(57)【要約】【課題】血小板回収効率の向上を可能とする血小板産生デバイス等を提供すること。【解決手段】本血小板産生デバイスは、血小板を産生する巨核球が設置される巨核球設置面を備えた薄膜と、前記巨核球設置面に設けられ、前記巨核球設置面を、夫々に設置される巨核球の数が制限された複数の領域に分割する仕切り部と、を有し、夫々の前記領域には、前記薄膜を貫通する孔が配されている。【選択図】図２
2015163060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を産生する巨核球が設置される巨核球設置面を備えた薄膜と、
前記巨核球設置面に設けられ、前記巨核球設置面を、夫々に設置される巨核球の数が制限された複数の領域に分割する仕切り部と、を有し、
夫々の前記領域には、前記薄膜を貫通する孔が配されている血小板産生デバイス。
【請求項２】
前記巨核球設置面の外縁部には環状の枠部が設けられ、
夫々の前記領域は、前記枠部と前記仕切り部とにより側壁が形成され、前記巨核球設置面により底面が形成された、巨核球を設置するための巨核球設置溝である請求項１記載の血小板産生デバイス。
【請求項３】
前記巨核球設置溝の深さは、２０μｍ以上２００μｍ以下である請求項２記載の血小板産生デバイス。
【請求項４】
前記巨核球設置溝の底面の面積は、４００μｍ２以上１００００μｍ２以下である請求項２又は３記載の血小板産生デバイス。
【請求項５】
前記仕切り部は、前記巨核球設置面に複数の部材が積層された層構造を有し、
前記枠部は、前記巨核球設置面に複数の部材が積層された層構造を有し、
前記仕切り部の層構造は、前記枠部の層構造の一部と同一である請求項２乃至４の何れか一項記載の血小板産生デバイス。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか一項記載の血小板産生デバイスと、
前記薄膜の前記巨核球設置面側に設けられ、前記巨核球が培養される培養室と、
前記薄膜の前記巨核球設置面とは反対側に設けられ、前記培養室内で前記巨核球が培養される間、培養液が流れる流路と、を有する血小板産生流路装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板産生デバイス及び血小板産生流路装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、体内において、骨髄中で造血前駆細胞が巨核球へと分化し、更に巨核球の細胞質が断片化して、血液中に放出されることにより産生される。又、近年、ｉＰＳ細胞（induced Pluripotent Stem cell）を用いて、体外において巨核球から血小板を産生することも報告されている。
【０００３】
しかしながら、血小板は、凍結保存ができないため、血小板を含む血液を採取してから、或いはｉＰＳ細胞に由来する巨核球を用いて産生されてから、数日程度しか保存できない。一方、造血前駆細胞は、凍結保存が可能である。
【０００４】
そのため、例えば、不織布等の支持多孔膜と有機高分子の多孔薄膜とを積層して作製された複合膜を培養液中に浸漬し、多孔薄膜で仕切られた２つの領域のうち、支持多孔膜側の領域に血小板前駆細胞を配置する。そして、多孔薄膜側の領域でスターラーを用いて培養液の回転流を生じさせることにより多孔薄膜にシェアストレスを与え、血小板前駆細胞より血小板を産生する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２９７０２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、血小板を工業的に産生する流路装置において、血小板の元となる巨核球を確実に血小板産生デバイスの血小板排出箇所に設置させることが非常に重要である。しかしながら、従来の血小板産生デバイスでは、その製造プロセス等の要因で、平面部に多くの巨核球を設置せざるを得なかった。そのため、産生中、回収液の圧力変動等により、巨核球の乖離や移動が容易に発生し、血小板回収効率の低下を引き起こす原因となっていた。
【０００７】
本発明は上記の点に鑑みてなされたもので、血小板回収効率の向上を可能とする血小板産生デバイス等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本血小板産生デバイスは、血小板を産生する巨核球が設置される巨核球設置面を備えた薄膜と、前記巨核球設置面に設けられ、前記巨核球設置面を、夫々に設置される巨核球の数が制限された複数の領域に分割する仕切り部と、を有し、夫々の前記領域には、前記薄膜を貫通する孔が配されていることを要件とする。
【発明の効果】
【０００９】
開示の技術によれば、血小板回収効率の向上を可能とする血小板産生デバイス等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施の形態に係る血小板産生流路装置を例示する図である。
【図２】本実施の形態に係る血小板産生デバイスを例示する図である。
【図３】多孔薄膜に形成される複数の微小孔の配置を例示する図である。
【図４】本実施の形態に係る血小板産生デバイスを用いて巨核球から血小板を産生する方法を説明する図である。
【図５Ａ】本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程を例示する図（その１）である。
【図５Ｂ】本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程を例示する図（その２）である。
【図５Ｃ】本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程を例示する図（その３）である。
【図５Ｄ】本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程を例示する図（その４）である。
【図５Ｅ】本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程を例示する図（その５）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照して発明を実施するための形態について説明する。なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。
【００１２】
［本実施の形態に係る血小板産生流路装置の構造］
まず、本実施の形態に係る血小板産生流路装置の構造について説明する。図１は、本実施の形態に係る血小板産生流路装置を例示する図であり、図１（ａ）は断面図、図１（ｂ）は平面図である。但し、図１（ｂ）では、図１（ａ）に示す培養室２０の上方の開口部を塞ぐ蓋部６４を取り外した状態を示している。図２は、本実施の形態に係る血小板産生デバイスを例示する図であり、図２（ａ）は平面図、図２（ｂ）は図２（ａ）のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【００１３】
図１及び図２を参照するに、本実施の形態に係る血小板産生流路装置１は、体外において巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する装置であり、血小板産生デバイス２と、培養室２０と、微小流路３０とを有する。血小板産生デバイス２は、多孔薄膜１０と、多孔薄膜１０を囲む枠部４０と、枠部４０で囲まれた範囲内において多孔薄膜１０を複数の領域に分割する仕切り部５０とを有する。なお、１０ａは多孔薄膜１０の一方の表面を、１０ｂは多孔薄膜１０の他方の表面を示している。
【００１４】
血小板産生デバイス２と微小流路３０とは、上ホルダー６１と下ホルダー６２とで挟まれており、上ホルダー６１と下ホルダー６２とは、例えば固定具６３（例えば、ボルト及びナット）で固定されている。
【００１５】
上ホルダー６１は、例えば金属製であり、血小板産生デバイス２上に積層することができる。例えば、上ホルダー６１の多孔薄膜１０に対応する位置には貫通孔が形成されており、培養室２０内で巨核球Ｍを培養する際には、上ホルダー６１の貫通孔の上方の開口部は蓋部６４で塞ぐことができる。
【００１６】
下ホルダー６２は、例えば金属製であり、微小流路３０の下方側に積層することができる。例えば、下ホルダー６２の微小流路３０の上流端及び下流端のそれぞれの開口に対応する位置には、貫通孔が形成されている。
【００１７】
例えば、積層した部品の間（例えば、枠部４０及び微小流路３０と上ホルダー６１との間、微小流路３０と下ホルダー６２との間等）にシーリング材６５（例えば、Ｏリング）を配置することで、液漏れを防止することができる。
【００１８】
又、例えば、微小流路３０の上流端には、下ホルダー６２を介して、図示しないシリコンチューブを上流流路部として接続することができる。更に、例えば、上流流路部の上流端には、微小流路３０に流入させる新鮮な培養液Ｓが収容された図示しないガラス瓶を上流容器部として接続することができる。
【００１９】
一方、微小流路３０の下流端には、例えば、下ホルダー６２を介して、図示しないシリコンチューブを下流流路部として接続することができる。更に、例えば、下流流路部の下流端には、微小流路３０から回収された培養液Ｓを収容するための図示しないガラス瓶を下流容器部として接続することができる。又、例えば、シリコンチューブには、送液部として、培養液Ｓを圧送するためのシリンジポンプを接続することができる。
【００２０】
多孔薄膜１０には、制御された形状及び配置で複数の微小孔１１が形成されている。培養室２０は、巨核球Ｍを培養する部屋であり、多孔薄膜１０の一方の側に形成されている。微小流路３０は、培養室２０内で巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する間培養液Ｓが流れる流路であり、多孔薄膜１０の他方の側に形成されている。培養室２０は、例えば、血小板産生デバイス２と、血小板産生デバイス２上に積層された上ホルダー６１とで形成することができる。
【００２１】
微小流路３０は、例えば、孔及び溝が形成された複数枚の石英チップ３１、３２、及び３３を積層することにより形成することができる。微小流路３０は、例えば、流れ方向Ｘの長さが２ｍｍ超程度、幅（幅方向の長さ）が２ｍｍ程度、高さが０．３ｍｍ程度の直線状に形成することができる。すなわち、微小流路３０は、その内部を培養液Ｓが多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂ全体と接触しながら直線的に流れるよう形成することができる。なお、微小流路３０は、石英チップに代えて、ホウケイ酸ガラス等の他の材料を用いて形成してもよい。或いは、樹脂系の材料を用いてフレキシブルな微小流路３０を形成してもよい。
【００２２】
枠部４０は、第１層４１、第２層４２、第３層４３、及び第４層４４が積層された構造を有し、巨核球設置面となる多孔薄膜１０の一方の表面１０ａの外縁部に環状（例えば、平面形状が額縁状）に設けられている。なお、平面形状とは対象物を多孔薄膜１０の一方の表面１０ａの法線方向から視た形状を指すものとする。
【００２３】
枠部４０は、巨核球Ｍを培養する培養液を導入する培養液導入溝を形成している。培養液導入溝（枠部４０に囲まれた部分）の形状は、例えば矩形状（例えば、２ｍｍ×２ｍｍ程度の範囲）とすることができる。なお、第４層４４の内壁面は、第３層４３側が広いテーパ形状とすることができる。
【００２４】
仕切り部５０は、第１層４１、及び第２層４２が積層された構造を有し、巨核球設置面となる多孔薄膜１０の一方の表面１０ａの枠部４０の内側に設けられている。仕切り部５０は、巨核球設置面となる多孔薄膜１０の一方の表面１０ａを複数の領域に分割している。仕切り部５０を設けることで、分割された夫々の領域に設置される巨核球の数を制限することができる。
【００２５】
仕切り部５０に分割された夫々の領域は、枠部４０と仕切り部５０とにより側壁が形成され、巨核球設置面により底面が形成された、巨核球Ｍを設置するための巨核球設置溝である。なお、仕切り部５０に分割された夫々の領域には、多孔薄膜１０を貫通する微小孔１１が複数配されている。
【００２６】
各巨核球設置溝の大きさ（溝の底面の面積、及び仕切り部５０の高さ）は、巨核球Ｍの大きさに対応するように形成されている。ここで、『巨核球Ｍの大きさに対応する』とは、各巨核球設置溝の大きさが、１個の巨核球Ｍを設置可能な程度の大きさであることを意味する。
【００２７】
巨核球Ｍの大きさ（最大幅Ｗ：図４参照）は通常２０μｍ〜１００μｍ程度であるから、巨核球設置溝の底面の面積は、４００μｍ２以上１００００μｍ２以下程度とすることが好ましい。又、巨核球設置溝の深さ（仕切り部５０の高さ）は、２０μｍ以上２００μｍ以下程度とすることが好ましい。
【００２８】
但し、巨核球設置溝に設置される巨核球Ｍは１個ではなく、数個程度であっても構わない。この場合も、従来のように仕切りのない１つの平面部に多数の巨核球Ｍが配置される状態と比較すると、血小板の産生中に、回収液の圧力変動等により巨核球Ｍが横方向へ動くこと（乖離したり移動したりすること）を抑制可能となり、血小板回収効率を向上できるからである。
【００２９】
なお、図２（ａ）の例では、十字状の仕切り部５０を設けて巨核球設置面となる多孔薄膜１０の一方の表面１０ａを複数の領域に分割し、枠部４０と仕切り部５０とにより側壁が形成され巨核球設置面により底面が形成された４つの巨核球設置溝１０１、１０２、１０３、及び１０４を設けているが、これは説明の便宜のためであり、多孔薄膜１０上には任意の数のより多くの巨核球設置溝を設けることができる。この場合には、例えば、仕切り部５０を格子状やハニカム状等にすればよい。
【００３０】
このように、多孔薄膜１０上に仕切り部５０を設けることにより、仕切り部５０で仕切られた多孔薄膜１０上の１つの巨核球設置溝には巨核球Ｍが１個〜数個程度しか配置されない。そのため、巨核球Ｍが多孔薄膜１０上の１つの領域に多数個配置された場合のように、血小板の産生中に、回収液の圧力変動等により巨核球Ｍが横方向へ動くこと（乖離したり移動したりすること）を抑制可能となり、血小板回収効率を向上できる。なお、枠部４０及び仕切り部５０を構成する各層の材料等については、製造方法の説明において後述する。
【００３１】
このような構成部を有する血小板産生流路装置１により、培養室２０内において多孔薄膜１０の一方の側に巨核球Ｍを配置し、微小流路３０に培養液Ｓを流しながら培養室２０内で巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生し、微小孔１１を介して微小流路３０内の培養液Ｓ中に放出された血小板Ｐを回収することができる。以下、血小板産生流路装置１の各構成部について更に詳しく説明する。
【００３２】
多孔薄膜１０は、制御された形状及び配置で複数の微小孔１１が形成され、血小板産生流路装置１において巨核球Ｍを培養する際に巨核球Ｍが設置される巨核球設置面となる一方の表面１０ａを備えたものであれば特に限られない。多孔薄膜１０は、例えば、基板の微細加工により形成することができる。微細加工は、例えば、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の加工技術であり、より具体的には、例えば、フォトリソグラフィである。
【００３３】
多孔薄膜１０は、例えば、エッチング等の微細加工により、基板の一部を削って厚さを減じることにより形成してもよい。この場合、血小板産生流路装置１は、微細加工により基板の一部を削って厚さを減じることにより形成された多孔薄膜１０と、多孔薄膜１０より厚く、多孔薄膜１０を囲む基板の他の一部から構成された枠部とを一体的に有する基板部を備えるようにしてもよい（後述）。
【００３４】
多孔薄膜１０を構成する材料は、特に限られず、無機材料、有機材料の何れか一方又は双方を使用することができる。無機材料製の多孔薄膜１０は、耐熱性に優れている点で好ましい。無機材料製の多孔薄膜１０は、例えば、無機材料製の基板（例えば、シリコンウェハ）の微細加工により形成することができる。
【００３５】
多孔薄膜１０において、巨核球Ｍが配置される一方の表面１０ａと他方の表面１０ｂとは平坦な面とすることができ、一方の表面１０ａと他方の表面１０ｂとは平行に形成されてもよい。
【００３６】
多孔薄膜１０の厚さは、多孔薄膜１０が、一方の表面１０ａにおける巨核球Ｍの配置及び培養に耐える力学的強度を有し、かつ巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの微小孔１１を介した微小流路３０への放出を著しく妨げない範囲であれば特に限られないが、例えば、５〜４０μｍとしてもよく、５〜３０μｍとしてもよく、５〜２０μｍとしてもよい。
【００３７】
例えば、多孔薄膜１０の厚さが５〜２０μｍである場合には、多孔薄膜１０が、巨核球Ｍから血小板Ｐが産生される生体内環境における血管壁（厚さ１０μｍ程度）に類似した構造となり好ましい。
【００３８】
複数の微小孔１１は、制御された形状及び配置で形成されたものであれば特に限られない。制御された形状及び配置で形成された複数の微小孔１１は、例えば、基板の微細加工により形成された複数の微小孔１１であってもよい。微細加工は、例えば、ＭＥＭＳの加工技術であり、より具体的には、例えば、フォトリソグラフィである。複数の微小孔１１は、例えば、図３（ａ）に示すように、ハニカム配置とすることができる。又、複数の微小孔１１を形成する基板がシリコンであれば、例えば、図３（ｂ）に示すように、基板を構成するシリコンの結晶軸方向に直近の微小孔１１が配置されないようなシフトタイプの配置等とすることができる。但し、制御された意図的な配置であれば、これらには特に限られない。
【００３９】
微小孔１１は、多孔薄膜１０の一方の表面１０ａから他方の表面１０ｂまで貫通する孔である。又、微小孔１１は、巨核球Ｍが通過できず血小板Ｐが通過できる形状及びサイズで形成されている。
【００４０】
複数の微小孔１１の各々の孔径（各微小孔１１の直径）は、微小孔１１を巨核球Ｍが通過できず血小板Ｐが通過できる範囲であれば特に限られないが、例えば、２〜１５μｍとしてもよく、２〜１０μｍとしてもよく、２〜５μｍとしてもよい。
【００４１】
例えば、各微小孔１１の孔径が２〜５μｍである場合には、成熟した巨核球が微小孔１１を通過することを防止できるだけでなく、未成熟の巨核球が微小孔１１を通過することも確実に防止することができる。
【００４２】
複数の微小孔１１の平均孔径は、微小孔１１を巨核球Ｍが通過できず血小板Ｐが通過できる範囲であれば特に限られないが、例えば、２〜１５μｍとしてもよく、２〜１０μｍとしてもよく、２〜５μｍとしてもよい。
【００４３】
複数の微小孔１１は、例えば、孔径加工精度±１０％以下で形成されているようにしてもよい。すなわち、制御された形状及び配置で形成された複数の微小孔１１は、孔径加工精度±１０％以下で形成された複数の微小孔１１であるようにしてもよい。
【００４４】
更に、複数の微小孔１１は、例えば、平均孔径が２〜１５μｍであり、孔径加工精度±１０％以下で形成された複数の微小孔１１であるようにしてもよい。この場合、複数の微小孔１１の平均孔径は、２〜１０μｍとしてもよく、２〜５μｍとしてもよい。なお、例えば、多孔薄膜１０に平均孔径が１０μｍの複数の微小孔１１が孔径加工精度±１０％で形成されている場合、複数の微小孔１１の孔径は、９〜１１μｍの範囲内となる。
【００４５】
複数の微小孔１１の開口率は、多孔薄膜１０が、一方の表面１０ａにおける巨核球Ｍの配置及び培養に耐える力学的強度を有し、かつ巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの微小孔１１を介した微小流路３０への放出を著しく妨げない範囲であれば特に限られないが、例えば、４〜４５％としてもよく、４〜３５％としてもよく、４〜２５％としてもよい。
【００４６】
培養室２０は、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される一方の表面１０ａ側に設けられ、その内部で巨核球Ｍが培養される部屋であれば特に限られない。本実施の形態では、一例として、血小板産生デバイス２（多孔薄膜１０、枠部４０、仕切り部５０）、上ホルダー６１、及び蓋部６４により、培養室２０を構成している。
【００４７】
培養室２０は、例えば、その内部で巨核球Ｍが培養される間、多孔薄膜１０の微小孔１１を介して微小流路３０と連通する以外は密閉される部屋である。又、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される一方の表面１０ａは、培養室２０の微小流路３０側の内壁面を構成してもよい。
【００４８】
巨核球Ｍの培養において、培養室２０には、巨核球Ｍを含む培養液Ｓが収容される。すなわち、多孔薄膜１０の一方の表面１０ａに配置された巨核球Ｍは、培養室２０に収容された培養液Ｓ中で培養される。
【００４９】
微小流路３０は、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される一方の表面１０ａと反対側に設けられ、培養液Ｓが流れる流路であれば特に限られない。本実施の形態では、一例として、石英チップ３１、３２、及び３３により、微小流路３０を構成している。微小流路３０内において、培養液Ｓは、多孔薄膜１０の巨核球Ｍが配置される一方の表面１０ａと反対側の他方の表面１０ｂと接しながら流れる。
【００５０】
微小流路３０は、培養液Ｓの流れる方向（図１に示す矢印Ｘの指す方向）（以下、「流れ方向Ｘ」という。）において、少なくとも多孔薄膜１０の上流端から下流端まで直線的に形成されているようにしてもよい。この場合、微小流路３０の流れ方向Ｘにおける長さは、多孔薄膜１０のそれ以上となる。このため、微小流路３０内の培養液Ｓは、流れ方向Ｘにおいて、多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂの上流端から下流端まで接触しながら流れる。
【００５１】
又、微小流路３０は、多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂに沿った方向であって、流れる方向に直交する方向（以下、「幅方向」という。）において、多孔薄膜１０の一方端から他方端まで形成されているようにしてもよい。この場合、微小流路３０の幅方向における長さ（微小流路３０の幅）は、多孔薄膜１０のそれ以上となる。このため、微小流路３０内の培養液Ｓは、幅方向において、多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂの一方端から他方端まで接触しながら流れる。
【００５２】
このように、微小流路３０が、多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂの全体にわたって直線的に形成されることにより、微小流路３０内において、培養液Ｓを他方の表面１０ｂの全体と接触させながら直線的に流すことができ、その結果、他方の表面１０ｂの全体に均一なシェアストレスを与えることができる。
【００５３】
微小流路３０は、培養液Ｓを１〜１００ｍｍ／秒の流速で流すことができるよう形成されているようにしてもよい。すなわち、微小流路３０は、その内部を培養液Ｓが、１ｍｍ／秒（生体の毛細血管における血液の流速と同等の流速）〜１００ｍｍ／秒（生体の静脈における血液の流速と同等の流速）で流れることができるような形状及びサイズで形成される。この場合、微小流路３０内において、生体における血管内の血液流れを模した培養液Ｓの流れを形成することができる。
【００５４】
図４は、血小板産生デバイス２を用いて巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する方法を説明する図であり、図１（ａ）の一部を拡大して例示したものである。図４に示すように、まず、血小板産生流路装置１の培養室２０内において血小板産生デバイス２の多孔薄膜１０の一方の表面１０ａに巨核球Ｍを配置する。巨核球Ｍの配置は、例えば、巨核球Ｍを含む培養液Ｓを培養室２０内に入れて、巨核球Ｍを多孔薄膜１０の一方の表面１０ａ上に沈降させることにより行う。又、巨核球Ｍの配置は、例えば、巨核球Ｍの前駆細胞を含む培養液Ｓを培養室２０内に入れて、前駆細胞を多孔薄膜１０の一方の表面１０ａ上に沈降させ、更に培養室２０内で前駆細胞を培養して巨核球Ｍに分化させることにより行ってもよい。
【００５５】
巨核球Ｍの由来は、特に限られず、ヒトの巨核球でもよく、ヒト以外の動物の巨核球でもよい。又、巨核球Ｍは、生体から採取された血液に由来する巨核球であってもよく、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞に由来する巨核球であってもよく、株化された巨核球であってもよく、株化された前駆細胞に由来する巨核球であってもよい。
【００５６】
次に、微小流路３０に培養液Ｓを流しながら培養室２０内で巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する。具体的に、例えば、図１に示すように、多孔薄膜１０の複数の微小孔１１を介して微小流路３０と連通する以外は密閉された培養室２０内において多孔薄膜１０の一方の表面１０ａに巨核球Ｍを配置した状態で、微小流路３０の上流端から下流端まで、培養液Ｓを多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂと接触させながら流すことにより、培養室２０内で巨核球Ｍを培養するとともに、巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する。
【００５７】
ここで、微小流路３０に培養液Ｓを流すことにより、多孔薄膜１０の複数の微小孔１１を介して、多孔薄膜１０の微小流路３０と反対側の一方の表面１０ａに配置された巨核球Ｍに対して、血小板Ｐの産生を促進するシェアストレスを与えることができる。
【００５８】
特に、上述のとおり、多孔薄膜１０が平坦な一方の表面１０ａ及び平坦な他方の表面１０ｂを有し、微小流路３０が多孔薄膜１０の全体に沿って直線的に形成されている場合には、多孔薄膜１０の全体に分散された巨核球Ｍに均一なシェアストレスを与えることができる。
【００５９】
微小流路３０内における培養液Ｓの流速は、巨核球Ｍに血小板Ｐの産生を促進するシェアストレスを与えることができ、かつ血小板Ｐの回収を著しく妨げない範囲であれば特に限られないが、例えば、微小流路３０に１〜１００ｍｍ／秒の流速で培養液Ｓを流すようにしてもよい。
【００６０】
この場合、微小流路３０における培養液Ｓの流速を、生体の毛細血管における血液の流速と同等の１ｍｍ／秒から、生体の静脈における血液の流速と同等の１００ｍｍ／秒までの範囲とすることにより、微小流路３０内において、生体における血管内の血液流れを模した培養液Ｓの流れを形成し、巨核球Ｍからの血小板Ｐの産生を効果的に促進することができる。
【００６１】
又、微小流路３０における培養液Ｓの流速は、血小板産生流路装置１内における血小板Ｐの産生速度と培養液Ｓの流量とに基づき算出される培養液Ｓ中の血小板Ｐの濃度が、血小板Ｐの回収に支障のない範囲となるよう決定するようにしてもよい。
【００６２】
そして、本方法においては、多孔薄膜１０の一方の表面１０ａ上で巨核球Ｍを培養することにより、巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する。すなわち、巨核球Ｍは、多孔薄膜１０の一方の表面１０ａ上において、その細胞質の一部を突起状に変形させ、その後、巨核球Ｍに形成された突起の先端がちぎれて、血小板Ｐとして培養液Ｓ中に放出される。
【００６３】
なお、巨核球Ｍの培養に使用される培養液Ｓは、培養液Ｓ中で巨核球Ｍから血小板Ｐを産生できる溶液であれば特に限られない。又、微小流路３０に培養液Ｓを流す方法は、特に限られず、例えば、血小板産生流路装置１は、微小流路３０に培養液Ｓを流すための推進力を発生させる送液部を備えるようにしてもよい。送液部は、例えば、培養液Ｓを圧送するためのポンプであるようにしてもよい。
【００６４】
又、血小板産生流路装置１は、例えば、微小流路３０の上流端に接続され微小流路３０に培養液Ｓを流入させるための上流流路部と、微小流路３０の下流端に接続され微小流路３０から培養液Ｓ（例えば、血小板Ｐを含む培養液Ｓ）を流出させるための下流流路部とを備えるようにしてもよい。上流流路部及び下流流路部は、例えば、樹脂製のチューブであるようにしてもよい。
【００６５】
又、血小板産生流路装置１は、例えば、上流流路部の上流端に接続され、微小流路３０に流入させる培養液Ｓを収容した上流容器部と、下流流路部の下流端に接続され、微小流路３０から流出する培養液Ｓ（例えば、血小板Ｐを含む培養液Ｓ）を収容する下流容器部とを備えるようにしてもよい。上流容器部及び下流容器部は、例えば、樹脂製又はガラス製の容器であるようにしてもよい。
【００６６】
次に、巨核球Ｍから多孔薄膜１０の微小孔１１を介して微小流路３０内の培養液Ｓ中に放出された血小板Ｐを回収する。すなわち、巨核球Ｍは、微小孔１１が開口する多孔薄膜１０の一方の表面１０ａに配置され、微小孔１１は血小板Ｐが通過できる形状及びサイズで形成されているため、一方の表面１０ａに配置された巨核球Ｍから産生された血小板Ｐは、微小孔１１を介して微小流路３０内を流れる培養液Ｓ中に放出される。
【００６７】
なお、血小板Ｐの微小孔１１を介した放出は、培養室２０内又は多孔薄膜１０の微小孔１１内で産生された血小板Ｐが微小孔１１を通過して微小流路３０に放出される場合を含み、微小孔１１を介して微小流路３０内に突出した巨核球Ｍの細胞質の一部から血小板Ｐが放出される場合も含む。或いは、その両方が同時に行われてもよい。
【００６８】
微小流路３０内を流れる培養液Ｓ中に放出された血小板Ｐは、微小流路３０の流れ方向Ｘにおける下流端から回収する。すなわち、巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを含む培養液Ｓを微小流路３０の下流端から回収することにより、血小板Ｐを回収する。
【００６９】
血小板産生デバイス２を備えた血小板産生流路装置１を用いて巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する方法によれば、体外において巨核球Ｍから血小板Ｐを効果的に大量産生することができる。すなわち、制御された形状及び配置で複数の微小孔１１が形成された多孔薄膜１０を使用することにより、多孔薄膜１０の一方の表面１０ａへの巨核球Ｍの配置を直接的に制御し、かつ、微小流路３０において多孔薄膜１０の他方の表面１０ｂと接触させながら培養液Ｓを流すことにより、適切に配置された巨核球Ｍにシェアストレスを効果的に与えて、血小板Ｐを効率よく産生することができる。
【００７０】
例えば、基板の微細加工により平均孔径２〜１５μｍの複数の微小孔１１が孔径加工精度±１０％以下及び開口率４〜４５％で形成された厚さ５〜４０μｍの多孔薄膜１０と、多孔薄膜１０の一方側に設けられた培養室２０と、多孔薄膜１０の他方側に設けられた微小流路３０とを備える血小板産生流路装置１を使用して、培養室２０内において多孔薄膜の一方の表面１０ａに巨核球Ｍを配置し、微小流路３０に培養液Ｓを流しながら培養室２０内で巨核球Ｍを培養する場合には、巨核球Ｍにシェアストレスを効果的に与えながら効率よく血小板Ｐを産生し、微小孔１１を介して微小流路３０内の培養液Ｓ中に放出された血小板Ｐを効率よく回収することができる。
【００７１】
この場合、複数の微小孔１１の平均孔径は、２〜１０μｍとしてもよく、２〜５μｍとしてもよい。又、複数の微小孔１１の開口率は、４〜３５％であるとしてもよく、４〜２５％であるとしてもよい。又、多孔薄膜１０の厚さは、５〜３０μｍであるとしてもよく、５〜２０μｍであるとしてもよい。
【００７２】
又、例えば、ｉＰＳ細胞から誘導した巨核球Ｍ又は巨核球Ｍの前駆細胞（例えば、造血前駆細胞）を予め凍結保存しておき、巨核球Ｍ又は前駆細胞を任意のタイミングで解凍し、そのまま血小板産生流路装置１内で培養することにより、生体外において血小板Ｐを短期間で大量に産生することができる。従って、血小板産生流路装置１を用いて、生体外において、巨核球Ｍから血小板Ｐを工業的に大量産生することも期待できる。
【００７３】
又、血小板産生流路装置１は、多孔薄膜１０近傍の温度を制御する温度制御部を更に備えるようにしてもよい。この温度制御部は、例えば、多孔薄膜１０近傍の温度を３０〜４０℃に制御するようにしてもよい。
【００７４】
温度制御部は、多孔薄膜１０近傍の温度を制御するものであれば特に限られない。すなわち、多孔薄膜近傍の温度を制御する温度制御部は、例えば、血小板産生流路装置１の培養室２０内の培養液Ｓ、又は微小流路３０内の培養液Ｓの温度を制御する温度制御部であるようにしてもよい。或いは、培養室２０内の培養液Ｓ、及び微小流路３０内の培養液Ｓの温度を制御する温度制御部であるようにしてもよい。
【００７５】
具体的に、温度制御部は、例えば、血小板産生流路装置１の培養室２０に収容されている培養液Ｓ、又は微小流路３０を流れる培養液Ｓの温度を測定する温度センサー（例えば、熱電対を含む温度センサー）と、この温度センサーによる温度測定結果に基づき培養液Ｓを加熱するヒーターとを有するようにしてもよい。或いは、血小板産生流路装置１の培養室２０に収容されている培養液Ｓ、及び微小流路３０を流れる培養液Ｓの温度を測定する温度センサー（例えば、熱電対を含む温度センサー）と、この温度センサーによる温度測定結果に基づき培養液Ｓを加熱するヒーターとを有するようにしてもよい。
【００７６】
この場合、温度制御部は、血小板産生流路装置１の培養室２０内の培養液Ｓ、又は微小流路３０内の培養液Ｓの温度を（或いは、培養室２０内の培養液Ｓ、及び微小流路３０内の培養液Ｓの温度を）、巨核球Ｍからの血小板Ｐの産生に適した所定の温度範囲内に維持することができる。この温度範囲は、例えば、３０〜４０℃であるようにしてもよい。
【００７７】
又、温度センサーは、例えば、その検出部（例えば、温度センサーの先端部）が培養室２０内の培養液Ｓ中に浸漬されるよう設けられるようにしてもよい。この場合、例えば、巨核球Ｍの培養中において、その検出部が培養室２０内の培養液Ｓ中に浸漬されることにより、巨核球Ｍが浸漬されている培養液Ｓの温度を迅速かつ正確に測定することができる。血小板産生流路装置１が上述のような温度制御部を備えることにより、巨核球Ｍを血小板Ｐの産生に適した温度で確実に安定して培養することができる。
【００７８】
又、血小板産生流路装置１は、多孔薄膜１０を振動させる薄膜振動部を更に備えてもよい。薄膜振動部は、多孔薄膜１０を振動させるものであれば特に限られないが、例えば、超音波の印加により多孔薄膜１０を振動させる超音波発生器であるようにしてもよい。超音波発生器としては、例えば、超音波振動子（例えば、ピエゾ素子を含む超音波振動子）を用いてもよい。
【００７９】
薄膜振動部は、培養室２０内又は微小流路３０内（或いは、培養室２０内及びは微小流路３０内）の培養液Ｓ中にキャビテーションを発生させない周波数の超音波を印加して、多孔薄膜１０を振動させるものであるようにしてもよい。薄膜振動部によって多孔薄膜１０を振動させることにより、多孔薄膜１０の一方の表面１０ａに配置した巨核球Ｍに対して、血小板Ｐの産生を促進するストレスを外部から与えることができる。
【００８０】
なお、血小板産生流路装置１は、上述した例に限られない。すなわち、血小板産生流路装置１においては、上述した例以外にも、例えば、巨核球Ｍに対して外部から物理的ストレスを印加する構成、巨核球Ｍに対して外部から電気的ストレスを印加する構成（例えば、多孔薄膜１０に対する電極の設置）、外部との電気信号の入出力を行うための配線、血小板産生流路装置１内の状態をモニターするためのセンサー等の構成を設けてもよい。
【００８１】
［本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程］
次に、本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程について説明をする。図５Ａ〜図５Ｅは、本実施の形態に係る血小板産生デバイスの製造工程を例示する図である。
【００８２】
まず、図５Ａ（ａ）に示す工程では、基板１００を準備する。ここでは、基板１００として無機材料製の基板、具体的には、シリコンウェハの一種である所謂ＳＯＩウェハを用いる場合を例にして以下の説明を行う。基板１００は、シリコン基板１４５上に順次積層されたＢＯＸ（Ｂｕｒｉｅｄ  Ｏｘｉｄｅ）層１４１及びＳＯＩ層１１０を有している。
【００８３】
図５Ａ（ａ）において、Ｃは、ダイシングブレード等が基板１００を切断して個片化する位置（以下、「切断位置Ｃ」とする）を示している。すなわち、切断位置Ｃにより分離された各領域は、最終的に個片化されて１つの多孔薄膜１０、枠部４０、及び仕切り部５０（図２（ａ）及び図２（ｂ）に示した部分）となる領域である。なお、以下の各工程の説明では、適宜、切断位置Ｃにより分離された各領域のうちの一つを拡大して例示する場合がある。
【００８４】
次に、図５Ａ（ｂ）に示す工程では、基板１００の表面（ＳＯＩ層１１０の表面）を覆うように感光性のレジスト膜２１０を形成する。そして、レジスト膜２１０を露光し、次いで露光処理されたレジスト膜２１０を現像することで、レジスト膜２１０に複数の微小孔１１の配置パターン（例えば、図２（ａ）に示す配置）に対応する開口部２１０ｘを形成する。
【００８５】
次に、図５Ａ（ｃ）に示す工程では、開口部２１０ｘ内に露出するＳＯＩ層１１０を例えばドライエッチングにより除去し、複数の微小孔１１を形成する。ドライエッチングとしては、例えば、ＳＦ６及びＣ４Ｆ８を用いる一般的なＢｏｓｃｈプロセスによる誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）により行うことができる。
【００８６】
次に、図５Ａ（ｄ）に示す工程では、例えば、レジスト剥離液等を用いて、レジスト膜２１０を除去する。次に、図５Ａ（ｅ）に示す工程では、微小孔１１内を含む基板１００の表面全体を被覆するハードマスク２２０を形成する。ハードマスク２２０としては、例えば、厚さ３μｍ程度のＳｉＯ２膜を用いることができる。ＳｉＯ２膜は、例えば、プラズマＣＶＤ法（例えば、３００℃程度のＳｉＨ４、Ｎ２Ｏガスを用いる一般的なＲＦプラズマＣＶＤ法）により形成できる。
【００８７】
次に、図５Ｂ（ａ）に示す工程では、支持体３０１を準備し、支持体３０１の一方の面に接着層３０２を形成する。そして、図５Ａ（ｅ）に示す基板１００のＳＯＩ層１１０と支持体３０１の接着層３０２とを対向させ、基板１００を支持体３０１の一方の面に接着層３０２を介して接合（仮固定）する。支持体３０１としては、例えば石英ガラスの基板等を用いることができる。接着層３０２としては、例えば後述する図５Ｃ（ｄ）に示す工程において加熱する温度で軟化する接着剤（２００℃程度又はそれ以下で軟化する接着剤）を用いることができる。接着層３０２は、例えばスピンコート法により支持体３０１の一方の面に形成できる。接着層３０２は、スピンコート法の代わりに、フィルム状の接着剤を貼り付ける方法等を用いて支持体３０１の一方の面に形成しても構わない。
【００８８】
次に、図５Ｂ（ｂ）に示す工程では、基板１００のシリコン基板１４５をグラインダー等で研削して除去する。そして、図５Ｂ（ｃ）に示す工程では、図５Ｂ（ｂ）に示す構造体を上下反転させる。次に、図５Ｂ（ｄ）に示す工程では、ＢＯＸ層１４１上にハードマスク１４２を成膜する。ハードマスク１４２としては、例えば、ＴｉＮ等を用いることができる。ハードマスク１４２の厚さは、例えば、２００ｎｍ〜４００ｎｍ程度とすることができる。
【００８９】
次に、図５Ｂ（ｅ）に示す工程では、ハードマスク１４２を覆うように感光性のレジスト膜２３０を形成する。そして、レジスト膜２３０を露光し、次いで露光処理されたレジスト膜２３０を現像することで、レジスト膜２３０に巨核球設置溝１０１、１０２、１０３、及び１０４の配置パターン（例えば、図２（ａ）に示す配置）に対応する開口部２３０ｘを形成する。
【００９０】
次に、図５Ｃ（ａ）に示す工程では、開口部２３０ｘ内に露出するハードマスク１４２を例えばドライエッチングにより除去し、開口部１４２ｘを形成する。ドライエッチングとしては、例えば、ＳＦ６及びＣ４Ｆ８を用いる一般的なＢｏｓｃｈプロセスによる誘導結合プラズマ反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）により行うことができる。次に、図５Ｃ（ｂ）に示す工程では、例えば、レジスト剥離液等を用いて、レジスト膜２３０を除去する。そして、図５Ｃ（ｃ）に示す工程では、図５Ｃ（ｂ）に示す構造体を上下反転させる。
【００９１】
次に、図５Ｃ（ｄ）に示す工程では、背面にハードマスク２４０（例えば、厚さ３μｍ程度のＳｉＯ２膜等）が形成されたシリコン基板１４４（シリコンウェハ）を準備する。そして、準備したシリコン基板１４４の主面（ハードマスク２４０が形成されていない側の面）に、半硬化状態の接着層１４３を形成する。そして、図５Ｃ（ｃ）に示す構造体のハードマスク１４２と接着層１４３とを対向させ、図５Ｃ（ｃ）に示す構造体をシリコン基板１４４の主面に接着層１４３を介して配置する。
【００９２】
そして、例えば２５０℃で加熱した状態で、支持体３０１をシリコン基板１４４側に押圧し、ハードマスク１４２と接着層１４３とを圧着させる。これにより、接着層１４３は硬化し、図５Ｃ（ｃ）に示す構造体は接着層１４３を介してシリコン基板１４４に接合される。なお、加熱温度は３００℃以上としてもよいが、２００℃以下とすることが望ましい。３００℃のような高温を用いると熱膨張の違いにより応力が発生し、剥がれやシリコン基板１４４の割れの原因になるためである。
【００９３】
なお、接着層１４３は、例えばスピンコート法によりシリコン基板１４４の主面に、例えば熱硬化性の絶縁性樹脂を塗布した後、或いは塗布後スキージ処理した後、所定の温度以上に加熱することで半硬化状態にすることで形成できる。但し、接着層１４３は、スピンコート法の代わりに気相成長法を用いて形成しても構わないし、半硬化状態のフィルム状の熱硬化性の絶縁性樹脂を貼付する方法を用いて形成しても構わない。
【００９４】
接着層１４３の材料としては、例えば主たる組成がベンゾシクロブテンである熱硬化性の絶縁性樹脂（例えば、ジビニルシロキサンベンゾシクロブテン：ＤＶＳ−ＢＣＢ）を用いることができる。又、接着層１４３の材料として、主たる組成がエポキシ系樹脂、アクリル系樹脂、ポリイミド系樹脂である熱硬化性の絶縁性樹脂、及びシリカ等の固形微粉末を添加した絶縁性複合材料等を用いても構わない。接着層１４３の厚さは、例えば、５０μｍ程度とすることができる。
【００９５】
次に、図５Ｃ（ｅ）に示す工程では、図５Ｃ（ｄ）に示す支持体３０１及び接着層３０２を除去する。前述のように、接着層３０２として、図５Ｃ（ｄ）に示す工程において加熱する温度で軟化する接着剤（２００℃程度又はそれ以下で軟化する接着剤）を用いると好適である。接着層１４３を硬化させて図５Ｃ（ｃ）に示す構造体は接着層１４３を介してシリコン基板１４４に接合した後、支持体３０１を容易に除去できるからである。なお、この場合、図５Ｃ（ｄ）に示す工程と図５Ｃ（ｅ）に示す工程は一連の工程となる。
【００９６】
次に、図５Ｄ（ａ）に示す工程では、ＳＯＩ層１１０側のハードマスク２２０上に、保護膜としてレジスト膜２５０を形成する。そして、図５Ｄ（ｂ）に示す工程では、図５Ｄ（ａ）に示す構造体を上下反転させる。次に、図５Ｄ（ｃ）に示す工程では、ハードマスク２４０を覆うように感光性のレジスト膜２６０を形成する。そして、レジスト膜２６０を露光し、次いで露光処理されたレジスト膜２６０を現像することで、レジスト膜２６０に枠部４０により形成される培養液導入溝の配置パターン（例えば、図２（ａ）に示す配置）に対応する開口部２６０ｘを形成する。
【００９７】
次に、図５Ｄ（ｄ）に示す工程では、開口部２６０ｘ内に露出するハードマスク２４０をエッチングにより除去し、開口部２４０ｘを形成する。エッチングには、例えば、ＨＦ水（フッ化水素水）等を用いることができる。次に、図５Ｅ（ａ）に示す工程では、例えば、レジスト剥離液等を用いて、レジスト膜２６０を除去する。
【００９８】
次に、図５Ｅ（ｂ）に示す工程では、開口部２４０ｘ内に露出するシリコン基板１４４をエッチングにより除去し、開口部１４４ｘを形成する。エッチングには、例えば、ＴＭＡＨ（水酸化テトラメチルアンモニウム）やＫＯＨ（水酸化カリウム）等を用いることができる。
【００９９】
次に、図５Ｅ（ｃ）に示す工程では、開口部１４４ｘ内に露出するＢＯＸ層１４１、ハードマスク１４２、及び接着層１４３をドライエッチングにより除去し、ＳＯＩ層１１０を露出させる。その後、ハードマスク２２０及び２４０をウェットエッチングにより除去する。ウェットエッチングには、例えば、ＨＦ水（フッ化水素水）等を用いることができる。なお、ハードマスク２２０及び２４０は除去しないで残存させてもよい。
【０１００】
その後、ダイシング等により切断位置Ｃで分割して個片化する。これにより、ＳＯＩ層１１０から多孔薄膜１０が形成される。又、ＢＯＸ層１４１、ハードマスク１４２、接着層１４３、及びシリコン基板１４４から、夫々枠部４０及び仕切り部５０を構成する第１層４１、第２層４２、第３層４３、及び第４層４４が形成される。すなわち、図２に示す血小板産生デバイス２が複数個作製される。
【０１０１】
なお、以上の説明からわかるように、仕切り部５０は巨核球設置面に複数の部材が積層された層構造を有し、枠部４０も巨核球設置面に複数の部材が積層された層構造を有する。そして、仕切り部５０の層構造は、枠部４０の層構造の一部（第１層４１及び第２層４２）と同一である。
【０１０２】
このように、本実施の形態に係る血小板産生デバイスは、複数の基板（ウェハ）を基板（ウェハ）の状態で積層し、積層した基板（ウェハ）の状態で必要な加工を施し、その後分割して個片化する技術を利用して作製される。そして、この方法で作製された血小板産生デバイスには、多孔薄膜１０上に巨核球Ｍの大きさに対応する複数の巨核球設置溝を形成するための仕切り部５０が設けられる。
【０１０３】
これにより、仕切り部５０によって形成された各巨核球設置溝には１個〜数個程度の巨核球Ｍが配置可能となり、従来のように仕切りのない１つの平面部に多数の巨核球Ｍが配置される状態を回避できる。
【０１０４】
その結果、血小板の産生中に、回収液の圧力変動等により巨核球Ｍが横方向へ動くこと（乖離したり移動したりすること）を抑制可能となり、血小板回収効率を向上することができる。
【０１０５】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳説したが、本発明は、上述した実施の形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、上述した実施の形態に種々の変形及び置換を加えることができる。
【符号の説明】
【０１０６】
１  血小板産生流路装置
２  血小板産生デバイス
１０  多孔薄膜
１０ａ  一方の表面
１０ｂ  他方の表面
１１  微小孔
２０  培養室
３０  微小流路
３１、３２、３３  石英チップ
４０  枠部
５０  仕切り部
６１  上ホルダー
６２  下ホルダー
６３  固定具
６４  蓋部
６５  シーリング材
１００  基板
１１０  ＳＯＩ層
１４１  ＢＯＸ層
１４２、２２０、２４０  ハードマスク
１４３、３０２  接着層
１４４、１４５  シリコン基板
３０１  支持体
Ｍ  巨核球
Ｐ  血小板
Ｓ  培養液
【図１】
2015163060.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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