(57)【要約】      （修正有）【課題】高い抗炎症作用を有する新規リン脂質、並びに特定の酸性脂質を含む抗炎症剤及び炎症性サイトカイン抑制剤を提供。【解決手段】１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロール、並びにグリセロール骨格の1,2位の位置に脂肪酸が2個結合したグリセロ型の酸性脂質であって、炭素数が20以上で、二重結合の数が4個以上の脂肪酸である脂質を含む抗炎症剤又は炎症性サイトカイン産生抑制剤。2015174850.tif 000010【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロール。
【請求項２】
グリセロール骨格の1,2位の位置に脂肪酸が2個結合したグリセロ型の酸性脂質であって、構成脂肪酸の少なくとも1つが、炭素数が20以上で、二重結合の数が4個以上の脂肪酸である脂質を含む抗炎症剤。
【請求項３】
グリセロール骨格の1,2位の位置に脂肪酸が2個結合したグリセロ型の酸性脂質であって、構成脂肪酸の少なくとも1つが、炭素数が20以上で、二重結合の数が4個以上の脂肪酸である脂質を含む炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項４】
１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールを含む食品組成物。
【請求項５】
１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールを含む化粧料。
【請求項６】
１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールを含む医薬組成物。
【請求項７】
ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類をエタノール濃度が60〜90容量%の含水エタノールを用いて抽出する工程を含む藻類エキスの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の製造方法により得られる藻類エキス。
【請求項９】
請求項８に記載の藻類エキスを含む抗炎症剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の藻類エキスを含む炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項１１】
請求項８に記載の藻類エキスを含む食品組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の藻類エキスを含む化粧料。
【請求項１３】
請求項８に記載の藻類エキスを含む医薬組成物。
【請求項１４】
ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物を含む抗炎症剤。
【請求項１５】
ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物を含む炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のリン脂質、藻類エキスの製造方法、及び該製造方法により得られる藻類エキスに関する。さらに、本発明は、抗炎症剤、炎症性サイトカイン産生抑制剤、食品組成物、化粧料及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームの共通の病態としての炎症反応が注目され、慢性炎症による過度のストレスが動脈硬化などの生活習慣病の発症リスクを増大させることが指摘されている。また、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病など)、自己免疫性疾患(リウマチ、乾癬など)、癌などの疾患も慢性炎症により引き起こされる。
【０００３】
そのため、医療費の削減、QOLの向上、更には地域の素材を活かした独自性の高い商品開発の観点から、特産物等を利用した抗炎症素材(機能性食品、機能性化粧品)の開発が求められている。
【０００４】
機能性食品等として利用されている藻類としては、クロレラ、ドナリエラ、スピルリナ、ユーグレナ、ヘマトコッカス等が知られている。この中で、ヘマトコッカスは、サプリメントとして使用されているアスタキサンチンを多く含有することが知られている。
【０００５】
産業上利用されている他の藻類としては、ナンノクロロプシス属(Nannochloropsis sp.)が知られている。ナンノクロロプシス属は、直径2〜6μmの球形又は楕円形の微細藻類であり(別名：海産クロレラ)、養殖魚飼料のワムシ用の餌料として培養及び販売されてきた。その他にも、ナンノクロロプシス属は油分含有量が高く(乾燥重量あたり20〜30%)、培養し易いため、再生可能エネルギーである、バイオ燃料の候補として注目されている。
【０００６】
また、特許文献１では、ナンノクロロプシス属を含む飼料を鶏に給餌するとEPA及び／又はDHAを高濃度で含有する鶏卵を生産することができ、得られた鶏卵は、魚油臭がなく風味に優れたものであることが報告されている。また、この飼料を摂餌させた場合には、産卵率が低下することが無いので、効率的に鶏卵を生産できることも報告されている。
【０００７】
特許文献２では、ナンノクロロプシス属又はその抽出物が、抗酸化ストレス作用、優れた皮膚引締め効果を有し、たるみ、しわ等の老化兆候等を緩和できるので、ナンノクロロプシス属又はその抽出物を皮膚化粧料に適用できることが報告されている。
【０００８】
しかしながら、現在まで、ナンノクロロプシス属由来の脂質を抗炎症素材として活用するという報告はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平8-173056号公報
【特許文献２】特開2006-232766号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、高い抗炎症作用を有する新規リン脂質、並びに特定の酸性脂質を含む抗炎症剤及び炎症性サイトカイン抑制剤を提供することを目的とする。また、本発明は、抗炎症性脂質を高含有する藻類エキスの製造方法、該製造方法により得られる藻類エキス、該藻類エキスを含む抗炎症剤及び炎症性サイトカイン抑制剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、特定の藻類又はその抽出物を含む抗炎症剤及び炎症性サイトカイン抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、新規のリン脂質である１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロール(EpPOH-PG)、及び公知のリン脂質である１−エイコサペンタノエイル−２−（３−ｔｒａｎｓ−ヘキサデセノイル）ホスファチジルグリセロール(EpHe-PG)が高い抗炎症作用を有すること、これらのリン脂質がナンノクロロプシス属等の藻類に含まれること、並びに特定の濃度範囲の含水エタノールを使用することで抗炎症作用を有する脂質をナンノクロロプシス属から高収率で抽出できるという知見を得た。
【００１２】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のリン脂質、抗炎症剤、炎症性サイトカイン抑制剤、藻類エキスの製造方法、藻類エキス等を提供するものである。
項１．１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロール。
項２．グリセロール骨格の1,2位の位置に脂肪酸が2個結合したグリセロ型の酸性脂質であって、構成脂肪酸の少なくとも1つが、炭素数が20以上で、二重結合の数が4個以上の脂肪酸である脂質を含む抗炎症剤。
項３．グリセロール骨格の1,2位の位置に脂肪酸が2個結合したグリセロ型の酸性脂質であって、構成脂肪酸の少なくとも1つが、炭素数が20以上で、二重結合の数が4個以上の脂肪酸である脂質を含む炎症性サイトカイン産生抑制剤。
項４．１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールを含む食品組成物。
項５．１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールを含む化粧料。
項６．１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールを含む医薬組成物。
項７．ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類をエタノール濃度が60〜90容量%の含水エタノールを用いて抽出する工程を含む藻類エキスの製造方法。
項８．項７に記載の製造方法により得られる藻類エキス。
項９．項８に記載の藻類エキスを含む抗炎症剤。
項１０．項８に記載の藻類エキスを含む炎症性サイトカイン産生抑制剤。
項１１．項８に記載の藻類エキスを含む食品組成物。
項１２．項８に記載の藻類エキスを含む化粧料。
項１３．項８に記載の藻類エキスを含む医薬組成物。
項１４．ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物を含む抗炎症剤。
項１５．ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物を含む炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のEpPOH-GPは、新規のリン脂質であって高い抗炎症作用を有している。また、本発明は、特定の酸性脂質を含む抗炎症剤及び炎症性サイトカイン産生抑制剤を提供する。
【００１４】
本発明の藻類エキスの製造方法によれば、特定の藻類から抗炎症作用を有する脂質を高収率で抽出することが可能である。それ故、当該製造方法により得られた藻類エキスは、高い抗炎症作用を有している。
【００１５】
さらに、本発明は、特定の藻類又はその抽出物を含む抗炎症剤及び炎症性サイトカイン産生抑制剤を提供する。
【００１６】
本発明の抗炎症性脂質は、藻類等の天然素材から製造できるものであるので、安全性が高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】試験例４の薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。1: 50%aq EtOH抽出物, 2: 60%aq. EtOH抽出物, 3: 70%aq. EtOH抽出物, 4: 80%aq. EtOH抽出物, 5: 90%aq. EtOH抽出物, 6: 95%aq. EtOH抽出物, 7: 99.9%aq EtOH抽出物
【図２】試験例５におけるNO及び炎症性サイトカイン(TNF-α及びIL-6)の産生阻害率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
酸性脂質
本発明における酸性脂質は、グリセロール骨格の1,2位の位置に脂肪酸が2個結合したグリセロ型の酸性脂質であって、構成脂肪酸の少なくとも1つが、炭素数が20以上で、二重結合の数が4個以上の脂肪酸であることを特徴とする。そして、当該酸性脂質は、抗炎症作用及び／又は炎症性サイトカイン抑制作用を有することを特徴とする。
【００２０】
上記酸性脂質としては、例えば、ホスファチジルグリセロール、スルホキノボシルジアシルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン等が挙げられ、好ましくはホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びスルホキノボシルジアシルグリセロール、より好ましくはホスファチジルグリセロールである。
【００２１】
上記脂肪酸は、炭素数は好ましくは20〜24、より好ましくは20であり、二重結合の数は好ましくは4〜6個、より好ましくは4又は5個である。上記脂肪酸としては、特に限定されないが、例えば、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸等が挙げられ、好ましくは5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸である。
【００２２】
上記脂肪酸以外の構成脂肪酸としては、特に限定されないが、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、３−ヒドロキシパルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ヘキサデセン酸等が挙げられ、好ましくはパルミチン酸、３−ヒドロキシパルミチン酸及びヘキサデセン酸(特に３−ｔｒａｎｓ−ヘキサデセン酸)である。
【００２３】
上記酸性脂質の具体例としては、例えば、１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロール、１−エイコサペンタノエイル−２−（３−ｔｒａｎｓ−ヘキサデセノイル）ホスファチジルグリセロール、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ホスファチジルグリセロール(PA-PG)、１−エイコサペンタエノイル−２−パルミトイル−スルホキノボシルグリセロール(EpP-SQDG)等を挙げることができ、好ましくは１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロール及び１−エイコサペンタノエイル−２−（３−ｔｒａｎｓ−ヘキサデセノイル）ホスファチジルグリセロールである。
【００２４】
以下に、EpPOH-PGとEpHe-PGの構造を示す。
【００２５】
【化１】
2015174850.tif 000002
【００２６】
【化２】
2015174850.tif 000003
【００２７】
上記酸性脂質の中でも、特に１−エイコサペンタエノイル−２−（３−ヒドロキシ）パルミトイルホスファチジルグリセロールは新規のリン脂質である。
【００２８】
本発明における酸性脂質は、市販品を入手できるか若しくは公知の方法により製造でき、又は当該酸性脂質を含む藻類等の生物から分離、精製することにより得ることもできる。
【００２９】
例えば、EpPOH-PGは、ユカリ属、アカバギンナンソウ属、ダルス属、ナンノクロロプシス属等に含まれており、EpHe-PGは、ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属、ダルス属等に含まれている。
【００３０】
中でも、ナンノクロロプシス属は、EpPOH-PG及びEpHe-PGの含有量が多いため、EpPOH-PG及びEpHe-PGを抽出するために使用する藻類としては特に好適に使用できる。ナンノクロロプシス属は、N. gaditana、N. granulata、N. limnetica、N. oceanica、N. oculata、N. salinaの6種類が知られており、いずれの株も好適に使用できる。
【００３１】
本発明において、ミツデソゾ属としてはミツデソゾが、フシツナギ属としてはフシツナギが、イバラノリ属としてはイバラノリが、マクサ属としてはマクサが、ウスバノリ属としてはウスバノリが、アミジグサ属としてはアミジグサが、ヤハズグサ属としてはヤハズグサが、オバクサ属としてはオバクサが、ホンダワラ属としてはマメタラワ及びホンダワラが、ユカリ属としてはユカリが、オゴノリ属としてはオゴノリが、アカバギンナンソウ属としてはアカバギンナンソウが、フノリ属としてはフノリ及びフクロフノリが、ダルス属としてはダルスがそれぞれ好ましい。
【００３２】
EpPOH-PG及びEpHe-PGは、上記藻類から、例えば、シリカゲルによる精製、合成吸着樹脂による精製、順相分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、電気透析等による脱塩、限外ろ過膜等による分子量分画、サイズ排除クロマトグラフィー等を用いて精製することができる。精製効率を上げる観点から、複数の精製方法を併用しても構わない。
【００３３】
藻類エキスの製造方法
本発明の藻類エキスの製造方法は、ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類をエタノール濃度が60〜90容量%の含水エタノールを用いて抽出する工程を含むことを特徴とする。
【００３４】
上記製造方法によれば、抗炎症作用を有する脂質(EpPOH-PG、EpHe-PG)を高収率で抽出することが可能である。そのため、得られる藻類エキスは、高い抗炎症作用を有している。
【００３５】
上記の藻類の中でも、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、オゴノリ属及びフノリ属を使用した場合は、EpHe-PGを抽出することができるが、ユカリ属、アカバギンナンソウ属、ダルス属及びナンノクロロプシス属を使用した場合は、EpPOH-PG及びEpHe-PGの両方を抽出することができる。
【００３６】
上記の藻類の中で、ナンノクロロプシス属は、EpPOH-PG及びEpHe-PGの含有量が多く、EpPOH-PG及びEpHe-PGを多量に抽出することが可能であるので好ましい。
【００３７】
抽出に使用する藻類としては、乾燥されていない生の状態のもの、又は乾燥された状態のもののいずれであってもよい。また、藻類は、切断や粉砕されていない原形のままの状態のもの、又はスライスや粉砕された状態のものであってもよい。
【００３８】
抽出に使用する含水エタノールのエタノール濃度は、通常60〜90容量%、好ましくは70〜90容量%である。この濃度範囲であると、夾雑物である色素の量が少なく、目的とする脂質が高い収率で得ることができる。
【００３９】
抽出を行う際の含水エタノールの温度は、例えば10〜50℃、好ましくは20〜40℃である。簡便さから抽出を室温下で行うことが望ましい。抽出を行う時間は、好ましくは5分以上、より好ましくは10分以上であり、更に好ましくは10〜120分である。含水エタノールの使用量は、特に限定されないが、例えば、藻類1重量部に対し5〜50重量部、好ましくは5〜20重量部である。抽出は、静置した状態又は含水エタノールを常時若しくは適宜撹拌した状態のいずれの状態で行ってもよい。
【００４０】
抽出が終了した後に、含水エタノールを回収する方法としては、含水エタノールに含まれる固形物を排除できる方法であればよく、例えば、遠心分離、ろ過等が挙げられる。
【００４１】
ここで回収した含水エタノールは、必要に応じて、固相抽出、活性炭処理、グラファイトカーボン処理、活性白土処理、酸性白土処理、限外濾過、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、透析法、これらの組合せなどにより精製を行ってもよい。
【００４２】
藻類又はその抽出物
前述するように、ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物は、上記酸性脂質を含有しているので、抗炎症剤及び炎症性サイトカイン抑制剤の有効成分として有用である。
【００４３】
上記藻類としては、乾燥されていない生の状態のもの、又は乾燥された状態のもののいずれであってもよい。また、藻類は、切断や粉砕されていない原形のままの状態のもの、又はスライスや粉砕された状態のものであってもよい。
【００４４】
藻類の抽出物を製造するために使用する抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール(メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノールなど)、ケトン類(アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトンなど)、スクワラン、グリコール類(エチレングリコール、プロピレングリコール)、アセトニトリル、グリセリン、テトラヒドロフラン、アセトアミド、酢酸、プロピオン酸、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。これらの抽出溶媒は1種単独又は2種以上を任意に組み合わせて用いることができる。
【００４５】
抽出は、溶媒に上記藻類の一部又は全部を加え、0℃〜溶媒が沸騰する温度、通常100℃以下の温度で、5分から3日程度、浸漬静置又は浸漬振盪抽出し、次いで不溶物を除去すること等により行うことができる。斯くして得られた溶媒抽出物は、更に分離精製工程に供されてもよい。
【００４６】
抗炎症剤
本発明の抗炎症剤は、上記酸性脂質又は上記藻類エキスを含むことを特徴とする。
【００４７】
さらに、本発明の抗炎症剤は、ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物を含むことを特徴とする。
【００４８】
上記酸性脂質は、強い抗炎症作用を示すことから、抗炎症剤の有効成分として有用である。上記酸性脂質を含む藻類エキスも同様に、抗炎症剤の有効成分として有用である。
【００４９】
本発明の抗炎症剤は、食品組成物、医薬組成物、化粧料等の分野で好適に使用することができる。
【００５０】
本発明の抗炎症剤における上記酸性脂質の含量は、食品組成物、医薬組成物、化粧料等に含有されたときの最終的な上記酸性脂質の含量が重要であるため特に限定されないが、通常、1〜100重量%程度、好ましくは5〜100重量%程度である。食品組成物、医薬組成物、化粧料等に添加される抗炎症剤における上記酸性脂質の含量は、後述する。抗炎症剤における上記酸性脂質の含量は、100重量%であってもよい。
【００５１】
本書において、抗炎症剤、炎症性サイトカイン抑制剤、食品組成物、医薬組成物、化粧料等における藻類エキス、藻類又は藻類の抽出物の含量は、特に言及しない限り、抗炎症剤、炎症性サイトカイン抑制剤、食品組成物、医薬組成物、化粧料等における上記酸性脂質の合計量(重量%)として表される。
【００５２】
炎症性サイトカイン抑制剤
本発明の炎症性サイトカイン抑制剤は、上記酸性脂質又は上記藻類エキスを含むことを特徴とする。
【００５３】
さらに、本発明の炎症性サイトカイン抑制剤は、ナンノクロロプシス属、ミツデソゾ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、フノリ属及びダルス属からなる群から選択される少なくとも1種の藻類又はその抽出物を含むことを特徴とする。
【００５４】
上記酸性脂質は、強い炎症性サイトカイン抑制作用を示すことから、炎症性サイトカイン抑制剤の有効成分として有用である。上記酸性脂質を含む藻類及びその抽出物も同様に、炎症性サイトカイン抑制剤の有効成分として有用である。
【００５５】
本発明の炎症性サイトカイン抑制剤は、食品組成物、医薬組成物、化粧料等の分野で好適に使用することができる。
【００５６】
本発明の炎症性サイトカイン抑制剤における上記酸性脂質の含量は、食品組成物、医薬組成物、化粧料等に含有されたときの最終的な上記酸性脂質の含量が重要であるため特に限定されないが、通常、1〜100重量%程度、好ましくは5〜100重量%程度である。食品組成物、医薬組成物、化粧料等に添加される炎症性サイトカイン抑制剤における上記酸性脂質の含量は、後述する。炎症性サイトカイン抑制剤における上記酸性脂質の含量は、100重量%であってもよい。
【００５７】
食品組成物
本発明の食品組成物は、EpPOH-PG又は上記藻類エキスを含むことを特徴とする。本発明の食品組成物には、動物(ヒトを含む)が摂取できるあらゆる食品組成物が含まれる。
【００５８】
本発明の食品組成物には、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。かかる添加物については、本書においてそれらの全体が援用される「指定品目  食品添加物便覧  １９９９年版」岸  眞之輔  編集、平成11年12月10日発行、又は、「新訂版＝よくわかる  暮しのなかの食品添加物」日本食品添加物協会編集、1996年12月20日発行」に記載される添加物を用いることができる。
【００５９】
食品組成物としては、例えば、ハム・ソーセージ等の食肉加工品、たらこ・サーモン等の水産物加工品、バター・チーズ・ヨーグルト等の乳加工品、うどん・そば・中華そば・スパゲッティ・インスタントラーメン等の麺類、豆腐・豆乳・大豆粉・醤油・豆菓子・分離大豆タンパク質などの大豆加工品、農産物加工品、ジャム・プルーンエキス・ピューレ等の果実加工品、調味料、発泡酒・ワイン・ビール等の酒、清涼飲料水・炭酸飲料水・コーヒー・紅茶等の飲料、漬物、パン、菓子、氷菓、惣菜、レトルト、米製品等が好適に例示される。
【００６０】
本発明の食品組成物におけるEpPOH-PG及び／又はEpHe-PGの含量は、食品組成物の種類、形態、油脂含量、加工状態、設定される消費又は賞味期限、所望の効果、食品組成物の保存形態、共存する成分等によって異なるため限定されないが、例えば、0.00001〜80重量%、好ましくは0.0001〜50重量%、より好ましくは0.0001〜30重量%である。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の食品組成物は、炎症反応が一因となって引き起こされる疾患又は症状(例えば、メタボリックシンドローム、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病など)、自己免疫性疾患(リウマチ、乾癬など)等)を改善及び／又は予防し得る機能性食品組成物である。機能性食品組成物としては、例えば、粉末、錠剤、顆粒、タブレット、チュアブルタブレット、カプセル、ソフトカプセル、トローチ、飴、キャンディー、ガム、ゼリー、グミ、ビスケット、クッキー、飲料等の食品組成物が好適に例示される。
【００６２】
本発明の食品組成物は、機能性食品組成物として、炎症反応が一因となって引き起こされる前述の疾患又は症状を改善及び／又は予防し得る。
【００６３】
化粧料
本発明の化粧料(ヘアケア化粧料も含む)は、EpPOH-PG又は上記藻類エキスを含むことを特徴とする。本発明の化粧料には、動物(ヒトを含む)の皮膚、粘膜、体毛、頭髪、頭皮、爪、歯、顔皮、口唇等に適用されるあらゆる化粧料が含まれる。
【００６４】
本発明の化粧料には、必須成分であるEpPOH-PG又は上記藻類エキスに加え、必要に応じて、粉末、顔料、油脂類、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、増粘剤、洗浄剤、賦形剤、乳化剤、可塑剤、防腐剤、防黴剤、pH調整剤、紫外線吸収剤、アミノ酸、香料等の通常の化粧料に用いられる成分を本発明の効果を損なわない範囲で適当に配合することができる。これらの添加剤については、本書においてその全体が援用される特開平9-87133公報、特開平3-264510公報等の公報を参照することができる。
【００６５】
本発明の化粧料の剤型は任意であり、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系等のような剤型であり得る。皮膚への安全性の点からpH4〜8程度に調整されることが好ましい。
【００６６】
本発明の化粧料の用途も任意であり、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等のフェーシャル化粧料、シャンプー、ヘアリンス、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアムース、ヘアスプレー等の頭髪又は整髪化粧料、ファンデーション、口紅、グロス、アイシャドー、アイブロー、チーク、マスカラ等のメーキャップ化粧料、ボディーローション、ボディークリーム等のボディー化粧料、クレンジングフォーム、洗顔料、ハンドソープ、ボディーソープ等の洗浄料、香水、デオドラント剤等の芳香化粧、マニキュア、ベースコート、トップコート、除光液等のネイル化粧料、入浴剤等に用いることができる。
【００６７】
本発明の化粧料におけるEpPOH-PG及び／又はEpHe-PGの含量は、化粧料の使用目的、剤型、組成、設定される使用期限、設定される保存状態、共存する成分等によって異なるため特に限定されないが、例えば、0.000001〜50重量%、好ましくは0.00001〜50重量%、より好ましくは0.0001〜30重量%である。
【００６８】
本発明の化粧料は、炎症反応が一因となって引き起こされる前述の疾患又は症状の治療及び／又は予防し得る。
【００６９】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、EpPOH-PG又は上記藻類エキスを含むことを特徴とする。本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対して投与される。
【００７０】
本発明の医薬組成物には、必要に応じて、薬学的に許容される担体、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、安定剤等の通常の医薬組成物に用いられる成分を本発明の効果を損なわない範囲で適当に配合することができる。これらの添加剤については、例えば、本書においてその全体が援用される「医薬品添加物事典２０００」日本医薬品添加剤協会  編集、2000年4月28日発行に記載の添加剤を用いることができる。
【００７１】
医薬組成物の投与形態及び製剤形態は、特に限定されない。投与形態としては、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、経腸投与、直腸内投与、皮下投与等が挙げられる。製剤形態としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、トローチ剤、座剤、散剤、パウダー等の固形又は半固形剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、ローション剤、エアゾール剤、浸剤、煎剤等の液剤等が挙げられる。
【００７２】
医薬組成物におけるEpPOH-PG及び／又はEpHe-PGの含量は、使用目的、製剤形態、組成、設定される使用期限、共存する成分等によって異なるため限定されないが、例えば、0.00001〜100重量%、好ましくは0.00001〜90重量%、より好ましくは0.0001〜90重量%である。
【００７３】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、炎症反応が一因となって引き起こされる上記疾患又は症状の治療及び／又は予防に有効である。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００７６】
試験例では、以下の方法に従いサイトカイン産生抑制率、NO産生抑制率、細胞傷害性を測定した。
【００７７】
[サイトカイン産生阻害率及びNO産生阻害率の測定方法]
マウス由来マクロファージ様細胞株RAW264.7 (理研バイオリソースより提供)を用いて細胞試験を行った。細胞は1% penicillin/streptomycin, 10% FBS含有DMEM培地により5%CO2存在下37℃で継代培養した。LPS誘導型炎症性サイトカイン(TNF-α/IL-6)及びNOの産生試験は、以下の条件で行った。細胞を2×105 cells/mLの細胞密度になるよう培地で希釈し、細胞培養用96 wellプレートに200μLずつ分注して16時間前培養し、細胞をプレートに接着させた。
【００７８】
細胞より培養上清を除去し、新鮮な培地で洗浄後、所定の濃度にて試料を分散させた培地を180μL添加し、さらに15分後に濃度100 ng/mLのLPSを20μL添加して総量200μLで培養した(n = 3)。培養6時間後及び培養19時間後の培養上清を採取し、サイトカイン(TNF-α及びIL-6)濃度(培養6時間後)並びにNO濃度(培養19時間後)を測定した。試料は溶媒を乾固させた後に15 mmol/Lの濃度で一旦DMSOに溶解し、その後所定の濃度になるよう培地に分散させた。DMSOの細胞毒性を考慮し、培地におけるDMSOの終濃度が0.2%を超えないようにした。
【００７９】
サイトカイン濃度はELISA法により求めた。試料添加培地の代わりに同一のDMSO濃度に調整した試料無添加培地を添加したものをコントロール、LPS含有培地の代わりにLPS無添加培地を添加したものをブランクとし、サイトカイン産生抑制活性の度合い(阻害率)を以下の式で算出した。
【００８０】
サイトカイン産生阻害率 (%)={1-(Sa-Sb)/(Sc-Sb)}×100
ここで，
Sa：試料添加培地におけるサイトカイン濃度
Sb：ブランクのサイトカイン濃度
Sc：コントロールのサイトカイン濃度
【００８１】
NO産生量は、Griess 法により培養上清に蓄積した亜硝酸イオン(NO2-)濃度を測定することにより算出した。すなわち、培養上清125μLを96 wellマイクロプレートに採取し、Griess試薬を125μL添加して速やかに撹拌し、10分室温放置後マイクロプレートリーダー(Molecular devices製M5)にて波長500 nmと650 nmにおける吸光度差(ΔA)を測定した。
【００８２】
培地にNO2-を溶解させたものを標準液として検量曲線を作成し、培地中のNO2-濃度を求めた。NO産生阻害率は、サイトカイン産生阻害率と同様に以下の式で算出した。
【００８３】
NO産生阻害率 (%)={1-(ΔAa-ΔAb)/(ΔAc-ΔAb)}×100
ここで、
ΔAa：試料添加培地の吸光度差
ΔAb：ブランクの吸光度差
ΔAc：コントロールの吸光度差
【００８４】
[細胞傷害性の測定方法]
細胞試験によるNO/TNF-α産生抑制の妥当性を確認するべく、細胞活性測定キット(Cell Counting Kit-8)を用いて、試料の細胞障害性を測定した。上記と同一の培養条件で試料及びLPSの存在下20時間細胞培養し、培地を一旦除去後、Cell Counting Kit-8を含む培地(2μL reagent/98μL medium)で6時間培養し、マイクロプレートリーダーにて波長450 nmと650 nmにおける吸光度差(ΔA)を測定した。細胞傷害性の程度は、コントロール区におけるΔAに対する試料添加培地区のΔAの比で表した。
【００８５】
試験例１：リン脂質における抗炎症作用の比較
種々のリン脂質及び糖脂質(EpPOH-PG、EpHe-PG、EpP-SQDG、PA-PG、PO-PG、diP-PG、PO-PC、diEp-PC、POPS、PO-PE、PO-PA及びP-LPC)の抗炎症作用を比較した。各種脂質を300 nmol/mLになるよう培地に溶解させ、細胞に対して終濃度30, 10, 3 nmol/mLで添加した。抗炎症作用は、LPSにより刺激されたマクロファージ様細胞RAW264.7のNO産生阻害率、TNF-α産生阻害率及びIL-6産生阻害率で表した。結果を表１及び表２に示す。
【００８６】
【表１−１】
2015174850.tif 000004
【００８７】
【表１−２】
2015174850.tif 000005
【００８８】
【表２−１】
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【００８９】
【表２−２】
2015174850.tif 000007
【００９０】
表１及び２に示すように、既に報告されている抗炎症性リン脂質であるPO-PGに比べて抗炎症作用が強かった脂質は、EpPOH-PG, EpHe-PG, EpP-SQDG及びPA-PGの4種類であった。また、最も抗炎症作用が強かったのは、EpPOH-PGであった。
【００９１】
細胞の活性を示すWST活性は、脂質無添加の場合に比べて変化がなく、脂質添加による細胞毒性は認められなかった。
【００９２】
試験例２：種々の海藻由来脂質における抗炎症性脂質の検出
種々の藻類よりエタノール抽出物を抽出し、高速液体クロマトグラフィー-質量分析装置(LC-ESIITMS)を用いて、抗炎症作用が最も強かったEpPOH-PG及びEpHe-PGの存在状態を調べた。表２に示す藻類を乾燥し、粉末化した。この粉末500 mgを25 ml容ねじ口試験管に入れ、エタノール10 mLを添加して1 hr常温にて撹拌し、遠心分離により上清を得た。残渣にエタノール10 mLを再度加え、30 min撹拌し、遠心分離により上清を得た。これらを併せて遠心濃縮し、エタノール抽出物を得た。
【００９３】
得られた抽出物を0.1 mg/mLの濃度になるようエタノールに溶解し、微粒子を除去した後、LC-ESIITMSに供した。LCの条件は以下のとおり：LC, Agilent LC1100 series; column, Cadanza CW-C18 (Imtakt Co., φ2×250 mm); column temp., 40℃; mobile phase-A , water/acetic acid/1mmol/L ammonium acetate = 100/0.07/3; mobile phase-B, methanol/acetic acid/1mmol/L ammonium acetate = 100/0.07/3; gradient program, 0 min (B80%)→30 min (B100% with linear gradient)→50 min (B100%); injection volume, 3μL。また、ITMS検出の条件は以下のとおり：ion source, electrospray ionization; polarity, negative; scan range, 50-1200 m/z。
【００９４】
この条件でLC-MSを実施した場合、保持時間29.5 minにEpPOH-PGが、保持時間31.5 minにEpHe-PGがそれぞれm/z 783, m/z 765で検出された。このピークの面積を相対含量とし、ナンノクロロプシス属の場合を100として表した。その結果を表３に示す。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
エタノール抽出物中にEpPOH-PGが含まれるのはユカリ属、アカバギンナンソウ属、ダルス属及びナンノクロロプシス属であった。また、EpHe-PGが含まれるのは、ミツデソゾ属、フノリ属、フシツナギ属、イバラノリ属、マクサ属、ウスバノリ属、アミジグサ属、ヤハズグサ属、オバクサ属、ホンダワラ属、ユカリ属、オゴノリ属、アカバギンナンソウ属、ダルス属及びナンノクロロプシス属であった。藻体乾燥重量あたりの相対含量はナンノクロロプシス属が最も多かった。このことは、EpPOH-PG及びEpHe-PGを含む抗炎症性素材の抽出源として、ナンノクロロプシス属が最も好適であることを示すものである。
【００９７】
試験例３：藻類の抗炎症作用
種々の藻類より得られたエタノール抽出物の抗炎症作用をin vitro試験にて評価した。エタノール抽出物を培地に溶解させ、終濃度100μg/mLで添加した。その結果を表３に示す。
【００９８】
EpPOH-PGが検出された藻類(ユカリ属、アカバギンナンソウ属、ダルス属、ナンノクロロプシス属)はいずれも抗炎症作用が高かった。
【００９９】
試験例４：抗炎症性脂質の抽出試験
抽出源として最も好適であったナンノクロロプシス属から抗炎症作用を有する脂質を抽出する手法について検討した。ナンノクロロプシス乾燥粉末1 gを25 mL容ねじ口試験管に入れ、含水率の異なる種々のエタノール20 mLを加えて30 min撹拌した。遠心分離により抽出液を得、残渣に再度エタノールを加えて20 min撹拌し、遠心分離により抽出液を得た。これらを合わせ、遠心濃縮により乾固させて抽出物を得た。
【０１００】
抽出法の評価は、(1)抽出物中の脂質の回収率、(2)夾雑物である色素(クロロフィル及びカロテノイド)の含量並びに(3)目的物であるEpPOH-PG及びEpHe-PGの含量の3点に着目して評価を実施した。抽出物中の脂質の回収率は、抽出物をchloroform/methanol/水の系で下層に分配される画分の重量を測定することにより算出した。色素及び目的脂質の含量は、TLCにより確認した。結果を表４及び図１に示す。
【０１０１】
TLC展開条件
溶媒：クロロホルム：メタノール：水：トリエチルアミン= 30/35/7/35 (v/v/v/v)
薄層プレート：Merck製シリカゲル60
展開槽：内寸12×12×4 cm周囲に濾紙をめぐらせ、一晩以上飽和させた。
試料塗量：抽出液50μLを遠心濃縮し、10μLのCM2:1で溶解させ、下端及び上端より1.5 cmのところに線を引き、試料を1 cm間隔でバンド状に塗布した。
展開時間：約22分、常温で、上端より1.5 cmのところまで展開させ、直ちに乾燥させた。
呈色：50%硫酸  加熱はオーブン(160℃ 5〜10 min)で行った。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
表４に示すように、抽出物中の脂質画分の収率は抽出溶媒のエタノール濃度が70〜90容量%の範囲で最も高かった。他方、図１に示すように、色素の量は、エタノール濃度が高くなるに連れて増加し、90容量%以上で一定量に達した。また、EpPOH-PG及びEpHe-PG量もエタノール濃度が高くなるに連れて増加し、70容量%以上で一定量に達した。これらの結果から、ナンノクロロプシス属から抗炎症作用を有する脂質を抽出する際の手法として最も好適なのは、夾雑物である色素の含量が少なく、目的物の収率が高いエタノール濃度が70〜90容量%の範囲で抽出する手法であることが見出された。
【０１０４】
試験例５：遊離のエイコサペンタエン酸との比較
EpPOH-PGの抗炎症作用を、EpPOH-PGの構成脂肪酸である遊離のエイコサペンタエン酸(EPA)と比較した。EpPOH-PG又はEPA (Sigma-Aldrich製)を培地に溶解させ、10μmol/Lの濃度で細胞に添加した。終濃度10-4〜10-1μg/mLになるようLPSを添加してマクロファージを刺激し、炎症反応の指標であるNO及び炎症性サイトカイン(TNF-α及びIL-6)の産生阻害率を比較した。その結果、図２に示すように、EpPOH-PGには、LPS濃度が10-2μg/mL以下の範囲で顕著なNO産生抑制が認められたが、EPAにはほとんどNOの抑制効果が認められなかった。同様に、TNF-αにおいては、測定したすべてのLPS濃度範囲でEpPOH-PGに産生抑制効果が認められたが、EPAにはほとんど抑制効果が認められなかった。また、IL-6については、LPS濃度が10-2μg/mL以下の範囲でEpPOH-PGに顕著なIL-6産生抑制効果が認められたが、EPAにはほとんど抑制効果が認められなかった。
【図１】
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【図２】
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