(57)【要約】【課題】治療用ＴＰＯ／ＥＰＯ模倣ペプチドを含む抗体の提供。【解決手段】本開示は、治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）およびその治療的に活性な断片ならびにこの抗体および断片を調製し使用する方法を特徴付ける。例えば、この治療用抗体およびそれらの断片は、被験体において血小板レベルを増加させる方法などの様々な診断用途および／または治療用途において有用である。治療用抗体または上記抗体の治療的に活性な断片が提供され、上記抗体または上記断片が少なくとも２つの治療用ペプチドを含み、上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つは、上記治療用ペプチドが上記抗体の中央の裂け目に存在することを構造的に許容する位置において軽鎖ポリペプチドの定常領域内に組み込まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００９年２月２４日に出願された米国仮出願第６１／２０８，４８７号（この出願は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１０年２月１８日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＡＬＸＮ１４６ＷＯ１．ｔｘｔと題され、サイズは１８，９４６バイトである。
【０００３】
本発明の分野は、医薬、免疫学、分子生物学およびタンパク質化学である。
【背景技術】
【０００４】
血小板減少症は様々な疾患に関連し、多くの場合、血小板産生低下、血小板喪失、不完全な血小板の産生または血小板破壊の増加による血中血小板数の異常な低下を特徴とする。血小板減少症の症状は、例えば、倦怠感、あざの形成（例えば紫斑）および出血（例えば、鼻または歯茎から）を含む。血小板減少症関連疾患の一例は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）であり、これは、全身の微小血管における広範囲に及ぶ微小な血の塊の形成（血栓）を特徴とする障害である。治療しないまま放置した場合、患者の病態は急速に悪化し、重篤な神経障害、（例えば、昏迷または昏睡）、腎不全、発作および心停止を含み得る。治療しなかった場合のＴＴＰの死亡率は９０％を超える。
【０００５】
血小板減少症関連疾患は、放射線への曝露（例えば、放射線療法レジメン）、癌、特定の化合物（例えば、細胞毒性剤）の投与および特定のワクチンに対する免疫応答によっても起こり得る。
【０００６】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、多数の血小板を生み出す骨髄細胞である巨核球の産生および分化を刺激する、グリコシル化された成長因子である（例えば、非特許文献１を参照されたい）。ＴＰＯは、巨核球前駆細胞において発現されたｃ−Ｍｐｌ受容体と結合し、したがって血小板内への細胞の増殖および分化を刺激する。逆説的に、組換えヒトＴＰＯによる患者の治療は、患者の天然発生ＴＰＯと結合し、その活性に干渉した抗ＴＰＯ中和抗体の発生をもたらした（例えば、非特許文献２；非特許文献３；ならびに非特許文献４を参照されたい）。したがって、血小板減少症関連疾患を有する患者のための新規でより良い治療の必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．（２００６年）３５４巻（１９号）：２０３４〜４５頁
【非特許文献２】ＫｕｔｅｒおよびＢｅｇｌｅｙ、Ｂｌｏｏｄ（２００２年）１００巻：３４５７〜３４６９頁
【非特許文献３】Ｌｉら、Ｂｌｏｏｄ（２００１年）９８巻：３２４１〜３２４８頁
【非特許文献４】Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊら、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ（２０００年）１３２巻：３６４〜３６８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、治療用ペプチドを含有する治療的に活性な組換え抗体に関する（これ以降、これらの抗体は「治療用抗体」と称される）。いくつかの実施形態において、本開示に従って、この抗体はトロンボポエチン（ＴＰＯ）模倣ペプチドを含有する（これ以降、これらの抗体は「ＴＰＯ模倣抗体」と称される）。本開示は、治療用抗体の治療的に活性な断片（例えば、ＴＰＯ模倣抗体の治療的に活性な断片）にさらに関する。治療用抗体およびそれらの断片は、例えば、様々な診断用途および／または治療用途に使用できる。例えば実施例において述べるように、ＴＰＯ模倣抗体および／またはそれらの断片は、血小板産生の増加を必要とする被験体、骨髄が激減した、血小板産生が減少した、および／または血小板破壊が増加した、例えば放射線への曝露された被験体（例えば、放射線療法を受けている癌患者）または他の薬剤にさらされた被験体の治療に使用できる。ＴＰＯ模倣抗体および／または断片は、本明細書に記載または当技術分野において公知のこれらの障害のいずれかの、血小板レベルの不足に関する障害（血小板減少症）を有する被験体の治療にもさらに使用できる。
【０００９】
本明細書に記載の治療用抗体およびそれらの治療的に活性な断片は、対応する単離治療用ペプチドと比較して多くの有利性を有する。第１に、この抗体は血清中半減期が増加している。第２に、抗体足場内において治療用ペプチドの活性領域の構造が安定化され、単離治療用ペプチドと比較して標的に対するその結合に関してより活性かつ特異的となり得る。さらに、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体および断片はそれらの単離天然ＴＰＯペプチド対応物と比較して多数のさらなる有利性を有する。例えば、哺乳動物被験体（例えばヒト被験体）に投与した場合、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、有害な免疫応答が天然のＴＰＯに対して発生されるであろう可能性が実質的に低下する。これは、多くの場合患者においてＴＰＯ中和抗体の発生をもたらし、この抗体が患者の天然発生ＴＰＯの活性に干渉する、天然ＴＰＯタンパク質の組換え体を使用する治療と対照的である。例えば、Ｋｕｔｅｒ  およびＢｅｇｌｅｙ（２００２年）Ｂｌｏｏｄ１００巻：３４５７〜３４６９頁；Ｌｉら（２００１年）Ｂｌｏｏｄ  ９８巻：３２４１〜３２４８頁；ならびにＶａｄｈａｎ−Ｒａｊら、（２０００年）Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３２巻：３６４〜３６８頁を参照されたい。本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体（および治療的に活性な断片）のさらなる別の有利性は、ＴＰＯ模倣抗体の単回投与が被験体における血小板レベルの上昇において有効であること、または複数回投与レジメンより有効であることである。
【００１０】
本明細書に記載の治療用抗体の有利性の多くは、抗体足場内における治療用ペプチドの特有の位置に由来する。本明細書に詳述し、実施例において例示するように、本発明者らは、軽鎖ポリペプチド定常領域内の特有の位置に組み込まれた治療用ペプチドおよび／または重鎖ポリペプチド定常領域内の特有の位置に組み込まれた治療用ペプチドを含有する治療用抗体を開発した。例えば、本発明者らは、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域およびその近くにおいて治療用ペプチドを組み込むことが、本明細書に記載の有利性の多くを有する治療用抗体をもたらすと判定した。同様に、抗体の中央の裂け目（ｃｅｎｔｒａｌ  ｃｌｅｆｔ）（例えば、軽鎖ポリペプチド定常領域のβターン領域または軽鎖定常領域のカルボキシ末端において）に存在させることを構造的に許容する軽鎖定常領域中の位置に治療用ペプチドを組み込むことによって、本明細書に記載の有利性の多くを有する治療用抗体が作製される。本明細書において使用する場合、抗体の「中央の裂け目」は、抗体の２つの「アーム」が合う全抗体の領域を指す。すなわち、ジスルフィド結合によって１つに連結された大文字の「Ｙ」を形作る３次元構造をとる、４つのタンパク質鎖からなる（２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチド）すべての全免疫グロブリン（Ｉｇ）分子である。「Ｙ」構造の「アーム」は抗体の可変領域を含有し、中央の裂け目領域は、「Ｙ」構造の２つのアームの間のジャンクションに位置する。
【００１１】
したがって、一態様において、本開示は治療用抗体または抗体の治療的に活性な断片を特徴付け、抗体または断片は少なくとも２つの治療用ペプチドを含み、治療用ペプチドのうちの少なくとも１つは、治療用ペプチドが抗体の中央の裂け目に存在することを構造的に許容する位置において軽鎖ポリペプチドの定常領域内に組み込まれる。治療用抗体またはそれらの断片は、治療用ペプチドのうちの少なくとも１つを含有する重鎖ポリペプチドをさらに含有することができる。少なくとも１つの治療用ペプチドは、以下のようにヒンジ領域に組み込まれる：（ａ）重鎖ポリペプチドのヒンジ領域内；（ｂ）ヒンジ領域のアミノ末端とヒンジ領域の上流である重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクションにおいて；（ｃ）ヒンジ領域のカルボキシ末端とヒンジ領域の下流である重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクションにおいて；または（ｄ）重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の、アミノ末端の上流２０アミノ酸未満内に開始される位置もしくはカルボキシ末端の下流２０アミノ酸未満内に開始される位置において。
【００１２】
別の態様において、本開示は治療用抗体または抗体の治療的に活性な断片を特徴付け、抗体または断片は少なくとも２つの治療用ペプチドを含み、抗体の重鎖ポリペプチドは以下のように重鎖に組み込まれた少なくとも１つの治療用ペプチドを含む：（ａ）重鎖ポリペプチドのヒンジ領域内；（ｂ）ヒンジ領域のアミノ末端とヒンジ領域の上流である重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクションにおいて；（ｃ）ヒンジ領域のカルボキシ末端とヒンジ領域の下流である重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクションにおいて；または（ｄ）重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の、アミノ末端の上流２０アミノ酸未満内に開始される位置もしくはカルボキシ末端の下流２０アミノ酸未満内に開始される位置において。治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、軽鎖ポリペプチドの定常領域が少なくとも１つの治療用ペプチドを含む軽鎖ポリペプチドをさらに含むことができる。治療用ペプチド（例えば、ＴＰＯ模倣ペプチド）は、治療用ペプチドが抗体の中央の裂け目に存在することを構造的に許容する位置において軽鎖ポリペプチドの定常領域内に組み込まれる。
【００１３】
本明細書に記載の任意の治療用抗体またはそれらの断片のいくつかの実施形態において、治療用ペプチドは、軽鎖ポリペプチド定常領域のβターン領域内において、挿入および／または置換として組み込むことができる。本明細書に記載の任意の治療用抗体またはそれらの断片のいくつかの実施形態において、治療用ペプチドは、軽鎖ポリペプチドのカルボキシ末端への付加として組み込むことができる。いくつかの実施形態において、治療用ペプチドは、ポリペプチド中の最終βシート構造の下流にある軽鎖ポリペプチド定常領域の領域への挿入および／またはその置換として組み込むことができる。
【００１４】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、重鎖のヒンジ領域全体は、治療用ペプチドと置換される。
【００１５】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドのカルボキシ末端は、少なくとも１つの治療用ペプチドを含み、重鎖ポリペプチドは少なくとも１つの治療用ペプチドを含む。
【００１６】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、抗体または断片は少なくとも３つ（例えば少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１５以上）の治療用ペプチドを含む。
【００１７】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、少なくとも２つの治療用ペプチドは同一である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの治療用ペプチドは互いに異なる。例えば、少なくとも２つの異なる治療用ペプチドは、異なるアミノ酸配列を有するが、同じ型の治療活性を有することができる（例えば、異なるアミノ酸配列を有する２つのＴＰＯ模倣体）、または少なくとも２つの異なる治療用ペプチドは、異なるアミノ酸配列を有し、異なる治療活性を有することができる（例えば、ＴＰＯ模倣体およびＥＰＯ模倣体）。任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、すべての治療用ペプチドは同一である。いくつかの実施形態において、すべての治療用ペプチドは互いに異なる（例えば、一方または両方が異なるアミノ酸配列を有し、異なる治療活性を有する）。
【００１８】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片の少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原と結合する能力を保有している。いくつかの実施形態において、治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片の少なくとも２つの抗原結合部位は、抗原と結合する能力を保有している。
【００１９】
いくつかの実施形態において、任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、少なくとも１つの治療用ペプチドに対してアミノ末端にあるスペーサーアミノ酸配列および／または少なくとも１つの治療用ペプチドに対してカルボキシ末端にあるスペーサーアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、スペーサーアミノ酸配列は治療用ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に存在することができる。２つのスペーサーは、同じアミノ酸配列を有しても、または異なるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２０】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療用ペプチドはアンタゴニストペプチドである。任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療用ペプチドはアゴニストペプチドである。任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの治療用ペプチドはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）（例えば、ＴＰＯ模倣体またはＥＰＯ模倣体）である。任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、すべての治療用ペプチドはＴＰＯ模倣体（例えば、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有する、またはそれらからなるＴＰＯ模倣体）である。
【００２１】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、治療用抗体は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび／または配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを含有することができる。任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、本抗体は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを含有する、またはそれらからなる。任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、本抗体は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドからなる。
【００２２】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、本抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ化抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、完全ヒト抗体またはＦ（ａｂ’）２断片であってよい。
【００２３】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、治療的に活性な断片は、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片からなる群より選択することができ、この治療的に活性な断片は、少なくとも２つの治療用ペプチドおよび重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の少なくとも一部または軽鎖ポリペプチドのカルボキシ末端の少なくとも一部を含有する。
【００２４】
任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のいくつかの実施形態において、抗体または治療的に活性な断片は異種部分を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の治療的活性断は、抗体の軽鎖ポリペプチドおよび／または重鎖ポリペプチドの可変領域の少なくとも一部または全部を含む。可変領域の一部は、軽鎖ポリペプチドおよび／または重鎖ポリペプチドの少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６、７，８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００を超える）アミノ酸を含む。可変領域の少なくとも一部は、軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドまたは重鎖（ＨＣ）ポリペプチドＣＤＲ（例えば、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２またはＨＣ−ＣＤＲ３）、フレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、ＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、ＬＣ−ＦＲ４、ＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３またはＨＣ−ＦＲ４）の１つもしくは複数または前述のいずれかの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、治療的に活性な断片は抗体のＦｃ断片ではない。
【００２６】
別の態様において、本開示は、任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片および薬学的に許容される担体の組成物を特徴付ける。例えばいくつかの実施形態において、この組成物は本明細書に記載の任意のＴＰＯ模倣抗体を含有することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の組成物は単回投与の使用のために処方され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の組成物は複数回投与における使用のために処方され得る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の組成物は、放射線への曝露の副作用を減少させる、または化学療法の副作用を減少させるための少なくとも１種の活性薬剤をさらに含有することができる。少なくとも１種の活性薬剤は、抗生物質、麻酔薬、制吐薬、ステロイド、キレート剤および利尿薬からなる群より選択することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の組成物は、被験体において血小板産生を増加させるための少なくとも１種のさらなる活性薬剤をさらに含むことができる。少なくとも１つのさらなる活性薬剤は、例えば、エルトロンボパグ（ｅｌｔｒｏｍｂｏｐａｇ）、オプレルベキン（ｏｐｒｅｌｖｅｋｉｎ）、ロミプロスチム（ｒｏｍｉｐｌｏｓｔｉｍ）、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、エリスロポエチン刺激剤（ＥＳＡ）、または本明細書に記載の、もしくは当技術分野において公知の任意の他の適切な薬剤であってよい。
【００３０】
さらに別の態様において、本開示は被験体において血小板産生を増加させる方法を特徴付ける。この方法は、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の任意のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片を含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む。
【００３１】
別の態様において、本開示は被験体において血小板産生を増加させる方法を特徴付け、この方法は、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の、治療有効量の任意のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片を含む組成物を投与するステップを含む。
【００３２】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、被験体は哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト霊長類である。本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、被験体は非ヒト哺乳動物である。
【００３３】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、被験体は血小板数の不足に関連する障害を有する。この障害は、例えば、ベルナール・スーリエ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、脾機能亢進、血栓性微小血管症、播種性血管内凝固症候群、ヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）、フォン・ヴィレブランド病、変異型フォン・ヴィレブランド病、ＨＩＶ感染によりもたらされる血小板減少症、慢性肝疾患によりもたらされる血小板減少症またはグランツマン血小板無力症の任意の１つであってよい。いくつかの実施形態において、この障害は、ウイルス感染、癌または炎症性障害のために被験体を処置することによりもたらされ得る。例えば障害は、細胞毒性剤療法（例えば、薬剤誘導性血小板不全）の結果であり得る。いくつかの実施形態において、障害は被験体への放射線療法レジメンの施行によりもたらされ得る。
【００３４】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、被験体は、限定するものではないが、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌（ｂｏｎｅ  ｃａｎｃｅｒ）、血液癌、神経組織癌、メラノーマ、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部の癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、膣癌または膀胱癌などの癌を有し得る。
【００３５】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、血小板不全（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は化学療法薬によって誘発される。
【００３６】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、被験体は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンを施されている、または施されるであろう。化学療法レジメンは、シクロホスファミド、タキソール、メトトレキセート、ナイトロジェンマスタード、アザチオプリン、クロラムブシル、フルオロウラシル、シスプラチン、ノコダゾール、ヒドロキシウレア、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、カルボプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、トポテカンおよびチオグアニンからなる群より選択される１種または複数の細胞毒性剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
ａｇｅｎｔ）を被験体に投与するステップを含み得る。放射線療法レジメンはＸ線またはγ線照射を含み得る。放射線療法レジメンは被験体への放射性薬剤（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンの前に被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンの間または後に被験体に投与され得る。
【００３７】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は被験体に対して静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内に投与され得る。本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は単回投与または複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１５以上）として被験体に投与される。
【００３８】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、組成物は被験体に化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンの、（ｉ）前および（ｉｉ）間または後に投与され得る。
【００３９】
本明細書に記載の任意の方法のいくつかの実施形態において、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンは、組成物が投与されない場合に安全であり得る化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンよりも、被験体に対して（ｉ）より強力である、または（ｉｉ）より頻繁に施される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンの副作用を減少させるための、少なくとも１種の活性薬剤を被験体に投与するステップをさらに含むことができる。少なくとも１種の薬剤は、抗生物質、麻酔薬、制吐剤およびアンドロステンジオールなどのステロイドからなる群より選択できる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、血小板産生を増加させるための少なくとも１種のさらなる薬剤を被験体に投与するステップをさらに含み得る。血小板産生を増加させるための少なくとも１種のさらなる薬剤は、エルトロンボパグ、オプレルベキン、ロミプロスチム、ペグフィルグラスチムおよびＥＳＡからなる群より選択され得る薬剤であってよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の方法は、組成物の投与後の血小板レベルの増加に関して被験体をモニターするステップをさらに含み得る。
【００４２】
さらに別の態様において、本開示は被験体において血小板産生を増加させる方法を特徴付け、この方法は、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の血小板産生増加量の単回投与を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。本開示は、放射線への曝露または血小板レベルを減少させる化学療法レジメンに関して被験体を処置する方法をさらに特徴付ける。この方法は、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の血小板産生増加量の単回投与を、被験体に投与するステップを含む。被験体は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンを受けたことがある、受ける可能性がある、または受ける予定である被験体であってよい。被験体は放射線を照射されたことがある、照射される可能性がある、または照射される予定である被験体であってよい。
【００４３】
さらに別の態様において、本開示は被験体において血小板産生を増加させる方法を特徴付け、この方法は、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の血小板産生増加量の複数回（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２以上）投与を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。本開示は、放射線への曝露または血小板レベルを減少させる化学療法レジメンに関して被験体を処置する方法をさらに特徴付ける。この方法は、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の血小板産生増加量の複数回投与を被験体に投与するステップを含む。被験体は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンを受けたことがある、受ける可能性がある、または受ける予定である被験体であってよい。被験体は放射線を照射されたことがある、照射される可能性がある、または照射される予定である被験体であってよい。
【００４４】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６または８）のＴＰＯ模倣体ペプチドを含有するポリペプチドをコードする核酸を特徴付け、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０または配列番号１２で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０（例えば、少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）％同一である。いくつかの実施形態において、この核酸は配列番号１０のアミノ酸１〜２１４と少なくとも８０％同一である、または配列番号１０のアミノ酸１〜２１８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１０のアミノ酸２１９〜２３２がアミノ酸配列と配列番号１０との間で１００％同一であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、この核酸は配列番号１２のアミノ酸１〜２３４と少なくとも８０％同一であり、配列番号１２のアミノ酸２４９〜４６１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１２のアミノ酸２３５〜２４８がアミノ酸配列と配列番号１２との間で１００％同一であるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、この核酸は配列番号１２のアミノ酸１〜２３２と少なくとも８０％同一であり、配列番号１２のアミノ酸２５１〜４６１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列をコードし、配列番号１２のアミノ酸２３５〜２４８がアミノ酸配列と配列番号１２との間で１００％同一である。
【００４５】
アミノ酸配列または核酸配列の同一性パーセント（％）は、配列をアライメントし、ギャップを導入し、必要に応じて配列同一性の最大パーセントを得た後の、参照配列中のアミノ酸または核酸と同一である候補配列中のアミノ酸または核酸のパーセントとして定義され。パーセント配列同一性を決定する目的のアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成され得る。比較される配列の完全長にわたる最大アライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するために適切なパラメーターは、公知の方法によって決定され得る。
【００４６】
特に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者により一般に理解される同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が対照であるとする。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載の方法および材料と同様または等価の方法および材料もまた、目下開示している方法および組成物の実践または試験に使用できる。本明細書において述べたすべての広報、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００４７】
本開示、例えば被験体において血小板産生を増加させる方法の他の特徴および有利性は、以下の説明、実施例および特許請求の範囲から明らかであると思われる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
治療用抗体または上記抗体の治療的に活性な断片であって、上記抗体または上記断片が少なくとも２つの治療用ペプチドを含み、上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つは、上記治療用ペプチドが上記抗体の中央の裂け目に存在することを構造的に許容する位置において軽鎖ポリペプチドの定常領域内に組み込まれる、治療用抗体または上記抗体の治療的に活性な断片。
（項目２）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つを含む重鎖ポリペプチドをさらに含み、上記少なくとも１つの治療用ペプチドが、
（ａ）上記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域内；
（ｂ）上記ヒンジ領域のアミノ末端と上記ヒンジ領域の上流である上記重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクション；
（ｃ）上記ヒンジ領域のカルボキシ末端と上記ヒンジ領域の下流である上記重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクション；または
（ｄ）上記重鎖ポリペプチドの上記ヒンジ領域の、アミノ末端の上流２０アミノ酸未満内に開始される位置もしくはカルボキシ末端の下流２０アミノ酸未満内に開始される位置
に組み込まれる、項目１に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目３）
治療用抗体または上記抗体の治療的に活性な断片であって、上記抗体または上記断片が少なくとも２つの治療用ペプチドを含み、重鎖ポリペプチドが上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つを含み、上記少なくとも１つの治療用ペプチドが、
（ａ）上記重鎖ポリペプチドのヒンジ領域内；
（ｂ）上記ヒンジ領域のアミノ末端と上記ヒンジ領域の上流である上記重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクション；
（ｃ）上記ヒンジ領域のカルボキシ末端と上記ヒンジ領域の下流である上記重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクション；または（ｄ）上記重鎖ポリペプチドの上記ヒンジ領域の、アミノ末端の上流２０アミノ酸未満内に開始される位置もしくはカルボキシ末端の下流２０アミノ酸未満内に開始される位置
に組み込まれる、治療用抗体または上記抗体の治療的に活性な断片。
（項目４）
軽鎖ポリペプチドをさらに含む、項目３に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片であって、ここで、上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つが、上記治療用ペプチドが上記抗体の中央の裂け目に存在することを構造的に許容する位置において軽鎖ポリペプチドの定常領域内に組み込まれる、治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目５）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つが、上記重鎖ポリペプチドの上記ヒンジ領域内に組み込まれる、項目２から４のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目６）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つが、上記ヒンジ領域のアミノ末端と上記ヒンジ領域の上流である上記重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクションに組み込まれる、項目２から４のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目７）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つが、上記ヒンジ領域のカルボキシ末端と上記ヒンジ領域の下流である上記重鎖ポリペプチドの領域との間のジャンクションに組み込まれる、項目２から４のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目８）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つが、上記ヒンジ領域のアミノ末端の上流２０アミノ酸未満内に開始される位置に組み込まれる、項目２から４のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目９）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つが、ヒンジ領域のカルボキシ末端の下流２０アミノ酸未満内に開始される位置に組み込まれる、項目２から４のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１０）
上記治療用ペプチドが、（ｉ）上記定常領域のβターン領域内への挿入；または（ｉｉ）上記定常領域のβターン領域内での置換として、上記軽鎖ポリペプチドの上記定常領域内に組み込まれる、項目１、２または４から９のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１１）
上記治療用ペプチドが、上記定常領域のカルボキシ末端に対する付加として、上記軽鎖ポリペプチドの上記定常領域内に組み込まれる、項目１、２または４から９のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１２）
上記治療用ペプチドが、（ｉｉｉ）上記定常領域の最終βシート構造の下流である位置への挿入、または（ｉｖ）上記定常領域の最終βシート構造の下流である位置への付加として、上記軽鎖ポリペプチドの上記定常領域内に組み込まれる、項目１、２または４から９のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１３）
軽鎖ポリペプチドのカルボキシ末端が上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つを含み、重鎖ポリペプチドが上記治療用ペプチドのうちの少なくとも１つを含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１４）
上記抗体または上記断片が少なくとも４つの治療用ペプチドを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１５）
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも２つが同一である、項目１から１４のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１６）
上記治療用ペプチドのすべてが同一である、項目１から１５のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１７）
少なくとも１つの治療用ペプチドに対してアミノ末端にあるスペーサーアミノ酸配列をさらに含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１８）
少なくとも１つの治療用ペプチドに対してカルボキシ末端にあるスペーサーアミノ酸配列をさらに含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目１９）
少なくとも１つの治療用ペプチドがアゴニストペプチドである、項目１から１８のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２０）
少なくとも１つの治療用ペプチドがペプチド模倣体である、項目１から１９のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２１）
上記ペプチド模倣体がＴＰＯ模倣体である、項目２０に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２２）
上記治療用ペプチドのすべてがＴＰＯ模倣体である、項目１から２１のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２３）
上記ＴＰＯ模倣体が配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、項目２１または２２に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２４）
上記抗体が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む、項目２１から２３のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２５）
上記抗体が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを含む、項目２１から２３のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２６）
上記抗体が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを含む、項目２１から２５のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２７）
上記抗体が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドおよび配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドからなる、項目２１から２３のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２８）
上記抗体がモノクローナル抗体である、項目１から２７のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目２９）
上記抗体がヒト化抗体である、項目１から２３のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目３０）
上記抗体またはその治療的に活性な断片が、キメラ化抗体、キメラ抗体、脱免疫化ヒト抗体、完全ヒト抗体およびＦ（ａｂ’）２断片からなる群より選択される、項目１から２８のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目３１）
上記治療的に活性な断片が、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片からなる群より選択され、上記治療的に活性な断片が、
上記治療用ペプチドのうちの少なくとも２つ、および
重鎖ポリペプチドのヒンジ領域の少なくとも一部または軽鎖ポリペプチドのカルボキシ末端の少なくとも一部
を含む、項目１から２８のいずれか一項に記載の治療的に活性な断片。
（項目３２）
上記抗体または上記治療的に活性な断片が異種部分をさらに含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片。
（項目３３）
項目１から３２のいずれか一項に記載の治療用抗体または治療的に活性な断片および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目３４）
項目２１から３２のいずれか一項に記載の治療用抗体または治療的に活性な断片および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目３５）
放射線への曝露の副作用を減少させる、または化学療法の副作用を減少させるための少なくとも１種の活性薬剤をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
上記少なくとも１種の活性薬剤が、抗生物質、麻酔薬、制吐薬、ステロイド、キレート剤および利尿薬からなる群より選択される、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
被験体において血小板産生を増加させるための少なくとも１種のさらなる活性薬剤をさらに含む、項目３４から３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
被験体において血小板産生を増加させるための上記少なくとも１種のさらなる活性薬剤が、エルトロンボパグ、オブレルベキン、ロミプロスチム、ペグフィルグラスチムおよびエリスロポエチン刺激剤からなる群より選択される、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
被験体において血小板産生を増加させるための方法であって、血小板産生の増加を必要とする被験体に、項目２１から３２のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片を含む、治療有効量の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目４０）
被験体において血小板産生を増加させるための方法であって、血小板産生の増加を必要とする被験体に、治療有効量の項目２１から３２のいずれか一項に記載の治療用抗体またはその治療的に活性な断片を含む、組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目４１）
上記被験体が血小板数の不足に関連する障害を有する、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
上記障害が、ベルナール・スーリエ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、脾機能亢進、血栓性微小血管症、播種性血管内凝固症候群、ヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）、フォン・ヴィレブランド病、変異型フォン・ヴィレブランド病、ＨＩＶ感染によりもたらされる血小板減少症、慢性肝疾患によりもたらされる血小板減少症およびグランツマン血小板無力症からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
上記障害が薬剤誘導性血小板不全である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
上記被験体が癌を有する、項目３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
上記被験体が、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、血液癌、神経組織癌、メラノーマ、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部の癌、膣癌および膀胱癌からなる群より選択される癌を有する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
上記血小板不全が化学療法薬によって誘導される、項目４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
上記被験体が、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンを施されている、または施されるであろう、項目３９から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
上記化学療法レジメンが、シクロホスファミド、タキソール、メトトレキセート、ナイトロジェンマスタード、アザチオプリン、クロラムブシル、フルオロウラシル、シスプラチン、ノコダゾール、ヒドロキシウレア、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、カルボプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、トポテカンおよびチオグアニンからなる群より選択される１種または複数の細胞毒性剤を上記被験体に投与するステップを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記放射線療法レジメンがＸ線またはガンマ線照射を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
上記放射線療法レジメンが上記被験体に放射性薬剤を投与するステップを含む、項目４７または４９に記載の方法。
（項目５１）
上記組成物が、上記化学療法レジメンまたは上記放射線療法レジメンの前に上記被験体に投与される、項目４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
上記組成物が上記化学療法レジメンまたは上記放射線療法レジメンの間または後に上記被験体に投与される、項目４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
上記被験体がヒトである、項目３９から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
上記組成物が、上記被験体に静脈内投与される、項目３９から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
上記組成物が、上記被験体に皮下、腹腔内、または筋肉内投与される、項目３９から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
上記組成物が上記被験体に単一の用量として投与される、項目３９から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
上記組成物の１つより多い用量が上記被験体に投与される、項目３９から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
上記組成物が、上記化学療法レジメンまたは上記放射線療法レジメンの、（ｉ）前および（ｉｉ）間または後に上記被験体に投与される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
上記化学療法レジメンまたは上記放射線療法レジメンが、上記組成物が投与されない場合に安全であり得る化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンよりも、被験体に対して（ｉ）より強力である、または（ｉｉ）より頻繁に施される、項目３９から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンの副作用を減少させるための、少なくとも１種のさらなる薬剤を上記被験体に投与するステップをさらに含む、項目３９から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
上記少なくとも１種の薬剤が、抗生物質、麻酔薬、制吐剤およびアンドロステンジオールからなる群より選択される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
血小板産生を増加させるための少なくとも１種のさらなる薬剤を上記被験体に投与するステップをさらに含む、項目３９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
血小板産生を増加させるための上記少なくとも１種のさらなる薬剤が、エルトロンボパグ、オプレルベキン、ロミプロスチム、ペグフィルグラスチムおよびエリスロポエチン刺激剤からなる群より選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
上記組成物の投与後に、血小板レベルの増加に関して上記被験体をモニターするステップをさらに含む、項目３９から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも１つのＴＰＯ模倣体ペプチドのアミノ酸配列を含み、
（ｉ）配列番号１０で表される核酸によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、または
（ｉｉ）配列番号１２で表される核酸によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、
アミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目６６）
少なくとも１つのＴＰＯ模倣体ペプチドのアミノ酸配列を含み、
（ｉ）配列番号１０で表される核酸によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、または
（ｉｉ）配列番号１２で表される核酸によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離核酸。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、マウスにおける血小板レベルについての、組換えヒトＴＰＯおよびいくつかのＴＰＯ模倣組成物の複数回投与レジメンの効果を表す線グラフである。Ｙ軸は１０６／ｍＬユニットにおける血小板数を表す。Ｘ軸は処置レジメン開始後の日数を表す。両矢印により示されるように、処置は５日間継続した。黒丸は、Ｆ（ａｂ’）２抗体の重鎖のＣＤＲ３領域および軽鎖のＣＤＲ２領域にＴＰＯ模倣体を含有するＦ（ａｂ’）２抗体断片を用いて処置されたマウスを表す。白丸は、ＴＰＯ模倣体を含有しなかった抗補体成分Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）を用いて処置されたマウスを表す。黒四角は、組換えヒトＴＰＯを用いて処置されたマウスを表し、黒菱形はＣＤＲ３領域にＴＰＯ模倣体を含有する抗補体成分Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）を用いて処置されたマウスを表す。ＴＰＯ模倣体を含有する抗Ｃ５抗体はＣ５と結合しない。抗Ｃ５抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ２／ＩｇＧ４定常領域の融合である。
【図２】図２は、マウスにおける血小板レベルについての、ＴＰＯ模倣抗体の複数回投与レジメンの効果を表す線グラフである。Ｙ軸は１０６／ｍＬユニットにおける血小板数を表す。Ｘ軸は処置レジメン開始後の日数を表す。両矢印により示されるように、処置は５日間継続した。両矢印により示されるように、処置は５日間継続した。黒菱形は重鎖のＣＤＲ３領域にＴＰＯ模倣体を含有する抗補体成分Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）を用いて処置されたマウスを表す。ＴＰＯ模倣体を含有する抗Ｃ５抗体はＣ５と結合せず、抗Ｃ５抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ２／ＩｇＧ４定常領域の融合である。白四角は、ＴＰＯ模倣体を含有せず、ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。黒三角（底辺の左が直角）は、個々の軽鎖ポリペプチドがそのカルボキシ末端にＴＰＯ模倣ペプチドを含有する抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。黒三角（底辺の右が直角）は、個々の重鎖ポリペプチドがヒンジ領域の近くにＴＰＯ模倣体を含有する抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。黒四角は、個々の軽鎖および重鎖のポリペプチドがＴＰＯ模倣ペプチドを含有する抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。ＴＰＯ模倣体を含有する個々の抗炭疽抗体は、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４融合重鎖定常領域をさらに含有する。
【図３】図３は、マウスにおける血小板レベルについての、ＴＰＯ模倣抗体の単回投与レジメンの効果を表す線グラフである。Ｙ軸は１０６／ｍＬユニットにおける血小板数を表す。Ｘ軸は処置レジメン開始後の日数を表す。灰色四角は、ＣＤＲ３領域にＴＰＯ模倣体を含有する抗補体成分Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）を用いて処置されたマウスを表す。ＴＰＯ模倣体を含有する抗Ｃ５抗体はＣ５と結合しない。ＴＰＯ模倣体を含有する個々の抗Ｃ５抗体は、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４融合重鎖定常領域をさらに含有する。アスタリスクはＴＰＯ模倣体を含有しない抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。この抗炭疽抗体はＩｇＧ１アイソタイプ重鎖定常領域を含有する。灰色三角は、個々の軽鎖ポリペプチドがＴＰＯ模倣ペプチドを含有する抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。白三角は、個々の軽鎖および重鎖のポリペプチドがＴＰＯ模倣ペプチドを含有する抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。この抗炭疽抗体は、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４融合重鎖定常領域を含有する。黒菱形は、ＴＰＯ模倣体を含有せず、重鎖定常領域がＩｇＧ２／ＩｇＧ４定常領域である抗炭疽抗体を用いて処置したマウスを表す。
【図４】図４は、骨髄抑制療法後の血小板レベルについてのＣＤＲ−ＴＰＯ抗体の効果を表す線グラフである。Ｙ軸は１０６／ｍＬユニットにおける血小板数を表す。Ｘ軸は処置レジメン開始後の日数を表す。黒丸は、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）およびＴＰＯ模倣体を含有しない抗Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）を用いて処置したマウスを表す。灰色四角は、ＭＭＣおよび  ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体（ＣＤＲ３に挿入されたＴＰＯ模倣体を含有する抗Ｃ５抗体（５Ｇ１．１））を用いて処置したマウスを表す。ＴＰＯ模倣体を含有する抗Ｃ５抗体はＣ５と結合しない。黒菱形は、抗体またはＭＭＣを用いて処置されなかったマウスを表す。ＴＰＯ模倣体を含有する個々の抗Ｃ５抗体は、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４融合重鎖定常領域をさらに含有する。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本開示は、治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）およびそれらの治療的に活性な断片ならびにこの抗体および断片を調製し使用する方法を特徴付ける。限定する意図のものではないが、例示の抗体および断片、接合体、医薬組成物および製剤ならびに前述のいずれかを使用するための方法を以下に詳細に述べ、実施例において例示する。
【００５０】
治療用抗体およびそれらの治療的に活性な断片
本明細書に記載の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上）の治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含有し、（ｉ）抗体の軽鎖ポリペプチドが少なくとも１つの治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含む、および（ｉｉ）抗体の重鎖ポリペプチドが少なくとも１つの治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含む：の一方または両方である。少なくとも１つの治療用ペプチド（例えば、ＴＰＯ模倣ペプチド）は、以下のように重鎖に組み込まれる：（ａ）ヒンジ領域それ自体の内部；（ｂ）ヒンジ領域のアミノ末端と重鎖の上流領域との間のジャンクションにおいて；（ｃ）ヒンジ領域のカルボキシ末端と重鎖の下流領域との間のジャンクションにおいて；または（ｄ）ヒンジ領域の、アミノ末端から上流２０アミノ酸未満（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満）内に開始される位置もしくはカルボキシ末端の下流２０アミノ酸未満（例えば、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満）内に開始される位置において。
【００５１】
本開示に従って、少なくとも１つの治療用ペプチド（例えば、ＴＰＯ模倣ペプチド）は、治療用ペプチドが抗体の中央の裂け目に存在することを構造的に許容する位置において軽鎖ポリペプチドの定常領域内に組み込まれる。本明細書において使用する場合、軽鎖ポリペプチド定常領域に関連して「構造的に許容する」領域または位置は、（１）治療用ペプチドの挿入、置換および／または付加を、定常領域の３次元構造に実質的に影響を与えずに許容できる、および（２）治療用ペプチドを、治療用ペプチドの治療活性に影響を与えずに抗体の中央の裂け目に存在させる軽鎖定常領域内の領域または位置を指す。例えば、治療用ペプチドは、（ａ）軽鎖ポリペプチドの定常領域のカルボキシ末端に対する付加、または（ｂ）軽鎖ポリペプチドの定常領域の最終カルボキシ末端のβシート構造の下流である位置において、アミノ酸の挿入および／または置換として組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチド定常領域のβターン領域に組み込まれ得、このβターンは、組み込まれた治療用ペプチドを抗体の中央の裂け目に存在させる位置において構造的である。
【００５２】
当業者は、軽鎖ポリペプチドの定常領域内のどのアミノ酸またはアミノ酸の配列がこのような付加、挿入または置換されやすいかを決定する方法を知っていると思われる。例えば、任意の数の自由に利用可能なコンピュータプログラムを使用して、抗体またはそれらの断片の３次元構造をモデル化、例えば治療用ペプチドが組み込まれ得る適切な軽鎖定常領域βターン領域を特定できる。適切なコンピュータプログラムは、例えば、Ｃ３ｎＤおよびＲａｓｍｏｌを含み、これらは両方とも、それぞれＵ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈおよびＵ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから電子的に利用可能である。さらなるプログラムは、例えば、ＪＭｏｌ、ＹＡＳＡＲＡ、Ｏｓｃａｉｌ、ＴＩＮＫＥＲ、ＭＡＧＥ、ＡｒｇｕｓＬａｂおよびＳｗｉｓｓＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒを含む。
【００５３】
一実施例において、当業者は、Ｆａｂｅｒら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３巻（４号）：２５３〜２７０頁に記載されたヒト抗破傷風トキソイドＦａｂ抗体断片の分子構造を可視化するためにＣ３ｎＤを使用できる。（ＭＭＤＢ  Ｉｄ  Ｎｏ．６９９７をさらに参照されたい。）技術者は、治療用ペプチド組み込みの可能性がある適切な部位として、断片内の軽鎖カルボキシ末端βターン配列「ＥＱＷＫＳＨＫ」（配列番号１３）を特定できた。技術者は、治療用ペプチドの組み込みの可能性がある適切な部位として、断片内の軽鎖カルボキシ末端のアミノ酸配列「ＰＡＥＣＳ」（配列番号１４）をさらに特定できた。他の実施例において、Ｃ３ｎＤは、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０内のエピトープと結合する２Ｆ５抗体のヒトＦａｂ断片の分子構造を可視化するために使用され得る。（ＭＭＤＢ  Ｉｄ  Ｎｏ．６５７４７を参照されたい。）したがって、技術者は本開示に従った治療用ペプチドの組み込みに構造的に適合する可能性があるとして、断片内の軽鎖カルボキシ末端βターン配列「ＳＤＥＱＬＫＳ」（配列番号１５）および「ＡＤＹＥＫＨ」（配列番号１６）および／または軽鎖カルボキシ末端のアミノ酸配列「ＧＥＣ」を特定できた。他の抗体の構造的に同様な領域のアミノ酸配列は、例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」１巻、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）を使用して特定され得る。
【００５４】
このような実施形態において、治療用ペプチドは軽鎖ポリペプチドの対象定常領域（例えば、定常領域のβターン領域または最終βシート構造の下流である領域）に挿入され得る、および／またはペプチドの組み込みは、軽鎖ポリペプチドの対象定常領域（例えば、定常領域のβターン領域または最終βシート構造の下流である領域）の全体または一部と置換できる。本明細書において使用する場合、「軽鎖ポリペプチドの定常領域の一部」は、この領域の少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２以上）アミノ酸を指す。したがっていくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドの定常領域の少なくとも５アミノ酸は治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）と置換され得る。置換は１対１、すなわち元の軽鎖定常領域の１つのアミノ酸が治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）の１つのアミノ酸と置換される必要はないと理解される。例えば、最終の五（５）アミノ酸軽鎖定常領域は欠失され得る、および１４アミノ酸のＴＰＯ模倣ペプチド（例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ペプチド）で置換され得、その結果軽鎖カルボキシ末端領域の部分的置換をもたらし、軽鎖の末端に９アミノ酸の付加を有効にもたらす。別の実施例において、軽鎖ポリペプチド定常領域の五（５）アミノ酸のβターン領域は、１４アミノ酸のＴＰＯ模倣ペプチド（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ペプチド）で置換され得、その結果βターン領域の部分的置換をもたらし、９アミノ酸の挿入を有効にもたらす。
【００５５】
治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）がヒンジ領域それ自体に組み込まれる実施形態において、治療用ペプチドは挿入であってよく、および／またはヒンジ領域のすべてまたは一部は治療用ペプチドと置換され得る。明細書において使用する場合、「ヒンジ領域の一部」は、抗体のヒンジ領域の少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５以上）アミノ酸を指す。したがって、いくつかの実施形態において、ヒンジ領域の少なくとも５アミノ酸は、治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）と置換され得る。ヒンジ領域の一部は、重鎖ポリペプチドのヒンジ領域のアミノ末端またはカルボキシ末端にアミノ酸を含み得る、またはこの一部はヒンジ領域の中にアミノ酸を含み得る。置換は１対１、すなわち元のヒンジ領域の１つのアミノ酸が治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）の１つのアミノ酸と置換される必要はないと理解される。例えば、ヒンジ領域のアミノ末端の五（５）アミノ酸は欠失され得、１４アミノ酸のＴＰＯ模倣ペプチド（例えば、配列番号１を参照されたい）で置換され得、その結果ヒンジの部分的置換をもたらし、重鎖定常領域１（ＣＨ１）と部分的ヒンジとの間の９アミノ酸の有効な挿入をもたらす。しかし、いくつかの実施形態において、例えば、ヒンジ領域の１４アミノ酸は、治療用ペプチド（配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ペプチドなど）の等価の１４アミノ酸と置換され得る。いくつかの実施形態において、全ヒンジ領域が治療用ペプチドと置換される。ヒンジ領域の一部または全てが治療用ペプチドと置換される実施形態において、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方または両方に隣接するスペーサーアミノ酸配列を含むことは有用であり得る（以下を参照されたい）。
【００５６】
したがって、いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）は、それぞれ少なくとも１つの治療用ペプチドを含有する二（２）つの軽鎖ポリペプチドおよび治療用ペプチドを含有しない２つの重鎖ポリペプチドを含有できる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療用抗体は、それぞれ少なくとも１つの治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含有する２つの重鎖ポリペプチドおよび治療用ペプチドを含有しない２つの軽鎖ポリペプチドを含有できる。さらに別の実施例において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有でき、この重鎖および軽鎖ポリペプチドはそれぞれ、少なくとも１つの本開示に従った治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、軽鎖および重鎖ポリペプチドそれぞれの中の治療用ペプチドは同じ治療用ペプチドであってもよい。例えば、軽鎖および重鎖ポリペプチドは、それぞれＴＰＯ模倣ペプチド（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ペプチド）を有することができる。いくつかの実施形態において、軽鎖ポリペプチド中の治療用ペプチドは重鎖ポリペプチド中の治療用ペプチドと異なっていてもよい。例えば、抗体はそれぞれ第１のＴＰＯ模倣ペプチド（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する）を含有する２つの軽鎖ポリペプチドおよびそれぞれ第２のＴＰＯ模倣ペプチド（例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する）を含有する２つの重鎖ポリペプチドを含むことができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、治療用抗体は、治療用抗体の１つの「アーム」（例えばＦａｂ領域）が１種の治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含有し、治療用抗体の第２の「アーム」（例えば、第２のＦａｂ領域）が異なる種類の治療用ペプチド（例えば、ＥＰＯ模倣ペプチド）を含有し、両方が本開示に従った治療用ペプチドである、２重治療性であってもよい（以下を参照されたい）。
【００５９】
少なくとも１つの治療用ペプチドが、本開示に従った重鎖または軽鎖に組み込まれていれば、治療用抗体は、２つを超える（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１５以上）治療用ペプチドを含むことができると理解される。いくつかの実施形態において、治療用抗体が２つを超える治療用ペプチドを含有する場合、少なくとも１つの治療用ペプチドは本開示に従った軽鎖に組み込まれ、少なくとも１つの治療用ペプチドは本開示に従った重鎖に組み込まれる。
【００６０】
抗体の重鎖内のヒンジ領域の位置およびアミノ酸配列は当業者には周知である。例示的ヒンジ領域のアミノ酸配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ０７／０４８０２２号の図２８に明記され、この開示（特に図２８）は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、治療用抗体の少なくとも１つ（例えば、２、３、４またはすべて）の治療用ペプチドは、アミノ酸配列ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号１）もしくはＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡＰ（配列番号２）を有するＴＰＯ模倣ペプチドを含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、治療用抗体の少なくとも１つ（例えば、２、３、４またはすべて）の治療用ペプチドは、米国特許出願第２００３００４９６８３号の図５に表されるアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ペプチドを含む、またはそれからなり、米国特許出願第２００３００４９６８３号の開示（特に図５）は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態において、治療用抗体の少なくとも１つ（例えば、２、３、４、またはすべて）の治療用ペプチドは、米国特許第６，０８３，９１３号の表１および表２に表されるアミノ酸配列を有するＴＰＯ模倣ペプチドを含む、またはそれからなり、米国特許第６，０８３，９１３号の開示（特に表１および表２）は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本明細書に記載の治療用抗体に含まれ得るさらなる治療用ペプチドは、例えば、限定するものではないが、ＥＰＯ模倣ペプチドなどの他の模倣ペプチドを含む。例えば、適切なＥＰＯ模倣ペプチドは、例えばＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号３）または例えば米国特許第５，８３５，３８２号および第５，８３０，８５１号に記載の任意のＥＰＯ模倣体を含む。他の例は、ＷｈｉｔｔｙおよびＢｏｒｙｓｅｎｋｏ（１９９９年）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．４巻：Ｒ１０７〜１８頁に記載のＧ−ＣＳＦ活性、ＧＨＲ活性およびプロラクチン活性を示す活性断片を含む、リガンド誘導性ホモ二量化によって活性化される受容体と結合するペプチドを含む。適切なペプチドのさらなる例は、Ｚａｃｃａｒｏら（２０００年）Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．４３巻（１９号）：３５３０〜４０頁に記載のＣＤループ由来の神経成長因子模倣体；Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら（２０００年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５巻（８号）：４３１２〜８頁に記載のＩＬ−２模倣体；Ｅｖａｎｓら（１９９９年）Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．２巻（２号）：７５〜９４頁に記載のグルカゴン用ペプチド−１；アポトーシスを促進でき、例えば、Ｔ細胞恒常性、免疫特権および母性寛容に関与するＦａｓＬペプチド、（例えば、Ｓｈｅｉｋｈら（２０００年）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４巻（８号）：１５０９〜１５１３頁を参照されたい）；インスリンｃ−ペプチド；インスリンβ鎖；およびＧａｇｎｏｎら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ１８巻（１８号）：１８８６〜９２頁に記載の、マイトジェンにより活性化されるＢ細胞増殖を刺激するテトラペプチドＩ（Ｄ−リジン−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシン）を含む。治療用ペプチド（例えば、模倣ペプチド）は、それらの同属のリガンドまたは受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有することができる。例えば、本明細書に記載の治療用抗体に使用するための受容体アンタゴニスト活性を示すペプチドは、例えば、Ｌｕｏら（２０００年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９巻（４４号）：１３５４５〜５０頁に記載のＨＩＶの治療に使用するためのＣＸＣＲ４のアンタゴニストとしてのｖＭＩＰ−ＩＩのアミノ末端ペプチド；Ｐａｋａｌａら（２０００年）Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．１００巻（１号）：８９〜９６頁に記載の抗血栓症治療のためのトロンビン受容体のアンタゴニストペプチドリガンド「ＡＦＬＡＲＡＡ」（配列番号：４）；Ｐｏｗｅｌｌら（２０００年）Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３１巻（５号）：８７５〜８４頁に記載の、麻酔薬に対する忍容性を低減させるためのペプチドＣＧＲＰ受容体アンタゴニストＣＧＲＰ（８−３７）；Ｈｏａｒｅら（２０００年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．２９５巻（２号）：７６１〜７０頁に記載の、副腎甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−１受容体アンタゴニスト；例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３６８５８号、Ｔｃｈｅｎｇら（１９９５年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９１巻：２１５１頁およびＢｏｖｙら（１９９４年）Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ２巻：８８１頁に記載の、冠状動脈血栓症、ぜんそく、炎症性腸疾患および／または癌の治療に使用するためのインテグリン特異的ペプチド模倣体アンタゴニスト；Ｚａｇｏｎら（２０００年）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．１７巻（５号）：１０５３〜６１頁に記載のオピオイド成長因子；Ｙａｎｏｆｓｋｙら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９３巻：７３８１〜７３８６頁およびＶｉｇｅｒｓら（２０００年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７５巻（４７号）：３６９２７〜３６９３３頁に開示の、高親和性Ｉ型インターロイキン１受容体アンタゴニスト；Ｆａｎら（２０００年）ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ４９巻（６号）：５４５〜４８頁に記載の酸性線維芽細胞成長因子結合ペプチド；ならびに例えば、Ｍａｚｉｔｓｃｈｅｋら（２００２年）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ２巻（５号）：４９１〜５０６頁に記載の被験体における血管形成を処置するために有用な模倣ペプチドを含むことができる。
【００６３】
さらなる治療用ペプチド（例えばペプチド模倣薬）の特定方法は、当技術分野において公知である。例えば、特定の生物学的機能に関与するタンパク質領域を特定するために、そのタンパク質を構成しているより短いペプチド断片の調査が、原因となる線状ペプチドエピトープを明らかにできる。または、ランダムなペプチドのライブラリを調査することによって、天然タンパク質の活性を模倣する最適な線状エピトープまたは非連続性エピトープを表すペプチドを発見できる。選択方法の１つはペプチドファージディスプレイと呼ばれる。この取り組みにおいて、ペプチドをバクテリオファージ粒子表面に提示するようにランダムなペプチドエピトープライブラリが作製される。ペプチドのこれらのコレクションまたはライブラリは、その後、特定の固定された標的タンパク質と結合できるペプチドに関して調査され得る。例えば、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら（１９９７年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ８巻（４号）：４３５〜４４１頁；Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉら（２００６年）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ１３巻（２０号）：２４４９〜２４６６頁；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９５年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０巻：１１８９〜１１９６頁；Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３巻：４５８〜４６３頁；Ｃｗｉｒｌａら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６巻：１６９６〜１６９９頁；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら（１９９３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８巻：２０２０５〜２０２１０頁；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら（１９９５年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３巻：２６５〜２７０頁；Ｈｅａｌｙら（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４巻：３９４８〜３９５５頁；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９５年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．
１３０巻：１１８９〜１１９６頁を参照されたい。細胞表面ディスプレイおよびリボソームディスプレイを含む別のペプチド選択系もまた可能である。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、長さまたは翻訳後の修飾に関係なく、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を指す。
【００６５】
いくつかの実施形態において、治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）は、スペーサーアミノ酸配列（またはスペーサー配列）と一緒にカルボキシ末端およびアミノ末端の一方または両方に隣接できる。スペーサー配列は、例えば模倣体の構造的制約を減少させるため、生物学的に活性な立体構造をより簡単に推測可能にするため、および／または抗体足場の関連の中で、ペプチドをより有効に存在させるために使用できる。いくつかの実施形態においてスペーサー配列は、限定するものではないが、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５または３０以上）のアミノ酸を含むことができる。スペーサー配列は、例えば、１つまたは複数のプロリンまたはグリシン残基を含むことができる。いくつかの実施形態において、スペーサーアミノ酸配列は、アミノ酸ＡＲＳＬ（配列番号５）であってよく、またはそれらを含有できる。いくつかの実施形態において、スペーサーアミノ酸配列は、「ＰＩ」（配列番号６）、「ＮＰ」（配列番号７）または「ＬＶＧ」（配列番号：８）を含むことができる、またはそれらであることができる。いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣体は「ＡＲＳＬ」スペーサー配列をアミノ末端に、「ＬＶＧ」スペーサー配列をカルボキシ末端に有することができる。
【００６６】
任意の抗体（または抗体の断片）は治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）がグラフトされる足場配列として機能できる。しかし、抗体またはそれらの断片がヒトにおいて使用される場合、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であることが好ましいと思われる。足場としての使用に適切な抗体の１つは、ヒト抗破傷風トキソイド（ＴＴ）抗体またはそれらの断片（例えば、Ｆａｂ断片）である。例えば、Ｂａｒｂａｓら（１９９４年）Ｊ．
Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１６巻：２１６１〜２１６２頁およびＢａｒｂａｓら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：２５２９〜２５３３頁を参照されたい。本開示に従った足場としての使用に適切な他の抗体は、実施例に示すように、例えば、抗炭疽抗体（例えば、抗炭疽ＰＡ８３または抗炭疽ＰＡ６３抗原抗体）を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の足場抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の抗原結合特異性を変化させる、または部分的に、もしくは完全に除去するために十分な手法で修飾（例えば置換、欠失または翻訳後修飾）され得る。抗体のＣＤＲを修飾する方法は、分子生物学の分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓに記載されている。さらに、抗体がタンパク質抗原に結合するかどうか、および／またはタンパク質抗原に対する抗体の親和性（または親和性の喪失）を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、抗体とタンパク質抗原との結合は、限定するものではないが、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）または酵素結合免疫吸着法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイなどの様々な技術を使用して検出および／または定量化できる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；  Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．  Ｃ．  Ｌｏ（２００４年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：  １５８８２９０９２１）；  Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９２年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ」Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ＮＹ；  Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９５年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｏｘｆｏｒｄ；  Ｊｏｈｎｅら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．１６０巻：１９１〜１９８頁；Ｊｏｎｓｓｏｎら（１９９３年）Ａｎｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｌｉｎ．５１巻：１９〜２６頁；ならびにＪｏｎｓｓｏｎら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１巻：６２０〜６２７頁を参照されたい。さらに、米国特許第６，３５５，２４５号を参照されたい。このような技術は、治療用抗体に関連する治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）が、その同族標的（例えば、ｃ−Ｍｐｌなどの細胞表面受容体）と結合する能力を保有しているかどうかを決定するためにも有用である。例えば、ｃ−Ｍｐｌに対するＴＰＯ模倣抗体の親和性を決定するために適切な方法を実施例に明記する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）の１つまたは複数の定常領域（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）は、宿主細胞において発現したＦｃ受容体と結合するそれらの能力を、部分的または完全に取り除くように修飾され得る。修飾は、例えば、１つまたは複数のＦｃ定常領域の突然変異誘発および翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）は、抗体が、未修飾の治療用抗体のＦｃ受容体と結合する能力の５０％未満（例えば、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５未満または０．０１未満）を有するように修飾され得る。抗体がＦｃ受容体と結合するかどうかを決定する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｌｕｎｄら（１９９１年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻（８号）：２６５７〜６２頁に記載されている。
【００６９】
いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）の少なくとも一部は、配列番号９で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）の少なくとも一部は、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）は、配列番号９で表されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖アミノ酸配列および配列番号１１で表されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖アミノ酸配列を含有し得る、またはそれらからなる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）の少なくとも一部は、以下のアミノ酸配列：
【００７１】
【化１】
2015043783.tif 000002
を有する軽鎖ポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）の少なくとも一部は、以下のアミノ酸配列：
【００７２】
【化２】
2015043783.tif 000003
を有する重鎖ポリペプチドを含み得る（上記：抗体の可変領域の配列に下線を引いてある；個々のポリペプチドにおけるＴＰＯ模倣ペプチドのアミノ酸配列は太字で示す；および抗体の定常領域のアミノ酸配列はイタリックとした。強調していないアミノ酸配列はスペーサー配列に相当する）。
【００７３】
本開示を通して使用する場合、「治療用抗体」および「ＴＰＯ模倣抗体」という用語は、少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３または４）の本開示に従った治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を含有する全抗体または無傷の抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥを含む）分子を指す。治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）は、少なくとも２つの治療用ペプチドおよびＧ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域などのハイブリッド定常領域またはそれらの一部を有する全抗体をさらに含む（例えば、Ｂｕｒｔｏｎら（１９９２年）Ａｄｖ．
Ｉｍｍｕｎ．  ５１巻：１〜１８頁；Ｃａｎｆｉｅｌｄら（１９９１年）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１７３巻：１４８３〜１４９１頁；およびＭｕｅｌｌｅｒら（１９９７年）Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４巻（６号）：４４１〜４５２頁を参照されたい）。例えば、（およびＫａｂａｔのナンバリングに従って）、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４定常領域は、Ｇ２４９Ｇ２５０残基を含有し、それに対してＩｇＧ２定常領域は残基２４９を含有しないが、Ｇ２５０を含有する。Ｇ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域において、２４９〜２５０領域がＧ２配列に由来する場合、定常領域は、２４９位のグリシン残基を導入し、Ｇ２４９／Ｇ２５０を有するＧ２／Ｇ４の融合を作製するようにさらに修飾され得る。Ｇ２４９／Ｇ２５０を含有する他の定常ドメインハイブリッドは、本開示に従ったＴＰＯ模倣抗体の足場としても使用され得る。
【００７４】
「抗体」という用語は、例えば、キメラ化またはキメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫化ヒト抗体および完全ヒト抗体を含む。抗体足場は、任意の様々な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒまたはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラットおよびマウスから構成され得る、またはそれらに由来し得る。
【００７５】
本明細書において使用する場合、「治療的活性抗体断片」またはいくつかの事例において「抗体断片」または「治療的に活性な断片」という用語は、（ｉ）本開示に従った無傷の治療用抗体中に存在する、少なくとも２つ（例えば、少なくとも２、３または４；上記を参照されたい）の治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）を構造的に保有する、および（ｉｉ）無傷の治療用抗体の治療活性の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％以上）を機能的に保有する治療用抗体の断片（例えば、ＴＰＯ模倣抗体の断片）を指す。例えば、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体の治療的に活性な断片は、無傷のＴＰＯ模倣抗体のＴＰＯ様活性の少なくとも１０％を保有すると思われる（以下の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」を参照されたい）。別の実施例において、エリスロポエチン（ＥＰＯ）模倣ペプチドを含有する抗体の治療的に活性な断片は、無傷の「ＥＰＯ模倣抗体」のＥＰＯ様活性の少なくとも１０％を保有すると思われる。治療用抗体の治療的に活性な断片は、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片を含む。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖが由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む一本鎖ポリペプチドである。さらに、重鎖および／または軽鎖定常領域の少なくとも一部と融合され、少なくとも２つの本開示に従った治療用ペプチドを含有するミニボディ、トリアボディおよびダイアボディ（例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら（２００１年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２４８巻（１号）：４７〜６６頁；Ｈｕｄｓｏｎおよび  Ｋｏｒｔｔ（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２３１巻（１号）：１７７〜１８９頁；ならびにＰｏｌｊａｋ（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２巻（１２号）：１１２１〜１１２３頁を参照されたい、これらのそれぞれの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）は、本明細書に記載の方法で調製でき、使用できる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体（またはＦ（ａｂ’）２などのそれらの断片）は、少なくとも２つの本開示に従った治療用ペプチドを導入するための足場として機能できる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の少なくとも一方（または両方）の抗原結合部位の抗原結合能力は保持される。例えば、２つ以上の治療用ペプチドは、本開示に従った二重特異性抗体の１つのアーム（例えば、Ｆａｂ領域）に組み込まれ得るが、二重特異性抗体の第２のアーム（例えば、第２のＦａｂ領域）には組み込まれない。別の実施例において、治療用ペプチドは二重特異性抗体の両方のアーム（例えば両方のＦａｂ領域）に組み込まれ得、抗体アームの少なくとも１つ（または両方）の抗原結合能力は、治療用ペプチドの組み込みにより影響を受けない。このような（「治療用抗体」という用語によって完全に包含される）治療用二重特異性抗体は、例えば、特定の標的細胞に対する治療用抗体の治療用ペプチドを標的にするために使用され得る。例えば、治療用二重特異性抗体がＴＰＯ模倣ペプチドを含有する場合、治療用二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原結合部位は、巨核球のタンパク質マーカーと結合できる。適切な巨核球タンパク質マーカーは、例えば、ＣＤ４１（Ｉｌｂ／ＩＩＩａ）およびＣＤ４２（ｌｂ）を含む。
【００７７】
治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片を作製する方法
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片は、分子生物学およびタンパク質化学の分野において公知の様々な技術を使用して作製できる。例えば、抗体のヒンジ領域とペプチド配列とを置換するために、治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）をコードするＤＮＡ配列を、抗体をコードするＤＮＡ配列内にグラフトすることは、限定するものではないが、オーバーラップＰＣＲ、制限酵素部位クローニング、部位特異的突然変異誘発および完全合成手法などの組換えＤＮＡ技術を使用して実施され得る。部位特異的突然変異誘発は、いくつかの方法で達成できる。１つは、ｄｕｔ／ｕｎｇ  Ｋｕｎｋｅｌの突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：４８８〜９２頁）に基づく。いくつかのＰＣＲ増幅に基づく突然変異誘発の取り組みは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＫｉｔおよびＥｘＳｉｔｅ（商標）ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などがすでに市販されている。別の非ＰＣＲ法は、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）である。完全合成手法もまた周知であり、例えば、Ｄｅｎｇら（１９９５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．５１巻：３２９〜４２頁；Ｋｕｔｅｍｅｌｅｒら（１９９４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７巻（２号）：２４２〜２４６頁；Ｓｈｉら（１９９３年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３巻（１号）：４６〜５３頁；ならびにＫｎｕｐｐｉｋら（２０００年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６巻（１号）：５７１〜８６頁に記載されている。
【００７８】
標準的分子生物学技術は、治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）のカルボキシ末端および／またはアミノ末端に、隣接するスペーサーアミノ酸配列を導入するためにもさらに使用できる。上記のように、このような隣接配列は、例えば、治療用ペプチドの構造的制約を減少させるため、および生物学的活性に必要な立体構造をより簡単に適用させるために有用であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、隣接領域は、例えば、１つまたは複数のプロリン残基を含み得る。例えば、ＫｉｎｉおよびＥｖａｎｓ（１９９５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ２１２巻（３号）：１１５〜２４頁ならびにＫｉｎｉら（１９９５年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ３７５巻：１５〜１７頁を参照されたい。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のプロリン残基が、治療用ペプチド（例えばＴＰＯ模倣ペプチド）のカルボキシ末端に付加される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、スペーサーアミノ酸配列は、例えば、配列番号：５〜８のいずれかの１つまたは複数を含み得る。
【００８１】
核酸は、転写制御配列および翻訳制御配列を含有する発現ベクターに挿入され得、これらは、例えばプロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、転写ターミネータシグナル、ポリアデニル化シグナルならびにエンハンサー配列またはアクチベータ配列を含む。制御配列は、プロモーターならびに転写開始配列および転写終止配列を含む。さらに、発現ベクターは２種の異なる生物に、例えば発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞およびクローニングおよび増幅のための原核生物細胞に保持され得るように、発現ベクターは複数の複製系を含み得る。
【００８２】
いくつかのベクター系候補は、哺乳動物細胞中の核酸に由来するクローン化された重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現のために利用可能である。ベクターの１クラスは、宿主細胞ゲノムへの所望の遺伝子配列の統合に頼っている。安定に統合されたＤＮＡを有する細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ（１９８１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７８巻：２０７２頁）またはＴｎ５  ｎｅｏ（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ（１９８２年）Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．１巻：３２７頁）などの薬剤耐性遺伝子を同時に導入することによって選択され得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列と連結されるか、または共トランスフェクションによって同じ細胞に導入されるかのいずれかが可能である。（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９年）Ｃｅｌｌ１６巻：７７頁）。ベクターの第２のクラスは、自律的複製能力を染色体外プラスミドにもたらすＤＮＡ成分を利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（Ｓａｒｖｅｒら（１９８２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７９巻：７１４７頁）、ポリオーマウイルス（Ｄｅａｎｓら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻：１２９２頁）またはＳＶ４０ウイルス（ＬｕｓｋｙおよびＢｏｔｃｈａｎ（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ２９３巻：７９頁）などの動物ウイルスに由来し得る。
【００８３】
発現ベクターは、核酸のその後の発現のために適切な手法で細胞に導入され得る。導入の方法は、以下の述べるように標的とする細胞の型により大きく指示される。例示的方法は、ＣａＰＯ４沈降、リポソーム融合、リポフェクチン、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合および直接マイクロインジェクションを含む。
【００８４】
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片の発現に適切な宿主細胞は、酵母、細菌、昆虫、植物および哺乳動物の細胞を含む。特に興味深いのは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞系（例えばヒト細胞系）および初代細胞系である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、治療用抗体は、トランスジェニック動物において発現し、およびそれらから精製され得る（例えばトランスジェニック哺乳動物）。例えば、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１３巻（６号）：６２５〜６２９頁；ｖａｎ  Ｋｕｉｋ−Ｒｏｍｅｉｊｎら（２０００年）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ９巻（２号）：１５５〜１５９頁；ならびにＰｏｌｌｏｃｋら（１９９９年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２３１巻（１〜２）：１４７〜１５７頁に記載のように、例えば治療用抗体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えばげっ歯類）において作製でき、ミルクから単離できる。
【００８６】
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）およびそれらの断片は、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、タンパク質を発現させるために十分な条件および十分量の時間において培養することによって細胞から作製される。タンパク質発現のこのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択により変動すると思われ、日常の実験を介して当業者により容易に確認されると思われる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現した治療用抗体は、封入体からリフォールディングされ得る（例えば、Ｈｏｕら（１９９８年）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１０巻：３１９〜３０頁を参照されたい）。細菌発現系およびそれらの使用方法は当技術分野において周知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  ＆  ＳｏｎｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）を参照されたい）。コドン、適切な発現ベクターおよび適切な宿主細胞の選択は多くの因子に依存して変動すると思われ、必要に応じて容易に最適化できる。治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片は、哺乳動物細胞または限定するものではないが酵母、バキュロウイルスを含む他の発現系およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において発現され得る（例えば、Ｋａｓｚｕｂｓｋａら（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １８巻：２１３〜２２０頁を参照されたい）。
【００８７】
発現後、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片は単離され得る。本明細書に記載の任意のタンパク質（例えばＴＰＯ模倣抗体タンパク質またはそれらの断片）に適用される「精製された」または「単離された」という用語は、ポリペプチドに天然に付随している成分（例えば、タンパク質または他の天然発生の生物学的または有機的分子）、例えば他のタンパク質、脂質およびタンパク質を発現する原核生物中の核酸から分離された、または精製されたポリペプチドを指す。通常、ポリペプチドが、試料中の全タンパク質の少なくとも６０（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７または９９）重量％を構成する場合、ポリペプチドは精製されている。
【００８８】
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片は、試料中に存在する他の成分に依存して、当業者に公知の様々な方法で単離または精製され得る。標準的精製方法は、電気泳動、分子、免疫学的およびイオン交換、疎水性、アフィニティーおよび逆相ＨＰＬＣのクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーの技術を含む。例えば、ＴＰＯ模倣抗体が標準的抗抗体カラム（例えば、タンパク質−Ａまたはタンパク質−Ｇカラム）を使用して精製され得る。タンパク質の濃縮と併用して、限外ろ過および透析ろ過の技術もまた有用である。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４年）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第３版」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。精製必要性の程度は所望の使用に依存して変動するであろう。場合によっては、発現した治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）または断片の精製が必要ないこともある。
【００８９】
精製された治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片の収率または純度を決定する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＵＶ分光法、Ｂｉｕｒｅｔプロテインアッセイ、Ｌｏｗｒｙプロテインアッセイ、アミドブラックプロテインアッセイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法（ＭＳ）およびゲル電気泳動法（例えば、クマシー・ブルーまたはコロイド銀染色などのタンパク質染色を使用する）を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、エンドトキシンは治療用抗体または断片から除去され得る。タンパク質試料からエンドトキシンを除去する方法は当技術分野において公知であり、実施例に例示する。例えば、限定するものではないが、ＰｒｏｔｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔｓ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＭｉｒａＣＬＥＡＮ（登録商標）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）またはＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）−Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む様々な市販の試薬を使用して、エンドトキシンはタンパク質試料から除去され得る。
【００９１】
試料中に存在するエンドトキシンの検出および／または量の測定方法（精製前および後の両方）は当技術分野において公知であり、市販のキットが利用可能である。例えば、タンパク質試料中のエンドトキシンの濃度は、ＱＣＬ−１０００Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃキット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）に基づくキット、例えば、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標）、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬおよびＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ
Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから利用可能なＣＳＥキットを使用して決定され得る。
【００９２】
治療用抗体を作製および精製する適切な方法は、実施例にも明記する。
【００９３】
治療用抗体および断片の修飾
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片は、それらの発現および精製後に修飾され得る。修飾は、共有結合修飾または非共有結合修飾であってよい。このような修飾は、例えば、ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤とを反応させることによって、抗体または断片に導入され得る。修飾のための適切な部位は、例えば、治療用抗体または断片のタンパク質の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む任意の様々な基準を使用して選択され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態において、治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、異種部分と接合され得る。異種部分は、例えば、非相同ポリペプチド、治療薬（例えば、毒素または薬剤）または限定するものでないが、放射活性標識、酵素標識、蛍光標識または発光標識などの検出可能な標識であってよい。適切な非相同ポリペプチドは、例えば、治療用抗体または断片の精製に使用する、抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、血液凝集素（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））を含む。非相同ポリペプチドは、診断マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をさらに含む。適切な放射活性標識は、例えば３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈを含む。適切な蛍光標識は、限定するものではないが、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＧＦＰ、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニンおよびＣｙ７を含む。発光標識は、例えば、任意の様々な発光性ランタニド（例えば、ユーロピウムまたはテルビウム）キレートを含む。例えば、適切なユーロピウムキレートはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のユーロピウムキレートを含む。酵素標識は、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。
【００９５】
２つのタンパク質（例えばＴＰＯ模倣抗体および非相同アミノ酸配列）は、任意の多数の公知の化学架橋剤を使用して架橋され得る。このような架橋剤の例は、「ヒンダード」ジスルフィド結合を含む結合を介して、２つのアミノ酸残基を連結する架橋剤である。これらの結合において、架橋ユニット内のジスルフィド結合は、還元グルタチオンまたは酵素のジスルフィドレダクターゼの作用によって（ジスルフィド結合の両側のヒンダリング基によって）還元から保護されている。１種の適切な試薬、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、一方のタンパク質の末端リジンと他方の末端システインとを利用して、２つのタンパク質の間のこのような結合を形成する。それぞれのタンパク質の異なるカップリング部分を架橋する、ヘテロ二官能性試薬もまた使用され得る。他の有用な架橋剤は、限定するものではないが、２つのアミノ基を連結する試薬（例えばＮ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基を連結する試薬（例えば１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基とスルフヒドリル基とを連結する試薬（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基とカルボキシル基とを連結する試薬（例えば４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）およびアミノ基とアルギニンの側鎖に存在するグアナジニウム基とを連結する試薬（例えばｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）を含む。
【００９６】
放射活性標識は、タンパク質アミノ酸骨格に直接接合され得る。または、放射活性標識は、遊離のアミノ基と結合して、関連タンパク質のメタ−インドフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成するより大きな分子（例えば、メタ−［１２５Ｉ］インドフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ）中の１２５Ｉ（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら（１９９７年）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３８巻：１２２１〜１２２９頁を参照されたい）または順にタンパク質骨格と結合されるキレート（例えばＤＯＴＡまたはＤＴＰＡに）の一部として含まれ得る。治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片を含有する放射活性標識またはより大きな分子／キレートの接合方法は、当技術分野において公知である。このような方法は、放射活性標識またはキレートとタンパク質との結合を容易にする条件下（例えば、ｐＨ、塩濃度および／または温度）でタンパク質と放射活性標識とをインキュベートするステップを含む（例えば米国特許第６，００１，３２９号を参照されたい）。
【００９７】
蛍光標識（時として「フルオロフォア」と称される）を、タンパク質（例えば、治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片）に接合する方法は、タンパク質化学の分野において公知である。例えば、フルオロフォアは、フルオロフォアに結合したスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル部分またはＴＦＰエステル部分を使用して、タンパク質の遊離の（例えばリジンの）アミノ基または（例えばシステインの）スルフヒドリル基と接合され得る。いくつかの実施形態において、フルオロフォアはスルホ−ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤部分と接合され得る。適切な接合方法は、フルオロフォアとタンパク質との結合を容易にする条件下で、治療用抗体タンパク質またはそれらの断片とフルオロフォアとをインキュベートするステップを含む。例えば、Ｗｅｌｃｈ  およびＲｅｄｖａｎｌｙ（２００３年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（ＩＳＢＮ０４７１４９５６０３）を参照されたい。
【００９８】
上記のように、本明細書に記載の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、それらが含有される治療用ペプチドに血清半減期の延長を提供する。しかし、いくつかの実施形態において、抗体または断片は、例えば、循環、例えば血液、血清または他の組織における抗体それ自体の安定化および／または保持を改善する部分を用いて修飾され得る。例えば、抗体または断片は、例えば、Ｌｅｅら（１９９９年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ１０巻（６号）：９７３〜８頁；Ｋｉｎｓｔｌｅｒら（２００２年）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ５４巻：４７７〜４８５頁；およびＲｏｂｅｒｔｓら（２００２年）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ５４巻：４５９〜４７６頁に記載のようにＰＥＧ化され得る。安定化部分は、抗体（または断片）の安定性または保持を、少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０倍以上）改善できる。安定化部分は、治療用ペプチド（遊離形態の治療用ペプチドと比較して）安定性または保持を、少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０倍以上）さらに改善できる。
【００９９】
治療用抗体または断片の生物学的活性のアッセイ
様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的アッセイを、本明細書に記載の治療用抗体または抗体の治療的に活性な断片の生物学的活性をアッセイするために使用できる。この方法は、抗体に含有される特定の治療用ペプチドの活性に依存して変更できる。例えば、ＴＰＯ模倣抗体、断片または記載された接合体のトロンボポエチン様活性は、例えば、コロニー形成アッセイ、増殖アッセイ、リン酸化アッセイおよび／または転写に基づくアッセイを使用してアッセイできる。コロニー形成アッセイは、被験体から得た骨髄試料から形成された巨核球コロニーを測定する（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  ＢＣ、ＣａｎａｄａによるＭｅｇａｃｕｌｔ（登録商標）Ｃ  Ｋｉｔを参照されたい）。増殖アッセイは、ＴＰＯ模倣抗体、断片または接合体の存在下で、不在の場合と比較したｃ−Ｍｐｌ受容体発現Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖を測定するために使用できる。例えば、Ｃｗｉｒｌａら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６巻：１６９６〜１６９９頁およびｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６９巻：５３３頁を参照されたい。ＴＰＯ模倣抗体（または断片）の不在下での細胞の増殖量と比較した、ＴＰＯ模倣抗体（または断片）と接触させた細胞の増殖の増加は、ＴＰＯ模倣抗体（または断片）がＴＰＯ様生物学的活性を有することの表示である。ＴＰＯ模倣抗体の活性の基準として、例えば、Ｄｒａｃｈｍａｎら（１９９９年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７４巻：１３４８０〜１３４８４頁およびＭｉｙａｋａｗａら（１９９６年）Ｂｌｏｏｄ８７巻（２号）：４３９〜４６頁に記載のように、ＪＡＫ２またはＳｔａｔ３またはＳｔａｔ５のリン酸化を測定することによってｃ−Ｍｐｌ受容体の活性化をアッセイできる。ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の活性は、米国特許出願公開第２００３００４９６８３号に記載の転写に基づくアッセイを使用して測定できる。例えば、哺乳動物細胞に、完全長ｃ−Ｍｐｌ受容体をコードする核酸およびルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトすることができ、その発現はｃ−Ｆｏｓプロモーターの調節下にある。細胞にｃ−Ｍｐｌ受容体を発現させた後、抗体と受容体とを結合させ得る時間および条件下で、細胞をＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片と接触させる。抗体と接触していない細胞において産生されたルシフェラーゼ量と比較した、細胞内で産生されるルシフェラーゼ量の増加は、ＴＰＯ模倣抗体がＴＰＯ様活性を有することの表示である。
【０１００】
さらに、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片のＴＰＯ様活性は、当技術分野において公知の様々なｉｎ  ｖｉｖｏ技術を使用してアッセイされ得る。例えば、血小板レベルの産生は、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片の投与後マウスにおいて測定され得る。治療を受けなかったマウスと比較した、治療されたマウスによる血小板産生の増加は、ＴＰＯ模倣抗体または断片がＴＰＯ様活性を有することの表示である。例示的ｉｎ
ｖｉｖｏアッセイ（例えば、動物における血小板産生の測定および／または放射線を照射された動物のＴＰＯ模倣抗体による生存の効果の研究）を実施例に例示する。
【０１０１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）模倣ペプチドを含有する治療用抗体（または断片）に関して、抗体または断片のＥＰＯ様活性は、骨髄赤血球コロニー形成アッセイ（例えば、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３巻：４５８〜４６３頁を参照されたい）；ヒト赤白血病細胞増殖アッセイ（Ｋｉｔａｍｕｒａら（１９８９年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４０巻：３２３〜３３４頁）；および／または例えば、Ｗｉｔｔｈｕｈｎら（１９９３年）Ｃｅｌｌ７４巻：２２７〜２３６頁に記載のリン酸化または転写活性化アッセイを使用してアッセイできる。例えば、１つの有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、急性巨核球白血病を有する患者に由来するＥＰＯ依存性ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞系を利用する（例えば、Ｋｏｍａｔｓｕら（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８２巻（２号）：４５６〜４６４頁を参照されたい）。ＵＴ−７／ＥＰＯ細胞は、ｒＨｕＥＰＯ添加培地の離脱後にアポトーシスを受ける。しかし、ｒＨｕＥＰＯまたはＥＰＯアゴニストにより処置した場合、この細胞は救うことができる。したがって、ＥＰＯを含有する治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片を、飢餓状態のＵＴ−７／ＥＰＯ細胞と接触させることができ、細胞の生存能力を決定できる。治療用抗体の不在下での細胞の生存と比較した、治療用抗体と接触させた飢餓細胞の生存の増加は、治療用抗体がＥＰＯ様活性を有することの表示である。
【０１０２】
医薬組成物
本明細書に記載の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片を含有する組成物は、例えば血小板産生の増加のために被験体に投与する医薬組成物として製剤化され得る。この医薬組成物は全般に薬学的に許容される担体を含むであろう。本明細書において使用する場合「薬学的に許容される担体」は、生理学的に相溶性のあるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指す、およびそれらを含む。この組成物は、薬学的に許容される塩は、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
【０１０３】
この組成物は、標準的方法に従って製剤化され得る。医薬製剤は、十分に確立された分野であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら（１９９９年）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（２０００年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」、第３版（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。いくつかの実施形態において、例えば、適切な濃度で２〜８℃（例えば、４℃）における保存に適した緩衝化溶液として組成物は製剤化され得る。いくつかの実施形態において、組成物は０℃以下（例えば、−２０℃または−８０℃）の温度における保存のために製剤化され得る。いくつかの実施形態において、組成物は２〜８℃（例えば、４℃）における２年まで（例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１年半または２年）の保存のために製剤化され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は少なくとも２〜８℃（例えば、４℃）においての１年間安定に保存される。
【０１０４】
医薬組成物は様々な形態であり得る。これらの形態は、例えば、液体、半固体および固体の剤形、例えば溶液（例えば、注射溶液および注入溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、リポソームおよび座薬を含む。好ましい形態は、意図する投与様式および治療用途に一部依存する。例えば、全身送達または局所送達を意図する、抗体または断片を含有する組成物は、注射溶液または注入溶液の形態であってよい。したがって、組成物は非経口様式（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射または筋肉内注射）による投与のために製剤化され得る。「非経口投与」「非経口的に投与される」および他の文法的に同等のフレーズは、本明細書において使用する場合、腸内投与および局所投与以外の、通常注射による投与様式を指し、限定するものではないが、静脈内、鼻腔内、眼球内、肺、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、大脳内、頭蓋内、頚動脈内および大槽内の注射および注入を含む（以下を参照されたい）。
【０１０５】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高濃度での安定な保存に適した他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射溶液は適切な溶媒中の所要量の本明細書に記載の抗体（または抗体の断片）と上記の原料の１種または組み合わせとを組み込み、必要に応じてその後ろ過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、本明細書に記載の抗体または断片を、基礎分散媒および上記の原料からの所要の他の原料を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌散剤の場合、調製方法は、本明細書に記載の治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片＋任意のさらなる所望の原料（以下を参照されたい）の既に滅菌ろ過されたそれらの溶液の粉末を得る、真空乾燥およびフリーズドライを含む。溶液の固有の流動性は維持され得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合所要の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片は、迅速な放出から化合物を保護すると思われる担体と一緒に、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化遅延系を含む放出制御製剤に調製され得る。生分解性、生体適合性のポリマーは、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。このような製剤の多くの調製方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９７８年）「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０１０７】
治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片をコードする核酸は、遺伝子構築体に組み込まれ、細胞内で薬剤を発現および産生するために使用され得る核酸を送達する、遺伝子療法プロトコルの一部として使用され得る（以下を参照されたい）。このような成分の発現構築体は、任意の治療的に有効な担体、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで成分遺伝子を細胞に有効に送達できる任意の製剤または組成物において投与され得る。取り組みは、対象遺伝子を、組換えのレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルスおよび単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）または組換え細菌もしくは真核生物プラスミドを含むウイルスベクターへ挿入することを含む。ウイルスベクターは細胞に直接トランスフェクトでき、プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体化された（例えば、抗体を接合された）ポリリジン接合体、グラミシジンＳ、人工のウイルスエンベロープまたは他のこのような細胞内担体の助けにより送達され得、および遺伝子構築体の直接注射またはＣａＰＯ４沈降（例えば、ＷＯ０４／０６０４０７を参照されたい）がｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。（以下の「Ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」もさらに参照されたい。）適切なレトロウイルスの例は、当業者に公知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含む（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０巻：１３９５〜１３９８頁；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８５巻：６４６０〜６４６４頁；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８５巻：３０１４〜３０１８頁；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８７巻：６１４１〜６１４５頁；Ｈｕｂｅｒら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８８巻：８０３９〜８０４３頁；Ｆｅｒｒｙら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８８巻：８３７７〜８３８１頁；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４巻：１８０２〜１８０５頁；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９頁：７６４０〜７６４４頁；Ｋａｙら（１９９２年）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ３巻：６４１〜６４７頁；Ｄａｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９巻：１０８９２〜１０８９５頁；Ｈｗｕら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０巻：４１０４〜４１１５頁；米国特許第４，８６８，１１６号および第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０７１３６、ＷＯ８９／０２４６８、ＷＯ８９／０５３４５およびＷＯ９２／０７５７３を参照されたい）。別のウイルス遺伝子送達系はアデノウイルス由来ベクターを利用する（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６巻：６１６頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２巻：４３１〜４３４頁；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２年）Ｃｅｌｌ６８巻：１４３〜１５５頁を参照されたい）。Ａｄ株５  ｄｌ３２４型またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。対象遺伝子の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．７巻：３４９〜３５６頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：３８２２〜３８２８頁；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ６２巻：１９６３〜１９７３頁を参照されたい。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、被験体において血小板産生を増加させるために有用な１種または複数のさらなる活性薬剤と一緒に製剤化され得る。被験体において血小板産生を増加させるさらなる薬剤は、限定するものではないが、Ｐｒｏｍａｃｔａ（登録商標）／Ｒｅｖｏｌａｄｅ（登録商標）（エルトロンボパグ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、Ｎｐｌａｔｅ（商標）（ロミプロスチム；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびＮｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン；ｒｈＩＬ−１１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）を含む。いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、例えば、赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）またはＮｅｕｌａｓｔａ（商標）（ペグフィルグラスチム；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を含む、貧血または好中球減少の治療に有用な１種または複数のさらなる活性薬剤と一緒に製剤化され得る。ＥＳＡは、限定するものではないが、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ；Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、放射線への曝露の症状を処置するために有用な１種または複数のさらなる薬剤と一緒に製剤化され得る。例えば、ＴＰＯ模倣抗体または断片は、抗生物質、麻酔薬、制吐剤、ステロイド（例えば、４−アンドロステンジオールまたは５−アンドロステンジオールなどのアンドロステンジオール）、キレート剤および幹細胞と一緒に製剤化され得る。適切な制吐剤は、限定するものではないが、５−ＨＴ３受容体アンタゴニスト、ドーパミンアンタゴニストおよびカンナビノイドを含む。例えば、Ｄｏｎｎｅｒｅｒ  Ｊ．（２００３年）「Ａｎｔｉｅｍｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｋａｒｇｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ＩＳＢＮ３８０５５７５４７５）を参照されたい。キレート剤を含む製剤は、治療される被験体が、セシウム−１３７またはタリウム−２０１などの放射性核種を照射された被験体である実施形態において有用であり得る。適切なキレート剤は、例えば、Ｃａ−ＤＴＰＡ、Ｚｎ−ＤＴＰＡ、Ｒａｄｉｏｇａｒｄａｓｅ（商標）（「プルシアンブルー」とも称される）、デフェリオキサミンおよびペニシラミンを含む。いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片は、限定するものではないが、ヨウ化カリウムまたはカルシウム塩などの放射性核種置換剤と一緒に製剤化され得る。いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片は、被験体から放射性同位元素の分泌を促進するための薬剤と一緒に製剤化され得る。例えば、抗体または断片は利尿薬と一緒に製剤化され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、例えば、被験体における血小板数の減少が感染（例えば、感染関連血栓性血小板減少紫斑病またはＤＩＣ）によりもたらされる場合、抗体またはそれらの断片は、感染（例えば、細菌感染またはＨＩＶなどのウイルスによる感染）の治療に使用するための１種または複数の薬剤と一緒に製剤化され得る。例えば、抗体または断片は抗生物質または抗ウイルス剤と一緒に製剤化され得る。抗生物質は、感染型に依存して変動すると思われるが、例えば、ペニシリン、エリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはドキシサイクリンを含むことができる。同様に、抗ウイルス剤も感染型に依存して変動すると思われる。例えば、ＨＩＶ感染の治療に有用な抗ウイルス剤は、例えば、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤あるいはＨＩＶと細胞との結合および／またはＨＩＶの細胞への侵入を阻害する薬剤を含む。
【０１１１】
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片が、第２の活性薬剤と組み合わせて使用される場合、この薬剤は別々に製剤化されても、または一緒に製剤化されてもよい。例えば、それぞれの医薬組成物は、投与直前に混合され一緒に投与されても、または個々の組成物が、例えば、同時または異なる時間に別々に投与されてもよい（以下を参照されたい）。
【０１１２】
上記のように、組成物は、治療有効量の（例えば、血小板産生を増加する量）の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片を含むように製剤化され得る、または組成物は治療量以下の量の抗体および治療量以下の量の１種または複数のさらなる活性薬剤を合計の成分が治療的に有効（例えば、被験体において、放射線への曝露患者の治療または血小板産生の増加に治療的に有効）になるように含むように製剤化され得る。例えば、組成物は、ＴＰＯ模倣抗体およびエルトロンボパグのそれぞれを、両方の薬剤の量が合計で被験体にとって治療的に有効なように治療量以下の量を含むことができる。治療的に有効な用量の決定方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載してある。
【０１１３】
治療方法
特定の治療用ペプチドに依存して、上記の組成物は、様々な治療方法においてとりわけ有用である。例えばＴＰＯ模倣抗体は、それを必要とする被験体（例えばヒト）における血小板産生の増加方法において有用である。組成物は、投与経路に一部応じて様々な方法を使用して、被験体、例えばヒト被験体に投与できる。この経路は、例えば静脈内注射または注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）または筋肉内の注射であってよい。
【０１１４】
投与は、例えば、局所注入、局所注射によって、またはインプラントを用いることによって達成され得る。インプラントは、サイラスティックの膜または線維などの膜を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン質の材料のインプラントであってよい。インプラントは、被験体への組成物の持続放出または周期的放出のために形成され得る。（例えば、米国特許公開第２００８０２４１２２３号、米国特許第５，５０１，８５６号；第４，８６３，４５７号；および第３，７１０，７９５号；ＥＰ第４８８４０１号；およびＥＰ第４３０５３９号を参照されたく、これらそれぞれの開示は参照にそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。この組成物は、例えば、拡散性、浸蝕性または対流性の系、例えば、浸透圧ポンプ、生分解性インプラント、電気拡散系、電気浸透系、蒸気圧ポンプ、電解ポンプ、発泡ポンプ、圧電ポンプ、浸食に基づく系または電気機械系に基づくインプラント可能なデバイスを用いて被験体に送達され得る。
【０１１５】
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片の適切な用量（例えば、被験体において血小板の産生を増加できる用量）は、例えば、治療される被験体の年齢、性別および体重ならびに使用される特定の治療用抗体を含む様々な因子に依存し得る。例えば、同じ被験体を処置するために必要なＴＰＯ模倣抗体の断片の用量と比較して、異なる用量のＴＰＯ模倣抗体が、被験体において血小板の産生を増加させるために必要であると思われる。被験体に投与されるＴＰＯ模倣抗体の用量に影響を与える他の因子は、例えば、被験体における血小板レベルの減少の原因または血小板数の減少の重症度を含む。例えば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の患者は、放射線誘導性血小板減少症を患う被験体とは異なる投与量のＴＰＯ模倣抗体（または断片）の投与を必要とすると思われる。特定の治療用抗体（または断片）の投与量に影響を与える他の因子は、例えば、同時に、または以前に被験体を襲った他の医学的障害、被験体の全体的な健康、被験体の遺伝的傾向、食事、投与時間、排出速度、併用薬剤、および被験体に投与された任意の他のさらなる治療薬を含み得る。任意の特定の被験体のための、特定の投与量および治療レジメンは、治療に当たっている医療実践者（例えば、医師または看護師）の判断に依存するであろうことを、さらに理解するべきである。
【０１１６】
治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）または断片は、固定用量として、またはマイクログラム／キログラム（μｇ／ｋｇ）もしくはミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、用量は、組成物中の１種または複数の活性薬剤に対する抗体の産生または他の宿主免疫反応をさらに減少させる、または避けるためにも選択され得る。限定する意図のものではないが、本明細書に記載の抗体またはそれらの断片の例示的投与量は、例えば、１〜１００μｇ／ｋｇ、０．５〜５０μｇ／ｋｇ、０．１〜１００μｇ／ｋｇ、０．５〜２５μｇ／ｋｇ、１〜２０μｇ／ｋｇ、および１〜１０μｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇおよび１〜１０ｍｇ／ｋｇを含む。治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）の例示的投与量は、限定するものではないが、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇおよび８μｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、および８ｍｇ／ｋｇを含む。
【０１１７】
医薬組成物は、治療有効量の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片を含むことができる。このような有効量は、投与された抗体（または断片）の効果、または複数の薬剤を使用する場合、抗体および１種または複数のさらなる活性薬剤の組み合わせ効果に一部基づき、当業者により容易に決定され得る。治療有効量の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに個体における所望の反応、例えば、被験体における血小板産生の増加を誘発する抗体（および１種または複数の活性薬剤）の能力などの因子に従ってさらに変動し得る。例えば、治療有効量のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片は、個体において血小板産生を増加でき、従って、例えば、放射線への曝露または化学療法後の血小板枯渇を阻害（重症度を低下させるまたは発症を取り除く）および／または阻止を可能にする。また治療有効量の治療用抗体は、組成物の任意の毒性効果または有害効果を治療的に有益な効果を上回る量である。
【０１１８】
本明細書で使用する「治療有効量」または「治療有効用量」という用語または同様の用語は、所望の生物学的反応または医学的反応（例えば、被験体における血小板産生の増加）を誘発するであろう薬剤（例えば、本明細書に記載の治療用抗体または断片）の量を意味することを意図する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、治療有効量の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片を含有する。いくつかの実施形態において、この組成物は、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの断片および１種または複数（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１以上）のさらなる治療薬剤を、全体としての組成物が治療的に有効であるように含有する。例えば、組成物は、ＴＰＯ模倣抗体およびエルトロンボパグを含有することができ、抗体および小分子は、それぞれ組み合わせた場合に治療的に有効な濃度である。
【０１１９】
このような組成物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における公知の薬学的手順により決定され得る。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対する治療有効用量）を決定するために使用され得る。毒性効果および治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表され得る。高い治療指数を示す治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片の組成物が好ましい。毒性副作用を示す組成物が使用され得る一方で、このような化合物を標的とする病気に冒された組織の部位への送達系の設計には注意を払うべきであり、正常な細胞を損傷する可能性を最小化し、その結果副作用が減少する。
【０１２０】
本明細書に記載の治療用抗体または治療的に活性な断片の毒性および／または治療有効性をアッセイするために適切な動物モデルは当技術分野において公知である。当然のことながら、このようなモデルは、抗体または断片に含有される特定の治療用ペプチドの生物学的活性に一部基づき、変動すると思われる。例えば、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の治療有効性をアッセイするために適切な動物モデル（例えば、マウスおよび非ヒト霊長類モデル）は、例えば、Ｔｈｏｍａｓら（１９９６年）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ１４巻：２４４頁；Ｗｉｎｔｏｎら（１９９５年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ２３巻：４８６頁；Ｎｅｅｌｉｓら（１９９８年）Ｂｌｏｏｄ９２巻（５号）：１５８６〜１５９７頁；およびＭｏｕｔｈｏｎら（１９９９年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ４３巻（４号）：８６７〜８７５頁に記載されるように、当技術分野において公知である。さらに、ＴＰＯ模倣抗体の毒性および／または治療有効性をアッセイするために適切な動物モデルを実施例に例示する。
【０１２１】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒトにおいて使用するための投与量範囲の処方に使用され得る。組成物（例えば、それらに含有されるＴＰＯ模倣抗体または断片）の評価に使用するために適切な動物モデルは当技術分野において公知であり、実施例に例示する。このような治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）または断片の投与量は、毒性がわずか、またはないＥＤ５０を含む抗体の循環濃度の範囲内に一般的に収まる。投与量は、用いた剤形および利用した投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。本明細書に記載のように使用される（例えば、被験体における血小板産生を増加するため）治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片に関して、治療有効用量は細胞培養アッセイからはじめに推定され得る。用量は動物モデルにおいて処方され得、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得ることができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。治療用抗体の適切なヒト用量は、例えば、第１相用量漸増試験においてさらに評価され得る。例えば、ｖａｎ  Ｇｕｒｐら（２００８年）Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ８巻（８号）：１７１１〜１７１８頁；Ｈａｎｏｕｓｋａら（２００７年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１３巻（２号、パート１）：５２３〜５３１頁；およびＨｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎら（２００６年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ５０巻（１０号）：３４９９〜３５００頁を参照されたい。
【０１２２】
上記のように、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の所要の用量は、被験体の血液中の血小板数に一部基づいて決定され得る。例えば、血小板数の低い被験体は、血小板数の高い被験体より高い用量のＴＰＯ模倣抗体を必要とすると思われる。
【０１２３】
ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の使用を含む本明細書に記載の任意の方法は、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片を含有する組成物の投与後に血小板数をモニターするステップを含み得る。組成物が化学療法または放射線療法レジメンと併せて投与される場合、モニタリングは、化学療法または放射線療法レジメンにさらされる前、間および／または後に起こり得る。
【０１２４】
被験体からの血液由来試料中の血小板数を決定する方法は、医療の分野において周知であり、例えば、Ｓａｌｌａｈら（１９９８年）Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１０３巻：２０９〜２１０頁；Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ（１９９４年）Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．８巻：８０９〜８５３頁；Ｒｅｄｅｉら（１９９５年）Ｊ  Ｃｒｉｔ  Ｉｌｌｎ１０巻：１３３〜１３７頁；Ｂｕｔｋｉｅｗｉｃｚら（２００６年）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１８巻（２号）：１９９〜２０４頁；Ｔｏｍｉｔａら（２０００年）Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ６３巻（３号）：１３１〜１３５頁；およびＳｃｈｒｅｚｅｎｍｅｉｅｒら（１９９８年）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ１００巻（３号）：５７１〜５７６頁に記載されている。
【０１２５】
医療実践者が、被験体の血小板レベルのリアルタイムなモニタリングに基づいて、組成物の用量の量、用量の頻度または投与経路の変更を選ぶことができることを理解するべきである。
【０１２６】
本明細書において使用する場合「被験体」は、任意の哺乳動物であってよい。例えば、被験体はヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒまたはチンパンジー）ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラットまたはマウスであり得る。いくつかの実施形態において、被験体は幼児（例えば、ヒト幼児）である。
【０１２７】
本明細書において使用する場合、「予防を必要とする」、「治療を必要とする」または「それらを必要とする」被験体は適切な医療実践者（例えば、医師、看護師またはヒトの場合ナース・プラクティショナー：非ヒト哺乳動物の場合獣医師）の判断により、所与の治療（治療用抗体、例えばＴＰＯ模倣抗体を用いた治療など）から合理的に利益を得るであろう被験体を指す。例えば、血小板レベルが十分でないことに関連する障害（血小板減少症関連疾患）を有する被験体は、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片を用いた治療を必要とする被験体であり得る。
【０１２８】
したがって、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、血小板数不足に関連する障害（血小板減少症）を有する被験体に投与され得る。このような障害は医薬の分野において周知であり、限定するものではないが、ベルナール・スーリエ症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、脾機能亢進、血栓性微小血管症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、再生不良性貧血、溶血性尿毒症症候群、（ＨＵＳ；定型または非定型）、劇症型抗リン酸脂質症候群（ＣＡＰＳ）、新生児同種免疫ＩＴＰ、輸血後紫斑病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、尿毒症、フォン・ヴィレブランド病、変異型フォン・ヴィレブランド病、グランツマン血小板無力症、ＴＴＰ、紅斑性狼瘡およびビタミン欠乏症を含む。この障害は、放射線誘導性血小板減少症（以下を参照されたい）および薬剤誘導性血小板減少症（ＤＩＴ；「薬剤誘導性血小板不全」とも称される）、限定するものではないが、例えばヘパリン、キナアルカロイド誘導体（キニーネおよびキニジン）、ペニシリン、スルホンアミド、非ステロイド抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）、抗痙攣薬、抗リウマチ薬および経口抗糖尿病薬、金塩、利尿薬、リファンピシン、インターフェロンガンマ、リボバリン（ｒｉｂｏｖａｒｉｎ）およびラニチジンにより誘導される血小板減少症をさらに含む。例えば、Ｃｈｏｎｇら（１９９１年）Ｂｌｏｏｄ７７巻：２１９０〜２１９９頁；Ｃｕｒｔｉｓら（１９９４年）Ｂｌｏｏｄ８４巻：１７６〜１８３頁；Ｇｅｎｔｉｌｉｎｉら（１９９８年）Ｂｌｏｏｄ９２巻：２３５９〜２３６５頁；Ｂｕｒｇｅｓｓら（２０００年）Ｂｌｏｏｄ９５巻：１９８８〜１９９２頁；ｖａｎ  ｄｅ  Ｂｅｍｔら（２００４年）Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．２７巻：１２４３〜１２５２頁；Ａｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｕｇｉｅ（２００７年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ３５７巻（６号）：５８０〜５８７頁；Ｇｅｏｒｇｅら（１９９８年）Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ１２９巻（１１号）：８８６〜８９０頁；およびＬｉら（２００７年）Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．３０巻（２号）：１８５〜１８６頁を参照されたく、これらの個々の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＩＴは、様々な病態、限定するものではないが、例えば新生物、骨髄異型性症候群およびＨＩＶおよび肝炎感染などの特定のウイルス感染の治療によりもたらされ得る。例えば、化学療法レジメンと関係があるＤＩＴについて以下でさらに詳しく述べる。
【０１２９】
ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片はさらに、化学療法薬または放射線療法薬のレジメンと併せて患者に投与され得る。化学療法または放射線療法の骨髄抑制効果により、これらの治療を受けた患者は、出血の危険性による生命を脅かされる可能性のある重症な好中球減少症および血小板減少症を発症し得る。血小板減少症は、多くの場合、医療実践者（例えば、癌専門医）の能力を制限し得る、例えば、化学療法投与量を上昇させ、および／または化学療法レジメンを継続させ、これは順に癌の寛解または癌患者の治癒の可能性を妨げる、または低下させる。例えば、Ｎｅｅｌｉｓら（１９９７年）Ｂｌｏｏｄ９０巻（７号）：２５６５〜２５７３頁；Ａｌｌｅｎら（２００４年）「Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（ＩＳＢＮ  ０７８１７４６１２４）；  Ｂｅｕｔｌｅｒ（１９９３年）Ｂｌｏｏｄ８１巻：１４１１頁；およびＮｉｒｅｍｂｕｒｇ（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｕｒｓ２６巻（６号）：３２Ｓ〜３７Ｓを参照されたい。したがって、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、医療実践者により使用され、放射線療法レジメンまたは化学療法レジメンと併せて血小板の回復が加速し得る（以下を参照されたい）。上記および実施例に例示のように、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体は、動物における合計血小板レベルの増加に高度に有効である。ＴＰＯ模倣抗体は、動物における枯渇した血小板レベルの迅速な回復にも有効である。したがって、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体または断片は、癌を有する被験体に投与した場合、医療実践者が、ＴＰＯ模倣抗体（または断片）の不在下で安全であるより、より強力な用量またはより頻繁な投与の化学療法または放射線療法を被験体に施行可能にさせる。上記の関連で使用する場合、「安全」または「安全になし得る」は、被験体において治療的に有効な化学療法または放射線療法レジメンを開始するために十分な、被験体中の血小板レベルの医療実践者による決定を指す。
【０１３０】
したがって、ＴＰＯ模倣抗体または断片は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンの施行の前、その間および／または後に被験体に投与され得る。上記のように、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンを必要とする被験体は、癌を有する被験体を含む。例えば、被験体は、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、骨癌、血液癌、神経組織癌、メラノーマ、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、頚部の癌、膣癌または膀胱癌からなる群より選択される癌を有し得る。
【０１３１】
化学療法レジメンまたは放射線療法レジメンを必要とする被験体は、炎症性または自己免疫性の障害、特定の神経障害または特定のウイルス感染または真菌感染を有する被験体をさらに含む。炎症性障害は、例えば、変形性関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、脊椎関節症、ＰＯＥＭＳ症候群、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、多中心性キャスルマン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、リウマチ性多発筋痛、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性筋炎、皮膚筋炎、ギラン・バレー症候群などの炎症性ニューロパシー、ウェゲナー肉芽種症などの血管炎、結説性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、シェーングレン症候群、ベーチェット病、チャーグ・ストラウス症候群または高安動脈炎を含み得る。
【０１３２】
様々な細胞毒性剤は、化学療法レジメンの一部として含まれ得る。特定の細胞毒性剤または薬剤の組み合わせは、例えば、癌の型、および処置する癌の重症度に依存し得る。例えば、被験体は、限定するものではないが、シクロホスファミド、タキソール、メトトレキセート、ナイトロジェンマスタード、アザチオプリン、クロラムブシル、フルオロウラシル、シスプラチン、ノコダゾール、ヒドロキシウレア、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、カルボプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、トポテカン、チオグアニン、前述の任意の治療的類似体および被験体において血小板数の減少（または血小板産生の減少）をもたらすことが公知である任意の他の化合物を含む、１種または複数の任意の様々な細胞毒性剤を投与され得る。
【０１３３】
放射線療法は、例えば、外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴまたはＸＢＲＴ）、小線源療法（または密封線源放射線療法）および非密封線源放射線療法を含むことができ、違いは放射線源の位置である。「外部」は、体外からもたらされる治療用放射線の供給源を指し、一方、密閉および非密閉の線源放射線療法は、被験体内部に投与された放射活性材料を含む。放射線の型は、例えば、Ｘ線またはガンマ線であってよい。いくつかの実施形態において、放射線療法は、プロトンビーム放射線療法を含む。「内部」放射線療法は、注入または摂取により被験体へ投与され得る。例えば、メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）注入は、神経芽腫の治療に使用され得る。ヨード−１３１は、甲状腺癌または甲状腺中毒症の治療のために経口投与され得る。ルテチウム−１７７またはイットリウム−９０と接合されたホルモンは、神経内分泌腫瘍の治療のために使用され得る。治療用抗体もまた、放射線療法における使用のために、放射性核種と接合され得る。例えば、非ホジキンリンパ腫は、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、イットリウム−９０と接合された抗ＣＤ２０抗体およびトシツモマブ・ヨード−１３１（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、ヨード−１３１と接合された抗ＣＤ２０抗体を使用して治療され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片は、骨髄移植、外科手術および／または自己血輸血を受けたことがある被験体、または受けようとしている被験体に投与され得る。
【０１３５】
本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、放射線への曝露に関する被験体を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片は、放射線を照射された後の被験体に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片は、放射線を照射される可能性のある被験体に投与され得る。上記のように、放射線を照射される可能性のある被験体は、例えば、癌と診断され、化学療法または放射線療法を受ける可能性のある被験体；骨髄移植を受ける可能性のある被験体；または外科手術を受ける可能性のある被験体であってよい。放射線を照射される可能性のある被験体はまた、放射活性材料を保有するまたは使用する施設において、またはその近くで作業する被験体であってもよい。例えば、原子力発電所または核廃棄物保存施設において、またはその近くで作業する被験体であってもよい。
【０１３６】
被験体が照射された放射線量を決定する適切な方法もまた、当技術分野において公知である。被験体が照射時間をモニタリングするデバイスを着用していた場合、および／または医療実践者が、公知の、治療的に有効な用量の放射線を投与した場合、照射の計算は非常に単純化される。モニタリングデバイスがなかった場合、医療実践者は、放射線の強度および型、照射期間および供給源からの距離などの照射についての情報を必要とすると思われる。臨床的には、即時全血球計算値および差動血球数を、血液学的なベースラインを確立するために使用され得る。白血球および血小板の変化は数日から数週間の間に起こる。これらの変化の重症度は、照射を概算するためにも使用され得る。例えば、１００Ｒａｄ（１Ｇｒａｙ）を超える全身の放射線への曝露は、リンパ球の循環レベルの減少をもたらし得る。この減少は、照射後最初の２４時間内に観察され得る。減少量は照射の重症度に比例するので、リンパ球は生物学的線量計として使用され得る。
【０１３７】
本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体および治療的に活性な断片の有効性を考慮して、それらは単回投与として被験体に投与され得る（実施例を参照されたい）。ヒトにおけるＴＰＯ模倣ペプチドを使用する単回投与療法の有効性は、例えば、Ｗａｎｇら（２００４年）Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ７６巻：６２８〜６３８頁およびＫｕｔｅｒら（２００９年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ６０巻：３３．１Ｉ〜３３．１４Ｉ（２００８年１０月３１日の出版に先立ちオンラインで公開されている）に記載されている。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＴＰＯ模倣抗体または断片は、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１５回以上の）投与として被験体に投与され得る。複数回投与の実施形態において、投与は例えば、１日１回、２日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回または１月に１回であり得る。例えば、被験体は、ＴＰＯ模倣抗体を１日１回、少なくとも５日間投与され得る。別の実施例において、被験体は、ＴＰＯ模倣抗体を１日１回、３日間投与され得る。上記のように、投与は、放射線への曝露または化学療法などの血小板数減少事象の前、その間および／または後に実施できる。いくつかの実施形態において、被験体は、例えば、放射線の照射または化学療法レジメンを受ける前約１日（例えば、約２０時間、約２４時間または約３０時間）にＴＰＯ模倣体またはそれらの断片の単回投与を投与され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、被験体は、放射線の照射（例えば、放射線療法レジメン）または化学療法レジメンを受ける前または後、一（１）日未満（例えば、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１時間未満または１時間未満）にＴＰＯ模倣抗体、またはそれらの治療的に活性な断片を投与され得る。例えば、被験体は、放射線への曝露の６または１２時間前にＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の単回投与を投与され得る。別の実施例において、被験体は、放射線への曝露の６、１２または２４時間後に、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片の単回投与を投与され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、少なくとも３（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９または１０）μｇ／被験体のｋｇの用量で、１週間に１回、連続する六（６）週間の間ヒト被験体に皮下投与され得る。例えば、Ｂｕｓｓｅｌら（２００６年）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３５５巻：１６７２〜１６８１頁を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、少なくとも０．２から１０μｇ／被験体のｋｇの用量で、１週間に１回、連続する二（２）週間の間ヒト被験体に皮下投与され得る（例えば、上記のＷａｎｇら（２００４年）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体または治療的に活性な断片は、約０．３から１０（例えば、約０．５から５、１．０から１０、２．０から５、６から１０、６から８、９から１０、１から４、２から４、０．３から１．０、０．３から３、０．５から２または０．７から７）μｇ／被験体のｋｇの用量で、ヒト被験体に静脈内投与され得る。例えば、上記のＷａｎｇら（２００４年）を参照されたい。
【０１４１】
同様に、任意の治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片は、単回投与として投与され得る。いくつかの実施形態において、治療用抗体またはそれらの断片は、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１５回以上の）投与として被験体に投与され得る。複数回投与の実施形態において、投与は例えば、１日１回、２日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回または１月に１回であり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、例えば、治療用抗体が、治療される被験体において免疫反応を誘発することが発見された場合、特定の投与レジメンは改変され得る。実際に、医師、看護師または他の公認された医療実践者は、治療用抗体に特異的に結合する、および／または治療用抗体の治療的活性を阻害する抗体の産生に関して、治療される被験体をモニターできる。このような場合、医療実践者は、被験体への治療用抗体の投与の停止を選択でき、および／または被験体へ別の治療用抗体を投与することを選択できる。例えば、治療される被験体が、第１のＴＰＯ模倣抗体内の特定のＴＰＯ模倣ペプチドと結合する抗体を産生することが発見された場合、医療実践者は、（試薬が利用可能な場合）被験体の抗体と結合することが期待されない異なるＴＰＯ模倣体を含有する、異なるＴＰＯ模倣抗体を被験体に投与することを選択できる。別の実施例において、治療される被験体が、第１のＴＰＯ模倣抗体の特定の足場抗体のエピトープと結合する抗体を産生することが発見された場合、医療実践者は、（試薬が利用可能な場合）対象の抗体と結合することが期待されない異なる抗体の足場の周りに構築される、異なるＴＰＯ模倣抗体を被験体に投与することを選択できる。治療用抗体と結合し、治療用抗体の活性を阻害する中和抗体の、被験体（例えば、ヒト被験体）による産生を検出する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Ｗｅｌｔら（２００３年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ９巻（４号）：１３３８〜４６頁；ＳｚｏｌａｒらＪ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ４１巻（４号）：１３４７〜１３５３頁；およびＬｏｆｇｒｅｎら（２００７年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１７８巻（１１号）：７４６７〜７４７２頁に記載されている。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片は、単剤療法として被験体に投与され得る。または、上記のように、抗体または断片は、別の治療、例えば、被験体において血小板産生を増加させる別の治療、または放射線への曝露に関して被験体を処置するための別の治療と一緒に併用療法として被験体に施され得る。例えば、併用療法は、被験体（例えば、ヒト患者）に、それを必要とする被験体に治療利益を提供する、１種または複数のさらなる薬剤（例えば、エルトロンボパグ、オプレルベキンまたはロミプロスチム）を投与するステップを含み得る。いくつかの実施形態において、治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片および１種または複数のさらなる活性薬剤は同時に投与される。他の実施形態において、抗体または断片が最初に投与され、１種または複数のさらなる活性薬剤が２番目に投与される。いくつかの実施形態において、１種または複数のさらなる活性薬剤が最初に投与され、抗体または断片が２番目に投与される。
【０１４４】
治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片は、以前施された療法または現在施されている療法と置き換える、またはそれを増強できる。例えば、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片による治療において、１種または複数のさらなる活性薬剤（例えば、エルトロンボパグ、オプレルベキンまたはロミプロスチム）の投与は、中断または縮小できる、例えば、低レベルで投与され得る。いくつかの実施形態において、以前の療法の施行は継続され得る。いくつかの実施形態において、以前の療法は、治療用抗体またはそれらの治療的に活性な断片のレベルが治療効果を提供するために十分なレベルに達するまで継続される。２つの療法は、組み合わせて施され得る。
【０１４５】
上記のように、いくつかの実施形態において、被験体は、治療後血小板産生の増加（または血小板レベルの増加）に関してモニターされ得る。いくつかの実施形態において、被験体は、ＴＰＯ模倣抗体またはそれらの断片を用いた治療後に放射線への曝露の１つまたは複数の症状の改善に関してモニターされ得る。このような症状は、被験体が照射された放射線の型、放射線の用量および照射位置に従って変動する。この症状は当技術分野において公知であり、例えば、倦怠感、痛み、咽頭痛、胃腸障害（嘔吐および／または下痢）、脱毛、食欲不振、ほてりおよび出血を含む。血小板数の不足に関連する障害の改善に関する被験体（例えば、ヒト患者）のモニタリングは、本明細書において規定するように疾患パラメーター、例えば、障害の１種または複数の症状の改善の変化に関して被験体を評価することを意味する。このような症状は特定の障害に依存して変動するが、医療の分野においては周知である。例えば、ＨａｒｋｅｒおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎ（１９８３年）「Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｓａｕｎｄｅｒｓ、３６０頁；およびＧｒｅｓｅｌｅら（２００２年）「Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ０５２１８０２６１Ｘ）を参照されたい。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、評価は、投与後少なくとも１時間、例えば、少なくとも２、４、６、８、１２、２４または４８時間または少なくとも１日、２日、４日、１０日、１３日、２０日以上または少なくとも１週間、２週間、４週間、１０週間、１３週間、２０週間以上で実施される。被験体は、以下の期間：治療開始前；治療中；または治療の１つまたは複数の要素が投与された後：の１つまたは複数において評価され得る。評価は、更なる治療の必要性を評価するステップ、例えば、投与量、投与の頻度または治療期間を改変すべきかどうかを評価するステップを含み得る。選択された治療法を加える、または中断する必要性、例えば、本明細書に記載のように、放射線への曝露または被験体における血小板産生の増加のための任意の治療の付加または中断を評価するステップをさらに含むことができる。
【０１４７】
Ｅｘ  ｖｉｖｏの取り組み。被験体における血小板産生を増加させるためのｅｘ  ｖｉｖｏ戦略は、被験体から得た１つまたは複数の細胞に、本明細書に記載の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトまたはトランスダクトするステップを含み得る。例えば、細胞にＴＰＯ模倣抗体の重鎖または軽鎖をコードする単一ベクターをトランスフェクトできる、または細胞に、抗体の重鎖をコードする第１のベクターおよび抗体の軽鎖をコードする第２のベクターをトランスフェクトできる。いくつかの実施形態において、ベクターは、医療実践者に、被験体におけるＴＰＯ模倣抗体（または断片）の産生を始めさせる、または停止させる誘導可能なプロモーターを含有する。例えば、医療実践者は、放射線療法レジメンの第２ラウンドを受ける予定の患者において、本明細書に記載のＴＰＯ模倣抗体の発現を始めることを選択できる。レジメンおよび被験体における血小板レベルの回復後、医療実践者は、被験体において抗体の発現を停止することを選択できる。
【０１４８】
トランスフェクトされた、またはトランスダクトされた細胞はその後被験体に戻される。この細胞は、限定するものではないが、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単核、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイトまたは筋肉細胞を含む任意の広範囲の型であってよい。このような細胞は、それらが被験体内で生存している限り、治療用抗体（例えば、ＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片の供給源（例えば、持続性供給源または周期的供給源）として作用できる。いくつかの実施形態において、ベクターおよび／または細胞は、抗体の誘導可能な発現または抑制可能な発現のために構成され得る（例えば、Ｓｃｈｏｃｋｅｔｔら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻：５１７３〜５１７６頁および米国特許第７，０５６，８９７号を参照されたい）。
【０１４９】
好ましくは、細胞は被験体から得られるが（自己移植）、この被験体以外の同じ種の被験体から得られる可能性もある（同種異系）。
【０１５０】
被験体から細胞を得る適切な方法および細胞をトランスダクトまたはトランスフェクトするための適切な方法は、分子生物学の分野において公知である。例えば、トランスダクトのステップは、リン酸カルシウム、リポフェクチン、エレクトロポレーション、ウイルス感染（上記を参照されたい）および微粒子銃遺伝子移入を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子療法に使用される任意の標準的な手法により達成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）およびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照されたい。または、リポソームまたは高分子微粒子が使用され得る。トランスダクトに成功した細胞は、例えば、コード配列の発現または薬剤耐性遺伝子の発現のために選択され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、巨核球を含有する生物学的試料を被験体から得、ＴＰＯ模倣抗体と接触させ、血小板の産生を促進できる。処置された生物学的試料は、その後被験体に再導入、または被験体と同じ種の別の被験体に再導入され得る。このようなｅｘ  ｖｉｖｏの自己移植または同種異系移植の方法は、放射線療法または化学療法を受けた、または受けている被験体における血小板レベルの復元にとって有用であり得る。このような場合、生物学的試料は、放射線療法または化学療法より前に採取される。
【０１５２】
キット
本開示は、ラベルを有する容器および本明細書に記載の治療用抗体（例えばＴＰＯ模倣抗体）またはそれらの治療的に活性な断片を含有する組成物を含む製造物またはキットをさらに特徴付ける。組成物がＴＰＯ模倣抗体またはそれらの治療的に活性な断片を含有する場合、ラベルは、この組成物は、それを必要とする被験体において血小板産生の増加のために使用すること、および／または化学療法または放射線療法に関連する被験体（例えばヒト）に投与されるべきであることを示すことができる。このキットは、場合により組成物を被験体に投与する手段を含み得る。例えば、このキットは１つまたは複数の注射器を含み得る。このキットは、場合により、組成物を被験体に投与するための指示書をさらに含み得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、このキットは、被験体において血小板産生を増加させるための、１種または複数のさらなる活性薬剤をさらに含み得る。例えば、このキットは、１種または複数のＰｒｏｍａｃｔａ（登録商標）／Ｒｅｖｏｌａｄｅ（登録商標）（エルトロンボパグ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン；ｒｈＩＬ−１１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）、Ｎｐｌａｔｅ（商標）（ロミプロスチム；Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）および本明細書に記載の任意の他の活性薬剤を含み得る。いくつかの実施形態において、このキットは、放射線への曝露に関して被験体を処置する、１種または複数の活性薬剤を含み得る。例えば、このキットは、１種または複数の抗生物質、麻酔薬、制吐剤、ステロイド（例えば、４−アンドロステンジオールまたは５−アンドロステンジオールなどのアンドロステンジオール）、キレート剤、利尿薬、放射性核種置換剤および幹細胞を含み得る。
【０１５４】
このキットは、場合により、被験体から得た血液試料中の血小板レベルを決定するための、１種または複数の試薬を含み得る。このキットは、被験体から血液試料を収集するための１種または複数の試薬をさらに含み得る。
【０１５５】
以下の実施例は例示を意図するものであり、発明を限定する意図のものではない。
【実施例】
【０１５６】
（実施例１）
試薬
以下の試薬を下記の実験に使用した。
【０１５７】
（１）組換えヒトトロンボポエチン（これ以降「ｒｈＴＰＯ」と称される）；
（２）重鎖のＣＤＲ３がＴＰＯ模倣ペプチドで置換されたヒト化抗補体成分Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）足場（これ以降「ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体」と称される）を含有する組成物；抗体はもはやＣ５と結合しない；重鎖定常領域は、上記のようにＧ２／Ｇ４定常領域融合である；
（３）ＴＰＯ模倣ペプチドを含まないヒト化抗補体成分Ｃ５抗体（５Ｇ１．１）（これ以降「抗Ｃ５対照抗体」と称される）を含有する組成物；上記のように重鎖定常領域はＧ２／Ｇ４定常領域融合である；
（４）重鎖のＣＤＲ３がＴＰＯ模倣ペプチドを含有し、軽鎖のＣＤＲ２がＴＰＯ模倣ペプチドを含有する、抗破傷風トキソイド抗体のＦ（ａｂ’）２断片を含有する組成物（これ以降「ＴＰＯ−Ｆａｂ」と称される）；
（５）軽鎖ポリペプチドがカルボキシ末端にＴＰＯ模倣体を含有する、ヒト抗炭疽抗体足場を有するＴＰＯ模倣抗体（これ以降「ＬＣ−ＴＰＯ抗体」と称される）；上記のように重鎖定常領域はＧ２／Ｇ４定常領域融合である；抗体の抗原結合部位は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｐＡ８３抗原と結合する；
（６）重鎖ポリペプチドが重鎖ヒンジ領域のカルボキシ末端のわずかに下に挿入されたＴＰＯ模倣体を含有し、ＴＰＯ模倣体は、抗炭疽抗体足場のＣＨ２部分の５番目の残基と６番目の残基との間に挿入される、ヒト抗炭疽抗体足場を有するＴＰＯ模倣抗体（これ以降「ＨＣ−ＴＰＯ抗体」と称される）；上記のように重鎖定常領域はＧ２／Ｇ４定常領域融合である；抗体の抗原結合部位は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＰＡ８３抗原と結合する；
（７）軽鎖ポリペプチドがカルボキシ末端にＴＰＯ模倣体を含有し、重鎖ポリペプチドが重鎖ヒンジ領域のカルボキシ末端のわずかに下に挿入されたＴＰＯ模倣体を含有する、ヒト抗炭疽抗体足場を有するＴＰＯ模倣抗体（これ以降「ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体」と称される）；上記のように重鎖定常領域はＧ２／Ｇ４定常領域融合である；抗体の抗原結合部位は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＰＡ８３抗原と結合する；
（８）ＴＰＯ模倣体を含有せず、上記のように重鎖定常領域はＧ２／Ｇ４定常領域融合を含有した、ヒト抗炭疽抗体（これ以降「抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体」と称される）；抗体の抗原結合部位は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＰＡ８３抗原と結合する；ならびに
（９）ＴＰＯ模倣体を含有せず、重鎖定常領域がＧ１定常領域であるヒト抗炭疽抗体（これ以降「抗炭疽Ｇ１対照抗体」と称される）であり、抗体の抗原結合部位は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＰＡ８３抗原と結合する。
【０１５８】
（実施例２）
ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の作製および精製
プラスミド発現ベクターを、標準的分子生物学的技術を使用して作製し、このベクターは、上記のＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸を含有する。このベクターを、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ細胞系にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクタントを、抗体を安定に発現するクローンのためにスクリーニングした。クローンを選択し、治療用抗体の作製および精製のための大規模培養を実施するために使用した。
【０１５９】
精製
ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を、タンパク質Ａ（ＰＯＲＯＳ（登録商標））樹脂を使用して、細胞培養の上清（９００ｍＬ）から精製した。上清をカラムに通過させる前に、カラムをまず、カラムの８倍量の平衡化バッファー（２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグリシン、ｐＨ８）で平衡化した。カラムの平衡化後、流速９ｍＬ／分で上清をカラムに添加した。一度試料をカラムに添加したら、カラムを、平衡化バッファーを用いて２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度がゼロに戻るまで洗浄した。抗体を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．５を用いてカラムから溶出し、ピークの分画を手作業で収集した。ピークの分画を、１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９を用いて中和し、リン酸緩衝生理食塩水中で透析した。透析後、試料を０．２２μｍのＳｔｅｒｉｖｅｘフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、濃度を、波長２８０ｎｍにおいてＵＶ分光法により決定した。精製された抗体を、ＱＣＬ−１０００ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用してエンドトキシンの混入に関して試験した。
【０１６０】
（実施例３）
ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ  抗体のＩｎ  ｖｉｔｒｏの機能的特徴付け
組換えＴＰＯ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン：タンパク質を１：１比でビオチン化した。ビオチン化ＴＰＯ受容体（５μｇ／ｍＬ）を、ストレプトアビジンプローブと１５分間結合させた。このプローブを洗浄し、その後、２５ｎＭのＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ  抗体と接触させた。抗体とプローブとの会合および解離を、１５分間にわたってＯｃｔｅｔ  ＱＫ（Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏ（登録商標）；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によってモニターした。２種のタンパク質の間の結合反応速度を、Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏ（登録商標）分析ソフトウェアと併せて部分適合を使用して決定した。ＫＤはおよそ２．３２ｎＭであると決定した。
【０１６１】
同様の実験を、上記のビオチン化ＴＰＯ受容体およびストレプトアビジンプローブを使用してさらに実施し、このプローブを、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはｒｈＴＰＯと接触させた。この実験において、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体およびｒｈＴＰＯそれぞれに関して、ＫＤはおよそ３ｎＭであると決定した。これらの結果は、ＴＰＯ受容体に対するＴＰＯ模倣抗体の親和性は、受容体に対するｒｈＴＰＯの親和性と同じであったことを示す。
【０１６２】
（実施例４）
マウスにおける血小板数に関するＴＰＯ模倣体の効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス、１３週齢を、ｒｈＴＰＯ、ＴＰＯ−Ｆａｂ、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体または抗Ｃ５対照抗体を用いて、実施例１に記載のように処置した。５匹のマウスを各群において処置した。組成物を、投与量２ｍｇ／ｋｇのＣＤＲ−ＴＰＯもしくは対照抗体、１３．３ｍｇ／ｋｇのＴＰＯ−Ｆａｂまたは１１０μｇ／ｋｇのｒｈＴＰＯの投与量で、連続５日間１日１回、皮下注射によりマウスに投与した。個々のマウスから１００μＬの血液を、３、５、８、１０および１２日目に得、１日目が最初の処置であった。血液中の末梢血の血小板を、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（商標）３１００Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して測定した。
【０１６３】
図１に示すように、血小板レベルは、対照抗体と比較してｒｈＴＰＯ、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体およびＴＰＯ−Ｆａｂを用いて処置したマウスにおいて実質的に増加していた。
【０１６４】
（実施例５）
マウスにおける血小板数に関するＴＰＯ模倣抗体の効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス、１３週齢を、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、抗炭疽Ｇ１対照抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置した。この抗体は実施例１において上に記載した。
【０１６５】
個々の処置群に５匹のマウスであった。抗体を、投与量２ｍｇ／ｋｇで、連続５日間１日１回、皮下注射によりマウスに投与した。個々のマウスから１００μＬの血液を、０、４、７、９、１１、１６および１８日目に得、１日目が最初の処置であった。血液中の末梢血の血小板を、上記のように測定した。
【０１６６】
図２に示すように、血小板レベルは、抗炭疽Ｇ１対照抗体と比較して、任意のＴＰＯ模倣抗体を用いて処置したマウスにおいて増加していた。さらに、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて得た血小板レベルは、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて得た血小板レベルより実質的に高かった。例えば、１１日目に、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて得た血小板レベル（５，３７５×１０６血小板／ｍＬ）は、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおける対応する血小板レベル（１，８０２×１０６血小板／ｍＬ）より３倍近く高かった。これらの結果は、驚いたことに、軽鎖および／または重鎖ヒンジ領域のカルボキシ末端にＴＰＯ模倣体を有する抗体が、ＣＤＲ領域にＴＰＯ模倣ペプチドを含有する抗体より、動物における血小板レベル上昇にさらにより有効であったことを実証した。
【０１６７】
さらに、血小板レベルは、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体と比較して、例えば、ＬＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいてより迅速に増加した（４日目の血小板レベル；図２を参照されたい）。
【０１６８】
いくつかの他のＣＤＲ−ＴＰＯ模倣体構築体を、上記の方法を使用して、マウスにおける血小板産生を刺激するそれらの能力に関して試験した。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲに挿入された、２つまたは４つのＴＰＯ模倣体を含有した。例えば、１つの抗体は、ＣＤＲ３がＴＰＯ模倣体で置換された２つの重鎖ポリペプチドおよびＣＤＲ２がＴＰＯ模倣体で置換された２つ軽鎖ポリペプチドを含有した。別の抗体は、ＣＤＲ３がＴＰＯ模倣体で置換された２つの重鎖ポリペプチドおよびＣＤＲ１がＴＰＯ模倣体で置換された２つの軽鎖ポリペプチドを含有した。これらの抗体はいずれも、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体ほどマウスにおける血小板レベルの上昇に強力ではない。
【０１６９】
総合すれば、これらのデータは、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体は、ＣＤＲ−ＴＰＯ対応物抗体分子より、動物において合計血小板産生の増加および血小板産生の加速の誘発により有効であることを実証した。これらのデータは、軽鎖の一方または両方のカルボキシ末端および重鎖のヒンジ領域に、またはその近くにおけるＴＰＯ模倣ペプチドの特定の置換（抗体の中央の裂け目に模倣体を提示させる）がＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体に対する優れたＴＰＯ様生物活性を提供することもまた示唆している。
【０１７０】
（実施例６）
マウスにおける血小板数に関する単回投与ＴＰＯ模倣抗体処置の効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス、１４週齢を、抗炭疽Ｇ１対照抗体、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体および抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体を用いて処置した。個々の処置群に三（３）匹のマウスであった。抗体を、投与量２ｍｇ／ｋｇで、一（１）回、皮下注射によりマウスに投与した。個々のマウスから血液を、処置に対して０、２、４、７、９、１１、１５、１８および２１日目に採取した。末梢血の血小板を、上記のように分析した。図３に示すように、血小板レベルは、抗炭疽対照抗体を用いて処置したマウスにおける血小板レベルと比較して、ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて増加した。再度、これらのデータは、ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて得た血小板レベルは、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて得た血小板レベルより実質的に高かったことを実証した。これらのデータはさらに、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体と比較して、ＬＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体が、動物の血中血小板レベルの上昇をより維持できたことを実証した（例えば、９から１５日目、図３を参照されたい）。
【０１７１】
さらに、驚いたことにこれらのデータは、ＬＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の単回投与が、マウスにおいて血小板レベルを実質的に増加できたことだけでなく、単回投与が複数回投与スケジュールとほぼ同等に有効であったことを実証した（図２と比較されたい）。
【０１７２】
（実施例７）
ＭＭＣ処置マウスにおける血小板レベルに関するＴＰＯ模倣抗体の効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス、１４週齢に、用量３ｍｇ／ｍＬでマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を静脈内投与した。ＭＭＣ処置後、上記のＣＤＲ−ＴＰＯ抗体または抗−Ｃ５対照抗体を、投与量６００μｇ／ｋｇで、連続５日間１日１回、皮下注射によりマウスにさらに投与した。血液を、処置マウスおよびシャム対照マウスから、ＭＭＣ処置（０日目）後８、１１、１５、１８、２１、２５および３２日目に採取した。血液中の末梢血の血小板を、上記のように測定した。
【０１７３】
図４に示すように、血小板レベルは抗Ｃ５対照抗体を用いて処置したマウスと比較して、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて増加した。これらの結果は、血小板産生を増加させる薬剤を用いて処置しなかった場合と比較して、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体が、骨髄抑制療法後のより迅速な血小板レベルの回復にとって、動物において有効であることを示す。
【０１７４】
ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を使用する上記の実験の結果に基づいて、これらの抗体が骨髄抑制療法後の血小板レベルの回復にとって、動物において有効であろうことが期待される。さらに、先の結果は、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体が、血小板の回復においてＣＤＲ−ＴＰＯ抗体と同等またはより有効であろうことをさらに示唆している。
【０１７５】
この仮定を試験するための実験は、以下の通りである。Ｂａｌｂ／ｃマウス、１４週齢に、用量３ｍｇ／ｍＬでマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を静脈内投与した。ＭＭＣ処置後、以下の抗体：ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体、抗Ｃ５対照抗体、抗炭疽Ｇ１対照抗体および抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体の１種を、皮下注射によりマウスにさらに投与した。
【０１７６】
抗体を、用量２ｍｇ／ｋｇで、連続５日間１日１回投与した。血液を個々のマウスから、ＭＭＣ処置（０日目）後０、２、４、７、９、１１、１５、１８および２１日目に採取した。血液中の末梢血の血小板を、上記のように測定した。末梢血の血小板を上記のように分析した。血小板レベルは、対照抗体と比較して、個々の２種のＴＰＯ模倣抗体およびＣＤＲ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおいて増加することが期待される。これらのデータは、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体が、骨髄抑制療法後の血小板レベルの回復にとって、動物において有効であることを示すと思われる。さらに、このデータは、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体が、動物において、ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体よりも迅速に血小板レベルを上昇させ、より長く血小板レベルを維持することを示すことが期待される。
【０１７７】
別の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウス、１４週齢に、以下の抗体：ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体、抗Ｃ５対照抗体、抗炭疽Ｇ１対照抗体および抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体の１種を、皮下注射により投与する。抗体を、以下の投与レジメン下で投与する。第１の処置レジメンは、用量６００μｇ／ｋｇで、連続５日間１日１回、抗体をマウスに投与するステップを含む。最終投与の１日後、マウスに用量３ｍｇ／ｍＬでマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を静脈内投与する。第２の処置レジメンは、ＭＭＣ処置の３日前に、単回６００μｇ／ｋｇ用量の抗体をマウスに投与するステップを含む。第３の処置レジメンは、ＭＭＣ処置の１日前に、単回６００μｇ／ｋｇ用量の抗体をマウスに投与するステップを含む。抗炭疽対照抗体または抗Ｃ５対照抗体を用いて処置したマウスにおける血小板レベルと比較して、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおける血小板レベルが増加することが期待される。ＭＭＣ処置前にマウスに投与されたＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の単回投与は、その後ＭＭＣ処置マウスにおいて血小板レベルを実質的に増加させるであろうことがさらに期待される。
【０１７８】
さらに別の実験において、Ｂａｌｂ／ｃマウス、１４週齢に、以下の抗体：ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体、抗Ｃ５対照抗体、抗炭疽Ｇ１対照抗体および抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体の１種を、皮下注射により投与する。抗体を、以下の投与レジメン下で投与する。第１の処置レジメンは、用量６００μｇ／ｋｇで、連続５日間１日１回、抗体をマウスに投与するステップを含む。最初の投与の１日前に、マウスに用量３ｍｇ／ｍＬでマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を静脈内投与する。第２の処置レジメンは、ＭＭＣ処置の１日後に、単回６００μｇ／ｋｇ用量の抗体をマウスに投与するステップを含む。第３の処置レジメンは、ＭＭＣ処置の３日後に、単回６００μｇ／ｋｇ用量の抗体をマウスに投与するステップを含む。抗炭疽対照抗体または抗Ｃ５対照抗体を用いて処置したマウスにおける血小板レベルと比較して、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置したマウスにおける血小板レベルが増加させるであろうことが期待される。ＭＭＣ処置直後にマウスに投与されたＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の単回投与は、その後ＭＭＣ処置マウスにおいて血小板レベルを実質的に増加させるであろうことがさらに期待される。
【０１７９】
総合して、これらの発見は、軽鎖の一方または両方のカルボキシ末端および重鎖のヒンジ領域に、またはその近くにおけるＴＰＯ模倣ペプチドの特定の置換（抗体の中央の裂け目にＴＰＯ模倣体を提示させる）が、これらのＴＰＯ模倣抗体分子に対する優れたＴＰＯ様生物活性を提供するという結論をさらに支持すると思われる。
【０１８０】
したがって、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体およびＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体は、骨髄抑制療法を受けた動物の治療に有用であることが期待される。
【０１８１】
（実施例８）
ガンマ線照射マウスにおける血小板レベルに関するＴＰＯ模倣抗体の効果（処置前）
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス、８〜１０週齢に、以下の抗体：ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体、抗Ｃ５対照抗体、抗炭疽Ｇ１対照抗体および抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体の１種を、皮下注射により投与する。
【０１８２】
抗体を３つの処置レジメン下で投与する。第１の処置レジメンは、用量２ｍｇ／ｋｇで、連続５日間１日１回、抗体をマウスに投与するステップを含む。最終投与の１日後、Ｍｏｕｔｈｏｎら（１９９９年）Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ４３巻（４号）：８６７〜８７５頁に記載のように、マウスを８．０Ｇｒａｙ（Ｇｙ）の放射線におよそ０．９０Ｇｙ／分で供した。第２の処置レジメンは、照射の３日前に、単回２ｍｇ／ｋｇ用量の抗体をマウスに投与するステップを含む。第３の処置レジメンは、照射の１日前に、単回２ｍｇ／ｋｇ用量の抗体をマウスに投与するステップを含む。処置マウスの生存を、照射後３０日にわたってモニターする。抗炭疽対照抗体または抗Ｃ５対照抗体を用いて処置したマウスの生存と比較して、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置した照射マウスの生存が増加されるであろうことが期待される。照射前にマウスに投与されたＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の単回投与は、照射マウスの生存を実質的に増加させるであろうことがさらに期待される。
【０１８３】
さらに、ＣＤＲ領域にＴＰＯ模倣体を含有する抗体より、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体が、照射マウスの生存の増加においてより有効であろうことが期待される。
【０１８４】
（実施例９）
ガンマ線照射マウスにおける血小板レベルに関するＴＰＯ模倣抗体の効果（処置後）
別の実験において、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス、８〜１０週齢に、以下の抗体：ＣＤＲ−ＴＰＯ抗体、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体、抗Ｃ５対照抗体、抗炭疽Ｇ１対照抗体および抗炭疽Ｇ２／Ｇ４対照抗体の１種を、皮下注射により投与する。
【０１８５】
１つの処置レジメン下で、抗体を、上記のＭｏｕｔｈｏｎら（１９９９年）に記載のように、８．０Ｇｒａｙ（Ｇｙ）の放射線をおよそ０．９０Ｇｙ／分で照射した６時間後に抗体をマウスに投与した。第２の処置レジメンにおいて、マウスの照射後６時間において、連続４日間、１日１回、抗体をマウスに投与する。処置マウスの生存を、照射後３０日にわたってモニターする。抗炭疽対照抗体または抗Ｃ５対照抗体を用いて処置したマウスの生存と比較して、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体を用いて処置した照射マウスの生存が増加されるであろうことが期待される。照射後に投与されたＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体の単回投与は、対照抗体を用いて処置されたマウスの生存と比較して、照射マウスの生存を実質的に増加させるであろうことがさらに期待される。
【０１８６】
さらに、ＣＤＲ領域にＴＰＯ模倣体を含有する抗体より、ＬＣ−ＴＰＯ抗体、ＨＣ−ＴＰＯ抗体またはＨＣ＋ＬＣ−ＴＰＯ抗体が、照射マウスの生存の増加においてより有効であろうことが期待される。
【０１８７】
本開示は、それらの具体的な実施形態を参照して説明してきたが、本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が実施でき、同等物を置き換えることができることは当業者により理解されるべきである。さらに、本開示の目的、精神および範囲に、特定の状況、材料、組成物、方法、方法のステップもしくはステップを適合させるために多くの改良が実施され得る。このような改良はすべて、本開示の範囲内にあると意図するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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