(57)【要約】【課題】効果的な大腸癌治療剤を提供すること。【解決手段】歯のエナメル形成に関与するタンパク質として知られているＦＡＭ８３Ｈに対するｓｉＲＮＡ等のＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質や、抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体等のＦＡＭ８３Ｈタンパク質の機能阻害物質を投与することにより、（１）大腸癌細胞株の増殖が抑制されること（２）大腸癌細胞株のアポトーシスが誘導されること、（３）大腸癌細胞の運動機能を抑制することを見いだし、大腸癌治療剤、又は大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有する大腸癌治療剤。
【請求項２】
ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質が、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の大腸癌治療剤。
【請求項３】
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、配列番号１に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２記載の大腸癌治療剤。
【請求項４】
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、ベクターに組み込まれていることを特徴とする請求項２又は３に記載の大腸癌治療剤。
【請求項５】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備える大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法。
（ａ）被検者由来の生体試料中の、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質を定量する工程；
（ｂ）前記生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と、大腸癌非罹患者又は大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量とを比較・評価する工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有する大腸癌治療剤や、大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は歯のエナメル形成に関与するタンパク質として知られており、その遺伝子変異はエナメル形成不全を引き起こすことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）ため、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は歯の発生段階でのみ重要な機能を有すると考えられていた。
【０００３】
近年、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子が子宮癌の新生血管マーカーの候補として報告されている論文が発表された（例えば、非特許文献２参照）。したがって、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質は、歯のエナメル形成においてのみならず、他の組織においても所定の役割を果たしている可能性があるといえるが、大腸癌の阻害効果を有することについては、なんら報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Int J Paediatr Dent 21 (6), 407-412 (2011)
【非特許文献２】Cancer Biology & Therapy 12:3, 1-12; August 1, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、より効果的で副作用の少ない大腸癌治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、大腸癌組織の遺伝子発現解析を行い、大腸癌において発現が転写レベルで上昇している遺伝子やその産物であるタンパク質を同定することにより、大腸癌の増殖・転移を抑制する機構について検討を続けていたが、大腸癌患者の癌組織において、歯のエナメル形成に関与するタンパク質として知られていたＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現が転写レベルで上昇することをたまたま確認した。発明者らは、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の大腸癌細胞における機能と癌治療への応用についてさらに検討を続け、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの投与により、（１）大腸癌細胞株の増殖が抑制されること（２）大腸癌細胞株のアポトーシスが誘導されること、（３）大腸癌細胞株の運動機能を抑制することを見い出した。本発明は上記の知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、［１］ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有する大腸癌治療剤や、［２］ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質が、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［１］記載の大腸癌治療剤や、［３］ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、配列番号１に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３に示されるＲＮＡ配列及びその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［２］記載の大腸癌治療剤や、［４］ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡが、ベクターに組み込まれていることを特徴とする上記［２］又は［３］に記載の大腸癌治療剤に関する。
【０００８】
また、本発明は、［５］（ａ）被検者由来の生体試料中の、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質を定量する工程；（ｂ）前記生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と、大腸癌非罹患者又は大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量とを比較・評価する工程；を備える大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の大腸癌治療剤によれば、投与方法を工夫することにより、歯のエナメル形成不全等の副作用なく大腸癌を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）は、非癌部組織と大腸癌組織とにおけるＦＡＭ８３Ｈのマイクロアレイ解析によるｍＲＮＡ発現量をプロットした結果を示すグラフである。（ｂ）は、非癌部組織と大腸癌組織とにおけるＦＡＭ８３ＨのｑＰＣＲによるｍＲＮＡ発現量をプロットした結果を示すグラフである。
【図２】ｓｉＲＮＡ導入後２４、４８、７２時間経過毎のＳ１細胞、Ｓ２細胞、及びコントロール細胞の生細胞数を示すグラフである。
【図３】ｓｉＲＮＡ導入後２日経過時のＳ１細胞とコントロール細胞のウェスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】（ａ）は、一次抗体として抗ケラチン１８抗体と、抗α−チューブリン抗体とを使用して、共焦点顕微鏡を用いて観察した画像を示す。画像におけるスケールは１０μｍである。（ｂ）は、Ｓ１細胞、Ｓ２細胞、及びそれらのコントロール細胞、並びにＤ−Ｓ１細胞及びＤ−コントロール細胞における細胞分裂期における紡錘体の正常形成率を示すグラフである。
【図５】（ａ）は、一次抗体として抗ラミンＢ２抗体と、抗α−チューブリン抗体とを使用して、共焦点顕微鏡を用いて観察したＳ１細胞の画像を示す。画像におけるスケールは５００μｍである。（ｂ）は、Ｓ１細胞、Ｓ２細胞及びコントロール細胞における細胞分裂期におけるラミンＢ紡錘体マトリクスの正常形成率を示すグラフである。
【図６】（ａ）は、Wound healing 解析における創傷直後と２４時間後の細胞シートの画像を示す図である。（ｂ）は、無細胞面の先端に位置する細胞の移動距離を示すグラフである。
【図７】（ａ）は、Wound healing 解析における創傷直後と６時間後の細胞シートの画像を示す図である。画像におけるスケールは１０μｍである。（ｂ）は、無細胞面の先端に位置する細胞の細胞突起の長さを示すグラフである。
【図８】Wound healing 解析における創傷直後と６時間後の細胞シートの画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の大腸癌治療剤は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質を有効成分として含有している限り特に制限されず、本発明の大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法としては、（ａ）被検者由来の生体試料中の、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質を定量する工程；と（ｂ）前記生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と、大腸癌非罹患者由来の生体試料及び／又は大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量とを比較・評価する工程；とを備える方法であれば特に制限されず、本発明における大腸癌としては、上行結腸癌、横行結腸癌、下行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、又は盲腸癌を挙げることができ、また、本発明の大腸癌治療剤の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を例示することができる。
【００１２】
本発明におけるＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質としては、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の転写レベルや翻訳レベル等において、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現を完全に又は有意に抑制する物質であればよく、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の転写レベルや翻訳レベルの抑制物質としては、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ等の他、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡの切断活性を有するリボザイムや、ＦＡＭ８３ＨのｍｉＲＮＡを挙げることができる。
【００１３】
上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡとしては、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡを分解することで配列特異的に発現を抑制するＲＮＡｉ（RNA interference；ＲＮＡ干渉）において用いることができる、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡ配列の一部配列と相同の配列であるセンスＲＮＡと、該当センスＲＮＡと相補的な配列であるアンチセンスＲＮＡとを含む１８〜２６塩基、好ましくは１９〜２５塩基、より好ましくは２０〜２４塩基、特に好ましくは２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを挙げることができ、具体的には、5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）及びその相補的配列である3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡや、5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）及びその相補的配列である3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）を含む二本鎖ＲＮＡ配列からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡを挙げることができ、好ましくは、5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）及びその相補的配列である3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１や、5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）及びその相補的配列である3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）からなるＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ２を挙げることができ、特にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を好適に例示することができる。また、上記ｓｉＲＮＡは１又は２種類以上用いることもできる。
【００１４】
上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡには、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの誘導体や、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの前駆体を含めることができ、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの前駆体としては、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子のｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）を含めることができる。
【００１５】
上記ＦＡＭ８３ＨのｓｈＲＮＡとしては、部分的に回文状の塩基配列を含むことにより分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピンのような構造をとる一本鎖ＲＮＡを挙げることができ、かかるｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、Ｄｉｃｅｒにより例えば２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡに分解され、上記ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことができ、上記２１〜２３塩基の長さの二本鎖ＲＮＡとしては、5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）及びその相補的配列である3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）、又は、5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）及びその相補的配列である3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）を例示することができる。
【００１６】
上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの誘導体としては、ＲＮＡｉ効果を高め、また細胞内のＲＮａｓｅに対して分解されにくいようにＲＮＡの安定性を向上させるための修飾が施された誘導体を挙げることができ、具体的には、３’側にＵを数個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２又は３個、最も好ましくは２個付加させた３’オーバーハング型誘導体や、ポリエチレングリコール、コレステロール、又は２’−ｏ−ｍｅｔｈｙｌ等メチル化処理やチオリン酸化処理などの抗ＲＮａｓｅ処理で適切に修飾した誘導体を挙げることができる。
【００１７】
上記ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡは、ＦＡＭ８３Ｈに関する公知の配列情報（例えばNCBI Reference Sequence: NM_198488.3）に基づいて設計することができ、具体的には、配列番号９に示される配列に基づいて設計することができ、合成による作製方法や遺伝子組換え技術を用いる作製方法等、公知の作製方法を用いることにより作製することができる。
【００１８】
上記合成による作製方法としては、上記配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成する方法を例示することができ、すなわち、センス鎖オリゴリボヌクレオチド及びアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドを、保護基のついた４種類（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用して２本鎖のオリゴリボヌクレオチドであるｓｉＲＮＡを、有機合成法により合成することができる。
【００１９】
上記遺伝子組換え技術を用いる作製方法としては、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡを発現ベクターに組み込むことで発現させる方法を挙げることができ、例えばベクター中の適当なプロモーターの下流にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ発現カセットを挿入することによりｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。かかるｓｉＲＮＡ発現ベクターとしては、市販の二本鎖ＲＮＡ発現用のベクターを含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましく、ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクターや、アデノ随伴ウイルスベクターや、アデノウイルスベクターや、レンチウイルスベクターなどを挙げることができるが、アデノウイルスベクターが好ましく、ベクターによる発現系を構築する際には、発現を起こさせるだけでなく、Ｕ６プロモーター等発現を調節する制御配列を含めることもできる。
【００２０】
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡは、上記組換えウイルスベクターを細胞に感染させることにより、大腸癌細胞に導入することができる。組換えウイルスベクターを癌細胞に直接感染させることにより、二本鎖ｓｉＲＮＡを直接細胞内に導入する場合に比べて、細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなる。
【００２１】
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡは、リポフェクション法等によっても、大腸癌細胞に導入することができる。具体的には、陰電荷を有するホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームを用いることができるが、より安定したリポソームを形成する陽イオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）や、2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N, N- dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate（ＤＯＳＰＡ）と、中性脂質 dioleoylphosphatidyl ethanolamine（ＤＯＰＥ）を混合した細胞内移行性及び核内移行性を有する人工リポソーム等を用いて導入することができる。
【００２２】
前記アンチセンスＲＮＡやアンチセンスＤＮＡとしては、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡの配列に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡやＤＮＡであって、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡとハイブリッドを形成することによって、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の合成を抑制するものを挙げることができ、また、前記リボザイムとしては、触媒活性を有するＲＮＡ分子であって、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡを切断することによって、大腸癌の治療剤としての効果を発揮するものを挙げることができる。
【００２３】
前記ｍｉＲＮＡとしては、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡの配列に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡであって、転写や翻訳阻害を引き起こし、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現を抑制するものを挙げることができる。
【００２４】
本発明におけるＦＡＭ８３Ｈタンパク質の機能阻害物質としては、抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体や、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質に対するペプチドアプタマーを例示することができる。
【００２５】
前記抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体としては、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質に特異的に結合し、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の機能を阻害しうる抗体を例示することができ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、また、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２）や組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。
【００２６】
上記抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体は、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質若しくはその適当なペプチド断片、又はそれらの各種誘導体若しくは複合体等を免疫原として用いて、当業者に公知の適当な方法で調製することができる。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することでポリクローナル抗体を調製することが可能であり、公知の細胞融合を用いる方法（例えば「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996））によりモノクローナル抗体を調製することが可能である。
【００２７】
ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の発現抑制物質又は機能阻害物質によると、大腸癌細胞の増殖を抑制したり、大腸癌細胞におけるアポトーシスを誘導したり、大腸癌細胞の細胞分裂期における紡錘体の正常形成率を低下したり、大腸癌細胞の細胞運動機能を抑制することができ、この意味において、本発明の大腸癌治療剤は、大腸癌細胞の増殖抑制剤、大腸癌細胞におけるアポトーシス誘導剤、大腸癌細胞の細胞分裂期における紡錘体の正常形成率低下剤、大腸癌細胞の細胞運動機能抑制剤ということができる。
【００２８】
本発明の大腸癌治療剤を上記大腸癌細胞の細胞分裂期における紡錘体の正常形成率低下剤として投与した場合、細胞分裂期にラミンＢ２が細胞周辺部で凝集し、その結果、大腸癌細胞又は大腸癌細胞株における細胞分裂期に紡錘体マトリクス形成が阻害される。このように、紡錘体形成が阻害されると、大腸癌細胞の増殖が抑制されると考えられる。
【００２９】
本発明の大腸癌治療剤を上記大腸癌細胞におけるアポトーシス誘導剤として投与した場合、大腸癌細胞又は大腸癌細胞株において、アポトーシスマーカーが有意に発現し、アポトーシス誘導作用が生じる。上記アポトーシスマーカーとしては、断片化ＰＡＲＰや断片化カスパーゼ３を例示することができる。このように、アポトーシスが誘導されると、大腸癌細胞が死滅すると考えられる。
【００３０】
本発明の大腸癌治療剤を上記大腸癌細胞の細胞運動機能抑制剤として投与した場合、大腸癌細胞又は大腸癌細胞株における細胞の運動機能が阻害される。このように、大腸癌細胞の運動機能が阻害されると、大腸癌の転移が抑制されると考えられる。
【００３１】
本発明の大腸癌治療剤は、常法によって適宜の製剤とすることができ、薬理学的に許容される公知の担体又は希釈剤等からなる補助成分や癌の治療及び予防のための他の生理活性物質をさらに含有することもできる。
【００３２】
本発明の大腸癌治療剤は、所望の大腸癌治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、注腸投与等を例示することができるが、静脈内投与が好ましい。
【００３３】
本発明の大腸癌治療剤の投与量としては、有効成分の種類、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及び患者の遺伝的背景に応じて、当業者が適宜選択することができるが、例えば、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を投与する場合、０．１〜１００ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.、より好ましくは、１〜１０ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.、さらに好ましくは３〜７ｍｇ／日／ｋｇｂ.ｗ.を挙げることができる。
【００３４】
本発明の大腸癌発症・再発のリスクを評価するためのデータを収集する方法において、大腸癌非罹患者由来の生体試料はネガティブコントロールであり、大腸癌罹患者由来の生体試料はポジティブコントロールである。被検者由来の生体試料としては、糞便、血液、生検検体が好ましく、ＦＡＭ８３Ｈは、当業者に公知の任意の方法で定量することが可能であり、例えば、抗ＦＡＭ８３Ｈタンパク質抗体を用いたＥＬＩＳＡ法や、ウェスタンブロット法、免疫染色法等の各種の免疫学的特異反応を利用する方法を用いることができる。
【００３５】
上記データを収集する方法において、例えば、大腸癌罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と比較して、上記被検者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量が同等以上である場合に、大腸癌発症・再発のリスクが高いと判断することができ、また、大腸癌非罹患者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量と比較して、被検者由来の生体試料中のＦＡＭ８３Ｈタンパク質量が有意に高い場合に、大腸癌発症・再発のリスクが高いと判定することができる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
（大腸癌培養細胞株）
大腸癌培養細胞株として、ＡＴＣＣから購入したＨＣＴ１１６細胞とＤＬＤ−１細胞とを用いた。それぞれの細胞は５％ＣＯ２雰囲気下、１０％牛胎児血清（Invitrogen社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Invitrogen社製）で培養した。
【００３８】
［実施例１］
［ヒト大腸癌組織の遺伝子発現解析］
千葉大学医学部附属病院において、１３名の大腸癌患者から摘出された大腸癌組織とその周辺の非癌部組織を検体として採取した。各組織からRNeasy Plus kit（Qiagen社製）を用いてtotalＲＮＡを抽出した。
【００３９】
上記採取した検体のうち、１２名の検体を用いて、大腸癌組織と非癌部組織における遺伝子発現レベルの差異をマイクロアレイ解析によって網羅的に解析した。TotalＲＮＡからGene Chip(R) 3’ IVT Express Kit（Affymetrix社製）を用いてａＲＮＡを作製し、全遺伝子型マイクロアレイ（Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Array）（Affimetrix社製）と同社製のプローブセットとを用いてマイクロアレイ解析を行った。かかるマイクロアレイ解析により得られた全遺伝子の発現値を、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸソフトウェア（アジレントテクノロジー社）を用いて、中央値による正規化を行い、発現量の高かったＦＡＭ８３Ｈについて、一患者毎に発現比を大腸癌組織：非癌部組織として算出し、そのｌｏｇ２値をプロットした結果を図１（ａ）に示す。スチューデントのｔ検定法（対応有り）により有意差検定を行った。結果を図１（ａ）に示す。
【００４０】
ＦＡＭ８３ＨのｍＲＮＡの発現は、２２６１２９＿ａｔプローブセットを用いたマイクロアレイ解析により同定されたが、その再現性を検討するために、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子について、上記マイクロアレイ解析に用いた検体のうち１０名の検体に新たに１名の検体を加えた１１名の大腸癌組織とその周辺の非癌部組織とを検体として、Power CYBR(R) Green試薬と、Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）とを用いて、ｑＰＣＲによって解析した。使用したプライマー配列はフォワードプライマー5’-CGACAAGTGCCGTGTCAACC-3’（配列番号５）とリバースプライマー5’-ACTTCCCAGTGCGGCAGTAG-3’（配列番号６）であった。発現量補正用のアクチン遺伝子のプライマーとしては、フォワードプライマー5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’（配列番号７）とリバースプライマー5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’（配列番号８）とを使用した。一患者毎にＦＡＭ８３Ｈの発現比を大腸癌組織：非癌部組織として算出し、そのｌｏｇ２値をプロットした結果を図１（ｂ）に示す。
【００４１】
（結果）
図１（ａ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡ発現量は、非癌部組織と比較して大腸癌組織において有意に増加していることがマイクロアレイ解析によって示唆された。また、図１（ｂ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３ＨｍＲＮＡ発現量は、非癌部組織と比較して大腸癌組織において有意に増加していることがｑＰＣＲ解析により示され、ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の発現は大腸癌特異的であることが確認された。
【００４２】
［実施例２］
［大腸癌細胞増殖試験］
ＦＡＭ８３Ｈ遺伝子の転写を抑制することによる影響を調べるために、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡを用いて検討した。使用したＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの配列の詳細は以下の通りである。
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１      
5’-ACACGAAGGCCAUUCUGGAGCAGAU-3’（配列番号１）
3’-UGUGCUUCCGGUAAGACCUCGUCUA-5’（配列番号２）
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ２      
5’-CAACGCCUUGUACAGCAGCAACCUU-3’（配列番号３）
3’-GUUGCGGAACAUGUCGUCGUUGGAA-5’（配列番号４）
【００４３】
上記ＨＣＴ１１６細胞にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡの導入を行うことでＦＡＭ８３Ｈノックダウン大腸癌細胞（以下、「ＦＡＭ８３ＨノックダウンＨＣＴ１１６細胞」ということもある）の細胞増殖試験を行った。一万個のＨＣＴ１１６細胞を１２ウェルディッシュに播種し、２日間培養した。上記２種類のＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１とｓｉＲＮＡＳ２とをＨＣＴ１１６細胞にリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社製）を用いてそれぞれ導入（transfection）し、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を導入したＦＡＭ８３ＨノックダウンＨＣＴ１１６細胞（以下、「Ｓ１細胞」ともいう）と、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ Ｓ２を導入したＦＡＭ８３ＨノックダウンＨＣＴ１１６細胞（以下、「Ｓ２細胞」ともいう）とを作製した。コントロールｓｉＲＮＡとしては、Medium GC Duplex #2（Invitrogen社製）を用い、同様にＨＣＴ１１６細胞に導入してコントロール細胞とした。
【００４４】
ｓｉＲＮＡ導入後それぞれ２４、４８、７２時間経過毎にＳ１細胞、Ｓ２細胞及びコントロール細胞の生細胞数を、トリパンブルー染色法を用いてそれぞれ計測した。同様の実験を３回行い、生細胞数平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図２に示す。
【００４５】
（結果）
図２より明らかなとおり、コントロール細胞と比較して、Ｓ１細胞及びＳ２細胞の細胞数は、スチューデントのｔ検定（対応なし）により有意に減少したことが確認された （＊, ｐ＜０．００５； ＊＊， p＜０．００００５；＊＊＊, ｐ＜０．０００５）。具体的には、ｓｉＲＮＡを導入して７２時間後のＳ１細胞の細胞数は、コントロール細胞の５％程度であり、Ｓ２細胞の細胞数は、コントロール細胞の３０％であり、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ導入による顕著な細胞数減少効果があった。よって、ＦＡＭ８３Ｈは大腸癌細胞の増殖と生存に必要であることが示唆された。
【００４６】
［実施例３］
［ウェスタンブロット解析］
上記Ｓ１細胞のウェスタンブロット解析をｓｉＲＮＡ導入後２日経過時に行った。ＨＣＴ１１６細胞トータルタンパク質の抽出はLaemmli法により、ＳＤＳサンプルバッファーを用いて行った。タンパク質を５−２０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＤＲＣ社製）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて分離し、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Milipore, Bedford, MA）にトランスファーした。かかる膜をブロッキングワン（ナカライテスク社製）を用いてブロッキングした。メンブレンに、抗ＰＡＲＰ分解物抗体（#5625、Cell Signaling Technology社製）と、抗カスパーゼ−３分解物抗体（#9664、Cell Signaling Technology社製）と、抗ＦＡＭ８３Ｈ抗体（HPA024604、Sigma社製）と、対照として抗アクチン抗体（sc-1615、Santa Cruz Biotechnology社製）とを一次抗体として添加してインキュベートしてから洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（sc-2020、Santa Cruz Biotechnology社製）とＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（NA934 、GEヘルスケア社製）とを標識した二次抗体として添加してインキュベートを行なった後、洗浄した。ＥＣＬ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用いた化学発光法で発光させ、ＬＡＳ−４０００イメージアナライザー（ＧＥヘルスケア社製）で検出した。結果を図３に示す。
【００４７】
（結果）
図３より明らかなとおり、Ｓ１細胞ではアポトーシスマーカーとして知られている断片化ＰＡＲＰ（cleaved PARP）と断片化カスパーゼ−３（cleaved caspase 3）が検出され、ＦＡＭ８３Ｈタンパク質の産生が抑制されていた。したがって、ＦＡＭ８３Ｈは大腸癌細胞の増殖と生存に必要であり、ＦＡＭ８３Ｈが欠損すると大腸癌細胞がアポトーシスに導かれることが示された。
【００４８】
［実施例４］
［免疫染色１］
上記Ｓ１細胞及びＳ２細胞、並びにＤＬＤ１細胞にＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ Ｓ１をリポフェクトアミン ＲＮＡｉＭＡＸ（Invitrogen社製）を用いて導入した細胞（以下、「Ｄ−Ｓ１細胞」ともいう。）、及びＤＬＤ１細胞にMedium GC Duplex #2を導入して細胞（以下、「Ｄ−コントロール細胞」ともいう。）に免疫染色を行うことで、ＦＡＭ８３Ｈの機能をさらに検討した。免疫染色は、上記各細胞を、−２０℃に冷やした１００％メタノールに１分間浸して固定し、３％牛血清アルブミンを用いてブロッキングした後、一次抗体、二次抗体の順に反応させ、二次抗体溶液にＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を混合してＤＮＡを共染色した。細胞の観察は共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Zeiss社製）を用いて行った。一次抗体として、抗ケラチン１８抗体（MS-142-P0、Thermo Scientific社製）と、抗α−チューブリン抗体（YOL1/34、Santa Cruz Biotechnology社製）とを使用し、二次抗体としては、Alexa488標識抗マウスＩｇＧ抗体とAlexa594標識抗ラットＩｇＧ抗体（ともにインビトロジェン社製）とを使用した。同様の実験を３回行い、正常な紡錘体を形成している分裂期細胞の割合の平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図４（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００４９】
（結果）
図４（ｂ）より明らかなとおり、スチューデントのｔ検定（対応なし）によると、Ｓ１細胞、Ｓ２細胞、及びＤ−Ｓ１細胞における細胞分裂期における紡錘体の正常形成率が、コントロール細胞（Ｄ−コントロール細胞を含む）と比較して有意に低いことが確認された（＊，ｐ＜１×１０−６; ＊＊，ｐ＜０．０００５）。また、図４（ａ）より明らかなとおり、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ１を導入した細胞を、共焦点顕微鏡を用いて観察した画像においては、コントロール細胞では紡錘体が正常に形成していることが観察されるが、Ｓ１細胞ではケラチン１８とα−チューブリンの染色から明らかなとおり、ケラチン細胞骨格と紡錘体形成の異常が観察された。
【００５０】
［実施例５］
［免疫染色２］
一次抗体として抗ラミンＢ２抗体（10895-1-AP、ProteinTech Group社製）と抗α−チューブリン抗体（DM1A、Sigma社製）とを使用したことのほかは、実施例４と同様の方法でＳ１細胞、Ｓ２細胞及びコントロール細胞について免疫染色を行った。細胞の観察は共焦点顕微鏡を用いて行った。ｓｉＲＮＡ導入後２日経過時に同様の実験を３回行い、ラミンＢ２が正常なマトリクスを形成している分裂期細胞の割合の平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図５（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００５１】
（結果）
図５（ｂ）より明らかなとおり、コントロール細胞と比較して、Ｓ１細胞及びＳ２細胞の細胞分裂期におけるラミンの紡錘体マトリックスの正常形成率は、スチューデントのｔ検定（対応なし）により有意差をもって低いことが確認された（＊，ｐ＜１×１０−５; ＊＊，ｐ＜０．０００５）。具体的には、ｓｉＲＮＡ導入後２日後のＳ１細胞の細胞分裂期における正常紡錘体形成細胞数は、コントロール細胞の５％程度であり、Ｓ２細胞の細胞分裂期における正常紡錘体形成細胞数は、コントロール細胞の２２％程度であり、ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡ導入による顕著な紡錘体形成阻害効果があった。また、図５（ａ）より明らかなとおり、コントロール細胞ではラミンＢ２が紡錘体の外側でマトリクスを形成し、紡錘体が正常に形成されていることが観察されるが、Ｓ１細胞では、ラミンＢ２が細胞周辺部で凝集し、ラミンの紡錘体マトリクス形成が阻害されていることが観察された。以上のとおり、ＦＡＭ８３Ｈは、ラミン紡錘体マトリックスの形成を介して、癌細胞の分裂を促進していると考えられる。紡錘体の形成異常は、細胞分裂の停止や染色体異常分配を介して細胞死を誘導するので、細胞増殖抑制を誘導するメカニズムの一つであると考えられる。
【００５２】
［実施例６］
［Wound healing 解析１］
上記Ｓ１細胞とＳ２細胞の運動に関連する機能を調べるために、Wound healing 解析を行った。Ｓ１細胞とＳ２細胞それぞれについて、ｓｉＲＮＡ導入後２４時間経過時に細胞シートに創傷し、形成された無細胞面を細胞が遊走して埋めていく様子を、傷をつけた直後と２４時間後に光学顕微鏡下で観察した。同様の実験を３回行い、細胞シートの無細胞面の先端に位置する細胞の移動距離の平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００５３】
（結果）
図６（ｂ）より明らかなとおり、コントロール細胞に比べてＳ１細胞及びＳ２細胞は、細胞シート先端の移動距離が有意差をもって減少していることが示された（＊，ｐ＜０．００１; ＊＊，ｐ＜０．００５）。具体的には、Ｓ１細胞の移動距離は、コントロール細胞の約４分の１であり、Ｓ２細胞の移動距離は、コントロール細胞の約２分の１であった。また、図６（ａ）より明らかなとおり、コントロール細胞は、２４時間後には細胞が無細胞面を遊走してほぼ埋めているのに対し、Ｓ１細胞では、細胞シート先端の移動スピードが著しく減少し、細胞運動機能が抑制されていることが確認された。
【００５４】
［実施例７］
［Wound healing 解析２]
上記Ｓ１細胞について、ｓｉＲＮＡ導入後３６時間経過時に細胞シートに創傷し、その６時間後に、α−チューブリンに対する抗体で免疫染色し共焦点顕微鏡で観察した。１回の実験ごとに約１００個の細胞について、α−チューブリンの染色から細胞シートの先端に位置する細胞の葉状仮足の長さを測定し、平均値と標準偏差を３回の実験結果から算出し、グラフ化した。結果を図７（ａ）及び（ｂ）に示す。
【００５５】
（結果）
図７（ｂ）より明らかなとおり、コントロール細胞と比較してＳ１細胞は、細胞シート先端の葉状仮足の長さが有意差をもって減少していることが示された(＊，ｐ＜０．０５)。また、図７（ａ）より明らかなとおり、細胞シート先端部を上記共焦点顕微鏡下で観察したところ、Ｓ１細胞では細胞シート先端に位置する細胞の葉状仮足形成が抑制されることが示された。葉状仮足は細胞が移動する際に形成されるものであり、葉状仮足の形成抑制はすなわち大腸癌細胞の運動を抑制している事を示唆している。
【００５６】
［実施例８］
［Wound healing解析３］
上記Ｓ１細胞について、ｓｉＲＮＡ導入後３６時間経過時に細胞シートに創傷し、その６時間後に細胞をα−チューブリンに対する抗体及びケラチン８に対する抗体で免疫染色し、上記共焦点顕微鏡で観察した。結果を図８に示す。
【００５７】
（結果）
図８より明らかなとおり、コントロールの先端細胞では細胞移動に伴ったケラチンフィラメントの脱重合が誘導されていたが、Ｓ１細胞ではケラチン骨格の束化が促進され移動が抑制されていることが観察された。細胞移動時に必要なケラチン骨格の再構築を抑制することが癌細胞の移動能を抑制するメカニズムの一つであると考えられる。
【００５８】
［実施例９］ 
ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ３として、以下の配列を用いて上記各実施例と同様の実験を行ったところ、大腸癌細胞の増殖抑制効果、アポトーシス誘導効果、及び運動機能抑制効果が認められた。ＦＡＭ８３ＨのｓｉＲＮＡＳ３を構成する二本鎖ＤＮＡの配列は以下の通りである。
ＦＡＭ８３Ｈ ｓｉＲＮＡ Ｓ３
5’-UCCACUCGAAGAGGAAGUCCAACUA-3’ （配列番号１０）
3’-AGGUGAGCUUCUCCUUCAGGUUGAU-5’ （配列番号１１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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