(57)【要約】【課題】  簡便で安定したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供する。また、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズを増大させることのできるモデル動物の作製方法を提供する。【解決手段】  ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法は、T細胞機能を欠如した免疫不全非ヒト動物を宿主動物として準備するステップ（A）と、摘出後のヒト子宮筋腫からヒト子宮筋腫組織片を調整するステップ（B）と、宿主動物に対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与するステップ（C）と、宿主動物に対し、ヒト子宮筋細胞及び/又はヒト子宮筋腫組織片を移植するステップ（D）と、を含む。【選択図】  図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞機能を欠如した免疫不全非ヒト動物を宿主動物として準備するステップ（A）と、
摘出後のヒト子宮筋腫からヒト子宮筋腫細胞及び/又はヒト子宮筋腫組織片を調整するステップ（B）と、
前記宿主動物に対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与するステップ（C）と、
前記宿主動物に対し、前記ヒト子宮筋腫細胞及び/又はヒト子宮筋腫組織片を移植するステップ（D）と、
を含む、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）は、黄体期における女性ホルモンの分泌量における前記エストロゲンと前記プロゲステロンとの比率に基づいて、行われるステップである、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）は、前記エストロゲンを１．５mg、前記プロゲステロンを５mg投与するステップである、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）と前記ステップ（D）とは、単一のステップで行われる、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項５】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）は、前記ステップ（D）よりも前に行われる、
ことを特徴とする、  ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項６】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）は、前記エストロゲン及び前記プロゲステロンを含有する徐放性の複合女性ホルモン剤を前記宿主動物の皮下に埋め込むことによって行われる、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項７】
請求項６に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）は、前記複合女性ホルモン剤として、徐放期間を３０日〜４０日とする徐放ペレットを用いる、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ヒト子宮筋腫組織片は、前記摘出したヒト子宮筋腫の辺縁部位における前記ヒト子宮筋腫組織片である、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項９】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ヒト子宮筋腫組織片は、摘出した多発子宮筋腫であると共に同一個体からの複数ある摘出筋腫から調整したものであって、且つ、直径５ｃｍ以上のサイズを有するものである、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ヒト子宮筋腫組織片は、偽閉経療法後に摘出した前記ヒト子宮筋腫から調整したものである、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記ステップ（C）は、前記エストロゲンヒト子宮筋腫組織片は、前記摘出した子宮筋腫であって、且つ、ERα, PR, IGF2, SMembの発現が高い子宮筋腫から調整したものである、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法
【請求項１２】
請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、
前記宿主動物は、BALB/cヌードマウスである、
ことを特徴とする、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮筋腫は、子宮を構成する子宮筋層に発生する良性腫瘍で、生殖年齢女性の約２５〜５０％に認められる。子宮筋腫は、極めてありふれた疾患であるが、その病態生理や発症機序について不明な点が多く、有効で且つ長期投与の可能な治療薬は未だに開発されておらず、現在行われている子宮筋腫の治療方法はいずれも十分な治療法であるとは言えない。
【０００３】
その主要な原因は、子宮筋腫では、in vitro実験系で確認された薬剤の有効性を検証するための適当なin vivo実験系が確立されていない点が挙げられる。近年では、ヒト子宮筋腫に対する薬剤の有効性を検証するためのモデル動物として、ヒト子宮筋腫由来の組織を移植したヒト子宮筋腫モデル動物の開発が進められているが、移植組織が生着しないという問題やモデル動物の作製が煩雑であるという問題がある。
【０００４】
これに対し、例えば、特許文献１及び非特許文献１には、ヒト子宮筋腫組織片を長期に亘って安定して生着することができるヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法が提案されている。当該特許文献１に開示のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法では、準備したNOG（登録商標）マウス内に、ヒト子宮筋腫組織片を、細胞外マトリクス成分を含むゲル状基質(マトリゲル)と共に移植することにより、ヒト子宮筋腫組織を宿主動物に簡便かつ安定に生着させたヒト子宮筋腫モデル動物を作製する方法が開示されている。当該作製方法によると、移植したヒト子宮筋腫組織は、その移植前の腫瘍サイズをほぼ減少させることなく、ほぼ同じ組織像を呈するヒト子宮筋腫をマウスの生体内で生育させることを可能にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１-１３５８１８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tsuiji K,Takeda T, Li B, Kondo A, Ito M, and Yaegashi N. Establishment of a novelxenograft model for human uterine leiomyoma in immunodeficient mice. Tohoku J ExpMed.2010;222(1):55-61.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法では、厳密な飼育管理が必要であって且つ死亡しやすい重症免疫不全マウス（NOGマウス：T,B,NK細胞の欠失、樹状細胞・マクロファージ細胞機能の低下、補体活性の低下などの特徴を持つ）に対して、高価な成長因子を含むゲル状基質と共に子宮筋腫組織を移植しなければならず、モデル動物の汎用性という観点から問題がある。さらに、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズは、移植時のヒト子宮筋腫組織のサイズと同じ程度に留まるが、実際の臨床像と同様に、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズを増大させることのできるモデル動物の作製方法が必要とされている。
【０００８】
前述した通り、子宮筋腫に対する新規治療法開発のためには動物モデルの作製が必要不可欠であるが、これまでは、簡便で安定したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法は存在しておらず、また、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズを増大させることのできるモデル動物の作製方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記に鑑み、本発明の目的は、簡便で安定したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供し、さらには、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズを増大させることのできるヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供することである。
【００１０】
上記の目的を達成するため、本件発明者は鋭意検討を重ねた結果、使用マウスとして、汎用されているヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）を用いて、当該マウスに対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与すると共に、ヒト子宮筋腫組織片のみを移植することにより、移植後の子宮筋腫組織のサイズが時間経過と共に２倍〜５倍に発育・増大するということを見出した。そして、さらに、本件発明者は、使用マウスに投与するエストロゲンとプロゲステロンの比率として、黄体期における女性ホルモンの分泌比率、すなわち、黄体期におけるエストロゲンとプロゲステロンの分泌比率に応じた比率を少なくとも採用することにより、移植後の子宮筋腫組織のサイズが上記の通り２倍〜５倍に発育・増大することを見出した。
【００１１】
具体的に、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法は、
T細胞機能を欠如した免疫不全非ヒト動物を宿主動物として準備するステップ（Ａ）と、
摘出後のヒト子宮筋腫からヒト子宮筋腫組織片を調整するステップ（Ｂ）と、
宿主動物に対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与するステップ（Ｃ）と、
宿主動物に対し、ヒト子宮筋腫組織片を移植するステップ（Ｄ）と、
を含む、ヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法である。
【００１２】
本発明によると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に発育・増大させることができる。したがって、ヒト子宮筋腫の臨床像と類似したヒト子宮筋腫モデル動物を実現することができる。また、本発明では、丈夫で汎用性の高いＴ細胞のみ欠失した免疫不全非ヒト動物が宿主動物として用いられるので、従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法と比較してより簡便で安価な方法を実現できる。
【００１３】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）は、黄体期における女性ホルモンの分泌量におけるエストロゲンとプロゲステロンとの比率に基づいて、行われるステップである、ことが好ましい。このようすると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に確実に増大させることができる。
【００１４】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）は、エストロゲンを１．５mg、プロゲステロンを５mg投与するステップである、ことが好ましい。このようすると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に確実に発育・増大させることができる。
【００１５】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）とステップ（Ｄ）とは、単一のステップで行われる、ことが好ましい。このようにすると、簡便な方法でヒト子宮筋腫モデル動物を作製できる。
【００１６】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）は、ステップ（Ｄ）よりも前に行われる、ことが好ましい。このようにすると、方法としての簡便性は劣るものの、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を移植後すぐに発育・増大させることができる。
【００１７】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）は、エストロゲン及びプロゲステロンを含有する徐放性の複合女性ホルモン剤を宿主動物の皮下に埋め込むことによって行われる、ことが好ましい。このようすると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に確実に発育・増大させることができる。また、必要に応じて、徐放性の複合女性ホルモン剤の埋め込みを追加で行ってもよい。
【００１８】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）は、複合女性ホルモン剤として、徐放期間を３０日〜４０日とする徐放ペレットを用いる、ことが好ましい。このようすると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に確実に発育・増大させることができる。また、必要に応じて、徐放期間の３０日〜４０日を短縮し、徐放ペレットを追加で埋め込んだり、徐放期間を長くした徐放ペレットを用いたりしてもよい。
【００１９】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ヒト子宮筋腫組織片は、摘出したヒト子宮筋腫の辺縁部位におけるヒト子宮筋腫組織片である、ことが好ましい。このようにするのは、本件発明者が、ヒト子宮筋腫の辺縁部位（漿膜側（外側）部位）におけるヒト子宮筋腫組織片を移植する場合の方が、ヒト子宮筋腫の内部部位（中心部位）におけるヒト子宮筋腫組織片を移植する場合に比べて、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることを見出したことに基づいたものである。
【００２０】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ヒト子宮筋腫組織片は、摘出した多発筋腫から調整したものであって、且つ、同一個体からの複数ある摘出筋腫の場合は、比較的大きな（直径５ｃｍ以上が目安）サイズを有するものである、ことが好ましい。このようにするのは、本件発明者が、多発筋腫で相対的にサイズが大きいヒト子宮筋腫組織片を移植する場合の方が、多発筋腫で相対的にサイズが小さいヒト子宮筋腫組織片を移植する場合に比べて、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることを見出したことに基づいたものである。そして、ヒト子宮筋腫組織片のサイズが直径５ｃｍ以上のサイズを有する場合に、その増大率が確実に大きくなる。ここで、ヒト子宮筋腫組織片のサイズは、直径３ｃｍ以上であればその組織片は大きくなるが、直径５ｃｍ以上で且つ直径１０ｃｍ以下であることがより好ましい。
【００２１】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ヒト子宮筋腫組織片は、偽閉経療法後に摘出したヒト子宮筋腫から調整したものである、ことが好ましい。このようにするのは、本件発明者が、偽閉経療法後に摘出したヒト子宮筋腫から調整したヒト子宮筋腫組織片を移植する場合の方が、偽閉経療法なしに摘出したヒト子宮筋腫から調整したヒト子宮筋腫組織片を移植する場合に比べて、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることを見出したことに基づいたものである。
【００２２】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、ステップ（Ｃ）は、ヒト子宮筋腫組織片は、摘出した子宮筋腫であって、且つ、ERα, PR, IGF2, SMembの発現が高い子宮筋腫から調整したものである、ことが好ましい。このようにするのは、本件発明者が、比較的小さなサイズの摘出子宮筋腫で移植後の増大があまり期待出来ない場合あっても、組織のERα, PR, IGF2, SMembの発現が高い場合に限っては小さな子宮筋腫から調整したヒト子宮筋腫組織片であっても移植すると、ヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることを見出したことに基づいたものである。
【００２３】
また、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法において、宿主動物は、BALB/cヌードマウスである、ことが好ましい。このように、本発明では、丈夫で汎用性の高いT細胞のみ欠失した免疫不全マウスであるBALB/cヌードマウスが宿主動物として用いられるので、従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法と比較してより簡便で安価な方法を実現できる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によると、簡便で安定したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供できる。さらに、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズを増大させることのできるヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供できる。このように、子宮筋腫の臨床像に類似したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を実現でき、婦人科研究領域における実用化を図ることにより、子宮筋腫に対する新しい治療法の開発の進展に大いに資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、開腹手術により摘出したヒト正常子宮筋層及び子宮筋腫を示す図である。
【図２】図２は、ヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）に対し、左側に径が約５ｍｍの正常子宮筋層を該マウスの皮下に移植すると共に右側に径が約５ｍｍの子宮筋腫を該マウスの皮下に移植し、この際、上側の正常子宮筋層及び子宮筋腫にはマトリゲルを一緒に移植し、これらの移植直後の写真である。
【図３】図３は、図２に示した移植後から２５日目を示す写真である。
【図４】図４は、図２に示した移植後から５０日目を示す写真である。
【図５】図５は、図２に示した移植後から５０日目における切開により確認した子宮筋腫の写真である。
【図６】図６は、図２に示した移植後から５０日目における切開により確認した正常子宮筋層の写真である。
【図７】図７は、図４に示した移植後５０日目の正常子宮筋層及び子宮筋腫を取り出して、そのサイズ及び重量について、マトリゲルの有無に応じた比較を示したものである。
【図８】図８は、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を示すフローチャートである。
【図９ａ】図９（ａ）は、摘出された後のヒト子宮筋腫において、辺縁部（漿膜側）から調整したヒト子宮筋腫組織片（左二つ）と、筋腫の中心部から調整したヒト子宮筋腫組織片（右二つ）を示したものである。
【図９ｂ】図９（ｂ）は、図９（ａ）の組織片の移植と共に複合女性ホルモン剤をヌードマウスに移植した写真である。
【図１０】図１０は、図９（ｂ）に示したヒト子宮筋腫組織片の移植から２週間後を示す写真である。
【図１１】図１１は、図９（ｂ）に示したヒト子宮筋腫組織片の移植から６週間後を示す写真である。
【図１２】図１２は、子宮筋腫サイズの違いによる遺伝子発現を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明の一実施形態について図表を用いながら説明する。
【００２７】
（本発明の技術的思想）
本発明は、上述した目的を達成するために、本件発明者が鋭意検討及び試行錯誤を繰り返して得られた知見に基づいてなされた発明である。すなわち、本発明は、上述した通り、使用マウスとして、汎用されているヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）を用いて、当該マウスに対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与すると共に、ヒト子宮筋腫組織片のみを移植することにより、移植後の子宮筋腫組織のサイズが時間経過と共に２倍〜５倍に発育・増大するという知見を見出してなるものである。そして、さらに、本発明は、使用マウスに投与するエストロゲンとプロゲステロンの比率として、黄体期における女性ホルモンの分泌比率、すなわち、黄体期におけるエストロゲンとプロゲステロンの分泌比率に応じた比率を少なくとも採用することにより、移植後の子宮筋腫組織のサイズが上記の通り２倍〜５倍に発育・増大するという知見を見出してなるものである。
【００２８】
まず、本発明を完成させるにあたり、本件発明者は、上記背景技術で説明した特許文献１に係る従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法の有効性を確認することにした。
【００２９】
図１は、開腹手術により摘出したヒト正常子宮筋層及び子宮筋腫を示している。図１におけるヒト正常子宮筋層及び子宮筋腫を用いて、従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法の有効性を確認することとした。
【００３０】
図２に示すように、上述したヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）に対し、左側に径が約５ｍｍの正常子宮筋層を当該マウスの皮下に移植すると共に右側に径が約５ｍｍの子宮筋腫を当該マウスの皮下に移植し、この際、上側の正常子宮筋層及び子宮筋腫にはマトリゲル（具体的には、ラミニン・コラーゲンＩＶ・エンタクチン・ヘパラン硫酸プロテオグリカン１・TGF-β線維芽細胞増殖因子・組織プラスミノーゲン活性化因子・マウスEHS腫瘍由来増殖因子よりなるマトリゲルを使用した）を一緒に移植した。なお、下側の正常子宮筋層及び子宮筋腫にはマトリゲルを移植しなかった。図２はこれらの移植直後の写真である。
【００３１】
図３に示すように、図２を用いて説明した移植後の２５日目では、左側の上下二つの正常子宮筋層及び右側の上下二つの子宮筋腫のサイズに大きな変化はなかった。また、マトリゲルの有無による子宮筋層（左側）及び子宮筋腫のサイズに大きな差異は見られなかった。
【００３２】
ところが、図４に示すように、移植後の５０日目では、マトリゲルも一緒に移植された上側の正常子宮筋層及び子宮筋腫のサイズが小さくなる一方で、マトリゲルが一緒に移植されなかった下側の正常子宮筋層及び子宮筋腫のサイズはほぼ同じ大きさを維持していた。このことは、用いたマウスがヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）であって従来技術に開示されたＮＯＧマウスとは異なっていることもあるが、マトリゲルを一緒に移植することによって維持されるはずの子宮筋腫のサイズが小さくなる一方で、マトリゲルを一緒に移植しなかった子宮筋腫のサイズが維持されるという結果が確認された。
【００３３】
図４に示したそれぞれの移植組織片を皮膚切開により仔細に確認すると、図５に示すように、上側の子宮筋腫では確かにマトリゲルの効果によって血管新生が促進されてはいるがそのサイズが小さくなっており、反対に、下側の子宮筋腫ではマトリゲルが一緒に移植されなかったために上側の子宮筋腫のようには血管新生が促進されていないがそのサイズが維持されていた。また、図６に示すように、上側のマトリゲルが一緒に移植された正常子宮筋層はそのサイズが小さくなっており、反対に、下側のマトリゲルが一緒に移植されなかった正常子宮筋層はそのサイズが維持されていたことが確認された。
【００３４】
図７は、図４に示した移植後５０日目の正常子宮筋層及び子宮筋腫を取り出して、そのサイズ及び重量について、マトリゲルの有無に応じて比較したものである。図７に示すように、マトリゲルと一緒に移植した正常子宮筋層及び子宮筋腫はそのサイズ及び重量が小さくなったが、マトリゲルと一緒に移植しなかった正常子宮筋層及び子宮筋腫はそのサイズ及び重量がほぼ同じか少し小さくなった程度であることが確認された。なお、摘出した正常子宮筋層及び子宮筋腫の移植前の重量はそれぞれ約５０ｍｇ及び約６０ｍｇであった。
【００３５】
以上の結果により、本件発明者は、汎用されているヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）を用いてヒト子宮筋腫モデル動物を作製するには、上記特許文献１に開示されたマトリゲルを用いる必要はむしろないことを見出し、ホルモン投与しない場合でも正常子宮筋層組織と子宮筋腫組織はマトリゲル（-）では「移植後も縮小しない」ということが言えることを見出した。この得られた知見に基づいて、本件発明者は、下記で詳述するように、本発明の特徴であるエストロゲン及びプロゲステロンを同時に投与することにより、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に発育・増大させることに成功した。
【００３６】
すなわち、上述した経過を経て、本件発明者は、図８に示す以下の各ステップを備えるヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供することにより、以下の効果を奏することができることを見出した。
【００３７】
具体的には、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法は、T細胞機能を欠如した免疫不全非ヒト動物を宿主動物として準備するステップ（Ａ）と、摘出後のヒト子宮筋腫から筋腫組織片を調整するステップ（Ｂ）と、宿主動物に対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与するステップ（Ｃ）と、宿主動物に対し、ヒト子宮筋腫組織片を移植するステップ（Ｄ）と、を含んでいる。このようにすると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に発育・増大させることができる。したがって、ヒト子宮筋腫の臨床像と類似したヒト子宮筋腫モデル動物を実現することができる。また、本発明では、丈夫で汎用性の高いＴ細胞のみ欠失した免疫不全非ヒト動物が宿主動物として用いられるので、従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法と比較してより簡便で安価な方法を実現できる。また、本発明では、宿主動物への筋腫組織の移植時に、従来のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法のような移植部位に成長因子を含むゲル基質を用いることなく、後述する実施例のように少量の生理食塩水を使用するのみであり、より簡便で安価な方法を実現できる。例えば、従来の特許文献１のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法によると、マトリゲルが必須であったが、本発明ではマトリゲルが不要である。これは、軽度の免疫不全BALB/cヌードマウスの場合には適度の炎症が発生し、血管新生が起こることになるが、この場合にマトリゲルを使用すると過剰な血管新生が起こり、筋腫組織が高度に酸素化（活性酸素などの細胞傷害性物質が産生されやすくなる）されてしまい組織傷害が起こるため小さくなってしまうためと推察される。
【００３８】
以下に、より具体的に説明する。
【００３９】
（ステップ（Ａ））:Ｔ細胞機能を欠如した免疫不全非ヒト動物を宿主動物として準備するステップについて
本ステップ（Ａ）では、Ｔ細胞機能を欠如した（正常な機能を有するT細胞及びB細胞がその個体中に存在しない）免疫不全非ヒト動物を宿主動物として準備する。具体的には、本実施形態では、宿主動物として、汎用されているヌードマウス（BALB/c ヌードマウス）使用した。ここで、当該ヌードマウスの特徴は、単一劣性遺伝子nuの支配により、ホモ個体（nu/nu）は解剖学的に無胸腺、外見的に無毛（組織学的には毛包が存在し、ウブ毛を発生する個体もある）で免疫学的にはＴ細胞機能が欠如している。また、恒久的にバッククロスされており、遺伝的・微生物学的に安定した品質で供給されている。なお、上記従来の特許文献１に開示されたヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法で使用されたマウスはＮＯＧマウス（登録商標）であって、Ｔ，Ｂ細胞の欠失、ナチュラルキラーＮＫ）細胞の欠失、樹状細胞機能の低下、マクロファージ機能の低下、補体活性の欠失、老化に伴うＴ，Ｂ細胞leaknessが認められない、という特徴を有する特殊なマウスである。
【００４０】
（ステップ（Ｂ））：摘出後のヒト子宮筋腫からヒト子宮筋腫組織片を調整するステップについて
本ステップ（Ｂ）では、例えば、インフォームドコンセントを得た上で、開腹手術により摘出された後のヒト子宮筋腫からヒト子宮筋腫組織片を調整する。ここでは、図９（ａ）に示すように、摘出された後のヒト子宮筋腫のうち、左側の二つである筋腫の辺縁部位（漿膜側）からヒト子宮筋腫組織片を調整し、また、右側の二つである筋腫の中心部位からヒト子宮筋腫組織片を調整した。これら４つの子宮筋腫組織片のうちの２つを上記ヌードマウスに移植することとした。
【００４１】
（ステップ（Ｃ））：宿主動物に対し、エストロゲン及びプロゲステロンを投与するステップについて
本ステップ（Ｃ）では、宿主動物に対してエストロゲン及びプロゲステロンを投与する。すなわち、図９（ｂ）に示したように、複合女性ホルモン剤、ここでは、１７ベータ・エストロゲン１．５ｍｇのシートとプロゲステロン５ｍｇのシートよりなる複合女性ホルモン剤の２枚を、上記ヌードマウスに埋め込んだ。ここで、複合女性ホルモン剤におけるエストロゲンとプロゲステロンの比率は、上述した通り、黄体期における女性ホルモンの分泌比率、すなわち、黄体期におけるエストロゲンとプロゲステロンの分泌比率に応じた比率に合せて、それぞれ１．５ｍｇ及び５ｍｇとした。なお、ここでは、複合女性ホルモン剤を２枚埋め込んだ場合について説明したが、１枚埋め込むこととして、後に追加でもう１枚を埋め込むようにすることもできる。
【００４２】
また、上述の通り、エストロゲン及びプロゲステロンを含有する複合女性ホルモン剤は徐放性の例えばペレットを宿主動物の皮下に埋め込むことによって行うことができる。そして、徐放期間を３０日〜４０日とする徐放ペレットを用いことが好ましい。このようすると、宿主動物に移植した子宮筋腫組織を時間経過と共に確実に発育・増大させることができる。また、必要に応じて、徐放期間の３０日〜４０日を短縮し、徐放ペレットを追加で埋め込んだり、徐放期間を長くした徐放ペレットを用いたりしてもよいし、必要に応じて、徐放ペレットの埋め込みを追加で行ってもよい。
【００４３】
（ステップ（Ｄ））：宿主動物に対し、ヒト子宮筋腫組織片を移植するステップについて
本ステップ（Ｄ）では、宿主動物に対してヒト子宮筋腫組織片を移植する。そして、ここでは、上記図９（ｂ）に示すように、上記ヌードマウスに対して、その左側に筋腫の辺縁部位（漿膜側）から調整したヒト子宮筋腫組織片（重量５６ｍｇで径が５ｍｍ程度）を移植し、その右側に筋腫の中心部位から調整したヒト子宮筋腫組織片（重量６３ｍｇで径が５ｍｍ程度）を移植した。また、この移植のタイミングに、上述したステップ（Ｃ）としての複合女性ホルモン剤を上記ヌードマウスに埋め込んだ。また、ここでは、上記ステップ（Ｃ）及びステップ（Ｄ）が同じタイミング（単一のステップとして）で実施される場合について説明したが、ヒト子宮筋腫組織片の上記ヌードマウスへの移植後すぐに複合女性ホルモン剤の効果を得る目的で、ヒト子宮筋腫組織片の上記ヌードマウスへ移植する数日前、例えば２日前に、複合女性ホルモン剤を先に上記ヌードマウスへ移植しておくこともできる。
【００４４】
図１０は、上記ステップ（Ｄ）のヒト子宮筋腫組織片の移植２週間後の状態を示している。図１０に示すように、ヒト子宮筋腫組織片の移植２週間後では、筋腫の辺縁部位（漿膜側）から調整したヒト子宮筋腫組織片も、筋腫の中心部位から調整したヒト子宮筋腫組織片も、そのサイズに大きな変化は見られなかった。
【００４５】
しかしながら、図１１に示すように、上記ステップ（Ｄ）のヒト子宮筋腫組織片の移植６週間後では、筋腫の辺縁部位（漿膜側）から調整したヒト子宮筋腫組織片では、移植前の５６ｍｇの重量が１７８ｍｇとなり、移植前の約５ｍｍの径が９ｍｍとなった。これに対し、筋腫の中心部位から調整したヒト子宮筋腫組織片では、移植前の６３ｍｇの重量が１５１ｍｇとなり、移植前の約５ｍｍの径が７ｍｍとなった。この結果により、本実施形態において、ヒト子宮筋腫の筋腫の辺縁部位（漿膜側）部位におけるヒト子宮筋腫組織片を移植する場合の方が、ヒト子宮筋腫の筋腫の中心部位におけるヒト子宮筋腫組織片を移植する場合に比べて、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることが見出された。
【００４６】
また、同時に、偽閉経療法の有無によるその移植子宮筋腫組織片の増大率の差異を確認した。なお、ここで、増大率（％）は、（移植２か月後の組織片重量ｍｇ／移植前の組織片重量ｍｇ）×１００で示したものである。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
表１から明らかなように、ヒト子宮筋腫の辺縁部位（漿膜側（外側）部位）におけるヒト子宮筋腫組織片を移植する場合の方が、ヒト子宮筋腫の内部部位（中心部位）におけるヒト子宮筋腫組織片を移植する場合に比べて、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることが見出された。また同時に、その増大率は、偽閉経療法を行った方が行わない場合に比べて大きくなることが見出された。
【００４９】
また、別の実施形態として、下記表２に示すように、上記ヌードマウスに対して、多発筋腫で相対的にサイズが大きいヒト子宮筋腫組織片を移植する場合と、多発筋腫で相対的にサイズが小さいヒト子宮筋腫組織片を移植する場合における、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率の差異を確認した。また、同時に、偽閉経療法の有無によるその増大率の差異を確認した。なお、ここで、増大率（％）は、（移植２か月後の組織片重量ｍｇ／移植前の組織片重量ｍｇ）×１００で示したものである。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
表２から明らかなように、多発筋腫で且つ同一個体からの複数ある摘出筋腫の場合には、相対的にサイズが大きいヒト子宮筋腫組織片を移植する場合の方が、多発筋腫で相対的にサイズが小さいヒト子宮筋腫組織片を移植する場合に比べて、移植後のヒト子宮筋腫組織片の増大率が大きくなることが見出された。そして、表に示していないが、ヒト子宮筋腫組織片のサイズが直径５ｃｍ以上のサイズを有する場合に、その増大率が確実に大きくなることも見出された。ここで、ヒト子宮筋腫組織片のサイズは、直径３ｃｍ以上であればその組織片は大きくなるが、直径５ｃｍ以上で且つ直径１０ｃｍ以下であることがより好ましい。また同時に、その増大率は、偽閉経療法を行った方が行わない場合に比べて大きくなることが見出された。
【００５２】
ここで、表１及び表２の結果によると、上述の通り、偽閉経療法を行った症例の方が移植筋腫の増大率が高くなることが確認された。これは、偽閉経療法、すなわち、内因性のエストロゲンが卵巣から合成・分泌されない状態を意味し、エストロゲンが少ないと、エストロゲン受容体ERαの数は一般的に多くなる。この現象は、アップレギュレーションやポジティブフィードバックという言葉で説明されることが多いものであって、生体における生理的な反応として、エストロゲン受容体ERはエストロゲンが少ないと感受性を上げようとして自らのERαの数を増やそうとするものである。したがって、偽閉経療法によってエストロゲン受容体ERαの数の増えた筋腫組織をマウスに移植して、大量のエストロゲンが存在する環境にすると、エストロゲンの作用が最大限に発揮されて筋腫が増大するというメカニズムによるものである。よって、偽閉経療法の筋腫を用いることも、本発明のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法にとって、重要な一つのファクターであると言える。なお、偽閉経療法としては公知の方法で行えばよい。
【００５３】
また、別の実施形態として、図１２は、子宮筋腫サイズの違いによる遺伝子発現を示している。ここで、ERα，ERβはエストロゲンの２種類の受容体、PRはプロゲステロンの受容体であり、エストロゲンはPRの発現調節に重要との報告もなされている（文献１を参照：文献１「Hiroshi Ishikawa, et al., Progesterone Is Essential for Maintenanceand Growth of Uterine Leiomyoma, Endocrinology 2010」）。また、IGF2は、細胞増殖機能を促進させたり、骨髄由来の血管内皮前駆細胞を動員して血管新生を促進する作用を有する成長因子である（文献２を参照：文献２「Yong-Sun Maeng et al., Endothelial progenitor cell homing: prominentrole of the IGF2-IGF2R-PLCβ2 axis, Blood 2009」）。また、SMembは、増殖型の平滑筋細胞に特異的に発現するマーカー蛋白である。
【００５４】
図１２から分かるように、多発筋腫で相対的に小さいサイズの筋腫組織でも、移植後の増大率の高いものが存在していた。これらは、多発筋腫で相対的に大きいサイズの筋腫組織と同様に、ERα, PR, IGF2, SMembの発現が高いことが確認された。すなわち、移植後の筋腫組織の発育・増大には、ERα, PR, IGF2, SMembの発現が重要であることが示唆される。したがって、ERα, PR, IGF2, SMembの発現が高い筋腫組織を上記ヌードマウスに移植することが好ましい。
【００５５】
以下に、上記図８に示した本実施形態のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法における上述した各ステップに相当する具体的な一実施例を説明する。
【００５６】
［実施例］
まず、BALB/cヌードマウス（6-10週齢の雌）をトリブロモエタノール300mg/kgの腹腔内投与にて麻酔し腹臥位に保定する。次に、BALB/cヌードマウスの背部皮膚をイソジン消毒した後に、ハサミで約５ｍｍの皮切を上部（複合女性ホルモン徐放剤植込用）と下部（筋腫組織片移植用）に加えて皮下ポケットを作製する（ステップ（Ａ）に対応する）。
【００５７】
次に、５ｍｍ径の皮膚生検用のトレパン（円形メス）を用いて筋腫より採取した約５×５ｍｍ２程度の組織片を調整する（ステップ（Ｂ）に対応する）。そして、該組織片を上記下部の皮下ポケットに植え込むと共に、５ｍｍ径の上述した複合女性ホルモン錠剤を上部の皮下ポケットに植え込む（ステップ（Ｃ）及び（Ｄ）に対応する）。
【００５８】
次に、それぞれの移植部（皮下ポケット）を生理食塩水で満たし、6-0ナイロン糸による皮膚縫合で閉創ののち、生体組織用接着剤で縫合部を補強する。
【００５９】
４週間後、上述と同様の手技により、５ｍｍ径の複合女性ホルモン錠剤を背側上部皮下に追加挿入する。そして、８週間後に廃部の筋腫組織移植部の皮膚を切開し、移植した筋腫を摘出する。
【００６０】
例えば、このような実施例を用いて、上述した本実施形態のヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を実施することが可能である。
【００６１】
なお、以上の実施形態では、Ｔ細胞機能だけを欠如した免疫不全非ヒト動物としての宿主動物がマウスである場合について説明したが、ヒト以外の動物、好ましくはヒト以外の哺乳動物であり、例えば、ラットが挙げられる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によると、簡便で安定したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供できる。さらに、移植後のヒト子宮筋腫組織のサイズを増大させることのできるヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を提供できる。このように、子宮筋腫の臨床像に類似したヒト子宮筋腫モデル動物の作製方法を実現でき、婦人科研究領域における実用化を図ることにより、子宮筋腫に対する新しい治療法の開発の進展に大いに資するものである。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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