(57)【要約】【課題】外科的に皮膚を摘出したりして皮膚に刺激を与える等のない方法であって、血流の状態を簡便かつ確実に測定又は評価することができる、生化学的指標を用いた新規な測定又は評価方法を提供することを課題とする。【解決手段】皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量を指標とすることを特徴とする皮膚の血流量の間接測定又は評価方法。【選択図】図１
2015132482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量を指標とすることを特徴とする皮膚の血流量の間接測定又は評価方法。
【請求項２】
測定又は評価方法に用いる皮膚角層がテープストリッピング法により採取されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
あらかじめ測定した血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいて作成された相関式から、皮膚の血流量を間接的に測定する方法。
【請求項４】
角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を予め測定しておいた集団の角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量分布から求めた血流量の相関を求めた回帰式により皮膚血流量に換算する工程、
とからなる、皮膚血流量の間接測定法。
【請求項５】
あらかじめ測定した血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいて作成した散布図と対比して評価する、皮膚の血流量の評価方法。
【請求項６】
角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を予め測定しておいた集団の角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量の分布と比較する比較工程、
とから構成される、皮膚血流の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肌の血流量のレベル評価又は間接測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌の老化現象の原因の一つとして、血行不良による肌色の赤みの低下を挙げることができる。この肌の赤みの低下現象が、端的には「肌のくすみ」として現れ、化粧によるカバーリングが難しい現象とされている。そして肌の血流を改善することにより、透明性及び明るさが向上し、皮膚組織の代謝活性の促進、細胞賦活が期待でき、その結果としてくすみの原因を始め肌の各種の老化現象の原因に対処できるといわれている。
肌組織は、血流量の増加により代謝が促進され、老廃物が除去される。例えば、化学発光により近赤外線を含む光を照射することで、肌の血流を改善する技術が開発されている（特許文献１：ＷＯ２００５／０７７４５８号公報）。特許文献１では肌の血流量の変化はレーザードップラー血流計を用いて測定している。
このように、肌の健康状態を評価するために、皮膚の血流量を測定することが必要である。前記のレーザードップラー式血流計と同様に、レーザー光を用いるマルチチャンネル式の血流計（特許文献２：特許第3783491号公報）や加圧式血流計（特許文献３：特開平１１−２８５４７６号公報）が肌の血流測定に用いられている。しかしながら、測定に当たっては被験者を直接、血流量計で測定する必要があり、遠隔地の被験者の肌の血流量を測定するためには、測定装置を被験者の住居近くに設置するか、あるいは被験者が直接、測定装置の設置場所に出向かない限り測定することは不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７７４５８号公報
【特許文献２】特許第３７８３４９１号公報
【特許文献３】特開平１１−２８５４７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、遠隔地の被験者の血流の状態を間接的に評価することを可能とするために、被験者から採取した角層を用いて、血流量の間接的に測定又は評価することが望まれている。  
本発明は、外科的に皮膚を摘出したりして皮膚に刺激を与える等のない方法であって、血流の状態を簡便かつ確実に測定又は評価することができる、生化学的指標を用いた新規な測定又は評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の構成である。
（１）皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量を指標とすることを特徴とする皮膚の血流量の間接測定又は評価方法。
（２）測定又は評価方法に用いる皮膚角層がテープストリッピング法により採取されたものである（１）に記載の方法。
（３）あらかじめ測定した血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいて作成された相関式から、皮膚の血流量を間接的に測定する方法。
（４）角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を予め測定しておいた集団の角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量分布から求めた血流量の相関を求めた回帰式により皮膚血流量に換算する工程と、
からなる、皮膚血流量の間接測定法。
（５）あらかじめ測定した血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいて作成した散布図と対比して評価する、皮膚の血流量の評価方法。
（６）角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量を予め測定しておいた集団の角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−１αの発現量の分布と比較する比較工程
とから構成される皮膚血流の評価方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法によれば、皮膚の血流の測定又は評価を角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト又はインターロイキン−１αの発現量を測定することで間接的に測定又は評価することができる。
また、本発明の方法は、テープストリッピング法など簡便な操作方法で評価試料を採取するため、被験者の負担が少なく、だれでも簡単に評価することが可能となる。
特に遠隔地の被験者から採取したサンプル、例えば、テープストリッピングによる角層を用いて、簡便に肌の血流量あるいは血流の状態を間接的に評価することができるため被験者が直接試験場所に来る必要がなくなる。そうすれば、血流量測定の対象とする適用範囲が広がり、簡便に皮膚の状態を診断又は評価できる。
さらに血流量計で直接被験者を測定する必要がなく、遠隔地の被験者であっても角層さえ入手できれば、簡便に皮膚血流量の測定又は評価が可能となる。
さらにまた、本発明の方法によって肌の状態や化粧料などの効果を客観的に評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】皮膚角層におけるインターロイキン―１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）と皮膚血流量に比例する相対出力量（Ｖ）を測定した結果を散布図と、回帰直線を求めたグラフである。
【図２】皮膚角層におけるインターロイキン―１α（ＩＬ−１α）と皮膚血流量に比例する相対出力量（Ｖ）を測定した結果を散布図と、回帰直線を求めたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト及び／又はインターロイキン−１αの発現量を指標とすることを特徴とする皮膚の血流量の間接測定又は評価方法に係る発明である。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の血流量の測定又は評価方法は、皮膚角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（以下、ＩＬ−１ＲＡとよぶ。）、又は、インターロイキン−１α（以下、ＩＬ−１αとよぶ。）の発現量を指標とすることを特徴としている。
本発明における血流量とは、レーザードップラー血流量計で測定される皮膚の毛細血管内血流量である。レーザードップラー血流量計で測定された血流量と、皮膚角層におけるＩＬ−１ＲＡ又はＩＬ−１αの発現量が相関することが見出された。したがってＩＬ−１ＲＡ又はＩＬ−１αの皮膚角層における発現量を測定することで、間接的に皮膚血流量又は皮膚血流状態の評価を行うことができることが可能となる。
【０００９】
ＩＬ−１ＲＡは単球やマクロファージ等で産生される抗炎症性のサイトカインであり、炎症時に増加し、皮膚を正常化させる。ＩＬ−１ＲＡはインターロイキン−１の働きを拮抗的に阻害する。細胞レベルでＩＬ−１ＲＡが増加すると、コラーゲンを分解し、断片化する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ−１が減少する。
【００１０】
ＩＬ−１αは単球やマクロファージ等で産生される炎症性のサイトカインであり、リンパ球やマクロファージを活性化し、炎症を引き起こす。ＩＬ−１ＲＡはインターロイキン−１の働きを拮抗的に阻害する。ＩＬ−１αが増加すると、コラーゲンを分解し、断片化する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ−１が増加することが知られている。
【００１１】
角層は、皮膚の一番上にある組織であり、体の外からの異物や刺激から皮膚を守る働きを有している。
本発明における測定又は評価対象部位は、角層が入手できる部分であれば、いかなる部位をも包含しうるが、主な部位としては顔面、頚部、上腕部を挙げることができる。従来の方法に従い、これらの部位の皮膚由来の角層を得ることができる。しかし、前述のように、外科的に皮膚を摘出する等の方法は、ユーザーに負担を与えるため、テープストリッピング、擦過等の簡便に角層を得られる方法が好ましい。特にテープストリッピングが好ましい。
【００１２】
こうして用意した各試料におけるＩＬ−１ＲＡ又はＩＬ−１αの発現量は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、ＩＬ−１ＲＡ又はＩＬ−１αに対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング等の方法を用いることができる。このような測定手段はすでに市販されており、代表的なＩＬ−１ＲＡのエンザイムイムノアッセイキットとしてR&D Systems製のHuman IL-1ＲＡ/IL-1F3 Quantikine ELISA KitやLife Technologies社製のIL-1ＲＡ Human ELISA Kitを例示することができる。
また代表的なＩＬ−１αのエンザイムイムノアッセイキットとしてR&D Systems製のHuman IL-1α/IL-1F1 Quantikine ELISA KitやThermo Scientific社製のHuman IL-1 alpha ELISA Kitを例示することができる。
各試料からＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αをそれ自体既知の生化学的方法、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジュネート法等により可溶性画分として抽出する。抽出後、速やかに測定する。
【００１３】
皮膚の血流量が多い人の角層におけるＩＬ−１ＲＡの発現量が皮膚の血流量が少ない人の角層におけるＩＬ−１ＲＡの発現量と比べて高いため、角層におけるＩＬ−１ＲＡの発現量の多寡を指標として、簡便に皮膚の血流量の多寡を測定又は評価できる。
また、皮膚の血流量の多い人の角層におけるＩＬ−１αの発現量が皮膚の血流量が少ない人の角層におけるＩＬ−１αの発現量と比べて低いため、角層におけるＩＬ−１αの発現量の多寡を指標として、簡便に皮膚の血流量の多寡を評価できる。
本発明に用いる角層は、テープストリッピング法といった角層の表層部分のみを角質テープで採取する簡単な方法で採取することができる。このため、被験者に負担を与えることなく、被験者の皮膚の血流量の測定又は皮膚の血流の状態を評価することができる。
【００１４】
本発明の皮膚血流量の測定方法は、角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αの発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αの発現量を予め測定しておいた集団の角層におけるＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αの発現量分布から求めた血流量の相関を求めた回帰式により皮膚血流量に換算する工程からなる。
【００１５】
本発明の皮膚血流量の評価方法は、角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αの発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αの発現量を予め測定しておいた集団の角層におけるＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１αの発現量分布と比較する比較工程から構成される。被験者のＩＬ−１ＲＡの発現量が予め測定しておいた集団の角層におけるＩＬ−１ＲＡの発現量分布と比べて、発現量が多ければ、皮膚の血流量が大きいと判定され、発現量が少なければ、皮膚の血流量が小さいと判定される。被験者のＩＬ−１αの発現量が予め測定しておいた集団の角層におけるＩＬ−１αの発現量分布と比べて、発現量が多ければ、皮膚の血流量が小さいと判定され、発現量が少なければ、皮膚の血流量が大きいと判定される。
【００１６】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
試験例１
被験集団の皮膚の血流量の測定結果とＩＬ−１ＲＡの発現量測定結果の分布と相関
＜被験者＞
健常人の女性７５名の頬の角層をテープストリッピング法により採取した。
＜角層サンプル抽出方法、タンパク質定量＞
被験者の頬に角層チェッカー(アサヒバイオメッド社製)を貼り付け、角層を採取した。角層チェッカーからビーズ法（容器に検体と直径約2mmのガラスビーズと抽出液を入れて振盪抽出する方法）にてT-PER抽出バッファー（Tissue Protein ExtRAction Reagent Thermo Scientific製（product# 78510）））５００μｌを用いて角層タンパク質の抽出を行った。各サンプルのタンパク質量はPierce BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific #23225)で測定した。測定には前記角層タンパク質抽出液10μlにPierce BCA protein Assay Kitの反応試薬液２００μｌを加え、６０℃３０分でインキュベーションしたのち、５６２ｎｍの吸光度を測定した。同時にＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で検量線をひき、吸光度の値からタンパク質量を算出した。
【００１８】
＜角層中のＩＬ−１ＲＡの発現量測定＞
同様にテープから抽出した角層タンパク質抽出液中のＩＬ−１ＲＡの発現量をR&D SystemsのELISAキット［Human IL-1ＲＡ/IL-1F3 Quantikine ELISA Kit］を用いて測定した。まず、costar製の９６wellプレート（#3590）に1次抗体となる固相化抗体をキット指定の濃度で20℃、overnightで固相化した。次に１％ＢＳＡ、３７℃１時間でプレートをブロッキングし、０．０１％ Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、検量線となるスタンダードおよびサンプルを100μlずつアプライし、２５℃で２時間インキュベーションした。０．０１％ Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、２次抗体をキット指定濃度で２５℃、２時間インキュベーションした。さらに、０．０１％ Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、Streptavidin-HRPをキット指定濃度で２５℃、３０分インキュベーションした。最後に、０．０１％ Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、発色基質であるTMB solution (Promega, G7431))を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、キット指定の時間の後、stop solution (０．５Ｍ 硫酸)を１００μｌ加え、４５０ｎｍの吸光度を測定し、ＩＬ−１ＲＡの発現量を算出した。
【００１９】
＜皮膚の血流量の測定＞
レーザードップラー血流量計（Lisca Ab製PIMII Laser Doppler Perfusion Imager）を用いて、被験者の頬の血流量に比例する相対出力量（Ｖ）を測定した。
【００２０】
＜結果＞
測定結果を、Ｘ軸をＩＬ１−ＲＡ発現量、Ｙ軸を血流量に比例する相対出力量（Ｖ）として散布図を作成し、この撒布データをもとに直線回帰式を求めた。散布図及び回帰直線、相関係数、相関式を図１に示す。
Ｘ軸をＩＬ１−ＲＡ値、Ｙ軸を血流量に比例する相対出力量（Ｖ）としたとき、回帰式はＹ ＝ ０．００５１１０ ＋ ０．４４３４、Ｒ2 ＝ ０．０７０３、相関係数０．２７の直線回帰を示した。
図１に示す回帰直線又は回帰式から、測定したＩＬ−１ＲＡを血流量に比例する相対出力量（Ｖ）に換算することができた。また散布図から標準的な皮膚血流量に比例する相対出力量（Ｖ）の分布が判明した。この散布図及び回帰式に基づけば、皮膚角層中のＩＬ−１ＲＡの発現量を測定することで皮膚の血流量が明らかとなり、また分布から被験者の血流量が正常か否かを評価できた。
【００２１】
試験例２．
被験集団の皮膚の血流量に比例する相対出力量（Ｖ）の測定結果とＩＬ−１αの発現量測定結果の分布と相関
＜被験者＞
健常人の女性７３名の頬の角層をテープストリッピング法により採取した。
＜角層サンプル抽出方法、タンパク質定量＞
ＩＬ−１ＲＡの測定と同様に測定した。
【００２２】
＜角層中のＩＬ−１αの測定＞
試験例１同様にテープから抽出した角層タンパク質抽出液中のＩＬ−１αの発現量をR&D SystemsのＥＬＩＳＡキット［Human IL-1α/IL-1F1 Quantikine ELISA Kit］を用いて測定した。まず、costar製の９６ｗｅｌｌプレート（#3590）に1次抗体となる固相化抗体をキット指定の濃度で20℃、overnightで固相化した。次に１％ＢＳＡで３７℃１時間でプレートをブロッキングし、0.01% Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、検量線となるスタンダードおよびサンプルを１００μｌずつアプライし、２５℃で２時間インキュベーションした。０．０１％ Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、２次抗体をキット指定濃度で２５℃、２時間インキュベーションした。さらに、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでプレートを洗浄した後、Streptavidin-HRPをキット指定濃度で25℃、30分インキュベーションした。最後に、0.01% Tween-PBSでプレートを洗浄したのち、発色基質であるTMB solution (Promega, G7431))を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、キット指定の時間の後、stop solution (０．５Ｍ 硫酸）を１００μｌ加え、４５０ｎｍの吸光度を測定し、発現量を算出した。
【００２３】
＜皮膚の血流量の測定＞
試験例１と同様にレーザードップラー血流量計（Lisca Ab製PIMII Laser Doppler Perfusion Imager）を用いて、被験者の頬の血流量に比例する相対出力量（Ｖ）を測定した。
【００２４】
＜結果＞
測定結果を、Ｘ軸をＩＬ−α発現量、Ｙ軸を血流量として散布図を作成し、この撒布データをもとに直線回帰式を求めた。散布図及び回帰直線、相関係数、相関式を図２に示す。
Ｘ軸をＩＬ−α値、Ｙ軸を血流量に比例する相対出力量（Ｖ）としたとき、回帰式はＹ ＝ −０．１８７３Ｘ ＋ ０．５６８１、Ｒ2 ＝ ０．０９１２、相関係数０．３０の負の直線回帰を示した。
図１に示す回帰直線又は回帰式から、測定したＩＬ−１αを血流量に換算することができた。また散布図から標準的な皮膚血流量の分布が判明した。この散布図及び回帰式に基づけば、皮膚角層中のＩＬ−１αの発現量を測定することで皮膚の血流量が明らかとなり、また分布から被験者の血流量が正常か否かを評価できた。
【図１】
2015132482.tif 000003
【図２】
2015132482.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月23日(2015.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を指標とすることを特徴とする皮膚の血流量の間接測定又は評価方法。
【請求項２】
測定又は評価方法に用いる皮膚角層がテープストリッピング法により採取されたものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいてあらかじめ作成された相関式から、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を測定することで皮膚の血流量を間接的に測定する方法。
【請求項４】
角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を角層のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量と血流量の分布からあらかじめ求めた回帰式により皮膚血流量に換算する工程、
とからなる、皮膚血流量の間接測定法。
【請求項５】
血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいてあらかじめ作成した散布図と、測定したインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量とを対比して評価する、皮膚の血流量の評価方法。
【請求項６】
角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を、あらかじめ測定しておいた集団の、角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量と血流量に基づいて、あらかじめ作成した分布図と比較する比較工程、
とから構成される、皮膚血流の評価方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明は以下の構成である。
（１）皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を指標とすることを特徴とする皮膚の血流量の間接測定又は評価方法。
（２）測定又は評価方法に用いる皮膚角層がテープストリッピング法により採取されたものである（１）に記載の方法。
（３）血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいてあらかじめ作成された相関式から、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を測定することで皮膚の血流量を間接的に測定する方法。
（４）角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を角層のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量と血流量の分布からあらかじめ求めた回帰式により皮膚血流量に換算する工程、
とからなる、皮膚血流量の間接測定法。
（５）血流量と皮膚角層中のインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量の相関関係に基づいてあらかじめ作成した散布図と、測定したインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量とを対比して評価する、皮膚の血流量の評価方法。
（６）角層を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取された角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定されたインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量を、あらかじめ測定しておいた集団の、角層におけるインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、又はインターロイキン−１αの発現量と血流量に基づいて、あらかじめ作成した分布図と比較する比較工程、
とから構成される、皮膚血流の評価方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜結果＞
測定結果を、Ｘ軸をＩＬ−１ＲＡ発現量、Ｙ軸を血流量に比例する相対出力量（Ｖ）として散布図を作成し、この撒布データをもとに直線回帰式を求めた。散布図及び回帰直線、相関係数、相関式を図１に示す。
Ｘ軸をＩＬ−１ＲＡ値、Ｙ軸を血流量に比例する相対出力量（Ｖ）としたとき、回帰式はＹ ＝ ０．００５１１０ ＋ ０．４４３４、Ｒ2＝ ０．０７０３、相関係数０．２７の直線回帰を示した。
図１に示す回帰直線又は回帰式から、測定したＩＬ−１ＲＡを血流量に比例する相対出力量（Ｖ）に換算することができた。また散布図から標準的な皮膚血流量に比例する相対出力量（Ｖ）の分布が判明した。この散布図及び回帰式に基づけば、皮膚角層中のＩＬ−１ＲＡの発現量を測定することで皮膚の血流量が明らかとなり、また分布から被験者の血流量が正常か否かを評価できた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
＜結果＞
測定結果を、Ｘ軸をＩＬ−１α発現量、Ｙ軸を血流量として散布図を作成し、この撒布データをもとに直線回帰式を求めた。散布図及び回帰直線、相関係数、相関式を図２に示す。
Ｘ軸をＩＬ−１α値、Ｙ軸を血流量に比例する相対出力量（Ｖ）としたとき、回帰式はＹ ＝ −０．１８７３Ｘ ＋ ０．５６８１、Ｒ2 ＝ ０．０９１２、相関係数０．３０の負の直線回帰を示した。
図２に示す回帰直線又は回帰式から、測定したＩＬ−１αを血流量に換算することができた。また散布図から標準的な皮膚血流量の分布が判明した。この散布図及び回帰式に基づけば、皮膚角層中のＩＬ−１αの発現量を測定することで皮膚の血流量が明らかとなり、また分布から被験者の血流量が正常か否かを評価できた。