(57)【要約】【課題】本発明は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子発現を不活性化するための方法および組成物を提供することを目的とする。【解決手段】亜鉛フィンガータンパク質および切断ドメインまたは切断半ドメインを含む融合タンパク質を用いてＦＵＴ８遺伝子を不活性化するための方法および組成物が、本明細書中で開示される。前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも、前記ポリヌクレオチドおよび融合タンパク質を含む細胞と同様に、提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインであって、前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端にＦ１〜Ｆ４の順に並べられる４つの亜鉛フィンガー認識領域を含み、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４が以下のアミノ酸配列：
Ｆ１：ＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号９）；
Ｆ２：ＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号１０）；
Ｆ３：ＲＳＤＤＬＳＫ（配列番号１１）；および
Ｆ４：ＤＲＳＡＬＡＲ（配列番号１２）
を含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援による研究における特許権に関する規定
適用可能な引照なし。
【０００２】
本開示は、ゲノム工学処理、細胞培養およびタンパク質産生の分野である。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体療法は、医療において重要な且つ発展中の治療法である（Glennie et al. (2000) Immunol Today 21: 403-10）。２０を超えるＦＤＡ承認モノクローナル抗体療法が存在し、多くが現在臨床試験中である。可溶性因子（例えば、血管内皮細胞増殖因子または腫瘍壊死因子）に対して行われる抗体療法は、免疫複合体形成により遊離リガンド濃度を単に低減することをねらいとする。それとは対照的に、抗体療法が細胞表面抗原に対して行われる場合（多くの場合、抗新生物免疫療法における場合と同様に）、その目標は多くの場合、細胞それ自体の除去である。治療用抗体は、アポトーシスを直接誘導し得る（Shan et al. (1998) Blood 91: 1644-52；Shan (2000) Cancer Immunol Immunother 48: 673-83）が、しかし、さらに頻繁に、それは、標的細胞を破壊するために患者の免疫系を動員しなければならない（Reff et al. (1994) Blood 83: 435-45；Idusogie et al. (2000) J Immunol 164: 4178-84；Golay et al. (2000) Blood 95: 3900-8；Harjunpaa et al. (2000) Scand J Immunol 51: 634-41；Anderson et al. (1997) Biochem Soc Trans 25, 705-8；Clynes et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 652-6；Clynes et al. (2000) Nat Med 6: 443-6；Sampson et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 7503-8参照）。
【０００４】
攻撃している細胞を抗体活性化免疫系が破壊し得る、２つの主なメカニズムが存在する：補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）と抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）である。ＡＤＣＣは、抗体被覆標的に対してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により主に生成される免疫応答である（Lewis et al. (1993) Cancer Immunol Immunother 37: 255-63参照）。ＡＤＣＣでは、ＮＫ細胞は、主にＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体との相互作用により、抗体の定常（Ｆｃ）領域を認識する。ＮＫ細胞は次に、標的細胞表面上にパーフォリンおよびグランザイムを沈着させて、それぞれ細胞溶解およびアポトーシスを誘導する。Ｆｃ−ＦｃγＲＩＩＩ相互作用は、Ｆｃグリコシル化に対して極端に感受性である。非グリコシル化免疫グロブリンは、Ｆｃ受容体を結合できない（Leatherbarrow et al. (1985) Mol Immunol 22: 407-15 (1985)；Walker et al. (1989) Biochem J 259: 347-53 (1989)；Leader et al. (1991) Immunology 72: 481-5参照）。さらに、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合される炭水化物鎖のフコシル化は、ＦｃγＲＩＩＩとの結合を阻害し、試験管内でＡＤＣＣ活性を低減する（Shields et al. (2002) J Biol Chem 277: 26733-40；Shinkawa et al. (2003) J Biol Chem 278: 3466-73；Niwa et al. (2004) Cancer Res 64: 2127-33参照）。
【０００５】
大多数の哺乳類免疫グロブリン、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞により産生されるもの（ＣＨＯ細胞、モンゴルキヌゲネズミ（Cricetulus griseus））は、フコシル化される（Jefferis et al. (1990) Biochem J 268: 529-37；Hamako et al. (1993) Comp Biochem Physiol B 106: 949-54；Raju et al. (2000) Glycobiology 10: 477-86）。Ｆｃコア領域とのフコース結合は、外見上は哺乳類細胞中の単独のα−１，６フコシルトランスフェラーゼであるα１，６フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）タンパク質により生成されるα−１，６結合を介してである（Oriol et al. (1999) Glycobiology 9: 323-34；Costache et al. (1997) J Biol Chem 272: 29721-8）。ＣＨＯ細胞中のＦＵＴ８遺伝子の破壊は、抗体のコアフコシル化を排除し、ＡＤＣＣを約１００倍増大した（Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22参照）。しかしながら、相同組換えによるこのような慣用的遺伝子破壊は、典型的には、多くの時間と労力を要する工程である。これは、約１２０，０００クローン細胞株がスクリーニングされて、３つの健常ＦＵＴ８−／−クローンを発見したので、チャイニーズハムスターＦＵＴ８の場合に特に該当した（Yamane-Ohnuki et al. (2004)、上記）。
【０００６】
したがって、Ｆｕｔ８発現が部分的にまたは完全に不活性化される細胞株に対する必要性が依然として存在する。ゲノム遺伝子座の部位特異的切断は、慣用的相同組換えに効率的補足物および／または代替物を提供する。二本鎖切断（ＤＳＢ）の作製は、標的化遺伝子座での相同組換えの頻度を１０００倍以上増大する。さらに分かり易く言えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による部位特異的ＤＳＢの不正確な修復も、遺伝子破壊を生じ得る。２つのこのようなＤＳＢの作製は、随意に大きい領域の欠失を生じ得る。亜鉛フィンガータンパク質のモジュール方式のＤＮＡ認識の選択は、部位特異的多フィンガーＤＮＡ結合タンパク質の合理的設計を可能にする。ＩＩ型認識酵素ＦｏｋＩからのヌクレアーゼドメインと部位特異的亜鉛フィンガータンパク質との融合は、部位特異的ヌクレアーゼの作製を可能にする（例えば、米国特許公開２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５００２６１５７；２００５００６４４７４；２００６０１８８９８７；２００６００６３２３１；ならびに国際公開ＷＯ０７／０１４２７５（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＦＵＴ８遺伝子の部分的または完全不活性化のための組成物が、本明細書中で開示される。例えば細胞中のＦＵＴ８を不活性化して、ＦＵＴ８遺伝子が不活性化される細胞株を産生するために、これらの組成物（試薬）を製造し、使用する方法も、本明細書中で開示される。Ｆｕｔ８発現が低減される細胞中で産生される抗体はＡＤＣＣ機能増強を示すため、ＦＵＴ８破壊細胞株は、例えば、α１−アンチトリプシンおよびモノクローナル抗体のような組換えタンパク質の産生において有用である。
【０００８】
一態様では、ＦＵＴ８遺伝子において結合されるよう工学処理される亜鉛フィンガータンパク質が提供される。本明細書中に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれかは、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の亜鉛フィンガーを含み、各亜鉛フィンガーはＦＵＴ８遺伝子中の標的亜部位と結合する認識ヘリックスを有し得る。ある実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質は、４、５または６つのフィンガーを含み（この場合、個々の亜鉛フィンガーは、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６と呼ばれる）、表１に示された認識ヘリックスのアミノ酸配列を含む。
【０００９】
ある実施形態では、工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインであって、上記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端にＦ１〜Ｆ４の順に並べられる４つの亜鉛フィンガー認識領域を含み、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４が以下のアミノ酸配列：Ｆ１：ＱＳＳＤＬＳＲ（配列番号９）；Ｆ２：ＴＳＧＮＬＴＲ（配列番号１０）；Ｆ３：ＲＳＤＤＬＳＫ（配列番号１１）；およびＦ４：ＤＲＳＡＬＡＲ（配列番号１２）を含む工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインが、本明細書中で提供される。
これらの実施形態のいずれかにおいて、Ｆ３はＲＳＤＮＬＳＴ（配列番号２０）またはＲＳＤＨＬＳＱ（配列番号２４）を含み得る。
【００１０】
他の実施形態では、本開示は、工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインであって、上記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端にＦ１〜Ｆ４の順に並べられる４つの亜鉛フィンガー認識領域を含み、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４が以下のアミノ酸配列：Ｆ１：ＲＳＤＶＬＳＡ（配列番号１４）；Ｆ２：ＱＮＡＴＲＩＮ（配列番号１５）；Ｆ３：ＤＲＳＮＬＳＲ（配列番号１６）；およびＦ４：ＲＬＤＮＲＴＡ（配列番号１７）を含む工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインを提供する。
【００１１】
他の実施形態では、本開示は、工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインであって、上記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端にＦ１〜Ｆ６の順に並べられる６つの亜鉛フィンガー認識領域を含み、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６が以下のアミノ酸配列：Ｆ１：ＲＳＤＮＬＳＶ（配列番号１９）；Ｆ２：ＱＮＡＴＲＩＮ（配列番号１５）；Ｆ４：ＱＳＡＴＲＴＫ（配列番号２１）；Ｆ５：ＲＳＤＮＬＳＲ（配列番号２２）；およびＦ６：ＲＮＤＮＲＫＴ（配列番号２３）を含む工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインを提供する。
【００１２】
他の実施形態では、本開示は、工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインであって、上記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｎ末端からＣ末端にＦ１〜Ｆ５の順に並べられる５つの亜鉛フィンガー認識領域を含み、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５が以下のアミノ酸配列：Ｆ１：ＲＳＤＮＬＲＥ（配列番号２６）；Ｆ２：ＮＮＴＱＬＩＥ（配列番号２７）；Ｆ３：ＴＳＳＩＬＳＲ（配列番号２８）；Ｆ４：ＲＳＤＮＬＳＡ（配列番号２９）；およびＦ５：ＲＫＤＴＲＩＴ（配列番号３０）を含む工学処理亜鉛フィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインを提供する。
【００１３】
別の態様では、本明細書中に記載される亜鉛フィンガータンパク質のいずれか、および少なくとも１つの切断ドメインまたは少なくとも１つの切断半ドメインを含む融合タンパク質も提供される。ある実施形態では、切断半ドメインは野生型ＦｏｋＩ切断半ドメインである。他の実施形態では、切断半ドメインは工学処理ＦｏｋＩ切断半ドメインである。
【００１４】
さらに別の態様では、本明細書中に記載されるタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
さらに別の態様では、本明細書中に記載されるようなタンパク質および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む単離細胞が提供される。ある実施形態では、Ｆｕｔ８は、細胞中で（部分的にまたは完全に）不活性化される。本明細書中に記載される細胞のいずれかは、例えば、選択された遺伝子中の標的部位に結合するよう意図された亜鉛フィンガーヌクレアーゼを用いて、不活性化された付加的遺伝子を含み得る。ある実施形態では、ＦＵＴ８、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）が不活性化された細胞または細胞株が、本明細書中で提供される。
【００１６】
さらに、細胞または細胞株中でのＦＵＴ８の不活性化方法における亜鉛フィンガータンパク質およびその融合物の使用方法が提供される。ある実施形態では、ＦＵＴ８遺伝子の不活性化は、高レベルで組換えタンパク質を産生し得る細胞株、あるいはＦＵＴ８遺伝子が不活性化されない細胞中で産生されるタンパク質と比較して当該タンパク質の１つ以上の活性（機能）が増大される細胞株を生じる。例えば、不活性化ＦＵＴ８遺伝子を有する本明細書中に記載されるような細胞株を用いて、免疫療法のためのＡＤＣＣ機能増強を示すモノクローナル抗体を産生し得る。本明細書中に記載されるような細胞株は、組換えα１−アンチトリプシンを産生するためにも用いられ得る。
【００１７】
したがって、別の態様では、細胞中の細胞性ＦＵＴ８遺伝子を不活性化する方法であって、以下：（ａ）第一ポリペプチドをコードする第一核酸を細胞中に導入するステップであって、前記第一ポリペプチドが以下の：（ｉ）内因性ＦＵＴ８遺伝子中の第一標的部位と結合するよう工学処理される亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）切断ドメインを含み；したがって上記ポリペプチドが細胞中で発現され、それにより上記ポリペプチドが上記標的部位と結合して、ＦＵＴ８遺伝子を切断するステップを包含する方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、当該方法は、第二ポリペプチドをコードする核酸を導入することをさらに包含し、この場合、上記第二ポリペプチドが以下の：（ｉ）上記ＦＵＴ８遺伝子中の第二標的部位と結合するよう工学処理される亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）切断ドメインを含み；したがって上記第二ポリペプチドが細胞中で発現され、それにより上記第一及び第二ポリペプチドがそれらのそれぞれの標的部位と結合して、ＦＵＴ８遺伝子を切断するステップを包含する。第一および第二ポリペプチドは、上記第一核酸により、または異なる核酸によりコードされ得る。ある実施形態では、１つ以上の付加的ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、例えば、付加的亜鉛フィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドが、細胞中に導入される。
【００１８】
さらに別の態様では、本開示は、宿主細胞における当該組換えタンパク質の産生方法であって、以下：（ａ）内因性ＦＵＴ８遺伝子を含む宿主細胞を提供するステップ；（ｂ）本明細書中に記載される方法のいずれかにより宿主細胞の内因性ＦＵＴ８遺伝子を不活性化するステップ；ならびに（ｃ）当該タンパク質をコードする配列を含む導入遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより組換えタンパク質を産生するステップを包含する方法を提供する。ある実施形態では、当該タンパク質は抗体、例えばモノクローナル抗体を含む。
【００１９】
本明細書中に記載される細胞および方法のいずれかにおいて、細胞または細胞株は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えばハスモンヨウ近種ヨウトガ（Ｓｆ）または真菌細胞、例えば出芽酵母、ピキア酵母および分裂酵母であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ（モンゴルキヌゲネズミ）ＦＵＴ８  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【図２】Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ（モンゴルキヌゲネズミ）Ｆｕｔ８のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【図３】Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ（モンゴルキヌゲネズミ）ＦＵＴ８  ｃＤＮＡのエキソン９、イントロン９、エキソン１０およびイントロン１０の部分的ヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。
【図４】パネルＡおよびＢは、ＦＵＴ８エキソン１０内の亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）結合および切断部位の位置を示す概略図である。図４Ａは、エキソン９−イントロン１０領域の概観である。エキソンは黒色矢印で示され、灰色線は非コードＤＮＡを示す。図４Ｂは、フコシルトランスフェラーゼ  モチーフＩＩおよびＺＦＮ結合部位の詳細図を示す。フコシルトランスフェラーゼ  モチーフＩＩの位置（明灰色ボックス）は、Oriol et al. (1999) Glycobiology 9: 323-34 (1999)に記載されたように確定された。ＦｕｔモチーフＩＩの翻訳は、ＤＮＡ配列の上に示されている。遺伝子のセンス鎖に関するＺＦＮの認識配列の位置は、暗灰色ボックスとして示されている。ＺＦＮ  １２１７６（表１）は１５ｂｐの標的部位を認識する５Ｚｎ−フィンガータンパク質であり、ＺＦＮ１２１７０（表１）は１８ｂｐの標的部位を認識する６ＺＮ−フィンガータンパク質である。示された最後の２つのヌクレオチド（ＧＴ）は、イントロン１０に関する５‘スプライスドナー部位である。
【００２１】
【図５】パネルＡおよびＢは、内因性ＦＵＴ８遺伝子座でのＺＦＮ活性に関するＣｅｌ−ミスマッチアッセイの結果を示す。各ＺＦＮ対の効力は、親ＰＣＲ産物より低い切断産物の総量に反映される。図５Ａは、指示プラスミドと、オリゴＧＪＣ  ７１Ｆ：ＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧ（配列番号４）およびＧＪＣ  ８９Ｒ：ＧＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＴＴＣＴ（配列番号５）を用いて増幅されたＦＵＴ８遺伝子座ＰＣＲ、の一部のトランスフェクション後２日目に収穫されたＤＮＡに関するＣｅｌ−１アッセイ結果を示す。予測切断産物のサイズは、２６４ｂｐおよび２１６ｂｐである。図５Ｂは、トランスフェクション後２日目に収穫されたＤＮＡと、オリゴＧＪＣ  ９０Ｆ:ＣＴＧＴＴＧＡＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＣＡ(配列番号６)およびＧＪＣ  ９１Ｒ：ＴＧＴＴＡＣＴＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣ（配列番号７）を用いて増幅されたＦＵＴ８遺伝子座ＰＣＲの一部、の結果を示す。予測切断産物のサイズは、４３１ｂｐおよび３４２ｂｐである。ＺＦＮ組合せは、適切なレーンの上に示されている；ＺＦＮ特異的切断産物は、白矢じりで示されている。非相同末端結合により修飾される染色体のパーセントは、各レーンの下に列挙されている。分子量マーカー帯域のサイズは、ゲルの左側に示されている。
【図６】パネルＡおよびＢは、内因性ＦＵＴ８遺伝子座でのＺＦＮ活性を示す。図６Ａは、２日後に収穫されたゲノムＤＮＡで平行してトランスフェクトされた２つの指示ＺＦＮ対を用いた１．３ｋｂのＦＵＴ８のヌクレアーゼ媒介性欠失の結果を示す。ＺＦＮ部位間の約１３００ｂｐの欠失は、約５５９ｂｐの産物を生じた。図６Ｂは、ＣＨＯ細胞中のレンズマメアグルチニン（ＬＣＡ）濃縮を伴う場合と伴わない場合の、内因性ＦＵＴ８遺伝子座でのＺＦＮ活性に関するＣｅｌ−１ミスマッチアッセイの結果を示す。ＺＦＮ対は、最上段に示されている（レーン２〜４に関しては（左から右に）ＺＦＮ対１２１７０および１２１７６、レーン５〜７に関しては（左から右に）ＺＦＮ対１２１７２および１２１７６）。「ｐＶＡＸ」と呼ばれるレーンは、空プラスミド（無ＺＦＮ）でトランスフェクトされた対照細胞を指す。「２」および「３０」と呼ばれるレーンはトランスフェクト後日数を指し、「ＬＣＡ」はＬＣＡ選択を受ける細胞を指す。
【００２２】
【図７】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子がともに前のＺＦＮ処理により破壊されているＣＨＯ細胞において、レンズマメアグルチニン（ＬＣＡ）濃縮を伴う場合と伴わない場合の、内因性ＦＵＴ８遺伝子座でのＺＦＮ活性に関するＣｅｌ−１ミスマッチアッセイの結果を示す。用いられたＺＦＮプール（１、３、５、７）は各レーンの上部に示されており、そして非相同末端結合により修飾される染色体のパーセントは、各レーンの下に列挙されている。「Ｃｏｎｔ．」の印を付けた２つのレーンは、細胞がＧＦＰ発現プラスミドでトランスフェクトされた（左「Ｃｏｎｔ．」レーン）、またはトランスフェクトされなかった（右「Ｃｏｎｔ．」レーン）場合の陰性対照を示す。
【図８】ＬＣＡ濃縮ＺＦＮ処理プール＃１から単離された三重鎖遺伝子（ＤＨＦＲ／ＧＳ／ＦＵＴ８）ノックアウトクローンの指示特性を示す。
【図９】蛍光ＬＣＡと指示細胞型との結合を示すグラフである。「非染色」は、野生型Ｆｕｔ８を含有するが、しかし蛍光ＬＣＡに曝露されていないＣＨＯ細胞を指す；「三重鎖ＫＯ」は、ＤＨＦＲ、ＧＳおよびＦＵＴ８遺伝子の３つすべてがＺＦＮを用いて破壊された細胞を指す；そして「ｆｕｔ８  ｗｔ」は、野生型ＦＵＴ８を含有し、蛍光ＬＣＡに曝露されたＣＨＯ細胞を指す。
【００２３】
【図１０】ＦＵＴ８低次形態遺伝子（ハイポモルフ）中の内因性ＦＵＴ８遺伝子座でのＺＦＮ活性に関するＣｅｌ−１ミスマッチアッセイの結果を示す。クローン数はレーンの上に示され、対立遺伝子破壊は各レーンの下に示されている。
【図１１】蛍光ＬＣＡと指示細胞型との結合を示すグラフである。「野生型非染色」は、野生型Ｆｕｔ８を含有するが、しかし蛍光ＬＣＡに曝露されていないＣＨＯ細胞を指す；「低次形態クローン」は、ＦＵＴ８が部分的に不活性化された（ＦＵＴ８低次形態）細胞の集団を指す；そして「ＣＨＯ−Ｋ１」は、野生型ＦＵＴ８を含有し、蛍光ＬＣＡに曝露されたＣＨＯ細胞を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ＦＵＴ８遺伝子の部分的または完全不活性化のための組成物および方法が、本明細書中で記載される。例えば標的細胞中のＦｕｔ８遺伝子を不活性化するためのこれらの組成物（試薬）を製造し、用いるための方法も開示される。標的細胞中のＦｕｔ８の不活性化を用いて、組換えタンパク質、特にＡＤＣＣ増強を引き出すモノクローナル抗体の発現のための細胞株を産生し得る。
【００２５】
哺乳類細胞において、Ｆｕｔ８はコアフコースを抗体のＦｃ領域上に存在するオリゴ糖に結合するが、これは、抗体依存性細胞性細胞傷害性のエフェクター機能のために非常に重要であると広く認識されている。ヒトＦｕｔ８の構造の三次元解析は、３つのα２／α６フコシルトランスフェラーゼ・モチーフが酵素の触媒的コアを形成する、ということを示している（Ihara et al. (2007) Glycobiology 17: 455-66参照）。この領域において、多数の単一残基のアラニンへの点突然変異は酵素の完全不活性化を生じる（Ihara et al. (2007) Glycobiology 17:455-66；Takahashi et al. (2000) Glycobiology 10:503-10参照）。上記のように、ＦＵＴ８発現が低減されるかまたは排除される細胞（例えば、ノックアウト細胞株、またはｓｉＲＮＡを有する）は、より大きなエフェクター機能を有する非フコシル化抗体を産生する（例えばKanada et al. (2007) Biotechnol. 130(3):300-310；Kanada et al. (2007) Glycobiology 18:104-118；Mori et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 88:901-908参照）。
【００２６】
したがって、本明細書中に開示される方法および組成物は、抗体のような非フコシル化タンパク質を産生するための細胞株の生成を可能にするＦＵＴ８の標的化遺伝子ノックアウト（部分的または完全）のための非常に効率的な方法を提供する。
【００２７】
概要
方法の実施、ならびに本明細書中に開示される組成物の調製は、別記しない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および分析、コンピューター化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当業者の知識の範囲内であるような関連分野における慣用的技法を用いる。これらの技法は、文献中で十分に説明されている（例えばSambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989および第３版, 2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的更新；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 第３版, Academic Press, San Diego, 1998；METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, ”Chromatin”（編者：P.M. Wassarman およびA.P. Wolffe）, Academic Press, San Diego, 1999；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, ”Chromatin Protocols”(編者：P.B. Becker) Humana Press, Totowa, 1999参照）。
【００２８】
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に用いられ、線状または環状立体配置の、且つ一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を指す。本開示の目的のために、これらの用語は、重合体の長さに関して限定するよう意図されない。当該用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸塩部分（例えばホスホロチオエート主鎖）において修飾されるヌクレオチドを包含し得る。概して、特定ヌクレオチドの類似体は同一塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すために互換的に用いられる。当該用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然生成アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸重合体にも当てはまる。
【００３０】
「結合」とは、高分子物質間（例えば、タンパク質および核酸間）の配列特異的、非共有的相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の構成成分のすべてが配列特異的である必要があるわけではない（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸塩基との接触）。このような相互作用は、一般的に、１０-6Ｍ-1またはそれ以下の解離定数（Ｋd）により特性化される。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性増大は、より低いＫdと相関する。
【００３１】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有的に結合し得るタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）と結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それはそれ自体と結合し得る（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）し、あるいはそれは、異なる単数または複数のタンパク質のうちの１つ以上の分子と結合し得る。結合タンパク質は、１種類より多くの結合活性を有し得る。例えば亜鉛フィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００３２】
「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上の亜鉛フィンガーを介して、配列特異的方法でＤＮＡを結合するタンパク質、または大型タンパク質内のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、亜鉛フィンガータンパク質またはＺＥＰと省略される。
【００３３】
亜鉛フィンガー結合ドメインは、「工学処理」されて、予定ヌクレオチド配列と結合し得る。亜鉛フィンガータンパク質を工学処理するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、その設計／組成が主に合理的規準に起因する天然でないタンパク質である。設計のための合理的規準としては、置換規則の適用、ならびに現行ＺＦＰ設計および結合データのデータベース貯蔵情報における情報を処理するためのコンピューターアルゴリズムが挙げられる（例えば米国特許第６，１４０，０８１号;第６，４５３，２４２号;および第６，５３４，２６１号参照;ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照）。
【００３４】
「選択」亜鉛フィンガータンパク質は、その産生が主に実験的方法、例えばファージ表示、相互作用トラップまたはハイブリッド選択に起因する、現実には見出されないタンパク質である（例えば米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４参照）。
【００３５】
「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る;線状、環状または分枝鎖であり得る;そして一本鎖または二本鎖であり得る任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「ドナー配列」という用語は、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間の、またはそれより大きい任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、さらに好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。
【００３６】
「相同、非同一配列」は、第二配列とある程度の配列同一性を共有するが、しかしその配列が第二配列の配列と同一でない第一の配列を指す。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異体遺伝子の配列と相同であり、且つ非同一である。ある実施形態では、２つの配列間の相同の程度は、正常細胞機構を利用して、その間の相同組換えを可能にするのに十分である。２つの相同、非同一配列は任意の長さであり得、それらの非相同の程度は単一ヌクレオチドと同じくらい小さいか（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の補正のため）、あるいは１０キロ塩基以上のというくらい大きい（例えば、染色体中の予定転位部位での遺伝子の挿入のため）。相同、非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同一長である必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）が用いられ得る。
【００３７】
核酸およびアミノ酸配列同一性を確定するための技法は、当該技術分野で知られている。典型的には、このような技法は、遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を確定するか、あるいはそれによりコードされるアミノ酸配列を確定すること、およびこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを包含する。ゲノム配列も、この仕方で確定され、比較され得る。概して、同一性は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを確定することにより比較され得る。２つの配列の同一性パーセントは、核酸であれアミノ酸配列であれ、２つの整列された配列間の正確な整合の数をより短い配列の長さで割り、１００を掛ける。核酸配列に関するおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, 編者：M.O. Dayhoff, 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USAにより開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763 (1986)により正規化されたスコアリングマトリックスを用いることにより、アミノ酸配列に適用され得る。配列の同一性パーセントを確定するためのこのアルゴリズムの例示的手段は、「BestFit」ユーティリティー・アプリケーションで、Genetics Computer Group (Madison, WI)により提供される。配列間の同一性または類似性パーセントを算定するための他の適切なプログラムは、当該技術分野で一般的に知られており、例えば別のアラインメント・プログラムは、デフォルトパラメーターを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えばＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：遺伝暗号＝標準;フィルター＝なし;鎖＝両方;カットオフ＝６０；除外＝１０;マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述子＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ;データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウエブサイトに見出され得る。本明細書中に記載される配列に関して、所望の程度の配列同一性の範囲は、約８０％〜１００％、ならびにその間の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００３８】
代替的には、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、その後の１本鎖特異的ヌクレアーゼ（単数または複数）での消化、および消化断片のサイズ確定により決定され得る。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法により確定される場合に、分子の限定長全体で、少なくとも約７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、さらに好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、互いに実質的に相同である。本明細書中で用いる場合、実質的に相同という用語は、特定ＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系に関して定義されているように、例えば緊縮条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を限定することは、当該技術分野の技術の範囲内である（例えばSambrook et al.、上記；Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 編者：B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press参照）。
【００３９】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように確定され得る。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、完全同一配列の標的分子とのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全同一配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野でよく知られているハイブリダイゼーションアッセイを用いて査定され得る（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.参照）。このようなアッセイは、種々の程度の選択性を用いて、例えば、低緊縮から高緊縮まで変化する条件を用いて、実行され得る。低緊縮性の条件が用いられる場合、非特異的結合事象の非存在下で、第二プローブが標的とハイブリダイズしないよう、部分的程度の配列同一性さえ欠く第二プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて、非特異的結合の非存在が査定され得る。
【００４０】
ハイブリダイゼーションベースの検出システムを利用する場合、参照核酸配列と相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択により、プローブおよび参照配列が互いに選択的にハイブリダイズまたは結合して、二重鎖分子を形成する。中等度の緊縮ハイブリダイゼーション条件下で参照配列と選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、典型的には、選択核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択核酸プローブの配列と約９０〜９５％より高い配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび参照配列が特定程度の配列同一性を有する場合、当該技術分野で既知であるように確定され得る（例えばNucleic Acid Hybridization: A Practical Approach,編者：B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press参照）。
【００４１】
ハイブリダイゼーションのための条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーション緊縮性は、ハイブリダイゼーション条件が不適性ヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、高緊縮性は不適性ハイブリッドに対する低い耐容性と相関した。ハイブリダイゼーションの緊縮度に影響を及ぼす因子は当業者に周知であり、例としては、温度、ｐＨ、イオン強度、ならびに有機溶媒、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドの濃度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に既知であるように、ハイブリダイゼーション緊縮性は、温度が高いほど、イオン強度が低いほど、および溶媒濃度が低いほど、増大される。
【００４２】
ハイブリダイゼーションのための緊縮条件に関して、数的等価条件を用いて、例えば以下の因子：配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩およびその他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断薬（例えば、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）の存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、ならびに種々の洗浄条件：を変えることにより、特定の緊縮性を確立し得る、ということが当該技術分野でよく知られている。特定組のハイブリダイゼーション条件の選択は、当該技術分野における標準的方法に従って選択される（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.参照）。
【００４３】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換の過程を指す。本開示の目的のために、「相同的組換え（ＨＲ）」は、例えば細胞中の二本鎖破壊修復中に起こるこのような交換の特殊形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖破壊を経たもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を用い、そして種々に「非交差遺伝子変換」または「短い領域の遺伝子変換」として既知であるが、それがドナーから標的への遺伝子情報の移入をもたらすためである。如何なる特定の理論にも縛られることなく考えると、このような移入は、破壊された標的とドナーとの間に生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡの誤対合の修正に、および／または標的の一部になるであろう、遺伝子情報を再合成するためにドナーが用いられる「合成依存性鎖アニーリング」に、および／または関連過程に関与し得る。このような特殊化ＨＲは多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組入れられるよう、標的分子の配列の変更を引き起こす。
【００４４】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合主鎖の破損を指す。切断は、種々の方法、例えば、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解（これらに限定されない）により開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断はともに可能であり、二本鎖切断は２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端を作り出し得る。ある実施形態では、融合ポリペプチドが標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために用いられる。
【００４５】
「切断半ドメイン」は、第２ポリペプチド（同一であるかまたは異なる）と一緒に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第一及び第二切断半ドメイン」、「＋および−切断半ドメイン」ならびに「右および左切断半ドメイン」という用語は、互換的に用いられて、二量体化する切断半ドメインの対を指す。
【００４６】
「工学処理切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の工学処理切断半ドメイン）と絶対へテロ二量体を形成するよう修飾された切断半ドメインである（米国特許公開番号２００５／００６４４７４；２００７／０２１８５２８及び２００８／０１３１９６２も参照）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【００４７】
「クロマチン」は、細胞ゲノムからなる核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにタンパク質、例えばヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質からなる。大多数の真核生物細胞クロマチンはヌクレオソームの形態で存在し、この場合、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のうちの各々２つを含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡからなり；そしてリンカーＤＮＡ（生物体によって種々の長さを有する）がヌクレオソームコア間に伸びる。ヒストンＨ１の分子は、一般的にリンカーＤＮＡと会合される。本発明の開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方のすべての種類の細胞核タンパク質を包含するよう意図される。細胞クロマチンとしては、染色体およびエピソームの両方のクロマチンが挙げられる。
【００４８】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを含む染色体すべての収集物であるその核型により特性化される。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【００４９】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含むその他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある種のウイルスゲノムが挙げられる。
【００５０】
「接触可能領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子により結合され得る細胞クロマチン中の部位である。如何なる特定の理論にも縛られることなく考えると、接触可能領域は、ヌクレオソーム構造中に包装されないものである。化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性により、接触可能領域の別個の構造がしばしば検出され得る。
【００５１】
「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を限定する核酸配列であるが、但し、結合のための十分な条件が存在する。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ  ＲＩ制限エンドヌクレアーゼに関する標的部位である。
【００５２】
「外因性」分子は、細胞中に普通は存在しないが、しかし1つまたは複数の遺伝的、生化学的またはその他の方法により細胞中に導入され得る分子である。「細胞中の普通の存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して確定される。したがって、例えば筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば機能不全性内因性分子の機能性バージョンまたは正常機能性内因性分子の機能性バージョンを含み得る。
【００５３】
外因性分子は、特に、例えば組合せ化学工程により生成されるような小分子、あるいは高分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾誘導体、または上記分子のうちの1つまたは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、一本鎖または二本鎖であり；線状、分枝鎖または環状であり；そして任意の長さを有し得る。核酸は、二重鎖を形成し得るもの、ならびに三重鎖形成核酸を包含する（例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号参照）。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構築因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同型の分子でもあり得るが、しかし当該細胞が由来するものとは異なる種に由来する。例えばヒト核酸配列は、そもそもマウスまたはハムスターに由来する細胞株中に導入され得る。
【００５４】
外因性分子はすべて、内因性分子、例えば外因性タンパク質または核酸と同型の分子であり得る。例えば外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソーム、あるいは細胞中に普通は存在しない染色体中を含み得る。細胞中への外因性分子の導入方法は当業者に既知であり、例としては、脂質媒介性移入（すなわち、リポソーム、例えば中性および陽イオン性脂質）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
それに対比して、「内因性」分子は、特定環境条件下で、特定発生段階の特定細胞中に普通に存在するものである。例えば内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体またはその他の細胞小器官、あるいは天然エピソーム核酸を含む。さらなる内因性分子としては、タンパク質、例えば転写因子および酵素が挙げられ得る。
【００５６】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有的に、連結される分子である。サブユニット分子は同一化学型の分子であり得、あるいは異なる化学型の分子であり得る。第一の型の融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第二の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物；ならびに小溝結合因子と核酸間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
細胞中の融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達に起因するか、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によるが、この場合、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生じる。トランス・スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド結紮も、細胞中でのタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の別の箇所に提示されている。
【００５８】
本発明の開示の目的のための「遺伝子」としては、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびにこのような調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域が挙げられる。したがって、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、絶縁体、境界要素、複製の起点、マトリックス結合部位、ならびに遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００５９】
「遺伝子発現」は、遺伝子産物への遺伝子中に含入される情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）リボザイム、構造ＲＮＡまたは任意のその他の型のＲＮＡ）、あるいはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集のようなプロセスにより修飾されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化およびグリコシル化により修飾されるタンパク質も包含する。
【００６０】
遺伝子発現の「調整」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の調整としては、遺伝子活性化および遺伝子抑制が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子不活性化は、本明細書中に上記したようなＺＦＰを含まない細胞と比較した場合の遺伝子発現における任意の低減を指す。したがって遺伝子不活性化は、完全であるか（ノックアウト）、あるいは部分的であり得る（例えば、遺伝子が正常より低い発現レベルを示す低次形態、またはそれが影響を及ぼす活性の部分的低減を示す突然変異体遺伝子の産物）。
【００６１】
「真核生物」細胞としては、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
「当該領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば遺伝子、あるいは遺伝子内または遺伝子に隣接する非コード配列であって、この場合、外因性分子を結合することが望ましい。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。当該領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。当該領域は、遺伝子のコード領域内、転写非コード領域内、例えばリーダー配列、トレイラー配列またはイントロン内、あるいは非転写領域内（コード領域の上流であれ、下流であれ）であり得る。当該領域は、単一ヌクレオチド対ほど小さいか、または２，０００ヌクレオチド対長までであり得、あるいは任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
【００６３】
「操作的連結」および「操作的に連結される」（または「操作可能的に連結される」）という用語は、２つ以上の構成成分（例えば、配列素子）の並置に関して互換的に用いられるが、この場合、構成成分がともに正常に機能し、構成成分のうちの少なくとも１つが他の構成成分のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介し得ることを可能にするよう、当該構成成分は整列される。例証として、転写調節配列が1つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、転写調節配列、例えばプロモーターは、コード配列と操作的に連結される。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシス位置で操作的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えばエンハンサーは、それらが連続的でない場合でも、コード配列と操作的に連結される転写調節配列である。
【００６４】
融合ポリペプチドに関して、「操作的に連結される」という用語は、当該構成成分の各々が、それがそのように連結されない場合と同様に、他の構成成分との連結において同一機能を実施する、という事実を指す。例えばＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合される融合ポリペプチドに関しては、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位を結合し、一方、切断ドメインが標的部位に近接したＤＮＡを切断し得る場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは操作的連結である。
【００６５】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一の機能を依然として保有しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子より多いか、より少ないかまたは同一の数の残基を保有し、および／または1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸とハイブリダイズする能力）の確定方法は、当該技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能の確定方法は良く知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイにより確定され得る。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によりアッセイされ得る（Ausubel et al.,上記、参照）。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、２−ハイブリッドアッセイまたは相補性（遺伝的および生化学的の両方）により確定され得る（例えば、Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ  ９８／４４３５０参照）。
【００６６】
「抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリクローナルおよびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに以下のもの：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えばWinter et al., Nature (1991) 349: 293-299；および米国特許第４，８１６，５６７号参照）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子（非共有的へテロ二量体、例えばInbar et al., Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69: 2659-2662；およびEhrlich et al., Biochem (1980) 19: 4091-4096参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えばHuston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 5879-5883参照）；二量体および三量体抗体断片構築物；ミニボディ（例えばPack et al., Biochem (1992) 31: 1579-1584；Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126参照）；ヒト化抗体分子（例えばRiechmann et al., Nature (1988) 332: 323-327；Verhoeyan et al., Science (1988) 239: 1534-1536；および英国特許公開番号ＧＢ  ２，２７６，１６９（１９９４年９月２１日公開）参照）；ならびにこのような分子から得られる任意の機能的断片（ここで、このような断片は親抗体分子の免疫学的結合特性を保持する）を包含する。
【００６７】
本明細書中で用いる場合、「モノクローナル抗体」という用語は、均一抗体集団を有する抗体組成物を指す。当該用語は、抗体の種または供給源に関して限定されないし、それが作られる方式により限定されるよう意図されない。当該用語は、全免疫グロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのような断片およびその他の断片、ならびに親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示すキメラおよびヒト化均一抗体集団を包含する。
【００６８】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
ＦＵＴ８遺伝子の不活性化のために用いられ得る亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が本明細書中に記載される。ＺＦＮは、亜鉛フィンガータンパク質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。
【００６９】
Ａ．亜鉛フィンガータンパク質
亜鉛フィンガー結合ドメインは、選択配列と結合するよう工学処理され得る（例えば、Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141；Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340；Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660；Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637；Choo et al., (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416参照）。工学処理亜鉛フィンガー結合ドメインは、天然生成亜鉛フィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。工学処理方法としては、合理的設計および種々の型の選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的設計としては、例えば三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が挙げられるが、この場合、各三重または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重および四重鎖配列を結合する亜鉛フィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合される（例えば共有米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号参照）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。
【００７０】
例示的選択方法、例えばファージ表示および２−ハイブリッド系は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ  ９８／３７１８６；ＷＯ  ９８／５３０５７；ＷＯ  ００／２７８７８；ＷＯ  ０１／８８１９７およびＧＢ  ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、亜鉛フィンガードメインに関する結合特異性の増強は、例えば共有ＷＯ  ０２／０７７２２７に記載されている。
【００７１】
標的部位の選択；ＺＦＰおよび融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知であり、米国特許出願公開番号２００５００６４４７４および２００６０１８８９８７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳細に記載されている。
【００７２】
さらに、これらのおよびその他の参考文献に開示されているように、亜鉛フィンガードメインおよび／または多指状亜鉛フィンガータンパク質は、任意の適切なリンカー配列、例えば５以上のアミノ酸長のリンカー（例えばＴＧＥＫＰ（配列番号３６）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号３７）、ＴＧＱＫＰ（配列番号３８）および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号３９））を用いて、共に連結され得る。６以上のアミノ酸長の例示的リンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書中に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々の亜鉛フィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せも包含し得る。さらなるリンカー構造の例は、米国特許仮出願第６１／１３０，０９９号（２００８年５月２８日提出、表題：Compositions For Linking DNA-Binding Domains And Cleavage Domains）に見出される。
【００７３】
表１は、ＦＵＴ８遺伝子中のヌクレオチド配列と結合するよう工学処理された多数の亜鉛フィンガー結合ドメインを記載する（図１および図３も参照）。各横列は、別々の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを記載する。各ドメインに関するＤＮＡ標的配列は、第１縦列および第２〜第５縦列は、タンパク質中の亜鉛フィンガー（Ｆ１〜Ｆ４、Ｆ５またはＦ６）の各々の認識領域（ヘリックスの開始に関して、アミノ酸−１〜＋６）のアミノ酸配列を示す。第１縦列には、タンパク質の同定数も提供される。
【００７４】
【表１】
2015172081.tif 000002
【００７５】
下記のように、ある実施形態では、表１に示されるような４−、５−または６−フィンガードメインは、切断半ドメイン、例えばＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩの切断ドメインと融合される。このような亜鉛フィンガー／ヌクレアーゼ半ドメイン融合物の1つまたは複数の対は、例えば米国特許公開番号２００５００６４４７４および２００７０２１８５２８に開示されたように、標的化切断のために用いられる。
【００７６】
標的化切断に関して、結合部位の近接縁は、５以上のヌクレオチド対により分離され得、融合タンパク質の各々はＤＮＡ標的の反対鎖に結合され得る。表１に示されたタンパク質のすべての対の組合せ（例えば、ＺＦＮ１２０２９とＺＦＮ１２０３０との、およびＺＦＮ１２１７０とＺＦＮ１２１７２またはＺＦＮ１２１７６との組合せ）は、ＦＵＴ８遺伝子の標的化切断のために用いられ得る。本発明の開示に従って、ＺＦＮはＦＵＴ８遺伝子中の任意の配列に標的化され得る。
【００７７】
Ｂ．切断ドメイン
ＺＦＮは、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断半ドメイン）も含む。本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られる。切断ドメインが由来する例示的エンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミング・エンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA；およびBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388参照）。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；緑豆ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；編者；Linn et al. Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの1つまたは複数は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として用いられ得る。
【００７８】
同様に、切断半ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする上記のような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。代替的には、２つの切断半ドメインを含む単一タンパク質が用いられ得る。２つの切断半ドメインは、同一エンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得、あるいは各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。さらに、例えば二量体化することにより、２つの融合タンパク質とそれらのそれぞれの標的部位との結合が切断半ドメインに機能的切断ドメインを形成させる互いに対する空間的配向で切断半ドメインを配置するよう、好ましくは、２つの融合タンパク質に関する標的部位が置かれる。したがって、ある実施形態では、標的部位の近接縁は、５〜８個のヌクレオチドにより、または１５〜１８個のヌクレオチドにより分離される。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位間に介入し得る（例えば、２〜５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断の部位は、標的部位間にある。
【００７９】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多数の種において存在し、ＤＮＡと配列特異的に結合し（認識部位で）、結合部位またはその近くでＤＮＡを切断し得る。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去される部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えばＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ  Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチドで、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する（例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31,978-31,982参照）。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または切断半ドメイン）、ならびに1つまたは複数の亜鉛フィンガー結合ドメイン（工学処理されるかまたは工学処理されない）を含む。
【００８０】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能であるＩＩＳ型制限酵素の一例は、Ｆｏｋ  Ｉである。この特定酵素は、二量体として活性である（Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575）。したがって、本発明の開示の目的のために、開示融合タンパク質に用いられるＦｏｋ  Ｉ酵素の一部は、切断半ドメインと考えられる。したがって、亜鉛フィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合物を用いる細胞性配列の標的化二本鎖切断および／または標的化置換に関して、各々がＦｏｋ  Ｉ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性名切断ドメインを再構築し得る。代替的には、亜鉛フィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ  Ｉ切断半ドメインを含有する単一ポリペプチド分子も用いられ得る。亜鉛フィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合物を用いる標的化切断および標的化配列変更に関するパラメーターは、本開示中の他の箇所に提供されている。
【００８１】
切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【００８２】
例示的ＩＩＳ型制限酵素は、国際公開番号ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）。さらなる制限酵素も分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは本発明の開示により意図される（例えばRoberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420参照）。
【００８３】
ある実施形態では、切断ドメインは、例えば米国特許公開番号：２００５００６４４７４；２００６０１８８９８７および２００８０１３１９６２（これらの記載内容はすべて参照により本明細書中で援用される）に記載されたような、ホモ二量体化を最小限にするかまたは阻止する1つまたは複数の工学処理切断半ドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれる）を含む。Ｆｏｋ  Ｉの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８でのアミノ酸残基はすべて、Ｆｏｋ  Ｉ切断半ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【００８４】
絶対へテロ二量体を形成するＦｏｋ  Ｉの例示的工学処理切断半ドメインは、第一切断半ドメインがＦｏｋ  Ｉの位置４９０および５３８でのアミノ酸残基の突然変異を含み、第二切断半ドメインがアミノ酸残基４８６および４９９での突然変異を含む対を包含する。
【００８５】
したがって、一実施形態では、４９０での突然変異は、Ｌｙｓ（Ｋ）がＧｌｕ（Ｅ）に取って代わり；５３８での突然変異は、Ｌｙｓ（Ｋ）がＩｓｏ（Ｉ）に取って代わり；４８６での突然変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）がＧｌｎ（Ｑ）に取って代わり；そして４９９での突然変異は、Ｌｙｓ（Ｋ）がＩｓｏ（Ｉ）に取って代わる。具体的には、一切断半ドメインにおいて位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を突然変異化して、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる工学処理切断半ドメインを産生し、別の切断半ドメインにおいて位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を突然変異化して、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる工学処理切断半ドメインを産生することにより、本明細書中に記載される工学処理切断半ドメインを調製した。本明細書中に記載される工学処理切断半ドメインは、これらの切断半ドメインを含有するヌクレアーゼの1つまたは複数の対が切断のために用いられる場合、異所性切断が最小限にされるかまたは廃止される絶対へテロ二量体突然変異体である（例えば米国特許公開番号：２００８０１３１９６２（この記載内容はすべての目的のために参照により本明細書中で援用される）参照）。
【００８６】
本明細書中に記載される工学処理切断半ドメインは、任意の適切な方法を用いて、例えば米国特許公開番号：２００５００６４４７４（実施例５）および２００７０１３４７９６（実施例３８）に記載されたような野生型切断半ドメイン（Ｆｏｋ  Ｉ）の部位特異的突然変異誘発により、調製され得る。
【００８７】
Ｃ．ＦＵＴ８における標的化切断のための付加的方法
ＦＵＴ８遺伝子中に標的部位を有する任意のヌクレアーゼが、本明細書中に開示される方法に用いられ得る。例えば、ホーミング・エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは長い認識配列を有し、そのいくつかは、統計学に基づいて、ヒトサイズのゲノム中に１回存在すると思われる。ＦＵＴ８遺伝子中に独自の標的部位を有する任意のこのようなヌクレアーゼは、ＦＵＴ８遺伝子における標的化切断のために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼの代わりに、またはそれに加えて、用いられ得る。
【００８８】
例示的ホーミング・エンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は既知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388；Dujon et al. (1989) Gene 82: 115-118；Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet. 12: 224-228；Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 163-180；Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280: 345-353およびNew England Biolabsカタログも参照されたい。
【００８９】
大半のホーミング・エンドヌクレアーゼの切断特異性は、それらの認識部位に関して絶対的ではないが、しかしその部位は、その認識部位の単一コピーを含有する細胞中でホーミング・エンドヌクレアーゼを発現させることにより哺乳類サイズのゲノム当たり１回の切断事象が得られるのに十分な長さを有する。ホーミング・エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は非天然標的部位を結合するよう工学処理され得る、ということも報告されている（例えばChevalier et al. (2002) Molec. Cell 10: 895-905；Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 2952-2962；Ashworth et al. (2006) Nature 441: 656-659；Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7: 49-66参照）。
【００９０】
送達
本明細書中に記載されるＺＦＮは、任意の適切な手段により標的細胞に送達され得る。適切な細胞としては、真核生物および原核生物の細胞および／または細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このような細胞または細胞株の非限定例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびに昆虫細胞、例えばハスモンヨウ近種ヨウトガ（Ｓｆ）、または真菌細胞、例えば出芽酵母、ピキア酵母および分裂酵母が挙げられる。
【００９１】
亜鉛フィンガーを含むタンパク質の送達方法は、例えば米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号（これらの記載内容はすべて参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００９２】
本明細書中に記載されるようなＦＵＴ８  ＺＦＮは、ＺＦＮのうちの1つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを用いても送達され得る。任意のベクター系、例えば、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどが用いられ得るが、これらに限定されない。第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号（これらの記載内容はすべて参照により本明細書中で援用される）も参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれかは、1つまたは複数のＺＦＮコード配列を含み得る、ということも明らかになる。したがって、ＺＦＮの1つまたは複数の対が細胞中に導入される場合、ＺＦＮは同一ベクター上で、または異なるベクター上で運ばれ得る。多数のベクターが用いられる場合、各ベクターは１つまたは多数のＺＦＮをコードする配列を含み得る。
【００９３】
慣用的ウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を用いて、細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織中で発現されるＺＦＰをコードする核酸を導入し得る。このような方法は、試験管内で細胞にＺＦＰをコードする核酸を投与するためにも用いられ得る。ある実施形態では、ＺＦＰをコードする核酸は、生体内または生体外遺伝子療法用途のために投与される。非ウイルス性ベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸核酸、ならびに送達ビヒクル、例えばリポソームまたはポロキサマーと複合体形成された核酸が挙げられる。ウイルス性ベクター送達系としては、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス（細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組込みゲノムを有する）が挙げられる。遺伝子療法手順の再検討に関しては、Anderson, Science 256: 808-813 (1992)；Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993)；Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993)；Dillon, TIBTECH 11: 167-175 (1993)；Miller, Nature 357: 455-460 (1992)；Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36 (1995)；Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31-44 (1995)；Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology 編者：DoerflerおよびBohm (1995)；およびYu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994)を参照されたい。
【００９４】
工学処理ＺＦＰをコードする核酸の非ウイルス性送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸複合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ならびにＤＮＡ取込みの作因性増強が挙げられる。例えばソニトロン２０００系（Rich-Mar）を用いる超音波穿孔も、核酸の送達のために用いられ得る。
【００９５】
さらなる核酸送達系の例としては、Amaxa Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Maryland）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, MA）およびCopernicus Therapeutics Inc.（例えば米国特許第６，００８，３３６号参照）により提供されるものが挙げられる。
【００９６】
リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号；米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Transfectam（登録商標）およびLipofectin（登録商標））。ポリヌクレオチドの効率的受容体認識リポフェクションに適している陽イオン性および中性脂質としては、Felgner、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（生体外投与）または標的組織（生体内投与）へ向けてのものであり得る。
【００９７】
脂質：核酸複合体、例えば標的化リポソーム、例えば免疫脂質複合体の調製は、当業者によく知られている（例えばCrystal, Science 270: 404-410 (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994)；Remy et al., Bioconjutage Chem. 5: 647-654 (1994)；Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995)；Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992)；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号および第４，９４６，７８７号参照）。
【００９８】
工学処理ＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、身体中の特定細胞に対してウイルスを標的化し、核にウイルス荷重を輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは患者に直接投与され得（生体内）、またはそれらは試験管内で細胞を治療するために用いられ、修飾細胞が患者に投与される（生体外）。ＺＦＰの送達のための慣用的ウイルスベースの系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノムにおける取込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる。さらに、高い形質導入効率が、多数の異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【００９９】
レトロウイルスの親和性は、外来性エンベロープタンパク質を組入れて、標的細胞の強力な標的集団を拡張することにより変更され得る。レンチウイルスベクターは、非分裂中細胞に形質導入するかまたは感染し、典型的には高ウイルス力価を生じ得るレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列に関するパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングのために十分であり、これは次に、標的細胞中に治療用遺伝子を組込んで、恒久的導入遺伝子発現を提供するために用いられる。広範に用いられるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびその組合せを基礎にしたものが挙げられる（例えばBuchscher et al., J. Virol. 66: 2731-2739 (1992)；Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640 (1992)；Sommerfelt et al., Virol. 176: 58-59 (1990)；Wilson et al., J. Virol. 63: 2374-2378 (1989)；Miller et al., J. Virol. 65: 2220-2224 (1991)；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）。
【０１００】
ＺＦＰ融合タンパク質の一過性発現が選択される適用では、アデノウイルスベースの系が用いられ得る。アデノウイルスベースのベクターは、多数の細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に簡単な系で大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば核酸およびペプチドの試験管内産生において、ならびに生体内および生体外遺伝子療法手順のために、標的核酸で細胞に形質導入するために用いられる（例えばWest et al., Virology 160: 38-47 (1987)；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin, Human Gene Therapy 5: 793-801 (1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94: 1351 (1994)参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の出版物に、例えば米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985)；Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081 (1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS 81: 6466-6470 (1984)；およびSamulski et al., J. Virol. 63: 03822-3828 (1989)に記載されている。
【０１０１】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが臨床試験における遺伝子移入のために一般に利用可能であり、これは、形質導入作因を生成するためにヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用する。
【０１０２】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に用いられたことがあるレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85: 3048-305 (1995)；Kohn et al., Nat. Med. 1: 1017-102 (1995)；Malech et al., PNAS 94: 22 12133-12138 (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験に用いられた最初の治療用ベクターであった（Blaese et al., Science 270: 475-480 (1995)）。ＭＦＧ−Ｓパッケージ化ベクターに関して、５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1): 10-20 (1997)；Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1: 111-2 (1997)）。
【０１０３】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥性および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスを基礎にした有望な代替的遺伝子送達系である。ベクターはすべて、導入遺伝子発現カセットの側面に位置するＡＡＶ  １４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノム中への組込みのための効率的遺伝子移入および安定導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Wagner et al., Lancet 351: 9117 1702-3 (1998)；Kearns et al., Gene Ther. 9: 748-55 (1996)）。
【０１０４】
複製欠陥性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され、多数の異なる細胞型に容易に感染し得る。大半のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子に取って代わり；その後、欠陥ベクターの複製が、トランスで欠失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中で増殖されるよう、工学処理される。Ａｄベクターは、多数の型の組織、例えば非分裂中の分化細胞、例えば肝臓、腎臓および筋肉中に見出されるものを生体内で形質導入し得る。慣用的Ａｄベクターは、大きな輸送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫感作のためのポリヌクレオチド療法に関連した（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-9 (1998)）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Rosenecker et al., Infection 24: 1 5-10 (1996)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998)；Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2: 205-18 (1995)；Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5: 597-613 (1997)；Topf et al., Gene Ther. 5: 507-513 (1998)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7: 1083-1089 (1998)が挙げられる。
【０１０５】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために用いられる。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージする２９３細胞、ならびにレトロウイルスをパッケージするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に用いられるウイルスベクターは、通常は、ウイルス粒子中に核酸ベクターをパッケージする産生細胞株により生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングとその後の宿主中への組込み（適切な場合）のために必要とされる最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットにより取って代わられる。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば遺伝子療法に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングと宿主ゲノム中への組込みに必要とされるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を保有するだけである。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製ならびにヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促す。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くため、有意量でパッケージされない。アデノウイルスの夾雑は、例えばアデノウイルスがＡＡＶより感受性である熱処置により低減され得る。
【０１０６】
多数の遺伝子療法適用において、遺伝子療法ベクターは高度の特異性で特定組織型に送達されるのが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上でウイルス外被タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することにより所定の細胞型に関する特異性を有するよう修飾され得る。リガンドは、当該細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するよう選択される。例えばHan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9747-9751 (1995)は、モロニー・ネズミ白血病ウイルスがｇｐ７０と融合されたヒトヘレグリンを発現するよう修飾され、組換えウイルスはヒト表皮増殖因子受容体を発現するある種のヒト乳癌細胞に感染し得る、と報告した。この原理は、他のウイルス−標的細胞対に拡大され得るが、この場合、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面受容体に関するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、糸状ファージは、事実上、任意の選択された細胞受容体に対する特定結合親和性を有する抗体断片（例えばＦＡＢまたはＦｖ）を表示するよう工学処理され得る。上記は主にウイルスベクターに当てはまるが、しかし同一原理は非ウイルスベクターに適用され得る。このようなベクターは、特定標的細胞による取込みを好む特定取込み配列を含有するよう工学処理され得る。
【０１０７】
遺伝子療法ベクターは、個々の患者への投与により、典型的には全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または下記のような局所的適用により、生体内で送達され得る。代替的には、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）、または万能ドナー造血幹細胞のような細胞に生体外で送達し、その後、通常はベクターを組入れた細胞に関する選択後に、患者に細胞を再移植し得る。
【０１０８】
診断、研究のための、または遺伝子療法のための生体外細胞トランスフェクション（例えば宿主生物体中へのトランスフェクト化細胞の再注入による）は、当業者によく知られている。好ましい一実施形態では、細胞は対象生物体から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、そして対象生物体（例えば患者）に再注入し戻される。生体外トランスフェクションに適した種々の細胞型が、当業者によく知られており（例えばFreshney et al., Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique (第３版、1994)参照）、患者から細胞を単離し、培養する方法についての考察のために参考文献が引用される。
【０１０９】
一実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のために、生体外手法で用いられる。幹細胞を用いる利点は、それらが試験管内で他の細胞型に分化され得るし、あるいは哺乳類（例えば細胞のドナー）中に導入され得るが、この場合、それらは骨髄中に移植される、という点である。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなサイトカインを用いてＣＤ３４＋細胞を試験管内で臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法が知られている（Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693-1702 (1992)参照）。
【０１１０】
幹細胞は、既知の方法を用いて、形質導入および分化のために単離される。例えば幹細胞は、望ましくない細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）およびＩａｄ（分化抗原提示細胞）を結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることにより、骨髄細胞から単離される（Inaba et al., J. Exp. Med. 176: 1693-1702 (1992)参照）。
【０１１１】
治療用ＺＦＰ核酸を含有するベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、さらにまた、生体内での細胞の形質導入のために、生物体に直接投与され得る。代替的には、裸ＤＮＡが投与され得る。投与は、普通は血液または組織細胞との最終的接触に分子を導入するために用いられる経路、例えば注射、注入、局所適用および電気穿孔（これらに限定されない）のいずれかによる。このような核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、当業者によく知られており、そして１つより多くの経路が特定の組成物を投与するために用いられ得るが、しかし特定経路はしばしば、別の経路より即時的且つより効果的な反応を提供し得る。
【０１１２】
造血幹細胞中へのＤＮＡの導入方法は、例えば米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４+細胞中への導入遺伝子の導入のために有用なベクターとしては、アデノウイルス３５型が挙げられる。
【０１１３】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）中への導入遺伝子の導入に適したベクターとしては、非組込み型レンチウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-11388；Dull et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471；Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72: 9873-9880；Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25: 217-222参照）。
【０１１４】
製薬上許容可能な担体は、一部は、投与されている特定の組成物により、ならびに組成物を投与するために用いられる特定の方法により、確定される。したがって、下記のように、利用可能な医薬組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences,第１７版, 1989参照）。
【０１１５】
上記のように、開示された方法および組成物は、任意の細胞型、例えば原核生物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞およびヒト細胞（これらに限定されない）において用いられ得る。タンパク質発現のための適切な細胞株は当業者に知られており、例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えばハスモンヨウ近種ヨウトガ（Ｓｆ）、および真菌細胞、例えば出芽酵母、ピキア酵母および分裂酵母が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞株の子孫、変異体および誘導体も用いられ得る。
【０１１６】
適用
開示された方法および組成物は、ＦＵＴ８ゲノム配列の不活性化のために用いられ得る。上記のように、不活性化は、細胞中のＦＵＴ８遺伝子発現の部分的または完全抑圧を包含する。ＦＵＴ８遺伝子の不活性化は、例えば単一切断事象により、切断とその後の非相同末端結合により、２つの部位での切断とその後の２つの切断部位間の配列を欠失するための結合により、コード領域中へのミスセンスまたはナンセンスコドンの標的化組換えにより、遺伝子または調節領域を破壊するための、遺伝子またはその調節領域中への無関連配列（すなわち、「スタッファー」配列）の標的化組換えにより、あるいは転写物のミススプライシングを引き起こすためのイントロン中へのスプライス受容体配列の組換えをターゲッティングすることにより、達成され得る。
【０１１７】
ＦＵＴ８のＺＦＮ媒介性不活性化（ノックアウトまたはノックダウン）のための種々の適用が存在する。例えば、本明細書中に記載される方法および組成物は、組換えタンパク質産生、例えばα１−アンチトリプシンおよび／またはモノクローナル抗体産生に用いるためのＦｕｔ８欠損細胞株の生成を可能にする。Ｆｕｔ８が不活性化される細胞は、特にＡＤＣＣの誘導において、より大きいエフェクター機能を示す抗体を産生する。
【０１１８】
同様に、Ｆｕｔ８が部分的にまたは完全に不活性化される細胞は、フコシル化セリンプロテアーゼ阻害剤アルファ１−アンチトリプシンまたはα１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）を産生するためにも用いられ得る。Ａ１ＡＴは、癌転移の抑制において一役を果たし得（Goodarzi and Turner (1995) Chim Acto 236(2): 161-171）、種々の癌に罹患した患者は、正常集団において見出されるものと比較して、より重度にフコシル化されるＡ１ＡＴを示す（Saitoh et al. (1993) Archives Biochem. & Biophysics 303: 281-287）が、これは、内因性Ａ１ＡＴのフコシル化が機能性低減をもたらし得るということを示唆する。さらに、卵巣癌患者におけるフコシル化Ａ１ＡＴの存在は、化学療法に対する非応答性を予示する、ということが示されている（Thompson et al. (1988) Br. J. Cancer 58(5): 89-93）。血漿から単離されるアルファ１−アンチトリプシンは、Ａ１ＡＴの欠如により引き起こされる肺劣化（例えば肺気腫）の治療のために用いられてきた。Ｆｕｔ８ノックアウトまたはノックダウン細胞株におけるＡ１ＡＴの産生は、より大きな粘稠性および活性を有するタンパク質を生じ得る。したがって、本明細書中に記載される細胞および細胞株は、Ａ１ＡＴの効率的産生も可能にする。
【０１１９】
本明細書中に記載されるＦｕｔ８欠陥細胞および細胞株中のさらなる遺伝子も、不活性化され得る。タンパク質過剰発現に関与するさらなる遺伝子、ならびにこれらの遺伝子を不活性化するための組成物および方法は、米国特許公開番号２００６／００６３２３１および２００８００１５１６４（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されている。例えば、実施例５に開示されるように、Ｆｕｔ８、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）が不活性化された細胞は、本明細書中に記載される方法を用いて生成され得る（実施例５参照）。これらの細胞は、当該タンパク質を過剰発現するために有用である。
【実施例】
【０１２０】
実施例１：ＦＵＴ８  ＺＦＮの設計および構築
α−２およびα−６フコシルトランスフェラーゼ中に保存された３つのモチーフは、Ｆｕｔ８の酵素活性とその後の組換え的に産生された抗体治療薬のフコシル化に関与する（Ihara et al. (2007) Glycobiology 17: 455-66参照）。これらのモチーフは、ハムスター（モンゴルキヌゲネズミ）配列で容易に同定可能であった（Oriol et al. (1999) Glycobiology 9: 323-34；Javaud et al. (2000) Mol Biol Evol 17: 1661-72参照）。特に、ハムスターＦＵＴ８  ＦｕｔモチーフＩＩ（図４）はウシおよびヒトモチーフと同一であり、ブタおよびマウスからのモチーフとは１つのアミノ酸のみが異なる（Javaud et al. (2000) Mol Biol Evol 17: 1661-72）。さらに、ハツカネズミおよびドブネズミＦＵＴ８ゲノムＤＮＡ配列のアラインメントは、ハムスターのＦＵＴ８遺伝子のイントロン９が容易にクローン化可能であるほど十分に小さい、ということを示唆した。
【０１２１】
ハムスターＦＵＴ８  ｃＤＮＡを、以下のようにクローン化した。プライマーＧＪＣ  １１９Ｆ：ＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴ（配列番号３１）およびＧＪＣ  １０６Ｒ：ＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡ（配列番号３２）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来のｃＤＮＡライブラリー１０ナノグラムをＰＣＲ増幅し、ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogen）を用いてクローン化し、そしてシーケンシングした。同様に、ＥａｓｙＡ（登録商標）ポリメラーゼ（Stratagene）ならびにオリゴヌクレオチドプライマーＧＪＣ  ７１Ｆ：ＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧ（配列番号４）およびＧＪＣ  ７２Ｒ：ＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡ（配列番号３３）を用いて、ハムスターゲノムＤＮＡからＦＵＴ８イントロン９をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をクローン化し、シーケンシングした。ＥａｓｙＡ（登録商標）ポリメラーゼ（Stratagene）ならびにオリゴヌクレオチドＧＪＣ  ７５Ｆ：ＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＧ（配列番号３４）およびＧＪＣ  ７７Ｒ：ＣＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＣＡＴＡＡＡＣＴＧ（配列番号３５）を用いて、ハムスターゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により、イントロン１０の部分配列を得た。
【０１２２】
次に、上記のようにクローン化したＦＵＴ８ｃＤＮＡ、イントロン９およびイントロン１０配列を、ＦＵＴ８内のＺＦＮ結合の設計のために用いた。特に、ＦＵＴ８  ｃＤＮＡ（図１）配列を、亜鉛フィンガーヌクレアーゼによる認識に好都合の部位に関して走査し、Ｆｕｔ８酵素モチーフと重複したこのような一位置を同定した（図４）。さらに、イントロンＤＮＡ（図３）も、潜在的ＺＦＮ結合部位に関して走査した。
【０１２３】
ＦＵＴ８内の配列を認識するために、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）のいくつかの対を設計した。ＦＵＴ８遺伝子中の２つのＺＦＮのおおよその位置を、図４に示す。亜鉛フィンガー認識ヘリックスの配列およびＤＮＡ配列（それらは認識するよう設計される）を、表１に列挙する。ＦＵＴ８  ＺＦＮをコードする配列を含むプラスミドを、本質的にUrnov et al. (2005) Nature 435(7042): 646-651に記載されたように構築した。
【０１２４】
実施例２：Ｃｅｌ−１ミスマッチアッセイ
ＦＵＴ８標的化ＺＦＮが予測どおり内因性ＦＵＴ８遺伝子座を修飾したか否かを確定するために、本質的にメーカーの使用説明書（Trangenomic SURVEYOR（登録商標））に従ってＣｅｌ−１ミスマッチアッセイを実施した。要するに、適切なＺＦＮプラスミド対をＣＨＯ  Ｋ−Ｉ細胞中にトランスフェクトした。ＣＨＯ  Ｋ−Ｉ細胞をAmerican Type Culture Collectionから入手して、１０％規格ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Hyclone）を補足したＦ−１２培地（Invitrogen）中で推奨されたように増殖させた。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）プロテアーゼ（Invitrogen）を用いて、細胞をプラスチック容器から引き離した。トランスフェクションのために、１００万個のＣＨＯ  Ｋ−１細胞を１μｇの各亜鉛フィンガーヌクレアーゼおよび１００μｌのAmaxa溶液Ｔと混合した。プログラムＵ−２３を用いてAmaxa  NucleofectorＩＩ（登録商標）中で細胞をトランスフェクトし、１．４ｍＬの温Ｆ−１２培地＋１０％ＦＣＳ中に回収した。
【０１２５】
トランスフェクションの２日後に細胞を収穫し、Masterpure（登録商標）ＤＮＡ精製キット（Epicentre）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。Accuprime（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて、ＦＵＴ８遺伝子座の適切な領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応を９４℃に加熱し、漸次室温に冷却した。約２００ｎｇのアニール化ＤＮＡを０．３３μＬのＣＥＬ−Ｉ（登録商標）酵素（Transgenomic）と混合し、４２℃で２０分間インキュベートした。１×トリス−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液中でポリアクリルアミドゲル電気泳動により、反応産物を分析した。
【０１２６】
図５Ａおよび５Ｂに示したように、ＦＵＴ８  ＺＦＮは内因性ＦＵＴ８遺伝子座を修飾した。特に、ＺＦＮ１２０２９およびＺＦＮ１２０３０のＺＦＮ対は、３．３％の染色体の修飾を生じた（図５Ａ）。ＺＦＮ対１２１７０／１２１７６および１２１７２／１２１７６は、それぞれ３．０％および４．４％の染色体を修飾した（図５Ｂ）。
【０１２７】
実施例３：遺伝子型解析
ＦＵＴ８欠失クローンも、遺伝子レベルで解析した。二重突然変異体クローンを迅速に同定するために、レクチン  レンズマメ  アグルチニン（ＬＣＡ、Vector Laboratories）に対するフコシル化欠陥ＣＨＯ細胞の耐性に基づいた表現型スクリーンを用いた。ＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ１３は、野生型ＣＨＯ細胞より５０倍高いＬＣＡの濃度でそれを増殖させるフコース生合成遺伝子ＧＭＤにおける突然変異を含有する（例えばRipka et al. (1986) Somat Cell Mol Genet 12: 51-62；Ohyama et al. (1998) J Biol Chem 273: 14582-7参照）。ＦＵＴ８−／−細胞は、蛍光標識ＬＣＡを結合できない（Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22参照）。したがって、ＦＵＴ８−／−細胞もＬＣＡ中での増殖に耐性である、とわれわれは推論した。
【０１２８】
ＺＦＮ対１２１７０／１２１７６を用いて実施例２に記載したように細胞をトランスフェクトしたが、但し、トランスフェクション後６〜３０日に、ＺＦＮ処理細胞を、約０．４細胞／ウエルで、限定希釈で、９６ウエルフォーマット中にプレート化した。２週間増殖後、ウエル当たりのクローン数を数えて、細胞を１×ＰＢＳ中で洗浄し、２０μＬのTrypLE Select（登録商標）（Invitrogen）を付加した。１０μＬの解離細胞を、Ｆ−１２培地＋１０％  ＦＣＳ＋５０μｇ／ｍＬのＬＣＡを含有する平行９６ウエルプレートに移した。１００μＬのＦ−１２培地＋１０％  ＦＣＳを、元の９６ウエルプレート中の残りの１０μＬの細胞に付加した。ＬＣＡ含有プレート中の細胞の形態を、１８時間後にスコアした。ＬＣＡの存在下で野生型非円形ＣＨＯ−ＫＩ形態を保持するクローンが認められた。非ＬＣＡ処理プレートからの対応するコロニーを拡張した。元のウエルが１つより多いクローンを含有することが判明した場合（したがって、ＬＣＡ中で増殖した場合、円形野生型出現細胞の混合物も生じる）、ウエルの内容物を上記のように再希釈クローン化した。
【０１２９】
ゲノムＤＮＡを非ＬＣＡ処理ＬＣＡ耐性細胞から収穫し、ＦＵＴ８遺伝子座の一部を、オリゴＧＪＣ  ７５Ｆ：ＡＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＧＣＡＣＴＧ（配列番号３４）およびＧＪＣ  ９１Ｒ：ＴＧＴＴＡＣＴＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣ（配列番号７）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３０】
ＰＣＲ産物の半分（約２００ｎｇ）を、上記のようにＣＥＬ−Ｉアッセイを用いて解析し、一方、他の半分をゲル精製した。ＣＥＬ−Ｉ陰性（ホモ接合体）であった精製帯域を、直接シーケンシングした。ＣＥＬ−Ｉ陽性帯域をＴｏｐｏ（登録商標）クローン化し（Invitrogen）、２つの対立遺伝子を回収するまでクローンをシーケンシングした。
【０１３１】
このようにして解析した６００クローンのうち、２８はＬＣＡに対して耐性であった（４．７％）。２８のＬＣＡ耐性細胞株のうちの１５は、単一細胞クローンであった。細胞株を、ＬＣＡに曝露されなかった培養の半分から拡張した。これらのクローンのＦＵＴ８遺伝子型を、表２に示す。ここに示した配列の領域は、図４に示したものと同一である。いくつかのクローンに認められる小挿入を含有する対立遺伝子配列を収容するために、５つの塩基対ギャップが野生型配列のこの表示に挿入されている。対立遺伝子はＡおよびＢとして示されている：対立遺伝子の指示がないクローンは、ホモ接合性である。クローン１２−Ｂは、ハムスターリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列の１４８ｂｐの挿入ならびに指示された欠失を含有する。
【０１３２】
【表２】
2015172081.tif 000003
【０１３３】
【表３】
2015172081.tif 000004
【０１３４】
シーケンシングされたすべてのクローンに関して、ＦＵＴ８の両対立遺伝子を修飾した。クローンのうちの５つはホモ接合性であった。遺伝子型分類は、２〜３８塩基対間の欠失ならびに１〜５塩基対の小挿入を有するクローンも明示した。クローン１２の対立遺伝子Ｂは、ハムスターｒＤＮＡ配列の１２塩基対欠失ならびに１４８塩基対挿入を含有した。
【０１３５】
実施例４：二重ＺＦＮ修飾によるＦＵＴ８の破壊
イントロンＺＦＮ対ＺＦＮ１２０２９／１２０３０およびエキソン対ＺＦＮ１２１７２／１２１７６の同時トランスフェクションにより、ＦＵＴ８におけるより大きな欠失（ＦＵＴ８の１３００ｂｐ、エキソン１０の大部分を含む）も作製した。特に、ＺＦＮ  １２０２９、１２０３０、１２１７２および１２１７６の各々１μｇを、上記のようにＣＨＯ  Ｋ−Ｉ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に細胞を収穫し、ゲノムＤＮＡを精製した。ＤＮＡをＥｃｏＲ  ＩおよびＸｍｎ  Ｉで消化して、野生型染色体を破壊し、オリゴＧＪＣ  ７１Ｆ：ＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧ（配列番号４）およびＧＪＣ  ９１Ｒ：ＴＧＴＴＡＣＴＴＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣ（配列番号７）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３６】
結果を図６Ａに示す。これは、予測サイズの断片が生成されたことを実証する。
【０１３７】
ＣＨＯ細胞株も、その後、ＬＣＡ濃縮を伴う場合と伴わない場合とで、ＦＵＴ８遺伝子を標的にするＺＦＮの異なる対で処理した。実施例２に上記したように、ＺＦＮプラスミドによるトランスフェクションの２および３０日後に、ＣＥＬ−Ｉアッセイを実施した。
【０１３８】
図６Ｂに示したように、ＬＣＡ処理は、ＦＵＴ８−／−細胞のパーセンテージの有意の増大を生じた。
【０１３９】
実施例５：付加的遺伝子の不活性化
ＦＵＴ８および付加的遺伝子が不活性化された細胞株も作製した。特に、ＤＨＦＲおよびＧＳに向けられる亜鉛フィンガーヌクレアーゼを、米国特許公開番号２００６／００６３２３１および米国特許２００８／０１５１６４に記載されたように設計し、構築した。ＤＨＦＲおよびＧＳ標的化ＺＦＮを、実施例２に記載したようにＣＨＯ細胞中に導入し、ＧＳ-/-／ＤＨＦＲ-/-ＣＨＯ細胞株を作製した。
【０１４０】
その後、ＧＳ-/-／ＤＨＦＲ-/-ＣＨＯ細胞株を、ＦＵＴ８遺伝子を標的にするＺＦＮの４つの異なる対（プール１、３、５および７）のいずれかで処理した。各プールをＬＣＡに付して、ＦＵＴ８発現が破壊された集団（図７、ＬＣＡ濃縮を伴う）に関して選択した。上記のようなＬＣＡ選択および非選択（図７、ＬＣＡ濃縮なし）プールの両方に関して、ＣＥＬ−Ｉアッセイを実施した。
【０１４１】
図７に示したように、ＬＣＡ選択プール中のＦＵＴ８遺伝子の破壊コピーの頻度は、３４％と高かった（ＬＣＡ濃縮を伴うプール１）。
【０１４２】
プール＃１またはプール＃５から単離された種々の三重ノックアウトクローンの遺伝子型分類解析も、本質的に上記の実施例３に記載したように実施した。図８に示したように、プール＃１からスクリーニングされた７５のクローンのうち、３３（または約４４％）を、ＦＵＴ８遺伝子の両コピーで修飾した。
【０１４３】
最後に、ＤＨＦＲ、ＧＳおよびＦＵＴ８がＺＦＮでの処理により破壊されたＣＨＯ細胞も、蛍光ＬＣＡを結合するそれらの能力に関して試験した。約１００，０００個の細胞をトリプシン処理し、１×ＰＢＳで洗浄し、２μｇ／ｍＬのフルオレセイン−ＬＣＡ（Ｆ−ＬＣＡ）と混合した。Ｆ−ＬＣＡ結合を、フローサイトメトリーによりアッセイした（Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotech. Bioeng. 87: 614）。図９に示したように、蛍光ＬＣＡは、ＧＳ、ＤＨＦＲおよびＦＵＴ８遺伝子が破壊されている細胞と結合しない。したがってＦＵＴ８および１、２個（またはそれより多い）の遺伝子のいずれかが不活性化される細胞を、当該組換えタンパク質の発現（過剰発現）のために用いる。
【０１４４】
これらの結果は、ＦＵＴ８遺伝子を切断するために標的化されたＺＦＮを用いたＦｕｔ８欠陥細胞株の迅速な生成を示す。切断の部位でのＮＨＥＪの誤りがちなプロセスによるＤＮＡ修復は、機能的に有害な突然変異を生じた。ＮＨＥＪ由来突然変異は時として慣用的遺伝子破壊により作られたものに比して小さいが、しかしＦＵＴ８の重要な触媒領域をコードするＤＮＡに対してこれらの突然変異を標的にする本明細書中に記載されるＺＦＮの能力は、小さいインフレーム対立遺伝子でも、酵素活性の重度の欠陥を生じる、ということを保証した。例えば、ロイシン４１３のみのホモ接合性欠失（クローン５、８、９および１５）は、ＬＣＡに耐性の細胞を生じた。
【０１４５】
さらに、しばしばあつらえた遺伝子または表現型変化を伴ってＣＨＯ細胞株の多数の異なるサブタイプが存在するが、しかし本明細書中に記載されるＺＦＮは、任意の細胞株またはサブタイプにおいてＦＵＴ８を迅速に破壊するために用いられ得る。さらに、哺乳類種間で保存される亜鉛フィンガータンパク質結合部位が選択されるため、ＺＦＮは、任意の種に由来する細胞株中のＦＵＴ８を不活性化するよう設計され得る。
【０１４６】
実施例６：Ｆｕｔ８低次形態
ＦＵＴ８のＺＦＮ修飾を有するいくつかのＣＨＯ細胞は、それらの野生型Ｆｕｔ８活性の分画を保持し得る。このような細胞は、初期スクリーンを実施するために用いられる相対的に低濃度のＬＣＡ（５０μｇ／ｍＬ）に耐性であり得るが、しかしより高濃度のＬＣＡに対しては依然として感受性である。
【０１４７】
実施例２に記載したように細胞をトランスフェクトし、５０μｇ／ｍＬのＬＣＡに対する耐性に関してスクリーニングして、実施例３と同様に遺伝子型分類した。個々のクローンのＣＥＬ−Ｉアッセイおよびこれらのクローンの遺伝子型を、図１０に示す。５０μｇ／ｍＬのＬＣＡを用いたこの一次スクリーニング後、より高濃度のＬＣＡを用いてこれらの初期ＺＦＮ修飾ＬＣＡ耐性細胞株の二次スクリーニングを実施して、低次形態を同定した。５０μｇ／ｍＬのＬＣＡに耐性である細胞株を、１００、２００、４００および８００μｇ／ｍＬのＬＣＡ中での増殖に関してアッセイした。このようにして試験した１６の細胞株のうち１１は、８００μｇ／ｍＬのＬＣＡで野生型増殖および細胞形態を示した。試験した１６の細胞株のうち５つは、８００μｇ／ｍＬより低いＬＣＡ濃度下でのみ、野生型増殖および細胞形態を示した。中等度のＬＣＡ耐性を有するこれら５つのクローンは、したがって、Ｆｕｔ８活性に関して低次形態性である。Ｆｕｔ８低次形態は、ＺＦＮ結合部位間の３つのヌクレオチド（ＡＴＴ）挿入の存在と完全に相関した。この挿入は、位置４１５でハムスターＦｕｔ８タンパク質に１つのロイシン残基を付加する。これらのクローンの各々における他の対立遺伝子は、酵素活性を排除することが予測される。これら５つのクローンのうちの２つはクローン１４およびクローン１９であり、図１０に示されている。
【０１４８】
ＬＣＡ耐性滴定で発見された低次形態を、細胞表面曝露α１−６−結合フコースと結合する蛍光−ＬＣＡ（Ｆ−ＬＣＡ）のアッセイにより確証した。解析した各細胞株に関して、約１００，０００個の細胞をトリプシン処理し、１×ＰＢＳで洗浄し、２μｇ／ｍＬのフルオレセイン−ＬＣＡ（Ｆ−ＬＣＡ）と混合した。Ｆ−ＬＣＡ結合を、フローサイトメトリー（Guava Technologies）によりアッセイした。Ｆ−ＬＣＡ結合により検査した低次形態クローンはすべて、野生型より約５倍低いＦ−ＬＣＡ結合を有した。８００μｇ／ｍＬのＬＣＡに耐性であるクローンはすべて、Ｆ−ＬＣＡを結合する能力を示さなかった。野生型ＣＨＯ−ＫＩ細胞およびこのような一低次形態クローンの染色を、図１１に示す。
【０１４９】
本明細書中で言及される特許、特許出願および出版物はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【０１５０】
理解し易くする目的のために例証および実施例により開示を多少詳細に提供してきたが、本開示の精神または範囲を逸脱しない限り、種々の変更および修正がなされ得ることは、当業者に明らかである。したがって前記の説明および実施例は、本発明を限定するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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