(57)【要約】【課題】染色体を大規模に削除したＳ．ポンベゲノム縮小化株、蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株、該蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を用いた蛋白質の生産方法を提供する。【解決手段】シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されており、全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の染色体中、
第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、
第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、
第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および
第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されており、全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項２】
前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域である請求項１に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項３】
前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域である請求項１に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項４】
前記領域（ｂ）が第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域である請求項１〜３のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項５】
前記領域（ｃ）が第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域である請求項１〜４のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項６】
前記領域（ｄ）が第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域である請求項１〜５のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項７】
前記領域（ａ）および前記領域（ｃ）からなる群より選択される１以上の領域が少なくとも削除されている請求項１〜６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項８】
前記領域（ｂ）と、前記領域（ａ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域とが削除されている請求項１〜６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項９】
前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）、および前記領域（ｄ）が削除されている請求項１〜６のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項１０】
少なくとも前記領域（ａ）が削除されており、かつ該領域（ａ）はｐｄｃ２遺伝子座を含み、
ｐｄｃ２遺伝子が、染色体中の前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）以外の領域に挿入されている請求項１〜９のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項１１】
第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に、ｐｄｃ２遺伝子が挿入されている請求項１０に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株に、構造遺伝子を発現させるための発現カセットが導入されていることを特徴とする蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
【請求項１３】
請求項１２に記載の蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株を培養して得られる菌体または培養液上清から、前記構造遺伝子から発現させた蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
【請求項１４】
シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中、
第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、
第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、
第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および
第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域を削除し、
全削除領域の長さを、野生株のゲノムの０．９％以上にすることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、以下、Ｓ．ポンベ）の染色体を大規模に削除したシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株、該シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株の製造方法、蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株、該蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株を用いた蛋白質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母を宿主とした発現系を利用して、蛋白質および有機酸等の有用成分を製造する技術が開発されている。中でも分裂酵母Ｓ．ポンベは、出芽酵母とは系統進化的にきわめて異なる酵母であり、細胞増殖機構、染色体構造、ＲＮＡスプライシング機構、糖蛋白質糖鎖へのガラクトース残基の付加等の諸性質が複雑で動物細胞と類似している利点がある。そのため、Ｓ．ポンベは高等動物の遺伝子機能をよく相補し、特にヒトに由来する蛋白質の生産に利用することができる有用な蛋白質生産宿主株の一つである。
【０００３】
また一方で近年、様々なツールを導入するための宿主細胞として、物質生産に不要な代謝エネルギーの浪費を削減したシンプルな細胞の構築が望まれている。該細胞は、たとえば、染色体中の生存に非必須遺伝子を含む領域を大規模に削除することにより、製造することができる。Ｓ．ポンベについても、非必須遺伝子が大規模に削除され、不要な代謝エネルギーの浪費が抑えられた物質生産宿主株が求められているが、未だ得られていない。
【０００４】
Ｓ．ポンベの染色体は、長さが５．７Ｍｂｐ、４．６Ｍｂｐ、３．５Ｍｂｐの３本の線状ＤＮＡで構成されており、全ゲノム配列はデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／）に公開されている。近年、Ｋｉｍらによって、Ｓ．ポンベの一遺伝子破壊ライブラリーの構築によって得られた必須遺伝子（生育維持に必須な遺伝子）の情報が開示された（たとえば、非特許文献１参照。）。Ｓ．ポンベには約４９００個の遺伝子があり、約２１．６％が生存のための必須遺伝子である。該情報によれば、Ｓ．ポンベでは必須遺伝子が染色体上に満遍なく散在しており、大規模な非必須遺伝子クラスター領域はほとんどない。ただ、第１染色体と第２染色体の末端領域には、比較的大きな非必須遺伝子クラスター領域が存在しており、第１染色体左腕の最も端にある必須遺伝子はｐｄｃ２（ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）であり、第１染色体右腕の最も端にある必須遺伝子はｓｅｃ１６（ＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０７）であり、第２染色体左腕の最も端にある必須遺伝子はＳＰＢＣ１３４８．０６ｃであり、第２染色体右腕の最も端にある必須遺伝子はｕｓｐ１０９（ＳＰＢＣ１２８９．１２）であるとされていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（２０１０）ｖｏｌ．２８，ｐ６１７〜６２３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明では、Ｓ．ポンベの染色体を大規模に削除した株、および該株を用いて蛋白質を生産する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｓ．ポンベの第１染色体右腕の最も端にある必須遺伝子および第２染色体右腕の最も端にある必須遺伝子はＫｉｍらの報告と一致するが、第１染色体左腕の最も端にある必須遺伝子はｔｒｓ３３（ＳＰＡＣ１３Ｇ６．０５ｃ）であり、第２染色体左腕の最も端にある必須遺伝子がｚａｓ１（ＳＰＢＣ１１９８．０４ｃ）であることを見出し、さらに、最末端の遺伝子からこれらの遺伝子までの非必須遺伝子クラスター領域を全て削除したとしても合成致死が生じないことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株、およびその製造方法等は下記［１］〜［１４］である。
［１］  シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）の染色体中、
第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、
第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、
第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および
第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されており、全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［２］  前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域である前記［１］のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［３］  前記領域（ａ）が第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域である前記［１］のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［４］  前記領域（ｂ）が第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域である前記［１］〜［３］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［５］  前記領域（ｃ）が第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域である前記［１］〜［４］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［６］  前記領域（ｄ）が第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域である前記［１］〜［５］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［７］  前記領域（ａ）および前記領域（ｃ）からなる群より選択される１以上の領域が少なくとも削除されている前記［１］〜［６］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［８］  前記領域（ｂ）と、前記領域（ａ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域とが削除されている前記［１］〜［６］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［９］  前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）、および前記領域（ｄ）が削除されている前記［１］〜［６］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［１０］  少なくとも前記領域（ａ）が削除されており、かつ該領域（ａ）はｐｄｃ２遺伝子座を含み、
ｐｄｃ２遺伝子が、染色体中の前記領域（ａ）、前記領域（ｂ）、前記領域（ｃ）および前記領域（ｄ）以外の領域に挿入されている前記［１］〜［９］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［１１］  第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に、ｐｄｃ２遺伝子が挿入されている前記［１０］のシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株。
［１２］  前記［１］〜［１１］のいずれかのシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株を培養して得られる菌体または培養液上清から、前記構造遺伝子から発現させた蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
［１３］  前記［１２］の蛋白質発現用シゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株を培養して得られる菌体または培養液上清から、前記構造遺伝子から発現させた蛋白質を取得することを特徴とする蛋白質の生産方法。
［１４］  シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中、
第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、
第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、
第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および
第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域を削除し、
全削除領域の長さを、野生株のゲノムの０．９％以上にすることを特徴とするシゾサッカロミセス・ポンベゲノム縮小化株の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、非必須遺伝子が大規模に削除されたＳ．ポンベゲノム縮小化株を提供することができる。
また、該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、外来蛋白質の生産効率が高く、外来蛋白質発現系の宿主として好適である。よって、該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を宿主として用いる本発明の蛋白質の生産方法により、外来蛋白質をより効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｓ．ポンベの３本の染色体の模式図である。
【図２】図２は、非特許文献１に開示された情報に基づき、Ｓ．ポンベの必須遺伝子と非必須遺伝子の推測された分布を模式的に示した図である。
【図３】図３は、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の好ましい一態様の染色体の模式図である。
【図４】図４は、本発明者らによって推測されたＳ．ポンベの第１染色体および第２染色体の末端領域を模式的に示した図である。
【図５】図５は、実施例１における染色体大規模削除の様子を模式的に示した図である。
【図６】図６は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各一領域削除株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図７】図７は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各一領域削除株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図８】図８は、実施例１において、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座の近傍の領域を削除した削除株ＡＬＴ−１〜ＡＬＴ−６の染色体の模式図である。
【図９】図９は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各一領域削除株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図１０】図１０は、実施例１において、親株であるＡＲＣ０１０株に対する、各遺伝子の復帰株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図１１】図１１は、実施例１において、Ｓ．ポンベのＵＭＰ生合成経路を示した図である。
【図１２】図１２は、実施例１において、ＡＲＣ０１０株に対する、各遺伝子の復帰株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図１３】図１３は、実施例１において、ＡＲＣ００１株に対する、各削除株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図１４】図１４は、実施例１において、各削除株の最終到達濁度（ＯＤ６６０）を示した図である。
【図１５】図１５は、実施例１において、ＡＲＣ００１株に対する、各削除株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）を示した図である。
【図１６】図１６は、実施例１において、各削除株の最終到達濁度（ＯＤ６６０）を示した図である。
【図１７】図１７は、実施例１において、各株の微分干渉像（ＤＩＣ）およびＤＡＰＩ染色像である。
【図１８】図１８は、実施例１において、ロイシン要求性の削除株を培養した後の平板培地の落斜光画像である。
【図１９】図１９は、実施例１において、ロイシン非要求性の削除株を各種平板培地で培養した後の平板培地の落斜光画像である。
【図２０】図２０は、実施例１において、約１００世代培養後のＩＧＦ７４２株およびＡＲＣ００１株のゲノムＤＮＡに対してテロメア反復配列をプローブに用いて行ったサザンプロット解析の結果を示した図である。
【図２１】図２１は、実施例２において、各削除株のＥＧＦＰの蛍光値の測定結果を、ＡＲＣ００１株の結果とともに示した図である。
【図２２】図２２は、実施例２において、各株の培養液上清のｈＧＨ含有量を示した図である。
【図２３】図２３は、実施例２において、各株の培養液上清のｈＴＦ含有量を示した図である。
【図２４】図２４は、実施例２において、各ゲノム縮小化株の蛋白質生産効率を、親株に対する相対値として示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［Ｓ．ポンベゲノム縮小化株］
図１に、Ｓ．ポンベの３本の染色体の模式図を示す。図１中、各染色体の両端の塗潰し領域はテロメアを、中央付近の塗潰し領域はセントロメアを、それぞれ示す。また、図１中、「ＡＬＴ」は第１染色体左腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域、「ＡＲＴ」は第１染色体右腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域、「ＢＬＴ」は第２染色体左腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域、および「ＢＲＴ」は第２染色体右腕遠位の非必須遺伝子クラスター領域を、それぞれ示す。また、第２染色体中のｌｅｕ１遺伝子座、第３染色体中のｕｒａ４遺伝子座もそれぞれ示した。
【００１２】
本発明者らは、Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を製造するにあたり、出芽酵母の一遺伝子破壊ライブラリーによる必須遺伝子情報と、Ｓ．ポンベと出芽酵母の相同遺伝子情報とを参考に、Ｓ．ポンベの染色体上の必須遺伝子の分布を推測した。この結果、第１染色体および第２染色体の最末端の必須遺伝子は、第１染色体左腕がｔｒｓ３３であり、第１染色体右腕ｓｅｃ１６であり、第２染色体左腕がｚａｓ１であり、第２染色体右腕がｕｓｐ１０９であると推察した。そこで、後記実施例に示すように、第１染色体左腕のｔｒｓ３３遺伝子座よりも遠位側（テロメア側）、第１染色体右腕のｓｅｃ１６遺伝子座よりも遠位側、第２染色体左腕のｚａｓ１遺伝子座よりも遠位側、および第２染色体右腕のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも遠位側をＬａｔｏｕｒ法により削除したところ、Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を製造することができた。
【００１３】
図２に、非特許文献１に開示された情報に基づき、Ｓ．ポンベの必須遺伝子と非必須遺伝子の推測された分布を模式的に示した。各染色体の上段が必須遺伝子であり、中段が非必須遺伝子である。図中、四角で囲った遺伝子が、本発明者らが各染色体の最末端の必須遺伝子と推定した遺伝子であり、各染色体の下段の塗潰し領域が本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の製造方法において削除可能な領域である。第１染色体左腕の塗潰し領域中の必須遺伝子とされているｐｄｃ２（ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）遺伝子、並びに第２染色体左腕の塗潰し領域中の必須遺伝子とされているＳＰＢＣ１３４８．０６ｃ遺伝子、ａｌｒ２（ＳＰＢＣ３５９．０２）遺伝子およびｄｅａ２（ＳＰＢＣ１１９８．０２）遺伝子は、非特許文献１では必須遺伝子とアノテーションされていたが、本発明者らにより非必須遺伝子であることが確認された。つまり、第１染色体左腕の最末端の必須遺伝子がｔｒｓ３３遺伝子であり、第２染色体左腕の最末端の必須遺伝子がｚａｓ１遺伝子であることは、本発明者らにより初めて得られた知見である。なお、実際には非必須遺伝子であるにもかかわらず、非特許文献１における一遺伝子破壊ライブラリーにおいて必須遺伝子と判定された理由として、該遺伝子の削除により増殖能が著しく低下したため削除株を得ることが困難であったこと、および染色体の部位により相同組換え効率が低いため削除株を得ることが困難であったこと等が挙げられる。
【００１４】
すなわち、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、Ｓ．ポンベの第１染色体および第２染色体の両端の非必須遺伝子クラスター領域の少なくとも一部分が削除されており、全削除領域の長さが、野生株のゲノムの０．９％以上であることを特徴とする。全削除領域の長さは、野生株のゲノムの１％以上であることが好ましく、２％以上であることがより好ましく、３％以上であることがさらに好ましく、３．５％以上であることがよりさらに好ましく、４％以上であることが特に好ましい。
【００１５】
具体的には、Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ａ）、第１染色体のｓｅｃ１６遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｂ）、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座よりも左腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｃ）、および第２染色体のｕｓｐ１０９遺伝子座よりも右腕遠位側のテロメア以外の少なくとも一部分である領域（ｄ）からなる群より選択される１以上の領域が削除されている株である。該領域は非必須遺伝子クラスター領域であり、該領域の一部分または全部を削除した場合でも、野生株と同様の形態を有し、安定して増殖可能なＳ．ポンベゲノム縮小化株を得ることができる。また、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、非必須遺伝子クラスター領域が削除されていることにより、外来蛋白質発現系の宿主として好適である。
【００１６】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第１染色体の左腕側では、ｔｒｓ３３遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第１染色体の左腕側の削除領域（領域（ａ））の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上となればよく、特に限定されない。本発明においては、領域（ａ）は、ｔｒｓ３３遺伝子座よりも遠位側であり、かつｐｄｃ２遺伝子座またはｐｄｃ２遺伝子座よりも近位側にある領域を含む領域が好ましく、ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域、またはｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域がより好ましい。ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域を削除することにより、１６８．６ｋｂｐもの領域（染色体全体の１．３％）を削除することができる。一方で、ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域を削除した削除株では、野生株よりも増殖能が低下する傾向があるが、削除領域をｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域（染色体全体の１．２％）にすることで、得られた削除株の増殖能の低下を抑制できるため好ましい。
【００１７】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第１染色体の右腕側では、ｓｅｃ１６遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第１染色体の右腕側の削除領域（領域（ｂ））の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上となればよく、特に限定されない。本発明においては、１５５．４ｋｂｐもの領域（染色体全体の１．１％）を削除することができるため、領域（ｂ）は、ＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域が好ましい。  
【００１８】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第２染色体の左腕側では、ｚａｓ１遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第２染色体の左腕側の削除領域（領域（ｃ））の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であればよく、特に限定されない。本発明においては、領域（ｃ）は、ｚａｓ１遺伝子座よりも遠位側であり、かつＳＰＢＣ１３４８．０６ｃ遺伝子座またはＳＰＢＣ１３４８．０６ｃ遺伝子座よりも近位側にある領域を含む領域が好ましい。特に、２１１．７ｋｂｐもの領域（染色体全体の１．５％）を削除することができるため、領域（ｃ）は、ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域が好ましい。  
【００１９】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の第２染色体の右腕側では、ｕｓｐ１０９遺伝子座よりも遠位側のテロメア以外の領域の少なくとも一部分が削除されている。第２染色体の右腕側の削除領域の長さは、染色体全体の全削除領域の長さが野生株のゲノムの０．９％以上であればよく、特に限定されない。本発明においては、１２１．６ｋｂｐもの領域（染色体全体の０．９％）を削除することができるため、領域（ｄ）は、ＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域が好ましい。  
【００２０】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、領域（ａ）〜領域（ｄ）の４領域のうちの１領域が削除されている株であってもよく、該４領域中の２以上の領域が削除されている株であってもよい。本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株としては、該４領域のうち、領域（ａ）または領域（ｃ）の少なくとも１領域が削除されている株が好ましく、少なくとも領域（ａ）または領域（ｃ）を含む２以上の領域が削除されている株がより好ましい。また、該４領域のうち、領域（ｂ）を含む２以上の領域が削除されている株も好ましく、領域（ｂ）を含む３以上の領域が削除されている株もより好ましい。
【００２１】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株としては、該４領域全てが削除されているＳ．ポンベゲノム縮小化株が特に好ましい。中でも、Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域と、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域と、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域と、第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域とが削除されていることが好ましい。該領域を削除することによって、６６５．６ｋｂｐが削除される。
【００２２】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株としては、Ｓ．ポンベの染色体中、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域と、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域と、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域と、第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域とが削除されていることが特に好ましい。該領域を削除することによって、６５７．３ｋｂｐ（野生株のゲノムの４．７％）が削除される。該株は、第１染色体左腕のｒｐｓ１０１（ＳＰＡＣ１３Ｇ６．０２ｃ）遺伝子が残存しているため、該遺伝子が削除されたＳ．ポンベゲノム縮小化株よりも増殖能が高い。
【００２３】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株が、少なくとも領域（ａ）が削除されており、かつ該領域（ａ）がｐｄｃ２遺伝子座を含む場合には、ｐｄｃ２遺伝子が、染色体中の該領域（ａ）、該領域（ｂ）、該領域（ｃ）、および該領域（ｄ）以外の領域に挿入されていることが好ましく、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座からｓｅｃ１６遺伝子座までの領域、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座からｕｓｐ１０９遺伝子座までの領域、または第３染色体中の必須遺伝子以外の領域に挿入されていることがより好ましい。ｐｄｃ２遺伝子を染色体中に残すことにより、該遺伝子が削除されたＳ．ポンベゲノム縮小化株よりも、増殖能を高めることができる。ｐｄｃ２遺伝子は、たとえば、第３染色体のｕｒａ４遺伝子座、特にｕｒａ４遺伝子とＳＰＣＣ３３０．０６遺伝子の間に挿入することができる。
【００２４】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株が、少なくとも領域（ｃ）が削除されており、かつ該領域（ｃ）がＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子座を含む場合であって、さらにｕｒａ４遺伝子を欠失している場合には、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子が、染色体中の該領域（ａ）、該領域（ｂ）、該領域（ｃ）、および該領域（ｄ）以外の領域に挿入されていることが好ましく、第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座からｓｅｃ１６遺伝子座までの領域、第２染色体のｚａｓ１遺伝子座からｕｓｐ１０９遺伝子座までの領域、または第３染色体中の必須遺伝子以外の領域に挿入されていることがより好ましい。ｕｒａ４遺伝子とＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子の両方が欠失している場合には、酵母の増殖速度が低下する傾向にあるが、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子を染色体中の他の領域に残すことにより、ｕｒａ４遺伝子が欠失していた場合でも増殖速度が回復される。ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子は、たとえば、第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に挿入することができる。
【００２５】
図３に、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株のなかでも、特に好ましい一態様の染色体の模式図を示す。すなわち、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域と、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域と、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域と、第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域とが削除されており、ｐｄｃ２遺伝子が、第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に挿入されている。また、必要に応じて、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子が、第２染色体のｌｅｕ１（ＳＰＢＣ１Ａ４．０２ｃ）の不活化変異体であるｌｅｕ１−３２遺伝子座に挿入される。該Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、染色体が大規模に削除されている上に、野生株と同等の増殖速度が維持されている。
【００２６】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、たとえば、Ｓ．ポンベ野生株の染色体中の第１染色体および第２染色体の両端の領域を削除することにより製造できる。染色体領域を削除する方法は特に限定されず、テロメアトランケ―ション法等の公知の手法のいずれを用いて行ってもよいが、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレットに記載）で行うことが好ましい。Ｌａｔｏｕｒ法は、削除する領域の一方の端の遺伝子配列をもう一方の端に挿入し、相同組換えにより内部の領域をループアウトさせる方法であり、外来の塩基配列を残存させずに染色体領域を削除できる。
【００２７】
また、ｐｄｃ２遺伝子またはＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子の染色体への挿入は、公知の手法のいずれを用いて行ってもよい。たとえば、染色体中の適当な標的部位に相同組換えにより外来遺伝子挿入する際に用いられる形質転換法を用い、各遺伝子を染色体中の所望の部位に挿入できる。
【００２８】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、Ｓ．ポンベ野生株と同様に、蛋白質等の各種有用物質の生産、遺伝子等の生体分子の機能解析等に使用できる。また、残存している染色体中の必須遺伝子がコードされている領域以外の領域に、野生株に対して１以上の塩基が置換、欠損、または付加されていてもよい。
【００２９】
［蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株］
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、物質生産能力が野生株よりも増大している。よって本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、外来蛋白質を発現させるために外来構造遺伝子を導入する宿主として好適である。具体的には、本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株に、構造遺伝子を発現させるための発現カセットが導入されていることを特徴とする。該発現カセットは、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中に挿入されていてもよく、染色体外遺伝子として存在していてもよい。
【００３０】
発現カセットとは、蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、蛋白質をコードする構造遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、構造遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。発現カセットには複数の構造遺伝子が存在していてもよい。
【００３１】
Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）またはＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーター等）を使用できる。プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照）等が挙げられる。Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーター等が挙げられる。該プロモーターのうち、発現効率が良好なｎｍｔ１遺伝子プロモーターおよびその改変プロモーター（たとえば、ｎｍｔ１＋、ｎｍｔ４１）、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
【００３２】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株に導入される外来構造遺伝子は、蛋白質をコードする構造遺伝子であれば特に限定されず、Ｓ．ポンベが元々有している遺伝子と同種のものであってもよく、異種生物由来の構造遺伝子であってもよい。Ｓ．ポンベの内在性蛋白質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターにより得られた形質転換体から、より大量に該内在性蛋白質を生産することができる。また、異種生物由来の構造遺伝子を含む発現ベクターにより得られた形質転換体から、大量の異種蛋白質（宿主であるＳ．ポンベが本来有していない蛋白質）を生産することができる。該外来構造遺伝子がコードする蛋白質は、異種蛋白質が好ましく、多細胞生物である動物や植物が産生する蛋白質がより好ましく、哺乳動物（ヒトを含む）の産生する蛋白質がさらに好ましい。
【００３３】
該外来構造遺伝子は、蛋白質をコードするものである限り、野生型の構造遺伝子であってもよく、野生型の構造遺伝子を改変した遺伝子であってもよく、人工的に合成された遺伝子であってもよい。野生型以外の構造遺伝子としては、たとえば、野生型の複数の蛋白質を融合させたキメラ蛋白質をコードする遺伝子、野生型の蛋白質のＮ末端またはＣ末端にその他のペプチド等が結合した蛋白質をコードする遺伝子等が挙げられる。該その他のペプチドとしては、分泌シグナル、特定の細胞内小器官への移行シグナル等のシグナル、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ等が挙げられる。各種シグナルは、シゾサッカロミセス属酵母内で機能するシグナルであることが必要である。分泌シグナルは、Ｎ末端に存在することにより、発現した蛋白質を宿主細胞外に分泌させる機能を有するペプチドである。Ｓ．ポンベ内で機能する分泌シグナルとしては、国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のＰ３シグナルが特に好ましい。
【００３４】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中へ前記発現カセットを導入する方法としては公知の方法を使用できる。たとえば、発現カセットと組換え部位とを有するベクターをＳ．ポンベゲノム縮小化株に導入する方法が挙げられる。
【００３５】
ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
該発現カセットを相同組換え法によりＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中に組み込む場合には、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターおよびその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
【００３６】
ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせられる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【００３７】
ベクターを組み込む標的部位は、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株の染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベゲノム縮小化株の染色体に組み込まれるベクターを２箇所以上にできる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株においては、たとえば、第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に挿入することができる。
【００３８】
ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）等が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、上記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターであり、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
【００３９】
上記ベクターを用いて、宿主である本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株を形質転換することで、本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株が得られる。形質転換方法は、公知のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換方法をいずれも用いることができる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法［K. Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 18, 6485-6489 (1990)］、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法などを挙げることができる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００４０】
形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。その他、それら選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べることができる。
【００４１】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株および本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株は、天然のシゾサッカロミセス属酵母と同様に培養することができる。
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株等の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００４２】
炭素源としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
具体的には、ＹＰＤ培地等の栄養培地（M.D.Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor LabolatoryPress(1990) ）またはＭＢ培地等の最少培地（K.Okazaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990)）等を使用できる。
【００４３】
培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
【００４４】
［蛋白質の生産方法］
本発明の蛋白質の生産方法は、本発明の蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を培養し、得られた菌体または培養液上清から、該蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株中に導入された外来構造遺伝子がコードする蛋白質を取得することを特徴とする。
【００４５】
培養条件は、生産させる目的の外来蛋白質の種類等を考慮して適宜設定することができる。たとえば、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時間、好ましくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。
【００４６】
培養終了後、超音波破砕や機械的破砕により、菌体から目的の外来蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該細胞抽出液から外来蛋白質を単離・精製法できる。また、外来蛋白質が細胞外に分泌される場合は、培養液上清から外来蛋白質を単離・精製法できる。これらの生産された蛋白質を取得するための単離・精製法としては、公知の、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。 
【００４７】
単離・精製した蛋白質の確認方法としては、公知のウエスタンブロッティング法または活性測定法等が挙げられる。精製された蛋白質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
【００４９】
［実施例１］Ｓ．ポンベゲノム縮小化株の作製
＜一領域非必須遺伝子クラスター削除株の作製＞
発明者らはまず、Ｌａｔｏｕｒ法により、Ｓ．ポンベのウラシル要求性株（ＡＲＣ０１０、遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）の染色体中、第１染色体または第２染色体の左腕端側または右腕端側が削除された一領域削除株を作製した。具体的には、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域（１７６．８ｋｂｐ、ＡＬＴ＿ｌｏｎｇ領域）を削除した第１染色体左腕株（ΔＡＬＴ＿ｌｏｎｇ）、第１染色体右腕のＳＰＡＣ２９Ｂ１２．０８遺伝子座からｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座までの領域（１５５．４ｋｂｐ、ＡＲＴ領域）を削除した第１染色体右腕株（ΔＡＲＴ）、第２染色体左腕のｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｔｌｈ遺伝子座からＳＰＢＣ１１９８．０３ｃ遺伝子座までの領域（２１１．７ｋｂｐ、ＢＬＴ領域）を削除した第２染色体左腕株（ΔＢＬＴ）、および第２染色体右腕のＳＰＢＣ１２８９．１３ｃ遺伝子座からｔｌｈ２遺伝子座までの領域（１２１．６ｋｂｐ、ＢＲＴ領域）を削除した第２染色体右腕株（ΔＢＲＴ）を作製した。
【００５０】
第２染色体右腕を除く３箇所の染色体末端のテロメアまでの領域は、ゲノムプロジェクトによる配列決定が完了していない領域であった。そこで、本発明者らは、各染色体末端の未解読領域近傍の塩基配列の相同性が非常に高いため、未解読領域の相同性も高く、図４に示すようになっていると推測した。図４中、塗潰した箱は遺伝子座を表しており、上向きに示した遺伝子は５’→３’の向きであり、下向きに示した遺伝子は３’→５’の向きである。各染色体中、ハッチングされたゾーンで繋がれた領域は、塩基配列レベルの相同性が９８％以上の領域を示している。さらに、ハッチングされた箱は、テロメアまで塩基配列が決定されている第２染色体右腕より推測された遺伝子を示す。
【００５１】
第２染色体右腕の塩基配列に基づいて、相同組換え用のＤＮＡ断片を作製し、該ＤＮＡ断片を用いてＬａｔｏｕｒ法により、一領域削除株を作製した。ただし、第１染色体左腕では、ｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの全領域を削除することが非常に困難であったため、ｔｌｈ１遺伝子座からＳＰＡＣ９７７．０９ｃ遺伝子座までの領域（４６．８ｋｂｐ）を削除した第１染色体左腕株（Δｔｌｈ１−ＳＰＡＣ９７７．０９ｃ）およびＳＰＡＣ９７７．１１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの領域（１２１．８ｋｂｐ）を削除した第１染色体左腕株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１−ｇｐｉ７）を作製した。
【００５２】
一領域削除株を作製する際に用いたＬａｔｏｕｒ断片（染色体大規模削除に用いる削除用断片）は、次のようにして作製した。Ｌａｔｏｕｒ断片は、２つの染色体上へ挿入するために必要な約５００ｂｐから成る相同領域（左側をＵＰ領域、右側をＤＮ領域）、ターゲットとなる削除領域において削除断片を挿入する部位とは反対側に隣接する約２００ｂｐから成るＤＮＡ領域（ＯＬ領域）、およびマーカー遺伝子となるｕｒａ４遺伝子領域（ｕｒａ４領域）の合計４つのＤＮＡ断片から構成された。ただし、染色体左腕末端削除と染色体右腕末端削除では、Ｌａｔｏｕｒ断片の構成において、ＯＬ領域とｕｒａ４領域の順番は逆にした。
【００５３】
各領域のＤＮＡ断片は、Ｓ．ポンベの野生株であるＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ−、東京大学大学院理学系研究科附属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）よりＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法（９８℃で１０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１ｋｂ／分間を３０サイクル）によりクローニングした。各ＤＮＡ断片の増幅に用いたプライマーを表１〜３に示す。続いて、それぞれの増幅断片を含むＰＣＲ反応溶液からＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００カラム（ミリポア社製）を用いてプライマーを除去し、ＰＣＲ法により２つのＤＮＡ断片の連結反応を行った。連結には、約２０ｂｐの相同領域を持つ２対のＤＮＡ断片と、連結後の断片を増幅する２対のプライマーを反応液に混合し、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてステップダウンＰＣＲ反応（９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で３分間を２サイクル、次いで、順次アニール温度を２℃ずつ下げて２サイクルずつ反応させ、最後のサイクルではアニール温度５５℃で５サイクル反応させた。）を行った。増幅効率が悪い場合は、ＰＣＲ反応液に、終濃度で５％となるようにＤＭＳＯを、終濃度で１Ｍとなるようにベタインを、それぞれ混合させた。連結の組合せは、まずＵＰ領域とＯＬ領域（もしくはｕｒａ４領域）、ｕｒａ４領域（もしくはＯＬ領域）とＤＮ領域を連結させ、最後にＵＰ領域を含む断片とＤＮ領域を含む断片を結合させたものを、Ｌａｔｏｕｒ断片とした。
【００５４】
【表１】
2015043695.tif 000002
【００５５】
【表２】
2015043695.tif 000003
【００５６】
【表３】
2015043695.tif 000004
【００５７】
構築したＬａｔｏｕｒ断片を用いてＳ．ポンベＡＲＣ０１０株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｄ１８）を形質転換した。形質転換は、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Bahler, J, et.al., Yeast, vol.14, p943-951 (1998)）に基づき行った。Ｌａｔｏｕｒ断片が染色体上に組込まれた形質転換体（Ｌａｔｏｕｒ断片潜在株）は、ロイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む最少培地で選択した。Ｌａｔｏｕｒ断片がターゲット部位に挿入された形質転換体であることを、挿入したＬａｔｏｕｒ断片の外側の染色体ＤＮＡ配列を持つプライマー（表１〜３中、ｃｈｅｃｋ−１、ｃｈｅｃｋ−２）を用いたＰＣＲ法により、Ｌａｔｏｕｒ断片を含むターゲット領域を増幅して確認した。続いてＬａｔｏｕｒ断片潜在株を栄養培地で定常期まで増殖させ、培養液１００μｌをウラシル（１００ｍｇ／Ｌ）、ロイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ、５００ｍｇ／Ｌ）を含む最少培地（ＦＯＡ培地）に塗り拡げた。ＦＯＡ培地で選択されたＦＯＡ処理株は、染色体上のＯＬ領域と削除断片のＯＬ領域の相同組換えにより、その間の染色体領域がｕｒａ４領域と共に欠失した株（ゲノム縮小化株）か、もしくはｕｒａ４遺伝子中に変異が生じた株である。ＦＯＡ処理株の染色体が削除されているか確認するため、削除領域を挟んだプライマー対（表１〜３中、ｃｈｅｃｋ−３とｃｈｅｃｋ−２、もしくはｃｈｅｃｋ−２とｃｈｅｃｋ−３）を用いてＰＣＲ反応を行った。削除領域は１２０ｋｂ以上であるため、削除が生じていなければＰＣＲ法による増幅断片は得られない。反対に想定通りに削除されていれば、約１ｋｂ前後の増幅断片が得られる。ＦＯＡ処理株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法により、染色体大規模削除後に生じる約１ｋｂの増幅断片を確認し、これを各領域の染色体大規模削除株とした。複数の領域の削除株を構築する際は、次に削除する領域のＬａｔｏｕｒ断片を用いて形質転換しＦＯＡ処理をする操作を繰り返した。
【００５８】
図５に、染色体大規模削除の様子を模式的に示した。図は染色体を示しており、四角は遺伝子を表している。上側の四角で示した遺伝子の向きは５’→３’、下側の四角で示した遺伝子の向きは３’←５’である。ＵＰ領域、ＯＬ領域、ｕｒａ４領域、ＤＮ領域から成る断片はＬａｔｏｕｒ断片であり、Ｌａｔｏｕｒ断片から染色体へ伸びる波線は、染色体上へＬａｔｏｕｒ断片を挿入した位置を示している。染色体模式図の下に示した矢印は、染色体上に挿入されたＬａｔｏｕｒ断片を確認するプライマー、または染色体が削除されたことを確認するプライマーを示しており、各プライマーの名称は表１〜３中の名称と共通する。図５（Ａ）は染色体左腕末端を削除する際の模式図であり、図５（Ｂ）は染色体右腕末端を削除する際の模式図である。染色体左腕末端と右腕末端では削除する方向が違うため、ＯＬ領域とｕｒａ４領域が逆になる。
【００５９】
得られた一領域削除株の最大増殖速度を測定した。具体的には、各削除株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液の６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０）から最大増殖速度（μＭＡＸ）を算出し、親株であるＡＲＣ０１０株の最大増殖速度に対する相対比（以下、最大比増殖速度）を求めた。算出された結果を図６に示す。この結果、ＩＧＦ５２２株（Δｔｌｈ１−ＳＰＡＣ９７７．０９ｃ）、ＩＧＦ５２４株（ΔＡＲＴ）、およびＩＧＦ５２６株（ΔＢＲＴ）では、親株ＡＲＣ０１０株とほぼ同等の増殖速度を維持していた。一方、ＩＧＦ５２３株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１−ｇｐｉ７）は親株比０．４程度であり顕著に低下していた。また、ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）は、親株の８割程度の増殖速度を維持していた。よって該２株の削除領域中に、増殖速度に影響する遺伝子が存在していることが示唆された。
【００６０】
増殖速度が親株と同程度まで回復した削除株を作製するため、まず、ＩＧＦ５２３株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１−ｇｐｉ７）の削除領域中に存在する増殖速度に影響する遺伝子の探索を試みた。
第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に、ＳＰＡＣ９７７．１１遺伝子からｇｐｉ７遺伝子までの領域内にあるｐｄｃ２遺伝子を挿入した上で、第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｔｉｍ８遺伝子座までの全領域を削除したＩＧＦ７１９株（Δｔｌｈ１−ｔｉｍ８、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）および第１染色体左腕のｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までの全領域を削除したＩＧＦ６２２株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）を作製した。ＩＧＦ７１９株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して最大比増殖速度を算出した。算出結果を図７に示す。この結果、ＩＧＦ７１９株の増殖速度は、親株比０．８３倍まで改善された。
【００６１】
さらに第１染色体左腕削除株の増殖速度を改善するため、ｐｄｃ２遺伝子以外の増殖速度維持に必要な遺伝子を探索した。第１染色体のｔｒｓ３３遺伝子座の近傍の領域中、様々な長さの領域を削除した削除株を構築し、各削除株の最大比増殖速度を算出した。各削除株の削除領域を図８に、各削除株の最大比増殖速度を図９に示す。図８中、両端の黒丸を結ぶ黒線は、各削除株の削除領域を示す。この結果、削除株ＡＬＴ−１および削除株ＡＬＴ−２では親株とほぼ同等の増殖速度を維持していたが、その他の削除株では増殖速度の低下が確認された。よって、ｇｍｈ１（ＳＰＡＣ５Ｈ１０．１１）遺伝子、ＳＰＡＣ５Ｈ１０．１２ｃ遺伝子、およびｇｍｈ２遺伝子は増殖速度に影響せず、ｒａｄ８（ＳＰＡＣ１３Ｇ６．０１ｃ）遺伝子、ｒｐｓ１０１遺伝子、ｇｐｉ７遺伝子、またはｔｉｍ８遺伝子のいずれかが増殖速度の維持に必要なことが示唆された。
【００６２】
続いて、ｒａｄ８遺伝子、ｒｐｓ１０１遺伝子、またはｇｐｉ７遺伝子を復帰させることで、増殖速度が改善されるかどうかを調べた。まず、ＩＧＦ６２２株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）の第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に、ｒａｄ８遺伝子、ｒｐｓ１０１遺伝子、またはｇｐｉ７遺伝子を挿入し、各遺伝子の復帰株を作製した。得られた復帰株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して最大比増殖速度を算出した。算出結果を図１０に示す。この結果、ｒｐｓ１０１遺伝子を復帰させたｒｐｓ１０１／ＩＧＦ６２２株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰、ｌｅｕ１遺伝子座へｒｐｓ１０１遺伝子復帰）で増殖速度の改善がみられた。
【００６３】
これらの結果から、増殖速度を野生株と同程度に維持したＳ．ポンベゲノム縮小化株を得るためには、ｐｄｃ２遺伝子およびｒｐｓ１０１遺伝子を染色体中に残存させたほうがよいことがわかった。実際に、ＳＰＡＣ９７７．１１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域を削除し、かつｕｒａ４遺伝子座にｐｄｃ２遺伝子を挿入した削除株（ΔＳＰＡＣ９７７．１１−ｇｍｈ２、ｕｒａ遺伝子座へｐｄｃ２遺伝子復帰）の最大比増殖速度は、親株と同程度にまで回復した（図７参照。）。そこで、本実施例においては、増殖速度を親株と同程度に維持したＳ．ポンベゲノム縮小化株を得るために、第１染色体左腕ではｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までの領域（ＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ領域）を削除し、かつ、削除されたｐｄｃ２遺伝子を第３染色体のｕｒａ４遺伝子座に復帰させることにした。
【００６４】
続いて、ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の削除領域中に存在する増殖速度に影響する遺伝子の探索を行った。ＩＧＦ５２５株にｕｒａ４遺伝子を復帰させてウラシル非要求性になったＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）は、ＩＧＦ５２５株よりも大幅に増殖速度が改善され、てウラシル非要求性の野生株であるＡＲＣ００１株とほぼ同程度の増殖速度であった（図１２参照。）。ｕｒａ４遺伝子はピリミジン塩基の材料となるＵＭＰ生合成過程において、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路の最終段階を触媒するオロチジン５’−リン酸脱炭酸酵素をコードしている。第２染色体左腕削除株ではｕｒａ４遺伝子を復帰させてｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路を正常化することで増殖速度が回復したと考えられたため、ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の削除領域中には、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路を補完する経路、すなわち細胞外からウラシルまたはウリジンを取り込み、ＵＭＰを合成するｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与する遺伝子があり、該遺伝子を削除したことでＵＭＰの生合成が充分に行われず、増殖速度が低下したと推測された。
【００６５】
ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の削除領域中の遺伝子を調べたところ、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子およびＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ遺伝子がｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与していることが推測された。図１１に、ＵＭＰ生合成経路を示す。該２遺伝子をそれぞれＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ）の第２染色体のｌｅｕ１遺伝子座に挿入した復帰株を作製した。得られた復帰株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して最大比増殖速度を算出した。算出結果を図１２に示す。この結果、ＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ遺伝子を復帰させたＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ／ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ、ｌｅｕ１遺伝子座へＳＰＢＣ１６８３．０６ｃ遺伝子復帰）ではＩＧＦ５２５株と同程度の増殖測定であったが、ＳＰＢＣ１６８３．０５遺伝子遺伝子を復帰させたＳＰＢＣ１６８３．０５／ＩＧＦ５２５株（ΔＢＬＴ、ｌｅｕ１遺伝子座へＳＰＢＣ１６８３．０５ｃ遺伝子復帰）では親株であるＡＲＣ０１０株とほぼ同等の増殖速度にまで回復した。
【００６６】
これらの結果から、Ｓ．ポンベの染色体の最末端の必須遺伝子は、第１染色体左腕でｔｒｓ３３遺伝子、第１染色体右腕でｓｅｃ１６遺伝子、第２染色体左腕でｚａｓ１遺伝子、第２染色体右腕でｕｓｐ１０９であること、最末端遺伝子から該必須遺伝子までの１００〜２００ｋｂｐの非必須遺伝子クラスター領域を削除できることがわかった。さらに、増殖速度が削除前の株と同程度に維持されるためには、第１染色体左腕遠位にあるｐｄｃ２遺伝子およびｒｐｓ１０１遺伝子が必要であること、ｕｒａ４遺伝子が欠失株では第２染色体左腕遠位にあるＳＰＢＣ１６８３．０５ｃ遺伝子が必要なことがわかった。
【００６７】
＜複数領域の非必須遺伝子クラスター削除株の作製＞
第１染色体および第２染色体の両末端の大規模削除領域の２以上の領域を統合し、さらにｕｒａ４遺伝子座にｐｄｃ２遺伝子（必要によってはＳＰＢＣ１６８３．０５ｃ遺伝子も）を復帰させたＳ．ポンベゲノム縮小化株を作製した。
具体的には、前記で作製した一領域非必須遺伝子クラスター削除株に対して、前記と同様にＬａｔｏｕｒ法により他の染色体末端の非必須遺伝子クラスター領域を作製した。作製された各削除株の株名および削除された領域を表４に示す。表４中、「ｕｒａ４−Ｄ１８」はｕｒａ４遺伝子の欠失株であり、「ｕｒａ４＋」はｕｒａ４遺伝子を有する株である。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
各削除株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）で培養し、培養液のＯＤ６６０を測定して、最大比増殖速度（μＭＡＸ）および最終到達濁度（培養終了時の培養液の濁度）（ＯＤ６６０）を測定した。なお、Ｓ．ポンベでは、ｕｒａ４遺伝子の欠失株よりもｕｒａ４遺伝子を有する株のほうがより増殖が安定するため、増殖効率の解析にはｕｒａ４＋株を用い、対照としてウラシル非要求性のＡＲＣ００１株を用いた。図１３に各削除株の最大比増殖速度（μＭＡＸ）の算出結果を、図１４に各削除株の最終到達濁度（ＯＤ６６０）の測定結果を示す。この結果、染色体削除領域の統合を進めるにつれて、最大比増殖速度および最終到達濁度のいずれも低下する傾向が観察された。中でも、第１染色体左腕を削除した場合に、該傾向が強かった。４領域を全て削除したＩＧＦ６９３株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、およびΔＢＲＴ）では、最大比増殖速度が親株比０．７８であり、最終到達濁度（ＯＤ６６０）は親株が２３であったのに対してＩＧＦ６９３株は１９まで低下していた。
【００７０】
また、第１染色体左腕の削除領域をｔｌｈ１遺伝子座からｇｍｈ２遺伝子座までとした削除株では、第１染色体左腕の削除領域をｔｌｈ１遺伝子座からｇｐｉ７遺伝子座までとした削除株よりも、最大比増殖速度および最終到達濁度がいずれも改善された。たとえば、ＩＧＦ６３７株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ）の最大比増殖速度が親株比０．７９、最終到達濁度（ＯＤ６６０）が２０であったのに対して、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）は最大比増殖速度が親株比０．９６、最終到達濁度（ＯＤ６６０）が２７であり、いずれも改善された（図１５および１６参照。）。また、４領域削除株でも、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、およびΔＢＲＴ）の最大比増殖速度が親株比０．８２、最終到達濁度（ＯＤ６６０）が２２であり、いずれもＩＧＦ６９３株よりも改善されていた（図１５および１６参照。）。
【００７１】
＜各削除株の形態および細胞分裂の観察＞
次いで、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）、ＩＧＦ６２８株（ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３０株（ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、および親株であるＡＲＣ００１株の顕微鏡観察を行い、細胞分裂および染色体分配が正常に行われているか否かを調べた。まず、各削除株をＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）、３２℃で培養し、培養液のＯＤ６６０が約５．０の時点（対数増殖期中期）に該培養液の一部を分取し、含まれている酵母の染色体をＤＡＰＩで染色した後、顕微鏡で観察した。各株の微分干渉像（ＤＩＣ）およびＤＡＰＩ染色像を図１７に示す。どの株も細胞形態および染色体分配の様子に異常は観察されなかった。ただし、ＩＧＦ７４２株では、細胞の大きさが若干小さい傾向があった。
【００７２】
＜各削除株のアミノ酸取り込み能＞
Ｓ．ポンベでは、培地中の窒素源が少ないことによる栄養飢餓ストレスで細胞が小さくなるという報告がある。そこで、前記で得られたロイシン要求性を備える削除株のロイシン取り込み能を調べた。具体的には、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）、ＩＧＦ６２８株（ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３０株（ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、およびＡＲＣ００１株を、ロイシンを２５０ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｌｅｕ）またはＹＥＳ平板培地にスポットし、３２℃で４日間培養した。
培養後の平板培地の落斜光画像を図１８に示す。この結果、ＩＧＦ７２４株、ＩＧＦ６２８株、およびＩＧＦ７４２株で増殖の遅延が観察された。ＩＧＦ６２８株の削除領域であるＡＲＴ領域には、アミノ酸トランスポーターであるｉｓｐ５（ＳＰＡＣ１０３９．０９）とｐｕｔ４（ＳＰＡＣ８６９．１０）が含まれており、該蛋白質はロイシンの取り込みに関与していると推測される。ＡＲＴ領域を削除した削除株では、ＥＭＭ＋Ｌｅｕ平板培地中のロイシンの取り込み効率が低下し増殖が遅延したと推察された。また、ＩＧＦ７２４株の削除領域であるＡＬＴ領域には、ロイシン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターであると報告されている遺伝子はなく、ｉｓｐ５またはｐｕｔ４の相同遺伝子も存在していないが、ロイシン取り込み能を有する蛋白質をコードする遺伝子が存在していると推測された。
一方で、ＹＥＳ平板培地では、ＩＧＦ７２４株、ＩＧＦ６２８株、およびＩＧＦ７４２株は、いずれも目立った増殖遅延は観察されなかった。
２００８年に公開されたＳ．ポンベのゲノムワイドなトランスクリプトーム解析によると、ｉｓｐ５およびｐｕｔ４はＹＥ培地よりも主に最小培地や窒素飢餓状態で発現が誘導されている。よって、窒素源が豊富な栄養培地では、他のロイシン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターが機能していることが推測された。
【００７３】
次に、各株を、ＥＭＭ平板培地、アルギニン類似体であるカナバニンを６０ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｃａｎａｖａｎｉｎｅ）、およびリシン類似体であるチアリジンを２００ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｔｈｉａｌｙｓｉｎｅ）、メチオニン類似体であるエチオニンを３０ｍｇ／Ｌになるように添加したＥＭＭ平板培地（ＥＭＭ＋Ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）にスポットし、３２℃で４日間培養した。これらのアミノ酸類似体が細胞内に取り込まれると、正常な蛋白質合成が阻害されるため、細胞は増殖できなくなる。つまり、アミノ酸取り込み能が低下している株では、培地中のアミノ酸類似体の取り込みも抑制されるため、該アミノ酸類似体に対する耐性を示す。
培養後の平板培地の落斜光画像を図１９に示す。この結果、ＩＧＦ６２８株およびＩＧＦ７４２株が、カナバニン耐性およびチアリジン耐性を有することが確認された。また、ＩＧＦ７４２株のみがエチオニン耐性を有することが確認された。
ＩＧＦ６２８株の削除領域であるＡＲＴ領域には、アルギニンおよびリシン等の主要な塩基性アミノ酸トランスポーターであるｃａｔ１が存在している。このため、ＩＧＦ６２８株およびＩＧＦ７４２株では、アルギニンおよびリシンの取り込み能が低下し、カナバニン耐性およびチアリジン耐性を示したと推測された。また、カナバニン耐性は、ＩＧＦ６２８株よりもＩＧＦ７４２株のほうが高かったため、ＡＲＴ領域以外にもアルギニン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターが存在していることが示唆された。
さらに、ＩＧＦ７４２株はエチオニン耐性をも有していることから、ＩＧＦ７４２株の削除領域内にメチオニン取り込み能を有するアミノ酸トランスポーターが複数存在しており、ＩＧＦ７４２株のエチオニン耐性は、該アミノ酸トランスポーターを多重に削除したことによって現れた表現型であると示唆された。
【００７４】
＜ＩＧＦ７４２株のテロメア長さの確認＞
ＩＧＦ７４２株の染色体はいずれもテロメアを有しているが、ＩＧＦ７４２株の削除領域中にはテロメアのヘテロクロマチン形成に必要な蛋白質との結合部位が含まれている。そこで、ヘテロクロマチン形成蛋白質との結合部位が削除されたことにより、削除株中のテロメアの安定性に与える影響について調べた。具体的には、ＩＧＦ７４２株および親株であるＡＲＣ００１株を、それぞれＹＥＳ培地（ｐＨ５．０）、３２℃で約１００世代培養した後、得られた菌体からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に消化したゲノムＤＮＡを電気泳動し、テロメア反復配列をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。サザンハイブリダイゼーションの結果を図２０に示す。この結果、ＩＧＦ７４２株のテロメアの長さはＡＲＣ００１株とほとんど同じであり、第１染色体および第２染色体の末端を削除することは、テロメア長にほとんど影響していないことが確認された。
【００７５】
［実施例２］
実施例１で作製した削除株に外来遺伝子発現カセットを導入し、該外来遺伝子がコードする蛋白質を発現させ、該蛋白質の生産効率を調べた。外来蛋白質として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、細胞外分泌蛋白質）、ヒトトランスフェリン（ｈＴＦ、糖鎖付加・細胞外分泌蛋白質）を用いた。
具体的には、まず、ＩＧＦ７２４株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ）、ＩＧＦ６２８株（ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６２９株（ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３０株（ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６３１株（ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６３２株（ΔＡＲＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６３３株（ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６４７株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ６４８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６４９株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７５５株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ）、ＩＧＦ７５６株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６３４株（ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６５８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ６５９株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ６６０株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、ＩＧＦ７２８株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）、ＩＧＦ７４２株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ、ΔＢＲＴ）、およびＡＲＣ００１株の第２染色体のＬｅｕ１遺伝子座に、各外来蛋白質をコードする遺伝子を含む発現カセットを挿入し、蛋白質発現用Ｓ．ポンベゲノム縮小化株を得た。各外来蛋白質をＳ．ポンベで構成的に発現させるため、各外来蛋白質をコードする遺伝子を、ｈＣＭＶ（ヒトサイトメガロウィルス）プロモーターおよびリポコルチンターミネーターの間に配置した発現カセットを用いた。
【００７６】
ＥＧＦＰ遺伝子を含む発現カセットを挿入した株を、ＥＭＭ培地、３２℃で培養し、蛋白質生産が盛んな対数増殖期に、各培地のＥＧＦＰの蛍光値を経時的に測定した。図２１は、各削除株のＥＧＦＰの蛍光値の測定結果を、ＡＲＣ００１株の結果とともに示した図である。この結果、ＩＧＦ７２４株、ＩＧＦ６２８株、ＩＧＦ６２９株、およびＩＧＦ６３０株のＥＧＦＰの蛍光値は、親株であるＡＲＣ００１株とほぼ同等であり、一領域削除株では蛋白質生産効率の改善は観察されなかった。削除領域が増大するに従い、ＥＧＦＰの蛍光値はＡＲＣ００１株よりも高くなり、ＥＧＦＰ発現効率の上昇が観察された。４領域が削除されたＩＧＦ７４２株が最も高いＥＧＦＰ発現効率を示した。
【００７７】
次に、ｈＧＨ遺伝子を含む発現カセットを挿入した株を、ＹＰＤ培地、３２℃で培養し、培養開始から２〜６日経過した定常期の培養液上清を回収した。各培養液上清をＴＣＡ濃縮し、得られた濃縮液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ＣＢＢ染色を行い、画像解析によりバンドの濃度勾配からｈＧＨの含有量を算出した。算出されたｈＧＨ含有量を、培養液上清が回収された時点の細胞密度（ＯＤ６６０＝２０に換算）により補正し、該培養液上清に含まれていたｈＧＨ含有量を算出した。図２２は、各株の培養液上清のｈＧＨ含有量を示した図である。この結果、ＩＧＦ７２４株等の一領域削除株でもｈＧＨの分泌発現効率が向上しており、菌体濁度あたりの分泌発現効率が最も上昇した株はＩＧＦ６５８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）であった。
【００７８】
さらに、ｈＴＦ遺伝子を含む発現カセットを挿入した株を、ＹＰＤ培地、３２℃で培養し、培養開始から２〜１０日経過した定常期の培養液上清を回収した。各培養液上清中のｈＴＦをＥＬＩＳＡ法により定量した。各測定値を、培養液上清が回収された時点の細胞密度（ＯＤ６６０＝２０に換算）により補正した。図２３は、各株の培養液上清のｈＴＦ含有量を示した図である。この結果、ｈＴＦ分泌発現でも一領域削除株でもｈＧＨの分泌発現効率が向上しており、菌体濁度あたりの分泌発現効率が最も上昇した株はＩＧＦ７２８株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）であった。
【００７９】
図２４に、各ゲノム縮小化株の蛋白質生産効率を、親株に対する相対値として示した。ＥＧＦＰ発現では、４領域削除株（ＩＧＦ７４２株）で親株の１．８倍、ｈＧＨ分泌発現ではＩＧＦ６５８株（ΔＡＬＴ＿ＬＯＮＧ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）で親株の３．３倍、ｈＴＦ分泌発現ではＩＧＦ７２８株（ΔＡＬＴ＿ｓｈｏｒｔ、ΔＡＲＴ、ΔＢＬＴ）で親株の２．０倍であった。つまり、蛋白質の種類に関わらず、本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株を宿主として用いることにより、外来蛋白質の発現効率を削除前の親株よりも上昇させられることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のＳ．ポンベゲノム縮小化株は、外来蛋白質を野生株よりも効率よく発現できるため、特に、酵母を利用した発現系の宿主として好適に用いることができる。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２】
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【図４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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