(57)【要約】【課題】本発明は、ポリアミド結合した親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）用の固定相と、当業者にグリカンとして既知の極性基で修飾された巨大生体分子のキャラクタリゼーションにおいて使用する新規なＨＩＬＩＣ法とに関する。【解決手段】本発明は、特に、巨大生体分子、たとえば高い率で大きな孔（幅広の孔）を有する材料を効率的に分離するように設計された、新規なポリアミド結合材料を提供する。さらに、本発明は、有利には、孔の拡散が制限されていることと長い粒子内／粒子間拡散距離に起因する、タンパク質サンプルのオンカラム凝集、クロマトグラフィー検出のグリカン部分の低感受性およびピークの低分解能などの以前から未解決の問題を解消することによって、タンパク質およびペプチドのグリコフォームを効率的に分離するために、本明細書に記載の固定相材料と組み合わせて使用することができる新規なＨＩＬＩＣ法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含み、平均孔径が約２００Å以上である、多孔質材料。
【請求項２】
平均孔径が約２５０Å以上である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項３】
平均孔径が約３００Å以上である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項４】
平均孔径が約４５０Å以上である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項５】
前記コポリマーを含む多孔質粒子を含む、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項６】
前記コポリマーを含む多孔質モノリスを含む、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項７】
前記親水性モノマーが、３−メタクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルクロロシラン３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、スチリルエチルトリクロロシラン、スチリルエチルメチルジクロロシラン、スチリルエチルジメチルクロロシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、スチリルエチルメチルジメトキシシラン、スチリルエチルジメチルメトキシシラン、スチリルエチルトリエトキシシラン、スチリルエチルメチルジエトキシシラン、スチリルエチルジメチルエトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、Ｎ−（３−アクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、Ｏ−（メタクリロキシエチル）−Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）ウレタン、Ｎ−（３−メタクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、３−（Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン塩酸塩、
【化１】
2015121539.tif 000015
である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項８】
前記ポリアミド結合相が、アクリルアミド、ジビニルベンゼン、スチレン、エチレングリコールジメタクリレート、１−ビニル−２−ピロリジノンおよびｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ブチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルアクリレート、２−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ビス（２−シアノエチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリス［（２−アクリロイルオキシ）エチル］イソシアヌレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、イタコン酸、メタクリル酸、トリメチルシリルメタクリレート、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）水酸化アンモニウム内塩、
【化２】
2015121539.tif 000016
に由来する、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項９】
第２のポリアミド結合相を含む、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項１０】
第２のポリアミド結合相が、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ブチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドまたは１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジンに由来する、請求項９に記載の多孔質材料。
【請求項１１】
第１のポリアミド結合相が、全ポリアミド結合相の３５から９９モル％を占める、請求項８に記載の多孔質材料。
【請求項１２】
第２のポリアミド結合相が、全ポリアミド結合相の６５から１モル％を占める、請求項８に記載の多孔質材料。
【請求項１３】
約１００Åから約１０００Åの中央孔径を有する、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項１４】
約３００Åから約８００Åの中央孔径を有する、請求項１２に記載の多孔質材料。
【請求項１５】
約３００Åから約５５０Åの中央孔径を有する、請求項１３に記載の多孔質材料。
【請求項１６】
約３００Åの中央孔径を有する、請求項１４に記載の多孔質材料。
【請求項１７】
窒素含有率が、約０．５％Ｎから約２０％Ｎである、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項１８】
窒素含有率が、約１％Ｎから約１０％Ｎである、請求項１７に記載の多孔質材料。
【請求項１９】
窒素含有率が、約２％Ｎから約１０％Ｎである、請求項１８に記載の多孔質材料。
【請求項２０】
窒素含有率が、約４％Ｎから約１０％Ｎである、請求項１９に記載の多孔質材料。
【請求項２１】
混合物を、請求項１に記載の多孔質材料を含むクロマトグラフィー材料と接触させ、これにより混合物から成分を除去または単離することを含む、混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２２】
多孔質材料が、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルカプロラクタム）コポリマーである、請求項２１に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２３】
成分が生物学的材料である、請求項２２に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２４】
生物学的材料が、インタクトなタンパク質、変性タンパク質、修飾タンパク質、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項２３に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２５】
生物学的材料が、封入体、生体液、生物組織、生体マトリックス、埋め込み組織サンプルまたは細胞培養上清である、請求項２３に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２６】
混合物中の成分のレベルを決定する方法であって、
ａ）成分を多孔質材料に収着させる条件下で、混合物を、請求項１に記載の多孔質材料を含むクロマトグラフィー材料と接触させること、
ｂ）収着した成分を有するクロマトグラフィー材料を、多孔質材料から成分を脱着させる条件下で、溶媒で洗浄すること、および
ｃ）脱着した成分のレベルを決定すること
を含む、方法。
【請求項２７】
多孔質材料が、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルカプロラクタム）コポリマーである、請求項２６に記載の混合物中の成分のレベルを決定する方法。
【請求項２８】
成分が生物学的材料である、請求項２７に記載の混合物中の成分のレベルを決定する方法。
【請求項２９】
生物学的材料が、インタクトなタンパク質、変性タンパク質、修飾タンパク質、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項２８に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項３０】
生物学的材料が、封入体、生体液、生物組織、生体マトリックス、埋め込み組織サンプルまたは細胞培養上清である、請求項２８に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の多孔質材料を含む分離装置。
【請求項３２】
前記装置が、クロマトグラフィーカラム、カートリッジ、薄層クロマトグラフィープレート、濾過膜、サンプルクリーンアップ装置、固相有機合成担体およびマイクロタイタープレートからなる群から選択される、請求項３１に記載の分離装置。
【請求項３３】
請求項１に記載の多孔質材料を含む親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジ。
【請求項３４】
多孔質材料を含有する終端部が開口のカラムを含む、請求項３３に記載の親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジ。
【請求項３５】
グリコシル化タンパク性サンプルを分析する方法であって、前記サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させるステップを含み、前記固定相材料が、少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含む、方法。
【請求項３６】
前記グリコシル化タンパク性サンプルが、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
固定相材料が、完全に多孔質であるまたは表面が多孔質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記孔の平均直径が約２００Å以上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記孔の平均直径が約２５０Å以上である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記孔の平均直径が約３００Å以上である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記孔の平均直径が約４５０Å以上である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記孔の平均直径が約１から約５０Åである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記孔の平均直径が約５から約４０Åである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記孔の平均直径が約１０から約３０Åである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
固定相材料が、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
脂肪族架橋シランの脂肪族基がエチレンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
固定相材料が、１種以上の粒子形態である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
粒子の平均直径が約０．１μｍから約５００μｍである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
粒子の平均直径が約１μｍから約１００μｍである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
粒子の平均直径が約１μｍから約１０μｍである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
水性サンプルが、クロマトグラフィーカラム体積の約１／１００未満の注入容量を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルをサンプル希釈液中で調製するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
サンプル希釈液が変性剤を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
変性剤が塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせによってサンプルを調製するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
クロマトグラフィーの移動相溶離液が高有機溶離液である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
クロマトグラフィーの移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
イオン対形成剤を移動相溶離液に添加するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５９】
イオン対形成剤が、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸およびブタン酸からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が約３，０００ｐｓｉ以上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項６１】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が約４，０００ｐｓｉ以上である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が約５，０００ｐｓｉ以上である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が約６，０００ｐｓｉ以上である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が約７，０００ｐｓｉ以上である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
グリコシル化タンパク性サンプルを同定するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６６】
グリコシル化タンパク性サンプルを同定するステップが、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
グリコシル化タンパク性サンプルを同定するステップが、質量分析ピークとコンピューターデータベース中の既知の化合物との比較によってさらに行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
糖ペプチドをキャラクタライズするために親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）糖ペプチドを含有するサンプルをサンプル希釈液中で調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびに前記カラム中の固定相材料を準備するステップであって、前記固定相材料が少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含むステップ、
ｃ）カラム入口圧力約３，０００ｐｓｉ以上でサンプルを前記固定相材料にロードし、移動相溶離液とともにサンプルを前記カラムに通して流すステップ、
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ、
ｅ）分画を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項６９】
前記糖ペプチドが、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
固定相材料が、完全に多孔質または表面が多孔質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記孔の平均直径が約２００Å以上である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記孔の平均直径が約２５０Å以上である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記孔の平均直径が約３００Å以上である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記孔の平均直径が約１から約５０Åである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記孔の平均直径が約５から約４０Åである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記孔の平均直径が約１０から約３０Åである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
固定相材料が、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
脂肪族架橋シランの脂肪族基がエチレンである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
固定相材料が、１種以上の粒子形態である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
粒子の平均直径が、約０．１μｍから約５００μｍである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
粒子の平均直径が、約１μｍから約１００μｍである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
粒子の平均直径が、約１μｍから約１０μｍである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
水性サンプルが、カラム体積の約１／１００未満の注入容量を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
サンプル希釈液が変性剤を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
変性剤が塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
サンプルを調製するステップが、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８７】
移動相溶離液が、高有機溶離液である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８８】
移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
イオン対形成剤を移動相溶離液に添加するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９０】
イオン対形成剤が、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸およびブタン酸からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
カラム入口圧力が、約４，０００ｐｓｉ以上である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９２】
カラム入口圧力が、約５，０００ｐｓｉ以上である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
カラム入口圧力が、約６，０００ｐｓｉ以上である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
カラム入口圧力が、約７，０００ｐｓｉ以上である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
糖ペプチドを同定するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９６】
糖ペプチドを同定するステップが、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
糖ペプチドを同定するステップが、質量分析ピークとコンピューターデータベース中の既知の化合物との比較によってさらに行われる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
グリコシル化モノクローナル抗体をキャラクタライズするために親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）グリコシル化モノクローナル抗体を含有するサンプルを調製するステップであって、グリコシル化モノクローナル抗体が、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせによって調製されるステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびに固定相材料を準備するステップであって、前記固定相材料が、少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含み、孔のサイズが約３００Å以上または約１Åから約５０Åの間の直径であるステップ、
ｃ）約３，０００ｐｓｉ以上のカラム入口圧力で、サンプルを前記固定相材料にロードし、サンプルを移動層溶離液とともに前記カラムに通して流し、ここでイオン対形成剤をサンプルおよび／または移動相溶離液に添加するステップであって、移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択され、ならびに前記サンプルの水性注入容量がカラム体積の約１／１００未満であるステップ、
ｄ）１つ以上のサンプル分画に分離するステップ、
ｅ）分画を、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法もしくはこれらの組み合わせによってまたは質量分析ピークとコンピューターデータベース中の既知の化合物との比較によって同定するステップ
を含む、方法。
【請求項９９】
グリコシル化タンパク質またはペプチドを分離するために親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）グリコシル化タンパク質またはペプチドを含有するサンプルを調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するＨＩＬＩＣカラムならびに固定相材料を準備するステップ、
ｃ）カラム入口圧力約３，０００ｐｓｉ以上でサンプルを前記固定相材料にロードし、移動相溶離液とともにサンプルを前記カラムに通して流すステップ、ならびに
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
親水性相互作用クロマトグラフィー（または親水性相互作用液体クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ）は、イオンクロマトグラフィーおよび逆相液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーの利用と部分的に共通する順相液体クロマトグラフィーの変形形態である。ＨＩＬＩＣの固定相は、極性分析物に強力な保持率をもたらす極性の親水性相である。ＨＩＬＩＣの移動相は、逆相タイプの高有機溶離液、たとえば水とアセトニトリルとの混合物である。ＨＩＬＩＣにおける分析物を分離する機構は、分配、イオン交換および逆相クロマトグラフィーの組み合わせであってもよい。
【０００２】
本発明より以前は、ＨＩＬＩＣは、糖タンパク質などのタンパク性巨大生体分子の分離および分析の使用に限定されると見なされていた。Ｔ．Ｔｅｔａｚら、Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．、Ａ１２１８、５８９２−５８９６頁（２０１１年）の著者は、ＨＩＬＩＣを使ってインタクトな可溶性タンパク質の分析を探究したが、結果は可もなく不可もなく、クロマトグラムは比較的低分解能の分離を示した。同様に、第３３回Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ国際シンポジウム出展（２０１３年７月１７−１９日、米国ＭＡ州ボストン）での「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＨＩＬＩＣ」の著者は、ＨＩＬＩＣによる糖タンパク質分離が極めて興味深いものであるが、現時点では重要な難題をもたらすことを表明した。彼らの発表した研究は、小型（＜２０ｋＤａ）の糖タンパク質の分離に限られていた。
【０００３】
その上、Ｇｕｉｌｌａｒｍｅ（「Ｗｈａｔ  Ｙｏｕ  Ｎｅｅｄ  ｔｏ  Ｋｎｏｗ  Ａｂｏｕｔ  ＨＩＬＩＣ」、２０１３年７月１日、ＬＣＧＣ  ＮＯＲＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡ  ３１巻、７版、５６０−５６３頁）は、ＨＩＬＩＣを使用した巨大タンパク質（２０ｋＤａ超）のピーク形状が、本発明より以前に、最適化された幅広の孔ＨＩＬＩＣ相が利用不可なため、許容され得ないことに留意している。
【０００４】
巨大生体分子（たとえば、大きな平均孔径）の高効率／高分解能分離と、当業者にグリカンとして知られる極性基で修飾したタンパク性生体分子を含有するものを含めた該サンプルの分析のための改善されたクロマトグラフィー手法とのために設計されたＨＩＬＩＣ材料のニーズは依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔ．Ｔｅｔａｚら、Ｊ．Ｃｈｏｍａｔｏｇｒ．、Ａ１２１８、５８９２−５８９６頁（２０１１年）
【非特許文献２】Ｇｕｉｌｌａｒｍｅ、「Ｗｈａｔ  Ｙｏｕ  Ｎｅｅｄ  ｔｏ  Ｋｎｏｗ  Ａｂｏｕｔ  ＨＩＬＩＣ」、２０１３年７月１日、ＬＣＧＣ  ＮＯＲＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡ  ３１巻、７版、５６０−５６３頁
【発明の概要】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ポリアミド結合ＨＩＬＩＣ固定相を、当業者にグリカンとして既知の極性基で修飾される巨大生体分子のキャラクタリゼーションにおいて使用する新規なＨＩＬＩＣ関連方法と共に提供する。新規な固定相材料は、クロマトグラフィープロセス、たとえば親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて有用であり、多数の利点をもたらす。このような利点には、巨大生体分子の高分解能、グリカン／グリコフォームの望ましい残磁性および選択性ならびに妨害分析物を保持しないことがある。本発明は、巨大生体分子、たとえば大きな孔（すなわち幅広の孔）の比率が高い材料を効率的に分離するように設計した新規なポリアミド結合材料を有利に提供する。最も重要なことに、本発明は、本明細書に記載の方法と組み合わせて使用して、タンパク質およびペプチドのグリコフォームをＨＩＬＩＣによって効率的に分離できる新規な材料を有利に提供する。
【０００７】
一態様において、多孔質材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含み、平均孔径は、約２００Å以上、約２５０Å以上、約３００Å以上または約４５０Å以上である。
【０００８】
ある態様において、多孔質材料は、前記コポリマーを含む多孔質粒子を含む。別のある態様において、多孔質材料は、前記コポリマーを含む多孔質モノリスを含む。
【０００９】
別の態様において、親水性モノマーは、３−メタクリルオキシプロピルトリクロロシラン、３−メタクリルオキシプロピルメチルジクロロシラン、３−メタクリルオキシプロピルジメチルクロロシラン、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−アクリルオキシプロピルトリクロロシラン、３−アクリルオキシプロピルメチルジクロロシラン、３−アクリルオキシプロピルジメチルクロロシラン３−アクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリルオキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリルオキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−アクリルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリルオキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−アクリルオキシプロピルジメチルエトキシシラン、スチリルエチルトリクロロシラン、スチリルエチルメチルジクロロシラン、スチリルエチルジメチルクロロシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、スチリルエチルメチルジメトキシシラン、スチリルエチルジメチルメトキシシラン、スチリルエチルトリエトキシシラン、スチリルエチルメチルジエトキシシラン、スチリルエチルジメチルエトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、Ｎ−（３−アクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、（３−アクリルオキシプロピル）トリメトキシシラン、Ｏ−（メタクリルオキシエチル）−Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）ウレタン、Ｎ−（３−メタクリルオキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリルオキシメチルトリエトキシシラン、メタクリルオキシメチルトリメトキシシラン、メタクリルオキシプロピメチルジエトキシシラン、メタクリルオキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、３−（Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン塩酸塩、
【００１０】
【化１】
2015121539.tif 000002
である。
【００１１】
さらに別の態様において、ポリアミド結合相は、アクリルアミド、ジビニルベンゼン、スチレン、エチレングリコールジメタクリレート、１−ビニル−２−ピロリジノンおよびｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ブチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルアクリレート、２−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ビス（２−シアノエチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリス［（２−アクリロイルオキシ）エチル］イソシアヌレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、イタコン酸、メタクリル酸、トリメチルシリルメタクリレート、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）水酸化アンモニウム内塩、
【００１２】
【化２】
2015121539.tif 000003
に由来する。
【００１３】
本発明のある態様において、多孔質材料は、第２のポリアミド結合相を含む。特定の態様において、第２のポリアミド結合相は、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ブチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドまたは１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジンに由来する。
【００１４】
本発明の他の態様において、第１のポリアミド結合相は、全ポリアミド結合相の約３５から約９９モル％を占め、第２のポリアミド結合相は、全ポリアミド結合相の約６５から約１モル％を占める。
【００１５】
ある態様において、多孔質材料は、約１００Åから約１０００Å、約３００Åから約８００Åまたは約３００Åから約５５０Åの中央孔径を有する。特定の態様において、多孔質材料は、約３００Åの中央孔径を有する。
【００１６】
別のある態様において、多孔質材料の窒素含有率は、約０．５％Ｎから約２０％Ｎ、約１％Ｎから約１０％Ｎ、約２％Ｎから約１０％Ｎまたは約４％Ｎから約１０％Ｎである。
【００１７】
一実施形態によれば、本発明は、混合物から成分を除去または単離する方法であって、混合物を、多孔質材料を含むクロマトグラフィー材料と接触させて、それにより混合物から成分を除去または単離することを含む前記方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法によるある実施形態において、多孔質材料は、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルカプロラクタム）コポリマーである。本発明の方法による別のある態様において、成分は生物学的材料である。さらに別のある態様において、生物学的材料は、インタクトなタンパク質、変性タンパク質、修飾タンパク質、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドである。特定の態様において、生物学的材料は、封入体、生体液、生物組織、生体マトリックス、埋め込み組織サンプルまたは細胞培養上清である。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、混合物中の成分のレベルを決定する方法であって、
ａ）成分を多孔質材料に収着させる条件下で、混合物を、本発明の多孔質材料を含むクロマトグラフィー材料と接触させること、
ｂ）多孔質材料から成分を脱着させる条件下で、収着した成分を有するクロマトグラフィー材料を溶媒で洗浄すること、
ｃ）脱着した成分のレベルを決定すること
を含む前記方法を提供する。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、分離装置は、本発明の多孔質材料を含む。ある実施形態において、分離装置は、クロマトグラフィーカラム、カートリッジ、薄層クロマトグラフィープレート、濾過膜、サンプルクリーンアップ装置、固相有機合成担体およびマイクロタイタープレートからなる群から選択される。
【００２１】
関連の実施形態において、本発明は、多孔質材料を含む親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジを提供する。ある実施形態において、カートリッジは、多孔質材料を含有する、終端部が開口したカラムを備える。
【００２２】
本発明の一態様において、グリコシル化タンパク性サンプルを分析する方法は、前記サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させるステップを含み、前記固定相材料は、複数の孔を含む。特定の実施形態において、固定相材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含む。
【００２３】
ある態様において、グリコシル化タンパク性サンプルは、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する。
【００２４】
別のある態様において、固定相は、完全に多孔質であるまたは表面が多孔質である。関連の態様において、前記孔の平均直径は、約２００Å以上、約２５０Å以上、約３００Å以上または約４５０Å以上である。別の関連の態様において、前記孔の平均直径は、約１から約５０Å、約５から約４０Åまたは約１０から約３０Åである。
【００２５】
本発明の別の態様において、固定相材料は、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアを含む。関連の態様において、脂肪族架橋シランの脂肪族基はエチレンである。
【００２６】
ある態様において、固定相材料は、１種以上の粒子形態である。特定の態様において、粒子の平均直径は、約０．１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約１００μｍまたは約１μｍから約１０μｍである。別のある態様において、固定相材料は、多孔質モノリスをさらに含む。
【００２７】
本発明によれば、本方法は、前記サンプルをサンプル希釈液中で調製するステップを含む。ある態様において、水性サンプル希釈液の注入容量は、クロマトグラフィーカラム体積の約１／１００未満である。別のある態様において、サンプル希釈液は、変性剤を含む。特定の態様において、変性剤は、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である。
【００２８】
さらに別の態様において、サンプルを調製するステップは、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂およびこれらの組み合わせをさらに含む。
【００２９】
本発明の方法によるある態様において、クロマトグラフィーの移動相は高有機溶離液である。関連の態様において、クロマトグラフィーの移動相は、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上である。
【００３０】
本発明のある態様において、本方法は、イオン対形成剤（ｉｏｎ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を移動相溶離液に添加するステップを含む。特定の態様において、イオン対形成剤は、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸およびブタン酸からなる群から選択される。
【００３１】
本方法の別のある態様において、サンプルを固定相と接触させるときのカラム圧力は、約３，０００ｐｓｉ以上、約４，０００ｐｓｉ以上、約５，０００ｐｓｉ以上、約６，０００ｐｓｉ以上または約７，０００ｐｓｉ以上である。
【００３２】
本発明によれば、本方法は、糖ペプチドを同定するステップを含む。特定の態様において、同定ステップは、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる。別の特定の態様において、ペプチドのグリコシル化の同定は、質量分析ピークを、コンピューターデータベース中の既知の化合物と比較することによってさらに行われる。
【００３３】
本発明の別の態様において、糖ペプチドをキャラクタライズする親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法は、
ａ）糖ペプチドを含有するサンプルをサンプル希釈液中で調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびに該カラム中の固定相材料を準備するステップであって、前記固定相材料が複数の孔を含むステップ、
ｃ）カラム入口圧力約３，０００ｐｓｉ以上でサンプルを固定相材料にロードし、移動相溶離液とともに該サンプルを前記カラムに通して流すステップ、
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ、
ｅ）分画を同定するステップ
を含む。
【００３４】
特定の実施形態において、固定相材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含む。
【００３５】
ある態様において、糖ペプチドは、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する。
【００３６】
別のある態様において、固体相材料は、完全に多孔質であるまたは表面が多孔質である。関連の態様において、前記孔の平均直径は、約２００Å以上、約２５０Å以上、約３００Å以上または約４５０Å以上である。別の関連の態様において、前記孔の平均直径は、約１から約５０Å、約５から約４０Åまたは約１０から約３０Åである。
【００３７】
本発明の別の態様において、固定相材料は、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアを含む。関連の態様において、脂肪族架橋シランの脂肪族基はエチレンである。
【００３８】
ある態様において、固定相材料は、１種以上の粒子形態である。特定の態様において、粒子の平均直径は、約０．１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約１００μｍまたは約１μｍから約１０μｍである。別のある態様において、固定相材料は、多孔質モノリスをさらに含む。
【００３９】
ある態様において、水性サンプル希釈液の注入容量は、カラム体積の約１／１００未満である。別のある態様において、サンプル希釈液は、変性剤を含む。特定の態様において、変性剤は、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である。
【００４０】
さらに別の態様において、サンプルを調製するステップは、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせである。
【００４１】
本発明の方法によるある態様において、クロマトグラフィーの移動相は高有機溶離液である。関連の態様において、クロマトグラフィーの移動相は、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上である。
【００４２】
本発明のある態様において、本方法は、イオン対形成剤を移動相溶離液に添加するステップを含む。特定の態様において、イオン対形成剤は、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸およびブタン酸からなる群から選択される。
【００４３】
ある実施形態において、移動相は、ｐＨ、塩濃度、温度または他のパラメータにおける勾配が確立されるように移動相の勾配を含めることができる。
【００４４】
本方法の別のある態様において、サンプルを固定相材料にロードするときのカラム入口圧力は、約４，０００ｐｓｉ以上、約５，０００ｐｓｉ以上、約６，０００ｐｓｉ以上または約７，０００ｐｓｉ以上である。
【００４５】
本発明によれば、本方法は、糖ペプチドを同定するステップをさらに含む。特定の態様において、同定ステップは、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる。別の特定の態様において、ペプチドのグリコシル化の同定は、質量分析ピークを、コンピューターデータベース中の既知の化合物と比較することによってさらに行われる。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明は、グリコシル化モノクローナル抗体をキャラクタライズする親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）グリコシル化モノクローナル抗体を含有するサンプルを調製するステップであって、糖ペプチドが、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせによって調製されるステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびに固定相材料を準備するステップであって、前記固定相材料が、サイズが約３００Å以上または約１Åから約５０Åの間の直径を有する複数の孔を含むステップ、
ｃ）約３，０００ｐｓｉ以上のカラム入口圧力で、サンプルを前記固定相材料にロードし、サンプルを移動相溶離液とともに前記チャンバーに通して流し、イオン対形成剤をサンプルおよび／または溶離液に添加するステップであって、移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択され、水溶液の注入容量が、カラム体積の約１／１００未満であるステップ、
ｄ）１つ以上のサンプル分画を分離するステップ、
ｅ）紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法もしくはこれらの組み合わせによってまたは質量分析ピークをコンピューターデータベース中の既知の化合物と比較することによって分画を同定するステップ
を含む前記方法を提供する。
【００４７】
特定の実施形態において、固定相材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含む。
【００４８】
別の特定の実施形態において、本発明は、グリコシル化タンパク質またはペプチドを分離する親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）グリコシル化タンパク質またはペプチドを含有するサンプルを調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するＨＩＬＩＣカラムならびに固定相材料を準備するステップ、
ｃ）約３，０００ｐｓｉ以上のカラム入口圧力で、サンプルを前記固定相材料にロードし、サンプルを移動相溶離液とともに前記カラムに通して流すステップ、
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ
を含む前記方法を提供する。
【００４９】
本発明の上記および他の特徴について、以下に添付の図面で例証される、そのある例示的実施形態を参照して、ここで詳細に説明していくが、これは例証のみを目的とし、したがって本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】種々のタイプの固定相：１３０Åの孔を有する５μｍの非結合固定相、１３０Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相および３００Åの孔（幅広の孔相）を有する親水性ポリアミド結合固定相で行われたＲＮａｓｅＢ分離を比較したクロマトグラム一式である。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  ２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ  注入容量：０．５μＬ、１μｇタンパク質、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＣＡＮ、２０分間で２０％から８０％Ｈ２Ｏ、カラム温度：８０℃）
【図２】１３０Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相と３００Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相（幅広の孔の相）との間の性能差をより良好に実証する、浅い勾配で得られるＲＮａｓｅＢ分離に対応するクロマトグラム一式である。ピーク同定：１−脱グリコシル化、２−Ｍａｎ５、３−Ｍａｎ６、４−Ｍａｎ７、５−Ｍａｎ８、６−Ｍａｎ９。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、１３０／３００Å  ２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、流速：０．１−０．４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃、注入容量：０．５μＬ、１μｇタンパク質、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＣＡＮ、１分間２０％から３４％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間３４％から４１％Ｈ２Ｏ）
【図３】種々のタイプのイオン対形成剤：０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）、５０ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で行われたＲＮａｓｅＢ分離を比較したクロマトグラム一式である。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２８０、２Ｈｚ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å  ２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入容量：０．５μＬ、１μｇタンパク質、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：ＣＡＮ、２０分間２０％から８０％Ｈ２Ｏ  カラム温度：８０℃）
【図４Ａ】インタクトなトラスツズマブのグリコフォームの分離に与える圧力の効果を実証するクロマトグラムおよび質量スペクトルである。図４Ａは、３２００ｐｓｉのカラム圧力で凝集体形成を示すＭＳデータ（室温、１８−２２分）を含めた、トラスツズマブグリコフォームのＭＳベースの同定を示す。（３μｇタンパク質、温度：３０℃、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１分間で２０％−３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％−３７％Ｈ２Ｏ、ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑｔｏｆ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入容量：１．５μＬ）
【図４Ｂ】インタクトなトラスツズマブのグリコフォームの分離に与える圧力の効果を実証するクロマトグラムおよび質量スペクトルである。図４Ｂは、ポストカラム流量制限を利用してカラム圧力を３２００ｐｓｉから４５００ｐｓｉまでおよび７３００ｐｓｉまで高めたクロマトグラム一式を示す。最大カラム圧力は、図４Ａに規定のサンプル凝集を最小限にする上で効果的であることを証明した。（３μｇタンパク質、温度：３０℃、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１分間で２０％−３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％−３７％Ｈ２Ｏ、ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑｔｏｆ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入容量：１．５μＬ）
【図５】種々の水性サンプルローディング容量（Ａ）およびサンプルローディング量（Ｂ）のＲＮａｓｅＢ分離の比較図を示すクロマトグラムである。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ  注入容量：０．５−１０μＬ、１μｇＲＮａｓｅＢ、温度：３０℃、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１分間で２０％から３４％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３４％から４１％）
【図６】３０℃から８０℃を範囲とする種々のカラム温度でのＲＮａｓｅＢとインタクトなトラスツズマブの分離の比較図を示すクロマトグラムである。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入容量：０．５μＬ、１μｇタンパク質、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：ＡＣＮ、２０分間で２０％から８０％Ｈ２Ｏ）
【図７】種々の流速：０．１ｍＬ／ｍｉｎ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、０．３ｍＬ／ｍｉｎおよび０．４ｍＬ／ｍｉｎでのＲＮａｓｅＢ分離の比較図を示すクロマトグラムである。
【図８Ａ−Ｂ】本発明における固定相材料でキャラクタライズされたＩｄｅＳ消化トラスツズマブのクロマトグラムである。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏＦ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ、２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１μｇタンパク質、注入容量：０．６７μＬ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、温度：３０℃、１分間で２０％から３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％から３７％Ｈ２Ｏ）
【図９】本発明における固定相材料でキャラクタライズされたＬｙｓ−Ｃ消化トラスツズマブのクロマトグラムである。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  Ａ２１４  １０Ｈｚ、Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ、５０−２５００ｍ／ｚ、１０Ｈｚ、２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、９．２μｇ、Ｌｙｓ−Ｃ消化トラスツズマブ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ）
【図１０】種々の変性／還元手順および希釈条件に従って、本発明における固定相材料でキャラクタライズされたトラスツズマブに対応するクロマトグラムの比較図である。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ、Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入容量：０．６７μＬ、１μｇ、タンパク質、温度：３０℃、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１分間で２０％から３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％から３７％Ｈ２Ｏ）
【図１１】逆相Ｃ４カラムと親水性ポリアミド結合固定相カラムとの間の分離の直交性を示すクロマトグラムである。ＲＮａｓｅＢは、このクロマトグラムで分析される。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ、２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１μｇタンパク質、注入容量：０．６７μＬ／ＢＥＨ３００  Ｃ４、１．７μｍ、３００Å、温度：８０℃、１分間で５％−３３．３％ＡＣＮ、次いで２０分間で３３．３％−４０．３％ＡＣＮ／ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å、温度：３０℃、１分間で２０％から３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％から３７％Ｈ２Ｏ）
【図１２】１３０Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相と、３００Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相（幅広の孔の相）とを対比させて行なったトラスツズマブのＬｙｓ−Ｃ糖ペプチドマッピングに対応するクロマトグラム一式である。糖ペプチドマップの分解能（Ｒｓ）における差に留意されたい。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、１３０または３００Å、２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、温度：３０℃、９．２μｇ  Ｌｙｓ−Ｃ消化トラスツズマブ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、６０分間で２０％から５０％ＭＰＡ、Ａ２１４、１０Ｈｚ）
【図１３】３００Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相で得られたトラスツズマブのＬｙｓ−Ｃ糖ペプチドマッピングと、１３０Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相で得られた（トラスツズマブ由来の）アントラニルアミドで標識された、放出Ｎグリカンの分析との対比に対応したクロマトグラムを表す。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  Ａ２１４、１０Ｈｚ、Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ、５０−２５００ｍ／ｚ、１０Ｈｚ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å  ２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、温度：３０℃、９．２μｇ  Ｌｙｓ−Ｃ消化トラスツズマブ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、６０分間で２０％−５０％ＭＰＡ／ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ＦＬＲ、３６０／４２８ｎｍ、１０Ｈｚ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ、５００−２５００ｍ／ｚ、２Ｈｚ、ＢＥＨ  Ｇｌｙｃａｎ／Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、１３０Å  ２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．４ｍＬ／ｍｉｎ、温度：４０℃、９．２μｇのトラスツズマブから放出された２−ＡＢ標識グリカン（Ｇｌｙｃｏ  Ｗｏｒｋｓ）、移動相Ａ：５０ｍＭ  ギ酸ＮＨ４、Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．４、移動相Ｂ：ＡＣＮ、２．０６分間で３０％ＭＰＡ、次いで３２．７４分にわたって３０％から４７％ＭＰＡ）
【図１４】本発明における固定相材料で得られた種々の製造バッチからのＩｄｅＳ消化トラスツズマブに対応したクロマトグラム一式を示す。種々の分解グリコフォームの統合および相対定量が実証されている。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ  ２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１分間で２０％から３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％から３７％Ｈ２Ｏ、１μｇタンパク質、温度：３０℃、注入容量：０．６７μＬ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å）
【図１５】本発明における固定相材料で得られた、ＩｄｅＳ消化型の、カルボキシペプチダーゼＢで処理したセツキシマブに対応するクロマトグラムである。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２Ｈｚ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ、５００−４０００ｍ／ｚ、２Ｈｚ、２．１×１５０ｍｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ、１分間で２０％から３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％から３７％Ｈ２Ｏ、１μｇタンパク質、温度：６０℃、注入容量：０．６７μＬ、ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å）
【図１６】３００Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相（本発明における固定相材料）で得られた、トラスツズマブの、トリプシンの糖ペプチドマッピングに対応するクロマトグラムを表す。（ＡＣＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ、Ａ２１４、２１０Ｈｚ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ、５０−２５００ｍ／ｚ、１０Ｈｚ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ、１．７μｍ、３００Å  ２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、注入容量：２４３．２μＬ、サンプル希釈液：８０％ＡＣＮ、９．２μｇ  還元およびアルキル化セツキシマブのＬｙｓ−Ｃ／トリプシン消化物、温度：６０℃、移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ２）
【図１７】異なる粒子形態（プロトタイプＡ−Ｄ）で構成されるアミド結合固定相によるＲＮａｓｅＢ分離を表す。ＲＮａｓｅＢ（２μｇ）は３０℃で分離した。
【図１８】異なるＮ被覆率（プロトタイプＥおよびＦ）を有するように結合した１．７μｍのアミド結合ＢＥＨ（３００ÅＡＰＤ）によるＲＮａｓｅＢ分離を表す。クロマトグラフィー分解能（高さ半分でのピーク幅）および圧力（系）に留意されたい。ＲＮａｓｅＡ（０．２μｇ）およびＲＮａｓｅＢ（１．８μｇ）は、４５℃で分離した。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
添付の図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、本発明の基本原理を説明する種々の好ましい特徴を簡単に表したものであることを理解されたい。本明細書に開示される本発明の特定の設計特性、たとえば特定の寸法、配向、位置および形状は、特定の対象とする用途および使用環境によって部分的に決定される。
【００５２】
定義
本発明を、以下に説明する定義を参照することによって、より完全に説明していく。
【００５３】
用語「親水性」は、水に親和性を有すること、水を引きつけること、水を吸着することまたは水を吸収することを説明する。
【００５４】
用語「疎水性」は、水に親和性がないこと、水と混じらないことまたは水を吸着もしくは吸収できないことを説明する。
【００５５】
用語「イオン交換官能基」は、対イオンが部分的に遊離して、同じ徴候を示す他のイオンと容易に交換され得る基を包含するよう意図されている。
【００５６】
用語「モルパーセント」は、本発明の多孔質材料のコポリマーを含む様々な（２種以上の）モノマーの総モルに対する、パーセントで表した、対象モノマーのモル分率を説明する。
【００５７】
用語「モノリス」は、連続的に相互接続された孔構造を一体中に有する多孔質の三次元材料を包含することが意図される。モノリスは、たとえば、前駆体を所望の形状の型に鋳造することによって調製される。モノリスという用語は、充填されてベッドを形成する個々の粒子の集合体であって、その最終産物がなおベッド構造中に個々の粒子を含むようなものとは区別されることとする。
【００５８】
用語「モノマー」は、重合前に１種以上の重合可能な官能基を含む分子またはポリマーの繰り返し単位を包含することが意図される。
【００５９】
用語「多孔質材料」は、孔によって貫通され、そこを通って溶液の拡散が可能な多孔質架橋ポリマー類の１種を包含することが意図される。孔は、高密度に充填されたポリマー鎖間の領域である。ある実施形態において、孔は、通常、直径のサイズで規定される空きスペースを含む。クロマトグラフィーの表面上の孔は、通常、終端部が開口型であるため、孔のサイズより小さい分子が孔の中に存在し得るまたは孔を通過し得、任意の形態であることができる。複数の孔が広い表面積および代替の流路をもたらすので、クロマトグラフィー表面上の孔は、クロマトグラフィー中の分析物の保持時間に影響を与え得、高い分離効率および良好な物質移動特性など、クロマトグラフィーを強化し得る（たとえば、帯域の広がりの低減および良好なピーク形状によって証明される。）。したがって、孔のサイズ分布は、通常、本発明におけるクロマトグラフィーの利益に貢献する鍵である。クロマトグラフィー表面の孔は、合成ポリマー、たとえばエチレン架橋ハイブリッド（ＢＥＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）と、不活性化学構造を作製するシリカとで導入できる。
【００６０】
用語「ランダムな順序付け」は、個々の単位が無作為に結合する順序付けを包含することが意図される。
【００６１】
用語「親水性相互作用クロマトグラフィー」またはＨＩＬＩＣは、親水性固定相および疎水性有機移動相を用いるプロセスを含むことが意図され、親水性化合物は疎水性化合物より長く保留される。ある実施形態において、プロセスは、水混和性溶媒の移動相を利用する。ある実施形態において、この用語は、ＥＲＬＩＣ（静電反発力親水性相互作用クロマトグラフィー）、カチオン性ＥＲＬＩＣおよびアニオン性ＥＲＬＩＣをも包含する。
【００６２】
用語「収着」は、物質が吸収または吸着によって別の材料を取り込み、保有する能力を説明している。
【００６３】
用語「表面改質剤」は、（一般的に）所定のクロマトグラフィーのための官能性を材料に付与する官能基を含む。
【００６４】
「表面改質した」という言葉は、追加的に表面改質剤で置換または誘導体化され得る有機基を保有する本発明の複合材料を説明するために本明細書で使用される。「表面改質剤」は、これらに限定されないが、所定のクロマトグラフィーのための官能性を物質に付与する有機官能基を含む。
【００６５】
「表面官能化した」という言葉は、所定のクロマトグラフィーのための官能性を物質に付与するイオン交換官能基を保有する本発明の複合材料を説明するために本明細書で使用される。
【００６６】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、分離、分析、抽出、濃縮またはプロファイリングを含めた、本発明の方法による操作にかけられる、少なくとも分析用分子、たとえば糖タンパク質を含む分子の混合物を指す。
【００６７】
本明細書で使用する用語「分析」または「分析した」は区別なく使われ、対象の分子（たとえば、糖タンパク質）を分離、検出、単離、精製、可溶化、検出および／またはキャラクタライズする任意の様々な方法を指す。例として、これらに限定されないが、固相抽出、固相微量抽出、電気泳動、質量分析法、たとえばＨＩＬＩＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＥＳＩ、液体クロマトグラフィー、たとえば高速の、たとえば逆相、順相またはサイズ排除、イオン対液体クロマトグラフィー、液液抽出、たとえば加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波アシスト抽出、膜抽出、ソックスレー抽出、沈殿法、清澄化、電気化学検出、染色法、元素分析、エドマン分解、核磁気共鳴、赤外分析法、フローインジェクション分析、毛管電気クロマトグラフィー、紫外検出およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６８】
本明細書で使用する用語「プロファイリング」は、サンプル中の生物学的分子（たとえば、糖タンパク質）の含有率、組成または特性比を規定するために組み合わせて使用される任意の様々な方法を指す。
【００６９】
本明細書で使用する用語「クロマトグラフィー表面」は、サンプルまたは分析物にさらされる表面を含む。クロマトグラフィー表面は、化学的に修飾、官能化もしくは活性化させることができる、または微細構造、たとえば孔を有する。ある実施形態において、クロマトグラフィー表面は、疎水性、親水性（極性）またはイオン性であってもよい。他の実施形態において、クロマトグラフィー表面は、完全に多孔質である、表面が多孔質であるまたは無孔である。
【００７０】
本明細書で使用する用語「クロマトグラフィーコア」は、本発明の材料の内部部分を形成する、粒子、モノリスまたは別の好適な構造の形態の、本明細書に規定のシリカまたはハイブリッド材料などの有機材料を含むがこれらに限定されないクロマトグラフィー材料を含む。ある態様において、クロマトグラフィーコアの表面は、本明細書に規定のクロマトグラフィー表面を表すまたは本明細書に規定のクロマトグラフィー表面によって閉じ込められた材料を表す。クロマトグラフィー表面材料は、離散したまたは別個の移行が識別されるようなやり方で、クロマトグラフィーコアに配置、結合またはアニールされ得るまたはクロマトグラフィーコアの表面とブレンドし、結果として材料のグラデーションがもたらされ、内部コア表面の離散がないやり方でクロマトグラフィーコアに結合し得る。ある態様において、クロマトグラフィー表面材料は、クロマトグラフィーコアの材料と同一であっても異なっていてもよく、孔容積、表面積、平均孔径、炭素含有率または加水分解ｐＨ安定性を含むがこれらに限定されない、クロマトグラフィーコアとは異なる物理的または生理化学的性質を示し得る。
【００７１】
本明細書で使用する用語「アミド」は、ヒドロキシル基がアミンまたはアンモニアと置き換わったカルボン酸の誘導体形態を含むことが意図される。炭素に隣接する強力な電気陰性原子、酸素および窒素の存在のために、双極子モーメントが生じ、アミド基を有する分子は極性または親水性を表す。クロマトグラフィーのある態様において、アミド基は、クロマトグラフィーコアの表面に共有結合して、クロマトグラフィー固定相に親水性を付与することができる。
【００７２】
本明細書で使用する用語、「ハイブリッド無機／有機材料」を含めた「ハイブリッド」は、無機ベースの構造を含み、有機官能基は、内部または「骨組み」の無機構造とハイブリッド材料表面の両方に不可欠である。ハイブリッド材料の無機部分は、たとえば、アルミナ、シリカ、チタン、セリウムもしくはジルコニウムまたはこれらの酸化物またはセラミック材料であってよい。「ハイブリッド」は、無機ベースの構造を含み、有機官能基は、内部または「骨組み」の無機構造とハイブリッド材料表面の両方に不可欠である。
【００７３】
本明細書で使用する用語「イオン対形成剤」は、所定の疎水性を他の分子、たとえば分析物に付与するイオン化合物を含むことが意図される。イオン対形成剤は、これに限定されないが、疎水性対イオン、たとえば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。イオン対形成剤は、正電荷を持つ分析物の残基、たとえば正電荷を持つペプチドのアミノ酸残基でイオン対形成させることができる。一般的に、イオン対形成剤をクロマトグラフィーに添加し、分析用分子の親水性を低減するまたは疎水性を強化する。
【００７４】
本明細書で使用する用語「糖ペプチド／糖タンパク質」は、これらの合成中またはその後に、共有結合した炭水化物またはグリカンによる修飾ペプチド／タンパク質である。
【００７５】
本明細書で使用する用語「グリカン」は、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）を一般的に含む１種以上の糖単位を含む化合物である（Ｆｒａｎｋ  Ｋｊｅｌｄｓｅｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３、７５、２３５５−２３６１頁）。糖タンパク質中のグリカン部分は、その官能性または細胞部位を同定する上で重要な形質である。たとえば、ほとんどの膜結合タンパク質は、その細胞間または細胞外の機能のための糖タンパク質である。他の例において、特定のモノクローナル抗体、たとえば、トラスツズマブ（乳癌治療に使用される市販のモノクローナル抗体）は、特定のグリカン部分で修飾される。
【００７６】
本発明の組成物
一態様において、本発明は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含む多孔質材料を提供し、平均孔径は約２００Å以上である。ある実施形態において、平均孔径は約２５０Å以上である。さらに他の実施形態において、平均孔径は約３００Å以上である。さらに別の実施形態において、平均孔径は約４５０Å以上である。
【００７７】
別の態様において、本発明は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含む多孔質材料を提供し、前記材料は約１００Åから約１０００Åの中央孔径を有する。中央孔径は、たとえば、逆相サイズ排除クロマトグラフィー（Ｉ−ＳＥＣ）によって測定できる。ある態様において、材料は、約２００Åから約８００Å、約３００Åから約５５０Å、約１００Å、約２００Å、約３００Å、約４００Å、約４２５、約４５０Å、約４７５Å、約５００Å、約５２５Å、約５５０Å、約５７５Å、約６００Å、約７００Åまたは約８００Åの中央孔径を有する。
【００７８】
本発明は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含む多孔質材料であって、約０．５％Ｎから約２０％Ｎ、約１％Ｎから約１０％Ｎ、約１％Ｎから約５％Ｎ、約１％Ｎから約４％Ｎ、約１％Ｎ、約１．５％Ｎ、約２％Ｎ、約２．５％Ｎ、約３％Ｎ、約３．５％Ｎ、約４％Ｎ、約４．５％Ｎ、約５％Ｎ、約５．５％Ｎ、約６％Ｎ、約６．５％Ｎ、約７％Ｎ、約７．５％Ｎ、約８％Ｎ、約８．５％Ｎ、約９％Ｎ、約９．５％Ｎ、約１０％Ｎ、約１０．５％Ｎ、約１１％Ｎ、約１１．５％Ｎ、約１２％Ｎ、約１２．５％Ｎ、約１３％Ｎ、約１３．５％Ｎ、約１４％Ｎ、約１４．５％Ｎまたは約１５％Ｎの窒素含有率を有する前記材料をさらに提供する。
【００７９】
ある実施形態において、本発明の多孔質材料は、約１００Åから約１０００Å、約２００Åから約９００Å、約３００Åから約８００Åまたは約３００Åから約５５０Åの中央孔径と、約０．５％Ｎから約２０％Ｎ、約１％Ｎから約１０％Ｎ、約１％Ｎから約５％Ｎ、約１％Ｎから約４％Ｎ、約１％Ｎ、約１．５％Ｎ、約２％Ｎ、約２．５％Ｎ、約３％Ｎ、約３．５％Ｎ、約４％Ｎ、約４．５％Ｎ、約５％Ｎ、約５．５％Ｎ、約６％Ｎ、約６．５％Ｎ、約７％Ｎ、約７．５％Ｎ、約８％Ｎ、約８．５％Ｎ、約９％Ｎ、約９．５％Ｎ、約１０％Ｎ、約１０．５％Ｎ、約１１％Ｎ、約１１．５％Ｎ、約１２％Ｎ、約１２．５％Ｎ、約１３％Ｎ、約１３．５％Ｎ、約１４％Ｎ、約１４．５％Ｎまたは約１５％Ｎの窒素含有率との両方を有する。
【００８０】
他の実施形態において、多孔質材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含み、前記材料は、約１％Ｏから約２０％Ｏ、約１％Ｏから約１０％Ｏ、約１％Ｏから約５％Ｏ、約１％Ｏから約４％Ｏ、約１％Ｏ、約２％Ｏ、約３％Ｏ、約４％Ｏ、約５％Ｏ、約６％Ｏ、約７％Ｏ、約８％Ｏ、約９％Ｏ、約１０％Ｏ、約１１％Ｏ、約１２％Ｏ、約１３％Ｏ、約１４％Ｏまたは約１５％Ｏの酸素含有率を有する。
【００８１】
さらに他の実施形態において、多孔質材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含み、前記材料は、約１％Ｓから約２０％Ｓ、約１％Ｓから約１０％Ｓ、約１％Ｓから約５％Ｓ、約１％Ｓから約４％Ｓ、約１％Ｓ、約２％Ｓ、約３％Ｓ、約４％Ｓ、約５％Ｓ、約６％Ｓ、約７％Ｓ、約８％Ｓ、約９％Ｓ、約１０％Ｓ、約１１％Ｓ、約１２％Ｓ、約１３％Ｓ、約１４％Ｓまたは約１５％Ｓの硫黄含有率を有する。
【００８２】
さらに他の実施形態において、多孔質材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含み、前記材料は、約１％Ｐから約２０％Ｐ、約１％Ｐから約１０％Ｐ、約１％Ｐから約５％Ｐ、約１％Ｐから約４％Ｐ、約１％Ｐ、約２％Ｐ、約３％Ｐ、約４％Ｐ、約５％Ｐ、約６％Ｐ、約７％Ｐ、約８％Ｐ、約９％Ｐ、約１０％Ｐ、約１１％Ｐ、約１２％Ｐ、約１３％Ｐ、約１４％Ｐまたは約１５％Ｐのリン含有率を有する。
【００８３】
ある態様において、多孔質材料は、約５０から約８５０平方メートル／グラムの範囲の比表面積および約１から５０Åまたは２００から１０００Åの範囲の直径を有する孔を有する。
【００８４】
ある実施形態において、本発明の多孔質材料は、多孔質粒子の形態、たとえば、ビーズ、ペレットまたは使用に望ましい他の任意の形態をとる。多孔質粒子は、たとえば、球状、定形または異形であってもよい。いくつかの実施形態において、粒子は、約０．１から約５００μｍ、約１から約１００μｍまたは約１から約１０μｍの範囲の直径を有するビーズである。
【００８５】
他の実施形態において、本発明の多孔質材料は、多孔質モノリスの形態をとる。ある実施形態において、モノリスは、以下の特性、即ち約５０から約８００ｍ２／ｇ、より特定すると約３００から約７００ｍ２／ｇの範囲の表面積、約０．２から約２．５ｃｍ３／ｇ、より特定すると約０．４から約２．０ｃｍ３／ｇ、さらにより特定すると約０．６から約１．４ｃｍ３／ｇの範囲の孔容積および約２０から約５００Å、より特定すると約５０から３００Å、さらにより特定すると約８０から約１５０Åの範囲の孔径を有する。
【００８６】
本発明の成分材料
本発明の多孔質材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含む。ある実施形態において、本発明のコポリマーは、非スルホン化である。ある他の実施形態において、コポリマーはスルホン化である。
【００８７】
親水性モノマー
ある実施形態において、親水性モノマーは、３−メタクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルクロロシラン  ３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、スチリルエチルトリクロロシラン、スチリルエチルメチルジクロロシラン、スチリルエチルジメチルクロロシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、スチリルエチルメチルジメトキシシラン、スチリルエチルジメチルメトキシシラン、スチリルエチルトリエトキシシラン、スチリルエチルメチルジエトキシシラン、スチリルエチルジメチルエトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、Ｎ−（３−アクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、Ｏ−（メタクリロキシエチル）−Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）ウレタン、Ｎ−（３−メタクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、３−（Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン塩酸塩、
【００８８】
【化３】
2015121539.tif 000004
である。
【００８９】
ポリアミド結合相
ある実施形態において、ポリアミド結合相は、アクリルアミド、ジビニルベンゼン、スチレン、エチレングリコールジメタクリレート、１−ビニル−２−ピロリジノンおよびｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ブチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルアクリレート、２−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ、Ｎ−ビス（２−シアノエチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリス［（２−アクリロイルオキシ）エチル］イソシアヌレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、イタコン酸、メタクリル酸、トリメチルシリルメタクリレート、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウム水酸化物内塩、
【００９０】
【化４】
2015121539.tif 000005
に由来する。
【００９１】
他の実施形態において、本発明の材料は、２種以上の異なるポリアミド結合相を含む。特定の実施形態において、本発明の材料は、第１および第２のポリアミド結合相を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、第２のポリアミド結合相は、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ブチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドまたは１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジンに由来する。
【００９３】
本発明の材料が第１および第２のポリアミド結合相を含む特定の実施形態において、第１のポリアミド結合相は、総ポリアミド結合相の約３５から約９９モル％を占める。ある実施形態において、第１のポリアミド結合相は、総ポリアミド結合相の、約３５モル％、約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、約６０モル％、約６５モル％、約７０モル％、約７５モル％、約８０モル％、約８５モル％、約９０モル％、約９５モル％、約９６モル％、約９７モル％、約９８モル％または約９９モル％を占める。本発明の材料が第１および第２のポリアミド結合相を含む他の実施形態において、第２のポリアミド結合相は、総ポリアミド結合相の６５から１モル％を占める。ある実施形態において、第２のポリアミド結合相は、総ポリアミド結合相の、約６５モル％、約６０モル％、約５５モル％、約５０モル％、約４５モル％、約４０モル％、約３５モル％、約３０モル％、約２５モル％、約２０モル％、約１５モル％、約１０モル％、約５モル％、約４モル％、約３モル％、約２モル％または約１モル％を占める。
【００９４】
表面機能化／修飾
多孔質粒子またはモノリスのいずれかの形態の多孔質材料は、機能化されてイオン交換官能性部分を生成することができる。
【００９５】
ある実施形態において、イオン交換官能性部分は、参照により本明細書に組み込む米国特許第７，７３１，８４４号に記載の方法にあるように、クロロメチル化後、本発明の材料上にアミン官能性を形成させることによって形成できる。他の実施形態において、アミン官能性は、純アミンと直接反応させることによって形成できる。
【００９６】
本発明によれば、イオン交換官能性部分は、置換非環式アミンまたは置換環式アミンから形成できる。置換は、ヘテロ原子を含め、環原子のどこで行なわれてもよい。たとえば、ある実施形態において、イオン交換官能性部分は、置換環式第２級アミン、たとえばＮ−メチルジアジナン（ｍｅｔｈｙｌｄｉａｚｉｎａｎｅ）および４−メチルピペリジンである。
【００９７】
他の実施形態において、前述のアミンは、有利には、電子求引基で置換される。ある実施形態において、電子求引基は、ハロゲン、芳香族基、不飽和の基、エーテル、チオエーテル、ニトリル、ニトロ基、エステル、アミド、カルバメート、尿素、カーボネート、スルホンアミド、スルホン、スルホキシドならびにヘテロ原子、たとえばＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される。ある実施形態において、電子求引基は、ハロゲン、エーテルまたは芳香族基である。
【００９８】
本発明によれば、アミンの電子求引基は、電子求引基を持たないアミンの共役酸と比較して、アミンの共役酸の平均ｐＫａを低くする作用がある。ある実施形態において、ｐＫａは、約５から約７の範囲である。
【００９９】
ある実施形態において、電子求引基で置換された非環式アミンには、ベンジルアミン、Ｎ−メチルベンジルアミン、Ｎ−エチルベンジルアミン、Ｎ−プロピルベンジルアミン、Ｎ−ブチルベンジルアミン、Ｎ−ペンチルベンジルアミン、Ｎ−ヘキシルベンジルアミン、Ｎ−ヘプチルベンジルアミン、Ｎ−オクチルベンジルアミン、Ｎ−ノニルベンジルアミン、Ｎ−デシルベンジルアミン、Ｎ−ウンデシルベンジルアミン、Ｎ−ドデシルベンジルアミン、Ｎ−トリデシルベンジルアミン、Ｎ−テトラデシルベンジルアミン、Ｎ−ペンタデシルベンジルアミン、Ｎ−ヘキサデシルベンジルアミン、Ｎ−ヘプタデシルベンジルアミン、Ｎ−オクタデシルベンジルアミン、ジベンジルアミン、アニリン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン、Ｎ−プロピルアニリン、Ｎ−ブチルアニリン、Ｎ−ペンチルアニリン、Ｎ−ヘキシルアニリン、Ｎ−ヘプチルアニリン、Ｎ−オクチルアニリン、Ｎ−ノニルアニリン、Ｎ−デシルアニリン、Ｎ−ウンデシルアニリン、Ｎ−ドデシルアニリン、Ｎ−トリデシルアニリン、Ｎ−テトラデシルアニリン、Ｎ−ペンタデシルアニリン、Ｎ−ヘキサデシルアニリン、Ｎ−ヘプタデシルアニリン、Ｎ−オクタデシルアニリン、ビス（２，２，２−トリフルオロメチル）アミン、フェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、４−メチルフェネチルアミン、３−フェニルプロピルアミン、１−メチル−３−フェニルプロピルアミン、Ｎ−イソプロピルベンジルアミン、および４−フェニルブチルアミンが挙げられる。ある好ましい実施形態において、電子求引基で置換された非環式アミンは、ベンジルアミン、Ｎ−メチルベンジルアミンまたはフェネチルアミンである。好ましい実施形態において、電子求引基で置換された非環式アミンは、Ｎ−メチルベンジルアミンである。
【０１００】
他の実施形態において、電子求引基で置換された環式第２級アミンには、オキサゼタン（ｏｘａｚｅｔａｎｅ）、オキサゾラン（ｏｘａｚｏｌａｎｅ）、オキサジナン（ｏｘａｚｉｎａｎｅ）、オキサゼパン（ｏｘａｚｅｐａｎｅ）、オキサゾカン（ｏｘａｚｏｃａｎｅ）、オキサゾナン（ｏｘａｚｏｎａｎｅ）、オキサゼカン（ｏｘａｚｅｃａｎｅ）、チアゼタン（ｔｈｉａｚｅｔａｎｅ）、チアゾラン（ｔｈｉａｚｏｌａｎｅ）、チアジナン（ｔｈｉａｚｉｎａｎｅ）、チアゼパン（ｔｈｉａｚｅｐａｎｅ）、チアゾカン（ｔｈｉａｚｏｃａｎｅ）、チアゾナン（ｔｈｉａｚｏｎａｎｅ）およびチアゼカン（ｔｈｉａｚｅｃａｎｅ）が挙げられる。一実施形態において、環式第２級アミンは、１，４−オキサジナンである。これらの実施形態において、当業者は、電子求引基が、環内の炭素原子と置き換わった第２のヘテロ原子であることを理解する。たとえば、アゼチジン中の窒素原子に隣接する環炭素が酸素で置換されてオキサゼタンが得られるが、これも用語「電子求引基で置換された環式第２級アミン」に包含されるアミンである。
【０１０１】
さらに他の実施形態において、イオン交換官能性部分は、本発明の材料と過酸化水素とを反応させることによって形成することができる。
【０１０２】
ある実施形態において、表面機能化は、参照により本明細書に組み込む米国特許第７，２３２，５２０号および同第７，７３１，８４４号に記載の方法によって、本発明の材料上で行うことができる。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明の材料は、ポリマーでコーティングすることによって表面改質されていてもよい。
【０１０４】
さらに別の実施形態において、本発明の材料は、有機基による改質とポリマーコーティングとの組み合わせによって表面改質されていてもよい。さらなる実施形態において、有機基は、キラル部位を含む。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明の材料は、材料上の有機基と改質試薬との間の有機共有結合の形成を介して表面改質されていてもよい。
【０１０６】
グラフト化材料
ある実施形態において、本発明の多孔質材料は、限定されないが、無機コア、有機コアまたはハイブリッドコアを含めた多孔質または無孔のコアを含み、その上に、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーがグラフト化されている。ある他の実施形態において、本発明の多孔質材料は、少なくとも１種の疎水性モノマーから構成された多孔質ポリマーコアを含み、その上に、少なくとも１種の親水性モノマーから構成されたポリマーがグラフト化されている。さらに他の実施形態において、本発明の多孔質材料は、少なくとも１種の親水性モノマーから構成された多孔質ポリマーコアを含み、その上に、少なくとも１種の疎水性モノマーから構成されたポリマーがグラフト化されている。
【０１０７】
このような実施形態において、親水性モノマーは、本明細書で記載の通りであってよい。コアは、シリカ材料、ハイブリッド無機／有機材料、表面が多孔質の材料または表面が多孔質の粒子を含んでいてもよい。
【０１０８】
調製方法
本発明の多孔質材料は、これらに限定されないが、連鎖付加および段階凝縮プロセス（ｓｔｅｐ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、ラジカル、アニオン性、カチオン性、開環、基移動、複分解ならびに光化学機構を含めた、多数のプロセスおよび機構によって調製できる。
【０１０９】
コポリマーは、当業者に既知の、たとえば実施例に記載の、標準の合成方法によって調製できる。
【０１１０】
さらに、多孔質材料は、たとえば、米国特許第４，０１７，５２８号、同第６，５２８，１６７号、同第６，６８６，０３５号、同第７，１７５，９１３号、同第７，７３１，８４４号およびＷＯ２００４／０４１３９８に記載の方法など、既知の方法によって作製してもよい。
【０１１１】
本発明の方法：ＨＩＬＩＣクロマトグラフィー
本発明は、新規なＨＩＬＩＣ分離法および今まで未使用のカラム充填剤を通してタンパク質グリコシル化のキャラクタリゼーションを容易にする。
【０１１２】
通常の方法において、グリカンのキャラクタリゼーションは、ペプチド鎖からグリカンを放出させ、次いでこれらをペプチドとは分けて分析することに依存する。グリカンはＵＶ検出に向かないため、放出したグリカンは、蛍光検出には、フルオロフォアタグ、たとえばアントラニルアミド、アントラニル酸もしくは２−アミノピリジンで標識化し、または、ＭＳ検出には、分子、たとえば塩基性度が高いプロカインアミドで標識化することが多い。しかし、この手法によるグリカン分析では、グルコシル化の概括的な評価でしかない。特に、放出手順に依存するこうしたワークフローにより、グリカンについての部位特異的な情報は失われる。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、対応するタンパク質、タンパク質フラグメントおよびペプチドに依然として共有結合されたままのグリカンを研究する能力に際して、改善された分離および分析の結果を提供する。別の実施形態において、本発明は、インタクトなタンパク質およびペプチド両方のレベルの分析でグリコシル化の概略を描く新規なクロマトグラフィー法を提供する。グリコフォームのペプチドレベルの分析において、逆相ペプチドマッピング、たとえばＬｙｓ−Ｃ消化型ＨＩＬＩＣベースの糖ペプチドマッピングに単一のサンプルを利用できるという点で、生物薬剤学的キャラクタリゼーションにおける利点もある。その上、グリカンとペプチド／タンパク質との間のつながりは、発色団および塩基性残基を含有するタンパク性成分をベースとしたＵＶおよびＭＳ検出を促進する。
【０１１４】
ある実施形態において、糖タンパク質、グリコフラグメント（ｇｌｙｃｏｆｒａｇｍｅｎｔ）および糖ペプチドのＨＩＬＩＣ分離に関連する問題も本発明によって解決された。たとえば、制限された孔拡散および長い粒子内／粒子間拡散の距離が原因の、タンパク質サンプルのオンカラム凝集、低感受性のグリカン部分のクロマトグラフィー検出および低分解能のピークなどである。
【０１１５】
本発明の一実施形態において、本発明は、サンプル中の糖ペプチドを分析する方法であって、前記サンプルを固定相に接触させるステップを含み、前記固定相が少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含み、平均孔径が約２００Å以上、約２５０Å以上、約３００Å以上または約４５０Å以上である前記方法を提供する。
【０１１６】
別のある実施形態において、固定相は、粒子の孔ネットワークからの糖タンパク質／糖ペプチドのアクセスを完全に制限するのに十分小さい直径の平均孔径を有し、この平均孔径は、１−約５０Å、約５−約４０Åまたは約１０−約３０Åである。
【０１１７】
特に、本方法は、カラム圧力を高めてオンカラムのタンパク質凝縮を最小化／解消することによって、低注入容量の水性サンプルを用いて使いやすさを改善することによって、高濃度の変性剤を含有する希釈液からサンプルを注入してタンパク鎖の自己会合を制限することによっておよびイオン対形成剤を移動相添加剤として添加して、タンパク性分析成分である故の固着を減らし、これによりグリカンとの共有結合につながる分離の選択性を増やす。
【０１１８】
通常、タンパク質のグリカン部分のキャラクタリゼーションは、かなり複雑である。たとえば、グリカンが放出され、タンパク質とは別に分析される。しかし、グリカン部分は、ＵＶ検出にかけることができず、好適に検出されるように追加的なタグ付け、たとえばアントラニルアミド、アンタラニル酸または２−アミノピリジンを必要とする。その上、タンパク質から該グリカン部分を放出させると、タンパク質プロファイリングのインタクトな情報が失われる可能性がある。
【０１１９】
さらに、本発明は、クロマトグラフィー装置に新規な充填材料を使って巨大生体分子を分離する効率的なＨＩＬＩＣ法を提供する。
【０１２０】
ある実施形態において、本発明は、巨大生体分子、グリコシル化タンパク質またはペプチドなどのＨＩＬＩＣ分離を提供し、ここでカラム入口圧力は、（タンパク質の凝縮を最小限にするために）３，０００ｐｓｉ以上である。ある実施形態において、カラム入口圧力は、３０００ｐｓｉ、４０００ｐｓｉ、５０００ｐｓｉ、６０００ｐｓｉまたは７０００ｐｓｉ以上であってもよい。
【０１２１】
ある実施形態において、本発明の高純度固定相材料は、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣまたはＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｅｄ．Ｍｙｅｒｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、たとえばＩｒｇｕｍ、Ｋ．著の章、２００６、Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ＣｈｅｍｉｓｔｒｙまたはＵ．Ｄ．Ｎｅｕｅ、ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  Ｔｈｅｏｒｙ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９７）またはＬ．Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ｊ．Ｗ．Ｄｏｌａｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、２０１０）に記載の方法のいずれかなどの他の分離法に適用することができる。
【０１２２】
Ａ．グリコシル化タンパク性化合物を含有するサンプルの調製
本発明におけるグリコシル化タンパク性化合物は、これらに限定されないが、糖タンパク質、グリコシル化モノクローナル抗体または糖ペプチドであってもよい。
【０１２３】
本発明のＨＩＬＩＣクロマトグラフィーの方法では、グリコシル化タンパク質は、インタクトなタンパク質として分析することができるまたは還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂およびこれらの組み合わせによって調製することができる。
【０１２４】
還元は、三次元タンパク質構造中のジスルフィド結合を２つのチオールに還元することである。還元は、還元剤、たとえばＴＣＥＰの存在下、熱変性、界面活性剤の添加または変性剤、たとえばグアニジン・ＨＣｌ（６Ｍ）の添加によって実行できる。酵素分解は、プロテアーゼ、たとえばアクロモバクタープロテアーゼＩ（Ｌｙｓ−Ｃ）またはトリプシンによるタンパク消化である。さらに、糖タンパク質は、熱もしくは化学物質またはこれらの組み合わせによって変性され得る。フラグメント化は、物理的、生物学的または化学方法によって、モノクローナル抗体などの、単一またはマルチサブユニットタンパク質の開裂したタンパク部分である。たとえば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＩｄｅＳ）由来の免疫グロブリン分解酵素は、抗体サブユニットフラグメント化に一般的に使用されている。
【０１２５】
一実施形態において、サンプル中の糖ペプチドは、選択性またはクロマトグラフィーの効率を高めるために、ＨＩＬＩＣ固定相と接触させる前に、還元、酵素分解、変性またはフラグメント化することによって処理および調製することができる。
【０１２６】
特定の実施形態において、サンプルは、高濃度の変性剤を含有するサンプル希釈液中で調製して、タンパク鎖の自己会合を制限することができる。特定の実施形態において、サンプル希釈液は、初期の移動相組成物の適合絶縁耐力を有する。別のある実施形態において、サンプル希釈液は、変性剤を含む。変性剤は、非限定的に、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）であってもよい。証拠として、図１０は、種々の変性／還元手順および希釈条件によるサンプル希釈液中の該変性剤の効果を示す。
【０１２７】
Ｂ．固定相
クロマトグラフィーの固定相は、対象とする分析物を捕獲する機構をベースとするクロマトグラフィーに特性を主に付与する。
【０１２８】
固定相上のクロマトグラフィー表面は、非限定的に、疎水性、イオン性、極性、親水性またはこれらの組み合わせと確認される特定の化学基と結合できる。本発明の一実施形態において、クロマトグラフィー表面は、親水性または極性である。他の実施形態において、クロマトグラフィー表面は、極性および親水性を付与して極性分析物を保持するアミド結合相である。それと同時に、アミド結合相は、逆相クロマトグラフィー移動相と適合することもできる。
【０１２９】
固定相は、タンパク質、たとえばＲＮａｓｅＢのマンノース５種由来のＲＮａｓｅＡの脱グリコシル化イソ型およびグリコシル化イソ型間の所望の分解能を作製するように構成することができる。窒素（Ｎ）被覆率は、図１８で明らかなように、クロマトグラフィー性能を調節する手段として改変できる。特定の実施形態において、実施例２２に概説する条件下でＲＮａｓｅＡおよびＲＮａｓｅＢ（マンノース−５種）を分離するために１８以上のクロマトグラフィー分解能（高さ半分のピーク幅）を生成するように固定相のＮ被覆率を制御する。他のクロマトグラフィー性質も同様に、Ｎ被覆率への変更を利用して調節することができる。図１８は、異なるクロマトグラフィー圧力、特に水性移動相条件下のクロマトグラフィー圧力が、異なる％Ｎ含有率および異なる窒素（Ｎ）被覆率を示す固定相によっていかに得られるかを強調している。
【０１３０】
固定相は、非限定的に、クロマトグラフィー材料中で、完全にまたは表面に孔を含むことができる。孔のサイズは通常、クロマトグラフィーの間に、孔を浸透してもしなくてもよい分析物の保持時間を制限することができる。たとえば、孔入口のサイズより小さい分析物は、孔を介して流れ、その分析物の保持時間は延長する。本発明のある実施形態において、固定相は、複数の孔を組み、これらの孔の平均孔径は、直径２００Å超、直径２５０Å、直径３００Åまたは直径４５０Åである。本発明の他の実施形態において、固定相は、完全にまたは表面が多孔質である。図１−２および図１２で明らかなように、２００Å超の孔径は、高い分離効率および良好な物質移動特性を含めたクロマトグラフィー強化をさらにもたらす。その上、図１７（プロトタイプＣおよびＤ）で提供されている典型的なクロマトグラフィーは、幅広の孔（＞２００Ａ  ＡＰＤ）の、アミド結合した、表面が多孔質の固定相の有用性の証拠を示す。
【０１３１】
理論に制限されないが、効率的な糖タンパク質および糖ペプチドに提案されるアミド結合相は、完全に多孔質の形態または表面が多孔質の形態で構成されていてよく、孔径は、粒子の孔ネットワークからの糖タンパク質／糖ペプチドのアクセスを完全に制限するのに十分小さい直径である。吸着、分配および拡散は、これにより粒子表面に限られると思われ、したがって限定された拡散および長い拡散距離のために帯域の広がりは最小化されると思われる。ある実施形態において、５０Å未満の孔径は使用すると、このような効果を実現することができる。（図１７、プロトタイプＡ）。他のある実施形態において、平均孔径は１−約５０Å、約５−約４０Åまたは約１０−約３０Åである。この形態の粒子は、無孔の粒子として機能すると予想されるが、真に無孔の粒子より高い摩擦係数を有する表面を示す。この特徴は、カラムに一度は充填された相のパッキングおよび安定性を強化すると予想される。
【０１３２】
ある実施形態において、固定相材料は、１種以上の粒子形態である。粒子の平均粒径は、約０．１μｍから約５００μｍ、約１μｍから約１００μｍまたは約１μｍから約１０μｍである。別のある実施形態において、固定相材料は、多孔質モノリスをさらに含む。
【０１３３】
固定相に使用される材料にクロマトグラフィーコアを含んでもよい。クロマトグラフィーコア材料は、対象とする分析物と相互作用しても、そのような相互作用に関与しなくてもよい。クロマトグラフィーコアは、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアであってもよい。ある他の特定の実施形態において、脂肪族架橋シランの脂肪族基はエチレンである。エチレン架橋ハイブリッド（ＢＥＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、以後ＢＥＨと呼ぶ）シリカは、固定相に多孔性を付与し、孔のサイズはＢＥＨによって決定される。
【０１３４】
ある実施形態において、本発明の方法は、ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）をサンプル分析ツールとして使用する。ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣカラムは多孔質であり、サイズが異なる様々な孔を含有することができ、とりわけ移動相が逆相溶媒のときに、高い保持率および極性分析物の能力を維持する。
【０１３５】
たとえば、混合モード保持機構（親水性およびサイズ排除）を特徴とするＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を、最大選択性および感受性についてかなり予想通りに改変することができる。
【０１３６】
ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣカラムおよびＢＥＨ  Ａｍｉｄｅカラムが、本発明における方法開発に様々なオプションを提供することを理解されたい。これらの独特のカラムを最適化し、試験して、ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣおよびＵＰＬＣ  ＨＩＬＩＣ条件下で効率的で再現性のある分離を生み出す。ＢＥＨ粒子は、シリカベースのＨＩＬＩＣ相よりも堅牢なため、ＢＥＨ粒子は化学的安定性をもたらし、さらに結果としてカラム寿命を延長する。
【０１３７】
Ｃ．移動相
移動相は通常、分析物を、カラムなどのクロマトグラフィー装置に通してまたはその全体にわたって運搬する。クロマトグラフィーの間、分析物は、クロマトグラフィー装置の固定相と相互作用することができる。クロマトグラフィーの移動相は、気体、液体および任意の他の流体であってもよい。分離機構に基づいて、移動相は、水性、イオン性または高有機性であってもよい。本発明のある実施形態において、移動相は高有機溶媒である。他の実施形態において、移動相は、アセトニトリルおよび水を含む。他の特定の実施形態において、移動相は、極性溶媒、たとえば、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノールおよびブタノールをさらに含む。
【０１３８】
通常、ＨＩＬＩＣの移動相は、水と高有機溶媒との混合物である。クロマトグラフィーの間、糖ペプチドまたは本発明における糖タンパク質の破片などの極性分析物は、極性固定相によって保持される。固定相周辺の水性層と有機移動層との間の力学は、極性に基づいて分析物の保持率を正規化する。しかし、非極性分子は、移動相によって容易にクロマトグラフィーカラムから容易に除去できるように、クロマトグラフィー表面に結合できないまたは弱く結合し得る。ある実施形態において、移動相は、非限定的に、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物を含むことができる。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明におけるイオン対形成剤は、疎水性対イオンおよび移動相への添加剤である。イオン対形成剤は、主に、糖タンパク質／糖ペプチド中にあるタンパク関連成分の正電荷を持つ残基によってイオン対を形成するが、グリカンはカチオン性でないことがあるので、グリカンでは形成されない。したがって、タンパク質部分は、分配または固定相への結合に広範には貢献できない。結果として、グリカン部分は、主に固定相と相互作用し、分離はほとんどグリカン部分によって決まる。そのため、種々のグリカンで修飾された糖タンパク質／糖ペプチドを分離することができる。証拠として、図３は、対イオン形成剤の効果を示し、プロトン化した正電荷を持つタンパク質残基へのイオン対形成がＨＩＬＩＣ保持機構を平易にし、ペプチド／タンパク性鎖に共有結合したままのグリカンの選択性を強化することを示す。イオン対形成剤は、非限定的に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）、ペンタフルオロプロピオン酸（ＰＥＰＡ）、ノナフルオロペンタン酸（ＮＦＰＡ）、酢酸、プロパン酸またはブタン酸を含むことができる。特定の実施形態において、ＴＦＡの使用は、これがｐＨおよびイオン対形成を制御するという理由だけでなく、これが感受性の低波長のＵＶ検出を可能にし、ＭＳにも適合するという理由もあって有益であり得る。
【０１４０】
Ｄ．操作
ａ．カラム圧力
本発明によれば、クロマトグラフィー操作のためのカラム入口圧力を上昇させて、ロードされたサンプル、たとえば糖タンパク質の凝集を最小限に抑える。ある実施形態において、カラム入口圧力は、３０００ｐｓｉ以上、４０００ｐｓｉ、５０００ｐｓｉ、６０００ｐｓｉまたは７０００ｐｓｉであってもよい。
【０１４１】
図４Ａおよび図４Ｂに示すように、カラム上のタンパク質の凝集は低減または解消され、該サンプル分析物の保持時間は短縮される。
【０１４２】
ｂ．水性希釈液および注入容量
ある実施形態において、糖タンパク質／糖ペプチドを含有する水性サンプルをＨＩＬＩＣカラムに導入し、本発明の使いやすさを向上させる。ある実施形態において、糖タンパク質を含有するサンプルを２．１ｍｍのＩＤカラムに１０．０μＬ未満、９．０μＬ未満、８．０μＬ未満、７．０μＬ未満、６．０μＬ未満、５．０μＬ未満、４．０μＬ未満、３．０μＬ未満、２．０μＬ未満または１．５μＬ未満の容量でロードする。
【０１４３】
さらに他の実施形態において、糖タンパク質を含有する水性サンプルを、注入容量がクロマトグラフィーカラム体積の１／１００未満になるようにロードする。低容量の水性サンプルをＨＩＬＩＣカラムに注入することは、サンプル希釈液が初期の移動相組成物とマッチできることがより多い一般的実践に反する。別の実施形態において、サンプルの注入容量は、サンプル希釈液が初期の移動相組成物の絶縁耐力に適合するのであれば、いかなる容量でもよい。
【０１４４】
図５に示すように、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで操作される本発明の２．１×１５０ｍｍカラムは、１．５μＬまでの水性サンプルの注入に耐えることができる。
【０１４５】
ｃ．使用温度
本発明によれば、クロマトグラフィーの使用温度は、約０℃から１００℃の間、約１０℃から８０℃の間、約３０℃から８０℃の間、約５０℃から８０℃の間、約６０℃から８０℃の間または約７０℃から８０℃の間であることができる。たとえば、図６は、３０℃から８０℃の範囲の異なるカラム温度でのＲＮａｓｅＢとインタクトなトラスツズマブの分離の比較図を示している。
【０１４６】
ｄ．流速
本発明のある実施形態において、２．１ｍｍＩＤカラムが用いられ、移動相の流速は、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから１．０ｍＬ／ｍｉｎの間、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．９ｍＬ／ｍｉｎの間、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．８ｍＬ／ｍｉｎの間、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．７ｍＬ／ｍｉｎの間、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．６ｍＬ／ｍｉｎの間、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．５ｍＬ／ｍｉｎの間、約０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．４ｍＬ／ｍｉｎの間または約０．２ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎの間であってもよい。たとえば、図７は、異なる流速：０．１ｍＬ／ｍｉｎ、０．２ｍＬ／ｍｉｎ、０．３ｍＬ／ｍｉｎおよび０．４ｍＬ／ｍｉｎでのＲＮａｓｅＢの分離の比較図を示すクロマトグラムである。
【０１４７】
ＨＩＬＩＣクロマトグラフィーを使用して糖タンパク質または糖ペプチドをキャラクタライズする方法
本発明の一実施形態において、糖ペプチドをキャラクタライズするために親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実行する方法は、
ａ）糖ペプチドを含有するサンプルをサンプル希釈液中で調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびにカラム中の固定相材料を準備するステップであって、固定相材料が複数の孔を含むステップ、
ｃ）約３，０００ｐｓｉ以上のカラム入口圧力で、サンプルを固定相材料上にロードし、該サンプルを移動層溶離液とともに前記カラムに通して流すステップ、
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ、
ｅ）分画を同定するステップ
を含む。
【０１４８】
特定の実施形態において、固定相材料は、少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含む。
【０１４９】
一実施形態において、糖ペプチドは、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する。
【０１５０】
本発明の他の実施形態において、ａ）の調製ステップの方法は、非限定的に、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせであってもよい。
【０１５１】
ある実施形態において、ステップｂ）の固定相材料は、完全に多孔質または表面が多孔質である。
【０１５２】
ある実施形態において、平均孔径は、約２００Å以上、約２５０Å以上、約３００Å以上または約４５０Å以上である。
【０１５３】
別のある実施形態において、固定相は、粒子の孔ネットワークからの糖タンパク質／糖ペプチドのアクセスを完全に制限するのに十分小さい直径の平均孔径を有し、この平均孔径は約１から約５０Å、約５から約４０Åまたは約１０から約３０Åである。
【０１５４】
ある態様において、固定相は、多孔質粒子、たとえばビーズ、ペレットまたは使用に望ましい他の任意の形態の１種以上の形態である。多孔質粒子は、たとえば、球状、定形または異形を有することができる。いくつかの実施形態において、粒子は、約０．１から約５００μｍ、約１から約１００μｍまたは約１から約１０μｍの範囲の直径を有するビーズである。さらに別のある態様において、固定相材料は、多孔質モノリスをさらに含む。
【０１５５】
本発明のある実施形態において、移動相は高有機溶媒である。他の実施形態において、移動相は、アセトニトリルおよび水を含む。他の特定の実施形態において、移動相は、極性溶媒、たとえば、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノールおよびブタノールをさらに含む。
【０１５６】
他の実施形態において、糖タンパク質を含有する水性サンプルは、注入容量がカラム体積の１／１００未満になるようにロードする。別の実施形態において、サンプルの注入容量は、サンプル希釈液が適合した初期の移動相組成物の絶縁耐力を有していれば、いかなる容量であってもよい。
【０１５７】
別のある実施形態において、サンプル希釈液は変性剤を含む。変性剤は、非限定的には、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）であってもよい。
【０１５８】
本発明のある実施形態において、本方法は、イオン対形成剤を移動相に添加するステップをさらに含む。イオン対形成剤は、非限定的には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）、ペンタフルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸またはブタン酸を含むことができる。
【０１５９】
ある実施形態において、本方法は、カラム圧力を上昇させることをさらに含む。さらにある実施形態において、カラム圧力は、３，０００ｐｓｉ以上、４，０００ｐｓｉ以上、５，０００ｐｓｉ以上、６，０００ｐｓｉ以上または７，０００ｐｓｉ以上である。
【０１６０】
さらに他の実施形態において、同定ステップは、紫外検出、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−質量分析法（ＭＳ）、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる。ある実施形態において、同定は、質量分析ピークと、コンピューターデータベース中の既知の化合物とを比較することによって行うことができる。
【０１６１】
本発明の一態様において、サンプル中の糖ペプチドを分析する方法は、前記サンプルを固定相と接触させるステップを含み、前記固定相は、少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含み、平均孔径は、約２００Å以上、約２５０Å以上、約３００Å以上または約４５０Å以上である。
【０１６２】
いずれの糖ペプチドも、本発明に従って分析することができる。糖ペプチドは、非限定的に、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来することができる。
【０１６３】
ある態様において、固定相材料は、完全に多孔質または表面が多孔質の材料である。
【０１６４】
別のある態様において、固定相材料は、多孔質粒子、たとえばビーズ、ペレットまたは使用に望ましい他の任意の形態の１種以上の形態である。多孔質粒子は、たとえば、球状、定形または異形を有することができる。いくつかの実施形態において、粒子は、約０．１から約５００μｍ、約１から約１００μｍまたは約１から約１０μｍの範囲の直径を有するビーズである。さらに別のある態様において、固定相材料は、多孔質モノリスをさらに含む。
【０１６５】
本発明のさらに別の態様において、本方法は、前記サンプルを調製するステップをさらに含む。サンプルを調製するステップは、非限定的に、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせであってもよい。
【０１６６】
本発明のさらに別の態様において、本方法は、イオン対形成剤を移動相溶離液に添加するステップをさらに含む。イオン対形成剤は、非限定的には、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸またはブタン酸であってもよい。
【０１６７】
ある態様において、本方法は、カラム圧力を上昇させることをさらに含む。カラム圧力は、約３，０００ｐｓｉ以上、約４，０００ｐｓｉ以上、約５，０００ｐｓｉ以上、約６，０００ｐｓｉ以上または約７，０００ｐｓｉ以上であることが好ましい。
【０１６８】
さらに別の好ましい態様において、本方法は、糖ペプチドのグリコシル化の同定ステップを含み、これは、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行うことができる。ある実施形態において、同定は、質量分析ピークと、コンピューターデータベース中の既知の化合物とを比較することによって行うことができる。
【０１６９】
ＨＩＬＩＣクロマトグラフィーを使用してモノクローナル抗体のグリコシル化をキャラクタライズする方法
本発明の方法はまた、インタクトなタンパク質、フラグメントおよびペプチドレベルＨＩＬＩＣ−ＵＶ−ＭＳ分析法の手段によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療薬のグリコシル化をキャラクタライズする新規なクロマトグラフィー法も提供する。
【０１７０】
ある実施形態において、モノクローナル抗体は、ＩｄｅＳ（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の免疫グロブリン分解酵素）などの酵素によって分解または断片化されるが、断片化したｍＡｂは依然としてグリカンを含有したままである。特定の実施形態において、１つのＧ０Ｆおよび１つのＧ１Ｆグリカンを含有する種に由来する２つのＧＯＦグリカンを含有する種などのインタクトなトラスツズマブの分化グリコフォームを部分的に分解することが可能であった。図４Ａ−Ｂで明らかなように、インタクトなトラスツズマブグリカンプロファイルの概括評価が、本発明の固定相材料で可能である。本発明のＨＩＬＩＣ固定相に添加したインタクトなトラスツズマブは、調製して、ＩｄｅＳによってＦｃおよびＦｄに断片化することもできる。図８Ａ−Ｂおよび図１５で明らかなように、ＩｄｅＳによって断片化されたトラスツズマブまたはセツキシマブのグリコシル化は、本発明の固定相材料によってよくキャラクタライズされた。図１４で明らかなように、これらの方法は、トラスツズマブの２つの異なるバッチのグリカンプロファイル／組成物における違いを検出する上で好適である。
【０１７１】
別のある実施形態において、モノクローナル抗体を、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィーの前に、プロテアーゼ、たとえばＬｙｓ−Ｃまたはトリプシンにかける。結果として、これらの方法を用いて、セツキシマブの高分解能Ｌｙｓ−Ｃ（図９）およびトリプシンによる糖ペプチドマッピング（図１６）を得た。図１３で明らかなように、これらの発明は、同様の結果および放出グリカン分析技術によって他で得られるこれに類する情報を得る方法を提供する。
【０１７２】
別の実施形態において、本発明はまた、インタクトなタンパク質、フラグメントおよびペプチドレベルの分析で、グリコシル化以外のタンパク質修飾を分解する方法も提供できる。たとえば、本発明は、抗体薬物複合体のプロファイルをクロマトグラフィーによる分解のために使用してもよく、様々な数の複合体を含有する抗体種が分離される。
使用および用途
たとえば多孔質粒子またはモノリスの形態の本発明の新規な材料は、任意の従来の形式の分離において使用することができる。特に、たとえば多孔質粒子またはモノリスの形態の本発明の新規な材料は、親水性相互作用クロマトグラフィーに使用することができる。そのため、本発明は、親水性相互作用クロマトグラフィーまたは少なくとも１つのイオン交換官能基、少なくとも１種の親水性成分および少なくとも１種の疎水性成分を含むクロマトグラフィーのための多孔質材料をも提供する。イオン交換官能基は、多孔質材料を、アニオン性、カチオン性、酸性および／または塩基性の溶質と相互作用できるようにする。親水性の極性成分は、多孔質材料に、溶質と極性相互作用および水素結合する能力を持たせることができる。疎水性成分は、多孔質材料に、疎水性相互作用を通して非極性溶質に親和性を持たせることができる。本発明の多孔質材料は、溶質に対して様々な相互作用力の組み合わせを有するため、たとえば、親水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換および液体クロマトグラフィーの用途に非常に有用な材料である。たとえば、これらの新規な多孔質材料は、流体から溶質を結合、回収および／または除去するのに使用できる。同様に、これらの新規な多孔質材料は、材料と、ある分子、特に生物学的または生物化学的分子、たとえばタンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ビタミン、補助因子、代謝産物、脂質および炭水化物との間に、ある化学的親和力または引力を有する。したがって、本発明の材料は、ある生体分子を、分析および定量化のために、選択的に吸着および単離するために使用できる。
【０１７３】
本発明はまた、成分、たとえば溶質を混合物から除去または単離する方法も提供する。溶質を有する溶液は、溶質を多孔質材料に収着させる条件下で、本発明の多孔質材料と接触させる。
【０１７４】
溶質は、たとえば、疎水性、親水性もしくはイオン相互作用またはこれらの相互作用の２種もしくは３種の組み合わせを有する任意の分子であってもよい。好ましくは、溶質は、多孔質材料に吸着されるのに好適な極性の有機化合物である。このような溶質は、たとえば、化石燃料の燃焼または他の産業活動から生じる薬物、殺虫剤、除草剤、毒素および環境汚染物質、たとえば水銀、鉛またはカドミウムなどの重金属を含む金属有機化合物を含む。溶質はまた、前述の材料の代謝産物または分解産物でもよい。溶質はまた、たとえば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ビタミン、補助因子、代謝産物、脂質および炭水化物などの生体分子も含む。溶質はまた、たとえば、修飾タンパク質、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡも含む。
【０１７５】
ある実施形態において、本発明の材料は、インタクトなタンパク質、ポリマー生体分子、生体分子誘導生成物、バイオミメティックス、樹状、合成および非天然生体分子などの分離のために使用できる。
【０１７６】
溶液は、たとえば、水、水溶液または水もしくは水溶液の混合物および水混和性の極性有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリルを含んでもよい。好ましい実施形態において、溶液は、酸性、塩基性または中性の、約０％容−約９９％容の水を含む水溶液である。具体例は、実験で示される。溶質を含む溶液は、場合により、１種以上の追加の溶質をさらに含有することができる。一実施形態において、溶液は、複合的な様々な溶質を含む水溶液である。このタイプの溶液としては、たとえば、細胞培養抽出物、血液、血漿、尿、脳脊髄液、滑液および他の生体液、たとえば肝臓組織、筋肉組織、脳組織または心臓組織などの組織の抽出物が挙げられる。このような抽出物は、たとえば、水性抽出物であっても、有機抽出物であってもよく、これらは乾燥させてあり、後で水または水／有機混合物中で再構成させる。溶液はまた、たとえば、地下水、地表水、飲用水または環境サンプル、たとえば土壌サンプルの水性もしくは有機抽出物も挙げられる。溶液の他の例には、果物もしくは野菜ジュースもしくはミルクなどの食物または果物、野菜、シリアルもしくは肉などの食物の水性もしくは水性／有機抽出物が挙げられる。他の溶液として、たとえば、植物および肉汁からの天然産物の抽出物が挙げられる。
【０１７７】
溶液は、バッチまたはクロマトグラフィープロセスなどの、多孔質材料への溶質の収着を可能にするあらゆる様式で、多孔質材料と接触させることができる。たとえば、溶液を多孔質ポリマーカラム、ディスクまたはプラグに押し入れて通してもよく、または溶液を、バッチ式撹拌反応器中などで、多孔質材料と共に撹拌してもよい。溶液はまた、多孔質材料を含有するマイクロタイタープレートのウェルに添加してもよい。多孔質材料は、モノリスまたは粒子、たとえばビーズまたはペレットの形態をとることができる。溶液は、対象とする溶液が多孔質材料に実質的に収着するのに十分な時間だけ多孔質材料と接触させる。この時間は通常、多孔質材料表面と溶液との間で溶質が平衡を保つのに必要な時間である。溶質の多孔質材料への収着または分配は、部分的であっても完全であってもよい。
【０１７８】
本発明はまた、溶液中の溶質レベルを分析により決定する方法も含む。溶質を有する溶液は、溶質を多孔質材料に収着させる条件下で、多孔質材料と接触させる。この材料は、少なくとも１つのイオン交換官能基、少なくとも１種の親水性の極性成分および少なくとも１種の疎水性成分を含む。収着した溶質を有する多孔質材料は、多孔質材料から溶質を脱着させる条件下で、溶媒で洗浄する。洗浄後に溶媒中に存在する脱着した溶質のレベルは、分析によって決定される。
【０１７９】
多孔質材料と接触させた溶液は、希釈された形態で、たとえば、正確に定量化するには低すぎる濃度で対象溶質を含む可能性がある。溶質を多孔質材料に収着させて、次いでたとえば実質的に低容量の極性の低い溶媒で溶質を脱着させることにより、対象溶質を含む溶液を調製できるが、この溶液は、元の溶液の濃度よりも実質的に高い濃度で対象溶質を有する。本方法はまた、溶媒の交換をもたらすことができ、すなわち第１の溶媒から溶質を除去して第２の溶媒に再溶解させる。
【０１８０】
溶質を多孔質材料から脱着させるのに好適な溶媒は、たとえば、極性の水混和性有機溶媒、たとえばメタノール、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール、アセトニトリル、アセトンおよびテトラヒドロフランまたは水とこれらの溶媒との混合物であってもよい。脱着溶媒はまた、たとえば、非極性または中程度に極性の水不混和性溶媒、たとえばジクロロメタン、ジエチルエーテル、クロロホルムまたは酢酸エチルであってもよい。これらの溶媒の混合物も好適である。好ましい溶媒または溶媒混合物は、それぞれ個々の事例に応じて決定されなければならない。具体例は、詳しい実験で示される。好適な溶媒は、当業者によって、余計な実験を行なうことなく、クロマトグラフィー法の開発において慣例的に行なうことで、決定され得る（たとえば、「Ａ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、第６版、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ（１９９５）、ＳｎｙｄｅｒおよびＫｉｒｋｌａｎｄ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９７４）を参照されたい。）。
【０１８１】
溶媒中に存在する脱着した溶質のレベルは、当業者に既知の様々な技術、たとえば高速液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー／質量分析法、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー／質量分析法または免疫測定法によって分析して決定できる。
【０１８２】
本発明はまた、本発明の多孔質材料を含む分離装置も提供する。このような装置は、クロマトグラフィーカラム、カートリッジ、薄層クロマトグラフィープレート、濾過膜、サンプルクリーンアップ装置、固相有機合成担体およびマイクロタイタープレートを含む。ある実施形態において、１種より多くのタイプの官能性多孔質材料が、分離装置、たとえばカラム、カートリッジなどに使用できる。
【０１８３】
上に述べたように、本発明の多孔質材料は、親水性相互作用クロマトグラフィーにとりわけよく適している。したがって、本発明は、終端部が開口の容器の内部に充填された、本発明の多孔質材料を含む親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジも含む。一実施形態において、多孔質材料は、粒子として終端部が開口の容器内に充填し、親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジを形成する。
【０１８４】
容器は、たとえば、溶液を一方の端部から容器に入れて、容器内の多孔質材料と接触させ、他方の端部を通って容器から出せるように両端が開いた円筒形の容器またはカラムであってもよい。多孔質材料は、多孔質粒子の形態で、直径が約０．１μｍから約５００μｍの間、約１μｍから約１００μｍの間または約１μｍから約１０μｍの間のビーズなどの小型粒子として容器内に充填することができる。ある実施形態において、多孔質粒子は、多孔質膜に絡ませて容器に充填してもよい。
【０１８５】
容器は、親水性相互作用クロマトグラフィープロセスの時間枠の間、この手順の中で使用する溶液および溶媒に適合する任意の材料で形成され得る。このような材料として、ガラス、高密度ポリエチレンおよびポリプロピレンなどの様々なプラスチック、スチールおよびチタンなどの様々な金属が挙げられる。一実施形態において、容器は、その長さの大部分を通して円筒形であり、片方の終端部が先細りの先端部になっている。このような容器の一例として、注射筒がある。容器内の多孔質材料の量は、容器の体積によって制限され、約０．００１ｇから約５０ｋｇの範囲であってよく、好ましくは約０．０２５ｇから約１ｇである。所定の抽出に好適な多孔質材料の量は、収着させようとする溶質の量、多孔質材料の有効な表面積および溶質と多孔質材料との相互作用の強度によって決まる。この量は、当業者によって容易に決定することができる。カートリッジは、一つのサンプルの処理に使用した後は廃棄される使い捨てのカートリッジであってもよく、または複数のサンプルを処理するのに使用してもよい。
【実施例】
【０１８６】
材料
すべての材料は、特記がない限り、そのまま使用した。Ｎ−ビニルカプロラクタムおよびＮＶＰはＩＳＰから入手し、オレイル硫酸ナトリウムはＡＬＣＯＬＡＣから入手した。ジエテチルベンゼン（ｄｉｅｔｈｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ）、２−エチルヘキサノールは、ＡＬＤＲＩＣＨから入手した。ＡＩＢＮはＤＵＰＯＮＴから入手した。Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ−１５およびジビニルベンゼンは、ＤＯＷから購入した。阻害剤は、使用前にＤＶＢから除去した。
【０１８７】
キャラクタリゼーション
当業者は、以下の機器および存在する製造業者に等価なものを認識しているものとし、したがって以下に列挙した機器に限定されるとは解釈すべきでない。
【０１８８】
％Ｃ値は、燃焼分析（ＣＥ−４４０元素分析計、Ｅｘｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｅｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ）によってまたは電量炭素分析計（モジュールＣＭ５３００、ＣＭ５０１４、ＵＩＣ  Ｉｎｃ．、Ｊｏｌｉｅｔ、ＩＬ）によって測定した。これらの材料の比表面積（ＳＳＡ）、比孔容量（ＳＰＶ）および平均孔径（ＡＰＤ）は、多点Ｎ２収着法（Ｍｉｃｒｏｍｅｔｒｉｔｉｃｓ  ＡＳＡＰ２４００、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を利用して測定した。ＳＳＡは、ＢＥＴ法を使用して計算し、ＳＰＶはＰ／Ｐ０＞０．９８について決定した一点値であり、ＡＰＤは、ＢＪＨ法を使用して等温線の脱着の脚部（ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｌｅｇ）から計算した。ミクロ孔表面積（ＭＳＡ）は、比表面積（ＳＳＡ）から差し引かれた３４Å未満の孔についての累積吸着孔径データとして決定した。中央メソ孔径（ＭＰＤ）およびメソ孔容量（ＭＰＶ）は、水銀ポロシメトリー（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  ＡｕｔｏＰｏｒｅ  ＩＶ、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｅｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）によって測定した。骨格密度は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  ＡｃｃｕＰｙｃ  １３３０  Ｈｅｌｉｕｍ  Ｐｙｃｎｏｍｅｔｅｒ（Ｖ２．０４Ｎ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）を用いて測定した。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像解析を、７ｋＶで行なった（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−５６００機器、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）。高分解能ＳＥＭ画像解析は、集束イオンビーム（ＦＩＢ／ＳＥＭ）機器（Ｈｅｌｉｏｓ６００  Ｎａｎｏｌａｂ、ＦＥＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を用いて２０ｋＶで行なった。粒径は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３アナライザー（３０μｍアパーチャ、７０，０００カウント、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を用いて測定した。粒子直径（ｄｐ）は、容量ベース粒径分布の５０％累積直径として測定した。分布の幅は、９０％累積容積直径を１０％累積容積直径で分割したもの（９０／１０比を示す。）として測定した。粘度は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄデジタル粘度計Ｍｏｄｅｌ  ＤＶ−ＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ、ＭＡ）を使用してこれらの材料について決定した。ＦＴ−ＩＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｔｅｎｓｏｒ２７（Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得た。多核（１３Ｃ、２９Ｓｉ）ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ａｖａｎｃｅ−３００分光計（７ｍｍダブルブロードバンドプローブ）を用いて得た。スピン速度は通常、５．０−６．５ｋＨｚであり、待ち時間（ｒｅｃｙｃｌｅ  ｄｅｌａｙ）は５秒であり、干渉偏波接触時間は６ミリ秒であった。報告された１３Ｃおよび２９Ｓｉ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲスペクトルシフトは、外部標準アダマンタン（１３Ｃ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲ、δ−３８．５５）およびヘキサメチルシクロトリシロキサン（２９Ｓｉ  ＣＰ−ＭＡＳ  ＮＭＲ、δ−９．６２）を使用して、テトラメチルシランに対して記録した。異なるケイ素環境の集団は、ＤＭＦｉｔソフトウェアを用いて、スペクトルデコンボリューションによって評価した。［Ｍａｓｓｉｏｔ、Ｄ．、Ｆａｙｏｎ、Ｆ．、Ｃａｐｒｏｎ、Ｍ．、Ｋｉｎｇ、Ｉ．、Ｌｅ  Ｃａｌｖｅ、Ｓ、Ａｌｏｎｓｏ、Ｂ．、Ｄｕｒａｎｄ、Ｊ．−Ｏ．、Ｂｕｊｏｌｉ、Ｂ．、Ｇａｎ、Ｚ．、Ｈｏａｔｓｏｎ、Ｇ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．２００２、４０、７０−７６］
【０１８９】
［実施例１］
米国特許第６，６８６，０３５号に記載の方法に従って調製した、多孔質エチレン架橋ハイブリッド粒子（６０ｇ、１．８０μｍ、ＳＳＡ＝８８ｍ２／ｇ、ＳＰＶ＝０．６６ｃｍ３／ｇ、ＡＰＤ＝３００Å、６．４１％Ｃ）は、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランが３−メタクリルオキシプロピルトリクロロシランで置換された米国特許第４，８３５，０５８Ａ号の実施例６に詳述されている改質プロセスを利用して表面改質した。このプロセスにおいて、メタクリルオキシプロピル表面改質粒子を、米国特許第６，６８６，０３５号の実施例２４に詳述されているものと類似のアセトン／酢酸アンモニウム溶液にさらした。この反応の生成物は、７．６５％Ｃを有していた。
【０１９０】
［実施例２］
実施例１の材料を、米国特許第４，８３５，０５８Ａ号の実施例６に詳述されているように、メタノール溶液中で、アクリルアミドおよび過硫酸カリウムとさらに反応させた。生成物を３０−５０℃の真空オーブン中で乾燥する。この反応の生成物は、１．１２−１．２０％Ｎを有していた。
【０１９１】
［実施例３］
実施例１および２のプロセスを、３−メタクリルオキシプロピルトリクロロシランを以下、３−メタクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルクロロシラン３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、スチリルエチルトリクロロシラン、スチリルエチルメチルジクロロシラン、スチリルエチルジメチルクロロシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、スチリルエチルメチルジメトキシシラン、スチリルエチルジメチルメトキシシラン、スチリルエチルトリエトキシシラン、スチリルエチルメチルジエトキシシラン、スチリルエチルジメチルエトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、Ｎ−（３−アクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、Ｏ−（メタクリロキシエチル）−Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）ウレタン、Ｎ−（３−メタクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、３−（Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン塩酸塩、
【０１９２】
【化５】
2015121539.tif 000006
の１つ以上と置換して、修正する。
【０１９３】
［実施例４］
実施例２−３のプロセスは、アクリルアミドを以下、ジビニルベンゼン、スチレン、エチレングリコールジメタクリレート、１−ビニル−２−ピロリジノンおよびｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ブチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルアクリレート、２−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ビス（２−シアノエチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリス［（２−アクリロイルオキシ）エチル］イソシアヌレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、イタコン酸、メタクリル酸、トリメチルシリルメタクリレート、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）アンモニウム水酸化物内塩、
【０１９４】
【化６】
2015121539.tif 000007
およびその全体が本明細書に含まれるＰｅｔｅｒ  Ａ．Ｇ．Ｃｏｒｍａｃｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、８０４（２００４）１７３−１８２に詳述されているモノマーの１つ以上と置換して、修正する。
【０１９５】
［実施例５］
実施例２−４のプロセスは、修正されており、重合に使用するモノマーは、３５−９９モルパーセントのアクリルアミドと、６５−１モルパーセントの以下、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ブチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドおよび１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジンのうちの１つとの二元混合物である。この手法により調製された材料は、結合相での架橋を増加させる。これは、酸性および塩基性の移動相にさらしたとき、化学安定性を改善する。また、温度安定性も改善し、化学ブリードを減らし（ＵＶまたはＭＳ検出によって観察された。）、カラムが勾配モードで使用されるときまたは移動相組成物に変化を有するとき（たとえば、水に対するアセトニトリルの異なる比率）、圧力安定性を改善する。
【０１９６】
［実施例６］
実施例２−５のプロセスを、実施例４および５に詳述されているモノマーの二元、三元またはそれ以上の混合物を使用するように修正する。
【０１９７】
［実施例７］
実施例２−６のプロセスは、過硫酸カリウムを、以下、ｔｅｒｔ−アミルペルオキシベンゾエート、４，４−アゾビス（４−シアノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、ベンゾイルペルオキシド、２，２−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、２，５−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ビス（１−（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−１−メチルエチル）ベンゼン、１，１−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルアセテート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、クメンヒドロペルオキシド、シクロヘキサノンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、１，２，４−ペンタンジオンペルオキシドおよび過酢酸のうちの１つと置換するように修正される。
【０１９８】
［実施例８］
実施例１−７のプロセスを、実施例４−６に詳述されている任意のモノマーの可逆的付加フラグメント化連鎖移動（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＲＡＦＴ）で使用できる末端基を持つシランを使用するように修正する。ここに挙げるものは、次式のシランの使用である。
Ａ（ＣＲ８Ｒ９）ｎＳｉ（Ｙ）３−ｘ（Ｒ’）ｘ  （式１）
式中、ｎ＝１−３０、有利には２−３であり、
ｘは０−３、有利には０であり、
Ｙは塩素、ジメチルアミノ、トリフラート、メトキシ、エトキシまたは長鎖アルコキシ基を表し、
Ｒ８およびＲ９は、独立に、水素、メチル、ｎ−アルキル、分枝アルキル、アリール、ナフチル、複素環、カルボン酸またはシアノであり、
Ｒ’は、独立に、アルキル、分枝アルキル、アリールまたはシクロアルキル基を表し、
Ａは、ＲＡＦＴ重合に使用される基を表し、（これらに限定されないが）
【０１９９】
【化７】
2015121539.tif 000008
が挙げられる。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３の各例が、独立に、水素、メチル、ｎ−アルキル、分枝アルキル、アリール、ナフチル、複素環、カルボン酸またはシアノであるとき、
ｎ１０、ｎ１２およびｎ１３は０−３０であり、
Ｘ１０は、存在する場合、カルバメート、カルボネート、チオエーテル、エーテル、アミド、尿素、エポキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、糖、アルキル、アリールまたは複素環基であり、
ｎ１１は０または１である。
ＲＡＦＴに使用した条件および追加の試薬は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＲＡＦＴ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２００８およびその中の参照に詳述されている。この参照はその全体が本明細書に含まれる。
【０２００】
［実施例９］
実施例１−７のプロセスを、実施例４−６に詳述されている任意のモノマーの原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）で使用できる末端基を持つシランを使用するように修正する。この分野に挙げるものは、次式のシランの使用である。
Ｘ（Ｒ８Ｒ９）ｎＳｉ（Ｙ）３−ｘ（Ｒ’）ｘ  （式２）
式中、ｎ＝１−３０、有利には２−３であり、
ｘは０−３、有利には０であり、
Ｙは塩素、ジメチルアミノ、トリフラート、メトキシ、エトキシまたは長鎖アルコキシ基を表し、
Ｒ８およびＲ９は、独立に、水素、メチル、ｎ−アルキル、分枝アルキル、アリール、ナフチル、複素環、カルボン酸またはシアノであり、
Ｒ’は、独立に、アルキル、分枝アルキル、アリールまたはシクロアルキル基を表し、
Ｘは、ＡＴＲＰに利用される基を表し、（これに限定されないが）
【０２０１】
【化８】
2015121539.tif 000009
が挙げられる。
Ｒ１２およびＲ１３の各例が、独立に、水素、メチル、ｎ−アルキル、分枝アルキル、アリール、ナフチル、複素環、シクロアルキル、カルボン酸またはシアノであるとき、
ｎ１４は０−３０であり、
Ｘ１１は、存在する場合、カルバメート、カルボネート、チオエーテル、エーテル、アミド、尿素、エポキシド、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、糖、アルキル、アリールまたは複素環基であり、
ｎ１１は０または１である。
ＡＴＲＰに使用した条件および追加の試薬は、Ｓｉｌａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ、５巻、Ｋ．Ｌ．Ｍｉｔｔａｌ（ＶＳＰ／Ｂｒｉｌｌ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、２００９およびその中の参照に詳述されている。この参照はその全体が本明細書に含まれる。
【０２０２】
［実施例１０］
実施例２−９のプロセスを、重合ステップの間、異なる溶媒系を使用するように修正する。これらの反応のための溶媒として、（これらに限定されないが）以下：メタノール、エタノール、水、プロパノール、トルエン、ベンゼン、ジレン（ｚｙｌｅｎｅ）、トリメチルベンゼン、パラフィン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサン、ジオキサン、エチレングリコール、ジメチルエチレングリコール、ヘキサン、塩化メチレン、クロロホルムおよび超臨界二酸化炭素のうちの１種以上が挙げられる。
【０２０３】
［実施例１１］
実施例１−１０のプロセスを、実施例１に示す基本手順に従って追加の表面改質を利用するように修正し、以下：アミノプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシラン、２−（２−（トリクロロシリル）エチル）ピリジン、２−（２−（トリメトキシ）エチル）ピリジン、２−（２−（トリエトキシ）エチル）ピリジン、２−（４−ピリジルエチル）トリエトキシシラン、２−（４−ピリジルエチル）トリメトキシシラン、２−（４−ピリジルエチル）トリクロロシラン、クロロプロピルトリメトキシシラン、クロロプロピルトリクロロシラン、クロロプロピルトリクロロシラン、クロロプロピルトリエトキシシラン、イミダゾリルプロピルトリメトキシシラン、イミダゾリルプロピルトリエトキシシラン、イミダゾリルプロピルトリクロロシラン、スルホプロピルトリシラノール、カルボキシエチルシラントリオール、２−（カルボメトキシ）エチルメチルジクロロシラン、２−（カルボメトキシ）エチルトリクロロシラン、２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシシラン、ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸、（２−ジエチルホスファトエチル）トリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド、２，２−ジメトキシ−１−チア−２−シラシクロペンタン、ビス（トリクロロシリルエチル）フェニルスルホニルクロリド、２−（クロロスルホニルフェニル）エチルトリクロロシラン、２−（クロロスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（エトキシスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（エトキシスルホニルフェニル）エチルトリメトキシシラン、２−（エトキシスルホニルフェニル）エチルトリクロロシラン、スルホン酸フェネチルトリシラノール、（トリエトキシシリルエチル）フェニルホスホン酸ジエチルエステル、（トリメトキシシリルエチル）フェニルホスホン酸ジエチルエステル、（トリクロロシリルエチル）フェニルホスホン酸ジエチルエステル，ホスホン酸フェネチルトリシラノール、Ｎ−（３−トリメトキシシリルプロピル）ピロール、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４，５−ジヒドロイミダゾール、ビス（メチルジメトキシシリルプロピル）−Ｎ−メチルアミン、トリス（トリエトキシシリルプロピル）アミン、ビス（３−トリメトキシシリルプロピル）−Ｎ−メチルアミン、（Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−アミノプロピル）トリメトキシシラン、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチルアミノプロピルトリメトキシシラン、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ’−ビス（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン、またはＮ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロピルメチルジメトキシシランのうちの１種以上が挙げられる。
【０２０４】
［実施例１２］
実施例１−１１のプロセスは、実施例１に示す基本手順に従って追加の表面改質を利用するように修正され、以下：
Ｚａ（Ｒ’）ｂＳｉ−Ｒ’’（式中、Ｚ＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ、ジアルキルアミノまたはトリフルオロメタンスルホネートであり、ａおよびｂは、それぞれ０−３の整数であるが、但しａ＋ｂ＝３とし、Ｒ’はＣ１−Ｃ６直鎖、環状または分枝アルキル基であり、Ｒ’’は官能基である。）のうちの１種以上が挙げられる。
【０２０５】
別の実施形態において、材料は、ポリマーでコーティングすることによって表面改質される。
【０２０６】
ある実施形態において、Ｒ’は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルおよびシクロヘキシルからなる群から選択される。他の実施形態において、Ｒ’は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シアノ、アミノ、ジオール、ニトロ、エステル、カチオンまたはアニオン交換基、埋め込み極性官能基を含有するアルキル基またはアリール基およびキラル部位からなる群から選択される。ある実施形態において、Ｒ’は、芳香族、フェニルアルキル、フルオロ芳香族、フェニルヘキシル、ペンタフルオロフェニルアルキルおよびキラル部位からなる群から選択される。
【０２０７】
一実施形態において、Ｒ’’はＣ１−Ｃ３０アルキル基である。さらなる実施形態において、Ｒ’’はキラル部位を含む。別のさらなる実施形態において、Ｒ’’はＣ１−Ｃ２０アルキル基である。
【０２０８】
ある実施形態において、表面改質剤は、埋め込み極性官能基を含む。ある実施形態において、このような埋め込み極性官能基として、カーボネート、アミド、尿素、エーテル、チオエーテル、スルフィニル、スルホキシド、スルホニル、チオ尿素、チオカーボネート、チオカルバメート、エチレングリコール、複素環またはトリアゾール官能基が挙げられる。他の実施形態において、このような埋め込み極性官能基として、米国特許第５，３７４，７５５号に開示されるようなカルバメート官能基およびキラル部位が挙げられる。このような基には、以下の一般式のものが挙げられる。
【０２０９】
【化９】
2015121539.tif 000010
（式中、ｌ、ｍ、ｏ、ｒおよびｓは、０または１であり、ｎは０、１、２または３であり、ｐは０、１、２、３または４であり、ｑは０−１９の整数であり、Ｒ３は、水素、アルキル、シアノおよびフェニルからなる群から選択され、Ｚ、Ｒ’、ａおよびｂは上記の通りである。）好ましくは、カルバメート官能基は、以下に示す一般構造を有する。
【０２１０】
【化１０】
2015121539.tif 000011
（式中、Ｒ５は、たとえば、シアノアルキル、ｔ−ブチル、ブチル、オクチル、ドデシル、テトラデシル、オクタデシルまたはベンジルでよい。有利には、Ｒ５は、オクチル、ドデシルまたはオクタデシルである。）
【０２１１】
ある実施形態において、表面改質剤は、フェニルヘキシルトリクロロシラン、ペンタフルオロフェニルプロピルトリクロロシラン、オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシラン、オクチルジメチルクロロシランおよびオクタデシルジメチルクロロシランからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、表面改質剤は、オクチルトリクロロシランおよびオクタデシルトリクロロシランからなる群から選択される。他の実施形態において、表面改質剤は、イソシナネートまたは１，１’−カルボニルジイミダゾール（特にハイブリッド基が（ＣＨ２）３ＯＨ基を含有するとき）からなる群から選択される。
【０２１２】
［実施例１３］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を異なる材料と置き換えるように修正する。ここに挙げるものは、モノリシック、球状、粒状の、表面が多孔質な不規則性材料のシリカ、ハイブリッド有機／無機材料、ハイブリッド無機／有機、シリカ、チアニア、アルミナ、ジルコニア、ポリマーまたは炭素材上のハイブリッド無機／有機表層およびハイブリッド無機／有機、シリカ、チアニア、アルミナ、ジルコニアまたはポリマーもしくは炭素材上のシリカ表層がある。球状、粒状または不規則性材料の粒径は、０．５−１００μｍ、より好ましくは１−５０μｍ、より好ましくは１．５−１０μｍ、より好ましくは１．７−５μｍで変動する。これらの材料のＡＰＤは、２００から２，０００Å、より好ましくは２５０から１，０００Å、より好ましくは３００から１，０００Åで変動する。これらの材料のＳＳＡは、２０から１０００ｍ２／ｇ、より好ましくは９０から８００ｍ２／ｇ、より好ましくは１５０から６００ｍ２／ｇ、より好ましくは３００から５５０ｍ２／ｇで変動する。これらの材料のＴＰＶは、０．２から１．５ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．５から１．２ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．７から１．１ｃｍ３／ｇで変動する。モノリシック材料のマクロ孔径は、０．１から３０μｍ、より好ましくは０．５から２５μｍ、より好ましくは１から２０μｍで変動する。これらの材料に対して、多点Ｎ２収着法または水銀多孔度測定法によって測定して、５−１００％の粒子孔隙率、より好ましくは１０−９０％の粒子孔隙率、より好ましくは２０−８０％の粒子孔隙率、より好ましくは３０−７０％の粒子孔隙率、より好ましくは４０−６０％の粒子孔隙率を充たすやり方で重合ステップを実施する。生成物の窒素含有率は、このプロセスで増加する。
【０２１３】
［実施例１４］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を、平均孔径が４５０Åの球状ＢＥＨ材料に置き換えるように修正する。これらの材料に対して、多点Ｎ２収着法または水銀多孔度測定法によって測定して、５−１００％の粒子孔隙率、より好ましくは１０−９０％の粒子孔隙率、より好ましくは２０−８０％の粒子孔隙率、より好ましくは３０−７０％の粒子孔隙率、より好ましくは４０−６０％の粒子孔隙率を充たすやり方で重合ステップを実施する。生成物の窒素含有率は、このプロセスで増加する。
【０２１４】
［実施例１５］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を、平均孔径が９００−１，０００Åの球状ＢＥＨ材料に置き換えるように修正する。これらの材料に対して、多点Ｎ２収着法または水銀多孔度測定法によって測定して、５−１００％の粒子孔隙率、より好ましくは１０−９０％の粒子孔隙率、より好ましくは２０−８０％の粒子孔隙率、より好ましくは３０−７０％の粒子孔隙率、より好ましくは４０−６０％の粒子孔隙率を充たすやり方で重合ステップを実施する。生成物の窒素含有率は、このプロセスで増加する。
【０２１５】
［実施例１６］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を、球状無孔シリカに置き換えるように修正する。このシリカの粒径は、０．５−１００μｍ、より好ましくは１−５０μｍ、より好ましくは１．５−１０μｍ、より好ましくは１．７−５μｍで変動する。これらの材料のＳＳＡは、０．５−５００ｍ２／ｇ、より好ましくは１−１００ｍ２／ｇ、より好ましくは２−２０ｍ２／ｇで変動する。これらの材料のＴＰＶは、０−０．１ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．０８ｃｍ３／ｇ未満である。これらの材料に対して、このプロセスの生成物の窒素含有率を増加させるやり方で重合ステップを実施する。
【０２１６】
［実施例１７］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を、球状無孔ハイブリッド有機／無機粒子に置き換えるように修正する。このシリカの粒径は、０．５−１００μｍ、より好ましくは１−５０μｍ、より好ましくは１．５−１０μｍ、より好ましくは１．７−５μｍで変動する。これらの材料のＳＳＡは、０．５−５００ｍ２／ｇ、より好ましくは１−１００ｍ２／ｇ、より好ましくは２−２０ｍ２／ｇで変動する。これらの材料のＴＰＶは、０−０．１ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．０８ｃｍ３／ｇ未満である。これらの材料に対して、このプロセスの生成物の窒素含有率を増加させるやり方で重合ステップを実施する。
【０２１７】
［実施例１８］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を、幅広の孔の表面が多孔質のシリカ粒子、幅広の孔の表面が多孔質のハイブリッド有機／無機粒子、幅広の孔の表面が多孔質のシリカモノリスおよび幅広の孔の表面が多孔質のハイブリッド有機／無機モノリスに置き換えるように修正する。このシリカの粒径は、０．５−１００μｍ、より好ましくは１−５０μｍ、より好ましくは１．５−１０μｍ、より好ましくは１．７−５μｍで変動する。これらの材料のＡＰＤは、２００から２，０００Å、より好ましくは２５０から１，０００Å、より好ましくは３００から１，０００Åで変動する。これらの材料のＳＳＡは、１０から５００ｍ２／ｇ、より好ましくは２０から２００ｍ２／ｇ、より好ましくは３０から１００ｍ２／ｇで変動する。これらの材料のＴＰＶは、０．１から０．７ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．１５から０．３５ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．２から０．３ｃｍ３／ｇで変動する。最終粒径（ＲＨＯで表す。）に対する無孔コア径の比率は、０．５−０．９９、より好ましくは０．７−０．９８、より好ましくは０．８−０．９７、より好ましくは０．８５−０．９６、より好ましくは０．８７−０．９５、より好ましくは０．８９−０．９４、より好ましくは０．９０−０．９３で変動する。モノリシック材料のマクロ孔径は、０．１から３０μｍ、より好ましくは０．５から２５μｍ、より好ましくは１から２０μｍで変動する。これらの材料に対して、多点Ｎ２収着法または水銀多孔度測定法によって測定して、５−１００％の粒子孔隙率、より好ましくは１０−９０％の粒子孔隙率、より好ましくは２０−８０％の粒子孔隙率、より好ましくは３０−７０％の粒子孔隙率、より好ましくは４０−６０％の粒子孔隙率を充たすやり方で重合ステップを実施する。生成物の窒素含有率は、このプロセスで増加する。
【０２１８】
［実施例１９］
実施例１−１２のプロセスを、ＢＥＨ（３００Å）材料を、平均孔径が１から５０Å、より好ましくは５から４０Å、より好ましくは１０から３０Åで変動する、完全に多孔質のもしくは表面が多孔質のシリカ粒子、ハイブリッド有機／無機粒子、シリカモノリスまたはハイブリッド有機／無機モノリスに置き換えるように修正する。このシリカの粒径は、０．５−１００μｍ、より好ましくは１−５０μｍ、より好ましくは１．５−１０μｍ、より好ましくは１．７−５μｍで変動する。これらの材料のＳＳＡは、１０から５００ｍ２／ｇ、より好ましくは２０から２００ｍ２／ｇ、より好ましくは３０から１００ｍ２／ｇで変動する。これらの材料のＴＰＶは、０．１から０．７ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．１５から０．３５ｃｍ３／ｇ、より好ましくは０．２から０．３ｃｍ３／ｇで変動する。最終粒径（ＲＨＯで表す。）に対する無孔コア径の比率は、０．５−０．９９、より好ましくは０．７−０．９８、より好ましくは０．８−０．９７、より好ましくは０．８５−０．９６、より好ましくは０．８７−０．９５、より好ましくは０．８９−０．９４、より好ましくは０．９０−０．９３で変動する。モノリシック材料のマクロ孔径は、０．１から３０μｍ、より好ましくは０．５から２５μｍ、より好ましくは１から２０μｍで変動する。これらの材料に対して、多点Ｎ２収着法または水銀多孔度測定法によって測定して、５−１００％の粒子孔隙率、より好ましくは１０−９０％の粒子孔隙率、より好ましくは２０−８０％の粒子孔隙率、より好ましくは３０−７０％の粒子孔隙率、より好ましくは４０−６０％の粒子孔隙率を充たすやり方で重合ステップを実施する。生成物の窒素含有率は、このプロセスで増加する。
【０２１９】
［実施例２０］
実施例１−１９のプロセスを、実施例１に示す基本手順に従って追加の表面改質を利用するように修正し、以下のうちの１種以上が挙げられる。
【０２２０】
有機基およびシラノール基の修飾の組み合わせ。さらに別の実施形態において、材料を、有機基修飾とポリマーによるコーティングとの組み合わせによって表面改質した。さらなる実施形態において、有機基は、キラル部位を含む。さらに別の実施形態において、材料を、シラノール基修飾とポリマーによるコーティングとの組み合わせによって表面改質した。他の実施形態において、材料を、粒子の有機基と修飾試薬との間の有機共有結合の形成を介して表面改質した。さらに他の実施形態において、材料を、有機基修飾、シラノール基修飾およびポリマーによるコーティングの組み合わせによって表面改質した。別の実施形態において、材料を、シラノール基修飾によって表面改質した。
【０２２１】
［実施例２１］
実施例１−２０のプロセスを、以下の溶媒：アセトン、水、ヘキサン、トルエン、メタノール、エタノールおよび超臨界二酸化炭素のうちの１種以上の中で、追加のサイズ変更、洗浄、沈殿、超音波処理および／または処理の各ステップを含むように修正する。
【０２２２】
［実施例２２］
実施例１−２１のプロセスを、以下のプロセスを使用して修正する。
ａ）実施例１、１３−１９に詳述される１種以上の前駆体材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒系を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、一次表面改質にかける。
ｂ）次いで、これらの結果として得られる材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒系を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、二次表面改質にかける。
ｃ）次いで、結果として得られる材料を、実施例２、４−１０に詳述されるプロセスを利用して、三次表面改質にかける。
ｄ）次いで、結果として得られる材料を、実施例２１に詳述される追加の処理にかける。
【０２２３】
［実施例２３］
実施例１−２２のプロセスを、以下のプロセスを使用して修正する。
ａ）実施例１、１３−１９に詳述される１種以上の前駆体材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒および条件を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、一次表面改質にかける。
ｂ）次いで、これらの結果として得られる材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒および条件を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、二次表面改質にかける。
ｃ）次いで、結果として得られる材料を、実施例２、４−１０に詳述されるプロセスを利用して、三次表面改質にかける。
ｄ）次いで、これらの結果として得られる材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒および条件を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、二次表面改質にかける。
ｅ）次いで、結果として得られる材料を、実施例２１に詳述される追加の処理にかける。
【０２２４】
［実施例２４］
実施例１−２２のプロセスを、以下のプロセスを使用して修正する。
ａ）実施例１、１３−１９に詳述される１種以上の前駆体材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒および条件を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、一次表面改質にかける。
ｂ）次いで、結果として得られる材料を、実施例２、４−１０に詳述されるプロセスを利用して、二次表面改質にかける。
ｄ）次いで、これらの結果として得られる材料を、実施例１、３、１０−１２に詳述される溶媒および条件を使用する実施例１、３、１１または１２に詳述されるプロセスを利用して、三次表面改質にかける。
ｅ）次いで、結果として得られる材料を、実施例２１に詳述される追加の処理にかける。
【０２２５】
［実施例２５］
実施例２２−２３のプロセスを、実施例１または３に詳述される重合可能な基を有する１つ以上のシランによる初期の表面改質の後に、実施例１１のイオン性基を有する１つ以上のシランによる第２の表面改質、後続して実施例２、４−１０に詳述されるように、重合可能な基をさらに反応させる第３の表面改質を有するように修正する。
【０２２６】
［実施例２６］
実施例２２−２３のプロセスを、実施例１または３に詳述される重合可能な基を有する１つ以上のシランによる初期の表面改質の後に、実施例１２の１つ以上のシランによる第２の表面改質、後続して実施例２、４−１０に詳述されるように、重合可能な基をさらに反応させる第３の表面改質を有するように修正する。
【０２２７】
［実施例２７］
実施例２２−２３のプロセスを、任意の順で連続的に実施する３つの表面改質を有するように修正し、実施例１または３に詳述される重合可能な基、実施例１２の１つ以上のシランおよび実施例１１のイオン性基を有する１つ以上のシランを含む。結果として得られる材料は、実施例２、４−１０に詳述されるように、重合可能な基をさらに反応させる。
【０２２８】
［実施例２８］
実施例２７のプロセスを、ワンポット反応中で同時に実行する３つの初期表面改質を有するように修正する。
【０２２９】
［実施例２９］
実施例２２−２８のプロセスを、実施例１１のイオン性基を有する１つ以上のシラン、実施例１または３に詳述される１つ以上の重合可能な基を使用し、イオン性基を含有する１種以上の重合可能モノマーを使用する実施例２、４−１０に詳述されるように、重合可能基をさらに反応させるように修正する。
【０２３０】
［実施例３０］
実施例２９のプロセスを、シラン修飾による少なくとも１つおよび重合可能モノマーの反応から生じる少なくとも１つであって、すべての基が同一の電荷を有する（たとえば、酸性または塩基性の基）２つ以上のイオン性基を有するように修正する。
【０２３１】
［実施例３１］
実施例２９のプロセスを、シラン修飾による少なくとも１つおよび重合可能モノマーの反応から生じる少なくとも１つであって、これらの基が異なる電荷を有する（たとえば、酸性、塩基性または双性イオン基）２つ以上のイオン性基を有するように修正する。
【０２３２】
［実施例３２］
結果として得られる生成物が双性イオン基を含有する、実施例２２−３１のプロセス。
【０２３３】
［実施例３３］
実施例２２−２９のプロセスを、実施例２１に詳述される追加のプロセスステップを省くように修正する。
【０２３４】
［実施例３４］
表面が多孔質のシリカ粒子（１．９μｍ、ＳＳＡ＝１９ｍ２／ｇ、ＡＰＤ＝３２４Å）を、実施例１および２に詳述されるプロセスを利用して表面改質した。供給粒子の最終粒径（Ｒｈｏで表す。）に対する無孔コア径の比率は、ＳＥＭおよびＦＩＢ−ＳＥＭによって決定したところ０．８４であった。この反応の生成物は、１．０％Ｃを有していた。
【０２３５】
［実施例３５］
表面が多孔質のシリカ粒子（１．７μｍ、ＳＳＡ＝７ｍ２／ｇ、ＡＰＤ＝２３２Å）を、実施例１および２に詳述されるプロセスを利用して表面改質した。供給粒子の最終粒径（Ｒｈｏで表す。）に対する無孔コア径の比率は、ＳＥＭおよびＦＩＢ−ＳＥＭによって決定したところ０．９３であった。この反応の生成物は、０．４％Ｃを有していた。
【０２３６】
［実施例３６］
多孔質のシリカ粒子（２０μｍ、ＳＳＡ＝３２６ｍ２／ｇ、ＡＰＤ＝１０４Å）を、実施例１および２に詳述されるプロセスを利用して表面改質した。この反応の生成物は、１０．２％Ｃおよび２．０７％Ｎを有していた。
【０２３７】
［実施例３７］
米国特許第６，６８６，０３５号に記載の方法に従って調製した多孔質のエチレン架橋ハイブリッド粒子を、実施例１に詳述するように、３−メタクリルオキシプロピルトリクロロシラン（ＭＯＳ）を使用して一次表面改質し、後続して実施例２に詳述するように、アクリルアミドによる二次反応にかけた。表１は、選択したプロトタイプの詳細を示す。
【０２３８】
【表１】
2015121539.tif 000012
【０２３９】
［実施例３８］
糖タンパク質の分析
材料／試薬
ＬＣ／ＭＳ等級の溶媒（水およびアセトニトリル）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ギ酸（ＦＡ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手した。酢酸アンモニウム（Ｆｌｕｋａ７３５９４）、ギ酸アンモニウム（Ｆｌｕｋａ７０２２１）、アントラニルアミド（２−ＡＢ、Ａ８９８０４）、ウシリボヌクレアーゼＢ（Ｒ−７８８４）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢ（Ｆ−３２６１）、ヨードアセトアミド、Ｌ−塩酸システイン（Ｆｌｕｋａ３０１１９）、プロテオミクス等級トリプシン（Ｔ６５６７）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、塩酸ヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）、ヨードアセトアミド、ヨウ化ナトリウムおよび尿素もＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。第一リン酸ナトリウムは、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテアーゼＩ（Ｌｙｓ−Ｃ）は、Ｗａｋｏ  Ｃｏ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）から購入した。水酸化ナトリウム（１０Ｎ）溶液は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）から入手した。濃塩化水素は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）から購入した。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）およびセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）は、Ｂｅｓｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＯＨ）から得た。カルボキシペプチダーゼＢは、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）から購入した。ＰＮＧａｓｅＦは、Ｐｒｏｚｙｍｅ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）から入手した。ＲａｐｉＧｅｓｔ界面活性剤は、Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から得た。ストレプトコッカス・ピオゲネス（ＩｄｅＳ、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）由来の免疫グロブリン分解酵素は、Ｇｅｎｏｖｉｓ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、氷酢酸およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムは、Ｇｌｙｃｏ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（１８６００７０３４、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）の一部であるＷａｔｅｒｓから得た。
【０２４０】
モデルグリコシル化タンパク質、ＲＮａｓｅＢまたはインタクトなトラスツズマブによるＨＩＬＩＣクロマトグラフィー最適化
本発明における一般的方法開発では、モデルＲＮａｓｅＢを使用する。ＲＮａｓｅＢは、インタクトな糖タンパク質または断片化糖ペプチドとして使用する。
【０２４１】
Ａ．固定相最適化（図１−２および図５）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：様々なＨＩＬＩＣ収着剤を有する口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：
【０２４２】
【表２】
2015121539.tif 000013
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ
勾配（図１）：２０分間で２０％−８０％Ｈ２Ｏ
勾配（図２および図５）：１分間で２０％−３４％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３４％−４１％Ｈ２Ｏ
カラム温度：３０−８０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
【０２４３】
ＭＳ条件
機器：Ｘｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏＦ
源温度：１５０℃
脱溶温度：３５０℃
キャピラリー電圧：３．０ｋＶ
サンプルコーン電圧：４５Ｖ
【０２４４】
Ｂ．移動相添加剤（図３）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）
移動相Ａ：Ｈ２Ｏおよび移動相添加剤
移動相Ｂ：アセトニトリルおよび移動相添加剤
勾配：２０分間で２０％−８０％Ｈ２Ｏ
移動相添加剤：０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸
５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）
０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
カラム温度：８０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
抽出容量：１μｇのタンパク質に０．５μＬ
【０２４５】
Ｃ．カラム圧力（図４Ａ−Ｂ）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、アセトニトリル
勾配：１分間で２０％−３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３０％−３７％Ｈ２Ｏ
分析物の溶出時のカラム圧力：３２００ｐｓｉ、４５００ｐｓｉおよび７２００ｐｓｉ
カラム温度：３０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
抽出容量：３μｇのインタクトなトラスツズマブ（タンパク質）で１．５μＬ
【０２４６】
Ｄ．カラム温度（図６）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル
勾配：２０分間で２０％−８０％Ｈ２Ｏ
カラム温度：３０℃−８０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入容量：１μｇのタンパク質に対して０．５μＬ
【０２４７】
Ｅ．流速（図７）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル
勾配：様々な時間にわたって３４％−４１％Ｈ２Ｏ（流速０．２ｍＬ／ｍｉｎの場合、２０分）
流速：０．１−０．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
注入容量：１μｇのタンパク質に対して０．５μＬ
【０２４８】
Ｆ．サンプル溶媒効果（図５）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル
勾配：１分間で２０％−３０％Ｈ２Ｏ、次いで２０分間で３４％−４１％
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
注入容量：１μｇのタンパク質に対して０．５−１０μＬ（水性希釈液）
【０２４９】
Ｇ．Ｃ４逆相カラムによる直交性（図１１）
ＬＣ条件
機器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
【０２５０】
【表３】
2015121539.tif 000014
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入容量：１μｇのタンパク質に対して０．５μＬ
【０２５１】
グリコシル化モノクローナル抗体のグリコシル化プロファイリング
Ａ．タンパク質サンプル
還元トラスツズマブの調製
トラスツズマブは、変性条件下で還元した。配合したトラスツズマブを１．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、最終組成が６ＭのＧｕＨＣｌおよび８０ｍＭのＴＣＥＰの溶液にし、次いで３７℃で１時間インキュベートした。また、トラスツズマブの他のプロトコル、たとえばＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ界面活性剤の使用を要するものと、８０℃の熱変性を要するものとを評価した。界面活性剤を利用した還元の場合、トラスツズマブを２ｍｇ／ｍＬに希釈して、０．０５％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦおよび４０ｍＭ  ＴＣＥＰで構成される溶液にし、次いで３７℃で１時間インキュベートした。熱変性を要する手順の場合、配合したトラスツズマブを１．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、８０ｍＭ  ＴＣＥＰを含有する溶液とし、次いで１０分間８０℃、後続して５０分間３７℃で加熱した。すべての手順で還元された形態の抗体が生じるが、グアニジン手順は、他の手順と異なり、この調製物の水溶液はアミドＨＩＬＩＣカラムに注入しても自己会合した重鎖を示さないので、大きな利点がある。図１０は、還元したトラスツズマブサンプル調製物のクロマトグラムの比較図を示す。
【０２５２】
トラスツズマブおよびセツキシマブのＩｄｅＳ消化
ＩｄｅＳによる消化の前に、セツキシマブは、カルボキシペプチダーゼＢによって消化されて、抗体の典型であるリシンＣ末端残基の部分的除去を完了させた（Ａｙｏｕｂら、Ｃｏｒｒｅｃｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｙｃｏ−ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ，ｍｉｄｄｌｅ−ｕｐ，ｍｉｄｄｌｅ−ｄｏｗｎ  ａｎｄ  ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ＥＳＩ  ａｎｄ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＭＡｂｓ、５（５）、６９９−７１０、２０１３）。配合したセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）は、カルボキシペプチダーゼＢ（２２３ｕ／ｍｇ）と１００：１（ｗ／ｗ）の比率で混合し、２０ｍＭ  ホスフェート（ｐＨ７．１）に希釈し、１．８ｍｇ／ｍＬの濃度で２時間３７℃にてインキュベートした。次いで、カルボキシペプチダーゼＢで処理したセツキシマブを１００単位のＩｄｅＳに添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。同様に、配合したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を２０ｍＭ  ホスフェート（ｐＨ７．１）に希釈し、１００単位のＩｄｅＳに添加し、３ｍｇ／ｍＬの濃度で３０分間３７℃にてインキュベートした。
【０２５３】
結果として得られたＩｄｅＳ消化抗体は両方とも変性し、１Ｍ  ＴＣＥＰおよび固体ＧｕＨＣｌの添加によって還元した。変性／還元ステップの最終緩衝液組成物は、およそ６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、８０ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７．１）であった。ＩｄｅＳ消化セツキシマブ（０．９ｍｇ／ｍＬ）およびＩｄｅＳ消化トラスツズマブ（１．５ｍｇ／ｍＬ）をこの緩衝液中、３７℃で１時間インキュベートした後、４℃で保管した。
【０２５４】
トラスツズマブのペプチドへの消化
既刊の手順を改作して、非還元Ｌｙｓ−Ｃ消化のトラスツズマブを調製した（Ｌａｕｂｅｒら、Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＭＳ−Ｆｒｉｅｎｄｌｙ  Ｍｏｂｉｌｅ  Ｐｈａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｇｅ−Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃ１８．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ２０１３、８５（１４）、６９３６−４４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２０１１、４１１（２）、２８４−９１）。抗体は、先ず、非還元条件下、ヨードアセトアミドの存在下で変性し、これは遊離チオールをアルキル化する作用をし、これによりジスルフィドスクランブリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）を最小限にした。抗体を２．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、最終組成が５．８Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０．５ｍＭヨードアセトアミドおよび０．１Ｍホスフェート（ｐＨ７．１）の変性緩衝液とし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。後続して、変性トラスツズマブを、緩衝液を含有する尿素で０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、アクロモバクタープロテアーゼＩ（Ｌｙｓ−Ｃ）と２０：１ｗ／ｗ比率で混合した。消化中の最終緩衝液組成物は、３Ｍ尿素、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、４０ｍＭ  ＮＨ２ＯＨ、０．０８ｍＭヨードアセトアミドおよび０．１Ｍホスフェート（ｐＨ７．１）であった。Ｌｙｓ−Ｃ消化は、３７℃で１６時間インキュベートした後、ＴＦＡによる酸性化によって失活させ、分析まで−８０℃で保管した。
【０２５５】
セツキシマブのペプチドへの消化
還元およびアルキル化されたセツキシマブ（有効期限前）は、アクロモバクタープロテアーゼＩ（Ｌｙｓ−Ｃ）およびトリプシンの組み合わせによって消化した。配合したセツキシマブを１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって緩衝液交換して、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ  ＤＴＴおよび０．２Ｍホスフェート（ｐＨ８．１）の溶液とし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。その後、サンプルをヨードアセトアミド溶液で希釈し、抗体濃度を８ｍｇ／ｍＬにし、緩衝液組成物を４．８Ｍ  ＧｕＨＣｌ、４０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭヨードアセトアミドおよび０．１７Ｍホスフェート（ｐＨ８．１）にした。ヨードアセトアミドによってアルキル化させて、３７℃の暗闇の中で１０分間、これらの条件下、進めた後にシステインの添加によって失活させ、尿素含有緩衝液で希釈し、アクロモバクタープロテアーゼＩ（Ｌｙｓ−Ｃ）と４：１ｗ／ｗ比率で混合した。結果として得られた０．８ｍｇ／ｍＬのセツキシマブ、０．５Ｍ  ＧｕＨＣｌ、３Ｍ尿素、４０ｍＭ  ＮＨ２ＯＨ、４ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭヨードアセトアミド、６ｍＭシステインおよび０．１Ｍホスフェート（ｐＨ約７．１）の消化溶液は、３７℃でインキュベートした。インキュベートの２時間後、この消化溶液を水と一定分量のトリプシンで２倍に希釈し、タンパク質：トリプシン比率が４：１（ｗ／ｗ）になるようにした。さらに２時間３７℃でインキュベートした後、消化溶液を再度、水および新鮮な一定分量のトリプシンで２倍に希釈した。タンパク質：トリプシンの総比率が２：１（ｗ／ｗ）で、消化を放置して３７℃で１６時間インキュベートさせた。このインキュベーションの後、ＴＦＡで酸性化することによって消化を失活させ、分析まで−８０℃で保管した。
【０２５６】
Ｂ．インタクトなグリコシル化モノクローナル抗体およびそのフラグメントのキャラクタリゼーションのためのＨＩＬＩＣクロマトグラフィーおよび質量分析法
インタクトなトラスツズマブのグリコフォームは、１．７μｍのポリアミド結合した幅広の孔のＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）固定相、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＸｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏｆ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して分離および分析した。トラスツズマブの水溶液を２．１ｍｍＩＤカラムに、１．５μＬの容量で注入した。注入サンプル（３μｇ）を、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３０℃および１分ランプの２０から３０％の水性移動相に後続して２０分ランプの３０から３７％水性移動相（水性移動相：水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ；有機移動相：ＡＣＮ中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）からなる勾配を利用して分離した。図４Ａ−Ｂおよび図６は、これらの分離の例を示す。こうした記述と同様の方法は、トラスツズマブ由来のグリコシル化重鎖およびトラスツズマブＩｄｅＳ消化を起源とするグリコシル化フラグメントのＨＩＬＩＣベース分離にも適用した。これらの分析において、１μｇのサンプルを、高濃度の変性剤（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ）を含有する水性希釈液０．６７μＬ中で注入した。同一の方法を利用して、カルボキシペプチダーゼＢで処理したセツキシマブのＩｄｅＳ消化物中に存在するグリコシル化種を分離したが、この分離において、カラム温度６０℃を利用してグリコフォーム間で所望の選択性を実現した。図８Ａ−Ｂ、１１、１４および１５は、これらの分離の例を示す。
【０２５７】
ＩｄｅＳ断片化トラスツズマブの逆相（ＲＰ）分離を実施して、ＲＰ分離および記載のＨＩＬＩＣ分離間の直交性を実証した。ＢＥＨ３００  Ｃ４カラム（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、３００Å、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎおよび温度８０℃で、１分ランプの５から３３．３％有機移動相に後続して２０分ランプの３３．３から４０．３％有機移動相（水性移動相：水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ；有機移動相：ＡＣＮ中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）からなる直線勾配に沿って、サンプルをクロマトグラフィーにかけた。図１１は、逆相Ｃ４と、ＩｄｅＳ断片化トラスツズマブのＨＩＬＩＣアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）ベースの分離との比較を表す。
【０２５８】
上記の分離の間に溶出する種は、２１４および２８０ｎｍの紫外吸光度（２Ｈｚ走査周波数）を介し、後続してオンラインＥＳＩ−ＭＳによって連続的に検出した。質量スペクトルを、キャピラリー電圧３．０ｋＶ、源温度１５０℃、脱溶媒和温度３５０℃およびサンプルコーン電圧４５Ｖで操作するＸｅｖｏ  Ｇ２  ＱＴｏＦで得た。質量スペクトルを、５００−４０００ｍ／ｚの範囲にわたって、およそ２０，０００の分解能によって２Ｈｚの周波数で得た。
【０２５９】
質量スペクトルのデコンボリューション
粗ＥＳＩ質量スペクトルは、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｖ４．１）およびＭａｘＥｎｔ１を使用してデコンボリューションした。デコンボリューションパラメーターは以下の通りであった：ｍ／ｚ入力範囲は８００−３２００（ＲＮａｓｅＢ）、８００−３８００（ＩｄｅＳ  ｍＡｂフラグメント）および２０００−４０００（インタクトなｍＡｂ）であり；出力質量範囲は１０，０００−２０，０００（ＲＮａｓｅＢ）、２０，０００−４０，０００（ＩｄｅＳ  ｍＡｂフラグメント）および１４０，０００−１６０，０００（インタクトなｍＡｂ）に設定し；出力解像度は０．１Ｄａ／チャンネル（ＲＮａｓｅＢ）、０．５Ｄａ／チャンネル（ＩｄｅＳ  ｍＡｂフラグメント）および１Ｄａ／チャンネル（インタクトなｍＡｂ）に設定し；均一なガウスモデルの高さが半分のときの幅は１Ｄａ（ＲＮａｓｅＢおよびＩｄｅＳ  ｍＡｂフラグメント）および１．５Ｄａ（インタクトなｍＡｂ）に設定し；左右の最小強度比は３３％に設定し；反復の最大回数を１５と規定した。
【０２６０】
グリコシル化のプロファイリングロット間変動
トラスツズマブの種々のバッチは、ｍＡｂのグリカンプロファイルのロット間変動を研究する手段として、上記のＩｄｅＳフラグメントレベルの分析で、複製物でキャラクタライズされた。ＵＶクロマトグラムはＵＮＩＦＩ  Ｖ１．６を使用して統合され、主な成分／断片は相対存在量の形態で定量化した。図１４は、本発明の固定相材料によって得られた異なる製造バッチからのＩｄｅＳ消化トラスツズマブに対応するクロマトグラム一式を示す。種々の分解グリコフォームの統合および相対定量を実証する。
【０２６１】
Ｃ．糖ペプチドマッピングのためのＨＩＬＩＣクロマトグラフィーおよび質量分析法
モノクローナル抗体（トラスツズマブおよびセツキシマブ）のトリプシンおよびＬｙｓ−Ｃ消化は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）によるＨＩＬＩＣ−ＵＶ−ＭＳによって分析した。
【０２６２】
ＨＩＬＩＣクロマトグラフィーのための調製において、水性Ｌｙｓ−Ｃおよびトリプシン消化物を、１：４の比率で、アセトニトリルで希釈し、１６×１０００ｇで１０分間遠心分離し、任意の不溶性組成物を除去した。その後、遠心分離にかけた消化物の上澄みを注入した。
【０２６３】
これらの分析に特有の結果を図９および図１６に示す。図９は、本発明の固定相材料でキャラクタライズしたＬｙｓ−Ｃ消化トラスツズマブのクロマトグラムである。図１６は、３００Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相（本発明における固定相材料）によって得られたトラスツズマブのトリプシンの糖ペプチドマッピングに対応するクロマトグラムを表す。
【０２６４】
固定相最適化（図１２）
ＬＣ条件
機器：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）
カラム：様々なＨＩＬＩＣ収着剤を有する口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ）
ＨＩＬＩＣ収着剤：１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（１３０Å  ＡＰＤ）
１．７μｍアミド結合ＢＥＨ（３００Å  ＡＰＤ）
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ、ＡＣＮ
勾配：６０分間で２０％−５０％Ｈ２Ｏ
カラム温度：３０−６０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＴＵＶ検出器（５００ｎＬフローセル、１０Ｈｚ走査周波数）、
２１４ｎｍでの吸光度
【０２６５】
各実行の最初の５分は、廃液は、ＥＳＩ源に回さず、消費した。
【０２６６】
ＭＳ条件
機器：Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ質量分析計
源温度：１２０℃
脱溶媒和温度：３５０℃
キャピラリー電圧：３．０ｋＶ
サンプルコーン電圧：２５Ｖ
質量スペクトルは、５０−２５００ｍ／ｚの範囲にわたっておよそ２０，０００の分解能で１０Ｈｚの周波数にて得られた。
【０２６７】
さらに、実時間質量補正を、ｌｏｃｋｓｐｒａｙを介して、０．１μＭ  Ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢの５０：５０水／ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡ中溶液で利用した。この校正物質は、２０μｌ／ｍｉｎの流速で浸出させ、１分毎にサンプルを抜き取った。
【０２６８】
モノクローナル抗体のグリコシル化の同定
これらの分離の間に得られたデータを、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ（Ｖ１．３．３）による自動解釈およびＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｖ４．１）による手動解釈を通して分析した。糖ペプチド同定は、シリコタンパク質消化によって生じたペプチドの実験質量と理論的質量とをマッチングさせ、またトラスツズマブおよびセツキシマブについて過去に報告されたグリカンを考慮して行なった（ＭＡｂｓ  ２０１３、５（５）、６９９−７１０；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３、９８８、９３−１１３；Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００７、３６４（１）、８−１８）。トラスツズマブ由来の糖ペプチドは、最も豊富な糖ペプチドに対して１％のイオン強度レベルまで下げて同定し、各特有のクロマトグラフィーピークの組成物は、その保持時間で検出した最も豊富な糖ペプチドに対して５％のイオン強度レベルから見つけ出した。セツキシマブ由来の糖ペプチドは、それぞれ２％および１０％の相対強度で、同様に同定した。同定した糖ペプチドで観察された質量は、理論的質量と１１ｐｐｍ以内で合致が見出された。
【０２６９】
放出されたグリカンの分析
トラスツズマブ由来の２−ＡＢ標識された放出Ｎ結合型グリカンを調製し、トラスツズマブの糖ペプチドマッピング分析と平行して分析して、グリカン分析の近年の最先端手法を基準に従って評価した（Ｈｏｕｅｌ、Ｓ．；Ｙｕ、Ｙ．Ｑ．；Ｃｏｓｇｒａｖｅ、Ｅ．；Ｃｈｅｎ，Ｗ．、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｌｅａｓｅｄ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ：Ａ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  Ｉｎ  ＨＰＬＣ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２０１３）。Ｎ結合型グリカンを放出させ、Ｇｌｙｃｏ  Ｗｏｒｋｓ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（１７６００３０９０、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して２−ＡＢで標識化した。配合したトラスツズマブを０．５ｍｇ／ｍＬに希釈して、０．１％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ界面活性剤、５ｍＭ  ＤＴＴおよび２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）を含有する緩衝液とし、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。これに続いて、アルキル化ステップを行い、ｍＡｂを室温で３０分間、１０ｍＭヨードアセトアミドと一緒にインキュベーションにかけた。その後、依然として濃度がおよそ０．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを、およそ０．１％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦを含有する２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）緩衝液中で１６時間、５：１の酵素活性濃度（Ｕ／ｍＬ）とタンパク質重量濃度（ｍｇ／ｍＬ）の比率で、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｇｌｙｋｏ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ、ＧＫＥ５００６Ａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）にさらした。その後、放出グリカンを、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ  ＨＩＬＩＣ溶出用マイクロプレート（１８６００２７８０、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用してＰＮＧａｓｅＦ消化物から抽出した。５ｍｇのＨＩＬＩＣ固相抽出（ＳＰＥ）収着剤（溶出用マイクロプレートの個々のウェルに充填されている。）を、２００μＬ容量の水、後続して２００μＬの１５：８５の水／ＡＣＮでコンディショニングした。続けて、５０μＬのＰＮＧａｓｅＦ消化物をＡＣＮで４００μＬまで希釈し、ＳＰＥ収着剤にロードした。次いで、吸着サンプルを２００μＬの８５％ＡＣＮで３回洗浄した。この後、グリカンを、各容量が３μＬ、５０μＬの１００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７）、５％ＡＣＮで溶出し、得られた溶出液を真空下で乾燥した。グリコシルアミン末端グリカンを、遊離した還元終端を有するグリカンに変換するために、乾燥溶出液を５０μＬの１％（ｖ／ｖ）ギ酸、５０：５０の水／ＡＣＮ中で再構成し、室温で４０分間インキュベートした後、真空下で乾燥した。
【０２７０】
酸処理の後、グリカンを、還元的アミノ化の手段によって２−ＡＢで標識化し、乾燥グリカンは、９０ｍＭ  ２−ＡＢおよび２４０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含有する容量１０μＬの３０：７０の酢酸／ＤＭＳＯ中で再構成した後、６５℃で３時間インキュベートした。次いで、非標識の放出グリカンをＰＮＧａｓｅＦ消化物から抽出したように、結果として得られた２−ＡＢ標識グリカンは、ＨＩＬＩＣ  ＳＰＥを使用して２−ＡＢ標識化する混合物から抽出した。この最終的ＳＰＥクリーンアップから得られた溶出液は、真空下で乾燥し、４０：６０の水／ＡＣＮ中で再構成させ、分析まで４℃で保管した。
【０２７１】
２−ＡＢ標識化Ｎ−グリカンの分離および分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＦＬＲ検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）およびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いたＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ−ＭＳによって実施した。およそ９μｇのトラスツズマブから調製した標識化Ｎ−グリカンは、グルコース単位（ＧＵ）値をクロマトグラフィーピークに割り当て、ＧｌｙｃｏＢａｓｅを使用して試験的に種を同定するように先に用いられた条件を使用して、ポリアミド結合した標準孔径のＢＥＨ粒子で充填された口径の狭いカラム（２．１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å）にロードし、分離した（Ｈｏｕｅｌら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｌｅａｓｅｄ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｎｏｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ：Ａ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ  Ｉｎ  ＨＰＬＣ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２０１３；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、ＧｌｙｃｏＢａｓｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏＧＵ：ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＨＰＬＣ−ｂａｓｅｄ  ｇｌｙａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２４（９）、１２１４−１２１６、２００８）。簡潔に言えば、分離は、カラム温度４０℃、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎおよび３０％水性移動相での２．０６分間の保持後、３２．７４分にわたる３０から４７％水性移動相からの二元の直線勾配（水性移動相：５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．４；有機移動相：ＡＣＮ）からなる方法によって行なわれた。溶出種を、蛍光（２μＬフローセル；３６０／４２８ｎｍでの励起／発光；１０Ｈｚ走査周波数；Ｇａｉｎ＝１）およびＥＳＩ−ＭＳによって連続的に検出した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２−Ｓは、以下の設定：キャピラリー電圧３．０ｋＶ、源温度１２０℃、脱溶媒和温度３５０℃およびサンプルコーン電圧８０Ｖで操作される。質量スペクトルは、２Ｈｚの周波数で、およそ２０，０００の分解能にて５００−２５００ｍ／ｚの範囲を超えて得た。質量補正は、流速２０μｌ／ｍｉｎで注入し、１分毎にサンプル採集した、０．１μＭ  Ｇｌｕ−フィブリノペプチドＢの、５０：５０の水／ＡＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸中溶液を用いるｌｏｃｋｓｐｒａｙを介して、実時間で用いた。
【０２７２】
図１３は、３００Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相によって得られたトラスツズマブのＬｙｓ−Ｃ糖ペプチドマッピング対１３０Åの孔を有する親水性ポリアミド結合固定相によって得られた（トラスツズマブ由来の）アントラニルアミド標識、放出Ｎグリカンの分析に対応するクロマトグラムを表す。
【０２７３】
タンパク質配列データ
トラスツズマブおよびセツキシマブの各配列は、過去の刊行物（Ｈａｒｒｉｓら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ、７５２（２）、２３３−４５、２００１）およびＩＭＧＴ／ｍＡｂ−ＤＢ（Ｐｏｉｒｏｎら、ＩＭＧＴ／ｍＡｂ−ＤＢ：ｔｈｅ  ＩＭＧＴ（登録商標）ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎ  ＪＯＢＩＭ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ、２０１０）から得られた。
【０２７４】
参照による組み込み
すべての特許、刊行された特許出願および本明細書中で引用されたその他の参考文献の全内容は、参照によりそれらの全内容が本明細書中に明確に組み込まれる。
【０２７５】
等価物
当業者は、慣例的な実験をこれ以上することなく、本明細書に記載の特定の手順の数々の等価物を認識するまたは確認できる。このような等価物は、本発明の範囲内と見なされ、以下の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
2015121539.tif 000017
【図２】
2015121539.tif 000018
【図３】
2015121539.tif 000019
【図４Ａ】
2015121539.tif 000020
【図４Ｂ】
2015121539.tif 000021
【図５】
2015121539.tif 000022
【図６】
2015121539.tif 000023
【図７】
2015121539.tif 000024
【図８Ａ−Ｂ】
2015121539.tif 000025
【図９】
2015121539.tif 000026
【図１０】
2015121539.tif 000027
【図１１】
2015121539.tif 000028
【図１２】
2015121539.tif 000029
【図１３】
2015121539.tif 000030
【図１４】
2015121539.tif 000031
【図１５】
2015121539.tif 000032
【図１６】
2015121539.tif 000033
【図１７】
2015121539.tif 000034
【図１８】
2015121539.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月25日(2015.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の親水性モノマーおよびポリアミド結合相を含むコポリマーを含み、平均孔径が２００Å以上である、多孔質材料。
【請求項２】
平均孔径が２５０Å以上である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項３】
平均孔径が３００Å以上である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項４】
平均孔径が４５０Å以上である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項５】
前記コポリマーを含む多孔質粒子を含む、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項６】
前記コポリマーを含む多孔質モノリスを含む、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項７】
前記親水性モノマーが、３−メタクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルクロロシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリクロロシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジクロロシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルクロロシラン３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、スチリルエチルトリクロロシラン、スチリルエチルメチルジクロロシラン、スチリルエチルジメチルクロロシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、スチリルエチルメチルジメトキシシラン、スチリルエチルジメチルメトキシシラン、スチリルエチルトリエトキシシラン、スチリルエチルメチルジエトキシシラン、スチリルエチルジメチルエトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、Ｎ−（３−アクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、Ｏ−（メタクリロキシエチル）−Ｎ−（トリエトキシシリルプロピル）ウレタン、Ｎ−（３−メタクリロキシ−２−ヒドロキシプロピル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリエトキシシラン、メタクリロキシメチルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルオキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、３−（Ｎ−スチリルメチル−２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン塩酸塩、
【化１】
2015121539.tif 000036
である、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項８】
前記ポリアミド結合相が、アクリルアミド、ジビニルベンゼン、スチレン、エチレングリコールジメタクリレート、１−ビニル−２−ピロリジノンおよびｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ブチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルアクリレート、２−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ビス（２−シアノエチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３−（アクリルオキシ）−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、トリス［（２−アクリロイルオキシ）エチル］イソシアヌレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、イタコン酸、メタクリル酸、トリメチルシリルメタクリレート、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］ジメチル（３−スルホプロピル）水酸化アンモニウム内塩、
【化２】
2015121539.tif 000037
に由来する、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項９】
第２のポリアミド結合相を含む、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項１０】
第２のポリアミド結合相が、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ブチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミドまたは１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジンに由来する、請求項９に記載の多孔質材料。
【請求項１１】
第１のポリアミド結合相が、全ポリアミド結合相の３５から９９モル％を占める、請求項８に記載の多孔質材料。
【請求項１２】
第２のポリアミド結合相が、全ポリアミド結合相の６５から１モル％を占める、請求項８に記載の多孔質材料。
【請求項１３】
１００Åから１０００Åの中央孔径を有する、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項１４】
３００Åから８００Åの中央孔径を有する、請求項１２に記載の多孔質材料。
【請求項１５】
３００Åから５５０Åの中央孔径を有する、請求項１３に記載の多孔質材料。
【請求項１６】
３００Åの中央孔径を有する、請求項１４に記載の多孔質材料。
【請求項１７】
窒素含有率が、０．５％Ｎから２０％Ｎである、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項１８】
窒素含有率が、１％Ｎから１０％Ｎである、請求項１７に記載の多孔質材料。
【請求項１９】
窒素含有率が、２％Ｎから１０％Ｎである、請求項１８に記載の多孔質材料。
【請求項２０】
窒素含有率が、４％Ｎから１０％Ｎである、請求項１９に記載の多孔質材料。
【請求項２１】
混合物を、請求項１に記載の多孔質材料を含むクロマトグラフィー材料と接触させ、これにより混合物から成分を除去または単離することを含む、混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２２】
多孔質材料が、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルカプロラクタム）コポリマーである、請求項２１に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２３】
成分が生物学的材料である、請求項２２に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２４】
生物学的材料が、インタクトなタンパク質、変性タンパク質、修飾タンパク質、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項２３に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２５】
生物学的材料が、封入体、生体液、生物組織、生体マトリックス、埋め込み組織サンプルまたは細胞培養上清である、請求項２３に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項２６】
混合物中の成分のレベルを決定する方法であって、
ａ）成分を多孔質材料に収着させる条件下で、混合物を、請求項１に記載の多孔質材料を含むクロマトグラフィー材料と接触させること、
ｂ）収着した成分を有するクロマトグラフィー材料を、多孔質材料から成分を脱着させる条件下で、溶媒で洗浄すること、および
ｃ）脱着した成分のレベルを決定すること
を含む、方法。
【請求項２７】
多孔質材料が、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルカプロラクタム）コポリマーである、請求項２６に記載の混合物中の成分のレベルを決定する方法。
【請求項２８】
成分が生物学的材料である、請求項２７に記載の混合物中の成分のレベルを決定する方法。
【請求項２９】
生物学的材料が、インタクトなタンパク質、変性タンパク質、修飾タンパク質、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドである、請求項２８に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項３０】
生物学的材料が、封入体、生体液、生物組織、生体マトリックス、埋め込み組織サンプルまたは細胞培養上清である、請求項２８に記載の混合物から成分を除去または単離する方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の多孔質材料を含む分離装置。
【請求項３２】
前記装置が、クロマトグラフィーカラム、カートリッジ、薄層クロマトグラフィープレート、濾過膜、サンプルクリーンアップ装置、固相有機合成担体およびマイクロタイタープレートからなる群から選択される、請求項３１に記載の分離装置。
【請求項３３】
請求項１に記載の多孔質材料を含む親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジ。
【請求項３４】
多孔質材料を含有する終端部が開口のカラムを含む、請求項３３に記載の親水性相互作用クロマトグラフィーカートリッジ。
【請求項３５】
グリコシル化タンパク性サンプルを分析する方法であって、前記サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させるステップを含み、前記固定相材料が、少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含む、方法。
【請求項３６】
前記グリコシル化タンパク性サンプルが、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
固定相材料が、完全に多孔質であるまたは表面が多孔質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記孔の平均直径が２００Å以上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記孔の平均直径が２５０Å以上である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記孔の平均直径が３００Å以上である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記孔の平均直径が４５０Å以上である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記孔の平均直径が１から５０Åである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記孔の平均直径が５から４０Åである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記孔の平均直径が１０から３０Åである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
固定相材料が、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
脂肪族架橋シランの脂肪族基がエチレンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
固定相材料が、１種以上の粒子形態である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
粒子の平均直径が０．１μｍから５００μｍである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
粒子の平均直径が１μｍから１００μｍである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
粒子の平均直径が１μｍから１０μｍである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
水性サンプルが、クロマトグラフィーカラム体積の１／１００未満の注入容量を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルをサンプル希釈液中で調製するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
サンプル希釈液が変性剤を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
変性剤が塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせによってサンプルを調製するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
クロマトグラフィーの移動相溶離液が高有機溶離液である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
クロマトグラフィーの移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
イオン対形成剤を移動相溶離液に添加するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５９】
イオン対形成剤が、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸およびブタン酸からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が３，０００ｐｓｉ以上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項６１】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が４，０００ｐｓｉ以上である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が５，０００ｐｓｉ以上である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が６，０００ｐｓｉ以上である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
サンプルを、クロマトグラフィーカラム中の固定相材料と接触させたときのカラム圧力が７，０００ｐｓｉ以上である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
グリコシル化タンパク性サンプルを同定するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６６】
グリコシル化タンパク性サンプルを同定するステップが、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
グリコシル化タンパク性サンプルを同定するステップが、質量分析ピークとコンピューターデータベース中の既知の化合物との比較によってさらに行われる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
糖ペプチドをキャラクタライズするために親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）糖ペプチドを含有するサンプルをサンプル希釈液中で調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびに前記カラム中の固定相材料を準備するステップであって、前記固定相材料が少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含むステップ、
ｃ）カラム入口圧力３，０００ｐｓｉ以上でサンプルを前記固定相材料にロードし、移動相溶離液とともにサンプルを前記カラムに通して流すステップ、
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ、
ｅ）分画を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項６９】
前記糖ペプチドが、糖タンパク質またはグリコシル化モノクローナル抗体に由来する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
固定相材料が、完全に多孔質または表面が多孔質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記孔の平均直径が２００Å以上である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記孔の平均直径が２５０Å以上である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記孔の平均直径が３００Å以上である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記孔の平均直径が１から５０Åである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記孔の平均直径が５から４０Åである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記孔の平均直径が１０から３０Åである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
固定相材料が、脂肪族架橋シランを含む有機−無機ハイブリッドコアを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
脂肪族架橋シランの脂肪族基がエチレンである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
固定相材料が、１種以上の粒子形態である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
粒子の平均直径が、０．１μｍから５００μｍである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
粒子の平均直径が、１μｍから１００μｍである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
粒子の平均直径が、１μｍから１０μｍである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
水性サンプルが、カラム体積の１／１００未満の注入容量を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
サンプル希釈液が変性剤を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
変性剤が塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
サンプルを調製するステップが、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８７】
移動相溶離液が、高有機溶離液である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８８】
移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
イオン対形成剤を移動相溶離液に添加するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９０】
イオン対形成剤が、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、ペンタフルオロプロピオン酸、ノナフルオロペンタン酸、酢酸、プロパン酸およびブタン酸からなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
カラム入口圧力が、４，０００ｐｓｉ以上である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９２】
カラム入口圧力が、５，０００ｐｓｉ以上である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
カラム入口圧力が、６，０００ｐｓｉ以上である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
カラム入口圧力が、７，０００ｐｓｉ以上である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
糖ペプチドを同定するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９６】
糖ペプチドを同定するステップが、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法またはこれらの組み合わせによって行われる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
糖ペプチドを同定するステップが、質量分析ピークとコンピューターデータベース中の既知の化合物との比較によってさらに行われる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
グリコシル化モノクローナル抗体をキャラクタライズするために親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）グリコシル化モノクローナル抗体を含有するサンプルを調製するステップであって、グリコシル化モノクローナル抗体が、還元、酵素消化、変性、フラグメント化、化学開裂またはこれらの組み合わせによって調製されるステップ、
ｂ）入口および出口を有するカラムならびに固定相材料を準備するステップであって、前記固定相材料が、少なくとも１種の親水性モノマーおよび複数の孔を有するポリアミド結合相を含み、孔のサイズが３００Å以上または１Åから５０Åの間の直径であるステップ、
ｃ）３，０００ｐｓｉ以上のカラム入口圧力で、サンプルを前記固定相材料にロードし、サンプルを移動層溶離液とともに前記カラムに通して流し、ここでイオン対形成剤をサンプルおよび／または移動相溶離液に添加するステップであって、移動相溶離液が、アセトニトリル、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、水およびこれらの混合物からなる群から選択され、ならびに前記サンプルの水性注入容量がカラム体積の１／１００未満であるステップ、
ｄ）１つ以上のサンプル分画に分離するステップ、
ｅ）分画を、紫外検出、ＥＳＩ−ＭＳ、蒸発光散乱、蛍光、質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ、ＭＳｅ、核磁気共鳴、赤外分析法もしくはこれらの組み合わせによってまたは質量分析ピークとコンピューターデータベース中の既知の化合物との比較によって同定するステップ
を含む、方法。
【請求項９９】
グリコシル化タンパク質またはペプチドを分離するために親水性クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を実施する方法であって、
ａ）グリコシル化タンパク質またはペプチドを含有するサンプルを調製するステップ、
ｂ）入口および出口を有するＨＩＬＩＣカラムならびに固定相材料を準備するステップ、
ｃ）カラム入口圧力３，０００ｐｓｉ以上でサンプルを前記固定相材料にロードし、移動相溶離液とともにサンプルを前記カラムに通して流すステップ、ならびに
ｄ）出口からのサンプルを１つ以上の分画に分離するステップ
を含む、方法。
【外国語明細書】
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