(57)【要約】【課題】煩雑な測定準備及び操作を必要とせず、短い測定時間で、効率よく、血液、尿等の様々な検体に含まれる種々の成分を測定することを可能にする免疫クロマト分析装置を提供することを課題とする。【解決手段】試料添加部１２、標識物質保持部１３、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部１４及び吸収部１５を含む免疫クロマト分析装置１であって、試料添加部１２中に陰イオン性界面活性剤を含有し、被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置１によって上記課題を解決した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置。
【請求項２】
前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた１種である請求項１記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項３】
前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する請求項１又は２に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項４】
前記被検出物質が血液中の糖化タンパク質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項５】
前記血液中の糖化タンパク質がＨｂＡ１ｃである請求項４に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項６】
前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項７】
陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
【請求項８】
前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を０．０１〜５質量％することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの検体に含まれる種々の成分を測定することは、患者の健康状態を把握する上で臨床上極めて重要であり、従来、その成分に応じて各種の測定方法が採用されている。その一つとして、検体に含まれる被検出物質を免疫反応により発色させ、その発色シグナルを確認する免疫クロマト分析装置及び分析方法が知られている。
【０００３】
一方、世界の糖尿病患者数は、２０１１年で３億６６００万人存在し、２０３０年は５億５２００万人（成人人口の約１０％）にも及ぶと予測されている。またいわゆる糖尿病予備軍もそれと同等以上であると考えられる。従来、糖尿病の診断は血糖値を測定することによりなされていたが、近年では、血中のヘモグロビンに糖が結合した糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン）、とくにヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」と言う）の総ヘモグロビン量に対する濃度が、過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病の診断や糖尿病の経過観察に適した指標として使用されつつある。
【０００４】
しかし従来においてＨｂＡ１ｃの測定は、ＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素法、免疫学的測定法等により実施されるが、これらの方法は特定の装置や分析に対する専門的知識を必要とするために、小規模の病院や家庭等ではＨｂＡ１ｃの値を簡単に知ることができない、という問題点があった。
【０００５】
また、ＨｂＡ１ｃの血中濃度は、血中成分に個人差が存在するため、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンも同時に測定し、ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンとの総ヘモグロビン量に対するＨｂＡ１量の比率を把握することで、糖尿病の陰性または陽性を判定していたが、この場合、ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンを個別に上記手段によって測定する必要があるため、測定の煩雑さがさらに悪化するという問題点も存在する。
【０００６】
そこで、例えば、特許文献１には、ＨｂＡ１ｃを簡易的に測定する方法が提案され、ここで使用される免疫クロマト分析装置は、図３（ａ）の断面図、（ｂ）の平面図に示されるように、プラスチック製粘着シートａ上に、サンプルパッドｂ、標識物質で標識された粒子標識抗体含有パッドｃ、抗体固定化メンブレンｆ、吸水パッドｇがこの順で装置の長手方向に沿ってそれぞれ設けられ、抗体固定化メンブレンｆ上には、抗ＨｂＡ１ｃ抗体が塗布された抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部ｄ、抗ＨｂＡ０抗体が塗布された抗ＨｂＡ０抗体塗布部ｅがそれぞれ設けられ、免疫クロマト分析装置３０を構成している。
【０００７】
ＨｂＡ１ｃの血中濃度を測定する際は、図４のフローチャートに示すように、まず、採取した血液と、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端をタンパク質表面に露出させる成分（Ｎ末端露出剤）とを混合し（Ｓ４０１）、数分間静置し、ＨｂＡ１ｃのエピトープをヘモグロビンタンパク質の表面に露出させ、試料液を作成する（Ｓ４０２）。得られた試料液の適当量をサンプルパッドｂに滴下する（Ｓ４０３）。
【０００８】
続いて、サンプルパッドｂにさらに展開液を適当量滴下し（Ｓ４０４）、試料液を毛細管現象により抗体固定化メンブレンｆ上で展開させる（Ｓ４０５）。抗体固定化メンブレンｆ上を展開した試料液は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部ｄに到達し、ここで試料液中のＨｂＡ１ｃのみが反応し、検出される（Ｓ４０６）。
【０００９】
続いてさらに抗体固定化メンブレンｆ上を展開した試料液は、抗ＨｂＡ０抗体塗布部ｅに到達し、試料液中のＨｂＡ０のみが反応し、検出される（Ｓ４０７）。その他のヘモグロビンは反応せずに吸水パッドｇまで移動する（Ｓ４０８）。このようにして、試料液中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１２−２５１７８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、前記の従来の免疫クロマト分析装置を用いた場合、採取した血液と、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端をタンパク質表面に露出させる成分（Ｎ末端露出剤）とを混合する工程（Ｓ４０１）と、数分間静置して試料液を作成する工程と（Ｓ４０２）、試料液をサンプルパッドｂに滴下する工程と（Ｓ４０３）、さらに展開液を別途準備してこれをサンプルパッド上に滴下する工程と（４０４）を有するため、試料液及び展開液の２液を必要とするとともに、これらを別々にサンプルパッドｂに滴下する必要があり、測定準備及び操作が煩雑であり、また測定時間がかかり、効率性が悪いという問題点があった。
【００１２】
そこで本発明の目的は、上述の従来の課題を解決し、煩雑な測定準備及び操作を必要とせず、短い測定時間で、効率よく、血液、尿等の様々な検体に含まれる種々の成分を測定することを可能にする免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、被検出物質を含む検体を添加する試料添加部（サンプルパッド）に、陰イオン性界面活性剤を含有させることにより、上記のような従来の課題を解決できることを見出し、本発明を完成することができた。
【００１４】
すなわち本発明は、以下の通りである。
１．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置。
２．前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた１種である前記１記載の免疫クロマト分析装置。
３．前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する前記１又は２に記載の免疫クロマト分析装置。
４．前記被検出物質が血液中の糖化タンパク質である前記１〜３のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置。
５．前記血液中の糖化タンパク質がＨｂＡ１ｃである前記４に記載の免疫クロマト分析装置。
６．前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である前記１〜５のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置。
７．陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
８．前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する前記７に記載の方法。
９．前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を０．０１〜５質量％含有することを特徴とする前記８に記載の方法。
１０．前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する前記７〜９のいずれか１項に記載の方法。
１１．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キットは、試料添加部に陰イオン性界面活性剤を含有しているので、従来のように試料液及び展開液の２液を必要とせず、被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の１液のみを試料添加部に滴下すればよく、煩雑な測定準備及び操作を必要とせず、短い測定時間で、効率よく、血液、尿等の様々な検体に含まれる種々の成分を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明の免疫クロマト分析装置の一例を説明するための概略図であり、図１（ａ）は断面図、図１（ｂ）は平面図である。
【図２】図２は、本発明の免疫クロマト分析キットを用いてＨｂＡ１ｃの血中の総ヘモグロビン量に対する濃度を測定する際のフローチャートである。
【図３】図３は、従来技術の免疫クロマト分析装置を説明するための概略図であり、図３（ａ）は断面図、図３（ｂ）は平面図である。
【図４】図４は、従来技術の免疫クロマト分析装置を用いてＨｂＡ１ｃの血中の総ヘモグロビン量に対する濃度を測定する際のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１８】
本発明に用いられる検体は、例えば血液、血漿、血清のような血液試料、尿、唾液、髄液、汗、涙、羊水、乳頭分泌液、鼻汁、痰、鼻腔又は咽頭拭い液、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び糞便からの抽出物等が挙げられる。
【００１９】
本発明における被検出物質としては、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）等の腫瘍マーカー物質、フェリチン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）等の血清タンパク質、リューマチ因子、成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）等のホルモン関連物質、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、クラミジア抗原、Ａ群溶連菌抗原等の細菌抗原、およびヘモグロビン由来のタンパク質等が挙げられ、好ましくは血液中の被検出物質、例えば、ヘモグロビン由来のタンパク質、血漿タンパク、リポタンパク、分泌タンパク、ホルモン、補体、脂質、コレステロール、糖、その他生体内成分、生体内投与薬物およびその代謝産物等が挙げられる。中でも本発明の効果の観点から、血液中の糖化アルブミンや糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質であることが好ましく、ＨｂＡ１ｃであることがより好ましい。以下、被検出物質としてＨｂＡ１ｃを、陰性または陽性の判定の基準となる物質としてＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンを例として説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
【００２０】
本発明の免疫クロマト分析装置は、試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む。以下、図面を参照しながら本発明のクロマト分析装置について説明する。図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明の免疫クロマト分析装置の一例を説明するための概略図であり、図１（ａ）は断面図、図１（ｂ）は平面図である。
【００２１】
図１に示すように、免疫クロマト分析装置１は、プラスチック製粘着シート１１上に、試料添加部１２、標識物質で標識された抗ヘモグロビン抗体を含有する標識物質保持部１３、クロマトグラフ媒体部１４、吸収部１５の順でキットの長手方向に沿ってそれぞれ設けられている。
【００２２】
また、クロマトグラフ媒体部１４上には、検出部として、抗ＨｂＡ１ｃ抗体が塗布された抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６、抗ヘモグロビン抗体が塗布された抗ヘモグロビン抗体塗布部１７、コントロールとして抗ＩｇＧ抗体が塗布された抗ＩｇＧ抗体塗布部１８がそれぞれ設けられている。
【００２３】
プラスチック製粘着シート１１は、免疫クロマト分析装置１の基材をなすものであり、片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより片面が粘着面となり、該粘着面上に下記の各構成部位の一部または全部が密着する。プラスチック製粘着シート１１の材質は、試料に対して不透過性、非透湿性となるようなものを適宜選択すればよい。
【００２４】
試料添加部１２は、下記で説明する検体含有液を迅速に吸収するが、保持力は弱く、速やかに抗原抗体反応領域へと検体含有液が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、グラスファイバー、セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、綿布等から構成されたパッド、繊維、メンブレン等が挙げられる。中でも、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた１種を用い、試料添加部１２を構成するのが好ましい。
【００２５】
試料添加部１２は、陰イオン性界面活性剤を含有する。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のアルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルメチルアラニン、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩等のアシルアミノ酸塩、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、βナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩及び特殊ポリカルボン酸型高分子界面活性剤等が挙げられ、中でも本発明の効果が向上するという観点から、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のアルキル硫酸塩がとくに好ましい。
【００２６】
試料添加部１２は、陰イオン性界面活性剤を、例えば、８〜８００μｇで含有することができ、１０〜５００μｇで含有するのが好ましく、１６〜４８０μｇで含有するのがより好ましい。
試料添加部１２に陰イオン性界面活性剤を乾燥保持するには、凍結乾燥、熱風乾燥、自然乾燥等の手段を適宜採用すればよい。
【００２７】
陰イオン性界面活性剤は、採取した血液中のＨｂＡ１ｃのエピトープをヘモグロビンタンパク質の表面に露出させる機能を有する。具体的には、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端をタンパク質表面に露出させる成分（Ｎ末端露出剤）として機能する。
【００２８】
このとき、試料添加部１２を構成する素材として、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた１種を用いた場合に、ＨｂＡ１ｃと陰イオン性界面活性剤との接触効率が高くなり、陰イオン性界面活性剤がＮ末端露出剤として効率的に作用するという効果を奏する。
【００２９】
また試料添加部１２には、必要に応じて、チオシアン酸ナトリウム、グアニジン塩酸塩、ＥＤＴＡ等の各種添加剤を添加することもできる。
【００３０】
標識物質保持部１３は、例えば標識物質で標識された抗ヘモグロビン抗体を保持する。標識物質保持部１３における抗ヘモグロビン抗体は、検体含有液中のヘモグロビンに対して特異的に結合し得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体等が挙げられる。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントは、公知であり、入手可能であり、公知の方法により調製することができる。
【００３１】
抗体産生動物種としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。モノクローナル抗体は、常法に従って、抗原で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する［例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照］。ポリクローナル抗体は、常法により、抗原を産生動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。
【００３２】
標識物質としては、視覚的に着色を確認できる有色物質が好ましく、当業界で公知のものを適宜採用できる。例えば、金属コロイド粒子、非金属コロイド粒子、着色ラテックス及び酵素標識等が挙げられるが、時間が経過しても退色し難い金属コロイド粒子が標識の安定性の観点からとくに好ましい。金属コロイド粒子としては、金、白金、銅、銀及びパラジウムコロイドの他、それらを混合した粒子等を使用することができ、とくに金コロイド粒子は適当な粒径において赤色を呈する点で好ましい。
【００３３】
金属コロイド粒子の平均粒径は、例えば、１〜５００ｎｍ、強い色調が得られる点で、好ましくは１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、より好ましくは２０〜１００ｎｍの範囲内である。非金属コロイド粒子として、セレニウムコロイド等を例示することができる。金属コロイド及び非金属コロイド粒子は、常法により調製することができ、このとき、粒径は所望の色調を呈するよう調節される。また、市販品を利用することもできる。
【００３４】
着色ラテックスは、ポリスチレン等の高分子重合体の粒子が赤や青色を呈する着色剤により着色したものが挙げられ、常法により調製することができる。酵素標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びガラクトシダーゼ等が挙げられる。酵素標識を使用する場合、当該酵素に対する基質及び必要に応じて発色試薬を作用させ、その反応により生じる発色を検出する。
【００３５】
なお、標識物質で標識された抗体の調製は、公知の手段にしたがって行うことができる。例えば金コロイド粒子を抗体に担持する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が挙げられ、具体的には、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液などのブロッキングタンパクを添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製することができる。また、抗原抗体反応は、公知のサンドイッチ法、競合法や、それらを組み合わせた方法を採用することができる。
【００３６】
標識物質保持部１３の材質としては、例えば、グラスファイバー、セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリアセテート、ナイロンまたは綿布等が挙げられる。
【００３７】
クロマトグラフ媒体部１４は、毛細管現象により試料検体を吸収し移動させることができるものであればよく、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラスファイバー、ポリオレフィン、セルロース及びこれらの混合繊維等から構成することができる。
【００３８】
クロマトグラフ媒体部１４上に設けられた、抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６、抗ヘモグロビン抗体塗布部１７、抗ＩｇＧ抗体塗布部１８は、例えば、それぞれの抗体を担持固定できる材料から構成され、該材料としては、例えば、ニトロセルロース等が挙げられる。
【００３９】
吸収部１５は、過剰の検体含有液を迅速に吸収する能力を有する材料が挙げられ、セルロース繊維、ガラス濾紙等が用いられる。
【００４０】
次に本発明の免疫クロマト分析方法について説明する。本発明の免疫クロマト分析方法は、上記で説明した免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出するものであって、以下の工程（１）〜（４）を含む。
（１）検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
【００４１】
以下、各工程について説明する。
（１）工程においては、まず、検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を調製する。検体希釈液は、（３）工程における検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させるための展開液として作用することができる。検体希釈液は、展開性が良好でありかつ抗原抗体反応を阻害しないという観点から、非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。
【００４２】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−ノニルフェニルエーテル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド及びアルキルモノグリセリルエーテル等を挙げることができる。
【００４３】
検体希釈液は、例えば、水を溶媒とし、非イオン性界面活性剤を、例えば、０．０１〜５質量％の割合で含有することができ、０．０３〜３．０質量％の割合で含有するのが好ましく、０．３〜３．０質量％の割合で含有するのがより好ましい。また、ｐＨを調整するためにバッファー類、無機塩類等の添加剤を適宜添加してもよい。
【００４４】
また、本発明の効果が向上するという観点から、試料添加部１２が含有する陰イオン性界面活性剤と、検体希釈液が含有する非イオン性界面活性剤との割合に一定の比率を持たせるのが好ましく、具体的には、該陰イオン性界面活性剤：該非イオン性界面活性剤（質量比）として、９：１〜１：９０であるのが好ましく、３：１〜１：６０であるのがより好ましい。
【００４５】
上記のようにして得られた検体希釈液と、患者から採取した血液とを混合し、検体含有液を調製し、試料添加部１２に滴下する。なお、患者からの血液の採取場所は、指、歯茎、腕静脈、耳等が挙げられる。
検体含有液に含まれるＨｂＡ１ｃは、試料添加部１２に含まれる陰イオン性界面活性剤によって、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端がタンパク質表面に露出し、毛細管現象により標識物質保持部１３に到達する。
【００４６】
（２）工程において、標識物質保持部１３に到達した検体含有液中のヘモグロビンは、標識物質により標識された抗ヘモグロビン抗体と抗原抗体反応することで、複合体を形成する。すなわち、被検出物質であるＨｂＡ１ｃも標識物質保持部１３に保持されている標識物質により認識されることになる。
【００４７】
（３）工程においては、検体及び標識物質、すなわち検体含有液と、抗ヘモグロビン抗体とヘモグロビンの複合体が移動相としてクロマトグラフ媒体部１４に展開される。このとき、検体含有液に含まれる非イオン性界面活性剤が該展開の展開性を良化し、また続く抗原抗体反応を阻害しない効果を奏することは上述の通りである。
【００４８】
続いて、（４）工程において、クロマトグラフ媒体部１４に展開された移動相中の被検出物質であるＨｂＡ１ｃは、抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６に到達し、ＨｂＡ１ｃはそこを通過する間に抗ＨｂＡ１ｃ抗体と反応して固定化される。ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビン及び検体含有液は、抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６を反応せずに通過するが、抗ヘモグロビン抗体塗布部１７に到達すると、ＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンは抗ヘモグロビン抗体と反応し固定化される。
【００４９】
なお、抗原と反応しなかった標識物質や抗体塗布部１６及び１７で反応しなかった標識物質は抗ＩｇＧ抗体塗布部１８で抗ＩｇＧ抗体と反応し固定化され、展開が正常に行われていることを示すコントロールとして発色する。その他の試料液成分は反応せずに吸収部１５まで移動する。このようにして、各塗布部においてＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンの存在による発色シグナルが確認できる。なお、抗ＨｂＡ１ｃ抗体及び抗ヘモグロビン抗体は、前述のようなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００５０】
血中成分には個人差が存在し、単にＨｂＡ１ｃを発色させてその強度を確認しただけでは、糖尿病の判定は困難である。そこで、ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンを同時に発色させ、両者の発色度合いの比較から該判定を行うのがよい。
【００５１】
具体的には、例えば、ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンの発色シグナルを比較し、ＨｂＡ１ｃの発色シグナルがＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンのそれよりも強い場合、陽性と判定することができる。逆にＨｂＡ１ｃの発色シグナルがＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビンと同等またはそれよりも弱い場合、陰性と判定することができる。
【００５２】
本発明の免疫クロマト分析キットは、前記陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部１２、標識物質保持部１３、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部１４及び吸収部１５を含む本発明の免疫クロマト分析装置と、前記検体を希釈して展開するための非イオン性界面活性剤を含有する検体希釈液とからなる。
【００５３】
図２は、本発明の免疫クロマト分析キットを用いてＨｂＡ１ｃの血中の総ヘモグロビン量に対する濃度を測定する際のフローチャートである。
【００５４】
図２のフローチャートに示すように、まず、採取した血液と検体希釈液とを混合し、検体含有液を調製する（Ｓ２０１）。得られた検体含有液の適当量を試料添加部１２に滴下する（Ｓ２０２）。続いて、検体含有液を毛細管現象により標識物質保持部１３上で展開させる（Ｓ２０３）。標識物質保持部１３上を展開した検体含有液は、クロマトグラフ媒体部１４に担持された抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６に到達し、ここで試料液中のＨｂＡ１ｃのみが反応し、検出される（Ｓ２０４）。
【００５５】
続いてさらにクロマトグラフ媒体部１４上を展開した検体含有液は、抗ヘモグロビン抗体塗布部１７に到達し、検体含有液中の抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６で反応しなかったヘモグロビンが反応し、検出される（Ｓ２０５）。その他の試料液成分は反応せずに吸収部１５まで移動する（Ｓ２０６）。このようにして、試料液中のＨｂＡ１ｃ以外のヘモグロビン及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ検出される。
【００５６】
本発明ではＮ末端露出剤である陰イオン性界面活性剤を試料添加部１２に含有させているので、従来技術のようにＮ末端露出剤を含有する試料液及び展開液の２液を用意し、かつこれらの２液を個別に試料添加部１２に滴下する必要がない。
【００５７】
したがって、本発明では、煩雑な測定準備及び操作を必要とせず、短い測定時間で、効率よく、血液、尿等の様々な検体に含まれる種々の成分を測定することが可能となる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例及び比較例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されない。
【００５９】
実施例１
以下の手順で、図１に示すような免疫クロマト分析装置１を作製した。
（１）試料添加部１２の作製
グラスファイバーパッド（ミリポア社製商品名グラスファイバーコンジュゲートパッド、サイズ縦３２ｍｍ（検体含有液展開方向）、横１５０ｍｍ、厚さ０．４３ｍｍ）に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、６０μｇ／ｃｍ２の割合で均一に添加し、５０℃で４時間乾燥することにより、試料添加部１２を作製した。
【００６０】
（２）抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６、抗ヘモグロビン抗体塗布部１７、抗ＩｇＧ抗体塗布部１８の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２２５０ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５質量％のスクロース及び５質量％のイソプロパノールを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体または抗ＩｇＧモノクローナル抗体を希釈し、その希釈された溶液１５０μＬを抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）によりメンブラン上に１ｍｍの幅で別々の場所に塗布し、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部１４上に抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６、抗ヘモグロビン抗体塗布部１７、抗ＩｇＧ抗体塗布部１８をそれぞれ設けた。
【００６１】
（３）標識物質溶液の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：平均粒子径４０ｎｍ）０．５ｍＬに、Ｔｒｉｓ緩衝（ｐＨ８．５）で０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗ヘモグロビンモノクローナル抗体０．１ｍＬ加え、室温で１０分間静置した。次いで、０．０１質量％のＰＥＧ−ＳＨ（日本油脂株式会社製、商品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＳＨ、分子量２００００）を含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）を０．１ｍｌ加え（添加後のＰＥＧ−ＳＨ濃度：０．００１質量％）、室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍＬを加え、標識物質溶液を作製した。
【００６２】
（４）免疫クロマト分析装置１の作製
上記作製した標識物質溶液  ２２０μｌに１００μｌの２５質量％トレハロース水溶液を含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えたものを８ｍｍ×１００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部１３を作製した。次に、プラスチック製粘着シート１１上に、上記作製した試料添加部１２、標識物質で標識された標識物質保持部１３、クロマトグラフ媒体部１４を貼り合わせ、汎用の吸収部１５をさらに貼り合わせ、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置１を作製した。この時、一装置あたりに含有するＳＤＳの量は、９６μｇであった。
【００６３】
下記の処方にて、各成分を攪拌し、検体希釈液を調製した。
非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＳＩＧＭＡ  社製、商品名）とＴｗｅｅｎ２０（和光純薬社製、商品名）との１：５の質量比の混合物：１．２質量％
バッファーとしてのＢｉｃｉｎｅ緩衝液：５０ｍＭ
無機塩として塩化カリウム：０．６質量％
添加剤としてカゼインナトリウム：２．０質量％
残量：水
【００６４】
検体の採取
健康成人男性及び糖尿病男性患者それぞれの指先を穿刺することにより、各種ＨｂＡ１ｃ濃度を有する血液を採取した。
【００６５】
検体含有液の調製
前記血液と前記検体希釈液とを、前者：後者として（容量比）、１：１０００で混合し、検体含有液を調製した。
【００６６】
免疫クロマト分析の実施
上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置１の試料添加部１２に、前記検体含有液１１０μｌを供給し、１０分後の抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部１６における赤色の発色シグナルを目視で確認した。結果を表１に示す。
なお表中の評価基準は以下の通りである。
−：赤色の発色を確認できないもの
±：赤色の発色は確認できるが非常に色が薄いもの
＋：赤色の発色を確認できるもの
＋＋：強い赤色の発色を確認できるもの
＋＋＋：非常に強い赤色の発色が確認できるもの
【００６７】
実施例２
実施例１において、試料添加部１２の構成素材をグラスファイバーパッドから、セルロースファイバーパッド（旭化成せんい社製商品名ＳＲ−６０１）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表１に示す。
【００６８】
実施例３
実施例１において、試料添加部１２の構成素材をグラスファイバーパッドから、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）パッド（旭化成せんい社製商品名ベンリーゼ  Ａ−０１）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表１に示す。
【００６９】
実施例４
実施例１において、試料添加部１２の構成素材をグラスファイバーパッドから、ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製商品名ＨＦ１２０）に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表１に示す。
【００７０】
参考例１
実施例１において、ＳＤＳを添加しない試料添加部を用い、下記の組成を有するＮ末端露出剤を含有する抽出液に血液を添加し２分間静置して調製した試料液１０μｌと、下記の組成を有する展開液１００μｌとを、それぞれ個別に試料添加部１２に滴下したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表１に示す。
（抽出液の組成）
陰イオン界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム：１．０質量％
添加剤としてチオシアン酸ナトリウム：１００ｍＭ
添加剤としてＥＤＴＡ：５ｍＭ
残量：水
（展開液の組成）
非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＳＩＧＭＡ  社製、商品名）とＴｗｅｅｎ２０（和光純薬社製、商品名）との１：５の質量比の混合物：１．２質量％
バッファーとしてのＢｉｃｉｎｅ緩衝液：５０ｍＭ
無機塩として塩化カリウム：０．６質量％
添加剤としてカゼインナトリウム：２．０質量％
残量：水
【００７１】
参考例２
参考例１において、抽出液を用いずに、展開液に血液を添加したこと以外は、参考例１を繰り返した。結果を表１に示す。
【００７２】
参考例３〜５
参考例１において、抽出液を用いずに、展開液に表１に示す濃度のＳＤＳ及び血液を添加したこと以外は、参考例１を繰り返した。結果を表１に示す。
【００７３】
【表１】
2015210167.tif 000003
【００７４】
実施例５〜８
実施例１において、試料添加部１２に添加するＳＤＳの一装置あたりの含有量と検体希釈液に含有する非イオン界面活性剤の含有率とを表２に記載の値に変更したこと以外は、実施例１を繰り返した。結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
2015210167.tif 000004
【００７６】
表１及び表２の結果から、本発明の免疫クロマト分析装置を用いることにより、従来の参考例１のように試料液及び展開液の２液を必要とせず、検体含有液の１液のみを試料添加部に滴下すればよく、煩雑な測定準備及び操作を必要とせず、短い測定時間で、効率よく、血液、尿等の様々な検体に含まれる種々の成分を、従来の参考例１と同等に測定することができる。
【００７７】
参考例２は、ＳＤＳを添加しない試料添加部を用い、かつ展開液のみを用いた例であるので、ＨｂＡ１ｃの濃度が高くても、発色の度合いが貧弱であった。
【００７８】
参考例３〜５は、ＳＤＳを添加しない試料添加部を用い、かつ展開液にＳＤＳを添加した例であるが、参考例２よりも発色の度合いは改善されるものの、依然として満足されるレベルに到達することはできなかった。
【符号の説明】
【００７９】
１  免疫クロマト分析装置
１１  プラスチック製粘着シート
１２  試料添加部
１３  標識物質保持部
１４  クロマトグラフ媒体部
１５  吸収部
１６  抗ＨｂＡ１ｃ抗体が塗布された抗ＨｂＡ１ｃ抗体塗布部
１７  抗ヘモグロビン抗体が塗布された抗ヘモグロビン抗体塗布部
１８  抗ＩｇＧ抗体が塗布された抗ＩｇＧ抗体塗布部
【図１】
2015210167.tif 000005
【図２】
2015210167.tif 000006
【図３】
2015210167.tif 000007
【図４】
2015210167.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月25日(2014.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを展開するための免疫クロマトグラフ分析装置。
【請求項２】
前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた１種である請求項１記載の免疫クロマトグラフ分析装置。
【請求項３】
前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する請求項１又は２に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項４】
前記血液中の糖化タンパク質がＨｂＡ１ｃである請求項３に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項５】
前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項６】
陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる血液中の糖化タンパク質を検出する、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
【請求項７】
前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を０．０１〜５質量％することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して検体含有液の１液のみを展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体に含まれる被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
すなわち本発明は、以下の通りである。
１．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを展開するための免疫クロマトグラフ分析装置。
２．前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた１種である前記１記載の免疫クロマトグラフ分析装置。
３．前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する前記１又は２に記載の免疫クロマト分析装置。
４．前記血液中の糖化タンパク質がＨｂＡ１ｃである前記３に記載の免疫クロマト分析装置。
５．前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である前記１〜４のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置。
６．陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる血液中の糖化タンパク質を検出する、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
７．前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する前記６に記載の方法。
８．前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を０．０１〜５質量％することを特徴とする前記７に記載の方法。
９．前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を８〜８００μｇ含有する前記６〜８のいずれか１項に記載の方法。
１０．試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して検体含有液の１液のみを展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体に含まれる被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月12日(2015.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用い、非イオン性界面活性剤を含有する検体希釈液で希釈した検体に含まれる血液中の糖化タンパク質を検出する、以下の工程（１）〜（４）を含む（但し、検体含有液を試料添加部に添加する前に被検出物質のエピトープを露出させる工程を除く）免疫クロマト分析方法であって、
前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を０．３〜３．０質量％含有し、
前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を１６〜４８０μｇ含有する
免疫クロマト分析方法。
（１）検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
（３）検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
【請求項２】
前記試料添加部の素材がグラスファイバーである請求項１に記載の免疫クロマト分析方法。
【請求項３】
試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して検体含有液の１液のみを展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体に含まれる被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を０．３〜３．０質量％含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を１６〜４８０μｇ含有し、
前記検体希釈液中に被検出物質のエピトープを露出させる物質を含まない
免疫クロマト分析キット。
【請求項４】
前記試料添加部の素材がグラスファイバーである請求項３に記載の免疫クロマト分析キット。