(57)【要約】      （修正有）【課題】アミロイドβ42に対する親和性と特異性が高い新たなペプチド及びこのペプチドの用途の提供。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列を有するペプチド。前記アミノ酸配列において、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有し、かつアミロイドβ４２に対する解離定数Ｋｄが１．０×１０−７Ｍ以下であるペプチド。前記ペプチドを用いたアミロイドβ42凝集阻害剤、アミロイドβ産生抑制用医薬組成物（アルツハイマー病の治療または予防薬として利用できる）。アミロイドβ42に対する親和性がさらに改善されたペプチドを得るためのスクリーニング方法、生体試料中のアミロイドβ42の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有し、かつアミロイドβ42に対する解離定数Kdが1.0×10-7M以下であるペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを含有するアミロイドβ42凝集阻害剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のペプチドを有効成分として含有するアミロイドβ産生抑制用医薬組成物。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のペプチドに改変を加える工程、
得られた改変ペプチドのアミロイドβ42に対する解離定数Kdを測定する工程
を含むアミロイドβ42親和性ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項６】
生体試料と請求項１又は２に記載のペプチドとを混合する工程、
得られた混合物中のアミロイドβ42と前記ペプチドとの複合体を検出する工程
を含む前記生体試料中のアミロイドβ42の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβ42（以下、Aβ42）に高い親和性と特異性を有する新規ペプチド、並びにこのペプチドを用いたAβ42凝集阻害剤、アミロイドβ産生抑制用医薬組成物、Aβ42親和性ペプチドのスクリーニング方法、及び生体試料中のアミロイドβ42の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド凝集体形成やAβのオリゴマー形成はアルツハイマー病の原因因子であること、さらにこれらアミロイド凝集体形成やAβのオリゴマー形成はAβ42が会合することで、発症すると考えられている。そのためAβ42の会合を阻害することで、アルツハイマー病の治療効果が得られるものと考えられている。
【０００３】
従来Aβ42の会合阻害剤として種々の物質が提案されている。中でもペプチド型の会合阻害剤としては、Aβ42ペプチドミミック（Aβ42断片を修飾したものなど）がある。非特許文献１には、Aβ42のコンビナトリアル・ライブラリーから得られた３種類のペプチド1A、1B及び1C （P1-MSNKGASIGLMAGDVDIADSHS、P2- MSNKGASNALMAGDGDIADSHS、P3- MQKLDVVAEDAGSNK）が記載されている。Aβ42に対する解離定数Kdの記載はないが、185 μMのペプチドP1は24時間後に60%のAβ42 fibrillizationを示すことが記載されている。非特許文献２には、ペプチドP13H（HIKVVLFGEHLKNVIFLE）が記載され、Aβ42に対する解離定数Kdは100 nMと記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本特許第5210620号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Baine et al., J.Pept.Sci. (2009)
【非特許文献２】T. Takahashi et al., 2009, Proteins
【非特許文献３】Stroud JC, et al., Proc Natl Acad Sci U S A.;109(20):7717-7722(2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アルツハイマー病の治療薬として利用されるためには、Aβ42に対する解離定数KdはnMオーダーに近づける必要があるとされており、上記非特許文献1および2に記載のペプチドはAβ42に対する親和性は依然として低い。
【０００７】
また、Aβ42の会合阻害剤としては、ペプチド以外には抗体も知られているが、Aβ42に対する親和性は低く、小分子の場合、特異性も弱いという問題がある。また、抗体はとりわけDDSにおける問題がある。価格的にも抗体は不利である。
【０００８】
そこで本発明は、Aβ42に対する親和性と特異性が高い新たなペプチドを提供することを目的とする。
【０００９】
さらに本発明は、これら新規なペプチドを用いた、Aβ42凝集阻害剤、アルツハイマー病の治療または予防薬として利用できるアミロイドβ産生抑制用医薬組成物の提供、さらにはAβ42に対する親和性がさらに改善されたペプチドを得るためのスクリーニング方法、生体試料中のアミロイドβ42の検出方法を提供することも目的とする。
【００１０】
本発明者らは、本発明者らが開発したペプチドアプタマーライブラリーの作製方法(特許文献１)を利用して、Aβ42に対する親和性が高いペプチドをスクリーニングした。その結果、Aβ42に強い結合活性(解離定数Kdが12nMや20nM)を示す新たなペプチドを見出して本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の通りである。
[１]
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
[２]
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有し、かつアミロイドβ42に対する解離定数Kdが1.0×10-7M以下であるペプチド。
[３]
［１］又は［２］に記載のペプチドを含有するアミロイドβ42凝集阻害剤。
[４]
［１］又は［２］に記載のペプチドを有効成分として含有するアミロイドβ産生抑制用医薬組成物。
[５]
［１］又は［２］に記載のペプチドに改変を加える工程、
得られた改変ペプチドのアミロイドβ42に対する解離定数Kdを測定する工程
を含むアミロイドβ42親和性ペプチドのスクリーニング方法。
[６]
生体試料と［１］又は［２］に記載のペプチドとを混合する工程、
得られた混合物中のアミロイドβ42と前記ペプチドとの複合体を検出する工程
を含む前記生体試料中のアミロイドβ42の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のペプチドはAβ42に対して強い結合活性(解離定数:12nMや20nM)を有し、Aβ42の会合を阻害して、細胞レベルでAβ42の細胞毒性を阻止する効果を有するものである。
【００１３】
従来からペプチドをAβ42重合阻害薬にとの試みはある。しかし、新規分子というよりは、Aβの部分断片の改変というものであった。本発明のペプチドは、全く新規のペプチドであり、これまでのどのペプチドよりも強い結合（Kd=１２nM）の分子である（非特許文献３）。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１（Ａ）】Aβ42のペプチドに対する結合親和性向上のセレクションの概念図である。(A)in vitroのセレクションのスキームである。
【図１（Ｂ）】Aβ42のペプチドに対する結合親和性向上のセレクションの概念図である。(B)表面プラズモン共鳴(SPR)によるPPのAβ42に対する結合親和性の測定結果を示す。
【図２】P84とP131によるAβ42の線維化阻害実験結果を示す。(A)チオフラビンT(ThT)結合アッセイの結果を示す。(B)Aβ42(100μM)の線維化阻害実験結果を示す。
【図３】線維化条件下でインキュベーションしたAβ42のAFM(原子間力顕微鏡)画像を示す。(A)は24時間インキュベーション後、(B)は48時間インキュベーション後のAβ42のAFM解析を示す。
【図４】Aβ42のオリゴマー化に対するPPの影響を検討した結果を示す。(A)典型的なトリシンSDS−PAGEである。(B)Aβ42のオリゴマーの蛍光強度測定結果である。(C)50μMのAβ42のAFMによる画像である。(D)オリゴマー化したAβ42の一定分量(10μM)のThTアッセイの結果を示す。(E)Aβ42の一定分量(10μM)のANS蛍光アッセイの結果を示す。
【図５】PPがAβ42の細胞毒性を阻害するかの検討結果を示す。(A)線維化したAβ42の細胞毒性効果の阻害実験結果を示す。(B)オリゴマー化したAβ42の細胞毒性効果の阻害実験結果を示す。
【図６】PPによる凝集阻害の仮説のモデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜本発明のペプチド＞
本発明のペプチドは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドである。
これらのペプチドは、特許文献１に記載の方法を応用して多数の候補ペプチドの中からAβ42親和性ペプチドとしてスクリーニングされたものである。
これらのペプチドはアミノ酸配列が示されていることから、既知の合成方法を用いて容易に合成することができる。
【００１６】
さらに本発明のペプチドは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有し、かつAβ42に対する解離定数Kdが1.0×10-7M以下であるペプチドである。
【００１７】
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有するペプチドの中にも、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと同程度のAβ42親和性を有するペプチドは存在する。このような本発明のペプチドは、Aβ42に対する解離定数Kdが1.0×10-7M以下であるペプチドであり、好ましくは解離定数Kdが5.0×10-8M以下であるペプチドであり、より好ましくは解離定数Kdが2.0×10-8M以下であるペプチドである。Aβ42に対するペプチドの結合親和性（解離定数[Kd]）は、Biacore 2000(GE Healthcare)を用いたSPR（表面プラズモン共鳴法）によって測定することができる。詳細な条件は実施例の記載を参照できる。
【００１８】
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１から９個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の修飾を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、既存のランダム変異導入方法、あるいは点変異導入方法などを用いて合成することができる。修飾の数は、より好ましい範囲に向かって、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個の順である。アミノ酸修飾の種類は、欠失、置換、逆位、付加及び挿入の何れでも良い。
【００１９】
＜Aβ42凝集阻害剤＞
本発明は、上記本発明のペプチドを含有するAβ42凝集阻害剤を包含する。Aβ42凝集阻害剤は、上記本発明のペプチドのみからなっても良いが、適当な担体、溶媒または緩衝液などとの混合物であることもできる。担体としては、ペプチドの安定性を考慮すれば、タンパク質、ペプチド、糖、核酸、有機低分子、高分子などであることができる。
溶媒は、水またはペプチドを溶解できる有機溶媒であることができる。有機溶媒としては、例えば、DMSO,アセトニトリル、エタノールなどを挙げることができる。緩衝液としては、ペプチドの安定性を考慮すれば、pHが3〜11の範囲であるものが適当である。
【００２０】
＜アミロイドβ産生抑制用医薬組成物＞
本発明は上記本発明のペプチドを有効成分として含有するアミロイドβ産生抑制用医薬組成物を包含する。
【００２１】
本発明により提供される医薬は、本発明のペプチドを有効成分として含み、アミロイドβ産生抑制用医薬組成物として用いることができる。この医薬組成物は、さらに、アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための医薬として用いることができる。本発明のペプチドは、それ自体を医薬として患者に投与してもよいが、一般には、これらの有効成分の１種又は２種以上を含む医薬組成物を製造して患者に投与することが好適である。このような医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤、又は液剤などの経口投与の製剤、あるいは注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用の製剤を例示することができる。
【００２２】
経口投与用の錠剤又はカプセル剤は、通常は単位投与物として提供され、結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤及び湿潤剤のような通常の製剤用担体を添加して製造することができる。錠剤は、この当業界で周知の方法に従って、例えば、腸溶性コーティング剤等を用いてコーティングすることができ、例えば充填剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤等を用いて製造してもよい。
【００２３】
経口投与用の液剤は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解されうる乾燥製剤として提供される。このような液剤には、通常の添加剤、例えば沈殿防止剤、乳化剤、保存剤及び必要に応じて通常の香味剤又は着色剤を配合することができる。
【００２４】
経口投与剤の製剤は、混合、充填、又は打錠などの当業界で周知の方法により製造することができる。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用した製剤中に有効成分を分布させてもよい。非経口投与用の製剤は、一般には有効成分である物質と滅菌媒体とを含有する液体担体投与量製剤として提供される。非経口投与用の溶剤は、通常、有効成分である物質を媒体に溶解させて滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填して密封することにより製造される。安定性を高めるために組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することにより好適に製造できる。また、有効成分が均一分布となるように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加してもよい。
【００２５】
有効成分であるペプチドの投与量は、ペプチドの活性の強度、治療や予防の目的、患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定すればよい。また、１日あたり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。例えば、化合物が有効成分である場合、その投与量は、１日の経口投与において１ｋｇ体重あたり一般的には０．００５〜５００ｍｇの量で投与することができる。
【００２６】
＜Aβ42親和性ペプチドのスクリーニング方法＞
本発明は、本発明のペプチドを出発原料とするAβ42親和性ペプチドのスクリーニング方法を包含する。この方法は、本発明のペプチドに改変を加える工程、および得られた改変ペプチドのAβ42に対する解離定数Kdを測定する工程を含む方法である。
【００２７】
本発明のペプチドに改変を加える工程は、例えば、特許文献１に記載の方法を利用した方法で行うことができる。例えば、エラープローン法などで点置換体ライブラリーを作成した後にスクリーニングすることができる。あるいは部位特異的に異常アミノ酸を導入するような人工ペプチドを合成する方法を用いることもできる。
【００２８】
得られた改変ペプチドのAβ42に対する解離定数Kdを測定する工程は、前記で説明した、Biacore 2000(GE Healthcare)を用いたSPR（表面プラズモン共鳴法）によって測定するAβ42に対するペプチドの結合親和性（解離定数[Kd]）の測定と同様に行うことができる。詳細な条件は実施例の記載を参照できる。
【００２９】
本発明のAβ42親和性ペプチドのスクリーニング方法により、本発明のペプチドと同等かそれ以上のAβ42親和性ペプチドをスクリーニングすることができる。
【００３０】
＜Aβ42の検出方法＞
本発明は、生体試料中のAβ42の検出方法を包含し、この方法はいかの2つの工程を含むものである。
生体試料と本発明のペプチドとを混合する工程、
得られた混合物中のAβ42と前記ペプチドとの複合体を検出する工程
【００３１】
本発明において、「生体試料」とは、例えば、ヒトの血漿、血清、血液、尿、唾液、組織、分泌物などのAβ42を含む可能性がある試料である。生体試料と本発明のペプチドとの混合は、生体試料がAβ42を含むものであに場合、生体試料中のAβ42と本発明のペプチドとが結合できる条件であれば特に制限はない。例えば、pH3〜11の緩衝液中、室温(例えば、15〜30℃)で1分から24時間放置することが行うことができる。但し、これらの条件に限定される意図ではない。
【００３２】
得られた混合物中のAβ42と本発明のペプチドとの複合体の検出は、例えば、本発明のペプチドに公知の蛍光標識を結合させることが行うことができる。本発明のペプチドに対する蛍光標識の結合は公知の方法を用いて実施できる。あるいは、Aβ42と本発明のペプチドとの複合体の検出は、公知の免疫学的測定法を利用して実施することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は、これらの実施例に限定される意図ではない。
【００３４】
以下の実施例においては、特に記述がない限り、試薬類はWAKO（Japan）から得たものとする。
【００３５】
ペアードペプチドライブラリーの作製
ペアードペプチド（PP）ライブラリーはYライゲーションによるブロックシャッフリング法（YLBS）[非特許文献C]に従って作製した。
要約すると、まず以前使用したライブラリー[非特許文献B]から選んだ8種のペプチドブロックをコードしたcDNAと、2つのリンカー（表１参照）を合成、精製した。（JBios、日本）
【００３６】
【表１−１】
2015163051.tif 000002
【００３７】
【表１−２】
2015163051.tif 000003
【００３８】
【表２】
2015163051.tif 000004
【００３９】
図1に示した通り、YLBSの1次ラウンドは、ビオチンがラベルされた5'ハーフのペプチドブロックと、その相補鎖である3'ハーフのリンカーブロックによって行われた。
そして、“D5-ペプチド-スペイサーブロック”をコードした一本鎖の5'ハーフのDNAシーケンスを得るために、YLBS産物を制限酵素Mbo I（NEB）で処理し、ストレプトアビジンビーズ（Dynabeads MyOne Streptavidin C1、Invitrogen）で精製した。
図1は、Aβ42のペプチドに対する結合親和性向上のセレクションの概念図である。
(A)in vitroのセレクションのスキーム。ペアードペプチド(PP)ライブラリーはこの目的のために使用された。
(B)表面プラズモン共鳴(SPR)によるPPのAβ42に対する結合親和性の測定結果を示す。
曲線はCM5センサーチップ上に固定した0.5 mMのPP上に40μMのAβ42を流すことによって得た。
【００４０】
YLBSの2次ラウンドは、D5-ペプチド-スペイサーブロックと3'ハーフのペプチドブロックによって行われたが、その目的は“ペプチド-スペイサー-ペプチド”ブロックで構成されるPPをコードするDNAシーケンスを得るためである。
理論上、PPライブラリーは128種の変異体で成っている。しかしながら、実際のライブラリーのダイバーシティ（多様性）は、ライブラリー作製過程[非特許文献A]におけるポジティブな置換や挿入欠失変異のためにより高いものと仮定された。このライブラリーはcDNA-ペプチドの融合コンストラクトを作製するためのin vitroでの転写、ピューロマイシンリンカーのライゲーション、そしてin vitroの翻訳に用いられた。
【００４１】
新規ペプチドのin vitro selection(試験管内淘汰)
PPライブラリーから得たcDNA-ペプチドの融合コンストラクトを、自身に非特異に結合しているペプチドを取り除くため、ストレプトアビジンビーズと混合した後、室温にて30分間インキュベーションした。その上澄みをbiotin-LC-Aβ42（AnaSpec inc., U.S.A）を含んだ新しいチューブに回収し、セレクションの1次、2次ラウンドのものに対し、それぞれ室温にて20分間、10分間インキュベーションした。その一方で、セレクションの3次、4次ラウンドのものは、5分間をそれぞれ室温、37℃でインキュベーションした。
【００４２】
使用したbiotin-LC-Aβ42は、使用前にTsuji et al [非特許文献B]による方法でモノマー化した後、-80℃にて保存した。そしてAβ42結合PPを得るために、ストレプトアビジンビーズを加えた後、30分間インキュベーションした。このビーズは0.5%のtween-20を含んだD-PBS(-)で洗浄した。そのAβ42結合ペプチドは15分間、65℃、25%のアンモニア溶液の条件で溶出した。その溶出溶液をエタノール沈殿させた後、ペレットを蒸留水で再懸濁した。PPをコードしたcDNAは、クローン化した後、シーケンシング（配列決定）し、その情報を元にしてペプチドを化学合成した（表２）。
【００４３】
Aβ42の凝集体の準備
Aβ42ペプチドはAnaSpec Inc., U.S.Aから購入した。モノマー化したAβ42ペプチドは既に記述してある方法[29]で調製した。使用する前に、-80℃で保存していたモノマー化したAβ42ペプチドを解凍した後、0.5 mMのAβ42ペプチド溶液を得るためにNaOH（50mM）に溶解し、最終濃度が200 mMになるようにD-PBS(-)でさらに希釈した。その後、ペプチド溶液は3分間超音波処理し、10分間15,000 rpmで遠心した。そして、完全に溶解したペプチド溶液を得るために、遠心したペプチド溶液の上澄みを回収した。この上澄み溶液は-80℃で保存し、また、これはモノマーのペプチド溶液だと考えられる。
【００４４】
Aβ42の原線維化は、100μMのAβ42ペプチド溶液を37℃で350 rpmで振盪しながら48時間インキュベーションすることによって行った。（必要によっては、この時にPPも同時にインキュベーションする。また、化学合成したPPはSCRUM（Japan）によって95％以上に精製済みである。）同様に、Aβ42のオリゴマー化は、50μMのAβ42ペプチド溶液を37℃で振盪なしにインキュベーションすることによって行った。インキュベーションの後、試料は様々な実験で要求される濃度まで希釈した。
【００４５】
図2に結果を示す。
P84とP131はAβ42の線維化を阻害する。
(A)10μMのP84あるいはP131を37℃で48時間までインキュベーションしたとき、チオフラビンT(ThT)結合アッセイは、Aβ42(100μM)の線維化の時間依存的な阻害を示す。
(B)Aβ42(100μM)の線維化阻害は、2つの異なった濃度のPPを37℃で48時間までインキュベーションさせた。このデータは3回の独立的なアッセイから得たものであり、それぞれのアッセイは96ウェルマイクロプレート中で3つ組にして行った。エラーバーは標準偏差を表す。
【００４６】
結合親和性の測定
Aβ42に対するそれぞれのペプチドの結合親和性（解離定数[Kd]）は、Biacore 2000(GE Healthcare)を用いたSPR（表面プラズモン共鳴法）によって測定した。
まず、PPをホウ酸（10 mM）とNaCl(1 M)を含んだ固定化バッファー（PH 8.5）を使った一般的なアミンカップリング法によって、CM5 Biacore chip（GE Healthcare, UK）の別々のレーン上に固定した。リファレンスレーンはPPなしとする。
それから、Aβ42に対するPPの結合親和性を測定するために、各濃度のモノマーAβ42（2.5μM, 5μM, 10μM, 20μM, 40μM）を加えた。
全てのサンプルに対して、PBS(-)バッファー（PH 7.4）はランニングバッファーとして使用し、NaOH溶液（50 μM）はAβ42を取り除くのに使用した。
得られたグラフは、BIA計算ソフトウェア（GE Healthcare）を用いてラングミュア結合モデルで1：1の結合比として計算した。
【００４７】
チオフラビンT（ThT）結合アッセイ
原線維化のために準備したAβ42ペプチド溶液（100μM）とオリゴマー化のために準備したAβ42ペプチド溶液（50μM）は10 μMに希釈した。
50μLの希釈したペプチド溶液を96ウェルプレート（黒色、平底, Costar）に加えて、100μMのThT（Sigma-Aldrich, India）溶液を50μL投入する。ただし、ThTは50 mMのグリシンバッファー（PH 8.5）で調製した。
蛍光はTecan Infinite M200マイクロプレートリーダー（490 nm）を用いて測定した。
【００４８】
原子間力顕微鏡法
Aβ42ペプチドの線維化、オリゴマー化溶液は25 μMに希釈した。その後、希釈したサンプルの20 μLを分割した雲母の上に沈着させた。その雲母は室温にて30分間インキュベーションし、その後超純水ですすぎ、残った水分は不活性ガスで取り除いた。
そして、サンプルを一晩乾燥機で乾燥させた。原子間力顕微鏡法（AFM）画像は、Nano Wizard3 ultra(JPK Instruments AG)を使用して得た。Cantilever AC 160TS (Olympus)はACモードのイメージングに使用した。
線維化条件下でインキュベーションしたAβ42のAFM(原子間力顕微鏡)画像を図3に示す。パネル(A)と(B)は、それぞれ24時間、48時間インキュベーションしたAβ42のAFM解析を示す。なお、それぞれにおいて、何も投与なし、10μMのP84あるいはP131を投与したもととなっている。
【００４９】
トリシン-SDS-PAGE
FAMがラベルされたAβ42ペプチド（AnaSpec Inc., U.S.A）を無修飾のAβ42ペプチドに1:1の比率で混合し、最終的に50μMの濃度にした。それから、既に記述してあるオリゴマー化の条件の下、インキュベーションした。
オリゴマー化反応したペプチド溶液の一部を、SDS-PAGEする前に1×PBS(-)で希釈した。16％のランニングゲルと4％のスタッキングゲルは、既に確立されているプロトコル[非特許文献D]に従って調製した。そして、0.1μMのAβ42ペプチド溶液をスタッキングゲルのウェルに投入し、タンパク質マーカー（Precision Plus protein standard; Biorad）をそのウェルに加えた。
電気泳動は、サンプルがスタッキングゲルに完全に入り込むまで、約30分間、30Vの条件で行った。その後、電圧を90Vまで上げ、泳動が終わるまでその電圧で行った。
ゲルの画像は、スキャナー（BIO-RAD）を使用し、蛍光強度はQuantity One software(BIO-RAD)を使用することで定量した。
【００５０】
8-アニリノナフタレン-1-スルホン酸（ANS）蛍光解析
50μMのAβ42溶液と共に、PBS(-)で希釈した（0μM、10μM、100μM）PPを撹拌せずに、37℃で48時間インキュベーションした。その後、10μMのAβ42のコンフォメーションを評価するために、50μMのANS(Sigma-Aldrich, Switzerlamd)を加えた。
ANSの蛍光スペクトル（λex＝380 nm, bandpass 10 nm）は、Tecan Infinite M200 microplate readerを使用し、420 nmから570 nmまでの発光を測定した。
【００５１】
Aβ42のオリゴマー化に対するPPの影響を検討した。結果を図4に示す。
Aβ42(50μM)を37℃で24時間、48時間振盪なしという条件下で、PP(10μM, 100μM)の投与なしと投与ありに分けてインキュベーションした。
(A)典型的なトリシンSDS−PAGEであり、PPを投与し48時間インキュベーションしたときのAβ42の単量体形成と多量体形成を示している。100μMのP84を投与したとき、高分子量であるAβ42のオリゴマーの低下が見られる。それぞれのレーンは10 pmolのAβ42を含んでいる。タンパク質マーカー(最初のレーン中の水平のライン)は、矢印によって示されたAβ42のオリゴマーのサイズを定量するために使用した。モノマーのAβ42は本実験におけるコントロールとして使用した。
【００５２】
(B)パネルAに示されるように、Aβ42のオリゴマーの蛍光強度は、Aゾーン中の100 kDa以上の範囲に分布した。その蛍光強度を測定し、値をAβ42の線維化と同様に規格化した。このデータは、3回の独立した実験による3つの独立した画像から得た。この記号(*)は、PPを投与しなかったときに形成したAβ42のオリゴマーの値に関して、0.05よりも低いp値(有意な値)であることを示す。
【００５３】
(C)50μMのAβ42のAFMによる画像である。オリゴマー化条件下で48時間インキュベーションした際に、(左)何も投与なし、(中)10μMのP84を投与、(右)10μMのP131を投与、とした。(中)の画像における粒子の数の増加と、粒子の長さと幅が減少しているのがわかる。
【００５４】
(D)オリゴマー化したAβ42の一定分量(10μM)のThTアッセイの結果を示す。
【００５５】
(E)Aβ42の一定分量(10μM)のANS蛍光アッセイの結果を示す。サンプルであるAβ42は、50μMのAβ42に10μMと100μMのPPを投与して、撹拌せずに37℃で48時間までインキュベーションすることによって得たものを使用した。
【００５６】
細胞生存率（セルバイアビリティー）アッセイ
ラット褐色細胞腫（PC12）細胞はRIKEN BioResource Center(Japan)で購入し、10％ウマ血清、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを加えたDMEM培地で培養した。なお、特に記述がない限り、全ての細胞培養試薬は、GIBCO（U.S.A）で購入したものとする。
PC12細胞（25μLの培地中に2,500cells/well）を、384ウェルプレートに37℃で24時間培養した。次に、線維化、オリゴマー化したAβ42ペプチドのサンプルを最終的に10μMの濃度になるように調整（反応させるPPはここで加える）した後、細胞に加え、その混合物を37℃で48時間培養した。また、Aβ42ペプチド溶液中に持ち越されたNaOHは、ウェル当り0.6 mMである。よって、ペプチドサンプルを投与せず、0.6 mMのNaOHで処理した細胞群をコントロールとして使用した。
【００５７】
細胞生存率は、cell counting kit-8(CCK-8)と細胞毒性アッセイ（Dojindo, Japan）を製造会社の取扱説明書に従って使用し、測定した。簡潔に述べると、CCK-8溶液をPBS(-)中に1:2で希釈した後、その希釈溶液の5 μLを細胞に加えた。その後、細胞を37℃で2時間培養した。
そして、水溶性テトラゾリウム塩（WST-8）の吸光度（450 nm）を、Tecan Infinite M200 microplate readerを使用して測定した。ただし、吸光度の値はコントロールの値で規格化した。
【００５８】
結果を図5に示す。PPはAβ42の細胞毒性を阻害する。PC12細胞に10μMのAβ42を投与した後、2日間24時間毎にCCK-8アッセイを行った。
(A)異なった濃度のP84とP131を37℃で撹拌しながら24時間から48時間までインキュベーションした時、線維化したAβ42の細胞毒性効果を阻害した。
(B)10μMのP84とP131を37℃で撹拌せずに24時間から48時間までインキュベーションした時、オリゴマー化したAβ42の細胞毒性効果を阻害した。
WST-8(Materials and Methods参照)の吸光度は、細胞の生存率を計算するため450 nmで測定した。データは3回の独立した実験から得た。
この記号(*)は、PPを投与しなかったときに形成したAβ42のオリゴマーと線維化したAβ42の値に関して、0.05よりも低いp値(有意な値)であったことを示す。
【００５９】
PPによる凝集阻害の仮説のモデルを図6に示す。
このモデルは、Aβ42の線維化は最初はゆっくりと始まり、そこから時間経過に依存して比例的に進行し、最終的に平衡に達するという事実を考慮したものである。このスキームの本質は、PPによって結合した線維からPPと結合した安定なAβ42の状態に変換するというゆっくりとした段階中にあるということである。乏しいPPの濃度依存は、線維がPPと結合する部位の飽和と、PPの濃度に比例するモノマー状態の固定によるものであると考えられる。後者は、モノマーに対するPPの結合のゆっくりとした速度定数が原因で、非常に弱い線維が形成することに寄与する。使用した速度定数は、相対的なものであり、模式的なPPの形は、構造的な違いを表している。
【００６０】
実施例で引用された非特許文献
[A] Masayuki K, Biyani M, Ghimire Gautam S, Nishigaki K. Peptide-modulated activity enhancement of acidic protease cathepsin E at neutral pH. Int. J. Pept. 2012; 2012: doi: 10.1155/2012/316432
[B] Tsuji-Ueno S, Komatsu M, Iguchi K, Takahashi M, Yoshino S, Suzuki M, Neomoto N, Nishigaki K. Novel high-affinity Aβ-binding peptides identified by an advanced in vitro evolution, progressive library method.
Protein pept. lett. 2011; 18: 642-650
[C] Kitamura K, Kinoshita Y, Narasaki S, Nemoto N, Husimi Y, Nishigaki K. Construction of block-shuffled libraries of DNA for evolutionary protein engineering: Y-ligation-based block shuffling. Protein Eng. 2002; 15: 843-853
[D] Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat. Protoc. 2006; 1: 16-22
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、アルツハイマー病に関連するAβ42の検出やアルツハイマー病の治療または予防に関連する分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１：人工ペプチドＰＰ７０８４
配列番号２：人工ペプチドＰＰ７１３１
配列番号３〜３８：表１−１参照
配列番号３９及び４０：表２の脚注参照
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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