(57)【要約】【課題】抗うつ／抗不安薬のスクリーニングに有用な受容体とその受容体を用いた新しいメカニズムを有する抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法を提供する【解決手段】骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）を発現する真核細胞の培地に候補物質を添加し、BMPR1Aに対するアンタゴニストを選抜することを特徴とする、抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）を発現する真核細胞の培地に候補物質を添加し、BMPR1Aに対するアンタゴニストを選抜することを特徴とする、抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
リン酸化smadの量を低下させる候補物質をBMPR1Aのアンタゴニストとして選抜する、請求項1に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記発現細胞は、レポーター遺伝子がBMPR1Aアゴニストの刺激により発現量が増加又は減少する遺伝子のプロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を前記発現細胞で一過性または安定発現するように導入してあるものであり、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、蛍光タンパク質及び着色タンパク質からなる群から選ばれるものであり、前記レポーター遺伝子の発現量をアゴニスト刺激と反対方向に変化させる候補物質をBMPR1Aに対するアンタゴニストとして選抜する、請求項1に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記発現細胞は、レポーター遺伝子がBMPR1Aアゴニストの刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を前記発現細胞で一過性または安定発現するように導入してあるものであり、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、蛍光タンパク質及び着色タンパク質からなる群から選ばれるものであり、前記レポーター遺伝子の発現を低下させる候補物質をBMPR1Aに対するアンタゴニストとして選抜する、請求項1に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記遺伝子がId-1又はId-3である、請求項3又は4に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記遺伝子がId-1である、請求項５に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗うつ／抗不安薬のスクリーニングにおける骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗うつ／抗不安薬の新規標的受容体を用いた抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法及び抗うつ／抗不安薬のスクリーニングにおける新規標的受容体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代のストレス社会において精神疾患が増加している。日本では、精神疾患の患者数が（323万人、厚生労働省調査2008年）従来の４疾病（がん、脳卒中、心臓病、糖尿病）を大きく上回り、2011年から重点対策が必要な疾患に神経疾患が追加された。さらに、日本を含めた先進諸国や新興国では大きな抗ストレス市場が形成され、新しい作用機構に基づいた抗うつ・抗不安薬の開発が期待されている。
【０００３】
これまで本発明者らはジペプチドTyr-Leu（YL）が医薬品に匹敵する強力な抗不安作用を示すことを見出した(特許文献１)。しかしながら、YLの抗不安作用のメカニズムは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】再表2010/087480
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、抗うつ／抗不安薬のスクリーニングに有用な受容体とその受容体を用いた新しいメカニズムを有する抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ジペプチドTyr-Leu（YL）の標的受容体が骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、以下の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法及び使用を提供するものである。
項１．  骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）を発現する真核細胞の培地に候補物質を添加し、BMPR1Aに対するアンタゴニストを選抜することを特徴とする、抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
項２．  リン酸化smadの量を低下させる候補物質をBMPR1Aのアンタゴニストとして選抜する、項1に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
項３．  前記発現細胞は、レポーター遺伝子がBMPR1Aアゴニストの刺激により発現量が増加又は減少する遺伝子のプロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を前記発現細胞で一過性または安定発現するように導入してあるものであり、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、蛍光タンパク質及び着色タンパク質からなる群から選ばれるものであり、前記レポーター遺伝子の発現量をアゴニスト刺激と反対方向に変化させる候補物質をBMPR1Aに対するアンタゴニストとして選抜する、項1に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
項４．  前記発現細胞は、レポーター遺伝子がBMPR1Aアゴニストの刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーターの制御下にあり、前記レポーター遺伝子を前記発現細胞で一過性または安定発現するように導入してあるものであり、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ、蛍光タンパク質及び着色タンパク質からなる群から選ばれるものであり、前記レポーター遺伝子の発現を低下させる候補物質をBMPR1Aに対するアンタゴニストとして選抜する、項1に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
項５．  前記遺伝子がId-1又はId-3である、項3又は4に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
項６．  前記遺伝子がId-1である、項５に記載の抗うつ／抗不安薬のスクリーニング方法。
項７．  抗うつ／抗不安薬のスクリーニングにおける骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）が抗うつ／抗不安薬のスクリーニングにおける標的受容体になることが初めて明らかにされた。この受容体に基づき抗うつ/抗不安薬をスクリーニングすることで、従来と作用パターンの異なる抗うつ/抗不安薬を開発することができ、従来薬では有効性の低い患者に対しても有効な抗うつ／抗不安薬を開発することが可能になる。
【０００９】
本発明では、既にBMPR1AリガンドとしてYLを見出しているので、YLをリードとした新規リガンドの開発が可能である。加えて、BMPR1Aの内因性アンタゴニストnogginがiPS細胞の効率的分化を促進することが報告され、格段に安価なジペプチドYLが同様の効果を示すことも期待できるため、iPS細胞を用いた再生医療にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】YLの標的受容体が骨形成タンパク質受容体１A（BMPR1A）であることを示す。
【図２】YLのBMP2によるsmadリン酸化の阻害作用
【図３】YLによるBMP2による神経新生阻害のブロック
【図４】BMP阻害により抗うつ作用
【図５】BMPR1A発現抑制によるYLの抗うつ作用の消失
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明では、YLの標的受容体が骨形成タンパク質受容体１A（BMPR1A）であることを明らかにした。
【００１２】
本発明者は、YLの標的受容体を決定するため、図1に示すように、YLを担体に結合し、これをマウス脳膜画分とインキュベートした。プルダウンして得られたタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、ペプチドマスフィンガープリント法で標的受容体を同定した。その結果、YLの標的受容体はTGF-β受容体ファミリーに属する骨形成タンパク質受容体1A（BMPR1A）であることが明らかとなった。BMPR1Aの内因性リガンドであるBMP2およびBMP4により海馬神経新生が抑制されることが知られている(Shou J et al. Nat Neurosci. 2 339-345 (1999); Nakashima K et al. Proc Natl Acad Sci USA. 98 5868-5873 (2001)。このBMP2による海馬神経新生抑制作用はYL添加により阻害された。また、BMPR1Aの下流因子としてsmadが知られているが、 BMP2によるsmadリン酸化をYLが阻害することを本発明者は確認した。したがって、YLはBMPR1Aのアンタゴニスト様の作用を示すと考えられる。
【００１３】
BMPR1Aは抗うつ／抗不安薬の新しい標的であり、BMPR1Aに対するアンタゴニストをスクリーニングすることで、新しい抗うつ／抗不安薬を開発することが可能になる。なお、BMPR1Aのアンタゴニストタンパク質のnogginがiPS細胞の効率的分化を促進することが報告されており、格段に安価なジペプチドYLが同様の効果を示すことも期待できる。
【００１４】
本明細書において、骨形成タンパク質受容体１A（BMPR1A）は公知であり、一例としてヒト及びマウスのデータベースのアクセッション番号を以下に示す。
・ヒトBMPR1Aのアクセッション番号：P36894.2
・マウスBMPR1Aのアクセッション番号：P36895.1
【００１５】
BMPR1Aは、哺乳類由来のものが使用される。哺乳類としてはヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、ネコなどが挙げられ、ヒト由来のBMPR1Aが好ましい標的受容体である。BMPR1Aは、脳などの中枢神経系に存在し、末梢にも存在するが、抗うつ／抗不安薬のスクリーニングにおける標的受容体は、中枢神経系に存在するタイプの受容体が好ましい。
【００１６】
BMPR1Aを発現する細胞は、真核細胞が使用される。真核細胞としては、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などが挙げられ、ヒト細胞が好ましく例示される。哺乳類としては上記に例示されるものが使用される。細胞は、BMPR1Aを発現する。具体的には、BMPR1Aを本来発現する細胞(受容体細胞)を使用してもよく、BMPR1Aを発現しない細胞に対し、該細胞で機能するプロモーター(構成性又は誘導性)の制御下にBMPR1Aを組み込んだベクターなどの遺伝子構築物を細胞に導入し、BMPR1Aを高発現させた細胞を使用することができる。哺乳類細胞で使用される構成性プロモーターとしては、例えばＳＶ４０、ＲＳＶ、ニワトリβアクチンなどのプロモーターが挙げられ、誘導性プロモーターとしては、メタロプロテインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復などが挙げられる。酵母で使用されるプロモーターとしては、gal1プロモーター、gal10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞のプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。
【００１７】
本発明では、BMPR1Aのアンタゴニストをスクリーニング又は選抜し、このアンタゴニストは抗うつ／抗不安薬として有用である。
【００１８】
BMPR1Aのアンタゴニストは、従来公知の任意の方法により測定可能であるが、例えば、以下の2つの方法によりスクリーニングすることができる。
（１）リン酸化smadの量を抗体を用いたウェスタンブロッティングで測定する。BMPR1Aのアゴニストはリン酸化smadを増加させるので、候補物質をBMPR1A発現細胞に接触させたときにリン酸化smadの量が低下すれば、その候補物質はBMPR1Aのアンタゴニストとして選抜する。
（２）BMPR1A発現細胞に対し、Id-1遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を組み込み前記レポーター遺伝子を前記細胞で一過性または安定発現させる。リン酸化smadが増加するとId-1遺伝子の発現が増加するので、候補物質を前記細胞に接触させたときにId-1遺伝子の発現が低下した場合、その候補物質はBMPR1Aのアンタゴニストとして選抜する。
【００１９】
Id-1遺伝子以外にも、BMPR1Aアンタゴニストによりその発現量が増加又は減少する遺伝子、例えばId-3遺伝子などは、アンタゴニストを選抜するためのプロモーターアッセイに使用することができる。
【００２０】
レポーター遺伝子を用いるプロモーターアッセイは、検出が容易であるので好ましい。
【００２１】
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質及び着色タンパク質が挙げられる。ルシフェラーゼとしては、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫（ホタル、ヒカリコメツキなど）、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケ、オワンクラゲ（エクオリン）などの各種発光生物由来のルシフェラーゼが例示される。蛍光タンパク質としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ），黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ），青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ），シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＤｓＲＥＤ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などが例示される。着色蛋白質としては、フィコシアニン、フィコエリトリンが挙げられる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【００２３】
実施例1
マウス脳膜画分を採取し、YL結合担体によりプルダウンした。得られたタンパク質をSDS電気泳動で分離し、YL特異的に結合するタンパク質のバンドを切り出し、ペプチドマスフィンガープリント法により、YL結合タンパク質候補を同定した（図１）。その結果、BMPR1A（骨形成タンパク質受容体1A）が最も高いスコアを示した。この受容体はTGF-β受容体ファミリーに属する1回膜貫通型受容体であり、抗うつ作用との関連は全く知られていない。
【００２４】
BMPR1Aの内因性リガンドとしてBMP2が知られている。神経由来の培養細胞であるNeuro2aにBMP2を添加すると、下流因子のsmadがリン酸化されることを、リン酸化smad抗体を用いたwestern blottingにより確認した。さらに、BMP2によるsmadリン酸化がYL添加により阻害されることを明らかにした（図２）。
【００２５】
最近、抗うつ薬の効果に海馬神経新生が関与することが明らかとなり注目されている。マウス海馬（P1）を摘出し、7日間培養後、神経球を回収し、さらに3日間培養した。この神経細胞にYLおよびBMP2を添加し、新生細胞マーカーBrdUの取り込みを検討した。その結果、BMP2による海馬神経新生抑制はYLの添加により阻害されることが判明した（図３）。
【００２６】
実施例２
BMPアンタゴニストであるNogginの抗うつ作用に対する影響を調べた。マウスにNogginを3 mg/mouseの用量で脳室内投与し、強制水泳試験により抗うつ活性を評価した。その結果、Nogginは抗うつ作用を示し、BMPシグナルの阻害が抗うつ作用に関与することがわかった（図４）。
【００２７】
これまで本発明者はYLが抗うつ作用を示すことを見出した。その作用がBMPR1Aを介するか否かを明らかにするため、in vivo RNAiを用いてBMPR1Aの発現抑制し検討した。BMPR1A siRNAを脳室内投与し２日後にYLを腹腔内投与または脳室内投与し、その抗うつ作用について強制水泳試験を用いて調べたところ、BMPR1Aを発現抑制させた場合にYLの抗うつ作用が消失し、YLの抗うつ作用はBMPR1Aを介することが明らかになった（図５）。
【００２８】
以上、抗うつペプチドYLのプルダウンアッセイにより標的受容体BMPR1Aを同定した。YLは内因性リガンドBMP2による作用を阻害することを２つの評価系で明らかにした。したがって、YLはBMPR1Aアンタゴニストとして作用すると考えられる。BMPR1Aは新しい創薬のターゲットとして注目に値する。
【００２９】
低分子のBMPシグナル抑制薬（LDN-193189）により血管の石灰化と動脈硬化が低減するとの報告がある（骨粗鬆症治療11.1.p65. 2012）。この他、BMP阻害因子は、動脈血管内皮細胞における酸化LDL依存的な活性酸素の産生を抑制し、血清コレステロールレベルの低減と脂肪肝の発症を抑制することが明らかにされている。したがって、BMPシグナルを抑制するYLはこれらの作用を示すことが予想され動脈硬化改善作用が期待される。
【００３０】
記憶学習に重要な役割を果たす海馬で認められる神経新生は加齢ともに低下し、海馬依存性学習が低下することから、BMPシグナルを抑制し神経新生作用を示すYLは高齢者において低下した記憶学習能を改善する可能性がある。また、神経新生を高めることから脊髄損傷などにおいて神経再生促進作用が期待される。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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