(57)【要約】【課題】取得した１枚の画像から試料の位相分布を比較的簡単に定量的に推定すること【解決手段】デジタル顕微鏡において、照明光学系２０は、その瞳面に、少なくとも２つの同心円によって分割され、互いに光強度分布が異なる少なくとも２つの領域を形成し、結像光学系３０は、その瞳面に、光軸を中心とする１つの円によって分割され、入射光に互いに異なる一様な位相差をそれぞれ与える２つの領域を有する位相板３４を備える。【選択図】図１
2015200835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本を照明する照明光学系と、該照明光学系によって照明された前記標本の像を形成する結像光学系と、該結像光学系によって形成された前記標本の像を光電変換する撮像素子と、を有する撮像装置であって、
前記照明光学系は、該照明光学系の瞳面に、少なくとも２つの同心円によって分割され、互いに光強度分布が異なる少なくとも２つの領域を形成し、
前記結像光学系は、該結像光学系の瞳面に、該結像光学系の光軸を中心とする１つの円によって分割され、それぞれが入射光に互いに異なる一様な位相差を与える２つの領域を有する位相板を備えることを特徴とする撮像装置。
【請求項２】
前記撮像素子の像面の光強度分布をＩ、前記標本の位相分布をφ、Ｉの最大値をｍａｘ［Ｉ］、Ｉの最小値をｍｉｎ［Ｉ］、Ｃを係数、ＯＦＦをオフセット成分とすると、
2015200835.tif 000006
に従って前記撮像素子から得られる１枚の画像から前記標本の位相分布を推定する位相推定手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
【請求項３】
前記照明光学系が該照明光学系の瞳面に形成する前記少なくとも２つの領域は、内側の円領域と、該円領域の光強度よりも高い外側の輪帯領域から構成されることを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。
【請求項４】
前記照明光学系が該照明光学系の瞳面に形成する前記少なくとも２つの領域は、最も内側の輪帯領域と、該輪帯領域の光強度よりも高い外側の輪帯領域から構成されることを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。
【請求項５】
前記照明光学系が該照明光学系の瞳面に形成する前記少なくとも２つの領域の単位面積当たりの光強度は、最も外側の輪帯領域、最も内側の円領域、前記最も外側の輪帯領域と前記最も内側の円領域に挟まれた領域の任意の輪帯領域の順に増大することを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。
【請求項６】
前記結像光学系の瞳面に配置された位相板の前記１つの円の半径は、前記照明光学系が前記瞳面に形成する、最も光強度が高い輪帯領域の外側の半径と同一またはそれよりも大きいことを特徴とする請求項１乃至５のうちいずれか１項に記載の撮像装置。
【請求項７】
光束が通過する前記結像光学系の瞳面のすべての位置において透過率が９５％以上であることを特徴とする請求項１乃至６のうちいずれか１項に記載の撮像装置。
【請求項８】
前記位相板が２つの領域に与える位相差は、ある整数ｎに対し、６０°＋３６０×ｎから１３０°＋３６０×ｎの範囲にあることを特徴とする請求項1乃至７のうちいずれか１項に記載の撮像装置。
【請求項９】
標本を照明する照明光学系と、前記照明光学系によって照明された前記標本の像を形成する結像光学系と、前記結像光学系によって形成された前記標本の像を光電変換する撮像素子と、を有する撮像装置であって、前記照明光学系は、該照明光学系の瞳面に、少なくとも２つの同心円によって分割され、互いに光強度分布が異なる少なくとも２つの領域を形成し、前記結像光学系は、該結像光学系の瞳面に、該結像光学系の光軸を中心とする１つの円によって分割され、入射光に互いに異なる一様な位相差を与える２つの領域を有する位相板を備える撮像装置から得られた１枚の画像から前記標本の位相分布を推定する位相推定方法であって、
前記撮像素子の像面の光強度分布をＩ、前記標本の位相分布をφ、Ｉの最大値をｍａｘ［Ｉ］、Ｉの最小値をｍｉｎ［Ｉ］、Ｃを係数、ＯＦＦをオフセット成分とすると、
2015200835.tif 000007
に従って前記標本の位相分布を推定することを特徴とする位相推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撮像装置および位相推定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１〜３は、染色されていない生体試料等の無色透明な試料を可視化する位相差顕微鏡を提案している。また、非特許文献１は、照明光学系に挿入されたウォラストンプリズムによって照明光を偏光方向が直交し位置が僅かにずれた２光束に分割し、結像光学系に挿入されたウォラストンプリズムが試料を透過した２光束を合成する微分干渉顕微鏡を提案している。試料からの透過または反射光と参照光との干渉パターンを撮像し、得られた１枚の画像に対しデータ解析を行うことによって試料の透過光の位相分布を推定するデジタルホログラフィ顕微鏡も知られている。その他、非特許文献２は、デジタル顕微鏡における試料の像面上の光強度分布と試料による位相変化量の関係を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１６３０９０
【特許文献２】特開２０００−１００１３
【特許文献３】特開２０００−１９４１０
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃ  ．  Ｊ．  Ｂｅｌｌａｉｒ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｃｕｒｌ，  Ｂ．  Ｅ．  Ａｌｌｍａｎ，  Ｐ．  Ｊ．  Ｈａｒｒｉｓ，  Ａ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｌ  ．  Ｍ  ．  Ｄ．  Ｄｅｌｂｒｉｄｇｅ，  Ｋ．  Ａ．  Ｎｕｇｅｎｔ共著、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＩＶ：  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｈｉｃｋ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｖｏｌ．  ２１４，  Ｐａｒｔ  １  Ａｐｒｉｌ  ２００４，  ｐｐ．  ６２-６９
【非特許文献２】Ｍ．Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｈ．ＯＯＫＩ，Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｓｕｅｚｏｕ  Ｎａｋａｄａｔｅ共著、「Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｓｐｒｅａｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｈａｓｅ−Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」ＯＰＴＩＣＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ，  Ｖｏｌ．  １２，  Ｎｏ．  ２，  ２００５，  ｐｐ．１０５-１０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、試料の位相情報を取得するには、高価な光学素子を用い、手法によっては複数回の撮像が必要であった。また、位相分布を定性的に可視化することはできても、定量的な推定までは困難であった。例えば、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡で取得される像強度と試料による位相変化量の間には非線形な関係があるために、試料による位相変化量を定量的に正確に推定することは困難である。位相差顕微鏡は位相分布のエッジを強調するが、位相分布に忠実ではない。また、デジタルホログラフィ顕微鏡は、位相分布の推定精度は比較的高いが、従来の明視野顕微鏡の構成を大きく変更する必要がある点、観察像を位相分布に変換するための計算コストが大きい点、スペックルノイズに起因した誤差が発生する点に課題がある。
【０００６】
本発明は、取得した１枚の画像から試料の位相分布を比較的簡単に定量的に推定することが可能な撮像装置および位相推定方法を提供することを例示的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の撮像装置は、標本を照明する照明光学系と、該照明光学系によって照明された前記標本の像を形成する結像光学系と、該結像光学系によって形成された前記標本の像を光電変換する撮像素子と、を有する撮像装置であって、前記照明光学系は、該照明光学系の瞳面に、少なくとも２つの同心円によって分割され、互いに光強度分布が異なる少なくとも２つの領域を形成し、前記結像光学系は、該結像光学系の瞳面に、該結像光学系の光軸を中心とする１つの円によって分割され、それぞれが入射光に互いに異なる一様な位相差を与える２つの領域を有する位相板を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、取得した１枚の画像から試料の位相分布を比較的簡単に定量的に推定することが可能な撮像装置および位相推定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施形態の撮像装置のブロック図である。（実施例１、２）
【図２】試料の振幅透過率および位相分布の一例を示す図である。
【図３】図１に示す照明光学系の光学素子の透過率分布、結像光学系の位相板の位相分布、および推定された試料の位相分布の例を示す図である。（実施例１）
【図４】比較例としての位相差顕微鏡の照明光学系の光学素子の透過率分布、結像光学系の瞳フィルタの振幅透過率と位相分布、および推定された試料の位相分布を示す図である。
【図５】図１に示す照明光学系の光学素子の透過率分布、結像光学系の位相板の透過率分布と位相分布、および推定された試料の位相分布の例を示す図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１０】
図１は、本実施形態のデジタル顕微鏡のブロック図である。デジタル顕微鏡は、光源１０、照明光学系２０、結像光学系（対物レンズ）３０、撮像素子４０、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）５０、表示部６０を有する。デジタル顕微鏡は、明視野顕微鏡に光学素子２２と位相板３４を加えた構成を有している。
【００１１】
光源１０は、可視光（例えば、波長０．４μｍ〜波長０．７μｍ）の光を発する。光源１０の駆動はＰＣ５０によって制御される。
【００１２】
照明光学系２０は、試料（標本）ＳＰを光源１０からの光で照明し、光学素子２２とコンデンサーレンズ２４を有する。光学素子２２は照明光学系２０の瞳面に配置され、コンデンサーレンズ２４は光学素子２２を通過した光を試料ＳＰに集光する。
【００１３】
光学素子２２は、照明光学系２０の瞳面の光強度を変調するフィルタ、回折光学素子（ＣＧＨ）、プリズム、マイクロミラーデバイスなどを使用することができる。光学素子２２は、位相分布計測と通常観察を切り替えることができるように照明光学系２０の光軸に対して挿脱可能であってもよいし、照明光学系２０内に固定されていてもよい。
【００１４】
本実施形態では、照明光学系２０の瞳面に配置される光学素子２２によって、試料ＳＰがない場合の結像光学系３０の瞳面に形成される光強度分布を「有効光源」と呼ぶ。本実施形態の光学素子２２は、少なくとも２つの同心円によって分割される少なくとも２つの領域を有する。これにより、本実施形態における有効光源は、図３（ａ）に示すような光軸を中心とする円形と輪帯が組み合わされた光強度分布か、図５（ａ）に示すような光軸を中心とする多重輪帯状の光強度分布を有する。円と輪帯が組み合わされた光強度分布の場合の輪帯領域と最も内側の円領域は異なる一様な光強度を持つ。また、多重輪帯状の光強度分布の場合、各輪帯は異なる一様な光強度を持つ。光学素子２２は、最も外側の輪帯領域、最も内側の円領域、これら２つの領域に挟まれた領域の任意の輪帯の順に単位面積当たりの光強度が増大してもよい。
【００１５】
なお、有効光源の結像特性への影響は、有効光源の相対値（分布）が決定する。また、前述した通り、照明光学系の瞳と結像光学系の瞳は光学的に共役であるため、試料がない場合に結像光学系の瞳上に形成される照明光学系の絞り（フィルタ）の像が有効光源となる。したがって、結像特性へ影響を与えるのは、照明光学系の瞳における光強度分布である。この光強度分布と光学素子２２の強度透過率分布は等価であるので、以下では光学素子２２において、光強度と強度透過率を区別せず用いる。例えば、光学素子２２の最も内側の同心円の半径は０．４５〜０．５５、光強度は０．０５〜０．１０の範囲、等と表現する。
【００１６】
試料ＳＰは、例えば、染色されていない無色透明な生体試料等である観察対象である。デジタル顕微鏡は試料ＳＰからの透過光の位相情報を定量的に取得する。
【００１７】
結像光学系３０は、試料ＳＰからの光を撮像素子４０に結像する、つまり、試料ＳＰの光学像を撮像素子４０の像面に形成する。結像光学系３０は、対物レンズ３２、位相板３４、結像レンズ３６を有する。対物レンズ３２、結像レンズ３６は集光作用を有するコンデンサーレンズである。位相板３４は、結像光学系３０の瞳面に配置され、光学素子２２と光学的に共役な関係にある。
【００１８】
位相板３４は、光軸を中心とする１つの円によって分割される２つの領域を有し、位相板３４の２つの領域は入射光に互いに異なる一様な位相差をそれぞれ与える。ここで、位相板３４の領域の境界である円の半径は、有効光源において最も光強度が高い輪帯領域の外側の半径（図３（ａ）であれば０．５５）と同一であることが好ましいが、後者の円形境界の半径の方が大きくてもよい。また、２つの領域に与える位相差は、ある整数ｎに対し、６０°＋３６０×ｎから１３０°＋３６０×ｎの範囲にあることが好ましい。
【００１９】
撮像素子４０は、結像光学系３０が形成した光学像を光電変換する。
【００２０】
ＰＣ５０は、撮像素子４０から出力されるアナログ電気信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器、Ａ／Ｄ変換器から出力されるデジタル信号にノイズ除去、量子化などの処理を施す画像処理手段を含む。なお、Ａ／Ｄ変換器は撮像素子４０と一体であってもよい。また、ＰＣ５０はデジタル顕微鏡の各部の動作を制御すると共に試料ＳＰの位相分布を推定する制御手段を含む。位相推定手段はＰＣ５０に接続された外部の位相推定装置であってもよい。また、位相推定方法としてパーソナルコンピュータ（ＰＣ）にインストールされるソフトウェア（プログラム）であってもよい。
【００２１】
なお、光学素子２２、位相板３４を用いずに撮像する通常観察モードでは、画像処理手段はガンマ補正やホワイトバランスなどを行うが、位相分布計測の場合にはこれらの階調補正は行わないことが望ましい。なぜなら、取得される像の光強度と試料による位相変化量の間には略線形な関係があるが、階調補正を行うとこの関係が崩れ、試料ＳＰの位相分布の推定が困難になるためである。なお、図１に示す撮像装置において、通常観察を行うかどうかを、ユーザが選択してもよい。
【００２２】
表示部６０は、ディスプレイなどから構成され、ＰＣ５０から出力された試料ＳＰの画像を表示する。
【００２３】
ＰＣ５０は、１枚の画像によって試料の透過光の位相分布を推定する。ＰＣ５０は、観察像を位相分布に変換する際に後述する数式１の近似（あるいは数式２）を導入し、計算を簡略にし、計算コストを減らしている。
【００２４】
試料ＳＰに弱回折近似を仮定すると、非特許文献２により、観測される像面上の光強度分布Ｉ、試料ＳＰによる位相変化量φ、試料ＳＰの座標（ｘ，ｙ）における振幅透過率を１＋Ｐ（ｘ，ｙ）の間には数式１の関係が成立する。
【００２５】
【数１】
2015200835.tif 000003
【００２６】
ここで、Ｒｅ、Ｉｍはそれぞれ実部と虚部をとる演算を表し、＊は畳み込み演算を表す。ＥＰＳＦ（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｓｐｒｅａｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）は、瞳関数（位相板３４の複素振幅透過率）と有効光源とから決定される光学系に固有の関数である。
【００２７】
数式１から分かるように、Ｉとφの間には畳み込み演算を介した線形な関係があり、ＥＰＳＦの形状の広がりはぼけとしてＩに影響する。また、数式１の第２項は位相差顕微鏡や本実施形態では、ほぼ０となり、０にならない部分はオフセット成分となる。以上のことから、ＥＰＳＦの広がりに起因する像のぼけを無視するならば、取得したデータＩに対して線形演算を行えばφが近似的に推定できる。ＥＰＳＦの広がりに起因する像のぼけを無視できる場合は、例えば、結像光学系の試料側開口数が０．６５以上、好ましくは、０．７以上となる場合である。この時、φをデルタ関数に置き換えることができる。
【００２８】
ＰＣ５０は、位相分布算出のためのパラメータであるオフセット値および係数を決定する。オフセット値は、例えば、撮像した１枚の画像の全画素値の平均値、中央値、最大値と最小値の平均値、試料ＳＰの透明部分（背景）の値を用いることができるが、これらに限定されない。係数は、例えば、後述する数式２のＣであり、ユーザが指定してもよいし、位相変化量が既知の試料を用いて取得したデータから決定してもよい。オフセット値および係数を決定は、事前になされてもよい。
【００２９】
ＰＣ５０は、画像データから抽出されるオフセット値を全画素の輝度値から減算し、係数を乗じることで試料ＳＰによる位相変化量の分布の推定値を算出する。「試料ＳＰによる位相変化量の分布」とは、光軸と平行な方向で入射した平面波が試料ＳＰの透過直後に有する位相分布を意味する。換言すると、試料ＳＰを透過することで発生する位相の進みや遅れを、光軸に垂直な平面内の各位置において定量化した分布である。
【００３０】
算出された位相分布は、透明な試料の形態情報を得る目的で単独に使用することもできる。また、光学素子２２と位相板３４を用いずに撮像した画像に新たな情報を加える目的で使用することもできる。
【００３１】
本実施形態の位相分布推定方法は、試料の透過率分布が一様に近いほど誤差が小さいため、染色されていない生体試料など透過率が一様で位相のみ非一様な分布を持つ位相物体に特に好適である。
【００３２】
本実施形態で用いる光学部材は、強度か位相の一方だけを変調するため、位相差顕微鏡のリング状部材に比べ製造が容易であり、比較的安価で高精度であるという効果がある。また、実施形態の位相推定方法は通常の明視野顕微鏡の構成を変えずに、照明光学系２０と結像光学系３０に所定の光学部材を挿入するだけで実現可能である。さらには、取得データから位相分布を算出する方法は線形演算のため、計算コストが低い。そのため、他の位相差可視化方法に比べてコストおよび計算時間の点で優位性がある。
【実施例１】
【００３３】
以下、実施例１による、光学素子２２と位相板３４を挿入した明視野顕微鏡で撮像した１枚の画像から試料ＳＰによる位相変化量の分布（位相分布）を算出する方法について説明する。
【００３４】
図２（ａ）は、試料ＳＰの振幅透過率を示す図であり、図２（ｂ）は、試料ＳＰのラジアン単位の位相分布を示す図である。この試料ＳＰを本実施例の数値計算の評価に用いる。試料ＳＰにｘｙ軸を設定し、図２の横軸をｘ（μｍ）、縦軸をｙ（μｍ）とする。試料ＳＰでは、背景の振幅透過率を一様に０．８に設定し、１６個の正方形パターンをランダムに配置している。１６個の正方形の大きさを０．５〜１．５μｍ、それらの振幅透過率を０．５〜０．９、それらの位相を−１．５７〜１．５７ラジアン（−９０°〜９０°）の範囲でランダムに与えている。
【００３５】
実施例１では、光源１０の波長を０．５５μｍ、結像光学系３０の試料側開口数（対物ＮＡ）を０．７、結像倍率を１０倍としている。
【００３６】
図３（ａ）は、光学素子２２の透過率分布を示す図であり、横軸は規格化された半径の値、縦軸は透過率である。図３（ａ）の最も内側の同心円の半径は０．５０、その外側の同心円の半径は０．５５であり、光強度は、内側から順に０．０７、１．００、０．００である。また、光軸が同心円の中心を通るとし、最外周の半径１の円は試料側開口数０．７の絞りに対応している。このように、最も外側の輪帯領域の光強度は最も内側の円領域の光強度よりも高い。
【００３７】
図３（ｂ）は、位相板３４のラジアン単位で示す位相分布である。円形部の半径は０．５５であり、円形部の内側と外側の位相差は１．５７ラジアン（９０°）である。実施例１では、位相板３４の光束が通過する全ての位置において透過率は１００％であるが、９５％以上であればよい。
【００３８】
観測される像面上の光強度分布をＩ、Ｉの最大値をｍａｘ［Ｉ］、Ｉの最小値をｍｉｎ［Ｉ］、Ｃを係数、ＯＦＦをオフセット成分、試料ＳＰの推定位相分布をφとした場合、数式２によってφを計算する。試料ＳＰの位相分布と推定位相分布がシミュレーション上でよい一致を示すことから、本実施例では係数Ｃの値をπとした。係数ＣやＯＦＦはシミュレーションによって決定することができる。
【００３９】
【数２】
2015200835.tif 000004
【００４０】
図３（ｃ）に、図２の試料情報に基づいてシミュレートされた像面上の光強度分布Ｉから数式２のＣの値をπとして算出した位相分布φを示す。
【００４１】
なお、図３（ｃ）の効果を得るのに光学素子２２の構成は図３（ａ）に示すものに限定されず、位相板３４の構成は図３（ｂ）に示すものに限定されない。例えば、図３（ａ）において、最も内側の同心円の半径は０．４５〜０．５５、光強度は０．０５〜０．１０の範囲であればよい。同様に、その外側の同心円の幅は０．０３〜０．０７、光強度は、０．９０〜１．００であればよい。
【００４２】
比較例として、従来の位相差顕微鏡を使用して同様の計算を行った。位相差顕微鏡は、照明光学系の瞳面に輪帯形状の領域のみ照明光を透過する絞りを設け、結像光学系の瞳面に位相が１／４波長進み強度が減衰する効果を持つ輪帯形状の透光性光学部材を設け、絞りと透光性光学部材を互いに共役な関係に配置する。試料透過直後に直進光に対し１／４波長だけ位相が遅れる回折光は、光学部材を透過することで位相が１／４波長進む直進光に対し１／２波長の位相差をもつことになり、弱めあう干渉をする。この結果、試料の形状が非一様であり回折光が発生する位置と光学的に共役な像面上の位置においては、直進光と回折光の弱め合う干渉が起こるために像強度が低下する。一方、試料の形状が一様である位置と光学的に共役な像面上の位置においては、回折光が発生しないために弱め合う干渉が起こらず、像強度は低下しない。このように、試料の形状が観察画像の階調に変換され、無色透明な試料が可視化され、試料の形状に起因する透過光の位相分布を反映した観察像を得ることができる。
【００４３】
結像光学系の輪帯部は１．５７ラジアン（９０°）の位相差と１未満の透過率をもつ。図４（ａ）に位相差顕微鏡の有効光源（絞りの透過率分布）、図４（ｂ）に位相差顕微鏡の結像光学系の瞳フィルタの振幅透過率分布、図４（ｃ）に位相差顕微鏡の結像光学系の瞳フィルタの位相分布をラジアン単位でそれぞれ示す。ここで、輪帯の内側半径は０．９０、外側半径は１．００であり、結像光学系の輪帯部の透過率は０．９０である。
【００４４】
従来は、図４（ａ）に示す有効光源分布と図４（ｃ）に示す瞳フィルタの位相分布が同一形状であったが、本実施例では、図３（ａ）と図３（ｂ）に示すように異なる形状にしている。
【００４５】
図４（ｄ）は、図２の試料情報に基づいてシミュレートされた像面上の光強度分布Ｉから数式２のＣの値をπとして算出した位相分布φをラジアン単位で示す。座標（ｘｉ，ｙｊ）における試料ＳＰの真の位相をφ０（ｘｉ，ｙｊ）とし、位相推定誤差を数式３のＲＭＳＥ（Ｒｏｏｔ  Ｍｅａｎ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｅｒｒｏｒ）によって定義する。例えば、図２の試料ＳＰに対して、図２（ｂ）がφ０（ｘｉ，ｙｊ）に相当する。ＲＭＳＥは、１サンプリング点あたりの平均的な誤差をラジアン単位で表したものといえる。Ｍ，Ｎはそれぞれｘ，ｙ方向のサンプリング点数である。
【００４６】
【数３】
2015200835.tif 000005
【００４７】
図３（ｃ）の推定位相分布φに対するＲＭＳＥは０．２０、図４（ｄ）の推定位相分布φに対するＲＭＳＥは０．４２であり、従来の位相差顕微鏡を使用した方法よりも実施例１の方法の方が、推定誤差が低い。
【００４８】
次に、図２の試料ＳＰの代わりに１６個の正方形パターンの大きさを０．５〜１．５μｍ、振幅透過率を０．５〜０．９、位相を−１．５７〜１．５７ラジアン（−９０°〜９０°）の範囲でランダムに１００通り変化させ、同様の評価を行った。この１００通りの試料ＳＰに対してＩをシミュレートした後に位相分布φを算出し、試料の真の位相分布φ０に基づきＲＭＳＥを算出した。この結果、実施例１の方法では１００通りの試料に対するＲＭＳＥの平均値は０．２２、標準偏差は０．１１であった。一方、従来の位相差顕微鏡を使用する方法では、ＲＭＳＥの平均値は０．４２、標準偏差は０．１３であり、試料が変化しても実施例１の推定方法ではより少ない誤差で試料の位相分布を推定できることがわかる。
【００４９】
また、図３（ｂ）において、位相板３４の円の内側と外側の位相差を変化させたとき、１００通りの試料に対するＲＭＳＥの平均値は位相差が１．５７ラジアン（９０°）の場合に最小値０．２１をとった。この時、ＲＭＳＥの平均値の変化が０．２１の５％以内に収まる範囲は、位相差が１．１６ラジアン（６６°）以上２．０６ラジアン（１１８°）以下であった。以上より、任意の整数ｎに対し位相板３４の位相差は１．１６＋２πｎラジアン（６６°）以上２．０６＋２πｎラジアン（１１８°）以下に調整されることが望ましい。
【００５０】
なお、このようにして算出された位相分布は、試料の厚みや屈折率などの分布に換算して利用することが可能であることは言うまでもない。
【実施例２】
【００５１】
実施例２では、明視野顕微鏡において、照明光学系２０および結像光学系３０の光路中に遮光部がある場合に、実施例１と同様に位相分布を推定する方法を説明する。
【００５２】
照明光学系２０における遮光部は、図５（ａ）において、有効光源の中心の強度０の円形領域として示されている。すなわち、試料ＳＰがない場合の結像光学系３０の瞳面において、光軸と光軸から最も離れた光路との距離の３０％の半径を有し、光軸を中心とする円形領域内に光線が入射しないような照明光学系２０であると仮定する。
【００５３】
結像光学系３０における遮光部は、図５（ｂ）に示すように結像光学系３０の瞳面において、光軸と光軸から最も離れた光路との距離の３０％の半径を有し、光軸を中心とする円形領域とする。
【００５４】
試料ＳＰ、照明光の波長、対物ＮＡ、結像倍率は実施例１と同一とする。
【００５５】
図５（ａ）に示す有効光源を、照明光学系２０の瞳面に配置された光学素子２２によって形成する。ここで、光学素子２２の最も内側の円の半径は０．３３、その外側の同心円の半径は０．５０、その外側の同心円の半径は０．６０であり、光強度は内側から順に０．００、０．２０、１．００、０．００である。また、光軸が同心円の中心を通るとし、最外周の半径１の円は開口数０．７の絞りに対応している。このように、最も外側の輪帯領域の光強度は最も内側の輪帯領域の光強度よりも高い。
【００５６】
結像光学系の瞳面には、図５（ｂ）に示す透過率および図５（ｃ）にラジアン単位で示す位相差を与える位相板３４を配置する。ここで、位相板３４の領域を決定する円の半径は０．６０であり、円の内側の領域と外側の領域の位相差は１．５７ラジアン（９０°）である。
【００５７】
図５（ｄ）に、図３の試料情報に基づいてシミュレートされた像面上の光強度分布Ｉから式（２）のＣの値をπとして算出した位相分布φを示す。
【００５８】
なお、図５（ｄ）の効果を得るのに光学素子２２の構成は図５（ａ）に示すものに限定されず、位相板３４の構成は図５（ｂ）および（ｃ）に示すものに限定されない。例えば、図５（ａ）において、遮光部の外側に形成される、内側の輪帯の幅を０．１５〜０．２０、光強度を０．１８〜０．２２、内側の輪帯の外側に形成される輪帯の幅を０．０８〜０．１２、光強度を０．９０〜１．００としてもよい。
【００５９】
一方、実施例１と同じ位相差顕微鏡に対して同様の計算を行い比較する。但し、結像光学系の瞳面に図５（ｂ）と同一の遮光部を加える点だけは実施例１と異なる。
【００６０】
実施例１と同様に位相推定誤差を数式３のＲＭＳＥを用いて評価すると、図５の方法に対するＲＭＳＥは０．１６、位相差顕微鏡の方法に対するＲＭＳＥは０．３８であった。また、実施例１と同様に試料ＳＰをランダムに１００通り変化させ、それぞれの場合について推定位相分布φのＲＭＳＥを算出した結果、図５の手法の１００通りの試料ＳＰに対するＲＭＳＥの平均値は０．２１、同じく標準偏差は０．０９であった。一方、位相差顕微鏡の方法ではＲＭＳＥの平均値は０．３７、同じく標準偏差は０．１３であった。このように、照明光学系２０および結像光学系３０の光路中に遮光部がある場合においても、本実施例の方法は試料ＳＰの変化に依存せず位相差顕微鏡より少ない誤差で試料ＳＰの位相分布を推定できる。
【００６１】
また、図５（ｃ）において円の内側の領域と外側の領域の位相差を変化させたとき、１００通りの試料に対するＲＭＳＥの平均値は位相差が２．０４ラジアン（１１７°）の場合に最小値０．１９をとった。この時、ＲＭＳＥの平均値の変化が０．１９の５％以内に収まる範囲は、位相差が１．７２ラジアン（９８°）以上２．２７ラジアン（１３０°）以下であった。以上より、前記位相板の円の内側の領域と外側の領域の位相差は１．７２＋２πｎラジアン（９８°）以上２．２７＋２πｎラジアン（１３０°）以下に調整されることが望ましい。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、透明性の高い試料を観察する顕微鏡の用途に適用することができる。
【符号の説明】
【００６３】
２０…照明光学系、３０…結像光学系、３４…位相板、４０…撮像素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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