(57)【要約】      （修正有）【課題】エラスターゼ治療において望ましくない作用（例、プロテアーゼ活性化受容体１及び２活性化等）をもたらすトリプシンを含有しない、高純度組換えエラスターゼタンパク質含有医薬組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質を含む医薬組成物。前記組成物におけるトリプシン含有量は４ｎｇ未満であることが好ましい。前記組成物は、動脈又は静脈等の生体導管疾患用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）エラスターゼ認識配列を含むエラスターゼ活性化配列が（ｉｉ）成熟エラスター
ゼのアミノ酸配列に作動的に連結されているタンパク質。
【請求項２】
エラスターゼ認識配列が配列番号１１を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
エラスターゼ認識配列が配列番号１２を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
エラスターゼ認識配列が配列番号１３を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
エラスターゼ認識配列が配列番号９３を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
エラスターゼ認識配列が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２０、
または配列番号２１のいずれか１つを含む、請求項１、請求項２、または請求項４のいず
れかに記載のタンパク質。
【請求項７】
活性化配列が配列番号８０を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
活性化配列が配列番号２３、配列番号７２、または配列番号７３のいずれか１つを含む
、請求項１または請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号７４を含む切断ドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
切断ドメインが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号
５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５のいずれか１つを含む、請求項
１または請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
配列番号６４を含む、請求項１から５および７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
配列番号６９を含む、請求項１から５および７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列番号７４の切断ドメインを含むＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項１４】
切断ドメインが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号
５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５のいずれか１つを含む、請求項
１３に記載のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項１５】
成熟エラスターゼ配列が、配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミ
ノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３または請求項
１４に記載のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項１６】
配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列と少なくとも９５
％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のＩ型プロエラ
スターゼタンパク質。
【請求項１７】
配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列と少なくとも９８
％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のＩ型プロエラ
スターゼタンパク質。
【請求項１８】
成熟エラスターゼが、配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸
配列に対して、最大１０カ所の保存的アミノ酸変化を有する配列を含む、請求項１３また
は請求項１４に記載のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項１９】
配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列に対して、最大７
カ所の保存的アミノ酸変化を有する配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のＩ
型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項２０】
配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列に対して、最大５
カ所の保存的アミノ酸変化を有する配列を含む、請求項１３または請求項１４に記載のＩ
型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項２１】
配列番号７４中の「Ｘａａ１」によって示されるアミノ酸残基がグルタミン酸またはヒ
スチジンである、請求項１３から２０のいずれか一項に記載のＩ型プロエラスターゼタン
パク質。
【請求項２２】
配列番号７４中の「Ｘａａ４」によって示されるアミノ酸残基がプロリンである、請求
項１３から２１のいずれか一項に記載のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項２３】
配列番号７４中の「Ｘａａ５」によって示されるアミノ酸残基がアラニンである、請求
項１３から２２のいずれか一項に記載のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項２４】
配列番号７４中の「Ｘａａ１」によって示されるアミノ酸残基がヒスチジンであり、配
列番号７４中の「Ｘａａ４」によって示されるアミノ酸残基がプロリンであり、配列番号
７４中の「Ｘａａ５」によって示されるアミノ酸残基がアラニンである、請求項１３から
２３のいずれか一項に記載のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項２５】
配列番号１０３のアミノ酸配列を含む、請求項１３から２４のいずれか一項に記載のＩ
型プロエラスターゼタンパク質。
【請求項２６】
配列番号６４のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＩ型プロエラスターゼタンパ
ク質。
【請求項２７】
配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＩ型プロエラスターゼタンパ
ク質。
【請求項２８】
単離された、請求項１から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
シグナル配列を含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
（ｉ）シグナル配列と、（ｉｉ）エラスターゼ認識配列を含むエラスターゼ活性化配列
と、（ｉｉｉ）成熟エラスターゼのアミノ酸配列とを含むタンパク質。
【請求項３１】
シグナル配列がメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において作動
的である、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３２】
シグナル配列が酵母α因子シグナルペプチドである、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３３】
酵母α因子シグナルペプチドが配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載
のタンパク質。
【請求項３４】
シグナル配列が哺乳動物の分泌シグナル配列である、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３５】
哺乳動物の分泌シグナル配列がブタＩ型エラスターゼシグナル配列である、請求項３４
に記載のタンパク質。
【請求項３６】
哺乳動物の分泌シグナル配列がヒトＩ型エラスターゼシグナル配列である、請求項３４
に記載のタンパク質。
【請求項３７】
エラスターゼ認識配列がヒトＩ型エラスターゼ認識配列である、請求項１または請求項
３０に記載のタンパク質。
【請求項３８】
成熟エラスターゼがヒトＩ型エラスターゼである、請求項１または請求項３０に記載の
タンパク質。
【請求項３９】
成熟エラスターゼがブタＩ型エラスターゼである、請求項１または請求項３０に記載の
タンパク質。
【請求項４０】
請求項１から３９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４１】
（ｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化配列が（ｉｉ）エラスターゼのアミノ酸配列
に作動的に連結されているタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項４２】
タンパク質が、前記活性化配列に作動的に連結されたシグナル配列をさらに含む、請求
項４１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
シグナル配列がメタノール資化酵母において作動的である、請求項４１または請求項４
２に記載の核酸分子。
【請求項４４】
エラスターゼ認識配列がＩ型エラスターゼ認識配列である、請求項４１から４３のいず
れか一項に記載の核酸分子。
【請求項４５】
エラスターゼ認識配列がＩ型ヒトエラスターゼ認識配列である、請求項４１から４４の
いずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４６】
エラスターゼ認識配列が配列番号１１を含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記
載の核酸分子。
【請求項４７】
エラスターゼ認識配列が配列番号１２を含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記
載の核酸分子。
【請求項４８】
エラスターゼ認識配列が配列番号１３を含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記
載の核酸分子。
【請求項４９】
エラスターゼ認識配列が配列番号９３を含む、請求項４１から４５のいずれか一項に記
載の核酸分子。
【請求項５０】
エラスターゼ認識配列が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２０、
または配列番号２１のいずれか１つを含む、請求項４１から４６および４８のいずれか一
項に記載の核酸分子。
【請求項５１】
活性化配列が配列番号８０を含む、請求項４１から５０のいずれか一項に記載の核酸分
子。
【請求項５２】
活性化配列が配列番号２３、配列番号７２、または配列番号７３を含む、請求項４１か
ら４５および５１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５３】
タンパク質が、配列番号７４を含む切断ドメインを含む、請求項４１から４６のいずれ
か一項に記載の核酸分子。
【請求項５４】
切断ドメインが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配列番号
５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５のいずれか１つを含む、請求項
４１から４６および５３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５５】
エラスターゼが成熟ヒトＩ型エラスターゼである、請求項４１から５４のいずれか一項
に記載の核酸分子。
【請求項５６】
エラスターゼが成熟ブタＩ型エラスターゼである、請求項４１から５４のいずれか一項
に記載の核酸分子。
【請求項５７】
エラスターゼが配列番号５、配列番号８４、配列番号８７、および配列番号３９のいず
れか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４１から５４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５８】
エラスターゼが配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載
の核酸分子。
【請求項５９】
シグナル配列が酵母α因子シグナルペプチドである、請求項４２から５８のいずれか一
項に記載の核酸分子。
【請求項６０】
タンパク質が配列番号３４、配列番号５０、配列番号５１、配列番号９６、および配列
番号９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の核酸分子。
【請求項６１】
シグナル配列が哺乳動物の分泌シグナル配列である、請求項４２および４４から５８の
いずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６２】
哺乳動物の分泌シグナル配列がブタＩ型エラスターゼシグナル配列である、請求項６１
に記載の核酸分子。
【請求項６３】
哺乳動物の分泌シグナル配列がヒトＩ型エラスターゼシグナル配列である、請求項６１
に記載の核酸分子。
【請求項６４】
タンパク質が、配列番号８８から９１および９８から１０３のいずれか１つのアミノ酸
配列を含む、請求項４１から６３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６５】
タンパク質が、配列番号６から９および６４から６９のいずれか１つのアミノ酸配列を
含む、請求項６４に記載の核酸分子。
【請求項６６】
タンパク質が、表２に記載されるエラスターゼ多型の組合せのいずれかを含む、請求項
６４に記載の核酸分子。
【請求項６７】
タンパク質が、表３に記載されるエラスターゼ多型の組合せのいずれかを含む、請求項
６４に記載の核酸分子。
【請求項６８】
請求項４１から６７のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるタンパク質。
【請求項６９】
単離された、請求項６８に記載のタンパク質。
【請求項７０】
請求項４１から６７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７１】
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された、遺伝子発現を制
御するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７２】
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が多量体化される、請求項７０または請
求項７１に記載のベクター。
【請求項７３】
請求項７０から７２のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７４】
前記ベクターの少なくとも１コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、請求項７３に
記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記ベクターの１コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、請求項７４に記載の宿主
細胞。
【請求項７６】
前記ベクターの２〜５コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、請求項７４に記載の
宿主細胞。
【請求項７７】
前記ベクターの２コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、請求項７４または７６に
記載の宿主細胞。
【請求項７８】
前記ベクターの３コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、請求項７４または７６に
記載の宿主細胞。
【請求項７９】
請求項４１から６７のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも１コピーがそのゲノ
ム内に組み込まれる宿主細胞。
【請求項８０】
前記核酸分子の１コピーがそのゲノム内に組み込まれる、請求項７９に記載の宿主細胞
。
【請求項８１】
前記核酸分子の２〜５コピーがそのゲノム内に組み込まれる、請求項７９に記載の宿主
細胞。
【請求項８２】
前記核酸分子の２コピーがそのゲノム内に組み込まれる、請求項７９に記載の宿主細胞
。
【請求項８３】
前記核酸分子の３コピーがそのゲノム内に組み込まれる、請求項７９に記載の宿主細胞
。
【請求項８４】
請求項４１から６７のいずれか一項に記載の核酸分子を発現するように遺伝子改変され
た細胞。
【請求項８５】
前記ヌクレオチド配列がメタノール誘導性プロモーターに作動的に連結されている、請
求項８４に記載の細胞。
【請求項８６】
請求項４１から６７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を発現するように遺伝子
改変されたメタノール資化酵母細胞。
【請求項８７】
前記ヌクレオチド配列がメタノール誘導性プロモーターに作動的に連結されている、請
求項８７に記載のメタノール資化酵母細胞。
【請求項８８】
請求項１から２７または請求項６８のいずれか一項に記載のタンパク質を含む細胞培養
物上清。
【請求項８９】
請求項８４に記載の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを含
む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項９０】
請求項８５に記載の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを含
む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項９１】
請求項８６に記載の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを含
む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項９２】
請求項８７に記載の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを含
む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項９３】
前記条件が、ｐＨ２〜６での増殖時間または誘導時間を含む、請求項９１または請求項
９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記条件が、２２℃〜２８℃の温度での増殖時間または誘導時間を含む、請求項９１ま
たは請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
宿主細胞が複合培地中で培養される、請求項８９から９２のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項９６】
複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合培地で
ある、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
宿主細胞がクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養される
、請求項８９から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸ナトリウ
ム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、請求項９７または請
求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中に存在し
、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が５
〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５
０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項９７または請求項９
８に記載の方法。
【請求項１０１】
タンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項８９から１００のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項１０２】
タンパク質が、上清を回収することによって回収される、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０３】
タンパク質が上清から回収される、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０４】
回収されたタンパク質がシグナル配列を欠く、請求項９５から１０４のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項１０５】
回収されたタンパク質がシグナル配列および活性化配列を欠く、請求項９５から１０４
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
タンパク質を含有する溶液のｐＨをｐＨ６〜１２まで上昇させるステップをさらに含む
、請求項８９から９２および９３から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
タンパク質を触媒量のエラスターゼと接触させるステップをさらに含む、請求項８９か
ら９２および９３から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
タンパク質を自己活性化条件下に置くステップ、タンパク質を触媒量のエラスターゼと
接触させるステップ、またはこれらの両方のステップをさらに含む、請求項８９から９２
および９３から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
タンパク質が自己活性化条件下に置かれる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
自己活性化条件下に置かれるとき、タンパク質が上清中にある、請求項１０９に記載の
方法。
【請求項１１１】
エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）組換えプロエラスターゼタンパク質の発現が可能な宿主細胞を、第１のクエン酸
化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞の培養物から組換えプロエラスターゼタンパク質を回収するステッ
プと、
（ｃ）場合によって、前記組換えプロエラスターゼタンパク質を活性化条件に曝露して
、成熟エラスターゼタンパク質を作製するステップと
を含み、これらによりエラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項１１２】
組換えプロエラスターゼタンパク質を活性化条件に曝露して、成熟エラスターゼタンパ
ク質を作製するステップを含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
活性化条件への前記曝露前に組換えプロエラスターゼタンパク質が精製される、請求項
１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
精製されたプロエラスターゼタンパク質と、第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、
または酢酸化合物とを含む溶液が生成されるように、前記組換えプロエラスターゼタンパ
ク質が、第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で精製され
る、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第１のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン
酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項１１１から１
１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン
酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項１１４または
請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第１および第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が同じであ
る、請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第１および第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が異なる、
請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、請求項１１４から１
１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中に存在し
、前記培養物中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が
５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１
５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項１１４から１１８
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記溶液中に存在する、請求項１１１から１２
０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記溶液中に存在し、
前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が５〜
５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０
ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項１１１から１２０のい
ずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
宿主細胞が複合培地中で培養される、請求項１１１から１２２のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項１２４】
複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合培地で
ある、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
プロエラスターゼタンパク質が、前記宿主細胞の上清から回収される、請求項１１１か
ら１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記活性化条件がトリプシンへの曝露を含む、請求項１１１から１２５のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項１２７】
前記活性化条件が自己活性化条件である、請求項１１１から１２５のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項１２８】
前記成熟エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項１１１から
１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
成熟エラスターゼタンパク質が成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質である、請求項１１１
から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
成熟エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）プロエラスターゼタンパク質を凍結乾燥させるステップと、
（ｂ）凍結乾燥したプロエラスターゼタンパク質を保存するステップと、
（ｃ）凍結乾燥したプロエラスターゼタンパク質を再溶解するステップと、
（ｄ）再溶解されたプロエラスターゼタンパク質を活性化するステップと
を含み、これらにより成熟エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項１３３】
プロエラスターゼタンパク質が組換え体である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
（ｉ）プロエラスターゼタンパク質を発現させることが可能な宿主細胞をプロエラスタ
ーゼタンパク質が発現する条件下で培養するステップと、（ｉｉ）プロエラスターゼタン
パク質を回収するステップとを含む工程により、プロエラスターゼタンパク質が作製され
るかまたは得ることができる、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
宿主細胞が複合培地中で培養される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合培地で
ある、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養され
る、請求項１３２から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸ナトリウ
ム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、請求項１３７または
請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中に存在し
、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が５
〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５
０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項１３７または請求項
１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
プロエラスターゼタンパク質が、前記宿主細胞の上清から回収される、請求項１３２か
ら１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
プロエラスターゼタンパク質が、凍結乾燥前に精製される、請求項１３２から１４１の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
凍結乾燥したプロエラスターゼタンパク質が、少なくとも１日間、少なくとも１週間、
少なくとも１カ月間、または少なくとも３カ月間にわたり保存される、請求項１３２から
１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
プロエラスターゼタンパク質が−８０℃〜＋４℃の温度で保存される、請求項１３２か
ら１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記活性化するステップがトリプシン活性化を含む、請求項１３２から１４４のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記活性化するステップが自己活性化を含む、請求項１３２から１４４のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項１４７】
前記成熟エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項１３２から
１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
成熟エラスターゼタンパク質が成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質である、請求項１３２
から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、組換え自己活性化Ｉ型プロ
エラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置くステップ、組換え自己活性化Ｉ型プロ
エラスターゼタンパク質を触媒量のエラスターゼと接触させるステップ、またはこれらの
両方のステップを含み、これらにより成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項１５２】
（ａ）請求項８４または８６に記載の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件下で培
養するステップと、
（ｂ）発現したタンパク質を回収するステップと
を含み、これらにより組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を作製する工程
により、前記組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼタンパク質が得られるかまたは得る
ことができる、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
宿主細胞が複合培地中で培養される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合培地で
ある、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養され
る、請求項１５２から１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸ナトリウ
ム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、請求項１５５または
請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中に存在し
、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が５
〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５
０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項１５５または請求項
１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
発現したタンパク質を回収するステップが、上清を回収することを含む、請求項１５２
から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記自己活性化ステップが上清中において実施される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
発現したタンパク質が上清から回収される、請求項１５２から１５４のいずれか一項に
記載の方法。
【請求項１６２】
前記自己活性化ステップが上清中において実施される、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
発現したタンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置くステップ
が、回収されたタンパク質を含有する溶液のｐＨを上昇させることを含む、請求項１５１
から１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
溶液のｐＨを塩基性ｐＨまで上昇させる、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
塩基性ｐＨが７〜９の範囲内にある、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
塩基性ｐＨが８である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である、請求
項１６４から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６９】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である、請求項
１６４から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である、請求項
１６４から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である、請求項
１６４から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７２】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において０．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である、請
求項１６４から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において０．２５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である、
請求項１６４から１６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの濃度であ
る、請求項１６５から１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
回収されたタンパク質が、前記溶液中において少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌの濃度であ
る、請求項１６５から１７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
回収されたタンパク質が、０．５〜８時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、請求項１
６５から１７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７７】
回収されたタンパク質が、２〜７時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、請求項１７４
に記載の方法。
【請求項１７８】
回収されたタンパク質が、６時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、請求項１７７に記
載の方法。
【請求項１７９】
前記塩基性ｐＨへの曝露が２２℃〜２８℃の温度で実施される、請求項１６５から１７
８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記塩基性ｐＨへの曝露が２６℃の温度で実施される、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
回収されたタンパク質が自己活性化前に保存される、請求項１５２から１８０のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項１８２】
回収されたタンパク質が保存前に乾燥凍結される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
回収されたタンパク質が乾燥凍結前に精製される、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
回収されたタンパク質が、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも１カ月間
、または少なくとも３カ月間にわたり保存される、請求項１８１から１８３のいずれか一
項に記載の方法。
【請求項１８５】
回収されたタンパク質が８０℃〜＋４℃の温度で保存される、請求項１８４に記載の方
法。
【請求項１８６】
組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼが、自己活性化条件下に置かれる前に精製され
る、請求項１５０から１８５のいずれか一項に記載の方法（ただし、これらの請求項が請
求項１６０または１６２に従属しない場合に限る）。
【請求項１８７】
前記成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項１５０
から１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１５０から１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１５０から１８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
成熟Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項８４または８６に記載の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件下で培
養するステップと、
（ｂ）発現したタンパク質を回収するステップと、
（ｃ）回収されたタンパク質を精製するステップと、
（ｄ）前記タンパク質を含有する溶液のｐＨを上昇させるか、または回収されたタンパ
ク質を触媒量のエラスターゼと接触させて、成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する
ステップと
を含み、これらにより成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項１９１】
宿主細胞が複合培地中で培養される、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合培地で
ある、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養され
る、請求項１９０から１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸ナトリウ
ム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、請求項１９３または
請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中に存在し
、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が５
〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５
０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項１９３または請求項
１９４に記載の方法。
【請求項１９７】
（ｅ）前記成熟Ｉ型エラスターゼを精製するステップをさらに含む、請求項１９０から
１９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１９０から１９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項１９０から１９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２００】
成熟Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）請求項８４または８６に記載の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件下で培
養するステップと、
（ｂ）発現したタンパク質を回収するステップと、
（ｃ）成熟タンパク質が生成されるまで、回収されたタンパク質を塩基性ｐＨに曝露す
るステップと
を含み、これらにより成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法。
【請求項２０１】
宿主細胞が複合培地中で培養される、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合培地で
ある、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養され
る、請求項２００から２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸ナトリウ
ム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、７．５
〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２
５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、請求項２０３または
請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中に存在し
、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃度が５
〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５
０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、請求項２０３または請求項
２０４に記載の方法。
【請求項２０７】
塩基性ｐＨが７〜９である、請求項２００から２０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
塩基性ｐＨが８である、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度であ
る、請求項２００から２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
、請求項２００から２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
、請求項２００から２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１２】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
、請求項２００から２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１３】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに０．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で
ある、請求項２００から２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１４】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに０．２５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度
である、請求項２００から２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの
濃度である、請求項２０９から２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌの
濃度である、請求項２０９から２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１７】
回収されたタンパク質が、０．５〜８時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、請求項２
００から２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
回収されたタンパク質が、２〜７時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、請求項２１７
に記載の方法。
【請求項２１９】
回収されたタンパク質が、６時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、請求項２１８に記
載の方法。
【請求項２２０】
前記塩基性ｐＨへの曝露が２２℃〜２８℃の温度で実施される、請求項２００から２１
９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記塩基性ｐＨへの曝露が２６℃の温度で実施される、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
（ｄ）前記成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、請求項
２００から２２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２３】
成熟Ｉ型エラスターゼが成熟ブタＩ型エラスターゼである、請求項１５０から２２２の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項２２４】
成熟Ｉ型エラスターゼが成熟ヒトＩ型エラスターゼである、請求項１５０から２２２の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項２２５】
成熟エラスターゼタンパク質の製剤を作製する方法であって、
（ａ）活性化プロエラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置いて成熟エラスター
ゼタンパク質を作製するステップと、
（ｂ）成熟エラスターゼタンパク質を製剤化するステップと
を含み、これらにより成熟エラスターゼタンパク質の製剤を作製する方法。
【請求項２２６】
自己活性化プロエラスターゼタンパク質が組換え体である、請求項２２５に記載の方法
。
【請求項２２７】
ステップ（ａ）の前に、プロエラスターゼタンパク質が発現する条件下で増殖した前記
自己活性化プロエラスターゼタンパク質を発現させることが可能な宿主細胞の培養物から
プロエラスターゼタンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項２２６に記載の方
法。
【請求項２２８】
ステップ（ｂ）の前に、前記成熟エラスターゼタンパク質を精製するステップをさらに
含む、請求項２２５または請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２９】
前記製剤化するステップが、前記成熟エラスターゼタンパク質を凍結乾燥させることを
含む、請求項２２５から２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３０】
凍結乾燥前に、成熟エラスターゼタンパク質が緩衝液または緩衝成分と混合されない、
請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
凍結乾燥後に、成熟エラスターゼタンパク質が１種または複数種の緩衝成分と混合され
る、請求項２３０に記載の方法。
【請求項２３２】
凍結乾燥前に、成熟エラスターゼタンパク質が緩衝液または１種もしくは複数種の緩衝
成分と混合される、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３３】
緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）バッファーであるか、または緩衝成分が
ＰＢＳ緩衝成分である、請求項２３１または２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
緩衝液がデキストランを含むか、または緩衝成分がデキストランを含む、請求項２３１
から２３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
デキストランがデキストラン−１８である、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
緩衝液がポリソルベート８０を含む、請求項２３０から２３５のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項２３７】
前記製剤化するステップが、凍結乾燥した成熟エラスターゼタンパク質を液体で再溶解
することをさらに含む、請求項２２９から２３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３８】
液体が水である、請求項２３７に記載の方法。
【請求項２３９】
液体が緩衝液である、請求項２３７に記載の方法。
【請求項２４０】
緩衝液が、希釈されない緩衝液であるか、濃縮緩衝液であるか、または希釈緩衝液であ
る、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
再溶解時において、成熟エラスターゼタンパク質溶液が、希釈されない緩衝液、濃縮緩
衝液、または希釈緩衝液中において生成される、請求項２３７から２４０のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項２４２】
緩衝成分が凍結乾燥物中に存在するか、再溶解時に添加されるか、またはその両方であ
る、請求項２４１に記載の方法。
【請求項２４３】
希釈されない緩衝液が１×ＰＢＳを含む、請求項２４０から２４２のいずれか一項に記
載の方法。
【請求項２４４】
希釈緩衝液が０．１×ＰＢＳ〜０．５×ＰＢＳを含む、請求項２４０または請求項２４
１に記載の方法。
【請求項２４５】
希釈緩衝液が０．１×ＰＢＳを含む、請求項２４４に記載の方法。
【請求項２４６】
希釈緩衝液が０．５×ＰＢＳを含む、請求項２４４に記載の方法。
【請求項２４７】
濃縮緩衝液が１．１×ＰＢＳ〜３×ＰＢＳを含む、請求項２４０または請求項２４１に
記載の方法。
【請求項２４８】
濃縮緩衝液が１．５×ＰＢＳ〜２×ＰＢＳを含む、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
緩衝液がデキストランを含む、請求項２４１から２４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５０】
デキストランがデキストラン１８である、請求項２４９に記載の方法。
【請求項２５１】
緩衝液がポリソルベート８０を含む、請求項２４１から２５０のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項２５２】
緩衝液がｐＨ７〜８である、請求項２４１から２５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
緩衝液がｐＨ７．４である、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
成熟エラスターゼタンパク質が０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解
される、請求項２３７から２５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５５】
成熟エラスターゼタンパク質が０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解され
る、請求項２５４に記載の方法。
【請求項２５６】
成熟エラスターゼタンパク質が５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解される、
請求項２５５に記載の方法。
【請求項２５７】
成熟エラスターゼタンパク質が１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解される
、請求項２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
前記製剤が、前記成熟エラスターゼタンパク質を含む医薬組成物である、請求項２２５
から２５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５９】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項２２５から２５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６０】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項２２５から２５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６１】
凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを作製する方法であって、
（ａ）請求項１５１から１８１のいずれか一項に記載の方法に従って成熟Ｉ型エラスタ
ーゼを作製するステップと、
（ｂ）成熟Ｉ型エラスターゼを単離するステップと、
（ｃ）前記単離された成熟Ｉ型エラスターゼを凍結乾燥させるステップと
を含み、これらにより凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを作製する方法。
【請求項２６２】
凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが９５％〜１００％の純度にある、請求項２６１に
記載の方法。
【請求項２６３】
凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが少なくとも９５％の純度にある、請求項２６１ま
たは請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６４】
凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが少なくとも９８％の純度にある、請求項２６１ま
たは請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６５】
凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが均一になるまで精製される、請求項２６１から２
６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項２６１から２６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６７】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項２６１から２６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６８】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または配列番号
８７から本質的になる、請求項１３０、１４９、１８８、１９８、２２３、２５９、およ
び２６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本質的にな
る、請求項２６８に記載の方法。
【請求項２７０】
成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、請求項１３
１、１５０、１８９、１９９、２２４、２６０、および２６８のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項２７１】
プロエラスターゼタンパク質が、請求項１３から２７のいずれか一項に記載のタンパク
質である、請求項１１１から１２８、１３２から１４８、１５１から１９７、および２２
５から２５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７２】
発現されるタンパク質が請求項１３から２７のいずれか一項に記載のタンパク質である
、請求項２００から請求項２２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７３】
請求項１４９、１８８、１９８、および２２３のいずれか一項に記載の方法により作製
されるかまたは得ることができる成熟ヒトＩ型エラスターゼ。
【請求項２７４】
１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を有する、請求項２７３に記載の成熟ヒトＩ型エ
ラスターゼ。
【請求項２７５】
請求項１５０、１８９、１９９、および２２４のいずれか一項に記載の方法により作製
されるかまたは得ることができる、成熟ブタＩ型エラスターゼ。
【請求項２７６】
１０〜１００Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を有する、請求項２７５に記載の成熟ヒトＩ
型エラスターゼ。
【請求項２７７】
治療有効量の（ａ）請求項２７３もしくは請求項２７４に記載の成熟ヒトＩ型エラスタ
ーゼ、または（ｂ）請求項２５９に記載の方法により作製されるかもしくは得ることがで
きる成熟ヒトＩ型エラスターゼの製剤を含む医薬組成物。
【請求項２７８】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または配列番号
８７から本質的になる、請求項２７７に記載の医薬組成物。
【請求項２７９】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本質的にな
る、請求項２７８に記載の医薬組成物。
【請求項２８０】
治療有効量の（ａ）請求項２７５もしくは請求項２７６に記載の成熟ブタＩ型エラスタ
ーゼ、または（ｂ）請求項２６０に記載の方法により作製されるかもしくは得ることがで
きる成熟ブタＩ型エラスターゼの製剤を含む医薬組成物。
【請求項２８１】
成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、請求項２８
０に記載の医薬組成物。
【請求項２８２】
（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物であって、以下の特性：
（ａ）組成物がトリプシンを含まないこと、
（ｂ）組成物がトリプシンを実質的に含まないこと、
（ｃ）組成物が配列番号２、３、３７、３８、７０および／または７１からなる任意の
タンパク質を含まないこと、
（ｄ）組成物が配列番号２、３、３７、３８、７０および／または７１からなる任意の
タンパク質を実質的に含まないこと、
（ｅ）組成物が細菌タンパク質を含まないこと、
（ｆ）組成物が細菌タンパク質を実質的に含まないこと、
（ｇ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を含まない
こと、
（ｈ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を実質的に
含まないこと
の少なくとも１つを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８３】
（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物であって、以下の特性：
（ａ）組成物がトリプシンを含まないこと、
（ｂ）組成物がトリプシンを実質的に含まないこと、
（ｃ）組成物が配列番号７０および７１からなる任意のタンパク質を含まないこと、
（ｄ）組成物が配列番号２および３からなる任意のタンパク質を実質的に含まないこと
、
（ｅ）組成物が細菌タンパク質を含まないこと、
（ｆ）組成物が細菌タンパク質を実質的に含まないこと、
（ｇ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を含まない
こと、
（ｈ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を実質的に
含まないこと
の少なくとも１つを特徴とする医薬組成物。
【請求項２８４】
特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも２つを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３
に記載の医薬組成物。
【請求項２８５】
前記少なくとも２つの特性が（ａ）および（ｃ）を含む、請求項２８４に記載の医薬組
成物。
【請求項２８６】
前記少なくとも２つの特性が（ｂ）および（ｄ）を含む、請求項２８４に記載の医薬組
成物。
【請求項２８７】
特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも３つを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３
に記載の医薬組成物。
【請求項２８８】
前記少なくとも３つの特性が（ａ）、（ｃ）、および（ｅ）を含む、請求項２８４に記
載の医薬組成物。
【請求項２８９】
前記少なくとも３つの特性が（ｂ）、（ｄ）、および（ｆ）を含む、請求項２８４に記
載の医薬組成物。
【請求項２９０】
特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも４つを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３
に記載の医薬組成物。
【請求項２９１】
前記少なくとも４つの特性が（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、および（ｇ）を含む、請求項２
８４に記載の医薬組成物。
【請求項２９２】
前記少なくとも４つの特性が（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、および（ｈ）を含む、請求項２
８４に記載の医薬組成物。
【請求項２９３】
特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも５つを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３
に記載の医薬組成物。
【請求項２９４】
特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも６つを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３
に記載の医薬組成物。
【請求項２９５】
特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも７つを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３
に記載の医薬組成物。
【請求項２９６】
特性（ａ）〜（ｈ）のすべてを特徴とする、請求項２８２または請求項２８３に記載の
医薬組成物。
【請求項２９７】
配列番号８５、８６、９４、および９５からなる１つ、２つ、３つ、または４つすべて
のタンパク質を含まないかまたは実質的に含まない、請求項２８２から２９６のいずれか
一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９８】
配列番号８５および配列番号８６からなるタンパク質を含まないかまたは実質的に含ま
ない、請求項２８２から２９７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９９】
配列番号９４および配列番号９５からなるタンパク質を含まないかまたは実質的に含ま
ない、請求項２８２から２９７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３００】
配列番号１０６、１０７、および１０８からなる１つ、２つ、または３つすべてのタン
パク質を含まないかまたは実質的に含まない、請求項２８２から２９７のいずれか一項に
記載の医薬組成物。
【請求項３０１】
薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンを含有する、請求項２８２から３００のい
ずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０２】
前記医薬組成物が液体組成物であり、前記薬学的に許容されるレベルのエンドトキシン
が８ＥＵ／ｍｌ以下である、請求項３０１に記載の医薬組成物。
【請求項３０３】
前記薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンが５ＥＵ／ｍｌ以下である、請求項３
０２に記載の医薬組成物。
【請求項３０４】
前記医薬組成物が固体組成物であり、前記薬学的に許容されるレベルのエンドトキシン
が成熟ヒトＩ型エラスターゼ１グラム当たり１０ＥＵ以下である、請求項３０１に記載の
医薬組成物。
【請求項３０５】
前記薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンが成熟ヒトＩ型エラスターゼ１グラム
当たり５ＥＵ以下である、請求項３０４に記載の医薬組成物。
【請求項３０６】
成熟ヒトＩ型エラスターゼが、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴とする、請
求項２８２から３０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０７】
成熟ヒトＩ型エラスターゼが、２５〜３５Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴とする、
請求項３０６に記載の医薬組成物。
【請求項３０８】
成熟ヒトＩ型エラスターゼが、１０Ｕ／タンパク質ｍｇを超える比活性を特徴とする、
請求項３０６に記載の医薬組成物。
【請求項３０９】
成熟ヒトＩ型エラスターゼが、２０Ｕ／タンパク質ｍｇを超える比活性を特徴とする、
請求項３０６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１０】
成熟ヒトＩ型エラスターゼが、配列番号５、８４、または８７から本質的になる、請求
項２８２から３０９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１１】
成熟ヒトＩ型エラスターゼが、配列番号１または配列番号４から本質的になる、請求項
３１０に記載の医薬組成物。
【請求項３１２】
トリプシン活性が、成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり４ｎｇ未満に相
当する、請求項２８２から３１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１３】
トリプシン活性が、成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり２ｎｇ未満に相
当する、請求項３１２に記載の医薬組成物。
【請求項３１４】
１ｍｇ／ｍｌの前記タンパク質濃度への再溶解時において、トリプシン活性が２ｎｇ／
トリプシンｍｌ未満に相当する、配列番号５、８４、または８７から本質的になるタンパ
ク質の凍結乾燥製剤。
【請求項３１５】
水分含量が５％未満である、請求項３１４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３１６】
ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、および塩化物イオンを含む、請求
項３１５に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３１７】
ポリソルベート８０を含む、請求項３１５に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３１８】
デキストランを含む、請求項３１５に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３１９】
デキストランがデキストラン−１８である、請求項３１８に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２０】
ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、およびポリソルベ
ート８０を含む、請求項３１１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２１】
ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、およびデキストラ
ンを含む、請求項３１４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２２】
デキストランがデキストラン−１８である、請求項３２１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２３】
ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、ポリソルベート８
０、およびデキストランを含む、請求項３１４に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２４】
デキストランがデキストラン−１８である、請求項３２３に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３２５】
トリプシン活性が２ｎｇ／トリプシンｍｌ未満に相当する、配列番号５、８４、または
８７から本質的になる少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を含む液体製剤。
【請求項３２６】
溶液が緩衝液である、請求項３２５に記載の液体製剤。
【請求項３２７】
溶液がｐＨ７〜８まで緩衝される、請求項３２６に記載の液体製剤。
【請求項３２８】
溶液がＰＢＳである、請求項３２６に記載の液体製剤。
【請求項３２９】
溶液が１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、および１０ｍＭの
リン酸ナトリウムを含む、請求項３２８に記載の液体製剤。
【請求項３３０】
１種または複数種の賦形剤をさらに含む、請求項３２５から３２９のいずれか一項に記
載の液体製剤。
【請求項３３１】
前記１種または複数種の賦形剤がデキストラン−１８を含む、請求項３３０に記載の液
体製剤。
【請求項３３２】
デキストラン−１８が、前記溶液に対する重量／容量比で８％の量である、請求項３３
１に記載の液体製剤。
【請求項３３３】
前記１種または複数種の賦形剤がポリソルベート８０を含む、請求項３３０に記載の液
体製剤。
【請求項３３４】
ポリソルベート８０が、前記溶液に対する重量／容量比で０．０１％の量である、請求
項３３３に記載の液体製剤。
【請求項３３５】
前記溶液中における前記タンパク質の濃度が０．００１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの
範囲にある、請求項３２５から３３４のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項３３６】
前記溶液中における前記タンパク質の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲
にある、請求項３３５に記載の液体製剤。
【請求項３３７】
１種または複数種の防腐剤、溶解剤、および着色剤をさらに含む、請求項３２５から３
３６のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項３３８】
配列番号５、８４、または８７の前記タンパク質以外の哺乳動物タンパク質を実質的に
含まない、請求項３２５から３３７のいずれか一項に記載の液体製剤。
【請求項３３９】
細菌タンパク質を実質的に含まない、請求項３２５から３３８のいずれか一項に記載の
液体製剤。
【請求項３４０】
請求項２２５から２５８のいずれか一項に記載の方法により作製されるかまたは得るこ
とができる製剤。
【請求項３４１】
液体製剤である、請求項３４０に記載の製剤。
【請求項３４２】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項３４０または３４１に記載の製剤。
【請求項３４３】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または配列番号
８７から本質的になる、請求項３４２に記載の製剤。
【請求項３４４】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本質的にな
る、請求項３４２に記載の製剤。
【請求項３４５】
成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求
項３４０または３４１に記載の製剤。
【請求項３４６】
成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、請求項３４
５に記載の製剤。
【請求項３４７】
正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正確にプロセシングさ
れた成熟エラスターゼタンパク質の混合物から、１種または複数種の不正確にプロセシン
グされた成熟エラスターゼタンパク質を除去する方法であって、
（ａ）正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正確にプロセシ
ングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物を含む組成物を、正確にプロセシングさ
れた成熟酵素が活性となるｐＨ下に置くステップと、
（ｂ）１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
分解される時間までこのようなｐＨを維持するステップと
を含み、これらにより、正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不
正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物から、前記１種または複
数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質を除去する方法。
【請求項３４８】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が、
正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質と比べて、少なくとも１つの付加
的アミノ酸またはより少数のアミノ酸をＮ末端において含有する、請求項３４７に記載の
方法。
【請求項３４９】
前記ｐＨが５〜１２である、請求項３４７または３４８に記載の方法。
【請求項３５０】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が５
０％〜１００％分解される、請求項３４７から３４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５１】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が５
０％〜９９％分解される、請求項３４８に記載の方法。
【請求項３５２】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が５
０％〜９８％分解される、請求項３４８に記載の方法。
【請求項３５３】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が５
０％〜９５％分解される、請求項３４８に記載の方法。
【請求項３５４】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が５
０％〜９０％分解される、請求項３４８に記載の方法。
【請求項３５５】
前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少
なくとも５０％分解される、請求項３５０から３５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５６】
混合物中におけるすべての不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
少なくとも５０％分解される、請求項３５５に記載の方法。
【請求項３５７】
少なくとも１種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なくと
も７５％分解される、請求項３５０から３５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５８】
複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なくとも７５％
分解される、請求項３５７に記載の方法。
【請求項３５９】
混合物中におけるすべての不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
少なくとも７５％分解される、請求項３５７に記載の方法。
【請求項３６０】
少なくとも１種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なくと
も９０％分解される、請求項３５０から３５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６１】
複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なくとも９０％
分解される、請求項３６０に記載の方法。
【請求項３６２】
混合物中のすべての不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なく
とも９０％分解される、請求項３６０に記載の方法。
【請求項３６３】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組成物で
ある、請求項３４７から３６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６４】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組成物であ
る、請求項３４７から３６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６５】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組成物であ
る、請求項３４７から３６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６６】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組成物であ
る、請求項３４７から３６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６７】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が０．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組成物
である、請求項３４７から３６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６８】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が０．２５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組成
物である、請求項３４７から３６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６９】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの濃度である液体
組成物である、請求項３６３から３６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７０】
組成物が、総エラスターゼタンパク質が少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌの濃度である液体
組成物である、請求項３６３から３６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７１】
前記組成物中におけるトリプシン活性が、総エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり４ｎ
ｇ／トリプシンｍｌ未満である、請求項３４７から３７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７２】
前記組成物中におけるトリプシン活性が、総エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり２ｎ
ｇ／トリプシンｍｌ未満である、請求項３４７から３７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７３】
組成物が、配列番号１０４からなるタンパク質を含まないかもしくは実質的に含まず、
かつ／または配列番号１０５からなるタンパク質を含まないかもしくは実質的に含まない
、請求項３４７から３７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７４】
成熟Ｉ型エラスターゼを含む医薬組成物を作製する方法であって、（ｉ）請求項２６１
から２６５のいずれか一項に記載の方法により凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを作製
するステップと、（ｉｉ）水または薬学的に許容される担体中において凍結乾燥した成熟
Ｉ型エラスターゼを再溶解するステップとを含み、これらにより成熟ヒトＩ型エラスター
ゼを含む医薬組成物を作製する方法。
【請求項３７５】
成熟Ｉ型エラスターゼを含む医薬組成物を作製する方法であって、水または薬学的に許
容される担体中において請求項３１４から３２４のいずれか一項に記載の乾燥凍結製剤を
再溶解するステップを含み、これにより成熟Ｉ型エラスターゼを含む医薬組成物を作製す
る方法。
【請求項３７６】
医薬組成物がリン酸を含む、請求項３７４または３７５に記載の方法。
【請求項３７７】
成熟Ｉ型エラスターゼが成熟ヒトＩ型エラスターゼである、請求項３７４から３７６の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項３７８】
１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴とする、請求項３７７に記載の方法。
【請求項３７９】
成熟Ｉ型エラスターゼが２５〜３５Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴とする、請求項
３７７に記載の方法。
【請求項３８０】
前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１週間の保
存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４℃で
少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後において、その
比活性の６０％〜１００％を維持する、請求項３７７から３７９のいずれか一項に記載の
方法。
【請求項３８１】
前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１週間の保
存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４℃で
少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後において、その
比活性の６０％〜９８％を維持する、請求項３７７から３７９のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項３８２】
前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１週間の保
存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４℃で
少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後において、その
比活性の６０％〜９５％を維持する、請求項３７７から３７９のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項３８３】
前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１週間の保
存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４℃で
少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後において、その
比活性の６０％〜９０％を維持する、請求項３７７から３７９のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項３８４】
前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１週間の保
存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４℃で
少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後において、その
比活性の６０％〜８０％を維持する、請求項３７７から３７９のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項３８５】
前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１週間の保
存後において、その比活性の少なくとも７０％を維持する、請求項３７７から３８４のい
ずれか一項に記載の方法。
【請求項３８６】
請求項３７４から３８５のいずれか一項に記載の方法により作製されるかまたは得るこ
とができる医薬組成物。
【請求項３８７】
それを必要とするヒト対象における動脈または静脈の直径を治療的に増大させる方法で
あって、（ａ）請求項２７７から３１３および３８６のいずれか一項に記載の医薬組成物
、（ｂ）請求項３２５から３３９のいずれか一項に記載の液体製剤、または（ｃ）請求項
３４１に記載の製剤を、前記動脈または静脈の直径を増大させるのに十分な用量で、前記
ヒト対象における動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含む方法。
【請求項３８８】
血管の直径、血管の内腔径、またはこれらの両方が増大する、請求項３８７に記載の方
法。
【請求項３８９】
それを必要とするヒト対象における動脈または静脈の血管攣縮を予防または治療する方
法であって、（ａ）請求項２７７から３１３および３８６のいずれか一項に記載の医薬組
成物、（ｂ）請求項３２５から３３９のいずれか一項に記載の液体製剤、または（ｃ）請
求項３４１に記載の製剤を、前記動脈または静脈の血管攣縮を予防または治療するのに十
分な用量で、前記ヒト対象における動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含む
方法。
【請求項３９０】
そのような治療を必要とするヒト対象における動脈または静脈の閉塞を治療する方法で
あって、（ａ）請求項２７７から３１３および３８６のいずれか一項に記載の医薬組成物
、（ｂ）請求項３２５から３３９のいずれか一項に記載の液体製剤、または（ｃ）請求項
３４１に記載の製剤を前記ヒト対象における動脈壁または静脈壁へと局所投与するステッ
プを含み、前記投与の結果として前記動脈壁または静脈壁内におけるエラスチンのタンパ
ク質分解をもたらし、前記動脈または静脈の直径を拡張する方法。
【請求項３９１】
そのような治療を必要とするヒト対象における動静脈の血液透析グラフトまたは動静脈
瘻へと接合される動脈または静脈を治療する方法であって、（ａ）請求項２７７から３１
３および３８６のいずれか一項に記載の医薬組成物、（ｂ）請求項３２５から３３９のい
ずれか一項に記載の液体製剤、または（ｃ）請求項３４１に記載の製剤を前記ヒト対象に
おける動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含み、前記投与の結果として前記
動脈壁または静脈壁内におけるエラスチンのタンパク質分解をもたらし、前記動脈または
静脈の直径を拡張する方法。
【請求項３９２】
血液透析において用いられるヒト対象における静脈を治療する方法であって、（ａ）請
求項２７７から３１３および３８６のいずれか一項に記載の医薬組成物、（ｂ）請求項３
２５から３３９のいずれか一項に記載の液体製剤、または（ｃ）請求項３４１に記載の製
剤を前記ヒト対象における静脈壁へと局所投与するステップを含み、前記投与の結果とし
て前記静脈壁内におけるエラスチンのタンパク質分解をもたらし、前記静脈の直径を拡張
する方法。
【請求項３９３】
動脈壁または静脈壁内に送達装置の一部を挿入し、動脈壁または静脈壁へとエラスター
ゼを送達するステップをさらに含む、請求項３８７から３９２のいずれか一項に記載の方
法。
【請求項３９４】
医薬製剤または液体製剤がカテーテルにより投与される、請求項３８７から３９３のい
ずれか一項に記載の方法。
【請求項３９５】
医薬組成物または液体製剤が、動脈壁または静脈壁内へと直接に投与される、請求項３
８７から３９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９６】
動脈または静脈が閉塞している、請求項３８７から３９５のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項３９７】
動脈または静脈が狭窄により閉塞している、請求項３９６に記載の方法。
【請求項３９８】
治療前において、閉塞により不十分な量の血液しか流過できない、請求項３９７に記載
の方法。
【請求項３９９】
閉塞が狭窄である、請求項３９８に記載の方法。
【請求項４００】
動脈または静脈が内膜過形成により閉塞している、請求項３９９に記載の方法。
【請求項４０１】
医薬組成物または液体製剤が、閉塞した冠動脈または末梢動脈に投与される、請求項３
８７から４００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０２】
動脈または静脈が内膜過形成による閉塞を受けやすい、請求項３８７から３９５のいず
れか一項に記載の方法。
【請求項４０３】
組成物が静脈壁へと投与される、請求項３８７から４００および４０２のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項４０４】
静脈が、動静脈の血液透析グラフトまたは動静脈瘻へと接合される、請求項４０３に記
載の方法。
【請求項４０５】
静脈が血液透析において用いられる、請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０６】
前記静脈を動脈へと直接に接合するか、またはグラフトを介して前記静脈を動脈へと接
合するステップをさらに含む、請求項４０５に記載の方法。
【請求項４０７】
組成物が、手術で露出した動脈または静脈の外膜表面へと投与される、請求項３８７か
ら３９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０８】
それぞれ、前記医薬組成物、液体製剤、または製剤中における成熟Ｉ型エラスターゼタ
ンパク質が、ヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求項３８７から４０７のい
ずれか一項に記載の方法。
【請求項４０９】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または配列番号
８７から本質的になる、請求項４０８に記載の方法。
【請求項４１０】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本質的にな
る、請求項４０８に記載の方法。
【請求項４１１】
それぞれ、前記医薬組成物、液体製剤、または製剤中における成熟Ｉ型エラスターゼタ
ンパク質が、ブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、請求項３８７から４０７のい
ずれか一項に記載の方法。
【請求項４１２】
成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、請求項４１
１に記載の方法。
【請求項４１３】
０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの（ａ）請求項２７３または２７４に記載の成熟ヒトＩ
型エラスターゼ、または（ｂ）請求項２５９に記載の方法により作製されるかもしくは得
ることができる成熟ヒトＩ型エラスターゼの製剤を含む単位用量。
【請求項４１４】
成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または配列番号
８７から本質的になる、請求項４１３に記載の単位用量。
【請求項４１５】
０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの（ａ）請求項２７５または２７６に記載の成熟ブタＩ
型エラスターゼ、または（ｂ）請求項２６０に記載の方法により作製されるかもしくは得
ることができる成熟ブタＩ型エラスターゼの製剤を含む単位用量。
【請求項４１６】
成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、請求項４１
５に記載の単位用量。
【請求項４１７】
０．５ｍｇ〜５０ｍｇの前記成熟Ｉ型エラスターゼを含む、請求項４１３から４１６の
いずれか一項に記載の単位用量。
【請求項４１８】
１ｍｇ〜２０ｍｇの前記成熟Ｉ型エラスターゼを含む、請求項４１７に記載の単位用量
。
【請求項４１９】
５ｍｇ〜１０ｍｇの前記成熟Ｉ型エラスターゼを含む、請求項４１８に記載の単位用量
。
【請求項４２０】
容器、パック、分注器、またはカテーテル内にある、請求項４１３から４１９のいずれ
か一項に記載の単位用量。
【請求項４２１】
請求項１から３９および６８から６９のいずれか一項に記載のエラスターゼタンパク質
または請求項８９から２２４、２６１から２７６、および３４７から３７３のいずれか一
項に記載の方法により得られるかもしくは得ることができるエラスターゼタンパク質、請
求項４０から６７のいずれか一項に記載の核酸、請求項７０から７２のいずれか一項に記
載のベクター、請求項７３から８７のいずれか一項に記載の細胞、請求項８８に記載の細
胞培養物上清、請求項３１４から３４６のいずれか一項に記載のエラスターゼ製剤または
請求項２６１から２７６のいずれか一項に記載の方法により得られるかもしくは得ること
ができるエラスターゼ製剤、請求項２７７から３１３および３８６のいずれか一項に記載
の方法による医薬組成物または請求項３７４から３８５のいずれか一項に記載の方法によ
り得られるかもしくは得ることができる医薬組成物、あるいは請求項４１５から４２０の
いずれか一項に記載の単位用量を含むキット。
【請求項４２２】
治療用のキットである、請求項４２１に記載のキット。
【請求項４２３】
容器、パック、分注器、またはカテーテルを含む、請求項４２２に記載のキット。
【請求項４２４】
製造キットである、請求項４２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、２０
０７年１２月４日に出願された米国仮出願第６０／９９２，３１９号の優先権を主張する
。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、生体導管疾患を治療および予防するのに用いられるエラスターゼタンパク質
を製造および製剤化する組換え法に関する。本発明は、新規の組換えエラスターゼタンパ
ク質およびこのようなタンパク質を含有する医薬組成物にさらに関する。さらにまた、本
発明は、生体導管疾患に対する治療および予防のための組換えエラスターゼタンパク質を
含む医薬組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
エラスチンは、伸ばされた後における自発的な反跳が可能なタンパク質である。架橋さ
れたエラスチンは、組織弾性をもたらす弾性繊維の主要な構造成分である。プロテイナー
ゼが、架橋された成熟エラスチンに対する溶解能を有する場合、これをエラスターゼと称
する（Ｂｉｅｔｈ，ＪＧ、「Ｅｌａｓｔａｓｅｓ：ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、２１７〜３２０頁（Ｍｅｃｈａｍ編、「Ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒ
ｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。公開された複数の特許出願（ＷＯ２
００１／２１５７４、ＷＯ２００４／０７３５０４、およびＷＯ２００６／０３６８０４
）は、エラスターゼが、単独または他の作用物質との組合せで、閉塞および血管攣縮を受
けつつあるか、またはこれを受けやすい生体導管を含む生体導管の疾患を治療するのに有
益であることを示している。ヒト対象に対するエラスターゼ療法の場合、非ヒトエラスタ
ーゼに対する免疫反応の危険性を低下させるのにヒトエラスターゼの使用が望ましい。
【０００４】
しかし、現在のところ、臨床的適用に十分に純粋な形態および十分な量で、生物学的に
活性なエラスターゼを作製する市販可能な手段は知られていない。エラスターゼはエラス
チン以外の多数のタンパク質を加水分解しうる強力なプロテアーゼであるため、エラスタ
ーゼのタンパク質分解活性が、その組換え作製の潜在的な障害を提示している。例えば、
成熟エラスターゼの活性は、エラスターゼを発現させる宿主細胞を損傷することもあり、
エラスターゼ自体を分解することもあり、エラスターゼの作製または特徴づけを補助する
のに用いられる作用物質を分解することもある。
【０００５】
エラスターゼは、シグナルペプチド、活性化ペプチド、および活性な成熟部分を含有す
るプレプロタンパク質として発現することが多い。分泌時におけるシグナル配列の切断に
より、酵素活性をほとんどまたはまったく有しえず、そのアミノ酸配列が活性化ペプチド
および成熟タンパク質のアミノ酸配列を含有するプロタンパク質がもたらされる。一般に
、組換え発現の場合、活性な成熟酵素の代わりに不活性な前駆体を発現させて、それを発
現させる細胞に対する損傷を回避することができる。例えば、米国特許第５，２１２，０
６８号は、ヒト膵臓エラスターゼのｃＤＮＡ（該明細書では、エラスターゼ「ＩＩＡ」、
「ＩＩＢ」、「ＩＩＩＡ」、および「ＩＩＩＢ」と称する）のクローニングについて説明
している。哺乳動物のＣＯＳ−１細胞において、各種のエラスターゼが、天然のシグナル
配列を含む全長ｃＤＮＡとして発現した。加えて、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のシ
グナル配列およびβ−ガラクトシダーゼのシグナル配列を含有するエラスターゼの改変形
もまた、それぞれ、枯草菌および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現した。米国特許第
５，２１２，０６８号はまた、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内におけるエラス
ターゼの発現も示唆している。一般に、米国特許第５，２１２，０６８号におけるエラス
ターゼ発現の実施例は、回収されたエラスターゼの活性が低いか、または活性エラスター
ゼの生成に、トリプシンによる処理を伴う活性化ステップを必要とする。加えて、大腸菌
内で発現した場合、エラスターゼは大半が封入体内に存在し、可溶性および活性なのは発
現したエラスターゼのごくわずかな部分であった。米国特許第５，２１２，０６８号にお
いて説明されるエラスターゼ調製物のいずれもが、医薬グレードまで精製されていなかっ
た。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当技術分野では、治療量の、生物学的に活性な、医薬グレードのエラスタ
ーゼの生成を可能とし、大規模調製に費用がかかり、最終生成物のトリプシン汚染を結果
としてもたらしうる、トリプシンによる活性化ステップを回避することが好ましい、組換
え製造方法が必要とされている。トリプシンを含有するエラスターゼを患者に投与すると
、プロテアーゼ活性化受容体１および２の活性化を結果としてもたらす可能性があり、こ
れにより、エラスターゼ治療の有益な効果の一部が減殺される恐れがある。
【０００７】
本出願の第２節または他の任意の節における任意の参考文献の引用または同定は、この
ような参考文献が、本発明に対する先行技術として用いられることの容認としては解釈さ
れないものとする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
３．発明の概要
本発明は、組換えエラスターゼタンパク質の新規で効率的な作製方法、および組成物、
例えば、生体導管疾患に対する治療および予防のための医薬組成物、エラスターゼ製剤、
または単位用量中における組換えタンパク質の使用を提供する。
【０００９】
本発明は、自己活性化プロエラスターゼタンパク質、自己活性化プロエラスターゼタン
パク質をコードする核酸、前記核酸を含む宿主細胞、自己活性化プロエラスターゼタンパ
ク質を作製する方法、および、例えば、医薬製剤中において用いられる生物学的に活性な
成熟エラスターゼタンパク質の製造における自己活性化プロエラスターゼタンパク質の使
用を目的とする。本明細書において、「自己活性化（ａｕｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」
（または「自己活性化（ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ）」）という用語は、「自己活性化
（ａｕｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）」、「自己活性化（ｓｅｌｆ−ａｃｔｉｖａｔｉｎ
ｇ）」、および「自己活性化（ｓｅｌｆ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」という用語と互換的に
用いられ、活性化ステップが生じることの示唆を意図しない。本明細書において、「活性
化」という用語は、「転換」という用語と互換的に用いられ、「活性化」から生じるタン
パク質が、必ずしも酵素活性を有することの示唆を意図しない。
【００１０】
別段に示さない限り、以下の本明細書において用いられる「エラスターゼ」という用語
は一般に、エラスターゼ活性を有する成熟エラスターゼタンパク質のほか、未成熟プロエ
ラスターゼタンパク質（本明細書では、エラスターゼプロタンパク質とも称する）および
未成熟プレプロエラスターゼタンパク質（本明細書では、エラスターゼプレプロタンパク
質とも称する）を含む未成熟エラスターゼタンパク質を指す。
【００１１】
本発明の好ましいエラスターゼは、Ｉ型膵臓エラスターゼ、例えば、ヒトＩ型膵臓エラ
スターゼおよびブタＩ型膵臓エラスターゼである。本明細書において、Ｉ型膵臓エラスタ
ーゼは、場合によって、「エラスターゼ−１」、「エラスターゼＩ」、「エラスターゼ１
型」、「１型エラスターゼ」、または「ＥＬＡ−１」とも称する。本明細書において、ヒ
トＩ型膵臓エラスターゼはまた、ｈＥＬＡ−１またはヒトＥＬＡ−１とも称し、ブタＩ型
膵臓エラスターゼはまた、ｐＥＬＡ−１またはブタＥＬＡ−１とも称する。
【００１２】
本発明の成熟エラスターゼタンパク質は、天然のエラスターゼ遺伝子によりコードされ
るアミノ酸配列またはこのような配列の変異体を有することが典型的である。本明細書で
は、アミノ酸置換を含有する変異体を含む好ましい配列変異体が説明される。プロエラス
ターゼタンパク質は、大半が成熟エラスターゼタンパク質の不活性な前駆体であり、プレ
プロエラスターゼタンパク質は、タンパク質分泌のためのシグナル配列をさらに含有する
。本発明のエラスターゼタンパク質のプレ配列およびプロ配列は、本発明の成熟エラスタ
ーゼタンパク質をコードするエラスターゼ遺伝子にとって天然のものではないことが典型
的である。したがって、ある意味で、本発明の未成熟エラスターゼタンパク質は「キメラ
」タンパク質であり、それらの成熟部分は天然のエラスターゼ遺伝子によりコードされ、
それらの未成熟部分はエラスターゼ遺伝子以外の配列によりコードされる。
【００１３】
言及を容易にするため、本発明のエラスターゼタンパク質およびそれらの配列のコア構
成要素を図２に示す。図２に示す通り、本明細書では、切断結合（すなわち、切断されて
成熟エラスターゼタンパク質をもたらす結合）に対してＮ末端側にあるプロエラスターゼ
配列内のアミノ酸残基をＰＸ、・・・Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、およびＰ１と表示する（
切断結合に対してすぐのＮ末端側をＰ１とする）一方で、成熟エラスターゼタンパク質の
切断結合に対して（および該Ｎ末端に対して）Ｃ末端に位置するアミノ酸残基をＰ１’、
Ｐ２’、Ｐ３’、・・・ＰＸ’と表示して（切断結合に対してすぐのＣ末端側をＰ１’と
する）該成熟タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基を表す。図２はまた、以下の構成要素も
示す：
【００１４】
（１）シグナル配列：細胞から分泌される発現分子の比率を増大させる配列。例示的な
配列は、配列番号５０および５１のアミノ酸１〜２２である。
【００１５】
（２）プロペプチド＋スペーサー：エラスターゼ以外であることが好ましい任意選択の
プロペプチド配列（酵母α因子のプロペプチドなど）であり、これは場合によって、１つ
または複数のスペーサー配列（酵母α因子のプロペプチド配列ならびにＫｅｘ２およびＳ
ＴＥ１３スペーサー配列を図１Ｂに示す）をさらに含みうる。具体的な実施形態において
、該プロペプチド配列は、スペーサーを含まない。
【００１６】
（３）エラスターゼプロペプチド：エラスターゼのＮ末端に存在すると、該分子を不活
性にするか、または対応する成熟エラスターゼタンパク質と比較してより低活性にするペ
プチド。エラスターゼプロペプチドは、活性化ペプチドと隣接する場合もあり、活性化ペ
プチドに対して付加的なアミノ酸を含有する場合もある。例示的なエラスターゼプロペプ
チド配列は、配列番号６４または６９のアミノ酸１〜１０である。
【００１７】
（４）活性化ペプチド：本明細書では「活性化配列」と互換的に用いられる活性化ペプ
チドは、エラスターゼプロペプチドの構成要素であり、これと隣接することがある。図２
に示す通り、活性化ペプチドは、アミノ酸残基Ｐ１０〜Ｐ１を含有する。例示的な活性化
ペプチドのコンセンサス配列は配列番号８０であり、活性化ペプチド配列の他の例は配列
番号２３、７２、および７３である。
【００１８】
（５）認識配列：認識配列は、エラスターゼプロペプチドの構成要素である。図２に示
す通り、認識配列は、アミノ酸残基Ｐ３〜Ｐ１を含有する。例示的な認識配列のコンセン
サス配列は配列番号１１〜１３および９３であり、例示的な認識配列は配列番号２０であ
る。
【００１９】
（６）切断ドメイン：切断結合の範囲にわたるプロエラスターゼタンパク質内の領域。
図２に示す通り、切断ドメインは、アミノ酸残基Ｐ５〜Ｐ３’を含有する。例示的な切断
ドメイン配列は、配列番号４２、４３、４８、４９、５３、５３、５４、および５５であ
る。
【００２０】
（７）切断部位：これもまた切断結合の範囲にわたるプロエラスターゼタンパク質内の
別の領域。図２に示す通り、切断部位は、アミノ酸残基Ｐ４〜Ｐ４’を含有する。例示的
な切断部位配列は、配列番号２７である。
【００２１】
（８）プレプロエラスターゼタンパク質：構成要素のすべての部分を含みうるタンパク
質。例示的なプレプロエラスターゼタンパク質は、作動的に連結された配列番号６４また
は配列番号６９のタンパク質を後続させる配列番号５０、５１、９６、または９７のペプ
チドを含みうる。
【００２２】
（９）プロエラスターゼタンパク質：成熟エラスターゼタンパク質、エラスターゼプロ
ペプチド、ならびに任意選択のプロペプチド配列およびスペーサー配列を含むタンパク質
。例示的なプロエラスターゼ配列は、配列番号６４および６９である。
【００２３】
（１０）成熟エラスターゼタンパク質：正確にプロセシングされるとエラスターゼ活性
を示すタンパク質。例示的な成熟配列は、配列番号１（ヒト）および配列番号３９（ブタ
）である。
【００２４】
エラスターゼタンパク質の構成要素は、エラスターゼタンパク質、プロエラスターゼタ
ンパク質、およびプレプロエラスターゼタンパク質のモジュール式構成単位と考えること
ができる。例えば、本発明は、エラスターゼプロペプチドおよび成熟エラスターゼタンパ
ク質の配列を含むプロエラスターゼタンパク質を提供する。エラスターゼプロペプチドは
、活性化ペプチドを含有しうる。エラスターゼプロペプチドはまた、エラスターゼ認識配
列も含有しうる。本発明はまた、エラスターゼプロペプチドと成熟エラスターゼタンパク
質との間の結合部分の範囲にわたる領域内における切断ドメインまたは切断部位を含むプ
ロエラスターゼタンパク質も提供する。プロエラスターゼタンパク質は、分泌のためのシ
グナル配列をさらに含みうる。このようなタンパク質は、プレプロエラスターゼタンパク
質と考えられる。プレプロエラスターゼタンパク質は、酵母α因子のプロペプチド、また
場合によって、該シグナル配列とエラスターゼプロペプチドとの間のスペーサー配列をさ
らに含む場合がある。本発明のエラスターゼタンパク質はまた、図２に示したモジュール
式のコア構成要素に加えた構成要素も含有しうる。例えば、エラスターゼタンパク質は、
精製のためのエピトープタグまたはヒスチジンタグを含有しうる。本発明のエラスターゼ
タンパク質は、図２に示したすべての構成要素を含有する必要がなく、一般に、図２に示
した少なくとも１つの構成要素（限定ではなく例として述べると、成熟エラスターゼ配列
またはプロエラスターゼ配列を含む）を含有する。本発明の例示的なエラスターゼタンパ
ク質は、後出の第８節における実施形態１〜１２、２８〜３９、および６８〜６９に記載
され、後出の第８節における実施形態１３〜２７に記載の例示的なＩ型プロエラスターゼ
タンパク質を含む。
【００２５】
本明細書では、本発明のエラスターゼタンパク質をコードする核酸、該タンパク質を作
製および精製する方法、組換え細胞および細胞培養物上清、エラスターゼタンパク質を含
む組成物（例えば、医薬組成物、単位用量、製剤）、治療を目的とする該タンパク質の使
用、ならびに該タンパク質を含むキット、製剤、医薬組成物、および単位用量が対象とさ
れる。本発明のエラスターゼタンパク質をコードする核酸は、後出の第８節における実施
形態４０〜６７で例示され、ベクター（例えば、実施形態７０〜７２を参照されたい）を
含む。また、第８節では、組換え細胞（例えば、実施形態７３〜８４を参照されたい）、
エラスターゼタンパク質を含有する細胞上清（例えば、実施形態８８を参照されたい）も
例示される。エラスターゼタンパク質を作製する方法は、第８節の実施形態８９〜２２４
、２６１〜２７６、および３４７〜３７３において例示される。エラスターゼ製剤を作製
する方法は、第８節の実施形態２２５〜２６０において例示される。医薬組成物を作製す
る方法は、第８節の実施形態３７４〜３８５において例示される。エラスターゼタンパク
質を含む医薬組成物は第８節の実施形態２７７〜３１３、および３８６において例示され
、単位用量は第８節の実施形態４１５〜４２０において例示される。エラスターゼタンパ
ク質の製剤は、第８節の実施形態３２４〜３４６において例示される。治療を目的とする
エラスターゼタンパク質の使用は、第８節の実施形態３８７〜４１４において例示される
。該タンパク質を含むキットは、第８節において、実施形態４２１〜４２４により例示さ
れる。
【００２６】
配列番号６４および６９による医薬組成物および／またはプロエラスターゼタンパク質
に関する本発明の各種の態様は、後出の第８節における実施形態４２５〜４７２として例
示されるが、このような実施形態は、本明細書で開示される他のエラスターゼタンパク質
の配列および組成物に適用可能である。
【００２７】
本明細書で説明される作製方法は、活性化ペプチドをプロエラスターゼ配列から除去し
／成熟エラスターゼ配列から分離し、これにより、成熟エラスターゼタンパク質を生成さ
せる活性化ステップを含むことが多い。本明細書で説明される活性化ステップは、自己活
性化ステップでありうる、すなわち、エラスターゼ活性により実行される場合もあり、非
自己活性化ステップの場合もある、すなわちエラスターゼ以外に媒介される、例えば、ト
リプシンにより実行される場合もある。
【００２８】
ある態様において、本発明は、（ｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化ペプチド配列
を含むエラスターゼプロペプチドが（ｉｉ）エラスターゼ活性を有するタンパク質のアミ
ノ酸配列に作動的に連結されているエラスターゼタンパク質（配列番号６〜９、６４〜６
９、８８〜９１、または９８〜１０３のいずれか１つのタンパク質を含むがこれに限定さ
れない）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。このタンパク質は、
前記エラスターゼプロペプチドに作動的に連結された、酵母α因子シグナルペプチドなど
の、配列番号３４のアミノ酸配列によって例示されるシグナル配列を場合によってさらに
含む。本明細書では、α因子を「アルファ因子」、または「アルファ接合因子」または「
α接合因子」とも称する。ある具体的な実施形態において、このタンパク質は、酵母α因
子プロペプチドなど、エラスターゼ以外のプロペプチドを含む。ある具体的な実施形態に
おいて、該タンパク質は、１つまたは複数のスペーサー配列を含みうる。スペーサー配列
は、Ｋｅｘ２およびＳＴＥ１３プロテアーゼ切断部位を含むがこれらに限定されない。具
体的な実施形態では、Ｋｅｘ２スペーサーを用いることができる。別の実施形態では、図
１Ｂで示す通り、Ｋｅｘ２スペーサーをＳＴＥ１３スペーサーに作動的に連結することが
できる。シグナルペプチド配列およびエラスターゼ以外のプロペプチド配列は、配列番号
５１または９７のアミノ酸配列により例示される。シグナルペプチド配列、エラスターゼ
以外のプロペプチド配列、およびスペーサー配列を含有するペプチドは、配列番号５０ま
たは９６のアミノ酸配列により例示される。
【００２９】
他の具体的な実施形態において、シグナル配列は、ブタまたはヒトのＩ型エラスターゼ
（Ｉ型膵臓エラスターゼと互換的に用いられる）のシグナル配列など、哺乳動物の分泌シ
グナル配列である。
【００３０】
エラスターゼ認識配列は、Ｉ型膵臓エラスターゼ認識配列であることが好ましい。
【００３１】
具体的な実施形態において、Ｉ型エラスターゼ活性を有するタンパク質は、成熟ヒトＩ
型エラスターゼ、例えば、配列番号１、４、５、８４、または８７のアミノ酸配列による
タンパク質である。
【００３２】
本発明はまた、（ｉ）メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におい
て作動的であるシグナル配列が（ｉｉ）プロテアーゼ認識配列（配列番号１１〜２３およ
び９３のいずれかのアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない）を含む活性化配列（配
列番号２３、７２、７３、または８０のアミノ酸配列を含むがこれらに限定されない）に
作動的に連結されており、さらに（ｉｉ）が（ｉｉｉ）成熟ヒトＩ型エラスターゼのアミ
ノ酸配列に作動的に連結されているタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
分子も提供する。好ましい実施形態において、プロテアーゼ認識配列は、ヒトＩ型エラス
ターゼ認識配列であり、最も好ましくは配列番号２０のエラスターゼ認識配列である。
【００３３】
前記成熟エラスターゼタンパク質を含む組成物（例えば、医薬組成物、製剤、および単
位用量）と同様、本発明の核酸によりコードされるプロエラスターゼタンパク質（場合に
よって、シグナル配列を含み、したがって、プレプロエラスターゼタンパク質を表す）お
よび成熟エラスターゼタンパク質もまた提供される。
【００３４】
好ましい実施形態において、プロエラスターゼタンパク質または成熟エラスターゼタン
パク質は、Ｎ末端のメチオニン残基を有さない。しかし、別の実施形態において、プロエ
ラスターゼタンパク質または成熟エラスターゼタンパク質は、Ｎ末端のメチオニン残基を
有する。
【００３５】
以下の表１では、本明細書で用いられる配列識別子がまとめられる。本発明の好ましい
タンパク質は、以下の表１に列挙する配列番号１〜３２、３４、３７〜７３、７７、７８
、８２〜９２、および９８〜１０５のいずれかを含むかもしくはこれからなるか、または
配列番号３３および配列番号８１のヌクレオチド配列により部分的もしくは全体的にコー
ドされる。
【００３６】
【表１Ａ】
2015172056.tif 000002
【表１Ｂ】
2015172056.tif 000003
【表１Ｃ】
2015172056.tif 000004
【表１Ｄ】
2015172056.tif 000005
【表１Ｅ】
2015172056.tif 000006
【表１Ｆ】
2015172056.tif 000007
【表１Ｇ】
2015172056.tif 000008
【表１Ｈ】
2015172056.tif 000009
表1:アミノ酸およびヌクレオチドの配列番号の概要
【００３７】
ヒトＩ型エラスターゼタンパク質では、位置１０（ＱまたはＨ）、４４（ＷまたはＲ）
、５９（ＭまたはＶ）、２２０（ＶまたはＬ）、および２４３（ＱまたはＲ）において、
少なくとも５種の多型が確認されている。全長（プレプロエラスターゼ）タンパク質は、
２５８の長さのアミノ酸である。最初の８アミノ酸が、切断されて不活性のプロタンパク
質を生成するシグナル配列または「プレ」ペプチド配列に対応し、さらなる「プロ」ペプ
チド配列（活性化ペプチドに対応する１０アミノ酸を含むかまたはこれからなる）が切断
されて活性な成熟タンパク質を生成する。したがって、位置１０における多型は、プロタ
ンパク質には存在するが、成熟タンパク質には存在しない。
【００３８】
したがって、以下の表２に、ヒトＩ型エラスターゼの５種の多型の可能なすべての組合
せを示す。本発明は、以下の表２に記載される多型の組合せのいずれかを含む、第８節に
おける実施形態１〜３９および６８〜６９で例示されるタンパク質、または同実施形態８
９〜２２４、２６１〜２７６、および３４７〜３７３に記載のいずれか１つの方法により
得られるかもしくは得ることができるタンパク質などのプレプロエラスターゼタンパク質
およびプロエラスターゼタンパク質（本明細書で説明される変異体のプレプロエラスター
ゼタンパク質およびプロエラスターゼタンパク質を含むがこれらに限定されない）を提供
する。
【００３９】
【表２】
2015172056.tif 000010
表2:ヒトI型未成熟エラスターゼ(プレプロ)タンパク質およびプロエラスターゼタンパ
ク質の変異体。位置の番号付けは、天然ヒトI型エラスターゼのプレプロタンパク質の状
況での位置を指す。
【００４０】
さらに、以下の表３に、成熟エラスターゼタンパク質に存在しうるヒトＩ型エラスター
ゼの４種の多型の可能なすべての組合せを示す。本発明は、以下の表３に記載される多型
の組合せのいずれかを含む、第８節における実施形態８９〜２２４、２６１〜２７６、お
よび３４７〜３７３のいずれか１つの方法により得られるかまたは得ることができる成熟
エラスターゼタンパク質などの成熟エラスターゼタンパク質（本明細書で説明される変異
体の成熟エラスターゼタンパク質を含むがこれらに限定されない）を提供する。
【００４１】
【表３】
2015172056.tif 000011
表3:成熟ヒトI型エラスターゼタンパク質の変異体。位置の番号付けは、天然ヒトI型エ
ラスターゼのプレプロタンパク質の状況での位置を指す。
【００４２】
本発明の成熟Ｉ型エラスターゼは精製して、例えば、医薬組成物中において用いること
ができる。具体的な実施形態において、該エラスターゼは、少なくとも７０％、８０％、
９０％、９５％、９８％、または９９％の純度にある。
【００４３】
本発明の成熟Ｉ型エラスターゼは、エラスターゼの添加により触媒される小型のペプチ
ド基質であるＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐニトロアリニド（ＳＬＡＰ）
の加水分解速度を測定することにより決定される通り、１Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、
５Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、１０Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、２０Ｕ／タンパク質
ｍｇを超える、２５Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、または３０Ｕ／タンパク質ｍｇを超え
る比活性を有することが好ましい。１単位の活性は、３０℃で１分間当たりに１マイクロ
モルの基質に対する加水分解を触媒するエラスターゼ量として定義され、比活性は、エラ
スターゼタンパク質ｍｇ当たりの活性（Ｕ／ｍｇ）として定義される。成熟ヒトＩ型エラ
スターゼは、下限が１、２、３、４、５、７、１０、１５、または２０Ｕ／タンパク質ｍ
ｇであり、これとは独立に、上限が５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、ま
たは５０Ｕ／タンパク質ｍｇの範囲内にある比活性を有することが好ましい。例示的な実
施形態において、比活性は、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇ、１〜５Ｕ／タンパク質ｍｇ、
２〜１０Ｕ／タンパク質ｍｇ、４〜１５Ｕ／タンパク質ｍｇ、５〜３０Ｕ／タンパク質ｍ
ｇ、１０〜２０Ｕ／タンパク質ｍｇ、２０〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの範囲、またはその
上限および下限が前出の値のいずれかから選択される任意の範囲にある。成熟ブタＩ型エ
ラスターゼは、下限が１、２、３、４、５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、
６０、または７５Ｕ／タンパク質ｍｇであり、これとは独立に、上限が５、１０、１５、
２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、９０、９５、または１００Ｕ／タン
パク質ｍｇの範囲内にある比活性を有することが好ましい。例示的な実施形態において、
ブタエラスターゼの比活性は、１０〜５０Ｕ／タンパク質ｍｇ、２０〜６０Ｕ／タンパク
質ｍｇ、３０〜７５Ｕ／タンパク質ｍｇ、３０〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇ、２０〜３５Ｕ
／タンパク質ｍｇ、５０〜９５Ｕ／タンパク質ｍｇ、２５〜１００Ｕ／タンパク質ｍｇの
範囲、またはその上限および下限が前出の値のいずれかから選択される任意の範囲にある
。
【００４４】
したがって、本発明のある態様は、後出の第８節における実施形態２７７〜３１４、３
４６、３８６、および４１５〜４２０で例示される医薬組成物、エラスターゼ製剤、およ
び単位用量、または同実施形態２６１〜２７６および３７４〜３８５のいずれか１つの方
法により得られるかもしくは得ることができる医薬組成物、エラスターゼ製剤、および単
位用量などの組成物に関する。
【００４５】
ある実施形態において、本発明の組成物は、トリプシン活性化エラスターゼタンパク質
、例えば、本明細書で開示される方法のいずれかにより作製されるトリプシン活性化タン
パク質を含む。他の実施形態において、この組成物は、自己活性化エラスターゼタンパク
質、例えば、本明細書で開示される方法のいずれかにより作製される自己活性化エラスタ
ーゼタンパク質を含む。ある態様において、本発明の組成物は、以下の特性：（ａ）組成
物はトリプシンを含まないこと；（ｂ）組成物はトリプシンを実質的に含まないこと；（
ｃ）組成物は配列番号７０および７１からなる任意のタンパク質を含まないこと；（ｄ）
組成物は配列番号２および３からなる任意のタンパク質を実質的に含まないこと；（ｅ）
組成物は細菌タンパク質を含まないこと；（ｆ）組成物は細菌タンパク質を実質的に含ま
ないこと；（ｇ）組成物は前記成熟エラスターゼタンパク質以外の哺乳動物タンパク質を
含まないこと；（ｈ）組成物は前記成熟エラスターゼタンパク質以外の哺乳動物タンパク
質を実質的に含まないこと；（ｉ）組成物は配列番号８５、８６、９４、および９５から
なる１つ、２つ、３つ、または４つすべてのタンパク質を含まないかまたは実質的に含ま
ないこと；（ｊ）組成物は配列番号１０６、１０７、および１０８からなる１つ、２つ、
または３つすべてのタンパク質を含まないかまたは実質的に含まないこと；（ｋ）組成物
は薬学的に許容されるレベルのエンドトキシン（例えば、１０ＥＵ／エラスターゼｍｇ以
下、または５ＥＵ／エラスターゼｍｇ以下）を含むこと；（ｌ）組成物中の成熟エラスタ
ーゼタンパク質は、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性または本明細書で開示される他
の任意の範囲の比活性を特徴とすること；（ｍ）前記組成物中のトリプシン活性は、成熟
エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり４ｎｇ未満、または本明細書で開示される他の任意
の範囲のトリプシン活性に相当すること；（ｎ）組成物はポリソルベート−８０を含むこ
と；（ｏ）組成物はデキストランを含むこと；（ｐ）組成物はナトリウムイオン、カリウ
ムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、およびポリソルベート−８０を含むこと；（ｑ
）組成物はナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、およびデ
キストランを含むこと；（ｒ）組成物はナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオ
ン、塩化物イオン、ポリソルベート−８０、およびデキストランを含むこと；（ｓ）前記
組成物中における成熟エラスターゼタンパク質は、本明細書で開示されるある量の安定性
を示す、例えば、４℃で少なくとも１週間の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後
、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃
で少なくとも６カ月間の保存後においてその比活性の６０％〜１００％を維持すること；
ならびに（ｔ）組成物は、単位用量０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの前記成熟エラスター
ゼタンパク質、または本明細書で開示される他の任意の単位用量の成熟エラスターゼタン
パク質を含むことの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ
、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つを特徴とする。
【００４６】
ある態様において、組成物は、以下の群（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）（ａ）、（ｂ）、または（ｍ）
（ｉｉ）（ｅ）または（ｆ）
（ｉｉｉ）（ｇ）または（ｈ）
（ｉｖ）（ｋ）
（ｖ）（ｌ）
から独立に選択される少なくとも３つの特性、少なくとも４つの特性、または少なくとも
５つの特性を特徴とする。
【００４７】
具体的な実施形態では、前記少なくとも３つの特性または前記少なくとも４つの特性の
うちの２つが、群（ｉ）および（ｉｖ）または（ｖ）から選択される。他の実施形態では
、前記少なくとも４つの特性のうちの３つが、群（ｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）から選
択される。
【００４８】
具体的な実施形態において、本発明は、（ｉ）トリプシンを含まない治療有効量のヒト
Ｉ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物、エラスタ
ーゼ製剤、または単位用量を含むがこれらに限定されない組成物を提供する。代替的に、
本発明は、（ｉ）トリプシンを実質的に含まない治療有効量のヒトＩ型エラスターゼと、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。具体的な実施形態において
、ヒトＩ型エラスターゼおよび／または該組成物は、５ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性
、４ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、３ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、２ｎｇ／ｍ
ｌ未満のトリプシン活性、または１．５６ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性を含む。前出
の例において、ｎｇ／ｍｌ単位のトリプシン活性は、１ｍｇ／ｍｌのヒトＩ型エラスター
ゼタンパク質を含有する液体によるヒトＩ型エラスターゼの組成物または調製物中におい
てアッセイすることができる。したがって、トリプシン活性はまた、例えば、３ｎｇ／エ
ラスターゼタンパク質ｍｇ未満のトリプシン活性、１．５６ｎｇ／エラスターゼタンパク
質ｍｇ未満のトリプシン活性など、ミリグラム単位のエラスターゼタンパク質との関係に
おいても記載することができる。本発明は、（ｉ）治療有効量のヒトＩ型エラスターゼと
、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含み、エラスターゼｍｇ当たり５ｎｇ未満のトリ
プシン活性、エラスターゼｍｇ当たり４ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当
たり３ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当たり２ｎｇ未満のトリプシン活性
、またはエラスターゼｍｇ当たり１．５６ｎｇ未満のトリプシン活性を含む組成物をさら
に提供する。
【００４９】
本発明は、トリプシン活性化法により作製される成熟エラスターゼタンパク質の品質を
改善する方法（例えば、後出の第８節における実施形態１４５に記載の方法）であって、
Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂カラム上において成熟エラスターゼタンパク質
を精製するステップを含む方法をさらに提供する。本発明者らは、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ
Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂カラム上で精製された成熟エラスターゼタンパク質が、約１０００ｎ
ｇ／エラスターゼタンパク質ｍｇのトリプシン活性に相当するトリプシン活性レベルを有
するエラスターゼ組成物をもたらすＰｏｒｏｓ（ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン））
カラム上における精製と比較して、２０〜２５ｎｇ／エラスターゼタンパク質ｍｇのトリ
プシン活性に相当するトリプシン活性レベルを有するエラスターゼ組成物をもたらすこと
を見出した。本発明は、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂カラム上においてトリ
プシン活性化エラスターゼタンパク質を精製することにより作製される成熟エラスターゼ
タンパク質を含むエラスターゼ組成物をさらに提供する。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇ
ｈ  Ｓ樹脂はＢｉｏｒａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から市販されており、同社によ
れば、収縮および膨張がほとんどない剛性のメタクリレート製支持体によるカラムである
。他のメタクリレートカラムなど、同じクラスで、かつ／またはビーズサイズが同じ（約
５０μｍ）である他の類似の陽イオン交換カラムも適切に用いることができる。
【００５０】
本発明の他の態様は、ブタＩ型膵臓エラスターゼを含む、医薬組成物、エラスターゼ製
剤、または単位用量を含むがこれらに限定されない組成物に関する。具体的な実施形態に
おいて、本発明は、（ｉ）トリプシンを含まない治療有効量のブタＩ型膵臓エラスターゼ
と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。代替的に、本発明は、
（ｉ）トリプシンを実質的に含まない治療有効量のブタＩ型膵臓エラスターゼと、（ｉｉ
）薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。具体的な実施形態において、ブタ
Ｉ型膵臓エラスターゼおよび／または組成物は、１００ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性
、７５ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、５０ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、２５ｎ
ｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、１５ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、１０ｎｇ／ｍｌ
未満のトリプシン活性、５ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、４ｎｇ／ｍｌ未満のトリプ
シン活性、３ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、２ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性、ま
たは１．５６ｎｇ／ｍｌ未満のトリプシン活性を含む。前出の例において、ｎｇ／ｍｌ単
位のトリプシン活性は、１ｍｇ／ｍｌのブタＩ型膵臓エラスターゼを含有する液体による
ブタＩ型膵臓エラスターゼの組成物または調製物中においてアッセイすることができる。
したがって、トリプシン活性はまた、例えば、２５ｎｇ／エラスターゼタンパク質ｍｇ未
満のトリプシン活性、５ｎｇ／エラスターゼタンパク質ｍｇ未満のトリプシン活性など、
ミリグラム単位のエラスターゼタンパク質との関係においても記載することができる。本
発明は、（ｉ）治療有効量のブタＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体
とを含み、エラスターゼｍｇ当たり１００ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ
当たり７５ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当たり５０ｎｇ未満のトリプシ
ン活性、エラスターゼｍｇ当たり２５ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当た
り１５ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当たり１０ｎｇ未満のトリプシン活
性、エラスターゼｍｇ当たり５ｎｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当たり４ｎ
ｇ未満のトリプシン活性、エラスターゼｍｇ当たり３ｎｇ未満のトリプシン活性、エラス
ターゼｍｇ当たり２ｎｇ未満のトリプシン活性、またはエラスターゼｍｇ当たり１．５６
ｎｇ未満のトリプシン活性を含む組成物をさらに提供する。
【００５１】
他の実施形態において、本発明は、配列番号７０、７１、１０４、１０５の１つ、２つ
、３つ、または４つすべてに対応するＮ末端変異体を含まない、医薬組成物、エラスター
ゼ製剤、または単位用量を含むがこれらに限定されない成熟エラスターゼタンパク質など
のエラスターゼタンパク質組成物を提供する。ある実施形態において、本発明は、（ｉ）
治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含み、
配列番号７０、７１、１０４、１０５による任意のタンパク質を含まない医薬組成物を提
供する。
【００５２】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）成熟エラスターゼタンパク質のＮ末端上にお
いてさらなる特異的なアミノ酸を含有する変異体タンパク質（配列番号３７、３８、７０
、７１、９４、９５、１０４、１０５）を含まないかまたは実質的に含まない治療有効量
のヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物、エ
ラスターゼ製剤、または単位用量を含むがこれらに限定されない組成物を提供する。他の
実施形態において、本発明は、（ｉ）成熟エラスターゼタンパク質のＮ末端アミノ酸を欠
く変異体タンパク質（配列番号２、３、３７、３８、７０、７１、８５、８６、９４、９
５、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８）を含まないかまたは実質的に含まない治
療有効量のヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物を
提供する。具体的な実施形態において、ヒトＩ型エラスターゼおよび／または該組成物は
、２５％未満のＮ末端変異体、２０％未満のＮ末端変異体、１５％未満のＮ末端変異体、
１０％未満のＮ末端変異体、５％未満のＮ末端変異体、４％未満のＮ末端変異体、３％未
満のＮ末端変異体、２％未満のＮ末端変異体、１％未満のＮ末端変異体、０．５％未満の
Ｎ末端変異体、０％のＮ末端変異体を含むか、または前出の百分率のいずれか２つの間の
範囲の量でＮ末端変異体を含む（例えば、２％〜２５％のＮ末端変異体、０．５％〜１０
％のＮ末端変異体、５％〜１５％のＮ末端変異体、０％〜２％のＮ末端変異体）。本明細
書で用いられる「Ｘ％未満のＮ末端変異体」という用語は、総エラスターゼタンパク質に
対する百分率としてのＮ末端変異体の量を指す。
【００５３】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）治療有効量のヒトＩ型エラスターゼと、（ｉ
ｉ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物、エラスターゼ製剤、または単位用量
を含むがこれらに限定されない組成物であって、細菌タンパク質を実質的に含まず、かつ
／または前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない医
薬組成物を提供する。具体的な実施形態において、ヒトＩ型エラスターゼおよび／または
該組成物は、２５％未満の細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスター
ゼ以外の哺乳動物タンパク質、２０％未満の細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒ
トＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、１５％未満の細菌タンパク質および／も
しくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、１０％未満の細菌タン
パク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、５％
未満の細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タ
ンパク質、４％未満の細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以
外の哺乳動物タンパク質、３％未満の細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型
エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、２％未満の細菌タンパク質および／もしくは前
記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、１％未満の細菌タンパク質およ
び／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、０．５％未満の
細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク
質、０％の細菌タンパク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動
物タンパク質を含むか、または前出の百分率のいずれか２つの間の範囲の量で細菌タンパ
ク質および／もしくは前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を含む（
例えば、２％〜２５％の細菌タンパク質および／または前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以
外の哺乳動物タンパク質、０．５％〜１０％の細菌タンパク質および／または前記成熟ヒ
トＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、５％〜１５％の細菌タンパク質および／
または前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質、０％〜２％の細菌タン
パク質および／または前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質）。本明
細書で用いられる「Ｘ％未満の細菌タンパク質および／または前記成熟ヒトＩ型エラスタ
ーゼ以外の哺乳動物タンパク質」という用語は、エラスターゼ調製物または前記組成物中
における総タンパク質に対する百分率としてのこのようなタンパク質の量を指す。ある実
施形態において、エラスターゼは、このような組成物または調製物中における総タンパク
質の少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少な
くとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．８％を占める。
【００５４】
生体導管疾患に対する治療および予防の方法であって、それを必要とする患者に対する
、本発明の精製された成熟ヒトＩ型エラスターゼを含む組成物（例えば、医薬組成物、エ
ラスターゼ製剤、または単位用量）の投与を含む方法もまた提供される。
【００５５】
本発明のエラスターゼタンパク質のいずれかをコードする核酸（「本発明の核酸」）を
含むベクター、本発明の核酸を発現するように改変された宿主細胞がさらに提供される。
具体的な実施形態において、ベクターは、エラスターゼタンパク質の発現を調節するヌク
レオチド配列をさらに含む。例えば、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列
は、メタノール誘導性プロモーターに作動的に連結することができる。他の適切なプロモ
ーターは、後出の第５．３節において例示される。
【００５６】
具体的な実施形態において、本発明は、ヒトＩ型エラスターゼプロタンパク質配列に作
動的に連結された酵母α因子シグナルペプチドまたはＩ型エラスターゼシグナルペプチド
（例えば、ブタエラスターゼシグナルペプチド）を含むオープンリーディングフレームを
コードする核酸配列を含むベクターを提供する。場合によって、ベクターは、該オープン
リーディングフレームに作動的に連結されたメタノール誘導性プロモーターをさらに含む
。
【００５７】
本発明の核酸およびベクターを含む宿主細胞もまた提供される。ある実施形態では、ベ
クターまたは核酸が宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、他の実施形態では、ベクターまたは
核酸が染色体外にある。好ましい宿主細胞は、メタノール資化酵母細胞である。他の適切
な宿主細胞は、後出の第５．３節で例示される。
【００５８】
具体的な実施形態において、本発明は、ヒトＩ型エラスターゼプロ酵素配列に作動的に
連結された酵母α因子シグナルペプチドまたはブタエラスターゼシグナルペプチドを含む
オープンリーディングフレームをコードするように遺伝子改変されたメタノール資化酵母
宿主細胞を提供する。場合によって、該オープンリーディングフレームは、メタノール誘
導性プロモーターの制御下にある。
【００５９】
本発明は、本発明の未成熟または成熟のエラスターゼタンパク質を作製する方法であっ
て、本発明の核酸を発現するように改変された宿主細胞をプロエラスターゼタンパク質が
生成される条件下で培養するステップを含む方法をさらに提供する。ある実施形態では、
成熟エラスターゼタンパク質もまた作製される。
【００６０】
本発明のプロエラスターゼタンパク質および成熟タンパク質を作製するのに好ましい培
養条件は、特に宿主細胞がメタノール資化酵母の場合、低度のｐＨにおける増殖時間を含
む。低度のｐＨは、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５
、６．０、または前出の値のいずれかの対の間にある任意の範囲であることが典型的であ
る。具体的な実施形態において、低度のｐＨは、２．０〜６．０、２．０〜５．０、３．
０〜６．０、３．０〜５．０、４．０〜６．０、または３．０〜４．０の範囲のｐＨであ
る。培養時間の終了時には、成熟エラスターゼタンパク質から活性化配列を分離または除
去する目的で、培養物のｐＨを、好ましくはｐＨ７．０、７．５、８．０、８．５、９．
０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、または前出の値のいずれか２つの間の範囲
のｐＨまで上昇させることができる。具体的な実施形態において、培養物のｐＨは、７．
５〜１０．０または８．０〜９．０の範囲のｐＨ、また最も好ましくはｐＨ８．０まで上
昇させることができる。
【００６１】
本発明のプロエラスターゼタンパク質の発現がメタノール誘導性プロモーターの制御下
にある場合、本発明の未成熟または成熟のエラスターゼタンパク質を作製するための条件
はまた、メタノール誘導時間も含む。
【００６２】
本発明のエラスターゼ作製方法は、宿主細胞により発現するタンパク質を回収するステ
ップをさらに含みうる。ある場合において、回収されるタンパク質は、活性化配列を含む
プロエラスターゼである。他の場合において、回収されるタンパク質は、活性化配列を欠
く成熟エラスターゼである。ある条件下では、プロエラスターゼタンパク質および成熟エ
ラスターゼタンパク質の両方が回収される。
【００６３】
特に自己活性化プロエラスターゼの自己活性化を回避することが望ましい場合、プロエ
ラスターゼ発現のための培養条件は、低度のｐＨにおける増殖時間および誘導時間を含む
ことが好ましい。低度のｐＨは、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５
．０、５．５、６．０、または前出の値のいずれかの対の間にある任意の範囲であること
が典型的である。具体的な実施形態において、低度のｐＨは、２．０〜３．０、４．０〜
５．０、５．０〜６．０、または６．０〜７．０の範囲のｐＨである。具体的な実施形態
において、ｐＨは、４．０〜６．０の範囲にあり、また最も好ましくはｐＨ５．５である
。
【００６４】
特に自己活性化プロエラスターゼの自己活性化を回避することが望ましい場合、プロエ
ラスターゼ発現のための培養条件は、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または
酢酸ナトリウム中における増殖時間および誘導時間を含むことが好ましい。具体的な実施
形態では、５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、７
５〜１７５ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、またはその上限および下限が
前出の値のいずれかから選択される任意の範囲（例えば、５０〜７５ｍＭ、７５〜１００
ｍＭなど）の濃度が用いられる。好ましい実施形態において、クエン酸ナトリウム、コハ
ク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムの濃度は、９０〜１１０ｍＭであり、最も好まし
くは１００ｍＭである。
【００６５】
加えて、特に自己活性化プロエラスターゼの自己活性化または成熟エラスターゼによる
自己分解を回避することが望ましい場合、未成熟エラスターゼタンパク質の発現のための
培養条件は、対象の宿主細胞に適する温度範囲の最下端における増殖時間および誘導時間
を含みうる。例えば、宿主細胞がメタノール資化酵母による宿主細胞である場合、好まし
い範囲は約２２〜２８℃である。具体的な実施形態において、メタノール資化酵母による
宿主細胞は、２８℃で培養される。
【００６６】
加えて、特に宿主細胞のプロテアーゼによるタンパク質分解を回避することが望ましい
場合、未成熟エラスターゼタンパク質の発現のための培養条件は、対象の宿主細胞に適す
る温度範囲の最下端における増殖時間および誘導時間を含みうる。例えば、宿主細胞がメ
タノール資化酵母による宿主細胞である場合、好ましい範囲は約２２〜２８℃である。具
体的な実施形態において、メタノール資化酵母による宿主細胞は、２８℃で培養される。
【００６７】
本発明の自己活性化プロエラスターゼタンパク質の活性化は、少（触媒）量の外因性エ
ラスターゼの添加により誘発されうる。ある実施形態において、触媒量の外因性エラスタ
ーゼは、触媒エラスターゼが添加される試料中におけるエラスターゼのモル重量ベースま
たは分子量ベースで１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、または
０．１％未満を占める。
【００６８】
代替的に、または同時に、自己活性化プロエラスターゼをｐＨ７〜１１（最も好ましく
はｐＨ８）下に置くことができ、このとき、自己活性化プロエラスターゼの活性化ペプチ
ドはトリプシンを必要とすることなく除去され、結果として、活性な成熟エラスターゼが
もたらされる。具体的な実施形態では、活性化ステップの間において、５０〜２００ｍＭ
、７５〜１７５ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、またはその上限もしくは
下限が前出の値のいずれかから選択される任意の範囲の濃度（例えば、５０〜７５ｍＭ、
７５〜１００ｍＭなど）までトリス塩基を添加する。好ましい実施形態において、トリス
塩基は、９０〜１１０  ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭの濃度まで添加される。トリス
塩基のｐＨは７〜１１であることが好ましく、具体的な実施形態において、トリス塩基は
、ｐＨ７．０〜１１．０、７〜９、７．５〜９．５、７．５〜１０、８〜１０、８〜９、
またはその上限もしくは下限が前出の値のいずれかから選択される任意の範囲にある。好
ましい実施形態において、トリス塩基は、ｐＨ７．５〜８．５、最も好ましくはｐＨ８．
０である。
【００６９】
未成熟エラスターゼ配列の発現は、場合によって、プロエラスターゼタンパク質および
成熟エラスターゼタンパク質のほか、Ｎ末端変異体のエラスターゼタンパク質の混合物を
もたらす。したがって、本発明は、（１）プロエラスターゼタンパク質、（２）成熟エラ
スターゼタンパク質、および（３）Ｎ末端変異体のエラスターゼタンパク質のうちの少な
くとも２つを含む組成物を提供する。
【００７０】
成熟エラスターゼが作製されると、例えば、医薬製剤用にこれを凍結乾燥させることが
できる。例示的な実施形態において、本発明は、凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを単
離する方法であって、
（ａ）プレプロエラスターゼのオープンリーディングフレームをコードする核酸分子を
発現するように改変されたメタノール資化酵母による宿主細胞などの宿主細胞を、該オー
プンリーディングフレームが発現する条件下で培養するステップであって、具体的な実施
形態では、前記オープンリーディングフレームが、５’から３’の方向において、（ｉ）
シグナルペプチド、例えば、メタノール資化酵母内おいて作動的であるシグナルペプチド
と、（ｉｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化配列と、（ｉｉｉ）成熟Ｉ型エラスター
ゼタンパク質の配列とをコードするヌクレオチド配列を含み、これによりプロエラスター
ゼタンパク質を作製するステップと；
（ｂ）プロエラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置き、これにより、成熟Ｉ型
エラスターゼを作製するステップであって、自己活性化条件が、
（ｉ）プロテアーゼタンパク質を含有する溶液（細胞培養物上清でありうる）のｐＨ
を、例えば、ｐＨ６．５〜１１、好ましくはｐＨ８〜９まで変化させること；
（ｉｉ）例えば、イオン交換クロマトグラフィーによりプロエラスターゼタンパク質
を精製し、該溶液を延長転換にかけてＮ末端変異体を除去し、これにより、成熟ヒトＩ型
エラスターゼを作製すること；
（ｉｉｉ）プロエラスターゼタンパク質を濃縮（例えば、２倍、３倍、５倍、８倍、
１０倍、１２倍、またはその上限もしくは下限が前出の濃度レベルから独立に選択される
範囲）すること；
（ｉｖ）プロエラスターゼタンパク質を高温（例えば、２９℃、３０℃、３２℃、３
５℃、４０℃、４５℃、または４０℃、またはその上限もしくは下限が前出の温度から独
立に選択される範囲）下に置くこと；
（ｖ）細胞培養物上清からプロエラスターゼタンパク質を精製（例えば、Ｍａｃｒｏ
−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ樹脂を用いて）し、精製されたプロエラスターゼタンパク質を
含む溶液を、少なくとも１日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、ま
たは６日間、またはその上限もしくは下限が前出の値から独立に選択される範囲の日数）
（これは、溶液中におけるクエン酸／酢酸の存在、濃度、温度、およびｐＨによる影響を
受けるが、当業者による容易な決定が可能である）にわたり、周囲温度（例えば、２２℃
〜２６℃）においてインキュベートすること
の１つまたはこれらの組合せを含むステップと；
（ｃ）場合によって、成熟ヒトＩ型エラスターゼを精製するステップ、例えば、仕上げ
のクロマトグラフィーのためのイオン交換クロマトグラフィーステップと；
（ｄ）成熟Ｉ型エラスターゼを凍結乾燥させ、これにより、凍結乾燥した成熟ヒトＩ型
エラスターゼを単離するステップと
を含む方法を提供する。成熟Ｉ型エラスターゼは、ヒトＩ型エラスターゼであることが好
ましい。ある態様において、凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼは、９５％を超えた純度
にあることが好ましく、具体的な実施形態において、凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼ
は、９８％を超えるかまたは９９％を超えた純度にある。
【００７１】
本発明の成熟エラスターゼタンパク質は、医薬組成物に製剤化することができる。した
がって、例示的な実施形態において、本発明は、成熟ヒトＩ型エラスターゼを含む医薬組
成物を作製する方法であって、（ｉ）上記で説明した方法により、乾燥凍結した成熟ヒト
Ｉ型エラスターゼを単離するステップと、（ｉｉ）乾燥凍結した成熟ヒトＩ型エラスター
ゼを、薬学的に許容される担体中において再溶解するステップとを含む方法を提供する。
本発明の成熟ヒトＩ型エラスターゼは、エラスターゼの添加により触媒される小型のペプ
チド基質であるＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐニトロアリニド（ＳＬＡＰ
）の加水分解速度を測定することにより決定される通り、１Ｕ／タンパク質ｍｇを超える
、５Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、１０Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、２０Ｕ／タンパク
質ｍｇを超える、２５Ｕ／タンパク質ｍｇを超える、または３０Ｕ／タンパク質ｍｇを超
える比活性を有することが好ましい。１単位の活性は、３０℃で１分間当たりに１マイク
ロモルの基質に対する加水分解を触媒するエラスターゼ量として定義され、比活性は、エ
ラスターゼタンパク質ｍｇ当たりの活性（Ｕ／ｍｇ）として定義される。成熟ヒトＩ型エ
ラスターゼは、下限が１、２、３、４、５、７、１０、１５、または２０Ｕ／タンパク質
ｍｇであり、これとは独立に、上限が５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、
または５０Ｕ／タンパク質ｍｇの範囲内にある比活性を有することが好ましい。例示的な
実施形態において、比活性は、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇ、１〜５Ｕ／タンパク質ｍｇ
、２〜１０Ｕ／タンパク質ｍｇ、４〜１５Ｕ／タンパク質ｍｇ、５〜３０Ｕ／タンパク質
ｍｇ、１０〜２０Ｕ／タンパク質ｍｇ、２０〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの範囲、またはそ
の上限および下限が前出の値のいずれかから選択される任意の範囲（例えば、１〜１０Ｕ
／ｍｇ、５〜４０Ｕ／ｍｇなど）にある。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、安定であることが好ましい。具体的な実施形態において、医薬
組成物（例えば、上記で説明した通り、凍結乾燥および再溶解により調製される医薬組成
物）は、４℃で１週間の保存後において、その比活性の少なくとも５０％、より好ましく
は少なくとも６０％、また最も好ましくは少なくとも７０％を維持する。具体的な実施形
態において、医薬組成物は、再溶解および４℃で１週間の保存後において、その比活性の
少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％を維
持する。
【００７３】
本発明はまた、エラスターゼの切断ドメイン配列を含有するＩ型エラスターゼプロタン
パク質のアミノ酸配列を含むタンパク質も提供する。本発明において用いうる他の切断ド
メインは、コンセンサス切断ドメイン配列（配列番号７４）であるＸａａ１  Ｘａａ２ 
Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ｘａａ７  Ｘａａ８により記載される配列の
いずれかである［ここで、Ｘａａ１＝Ｐ５、Ｘａａ２＝Ｐ４、Ｘａａ３＝Ｐ３、Ｘａａ４
＝Ｐ２、Ｘａａ５＝Ｐ１、Ｘａａ６＝Ｐ’１、Ｘａａ７＝Ｐ’２、およびＸａａ８＝Ｐ’
３であり、また、
・Ｘａａ１は、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、グリシン、アスパラギン、リシン
、もしくはアラニン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ２は、トレオニン、アラニン、プロリン、もしくはヒスチジン、または場合に
よってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ３は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、リシン、アスパラギ
ン、もしくはバリン、または場合によってこれらの類似体であるが、グリシンもしくはプ
ロリンではないことが好ましく；
・Ｘａａ４は、プロリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、バリン、も
しくはトレオニン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ５は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリンであるが
、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、アルギニン、グルタミン酸、もし
くはリシンではないか、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ６は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリン、または
場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ７は、グリシン、アラニン、もしくはバリン、または場合によってこれらの類
似体であり；
・Ｘａａ８は、バリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプト
ファン、または場合によってこれらの類似体である］。
【００７４】
本発明はまた、成熟ヒトＩ型エラスターゼを単離する方法であって、（ａ）ｐＨ２〜６
での増殖時間または誘導時間を含む培養条件下で、（ｉ）トリプシン認識配列を含む活性
化配列が（ｉｉ）前記培養条件下でエラスターゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
に作動的に連結されているプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞
を培養するステップと；（ｂ）発現したプロタンパク質を回収するステップと；（ｃ）ト
リプシンが活性なｐＨ条件下において、回収されたタンパク質を触媒量のトリプシンと接
触させるステップと；（ｄ）成熟ヒトＩ型エラスターゼを単離するステップとを含む方法
も提供する。この方法において、成熟ヒトＩ型エラスターゼは、配列番号１、４、５、８
４、または８７から本質的になることが可能である。ある実施形態において、該条件は、
（ａ）ｐＨ４〜６における増殖時間もしくは誘導時間；（ｂ）２２℃〜２８℃における増
殖時間もしくは誘導時間；あるいは（ｃ）前記宿主細胞の培地中における約５０ｍＭ〜約
２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、もしくは酢酸ナトリウムの濃度
、または９０ｍＭ〜約１１ｍＭのクエン酸ナトリウム濃度を含みうる。
【００７５】
特許出願において一般的であるのと同様、本出願においても、不定冠詞「ａ」および「
ａｎ」ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、文脈により別段に指示されない限り、１つまたは複
数を意味するのに用いられることに注意されたい。さらに、特許出願において一般的であ
るのと同様、本出願においても、「または」という用語は、選言的な「または」または連
言的な「および」を意味するのに用いられる。
【００７６】
本明細書において言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、製品などについての任意の議論は
、本発明の文脈を提供することだけを目的とする。これらの事物のいずれかまたはすべて
は、本出願の優先年月日以前においてそれがどこかに存在していたために、先行技術の基
板の一部を形成するか、または本発明と関連する分野内における共通の一般的な知識であ
ったことの容認として理解されるべきではない。
【００７７】
本発明の特徴および利点は、それらの実施形態についての以下の詳細な説明からさらに
明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】図１Ａ：合成の（すなわち、組換え）ヒトＥＬＡ−１．２Ａ配列を示す図である。組換えヒトエラスターゼ−１（すなわち、ヒトＩ型膵臓エラスターゼ）配列は７５０塩基対のコード領域を含む。選択された制限酵素部位に下線を引く。塩基置換は二重下線の太字のテキストであり、それらを含むコドンに二重下線を引く。終止コドンを囲む。プロペプチド配列をイタリック体にする。コード領域は２５０個のアミノ酸のタンパク質となる。１０個のアミノ酸のプロペプチドの切断後、得られる成熟酵素は２４０個のアミノ酸である。図１Ｂ：ｐＰＲＯＴ２４翻訳融合領域を示す図である。ベクターとＥＬＡ−１コード領域の翻訳融合を示す。ＥＬＡ−１配列のＰＣＲ増幅は、Ｋｅｘ２およびＳＴＥ１３シグナル切断ドメインを組み込むために施され、活性化配列（イタリック体）の第１のアミノ酸（太字のテキスト）の予期されたＮ末端を有する分泌された生成物を得た。
【図２】本発明のエラスターゼタンパク質の（重複している）コア構成要素のＮ末端からＣ末端の略図である。ここで、番号を付された構成要素は以下を示す：（１）シグナル配列（縦縞）；（２）任意のプロペプチド／スペーサー配列（レンガ）；（３）エラスターゼプロペプチド（斜めの縞、陰影なし、および菱形パターンの組合せ）；（４）活性化ペプチド（陰影なし、および菱形パターンの組合せ）；（５）認識配列（菱形パターン）；（６）切断ドメイン（陰影なし、菱形パターン、および横縞の左部分）；（７）切断部位（陰影なし、菱形パターン、および横縞の左部分）；（８）プレプロエラスターゼタンパク質（略図全体）；（９）プロエラスターゼタンパク質（斜めの縞、陰影なし、菱形パターン、および横縞の組合せ）；ならびに成熟エラスターゼタンパク質（横縞）。表は、矢印によって展開された略図における領域のアミノ酸記号表示を示す。原寸に比例して描かれていない。命名は参照の目的のためだけであり、特定の機能、活性または機構を暗示することを意図していない。
【図３】ｐＰＲＯＴ２４−Ｖベクターの図である。「α因子分泌」は、酵母α因子シグナルペプチドおよびプロペプチド、続くＫｅｘ２およびＳＴＥ１３リピートを含むカセットを指す。
【図４】トリプシン活性化プロＰＲＴ−２０１を含む２０１−２４−２６６−ＶＵ培養物の捕捉クロマトグラフィーからの分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。レーン番号は分画番号に対応する。分割６〜１８は、主にグリコシル化プロ酵素（上部バンド）および非グリコシル化プロ酵素（下部バンド）からなる。分画１９〜３５は、主に非グリコシル化プロ酵素からなる。Ｍ＝分子量マーカー。ＦＴ＝カラムフロースルー（column flow through）。
【図５Ａ】自己活性化プロタンパク質データ表である。プロペプチド配列を第１列に列挙する。誘導の１、２および３日後（それぞれレーン１、２および３）の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを第２列に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく相対的なプロタンパク質収量を第３列に列挙する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく誘導の３日間のプロタンパク質の相対的な安定性を第４列に列挙する。４２および４８のプロペプチド配列を有するプロタンパク質は、誘導中の成熟タンパク質の存在のために低い安定性を有するプロタンパク質として位置づけられる（４２変異体については１、２および３日後、ならびに４８変異体については２および３日後に観察される）。最大ＳＬＡＰ反応速度を達成するための時間によって決定されるプロタンパク質の相対的な変換速度を第５列に列挙される。成熟エラスターゼタンパク質のＮ末端変異体を含む変換されたタンパク質の推定されるパーセンテージを第６列に列挙する。
【図５Ｂ】図５Ｂ：プロペプチド配列２４についての変換速度データを示す図である。図５Ｃ：プロペプチド配列４２についての変換速度データを示す図である。図５Ｄ：プロペプチド配列４８についての変換速度データを示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｅ：プロペプチド配列４９についての変換速度データを示す図である。図５Ｆ：プロペプチド配列５５についての変換速度データを示す図である。
【図６】ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖクローニングスキームである。ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖは、４．３ｋｂのｐＰＲＯＴ５５−Ｖベクター骨格への２つの追加の発現カセットのインビトロライゲーションによって改変され、合計３つのタンデムな発現カセットを得た。２．３ｋｂの発現カセット断片は、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限消化によりｐＰＲＯＴ５５−Ｖから放出され、ならびに精製され、ＢａｍＨＩで線状化されたｐＰＲＯＴ５５−Ｖに２コピーの発現カセットをライゲートした。
【図７】クローン２０１−５５Ｍ３−００６−ＶＵの振とうフラスコ最適化を示す図である。標準誘導培地であるＢＫＭＥを調製し、クエン酸ナトリウムを補足し、最終濃度０、１２．５、２５および５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５を達成した。この培地を用いて、１０ｍＬの誘導培地に対して１ｇの湿潤細胞重量を用いて増殖相の細胞ペレットを再懸濁させた。２５ｍＬの細胞懸濁液を各々、２５０ｍＬの非バッフルフラスコに入れ、２２℃または２５℃で３日間、２７５ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。メタノールを１日２回添加し、最終濃度を０．５体積％にした。上清の一定分量を３日間採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によってタンパク質発現を解析した。パネルＡは２２℃で誘導された試料を示し、パネルＢは２５℃で誘導された試料を示す。両方のパネルにおいて、レーン１〜３は、それぞれ誘導の１、２および３日後の上清であり、０％クエン酸ナトリウムを含む；レーン４〜６は、１２．５％クエン酸ナトリウムを用いることを除いて類似している；レーン７〜９は、２５％クエン酸ナトリウムを用いることを除いて類似している；ならびにレーン１０〜１２は、５０ｍＭクエン酸ナトリウムを用いることを除いて類似している。
【図８】２０１−５５−００１−ＶＵおよび２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ発酵上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。レーン１、２：２０１−５５−００１−ＶＵ上清；レーン３、４：２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ上清；レーン５；空；レーン６；分子量マーカー。
【図９】ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖプロタンパク質捕捉クロマトグラフィーからの分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。各溶出分画から合計３０μｌは、ベータ−メルカプトエタノールで補足された、１０μｌの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料添加緩衝液と混合された。８〜１６％の直線勾配ゲル上でタンパク質を電気泳動し、その後、クーマシー染色した。ＰＲＴ−２０１の２つの主な形態が観察された：プロタンパク質（分画１５〜４３）および自然に変換された成熟ＰＲＴ−２０１（分画１５〜４４）。レーン番号は分画番号に対応する。Ｍ、分子量マーカー。ＢＣ、カラム前（添加前）試料。
【図１０】精製されたプロタンパク質変換のＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析を示す図である。精製されたプロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵは２６℃で変換に供された。グラフは、変換中に生成された成熟（全長）ＰＲＴ−２０１およびＮ末端変異体の相対量を示す。
【図１１】接線フロー（tangential flow）ろ過によって達成された発酵上清のプロタンパク質変換のＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析を示す図である。清澄化された２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ発酵上清は、再生されたセルロースメンブレンを使用した、周囲温度での一定体積の透析ろ過を用いて、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いた接線フローろ過に供された。グラフは、変換中の種々の時間点でのプロタンパク質、成熟（全長）ＰＲＴ−２０１およびＮ末端変異体の相対量を示す。
【図１２】ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖ変換捕捉クロマトグラフィーからの分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。各溶出分画からの合計３０μｌは、ベータ−メルカプトエタノールで補足された、１０μｌの４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料添加緩衝液と混合された。８〜１６％の直線勾配ゲル上でタンパク質を電気泳動し、次にクーマシー染色した。ＰＲＴ−２０１の２つの主な形態が観察された：グリコシル化成熟形態（分画３５〜７０）、および非グリコシル化成熟形態（分画７５〜１６０）。レーン番号は分画番号に対応する。Ｍ、分子量マーカー。ＢＣ、カラム前（添加前）試料。
【図１３】プロ変換の濃度依存性を示す図である。２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵクローンから精製されたプロＰＲＴ−２０１形態（プロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ）は、濃度０．２、１．０、１．６、および１．８ｍｇ／ｍＬで変換に供された。変換反応は、プロタンパク質が総タンパク質の≦１％になるまでリアルタイムでＨＩＣ−ＨＰＬＣによって監視された。グラフは、変換中に生成された成熟（全長）ＰＲＴ−２０１（陰影なしのバー）およびＮ末端変異体（斜めの黒塗りバー）の相対量を示す。
【図１４】合成の（すなわち、組換え）ブタ膵臓エラスターゼＩ型のＤＮＡ配列を示す図である。組換え配列は７５０塩基対のコード領域を含む。下線を引いたＳａｃＩＩおよびＸｂａ１制限部位は、クローニングを促進するために組み込まれた。終止コドンを囲む。プロペプチド配列は太字体である。
【図１５】合成の（すなわち、組換え）ブタＩ型膵臓エラスターゼのアミノ酸配列を示す図である。プロペプチド領域は太字体であり、トリプシン切断部位は囲まれている。１０個のアミノ酸のプロペプチドの切断後、得られる成熟酵素は２４０個のアミノ酸である。
【図１６】ブタＩ型膵臓エラスターゼのＰＶ−１ベクターへのクローニングスキームである。ブタＩ型膵臓エラスターゼプロタンパク質クローニング領域の合成後、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  ｐＵＣベクターにクローニングした。ブタＩ型膵臓エラスターゼのコード配列の増幅に加えて、ＰＣＲを用いて、ＰＶ−１ベクターにクローニングするためのＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩ制限部位を組み込んだ。ＰＣＲ産物を消化し、ゲル精製し、ならびにＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩで消化されたＰＶ−１ベクターとライゲートし、このようにして、トリプシン活性化ブタＩ型膵臓エラスターゼプロタンパク質をコードするｐＰＲＯＴ１０１−２４−Ｖ発現ベクターをもたらした。
【図１７】メタノール誘導中の自己活性化ｐＰＲＯＴ１０１−４２−Ｖおよびトリプシン活性化ｐＰＲＯＴ１０１−２４−ＶクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現解析を示す図である。誘導１日後の振とうフラスコ上清は、８〜１６％勾配ゲル上で解析され、クーマシー染色で染色された。レーン１〜１０は、ｐＰＲＯＴ１０１−４２−Ｖで形質転換された１０種のクローン由来の上清を含む。レーン１１〜１２は、ｐＰＲＯＴ１０１−２４−Ｖで形質転換された２種のクローン由来の上清を含む。Ｍ、分子量マーカー。
【図１８】メタノール誘導中の自己活性化ｐＰＲＯＴ１０１−４９−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−ＶクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現解析を示す図である。誘導の１および２日後の振とうフラスコ上清は、８〜１６％勾配ゲル上で解析され、クーマシー染色された。レーン１〜２は、それぞれ誘導の１および２日後のｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖクローン由来の上清を含む。レーン３〜４は、それぞれ誘導の１および２日後のｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖクローン由来の上清を含む。Ｍ、分子量マーカー。
【図１９】ＳＬＡＰエラスターゼ活性によって決定された、小スケール変換アッセイによるｐＰＲＯＴ１０１−４９−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖタンパク質の経時的活性化を示す図である。誤差バーは平均の±ＳＤを表す（ｎ＝４）。
【図２０】小スケール変換アッセイ前後のｐＰＲＯＴ１０１−４９−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖ上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。電気泳動前に、試料をクエン酸、還元剤ＴＣＥＰ、およびＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ）と混合した。試料を７０℃で１０分間加熱した。レーン１〜２：それぞれｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖの変換前後のアッセイ上清；レーン３〜４：それぞれｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖの変換前後のアッセイ上清。Ｍ、分子量マーカー。
【図２１】ＴｒｙｐＺｅａｎ標準曲線である。
【図２２】５．９節に記載された医療デバイスの一実施形態の側面、部分的な断面図である。
【図２３】医療デバイスのアクチュエータの動作を説明する、図２２に類似した図である。
【図２４】図２２におけるレーン２−２の平面の端面図である。
【図２５】図２２におけるレーン３−３の平面の端面図である。
【図２６】流体送達導管を通じたルアーハブからリザーバ、次に組織貫通器に伸長した、図２２の医療デバイスの流体経路の図である。
【図２７】制約された構造のアクチュエータを示す、本発明の医療デバイスの第２の実施態様の側面、部分的な断面図である。
【図２８】図２７に類似した図であるが、制約されていない構造のアクチュエータを示す。
【図２９】図２７におけるライン３’−３’に沿った組立体の端斜視図である。
【図３０】組織貫通器を示す図２９のライン４’−４’に沿った組立体の端斜視図である。
【図３１】デバイスの近接端部の詳細を示す側面図であり、図２７および２８の右に示される。
【図３２】制約された位置にある図２２の医療デバイスの外観の部分図である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、生物学的に活性な成熟エラスターゼタンパク質の組換えによる発現および作
製の方法を目的とする。本発明は、プロエラスターゼタンパク質およびプレプロエラスタ
ーゼタンパク質をコードする核酸を含む、好ましい宿主細胞であるメタノール資化酵母を
含む宿主細胞を培養することにより、組換えエラスターゼタンパク質を作製する新規の効
率的な方法を提供する。生体導管（動脈または静脈を含む）疾患を治療および予防する医
薬組成物を製造するための組換えタンパク質の使用もまた提供される。
【００８０】
ある態様において、本発明は、組換え自己活性化プロエラスターゼタンパク質、ならび
に関連する核酸、宿主細胞、および製造方法を目的とする。このような自己活性化プロエ
ラスターゼタンパク質は、成熟エラスターゼタンパク質の第１の残基に対してすぐのＮ末
端側にあるエラスターゼ認識部位を含有するように改変される。後出の第６節において説
明される条件などの指定された培養条件下においては、活性化が所望されるまで、自己活
性化を抑制することができる。また、細胞培養物からプロエラスターゼが除去されるまで
、自己活性化を抑制することもできる。
【００８１】
本発明は、医薬グレードのエラスターゼタンパク質を作製するのに効率的な発現工程お
よび精製工程を提供する。本発明はまた、本発明のエラスターゼタンパク質を用いて、生
体導管疾患を治療または予防する方法も提供する。
【００８２】
本明細書の第５節における説明は、第８節の実施形態に適用可能である。したがって、
例えば、本発明のエラスターゼタンパク質に対する言及は、実施形態１〜３９および６８
〜６９のいずれか１つによるエラスターゼタンパク質、または実施形態８９〜２２４、２
６１〜２７６、および３４７〜３７３のいずれか１つに記載の方法により得られるかもし
くは得ることができるエラスターゼタンパク質に対する言及を含むがこれに限定されない
。同様に、本発明の核酸に対する言及は、とりわけ、実施形態４０〜６７のいずれか１つ
による核酸を指し；本発明のベクターに対する言及は、とりわけ、実施形態７０〜７２の
いずれか１つによるベクターを指し；本発明の細胞に対する言及は、とりわけ、実施形態
７３〜８７のいずれか１つによる細胞を指し；本発明の細胞培養物上清に対する言及は、
とりわけ、実施形態８８による細胞培養物上清を指し；医薬組成物、エラスターゼ製剤、
および単位用量などの組成物に対する言及は、例えば、実施形態２７７〜３１４、３４６
、３８６、および４１５〜４２０で例示される組成物、または実施形態２６１〜２７６お
よび３７４〜３８５のいずれか１つの方法により得られるかもしくは得ることができる組
成物を含み；治療法に対する言及はまた、実施形態３８７〜４１４のいずれか１つによる
治療法に値する言及も含み；キットに対する言及は、とりわけ、第８節の実施形態４２１
〜４２５に記載のキットに対する言及を含む。
【００８３】
５．１  エラスターゼタンパク質
本発明は、とりわけ、生物学的に活性な成熟エラスターゼタンパク質の組換えによる発
現および作製の方法を目的とする。エラスターゼタンパク質は一般に、数ある配列の中で
も、シグナルペプチド、活性化ペプチド、および生物学的活性を有する成熟部分を含有す
るプレプロタンパク質として発現する。適切な成熟エラスターゼタンパク質の配列は、後
出の第５．１．１節に記載される。適切な活性化ペプチドの配列は、後出の第５．１．２
節に記載される。適切なシグナル配列は、後出の第５．１．３節に記載される。
【００８４】
したがって、ある態様において、本発明のエラスターゼタンパク質は、プレプロエラス
ターゼタンパク質である。分泌時における該プレプロタンパク質からのシグナル配列の除
去は一般に、活性化ペプチドおよび成熟タンパク質を含有する不活性なプロタンパク質を
もたらす。本明細書において、「活性化配列」および「活性化ペプチド」という表現は互
換的に用いられる。したがって、他の態様において、本発明のエラスターゼタンパク質は
、成熟エラスターゼタンパク質に作動的に連結された活性化ペプチドを含むプロエラスタ
ーゼタンパク質である。例示的な実施形態において、野生型ヒトＩ型膵臓エラスターゼの
活性化ペプチドまたは活性化配列は、ヒトＩ型エラスターゼタンパク質の最初の１０のＮ
末端アミノ酸（配列番号２２）を含む。ある実施形態において、活性化ペプチドは、配列
番号８０のペプチドである。本発明の実施において有用な活性化ペプチドまたは活性化配
列はまた、配列番号２３、７２、および７３も含むがこれらに限定されない。本発明の実
施において有用なさらに他の活性化配列は、配列番号６４〜６９および９８〜１０３のＮ
末端残基１〜１０から得ることができる。
【００８５】
プロエラスターゼ配列からの活性化ペプチドの除去により、成熟エラスターゼタンパク
質が生成される。活性化ペプチドがプロエラスターゼ配列から除去され／成熟エラスター
ゼ配列から分離されて成熟エラスターゼタンパク質が生成されるステップを、本明細書で
は活性化ステップと称する。したがって、さらに他の態様において、本発明のエラスター
ゼタンパク質は、成熟エラスターゼタンパク質である。
【００８６】
切断結合を挟む活性化ペプチドのＣ末端（すなわち、カルボキシ末端）および成熟タン
パク質のＮ末端（すなわち、アミノ末端）を含むアミノ酸残基を図２に示し、また、本明
細書では以下の通りに識別する。まず、活性化ペプチドのＣ末端に位置する残基をＰＸ、
・・・Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、および  Ｐ１と表示する（活性化ペプチドのＣ末端残基
をＰ１とする）。成熟タンパク質のＮ末端に位置する残基をＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、・
・・ＰＸ’と表示する（成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸残基をＰ１’とする）。タンパ
ク質分解によって切断される切断可能な結合（図２では、「切断結合」と称する）は、活
性化ペプチドのＰ１残基と、成熟タンパク質のＰ１’残基との間におけるペプチド結合で
ある。
【００８７】
本明細書では、活性化ペプチドＣ末端の４つのアミノ酸（残基Ｐ４〜Ｐ１）から成熟タ
ンパク質Ｎ末端の最初の４つのアミノ酸（残基Ｐ１’〜Ｐ４’）の範囲にわたる領域を、
「切断部位」と称する。
【００８８】
本明細書では、活性化ペプチドＣ末端の約５つのアミノ酸（すなわち、残基Ｐ５〜Ｐ１
）から成熟タンパク質Ｎ末端の最初の約３つのアミノ酸（すなわち、残基Ｐ１’〜Ｐ３’
）の範囲にわたる領域を、「切断ドメイン」と称する。本発明の文脈において用いうる切
断ドメインの例は、配列番号４２、４３、４８、４９、５２、５３、５４、または５５を
含むがこれらに限定されない。本発明において用いうる他の切断ドメインは、コンセンサ
ス切断ドメイン配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３  Ｘａａ４  Ｘａａ５  Ｘａａ６  Ｘ
ａａ７  Ｘａａ８により記載される配列のいずれかである［ここで、Ｘａａ１＝Ｐ５、Ｘ
ａａ２＝Ｐ４、Ｘａａ３＝Ｐ３、Ｘａａ４＝Ｐ２、Ｘａａ５＝Ｐ１、Ｘａａ６＝Ｐ１’、
Ｘａａ７＝Ｐ２’、およびＸａａ８＝Ｐ３’であり、また、
・Ｘａａ１は、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、グリシン、アスパラギン、リシン
、もしくはアラニン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ２は、トレオニン、アラニン、プロリン、もしくはヒスチジン、または場合に
よってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ３は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、リシン、アスパラギ
ン、もしくはバリン、または場合によってこれらの類似体であるが、グリシンもしくはプ
ロリンではないことが好ましく；
・Ｘａａ４は、プロリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、バリン、も
しくはトレオニン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ５は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリンであるが
、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、アルギニン、グルタミン酸、もし
くはリシンではないか、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ６は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリン、または
場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ７は、グリシン、アラニン、もしくはバリン、または場合によってこれらの類
似体であり；
・Ｘａａ８は、バリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプト
ファン、または場合によってこれらの類似体である］。
【００８９】
本明細書では、活性化ペプチドの残基Ｐ３、Ｐ２、およびＰ１の範囲にわたる３アミノ
酸の領域を、「エラスターゼ認識部位」と称する。本発明の文脈において用いうる認識部
位の例は、配列番号１４〜１６および１８〜２１を含むがこれらに限定されない。本発明
により意図される他の認識部位は、配列番号１１、１２、１３、または９３によるコンセ
ンサス認識部位により記載される任意の認識部位を含む。配列番号１１によるコンセンサ
スエラスターゼ認識配列１は、ペプチド配列Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｘａａ３により表され
る［ここで、Ｘａａ１＝Ｐ３、Ｘａａ２＝Ｐ２、Ｘａａ３＝Ｐ１であり、また、
・Ｘａａ１は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、リシン、アスパラギ
ン、もしくはバリン、または場合によってこれらの類似体であるが、グリシンもしくはプ
ロリンではないことが好ましく；
・Ｘａａ２は、プロリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、バリン、も
しくはトレオニン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ３は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリン、または
場合によってこれらの類似体であるが、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、プロリ
ン、アルギニン、グルタミン酸、もしくはリシンではないことが好ましい］。
【００９０】
配列番号１２によるコンセンサスエラスターゼ認識配列２は、配列Ｘａａ１  Ｐｒｏ  
Ｘａａ２により表される［ここで、
・Ｘａａ１は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、リシン、もしくはバ
リン、または場合によってこれらの類似体であるが、グリシンもしくはプロリンではない
ことが好ましく；
・Ｐｒｏは、プロリン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ２は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリン、または
場合によってこれらの類似体であるが、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、プロリ
ン、アルギニン、グルタミン酸、もしくはリシンではないことが好ましい］。
【００９１】
配列番号１３によるコンセンサスエラスターゼ認識配列３は、ペプチド配列Ｘａａ１ 
Ｘａａ２  Ｘａａ３により表される［ここで、Ｘａａ１＝Ｐ３、Ｘａａ２＝Ｐ２、Ｘａａ
３＝Ｐ１であり、また、Ｘａａ１は、アスパラギンもしくはアラニン、または場合によっ
てこれらの類似体であり；Ｘａａ２は、プロリンもしくはアラニン、または場合によって
これらの類似体であり；Ｘａａ３は、アラニン、ロイシン、もしくはバリン、または場合
によってこれらの類似体である］。
【００９２】
配列番号９３によるコンセンサスエラスターゼ認識配列４は、配列Ｘａａ１  Ｐｒｏ  
Ｘａａ２により表される［ここで、
・Ｘａａ１は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、リシン、アスパラギ
ン、もしくはバリン、または場合によってこれらの類似体であるが、グリシンもしくはプ
ロリンではないことが好ましく；
・Ｐｒｏは、プロリン、または場合によってこれらの類似体であり；
・Ｘａａ２は、アラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、もしくはセリン、または
場合によってこれらの類似体であるが、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、プロリ
ン、アルギニン、グルタミン酸、もしくはリシンではないことが好ましい］。
【００９３】
「切断配列」、「切断ドメイン」、「活性化配列」、「エラスターゼ認識配列」などと
しての配列への言及は、言及を容易にするためだけのものであり、該配列の任意の機能、
または該配列が認識もしくはプロセシングされる機構の示唆を意図するものではない。
【００９４】
本発明のタンパク質は、一般にアミノ酸からなり、加えて、１つまたは複数の（例えば
、最大２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１２、または１５の）
アミノ酸類似体を含みうる。一般に、本明細書で用いられるアミノ酸とは、天然のＬ型立
体異性体を指す。アミノ酸類似体とは、Ｄ型立体異性体、化学修飾されたアミノ酸、また
は他の非天然アミノ酸を指す。例えば、非天然アミノ酸は、アゼチジンカルボン酸、２−
アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−ア
ミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノ
イソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三ブチルグリシン、２，４−
ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロ
ピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリ
シン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イ
ソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メ
チルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフタアラニン、
ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコール酸、およびチオ
プロリンを含むがこれらに限定されない。化学修飾されたアミノ酸は、可逆的もしくは不
可逆的な形で化学的に遮断され、かつ／またはその側基、α炭素原子、末端アミノ基、も
しくは末端カルボン酸基の１つもしくは複数において修飾されたアミノ酸を含む。化学修
飾は、化学的部分の付加、新たな結合の創出、および化学的部分の除去を含む。化学修飾
されたアミノ酸の例は、例えば、硫酸メチオニン、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキ
シメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、および
Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホンを含む。アミノ酸側基における修飾は、
リシンのε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリシンのＮ−アルキ
ル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミ
ンまたはアスパラギンの脱アミド化を含む。末端アミノ基の修飾は、デス−アミノ修飾、
Ｎ−低級アルキル修飾、Ｎ−ジ−低級アルキル修飾、およびＮ−アシル修飾を含む。末端
カルボキシル基の修飾は、アミド修飾、低級アルキルアミド修飾、ジアルキルアミド修飾
、および低級アルキルエステル修飾を含む。低級アルキルとはＣ１〜Ｃ４のアルキルであ
る。さらに、当技術分野におけるタンパク質化学者に知られる保護基により、１つまたは
複数の側基または末端基を保護することもできる。アミノ酸のα炭素は、モノメチル化さ
れる場合もあり、ジメチル化される場合もある。
【００９５】
本発明のタンパク質は、リン酸化もしくはグリコシル化による修飾、または例えば、脂
質もしくは別のタンパク質（例えば、標的化または安定化のための）などへのコンジュゲ
ーションによる誘導体化など、修飾または誘導体化することができる。
【００９６】
本発明は、多くの場合、「単離」または「精製」されたエラスターゼタンパク質に関す
る。単離されたエラスターゼタンパク質とは、その細胞環境から取り出されたタンパク質
である。精製されたエラスターゼタンパク質は、該エラスターゼタンパク質が由来する細
胞もしくは組織の供給源に由来する細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含ま
ないか、または化学合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含ま
ない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、エラスターゼタンパク質がそこか
ら組換えにより作製される細胞の細胞成分から該タンパク質が分離される、該タンパク質
の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まないエラスターゼタンパク質は、
約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量による）未満の異種タンパク質（本明
細書では、「夾雑タンパク質」とも称する）を有するエラスターゼタンパク質の調製物を
含む。それが培地内に分泌される工程によりエラスターゼタンパク質が作製される場合、
それはまた、培地も実質的に含まないこと、すわなち、培地がエラスターゼタンパク質の
調製物容量の約２０％、１０％、または５％未満を占めることも好ましい。
【００９７】
加えて、ある実施形態において、単離または精製されたエラスターゼは、細胞ＤＮＡも
含まないか、またはこれも実質的に含まない。具体的な実施形態において、宿主細胞のゲ
ノムＤＮＡは、単離もしくは精製されたエラスターゼタンパク質の調製物中、または単離
もしくは精製されたエラスターゼタンパク質を含む組成物中において、エラスターゼタン
パク質ミリグラム当たり１０ピコグラム未満、５ピコグラム未満、３ピコグラム未満、２
ピコグラム未満、または１ピコグラム未満のＤＮＡ量で存在する。一実施形態において、
宿主細胞のＤＮＡは、メタノール資化酵母のＤＮＡである。
【００９８】
有用なエラスターゼタンパク質の配列を表１に記載する。具体的な実施形態において、
本発明は、（ｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化配列が（ｉｉ）Ｉ型エラスターゼ活
性を有するタンパク質のアミノ酸配列に作動的に連結されているプロエラスターゼタンパ
ク質（配列番号６〜９、６４〜６９、８８〜９１、および９８〜１０３のいずれか１つに
よるタンパク質を含むがこれに限定されない）を提供する。ヒトＩ型エラスターゼについ
ては、複数の多型が知られている。本発明のプロエラスターゼタンパク質の配列では、表
２に記載された多型の組合せを含むがこれらに限定されない任意の多型の組合せが意図さ
れている。場合によって、タンパク質は、前記活性化配列に作動的に連結されたシグナル
配列をさらに含む。ある具体的な実施形態において、シグナル配列は、配列番号３４のア
ミノ酸配列により例示される酵母α因子シグナルペプチドなど、メタノール資化酵母にお
いて作動的である。シグナルペプチドを含有する代替的な配列は、配列番号５０および９
６（シグナルペプチド、エラスターゼ以外のプロペプチド、およびスペーサー配列を含有
する）ならびに配列番号５１および９７（シグナルペプチドおよびエラスターゼ以外のプ
ロペプチドを含有する）において例示される。他の具体的な実施形態において、シグナル
配列は、ブタエラスターゼのシグナル配列など、哺乳動物の分泌シグナル配列である。エ
ラスターゼ認識配列は、Ｉ型エラスターゼ認識配列であることが好ましく、ヒトＩ型エラ
スターゼ認識配列であることが最も好ましい。
【００９９】
本発明は、本発明のエラスターゼタンパク質の変異体をさらに対象とする。変異体は、
推定される１つまたは複数の非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を含有しうる。変
異体は、天然の成熟エラスターゼと比べて１５カ所以下、１２カ所以下、１０カ所以下、
９カ所以下、８カ所以下、７カ所以下、６カ所以下、５カ所以下、４カ所以下、３カ所以
下、２カ所以下、または１カ所以下の保存的アミノ酸置換、および／あるいは天然の成熟
エラスターゼと比べて５カ所以下、４カ所以下、３カ所以下、もしくは２カ所以下の非保
存的アミノ酸置換、または１カ所以下の非保存的アミノ酸置換を含むことが好ましい。
【０１００】
具体的な実施形態において、変異体は、配列番号１もしくは配列番号８４の成熟エラス
ターゼ、または配列番号６〜９、６４〜６９、８８〜９１、および９８〜１０３のプロエ
ラスターゼタンパク質など、本発明の成熟エラスターゼ、プロエラスターゼ、またはプレ
プロエラスターゼと比べて、１０カ所以下、または好ましくは５カ所以下の保存的アミノ
酸置換を有する。配列番号１および８４のアミノ酸配列は、位置４４（ＷまたはＲ）、５
９（ＭまたはＶ）、２２０（ＶまたはＬ）、および２４３（ＱまたはＲ）（位置はプレプ
ロタンパク質を指す）において、成熟エラスターゼ配列内の潜在的な多型に対応する１つ
または複数の位置を含有する。したがって、本発明は、配列番号８４において同定される
４つの多型の任意の組合せを有する成熟エラスターゼタンパク質を対象とする。このよう
な組合せの各々は、前出の表３に概括されている。配列番号８８〜９１および９８〜１０
３の配列は、位置１０（ＱまたはＨ）において、プロペプチド配列内の潜在的な多型をさ
らに含有する。したがって、本発明は、配列番号８８〜９１および９８〜１０３において
同定される５つの多型の任意の組合せを含有するプレプロエラスターゼ配列およびプロエ
ラスターゼ配列を対象とする。このような組合せの各々は、前出の表２に概括されている
。
【０１０１】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によ
り置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術
分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例
えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、ア
スパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を
有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ
ニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖を有するアミノ酸（例
えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香環側鎖を有するアミノ酸（例え
ば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む。
【０１０２】
本明細書で説明する通り、本発明の変異体エラスターゼタンパク質は、アミノ酸による
アミノ酸置換ほか、アミノ酸類似体によるアミノ酸置換も含みうる。
【０１０３】
具体的な実施形態において、本発明のタンパク質は、成熟ヒトＩ型エラスターゼの変異
体、例えば、配列番号６〜９、６４〜６９、８８〜９１、および９８〜１０３のエラスタ
ーゼプロタンパク質などであるがこれらに限定されない、表１に列挙されるエラスターゼ
プロタンパク質または成熟エラスターゼタンパク質と少なくとも約７５％、８５％、９０
％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の変異体を含むかまた
はこれから本質的になり、配列番号１、４、５、８４、または８７の成熟エラスターゼタ
ンパク質を生成するように発現する場合にエラスターゼ活性を保持する。
【０１０４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の百分率による同一性を決定するためには、最適
比較を目的として配列を整列する（例えば、第１のアミノ酸配列または核酸配列中にギャ
ップを導入して、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントを得る）。次
いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置において、アミノ酸残基またはヌク
レオチドを比較する。第１の配列中における位置が、第２の配列中における対応する位置
と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、該分子はその位置
において同一である。２つの配列間における百分率による同一性は、該配列により共有さ
れる同一な位置の数の関数である（％同一性＝（同一な位置の数／重複する位置の総数）
×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。他の実施形態において
、２つの配列は、その長い方の配列の長さの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％
、８％、９％、または１０％以下だけ長さが異なる。
【０１０５】
２つの配列の間における百分率による同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達
成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的なアルゴリズムの好ましく非
限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３〜５８７７に記載の通りに改変されたＫａ
ｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、８７：２２６４〜２２６８に記載のアルゴリズムである。このようなアルゴリ
ズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜
４１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれてい
る。ＢＬＡＳＴによるヌクレオチドの検索は、スコア＝１００、ワード長＝１２のＮＢＬ
ＡＳＴプログラムにより実行され、これにより、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチ
ド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴによるタンパク質の検索は、スコア＝５０、ワー
ド長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムにより実行され、これにより、本発明のタンパク質分
子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップを伴うアライ
メントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２で説明される通りに、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ
を用いることができる。代替的に、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて反復検索を実行し、これ
により、分子間における遠隔の類縁性を検出することもできる（同上）。ＢＬＡＳＴプロ
グラム、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラム、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを
用いる場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトの
パラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖを参照されたい。
【０１０６】
配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましく非限定的な別の例は、Ｍｙｅｒ
ｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）に記載のアルゴリズムである。このよ
うなアルゴリズムはＣＧＣ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩ
ＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するのに
ＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長ペナルテ
ィー１２、およびギャップペナルティー４を用いることができる。当技術分野では、配列
解析のためのさらなるアルゴリズムが知られており、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔ
ｔｉ、１９９４、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３〜５において説明さ
れるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９
８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４〜８において説明される
ＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡにおいては、ｋｔｕｐが、検索の感度および速度を設定す
る制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合は、整列された残基の対を見比べることに
よって、比較される２つの配列内における類似の領域を見出し、ｋｔｕｐ＝１の場合は、
整列された単一のアミノ酸を検討する。タンパク質配列の場合はｋｔｕｐを２または１に
設定することもでき、ＤＮＡ配列の場合は１〜６に設定することもできる。ｋｔｕｐが指
定されない場合のデフォルトは、タンパク質の場合が２であり、ＤＮＡの場合が６である
。ＦＡＳＴＡパラメータのさらなる説明については、その内容が参照により本明細書に組
み込まれるｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｅｓ／ｍａｎ／ｍ
ａｎ／ｆａｓｔａ．Ｉ．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔ２を参照されたい。
【０１０７】
２つの配列の間における百分率による同一性は、ギャップを許容する場合であれ、許容
しない場合であれ、上記で説明した技法と同様の技法を用いて決定することができる。百
分率による同一性の計算においては、正確なマッチをカウントすることが典型的である。
【０１０８】
本発明のエラスターゼタンパク質は、グリコシル化（例えば、Ｎ−結合型グリコシル化
またはＯ−結合型グリコシル化）、ミリスチル化、パルミチル化、アセチル化、およびリ
ン酸化（例えば、セリン／トレオニンまたはチロシン）を含むがこれらに限定されない翻
訳後修飾を示しうる。一実施形態において、本発明のエラスターゼタンパク質は、内因的
に発現するエラスターゼタンパク質と比べて、Ｏ−結合型グリコシル化および／またはＮ
−結合型グリコシル化のレベルが低下する。別の実施形態において、本発明のエラスター
ゼタンパク質は、Ｏ−結合型グリコシル化またはＮ−結合型グリコシル化を示さない。
【０１０９】
５．１．１  成熟エラスターゼ配列
本発明の成熟エラスターゼ配列は、哺乳動物エラスターゼ配列であることが好ましく、
ヒトエラスターゼ配列であることが最も好ましい。他の実施形態において、成熟哺乳動物
エラスターゼ配列は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、またはウマなど、他の哺乳動物に由
来する。
【０１１０】
本発明の方法および組成物において、用いられる成熟エラスターゼ配列は、好ましくは
アラニンなど、小型の疎水性残基のカルボキシ側において、優先的に疎水性タンパク質配
列を切断する、Ｉ型膵臓エラスターゼの配列であることが好ましい。Ｉ型膵臓エラスター
ゼの例は、皮膚において発現するヒトエラスターゼＩ酵素（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０
０１９６２）、および膵臓において発現するブタ膵臓エラスターゼＩ酵素（ＮＣＢＩ受託
番号：ＣＡＡ２７６７０）を含む。配列番号１および配列番号８４は、成熟ヒトＩ型エラ
スターゼ配列の例である。
【０１１１】
代替的に、好ましくは中型〜大型の疎水性アミノ酸残基のカルボキシ側において疎水性
タンパク質配列を切断しうるＩＩ型エラスターゼも用いることができる。ＩＩ型エラスタ
ーゼの例は、いずれも膵臓において発現する、ヒトエラスターゼＩＩＡ酵素（ＮＣＢＩ受
託番号：ＮＰ２５４２７５）、およびブタエラスターゼＩＩ酵素（ＮＣＢＩ受託番号：Ａ
２６８２３）を含む。
【０１１２】
本発明の成熟エラスターゼタンパク質の変異体もまた対象となる。変異体は、本発明の
成熟エラスターゼタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはこれに由来す
るアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、エラスターゼの生物学的活性を示す。本発明の
成熟エラスターゼタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、少なくとも１５０、１
６０、１７５、１８０、１８５、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２３１、２
３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、または２３９の長さのアミノ
酸である。さらに、組換え法により、タンパク質の他の領域が欠失する生物学的に活性な
他の部分を調製し、本発明の成熟エラスターゼタンパク質の天然形態の１つまたは複数の
機能的活性について評価することもできる。
【０１１３】
加えて、４つのヒトＩ型エラスターゼ多型の任意の組合せを含む成熟エラスターゼタン
パク質を、配列番号８４によって表す。可能な組合せは、前出の表３に記載されている。
【０１１４】
５．１．２  プロエラスターゼ活性化配列
エラスターゼ活性化配列とは、それをプロエラスターゼタンパク質から除去する結果と
して、生物学的に活性な成熟エラスターゼタンパク質がもたらさられる任意の配列である
。
【０１１５】
活性化配列は一般に、プロタンパク質が切断されて、生物学的に活性な成熟タンパク質
が生成される位置に隣接するプロテアーゼ認識部位を含有する。活性化配列を改変してプ
ロテアーゼ認識部位またはエラスターゼ認識部位を付加することもでき、これを改変して
既存のプロテアーゼ認識部位を別のプロテアーゼ認識部位により置き換えることもできる
。本発明の実施において有用な活性化ペプチドまたは活性化配列は、配列番号２３、７２
、および７３を含むがこれらに限定されない。本発明の実施において有用なさらに他の活
性化配列は、配列番号６４〜６８のＮ末端残基１〜１０から得ることができる。好ましい
態様では、Ｉ型エラスターゼまたはＩＩ型エラスターゼに対する認識配列を含有するよう
に、プロエラスターゼ活性化配列を改変する。エラスターゼ認識配列は、それが作動的に
連結される成熟エラスターゼにより認識されることが最も好ましい。したがって、ＩＩ型
エラスターゼを目的とする実施形態において、認識配列は、ＩＩ型エラスターゼ認識配列
であることが最も好ましい。逆に、Ｉ型エラスターゼを目的とする実施形態において、認
識配列は、Ｉ型エラスターゼ認識配列であることが最も好ましい。好ましい実施形態にお
いて、認識配列は、ヒトＩ型エラスターゼ認識配列である。例示的なＩ型認識配列は、配
列番号１４〜１６および１８〜２１のアミノ酸配列を含む。本発明により意図される他の
認識部位は、配列番号１１、１２、または１３のコンセンサス認識部位により記載される
任意の認識部位を含む。
【０１１６】
５．１．３  シグナル配列
本発明のプロエラスターゼタンパク質は、それが発現する宿主細胞の培地内へのプロエ
ラスターゼタンパク質の分泌を増大させるシグナル配列をさらに含有しうる。
【０１１７】
特に、哺乳動物の宿主細胞における発現には、エラスターゼタンパク質の天然のシグナ
ル配列を用いることができる。他の実施形態では、本発明のエラスターゼタンパク質の天
然のシグナル配列を除去し、ブタＩ型エラスターゼのシグナル配列、ヒトＩ型エラスター
ゼのシグナル配列、または酵母α因子のシグナル配列など、別のタンパク質に由来するシ
グナル配列で置き換えることができる。ある具体的な実施形態において、酵母α因子シグ
ナルペプチドは、各々がそれぞれ、配列番号５０および９６または配列番号５１および９
７のアミノ酸配列により例示される、（１）酵母α因子のプロペプチド、または（２）酵
母α因子のプロペプチドおよびスペーサー配列をさらに含みうる。代替的に、バキュロウ
イルスのエンベロープタンパク質のｇｐ６７分泌配列を、異種シグナル配列として用いる
こともできる（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２
））。真核生物の異種シグナル配列の他の例は、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスフ
ァターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の分泌配
列を含む。さらに別の例において、有用な原核生物の異種シグナル配列は、ｐｈｏＡ分泌
シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を含む。
【０１１８】
５．２  エラスターゼの核酸
本発明の一態様は、本発明の組換えエラスターゼタンパク質をコードする組換え核酸分
子に関連する。本明細書で用いられる「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃ
ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオ
チド類似体を用いて作製されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことを意図する。核酸
分子は、一本鎖ＤＮＡの場合もあり、二本鎖ＤＮＡの場合もあるが、二本鎖ＤＮＡである
ことが好ましい。
【０１１９】
本発明は、本発明のエラスターゼタンパク質をコードする核酸を目的とする。したがっ
て、ある実施形態において、本発明は、（ｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化配列が
（ｉｉ）Ｉ型エラスターゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列に作動的に連結されて
いるプロエラスターゼタンパク質（配列番号６〜９、６４〜６９、８８〜９１、および９
８〜１０３のいずれか１つのタンパク質を含むがこれらに限定されない）をコードするヌ
クレオチド配列を含む核酸分子を提供する。他の実施形態において、本発明はまた、（ｉ
）メタノール資化酵母内で作動的なシグナル配列が（ｉｉ）プロテアーゼの認識部位を含
む活性化配列（配列番号２３、７２、および７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むが
これらに限定されない）に作動的に連結されており、さらに（ｉｉ）が（ｉｉｉ）成熟ヒ
トＩ型エラスターゼのアミノ酸配列に作動的に連結されているタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列を含む核酸分子も提供する。
【０１２０】
本発明の核酸は、精製が可能である。ｃＤＮＡ分子などの「精製」された核酸分子は、
組換え法により作製される場合に他の細胞物質または培地を実質的に含まないことも可能
であり、化学合成される場合に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないこと
も可能である。
【０１２１】
核酸分子がｃＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ分子である場合において
、このような分子は、ポリＡ「テール」を含む場合もあり、代替的に、このような３’側
テールを欠く場合もある。
【０１２２】
本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲ増幅法による鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、
またはゲノムＤＮＡと、適切なオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて増幅することが
できる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクター内でクローニングし、ＤＮＡ
配列解析により特徴づけすることができる。さらに、標準的な合成法により、例えば、自
動式ＤＮＡ合成器を用いて、本発明の核酸分子の全部または一部に対応するオリゴヌクレ
オチドを調製することができる。
【０１２３】
５．３  組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の核酸のいずれかを含むベクター、または本発明の核酸を発現するように改変さ
れた宿主細胞がさらに提供される。具体的な実施形態において、ベクターは、本発明の核
酸によりコードされるタンパク質の発現を調節するヌクレオチド配列を含む。例えば、本
発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、メタノール誘導性プロモーターに作
動的に連結することができる。
【０１２４】
本発明の核酸およびベクターを含む宿主細胞もまた提供される。ある実施形態では、ベ
クターまたは核酸が宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、他の実施形態では、ベクターまたは
核酸が染色体外にある。好ましい宿主細胞は、メタノール資化酵母細胞である。
【０１２５】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸の移送が
可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、その中
に付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションしうる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。
別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでは、付加的なＤＮＡセグメントを
ウイルスゲノム内にライゲーションすることができる。あるベクターは、それらが導入さ
れる宿主細胞内における自律的複製が可能である（例えば、細菌による複製起点を有する
細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物
の非エピソームベクター）は、宿主細胞内への導入時において宿主細胞のゲノム内に組み
込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクター、発現ベクタ
ーは、それらが作動的に連結されるコード配列の発現の方向付けが可能である。一般に、
組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態であるこ
とが多い。
【０１２６】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内における発現に適する形態にある本発明の
成熟エラスターゼ、プロエラスターゼ、またはプレプロエラスターゼをコードするヌクレ
オチド配列を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づい
て選択され、発現する核酸配列に作動的に連結される、１つまたは複数の調節配列を含む
ことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動的に連結される」とは、対象のヌ
クレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能とする形で、（１つまたは複数の）
調節配列に連結される（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写／翻訳系において、また
は宿主細胞内にベクターを導入する場合の宿主細胞において）ことを意味すると意図する
。「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例
えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば
、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓ
ａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０）において説明されている。調節配
列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向付ける配列と
、特定の宿主細胞だけにおいてヌクレオチド配列の発現を方向付ける配列（例えば、組織
特異的な調節配列）とを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、
エラスターゼタンパク質の所望される発現レベルなどの因子に依存する場合があることを
、当業者は理解するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入し、これにより
、本明細書で説明される核酸によりコードされるエラスターゼタンパク質を作製すること
ができる。
【０１２７】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明のエラスターゼタンパク質の原核細胞（例えば
、大腸菌）における発現にも、真核細胞（例えば、昆虫細胞（バキュロウイルスによる発
現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳動物細胞）における発現にも用いることが
できる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、前出においてさらに論じられている。代替
的に、例えば、Ｔ７プロモーターの調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用い、ｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏにおいて、組換え発現ベクターを転写および翻訳することもできる。
【０１２８】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ベクターが、融合タンパク質または非融合タン
パク質の発現を方向付ける構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含有する、大
腸菌において実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中でコードされるタンパ
ク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような
融合ベクターは、３つの目的：１）組換えエラスターゼタンパク質の発現を増大させる目
的と、２）組換えエラスターゼタンパク質の溶解性を増大させる目的と、３）アフィニテ
ィー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えエラスターゼタンパク質の
精製を補助する目的に資することが典型的である。融合発現ベクターにおいては、融合部
分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解性の切断ドメインを導入することで、
融合タンパク質の精製後における、融合部分からの組換えタンパク質の分離が可能となる
。したがって、融合部分およびタンパク質分解性の切断ドメインは、エラスターゼタンパ
ク質の組換え発現のための、プロテアーゼ認識部位を含む活性化配列として共に作用しう
る。このような融合タンパク質の活性化が可能な酵素、およびそれらと同種の認識配列は
、因子Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは
、標的の組換えタンパク質に、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ
）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８
、Ｇｅｎｅ、６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ
、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を含む。
【０１２９】
適切な誘導型非融合大腸菌発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８、
Ｇｅｎｅ、６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ−１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０
、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１８５：６０〜８９）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺
伝子の発現は、ハイブリッド体のｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリ
メラーゼの転写に依拠する。ｐＥＴ−１１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、共発現
するウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）を介する、Ｔ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融
合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プ
ロモーターの転写制御下において、Ｔ７  ｇｎ１遺伝子を保有するレジデントλプロファ
ージに由来する宿主菌株であるＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により
供給される。
【０１３０】
大腸菌内における組換えエラスターゼタンパク質の発現を最大化するための１つの戦略
は、タンパク質分解により組換えタンパク質を切断する能力が損なわれた宿主細菌におい
て、該タンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、１９９０、「Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ」、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ、１８５：１１９〜１２９）。別の戦略は、各アミノ酸に対応する個々のコド
ンが大腸菌において優先的に用いられるコドンであるように、発現ベクター内に挿入され
る核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃ
ｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は
、標準的なＤＮＡ合成法により実施することができる。
【０１３１】
別の実施形態において、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。出芽酵母またはメ
タノール資化酵母などの酵母内における発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１
（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋ
ｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２、Ｃｅｌｌ、３０：９３３〜９４３）
、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５４：１１３〜１２３）、ｐ
ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ
）、およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）
を含む。酵母内における発現の場合、メタノール誘導性プロモーターを用いることが好ま
しい。本明細書では、各アミノ酸に対応する個々のコドンがメタノール資化酵母において
優先的に用いられるコドンであるような、発現ベクター内に挿入される核酸の核酸配列の
変更もまた意図する。より具体的に述べると、配列番号３３または配列番号８１のコドン
を、メタノール資化酵母において優先的に用いられるコドンに置換することができる。
【０１３２】
代替的に、発現ベクターは、バキュロウイルスによる発現ベクターでもある。培養昆虫
細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）内におけるタンパク質の発現に用いられるバキュロウイルス
ベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、３
：２１５６〜２１６５）、およびｐＶＬ系列（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１
９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１〜３９）を含む。別の戦略は、各アミノ酸に対
応する個々のコドンが昆虫細胞において優先的に用いられるコドンであるように、発現ベ
クター内に挿入される核酸の核酸配列を変更することである。
【０１３３】
さらに別の実施形態において、エラスターゼタンパク質は、哺乳動物による発現ベクタ
ーを用いる哺乳動物細胞において発現する。哺乳動物による発現ベクターの例は、ｐＣＤ
Ｍ８（Ｓｅｅｄ、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２９（６１４２）：８４０〜２）、および
ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：１８７〜１９５）を
含む。哺乳動物細胞内で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルスの調節エ
レメントによりもたらされることが多い。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、
ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０に由来
する。原核細胞および真核細胞の両方に適する他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、前出の第１６および１７章を参照されたい。
【０１３４】
別の実施形態において、哺乳動物による組換え発現ベクターは、特定の細胞型における
核酸発現の優先的な方向付けが可能である（例えば、組織特異的な調節エレメントを用い
て核酸を発現させる）。組織特異的な調節エレメントは、当技術分野で知られている。適
切な組織特異的プロモーターの非限定的な例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；
Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１：２６８〜２７７）、リンパ球
特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ、１９８８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、４３：２３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞受容体（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍ
ｏｒｅ、１９８９、ＥＭＢＯ  Ｊ．、８：７２９〜７３３）および免疫グロブリン（Ｂａ
ｎｅｒｊｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３：７２９〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔ
ｉｍｏｒｅ、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３：７４１〜７４８）のプロモーター、ニューロン
特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲ
ｕｄｄｌｅ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：５４７
３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモー
ター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第ＥＰ２６４１６６号）を含
む。例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ、１９９０、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２４９：３７４〜３７９）およびベータ−フェトプロテインプロモーター
（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、３：５３７
〜５４６）など、発達学的に調節されるプロモーターもまた対象とされる。
【０１３５】
本発明のある態様において、本発明のタンパク質の発現は、対応する遺伝子の用量を増
大させることにより、例えば、高コピーの発現ベクターまたは遺伝子増幅を用いて増大さ
せることができる。ｄｈｆｒ遺伝子による対象遺伝子の共トランスフェクション、および
メトトレキサート濃度を段階的に増大させる選択培地への曝露により、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（「ｄｈｆｒ」）欠損ＣＨＯ細胞において遺伝子増幅を達成することができる。
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｕｎｉｔ  １６．１４（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏ
ｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６）を参照されたい。遺伝子コピー数を増大させる代替
的な方法は、宿主細胞内にベクターを導入する前に、ベクターにおいて対象のエラスター
ゼタンパク質をコードする発現カセット（例えば、コード配列を伴うプロモーター）を多
量体化することである。発現カセットの多量体化を達成する方法およびベクターは、酵母
および哺乳動物の宿主細胞系において知られている（例えば、Ｍｏｎａｃｏ、「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ」、３９〜３４８頁（Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｖａｓ
ｓｉｌｅｖａら、２００１、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ、２１：７１〜８０；Ｍａｎｓｕｒら、２００５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒ、２７（５）：３３９〜４５を参照されたい）。加えて、マルチ
コピー遺伝子発現のためのキットが市販されている。例えば、メタノール資化酵母による
マルチコピー発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａ）から購入することができる。発現カセットの多量体化は、前出の実施例６にお
いて例示されている。
【０１３６】
したがって、本発明の他の態様は、その中に本発明の組換え発現ベクターが導入される
宿主細胞に関連する。本明細書において、「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という
用語は互換的に用いられる。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような
細胞の子孫細胞または潜在的な子孫細胞も指すことが理解される。突然変異または環境の
影響により、後続世代においては何らかの変化が発生しうるため、実のところ、このよう
な子孫細胞は親細胞と同一ではないが、本明細書では、やはり該用語の範囲内に含める。
【０１３７】
宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌細胞）でもありえ、真核細胞（例えば、
昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞）でもありうる。
【０１３８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法を介して、原核細
胞にも真核細胞にも導入することができる。本明細書で用いられる「形質転換」および「
トランスフェクション」という用語は、宿主細胞内に外来核酸を導入する、当技術分野で
認められた各種の技法を指すことを意図し、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムに
よる共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、また
は電気穿孔を含む。宿主細胞を形質転換するか、またはこれにトランスフェクトするのに
適する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）および他の実験室マニュアルにおいて見出す
ことができる。
【０１３９】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションを行う場合、用いられる発現ベクターお
よびトランスフェクション法にもよるが、それらのゲノム内に外来のＤＮＡを組み込みう
る細胞はごく一部であることが知られている。これらの組込み体を同定し選択するには、
一般に、対象のオープンリーディングフレームと共に、選択マーカー（例えば、抗生剤に
対する耐性マーカー）のコード配列を宿主細胞内に導入する。好ましい選択マーカーは、
Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ゼオシン、およびメトトレキサートなど、薬剤に対する耐
性を賦与するマーカーを含む。導入される核酸を安定的にトランスフェクトした細胞は、
薬剤の選択により同定することができる（例えば、選択マーカーのコード配列を組み込ん
だ細胞が生存するのに対し、他の細胞は死滅する）。
【０１４０】
別の実施形態では、細胞、安定的な細胞系、またはクローニングされた微生物のゲノム
内に内因性エラスターゼのコード配列に対して異種のＤＮＡ調節エレメントを挿入するこ
とにより、挿入された調節エレメントが該内因性遺伝子と作動的に連結されるように、細
胞、細胞系、または微生物内における該エラスターゼのコード配列の発現特性を改変する
ことができる。
【０１４１】
当業者によく知られ、例えば、Ｃｈａｐｐｅｌ、米国特許第５，２７２，０７１号；１
９９１年５月１６日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６６７において説明され
る、相同組換えの標的化などの技法を用いて、内因性エラスターゼ遺伝子と作動的に連結
され、その発現を活性化するように、安定的な細胞系またはクローニングされた微生物内
に、調節エレメントを含有する異種配列を挿入することができる。異種配列は、本発明の
シグナルペプチド、切断配列、および／または活性化配列をさらに含むことができる。
【０１４２】
５．４  成熟エラスターゼタンパク質の製造方法
培養物中における原核生物または真核生物の宿主細胞など、本発明の宿主細胞を用いて
、本発明のエラスターゼタンパク質を作製することができる。したがって、本発明は、本
発明の宿主細胞を用いて本発明のエラスターゼタンパク質を作製する方法をさらに提供す
る。一実施形態において、該方法は、該エラスターゼタンパク質が作製されるように、適
切な培地において本発明の宿主細胞（この中に、本発明のエラスターゼタンパク質をコー
ドする組換え発現ベクターが導入されている）を培養するステップを含む。別の実施形態
において、該方法は、培地または宿主細胞からエラスターゼタンパク質を単離するステッ
プをさらに含む。
【０１４３】
本発明は、本発明の未成熟エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、プロエラ
スターゼタンパク質が生成される条件下において、本発明の核酸を発現するように改変さ
れた宿主細胞を培養するステップを含む方法をさらに提供する。ある実施形態では、プレ
プロエラスターゼタンパク質もまた作製される。本発明は、本発明の成熟エラスターゼタ
ンパク質を作製する方法であって、プロエラスターゼタンパク質が生成される条件下にお
いて、本発明の核酸を発現するように改変された宿主細胞を培養するステップと、該成熟
エラスターゼタンパク質が生成されるような活性化条件下に該プロエラスターゼタンパク
質を置くステップとを含む方法をさらに提供する。
【０１４４】
特にメタノール資化酵母による宿主細胞の場合、本発明の未成熟タンパク質および成熟
タンパク質を作製するのに好ましい培養条件は、低度のｐＨにおける増殖時間を含む。具
体的な実施形態において、低度のｐＨとは、ｐＨ２〜６、ｐＨ２〜５、ｐＨ３〜６、ｐＨ
３〜５、ｐＨ４〜６、ｐＨ３〜４であるか、またはその上限および下限が前出の値のいず
れかから選択される任意の範囲である。培養時間の終了時において、培養物のｐＨは、好
ましくはｐＨ７〜１１、最も好ましくはｐＨ８．０まで上昇させることができる。
【０１４５】
本発明のプロエラスターゼタンパク質の発現がメタノール誘導性プロモーターの制御下
にある場合、本発明の未成熟エラスターゼタンパク質および成熟エラスターゼタンパク質
を作製するための条件はまた、メタノールによる誘導時間も含む。
【０１４６】
本発明のエラスターゼ作製方法は、宿主細胞により発現するタンパク質を回収するステ
ップをさらに含む。ある場合において、回収されるタンパク質は、活性化配列を含有する
プロエラスターゼである。他の場合において、回収されるタンパク質は、活性化配列を欠
く成熟エラスターゼである。ある条件下では、プロエラスターゼタンパク質および成熟エ
ラスターゼタンパク質の両方が回収される。他の場合には、プレプロエラスターゼが作製
される。
【０１４７】
特に自己活性化プロエラスターゼの自己活性化を回避することが望ましい場合、プロエ
ラスターゼ発現のための培養条件は、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または
酢酸ナトリウム中における増殖時間を含むことが好ましい。具体的な実施形態では、５〜
５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、７５〜１７５ｍ
Ｍ、１００〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、またはその上限および下限が前出の値のい
ずれかから選択される任意の範囲の濃度が用いられる。好ましい実施形態において、クエ
ン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムの濃度は９０〜１１０ｍＭ
であり、最も好ましくは１００ｍＭである。
【０１４８】
加えて、タンパク質の分解を回避することが望ましい場合、プロエラスターゼ発現のた
めの培養条件は、対象の宿主細胞に適する温度範囲の最下端における増殖時間および誘導
時間を含みうる。例えば、宿主細胞がメタノール資化酵母による宿主細胞である場合、好
ましい範囲は約２２〜２８℃である。具体的な実施形態において、メタノール資化酵母に
よる宿主細胞は、約２８℃の温度で培養される。増殖および誘導を同じ温度で実施する必
要はなく、例えば、宿主細胞としてメタノール資化酵母を用いる実施形態では、２８℃で
増殖を実施しうる一方、誘導は２２℃で実施することができる。
【０１４９】
本発明の自己活性化プロエラスターゼタンパク質の活性化は、少（触媒）量の外因性エ
ラスターゼの添加により誘発されうる。代替的に、または同時に、自己活性化プロエラス
ターゼタンパク質を含有する溶液のｐＨを上昇させることにより、本発明の自己活性化プ
ロエラスターゼタンパク質の活性化を誘発することができる。ｐＨは７〜１１であること
が好ましく、具体的な実施形態において、溶液は、ｐＨ７〜１０、７〜９、８〜１０、８
〜９、またはその上限および下限が前出の値のいずれかから選択される任意の範囲にある
。好ましい実施形態において、溶液のｐＨは７〜９であり、８であることが最も好ましい
。
【０１５０】
具体的な実施形態では、活性化ステップの間において、自己活性化プロエラスターゼを
トリス塩基下に置くことができる。具体的な実施形態では、５〜５０ｍＭ、７．５〜１０
０ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、７５〜１７５ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、
７５〜１２５ｍＭ、またはその上限もしくは下限が前出の値のいずれかから選択される任
意の範囲の濃度までトリス塩基を添加する。好ましい実施形態において、トリス塩基は、
９０〜１１０ｍＭ、最も好ましくは１００ｍＭの濃度まで添加される。トリス塩基のｐＨ
は７〜１１であることが好ましく、具体的な実施形態において、トリス塩基は、ｐＨ７〜
１０、７〜９、８〜１０、８〜９、またはその上限もしくは下限が前出の値のいずれかか
ら選択される任意の範囲にある。好ましい実施形態において、トリス塩基は、ｐＨ７〜９
、最も好ましくはｐＨ８である。
【０１５１】
本発明のある態様において、エラスターゼの自己活性化温度は周囲温度、例えば、２２
℃〜２６℃の範囲の温度である。ある実施形態において、エラスターゼの活性化ステップ
は、切断反応の精度を最適化し、Ｎ末端変異体の形成を最小化するため、低度の初期濃度
、例えば、０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌのプロエラスターゼにより実施することが好ましい
。
【０１５２】
本発明のある実施形態では、プロエラスターゼが自己タンパク質分解を受ける可能性が
あるため、自己活性化プロエラスターゼを成熟エラスターゼへと転換するのに、触媒量の
エラスターゼの添加は必要とされない。ある実施形態において、自己タンパク質分解の速
度は、濃度に依存しない。理論に制約されることは望まないが、ある種の自己活性化プロ
エラスターゼタンパク質の濃度に依存しない自己タンパク質分解は、プロエラスターゼ分
子が分子内反応により自身を切断する分子内過程を介すると考えられる。しかし、他の実
施形態において、自己活性化プロエラスターゼの活性化は、濃度依存的である。理論に制
約されることは望まないが、ある種の自己活性化プロエラスターゼタンパク質の濃度依存
的な自己タンパク質分解は、プロエラスターゼが、別のプロエラスターゼにより、かつ／
または成熟エラスターゼにより切断される分子間反応を介すると考えられる。さらに他の
実施形態において、ある種の自己活性化エラスターゼタンパク質は、濃度依存的な活性化
と、濃度に依存しない活性化との組合せを示す。自己活性化が濃度依存的である場合、所
望なら、プロタンパク質を一層の希釈形態に維持することで活性化を低下させることがで
きる。配列番号６９のプロタンパク質を含むがこれに限定されない配列番号５５のエラス
ターゼプロペプチドの切断ドメインを含むエラスターゼプロタンパク質の活性化は、この
ようなプロタンパク質を希釈形態に維持することにより制御することができる。
【０１５３】
本発明の成熟エラスターゼタンパク質を作製する過程ではまた、成熟エラスターゼのあ
る種の望ましくないＮ末端配列変異体が蓄積されうることも認められている。より具体的
に述べると、配列番号６のプロタンパク質を含む配列番号４２のエラスターゼプロペプチ
ドの切断ドメインを含有するプロエラスターゼタンパク質は、位置Ｐ３またはＰ２におけ
るいずれかの残基に対してＣ末端側にあるペプチド結合において切断が生じたＮ末端配列
の変異体をもたらす可能性がある。しかし、活性化配列内の特定の位置に特定のアミノ酸
を配置することにより、このような望ましくないＮ末端変異体を減少させることができる
。例えば、プロリンが位置Ｐ２に存在する場合、１つまたは２つのさらなるＮ末端アミノ
酸を有するＮ末端変異体の生成が減少するかまたはこれが生成されなくなる。また、トリ
プシンが活性化に必要でなくなることにより、９つのＮ末端残基を欠く変異体の生成が減
少するかまたはこれが生成されなくなる。加えて、ある条件下において活性化反応を実行
することにより、望ましくないＮ末端変異体を減少させるかまたは除去することができる
。
【０１５４】
より具体的に述べると、ある実施形態において、活性化条件は、転換反応の初期部分に
おいて生成されたＮ末端変異体がその後選択的に分解される「延長転換」ステップを含む
。「延長転換」時におけるタンパク質分子種の相対量は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより、リア
ルタイムでモニタリングすることができる。望ましくないＮ末端変異体の選択的な分解に
より、転換反応における全長の成熟ＰＲＴ−２０１の比率が増大し、Ｎ末端変異体の比率
が低下する。配列番号５５のエラスターゼプロペプチドの切断ドメインを含有するプロエ
ラスターゼタンパク質の場合、延長転換ステップは４〜８時間にわたり実施され、約６時
間であることが好ましい。他のプロエラスターゼタンパク質の場合、延長転換ステップは
、すべてのプロエラスターゼが転換された直後において、（全長の）成熟エラスターゼと
比べたＮ末端変異体の比率に応じて延長される場合もあり、短縮される場合もある。転換
が発酵培養液などの複合培地において生じる場合、成熟エラスターゼの活性部位における
、溶液内における他のタンパク質およびペプチドによる競合のために、延長転換の時間は
延長される場合がある。代替的に、延長転換ステップの前に複合培地から成熟エラスター
ゼおよびＮ末端変異体エラスターゼの混合物を回収し、これにより活性部位の競合を低下
させ、Ｎ末端変異体分子種を除去するのに必要とされる時間を短縮することができる。
【０１５５】
上述の通り、プロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵの転換反応時には、Ｎ末端
変異体の生成をもたらす副反応が生じる。具体的なプロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３−００
３−ＶＵの場合、これらのＮ末端変異体は、最初の２つのバリンを欠いており、エラスタ
ーゼ活性をほとんどまたはまったく有さない。他の変異プロタンパク質の場合、ある場合
は付加を有し、他の場合は異なる欠失を有する、さらなるＮ末端変異体が生成される。Ｎ
末端変異体を０〜２％の範囲に減少させるＮ末端除去ステップが開発されている。この除
去ステップの開発は、各種の実験および観察から進展した。既に述べた通り、プロＰＲＴ
−２０１−４２に関する転換条件を最適化する実験において、転換反応を延長すると、多
くの場合、Ｎ末端変異体の百分率がきわめて低下することが観察された。その後、転換反
応を延長すると、成熟ＰＲＴ−２０１によるＮ末変異体の選択的な分解が可能となること
が決定された。ある条件下においてＮ末端変異体を選択的に分解するＰＲＴ−２０１の能
力の発見は、より少ないＮ末端変異体を伴うより多くの精製されたＰＲＴ−２０１生成物
を作製する一助となることで、多大な利益をもたらした。プロＰＲＴ−２０１の成熟ＰＲ
Ｔ−２０１への転換を可能とし、次いで、該ＰＲＴ−２０１によるＮ末端変異体の分解を
可能とする条件を確立することで、このＮ末端変異体の除去ステップは大規模作製工程へ
と実装された。
【０１５６】
ＨＩＣ−ＨＰＬＣによりリアルタイムでモニタリングされた、このようなステップの代
表例を図１０に示す。約５０分間後において、１００％のプロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３
が、約８６％の成熟ＰＲＴ−２０１と１４％のＮ末端変異体とに完全に転換された。成熟
ＰＲＴ−２０１によるＮ末端変異体の選択的な分解を可能とする転換反応が延長された結
果、変異体は１４％から２％へと減少した。インキュベーションを延長すると、Ｎ末端変
異体を検出不可能なレベルまで選択的に分解することができる。Ｎ末端変異体のレベルが
十分に低下したら、クエン酸ナトリウムによりＰＲＴ−２０１の活性を抑制し、反応ｐＨ
を５．０へと調整する。
【０１５７】
精製された成熟エラスターゼが得られたら、該活性酵素を、該エラスターゼタンパク質
が比較的不活性となる溶液中に入れ、さらなるカラムクロマトグラフィー、例えば、陽イ
オン交換クロマトグラフィーによる精製ステップのための緩衝液中に入れることができる
。一般に、エラスターゼタンパク質は、濃度が約５〜２５ｍＭであり、ｐＨが約２〜５の
クエン酸ナトリウム中に入れることができる。具体的な実施形態では、ｐＨ５で２０ｍＭ
のクエン酸ナトリウム中にエラスターゼを入れる。次いで、場合によって、以下の方法：
（１）濃度を決定する吸光度２８０ｎｍでの分光光度分析、（２）純度を評価するＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、（３）エラスターゼの比活性を評価する活性アッセイ、例えば、ＳＬＡＰア
ッセイ、および（４）成熟エラスターゼおよびＮ末端変異体を検出するＨＩＣ−ＨＰＬＣ
の１つ、複数、またはすべてにより溶出した画分を解析し、適切な特性（例えば、許容さ
れる比活性、許容される程度に低レベル（不在が好ましい）の検出可能なグリコフォーム
、および許容される程度に低レベル（不在が好ましい）の検出可能なＮ末端変異体）を有
する画分をプールした。
【０１５８】
精製された成熟エラスターゼが得られたら、該活性酵素を、凍結乾燥に適する溶液中に
入れることができる。一般には、凍結乾燥前に、エラスターゼタンパク質を１×リン酸緩
衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ｐＨ７．４の１３７ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸
ナトリウム、２．７ｍＭリン酸カリウム）中に入れることができる。ある実施形態では、
凍結乾燥前に、エラスターゼタンパク質を０．１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４の１３．７ｍＭ  
塩化ナトリウム、１．０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２７ｍＭリン酸カリウム）中に入れ
ることができる。
【０１５９】
場合によって、プロエラスターゼ配列の発現は、プロエラスターゼタンパク質および成
熟エラスターゼタンパク質の混合物をもたらす。したがって、本発明は、プロエラスター
ゼタンパク質および成熟エラスターゼタンパク質の両方を含む組成物を提供する。
【０１６０】
５．５  医薬組成物
本発明の成熟エラスターゼタンパク質は、投与に適した医薬組成物中に取り込ませるこ
とが可能である。このような組成物は、エラスターゼタンパク質および薬学的に不活性な
成分、例えば薬学的に許容される担体を典型的には含む。本明細書で使用する用語「薬学
的に許容される担体」は、医薬投与と適合性がある、任意およびすべての溶媒、分散媒、
コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。
従来の賦形剤、ビヒクル、充填剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、可溶化剤、および着色剤も、
薬学的に不活性な成分として企図される。薬学的に活性がある物質に関するこのような媒
体および作用物質の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または作
用物質が成熟エラスターゼタンパク質と不適合である場合を除いて、組成物におけるそれ
らの使用は企図される。補助的活性化合物を組成物中に取り込ませることも可能である。
【０１６１】
したがって、本発明の特定の態様は医薬組成物に関する。具体的な実施形態において、
本発明は、（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼおよび（ｉｉ）薬学的に許容さ
れる担体を含む組成物を提供する。組成物中に使用することができる成熟ヒトＩ型エラス
ターゼには、配列番号１、４、５、８４、８７のタンパク質があるが、これらだけには限
られない。成熟ヒトＩ型エラスターゼは、前述の表３中に述べた多型の組合せのいずれか
を含有することができる。
【０１６２】
他の実施形態において、本発明は、（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼと、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供し、この医薬組成物はトリプ
シン、またはトリプシンの断片を含まない。他の実施形態において、医薬組成物は、トリ
プシンまたはトリプシンの断片を実質的に含まない。本明細書で使用する語句「トリプシ
ンを含まない」は、製造工程の任意の部分でトリプシンが使用されない組成物を指す。本
明細書で使用する語句「トリプシンを実質的に含まない」は、重量／重量ベースにおいて
約０．００２５％を超えない、またはより好ましくは約０．００１％未満の最終率（すな
わち、トリプシンの重量／組成物全体の重量）でトリプシンが存在する組成物を指す。本
明細書で使用する語句トリプシンを「含まない」は、例えば酵素アッセイまたはＥＬＩＳ
Ａによって変異体が検出不能である組成物を指す。
【０１６３】
特定の態様では、本発明の組成物は、ＢＥＮＺアッセイにより測定してトリプシンの３
ｎｇ／ｍｌの当量未満のトリプシン活性、好ましくはＢＥＮＺアッセイにより測定して２
．５ｎｇ／トリプシンｍｌの当量未満のトリプシン活性、さらにより好ましくはＢＥＮＺ
アッセイにより測定して２ｎｇ／トリプシンｍｌの当量未満のトリプシン活性を有する。
具体的な実施形態において、本発明は、トリプシン活性がＢＥＮＺアッセイにより測定し
て１．６ｎｇ／トリプシンｍｌ未満の当量である、治療有効量のエラスターゼタンパク質
を含む組成物を提供する。ＢＥＮＺアッセイにより測定して１．６ｎｇ／トリプシンｍｌ
当量未満のトリプシン活性を有するエラスターゼ組成物の例は、以下の実施例８中に提供
する。特定の実施形態では、ｎｇ／トリプシンｍｌ活性を、液状ヒトＩ型エラスターゼ組
成物または１ｍｇ／ヒトＩ型エラスターゼタンパク質ｍｌを含有する調製物においてアッ
セイすることができる。したがって、トリプシン活性は、エラスターゼタンパク質のミリ
グラムの点で、例えば３ｎｇトリプシン活性／エラスターゼタンパク質ｍｇ未満、１．５
６ｎｇトリプシン活性／エラスターゼタンパク質ｍｇ未満などで記載することもできる。
【０１６４】
本発明は、成熟エラスターゼの望ましくないＮ末端変異体を含まないかまたは実質的に
含まないかのいずれかである医薬組成物をさらに提供する。望ましくないＮ末端変異体に
は、Ｐ５、Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ’１、Ｐ’２、Ｐ’３、Ｐ’４、Ｐ’６、および／また
はＰ’９位置における残基のいずれかに対するＣ末端であるペプチド結合での切断によっ
て生成する変異体があるが、これらだけには限られない。特定の望ましくないＮ末端変異
体はトリプシン活性化によって生成され、他の変異体は最適活性化配列を含有しないプロ
エラスターゼ配列の自己活性化によって生成される。
【０１６５】
特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号２、３、３７、３８、７０、７１、８５
、８６、９４、９５、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８だけには限られないがこ
れらを含む、成熟エラスターゼの１個、２個以上またはすべてのＮ末端変異体を含まない
かまたは実質的に含まない。特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）治療有効量の成熟ヒ
トＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供し、
この医薬組成物は配列番号２、３、３７、３８、７０、７１、８５、８６、９４、９５、
１０４、１０５、１０６、１０７、または１０８を有する任意のタンパク質を含まないか
または実質的に含まない。他の実施形態では、医薬組成物は、配列番号２、３、３７、３
８、７０、７１、８５、８６、９４、９５、１０４、１０５、１０６、１０７、または１
０８だけには限られないがこれらを含む成熟エラスターゼのＮ末端変異体を実質的に含ま
ない。本明細書で使用する語句特定の変異体を「含まない」は、例えばカチオン交換ＨＰ
ＬＣアッセイ、疎水性相互作用ＨＰＬＣアッセイ、または液体クロマトグラフィーと組み
合わせた質量分析によって変異体が検出不能である組成物を指す。本明細書で使用する語
句「実質的に含まない」は、少なくとも約０．５％未満の最終率（すなわち、Ｎ末端変異
体の重量／組成物全体の重量）でＮ末端変異体が存在する組成物を指す。特定の好ましい
実施形態では、Ｎ末端変異体を実質的に含まない組成物は、Ｎ末端変異体の濃度が重量／
重量ベースにおいて約０．１％未満または約０．０１％未満または、より好ましくは、さ
らに約０．００１％未満である組成物である。特定の態様では、Ｎ末端変異体の存在を、
カチオン交換ＨＰＬＣアッセイ、疎水性相互作用ＨＰＬＣアッセイ、または液体クロマト
グラフィーと組み合わせた質量分析によって検出する。
【０１６６】
特定の具体的実施形態では、配列番号７０、７１、１０４および１０５のＮ末端変異体
を含まない医薬組成物は、Ｐ１位置中にアルギニンおよび／またはＰ２位置中にアラニン
を含有しないプロエラスターゼの活性化によって生成する。
【０１６７】
他の実施形態では、本発明は、（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼ（ｉｉ）
薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供し、この医薬組成物は細菌タンパク質を
実質的に含まない、および／または前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパ
ク質を実質的に含まない。本明細書で使用する語句「哺乳動物タンパク質を実質的に含ま
ない」または「細菌タンパク質を実質的に含まない」は、少なくとも約０．５％未満の最
終率（すなわち、哺乳動物タンパク質（エラスターゼ以外および、場合によっては、アル
ブミンなどの担体タンパク質）または細菌タンパク質の重量／組成物全体の重量）で、こ
のようなタンパク質が存在する組成物を指す。特定の好ましい実施形態では、このような
タンパク質を実質的に含まない組成物は、望ましくないタンパク質の濃度が重量／重量ベ
ースにおいて約０．１％未満または約０．０１％未満、または、より好ましくは、さらに
約０．００１％未満である組成物である。
【０１６８】
特定の態様では、（エラスターゼ以外の）「哺乳動物タンパク質を含まない」医薬組成
物は、哺乳動物細胞ではない組換え細胞系から生成されるエラスターゼを含有し、この場
合、哺乳動物配列を有するかまたは哺乳動物配列を実質的に有するタンパク質は、製造工
程の任意の部分で存在しない。特定の態様では、「細菌タンパク質を含まない」医薬組成
物は、細菌細胞ではない組換え細胞系から生成されるエラスターゼを含有し、この場合、
細菌配列を有するかまたは細菌配列を実質的に有するタンパク質は、製造工程の任意の部
分で存在しない。
【０１６９】
本発明の成熟ヒトＩ型エラスターゼ（変異体を含む）は、医薬組成物中で使用するため
に精製することが最も好ましい。具体的な実施形態において、エラスターゼは少なくとも
７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度にある。
他の具体的な実施形態において、エラスターゼは９８％、９８．５％、９９％、９９．２
％、９９．５％または９９．８％までの純度にある。
【０１７０】
医薬組成物に製剤化するために、本発明の成熟ヒトＩ型エラスターゼは、エラスターゼ
の添加によって触媒される小分子ペプチド基質Ｎ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−ｐニトロアニリド（ＳＬＡＰ）の加水分解率を測定することにより決定して、１Ｕ／タ
ンパク質１ｍｇを超える超える、５Ｕ／タンパク質１ｍｇを超える、１０Ｕ／タンパク質
１ｍｇを超える、２０Ｕ／タンパク質１ｍｇを超える、２５Ｕ／タンパク質１ｍｇを超え
る、または３０Ｕ／タンパク質１ｍｇを超える比活性度を有することが好ましい。活性の
１単位は３０℃において１分間当たりで１マイクロモルの基質の加水分解を触媒するエラ
スターゼの量として定義し、かつ比活性度はエラスターゼタンパク質１ｍｇ当たりの活性
（Ｕ／ｍｇ）として定義する。医薬組成物は、下限が１、２、３、４、５、７、１０、１
５または２０Ｕ／タンパク質１ｍｇであり、かつ上限が独立に５、１０、１５、２０、２
５、３０、３５、４０または５０Ｕ／タンパク質１ｍｇである範囲内で比活性度を有する
、成熟ヒトＩ型エラスターゼを含むことが好ましい。例示的な実施形態では、比活性度は
、１〜４０Ｕ／タンパク質１ｍｇ、１〜５Ｕ／タンパク質１ｍｇ、２〜１０Ｕ／タンパク
質１ｍｇ、４〜１５Ｕ／タンパク質１ｍｇ、５〜３０Ｕ／タンパク質１ｍｇ、１０〜２０
Ｕ／タンパク質１ｍｇ、２０〜４０Ｕ／タンパク質１ｍｇの範囲、またはその上限および
下限が前述の値のいずれかから選択される任意の範囲の範囲内である。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は安定状態であることが好ましい。具体的な実施形態において、医
薬組成物（例えば前述の凍結乾燥によって調製した医薬組成物）は、４℃での保存の１週
間後、より好ましくは１カ月後、さらにより好ましくは３カ月後、最も好ましくは６カ月
後に、その比活性度の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好まし
くは少なくとも７０％を維持する。具体的な実施形態において、医薬組成物は、４℃での
保存の１週間後、より好ましくは１カ月後、さらにより好ましくは３カ月後、最も好まし
くは６カ月後に、その比活性度の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５
％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を維持する。
【０１７２】
本発明の医薬組成物は、その目的とする投与の経路と適合するように製剤化する。生体
導管の疾患を治療または予防するためにエラスターゼを投与するための方法は、ＷＯ２０
０１／２１５７４；ＷＯ２００４／０７３５０４；およびＷＯ２００６／０３６８０４中
に記載される。最も好ましい投与の経路は、手術により露出した血管の外側外膜表面への
局所投与および薬剤送達用カテーテルを使用した血管壁への局所投与を含めた、非経口投
与、例えば血管壁への直接投与である。非経口投与に使用する溶液または懸濁液は、以下
の構成要素：注射用水などの滅菌希釈液、生理食塩水溶液、リン酸緩衝生理食塩水溶液、
スクロースまたはデキストランなどの糖、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン
、プロピレングリコール、ポリソルベート−８０（ｔｗｅｅｎ−８０としても知られる）
、または他の合成溶媒；メチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素
ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン４酢酸などのキレート剤；リン酸などのバ
ッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張の調節用の作用物質を
含むことができる。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて、ｐＨは調
節することができる。非経口調製物はアンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしく
はプラスチックでできた単回もしくは反復投与用バイアル中に密閉することができる。非
経口調製物は、薬剤送達用カテーテル中に密閉することもできる。すべての場合において
、組成物は滅菌状態でなければならない。
【０１７３】
具体的な実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の賦形剤：デキストロース（
例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；ラクトース（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；マンニトール
（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；スクロース（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；トレハロー
ス（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；アスコルビン酸（例えば、２〜１０ｍＭ）；塩化カル
シウム（例えば、４〜２０ｍＭ）；デキストラン−７０（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；
ポロキサマー１８８（例えば、０．２〜１％ｗ／ｖ）；ポリソルベート−８０（例えば、
０．００１〜５％ｗ／ｖ、より好ましくは０．１〜５％）；グリセリン（例えば、０．２
〜５％ｗ／ｖ）；アルギニン（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；グリシン（例えば、２〜１
０％ｗ／ｖ）；デキストラン−４４（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）；およびデキストラン
−１８（例えば、２〜１０％ｗ／ｖ）の１つまたは複数を含む液体製剤である。特定の実
施形態では、デキストロース、ラクトース、マンニトール、スクロース、トレハロース、
デキストラン−７０、グリシン、アルギニン、グリシン、デキストラン−４４またはデキ
ストラン−１８の単独または凝集体での濃度は、下限が２．５、４、５、または７％ｗ／
ｖであり、かつ上限が独立に４、５、６、８、または１０％ｗ／ｖである範囲内である。
【０１７４】
成熟エラスターゼタンパク質、１つまたは複数のバッファー試薬および／または１つま
たは複数の賦形剤を含有する乾燥製剤に水を加えることによって、液体製剤を作製するこ
とができる。乾燥製剤は、成熟エラスターゼタンパク質、１つまたは複数のバッファー試
薬および／または、１つまたは複数の賦形剤を含む溶液を凍結乾燥させることによって作
製することができる。
【０１７５】
例えば、滅菌水またはバッファー溶液で本発明の凍結乾燥エラスターゼタンパク質を戻
すことによって、液体製剤を作製することができる。バッファー溶液の例には、生理食塩
水の滅菌溶液またはリン酸緩衝生理食塩水がある。具体的な実施形態では、望ましいタン
パク質濃度への成熟エラスターゼタンパク質を含む乾燥製剤の再溶解後、溶液は約１３７
ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（１
×と考えられるリン酸緩衝生理食塩水濃度）を含有し、かつ溶液のｐＩＩは約７．４であ
る。特定の態様では、成熟エラスターゼタンパク質を含む乾燥製剤は、再溶解に水のみが
必要とされるような量で、ナトリウム、塩化物、およびリン酸イオンも含有する。
【０１７６】
例えば、１つまたは複数の賦形剤を含有するバッファー溶液で、凍結乾燥エラスターゼ
タンパク質を戻すことによって、液体製剤を作製することもできる。賦形剤の例には、ポ
リソルベート−８０およびデキストランがある。具体的な実施形態では、望ましいタンパ
ク質濃度への成熟エラスターゼタンパク質を含む乾燥製剤の再溶解後、生成する溶液は約
１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム、０．０１％のポリソルベート−８０を含有し、かつ溶液のｐＨは約７．４である。凍
結乾燥前または凍結乾燥後ただし再溶解の前に、１つまたは複数の賦形剤を成熟エラスタ
ーゼタンパク質と混合することができる。したがって、特定の態様では、成熟エラスター
ゼタンパク質を含む乾燥製剤は、ポリソルベート−８０またはデキストランなどの賦形剤
も含有する。
【０１７７】
特定の態様では、本発明は、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウ
ム、１０ｍＭのリン酸ナトリウムの溶液中に０．００１〜５０ｍｇ／ｍｌの成熟エラスタ
ーゼタンパク質を含み、かつデキストロース、ラクトース、マンニトール、スクロース、
トレハロース、デキストラン−７０、グリセリン、アルギニン、グリシン、デキストラン
−４４またはデキストラン−１８から選択される５〜１０％、より好ましくは６〜９％の
賦形剤を含む液体製剤を提供する。
【０１７８】
具体的な実施形態において、本発明は、７．４のｐＨを有する、１３７ｍＭの塩化ナト
リウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウムの溶液中に０．００
１〜５０ｍｇ／ｍｌの成熟エラスターゼタンパク質を含む液体製剤を提供する。
【０１７９】
別の具体的な実施形態において、本発明は、７．４のｐＨを有する、１３７ｍＭの塩化
ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウムの溶液中に０．
００１〜５０ｍｇ／ｍｌの成熟エラスターゼタンパク質を含み、かつ０．０１％のポリソ
ルベート−８０を含む液体製剤を提供する。
【０１８０】
別の具体的な実施形態において、本発明は、７．４のｐＨを有する、１３７ｍＭの塩化
ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウムの溶液中に０．
００１〜５０ｍｇ／ｍｌの成熟エラスターゼタンパク質を含み、かつ０．０１％のポリソ
ルベート−８０および８％のデキストラン−１８を含む液体製剤を提供する。
【０１８１】
別の具体的な実施形態において、本発明は、７．４のｐＨを有する、１３７ｍＭの塩化
ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウムの溶液中に０．
００１〜５０ｍｇ／ｍｌの成熟エラスターゼタンパク質を含み、かつ８％のデキストラン
−１８を含む液体製剤を提供する。
【０１８２】
本発明の液体製剤は、下限が０．１、０．５、１、２．５、５、１０、１５または２０
ｍｇ／ｍｌであり、かつ上限が独立に０．５、１、２．５、５、１０、２５、５０、１０
０、２５０、５００、１０００、または１５００ｍｇ／ｍｌである範囲内で、最終濃度の
成熟エラスターゼタンパク質を含有することが好ましい。
【０１８３】
特定の態様では、本発明はデキストロース、ラクトース、マンニトール、スクロース、
トレハロース、デキストラン−７０、グリセリン、アルギニン、グリシン、デキストラン
−４４またはデキストラン−１８から選択される５〜１０％（より好ましくは６〜９％）
の賦形剤を含み、６．５〜８．５のｐＨを有する、０．５×ＰＢＳ〜１．５×ＰＢＳ（よ
り好ましくは１×ＰＢＳ）の溶液中に、０．０００１〜５００ｍｇ／ｍｌ（より好ましく
は１〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ）の成熟エラス
ターゼタンパク質を含む液体製剤を提供する。具体的な実施形態において液体製剤は、１
×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に０．５ｍｇ／ｍｌの成熟エラスターゼタンパク質および８％デ
キストラン−１８を含む。具体的な実施形態において液体製剤は、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．
４中に５ｍｇ／ｍｌの成熟エラスターゼタンパク質および８％デキストラン−１８を含む
。
【０１８４】
本発明の液体製剤は、下限が１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０または
２７５ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつ上限が独立に５００、４５０、４００、３５０、３２
５、３００、２７５または２５０ｍＯｓｍ／ｋｇである範囲内でオスモル濃度を有するこ
とが好ましい。具体的な実施形態では、本発明の液体製剤のオスモル濃度は、例えば凝固
点降下法により測定して、約１２５〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは約２７５〜
３２５ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有することが好ましい。
【０１８５】
投与の容易性および用量の均一性のための単位剤形の、本発明の液体製剤に作製するこ
とができる組成物などの、非経口組成物を製剤化することは非常に有利である。本明細書
で使用する単位剤形は、治療対象の単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、そ
れぞれの単位は、必要とされる医薬担体と共に望ましい治療効果をもたらすと計算された
所定量の成熟エラスターゼタンパク質を含有する。
【０１８６】
本明細書で定義するように、治療有効量の成熟エラスターゼタンパク質（すなわち、有
効用量）は約０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの範囲である。皮下動静脈フィステル中の血
管などの、小さな直径および薄い壁を有する血管に関しては、小用量（０．００３３ｍｇ
〜２．０ｍｇなど）が好ましい。大腿動脈などの大きな直径および厚い壁を有する血管に
関しては、大用量（２．０５〜１００ｍｇなど）が好ましい。
【０１８７】
特定の実施形態では、医薬組成物は容器、パック、ディスペンサー、またはカテーテル
中に含めることが可能である。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、投与に関する説
明書と共に、容器、パック、ディスペンサー、またはカテーテル中に含めることが可能で
ある。投与に関する説明書は、容器、パック、ディスペンサー、またはカテーテルの内部
または表面のいずれかに印刷された形で含めることが可能である。あるいは、投与に関す
る説明書は、説明を与える別の印刷文書またはインターネットでアクセス可能な文書に対
する参照の形で、容器、パック、ディスペンサー、またはカテーテルの内部または表面の
いずれかに含めることが可能である。
【０１８８】
特定の実施形態では、医薬組成物は容器、パック、またはディスペンサー中に含めるこ
とが可能である。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、投与に関する説明書と共に、
容器、パック、またはディスペンサー中に含めることが可能である。投与に関する説明書
は、容器、パック、またはディスペンサーの内部または表面のいずれかに印刷された形で
含めることが可能である。あるいは、投与に関する説明書は、説明を与える別の印刷文書
またはインターネットでアクセス可能な文書に対する参照の形で、容器、パック、または
ディスペンサーの内部または表面のいずれかに含めることが可能である。
【０１８９】
本発明は、医薬組成物を調製するための方法を含む。本発明に従い成熟エラスターゼを
生成した後、それを凍結乾燥し、それを投与に適した医薬製剤に戻すまで保存することが
できる。例示的な実施形態では、本発明は、（ａ）オープンリーディングフレームが発現
され、前記オープンリーディングフレームが５’から３’方向に（ｉ）メタノール資化酵
母において作動的なシグナルペプチド（ｉｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化配列お
よび（ｉｉｉ）成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質の配列をコードするヌクレオチド配列を
含む条件下で、プレプロエラスターゼのオープンリーディングフレームをコードする核酸
分子を発現するように改変された、メタノール資化酵母宿主細胞などの宿主細胞を培養し
、それによりプロエラスターゼタンパク質を作製すること、（ｂ）プロエラスターゼタン
パク質を、例えば（ｉ）例えば６．５〜１１、好ましくは８〜９のｐＨへのプロエラスタ
ーゼタンパク質を含有する溶液のｐＨの変更、または（ｉｉ）例えばイオン交換クロマト
グラフィーによるプロエラスターゼタンパク質の精製を含む自己活性化条件に施すことで
あって、それにより成熟Ｉ型エラスターゼを作製すること、および溶液を長期変換に施し
てＮ末端変異体を除去し、それにより成熟ヒトＩ型エラスターゼを作製すること、（ｃ）
場合によっては、成熟ヒトＩ型エラスターゼを精製すること、例えば、クロマトグラフィ
ーを向上させるためのイオン交換クロマトグラフィーステップ、および（ｄ）成熟Ｉ型エ
ラスターゼを凍結乾燥させ、それにより凍結乾燥成熟ヒトＩ型エラスターゼを単離するこ
とを含む、凍結乾燥成熟ヒトＩ型エラスターゼを単離する方法を提供する。成熟Ｉ型エラ
スターゼは、ヒトＩ型エラスターゼであることが好ましい。特定の態様では、凍結乾燥成
熟Ｉ型エラスターゼは９５％を超えた純度にあることがより好ましく、具体的な実施形態
では、凍結乾燥成熟Ｉ型エラスターゼは９８％を超えた純度または９９％を超えた純度に
ある。
【０１９０】
本発明の成熟エラスターゼタンパク質は、医薬組成物に製剤化することができる。した
がって、例示的な実施形態において本発明は、成熟ヒトＩ型エラスターゼを含む医薬組成
物を作製する方法を提供し、前記方法は（ｉ）（例えばセクション５．４中に）前に記載
した方法により凍結乾燥成熟ヒトＩ型エラスターゼを単離すること、および（ｉｉ）薬学
的に許容される担体に凍結乾燥成熟ヒトＩ型エラスターゼを再溶解することを含む。
【０１９１】
５．６  有効用量
本発明は概して、生体導管中の疾患を治療または予防するための、単独または他の作用
物質と組み合わせた、組換えエラスターゼタンパク質の非経口、好ましくは局所投与の利
点を提供する。
【０１９２】
特定の実施形態では、非経口投与の代替として、生体導管中の疾患を治療または予防す
るための作用物質の経口投与を使用することができる。
【０１９３】
本発明の方法の実施において利用するエラスターゼタンパク質の毒性および治療効果は
、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％におい
て治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬
手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり
、かつそれは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。このような情報を使用して
、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１９４】
５．７  投与の方法
本発明は、新規なエラスターゼタンパク質を含む医薬組成物、および生体導管中の疾患
を予防または治療するためのそれらの使用法に関する。このような医薬組成物は、セクシ
ョン５．５中に記載したのと同様に従来の方法で製剤化することができる。
【０１９５】
本発明のエラスターゼ組成物は、動脈または静脈の壁への溶液の送達に許容可能である
ことが当業者に知られているデバイス、例えばシリンジ、薬剤送達用カテーテル、薬剤送
達用ニードル、埋め込み型薬剤送達用ポリマー、シートまたはミクロスフェア調製物など
、埋め込み型カテーテル、またはポリマーコーティング血管ステント、好ましくは自己拡
張型ステントによって、治療する生体導管の望ましい部分に投与することができる。
【０１９６】
特定の実施形態では、望ましい部分への投与は、直接可視化、超音波、ＣＴ、蛍光透視
鏡誘導、ＭＲＩまたは内視鏡誘導によって誘導することができる。
【０１９７】
本発明の特定の態様では、生体導管へのエラスターゼの投与は、手術により露出した動
脈または静脈の外側外膜表面へのエラスターゼの液体製剤の直接施用を含む。本発明の具
体的な態様では、シリンジを用いて投与を実施する。
【０１９８】
本発明の特定の態様では、生体導管へのエラスターゼの投与は、治療する生体導管の部
分の非常に近くに送達用装置を局所的に配置することを含む。いくつかの実施形態では、
送達用装置によるエラスターゼタンパク質の送達中に、送達用装置の一部分を生体導管の
壁に挿入することができる。いくつかの実施形態では、エラスターゼタンパク質を生体導
管の加圧部分に送達しながら、生体導管の内腔を加圧することができる。いくつかの実施
形態では、機械的作用によって生体導管の内腔を加圧する。いくつかの実施形態では、バ
ルーンカテーテルを用いて生体導管の内腔を加圧する。いくつかの実施形態では、カテー
テルまたはデバイスの一部分である自己拡張型部材によって生体導管の内壁に圧力を加え
る。いくつかの実施形態では、エラスターゼタンパク質を投与し、同じデバイスによって
加圧を実施する。いくつかの実施形態では、生体導管を手術により露出させ、エラスター
ゼタンパク質を内腔に送達し、またはｉｎ  ｖｉｖｏで生体導管の外部表面に施用する。
内腔送達に関する実施形態では、血管中の血流をクランプで止め、またはエラスターゼを
長時間の間血管壁に接触させて、血清によるエラスターゼの阻害を妨げることができる。
いくつかの実施形態では、生体導管を手術により除去し、エラスターゼは内腔表面および
／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで導管の外部表面に送達する。特定の実施形態では、治療する
導管を次いで身体に戻すことができる。
【０１９９】
本発明の他の態様では、生体導管へのエラスターゼの投与は、治療する血管内にステン
トとして置かれるポリマー製剤、生体導管の外部表面に施用するクランプまたはストリッ
プ、または治療する血管上もしくは周辺のラップ、または治療する血管中、周辺もしくは
近辺の他のデバイスの使用を伴う。
【０２００】
本発明のさらに他の態様では、側副動脈を含めたその領域内の動脈および／または静脈
を拡張させる目的で、エラスターゼを組織領域に経皮注射する。他の態様では、血管の特
定部分を拡張させる目的で、エラスターゼを動脈もしくは静脈または周辺組織の壁に直接
経皮注射する。心臓血管の治療を目的とする実施形態では、エラスターゼタンパク質は心
膜腔に経皮送達すること、または手術により露出した冠状血管に直接施用することのいず
れかが可能である。
【０２０１】
本発明のエラスターゼタンパク質を血管に投与するために使用することができる医療デ
バイスは、以下のセクション５．９中に記載する。
【０２０２】
５．８  キット
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。本発明の「治療用」キッ
トは、１つまたは複数の容器中に、場合によってはその送達を容易にする任意の作用物質
と共に、生体導管中の疾患を治療または予防するのに有用な本明細書に記載するような作
用物質の１つまたは複数を含む。本発明の別のキット、「製造」キットは、１つまたは複
数の容器中に、組換えエラスターゼタンパク質を作製するのに有用な本明細書に記載する
ような作用物質の１つまたは複数を含む。
【０２０３】
本発明の治療用キットは、本発明の方法を実施するのに有用な追加的な構成要素を場合
によっては含むことができる。例えば、治療用キットは、本発明の作用物質を製剤化する
のに有用である医薬担体を含むことができる。治療用キットは、本発明の治療法を実施す
るためのデバイスまたはデバイスの構成要素、例えばシリンジまたはニードルも含むこと
ができる。治療用キット中への、壁内または心膜腔注射用カテーテルまたは腔内注射用カ
テーテルなどのデバイスの封入も企図される。特定の実施形態では、単位剤形で本発明の
作用物質を提供することができる。追加的または代替的に、本発明のキットは、１つまた
は複数の本発明の方法の実施を記載する説明書、または製造機関による承認を表す、医薬
品または生物製品の製造、使用または販売、ヒト投与に関する使用または販売を管理する
行政機関によって規定された形の通知書を提供することができる。キットの１つまたは複
数の容器内または上のいずれかに、印刷された形で説明書を含めることが可能である。あ
るいは、キットの１つまたは複数の容器内または上のいずれかに、説明書を与える別の印
刷文書またはインターネットでアクセス可能な文書に対する参照の形で、説明書を含める
ことが可能である。
【０２０４】
特定の実施形態では、本発明のキットは、以下のセクション５．９中に記載する医療デ
バイスを含む。
【０２０５】
本発明の製造キットは、本発明の方法を実施するのに有用な追加的な構成要素を場合に
よっては含むことができる。
【０２０６】
５．９エラスターゼタンパク質の投与に有用な医療デバイス
本明細書では、動脈または静脈などの生体導管に本発明のエラスターゼタンパク質を投
与するために使用され得る医療デバイスが提供される。そのようなデバイスは、以下にお
いて、また、その各々が参照によって全体的に本明細書に組み込まれる、２００８年１月
３１日出願の仮出願第６１／０２５，０８４号、２００８年２月１日出願の仮出願第６１
／０２５，４６３号、および２００８年６月２５日出願の仮出願第６１／０７５，７１０
号において説明される。本発明のエラスターゼタンパク質はまた、従来のカテーテルを介
して生体導管に投与することもできる。
【０２０７】
１つの実施形態では、エラスターゼタンパク質の投与に有用な医療デバイスは、中央の
長手方向軸を有し、１つまたは複数のアクチュエータを備え、この場合、１つまたは複数
のアクチュエータは、前記１つまたは複数のアクチュエータの長手部分が前記医療デバイ
スの長手方向軸にほぼ平行に向けられる拘束形状、および前記１つまたは複数のアクチュ
エータの長手部分の少なくとも一部分がデバイスの中央の長手方向軸にほぼ非平行に向け
られる非拘束形状で存在することができる。デバイスが、生体導管の壁に隣接して標的部
位に配置された後、１つまたは複数のアクチュエータ（所望であればアクチュエータのす
べて）は、拘束形状から解放され、非拘束形状をとることが可能にされ、それにより生体
導管の壁と接触することができる。１つまたは複数のアクチュエータは、任意の形状のも
のでよく、好ましい実施形態では、１つまたは複数のアクチュエータの拘束形状から非拘
束形状への移動は、デバイス操作者が、デバイスまたは標的組織にいかなる変形力を与え
ることなく拘束力を解放した際に行われる。
【０２０８】
図２２に示す第１の特有の実施形態では、デバイスは、１対の細長いスプライン１２、
１４として形成された１つまたは複数のアクチュエータを備える流体送達カテーテル１０
であり、スプラインの中間領域は、カテーテル組立体の中央の長手方向軸１５にほぼ平行
に向けられる拘束形状と、スプラインの対の少なくとも一部分が前記中央の長手方向軸に
ほぼ非平行に向けられる非拘束形状の間で移動可能である（図２３のスプラインの長手部
分の左Ｌおよび右Ｒ部分を参照）。１つまたは複数のスプライン１２、１４は、向かい合
わせの近位および遠位の端部を各々が有する細長いバンドまたはワイヤとして構築されて
よい。好ましい実施形態では、スプラインは、平坦な、向かい合う内面２４、２６と、平
坦な、反対側に向いている外面２８、３０とを有する。この実施形態では、スプライン１
２、１４は、図２２および２３にそれぞれ示すように、拘束位置と非拘束位置の間を平行
移動することができる。１つの実施形態では、スプラインの対は、図２２に示すようにそ
の拘束形状で背中合わせに配置される。
【０２０９】
カテーテル１０は、さらに、１つまたは複数のスプライン１２、１４の１つまたは複数
の表面に固定された１つまたは複数の組織貫通器１６、１８と、細長い長手部分を有する
中央カテーテル構成要素２０と、生体導管内でのカテーテルの移動中、１つの組織貫通器
または複数の貫通器を遮蔽することができる外側カテーテル構成要素２２とを備える。
【０２１０】
組織貫通器１６、１８は、任意の適切な材料から構築されてよい。そのような材料の好
ましい例としては、それだけに限定されないが、ニッケル、アルミニウム、鋼およびそれ
らの合金が挙げられる。特有の実施形態では、組織貫通器は、ニチノールから構築される
。
【０２１１】
中央カテーテル構成要素２０および外側カテーテル構成要素２２は、カテーテルを構築
するのに一般的に使用される材料から構築されてよい。そのような材料の例としては、そ
れだけに限定されないが、シリコーン、ポリウレタン、ナイロン、ダクロン、およびＰＥ
ＢＡＸ（商標）が挙げられる。
【０２１２】
アクチュエータは、好ましくは、可撓性の弾性材料から構築される。好ましい実施形態
では、可撓性の弾性材料は、拘束力がかけられた際、例えばアクチュエータが拘束形状に
あるときに拘束されることが可能であり、拘束力が除去されたとき、例えばアクチュエー
タが非拘束形状にあるときにその元の非拘束の形をとる。それだけに限定されないが、外
科用鋼、アルミニウム、ポリプロピレン、オレフィン材料、ポリウレタン、および他の合
成ゴムまたはプラスチック材料を含む任意のそのような可撓性の弾性材料が使用され得る
。１つまたは複数のアクチュエータは、最も好ましくは、形状記憶材料から構築される。
そのような形状記憶材料の例としては、それだけに限定されないが、銅−亜鉛−アルミニ
ウム−ニッケル合金、銅−アルミニウム−ニッケル合金、およびニッケル−チタン（Ｎｉ
Ｔｉ）合金が挙げられる。好ましい実施形態では、形状記憶材料はニチノールである。好
ましい実施形態では、スプラインの対が非拘束形状をとるとき、各々のスプラインが形成
される材料の形状記憶特性により、スプラインは、いかなる外側からの変形力をかけるこ
となく、図２３に示すように単一の平面において径方向に曲がって互いから離れる。
【０２１３】
スプラインの１つまたは複数（好ましくはスプラインの各々）は、図２４に示すように
、スプラインの長手部分に沿ってまたはスプライン内を延びる可撓性の流体送達導管３２
、３４を有する。スプライン１２、１４がその真っすぐな拘束形状からその曲がった非拘
束形状に移動するとき、流体送達導管３２、３４もまた、真っすぐな形状から曲がった形
状に移動する。１つの実施形態では、流体送達導管３２、３４は、スプライン１２、１４
の対の長手部分に沿って固定された別個の管状の導管である。別の実施形態では、流体送
達導管は、スプラインの材料中にまたはその内部に形成される導管である。
【０２１４】
スプラインの１つまたは複数（好ましくはスプライン１２、１４の各々）はまた、スプ
ラインの長手部分に沿って延びるジッパレール３６、３８を有して形成される（図２４）
。ジッパレール３６、３８は、スプライン１２、１４と同じ材料またはスプライン１２、
１４と共に可撓する材料から形成される。
【０２１５】
組織貫通器１６、１８の１つまたは複数は、スプライン１２、１４の対の外面２８、３
０に固定される（図２４）。組織貫通器１６、１８は、スプライン１２、１４の長手部分
に沿って延びる流体送達導管３２、３４に連結され、これと連通する。組織貫通器１６、
１８は、スプライン１２、１４の外面２８、３０からほぼ垂直に突出するように配置され
る。組織貫通器１６、１８は、スプラインの流体送達導管３２、３４と連通する中空の内
部孔を有する。組織貫通器の遠位端部は、組織貫通器の内部孔と連通する流体送達ポート
を有する。
【０２１６】
デバイスは、生体導管の壁、例えば血管壁の１つまたは複数の異なった層内へのまたは
それを貫通する流体の送達を可能にする。血管壁は、内皮層および基底膜層（まとめて内
膜層）、内弾性板、内側層、および外膜層を含む、数多くの構造および層を含む。これら
の層は、米国特許出願公開第２００６／０１８９９４１Ａ１号に記載されるように、内皮
が血管腔に曝され、基底膜、内弾性板、内側および外膜がそれぞれ、内皮の上方に次々と
重ねられるように構成されている。本発明の医療デバイスの場合、組織貫通器１６、１８
が貫通することができる深さは、各組織貫通器１６、１８の長さによって決定される。例
えば、標的層が外膜層である場合、デバイスの展開時に外膜層の深さまで貫通するのに十
分な規定された長さを有する組織貫通器１６、１８が、使用される。同様に、標的層が内
側層である場合、デバイスの展開時に内膜層の深さまで貫通するのに十分な規定された長
さを有する組織貫通器１６、１８が、使用される。
【０２１７】
特有の実施形態では、組織貫通器１６、１８の長さは、血管用途では約０．３ｍｍ〜約
５ｍｍ、他の生体空間または導管を含む用途、例えば結腸用途では約２０ｍｍまたはさら
には３０ｍｍまでの範囲になり得る。組織貫通器１６、１８は、好ましくは、約０．２ｍ
ｍ（３３ゲージ）〜約３．４ｍｍ（１０ゲージ）、より好ましくは０．２ｍｍ〜１．３ｍ
ｍ（約３３〜２１ゲージ）の直径を有する。組織貫通器の遠位先端部は、標準的な面取部
、短い面取部、または真に短い面取部を有することができる。代替の実施形態では、スプ
ラインの任意の１つに取り付けられた組織貫通器は、同一の長さのものではないが、医療
デバイスが、例えば使用中などに非拘束位置にあるとき、それらの遠位端部が生体導管の
壁から等距離になるように揃うように構成されてよい。
【０２１８】
中央カテーテル構成要素２０は、図２２の左および右それぞれに示す向かい合わせの近
位および遠位の端部を備えた細長い長手部分を有する。１つの実施形態では、中央カテー
テル構成要素２０は、その細長い長手部分に沿って延びる円筒状の外面を有する。スプラ
イン１２、１４の近位端部は、中央カテーテル構成要素２０の遠位端部に取り付けられ、
例えばはんだ付けされ、または接着され、一方でスプライン１２、１４の遠位端部は、カ
テーテルのガイド先端部４０に取り付けられ、例えばはんだ付けされ、または接着される
。先端部４０は、生体導管内で容易に移動するように設計された滑らかな外面を有する。
ガイドワイヤ孔４８が、中央カテーテル２０および先端部４０の長手部分を通って延びる
。ガイドワイヤ孔は、ガイドワイヤを孔内に滑動係合状態で受け入れるように寸法設定さ
れる。
【０２１９】
１対の流体送達管腔４４、４６が、中央カテーテル構成要素２０の内部を通ってカテー
テル構成要素の長手部分全体を延びる（図２５）。中央カテーテル構成要素２０の遠位端
部では、流体送達管腔４４、４６の対は、スプライン１２、１４の長手部分に沿って組織
貫通器１６、１８まで延びる流体送達導管３２、３４の対と連通する。ガイドワイヤ孔４
８もまた、中央カテーテル構成要素２０の内部を通って中央カテーテル構成要素の近位端
部から遠位端部まで延びる（図２５）。中央カテーテル構成要素２０の近位端部には、１
対のルアーハブ５０、５２が設けられる（図２２）。１つの実施形態では、各ルアーハブ
５０、５２は、中央カテーテルの長手部分を通って延びる流体送達管腔４４、４６の１つ
と連通する。各ルアーハブ５０、５２は、流体を、各ルアーハブ５０、５２を通り、次い
で中央カテーテル構成要素２０を通って延びる各流体送達管腔４４、４６を通り、次いで
スプライン１２、１４の対の長手部分に沿って延びる各流体送達導管３２、３４を通り、
次いでスプラインの対の各々に固定された組織貫通器１６、１８を通るように連通させる
ために、流体送達源と連結されるように設計される。別の実施形態では、各ルアーハブ５
０、５２は、中央カテーテル構成要素の長手部分を通って延びる流体送達管腔４４、４６
の両方と独立して連通する。この構成では、第１の流体が、第１のルアーハブを通って両
方の組織貫通器１６、１８へと送達可能であり、第２の流体が、第２のルアーハブを通っ
て両方の組織貫通器１６、１８へと送達可能である。各ルアーハブから両方の組織貫通器
への流体の送達は、図３２に示すように、各ルアーハブから遠位の共通のリザーバ６１ま
で延びる独立した導管によって達成することができる。このリザーバは、両方の組織貫通
器１６、１８と連通する。代替的に、別の実施形態では、本発明の医療デバイスは、中央
カテーテルを通って延びる単一流体送達管腔に連結された単一のルアーハブのみを備え、
このルアーハブは、次いで、遠位の共通のリザーバに取り付けられて、両方の組織貫通器
１６、１８への単一の流体の送達を可能する。
【０２２０】
外側カテーテル構成要素２２は、スプライン１２、１４の対および中央カテーテル２０
の大部分を取り囲む管状形状を有する（図２２）。カテーテル構成要素２２は、図２２に
おいて左および右にそれぞれ示す、カテーテル構成要素の向かい合わせの近位端部と遠位
端部の間を延びる細長い長手部分を有する。カテーテル構成要素の遠位端部は、ガイド先
端部４０と固定係合状態で係合するように寸法設定され、ここでは、先端部４０の外面は
、カテーテル構成要素の遠位端が先端部と係合されたときにカテーテル構成要素２２の外
面と同化する。カテーテル構成要素２２の管状形状は、カテーテル構成要素２２の内面が
、スプラインの対の拘束位置においてスプライン１２、１４の対上の複数の組織貫通器１
６、１８から外方向に離間されるように寸法設定される。中央カテーテル２０の近位端部
は、カテーテル構成要素の遠位端部がカテーテルガイド先端部４０と係合するとき、カテ
ーテル構成要素２２の近位端部を超えて延びる。
【０２２１】
外側カテーテル構成要素２２の近位端部と中央カテーテル構成要素２０の近位端部の間
には、機械的連結部５４が設けられ、この機械的連結部５４は、外側カテーテル構成要素
を、スプライン１２、１４の対および中央カテーテル構成要素２０の長手部分に沿って後
方向に移動させることを可能にして、外側カテーテル構成要素２２の遠位端部をガイド先
端部４０から離してスプライン１２、１４の対の上を通過させ、また、中央カテーテル構
成要素２０の長手部分にわたっておよびスプライン１２、１４の対の長手部分にわたって
前方向に移動させて外側カテーテル構成要素２２の遠位端部を先端部４０に係合させる（
図２２）。機械的連結部５４は、手動で外側カテーテル構成要素２２を中央カテーテル構
成要素２０にわたって滑動させるハンドルまたはボタンによって設けることができる。連
結部５４はまた、サムホイールまたはトリガ機構によって提供することができる。さらに
、連結部５４にはまた、中央カテーテル構成要素２０に対する外側カテーテル構成要素２
２の増分的移動の可聴式または触覚式のインジケータ（クリッキングなど）を設けること
ができる。
【０２２２】
１つの実施形態では、外側カテーテル構成要素２２には、外側カテーテル構成要素の内
面上で、外側カテーテル構成要素２２の片側の長手部分全体に沿って延びる単一のジッパ
トラック５６が設けられる（図２４）。外側カテーテル構成要素２２の内部のジッパトラ
ック５６は、スプライン１２、１４の各々の片側にあるジッパレール３６、３８と滑動係
合状態で係合する。外側カテーテル構成要素２２を中央カテーテル構成要素２０およびス
プライン１２、１４の対の長手部分に沿って、カテーテル組立体のガイド先端部４０に向
かって前方向に進めることにより、外側カテーテル構成要素のジッパトラック５６はスプ
ライン１２、１４の対のレール３６、３８に沿って滑動する。このため、スプライン１２
、１４の対は、図２３に示すその曲がった非拘束形状から図２２に示すその背中合わせの
拘束形状に向かって移動する。スプラインレール３６、３８が外側カテーテル構成要素２
２のジッパトラック５６内に係合することにより、スプライン１２、１４の対は、図２２
に示すその背中合わせの相対位置に保持される。外側カテーテル構成要素２２を中央カテ
ーテル構成要素２０およびスプライン１２、１４の対にわたって、外側カテーテル構成要
素２２の遠位端部がガイド先端部４０と係合するところまで前方に押し出すと、組織貫通
器１６、１８は覆われ、本発明のカテーテル組立体は、生体導管内で前方または逆方向に
安全に移動することができる。外側カテーテル構成要素２２は、スプライン１２、１４の
対から突出する組織貫通器１６、１８を覆い、外側カテーテル構成要素２２と遠位ガイド
先端部４０が係合することにより、カテーテル組立体には滑らかな外面がもたらされ、こ
の外面は、カテーテル組立体が血管などの生体導管に入りそこを通って挿入されることを
容易にする。別の実施形態では、外側カテーテル構成要素２２には、内面上で外側カテー
テル構成要素２２の長手部分全体に沿って延びる、互いから１８０°のところにある２本
のジッパトラックが設けられ、スプラインは、両側にレールを有する。
【０２２３】
ガイドワイヤ５８が、カテーテル組立体と共に使用される（図２２）。ガイドワイヤ５
８は、中央カテーテル構成要素のガイドワイヤ孔４８を通り、スプライン１２、１４に沿
ってガイド先端部の出口４２を通って延びる。特定の実施形態では、ガイドワイヤ５８は
、例えばステンレス鋼または超弾性ニチノールなどのソリッドコアを有する。ガイドワイ
ヤは、その全体またはその遠位部分（例えば最遠位１ｍｍ〜２５ｍｍまたは最遠位３ｍｍ
〜１０ｍｍ）をＸ線不透過性材料から構築してよい。ガイドワイヤ５８は、任意選択で、
ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）などの医学的に不活性なコーティング剤でコーティングされて
よい。
【０２２４】
本デバイスの使用時、ガイドワイヤ５８は、当技術分野で良く知られている方法によっ
て生体導管内に配置される。ガイドワイヤ５８は、生体導管から、組立体の先端部４０内
のガイドワイヤ出口４２を通り、外側遮蔽カテーテル２２を通って組織貫通器１６、１８
を過ぎ、中央カテーテル２０のガイドワイヤ孔４８を通って延びる。他の実施形態では、
カテーテル組立体は、迅速交換カテーテル組立体であり、この場合、ガイドワイヤ管腔は
、カテーテルのガイド先端部４０の遠位端部内に存在しているが、医療デバイスの長手部
分全体を通り抜けて延びてはいない。
【０２２５】
ガイドワイヤの配置後、デバイスは、事前に配置されたガイドワイヤ５８に沿って生体
導管内に入るように進められる。任意選択で、生体導管内でデバイスの位置を監視するた
めに、１つまたは複数のＸ線不透過性マーカーをデバイス上に設けることができる。電磁
波放射の通過を防止するものであればどのような材料も、Ｘ線不透過性として考慮され、
使用することができる。好ましいＸ線不透過性材料としては、それだけに限定されないが
、白金、金または銀が挙げられる。Ｘ線不透過性材料は、先端部４０のすべてまたは一部
の表面上、スプライン１２、１４または他のアクチュエータのすべてまたは一部上、ガイ
ドワイヤ５８上、または上述の構造の何らかの組合せ上にコーティングすることができる
。代替的に、Ｘ線不透過性材料のリングを、先端部４０に取り付けることができる。デバ
イスには、任意選択で、血管内超音波または光学コヒーレンストモグラフィーなどの内蔵
の画像処理を設けることができる。デバイスの先端部には、任意選択で、デバイスの位置
または周囲の生体導管の特徴を決定するために使用される光学素子を設けることができる
。
【０２２６】
デバイスが生体導管内でその所望の位置にあるとき、操作者は、機械的連結部５４を使
用して外側カテーテル構成要素２２を後方向に後退させてガイド先端部４０から離す。好
ましい実施形態では、外側カテーテル構成要素２２が組織貫通器１６、１８からそれにわ
たって引っ込められるとき、外側カテーテル構成要素２２のジッパトラック５６は、スプ
ライン１２、１４の対のレール３６、３８にわたって引っ込められる。この移動は、スプ
ライン１２、１４の対を、図２２に示すその拘束の背中合わせの形状から解放し、スプラ
イン１２、１４の形状記憶材料が、図２３に示すその非拘束の曲がった形状をとることを
可能にする。スプライン１２、１４がその非拘束の曲がった形状に移動するとき、スプラ
インは、生体導管の（１つまたは複数の）壁の内側表面と接触するようになり、スプライ
ン１２、１４の外面２８、３０上の組織貫通器１６、１８は、デバイスの位置にある生体
導管の内面に押し込まれる。
【０２２７】
組織貫通器１６、１８が生体導管の壁の所望の層に入った後、流体を、中央カテーテル
構成要素２０内の流体送達管腔４４、４６を通り、スプライン１２、１４の対上の流体送
達導管３２、３４を通り、組織貫通器１６、１８を通って送達することができる。流体の
送達が完了すると、操作者は、機械的連結部５４を使用して（遮蔽構成要素とも称され得
る）外側カテーテル構成要素２２を、中央カテーテル構成要素２０にわたって、およびス
プライン１２、１４の対にわたってガイド先端部４０に向かって前方に移動させる。外側
カテーテル構成要素２２がスプライン１２、１４の対にわたって前方に移動するとき、外
側カテーテル構成要素２２の内部のジッパトラック５６は、スプライン１２、１４の対上
のレール３６、３８を通過して、スプライン１２、１４を移動させてその非拘束の曲がっ
た形状からその拘束形状に戻す。外側カテーテル構成要素２２が対のスプライン１２、１
４にわたって完全に進められ、ガイド先端部４０と再度係合するとき、外側カテーテル構
成要素２２内のジッパトラック５６は、スプライン１２、１４をその拘束形状に保持する
。デバイスは、次いで、その生体導管または別の生体導管の別の場所における解放のため
に再配置する、あるいは体内から引っ込めることができる。
【０２２８】
スプライン１２、１４の形状および長さは、デバイスの様々な実施形態を、様々なサイ
ズまたは直径を有する生体空間または生体導管内で使用することができるように選択され
る。特定の実施形態では、スプラインは平坦または円形でよい。平坦なスプラインは、個
々の用途に応じて、好ましくは、約０．２ｍｍ〜約２０ｍｍの範囲の幅、約０．２ｍｍ〜
約５ｍｍの範囲の高さ、および約１０ｍｍ〜約２００ｍｍの範囲の長さを有する。円形の
スプラインは、個々の用途に応じて、好ましくは、約０．２ｍｍ〜約２０ｍｍの範囲の直
径および約１０ｍｍ〜約２００ｍｍの範囲の長さを有する。特有の実施形態では、平坦な
スプラインは、幅３．５ｍｍ〜５ｍｍ、５ｍｍ〜１０ｍｍ、１０ｍｍ〜１５ｍｍ、１５ｍ
ｍ〜２０ｍｍまたはその中の任意の範囲（例えば３．５ｍｍ〜１０ｍｍ）、高さ３．５ｍ
ｍ〜５ｍｍ、５ｍｍ〜１０ｍｍ、１０ｍｍ〜１５ｍｍ、１５ｍｍ〜２０ｍｍまたはその中
の任意の範囲（例えば３．５ｍｍ〜１０ｍｍ）、および長さ１０ｍｍ〜２０ｍｍ、２０ｍ
ｍ〜４０ｍｍ、４０ｍｍ〜８０ｍｍ、８０ｍｍ〜１２０ｍｍ、１２０ｍｍ〜１５０ｍｍも
しくは１５０〜２００ｍｍまたはその中の任意の範囲（例えば１０ｍｍ〜４０ｍｍ）のも
のであり、あるいは前述の任意の順列（例えば５ｍｍ〜１０ｍｍの幅、３．５〜５ｍｍの
高さ、および２０〜４０ｍｍの長さ）である。他の実施形態では、円形スプラインは、直
径３．５ｍｍ〜５ｍｍ、５ｍｍ〜１０ｍｍ、１０ｍｍ〜１５ｍｍ、１５ｍｍ〜２０ｍｍま
たはその中の任意の範囲（例えば３．５ｍｍ〜１０ｍｍ）、および長さ１０ｍｍ〜２０ｍ
ｍ、２０ｍｍ〜４０ｍｍ、４０ｍｍ〜８０ｍｍ、８０ｍｍ〜１２０ｍｍ、１２０ｍｍ〜１
５０ｍｍもしくは１５０〜２００ｍｍ、またはその中の任意の範囲（例えば１０ｍｍ〜４
０ｍｍ）のものであり、あるいは前述の任意の順列（例えば５ｍｍ〜１０ｍｍの直径およ
び２０〜４０ｍｍの長さ）である。
【０２２９】
図２７に示す第２の特有の実施形態では、本発明のデバイスは、長手方向軸１１３を備
えた細長い長手部分を有する中央カテーテル構成要素１１２と、この特有の実施形態では
、中央カテーテル構成要素１１２の遠位部分から延びる組織貫通器の先進（ｐｒｅｓｅｎ
ｔａｔｉｏｎ）チューブ１１４、１１６として形成される１つまたは複数（好ましくは２
つ）の可撓性の弾性アクチュエータとを備える流体送達カテーテル１１０である。組織先
進チューブ１１４、１１６の少なくとも一部分は、カテーテル組立体の中央の長手方向軸
１１３にほぼ平行に向けられる拘束形状と、カテーテルの中央の長手方向軸１１３にほぼ
非平行に向けられる非拘束形状との間で移動可能である。
【０２３０】
カテーテルは、さらに、２本の組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６を通って延び
る１つまたは複数（好ましくは２つ）の可撓性の細長い組織貫通器１１８、１２０と、中
央カテーテル構成要素１１２、組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６、および中間レ
ール１３２の長手部分にわたって延びる外側展開チューブ１２２とを備える。
【０２３１】
中央カテーテル構成要素１１２および外側展開チューブ１２２は、カテーテルを構築す
るのに適した任意の材料から構築されてよい。そのような材料の例としては、それだけに
限定されないが、シリコーン、ポリウレタン、ナイロン、ダクロン、およびＰＥＢＡＸ（
商標）が挙げられる。
【０２３２】
組織貫通器１１８、１２０は、それぞれのハブ１６６、１６８に連結する（図３１）。
組織貫通器１１８、１２０の対の１つまたは複数は、好ましくは、約０．２ｍｍ（３３ゲ
ージ）〜約３．４ｍｍ（１０ゲージ）、より好ましくは０．８ｍｍ〜１．３ｍｍ（約１８
〜２１ゲージ）の直径を有する。組織貫通器の対の１つまたは複数は、標準的な面取部、
短い面取部、または真に短い面取部を有することができる。組織貫通器１１８、１２０の
対は、好ましくは、組織貫通器がその長手部分に沿って可撓することを可能にする材料か
ら構築される。そのような材料の例としては、それだけに限定されないが、ニッケル、ア
ルミニウム、鋼、およびそれらの合金が挙げられる。特有の実施形態では、組織貫通器は
、ニチノールから構築される。組織貫通器１１８、１２０の全長は、単一の材料から構築
することができ、あるいは組織貫通器１１８、１２０の、先端部１５６、１５８を含む遠
位端部（例えば遠位１ｍｍ〜遠位２０ｍｍ）を１つの材料から構築し、異なる材料、例え
ばプラスチックなどから構築されたチュービングを介してそれぞれのハブ１６６、１６８
に連結させてよい。
【０２３３】
組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の対の１つまたは複数は、好ましくは、可撓
性の弾性材料から構築される。そのような可撓性の弾性材料は、例えば組織貫通器の先進
チューブ１１４、１１６が、図２７の真っすぐな拘束形状にあるときに変形することがで
きるが、変形力が除去されたとき、例えば組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６が、
図２８に示す湾曲した非拘束形状にあるときにその元の形に戻る。それだけに限定されな
いが、外科用鋼、アルミニウム、ポリプロピレン、オレフィン材料、ポリウレタンおよび
他の合成ゴムまたはプラスチック材料を含む、任意のそのような可撓性の弾性材料が使用
され得る。組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の対は、最も好ましくは形状記憶材
料から構築される。そのような形状記憶材料の例としては、それだけに限定されないが、
銅−亜鉛−アルミニウム−ニッケル合金、銅−アルミニウム−ニッケル合金、およびニッ
ケル−チタン（ＮｉＴｉ）合金が挙げられる。好ましい実施形態では、形状記憶材料はニ
チノールである。
【０２３４】
中央カテーテル構成要素１１２は、向かい合わせの近位端部１２４および遠位端部１２
６を備えた可撓性の細長い長手部分を有する（図２７）。中央カテーテル構成要素の遠位
端部１２６は、遠位端部１２６を生体導管内で誘導する外形の形状を有するガイド先端部
として形成される。中間レール１３２内のガイドワイヤ孔１２８が、中央カテーテル１１
２の中心を通って近位端部１２４から遠位端部１２６まで延びる。ガイドワイヤ孔１２８
は、可撓性の細長いガイドワイヤ１３０を受け入れて、孔１２８をそのワイヤにわたって
滑動移動させるようにする（図２９）。ガイドワイヤ１３０は、カテーテル組立体を生体
導管内で誘導するために使用される。特定の実施形態では、ガイドワイヤ１３０は、例え
ばステンレス鋼または超弾性ニチノールなどのソリッドコアを有する。ガイドワイヤは、
任意選択で、その全体またはその遠位部分（例えば最遠位１ｍｍ〜２５ｍｍまたは最遠位
１ｍｍ〜３ｍｍ）をＸ線不透過性材料から構築してよい。ガイドワイヤ１３０は、任意選
択で、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）などの医学的に不活性なコーティング剤でコーティング
されてよい。他の実施形態では、カテーテル組立体は、迅速交換カテーテル組立体であり
、この場合、ガイドワイヤは、ガイド先端部１２６の遠位端部上に配置され、そこから延
びている。
【０２３５】
ガイドワイヤ孔１２８を取り囲む狭小の中間レール１３２は、カテーテル遠位端部１２
６のガイド先端部からカテーテル近位端部１２４に向かって延びる。中間レール１３２は
、ガイド先端部１２６を中央カテーテル構成要素の基部部分１３８に連結する。
【０２３６】
中央カテーテル構成要素の基部部分１３８は、基部部分の長手部分全体に沿って延びる
円筒状の外面を有する。基部部分１３８は、中央カテーテル構成要素１１２の総長さの大
部分に沿って延びる。図２９に示すように、ガイドワイヤ孔１２８は、中央カテーテル構
成要素の基部部分１３８の中心を通って延びる。加えて、１対の組織貫通器の管腔１４０
、１４２もまた、中央カテーテル構成要素の基部部分１３８の長手部分を通ってガイドワ
イヤ孔１２８と平行に延びる。中央カテーテル構成要素の近位端部１２４においては、１
対のポート１４４、１４６が、管腔１４０、１４２の対を中央カテーテル構成要素１１２
の外側と連通させる（図２７）。
【０２３７】
代替の実施形態では、図２７の医療デバイスはまた、組織貫通器の先進チューブとして
形成された単一の可撓性の弾性アクチュエータと、組織貫通器の先進チューブを通って延
び、ハブに連結する単一の可撓性の細長い組織貫通器と、中央カテーテル構成要素、組織
貫通器の先進チューブ、および中間レールの長手部分にわたって延びる外側展開チューブ
とを備えることもできる。
【０２３８】
第１および第２の組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の対は、カテーテルの中央
構成要素の基部部分１３８からカテーテル遠位端部１２６に向かって突出する。組織貫通
器の先進チューブの各々は、中央カテーテル構成要素の基部部分１３８に固定された近位
端部と、反対側の遠位端部１４８、１５０とを有する狭小の細長いチューブとして形成さ
れる。第１および第２の組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の各々は、中央カテー
テル構成要素の基部部分１３８内の第１の組織貫通器の管腔１４０および第２の組織貫通
器の管腔１４２それぞれと連通する内部孔１５２、１５４を有する。
【０２３９】
図２９および３０に示すように、組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の外側形状
は、組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の長手部分が中間レール１３２の両側に隣
り合って配置され得るように中間レール１３２に合わせられている。組織貫通器のチュー
ブの遠位端部１４８、１５０は、カテーテルが血管系を通って通過することも容易にする
ガイド先端面として形成することができる。組織貫通器のチューブの遠位端部１４８、１
５０は、好ましくは、組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６より大きい直径のもので
ある。特有の実施形態では、組織貫通器チューブの遠位先端部１４８、１５０は、円形の
球根状の先端部である。そのような先端部は無傷のものであり、チューブが生体導管の壁
を不注意に刺すことはない。先端部１４８、１５０は、露出されており、ガイド先端部１
２６の直径を超えて外方向に延びてはいない。
【０２４０】
組織貫通器チューブ１１４、１１６の各々は、好ましくは、ニチノールなどの形状記憶
材料から構築される。チューブ１１４、１１６は、図２８に示す湾曲した非拘束形状を有
して形成される。チューブ１１４、１１６は、チューブに対して拘束力がかけられていな
いとき、図２８に示す湾曲した非拘束形状に移動する。先進チューブ１１４、１１６が中
間レール１３２に沿って真っすぐな拘束形状に位置するには、チューブを図２７に示すそ
の真っすぐな拘束位置に保つために、チューブに拘束力をかけなければならない。チュー
ブ１１４、１１６の各々が、図２８に示すその真っすぐな拘束形状から図２８に示すその
湾曲した非拘束形状に移動するとき、チューブを通って延びる組織貫通器孔１５２、１５
４もまた、真っすぐな形状から湾曲した形状に移動する。
【０２４１】
組織貫通器１１８、１２０の対のその遠位先端部からハブ１６６、１６８までは、中央
カテーテルの基部部分１３８を通って延びる組織貫通器の管腔１４０、１４２の長さおよ
び組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６を通って延びる組織貫通器孔１５２、１５４
の長さの組合せよりもわずかに長い長さを有する。組織貫通器１１８、１２０の先端部１
５６、１５８は、組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の遠位端部１４８、１５０に
隣接して配置され、チューブの孔１５２、１５４内側で図２７の拘束形状で配置される。
組織貫通器１１８、１２０の反対側の近位端部は、中央カテーテル１１２の側部ポート１
４４、１４６を貫通して外に突出する。組織貫通器１１８、１２０の対は、中央カテーテ
ル構成要素１１２の組織貫通器の管腔１４０、１４２および組織貫通器の先進チューブ１
１４、１１６の組織貫通器孔１５２、１５４を通って容易に滑動するように寸法設定され
る。中央カテーテル構成要素１１２の側部ポート１４４、１４６は、好ましくは、中央カ
テーテルの近位端部１２４に対して２０°〜９０°の角度にあり、最も好ましくは中央カ
テーテル近位端部１２４に対して３０°〜６０°の角度にある。
【０２４２】
手動による操作者の運動を線形運動にする１対の制御器１６２、１６４が、組織貫通器
１１８、１２０の近位端部に連結され、中央カテーテルポート１４４、１４６に固定され
得る（図３１）。制御器１６２、１６４は、操作者の運動を、中央カテーテル組織貫通器
の管腔１４０、１４２を通り、組織貫通器の先進チューブ孔１５２、１５４を通って組織
貫通器１１８、１２０の制御された線形運動に変換するように構築することができる。１
つの実施形態では、一方方向に手動で移動させることができる回転式制御器１６２、１６
４が存在し、その結果、組織貫通器の遠位端部にある組織貫通器の注入先端部１５６、１
５８は、組織貫通器のチューブの遠位端部１４８、１５０にある組織貫通器のチューブ孔
１５２、１５４から出て所望の長さだけ延びるように調整可能に配置させることができる
。制御器を反対方向に回転させることにより、組織貫通器１１８、１２０は、後退して組
織貫通器チューブ孔１５２、１５４内に戻ることができる。操作者の運動を線形運動にす
る制御器１６２、１６４の各々には、組織貫通器１１８、１２０を通って延びる内部孔と
連通し、診断用または治療用の作用物質の溶液を含有する注射器またはチュービングを連
結するために使用され得るハブ１６６、１６８を設けることができる。
【０２４３】
外側展開チューブ１２２は、中央カテーテル１１２、組織貫通器の先進チューブ１１４
、１１６、および中間レール１３２を取り囲む管状の長手部分を有する。展開チューブ１
２２は、図２７に示すように、展開チューブの開放遠位端部１７２が組織貫通器の先進チ
ューブ１１４、１１６の遠位端部１４８、１５０に隣接して配置される展開チューブ１２
２の前方位置、および図２８に示すように、チューブ遠位端部１７２が組織貫通器の先進
チューブ１１４、１１６と中央カテーテル構成要素１１２の連結部に隣接して配置される
、展開チューブ１２２の後方位置へと滑動移動するように、中央カテーテル構成要素１１
２および組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の対上に装着することができる。展開
チューブ１２２の反対側の近位端部１７４には、中央カテーテル１１２との機械的連結部
１７６を設けることができる。機械的連結部１７６は、展開チューブ１２２を中央カテー
テル１１２および組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６に対してその前方位置と後方
位置の間を移動させることを可能にする（図２７および２８）。そのような連結は、展開
チューブ１２２を中央カテーテル１１２および先進チューブ１１４、１１６に対して移動
させるように手動で作動可能である、サムホイール、滑動連結、トリガまたはプッシュボ
タン、あるいは何らかの他の連結部によって提供することができる。展開チューブ１２２
が、図２７に示すその前方位置に移動されたとき、チューブ遠位端部１７２は、組織貫通
器の先進チューブ１１４、１１６の長手部分を通過し、先進チューブを中央カテーテルの
中間レール１３２の両側に沿って延びるその拘束位置まで移動させる。展開チューブ１２
２が図２８に示すその後方位置に移動されたとき、展開チューブの遠位端部１７２は、組
織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の長手部分にわたって後退し、先進チューブ１１
４、１１６が、その拘束エネルギーを解放し、図２８に示すその湾曲した非拘束形状に移
動することを除々に可能にする。
【０２４４】
カテーテル１１０の使用時、展開チューブ１２２は、図２７に示す前方位置にある。ガ
イドワイヤ１３０は、知られた方法で（動脈または静脈などの）生体導管内に配置される
。カテーテルは、次いで、ガイドワイヤにわたって生体導管内に進められる。ガイドワイ
ヤ１３０は、生体導管から延び、中央カテーテル構成要素の遠位端部１２６に入ってガイ
ドワイヤ管腔１２８を通る。ワイヤ１３０は、中央カテーテル１１２の長手部分を通って
通過し、カテーテルポート１４４、１４６に隣接する中央カテーテル構成要素の近位端部
に現れ、ここでは、ガイドワイヤ１３０を手動で操作することができる。
【０２４５】
カテーテル１１０は、生体導管を通って進められ、ガイドワイヤ１３０によって誘導さ
れ得る。任意選択で、生体導管内の組立体の位置を監視するために、Ｘ線不透過性マーカ
ーを組立体上に設けることができる。電磁波放射の通過を防止するものであればどのよう
な材料も、Ｘ線不透過性として考慮され、使用することができる。有用なＸ線不透過性材
料としては、それだけに限定されないが、白金、金または銀が挙げられる。Ｘ線不透過性
材料は、先端部１２６のすべてまたは一部の表面上、先進チューブ１１４、１１６のすべ
てまたは一部上、組織貫通器１１８、１２０のすべてまたは一部上、ガイドワイヤ１３０
上、または上述の構造の任意の組合せ上にコーティングすることができる。代替的に、Ｘ
線不透過性材料のリングを、先端部１２６に取り付けることができる。組立体には、任意
選択で、血管内超音波または光学コヒーレンストモグラフィーなどの内蔵の画像処理を設
けることができる。組立体の先端部には、任意選択で、組立体の位置または周囲の生体導
管の特徴を決定するのに有用である光学素子を設けることができる。組立体が所望の位置
にあるとき、外側展開チューブ１２２は、機械的連結部１７６の手動操作によって、図２
７に示すその前方位置から図２８に示すその後方位置に向かって移動させることができる
。
【０２４６】
展開チューブ１２２が組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の対からそれにわたっ
て引っ込められるとき、組織貫通器の先進チューブ１１４、１１６の拘束エネルギーが解
放され、チューブは、図２８に示すその非拘束の湾曲した形状に向かって移動する。この
移動により、組織貫通器チューブの遠位端部１４８、１５０にある組織貫通器孔１５２、
１５４が、組立体１１０が中に挿入された生体導管の内面に押し付けられて配置される。
【０２４７】
次いで、組織貫通器の遠位端部１５６、１５８を、組織貫通器の先進チューブの遠位端
部１４８、１５０にある組織貫通器孔１５２、１５４から延ばすために、操作者の運動を
線形運動にする制御器１６２、１６４を手動で作動させることができる。操作者の運動を
線形運動にする制御器１６２、１６４の各々には、制御器１６２、１６４が回転するとき
、組織貫通器のチューブ端部１４８、１５０からの組織貫通器の先端部１５６、１５８の
突出度を視覚的に表示するゲージを設けることができる。制御器はまた、組織貫通器の移
動の増分的な距離段階を表示するためのクリッキングなどの可聴音または触覚的感触を提
供することもできる。このため、組織貫通器の先端部１５６、１５８は、所望の距離だけ
生体導管の壁内へと展開される。
【０２４８】
第３の特有の実施形態では、本発明の医療デバイスは、可撓性の弾性材料から構築され
た１つまたは複数の組織貫通器を備える流体送達カテーテルである。特定の態様では、本
発明の医療デバイスは、中央の長手方向軸を有し、１つまたは複数の組織貫通器を備え、
この場合、１つまたは複数の組織貫通器は、前記１つまたは複数の組織貫通器の長手部分
が前記医療デバイスの長手方向軸にほぼ平行に向けられる拘束形状、および前記１つまた
は複数の組織貫通器の長手部分の少なくとも一部分が、デバイスの中央の長手方向軸にほ
ぼ非平行に向けられる非拘束形状で存在することができる。デバイスが生体導管の壁に隣
接して標的部位に配置された後、１つまたは複数の組織貫通器（所望であれば、組織貫通
器のすべて）は、拘束形状から解放され、非拘束形状をとることが可能になり、それによ
り生体導管の壁と接触することができる。１つまたは複数の組織貫通器は、任意の形状の
ものでよく、好ましい実施形態では、１つまたは複数の組織貫通器の拘束形状から非拘束
形状の移動は、デバイス操作者が、デバイスまたは標的組織にいかなる変形力を与えるこ
となく拘束力を解放した際に行われる。
【０２４９】
好ましい実施形態では、組織貫通器は、可撓性の弾性材料から構築され、この材料は、
拘束力をかけた際、例えば組織貫通器が拘束形状にあるときに拘束されることが可能であ
り、拘束力が除去されたとき、例えば組織貫通器が非拘束形状にあるときにその元の非拘
束の形をとる。それだけに限定されないが、外科用鋼、アルミニウム、ポリプロピレン、
オレフィン材料、ポリウレタン、および他の合成ゴムまたはプラスチック材料を含む任意
のそのような可撓性の弾性材料が使用され得る。１つまたは複数の組織貫通器は、最も好
ましくは形状記憶材料から構築される。そのような形状記憶材料の例としては、それだけ
に限定されないが、銅−亜鉛−アルミニウム−ニッケル合金、銅−アルミニウム−ニッケ
ル合金、およびニッケル−チタン（ＮｉＴｉ）合金が挙げられる。好ましい実施形態では
、形状記憶材料はニチノールである。好ましい実施形態では、組織貫通器が非拘束形状を
とるとき、各組織貫通器が形成される材料の形状記憶特性により、組織貫通器は、いかな
る外側からの変形力をかけることなく、医療デバイスの長手方向軸にほぼ平行な位置から
医療デバイスの長手方向軸にほぼ垂直な位置へと移動する。
【０２５０】
好ましい実施形態では、組織貫通器は、組織貫通器を取り囲む管状形状を有する外側カ
テーテル構成要素によって拘束形状に維持される。外側カテーテル構成要素と、組織貫通
器が取り付けられる中央カテーテル構成要素との間には、機械的連結部が設けられる。機
械的連結部は、外側カテーテル構成要素を中央カテーテル構成要素の長手部分に沿って後
方向に移動させることを可能にし、それにより拘束された１つまたは複数の組織貫通器を
露出させ、１つまたは複数の組織貫通器が、それらが標的送達部位と接触する、非拘束形
状をとることを可能にする。この特有の実施形態は、デバイスの配置を容易にするための
Ｘ線不透過性マーカー、あるいはデバイスの使用を容易にするための迅速交換特徴を組み
込むように簡単に適合され得ることを当業者は理解するはずである。
【０２５１】
本発明の医療デバイスは、その様々な実施形態では、血管壁の異なる層内への流体の送
達を可能にする。血管壁は、数多くの構造および層からなり、その構造および層は、内皮
層および基底膜層（まとめて内膜層）、内弾性板、内側層、および外膜層を含む。これら
の層は、米国特許出願公報第２００６／０１８９９４１Ａ１号に記載されるように、内皮
が血管腔に曝され、基底膜、内膜、内弾性板、内側および外膜がそれぞれ、内皮の上方に
次々と重ねられるように構成されている。本発明の医療デバイスの場合、組織貫通器の先
端部１５６、１５８が標的部位内に貫通することができる深さは、制御器１６２、１６４
を回転させることによって制御することができる。例えば標的層が外膜層である場合、チ
ューブ１１４、１１６の拘束エネルギーは解放され、チューブは、図２８に示すその非拘
束の湾曲した形状をとり、組織貫通器の先端部１５６、１５８は、制御器によって外膜層
の深さまで貫通するのに十分な長さまで進められる。同様に、標的部位が内側層である場
合、チューブ１１４、１１６の拘束エネルギーは解放され、チューブは、図２８に示すそ
の非拘束の湾曲した形状をとり、組織貫通器の先端部１５６、１５８は、制御器によって
内側層の深さまで貫通するのに十分な長さまで進められる。
【０２５２】
組織貫通器が生体導管の壁の所望の層に埋め込まれると、次いで、流体を組織貫通器１
１８、１２０を通して送達することができる。流体の送達が完了すると、制御器１６２、
１６４を作動させて組織貫通器の先端部１５６、１５８を引っ込めて組織貫通器の先進チ
ューブ１１４、１１６の内部孔１５２、１５４内に戻すことができる。展開チューブ１２
２は、次いで、展開チューブの遠位端部１７２が組織貫通器の先進チューブ１１４、１１
６を移動させて図２７に示すその拘束位置に戻すその前方位置まで移動することができる
。展開チューブ１２２が図２７に示すその完全な前方位置に移動されると、次いで、組立
体を再配置させる、または本体から引っ込めることができる。
【０２５３】
本発明の医療デバイスはまた、生体導管の壁の内側または生体導管の壁内の血小板沈着
（plaque deposits）への流体の送達も可能にする。
【０２５４】
本発明の医療デバイスはまた、生体導管の外壁の外側に配置された細胞外空間または組
織（例えば血管の外面または心筋などの血管の外側表面に対して配置された筋肉）への流
体の送達も可能にする。
【０２５５】
本発明のデバイスの１つの有利な利点は、アクチュエータが、その設計により、生体導
管内のその展開後に、生体導管の内壁と、その全周囲未満で接触することである。好まし
い実施形態では、アクチュエータは、それらが中で展開される生体導管の内壁と、その周
囲の１００％未満で接触する。より好ましくは、アクチュエータは、それらが中で展開さ
れる生体導管の内壁と、その周囲の７５％、５０％、または２５％未満で接触する。最も
好ましくは、アクチュエータは、それらが中で展開される生体導管の内壁と、その周囲の
１０％、５％、２．５％、１％、０．５％または０．１％未満で接触する。
【０２５６】
デバイスは、様々な治療用および／または診断用の作用物質を含む流体を生体導管の壁
に送達するために使用することができる。治療用作用物質としては、それだけに限定され
ないが、タンパク質、化学物質、小分子、細胞および核酸が挙げられる。デバイスによっ
て送達される治療用作用物質は、微小粒子またはナノ粒子を含む、微小粒子またはナノ粒
子と錯体を形成する、あるいは微小粒子またはナノ粒子と結合させることができる。タン
パク質作用物質は、エラスターゼ、抗増殖剤、および血管攣縮を阻害する作用物質を含む
。デバイスを使用したエラスターゼの送達が、詳細に企図される。いくつかの公開された
特許出願（ＷＯ２００１／２１５７４、ＷＯ２００４／０７３５０４、およびＷＯ２００
６／０３６８０４）では、エラスターゼは、単独および他の作用物質と組み合わせて、生
体導管の閉塞および血管攣縮を含む生体導管の疾患の治療に有益であることを教示してい
る。診断用作用物質としては、それだけに限定されないが、コントラスト、微小粒子、ナ
ノ粒子または他の造影剤が挙げられる。
【０２５７】
様々な異なる流体送達方法を、本デバイスによって実践することができる。特定の用途
では、異なる流体を、同時にまたは連続してデバイスの各組織貫通器を通して送達するこ
とができる。他の用途では、同じ流体を、同時にまたは連続して両方の組織貫通器を通し
て送達することができる。第１の流体を両方の組織貫通器を通して送達し、その後第２の
流体を両方の組織貫通器を通して送達する実施形態および／または方法もまた、企図され
る。
【０２５８】
デバイスを使用して流体を生体導管の壁内にまたはそこを貫通させて送達する方法もま
た、詳細に企図される。これらの方法は、デバイスを生体導管内に導入するステップと、
デバイスを導管内の標的部位まで進めるステップと、アクチュエータをその拘束位置から
解放するステップと、任意選択で、生体導管の壁内に所望の深さだけ貫通するように組織
貫通器をアクチュエータ内の管腔を通して進めるステップと、少なくとも１つの流体を壁
内にまたはそこを貫通させて送達するステップと、任意選択で、組織貫通器をアクチュエ
ータの管腔内に戻すステップと、アクチュエータをその拘束位置まで後退させるステップ
と、所望の場合の追加の流体の送達のためにデバイスを同じまたは異なる導管に再配置す
るステップと、デバイスを導管から取り除くステップとを含む。
【実施例】
【０２５９】
６．実施例
本節は、例えば血管の径を拡張し、それにより血管の内腔を拡張するための作用物質と
して、臨床使用のための組換えＩ型エラスターゼを作製する方法を記載する。ヒトＩ型膵
臓エラスターゼは、ブタＩ型膵臓エラスターゼの全長と８９％のアミノ酸同一性を示し、
「触媒トライアッド（triad）」と基質特異性決定残基は完全に保存されている。ブタＩ
型エラスターゼは、４つの内部ジスルフィド結合を含み、およびグリコシル化がない成熟
酵素を生じさせるために、トリプシンによって活性化される酵素的に不活性なプロ酵素と
して初期には合成される（Ｓｈｏｔｔｏｎ、１９７０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ
１９：１１３−１４０、Ｅｌａｓｔａｓｅ；ならびに、ＨａｒｔｌｅｙおよびＳｈｏｔ
ｔｏｎ、１９７１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２４（２）：２８９−２９９、Ｐａｎｃｒｅ
ａｔｉｃ  Ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ３：３２３−３７３およびそれ
に含まれる参考資料を参照されたい）。
【０２６０】
以下の実施例は、非臨床研究および臨床研究用、ならびに市販の製薬的使用のこれらの
酵素のｃＧＭＰ製造に適した、効果的であり、測定可能な組換えブタおよびヒトＩ型エラ
スターゼ発現および精製スキームの開発を示す。成熟ブタエラスターゼは、名称ＰＲＴ−
１０２が付けられている。成熟ヒトＩ型エラスターゼは、名称ＰＲＴ−２０１が付けられ
ている。
【０２６１】
６．１  用語および省略形
本明細書中で使用するとき、用語ＰＲＴ−１０１、ＰＲＴ−１０２、ＰＲＴ−２０１、
およびプロＰＲＴ−２０１は下記を意味する：
ＰＲＴ−１０１：ブタ膵臓エラスターゼ。他に指示がない限り、本実施例で使用される
ブタ膵臓エラスターゼは、Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ
、ミズーリ州オーエンズビルからカタログ＃ＥＣ１３４として購入される高度に精製され
たブタ膵臓エラスターゼである。
ＰＲＴ−１０２：成熟組換えＩ型ブタ膵臓エラスターゼ。記号表示「ｐＰＲＯＴ１０１
−ＸＸＸ」のベクターはＰＲＴ−１０２をコードすることに留意されたい。
ＰＲＴ−２０１：成熟組換えＩ型ヒト膵臓エラスターゼ。
プロＰＲＴ−２０１：プロペプチド配列を含む組換えヒトＩ型膵臓エラスターゼのプロ
酵素形態。
【０２６２】
以下の省略形は、本明細書の第６節で使用される：
ＢＫＧＹ：緩衝化されたグリセロール複合体培地
ＢＫＭＥ：緩衝化されたメタノール複合体培地
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
ＥＬＡ−１：Ｉ型膵臓エラスターゼ
ＨＥＫ：ヒト胎児腎臓
ｈＥＬＡ−１：ヒトＥＬＡ−１
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＭＢＰ：マルトース結合タンパク質
ｐＥＬＡ−１：ブタＥＬＡ−１
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＭＳＦ：フッ化フェニルメチルスルホニル
ＲＰ：逆相
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
ＵＳＰ：米国薬局方
ＹＰＤＳ：酵母抽出ペプトンデキストロースソルビトール培地
【実施例１】
【０２６３】
６．２  エラスターゼＤＮＡ合成
ヒトエラスターゼ−１コード配列を米国特許第５，１６２，２０５号（Ｔａｋｉｇｕｉ
ｃｈｉら、１９９２）から得た。いくつかの配列変化は、発現ベクターへのクローニング
を促進するために行われた（図１Ａ）。アミノ酸残基が変化しないように、塩基変化は遺
伝子コードの縮重の範囲であった。第２の終止コドンは、潜在的なリボソームの読み終わ
りを最小にするため天然の停止コドンの直後に付与された。
【０２６４】
修飾されたコード配列は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ワシ
ントン州ボセル）によって、Ａｍｇｅｎ（カリフォルニア州サウザンドオークス）から許
可を受けた非ＰＣＲ「長鎖オリゴ」技術を用いて合成された。組換えＤＮＡはＥＬＡ−１
．２Ａ（配列番号８１）と命名され、ｐＵＣ１１９由来のベクターＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ
ｐＵＣにクローニングされ、得られたプラスミドをｐＰＲＯＴ１と命名した。ｐＰＲＯ
Ｔ１は両鎖について配列決定され、正しい配列であることを確かめた。両鎖の広範な重複
のある高品質の配列決定データは、各鎖に対して少なくとも１つの反応を有する最低４つ
の配列決定反応によってカバーされる全配列の全体で明確な塩基の帰属を可能にした。
【実施例２】
【０２６５】
６．３  大腸菌におけるＰＲＴ−２０１の発現
可溶性であり、酵素的に活性なヒトエラスターゼを大腸菌において得ようとして、種々
の発現戦略を試みた。
【０２６６】
１セットの大腸菌発現ベクターは、読み枠で、ヒトＩ型膵臓エラスターゼ（ＥＬＡ−１
）と、順にＮ末端の分泌ペプチドに融合されているマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）
のカルボキシ末端の融合を含む。ヒトＥＬＡ−１成熟およびプロ酵素のコード配列は共に
、プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２Ｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、
マサチューセッツ州ベバリー）のＭＢＰコード配列への読み枠のＣ末端融合としてクロー
ニングされ、ｐＰＲＯＴ３（成熟ＥＬＡ−１）またはｐＰＲＯＴ５（ＥＬＡ−１プロ酵素
）を生じさせた。ｐＰＲＯＴ３の構築は、成熟ＥＬＡ−１のＮ末端バリンコドンのＳｎａ
ＢＩ部位、および成熟ＥＬＡ−１終止コドンに対して３’に位置したＨｉｎｄＩＩＩ部位
を有する６．６ｋｂの成熟ヒトＥＬＡ−１をコードする断片をＰＣＲ突然変異誘発によっ
て最初に得ることによって達成された。このＰＣＲ突然変異誘発は、ＥＬＡ−１．２Ａコ
ード配列（配列番号８１）を含むｐＰＲＯＴ１鋳型と、２つのオリゴヌクレオチドプライ
マー（５’ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣＣ
、配列番号７５；および５’ｇｔｃ  ｇａｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ａｔｃ  ａｇｔ  ｔｇｇ
ａｇｇ  ｃｇａ  ｔ、配列番号７６）を使用した。得られた６．６ｋｂのＰＣＲ断片を
単離し、ＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、ＸｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
消化したｐＭＡＬ−ｐ２Ｇベクターにクローニングし、ｐＰＲＯＴ３を生じさせた。ｐＰ
ＲＯＴ５の構築は、ｐＰＲＯＴ１からのＳｃａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をクローニングし
、ＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＭＡＬ  ｐ２Ｇベクターにライゲート
することによって達成された。得られる融合物は、ｐＰＲＯＴ５におけるｐＭＡＬ−ｐ２
ＧのＭＢＰのＣ末端にヒトＥＬＡ−１プロ酵素コード領域のＮ末端に作動的に連結してい
る。ヒトＥＬＡ−１プロタンパク質のトリプシン切断ドメインはｐＰＲＯＴ５に保存され
ている。
【０２６７】
大腸菌株ＴＢ１をｐＰＲＯＴ３およびｐＰＲＯＴ５で形質転換し、その後、ＩＰＴＧで
誘導し、融合タンパク質または酵素的に活性なヒトＥＬＡ−１のいずれかを生成すること
ができたかどうかを決定した。ｐＰＲＯＴ３の場合、生成されたＭＢＰ−ＥＬＡ−１融合
タンパク質のすべてが不溶性であった。誘導されたｐＰＲＯＴ３含有の大腸菌の浸透圧衝
撃によって得られたペリプラスム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ）材料において、可溶性およ
び酵素的に活性なＭＢＰ−ＥＬＡ−１融合タンパク質は検出されなかった。ｐＰＲＯＴ５
の場合、低レベルの可溶性組換えＭＢＰ−プロＥＬＡ−１タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅおよびクーマシー染色の使用、またはウェスタンブロットにおける抗ＭＢＰ抗体の使用
（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ベバリー）
を通じて、誘導されたｐＰＲＯＴ５含有の大腸菌の浸透圧衝撃によって得られたペリプラ
スム材料において検出することができた。可溶性組換えＭＢＰ−プロＥＬＡ−１タンパク
質をトリプシンで消化し、ＭＢＰおよび成熟ヒトＥＬＡ−１を共に生じさせることができ
た。その後、ｐＰＲＯＴ５の誘導から得られた成熟ヒトＥＬＡ−１は、ＳＬＡＰペプチド
基質を用いてエラスターゼ活性についてアッセイした。エラスターゼ活性は、ｐＰＲＯＴ
５ペリプラスム抽出物において観察された。このエラスターゼ酵素活性は、トリプシン活
性化に依存していた（すなわち、トリプシンが存在しない場合には活性は観察されず、お
よび活性量はトリプシン活性化の時間増加によって増加される）。さらに、エラスターゼ
活性はｐＰＲＯＴ５に依存していたけれども、並行してトリプシンで処理されたｐＭＡＬ
−ｐ２Ｇベクター対照抽出物において活性が観察されなかった。最後に、ｐＰＲＯＴ５エ
ラスターゼ活性は、ＰＭＳＦ（既知のセリンプロテアーゼ阻害剤）によって阻害された。
【０２６８】
その後、組換えＭＢＰ−プロＥＬＡ−１融合タンパク質を精製し、トリプシンで切断し
、酵素的に活性なｐＰＲＯＴ５由来の成熟ヒトＥＬＡ−１を得た。融合タンパク質は、最
初に、アミロースアフィニティークロマトグラフィー上で精製され、次にマルトースで溶
出された。次に、精製されたＭＢＰ−プロＥＬＡ−１を固定化トリプシンで処理した。ト
リプシン活性化工程後、切断されたＭＢＰ−プロＥＬＡ−１を陽イオン系ＳＰセファロー
スクロマトグラフィーによって精製した。しかしながら、アフィニティー精製されたｐＰ
ＲＯＴ５由来の成熟ヒトＥＬＡ−１を用いたその後の実験によって、非常に限定された量
の可溶性であり、酵素的に活性なエラスターゼだけがｐＰＲＯＴ５を含む大腸菌から得る
ことができたことが示された。さらに、アフィニティー精製されたｐＰＲＯＴ５由来の成
熟ヒトＥＬＡ−１の比活性は非常に低く、０．２７〜０．３８Ｕ／ｍｇ（Ｕ＝１分間当た
りに加水分解されたＳＬＡＰ基質のμｍｏｌ）の範囲であった。
【０２６９】
また、大腸菌において可溶性であり、酵素的に活性なＥＬＡ−１を得る代替の戦略を続
ける。簡潔には、大腸菌のｌａｃＺアルファサブユニットの最初の８個のアミノ酸残基＋
ポリリンカーをコードした残基の５個のアミノ酸を含むタンパク質融合、その後のヒトＥ
ＬＡ−１のＮ末端プロ酵素をコードするｐＰＲＯＴ８ベクターを構築した。このベクター
は、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消化されたｐＢｌｕｅＨｅｒｏｎ  ｐＵＣ（Ｂｌｕｅ  Ｈｅ
ｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ワシントン州ボセル、米国）に、ｐＰＲＯＴ１か
らヒトＥＬＡ−１コード配列を含むＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片をライゲートすることによ
って構築された（すなわち、ＥＬＡ−１．２Ａ配列；配列番号８１を含むベクター）。
【０２７０】
大腸菌株ＥＣ１００（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィス
コンシン州マディソン）をｐＰＲＯＴ８で形質転換し、その後、ＩＰＴＧで誘導し、融合
タンパク質または酵素的に活性なヒトＥＬＡ−１のいずれかを生成することができたかど
うかを決定した。ＥＣ１００形質転換細胞の場合、生成されたｐＰＲＯＴ８由来のＬａｃ
Ｚ−ｐｒｏＥＬＡ−１融合タンパク質のすべてが不溶性であった（すなわち、封入体に見
られた）。その後、ｔｒｘＢおよびｇｏｒ遺伝子において突然変異を含む大腸菌株（Ｏｒ
ｉｇａｍｉ（商標）菌株、Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｎｔｓ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシ
ン州マディソン）をｐＰＲＯＴ８で形質転換し、これは、これらのコード配列において突
然変異を有する大腸菌株は、可溶性であり、酵素的に活性な組換えタンパク質の回復を促
進することで知られているためである。いくつかのｔｒｘＢ／ｇｏｒ大腸菌株におけるあ
る種の可溶性ｐＰＲＯＴ８由来のＬａｃＺ−ｐｒｏＥＬＡ−１融合タンパク質がＩＰＴＧ
による誘導に基づいて回復されたが、トリプシンによって酵素的に活性なヒトＥＬＡ−１
に変換することができなかった。
【実施例３】
【０２７１】
６．４  哺乳動物細胞株におけるＰＲＴ−２０１の発現
哺乳動物細胞株において可溶性であり、酵素的に活性なヒトＩ型膵臓エラスターゼ（Ｅ
ＬＡ−１）を得ようとして、いくつかの発現戦略を試みた。ＣＭＶプロモーターを含む高
コピーの哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、２つのヒ
トＥＬＡ−１エラスターゼ発現ベクターであるｐＰＲＯＴ３０およびｐＰＲＯＴ３１に対
する基幹として使用された。ｐＰＲＯＴ３０を構築するために、ヒトＥＬＡ−１プロ酵素
配列をＰＣＲによって増幅し、フォワードＰＣＲプライマーに組み込まれたブタ膵臓エラ
スターゼシグナル配列に融合した。ＰＣＲプライマーに組み込まれた制限部位を用いて、
ＰＣＲ産物を消化し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおける対応する制限部位を用いてライ
ゲートした。成熟酵素の直接的な発現の試みにおいてプロ酵素コード配列の代わりにヒト
ＥＬＡ−１成熟コード配列を使用したことを除いて、ｐＰＲＯＴ３１を同じように構築し
た。大腸菌をライゲーション反応物で形質転換し、クローンをミニプレップスクリーニン
グのために選択した。各発現ベクターの１つのクローンは、正しい挿入について期待され
た制限消化パターンに基づいて選択された。プラスミドＤＮＡは各クローンについて調製
され、発現ベクターのコード配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２７２】
哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３Ｔは、ｐＰＲＯＴ３
０およびｐＰＲＯＴ３１を用いて別々に一過性にトランスフェクトされた。数日後、細胞
培養上清を回収し、ウェスタンブロットによって、ヒトＥＬＡ−１プロタンパク質（ｐＰ
ＲＯＴ３０）または成熟タンパク質（ｐＰＲＯＴ３１）発現について解析した。抗ブタ膵
臓エラスターゼポリクローナル抗体は、ｐＰＲＯＴ３０上清中のヒトＥＬＡ−１プロタン
パク質、およびｐＰＲＯＴ３１上清中の成熟ヒトＥＬＡ−１タンパク質に対して予測され
た分子量のバンドと交差反応した。
【０２７３】
ｐＰＲＯＴ３０およびｐＰＲＯＴ３１上清は、ＳＬＡＰアッセイによってエラスターゼ
活性について解析された。ｐＰＲＯＴ３０については、上清を最初にトリプシンで処理し
、プロ酵素を成熟ＰＲＴ−２０１に変換した。ＳＬＡＰアッセイを用いていずれかのベク
ターに対する上清のいずれにおいてもエラスターゼ活性は検出されなかった。
【実施例４】
【０２７４】
６．５  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるトリプシン活性化ＰＲＴ−２０１の発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ分泌発現用のベクターであるＰＶ−１は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ
によって合成され、最初に野生型ヒトＥＬＡ−１コード配列をクローニングするために用
いられた。ＰＶ−１ベクターは、組換えタンパク質の容易なクローニング、選択および高
レベルの発現のために設計された。ベクターは、多コピー成分の直接的な選択のためにＺ
ｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子を含む。図１Ｂに示されるように、エラスターゼプロペプ
チドのＮ末端の、酵母分泌シグナル、プロペプチドおよびスペーサー配列を含む酵母α接
合型配列への融合は、培地中に発現タンパク質の分泌を可能にする。分泌されたエラスタ
ーゼプロタンパク質は、細胞ペレットから容易に分離することができ、精製に向けた実質
的な第１の工程である。さらに、組換え酵素を発現する細胞にタンパク質の誤ったフォー
ルディングまたは毒性をもたらす可能性がある成熟の活性化酵素が直接的に発現するのを
避けるために、トリプシン切断部位を含むヒトＥＬＡ−１のプロ酵素形態が発現のために
選択された。
【０２７５】
ＥＬＡ−１プロ酵素の発現を指向するための発現構築物ｐＰＲＯＴ２４−Ｖのクローニ
ングは以下のように達成された。ヒトＥＬＡ−１をコードする領域（配列番号８１）は、
ＰＣＲ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈ
ｅ、インディアナ州インディアナポリス）によって、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  ｐＵＣ  Ｅ
ＬＡ−１から増幅された。２０Ｆフォワードプライマーは、ＸｈｏＩ部位（５’−ｇｇｃ
ｔｃｇａｇａａａａｇａｇａｇｇｃｔｇａａｇｃｔａｃｔｃａｇｇａｃｃｔｔｃｃｇｇａ
ａａｃｃａａｔｇｃｃｃｇｇ−３；配列番号３５）を組み込んだ。２４Ｒプライマーは、
ＳａｃＩＩ部位（５’−ｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔｔａｔｃａｇｔｔｇｇａｇｇｃｇａｔｇ
ａｃａｔ−３’；配列番号３６）を組み込んだ。得られたＰＣＲ産物はゲル精製され、ｐ
ＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。ＥＬＡ−１クロ
ーニング配列は、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩを用いて単離され、ゲル精製され、ならびに
それらの部位でＰＶ−１ベクターにクローニングされ、ｐＰＲＯＴ２４−Ｖを得た（図３
）。
【０２７６】
ｐＰＲＯＴ２４−Ｖライゲートされた産物を大腸菌株ＴＯＰ１０において増幅した。細
胞混合物は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎで補足された低塩ＬＢプレートに配置された
。ＤＮＡプラスミドを調製し（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）、ヒトＥＬ
Ａ−１挿入物を制限消化によって同定した。ｐＰＲＯＴ２４コード配列は、複数の重複反
応により精製されたマキシプレップＤＮＡの両鎖を配列決定することによって確認された
。高品質の配列決定データは明確な塩基の帰属を可能にし、正しいコード配列を確認した
。ｐＰＲＯＴ２４−Ｖ／ＴＯＰ１０のグリセロールストックを作製し、−８０℃で保存し
た。
【０２７７】
米国農務省（ＵＳＤＡ、イリノイ州ピオリア、米国）から得た野生型ＮＲＲＬ  Ｙ−１
１４３０Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株を形質転換に使用した。ｐＰＲＯＴ２４−Ｖのプラス
ミドＤＮＡをＳａｃＩで線状にし、完全消化はアガロースゲル上で少量の反応物を流すこ
とによって確認された。エレクトロポレーションを用いて、ｐＰＲＯＴ２４−Ｖプラスミ
ドＤＮＡでＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換した。細胞混合物は、１００μｇ／ｍＬのＺ
ｅｏｃｉｎを含むＹＰＤＳプレートに配置された。３日後、コロニーが形成し始め、新鮮
なプレート上で再ストリーキング（re-streaking）のためにもう数日の間、選択された。
【０２７８】
一般に、薬物耐性形質転換体は、１Ｌのバッフル（buffled）フラスコにおいて発現の
ためにスクリーニングされた。単一コロニーを用いて、２００ｍＬのＢＫＧＹ培地に植菌
した。ＢＫＧＹ溶液の組成は以下の通りであった：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
５．０）中の１０ｇ／Ｌグリセロール、硫酸アンモニウムを含み、アミノ酸を含まない１
３．４ｇ／Ｌ酵母窒素塩基（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｇ／Ｌ大豆ペプトン、１０ｇ
／Ｌ酵母抽出物、０．４ｍｇ／Ｌビオチン。２７５ｒｐｍで振とうしながら２日間２８℃
で培養物を増殖した。６５０×ｇ、１０分間、室温で遠心分離により培養物をペレットに
した。ＢＫＭＥインキュベーション培地、ｐＨ５．０で細胞ペレットを再懸濁し、５ｍＬ
のインキュベーション培地に対して１ｇの湿潤細胞の比率でペレットを再懸濁した。５０
ｍＬの細胞懸濁液を５００ｍＬの非バッフルフラスコに入れ、細胞懸濁液とフラスコ体積
を１：１０の比率で得た。細胞は、２２℃、２７５ｒｐｍで振とうしながら１〜３日間イ
ンキュベートされた。誘導の最中に毎日２回、最終濃度が０．５％となるように誘導培地
中のメタノールを補充した。
【０２７９】
発現についてスクリーニングするために、１ｍｌの一定分量を採取し、１．５ｍＬの微
量遠心チューブに移し、微量遠心分離機で５分間、２０，０００×ｇで遠心分離した。懸
濁物を新鮮なチューブに移し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために、上
清の一定量を解凍し、還元剤ベータ−メルカプトエタノールで５体積％に補足された４×
Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合した。試料を５分間煮沸し、穏やかに遠心分離し、Ｃｒｉｔ
ｅｒｉｏｎ電気泳動システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の８〜１６％勾配のＴｒｉｓ−ＨＣｌ
プレキャストゲルに添加した。電気泳動後、ゲルをクーマシーで染色し、ヒトＥＬＡ−１
プロ酵素発現について解析した。さらなる評価のために高収率クローンとしてクローン２
０１−２４−２６６−ＶＵを選択した。２０１−２４−２６６−ＶＵグリセロールストッ
クからなる開発細胞バンクを調製し、−８０℃で保存した。
【０２８０】
クローン２０１−２４−２６６−ＶＵを用いたヒトＥＬＡ−１プロ酵素のスケールアッ
プ生産のために、一般には後述される方法に従う複数の生産工程を行った。適用可能であ
る場合、この方法におけるラン−ツー−ラン（run-to-run）変更が留意される。
【０２８１】
細胞培養について、５００ｍＬのＢＫＧＹ増殖培地を含む一連の２Ｌバッフル振とうフ
ラスコ（典型的には２０〜４０個の範囲のフラスコ）は、２５０μｌの解凍した２０１−
２４−２６６−ＶＵグリセロールストックで植菌された。培養物は、２５０〜３００ｒｐ
ｍの振とうインキュベーター中で２８℃で２日間増殖させた。２日後、遠心分離により細
胞をペレットにし、上清を廃棄した。５ｍＬの培地に対して１重量ｇの細胞の比率でＢＫ
ＭＥインキュベーション培地、ｐＨ５．０に細胞を再懸濁した。２００〜４００ｍＬの細
胞懸濁液の体積を２Ｌの非バッフルフラスコに入れ、振とうインキュベーター（２５０〜
３００ｒｐｍ）中、２２℃で３日間培養した。誘導の最中に１日２回、０．５体積％にな
るように培地中のメタノールを補充した。誘導の終わりに、振とうフラスコ培養物を遠心
分離し、細胞をペレットにした。上清を除去し、すぐに、１Ｌの真空ろ過ユニットを用い
て、０．２２μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを通して室温でろ過し、あらゆる残
った細胞残屑を除去した。最大１．５カ月、２〜８℃でろ過物を保存した。ＨＩＣ−ＨＰ
ＬＣ分析に基づいて、清澄された上清中のクローンのプロＰＲＴ−２０１−２４−２６６
−ＶＵからのヒトＥＬＡ−１プロ酵素の収量は、典型的には２００〜２５０ｍｇ／ｍＬで
あった。
【０２８２】
上清からのプロＰＲＴ−２０１−２４−２６６−ＶＵからの捕捉は次のように達成され
た。最初に、複数回ラウンドの振とうフラスコ培養物（典型的には４〜１０ラウンド）か
らの上清を合わせ（典型的には総量８〜２５Ｌ）、水で８倍に希釈し、１ＭのＨＣｌでｐ
Ｈ５．０に調整した。次に、希釈された上清は、１００ｍＬ／分（直線流７６ｃｍ／時）
の速度で、２〜８℃で、平衡化した２Ｌベッド体積のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  
Ｓイオン交換捕捉カラムに添加された。クロマトグラフィープログラムは以下の工程を含
んでいた：１．１０Ｌ（５カラム体積［ＣＶ］）の緩衝液Ａ（２０ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．０）を用いて１００ｍＬ／分（７６ｃｍ／時）でカラムを洗浄する；２．５
０ｍＭ塩化ナトリウム；２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０の最終緩衝液組成に対
して、９０％緩衝液Ａと１０％緩衝液Ｂ（５００ｍＭ塩化ナトリウム；２０ｍＭクエン酸
ナトリウム、ｐＨ５．０）の混合物の４Ｌ（２ＣＶ）を用いて１００ｍＬ／分（７６ｃｍ
／時）でカラムを洗浄する；３．１００ｍＭ塩化ナトリウム；２０ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．０の最終緩衝液組成に対して、８０％緩衝液Ａと２０％緩衝液Ｂの混合物の
６Ｌ（３ＣＶ）を用いて１００ｍＬ／分（７６ｃｍ／時）でカラムを洗浄する；４．７５
％緩衝液Ａと２５％緩衝液Ｂから開始して、６８％緩衝液Ａと３２％緩衝液Ｂまでの直線
勾配の６Ｌ（３ＣＶ）を用いて１００ｍｌ／分（１５３ｃｍ／時）でカラムを洗浄する；
５．６８％緩衝液Ａと３２％緩衝液Ｂから開始して、０％緩衝液Ａと１００％緩衝液Ｂま
での３０Ｌ（１５ＣＶ）の直線勾配を用いて１００ｍｌ／分（７６ｃｍ／時）で溶出する
。各々５００〜１０００ｍＬの分画で溶出物を回収した。
【０２８３】
典型的には、２つの主なタンパク質種をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシー染色によっ
て観察した：グリコシル化ヒトＥＬＡ−１プロ酵素および非グリコシル化ヒトＥＬＡ−１
プロ酵素であり、その後のＬＣ／ＭＳ解析によって決定され、典型的には、図４に示され
るように、約３２０ｍＭ塩化ナトリウムで溶出する。いくつかの製造過程では、ヒトＥＬ
Ａ−１プロ酵素よりもわずかに小さいタンパク質が少数種として観察された。これらの分
画のその後のＬＣ／ＭＳ解析により、大部分のタンパク質は全長のプロ酵素ではないが、
その代わりに、Ｎ末端のいくつかのアミノ酸が欠損していることが示された。これらのＮ
末端変異体を精製し、エラスターゼ活性解析に供し、それらが全長ＰＲＴ−２０１よりも
低いエラスターゼ活性を有することが示された。Ｎ末端変異体は、細胞培養および捕捉ク
ロマトグラフィー操作中に低レベルのエラスターゼ活性を示し、分子内反応を通じてそれ
自体切断するか、または分子間反応を介して別のＥＬＡ−１プロ酵素分子を切断するヒト
ＥＬＡ−１プロ酵素から生じる。これらの操作中の準最適な切断条件は、無傷の全長ＰＲ
Ｔ−２０１というよりはむしろ、大部分はＮ末端の変異体をもたらす、プロ酵素の高レベ
ルの不正確な切断（自然発生または未制御の変換とも称することがある）に至る場合があ
った。
【０２８４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の検査後、一部の分画がプールされ、さらなる処理のために精製
された非グリコシル化プロＰＲＴ−２０１を得た。グリコシル化プロ酵素もしくは全長Ｐ
ＲＴ−２０１および／またはＮ末端変異体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で同時に移動する）を含
む分画は、典型的にはプールから排除された。典型的には、プールされたプロＰＲＴ−２
０１は、プロ酵素から成熟酵素に変換する前、数時間から一晩、２〜８℃で５Ｌのプラス
チックビーカーに保存された。
【０２８５】
固定化トリプシンによるプロＰＲＴ−２０１から成熟ＰＲＴ−２０１への変換は以下の
ように達成された。プールされたプロＰＲＴ−２０１分画は、２０ｍＭリン酸ナトリウム
、ｐＨ５．０中、一晩２〜８℃で透析された。この工程は、トリプシンを阻害するクエン
酸を除去するために設けられる。透析後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．０で予め
平衡化されたアガロースビーズに固定化された組換えトリプシン（ＴｒｙｐＺｅａｎ）の
カラムにプロＰＲＴ−２０１を通過させた。典型的には、プロＰＲＴ−２０１と固定化Ｔ
ｒｙｐＺｅａｎの接触時間は３．５〜５分であった。得られた変換後の材料をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって解析し、変換を確認し、その後、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ仕
上げカラム上に添加した。カラムは、５ＣＶの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０
；２ＣＶの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０；および
３ＣＶの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０で連続し
て洗浄された。２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の１２５ｍＭ塩化ナトリウム
から１６０ｍＭ塩化ナトリウムまでの直線勾配でカラムをさらに洗浄した。２０ｍＭクエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の１６５ｍＭから５００ｍＭ塩化ナトリウムまでの直線勾
配においてＰＲＴ−２０１を溶出し、分画にして回収した。分画は、タンパク質について
はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くクーマシー染色によって解析され、エステラーゼ活性について
はＳＬＡＰアッセイによって解析された。典型的には、最大比活性を有する分画の９０％
以上の比活性を有する分画をプールした。その後のＬＣ／ＭＳ解析では、より低い比活性
を有する遅く溶出する分画は、ＰＲＴ−２０１のＮ末端変異体に富んでいることが分かっ
た。
【０２８６】
高い比活性を有するプールされた分画は、０．１×ＰＢＳ（１３．７塩化ナトリウム、
１ｍＭリン酸ナトリウム、０．２７ｍＭリン酸カリウム）から構成される調製用緩衝液中
、ｐＨ５．０で透析ろ過（diafilter）された。ＰＲＴ−２０１を１ｍｇ／ｍＬに濃縮後
、ｐＨを７．４に調整した。次に、エラストマー栓を有するガラス血清バイアルに溶液を
分注し、凍結乾燥した。典型的には、凍結乾燥は、−３０〜−５０℃の第１の乾燥サイク
ルおよび−１５℃の第２の乾燥サイクルで行われた。凍結乾燥後、バイアルは、真空下で
栓をされ、アルミニウムシールで厚着された。次に、典型的には２〜８℃または−８０℃
でバイアルを保存した。
【０２８７】
バイアル中で凍結乾燥されたＰＲＴ−２０１の安定性を評価するために、無菌ＧＭＰ製
剤に加工された２つのロットを安定性プログラムに置いた。安定性プログラムは、−１５
℃での製剤の保存、および、以下の安定性を指示する解析方法（仕様を括弧内に示す）に
よって試験するための一部のバイアルの定期的な取り出しからなる：凍結乾燥された材料
の出現（ホワイトからオフホワイトの粉末）、再溶解後の出現（粒子を含まない透明な無
色の溶液）、ＳＬＡＰアッセイによる比活性（２４〜４５Ｕ／ｍｇ）、ＲＰ−ＨＰＬＣに
よる純度（全純度：９３％以上；個々の不純物：２％以下）、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る純度（９３％以上）、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度（９３％以上）、粒子状物質
の注入（ＵＳＰに準拠する）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる凝集体（３％以下）、バイアル当
たりの含有量（４．５〜５．５ｍｇ）、ｐＨ（６．５〜８．５）、湿度（５％を超えない
）および無菌性（ＵＳＰに準拠する）。これまで、両方のロットは、試験されたすべての
時間点で指示された仕様を満たしていた（１２カ月を通じてロットＣ０８０７１１７、お
よび９カ月を通じてロットＣ１００７１３２）。これらの結果は、ＰＲＴ−２０１が、−
１５℃でバイアルに凍結乾燥され、保存された場合、少なくとも１２カ月の間は安定であ
ることを示す。
【０２８８】
プロＰＲＴ−２０１の捕捉クロマトグラフィーおよび変換ＰＲＴ−２０１の仕上げクロ
マトグラフィーの両方の最中におけるクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０の使用は、クエン
酸ナトリウムが精製されたＰＲＴ−２０１のエラスターゼ活性を阻害し、したがって、処
理操作中のプロＰＲＴ−２０１およびＰＲＴ−２０１のエラスターゼ活性も阻害し得るこ
とを示すデータに基づいていた。このような阻害は、プロＰＲＴ−２０１からＮ末端変異
体への自然変換を最小限にし、ＰＲＴ−２０１の自己分解を最小限にすることができた。
ＳＬＡＰアッセイ緩衝液が１１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含む場合の実施
形態では、ＰＲＴ−２０１の比活性は９１％まで阻害された。
【０２８９】
ある場合には、プロＰＲＴ−２０１捕捉カラムから溶出された物質は、上述されるよう
にトリプシンによる変換に供されなかったが、その代わりに、種々のタンパク質種におい
て富んだ調製物を得た。例えば、自然変換から生じた、主としてグリコシル化プロＰＲＴ
−２０１、非グリコシル化プロＰＲＴ−２０１またはタンパク質を含む分画のプールは、
捕捉カラム溶出物から作られた。典型的には、これらの分画プールは、１０ｍＭリン酸ナ
トリウム、ｐＨ５．０に透析ろ過され、凍結乾燥され、−８０℃で保存された。
【０２９０】
長期にわたる、精製されたプロＰＲＴ−２０１の安定性に対するｐＨおよび温度の効果
を決定するために研究が行われた。凍結乾燥されたプロＰＲＴ−２０１は、ｐＨが３．０
〜８．４の範囲の１０ｍＭリン酸ナトリウム中で再溶解され、続いて４℃または２５℃で
７日間、インキュベートされた。７日後、ｐＨ４．０〜８．０および２５℃の条件下にあ
るプロＰＲＴ−２０１試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって示される
ように、ｐＨの増加と共に増加する成熟ＰＲＴ−２０１に富んでいることを示した。ｐＨ
８．４と２５℃の条件下、プロＰＲＴ−２０１から成熟ＰＲＴ−２０１への完全な変換が
観察された。４℃、ｐＨ４．０〜８．４の試料は、ほとんど変換しない〜まったく変換し
ないことを示した。ｐＨ３．０では、４℃および２５℃のいずれでも変換が観察されなか
った。ブタ膵臓エラスターゼは、３．０よりも低いｐＨでの長期保存後、不可逆的に不活
性化することが文献（Ｈａｒｔｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｔｔｏｎ、１９７１、Ｐａｎｃｒ
ｅａｔｉｃ  Ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｅｎｚｙｍｅｓ  ３：３２３−３７３）において報告さ
れている。このようにして、この研究のこれらの結果に基づき、ＰＲＴ−２０１を不可逆
的に不活性にすることを避けるために、精製されたプロＰＲＴ−２０１の変換を最小限に
するために有用な条件は、４℃、ｐＨ３．０〜４．０での保存である。
【実施例５】
【０２９１】
６．６  Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける自己活性化ＰＲＴ−２０１の発現
自己活性化を可能にする変異体プロ酵素を得て、それによりトリプシン活性化の必要性
を排除するために、様々なエラスターゼ切断ドメイン変異体ベクターを構築し、小スケー
ル培養および変換実験において解析した。変異体ベクターは、ｐＰＲＯＴ２４−Ｖベクタ
ーおよびその後の誘導ベクターの部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発によって作製された。部
位特異的突然変異誘発は、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を用いて行われた。大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ菌株は、得られたプラスミドで形質
転換された。形質転換細胞の混合物は、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎを補足された低塩
ＬＢプレート上に置かれた。薬物耐性クローンを選別し、プラスミドＤＮＡを調製した（
Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）。クローンは、複数の重複反応を用いて、
プロペプチド領域におけるプラスミドＤＮＡの両鎖を配列決定することによって予期され
たコドン変化について確かめられた。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを変異体ベクターで形質転換
し、先行する実施例に記載したようにクローンを選択した。
【０２９２】
作製されたエラスターゼ切断ドメイン変異体の概要を以下の表４に与える：
【０２９３】
【表４】
2015172056.tif 000012
表4:エラスターゼ切断ドメイン変異体
【０２９４】
上記表４について、「プロペプチド配列名」の第１列リストは、指示されたエラスター
ゼ切断ドメインについての配列番号に対応する。このようにして、２４は、配列番号２４
の野生型トリプシン切断ドメインに対応する。番号４０〜４９、５２〜６３は、配列番号
４０〜４９、および５２〜６３の変異体エラスターゼ切断ドメインにそれぞれ対応する。
【０２９５】
変異体クローンを培養するために、先行する実施例に記載されたトリプシン活性化２０
１−２４−２６６−ＶＵクローンのために開発された振とうフラスコ培養条件は、一般的
には以下の通りであった。振とうフラスコの上清に分泌された変異体プロタンパク質を成
熟ＰＲＴ−２０１に変換するいくつかの方法を試験した。第１の変換戦略は、変異体プロ
酵素を最初にクロマトグラフィーにより精製し、特定の変換緩衝液中での制御された切断
からなっていた。変異体プロタンパク質におけるアミノ酸変化が、野生型プロ酵素と比較
して、理論的な等電点においてごく小さな変化をもたらすので、陽イオン交換クロマトグ
ラフィーが、一般的には、先行する実施例に記載されるように行われた。変異体クローン
培養物からの上清は、一般的には先行する実施例に記載されるように、水による希釈によ
って、または濃縮、続いて接線フローろ過を用いた、カラムローディング緩衝液への上清
の透析ろ過によって、クロマトグラフィー用に調製された。クロマトグラフィー精製後、
溶出分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くクーマシー染色によって解析された。ゲル解析は、
開始上清と比較して、分画中のプロタンパク質に対してより多量の変換された成熟タンパ
ク質を示し、かなりの量の自然なプロタンパク質変換が起こったことを指示した。続く精
製に基づいて、自然に変換したタンパク質は、ＳＬＡＰアッセイにおいてほとんどエラス
ターゼ活性がないかまたはエラスターゼ活性がまったくないことを示す、主としてＮ末端
の変異体からなることをＬＣ／ＭＳによって決定された。
【０２９６】
第２の変換戦略は、培養上清から精製する前に変異体プロタンパク質の変換、続いて成
熟酵素のクロマトグラフィー精製からなっていた。この変換戦略は、最初に小スケールア
ッセイで試験され、その後、より大きな変換体積を収容するためにスケールアップされた
。小スケール変換に関して、変換クローン培養物から清澄された上清は、典型的には、超
遠心ろ過装置において２〜８℃で遠心分離することによって５倍に濃縮された。遠心分離
後、リテンテートは、Ｔｒｉｓ緩衝液で５倍に希釈し、典型的には８．０〜９．０のｐＨ
範囲で、最終濃度を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにした。試料は、室温、ロッキングプ
ラットフォーム上でインキュベートされた。エラスターゼ活性は、典型的には活性反応速
度がプラトーに達するまで、ＳＬＡＰアッセイによって監視された。いくつかの場合では
、反応速度は非常にゆっくりと増加するので、ＳＬＡＰ監視は、プラトーが達成される前
に停止された。変換された試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、タンパク質種（例えば、
プロタンパク質およびＰＲＴ−２０１／Ｎ末端変異体）について解析された。この変換戦
略をスケールアップするために、変異体プロタンパク質を含む上清は、接線フローろ過を
用いて１０倍に濃縮され、その後、ｐＨが６．０〜９．０の範囲で１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌを用いて透析ろ過された。変換反応の進行は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析によって長
期に監視され、そこでは、プロタンパク質、ＰＲＴ−２０１、およびＮ末端種が定量され
た。透析ろ過のｐＨが８．０〜９．０である場合、一般には、変換はより高い率であった
。
【０２９７】
表５に列挙されたエラスターゼプロタンパク質は、記載されるようにＰ．ｐａｓｔｏｒ
ｉｓにおいて発現され、上記の第２の変換戦略において記載されるように小スケール変換
解析における自己変換を受けるエラスターゼプロタンパク質の能力について試験された。
それらの研究の結果を以下の表５に概説する：
【０２９８】
【表５】
2015172056.tif 000013
表5:メタノール資化酵母におけるエラスターゼプロタンパク質の発現結果
【０２９９】
上記の表５では、「プロペプチド配列名」の第１列リストは、指示されたエラスターゼ
切断ドメインについての配列番号に対応する。このようにして、２４は、配列番号２４の
野生型トリプシン活性化エラスターゼ切断ドメインに対応する。番号４０〜４９、５２〜
６３は、配列番号４０〜４９、および５２〜６３の変異体エラスターゼ切断ドメインにそ
れぞれ対応する。「振とうフラスコ収量」と表示された列は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によ
って決定された、誘導の３日間の培養上清中の対応するプロタンパク質の量に対応する。
「振とうフラスコ安定性」と表示された列は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析上で見られたＰＲＴ
−２０１／Ｎ末端変異体の量によって決定された、誘導の３日間の振とうフラスコ培地の
上清における対応するプロタンパク質の安定性に対応する。「変換速度」と表示された列
は、最大ＳＬＡＰ反応速度を達成するための時間によって指示された、ＰＲＴ−２０１に
対するプロタンパク質の変換の相対的速度に対応する（速い：６０未満；中くらい：６０
〜１２０分；遅い：１２０分を超える）。変異体プロタンパク質の変換時間経過は、上述
された小スケール変換アッセイを用いて決定され、固定化トリプシンを用いた活性化によ
って決定された２４のプロタンパク質の変換時間経過と比較された。「Ｎ末端変異体％」
と表示された列は、成熟エラスターゼタンパク質のＮ末端変異体（すなわち、Ｐ１以外の
任意の部位に対してＣ末端の結合での切断を含む変異体）を含む変換タンパク質のパーセ
ンテージを指す。表５において使用された相対的な等級法を説明するために、一部の自己
活性化された変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、変換率およびＮ末端変異体解析を図５に示す。
【０３００】
種々の変異体の解析によって、配列番号４８または配列番号５５の変異体エラスターゼ
切断ドメインを含むエラスターゼプロタンパク質は、変換に基づく、中くらい〜高い振と
うフラスコ収量と低いパーセンテージの変異体を含む優れた品質を有する自己活性化され
たエラスターゼを提供することが示された。配列番号４８または配列番号５５の変異体エ
ラスターゼ切断ドメインを含むエラスターゼプロタンパク質のさらなる解析によって、対
応するプロタンパク質（すなわち、それぞれ、配列番号６４および配列番号６９のエラス
ターゼプロ酵素）の自己活性化は、Ｐ’２残基に対してＣ末端のペプチド結合での切断を
有する、たった１種類のＮ末端変異体を生成したことが示された。エラスターゼプロタン
パク質のさらなる解析によって、配列番号５５変異体エラスターゼ切断ドメインを含むプ
ロタンパク質は、配列番号４８の変異体エラスターゼ切断ドメインを含むプロタンパク質
より安定であることが示された。
【０３０１】
精製されたプロＰＲＴ−２０１の制御された切断についての条件を最適化するための初
期の実験は、４２のプロペプチド配列（配列番号６）を有するプロタンパク質を用いて行
われた。この精製されたプロタンパク質は、ｐＨ（７．７〜８．９）、緩衝液組成（０．
４〜１０ｍＭクエン酸ナトリウム）、タンパク質濃度（０．１４〜０．２３ｍｇ／ｍＬ）
、および反応時間（５〜２４時間）を含む条件のマトリックスにおける変換に供された。
変換期間の終わりに、ｐＨを３．０に低下させるためにギ酸を添加することによって反応
を停止した。各反応におけるタンパク質種の相対量は、質量分析によって決定された。こ
れらの結果に基づいて、Ｎ末端変異体の最低のパーセンテージをもたらす変換条件は、ｐ
Ｈ８．３、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１ｍＭ未満のクエン酸ナトリウムの緩衝液組成、
０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度、ならびに５〜２４時間の反応時間を含んだ。この研
究では、反応の評価項目だけを解析した。このようにして、変換の質に関するリアルタイ
ムデータは観察されず、最後の結果は、Ｎ末端変異体の初期の生成と、分解されたそれら
の変異体の実質的な時間量を反映した可能性がある。その後、ＨＩＣ−ＨＰＬＣアッセイ
は、変換反応のリアルタイムモニタリングを可能にするように開発された。さらなる変換
の最適化研究は、リアルタイムＨＩＣ−ＨＰＬＣモニタリングを使用するものを含み、実
施例６に記載されている。
【実施例６】
【０３０２】
６．７  多コピー変異体ベクターを用いたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける自己活性化ＰＲ
Ｔ−２０１の発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける組換え遺伝子の多コピー組込みは、所望のタンパク質の
発現を増加させるために利用されていた（例えば、Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、１９８９
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４１１７−４１２５；Ｃｌａｒｅら、１９９１、Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：４５５−４６０；Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９１、Ｖａ
ｃｃｉｎｅ  ９：９０１−９０６を参照されたい）。しかしながら、特定の場合には、１
コピーベクター組込み体から得られた発現レベルは有効であり、多コピーベクター組込み
体によって改善されなかった（Ｃｒｅｇｇら、１９８７、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
５：４７９−４８５）。自然な多コピープラスミド組込み事象は、インビトロではＰ．
ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて低頻度で起こる。遺伝子の多コピーのゲノム組込みを得て、タ
ンパク質発現をできる限り増加させるために、インビトロのライゲーション法を用いて、
発現ベクターへの遺伝子のタンデムな挿入を生じさせ、その後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形
質転換する。
【０３０３】
ｐＰＲＯＴ５５−Ｖ変異体の多コピー組込み体を得るために、インビトロのライゲーシ
ョン法を用いて、その後にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換用に使用されるｐＰＲＯＴ５５
−Ｖの多コピーを含むベクターを構築した。多コピーベクターを作製するために、ｐＰＲ
ＯＴ５５−Ｖベクターは、プロＰＲＴ−２０１遺伝子、ＡＯＸ１プロモーター、およびＡ
ＯＸ１転写終止配列をコードする２．３ｋｂ発現カセットを放出するようにＢｇｌＩＩお
よびＢａｍＨＩを用いて消化された。次に、発現カセットは、自己ライゲーションを防ぐ
ために、ＢａｍＨＩで線状化され、ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａ
ｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、米国）で処理されたｐＰＲＯＴ５５−Ｖベ
クターの調製物とライゲートされた。ライゲーション混合物を一晩１６℃でインキュベー
トした。大腸菌ＴＯＰ１０菌株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）をラ
イゲーション反応で形質転換した。形質転換ミックスは、２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ
の存在下で低塩ＬＢ上に播種された。薬物耐性形質転換体を選別し、プラスミドＤＮＡを
調製した。
【０３０４】
得られたクローンにおける発現カセットの数を決定するために、プラスミドＤＮＡをＢ
ｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡサイズ標準マーカーを用いて、アガロースゲ
ル電気泳動によって解析した。３つの２．３ｋｂ発現カセットと一致したサイズを有する
単一の明確な挿入バンドを含むクローンを同定し、ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖと命名した。
制限酵素マッピングを用いて、ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖベクターについて、線状の頭−尾
多量体形成の配向を確認した。図６は、ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖクローニングスキームを
示す。
【０３０５】
野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０を形質転換のために使用し
、ｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖベクターが形質転換前にＳａｃＩの代わりにＢｇｌＩＩで線状
化されることを除いて、実施例４に記載されるように行った。薬物耐性形質転換体を培養
し、実施例４に記載されるようにｐＰＲＯＴ５５Ｍ３プロタンパク質の発現についてスク
リーニングした。
【０３０６】
振とうフラスコ培養条件の最適化は、誘導中の自然な切断を最小限にするために行われ
た。振とうフラスコ最適化は、２つの変数、誘導温度および誘導培地組成に焦点が当てら
れた。第１に、２５℃と比較して２２℃で誘導を行うことにより、試験されるすべての培
地組成について、培養上清中の成熟酵素に対するプロ酵素のより高い比率がもたらされる
ことが分かった。第２に、誘導培地の緩衝強度を増加させるためにクエン酸ナトリウムを
添加することによって、試験されたクエン酸ナトリウムの濃度（１２．５〜５０ｍＭ）の
全体を通じて培養上清において自然に変換した成熟酵素が存在しなくなった。長期間の振
とうフラスコ上清におけるプロタンパク質発現収量と安定性に対するこれらの変数の効果
を図７に説明する。
【０３０７】
高発現の３コピークローン２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵは、以下のように記載され
る２０１−５５−００１−ＶＵクローン用に確立した発酵手法を用いて、スケールアップ
した発酵解析のために選択された。２０１−５５−００１−ＶＵクローンの発酵は、１つ
の細胞バンクバイアルを解凍し、それを使用して、ｐＨ５．７の５００ｍｌのＢＫＧＹ増
殖培地を含む振とうフラスコに植菌することによって達成された。湿潤細胞重量が約４０
ｇ／Ｌになるまで、種培養は２８℃で振とうしながら２４時間増殖させた。ｐＨ５．７の
ＢＫＧＹ増殖培地を含む発酵槽はオートクレーブで滅菌された。培地を２８℃に冷却後、
酵母窒素塩基およびビオチンを含む補足物を添加した。発酵槽は、種培養とＢＫＧＹ増殖
培地を１：３３の比率で植菌された。
【０３０８】
発酵手法は、ｐＨ５．７、２８℃で、グリセロールのフィードバッチ（fed-batch）お
よびグリセロールフィード（feed）を用いて開始した。ｐＨは、１０％リン酸および３０
％硫酸アンモニウムの溶液によって調節された。培養物を給気しながら３００〜１０００
ｒｐｍで激しく撹拌し、溶存酸素を４０％に調節した。システムからグリセロールが枯渇
したことを示す、初期のグリセロールバッチが枯渇し、溶存酸素が急増した後、湿潤細胞
重量が好ましくは２００ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌに到達するまで、追加の５０％グリセロー
ルが１３１ｇ／時で添加された。湿潤細胞重量が２００ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌに到達した
後、湿潤バイオマス１ｇ当たり０．０２５ｍＬのメタノールボーラスを用いて、誘導を即
座に開始した。メタノールボーラスが枯渇し、溶存酸素が上昇した後、０．００３４ｇメ
タノール／ｇ湿潤細胞重量／時の一定の添加速度で制限量のメタノールを添加することに
よって誘導を継続した。一定のメタノール添加の開始時に、発酵ブロスのｐＨを５．７か
ら５．５に変更し、温度を２８℃から２２℃に変更した。発酵は、誘導の７０時間後に回
収された。
【０３０９】
単一コピーのｐＰＲＯＴ５５−Ｖベクターの１つのゲノム組込み体を含む、単一の３コ
ピークローンであるクローン２０１−５５−００１−ＶＵの相対的収量を決定するために
、３コピーのｐＰＲＯＴ５５Ｍ３−Ｖベクターの１つのゲノム組込み体を含む、クローン
２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵと共に並行して発酵させた。培養のｐＨが誘導全体で５
．７に維持されたことを除いて、上述されるように発酵を行った。２０１−５５−００１
−ＶＵおよび２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ発酵から回収した上清は、勾配ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、続くコロイダルブルー染色によって解析され（図８）、単一コピーの２０１−５
５−００１−ＶＵクローンと比較して、多コピーの２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵクロ
ーンからより高いプロタンパク質発現が得られたことを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は
、発酵上清のプロタンパク質濃度のＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析により確認され、２０１−５５
Ｍ３−００３−ＶＵクローンは、約６００ｍｇ／Ｌの分泌されたプロタンパク質を生成し
、２０１−５５−００１−ＶＵクローンは約４００ｍｇ／ｍＬを生産したことを示す。こ
のようにして、３つの発現カセットを含む多コピー２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵクロ
ーンは、単一の発現カセットを含む単一コピー２０１−５５−００１−ＶＵクローンと比
較して、約５０％を超えるプロタンパク質を生成した。
【０３１０】
２つの変換戦略は、発酵から生成された２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ上清を用いて
試験された。これらの戦略は、一般には、それらがラージスケールで行われたことを除い
て、実施例５の他のプロタンパク質変異体について記載された戦略に従った。第１の戦略
では、プロタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって上清から捕捉され、
その後、成熟タンパク質に変換され、仕上げクロマトグラフィーが行われた。第２の戦略
では、プロタンパク質は、精製前に成熟タンパク質に変換され、その後、陽イオン交換ク
ロマトグラフィーを用いて捕捉され、Ｎ末端変異体を取り除くために延長して変換され、
さらに仕上げクロマトグラフィーが行われた。また、両方の戦略は、Ｎ末端変異体の選択
的分解を達成するために変換後、ｐＨ８．０の緩衝液で長期のインキュベーション工程を
含んでいた。
【０３１１】
第１の戦略を用いて、プロタンパク質の捕捉、その後の変換、およびＰＲＴ−２０１の
仕上げ精製を以下のように達成した。２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ上清を発酵培養か
ら回収し、−８０℃で凍結した。約７Ｌの凍結され、清澄された上清（上述される２０１
−５５Ｍ３−００３−ＶＵ発酵から３．５Ｌ、および実施例４と５に記載されるように一
般的に調製された２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ振とうフラスコ培養からの３．５Ｌ）
を解凍し、脱イオン水および１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を用いて２〜８℃で８
倍に希釈し、最終濃度が２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを得た。溶液のｐＨを４．７に調
整した。２．３ＬのベッドのＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ陽イオン交換カラム上に
７６ｃｍ／時、２〜８℃で溶液を添加した。カラムは、５ＣＶの２５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ４．７、その後、５ＣＶの１６０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナト
リウム、ｐＨ４．７で洗浄された。２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．７中の１６０
ｍＭ塩化ナトリウムから開始し、５００ｍＭ塩化ナトリウムまでの直線勾配の１５ＣＶを
用いて８７ｍｌ／分（６７ｃｍ／時）でプロタンパク質を溶出した。溶出物を分画にして
回収した。分画は、タンパク質含有量についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析された（図
９）。少量の自然に変換したタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察された。プロタ
ンパク質を含む分画をさらなる処理のためにプールした。プールされた物質をＨＩＣ−Ｈ
ＰＬＣ解析に供し、それは９２％プロタンパク質および８％成熟ＰＲＴ−２０１からなる
ことを示した。
【０３１２】
変換を開始するために、プールされた物質は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ、ｐＨ４．０に接線フローろ過を使用して、１０〜１２℃で一定体積の透析ろ過を
用いて緩衝液交換された。接線フローろ過は、再生されたセルロースメンブレン、１５ｐ
ｓｉの膜透過圧、２０Ｌ／分の交差流速度、および８００ｍＬ／分の流量を用いて行われ
た。２〜８℃の３透析体積の緩衝液が、その流量と同じ流速で添加された。その後、周囲
温度で、さらに３体積の緩衝液がその流量と同じ速度で添加され、２６℃の目標まで変換
溶液の温度を上昇させた。接線フローろ過は、１５ｐｓｉの膜透過圧、１．２Ｌ／分の交
差流速度、および７６ｍｌ／分の流量の条件を用いて、１．５ｍｇ／ｍＬの標的まで変換
溶液を濃縮するために使用された。しかしながら、濃縮手法を開始して約２分後、予期し
ない沈殿が観察され、濃縮プロセスを中止した。変換溶液のタンパク質濃度は、５７０ｍ
Ｌ中、２８０ｎｍのＵＶ吸収によって１．１ｍｇ／ｍＬであると決定された。さらなる沈
殿を最小限にするために、変換溶液は、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ
、ｐＨ４．０を用いて１ｍｇ／ｍＬに希釈され、０．２２ミクロンのメンブレンを通過さ
せてろ過された。１６ｍＬの３Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０を変換溶液に添加した。変換溶
液を２６℃の水浴に置いた。変換反応をＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析によって監視した。３０分
後、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによって、大部分のプロタンパク質はＰＲＴ−２０１に変換され、
いくつかはＮ末端変異体であったことが示された（図１０）。１時間後、変換反応は、０
％のプロタンパク質、８６％の全長ＰＲＴ−２０１、および１４％のＮ末端変異体からな
っていた。変換物質をさらに４時間を超えてインキュベートされ、その時間でＨＩＣ−Ｈ
ＰＬＣ解析によって、変換物質は９８％の全長ＰＲＴ−２０１および２％のＮ末端変異体
からなっていたことが示された。
【０３１３】
変換物質は、脱イオン水および１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．３で４倍に希釈し、
最終濃度を２５ｍＭクエン酸ナトリウムにした。溶液のｐＨを５．０に調整し、仕上げカ
ラムに添加するために準備した。６００ｍＬベッドのＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ
陽イオン交換カラムに２７ｍＬ／分（８３ｃｍ／時）で溶液を添加した。カラムは、５Ｃ
Ｖの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、続く５ＣＶの１６０ｍＭ塩化ナトリウム
、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄された。ＰＲＴ−２０１は、１５ＣＶ
の２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の１６０ｍＭから開始して５００ｍＭまで
の直線勾配の塩化ナトリウムで８７ｍＬ／分（６７ｃｍ／時）で溶出された。溶出物は分
画にして回収された。分画は、タンパク質含有量についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、
および比活性についてはＳＬＡＰアッセイによって解析された。比活性が≧３０Ｕ／ｍｇ
であるＰＲＴ−２０１を含む分画をプールした。プールされたＰＲＴ−２０１分画は、調
製用緩衝液（０．１×ＰＢＳ、ｐＨ５．０）に接線フローろ過によって透析ろ過された。
透析ろ過されたＰＲＴ−２０１のｐＨをｐＨ７．４に調整し、接線フローろ過によってタ
ンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。実施例４における２０１−２４−２６６−ＶＵ
クローンから生成されたＰＲＴ−２０１について記載したように、バイアルを満たし、凍
結乾燥した。
【０３１４】
第２の戦略を用いて、プロタンパク質の変換、続くＰＲＴ−２０１の精製を以下のよう
に達成した。上述した２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ発酵由来の約７Ｌの凍結され、清
澄された上清を解凍し、変換反応は、再生されたセルロースメンブレンを用いた、周囲温
度の一定の体積の透析ろ過を使用して、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を含む変換緩
衝液で接線フローろ過によって開始された。１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０
の２つの透析体積は、リテンテートのｐＨをｐＨ５．０から８．０に変化させ、変換を達
成するには十分であった。また、実験は、１００ｍＭの最終濃度にＴｒｉｓ塩基を添加し
、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整することによって、清澄された上清のｐＨ
を８．０に直接調整することによって行われた。これは、恐らくはブロス成分の沈殿のた
めに、望ましくない沈殿物の形成および上清の混濁をもたらしたことによる。接線フロー
ろ過を用いた変換の好ましい方法は沈殿を生じさせなかった。
【０３１５】
変換反応は、リアルタイムＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析によって監視された。変換の開始後、
プロＰＲＴ−２０１は、最初の２時間、ゆっくりと成熟ＰＲＴ−２０１に変換し、その後
、変換が加速した（図１１）。４．５時間で、変換反応は、約４％のプロＰＲＴ−２０１
、７５％の成熟ＰＲＴ−２０１および２１％のＮ末端変異体からなっていた。６．５時間
で、変換反応は、約１％のプロＰＲＴ−２０１、８３％の成熟ＰＲＴ−２０１および１６
％のＮ末端変異体からなっていた。４．５時間から６．５時間の２１％から１６％のＮ末
端変異体の減少は、全長の活性なＰＲＴ−２０１によるＮ末端変異体の分解による可能性
があるが、これは完全ではなく、精製されたプロＰＲＴ−２０１の変換中に見られたＮ末
端変異体の減少ほど急速ではなかった。この第２の戦略では、変換反応を延長することは
、エラスターゼの活性部位と競合する上清中の競合タンパク質に起因して、Ｎ末端変異体
を完全に除去しない場合がある。変換反応を改善するために、変換後の物資が捕捉され、
その後、以下に記載されるＮ末端変異体の選択的分解のためにｐＨ８．０で延長された変
換を開始するための適切な緩衝液に透析ろ過された。
【０３１６】
変換物質からのＰＲＴ−２０１の捕捉は以下のように達成された。変換物質は、２０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０に緩衝液交換され、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ
Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に添加された。カラムは、５ＣＶの２０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０、続く５ＣＶの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１６０
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄された。ＰＲＴ−２０１は、２０ｍＭクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ５．０中の１６０ｍＭから５００ｍＭクエン酸ナトリウムの直線勾配で溶
出された。分画は、タンパク質含有量についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端変異体につい
てはＨＩＣ−ＨＰＬＣ、タンパク質濃度については２８０ｎｍのＵＶ吸光度、およびエラ
スターゼ活性についてはＳＬＡＰアッセイによって解析された。２つの主要なタンパク質
バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出され、図１２に示されるように、ＰＲＴ−２０１
およびＰＲＴ−２０１糖形態に対応していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されたＰＲ
Ｔ−２０１糖形態、またはＨＩＣ−ＨＰＬＣによって決定されたＮ末端変異体を含む分画
はプールから排除された。また、ＳＬＡＰアッセイによって決定されたように、相対的に
低い比活性（３０Ｕ／ｍｇ未満）を示す分画はプールから排除された。ＰＲＴ−２０１を
含む残りの分画は、さらなる処理のためにプールされた。プールされた分画のＨＩＣ−Ｈ
ＰＬＣ解析は、この物質が約９８％の全長ＰＲＴ−２０１および１〜２％のＮ末端変異体
からなることを示した。プールされた物質は２〜８℃で１２〜１６時間保存された。
【０３１７】
Ｎ末端変異体が上述される長期の変換期間中に減少するように見えるという従来の観察
を示したので、プールされたＰＲＴ−２０１物質をｐＨ８．０で延長されたインキュベー
ション工程に供した。延長されたインキュベーションは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、３００
ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０で、２．５時間、周囲温度で透析ろ過および接線フ
ローろ過によって行われた。２．５時間後、変換物質は、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ解析によって
示されるように、１００％の成熟ＰＲＴ−２０１からなっていた。変換物質は、エラスタ
ーゼ活性を抑制し、カラムクロマトグラフィーのために用意するために、２０ｍＭクエン
酸ナトリウム、ｐＨ５．０への透析ろ過および接線フローろ過に供された。透析ろ過され
たＰＲＴ−２０１物質は、約６４時間、２〜８℃で保存された。
【０３１８】
ＰＲＴ−２０１の仕上げクロマトグラフィー精製は以下のように達成された。透析ろ過
されたＰＲＴ−２０１物質は、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ陽イオン交換カラム
上に添加され、５ＣＶの緩衝液Ｃ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）、続く５
ＣＶの１６０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄され
た。ＰＲＴ−２０１の溶出は、１５ＣＶの６８％緩衝液Ｃと３２％緩衝液Ｄ（１６０ｍＭ
塩化ナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）から０％緩衝液Ｃと１００
％緩衝液Ｄ（５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）の
直線勾配で、５０ｍｌ／分（１５３ｃｍ／時）で行われた。溶出物を分画にして回収した
。ＰＲＴ−２０１は、３７ｍＳ／ｃｍで対称ピークとして溶出した（３３０ｍＭクエン酸
ナトリウム）。分画は、タンパク質含有量についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、タンパク質
濃度については２８０ｎｍのＵＶ吸光度、および比活性についてはＳＬＡＰアッセイによ
って解析された。３０．１〜３８．８Ｕ／ｍｇの比活性を有するＰＲＴ−２０１を含む分
画をプールした。プールされたＰＲＴ−２０１分画は、調製用緩衝液（０．１×ＰＢＳ、
ｐＨ５．０）への接線フローろ過によって透析ろ過された。透析ろ過されたＰＲＴ−２０
１のｐＨはｐＨ７．４に調整され、タンパク質濃度は接線フローろ過によって１ｍｇ／ｍ
Ｌに調整された。実施例４の２０１−２４−２６６−ＶＵクローンから生成されたＰＲＴ
−２０１について記載されるように、バイアルを満たし、凍結乾燥した。
【０３１９】
上述される変換手法のための条件は、タンパク質濃度、温度、緩衝液組成、透析体積お
よびｐＨの変数を調べる変換の最適化研究に基づいて選択された。第１の研究では、変換
中のＮ末端変異体の生成に対するプロタンパク質濃度の効果を解析した。２０ｍＭリン酸
ナトリウム、ｐＨ５．０中の０．２ｍｇ／ｍＬの開始濃度の２０１−５５Ｍ３−００３−
ＶＵクローンからの精製されたプロＰＲＴ−２０１（プロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３−０
０３−ＶＵ）を分注し、遠心分離濃縮デバイスを用いて２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって
決定すると、１．０、１．６、および１．８ｍｇ／ｍＬに濃縮された。プロタンパク質の
変換は、Ｔｒｉｓおよび塩化ナトリウムを１００ｍＭの４つの濃度試料の各々に添加し、
ｐＨを５．０〜８．０に調整し、周囲温度で試料をインキュベートすることによって達成
された。変換反応は、プロタンパク質が全タンパク質の≦１％になるまで、リアルタイム
でＨＩＣ−ＨＰＬＣによって監視された（図１３）。この終点で、０．２ｍｇ／ｍＬの試
料は、約８％のＮ末端変異体からなり、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．６および２．０ｍｇ／ｍ
Ｌの試料は、それぞれ、約１４％、１９％および２９％のＮ末端変異体からなっていた。
各試料における残りのタンパク質は、全長ＰＲＴ−２０１からなっていた。これらの結果
は、変換中のプロＰＲＴ−２０１−５５−００３−ＶＵの濃度上昇がより多くのＮ末端変
異体および全長未満のＰＲＴ−２０１の形成をもたらすことを示す。他の研究は、プロＰ
ＲＴ−２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ変換が分子内および分子間の反応を通じて起こる
ことを示唆していた。このようにして、この変異体プロタンパク質について、分子内反応
は、より低濃度のプロタンパク質溶液が好まれ、精度の高い変換を生じさせ、分子間反応
は、より濃縮されたプロタンパク質溶液が好まれ、精度の低い変化、すなわち、全長ＰＲ
Ｔ−２０１と比較して、Ｎ末端変異体の高いパーセンテージの形成をもたらす。
【０３２０】
第２の研究では、変換中のＮ末端変異体の生成に対する温度の効果が解析された。２０
１−５５Ｍ３−００３−ＶＵクローンから精製されたプロＰＲＴ−２０１（プロＰＲＴ−
２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵと命名される）は、１．６ｍｇ／ｍＬの濃度で生成され
、１５℃または２６℃で、上述されるように変換に供された。変換反応は、ＨＩＣ−ＨＰ
ＬＣによってリアルタイムで監視され、プロタンパク質が全タンパク質を＜１％含むまで
進めさせた。プロタンパク質におけるこの減少を到達するのに必要とされる時間は、２６
℃で約３０分であり、１５℃で約９０分であった。これらの時間で、両温度について、Ｎ
末端変異体の類似したパーセンテージ（全タンパク質の約２０％）が観察された。このよ
うにして、２６℃という高温は、本質的な同一の反応生成プロフィーリングを生じさせな
がら、１５℃の低温と比較してより急速な変換反応をもたらした。
【０３２１】
第３の研究は、変換反応中のプロタンパク質の溶解性に対する緩衝液組成の効果を調べ
た。１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で精製されたプロＰＲＴ−２０１（プロＰＲＴ−２０１−５
５Ｍ３−００３−ＶＵ）は、表６に列挙された条件下で変換に供された。変換反応は、２
〜８℃で行われた反応（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ
４．０の緩衝液組成）を除いて、周囲温度で行われた。変換反応は、沈殿について視覚的
に検査された。表６に示されるように、沈殿を生じさせなかった緩衝液組成は、１００ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ塩化ナ
トリウム、ｐＨ５．０；および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、ｐＨ８．０を含んでいた。低濃度のＴｒｉｓを含むか、または低ｐＨ（すなわち、ｐ
Ｈ５．０）の塩化ナトリウムを含まない緩衝液組成は沈殿を示した。
【０３２２】
【表６】
2015172056.tif 000014
表6:変換中の沈殿に対する緩衝液組成の効果。
【０３２３】
第４の研究では、プロタンパク質（プロＰＲＴ−２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ）を
含む上清の変換中の沈殿に対する接線フローろ過の透析体積数の効果を解析した。緩衝液
交換に使用される溶液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、
ｐＨ８．０であった。さらに、接線フローろ過なしに、ｐＨ５．０〜８．０の上清の直接
的なｐＨ調整を試験した。表７に示されるように、上清の直接的なｐＨ調整は、多量の沈
殿を生じさせた。１透析体積の交換を用いると、幾分の沈殿が観察された。２〜５透析体
積を用いた場合には、沈殿は観察されなかった。
【０３２４】
【表７】
2015172056.tif 000015
表7:緩衝液交換中の沈殿に対する透析体積数の効果。
【０３２５】
第５の研究では、成熟ＰＲＴ−２０１のエラスターゼ活性に対するｐＨの効果を解析し
た。この研究では、成熟ＰＲＴ−２０１変換生成物のエラスターゼ活性の不可逆的な喪失
を生じない変換の有用なｐＨ範囲を同定するために設計された。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、２０ｍＭリン酸カリウム中の１ｍｇ／ｍＬのＰＲＴ−２０１の溶液は、ｐＨ１〜１
４で調製された。溶液は、０．５、２、２４および４８時間、周囲温度で保持された。指
示された時間点で、溶液は、ＳＬＡＰアッセイにおいてエラスターゼ活性について試験さ
れた。エラスターゼ活性は、すべての時間点でｐＨ３〜８で大部分は安定であった。３未
満のｐＨおよび８を超えるｐＨでは、エラスターゼ活性はすべての時間点で減少し、より
長い時間点とより低いエラスターゼ活性の間で補正された。これらの結果は、３〜８のｐ
Ｈ範囲外で行われる変換反応は、ＰＲＴ−２０１変換生成物のエラスターゼ活性に負の影
響を与え得ることを指示した。
【実施例７】
【０３２６】
６．８  自己活性化組換えブタＩ型膵臓エラスターゼの生成
自己活性化ブタＥＬＡ−１プロ酵素をコードするベクターがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓで発
現された。得られた自己活性化されたブタＥＬＡ−１は、トリプシンで活性化された野生
型プロタンパク質として発現されたブタＥＬＡ−１タンパク質と比較された。
【０３２７】
トリプシン活性化ブタＥＬＡ−１ベクターを構築するために、ブタＥＬＡ−１コード領
域は、Ａｍｇｅｎ（カリフォルニア州サウザンドオークス）から許可を受けたＢｌｕｅ  
Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ワシントン州ボセル）によって、非ＰＣＲ「
長鎖オリゴ」技術を用いて合成された。組換え遺伝子は、ｐＵＣ１１９由来のベクターＢ
ｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  ｐＵＣにクローニングされた。ブタＥＬＡ−１遺伝子は両鎖につい
て配列決定され、正しい配列であることを確かめた。ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩ制限部位
は、図１４に示されるように、ブタＥＬＡ−１遺伝子に隣接する潜在的なクローニング部
位として組み込まれた。第２の終止コドンは、潜在的なリボソームの読み終わりを最小に
するため天然の停止コドンの直後に添加された。図１５は、トリプシン活性化部位を含む
、ブタＥＬＡ−１プロ酵素の天然の同一アミノ酸配列を示す。
【０３２８】
ブタＥＬＡ−１のコード領域は、クローニングを促進するためのＸｈｏＩおよびＳａｃ
ＩＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産
物は、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩで消化され、アガロースゲル電気泳動によって精製され
た。ブタＥＬＡ−１断片をＸｈｏＩおよびＳａｃＩＩ制限部位でＰＶ−１ベクターにクロ
ーニングした。大腸菌ＴＯＰ１０菌株は、ライゲーション混合物で形質転換された。細胞
混合物は、２５ｍｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎで補足された低塩ＬＢプレート上に置かれた。
薬物耐性クローンを選別し、プラスミドＤＮＡを調製した（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）。制限
解析に基づいて、ブタＥＬＡ−１遺伝子挿入物を含むクローンを同定し、ベクターをｐＰ
ＲＯＴ１０１−２４−Ｖと命名した。このベクターのコード配列は、ＤＮＡ配列決定によ
って確認された。ｐＰＲＯＴ１０１−２４−Ｖのためのクローニングスキームを図１６に
示す。
【０３２９】
トリプシン活性化ｐＰＲＯＴ１０１−２４−Ｖベクターを用いて、３種の自己活性化ク
ローンは、ブタＥＬＡ−１のプロペプチド領域のトリプシン切断部位をエラスターゼ切断
部位に変更することによって改変された。部位特異的突然変異誘発は、一般には、実施例
４に記載されるように行い、表８に記載される所望の突然変異を含む合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。プロペプチド領域の突然変異のすべては、二本鎖ＤＮＡ配列決
定によって確認された。
【０３３０】
【表８】
2015172056.tif 000016
表8.トリプシンで活性化され、自己活性化されたブタELA-1ベクターの切断ドメイン配
列。突然変異を誘発したコドンに陰影を付ける。切断結合はP1とP'1の間である。
【０３３１】
野生型ＮＲＲＬ  Ｙ−１１４３０のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株を形質転換し、薬物耐性
形質転換体を培養し、実施例３に記載されるように、ブタＥＬＡ−１プロタンパク質の発
現についてスクリーニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色による解析に基
づいて（図１７および図１８を参照されたい）、野生型トリプシン活性化ｐＰＲＯＴ１０
１−２４−Ｖクローンは、自己活性化クローンと比較して、最高レベルの発現を有してい
た。自己活性化クローンのうち、ｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖクローンは、最高レベルの
発現を有し、続いてｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖクローン、次にｐＰＲＯＴ１０１−４
９−Ｖクローンであった。自己活性化ｐＰＲＯＴ１０１−４２−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０
１−５５Ｌ−Ｖプロタンパク質は、誘導中にかなりの自然な変換を示し、トリプシン活性
化ｐＰＲＯＴ１０１−２４−Ｖおよび自己活性化されたｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖプロ
タンパク質は、誘導培地でより大きな安定性を示した。
【０３３２】
ｐＰＲＯＴ１１０１−２４−Ｖから発現されたプロエラスターゼタンパク質のトリプシ
ン活性化によって生成されたＰＲＴ−１０２のエラスターゼ活性化についての研究は、以
下の表９に示されるように、ＰＲＴ−２０１よりも高い比活性を示した。
【０３３３】
【表９】
2015172056.tif 000017
表9:成熟ヒトI型膵臓エラスターゼと比較した、成熟ブタI型膵臓エラスターゼ(トリプ
シン活性化)の3種の異なる試料のエラスターゼ活性
【０３３４】
小スケールの変換実験を用いて、ｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０
１−４９−Ｖプロタンパク質がエラスターゼ活性を示す成熟酵素に変換され得るかどうか
を決定した。ｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖの振とう
フラスコの上清は、遠心ろ過ユニットを用いて１０倍に濃縮され、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で５倍に希釈された。変換は室温で進行するようにし、エラスター
ゼ活性はＳＬＡＰアッセイによって経時的に監視された。１分当たりの吸光度の平均的な
変化は各時間点から決定され、標準化されていない反応速度として報告された（図１９）
。ｐＰＲＯＴ１０１−４９−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖの上清の変換は共に
、エラスターゼ活性の増加をもたらした。各クローンからの最終の時間点の試料は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって、続くクーマシー染色によって解析され、変換前の試料と比較され
た（図２０）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によって、ほぼすべてのｐＰＲＯＴ１０１−４９
−Ｖプロタンパク質が変換アッセイの終わりまでに成熟タンパク質に変換されたことが確
認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、ほぼすべてのｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−
Ｖが変換アッセイの前に成熟タンパク質に自然に変換されたことを示した。
【０３３５】
ｐＰＲＯＴ１０１−２４−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖプロタンパク質および
成熟酵素の精製調製物は、そのまま分子量解析を行うために、Ｄａｎｆｏｒｔｈ  Ｐｌａ
ｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ミズーリ州に供された。プロタンパク質は、陽イ
オン交換クロマトグラフィー（Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に
よって精製された。成熟酵素解析について、両方のクローンからのプロタンパク質を最初
に処理し、成熟酵素を生成し、次に陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
トリプシン活性化プロタンパク質はトリプシンで処理され、自己活性化プロタンパク質は
、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０の存在下で変換され、続いて陽イオン交換
クロマトグラフィーにかけられた。質量分析解析から得られた主要ピークを表１０に列挙
する。
【０３３６】
【表１０】
2015172056.tif 000018
表10:ブタELA-1タンパク質の予測分子量および測定分子量
【０３３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、エラスターゼ活性および質量分析の結果は、Ｉ型ブタ膵臓エラスタ
ーゼの自己活性化形態が、トリプシン切断部位をエラスターゼ切断部位で置換するように
プロペプチド配列を操作することによって生成し得ることを示した。Ｉ型ブタ膵臓エラス
ターゼのこれらの自己活性化形態の発現レベルは、野生型トリプシン活性化形態よりも低
い。試験された自動活性化クローンのうち、ｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖプロペプチド配
列を有するクローンは、最高レベルの発現、および少なくとも自然な変換の変換を示した
。ｐＰＲＯＴ１０１−４９−ＶおよびｐＰＲＯＴ１０１−５５Ｌ−Ｖクローンの変換は、
実質的なエラスターゼ活性を有する成熟タンパク質の生成をもたらした。質量分析解析は
、ｐＰＲＯＴ１０１−４９−Ｖプロタンパク質、および成熟ブタＩ型の分子量が予測され
た質量に相当することを明らかにした。
【実施例８】
【０３３８】
６．９  ＢＥＮＺ比色ペプチド基質アッセイによる成熟組換えヒトエラスターゼ−１のト
リプシン活性解析
低分子ペプチド基質Ｎ−ベンゾイル−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐニトロアニリド（Ｂ
ＥＮＺ）を用いた比色加水分解アッセイを行って、自己活性化クローン２０１−５５Ｍ３
−００３−ＶＵによって生成された、精製された成熟エラスターゼタンパク質がトリプシ
ン活性を有するかどうかを決定した。クローン２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵから精製
された、凍結乾燥されたＰＲＴ−２０１の３つのバイアルを−８０℃保存から回復し、水
で再構築し、０．１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１ｍｇ／ｍＬのＰＲＴ−２０１を得た。２
８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定することによって、タンパク質濃度を確認した。ＴｒｙｐＺ
ｅａｎストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いて、トリプシン活性について標準曲線を作
成した。以前に試験されたトリプシン活性化ＰＲＴ−２０１試料を正の対照として含めた
。さらに、いくつかの実験試料および対照試料は、ＴｒｙｐＺｅａｎでスパイクされ、Ｐ
ＲＴ−２０１の存在下でトリプシン活性回復を決定した。スパイクされた試料およびスパ
イクされていない試料の一部は、大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）で処理され、任意の
固有のトリプシン活性またはスパイクされたトリプシン活性を阻害するＳＢＴＩの能力に
ついて決定した。また、ＴｒｙｐＺｅａｎ標準をＳＢＴＩで処理し、阻害剤の有効性を確
認した。この研究に含まれる試料の概要については以下の表１１を参照されたい。
【０３３９】
【表１１】
2015172056.tif 000019
表11:標準曲線のためのTrypZean希釈物はアッセイ緩衝液(0.1M Tris、pH8.3)を用いて
調製された。TrypZean溶液についての標準曲線を図21に示す。
【０３４０】
基質溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３中の０．４ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−ベンゾイル−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐニトロアニリド  ロット７７３３）を調製し、水浴中で３０
℃に予熱した。３点測定にして、１００μｌの各試料を９６ウェルマイクロプレートにピ
ペッティングした。マルチチャンネルのピペッターを用いて、２００μｌの基質溶液を各
ウェルにピペッティングし、予め３０℃に加熱されたマイクロプレリーダーにマイクロプ
レートを即座に置いた。マイクロプレリーダーは、６０分間、１分当たり１回、各ウェル
について４０５ｎｍの吸光度を記録した。
【０３４１】
また、ＰＲＴ−２０１試料は、ＳＬＡＰアッセイにおいてエラスターゼ活性について試
験された。ＳＬＡＰ基質溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３中の４．５ｍｇ／ｍＬ  
ＳＬＡＰ）を調製し、水浴中で３０℃に予熱した。１ｍｇ／ｍＬのＰＲＴ−２０１試料を
水で２０倍に希釈し、０．０５ｍｇ／ｍＬとした。３点測定にして、１０μｌの各試料希
釈物を９６ウェルマイクロプレートにピペッティングした。マルチチャンネルピペッター
を用いて、３００μｌのＳＬＡＰ基質溶液を各ウェルにピペッティングし、予め３０℃に
加熱されたマイクロプレリーダーにマイクロプレートを即座に置いた。マイクロプレート
リーダーは、５分間、１分当たり１回、各ウェルについて４０５ｎｍの吸光度を記録した
。
【０３４２】
ＢＥＮＺおよびＳＬＡＰ活性アッセイの結果をそれぞれ下記の表１２および１３に示す
。
【０３４３】
【表１２】
2015172056.tif 000020
表12.平均トリプシン活性、TrypZean濃度同等物(ng/mL)として報告される。[a]回帰係
数<0.8。
【０３４４】
【表１３】
2015172056.tif 000021
表13.平均SLAP活性、U/mgとして報告される。
【０３４５】
クローン２０１−５５Ｍ３−００３−ＶＵ由来のＰＲＴ−２０１のトリプシン活性のレ
ベルは、トリプシン活性アッセイにおける標準曲線の範囲を下回っていた（＜１．５６ｎ
ｇ／ｍＬ）。加えて、３点測定の加水分解反応物の回帰係数は小さく（＜０．８）、さら
に、この自己活性化成熟エラスターゼタンパク質におけるトリプシン活性の不存在を指示
した。対照的に、対照のトリプシン活性試料のトリプシン活性のレベルは８．７ｎｇ／ｍ
Ｌであると決定された。
【０３４６】
７．配列表
【０３４７】
【表１４Ａ】
2015172056.tif 000022
【表１４Ｂ】
2015172056.tif 000023
【表１４Ｃ】
2015172056.tif 000024
【表１４Ｄ】
2015172056.tif 000025
【表１４Ｅ】
2015172056.tif 000026
【表１４Ｆ】
2015172056.tif 000027
【表１４Ｇ】
2015172056.tif 000028
【表１４Ｈ】
2015172056.tif 000029
【表１４Ｉ】
2015172056.tif 000030
【表１４Ｊ】
2015172056.tif 000031
【表１４Ｋ】
2015172056.tif 000032
【表１４Ｌ】
2015172056.tif 000033
【表１４Ｍ】
2015172056.tif 000034
【表１４Ｎ】
2015172056.tif 000035
【表１４Ｏ】
2015172056.tif 000036
【表１４Ｐ】
2015172056.tif 000037
【表１４Ｑ】
2015172056.tif 000038
【表１４Ｒ】
2015172056.tif 000039
【表１４Ｓ】
2015172056.tif 000040
【表１４Ｔ】
2015172056.tif 000041
【０３４８】
８．具体的な実施形態、参考文献の引用
本発明は、以下の具体的な実施形態により例示される。
１．（ｉ）エラスターゼ認識配列を含むエラスターゼ活性化配列が（ｉｉ）成熟エラス
ターゼのアミノ酸配列に作動的に連結されているタンパク質。
２．エラスターゼ認識配列が配列番号１１を含む、実施形態１のタンパク質。
３．エラスターゼ認識配列が配列番号１２を含む、実施形態１のタンパク質。
４．エラスターゼ認識配列が配列番号１３を含む、実施形態１のタンパク質。
５．エラスターゼ認識配列が配列番号９３を含む、実施形態１のタンパク質。
６．エラスターゼ認識配列が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２
０、または配列番号２１のいずれか１つを含む、実施形態１、実施形態２、または実施形
態４のいずれかのタンパク質。
７．活性化配列が配列番号８０を含む、実施形態１のタンパク質。
８．活性化配列が配列番号２３、配列番号７２、または配列番号７３のいずれか１つを
含む、実施形態１または実施形態７のタンパク質。
９．配列番号７４を含む切断ドメインを含む、実施形態１のタンパク質。
１０．切断ドメインが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配
列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５のいずれか１つを含む、
実施形態１または実施形態９のタンパク質。
１１．配列番号６４を含む、実施形態１から５および７のいずれか１つのタンパク質。
１２．配列番号６９を含む、実施形態１から５および７のいずれか１つのタンパク質。
１３．配列番号７４の切断ドメインを含むＩ型プロエラスターゼタンパク質。
１４．切断ドメインが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配
列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５のいずれか１つを含む、
実施形態１３のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
１５．成熟エラスターゼ配列が、配列番号８４または配列番号１の位置６（例えば、本
明細書のエラスターゼアミノ酸記号表示によるＰ’５残基のＣ末端側）から末端までのア
ミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１３または実
施形態１４のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
１６．配列番号８４または配列番号１の位置６（例えば、本明細書のエラスターゼアミ
ノ酸記号表示によるＰ’５残基のＣ末端側）から末端までのアミノ酸配列と少なくとも９
５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１３または実施形態１４のＩ型プロエラ
スターゼタンパク質。
１７．配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列と少なくと
も９８％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１３または実施形態１４のＩ型プロ
エラスターゼタンパク質。
１８．成熟エラスターゼが、配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのア
ミノ酸配列に対して、最大１０カ所の保存的アミノ酸変化を有する配列を含む、実施形態
１３または実施形態１４のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
１９．配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列に対して、
最大７カ所の保存的アミノ酸変化を有する配列を含む、実施形態１３または実施形態１４
のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
２０．配列番号８４または配列番号１の位置６から最後までのアミノ酸配列に対して、
最大５カ所の保存的アミノ酸変化を有する配列を含む、実施形態１３または実施形態１４
のＩ型プロエラスターゼタンパク質。
２１．配列番号７４中の「Ｘａａ１」によって示されるアミノ酸残基がグルタミン酸ま
たはヒスチジンである、実施形態１３から２０のいずれか１つのＩ型プロエラスターゼタ
ンパク質。
２２．配列番号７４中の「Ｘａａ４」によって示されるアミノ酸残基がプロリンである
、実施形態１３から２１のいずれか１つのＩ型プロエラスターゼタンパク質。
２３．配列番号７４中の「Ｘａａ５」によって示されるアミノ酸残基がアラニンである
、実施形態１３から２２のいずれか１つのＩ型プロエラスターゼタンパク質。
２４．配列番号７４中の「Ｘａａ１」によって示されるアミノ酸残基がヒスチジンであ
り、配列番号７４中の「Ｘａａ４」によって示されるアミノ酸残基がプロリンであり、配
列番号７４中の「Ｘａａ５」によって示されるアミノ酸残基がアラニンである、実施形態
１３から２３のいずれか１つのＩ型プロエラスターゼタンパク質。
２５．配列番号１０３のアミノ酸配列を含む、実施形態１３から２４のいずれか１つの
Ｉ型プロエラスターゼタンパク質。
２６．配列番号６４のアミノ酸配列を含む、実施形態２５のＩ型プロエラスターゼタン
パク質。
２７．配列番号６９のアミノ酸配列を含む、実施形態２５のＩ型プロエラスターゼタン
パク質。
２８．単離された、実施形態１から２７のいずれか１つのタンパク質。
２９．シグナル配列を含む、実施形態１から２７のいずれか１つのタンパク質。
３０．（ｉ）シグナル配列と、（ｉｉ）エラスターゼ認識配列を含むエラスターゼ活性
化配列と、（ｉｉｉ）成熟エラスターゼのアミノ酸配列とを含むタンパク質。
３１．シグナル配列がメタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）におい
て作動的である、実施形態３０のタンパク質。
３２．シグナル配列が酵母α因子シグナルペプチドである、実施形態３０のタンパク質
。
３３．酵母α因子シグナルペプチドが配列番号３４のアミノ酸配列を含む、実施形態３
２のタンパク質。
３４．シグナル配列が哺乳動物の分泌シグナル配列である、実施形態３０のタンパク質
。
３５．哺乳動物の分泌シグナル配列がブタＩ型エラスターゼシグナル配列である、実施
形態３４のタンパク質。
３６．哺乳動物の分泌シグナル配列がヒトＩ型エラスターゼシグナル配列である、実施
形態３４のタンパク質。
３７．エラスターゼ認識配列がヒトＩ型エラスターゼ認識配列である、実施形態１また
は実施形態３０のタンパク質。
３８．成熟エラスターゼがヒトＩ型エラスターゼである、実施形態１または実施形態３
０のタンパク質。
３９．成熟エラスターゼがブタＩ型エラスターゼである、実施形態１または実施形態３
０のタンパク質。
４０．実施形態１から３９のいずれか１つのタンパク質をコードする核酸。
４１．（ｉ）エラスターゼ認識配列を含む活性化配列が（ｉｉ）エラスターゼのアミノ
酸配列に作動的に連結されているタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分
子。
４２．タンパク質が、前記活性化配列に作動的に連結されたシグナル配列をさらに含む
、実施形態４１の核酸分子。
４３．シグナル配列がメタノール資化酵母において作動的である、実施形態４１または
実施形態４２の核酸分子。
４４．エラスターゼ認識配列がＩ型エラスターゼ認識配列である、実施形態４１から４
３のいずれか１つの核酸分子。
４５．エラスターゼ認識配列がＩ型ヒトエラスターゼ認識配列である、実施形態４１か
ら４４のいずれか１つの核酸分子。
４６．エラスターゼ認識配列が配列番号１１を含む、実施形態４１から４５のいずれか
１つの核酸分子。
４７．エラスターゼ認識配列が配列番号１２を含む、実施形態４１から４５のいずれか
１つの核酸分子。
４８．エラスターゼ認識配列が配列番号１３を含む、実施形態４１から４５のいずれか
１つの核酸分子。
４９．エラスターゼ認識配列が配列番号９３を含む、実施形態４１から４５のいずれか
１つの核酸分子。
５０．エラスターゼ認識配列が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号
２０、または配列番号２１のいずれか１つを含む、実施形態４１から４６および４８のい
ずれか１つの核酸分子。
５１．活性化配列が配列番号８０を含む、実施形態４１から５０のいずれか１つの核酸
分子。
５２．活性化配列が配列番号２３、配列番号７２、または配列番号７３を含む、実施形
態４１から４５および５１のいずれか１つの核酸分子。
５３．タンパク質が、配列番号７４を含む切断ドメインを含む、実施形態４１から４６
のいずれか１つの核酸分子。
５４．切断ドメインが配列番号４２、配列番号４３、配列番号４８、配列番号４９、配
列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、および配列番号５５のいずれか１つを含む、
実施形態４１から４６および５３のいずれか１つの核酸分子。
５５．エラスターゼが成熟ヒトＩ型エラスターゼである、実施形態４１から５４のいず
れか１つの核酸分子。
５６．エラスターゼが成熟ブタＩ型エラスターゼである、実施形態４１から５４のいず
れか１つの核酸分子。
５７．エラスターゼが配列番号５、配列番号８４、配列番号８７、および配列番号３９
のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態４１から５４のいずれか１つの核酸分子
。
５８．エラスターゼが配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態５
７の核酸分子。
５９．シグナル配列が酵母α因子シグナルペプチドである、実施形態４２から５８のい
ずれか１つの核酸分子。
６０．タンパク質が配列番号３４、配列番号５０、配列番号５１、配列番号９６、およ
び配列番号９７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態５９の核酸分子。
６１．シグナル配列が哺乳動物の分泌シグナル配列である、実施形態４２および４４か
ら５８のいずれか１つの核酸分子。
６２．哺乳動物の分泌シグナル配列がブタＩ型エラスターゼシグナル配列である、実施
形態６１の核酸分子。
６３．哺乳動物の分泌シグナル配列がヒトＩ型エラスターゼシグナル配列である、実施
形態６１の核酸分子。
６４．タンパク質が、配列番号８８から９１および９８から１０３のいずれか１つのア
ミノ酸配列を含む、実施形態４１から６３のいずれか１つの核酸分子。
６５．タンパク質が、配列番号６から９および６４から６９のいずれか１つのアミノ酸
配列を含む、実施形態６４の核酸分子。
６６．タンパク質が、表２に記載されるエラスターゼ多型の組合せのいずれかを含む、
実施形態６４の核酸分子。
６７．タンパク質が、表３に記載されるエラスターゼ多型の組合せのいずれかを含む、
実施形態６４の核酸分子。
６８．実施形態４１から６７のいずれか１つの核酸分子によりコードされるタンパク質
。
６９．単離された、実施形態６８のタンパク質。
７０．実施形態４１から６７のいずれか１つの核酸分子を含むベクター。
７１．前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結された、遺伝子発
現を制御するヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態７０のベクター。
７２．前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が多量体化される、実施形態７０
または実施形態７１のベクター。
７３．実施形態７０から７２のいずれか１つのベクターを含む宿主細胞。
７４．前記ベクターの少なくとも１コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施形
態７３の宿主細胞。
７５．前記ベクターの１コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施形態７４の宿
主細胞。
７６．前記ベクターの２〜５コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施形態７４
の宿主細胞。
７７．前記ベクターの２コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施形態７４また
は７６の宿主細胞。
７８．前記ベクターの３コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施形態７４また
は７６の宿主細胞。
７９．実施形態４１から６７のいずれか１つの核酸分子の少なくとも１コピーがそのゲ
ノム内に組み込まれる宿主細胞。
８０．前記核酸分子の１コピーがそのゲノム内に組み込まれる、実施形態７９の宿主細
胞。
８１．前記核酸分子の２〜５コピーがそのゲノム内に組み込まれる、実施形態７９の宿
主細胞。
８２．前記核酸分子の２コピーがそのゲノム内に組み込まれる、実施形態７９の宿主細
胞。
８３．前記核酸分子の３コピーがそのゲノム内に組み込まれる、実施形態７９の宿主細
胞。
８４．実施形態４１から６７のいずれか１つの核酸分子を発現するように遺伝子改変さ
れた細胞。
８５．前記ヌクレオチド配列がメタノール誘導性プロモーターに作動的に連結されてい
る、実施形態８４の細胞。
８６．実施形態４１から６７のいずれか１つのヌクレオチド配列を発現するように遺伝
子改変されたメタノール資化酵母細胞。
８７．前記ヌクレオチド配列がメタノール誘導性プロモーターに作動的に連結されてい
る、実施形態８７のメタノール資化酵母細胞。
８８．実施形態１から２７または実施形態６８のいずれか１つのタンパク質を含む細胞
培養物上清。
８９．実施形態８４の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを
含む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
９０．実施形態８５の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを
含む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
９１．実施形態８６の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを
含む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
９２．実施形態８７の宿主細胞をタンパク質が生成される条件下で培養するステップを
含む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
９３．前記条件が、ｐＨ２〜６での増殖時間または誘導時間を含む、実施形態９１また
は実施形態９２の方法。
９４．前記条件が、２２℃〜２８℃の温度での増殖時間または誘導時間を含む、実施形
態９１または実施形態９２の方法。
９５．宿主細胞が複合培地中で培養される、実施形態８９から９２のいずれか１つの方
法。
９６．複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複合
培地である、実施形態９５の方法。
９７．宿主細胞がクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養
される、実施形態８９から９６のいずれか１つの方法。
９８．クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸ナ
トリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態９７の方法。
９９．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ、
７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７５
〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、実施形態９７
または実施形態９８の方法。
１００．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中
に存在し、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総
濃度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１０
０〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態９７また
は実施形態９８の方法。
１０１．タンパク質を回収するステップをさらに含む、実施形態８９から１００のいず
れか１つの方法。
１０２．タンパク質が、上清を回収することによって回収される、実施形態９５の方法
。
１０３．タンパク質が上清から回収される、実施形態９５の方法。
１０４．回収されたタンパク質がシグナル配列を欠く、実施形態９５から１０４のいず
れか１つの方法。
１０５．回収されたタンパク質がシグナル配列および活性化配列を欠く、実施形態９５
から１０４のいずれか１つの方法。
１０６．タンパク質を含有する溶液のｐＨをｐＨ６〜１２まで上昇させるステップをさ
らに含む、実施形態８９から９２および９３から１０５のいずれか１つの方法。
１０７．タンパク質を触媒量のエラスターゼと接触させるステップをさらに含む、実施
形態８９から９２および９３から１０６のいずれか１つの方法。
１０８．タンパク質を自己活性化条件下に置くステップ、タンパク質を触媒量のエラス
ターゼと接触させるステップ、またはこれらの両方のステップをさらに含む、実施形態８
９から９２および９３から１０６のいずれか１つの方法。
１０９．タンパク質が自己活性化条件下に置かれる、実施形態１０８の方法。
１１０．自己活性化条件下に置かれるとき、タンパク質が上清中にある、実施形態１０
９の方法。
１１１．エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）組換えプロエラスターゼタンパク質の発現が可能な宿主細胞を、第１のクエン酸
化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で培養するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞の培養物から組換えプロエラスターゼタンパク質を回収するステッ
プと、
（ｃ）場合によって、前記組換えプロエラスターゼタンパク質を活性化条件に曝露して
、成熟エラスターゼタンパク質を作製するステップと
を含み、これらによりエラスターゼタンパク質を作製する方法。
１１２．組換えプロエラスターゼタンパク質を活性化条件に曝露して、成熟エラスター
ゼタンパク質を作製するステップを含む、実施形態１１１の方法。
１１３．活性化条件への前記曝露前に組換えプロエラスターゼタンパク質が精製される
、実施形態１１２の方法。
１１４．精製されたプロエラスターゼタンパク質と、第２のクエン酸化合物、コハク酸
化合物、または酢酸化合物とを含む溶液が生成されるように、前記組換えプロエラスター
ゼタンパク質が、第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で
精製される、実施形態１１３の方法。
１１５．前記第１のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ
、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態１
１１から１１４のいずれか１つの方法。
１１６．前記第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ
、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態１
１４または実施形態１１５の方法。
１１７．前記第１および第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が
同じである、実施形態１１４から１１６のいずれか１つの方法。
１１８．前記第１および第２のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が
異なる、実施形態１１４から１１６のいずれか１つの方法。
１１９．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ
、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７
５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、実施形態１
１４から１１８のいずれか１つの方法。
１２０．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中
に存在し、前記培養物中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の
総濃度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１
００〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態１１４
から１１８のいずれか１つの方法。
１２１．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ
、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７
５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記溶液中に存在する、実施形態１１
１から１２０のいずれか１つの方法。
１２２．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記溶液中に
存在し、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総濃
度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００
〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態１１１から
１２０のいずれか１つの方法。
１２３．宿主細胞が複合培地中で培養される、実施形態１１１から１２２のいずれか１
つの方法。
１２４．複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複
合培地である、実施形態１２３の方法。
１２５．プロエラスターゼタンパク質が、前記宿主細胞の上清から回収される、実施形
態１１１から１２４のいずれか１つの方法。
１２６．前記活性化条件がトリプシンへの曝露を含む、実施形態１１１から１２５のい
ずれか１つの方法。
１２７．前記活性化条件が自己活性化条件である、実施形態１１１から１２５のいずれ
か１つの方法。
１２８．前記成熟エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、実施形態
１１１から１２７のいずれか１つの方法。
１２９．成熟エラスターゼタンパク質が成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質である、実施
形態１１１から１２８のいずれか１つの方法。
１３０．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１２９の方法。
１３１．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１２９の方法。
１３２．成熟エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）プロエラスターゼタンパク質を凍結乾燥させるステップと、
（ｂ）凍結乾燥したプロエラスターゼタンパク質を保存するステップと、
（ｃ）凍結乾燥したプロエラスターゼタンパク質を再溶解するステップと、
（ｄ）再溶解されたプロエラスターゼタンパク質を活性化するステップと
を含み、これらにより成熟エラスターゼタンパク質を作製する方法。
１３３．プロエラスターゼタンパク質が組換え体である、実施形態１３２の方法。
１３４．（ｉ）プロエラスターゼタンパク質を発現させることが可能な宿主細胞をプロ
エラスターゼタンパク質が発現する条件下で培養するステップと、（ｉｉ）プロエラスタ
ーゼタンパク質を回収するステップとを含む工程により、プロエラスターゼタンパク質が
作製されるかまたは得ることができる、実施形態１３３の方法。
１３５．宿主細胞が複合培地中で培養される、実施形態１３４の方法。
１３６．複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複
合培地である、実施形態１３５の方法。
１３７．宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で
培養される、実施形態１３２から１３６のいずれか１つの方法。
１３８．クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸
ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態１３７の方法
。
１３９．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ
、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７
５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、実施形態１
３７または実施形態１３８の方法。
１４０．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中
に存在し、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総
濃度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１０
０〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態１３７ま
たは実施形態１３８の方法。
１４１．プロエラスターゼタンパク質が、前記宿主細胞の上清から回収される、実施形
態１３２から１４０のいずれか１つの方法。
１４２．プロエラスターゼタンパク質が、凍結乾燥前に精製される、実施形態１３２か
ら１４１のいずれか１つの方法。
１４３．凍結乾燥したプロエラスターゼタンパク質が、少なくとも１日間、少なくとも
１週間、少なくとも１カ月間、または少なくとも３カ月間にわたり保存される、実施形態
１３２から１４２のいずれか１つの方法。
１４４．プロエラスターゼタンパク質が−８０℃〜＋４℃の温度で保存される、実施形
態１３２から１４３のいずれか１つの方法。
１４５．前記活性化するステップがトリプシン活性化を含む、実施形態１３２から１４
４のいずれか１つの方法。
１４６．前記活性化するステップが自己活性化を含む、実施形態１３２から１４４のい
ずれか１つの方法。
１４７．前記成熟エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、実施形態
１３２から１４６のいずれか１つの方法。
１４８．成熟エラスターゼタンパク質が成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質である、実施
形態１３２から１４７のいずれか１つの方法。
１４９．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１４８の方法。
１５０．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１４８の方法。
１５１．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、組換え自己活性化
Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置くステップ、組換え自己活性化
Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を触媒量のエラスターゼと接触させるステップ、または
これらの両方のステップを含み、これらにより成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製す
る方法。
１５２．（ａ）実施形態８４または８６の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件下
で培養するステップと、
（ｂ）発現したタンパク質を回収するステップと
を含み、これらにより組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を作製する工程
により、前記組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼタンパク質が得られるかまたは得る
ことができる、実施形態１５１の方法。
１５３．宿主細胞が複合培地中で培養される、実施形態１５２の方法。
１５４．複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複
合培地である、実施形態１５３の方法。
１５５．宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で
培養される、実施形態１５２から１５４のいずれか１つの方法。
１５６．クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸
ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態１５５の方法
。
１５７．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ
、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７
５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、実施形態１
５５または実施形態１５６の方法。
１５８．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中
に存在し、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総
濃度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１０
０〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態１５５ま
たは実施形態１５６の方法。
１５９．発現したタンパク質を回収するステップが、上清を回収することを含む、実施
形態１５２から１５８のいずれか１つの方法。
１６０．前記自己活性化ステップが上清中において実施される、実施形態１５９の方法
。
１６１．発現したタンパク質が上清から回収される、実施形態１５２から１５４のいず
れか１つの方法。
１６２．前記自己活性化ステップが上清中において実施される、実施形態１６１の方法
。
１６３．発現したタンパク質を精製するステップをさらに含む、実施形態１６１の方法
。
１６４．組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置く
ステップが、回収されたタンパク質を含有する溶液のｐＨを上昇させることを含む、実施
形態１５１から１６３のいずれか１つの方法。
１６５．溶液のｐＨを塩基性ｐＨまで上昇させる、実施形態１６４の方法。
１６６．塩基性ｐＨが７〜９の範囲内にある、実施形態１６５の方法。
１６７．塩基性ｐＨが８である、実施形態１６６の方法。
１６８．回収されたタンパク質が、前記溶液中において１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度であ
る、実施形態１６４から１６７のいずれか１つの方法。
１６９．回収されたタンパク質が、前記溶液中において５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
、実施形態１６４から１６７のいずれか１つの方法。
１７０．回収されたタンパク質が、前記溶液中において２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
、実施形態１６４から１６７のいずれか１つの方法。
１７１．回収されたタンパク質が、前記溶液中において１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
、実施形態１６４から１６７のいずれか１つの方法。
１７２．回収されたタンパク質が、前記溶液中において０．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で
ある、実施形態１６４から１６７のいずれか１つの方法。
１７３．回収されたタンパク質が、前記溶液中において０．２５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度
である、実施形態１６４から１６７のいずれか１つの方法。
１７４．回収されたタンパク質が、前記溶液中において少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの
濃度である、実施形態１６５から１７３のいずれか１つの方法。
１７５．回収されたタンパク質が、前記溶液中において少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌの
濃度である、実施形態１６５から１７３のいずれか１つの方法。
１７６．回収されたタンパク質が、０．５〜８時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、
実施形態１６５から１７５のいずれか１つの方法。
１７７．回収されたタンパク質が、２〜７時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、実施
形態１７４の方法。
１７８．回収されたタンパク質が、６時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、実施形態
１７７の方法。
１７９．前記塩基性ｐＨへの曝露が２２℃〜２８℃の温度で実施される、実施形態１６
５から１７８のいずれか１つの方法。
１８０．前記塩基性ｐＨへの曝露が２６℃の温度で実施される、実施形態１７９の方法
。
１８１．回収されたタンパク質が自己活性化前に保存される、実施形態１５２から１８
０のいずれか１つの方法。
１８２．回収されたタンパク質が保存前に乾燥凍結される、実施形態１８１の方法。
１８３．回収されたタンパク質が乾燥凍結前に精製される、実施形態１８２の方法。
１８４．回収されたタンパク質が、少なくとも１日間、少なくとも１週間、少なくとも
１カ月間、または少なくとも３カ月間にわたり保存される、実施形態１８１から１８３の
いずれか１つの方法。
１８５．回収されたタンパク質が８０℃〜＋４℃の温度で保存される、実施形態１８４
の方法。
１８６．組換え自己活性化Ｉ型プロエラスターゼが、自己活性化条件下に置かれる前に
精製される、実施形態１５０から１８５のいずれか１つの方法（ただし、これらの実施形
態が実施形態１６０または１６２に従属しない場合に限る）。
１８７．前記成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む、実施
形態１５０から１８６のいずれか１つの方法。
１８８．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１５０から１８７のいずれか１つの方法。
１８９．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１５０から１８７のいずれか１つの方法。
１９０．成熟Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）実施形態８４または８６の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件下で培養す
るステップと、
（ｂ）発現したタンパク質を回収するステップと、
（ｃ）回収されたタンパク質を精製するステップと、
（ｄ）前記タンパク質を含有する溶液のｐＨを上昇させるか、または回収されたタンパ
ク質を触媒量のエラスターゼと接触させて、成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する
ステップと
を含み、これらにより成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法。
１９１．宿主細胞が複合培地中で培養される、実施形態１９０の方法。
１９２．複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複
合培地である、実施形態１９１の方法。
１９３．宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で
培養される、実施形態１９０から１９２のいずれか１つの方法。
１９４．クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸
ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態１９３の方法
。
１９５．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ
、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７
５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、実施形態１
９３または実施形態１９４の方法。
１９６．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中
に存在し、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総
濃度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１０
０〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態１９３ま
たは実施形態１９４の方法。
１９７．（ｅ）前記成熟Ｉ型エラスターゼを精製するステップをさらに含む、実施形態
１９０から１９６のいずれか１つの方法。
１９８．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１９０から１９７のいずれか１つの方法。
１９９．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態１９０から１９７のいずれか１つの方法。
２００．成熟Ｉ型プロエラスターゼタンパク質を作製する方法であって、
（ａ）実施形態８４または８６の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件下で培養す
るステップと、
（ｂ）発現したタンパク質を回収するステップと、
（ｃ）成熟タンパク質が生成されるまで、回収されたタンパク質を塩基性ｐＨに曝露す
るステップと
を含み、これらにより成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を作製する方法。
２０１．宿主細胞が複合培地中で培養される、実施形態２００の方法。
２０２．複合培地が、緩衝されたメタノール複合培地または緩衝されたグリセロール複
合培地である、実施形態２０１の方法。
２０３．宿主細胞が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存在下で
培養される、実施形態２００から２０２のいずれか１つの方法。
２０４．クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、それぞれ、クエン酸
ナトリウム、コハク酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムである、実施形態２０３の方法
。
２０５．１種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が、５〜５０ｍＭ
、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、７
５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭの濃度で前記培養物中に存在する、実施形態２
０３または実施形態２０４の方法。
２０６．複数種のクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物が前記培養物中
に存在し、前記溶液中におけるクエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の総
濃度が５〜５０ｍＭ、７．５〜１００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、１０
０〜１５０ｍＭ、７５〜１２５ｍＭ、または９０〜１１０ｍＭである、実施形態２０３ま
たは実施形態２０４の方法。
２０７．塩基性ｐＨが７〜９である、実施形態２００から２０６のいずれか１つの方法
。
２０８．塩基性ｐＨが８である、実施形態２０７の方法。
２０９．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに１０ｍｇ／ｍｌ以下の
濃度である、実施形態２００から２０８のいずれか１つの方法。
２１０．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに５ｍｇ／ｍｌ以下の濃
度である、実施形態２００から２０８のいずれか１つの方法。
２１１．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに２ｍｇ／ｍｌ以下の濃
度である、実施形態２００から２０８のいずれか１つの方法。
２１２．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに１ｍｇ／ｍｌ以下の濃
度である、実施形態２００から２０８のいずれか１つの方法。
２１３．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに０．５ｍｇ／ｍｌ以下
の濃度である、実施形態２００から２０８のいずれか１つの方法。
２１４．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに０．２５ｍｇ／ｍｌ以
下の濃度である、実施形態２００から２０８のいずれか１つの方法。
２１５．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに少なくとも０．１ｍｇ
／ｍｌの濃度である、実施形態２０９から２１４のいずれか１つの方法。
２１６．回収されたタンパク質が、塩基性ｐＨに曝露したときに少なくとも０．２ｍｇ
／ｍｌの濃度である、実施形態２０９から２１４のいずれか１つの方法。
２１７．回収されたタンパク質が、０．５〜８時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、
実施形態２００から２１４のいずれか１つの方法。
２１８．回収されたタンパク質が、２〜７時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、実施
形態２１７の方法。
２１９．回収されたタンパク質が、６時間にわたり塩基性ｐＨに曝露される、実施形態
２１８の方法。
２２０．前記塩基性ｐＨへの曝露が２２℃〜２８℃の温度で実施される、実施形態２０
０から２１９のいずれか１つの方法。
２２１．前記塩基性ｐＨへの曝露が２６℃の温度で実施される、実施形態２２０の方法
。
２２２．（ｄ）前記成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質を単離するステップをさらに含む
、実施形態２００から２２１のいずれか１つの方法。
２２３．成熟Ｉ型エラスターゼが成熟ブタＩ型エラスターゼである、実施形態１５０か
ら２２２のいずれか１つの方法。
２２４．成熟Ｉ型エラスターゼが成熟ヒトＩ型エラスターゼである、実施形態１５０か
ら２２２のいずれか１つの方法。
２２５．成熟エラスターゼタンパク質の製剤を作製する方法であって、
（ａ）活性化プロエラスターゼタンパク質を自己活性化条件下に置いて成熟エラスター
ゼタンパク質を作製するステップと、
（ｂ）成熟エラスターゼタンパク質を製剤化するステップと
を含み、これらにより成熟エラスターゼタンパク質の製剤を作製する方法。
２２６．自己活性化プロエラスターゼタンパク質が組換え体である、実施形態２２５の
方法。
２２７．ステップ（ａ）の前に、プロエラスターゼタンパク質が発現する条件下で増殖
した前記自己活性化プロエラスターゼタンパク質を発現させることが可能な宿主細胞の培
養物からプロエラスターゼタンパク質を回収するステップをさらに含む、実施形態２２６
の方法。
２２８．ステップ（ｂ）の前に、前記成熟エラスターゼタンパク質を精製するステップ
をさらに含む、実施形態２２５または実施形態２２６の方法。
２２９．前記製剤化するステップが、前記成熟エラスターゼタンパク質を凍結乾燥させ
ることを含む、実施形態２２５から２２８のいずれか１つの方法。
２３０．凍結乾燥前に、成熟エラスターゼタンパク質が緩衝液または緩衝成分と混合さ
れない、実施形態２２９の方法。
２３１．凍結乾燥後に、成熟エラスターゼタンパク質が１種または複数種の緩衝成分と
混合される、実施形態２３０の方法。
２３２．凍結乾燥前に、成熟エラスターゼタンパク質が緩衝液または１種もしくは複数
種の緩衝成分と混合される、実施形態２２９の方法。
２３３．緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）バッファーであるか、または緩
衝成分がＰＢＳ緩衝成分である、実施形態２３１または２３２の方法。
２３４．緩衝液がデキストランを含むか、または緩衝成分がデキストランを含む、実施
形態２３１から２３３のいずれか１つの方法。
２３５．デキストランがデキストラン−１８である、実施形態２３４の方法。
２３６．緩衝液がポリソルベート８０を含む、実施形態２３０から２３５のいずれか１
つの方法。
２３７．前記製剤化するステップが、凍結乾燥した成熟エラスターゼタンパク質を液体
で再溶解することをさらに含む、実施形態２２９から２３６のいずれか１つの方法。
２３８．液体が水である、実施形態２３７の方法。
２３９．液体が緩衝液である、実施形態２３７の方法。
２４０．緩衝液が、希釈されない緩衝液であるか、濃縮緩衝液であるか、または希釈緩
衝液である、実施形態２３９の方法。
２４１．再溶解時において、成熟エラスターゼタンパク質溶液が、希釈されない緩衝剤
、濃縮緩衝液、または希釈緩衝液中において生成される、実施形態２３７から２４０のい
ずれか１つの方法。
２４２．緩衝成分が凍結乾燥物中に存在するか、再溶解時に添加されるか、またはその
両方である、実施形態２４１の方法。
２４３．希釈されない緩衝液が１×ＰＢＳを含む、実施形態２４０から２４２のいずれ
か１つの方法。
２４４．希釈緩衝液が０．１×ＰＢＳ〜０．５×ＰＢＳを含む、実施形態２４０または
実施形態２４１の方法。
２４５．希釈緩衝液が０．１×ＰＢＳを含む、実施形態２４４の方法。
２４６．希釈緩衝液が０．５×ＰＢＳを含む、実施形態２４４の方法。
２４７．濃縮緩衝液が１．１×ＰＢＳ〜３×ＰＢＳを含む、実施形態２４０または実施
形態２４１の方法。
２４８．濃縮緩衝液が１．５×ＰＢＳ〜２×ＰＢＳを含む、実施形態２４７の方法。
２４９．緩衝液がデキストランを含む、実施形態２４１から２４８のいずれか１つの方
法。
２５０．デキストランがデキストラン１８である、実施形態２４９の方法。
２５１．緩衝液がポリソルベート８０を含む、実施形態２４１から２５０のいずれか１
つの方法。
２５２．緩衝液がｐＨ７〜８である、実施形態２４１から２５１のいずれか１つの方法
。
２５３．緩衝液がｐＨ７．４である、実施形態２５２の方法。
２５４．成熟エラスターゼタンパク質が０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度
で再溶解される、実施形態２３７から２５３のいずれか１つの方法。
２５５．成熟エラスターゼタンパク質が０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度で再
溶解される、実施形態２５４の方法。
２５６．成熟エラスターゼタンパク質が５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解
される、実施形態２５５の方法。
２５７．成熟エラスターゼタンパク質が１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶
解される、実施形態２５６の方法。
２５８．前記製剤が、前記成熟エラスターゼタンパク質を含む医薬組成物である、実施
形態２２５から２５７のいずれか１つの方法。
２５９．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態２２５から２５８のいずれか１つの方法。
２６０．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態２２５から２５８のいずれか１つの方法。
２６１．凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを作製する方法であって、
（ａ）実施形態１５１から１８１のいずれか１つの方法に従って成熟Ｉ型エラスターゼ
を作製するステップと、
（ｂ）成熟Ｉ型エラスターゼを単離するステップと、
（ｃ）前記単離された成熟Ｉ型エラスターゼを凍結乾燥させるステップと
を含み、これらにより凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを作製する方法。
２６２．凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが９５％〜１００％の純度にある、実施形
態２６１の方法。
２６３．凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが少なくとも９５％の純度にある、実施形
態２６１または実施形態２６２の方法。
２６４．凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが少なくとも９８％の純度にある、実施形
態２６１または実施形態２６２の方法。
２６５．凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼが均一になるまで精製される、実施形態２
６１から２６４のいずれか１つの方法。
２６６．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態２６１から２６５のいずれか１つの方法。
２６７．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態２６１から２６５のいずれか１つの方法。
２６８．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または
配列番号８７から本質的になる、実施形態１３０、１４９、１８８、１９８、２２３、２
５９、および２６７のいずれか１つの方法。
２６９．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本
質的になる、実施形態２６８の方法。
２７０．成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、実
施形態１３１、１５０、１８９、１９９、２２４、２６０、および２６８のいずれか１つ
の方法。
２７１．プロエラスターゼタンパク質が、実施形態１３から２７のいずれか１つのタン
パク質である、実施形態１１１から１２８、１３２から１４８、１５１から１９７、およ
び２２５から２５７のいずれか１つの方法。
２７２．発現されるタンパク質が実施形態１３から２７のいずれか１つのタンパク質で
ある、実施形態２００から実施形態２２２のいずれか１つの方法。
２７３．実施形態１４９、１８８、１９８、および２２３のいずれか１つの方法により
作製されるかまたは得ることができる成熟ヒトＩ型エラスターゼ。
２７４．１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を有する、実施形態２７３の成熟ヒトＩ
型エラスターゼ。
２７５．実施形態１５０、１８９、１９９、および２２４のいずれか１つの方法により
作製されるかまたは得ることができる、成熟ブタＩ型エラスターゼ。
２７６．１０〜１００Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を有する、実施形態２７５の成熟ヒ
トＩ型エラスターゼ。
２７７．治療有効量の（ａ）実施形態２７３もしくは実施形態２７４の成熟ヒトＩ型エ
ラスターゼ、または（ｂ）実施形態２５９の方法により作製されるかもしくは得ることが
できる成熟ヒトＩ型エラスターゼの製剤を含む医薬組成物。
２７８．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または
配列番号８７から本質的になる、実施形態２７７の医薬組成物。
２７９．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本
質的になる、実施形態２７８の医薬組成物。
２８０．治療有効量の（ａ）実施形態２７５もしくは実施形態２７６の成熟ブタＩ型エ
ラスターゼ、または（ｂ）実施形態２６０の方法により作製されるかもしくは得ることが
できる成熟ブタＩ型エラスターゼの製剤を含む医薬組成物。
２８１．成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、実
施形態２８０の医薬組成物。
２８２．（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容され
る担体とを含む医薬組成物であって、以下の特性：
（ａ）組成物がトリプシンを含まないこと、
（ｂ）組成物がトリプシンを実質的に含まないこと、
（ｃ）組成物が配列番号２、３、３７、３８、７０および／または７１からなる任意の
タンパク質を含まないこと、
（ｄ）組成物が配列番号２、３、３７、３８、７０および／または７１からなる任意の
タンパク質を実質的に含まないこと、
（ｅ）組成物が細菌タンパク質を含まないこと、
（ｆ）組成物が細菌タンパク質を実質的に含まないこと、
（ｇ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を含まない
こと、
（ｈ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を実質的に
含まないこと
の少なくとも１つを特徴とする医薬組成物。
２８３．（ｉ）治療有効量の成熟ヒトＩ型エラスターゼと、（ｉｉ）薬学的に許容され
る担体とを含む医薬組成物であって、以下の特性：
（ａ）組成物がトリプシンを含まないこと、
（ｂ）組成物がトリプシンを実質的に含まないこと、
（ｃ）組成物が配列番号７０および７１からなる任意のタンパク質を含まないこと、
（ｄ）組成物が配列番号２および３からなる任意のタンパク質を実質的に含まないこと
、
（ｅ）組成物が細菌タンパク質を含まないこと、
（ｆ）組成物が細菌タンパク質を実質的に含まないこと、
（ｇ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を含まない
こと、
（ｈ）組成物が、前記成熟ヒトＩ型エラスターゼ以外の哺乳動物タンパク質を実質的に
含まないこと
の少なくとも１つを特徴とする医薬組成物。
２８４．特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも２つを特徴とする、実施形態２８２または実
施形態２８３の医薬組成物。
２８５．前記少なくとも２つの特性が（ａ）および（ｃ）を含む、実施形態２８４の医
薬組成物。
２８６．前記少なくとも２つの特性が（ｂ）および（ｄ）を含む、実施形態２８４の医
薬組成物。
２８７．特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも３つを特徴とする、実施形態２８２または実
施形態２８３の医薬組成物。
２８８．前記少なくとも３つの特性が（ａ）、（ｃ）、および（ｅ）を含む、実施形態
２８４の医薬組成物。
２８９．前記少なくとも３つの特性が（ｂ）、（ｄ）、および（ｆ）を含む、実施形態
２８４の医薬組成物。
２９０．特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも４つを特徴とする、実施形態２８２または実
施形態２８３の医薬組成物。
２９１．前記少なくとも４つの特性が（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、および（ｇ）を含む、
実施形態２８４の医薬組成物。
２９２．前記少なくとも４つの特性が（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、および（ｈ）を含む、
実施形態２８４の医薬組成物。
２９３．特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも５つを特徴とする、実施形態２８２または実
施形態２８３の医薬組成物。
２９４．特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも６つを特徴とする、実施形態２８２または実
施形態２８３の医薬組成物。
２９５．特性（ａ）〜（ｈ）の少なくとも７つを特徴とする、実施形態２８２または実
施形態２８３の医薬組成物。
２９６．特性（ａ）〜（ｈ）のすべてを特徴とする、実施形態２８２または実施形態２
８３の医薬組成物。
２９７．配列番号８５、８６、９４、および９５からなる１つ、２つ、３つ、または４
つすべてのタンパク質を含まないかまたは実質的に含まない、実施形態２８２から２９６
のいずれか１つの医薬組成物。
２９８．配列番号８５および配列番号８６からなるタンパク質を含まないかまたは実質
的に含まない、実施形態２８２から２９７のいずれか１つの医薬組成物。
２９９．配列番号９４および配列番号９５からなるタンパク質を含まないかまたは実質
的に含まない、実施形態２８２から２９７のいずれか１つの医薬組成物。
３００．配列番号１０６、１０７、および１０８からなる１つ、２つ、または３つすべ
てのタンパク質を含まないかまたは実質的に含まない、実施形態２８２から２９７のいず
れか１つの医薬組成物。
３０１．薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンを含有する、実施形態２８２から
３００のいずれか１つの医薬組成物。
３０２．前記医薬組成物が液体組成物であり、前記薬学的に許容されるレベルのエンド
トキシンが８ＥＵ／ｍｌ以下である、実施形態３０１の医薬組成物。
３０３．前記薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンが５ＥＵ／ｍｌ以下である、
実施形態３０２の医薬組成物。
３０４．前記医薬組成物が固体組成物であり、前記薬学的に許容されるレベルのエンド
トキシンが成熟ヒトＩ型エラスターゼ１グラム当たり１０ＥＵ以下である、実施形態３０
１の医薬組成物。
３０５．前記薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンが成熟ヒトＩ型エラスターゼ
１グラム当たり５ＥＵ以下である、実施形態３０４の医薬組成物。
３０６．成熟ヒトＩ型エラスターゼが、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴と
する、実施形態２８２から３０５のいずれか１つの医薬組成物。
３０７．成熟ヒトＩ型エラスターゼが、２５〜３５Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴
とする、実施形態３０６の医薬組成物。
３０８．成熟ヒトＩ型エラスターゼが、１０Ｕ／タンパク質ｍｇを超える比活性を特徴
とする、実施形態３０６の医薬組成物。
３０９．成熟ヒトＩ型エラスターゼが、２０Ｕ／タンパク質ｍｇを超える比活性を特徴
とする、実施形態３０６のいずれか１つの医薬組成物。
３１０．成熟ヒトＩ型エラスターゼが、配列番号５、８４、または８７から本質的にな
る、実施形態２８２から３０９のいずれか１つの医薬組成物。
３１１．成熟ヒトＩ型エラスターゼが、配列番号１または配列番号４から本質的になる
、実施形態３１０の医薬組成物。
３１２．トリプシン活性が、成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり４ｎｇ
未満に相当する、実施形態２８２から３１１のいずれか１つの医薬組成物。
３１３．トリプシン活性が、成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり２ｎｇ
未満に相当する、実施形態３１２の医薬組成物。
３１４．１ｍｇ／ｍｌの前記タンパク質濃度への再溶解時において、トリプシン活性が
２ｎｇ／トリプシンｍｌ未満に相当する、配列番号５、８４、または８７から本質的にな
るタンパク質の凍結乾燥製剤。
３１５．水分含量が５％未満である、実施形態３１４の凍結乾燥製剤。
３１６．ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、および塩化物イオンを含
む、実施形態３１５の凍結乾燥製剤。
３１７．ポリソルベート８０を含む、実施形態３１５の凍結乾燥製剤。
３１８．デキストランを含む、実施形態３１５の凍結乾燥製剤。
３１９．デキストランがデキストラン−１８である、実施形態３１８の凍結乾燥製剤。
３２０．ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、およびポ
リソルベート８０を含む、実施形態３１１の凍結乾燥製剤。
３２１．ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、およびデ
キストランを含む、実施形態３１４の凍結乾燥製剤。
３２２．デキストランがデキストラン−１８である、実施形態３２１の凍結乾燥製剤。
３２３．ナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、ポリソル
ベート８０、およびデキストランを含む、実施形態３１４の凍結乾燥製剤。
３２４．デキストランがデキストラン−１８である、実施形態３２３の凍結乾燥製剤。
３２５．トリプシン活性が２ｎｇ／トリプシンｍｌ未満に相当する、配列番号５、８４
、または８７から本質的になる少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を含む液体
製剤。
３２６．溶液が緩衝液である、実施形態３２５の液体製剤。
３２７．溶液がｐＨ７〜８まで緩衝される、実施形態３２６の液体製剤。
３２８．溶液がＰＢＳである、実施形態３２６の液体製剤。
３２９．溶液が１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、および１
０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、実施形態３２８の液体製剤。
３３０．１種または複数種の賦形剤をさらに含む、実施形態３２５から３２９のいずれ
か１つの液体製剤。
３３１．前記１種または複数種の賦形剤がデキストラン−１８を含む、実施形態３３０
の液体製剤。
３３２．デキストラン−１８が、前記溶液に対する重量／容量比で８％の量である、実
施形態３３１の液体製剤。
３３３．前記１種または複数種の賦形剤がポリソルベート８０を含む、実施形態３３０
の液体製剤。
３３４．ポリソルベート８０が、前記溶液に対する重量／容量比で０．０１％の量であ
る、実施形態３３３の液体製剤。
３３５．前記溶液中における前記タンパク質の濃度が０．００１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ
／ｍｌの範囲にある、実施形態３２５から３３４のいずれか１つの液体製剤。
３３６．前記溶液中における前記タンパク質の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍ
ｌの範囲にある、実施形態３３５の液体製剤。
３３７．１種または複数種の防腐剤、溶解剤、および着色剤をさらに含む、実施形態３
２５から３３６のいずれか１つの液体製剤。
３３８．配列番号５、８４、または８７の前記タンパク質以外の哺乳動物タンパク質を
実質的に含まない、実施形態３２５から３３７のいずれか１つの液体製剤。
３３９．細菌タンパク質を実質的に含まない、実施形態３２５から３３８のいずれか１
つの液体製剤。
３４０．実施形態２２５から２５８のいずれか１つの方法により作製されるかまたは得
ることができる製剤。
３４１．液体製剤である、実施形態３４０の製剤。
３４２．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態３４０または３４１の製剤。
３４３．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または
配列番号８７から本質的になる、実施形態３４２の製剤。
３４４．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本
質的になる、実施形態３４２の製剤。
３４５．成熟Ｉ型エラスターゼタンパク質がブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質であ
る、実施形態３４０または３４１の製剤。
３４６．成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、実
施形態３４５の製剤。
３４７．正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正確にプロセ
シングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物から、１種または複数種の不正確にプ
ロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質を除去する方法であって、
（ａ）正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正確にプロセシ
ングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物を含む組成物を、正確にプロセシングさ
れた成熟酵素が活性となるｐＨ下に置くステップと、
（ｂ）１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
分解される時間までこのようなｐＨを維持するステップと
を含み、これらにより、正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不
正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物から、前記１種または複
数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質を除去する方法。
３４８．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が、正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質と比べて、少なくとも１
つの付加的アミノ酸またはより少数のアミノ酸をＮ末端において含有する、実施形態３４
７の方法。
３４９．前記ｐＨが５〜１２である、実施形態３４７または３４８の方法。
３５０．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が５０％〜１００％分解される、実施形態３４７から３４９のいずれか１つの方法。
３５１．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が５０％〜９９％分解される、実施形態３４８の方法。
３５２．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が５０％〜９８％分解される、実施形態３４８の方法。
３５３．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が５０％〜９５％分解される、実施形態３４８の方法。
３５４．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が５０％〜９０％分解される、実施形態３４８の方法。
３５５．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が少なくとも５０％分解される、実施形態３５０から３５４のいずれか１つの方法。
３５６．混合物中におけるすべての不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタン
パク質が少なくとも５０％分解される、実施形態３５５の方法。
３５７．少なくとも１種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
少なくとも７５％分解される、実施形態３５０から３５４のいずれか１つの方法。
３５８．複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なくと
も７５％分解される、実施形態３５７の方法。
３５９．混合物中におけるすべての不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタン
パク質が少なくとも７５％分解される、実施形態３５７の方法。
３６０．少なくとも１種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
少なくとも９０％分解される、実施形態３５０から３５４のいずれか１つの方法。
３６１．複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が少なくと
も９０％分解される、実施形態３６０の方法。
３６２．混合物中のすべての不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質
が少なくとも９０％分解される、実施形態３６０の方法。
３６３．組成物が、総エラスターゼタンパク質が１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体
組成物である、実施形態３４７から３６２のいずれか１つの方法。
３６４．組成物が、総エラスターゼタンパク質が５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組
成物である、実施形態３４７から３６２のいずれか１つの方法。
３６５．組成物が、総エラスターゼタンパク質が２ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組
成物である、実施形態３４７から３６２のいずれか１つの方法。
３６６．組成物が、総エラスターゼタンパク質が１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液体組
成物である、実施形態３４７から３６２のいずれか１つの方法。
３６７．組成物が、総エラスターゼタンパク質が０．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である液
体組成物である、実施形態３４７から３６２のいずれか１つの方法。
３６８．組成物が、総エラスターゼタンパク質が０．２５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度である
液体組成物である、実施形態３４７から３６２のいずれか１つの方法。
３６９．組成物が、総エラスターゼタンパク質が少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で
ある液体組成物である、実施形態３６３から３６８のいずれか１つの方法。
３７０．組成物が、総エラスターゼタンパク質が少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で
ある液体組成物である、実施形態３６３から３６８のいずれか１つの方法。
３７１．前記組成物中におけるトリプシン活性が、総エラスターゼタンパク質１ｍｇ当
たり４ｎｇ／トリプシンｍｌ未満である、実施形態３４７から３７０のいずれか１つの方
法。
３７２．前記組成物中におけるトリプシン活性が、総エラスターゼタンパク質１ｍｇ当
たり２ｎｇ／トリプシンｍｌ未満である、実施形態３４７から３７０のいずれか１つの方
法。
３７３．組成物が、配列番号１０４からなるタンパク質を含まないかもしくは実質的に
含まず、かつ／または配列番号１０５からなるタンパク質を含まないかもしくは実質的に
含まない、実施形態３４７から３７２のいずれか１つの方法。
３７４．成熟Ｉ型エラスターゼを含む医薬組成物を作製する方法であって、（ｉ）実施
形態２６１から２６５のいずれか１つの方法により凍結乾燥した成熟Ｉ型エラスターゼを
作製するステップと、（ｉｉ）水または薬学的に許容される担体中において凍結乾燥した
成熟Ｉ型エラスターゼを再溶解するステップとを含み、これらにより成熟ヒトＩ型エラス
ターゼを含む医薬組成物を作製する方法。
３７５．成熟Ｉ型エラスターゼを含む医薬組成物を作製する方法であって、水または薬
学的に許容される担体中において実施形態３１４から３２４のいずれか１つの乾燥凍結製
剤を再溶解するステップを含み、これにより成熟Ｉ型エラスターゼを含む医薬組成物を作
製する方法。
３７６．医薬組成物がリン酸を含む、実施形態３７４または３７５の方法。
３７７．成熟Ｉ型エラスターゼが成熟ヒトＩ型エラスターゼである、実施形態３７４か
ら３７６のいずれか１つの方法。
３７８．１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴とする、実施形態３７７の方法。
３７９．成熟Ｉ型エラスターゼが２５〜３５Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を特徴とする
、実施形態３７７の方法。
３８０．前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１
週間の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後
、４℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後におい
て、その比活性の６０％〜１００％を維持する、実施形態３７７から３７９のいずれか１
つの方法。
３８１．前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１
週間の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後
、４℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後におい
て、その比活性の６０％〜９８％を維持する、実施形態３７７から３７９のいずれか１つ
の方法。
３８２．前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１
週間の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後
、４℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後におい
て、その比活性の６０％〜９５％を維持する、実施形態３７７から３７９のいずれか１つ
の方法。
３８３．前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１
週間の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後
、４℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後におい
て、その比活性の６０％〜９０％を維持する、実施形態３７７から３７９のいずれか１つ
の方法。
３８４．前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１
週間の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後
、４℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後におい
て、その比活性の６０％〜８０％を維持する、実施形態３７７から３７９のいずれか１つ
の方法。
３８５．前記医薬組成物中における成熟ヒトＩ型エラスターゼが、４℃で少なくとも１
週間の保存後において、その比活性の少なくとも７０％を維持する、実施形態３７７から
３８４のいずれか１つの方法。
３８６．実施形態３７４から３８５のいずれか１つの方法により作製されるかまたは得
ることができる医薬組成物。
３８７．それを必要とするヒト対象における動脈または静脈の直径を治療的に増大させ
る方法であって、（ａ）実施形態２７７から３１３および３８６のいずれか１つの医薬組
成物、（ｂ）実施形態３２５から３３９のいずれか１つの液体製剤、または（ｃ）実施形
態３４１の製剤を、前記動脈または静脈の直径を増大させるのに十分な用量で、前記ヒト
対象における動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含む方法。
３８８．血管の直径、血管の内腔径、またはこれらの両方が増大する、実施形態３８７
の方法。
３８９．それを必要とするヒト対象における動脈または静脈の血管攣縮を予防または治
療する方法であって、（ａ）実施形態２７７から３１３および３８６のいずれか１つの医
薬組成物、（ｂ）実施形態３２５から３３９のいずれか１つの液体製剤、または（ｃ）実
施形態３４１の製剤を、前記動脈または静脈の血管攣縮を予防または治療するのに十分な
用量で、前記ヒト対象における動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含む方法
。
３９０．そのような治療を必要とするヒト対象における動脈または静脈の閉塞を治療す
る方法であって、（ａ）実施形態２７７から３１３および３８６のいずれか１つの医薬組
成物、（ｂ）実施形態３２５から３３９のいずれか１つの液体製剤、または（ｃ）実施形
態３４１の製剤を前記ヒト対象における動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを
含み、前記投与の結果として前記動脈壁または静脈壁内におけるエラスチンのタンパク質
分解をもたらし、前記動脈または静脈の直径を拡張する方法。
３９１．そのような治療を必要とするヒト対象における動静脈の血液透析グラフトまた
は動静脈瘻へと接合される動脈または静脈を治療する方法であって、（ａ）実施形態２７
７から３１３および３８６のいずれか１つの医薬組成物、（ｂ）実施形態３２５から３３
９のいずれか１つの液体製剤、または（ｃ）実施形態３４１の製剤を前記ヒト対象におけ
る動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含み、前記投与の結果として前記動脈
壁または静脈壁内におけるエラスチンのタンパク質分解をもたらし、前記動脈または静脈
の直径を拡張する方法。
３９２．血液透析において用いられるヒト対象における静脈を治療する方法であって、
（ａ）実施形態２７７から３１３および３８６のいずれか１つの医薬組成物、（ｂ）実施
形態３２５から３３９のいずれか１つの液体製剤、または（ｃ）実施形態３４１の製剤を
前記ヒト対象における静脈壁へと局所投与するステップを含み、前記投与の結果として前
記静脈壁内におけるエラスチンのタンパク質分解をもたらし、前記静脈の直径を拡張する
方法。
３９３．動脈壁または静脈壁内に送達装置の一部を挿入し、動脈壁または静脈壁へとエ
ラスターゼを送達するステップをさらに含む、実施形態３８７から３９２のいずれか１つ
の方法。
３９４．医薬製剤または液体製剤がカテーテルにより投与される、実施形態３８７から
３９３のいずれか１つの方法。
３９５．医薬組成物または液体製剤が、動脈壁または静脈壁内へと直接に投与される、
実施形態３８７から３９４のいずれか１つの方法。
３９６．動脈または静脈が閉塞している、実施形態３８７から３９５のいずれか１つの
方法。
３９７．動脈または静脈が狭窄により閉塞している、実施形態３９６の方法。
３９８．治療前において、閉塞により不十分な量の血液しか流過できない、実施形態３
９７の方法。
３９９．閉塞が狭窄である、実施形態３９８の方法。
４００．動脈または静脈が内膜過形成により閉塞している、実施形態３９９の方法。
４０１．医薬組成物または液体製剤が、閉塞した冠動脈または末梢動脈に投与される、
実施形態３８７から４００のいずれか１つの方法。
４０２．動脈または静脈が内膜過形成による閉塞を受けやすい、実施形態３８７から３
９５のいずれか１つの方法。
４０３．組成物が静脈壁へと投与される、実施形態３８７から４００および４０２のい
ずれか１つの方法。
４０４．静脈が、動静脈の血液透析グラフトまたは動静脈瘻へと接合される、実施形態
４０３の方法。
４０５．静脈が血液透析において用いられる、実施形態４０４の方法。
４０６．前記静脈を動脈へと直接に接合するか、またはグラフトを介して前記静脈を動
脈へと接合するステップをさらに含む、実施形態４０５の方法。
４０７．組成物が、手術で露出した動脈または静脈の外膜表面へと投与される、実施形
態３８７から３９４のいずれか１つの方法。
４０８．それぞれ、前記医薬組成物、液体製剤、または製剤中における成熟Ｉ型エラス
ターゼタンパク質が、ヒトＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、実施形態３８７から
４０７のいずれか１つの方法。
４０９．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または
配列番号８７から本質的になる、実施形態４０８の方法。
４１０．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号１または配列番号４から本
質的になる、実施形態４０８の方法。
４１１．それぞれ、前記医薬組成物、液体製剤、または製剤中における成熟Ｉ型エラス
ターゼタンパク質が、ブタＩ型成熟エラスターゼタンパク質である、実施形態３８７から
４０７のいずれか１つの方法。
４１２．成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、実
施形態４１１の方法。
４１３．０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの（ａ）実施形態２７３または２７４の成熟ヒ
トＩ型エラスターゼ、または（ｂ）実施形態２５９の方法により作製されるかもしくは得
ることができる成熟ヒトＩ型エラスターゼの製剤を含む単位用量。
４１４．成熟ヒトＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号５、配列番号８４、または
配列番号８７から本質的になる、実施形態４１３の単位用量。
４１５．０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの（ａ）実施形態２７５または２７６の成熟ブ
タＩ型エラスターゼ、または（ｂ）実施形態２６０の方法により作製されるかもしくは得
ることができる成熟ブタＩ型エラスターゼの製剤を含む単位用量。
４１６．成熟ブタＩ型エラスターゼタンパク質が、配列番号３９から本質的になる、実
施形態４１５の単位用量。
４１７．０．５ｍｇ〜５０ｍｇの前記成熟Ｉ型エラスターゼを含む、実施形態４１３か
ら４１６のいずれか１つの単位用量。
４１８．１ｍｇ〜２０ｍｇの前記成熟Ｉ型エラスターゼを含む、実施形態４１７の単位
用量。
４１９．５ｍｇ〜１０ｍｇの前記成熟Ｉ型エラスターゼを含む、実施形態４１８の単位
用量。
４２０．容器、パック、分注器、またはカテーテル内にある、実施形態４１３から４１
９のいずれか１つの単位用量。
４２１．実施形態１から３９および６８から６９のいずれか１つによるエラスターゼタ
ンパク質または実施形態８９から２２４、２６１から２７６、および３４７から３７３の
いずれか１つの方法により得られるかもしくは得ることができるエラスターゼタンパク質
、実施形態４０から６７のいずれか１つによる核酸、実施形態７０から７２のいずれか１
つによるベクター、実施形態７３から８７のいずれか１つによる細胞、実施形態８８によ
る細胞培養物上清、実施形態３１４から３４６のいずれか１つによるエラスターゼ製剤ま
たは実施形態２６１から２７６のいずれか１つの方法により得られるかもしくは得ること
ができるエラスターゼ製剤、実施形態２７７から３１３および３８６のいずれか１つの方
法による医薬組成物または実施形態３７４から３８５のいずれか１つの方法により得られ
るかもしくは得ることができる医薬組成物、あるいは実施形態４１５から４２０のいずれ
か１つによる単位用量を含むキット。
４２２．治療用のキットである、実施形態４２１のキット。
４２３．容器、パック、分注器、またはカテーテルを含む、実施形態４２２のキット。
４２４．製造キットである、実施形態４２３のキット。
【０３４９】
本発明は、配列番号６４および配列番号６９のプロエラスターゼタンパク質に焦点を絞
るがこれらに限定されない以下の具体的な実施形態によりさらに例示される：
４２５．配列番号６４または配列番号６９のアミノ酸配列を含むタンパク質。
４２６．単離された、実施形態４２５のタンパク質。
４２７．実施形態４２５のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
４２８．該タンパク質が、配列番号６４または配列番号６９の前記アミノ酸配列に作動
的に連結されたシグナル配列を含む、実施形態４２７の核酸分子。
４２９．シグナル配列がメタノール資化酵母において作動的である、実施形態４２８の
核酸分子。
４３０．シグナル配列が酵母α因子シグナルペプチドである、実施形態４２９の核酸分
子。
４３１．実施形態４２７から４３０のいずれか１つの核酸分子を含むベクター。
４３２．ヌクレオチド配列が多量体化される、実施形態４３１のベクター。
４３３．実施形態４３１のベクターを含む宿主細胞。
４３４．前記ベクターの少なくとも１コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施
形態４３３の宿主細胞。
４３５．前記ベクターの２〜５コピーが宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、実施形態４
３４の宿主細胞。
４３６．ヌクレオチド配列が多量体化される、実施形態４３３の宿主細胞。
４３７．該ベクターが、前記ヌクレオチド配列の２〜５コピーを含む、実施形態４３６
の宿主細胞。
４３８．実施形態４２７から４３０のいずれか１つの核酸分子を発現するように遺伝子
改変された細胞。
４３９．メタノール資化酵母細胞である、実施形態４３８の細胞。
４４０．前記ヌクレオチド配列がメタノール誘導性プロモーターに作動的に連結されて
いる、実施形態４３９の細胞。
４４１．実施形態４２５に記載のタンパク質を含む細胞培養物上清。
４４２．実施形態４２９の細胞を配列番号６４または配列番号６９のタンパク質が発現
される条件下で培養するステップを含む、エラスターゼタンパク質を作製する方法。
４４３．前記条件が、（ｉ）ｐＨ２〜６での増殖時間もしくは誘導時間、（ｉｉ）２２
℃〜２８℃の温度での増殖時間もしくは誘導時間、（ｉｉｉ）複合培地中において培養す
ること、または（ｉｖ）クエン酸化合物、コハク酸化合物、もしくは酢酸化合物の存在下
で培養することの１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含む、実施形態４４２の方法。
４４４．タンパク質を回収するステップをさらに含む、実施形態４４２または実施形態
４３の方法。
４４５．配列番号６４または配列番号６９の前記タンパク質を活性化条件に曝露して成
熟エラスターゼタンパク質を作製するステップをさらに含む、実施形態４４２から４４４
のいずれか１つの方法。
４４６．前記活性化条件への曝露前に前記タンパク質が精製される、実施形態４４５の
方法。
４４７．前記タンパク質が、クエン酸化合物、コハク酸化合物、または酢酸化合物の存
在下で精製される、実施形態４４６の方法。
４４８．成熟エラスターゼタンパク質を精製するステップをさらに含む、実施形態４４
５から４４７のいずれか１つの方法。
４４９．精製された成熟エラスターゼタンパク質を凍結乾燥させるステップをさらに含
む、実施形態４４８の方法。
４５０．成熟エラスターゼタンパク質を作製する方法であって、実施形態４４１による
細胞培養物上清を自己活性化条件下に置くステップを含み、これにより成熟エラスターゼ
タンパク質を作製する方法。
４５１．成熟エラスターゼタンパク質を精製するステップをさらに含む、実施形態４５
０の方法。
４５２．精製された成熟エラスターゼタンパク質を凍結乾燥させるステップをさらに含
む、実施形態４５１の方法。
４５３．成熟エラスターゼタンパク質を含む医薬組成物を作製する方法であって、実施
形態４４９または実施形態４５２の方法により作製される凍結乾燥したプロエラスターゼ
タンパク質を含む凍結乾燥物を再溶解するステップを含む方法。
４５４．凍結乾燥物が、（ａ）１種もしくは複数種の緩衝成分を含むか、または（ｂ）
緩衝成分を含まない、実施形態４５３の方法。
４５５．凍結乾燥物が水または緩衝液に再溶解される、実施形態４５４の方法。
４５６．再溶解時において、成熟エラスターゼタンパク質溶液が、希釈されない緩衝液
、濃縮緩衝液、または希釈緩衝液中において生成される、実施形態４５５の方法。
４５７．緩衝液がリン酸緩衝生理食塩液である、実施形態４５６の方法。
４５８．成熟エラスターゼタンパク質が０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度
へと再溶解される、実施形態４５３から４５７のいずれか１つの方法。
４５９．成熟エラスターゼタンパク質が、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活性を有す
る、実施形態４５３から４５８のいずれか１つの方法。
４６０．以下の特性：
（ａ）組成物がトリプシンを含まないこと；
（ｂ）組成物がトリプシンを実質的に含まないこと；
（ｃ）組成物が配列番号７０および７１からなる任意のタンパク質を含まないこと；
（ｄ）組成物が配列番号２および３からなる任意のタンパク質を実質的に含まないこと
；
（ｅ）組成物が細菌タンパク質を含まないこと；
（ｆ）組成物が細菌タンパク質を実質的に含まないこと；
（ｇ）組成物が前記成熟エラスターゼタンパク質以外の哺乳動物タンパク質を含まない
こと；
（ｈ）組成物が前記成熟エラスターゼタンパク質以外の哺乳動物タンパク質を実質的に
含まないこと；
（ｉ）組成物が配列番号８５、８６、９４、および９５からなる１つ、２つ、３つ、ま
たは４つすべてのタンパク質を含まないかまたは実質的に含まないこと；
（ｊ）組成物が配列番号１０６、１０７、および１０８からなる１つ、２つ、または３
つすべてのタンパク質を含まないかまたは実質的に含まないこと；
（ｋ）組成物が薬学的に許容されるレベルのエンドトキシンを含むこと；
（ｌ）組成物中の成熟エラスターゼタンパク質が、１〜４０Ｕ／タンパク質ｍｇの比活
性を特徴とすること；
（ｍ）前記組成物中のトリプシン活性が、成熟エラスターゼタンパク質１ｍｇ当たり４
ｎｇ未満に相当すること；
（ｎ）組成物がポリソルベート−８０を含むこと；
（ｏ）組成物がデキストランを含むこと；
（ｐ）組成物がナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、お
よびポリソルベート−８０を含むこと；
（ｑ）組成物がナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、お
よびデキストランを含むこと；
（ｒ）組成物がナトリウムイオン、カリウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、ポ
リソルベート−８０、およびデキストランを含むこと；
（ｓ）前記組成物中における成熟エラスターゼタンパク質が、４℃で少なくとも１週間
の保存後、４℃で少なくとも１カ月間の保存後、４℃で少なくとも２カ月間の保存後、４
℃で少なくとも３カ月間の保存後、または４℃で少なくとも６カ月間の保存後においてそ
の比活性の６０％〜１００％を維持すること；ならびに
（ｔ）組成物が、単位用量０．００３３ｍｇ〜２００ｍｇの前記成熟エラスターゼタン
パク質を含むこと
の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ
、少なくとも６つ、少なくとも７つを特徴とする成熟エラスターゼタンパク質を含む医薬
組成物。
４６１．以下の群（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）（ａ）、（ｂ）、または（ｍ）
（ｉｉ）（ｅ）または（ｆ）
（ｉｉｉ）（ｇ）または（ｈ）
（ｉｖ）（ｋ）
（ｖ）（ｌ）
から独立に選択される少なくとも３つの特性、少なくとも４つの特性、または少なくとも
５つの特性を特徴とする、実施形態４６０の医薬組成物。
４６２．前記少なくとも３つの特性または前記少なくとも４つの特性のうちの２つが、
群（ｉ）および（ｉｖ）または（ｖ）から選択される、実施形態４６１の医薬組成物。
４６３．前記少なくとも４つの特性のうちの３つが、群（ｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ
）から選択される、４６２の医薬組成物。
４６４．実施形態４５３から４５９のいずれか１つの方法により作製される、実施形態
４６０から４６３のいずれか１つの医薬組成物。
４６５．正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正確にプロセ
シングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物から、１種または複数種の不正確にプ
ロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質を除去する方法であって、
（ａ）正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正確にプロセシ
ングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物を含む組成物を、正確にプロセシングさ
れた成熟酵素が活性となるｐＨ下に置くステップと、
（ｂ）１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質が
分解される時間までこのようなｐＨを維持するステップと
を含み、これにより、正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質および不正
確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質の混合物から、前記１種または複数
種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質を除去する方法。
４６６．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が、正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパク質と比べて、少なくとも１
つの付加的アミノ酸またはより少数のアミノ酸をＮ末端において含有する、実施形態４６
５の方法。
４６７．前記ｐＨが５〜１２である、実施形態４６５または実施形態４６６の方法。
４６８．前記１種または複数種の不正確にプロセシングされた成熟エラスターゼタンパ
ク質が５０％〜１００％分解される、実施形態４６５から４６７のいずれか１つの方法。
４６９．それを必要とするヒト対象における動脈または静脈の直径を治療的に増大させ
る方法であって、実施形態４６０から４６４のいずれか１つの医薬組成物を、該動脈また
は静脈の直径を増大させるのに十分な用量で、該ヒト対象における動脈壁または静脈壁へ
と局所投与するステップを含む方法。
４７０．血管の直径、血管の内腔径、またはこれらの両方が増大する、実施形態４６９
の方法。
４７１．それを必要とするヒト対象における動脈または静脈の血管攣縮を予防または治
療する方法であって、実施形態４６０から４６４のいずれか１つの医薬組成物を、該動脈
または静脈の血管攣縮を予防または治療するのに十分な用量で、該ヒト対象における動脈
壁または静脈壁へと局所投与するステップを含む方法。
４７２．そのような治療を必要とするヒト対象における動脈または静脈の閉塞を治療す
る方法であって、実施形態４６０から４６４のいずれか１つの医薬組成物を該ヒト対象に
おける動脈壁または静脈壁へと局所投与するステップを含み、前記投与の結果として前記
動脈壁または静脈壁内におけるエラスチンのタンパク質分解をもたらし、該動脈または静
脈の直径を拡張する方法。
４７３．そのような治療を必要とするヒト対象における動静脈の血液透析グラフトまた
は動静脈瘻へと接合される動脈または静脈を治療する方法であって、実施形態４６０から
４６４のいずれか１つの医薬組成物を該ヒト対象における動脈壁または静脈壁へと局所投
与するステップを含み、前記投与の結果として該動脈壁または静脈壁内におけるエラスチ
ンのタンパク質分解をもたらし、該動脈または静脈の直径を拡張する方法。
４７４．血液透析において用いられるヒト対象における静脈を治療する方法であって、
実施形態４６０から４６４のいずれか１つの医薬組成物を該ヒト対象における静脈壁へと
局所投与するステップを含み、前記投与の結果として該静脈壁内におけるエラスチンのタ
ンパク質分解をもたらし、該静脈の直径を拡張する方法。
４７５．実施形態４６０から４６４のいずれか１つの医薬組成物を含むキット。
４７６．医薬組成物が容器、パック、分注器、またはカテーテル内にある、実施形態４
７５のキット。
【０３５０】
２００７年１２月４日に出願された米国仮出願第６０／９９２，３１９号の特許請求の
範囲が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれ、このような特許請求の範囲
に記載の各実施形態が、本明細書における具体的な実施形態として、参照により組み込ま
れる。
【０３５１】
本発明は、本明細書で説明される具体的な実施形態により範囲が限定されるものではな
い。実際、本明細書で説明される実施形態に加えた、本発明の各種の改変は、前出の説明
および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。このような改変は、添付の特許
請求の範囲内に収まることが意図される。
【０３５２】
本明細書では、特許出願、特許、および科学的刊行物を含む各種の参考文献が引用され
、各々のこのような参考文献の開示は、その全体において、参照により本明細書に組み込
まれる。
【図１Ａ】
2015172056.tif 000042
【図２】
2015172056.tif 000043
【図３】
2015172056.tif 000044
【図４】
2015172056.tif 000045
【図５Ａ】
2015172056.tif 000046
【図５Ｂ】
2015172056.tif 000047
【図５Ｃ】
2015172056.tif 000048
【図６】
2015172056.tif 000049
【図７】
2015172056.tif 000050
【図８】
2015172056.tif 000051
【図９】
2015172056.tif 000052
【図１０】
2015172056.tif 000053
【図１１】
2015172056.tif 000054
【図１２】
2015172056.tif 000055
【図１３】
2015172056.tif 000056
【図１４】
2015172056.tif 000057
【図１５】
2015172056.tif 000058
【図１６】
2015172056.tif 000059
【図１７】
2015172056.tif 000060
【図１８】
2015172056.tif 000061
【図１９】
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【図２０】
2015172056.tif 000063
【図２１】
2015172056.tif 000064
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2015172056.tif 000072
【図３０】
2015172056.tif 000073
【図３１】
2015172056.tif 000074
【図３２】
2015172056.tif 000075
【配列表】
2015172056000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月15日(2015.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、5又は84に示すアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む成熟ヒトI型エラスターゼタンパク質を含む医薬組成物であって、トリプシンが存在する場合、前記トリプシンの上限が前記成熟エラスターゼタンパク質1 mgに対し5 ng未満のトリプシンである、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記トリプシンの上限が前記成熟エラスターゼタンパク質1 mgに対し4 ng未満のトリプシンである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記トリプシンの上限が前記成熟エラスターゼタンパク質1 mgに対し1.56 ng未満である、請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記トリプシンの上限がN-ベンゾイル-Phe-Val-Arg-pニトロアニリド（BENZ）比色分析トリプシン活性アッセイを用いて定量されるものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
トリプシンを含まない、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の医薬組成物であって、以下：
（a）エラスターゼ活性化配列を含むI型膵臓プロエラスターゼタンパク質であって、前記エラスターゼ活性化配列が、エラスターゼ認識配列を含み、かつ、成熟I型膵臓エラスターゼのアミノ酸配列に作動的に連結されたものであるI型膵臓プロエラスターゼタンパク質を調製する工程、
（b）成熟I型エラスターゼタンパク質が生成される自己活性化条件下に前記I型膵臓プロエラスターゼタンパク質を置く工程、及び
（c）前記成熟I型膵臓エラスターゼタンパク質を製剤化する工程、
を含み、前記工程により前記医薬組成物を製造する方法によって得られる、医薬組成物。
【請求項７】
前記I型膵臓プロエラスターゼタンパク質が前記エラスターゼ認識配列の位置2にプロリン残基を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記エラスターゼ認識配列が配列番号11、12、13、18、20、21及び93からなる群より選択される配列を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記活性化配列が配列番号72、73及び80からなる群より選択される配列を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記I型膵臓プロエラスターゼタンパク質が配列番号42、48、49、52、53、54、55、56、57、58、59、60及び74からなる群より選択される配列を含む切断ドメインを含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記切断ドメインが配列番号74のアミノ酸配列を含み、配列番号74中の「Xaa1」と表されるアミノ酸残基がグルタミン酸又はヒスチジンである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記切断ドメインが配列番号74のアミノ酸配列を含み、配列番号74中の「Xaa4」と表されるアミノ酸残基がプロリンである、請求項10又は11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記切断ドメインが配列番号74のアミノ酸配列を含み、配列番号74中の「Xaa5」と表されるアミノ酸残基がアラニンである、請求項10〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記切断ドメインが配列番号74のアミノ酸配列を含み、配列番号74中の「Xaa1」と表されるアミノ酸残基がグルタミン酸であり、「Xaa4」と表されるアミノ酸残基がプロリンであり、「Xaa5」と表されるアミノ酸残基がアラニンである、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記I型膵臓プロエラスターゼタンパク質が配列番号64、65、67及び69からなる群より選択される配列を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号70及び71からなるタンパク質のいずれをも含まない、請求項1〜15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記成熟ヒトI型エラスターゼタンパク質が、N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-pニトロアリニド（SLAP）比色加水分解アッセイを用いて定量した場合にタンパク質1mg当たり20〜50 Uの活性を有する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記成熟ヒトI型エラスターゼタンパク質が配列番号1、5又は84に示すアミノ酸配列と少なくとも99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
細菌タンパク質を含まない、請求項1〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記成熟エラスターゼタンパク質以外には哺乳動物タンパク質を含まない、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
エンドトキシンの量が薬学的に許容される量を超えない、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記成熟エラスターゼタンパク質を0.0033 mg〜200 mg含む単位用量の形態にある、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
リン酸イオンを含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
カリウムイオンを含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ポリソルベート-80を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ナトリウムイオン及び塩化物イオンを含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
0.5重量％未満の配列番号2からなるタンパク質及び0.5重量％未満の配列番号3からなるタンパク質を含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
液体医薬組成物である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
凍結乾燥医薬組成物である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記成熟エラスターゼタンパク質が4℃で少なくとも1ヶ月保存した後にその比活性の60％〜100％を維持する、請求項29に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記成熟エラスターゼタンパク質が4℃で少なくとも3ヶ月保存した後にその比活性の60％〜100％を維持する、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記成熟エラスターゼタンパク質が4℃で少なくとも6ヶ月保存した後にその比活性の60％〜100％を維持する、請求項31に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
動脈又は静脈の治療を必要とするヒト対象の動脈又は静脈の治療に使用するための、請求項1〜32のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2015172056000001.pdf