(57)【要約】      （修正有）【課題】グリホサート除草剤の施用に商業上許容できる耐性を示す事象１７３１４を含む遺伝子組換えイネ植物の提供。【解決手段】イネ事象１７３１４に関係するＤＮＡ分子であって、イネ事象１７３１４の導入遺伝子挿入およびフランキングゲノムＤＮＡ間の結合、および／または挿入ＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの領域、および／または挿入部位に隣接する組込み遺伝子組換えＤＮＡの領域、および／または組込み遺伝子組換え発現カセットの領域、および／またはこれらの領域のいずれかのコンティグ配列を表すかまたはそれらに由来するヌクレオチド配列を含む。イネ事象１７３１４に特徴的なプライマーおよびプローブとして有用なＤＮＡ分子により、イネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４よりなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号：３のヌクレオチドの第２８３〜３０２位の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチド分子；
（ｃ）配列番号：４のヌクレオチドの第６６６〜６８５位の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチド分子；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的な配列
を含むＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号：６に少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
該ＤＮＡ分子が事象１７３１４に由来し、事象１７３１４を含む種子の代表的試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されている請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
イネ植物、植物細胞、種子、後代植物、植物器官または商品に含まれる請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
事象１７３１４からのテンプレート分子から生成されたアンプリコンである請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
事象１７３１４の存在に特徴的であるポリヌクレオチドプローブであって、該プローブが配列番号：１および配列番号：２、ならびにその相補体よりなる群から選択される配列の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドの配列に結合するのに十分な長さであることを特徴とする該ポリヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
第１のＤＮＡ分子、および第１のＤＮＡ分子と異なる第２のＤＮＡ分子よりなる１対のＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子は、イネ事象１７３１４からのテンプレートとの増幅反応において一緒に用いた場合にＤＮＡプライマーとして機能して、試料中のイネ事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成するのに十分な長さの配列番号：６の隣接ヌクレオチドまたはその相補体のヌクレオチド配列を有する該１対のＤＮＡ分子。
【請求項８】
該アンプリコンが、配列番号：１および配列番号：２ならびにその相補体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項７記載の１対のＤＮＡ分子。
【請求項９】
（ａ）ＤＮＡ試料と請求項７記載の１対のＤＮＡ分子とを接触させ；
（ｂ）配列番号：１および配列番号：２ならびにその相補体よりなる群から選択される配列の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドを有するポリヌクレオチド分子を含むアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を行い；次いで
（ｃ）該ＤＮＡアンプリコンを検出する
ことを含み、
ここに、該ＤＮＡアンプリコンの検出は、該ＤＮＡ試料中のイネ事象１７３１４からの該ＤＮＡ分子の存在に特徴的であることを特徴とするイネ事象１７３１４からのＤＮＡ分子の存在の検出方法。
【請求項１０】
試料中の配列番号：３および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子の存在の検出方法であって、
（ａ）試料と配列番号：１および配列番号：２、ならびにその相補体よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡプローブとを接触させ、ここに、該ＤＮＡプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：３および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子とハイブリダイズし、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：３および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含まないＤＮＡ分子とハイブリダイズせず：
（ｂ）該試料および該ＤＮＡプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に付し；次いで
（ｃ）配列番号：３および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む該ＤＮＡ分子に対する該ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする該検出方法。
【請求項１１】
イネ事象１７３１４からＤＮＡの存在を検出するのに特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号：６およびその相補体の隣接ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み、該ＤＮＡの検出が、試料中の該イネ事象１７３１４の存在に特徴的であるＤＮＡ検出キット。
【請求項１２】
該ＤＮＡ分子が、配列番号：１もしくは配列番号：２またはその相補体の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む請求項１１記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１３】
（ａ）試料と請求項７記載の１対のＤＮＡ分子とを接触させ；
（ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：２またはその相補体の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を行い；次いで
（ｃ）該アンプリコンを検出する
ことを含む方法を使用する、請求項１１記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項１４】
配列番号：１、配列番号：２およびその相補体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含むイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項１５】
該植物、種子、細胞またはその植物器官がグリホサート除草剤処置に耐性である請求項１４記載のイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項１６】
そのゲノムが、ＤＮＡ増幅方法において試験された場合に事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成する、請求項１４記載のイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項１７】
事象１７３１４を含む種子の代表的試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されている事象１７３１４を含むイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項１８】
植物またはその器官が、グリホサート除草剤処置に耐性である請求項１７記載のイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項１９】
該イネ植物または種子が、事象１７３１４から由来するか、または事象１７３１４を含む少なくとも１つの親を有する雑種であり、事象１７３１４を含む種子の代表的試料が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されている請求項１７記載のイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項２０】
細胞、花粉、胚珠、鞘、花、根組織、茎組織または葉組織として規定される請求項１７記載のイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項２１】
さらに、該事象１７３１４を含むいずれかの世代のイネ植物の後代植物として規定される請求項１７記載のイネ植物、種子、細胞またはその植物器官。
【請求項２２】
配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択されるＤＮＡ分子を含むイネ商品。
【請求項２３】
さらに、全体または加工されたイネ種子、動物飼料、油、ミール、粉末、フレーク、糠、パフトライス（puffed rice）、ミルク、チーズ、紙、クリーム、ワイン、アルコール、バイオマスおよび燃料生成物よりなる群から選択される商品として規定される請求項２２記載のイネ商品。
【請求項２４】
商品が事象１７３１４を含み、該事象１７３１４を含む代表的な種子が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されている請求項２２記載のイネ商品。
【請求項２５】
さらに、ＤＮＡ増幅方法において試験された場合に事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成する核酸を含む請求項２２記載のイネ商品。
【請求項２６】
さらに、ＤＮＡ増幅方法において試験された場合に事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成でき、該事象１７３１４を含む代表的な種子が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されているイネ植物またはその器官。
【請求項２７】
アンプリコンが配列番号：１または配列番号：２を含む請求項２６記載のイネ植物。
【請求項２８】
ＤＮＡ増幅方法において試験された場合に事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成でき、該事象１７３１４を含む代表的な種子が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されているイネ種子。
【請求項２９】
アンプリコンが配列番号：１または配列番号：２を含む請求項２８記載のイネ種子。
【請求項３０】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−９８４４として寄託されている事象１７３１４を含む代表的な種子を該植物事象１７３１４のゲノムに導入することを含むグリホサート除草剤に耐性のイネ植物の生成方法。
【請求項３１】
（ａ）事象１７３１４を含む第１のイネ植物と、事象１７３１４を欠く第２のイネ植物とを交配させて、後代植物を生成し；次いで
（ｂ）該事象１７３１４を含み、かつグリホサートに耐性である第１の後代植物を少なくとも選択する
工程を含む請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
さらに、該第１の後代植物を自家受粉して、第２世代の後代植物を生成し、次いで、少なくとも該事象１７３１４にホモ接合性の第１の植物を選択することを含むことを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）請求項１７記載のイネ植物またはその器官を得；次いで
（ｂ）イネ植物またはその器官からイネ商品を生成する
ことを含むイネ商品の生成方法。
【請求項３４】
商品が、全体または加工されたイネ種子、動物飼料、油、ミール、粉末、フレーク、糠、パフトライス、ミルク、チーズ、紙、クリーム、ワイン、アルコール、バイオマスおよび燃料生成物よりなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
雑草の生長を防除するのに有効なグリホサートの量で圃場を処理することを含み、イネ植物は、グリホサートに耐性を示す、事象１７３１４を含むイネ植物を含む圃場における雑草生長の防除方法。
【請求項３６】
該有効量のグリホサートが、１エーカー当たり約０．５ポンド〜約４．５ポンドである請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
配列番号：１、配列番号：２およびその相補体よりなる群から選択されるＤＮＡ分子を含む非生存植物物質。
【請求項３８】
配列番号：１、配列番号：２およびその相補体よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含む微生物。
【請求項３９】
該微生物が植物細胞である請求項３８記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子組換えイネ事象１７３１４に関する。本事象を含む植物は、グリホサート除草剤に対する耐性を示す。また、本発明は、事象１７３１４に関連する核酸分子、植物、植物器官、植物種子、植物細胞、農産物および方法に関する。本発明は、本事象にユニークであり、イネ植物のゲノムへの遺伝子組換えＤＮＡの挿入と関連して創製されたヌクレオチド分子を提供する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年３月３０日付けで出願した米国仮出願第６１／１６４，８９５号（ここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）の利益を主張する。
【０００３】
（配列表の取込み）
本開示の一部分である配列表は、ＥＦＳウェブを介して提出された本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む、「ＭＯＮＳ２４５ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するコンピューター判読可能な１５ＫＢのファイルを含む。本配列表の対象をここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００４】
コメは世界の多数の地域における重要な作物である。生物工学方法は、改善された形質を持つコメを生成するためにイネに適用されてきている。かかる改善された１つの形質は、除草剤耐性である。植物中の除草剤耐性導入遺伝子の発現は、除草剤耐性の所望の特性を有する植物を生成する目的で有用である。植物中の導入遺伝子の発現は、恐らく染色質構造（例えば、異質染色質）、または組込み部位に近い転写調節因子（例えば、エンハンサー）の近接により、導入遺伝子の染色体の位置によって影響され得る。この理由のために、導入遺伝子の最適な発現、従って特定の所望の特性を有する事象を同定するために、しばしば多数の個々の植物形質転換事象をスクリーニングすることが必要である。例えば、それは、事象中の導入遺伝子発現のレベルにおける広範囲の変動が存在し得ることが植物において観察されている。また、発現の空間的または時間的なパターンにおける差、例えば、種々の植物組織中の相対的な導入遺伝子発現レベルにおける差も存在でき、これは、導入された遺伝子構築体に存在する転写調節因子から期待されるパターンに対応しないかもしれない。従って、商業目的のための所望の導入遺伝子発現レベルおよびパターンを有する事象につき、数百〜数千の異なる遺伝子組換え事象を生成し、これらをスクリーニングすることが必要となり得る。次いで、所望のレベルまたはパターンの導入遺伝子発現を有するかかる事象は、植物育種方法を用いる性的交配によって導入遺伝子を他の遺伝的背景に遺伝子移入するために用い得る。かかる交配の後代は、元来の形質転換体の導入遺伝子発現特性を有するであろう。これは、特定の地域の生育条件に適切に適する多数の異なる品種における信頼できる遺伝子発現を保証するために用い得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は遺伝子組換えイネ事象１７３１４に関する。本事象を含む植物は、グリホサート除草剤に対する耐性を示す。また、本発明は、事象１７３１４に関連する核酸分子、植物、植物器官、植物種子、植物細胞、農産物および方法に関する。本発明は、本事象にユニークであり、イネ植物のゲノムへの遺伝子組換えＤＮＡの挿入と関連して創製されたヌクレオチド分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に受入番号ＰＴＡ−９８４４で寄託された代表的な種子を有する、グリホサート除草剤の施用に商業上許容できる耐性を示す事象１７３１４を含む遺伝子組換えイネ植物を提供する。また、本発明は、事象１７３１４を含むイネの種子、後代、植物器官、細胞および商品を提供する。また、本発明は、事象１７３１４を含むイネのゲノムに関連する新規なＤＮＡ分子、およびこれらの分子の使用方法を提供する。また、本発明は、遺伝子組換えイネ事象１７３１４およびこの事象を含む植物の使用方法、ならびにグリホサート耐性イネの生成方法を提供する。
【０００７】
本発明は、イネ事象１７３１４に関係するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子は、イネ事象１７３１４の導入遺伝子挿入およびフランキングゲノムＤＮＡ間の結合、および／または挿入ＤＮＡに隣接するゲノムＤＮＡの領域、および／または挿入部位に隣接する組込み遺伝子組換えＤＮＡの領域、および／または組込み遺伝子組換え発現カセットの領域、および／またはこれらの領域のいずれかのコンティグ配列を表すかまたはそれらに由来するヌクレオチド配列を含み得る。また、本発明は、イネ事象１７３１４に特徴的なプライマーおよびプローブとして有用なＤＮＡ分子を提供する。これらの分子を含むイネ植物、植物細胞、植物器官、商品、後代および種子を提供する。
【０００８】
本発明は、イネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出するのに有用な方法、組成物およびキットを提供する。本発明は、ＤＮＡを含む試料と、イネ事象１７３１４からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に用いた場合にイネ事象１７３１４に特徴的な増幅されたＤＮＡを生成するプライマーセットとを接触させ、核酸増幅反応を行い、それにより増幅されたＤＮＡを生成し、次いで、増幅されたＤＮＡを検出することによる事象１７３１４の検出方法を提供する。また、本発明は、ＤＮＡを含む試料と、事象１７３１４からのゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応に用いた場合にイネ事象１７３１４に特異的なＤＮＡ分子にハイブリダイズするプローブとを接触させ、ハイブリダイゼーション反応を行ない、次いで、ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションを検出ことによる事象１７３１４の検出方法を提供する。また、イネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出するのに有用な本発明の方法および組成物を含むキットを提供する。
【０００９】
本発明は、事象１７３１４を含む植物、植物細胞または種子に由来するイネ植物、種子、植物細胞、後代植物、植物器官、または商品を提供する。また、本発明は、配列番号：１〜６、ならびにその相補体および断片よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子、あるいは配列番号：６に少なくとも９０％の配列同一性を含むＤＮＡ分子を含むイネ植物、種子、植物細胞、後代植物、植物器官、または商品を提供する。また、本発明は、例えば、ＤＮＡ増幅方法において、事象１７３１４あるいは配列番号：１および／または２を含む増幅されたＤＮＡ分子を生成するＤＮＡ分子を含む植物または種子に由来するイネ植物、種子、植物細胞、後代植物、植物器官または商品を提供する。
【００１０】
本発明は、事象１７３１４を含むイネを植え、次いで、事象１７３１４を含む植物を害することなく、雑草を防除できる有効量のグリホサート除草剤を施用することによる、圃場における雑草の防除方法を提供する。
【００１１】
本発明は、事象１７３１４を含むか、または配列番号：１または配列番号：２を含むイネ植物と第２のイネ植物とを性的交配し、それにより、種子を生成し、その種子を生育させて、後代植物を生成し、後代植物をグリホサートで処理し、次いで、グリホサートに耐性である後代植物を選択することによる、グリホサート除草剤の施用に耐性であるイネ植物および／または種子の生成方法を提供する。また、方法は、選択された後代植物を自家受粉して、複数の第２世代の後代植物を生成し、これらからグリホサート耐性植物を選択することを含み得る。また、方法は、選択された後代植物ともう一つのイネ植物とを性的交配させ、種子を生育させて、第２世代の後代植物を生成し、第２世代の後代植物をグリホサートで処理し、次いで、グリホサートに耐性である第２世代の後代植物を選択することを含む。本発明は、事象１７３１４を含みかつ配列番号：１または配列番号：２を含むグリホサート耐性植物を自家受粉し、それにより、種子を生成し、その種子を生育させて、後代植物を生成し、後代植物とグリホサートで処理し；次いで、グリホサートに耐性である後代植物を選択することによる、グリホサート除草剤の施用に耐性であるイネ植物および／または種子の生成方法を提供する。
【００１２】
本発明の前記および他の態様は、以下の詳細な記載からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】事象１７３１４の概略図：［Ａ］は、５’結合領域の相対的位置に対応し、それはイネゲノムと挿入された遺伝子組換えＤＮＡの５’部分との間の結合部である（配列番号：１として提供）；［Ｂ］は、３’結合領域の相対的位置に対応し、それはイネゲノムと挿入された遺伝子組換えＤＮＡの３’部分との間の結合部である（配列番号：２として提供）；［Ｃ］は、５’フランキング領域の相対的位置、および挿入された遺伝子組換えＤＮＡの５’末端の一部分に対応し、それは事象１７３１４の組込み発現カセットおよび導入遺伝子ＤＮＡの５’末端の領域に隣接する５’イネゲノム配列を含む（配列番号：３として提供）；［Ｄ］は、３’フランキング領域の相対的位置、および挿入された遺伝子組換えＤＮＡの３’末端の一部分に対応し、それは事象１７３１４の組込み発現カセットおよびに導入遺伝子ＤＮＡの３’末端の領域に隣接する３’イネゲノム配列を含む（配列番号：４として提供）；［Ｅ］は、事象１７３１４のゲノムに挿入された導入遺伝子発現カセットを表す（配列番号：５として提供）；および［Ｆ］は、左から右に図中に表された、配列番号：３、配列番号：５および配列番号：４を含む、フランキング配列および導入遺伝子発現カセットの隣接配列を表し（配列番号：６として提供）、ここに、配列番号：１および配列番号：２は、これらの配列が事象１７３１４の結合配列を前記に組み込まれるので、前記にごとく組み込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（配列の簡単な記載）
配列番号：１−イネゲノムＤＮＡと組込み発現カセットとの間の５’結合配列を表わす２０ヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、配列番号：３の第２８３〜３０２位に対応する（［Ｃ］、図１参照）および配列番号：６の第２８３〜３０２位に対応する。 
【００１５】
配列番号：２−組込み発現カセットとイネゲノムＤＮＡとの間の３’結合を表す２０ヌクレオチド配列。このヌクレオチド配列は、配列番号：４の第６６６〜６８５位に対応し（［Ｄ］、図１参照）、配列番号：２の逆方向の相補体は、配列番号：６の第３３９７〜３４１６位に対応する。
【００１６】
配列番号：３−遺伝子組換えＤＮＡの領域まででかつ遺伝子組換えＤＮＡの領域を含む事象１７３１４の挿入されたＤＮＡに隣接する５’配列。配列番号：３の第２８３〜３０２のヌクレオチド位置は、配列番号：１の第１〜２０位のヌクレオチド位置に対応し、配列番号：３の第２９３〜３０２のヌクレオチド位置は、配列番号：５の第１〜１０位置に対応する。
【００１７】
配列番号：４−遺伝子組換えＤＮＡ挿入の領域まででかつ遺伝子組換えＤＮＡ挿入の事象１７３１４の挿入されたＤＮＡに隣接する３’配列。配列番号：４の第６６６〜６８５のヌクレオチド位置は、配列番号：２の第１〜２０位のヌクレオチド位置に対応し、配列番号：４の第６６６〜６８５のヌクレオチド位置の逆方向の相補的な鎖は、配列番号：５の第３１０５〜３１１４のヌクレオチド位置に対応する。
【００１８】
配列番号：５−グリホサート除草剤耐性を与える組込み発現カセットの配列。配列番号：５は、配列番号：６の２９３〜３０４６のヌクレオチド位置に対応する。
【００１９】
配列番号：６−事象１７３１４（配列番号：３）の挿入されたＤＮＡに隣接する５’配列のコンティグ、組込み発現カセットの配列（配列番号：５）および事象１７３１４の挿入ＤＮＡに隣接する３’配列（配列番号：４の逆方向相補体）を表す配列。
【００２０】
配列番号：７−事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ４１８３。プライマーＳＱ４１８３は、右の導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの５’領域に隣接するゲノム領域に相補的である。プライマーＳＱ４１８３およびＳＱ４１９１（配列番号：８）の組合せを用いて生成されたアンプリコンは、事象１７３１４の存在を示す。
【００２１】
配列番号：８−事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ４１９１。
プライマーＳＱ４１９１は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの５’領域に相補的である。プライマーＳＱ４１８３（配列番号：７）およびＳＱ４１９１の組合せを用いて生成されたアンプリコンは、事象１７３１４の存在を示す。
【００２２】
配列番号：９−事象１７３１４を同定するために用い、かつ、５’結合配列の断片に相補的であるプローブＰＢ１４９１。このプローブは、６ＦＡＭＴＭのごとき検出可能な標識に連結し得る。６ＦＡＭＴＭ標識プローブＰＢ１４９１のごときプローブと組み合わせたＳＱ４１８３およびＳＱ４１９１のごとき、プライマーを用いるＴＡＱＭＡＮＲ(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)アッセイ中の蛍光シグナルの放出は、事象１７３１４の存在に特徴的である。
【００２３】
配列番号：１０−事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ１８７５。プライマーＳＱ１８７５は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界へ接近する挿入された発現カセットの３’領域に相補的である。プライマーＳＱ１８７５およびＳＱ３６２８（配列番号：１１）の組合せを用いて生成されたアンプリコンは、事象１７３１４の存在を示す。
【００２４】
配列番号：１１−事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ３６２８。
プライマーＳＱ３６２８は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの３’末端に隣接するゲノム領域に相補的である。プライマーＳＱ１８７５（配列番号：１０）およびＳＱ３６２８の組合せを用いて生成されたアンプリコンは、事象１７３１４の存在を示す。
【００２５】
配列番号：１２−ゲノムＤＮＡに隣接する事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ１８７１。プライマーＳＱ１８７１は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの５’領域に相補的である。
【００２６】
配列番号：１３−ゲノムＤＮＡに隣接する事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ１８６９。プライマーＳＱ１８６９は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの５’領域に相補的である。
【００２７】
配列番号：１４−ゲノムＤＮＡに隣接する事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ１８８０。プライマーＳＱ１８８０は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの３’領域に相補的である。
【００２８】
配列番号：１５−ゲノムＤＮＡに隣接する事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ３６２９。プライマーＳＱ３６２６は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの５’末端に隣接するゲノム領域に相補的である。
【００２９】
配列番号：１６−ゲノムＤＮＡに隣接する事象１７３１４を同定するために用いたプライマーＳＱ３６２７。プライマーＳＱ３６２６は、導入遺伝子ＤＮＡ挿入境界に接近する挿入された発現カセットの３’末端に隣接するゲノム領域に相補的である。
【００３０】
（詳細な記載）
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特記しない限りは、用語は、関連技術分野における当業者により従来の使用により理解されるべきである。
本明細書に用いた「含む」なる用語は、「限定されるものではないが、〜を含む」を意味する。
【００３１】
本発明は、事象１７３１４、およびグリホサート除草剤の施用に対する商業上許容できる耐性を示す事象１７３１４を含む遺伝子組換えイネ植物を提供する。この事象は、イネ遺伝資源の染色体／ゲノムへの遺伝子組換えＤＮＡの単一の挿入を含む。植物を含む事象は、以下のものによって生成できる：（ｉ）注目する導入遺伝子を含む核酸構築体での植物細胞の形質転換、（ｉｉ）植物のゲノムへの導入遺伝子の挿入に起因する植物の集団の再生、および（ｉｉｉ）植物のゲノム中の特定の位置への導入遺伝子の挿入により特徴付けられた特定の植物の選択。「事象」なる用語とは、ゲノム中の特定の位置への注目する遺伝子の特定の遺伝子組換え挿入をいう。その事象を含む植物とは、植物ゲノムの特定の位置に挿入された導入遺伝子を含む元来の形質転換体をいうことができる。また、その事象を含む植物は、植物ゲノムの特定の位置に挿入された導入遺伝子を含む形質転換体の後代をいうことができる。かかる後代は、形質転換体またはその後代、およびもう一つの植物間の性的交配により生成し得る。かかる他の植物は、同一もしくは異なる導入遺伝子を含む遺伝子組換え植物、および／または異なる品種からのもののごとき非遺伝子組換え植物であり得る。反復親への戻し交配の繰り返し後でさえ、形質転換した親からの挿入されたＤＮＡおよびフランキングＤＮＡは、同一ゲノムの位置での交配の後代に存在する。
【００３２】
本明細書に用いた「イネ」なる用語は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを意味し、野生イネ種ならびに種間での生育を可能にする属Ｏｒｙｚａに属するそれらの植物を含めたイネで生育できるすべての植物品種を含む。
【００３３】
また、「事象」なる用語は、挿入されたＤＮＡ、および挿入されたＤＮＡのいずれか一側に直ちに隣接しているフランキングイネゲノムＤＮＡを含む元来の形質転換体からのＤＮＡ分子をいう。このＤＮＡ分子は、イネ植物のゲノムに遺伝子組換えＤＮＡを挿入する行為によって（すなわち、形質転換の行為によって）創製される。従って、このＤＮＡ分子は、このヌクレオチド配列がイネゲノムＤＮＡおよび遺伝子組換えＤＮＡ挿入物の特定の領域の双方の配列を含むという点で、双方とも事象に特異的であり、その組換えＤＮＡが挿入されたイネ植物のゲノムにユニークであるヌクレオチド配列を含む。従って、周囲のイネ植物ゲノムＤＮＡに関しての事象１７３１４に挿入されたＤＮＡの配置は、事象１７３１４に特有でかつユニークである。また、このＤＮＡ分子は、事象１７３１４を含み、それ自体が植物において静的であり、植物の後代に伝え得る植物のイネ染色体の不可欠な部分である。
【００３４】
事象１７３１４は、イネ植物に施用されたグリホサート除草剤に対する耐性を与える。「グリホサート」はＮ−ホスホノメチル−グリシンおよびその塩をいう。Ｎ−ホスホノメチル−グリシンは、広範囲の植物種に対する活性を有する除草剤である。植物表面に施用された場合、グリホサートは植物を介して全身的に移動する。グリホサートは、芳香族アミノ酸の合成のための前駆体を提供するシキミ酸経路のその抑制により植物毒素である。
【００３５】
本明細書に用いた「組換え体」なる用語は、通常天然に見出されず、かつそれ自体がヒト介在によって創製されたＤＮＡおよび／またはタンパク質および／または有機体の形態をいう。かかるヒト介在は、組換えＤＮＡ分子および／または組換え植物を生成し得る。本明細書に用いた「組換えＤＮＡ分子」は、天然に一緒に発生せず、ヒト介在の結果であるＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子、例えば、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子、および／または人工的に合成され、天然に通常存在するポリヌクレオチド配列から逸脱するポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および／または宿主細胞のゲノムＤＮＡおよび宿主細胞のゲノムの関連するフランキングＤＮＡに人工的に組み込まれた導入遺伝子を含むＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子の一例は、イネゲノムへの導入遺伝子の挿入に起因して、本明細書に記載されたＤＮＡ分子であり、それは最終的には、その有機体中の組換ＲＮＡおよび／または蛋白分子の発現を生じさせ得る。本明細書に用いた「組換え植物」は、天然に通常存在しない植物であり、ヒト介在の結果であり、導入遺伝子および／またはそのゲノムに組み込まれた異種のＤＮＡ分子を含む。かかるゲノムの改変の結果、遺伝子組換え植物は、関連する野性型植物とは明確に異なる。組換え植物の一例は、事象１７３１４を含むと本明細書に記載されたイネ植物である。
【００３６】
本明細書に用いた「導入遺伝子」なる用語は、宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれたポリヌクレオチド分子をいう。かかる導入遺伝子は、宿主細胞に異種であり得る。「遺伝子組換え植物」なる用語は、かかる導入遺伝子を含む植物をいう。
【００３７】
本明細書に用いた「異種」なる用語は、天然における第２の分子と組み合わせて通常見出されない第１の分子をいう。例えば、分子は、第１の種に由来し、第２の種のゲノムに挿入され得る。かくして、分子は、宿主に異種であり、宿主細胞のゲノムに人工的に組み込まれるであろう。
【００３８】
本明細書に用いた「キメラ」なる用語は、第２のＤＮＡ分子に第１のＤＮＡ分子を融合させることにより生成された単一のＤＮＡ分子をいい、ここに、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、その配置、すなわち、他方に融合されたもので通常見出されないであろう。かくして、キメラＤＮＡ分子は通常天然に見出されない限りは新しいＤＮＡ分子である。
【００３９】
本発明は、ＤＮＡ分子およびそれらの対応するヌクレオチド配列を提供する。本明細書に用いた「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ分子」、「ポリヌクレオチド分子」なる用語は、ゲノムまたは合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、５’（上流）末端から３’（下流）末端から読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基のポリマーまたはポリヌクレオチド分子をいう。本明細書に用いた「ＤＮＡ塩基配列」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」なる用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列をいう。本明細書に用いた命名法は、米国特許法施行規則第１．８２２条によって必要とされ、ＷＩＰＯ標準  ＳＴ．２５（１９９８）、付録２、表１および３中の表に記載されたものである。本発明は、遺伝子組換え事象１７３１４のゲノム中に存在する２つのヌクレオチド配列鎖の１つの鎖だけを参照して、特に、配列番号：１〜６を参照して開示される。従って、含意および派生によって、当該技術分野において完全な相補体または逆方向の相補的配列といわれる相補的配列も、本発明の範囲内にあり、従って、特許請求された主題の範囲内にあることも意図される。
【００４０】
挿入された遺伝子組換えＤＮＡ、およびその挿入された遺伝子組換えＤＮＡのいずれかの末端に隣接するイネゲノムＤＮＡの実質的なセグメントに対応するヌクレオチド配列は、配列番号：６として本明細書に提供される。このサブセクションは、配列番号：５として提供された挿入された遺伝子組換えＤＮＡである。リン酸ジエステル結合によって物理的に連結し、従って、挿入された遺伝子組換えＤＮＡ（配列番号：５）の５’末端に隣接するイネゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号：３に示すごとく記載される。リン酸ジエステル結合によって物理的に連結し、従って、挿入された遺伝子組換えＤＮＡ（配列番号：５）の３’末端に隣接するイネゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号：４に示すごとく記載される。
【００４１】
さらに、事象１７３１４は、２つのポリヌクレオチド配列を含み、遺伝子組換えＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入される場合に、１つは５’位置にわたり、１つは３’位置にわたり、これは本明細書では結合配列という。「結合配列」または「結合領域」とは、挿入された遺伝子組換えＤＮＡおよび隣接したフランキングゲノムＤＮＡの双方にわたるＤＮＡ配列および／または対応するＤＮＡ分子をいう。結合配列は、２つの２０ヌクレオチド配列によって任意に表わされ、配列番号：１および配列番号：２として提供され、その各々は、挿入物ＤＮＡの１０ヌクレオチドに結合した直ちに隣接するフランキングゲノムＤＮＡの１０ヌクレオチドを表す。これらのヌクレオチドは、リン酸ホスホジエステル結合により連結される。イネにおいて、配列番号：１および配列番号：２は、そのゲノム中で天然には発生せず、遺伝子組換え事象１７３１４に特有でユニークであり、イネ植物に由来するいずれかのヌクレオチド配列におけるこれらの配列、またはこれらの各配列の少なくとも約１１，少なくとも約１３または少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドの同定は、ＤＮＡがイネ事象１７３１４から得られることに決定的であり、イネ事象１７３１４からのＤＮＡの試料中の存在に特徴的である。配列番号：１は、イネゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの５’末端との間の結合にわたる２０ヌクレオチド配列である。配列番号：２は、イネゲノムＤＮＡと挿入されたＤＮＡの３’末端との間の結合にわたる２０ヌクレオチド配列である。かくして、本発明は、配列番号：１および配列番号：２のいずれかまたは双方に記載された少なくともヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。配列番号：１の少なくとも約１１、少なくとも約１３または少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドを含むのに十分な遺伝子組換えイネ事象１７３１４に由来したＤＮＡのいずれのセグメントも、本発明の範囲内にある。配列番号：２の少なくとも約１１、少なくとも約１３または少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドを含むのに十分な遺伝子組換えイネ事象１７３１４に由来したＤＮＡのいずれのセグメントも、本発明の範囲内にある。加えて、この段落内に記載されたいずれかの配列に相補的な配列を含むいずれのポリヌクレオチドも、本発明の範囲内である。図１は、５’〜３’に配置された配列番号：６に対し、配列番号：１〜５の物理的な配置を示す。また、本発明は、配列番号：６の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％を含む核酸分子を提供する。
【００４２】
本発明は、試料中の事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を分析するためのプライマーまたはプローブのいずれとしても用いることができる典型的なＤＮＡ分子を提供する。かかるプライマーまたはプローブは標的核酸配列に特異的で、それ自体が本明細書に記載された本発明方法によるイネ事象１７３１４の同定に有用である。
【００４３】
「プライマー」は、典型的には、熱増幅を含む特定のアニーリングまたはハイブリダイゼーションにおける使用のために設計される高度に精製され単離されたポリヌクレオチドである。プライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のごとき熱増幅におけるイネゲノムＤＮＡの試料のごときテンプレートＤＮＡと共に用いて、かかる反応から生成したアンプリコンが、プライマーがテンプレートにハイブリダイズした場合に２つの部位間に位置したテンプレートＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有する場合にアンプリコンを生成し得る。本明細書に用いた「アンプリコン」は、増幅技術を用いて合成されたＤＮＡの一片または断片である。本発明の１つの具体例において、事象１７３１４に特徴的なアンプリコンは、イネゲノム中で天然に見出されない配列を含む。本発明のアンプリコンは、配列番号：１、配列番号：２および／またはその相補体の少なくとも約１１の隣接ヌクレオチド、少なくとも約１３の隣接ヌクレオチド、または少なくとも約１１、少なくとも約１３または少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドを含む。プライマーは、典型的には、相補的な標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリダイゼーションを形成するように設計され、プライマーの存在は、テンプレートとして標的ＤＮＡ鎖を用いるプライマーの伸長（すなわち、延長するポリヌクレオチド分子へのさらなるヌクレオチドの重合）を始めるポリメラーゼによる認識ポイントである。本発明に用いたプライマー対は、典型的には、熱増幅反応または他の従来の核酸増幅方法において、プライマー対の個々のメンバーによって結合するための標的とされた位置間にポリヌクレオチドセグメントを直線的に増幅する目的で、２本鎖のヌクレオチドセグメントの反対の鎖に結合する２つのプライマーの使用をいうように意図される。プライマーとして有用な典型的なＤＮＡ分子は、配列番号：７〜８および１０〜１１として提供される。配列番号：７および配列番号：８として提供されるプライマー対は、第１のＤＮＡ分子、および第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子として提供され、双方の分子は、各々、イネ事象１７３１４に由来したテンプレートＤＮＡでの熱増幅反応中に一緒に用いた場合に、配列番号：１の少なくとも約１１の隣接ヌクレオチド、少なくとも約１３の隣接ヌクレオチド、あるいは少なくとも約１１、少なくとも約１３または少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドを含むアンプリコンを生成するＤＮＡプライマーとして機能するための配列番号：３、配列番号：５または配列番号：６あるいはその相補体のいずれかの隣接ヌクレオチドの十分な長さのものである。典型的な対のＤＮＡ分子、すなわち、第１のＤＮＡ分子およびその第１のＤＮＡ分子とは異なる第２のＤＮＡ分子としての配列番号：１０および配列番号：１１が提供され、双方の分子は、各々、イネ事象１７３１４に由来したテンプレートＤＮＡでの熱増幅反応中に一緒に用いた場合に、配列番号：２の少なくとも約１１の隣接ヌクレオチド、少なくとも約１３の隣接ヌクレオチド、あるいは少なくとも約１１、少なくとも約１３または少なくとも約１５の隣接ヌクレオチドのアンプリコンを生成するＤＮＡプライマーとして機能するための配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６あるいはその相補体のいずれかの隣接ヌクレオチドの十分な長さのものである。
【００４４】
「プローブ」は、標的核酸の鎖に相補的である単離された核酸である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、ポリアミドおよび標的ＤＮＡ配列に特異的に結合する他のプローブ物質も含み、かかる結合の検出は、特定の試料中のその標的ＤＮＡ配列の存在を分析、識別、決定または確認するのに有用であることができる。プローブは、従来の検出可能な標識またはリポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素に結合し得る。本発明の１つの具体例において、事象１７３１４に特徴的なプローブは、イネゲノムにおいて天然に見出されない配列を含む。プローブとして有用な典型的なＤＮＡ分子は配列番号：９として提供される。
【００４５】
本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列同一性を有することができるが、標的配列に優先的にハイブリダイズする能力を保持する標的配列とは異なるプライマーおよびプローブも、従来方法によって設計され得る。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するために、使用した特定の溶媒および塩濃度下で安定な２本鎖構造を形成できるために、配列における十分に相補的であることだけを必要とする。いずれの通常の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いても、試料中のイネ事象１７３１４からの遺伝子組換えＤＮＡの存在を同定できる。プローブおよびプライマーは、長さが一般的に少なくとも約１１以上のヌクレオチド、少なくとも約１８以上のヌクレオチド、少なくとも約２４以上のヌクレオチドまたは少なくとも約３０以上のヌクレオチドである。かかるプローブおよびプライマーは、ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。通常のストリンジェンシー条件は、Sambrookら, 1989、およびHaymesら, Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)により記載される。本明細書に用いた２つの核酸分子は、その２つの分子が逆平行の２本鎖核酸構造を形成できるならば、相互に特異的にハイブリダイズできると言われる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示すならば、もう一つの核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書に用いた分子は、一方の分子のすべてのヌクレオチドが他方のヌクレオチドに相補的である場合に、「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子が、それらが少なくとも通常の「低ストリンジェンシー」条件下でそれらが相互にアニーリングされたままとするのを可能とするように十分な安定性で相互にハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であると言われる。同様に、分子は、それらが通常の「高ストリンジェンシー」条件下でそれらが相互にアニーリングされたままとするのを可能とするように十分な安定性で相互にハイブリダイズできるならば、「相補的」であると言われる。従って、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が２本鎖構造を形成する分子の能力を完全に除外しない限りは、許容可能である。
【００４６】
本明細書に用いた「単離された」なる用語は、そのネイティブまたは天然状態においてそれに通常関連する他の分子から少なくとも部分的に分子を分離することをいう。１つの具体例において、「単離された」なる用語は、そのネイティブまたは天然状態においてＤＮＡ分子に通常隣接する核酸から少なくとも部分的に単離されたＤＮＡ分子をいう。かくして、例えば、組換え技術の結果としての通常関連しない調節またはコード配列に融合したＤＮＡ分子は、本明細書において単離されたと考えれれる。かかる分子は、宿主細胞の染色体に組み込まれたか、または他のＤＮＡ分子を含む核酸溶液中に存在する場合でさえ、単離されたと考えられる。
【００４７】
当業者によく知られた多数の方法を用いて、本発明に開示されるＤＮＡ分子またはその断片を単離および操作できる。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を用いて、特定の出発ＤＮＡ分子を増幅でき、および／または元来の分子の変異体を生成できる。また、ＤＮＡ分子またはその断片は、化学的手段によって直接的に断片を合成することによってのごとく、他の技術によって得ることができ、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーの使用により一般的に実行される。
【００４８】
従って、本明細書に提供されるＤＮＡ分子および対応するヌクレオチド配列は、特に、イネ事象１７３１４を同定する、イネ事象１７３１４を含む植物品種または雑種を選択する、試料中のイネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出する、およびイネ事象１７３１４またはイネ事象１７３１４を含む植物および植物器官の存在および／または不存在につき試料をモニタリングするのに有用である。
【００４９】
本発明は、イネ植物、後代、種子、植物細胞、植物器官（例えば、花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織、繊維および葉）および商品を提供する。これらの植物、後代、種子、植物細胞、植物器官および商品は、本発明の検出可能な量のポリヌクレオチド。すなわち、配列番号：１および配列番号：２として供される配列の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドを含む。また、本発明の植物、後代、種子、植物細胞および植物器官は、１以上のさらなる導入遺伝子を含み得る。かかる導入遺伝子は、限定されるものではないが、耐虫性の増加、水使用効率の増加、収率効率の増加、耐乾燥性の増加、種子品質の増加、栄養価の改善および／または除草剤耐性の増加を含めた望ましい形質を与えるタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列またはＲＮＡ分子であり得、ここに、その望ましい形質は、かかるさらなる導入遺伝子を欠くイネ植物に関して測定される
【００５０】
本発明は、事象１７３１４を含む遺伝子組換えイネに由来したイネ植物、後代、種子、植物細胞、ならびに花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織、および葉のごとき植物器官を提供する。事象１７３１４を含む種子の代表的試料は、本発明を可能にする目的でブダペスト条約により寄託されている。その寄託を受けるために選択された貯蔵所は、郵便番号2011、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USAの住所を有する米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）である。そのＡＴＣＣ貯蔵所は、事象１７３１４種子に受入番号ＰＴＡ−９８４４を割り当てた。
【００５１】
本発明は、そのゲノム中に存在する配列番号：１および配列番号：２を有するＤＮＡ分子を含む微生物を提供する。かかる微生物の例は、遺伝子組換え植物細胞である。本発明の植物細胞のごとき微生物は、限定されるものではないが、以下を含めて多数の産業上の適用に有用である：（ｉ）科学研究または産業調査用の研究ツールとしての使用；（ｉｉ）引き続いての科学的調査または工業製品として用い得る内因性または組換え炭水化物、脂質、核酸もしくは蛋白質製品を生成する小分子のための培養での使用；および（ｉｉｉ）農業の研究または生成に次いで用い得る遺伝子組換え植物または植物組織培養物を生成する現代の植物組織培養技術での使用を含めて多数の産業適用に有用である。遺伝子組換え植物細胞のごとき微生物の生成および使用は、現代の微生物学技術およびヒト介在を利用して、人工のユニークな微生物を生成する。このプロセスにおいて、組換えＤＮＡを植物細胞のゲノムに挿入して、自然発生の植物細胞とは離れおよびユニークである遺伝子組換え植物細胞を創製する。次いで、この遺伝子組換え植物細胞は、現代の微生物学技術を用いて細菌および酵母菌のように培養することができ、未分化の単細胞状態で存在し得る。新しい植物細胞の遺伝子組成および表現型は、細胞のゲノムへの異種ＤＮＡの組込みによって創製された技術的効果である。本発明のもう一つの態様は、本発明の微生物の使用方法である。遺伝子組換え植物細胞のごとき本発明の微生物の使用方法は、（ｉ）細胞のゲノムへ組換えＤＮＡを組み込み、次いで、細胞を用いて、同じ異種ＤＮＡを所有するさらなる細胞を得ることによる遺伝子組換え細胞を生成する方法；（ｉｉ）現代の微生物学技術を用いて、組換えＤＮＡを含む細胞を培養する方法；（ｉｉｉ）培養細胞から内因性ももしくは組換え炭水化物、脂質、核酸または蛋白質製品を生成し精製する方法；および（ｉｖ）遺伝子組換え植物または遺伝子組換え植物組織培養物を生成するための遺伝子組換え植物細胞での現代の植物組織培養技術を使用する方法を含む。
【００５２】
本発明の植物は、後代に導入遺伝子を含めた事象ＤＮＡを伝え得る。本明細書に用いた「後代」は、いずれの植物、種子、植物細胞および／または祖先植物に由来した事象ＤＮＡおよび／または配列番号：１もしくは配列番号：２として提供される少なくとも１つの配列を有するポリヌクレオチドを含む再生可能な植物器官を含む。植物、後代および種子は、導入遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。後代は事象１７３１４を含む植物により生成された種子、および／または事象１７３１４を含む植物からの花粉で受精された植物によって生成された種子から生育し得る。
【００５３】
後代植物は、自家受粉（「自配」としても知られている）して、植物、すなわち、導入遺伝子にホモ接合性の植物の真の生育系を生成する。適切な後代の自家受粉は、双方の追加された外来性遺伝子にホモ接合性である植物を生成できる。
【００５４】
別法として、後代植物は、他家交配、例えば、もう一つの無関係な植物で生育させて、変種または雑種の種子または植物を生成し得る。他の無関係な植物は、遺伝子組換えまたは非遺伝子組み換えであり得る。かくして、本発明の変種または雑種種子または植物は、イネ事象１７３１４の特有でユニークなＤＮＡを欠く第１の親と、イネ事象１７３１４を含む第２の親とを交配させることにより誘導する結果、事象１７３１４の特有でユニークなＤＮＡを含む雑種を生じ得る。各親は、その交配または生育が、本発明の植物または種子、すなわち、配列番号：１および配列番号：２を含む事象１７３１４の特有でユニークなＤＮＡを含有する少なくとも１つの対立遺伝子を有する種子において生じる限りは、雑種または生来／変種であることができる。かくして、２つの異なる遺伝子組換え植物を交配させて、２つの独立して分離するさらなる外来性遺伝子を含む雑種子孫を生成し得る。例えば、事象１７３１４を含むグリホサート耐性のイネを他の遺伝子組換えイネ植物と交配させて、双方の遺伝子組換え親の特性を有する植物を生成できる。この１つの例は、１以上のさらなる形質を有するイネ植物との事象１７３１４を含むグリホサート耐性のイネの交配であり、その結果、グリホサートに耐性であり、１以上のさらなる形質を有する後代の植物または種子を生じるであろう。例えば、ホスフィノトリシンまたはグルホシネート除草剤に対する耐性を示すイネ植物を事象１７３１４を含むイネ植物と交配させて、グリホサート除草剤およびホスフィノトリシンまたはグルホシネート除草剤に耐性の後代植物または種子を生成できた。かくして、本明細書に開示された方法に用いた植物および種子は、１以上のさらなる導入遺伝子を含み得る。かかる導入遺伝子は、限定されるものではないが、耐虫性の増加、水使用効率の増加、収率効率の増加、耐乾燥性の増加、種子品質の増加、栄養価の改善、ストレス耐性の改善および／または除草剤耐性の増加を含めた望ましい形質を与えるタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列またはＲＮＡ分子であり得、ここに、望ましい形質は、かかるさらなる導入遺伝子を欠くイネ植物に関して測定される。
【００５５】
遺伝子組換え植物耐性が示されており、本発明の方法が適用できる除草剤は、限定されるものではないが、グリホサート、グルホシネート、スルホニル尿素系、イミダゾリノン系、ブロモキシニル、デラポン、シクロヘキサンジオン、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ抑制剤およびイソキサフルトール除草剤を含む。除草剤耐性に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、当該技術分野において知られており、限定されるものではないが、グリホサート−耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸塩シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（例えば、米国特許第５，６２７，０６１号；第５，６３３，４３５号；第６，０４０，４９７号；第５，０９４，９４５号；第５，８０４，４２５号；第６，２４８，８７６号；第７，１８３，１１０号；ＲＥ３９，２４７号を参照）；グリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）（例えば、米国特許第５，７７６，７６０号を参照）；グリホサート−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）；スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシベンゾエート、スルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンおよび／またはヘテロアリールエーテルに対する耐性についての除草剤耐性アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）としても知られている）；アリールオキシフェノキシプロピオン酸エステル（ＡＯＰＰ）（例えば、ハロキシホップ、キザロホップ、ジクロロホップおよびジクロホップ）に対する耐性についての除草剤耐性のアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）またはＲ−２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸ジオキシゲナーゼ（ｒｄｐＡ）；合成オーキシン除草剤に対する耐性についての２，４−Ｄジオキシゲナーゼ（ｔｆｄＡ）、Ｒ−２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸ジオキシゲナーゼ（ｒｄｐＡ）、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ）および／またはＳ−２，４−ジクロルプロップジオキシゲナーゼ（ｓｄｐＡ）のごとき解毒タンパク質；ブロモキシニル耐性についてのブロモキシニルニトリラーゼ（Ｂｘｎ）（例えば、米国特許第４，８１０，６４８号を参照）；ノルフルラゾンに対する耐性についてのフィトエンデサチュラーゼ（ｃｒｔＩ）；グルホシネートおよびビアラホスに対する耐性についてのビアラホス抵抗性（ｂａｒ）またはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質（例えば、米国特許第５，６４６，０２４号および第５，２７６，２６８号を参照）；および耐性４−ヒドロキシフェニルピルバートジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、解毒シトクロムＰ４５０、またはアルスロバクターグロビホルミス（Artbrobacter globiformis）ＨＰＰオキシダーゼ（ＨＰＰＯ）およびシュードモナス−アシドボランス４−ＨＰＡ  １−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）およびＮＡＤＨオキシドレダクターゼ（ＨＰＡＣ）のようなＨＰＰＤ経路バイパスのごときトリケトン（メゾトリオン、テンボトリオン、トプラメゾン（topromezone）、イソキサゾール）除草剤耐性についてのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含む。
【００５６】
遺伝子組換え植物に有用な他のタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、当該技術分野において知られており、限定されるものではないが、E. coli cspA（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０３３３１８号）；B. subtilis cspB（ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０３３３１８号）；Zea mays Mg輸送体（米国公開第２００４００３４８８８号；第２００７００１１７８３号；第２００７０２９４７８２号）；Zea mays nfb2 (a.k.a hap3) （米国公開第２００５００２２２６６号および第２００８０１０４７３０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／００２４８０号）；綿csp様（米国シリアル番号第１１／９８０，７５８号；米国公開第２００５００９７６４０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０３３３１８号）；小麦csp様（米国特許第７，２１４，７８６号；米国公開第２００５００９７６４０号）；Ｇ１９８８（米国シリアル番号０９／４７４，４３５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ０４／０３１３４９号）；Ｇ１０７３（米国特許第６，７１７，０３４号および米国公開第２００５００９７６３１号）；Ｇ１２７４（米国公開第２００９０２６５８１３号）；およびＣＧＰＧ２１１７（米国公開第２００８００９０９９８号）をコードするポリヌクレオチドを含む。遺伝子組換え植物に有用なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチド分子は、当該技術分野において知られており、殺線虫剤、殺真菌剤および殺虫剤のごとき病害虫防除に有用なものを含む。殺虫剤は、限定されるものではないが、Ｂｔ毒素、および／またはXenhorabdus、 Photorhabdus、Bacillus (例えば、 Bacillus laterosporous)、 Serratia, Klebsiella、 Erwinia等からの毒素を含む。Ｂｔ毒素は、限定されるものではないが、ＶＩＰ毒素、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ４、Ｃｒｙ５、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９毒素、およびＢｔに由来したものなどのごとき２成分の殺虫性毒素を含む。
【００５７】
また、親植物への戻し交配および非遺伝子組換え植物との他家交配は、栄養繁殖であると考えられる。異なる形質および作物に一般的に用いる他の育種方法の記載は、いくつかの引用文献の１つ、例えば、Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)に見出すことができる。
【００５８】
本発明は、事象１７３１４を含むイネ植物に由来する植物器官を提供する。本明細書に用いた「植物器官」とは、事象１７３１４を含むイネ植物に由来した物質を含む植物のいずれかの器官をいう。植物器官は、限定されるものではないが、花粉、胚珠、鞘、花、根もしくは茎組織、繊維および葉を含む。植物器官は、生存、非生存、再生可能および／または再生不能であり得る。
【００５９】
本発明は、事象１７３１４を含むイネ植物に由来する商品を提供する。本明細書に用いた「商品」とは、事象１７３１４を含むイネ植物、種子、植物細胞または植物器官に由来した物質を含むいずれかの組成物または生成物をいう。商品は消費者に販売でき、生存または非生存であり得る。非生存商品は、限定されるものではないが、非生存種子および粒；加工された種子、種子部分および植物器官；脱水された植物組織、冷凍植物組織および加工された植物組織；陸生および／または水生動物消費用の動物飼料、ヒト消費用の油、食事、小麦粉、フレーク、糠、繊維、ミルク、チーズ、紙、クリーム、ワインおよびいずれかの他の食物のために加工された種子および植物器官；バイオマスおよび燃料生成物を含む。生存商品は、限定されるものではないが、種子および植物細胞を含む。かくして、事象１７３１４を含むイネ植物を用いて、イネから典型的に獲得されるいずれの商品も製造できる。事象１７３１４を含む植物から由来するいずれのかかる商品も、事象１７３１４に対応する少なくとも検出可能な量の特有でユニークなＤＮＡを含むこともでき、具体的には、配列番号：１および配列番号：２の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含有する検出可能な量のポリヌクレオチドを含み得る。本明細書に開示された検出方法を含めて、ポリヌクレオチド分子についての検出のいずれの標準的な分析法も用い得る。商品は、商品中にいずれかの検出可能な量の配列番号：１または配列番号：２が存在するならば、本発明の範囲内にある。
【００６０】
従って、本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植物器官（例えば、花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織および葉）および商品は、特に、農業の目的のための事象１７３１４を含む種子および／または植物器官を生成する目的で植物を生育する、植物育種および研究目的のための事象１７３１４を含む後代を生成する、産業および研究適用についての微生物学技術での使用、および消費者への販売に有用である。
【００６１】
本発明は、グリホサート除草剤を用いる雑草の防除方法、および植物の生成方法、ならびに事象１７３１４を含む植物を提供する。圃場における雑草の防除方法が提供され、それは、圃場において事象１７３１４を含む変種または雑種植物を植え、次いで、事象１７３１４を含む植物を傷害することなく、圃場において雑草を防除する目的で圃場に除草上有効量のグリホサートを施用することよりなる。グリホサート除草剤のかかる施用は、発芽前、すなわち、事象１７３１４を含む種子が植えられかつ事象１７３１４を含む植物が出現する前のいずれかの時点、あるいは出芽後、すなわち、事象１７３１４を含む植物が出現した後のいずれかの時点であり得る。また、圃場において雑草を防除するもう一つの方法が提供され、有効量のグリホサート除草剤を施用して雑草を防除し、次いで、圃場における事象１７３１４を含むイネを植えることよりなる。グリホサート除草剤のかかる施用は、播種前、すなわち、事象１７３１４を含む種子を植える前であり、限定されるものではないが、播種前約１４日〜播種前約１日を含めた播種前のいずれの時点でもなすことができる。圃場における使用のための除草上有効用量のグリホサートは、栽培期にわたり、１エーカー当たり約０．５ポンドから１エーカー当たり約４．５ポンドと同程度までの範囲よりなるべきである。グリホサートの複数の施用、例えば、２つの施用（例えば、播種前施用でかつ出芽後施用、または出芽前施用および出芽後施用）または３つの施用（例えば、播種前施用、出芽前施用および出芽後施用）を栽培期にわたり用い得る。
【００６２】
本発明の遺伝子組換え事象１７３１４に特有でユニークなＤＮＡ配列を含む除草剤耐性のイネ植物の生成方法が提供される。これらの方法に用いた遺伝子組換え植物は、導入遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。これらの方法によって生成された後代植物は、変種または雑種植物であり得；植物によって生成された種子、および／または事象１７３１４を含む植物からの花粉で受精された植物によって生成された事象１７３１４を含む種子から生育でき；および導入遺伝子にホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。引き続いて、後代植物を自家受粉して、真の生育系の植物、すなわち、導入遺伝子にホモ接合性の植物を生成するか、あるいは、他家交配、例えば、もう一つの無関係の植物と生育して、変種もしくは雑種種子または植物を生成し得る。
【００６３】
グリホサート除草剤の施用に耐性であるイネ植物は、配列番号：１および配列番号：２の配列を含むポリヌクレオチド分子を含む事象１７３１４を含む植物ともう一つのイネ植物とを性的交配し、それにより、種子を生成し、次いで、これを後代植物に生育することにより生成し得る。次いで、これらの後代植物はグリホサート除草剤で処理して、グリホサート除草剤に耐性である後代植物を選択し得る。別法として、これらの後代植物を分析法を用いて分析して、事象１７３１４ＤＮＡを含む後代植物を選択し得る。交配に用いた他の植物は、グリホサート除草剤に耐性であっても、耐性でなくともよく、遺伝子組換えであってもなくてもよい。生成された後代植物および／または種子は、変種または雑種種子であり得る。
【００６４】
この方法の実施において、１つの植物ともう一つの植物とを性的交配する、すなわち、他家交配する工程は、ヒト介在、例えば、ヒトの手により、１つの植物の花粉を集めて、この花粉と第２の植物の花柱または柱頭とを接触させる；ヒト手および／または行為により、天然の自家受粉を防止し、他家交配が、受精が生じるように発生するにちがいないように（例えば、雄穂除去、または化学的ガメトサイドの適用により）植物の雄しべまたは葯を除去、破壊またはカバーする；「指令された受粉」についての位置における受粉用昆虫のヒト配置によって（例えば、果樹園または圃場にミツバチの巣を配置することによって、または受粉用昆虫を含む植物をかごに入れることによって）；ヒトにより、花の器官を咲かせるかまたは除去して、（例えば、それらをヒト介在なくして天然の避けられない自己花粉媒介者として、他家交配を妨害または防止する花を天然に有するイネにおいて）花柱または柱頭上で外来性の花粉の配置または接触を可能とする；植物の選択的な配置（例えば、受粉近傍において意図的に植物を植える）によって；および／または開花を誘発するまたは（花粉用の柱頭の）感受性を促進する化学薬品の適用によって達成または促進し得る。
グリホサート除草剤の施用に耐性であるイネ植物は、配列番号：１または２の配列を含むポリヌクレオチド分子を含む事象１７３１４を含む植物を自家受粉し、それにより、種子を生成し、次いで、後代植物に生育することによって生成され得る。次いで、これらの後代植物をグリホサート除草剤で処理して、グリホサート除草剤に耐性である後代植物を選択し得る。別法として、これらの後代植物は、分析方法を用いて分析して、事象１７３１４ＤＮＡを含む後代植物を選択し得る。
【００６５】
この方法を実施することにおいて、ある植物とそれ自体とを性的交配する、すなわち、自家受粉または自配する工程は、ヒト介在、例えば、ヒトの手により、植物の花粉を集めて、この花粉と同一の植物の花柱または柱頭とを接触させ、次いで、所望により、植物のさらなる受精を防止する；ヒト手および／または行為により、天然の自家受粉を防止し、他家交配が、受精が生じるように発生するにちがいないように（例えば、雄穂除去、または化学的ガメトサイドの適用による）他の付近の植物の雄しべまたは葯を除去、破壊またはカバーする；「指令された受粉」についての位置における受粉用昆虫のヒト配置によって（例えば、受粉用昆虫を含む植物のみをかごに入れることによって）；花またはその器官のヒト操作により、自家受粉を可能する；植物の選択的配置により（受粉近傍を超えて植物を意図的に植える）；および／または開花を誘発するまたは感受性を促進する化学薬品の適用によって達成または促進し得る。
【００６６】
これらの方法によって包含され、これらの方法を用いて生成された後代イネ植物および種子は他のイネ植物とは異なるであろう。それは、例えば、後代イネ植物および種子は、組み換えであって、それ自体がヒト介在によって作成され；グリホサート除草剤耐性であり；本発明の導入遺伝子ＤＮＡよりなる少なくとも１つの対立遺伝子を含み；および／または配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択される検出可能な量のポリヌクレオチド配列を含むためである。種子は、個々の後代から選択でき、その種子が配列番号：１および配列番号：２を含む限りは、それは本発明の範囲内にあるであろう。
【００６７】
本発明を実施するにおいて、２つの異なる遺伝子組換え植物を交配して、２つの独立し分離する異種遺伝子を含む雑種子孫を生成できる。適切な後代の自家受粉は、双方の遺伝子にホモ接合性である植物を生成できる。また、親植物への戻し交配および非遺伝子組換え植物との他家交配は、栄養繁殖であると考えられる。異なる形質および作物に一般的に用いる他の方法の記載は、いくつかの引用文献の１つ、例えば、Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)に見出すことができる。
【００６８】
また、本明細書に開示された方法に用いる植物および種子は、１以上のさらなる導入遺伝子を含み得る。かかる導入遺伝子は、限定されるものではないが、耐虫性の増加、水使用効率の増加、収率効率の増加、耐乾燥性の増加、種子品質の増加、栄養価の改善、および／または除草剤耐性の増加を含めた望ましい形質を与えるタンパク質をコードするいずれかのヌクレオチド配列またはＲＮＡ分子であり得、ここに、望ましい形質は、かかるさらなる導入遺伝子を欠くイネ植物に関して測定される。
【００６９】
したがって、本発明の方法は、特に、農業目的または研究目的のために事象１７３１４を含む種子および／または植物器官を生成する目的で植物を生育しつつ、圃場における雑草を防除し、植物生育または研究目的のため事象１７３１４を含む後代を選択し、次いで、事象１７３１４を含む後代植物および種子を生成するのに有用である。
【００７０】
本発明の植物、後代、種子、植物細胞、植物器官（例えば、花粉、胚珠、鞘、花、根または茎組織、および葉）および商品は、ＤＮＡ組成物、遺伝子発現および／またはタンパク質発現につき評価し得る。かかる評価は、ＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット、ウエスタンブロット、免疫沈降法およびＥＬＩＳＡのごとき標準的方法、あるいは本明細書において提供された検出方法および／または検出キットを用いることにより行い得る。
【００７１】
試料中の事象１７３１４に特異的な物質の存在の検出方法が提供される。１つの方法は、事象１７３１４を含むイネの細胞、組織または植物に特異的でかつそれらに由来するＤＮＡの存在の検出よりなる。方法は、熱増幅に適切な条件に付される際に事象１７３１４ＤＮＡからアンプリコン、特に、配列番号：１もしくは配列番号：２のいずれかの少なくとも１５の隣接ヌクレオチドまたはその相補体を含むアンプリコンを生成できるプライマー対と接触するテンプレートＤＮＡ試料を提供する。テンプレートＤＮＡ分子が配列番号：１および配列番号：２に記載された特有でユニークなヌクレオチド配列を組み込む限りは、アンプリコンは、事象１７３１４に由来したテンプレートＤＮＡ分子から生成される。アンプリコンは、アンプリコンの生成における使用につき選択されたポリメラーゼに依存して、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。方法は、いずれかのかかる熱増幅反応において生成されたアンプリコン分子の検出、およびアンプリコン配列内で配列番号：１もしくは配列番号：２に対応するヌクレオチドまたはその相補体の存在を確認することを提供する。アンプリコンにおける配列番号：１もしくは配列番号：２に対応するヌクレオチドまたはその相補体の検出は、事象１７３１４に特異的なＤＮＡ、かくして試料中に事象１７３１４を含む生物学的物質の存在につき決定的および／または特徴的である。
【００７２】
もう一つの方法は、イネ植物またはイネ植物組織に由来した物質よりなる試料中で配列番号：３および配列番号：４に対応するＤＮＡ分子の存在を検出するために提供される。その方法は、（ｉ）イネ植物からまたは異なるイネ植物の群からのＤＮＡ試料を抽出し、（ｉｉ）ＤＮＡ試料と、配列番号：１または配列番号：２のいずれかに記載された少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを示すＤＮＡプローブ分子とを接触させ、（ｉｉｉ）プローブおよびＤＮＡ試料が、ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを可能にし、次いで、（ｉｖ）プローブおよび標的ＤＮＡ試料間のハイブリダイゼーション事象を検出することよりなる。ハイブリッド組成物の検出は、ＤＮＡ試料中で場合によっては、配列番号：３または配列番号：４の存在に特徴的である。ハイブリダイゼーションの不存在は、別法として試料中の遺伝子組換え事象の不存在に特徴的である。あるいは、特定のイネ植物が、配列番号：１もしくは配列番号：２に対応する配列のいずれかまたは双方、あるいはその相補体を含むことを決定することは、イネ植物が事象１７３１４に対応する少なくとも１つの対立遺伝子を含むことに決定的である。
【００７３】
かくして、核酸プローブを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＤＮＡハイブリダイゼーションのごときいずれかのよく知られた核酸検出方法により、本発明の核酸分子の存在を検出することは可能である。事象に特異的なＰＣＲアッセイは、例えば、Taverniersら (J. Agric. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005)により言及され、遺伝子組換えトウモロコシ系Ｂｔ１１、Ｂｔ１７６およびＧＡ２１、およびキャノーラ事象ＲＴ７３についての事象に特異的な追跡システムが示されている。この研究において、事象に特異的なプライマーおよびプローブは、各事象についてのゲノム／導入遺伝子結合の配列に基づいて設計された。また、遺伝子組換え植物事象に特異的なＤＮＡ検出方法は、米国特許第６，８９３，８２６号；第６，８２５，４００号；第６，７４０，４８８号；第６，７３３，９７４号；第６，６８９，８８０号；第６，９００，０１４号および第６，８１８，８０７号に記載されている。
【００７４】
ＤＮＡ検出キットが提供される。１つのタイプのキットは、試料中の遺伝子組換えイネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出するのに特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する配列番号：３、配列番号：５または配列番号：６に同様または相補的な隣接ヌクレオチドの十分な長さの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。キットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号：１に記載の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドまたはその相補体を含む。別法として、キットは、生物学的試料中の遺伝子組換えイネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出するのに特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するための配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に同様または相補的な隣接ヌクレオチドの十分な長さの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含み得る。キットで検出されるＤＮＡ分子は、配列番号：２に記載の少なくとも１５の隣接ヌクレオチド、またはその相補体を含む。
【００７５】
代替キットは、標的ＤＮＡ試料が前記のごときプライマー対と接触し、次いで、配列番号：２の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドまたはその相補体を含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を行う方法を使用する。アンプリコンの検出、およびそのアンプリコンの配列内の配列番号：１または配列番号：２の１５以上の隣接ヌクレオチドまたはその相補体の存在の決定は、標的ＤＮＡ試料中の事象１７３１４に特異的なＤＮＡの存在に決定的であるか、別法として、その存在に特徴的である。
【００７６】
試料中の事象１７３１４ＤＮＡに特有でユニークであるＤＮＡの存在または不存在さえを決定、検出または分析するのに有用であるＤＮＡプローブとして用いるのに十分なＤＮＡ分子が、提供される。ＤＮＡ分子は、配列番号：１の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドもしくはその相補体、または配列番号：２の少なくとも１５の隣接ヌクレオチドもしくはその相補体を含む。
【００７７】
核酸増幅は、熱増幅方法を含めた当該技術分野において知られた種々の核酸増幅方法のいずれによっても達成できる。イネ事象１７３１４からの異種のＤＮＡ挿入物の配列、結合配列またはフランキング配列（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−９８４４として寄託された事象１７３１４を含む代表的な種子試料を含む）は、本明細書に提供された配列に由来するプライマーを用いて、その事象からのかかる配列を増幅し、次いで、アンプリコンまたはクローン化されたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定によって確認（必要ならば修正）できる。
【００７８】
これらの方法によって生成されたアンプリコンは、複数の技術によって検出し得る。隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列および挿入されたＤＮＡ配列の双方をオーバーラップさせるＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される場合、かかる１つの方法は、遺伝ビット分析（Genetic Bit Analysis）(Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェル中で固定化される。（挿入配列中の１つのプライマーおよび隣接するフランキングゲノム配列中の１つのプライマーを用いて）注目する領域の熱増幅後に、１本鎖のアンプリコン（熱増幅生成物）を固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、期待された次の塩基に特異的なＤＮＡポリメラーゼおよび標識されたｄｄＮＴＰｓを用いて、一塩基伸長反応用のテンプレートとして機能させることができる。読取りは、蛍光性またはＥＬＩＳＡベースであり得る。蛍光性または他のシグナルの検出は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００７９】
もう一つの方法は、Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)によって記載されたピロシーケンス（Pyrosequencing）技術である。この方法において、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。そのオリゴヌクレオチドは、注目する領域からの１本鎖の熱増幅生成物にハイブリダイズされ（挿入された配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列の１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルファートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ｄｄＮＴＰは個々に加えられ、その組み込みの結果、光シグナルが測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一または多重の塩基伸長により導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８０】
Chenら(Genome Res. 9:492-498, 1999)によって記載された蛍光偏光法は、アンプリコンを検出するために用いることができる方法である。この方法を用いて、ゲノムのフランキングおよび挿入されたＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドは注目する領域からの一本鎖の増幅生成物にハイブリダイズされ（挿入ＤＮＡにおける１つのプライマーおよびフランキングゲノムＤＮＡ配列における１つのプライマー）、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの組み込みを生じる。組み込みは、蛍光測定器を用いて偏光の変化として測定できる。偏光の変化は、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長による導入遺伝子挿入物／フランキング配列の存在を示す。
【００８１】
また、TAQMAN（商標登録）(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、製造者により提供された指示を用いてＤＮＡ配列の存在を検出および／または定量し得る。略言すると、ゲノムフランキングおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性部分がＦＲＥＴプローブ上の消光部分から離れて切断および遊離する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによりフランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。
【００８２】
分子標識（Molecular Beacon）は、Tyangiら (Nature Biotech.14:303-308, 1996)に記載された配列検出に用いるために記載されている。略言すると、フランキングゲノムおよび挿入物ＤＮＡ結合部をオーバーラップさせるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブのユニークな構造の結果、それは蛍光性および消光部分を密接な近接に保つ二次構造を含む。ＦＲＥＴプローブおよび増幅プライマー（挿入物ＤＮＡ配列における１つのプライマーおよびフランキングゲノム配列における１つのプライマー）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環する。増幅の成功に続いて、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションの結果、蛍光性および消光部分のプローブ二次構造および空間的分離を除去し、蛍光シグナルを生成する。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションにより、フランキング／導入遺伝子挿入物配列の存在を示す。ＤＮＡ試料を分離および増幅する方法およびデバイスを提供するマイクロフルイディクス（例えば、米国特許公開第２００６０６８３９８号、米国特許第６，５４４，７３４号参照）；特異的なＤＮＡ分子を検出および定量するための光学色素（例えば、ＷＯ／０５０１７１８１参照）；ＤＮＡ分子の検出用の電子センサーを含む検出のためのナノチューブデバイス（例えば、ＷＯ／０６０２４０２３参照）；および／または、次いで検出され得る特定のＤＮＡ分子を結合するナノビーズのごとき当該技術分野に知られた他の方法を本発明の方法を実施するために用い得る。
【００８３】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示された組成物、およびＤＮＡ検出の当該技術分野においてよく知られた方法を用いて開発できる。キットは、試料中の事象１７３１４の同定に有用であり、適切な事象ＤＮＡを含むイネ植物を育種する方法に適用できる。キットは、配列番号：１〜６もしくはその断片に同様または相補的であるＤＮＡプライマーまたはプローブを含み得る。従って、本発明のキットおよび検出方法は、特に、イネ事象１７３１４を同定する、事象１７３１４を含む植物品種または雑種を選択する、試料中のイネ事象１７３１４に由来したＤＮＡの存在を検出する、およびイネ事象１７３１４または事象１７３１４を含む植物、植物器官または商品の存在および／または不存在について試料をモニタリングするのに有用である。
【００８４】
以下の実施例は、本発明のある種の好ましい具体例の例を示すために含める。以下の実施例において開示された技術が、本発明者が本発明の実施に良好な機能を見出したアプローチを表し、かくして、その実施についての好ましい様式の例を含むと考えることができることは、当業者により理解されるであろう。しかしながら、本開示に徴して、当業者ならば、多数の変更を開示された特定の具体例になすことができ、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似する結果を得ることができることを理解するであろう。
【実施例】
【００８５】
実施例１：イネの形質転換および事象選択
この実施例は、遺伝子組換えイネ事象をどのように創製するか、および事象１７３１４をどのように選択するかを記載する。遺伝子組換えグリホサート耐性の事象１７３１４は、図１に示すごときその配列が配列番号：５に記載される導入遺伝子ＤＮＡ断片でのイネ細胞の粒子銃媒介形質転換によって生成した。導入遺伝子ＤＮＡ断片は、アグロバクテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ノパリンシンターゼ遺伝子に由来した３’転写末端領域ＤＮＡ分子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ）に作動可能に結合した、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ（ＡＧＲｔｕ．ＥＰＳＰＳ：ＣＰ４）をコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結した、葉緑体通過ペプチド（ＣＴＰ２、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結した、イネアクチン１遺伝子から由来するイントロン分子（Ｉ−Ｏｓ．Ａｃｔ１）に作動可能に連結した、複製エンハンサーを含むカリフラワーモザイクウイルスに由来したプロモーター（Ｐ−ＣａＭＶ．ｅ３５Ｓ）分子を含む発現カセットを含む。
【００８６】
まず、イネ品種Ｍ−２０２からの外植片を粒子銃方法を用いて、４つの発現カセットの１つで最初に形質転換した。次いで、形質転換細胞をグリホサートを含む培地で選択して、生存細胞を植物に再生した。形質転換プロセスは、９２８のＲ０植物を生成し、各Ｒ０植物は、別々の個々の事象であった。これらの９２８事象をＰＣＲおよびサザン分析によってＲ０段階にてスクリーニングして、多重コピー事象および／または分子複合事象を除去した。ＰＣＲ分析について、最初に、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを抽出されたＤＮＡで用いた。ＰＣＲスクリーニングに基づいて、５６５のＲ０事象を選択した。次いで、これらの５６５のＲ０事象をサザン分析によってスクリーニングした。サザン分析について、ＤＮＡをイネ組織から抽出し、ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩまたはＳｓｐＩで消化し、サザンブロットハイブリダイゼーション分析技術およびＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＥＰＳＰＳコード配列に相補的な放射性のＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズした。これらのデータを用いて、イネゲノムに挿入された導入遺伝子カセットのコピー数を決定し、単一の挿入を有する２４０のＲ０事象を選択した。
【００８７】
次いで、２４０の選択事象を、異型植物を同定するために表現型および稔性分析用グロースチャンバーに進めた。グロースチャンバー表現型および稔性スクリーニングから、１７０の事象を前進のために選択した。次いで、これらの１７０のＲ１事象をグロースチャンバー中でグリホサート耐性につきスクリーニングした。また、これらの植物は、無傷の導入遺伝子挿入につき２次的サザン分析によって分析した。これらの分析から収集したデータを用いて、１９の事象を前進のために選択した。引き続いて、これらの事象の１３についてのＲ２植物を圃場試験に進めた。複数特性についての圃場試験データを１栽培期を超えて１３の各事象についての植物につき収集し、また、５つの事象につき２栽培期で収集した。第１年の圃場試験において、１３の事象を、複数複製の圃場試験設計において最小３つの位置でのグリホサート耐性および農学的同等物につき試験した。結果を表１に示す。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
次いで、これらのデータを用いて、第２年圃場試験に進める５つのリード事象を選択した。これらの第２年圃場試験において、５つのリード事象を６つの位置の複合の複数圃場試験設計においてグリホサートおよび農学的同等物に対する耐性につき試験した。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
２シーズンの効力試験において、植物を、典型的な商業的な割合の２倍であるエーカー当たり３ポンド酸当量（ポンドａｅ／ａｃ）量のグリホサート、または典型的な商業的な割合の３倍である４．５ポンドａｅ／ａｃ）量のグリホサートで成長の４〜６葉期にて処理した。生長グリホサート耐性は生長損傷として測定した。また、再生グリホサート耐性は収率およびパーセント（％）稔性として測定した。これらの試験からのデータを用いて、事象１７３１４を選択した。事象１７３１４は、３ポンドａｅ／ａｃまたは４．５ポンドａｅ／ａｃのいずれでも生長損傷も、コメ粒のトン／エーカー（Ｔ／ａｃ）として測定したグリホサート処理後の収率損失も示さなかった。
【００９２】
実施例２：挿入ＤＮＡに隣接するイネ染色体配列の単離
すべてのＰＣＲ反応用のイネゲノムＤＮＡを迅速な高ｐＨ／高塩溶解プロトコールを用いて単離した。このプロトコールでは、約０．１ｇの凍結乾燥した地表葉組織を、６００μｌ（マイクロリットル）の溶解緩衝剤（１００ｍＭトリス、  １Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）と撹拌することにより混合し、続いて、摂氏６５度にて４５〜６０分間インキュベートした。次に、チューブを再び撹拌し、２００μｌの沈澱反応緩衝剤（５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ７．０）を添加し、再び撹拌して、遠心分離した。ＤＮＡ溶液の６００μｌアリコートをきれいなチューブに移し、５００μｌの氷冷イソプロパノールを添加して、ＤＮＡを沈殿させた。遠心分離後、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、空気乾燥して、このＤＮＡを２５０μｌの水に再懸濁した。
【００９３】
Liuら(Plant Journal 8: 457-463, 1995)に記載されたＴＡＩＬ−ＰＣＲプロトコールを実質的に用いて、導入遺伝子挿入に隣接するイネゲノムＤＮＡの伸長をその１７３１４事象につき得た。フランキングゲノムＤＮＡを同定するために、２組の２つのネステッドゲノム−ウオーキングプライマーを、フランキング結合部付近に設計した。一方の組を組込み発現カセットの５’末端から退場するように設計し、他方は組込み発現カセットの３’末端から退場するように設計した。
【００９４】
５’ＴＡＩＬ−ＰＣＲ用プライマーは、第１ラウンド用のプライマーＳＱ１８７１（配列番号：１２）および第２ラウンド用のプライマーＳＱ１８６９（配列番号：１３）である。３’ＴＡＩＬ−ＰＣＲ用プライマーは、第１ラウンド用のプライマーＳＱ１８７５（配列番号：１０）および第２ラウンド用のプライマーＳＱ１８８０（配列番号：１４）である。
【００９５】
各フランキング領域の同定について、２つのネステッドプライマーをLiuら(Plant Journal 8: 457-463, 1995)に記載された、短い任意の縮重（ＡＤ）プライマーでの連続ＰＣＲ反応に用いた。５’および３’フランキング配列の双方のためのＰＣＲの第１のラウンドでは、それぞれのＰＣＲ反応を表３に詳述したように設定した。これらの反応をデフォルトランプ速度設定で、表４に記載した循環パラメーターを持つＭＪエンジン・サーモサイクラー中で行った。
【００９６】
【表３】
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【００９７】
【表４】
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【００９８】
表５に詳述のごとく、ＴＡＩＬ−ＰＣＲの第１ラウンドのアリコートをＴＡＩＬ−ＰＣＲの第２ラウンドに用いた。これらの反応は、デフォルトランプ速度設定で表６に記載した循環パラメーターでＭＪエンジン・サーモサイクラー中で行った。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
【表６】
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【０１０１】
ＴＡＩＬ−ＰＣＲアンプリコンを視覚化するために、第２ラウンドのアリコートを２．０％アガロースゲル上で試行し、エチジウムブロマイドで染色した。加えて、ＴＡＩＬ−ＰＣＲの第２ラウンドのアリコートをモンサントゲノム配列決定センターに提出して、配列決定した。配列分析は、モンサント所有のフランキング配列適用配列分析ソフトウェアで行った。ＰＣＲプライマーは、第２ラウンドのＴＡＩＬ−ＰＣＲ反応の配列決定結果において観察されたゲノムフランキング配列を確認するように設計した。事象１７３１４について、５’ゲノムフランキング配列は、プライマー対ＳＱ３６２９（配列番号：１５）およびＳＱ１８６９（配列番号：１３）でのＰＣＲ反応によって確認した。事象１７３１４について、３’ゲノムフランキング配列は、プライマー対ＳＱ３６２７（配列番号：１６）およびＳＱ１８７５（配列番号：１０）でのＰＣＲ反応によって確認した。
【０１０２】
実施例３：事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ
この実施例は、試料中の事象１７３１４を同定するために開発した事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）の熱増幅方法を記載する。この方法で有用な条件の例を表７および表８に記載する。方法に有用なＤＮＡ分子は、例えば、プライマーＳＱ４１８３（配列番号：７）、ＳＱ４１９１（配列番号：８）および６ＦＡＭ（商標）標識オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１４９１（配列番号：９）である。他のプローブおよびプライマーは、本明細書に提供された導入遺伝子挿入物の配列および／またはフランキング配列に基づいて設計し得る。ＰＢ１４９１（配列番号：９）とのこれらの反応方法に用いる場合のＳＱ４１８３（配列番号：７）およびＳＱ４１９１（配列番号：８）は、事象１７３１４ＤＮＡに特徴的であるＤＮＡアンプリコンを生成する。この分析のための対照は、事象１７３１４ＤＮＡを含むイネからの陽性対照、非遺伝子組換えイネからの陰性対照およびテンプレートＤＮＡを含まない陰性対照を含む。
【０１０３】
これらのアッセイは、Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 もしくは Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700、またはEppendorf Mastercycler Gradient サーモサイクラーでの使用のために最適化する。他の方法および装置は、生物学的試料中の事象１７３１４ＤＮＡの同定用のアンプリコンを生成するのに有用であろうことが当業者に知られている。試料を分析する場合、表７および表８に記載された循環パラメーターを使用し得る。Eppendorf Mastercycler GradientまたはMJ Engineにおいて熱増幅を行う場合、そのサーモサイクラーは計算モードで試行されるであろう。Perkin-Elmer 9700において熱増幅を行う場合、そのサーモサイクラーは最大でのランプ速度で設定されるであろう。
【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
実施例４：生育活動中の事象１７３１４の同定。
この実施例は、事象１７３１４を含むイネを用いて、いずれかの生育活動の後代内の事象１７３１４をどのように同定し得るかを記載する。ＤＮＡ事象プライマー対を用いて、事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成する。事象１７３１４に特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの結合配列を含み、それは、本明細書において、配列番号：１または配列番号：２として供される（図１に示された、各々、［Ａ］および［Ｂ］）。配列番号：１（図１の［Ａ］）は、導入遺伝子挿入物の５’末端とのフランキング配列の結合部に対応するヌクレオチド配列である（配列番号：３の２８３〜３０２：図１参照）。配列番号：２（［Ｂ］、図１参照）は、導入遺伝子挿入物の３’末端とのフランキング配列の結合部に対応するヌクレオチド配列である（配列番号：４［Ｄ］の第６６６〜６８５位：図１参照）。
【０１０７】
事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成する事象プライマー対は、フランキング配列（配列番号：３および４）および挿入された遺伝子組換えＤＮＡ配列（配列番号：５）を用いて設計したプライマー対を含む。配列番号：１の少なくとも１１ヌクレオチドを見出す特徴的なアンプリコンを獲得するために、配列番号：３の第１〜２９２塩基に基づいた順方向プライマー分子および挿入された発現カセットＤＮＡ配列、配列番号：５の第１〜３，１１４位に基づいた逆方向プライマー分子を設計し、ここに、それらのプライマー分子は、配列番号：３および配列番号：５に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの隣接ヌクレオチドのものである。配列番号：２の少なくとも１１ヌクレオチドを見出す特徴的なアンプリコンを獲得するために、挿入された発現カセット、配列番号：５の第１〜３，１１４位に基づいた順方向プライマー分子、および３’フランキング配列、配列番号：４の第１〜６７５塩基に基づいた逆方向プライマー分子を設計し、ここに、それらのプライマー分子は、配列番号：４および配列番号：５に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの隣接ヌクレオチドのものである。実際的な目的のために、限られたサイズ範囲、例えば、１００〜１０００の塩基間のアンプリコンを生成するプライマーを設計するであろう。より小さな（より短いポリヌクレオチド長）のサイズのアンプリコンは、一般的にＰＣＲ反応においてより確実に生成され、短いサイクル時間を可能とでき、容易にアガロースゲル上で分離および視覚化されるか、またはエンドポントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）様アッセイにおける使用に適する。より小さなアンプリコンはＤＮＡアンプリコン検出の当該技術分野において知られた方法によって生成および検出できる。加えて、プライマー対を用いて生成したアンプリコンはベクターにクローン化でき、増殖、単離および配列決定できるか、または当該技術分野においてよく確立された方法を用いて直接的に配列決定できる。事象１７３１４またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：３もしくは配列番号：５の組合せまたは配列番号：４および配列番号：５の組合せに由来したいずれのプライマー対も、本発明の態様である。事象１７３１４を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：３の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドまたはその相補体を含む、いずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。事象１７３１４を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：４の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドまたはその相補体を含む、いずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。事象１７３１４を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅方法に有用である配列番号：５の少なくとも１１の隣接ヌクレオチドまたはその相補体を含む、いずれの単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子も、本発明の態様である。
【０１０８】
この分析のための増幅条件の一例を表７および表８に例示する。しかしながら、これらの方法、あるいは配列番号：３もしくは配列番号：４に相同的または相補的であるＤＮＡプライマーまたは事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成する事象１７３１４の導入遺伝子挿入物（配列番号：５）のＤＮＡ配列の使用の変更は、本開示の範囲内にある。特徴的なアンプリコンは、少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノム結合部ＤＮＡ（配列番号：１または配列番号：２）、またはその実質的な部分に相同的または相補的なＤＮＡ分子を含む。
【０１０９】
試料中の事象１７３１４の分析は、事象１７３１４からの陽性対照、事象１７３１４ではないイネ植物からの陰性対照（例えば、限定されるものではないが、Ｍ−２０２）および／またはイネゲノムＤＮＡを含まない陰性対照を含み得る。内因性イネＤＮＡ分子を増幅するプライマー対は、ＤＮＡ増幅条件についての内部標準として機能し得る。配列番号：３，配列番号：４または配列番号：５に記載された配列から選択された配列のいずれの断片も、表７および表８に示した方法によりアンプリコンの生成のためのＤＮＡ増幅プライマーとして用いることもでき、かかるアンプリコンは、事象１７３１４をかかる特徴的な増幅反応用のテンプレートとして用いる場合に、事象１７３１４に特徴的であり得る。表７および表８の方法に対する変更を含むこれらのＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲内にある。事象１７３１４に特徴的である配列番号：３，配列番号：４および配列番号：５から由来した少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列により生成されたアンプリコンは、本発明の態様である。
【０１１０】
かくして、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：５に由来した十分な長さの隣接ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含み、ＤＮＡ増幅方法に用いる場合に事象１７３１４を含む植物またはその後代に特徴的なアンプリコンを生成するであろうＤＮＡ検出キットを設計でき、これは本発明の態様である。ＤＮＡ増幅方法において試験された場合に事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成するイネ植物器官もしくは種子または商品は、本発明の態様である。事象１７３１４アンプリコンについてのアッセイは、Applied Biosystems GeneAmp（登録商標）PCR System 9700 もしくはStratagene RoboCycler（登録商標）またはMJ Engine、または Perkin-Elmer 9700, または Eppendorf Mastercycler（登録商標） Gradient tサーモサイクラー、または表８に示した事象１７３１４に特徴的なアンプリコンを生成するのに用いることができるいずれかの他の増幅システムを用いることにより行うことができる。
【０１１１】
前記に開示し、特許請求の範囲に引用したイネ事象１７３１４を含む種子の代表的試料の寄託は、郵便番号2011、10801 University Boulevard, Manassas, VAの米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）にブタペスト条約下でなされた。寄託日は２００９年２月１８日であった。この寄託についてのＡＴＣＣ受入番号はＰＴＡ−９８４４である。寄託は、３０年の期間、または最後の請求の５年後、あるいは特許有効期間のいずれか長く貯蔵施設において維持され、その期間中に必要ならば交換されるであろう。
【０１１２】
本発明の原理を例示および記載すると、本発明は、かかる原理から逸脱することなく、配置および詳細に変更できることは、当業者には明らかであろう。発明者らは、添付した特許請求の範囲の精神および範囲内にあるすべての変更を特許請求する。
【図１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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