(57)【要約】      （修正有）【課題】飲用水やその他の水資源に含まれる微弱な毒性物質を検出することができ、長期曝露によるヒトへの毒性を簡易に判定することができる水質評価方法を提供する。【解決手段】被験試料として飲用水やその他の水資源から採取した被検水を使用し、その毒性を評価する水質評価方法であって、毒性を評価しようとする被検水を用いて液体培地を調製する工程Ｓ１０と、前記液体培地を使用してヒト正常細胞を継代培養する工程Ｓ２０と、前記継代培養されているヒト正常細胞の細胞数を経時的に計数する工程Ｓ３０と、前記計数された細胞数から把握される前記ヒト正常細胞の細胞分裂能と、毒性が既知の液体培地で培養されたヒト正常細胞の細胞分裂能とを比較して前記被検水の毒性を評価する工程Ｓ４０とを含む水質評価方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性を評価しようとする被検水を用いて液体培地を調製する工程と、
前記液体培地を使用してヒト正常細胞を継代培養する工程と、
前記継代培養されているヒト正常細胞の細胞数を経時的に計数する工程と、
前記計数された細胞数から把握される前記ヒト正常細胞の細胞分裂能と、毒性が既知の液体培地で培養されたヒト正常細胞の細胞分裂能とを比較して前記被検水の毒性を評価する工程と、
を含むことを特徴とする水質評価方法。
【請求項２】
前記被検水の毒性の評価が、ヒト正常細胞の培養時間に対する細胞数の増加率を比較することによって行われ、
前記被検水を用いて調製された液体培地における前記増加率が、毒性が既知の液体培地における前記増加率よりも下回った場合には、前記被検水の毒性が高いと判定する
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項３】
前記ヒト正常細胞の細胞数が、継代操作を行うときに計数される
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項４】
前記毒性が既知の液体培地が、精製水を用いて調製された液体培地である
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項５】
前記ヒト正常細胞が、ヒト胎児肺由来線維芽細胞である
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項６】
前記ヒト正常細胞が、ＴＩＧ−１系統細胞である
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項７】
前記ヒト正常細胞が、ＴＩＧ−１−４０細胞である
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項８】
前記評価しようとする毒性が、亜急性毒性又は慢性毒性である
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【請求項９】
前記評価しようとする毒性が、ヒ素に因る毒性である
ことを特徴とする請求項１に記載の水質評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水質評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、水道水に課せられる水道水質基準としては、水道法やその関連法規において、必須の基本９項目、健康に関する３０項目等を含む５０項目の水質基準項目が設定されている。従来から、これらの水質基準項目の多くは、物理化学的分析法を利用して測定されており、被験試料の水を濃縮、抽出、精製等の前処理に適宜供した後に、吸光光度法、質量分析法、滴定法等による各種定量分析を実施することによって、水質の評価がなされている。
【０００３】
一般に、物理化学的分析法を利用した測定では、検出しようとする物質毎に前処理方法や定量分析方法を選択する必要があり、物質毎に測定を行うことを要する。そのため、多種類の物質について網羅的な測定を行う場合には、多大な労力とコストとを費やしている現状がある。また、検出しようとする物質毎の測定では、複数の物質の組み合わせに依る毒性を評価することができないという問題を抱えている。例えば、複数の物質同士が相互作用することによって、新たな反応生成物を生じるような場合には、そのような反応生成物を正確に定量分析したり、複数の物質が組み合わされることで生じる毒性を客観的に評価することは難しい。そこで、近年では、飲用水やその他の水資源の水質の評価に、生物個体や細胞等の応答を利用するバイオアッセイを適用する動きがみられる。
【０００４】
例えば、特許文献１には、標準試料の毒性指数を算出し（下記第一工程から第三工程）、被検水の毒性指数を算出し（下記第四工程から第六工程）、次に前記標準試料の毒性指数と前記被検水の毒性指数とをグラフ化し（下記下記第七工程から第八工程）、得られた前記標準試料の毒性指数と被検水の毒性指数のグラフのパターンを比較することにより被検水中に含まれる毒性物質の種類と濃度を同定することを特徴とする、毒性物質の評価方法が開示されている。但し、上記記載の第一工程から第八工程は以下の通りである。第一工程：既知の毒性物質の溶液について濃縮または希釈によって溶質濃度を変えた２段階以上の標準試料を含む培養液中で培養細胞を１時間から７日間の範囲で培養する工程、第二工程：培養後に培養細胞の増殖量または異常染色体出現率を計測する工程、第三工程：計測結果に基づいて５０％作用濃度を算出し、下式より毒性指数を算出する工程、毒性指数＝−ｌｏｇ（５０％作用濃度）（ここで５０％作用濃度として、既知の毒性物質に関する重量濃度またはモル濃度を用いる。）第四工程：被検水について濃縮または希釈によって濃度を変えた２段階以上の被検試料を含む培養液中で培養細胞を１時間から７日間の範囲で培養する工程、第五工程：培養後に培養細胞の増殖量または異常染色体出現率を計測する工程、第六工程：計測結果に基づいて５０％作用濃度を算出し、下式より毒性指数を算出する工程、毒性指数＝−ｌｏｇ（５０％作用濃度）（ここで５０％作用濃度として、被検水に対する濃縮率または希釈率を用いる。）第七工程：２種類以上の毒性評価項目に関して、第一工程から第三工程において算出した標準試料に関する毒性指数をグラフ化する工程、第八工程：第七工程で選択したのと同一の毒性評価項目に関して、第四工程から第六工程において算出した被検水に関する毒性指数をグラフ化する工程。
【０００５】
また、非特許文献１や非特許文献２には、米国水質浄化法（Clean Water Act）では、魚類、ミジンコ目、アミ目、藻類等の水生生物を利用した水質評価法（Whole Effluent Toxicity；ＷＥＴ）が採用されていることが記載されている。また、非特許文献３には、経済協力開発機構（Organisation for Economic Cooperation and Development；ＯＥＣＤ）では、魚類、藻類等の水生生物を利用した生態影響試験のテストガイドラインが提案されていることが記載されている。また、非特許文献４には、ヒト胎児正常２倍体細胞であるＴＩＧ−１細胞を用いて、オゾン処理水の細胞毒性の数理モデルを作成したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１３３４５２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition, Unites States Environmental Protection Agency, October 2002.
【非特許文献２】Short-term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms Fourth Edition, Unites States Environmental Protection Agency, October 2002.
【非特許文献３】生体影響試験ハンドブック、日本環境毒性学会編、朝倉出版、２００３年、ｐ．８８−９５、２５６−２５８
【非特許文献４】金範洙、外４名、「埋め立て地浸出水のオゾン処理における細胞毒性変化の解析と予測」、水環境学会誌、２００１年、第２４巻、第５号、ｐ．２９３−２９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に開示される技術では、培養細胞としては不死化細胞が利用され、培養細胞を１時間から７日間の範囲で培養することによって、毒性物質の種類と濃度を同定する構成とされている。しかしながら、このような構成では、毒性物質の細胞分裂に対する影響を把握することができず、毒性物質の長期曝露がもたらす危険性、例えば、亜急性毒性、慢性毒性等を評価することは難しい。また、５０％作用濃度を指標とする構成とされているため、毒性物質の毒性が弱かったり、毒性物質が微量であったりする場合には、微弱な毒性物質を検出することができず、毒性の客観的な判定が困難である。
【０００９】
また、非特許文献１や非特許文献２や非特許文献３に開示される方法では、非ヒト生物の生存ないし生育を指標として、化学物質の毒性を評価する方法とされているため、ヒトへの毒性を客観的に判定することができない。また、非特許文献４に開示されるような方法を、毒性が弱かったり微量であったりする不特定の毒性物質の検出や、そのような毒性物質の長期曝露がもたらす危険性の評価に適用するには、膨大な労力とコストとを要するという問題がある。
【００１０】
そこで、本発明は、飲用水やその他の水資源に含まれる微弱な毒性物質を検出することができ、長期曝露によるヒトへの毒性を簡易に判定することができる水質評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために本発明に係る水質評価方法は、毒性を評価しようとする被検水を用いて液体培地を調製する工程と、前記液体培地を使用してヒト正常細胞を継代培養する工程と、前記継代培養されているヒト正常細胞の細胞数を経時的に計数する工程と、前記計数された細胞数から把握される前記ヒト正常細胞の細胞分裂能と、毒性が既知の液体培地で培養されたヒト正常細胞の細胞分裂能とを比較して前記被検水の毒性を評価する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、飲用水やその他の水資源に含まれる微弱な毒性物質を検出することができ、水の長期曝露によるヒトへの毒性を簡易に判定することができる水質評価方法及び水質評価装置を提供することができる。具体的には、水に含まれる弱毒性の毒性物質や微量の毒性物質を、簡便且つ網羅的に検出することが可能である。また、これらの毒性物質のヒトに対する亜急性毒性、慢性毒性等の判定や危険性の予測を、簡便且つ短期間に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本実施形態に係る水質評価方法の工程を示す流れ図である。
【図２】本実施形態に係る水質評価方法を実施するための水質評価装置の一例を示す概略図である。
【図３】本実施形態に係る水質評価方法を適用した水質評価システムの一例を示す概略図である。
【図４】ヒト正常細胞の細胞分裂能の変動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施形態に係る水質評価方法及び水質評価装置について説明する。
【００１５】
図１は、本実施形態に係る水質評価方法の工程を示す流れ図である。
【００１６】
本実施形態に係る水質評価方法は、飲用水やその他の水資源の毒性を評価する水質評価方法であって、図１に示すように、培地調製工程Ｓ１０と、細胞培養工程Ｓ２０と、細胞計数工程Ｓ３０と、毒性評価工程Ｓ４０とを含んでなる。本実施形態に係る水質評価方法では、試験区として、被検水を用いて調製した液体培地を使用してヒト正常細胞を培養し、被検水に曝露されたヒト正常細胞の細胞分裂能を指標として、被検水の毒性の判定を行う。なお、対照区としては、毒性が既知の液体培地を使用してヒト正常細胞を培養し、そのヒト正常細胞の細胞分裂能を、試験区におけるヒト正常細胞の細胞分裂能との比較判定に使用する。
【００１７】
培地調製工程Ｓ１０では、毒性を評価しようとする被検水を用いて液体培地を調製する。すなわち、試験区として、被検水の存在下でヒト正常細胞の培養を行うための液体培地を、水質評価すべき被験試料としての水と、他の培地成分とを混合することによって調製する。
【００１８】
被検水としては、飲用水やその他の水資源から採取された被験試料としての水を適用することができる。被検水は、毒性物質の組成や濃度が未知の水溶液ないし懸濁水であってよく、具体的には、例えば、水道水、井戸水、水環境水、下水、家庭廃水、事業廃水等から採取した水を用いることができる。水環境水は、例えば、河川、湖沼、海洋、用水路等の水である。
【００１９】
水質評価の対象となる毒性は、無機物質、有機物質、金属等のいずれに因るものであってもよい。ヒトへの毒性が懸念される毒性物質としては、例えば、カドミウム、シアン化合物、鉛、六価クロム、ヒ素、水銀、アルキル水銀、ＰＣＢ、ジクロロメタン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，３−ジクロロプロペン、チウラム、シマジン、チオベンカルブ、ベンゼン、セレン、硝酸性窒素、亜硝酸性窒素、フッ素、ホウ素、１，４−ジオキサン等があり、これらの毒性物質に因る毒性も本実施形態に係る水質評価方法の評価の対象となる。
【００２０】
調製する液体培地としては、培養するヒト正常細胞の増殖に適した培地であれば、血清培地及び無血清培地のいずれであってもよい。液体培地の種類としては、具体的には、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭα培地、ＢＭ培地、ＢＭＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＲＰＭＩ１６２９培地、ＲＰＭＩ１６３０培地、ＥＲＤＦ培地、ＨＦＤＭ１培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＭＳＣＧＭ培地、Ｍ１９９培地等が挙げられる。これらの培地の種類は、用いるヒト正常細胞に応じて選択すればよい。
【００２１】
被検水と混合する培地成分は、液体成分及び固体成分のいずれであってもよく、液体成分及び固体成分の両方が含まれていてもよい。すなわち、溶液状、粉末状等のいずれかの形態の、糖質、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、無機塩類、脂質、微量元素等の培地基本成分や、血清や、成長因子や、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ等の緩衝剤や、抗生物質や、ｐＨ調製剤等の培地補助成分を被検水と混合することによって、用いるヒト正常細胞に適した所定の培地組成及びｐＨの液体培地を調製する。
【００２２】
血清としては、例えば、ウシ胎児血清、成ウシ血清、ヒト血清、ウマ血清等の適宜の血清を用いることができる。また、成長因子としては、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）等を用いることができる。
【００２３】
液体培地の調製においては、飲用水やその他の水資源から採取された被検水は、固液分離されていることが好ましい。すなわち、被検水を、濾過処理、沈降処理等に処して固液分離することで、被検水に含まれている固形物をあらかじめ除去した後に、他の培地成分と混合することが好ましい。このように細胞培養に支障を生じる固形物を除去すると、ヒト正常細胞の細胞分裂能の比較判定の信頼性を、より高めることができる。
【００２４】
液体培地の調製においては、被検水を濃縮又は希釈した後に、他の培地成分と混合してもよい。被検水を濃縮して毒性物質の濃度を増大させると、毒性の評価をより短期間で行える場合があるためである。一方で、被検水に含まれる毒性物質の濃度が過大である場合には、被検水を希釈して毒性物質の濃度が低下させると、ヒト正常細胞に対する毒性が緩和されて細胞分裂能を適切に把握できる場合がある。また、液体培地の調製においては、被検水を所定の倍率で濃縮又は希釈して、毒性物質の濃度の希釈（濃縮）系列をなす多数の液体培地を調製して用いてもよい。
【００２５】
対照区としては、毒性が既知の水を用いて液体培地を調製する。毒性が既知の水は、含まれる毒性物質の組成や濃度が確認された水に限られず、飲用やその他の水の利用を行う上で、毒性の水準が判定できる水であればよいが、脱イオン、蒸留又は再蒸留がなされて塩類等が除去されると共に、滅菌処理に処された精製水が好ましい。対照区における液体培地を精製水を用いて調製することによって、対照区のヒト正常細胞の細胞分裂能をより正確に把握することができ、試験区のヒト正常細胞の細胞分裂能と比較したときに、被検水の毒性の判定を確実且つ網羅的なものとすることができる。
【００２６】
培地調製工程Ｓ１０において調製された液体培地は、滅菌処理された後、細胞培養工程Ｓ２０に供される。滅菌処理方法は、高圧蒸気滅菌等の加熱滅菌法、及び、濾過滅菌等の非加熱滅菌（除菌）法のいずれに依ってもよく、被検水に含まれる毒性物質への影響を勘案していずれかを適用することができる。
【００２７】
細胞培養工程Ｓ２０では、培地調製工程Ｓ１０において調製された液体培地を使用してヒト正常細胞を継代培養する。すなわち、試験区として、培地調製工程Ｓ１０において調製された、被検水を含有する液体培地中においてヒト正常細胞の継代培養を行い、被検水に含まれ得る毒性物質の存在下に、ヒト正常細胞の細胞分裂を継続させる。
【００２８】
ヒト正常細胞としては、所定の分裂回数で分裂増殖を停止する不死化されていないヒト細胞であれば、初代培養細胞及び第２代以降の細胞株のいずれであってもよいが、分裂能が高く、増殖が良好な細胞が好ましい。具体的には、細胞分裂寿命が、ＰＤＬで２０程度以上であるものが好ましく、分裂が停止するまでの分裂回数が、５回以上、好ましくは１０回以上確保できる細胞が好ましい。なお、ヒト正常細胞の由来する組織や、分化の状態は任意のものとすることができる。
【００２９】
ヒト正常細胞の種類としては、具体的には、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、造血細胞、アストロサイト、神経細胞、メラニン細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等が挙げられる。より具体的には、例えば、ヒト胎児肺由来線維芽細胞であるＴＩＧ−１−２０、ＴＩＧ−１−３０、ＴＩＧ−１−４０、ＴＩＧ−１−５０、ＴＩＧ−１−６０等のＴＩＧ−１系統、ＴＩＧ−２系統、ＴＩＧ−３系統、ＴＩＧ−７系統や、ヒト皮膚由来線維芽細胞であるＴＩＧ−１０１系統〜ＴＩＧ−１１０系統、ＭＲＣ−５系統、ＭＲＣ−９系統、ヒト胎児皮膚由来線維芽細胞であるＴＩＧ−２Ｓ系統、ヒト筋組織由来線維芽細胞であるＴＩＧ−２Ｍ系統等が挙げられる。ヒト正常細胞の種類としては、これらの中でも、ヒト胎児肺由来線維芽細胞が好ましく、ＴＩＧ−１系統細胞がより好ましく、ＴＩＧ−１−４０細胞がさらに好ましい。このような細胞を用いると、細胞数の増加率の低下や細胞分裂寿命の到来を、培養開始後に短期間に把握することができ、毒性物質の毒性の判定や危険性の予測を短期間に行うことができる。
【００３０】
ヒト正常細胞の培養は、適宜の細胞培養容器を使用して行うことができる。例えば、ヒト正常細胞が、接着性細胞である場合には、接着因子によって表面処理された培養バッグ、Ｔフラスコ、ディッシュ、ウェルプレート等を使用して行う。播種するヒト正常細胞の細胞数は、細胞の増殖速度、細胞培養容器の面積等に応じて適宜の数とすることができるが、例えば、１×１０３ｃｅｌｌｓ〜１×１０７ｃｅｌｌｓ程度が好ましい。また、培養条件は、温度３７℃程度、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．７程度、二酸化炭素濃度は、５％〜１０％程度とすることが好ましい。
【００３１】
液体培地の培地交換は、常法にしたがって行うことができ、例えば、１日に１回から３日に１回程度の頻度で行うことができる。培地交換は、液体培地の全量交換又は部分交換のいずれでもよい。また、継代操作は、常法に従って行うことができ、例えば、ヒト正常細胞が、接着性細胞である場合には、ピペッティングやトリプシン処理を行い、培養細胞を浮遊させて細胞懸濁液の状態とし、ヒト正常細胞の細胞群の一部を分取して、細胞の増殖速度、培養容器の面積等に応じて適宜の細胞数としたヒト正常細胞を新しい液体培地に播種することにより行う。継代操作は、ヒト正常細胞が接着阻害を生じないように、飽和密度に達しない頻度で行えばよく、例えば、５日に１回から７日に１回程度の頻度で対数増殖期に行うことが好ましい。
【００３２】
対照区としては、毒性が既知の水を用いて調製された液体培地を使用してヒト正常細胞を継代培養する。対照区のヒト正常細胞としては、試験区として、被検水を含有する液体培地中において継代培養されるヒト正常細胞と同種且つ同世代の細胞が用いられる。
【００３３】
細胞培養工程Ｓ２０において継代培養されているヒト正常細胞は、継代培養の間に所定時間間隔で細胞計数工程Ｓ３０に供される。例えば、継代操作に際して、培養細胞を浮遊させて細胞懸濁液の状態とし、ヒト正常細胞の細胞群の一部を分取して、細胞計数工程Ｓ３０に供することができる。
【００３４】
細胞計数工程Ｓ３０では、継代培養されているヒト正常細胞の細胞数を経時的に計数する。すなわち、試験区として、継代培養されているヒト正常細胞の細胞数を、継代培養の間に時間間隔をあけて複数回計数することによって、所定培養時間の間に増加した細胞数から、ヒト正常細胞の細胞分裂能を把握する。ヒト正常細胞の増殖の低下は、被検水に毒性物質が含まれていることを示すため、継続的に継代培養されているヒト正常細胞の細胞分裂能を確認することで、被検水に含まれている微弱な毒性物質を網羅的に検出することができる。
【００３５】
細胞数の計数は、細胞数計数装置、細胞数計数盤等を使用して常法にしたがって行うことができる。計数方法としては、例えば、ＭＴＴ、ＭＴＳ等を利用した比色定量法、３Ｈ−チミジン等を利用した放射定量法、ＡＴＰ定量法等のいずれを用いてもよく、培養中に生じた死細胞を細胞数として合算してもよい。
【００３６】
ヒト正常細胞の細胞分裂能は、具体的には、ヒト正常細胞の細胞数を経時的に計数し、ヒト正常細胞の培養時間に対する細胞数の増加率の度合いを求めることによって把握することができる。例えば、集団倍加数（population doubling level；ＰＤＬ）を指標として判定することが可能である。ＰＤＬの値（Ｎ）は、増殖前の細胞数をｎ１、増殖後の細胞数をｎ２として、下記の式１のように表される。
Ｎ＝ｌｏｇ２（ｎ２／ｎ１）・・・（式１）
よって、播種した初代培養細胞の細胞数又は継代操作において播種した細胞数をｎ１、所定培養時間が経過した後に計数された細胞数をｎ２とすると、所定培養時間の間に増加した細胞数を間接的に示すＰＤＬの増加量を求めることができる。
【００３７】
対照区としては、毒性が既知の水を用いて調製された液体培地を使用して継代培養されているヒト正常細胞の細胞数を、継代培養の間に時間間隔をあけて複数回計数することによって、所定培養時間の間に増加した細胞数から、ヒト正常細胞の細胞分裂能を把握する。対照区のヒト正常細胞の細胞数の計数は、試験区のヒト正常細胞の細胞数の計数と同様の時間間隔且つ同様の時期に行うことが好ましい。
【００３８】
毒性評価工程Ｓ４０では、試験区のヒト正常細胞の細胞分裂能と、対照区のヒト正常細胞の細胞分裂能とを比較して被検水の毒性を評価する。例えば、ヒト正常細胞の細胞数の増加率が低下し、細胞分裂能の低下が認められると、被検水に毒性物質が含まれていると判断することができる。また、細胞数の増加率の変動量の大きさから、被検水の毒性、ヒトへの危険性等を評価することができる。
【００３９】
具体的には、毒性の評価は、ヒト正常細胞の培養時間に対する細胞数の増加率を比較することによって行うことができる。例えば、ＰＤＬの値を、培養時間に対してプロットし、その線形近似曲線を最小二乗法等の回帰分析で求め、その線形近似曲線の傾きを比較することによって被検水の毒性を評価することができる。この評価基準では、被検水を用いて調製された液体培地で継代培養を行った試験区における増加率が、毒性が既知の液体培地で継代培養を行った対照区における増加率よりも、有意差をもって下回った場合には、被検水の毒性が高いと判定することができる。このような評価基準によると、毒性物質の存在下に継代培養されたヒト正常細胞が、細胞数の増加率の低下を示すことで、その低下の度合に基づいて、被検水に含まれる毒性物質の多少を検出することができる。そのため、被検水に含まれる微弱な毒性物質を検出することができ、水の長期曝露によるヒトへの毒性を簡易に判定することができる。また、細胞数の増加率の低下の度合が早期に有意差をもって現れることを確認することによって、毒性物質のヒトに対する亜急性毒性、慢性毒性等の判定や危険性の予測を、疫学調査と比較して、簡便且つ短期間に行うことができる。
【００４０】
また、毒性の評価は、ヒト正常細胞の細胞分裂能が失われる細胞分裂寿命を比較することによって行うことができる。この評価基準では、被検水を用いて調製された液体培地で培養された試験区のヒト正常細胞の細胞分裂寿命が、毒性が既知の液体培地で培養された対照区のヒト正常細胞の細胞分裂寿命よりも、有意差をもって短くなった場合には、被検水の毒性が高いと判定することができる。このような評価基準によると、毒性物質の毒性が弱かったり、毒性物質が微量であったりする場合にも、微弱な毒性物質を高感度で簡便に検出することが可能となる。
【００４１】
次に、前記の水質評価方法を実施するための水質評価装置の一実施形態について説明する。
【００４２】
図２は、本実施形態に係る水質評価方法を実施するための水質評価装置の構成を示す概略図である。
【００４３】
本実施形態に係る水質評価装置１は、主に、液体供給部１０と、細胞培養部２０と、分取分注手段３０と、遠心分離装置４０と、撮像手段５０と、廃液回収器６０と、制御装置７０とを備えている。この水質評価装置１は、ヒト正常細胞を自動制御で継代培養し、ヒト正常細胞の細胞数を経時的に計数することができるように構成されている。
【００４４】
液体供給部１０は、雰囲気温度が４℃程度に冷却された冷蔵室の内部に区画され、複数の液体貯留容器１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ，１２Ｄを備えている。液体貯留容器は、例えば、被験培地貯留容器１２Ａ、対照培地貯留容器１２Ｂ、緩衝液貯留容器１２Ｃ、試薬貯留容器１２Ｄからなる。各液体貯留容器１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ，１２Ｄは、それぞれ送液手段１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄと管路で接続され、管路の末端にはノズル等が備えられている。また、管路には不図示の加熱手段が備えられており、送液される各液体が所定温度まで加温されるようになっている。
【００４５】
被験培地貯留容器１２Ａは、被検水を用いて調製された液体培地を貯留するための容器である。例えば、被験試料として採取された水溶液ないし懸濁水を、適宜、濾過処理、濃縮処理し、培地成分と混合して液体培地を調製した後、滅菌処理して被験培地貯留容器１２Ａに収容する。被検水貯留容器１２Ａに貯留されている液体培地は、送液手段１４Ａが駆動されると試験管２４あるいは細胞培養容器２２に送液され、試験区の液体培地が供給されるようになっている。なお、被験培地貯留容器には、被検水を用いて調製された液体培地に代えて、被検水を収容するようにしてもよい。この場合は、他の培地成分を被検水と混合するための濃縮された液体培地を併用し、被検水と濃縮された液体培地とを適切な比率で混合して試験区の液体培地とする。
【００４６】
対照培地貯留容器１２Ｂは、精製水を用いて調製された液体培地を貯留するための容器である。対照培地貯留容器１２Ｂに貯留されている液体培地は、送液手段１４Ｂが駆動されると試験管２４あるいは細胞培養容器２２に送液され、対照区の液体培地が供給されるようになっている。
【００４７】
緩衝液貯留容器１２Ｃは、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）、ＰＢＳ（−）等の緩衝液を貯留するための容器である。緩衝液貯留容器１２Ｃに貯留されている緩衝液は、送液手段１４Ｃが駆動されると、試験管２４あるいは細胞培養容器２２に送液されるようになっている。
【００４８】
試薬貯留容器１２Ｄは、トリプシン処理に使用されるトリプシン／ＥＤＴＡ溶液等の細胞剥離試薬を貯留する。試薬貯留容器１２Ｄに貯留されている細胞剥離試薬は、送液手段１４Ｄが駆動されると、細胞培養容器２２に送液されるようになっている。
【００４９】
細胞培養部２０は、雰囲気温度、湿度及び二酸化炭素濃度が管理される閉鎖空間を有し、複数の細胞培養容器２２と、不図示の温度調節手段、ガス供給手段及び湿度調節手段とを備えている。また、細胞培養部２０には、温度センサ、湿度センサ、二酸化炭素濃度センサ等が備えられる。
【００５０】
細胞培養容器２２は、例えば、ディッシュ、Ｔフラスコ等で構成され、複数器が備えられる。複数の細胞培養容器２２は、一部が試験区の培養、一部が対照区の培養に用いられる。また、継代操作毎に取り換えられたり、液体培地の希釈（濃縮）系列を作成するために用いられる。細胞培養容器２２は、細胞培養部２０に備えられる多段の培養容器台２１に載置され継代培養の間は静置される。一方で、継代操作時には、分取分注手段３０に把持されて、遠心分離装置４０や廃液回収器６０との間を移送される。
【００５１】
細胞培養部２０の雰囲気は、温度調節手段によって閉鎖空間の雰囲気温度が３７℃程度に調温され、ガス供給手段によって二酸化炭素濃度が５％〜１０％程度に調整され、湿度調節手段によって所定湿度に調湿される。そのため、継代培養の間には、細胞培養容器２２の環境は、一定に管理され、ヒト正常細胞の生存及び増殖に好適な環境が維持されるようになっている。
【００５２】
分取分注手段３０は、マニピュレータ、アーム等の可動装置で構成される。分取分注手段３０は、機能に応じて複数機が備えられ、一部は、細胞培養容器２２、試験管２４等を把持すると共に、細胞培養部２０、遠心分離装置４０及び廃液回収器６０の間を相互に移送させる機能を有し、一部は、先端に電動式ピぺッタ等が備えられ、各種液体を吸引及び吐出する機能を有している。
【００５３】
遠心分離装置４０は、細胞懸濁液を遠心分離することによって、細胞と液体とに固液分離させる機能を有している。遠心分離装置４０には、試験管２４が装着されるようになっており、遠心分離の際には、細胞培養容器２２に収容されている液体が、分取分注手段３０によって試験管２４に移し替えられ固液分離に供される。
【００５４】
撮像手段５０は、例えば、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等であり、試験管２４に収容された細胞群を撮像する機能を有している。撮像手段５０が、遠心分離されて試験管２４内に沈降した細胞群の画像を撮像すると、その画像が制御装置７０に送信され、制御装置７０が画像に基づいて細胞数を計数するようになっている。
【００５５】
廃液回収部６０は、廃液回収容器等を備え、培養に使用された液体培地、トリプシン処理に使用された細胞剥離試薬、細胞洗浄に使用された緩衝液、細胞計数後の不要細胞等を廃液として回収する機能を有している。
【００５６】
制御装置７０は、マイコン、メモリ、記憶手段、表示手段、入出力手段等を備えるＰＣ等で構成されている。制御装置７０は、出力制御プログラム、培養スケジュールプログラム、各種計測値、細胞数、培養時間、継代数等の情報を記憶手段に格納しており、温度調節手段、ガス供給手段、湿度調節手段、分取分注手段３０、遠心分離装置４０、各送液手段１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ等の出力や培養スケジュールを制御する機能を有している。また、計数された細胞数からＰＤＬを演算し、細胞数やＰＤＬについて回帰分析を行う演算機能を有している。
【００５７】
制御装置７０は、撮像手段５０が遠心分離によって沈降した細胞群の画像を撮像し、その画像を送信すると、画像から沈殿の深さを検出し、沈澱深さと細胞数との相関関係に基いて細胞数を計数することができるようになっている。この沈殿深さは、試験管２４に固有の値であり、沈澱深さと細胞数との相関関係は、試験管２４や細胞種に応じてあらかじめ求められて制御装置７０に格納される。そのため、画像から試験管２４の底辺位置と沈降した細胞群の沈殿深さとをそれぞれエッジ検出し、その差分から沈殿深さを演算し、あらかじめ求められている沈澱深さと細胞数との相関関係から細胞数が導出されることになる。
【００５８】
次に、前記の水質評価装置の運転方法について説明する。
【００５９】
はじめに、適宜、濾過処理、濃縮処理した被検水と他の培地成分とを混合して試験区の液体培地を調製する。そして、調製した試験区の液体培地を水質評価装置１の被験培地貯留容器１２Ａに収容する。また、対照培地貯留容器１２Ｂには、精製水を用いて調製された液体培地、緩衝液貯留容器１２Ｃには、ＰＢＳ、ＰＢＳ（−）等の緩衝液、試薬貯留容器１２Ｄには、細胞剥離試薬をそれぞれ収容する。
【００６０】
また、培養するヒト正常細胞を、例えば、液体培地に懸濁した細胞懸濁液の状態、細胞培養容器２２に播種した状態等として細胞培養部２０に搬入し、培養容器台２１に載置して培養を開始する。このとき、操作者による制御装置７０への指示入力によって、培地交換頻度等の培養スケジュールや、培養温度等の培養条件の制御を開始する。なお、播種するヒト正常細胞の細胞数は、細胞の増殖速度、培養容器の面積等に応じて所定の細胞数となるようにする。
【００６１】
培地交換の時期が到来すると、分取分注手段３０は、培養スケジュールにしたがって、細胞培養容器２２を培養容器台２１から取り出し、古い液体培地を廃棄する。そして、被験培地貯留容器１２Ａから、加温された新たな液体培地を細胞培養容器２２に供給して培地の交換を行う。培地交換を終えた細胞培養容器２２は、再び培養容器台２１に載置されて継代培養が継続される。
【００６２】
継代操作の時期が到来すると、分取分注手段３０は、培養スケジュールにしたがって、細胞培養容器２２を培養容器台２１から取り出し、古い液体培地を廃棄する。そして、緩衝液貯留容器１２Ｃから、緩衝液を細胞培養容器２２に供給して細胞の洗浄を行う。ヒト正常細胞が接着細胞である場合には、続いて、試薬貯留容器１２Ｄから、細胞剥離試薬を細胞培養容器２２に供給し、再び培養容器台２１に載置して反応させることで、細胞を剥離させると共に細胞懸濁液の状態とする。剥離したヒト正常細胞には、被験培地貯留容器１２Ａから、加温された新たな液体培地を供給して、細胞剥離試薬を不活化させる。なお、培地成分に血清等トリプシン阻害物質が含まれていない場合は、液体培地に代えてトリプシン阻害剤を含む培地や緩衝液を導入することが好ましい。
【００６３】
続いて、細胞懸濁液を細胞培養容器２２から試験管２４に移し替え、遠心分離装置４０に装着し、細胞と液体培地とに固液分離させる。そして、試験管２４の底部に沈降した細胞群を、撮像手段５０によって撮像し、制御装置７０において細胞数を計数し、計数された細胞数の値を培養時間に紐付けて評価情報として記憶手段に格納する。また、計数された細胞数に基づいて、再播種に最適な細胞数となるようにヒト正常細胞を分取し、新たな細胞培養容器２２に再播種する。ヒト正常細胞が再播種された細胞培養容器２２は、再び培養容器台２１に載置され、継代培養が継続される。
【００６４】
このようにして行われる継代培養は、被検水を用いて調製した液体培地による試験区と、精製水を用いて調製した液体培地による対照区のそれぞれについて行われ、各細胞数の計数が行われる。試験区の継代培養と対照区の継代培養は、培養条件等が一致している限り、同時期を並行して行っても、別時期に個別に行ってもよい。
【００６５】
制御装置７０では、このようにして継代培養を行う間に、経時的に記憶される細胞数に基づいて、ヒト正常細胞の細胞分裂能を判定する。すなわち、試験区の細胞数からＰＤＬの値を演算し、ＰＤＬと培養時間との関係から線形近似曲線を回帰分析により導出し、その線形近似曲線の傾きを、ヒト正常細胞の培養時間に対する細胞数の増加率として、細胞数の計数毎に求める。そして、求められた増加率を、対照区の継代培養において同様にして求められた増加率と比較判定し、傾きの値や傾きの相似率を培養時間に紐付けて評価情報として記憶手段に格納する。
【００６６】
制御装置７０では、試験区の継代培養を継続し、ヒト正常細胞の細胞数の増加が無くなると、ヒト正常細胞が細胞分裂寿命に達したと判定して継代培養を終了する。このとき制御装置７０は、ヒト正常細胞の培養時間と継代数を評価情報として記憶手段に格納する。また、この培養時間における対照区のヒト正常細胞の細胞数やＰＤＬを参照し、試験区における評価情報と紐付ける。そして、表示手段に水質評価が完了した旨を表示して、操作者に通知し、水質評価装置の運転が終了される。
【００６７】
図３は、本実施形態に係る水質評価方法を適用した水質評価システムの一例を示す概略図である。
【００６８】
前記の水質評価方法は、水質評価装置で取得される評価情報を消費者に提供する水質評価システムに適用することができる。図３に示すように、被検水の毒性を評価する水質評価機関１００は、評価情報を管理する管理サーバ１１０と、データベース（ＤＢ）１２０Ａ，１２０Ｂとを有している。水質評価機関１００は、例えば、被検水の提供者である評価対象提供者２００Ａ，２００Ｂからの依頼を受けて、被検水の毒性を評価し、その結果を評価情報として報告することを業とする機関、企業等であり、被検水の毒性の評価にあたっては、前記の水質評価装置１等を使用して本実施形態に係る水質評価方法を実施する。
【００６９】
水質評価機関１００の管理サーバ１１０は、評価情報のデータの書込、更新等を実行する機能を有している。なお、管理サーバ１１０は、管理サーバとの間でデータの入出力を行う不図示のＰＣ等と接続される。
【００７０】
水質評価機関１００は、複数の評価対象提供者２００Ａ，２００Ｂから提供される被検水毎に、被検水を識別する識別ＩＤを付与し、前記の水質評価装置の制御装置７０等に、識別ＩＤ、被検水名称、被検水組成、被検水採取地名、依頼者名、依頼者住所等の属性を個別データとして入力しておく。そして、前記の水質評価方法を実施して、被検水毎に評価情報を取得し、識別ＩＤに評価情報を紐付けて個別データを各評価対象提供者２００Ａ，２００Ｂから提供される被検水毎に各データベース（ＤＢ）１２０Ａ，１２０Ｂに記憶させる。
【００７１】
評価対象提供者２００Ａは、自身が提供した被検水の評価情報を管理サーバ１１０に要求して、データベース１２０Ａの情報を閲覧することが可能である。また、自身が提供した被検水の個別データの属性、例えば、被検水組成等を書込、更新することができる。同様にして、評価対象提供者２００Ｂは、自身が提供した被検水に関するデータベース１２０Ｂの情報を閲覧したり、個別データの属性を書込、更新することができる。
【００７２】
また、水質評価機関１００は、複数の評価対象提供者２００Ａ，２００Ｂから提供された被検水毎の評価情報を集積し、データベースを構築することができる。評価対象提供者２００Ａ，２００Ｂから提供される被検水組成と、その被検水の評価情報と共に、試験区の細胞分裂寿命と対照区の細胞分裂寿命の差分を危険度としてスコア化する等してデータベース化し、消費者３００に閲覧可能とすることができる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明の実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【００７４】
被検水を用いて液体培地を調製し、その液体培地を使用してヒト正常細胞を継代培養し、ヒト正常細胞の細胞分裂能に基づいて被検水の毒性を評価した。
【００７５】
被検水としては、超純水に亜ヒ酸ナトリウム（ＮａＡｓＯ２）をヒ素濃度が０．０１ｍｇ／Ｌとなるように溶解させた模擬環境水を使用した。また、ヒト正常細胞としては、ヒト胎児肺由来線維芽細胞（正常二倍体、ＰＤＬ：約４０）である「ＴＩＧ−１−４０細胞」を使用した。なお、参考例として、不死化されたヒト子宮頚がん細胞株である「ＨｅＬａ細胞」も使用した。
【００７６】
ヒト正常細胞を培養する液体培地としては、１０体積％となるようにウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）を添加したＭＥＭ（minimal essential medium）培地の組成とし、試験区については、被検水を用いてそれぞれ液体培地を調製し、対照区については、精製水（純水）を用いてそれぞれ液体培地を調製した。なお、参考例のＨｅＬａ細胞を培養する液体培地としては、１０体積％となるようにウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's medium）培地の組成とし、精製水（純水）を用いてそれぞれ液体培地を調製した。
【００７７】
次に、調製した液体培地をそれぞれ入れた直径１００ｍｍの細胞培養用ディッシュに、細胞数が１．５×１０５ｃｅｌｌｓとなるように各細胞を播種し、５％ＣＯ２の空気雰囲気下、３７℃で継代培養した。継代培養中には、３日から４日に１回の頻度で培地交換を行い、１週間に１回の頻度で継代操作を行った。
【００７８】
継代操作に際しては、液体培地をディッシュから吸引除去し、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。次いで、細胞にトリプシン溶液を添加し、数分間（２分〜１０分程度）静置させた後、細胞をピペッティングし、細胞懸濁液の細胞数を計数した。そして、計数した細胞数に基づいて、所定の細胞数となるように希釈した細胞懸濁液を、新たな液体培地を入れたディッシュに播種し、継代培養を継続して行った。
【００７９】
継代培養を継続する間に細胞数を計数することによって求められたヒト正常細胞の細胞分裂能の変動を図４及び表１に示す。
【００８０】
図４は、ヒト正常細胞の細胞分裂能の変動を示す図である。
図４の横軸は、培養を開始して以降、ヒト正常細胞の継代操作を行った回数（継代数）、縦軸は、培養を開始して以降、累積されたＰＤＬの値を示している。
【００８１】
図４に示すように、被検水を用いた試験区においては、ＰＤＬの累積値が６７に到達したところで、ＰＤＬの累積が認められなくなり、ヒト正常細胞が細胞分裂寿命に達したと判定された。その一方で、精製水を用いた対照区においては、ＰＤＬの累積値が７５に達することが確認された。このように、ヒト正常細胞を用いた実施例に係る水質評価方法によれば、被検水に毒性物質が含まれている場合には、ヒト正常細胞の細胞分裂能に変動が現れるため、培養しているヒト正常細胞の細胞数を計数することによって、被検水中の毒性物質を検出することが可能であることが確認された。また、このような水質評価方法によれば、毒性物質に対する暴露時間が最大２４時間から９６時間程度とされている急性毒性試験では検出し得ないような、微弱な毒性物質による毒性を検出することが可能であることが分かる。他方、参考例のＨｅＬａ細胞については、分裂増殖を続け、細胞分裂寿命に達することが無く、本水質評価方法に適用することができないことが確認された。
【００８２】
以下に示す表１は、水質評価を複数回（計４回）に亘って行ったときの、ヒト正常細胞の培養時間に対する細胞数の増加率を示している。なお、細胞数の増加率は、試験区におけるヒト正常細胞が細胞分裂寿命に達したときのＰＤＬの累積値を培養時間に対してプロットし、培養開始時のＰＤＬの累積値を切片とした線形近似曲線を最小二乗法で求めて導出した。表１に示す値は、線形近似曲線の傾きを、対照区を１００とした相対値で数値化したものである。
【００８３】
【表１】
2015172504.tif 000003
【００８４】
表１に示すように、ヒ素濃度が０．０１ｍｇ／Ｌとなるように溶解させた模擬環境水では、ＴＩＧ−１−４０細胞が細胞分裂寿命に達した際に、細胞分裂能が、対照区に対して８０％程度の低下を示すことが確認された。この細胞分裂能の低下には、有意差が認められており、本水質評価方法が毒性物質の検出による水質評価に有効であることが分かる。
【符号の説明】
【００８５】
Ｓ１０  培地調製工程
Ｓ２０  細胞培養工程
Ｓ３０  細胞計数工程
Ｓ４０  毒性評価工程
【図１】
2015172504.tif 000004
【図２】
2015172504.tif 000005
【図３】
2015172504.tif 000006
【図４】
2015172504.tif 000007