(57)【要約】【課題】魚肉加工食品またはその原料を改善（例えば、香気成分を改善）することを、本発明の課題とする。また、魚肉加工食品の強度を改善することを、本発明の課題とする。【解決手段】本発明においては、チロシナーゼを用いることによって、魚肉加工食品またはその原料における香気成分が改善される。例えば、本発明は、チロシナーゼを用いることによって、魚肉加工食品またはその原料において異臭の原因となる香気成分を消失および／または低減することが可能である。本発明はまた、チロシナーゼを用いることによって魚肉加工食品の強度を改善する。本発明はまた、魚肉加工食品またはその原料を改善するための組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）においてインキュベートした該混合物を加熱する工程、
を包含する、魚肉加工食品を製造する方法。
【請求項２】
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
を包含する、魚肉加工食品の原料を改善する方法。
【請求項３】
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）においてインキュベートした該混合物を加熱する工程、
を包含する、香気成分が改善された魚肉加工食品を製造する方法。
【請求項４】
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
を包含する、香気成分が改善された魚肉加工食品の原料を製造する方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、ここで、前記香気成分の改善が、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールからなる群から選択される物質の低減である、方法。
【請求項６】
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）においてインキュベートした該混合物を加熱する工程、
を包含する、強度を増強した魚肉加工食品を製造する方法。
【請求項７】
前記魚肉加工食品の原料がすり身である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１、３、または、６のいずれか一項に記載の方法によって製造された、魚肉加工食品。
【請求項９】
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
チロシナーゼを含有する、魚肉加工食品またはその原料を改善するための組成物。
【請求項１２】
チロシナーゼを含有する、魚肉加工食品またはその原料の香気成分を改善するための組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組成物であって、ここで、前記香気成分の改善が、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールからなる群から選択される物質の低減である、組成物。
【請求項１４】
チロシナーゼを含有する、魚肉加工食品の強度を増強するための組成物。
【請求項１５】
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされれ、そして、チロシナーゼ活性を有する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼを用いた魚肉加工食品の改善に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
魚肉練り製品（例えば、蒲鉾など）のような魚肉加工食品は、香気成分が少なく、魚自体と比較して臭いが少ない。そのため、蒲鉾のような魚肉加工食品の臭いの改善には、注力されていなかった。
【０００３】
チロシナーゼは、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、あるいは、カテコールオキシダーゼとも呼ばれる酵素であり、フェノール類の酸化反応を触媒する。チロシナーゼは、多くの生物種から単離・同定されている。近年、ナメコ由来のチロシナーゼが報告されている（特許文献１）。チロシナーゼは、チロシンを酸化して重合させることによって、メラニンを合成し、その結果、褐色〜黒色を呈する。しかしながら、チロシナーゼによって香気成分の改善をする試みは行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012-172145号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
例えば、本発明によって、以下が提供される：
（項目１）
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）においてインキュベートした該混合物を加熱する工程、
を包含する、魚肉加工食品を製造する方法。
（項目２）
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
を包含する、魚肉加工食品の原料を改善する方法。
（項目３）
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）においてインキュベートした該混合物を加熱する工程、
を包含する、香気成分が改善された魚肉加工食品を製造する方法。
（項目４）
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
を包含する、香気成分が改善された魚肉加工食品の原料を製造する方法。
（項目５）
項目３または４に記載の方法であって、ここで、前記香気成分の改善が、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールからなる群から選択される物質の低減である、方法。
（項目６）
以下：
（ａ）魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）工程（ｂ）においてインキュベートした該混合物を加熱する工程、
を包含する、強度を増強した魚肉加工食品を製造する方法。
（項目７）
前記魚肉加工食品の原料がすり身である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
項目１、３、または、６のいずれか一項に記載の方法によって製造された、魚肉加工食品。
（項目９）
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
チロシナーゼを含有する、魚肉加工食品またはその原料を改善するための組成物。
（項目１２）
チロシナーゼを含有する、魚肉加工食品またはその原料の香気成分を改善するための組成物。
（項目１３）
項目１２に記載の組成物であって、ここで、前記香気成分の改善が、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールからなる群から選択される物質の低減である、組成物。
（項目１４）
チロシナーゼを含有する、魚肉加工食品の強度を増強するための組成物。
（項目１５）
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼであり、該ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされれ、そして、チロシナーゼ活性を有する、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に従って、チロシナーゼを用いて、簡便に、魚肉加工食品またはその原料の香気成分を改善することができる。さらに、本発明に従って、チロシナーゼを用いて、魚肉加工食品の強度を増強することもできる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（Ｉ．用語の定義）
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【０００８】
本明細書において使用する場合、用語「魚肉加工食品」とは、魚肉加工食品の原料を加熱して製造した食品をいう。本発明の魚肉加工食品は、例えば、スケトウダラ、タイ、サメ、ワラヅカ、シログチ、イカ、または、エビ、あるいはこれら以外の魚類に由来する原料を用いて製造することができる。
【０００９】
本明細書において使用する場合、用語「魚肉加工食品の原料」とは、加熱を経て魚肉加工食品となる、任意の物質をいう。例えば、本発明において使用する魚肉加工食品の原料としては、魚肉（例えば、魚のすり身のように骨や皮を除去して磨砕した魚肉、あるいは、磨砕していない魚肉）が挙げられるがこれに限定されない。
【００１０】
「魚肉加工食品」としては、例えば、魚肉練り製品が挙げられるがこれに限定されない。魚肉練り製品に使用する魚肉加工食品の原料としては、例えば、すり身および落とし身が挙げられるがこれに限定されない。魚肉練り製品の加工法としては、加熱が挙げられ、そして、例えば、「焼き」「蒸し」「茹で」、および、「揚げ」が挙げられるがこれらに限定されない。「焼き」によって加工された魚肉練り製品としては、例えば、ちくわ、笹かまぼこ、および、伊達巻が挙げられるがこれらに限定されない。「蒸し」によって加工された魚肉練り製品としては、例えば、かまぼこ（カニカマ、すじかまぼこ、および、簀巻き）、ならびに、魚肉ソーセージが挙げられるがこれらに限定されない。「茹で」によって加工された魚肉練り製品としては、例えば、はんぺん、つみれ、および、鳴門巻きが挙げられるがこれらに限定されない。「揚げ」によって加工された魚肉練り製品としては、例えば、揚げかまぼこ（さつまあげ、テンプラ、つけあげ、えび天、じゃこ天、および、がんす）、フィッシュカツ（魚ロッケ）、ならびに、爆弾（沖縄県糸満市）が挙げられるがこれらに限定されない。魚肉練り製品は、魚肉に加えて、塩（例えば、食塩）、でんぷん、糖類、および、着色料からなる群から選択される原料を含むことができる。
【００１１】
本明細書において使用する場合、用語「香気成分」とは、食品に含まれる揮発性物質で、香りを有する物質をいう。本明細書において使用する場合、香気成分の「改善」とは、異臭の原因である「香気成分」の消失および／または低減をいう。本発明において、「異臭の原因である香気成分」とは、「不快臭成分」と互換可能に使用され、代表的には、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１２】
本明細書において使用する場合、用語「チロシナーゼ」とは、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、あるいは、カテコールオキシダーゼとも呼ばれる酵素であり、フェノール類の酸化反応を触媒する。例えば、チロシナーゼは、
Ｌ−チロシン＋Ｌ−ドーパ＋Ｏ２→Ｌ−ドーパ＋ドーパキノン＋Ｈ２Ｏ
という反応を触媒する。それゆえ、チロシナーゼは、チロシンを酸化してメラニンを生じる。チロシナーゼ活性の測定方法については特に制限はなく、通常の方法により測定することができる。チロシナーゼの供給源としては、代表的には、ナメコ、糸状菌、バクテリア、植物、および、動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
本明細書において「チロシナーゼ」の供給源として利用する「ナメコ」としては、Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ（菌界，担子菌門，菌じん綱，ハラタケ目，モエギダケ科，スギタケ属，ナメコ）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において使用される場合、「ナメコ由来のチロシナーゼ」とは、「ナメコ」から単離されたチロシナーゼ、または、ナメコのゲノムにコードされるチロシナーゼをいう。「ナメコ由来のチロシナーゼ」としては、配列番号１に記載の塩基配列またはその改変体によってコードされるポリペプチド、あるいは、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその改変体を含むポリペプチドをいい、例えば、
（１）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００１５】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００１６】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００１７】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００１８】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃（好ましくは６５℃）、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４（好ましくはｐＨ７．０）で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００１９】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００２０】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００２１】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００２２】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【００２３】
（遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００２４】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００２５】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００２６】
当該分野において、親水性指数もまた、改変設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００２７】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００２９】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【００３０】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００３１】
（変異型ポリペプチドの作製方法）
本発明のポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
【００３２】
（チロシナーゼ活性測定法）
チロシナーゼ活性測定法としては、周知の活性測定法を利用することが可能である。例えば、ｔ−ｂ−カテコールを基質とした比色法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００３４】
（ＩＩ．本発明のチロシナーゼ処理）
本発明では、魚肉加工食品の製造過程において、魚肉加工食品の原料にチロシナーゼを添加して酵素反応をさせることによって、魚肉加工食品またはその原料を改善することができる。例えば、本発明に従って、魚肉加工食品の臭い、および／または、魚肉加工食品の強度が改善される。臭いの改善としては、例えば、異臭の原因である香気成分の消失および／または低減が挙げられる。本発明において、「異臭の原因である香気成分」とは、「不快臭成分」と互換可能に使用され、代表的には、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールが挙げられるがこれらに限定されない。魚肉加工食品の強度の改善としては、強度の増強が挙げられるがこれに限定されない。
【００３５】
本発明の一つの局面では、魚肉加工食品の原料にチロシナーゼを添加して酵素反応をさせることによって、魚肉加工食品またはその原料の不快臭成分が消失および／または低減する。本発明によって消失および／または低減する不快臭成分としては、例えば、イソアミルアルコール、ノナナール、１−オクテン−３−オール、２−エチルヘキサノール、および、フェネチルアルコールが挙げられるがこれらに限定されない。本発明によるチロシナーゼ処理によって、必ずしもこれら不快臭成分の複数ないし全てが消失および／または低減する必要はない。好ましくは、本発明のチロシナーゼ処理によって、イソアミルアルコールおよび／またはノナナールを消失および／または低減する。
【００３６】
本発明の別の局面では、魚肉加工食品の製造において、原料にチロシナーゼを添加して酵素反応をさせることによって、製造された魚肉加工食品の強度が向上する。例えば、魚肉加工食品は、ゾル状、ゼリー状、ゲル状、固形状などの形状として製造することができるが、本発明に従ってチロシナーゼ処理した場合、魚肉加工食品の強度が向上する。
【００３７】
本発明におけるチロシナーゼ処理の方法は、特に限定されることはない。好ましくは、本発明のチロシナーゼ処理は、使用するチロシナーゼが酵素活性を発揮できる条件で行われる。例えば、本発明のチロシナーゼ処理方法は、代表的には、以下：
（ａ）処理対象である魚肉加工食品の原料とチロシナーゼとを混合する工程；および、
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；
を包含する。必要に応じて、工程（ｂ）の後に、工程（ｃ）として、混合物の加熱処理（例えば、「焼き」「蒸し」「茹で」、および、「揚げ」）を行ってもよい。
【００３８】
本発明では、本発明のチロシナーゼ処理の目的として、魚肉加工食品の改善のみならず、魚肉加工食品の原料の改善を選択することもできる。
【００３９】
例えば、本発明のチロシナーゼ処理は、魚肉加工食品の原料の製造時に行うことができる。例えば、魚肉加工食品の原料としての冷凍すり身の製造工程としては、代表的には、以下の工程：
１）魚体洗浄
２）魚体処理（フィレにする）
３）洗浄
４）魚肉採取
５）水晒し（２〜４回）
６）夾雑物除去
７）脱水
８）添加物混合
９）凍結
で行われる。上記工程中、例えば、工程５）の水晒し工程でチロシナーゼを混合することで、魚肉加工食品の原料を改善（例えば、イソアミルアルコールを低減ないし除去）することが可能である。なお、チロシナーゼを混合するタイミングは、工程５）に限定されるものではない。このように魚肉加工食品の原料の製造時にチロシナーゼ処理を行うことで、原料段階から風味等を改善することが可能になる。
【００４０】
本発明のチロシナーゼ処理方法において使用するインキュベーション温度としては、チロシナーゼが作用する任意の温度を利用することができる。当業者は、使用するチロシナーゼの特徴に応じて、適宜インキュベーション温度を決定することができる。インキュベーション温度は、限定されることはないが、例えば、５℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜４５℃、より好ましくは２０℃〜４５℃、最も好ましくは２５℃〜４５℃であるがこれに限定されない。
【００４１】
本発明のチロシナーゼ処理方法を行うインキュベーション時間は、チロシナーゼ処理の速度などに応じて、当業者が適宜決定することができる。インキュベーション時間は、限定されることはないが、例えば、３０分間〜４８時間、好ましくは４５分間〜３６時間、より好ましくは１時間〜２４時間、代表的には約１時間〜１６時間であるが、これらに限定されない。
【００４２】
インキュベーション温度と反応時間は、チロシナーゼにおける相補的なパラメーターである。そのため、一般的には、インキュベーション温度を高く設定した場合には反応時間を短くすることが可能であり、逆に、インキュベーション温度を低く設定した場合には反応時間を長くする必要がある。
【００４３】
また、本発明のチロシナーゼ処理工程においては、必要に応じてｐＨを調整してもよい。ｐＨは、使用するチロシナーゼの特性に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、当業者がｐＨを調整する場合、ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０、より好ましくはｐＨ５〜ｐＨ９、さらにより好ましくはｐＨ６〜ｐＨ８であるが、これらに限定されない。
【００４４】
使用するチロシナーゼの量は、チロシナーゼの反応速度などに応じて、当業者が適宜決定することができる。チロシナーゼ添加量は、限定されることはないが、例えば、１００〜１００００Ｕ／ｋｇ魚肉加工食品、好ましくは１０００〜９０００Ｕ／ｋｇ魚肉加工食品、より好ましくは２０００〜８０００Ｕ／ｋｇ魚肉加工食品、最も好ましくは５０００〜８０００Ｕ／ｋｇ魚肉加工食品であるが、これらに限定されない。
【００４５】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：チロシナーゼ酵素による香気成分の変化）
魚肉すり身を以下の配合で混合した：
（Ａ）試験区
・スケソウ陸上２級すり身    １５０．０ｇ
・食塩                          ４．０ｇ
・馬鈴薯澱粉                  １５．０ｇ
・冷水                        ５５．０ｇ
・チロシナーゼ                ２０．０ｇ
合計                    ２４４．０ｇ
（チロシナーゼは、２０ｇで約１３００Ｕである）
（Ｂ）対象区
・スケソウ陸上２級すり身    １５０．０ｇ
・食塩                          ４．０ｇ
・馬鈴薯澱粉                  １５．０ｇ
・冷水                        ７５．０ｇ
・チロシナーゼ                  ０．０ｇ
合計                    ２４４．０ｇ。
【００４７】
ケーシングに上記（Ａ）または（Ｂ）を充填して２５℃で１６時間インキュベートし、次に、９０℃で２０分間上記加熱し、冷水で冷却した後、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって、魚肉加工食品の香気成分を測定した。
【００４８】
その結果は、以下のとおりである。
【００４９】
【表１】
2015100277.tif 000002
【００５０】
イソアミルアルコールは、異臭成分として一般に知られている。ノナナールは、アルデヒドの酸化臭であり、異臭成分の一種である。１−オクテン−３−オールおよび２−エチルヘキサノールは、香りへの影響は比較的少ない。フェネチルアルコールは、花の香成分である。
【００５１】
チロシナーゼ処理によって、魚肉加工食品の味への影響はなかった。
【００５２】
上記の結果から、チロシナーゼ処理をすることにより、不快臭とみなされるイソアミルアルコールが消失し、花の香気成分であるフェニルエチルアルコールが減少した。不快臭の原因となるイソアミルアルコールが検出されなくなったことから、魚肉ゲルをチロシナーゼで処理することは蒲鉾などの魚肉加工食品の改善に効果的であることが実証された。
【００５３】
（実施例２：チロシナーゼ酵素による強度の変化）
実施例１で製造した魚肉加工食品は、冷水での冷却によってゼリー状となった。次に、対象区および試験区のゼリー状魚肉加工食品の強度を比較した。強度の測定は、ケーシングフィルムを剥がした蒲鉾を３ｃｍの厚さになるようにカットし、断面にレオメーターを用いて１ｍｍ/ｓｅｃの速度で５ｍｍ球形プランジャーを突き刺し、破断強度（ｇ）と圧縮距離（ｍｍ）を測定した。破断強度（ｇ）×圧縮距離（ｃｍ換算）の式より、ゼリー強度（ｇ・ｃｍ）を算出した。
【００５４】
試験区のゼリー強度は、１７２ｇ・ｃｍであり、それに対して、対象区のゼリー強度は、９８ｇ・ｃｍであった。この結果から、チロシナーゼ処理をすることにより、魚肉加工食品の強度が増強されることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明に従って、チロシナーゼを用いて、簡便に、魚肉加工食品またはその原料の香気成分を改善することができる。さらに、本発明に従って、チロシナーゼを用いて、魚肉加工食品の強度を増強することもできる。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ１をコードする遺伝子の核酸配列
配列番号２：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ１のアミノ酸配列
配列番号３：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ２をコードする遺伝子の核酸配列
配列番号４：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ２のアミノ酸配列
【配列表】
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