(57)【要約】【課題】簡便に、３−ニトロフェノールを高い収率で得られるようにする。【解決手段】ニトロベンゼンを含む培養液中でtodD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株を培養し、その培養液中から前記Pseudomonas putida T-57菌株により生成された３−ニトロフェノールを回収する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロベンゼンを含む培養液中でtodD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株を培養する工程と、
前記培養液中から前記Pseudomonas putida T-57菌株により生成された３−ニトロフェノールを回収する工程とを備えていることを特徴とする微生物による３−ニトロフェノールの製造方法。
【請求項２】
前記todD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されたPseudomonas putida T-57 ΔtodDE株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１７４６）であることを特徴とする請求項１に記載の微生物による３−ニトロフェノールの製造方法。
【請求項３】
todD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ニトロフェノールの製造方法に関し、特に、微生物を用いた３−ニトロフェノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、３−ニトロフェノールは、農薬、医薬、染料及び耐熱性高分子のモノマーの原料等に用いられる非常に重要な化合物として知られている。この３−ニトロフェノールを製造する方法としては、３−ニトロベンゼンスルホン酸からそのアルカリ融解による方法の他、３−ニトロアニリンをジアゾ化した後に、加水分解して合成する方法（非特許文献１を参照。）、３−ニトロフェノールのアルキルエーテルを加水分解する方法（特許文献１を参照。）や、ニトロベンゼンを過酸化水素で水酸化する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、複雑で且つ多段階の工程を必要とし、製造コストも増大してしまう。
【０００３】
そこで、より簡便で且つコストを低減できる方法として、上記のような化学合成法を用いた方法でなく、微生物を用いて３−ニトロフェノールを製造する方法も考えられている。これまで、エタノール等の親水性物質は微生物を用いて生産されていたが、微生物を用いて芳香族炭化水素等の疎水性物質を生産する場合、その原料及び生産物に起因する生物毒性の問題が多くの場合で生じるため、微生物の適用は困難であった。しかしながら、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等の有機溶媒耐性細菌が発見されてから、これらを利用して疎水性物質を生産するための研究が進んでいる。具体的に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）F1株、シュードモナス・メドシナ（Pseudomonas medocina）KR-1株、及びシュードモナス・ピケッティ（Pseudomonas pickettii）PKO1株は、ニトロベンゼンを基質として３−ニトロフェノールを産生することが報告されている（非特許文献２を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５９−１５７０５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Org.Syn.Coll., Vol.1, 404(1947)
【非特許文献２】Appl.Environ.Microbiol, 1991,57(11),3156.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献２に記載の上記菌株を用いることでニトロベンゼンから３−ニトロフェノールを得ることができるものの、Pseudomonas medocina KR-1株、及びPseudomonas pickettii PKO1株を用いると、ニトロベンゼンから３−ニトロフェノールのみならず４−ニトロフェノールが生成される。また、Pseudomonas putida F1株を用いると３−ニトロフェノールと共に３−ニトロカテコールも生成される。このため、所定量のニトロベンゼンから生成される３−ニトロフェノールの総量が低減することとなり、十分な量を得ることができない。
【０００７】
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、３−ニトロフェノールをより多く生成できる微生物を用いて、簡便に且つ低コストで３−ニトロフェノールを高い収率で得られるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、有機溶媒耐性細菌として既知であるシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株において、トルエンジオキシゲナーゼ（tod）遺伝子群のうちtodD遺伝子を欠損させることにより、上記菌株がニトロベンゼンから３−ニトロフェノールを生成する効率が向上することを見出して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明に係る微生物による３−ニトロフェノールの製造方法は、ニトロベンゼンを含む培養液中でtodD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株を培養する工程と、培養液中からPseudomonas putida T-57菌株により生成された３−ニトロフェノールを回収する工程とを備えていることを特徴とする。
【００１０】
todD遺伝子を有するシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57の野生株は、ニトロベンゼンを基質として３−ニトロフェノールのみならず、３−ニトロカテコールを産生するため、得られる３−ニトロフェノールの総量は多くはない。本発明者らはニトロベンゼンから３−ニトロカテコールの生成は、todD遺伝子が寄与していることを見出したため、本発明では、todD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株を用いた。この菌株においては、todD遺伝子が作用しないため、ニトロベンゼンから３−ニトロカテコールが生成される反応経路が進まずに、３−ニトロフェノールが生成される反応経路のみが進み、その結果、生成される３−ニトロフェノールの総量が増大することとなる。すなわち、本発明の方法を用いると、化学合成による複雑な製造工程を必要とせず、簡便に、高い収率で３−ニトロフェノールを製造することが可能となる。
【００１１】
本発明に係る微生物による３−ニトロフェノールの製造方法において、上記のtodD遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されたPseudomonas putida T-57 ΔtodDE株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１７４６）を用いることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る微生物による３−ニトロフェノールの製造方法によると、複雑な製造工程を必要とせず、簡便に、高い収率で３−ニトロフェノールを製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】二相反応系について説明するための模式図である。
【図２】todE遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダT-57株を二相反応系で培養した後の有機溶媒相及び無機培地相に対するＨＰＬＣ分析の結果を示すスペクトル図である。
【図３】todE遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダT-57株を二相反応系で培養した後の有機溶媒相に対して、２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール及び４−ニトロフェノールの標品を用いて行ったスパイク試験の結果を示すスペクトル図である。
【図４】todE遺伝子が欠損したシュードモナス・プチダT-57株を二相反応系で培養した後の有機溶媒相において、ＨＰＬＣでピークを示した物質を質量分析した結果を示すスペクトル図である。
【図５】ノンマーカー遺伝子欠損法を説明するための模式図である。
【図６】シュードモナス・プチダT-57菌株におけるtodD遺伝子及びtodE遺伝子の周辺の各tod遺伝子の配置を示す図である。
【図７】シュードモナス・プチダT-57菌株の野生株におけるtodD遺伝子及びtodE遺伝子の周辺の制限酵素サイトを示す図である。
【図８】シュードモナス・プチダT-57菌株のtodD及びtodE欠損株におけるtodD遺伝子及びtodE遺伝子の周辺の制限酵素サイトを示す図である。
【図９】シュードモナス・プチダT-57菌株の野生株と遺伝子破壊株とに対して行ったサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図１０】実施例及び比較例の３−ニトロフェノールの生産量を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されない。また、本発明の効果を奏する範囲を逸脱しない範囲で、適宜変更は可能である。
【００１５】
本発明に係る微生物による３−ニトロフェノールの製造方法は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）T-57菌株を用いてニトロベンゼンから３−ニトロフェノールを高効率で製造するものであり、特に、用いる微生物としては、todD遺伝子が欠損したPseudomonas putida T-57菌株（Pseudomonas putida T-57 ΔtodD株）である。本発明では、このPseudomonas putida T-57 ΔtodD株を、ニトロベンゼンを含む培養液中で培養し、培養液中から前記菌株により生成された３−ニトロフェノールを回収することで、高い収率で３−ニトロフェノールを得ることができる。
【００１６】
Pseudomonas putida T-57菌株は、有機溶媒耐性細菌として周知であり、todA、todB、todC1、todC2、todD及びtodE遺伝子等を含むtod遺伝子群を有し、それらの遺伝子がニトロベンゼンを基質とした３−ニトロフェノールの生成に寄与する。以下の［化１］にPseudomonas putida T-57菌株によるニトロベンゼンの酸化反応経路を示す。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
上記［化１］に示すように、ニトロベンゼンは、TodA、TodB、TodC1及びTodC2が寄与して、ニトロベンゼン−２，３−シス−グリコールに酸化された後、ニトロフェノールが生成される。また、ニトロベンゼン−２，３−シス−グリコールから、TodDが寄与して３−ニトロカテコールが生成される。
【００１９】
しかしながら、本発明では、Pseudomonas putida T-57 ΔtodD株を用いるため、３−ニトロカテコールは生成されず、３−ニトロフェノールのみが生成されるため、上記の通り、高い収率で３−ニトロフェノールを得ることができる。
【００２０】
なお、todD遺伝子が欠損したPseudomonas putida T-57菌株は、todDのみならずtodE等の３−ニトロフェノールの生成に影響しない他の遺伝子が欠損されていてもよい。todD遺伝子が欠損したPseudomonas putida T-57菌株としては、例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託されたPseudomonas putida T-57 ΔtodDE株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１７４６）を用いることができる。この菌株は、todD遺伝子とtodE遺伝子との両方が欠損しているものである。
【００２１】
Pseudomonas putida T-57 ΔtodD株の培養は、例えばＭＳＢ培地等の無機培地で培養することができる。培養条件としては、２８℃で１２０ｒｐｍ程度の緩やかな撹拌を行うことが好ましい。培養液には３−ニトロフェノールの生成のための基質となるニトロベンゼンを添加する。その量は、過剰に多い場合には生物毒性が強く生じることとなるため、生物毒性が生じない範囲で適宜選択する必要がある。また、生物毒性を抑制するために二相反応系を用いることが好ましい。二相反応系について図１を参照しながら説明する。
【００２２】
図１に示すように、二相反応系は、菌体（Pseudomonas putida T-57 ΔtodD）１を培養するための培養液として、水相である無機培地相１０の上に、ｎ−デカノール等の有機溶媒相２０を重層したものを用いる。そこに基質（ニトロベンゼン）２を添加し、撹拌装置３０により緩やかに撹拌しながら菌体１を培養し、菌体１により基質２から生成物（３−ニトロフェノール）３を得るものである。図１では、撹拌前の状態を示しており、撹拌時は、無機培地相１０に有機溶媒相２０が分散した状態となる。この二相反応系を用いると、基質２や生成物３の多くが有機溶媒相２０にトラップされた状態となり、水相１０に基質２や生成物３が溶解することを抑制することができて、生物毒性を防ぐことができる。
【００２３】
このようにして、Pseudomonas putida T-57 ΔtodDを培養することでニトロベンゼンから３−ニトロフェノールが生成される。培養後、有機溶媒相のみを採取して、有機溶媒相中に含まれる３−ニトロフェノールを分離及び精製することで、３−ニトロフェノールを得ることができる。その方法としては、バイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法として、有機化合物生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法または電気透析法等が用いられ得る。
【００２４】
以上のような３−ニトロフェノールの製造方法によると、化学合成による複雑な製造工程を必要とせず、簡便に、高い収率で３−ニトロフェノールを製造することが可能となる。
【実施例】
【００２５】
以下に、本発明に係る微生物による３−ニトロフェノールの製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【００２６】
−Pseudomonas putida T-57菌株による３−ニトロフェノールの生成の確認−
まず、todD遺伝子を欠損する前のPseudomonas putida T-57菌株において、ニトロベンゼンから３−ニトロフェノールが生成されることを確認するために、以下の試験を行った。なお、ここでは、todD遺伝子が欠損されていないPseudomonas putida T-57菌株として、todE遺伝子のみが欠損したPseudomonas putida T-57菌株（Pseudomonas putida T-57 ΔtodE：以下ΔtodE株と呼ぶ。）を用いた。
【００２７】
まず、試験管内で、ΔtodE株をＬＢ培地で前培養した後、１ＬのＬＢ培地で１２時間培養し、遠心分離により菌体を回収し、生理食塩水で洗浄を２回行った。これを４０ｍＬのＭＳＢ培地に懸濁し、１０ｍＬずつスクリュー管瓶に分注し、図１に示すような上記二相反応系によりΔtodE株から生成される生成物を採取した。
【００２８】
本試験では、上記１０ｍＬのＭＳＢ培地の上に３ｍＬのｎ−デカノールを重層し、基質であるニトロベンゼンを１０ｍＭ添加した。また、１２０ｒｐｍで撹拌し、２８℃で反応を開始させた。反応開始から２４時間後にｎ−デカノール層（有機溶媒相）及びＭＳＢ培地層（無機培地相）のそれぞれからサンプリングし、ＨＰＬＣ（日本分光）及びＬＣ−ＭＳ（Orbitrap;Thermo）を用いて得られた生成物の分析を行った。それらの結果を図２〜図４に示す。なお、ＨＰＬＣ分析条件は、カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ ４．６×２５０ｍｍ（東ソー社製）、移動相：メタノール：水＝７０：３０、カラム温度：４０℃、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＵＶ２２０ｎｍである。
【００２９】
デカノール層（有機溶媒相）のサンプルをＨＰＬＣで分析すると、図２に示すように、２つの顕著なピークが見られた。これらの保持時間は、５．０ｍｉｎ（１）及び５．４ｍｉｎ（２）であった。一方、無機培地相では、これらのピークは見られなかった。２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール及び４−ニトロフェノールの標品の保持時間は、それぞれ６．５ｍｉｎ、５．４ｍｉｎ及び５．２ｍｉｎであって（図示せず）、（２）のピークが３−ニトロフェノールと一致した。そこで、２−ニトロフェノール、３−ニトロフェノール及び４−ニトロフェノールをそれぞれサンプルに混合してスパイク分析を行った。その結果、図３に示すように、３−ニトロフェノールが加えられたサンプルにおいて、（２）のピークがより高くなった。
【００３０】
さらに、上記２つのピークに相当するものを同定するために、ＬＣ−ＭＳによる質量分析を行った。その結果、図４に示すように、ニトロカテコール及びニトロフェノールのそれぞれについて、プロトンが脱離した質量数［Ｍ−Ｈ］に相当する１５４と１３８とにおけるマスクロマトグラムでピークが認められた。これらのピークは、ＨＰＬＣでの分析による保持時間とほぼ同じタイミングで検出されている。ＬＣ−ＭＳの結果から上記ピーク（２）に相当するものはＣ６Ｈ４Ｏ３Ｎの精密質量と一致し、ピーク（１）に相当するものはＣ６Ｈ４Ｏ４Ｎの精密質量と一致した。これらは、それぞれニトロフェノール及びニトロカテコールの［Ｍ−Ｈ］と一致する。
【００３１】
以上の結果から、ΔtodE株がニトロベンゼンから３−ニトロフェノールを生成することができることが示された。
【００３２】
−todD欠損Pseudomonas putida T-57菌株の作製−
次に、３−ニトロカテコールの生成に関わる遺伝子であるtodDが欠損したPseudomonas putida T-57菌株の作製について説明する。
【００３３】
工業廃水処理施設の活性汚泥より単離されたPseudomonas putida T-57菌株から、ノンマーカー遺伝子欠損技術を用いて、todD遺伝子が欠損した菌株を作製する方法を以下に示す。なお、ここでは、todD遺伝子に加えてtodE遺伝子が欠損したPseudomonas putida T-57 ΔtodDE菌株を作製した。
【００３４】
（ノンマーカー遺伝子欠損技術について）
ノンマーカー遺伝子欠損技術は、標的となる染色体領域の前後２箇所の配列と相同な配列をもつプラスミドベクターと２回の相同組換えを起こすことにより標的領域の欠損を可能とする。その概要について図５を参照しながら説明する。
【００３５】
図５に示すように、まずカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）と枯草菌のレバーセスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）との２つのマーカー遺伝子を有するpK19mobsacBプラスミドに、欠損させるための標的遺伝子の上流領域（Ｕｐ）と下流領域（Ｄｏｗｎ）とが連続する配列が導入されたプラスミドを準備する。これをコンピテントセルに常法で導入した後、接合伝達法等を用いて宿主となる菌株に導入する。宿主内で導入されたプラスミドと染色体とが上流領域（Ｕｐ）間で１回目の相同組換えを起こすと、プラスミドの配列が染色体に導入されて、カナマイシン耐性で且つスクロース感受性の組換え菌株が得られる。続いて、下流領域（Ｄｏｗｎ）間で２回目の相同組換えが生じると、標的遺伝子が欠失したプラスミドの変異配列が染色体上に残り、染色体に組み込まれていたＫｍｒ遺伝子とｓａｃＢ遺伝子とを含むＤｏｗｎ間の配列が脱落する。その結果、標的遺伝子が欠損した菌株が得られ、この菌株は、カナマイシン感受性で且つスクロース非感受性となる。この特徴に基づいて菌株を選択することで標的遺伝子が欠損した菌株を得ることができる。
【００３６】
（todD及びtodE遺伝子領域欠損用プラスミドの作製）
以下に、Pseudomonas putida T-57菌株において、上記ノンマーカー遺伝子欠損技術を用いてtodD遺伝子及びtodE遺伝子を欠損させる方法を示す。
【００３７】
まず、上記todD及びtodE遺伝子領域欠損用プラスミドの構築について図６を参照しながら説明する。図６はシュードモナス・プチダT-57菌株におけるtodD遺伝子及びtodE遺伝子の周辺の各tod遺伝子の配置を示す図である。
【００３８】
上記プラスミドの構築のために、まず、図６に示すようにtodD遺伝子及びtodE遺伝子よりも上流に位置するtodB遺伝子の上流側の配列に対応する配列番号１のtodB-fwプライマーと、todD遺伝子及びtodE遺伝子よりも下流に位置するtodI遺伝子の下流側の配列に対応する配列番号２のtodI-rvプライマーとを用いて、トルエンジオキシゲナーゼ遺伝子クラスター（ｔｏｄオペロン）のtodBとtodIとの間の領域をＰＣＲで増幅した。これにより得られたＰＣＲ産物をEcoRVで切断したpBluescriptII KS+（Ampr；以下pBSIIと記す。）に組み込んだ。このプラスミドをpBSII・todとした。次に、todEとtodGとの間の配列に対応する配列番号３のtodG5-fwプライマーとtodAとtodDとの間の配列に対応する配列番号４のtodA3-rvプライマーとを用いて、pBSII・todを鋳型としてtodDとtodEとの間の領域を含まないようにインバースＰＣＲを行った。これにより得られた産物をセルフライゲーションさせて、pBSII・todからtodD及びtodEが欠損したpBSII・ΔtodDEを作製した。そのpBSII・ΔtodDEからtodDとtodEとが欠損したtodオペロン領域をEcoRI及びHindIIIで切り出し、同様にEcoRI及びHindIIIで処理した上記pK19mobsacBに連結することにより、todD及びtodE遺伝子領域欠損用プラスミドであるpK19・ΔtodDEプラスミドを得た。ここでは、todDとtodEとが欠損したtodオペロン領域が図５のＵｐ領域及びＤｏｗｎ領域となる。
【００３９】
（todD及びtodE遺伝子領域欠損用プラスミドのPseudomonas putida T-57菌株への導入）
次に、上記のようにして得られたpK19・ΔtodDEをPseudomonas putida T-57菌株に接合伝達法により導入するために、E. coli S17-1株のコンピテントセルにpK19・ΔtodDEを導入した。具体的に、１００μＬのコンピテントセルと１０μＬのpK19・ΔtodDEとを混合し、４２℃で４５秒間処理した。その後、２×ＹＴ寒天培地（16g/L トリプトン、10g/L イーストエクストラクト、5g/L ＮａＣｌ）にて３７℃で１２時間の静置培養をして形質転換体を得た。
【００４０】
上記のようにして得られたE. coli S17-1形質転換体のシングルコロニーを、カナマイシンを含む４ｍＬの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃での振とう培養を１晩行った。また、Pseudomonas putida T-57菌株のシングルコロニーを４ｍＬのＬＢ培地（10g/L トリプトン、5g/L イーストエクストラクト、10g/L ＮａＣｌ）に接種し２８℃での振とう培養を１晩行った。その後、それらを新鮮な上記培地４ｍＬにそれぞれ１％植菌し、E. coli S17-1形質転換体は３７℃で、Pseudomonas putida T-57菌株は２８℃でそれぞれ３〜４時間の振とう培養を行った。それらのＯＤ６００が０．５〜１．０となった時点で、それぞれの菌体培養液を１ｍＬずつチューブに分取し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３分、４℃）により菌体のペレットを得た後、それぞれの菌体ペレットを新鮮なＬＢ培地で再懸濁して洗浄した。３回の洗浄後、それぞれの菌株を適当量のＬＢ培地に懸濁し、それらの菌体濃度を揃え、E. coli S17-1形質転換体とPseudomonas putida T-57菌株との懸濁液量の割合を４：１で混合した。その混合液５０μＬをＬＢ寒天培地にスポットし、３７℃で１２時間の培養後、２８℃で１晩培養した。培養後、菌株を１ｍＬのＭＳＢ培地（4.3g/L K2HPO4, 3.4g/L KH2PO4, 2.0g/L (NH4)2SO4, 0.16g/L MgCl2・6H2O, 0.001g/L MnCl2・4H2O, 0.006g/L FeSO4・7H2O, 0.026g/L CaCl2・2H2O, 0.002g/L Na2MoO4・2H2O, 0.1mg/L ZnCl2, 0.01mg/L CoCl2・6H2O, 0.01mg/L CuSO4・5H2O, 0.001mg/L NiSO4, 0.001mg/L Na2SeO4・10H2O）に懸濁し、ＭＳＢ培地で３回洗浄した。洗浄後、菌株を１０−４及び１０−５倍に希釈した液を、それぞれカナマイシンを含むシモンズクエン酸寒天培地に接種し、２８℃で１晩培養した。培養後に得られたシングルコロニーを、カナマイシンを含むＬＢ培地、又はカナマイシン及びスクロースを含むＬＢ培地で培養した。カナマイシン及びスクロースを含むＬＢ培地では生育しなかった菌株をＬＢ培地で培養し、スクロースを含むＬＢ寒天培地及びカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に接種した。上記２回目の相同組換えが起こった菌株は、スクロースに耐性で且つカナマイシンに感受性となるため、スクロースを含むＬＢ培地でのみ生育した菌株を組換え候補株として選択した。
【００４１】
−組換え候補株におけるtodD遺伝子及びtodE遺伝子の欠損の確認−
（ＰＣＲ法による確認）
次に、組換え候補株がtodD及びtodE遺伝子を欠損しているかどうかの確認を、ＰＣＲを用いて行った。そのために、まず、組換え候補株を４ｍＬのＬＢ培地で一晩培養し、その培養液２００μＬを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３分、４℃）により菌体のペレットを得た。菌体ペレットを５４０μＬのＴＥバッファー（Tris-EDTAバッファー）に懸濁し、懸濁液に１０ｍｇ／ｍＬのProteinaseK（MERCK）、及び１０％ＳＤＳ溶液を添加し、５０℃で１時間保温した。フェノール／クロロホルム溶液によるＤＮＡ抽出を３回繰り返した後、上清に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）と９９．５％エタノールを添加し、室温で５分間静置した。その後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）により得られたＤＮＡペレットを７０％エタノール溶液で洗浄し、真空乾燥後、５０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅを含む１００μＬの滅菌水に懸濁した。
【００４２】
上記のようにして取得した遺伝子破壊株のＤＮＡと野生株から得られた染色体ＤＮＡとに対して、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、付属のプロトコールに従ってＰＣＲ増幅反応（９４℃で３０秒、５８℃で１５秒、６８℃で３．５分を３０サイクル）を行った。具体的に、鋳型となるそれぞれのＤＮＡを反応液中のＤＮＡ量が１００ｎｇとなるように滅菌水で希釈した溶液を調製し、todD遺伝子よりも上流側の配列（todA内の配列）に対応する配列番号５のtodDE-fwプライマーと、todE遺伝子よりも下流側の配列（todG内の配列）に対応する配列番号６のtodDE-rvプライマーとを用いてＰＣＲを行った。野生株における当該ＰＣＲによる増幅領域を図７に示し、遺伝子破壊株における当該ＰＣＲによる増幅領域を図８に示す。
【００４３】
遺伝子破壊株のＤＮＡと野生株の染色体ＤＮＡを鋳型として行った上記ＰＣＲの結果、野生株の増幅領域は約３．３ｋｂｐであり、遺伝子破壊株の増幅領域は約１．６ｋｂｐであった。todD及びtodE遺伝子領域は約１．７ｋｂｐであるため、この結果から、遺伝子破壊株は、todD及びtodE遺伝子領域を欠失したものと考えられる。
【００４４】
（サザンハイブリダイゼーションによる確認）
さらに、組換え候補株がtodD及びtodE遺伝子を欠損しているかどうかを、サザンハイブリダイゼーションを利用して確認した。そのために、まず、Pseudomonas putida T-57野生株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記todDE-fwプライマーとtodDE-rvプライマーとで増幅したＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼーション用のプローブとして得た。具体的に、ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動により分離し、該当サイズのバンドをカッターで切り出した。切り出したアガロースゲルからＤＮＡを、Geneclean kit(Q-Biogene)により抽出及び精製した。得られた核酸精製液１５μＬを沸騰水中に１０分間保持した後、氷上で冷却した。その後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０秒、４℃）したＤＮＡ溶液に、２μＬのHexanucleotide mixture(Roche Diagnostics)、２μＬのDNA labeling mixture(Roche Diagnostics)、及び１μＬのKlenow flagment(Roche Diagnostics)を添加し、混合した後、３７℃で１晩反応させた。その後、１．６μＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），及び６０μＬのエタノールを加え、−７０℃で２時間保持した。その後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）により得られたＤＮＡペレットを７０％エタノール溶液で洗浄し、真空乾燥後、３０μＬのＴＥバッファー（Tris-EDTAバッファー）に懸濁してプローブ溶液を得た。
【００４５】
次に、上記と同様の方法で、遺伝子破壊株と野生株との染色体ＤＮＡを抽出し、ＮｃｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とＳａｌＩ（ＴＯＹＯＢＯ）とを用いて３７℃で１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行った。その後、ゲルを１μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド溶液で染色し、Denaturation buffer（０．５Ｍ ＢａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に入れて１５分間振とうした。続いて、Neutralization buffer（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.2）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に入れて５分間振とうした。その後、３ＭＭろ紙、メンブレン、ゲル、３ＭＭろ紙、ペーパータオルの順に重ね、その上から２０×ＳＳＰＥ溶液（０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、３．６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を十分量注いだ後、２時間吸引した。
【００４６】
次に、２×ＳＳＰＥ溶液で洗浄したメンブレンを８０℃で３０分間処理した。このメンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れ、その中に１０ｍＬのhybridization buffer(250mL/L 20×SSPE、2mL/L 10%SDS、1g/L N-lauroylsarcosine Na、20g/L skim milk)を加えて密閉し、６８℃で２時間反応させた。その後、新しいハイブリダイゼーションバッグにメンブレンを移し、その中に５ｍＬのhybridization bufferを入れた。さらに、上記のようにして得られたプローブ５μＬを沸騰水中で２分間処理し、そのプローブを上記ハイブリダイゼーションバッグ内に加え、バッグを密閉して６８℃で１２時間反応させた。
【００４７】
反応後、メンブレンを０．１％ＳＤＳを含む１００ｍＬの２×ＳＳＰＥ溶液で５分間振とう洗浄し、０．１％ＳＤＳを含む新たな１００ｍＬの２×ＳＳＰＥ溶液で洗浄した。洗浄後、６８℃に保温した０．１％ＳＤＳを含む１００ｍＬの０．１×ＳＳＰＥ溶液をメンブレンに浸し、６８℃で１５分間保温した。これを再度行った後、Buffer I（0.1M Maleic acid、0.15M NaCl(pH7.5)）で洗浄し、２％スキムミルクを含むBuffer Iにメンブレンを３０分間浸した。その後、２％スキムミルクと0.2ml/L Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments(Roche Diagnostics)を含む５ｍＬのBuffer Iに３０分間浸し、１００ｍＬのBuffer Iで１５分間振とう洗浄した。２回の洗浄後、２０ｍＬのBuffer III（0.1M Tris-HCl(pH9.5)、0.1M NaCl、0.05M MgCl・6H2O）に３分間浸した。その後、メンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れ、その中に発色用buffer（10mLのbuffer IIIに、X-phosphate(50mg/mL)とNBT(75mg/mL)を３５μＬずつ添加）を５ｍＬ加えて密閉し、３７℃に保温して、メンブレンにおけるバンドを検出した。その結果を図９に示す。
【００４８】
図９に示すように、野生株（ＷＴ）では２．５ｋｂｐ、１．４ｋｂｐ及び１．０ｋｂｐの各断片が検出されたのに対し、遺伝子破壊株（ΔＤＥ）ではtodD及びtodE領域が欠失し、その領域内に存在するＮｃｏＩ及びＳａｌＩサイトが存在しないため、３．２ｋｂｐの断片が確認された（図７及び図８を参照）。この結果から、上記のようにして得られた遺伝子破壊株は、todD及びtodE遺伝子が欠損していると認められる。
【００４９】
以上のようにして、todD及びtodE遺伝子が破壊された株であるPseudomonas putida T-57 ΔtodDEを得ることができた。なお、Pseudomonas putida T-57 ΔtodDE株は、特許微生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−０１７４６）。
【００５０】
なお、本実施形態では、todD遺伝子及びtodE遺伝子の両方を欠損させたが、todD遺伝子のみを欠損させてもよい。そのために、上記ノンマーカー遺伝子欠損技術において、配列番号３のtodG5-fwプライマーの代わりに、todD遺伝子とtodE遺伝子との間の配列に対応する配列を有するプライマーと、上記配列番号４のtodA3-rvプライマーとを用いて、pBSII・todを鋳型としてtodDの領域を含まないようにインバースＰＣＲを行うことで、todDが欠損したpBSII・ΔtodDを作製してもよい。これを用いて、todD遺伝子のみが欠損したPseudomonas putida T-57菌株を作製することもできる。todD遺伝子とtodE遺伝子との間の配列に対応する配列を有するプライマーとしては、例えば配列番号７の配列を有するものを用いることができる。
【００５１】
−ΔtodDE株とΔtodE株とにおける３−ニトロフェノール生成量の比較−
本実施例では、上記のようにして得られたPseudomonas putida T-57 ΔtodDE株（以下、ΔtodDE株と呼ぶ。）を用いて、ニトロベンゼンを基質として得られた３−ニトロフェノールの生成量を測定した。また、比較例として上記ΔtodE株を用いて、同様に３−ニトロフェノールを生成させて、それぞれの生成量を比較した。
【００５２】
まず、ΔtodDE株及びΔtodE株のそれぞれを４ｍＬのＬＢ培地で１２時間培養した後、それらをそれぞれ１００ｍＬのＬＢ培地に１％植菌し、１２時間培養した。これらをそれぞれ２ＬのＬＢ培地を含む５Ｌフラスコに１％植菌し、６時間培養した。菌体を回収し、ＭＳＢ培地で洗浄した後、約３０倍に濃縮するように各菌体をＭＳＢ培地に懸濁した。これらの菌体懸濁液の１０ｍＬをそれぞれバイアル瓶に移し、そこに１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を加えた。それらに、３ｍＬのデカノールを重層し、１０μＬのニトロベンゼンを添加し、１２０ｒｐｍで撹拌し、２８℃で上記二相反応を行った。反応液を適宜採取した後、遠心分離器にて二相に分離し、３−ニトロフェノール量をＨＰＬＣによって定量した。その結果を図１０に示す。
【００５３】
図１０に示すように、二相反応を開始した約５０時間後に、ΔtodDE株は、ニトロベンゼンを基質として約６０ｍｇ／Ｌの３−ニトロフェノールを生成できることが確認できた。一方、ΔtodE株では、約５０時間後に約２０ｍｇ／Ｌの３−ニトロフェノールの生成が認められた。すなわち、ΔtodDE株は、ΔtodE株と比較して約３倍の３−ニトロフェノールを生成することができた。これは、ΔtodDE株では上記［化１］に示すニトロベンゼンからニトロカテコールを生成する経路が破壊されているためであると考えられる。
【００５４】
以上の通り、ΔtodDE株を用いることにより、簡便な方法でニトロベンゼンから高効率で３−ニトロフェノールを生成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明に係る微生物による３−ニトロフェノールの製造方法では、簡便に、３−ニトロフェノールを高い効率で得られ、３−ニトロフェノールを用いる農薬、医薬及び染料の製造業等の種々の産業において有用である。
【符号の説明】
【００５６】
１  菌体
２  基質
３  生成物
１０  水相（無機培地相）
２０  有機溶媒相
３０  撹拌装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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