(57)【要約】【課題】従来技術に関係する困難および不足のうちの１つ以上を克服するかまたは少なくとも軽減することが本発明の目的である。【解決手段】本発明は、植物におけるフルクタン生合成の修飾に、さらに詳細には、光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作するという方法に、そして関連の核酸および構築物に関する。本発明はまた、植物バイオマスを増大すること、そしてさらに詳細には、植物中の苗条および／または根の成長を含めて、バイオマスの収率および／または収率の安定性を増大する方法に、そして関連の核酸および構築物に関する。本発明はまた、生化学的経路の産生を増強する方法、さらに詳細には、植物中の融合タンパク質、ならびに関連の核酸および構築物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法であって、該植物中に、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターが光調節性プロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のフルクタン生合成酵素が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする前記核酸が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのうちの２つ以上の融合タンパク質をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
植物中の生化学的経路の生産性を増強する方法であって、該植物中に、該経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記核酸が連結されて、前記２つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生化学的経路が、フルクタン生合成経路であり、かつ該経路由来の２つ以上の酵素が１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作し得る遺伝子構築物であって、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項９に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
前記プロモーターが光調節性プロモーターである、請求項１０に記載の遺伝子構築物。
【請求項１２】
前記１つ以上のフルクタン生合成酵素が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項９に記載の遺伝子構築物。
【請求項１３】
１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする前記核酸が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのうちの２つ以上のＦＴ融合タンパク質をコードする、請求項１２に記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
植物中の生化学的経路の生産性を増強し得る遺伝子構築物であって、該経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む、遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記核酸が連結されて、前記２つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を形成する、請求項１４に記載の遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記生化学的経路が、フルクタン生合成経路であり、かつ該経路由来の２つ以上の酵素が１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項１５に記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
植物におけるバイオマスを増強する方法であって、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を該植物に導入する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロモーターが光調節性プロモーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上のフルクタン生合成酵素が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする前記核酸が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのうちの２つ以上のＦＴ融合タンパク質をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
植物中のバイオマスを増強する方法であって、該植物中に、該植物中の生化学的経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸を含む遺伝子構築物、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体の有効量を導入する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記核酸が、前記２つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を形成するように連結される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生化学的経路が、フルクタン生合成経路であり、かつ該経路由来の２つ以上の酵素が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
植物中のバイオマスを増強する方法であって、該植物中に、該植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作し得る遺伝子構築物、および該植物における老化を操作し得る遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
フルクタン生合成を操作し得る前記遺伝子構築物が、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結されたプロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロモーターが光調節性プロモーターである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
老化を操作し得る前記遺伝子構築物が、サイトキニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、ＭＹＢ遺伝子プロモーターもしくは修飾されたＭＹＢ遺伝子プロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
形質転換植物を選択する方法であって、該植物に１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程と、増強されたバイオマスを有する植物を選択する工程とを包含する、方法。
【請求項３０】
前記プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロモーターが光調節性プロモーターである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つ以上のフルクタン生合成酵素が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする前記核酸が、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのうちの２つ以上のＦＴ融合タンパク質をコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
形質転換されていないコントロールの植物に対して修飾されたフルクタン生合成特徴または増強されたバイオマスを有する、トランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
【請求項３５】
形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％の増大したバイオマスを有する、請求項３４に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
【請求項３６】
形質転換されていないコントロールの植物に対して、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％の増大した可溶性の炭水化物を有する、請求項３４に記載のトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物におけるフルクタン生合成の修飾に、さらに詳細には、光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作する方法に、そして関連の核酸および構築物に関する。
【０００２】
本発明はまた、植物バイオマスを増大すること、そしてさらに詳細には、植物中の苗条および／または根の成長を含めて、バイオマスの収率および／または収率の安定性を向上する方法に、そして関連の核酸および構築物に関する。
【０００３】
本発明はまた、生化学的経路の生産性を増強する方法、さらに詳細には、植物中の融合タンパク質、ならびに関連の核酸および構築物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
フルクタンは、ある種の水溶性の炭水化物であって、その主な機能は、植物の成長にとって容易に利用可能なエネルギー貯蔵をもたらすことである。フルクタンは草類における種々の有利な特徴、例えば、耐寒性および乾燥耐性、分げつ生残の増大、持続性の向上、切断または放牧後の良好な再成長、ストレスからの回復の改善、早春の成長、ならびに栄養質の増大に関連する。
【０００５】
草類および穀類でのフルクタンの合成および代謝は複雑である。フルクタンは、スクロースに結合した、直鎖のまたは分岐したフルクトース鎖からなる。植物のフルクタンの鎖長は、３から最大２〜３百のフルクトース単位におよぶ。種々のタイプのフルクタンは、存在する連結のタイプに基づいて識別され得る。ペレニアルライグラスでは、以下の３種のフルクタンが特定されており：イヌリン、イヌリン・ネオシリーズ（ｉｎｕｌｉｎ  ｎｅｏｓｅｒｉｅｓ）およびレバン・ネオシリーズ（ｌｅｖａｎ  ｎｅｏｓｅｒｉｅｓ）、ここでこのフルクタンプロフィールに関与する４つのフルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）酵素がある（図６）。酵素１−ＳＳＴ（スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ）はフルクタン生合成の第一段階を触媒するが、残りの酵素はフルクトース鎖の成長を伸長する（１−ＦＦＴ：フルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ、６Ｇ−ＦＦＴ：６−グルコースフルクトシルトランスフェラーゼ、および６−ＳＦＴ：スクロース：フルクトース６−フルクトシルトランスフェラーゼ）。酵素１−ＦＥＨまたは６−ＦＥＨ（フルクトエキソヒドロラーゼ）は、フルクトース分子を遊離することによってフルクタン鎖長を短くする。
【０００６】
フルクタンは、植物種のうちの１５％において主な非構造的炭水化物に相当し、かつ飼料の質において重要な役割を果たす。高いフルクタン食餌で放牧している反芻動物の家畜は、動物としての能力の改善を呈する。
【０００７】
草類におけるフルクタンのレベルおよび組成は、フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）遺伝子の操作された発現を通じて茎および葉鞘で増大されている。
【０００８】
しかし、生化学的経路において酵素の活性を操作することによるその経路の操作は、種々の酵素およびそれらの基質が相互作用し得る方法のせいで困難である場合がある。
【０００９】
従って、特に植物における生化学的経路を操作する方法を改善することが所望される。例えば、植物、例としては、草種、例えば、ＬｏｌｉｕｍおよびＦｅｓｔｕｃａ、ならびに穀類、例えば、コムギおよびトウモロコシにおいてフルクタン生合成を操作し、それによって、例えば、牧草の質が改善されている飼料草（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓｅｓ：イネ科牧草）の産生を容易にし、牧草の産生の改善、動物産生の改善および環境汚染の減少、例えば、バイオエタノール産生のためのバイオマス収率が向上したバイオエネルギー・グラス、ならびに、例えば、穀物およびバイオマス収率の増大した穀類をもたらす方法があることが望ましい。
【００１０】
フルクタン生合成経路に関与する酵素のいくつかをコードする核酸配列が、特定の種の植物について単離されている。例えば、本出願に対するＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５は、ＬｏｌｉｕｍおよびＦｅｓｔｕｃａ由来のフルクトシルトランスフェラーゼ相同体を記載する。しかし、植物でのフルクタン生合成の改変において、また植物の異なる部分におけるフルクタン蓄積を操作するために有用な物質は依然として必要とされている。
従来技術に関係する困難および不足のうちの１つ以上を克服するかまたは少なくとも軽減することが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
出願人らは、光合成細胞におけるフルクタン生合成経路の空間的再プログラミングによって、植物、例えば、飼料草を栄養的に向上させるか、および／または植物バイオマスを増大することが可能であることを見出している。このプロセスを用いれば、家畜によって主に食べられ、かつ正常にはフルクタンを蓄積し得ない植物の器官である葉身でのフルクタン蓄積を駆動することが可能である。従って、フルクタン（特に高い程度の重合化を呈するもの（「高ＤＰフルクタン」））の蓄積によって、動物が草を摂食するのにさらに利用可能な栄養が得られる。フルクタンは茎および葉鞘において蓄積し、葉のフルクタンはＣＯ２同化作用が増殖をしのぐ期間にのみ形成する。飼料草は、スクロースが合成される光合成細胞でフルクタン遺伝子を発現することによって栄養的に増強され得、これによってフルクタン蓄積は葉身で優先的に駆動して、草を摂食する家畜にさらにエネルギーを供給する。
【００１３】
飼料草におけるフルクタンは、反芻動物を放牧するための給餌において容易に利用可能なエネルギーに対して大きく寄与する。反芻胃での発酵過程には、容易に利用可能なかなりのエネルギーを必要とする。反芻胃で容易に利用可能なエネルギーの改善は、反芻胃の消化の効率を増大し得る。反芻胃消化における効率の増大は、反芻動物に対して給餌された飼料のタンパク質の乳汁または肉への変換の改善、および窒素性廃棄物の減少をもたらす。
【００１４】
出願人らはまた、例えば、葉の老化を遅らせることによって、寿命の延長のために光合成細胞を再プログラミングすることが植物バイオマスを増大することを補助するということを見出した。
【００１５】
出願人らはまた、生化学的経路由来の２つ以上の酵素の融合、さらに好ましくは翻訳的な融合をコードする遺伝子構築物により、この経路の酵素活性を同時協調することによって、この経路の生産性を増強することが可能であることも見出している。
【００１６】
出願人は、理論で束縛されることは望まないが、例えば、翻訳的な融合を発現することにより経路中の２つの酵素を近接近させることによって、個々の酵素の発現が協調されて、それによってその経路の効率が改善され得ると考えられる。
【００１７】
例えば、２つ以上のＦＴ遺伝子（例えば、Ｌｐ１−ＳＳＴおよびＬｐ６Ｇ−ＦＦＴ）の翻訳的な融合物を発現することによって、植物ゲノムに独立して組み込まれたこれらの遺伝子の発現パターンにおける相違に関連する問題が軽減され得、これによってスクロース分子は直接フルクタンに変換され、このことは低い程度の重合化（「低ＤＰフルクタン」）および高い程度の重合化（「高ＤＰフルクタン」）を示している。さらに、ＦＴタンパク質は物理的にお互いに会合して、フルクタンの効率的な生合成のための代謝チャネルを形成し得る。
【００１８】
さらに、光合成細胞で低ＤＰフルクタンおよび高ＤＰフルクタンの蓄積をもたらす光合成細胞におけるＦＴ遺伝子の発現は、光合成の阻害機序からの開放をもたらし得、それによって太陽エネルギー捕獲およびＣＯ２固定の増大が容易になる。
【００１９】
従って、出願人は、寿命の延長およびフルクタン生合成の増強のために光合成細胞を再プログラミングすることが太陽エネルギー捕獲を容易にし、かつ苗条および／または根の成長を含む植物バイオマス産生を増大することを見出している。
【００２０】
さらに、低ＤＰフルクタンおよび高ＤＰフルクタンの蓄積は、寒さおよび乾燥などの非生物的ストレスに対する植物耐性に関連している；そして、根の成長の増強および／または葉の老化の遅延はまた、乾燥ストレスの植物耐性に関係しているので、寿命の延長および／またはフルクタン生合成の増強のための光合成細胞の再プログラミングによって、収量の安定性および／または非生物学的ストレスの植物耐性が容易になり得る。
【００２１】
従って、一局面では、本発明は、植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成の操作の方法を提供し、この方法は、この植物に対して、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に作動可能に連結された、プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を備える遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する。
【００２２】
「フルクタン生合成を操作する」とは一般には、形質転換されていないコントロールの植物に対する、形質転換された植物におけるフルクタン生合成の増大を意味する。しかし、いくつかの適用では、形質転換されていないコントロール植物に対して、形質転換された植物におけるフルクタン生合成を低下するかそうでなければ改変することが所望され得る。例えば、形質転換されていないコントロールの植物に対して、形質転換された植物において、フルクタン生合成経路での特定の酵素の活性を増大または低下することが所望され得る。
【００２３】
「光合成細胞」とは、光合成が生じる植物の細胞を意味する。このような細胞は一般には、クロロフィル色素を含み、そうでなければ緑の細胞として知られる。ほとんどの光合成細胞は、植物の葉に含まれる。好ましくは、本発明の遺伝子構築物は、維管束鞘細胞で、さらに好ましくは、葉肉および／または実質性維管束鞘細胞で発現される。
【００２４】
「有効量」とは、このような植物で、またはある植物、植物種子もしくはそれらに由来する他の植物部分の特定可能な表現型形質を生じるのに十分な量を意味する。このような量は、当業者によって、植物のタイプ、投与経路および他の関連の要因を考慮して、容易に決定できる。このような人は容易に投与の適切な量および投与方法を決定できる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（その開示全体が参照によって本明細書に援用される）を参照のこと。
【００２５】
「遺伝子構築物」とは、組み換え核酸分子を意味する。
【００２６】
「プロモーター」とは、作動可能に連結された核酸配列の転写を指向するのに十分な核酸配列を意味する。
【００２７】
「作動可能に連結された」とは、適切な分子、例えば、転写活性因子タンパク質が調節性配列に結合される場合、核酸（単数または複数）および調節性配列、例えば、プロモーターが、適切な条件下でこのような核酸の発現を可能にするような方法で連結されていることを意味する。好ましくは、作動可能に連結されたプロモーターは、会合した核酸の上流である。
【００２８】
「上流」とは、その核酸にそって３’から５’の方向を意味する。
【００２９】
「核酸」とは、遺伝子情報を担持し得るヌクレオチドの鎖を意味する。この用語は一般に、生物体のゲノムにおける遺伝子またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体および／または他の配列であって、その表現型に影響するものを指す。「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖であり、必要に応じて、合成、非天然または変更されたヌクレオチド塩基、合成核酸およびそれらの組み合わせを含む、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）を包含する。
【００３０】
「フルクタン生合成酵素をコードする核酸」とは、植物中のフルクタン生合成経路の酵素、例えば、フルクトシルトランスフェラーゼ、例えば、スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）；フルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）；スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ（６−ＳＦＴ）；およびフルクタン：フルクタン６Ｇ−フルクトシルトランスフェラーゼ（６Ｇ−ＦＦＴ）；ならびにフルクトエキソヒドロラーゼ、例えば、１−フルクトエキソヒドロラーゼ（１−ＦＥＨ）および６−フルクトエキソヒドロラーゼ（６−ＦＥＨ）をコードする核酸を意味する。
【００３１】
プロモーターに関して「機能的に活性なフラグメントまたは改変体」とは、フラグメントまたは改変体（例えば、アナログ、誘導体または変異体）が、作動可能に連結された核酸の転写を指向し得ることを意味する。このような改変体としては、天然に存在する対立遺伝子改変体および天然には存在しない改変体が挙げられる。１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化は、改変がそのフラグメントまたは改変体の機能的な活性の喪失を生じない限り考慮される。好ましくは、機能的に活性なフラグメントまたは改変体は、上記で言及された配列の関連の部分（それに対してそのフラグメントまたは改変体が相当する）に対して少なくとも約８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらにそれより好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。好ましくはこのフラグメントは、少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの大きさを有する。
【００３２】
フルクタン生合成酵素をコードする核酸に関して「機能的に活性な」とは、フラグメントまたは改変体（例えば、アナログ、誘導体または変異体）が、本発明の方法によって、例えば、フルクタン生合成経路に関与し得る酵素に翻訳されることによって、植物のフルクタン生合成を操作し得るということを意味する。このような改変体としては天然に存在する対立遺伝子改変体および天然に存在しない改変体が挙げられる。１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化は、その修飾がフラグメントまたは改変体の機能的な活性の喪失を生じない限り、考慮される。好ましくは、機能的に活性なフラグメントまたは改変体は、上記で言及された配列の関連の部分（それに対してそのフラグメントまたは改変体が相当する）に対して少なくとも約８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の同一性、さらにそれより好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。このような機能的に活性な改変体およびフラグメントとしては、例えば、保存的な核酸変化を有するものが挙げられる。
【００３３】
「保存的な核酸変化」とは、遺伝子コードの縮重に起因して、コードされたタンパク質におけるアミノ酸の保存を生じる核酸置換を意味する。このような機能的に活性な改変体およびフラグメントとしてはまた、例えば、対応するアミノ酸配列における１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を生じる核酸変化を有するものが挙げられる。
【００３４】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸の同じクラスの別のアミノ酸による置換を意味し、この分類は以下のとおりである：
非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ  
塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
他の保存的アミノ酸置換もまた、以下のとおり作製され得る：
芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ
プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ
プロトン受容体；Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
特に好ましいフラグメントおよび改変体としては、１つ以上の保存的スクロース結合／加水分解ドメインが挙げられる。このようなドメインの例は、本明細書の図１７、図１８および図３６に示される、例えば、（Ｎ／Ｓ）ＤＰ（Ｎ）Ｇ、ＦＲＤＰおよびＥＣ（Ｉ）Ｄ。
【００３５】
特に好ましいフラグメントおよび改変体としてはまた、本明細書の例えば、図１７、図１８および図３６に示されるような、Ｌｏｌｉｕｍ  ＦＴに見出される１つ以上の保存的アミノ酸ドメイン、インベルターゼおよびＦＥＨ配列を挙げることができる。
【００３６】
好ましくはこのフラグメントは、少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドの大きさを有する。
【００３７】
好ましくは、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸は、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴをコードする遺伝子、それらの組み合わせ、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される。好ましくはこの核酸は、これらのフルクタン生合成酵素の２つ以上のＦＴ融合タンパク質をコードする。
【００３８】
それよりさらに好ましくは、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸は１−ＳＳＴおよび／または６Ｇ−ＦＦＴ、それよりさらに好ましくは１−ＳＳＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのＦＴ融合タンパク質、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体をコードする。
【００３９】
好ましくは、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸は、目的の種由来の遺伝子（単数または複数）から単離されるかまたはそれに対応する。さらに好ましくは、この遺伝子（単数または複数）は、ドクムギ（ライグラス）、フェスク（ｆｅｓｃｕｅ）、または小麦種、例としては、イタリアン・ライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）または一年生ライグラス、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ  ｆｅｓｃｕｅ）、ヒロハノウシノケグサ（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）、オオウシノケグサ、パン小麦およびデュラム小麦由来である。それよりさらに好ましくは、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸は、Ｌｏｌｉｕｍ種、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍから単離されるか、またはそれらに由来する遺伝子に相当する。
【００４０】
フルクタン生合成酵素をコードする適切な核酸は、その全体の開示が参照によって本明細書に援用されるＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５およびＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５に記載される。
【００４１】
特に好ましい実施形態では、１−ＳＳＴをコードする核酸としては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号１１に示される配列；およびＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号１２に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００４２】
特に好ましい実施形態では、６Ｇ−ＦＦＴをコードする核酸としては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１１０および本明細書の図７に示される配列；ならびにＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１１１および本明細書の図８に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、１−ＦＦＴをコードする核酸としては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号３に示される配列、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１０３および１０５〜１０９および本明細書の図９に示される配列；ならびにＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号４、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１０４および本明細書の図１０に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００４４】
出願人らは、２つのＦＴ遺伝子の翻訳的な融合物、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ由来のスクロース−スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｌｐ１−ＳＳＴ）およびフルクタン−フルクタン６Ｇ−フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ）を、単一のオープンリーディングフレームとして生成することによって、単一のｍＲＮＡ転写物（組み合わせた酵素活性を有する単一のタンパク質として翻訳される）を生成することを見出している。２つのＦＴ遺伝子の翻訳的な融合物（例えば、Ｌｐ１−ＳＳＴおよびＬｐ６Ｇ−ＦＦＴ）を発現することによって、植物ゲノムへ独立して組み込まれたこれらの２つの遺伝子の発現パターンにおける相違に関連する問題は、緩和され得、これによってスクロースが低ＤＰフルクタンおよび高ＤＰフルクタンに変換される。
【００４５】
特に好ましい実施形態では、１−ＳＳＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのＦＴ融合タンパク質をコードする核酸としては、本明細書の図１２および図１４に示される配列からなる群より選択される配列、ならびに本明細書の図１３および図１５に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体が挙げられる。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、この遺伝子構築物は、本明細書の図２４〜図２７、３１、３２、３５、３６、３８および４１〜４７に示される配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００４７】
さらなる局面では、本発明は、植物の生化学的経路の生産性を向上する方法を提供し、この方法は、この植物に、この経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸を含む遺伝子構築物、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体の有効量を導入する工程を包含する。
【００４８】
好ましくは、この核酸は、この２つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合タンパク質を形成するように連結される。
【００４９】
「生化学的経路」とは、２つ以上の酵素または酵素サブユニットによって触媒され、基質の産物への変換を生じる、細胞内に生じる複数の化学的反応を意味する。これには、例えば、２つ以上の酵素サブユニット（各々が別々の遺伝子によってコードされる別個のタンパク質である）が組み合わさって、ある基質をある生成物へ変換するプロセシング単位を形成する状況を包含する。「生化学的経路」は、時間的または空間的な連続性によって拘束されない。
【００５０】
「生産性を増強する」とは一般には、生化学的経路の産物の量またはその産物の産生の速度が、形質転換されていないコントロールの植物に対して形質転換された植物で増大されるということを意味する。しかし、いくつかの適用では、形質転換されていないコントロールの植物に対して形質転換された植物において、生化学的経路の産物の量またはその産物の産生の速度を低下するかそうでなければ改変することが所望され得る。例えば、形質転換されていないコントロールの植物に対して形質転換された植物において、その経路の中間体の量、または産生の速度を増大または減少することが所望され得る。
【００５１】
「融合タンパク質」とは、もともと別々のタンパク質をコードしている２つ以上の連結した核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む融合遺伝子を発現することによって組み換え的に産生されるハイブリッドタンパク質またはキメラタンパク質を意味する。
【００５２】
「融合」、「翻訳的な融合物」または「融合遺伝子」とは、融合タンパク質、好ましくは翻訳的な融合物の発現を可能にするように２つ以上の核酸が連結されることを意味する。これは代表的には、第一のタンパク質をコードする核酸配列から停止コドンを除去する工程と、次いで第二のタンパク質の核酸配列をインフレームで追加する工程とを包含する。次いで、ＦＴ融合遺伝子は細胞によって単一のタンパク質として発現される。このタンパク質は、両方のもともとのタンパク質の全長配列、またはいずれかもしくは両方の機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含むように操作されてもよい。
【００５３】
遺伝子構築物はまた、２つの連結された核酸の間のリンカーをコードする核酸配列を含んでもよい。「リンカー」とは、融合タンパク質における２つの隣接する活性フラグメントの間に位置し、かつ２つの隣接する活性フラグメントに連結された、任意の化学的な、合成の、炭水化物、脂質、ポリペプチド分子（またはそれらの組み合わせ）である。本発明の好ましいリンカーとは、可塑性のリンカー、例えば、２つの活性なフラグメントに対するアミノ酸結合によって結合される１つ以上のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖である。例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、融合タンパク質中の２つの活性フラグメントの間に位置してもよい。
【００５４】
生化学的経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸に関して「機能的に活性な」とは、フラグメントまたは改変体（例えば、アナログ、誘導体または変異体）が、本発明の方法によって植物中の生化学的経路の生産性を増強し得ることを意味する。このような改変体としては、天然に存在する対立遺伝子改変体および天然には存在しない改変体が挙げられる。１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化は、その改変（修飾）がフラグメントまたは改変体の機能的な活性の喪失を生じない限り、考慮される。好ましくは、機能的に活性なフラグメントまたは改変体は、上述の配列の関連の部分（それに対してフラグメントまたは改変体が対応する）に対して少なくとも約８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の同一性、それよりさらに好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。このような機能的に活性な改変体およびフラグメントとしては、例えば、保存的な核酸変化を有するものが挙げられる。「保存的な核酸変化」とは、遺伝子コードの縮重に起因して、コードされたタンパク質における同じアミノ酸の保存を生じる核酸置換を意味する。このような機能的に活性な改変体およびフラグメントとしてはまた、例えば、対応するアミノ酸配列における１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を生じる核酸変化を有するものが挙げられる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸の同じ分類の別のアミノ酸による置換を意味し、この分類は以下のとおりである：
非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ
非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ  
塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ
他の保存的アミノ酸置換もまた、以下のとおり作製され得る：
芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ
プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ
プロトン受容体；Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
特に好ましいフラグメントおよび改変体としては、１つ以上の保存的スクロース結合／加水分解ドメインが挙げられる。このようなドメインの例は、本明細書の図１７、図１８および図３６に示される、例えば、（Ｎ／Ｓ）ＤＰ（Ｎ）Ｇ、ＦＲＤＰおよびＥＣ（Ｉ）Ｄ。
【００５５】
特に好ましいフラグメントおよび改変体としてはまた、本明細書の例えば、図１７、図１８および図３６に示されるような、Ｌｏｌｉｕｍ  ＦＴに見出される１つ以上の保存的アミノ酸ドメイン、インベルターゼおよびＦＥＨ配列を挙げることもできる。
【００５６】
好ましくはこのフラグメントは、少なくとも２０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドの大きさを有する。
【００５７】
好ましくは、生化学的経路はフルクタン生合成経路である。
【００５８】
好ましくは、この経路由来の２つ以上の酵素は、植物中のフルクタン生合成経路の酵素、例えば、フルクトシルトランスフェラーゼ、例えば、スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）；フルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）；スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ（６−ＳＦＴ）；およびフルクタン：フルクタン６Ｇ−フルクトシルトランスフェラーゼ（６Ｇ−ＦＦＴ）；およびフルクトエキソヒドロラーゼ、例えば、１−フルクトエキソヒドロラーゼ（１−ＦＥＨ）および６−フルクトエキソヒドロラーゼ（６−ＦＥＨ）からなる群から選択される。
【００５９】
それよりさらに好ましくは、ＦＴ融合タンパク質をコードする核酸としては、ＦＴ融合遺伝子を形成するように連結された、１−ＳＳＴ、１−ＦＦＴ、６−ＳＦＴおよび６Ｇ−ＦＦＴをコードする遺伝子、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される２つ以上の核酸が挙げられる。この核酸は、可塑性リンカーなどのリンカーによって必要に応じて接続される。
【００６０】
それよりさらに好ましくは、ＦＴ融合タンパク質をコードする核酸としては、可塑性リンカーなどのリンカーによって必要に応じて接続される、１−ＳＳＴおよび６Ｇ−ＦＦＴのＦＴ融合タンパク質を形成するように連結された２つ以上の核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体が挙げられる。
【００６１】
好ましくは、フルクタン生合成経路の酵素をコードする遺伝子は、ドクムギ（ライグラス）またはフェスク（ｆｅｓｃｕｅ）種、例としては、イタリアン・ライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）または一年生ライグラス、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ  ｆｅｓｃｕｅ）、ヒロハノウシノケグサ（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）、およびオオウシノケグサから単離されるか、またはそれら由来の遺伝子に対応する。それよりさらに好ましくは、フルクタン生合成経路の酵素をコードする遺伝子は、Ｌｏｌｉｕｍ種、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍから単離されるか、またはそれら由来の遺伝子に対応する。
【００６２】
フルクタン生合成酵素をコードする適切な核酸は、その全体の開示が参照によって本明細書に援用されるＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５およびＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５に記載される。
【００６３】
特に好ましい実施形態では、１−ＳＳＴをコードする核酸としては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号１１に示される配列；およびＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号１２に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００６４】
特に好ましい実施形態では、６Ｇ−ＦＦＴをコードする核酸としては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１１０および本明細書の図７に示される配列；ならびにＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１１１および本明細書の図８に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、１−ＦＦＴをコードする核酸としては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号３に示される配列、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１０３および１０５〜１０９および本明細書の図９に示される配列；ならびにＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号４、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１０４および本明細書の図１０に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００６６】
特に好ましい実施形態では、１−ＳＳＴおよび６Ｇ−ＦＦＴをコードする核酸としては、本明細書の図１２および図１４に示される配列からなる群より選択される配列、ならびに本明細書の図１３および図１５に示されるポリペプチド配列をコードする核酸配列；ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体が挙げられる。
【００６７】
特に好ましい実施形態では、この遺伝子構築物は、本明細書の図２４〜図２７、３１、３２、３５、３６、３８および４１〜４７５に示される配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００６８】
本発明の構築物および方法で用いられるプロモーターは、構成的プロモーターであっても、組織特異的プロモーターであっても、または誘導性プロモーターであってもよい。好ましい実施形態では、このプロモーターは、光調節性プロモーター、さらに好ましくは光合成プロモーターである。「光調節性プロモーター」とは、光刺激に応答して遺伝子発現を媒介し得るプロモーターを意味する。「光合成プロモーター」とは、植物における光合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を媒介し得るプロモーターを意味する。
【００６９】
葉鞘および茎よりも成熟した葉身で蓄積するフルクタンは少ない。葉身におけるフルクタンのレベルを特異的に増大するために、光合成細胞においてフルクタン生合成遺伝子を協調的に発現する戦略的アプローチが考案されている（図１）。光調節性プロモーターまたは光合成プロモーターの使用は以下の利点をもたらし得る：
・光合成プロモーターは、葉身、上の茎および外の茎を含む細胞の大きい群（５５％を超える細胞）で活性である；
・それらは、スクロース産生細胞（葉肉細胞および実質性維管束鞘細胞）で活性である；
・それらの発現パターンはスクロース蓄積と時間的におよび空間的に重複する；
・フルクトシルトランスフェラーゼ活性は、ソースからスクロースを取り出し、それによって光合成に対するフィードバック抑制を妨げ、そしてＣＯ２固定の増大を促進し得る。
【００７０】
特に好ましい光調節性プロモーターとしてはリブロース−１，５−ビフォスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｏｘｙｇｔｅｎａｓｅ）スモールサブユニット（ＲｂｃＳ）プロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）プロモーター、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体が挙げられる。
【００７１】
光調節性プロモーターは、任意の適切な植物種由来であってもよく、この植物種としては、単子葉植物［例えば、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、飼料草、バイオエネルギー・グラス］、双子葉植物（例えば、シロイヌナズナ、ダイズ、キャノーラ、ワタ、アルファルファおよびタバコ）および裸子植物が挙げられる。
【００７２】
好ましくは、光調節性プロモーターは、ドクムギ（ライグラス）、またはフェスク（ｆｅｓｃｕｅ）種、例としては、イタリアン・ライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）または一年生ライグラス、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ  ｆｅｓｃｕｅ）、ヒロハノウシノケグサ（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）、およびオオウシノケグサから単離されるか、またはそれら由来のプロモーターに相当する。それよりさらに好ましくは、光調節性プロモーターは、Ｌｏｌｉｕｍ種、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍから単離されるか、またはそれらに由来のプロモーターに相当する。
【００７３】
別の実施形態では、好ましくは光調節性プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、それよりさらに好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから単離されるか、またはそれに由来するプロモーターに相当する。
【００７４】
特に好ましい実施形態では、ＲｂｃＳプロモーターとしては、本明細書の図５に示される配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００７５】
特に好ましい実施形態では、ＲｂｃＳプロモーターとしては、本明細書の図３８に示される配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００７６】
別の特に好ましい実施形態では、ＣＡＢプロモーターとしては、本明細書の図４に示される配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、このプロモーターは、ユビキチン（Ｕｂｉ）プロモーターなどの構成的なプロモーターであってもよい。
【００７８】
特に好ましい実施形態では、このＵｂｉプロモーターとしては、本明細書の図４１に示される配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択される配列が挙げられる。
【００７９】
本発明の遺伝子構築物は、任意の適切な技術によって植物中に導入されてもよい。本発明の遺伝子構築物を植物細胞中に組み込むための技術（例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換または遺伝子標的化による）は、当業者に周知である。このような技術としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性導入、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ媒介性導入、組織、細胞およびプロトプラストへのエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、生殖器官への注入、未成熟胚への注入、ならびに細胞、組織、カルス、未熟胚および成熟胚への高速入射（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）導入、微粒子銃形質転換、ウィスカー（Ｗｈｉｓｋｅｒ）形質転換、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。技術の選択は、多くは、形質転換されるべき植物のタイプに依存し、かつ適切には当業者によって容易に決定され得る。
【００８０】
本発明の遺伝子構築物を組み込んでいる細胞を、下記のとおり選択し、次いで、適切な培地中で培養して、当該分野で周知の技術を用いて、形質転換された植物を再生してもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、当業者に明白である。得られた植物を、当該分野で周知の方法を用いて、性的にまたは無性的にいずれかで再生して、形質転換された植物の継続的世代を産生してもよい。
【００８１】
本発明の方法は、種々の植物、例としては、単子葉植物［例えば、草類（例えば、飼料、芝およびバイオエネルギー・グラス、例としては、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ  ｆｅｓｃｕｅ）、イタリアン・ライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）、オオウシノケグサ（ｒｅｄ  ｆｅｓｃｕｅ）、クサヨシ（ｒｅｅｄ  ｃａｎａｒｙｇｒａｓｓ）、オオウシクサ（ｂｉｇ  ｂｌｕｅｓｔｅｍ）、スパルティナ（ｃｏｒｄｇｒａｓｓ）、ネピアグラス（ｎａｐｉｅｒｇｒａｓｓ）、ハマムギ（ｗｉｌｄｒｙｅ）、野生サトウキビ（ｗｉｌｄ  ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、スイッチグラス）、コーンまたはトウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、ライムギ、カラスムギ）］、双子葉植物［例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、タバコ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ジャガイモ、キャッサバ、クローバー（例えば、シロツメグサ、アカツメクサ（ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ）、サブタレニアンクローバー）、アブラナ科の野菜（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｓ）、レタス、ホウレンソウ］および裸子植物に適用され得る。
【００８２】
本発明のさらなる局面では、植物の光合成細胞においてフルクタン生合成を操作し得る遺伝子構築物が提供され、この遺伝子構築物は、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、光調節性プロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む。
【００８３】
本発明のなおさらなる局面では、植物中の生化学的経路の生産性を増強し得る遺伝子構築物が得られ、この遺伝子構築物は、この経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む。
【００８４】
好ましくは、この核酸は、このような２つ以上の酵素の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を形成するように連結される。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の種々の局面による遺伝子構築物はベクターであり得る。
【００８６】
「ベクター」とは、標的細胞に対して遺伝物質を移すために用いられる遺伝子構築物を意味する。
【００８７】
ベクターは、任意の適切な種類であってもよく、かつウイルスであってもまたはウイルスでなくてもよい。ベクターは、発現ベクターであってもよい。このようなベクターとしては、染色体、非染色体および合成の核酸配列、例えば、植物ウイルスの誘導体：細菌プラスミド；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉプラスミドの誘導体；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のＲｉプラスミドの誘導体；ファージＤＮＡ；酵母人工染色体；細菌人工染色体；バイナリー（ｂｉｎａｒｙ）細菌人工染色体；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクターが挙げられる。しかし、任意の他のベクターが、植物細胞中で複製可能であるか、組み込み的であるかまたは実現可能である限り用いられてもよい。
【００８８】
本発明のこの局面の好ましい実施形態では、遺伝子構築物はさらに、ターミネーターを含んでもよく；このプロモーター、遺伝子およびターミネーターは作動可能に連結されている。
【００８９】
このプロモーター、遺伝子およびターミネーターは、それらが標的植物細胞中で機能的であるならば、任意の適切な種類であってもよいし、標的植物細胞に対して内因性であってもよいし、または外因性であってもよい。
【００９０】
本発明の遺伝子構築物において使用され得る種々のターミネーターは、当業者に周知である。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子または異なる遺伝子由来であってもよい。特に適切なターミネーターは、ポリアデニル化シグナル、例えば、（ＣａＭＶ）３５ＳポリＡ、ならびにノパリン合成酵素（ｎｏｓ）およびオクトピン合成酵素（ｏｃｓ）の遺伝子由来の他のターミネーターである。
【００９１】
遺伝子構築物はプロモーター、遺伝子およびターミネーターに加えて、核酸の発現に必要なさらなる構成要素、例えば、ベクター骨格、複製起点（ｏｒｉ）、マルチクローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン（例えば、トウモロコシユビキチンＵｂｉイントロン）、抗生物質耐性遺伝子、および他の選択マーカー遺伝子［例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔｌｌ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒまたはｐａｔ）遺伝子］およびレポーター遺伝子（例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｇｕｓＡ）］を、異なる組み合わせで含んでもよい。遺伝子構築物はまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含んでもよい。遺伝子構築物はまた、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。
【００９２】
詳細には、遺伝子構築物はさらに、本明細書において前に記載されたような、２つの連結された核酸の間のリンカーをコードする核酸配列を含んでもよい。
【００９３】
当業者は、遺伝子構築物の種々の構成要素がこの核酸の発現を生じるように作動可能に連結されることを理解する。本発明の遺伝子構築物の構成要素を作動可能に連結するための技術は、当業者に周知である。このような技術としては、例えば、１つ以上の制限酵素部位を含む、合成リンカーなどのリンカーの使用が挙げられる。
【００９４】
好ましくは、遺伝子構築物は、実質的に精製または単離される。「実質的に精製される」とは、その遺伝子構築物が、本発明の核酸またはプロモーターが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて、その核酸またはプロモーターに隣接している遺伝子を含まないことを意味する。従って、この用語は例えば、ベクター中に；自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス中に；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれている遺伝子構築物を包含する；またはこれは、他の配列とは独立して別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じるｃＤＮＡもしくはゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメント）として存在する。これはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である遺伝子構築物も包含する。好ましくは、実質的に精製された遺伝子構築物は、少なくとも約９０％純粋、さらに好ましくは少なくとも約９５％純粋、それよりさらに好ましくは少なくとも約９８％純粋である。
【００９５】
「単離された」という用語は、その物質がそのもとの環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている植物に存在する天然に存在する核酸は、単離されておらず、ただし、同じ核酸であって、天然の系の同時に存在する物質のいくつかまたは全てから分離された核酸は、単離されている。このような核酸は、ベクターの一部であってもよく、および／またはこのような核酸は、組成物の一部であってもよく、そしてこのようなベクターもしくは組成物がその天然の環境の一部ではないという点でやはり単離されている。
【００９６】
形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を得るための選択マーカー遺伝子の使用の別法として、形質転換された細胞における遺伝子構築物の存在を、当該分野で周知の他の技術、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、組織化学的アッセイ（例えば、ＧＵＳアッセイ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ノーザンブロットおよびウエスタンブロットのハイブリダイゼーション分析によって決定してもよい。
【００９７】
出願人はまた、本発明の方法が、形質転換されていないコントロールの植物に対して形質転換された植物でバイオマスの増強を生じ得ることを見出している。この増強されたバイオマスは次に、形質転換された植物を特定するための選択ツールとして用いられ得る。これは、ある状況では、このようなマーカーのその後の除去（およびマーカーなしの植物の作製のために）が困難であり得る場合、形質転換体について選択するために抗生物質耐性も他のマーカーも含む必要がない場合があるという利点を有する。
【００９８】
「バイオマスの増強」または「増強されたバイオマス」とは、形質転換されていないコントロールの植物に対して形質転換された植物における、苗条および／または根の成長を含む、バイオマスの収量の増強、増大または安定性の向上を意味する。例えば、植物の高さ、牧草乾燥重量、総葉面積、累積葉面積、葉成長動態（すなわち、経時的な葉の数）、苗条の数、分げつ数、根の数、根の量または重量、苗条の量または重量、根の長さ、苗条の長さ、走根の長さ、塊茎の数、塊茎重量、花の数、果実の数、種子の数、種子の重量、果実の重量、開花する植物の割合、および花あたりのまたは種を播いた面積あたりの種子の収率からなる群より選択される１つ以上の成長特徴；が、形質転換されていないコントロールの植物に対して形質転換された植物で増強されるか、増大されるかさらに安定化され得る。
【００９９】
この技術は特に、実質的に遺伝子的に均一であるか、または遺伝子的に同一であるか、または形質転換の前にバイオマスにおいてわずかな表現型の相違を示す植物に対して適用可能である。
【０１００】
従って、本発明のさらなる局面では、植物中のバイオマスを増強する方法が提供され、この方法は、この植物に対して、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する。好ましくは、このプロモーターは光調節性プロモーターである。
【０１０１】
本発明のなおさらなる局面では、植物中のバイオマスを増強する方法が提供され、この方法は、この植物中に、この植物における生化学的経路由来の２つ以上の酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する。
【０１０２】
本発明のなおさらなる局面では、植物中のバイオマスを増強する方法が提供され、この方法は、この植物中に、この植物の光合成細胞におけるフルクタン生合成を操作し得る遺伝子構築物、およびこの植物における老化を操作し得る遺伝子構築物の有効量を導入する工程を包含する。
【０１０３】
この遺伝子構築物は、本明細書において前に記載されるような任意の適切な技術によって植物に導入されてもよく、そして同時に導入されても、連続して導入されても、または別々に導入されてもよい。
【０１０４】
好ましくは、フルクタン生合成を操作し得る遺伝子構築物としては、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体が挙げられる。好ましくは、このプロモーターは光調節性プロモーターである。
【０１０５】
好ましくは、植物における老化を操作し得る遺伝子構築物は、植物の光合成細胞において老化を操作し得る。
【０１０６】
好ましくは、老化を操作し得る遺伝子構築物としては、サイトキニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、ＭＹＢ遺伝子プロモーター、または修飾されたＭＹＢ遺伝子プロモーター、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体が挙げられる。
【０１０７】
適切な遺伝子構築物またはベクターは、その開示全体が参照によって本明細書に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２および米国特許出願１１／７８９，５２６号に記載されている。
【０１０８】
「老化を操作する」とは一般には、形質転換されていないコントロール植物に対して、形質転換された植物、または形質転換された植物の細胞もしくは器官、例えば、光合成細胞における老化を遅らせることに関する。しかし、いくつかの適用では、植物中で老化を促進するか、そうでなければ修飾することが所望され得る。老化は、例えば、アンチセンス遺伝子を利用することによって促進されてもよいし、そうでなければ修飾されてもよい。
【０１０９】
ＭＹＢ遺伝子プロモーターは、任意の適切な種類であってもよい。好ましくは、ＭＹＢ遺伝子プロモーターは、ＭＹＢ３２遺伝子プロモーターである。好ましくはＭＹＢ遺伝子プロモーターは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、さらに好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来である。最も好ましくはＭＹＢ遺伝子プロモーターとしては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２の配列番号１に示される配列ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１１０】
適切なプロモーターは、その開示全体が参照によって本明細書に援用される、Ｌｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ＭＹＢ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＰＧＲ  ９９−１３８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２１：３１３（１９９９）に記載される。
【０１１１】
「修飾されたＭＹＢ遺伝子プロモーター」とは、ＭＹＢ遺伝子と正常には会合しているプロモーターであって、このプロモーターにおける１つ以上の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失または不活性化するように修飾されているプロモーターを意味する。
【０１１２】
好ましくは、修飾されたＭＹＢ遺伝子プロモーターは、修飾されたＭＹＢ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、この修飾されたＭＹＢ遺伝子プロモーターは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、さらに好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のＭＹＢ遺伝子プロモーターから修飾される。
【０１１３】
本発明によって修飾され得る適切なプロモーターは、その開示全体が参照によって本明細書に援用される、Ｌｉら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ＭＹＢ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ（ＰＧＲ  ９９−１３８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２１：３１３（１９９９）に記載される。
【０１１４】
「根特異的モチーフ」とは、植物の根における任意の関連する遺伝子の発現を指向する、３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、さらに好ましくは５ヌクレオチドの配列を意味する。
【０１１５】
好ましくは、根特異的なモチーフとしては、コンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴが挙げられる。
【０１１６】
「花粉特異的モチーフ」とは、植物の花粉における関連する遺伝子の発現を指向する、３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、さらに好ましくは４または５ヌクレオチドの配列を意味する。
【０１１７】
好ましくは、花粉特異的なモチーフとしては、ＴＴＴＣＴ、ＡＧＡＡＡ、ＴＴＣＴおよびＡＧＡＡからなる群より選択されるコンセンサス配列が挙げられる。
【０１１８】
根または花粉特異的なモチーフは、これがもはや好ましいコンセンサス配列を有さないように、モチーフ内に１つ以上のヌクレオチドを付加、欠失、置換または誘導体化することによって不活性化され得る。
【０１１９】
好ましくは、この修飾されたＭＹＢ遺伝子プロモーターは、米国特許出願第１１／７８９，５２６号の配列番号２、３および４に示される配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を包含する。
【０１２０】
「サイトキニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子」とは、キネチン、ゼアチンおよびベンジルアデニンのようなサイトキニン類の合成に関与する酵素をコードする遺伝子、例えば、イソペンチルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードする遺伝子、またはＩＰＴ様遺伝子、例えば、ｓｈｏ遺伝子（例えば、ペチュニア由来）を意味する。好ましくは、この遺伝子は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）遺伝子またはｓｈｏ遺伝子である。好ましい実施形態では、この遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、さらに好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｌｏｔｕｓ、さらに好ましくはＬｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ；およびＰｅｔｕｎｉａ、さらに好ましくはＰｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａからなる群より選択される種由来である。
【０１２１】
最も好ましくは、この遺伝子は、米国特許出願第１１／７８９，５２６号の配列番号５、７および９に示される配列、米国特許出願第１１／７８９，５２６号の配列番号６、８および１０に示されるポリペプチドをコードする配列、ならびにその機能的に活性なフラグメントおよび改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を包含する。
【０１２２】
本発明はまた、形質転換された植物の選択の方法を提供し、この方法は、この植物に対して、１つ以上のフルクタン生合成酵素をコードする核酸、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体に対して作動可能に連結された、プロモーターまたはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む遺伝子構築物の有効量を導入する工程と、バイオマスが増強された植物を選択する工程とを包含する。好ましくは、このプロモーターは光調節性プロモーターである。
【０１２３】
本発明のさらなる局面では、形質転換されていないコントロールの植物に対して、フルクタンの生合成の特徴が修飾されたか、またはバイオマスが増強された、トランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分が提供される。
【０１２４】
「修飾されたフルクタン生合成特徴」とは、形質転換された植物が、形質転換されていないコントロールの植物に対して、フルクタン生合成の増大を呈するか、および／または可溶性の炭水化物のレベルの増大を含むことを意味する。
【０１２５】
好ましい実施形態では、バイオマスが増強した、トランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分は、形質転換されていないコントロール植物に対して少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％のバイオマスの増大を有する。
【０１２６】
例えば、バイオマスは、形質転換されていないコントロール植物に対して、約１０％〜３００％の間、より好ましくは約２０％〜２００％の間、より好ましくは約３０％〜１００％の間、より好ましくは約４０％〜８０％の間まで増大され得る。
【０１２７】
例えば、植物の高さは、形質転換されていないコントロール植物に対して、約１０％〜３００％の間、より好ましくは約２０％〜２００％の間、より好ましくは約３０％〜１００％の間、より好ましくは約４０％〜８０％の間まで増大され得る。
【０１２８】
例えば、牧草の乾燥重量は、形質転換されていないコントロール植物に対して、約１０％〜６００％の間、より好ましくは約２０％〜４００％の間、より好ましくは約３０％〜３００％の間、より好ましくは約４０％〜２００％の間まで増大され得る。
【０１２９】
好ましい実施形態では、フルクタンの生合成特徴が修飾されているトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分は、形質転換されていないコントロール植物に対して少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なくとも約２０％、さらに好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％の可溶性炭水化物の増大を有する。
【０１３０】
例えば、可溶性の炭水化物は、形質転換されていないコントロール植物に対して、約１０％〜３００％の間、より好ましくは約２０％〜２００％の間、より好ましくは約３０％〜１００％の間、より好ましくは約４０％〜８０％の間まで増大され得る。
【０１３１】
例えば、フルクタン濃度は、形質転換されていないコントロール植物に対して、約１０％〜６００％の間、より好ましくは約２０％〜４００％の間、より好ましくは約３０％〜２００％の間、より好ましくは約４０％〜１５０％の間増大され得る。
【０１３２】
好ましくは、この植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分は、本発明による遺伝子構築物またはベクターを含む。好ましくはこのトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分は、本発明の方法によって産生される。
【０１３３】
本発明はまた、本発明の植物細胞由来であり、かつ本発明の遺伝子構築物またはベクターを含む、トランスジェニックの植物、植物種子または他の植物部分を提供する。
【０１３４】
本発明はまた、本発明の植物由来であり、かつ本発明の遺伝子構築物またはベクターを含む、トランスジェニックの植物、植物種子または他の植物部分を提供する。
【０１３５】
好ましくは、このトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分は、Ｌｏｌｉｕｍ種、さらに好ましくはＬｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍである。
【０１３６】
好ましくは、このトランスジェニックの植物細胞、植物、植物種子または他の植物部分は、穀物、さらに好ましくはＴｒｉｔｉｃｕｍ種、さらに好ましくはコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）である。
【０１３７】
例えば、本発明は、草食動物の栄養の改善のための、葉身におけるフルクタンの増大、活発な成長、および／または非生物的ストレスに対する大きい耐性があるトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の産生を可能にする。
【０１３８】
本発明はまた、使用可能な炭水化物の質量の増大のための、例えば、バイオ燃料産生または動物の飼料のための、フルクタン増大、活発な成長、および／または非生物的ストレスに対する耐性を有するトランスジェニックコムギ植物の産生を可能にする。
【０１３９】
「植物細胞」とは、半透過性の膜によって結合され、プラスチド（色素体）を含む任意の自己増殖性の細胞を意味する。このような細胞はまた、さらなる増殖が所望される場合、細胞壁を要する。本明細書において用いる場合、植物細胞としては、限定するものではないが、藻類、シアノバクテリア（ラン藻類）、種子懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉および小胞子が挙げられる。
【０１４０】
「トランスジェニック」とは、人工的に細胞へ挿入され、かつその細胞から発達する生物体のゲノムの一部になるＤＮＡ配列を含む任意の細胞を意味する。本明細書において用いる場合、トランスジェニック生物体とは一般には、トランスジェニック植物であり、かつＤＮＡ（導入遺伝子）が核または色素体のゲノムのいずれかに人工的に挿入される。  
【０１４１】
本発明のさらなる局面では、植物中の生化学的経路の２つ以上の酵素、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を含む融合タンパク質が提供される。
【０１４２】
この状況での「機能的に活性な」とは、このフラグメントまたは改変体が、対応するタンパク質（このフラグメントまたは改変体が由来する）の１つ以上の生物学的特性を有することを意味する。アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、置換および誘導体化は、修飾がフラグメントまたは改変体の機能的な活性の喪失を生じない限り、考慮される。好ましくは、このフラグメントまたは改変体は、このフラグメントまたは改変体が対応する上述の配列の関連部分に対して少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性を有する。このような機能的に活性な改変体およびフラグメントとしては、例えば、対応するアミノ酸配列における１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を有するものが挙げられる。
【０１４３】
好ましくは、このフラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸という大きさを有する。
【０１４４】
好ましくは、生化学的経路は、フルクタン生合成経路である。
【０１４５】
好ましくは、この経路由来の２つ以上の酵素は、植物におけるフルクタン生合成経路の酵素、例えば、フルクトシルトランスフェラーゼ、例えば、スクロース：スクロース１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＳＳＴ）；フルクタン：フルクタン１−フルクトシルトランスフェラーゼ（１−ＦＦＴ）；スクロース：フルクタン６−フルクトシルトランスフェラーゼ（６−ＳＦＴ）；およびフルクタン：フルクタン６Ｇ−フルクトシルトランスフェラーゼ（６Ｇ−ＦＦＴ）；およびフルクトエキソヒドロラーゼ、例えば、１−フルクトエキソヒドロラーゼ（１−ＦＥＨ）および６−フルクトエキソヒドロラーゼ（６−ＦＥＨ）からなる群より選択される。それよりさらに好ましくは、融合タンパク質とは、１−ＳＳＴ、および６Ｇ−ＦＦＴのＦＴ融合タンパク質、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体である。
【０１４６】
好ましくは、この経路由来の２つ以上の酵素は、ドクムギ（ライグラス）またはフェスク（ｆｅｓｃｕｅ）種、例としては、イタリアン・ライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）または一年生ライグラス、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ（ｔａｌｌ  ｆｅｓｃｕｅ）、ヒロハノウシノケグサ（ｍｅａｄｏｗ  ｆｅｓｃｕｅ）、およびオオウシノケグサ由来の酵素に相当する。それよりさらに好ましくは、この経路由来の２つ以上の酵素は、Ｌｏｌｉｕｍ種、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ由来の酵素に相当する。
【０１４７】
適切なフルクタン生合成酵素は、その開示全体が参照によって本明細書に援用されるＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５およびＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５に記載される。
【０１４８】
特に好ましい実施形態では、１−ＳＳＴとしては、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７０５の配列番号１２に示されるアミノ酸配列、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体が挙げられる。
【０１４９】
特に好ましい実施形態では、６Ｇ−ＦＦＴは、ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１２７５の配列番号１１１または本明細書の図８に示されるアミノ酸配列、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体を包含する。
【０１５０】
特に好ましい実施形態では、１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合タンパク質としては、本明細書の図１３または図１５に示されるアミノ酸配列、またはその機能的に活性なフラグメントもしくは改変体が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１は、葉身における光合成細胞におけるフルクタン生合成遺伝子の標的化発現のためのモデルを示す。フルクトシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）遺伝子の発現は、光合成プロモーターで駆動される。次いで、フルクタン生合成は、スクロース産生光合成細胞で生じる。ピラミッド化では、葉の老化を遅らせるサイトキニン生合成の修飾をともなっており、これによってフルクタンを合成するように操作されている光合成細胞の寿命が延長し、かつバイオマス産生の増大がもたらされる。
【図２】図２は、ペレニアルライグラスにおけるＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の発現は、定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって示されるように光調節されることを示す。組織サンプリングは４時間ごとに行った。ボックスは日光のある期間に相当する。
【図３】図３は、ペレニアルライグラスにおける、リブロース−１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（ＬｐＲｂｃＳ）およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬｐＣＡＢ）のインシリコでの発現パターンにおいて、これは植物性組織で最も豊富であることが示される。ＬｐＲｂｃＳ（コンティグＬＰＣＬ９＿Ｃ３５９）は、４７ＥＳＴによって示され、そしてＬｐＲｂｃＳ（コンティグＬＰＣＬ１１１２＿Ｃ１２）は、１９ＥＳＴによって示される。
【図４】図４は、ＬｐＣＡＢプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図５】図５は、ＬｐＲｂｃＳプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図６】図６は、いくつかの牧草でのフルクタン生合成経路の模式図を示す。
【図７−１】図７は、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図７−２】図７は、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図８】図８は、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴの推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図９−１】図９は、Ｌｐ１−ＦＦＴオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図９−２】図９は、Ｌｐ１−ＦＦＴオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図１０】図１０は、Ｌｐ１−ＦＦＴの推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図１１】図１１は、Ｌｐ１−ＳＳＴおよびＬｐ６Ｇ−ＦＦＴフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の翻訳的なＦＴ融合物（Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ）を生成するために用いられるストラテジーの図表示を示す。
【図１２−１】図１２は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図１２−２】図１２は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図１２−３】図１２は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図１２−４】図１２は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図１３−１】図１３は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物１の推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１３−２】図１３は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物１の推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１４−１】図１４は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１４−２】図１４は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１４−３】図１４は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１４−４】図１４は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１５−１】図１５は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３の推定アミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１５−２】図１５は、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３の推定アミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１６】図１６は、Ｌｐ１−ＳＳＴ、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＬｐ１−ＦＦＴフルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の種々の翻訳的なＦＴ融合物を生成するために用いられるべきストラテジーの図表示を示す。
【図１７】図１７（Ａ）および図１７（Ｂ）は、膜貫通タンパク質を形成するＦＴタンパク質の相互作用の仮想モデルを示す。図１７（Ｃ）は、Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ−ＦＦＴタンパク質における重要なタンパク質ドメインの提示である。ボックス１：（Ｎ／Ｓ）ＤＰＮＧ；ボックス２：ＲＤＰおよびＢｏｘ３：ＥＣは、基質（スクロース）結合および加水分解に関与する高度保存ドメインである。交差（Ｘ）は、Ｌｏｌｉｕｍ種、ＬＳ−大サブユニット、ＳＵ−小サブユニット由来のＦＴ、インベルターゼおよびＦＥＨ配列のなかで見出される高度保存アミノ酸配列（ドメイン）に相当する。Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３タンパク質のアミノ酸配列内の活性ドメインの提示は、図３６に見ることができる。
【図１８−１】図１８は、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ由来のＦＴ、ＩＮＶおよびＦＥＨのアミノ酸のアラインメント（配列番号１１〜３３）を示す。ＦＴ、インベルターゼおよびＦＥＨ配列のなかで見出される重要なタンパク質ドメイン、例えば、（Ｎ／Ｓ）ＤＰＮＧ、ＲＤＰおよびＥＣ（基質（スクロース）結合および加水分解に関与する高度保存ドメインに相当する）には、太字の下線を付し、表示している。Ｌｏｌｉｕｍ種由来のＦＴ、インベルターゼおよびＦＥＨの配列のなかで見出される高度に保存されたアミノ酸ドメインは、下線を付している。Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３タンパク質のアミノ酸配列内の活性ドメインの提示は図３６に見ることができる。
【図１８−２】図１８は、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ由来のＦＴ、ＩＮＶおよびＦＥＨのアミノ酸のアラインメント（配列番号１１〜３３）を示す。ＦＴ、インベルターゼおよびＦＥＨ配列のなかで見出される重要なタンパク質ドメイン、例えば、（Ｎ／Ｓ）ＤＰＮＧ、ＲＤＰおよびＥＣ（基質（スクロース）結合および加水分解に関与する高度保存ドメインに相当する）には、太字の下線を付し、表示している。Ｌｏｌｉｕｍ種由来のＦＴ、インベルターゼおよびＦＥＨの配列のなかで見出される高度に保存されたアミノ酸ドメインは、下線を付している。Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物３タンパク質のアミノ酸配列内の活性ドメインの提示は図３６に見ることができる。
【図１９】図１９は、フルクタン：フルクタン６Ｇ−フルクトシルトランスフェラーゼ（Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ）の機能的な分析を示す。Ａ）酵母発現ベクターにおけるＬｐ６Ｇ−ＦＦＴのプラスミドマップ。Ｂ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されただけの、ｐＰＩＣＺαＡ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴまたはｐＰＩＣＺαＡベクターのいずれかを含む酵母から排泄されるタンパク質。Ｃ）高圧陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）後の水溶性炭水化物（ＷＳＣ）のトレース。ＷＳＣはタマネギ、またはＬｐ６Ｇ−ＦＦＴ精製タンパク質（ｐＰＩＣＺαＡ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ）もしくはコントロールのみのベクター（ｐＰＩＣＺαＡ）のいずれかとインキュベートした１−ケストースの溶液から単離した。
【図２０】図２０は、マルチサイト・ゲートウェイ・組み換えクローニングに用いられるベースのデスティネーション・ベクターであるｐＰＺＰ２００−ｕｂｉ：ｂａｒ−ｎｏｓ  Ｒ４  Ｒ３を示す。
【図２１】図２１は、植物体一時的発現システムにおける手順の概要を示す。発現構築物を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培養物を調製する。これらをタバコの葉に注射する。濾過の３日後、タンパク質の発現を試験する。右上のパネルはＧＵＳ活性を示し、右下のパネルはＨＰＡＥＣによる水溶性炭水化物の分離の例を示す。
【図２２】図２２は、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を用いて、標準物（１−ケストース）を用いる炭水化物の分離および定量を行い、かつコントロールの植物（３５Ｓ：：ＧＵＳ）、ならびに一時的にＬｐ１−ＳＳＴ（３５Ｓ：：１−ＳＳＴ）、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ（３５Ｓ：：６Ｇ−ＦＦＴ）およびＦＴ融合物（３５Ｓ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ）を過剰発現するトランスジェニック植物から抽出した総フルクタンの量を定量することを示す。
【図２３−１】図２３は、（Ａ）Ｌｐ１−ＳＳＴ、（Ｂ）Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ、（Ｃ）Ｌｐ１ＳＳＴ＿Ｌｐ６ＧＦＦＴ  ＦＴ融合物１、（Ｄ）Ｌｐ１ＳＳＴ＿Ｌｐ６ＧＦＦＴ  ＦＴ融合物３、および（Ｅ）ＧＵＳマーカー遺伝子の発現を駆動するコムギＲｕＢｉｓＣＯプロモーターのデスティネーション・ベクターを示す。
【図２３−２】図２３は、（Ａ）Ｌｐ１−ＳＳＴ、（Ｂ）Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ、（Ｃ）Ｌｐ１ＳＳＴ＿Ｌｐ６ＧＦＦＴ  ＦＴ融合物１、（Ｄ）Ｌｐ１ＳＳＴ＿Ｌｐ６ＧＦＦＴ  ＦＴ融合物３、および（Ｅ）ＧＵＳマーカー遺伝子の発現を駆動するコムギＲｕＢｉｓＣＯプロモーターのデスティネーション・ベクターを示す。
【図２４−１】図２４は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ発現カセットの配列（配列番号３４）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれイタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２４−２】図２４は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ発現カセットの配列（配列番号３４）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれイタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２４−３】図２４は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ発現カセットの配列（配列番号３４）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれイタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２５−１】図２５は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６ＧＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ発現カセット（配列番号３５）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２５−２】図２５は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６ＧＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ発現カセット（配列番号３５）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２５−３】図２５は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６ＧＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ発現カセット（配列番号３５）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２６−１】図２６は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号３６）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２６−２】図２６は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号３６）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２６−３】図２６は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号３６）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２６−４】図２６は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号３６）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２６−５】図２６は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号３６）を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２７−１】図２７は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３発現カセット（配列番号３７）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２７−２】図２７は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３発現カセット（配列番号３７）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２７−３】図２７は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３発現カセット（配列番号３７）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２７−４】図２７は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３発現カセット（配列番号３７）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２７−５】図２７は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３発現カセット（配列番号３７）の配列を示す。調節性配列、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図２８】図２８は、ＬｐＦＴ４  ３’ターミネーター配列、ｐＢＳ−ＬｐＦＴ４を保有するベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫを示す。
【図２９】図２９は、（Ａ）プラスミドｐＢＳ−Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＦＴ４および（Ｂ）プラスミドｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４を示す。
【図３０】図３０は、（Ａ）プラスミドｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：ＬｐＦＴ４および（Ｂ）プラスミドｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４を示す。
【図３１−１】図３１は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４発現カセットの配列（配列番号３８）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３１−２】図３１は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４発現カセットの配列（配列番号３８）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３１−３】図３１は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４発現カセットの配列（配列番号３８）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３２−１】図３２は、ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４発現カセットの配列（配列番号３９）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３２−２】図３２は、ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４発現カセットの配列（配列番号３９）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３２−３】図３２は、ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４発現カセットの配列（配列番号３９）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３３】図３３は、プラスミドＰＣＲ  Ｂｌｕｎｔ−Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物を示す。
【図３４】図３４は、ＦＴ融合物１および３を駆動するライグラスＲｕＢｉｓＣＯ（ＬｐＲｂｃｓ）プロモーターを含むデスティネーション・ベクターを示す。（Ａ）ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１および（Ｂ）ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３。
【図３５−１】図３５は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号４０）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３５−２】図３５は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号４０）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３５−３】図３５は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号４０）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３５−４】図３５は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号４０）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３５−５】図３５は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１発現カセットの配列（配列番号４０）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図３６−１】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−２】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−３】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−４】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−５】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−６】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：  ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−７】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３６−８】図３６は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３発現カセットの配列（配列番号４１）を示す。調節性配列、ＬｐＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。このアミノ酸配列は太字で示される（配列番号４２）。ドメインは以下のように強調している：ボックスは、基質結合および加水分解に関与する、インベルターゼ、フルクトシルトランスフェラーゼおよびフルクタンエキソヒドロラーゼを含む３２個のグリコシド加水分解酵素のファミリーにおける高度に保存されたモチーフを示す：二重の下線は、膜貫通ドメインを示し；影付きのボックスは３２個のグリコシド加水分解酵素のなかの保存的ドメインに相当する。
【図３７】図３７は、ＦＴ融合物３、ｐＰＺＰ２００＿ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３を駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲｕＢｉｓＣＯ（ＡｔＲｂｃＳ）プロモーターを含むデスティネーション・ベクターを示す。
【図３８−１】図３８は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３発現構築物の配列（配列番号４３）を示す。
【図３８−２】図３８は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３発現構築物の配列（配列番号４３）を示す。
【図３８−３】図３８は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３発現構築物の配列（配列番号４３）を示す。
【図３８−４】図３８は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３発現構築物の配列（配列番号４３）を示す。
【図３８−５】図３８は、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３発現構築物の配列（配列番号４３）を示す。
【図３９】図３９は、示したクローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位の位置をともなう、ＰｒｏｍｅｇａのベースのベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）の詳細を示す。
【図４０】図４０は、ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：３５Ｓおよびｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓの構築のために用いたベクター骨格（Ｙｅら、２００１）を示す。
【図４１−１】図４１は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４４）を示す。調節性配列、ＵｂｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４１−２】図４１は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４４）を示す。調節性配列、ＵｂｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４１−３】図４１は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４４）を示す。調節性配列、ＵｂｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４１−４】図４１は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４４）を示す。調節性配列、ＵｂｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４１−５】図４１は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４４）を示す。調節性配列、ＵｂｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４１−６】図４１は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４４）を示す。調節性配列、ＵｂｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４２−１】図４２は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的な（（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４５）を示す。調節性配列、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４２−２】図４２は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的な（（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４５）を示す。調節性配列、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終  止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４２−３】図４２は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的な（（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４５）を示す。調節性配列、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４２−４】図４２は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的な（（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４５）を示す。調節性配列、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４２−５】図４２は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的な（（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４５）を示す。調節性配列、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４３−１】図４３は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＲＵＢＱ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４６）を示す。調節性配列、ＲＵＢＱ２ｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４３−２】図４３は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＲＵＢＱ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４６）を示す。調節性配列、ＲＵＢＱ２ｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４３−３】図４３は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＲＵＢＱ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４６）を示す。調節性配列、ＲＵＢＱ２ｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４３−４】図４３は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＲＵＢＱ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４６）を示す。調節性配列、ＲＵＢＱ２ｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４３−５】図４３は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＲＵＢＱ２）プロモーターの代表的な配列（配列番号４６）を示す。調節性配列、ＲＵＢＱ２ｉプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４４−１】図４４は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＯｓＡｃｔ１）プロモーターの代表的な配列（配列番号４７）を示す。調節性配列、ＯｓＡｃｔ１プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４４−２】図４４は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＯｓＡｃｔ１）プロモーターの代表的な配列（配列番号４７）を示す。調節性配列、ＯｓＡｃｔ１プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４４−３】図４４は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＯｓＡｃｔ１）プロモーターの代表的な配列（配列番号４７）を示す。調節性配列、ＯｓＡｃｔ１プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４４−４】図４４は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＯｓＡｃｔ１）プロモーターの代表的な配列（配列番号４７）を示す。調節性配列、ＯｓＡｃｔ１プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４４−５】図４４は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた構成的（ＯｓＡｃｔ１）プロモーターの代表的な配列（配列番号４７）を示す。調節性配列、ＯｓＡｃｔ１プロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４５−１】図４５は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた組織特異的（ｔｕｂｅｒ）プロモーター（Ｃａｔｈｌｎｈ）の代表的な配列（配列番号４８）を示す。調節性配列、ＣａｔｈｌｎｈプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４５−２】図４５は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた組織特異的（ｔｕｂｅｒ）プロモーター（Ｃａｔｈｌｎｈ）の代表的な配列（配列番号４８）を示す。調節性配列、ＣａｔｈｌｎｈプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４５−３】図４５は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた組織特異的（ｔｕｂｅｒ）プロモーター（Ｃａｔｈｌｎｈ）の代表的な配列（配列番号４８）を示す。調節性配列、ＣａｔｈｌｎｈプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４５−４】図４５は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた組織特異的（ｔｕｂｅｒ）プロモーター（Ｃａｔｈｌｎｈ）の代表的な配列（配列番号４８）を示す。調節性配列、ＣａｔｈｌｎｈプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４５−５】図４５は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた組織特異的（ｔｕｂｅｒ）プロモーター（Ｃａｔｈｌｎｈ）の代表的な配列（配列番号４８）を示す。調節性配列、ＣａｔｈｌｎｈプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４５−６】図４５は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせた組織特異的（ｔｕｂｅｒ）プロモーター（Ｃａｔｈｌｎｈ）の代表的な配列（配列番号４８）を示す。調節性配列、ＣａｔｈｌｎｈプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４６−１】図４６は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたストレス調節性（Ａｔｒｄ２９ａ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４９）を示す。調節性配列、Ａｔｒｄ２９ａプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４６−２】図４６は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたストレス調節性（Ａｔｒｄ２９ａ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４９）を示す。調節性配列、Ａｔｒｄ２９ａプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４６−３】図４６は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたストレス調節性（Ａｔｒｄ２９ａ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４９）を示す。調節性配列、Ａｔｒｄ２９ａプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４６−４】図４６は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたストレス調節性（Ａｔｒｄ２９ａ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４９）を示す。調節性配列、Ａｔｒｄ２９ａプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４６−５】図４６は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたストレス調節性（Ａｔｒｄ２９ａ）プロモーターの代表的な配列（配列番号４９）を示す。調節性配列、Ａｔｒｄ２９ａプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４７−１】図４７は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたスクロース調節性（１６Ｒ）プロモーターの代表的な配列（配列番号５０）を示す。調節性配列、１６ＲプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４７−２】図４７は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたスクロース調節性（１６Ｒ）プロモーターの代表的な配列（配列番号５０）を示す。調節性配列、１６ＲプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４７−３】図４７は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたスクロース調節性（１６Ｒ）プロモーターの代表的な配列（配列番号５０）を示す。調節性配列、１６ＲプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４７−４】図４７は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたスクロース調節性（１６Ｒ）プロモーターの代表的な配列（配列番号５０）を示す。調節性配列、１６ＲプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４７−５】図４７は、ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合わせたスクロース調節性（１６Ｒ）プロモーターの代表的な配列（配列番号５０）を示す。調節性配列、１６ＲプロモーターおよびＬｐＦＴ４ターミネーターは、それぞれ、イタリック体および下線付きのイタリック体で示している。ＯＲＦ配列は、標準のフォントで示しており、かつ、開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ）は影付きである。
【図４８】図４８は、ハイグロマイシンで選択した、ＴａＲｂｃＳプロモーター光調節性遺伝子構築物（表１）およびｐＡｃＨ１ベクターで同時形質転換した後のトランスジェニックのペレニアルライグラスの植物再生の表現型を示す。ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合構築物のいずれかを含む植物は、インビトロ培養条件下で成長の利点を示し、これによってその早期の特定およびスクリーニングが可能になる（最も右側の列）。
【図４９】図４９は、ハイグロマイシンで選択する、ＬｐＲｂｃＳプロモーター光調節性遺伝子構築物での同時形質転換後の、トランスジェニックのペレニアルライグラスの植物再生の表現型を示す。この植物は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４またはＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬＰＦＴ４ＦＴ融合物１／３構築物のいずれかを含む。ＦＴ融合構築物を含む植物は、インビトロ培養条件下で成長の利点を示す。
【図５０】図５０は、ガラス温室の条件下での成熟植物の表現型を示す。栄養生長期のトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の代表的なサンプル。ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合トランスジニックのペレニアルライグラス植物は、コントロールの非トランスジェニックのペレニアルライグラス植物に比較して、大きい葉、分げつの増強、根成長の増大をともなう成長能力の増強を示す。この植物は等しく、３週早く刈り込んだ。葉身の顕微鏡写真を拡大すれば、ＦＴ融合トランスジェニックの葉の直径が示されかつ大きくなる。
【図５１】図５１は、野外条件下でのトランスジェニックのペレニアルライグラス成熟植物表現型（４週）の代表的なサンプルを示す。ＦＴ融合トランスジェニックのペレニアルライグラス植物は、コントロールのＬｐ１−ＳＳＴのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物に比較して、大きい葉、分げつの増強、根の成長の増大を伴う成長能力の増強を示す。
【図５２】図５２は、野外条件下でのＦＴ融合導入遺伝子を発現するトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の表現型バイオマススコア（１の最小バイオマスから５の最大バイオマスまで）の代表例を示す。
【図５３】図５３は、トランスジェニックのペレニアルライグラスの葉の表現型を示す。栄養生長期の葉身の徒手切片の代表的なサンプル。左側は、葉の切片全体の比較、右は葉の切片の拡大図を示す。Ａｄ−同軸。Ａｂ−背軸。
【図５４】図５４は、安定なトランスジェニックのＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳペレニアルライグラス植物、およびコントロールのペレニアルライグラス植物（選択マーカー（ｈｐｈ遺伝子）のみを保有する）に存在するフルクタンのレベルおよび組成の生化学的分析（ＨＰＡＥＣ）を示す。
【図５５】図５５は、コントロールのペレニアルライグラス植物（レーン６’および１’）（選択マーカー（ｈｐｈ遺伝子）のみを保有する）と比較した、（Ａ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１、（Ｂ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３、（Ｃ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ，および（Ｄ）ＴａＲｂｃＳ：：６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の分げつ全体に存在する総フルクタンの生化学的分析（ＨＰＡＥＣ）を示す。
【図５６】図５６は、コントロールのペレニアルライグラス植物（レーン６’および１’）（選択マーカー（ｈｐｈ遺伝子）のみを保有する）と比較した、（Ａ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１、（Ｂ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３、（Ｃ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ、および（Ｄ）ＴａＲｂｃＳ：：６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の分げつ全体に存在する１−ケストースの生化学的分析（ＨＰＡＥＣ）を示す。
【図５７】図５７は、コントロールのペレニアルライグラス植物（レーン６’および１’）（選択マーカー（ｈｐｈ遺伝子）のみを保有する）と比較した、（Ａ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１、（Ｂ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３、（Ｃ）ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ、および（Ｄ）ＴａＲｂｃＳ：：６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の分げつ全体に存在するスクロースの生化学的分析（ＨＰＡＥＣ）を示す。
【図５８】図５８は、野外条件下で成長させ、２００９年１２月に収穫した、野性型（コントロール）およびＦＴ融合およびＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物における分げつ全体および葉身でのフルクタンレベルを示す。
【図５９】図５９は、野外条件下で成長した野性型およびＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の葉身におけるフルクタン組成を示す。ボックス１は、低ＤＰフルクタン（ＤＰ最大１０〜１５）に相当する。ボックス２は、高ＤＰフルクタン（ＤＰが１０〜１５より高い）に相当する。
【図６０】図６０は、野外条件下で成長したＬｐＲｂｃＳ  ＦＴ融合物およびＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴのトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の全体の分げつにおける導入遺伝子発現を示す。サンプルは２００９年の１１月（白のバー）および１２月（黒のバー）に収集した。サンプルを内因性のヒストン発現に対して正規化して、３５ｎｇのＲＮＡあたりの転写物のコピー数として示す。
【図６１】図６１は、単一の分げつから培養ミックス（ｐｏｔｔｉｎｇ  ｍｉｘ）中で７週（Ａ〜Ｃ）および１２週（Ｄ〜Ｅ）成長した後のトランスジェニックのペレニアルライグラスの表現型分析を示す。ＴａｒｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：Ｔａｒｂｃｓ  ＦＴ融合物１（Ａ、Ｄ）およびＴａｒｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：Ｔａｒｂｃｓ  ＦＴ融合物３（Ｂ）植物は、ｈｐｈ遺伝子のみを発現するコントロールの植物（Ｃ、Ｅ）に比較して融合植物中で示す葉の長さが大きく分げつの数が多い。
【図６２】図６２は、７週（白のバー）および１２週（黒のバー）成長させた後の、トランスジェニックのＴａｒｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：Ｔａｒｂｃｓ  ＦＴ融合物１、およびＴａｒｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：Ｔａｒｂｃｓ  ＦＴ融合物３植物の定量的な表現型分析を示す。測定は、ｈｐｈ遺伝子のみを発現する８つのコントロールの植物の平均と比較して植物の高さ（Ａ）、葉の幅（Ｂ）および分げつの数（Ｃ）について行った。
【図６３】図６３は、ガラス温室条件下で、ＬＸＲ（登録商標）テクノロジー単独（ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ）、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３単独、ならびにＬＸＲ（登録商標）およびＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３を一緒に発現するトランスジェニックのペレニアルライグラス植物を示す。
【図６４】図６４は、ガラス温室条件下で成長させ、刈り取り６週後に収集した、ＧＯＩ−ｖｅコントロール（５つの株の平均）および独立したＦＴ融合物単独またはＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の牧草乾燥重量分析を示す。
【図６５】図６５は、ガラス温室条件下で成長させた、ＧＯＩ−ｖｅコントロール（５つの株の平均）および独立したＦＴ融合物単独またはＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の葉身のフルクタンレベルを示す。
【図６６】図６６は、ガラス温室条件下の、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物３を発現するトランスジェニックヒロハノウシノケグサ植物を示す。
【図６７】図６７は、ガラス温室で成長させたＧＯＩ−ｖｅコントロール（５つの株の平均）および独立したＦＴ融合物単独またはＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックのヒロハノウシノケグサ植物の牧草乾燥重量分析を示す。
【図６８】図６８は、ガラス温室で成長させたＧＯＩ−ｖｅコントロール（５つの株の平均）および独立したＦＴ融合物単独またはＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックのヒロハノウシノケグサ植物の分げつ数を示す。
【図６９】図６９は、ガラス温室で成長させたＧＯＩ−ｖｅコントロール（５つの株の平均）およびＦＴ融合物を発現する独立したトランスジェニックのヒロハノウシノケグサ株の葉身におけるフルクタン蓄積を示す。
【図７０】図７０は、光調節性遺伝子構築物での形質転換後のトランスジェニックのコムギ植物の植物再生表現型を示す。Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合構築物を含むインビトロで成長させたトランスジェニックのコムギ植物は、インビトロ培養条件下で成長利点を示し、これによってその早期の特定およびスクリーニングが可能になる。トランスジェニックのコムギＦＴ融合株の優れた成長の表現型が、組織培養プレート上で行ったインビトロの植物再生の早期段階の間に観察された。光条件下のインキュベーション６週後、カルスでは、コントロールの植物に比較して、Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合構築物を含むインビトロで成長するトランスジェニックのコムギ植物で、さらに発達したインビトロで成長する分げつ／苗条（パネルＡ）およびさらに詳細にはさらに発達したインビトロで成長する根（パネルＢ）が示された。
【図７１】図７１は、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合構築物を含むトランスジェニックのコムギ植物では、（Ａ）インビトロ条件下で２カ月、および（Ｂ）ガラス温室条件下で、成長したコントロールの植物に比べて分げつ数の明らかな早期の増大が示されたことを示す。
【図７２】図７２は、ＦＴ融合構築物を含むトランスジェニックのコムギ植物では、ガラス温室条件下で成長するコントロールの植物に比較して分げつ数の明らかな早期の増大が示されたことを示す。
【図７３】図７３は、ＬＸＲ（登録商標）テクノロジーを含むトランスジェニックのコムギ植物では、ガラス温室条件下のコントロールの植物に比較して分げつ数の明らかな早期の増大が示された（Ａ）ことを示す。それらではまた、ガラス温室条件下で３５日後の光合成組織の増大を示された（Ｂ）。
【図７４】図７４は、ＬＸＲ（登録商標）テクノロジー単独（ＡｔＭＹＢ３：：ＩＰＴ：：３５Ｓ）、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３単独、ならびにＬＸＲ（登録商標）およびＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３を一緒にガラス温室条件下で発現するトランスジェニックのコムギ植物の表現型分析を示す。
【図７５】図７５は、ＦＴ融合構築物単独またはＬＸＲ（登録商標）プラスＦＴ融合構築物のいずれかを含むトランスジェニックのコムギ植物での、目的の遺伝子マイナス（ＧＯＩ−）コントロールの形質転換と比較した、フルクタン蓄積および分げつ数を示す。
【図７６】図７６は、Ｔ１  ＧＯＩ−ｖｅコントロール、ＦＴ融合物単独およびＬＸＲ（登録商標）プラスＦＴ融合トランスジェニックのコムギ植物における、播種９週後のフルクタン蓄積を示す。コントロールにおけるフルクタンのレベルは、６つのＧＯＩ−ｖｅ植物から得られたデータの平均に相当する。
【図７７】図７７は、形質転換されたＧＯＩマイナスコントロールと比較して、ＬＸＲ（登録商標）、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ＿ＦＦ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物またはＬＸＲ（登録商標）プラスＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ＿ＦＦ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合構築物を発現するトランスジェニックのシロツメグサ植物の表現型を示す。
【図７８】図７８は、シロツメグサ植物でＡｔＲｂｃＳプロモーターによって駆動されるＦＴ融合導入遺伝子の導入遺伝子発現レベルを示す。コントロールは、野性型の植物であった。サンプルは、内因性のヒストン発現に対して正規化し、３５ｎｇのＲＮＡあたりの転写物のコピーの数として提示される。
【図７９】図７９は、野性型コントロール、ＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物、およびＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックのシロツメグサ株におけるフルクタン蓄積を示す。
【図８０】図８０は、形質転換されたＧＯＩマイナスコントロールに比較した、ＬＸＲ（登録商標）、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ＿ＦＦ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物またはＬＸＲ（登録商標）プラスＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−６Ｇ＿ＦＦ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合構築物を発現するトランスジェニックのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の表現型を示す。
【図８１】図８１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物におけるＡｔＲｂｃＳプロモーターによって駆動されるＦＴ融合導入遺伝子の導入遺伝子発現レベルを示す。コントロールは野性型の植物であった。サンプルは、内因性のヒストン発現に対して正規化し、そして３５ｎｇのＲＮＡあたりの転写物のコピー数として示す。
【図８２】図８２は、土壌中で成長するトランスジェニックのＴ２ＦＴ融合シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を示す。
【図８３】図８３は、植物由来の葉の脱離後７〜２０日、陰性コントロール植物（コントロール植物由来の葉、上の画像）に対して比較した、Ａ）シロツメグサ、Ｂ）キャノーラ、およびＣ）コムギ植物由来の、葉の老化の遅延を示す、葉（ＬＸＲ（登録商標）トランスジェニック植物由来の葉、下の画像）を示す。
【図８４】図８４は、抗生物質選択なしのプレート上のインビトロの成長表現型のスクリーニングによるペレニアルライグラスのトランスジェニック植物の陽性選択を示す。Ａ〜Ｃ）形質転換後８週間にわたる暗野でのカルス；Ｄ〜Ｆ）光へ移行した１週後。
【図８５】図８５は、金粒子単独（コントロール）およびＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物ベクターで被覆した金粒子を用いて、光への移行の前、および４週後にボンバードメントした胚発生のペレニアルライグラスのカルスを示す。
【図８６】図８６は、金粒子単独（コントロール）およびＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１単独、ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３単独、ＬＸＲ単独、ならびにＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物プラスＬＸＲベクターで被覆した金粒子を用いて、光への移行の５週後にボンバードメントした胚発生のペレニアルライグラスのカルスを示す。分子分析陽性株：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１  ＃１、２、３、４、７、６、１２、１３、１４、１６、１７；ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３＃１、２、３、５、８、１０、１１、１２、１３；ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１プラスＬＸＲ＃１、２、７、１２（ＴａＲｂｃＳＦＴ融合物１単独）；＃８、１４（ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１プラスＬＸＲ）。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
実施形態の詳細な説明
本発明は、添付の実施例および図面を参照してここでさらに詳細に記載される。しかし、以下の説明は、例示でしかなく、上記の本発明の一般性を限定するとは決してとられるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１５３】
（実施例１）
光合成プロモーターの単離
パンコムギ由来の光合成のプロモーターのクローニング
リブロース−１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（ＲｂｃＳ）は、より高等な植物で十分特徴付けられた光調節性遺伝子である。パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ＴａＲｂｃＳ調節性配列（プロモーターおよびターミネーター）は、以前にクローニングされている（Ｚｅｎｇ，ら、１９９５；Ｓａｓａｎｕｍａ，２００１）。ＴａＲｂｃＳ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ０４２０６９）由来のＴＡＴＡシグナルを含む以前に公開された配列由来の６９５ｂｐのプロモーターフラグメントを、ＰＣＲ増幅した。
【０１５４】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の光合成のプロモーターのクローニング
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのリブロース−１，５−ビスフォスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット（ＡｔＲｂｃＳ）プロモーター配列の１７００ｂｐのフラグメントは、以前にクローニングされている。プライマーは、発現ベクターでの使用のためにＡｔＲｂｃＳプロモーター由来のＴＡＴＡシグナルを含む、より小さいフラグメントを増幅するように設計される。
【０１５５】
ペレニアルライグラス由来の光合成のプロモーターの発見およびクローニング
ＲｂｃＳおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）の発現は、高等植物で十分特徴付けられた光調節性遺伝子である。定量的なリアルタイムＰＣＲによるペレニアルライグラスにおけるＬｐＲｂｃＳ  ｍＲＮＡ転写物の豊富さは、図２に図示される。
【０１５６】
ＬｐＲｂｃＳ遺伝子およびＬｐＣＡＢ遺伝子の両方とも、ペレニアルライグラスにおけるプロモーター発見および単離について選択された。公的に利用可能なｃＤＮＡ配列（ＬｐＲｂｃＳ、ＥＣ７７８４３０およびＬｐＣＡＢ、ＥＣ７７８４３８）を、本発明者らの社内のデータベースにおいてペレニアルライグラスのＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索におけるクエリー配列として用いた。両方の遺伝子ともマルチ遺伝子のファミリーのメンバーであるので、いくつかのコンティグ（各々のコンティグは個々の遺伝子に相当する）を、本発明者らのペレニアルライグラスＥＳＴコレクション中で特定した。９つのコン
ティグは、公開されたＬｐＲｂｃＳのｃＤＮＡ配列に対して相同であることが特定され、そして１３個のコンティグがＬｐＣＡＢのｃＤＮＡ配列と相同であることが見出された。２つのコンティグである、ＬＰＣＬ９＿Ｃ３５９（ＬｐＲｂｃＳ）およびＬｐＣＬ１１１２＿Ｃ１２（ＬｐＣＡＢ）（単離されるべきプロモーターの遺伝子に相当する）は、それぞれ、（４７）および（１９）のＥＳＴ配列を含んだ。これらの配列は、ある範囲の種々の組織に相当する種々のライブラリー由来であった。このデータをインシリコの発現分析に用いて、両方の遺伝子が光合成組織でのみ発現されることが示された（図３）。
【０１５７】
遺伝子ファミリーメンバーの各々のためのＤＮＡ配列のアラインメントを行い、遺伝子特異的プライマーを、コンティグＬｐＲｂｃＳ＿Ｃ３５９およびＬｐＣＡＢ＿Ｃ１２について設計し、これを用いて、ＰＣＲによってペレニアルライグラスのＢＡＣ  ＤＮＡプールをスクリーニングした。ＢＡＣクローンを特定して、配列決定した。プライマーを設計して、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ特異的なプロモーター調節性配列をクローニングして、配列決定して（図４および図５）、光合成のプロモーターに特異的なｃｉｓ−調節性配列をＰＬＡＣＥによって特定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／）（表１）。この配列は、Ｉ−ＢｏｘモチーフおよびＲｂｃＳのＧＴ１ボックスを含んだ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ，ら、１９９５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，ら、２００２）。さらに、ＬｐＲｂｃＳ配列の１６／１９ヌクレオチドは、単子葉植物ＲｂｃＳコンセンサス配列と相同性を共有した（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，ら、１９９１）。Ｉ−ＣｏｒｅボックスおよびＳＯＲＬＩＰ  ｃｉｓ−調節性配列は、ＣＡＢプロモーターに存在した。ＳＯＲＬＩＰは、シロイヌナズナにおける光誘発性プロモーターで過剰提示されることが見出された（Ｈｕｄｓｏｎ，ら、２００３）。
【０１５８】
【表１】
2015154789.tif 000002
これらのＬ．ｐｅｒｅｎｎｅ特異的プロモーター調節性配列を引き続き、フルクタン生合成遺伝子を有する骨格なしの発現カセットの構築物で用いた。
【０１５９】
（実施例２）
フルクタン生合成遺伝子の単離
Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ由来のフルクタン生合成遺伝子の単離
Ｌｐ１−ＳＳＴおよびＬｐ６Ｇ−ＦＦＴの配列をコードするＬｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅのｃＤＮＡクローンは、ペレニアルライグラスのｃＤＮＡライブラリーから以前に単離されている（Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ら、２００３；Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ら、２００５）。単離されたペレニアルライグラスフルクトシルトランスフェラーゼ相同体の完全遺伝子配列が利用可能であり、かつＬｐ１−ＳＳＴのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、国際特許出願ＰＣＴ  ＡＵ０１／００７０５（配列番号１１および１２）に開示される。
【０１６０】
Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴの部分配列は、それぞれヌクレオチドおよびアミノ酸の配列について
、国際特許ＰＣＴ／ＡＵ／０１／０１２７５の配列番号１０９および１１０に開示されている。全長クローンは、ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、クローニングして、配列決定した（図７）。Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＯＲＦを、Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅ由来の公開されたＬｐ６Ｇ−ＦＦＴと比較して、２３個のヌクレオチド変化を記した。予想されるタンパク質配列の比較によって、２つのアミノ酸配列の間の２つの変化のみが明らかになった（図８）。
【０１６１】
用いられてもよく、そしてＬｐ１−ＳＳＴおよびＬｐ６Ｇ−ＦＦＴを用いて単独で形質転換されるかまたは同時形質転換され得る、他のＦＴ遺伝子としては、Ｌｐ１−ＦＦＴ、Ｌｐ６−ＳＦＴおよびＬｐ６−ＳＳＴが挙げられる。Ｌｐ１−ＦＦＴのｃＤＮＡ配列を、ペレニアルライグラスから単離し（図９）、そのアミノ酸配列を図１０に示す。例えば、この配列に基づくプライマーを用いて、下記のように、本発明でのクローニングおよび使用のためにＰＣＲによって全長ｃＤＮＡを増幅してもよい。
【０１６２】
他の相同なタンパク質は、データベース、例えば、ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ＃）をスクリーニングすることによって見出され得る。このようなデータベース検索では、例えば、図７〜１０に記載される配列が、データベースについてのデフォルトパラメーター設定を用いて、クエリーとして設定される。例えば、ＮＣＢＩとのタンパク質配列アラインメント（Ｂｌａｓｔｐ）のためには、これらの設定は以下のとおりである：ｌｉｍｉｔ  ｅｎｔｒｅｚ＝不活性化；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝低複雑性活性化（ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）；期待値（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）＝１０；ワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝３；マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ；ギャップコストイグジステンス（ｇａｐｃｏｓｔｓｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）−１１、エクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１。このようなデータベース検索を、ＦＴに含まれるドメインを有するタンパク質を見つけるために用いてもよい（デフォルトパラメーターを用いる）。
【０１６３】
（実施例３）
翻訳的なＦＴ融合タンパク質の作製
ＦＴ翻訳的なＦＴ融合物のクローニング
遺伝子ＦＴ融合は、図１１に示される手順に従って、Ｌｐ１−ＳＳＴとＬｐ６Ｇ−ＦＦＴのオープンリーディングフレームの間で作製した。Ｌｐ１−ＳＳＴ遺伝子は、フォワードプライマー中に組み込まれたＧＡＴＥＷＡＹ組み換え部位でＰＣＲ増幅された。３つのグリシン残基続いてＨｉｎｄＩＩＩ部位をコードする配列を、終止コドンを除去した、リバースプライマー中に組み込んだ。Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、続いて３つのグリシン残基をコードする配列およびＡＴＧなしの遺伝子特異的配列でＰＣＲ増幅した。Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ遺伝子のリバースプライマーは、第二のＧＡＴＥＷＡＹ組み換え部位に隣接した。プライマー配列を表２に示す。精製されたフラグメントをＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化して、連結された産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＡＴＥＷＡＹ  ｐＤＯＮＲ２２１エントリー（Ｅｎｔｒｙ）ベクター中にクローニングした。得られたｐＥＮＴＲＹ１−Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ−２エントリークローンを配列決定した場合、１つの配列（ＦＴ融合物１）が、２つの遺伝子を連結するリンカー中に８つのアミノ酸を有する、予想産物であることを確認した（図１２および１３）。一方で、別の配列（ＦＴ融合物３）は、２つの連続したＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を含み、この部位が別の２つのアミノ酸の付加を生じ、これが翻訳の際に２つのＦＴ遺伝子の間の全部で１０個のアミノ酸を生じる（図１４および１５）。
【０１６４】
【表２】
2015154789.tif 000003
表３に概観されるプライマー配列を用いることによって、上記で示されるのと同じ方法を用いてＬｐ６Ｇ−ＦＦＴ−Ｌｐ１ＳＳＴに対する順序を逆転する新しいＦＴ融合物を作製することができる。
【０１６５】
【表３】
2015154789.tif 000004
Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴでは、ＦＴタンパク質はお互いと物理的に会合してＦＴ融合タンパク質を形成し、このタンパク質は、ＳＯＳＵＩ、膜タンパク質データベースの分類および二次構造予想によって示される３つの膜貫通ドメインを含む（表４、図１７および１８）。
【０１６６】
【表４】
2015154789.tif 000005
植物フルクトシルトランスフェラーゼの構造的な特徴
植物ＦＴは、グリコシド加水分解酵素ファミリー３２（ＧＨ３２）のメンバーであり、かつモチーフ（Ｎ／Ｓ）ＤＰＮＧ（ｂ−フルクトシダーゼモチーフとも呼ばれる）、ＲＤＰおよびＥＣによって特徴付けられる３つの高度に保存された領域を共有する、液胞、酸インベルターゼ（ｂ−フルクトシダーゼ）に対して高い程度のアミノ酸相同性を有する（Ａｌｔｅｎｂａｃｈら、２００５）（図１７、図１８および図３６）。植物ＦＴおよび液胞インベルターゼの別の共通の特徴は、それらが翻訳後プロセシングに起因して大きいサブユニットおよび小さいサブユニットから構成されるということである。上記の３つ全ての保存されたモチーフを保有する大きいサブユニットは、触媒的な特異性を決定する（Ａｌｔｅｎｂａｃｈら、２００４）。
【０１６７】
他のＦＴ遺伝子であるＬｐ１−ＦＦＴ、Ｌｐ６−ＳＦＴおよびＬｐ６−ＳＳＴをまた、Ｌｐ１−ＳＳＴまたはＬｐ６Ｇ−ＦＦＴと組み合わせて用いて、下に示されるように、図１６Ａに概観されるスキームによって、翻訳的なＦＴ融合物の選択を行ってもよい。
・Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ
・Ｌｐ１−ＳＳＴ：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）
・（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：Ｌｐ１−ＳＳＴ
三連のＦＴ融合物はまた、類似の方法論を用いて作製され得る（図１６Ｂ）。三連の融合物が、遺伝子Ｌｐ１−ＳＳＴ、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＬｐ１−ＦＦＴ、Ｌｐ６−ＳＦＴまたはＬｐ６−ＳＳＴを組み込むように構築されることが提唱される。２つのＦＴ遺伝子を一緒に連結するために用いられるプライマー配列を変更することによって、リンカーの大きさを変化することおよび最大約３０個までのアミノ酸を可能性として追加することが可能になる。ＦＴタンパク質は、お互いと物理的に会合して、代謝チャネルを形成し得、従ってこの翻訳的な融合物内のＦＴ遺伝子を隔てる距離がタンパク質機能に影響し得る。ＦＴ融合タンパク質は好ましくは、図１７、図１８および図３６に示されるＬｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ植物由来のＦＴ、ＩＮＶおよびＦＥＨタンパク質の間で高度に保存されているドメインに相当する配列を含む。
【０１６８】
（実施例４）
フルクタン生合成遺伝子機能の一時的アッセイ
Ｌｐ１−ＳＳＴ、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＦＴ融合タンパク質の機能
Ｌｐ１−ＳＳＴ成熟タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて機能的な特徴付けのために以前に発現されており（Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ら、２００３）、そしてこのタンパク質の発現によって、スクロースが１−ケストースへ変換することが実証された。同様に、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴのｃＤＮＡを、機能的な特徴付けのための単離のために組み換えタンパク質の分泌を可能にする、メタノール誘導性プロモーターおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α因子配列を含む発現ベクターｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。この組み換えＬｐ６Ｇ−ＦＦＴ酵素は、事前培養培地へ接種され、４５時間にわたってメタノールの添加によって誘導された形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの単一のコロニーから産生された。この上清を濃縮して、サンプルを１００ｍＭのスクロースとともに一晩インキュベートした。産生された炭水化物を、コントロールとしてタマネギ由来のフルクタン抽出物を用いて、Ｃｈａｌｍｅｒｓら、２００３に従って、ＨＰＡＥＣによって分析した（図１９）。
【０１６９】
一時的遺伝子発現アッセイのためのベクターの生成
多数のベクターを、組み換えクローニングに基づくＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（商標）テクノロジー（製品のマニュアルについては、ｗｗｗ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍを参照のこと）を用いて構築した。この方法論は、組み換え部位に隣接する、プロモーター、目的の遺伝子（ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＧＯＩ）、またはターミネーター配列のいずれかを含む、個々のエントリー（Ｅｎｔｒｙ）プラスミドの生成に依拠する。この組み換え部位によって、組み換えによる、Ｇａｔｅｗａｙ可能デスティネーション・ベクターへのエントリー・プラスミドの各々の方向性の三重の挿入が容易になる。次いで、最終のベクターを配列決定して、プラスミドまたは発現カセット（植物の選択マーカーの発現のため）で植物を同時形質転換するために直接用いる。  
【０１７０】
ＦＴ融合タンパク質の機能を試験するために、ＦＴ融合物１および３のＯＲＦを、Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ組み換えシステム（製品のマニュアルに関してはｗｗｗ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍを参照のこと）を用いて、増強されたカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーター（Ｋａｙ，ら、１９８７）の制御下で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイナリー・ベクター中にクローニングした（図２１）（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，ら、１９９４）。
【０１７１】
Ｇａｔｅｗａｙ  Ｅｎｔｒｙベクターを、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーター、ＴａＲｂｃＳターミネーター配列、ならびにＦＴ融合物１および３のＯＲＦについて構築した。クローニングしたフラグメントの配列を確認して、ｐＰＺＰ２００−ｕｂｉ：ｂａｒ−ｎｏｓ  Ｒ４  Ｒ３デスティネーション・ベクター中への、クローニングされたＧＯＩ  ｃＤＮＡ配列を用いる三方向組み換えクローニングに用いた。さらに、構築物はまた、コントロールとして（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーターによって駆動されるＬｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＬｐ１−ＳＳＴ単一ＯＲＦを含んだ。例えば、Ｌｐ１−ＦＦＴ（またはＬｐ６−ＳＦＴ、Ｌｐ６−ＳＳＴ）単一ＯＲＦはまた、同じ方式でクローニングされる。コントロールとしてＧＵＳ  ＯＲＦを発現の確認のために用いた。以下の構築物を作製した。
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ（ＦＴ融合物１および３）
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：ＧＵＳ：：ＴａＲｂｃＳ
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを利用して、Ａｔｒｂｃｓ光合成プロモーターおよび（ＣＡＭＶ）３５Ｓターミネーターを一時的アッセイにおける使用のために含む以下のベクターを作製する。
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔｒｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：３５Ｓ
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔｒｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔｒｂｃＳ：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：３５Ｓ
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔｒｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ（ＦＴ融合物１および３）
一時的な導入遺伝子発現アッセイにおけるＬｐ１−ＳＳＴ、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＦＴ融合タンパク質の機能
機能証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のために、（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターによって駆動されるキメラＬｐ１−ＳＳＴ、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＦＴ融合タンパク質遺伝子を含む構築物の一時的発現を、タバコ植物で行った。なぜならタバコは天然にはフルクタンを産生しないからである。この方法は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉への個々の構築物の土壌浸潤（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（Ｋａｐｉｌａ，ら、１９９７；Ｗｙｄｒｏ，ら、２００６）、続いて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる生化学的分析を包含した。一時的発現手順のダイアグラムは、図２１に示される。注射の３日後、植物物質を回収して、水溶性の炭水化物を、熱水抽出法を用いて抽出した。その抽出物を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を用いて分離した。その結果、フルクタンの産生が示され、ここではＦＴ融合タンパク質による１−ケストースおよび６Ｇ−ケストースの両方の産生の増大があった（図２２）。等価な実験を用いて、ＡｔＲｂｃＳプロモーターによって駆動される、キメラのＬｐ１−ＳＳＴ、Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴおよびＦＴ融合タンパク質遺伝子を含む機能構築物を評価する。
【０１７２】
転写的な同時形質転換のためのベクターの組み合わせを用いる土壌浸潤（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
細胞中で転写的に一緒に共同する場合、フルクタン生合成の機能を評価するために、三重の土壌浸潤実験を、下に概説するベクターの群を用いて行う。図２１に示されるような一時的発現手順を用いて、３つのベクターを一緒に同じ植物組織に挿入する。注射の３日後、植物物質を回収して、熱水抽出法を用いて水溶性の炭水化物を抽出する。その抽出物を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を用いて分離する。その結果、この植物ゲノム中の３つのフルクタン生合成遺伝子の独立した発現から生じる相違が示される。
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ＋
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ＋
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：３５Ｓ＋
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ＋
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔＲｂｃＳ：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：３５Ｓ
翻訳的な同時形質転換のためのＦＴ融合ベクターを用いる土壌浸潤
転写的な同時形質転換に対して比較することによって、以前に考察されておりかつ下に示されているベクター内の一時的アッセイを行うことにより、翻訳的な同時形質転換を比較するための実験を行う。
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ（ＦＴ融合物１および３）
・ｐＰＺＰ２００−ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ（ＦＴ融合物１および３）
（実施例５）
トランスジェニック植物の安定な形質転換および産生のためのベクターの生成
微粒子銃およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換のためのＬＸＲ（登録商標）ベクターの産生
ＬＸＲ（登録商標）テクノロジーは、ＡｔＭＹＢ３２遺伝子プロモーターの制御下に葉の老化の遅延についてイソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）をコードする１つのサイトキニン生合成遺伝子を含むベクターに基づく。微粒子銃形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のためのＬＸＲ（登録商標）ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅテクノロジーを利用して構築した。バイナリー・ベクターｐＢＳ−ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ｎｏｓ＿ＡｔＭＹＢ３２＿ＩＰＴ＿３５Ｓの詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２に記載されている。
【０１７３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換のためのＬＸＲ（登録商標）ベクターの産生は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２に開示されている。候補遺伝子構築物は、完全に配列決定されており、ベクターを、厳密な品質保証プロトコールに従ってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換のために生成した。
【０１７４】
コムギ光合成プロモーターを含む構築物
ＴａＲｂｃＳ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ０４２０６９）由来のＴＡＴＡシグナルを含む以前に公開された配列由来の６９５ｋｂのプロモーターフラグメントを、プライマーに隣接するＧａｔｅｗａｙ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）組み換え部位でＰＣＲ増幅した。このフラグメントを、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）組み換えテクノロジーを用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＤＯＮＲＰ４−Ｐ１Ｒエントリー（Ｅｎｔｒｙ）ベクター中にクローニングした。６９６ｂｐのＴａＲｂｃＳ遺伝子終止シグナル配列（Ｓａｓａｎｕｍａ，２００１）をまた、組み換え部位でプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＤＯＮＲＰ２−Ｐ３Ｒエントリー・ベクター中にクローニングした。クローニングされたフラグメントを、配列を確認して、ｐＤＥＳＴ−Ｒ４Ｒ３デスティネーション・ベクター：ｐＤＥＳＴＲ１−Ｒ２Ｒ−Ｌｐ１−ＳＳＴ、ｐＤＥＳＴＲ１−Ｒ２−Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ、およびｐＤＥＳＴＰ１−Ｐ２Ｒ−Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ遺伝子ＦＴ融合物発現ベクターへの、クローニングされたＧＯＩ  ｃＤＮＡ配列での３方向組み換えクローニングに用いた。用いられるべきＴａＲｂｃＳプロモーターによるフルクトシルトランスフェラーゼの発現の光合成調節のための以下の構築物は、下に概説されており、かつ図２３にグラフで示される。ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ、ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳおよびｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１および３の発現カセット配列は、図２４〜２７に示される。
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ−ＴａＲｂｃＳ
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ−ＴａＲｂｃＳ
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１および３
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：ＧＵＳ：：ＴａＲｂｃＳ
ドクムギ（ライグラス）光合成プロモーターを含む構築物
ドクムギ（ライグラス）光合成プロモーターを含む構築物を、従来のクローニング方法によって産生した。６９３塩基対（ｂｐ）のフルクトシルトランスフェラーゼ４遺伝子（ＬｐＦＴ４）終止配列（Ｌｉｄｇｅｔｔ，ら、２００２）を、フォワードＰＣＲプライマーの５’末端に制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位ＥｃｏＲ  Ｉを含む遺伝子特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＥｃｏＲ  ＶおよびＸｍａ  Ｉエンドヌクレアーゼ制限部位を、リバースＰＣＲプライマーの３’末端に組み込んだ。ＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクターＤＮＡ（Ｓｈｏｒｔ，ら、１９８８）のＥｃｏＲ  ＩおよびＸｍａ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングして、プラスミドｐＢＳ−ＬｐＦＴ４を得た（図２８）。
【０１７５】
ＬｐＲｂｃＳプロモーターを、フォワードプライマーの５’末端でエンドヌクレアーゼ制限部位Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｖを含む遺伝子特異的なプライマーを用いて増幅し、ＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を、リバースプライマーの３’末端に組み込んだ。６１０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化したｐＢＳ−ＬｐＦＴ４プラスミド中にクローニングして、プラスミドｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：ＬｐＦＴ４（図２９Ａ）を得た。Ｌｐ１−ＳＳＴコーディング領域を、フォワードおよびリバースの両方のＰＣＲプライマーに隣接するＥｃｏＲ  Ｉ部位を有するｃＤＮＡテンプレート（Ｃｈａｌｍｅｒｓら、２００３）から増幅して、ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：ＬｐＦＴ４ベクターのＥｃｏＲ  Ｉ部位中にクローニングして、最終構築物ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４を生成した（図２９Ｂ）。プロモーターおよびターミネーターを示している発現カセットの配列、ならびにＯＲＦを図３１に示す。Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅ配列を含む発現カセットを、ＥｃｏＲ  Ｖ制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドベクターＤＮＡから切り出してもよい。アガロースゲル電気泳動後に、得られたＤＮＡフラグメントをアガロース基質から精製して、その後に、植物形質転換のために用いて、ベクター骨格配列のないＤＮＡを生成する。
【０１７６】
６９３塩基対ＬｐＦＴ４ターミネーター配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＬｐＦＴ４（図２８）を上記で概説されるとおり調製した。８７０塩基対のＬｐＣＡＢプロモーターフラグメントを、フォワードＰＣＲプライマー（Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｖ部位を含む）、およびリバースＰＣＲプライマー（ＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を含む）を用いて増幅した。このフラグメントを、ｐＢＳ−ＬｐＦＴ４のＸｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉ部位にクローニングして、ｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：ＬｐＦＴ４プラスミドを生成する（図３０Ａ）。Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴコード領域を、フォワードおよびリバース両方のＰＣＲプライマーに隣接するＥｃｏＲ  Ｉ部位を有するｃＤＮＡテンプレートから増幅して（Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ら、２００５）、ｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：ＬｐＦＴ４ベクターのＥｃｏＲ  Ｉ部位にクローニングして、最終構築物ｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４を得た（図３０Ｂ）。プロモーターおよびターミネーターを示す発現カセットの配列、ならびにＯＲＦを、図３２に示す。ＤＮＡ発現カセットは、ＥｃｏＲ  Ｖ制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドベクターＤＮＡから切り出してもよい。アガロースゲル電気泳動の後に、得られたＤＮＡフラグメントをアガロース基質から精製して、その後に植物形質転換のために用いて、ベクター骨格なしのＤＮＡを生成する。
【０１７７】
発現構築物を生成するために、遺伝子Ｌｐ１−ＳＳＴとＬｐ６Ｇ−ＦＦＴとの間の翻訳的なＦＴ融合物を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方に対して３’領域で操作されたＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を有する、ＯＲＦのすぐ外側の領域に特異的なプライマーを用いて、ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１および３プラスミド（図２３Ｃ−Ｄ）から増幅した。３９２０ｂｐのＯＲＦをＰＣＲ増幅して、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして、ＰＣＲ  Ｂｌｕｎｔ−Ｌｐ１−ＳＳＴ−Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ  ＦＴ融合物（図３３）を生成した。次に、これをＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素を用いて切り出して、ベクター特異的な配列を取り出して、ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：ＬｐＦＴ４プラスミド（図２９Ａ）中にＥｃｏＲ  Ｉ制限部位でクローニングして、ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４を生成した（図３４）。関連のドメイン（ＦＴ融合物３）を示しているＦＴ融合物１および３の発現カセットの配列を、それぞれ図３５および３６に示す。ＤＮＡ発現カセットは、ＥｃｏＲ  Ｖ制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドベクターＤＮＡから切り出してもよい。アガロースゲル電気泳動の後、得られたＤＮＡフラグメントをアガロース基質から精製して、その後に植物形質転換に用いてベクター骨格配列なしのＤＮＡを生成する。
【０１７８】
Ｌ  ｐｅｒｅｎｎｅプロモーター配列によるフルクトシルトランスフェラーゼの発現の光合成調節のための構築物を下に概説する。
・ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４
・ｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４
・ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１および３
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ光合成のプロモーターを含む構築物
ＦＴ融合物３の発現を駆動するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ光合成プロモーターを含む構築物を、Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙクローニング方法−ｐＰＺＰ２００＿ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ  ＦＴ融合物３（図３７）を用いて産生した。ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：ｎｏｓ  ＦＴ融合物３発現カセットの配列を図３８に示す。
【０１７９】
構成的ユビキチンプロモーターを含む構築物
トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子のプロモーターおよび最初のイントロンを含む構築物（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９２）を、従来のクローニング方法によって生成した。Ｕｂｉプロモーターは、構成的プロモーターであるとみなされるが、発現は、若い活発に成長している草組織で最高である（Ｒｏｏｋｅら、２０００）。
【０１８０】
候補遺伝子Ｌｐ１−ＳＳＴおよびＬｐ６Ｇ−ＦＦＴのｃＤＮＡコピーを、Ｃｈａｌｍｅｒｓら、（２００３）に記載のようにＰＣＲによって増幅し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）ベクター（図３９）中にクローニングした。ｃＤＮＡフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉを用いて切り出し、次いでｐ−Ｕｂｉ−３５ＳベクターのＢａｍＨ  Ｉ部位の中に平滑末端でクローニングした（図４０）。ｐ−Ｕｂｉ−３５Ｓバイナリー植物発現ベクターは、Ｌ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍの他の形質転換実験で以前に記載されている（Ｙｅら、２００１）。ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：３５Ｓおよびｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓクローン（必要な５’から３’の方向でＤＮＡインサートを含む）を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＦＴ融合タンパク質およびターミネーター配列と組み合された構成的（Ｕｂｉ）プロモーターの代表的な配列を図４１に示す。同様の方法を用いて、ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ１−ＦＦＴ：：３５Ｓクローンを構築する。
【０１８１】
Ｕｂｉプロモーター配列によるフルクトシルトランスフェラーゼの発現の光合成調節のための構築物を以下に概説する。
・ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：３５Ｓ
・ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ
・ｐ−Ｕｂｉ：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：３５Ｓ
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを含む構築物
強化されたカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２プロモーター（Ｋａｙ，ら、１９８７）の制御下でフルクトシルトランスフェラーゼの発現を調節するための構築物は、前の節に記載され、かつ下に概説される。
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１および３
組織特異的プロモーターまたは調節性プロモーターを含む構築物
組織特異性を有するプロモーターは、特定の組織／器官における蓄積を標的し、それ以外の位置の望ましくない発現を回避するように作物中の導入遺伝子の発現を駆動することが望ましい。異なる目標のための導入遺伝子発現を駆動する種々のプロモーターの例は表５に示す。ＦＴ融合物に連結された、構成的（Ｕｂｉ、（ＣＡＭＶ）３５Ｓ２、ＲＵＢＱ２、ＯｓＡｃｔ１）、塊茎および走根特異的な（Ｃａｔｈｌｎｈ）、ストレス調節性の（Ａｔｒｄ２９ａ）およびスクロース反応性の（１４−３−３タンパク質ファミリー１６Ｒ）のプロモーターの代表例をそれぞれ図４２〜図４８に示す。
【０１８２】
【表５−１】
2015154789.tif 000006
【０１８３】
【表５−２】
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【０１８４】
【表５−３】
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いくつかの光合成プロモーターは、光反応性組織における導入遺伝子の発現の強力な調節因子であることが示されている。フルクタン生合成遺伝子を発現するための光合成プロモーターの利点としては、植物バイオマスの大部分を占める、葉および茎の上部の細胞の大集団において活性であるということが挙げられる。それらは構成的に発現されるのではないが、それらの発現パターンはスクロース蓄積と一時的にかつ空間的に重複する。
【０１８５】
転写的な同時形質転換のためにベクターの組み合わせを用いる
以下のベクターを、単独でまたはグループ（二重および三重）で形質転換して、低ＤＰフルクタンおよび高ＤＰフルクタンの生成のために必要な同時発現の相乗的な応答を評価する。
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４
・ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：３５Ｓ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４
・ｐ−Ｕｂｉ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：ＴａＲｂｃＳ
・ｐ−Ｕｂｉ：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：３５Ｓ
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：（Ｌｐ１−ＦＦＴ／Ｌｐ６−ＳＦＴ／Ｌｐ−ＳＳＴ）：：ＴａＲｂｃＳ
翻訳的な同時形質転換のためにＦＴ融合物ベクターを用いる
上記で示されるような転写的な同時形質転換と比較するために、翻訳的な同時形質転換の実験をまた、以前に考察されかつ下に示されるＦＴ融合物ベクターを用いて行う。
・ｐＤＥＳＴ−ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１および３
・ｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４  ＦＴ融合物１および３
・ｐＰＺＰ２００−３５Ｓ２：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１および３
（実施例６）
形質転換による安定なトランスジェニック植物の産生
植物の形質転換
本発明の遺伝子構築物は、形質導入、トランスフェクション、形質転換または遺伝子標的によって植物細胞中に導入され得る。このような技術としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の導入、組織のエレクトロポレーション、細胞およびプロトプラスト、プロトプラスト融合物、生殖器官への注入、未熟胚への注入、ならびに細胞、組織、カルス、未熟および成熟胚への高速入射導入（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞およびプロトプラストへのマイクロインジェクション、プロトプラストへのポリエチレングリコール媒介性直接遺伝子移入、微粒子銃形質転換、ウィスカー形質転換、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。技術の選択は、形質転換されるべき植物のタイプに大きく依存し、かつ選択される方法に適切なベクターが用いられる。
【０１８６】
本発明の遺伝子構築物を組み込んでいる細胞を、用いられるベクターによって指向されるとおり選択して、次いで、十分確立された技術を用いて、形質転換された植物を再生するために適切な培地で培養してもよい。得られた植物は、形質転換された植物の後継的な世代をもたらすために、性的にまたは無性的にいずれかで再生産してもよい。
【０１８７】
本発明は、種々の植物、例としては、単子葉植物［例えば、コムギ、コーンまたはトウモロコシ、イネ、オオムギ、ソルガム、サトウキビ、カラスムギ、ライムギ、草類（例えば、飼料、芝およびバイオエネルギー・グラス、例としては、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサ、イタリアン・ライグラス（Ｉｔａｌｉａｎ  ｒｙｅｇｒａｓｓ）、オオウシノケグサ（ｒｅｄ  ｆｅｓｃｕｅ）、クサヨシ（ｒｅｅｄ  ｃａｎａｒｙ−ｇｒａｓｓ）、オオウシクサ（ｂｉｇ  ｂｌｕｅｓｔｅｍ）、スパルティナ（ｃｏｒｄｇｒａｓｓ）、ネピアグラス（ｎａｐｉｅｒｇｒａｓｓ）、スイッチグラス（ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ）、ハマムギ（ｗｉｌｄｒｙｅ）、ワイルド・シュガーケーン（ｗｉｌｄ  ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｐａｓｐａｌｕｍ）］、双子葉植物［例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、タバコ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ワタ、ジャガイモ、トマト、タバコ、クローバー（例えば、シロツメグサ、アカツメクサ（ｒｅｄ  ｃｌｏｖｅｒ）、サブタレニアンクローバー）、アブラナ科の野菜（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｓ）、レタス、ホウレンソウ］および裸子植物に適用可能であり得る。詳細には、本発明は、穀物類、例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、天然のフルクタンを含むＣ３グラス（ｇｒａｓｓｅｓ）、例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ（ドクムギ（ライグラス））およびＬｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ（ヒロハノウシノケグサ）、ならびにＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍ（スズメノヒエ（ｐａｓｐａｌｕｍ））、Ｃ４多年生単為生殖草（ａｐｏｍｉｔｉｃ  ｇｒａｓｓ）（天然のフルクタンがない）に適用され得る。本発明はまた、双子葉植物、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（タバコ）およびＴｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ（シロツメグサ）に適用されてもよい。
【０１８８】
単子葉植物、例えば、コムギ、ペレニアルライグラス、ヒロハノウシノケグサおよびスズメノヒエ（ｐａｓｐａｌｕｍ）の微粒子銃形質転換
プラスミド全体を用いる粒子ボンバードメントによって、候補遺伝子は植物ゲノムに挿入され、それによってベクター骨格配列もゲノムに組み込まれ得る。トランスジェニック植物組織は、選択剤を含む組織培養培地上での生存によって回収される。
【０１８９】
双子葉植物、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、キャノーラおよびシロツメクサのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換では、土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの天然の病原性活性を利用する。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは、双子葉植物の根および茎に感染し、これによって、感染した植物細胞のゲノムへの特異的な遺伝子（Ｔ−ＤＮＡ）の挿入により、腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラスミドによって指向される感染が生じる。候補遺伝子を、Ｔｉプラスミドに基づくバイナリー・ベクターを用いるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性の形質転換によって植物ゲノムに挿入した。
【０１９０】
（実施例７）
トランスジェニックの多年生牧草の産生
光合成プロモーターを含む構築物の使用
個々のフルクタン遺伝子の発現を、またはＦＴ翻訳的な融合物として駆動するＴａＲｂｃＳおよびＬｐＲｂｃＳ調節性配列を含むベクター、ならびにハイグロマイシン耐性のｐＡｃＨ１ベクターでのペレニアルライグラスの微粒子銃同時形質転換を、ペレニアルライグラスについて胚発生カルスで行った。ｐＡｃＨ１ベクターは、以前に構築され、かつ植物形質転換実験に首尾よく用いられている（Ｂｉｌａｎｇ，ら、１９９１；Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，ら、１９９５ａ；Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，ら、１９９５ｂ；Ｙｅ，ら、１９９７；Ｂａｉ，ら、２００１）。ＧＵＳマーカー遺伝子をまた、陽性コントロールとしてクローニングした。表６は、これらの株の生成のための形質転換および分子分析をまとめている。
【０１９１】
【表６】
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Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅ配列を含む「カセットＤＮＡ」を、ＥｃｏＲ  Ｖ制限エンドヌクレアーゼを用いて、プラスミドベクターｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＬｐＦＴ４、ｐＢＳ−ＬｐＣＡＢ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４およびｐＢＳ−ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＬｐＦＴ４（それぞれ、図２９、３０および３４）から切り出した。アガロースゲル電気泳動後、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから精製し、その後に植物形質転換に用いて、ベクター骨格配列なしのＤＮＡを産生した。事前に構築して、植物形質転換実験で首尾よく用いられたｐＡｃＨ１ベクターをまた、制限酵素で消化して、選択マーカーのみの発現のためにＤＮＡフラグメントを産生した。
【０１９２】
個々のフルクタン遺伝子の発現を、または翻訳的なＦＴ融合物として駆動するＬ．ｐｅｒｅｎｎｅ調節性配列を含むベクター、ならびにハイグロマイシン耐性のｐＡｃＨ１発現カセットでのペレニアルライグラスの微粒子銃同時形質転換を、ペレニアルライグラスについての胚発生カルスで行った。表７はこれらの株の生成のための形質転換および分子分析をまとめている。
【０１９３】
【表７】
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（実施例８）
トランスジェニックの多年生牧草の特徴付け
トランスジェニックのＦＴおよびＦＴ融合ペレニアルライグラス植物の特徴付け
トランスジェニックのペレニアルライグラス植物の再生の間、株の間で成長の表現型の相違が注目された。ＦＴ融合物１およびＦＴ融合物３のトランスジェニック植物の両方に由来する両方の組織培養物再生体および対応する土壌成長植物とも、単一のフルクタン生合成遺伝子を含むトランスジェニック植物、または選択マーカーｈｐｈのみを含むコントロール植物に比較して優れた成長能力の表現型を示した。組織培養物におけるトランスジェニックのペレニアルライグラス植物の表現型の例は、図４８〜５１で、ＴａＲｂｃＳプロモーターおよびＬｐＲｂｃＳ  ＦＴ融合トランスジェニックについて示している。
【０１９４】
優れた成長能力表現型を示す植物は、目的のＦＴ遺伝子を含むことが確認された。トランスジェニックのＦＴ融合物１およびＦＴ融合物３植物の優れた成長能力表現型は、プレート上で行った植物再生の早期段階の間に最初に観察された。特に、光のもとでのインキュベーションのちょうど１２日後、トランスジェニックのカルスでは、さらに発達した緑の苗条が示された。ＦＴ融合トランスジェニック植物の速い成長速度は、発根培地へ移した２２日後にさらに明白になった。ＦＴ融合物１またはＦＴ融合物３構築物のいずれかを含むトランスジェニック植物では、明確に多数の分げつが示された。さらに、ＦＴ融合トランスジェニック植物は一貫して、インビトロでコントロールの植物に比較して１植物あたり高い分げつ密度を示した（図４８〜４９）。
【０１９５】
ガラス温室条件下での土壌への移行および成長の後に、ＦＴ融合物１とＦＴ融合物３の株との間ではさらに特異的な相違が観察された。両方のＦＴ融合植物とも、成長能力の増強を示すが、ＦＴ融合物１植物の方が、長く、厚くかつわずかに濃い緑の葉身を有した。また植物は物理的にさらに堅強であって、厚い葉鞘および葉身を有した。ＦＴ融合物３株は他のコントロールの植物よりもはやく成長し続け、より長い葉身およびより活発な分げつ成長があるが、葉の形態は野性型とさらに類似であった。根のバイオマスにおける増大はまた、ＦＴ融合物１およびＦＴ融合物３の土壌の両方で成長したトランスジェニックのペレニアルライグラス植物で観察された（図５０）。コントロールのトランスジェニックの植物（Ｌｐ１−ＳＳＴまたはＬｐ６Ｇ−ＦＦＴを単一の遺伝子として保有する）では、ＦＴ融合物１および３のトランスジェニック植物で観察された成長速度の増大のレベルは示されなかった。それらの外観はお互いに似ているが、いくつかはＧＵＳまたはｈｐｈのいずれかを含むトランスジェニック植物よりも活発に発達した（図５０）。
【０１９６】
ガラス温室で観察された同様の表現型がまた、野外でも観察された。ＦＴ融合物トランスジェニック植物は、より活発な成長表現型を示し、分げつの数が増大し、葉身は長かった（図５１）。野外試験でトランスジェニック植物をバイオマス生産について分析した（表８）。バイオマスを、図５２に概説されるとおり評価し、ここでは最低のバイオマスであるスコア１から最高のバイオマスである５におよぶ。
【０１９７】
【表８】
2015154789.tif 000011
個々の植物由来の葉身を切断して、手で切片にした（図５３）。各々の細胞で葉緑体の量、および葉緑体を有する細胞数に明白な相違がみられ：コントロールの植物よりもトランスジェニックＦＴ融合植物では両方とも大きかった。さらに、葉緑体は、両方の植物を成長室で同じ光条件下で成長させたにもかかわらず、トランスジェニック植物の背軸面（葉の下部）に位置する細胞に存在した。時には、コントロールの植物は、背軸面よりも向軸面（光源に面する上側）に位置する葉肉細胞で多く葉緑体を産生することが観察されたが、トランスジェニック植物は両面でほぼ等しい数の葉緑体を産生する場合が多かった。
【０１９８】
ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳを保有する独立した形質転換体、および２つのコントロール株（ｈｐｈのみ）から抽出した水溶性炭水化物のＨＰＡＥＣによる生化学的分析によって、ＦＴ融合物１およびＦＴ融合物３のトランスジェニックの植物が、有意に高レベルの総フルクタンを含むことが示され（図５４）、このことは、コントロール株を超えて最大２．５倍までの増大を示している（図５４）。さらに、１−ケストースのレベルは、ｈｐｈコントロールに比較して、最大で、ＦＴ融合物１株では４倍（最大３．７μｇ／ｍｇのＤＷ、総フルクタン：２０．５μｇ／ｍｇのＤＷおよびスクロース５１．２μｇ／ｍｇのＤＷ．）、およびＦＴ融合物３株では３倍（２．４μｇ／ｍｇのＤＷ、総フルクタン：２６．０μｇ／ｍｇのＤＷおよびスクロース４９．８μｇ／ｍｇのＤＷ）であった（図５５Ａ−Ｂ）。ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ：：ＴａＲｂｃＳ植物では、１−ケストースは最大２．９μｇ／ｍｇまでのＤＷ（３倍の増大）を有したが、総フルクタン含量は０．５倍の１４μｇ／ｍｇのＤＷまでしか増大しなかった。対照的に、ＴａＲｂｃＳ：：Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：ＴａＲｂｃＳトランスジェニック植物株での１−ケストースレベルは、１−ケストースについて最大１．６μｇ／ｍｇのＤＷまでの不十分な増大（０．５倍まで）を示し、１つの株だけが総フルクタンで１０μｇ／ｍｇのＤＷまでのわずかな増大を示した（図５５Ｃ−Ｄおよび図５６Ｃ−Ｄ）。全ての株のスクロース含量の分析によって、高いフルクタン株のいくつかはまた、総スクロース含量の増大を示すことが明らかになった（図５７）。
【０１９９】
トランスジェニックのペレニアルライグラスをまた、総フルクタンのレベルおよび組成について（図５８および５９）ならびに導入遺伝子発現（図６０Ｃ）について野外条件下でも評価した。コントロールおよびトランスジェニックのペレニアルライグラス植物を、野外試験の成長シーズン全体にわたって繰り返しサンプリングした。野性型コントロールおよび独立した形質転換体の生化学的分析を行って、植物１つあたりの総フルクタンのレベルを示した。図５８は、トランスジェニックおよび野性型の野外で成長させた全体の分げつおよび葉身の乾燥重量（ＤＷ）の１グラム（ｇ）あたりのミリグラム（ｍｇ）でのフルクタンレベルを示す。複数の個体のＦＴ融合物およびＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴトランスジェニック植物は、全体の分げつおよび葉身サンプルの両方で、対応する野性型（ＷＴ）コントロール植物よりも８０〜１２０パーセント高いフルクタン濃度で特定された（図５８）。
【０２００】
野性型コントロールに比較した、３つのＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴトランスジェニックペレニアルライグラス植物の葉身におけるフルクタンの組成に対する代表的な結果を図５９に示す。この結果は、ＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴを発現するトランスジェニック植物における低ＤＰフルクタンのレベルの増大を示している（ボックス１、図５９）。
【０２０１】
導入遺伝子発現は、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した、代表的なＬｐＲｂｃＳＦＴ融合およびＬｐＲｂｃＳ：：Ｌｐ１ＳＳＴのトランスジェニックペレニアルライグラス植物で検出した（図６０）。
【０２０２】
バイオマスの増大を定量するため、単一の分げつを各々のＴ０トランスジェニック株およびコントロール株から分離し、ガラス温室条件下で培養ミックス（ｐｏｔｔｉｎｇ  ｍｉｘ）中で成長させた。７週後および１２週後、各々の植物を、植物の高さ、葉身の幅および総分げつ数について分析した（図６１および図６２）。７週後、コントロールの植物は、２４ｃｍという平均の高さを示し、平均の葉の幅は２．５ｍｍであって、各々の植物は平均で２つの分げつを有した。しかし、トランスジェニックのＦＴ融合物１および融合物３の株は、植物の高さで最大８０％の増大（４３ｃｍ）、葉の幅で最大６０％の増大（４ｍｍ）、および分げつ数で最大３倍までの増大（６分げつ）を示した。１２週後、コントロールの植物は平均で、４３ｃｍの高さで、葉身の幅は３．５ｍｍであって、１植物あたり５つの分げつが生じた。同じ期間にわたって、トランスジェニックのＦＴ融合物１および融合物３の植物は、最大６２ｃｍまでの高さを有した（コントロールに比較して４３％の増大）。葉の幅は最大６ｍｍ（７０％の増大）であって、観察された分げつの最大数は１植物あたり１６であった（２２０％の増大）（図６２）。
【０２０３】
トランスジェニックのＬＸＲ（登録商標）およびトランスジェニックのＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のペレニアルライグラス植物の特徴付け
ＦＴ融合およびＬＸＲ（登録商標）テクノロジーの同時形質転換によって、増強された成長表現型が得られた。ガラス温室条件下で成長させた植物は、コントロールのおよびＬＸＲ（登録商標）単独のトランスジェニック植物に比較して、増大した数の分げつおよび増強された根のバイオマスを示した（図６５）。
【０２０４】
植物組織の乾燥重量実験を行って、個々のＦＴ融合物のおよびＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックの植物のバイオマスを確立した。ガラス温室条件下で成長させたトランスジェニックのペレニアルライグラス植物を、１０分げつ段階で一番下の葉鞘の下５ｍｍで刈り取った。６週後、土壌レベルの上５ｃｍの高さから全ての植物バイオマスを紙袋に収穫して、オーブンで乾燥して、正確に秤量した。
【０２０５】
コントロールは、５つの独立した「目的の遺伝子」陰性（ＧＯＩ−ｖｅ）植物の平均として算出した。ＦＴ融合物およびＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックの植物の両方が、コントロールについての平均レベルより高い（最大２倍）乾燥重量を有する植物を生じた（図６４）。
【０２０６】
ＧＯＩ−ｖｅコントロールおよび独立した形質転換体の生化学的分析も行って、１植物あたりの総フルクタンのレベルを示した。ＦＴ融合物単独、およびＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックの植物の葉身におけるフルクタンレベルは、コントロールの植物の平均値に比較して最大６倍までの増大を示した（図６５）。
【０２０７】
トランスジェニックのＦＴ融合ヒロハノウシノケグサ植物の特徴付け
Ｌ．ｐｅｒｅｎｎｅ調節性配列（ＦＴ翻訳的融合物を駆動する）を含むベクターおよびハイグロマイシン耐性のためのｐＡｃＨ１発現カセットを用いて、ヒロハノウシノケグサ草の形質転換を行った。ガラス温室条件下で成長させたトランスジェニックのヒロハノウシノケグサ植物は、コントロールのトランスジェニック植物に比べて分げつ数の増大および根バイオマスの増強を示した（図６６）。
【０２０８】
トランスジェニックのＬＸＲ（登録商標）およびトランスジェニックのＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）ヒロハノウシノケグサ植物の特徴付け
ＬｐＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３単独、ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３単独、およびＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３プラスＬＸＲ（登録商標）テクノロジー（ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ）を一緒に発現するヒロハノウシノケグサ（Ｌｏｌｉｕｍ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅｕｍ  ｃｖ  Ｊｅｓｕｐ  Ｓ３）植物を産生した。表９はこれらの株の作製のための形質転換および分子分析をまとめている。
【０２０９】
【表９】
2015154789.tif 000012
植物組織の乾燥重量実験を行って、個々のトランスジェニック植物のバイオマスを確立した。ガラス温室条件下で成長したトランスジェニックのヒロハノウシノケグサ植物を、５分げつ段階で葉鞘の最も下よりも５ｍｍ下で刈り取った。６週後、土壌レベルより５ｃｍ上の高さから全ての植物バイオマスを紙袋に収穫して、オーブンで乾燥して、正確に秤量した。
【０２１０】
コントロールは、５つの独立したＧＯＩ−ｖｅ植物の平均として算出した。トランスジェニックのＦＴ融合物単独およびＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のヒロハノウシノケグサ植物の両方とも、コントロール植物の平均レベルと比べて２倍大きい牧草の乾燥重量が示された（図６７）。
【０２１１】
分げつ数の実験も行って、個々のトランスジェニック植物の成長活力を確立した。ヒロハノウシノケグサ植物のトランスジェニックおよびＧＯＩ−ｖｅコントロール植物の両方とも、５分げつの段階で、上述のようにおよび６週間ガラス温室条件下で成長させて刈り取って、その後に分げつの数をカウントした。コントロールでの分げつの数は、５つの個々のＧＯＩ−ｖｅ植物から得られた平均分げつ数に相当する。ＦＴ融合物単独、およびＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）ヒロハノウシノケグサ植物のトランスジェニック株は、コントロールの植物の平均値に比較して分げつ数の最大２倍までの増大を示した（図６８）。
【０２１２】
トランスジェニックのヒロハノウシノケグサ植物（５分げつ）を刈り取って（上記で示したとおり）、ガラス温室条件下で６週成長させ、このとき葉身を収集して、フルクタン分析のために凍結乾燥した。コントロールでの平均のフルクタンのレベルは、５つの独立したＧＯＩ−ｖｅ植物から得られたデータに相当する。ＦＴ融合ヒロハノウシノケグサ植物のトランスジェニック株は、ＧＯＩ−ｖｅのコントロール植物における平均フルクタンレベルに比較して葉身におけるフルクタン蓄積で劇的な増大（３〜５倍）を示す（図６９）。
【０２１３】
（実施例９）
トランスジェニックのコムギ植物の産生
単一のフルクタン遺伝子またはＦＴ翻訳的な融合物を発現する光調節性プロモーターの形質転換
個々のフルクタン遺伝子の発現を、または翻訳的なＦＴ融合物として駆動する光合成プロモーター調節性配列を含むベクター、およびグルホシネート耐性のためのキメラＵｂｉ：：ｂａｒ：：ｎｏｓ選択マーカー遺伝子を含むベクター（ｐＡｃＨ２５）を用いるコムギの微粒子銃同時形質転換をコムギ胚発生カルスで行った。
【０２１４】
老化遅延のためのＡｔＭＹＢ３２プロモーターおよびＩＰＴ遺伝子の形質転換
形質転換ベクターを、グルホシネート耐性のためのキメラＵｂｉ：：ｂａｒ：：ｎｏｓ選択マーカー遺伝子でキメラＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ：：３５Ｓを含むコムギの微粒子銃形質転換のために構築した。ＬＸＲ（登録商標）ベクターでのコムギの遺伝子形質転換は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２に記載されるようなＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ  Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６  コムギ株由来の胚発生カルスの微粒子銃形質転換に基づいた。候補遺伝子を、プラスミド全体を用いて微粒子銃によってコムギのゲノム中に挿入し、これによってベクター骨格配列をまたゲノム中に組み込んでもよい。トランスジェニック植物組織は、選択因子を含む組織培養培地での生存によって回収した。
【０２１５】
光合成細胞における再プログラミングされたフルクタン生合成および光合成細胞の寿命
延長のためのトランスジェニック植物の産生
上記で概説された方法を用いて、光合成細胞における再プログラミングされたフルクタン生合成および光合成細胞の寿命延長のための、光調節性プロモーターによって駆動されるフルクタン生合成遺伝子およびＬＸＲ（登録商標）テクノロジーの両方を含むトランスジェニック植物を生成した。表８は、これらのトランスジェニック植物の作製のための形質転換および分子分析をまとめている。
【０２１６】
【表１０】
2015154789.tif 000013
（実施例１０）
トランスジェニックのコムギ植物の特徴付け
トランスジェニックＦＴ融合コムギ植物の特徴付け
トランスジェニックのコムギ植物の再生の間、インビトロの成長表現型の相違が注目された。ＦＴ融合物１およびＦＴ融合物３の両方のトランスジェニック植物に由来する組織培養物の再生によって、コントロールの植物に比較して優れた活発な表現型が示された。
【０２１７】
トランスジェニックのＦＴ融合物１およびＦＴ融合物３の植物の優れた成長の表現型が、組織培養プレートで行ったインビトロの植物再生の初期段階の間に最初に観察された。微粒子銃形質転換後、カルスを２週間、暗野で組織培養プレート上で保持し、次いで光条件に移した。光条件下で約６週インキュベーションした後、形質転換されたカルスでは、極めて進んだ速度で成長されたＦＴ融合トランスジェニック再生体の緑の苗条および根のさらに十分な発達が示された（図７０）。
【０２１８】
ＦＴ融合トランスジェニック植物の早い成長速度は、発根培地へ移動した後さらに明白になった。ＦＴ融合トランスジェニック植物は、ヌルコントロールに比較した場合、ほぼ２カ月で分げつ数の明らかな早期の増大を示した（コントロールの植物で観察された１つの分げつに比較して最大５つまでの分げつ）。いくつかの植物の葉の幅は、コントロールの植物での２〜３ｍｍに比較して４〜５ｍｍであった。さらに、ＦＴ融合トランスジェニックでは一貫して、コントロールの株に比較して１植物あたり高い分げつ密度が示された（図７１）。
【０２１９】
土壌への移行およびガラス温室条件下での増殖後、ＦＴ融合構築物を含むトランスジェニックのコムギ植物は、コントロールの植物に比べて分げつ数の増大を示し続けた（図７２）。
【０２２０】
トランスジェニックのＬＸＲ（登録商標）およびＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）コムギ植物の特徴付け
ＬＸＲ（登録商標）テクノロジー構築物を含むトランスジェニックのコムギ植物は、ガラス温室条件下のコントロールの植物に比較した場合、分げつの数の増大を示した（図７３Ａ）。それらはまた、ガラス温室条件下で３５日後、光合成組織の増大を示した（図７３Ｂ）。
【０２２１】
ＦＴ融合構築物およびＬＸＲ（登録商標）テクノロジーの同時形質転換によって、ガラス温室で成長させた植物の成長表現型の増強が得られた。いくつかの植物はまた、ガラス温室条件下で明白な老化の遅延を（４０日で）示した（図７４）。ＦＴ融合構築物およびＦＴ融合構築物プラスＬＸＲ（登録商標）を発現するトランスジェニックのコムギ植物はまた、ガラス温室条件下のコントロールの植物に比較した場合、葉のフルクタンのレベルの増大および分げつ数の増大を示した（図７５）。
【０２２２】
ガラス温室条件下で成長させた、ＧＯＩ−ｖｅコントロール、ＦＴ融合物、ならびにＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）独立したＴ１コムギ形質転換体の生化学的分析を行って、１植物あたりの総フルクタンのレベルを示した。フルクタンレベルの劇的な増大（最大で５倍まで）を両方のトランスジェニックの株について検出した（図７６）。
【０２２３】
（実施例１１）
トランスジェニックのＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍ植物の産生
葉の老化の遅延のためのＡｔＭＹＢ３２プロモーターの制御下のＩＰＴ遺伝子の形質転換
Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍ（単為生殖のダリスグラス（ｄａｌｌｉｓｇｒａｓｓ））の遺伝子形質転換は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２に記載のとおり微粒子銃形質転換に基づく。
【０２２４】
候補遺伝子の発現構築物を、プラスミド全体を用いて微粒子銃によってＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍのゲノム中に挿入し、これによってベクター骨格配列を、ゲノム中に組み込んでもよい。トランスジェニック植物組織を、選択因子を含む組織培養培地上での生存によって回収した。
【０２２５】
光合成細胞でフルクタン生合成を操作するための光調節性プロモーターの制御下のＦＴ翻訳的融合物の形質転換
光合成調節性フルクタン生合成遺伝子でのＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍの遺伝子形質転換は、ＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックのＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍ植物を産生するために用いたのと同じ方法を用いて行う。
【０２２６】
（実施例１２）
トランスジェニックＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍ植物の特徴付け
ＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニックの植物は、優れた成長の表現型を示す。
【０２２７】
ＡｔＭＹＢ３２プロモーターの制御下でＩＰＴ遺伝子を発現するトランスジェニックのＰａｓｐａｌｕｍ  ｄｉｌａｔａｔｕｍ植物では、バイオマス蓄積の増強が明らかになった。推定のトランスジェニックのＰ．ｄｉｌａｔａｔｕｍ植物の再生の間、成長の表現型の相違が注目され、これによってコントロール植物に比較した優れた成長の表現型が示される。特有の成長表現型が、同時形質転換されたベクターと組み合わせて、形質転換植物を特定するための選択ツールとして用いられ得る。
【０２２８】
（実施例１３）
トランスジェニックの双子葉植物の産生
ＬＸＲ（登録商標）およびＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）双子葉植物の形質転換
ＦＴ融合物およびＬＸＲ（登録商標）テクノロジーを含むバイナリー・ベクターを、双子葉植物のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換のために生成した。形質転換ベクターはまた、選択マーカー遺伝子としてキメラ３５Ｓ：：ｎｐｔｌｌ：：３５Ｓまたは３５Ｓ：：ｈｐｈ：：３５Ｓも含んだ。
【０２２９】
トランスジェニックの双子葉植物の産生
ＬＸＲ（登録商標）テクノロジー単独（ＡｔＭＹＢ３：：ＩＰＴ）、ＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ  ＦＴ融合物単独、ならびにＬＸＲ（登録商標）テクノロジーおよびＡｔＲｂｃＳ：：Ｌｐ１−ＳＳＴ＿Ｌｐ６Ｇ−ＦＦＴ：：３５Ｓ  ＦＴ融合物を一緒に発現するトランスジェニックシロツメグサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの植物を産生した（図７７および８０）。表１１および１２は、それぞれ、これらの株の生成のための形質転換および分子分析をまとめている。
【０２３０】
【表１１】
2015154789.tif 000014
【０２３１】
【表１２】
2015154789.tif 000015
トランスジェニックのシロツメグサ植物の特徴付け
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、形質転換体を確認し、かつ選択された株でのＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物の発現レベルを検出した（図７８）。導入遺伝子の発現を示しているこれらの株はまた、増大したレベルのフルクタンを示した（図６８Ｂ）。コントロールの株では発現は検出されなかった（図７８）。
【０２３２】
ＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物単独、ＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）およびＧＯＩ−ｖｅコントロール株を発現する独立の形質転換体から抽出した水溶性炭水化物のＨＰＡＥＣによる生化学的分析を行って、１植物あたりの総フルクタンのレベルを示す。ＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物およびＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物プラスＬＸＲ（登録商標）のトランスジェニック株では、コントロールで観察されたよりも２倍高い葉のフルクタン蓄積が示された（図７９）。
【０２３３】
トランスジェニックのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の特徴付け
定量的なＲＴ−ＰＣＲを用いて、形質転換体を確認し、選択した株におけるＡｔＲｂｃＳ  ＦＴ融合物の発現レベルを検出した（図８１）。土壌中で成長したトランスジェニックのＴ２ＦＴ融合Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を図８２に示す。目的の遺伝子が陰性の植物（ＧＯＩ−ｖｅ）もまた提示され、かつ導入遺伝子を発現することが示されているＦＴ融合トランスジェニック植物に対して表現型の相違を示さない。
【０２３４】
バイナリー・ベクターはまた、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ）胚軸セグメントのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換のためにも用いられた（特許ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２）。
【０２３５】
（実施例１４）
トランスジェニックの双子葉植物の特徴付け
トランスジェニックのＬＸＲ（登録商標）双子葉植物の特徴付け
ＡｔＭＹＢ３２プロモーターの機能的に活性なフラグメントを用いて、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２に記載されるように、トランスジェニックのシロツメグサおよびキャノーラ植物においてＩＰＴ発現を駆動した。双子葉植物においてＬＸＲ（登録商標）テクノロジーから観察された結果は、葉の老化の遅延；葉の成長動態の増強；ほふく枝死の減少；バイオマス産生の増強；累積緑葉面積の増大；種子収率の増大；乾燥耐性の増強；遮光耐性の増大；増強した第一胃発酵動態によって反映される牧草の質の向上、および乾物消化率の向上であった。
【０２３６】
トランスジェニック植物は葉の老化表現型の遅延を示す。
【０２３７】
老化の進行の調節は、湿らせた濾紙上でインビトロにおける脱落した葉のシミュレートおよび人工的な加齢の開始によって評価され得る。脱落した葉の暗野でのインキュベーションは、老化関連遺伝子（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅｓ）（ＳＡＧＳ）、葉の黄色化、およびクロロフィルの喪失を誘導するのに極めて有効である（ＷｅａｖｅｒおよびＡｍａｓｉｎｏ，２００１）。図８３は、シロツメグサおよびキャノーラにおけるＡｔＭＹＢ３２プロモーターの２つの機能的に活性なフラグメントのうちの１つの制御下でのＩＰＴ遺伝子の発現に関連した、脱落した老化アッセイデータを示す。トランスジェニック植物では、脱落の７〜２０日後、コントロール植物からの葉に比較して、葉の老化の有意な遅延が示された。
【０２３８】
（実施例１５）
光合成細胞におけるフルクタン生合成を再プログラミングするため、およびこれらの光合成細胞の寿命を延長するためのトランスジェニック植物の産生
上記で概説された方法を用いて、光合成細胞におけるフルクタン生合成を再プログラミングするための光調節性、光合成プロモーターの制御下のフルクタン生合成遺伝子（ＦＴ融合遺伝子を含むＦＴ）および光合成細胞の寿命延長のためのＡｔＭＹＢ３２プロモーターで駆動されるＩＰＴ遺伝子の同時発現を通じたおよびＬＸＲ（登録商標）テクノロジーの両方を含むトランスジェニックの植物を生成した。
【０２３９】
（実施例１６）
インビトロでトランスジェニック植物を特定するための選択ツールとしての特有の成長
表現型の使用
トランスジェニックのＦＴ融合物１またはＦＴ融合物３の植物の優れた成長表現型が、形質転換された全ての植物タイプ（例えば、ペレニアルライグラスおよびコムギ）で観察された。ドクムギ（ライグラス）およびコムギの両方で、これはプレート中で行われた植物再生の早期段階の間で最初に観察された。抗生物質選択なしで行う実験では、強力な苗条誘導が、ボンバードメント後にカルスを暗野条件に８週間保持した段階で観察された（図８４Ａ〜Ｃ）。プレートを光条件に移した後（移行７日後）、強力な苗条誘導がトランスジェニック植物で観察され、かなり低レベルの苗条再生がコントロール植物で検出された（図８４Ｄ〜Ｆ）。
【０２４０】
ＴａＲｂｃＳまたは他の光合成の、スクロース調節性もしくは構成的プロモーターの制御下のＦＴ融合物の発現は、組織培養段階で形質転換された植物の特定のための選択ツールとして用いられ得る。ＦＴ融合タンパク質の発現は、組織培養培地に存在する高濃度のスクロースに起因して活性であり、かつ土壌成長植物に存在する低スクロースレベルではかなり活性が低い、あるセットのプロモーターによって駆動され得る。この導入遺伝子は、引き続き、後続世代で導入遺伝子植物から離れて分離され得る。選択因子として用いられるべき形質転換植物のバイオマスの増大には、選択プロセスに抗生物質耐性マーカーは必要としないはずであり、それによってすぐ上市できる製品を生み出すことができる。
【０２４１】
分析を行って、特有の成長表現型の使用を評価し、ペレニアルライグラスを生じる陽性の形質転換を検出した。胚発生ペレニアルライグラスのカルスＦＬＰ４１０−２０を、ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１単独、ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物３単独、ＡｔＭＹＢ３２：：ＩＰＴ（ＬＸＲ（登録商標）単独、ならびにＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１プラスＬＸＲ（登録商標）ベクター（選択マーカーなし）でカバーされた金粒子でボンバードメントした。コントロールのカルスは、金粒子だけでボンバードメントした。
【０２４２】
植物を抗生物質選択なしに再生して、暗野条件下で２週間保持し、次いで光条件（１６／８時間の光／暗の光周期）に移した。植物の成長は、光に移す前に、および光条件下で５週間毎週検査した。カルスは、５週間の間同じプレート上で徐々に飢餓する条件下で維持した（カルス誘導培地：ＭＳ全強度＋２５０ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン＋２．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ＋６％スクロース＋０．７％の寒天）。
【０２４３】
コントロール植物の成長は、光条件下で最初の２〜３週間の間に開始したが、有意に４週間および５週間後遅くなった（図８５）。ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物ベクターでボンバードメントしたカルスのいくつかは、最初の２〜３週間の間さらに活発な成長を示し、４週および５週で成長を続けた（速度は低下）（図８５）。ＬＸＲ（登録商標）単独でボンバードメントしたカルスでは明白な相違は観察されなかった。ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１プラスＬＸＲ（登録商標）ベクターでの同時形質転換は、コントロールとＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物１ベクター単独との間の中間の表現型を示した（図８６）。
【０２４４】
分子分析を行って、推定のトランスジェニック株においてｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合導入遺伝子の存在を検出した。ＦＴ融合トランスジェニックによって、６０％〜７０％の形質転換および抗生物質なしの選択有効性が示された。導入遺伝子の存在を示すＬＸＲ単独のトランスジェニック植物はなかった。ＴａＲｂｃＳ  ＦＴ融合物およびＬＸＲの同時形質転換では、１１％の効率の同時形質転換および選択が示された（図８６）。
【０２４５】
同時形質転換の効率を決定するための陽性選択のためのＦＴ融合物およびＬＸＲ（登録商標）の同時形質転換の方法を開発し、下に概説している。
【０２４６】
最初に、抗生物質選択マーカーを含むベクターを含む、種々の形質転換事象について同時形質転換の効率を決定する。これらの同時形質転換事象としては以下が挙げられる：
１．光合成プロモーター＋ｈｐｈ選択マーカーによって調節されるＦＴ融合物
２．ＬＸＲ（登録商標）プラスｈｐｈ選択マーカー
３．光合成プロモータープラスＬＸＲ（登録商標）プラスｈｐｈ選択マーカーによって調節されるＦＴ融合物
トランスジェニックについての抗生物質培地での選択を行い、各々の二重または三重の同時形質転換事象についての導入遺伝子の存在を決定し、これによって各々の事象について同時形質転換の効率の数が得られる。
【０２４７】
選択フリー培地で抗生物質選択マーカーなしでもまた、２回目の同時形質転換事象を行う。これらの同時形質転換事象としては以下が挙げられる：
１．光合成プロモーター＋ｄｓＲＥＤマーカーによって調製されるＦＴ融合物
２．ＬＸＲ（登録商標）プラスｄｓＲＥＤマーカー
３．光合成プロモータープラスＬＸＲ（登録商標）プラスｄｓＲＥＤマーカーによって調節されるＦＴ融合物
苗条および／または根の成長速度の増大についての選択を行い、各々の二重または三重の同時形質転換事象についての導入遺伝子の存在を決定する。ｄｓＲＥＤマーカー遺伝子の存在は、蛍光の可視化によって容易に決定され、これによって形質転換事象の各々についての同時形質転換の効率を決定することが補助される。選択マーカーの有無で決定した同時形質転換の効率の比較によって、選択ツールとして優れた表現型を用いることの効率を確立することが補助される。
【０２４８】
【数１】
2015154789.tif 000016
【０２４９】
【数２】
2015154789.tif 000017
【０２５０】
【数３】
2015154789.tif 000018
【０２５１】
【数４】
2015154789.tif 000019
【０２５２】
【数５】
2015154789.tif 000020
【０２５３】
【数６】
2015154789.tif 000021
【０２５４】
【数７】
2015154789.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2015154789.tif 000050
【図２２】
2015154789.tif 000051
【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２８】
2015154789.tif 000070
【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３５−５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３６−５】
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【図３６−６】
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【図３６−７】
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【図３６−８】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３８−５】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４１−５】
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【図４１−６】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４２−５】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４３−３】
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【図４３−４】
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【図４３−５】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４４−４】
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【図４４−５】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
2015154789.tif 000124
【図４５−３】
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【図４５−４】
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【図４５−５】
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【図４５−６】
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【図４６−１】
2015154789.tif 000129
【図４６−２】
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【図４６−３】
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【図４６−４】
2015154789.tif 000132
【図４６−５】
2015154789.tif 000133
【図４７−１】
2015154789.tif 000134
【図４７−２】
2015154789.tif 000135
【図４７−３】
2015154789.tif 000136
【図４７−４】
2015154789.tif 000137
【図４７−５】
2015154789.tif 000138
【図５２】
2015154789.tif 000139
【図５４】
2015154789.tif 000140
【図５８】
2015154789.tif 000141
【図５９】
2015154789.tif 000142
【図６０】
2015154789.tif 000143
【図６１Ａ】
2015154789.tif 000144
【図６１Ｂ】
2015154789.tif 000145
【図６１Ｃ】
2015154789.tif 000146
【図６１Ｄ】
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【図６１Ｅ】
2015154789.tif 000148
【図６４】
2015154789.tif 000149
【図６５】
2015154789.tif 000150
【図６７】
2015154789.tif 000151
【図６８】
2015154789.tif 000152
【図６９】
2015154789.tif 000153
【図７６】
2015154789.tif 000154
【図７８】
2015154789.tif 000155
【図７９】
2015154789.tif 000156
【図８１】
2015154789.tif 000157
【図１】
2015154789.tif 000158
【図２】
2015154789.tif 000159
【図３】
2015154789.tif 000160
【図１７】
2015154789.tif 000161
【図４８】
2015154789.tif 000162
【図４９】
2015154789.tif 000163
【図５０】
2015154789.tif 000164
【図５１】
2015154789.tif 000165
【図５３】
2015154789.tif 000166
【図５５】
2015154789.tif 000167
【図５６】
2015154789.tif 000168
【図５７】
2015154789.tif 000169
【図６２】
2015154789.tif 000170
【図６３】
2015154789.tif 000171
【図６６】
2015154789.tif 000172
【図７０】
2015154789.tif 000173
【図７１】
2015154789.tif 000174
【図７２】
2015154789.tif 000175
【図７３】
2015154789.tif 000176
【図７４】
2015154789.tif 000177
【図７５】
2015154789.tif 000178
【図７７】
2015154789.tif 000179
【図８０】
2015154789.tif 000180
【図８２】
2015154789.tif 000181
【図８３】
2015154789.tif 000182
【図８４】
2015154789.tif 000183
【図８５】
2015154789.tif 000184
【図８６】
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【配列表】
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