(57)【要約】【課題】ヒト腫瘍がアキシチニブでの治療に感受性であるかどうかを予測するための診断方法、およびヒト腫瘍を治療する方法を提供すること。【解決手段】本方法は、腫瘍の組織試料におけるＣＤ６８ポリペプチド発現レベルの測定に基づく。ＣＤ６８発現レベルは、腫瘍内のＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよびＣＤ６８陽性細胞の密度を決定することができる免疫組織化学を用いて測定することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アキシチニブでの治療に対して感受性である腫瘍を同定する方法であって、（ａ）アキシチニブでの治療を考慮されているヒト患者から得られた腫瘍の組織試料における、ＣＤ６８ポリペプチド発現レベルを測定するステップ、ならびに（ｂ）ステップ（ａ）におけるＣＤ６８発現レベルを、アキシチニブで事前に治療されアキシチニブに対して耐性であることが示されているヒト患者、およびアキシチニブで事前に治療されアキシチニブに対して感受性であることが示されているヒト患者から得られた腫瘍の組織試料におけるＣＤ６８ポリペプチド発現を測定することによって決定された閾値ＣＤ６８発現レベルに対して比較するステップを含み、ＣＤ６８発現レベルが閾値レベルを上回る場合、腫瘍がアキシチニブでの治療に対して感受性であることが示される、方法。
【請求項２】
ＣＤ６８ポリペプチド発現を測定するステップが、免疫組織化学によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫組織化学によってＣＤ６８ポリペプチド発現を測定するステップが、試料におけるＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージが決定される、ホールスライドスキャンからの画像分析によって実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試料におけるＣＤ６８陽性細胞の密度を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に従ってアキシチニブに対して感受性であるｍＲＣＣ腫瘍を有すると決定された患者に対してアキシチニブを投与するステップを含む、ｍＲＣＣを治療する方法。
【請求項７】
ａ）対象の腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージを決定するステップ、およびｂ）前記パーセンテージが少なくとも５％であれば対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項８】
ａ）対象の腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度を決定するステップ、およびｂ）前記細胞密度が少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２であれば対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項９】
腫瘍における細胞の少なくとも５％がＣＤ６８陽性である腫瘍を有する対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項１０】
腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度が少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２である腫瘍を有する対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項１１】
ａ）対象の腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージを決定するステップ、ｂ）腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度を決定するステップ、およびｃ）前記パーセンテージが少なくとも５％であり、かつ、前記細胞密度が少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２であれば対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項１２】
腫瘍における細胞の少なくとも５％がＣＤ６８陽性であり、かつ、腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度が少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２である腫瘍を有する対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍からなる群から選択される、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージまたは細胞密度を測定するステップが免疫組織化学を用いて行われる、請求項７、８、および１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージまたは細胞密度を測定するステップが、免疫組織化学およびホールスライドスキャンからの画像分析を用いて行われる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野は、分子生物学、腫瘍学、および臨床的診断方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
大部分の抗癌剤は、一部の患者において効果的であるが、他の患者においては効果的ではない。これは、腫瘍間の遺伝的多様性に起因し得、同一の患者内の腫瘍間でさえ観察され得る。変化しやすい患者応答は、標的治療学に関して特に顕著である。したがって、標的療法の最大限の潜在能力は、どの患者にどの薬剤が有益であるかを決定するための適切な試験を行わなくては、実現することができない。国立衛生研究所（ＮＩＨ）によると、用語「バイオマーカー」は、「治療的介入に対する通常の生物学的プロセスもしくは発病プロセスまたは薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価される特徴」として定義されている。
【０００３】
バイオマーカーの発見に基づく、改良された診断方法の開発は、所与の薬剤に対する臨床応答を示す可能性が最も高い患者を前もって同定することによって、新たな薬剤の開発を加速させる潜在能力を有する。このような診断方法は、臨床試験の規模、長さ、およびコストを顕著に低減させる潜在能力を有する。ゲノミクス、プロテオミクス、および分子イメージングなどの技術は、現在のところ、特異的な遺伝子の突然変異、特定の遺伝子の発現レベル、および他の分子バイオマーカーの迅速な、感度の高い、かつ信頼性の高い検出を可能にする。腫瘍の分子的特徴付けのための様々な技術の利用可能性にもかかわらず、癌バイオマーカーの臨床的利用は、依然としてほとんど実現されておらず、それは、発見されている癌バイオマーカーが比較的少ないためである。例えば、最近の総説は以下のように述べている：
課題は、癌バイオマーカーを発見することである。分子的に標的化された作用物質を用いて、慢性骨髄性白血病、消化管間質腫瘍、肺癌、および多形性膠芽腫などのいくつかの腫瘍タイプの分子的に規定されたサブセットを標的化することに、臨床的に成功してはいるが、このような成功をさらに広範な状況において適用する能力は、患者において標的作用物質を評価するための効率的な戦略を欠いていることによって非常に限られている。問題は、主に、これらの興味深い新たな薬剤を評価するための臨床試験に、分子的に規定された癌を有する患者を選択することが不可能であることにある。解決のためには、特定の作用物質が有益である可能性が最も高い患者を確実に同定するバイオマーカーが必要である（Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８〜５５２、５４８）。
先のようなコメントは、臨床的に有用なバイオマーカーおよびこのようなバイオマーカーに基づく診断方法の発見の必要性の認識を示している。
【０００４】
（１）予後バイオマーカー、（２）予測バイオマーカー、および（３）薬力学的（ＰＤ）バイオマーカーという、３つの異なるタイプの癌バイオマーカーが存在する。予後バイオマーカーは、侵襲性、すなわち成長および／または転移の速度、ならびに治療に対する応答性に従って、癌、例えば充実性腫瘍を分類するために用いられる。これは、「良好な転帰の」腫瘍を「不良な転帰の」腫瘍から区別するものと言われることがある。予測バイオマーカーは、特定の患者に特定の薬剤での治療が有益である見込みを評価するために用いられる。例えば、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２またはＮＥＵ）遺伝子が増幅している乳癌患者は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））での治療が有益である可能性が高く、一方、ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅を有さない患者は、トラスツズマブでの治療が有益である可能性が低い。ＰＤバイオマーカーは、患者が薬剤を投与されている間の、患者に対する薬剤の影響の指標である。したがって、ＰＤバイオマーカーは、新たな薬剤の臨床的開発の初期段階の際に投与量レベルおよび投与頻度を指導するために用いられることが多い。癌バイオマーカーの考察については、例えば、Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８〜５５２を参照されたい。
【０００５】
アキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ（登録商標）としても知られている）は、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）に作用する、経口的に投与される低分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。アキシチニブは、血管新生を阻害することによって腫瘍の成長および転移を低減させ、かつ、これらの受容体を発現する細胞およびこれらの受容体に依存性の細胞に直接的に作用することによって、腫瘍の成長を低減させ、退縮を生じさせると考えられている。アキシチニブは、サイトカインまたはスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）としても知られている）での疾患の増悪またはそれらに対する耐性があった後の転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）の治療について、多くの国で認可されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００９５６３４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  ４５２：５４８〜５５２、５４８
【非特許文献２】Ｐｏｌｉｍｅｎｏら、２０１３、ＢＪＵ  Ｉｎｔ  １１２：６８６〜６９６
【非特許文献３】Ｓｈｏｊａｅｉら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（８）：９１１〜９２０
【非特許文献４】Ｌｉｎら（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．８（７）：１９１
【非特許文献５】Ｔｏｎｉｎｉ  Ｇら（２０１１）Ｅｘｐｅｒ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１（６）：９２１〜９３０
【非特許文献６】Ｓｏｎｐａｖｄｅ  ＧおよびＣｈｏｕｅｉｒｉ  Ｔ、（２０１２）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０７（７）：１００９〜１０１６
【非特許文献７】Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ
【非特許文献８】Ｃｌａｒｋ−Ｌａｎｇｏｎｅら、２００７、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：２７９
【非特許文献９】Ｄｅ  Ａｎｄｒｅｓら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４
【非特許文献１０】Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００７、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ８７：９７９〜９９７
【非特許文献１１】Ｚｗｅｉｇら、１９９３、「Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）ｐｌｏｔｓ：ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：５６１〜５７７
【非特許文献１２】Ｐｅｐｅ、２００３、Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＶＥＧＦＲ阻害剤に焦点を当てた前臨床的リサーチおよび臨床的リサーチが多くあるにもかかわらず、このような阻害剤の抗腫瘍活性の原因であるメカニズムは、完全には理解されていない。特に、ｍＲＣＣ患者の予後および抗血管形成剤に対する感度／耐性への影響における腫瘍浸潤リンパ球の役割は、完全には理解されていない（例えば、Ｐｏｌｉｍｅｎｏら、２０１３、ＢＪＵ  Ｉｎｔ  １１２：６８６〜６９６を参照されたい）。他のタイプの標的療法でのように、全てではないが一部の患者は、アキシチニブ療法が有益である。したがって、アキシチニブでの治療に応答する可能性が高い（または可能性が低い）腫瘍を有する患者を同定するために用いることができる予測バイオマーカーに基づく診断方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書においてさらに詳細に論じられるように、本開示は、一部には、哺乳動物の腫瘍の組織試料における、腫瘍骨髄（すなわち、分化抗原群６８「ＣＤ６８」）の浸潤（例えば、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよびＣＤ６８陽性細胞の密度に関して上昇したＣＤ６８レベル）がアキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤での無増悪生存の向上と相関する、という所見に関するものである。したがって、本開示は、アキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤での治療が奏効する可能性がより高い腫瘍を同定する方法、およびアキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して応答する可能性がより高いと同定されている腫瘍を有する対象を治療する方法を提供する。
【００１０】
例えば、１つの実施形態において、本開示は、ＶＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性である腫瘍を同定する方法であって、（ａ）ＶＥＧＦＲ阻害剤での治療を考慮されているヒト患者から得られた腫瘍の組織試料における、ＣＤ６８ポリペプチド発現レベルを測定するステップ、ならびに（ｂ）ステップ（ａ）におけるＣＤ６８発現レベルを、ＶＥＧＦＲ阻害剤で事前に治療されＶＥＧＦＲ阻害剤に対して耐性であることが示されているヒト患者、およびＶＥＧＦＲ阻害剤で事前に治療されＶＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性であることが示されているヒト患者から得られた腫瘍の組織試料におけるＣＤ６８ポリペプチド発現を測定することによって決定された閾値ＣＤ６８発現レベルに対して比較するステップを含み、ＣＤ６８発現レベルが閾値レベルを上回る場合、腫瘍がＶＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性であることが示される、方法に関する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。さらなる実施形態において、ＣＤ６８ポリペプチド発現を測定するステップは、免疫組織化学によって行われる。さらなる実施形態において、免疫組織化学によってＣＤ６８ポリペプチド発現を測定するステップは、試料におけるＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージが決定される、ホールスライドスキャンからの画像分析によって実行される。さらなる実施形態において、このような方法は、試料におけるＣＤ６８陽性細胞の密度を決定するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、このような方法のいずれかにおける腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍からなる群から選択される。
【００１１】
さらなる実施形態において、本開示は、本明細書において記載される方法に従ってＶＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性であるｍＲＣＣ腫瘍を有すると決定された患者に対してＶＥＧＦＲ阻害剤を投与するステップを含む、ｍＲＣＣを治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１２】
さらなる実施形態において、本開示は、ａ）対象の腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージを決定するステップ、およびｂ）前記パーセンテージが少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも４．６％、少なくとも４．７％、少なくとも４．８％、少なくとも４．９％、少なくとも５．０％、少なくとも５．１％、少なくとも５．２％、少なくとも５．３％、少なくとも５．４％、少なくとも５．５％、少なくとも５．６％、少なくとも５．７％、少なくとも５．８％、少なくとも５．９％、少なくとも６．０％、少なくとも６．５％、少なくとも７．０％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％であれば、対象にＶＥＧＦＲ阻害剤を投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１３】
さらなる実施形態において、本開示は、ａ）対象の腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度を決定するステップ、およびｂ）前記細胞密度が少なくとも０．０５細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０６細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０７細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０９細胞／ｍｍ２、少なくとも１．０細胞／ｍｍ２、少なくとも１．１細胞／ｍｍ２、少なくとも１．２細胞／ｍｍ２、少なくとも１．３細胞／ｍｍ２、少なくとも１．４細胞／ｍｍ２、または少なくとも１．５細胞／ｍｍ２であれば、対象にアキシチニブを投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１４】
さらなる実施形態において、本開示は、腫瘍における細胞の少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも４．６％、少なくとも４．７％、少なくとも４．８％、少なくとも４．９％、少なくとも５．０％、少なくとも５．１％、少なくとも５．２％、少なくとも５．３％、少なくとも５．４％、少なくとも５．５％、少なくとも５．６％、少なくとも５．７％、少なくとも５．８％、少なくとも５．９％、少なくとも６．０％、少なくとも６．５％、少なくとも７．０％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％がＣＤ６８陽性である腫瘍を有する対象にＶＥＧＦＲ阻害剤を投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１５】
さらなる実施形態において、本開示は、腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度が少なくとも０．０５細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０６細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０７細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０９細胞／ｍｍ２、少なくとも１．０細胞／ｍｍ２、少なくとも１．１細胞／ｍｍ２、少なくとも１．２細胞／ｍｍ２、少なくとも１．３細胞／ｍｍ２、少なくとも１．４細胞／ｍｍ２、または少なくとも１．５細胞／ｍｍ２である腫瘍を有する対象にＶＥＧＦＲ阻害剤を投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１６】
さらなる実施形態において、本開示は、ａ）対象の腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージを決定するステップ、ｂ）腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度を決定するステップ、およびｃ）前記パーセンテージが少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも４．６％、少なくとも４．７％、少なくとも４．８％、少なくとも４．９％、少なくとも５．０％、少なくとも５．１％、少なくとも５．２％、少なくとも５．３％、少なくとも５．４％、少なくとも５．５％、少なくとも５．６％、少なくとも５．７％、少なくとも５．８％、少なくとも５．９％、少なくとも６．０％、少なくとも６．５％、少なくとも７．０％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％であり、かつ、前記細胞密度が少なくとも０．０５細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０６細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０７細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０９細胞／ｍｍ２、少なくとも１．０細胞／ｍｍ２、少なくとも１．１細胞／ｍｍ２、少なくとも１．２細胞／ｍｍ２、少なくとも１．３細胞／ｍｍ２、少なくとも１．４細胞／ｍｍ２、または少なくとも１．５細胞／ｍｍ２であれば、対象にＶＥＧＦＲ阻害剤を投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１７】
さらなる実施形態において、本開示は、腫瘍における細胞の少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも４．６％、少なくとも４．７％、少なくとも４．８％、少なくとも４．９％、少なくとも５．０％、少なくとも５．１％、少なくとも５．２％、少なくとも５．３％、少なくとも５．４％、少なくとも５．５％、少なくとも５．６％、少なくとも５．７％、少なくとも５．８％、少なくとも５．９％、少なくとも６．０％、少なくとも６．５％、少なくとも７．０％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％がＣＤ６８陽性であり、かつ、腫瘍におけるＣＤ６８陽性細胞の細胞密度が少なくとも０．０５細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０６細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０７細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０８細胞／ｍｍ２、少なくとも０．０９細胞／ｍｍ２、少なくとも１．０細胞／ｍｍ２、少なくとも１．１細胞／ｍｍ２、少なくとも１．２細胞／ｍｍ２、少なくとも１．３細胞／ｍｍ２、少なくとも１．４細胞／ｍｍ２、または少なくとも１．５細胞／ｍｍ２である腫瘍を有する対象にＶＥＧＦＲ阻害剤を投与するステップを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの実施形態において、ＶＥＧＦＲ阻害剤はアキシチニブである。
【００１８】
さらなる実施形態において、本開示は、前記腫瘍が乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍からなる群から選択される、本明細書において開示される方法のいずれかを提供する。１つの実施形態において、本開示は、癌または腫瘍がｍＲＣＣである、本明細書において開示される方法のいずれかを提供する。
【００１９】
さらなる実施形態において、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージまたは細胞密度を測定するステップが免疫組織化学を用いて行われ、またさらに、腫瘍試料から得たホールスライドスキャンからの画像分析の使用が採用される、本明細書において開示される方法が実行される。
【００２０】
本開示のいくつかの実施形態において、マクロファージ含有量の測定は、マクロファージマーカータンパク質の存在または量を測定することによって行われる。他の実施形態において、マクロファージ含有量の測定は、所与の細胞集団におけるマクロファージの数を決定することによって行われる。例えば、マクロファージ含有量の測定は、マクロファージマーカータンパク質の検出を伴う免疫組織化学によって行うことができる。別の実施形態において、マクロファージ含有量の測定は、マクロファージマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの存在または量を測定することによって行われる。マクロファージマーカータンパク質の例には、ＣＣＲ２、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、およびＭＳＲ１が含まれる。閾値決定分析は、受信者動作特性曲線分析を含み得る。本開示の方法は、例えば乳房腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、結腸直腸腫瘍、および膵臓腫瘍を含む、様々なタイプの腫瘍を試験するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ａ４０６１０３２研究に含まれた対象の人口統計学的特徴およびベースライン特徴を示す図である。
【図２】Ａ４０６１０３２研究の一部として収集されたスライド対ブロックによる、バイオマーカーＣＤ３およびＣＤ６８についての陽性細胞のパーセントおよび密度の概要を示す図である。
【図３】バイオマーカーＣＤ６８についての陽性細胞のパーセントおよび密度の、中央値未満の値と中央値以上の値との比較のための、ＰＦＳのカプラン・マイヤープロットを示す図である。
【図４】事前のＳｕｔｅｎｔ（登録商標）治療を受けた患者における、バイオマーカーＣＤ６８についての陽性細胞のパーセントおよび密度の、中央値未満の値と中央値以上の値との比較のための、ＰＦＳのカプラン・マイヤープロットを示す図である。
【図５】バイオマーカーＣＤ３についての陽性細胞のパーセントおよび密度の、中央値未満の値と中央値以上の値との比較のための、ＰＦＳのカプラン・マイヤープロットを示す図である。
【図６】事前のＳｕｔｅｎｔ（登録商標）治療を受けた患者における、バイオマーカーＣＤ３についての陽性細胞のパーセントおよび密度の、中央値未満の値と中央値以上の値との比較のための、ＰＦＳのカプラン・マイヤープロットを示す図である。
【図７】各バイオマーカーＣＤ３およびＣＤ６８の陽性細胞のパーセントおよび密度についての、中央値カットポイント層未満の値および中央値カットポイント層以上の値による、ＯＳの概要を示す図である。
【図８】事前のＳｕｔｅｎｔ（登録商標）治療を受けた患者における、各バイオマーカーＣＤ３およびＣＤ６８の陽性細胞のパーセントおよび密度についての、中央値カットポイント層未満の値および中央値カットポイント層以上の値による、ＯＳの概要を示す図である。
【図９】事前のＳｕｔｅｎｔ（登録商標）治療を受けた患者における、バイオマーカーＣＤ３およびＣＤ６８の陽性細胞のパーセントおよび密度についての、中央値未満の値と中央値以上の値との比較のための、ＯＳのカプラン・マイヤープロットを示す図である。
【図１０】応答カテゴリーごとの、ＣＤ３バイオマーカーおよびＣＤ６８バイオマーカーの陽性細胞のパーセントおよび密度の概要を示す図である。
【図１１】事前のＳｕｔｅｎｔ（登録商標）治療を受けた患者における、応答カテゴリーごとの、ＣＤ３バイオマーカーおよびＣＤ６８バイオマーカーの陽性細胞のパーセントおよび密度の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書において用いられる場合、Ｉｎｌｙｔａ（登録商標）、「ＡＧ−１３７３６」、および「アキシチニブ」は、その塩および多形を含む、以下の化学構造を有する６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールを意味する。
【００２３】
【化１】
2015210268.tif 000003
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「マクロファージマーカータンパク質」は、マクロファージ細胞表面タンパク質を意味し、その検出は、腫瘍の組織試料内に存在する他のタイプの細胞の間でマクロファージを同定するために有用である。典型的なヒトマクロファージマーカータンパク質は、ＣＣＲ２、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、およびＭＳＲ１である。他のマクロファージマーカータンパク質を、本開示の実施において採用することができる。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、「受信者動作特性」（ＲＯＣ）曲線は、２値分類系での偽陽性率（感度）対真陽性率（特異度）のプロットを意味する。ＲＯＣ曲線の構築において、以下の定義が適用される。
偽陰性率「ＦＮＲ」＝１−ＴＰＲ
真陽性率「ＴＰＲ」＝真陽性／（真陽性＋偽陰性）
偽陽性率「ＦＰＲ」＝偽陽性／（偽陽性＋真陰性）
【００２６】
本明細書において用いられる場合、治療された腫瘍に関して、治療に対する「応答」または「応答している」は、腫瘍が（ａ）成長の減速、（ｂ）成長の停止、または（ｃ）退縮を示すことを意味する。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「閾値決定分析」は、所与の腫瘍タイプ、例えばヒト腎細胞癌腫についての閾値スコアを決定するための、その特定の腫瘍タイプを代表するデータセットの分析を意味する。所与の腫瘍タイプを代表するデータセットには、このような腫瘍の群から得た各腫瘍について、（ａ）実際の腫瘍応答データ（アキシチニブなどの治療に対する応答および非応答）、ならびに（ｂ）マクロファージ含有量および／またはＣＤ６８発現レベルが含まれ得る。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「閾値スコア」は、それを超えると腫瘍がアキシチニブなどでの治療に対して感受性である可能性が高いと分類されるスコアを意味する。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「ＣＤ６８発現レベル」または「ＣＤ６８ポリペプチド発現レベル」は、腫瘍試料において発現され、免疫組織化学などのあらゆる適切な分析技術によって決定することができる、ＣＤ６８タンパク質のレベルを意味する。さらに、「ＣＤ６８発現レベル」は、所与の試料における「ＣＤ６８陽性」であると決定される細胞のパーセンテージ、および所与の試料における「ＣＤ６８陽性」であると決定される細胞の密度を含む、様々な用語で表現され得る。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、「ＣＣＲ２」（ＣＤ１９２、ＣＫＲ２、ＣＭＫＢＲ２、ＭＣＰ−Ｉ−Ｒ、ＣＣ−ＣＫＲ−２、ＦＬＪ７８３０２、ＭＧＣ１０３８２８、ＭＧＣ１１１７６０、およびＭＧＣ１６８００６としても知られている、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２）は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．７２９２３０によって同定される遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、およびその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「ＣＤ１４」は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．９２９によって同定される遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、およびその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「ＣＤ６８」（ＧＰ１１０、ＳＣＡＲＤ１、およびＤＫＦＺｐ６８６Ｍ１８２３６としても知られている）は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．９６８によって同定される遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、およびその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「ＣＤ６８陽性」細胞は、ＣＤ６８の存在が免疫組織化学などのあらゆる適切な分析技術によって検出される細胞である。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「ＣＤ１６３」（ＭＩ３０およびＭＭ１３０としても知られている）は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．９３３２によって同定される遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、およびその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「ＣＳＦ１Ｒ」（ＣＳＦＲ、ＦＭＳ、ＦＩＭ２、Ｃ−ＦＭＳ、およびＣＤ１１５としても知られている、コロニー刺激因子１受容体）は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．１４３６によって同定される遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、およびその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３６】
本明細書において用いられる場合、「ＭＳＲ１」（ＣＤ２０４、ＳＣＡＲＡ１、ＳＲ−Ａ、ｐｈＳＲＩ、およびｐｈＳＲ２としても知られている、マクロファージスカベンジャー受容体１）は、Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ  Ｎｏ．４４８１によって同定される遺伝子によってコードされるヒトタンパク質、およびその対立遺伝子変異体を意味する。
【００３７】
臨床研究
Ｉｎｌｙｔａ（登録商標）は、以下ではアキシチニブと呼ぶが、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）に作用する、経口的に投与される低分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。アキシチニブは、血管新生を阻害することによって腫瘍の成長および転移を低減させ、かつ、これらの受容体を発現する細胞およびこれらの受容体に依存性の細胞に直接的に作用することによって、腫瘍の成長を低減させ、退縮を生じさせることが期待されている。アキシチニブは、サイトカインまたはスニチニブでの疾患の増悪またはそれらに対する耐性があった後の転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）の治療について、多くの国で認可されている。
【００３８】
研究Ａ４０６１０３２（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号：ＮＣＴ００６７８３９２）は、「転移性腎細胞癌のための第二選択療法としてのアキシチニブ（ＡＧ−０１３７３６）：Ａｘｉｓトライアル」というタイトルの第３相登録試験であった。この試験は、１つの第一選択レジメンが失敗した後のｍＲＣＣ患者において腫瘍の増悪を遅らせることにおいてアキシチニブがソラフェニブよりも優れていることを実証するために設計された。全部で６５０人の患者が参加することが予定されており、７２３人の対象が実際に研究に参加した。
【００３９】
実施例においてさらに詳細に記載されるように、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）腫瘍試料を、Ａ４０６１０３２に加わり、腫瘍試料の収集について明確に同意した患者から収集した。腫瘍骨髄（分化抗原群６８「ＣＤ６８」）またはリンパ球（分化抗原群３「ＣＤ３」）の浸潤を、５２人のアキシチニブ治療した患者の腫瘍試料において免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価した。目的は、骨髄の浸潤が、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２経路を標的化する抗血管形成剤に対する耐性を付与するという仮説と一致する（Ｓｈｏｊａｅｉら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（８）：９１１〜９２０、およびＬｉｎら（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．８（７）：１９１を参照されたい）、これらのバイオマーカーと有効性との潜在的な関連を調べることであった。
【００４０】
ＣＤ３およびＣＤ６８の評価を、ホールスライドスキャンからの画像分析によって行った。目的の領域に丸印を付け、画像分析アルゴリズムを実行した。陽性細胞のパーセンテージ（細胞総数当たりの陽性細胞の数）および陽性細胞の密度（例えば、１ｍｍ２当たりの陽性細胞の数）を測定した。一部の患者はＦＦＰＥブロックを提供し、一部の患者はブロックからのスライドカットを提供した。全患者から得た試料を、それらがスライドとして提供されたかまたはブロックとして提供されたかについて分析した。
【００４１】
ＩＨＣデータについて５２人の評価可能な患者がおり、そのうち３３人はＳｕｔｅｎｔ（登録商標）（スニチニブ）で事前に治療されていた。ＣＤ３データと測定されたいずれの評価項目との間にも相関はなかった。実施例においてさらに詳細に記載されるように、ＣＤ６８では、陽性細胞のパーセンテージおよび細胞密度は密接に相関しており、非応答者に対して、客観的応答を有する患者において２倍高かった。
【００４２】
前治療にかかわらず、ＣＤ６８の中央値（カットオフ＝５．２１％の陽性細胞または０．０８細胞／ｍｍ２の細胞密度）以上の患者における無増悪生存（ＰＦＳ）の中央値は、両カットポイントで１２．０か月であり、それに対し、バイオマーカーの中央値より小さい患者ではそれぞれ３．７か月および３．８か月であった（ハザード比［ＨＲ］＝０．４２、ログランクＰ値≦０．０１）。Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者では、ぎりぎりの統計的有意性を伴って、ＰＦＳと類似の傾向が観察された（ｐ値：陽性細胞％および細胞密度についてそれぞれ０．０６６および０．０５６）。良好な有効性の類似の傾向が、比較的高いＣＤ６８細胞数を有する患者についての客観的応答および全生存（ＯＳ）で観察されたが、これらの差異は、全患者を共に評価した場合、またはＳｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者のみを評価した場合には、統計的に有意ではなかった。
【００４３】
さらなる受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を、ベースライン腫瘍ＣＤ６８レベルの感度および特異度をさらに良く理解するため、ならびに最初に選択されたＣＤ６８の中央値からのＣＤ６８カットポイントの定義を最適化するために行った。デフォルトのカットオフ値である２、４、６、および８か月のＰＦＳを選択し、ここでも、ＣＤ６８陽性細胞の高いパーセンテージおよび細胞密度を有する患者が、４つのＰＦＳ時点のそれぞれで、より長いＰＦＳ値を有する（または、疾患の増悪もしくは死亡の可能性が同等に低い）ことが観察された。
【００４４】
実施例においてさらに詳細に記載されるように、最も高い観察された感度、特異度、および曲線下面積（ＡＵＣ）の値は、２か月のＰＦＳで観察され、ここで、ＲＯＣ曲線のＡＵＣは、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび細胞密度でそれぞれ０．７７６および０．８０９であり、このことは、ＣＤ６８発現レベルを用いる、ＰＦＳについての説得力のある全体的な診断正確度を示す。６か月のＰＦＳを予測するための最適なカットオフ点は、ＣＤ６８の陽性細胞のパーセントおよび密度でそれぞれ４．４１％および０．０６細胞／ｍｍ２であった。値は、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者で同様であった。
【００４５】
ＲＯＣ分析もまた、ＯＲＲに対するＣＤ６８の評価のために用いた。実施例においてさらに詳細に記載されるように、ＡＵＣは、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび細胞密度でそれぞれ０．７９１および０．７８４であり、このことは、ここでも、ＣＤ６８発現レベルを用いてＯＲＲを予測するための説得力のある全体的な正確度を示す。ＯＲＲを予測するための最適なカットオフ点は、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび細胞密度でそれぞれ９．４２％および０．１３細胞／ｍｍ２であった。値は、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者で同様であった。試験のための中央値である２１か月での生存可能性について、ＲＯＣ分析は統計的に有意な関連を示さず、ＡＵＣは０．５５９であった。
【００４６】
結論として、事前の治療にかかわらず、良好なＰＦＳは、より高い腫瘍ＣＤ６８レベルを有する患者で観察された。ＣＤ６８の中央値を超える患者におけるＰＦＳの中央値は、両カットポイントで１２．０か月であり、それに対し、バイオマーカーの中央値より小さい値を有する患者では３．７か月および３．８か月であった（ＨＲ＝０．４２、ログランクｐ値≦０．０１）。ＲＯＣ分析は、２、４、６、および８か月でのこのデータについての説得力のある予測値、ならびに正確なカットオフ点（６か月  −  ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび細胞密度について、４．４１％および０．０６細胞／ｍｍ２）を示した。
【００４７】
したがって、本開示は、アキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤で治療した患者について、より高いＣＤ６８発現がより高いＯＲＲおよびより長いＰＦＳと関連するという所見に関する。ＯＳとの関連の不存在は、アキシチニブ増悪後の交絡的な増悪後治療に起因し得る。これらの所見は、ＶＥＧＦ生産の増大のメカニズム、およびそれに付随する、より高いマクロファージ浸潤を伴う血管形成状態、したがってアキシチニブの治療の影響に対するより高い感度と一致する。登録評価項目であるＰＦＳのＲＯＣ分析は、２か月の治療の後に最も高い感度および特異度を示した。
【００４８】
ＣＤ６８の発現は、チボザニブ治療を受けているｍＲＣＣ患者での転帰と関連することが先に報告されている（Ｌｉｎら（２０１０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．８（７）：１９１）。骨髄（ＣＤ１１ｂ  Ｇｒ＋）細胞もまた、肺動物モデルにおいて、ベバシズマブに対する耐性を付与することが先に示されている（Ｓｈｏｊａｅｉら（２００７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（８）：９１１〜９２０）。このデータは、より高いＣＤ６８腫瘍レベルを有する患者でのさらに不良な転帰と一致するであろう。しかし、このことは、この研究においては観察されなかった。
【００４９】
ＲＣＣ患者にとって、予後バイオマーカーの同定は著しく進歩してきているが、アキシチニブなどの標的ＶＥＧＦＲ阻害剤について、有効性の予測マーカーは同定されていない。最近の概説によると（Ｔｏｎｉｎｉ  Ｇら（２０１１）Ｅｘｐｅｒ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１（６）：９２１〜９３０）、ＲＣＣ患者にとって最も適切な治療法の選択は、依然として、リスク基準（ＭＳＫＣＣ）および他の予後基準に依存している。さらに、著者は、これらの組み合わされた基準がＲＣＣ患者の転帰についての情報を提供すること、およびｍＲＣＣについての治療法に対する応答の予測因子が必要であることを述べている。ランダム化された臨床試験（Ｉｄ．）における潜在的マーカーの検証が必要である。組織の収集および分析の標準化もまた、治療法を潜在的に指導するための分子バイオマーカーの開発における主要な課題として挙げられている（Ｓｏｎｐａｖｄｅ  ＧおよびＣｈｏｕｅｉｒｉ  Ｔ、（２０１２）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０７（７）：１００９〜１０１６）。
【００５０】
本開示の実行において用いることができる方法および分析技術を、以下にさらに開示する。
【００５１】
組織試料
ヒト患者における腫瘍の組織試料を、ＲＮＡの供給源、タンパク質の供給源、または免疫組織化学（ＩＨＣ）のための薄片の供給源として用いることができ、したがって、試料におけるＣＤ６８発現のレベルを、本開示において記載されているように決定することができる。組織試料は、従来の腫瘍生検機器および手順を用いて得ることができる。内視鏡生検、切除生検、切開生検、細針生検、パンチ生検、薄片生検、および皮膚生検が、腫瘍試料を得るために当業者によって用いられ得る、認識されている医療手順の例である。腫瘍組織試料は、マーカー遺伝子、例えばＣＤ６８発現レベルを測定するために、または、ＩＨＣによって、例えばＣＤ６８陽性細胞の発現によってマクロファージを可視化するために十分なＲＮＡ、タンパク質、または薄片を提供するために、十分な量でなくてはならない。
【００５２】
腫瘍組織試料は、マクロファージ含有量、または具体的にはＣＤ６８の測定を可能にするあらゆる形態であり得る。言い換えると、組織試料は、ＲＮＡ抽出、タンパク質抽出、または薄片の調製のために十分でなくてはならない。したがって、組織試料は、新鮮であり得るか、適切な低温技術を介して保存され得るか、または非低温技術を介して保存され得る。臨床生検標本を扱うための標準的なプロセスは、組織試料をホルマリン内で固定し、次いでそれをパラフィン内に包埋することである。この形態の試料は、ホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織として一般に知られている。その後の分析のための組織調製の適切な技術は、当業者に周知である。
【００５３】
マクロファージ含有量
本開示の実施において、組織試料（例えば、腫瘍から得た）における、マクロファージ含有量のレベル（例えば、マクロファージの数、またはＣＤ６８などのマクロファージマーカーの発現、例えば、マクロファージマーカータンパク質の発現、またはＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの発現）の決定は、いくつか存在するあらゆる適切な方法によって行うことができる。例えば、マクロファージ含有量の間接的な測定は、ＣＤ６８などのマクロファージマーカーとして有用であることが知られている１つまたは複数の遺伝子の発現を測定することによって行うことができる。遺伝子発現を測定するための様々な方法が、当技術分野において知られている。このような方法は、マクロファージマーカータンパク質またはマクロファージマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの決定において適用することができる。典型的なヒトマクロファージマーカー遺伝子は、ＣＣＲ２、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、およびＭＳＲ１である。他のマクロファージマーカーも同様に用いることができる。
【００５４】
ＲＮＡ分析
従来のマイクロアレイ分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）は、マクロファージマーカー遺伝子の発現のレベルをｍＲＮＡのレベルで決定するための方法の例である。本開示のいくつかの実施形態において、ＲＮＡは、標準的なプロトコルを用いて、目的の細胞、腫瘍、または組織から抽出される。他の実施形態において、ＲＮＡ分析は、ＲＮＡの単離を要しない技術を用いて行われる。
【００５５】
ＲＮＡの単離
組織試料からの、真核細胞ｍＲＮＡ、すなわちポリ（ａ）ＲＮＡの迅速かつ効率的な抽出のための方法は確立されており、当業者に知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照されたい。組織試料は、新鮮な、凍結された、または固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）、臨床研究腫瘍標本などの試料であり得る。通常、新鮮なまたは凍結された組織試料から単離されたＲＮＡは、ＦＦＰＥ試料から得たＲＮＡよりも断片化されにくい傾向がある。腫瘍材料のＦＦＰＥ試料は、しかし、より容易に入手可能であり、ＦＦＰＥ試料は、本開示の方法において用いるためのＲＮＡの適切な供給源である。ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングのためのＲＮＡ供給源としてのＦＦＰＥ試料の考察については、例えば、Ｃｌａｒｋ−Ｌａｎｇｏｎｅら、２００７、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：２７９を参照されたい。また、Ｄｅ  Ａｎｄｒｅｓら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４、およびＢａｋｅｒら、米国特許出願公開第２００５／００９５６３４号も参照されたい。ＲＮＡの抽出および調製のために、市販されているキットを販売者の指示と共に用いることは、広く行われており、一般的である。様々なＲＮＡ単離製品および完全なキットの商業的販売者には、Ｑｉａｇｅｎ（バレンシア、カリフォルニア州）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）、Ａｍｂｉｏｎ（オースチン、テキサス州）、およびＥｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ、マサチューセッツ州）が含まれる。
【００５６】
通常、ＲＮＡの単離は、組織／細胞の破壊で開始される。組織／細胞の破壊の間、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を最少にすることが望ましい。ＲＮＡ単離プロセスの間のＲＮａｓｅ活性を制限するための１つのアプローチは、細胞が破壊されたらすぐに変性剤を細胞内容物と接触させることを確実にすることである。別の一般的な慣例は、１つまたは複数のプロテアーゼをＲＮＡ単離プロセスに含めることである。場合によって、新鮮な組織試料が、それらが収集されるとすぐに、ＲＮＡ安定化溶液内に室温で浸される。安定化溶液は、迅速に細胞に浸透し、その後の単離のために、４℃での保存のためにＲＮＡを安定化させる。
【００５７】
いくつかのプロトコルにおいて、全ＲＮＡが、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって、破壊された腫瘍材料から単離される。通常、ｍＲＮＡは、全細胞ＲＮＡのおよそ１パーセントから５パーセントを占める。固定化されたオリゴ（ｄＴ）、例えばオリゴ（ｄＴ）セルロースは、リボソームＲＮＡおよび運搬ＲＮＡからｍＲＮＡを分離するために一般的に用いられる。単離の後に保存される場合、ＲＮＡは、ＲＮａｓｅの存在しない条件下で保存されなくてはならない。単離されたＲＮＡの安定な保存のための方法は、当技術分野において知られている。ＲＮＡの安定な保存のための様々な商品が利用可能である。
【００５８】
マイクロアレイ
ＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、従来のＤＮＡマイクロアレイ発現プロファイリング技術を用いて測定することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス、プラスチック、またはシリコンなどの固体表面または固体基質に固定された特異的なＤＮＡセグメントまたはプローブの集まりであり、各特異的ＤＮＡセグメントが、アレイ内の既知の位置に存在している。通常はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の、標識されたＲＮＡの試料とのハイブリダイゼーションによって、アレイ内の各プローブに対応するＲＮＡ分子の検出および定量が可能になる。非特異的に結合した試料材料を除去するためのストリンジェントな洗浄の後、マイクロアレイを、共焦点レーザー顕微鏡法または他の適切な検出方法によってスキャンする。ＤＮＡチップとして知られていることが多い、最新の市販のＤＮＡマイクロアレイは、何万ものプローブを典型的には含み、したがって、何万もの遺伝子の発現を同時に測定することができる。このようなマイクロアレイは、本開示の実施において用いることができる。あるいは、ＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現を測定するために必要なだけのプローブと、例えばデータの正規化のための必要な対照または標準とを含む、カスタムチップを、本開示の実施において用いることができる。
【００５９】
データの正規化を容易にするために、２色マイクロアレイリーダーを用いることができる。２色（２チャネル）システムにおいて、試料は、第１の波長を発する第１のフルオロフォアで標識され、一方、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ標準は、異なる波長を発する第２のフルオロフォアで標識される。例えば、Ｃｙ３（５７０ｎｍ）およびＣｙ５（６７０ｎｍ）が、２色マイクロアレイシステムにおいて共に採用されることが多い。
【００６０】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、良く開発されており、市販されており、かつ広く採用されている。したがって、本明細書において開示される方法の実施において、当業者は、不必要な実験を行うことなく、ＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するためのマイクロアレイ技術を用いることができる。ＤＮＡマイクロアレイチップ、試薬（ＲＮＡまたはｃＤＮＡの調製、ＲＮＡまたはｃＤＮＡの標識、ハイブリダイゼーション、および洗浄の溶液のためのものなど）、機器（マイクロアレイリーダーなど）、およびプロトコルは、当技術分野において周知であり、様々な商業的供給源から入手可能である。マイクロアレイシステムの商業的販売者には、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サンタ・クララ、カリフォルニア州）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（サンタ・クララ、カリフォルニア州）が含まれるが、他のＰＣＲシステムも同様に用いることができる。
【００６１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードする個別の遺伝子を代表するｍＲＮＡのレベルを、従来の定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）技術を用いて測定することができる。ｑＲＴ−ＰＣＲの利点には、感度、柔軟性、定量的正確度、および緊密に関連するｍＲＮＡの間を区別する能力が含まれる。定量的ＰＣＲのための組織試料の処理に関連するガイダンスは、ｑＲＴ−ＰＣＲのための商品の製造者および販売者（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（バレンシア、カリフォルニア州）およびＡｍｂｉｏｎ（オースチン、テキサス州））を含む、様々な供給源から入手可能である。ｑＲＴ−ＰＣＲの自動性能のための機器システムは市販されており、多くの実験室において日常的に用いられている。周知の市販のシステムの例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）である。
【００６２】
ｍＲＮＡが単離されると、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第１のステップは、ｃＤＮＡへのｍＲＮＡ鋳型の逆転写であり、ｃＤＮＡは次いで、ＰＣＲ反応において指数関数的に増幅される。２つの一般的に用いられる逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写反応は、典型的には、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴ（ｄＴ）プライマーで開始される。結果として得られるｃＤＮＡ生成物は、その後のポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として用いることができる。
【００６３】
ＰＣＲステップは、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行される。ＰＣＲシステムにおいて最も一般的に用いられるポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼである。ＰＣＲの選択性は、増幅のために標的化されるＤＮＡ領域、すなわち、ＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードする遺伝子から逆転写されるｃＤＮＡの領域に相補的なプライマーの使用の結果生じる。したがって、ｑＲＴ−ＰＣＲが本開示において採用される場合、各マーカー遺伝子に特異的なプライマーは、遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づく。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）などの市販の技術を、販売者の指示に従って用いることができる。メッセンジャーＲＮＡのレベルは、ベータアクチンまたはＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子のレベルを比較することによって、試料間のロード量における差異について正規化することができる。ｍＲＮＡの発現のレベルは、正常な非腫瘍組織または細胞から得たｍＲＮＡなどの、あらゆる単一の対照試料と比較して表すことができる。あるいは、それは、腫瘍試料もしくは腫瘍細胞系のプールから、または市販されている対照ｍＲＮＡのセットから得たｍＲＮＡと比較して表すことができる。
【００６４】
ＣＤ６８などのマクロファージマーカータンパク質をコードする遺伝子の発現レベルのＰＣＲ分析のための適切なプライマーセットは、不必要な実験を行うことなく、当業者によって設計および合成され得る。あるいは、本開示を実施するためのＰＣＲプライマーセットは、商業的供給源、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入することができる。ＰＣＲプライマーは、好ましくは、約１７から２５ヌクレオチド長である。プライマーは、融解温度（Ｔｍ）推定のための従来のアルゴリズムを用いて、特定のＴｍを有するように設計することができる。プライマーの設計およびＴｍ推定のためのソフトウェアは、例えばＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が商業的に入手可能であり、また、例えばＰｒｉｍｅｒ３（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）がインターネットで入手可能である。ＰＣＲプライマー設計の確立された原理を適用することによって、多くの異なるプライマーを、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＭＳＲ１、ＣＳＦＲ１、ＣＤ１６３、およびＣＣＲ２などのマクロファージマーカー遺伝子を含むあらゆる所与の遺伝子の発現レベルを測定するために用いることができる。
【００６５】
本開示のいくつかの実施形態において、ＲＮＡ分析は、ＲＮＡの抽出または単離を伴わない技術を用いて行われる。１つのこのような技術は、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイであり、これは、ｑＮＰＡ（商標）の名前で市販されている（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、トゥーソン、アリゾナ州）。この技術は、分析される腫瘍組織試料がＦＦＰＥ材料の形態である場合に有利であり得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００７、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ８７：９７９〜９９７を参照されたい。
【００６６】
タンパク質の分析
本開示の方法において、ＣＤ６８などのマクロファージマーカー遺伝子の発現は、タンパク質レベルで検出することができる。タンパク質レベルでマクロファージマーカー遺伝子の発現のレベルを測定するための方法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＩＨＣ分析が含まれる。
【００６７】
ＥＬＩＳＡ
マクロファージマーカータンパク質のＥＬＩＳＡ、例えばＣＤ６８のＥＬＩＳＡの実施には、マクロファージマーカータンパク質に対する少なくとも１つの抗体、すなわち検出抗体が必要である。典型的な実施形態において、ＣＤ６８は、マクロファージマーカータンパク質である。分析される試料から得たＣＤ６８タンパク質は、ポリスチレンマイクロタイタープレートなどの固体担体上に固定化される。この固定化は、例えば、表面への吸着を介する、ＣＤ６８の非特異的な結合によるものであり得る。あるいは、固定化は、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて、例えば、捕捉抗体（検出抗体と異なる抗ＣＤ６８抗体）による、試料から得たＣＤ６８タンパク質の結合を介する、特異的結合によるものであり得る。ＣＤ６８が固定化された後、検出抗体が添加され、そして検出抗体は、結合したＣＤ６８と複合体を形成する。検出抗体は、直接的にまたは間接的に、例えば検出抗体を特異的に認識する二次抗体を介して、酵素に連結する。典型的には各ステップの間に、結合したＣＤ６８を有するプレートを、穏やかな洗剤溶液で洗浄する。典型的なＥＬＩＳＡプロトコルにはまた、プレートへのタンパク質試薬の望ましくない非特異的な結合をブロックするための、ウシ血清アルブミンなどの非特異的結合タンパク質の使用を伴う、１つまたは複数のブロックステップも含まれる。最後の洗浄ステップの後、プレートを、適切な酵素基質の添加によって発色させて、試料内のＣＤ６８の量を示す可視的シグナルを生じさせる。基質は、例えば、発色性基質または蛍光発生性基質であり得る。ＥＬＩＳＡの方法、試薬、および設備は、当技術分野において周知であり、市販されている。
【００６８】
他のマクロファージマーカータンパク質、例えば、ＣＣＲ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、およびＭＳＲ１、ならびに他のマクロファージ特異的マーカータンパク質の発現レベルが、各マクロファージマーカータンパク質に特異的な抗体の検出を用いるＥＬＩＳＡによって測定され得ることが理解される。
【００６９】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
所与の細胞集団におけるマクロファージの数を、免疫組織化学によって決定する（例えば視覚化する）ことができる。さらに、ＣＤ６８などの所与のバイオマーカータンパク質について陽性の、試料内の細胞のパーセンテージおよび密度を、免疫化学によって決定することができる。ＩＨＣによるマクロファージマーカータンパク質のアッセイ、例えばＣＤ６８  ＩＨＣには、マクロファージマーカータンパク質に対する少なくとも１つの抗体、例えば、少なくとも１つの抗ＣＤ６８抗体が必要である。ＩＨＣに適切な多くの抗ＣＤ６８抗体が市販されている。例えば、適切な抗体は、Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（カーピンテリア、カリフォルニア州）、ａｂｅａｍ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、Ａｂｎｏｖａ（ウォールナット、カリフォルニア州）、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入することができる。標準的な技術を用いて、抗ＣＤ６８抗体は、パラフィン包埋され凍結された腫瘍切片を含む、腫瘍から得た切片、例えば５ミクロンの切片内の、ＣＤ６８タンパク質の存在を検出するために用いることができる。典型的には、腫瘍切片は、腫瘍材料の収集および保存の最初のプロセスにおいて固定されたタンパク質の抗原性構造を取り戻すような方法で、最初に処理される。スライドは、次いで、抗ＣＤ６８検出抗体による非特異的な結合を防ぐためにブロックされる。ＣＤ６８タンパク質の存在が、次いで、ＣＤ６８タンパク質への抗ＣＤ６８抗体の結合によって検出される。検出（一次）抗体は、直接的にまたは間接的に、例えば、検出（一次）抗体を特異的に認識する二次抗体またはポリマーを介して、酵素に連結する。典型的には、腫瘍切片は、ステップの間に、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質で洗浄およびブロックされる。スライドは、可視的なシグナルを生じさせるために、適切な酵素基質を用いて発色させられる。試料は、ヘマトキシリンで対比染色することができる。
【００７０】
他のマクロファージマーカータンパク質、例えば、ＣＣＲ２、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、およびＭＳＲ１、ならびに他のマクロファージ特異的マーカータンパク質の発現が、各マクロファージマーカータンパク質に特異的な抗体を用いる類似の様式でＩＨＣによって検出され得ることが、理解される。
【００７１】
データ解釈
腫瘍についてのマクロファージスコアは、閾値スコアに関して解釈することができる。閾値スコア以上のマクロファージスコア、またはＣＤ６８などの特定のバイオマーカーの発現レベルは、アキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して感受性（応答性）である可能性が高い腫瘍を予測するものとして解釈することができる。あるいは、閾値スコア以下のマクロファージスコア、またはＣＤ６８などの特定のバイオマーカーの発現レベルは、アキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤での治療に対して耐性（非応答性）である可能性が高い腫瘍を予測するものとして解釈することができる。
【００７２】
マクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルの最適閾値は、閾値決定分析を行うことによって経験的に決定（または少なくとも概算）することができる。好ましくは、閾値決定分析には、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析が含まれる。ＲＯＣ曲線分析は、確立された統計技術であり、その適用は、当技術分野における通常の技術の範囲内である。ＲＯＣ曲線分析の考察については、全般的に、Ｚｗｅｉｇら、１９９３、「Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）ｐｌｏｔｓ：ａ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：５６１〜５７７、およびＰｅｐｅ、２００３、Ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００７３】
マクロファージスコア、ＣＤ６８発現レベル、および最適閾値スコアは、腫瘍タイプごとに変化し得る。したがって、閾値決定分析は、好ましくは、本開示を用いて試験されるあらゆる所与の腫瘍タイプを代表する１つまたは複数のデータセットについて行われる。閾値決定分析に用いられるデータセットには、（ａ）実際の応答データ（応答または非応答）、および（ｂ）腫瘍の群から得た各腫瘍試料についてのマクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルが含まれる。所与の腫瘍タイプに関してマクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルの閾値が決定されると、その閾値は、その腫瘍タイプの腫瘍から得たマクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルを解釈するために適用され得る。
【００７４】
ＲＯＣ曲線分析は、以下のように行うことができる。閾値以上のマクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルを有するあらゆる試料を、応答者（感受性）として同定する。あるいは、閾値以下のマクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルを有するあらゆる試料を、非応答者（耐性）として同定する。試験した試料セットから得た全てのマクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルについて、「応答者」および「非応答者」（仮判定）を、そのスコアを閾値として用いて分類する。このプロセスによって、データセットについての実際の応答データに対する仮判定の比較を介して、各潜在的閾値についてのＴＰＲ（ｙベクトル）およびＦＰＲ（ｘベクトル）の計算が可能になる。次いで、ＴＰＲベクトルおよびＦＰＲベクトルを用いてドットプロットを作成することによって、ＲＯＣ曲線を構築する。ＲＯＣ曲線が、（０，０）点から（１．０，０．５）点まで対角線よりも上にあれば、このことは、マクロファージ試験の結果がランダムよりも良好な試験であることを示す。
【００７５】
ＲＯＣ曲線は、最良の動作点を同定するために用いることができる。最良の動作点は、偽陰性のコストに対して重み付けされた偽陽性のコスト間の最良のバランスをもたらす点である。これらのコストは、等しい必要はない。ＲＯＣ空間における点ｘ，ｙでの分類の平均予想コストは、以下の式によって決定される。
Ｃ＝（１−ｐ）アルファ＊ｘ＋ｐ＊ベータ（１−ｙ）
式中、
アルファ＝偽陽性のコスト、
ベータ＝陽性を見逃す（偽陰性の）コスト、および
ｐ＝陽性のケースの割合。
【００７６】
偽陽性および偽陰性は、アルファおよびベータに異なる値を割り当てることによって異なって重み付けされ得る。例えば、非応答者であるさらなる患者を治療するコストで応答者群にさらなる患者を含めることを決定する場合、アルファに対してさらなる重み付けをしてよい。このケースにおいて、偽陽性および偽陰性のコストは同一である（アルファはベータに等しい）ことが仮定される。したがって、ＲＯＣ空間における点ｘ，ｙでの分類の平均予想コストは、
Ｃ’＝（１−ｐ）＊ｘ＋ｐ＊（１−ｙ）
である。最小のＣ’は、偽陽性および偽陰性（ｘ，ｙ）の全ての対を用いた後に計算することができる。最適なスコア閾値は、Ｃ’での（ｘ，ｙ）のスコアとして計算される。
【００７７】
腫瘍がアキシチニブなどのＶＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性であるかまたは耐性であるかを予測することに加えて、マクロファージスコアまたはＣＤ６８発現レベルは、腫瘍が感受性または耐性である可能性がどの程度高いかの、おおよその、しかし有用な指標を提供する。
【００７８】
試験キット
本開示には、本開示の方法を行うための特定の構成要素を含む診断試験キットが含まれる。診断試験キットは、診断アッセイの性能における利便性、スピード、および再現性を高める。例えば、典型的な、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づく本開示の実施形態において、基本的な診断試験キットには、マクロファージマーカー、例えばＣＤ６８の発現を分析するためのＰＣＲプライマーが含まれる。他の実施形態において、より精密な試験キットは、ＰＣＲプライマーだけではなく、緩衝液、試薬、およびＰＣＲ技術を用いてＣＤ６８発現レベルを測定するための詳細な指示も含む。いくつかの実施形態において、キットには、試験プロトコル、および、ＲＮＡ試料を除く、試験に必要な全ての消耗構成要素が含まれる。
【００７９】
典型的な、ＤＮＡマイクロアレイに基づく本開示の実施形態において、試験キットには、特定の機器と共に用いるように設計されたマイクロ流体カード（アレイ）が含まれる。場合によって、マイクロ流体カードは、マクロファージマーカー遺伝子の発現の測定のために特別に設計された、オーダーメイドの装置である。このような特注のマイクロ流体カードは、市販されている。例えば、ＴａｑＭａｎ  Ａｒｒａｙは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）と共に用いるために設計された、３８４ウェルのマイクロ流体カード（アレイ）である。典型的な流体カードには、ＣＣＲ２、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、および／またはＭＳＲ１の発現を測定するためのプローブのあらゆる組み合わせと、例えばデータの正規化のための必要な対照または標準とが含まれ得る。他のマクロファージマーカータンパク質もまた、本開示を実施するための流体カード上に含まれ得る。
【００８０】
本開示のいくつかの実施形態において、試験キットは、ＩＨＣによって腫瘍のマクロファージ含有量を決定するための材料を含む。ＩＨＣキットは、例えば、ヒトマクロファージマーカーに対する一次抗体、例えばマウス抗ヒトＣＤ６８抗体、およびレポーター酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、二次抗体は、一次抗体を特異的に認識する、コンジュゲートしたポリマーで置き換えられる。
【実施例】
【００８１】
本開示を、以下の実施例によってさらに説明するが、これは、いかなる方法によっても本開示の範囲または内容を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８２】
（実施例１）
スライド対ブロックによる、ＣＤ３およびＣＤ６８陽性細胞のパーセントおよび密度
この研究は、作用物質スニチニブ、ベバシズマブ＋ＩＦＮα、テムシロリムス、またはサイトカインの１つまたは複数を含む１つの事前の全身の第一選択レジメンが失敗した後の、転移性腎細胞癌腫（ｍＲＣＣ）患者における、アキシチニブ対ソラフェニブの、２群の、ランダム化された、非盲検の、多施設の、第３相研究であった。全体で、７２３人のｍＲＣＣ患者がランダム化され、この研究に参加し、そのうち５２人のアキシチニブ治療した患者が、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析について評価可能であり、さらに、５２人の患者の３３人が、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で事前に治療された。
【００８３】
図１において示されるように、ＩＨＣ分析に含められた患者の大部分は、白人（患者の９０．４％）、男性（患者の６９．２％）、ならびに北アメリカ出身（患者の５７．７％）およびヨーロッパ出身（３２．７％）であった。年齢、身長、および体重の全体的な平均（標準偏差）は、それぞれ、５８．３（１１．０）歳、１７３．０（１０．０）ｃｍ、および８４．６（１９．１）ｋｇであった。全患者は、０（患者の５１．９％）または１（患者の４８．１％）のＥＣＯＧパフォーマンスステータスを有していた。全体で、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）の、生存についての予後群因子モデルについて、患者の２３．１％が良好と分類され、患者の３４．６％および４２．３％がそれぞれ中間および不良と分類された。さらに、ＭＳＫＣＣリスク群を、高ラクテートデヒドロゲナーゼ（＞１．５×正常の上限）、低血清ヘモグロビン（正常の下限未満）、高補正血清カルシウム（＞１０ｍｇ／ｄＬ）、および事前の腎臓摘出の不存在という４つのリスク因子を用いて導いた。
【００８４】
５２人の患者全員が、ＣＤ３およびＣＤ６８の両方について評価可能であった。５２人のＣＤ３およびＣＤ６８が評価可能な患者のうち、分析のために、２６人はホルマリン固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）腫瘍ブロックを提供し、２６人はスライドを提供した。Ｍｏｓａｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、ヒト正常物およびヒト癌を代表するＦＦＰＥ材料が提供された。標本は、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎによって規定された「Ｅｘｅｍｐｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」を規定するガイドラインの下で、残存の、非特定化された、または匿名化されたヒト試料の、インビトロ分析への使用を可能にする、ＩＲＢによって審査されたプロトコル（ＭＯＳ００１）の下で生産された。ＣＤ６８マウスモノクローナルＫＰ１抗体（カタログ番号Ｍ０８１４、ロット番号４６４０６、使用期限：２０１１年９月）をＤａｋｏ（カーピンテリア、カリフォルニア州、米国）から購入し、添付の文書に従って２〜８℃で保存した。マウスＩｇＧアイソタイプ対照抗体（ロット番号３７２１１、使用期限：２０１０年７月）をＤａｋｏから購入し、添付の文書に従って２〜８℃で保存した。ＩＨＣを、Ｍｏｓａｉｃ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＳＯＰに従って行った。ＣＤ６８  ＩＨＣアッセイを設計し、「ｈｏｍｅｂｒｅｗ」クラスＩ試験検証のためのＣＬＩＡガイドラインに適合することを確認した。
【００８５】
染色は病理学者によって評価され、反応性の評価は、ＣＤ６８染色の細胞局在化、染色強度、細胞内局在化、および目的の組織タイプの主な構成要素における染色細胞のパーセンテージの組み合わせを伴う。顕微鏡写真（２０倍倍率）を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ５０ｉ顕微鏡に付属した、Ｓｐｏｔ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＱＥ  Ｍｏｄｅｌ  ４．２冷却電荷結合素子カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、スターリングハイツ、ミシガン州、米国）で得た。
【００８６】
ＣＤ３およびＣＤ６８陽性細胞の平均パーセンテージは、スライドにおいてブロックよりもわずかに低く、ＣＤ３では１３．６１％対１７．９５％であり、ＣＤ６８では５．８３％対８．２１％であった。同様に、ブロックよりもわずかに低い平均細胞密度が、スライドにおいて観察され、ＣＤ３では４８９．１５細胞／ｍｍ２対５９０．５０細胞／ｍｍ２であり、ＣＤ６８では０．０８細胞／ｍｍ２対０．１３細胞／ｍｍ２であった（図２）。
【００８７】
（実施例２）
より高いＣＤ６８発現レベルは、良好なＯＲＲおよびＰＦＳと正に相関するが、ＯＳとはしない
ＩＨＣバイオマーカー分析では、少なくとも１用量の研究治療を受けた全患者を含む、バイオマーカー分析セットを用いた。ＰＦＳ、ＯＳ、および客観的奏効率（ＯＲＲ）という有効性評価項目を分析した。要約統計量を、応答カテゴリー（各マーカーについて、完全奏効［ＣＲ］＋部分奏効［ＰＲ］対、安定状態［ＳＤ］＋増悪［ＰＤ］））によって、陽性細胞のパーセントおよび密度について提供した。ウィルコクソンの順位和検定を行って、応答カテゴリー間の差について試験した。フィッシャーの正確確率検定を用いて、中央値をカットオフ点として用いて、応答カテゴリーとバイオマーカー層との間の関連について試験した。ＯＳおよびＰＦＳの分布を、カプラン・マイヤー法を用いて、カットオフ点としてのバイオマーカーの中央値によって、バイオマーカー層の間で比較し、ｐ値は、いずれの層においても、Ｎ＜１０である場合には提示されなかった。推定ハザード比（ＨＲ）およびその両側の９５％信頼区間（ＣＩ）、ならびに中央値イベント時刻およびその両側の９５％ＣＩが報告された。腫瘍容積における最良の応答パーセントの変化を、ウィルコクソンの順位和検定を用いて、カットオフ点としての中央値を用いて、バイオマーカー層の間で比較した。
【００８８】
バイオマーカー層の間の、ＯＲＲ、ＰＦＳ、およびＯＳの分析における有意な試験結果（ｐ＜０．０５）について、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成して、患者の選択マーカーとしての有用性の潜在能力について評価した。ＲＯＣ分析を、患者の客観的２値応答（ＣＲ＋ＰＲ対ＳＤ＋ＰＤ）の予測における連続的診断マーカーとしてのベースラインＣＤ６８値に基づいて行った。時間依存的な臨床転帰であるＰＦＳおよびＯＳについて、ＲＯＣ（ｔ）と呼ばれる（ｔは目的の時点を示す）時間依存的なＲＯＣが、カプラン・マイヤーｅｓｔｉｍａｔｏｒ２０を用いる生存転帰の予測において、ベースラインＣＤ６８値を分析するために適用された。臨床転帰を予測するためのＣＤ６８値の最適なカットオフ点を、感度および特異度の値が共に１である点からの距離が最小であるＲＯＣ曲線上の点から得た。ＡＵＣを、台形公式を用いて計算した。
【００８９】
より長いＰＦＳおよびより高いＯＲＲに関連する、より高いＣＤ６８発現が観察されたが、ＣＤ６８の発現と患者におけるＯＳとの間に相関は観察されなかった。前治療にかかわらず、ＣＤ６８中央値以上（カットオフ＝５．２１％の陽性細胞または０．０８細胞／ｍｍ２）の患者におけるＰＦＳ中央値は、両カットオフ点について１２．０か月であり、それに対し、全患者を前治療にかかわらず評価した場合、バイオマーカー中央値未満の患者ではそれぞれ３．７か月および３．８か月であった（ＨＲ＝０．４２、ログランクｐ値≦０．０１）（図３）。しかし、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者では、ＰＦＳとの類似であるが統計的に有意ではない傾向が観察された（図４）。前治療にかかわらない場合、またはＳｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者についての場合のいずれでも、ＣＤ３のレベルとＰＦＳとの間に統計的に有意な関連はなかった（図５および６）。
【００９０】
さらに、前治療にかかわらず、ＣＤ６８中央値以上（カットオフ＝５．２１％の陽性細胞または０．０８細胞／ｍｍ２）の患者におけるＯＳ中央値は、２０．０か月および２２．６か月であり、それに対し、全患者を前治療にかかわらず評価した場合、バイオマーカー中央値未満の患者ではそれぞれ２１．８か月または１７．８か月であった（全てのケースにおいてＨＲ＞０．６であり、統計的に有意ではない）（図７）。Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者では、ＯＳとの統計的に有意な関連は観察されなかった。治療にかかわらず、またはＳｕｔｅｎｔ（登録商標）で前治療された患者において、ＣＤ３のレベルとＯＳとの間に統計的に有意な関連はなかった（図８）。０．５５９というＡＵＣ値は、ＣＤ６８レベルの予測値において信頼性が低いことを示すものの、ＲＯＣ分析を用いて、良好なＯＳが、より高いＣＤ６８細胞数を有する患者で観察された（図９）。
【００９１】
最後に、前治療にかかわらず、陽性細胞のパーセンテージ（ｐ値＝０．００５９）または細胞密度（ｐ値＝０．００７１）によって測定されたＣＤ６８レベルは、非応答者（ＳＤ＋ＰＤ）に対して応答者（ＣＲ＋ＰＲ）において２倍高かった（図１０）。Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）で事前に治療された患者では、陽性細胞のパーセンテージ（ｐ値＝０．４０７）または細胞密度（ｐ値＝０．０７６２）によって測定されたＣＤ６８レベルは、非応答者に対して応答者において２倍高かった（図１１）。バイオマーカーが評価可能な患者についてのＯＲＲ分析において、ＣＤ６８の陽性細胞のパーセントおよび密度がより高い患者は、腫瘍の客観的応答が見られる可能性がより高い傾向にある。ＲＯＣ分析は、ＣＤ６８の陽性細胞のパーセンテージおよび密度でそれぞれ０．８１８および０．７９５の予測正確度を示す。０．７９１および０．７８４というＡＵＣは、ＣＤ６８バイオマーカーを用いるＯＲＲについての高い全体的な予測正確度を示す。ＯＲＲを予測するための最適なカットオフ点は、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび細胞密度でそれぞれ９．４２％および０．１３細胞／ｍｍ２であった。
【００９２】
同様の結果が、事前のＳｕｔｅｎｔ（登録商標）治療を受けた、バイオマーカーが評価可能な患者についてのＯＲＲ分析において見られた。ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび密度がより高い患者は、腫瘍の客観的応答が見られる可能性がより高い傾向にある。ＲＯＣ分析は、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび密度でそれぞれ０．７７７および０．８５２の予測正確度を示す。０．８０９および０．７６４というＡＵＣは、ＣＤ６８バイオマーカーを用いるＯＲＲについての高い全体的な診断正確度を示す。ＯＲＲを予測するための最適なカットオフ点は、ＣＤ６８陽性細胞のパーセンテージおよび密度でそれぞれ５．２０％および０．１６細胞／ｍｍ２である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【外国語明細書】
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