(57)【要約】【課題】ＤＮＡの増幅、合成、検出、配列決定および他の重要な組換えＤＮＡの技法のための頑強、高速、かつ正確なＤＮＡポリメラーゼを提供すること【解決手段】本発明は、とりわけ、少なくとも１つの明確な機能的特性（例えば、延長速度、プロセシビティー、エラー率または忠実度、塩許容性または塩抵抗性）を有する少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼに由来する配列を有する異種ドメインを含有するキメラＤＮＡポリメラーゼならびにその作製方法および使用方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、異なるＤＮＡポリメラーゼの望ましい機能的特性（例えば、プロセシビティーが高いこと；延長速度；熱安定性；塩、ＰＣＲ添加剤（例えば、ＰＣＲエンハンサー）および他の不純物に対する抵抗性が高いこと；ならびに忠実度が高いこと）を、キメラポリメラーゼの中に組み合わせることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１１月３日出願の米国仮特許出願第６１／１１０，８６２号に対して優先権を主張し、その全体の開示が本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して相補的なＤＮＡ鎖を合成する酵素である。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成する鎖の３’末端に遊離のヌクレオチドを付加し、その結果、新しい鎖を５’−３’の方向に延長させることができる。一部のＤＮＡポリメラーゼは、新たに合成されたＤＮＡにおける誤りを修正することができる。このプロセスは、エラー修正として公知である。これらのポリメラーゼは、間違って取り込まれたヌクレオチドを認識することができ、この酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、間違ったヌクレオチドを削除することが可能になる（この活性は校正として公知である）。塩基が削除された後、ポリメラーゼは、正しい塩基を再度挿入することができ、複製が継続され得る。校正機能により、合成が塩基対合を選択する工程のみの結果であった場合のＤＮＡ複製忠実度よりもはるかに高い忠実度のＤＮＡ複製がもたらされる。非特許文献１。３’−５’の校正エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、非校正エキソヌクレアーゼプロセシングポリメラーゼと比較すると、実質的に低いエラー率を有する。非特許文献２。しかし、時には、これらのポリメラーゼの利点は、ＤＮＡ増幅産物の収率を低下させる、その比較的低いプロセシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）によって相殺される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Brutlag，D.およびKornberg，A.、J. Biol. Chem.、２４７巻:２４１〜２４８頁（１９７２年）
【非特許文献２】Chang，L. M. S.、J. Biol. Chem.、２５２巻：１８７３〜１８８０頁（１９７７年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ドメイン交換により、異なるＤＮＡポリメラーゼの望ましい機能的特性（例えば、プロセシビティーが高いこと、延長速度が高いこと、熱安定性、塩、ＰＣＲ添加剤（例えば、ＰＣＲエンハンサー）および他の不純物に対する抵抗性、ならびに忠実度が高いこと）をキメラ酵素の中に組み合わせることができるという発見を包含する。したがって、本発明は、とりわけ、ＤＮＡの増幅、合成、検出、配列決定および他の重要な組換えＤＮＡの技法のための頑強、高速、かつ正確なＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０００５】
一態様では、本発明は、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性が高い特徴を有する第１のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一である配列を有する第１のドメイン；および忠実度が高い特徴を有する第２のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一である配列を有する第２のドメインを含有し、忠実度が高いことおよびプロセシビティーが高いことの両方、延長速度または塩抵抗性が高いという特徴を有するキメラポリメラーゼを提供する。本明細書で使用する、「プロセシビティーが高い」という用語は、プロセシビティーが、鋳型との会合／解離当たり２０ｎｔよりも高い（例えば、４０ｎｔ、６０ｎｔ、８０ｎｔ、１００ｎｔ、１２０ｎｔ、１４０ｎｔ、１６０ｎｔ、１８０ｎｔ、２００ｎｔ、２２０ｎｔ、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ，２８０ｎｔ、３００ｎｔ、３２０ｎｔ、３４０ｎｔ、３６０ｎｔ、３８０ｎｔ、４００ｎｔより高いかまたはそれを超えて高い）ことを指す。本明細書で使用する、「延長速度が高い」という用語は、延長速度が、２５ｎｔ／ｓよりも高い（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０ｎｔ／ｓよりも高い）ことを指す。本明細書で使用する、「塩抵抗性が高い」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、３０ｍＭよりも高い（例えば、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭまたは５０ｍＭよりも高い）塩濃度においてその酵素活性を実質的に維持できることを指す。本明細書で使用する、「忠実度が高い」という用語は、エラー率が、４．４５×１０−６変異／ｎｔ／倍加より低い（例えば、４．０×１０−６、３．５×１０−６、３．０×１０−６、２．５×１０−６、２．０×１０−６、１．５×１０−６、１．０×１０−６、０．５×１０−６変異／ｎｔ／倍加より低い）ことを指す。本明細書で使用する、「ＴＭＡＣ許容性が高い」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、１０ｍＭよりも高い（例えば、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭよりも高い）ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド）濃度においてその酵素活性を実質的に維持できることを指す。本明細書で使用する、「熱安定性が高い」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、９８℃において３０分超（例えば、４５分、６０分、９０分、１８０分、２１０分、２４０分）インキュベートした後、その酵素活性を実質的に維持できることを指す。「プロセシビティー」、「延長速度」、「忠実度」、「塩抵抗性」、「ＴＭＡＣ許容性」、および「熱安定性」という用語は、定義のセクションにおいてさらに定義する。
【０００６】
一部の実施形態では、本発明に適した代表的な第１のＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤポリメラーゼである。一部の実施形態では、本発明に適した代表的な第２のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔ．ｓｐ．ＧＴ、またはＰ．ｓｐ．ＧＢ−Ｄから単離されたポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第２のＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕポリメラーゼである。特定の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼであり、第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである。
【０００７】
一部の実施形態では、適切な第１のドメインは、エキソヌクレアーゼドメイン、Ｎ末端ドメイン、および／または親指ドメインである。一部の実施形態では、適切な第２のドメインは、掌および／または指ドメインである。
【０００８】
一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列は、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基２６〜１０５、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基１５６〜３０１、および／またはＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応する。
【０００９】
一部の実施形態では、第２のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列は、Ｐｆｕポリメラーゼ（配列番号９）のアミノ酸残基３９４〜５６３に対応する。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、
【００１１】
【化１】
2015154787.tif 000002
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
【００１２】
【化２】
2015154787.tif 000003
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
【００１３】
【化３】
2015154787.tif 000004
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
【００１４】
【化４】
2015154787.tif 000005
、（ここでＸ１はＫではなく、Ｘ２はＨではなく、Ｘ３はＲではなく、Ｘ４はＩではなく、Ｘ５はＲではなく、Ｘ６はＫではなく、Ｘ７はＧではなく、Ｘ８はＫではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＲではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＶではなく、Ｘ１３はＤではなく、Ｘ１４はＥではなく、Ｘ１５はＫではなく、Ｘ１６はＩではなく、Ｘ１７はＴではなく、Ｘ１８はＬではなく、Ｘ１９はＥではなく、Ｘ２０はＴではなく、Ｘ２１はＥではなく、Ｘ２２はＶではない。）
【００１５】
【化５】
2015154787.tif 000006
、（ここでＸ１はＩではなく、Ｘ２はＮではなく、Ｘ３はＥではなく、Ｘ４はＫではなく、Ｘ５はＩではなく、Ｘ６はＥではなく、Ｘ７はＳではなく、Ｘ８はＩではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＲではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＩではなく、Ｘ１３はＶではなく、Ｘ１４はＳではなく、Ｘ１５はＰではなく、Ｘ１６はＡではなく、Ｘ１７はＡではなく、Ｘ１８はＫではなく、Ｘ１９はＬではなく、Ｘ２０はＴではなく、Ｘ２１はＩではなく、Ｘ２２はＭではなく、Ｘ２３はＩではなく、Ｘ２４はＭではなく、Ｘ２５はＴではなく、Ｘ２６はＨではなく、Ｘ２７はＴではなく、Ｘ２８はＩではなく、Ｘ２９はＫではなく、Ｘ３０はＤではなく、Ｘ３１はＡではなく、Ｘ３２はＫではなく、Ｘ３３はＳではない。）
【００１６】
【化６】
2015154787.tif 000007
、（ここでＸ１はＴではなく、Ｘ２はＩではなく、Ｘ３はＨではなく、Ｘ４はＥではなく、Ｘ５はＩではなく、Ｘ６はＱではなく、Ｘ７はＡではなく、Ｘ８はＮではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＡではなく、Ｘ１１はＹではなく、Ｘ１２はＰではなく、Ｘ１３はＨではなく、Ｘ１４はＥではなく、Ｘ１５はＩではなく、Ｘ１６はＫではなく、Ｘ１７はＫではなく、Ｘ１８はＫではなく、Ｘ１９はＭではなく、Ｘ２０はＧではなく、Ｘ２１はＲではなく、Ｘ２２はＤではなく、Ｘ２３はＰではなく、Ｘ２４はＳではなく、Ｘ２５はＮではなく、Ｘ２６はＬではなく、Ｘ２７はＡではなく、Ｘ２８はＥではなく、Ｘ２９はＹではなく、Ｘ３０はＫではなく、Ｘ３１はＬではなく、Ｘ３２はＥではなく、Ｘ３３はＧではない。）
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第１のドメイン；ならびに
【００１７】
【化７】
2015154787.tif 000008
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
【００１８】
【化８】
2015154787.tif 000009
、（ここでＸ１はＲではなく、Ｘ２はＳではなく、Ｘ３はＲではなく、Ｘ４はＥではなく、Ｘ５はＶではなく、Ｘ６はＲではなく、Ｘ７はＦではなく、Ｘ８はＤではなく、Ｘ９はＫではなく、Ｘ１０はＡではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＲではなく、Ｘ１３はＫではなく、Ｘ１４はＲではなく、Ｘ１５はＩではなく、Ｘ１６はＹではなく、Ｘ１７はＲではなく、Ｘ１８はＥではなく、Ｘ１９はＴではなく、Ｘ２０はＭではなく、Ｘ２１はＴではなく、Ｘ２２はＩではなく、Ｘ２３はＩではなく、Ｘ２４はＹではなく、Ｘ２５はＩではなく、Ｘ２６はＳではなく、Ｘ２７はＦではなく、Ｘ２８はＦではなく、Ｘ２９はＡではなく、Ｘ３０はＤではなく、Ｘ３１はＡではなく、Ｘ３２はＴではなく、Ｘ３３はＶではなく、Ｘ３４はＭではない。）
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第２のドメイン
を含み、
このキメラポリメラーゼは忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性が高い特徴を有する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、コンセンサス配列
【００２０】
【化９】
2015154787.tif 000010
、（Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）によって定義され、このキメラポリメラーゼは、ＫＯＤの忠実度よりも高い忠実度を有し、Ｐｆｕのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性を有する。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、コンセンサス配列
【００２２】
【化１０】
2015154787.tif 000011
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
によって定義される。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明は、さらに、第１のＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメイン、Ｎ末端ドメイン、および／または親指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一である配列を有する第１のドメイン；および第２のＤＮＡポリメラーゼの掌および／または指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一であるを配列を有する第２のドメインを含有するキメラポリメラーゼを提供する。一部の実施形態では、キメラポリメラーゼは、第２のＤＮＡポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有し、第１のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性を有する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、キメラポリメラーゼを設計製作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法を提供する。本発明による発明の方法は、（ａ）第１のＤＮＡポリメラーゼに基づくＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、および／または親指ドメインを提供する工程；（ｂ）第２のＤＮＡポリメラーゼに基づく掌および／または指ドメインを提供する工程；（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）からのドメインを組み合わせてキメラポリメラーゼを形成する工程を含み、キメラポリメラーゼは、第１のＤＮＡポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有し、第２のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性を有する。一部の実施形態では、本発明に従って設計製作したキメラポリメラーゼは、第１のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性と実質的に同様のプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性、および第２のＤＮＡポリメラーゼの忠実度と実質的に同様の忠実度を有する。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明に適した代表的な第１のＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７（９  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎ−７）、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤポリメラーゼである。一部の実施形態では、本発明に適した代表的な第２のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔ．ｓｐ．ＧＴ、またはＰ．ｓｐ．ＧＢ−Ｄから単離されたポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第２のＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕポリメラーゼである。
【００２６】
一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼであり、第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである。一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼであり、第２のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼである。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を改善する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明による発明の方法は、対象のＤＮＡポリメラーゼの掌および／または指ドメイン内の配列を、対象のＤＮＡポリメラーゼと比較して忠実度が高い特徴を有する異なるＤＮＡポリメラーゼからの対応する配列と置き換える工程を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性を改善する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明による発明の方法は、対象のＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび／または親指ドメイン内の配列を、対象のＤＮＡポリメラーゼと比較してプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性または熱安定性が高い特徴を有する異なるＤＮＡポリメラーゼからの対応する配列と置き換える工程を含む。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載の発明の方法を用いて設計製作し、そして／または改善されたキメラポリメラーゼを含めた、本明細書に記載の種々のキメラポリメラーゼを提供する。一部の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、配列番号１６（配列のセクションにおいて示したＫｏｆｕのアミノ酸配列）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含有する。特定の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、配列番号１５（配列のセクションにおいて示したＰｏｄのアミノ酸配列）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含有する。特定の実施形態では、本発明によるキメラポリメラーゼは、配列番号１５のアミノ酸配列を含有する。
【００３０】
本発明は、本明細書に記載の種々のキメラポリメラーゼを含有するキットおよび組成物ならびにそれらの使用（例えば、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ断片を増幅する方法）も提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載の種々のキメラポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列ならびに本発明によるヌクレオチド配列を含有するベクターおよび／または細胞を提供する。
【００３１】
図面は、例示する目的のためのものにすぎず、限定するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】図１は、代表的な天然に存在するＢ型ＤＮＡポリメラーゼならびに代表的なキメラＤＮＡポリメラーゼであるＫｏｆｕおよびＰｏｄ中のドメインのアライメントを示す図である。ＫｏｆｕキメラおよびＰｏｄキメラにおいて交換されたＫＯＤポリメラーゼドメインおよびＰｆｕポリメラーゼドメインをアライメントの上部に示している。
【図１−２】図１は、代表的な天然に存在するＢ型ＤＮＡポリメラーゼならびに代表的なキメラＤＮＡポリメラーゼであるＫｏｆｕおよびＰｏｄ中のドメインのアライメントを示す図である。ＫｏｆｕキメラおよびＰｏｄキメラにおいて交換されたＫＯＤポリメラーゼドメインおよびＰｆｕポリメラーゼドメインをアライメントの上部に示している。
【図１−３】図１は、代表的な天然に存在するＢ型ＤＮＡポリメラーゼならびに代表的なキメラＤＮＡポリメラーゼであるＫｏｆｕおよびＰｏｄ中のドメインのアライメントを示す図である。ＫｏｆｕキメラおよびＰｏｄキメラにおいて交換されたＫＯＤポリメラーゼドメインおよびＰｆｕポリメラーゼドメインをアライメントの上部に示している。
【図２】図２は、代表的なキメラポリメラーゼであるＰｏｄが、ＰｆｕのＮ末端ドメイン、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメインならびにＫＯＤの掌および指ドメインを含有し、逆のキメラポリメラーゼであるＫｏｆｕが、ＫＯＤのＮ末端ドメイン、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメインならびにＰｆｕの掌および指ドメインを含有することを示す図である。
【図３】図３は、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄの熱安定性を示す代表的な結果を示す図である。
【図４】図４は、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄの塩抵抗性を示す代表的な結果を示す図である。
【図５】図５は、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄのＴＭＡＣ許容性を示す代表的な結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
アミノ酸：本明細書で使用する、「アミノ酸」という用語は、その広義では、ポリペプチド鎖に取り込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準的なアミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般に見られる２０種の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準的なアミノ酸」は、それが合成によって調製されるものであるか天然源から得られるものであるかに関わらず、標準的なアミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用する、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／またはアミノ酸置換を含むがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ末端のアミノ酸および／またはアミノ末端のアミノ酸を含めたアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または他の化学基での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。用語が遊離アミノ酸を指しているか、ペプチドの残基を指しているかは、この用語が使用されている文脈から明らかになる。本明細書において、全てのアミノ酸残基配列は、左右の方向づけが、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式で表されていることに注意されたい。
【００３４】
塩基対（ｂｐ）：本明細書で使用する、塩基対は、二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の連携、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の連携を指す。
【００３５】
キメラポリメラーゼ：本明細書で使用する、「キメラポリメラーゼ」という用語（「キメラ」とも称される）という用語は、天然には存在しないポリメラーゼを作出するために共有結合的または非共有結合的にのいずれかで連結された２つ以上の異種ドメイン、アミノ酸配列、ペプチド、および／またはタンパク質を含有する任意のポリメラーゼを指す。一般には、キメラポリメラーゼは、第２のドメインに連結された第１のドメインを含有し、第１のドメインおよび第２のドメインは、天然では同じ関係性が見られないものである。一般には、第１のドメインは第１のＤＮＡポリメラーゼに由来し、第２のドメインは第２のＤＮＡポリメラーゼに由来する。一般には、第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの明確な機能的特性（例えば、プロセシビティー、延長速度、忠実度、塩許容性、ＰＣＲ添加剤に対する許容性または熱安定性）の特徴を有する。本明細書で使用する、対象のＤＮＡポリメラーゼに由来する配列は、対象のＤＮＡポリメラーゼに見られる任意の配列、または対象のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有する任意の配列を指す。本発明による「キメラポリメラーゼ」は、新規の機能性タンパク質を形成するために連結された、関連するポリメラーゼまたは類似のポリメラーゼ（例えば、類似の配列および／または構造を共有しているタンパク質）からの２つ以上のアミノ酸配列を含有し得る。本発明による「キメラポリメラーゼ」は、新規の機能性タンパク質を形成するために連結された、関連のないポリメラーゼからの２つ以上のアミノ酸配列を含有し得る。例えば、本発明のキメラポリメラーゼは、異なる種類の生物体によって発現されたタンパク質構造の「種間の」または「遺伝子間の」融合物であり得る。
【００３６】
相補的な：本明細書で使用する、「相補的な」という用語は、塩基対合を通した、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間、または２つのヌクレオチド間の配列相補性の広範な概念を指す。アデニンヌクレオチドがチミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成できることは公知である。同様に、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドと塩基対合できることは公知である。
【００３７】
ＤＮＡ結合親和性：本明細書で使用する、「ＤＮＡ結合親和性」という用語は、一般には、ＤＮＡ核酸に結合することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合活性は、２バンドシフトアッセイにおいて測定することができる。例えば、一部の実施形態では（Guagliardiら、（１９９７年）、J.Mol. Biol.、２６７巻
：８４１〜８４８頁のアッセイに基づいて）、二本鎖核酸（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓのｌａｃＳ遺伝子からの４５２−ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片）を、少なくとも約２．５×１０７ｃｐｍ／μｇ（または少なくとも約４０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）の比活性まで、標準的な方法を使用して３２Ｐで標識する。例えば、Sambrookら、（２００１年）、MolecularCloning：ALaboratory Manual(第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY)の９．６３〜９．７５（核酸の末端標識について記載している）を参照されたい。反応混合物を、少なくとも約０．５μｇのポリペプチドを結合バッファー（５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）、１０％のグリセロール、２５ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２）約１０μｌ中に含有させて調製する。反応混合物を１０分間、３７℃まで加熱する。標識された二本鎖核酸約１×１０４〜５×１０４ｃｐｍ（または約０．５〜２ｎｇ）を反応混合物に加え、さらに１０分間インキュベートする。反応混合物を、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸バッファー中ネイティブポリアクリルアミドゲルにローディングする。反応混合物を、室温で電気泳動に供する。ゲルを乾燥させ、標準的な方法を使用したオートラジオグラフィーに供する。標識された二本鎖核酸の移動度の任意の検出可能な低下により、ポリペプチドと二本鎖核酸の間に結合性複合体が形成されたことが示される。そのような核酸結合活性は、最初の反応混合物における放射活性の総量と比較して、結合性複合体における放射活性の量を測定するための標準的なデンシトメトリー法を使用して定量化することができる。ＤＮＡ結合親和性を測定する他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Kongら、（１９９３年）、J.Biol.Chem.、２６８巻（３
号）：１９６５〜１９７５頁を参照されたい）。
【００３８】
ドメイン：本明細書で使用する、「ドメイン」という用語は、１つまたは複数の定義済みの機能または特質を含む、ポリペプチド（例えば、ポリメラーゼ）のアミノ酸配列を指す。
【００３９】
延長速度：本明細書で使用する、「延長速度」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼがポリマー鎖を伸長する平均速度を指す。本明細書で使用する、延長速度が高いとは、延長速度が２５ｎｔ／ｓよりも高い（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０ｎｔ／ｓよりも高い）ことを指す。
【００４０】
酵素活性：本明細書で使用する、「酵素活性」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼの特異性および効率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、「ポリメラーゼ活性」とも称され、一般には、ポリヌクレオチドの鋳型指向性合成を触媒することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。ポリメラーゼの酵素活性は、当技術分野で公知の種々の技法および方法を用いて測定することができる。例えば、ポリメラーゼの段階希釈物を、希釈バッファー（例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＫＣｌ、０．５％のＮＰ４０、および０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）中で調製することができる。各希釈物について、５μｌを取り出し、２５ｍＭのＴＡＰＳ（ｐＨ９．２５）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．１ｍＭのｄＣＴＰ、１２．５μｇの活性化ＤＮＡ、１００μＭの［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（０．０５μＣｉ／ｎｍｏｌ）および滅菌脱イオン水を含有する反応混合物４５μｌに加えることができる。反応混合物を３７℃（または、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼに対しては７４℃）で１０分間インキュベートし、次いで反応物を即座に４℃まで冷却し、氷冷の６０ｍＭのＥＤＴＡ１０μｌを加えることによって停止させることができる。各反応混合物から一定分量２５μｌを取り出すことができる。取り込まれなかった放射性標識ｄＣＴＰを、ゲル濾過（Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｎ．Ｊ．）によって各一定分量から取り出すことができる。カラム溶出液を、シンチレーション液（１ｍｌ）と混合することができる。カラム溶出液における放射活性を、シンチレーションカウンターを用いて定量化してポリメラーゼによって合成された産物の量を決定する。ポリメラーゼ活性の１単位は、３０分間に１０ｎモルの産物を合成するために必要なポリメラーゼの量として定義することができる（Lawyerら（１９８９年）、J.Biol. Chem.、２６４巻：６４２７〜６４７頁）。ポリメラーゼ活性を測定する他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Sambrookら（２００１年）、MolecularCloning:ALaboratory Manual （第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY）を参照されたい）。
【００４１】
忠実度：本明細書で使用する、「忠実度」という用語は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の正確度を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、一般には、エラー率（不正確なヌクレオチド、すなわち、鋳型ヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドが取り込まれる頻度）によって測定する。ＤＮＡ重合の正確度または忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。「忠実度が高い」という用語は、エラー率が、４．４５×１０−６変異／ｎｔ／倍加より低い（例えば、４．０×１０−６、３．５×１０−６、３．０×１０−６、２．５×１０−６、２．０×１０−６、１．５×１０−６、１．０×１０−６、０．５×１０−６変異／ｎｔ／倍加より低い）ことを指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、Cline、J.ら（１９９６年）、NAR、２４巻：３５４６〜３５５１頁に記載のｌａｃＩ  ＰＣＲ忠実度アッセイを使用して試験することができる。簡単に述べると、ｌａｃＩＯｌａｃＺα標的遺伝子をコードする１．９ｋｂの断片を、２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、７２℃、３０分間で全ｄＮＴＰ２５ｎモルを取り込むために必要な酵素の量）を適切なＰＣＲバッファー中で使用して、ｐＰＲＩＡＺプラスミドＤＮＡから増幅する。次いで、ｌａｃＩを含有するＰＣＲ産物をラムダＧＴ１０アームにクローニングし、ｌａｃＩ変異体のパーセンテージ（ＭＦ、変異の頻度）を、記載の通り（Lundberg,K.S.、Shoemaker,D. D.、Adams, M. W. W.、Short, J. M.、Sorge, J. A.、およびMathur, E. J.（１９９１年）、Gene、１８０巻：１〜８頁）着色スクリーニ
ングアッセイにおいて決定する。エラー率は、複製当たり１ｂｐ当たりの変異の頻度（ＭＦ／ｂｐ／ｄ）として表され、ここでｂｐはｌａｃＩ遺伝子配列（３４９）において検出可能な部位の数であり、ｄは、有効な標的倍加の数である。上記と同様に、ｌａｃＩＯｌａｃＺα標的遺伝子を含有する任意のプラスミドを、ＰＣＲ用の鋳型として使用することができる。ＰＣＲ産物は、青色／白色着色スクリーニングを可能にする、ラムダＧＴとは異なるベクター（例えば、プラスミド）にクローニングすることができる。
【００４２】
連結された：本明細書で使用する、「連結された」は、これらに限定されないが、介在ドメインを伴う組換え融合または介在ドメインを伴わない組換え融合、媒介性融合、非共有結合的会合、およびジスルフィド結合を含めた共有結合、水素結合、静電結合、および高次構造の結合（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｂｏｎｄｉｎｇ）を含めた、ポリペプチドドメインを機能的に結合するための当技術分野で公知の任意の方法を指す。
【００４３】
ヌクレオチド：本明細書で使用する、ＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニットは、糖部分（ペントース）、リン酸塩および窒素複素環塩基からなる。塩基はグリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結されていて、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの３’位または５’位に結合したリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと称される。作動可能に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書において、一般には「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と称され、本明細書において、左から右への方向づけが、５’末端から３’末端への方向になっている従来の式によって表されている。
【００４４】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：本明細書で使用する、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子と定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、その因子は同様にオリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、合成によってまたはクローニングによって導くことができる。本明細書で使用する、「ポリヌクレオチド」という用語は、鎖内で共有結合したヌクレオチド単量体で構成されたポリマー分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。
【００４５】
ポリメラーゼ：本明細書で使用する、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す（すなわち、ポリメラーゼ活性）。一般に、酵素は、ポリヌクレオチドの鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端において合成を開始し、鋳型鎖の５’末端へ進行する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。
【００４６】
プロセシビティー：本明細書で使用する、「プロセシビティー」は、ポリメラーゼが、鋳型に付着してとどまり、複数の修飾反応を行うことができることを指す。「修飾反応」として、重合、およびエキソヌクレアーゼ性の切断（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、「プロセシビティー」は、ＤＮＡポリメラーゼが、成長しているＤＮＡ鎖からの酵素の解離を間に起こすことなく一連の重合工程を行うことができることを指す。一般には、ＤＮＡポリメラーゼの「プロセシビティー」は、成長しているＤＮＡ鎖からのＤＮＡポリメラーゼの解離が間に起こることなく重合または修飾されるヌクレオチドの長さによって評価される（例えば２０ｎｔ、３００ｎｔ、０．５〜１ｋｂ以上）。「プロセシビティー」は、ポリメラーゼの性質、ＤＮＡ鋳型の配列、および反応条件、例えば、塩濃度、温度または特定のタンパク質の存在に依存し得る。本明細書で使用する、「プロセシビティーが高い」という用語は、プロセシビティーが、鋳型との会合／解離当たり、２０ｎｔよりも高い（例えば、４０ｎｔ、６０ｎｔ、８０ｎｔ、１００ｎｔ、１２０ｎｔ、１４０ｎｔ、１６０ｎｔ、１８０ｎｔ、２００ｎｔ、２２０ｎｔ、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ，２８０ｎｔ、３００ｎｔ、３２０ｎｔ、３４０ｎｔ、３６０ｎｔ、３８０ｎｔ、４００ｎｔより高いかまたはそれを超えて高い）ことを指す。プロセシビティーは、本明細書およびＷＯ０１／９２５０１Ａ１において定義された方法に従って測定することができる。
【００４７】
プライマー：本明細書で使用する、「プライマー」という用語は、天然に存在しているものであろうと、合成によって作出されたものであろうと、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、例えば、４種の異なるヌクレオチド三リン酸塩および熱安定性酵素が、適切な温度において適切なバッファー（「バッファー」は、適切なｐＨ、イオン強度、補助因子などを含む）中に存在するときに核酸合成の開始点の役割を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、代替として二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、まず、その鎖を分離するために処理され、その後、伸長産物を調製するために使用される。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、熱安定性酵素の存在下で伸長産物の合成を開始する（ｐｒｉｍｅ）ために十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源および方法の使用を含めた多くの因子に依存する。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは一般には１５〜２５ヌクレオチドを含有するが、それよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含有し得る。短いプライマー分子は、一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、低温度を必要とする。
【００４８】
塩抵抗性：本明細書で使用する、「塩抵抗性」（塩許容性とも称される）という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、塩またはＰＣＲ添加剤（例えば、ＴＭＡＣ）の存在下でその酵素活性を実質的に維持できることを指す。一部の実施形態では、塩またはＰＣＲ添加剤に対する抵抗性は、ＤＮＡポリメラーゼが依然として活性である最大塩濃度によって測定される。最大塩濃度は、各ポリメラーゼによって異なり、当技術分野で公知である、または、当技術分野の方法に従って実験的に決定することができる。例えば、Ｐｆｕは、３０ｍＭの塩で阻害される（ＰＣＲ反応において）。
【００４９】
合成：本明細書で使用する、「合成」という用語は、ポリヌクレオチドの新しい鎖を作製するため、または現存するポリヌクレオチド（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）を鋳型依存的な方式で延長するための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法を指す。本発明による、合成は、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列のコピー数を増加させる、増幅を含む。ポリヌクレオチドの合成（例えば、増幅）によりヌクレオチドがポリヌクレオチド（すなわちプライマー）に取り込まれ、それによってポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子が形成される。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、さらなるポリヌクレオチド分子を合成するために鋳型として使用することができる。本明細書で使用する「ＤＮＡ合成」は、ＰＣＲ、ポリヌクレオチドの標識（すなわちプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーに対して）、ポリヌクレオチドの配列決定を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
鋳型ＤＮＡ分子：本明細書で使用する、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えば、プライマー伸長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって、それから相補的な核酸鎖が合成される、核酸の鎖を指す。
【００５１】
鋳型依存的な方式：本明細書で使用する、「鋳型依存的な方式」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含むプロセスを指す。「鋳型依存的な方式」という用語は、一般には、新たに合成されるポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的な塩基対合の周知の規則によって規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチドの合成を指す（例えば、Watson,J. D.ら、Molecular Biology of the Gene、第４版、W. A. Benjamin,Inc.、Menlo Park、Calif.、（１９８７年）
を参照されたい）。
【００５２】
熱安定性酵素：本明細書で使用する、「熱安定性酵素」という用語は、熱に対して安定であり（熱抵抗性とも称する）、ヌクレオチドの重合を触媒して（容易にして）ポリヌクレオチド鋳型配列に相補的なプライマー伸長産物を形成する酵素を指す。一般には、熱安定性の、安定なポリメラーゼは、ＰＣＲサイクル中、二本鎖核酸を高温（例えば、約９５℃）に曝露させることによって変性させる熱サイクルプロセスにおいて好まれる。ＰＣＲ増幅反応に対して有効な本明細書に記載の熱安定性酵素は、少なくとも１つの基準を満たす、すなわち、酵素は、二本鎖核酸の変性をもたらすために必要な時間、高温度に供したとき、不可逆的に変性（不活化）しない。本明細書の目的での不可逆的な変性は、酵素活性の恒久的かつ完全な損失を指す。変性に必要な加熱条件は、例えば、バッファーの塩濃度および変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、一般には、主に温度および核酸の長さに依存する時間、一般には約０．２〜４分間、約９０℃〜約９８℃の範囲である。バッファーの塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が上昇するにつれて、より高い温度が許容され得る。一部の実施形態では、熱安定性酵素は、約９０℃〜１００℃において不可逆的に変性しない。一般には、本発明に適した熱安定性酵素は、それを下回る温度でプライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションが促進される温度である約４０℃よりも高い、作用の最適温度を有するが、（１）マグネシウム濃度および塩濃度および（２）プライマーの組成および長さに依存し、ハイブリダイゼーションはより高い温度（例えば、４５℃〜７０℃）で起こり得る。酵素に対して最適な温度が高くなるにつれて、プライマー指向性伸長プロセスの特異性および／または選択性が増す。しかし、４０℃未満（例えば、３７℃）で活性な酵素も、熱安定性であれば本発明の範囲である。一部の実施形態では、最適温度は、約５０℃〜９０℃にわたる（例えば、６０℃〜８０℃）。
【００５３】
ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性：本明細書で使用する、「ＴＭＡＣ許容性もしくは他のＰＣＲエンハンサー許容性」（ＴＭＡＣ抵抗性または他のＰＣＲエンハンサー抵抗性とも称される）という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、ＴＭＡＣまたは他のＰＣＲエンハンサー（例えば、グリセロール、ＤＭＳＯ、ベタイン、アミド、他のテトラメチルアンモニウム塩）の存在下でその酵素活性を実質的に維持できることを指す。
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、少なくとも１つの明確な機能的特性（例えば、延長速度、プロセシビティー、エラー率または忠実度、塩許容性または塩抵抗性）を有する少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼに由来する配列を有する異種ドメインを含有するキメラＤＮＡポリメラーゼならびにその作製方法および使用方法を提供する。
【００５５】
ＤＮＡポリメラーゼ
本発明によるキメラＤＮＡポリメラーゼは、任意のＤＮＡポリメラーゼ、特に、熱安定性のポリメラーゼから設計製作することができる。一般には、ＤＮＡポリメラーゼは、６つのファミリー：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＸおよびＹにグループ分けされる。ファミリーＡ、Ｂ、Ｃは、それぞれ、それらのアミノ酸配列の、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩに対する相同性に基づいてグループ分けされる。ファミリーＸは、相同性のＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼを有さない。一部の実施形態では、本発明に適したＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼである。ファミリーＢのポリメラーゼとして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  ＩＩ、古細菌のポリメラーゼ、ＰＲＤ１、ｐｈｉ２９、Ｍ２、Ｔ４バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、真核生物のポリメラーゼα、Δ、ε、および多くのウイルスのポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明に適したＤＮＡポリメラーゼは、古細菌のポリメラーゼ（例えば、ユーリ古細菌の（ｅｕｒｙａｒｃｈａｅａｌ）ポリメラーゼ）である。
【００５６】
適切な代表的な古細菌ポリメラーゼとして、古細菌からのＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｖｅｎｔ（商標）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ７２１０１）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１２９８３、ＢＡＡ０２３６２）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ＧＢ−Ｄ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６７１３１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤＩ（ＫＯＤ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＤ１７５５５３、ＢＡＡ０６１４２；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＫＯＤ株（Ｐｆｘ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＥ６８７３８））、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ、Ｐｄｂ：４６９９８０６）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌａｔａｒｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ００２７５４、Ｐ２６８１１）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８１１０９）、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｏ２９７５３）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ６３９５２）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０７５７９、ＢＡＡ０７５８０）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ９°  Ｎｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８８７６９、Ｑ５６３６６）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９３７３８、Ｐ７４９１８）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１８５５５）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＥ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８５０）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ１３５４５６；ＷＯ０１３２８８７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＴＹ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７３４７５）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ７７９１６）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８４９）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ１４３７７６）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＥ２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９０８８７）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＳＴ７００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８４７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ４１１３１２．１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３３６６８９０）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５０．１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｅ１４１３７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５７．１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ  ＮＡ１、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ２７８１５）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｑ５８２９５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＴＯＫ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔｔａ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ５２０２５）およびＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ６２７１２、Ｐ９５６９０１、ＢＡＡＡ０７５７９などの他の古細菌のＢポリメラーゼ））が挙げられる���、これらに限定されない。さらなる代表的な温度安定性のファミリーＡおよびファミリーＢのポリメラーゼとして、例えば、好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ種（例えば、ｆｌａｖｕｓ、ｒｕｂｅｒ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｌａｃｔｅｕｓ、ｒｕｂｅｎｓ、ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓから抽出されたポリメラーゼが挙げられる。
【００５７】
本発明に適したＤＮＡポリメラーゼは、未だ単離されていないＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明に適したＤＮＡポリメラーゼは、融合ポリメラーゼを含む。融合ポリメラーゼは、一般に、Ｎ末端またはＣ末端において、付加的ドメイン（ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ）を持たないポリメラーゼと比較して融合ポリメラーゼの表現型を変化させるさらなるタンパク質ドメインを含有する。代表的なポリメラーゼとして、Ｃ末端またはＮ末端において融合した二本鎖ＤＮＡ結合性ドメインを持つポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。融合ポリメラーゼの他の例として、Ｎ末端またはＣ末端に融合したｄＵＴＰアーゼを持つものが挙げられる（米国特許出願第２００７０１９０５３８号）。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明によるキメラＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの明確な機能的特性を有する２つ以上のＤＮＡポリメラーゼに由来する配列を含有する。代表的な機能的特性としては、プロセシビティー、延長速度、忠実度、塩またはＰＣＲ添加剤（例えば、ＰＣＲエンハンサー）に対する抵抗性、熱安定性、鎖の置き換え活性、エキソヌクレアーゼ活性、ウラシル先読み機能、ヌクレオチド選択性、修飾された類似体を取り込む能力、および逆転写酵素活性が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、一部のＤＮＡポリメラーゼは、忠実度が高い特徴を有する。本明細書で使用する、「忠実度が高い」という用語は、エラー率が、４．４５×１０−６変異／ｎｔ／倍加より低い（例えば、４．０×１０−６、３．５×１０−６、３．０×１０−６、２．５×１０−６、２．０×１０−６、１．５×１０−６、１．０×１０−６、０．５×１０−６変異／ｎｔ／倍加より低い）ことを指す。一部のＤＮＡポリメラーゼは、プロセシビティーが高い特徴を有する。本明細書で使用する、「プロセシビティーが高い」という用語は、プロセシビティーが、鋳型との会合／解離当たり２０ｎｔよりも高い（例えば、４０ｎｔ、６０ｎｔ、８０ｎｔ、１００ｎｔ、１２０ｎｔ、１４０ｎｔ、１６０ｎｔ、１８０ｎｔ、２００ｎｔ、２２０ｎｔ、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ，２８０ｎｔ、３００ｎｔ、３２０ｎｔ、３４０ｎｔ、３６０ｎｔ、３８０ｎｔ、４００ｎｔよりも高いまたはそれを超えて高い）ことを指す。一部のＤＮＡポリメラーゼは、延長速度が高い特徴を有する。本明細書で使用する、「延長速度が高い」という用語は、延長速度が、２５ｎｔ／ｓよりも高い（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０ｎｔ／ｓよりも高い）ことを指す。一部の酵素は、塩に対する抵抗性（塩許容性とも称される）が高い特徴を有する。本明細書で使用する、「塩抵抗性が高い」（塩許容性が高いとも称される）という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、３０ｍＭよりも高い（例えば、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭよりも高い）塩濃度においてその活性を実質的に維持できることを指す。さらに、一部の酵素は、ＰＣＲ添加剤に対する抵抗性を特徴とする。ある特定のＰＣＲ添加剤は、ＰＣＲエンハンサーである。例えば、Kovarovaらは、ＴＭＡ塩、ＤＭＳＯ、ベタインおよびホルムアミドがＰＣＲエンハンサーの役割を果たすことを示した（KovarovaおよびDraber（２０００年）、Nucl.Acids.Res.、２８巻（１３号）、ｅ７０）。ＰＣＲエンハンサーの他の例は、グリセロールである。一部の酵素は、ＰＣＲエンハンサー、特に、ＴＭＡＣに対する抵抗性（ＴＭＡＣ許容性とも称される）を特徴とする。本明細書で使用する、「ＴＭＡＣ許容性が高い」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼが、１０ｍＭよりも高い（例えば、１５ｍＭ、２０ｍＭよりも高い）ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド）濃度においてその酵素活性を実質的に維持できることを指す。代表的なＤＮＡポリメラーゼのある種の特性を表１に示す。
【００５９】
【表１】
2015154787.tif 000012
一般には、塩許容性が高い酵素は、プロセシビティーおよび／または延長速度が高い特徴も有する。いかなる理論にも縛られることは望まないが、塩許容性はポリメラーゼとＤＮＡの間の結合親和性に影響を及ぼし、それが今度はプロセシビティーまたは延長速度に影響を及ぼすと考えられている。一般には、ポリメラーゼのＤＮＡへの結合は、正電荷を持つアミノ酸残基と負電荷を持つＤＮＡの間の結合相互作用が関与する。高塩濃度では、ポリメラーゼ上の正電荷を持つアミノ酸残基に対する塩の陰イオンとの競合がＤＮＡ結合親和性の減少につながる。参照により本明細書に組み込まれている、Pavlovら（２００２年）、Proc.Natl. Acad. Sci.、９９巻（２１号）：１３５１０〜１３５１５頁を参照されたい。一方、ＤＮＡとポリメラーゼのさらなる接触点によりポリメラーゼのＤＮＡに対する結合親和性が増加し、解離速度が低下することがあり、そのためポリメラーゼがＤＮＡに長く会合したままになり、それが今度はプロセシビティーの増加につながるので、ＤＮＡとポリメラーゼの接触点が増加することによって、ポリメラーゼの塩抵抗性ならびにプロセシビティーまたは延長速度が増加し得る。例えば、Pavlovらは、トポイソメラーゼＶからの、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフをＴａｑおよびＰｆｕに加えた。これらのモチーフは、トポイソメラーゼＶにおけるＤＮＡ結合に関与する。Pavlovらは、ＰｆｕおよびＴａｑのどちらも、ＨｈＨモチーフと融合させると塩抵抗性が高まることを示した。Pavlovらは、ＴａｑおよびＰｆｕの双方に対するＨｈＨ融合によって、ポリメラーゼのプロセシビティーが増加することも示した。他の例として、ｄｓＤＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｓｓｏ７ｄをＤＮＡポリメラーゼに融合させて、ＤＮＡとポリメラーゼの接触点の数を増加させることができる（Wangら（２００４年）、Nucl.AcidsRes.、３２巻（３号）：１１９７〜１２０７頁、参照により本明細書に組み込まれている
）。Ｓｓｏ７ｄは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓにおける、ＤＮＡの安定性および／またはＤＮＡのパッキングを確実にすることに関与する配列非特異的なｄｓＤＮＡ結合性タンパク質である。Ｓｓｏ７ｄのＴａｑおよびＰｆｕの双方への融合によって、ポリメラーゼの塩抵抗性およびプロセシビティーが増加した。
【００６０】
プロセシビティー、延長速度、熱安定性、塩許容性またはＰＣＲエンハンサー許容性が高い特徴を有する代表的なＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９が挙げられるが、これらに限定されない。忠実度が高い特徴を有する代表的なＤＮＡポリメラーゼとして、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔ．ｓｐ．ＧＴ、またはＰ．ｓｐ．ＧＢ−Ｄから単離されたポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
これに限定するものでない例として、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９Ｎ−７のポリメラーゼが、キメラＤＮＡポリメラーゼを設計製作するために使用される（実施例のセクションを参照されたい）。
【００６２】
ＤＮＡポリメラーゼのドメイン
一般には、古細菌のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも以下のドメインを含む：Ｎ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン）、掌、指および親指ドメイン（図１を参照されたい）。ドメインの構造、機能および共調（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）の知識は、主に結晶構造の研究および種々のＤＮＡポリメラーゼ、特に、古細菌のＤＮＡポリメラーゼの部位特異的変異誘発に基づいている。例えば、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの第１の結晶構造の中で得られたのはバクテリオファージＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼのものである（Wangら（１９９７年）、Cell、８９巻：１０８７〜１０９９頁、参照により本明細書に組み込まれている）。古細菌のＤＮＡポリメラーゼの第１の結晶構造の中で、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼが解明された（参照により本明細書に組み込まれている、Hopfnerら、１９９９年、Proc.Natl.Acad. Sci.、９６巻（７号）、３６００〜３６０５頁を参照されたい）。最近、以下の古細菌のファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの結晶構造が報告されている：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｏＮ−７からのＤＮＡポリメラーゼ（Rodriguezら（２０００年）、J.Mol. Biol.、２９９巻：４４７〜４６２頁、参照により本明細書に組み込まれている）、ＫＯＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Hashimotoら、２００１年、J.Mol.Biol.、３０６巻（３
号）、４６９〜４７７頁、参照により本明細書に組み込まれている）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（その全てが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９４８，６６３号；同第５，８６６，３９５号；同第５，５４５，５５２号；同第５，５５６，７７２号およびKimら（２００８年）、Int.J.Biol. Macromol.、４２巻（４号）、３５
６〜６１頁を参照されたい）。
【００６３】
基質結合、ヌクレオチド転移、触媒活性、校正などの種々の機能が、ＤＮＡポリメラーゼの構造機能分析に基づいて、種々のドメインに割り当てられている。これらのドメインが互いにしっかりと共調して、ＤＮＡの複製プロセスを完了することも示唆されている。
【００６４】
例えば、ポリメラーゼ活性は、掌ドメイン、指ドメインおよび親指ドメインと関連付けられている。特に、掌サブドメインは、ポリメラーゼの触媒部位であると考えられている。ポリメラーゼは、入ってくるｄＮＴＰのアルファリン酸塩がＯＨプライマー末端からの求核攻撃を受ける、リン酸転移反応を触媒する。一般には、３つのカルボキシレート側鎖がこの活性部位に重要である。これらの残基は、ＯＨ末端の脱プロトン化およびｄＮＴＰのアルファリン酸塩における遷移状態の形成を容易にし得る２つの金属イオン（Ｍｇ＋＋）と結合し得る。親指ドメインは、新たに合成されたｄｓＤＮＡの副溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｖｅ）と相互作用し、入ってくるヌクレオチドとも相互作用すると考えられている。親指ドメインは、保存性が少ないが、一般には大部分がらせん構造を有する。指ドメインは、鋳型の固定およびヌクレオチド特異性において役割を果たし得る。親指ドメインと同様、指ドメインは、入ってくるヌクレオチドと相互作用する可能性が高い。親指ドメインは、αヘリックスおよび／またはβ鎖を含有する可能性がある。結合していないＤＮＡポリメラーゼは、指ドメインおよび親指ドメインの開放型の高次構造を形成し、ＤＮＡが結合したとき、２つのドメインは掌ドメインに向かって移動して、ＤＮＡ鋳型およびプライマーをさらにしっかりと保持し、入ってくるヌクレオチドと鋳型ヌクレオチドの間のワトソンクリック塩基対合を探索すると考えられている。鋳型とワトソンクリック塩基対を形成するヌクレオチドが存在することにより、ポリメラーゼの活性部位の適切な高次構造の形成、およびその後の、このヌクレオチドの取り込みが容易になる。総説について、Hamiltonら（２００１年）、BioTechniques、３１巻：３７０〜３８３頁を参照されたい。掌
／指ドメインにおける変異誘発が、ヌクレオチドの選択性および親和性に影響を及ぼし得、また親指ドメインにおける変異誘発がｄｓＤＮＡに対する結合親和性に影響を及ぼし得ることが報告された。掌ドメイン、指ドメインおよび親指ドメイン内の重要なアミノ酸は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００６０２８１１０９号に記載されている。
【００６５】
ウラシル先読み機能は、Ｎ末端ドメインと関連付けられている。例えば、古細菌のファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖内の未修復のウラシルを認識し、損傷の上流の重合を失速させてＡ−Ｔ変異を防止することができる。古細菌のＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメイン内の「ポケット」は、鋳型鎖と相互作用し、このウラシル先読み機能をもたらすように配置されていることが同定されている（Foggら（２００２年）NatureStructural Biology、９巻（１２号）、９２２〜９２７頁）。
【００６６】
エキソヌクレアーゼドメインは、間違って挿入されたヌクレオチドを除去するために必要な、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５”エキソヌクレアーゼ活性のいずれか、またはその両方と関連付けられている。ミスマッチヌクレオチドが取り込まれた場合、鋳型／プライマー鎖は、ポリメラーゼへの結合が弱くなり、かつ／またはポリメラーゼの活性部位に対して位置がずれ（ｍｉｓａｌｉｇｎｅｄ）、これによってミスマッチヌクレオチドがエキソヌクレアーゼドメインの活性部位に移動し、削除される。
【００６７】
忠実度は、ミスマッチヌクレオチドの存在下における解離速度、高次構造上の変化、およびヌクレオチドの取り込み速度に影響され得る、ポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性の比に影響されると考えられている。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性とポリメラーゼ活性のバランスは、Ｎ末端ドメインおよびエキソヌクレアーゼドメインとＣ末端ポリメラーゼドメインの間（すなわち、掌ドメイン、指ドメインおよび親指ドメイン）に位置するＹ−ＧＧ／Ａモチーフを含有する可動性ループによって媒介されることも示唆されている。Bohlkeら（２０００年）、Nucl.Acids Res.、２８巻（２０号）、３９１０〜３９１７頁を参照されたい。エキソヌクレアーゼドメインの独特のループおよび上記親指の先端が、ＤＮＡポリメラーゼにおける校正の配位およびポリメラーゼ活性にとって重要である。このループ、特にＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼのＨ１４７における部位特異的変異誘発により、このループと上記親指の静電気的相互作用および疎水性相互作用がエキソヌクレアーゼ活性とポリメラーゼ活性の間の比、したがって忠実度に影響を及ぼすことが示唆された。Kuroitaら、J.Mol.Biol.（２００５年）３５１巻、２９１〜２９８頁を参照
されたい。
【００６８】
ドメイン交換
本発明によれば、異なるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、少なくとも１つの明確な機能的特性を持つポリメラーゼ）からの異種ドメインを組み合わせてキメラポリメラーゼを形成することができる。適切なドメインとして、種々のＤＮＡポリメラーゼに見られる、天然に存在するＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、掌ドメイン、指ドメイン、および／または親指ドメインが挙げられる。種々のＤＮＡポリメラーゼの、天然に存在するＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、掌ドメイン、指ドメイン、および／または親指ドメインは良く定義されている。例えば、Ｎ末端ドメインは、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基２６〜１０５に対応する配列を含み得る。エキソヌクレアーゼドメインは、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基１５６〜３０１に対応する領域を含み得る。親指ドメインは、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応する領域を含み得る。掌および指ドメインは、Ｐｆｕポリメラーゼ（配列番号９）のアミノ酸残基３９４〜５６３に対応する領域を含み得る。
【００６９】
種々のＤＮＡポリメラーゼにおける対応するドメインまたは位置は、アミノ酸配列のアライメントによって決定することができる。アミノ酸配列のアライメントは、当技術分野の技術の範囲内の種々の様式で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アライメントを評価するための適切なパラメータを決定することができる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェアを使用してアミノ酸配列の同一性を決定することが好ましい（Altschulら、Methodsin Enzymology、２６６巻、４６０〜４８０頁（１９９６年）；http://blast.wustl/edu/blast/README.html）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほ
とんどはデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に従って設定される：オーバーラップスパン（ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ）＝１、オーバーラップフラクション（ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、ワード閾値（ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、プログラム自体によって確立されるが、特定の配列の組成によって、最小値は調整することができ、上記の通り設定される。アライメントの例を図１に示す。
【００７０】
一部の実施形態では、適切なドメインは、天然に存在するドメイン配列の変異体（例えば、変異体または断片）であってよい。例えば、適切なドメインは、対象のＤＮＡポリメラーゼに見られる天然に存在するドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の同一性を有する配列を有し得る。
【００７１】
Ｎ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、掌ドメイン、指ドメイン、および／または親指ドメインを規定している配列は、忠実度またはエラー率、延長速度、プロセシビティー、および塩抵抗性などのＤＮＡポリメラーゼの特定の酵素特性と相互に関係付けることができることも企図されている。例えば、実施例のセクションに記載の通り、本発明者らは、Ｎ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび／または親指ドメインを規定している配列が、延長速度、プロセシビティー、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または塩抵抗性に関連する特性と相互に関係付けることができ、また、掌ドメインおよび／または指ドメインを規定している配列が、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率に関連する特性と相互に関係付けることができることを実証した。
【００７２】
さらに、種々のＤＮＡポリメラーゼ間の配列アライメントに基づいて（例えば図１を参照されたい）、プロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または塩抵抗性が高いことと相関関係にあるドメインは、以下のポジティブコンセンサス配列の１つまたは複数によって規定することができることも意図している：
ポジティブコンセンサス配列１（Ｎ末端ドメインを規定している）
【００７３】
【化１１】
2015154787.tif 000013
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
ポジティブコンセンサス配列２（エキソヌクレアーゼドメインを規定している）
【００７４】
【化１２】
2015154787.tif 000014
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
ポジティブコンセンサス配列３（親指ドメインを規定している）
【００７５】
【化１３】
2015154787.tif 000015
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
それに加えてまたはその代わりに、プロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または塩抵抗性が高いことと相関関係にある（１つまたは複数の）ドメインは、以下のネガティブコンセンサス配列の１つまたは複数によって規定することができる。
【００７６】
ネガティブコンセンサス配列１（Ｎ末端ドメインを規定している）
【００７７】
【化１４】
2015154787.tif 000016
、（ここでＸ１はＫではなく、Ｘ２はＨではなく、Ｘ３はＲではなく、Ｘ４はＩではなく、Ｘ５はＲではなく、Ｘ６はＫではなく、Ｘ７はＧではなく、Ｘ８はＫではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＲではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＶではなく、Ｘ１３はＤではなく、Ｘ１４はＥではなく、Ｘ１５はＫではなく、Ｘ１６はＩではなく、Ｘ１７はＴではなく、Ｘ１８はＬではなく、Ｘ１９はＥではなく、Ｘ２０はＴではなく、Ｘ２１はＥではなく、Ｘ２２はＶではない。）
ネガティブコンセンサス配列２（エキソヌクレアーゼドメインを規定している）
【００７８】
【化１５】
2015154787.tif 000017
、（ここでＸ１はＩではなく、Ｘ２はＮではなく、Ｘ３はＥではなく、Ｘ４はＫではなく、Ｘ５はＩではなく、Ｘ６はＥではなく、Ｘ７はＳではなく、Ｘ８はＩではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＲではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＩではなく、Ｘ１３はＶではなく、Ｘ１４はＳではなく、Ｘ１５はＰではなく、Ｘ１６はＡではなく、Ｘ１７はＡではなく、Ｘ１８はＫではなく、Ｘ１９はＬではなく、Ｘ２０はＴではなく、Ｘ２１はＩではなく、Ｘ２２はＭではなく、Ｘ２３はＩではなく、Ｘ２４はＭではなく、Ｘ２５はＴではなく、Ｘ２６はＨではなく、Ｘ２７はＴではなく、Ｘ２８はＩではなく、Ｘ２９はＫではなく、Ｘ３０はＤではなく、Ｘ３１はＡではなく、Ｘ３２はＫではなく、Ｘ３３はＳではない。）
ネガティブコンセンサス配列３（親指ドメインを規定している）
【００７９】
【化１６】
2015154787.tif 000018
、（ここでＸ１はＴではなく、Ｘ２はＩではなく、Ｘ３はＨではなく、Ｘ４はＥではなく、Ｘ５はＩではなく、Ｘ６はＱではなく、Ｘ７はＡではなく、Ｘ８はＮではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＡではなく、Ｘ１１はＹではなく、Ｘ１２はＰではなく、Ｘ１３はＨではなく、Ｘ１４はＥではなく、Ｘ１５はＩではなく、Ｘ１６はＫではなく、Ｘ１７はＫではなく、Ｘ１８はＫではなく、Ｘ１９はＭではなく、Ｘ２０はＧではなく、Ｘ２１はＲではなく、Ｘ２２はＤではなく、Ｘ２３はＰではなく、Ｘ２４はＳではなく、Ｘ２５はＮではなく、Ｘ２６はＬではなく、Ｘ２７はＡではなく、Ｘ２８はＥではなく、Ｘ２９はＹではなく、Ｘ３０はＫではなく、Ｘ３１はＬではなく、Ｘ３２はＥではなく、Ｘ３３はＧではない。）
一部の実施形態では、忠実度が高いことと相関関係にあるドメインは、以下のポジティブコンセンサス配列（掌および指ドメインを規定している）によって規定することができる：
【００８０】
【化１７】
2015154787.tif 000019
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）。
【００８１】
それに加えてまたはその代わりに、忠実度が高いことと相関関係にあるドメインは、以下のネガティブコンセンサス配列（掌および指ドメインを規定している）によって規定することができる：
【００８２】
【化１８】
2015154787.tif 000020
、（ここでＸ１はＲではなく、Ｘ２はＳではなく、Ｘ３はＲではなく、Ｘ４はＥではなく、Ｘ５はＶではなく、Ｘ６はＲではなく、Ｘ７はＦではなく、Ｘ８はＤではなく、Ｘ９はＫではなく、Ｘ１０はＡではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＲではなく、Ｘ１３はＫではなく、Ｘ１４はＲではなく、Ｘ１５はＩではなく、Ｘ１６はＹではなく、Ｘ１７はＲではなく、Ｘ１８はＥではなく、Ｘ１９はＴではなく、Ｘ２０はＭではなく、Ｘ２１はＴではなく、Ｘ２２はＩではなく、Ｘ２３はＩではなく、Ｘ２４はＹではなく、Ｘ２５はＩではなく、Ｘ２６はＳではなく、Ｘ２７はＦではなく、Ｘ２８はＦではなく、Ｘ２９はＡではなく、Ｘ３０はＤではなく、Ｘ３１はＡではなく、Ｘ３２はＴではなく、Ｘ３３はＶではなく、Ｘ３４はＭではない。）。
【００８３】
したがって、明確な機能的特性を持つＤＮＡポリメラーゼから適切なドメインを取り出してまたは導き出して、望ましい組合せの機能的特性を持つキメラＤＮＡポリメラーゼを設計製作することができる。一部の実施形態では、本発明による発明の方法は、（ａ）第１のＤＮＡポリメラーゼに基づくＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、および／または親指ドメインを提供する工程；（ｂ）第２のＤＮＡポリメラーゼに基づく掌および／または指ドメインを提供する工程；（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）からのドメインを組み合わせてキメラポリメラーゼを形成する工程を含む。一部の実施形態では、第１および第２のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの明確な特性を特徴とする。例えば、第１のＤＮＡポリメラーゼが、プロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または塩抵抗性が高い特徴を有し、第２のＤＮＡポリメラーゼが、忠実度が高い特徴を有してよい。一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼは忠実度が高いことを特徴としてよく、第２のＤＮＡポリメラーゼはプロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または塩抵抗性が高い特徴ことを特徴としてよい。一部の実施形態では、本発明に従って設計製作したキメラポリメラーゼは、第１のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性または塩抵抗性と実質的に同様のプロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性または塩抵抗性、および第２のＤＮＡポリメラーゼの忠実度と実質的に同様の忠実度を有する。一部の実施形態では、本発明に従って設計製作したキメラポリメラーゼは、第１のＤＮＡポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有し、第２のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度または塩抵抗性よりも高いプロセシビティー、延長速度または塩抵抗性を有する。
【００８４】
本発明は、さらに、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度、プロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または塩抵抗性を改善する方法を企図している。一部の実施形態では、本発明による発明の方法は、対象のＤＮＡポリメラーゼの掌−指ドメイン内の配列を、対象のＤＮＡポリメラーゼと比較して忠実度が高い特徴を有する、異なるＤＮＡポリメラーゼからの対応する配列で置き換える工程を含む。
【００８５】
それに加えてまたはその代わりに、一部の実施形態では、本発明による発明の方法は、対象のＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび／または親指ドメイン内の配列を、対象のＤＮＡポリメラーゼと比較してプロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性または塩抵抗性が高い特徴を有する、異なるＤＮＡポリメラーゼからの対応する配列で置き換える工程を含む。
【００８６】
これに限定するものではない例として、本発明者らは、ＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼに基づいて、キメラＤＮＡポリメラーゼであるＫｏｆｕおよびその逆キメラであるＰＯＤを設計製作した（実施例のセクションを参照されたい）。実施例のセクションに記載の通り、Ｋｏｆｕは、ＫＯＤポリメラーゼからのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメイン、ならびにＰｆｕポリメラーゼからの掌−指ドメインを含有する。Ｋｏｆｕポリメラーゼの配列は、配列番号１６に示されている。逆キメラＰＯＤは、ＰｆｕポリメラーゼからのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメイン、ならびにＫＯＤポリメラーゼからの掌−指ドメインを含有する。ＰＯＤポリメラーゼの配列は配列番号１５に示されている。
【００８７】
実施例のセクションに記載の通り、Ｋｏｆｕキメラポリメラーゼは、Ｐｆｕに近似した複製忠実度を示すが、ＫＯＤと同様の延長速度、プロセシビティー、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性およびＰＣＲ性能を示す。あるいは、Ｐｏｄキメラポリメラーゼは、ＫＯＤに近似した複製忠実度を示すが、Ｐｆｕと同様の延長速度、プロセシビティー、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性およびＰＣＲ性能を示す。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６（Ｋｏｆｕのアミノ酸配列）と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一であるアミノ酸配列を含有する、Ｋｏｆｕキメラポリメラーゼの変異体を提供する。特定の実施形態では、本発明によるＫｏｆｕキメラポリメラーゼの変異体は、Ｋｏｆｕと実質的に同様のプロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または忠実度を有する。
【００８９】
一部の実施形態では、本発明によるＫｏｆｕキメラポリメラーゼの変異体は、コンセンサス配列
【００９０】
【化１９】
2015154787.tif 000021
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
によって規定される。
【００９１】
一部の実施形態では、本発明によるＫｏｆｕキメラポリメラーゼの変異体は、コンセンサス配列
【００９２】
【化２０】
2015154787.tif 000022
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
によって規定される。
【００９３】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１５（Ｐｏｄのアミノ酸配列）と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一であるアミノ酸配列を含有する、ＰＯＤキメラポリメラーゼの変異体を提供する。特定の実施形態では、本発明によるＰＯＤキメラポリメラーゼの変異体はＰＯＤと実質的に同様のプロセシビティー、延長速度、熱安定性、ＴＭＡＣ許容性および／または忠実度を有する。
【００９４】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの発現
標準的な組換えＤＮＡの技法（例えば、制限酵素による消化、ライゲーション、ＰＣＲ）を使用して、本発明によるキメラＤＮＡポリメラーゼを設計製作することができる。当技術分野で周知の方法を適用してキメラＤＮＡポリメラーゼを発現させ、単離することができる。多くの細菌性発現ベクターは、外来配列によってコードされるタンパク質を高レベルで誘導性発現させることができる配列要素または配列要素の組合せを含有する。発現ベクターは、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/AllTables.html#）から市販されている。
【００９５】
さらに、組み込まれた誘導型のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現している細菌を、Ｔ７プロモーターに連結されたキメラＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターで形質転換することができる。適切な誘導物質、例えば、ｌａｃ−誘導性プロモーターに対するイソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを誘導することにより、Ｔ７プロモーターからキメラ遺伝子の高レベルの発現が誘導される。
【００９６】
適切な細菌宿主株は、当業者によって当技術分野において入手可能なものから選択することができる。これに限定するものではない例として、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ−２１株が、Ｅ．ｃｏｌｉの他の株と比較してプロテアーゼ欠乏性であるので、外因性タンパク質を発現させるために一般に用いられている。特定のポリメラーゼ遺伝子についてのコドンの利用がＥ．ｃｏｌｉ遺伝子において通常見られるものと異なる状況のために、より希なアンチコドンを持つｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子（例えば、ａｒｇＵ  ｔＲＮＡ遺伝子、ｉｌｅＹ  ｔＲＮＡ遺伝子、ｌｅｕＷ  ｔＲＮＡ遺伝子およびｐｒｏＬ  ｔＲＮＡ遺伝子）を担持するように改変されたＢＬ−２１の株があり、クローニングされたキメラ遺伝子を高効率で発現させることを可能にする（希なコドンｔＲＮＡを担持しているいくつかのＢＬ２１−ＣＯＤＯＮ  ＰＬＵＳＴＭ細胞株は、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）。それに加えてまたはその代わりに、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を容易にするためにコドン最適化をすることができる。コドン最適化された配列は、化学合成することができる。
【００９７】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの精製に適した当業者に公知の多くの方法がある。例えば、Lawyerらの方法（１９９３年、PCR Meth. &App.、２巻：２７５頁）は、元々はＴａｑポリメラーゼを単離するために設計されたため、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させたＤＮＡポリメラーゼを単離するために良く適している。あるいは、宿主タンパク質を破壊するための熱変性工程、および、活性が高く、およそ８０％純粋なＤＮＡポリメラーゼを単離するための２カラム精製工程（ＤＥＡＥ−セファロースカラムおよびヘパリン−セファロースカラムを通じて）を使用するKongらの方法（１９９３年、J.Biol.Chem.、２６
８巻：１９６５頁、参照により本明細書に組み込まれている）を用いることができる。
【００９８】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、硫安分画し、続いてＱセファロースカラムおよびＤＮＡセルロースカラムによって、またはＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムにおいて夾雑物を吸着し、続いてＨｉＴｒａｐヘパリンカラムから勾配溶出させることによって単離することができる。
【００９９】
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼの使用
本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの合成を伴う任意の方法に使用することができる。ポリヌクレオチドの合成方法は、当業者に周知であり、例えば、MolecularCloning、第２版、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring Harbor、N.Y.（１９８９年）において見ることができる。 例えば、本発明のキメ
ラＤＮＡポリメラーゼは、これらに限定されないが、ニックトランスレーションによるＤＮＡの標識、ｃＤＮＡクローニングにおける第２鎖ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡの配列決定、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した核酸配列の増幅、検出、および／またはクローニングを含めた組換えＤＮＡ技術における種々の使用を有する。
【０１００】
一部の実施形態では、本発明は、ＰＣＲのための頑強、高速、かつ正確な酵素を提供する。ＰＣＲは、特異的なポリヌクレオチドの鋳型配列を増幅するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法を指す。ＰＣＲの技法は、PCR:APractical Approach、M. J. McPhersonら
、IRL Press（１９９１年）、InnisらによるPCR Protocols: AGuide to Methods and Applications、AcademicPress（１９９０年）、およびPCR Technology:Principals and Applications for DNAAmplification、H. A. Erlich、Stockton Press（１９８９年）を含
めた多数の出版物に記載されている。ＰＣＲは、それぞれが参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；同第４，９６５，１８８号；同第４，８８９，８１８号；同第５，０７５，２１６号；同第５，０７９，３５２号；同第５，１０４，７９２号；同第５，０２３，１７１号；同第５，０９１，３１０号；および同第５，０６６，５８４号を含めた多くの米国特許にも記載されている。
【０１０１】
プロセシビティー、延長速度および／または忠実度が高いキメラＤＮＡポリメラーゼにより、エラー率が低下し、長期増幅の効率および成功率が改善し（より高い収量で、より長く標的を増幅する）、および／またはＤＮＡ鋳型の必要量が減少することが予想される。
【０１０２】
種々の特異的なＰＣＲ増幅の応用が当技術分野において利用可能である（総説について、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている、Erlich、１９９９年、RevImmunogenet.、１巻:１２７〜３４頁; Prediger、２００１年、MethodsMol. Biol.、１６０巻:４９〜６３頁; Jurecicら、２０００年、Curr.Opin. Microbiol.、３巻:３
１６〜２１頁;Triglia、２０００年、Methods Mol. Biol.、１３０巻:７９〜８３頁; MaClellandら、１９９４年、PCRMethodsAppl.、４巻:Ｓ６６〜８１; AbramsonおよびMyers
、１９９３年、Current Opinion in Biotechnology、４巻:４１〜４７頁を参照されたい
）。
【０１０３】
これに限定するものでない例として、本発明は、これに限定されないが、ｉ）非特異的な増幅を減少させるホットスタートＰＣＲ；ｉｉ）高いアニーリング温度で開始し、次いで、非特異的なＰＣＲ産物を減少させるための工程においてアニーリング温度を低下させるタッチダウンＰＣＲ；ｉｉｉ）外側のプライマーセットおよび内側のプライマーセットを使用して信頼度がより高い産物を合成するネステッドＰＣＲ；ｉｖ）既知配列に隣接している領域を増幅するための逆ＰＣＲ。この方法では、ＤＮＡを消化し、所望の断片をライゲーションによって環状化し、その後、既知配列に相補的な外向きに伸長しているプライマーを使用したＰＣＲを行なう。ｖ）ＡＰ−ＰＣＲ（任意開始（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｐｒｉｍｅｄ））／ＲＡＰＤ（無作為増幅多型ＤＮＡ）。これらの方法では、任意のオリゴヌクレオチドを使用して増幅することによって、あまり知られていない標的配列を持つ種からゲノムフィンガープリントを作成する。；ｖｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを合成し、その後ｃＤＮＡをＰＣＲに使用するＲＴ−ＰＣＲ。この方法は、組織または細胞中の特定の配列の発現を検出するために非常に感度が高い。この方法は、ｍＲＮＡ転写物を定量化するためにも使用することができる。：ｖｉｉ）ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）。これは、ＤＮＡ／タンパク質の配列についての情報が限られている場合に使用される。この方法は、ｃＤＮＡの３’末端または５’末端を増幅し、それぞれ特異的なプライマー１つのみにより（加えて１つのアダプタープライマー）ｃＤＮＡ断片を生成させる。次いで、オーバーラップＲＡＣＥ産物を組み合わせて全長ｃＤＮＡを作出することができる；ｖｉｉｉ）異なる組織において示差的に発現された遺伝子を同定するために使用するＤＤ−ＰＣＲ（ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ）。ＤＤ−ＰＣＲにおける最初の工程はＲＴ−ＰＣＲを伴い、次いで短い、計画的な非特異的プライマーを使用して増幅を行う；ｉｘ）同じ検体中のＤＮＡ配列の２つ以上の独特な標的が同時に増幅されるマルチプレックスＰＣＲ。１つのＤＮＡ配列をＰＣＲの質を検証するための対照として使用することができる；ｘ）同じプライマーセットに対して、標的ＤＮＡと競合する（競合ＰＣＲ）内部コントロールＤＮＡ配列（しかしサイズが異なる）を使用するＱ／Ｃ−ＰＣＲ（定量的比較）；ｘｉ）遺伝子を合成するために使用する反復ＰＣＲ（Ｒｅｃｕｓｉｖｅ  ＰＣＲ）。この方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、一続きの遺伝子（＞８０塩基）に対して、あるいは末端のオーバーラップ（−２０塩基）を持つセンス鎖およびアンチセンス鎖に対して相補的である。；ｘｉｉ）非対称ＰＣＲ；ｘｉｉｉ）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ＰＣＲ；ｘｉｖ）部位特異的ＰＣＲ変異誘発；ｘｖ）全ゲノムを増幅するために、部分的に縮重した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを使用するＤＯＰ−ＰＣＲ；ｘｖｉ）増幅を検出するためにＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎまたはオリゴヌクレオチドプローブを使用する定量ＰＣＲ；ｘｖｉｉ）アダプターにライゲーションされたＤＮＡ断片ライブラリーを鋳型として使用する全ゲノム増幅、およびｘｖｉｉｉ）ＰＣＲ��物中の変異の数が増加するように条件を最適化したエラープローンＰＣＲを含めた、ＰＣＲの応用において使用することができる。
【０１０４】
本発明は、いかなる特定の増幅システムにも限定されないことが理解されよう。他のシステムが開発されたとき、それらのシステムは、本発明の実行によって利益を得ることができる。
【０１０５】
キット
本発明は、本発明のキメラＤＮＡポリメラーゼおよびその組成物を含有する１つまたは複数の容器を有するパッケージユニットを含むキット形式も企図している。一部の実施形態では、本発明は、ＰＣＲにおける合成を含めた、ポリヌクレオチドを合成するために使用する種々の試薬の容器をさらに含むキットを提供する。
【０１０６】
本発明による発明のキットは、以下の品目の１つまたは複数も含有してよい：ポリヌクレオチド前駆物質、プライマー、バッファー、説明書、およびコントロール。キットは、本発明による方法を実行するために適切な比率で互いに混合された試薬の容器を含んでよい。試薬の容器は、試薬を単位量で含有することが好ましく、それは、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の方法を実行するときの計量工程（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｓｔｅｐ）を不要にする。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１）
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのキメラの設計
本発明者らが本実験に含めるために選出した２つの酵素は、Ｐｙｒｏｃｃｏｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｒｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）のＤＮＡポリメラーゼであった。２つの酵素は類似のドメイン構造を有し、ｂｌａｓｔＰアライメント用いたアミノ酸レベルで７９％の同一性を有する（表２を参照されたい）。ＰｆｕおよびＫＯＤのドメイン構造を図１に示す。
【０１０８】
【表２】
2015154787.tif 000023
ＰｆｕおよびＫＯＤは、特に、延長速度、プロセシビティーおよびエラー率に関して非常に明確な表現型の特性を有する（表３を参照されたい）：
【０１０９】
【表３】
2015154787.tif 000024
したがって、目的は、ＫＯＤに匹敵するプロセシビティーおよび／または延長速度（それぞれ、約３００ｎｔ／ｓおよび１０６〜１３８ｎｔ／ｓ）を伴って、Ｐｆｕに匹敵するエラー率（２．０×１０−６）を示す、これら２つの酵素のキメラの組合せを見つけることであった。上記の特性を持つ酵素は、ＰＣＲのための頑強、高速、かつ正確な酵素としての有用性を有する。
【０１１０】
制限酵素部位を、ＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼのコドン最適化されたヌクレオチド配列の、上記酵素のポリメラーゼドメインにほぼ隣接する位置に挿入した（実施例２を参照されたい）。例えば、ポリメラーゼドメイン（掌ドメインおよび指ドメイン）に隣接しているＰｖｕＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を使用して、ＰｆｕのポリメラーゼドメインをＫＯＤのポリメラーゼドメインで置き換えて、Ｐｏｄとみなされるキメラを発生させた（図２）。このキメラは、ＰｆｕのＮ末端ドメイン、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメイン、ならびにＫＯＤの掌ドメインおよび指ドメインを含有する。キメラＫｏｆｕを生じる逆交換（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｗａｐ）を、ＫＯＤのポリメラーゼドメイン（掌および指）をＰｆｕのポリメラーゼドメイン（掌および指）で置き換えることによって発生させた。
【０１１１】
（実施例２）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓのＤＮＡポリメラーゼのコドン最適化および合成
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのポリメラーゼＩ（配列番号１）およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓのポリメラーゼＩ（配列番号２）についての天然のＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋから検索した。これらの２つのＤＮＡ配列は、Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて発現させるために、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて、Ｃｏｄｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によってコドン最適化し、その結果、ＰｆｕポリメラーゼＩのコドン最適化された遺伝子ＤＮＡ配列に対して配列番号３、ＫＯＤポリメラーゼＩのコドン最適化された遺伝子ＤＮＡ配列に対して配列番号４がもたらされた。２つのコドン最適化された遺伝子を化学合成し、Ｃｏｄｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によってｐＵＣ１９にクローニングし、その結果、ＰｆｕポリメラーゼＩに対して配列番号７、ＫＯＤポリメラーゼＩに対して配列番号８がもたらされた。
【０１１２】
（実施例３）
コドン最適化されたＫＯＤポリメラーゼＩおよびＰｆｕポリメラーゼＩの配列の発現ベクターｐＫＢｅｘｐへのクローニング
ＫＯＤポリメラーゼのコドン最適化されたｐＵＣ１９構築物（配列番号８）およびＰｆｕポリメラーゼのコドン最適化されたｐＵＣ１９構築物（配列番号７）を、下記の通りｐＫＢｅｘｐベクターにクローニングした：
ｐＫＢｅｘｐベクターは、非相補的な突出を持つ２つのＥｃｏ３１Ｉ部位を含有し、単一の制限酵素を使用した、挿入物の定方向クローニングを可能にする。ＫＯＤポリメラーゼ遺伝子およびＰｆｕポリメラーゼ遺伝子を、ｐＫＢｅｘｐへの定方向かつインフレームのクローニングを可能にする２つの隣接Ｅｃｏ３１Ｉ部位を用いて設計した。
【０１１３】
ｐＫＢｅｘｐベクターから精製したＤＮＡを、Ｅｃｏ３１Ｉを用いて消化し、アガロースゲルから精製した。ＫＯＤおよびＰｆｕのコドン最適化されたｐＵＣ  ＤＮＡ構築物（配列番号８および配列番号７）を、同様にＥｃｏ３１Ｉを用いて消化し、およそ２．３キロベースの挿入断片をアガロースゲルから切り取り、精製した。３０ｎｇのＫＯＤポリメラーゼ遺伝子またはＰｆｕポリメラーゼ遺伝子と１５ｎｇの消化されたｐＫＢｅｘｐを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。ライゲーション反応物を精製し、適格なＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用した。ＤＮＡミニプレップをアンピシリン抵抗性クローンで作製した。挿入物に隣接している２つの酵素であるＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてミニプレップを消化することにより、挿入物の存在を確認した。ＫＯＤポリメラーゼの遺伝子配列の、ｐＫＢ１１とみなされるｐＫＢｅｘｐへのクローニングおよびＰｆｕポリメラーゼ遺伝子の、ｐＫＢ１４とみなされるｐＫＢｅｘｐへのクローニングを、ＤＮＡを配列決定することによって確認した。
【０１１４】
（実施例４）
ＫＯＤポリメラーゼＩ遺伝子およびＰｆｕポリメラーゼＩ遺伝子からのＤＮＡ配列のドメイン交換
ＫＯＤポリメラーゼＩ遺伝子（配列番号５）およびＰｆｕポリメラーゼＩ遺伝子（配列番号３）のコドン最適化された配列を、ＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼの指ドメインおよび掌ドメインにほぼ隣接する制限酵素部位を用いて設計した。ＫＯＤのコドン最適化された配列は、ＰｖｕＩＩ制限酵素部位およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含有する。Ｐｆｕのコドン最適化された配列は、ＰｖｕＩＩ制限酵素部位およびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含有する。
【０１１５】
ｐＫＢ１１およびｐＫＢ１４から精製されたＤＮＡをそれぞれ、制限酵素のＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩを用いて消化した。それぞれの消化物からの大きな断片（４．７ｋｂ）および小さな断片（０．７ｋｂ）をアガロースゲルから別々に抽出し、精製した。それぞれの制限酵素による消化物からの小さな断片は、それぞれ、ＫＯＤおよびＰｆｕの指ドメインおよび掌ドメインを含有した。消化および精製された大きな断片（発現ベクターおよび残存ポリメラーゼ断片を含有する）を、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐａｔｅを使用して脱リン酸化した。ＰＯＤとみなされる構築物を、４．７ｋｂのＰｆｕの大きな断片（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基１〜３３５および５６７〜７７８）３０ｎｇと、０．７ｋｂのＫＯＤの小さな断片（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号１１のアミノ酸残基３３６〜５６５に対応する）１０ｎｇをライゲーションすることによって創出した。したがって、ＰＯＤは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼからのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメイン、ならびにＫＯＤからの掌ドメインおよび指ドメインを含む。Ｋｏｆｕとみなされる構築物を、４．７ｋｂのＫＯＤの大きな断片（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号１１のアミノ酸残基１〜３３５および５６６〜７７７に対応する）３０ｎｇと、０．７ｋｂのＰｆｕの小さな断片（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号１１のアミノ酸残基３３６〜５６６に対応する）１０ｎｇをライゲーションすることによって作製した。したがって、Ｋｏｆｕは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼからのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび親指ドメイン、ならびにＰｆｕからの掌ドメインおよび指ドメインを含む。ライゲーション反応を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換した。Ｐｏｄ（配列番号１３）およびＫｏｆｕ（配列番号１４）の構築を、ＤＮＡを配列決定することによって確認した。ＰＯＤおよびＫｏｆｕのドメイン構造を図１に示す。キメラポリメラーゼの発現および精製は、当技術分野で公知の方法、例えば、「発明を実施するための形態」に総説した方法を使用して行う。
【０１１６】
（実施例５）
ＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄの熱安定性
各酵素１０ｎｇを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２５ｍＭまたは５０ｍＭのＫＣｌ（ＰｆｕおよびＰｏｄに対して２５ｍＭ、ＫＯＤおよびＫｏｆｕに対して５０ｍＭ）を含有する１０μｌの体積中、９８℃で２４０分、１２０分、６０分、３０分、１５分、８分、４分、２分、１分または０分インキュベートした。加熱インキュベートした後、プライマー／鋳型混合物１０μｌを各チューブに加えた。プライマー鋳型混合物は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．６ｍＭのｄＮＴＰ、０．６μＭのそれぞれのプライマー、ＨＰＲＴ１−Ｆ１（５’−ｔｔｔｇｇａａａｃａｔｃｔｇｇａｇｔｃｃｔ−３’（配列番号４０））およびＨＰＲＴ１−Ｒ１（５’−ｇｃｃｃａａａｇｇｇａａｃｔｇａｔａｇｔｃ−３’（配列番号：４１））、１μｌ当たり２ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、および２５ｍＭまたは５０ｍＭのＫＣｌ（ＰｆｕおよびＰｏｄに対して２５ｍＭ、ＫＯＤおよびＫｏｆｕに対して５０ｍＭ）を含有した。増幅を以下のサイクルプロトコールを用いて行った：９５℃で３分、３５×（９８℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒）、７２℃で２０秒。ＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて分析した（図３を参照されたい）。図３に示したように、９８℃で４時間、酵素をプレインキュベートした後、Ｐｆｕについて増幅は観察されなかった。対照的に、ＫＯＤ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄでは、試験した全ての時点でＰＣＲ産物を増幅することができた。
【０１１７】
（実施例６）
忠実度アッセイ
酵素の忠実度を、Clineらおよびその中の参照文献（Nucl.Acids Res.、１９９６年、２４巻（１８号）：３５４６〜３５５１頁）に記載の方法と同様の方法によって決定した。ＬａｃＩをＥ．ｃｏｌｉからＰＣＲ増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングしてプラスミドｐＫＢ−ＬａｃＩＱＺアルファ（配列番号１７）を変性させた（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）。ｐＫＢ−ＬａｃＩＱＺアルファは、忠実度アッセイにおいてＬａｃＩをＰＣＲ増幅するための鋳型としての役割、および青色／白色コロニースクリーニングを行うための、増幅ＬａｃＩをその中にクローニングするベクターとしての役割の両方を果たした。
【０１１８】
ｐＫＢ−ＬａｃＩＱＺアルファプラスミド鋳型７０ｎｇ（ｌａｃＩ標的２５ｎｇと等価）および各酵素２．５Ｕを、１．３８６ＫｂのｌａｃＩＯＺアルファ断片を増幅するために使用して、ＰＣＲ反応物２×５０μｌ（各酵素に対して）を供給した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：ＰｆｕおよびＰｏｄを用いた増幅は、Ｐｆｕバッファー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）中で行い；ＫＯＤおよびＫｏｆｕを用いた増幅は、ＮｏｖａｇｅｎのＫＯＤバッファー１中で行った。最終濃度は、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４μＭのそれぞれのプライマー、Ｍ１３−４０（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号４２））およびＰＫＢｌａｃ−１Ｒ（ＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧ（配列番号４３））および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ。ＰｆｕおよびＰｏｄに対するサイクルパラメータは、９４℃で４分、３０×（９４℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で３分）、７２℃で６分であった。ＫＯＤおよびＫｏｆｕに対するサイクルパラメータは、９４℃で２分、３０×（９８℃で１５秒、５５℃で２秒、７２℃で２０秒）、７２℃で３０秒であった。
【０１１９】
ＰＣＲ産物の収量を、ゲル電気泳動によって定量化し、鋳型の倍加数を算出した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ、ＮｃｏＩおよびＤｐｎＩを用いて消化し、ゲル精製し（ＵＶ光に曝露させることなく）、ＸｂａＩ−ＮｃｏＩで消化したｐＫＢ−ＬａｃＩＱＺアルファにライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉをライゲーション混合物で形質転換し、細胞をＬＢ−Ａｍｐ−Ｘ−ｇａｌプレート上に播種した。青色コロニーの数、白色コロニーの数およびコロニーの総数を記録した。エラー率ｆをｆ＝−ｌｎ（Ｆ）／（ｄ×（ｂｐ））（ここで、Ｆ＝白色コロニーの割合（（全コロニー−青色のコロニー）／全コロニー）、ｄ＝鋳型の倍加数およびｂ＝３４９（３４９ｂｐのｌａｃＩアンプリコンのみをスコア化する））として算出した。代表的な結果を表４に要約している。表４に示したように、ＰｆｕおよびＫｏｆｕは類似した忠実度を有し、それらの忠実度はＫＯＤおよびＰｏｄの忠実度よりも高い。
【０１２０】
【表４】
2015154787.tif 000025
（実施例７）
プロセシビティーアッセイ
プロセシビティーは、（Wangら、Nucl. Acids Res、２００４年、３２巻（３号）：１１９７〜１２０７頁；およびVon Hippelら、NYAcadSci、１９９４年；７２６巻：１１８〜１３１頁）に記載のアッセイを使用して決定し、算出することができる。簡単に述べると、０．８ｐモルの５’ＦＡＭ標識したプライマー（−４０Ｍ１３ＬＦＦ、５’ＦＡＭ−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ−３’（配列番号４４））を、体積１６μＬ中、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３ｍＭのｄＮＴＰの存在下で１．６ｐモルのｓｓＭ１３ｍｐ１８  ＤＮＡに加える。プライマーを、サーモサイクラーにおいて９５℃で２分間加熱した後、０．１℃／秒の速度で７２℃までゆっくり冷却し、７２℃で１０分間インキュベートし、０．１℃／秒で４℃までさらに冷却することによって、鋳型にアニーリングする。ポリメラーゼを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＫＣｌに希釈する。刺激された（ｐｒｉｍｅｄ）鋳型および希釈されたポリメラーゼを７２℃まで加熱し、希釈されたポリメラーゼ４μｌを刺激された鋳型１６μｌに加えることによって反応を開始させる。ポリメラーゼを希釈して、ポリメラーゼ：鋳型の比を１：１０〜１：１００００にする。それぞれ異なる時点の後に、ＥＤＴＡを最終濃度が１０ｍＭになるように加えることによって反応を終了させる。
【０１２１】
伸長反応物を、ＡＢＩ  ３１３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて分析する。各反応物について産物の長さの中央値を決定する。産物の長さの中央値を、全ての産物の総蛍光強度が、全ての検出可能な産物の蛍光強度の和の５０％と等しい長さに達する産物の長さとして定義する。ポリメラーゼの濃度またはインキュベーション時間の変化で産物の長さの中央値が変化しない試料についての極微量（ｔｒａｃｅ）を用いて、VonHippelら（Von Hippelら、NY Acad Sci、１９９４年；７２６巻：１１８〜１３１頁）
に従ってプロセシビティーを算出する。バックグラウンドレベルを有意に超える蛍光レベルを持つ各ピーク（Ｉ）を積分してそのピークの蛍光強度（ｎｉ）をもたらす。総蛍光強度（ｎＴ）は、全てのピークの蛍光の和である。積分データをｌｏｇ（ｎｉ／ｎＴ）対ｎ−１（ここで、ｎは取り込まれたヌクレオチドの数である）としてプロットする。データを以下の方程式：ｌｏｇ（ｎｉ／ｎＴ）＝（ｎ−１）ｌｏｇＰｉ＋ｌｏｇ（１−Ｐｉ）に適合させる。Ｐｉ、顕微鏡的プロセシビティー係数（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）を、ｉ位において伸長が終了しない確率として定義する。平均のプライマー伸長長を１／（１−Ｐｉ）から決定する。
【０１２２】
（実施例８）
ＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄの塩抵抗性
以前の研究（Pavlovら（２００２年）、ProcNatl Acad Sci.、９９巻（２１号）、１３５１０〜１３５１５頁；Wangら（２００４年）、NuclAcids Res.、３２巻（３号）、１
１９７〜１２０７頁）により、ポリメラーゼの塩に対する許容性の増加とポリメラーゼのプロセシビティーの間に直接的な相関があることが示されている。試験した全てのポリメラーゼ（ファミリーＡまたはファミリーＢからのもの）について、塩許容性が増加したポリメラーゼは、プロセシビティーも増加したことが分かった。したがって、本発明者らは、プロセシビティーの代用として、キメラの塩許容性と親ポリメラーゼの塩許容性を比較した。
【０１２３】
精製したＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄのタンパク質濃度を、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を同じ供給業者のＰｒｏｔｅｉｎ  ２３０  Ｋｉｔと一緒に使用して決定した。ポリメラーゼを、加えるＫＣｌの量を次第に増加させて、リアルタイムＰＣＲで試験した。反応を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＣｌ２、３％のＤＭＳＯ、１０ｎｇのポリメラーゼ、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２５×  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ．ＤＭＳＯ中希釈したストック２０×  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを作製した）、０．３μＭのフォワードプライマーＨＰＲＴ１−Ｆ１（５’−ｔｔｔｇｇａａａｃａｔｃｔｇｇａｇｔｃｃｔ−３’（配列番号４０））および０．３μＭのリバースプライマーＨＰＲＴ１−Ｒ１（５’−ｇｃｃｃａａａｇｇｇａａｃｔｇａｔａｇｔｃ−３’（配列番号４１））を含有する体積２０μｌ中で行った。ＫＣｌを最終濃度が１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭまたは１２５ｍＭになるように加えた。ＰＣＲ増幅を、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ６０００  ＨＲＭリアルタイムサーモサイクラー（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において、以下のサイクルプロトコールを用いて行った：９５℃で３分、（９５℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒、データ収集）を４０サイクル、その後、１℃のステップで７２℃から９５℃まで勾配させ、各ステップの終わりにデータ収集する前に５秒待つ、融解曲線分析のステップ。各試料８μｌを１．５％アガロースゲルで分析した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｍｉｘ、カタログ番号ＳＭ０３３３（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）５μｌをＤＮＡマーカーとしてゲルにローディングした。代表的な結果を図４に示す。
【０１２４】
（実施例９）
ＫＯＤ、Ｐｆｕ、ＫｏｆｕおよびＰｏｄのＴＭＡＣ許容性
Kovarovaら（Kovarova,M.およびDraber, P.；Nucl. Acids Res.（２０００年）、２８
巻（１３号）、ｅ７０−）によって示されているように、テトラメチルアンモニウムを含有する塩により、ＰＣＲ反応が増強される。そのような塩の１つはテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）である。したがって、本発明者らは、本発明者らのキメラのＴＭＡＣ許容性と親ポリメラーゼのＴＭＡＣ許容性を比較した。
【０１２５】
ポリメラーゼを、加えるＴＭＡＣの量を次第に増加させて、リアルタイムＰＣＲで試験した。反応を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｎｇのポリメラーゼ、２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、０．３ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２５×  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ．ＤＭＳＯ中、希釈したストック２０×  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを作製した）、０．３μＭのフォワードプライマーＨＰＲＴ１−Ｆ１（５’−ｔｔｔｇｇａａａｃａｔｃｔｇｇａｇｔｃｃｔ−３’（配列番号４０））および０．３μＭのリバースプライマーＨＰＲＴ１−Ｒ１（５’−ｇｃｃｃａａａｇｇｇａａｃｔｇａｔａｇｔｃ−３’（配列番号４１））を含有する体積２０μｌ中で行った。ＴＭＡＣを、最終濃度が０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭまたは１２０ｍＭになるように加えた。ＰＣＲ増幅を、Ｃｏｒｂｅｔｔ  ６０００
ＨＲＭリアルタイムサーモサイクラー（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｉｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において、以下のサイクルプロトコールを用いて行った：９５℃で３分、（９５℃で１０秒、５０℃で２０秒、７２℃で２０秒、データ収集）を４０サイクル、その後、１℃のステップで７２℃から９５℃まで勾配させ、各ステップの終わりにデータ収集する前に５秒待つ、融解曲線分析のステップ。各試料８μｌを１．５％アガロースゲルで分析した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｍｉｘ、カタログ番号ＳＭ０３３３（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）５μｌをＤＮＡマーカーとしてゲルにローディングした。代表的な結果を図５に示す。
【０１２６】
（実施例１０）
ＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼのさらなるキメラ
本実施例は、ドメイン間の交換を行う位置を変更することができることを示すために設計している。
【０１２７】
ＫＯＤポリメラーゼとＰｆｕポリメラーゼの掌ドメインおよび指ドメインを、ＫｏｆｕおよびＰｏｄについての位置と比較して、その交換の正確な位置をわずかに変更して、さらなるキメラを作製する。Ｋｏｆｕ−ＩＩ（配列番号２６）を、ＫＯＤ（配列番号１２）のアミノ酸残基３０５〜６１５をＰｆｕ（配列番号１０）のアミノ酸３０５〜６１６で置き換えることによって作製する。Ｐｏｄ−ＩＩ（配列番号２７）を、Ｐｆｕ（配列番号１０）のアミノ酸３０５〜６１６をＫＯＤ（配列番号１２）のアミノ酸３０５〜６１５で置き換えることによって作製する。
【０１２８】
Ｋｏｆｕ−ＩＩＩ（配列番号２８）を、ＫＯＤ（配列番号１２）のアミノ酸残基３９６〜５６４をＰｆｕ（配列番号１０）のアミノ酸３９７〜５６５で置き換えることによって作製する。Ｐｏｄ−ＩＩＩ（配列番号２９）を、Ｐｆｕ（配列番号１０）のアミノ酸３９７〜５６５をＫＯＤ（配列番号１２）のアミノ酸３９６〜５６４で置き換えることによって作製する。
【０１２９】
キメラＫｏｆｕ−ＩＩ、キメラＰｏｄ−ＩＩ、キメラＫｏｆｕ−ＩＩＩおよびキメラＰｏｄ−ＩＩＩのアミノ酸配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させるために逆翻訳し、コドン最適化する。発現ベクターへのクローニングを容易にするために、Ｅｃｏ３１Ｉ制限酵素部位を含有するさらなるヌクレオチド配列を構築物の５’末端および３’末端に加える。より詳細には、５’配列および３’配列を、Ｅｃｏ３１Ｉを用いてＤＮＡを消化した後、突出が、特定の発現ベクター（例えば、ｐＫＢ）内の突出と相補的になるように設計することができる。コドン最適化および遺伝子合成を、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｍｂｈによって行う。キメラポリメラーゼの発現および精製を、当技術分野で公知の方法、例えば「発明を実施するための形態」で総説した方法を用いて行う。キメラポリメラーゼの熱安定性、忠実度、プロセシビティー、塩抵抗性およびＴＭＡＣ抵抗性を実施例５〜９に記載の通り決定する。
【０１３０】
（実施例１１）
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓのポリメラーゼと９°Ｎ−７のポリメラーゼのキメラ
キメラ９ＮｌｉおよびキメラＬｉ９Ｎを、図１のアライメントに基づいて設計する。これらは、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラーゼとＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ−７のＤＮＡポリメラーゼの間で掌および指ドメインを交換することによって作製する。これら２つのポリメラーゼの間の全体的な配列同一性は、アミノ酸レベルで７７％である。
【０１３１】
キメラ９Ｎｌｉは、９Ｎポリメラーゼの掌および指領域をＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓのポリメラーゼの掌および指領域で置き換えることによって作製することができる。この特定の実施例では、９Ｎｌｉは、９Ｎポリメラーゼ（配列番号１８）のアミノ酸３４７〜５８０をＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓのポリメラーゼ（配列番号１９）のアミノ酸３４９〜５８３で置き換えることによって作製する。９Ｎｌｉのコード領域の配列は、配列番号２０で提供される。
【０１３２】
キメラＬｉＮ９は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラーゼの掌および指ドメインを９°ＮｏｒｔｈのＤＮＡポリメラーゼの指ドメインで置き換えることによって作製することができる。この特定の実施例では、ＬｉＮ９は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓのポリメラーゼ（配列番号１９）のアミノ酸３４９〜５８３を９°Ｎ−７ポリメラーゼ（配列番号１８）のアミノ酸３４７〜５８０で置き換えることによって作製する。ＬｉＮ９のコード領域の配列は、配列番号２１で提供される。
【０１３３】
（実施例１２）
Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのＢ型ＤＮＡポリメラーゼとＴ．ｚｉｌｌｉｇｉｉのＢ型ＤＮＡポリメラーゼのキメラ
キメラＧｏＺｉおよびキメラＺｉＧｏを、図１のアライメントに基づいて設計する。これらは、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのＤＮＡポリメラーゼとＴ．ｚｉｌｌｉｇｉｉのＤＮＡポリメラーゼの間で、掌および指ドメインを交換することによって作製する。これら２つのポリメラーゼの間の全体的な配列同一性はアミノ酸レベルで９４％である。
【０１３４】
キメラＧｏＺｉは、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのポリメラーゼの掌および指領域をＴ．ｚｉｌｌｉｇｉｉのポリメラーゼの掌および指領域で置き換えることによって作製することができる。この特定の実施例では、ＧｏＺｉは、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのポリメラーゼ（配列番号２２）のアミノ酸３９１〜５５９をＴ．ｚｉｌｌｉｇｉｉのポリメラーゼ（配列番号２３）のアミノ酸３９１〜５５９で置き換えることによって作製する。得られたキメラＧｏＺｉの配列は、配列番号２４で提供される。
【０１３５】
キメラＺｉＧｏは、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉのＤＮＡポリメラーゼの掌および指ドメインをＴ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのＤＮＡポリメラーゼの指ドメインで置き換えることによって作製することができる。この特定の実施例では、ＺｉＧｏは、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉのポリメラーゼ（配列番号２３）のアミノ酸３９１〜５５９をＴ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのポリメラーゼ（配列番号２２）のアミノ酸３９１〜５５９で置き換えることによって作製する。ＺｉＧｏのコード領域の配列は、配列番号２５で提供される。
【０１３６】
【表５−１】
2015154787.tif 000026
【０１３７】
【表５−２】
2015154787.tif 000027
【０１３８】
【表５−３】
2015154787.tif 000028
【０１３９】
【表５−４】
2015154787.tif 000029
【０１４０】
【表５−５】
2015154787.tif 000030
【０１４１】
【表５−６】
2015154787.tif 000031
【０１４２】
【表５−７】
2015154787.tif 000032
【０１４３】
【表５−８】
2015154787.tif 000033
【０１４４】
【表５−９】
2015154787.tif 000034
【０１４５】
【表５−１０】
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【０１４６】
【表５−１１】
2015154787.tif 000036
【０１４７】
【表５−１２】
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【０１４８】
【表５−１３】
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【０１４９】
【表５−１４】
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【０１５０】
【表５−１５】
2015154787.tif 000040
等価物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または、常用の実験法だけを使用して確認することができる。本発明の範囲は上記の説明に限定されないものとするが、添付の特許請求の範囲に示す通りである。本明細書および特許請求の範囲において使用する「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（この）」という冠詞は、それに反することが明確に示されていない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。あるグループの１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、それに反することが示されていない、または他に文脈から明らかでない限り、そのグループのメンバーの１つ、２つ以上または全部が、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、そうでなければ関連する場合に満たされるとみなされる。本発明は、まさに１つのグループメンバーが、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、そうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、そのグループのメンバーの２つ以上または全部が、所与の産物またはプロセスに存在する、利用される、そうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、特に指示のない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、条項、説明的な用語などが、同じ基になる請求項に従属している別の請求項（または、関連した、任意の他の請求項）に導入されている、変形、組合せ、および並び替えを包含することが理解されよう。要素がリストとして、例えば、マルクーシェグループまたは類似の形式で提示されている場合、要素の各サブグループも開示され、任意の（１つまたは複数の）要素をそのグループから取り出すことができることが理解されよう。一般に、本発明または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと称される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴などからなる、または本質的になることが理解されよう。単純にする目的で、それらの実施形態は、本明細書において全ての場合を具体的に示していない。本発明の任意の実施形態、例えば、従来技術中に見られる任意の実施形態を、特定の除外について本明細書において列挙したかに関わらず、特許請求の範囲から除外することができることが理解されよう。
【０１５１】
それに反することが明確に示されていない限り、２つ以上の動作を含む本明細書で特許請求された任意の方法では、方法の動作の順序は、必ずしも方法の動作が列挙された順序に限定されないが、本発明は、順序がそのように限定された実施形態も包含することが理解されよう。さらに、特許請求の範囲が組成物を列挙している場合、本発明は、その組成物を使用する方法およびその組成物を作製する方法を包含する。特許請求の範囲が組成物を列挙している場合、本発明は、その組成物を使用する方法およびその組成物を作製する方法を包含することが理解されよう。
【０１５２】
参照文献の組み込み
本明細書において引用した全ての出版物および特許文献は、各出版物または特許文献のそれぞれの内容が本明細書に組み込まれたのと同じようにその全体が参照により組み込まれている。本発明は以下をも提供する。
（１）  プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性が高い特徴を有する第１のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第１のドメイン；および
忠実度が高い特徴を有する第２のＤＮＡポリメラーゼに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第２のドメイン
を含み、
忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性が高い特徴を有する、キメラポリメラーゼ。
（２）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤポリメラーゼまたはＴＮＡ１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９から選択される、項目１に記載のキメラポリメラーゼ。
（３）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼである、項目２に記載のキメラポリメラーゼ。
（４）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔ．ｓｐ．ＧＴ、またはＰ．ｓｐ．ＧＢ−Ｄから単離されたポリメラーゼから選択される、項目１に記載のキメラポリメラーゼ。
（５）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである、項目４に記載のキメラポリメラーゼ。
（６）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼであり、前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである、項目１に記載のキメラポリメラーゼ。
（７）  前記第１のドメインが、エキソヌクレアーゼドメイン、Ｎ末端ドメイン、親指ドメインおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目１から６のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
（８）  前記第２のドメインが掌および／または指ドメインである、項目１から７のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
（９）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基１５６〜３０１に対応する、項目１から８のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
（１０）  ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基２６〜１０５に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第３のドメインをさらに含む、項目９に記載のキメラポリメラーゼ。
（１１）  ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第４のドメインをさらに含む、項目１０に記載のキメラポリメラーゼ。
（１２）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基２６〜１０５に対応する、項目１から８のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
（１３）  ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第３のドメインをさらに含む、項目１２に記載のキメラポリメラーゼ。
（１４）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基６１２〜７４９に対応する、項目１から８のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
（１５）  ＫＯＤポリメラーゼ（配列番号１１）のアミノ酸残基１５６〜３０１に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第３のドメインをさらに含む、項目１４に記載のキメラポリメラーゼ。
（１６）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼに見られる前記アミノ酸配列が、Ｐｆｕポリメラーゼ（配列番号９）のアミノ酸残基３９４〜５６３に対応する、項目１から１５のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼ。
（１７）（１）
【化２１】
2015154787.tif 000041
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
（２）
【化２２】
2015154787.tif 000042
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
（３）
【化２３】
2015154787.tif 000043
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
（４）
【化２４】
2015154787.tif 000044
、（ここでＸ１はＫではなく、Ｘ２はＨではなく、Ｘ３はＲではなく、Ｘ４はＩではなく、Ｘ５はＲではなく、Ｘ６はＫではなく、Ｘ７はＧではなく、Ｘ８はＫではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＲではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＶではなく、Ｘ１３はＤではなく、Ｘ１４はＥではなく、Ｘ１５はＫではなく、Ｘ１６はＩではなく、Ｘ１７はＴではなく、Ｘ１８はＬではなく、Ｘ１９はＥではなく、Ｘ２０はＴではなく、Ｘ２１はＥではなく、Ｘ２２はＶではない。）
（５）
【化２５】
2015154787.tif 000045
、（ここでＸ１はＩではなく、Ｘ２はＮではなく、Ｘ３はＥではなく、Ｘ４はＫではなく、Ｘ５はＩではなく、Ｘ６はＥではなく、Ｘ７はＳではなく、Ｘ８はＩではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＲではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＩではなく、Ｘ１３はＶではなく、Ｘ１４はＳではなく、Ｘ１５はＰではなく、Ｘ１６はＡではなく、Ｘ１７はＡではなく、Ｘ１８はＫではなく、Ｘ１９はＬではなく、Ｘ２０はＴではなく、Ｘ２１はＩではなく、Ｘ２２はＭではなく、Ｘ２３はＩではなく、Ｘ２４はＭではなく、Ｘ２５はＴではなく、Ｘ２６はＨではなく、Ｘ２７はＴではなく、Ｘ２８はＩではなく、Ｘ２９はＫではなく、Ｘ３０はＤではなく、Ｘ３１はＡではなく、Ｘ３２はＫではなく、Ｘ３３はＳではない。）
（６）
【化２６】
2015154787.tif 000046
、（ここでＸ１はＴではなく、Ｘ２はＩではなく、Ｘ３はＨではなく、Ｘ４はＥではなく、Ｘ５はＩではなく、Ｘ６はＱではなく、Ｘ７はＡではなく、Ｘ８はＮではなく、Ｘ９はＩではなく、Ｘ１０はＡではなく、Ｘ１１はＹではなく、Ｘ１２はＰではなく、Ｘ１３はＨではなく、Ｘ１４はＥではなく、Ｘ１５はＩではなく、Ｘ１６はＫではなく、Ｘ１７はＫではなく、Ｘ１８はＫではなく、Ｘ１９はＭではなく、Ｘ２０はＧではなく、Ｘ２１はＲではなく、Ｘ２２はＤではなく、Ｘ２３はＰではなく、Ｘ２４はＳではなく、Ｘ２５はＮではなく、Ｘ２６はＬではなく、Ｘ２７はＡではなく、Ｘ２８はＥではなく、Ｘ２９はＹではなく、Ｘ３０はＫではなく、Ｘ３１はＬではなく、Ｘ３２はＥではなく、Ｘ３３はＧではない。）
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第１のドメイン、ならびに
（１）
【化２７】
2015154787.tif 000047
、（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
（２）
【化２８】
2015154787.tif 000048
、（ここでＸ１はＲではなく、Ｘ２はＳではなく、Ｘ３はＲではなく、Ｘ４はＥではなく、Ｘ５はＶではなく、Ｘ６はＲではなく、Ｘ７はＦではなく、Ｘ８はＤではなく、Ｘ９はＫではなく、Ｘ１０はＡではなく、Ｘ１１はＩではなく、Ｘ１２はＲではなく、Ｘ１３はＫではなく、Ｘ１４はＲではなく、Ｘ１５はＩではなく、Ｘ１６はＹではなく、Ｘ１７はＲではなく、Ｘ１８はＥではなく、Ｘ１９はＴではなく、Ｘ２０はＭではなく、Ｘ２１はＴではなく、Ｘ２２はＩではなく、Ｘ２３はＩではなく、Ｘ２４はＹではなく、Ｘ２５はＩではなく、Ｘ２６はＳではなく、Ｘ２７はＦではなく、Ｘ２８はＦではなく、Ｘ２９はＡではなく、Ｘ３０はＤではなく、Ｘ３１はＡではなく、Ｘ３２はＴではなく、Ｘ３３はＶではなく、Ｘ３４はＭではない。）
およびそれらの組合せ
からなる群から選択されるコンセンサス配列を有する第２のドメイン
を含み、
忠実度が高く、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性が高い特徴を有する、キメラポリメラーゼ。
（１８）  配列番号１６（Ｋｏｆｕのアミノ酸配列）と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
（１９）  前記アミノ酸配列が、
【化２９】
2015154787.tif 000049
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
のコンセンサス配列を含む、項目１８に記載のキメラＤＮＡポリメラーゼ。
（２０）  前記アミノ酸配列が配列番号１６（Ｋｏｆｕのアミノ酸配列）と同一である、項目１８に記載のキメラポリメラーゼ。
（２１）    
【化３０】
2015154787.tif 000050
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
のアミノ酸コンセンサス配列を含み、
ＫＯＤの忠実度よりも高い忠実度を有し、Ｐｆｕのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有する、キメラポリメラーゼ。
（２２）  前記アミノ酸コンセンサス配列が、
【化３１】
2015154787.tif 000051
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸またはペプチド結合である。）
である、項目２１に記載の方法。
（２３）  第１のＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメイン、Ｎ末端ドメイン、および／または親指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第１のドメイン；および
第２のＤＮＡポリメラーゼの掌および／または指ドメインに見られるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を有する第２のドメイン
を含み、
前記第２のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有し、前記第１のＤＮＡポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有する、キメラポリメラーゼ。
（２４）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９から選択される、項目２３に記載のキメラポリメラーゼ。
（２５）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼである、項目２３に記載のキメラポリメラーゼ。
（２６）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、またはＰ．ｓｐ．ＧＢ−Ｄから単離されたポリメラーゼから選択される、項目２３に記載のキメラポリメラーゼ。
（２７）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである、項目２６に記載のキメラポリメラーゼ。
（２８）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼであり、前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである、項目２３に記載のキメラポリメラーゼ。
（２９）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼであり、前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼである、項目２３に記載のキメラポリメラーゼ。
（３０）  配列番号１５（Ｐｏｄのアミノ酸配列）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
（３１）  項目１から３０のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列。
（３２）  項目３１に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
（３３）  項目３１に記載のヌクレオチド配列を含む細胞。
（３４）  項目１から３０のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを含むキット。
（３５）  項目１から３０のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを使用してＤＮＡを合成する方法。
（３６）  項目１から３０のいずれか一項に記載のキメラポリメラーゼを使用してＤＮＡ断片を増幅する方法。
（３７）  キメラポリメラーゼを設計製作する方法であって、
（ａ）第１のＤＮＡポリメラーゼに基づくＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメイン、および／または親指ドメインを提供する工程；
（ｂ）第２のＤＮＡポリメラーゼに基づく掌および／または指ドメインを提供する工程；（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）からのドメインを組み合わせて、キメラポリメラーゼを形成する工程、を含み、
前記キメラポリメラーゼが、前記第２のＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性よりも高いプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を有し、前記第１のＤＮＡポリメラーゼの忠実度よりも高い忠実度を有する、方法。
（３８）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤポリメラーゼ、またはＴＮＡ１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７、Ｔ４、Ｔ７、またはｐｈｉ２９から選択される、項目３７に記載の方法。
（３９）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼである、項目３８に記載の方法。
（４０）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔ．ｓｐ．ＧＴ、またはＰ．ｓｐ．ＧＢ−Ｄから単離されたポリメラーゼから選択される、項目３８に記載の方法。
（４１）  前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである、項目４０に記載の方法。
（４２）  前記第１のＤＮＡポリメラーゼがＫＯＤポリメラーゼであり、前記第２のＤＮＡポリメラーゼがＰｆｕポリメラーゼである、項目３７に記載の方法。
（４３）  項目３５から４２のいずれか一項に記載の方法を用いて設計製作したキメラポリメラーゼ。
（４４）  ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を改善する方法であって、対象のＤＮＡポリメラーゼの掌および／または指ドメイン内の配列を、前記対象のＤＮＡポリメラーゼと比較して、忠実度がより高い特徴を有する異なるＤＮＡポリメラーゼからの対応する配列で置き換える工程を含む方法。
（４５）  ＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティー、延長速度、塩抵抗性、熱安定性またはＴＭＡＣ許容性を改善する方法であって、対象のＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼドメインおよび／または親指ドメイン内の配列を、前記対象のＤＮＡポリメラーゼと比較して、プロセシビティー、延長速度、塩抵抗性またはＰＣＲエンハンサー抵抗性が高い特徴を有する異なるＤＮＡポリメラーゼからの対応する配列で置き換える工程を含む方法。
（４６）  項目４４または４５に記載の方法によって改善されたＤＮＡポリメラーゼ。
【図１−１】
2015154787.tif 000052
【図１−２】
2015154787.tif 000053
【図１−３】
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【図２】
2015154787.tif 000055
【図３】
2015154787.tif 000056
【図４】
2015154787.tif 000057
【図５】
2015154787.tif 000058
【配列表】
2015154787000001.app
【外国語明細書】
2015154787000001.pdf