(57)【要約】【課題】コハク酸を高生産し、発酵能が維持された菌株の選抜・育種を行うこと、および当該菌株を使用してコハク酸を製造する方法を提供すること。【解決手段】コハク酸生産量が顕著に高いアクチノバシラス・サクシノゲネスUV2-20株（NITE P-01748）、並びに当該菌株を用いることを特徴とするコハク酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸を高生産するアクチノバシラス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)UV2-20株（NITE P-01748）
【請求項２】
請求項１に記載するアクチノバシラス・サクシノゲネス(Actinobacillus
succinogenes) UV2-20株（NITE P-01748）を用いることを特徴とするコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコハク酸を高濃度で生産するバクテリア変異株を使用して、コハク酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸はTCA回路の中間物質の一つであり、自然界において植物や動物の組織の構成成分として様々な生物の体内に存在している。また、コハク酸は香料や調味料、化粧品などのpH調整剤として、その他これらに限らず様々な目的に用いられている。近年、環境に配慮した化学品が増えており、その背景から植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まっている。コハク酸およびその誘導体はポリブチレンサクシネート（PBS）系プラスチック原料として利用されている。PBSは生分解性プラスチックの一つであり、使用後、微生物の働きによって水と二酸化炭素に分解されるため、環境負荷の低いプラスチックとして注目されている。従来、PBSの原料となるコハク酸は、石油由来の無水マレイン酸から製造されていた。しかし、環境中への二酸化炭素排出量削減の観点から、プラスチック原料を植物バイオマス由来のものへ転換する技術開発が進められており、コハク酸についても微生物を利用した発酵法による生産方法が報告されている。
【０００３】
微生物を利用するコハク酸の製造法としては、キャンディダ（Candida）属に属する微生物を、ノルマルパラフィンを炭素源とする培地に培養し、得られた培養物からコハク酸を採取する方法（特許文献１参照）や、同様にアナエロビオスピルリウム・サクシニシプロデュセンス（Anaerobiospirillum succiniciproducens）（ATCC53488）を嫌気的に培養して得られた培養物からコハク酸を採取する方法（特許文献2参照）等が提案されている。
また、コハク酸の生産のために、組み換えられた大腸菌について多数の文献で報告されている。さらに、遺伝子工学により改変された微生物を利用してコハク酸生産性を向上させる方法も報告されており、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現量を減少させることによってコハク酸を製造する着想が開示されている（特許文献３参照）。
【０００４】
植物由来の原料を用いた場合、バイオマス資源から誘導される糖は主に6炭糖のグルコースと5炭糖のキシロースからなる。グルコースを利用してコハク酸をつくる微生物としてアナエロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンス、アクチノバシラス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、  マンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Mannheimia succiniciproducens）等が知られている。しかし、キシロースを利用してコハク酸をつくる微生物はアクチノバシラス・サクシノゲネスとキシロース利用のために組み換えられた微生物しかない。アクチノバシラス・サクシノゲネスの生産性は十分ではなく、産業的に利用は難しい。また、遺伝子組換え体の使用は特殊な設備が必要になるという問題点がある。
【０００５】
【特許文献１】特公昭５６−１７０７７号公報
【特許文献２】特開昭６２−２９４０９０号公報
【特許文献３】特開２００６−２３８８４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、非遺伝子組み換え微生物を使用したコハク酸の製造方法において、その生産効率を向上させることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は鋭意研究を進めた結果、グルコース、キシロースからコハク酸を生産するアクチノバシラス・サクシノゲネスを変異処理することで、従来に比べコハク酸を高生産する菌株を取得するに至った。また、この方法で取得した菌株を用いてバイオマスからコハク酸の生産に成功したものである。
【０００９】
すなわち請求項１に記載の本発明はアクチノバシラス・サクシノゲネス(Actinobacillus
succinogenes)130Z（ATCC55618）に由来し、変異処理後に選抜し、コハク酸生産量が親株より高く、発酵能を維持しているアクチノバシラス・サクシノゲネスUV2-20株（NITE P-01748）である。
請求項２記載の本発明は請求項１記載のアクチノバシラス・サクシノゲネスUV2-20株（NITE P-01748）を用いることを特徴とするコハク酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により効率よくコハク酸の製造が可能となる。
【００１１】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係る菌株は以下に示す方法によって取得することができる。
まず、コハク酸生産菌アクチノバシラス  サクシノゲネスを親株として、変異誘発により変異株を取得する。変異誘発剤は特に限定するものではなく、UVやエチルメタンスルホネートによる処理など公知の方法を利用できる。これを糖およびpH調整剤を含む培地に接種し、30〜40℃で3〜20日間、好ましくは37℃で5〜10日間静置培養した後、培養上清のコハク酸量を測定し、比較的コハク酸生産量の高く、発酵能が維持され、コハク酸収率の高い株を変異株として取得する。このようにして目的とする菌株を選抜し、これをアクチノバシラス・サクシノゲネスUV2-20株と命名した。
【００１３】
微生物変換においては、pHが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、微生物が死滅するため、通常は中和剤を使用する。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
中和剤としてはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩が挙げられる。なお、アルカリ（土類）金属の水酸化物としてはNaOH、KOH、Ca(OH)2、Mg(OH)2等、或いはこれらの混合物などが挙げられる。アルカリ（土類）金属の炭酸塩としては、Na2CO3、K2CO3、CaCO3、MgCO3、NaKCO3等、或いはこれらの混合物などが挙げられる。
【００１４】
本発明におけるコハク酸生産は合成培地およびバイオマスから生産される。バイオマスとしては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、トウモロコシ、サトウキビ、おから、バガス、植物油カス、イモ、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、食品廃棄物等が挙げられる。
【００１５】
そしてこれらのバイオマスは特に限定されないが、たとえば酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理学的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て、炭素源へ誘導される。その工程には特に限定されないが、例えば、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。こうして微細化されたバイオマスは、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導されるが、その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法や、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理学的方法、微生物の酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
【００１６】
次に本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
アクチノバシラス・サクシノゲネス130Zをトリプトソーヤブイヨン（SCD）培地で37℃、1日間静置培養後、集菌し、0.85％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。これを0.85％塩化ナトリウム溶液に懸濁し、スターラーで攪拌しながら、30cmの距離から紫外線照射して、その菌体をSCD寒天培地に37℃、2日間培養し、生育したコロニーをUV変異株として採取した。生存率0.1%前後の時点のコロニーを採取して、グルコースとキシロースが3：1（グルコース39g/l、キシロース13g/l）の割合で含み、炭酸マグネシウムを5％添加したAS液体培地（リン酸二ナトリウム12水和物0.15%、リン酸一ナトリウム2水和物0.1%、塩化ナトリウム0.1％、塩化マグネシウム0.02%、塩化カルシウム0.02%）で37℃、７日間、CO2インキュベーターで培養し、上清のコハク酸濃度を測定して生産量の多い株を取得した。コハク酸の定量はロシュ・ダイアグノスティック社製F-キットを用いて行った。この中からコハク酸高生産株としてUV2-20を選抜した。表１に示すようにUV2-20は親株に比べて有意にコハク酸生産量が高い。本菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はNITE P-01748である。
【００１８】
【表１】
2015100288.tif 000002
【実施例２】
【００１９】
稲わら糖化液を用いたコハク酸生産試験
実バイオマスである稲わら糖化液を用いてコハク酸の生産性を調べた。稲わら糖化液の調整は以下のように行った。稲わら15ｇに2%硫酸を入れ、100ｇにしたものを110℃、1時間オートクレーブし、水酸化ナトリウムを用いてpH6.0に調整後、50℃でメイセラーゼ・ヘミセルラーゼを用いて酵素糖化した上清を糖化液とした。AS培地の糖を稲わら糖化液とし、炭酸マグネシウムを5％添加して37℃、5％CO2インキュベーターで培養し、発酵試験を行った。表２にコハク酸生産量を示す。
【００２０】
【表２】
2015100288.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明によりコハク酸生産量が高い菌株を用いて、生分解性プラスチック等の原料となるコハク酸をバイオマスから製造することができる。