(57)【要約】【課題】これまでｉＰＳ細胞の標準的培養方法において不可欠とされたフィーダー細胞を使用せずにｉＰＳ細胞の高速増殖を可能とする培養方法並びに培養基材を提供すること。【解決手段】弾性可変ゲルの表面に細胞接着タンパク質を固定させてなる細胞培養基材を使用する人工多能性幹細胞の培養方法であって、前記弾性可変ゲルが１ｋＰａ超１００ＭＰａ未満の弾性率を有することを特徴とする、培養方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
弾性可変ゲルの表面に細胞接着タンパク質を固定させてなる細胞培養基材を使用する人工多能性幹細胞の培養方法であって、
前記弾性可変ゲルが１ｋＰａ超１００ＭＰａ未満の弾性率を有することを特徴とする、培養方法。
【請求項２】
前記弾性可変ゲルが光硬化性ゼラチンのゲルである、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンである、請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記細胞接着タンパク質がラミニンである、請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記ラミニンがラミニン−１１１である、請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
前記弾性可変ゲル１ｍＬに対して、反応濃度０．１ｍｇ乃至２．０ｍｇにて前記細胞接着タンパク質を固定させてなる、請求項１乃至請求項５のうちいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項７】
前記人工多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１乃至請求項６のうちいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項８】
1ｋＰａ超１００ＭＰａ未満の弾性率を有する弾性可変ゲル表面に細胞接着タンパク質を固定させてなる人工多能性幹細胞の培養基材。
【請求項９】
前記弾性可変ゲルが光硬化性ゼラチンのゲルである、請求項８に記載の培養基材。
【請求項１０】
前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンである、請求項８に記載の培養基材。
【請求項１１】
前記細胞接着タンパク質がラミニンである、請求項８に記載の培養基材。
【請求項１２】
前記ラミニンがラミニンー１１１である、請求項１１に記載の培養基材。
【請求項１３】
前記弾性可変ゲル１ｍＬに対して、反応濃度０．１ｍｇ乃至２．０ｍｇにて前記細胞接着タンパク質を固定させてなる、請求項８乃至請求項１２のうちいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項１４】
前記人工多能性幹細胞がヒト由来である、請求項８乃至請求項１３のうちいずれか一項に記載の培養基材。
【請求項１５】
光硬化性ゼラチンのゲルの表面にラミニンが固定されたゲル。
【請求項１６】
前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンである、請求項１５に記載のゲル。
【請求項１７】
前記ラミニンがラミニン−１１１である、請求項１５に記載のゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞の幹細胞性を維持しつつ該細胞を培養する方法並びの培養材料に関し、詳細には、従来の培養方法において使用されてきたフィーダー細胞を用いることなく、人工多能性幹細胞の分化を抑制した状態にて高速増殖を可能とする培養方法及び培養材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（以下ｉＰＳ細胞とも称する）は、体細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４遺伝子を導入し、細胞を初期化することによって得られる、人工の多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は胚性幹細胞（ＥＳ細胞と称する）と同等の三胚葉分化能を有しており、未分化状態を維持したまま高速・大量に増殖させることが現在の重要課題となっている。
これまでｉＰＳ細胞の培養方法として一般的に確立されている方法としては、マウスやヒト由来の細胞成分自体を用いる方法（フィーダー細胞層利用）、或いは生物（マウス）由来の生の原料を用いる方法（フィーダーフリーのＢＤマトリゲル（登録商標）利用）が挙げられ、これらは培養基材の生物学的特性に強く依存した培養方法といえる。
【０００３】
一方、これまでに、細胞の培養基材の表面化学特性並びに力学特性が、細胞培養の高速化（効率性、増殖率向上）のみならず、幹細胞分化の系統決定にも関与する重要なファクターとなっていることが知られている。例えば、ヤング率を特定範囲に定めたエラストマーから形成される細胞培養器具（特許文献１）や、剛性が特性範囲にある被覆ポリアクリルアミドゲルを用いる間葉系幹細胞集団の分化誘導方法（特許文献２）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５４０８０５号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３２１６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のフィーダー細胞やマトリゲルなど生物由来の細胞材料を主体に用いた方法は、異種のタンパク質等の混在や有害な病原体の潜在的可能性も含め、ヒトの体内に入った場合の安全性が不明であることを考慮すると、ｉＰＳ細胞をヒトへ臨床応用するための培養方法として適するものとはいえない。
また、ｉＰＳ細胞培養においても、培養基材の表面化学特性並びに力学特性を検討し定義することは重要であるとみられるものの、これまでｉＰＳ細胞培養に用いる培養基材の設計においてこうした化学的・物理的特性の観点から重要となるパラメーターの検討について十分になされているとはいい難い。
【０００６】
本発明は、ｉＰＳ細胞分化おいて重要なファクターとなり得る、表面化学特性及び力学特性の系統的設計を可能とする弾性基材を用いて、ｉＰＳ細胞の未分化・分化操作のための基材設計指針を確立することを目指しなされたものである。
すなわち本発明は、これまでｉＰＳ細胞の標準的培養方法において不可欠とされたフィーダー細胞を使用することのない培養基材を提供すること、特に培養基材を表面化学及び弾性率の観点から種々検討し、ｉＰＳ細胞の高速増殖を可能とする培養方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決する為に鋭意検討を重ねた結果、特定の表面弾性率を有する弾性可変ゲルの表面に対して細胞接着タンパク質を固定した培養基材が、ｉＰＳ細胞の高速増殖を可能とすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
具体的には、本発明は第１観点として、弾性可変ゲルの表面に細胞接着タンパク質を固定させてなる細胞培養基材を使用する人工多能性幹細胞の培養方法であって、
前記弾性可変ゲルが1ｋＰａ超１００ＭＰａ未満の弾性率を有することを特徴とする、培養方法に関する。
第２観点として、前記弾性可変ゲルが光硬化性ゼラチンのゲルである、第１観点に記載の培養方法に関する。
第３観点として、前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンである、第２観点に記載の培養方法に関する。
第４観点として、前記細胞接着タンパク質がラミニンである、第１観点に記載の培養方法に関する。
第５観点として、前記ラミニンがラミニン−１１１である、第４観点に記載の培養方法に関する。
第６観点として、前記弾性可変ゲル１ｍＬに対して、反応濃度０．１ｍｇ乃至２．０ｍｇにて前記細胞接着タンパク質を固定させてなる、第１観点乃至第５観点のうちいずれか一項に記載の培養方法に関する。
第７観点として、前記人工多能性幹細胞がヒト由来である、第１観点乃至第６観点のうちいずれか一項に記載の培養方法に関する。
第８観点として、1ｋＰａ超１００ＭＰａ未満の弾性率を有する弾性可変ゲル表面に細胞接着タンパク質を固定させてなる人工多能性幹細胞の培養基材に関する。
第９観点として、前記弾性可変ゲルが光硬化性ゼラチンのゲルである、第８観点に記載の培養基材に関する。
第１０観点として、前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンである、第９観点に記載の培養基材に関する。
第１１観点として、前記細胞接着タンパク質がラミニンである、第８観点に記載の培養基材に関する。
第１２観点として、前記ラミニンがラミニン−１１１である、第１１観点に記載の培養基材に関する。
第１３観点として、前記弾性可変ゲル１ｍＬに対して、反応濃度０．１ｍｇ乃至２．０ｍｇにて前記細胞接着タンパク質を固定させてなる、第８観点乃至第１２観点のうちいずれか一項に記載の培養基材に関する。
第１４観点として、前記人工多能性幹細胞がヒト由来である、第８観点乃至第１３観点のうちいずれか一項に記載の培養基材に関する。
第１５観点として、光硬化性ゼラチンのゲルの表面にラミニンが固定されたゲルに関する。
第１６観点として、前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンである、第１５観点に記載のゲルに関する。
第１７観点として、前記ラミニンがラミニン−１１１である、第１５観点に記載のゲルに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の培養方法によれば、従来のｉＰＳ細胞の培養に使用されてきたフィーダー細胞を使用することなく、ｉＰＳ細胞の幹細胞性（自己複製増殖能の保持、未分化性の維持、多分化能の保持）を維持しながら、効率的にｉＰＳ細胞の増殖・培養を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、製造例１で調製した光硬化性ゼラチンゲルにおける、ゲル作成時に照射した光照射時間に対する、得られた表面弾性率（ヤング率）の変化を示す図である。
【図２】図２は、製造例２で調製したラミニン固定化ゼラチンゲルにおける、免疫蛍光染色法によるゼラチンゲル表面上でのラミニン固定量の評価結果を示す図である（Ａ）反応させたラミニン濃度に対する蛍光強度の変化、（Ｂ）ラミニン固定後、１４日経過後までの蛍光強度の変化を夫々示す。
【図３】図３は、設計例１の培養基材（３ｋＰａ基材）上でｉＰＳ細胞を７日間培養した際の、ｉＰＳ細胞の接着・増殖挙動の結果を示す位相差顕微鏡写真である。
【図４】図４は、設計例２の培養基材（２０ｋＰａ基材）上でｉＰＳ細胞を７日間培養した際の、ｉＰＳ細胞の接着・増殖挙動の結果を示す位相差顕微鏡写真である。
【図５】図５は、設計例３の培養基材（５０ｋＰａ基材）上でｉＰＳ細胞を７日間培養した際の、ｉＰＳ細胞の接着・増殖挙動の結果を示す位相差顕微鏡写真である。
【図６】図６は、設計例４の培養基材（１００ｋＰａ基材）上でｉＰＳ細胞を７日間培養した際の、ｉＰＳ細胞の接着・増殖挙動の結果を示す位相差顕微鏡写真である。
【図７】図７は、比較例の培養基材（マトリゲル（登録商標）上でｉＰＳ細胞を７日間培養した際の、ｉＰＳ細胞の接着・増殖挙動の結果を示す位相差顕微鏡写真である。
【図８】図８は、設計例１-４および比較例の培養基材上で培養されたｉＰＳ細胞の増殖曲線（培養日数に対するＬＡＭ反応濃度別の細胞固定密度変化）を示す図である。ａ）３ｋＰａ基材、ｂ）２０ｋＰａ基材、ｃ）５０ｋＰａ基材及びマトリゲル基材、ｄ）１００ｋＰａ基材及びマトリゲル基材を夫々示す。
【図９】図９は、実施例２で調製した培養基材（設計例５）上で７日間培養・回収後のｉＰＳ細胞を、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上に再播種し培養後に観察された未分化マーカータンパクの免疫蛍光染色像を示す図である。ａ）ＳＳＥＡ−４、ｂ）ＴＲＡ−１−６０、ｃ）ＴＲＡ−１−８１、ｄ）ＳＳＥＡ−１を夫々示す。
【図１０】図１０は、実施例２で調製した培養基材（設計例５）上で７日間培養・回収後のｉＰＳ細胞を、ハンギングドロップ法により作製した胚様体の接着培養後に観察された三胚葉分化マーカータンパクの免疫蛍光染色像を示すである。ａ）βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ、ｂ）α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、ｃ）α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎを夫々示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、ｉＰＳ細胞を高速増殖させるように最適設計された本発明の培養方法並びにその培養方法に用いる培養基材について説明する。
本発明者らは、ｉＰＳ細胞を培養するハイドロゲル基材の設計において、ゲルの表面弾性率を最適化すること、そしてさらにそのゲル表面への細胞接着タンパク質の固定密度を最適化することで、ｉＰＳ細胞の高速増殖が実現できることを見出し、本発明を完成させたものである。
そして本発明では、特定の表面弾性率を有する弾性可変ゲルの表面に対して細胞接着タンパク質を特定密度にて固定させてなる細胞培養基材を用いることを特徴とする。
【００１２】
［弾性率可変ゲル］
上記弾性率可変ゲルとしては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸など生物由来の生体高分子のほか、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングルコールジアクリレートなどの合成高分子を用いて、適切な細胞接着性付与の下で、架橋度を制御し形成したゲルを使用できる。
架橋度の制御は、架橋剤濃度、反応温度、反応時間等の調節によって行うことができる。また、光反応を利用して架橋反応を行う系においては、光照射強度や照射時間の調節によっても架橋度を制御でき、結果としてゲルの弾性率を設計することが可能である。
【００１３】
上記弾性率可変ゲルは、その弾性率が１ｋＰａ超１００ＭＰａ未満の範囲にあるものを用い、好ましくは１０ｋＰａ以上１０ＭＰａ未満、さらに好ましくは１０ｋＰａ以上１ＭＰａ未満、例えば弾性率が３０ｋＰａ、４０ｋＰａ、５０ｋＰａ、６０ｋＰａ、７０ｋＰａ、８０ｋＰａ、９０ｋＰａであるゲルを用いることが好ましい。例えば後述する光硬化性ゼラチンゲルの場合、その弾性率が２０ｋＰａ超１００ｋＰａ未満、好ましくは３０ｋＰａ以上９０ｋＰａ以下、さらに好ましくは４０ｋＰａ以上６０ｋＰａ以下であるものが好適に用いられる。
弾性率が上述の数値範囲内にあるゲルを用いることにより、ｉＰＳ細胞の未分化性などの幹細胞性を維持したまま、既存のマトリゲル（登録商標、ＢＤ社）を用いた培養系と比べて遥かに上回る高速増殖を実現できる。弾性率が上述の数値範囲外のゲルを培養に用いた場合、増殖性が劣るだけでなく、分化を示唆する培養挙動がみられるために好ましくない。
【００１４】
中でも本発明において、上記弾性率可変ゲルとしてゼラチンゲル、特に光硬化性ゼラチンのゲルを好適に用いることができる。ゼラチンに対する光硬化性の付与は、ゼラチンが有する種々のアミノ酸残基の官能基に対して、適切な化学結合を介して光反応性部位を導入することにより行う。光反応性の部位（光反応性を有する官能基とも称する）としてはビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）アクリロイル基等のエチレン性不飽和基が挙げられ、例えばスチリル基を導入したゼラチン（光硬化性スチレン化ゼラチンと称する）などを用いることができる。
細胞培養材料を構成する材料として選択したゼラチンは、水に高濃度に溶解できるため、他の材料と比べてゲル化させたときにゲルの機械的強度を向上させることができるとともに、その機械的強度の数値範囲を幅広く調整することができる。また、ゼラチンは分子量の種類が豊富であるだけでなく、安価且つ入手が容易であり、細胞培養のコスト低減化につながるなどの有利な点も有する。また該ゼラチンに導入するエチレン性不飽和基の中でも、スチリル基は疎水性が高く、水溶液中で会合する。従ってスチリル基を導入したゼラチンを光重合反応させた場合、他の不飽和基を導入した場合と比べて重合効率が向上し、硬化時間を短縮化させることができる。
【００１５】
前記光硬化性ゼラチンのゲルは、光硬化性ゼラチンと光ラジカル重合開始剤とを含有する水溶液を調製し、該水溶液を光照射することによって得られる。
【００１６】
上記光硬化性ゼラチンは、縮合剤であるカルボジイミド類の存在下で、ゼラチンと、例えば光反応性の部位であるスチリル基及びカルボキシル基を有する化合物（例えば４−ビニル安息香酸）とを反応させることにより得ることができる。
この反応においては、ゼラチンを構成するタンパク質のアミノ基と、光反応性の部位を有する化合物のカルボキシル基とが反応し、アミド結合を介してゼラチンを構成するタンパク質への光反応性の部位（例：スチリル基）の導入がなされる。ゼラチンへの光反応性の部位の導入の際に縮合剤として用いられるカルボジイミド類として、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジエチルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、エチルシクロヘキシルカルボジイミド、ジフェニルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等を挙げることができる。
以上の反応において、ゼラチンに光架橋性（光硬化性）を付与する化合物としては、前述のビニル基を始めとするなどの光反応性を有する官能基と、水中での会合性の高い疎水性骨格構造、及びゼラチンとの化学結合に利用し得る官能基の三要素を含むものであれば特に限定されず、光硬化性ゼラチンの構成は一例として挙げた上述のスチリル基導入ゼラチンのみに限定されるものではない。
またここで使用するゼラチンは、その重量平均分子量が９５,０００〜１０５,０００（ＨＰＬＣ測定、ポリスチレン換算）であることが好ましく、またゼラチンへの光反応性の部位（例：スチリル基）の導入率はゼラチンのアミノ基全量に対して例えば８０〜１００％であることが好ましい。これら数値範囲のゼラチンの重量平均分子量並びに光反応性の部位の導入率を選択することにより、ｉＰＳ細胞培養に好適な機械的強度と、上述の弾性率とを備えたゼラチンゲルを得ることができる。
【００１７】
前記光ラジカル重合開始剤としては、光照射によりラジカルを発生する化合物であれば特に限定されず、例えば、カンファーキノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、ジメトキシフェニルアセトフェノン等のカルボニル化合物及びそれらの誘導体；ジチオカルバメート、キサントゲン酸塩、チオフェノール等の硫黄化合物及びそれらの誘導体；過酸化ベンゾイル、ブチルペルオキシド等の過酸化物及びそれらの誘導体；アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸エステル等のアゾビス化合物及びそれらの誘導体；ブロモプロパン、クロロメチルナフタレン等のハロゲン化合物及びそれらの誘導体；フェニルアジド等のアジド化合物及びそれらの誘導体；ローダミン、エリトロン、フルオレセイン、エオシン等のキサンテン系色素及びそれらの誘導体；リボフラビン及びそれらの誘導体等が挙げられる。これらのうち、好ましい光ラジカル重合開始剤として、その生体安全性が確立されている点でカンファーキノン、例えばスルホニルカンファーキノンが挙げられる。
これら使用する光ラジカル重合開始剤は一種単独で使用してもよいし、二種以上を組合せて使用してもよい。
また、光ラジカル重合開始剤は、光硬化性ゼラチンの総質量に対して、例えば０．０１質量％〜１０質量％、好ましくは０．１質量％〜３質量％で用いられる。
【００１８】
前記光硬化性ゼラチンと前記光ラジカル重合開始剤とを含有する水溶液の種類は、適用するｉＰＳ細胞が生存し得る水溶液であれば特に限定されないが、例えば、リンガー溶液、ロック溶液等の生理的塩類溶液、リン酸緩衝溶液、タイロート液、ハンクス液、アール液、ヘペス液等の平衡塩類溶液等が挙げられる。
上記水溶液中の前記光硬化性ゼラチンの濃度は、水溶液の総質量に対して２０質量％〜５０質量％、例えば３０質量％であることが好ましい。
なお上記水溶液には、培養するｉＰＳ細胞が増殖するために必要な栄養成分を添加していてもよい。このような栄養成分として、例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｐ及びＣｌ等のミネラル、アミノ酸、ビタミン、糖、脂肪、成長因子等が挙げられ、適宜選択することができる。
【００１９】
上記光硬化性ゼラチンと光ラジカル重合開始剤とを含有する水溶液を液状からゲル状に硬化させる際の光照射に用いる光源としては、ハロゲンランプ、キセノンランプ、白熱ランプ、水銀ランプ、エキシマレーザー、アルゴンイオンレーザー等が挙げられ、これらの光源を用いて好ましくは波長３００乃至８００ｎｍの光を照射する。光照射は上記水溶液がゲル化するまで行い、ゲル化までの時間は通常０．５〜５分程度である。
【００２０】
上記光硬化性ゼラチンと光ラジカル重合開始剤とを含有する水溶液が光照射によりゲル状に硬化（ゲル化）するメカニズムは以下のとおりである。まず光照射によって光ラジカル重合開始剤からラジカルが生成し、生成したラジカルによって光硬化性ゼラチン上の光反応性を有する官能基（例：ビニル基等）のラジカル重合が開始される。光照射により光反応性を有する官能基のラジカル重合が開始されると、該官能基を介してゼラチンが架橋され、網目構造が形成される。そしてこの網目構造に周囲の媒体が膨潤することによりゲル化が進行し、ゼラチンゲルが形成される。なお上記網目構造には、光反応性を有する官能基による架橋構造だけでなく、ゼラチンに含まれるアミノ基及びカルボキシル基によるアミド結合によっても構成され得る。
【００２１】
上記光硬化性ゼラチンは、ラジカル重合の進行に伴って液状からゲル状への硬化が進行する際、ゼラチン同士の架橋密度が増加するに伴い、形成されるゲルの膨潤度が減少する。これは、形成されるゲルの機械的強度が増加することを意味する。
したがって、前述の光照射時間（ラジカル生成量の制御）、光ラジカル重合開始剤の添加量、ゼラチンの水溶液中の濃度、さらにはゼラチンの分子量、ゼラチンへの光反応性を有する官能基の導入率等を調節することによって、ｉＰＳ細胞培養に好適な機械的強度と、上述の弾性率とを有するゲルを調製することができる。
【００２２】
［細胞接着タンパク質］
上記弾性率可変ゲルの表面に固定させる細胞接着タンパク質は、好ましくはラミニン、又はフィブロネクチン、ヴィトロネクチンなどを用いることができる。あるいは、これらのタンパク質の分子構造のうち、細胞側のインテグリンなどの特定の特異的結合を行うペプチド配列を表面固定に用いてもよい。中でも好適な細胞接着タンパク質としてラミニンが挙げられる。
【００２３】
ラミニンは、細胞外マトリックスの基底膜を構成する巨大なタンパク質であって、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子である。α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在し、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。例えば、サブユニットαがα１であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンを、ラミニン−１１１と称し、サブユニットの組み合わせによって理論上４５種のラミニンが存在し得る。
本発明の前記ゼラチンゲル表面に固定させるラミニンとしては、現時点で知られている１９種のラミニンファミリー（ラミニン−１１１，１２１，２１１，２２１，２１２，２２２，２１３，３Ａ１１，３Ａ２１，３Ａ３２、３Ａ３３，３Ｂ３２，４１１，４２１，４２３，５１１，５２１，５２２，５２３）の他、これから見出され得る他のラミニンを含み得、更に、臓器、細胞分泌物からの精製品のほか、リコンビナントラミニンであってもよい。
本発明では、中でもラミニン−１１１を用いることが好ましい。
【００２４】
［弾性率可変ゲル表面への細胞接着タンパク質の化学固定法］
前述の弾性率可変ゲルとして例えば光硬化性スチレン化ゼラチンより得られたゲルを用い、細胞接着タンパク質として例えばラミニンを用いた場合、縮合剤であるカルボジイミド類の存在下で、両者を反応させることにより、ゼラチンゲル表面のカルボキシル基とラミニンのアミノ基の反応によりアミド結合を介してゼラチン表面にラミニンが化学固定される。
ここで使用可能なカルボジイミド類は、前述のゼラチンへの光反応性の部位の導入時に使用するものとして挙げたカルボジイミド類を適用することができる。
なお、光硬化性ゼラチンのゲルの表面にラミニンが固定されたゲル、特に前記光硬化性ゼラチンが光硬化性スチレン化ゼラチンであり、及び／又は前記ラミニンがラミニン−１１１であるゲルも本発明の対象である。
【００２５】
前記弾性可変ゲル（例：ゼラチンゲル）１ｍＬに対して、反応濃度０．１ｍｇ乃至２．ｍｇにて、好ましくは０．５ｍｇ乃至１．０ｍｇとなるように前記細胞接着タンパク質（例：ラミニン）を反応させることにより、既存のマトリゲル（登録商標）を用いた培養系と比べて遥かに上回る高速増殖を実現できる。
【００２６】
［誘導多能性幹細胞］
本発明の培養方法の適用が想定される幹細胞には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などがあるが、特に本発明においては、いろいろな型の細胞に分化可能であり、治療に活用され得ることが期待されているｉＰＳ細胞を対象とする。
ｉＰＳ細胞は通常、成体の体細胞に初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの四遺伝子）を遺伝子導入することで作製される。
本発明を適用できるｉＰＳ細胞としては、患者の体細胞から直接樹立される臨床用のヒトｉＰＳ細胞ばかりでなく、試験研究用に用い得る細胞バンクより入手できるｉＰＳ細胞であってもよい。
【００２７】
［ｉＰＳ細胞の分散培養］
前述したように従来のｉＰＳ細胞の増殖培養方法には、フィーダー細胞層を用いた継代培養法と、これを用いずマトリゲル（ＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ；ＢＤ  ３５４２３４）上での継代培養法がある。
本発明でのｉＰＳ細胞の培養操作は、上述の接着タンパク質を固定化させた弾性率可変ゲルより構成される細胞培養基材上において、後者のマトリゲル上での通常の培養操作と同様に行うことができる。このときｉＰＳ細胞はシングルセル状態として本発明に係る培養基材上に分散播種し、増殖培養を行う。
【００２８】
本発明の接着タンパク質を固定化した弾性率可変ゲルより構成される細胞培養基材上でのｉＰＳ細胞の分散培養方法の一例を以下に記す。
事前にサブコンフルエント状態までに培養しておいたｉＰＳ細胞培養ディッシュを準備し、ＲＯＣＫ阻害剤を最終濃度１０iＭになるよう添加し、３７℃で１時間以上インキュベートする。培地を吸引除去し、細胞回収試薬であるＡｃｃｕｔａｓｅ（または０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ）を１ｍｌ／６ｍｍディッシュにて添加し、３７℃で５−７分、インキュベートする。続いてディッシュを軽くタッピングし、フィーダフリー用無血清培地（ｍＴｅＳＲＴＭ１：ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ０５８５０；０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを用いた場合はＭＥＦ培地等の血清入り培地）を３ｍｌ加え、細胞がほぼ単一になるまでピペッティングする。この細胞懸濁液を１５ｍｌチューブに移し、遠心加速度：１７０（×ｇ）（１，０００ｒｐｍ）、５分間遠心する。上清を吸引除去し、フィーダーフリー無血清培地で再懸濁し、上述の本発明のラミニン固定化弾性率可変ゼラチンゲルよりなる培養基材上に播種する。ＲＯＣＫ阻害剤を最終濃度１０ｍiＭになるよう添加する。翌日以降、細胞塊の接着を確認し、一日一回培地を交換し、培養を継続する。
【００２９】
本発明の接着タンパク質を固定化した弾性率可変ゲルよりなる培養基材上でのｉＰＳ細胞の分散培養により、７日間程度の培養期間で１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度まで、未分化性と多分化能を維持したｉＰＳ細胞を健常に増殖させることができる。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明の特徴をより具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容及び処理手順は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００３１】
［製造例１：弾性率可変ハイドロゲルの作製］
ビニル基を導入した光硬化性ゼラチン（光硬化性スチレン化ゼラチン：ＳｔＧ）（ゼラチンの分子量：約１０万、ビニル基導入率：ゼラチンのアミノ基に対して９８％）の３０質量％−リン酸緩衝生理食塩水（以降、ＰＢＳと称する）のゾル溶液（溶液中、１．５質量％スルホニルカンファーキノン含有）に、５００ｎｍ付近の波長を有する可視光を照射し、ビニル基間のラジカル重合反応による光架橋にてゲルを作製した。光照射時間を１００秒から８００秒程度の間で変え、作製されたゼラチンゲルの表面弾性率を、原子間力顕微鏡を用いた微視的圧入試験により測定した。ゲル作製時に照射した光照射時間に対して得られたゲルの表面弾性率（ヤング率）の変化を図１に示す。
図１に示すように、光照射時間を３００秒としたとき、表面弾性率が５０ｋＰａのゼラチンゲルを得た。なお照射時間を３００秒以上とした場合、ほぼ線形的にヤング率は増大した。
【００３２】
［製造例２：弾性率可変ゲル表面上へのラミニンの固定］
製造例１で作製した表面弾性率が５０ｋＰａのゲル表面に対して、０．５ｍｇ／ｍｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（水溶性カルボジイミド）−リン酸バッファー溶液（ｐＨ４．８）を４℃で一晩反応させた後、種々の濃度にて蛍光標識したラミニン−１１１−リン酸バッファー溶液を滴下し、４℃で所定の時間反応させた。
【００３３】
［ゲル表面のラミニンの固定量の評価］
製造例２で得た反応物をＰＢＳで洗浄後、ラミニン−１１１（以降、ＬＡＭと称する）に対し免疫抗体染色を行い、ゲル表面の蛍光観察を共焦点顕微鏡もしくは電子増倍ＣＣＤカメラにより行った。反応させたＬＡＭ濃度に対する蛍光強度の変化を図２（Ａ）に、ＬＡＭ固定後（ＬＡＭ濃度：１．０ｍｇ／ｍｌ）、１４日経過後までの蛍光強度の変化を図２（Ｂ）に夫々示す。なお、図２に示す蛍光強度の大きさは、ゲル表面へのＬＡＭ固定量（固定密度）に対応している。
ＬＡＭの基材表面固定量は、１時間以上の反応時間でほぼ一定であった。一方、ＬＡＭ反応濃度の増加に対しては線形的に増加することが確認された。特に、ＬＡＭ濃度が１．５ｍｇ／ｍｌの反応条件で、既存の培養系であるＢＤ社のマトリゲル（登録商標）に含まれる量と同等量のラミニン−１１１を、ゼラチンゲル上に固定できた（図２（Ａ））。
また、所定期間経過後のゲル表面の蛍光観察にて固定させたＬＡＭの経時的安定性（ＬＡＭ脱着の有無）について評価したところ、非特異吸着ＬＡＭの脱着に由来する多少の蛍光強度の減少はみられたものの、固定後１４日間日程度までは一定量のＬＡＭが安定してゲル表面上に存在した（図２（Ｂ））。
【００３４】
［設計例１］
前述の製造例１及び製造例２の手順に従い、表面弾性率が３ｋＰａとなるように光照射時間を調節して作製したゼラチンゲル上に、ＬＡＭ反応濃度を０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５ｍｇ／ｍｌにて固定反応を行い、図２（Ａ）に図示されるようにラミニン固定密度を線形的に調整した培養基材（３ｋＰａ基材とも称する）を得た。
【００３５】
［設計例２］
前述の製造例１及び製造例２の手順に従い、表面弾性率２０ｋＰａとなるように光照射時間を調節して作製したゼラチンゲル上に、ＬＡＭ反応濃度を０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５ｍｇ／ｍｌにて固定反応を行い、図２（Ａ）に図示されるようにラミニン固定密度を線形的に調整した培養基材（２０ｋＰａ基材とも称する）を得た。
【００３６】
［設計例３］
前述の製造例１及び製造例２の手順に従い、表面弾性率５０ｋＰａとなるように光照射時間を調節して作製したゼラチンゲル上に、ＬＡＭ反応濃度を０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５ｍｇ／ｍｌにて固定反応を行い、図２（Ａ）に図示されるようにラミニン固定密度を線形的に調整した培養基材（５０ｋＰａ基材とも称する）を得た。
【００３７】
［設計例４］
前述の製造例１及び製造例２の手順に従い、表面弾性率１００ｋＰａとなるように光照射時間を調節して作製したゼラチンゲル上に、ＬＡＭ反応濃度を０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５ｍｇ／ｍｌにて固定反応を行い、図２（Ａ）に図示されるようにラミニン固定密度を線形的に調整した培養基材（１００ｋＰａ基材とも称する）を得た。
【００３８】
［比較例基材］
ＢＤ社マトリゲル（登録商標）を氷上にて融解させ、血清を含まない培地にて３０倍に希釈した。希釈したマトリゲルを２ｍｌ／６０ｍｍディッシュに加え、３７℃で１時間（または４℃で一晩）インキュベートした。希釈したマトリゲルを吸引除去し、フィーダーフリー無血清培地にて軽く洗浄を行い、マトリゲル基材を得た。
【００３９】
［実施例１］
［設計例１−４及び比較例基材上でのｉＰＳ細胞の増殖挙動の評価］
本実施例では、上述の各基材上におけるｉＰＳ細胞の増殖挙動を評価した。
上述の設計例１−４で調製した基材上、並びに比較例基材上に、ヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で分散播種し、７日間培養を行い、各日における接着細胞密度を計測した。また比較のために、上述の設計例１−４においてＬＡＭを固定させていない基材についても、同様にヒトｉＰＳ細胞株を分散播種し、培養を行った。
ＬＡＭ反応濃度：０．５ｍｇ／ｍｌで調製した各基材における１日目（ｄａｙ１）、４日目（ｄａｙ４）、７日目（ｄａｙ７）の位相差顕微鏡写真を図３乃至図７に示す。
また、各基材における培養日数に対するＬＡＭ反応濃度別の細胞固定密度変化について、図８に示す。なお図８は、ａ）３ｋＰａ基材、ｂ）２０ｋＰａ基材、ｃ）５０ｋＰａ基材及びマトリゲル基材、ｄ）１００ｋＰａ基材及びマトリゲル基材を夫々示す。
【００４０】
設計例１で調製した３ｋＰａ基材では、いずれのラミニン濃度条件下でも細胞は培養日数に伴い減少した（図３、図８ａ）参照）。
設計例２で調製した２０ｋＰａ基材では、いずれのラミニン濃度条件下においても、小さな細胞塊が形成されたが、その後、細胞塊が崩壊し、シングルセルになる様子が観察され、細胞の増殖は見られなかった（図４、図８ｂ）参照）。
一方、設計例３で調製した５０ｋＰａ基材では、ＬＡＭ反応濃度：０．５又は１．０ｍｇ／ｍｌ条件下でｉＰＳ細胞の増殖が観察された（図５、図８ｃ）参照）。
また、設計例４で調製した１００ｋＰａ基材では、ＬＡＭ反応濃度：０．１ｍｇ／ｍｌ条件下ではｉＰＳ細胞の増殖が観察されたものの、他のＬＡＭ反応濃度では増殖が観察されなかった（図６、図８ｄ）参照）。
なお、比較例基材のマトリゲル基材では、培養７日後における細胞増殖はゆるやかであった（図７参照）。
【００４１】
特に図８ｃ）を参照すると、設計例３の５０ｋＰａ基材におけるＬＡＭ反応濃度：０．５及び１．０ｍｇ／ｍｌ条件では、比較例のマトリゲル基材を大きく上回る細胞増殖が見られるという結果を得た。但し、同じく５０ｋＰａ基材において、マトリゲルと同程度のラミニン固定量となるＬＡＭ反応濃度：１．５ｍｇ／ｍｌの反応条件（図２参照）では、細胞塊は形成されたが増殖は見られなかった。
【００４２】
以上より、ｉＰＳ細胞の増殖には培養基材の表面弾性率とラミニンの表面固定密度の両パラメーターが共に最適化された至適条件が存在するという結果が得られた。
そして本発明はこの両パラメーターの最適設計により、ｉＰＳ細胞の高速増殖基材を構成したものである。
【００４３】
［実施例２］
［培養後回収ｉＰＳ細胞の幹細胞性評価］
本実施例では、細胞増殖が確認された基材条件にて、培養後のｉＰＳ細胞が幹細胞性を正常に保持しているか（自己複製増殖能、未分化性、多分化能の有無）どうかを評価した。
培養基材には、前述の製造例１及び製造例２の手順に従い、表面弾性率５０ｋＰａとな
るように光照射時間を調節して作製したゼラチンゲル上に、ＬＡＭ反応濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにて固定反応を行った基材（設計例５）を用いた。この設計例５の基材に対して、前述の実施例１の手順に従い、ヒトｉＰＳ細胞株を播種し、７日間培養を行った。
７日間培養、培養基材から回収したｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞であるマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上に再播種し、７日間培養を行った後、免疫抗体染色法により未分化マーカータンパク（ＳＳＥＡ−１，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１）の発現について調べた。図９にｉＰＳ培養後に観察された未分化マーカー蛋白の免疫蛍光染色像を示す。なお図９は、ａ）ＳＳＥＡ−４、ｂ）ＴＲＡ−１−６０、ｃ）ＴＲＡ−１−８１、ｄ）ＳＳＥＡ−１を夫々示す。
図９にも示すように、ｉＰＳ細胞の正常なコロニー形成、及び３種全てのポジティブマーカー（ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１）の陽性、ネガティブマーカー（ＳＳＥＡ−１）の陰性が確認され、本発明の培養方法にて増殖させた後、回収されたｉＰＳ細胞が未分化性を維持していることが確認された。
【００４４】
さらに、回収したｉＰＳ細胞の多分化能保持について、ハンギングドロップ法により作製した胚様体の接着培養による自然分化誘導を行った。
上記の手順にて回収したｉＰＳ細胞に対し、免疫抗体染色法により三胚葉分化マーカータンパク（βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ，α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ，α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を調査した結果、全てのマーカーの発現が確認され、多分化能が保持していることも確認された。図９に各分化マーカー蛋白の免疫蛍光染色像を示す。なお図１０は、ａ）βＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ、ｂ）α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、ｃ）α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎを夫々示す。
以上、回収されたｉＰＳ細胞における自己複製増殖能、未分化性、多分化能の三挙動がいずれも正常であることより、本発明の培養方法による培養後においてもｉＰＳ細胞の幹細胞性が維持されているということが確認された。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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