(57)【要約】      （修正有）【課題】大規模バイオリアクター、大規模バイオリアクターシステム及びこれらのバイオリアクターを用いる哺乳動物細胞の大規模培養及び増殖のためのバイオリアクター及び方法の提供。【解決手段】哺乳動物細胞の培養用のバイオリアクター１であって、バイオリアクター１が少なくとも４０００リットルの体積及び少なくとも１個の頂部羽根車６８及び少なくとも１個の底部羽根車７８を有し、頂部羽根車６８が水中翼羽根車であり、頂部羽根車動力数（Ｎｐ）が、少なくとも０．１及び最大で０．９であるバイオリアクター１。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の培養用のバイオリアクターであって、前記バイオリアクター（１）が少なくとも４０００リットルの体積及び少なくとも１個の頂部羽根車（６８）及び少なくとも１個の底部羽根車（７８）を有し、前記頂部羽根車（６８）が水中翼羽根車であるバイオリアクター。
【請求項２】
バイオリアクター（１）が、頂部羽根車（６８）、好ましくは３ブレード水中翼設計羽根車、及び底部羽根車（７８）、好ましくは４ピッチブレード高堅牢性羽根車を有する請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
羽根車（６０、７０）／タンク（１０）直径比が、少なくとも０．３５及び最大で０．５５、好ましくは少なくとも０．４０及び最大で０．４８、最も好ましくは少なくとも０．４４及び最大で０．４６である請求項１又は２に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
頂部羽根車動力数（Ｎｐ）が、少なくとも０．１及び最大で０．９である請求項１〜３のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項５】
頂部羽根車フロー数（Ｎｑ）が、少なくとも０．４及び最大で０．９である請求項１〜４のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項６】
底部羽根車動力数（Ｎｐ）が、少なくとも０．５及び最大で０．９である請求項１〜５のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項７】
底部羽根車フロー数（Ｎｑ）が、少なくとも０．５０及び最大で０．８５である請求項１〜６のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項８】
バイオリアクター（１）が、少なくとも１個のスパージャー（１０８）を有する請求項１〜７のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項９】
バイオリアクター（１）が、少なくとも１個のバッフル（１２８）を有する請求項１〜８のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
バイオリアクター（１）が、好ましくは空間的に互いに分離している、アルカリ添加用の少なくとも２個のポート（１３８、１４８）を有する請求項１〜９のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
バイオリアクター（１）が、少なくとも１００００リットルの体積、最も好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のバイオリアクターで、適切な条件下、適切な培地中にて、少なくとも１個の哺乳動物細胞を培養する、哺乳動物細胞の培養及び増殖方法。
【請求項１３】
少なくとも２個の羽根車の撹拌速度が、少なくとも５５Ｗ／ｍ３及び最大で８５Ｗ／ｍ３である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターシステムであって、
ａ）少なくとも５００リットル、好ましくは少なくとも１０００リットルの体積を有する第一のバイオリアクター（１１１）が、
ｂ）前記第一のバイオリアクター（１）より大きい体積を有する少なくとも２０００リットル、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクター（１１）と連結されており、少なくとも２０００リットル、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する前記第二のバイオリアクター（１１）が、
ｃ）前記第二のバイオリアクター（１１）より大きい体積を有する少なくとも１００００リットル、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する請求項１〜１６のいずれかに記載の第三のバイオリアクター（１）に連結されているバイオリアクターシステム。
【請求項１５】
第一又は第二のバイオリアクター（１１１、１１）の少なくとも一方が、請求項１〜１１のいずれかに記載のバイオリアクターである請求項１４に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項１６】
哺乳動物細胞を培養及び増殖させる方法であって、
ａ）少なくとも５００リットルの体積、好ましくは少なくとも１０００リットルの体積を有する第一のバイオリアクターで、適切な条件下、適切な培地中にて、少なくとも１個の哺乳動物細胞を培養し、
ｂ）前記少なくとも１個の哺乳動物細胞から増殖によって得られた細胞を含む培地を、少なくとも２０００リットルの体積、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターに移動させ、
ｃ）前記移動した細胞を、少なくとも２０００リットルの体積、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターで培養し、
ｄ）段階ｃ）で得られた細胞を含む培地を、少なくとも１００００リットルの体積、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターに移動させ、
ｅ）前記移動した細胞を、少なくとも１００００リットルの体積、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターで培養する方法。
【請求項１７】
使用されるバイオリアクターの少なくとも一つが、請求項１〜１１のいずれかに記載のバイオリアクターである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培養条件が、段階ａ）、ｃ）及びｅ）のバイオリアクターで同一である請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクター並びにそのバイオリアクターを用いる哺乳動物細胞の大規模培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞培養方法においては、溶存酸素、培地ｐＨ、温度及び剪断感受性を考慮して物理化学的環境を維持することが重要である。さらに、栄養環境の維持が重要である。培養条件の維持は、哺乳動物細胞の大規模培養を実施する可能性を制限するものである。特に、濃度勾配が大規模バイオリアクターでの哺乳動物細胞の細胞増殖を阻害する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的の一つは、大規模な量での哺乳動物細胞の培養を可能とするバイオリアクター及び方法を提供することにある。さらに、大規模な量での増殖であっても至適な条件下での哺乳動物細胞の培養を可能とし、したがってバイオリアクターの大きさとは独立の方法のパフォーマンス及び製品品質を可能とするバイオリアクター及び方法を提供することも本発明の目的である。
【０００４】
本発明の一つの目的は、バイオリアクター内での十分に混合された細胞懸濁液を維持し、養分供給液を混合しながら、ｐＨ、溶存酸素圧（ＤＯＴ）及び温度等の工程パラメータに関して均一な環境での哺乳動物細胞の培養を可能とする大規模バイオリアクターを提供することにある。
【０００５】
さらに、本発明の一つの目的は、大規模で哺乳動物細胞及び哺乳動物細胞の産生物、特には哺乳動物細胞によって合成されるタンパク質、ペプチド、抗生物質又はアミノ酸の製造を可能とする装置及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、特許請求の範囲による真核細胞、特には哺乳動物細胞の培養のためのバイオリアクター、バイオリアクターシステム及び方法を提供することで、本発明の根底にある技術的問題を解決するものである。
【０００７】
本発明は、バイオリアクターが少なくとも２個の羽根車を有することを特徴とする、特に哺乳動物細胞の培養用のバイオリアクターを提供することで本発明の根底にある技術的問題を解決するものである。さらに本発明は、少なくとも２個の羽根車を有するバイオリアクター中にて適切な条件下及び適切な培地で少なくとも１個の哺乳動物細胞を培養することを特徴とする、哺乳動物細胞の培養及び増殖方法を提供することで、本発明の根底なる技術的問題を解決するものである。さらに本発明は、ａ）少なくとも５００リットルの体積を有する第一のバイオリアクターがｂ）前記第一のバイオリアクターより大きい体積を有する少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターと連結されており、前記少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターがｃ）前記第二のバイオリアクターより大きい体積を有する少なくとも２個の羽根車及び少なくとも１００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターに連結されていることを特徴とする哺乳動物細胞の培養のためのバイオリアクターシステムを提供することで本発明の根底にある技術的問題を解決するものである。
【０００８】
本発明は、ａ）少なくとも１個の哺乳動物細胞を、少なくとも５００リットルの体積を有する第一のバイオリアクターで適切な条件下に適切な培地で培養し、ｂ）前記少なくとも１個の哺乳動物細胞の増殖によって得られる前記細胞を含む前記培地を少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターに移し入れ、ｃ）前記移し入れた細胞を前記少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターで培養し、ｄ）段階ｃ）で得られた前記細胞を含む前記培地を少なくとも１００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターに移し入れ、ｅ）前記移し入れた細胞を前記少なくとも１００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターで培養することを特徴とする、哺乳動物細胞の培養及び増殖方法を提供することで本発明の根底にある技術的問題を解決するものである。
【０００９】
本発明によれば、培養細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞である。その哺乳動物細胞は、例えばヒト細胞系、マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系又はハイブリドーマ細胞系であることができる。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞系である。
【００１０】
好ましくは培養細胞を用いて、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、及び／又は組換えタンパク質、より好ましくは治療用の組換えタンパク質を製造する。当然のことながら当該細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸その他の有用な生化学的中間体もしくは代謝物を産生することができる。本発明によれば、培養細胞によって産生されるタンパク質の目標濃度は、０．５ｇ／Ｌ超、好ましくは２．０ｇ／Ｌ超、最も好ましくは１０．０ｇ／Ｌ超である。本発明による方法は、回分法又は流加回分法として用いることができる。本発明による方法で使用される細胞培地は、好ましくはタンパク質を含まない培地であるが、その設計はタンパク質を含む供給流の使用を除外するものでない。
【００１１】
本発明によれば、バイオリアクターは、具体的に哺乳動物細胞の培養及び増殖を可能とする例えば羽根車、バッフル、スパージャー及び／又はポート等の追加の装備を有する生体適合性のタンク又は容器である。好ましくは前記タンク又は容器は、管の形態であり、好ましくはタンクの頂部及び底部を構成するその管の両端にプレートがある。これらのプレートは、頂部プレート及び底プレートと称される。本発明の特に好ましい実施形態では、底プレートは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  Ｆｌａｎｇｅｄ  ａｎｄ  Ｄｉｓｈｅｄ（ＡＳＭＥ  Ｆ＆Ｄ）設計の底プレートである。頂部プレート設計は好ましくは、マンウェイに対応するものであるか、好ましくは羽根車の取り扱い／取り外しを可能とするフランジ頂部プレートである。
【００１２】
総タンク高さは、底部のタンク内側からタンク頂部のタンク内側までの接線である。
【００１３】
フリーボード高さは、バイオリアクターがその運転体積まで充填された時の液頭より上の真っ直ぐな面の長さと定義される。運転時の泡の集積、最大許容撹拌及び曝気での気体ホールドアップ、及び液体計量の誤りの程度を考慮すると、最小フリーボード高さが必要である。
【００１４】
本発明によるバイオリアクターは、好ましくは少なくとも５００リットル、より好ましくは少なくとも１０００リットル、より好ましくは少なくとも４０００リットル、さらにより好ましくは少なくとも１００００リットル、さらにより好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する。最も好ましくは、本発明によるバイオリアクターは、１０００リットル、１３０７リットル、４０００リットル、５３９８リットル、２００００リットル又は２７９３４リットルの体積を有する。
【００１５】
好ましくは、前記バイオリアクターは１０００００リットルの最大体積を有し、より好ましくは前記バイオリアクターは５００００リットルの最大体積を有し、最も好ましくは前記バイオリアクターは３００００リットルの最大体積を有する。
【００１６】
本発明によるバイオリアクターの設計は、バイオリアクター内での十分に混合された細胞懸濁液を維持し、養分供給液を混合しながら、ｐＨ、溶存酸素圧（ＤＯＴ）及び温度等の工程パラメータに関して均一な環境を確保するものである。これは、至適な細胞増殖、産生物蓄積及び産生物品質に関して必要な物理化学的環境に必要なものを提供する。本発明によるバイオリアクターの設計はさらに、幾何学的相似性の維持を確保するものである。これによって、１２リットルの実験室規模及び５００リットルのパイロット規模での規模縮小モデルを開発することが可能となる。
【００１７】
本発明による哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターは、少なくとも２個の羽根車を有する。より好ましくは当該バイオリアクターは、２個の羽根車、さらにより好ましくは頂部羽根車及び底部羽根車を有する。
【００１８】
本発明による哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターは、好ましくは少なくとも１個の頂部羽根車及び少なくとも１個の底部羽根車を有し、前記頂部羽根車は好ましくは水中翼羽根車である。
【００１９】
本発明による哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターは、好ましくは少なくとも１個の頂部羽根車及び少なくとも１個の底部羽根車を有し、前記頂部羽根車は水中翼羽根車である。
【００２０】
本発明による哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターは、好ましくは少なくとも１０００リットルの体積及び少なくとも１個の頂部羽根車及び少なくとも１個の底部羽根車を有し、前記頂部羽根車は水中翼羽根車である。
【００２１】
本発明による哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターは、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積及び少なくとも１個の頂部羽根車及び少なくとも１個の底部羽根車を有し、前記頂部羽根車は好ましくは水中翼羽根車である。
【００２２】
本発明による哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターは、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積及び少なくとも１個の頂部羽根車及び少なくとも１個の底部羽根車を有し、前記頂部羽根車は水中翼羽根車である。
【００２３】
本発明のある好ましい実施形態において、前記頂部羽根車は水中翼羽根車である。頂部羽根車は好ましくは、強いバルク混合を提供するのに用いることができる。
【００２４】
本発明のある好ましい実施形態において、前記底部羽根車は水中翼羽根車である。本発明のある好ましい実施形態において、頂部羽根車及び底部羽根車が水中翼羽根車である。
【００２５】
本発明のある好ましい実施形態において、少なくとも頂部羽根車が水中翼羽根車である。本発明のある好ましい実施形態において、全ての羽根車が水中翼羽根車である。
【００２６】
本発明のある好ましい実施形態によれば、底部羽根車は高堅牢性ピッチブレード羽根車又は高堅牢性水中翼羽根車である。底部羽根車は好ましくは、散布気体の放散に用いることができる。
【００２７】
好ましくは、水中翼羽根車はかなり大きい液体運動を提供することで、所定量の電力投入について相対的に大きいバルク混合が得られる。これは、フロー数（Ｎｑ）によっても決まり得る。
【００２８】
好ましくは、非水中翼羽根車は液体運動を提供することができるが、相対的に電力投入が大きい。これは、剪断感受性哺乳動物細胞の健全性に影響を与え得るものである。
【００２９】
本発明のある好ましい実施形態において、水中翼羽根車は下降流羽根車又は上昇流羽根車である。
【００３０】
本発明のある好ましい実施形態において、頂部羽根車は下降流羽根車である。本発明のある好ましい実施形態において、頂部羽根車は下降流軸方向水中翼羽根車である。
【００３１】
本発明のある好ましい実施形態において、頂部羽根車の引き下げ特性を用いて、十分に曝気された液体表面と液体バルクを混合する。
【００３２】
本発明のある好ましい実施形態において、水中翼羽根車は高効率水中翼羽根車である。本発明のある好ましい実施形態において、水中翼羽根車はＣｈｅｍｉｎｅｅｒ−ＳＣ−３型羽根車、ＬＩＧＨＴＮＩＮ−Ａ３１０型又はＡ５１０型羽根車、Ｐｒｏｍｉｘ−ＰＨＦ型シリーズ羽根車又はＣｌｅａｖｅｌａｎｄ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｍｉｘｅｒｓ羽根車である。
【００３３】
本発明のある好ましい実施形態において、頂部羽根車は高効率水中翼羽根車である。本発明のある好ましい実施形態において、頂部羽根車はＣｈｅｍｉｎｅｅｒ−ＳＣ−３型羽根車、ＬＩＧＨＴＮＩＮ−Ａ３１０型又はＡ５１０型羽根車、Ｐｒｏｍｉｘ−ＰＨＦ型シリーズ羽根車又はＣｌｅａｖｅｌａｎｄ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｍｉｘｅｒｓ羽根車である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係るバイオリアクターを示す図である。
【図２】本発明に係るバイオリアクターシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
頂部羽根車は好ましくは、３ブレード水中翼設計羽根車、例えばＬＩＧＨＴＮＩＮからのＡ３１０型羽根車である。底部羽根車は、好ましくは例えばＬＩＧＨＴＮＩＮからのＡ３１５型の４ピッチブレード高堅牢性羽根車である。頂部羽根車（Ｄｔｏｐ／Ｔ）及び／又は底部羽根車（Ｄｂｏｔｔｏｍ／Ｔ）の羽根車／タンク直径比は好ましくは少なくとも０．３５及び最大で０．５５であり、より好ましくは少なくとも０．４０及び最大で０．４８であり、最も好ましくは少なくとも０．４４及び最大で０．４６である。直径が０．５より大きいと軸方向流に乱れが生じることから、撹拌及び曝気が不十分となる。
【００３６】
頂部羽根車動力数（Ｎｐ）は、好ましくは少なくとも０．１及び最大で０．９であり、より好ましくは少なくとも０．２５及び最大で０．３５であり、最も好ましくは０．３である。頂部羽根車フロー数（Ｎｑ）は、好ましくは少なくとも０．４及び最大で０．９であり、より好ましくは少なくとも０．５０及び最大で０．６０であり、最も好ましくは０．５６である。底部羽根車動力数（Ｎｐ）は、好ましくは少なくとも０．５及び最大で０．９であり、より好ましくは少なくとも０．７０及び最大で０．８０であり、最も好ましくは０．７５である。底部羽根車フロー数（Ｎｑ）は、好ましくは少なくとも０．５０及び最大で０．８５であり、より好ましくは少なくとも０．７０及び最大で０．８０であり、最も好ましくは０．７３である。
【００３７】
羽根車動力数（Ｎｐ）は、回転する羽根車ブレードの運動エネルギーを流体に与える上での羽根車効率の尺度である。それは、気体分散を数量化する上で重要である。羽根車フロー数（Ｎｑ）は、羽根車のポンプ能力の尺度であり、流体のバルク運動を数量化する上で重要である。
【００３８】
少なくとも２個の羽根車の撹拌速度は、規模によって決まる。しかしながら、本発明の特に好ましい実施形態では、少なくとも２個の羽根車の撹拌速度は最大で毎分２００回（ｒｐｍ）、より好ましくは最大で１６５ｒｐｍである。
【００３９】
羽根車間隔（Ｄｓ）は、少なくとも２個の羽根車の間の空間である。それは本発明の特に好ましい実施形態では、少なくとも底部羽根車の直径（Ｄｂｏｔｔｏｍ）の１倍及び最大でＤｂｏｔｔｏｍの２倍であり、より好ましくはそれはＤｂｏｔｔｏｍの１．２２９倍又はＤｂｏｔｔｏｍの２倍である。これによって、両方の羽根車を最低接種後体積で液面下に留まらせることが可能となる。
【００４０】
上側羽根車より上の液体高さ（Ｄｏ）は、本発明の特に好ましい実施形態において少なくとも頂部羽根車の直径（Ｄｔｏｐ）の０．３倍及び最大でＤｔｏｐの２．５倍である。より好ましくはそれは、少なくともＤｔｏｐの０．５倍及び最大でＤｔｏｐの２．０倍である。
【００４１】
底部間隔（Ｄｃ）は、タンク底部と底部羽根車の中心線の間の間隔である。本発明の特に好ましい実施形態において、それは少なくともＤｂｏｔｔｏｍの０．３５倍であり、より好ましくはそれはＤｂｏｔｔｏｍの０．４倍又はＤｂｏｔｔｏｍの０．７５倍のいずれかである。
【００４２】
本発明によるバイオリアクターの羽根車の設計は、バルク混合、気体分散及び低剪断に関して至適な流体力学的特徴を与える。本発明による羽根車システムを介した撹拌により、哺乳動物細胞は均一な懸濁状態に維持される。
【００４３】
本発明によるバイオリアクターの羽根車の設計は、急速な混合を提供し、均質性を維持し、哺乳動物細胞を懸濁状態及び気泡分散状態に維持する。本発明によるバイオリアクターの羽根車の設計は、羽根車の幾何形状及び羽根車ブレード背後で生じる渦巻きもしくは渦流から生じる剪断力による細胞損傷を低減するものである。
【００４４】
本発明の特に好ましい実施形態において、前記少なくとも２個の羽根車は、頂部駆動攪拌機システムである。
【００４５】
空気、特には圧縮空気又は特定の気体、好ましくは酸素、窒素及び／又はＣＯ２の供給は、好ましくは少なくとも１個のスパージャーによって行う。
【００４６】
本発明によるバイオリアクターは、好ましくは少なくとも１個のスパージャーを有し、より好ましくは前記バイオリアクターは１個のスパージャー又は２個のスパージャーを有する。本発明によるバイオリアクターは好ましくは２個のスパージャーを有する。好ましくは前記バイオリアクターは少なくとも１個のパイプの幾何形状を有するスパージャーを有する。好ましくは前記少なくとも１個のスパージャーは、フルート型のものであるか、焼結スパージャーである。好ましくは前記少なくとも１個のスパージャーはフルート型のものである。本発明の特に好ましい実施形態において、三日月形のパイプが検討される。その三日月形の曲率は、好ましくはＤｂｏｔｔｏｍの０．８倍である。バイオリアクターの側面ポートからの設置及び取り外しを行いやすくするため、三日月形の外周は、好ましくはＤｂｏｔｔｏｍ環の０．８倍の完全な円周の２４０°である。
【００４７】
少なくとも１個のスパージャーは、培養の酸素要求を満足するだけの酸素質量移動（ＫＬａによって特徴付けられる）を提供する。少なくとも１個のスパージャーが、２０ｈ−１までのＫＬａを与えて、１時間当たりの酸素取り込み速度５ｍｍｏｌ／Ｌで２０×１０６細胞／ｍＬまでに達する培養となるようにする。二重スパージャーシステムとして用いられる２個のスパージャーは、溶存ＣＯ２の除去及び溶存酸素圧（ＤＯＴ）の制御を可能とするものである。フルート形スパージャーは、定置洗浄（ＣＩＰ）及び定置滅菌（ＳＩＰ）がより容易になるという利点を提供し、ｄＣＯ２除去で役立ち、複数回使用することから運転コストが低下する。焼結スパージャーは、より高いＫＬａ値を提供する。フルート形スパージ設計による固有ＫＬａ値が相対的に低いことは、酸素豊富空気を用いることで補償することができる。気体流速は一定の表面気体速度に基づいて高くする。
【００４８】
哺乳動物細胞の大規模培養においては、溶存酸素、培養ｐＨ及び温度、及び溶存ＣＯ２、栄養分及び代謝物濃度勾配に関して均質な物理化学的環境を維持することが重要である。適切な撹拌及び曝気を用いることで物理化学的環境の均質性を確保しながら、選択される運転時の撹拌及び曝気条件が有害な剪断環境を生じないようにすることが重要である。良好な細胞増殖を促進する均質環境の確保と剪断環境の有害効果を最小としながらの哺乳動物細胞培養方法の生産性との間の適切なバランスを、本発明では取り扱う。これは、具体的なバイオリアクター幾何形状、羽根車の設計及び位置決め、スパージャーの設計及び位置決め、並びに撹拌速度及び曝気速度についての具体的な運転範囲を規定することで達成される。
【００４９】
撹拌及びスパージされるバイオリアクターでの哺乳動物細胞に対する主たる損傷は、界面剪断によって生じるものである。界面剪断は、散布気体気泡の合体及び突発として生じる［参照：Ma N, Koelling KW, Chalmers JJ. Biotechnol Bioeng. 2002 Nov 20; 80(4): 428-37. Erratum in: Biotechnol Bioeng. 2003 Feb 5; 81(3): 379］。したがって、散布気体流及び過剰な泡蓄積を低減することが望ましい。最初に液体表面と液体バルクとの良好な混合による表面曝気の促進と次に好ましくは２個のスパージャーによる培地の分離酸素化による相対的に高い酸素駆動力による手法の組み合わせによって、界面剪断を低減することができる。
【００５０】
水中翼羽根車の規定された位置決め、特にはＤｔｏｐの約０．５倍である液体表面から下の上側羽根車より上の液体高さＤＯは、好ましくは液体表面の強力かつ連続的な液体バルクとの交換を助けることで、十分に酸素化された液体表面を酸素化が不十分な液体バルクと混合することが可能である。好ましくはＤｓ＝Ｄｂｏｔｔｏｍの１倍からＤｂｏｔｔｏｍの２倍である規定された羽根車間隔によって、上側羽根車によって生じる液体の下降流が下側羽根車への流体流を供給できるようになることで、流体バルク全体が良好に混合され、分離した混合ゾーンが生じないようにすることが可能である。好ましくはＤｃ＝Ｄの０．３５倍からＤの０．７５倍である規定の羽根車底部間隔により、バルク流が湾曲したＡＳＭＥＦ＆Ｄ底部から向きを変え、バイオリアクターの壁に沿って上昇することができるようになる。
【００５１】
制御スパージャーからの「オンデマンド」酸素化散布気体をバラストスパージャーからの非酸素化散布気体（ＣＯ２、空気及び窒素バラスト等）から分離することで、流体バルクから離れてヘッドスペースに入る前の流体バルクにおいて高酸素化スパージ気体気泡の滞留時間及び行程長さをより大きくすることができる。これによって、所定の体積質量移動係数ｋＬａに関してより大きい酸素移動速度を得ることが可能となる。連続的に液体表面及び液体バルクを引き下ろす下降流軸方向水中翼羽根車を具体的に決めることで、散布気体気泡の滞留時間及び行程長さを大きくすることができる。
【００５２】
本発明によるバイオリアクターは、好ましくは少なくとも１個のバッフル、より好ましくは少なくとも２個のバッフルを有する。本発明によるバイオリアクターは最も好ましくは４個のバッフルを有する。
【００５３】
バッフルは、垂直な放射方向に配置されたプレートである。バッフルは、ファンネル形成又は渦流形成を防止するのに用いられる。
【００５４】
本発明のある好ましい実施形態において、少なくとも１個のバッフルの長さはバイオリアクターの全直線高さ（Ｈ）の１．１倍である。バッフルの幅（Ｗ）は好ましくは、タンク内径（Ｔ）の０．１倍である。バッフル間隔（Ｗｃ）は好ましくは、タンク内径（Ｔ）の０．０１倍である。少なくとも１個のバッフルの高さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）は好ましくは、１．１×全直線高さ（Ｈ）−バイオリアクターヘッド高さ（Ｈｈ）である。したがって、Ｈｂａｆｆｌｅは好ましくは、式Ｈｂａｆｆｌｅ＝１．１×Ｈ−Ｈｈに従って計算される。
【００５５】
少なくとも１個のバッフルの厚さについては具体的に言及していないが、その厚さは流体流の放射方向成分に対する剛性を確保する必要がある。さらに、バッフルプレートがＳＩＰ時に歪むことでバッフルがタンク壁間隔に影響を与えないようにするために厚さが必要である。
【００５６】
本発明によるバイオリアクターは、好ましくはアルカリ添加用の少なくとも２個のポートを有する。より好ましくは、当該バイオリアクターは、アルカリ添加用の２個のポートを有する。最も好ましくは、当該バイオリアクターはアルカリ添加用の２個のポートを有し、第一のポートは底部羽根車の中心線に配置され、第二のポートは頂部羽根車の中心線に配置されている。好ましくはｐＨプローブが、バイオリアクターへのアルカリ添加個所に対して正反対に配置されている。
【００５７】
本発明のある好ましい実施形態において、前記バイオリアクターは１０００リットルの体積を有する。１０００リットルバイオリアクターのヘッド体積（Ｖｈ）は、好ましくは少なくとも４５リットル及び最大で６５リットル、より好ましくはヘッド体積は５５リットルである。１０００リットルバイオリアクターの底部体積（Ｖｂ）は好ましくは少なくとも４５リットル及び最大で６５リットルであり、より好ましくは底部体積は５５リットルである。本発明による１０００リットルバイオリアクターのタンク内径（Ｔ）は好ましくは少なくとも８５０ｍｍ及び最大で９００ｍｍであり、より好ましくは前記タンク内径は８６４ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターのタンク断面積（Ａ）は好ましくは少なくとも０．５５ｍ２及び最大で０．６５ｍ２であり、より好ましくは前記タンク断面積は０．５８６ｍ２である。本発明による１０００リットルの体積を有するバイオリアクターのヘッドプレートの高さであるヘッド高さ（Ｈｈ）及び／又は底プレートの高さである底部高さ（Ｈｂ）は好ましくは少なくとも１２０ｍｍ及び最大で１８０ｍｍであり、より好ましくは前記ヘッド高さ及び／又は底部高さは１５１ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターの合計タンク高さは好ましくは少なくとも２０００ｍｍ及び最大で２６００ｍｍであり、より好ましくは前記合計タンク高さは２３４７ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターの頂部羽根車直径（Ｄｔｏｐ）及び／又は底部羽根車直径（Ｄｂｏｔｔｏｍ）は好ましくは少なくとも３５０ｍｍ及び最大で４００ｍｍであり、より好ましくは前記頂部羽根車直径及び／又は底部羽根車直径は３８１ｍｍである。タンク底部と底部羽根車の中心線との間の間隔（Ｄｃ）は、本発明による１０００リットルバイオリアクターの場合、好ましくは少なくとも１２０ｍｍ及び最大で１８０ｍｍであり、より好ましくは前記間隔は１５２ｍｍである。羽根車距離とも称される少なくとも２個の羽根車の間の距離（Ｄｓ）は、本発明による１０００リットルバイオリアクターの場合、好ましくは少なくとも７３０及び最大で７９０ｍｍであり、より好ましくは前記羽根車距離は７６２ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターの羽根車の軸径は好ましくは少なくとも１０２ｍｍ及び最大で１５２ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターがバッフルを有する場合、バッフルの長さは好ましくは少なくとも２０００ｍｍ及び最大で２４００ｍｍであり、より好ましくは前記長さは２２５０ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターについてのバッフルの幅は、好ましくは少なくとも７０ｍｍ及び最大で１００ｍｍであり、より好ましくは前記幅は８６ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターにおけるバッフル間隔は好ましくは少なくとも７ｍｍ及び最大で１１ｍｍであり、より好ましくは前記バッフル間隔は９ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターにおけるバッフル高さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）は好ましくは少なくとも２０００ｍｍ及び最大で２２００ｍｍであり、より好ましくは前記バッフル高さは２０９９ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターは好ましくは少なくとも１個のスパージャーを有し、より好ましくはそれは１個のスパージャーを有する。本発明による１０００リットルバイオリアクターの少なくとも１個のスパージャーは好ましくは少なくとも１．５ｍｍ及び最大で２．５ｍｍのオリフィス径又は孔径を有し、より好ましくは前記オリフィス径又は孔径は２ｍｍである。オリフィス数又は孔数は好ましくは少なくとも２０及び最大で４０であり、より好ましくは前記オリフィス数又は孔数は３０である。スパージャー長さ（ＳＬ）は好ましくは少なくとも１５０ｍｍ及び最大で５５０ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャー長さは３０５ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターのスパージャーからタンク底部の間隔（Ｓｃ）は好ましくは少なくとも５０ｍｍ及び最大で７５ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャーからタンク底部間隔は６４ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターのスパージャーから底部羽根車間隔（Ｄｃ−Ｓｃ）は、好ましくは少なくとも７５ｍｍ及び最大で１００ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャーから底部羽根車間隔は８８ｍｍである。
【００５８】
本発明のある好ましい実施形態において、バイオリアクターは、４０００リットルの体積を有する。４０００リットルバイオリアクターのヘッド体積（Ｖｈ）は好ましくは少なくとも３４０リットル及び最大で３７０リットルであり、より好ましくは前記ヘッド体積は３５９リットルである。４０００リットルバイオリアクターの底部体積（Ｖｂ）は好ましくは少なくとも３４０リットル及び最大で３７０リットルであり、より好ましくは前記底部体積は３５９リットルである。本発明による４０００リットルバイオリアクターのタンク内径（Ｔ）は好ましくは少なくとも１６００ｍｍ及び最大で１６５０ｍｍであり、より好ましくは前記タンク内径は１６２６ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターのタンク断面積（Ａ）は好ましくは少なくとも１．９０ｍ２及び最大で２．３０ｍ２であり、より好ましくは前記タンク断面積は２．０７６ｍ２である。本発明による４０００リットルの体積を有するバイオリアクターのヘッド高さ（Ｈｈ）及び／又は底部高さ（Ｈｂ）は好ましくは少なくとも２６０ｍｍ及び最大で３００ｍｍであり、より好ましくは前記ヘッド高さ及び／又は底部高さは２８２ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターの合計タンク高さは好ましくは少なくとも２３００ｍｍ及び最大で３１００ｍｍであり、より好ましくは前記合計タンク高さは２８１７ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターの頂部羽根車直径（Ｄｔｏｐ）及び／又は底部羽根車直径（Ｄｂｏｔｔｏｍ）は好ましくは少なくとも６８０ｍｍ及び最大で７４０ｍｍであり、より好ましくは前記頂部羽根車直径及び／又は底部羽根車直径は７１０ｍｍである。タンク底部と底部羽根車の中心線の間の間隔（Ｄｃ）は、本発明による４０００リットルバイオリアクターにおいて、好ましくは少なくとも５００ｍｍ及び最大で５６０ｍｍであり、より好ましくは前記間隔は５３１ｍｍである。羽根車距離とも称される少なくとも２個の羽根車の間の距離（Ｄｓ）は、本発明による４０００リットルバイオリアクターにおいて、好ましくは少なくとも８４０ｍｍ及び最大で９００ｍｍであり、より好ましくは前記羽根車距離は８７２ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターにおける羽根車軸径は好ましくは少なくとも５１ｍｍ及び最大で６４ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターがバッフルを有する場合、バッフルの長さは好ましくは少なくとも２２００ｍｍ及び最大で２６００ｍｍであり、より好ましくは前記長さは２４７７ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターにおけるバッフルの幅は好ましくは少なくとも１５０ｍｍ及び最大で１８０ｍｍであり、より好ましくは前記幅は１６３ｍｍである。バッフル間隔は本発明による４０００リットルバイオリアクターにおいては、好ましくは少なくとも１２ｍｍ及び最大で２０ｍｍであり、より好ましくは前記バッフル間隔は１６ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターにおけるバッフル高さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）は好ましくは少なくとも２１００ｍｍ及び最大で２３００ｍｍであり、より好ましくは前記バッフル高さは２１９５ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターは好ましくは少なくとも１個のスパージャーを有し、より好ましくはそれは１個のスパージャーを有する。本発明による４０００リットルバイオリアクターの少なくとも１個のスパージャーは好ましくは少なくとも１．５ｍｍ及び最大で２．５ｍｍのオリフィス径又は孔径を有し、より好ましくは前記オリフィス径又は孔径は２ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターにおけるオリフィス数又は孔数は好ましくは少なくとも８０及び最大で１２０であり、より好ましくは前記オリフィス数又は孔数は１００である。スパージャー長さ（ＳＬ）は好ましくは少なくとも２５０ｍｍ及び最大で８００ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャー長さは５６８ｍｍである。本発明による４０００リットルバイオリアクターのスパージャーからタンク底部間隔（Ｓｃ）は好ましくは少なくとも３１５ｍｍ及び最大で３６０ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャーからタンク底部間隔は３３７ｍｍである。本発明による１０００リットルバイオリアクターのスパージャーから底部羽根車間隔（Ｄｃ−Ｓｃ）は好ましくは少なくとも１８０ｍｍ及び最大で２０５ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャーから底部羽根車間隔は１９４ｍｍである。
【００５９】
本発明のある好ましい実施形態において、バイオリアクターは２００００リットルの体積を有する。２００００リットルバイオリアクターのヘッド体積（Ｖｈ）は好ましくは少なくとも１６００リットル及び最大で２０００リットルであり、より好ましくは前記ヘッド体積は１８０３リットルである。２００００リットルバイオリアクターの底部体積（Ｖｂ）は好ましくは少なくとも１６００リットル及び最大で２０００リットルであり、より好ましくは前記底部体積は１８０３リットルである。本発明による２００００リットルバイオリアクターのタンク内径（Ｔ）は好ましくは少なくとも２５００ｍｍ及び最大で３０００ｍｍであり、より好ましくは前記タンク内径は２７９４ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターのタンク断面積（Ａ）は好ましくは少なくとも５．８ｍ２及び最大で６．５ｍ２であり、より好ましくは前記タンク断面積は６．１３１ｍ２である。本発明による２００００リットルの体積を有するバイオリアクターのヘッド高さ（Ｈｈ）及び／又は底部高さ（Ｈｂ）は好ましくは少なくとも４６０ｍｍ及び最大で５００ｍｍであり、より好ましくは前記ヘッド高さ及び／又は底部高さは４８５ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターの合計タンク高さは好ましくは少なくとも４８００ｍｍ及び最大で５１００ｍｍであり、より好ましくは前記合計タンク高さは４９３３ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターの頂部羽根車直径（Ｄｔｏｐ）及び／又は底部羽根車直径（Ｄｂｏｔｔｏｍ）は好ましくは少なくとも１１００ｍｍ及び最大で１３００ｍｍであり、より好ましくは前記頂部羽根車直径及び／又は底部羽根車直径は１２１９ｍｍである。タンク底部と底部羽根車の中心線の間の間隔（Ｄｃ）は本発明による２００００リットルバイオリアクターにおいては、好ましくは少なくとも８９０ｍｍ及び最大で９４５ｍｍであり、より好ましくは前記間隔は９１３ｍｍである。羽根車距離とも称される少なくとも２個の羽根車の間の距離（Ｄｓ）は、本発明による２００００リットルバイオリアクターにおいて、好ましくは少なくとも１２００ｍｍ及び最大で１７００ｍｍであり、より好ましくは前記羽根車距離は１４９８ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターにおける羽根車軸径は好ましくは少なくとも５１ｍｍ及び最大で６４ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターがバッフルを有する場合、バッフルの長さは好ましくは少なくとも４０００ｍｍ及び最大で４６００ｍｍであり、より好ましくは前記長さは４３６５ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターについてのバッフルの幅は好ましくは少なくとも２６０ｍｍ及び最大で２９０ｍｍであり、より好ましくは前記幅は２７９ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターについてのバッフル間隔は好ましくは少なくとも２０ｍｍ及び最大で３５ｍｍであり、より好ましくは前記バッフル間隔は２８ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターについてのバッフル高さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）は好ましくは少なくとも３６００ｍｍ及び最大で４０５０ｍｍであり、より好ましくは前記バッフル高さは３８８２ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターは好ましくは少なくとも１個のスパージャーを有し、より好ましくはそれは２個のスパージャーを有する。本発明による２００００リットルバイオリアクターが２個のスパージャーを有する場合、１個は好ましくは制御スパージャーであり、１個は好ましくはバラストスパージャーである。本発明による２００００リットルバイオリアクターにおける制御スパージャーは好ましくは少なくとも３ｍｍ及び最大で５ｍｍのオリフィス径又は孔径を有し、より好ましくは前記オリフィス径又は孔径は４ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターにおけるバラストスパージャーは、好ましくは少なくとも５ｍｍ及び最大で７ｍｍのオリフィス径又は孔径を有し、より好ましくは前記オリフィス径又は孔径は６ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターにおける制御スパージャーのオリフィス／孔数は好ましくは少なくとも２３０及び最大で２７０であり、より好ましくは前記オリフィス数又は孔数は２５０である。本発明による２００００リットルバイオリアクターにおけるバラストスパージャーのオリフィス−孔数は好ましくは少なくとも８５及び最大で１１５であり、より好ましくは前記オリフィス数又は孔数は１００である。制御及び／又はバラストスパージャーにおけるスパージャー長さ（ＳＬ）は好ましくは少なくとも５００ｍｍ及び最大で２０００ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャー長さは１０７７ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターのスパージャーからタンク底部間隔（Ｓｃ）は好ましくは制御及び／又はバラストスパージャーにおいて、少なくとも５６０ｍｍ及び最大で６２０ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャーからタンク底部間隔は５９３ｍｍである。本発明による２００００リットルバイオリアクターのスパージャーから底部羽根車間隔（Ｄｃ−Ｓｃ）は、制御及び／又はバラストスパージャーにおいては、好ましくは少なくとも３００ｍｍ及び最大で３４０ｍｍであり、より好ましくは前記スパージャーから底部羽根車間隔は３２０ｍｍである。別個のスパージャーであるバラストスパージャーからバラストを加える上での要件によって、酸素又は酸素豊富ＤＯＴ要求気体がバラスト気体によって希釈されることが防止される。これによって、スパージャーから生じる気泡の酸素濃度勾配が最大となることから、最良の酸素移動速度（ＯＴＲ）が確保される。第二に、バラストスパージャーを用いることで、スパージャーを異なる位置に配置することで、ｐＣＯ２制御のための所望のバラストの供給でのＤＯＴ制御への影響を回避することが可能となる。バラストスパージャーは、制御スパージャーから独立に設計することができる。
【００６０】
本発明によるバイオリアクター設計を用いると、異なる継代培養比を実施することができる。特に好ましい実施形態では、実施される継代培養比は、少なくとも１／５（２０体積％）及び最大で１／９（１１体積％）、より好ましくは１／５（２０体積％）又は１／９（１１体積％）の継代培養比である。
【００６１】
本発明はさらに、本発明によるバイオリアクターにおいて適切な条件下、適切な培地で、少なくとも１個の哺乳動物細胞を培養することを特徴とする哺乳動物細胞の培養及び増殖方法を含む。
【００６２】
本発明によるバイオリアクターには、少なくとも２個の羽根車を有し、上記で記載の少なくとも一つの特徴又は異なる特徴の組み合わせを示す全てのバイオリアクターが含まれる。
【００６３】
本発明による方法では、バイオリアクターの少なくとも２個の羽根車の撹拌速度は、好ましくは少なくとも５５Ｗ／ｍ３及び最大で８５Ｗ／ｍ３である。好ましくは、少なくとも５×１０−５ｍ／ｓ、より好ましくは少なくとも１０×１０−５ｍ／ｓの速度で空気を培地に拡散させる。
【００６４】
本発明の特に好ましい実施形態において、好ましくは互いに空間的に分離しているアルカリを分配するための二つの添加ポートからアルカリを加える。これによって、タンク中での再循環時間が長くなる場合にアルカリの混合がより迅速となる。ＣＯ２は好ましくは制御スパージャーを介して加える。
【００６５】
アルカリ及び／又はＣＯ２は好ましくは、培地のｐＨを調節するのに用いられる。
【００６６】
タンク底部から９１３ｍｍの下側ポートリングに制御プローブ及びバックアッププローブがあることが好ましい。
【００６７】
本発明のある好ましい実施形態において、本発明による方法は、１０００リットルの体積を有するバイオリアクターで行う。１０００リットルバイオリアクターを用いる当該方法で使用される培地の体積は、好ましくは接種前の間は５０リットルから２５０リットルである。接種後の期間では、培地の体積は好ましくは少なくとも３００リットル及び最大で９６０リットルである。移動前／回収期では、１０００リットルバイオリアクターでの培地の体積は好ましくは少なくとも３００リットル及び最大で９６０リットルである。本発明による１０００リットルの体積を有するバイオリアクターにおける最小運転体積（Ｖｍｉｎ）は好ましくは８０リットルから１２０リットルであり、より好ましくは前記最小運転体積は１００リットルであり、最大運転体積（Ｖ）は好ましくは少なくとも９００リットル及び最大で１１００リットルであり、最大運転体積はより好ましくは１０００リットルである。最小攪拌体積は好ましくは少なくとも２３０リットル及び最大で２５５リットルであり、より好ましくは前記最小攪拌体積は２４５リットルである。最小運転体積での液体高さ（Ｈｍｉｎ）は、１０００リットルの体積を有するバイオリアクターでは、好ましくは少なくとも２１０ｍｍ及び最大で２４０ｍｍであり、より好ましくは最小運転体積での前記液体高さは２２８ｍｍである。１０００リットルの体積を有するバイオリアクターにおける最大運転体積での液体高さ（ＨＬ）は好ましくは少なくとも１５００ｍｍ及び最大で１９００ｍｍであり、より好ましくは最大運転体積での前記液体高さは１７６４ｍｍである。最小アスペクト比（Ｈｍｉｎ／Ｔ）は好ましくは少なくとも０．１５及び最大で０．１９であり、より好ましくは前記最小アスペクト比は０．１７である。本発明による方法で使用される体積１０００リットルを有するバイオリアクターについての最大アスペクト比（ＨＬ−Ｔ）は好ましくは少なくとも１．８及び最大で２．１であり、より好ましくは前記最大アスペクト比は１．９６である。フリーボード体積は好ましくは少なくとも２７０リットル及び最大で３１０リットルであり、より好ましくは前記フリーボード体積は２９３リットルである。フリーボード高さは好ましくは少なくとも４５０ｍｍ及び最大で５５０ｍｍであり、より好ましくは前記フリーボード高さは５００ｍｍである。合計直線高さ（Ｈ）は好ましくは少なくとも１９００ｍｍ及び最大で２２００ｍｍであり、より好ましくは前記合計直線高さは２０４５ｍｍである。上側プローブ又はサンプルリングの高さは好ましくは少なくとも９００ｍｍ及び最大で１２００ｍｍ、より好ましくは上側プローブ又はサンプルリングの前記高さは１０９３ｍｍである。下側プローブ−サンプルリングの高さは好ましくは少なくとも１５２ｍｍ及び最大で２８６ｍｍである。
【００６８】
本発明のある好ましい実施形態において、本発明による方法は、４０００リットルの体積を有するバイオリアクターで行う。４０００リットルバイオリアクターを用いる当該方法で使用される培地の体積は、好ましくは接種前の間は１９１４リットルから３０７７リットルである。接種後の期間では、培地の体積は好ましくは少なくとも２１５３リットル及び最大で３８４６リットルである。移動前／回収期では、４０００リットルバイオリアクターでの培地の体積は好ましくは少なくとも２１５３リットル及び最大で３８４６リットルである。本発明による４０００リットルの体積を有するバイオリアクターにおける最小運転体積（Ｖｍｉｎ）は好ましくは１５００リットルから２２００リットルであり、より好ましくは前記最小運転体積は１９００リットルであり、最大運転体積（Ｖ）は好ましくは少なくとも３８００リットル及び最大で４２００リットルであり、最大運転体積はより好ましくは４０００リットルである。最小攪拌体積は好ましくは少なくとも１５００リットル及び最大で１８００リットルであり、より好ましくは前記最小攪拌体積は１６４５リットルである。最小運転体積での液体高さ（Ｈｍｉｎ）は、４０００リットルの体積を有するバイオリアクターでは、好ましくは少なくとも８００ｍｍ及び最大で１２００ｍｍであり、より好ましくは最小運転体積での前記液体高さは１０２４ｍｍである。４０００リットルの体積を有するバイオリアクターにおける最大運転体積での液体高さ（ＨＬ）は好ましくは少なくとも１８００ｍｍ及び最大で２２００ｍｍであり、より好ましくは最大運転体積での前記液体高さは２０３４ｍｍである。最小アスペクト比（Ｈｍｉｎ／Ｔ）は好ましくは少なくとも０．５５及び最大で０．７５であり、より好ましくは前記最小アスペクト比は０．６３である。本発明による方法で使用される体積４０００リットルを有するバイオリアクターについての最大アスペクト比（ＨＬ−Ｔ）は好ましくは少なくとも１．１及び最大で１．４であり、より好ましくは前記最大アスペクト比は１．２５である。フリーボード体積は好ましくは少なくとも８５０リットル及び最大で１２５０リットルであり、より好ましくは前記フリーボード体積は１０３９リットルである。フリーボード高さは好ましくは少なくとも４５０ｍｍ及び最大で５５０ｍｍであり、より好ましくは前記フリーボード高さは５００ｍｍである。合計直線高さ（Ｈ）は好ましくは少なくとも２０００ｍｍ及び最大で２４００ｍｍであり、より好ましくは前記合計直線高さは２２５２ｍｍである。上側プローブ又はサンプルリングの高さは好ましくは少なくとも１２００ｍｍ及び最大で１６００ｍｍ、より好ましくは上側プローブ又はサンプルリングの前記高さは１４０３ｍｍである。下側プローブ又はサンプルリングの高さは好ましくは少なくとも５００ｍｍ及び最大で５５０ｍｍであり、より好ましくは下側プローブ又はサンプルリングの前記高さは５３１ｍｍである。
【００６９】
本発明のある好ましい実施形態において、本発明による方法は、２００００リットルの体積を有するバイオリアクターで行う。２００００リットルバイオリアクターを用いる当該方法で使用される培地の体積は、好ましくは接種前の間は１３９１３リットルから１７０９６リットルである。接種後の期間では、培地の体積は好ましくは少なくとも１７３９１リットル及び最大で１９２３１リットルである。移動前／回収期では、２００００リットルバイオリアクターでの培地の体積は好ましくは少なくとも２００００リットル及び最大で２１７３９リットルである。本発明による２００００リットルの体積を有するバイオリアクターにおける最小運転体積（Ｖｍｉｎ）は好ましくは９０００リットルから１６０００リットルであり、より好ましくは前記最小運転体積は１３０００リットルであり、最大運転体積（Ｖ）は好ましくは少なくとも１９０００リットル及び最大で２５０００リットルであり、最大運転体積はより好ましくは２２０００リットルである。最小攪拌体積は好ましくは少なくとも８１００リットル及び最大で８５００リットルであり、より好ましくは前記最小攪拌体積は８３７９リットルである。最小運転体積での液体高さ（Ｈｍｉｎ）は、２００００リットルの体積を有するバイオリアクターでは、好ましくは少なくとも２１００ｍｍ及び最大で２５００ｍｍであり、より好ましくは最小運転体積での前記液体高さは２３０９ｍｍである。２００００リットルの体積を有するバイオリアクターにおける最大運転体積での液体高さ（ＨＬ）は好ましくは少なくとも３５５０ｍｍ及び最大で３９５０ｍｍであり、より好ましくは最大運転体積での前記液体高さは３７７７ｍｍである。最小アスペクト比（Ｈｍｉｎ／Ｔ）は好ましくは少なくとも０．７０及び最大で０．９９であり、より好ましくは前記最小アスペクト比は０．８３である。本発明による方法で使用される体積２００００リットルを有するバイオリアクターについての最大アスペクト比（ＨＬ−Ｔ）は好ましくは少なくとも１．２及び最大で１．５であり、より好ましくは前記最大アスペクト比は１．３５である。フリーボード体積は好ましくは少なくとも５７５０リットル及び最大で６５００リットルであり、より好ましくは前記フリーボード体積は６１３１リットルである。フリーボード高さは好ましくは少なくとも９００ｍｍ及び最大で１１００ｍｍであり、より好ましくは前記フリーボード高さは１０００ｍｍである。合計直線高さ（Ｈ）は好ましくは少なくとも３７００ｍｍ及び最大で４１００ｍｍであり、より好ましくは前記合計直線高さは３９６８ｍｍである。上側プローブ又はサンプルリングの高さは好ましくは少なくとも２２００ｍｍ及び最大で２６５０ｍｍ、より好ましくは上側プローブ又はサンプルリングの前記高さは２４１１ｍｍである。下側プローブ又はサンプルリングの高さは好ましくは少なくとも８８０ｍｍ及び最大で９４０ｍｍであり、より好ましくは下側プローブ又はサンプルリングの前記高さは９１３ｍｍである。
【００７０】
２００００リットルの体積を有するバイオリアクターに関して、使用される好ましい接種比は１１体積％（１／９希釈）又は２０体積％（１／５希釈）であり、接種後体積の４体積％から２５体積％の供給を行うのが好ましい。２００００リットルバイオリアクターでの接種後体積は好ましくは、１５％までの供給を行うように調節することで、全ての供給物を加えた後に、回収時の最終体積が２００００リットルで終了するようにする。しかしながら、１５体積％より大きい供給量の場合、接種後体積は好ましくは１５体積％供給量に関して調節するが、供給後は最終回収前体積は最小で２００００リットル、最大で２２０００リットルである。２００００リットルバイオリアクターは、バッチ終了後に合計２００００リットルから２２０００リットルを保持することが期待される。
【００７１】
２００００リットルの体積を有するバイオリアクターは好ましくは、１０から１５日間にわたり回分式又は流加回分式で運転する。
【００７２】
本発明はさらに、ａ）少なくとも５００リットル、好ましくは少なくとも１０００リットルの体積を有する第一のバイオリアクターがｂ）前記第一のバイオリアクターより大きい体積を有する少なくとも２０００リットル、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターと連結されており、前記少なくとも２０００リットル、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターがｃ）前記第二のバイオリアクターより大きい体積を有する少なくとも２個の羽根車及び少なくとも１００００リットル、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターに連結されていることを特徴とする哺乳動物細胞の培養のためのバイオリアクターシステムをも含む。
【００７３】
本発明のある好ましい実施形態において、前記バイオリアクターシステムは、前記バイオリアクターのうちの少なくとも一つが本発明によるバイオリアクターであることを特徴とする。より好ましくは、前記バイオリアクターシステムの全てのバイオリアクターが本発明によるバイオリアクターである。
【００７４】
本発明によるバイオリアクターは、この文脈において、本説明、実施例及び特許請求の範囲に記載の全てのバイオリアクターである。
【００７５】
本発明によるバイオリアクターシステムは、バイオリアクタートレイン又は装置とも称される。
【００７６】
バイオリアクタートレインは好ましくはステージとも称される各種バイオリアクターを有する。少なくとも５００リットル、好ましくは少なくとも１０００リットルの体積を有するバイオリアクターは、ステージＮ−３及び／又はＮ−２に相当する。少なくとも２０００リットル、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有するバイオリアクターは、ステージＮ−１に相当する。少なくとも１００００リットル、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有するバイオリアクターはステージＮに相当する。
【００７７】
バイオリアクタートレインの設計は、バイオリアクター内での良好に混合された細胞懸濁液及び混合養分供給を維持しながらｐＨ、溶存酸素圧（ＤＯＴ）及び温度等の工程パラメータに関して均質な環境を確保する必要性に基づくものである。バイオリアクタートレインのバイオリアクターは好ましくは、幾何学的類似性を示す。これにより、例えば１２リットル実験室規模又は５００リットルのパイロット規模での規模縮小モデルを開発することが可能となる。ステージＮ−３、Ｎ−２及びＮ−１のバイオリアクターはシードバイオリアクターとして用いる。ステージＮのバイオリアクターは製造バイオリアクターとして用いる。シード及び製造バイオリアクターの設計は好ましくは、同じ原理に基づいたものである。しかしながら、処理における柔軟性を可能とするためには、若干の逸脱が必要となる可能性がある。
【００７８】
本発明のある好ましい実施形態において、アスペクト比ＨＬ／Ｔは少なくとも０．１７及び最大で１．９６である。
【００７９】
本発明のある好ましい実施形態においては、さらに別のバイオリアクター、特にはステージＮ−４に相当する５０リットルバイオリアクターがある。
【００８０】
本発明のある好ましい実施形態において、Ｎ−４バイオリアクターはＳ−２００シードウェーブバイオリアクター又は１００リットル撹拌タンクリアクターである。
【００８１】
本発明のある好ましい実施形態において、液体、例えば培地は、空気圧式流動ポンプ又は蠕動ポンプによって一つのバイオリアクターから別のバイオリアクターに移動させることができる。
【００８２】
本発明はさらに、ａ）少なくとも１個の哺乳動物細胞を、少なくとも５００リットルの体積、好ましくは少なくとも１０００リットルの体積を有する第一のバイオリアクターで適切な条件下に適切な培地で培養し、ｂ）前記少なくとも１個の哺乳動物細胞からの増殖によって得られる前記細胞を含む前記培地を少なくとも２０００リットルの体積、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターに移し入れ、ｃ）前記移し入れた細胞を前記少なくとも２０００リットルの体積、好ましくは少なくとも４０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターで培養し、ｄ）段階ｃ）で得られた前記細胞を含む前記培地を少なくとも１００００リットルの体積、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターに移し入れ、ｅ）前記移し入れた細胞を前記少なくとも１００００リットルの体積、好ましくは少なくとも２００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターで培養することを特徴とする、哺乳動物細胞の培養及び増殖方法を含む。
【００８３】
本発明のある好ましい実施形態において、前記方法は、使用されるバイオリアクターのうちの少なくとも一つが本発明によるバイオリアクターであり、より好ましくは使用される全てのバイオリアクターが本発明によるバイオリアクターであることを特徴とする。
【００８４】
本発明によるバイオリアクターは、この文脈において、本説明、実施例及び特許請求の範囲に記載の全てのバイオリアクターである。
【００８５】
段階ｅ）のバイオリアクターは好ましくは、回分方式又は流加回分方式で運転される。段階ｅ）では、細胞は好ましくは１０から１５日間培養する。
【００８６】
段階ａ）は、ステージＮ−３及び／又はＮ−２とも称される。段階ｃ）は、ステージＮ−１とも称される。段階ｅ）はステージＮとも称される。
【００８７】
好ましくは段階ａ）、ｃ）及びｅ）のバイオリアクターでの培養条件は同じである。より好ましくは、段階ａ）、ｃ）及びｅ）のバイオリアクターでの培養条件は、ｐＨ、溶存酸素圧及び温度等の工程パラメータに関して均質な環境を有する。好ましくは段階ａ）、ｃ）及びｅ）のバイオリアクターでのｐＨ、溶存酸素圧及び温度は同じである。
【００８８】
本発明のある好ましい実施形態において、移動段階ｂ）及び／又はｄ）後の接種比は、少なくとも１０体積％、より好ましくは少なくとも１１体積％（１／９希釈）及び最大で３０体積％、より好ましくは２０体積％（１／５希釈）である。
【００８９】
好ましくは、段階ｂ）及びｄ）では、培地全体又は培地の一部のみを移動させる。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施形態は、下位クレームの主題である。
【実施例】
【００９１】
下記の実施例及び添付の図において、本発明をより詳細に説明する。
【００９２】
図１は、本発明によるバイオリアクターを示す。１はバイオリアクターである。１０はタンクの直径（Ｔ）である。２０はバイオリアクターの合計直線高さ（Ｈ）である。３０はバイオリアクターの底部高さ（Ｈｂ）である。４０はバイオリアクターのヘッド高さ（Ｈｈ）である。５０は、最大運転体積での液体高さ（ＨＬ）である。６０は、頂部羽根車直径（Ｄｔｏｐ）である。６８は頂部羽根車である。７０は底部羽根車直径（Ｄｂｏｔｔｏｍ）である。７８は底部羽根車である。８０は、タンク底部と底部羽根車の中心線との間の間隔（Ｄｃ）である。９０は羽根車距離（Ｄｓ）である。１００は、液体表面下の頂部羽根車の間隔（Ｄｏ）である。１０８はスパージャーである。１１０は、スパージャーからタンク底部の間隔（Ｓｃ）である。１２０は、スパージャーから底部羽根車の間隔（Ｄｃ−Ｓｃ）である。１２８はバッフルである。１３８は、下側リングに配置されたポートである。１４８は、頂部羽根車６８の中心線に配置されたポートである。
【００９３】
図２は、本発明のバイオリアクターシステムを示す。１１１は、１０００リットルの体積を有するバイオリアクターである。１１は、４０００リットルの体積を有するバイオリアクターである。１は、２００００リットルの体積を有する本発明によるバイオリアクターである。
【００９４】
実施例１：２００００リットルバイオリアクター
２００００リットルバイオリアクターを、１０から１５日間にわたり回分方式又は流加回分方式で運転して哺乳動物細胞の培養を行う。哺乳動物細胞は、羽根車システムを介した撹拌によって均質懸濁液に維持する。
【００９５】
容器の幾何形状
２００００リットルバイオリアクターの容器の幾何形状は、許容されるアスペクト比が達成されるまで最大作業体積、フリーボード直線側部距離、アスペクト比ＨＬ／Ｔ及び羽根車からタンクの直径、Ｄ／Ｔ比を変える反復設計基準によって決定した。
【００９６】
バイオリアクターアスペクト比ＨＬ／Ｔ
この非常に重要な設計パラメータにより、バイオリアクターの幾何形状の特徴付けが可能となる。相対的に高いアスペクト比を有するタンクは、より長い気体滞留時間を提供することで、より大きいＫＬａとすることができる。しかしながら、ヘッド圧が高くなると、可溶性気体の蓄積が生じ得る。タンクにおけるアスペクト比ＨＬ／Ｔが相対的に低くなると、気体滞留時間が短くなって、曝気により多くの気体流が必要となり、泡の蓄積がさらに多くなる可能性がある。低アスペクト比では表面破壊及び渦流形成が下側羽根車回転で起こることから、ＫＬａを大きくするための羽根車駆動撹拌もＨＬ／Ｔによって制限される。したがって、アスペクト比の選択は、表１で強調した問題について若干考えた上で経験に基づくところが大きい。
【表１】
2015043776.tif 000003
【００９７】
表２に、通常の処理の際に各種運転体積での２００００リットルバイオリアクターにおけるアスペクト比を記載してある。アスペクト比を５００リットル規模で調べたところ、表面気体速度及び単位体積当たり電力を一定に維持される場合、ＫＬａは一定のままである。
【表２】
2015043776.tif 000004
【００９８】
タンク直径
タンク直径を変えて、至適なアスペクト比ＨＬ／Ｔを得る。タンク内径（ＩＤ）に対する変更は、許容されるアスペクト比及びプラント設置面積によって制限される。ＩＤは２．７９４ｍである。
【００９９】
タンク高さ
最大運転体積、アスペクト比ＨＬ／Ｔ、フリーボード直線側面長さ、底部及び頂部プレート設計からタンク高さを決定する。最終タンク高さは、泡用の予備体積（volumetric contingency）、プラント高さ及び羽根車軸長さから決定される妥協的値である。底部からヘッドの接線までのタンク高さは４．９３３ｍである。
【０１００】
フリーボード高さ
フリーボード高さは、バイオリアクターがその最大運転体積まで充填された時の液体ヘッドより上の直線側面の長さと定義される。これは、下記のものの程度を考慮することで決定される。
【０１０１】
・運転時の泡蓄積
・最大許容撹拌及び曝気での気体ホールドアップ
・液体計量における誤差。
【０１０２】
フルスケールで工程を試験的に行いながらそれぞれの正確な寄与についてわからない場合は、通常は推算を行う。フリーボード高さの量は、頂部駆動システムにおける羽根車軸長さを短くする願望と均衡を取るものであり、余分な長さは利用可能な機械的密閉の設計及び選択、羽根車リングの定常的な支持及び安定化の要件を複雑化する可能性がある。したがって、１０００ｍｍの最小フリーボード高さ（又は６１００リットルの容積又は最大運転体積の２８体積％）を用いる。
【０１０３】
頂部及び底プレート
所望の機械的強度、自由排液クリーン設計及び流体流について考察して、頂部及び底プレートの設計の選択を行った。規模縮小とフルスケールの間の一貫したプレート設計の維持は、幾何学的類似性の維持に寄与するものである。底プレートは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  Ｆｌａｎｇｅｄ  ａｎｄ  Ｄｉｓｈｅｄ（ＡＳＭＥ  Ｆ＆Ｄ）設計のものである。頂部プレート設計は、マンウェイに対応するものであるか、羽根車の取り扱い／取り外しを可能とするフランジ頂部プレートである。
【０１０４】
バイオリアクター撹拌要件
バイオリアクターの撹拌は、急速な混合を達成し、均質性を維持し、哺乳動物細胞を懸濁状態に維持し、気泡を分散状態に維持するためのものである。上記の目的を達成する上で根底にある問題は、羽根車の幾何形状及び羽根車ブレードの背後で生じる渦巻きもしくは渦流から生じる剪断力による細胞損傷の低減である。適切な羽根車の種類を選択することで、上記目的の妥協点に達することができる。
【０１０５】
底部駆動と頂部駆動の羽根車軸
バイオリアクターの頂部又は底部から攪拌機軸を駆動する決定は重要であり、表３に明示した多くの問題を検討して決める。
【表３】
2015043776.tif 000005
【０１０６】
頂部取り付け羽根車軸は、底部取り付けのものより長くなる傾向があり、それによって軸は重くなり直径が大きくなる。さらに、軸長さは機械的シールの二つの面間の固有の間隔とともに、定常的な支持及び安定化リングによって過剰な「軸揺れ」を防止する上での要件を決定し得るものである。攪拌機、ギアボックス及びシールアセンブリ周囲の使える空間によって、整備及び保守が影響を受け、オンサイトでの軸取り付け及び取り外しはプラント高さによって制限を受ける。
【０１０７】
タンク底部でのシール及び羽根車軸の突出部によって、タンク底部付近のスパージャーの配置が制限される。この寸法は、タンクの流体力学に影響を与えることから、至適な設計を特定する上では、その変化に対する許容性が重要である。
【０１０８】
液体ヘッドとともに下降ポンプ送り羽根車の下方負荷は、シールの可動面と固定面の間の累積負荷が大きく（上昇ポンプ送り又は頂部取り付け軸と比較して）、結果的にシール面の摩耗が大きくなる。シールを供給する復水ラインでの過圧がさらに失われると、培地がシール内に浸透することになり得る。これによって、液面下シールが衛生性の低い設計となる。
【０１０９】
液面下シールによって、回収排液バルブの位置を妥協することで、自由排液バイオリアクターの設計が複雑となる。第二に、回収ノズルの直径が制限され得ることから、回収流の流量が制限されることになる。したがって、頂部取り付け羽根車軸は、２００００リットルバイオリアクターで用いる。
【０１１０】
バッフル
中心の取り付け羽根車についてのバッフル要件は、渦流形成を防止する上で必須である。バッフル関連の非常に重要な問題は、バッフル数、バッフル幅（Ｗ）、バッフル長さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）及びバッフルからタンク壁間隔（Ｗｃ）である。
【０１１１】
０．１×Ｔ又は２７９ｍｍ幅１．１×Ｈ−Ｈｈ又は３８８２ｍｍ高さであり、バッフルからタンク壁間隔Ｗｃが０．０１×Ｔ又は２８ｍｍである４個の等間隔に配置されたバッフルが推奨される。
【０１１２】
バッフルの厚さについては具体的には指定しないが、厚さによって流体流の放射方向成分に対する剛性を確保する必要がある。さらに、厚さによって、ＳＩＰ時にバッフルプレートが歪んでバッフルからタンク壁間隔に影響を与えないようにする必要がある。
【０１１３】
羽根車の種類
Ｒｕｓｈｔｏｎ（又はＲｕｓｈｔｏｎ型）等の高剪断羽根車は、気体分散に関して強力な放散を提供するが、混合及び均質性に必要な軸方向流に欠けている。さらに、高剪断羽根車からの撹拌は、過剰な細胞損傷の危険性を有する。
【０１１４】
表４は、等価な流体力学及び細胞増殖成績を与えた実験室規模（１２．２リットル）で調べた羽根車を示したものである。水中翼は、高堅牢性ピッチブレード羽根車の上に取り付けている。
【０１１５】
表４に記載のＤ／Ｔ比のＬｉｇｈｔｎｉｎ  Ａ３１０及びＡ３１５を、バイオリアクターを用いている。
【表４】
2015043776.tif 000006
【０１１６】
羽根車／タンク直径、Ｄ／Ｔ比
軸方向流羽根車の直径は、０．５×Ｔ未満であることが推奨される。これより大きい直径では軸方向流に乱れが生じることから、撹拌及び曝気が不十分となる。
【０１１７】
バイオリアクター中への電力散逸及びレイノルズ数も、乱流（負荷）形態を維持する上で十分に高いものである必要がある。したがって、羽根車直径の選択は、バイオリアクターの流体力学的特徴を超えることなく十分な均質混合を確保する上で十分に大きい直径の選択の間の妥協である。それには、軸方向流の絞り、不十分な電力散逸、羽根車先端速度の上限超え及び混合が不十分な層流ゾーンの形成等がある。
【０１１８】
直径を選択したら、規模縮小パイロット容器間で一定のＤ／Ｔ比を維持することが、規模研究の中心仮定である幾何形状の類似性維持の仮定を維持する上で非常に重要である。
【０１１９】
１２．２リットルでのＫＬａ規模拡大相関性を、表４に示したＤ／Ｔ比で４種類の羽根車について求めた。幾何学的類似性の観点から、Ａ３１０直径１．２２９ｍ（Ｄ／Ｔ０．４４）及びＡ３１５直径１．２８５ｍ（Ｄ／Ｔ０．４６）が推奨される。しかしながら、マンウェイ直径は、取り付け及び取り外し可能な最大羽根車直径を１．２１９ｍに制限し得る。したがって、１．２１９ｍ直径であるＡ３１０及びＡ３１５を用いることで、羽根車の取り付け及び取り外しの容易さに合わせ、規模縮小試験で提案される幾何学的類似性に近い状態を維持する。
【０１２０】
羽根車の間隔Ｄｃ及び間隔Ｄｓ
複数の羽根車を有するバイオリアクターでの羽根車の間の間隔は、検討すべき重要な寸法である。二重Ｒｕｓｈｔｏｎタービンを有するバイオリアクター（放射流）に関して、二重羽根車の間隔が軸方向に０．５×Ｄ未満である場合、無通気消費電力は単一の羽根車と同等である。２×Ｄの間隔では、消費電力は相加的（adductive）となる。したがって、羽根車間隔が０．５倍未満となり、複数羽根車の要件が不要となった場合、羽根車の効率低くなる。注目すべき重要な点として、羽根車間隔もバイオリアクター内でデッドゾーン（混合が不十分なゾーン）が形成される可能性に影響を与える。羽根車間隔の選択に対する別の制約は、バイオリアクター内で必要とされる個別の作業体積である。
【０１２１】
１．２２９×Ｄｂｏｔｔｏｍ（１４９８ｍｍ）の羽根車間隔Ｄｓにより、両方の羽根車が最低接種後体積１７３９２リットルで液面下に留まることができ、上側羽根車よりの液頭Ｄｏが０．５×Ｄｔｏｐ（６１５ｍｍ）であり、オフ（ｏｆｆ）底部間隔ＤＣが０．７５×Ｄｂｏｔｔｏｍ（９１３ｍｍ）である。
【０１２２】
表５には、羽根車より上の液体表面又は下側液体カバーを形成する体積を示してある。これらの臨界体積での発泡を回避するよう、撹拌を変える必要がある。
【表５】
2015043776.tif 000007
【０１２３】
液体表面下の頂部羽根車の間隔Ｄｏ
液体表面から上の羽根車ブレードの破壊は、それによって流れ及び羽根車の動力放散が無効となることから望ましくない。さらに、それにより、ヘッドスペース気体が流体中にかなり表面捕捉され、過剰の泡が生じるために不明のＫＬａ値が発生する。Ｄｏは放射方向流羽根車に関しては０．３×Ｄであり、Ａ３１０等の軸方向流羽根車に関しては０．５×Ｄである。しかしながら、Ｄｏが２×Ｄに近づくに連れて、羽根車は穏やかな混合負荷を与える。ＫＬａ試験でバイオリアクターＫＬａが底部Ａ３１５羽根車によって最も影響を受け、頂部Ａ３１０羽根車がバルク混合に寄与することが明らかになっていることから、これは製造バイオリアクター用途には許容される。
【０１２４】
Ｄｃ及びＤｓの値を設定することで、Ｄｏは製造バイオリアクターの運転時には至適範囲で維持される。バッチの途上において、頂部羽根車より上の液体カバーが０．５×ＤＡ３１０及び１．０８×ＤＡ３１０から変化する。バイオリアクターに養分供給液を送り、一定のｐＨを維持するためにアルカリを送るにつれて、頂部羽根車より上の液体カバーは多くなる。表６には、運転体積の範囲における頂部羽根車より上の液体カバーの範囲を示してある。
【表６】
2015043776.tif 000008
【０１２５】
撹拌速度−ｒｐｍ、Ｐ／Ｖ及び先端速度
下記の表７には、２００００リットルバイオリアクターについての撹拌速度を具体的に記載している。バイオリアクターは、代表的には２０から２６０Ｗ／ｍ３、好ましくは５５から８５１００Ｗ／ｍ３で撹拌する。撹拌戦略は、５００リットルパイロット醗酵時に開発されているところである。したがって、０から８０±１ｒｐｍの撹拌速度を運転範囲として用いる。
【表７】
2015043776.tif 000009
【０１２６】
機械的シールの規格
バイオリアクターにおいては、全てのシールは、最大「振れ」又はゆらぎ許容値０．２ｍｍの二重機械的シールであるべきである。下記の３種類が考えられる。
【０１２７】
・無菌凝縮物で潤滑される湿式シール
・Ｎ２又はＣＡ等の無菌気体で潤滑される乾式シール
・一方向回転性（uni-rotational）である非潤滑の浮遊シール。
【０１２８】
全ての機械的シールを、年１回整備することが推奨される。それには、バイオリアクターからのシールの取り外し及び販売者へのシールアセンブリの送付が必要である。したがって、設計では日常的保守の容易さを考慮しなければならない。
【０１２９】
乾式型のシール（Ｊｏｈｎ  Ｃｒａｎｅ−５２８０Ｄ型）では、年間３ｇの樹脂含浸炭素からなる損失（シール面及びシール座部材料）が生じる。これは、１年間にわたる連続２４時間運転に基づくものである。湿式シールからの損失の量は、それよりかなり少ない。したがって、全てのバイオリアクター二重シールに湿式凝縮物潤滑シールを採用する。
【０１３０】
バイオリアクター曝気要件及びガス処理戦略
２００００リットルバイオリアクターの曝気負荷は下記によって支配される。
【０１３１】
・ＫＬａ要件
・ＤＯＴ制御戦略
・ｐＣＯ２制御／除去戦略
・焼結又はフルート形スパージャーの使用。
【０１３２】
２００００リットルバイオリアクターは、酸素取り込み速度５ｍｍｏｌ×Ｌ−１×ｈ−１でのプロセスについて２０ｈ−１以下のＫＬａ値を提供するように設計される。バイオリアクター設計は、細胞２０×１０６個×ｍＬ−１に達するプロセスの培養を可能とするだけの柔軟性が必要である。
【０１３３】
その曝気要件は、多くの異なる手法によって達成可能である。しかしながら、ピーク酸素要求時における酸素移動速度（ＯＴＲ）の不足を補うために空気及び酸素豊富なフルート形スパージャーの使用を行った。この手法の利点は下記の通りである。
【０１３４】
・フルート形スパージ設計のＣＩＰ及びＳＩＰバリデーションの相対的容易さ；
・溶存ＣＯ２除去を助ける、相対的に大きい空気スループット；
・１回使用の焼結要素の購入を回避することによる運転コストの削減。
【０１３５】
上記で選択される手法の欠点も検討する必要がある。それには、下記のものがある。
【０１３６】
・選択される低動力数羽根車についての固有のＫＬａが相対的に低い。
【０１３７】
したがって、バイオリアクター曝気設計は、所望のＫＬａを満足するように変えられる柔軟性を有するべきである。
【０１３８】
表８には、２００００リットルバイオリアクターについての気体処理要件を記載してある。一定の表面気体速度で気体流量を大きくした。
【０１３９】
２種類のスパージャーを用いる。主又は「ＤＯＴ制御」スパージャーは、二重範囲清浄空気マスフローコントローラー（ＭＦＣ）及び酸素ＭＦＣによって供給され、気体流はＤＯＴ制御ループを介して計量され、ＣＯ２ＭＦＣは酸ｐＨ制御ループを介して気体を計量する。二重範囲ＭＦＣを用いて、所望の運転範囲の両端での正確な流動制御を行う。
【０１４０】
第２又は「バラスト」スパージャーは、窒素も供給されるＣＡＭＦＣによって供給される。早期ＤＯＴ要求を支援し、ＤＯＴを設定点まで低下させるのにわずかな窒素バラストが早期ＤＯＴ制御で必要とされることが測定された。バラストスパージャーは、バラスト空気も計量して、過剰のｐＣＯ２の除去を促進する。
【０１４１】
ヘッドスペースパージを用いて、ヘッドスペースからのＣＯ２及び酸素の除去を可能とする。これは、ｐＨ及びｐＣＯ２制御並びに環境に排気する前の高酸素混合物の希釈をより良好に促進するためである。ヘッドスペース流量を変える能力によって、酸素濃縮度及び制御点ｐＣＯ２の異なる混合物を必要とする多様なプロセスについて気体処理戦略の設計が可能となる。
【表８】
2015043776.tif 000010
【０１４２】
スパージャー取り付け用のバイオリアクターポートは、直径５１ｍｍの配管設計に適合するように設計する。ポートの位置は、下側羽根車の底部縁部下３２０ｍｍ及びタンク底部から５９３ｍｍ以下（Ｓｃ）の距離での制御スパージャー（Ｄｃ−Ｓｃ）の設置を可能とするものである。
【０１４３】
これにより、５９３ｍｍ又は（０．６５×Ｄｃ）のＳｃ値となり、それは０．２×Ｄｃから０．６×Ｄｃの許容範囲外である。しかしながら、５００リットルでの流体力学試験で、０．４１から０．７１×ＤｃのＳｃ間隔が測定されるＫＬａに全く影響しないことが示唆される。
【０１４４】
バラストスパージャーの設置用の別のポートも構築した。このポートの位置は、下側羽根車の底部縁部下３２０ｍｍ及びタンク底部から５９３ｍｍ以下（Ｓｃ）の距離（Ｄｃ−Ｓｃ）でのバラストスパージャーの設置を可能とするものである。別のスパージャーからバラストを加える要件は、下記の３個の理由によるものである。
【０１４５】
・第１に、それは、酸素又は酸素豊富ＤＯＴ要求気体のバラスト気体による希釈を防止する。スパージャーから発生する気泡の酸素濃度勾配が最大であることから、これによって最も良好なＯＴＲが確保される。
【０１４６】
・第２に、それによって、バラストスパージャーを制御スパージャーから異なる位置に配置して、ｐＣＯ２制御のために所望のバラストを送る際にＤＯＴ制御への影響を回避することができる。
【０１４７】
・第３に、バラストスパージャーを、ＤＯＴ制御スパージャーから独立に設計することができる。
【０１４８】
孔から出る気体の目標のレイノルズ数Ｒｅが＜２０００となり、チェーン（chain）気泡状態時に気泡のザウタ平均直径が１０から２０となるまで、孔径及び孔数の計算を反復する。表９には、２００００リットルバイオリアクターについての制御及びバラストスパージャーに関する主要規格を示してある。
【表９】
2015043776.tif 000011
【０１４９】
０．８×Ｄｂｏｔｔｏｍ（底部Ａ−３１５羽根車直径の８０％直径）のリングスパージャーを用いて、ブレード下に孔を分布させ、羽根車ハブはない。しかしながら、この構成のＣＩＰ及び設置は困難である。したがって、孔の最も良好な分布及び衛生的設計と一致する形で所望数の孔の分布を可能とするスパージャー幾何形状の選択も用いることができる。
【０１５０】
一つの選択肢として、直線配管ではなく三日月形配管が検討されている。三日月形の曲率は０．８×Ｄｂｏｔｔｏｍである。バイオリアクターの側面ポートからの取り付け及び取り外しを容易にするため、三日月形の外周は、０．８×Ｄｂｏｔｔｏｍ環形の完全な外周の２４０°であり、それは１０７７ｍｍである。
【０１５１】
ＤＯＴ制御スパージャーは長さ１０７７ｍｍであり、５１ｍｍの直径を有する。孔は４ｍｍの直径を有する。背面（鉛直）から４５°で２列（２×１２５）に分けられた合計２５０個の孔を用いる。スパージャーの両端にある直径４ｍｍの排液孔をスパージャーの前側に開けて、スパージャーの自由なＣＩＰ排液を助ける。
【０１５２】
バラストスパージャーは長さ１０７７ｍｍであり、５１ｍｍの直径を有し、一つの背面列で合計１００個の６ｍｍ直径の孔を有する。スパージャーの両端の直径４ｍｍの排液孔をスパージャーの前側に開けて、スパージャーの自由なＣＩＰ排液を助ける。
【０１５３】
プローブ、添加ポート及びサンプルポートの位置
プローブのリング位置は、バイオリアクターの混合が良好な代表的な領域にあるべきである。追加的な検討事項には、作業体積範囲及び人間工学的作業等があった。プローブポート、サンプルバルブ及び添加ポートの位置を一体で考慮して、一過性の急激な増量を回避した。さらに、プローブ制御に関してのサンプルバルブの位置は、測定される工程パラメータのオフライン検証の正確な計算ができるようにする必要がある。これを表１０に示す。
【表１０】
2015043776.tif 000012
【０１５４】
2015043776.tif 000013
【０１５５】
2015043776.tif 000014
【０１５６】
添加ポート、表面及び液面下
液体表面を終端とする添加ポート及び液面下のものを決定する必要性を、運転シナリオ及び工程制御に対する供給戦略の効果によって確認した。
【０１５７】
現在、タンパク質を含まないプロセスは、バイオリアクターの良好に混合された領域で放出される必要がある二つの連続供給流を有する。良好に混合された領域に、グルコース及び「ＬＳ１型」ショット添加もさらに重ねて行う。１：１０希釈Ｃ−乳濁液の表面添加によって発泡を制御する。培養物が培地表面上に滴下されるに連れて生じる泡の蓄積を回避することで、接種前バイオリアクターへのシード接種が行われる。下記のポートを設計した。
【０１５８】
・培地投入口、接種物投入口、容器壁内に向いた１個の小型添加投入口、そしてタンク壁から離れた液体表面上に滴下する他の投入口の６個所表面添加
・２個の供給タンクからの投入口及びアルカリタンクからの２層投入口からなる４個所表面下添加。
【０１５９】
サンプルポート
サンプルポート設計は、バイオリアクターからの代表的サンプル採取を可能とするものである。したがって、残留材料はできるだけ少なくすべきである。採取されたサンプルを用いて、溶存気体、ｐＨ、栄養素及びバイオマス濃度のオフラインチェックを行う。ポート開口部のオリフィスは、バイオマス凝集物の保持を生じる篩過を防止するだけの大きさのものとする。２ｍｍオリフィスＮｏｖａＳｅｐｔｕｍサンプリング装置を用いた。しかしながらこれは、ポートの残留体積を低く保ちたいという要求とバランスを取るべきである。そのポートは、オフラインチェックによって検証する必要があるプローブに隣接する良好混合ゾーンに配置する必要があり、ノズル位置によって決定される（表１０参照）。
【０１６０】
添加タンク
コスト及び時間を節減するため、バイオリアクターに供給を行う添加タンクはモジュール設計のものとする。生産バイオリアクターは、２５００リットルの公称体積を有する添加タンク３個を有する。添加タンクは２５リットル／分で充填される。添加タンクからバイオリアクターへの供給液の流量は、供給液０．２から１．０ｍＬ／接種後バイオリアクター体積１リットル／時間（ｍＬ／Ｌ／ｈ）に制御される。供給速度は接点点の±５％に制御されることが期待される。
【０１６１】
生産バイオリアクターでは、１３７２ｍｍＩＤ×１８８０ｍｍの添加タンク３個を使う。これらのタンクは、独立に及び生産バイオリアクターとともにクリーニング及び滅菌することができる。
【０１６２】
マンウェイ
ある種の整備操作を行うには、バイオリアクターへのアクセスが必要である。フランジ付きの頂部プレート又は頂部プレートへのマンウェイの組み込みを検討することで、アクセスは可能である。バイオリアクターへのアクセスの必要性は下記の理由によるものである。
【０１６３】
・羽根車の取り付け
・羽根車及び羽根車軸の取り付け及び交換
・機械的シールの取り付け及び交換
・容器付属品の整備
・所望の流体力学的特徴を得るためのスパージャー位置変更の可能性。
【０１６４】
マンウェイの大きさは、上記の目的のためのアクセスを可能とするだけのものでなければならない。使用したマンウェイは、直径１２１９ｍｍの２個の羽根車の取り外しを可能とするだけの直径のものであった。
【０１６５】
体積測定
この設計は、いずれのセンサーも運転範囲当たりでの体積測定において十分な正確さを与えるようなものとする。
【０１６６】
バイオリアクターにおける体積測定は、１３０００から２５０００リットルの範囲を測定することができる。そのセンサー感度は、フルスパンの少なくとも０．５％である必要がある。
【０１６７】
供給添加タンク及びアルカリタンクでの体積測定は、それぞれ０から２２００及び２５００リットルを測定することができる。そのセンサー感度は、フルスパンの少なくとも０．２％である必要がある。これによって、添加タンクにおける体積減少を測定することにより、最小流量０．２ｍＬ／Ｌ／時又は３．５リットル／時で供給流速の検証を毎時行うことができる。
【０１６８】
バイオリアクター温度制御
培地は、工程制御によって運転温度及びｐＨとする。これは、ジャケットの「温和な」加熱（容器壁での高温を回避）によって行われる。運転時の温度制御範囲は３６から３８℃であり、精度は設定点で±２℃である。
【０１６９】
ジャケット
バイオリアクタージャケット面積は、下記の検討事項を考慮して規定する。
【０１７０】
・１２１から１２５℃での蒸気滅菌
・＜２時間以内での１０℃から３６．５℃への培地の昇温
・バイオリアクター内のあらゆる個所が、熱電対による測定で代表的には３６．５℃の設定温度の±０．２℃に達するものでなければならない。
・＜２時間以内での３６．５℃から１０℃への培地の冷却。
【０１７１】
バイオリアクターｐＨ制御
トランスミッターを介してＤＣＳ系プロセス制御装置に接続されたプローブにより、プロセスｐＨをモニタリング及び制御する。プロセスは、ＣＯ２を加えることでｐＨを設定点まで下げ、アルカリを加えることでｐＨを設定点まで上昇させることによって制御される。ｐＨは、設定点の±０．０３で制御される。
【０１７２】
アルカリは、アルカリ分配用の２個所の添加個所から加える。これによって、タンク中での再循環時間が長い場合にアルカリの混合がより迅速になる。ＣＯ２は制御スパージャーを介して加える。
【０１７３】
制御プローブ及びバックアッププローブは、タンク底部から９１３ｍｍの下側ポートリングに配置する（表１０参照）。さらに、ｐＨプローブは、バイオリアクターへのアルカリ添加個所と正反対に配置する。
【０１７４】
バイオリアクターＤＯＴ制御
溶存酸素は、ポーラログラフィーＤＯＴプローブを用いてモニタリング及び制御する。ＤＯＴ設定点は、下記のものを吹き込むことで維持される。
【０１７５】
・必要時の初期Ｎ２バラスト及び／又は空気
・必要時の空気バラストと空気
・必要時の空気バラストと酸素
・酸素要求量が低下した時点での逆転ガス使用。
【０１７６】
ガスケードＤＯＴ制御によって、攪拌機速度の傾斜に伴うバラスト及びガス需要を変えることでＤＯＴ設定点を維持することが可能となる。
【０１７７】
ｐＣＯ２を制御するため、過剰のＣＯ２の除去に必要なバラストはＤＯＴ制御に影響を与える。したがって、代謝ＣＯ２が放出されるプロセスの場合に、ｐＣＯ２制御と併せてＤＯＴ制御を検討する。ＤＯＴは設定点の±２％で制御される。制御プローブ及びバックアッププローブは、タンク底部から９１３ｍｍの下側ポートリングに配置される。
【０１７８】
バイオリアクター溶存ＣＯ２制御
プロセスｄＣＯ２は、ｐＣＯ２プローブでモニタリングし、過剰のｄＣＯ２はバラストスパージャーでＣＡをガス処理することで除去する。このプローブについての至適な位置はｐＨプローブ付近である。
【０１７９】
供給添加制御
供給液（ＳＦ２２及びアミノ酸）はｐＨ及びオスモル濃度が高い。したがって、大量瞬時添加を回避して、良好なｐＨ制御を維持する必要がある。しかしながら、所望の流量の制御（設定点の±５％）は技術的には困難を伴う。したがって、送達モードでの添加個所を包含する添加戦略は、供給ボラスの循環とｐＨ制御の変動可能性を回避するものである。
【０１８０】
したがって、添加個所はタンク底部から９１３ｍｍという底部羽根車の中心線の面にあることで、供給ボラスを急速に混合する上で役立つ。
【０１８１】
消泡剤添加制御
消泡剤（Ｃ−乳濁液）添加を必要に応じて行って、バイオリアクター液体表面に泡のない状態を維持する。１：１０希釈Ｃ−乳濁液の作業原液を液体表面上に加えることができる。消泡剤懸濁液は、貯蔵容器中で連続撹拌して分離を防ぐ。タンクの中心付近で消泡剤を加えて、消泡剤が付着するタンク壁へ消泡剤を運搬する流体流の放射方向成分の効果を消すことが重要である。したがって、添加個所はタンク中心方向に０．２５×Ｔ又はタンク中心から６９９ｍｍである。
【０１８２】
実施例２：４０００リットルバイオリアクター
容器の幾何形状
４０００リットルバイオリアクターの容器の幾何形状は、許容されるアスペクト比が達成されるまで最大作業体積、フリーボード直線側部距離、アスペクト比（ＨＬ／Ｔ）及び羽根車からタンクの直径比（Ｄ／Ｔ）を変える反復設計基準によって決定した。
【０１８３】
バイオリアクターアスペクト比ＨＬ／Ｔ
表１１に、通常処理時の各種運転体積での４０００リットルバイオリアクターにおけるアスペクト比を記載している。これらのアスペクト比は、タンクＩＤ及び必要な運転体積の選択で得られる。加工処理の観点からは、３種類の運転条件で混合要件は異なる。接種前ステージでは、バイオリアクター混合は、培地が最小ＫＬａ要件と均衡を取れるようにする上で重要である。しかしながら、接種後及び移動前ステージの場合、混合及びＫＬａの両方が重要な検討事項である。したがって、これらの特徴の両方を、アスペクト比範囲で調べた。
【表１１】
2015043776.tif 000015
【０１８４】
タンク直径
タンク直径を変えて、至適なアスペクト比ＨＬ／Ｔを得た。タンク内径に対する変更は、許容されるアスペクト比及びプラント設置面積によって制限される。タンクＩＤは１６２６ｍｍである。
【０１８５】
タンク高さ
最大運転体積、アスペクト比ＨＬ／Ｔ、フリーボード直線側面長さ、底部及び頂部プレート設計からタンク高さを決定する。最終タンク高さは、泡用の予備体積、プラント高さ及び許容される羽根車軸長さから決定される妥協的値である。ヘッドから底部への接線高さは２８１７ｍｍである。
【０１８６】
フリーボード高さ
このシードバイオリアクターについては、５００ｍｍのフリーボード高さ（１０３９リットル又は最大運転体積の２７体積％）を用いる。
【０１８７】
頂部及び底プレート
底及び頂部プレートの設計は、このシードバイオリアクター用のＡＳＭＥ  Ｆ＆Ｄの設計である。
【０１８８】
バイオリアクター撹拌要件
バイオリアクターの撹拌は、急速な混合を達成し、均質性を維持し、哺乳動物細胞を懸濁状態に維持し、気泡を分散状態に維持するためのものである。上記の目的を達成する上で根底にある問題は、羽根車の幾何形状及び羽根車ブレードの背後で生じる渦巻きもしくは渦流から生じる剪断力による細胞損傷の低減である。適切な羽根車の種類を選択することで、上記目的の妥協点に達した。
【０１８９】
底部駆動と頂部駆動の羽根車軸
モーター駆動は、すでに説明した利点があることから頂部取り付けである。
【０１９０】
バッフル
中心の取り付け羽根車についてのバッフル要件は、渦流形成を防止する上で必須である。バッフル関連の非常に重要な問題は、バッフル数、バッフル幅（Ｗ）、バッフル長さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）及びバッフルからタンク壁間隔（Ｗｃ）である。
【０１９１】
０．１×Ｔ又は１６３ｍｍ幅１．１×Ｈ−Ｈｈ又は２１９５ｍｍ高さであり、バッフルからタンク壁間隔Ｗｃが０．０１×Ｔ又は１６ｍｍである４個の等間隔に配置されたバッフルを用いた。
【０１９２】
バッフルの厚さについては具体的には指定しないが、厚さによって流体流の放射方向成分に対する剛性を確保する必要がある。さらに、厚さによって、ＳＩＰ時にバッフルプレートが歪んでバッフルからタンク壁間隔に影響を与えないようにする必要がある。
【０１９３】
羽根車の種類、大きさ及び数
このバイオリアクター用の羽根車は、２００００リットル容器と全く同様に形成され、同じＤ／Ｔ比０．４４を有する。底部羽根車は直径７１０ｍｍのＬｉｇｈｔｎｉｎのＡ３１５であり、頂部羽根車は直径７１０ｍｍのＬｉｇｈｔｎｉｎのＡ３１０である。
【０１９４】
羽根車間隔、Ｄｃ、Ｄｓ及びＤｏ
頂部羽根車の中心線と下側羽根車の中心線の間の羽根車間隔Ｄｓは、１．２２９×Ｄｂｏｔｔｏｍ又は８７２ｍｍである。オフ底部羽根車間隔Ｄｃは０．７５×Ｄｂｏｔｔｏｍ又は５３１ｍｍである。これによって、下側羽根車が２１５３リットルの最低接種後体積で液面下の状態としておくことができ、３３６７リットルで両方の羽根車を液面下とし、液頭を上側羽根車の上（Ｄｏ）０．５×Ｄｔｏｐ又は３５８ｍｍとすることができる。
【０１９５】
表１２には、羽根車より上の液体表面又は下側液体カバーを形成する体積を示してある。これらの臨界体積での発泡を回避するよう、撹拌を変えることができる。
【表１２】
2015043776.tif 000016
【０１９６】
４０００リットルバイオリアクターは、下側羽根車が液面下にあるか（１／９シード接種プロセスの培養時）又は両方の羽根車が液面下にある（１／５シード接種プロセスの培養時）状態で二つの異なる接種後体積で運転することができ、表１３には、その運転時に上側及び下側羽根車に関して得られた液体カバーを示してある。
【０１９７】
１／９シード接種プロセスの培養時に、下側Ａ３１５羽根車より上の０．６７から０．８２×Ｄｂｏｔｔｏｍの液体カバーが認められる。これは、０．５から１×Ｄの推奨の範囲内である。
【０１９８】
１／５シード接種プロセスの培養時に、頂部Ａ３１０羽根車より上の０．０６から０．７８×Ｄｔｏｐの液体カバーが認められる。下側液体カバーは推奨外である。しかしながら、この液体カバーは、混合及び撹拌があまり重要でない場合に接種前の期間で認められる。
【表１３】
2015043776.tif 000017
【０１９９】
撹拌速度−ｒｐｍ、Ｐ／Ｖ及び先端速度
表１４には、４０００リットルバイオリアクターについての撹拌速度を具体的に記載している。バイオリアクターは、代表的には２０から２６０Ｗ／ｍ３、好ましくは５５から８５Ｗ／ｍ３で撹拌される。撹拌戦略は、５００リットルパイロット醗酵時に開発された。したがって、０から８８±１ｒｐｍの撹拌速度を運転範囲として用いる。
【表１４】
2015043776.tif 000018
【０２００】
機械的シールの規格
凝縮物潤滑された二重機械的シールを記載の方法に従って使用する。
【０２０１】
バイオリアクター曝気要件
表１５に、４０００リットルバイオリアクターでの接種物増殖時のＤＯＴ及びｐＨ制御についての表面ガス速度一定の規模拡大に基づく気体流を示してある。ＤＯＴ制御には酸素は必要ない。しかしながら、酸素豊富空気を用いることで、より低いガス処理を促進して、過剰の発泡を防止することができる。より小さい範囲のＮ２ＭＦＣで窒素を供給して、早期ＤＯＴ制御及び逸脱減少を行って、高レベルのＤＯＴとすることが推奨される。
【表１５】
2015043776.tif 000019
【０２０２】
孔から出る気体の目標のレイノルズ数が＜２０００となり、チェーン（chain）気泡状態時に気泡のザウタ平均直径が約１０ｍｍとなるまで、フルート形スパージャーについて孔径及び孔数の計算を反復する。
【０２０３】
表１６には、４０００リットルバイオリアクターについての主要なスパージャー設計規格を示してある。５６８ｍｍのスパージャー長さＳＬを、配管幾何形状に関して求める。スパージャーのいずれかの端に孔を分配して、Ａ３１５ハブ直下への気泡放出を防ぐ。あるいは、三日月形幾何形状を用いることができる。配管直径は、所望数の孔の間隔を助けるように選択する。直径は３８ｍｍである。１００個の２ｍｍ孔をスパージャーの背側表面に配置し、１個の２ｍｍ孔を前側表面に設けて、スパージャーの自由ＣＩＰ排液を助ける。
【０２０４】
スパージャー設置用のバイオリアクターポートを、直径３８ｍｍの嵌合配管設計に設計する。ポートの位置によって、制御スパージャーの配置を下側羽根車の底部縁下１９４ｍｍのＤｃ−Ｓｃ及びタンク底部から３３７ｍｍ以下のＳｃの距離に行うことができる。
【表１６】
2015043776.tif 000020
【０２０５】
プローブ、添加ポート及びサンプルポートの位置
プローブ、添加ポート及びサンプルポートの位置決めについての設計の基礎は実施例１に記載しており、表１７に挙げてある。
【表１７】
2015043776.tif 000021
【０２０６】
2015043776.tif 000022
【０２０７】
添加ポート、表面及び液面下
液体表面を終端とする添加ポート及び液面下のものを分類する必要性を、運転シナリオ及び工程制御に対する供給戦略の効果によって確認する。
【０２０８】
４０００リットルバイオリアクターは、バイオリアクターの良好に混合される領域に放出される必要がある二つの表面下供給液及びアルカリを受け入れるように設計した。１：１０希釈Ｃ−乳濁液の表面添加によって発泡を制御する。容器壁方向の単一のスペアの表面上添加ポートも、将来的な柔軟性のために設計する。シードバイオリアクターの接種時の培地表面上での培養液の跳ね上がりを回避して、泡の蓄積を防止することができる。したがって、接種物添加ポートは表面より上にあり、容器壁に向いている。底プレートでの回収ポートの使用は、接種物移動時の接種物取り出しのための理想的なポートである。さらに、培地添加ポートは、容器壁に向いている。要約すると、合計添加ポートは次の通りである。
【０２０９】
・培地投入口、接種物投入口、容器壁に向いたスペア小型添加投入口、そしてタンク壁から離れた液体表面上に滴下する消泡剤用の添加ポートの４個所表面添加
・供給液及びアルカリ用の３個所の表面下添加
【０２１０】
サンプルポート
サンプルポート設計は、２００００リットルバイオリアクターについて記載のものと同様である。
【０２１１】
体積測定
レベルセンサーは、フルスパンの±０．５％の精度で４０００リットルまで測定することができる。
【０２１２】
バイオリアクター温度制御
プロセス制御により、培地１９１４から３０７７リットルを、運転温度、代表的には３６．５℃とする。これは、ジャケットの「温和な」加熱によって行われ、容器壁での高温を回避する。
【０２１３】
ジャケット
バイオリアクタージャケット面積は、下記の検討事項を考慮して規定する。
【０２１４】
・１２１から１２５℃での蒸気滅菌
・＜２時間以内での１０℃から３６．５℃への１９１４から３０７７リットルの培地の昇温
・バイオリアクター内のあらゆる個所が、熱電対による測定で代表的には３６．５℃の設定温度の±０．２℃に達するものでなければならない。 
・２時間以内での３６．５±２℃から１０℃への１９１４から３０７７リットルの培地の冷却。
【０２１５】
バイオリアクターｐＨ制御
トランスミッターを介してＤＣＳ系プロセス制御装置に接続されたプローブにより、プロセスｐＨをモニタリング及び制御する。プロセスｐＨは、制御スパージャーからＣＯ２を加えることでｐＨを設定点まで下げ、アルカリを加えることでｐＨを設定点まで上昇させることによって制御される。
【０２１６】
アルカリは、底部羽根車の中心線にある少なくとも１個の液面下ポートから加える。ＣＯ２は制御スパージャーを介して加える。
【０２１７】
制御及びバックアッププローブは、表１７に示したようにタンク底から５３１ｍｍの位置の下側ポートリングにある。
【０２１８】
バイオリアクターＤＯＴ制御
溶存酸素は、ポーラログラフィーＤＯＴプローブを用いてモニタリング及び制御する。ＤＯＴ設定点は、下記のものを吹き込むことで維持される。
【０２１９】
・必要時の初期Ｎ２バラスト及び／又は空気
・必要時の空気バラストと空気
・必要時の空気バラストと酸素
ＤＯＴ制御によって、必要時気体として酸素又は空気を互換的に用いることで、ＤＯＴ設定点を維持することができる。接種物バイオリアクターでｐＣＯ２制御が必要とは考えられない。制御及びバックアッププローブは、表１７に示したようにタンク底から５３１ｍｍの位置の下側ポートリングにある。
【０２２０】
供給添加制御
添加個所は、下側羽根車の中心線の平面におけるタンク底から５３１ｍｍにあり、供給ボラスの急速な放散を助ける。
【０２２１】
消泡剤添加制御
添加個所は、タンク中心に向かって０．２５×Ｔ突出し、タンク中心から４０７ｍｍの表面である。
【０２２２】
実施例３：１０００リットルバイオリアクターの規格
容器の幾何形状
１０００リットルバイオリアクターの容器の幾何形状は、許容されるアスペクト比が達成されるまで最大作業体積、フリーボード直線側部距離、アスペクト比（ＨＬ／Ｔ）及び羽根車からタンクの直径比（Ｄ／Ｔ）を変える反復設計基準によって決定した。
【０２２３】
バイオリアクターアスペクト比ＨＬ／Ｔ
下記の表１８に、通常処理時の各種運転体積での１０００リットルバイオリアクターにおけるアスペクト比を記載している。これらのアスペクト比は、タンクＩＤ及び必要な運転体積の選択で得られる。加工処理の観点からは、異なる運転条件で混合要件は異なる。接種前ステージでは、バイオリアクター混合は、培地が最小ＫＬａ要件と均衡を取れるようにする上で重要である。しかしながら、接種後及び移動前ステージの場合、混合及びＫＬａの両方が重要な検討事項である。したがって、これらの特徴の両方を、アスペクト比範囲で調べた。
【表１８】
2015043776.tif 000023
【０２２４】
タンク直径
タンク直径を変えて、至適なアスペクト比ＨＬ／Ｔを得る。タンク内径に対する変更は、許容されるアスペクト比及びプラント設置面積によって制限される。タンクＩＤは０．８６４ｍである。
【０２２５】
タンク高さ
最大運転体積、アスペクト比ＨＬ／Ｔ、フリーボード直線側面長さ、底部及び頂部プレート設計からタンク高さを決定する。最終タンク高さは、泡用の予備体積、プラント高さ及び許容される羽根車軸長さから決定される妥協的値である。ヘッドから底部への接線高さは２．３４７ｍである。
【０２２６】
フリーボード高さ
このシードバイオリアクターについては、５００ｍｍのフリーボード高さ（２９３リットル又は最大運転体積の３１体積％）を用いる。
【０２２７】
頂部及び底プレート
底及び頂部プレートの設計は、このシードバイオリアクター用のＡＳＭＥＦ＆Ｄである。
【０２２８】
バイオリアクター撹拌要件
バイオリアクターの撹拌は、急速な混合を達成し、均質性を維持し、哺乳動物細胞を懸濁状態に維持し、気泡を分散状態に維持するためのものである。上記の目的を達成する上で根底にある問題は、羽根車の幾何形状及び羽根車ブレードの背後で生じる「渦巻き」もしくは渦流から生じる剪断力による細胞損傷の低減である。適切な羽根車の種類及びガス処理戦略を選択することで、上記目的の妥協点に達した。
【０２２９】
底部駆動と頂部駆動の軸
モーター駆動は、すでに説明した利点があることから頂部取り付けである。
【０２３０】
バッフル
中心の取り付け羽根車についてのバッフル要件は、渦流形成を防止する上で必須である。バッフル関連の非常に重要な問題は、バッフル数、バッフル幅（Ｗ）、バッフル長さ（Ｈｂａｆｆｌｅ）及びバッフルからタンク壁間隔（Ｗｃ）である。
【０２３１】
０．１×Ｔ又は８６ｍｍ幅１．１×Ｈ−Ｈｈ又は２０９９ｍｍ高さであり、バッフルからタンク壁間隔Ｗｃが０．０１×Ｔ又は９ｍｍである４個の等間隔に配置されたバッフルを用いた。
【０２３２】
バッフルの厚さについては具体的には指定しないが、厚さによって流体流の放射方向成分に対する剛性を確保する必要がある。さらに、厚さによって、ＳＩＰ時にバッフルプレートが歪んでバッフルからタンク壁間隔に影響を与えないようにする必要がある。
【０２３３】
羽根車の種類、大きさ及び数
１０００リットルバイオリアクター用の羽根車は、同じＤ／Ｔ比で２００００リットル容器と全く同様に形成される。したがって、底部羽根車は直径３８１ｍｍのＬｉｇｈｔｎｉｎのＡ３１５であり、頂部羽根車は直径３８１ｍｍのＬｉｇｈｔｎｉｎのＡ３１０である。
【０２３４】
羽根車間隔、Ｄｃ、Ｄｓ及びＤｏ
頂部羽根車の中心線と下側羽根車の中心線の間の羽根車間隔（Ｄｓ）は、２×Ｄｂｏｔｔｏｍ（７６２ｍｍ）である。オフ底部羽根車間隔（Ｄｃ）は０．４×Ｄｂｏｔｔｏｍ（１５２ｍｍ）である。これによって、底部羽根車を最低接種後体積１６７リットルで０．５×Ｄｂｏｔｔｏｍ又は１９０ｍｍの液体カバー（Ｄｏ）で液面下とすることができ、両方の羽根車を上側羽根車より上Ｄｏ、（０．５×Ｄｔｏｐ）（１９０ｍｍ）の液頭で６１６リットルで液面下とすることができる。
【０２３５】
表１９には、羽根車より上の液体表面又は下側液体カバーを形成する体積を示してある。これらの臨界体積での発泡を回避するよう、撹拌を変えることができる。
【表１９】
2015043776.tif 000024
【０２３６】
１０００リットルバイオリアクターは、１／５プロセス及び１／９プロセス時に液面下の底部羽根車又は１／５プロセスのＮ−２相及び１／５及び１／９プロセスの両方におけるローリングシード操作時に液面下の両方の羽根車のいずれかを用いて、二つの異なる接種後体積で動作する。
【０２３７】
表２０には、１／５及び１／９継代培養プロセスの運転時の上側及び下側羽根車より上の液体カバーを示してある。１／５及び１／９プロセスでのローリング操作中、下側羽根車より上の液体カバーは０．５×Ｄ以下を下回る。したがって、撹拌速度を低下させ、この低体積で運転しながら表面気体の取り込みを回避することが重要である。９６０リットルでは、２．０５×Ｄｔｏｐの液体カバー（Ｄｏ）が得られる。このレベルでは、ＫＬａは悪影響を受けてないことが明らかになっており、バルク混合は問題ではない。
【表２０】
2015043776.tif 000025
【０２３８】
撹拌速度−ｒｐｍ、Ｐ／Ｖ及び先端速度
表２１には、１０００リットルバイオリアクターについての撹拌速度を具体的に記載している。バイオリアクターは、代表的には２０から２６０Ｗ／ｍ３、好ましくは５５から８５Ｗ／ｍ３で撹拌される。撹拌戦略は、５００リットルパイロット醗酵時に開発された。０から１５５±１ｒｐｍの撹拌速度を運転範囲として用いる。
【表２１】
2015043776.tif 000026
【０２３９】
機械的シールの規格
記載の凝縮物潤滑された二重機械的シールを使用した。
【０２４０】
バイオリアクター曝気要件
表２２に、１０００リットルバイオリアクターでの接種物増殖時のＤＯＴ及びｐＨ制御についての表面ガス速度一定の規模拡大に基づく気体流を示してある。ＤＯＴ制御には酸素は必要ない。しかしながら、酸素豊富空気を用いることで、より低いガス処理を促進して、過剰の発泡を防止することができる。より小さい範囲のＣＡ  ＭＦＣを用いて窒素を送ることで、早期ＤＯＴ制御及び逸脱減少を行って、高レベルのＤＯＴとすることが推奨される。
【表２２】
2015043776.tif 000027
【０２４１】
孔から出る気体の目標のレイノルズ数が＜２０００となり、チェーン（chain）気泡状態時に気泡のザウタ平均直径が約１０ｍｍとなるまで、孔の径及び数の計算を反復する。
【０２４２】
表２３には、１０００リットルバイオリアクターについての主要なスパージャー設計規格を示してある。３０５ｍｍのスパージャー長さＳＬを、配管幾何形状に関して求める。スパージャーのいずれかの端に孔を分配して、Ａ３１５ハブ直下への気泡放出を防ぐ。あるいは、三日月形幾何形状を検討することができる。
【０２４３】
直径は２５ｍｍである。３０個の２ｍｍ孔をスパージャーの背側表面に配置し、１個の２ｍｍ孔を前側表面に設けて、スパージャーの自由ＣＩＰ排液を助ける。
【０２４４】
スパージャー設置用のバイオリアクターポートを、直径２５ｍｍの配管設計に適合するように設計する。ポートの位置によって、制御スパージャーの配置を底部羽根車の底部縁下８８ｍｍの距離（Ｄｃ−Ｓｃ）及びタンク底部から６４ｍｍ以下（Ｓｃ）の距離に行うことができる。
【表２３】
2015043776.tif 000028
【０２４５】
プローブ、添加ポート及びサンプルポートの位置
プローブ、添加ポート及びサンプルポートの位置決めについての設計の基礎は、２００００リットルバイオリアクターについてと同じである。
【表２４】
2015043776.tif 000029
【０２４６】
2015043776.tif 000030
【０２４７】
５０リットルの体積からモニタリング、制御及びサンプリングするため、プローブ及びポートリングはタンク底部から１５１ｍｍである必要がある。しかしながら、プローブ／ポートリングは、それがバイオリアクターの底プレート及び直線の円柱側面の溶接部に当たるまで低い位置に配置することはできない。プローブ及びポートリングはタンク底部から２８６ｍｍと指定した。これによって、１３４リットルの体積をモニタリング、制御及びサンプリングすることができる。プローブ／ポートリングを、モニタリング／制御体積を最小にできるほどタンク底部に近くに配置する。
【０２４８】
添加ポート、表面及び液面下
１０００リットルバイオリアクターは、二つの表面下供給液及びアルカリを受け入れて、バイオリアクターの良好に混合される領域に放出されるように設計した。１：１０希釈Ｃ−乳濁液の表面添加によって発泡を制御する。容器壁方向の単一の表面上スペア添加ポートも、将来的な柔軟性のために組み込んだ。シードバイオリアクターの接種時の培地表面上での培養液の跳ね上がりを回避して、泡の蓄積を防止すべきである。したがって、接種物添加ポートは表面より上にあり、容器壁に向いている。底プレートでの回収ポートの使用は、接種物移動時の接種物取り出しのための理想的なポートである。さらに、培地添加ポートは、容器壁に向いている。要約すると、合計添加ポートは次の通りである。
【０２４９】
・培地投入口、接種物投入口、容器壁に向いたスペア小型添加投入口、そしてタンク壁から離れた液体表面上に滴下する消泡剤用の添加ポートの４個所表面添加
・供給液及びアルカリ用の３個所の表面下添加
【０２５０】
サンプルポート
サンプルポート設計は、２００００リットルバイオリアクターについて記載のものと同様である。サンプルポートをタンク底部から２８６ｍｍに配置して、サンプリングできる体積を最小とする。
【０２５１】
体積測定
レベルセンサーは、１０００リットルまで測定することができる。センサー感度のレベルはフルスパンの少なくとも０．２５％である。
【０２５２】
バイオリアクター温度制御
プロセス制御により、初期接種及び「シードローリング運転」時に培地２５０から８００リットルを、運転温度、代表的には３６．５℃とする。これは、ジャケットの「温和な」加熱によって行われ、容器壁での高温を回避する。
【０２５３】
ジャケット
バイオリアクタージャケット面積は、下記の検討事項を考慮して規定する。
【０２５４】
・１２１から１２５℃での蒸気滅菌
・＜２時間以内での１０℃から３６．５℃への２５０から８００リットルの培地の昇温
・バイオリアクター内のあらゆる個所が、熱電対による測定で代表的には３６．５℃の設定温度の±０．２℃に達するものでなければならない。 
・２時間以内での３６．５±２℃から１０℃への４００リットルの培地の冷却。
【０２５５】
バイオリアクターｐＨ制御
トランスミッターを介してＤＣＳ系プロセス制御装置に接続されたプローブにより、プロセスｐＨをモニタリング及び制御する。プロセスｐＨは、ＣＯ２を加えることでｐＨを設定点まで下げ、アルカリを加えることでｐＨを設定点まで上昇させることによって制御される。アルカリは、底部羽根車の中心線にある少なくとも１個の液面下ポートから加える。ＣＯ２は制御スパージャーを介して加える。
【０２５６】
制御及びバックアッププローブは、表２４に示したようにタンク底から２８６ｍｍの位置の下側ポートリングに配置して、モニタリングできる体積を最小とする。
【０２５７】
バイオリアクターＤＯＴ制御
溶存酸素は、ポーラログラフィーＤＯＴプローブを用いてモニタリング及び制御する。ＤＯＴ設定点は、下記のものを吹き込むことで維持される。 
・必要時の初期Ｎ２バラスト及び／又は空気
・必要時の空気バラストと空気
・必要時の空気バラストと酸素
ＤＯＴ制御によって、必要時気体として酸素又は空気を互換的に用いることで、ＤＯＴ設定点を維持することができる。
【０２５８】
制御及びバックアッププローブは、表２４に示したようにタンク底から２８６ｍｍの位置の下側ポートリングに配置して、モニタリングできる体積を最小とする。
【０２５９】
供給添加制御
添加個所は、底部羽根車の中心線付近におけるタンク底から２８６ｍｍにあり、供給ボラスの急速な放散を助ける。
【０２６０】
消泡剤添加制御
添加個所は、タンク中心に向かって０．２５×Ｔ突出し、タンク中心から２１６ｍｍの表面である。
【０２６１】
実施例４：バイオリアクタートレイン
バイオリアクター設計は、１／５（２０体積％）及び１／９（１１体積％）の両方の継代培養比を行う能力に基づくものである。バイオリアクタートレインは、１０００リットル（ステージＮ−３及びＮ−２）及び４０００リットル（ステージＮ−１）シードバイオリアクターとそれに続く２００００リットル生産バイオリアクター（ステージＮ）からなる。各バイオリアクターについての運転体積は、実施例１から３で定義されている。バイオリアクターは、撹拌タンク設計に基づくものであり、頂部駆動攪拌機システムを用いた。
【０２６２】
その設計は、バイオリアクター内での良好に混合された細胞懸濁液を維持し、栄養素供給液を混合しながら、ｐＨ、溶存酸素圧（ＤＯＴ）及び温度等の工程パラメータに関して均質な環境を確保する必要性に基づいたものである。これは、至適な細胞増殖、産生物蓄積及び産生物品質に対して必要な物理化学的環境を提供するものである。設計哲学にとっての重要な点は、幾何学的類似性を維持する必要性である。これによって、１２リットルの実験室規模及び５００リットルのパイロット規模で規模縮小モデルを開発することが可能となる。シード及び生産バイオリアクターの設計は同じ原理に基づくものであるが、処理において柔軟性を持たせるには若干の逸脱が必要である。選択されるアスペクト比（ＨＬ／Ｔ）は、哺乳動物細胞培養で使用される代表的なものであり、０．１７から１．９６接種後の範囲である。
【表２５】
2015043776.tif 000031
【０２６３】
設計上の制約は、接種後体積の４体積％から２５体積％の供給付与を行いながらの、１１体積％（１／９希釈）及び２０体積％（１／５希釈）のシート接種比に基づくものである。生産バイオリアクターでの接種後体積を１５％以下の供給付与に調節して、全ての供給液の添加後に、回収での最終体積が２００００リットルで終わるようにする。しかしながら、１５体積％より大きい供給付与を行うには、接種後体積を１５体積％供給向けに調節するが、供給液を付与した後、最終的な回収前体積は最小で２００００リットル及び最大で２２０００リットルとなる。生産バイオリアクターは、バッチ終了時点で合計２００００から２２０００リットルを保持することを期待される。表２６には、三つの接種物増殖ステージ及び生産バイオリアクターのそれぞれについての接種前体積、接種体積及び移動もしくは回収体積を示してある。
【０２６４】
シードバイオリアクター（ステージＮ−１からＮ−３）は供給される可能性が低いことから、最大運転体積は接種時である。４０００リットルシードバイオリアクターについての運転体積範囲（ステージＮ−１）は１９１４から３８４６リットルである。２０体積％シード分割比から細胞を増殖させることができるバイオリアクターを設計するために、１０００リットルシードバイオリアクター（ステージＮ−２及びＮ−３）は二つの運転範囲で運転する。１１体積％シード分割比の場合、バイオリアクタートレインは、単一の増殖／継代培養ステージでのフォワード・プロセシング（forward processing）細胞濃度基準を満足するだけの培養物を製造することができる。しかしながら、バイオリアクタートレインは、２０体積％シード分割比プロセスの場合にフォワード・プロセシング基準を満足するには二つの増殖／継代培養ステージを必要とする。したがって、１１体積％シード分割比プロセスの場合、４００から４５０リットルの運転範囲が要求され、２０体積％シード分割比プロセスの場合、２５０から９６０リットルの運転体積範囲が要求される。
【表２６】
2015043776.tif 000032
【０２６５】
Ｓ２００ウェーブ（Wave）バイオリアクターで製造される培養液から、１０００リットルシードバイオリアクターに接種することが推奨される。
【０２６６】
１０００リットル：このバイオリアクターは、５日までのバッチで運転し、哺乳動物細胞の培養の場合に供給液の「ショット添加」を行う可能性がある。しかしながら、各バッチ終了後に繰り返しの排液及び再充填の操作があるため、このバイオリアクターでの総プロセス滞留時間は３０日を超えることがあり得る。哺乳動物細胞は、２００００リットルバイオリアクターと同一の羽根車システムを介した撹拌によって均一懸濁液に維持される。さらに可能である場合、他の特徴は２００００リットルバイオリアクターと幾何学的に同様に維持される。
【０２６７】
スパージ空気又は酸素及び空気又は窒素はそれぞれ、工程ＤＯＴを制御する。工程ｐＨは、塩基制御の場合にはアルカリを添加することで、酸制御にはスパージＣＯ２を添加することで制御される。
【０２６８】
バイオリアクターのプロセス運転体積は、運転の異なる相で変わる。最初に、バイオリアクターには、０．５時間以内に２５０から４００リットルで培地ボラスが無菌的に充填される。そのバイオリアクターは、接種前相で運転して、工程変数を所定の設定点とする。（Ｎ−４）Ｓ−２００シードウェーブバイオリアクターからの培養物５０リットルを、１／５又は１／９希釈で１０００リットルバイオリアクターに２５から３０分以内に、空気圧支援流によって接種するか、蠕動ポンプによってポンプ送りする。接種後運転体積は、１／５及び１／９シード接種プロセスでそれぞれ３００及び４５０リットルである。塩基制御のためのアルカリ及び泡抑制のための１／１０消泡剤懸濁液の添加が、最終体積に寄与する。培養間隔が予想より長い場合は、接種物培養物を「ショット添加」によって供給することができる。混合及び気体処理の結果、上記で記載の液体体積は、気体ホールドアップのために大きくなる。この上昇の程度は、使用されるスパージャーの種類、羽根車によって与えられる単位体積当たりの動力及び散布気体の表面気体速度によって決まる。
【０２６９】
生存細胞濃度が移動基準に達した時点で、Ｎ−３ステージは終了する。１／５プロセスにおけるＮ−２ステージは、１．５時間以内での１９２リットルの過剰培養物の排液と７６８リットルの新鮮な培地の添加によって９６０リットルに体積増加して開始する。１／５プロセスの場合、４０００リットルバイオリアクターに、Ｎ−２ステージの終了後に、６９６から７６９リットルの培養物を移動させる。１／９プロセスの場合、４０００リットルバイオリアクターに２３９リットルを移動させる。
【０２７０】
１０００リットルバイオリアクターは連続的に、「排液及び新鮮な培地によって再充填」されるか、「ローリング」することで、４０００リットルバイオリアクター用のバックアップ培養物を提供する。ローリングシード運転の期間は、生産活動の長さ及びシード培養物の許容される経過世代数によって決まる。代表的には、ローリングシード運転は、３０日間を超えると想定される。ローリング運転は、９６０リットル培養物のうちの約１９２リットルずつを保持する工程及び１／５プロセスでは７６８リットルの新鮮な培地で希釈する工程からなる。１／９プロセスでは、１０００リットルバイオリアクターは、４５０から９００リットルの培養物のうちの５０から１００リットルを保持し、４００から８００リットルの新鮮な培地で希釈することで「ローリング」されると予想される。工程制御範囲は、この運転を通じて緩くする。ローリング運転中にバイオリアクターに加えられる培地は、３０℃まで昇温する。
【０２７１】
４０００リットル：このバイオリアクターは、５日間以内のバッチで運転し、哺乳動物細胞の培養の場合に供給液の「ショット添加」を行う可能性がある。哺乳動物細胞は、実施例１に記載のものと同じ羽根車システムを介しての撹拌によって均質懸濁液に維持される。さらに、この容器は２００００リットルバイオリアクターと幾何形状的に類似している。
【０２７２】
スパージ空気もしくは酸素及び空気もしくは窒素はそれぞれ、工程ＤＯＴを制御する。工程ｐＨは、塩基制御の場合にはアルカリを添加することで、酸制御にはスパージＣＯ２を添加することで制御される。
【０２７３】
バイオリアクターのプロセス運転体積は、運転の異なる相で変わる。最初に、バイオリアクターには、１．５時間以内に１９１４から３０７７リットルでタンパク質を含まない培地のボラスが無菌的に充填される。そのバイオリアクターは、接種前相で運転して、工程変数を所定の設定点とする。１０００リットル（Ｎ−２）シードバイオリアクターからの培養物を、１／５又は１／９希釈で１時間以内に、空気圧流によって一定の流量にて接種する。接種後運転体積は、２１５３及び３８４６リットルである。塩基制御のためのアルカリ及び泡抑制のための１／１０消泡剤懸濁液の添加が、最終体積に寄与する。培養間隔が予想より長い場合は、接種物培養物を「ショット添加」によって供給することができる。混合及び気体処理の結果、液体体積は、気体ホールドアップのために大きくなる。この上昇の程度は、使用されるスパージャーの種類、羽根車によって与えられる単位体積当たりの動力及び散布気体の表面気体速度によって決まる。
【０２７４】
２００００リットル：このバイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養の場合には１０から１５日間にわたる回分方式又は流加回分方式で運転される。哺乳動物細胞は、羽根車システムを介した撹拌によって均質懸濁液に維持される。
【０２７５】
バイオリアクターのプロセス運転体積は、運転の異なる相で変わる。最初に、バイオリアクターには、１から２時間以内に１３９１３から１７０９６リットルで細胞培地が無菌的に充填される。そのバイオリアクターは、接種前相で運転して、工程変数を所定の設定点とする。４０００リットルシードバイオリアクター（Ｎ−１）からの培養物を、１／５又は１／９希釈で、空気圧流によって、流量範囲＜４０００リットル／時で接種する。接種後体積は、液面下添加後に連続的に増加して、最大で２００００リットルとなる（二つの供給液合計で４から２５体積％）。塩基制御のためのアルカリ及び泡抑制のための１／１０消泡剤懸濁液の添加が、それぞれ約１００リットル及び２０リットルを占める。混合及び気体処理の結果、液体体積は、気体ホールドアップのために大きくなる。この上昇の程度は、使用されるスパージャーの種類（フルート形又は焼結型）、羽根車によって与えられる単位体積当たりの動力及び散布気体の表面気体速度によって決まる。
【０２７６】
表２７には、通常加工処理時の各種運転体積での２００００リットルバイオリアクターにおけるアスペクト比が記載されている。アスペクト比は５００リットル規模で調べたものであり、表面気体速度及び単位体積当たり動力が一定に保たれている場合、ＫＬａは一定のままである。
【表２７】
2015043776.tif 000033
【符号の説明】
【０２７７】
１      バイオリアクター
１０    タンクの直径
２０    バイオリアクターの合計直線高さ
３０    バイオリアクターの底部高さ
４０    バイオリアクターのヘッド高さ
５０    最大運転体積での液体高さ
６０    頂部羽根車直径
６８    頂部羽根車
７０    底部羽根車直径
７８    底部羽根車
８０    タンク底部と底部羽根車の中心線との間の間隔
９０    羽根車距離
１００  液体表面下の頂部羽根車の間隔
１０８  スパージャー
１１０  スパージャーからタンク底部の間隔
１２０  スパージャーから底部羽根車の間隔
１２８  バッフル
１３８  ポート
１４８  ポート
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月30日(2014.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の培養用のバイオリアクターであって、前記バイオリアクター（１）が少なくとも４０００リットルの体積及び少なくとも１個の頂部羽根車（６８）及び少なくとも１個の底部羽根車（７８）を有し、前記頂部羽根車（６８）が水中翼羽根車であり、頂部羽根車動力数（Ｎｐ）が、少なくとも０．１及び最大で０．９であるバイオリアクター。
【請求項２】
頂部羽根車（６８）が、３ブレード水中翼設計羽根車である請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
底部羽根車（７８）が、４ピッチブレード高堅牢性羽根車である請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
羽根車（６０、７０）／タンク（１０）直径比が、少なくとも０．３５及び最大で０．５５である請求項１〜３のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項５】
羽根車（６０、７０）／タンク（１０）直径比が、少なくとも０．４０及び最大で０．４８である請求項４に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
羽根車（６０、７０）／タンク（１０）直径比が、少なくとも０．４４及び最大で０．４６である請求項４に記載のバイオリアクター。
【請求項７】
頂部羽根車フロー数（Ｎｑ）が、少なくとも０．４及び最大で０．９である請求項１〜６のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項８】
底部羽根車動力数（Ｎｐ）が、少なくとも０．５及び最大で０．９である請求項１〜７のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項９】
底部羽根車フロー数（Ｎｑ）が、少なくとも０．５０及び最大で０．８５である請求項１〜８のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
バイオリアクター（１）が、少なくとも１個のスパージャー（１０８）を有する請求項１〜９のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
バイオリアクター（１）が、少なくとも１個のバッフル（１２８）を有する請求項１〜１０のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１２】
バイオリアクター（１）が、アルカリ添加用の少なくとも２個のポート（１３８、１４８）を有する請求項１〜１１のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１３】
アルカリ添加用の少なくとも２個のポート（１３８、１４８）が、空間的に互いに分離している請求項１２に記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
バイオリアクター（１）が、少なくとも１００００リットルの体積を有する請求項１〜１３のいずれかに記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
バイオリアクター（１）が、少なくとも２００００リットルの体積を有する請求項１〜１４に記載のバイオリアクター。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のバイオリアクターで、適切な条件下、適切な培地中にて、少なくとも１個の哺乳動物細胞を培養する、哺乳動物細胞の培養及び増殖方法。
【請求項１７】
少なくとも２個の羽根車の撹拌速度が、少なくとも５５Ｗ／ｍ３及び最大で８５Ｗ／ｍ３である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物細胞培養用のバイオリアクターシステムであって、
ａ）少なくとも５００リットルの体積を有する第一のバイオリアクター（１１１）が、
ｂ）前記第一のバイオリアクター（１）より大きい体積を有する少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクター（１１）と連結されており、少なくとも２０００リットルの体積を有する前記第二のバイオリアクター（１１）が、
ｃ）前記第二のバイオリアクター（１１）より大きい体積を有する少なくとも１００００リットルの体積を有する請求項１〜１４のいずれかに記載の第三のバイオリアクター（１）に連結されているバイオリアクターシステム。
【請求項１９】
第一のバイオリアクター（１１１）が、少なくとも１０００リットルの体積を有する請求項１８に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２０】
第二のバイオリアクター（１１）が、少なくとも４０００リットルの体積を有する請求項１８又は１９に記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２１】
第三のバイオリアクター（１）が、少なくとも２００００リットルの体積を有する請求項１８〜２０のいずれかに記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２２】
第一又は第二のバイオリアクター（１１１、１１）の少なくとも一方が、請求項１〜１５のいずれかに記載のバイオリアクターである請求項１８〜２１のいずれかに記載のバイオリアクターシステム。
【請求項２３】
哺乳動物細胞を培養及び増殖させる方法であって、
ａ）少なくとも５００リットルの体積を有する第一のバイオリアクターで、適切な条件下、適切な培地中にて、少なくとも１個の哺乳動物細胞を培養し、
ｂ）前記少なくとも１個の哺乳動物細胞から増殖によって得られた細胞を含む培地を、少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターに移動させ、
ｃ）前記移動した細胞を、少なくとも２０００リットルの体積を有する第二のバイオリアクターで培養し、
ｄ）段階ｃ）で得られた細胞を含む培地を、少なくとも１００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターに移動させ、
ｅ）前記移動した細胞を、少なくとも１００００リットルの体積を有する第三のバイオリアクターで培養し、
使用されるバイオリアクターの少なくとも一つが、請求項１〜１５のいずれかに記載のバイオリアクターである方法。
【請求項２４】
第一のバイオリアクターが、少なくとも１０００リットルの体積を有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第二のバイオリアクターが、少なくとも４０００リットルの体積を有する請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
第三のバイオリアクターが、少なくとも２００００リットルの体積を有する請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
培養条件が、段階ａ）、ｃ）及びｅ）のバイオリアクターで同一である請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【外国語明細書】
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