(57)【要約】【課題】比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことのできる難治性乳がんの検査方法を提供する。【解決手段】CD44抗原とCD24抗原とEp-CAMとCD49f抗原との発現量を指標とすることとした。また、被験者から採取された腫瘍組織又は血清より被験サンプルを調製し、被験サンプルの単位体積あたりのCD44関連物質の量が比較サンプル中のCD44関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多く、CD24関連物質の量が下限よりも少なく、Ep-CAM関連物質の量が下限よりも少なく、CD49f関連物質の量が上限よりも多い場合、難治性の乳がんに罹患している可能性が高いと判断することとした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD44抗原とCD24抗原とEp-CAMとCD49f抗原との発現量を指標とする難治性乳がんの検査方法。
【請求項２】
被験者から採取された腫瘍組織又は血清より被験サンプルを調製する工程と、
前記被験サンプル中に含まれるCD44抗原及び／又はCD44抗原の断片であるCD44関連物質と、CD24抗原及び／又はCD24抗原の断片であるCD24関連物質と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片であるEp-CAM関連物質と、CD49f抗原及び／又はCD49f抗原の断片であるCD49f関連物質と、の単位体積あたりの量を測定する工程と、
前記被験サンプル中の単位体積あたりのCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49f関連物質の量と、前記被験者と同性で略同齢の複数の健常者における組織又は血清より調製した比較サンプル群中のCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49関連物質の単位体積あたりの量の範囲とを比較して、前記被験サンプルの単位体積あたりのCD44関連物質の量が前記比較サンプル中のCD44関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多く、CD24関連物質の量が前記比較サンプル中のCD24関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、Ep-CAM関連物質の量が前記比較サンプル中のEp-CAM関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、CD49f関連物質の量が前記比較サンプル中のCD49f関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多い場合、難治性の乳がんに罹患している可能性が高いと判断する工程と、
を有することを特徴とする難治性乳がんの検査方法。
【請求項３】
被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来の被験サンプル中に含まれるCD44抗原及び／又はCD44抗原の断片と、CD24抗原及び／又はCD24抗原の断片と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片と、CD49f抗原及び／又はCD49f抗原の断片との難治性乳がんの検査におけるマーカーとしての使用。
【請求項４】
難治性乳がんの診断を行うに際して、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来のマーカ量と健常者より採取した組織又は血清由来のマーカ量とを比較して難治性乳がんに罹患している可能性が高いか否かを判定するための、少なくともCD44抗原及び／又はCD44抗原の断片の量と、CD24抗原及び／又はCD24抗原の断片の量と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片の量と、CD49f抗原及び／又はCD49f抗原の断片の量とについての前記健常者に対する前記被験者の比が分かるデータが記録された媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難治性乳がんの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは本邦において昭和56年以降死因順位第１位となっており、平成23年の全死亡者に占める割合は28.5％である。すなわち、全死亡者のおよそ3.5人に1人はがんで死亡したことになる。
【０００３】
中でも乳がんは日本人女性の約30人に１人の割合で発症しており、日本人女性が最もかかりやすいがんといわれていることから、早期の発見、早期の治療が肝要である。
【０００４】
そこで、現在に至るまで、乳がんに関し、多くの検査方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２１６８２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、ERおよびPgR陰性、かつ、HER2陰性を示す所謂トリプルネガティブ乳がんなどの難治性乳がんは、他のサブタイプに分類される乳がんに比して転帰が不良であると言われており、乳がんが難治性乳がんであるか否かについて判定することは、乳がんの治療方針を決定し、適切な治療薬を選択する上で非常に重要である。トリプルネガテイブ乳がんの大部分は他の分類法ではbasal typeに含まれ、BRCA1遺伝子変異を伴うものが多いが、それらの分類法では必ずしも難治性を特定できない。抗がん剤や放射線治療への難治性は現在、癌幹細胞の存在が注目されており、癌幹細胞を含む第4の生物学的特性を探し出す必要性に迫られている。
【０００７】
本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、難治性の乳がんを従来の分類と異なった、癌幹細胞をターゲットとした難治性乳がんの検査方法を提供する。
【０００８】
また本発明では、乳がんである可能性が高いか否かについて指標となる物質のマーカとしての使用や、乳がんである可能性が高いか否かについての判断に供される媒体についても提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記従来の課題を解決するために、本発明に係る難治性乳がんの検査方法では、CD44とCD24とEp-CAMとCD49fとの発現量を指標とすることとした。
【００１０】
また、本発明に係る乳がんの検査方法では、被験者から採取された腫瘍組織又は血清より被験サンプルを調製する工程と、前記被験サンプル中に含まれるCD44及び／又はCD44断片であるCD44関連物質と、CD24及び／又はCD24断片であるCD24関連物質と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片であるEp-CAM関連物質と、CD49f及び／又はCD49f断片であるCD49f関連物質と、の単位体積あたりの量を測定する工程と、前記被験サンプル中の単位体積あたりのCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49f関連物質の量と、前記被験者と同性で略同齢の複数の健常者における組織又は血清より調製した比較サンプル群中のCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49関連物質の単位体積あたりの量の範囲とを比較して、前記被験サンプルの単位体積あたりのCD44関連物質の量が前記比較サンプル中のCD44関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多く、CD24関連物質の量が前記比較サンプル中のCD24関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、Ep-CAM関連物質の量が前記比較サンプル中のEp-CAM関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、CD49f関連物質の量が前記比較サンプル中のCD49f関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多い場合、難治性の乳がんに罹患している可能性が高いと判断する工程と、を有することとした。
【００１１】
また、本発明では、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来の被験サンプル中に含まれるCD44及び／又はCD44断片と、CD24及び／又はCD24断片と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片と、CD49f及び／又はCD49f断片とを難治性乳がんの検査におけるマーカーとして使用することとした。
【００１２】
また、本発明に係る媒体では、難治性乳がんの診断を行うに際して、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来のマーカ量と健常者より採取した組織又は血清由来のマーカ量とを比較して難治性乳がんに罹患している可能性が高いか否かを判定するための、少なくともCD44及び／又はCD44断片の量と、CD24及び／又はCD24断片の量と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片の量と、CD49f及び／又はCD49f断片の量とについての前記健常者に対する前記被験者の比が分かるデータが記録された媒体とした。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る難治性乳がんの検査方法では、CD44とCD24とEp-CAMとCD49fとの発現量を指標とすることとしたため、比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことのできる難治性乳がんの検査方法を提供することができる。
【００１４】
また、本発明に係る難治性乳がんの検査方法では、被験者から採取された腫瘍組織又は血清より被験サンプルを調製する工程と、前記被験サンプル中に含まれるCD44及び／又はCD44断片であるCD44関連物質と、CD24及び／又はCD24断片であるCD24関連物質と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片であるEp-CAM関連物質と、CD49f及び／又はCD49f断片であるCD49f関連物質と、の単位体積あたりの量を測定する工程と、前記被験サンプル中の単位体積あたりのCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49f関連物質の量と、前記被験者と同性で略同齢の複数の健常者における組織又は血清より調製した比較サンプル群中のCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49関連物質の単位体積あたりの量の範囲とを比較して、前記被験サンプルの単位体積あたりのCD44関連物質の量が前記比較サンプル中のCD44関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多く、CD24関連物質の量が前記比較サンプル中のCD24関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、Ep-CAM関連物質の量が前記比較サンプル中のEp-CAM関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、CD49f関連物質の量が前記比較サンプル中のCD49f関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多い場合、難治性の乳がんに罹患している可能性が高いと判断する工程と、を有することとしたため、比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことのできる難治性乳がんの検査方法を提供することができる。
【００１５】
また、本発明では、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来の被験サンプル中に含まれるCD44及び／又はCD44断片と、CD24及び／又はCD24断片と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片と、CD49f及び／又はCD49f断片とを、難治性乳がんの検査におけるマーカーとして使用することとしたため、比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことができる。
【００１６】
また、本発明に係る媒体では、難治性乳がんの診断を行うに際して、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来のマーカ量と健常者より採取した組織又は血清由来のマーカ量とを比較して難治性乳がんに罹患している可能性が高いか否かを判定するための、少なくともCD44及び／又はCD44断片の量と、CD24及び／又はCD24断片の量と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片の量と、CD49f及び／又はCD49f断片の量とについての前記健常者に対する前記被験者の比が分かるデータが記録された媒体としたため、比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】試験結果を示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、難治性乳がんの検査方法に関するものであり、CD抗原であるCD44抗原とCD24抗原とEp-CAM(CD326抗原)とCD49f抗原との発現量を指標とするものである。
【００１９】
換言すれば、生体から分離された生体検体について、CD抗原であるCD44抗原とCD24抗原とEp-CAM(CD326抗原)とCD49f抗原とを、難治性乳がんの腫瘍マーカーとして検出することを特徴とする。
【００２０】
CD44分子群は、hyaluronan結合タンパクであるhyaladherinファミリーに属する膜貫通タンパクである。多数のCD44アイソフォームが報告されているが、分子量85kDaのCD44Sが主要なアイソフォームとされている。CD44分子は、ほとんどの細胞/組織に発現するが、血小板、肝細胞、心筋、腎尿細管上皮、精巣、皮膚には発現しないという特徴を有している。
【００２１】
また、CD24抗原は、グリコシル-ホスファチジルイノシトール結合型シアロ糖タンパクであり、分子量は35-45kDaである。Pro-B細胞期から成熟B細胞期に至るB細胞に存在するが、形質細胞には存在しないという特徴を有している。また、成熟顆粒球および様々な上皮系細胞にも発現するという特徴を有している。
【００２２】
また、Ep-CAM（上皮細胞接着分子、CD326、KSA、TROP1）は、40kDaの細胞接着因子であり、同種親和性でカルシウム非依存性の細胞間相互作用に関与する。Ep-CAMはI型膜タンパクで、主に上皮の基底膜に発現するという特徴を有している。正常な上皮はEp-CAMを弱く発現するが、増殖と間葉系の移行と相関して発現が増加する。
【００２３】
また、CD49f抗原（GPＩcもしくはインテグリンα6鎖）は、ジスルフィド結合で架橋された分子量125kDaの大きなサブユニットと分子量25kDaの膜貫通型サブユニットで構成されており、分子量130kDaのインテグリンβ1鎖（CD29分子）と非共有結合的に会合してVLA-6複合体（ GPＩＩc/ＩＩaもしくはα6β1）を形成する。α6β1はラミニンのレセプタとして知られている。CD49f抗原は、血小板や巨核球に存在し、T細胞のサブポピュレーションに弱く発現するという特徴を有している。
【００２４】
そして本実施形態に係る難治性乳がんの検査方法では、被験者から採取された腫瘍組織又は血清より被験サンプルを調製する工程と、前記被験サンプル中に含まれるCD44抗原及び／又はCD44抗原の消化等によって生じた断片であるCD44関連物質と、CD24抗原及び／又はCD24抗原の消化等によって生じた断片であるCD24関連物質と、Ep-CAM及び／又はEp-CAMの消化等によって生じた断片であるEp-CAM関連物質と、CD49f抗原及び／又はCD49f抗原の消化等によって生じた断片であるCD49f関連物質と、の単位体積あたりの量を測定する工程と、前記被験サンプル中の単位体積あたりのCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49f関連物質の量と、前記被験者と同性で略同齢の複数の健常者における組織又は血清より調製した比較サンプル群中のCD44関連物質とCD24関連物質とEp-CAM関連物質とCD49関連物質の単位体積あたりの量の範囲とを比較して、前記被験サンプルの単位体積あたりのCD44関連物質の量が前記比較サンプル中のCD44関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多く、CD24関連物質の量が前記比較サンプル中のCD24関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、Ep-CAM関連物質の量が前記比較サンプル中のEp-CAM関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、CD49f関連物質の量が前記比較サンプル中のCD49f関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多い場合、難治性の乳がんに罹患している可能性が高いと判断する工程と、を有することとしても良い。
【００２５】
ここで被験サンプルは、被験者に腫瘍が存在する場合はその腫瘍組織又は血清、被験者に腫瘍が存在するか否か不明な場合は血清より調製する。例えば、腫瘍組織の場合はバイオプシーなどによって細胞を得て、トリプシン処理等を行った上で、上記CD抗原に対する抗体を用いて検査が行われることとなる。また、血清の場合は血清中に含まれる上記CD抗原を検出することとなる。
【００２６】
また、検出するCD44抗原やCD24抗原、Ep-CAM(CD326抗原)、CD49f抗原は、腫瘍組織を構成する腫瘍細胞の膜に発現しているものを抗原として検出してもよく、また、血中に含まれるこれらのCD抗原や生体内で分解されて生じた断片を検出するようにしても良い。
【００２７】
このような検査を行うことにより、被験者から得られた被験サンプルが、難治性の乳がんに罹患している患者由来のサンプルであるか否かについて判断を行うことができる。
【００２８】
換言すれば、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来の被験サンプル中に含まれるCD44関連物質と、CD24関連物質と、Ep-CAM関連物質と、CD49f関連物質とを、難治性乳がんの検査におけるマーカーとして使用するものであると言える。
【００２９】
また、本実施形態に係る媒体では、難治性乳がんの診断を行うに際して、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来のマーカ量と健常者より採取した組織又は血清由来のマーカ量とを比較して難治性乳がんに罹患している可能性が高いか否かを判定するための、少なくともCD44関連物質の量と、CD24関連物質の量と、Ep-CAM関連物質の量と、CD49f関連物質の量とについての前記健常者に対する前記被験者の比が分かるデータが記録された媒体としている。
【００３０】
ここで媒体としては、例えば、紙媒体であったり、電気的や磁気的、光学的に記録する媒体であっても良い。このようなデータが記録された媒体によれば、被験者より得られた被験サンプルが難治性の乳がんに罹患している患者由来のサンプルであるか否かについて、容易に確認を行うことができる。
【００３１】
以下、本実施形態に係る難治性乳がんの検査方法について、試験結果を参照しながら更に説明する。
【００３２】
〔１．基礎試験〕
図１は、乳がん患者より採取された腫瘍細胞のうち、CD44抗原が高値、CD24抗原が低値を示すがん幹細胞について、フローサイトメトリーによりEp-CAM及びCD49f抗原の発現量に着目してプロットした結果を示す図である。
【００３３】
図１からも分かるように、CD44抗原が高値、CD24抗原が低値を示すがん幹細胞はＡ、Ｂ、Ｃの３つの群に大きく分類された。
【００３４】
そして、Ａ群について更に検討を行ったところ、Ａ群はER-/HER2-であり、難治性のエピデルモイドであることが示された。
【００３５】
このことから、被験者より採取したサンプル中の被験サンプルの単位体積あたりのCD44関連物質の量が比較サンプル中のCD44関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多く、CD24関連物質の量が比較サンプル中のCD24関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、Ep-CAM関連物質の量が比較サンプル中のEp-CAM関連物質の単位体積あたりの量の範囲の下限よりも少なく、CD49f関連物質の量が比較サンプル中のCD49f関連物質の単位体積あたりの量の範囲の上限よりも多い場合、難治性の乳がんに罹患している可能性が高いといえる。
【００３６】
すなわち、CD44抗原とCD24抗原とEp-CAMとCD49f抗原との発現量を指標とすることにより、難治性乳がんに罹患している可能性が高いか否かについて検査可能であることが示された。
【００３７】
また、腫瘍組織を用いた本実施形態に係る難治性乳がんの検査方法によれば、組織採取後検鏡等を行って１週間程度要していた判定方法に比して、比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことができる。
【００３８】
〔２．記録媒体の作成〕
前述の難治性乳がんの検査方法を行って得られた結果を、紙面上に文字及び数字にて記載し、CD44及び／又はCD44断片の量と、CD24及び／又はCD24断片の量と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片の量と、CD49f及び／又はCD49f断片の量とについての前記健常者に対する前記被験者の比が分かるデータが記録された難治性乳ガンの診断を行うに際して、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来のマーカ量と健常者より採取した組織又は血清由来のマーカ量とを比較して難治性乳ガンに罹患している可能性が高いか否かを判定するための紙媒体を作成した。
【００３９】
また、同様に、上記データをコンピュータ上にて入力することによりデータファイルを作成し、このデータファイルをＣＤ−Ｒに記録することで、CD44及び／又はCD44断片の量と、CD24及び／又はCD24断片の量と、Ep-CAM及び／又はEp-CAM断片の量と、CD49f及び／又はCD49f断片の量とについての前記健常者に対する前記被験者の比が分かるデータが記録された難治性乳ガンの診断を行うに際して、被験者より採取した腫瘍組織又は血清由来のマーカ量と健常者より採取した組織又は血清由来のマーカ量とを比較して難治性乳ガンに罹患している可能性が高いか否かを判定するためのＣＤ−Ｒを作成した。
【００４０】
そして、これらの紙媒体やＣＤ−Ｒによれば、医師や看護師、又は被験者自身が、被験者が難治性乳ガンに罹患している可能性が高いか否かについて容易に知ることができる。
【００４１】
上述してきたように、本発明に係る難治性乳がんの検査方法によれば、CD44抗原とCD24抗原とEp-CAMとCD49f抗原との発現量を指標とすることとしたため、比較的速やかに難治性の乳がんである可能性が高いか否かについて検討を行うことのできる難治性乳がんの検査方法を提供することができる。
【００４２】
最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
【００４３】
特に近年では、難治性がんは乳がんに限らず、胃、肺、大腸がんなど多くのがんでがん幹細胞の存在が見いだされ、また、抗癌剤や放射線治療に抵抗性であることが示されており、それをターゲットとするがん治療がすすめられている。
【００４４】
このがん幹細胞は本申請のマーカー CD44high/CD24low ,Ep-CAM low /CD49f high に多く存在することから、多くの難治性がんにも診断、治療の対照となり得る。
【図１】
2015121469.tif 000003