比とから質量電荷比のずれを求め、このずれを補正するように質量校正を行う。それにより、解析対象化合物を含まない参照サンプル１２ｂについても、より正確な質量電荷比軸を持つＩＳＤマススペクトルが得られる（ステップＳ６）。
【００４２】
質量校正済みである二つのＩＳＤマススペクトルが得られると、減算処理部４３は、サンプル１２ａに対するＩＳＤマススペクトルから参照サンプル１２ｂに対するＩＳＤマススペクトルを質量電荷比毎に差し引く処理、即ち、バックグラウンド減算処理を実行する（ステップＳ７）。こうした、いわゆるマススペクトルの減算機能は、既存の様々なソフトウエアに搭載されているものを利用することができる。その一例として、非特許文献１に記載された「Mass++」と呼ばれる質量分析用のソフトウエアがある。この場合、質量校正済みの二つのＩＳＤマススペクトルをこの「Mass++」で読み込んだ後、「Mass++」に搭載されている減算機能を用いる。これにより、サンプル１２ａに対するＩＳＤマススペクトルから参照サンプル１２ｂに対するＩＳＤマススペクトルを減算し、図３（ｃ）に示すような、差分ＩＳＤマススペクトルを簡単に求めることができる。
【００４３】
上述したように、参照サンプル１２ｂに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析実行時のレーザ光パワーはサンプル１２ａに対するＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析実行時のレーザ光パワーよりも少し高く設定されているため、参照サンプル１２ｂに対するＩＳＤマススペクトル上のピークの信号強度は、サンプル１２ａに対するＩＳＤマススペクトル上の同じ質量電荷比を持つピークの信号強度よりも高くなっている。即ち、サンプル１２ａと参照サンプル１２ｂとで共通に含まれる内部標準物質やマトリクスに由来するイオンピークの信号強度は、参照サンプル１２ｂに対するＩＳＤマススペクトル上のほうが高くなっている。そのため、上述したバックグラウンド減算処理により、内部標準物質やマトリクスに由来するイオンピークがほぼ完全に除去された差分ＩＳＤマススペクトルを得ることができる。
【００４４】
続いて、ペプチド同定部４４は、差分ＩＳＤマススペクトルに対してピークピッキング処理を行い、ピーク情報（質量電荷比及び信号強度）を収集してピークリストを作成する（ステップＳ８）。そして、このピークリストに挙げられているデータを用い、例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチなどのデータベース検索を実行することにより、解析対象化合物であるペプチドのアミノ酸配列を推定する（ステップＳ９）。このデータベース検索には、既存の手法、例えばマトリクス・サイエンス（Matrix Science）社が提供しているデータベース検索エンジンであるマスコット（Mascot）やフリーのデータベース検索エンジンであるX! tandemに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いることができる。また、データベース検索ではなく、デノボシーケシングなどの他のアミノ酸配列推定手法を用いてもよい。ピークリストに挙げられているピーク情報の精度が高い、つまり解析対象化合物由来ではない物質由来のイオンピークの情報（いわば偽のイオンピーク情報）がない又は少ないため、いずれの解析手法を用いてもペプチドのアミノ酸配列を高い確度で推定することができる。そうして同定結果が得られたならば、制御部３を通して表示部６の画面上に結果を表示する。
【００４５】
なお、上記実施例では、「Mass++」などに搭載されている減算機能を利用してピークを差し引く処理を行っていたが、その代わりに、二つのマススペクトルにおいて質量電荷比が共通するピーク自体を削除する処理を行うようにしてもよい。
例えば非特許文献２には、非常に高い精度で質量分析が可能であるフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置（ＦＴ−ＩＣＲＭＳ）を用いて標準物質とサンプルとに対してそれぞれ質量分析を実行し、標準物質に対して取得されたマススペクトルにおいて出現している質量電荷比のイオン種が、サンプルに対して取得されたマススペクトルにおいても予め設定された質量許容範囲内に出現していた場合に、そのピークを削除する処理が行われている。こうした処理により、サンプルに対するマススペクトルからマトリクスなどの夾雑成分由来のピークを除去することができる。
【００４６】
上述したようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いた質量分析では、ＦＴ−ＩＣＲＭＳほど高い質量精度は得られないが、標準物質を用いた特徴的な質量校正によって少なくとも二つのマススペクトルの質量電荷比の誤差は非常に小さくなるので、上記のような単なる質量電荷比値のみに基づく（信号強度値を用いない）ピーク消去処理を利用することができ、そうした処理は上記減算機能による処理と実質的に同等である。
【実施例】
【００４７】
次に、上述したペプチド同定方法を実証するために実施した実測例について説明する。この実測において、解析対象化合物は副腎皮質刺激ホルモンであるＡＣＴＨ１８−３９であり、内部標準物質としてシグマアルドリッチ（SIGMA-ARDRICH）社製のＰ１４Ｒ、マトリクスとしてＤＨＢを使用した。また、測定に使用した装置は島津製作所製のAXIMA-Performanceである。
【００４８】
図４（ａ）は内部標準物質であるＰ１４Ｒのアミノ酸配列とこれに対する実測のＩＳＤマススペクトルであり、図４（ｂ）は解析対象化合物であるＡＣＴＨ１８−３９のアミノ酸配列とこれに対する実測のＩＳＤマススペクトルである。図４（ｂ）では、主としてインソース分解で生じるｃ系列のフラグメントイオンが多数観測されている。これに対し、図４（ａ）では、ｃ系列のフラグメントイオンは観測されていないことが分かる。このことから、Ｐ１４Ｒはインソース分解が殆ど起こらない化合物であることが分かる。また、Ｐ１４Ｒはペプチドの一種であって解析対象化合物と性質が非常に近い。そのため、Ｐ１４Ｒ由来のイオンは、インソース分解の有無を除き、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析の過程で解析対象化合物由来のイオンと類似した挙動を示すと考えられ、同じ測定条件の下で同じような質量電荷比ずれを生じると推測される。
【００４９】
こうしたことから、ペプチドやタンパク質を解析対象化合物とするＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ分析での質量校正のための内部標準物質として、Ｐ１４Ｒは好適であるということができる。また、同様の性質を有する、プロリン残基が連なったポリマー構造を持つ他のペプチドも、同じく内部標準物質として有用であると推測できる。
【００５０】
このようにプロリン残基の連なったポリマー構造を含む合成ペプチドを標準物質として使用する場合、解析対象の化合物に応じて、プロリン残基の含有数を適宜に調整することが望ましい。これは、精密な質量を取得するためには測定質量電荷範囲を数点の標準物質で挟んで質量校正を行う必要があるためである。合成されたプロリンのポリマーは組成式が確定しているので精密な質量の計算が可能であり、測定質量電荷範囲に対応したプロリン残基の数の調整も容易である。また、プロリン残基のポリマーにはＮ末端に塩基が付与されていることが望ましい。これはプロリン残基のＮ末端側ではＭＡＬＤＩ−ＩＳＤフラグメントが出現しないことが知られているため、Ｎ末端側に塩基を持つプロリンのポリマー自身からはＭＡＬＤＩ−ＩＳＤフラグメントは出現しないと推測できるためである。また、塩基を含まないプロリン残基のポリマーを使用すると、塩の付加体も高い強度で出現する可能性があるので、塩基を保有しているプロリン残基のポリマーを用いることが望ましい。
【００５１】
図５（ａ）は、上記ステップＳ７によるバックグラウンド減算処理を実施する前の、解析対象化合物を含むサンプルに対するＩＳＤマススペクトル(m/z＝1-2400）である。また、図５（ｂ）は、バックグラウンド減算処理を実施した後の差分ＩＳＤマススペクトル(m/z＝1-2400）である。これらマススペクトルの縦軸は信号強度の絶対値を示している。上述したように、解析対象化合物はＡＣＴＨ１８−３９、内部標準物質はＰ１４Ｒ、マトリクスはＤＨＢである。
【００５２】
図５（ａ）に示すように、バックグラウンド減算処理前のサンプルに対するＩＳＤマススペクトルでは、ＤＨＢ由来のイオンピーク（m/z 137）が大きな信号強度で現れており、これに対してＡＣＴＨ１８−３９由来のフラグメントイオンピークの信号強度は相対的にかなり低くなっている。このような状態では、ＤＨＢ等の夾雑物由来のイオンピークとＡＣＴＨ１８−３９由来のフラグメントイオンピークとを正確に識別することは困難である。
これに対し、図５（ｂ）に示すように、バックグラウンド減算処理を行ったあとの差分ＩＳＤマススペクトルでは、ＤＨＢ由来のイオンピークは殆ど見えなくなり、解析対象であるＡＣＴＨ１８−３９由来のフラグメントイオンピークが相対的に高い信号強度で出現している。このような状態であれば、これらフラグメントイオンピークを適切に抽出し、ピーク情報を収集することが可能である。
【００５３】
図６は、図５（ａ）に示したバックグラウンド減算処理前のＩＳＤマススペクトルに基づいて作成されたピークリストを利用したＭＳ／ＭＳイオンサーチの結果を示す図である。図７は、図５（ｂ）に示したバックグラウンド減算処理後の差分ＩＳＤマススペクトルに基づいて作成されたピークリストを利用したＭＳ／ＭＳイオンサーチの結果を示す図である。これらはいずれも、上述したマスコットに搭載されているＭＳ／ＭＳイオンサーチを利用したものである。
【００５４】
図６及び図７において、（ａ）はアミノ酸配列推定の確からしさを示すマスコットスコア（Mascot Score）のヒストグラム、（ｂ）はマススペクトル上でのピークの帰属、（ｃ）は帰属されたプロダクトイオンのイオン種を示す。マスコットスコアは、図６の場合には８４、図７の場合には９９であり、バックグラウンド減算処理を行うことでスコアが顕著に向上することが確認された。これは、ｃ系列イオンが帰属された数はほぼ同等であったものの、バックグラウンド減算処理を行った場合には、微弱に出現するａ系列イオンをより細かく帰属することができたこと、またアミノ酸配列に起因しないマトリクス由来のピークが除去されたことによるものと推定される。
【００５５】
以上の結果から、本実施例のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いたペプチド同定方法が、解析対象化合物であるペプチドの同定精度の向上に有効であることが確認できた。
【００５６】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎないから、上記記載以外の点において本発明の趣旨の範囲で適宜に修正、変更、追加などを行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
例えば、上記実施例ではＭＡＬＤＩイオン源を用いた質量分析装置に本発明を適用していたが、すでに述べたように、ＭＡＬＤＩ法以外のレーザ脱離イオン化法、典型的にはＳＡＬＤＩ法によるイオン源を用いた質量分析装置にも本発明を適用し、同様の効果が得られることは当然である。
【符号の説明】
【００５７】
１…ＭＡＬＤＩイオン源
１０…サンプルプレート
１１…ステージ
１２ａ…サンプル
１２ｂ…参照サンプル
１３…引き出し電極
１４…加速電極
１５…レーザ照射部
１６…反射鏡
２…ＴＯＦ部
２０…フライトチューブ
２１…飛行空間
２３…検出器
３…制御部
４…データ処理部
４１…スペクトル作成部
４２…質量校正部
４３…減算処理部
４４…ペプチド同定部
５…入力部
６…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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