(57)【要約】【課題】本発明は、優れた安定性を備え、臨床検査において常用される温度(３０〜３７℃)でも十分活性が示されるアシルＣｏＡシンテターゼを遺伝子工学的手法にて提供することを目的とする。【解決手段】シュードモナス・フラジ由来のアシルＣｏＡシンテターゼのアミノ酸配列において特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、常温(３０〜３７℃)における活性を備えさせつつ、熱安定性や溶液中での安定性を飛躍的に向上させ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、アシルＣｏＡシンテターゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、アシルＣｏＡシンテターゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
【請求項２】
次の(1a)〜(20a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(2a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目が、スレオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(3a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目が、非電荷アミノ酸、又は酸性アミノ酸に置換、
(4a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(5a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２０番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(6a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３６０番目が、非極性アミノ酸に置換、
(7a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５０番目が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(8a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５３番目が、塩基性アミノ酸、又は非電荷アミノ酸に置換、
(9a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０５番目が、非極性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換
(10a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１１番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(11a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１８番目が、フェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(12a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２２番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(13a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４０番目が、リジン以外の塩基性アミノ酸に置換、
(14a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２６５番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(15a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２３番目が、グルタミン酸に置換、
(16a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２４番目が、酸性アミノ酸に置換、
(17a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６０番目が、ロイシン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(18a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６２番目が、セリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(19a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４０番目が、塩基性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換、及び
(20a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４２番目が、非極性アミノ酸に置換。
【請求項３】
次の(1a)〜(20a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１又は２に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目が、バリンに置換、
(2a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目が、セリンに置換、
(3a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目が、グルタミン酸に置換、
(4a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目が、スレオニンに置換、
(5a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２０番目が、アスパラギンに置換、
(6a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３６０番目が、ロイシンに置換、
(7a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５０番目が、ロイシンに置換、
(8a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５３番目が、アルギニンに置換、
(9a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０５番目が、バリンに置換
(10a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１１番目が、プロリンに置換、
(11a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１８番目が、ロイシンに置換、
(12a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２２番目が、セリンに置換、
(13a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４０番目が、アルギニンに置換、
(14a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２６５番目が、グリシンに置換、
(15a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２３番目が、グルタミン酸に置換、
(16a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２４番目が、グルタミン酸に置換、
(17a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６０番目が、イソロイシンに置換、
(18a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６２番目が、グリシンに置換、
(19a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４０番目が、リジンに置換、及び
(20a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４２番目が、アラニンに置換。
【請求項４】
次の(1b)〜(28)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１１８番目、２２８番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、４６０番目、及び４６２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、４６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、４６０番目、５４０番目、５４１番目、及び５４２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、及び５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、５０番目、及び１１１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、及び１１１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１１８番目、及び２２２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(10b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、及び４２０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、５５３番目及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(13b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１０５番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、４６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、３６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２４０番目、３６０番目、及び４２０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(18b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(19b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(20b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(21b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(22b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、４２０番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(23b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(24b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、３６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(25b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目、５４０番目、５４２番目、及び５５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(26b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目、１１８番目、及び２２２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(27b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、並びに
(28b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目、４２３番目、及び４２４番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
【請求項５】
次の(1c)〜(28c)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(2c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、及び４６２番目がグリシンに置換、
(3c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(4c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、５４０番目がリジンに置換、５４１番目がセリンに置換、及び５４２番目がアラニンに置換、
(5c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、及び５３番目がアルギニンに置換、
(6c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２４０番目がロイシンに置換、及び１１１番目がプロリンに置換、
(7c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、及び１１１番目がプロリンに置換、
(8c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、及び２２２番目がセリンに置換、
(9c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(10c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、及び４２０番目がアスパラギンに置換、
(11c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換及び５４１番目がセリンに置換、
(12c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(13c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１０５番目がバリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(14c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(15c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、３６０番目がロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(16c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、３６０番目がロイシンに置換、及び４２０番目がアスパラギンに置換、
(17c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、２２２番目がセリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(18c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(19c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び５３番目がアルギニンに置換、
(20c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(21c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(22c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、４２０番目がアスパラギンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(23c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(24c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、３６０番目がロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(25c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目がセリンに置換、５４０番目がリジンに置換、５４２番目がアラニンに置換、及び５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、
(26c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目がセリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、及び２２２番目がセリンに置換、
(27c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、並びに
(28c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、４２３番目がグルタミン酸に置換、及び４２４番目がグルタミン酸に置換。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
【請求項７】
下記(i)又は(ii)に示すＤＮＡである、請求項６に記載のＤＮＡ。
(i)  配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
(ii)  アシルＣｏＡシンテターゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）、より具体的には、遊離脂肪酸にCoAを付加する反応を触媒するＡＣＳの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に変更することにより、安定性が改良された改変型ＡＣＳに関する。更に、本発明は、該改変型ＡＣＳをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いる改変型ＡＣＳの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＣＳは、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、以下の反応式で示されるように、遊離脂肪酸（例えば、パルミチン酸等）をアシルＣｏ−Ａ（例えば、パルミトイルＣｏ−Ａ等）に変換する触媒作用を有し、酵素番号Ｅ．Ｃ．６．２．１．３として知られている（非特許文献１参照）。
【化１】
2015163050.tif 000002
［式中、ＲＣＯＯ-は脂肪酸を、ＡＭＰはアデノシン１リン酸を、RCO-SCoAはAcyl-CoAを、ＰＰｉはピロリン酸を示す。］
【０００３】
また、ＡＣＳは、ラット肝（非特許文献２）や、細菌（非特許文献３）、かび（非特許文献４）、酵母（非特許文献５）などに属する微生物に広く存在することが知られている。種々のＡＣＳの中でも、特にシュードモナスス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の生産する酵素は物理化学的諸性質がよく知られている（非特許文献６）。また、シュードモナス・フラジ由来のＡＣＳが市販されている。
【０００４】
一方、血中の遊離脂肪酸は、例えば糖尿病の疾患において著しい増加がみられる等、その血中濃度の変動を知ることは医学的に重要視されており、臨床検査においては重要な測定項目の一つとなっている。そのため、血中の遊離脂肪酸の測定方法として種々の化学的方法が提案されているが、より正確で簡便な測定方法として、酵素法が一般的になってきている。この酵素法は、遊離の脂肪酸にＡＣＳを作用させ、前記反応式で示される反応により生成するアシルＣｏＡ、ＡＭＰ及びＰＰｉ等を他の酵素を用いることで測定する方法である。
【０００５】
また、血中の遊離脂肪酸は、脂肪細胞に蓄えられた中性脂肪（トリグリセリド）がホルモン感受性リパーゼの働きで分解されることによって生じる。あるいは、血清中トリグリセリドが組織へ吸収される際に、リポプロテインリパーゼの作用によって生じるとされている。遊離脂肪酸の大部分は通常アルブミンと結合した状態で血液中に存在し、体内を循環している（非特許文献７参照）。遊離脂肪酸は、糖脂質代謝のシグナル分子として、生体内で重要な役割を果たしており、急性にはインスリン分泌を促進するが、慢性に持続的に存在するとインスリン分泌を抑制することが知られている（非特許文献８参照）。また、遊離脂肪酸はプロテインキナーゼＣを活性化し、更にIκＢキナーゼ(IKK）やc-jun Ｎ末端キナーゼ（JNK）が活性化されることによりインスリン受容体基質のリン酸化を促進する。これにより、インスリンが受容体に結合してもそれ以降のシグナルが伝達されなくなることでインスリン抵抗性を示すようになることが知られている（非特許文献９参照）。血中の遊離脂肪酸の濃度は他の血清脂質に比べて著しく低いが、遊離脂肪酸は代謝的には最も活発な脂質であり、血中の遊離脂肪酸の動態を正確に把握することは、それが生体における糖質や脂質の代謝に基づくエネルギ−状態を微細に反映する。遊離脂肪酸が増加する疾患には、糖尿病、甲状腺機能亢進症、心筋梗塞、Von Gierke病、末端肥大症、急性膵炎、褐色細胞腫、Cushing症候群、冠不全等が知られており、また遊離脂肪酸が減少する疾患には、甲状腺機能低下症、アジソン病、汎下垂体機能低下症、インスリノーマ等が知られており、臨床的にも極めて意味深いものとなっている（非特許文献１０参照）。
【０００６】
また、近年、先進国では質量分析器による多項目同時臨床検査による診断が増加している。一方で、発展途上国では質量分析器による臨床検査は費用が高いことから酵素法や色素法のように安価な診断薬が用いられている。発展途上国においては、診断薬の輸送の条件も高温にさらされるなど劣悪な環境での輸送となるため、診断薬用途の酵素は安定性が非常に重要となっている。そのため、血中の遊離脂肪酸を測定する診断薬の開発には、優れた安定性を備えるＡＣＳの供給が不可欠となっている。
【０００７】
しかしながら、従来の常温微生物由来のＡＣＳは、安定性に欠点があり、そのため、精製時に失活しやすく、更には遊離脂肪酸測定用試薬としてＡＣＳを用いたときの保存安定性の低さが問題であった。他の２液系測定試薬の多くが溶液で供給されているのに対し、現在広く用いられている遊離脂肪酸測定試薬は、ＡＣＳの溶液安定性の低さから凍結乾燥状態のＡＣＳとバッファーが別々に供給されているため、測定前にＡＣＳをバッファーに溶解する必要があり、溶解後は長時間の保存ができない。例えば、市販品のシュードモナス・フラジ由来のＡＣＳは、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中で５５℃、１０分の熱処理により活性がおよそ半分になってしまう。一方，従来から最適生育温度が常温より著しく高い（６５〜８０℃）高度好熱性細菌や古細菌から得られる酵素は、一般に保存安定性に優れていることが知られているが、反応至適温度も著しく高いため，臨床検査において常用される温度（３０〜３７℃）では活性の低下が激しく、断薬用途における実用性に欠けている。また、シュウドモナス・フラジ由来のＡＣＳは、基質特異性やｐＨ安定性に優れているものの、耐熱性が低く保存安定性に問題があった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３４００８０９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】酵素ハンドブック[第３版]、 朝倉書店、２０１２年
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，８６８１−８６８５（１９９０）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６（１１）：５７０２−７（１９８１）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５０（２）：９８１−３（１９８２）
【非特許文献５】ＰＮＡＳ，７３（２）：３８６−９０（１９７６）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７(２)：１８４−９（１９９０）
【非特許文献７】生化学辞典[第４版]、東京化学同人、２００７年
【非特許文献８】栄養学研究の最前線、建帛社、２００８年
【非特許文献９】Vascul．Pharmacol．，５７（２−４）：９１−７（２０１２）
【非特許文献１０】日本臨床  ５３−増−６１１〜６１４（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、優れた安定性を備え、臨床検査において常用される温度(３０〜３７℃)でも十分活性が示されるＡＣＳを提供することである。更に、本発明は、該ＡＣＳ生産に必要な遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いるＡＣＳの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、シュードモナス・フラジ由来のＡＣＳのアミノ酸配列において特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、常温(３０〜３７℃)における活性を備えさせつつ、熱安定性や溶液中での安定性を飛躍的に向上させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１２】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  下記(A)〜(C)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、アシルＣｏＡシンテターゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド、
(C)配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、アシルＣｏＡシンテターゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
項２．  次の(1a)〜(20a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、請求項１に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(2a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目が、スレオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(3a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目が、非電荷アミノ酸、又は酸性アミノ酸に置換、
(4a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(5a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２０番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(6a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３６０番目が、非極性アミノ酸に置換、
(7a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５０番目が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸又は塩基性アミノ酸に置換、
(8a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５３番目が、塩基性アミノ酸、又は非電荷アミノ酸に置換、
(9a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０５番目が、非極性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換
(10a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１１番目が、アラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(11a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１８番目が、フェニルアラニン以外の非極性アミノ酸に置換、
(12a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２２番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(13a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４０番目が、リジン以外の塩基性アミノ酸に置換、
(14a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２６５番目が、非電荷アミノ酸に置換、
(15a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２３番目が、グルタミン酸に置換、
(16a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２４番目が、酸性アミノ酸に置換、
(17a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６０番目が、ロイシン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸に置換、
(18a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６２番目が、セリン以外の非電荷アミノ酸に置換、
(19a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４０番目が、塩基性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸に置換、及び
(20a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４２番目が、非極性アミノ酸に置換。
項３．  次の(1a)〜(20a)の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１又は２に記載のポリペプチド：
(1a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目が、バリンに置換、
(2a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目が、セリンに置換、
(3a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目が、グルタミン酸に置換、
(4a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目が、スレオニンに置換、
(5a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２０番目が、アスパラギンに置換、
(6a)配列番号１に示すアミノ酸配列における３６０番目が、ロイシンに置換、
(7a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５０番目が、ロイシンに置換、
(8a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５３番目が、アルギニンに置換、
(9a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１０５番目が、バリンに置換
(10a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１１番目が、プロリンに置換、
(11a)配列番号１に示すアミノ酸配列における１１８番目が、ロイシンに置換、
(12a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２２番目が、セリンに置換、
(13a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２４０番目が、アルギニンに置換、
(14a)配列番号１に示すアミノ酸配列における２６５番目が、グリシンに置換、
(15a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２３番目が、グルタミン酸に置換、
(16a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４２４番目が、グルタミン酸に置換、
(17a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６０番目が、イソロイシンに置換、
(18a)配列番号１に示すアミノ酸配列における４６２番目が、グリシンに置換、
(19a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４０番目が、リジンに置換、及び
(20a)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４２番目が、アラニンに置換。
項４．  次の(1b)〜(28)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド：
(1b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１１８番目、２２８番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、４６０番目、及び４６２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、４６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、４６０番目、５４０番目、５４１番目、及び５４２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、及び５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、５０番目、及び１１１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、及び１１１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１１８番目、及び２２２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(10b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、及び４２０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、５５３番目及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(13b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１０５番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、４６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、３６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２４０番目、３６０番目、及び４２０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(18b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(19b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(20b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(21b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(22b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、４２０番目、及び４６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(23b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(24b)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、３６０番目、及び５４１番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(25b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目、５４０番目、５４２番目、及び５５３番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(26b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目、１１８番目、及び２２２番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(27b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目、２４０番目、及び３６０番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換、並びに
(28b)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目、４２３番目、及び４２４番目が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
項５．  次の(1c)〜(28c)に示すアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されている、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド：
(1c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(2c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、及び４６２番目がグリシンに置換、
(3c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(4c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、５４０番目がリジンに置換、５４１番目がセリンに置換、及び５４２番目がアラニンに置換、
(5c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、及び５３番目がアルギニンに置換、
(6c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２４０番目がロイシンに置換、及び１１１番目がプロリンに置換、
(7c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、及び１１１番目がプロリンに置換、
(8c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、及び２２２番目がセリンに置換、
(9c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(10c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、及び４２０番目がアスパラギンに置換、
(11c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換及び５４１番目がセリンに置換、
(12c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(13c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１０５番目がバリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(14c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、４６０番目がイソロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(15c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、３６０番目がロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(16c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、３６０番目がロイシンに置換、及び４２０番目がアスパラギンに置換、
(17c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、２２２番目がセリンに置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(18c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目がバリンに置換、２２８番目がスレオニンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(19c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び５３番目がアルギニンに置換、
(20c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、
(21c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(22c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、４２０番目がアスパラギンに置換、及び４６０番目がイソロイシンに置換、
(23c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(24c)配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニンに置換、３６０番目がロイシンに置換、及び５４１番目がセリンに置換、
(25c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目がセリンに置換、５４０番目がリジンに置換、５４２番目がアラニンに置換、及び５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、
(26c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５４１番目がセリンに置換、１１８番目がロイシンに置換、及び２２２番目がセリンに置換、
(27c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、２４０番目がアルギニンに置換、及び３６０番目がロイシンに置換、並びに
(28c)配列番号１に示すアミノ酸配列における５５３番目がアルギニンに置換がグルタミン酸に置換、４２３番目がグルタミン酸に置換、及び４２４番目がグルタミン酸に置換。
項６．  項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項７．  下記(i)又は(ii)に示すＤＮＡである、項６に記載のＤＮＡ。
(i)  配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
(ii)  アシルＣｏＡシンテターゼ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアシルＣｏＡシンテターゼと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
項８．  項６又は７に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項９．  項８に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１０．  項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のポリペプチドは、常温(３０〜３７℃)におけるＡＣＳ活性を備えつつ、熱安定性や溶液中での保存安定性を備えており、臨床検査や食品分析などの分野において遊離脂肪酸の測定キットやセンサー等に利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００１５】
本明細書における「Ｇ５３Ｒ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば、「Ｇ５３Ｒ」とは、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から５３番目のアミノ酸Ｇが、アミノ酸Ｒに置換されていることを意味する。
【００１６】
また、本明細書における「Ｓ２２８Ｒ／Ｍ３６０Ｌ」等の表現は、多重変異を意味している。例えば、「Ｓ２２８Ｒ／Ｍ３６０Ｌ」とは、Ｓ２２８Ｒ及びＭ３６０Ｌのアミノ酸置換を同時に導入していることを意味する。
【００１７】
また、本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプチファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
【００１８】
本明細書において、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＳを「野生型ＡＣＳ」と表記することもある。
【００１９】
１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドシュードモナス・フラジ由来のＡＣＳ、野生型ＡＣＳ）の変異体であって、ＡＣＳ活性を有し、野生型ＡＣＳよりも熱安定性が向上しているポリペプチドである。
【００２０】
本発明のポリペプチドの一態様として、下記(A)に示すポリペプチドが挙げられる。
(A)  配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２１】
前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目において置換するアミノ酸の種類については、特に制限されないが、好適な具体例として、下記の(1a)〜(20a)に示すアミノ酸置換の内、１つ又は複数が導入されているポリペプチドが挙げられる。
(1a)５２８番目（アラニン）が、アラニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸；好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はフェニルアラニン；更に好ましくはバリンへの置換、
(2a)５４１番目（スレオニン）が、スレオニン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸；好ましくはセリン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はプロリン；更に好ましくはセリン、チロシン、又はトリプトファン；特に好ましくはセリンへの置換、
(3a)５５３番目（アスパラギン酸）が、非電荷アミノ酸又は酸性アミノ酸；好ましくはグルタミン酸又はグルタミン；更に好ましくはグルタミン酸への置換、
(4a)２２８番目（セリン）が、非電荷アミノ酸；好ましくはアスパラギン、スレオニン又はグルタミン；更に好ましくはスレオニンへの置換、
(5a)４２０番目（グルタミン酸）が、非電荷アミノ酸；好ましくはアスパラギン、グルタミン、セリン又はスレオニン；更に好ましくはアスパラギンへの置換、
(6a)３６０番目（メチオニン）が、非極性アミノ酸；好ましくはロイシン、アラニン、又はイソロイシン；更に好ましくはロイシンへの置換、
(7a)５０番目（イソロイシン）が、イソロイシン以外の非極性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸；好ましくはロイシン、リジン、又はメチオニン；更に好ましくはロイシンへの置換、
(8a)５３番目（グリシン）が、塩基性アミノ酸、又は非電荷アミノ酸；好ましくはアルギニン、リジン又はヒスチジン；更に好ましくはアルギニンへの置換、
(9a)１０５番目（スレオニン）が、非極性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸；好ましくはバリン、グリシン、又はアラニン；更に好ましくはバリンへの置換
(10a)１１１番目（アラニン）が、アラニン以外の非極性アミノ酸；好ましくはプロリンへの置換、
(11a)１１８番目（フェニルアラニン）が、フェニルアラニン以外の非極性アミノ酸；好ましくはロイシン、アラニン、又はイソロイシン；更に好ましくはロイシンへの置換、
(12a)２２２番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸；好ましくはセリンへの置換、
(13a)２４０番目（リジン）が、リジン以外の塩基性アミノ酸；好ましくはアルギニンへの置換、
(14a)２６５番目（アラニン）が、非電荷アミノ酸；好ましくはグリシンへの置換、
(15a)４２３番目（アスパラギン酸）が、グルタミン酸への置換、
(16a)４２４番目（アラニン）が、酸性アミノ酸；好ましくはグルタミン酸への置換、
(17a)４６０番目（ロイシン）が、ロイシン以外の非極性アミノ酸、非電荷アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸；好ましくはイソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はプロリン；更に好ましくはイソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン；特に好ましくはイソロイシンへの置換、
(18a)４６２番目（セリン）が、セリン以外の非電荷アミノ酸；好ましくはグリシンへの置換、
(19a)５４０番目（スレオニン）が、塩基性アミノ酸、又はスレオニン以外の非電荷アミノ酸；好ましくはリジン、グルタミン、又はアルギニン；更に好ましくはリジンへの置換、
(20a)５４２番目（アスパラギン）が、非極性アミノ酸；好ましくはアラニン、ロイシン又はイソロイシン；更に好ましくはアラニンへの置換。
【００２２】
前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目の中の少なくとも１つが置換されていればよいが、安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２６５番目、４６０番目、及び４６２番目の中の少なくとも１つ、より好ましくは５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、及び３６０番目の中の少なくとも１つ、更に好ましくは５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、及び４２０番目の中の少なくとも１つ、最も好ましくは少なくとも５２８番目が置換されているものが挙げられる。また、前記(A)のポリペプチドの好適な一態様として、配列番号１に示すアミノ酸配列の５２８番目、２２８番目、及び４６０番目の全てが置換されているものが挙げられる。
【００２３】
前記(A)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目の中のアミノ酸残基の１つが置換された変異体であればよいが、これらのアミノ酸残基の２つ以上が置換された多重変異体であってもよい。前記(A)のポリペプチドとして、安定性をより一層効果的に向上させるという観点から、好ましくは下記の(1b)〜(28b)に示す多重変異を有するポリペプチドが挙げられる。
(1b)５２８番目（アラニン）、１１８番目（フェニルアラニン）、２２８番目（セリン）、及び４６０番目（ロイシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(2b)５２８番目（アラニン）、２２８番目（セリン）、４６０番目（ロイシン）、及び４６２番目（セリン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(3b)５２８番目（アラニン）、２２８番目（セリン）、４６０番目（ロイシン）、及び５４１番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(4b)５２８番目（アラニン）、２２８番目（セリン）、４６０番目（ロイシン）、５４０番目（スレオニン）、５４１番目（スレオニン）、及び５４２番目（アスパラギン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(5b)５２８番目（アラニン）、及び５３番目（グリシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(6b)５２８番目（アラニン）、５０番目（イソロイシン）、及び１１１番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(7b)５２８番目（アラニン）、及び１１１番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(8b)５２８番目（アラニン）、１１８番目（フェニルアラニン）、及び２２２番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(9b)５２８番目（アラニン）、２４０番目（リジン）、及び３６０番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(10b)５２８番目（アラニン）、及び４２０番目（グルタミン酸）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(11b)５２８番目（アラニン）、５５３番目（アスパラギン酸）及び５４１番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(12b)５２８番目（アラニン）、２２８番目（セリン）、２４０番目（リジン）、及び３６０番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(13b)５２８番目（アラニン）、１０５番目（スレオニン）、２４０番目（リジン）、及び３６０番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(14b)５２８番目（アラニン）、４６０番目（ロイシン）、及び５４１番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(15b)５２８番目（アラニン）、３６０番目（メチオニン）、及び５４１番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(16b)５２８番目（アラニン）、２４０番目（リジン）、３６０番目（メチオニン）、及び４２０番目（グルタミン酸）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(17b)５２８番目（アラニン）、１１８番目（フェニルアラニン）、２２２番目（アラニン）、２４０番目（リジン）、及び３６０番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(18b)５２８番目（アラニン）、２２８番目（セリン）、及び４６０番目（ロイシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(19b)２２８番目（セリン）、及び５３番目（グリシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(20b)２２８番目（セリン）、及び３６０番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(21b)２２８番目（セリン）、及び４６０番目（ロイシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(22b)２２８番目（セリン）、４２０番目（グルタミン酸）、及び４６０番目（ロイシン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(23b)２２８番目（セリン）、及び５４１番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(24b)２２８番目（セリン）、３６０番目（メチオニン）、及び５４１番目（スレオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(25b)５４１番目（スレオニン）、５４０番目（スレオニン）、５４２番目（アスパラギン）、及び５５３番目（アスパラギン酸）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(26b)５４１番目（スレオニン）、１１８番目（フェニルアラニン）、及び２２２番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(27b)５５３番目（アスパラギン酸）、２４０番目（リジン）、及び３６０番目（メチオニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換、
(28b)５５３番目（アスパラギン酸）、４２３番目（アスパラギン酸）、及び４２４番目（アラニン）が、それぞれ他のアミノ酸に置換。
【００２４】
前記(1b)〜(28b)に示す各アミノ酸置換において、置換される他のアミノ酸の種類の具体例については、前記(1a)〜(20a)に示す通りである。
【００２５】
前記(1b)〜(28b)に示すアミノ酸置換の中でも、安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは(1b)〜(4b)及び(12b)〜(18b)のアミノ酸置換、更に好ましくは(1b)〜(4b)のアミノ酸置換、特に好ましくは(1b)のアミノ酸置換が挙げられる。
【００２６】
前記(A)のポリペプチドの好適な具体例として、以下の(1c)〜(28c)に示す多重変異のいずれかを有するポリペプチドが挙げられる：(1c)Ｆ１１８Ｌ／Ｓ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ／Ａ５２８Ｖ、(2c)Ｓ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ／Ｓ４６２Ｇ／Ａ５２８Ｖ、(3c)Ｓ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ／Ａ５２８Ｖ／Ｔ５４１Ｓ、(4c)Ｓ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ／Ａ５２８Ｖ／Ｔ５４０Ｋ／Ｔ５４１Ｓ／Ｎ５４２Ａ、(5c)Ｇ５３Ｒ／Ａ５２８Ｖ、(6c)Ｉ５０Ｌ／Ａ１１１Ｐ／Ａ５２８Ｖ、(7c)Ａ１１１Ｐ／Ａ５２８Ｖ、(8c)Ｆ１１８Ｌ／Ａ２２２Ｓ／Ａ５２８Ｖ、 (9c)Ｋ２４０Ｒ／Ｍ３６０Ｌ／Ａ５２８Ｖ、(10c)Ｅ４２０Ｎ／Ａ５２８Ｖ、 (11c)Ａ５２８Ｖ／Ｄ５５３Ｅ／Ｔ５４１Ｓ、(12c)Ｓ２２８Ｔ／Ｋ２４０Ｒ／Ｍ３６０Ｌ／Ａ５２８Ｖ、(13c)Ｔ１０５Ｖ／Ｋ２４０Ｒ／Ｍ３６０Ｌ／Ａ５２８Ｖ、(14c)Ｌ４６０Ｉ／Ａ５２８Ｖ／Ｔ５４１Ｓ、(15c)Ｍ３６０Ｌ／Ａ５２８Ｖ／Ｔ５４１Ｓ、(16c)Ｋ２４０Ｒ／Ｍ３６０Ｌ／Ｅ４２０Ｎ／Ａ５２８Ｖ、(17c)Ｆ１１８Ｌ／Ａ２２２Ｓ／Ｋ２４０Ｒ／Ｍ３６０Ｌ／Ａ５２８Ｖ、(18c)Ｓ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ／Ａ５２８Ｖ、(19c)Ｇ５３Ｒ／Ｓ２２８Ｔ、(20c)Ｓ２２８Ｔ／Ｍ３６０Ｌ、(21c)Ｓ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ、(22c)Ｓ２２８Ｔ／Ｅ４２０Ｎ／Ｌ４６０Ｉ、(23c)Ｓ２２８Ｔ／Ｔ５４１Ｓ、(24c)Ｓ２２８Ｔ／Ｍ３６０Ｌ／Ｔ５４１Ｓ、(25c)Ｔ５４０Ｋ／Ｔ５４１Ｓ／Ｎ５４２Ａ／Ｄ５５３Ｅ、(26c)Ｆ１１８Ｌ／Ａ２２２Ｓ／Ｔ５４１Ｓ、(27c)Ｋ２４０Ｒ／Ｍ３６０Ｌ／Ｄ５５３Ｅ、(28c)Ｄ４２３Ｅ／Ａ４２４Ｅ／Ｄ５５３Ｅ。
【００２７】
前記(1c)〜(28c)に示すアミノ酸置換の中でも、格段に優れた安定性の向上を実現するという観点から、好ましくは(1c)〜(4c)及び(12c)〜(18c)のアミノ酸置換、更に好ましくは(1c)〜(4c)のアミノ酸置換、特に好ましくは(1c)のアミノ酸置換が挙げられる。
【００２８】
また、本発明のポリペプチドの他の態様として、下記(B)及び(C)に示すポリペプチドが挙げられる。
(B)  配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、ＡＣＳ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＳと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
(C)  配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目よりなる群から選択される少なくとも１つアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、ＡＣＳ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＳと比較して安定性が向上しているポリペプチド。
【００２９】
以下、前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目以外のアミノ酸部位を「任意改変部位」と表記することもある。
【００３０】
前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における、５２８番目、５４１番目、５５３番目、２２８番目、４２０番目、３６０番目、５０番目、５３番目、１０５番目、１１１番目、１１８番目、２２２番目、２４０番目、２６５番目、４２３番目、４２４番目、４６０番目、４６２番目、５４０番目、及び５４２番目の中の少なくとも１つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(A)のポリペプチドの場合と同様である。
【００３１】
前記(B)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(B)のポリペプチドにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
【００３２】
また、前記(C)のポリペプチドにおける「配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
【００３３】
ここで、前記(C)のポリペプチドにおいて「配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００３４】
また、前記(B)及び(C)のポリペプチドの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換は、保存的置換であることが好ましい。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００３５】
前記(B)及び(C)のポリペプチドにおいて、「配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＳと比較して耐熱性が向上している」とは、下記条件にて加熱処理を行った場合に、ＡＣＳ活性の残存率が、同条件で加熱処理を行った野生型ＡＣＳのＡＣＳ活性の残存率よりも高いことを意味する。より具体的には、下記条件にて加熱処理を行った後のＡＣＳ活性の残存率から、同条件で加熱処理を行った野生型ＡＣＳのＡＣＳ活性の残存率を差し引いた値が０よりも高いことを意味し、好ましくは２％以上、より好ましくは５％以上、更に好ましくは１０％以上、一層好ましくは２０％以上、より一層好ましくは３０％以上、特に好ましくは４０％以上であることを意味する。
【００３６】
〔加熱処理条件〕
測定対象となるポリペプチドを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加して、６０℃に設定したウォーターバスで５分間インキュベートすることにより加熱処理を行った後に、急冷する。
【００３７】
〔ＡＣＳの活性の測定〕
本発明において、ＡＣＳ活性の測定は、ＡＴＰ及びＣｏＡの存在下、ＡＣＳの作用により生成するアシルＣｏＡを酵素的に測定することにより求められる。即ち、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．５に調製）１５μｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １５μｌ、１０ｍＭ ＣｏＡ(ｐＨ６．５) ７．５μｌ、１ｍＭパルミチン酸〔５％（重量％，以下全て同様）トリトンＸ−１００溶液に溶解。〕３０μｌ、及び水５２．５μｌよりなる反応液(Ｉ)に、測定対象となるポリペプチドを所定濃度に希釈した溶液１０μｌを加えて３７℃で１０分間反応させる。次に、２００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．５) ７５μｌ、２０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド１５μｌ、１５ｍＭ ４アミノアンチピリン４５μｌ、６ｍＭ Ｎ−エチル−Ｎ−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メトキシアニリン４５μｌ、１００Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ１５μｌ、１２０Ｕ／ｍｌアシルＣｏＡオキシダーゼ１５μｌ、０．５％ＮａＮ3 １５μｌ、及び水７５μｌよりなる反応液（II）を加えて３７℃で更に１０分間反応させ、０．５％ＳＤＳ１５０μｌにより反応を停止させた後、５５５ｎｍの吸光度を測定する。上記条件で、１分間に１μmoleのパルミトイルＣｏＡを生成する酵素量を１Ｕとする。
【００３８】
上記で得られた吸光度の値から、下記の計算式に従ってＡＣＳ活性値を求める。
【数１】
2015163050.tif 000003
３９．２：  ５５５ｎｍでのキノンジイミンダイのモル吸光係数（ｃｍ2/μｍｏｌｅ）
１/２：  ２モルのＨ2Ｏ2が１モルのキノンジイミンダイを生じることによる係数
【００３９】
次いで、上記で算出したＡＣＳ活性値活性値から、下記の計算式に従って、ＡＣＳ活性値の残存率（％）を求める。
【数２】
2015163050.tif 000004
【００４０】
２．ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、変異前の野生型ＡＣＳ（配列番号１）をコードしているＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。  また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。その際、該ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を、使用する宿主のコドン利用頻度に最適化したＤＮＡを人工合成することもできる。
【００４１】
ここで、野生型ＡＣＳをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号２に示す塩基配列として知られており（非特許文献４、特許第４３５２２８６号公報の配列表の配列番号２等）シュウドモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｇｉ）菌体からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。また、野生型ＡＣＳをコードしているＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。
【００４２】
また、野生型ＡＣＳをコードしているＤＮＡは、配列番号２に示される野生型ＡＣＳをコードしている塩基配列から、コドン利用頻度を使用する宿主のコドン利用頻度に最適化したＤＮＡを設計して合成することもできる。例えば、配列番号２に示される野生型ＡＣＳをコードしている塩基配列から、コドン利用頻度を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のコドン利用頻度に最適化した塩基配列として、配列番号３に示される塩基配列が挙げられる。
【００４３】
塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。
【００４４】
このようにして塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）又はＧＥＮＥＴＩＸ（ソフトウェア開発社製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のＡＣＳ遺伝子のコード領域を特定することができる。
【００４５】
一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００４６】
更に、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。
【００４７】
本発明のＤＮＡの一例として、配列番号４に示す塩基配列が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目がスレオニン、４６０番目がイソロイシン、及び５２８番目がバリンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡである。
【００４８】
また、本発明のＤＮＡには、ＡＣＳ素活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＳと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ、配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
【００４９】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００５０】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
【００５１】
更に、本発明のＤＮＡには、ＡＣＳ活性を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＡＣＳと比較して安定性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番（  ）に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。当該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。
【００５２】
ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００５３】
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
【００５４】
コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌のコドン利用頻度の一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
【００５５】
３．組換えベクター
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
【００５６】
本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【００５７】
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
【００５８】
ファージとしては、例えば、後述する大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１等が挙げられる。
【００５９】
プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びコスミドであるＳｕｐｅｒ  Ｃｏｓ  Ｉ等が挙げられる。
【００６０】
宿主としてシュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２、及びｐＣＮ５１等が挙げられる。更に、レトロウイルス及びワクシニアウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００６１】
４．形質転換体
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
【００６２】
形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母；ＣＯＳ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９等の昆虫細胞；アブラナ科等に属する植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根及び種子等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）、植物培養細胞等が挙げられる。これらの中でも大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＢＬ２１及び大大腸菌ＪＭ１０９がより好ましい。
【００６３】
本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセル用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
【００６４】
本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
【００６５】
ＰＣＲ法よって本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製すればよい。
【００６６】
組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
【００６７】
更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００６８】
ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
【００６９】
その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
【００７０】
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００７１】
４．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
【００７２】
本発明の形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００７３】
培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。
【００７４】
窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。
【００７５】
炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
【００７６】
培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
【００７７】
培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主が変異型ＡＣＳを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
【００７８】
本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
【００７９】
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
【００８０】
上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
【００８１】
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
【００８２】
本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
【００８３】
前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
【実施例】
【００８４】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００８５】
実施例１：組換えベクターの作製及び形質転換体の調製
公知のシュウドモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ）由来ＡＣＳ遺伝子配列（特許第３４００８０９号）をもとに、大腸菌での発現に最適化された塩基配列（配列番号３；配列番号１に示すアミノ酸配列からなる野生型ＡＣＳをコード）からなるＡＣＳ遺伝子を合成した（オペロンバイオテクノロジー社）。ＡＣＳ合成遺伝子は、設計配列の5'側にＥｃｏＲＩ認識配列が、3'側にＳａｌＩ認識配列が付加されており、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＳｍａＩサイトに挿入された状態であった。このＡＣＳ合成遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及び制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）にて切断した。同様に、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９ａも同じ制限酵素にて切断した。両者をアガロースゲル電気泳動により分離し、目的のＤＮＡ断片をＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を用いて回収した。次いでこれらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈキット（東洋紡績製）にて１６℃で１５分間反応させて連結し、シュードモナス・フラジ由来のＡＣＳ遺伝子を含む組換えベクターを得た。
【００８６】
その後、組換えベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡績製）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で終夜培養して形質転換体を取得した。この形質転換体からプラスミド抽出を行い、精製し、組換えベクターを取得した。得られた組換ベクターは、ＡＣＳ遺伝子本来の開始コドンの前に開始コドンを有するため、ＡＣＳ遺伝子のＮ末端に余分なアミノ酸配列が付加されてしまう。そこで、得られた組換ベクターを鋳型にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｔ Ｍ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行うことにより余分な配列を削除した。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は、配列番号５（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ）及びその相補的な配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）である。ＰＣＲ反応は、熱変性９８℃で１０秒、アニール５３℃で１５秒、伸長反応７２℃で４分を１２サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩで制限酵素処理することにより鋳型ＤＮＡを切断した後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αのコンピテントセル（東洋紡績製）に導入し、前記と同様の方法により形質転換体を取得した。この形質転換体からプラスミド抽出を行い、精製し、組換えベクターを取得した。取得した組換えベクターが設計通りに作製できているかをシーケンシングにより確認した。これにより得られた組換えベクターをｐＴｒｃ−ＡＣＳと命名した。更に、ｐＴｒｃ−ＡＣＳをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１のコンピテントセルに導入し、形質転換体を得た。
【００８７】
実施例２：変異型ＡＣＳの発現用組換えベクターの作製
野生型ＡＣＳをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドｐＴｒｃ−ＡＣＳ、表１に示す合成オリゴヌクレオチド（変位導入プライマー）、当該合成オリゴヌクレオチドと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｔ Ｍ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行った。以上の操作を繰り返し、複数の変異を有する変異型ＡＣＳ酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＴｒｃ−ＡＣＳ１〜４４）を取得した。表２−１及び２−２に作成した変異体ＡＣＳ−１〜４４と変異部位の詳細を示す。
【００８８】
【表１】
2015163050.tif 000005
【００８９】
【表２−１】
2015163050.tif 000006
【００９０】
【表２−２】
2015163050.tif 000007
【００９１】
ｐＴｒｃ−ＡＣＳ及びｐＴｒｃ−ＡＣＳ１〜４４を大腸菌ＢＬ２１に導入した形質転換体を用いて、以下の方法で野生型ＡＣＳ及びＡＣＳ変異体を発現させ、野生型ＡＣＳ及びＡＣＳ変異体を得た。
【００９２】
先ず、前記４４種の形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート培地で培養してコロニーを形成させた。それぞれの形質転換体の単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地２ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。その後、終濃度０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を加え、３７℃で４時間振とう培養し、菌液を回収した。回収した菌液を遠心分離し、それぞれの変異体酵素を発現させた大腸菌を回収した。
【００９３】
次いで、大腸菌を５００μＬのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に懸濁し、超音波により破砕した。破砕液を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）して上清を回収し、野生型ＡＣＳ又はＡＣＳ変異体を含む上清を得た。後述する実施例３では、該上清用いて安定性の評価を行った。
【００９４】
実施例３：野生型ＡＣＳ及びＡＣＳ変異体の安定性評価
（３−１）ＡＣＳ変異体の耐熱性の評価１
実施例２で得られた上清（野生型ＡＣＳ又はＡＣＳ変異体含有）を１．５ｍＬのプラスチックチューブに５０μＬずつ分注し、該プラスチックチューブを６０℃に調節したウォーターバスに投入し、５分間、熱処理した。熱処理終了後、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後の残存活性（％）を算出し、安定性の指標とした。
【００９５】
得られた結果を表３に示す。この結果から、変異体１〜１６のＡＣＳは、野生型ＡＣＳに比べて安定性が向上していることが確認された。単変異の導入では、Ｓ２２８Ｔ、Ｅ４２０Ｎ、Ａ５２８Ｖ、Ｄ５５３Ｅ、及びＴ５４１Ｓで特に安定性の向上が認められた。
【００９６】
【表３】
2015163050.tif 000008
【００９７】
（３−２）ＡＣＳ変異体の耐熱性の評価２
（３−１）で安定化に大きく寄与したＳ２２８Ｔ、Ａ５２８Ｖ、Ｔ５４１Ｓ、及びＤ５５３Ｅに変異をかけ合わせることでさらに安定化するかを調べた。実施例２で得られた上清（野生型ＡＣＳ又はＡＣＳ変異体含有）を１．５ｍＬのプラスチックチューブに５０μＬずつ分注し、該プラスチックチューブを６０℃に調節したウォーターバスに投入し、１０分間、熱処理した。熱処理終了後、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後の残存活性（％）を算出し、安定性の指標とした。
【００９８】
得られた結果を表４に示す。この結果から、変異体１７〜３３のＡＣＳは、野生型ＡＣＳに比べて安定性が格段に向上していることが確認された。この結果から、（３−１）で安定性に寄与した変異を複数組み合わせることで、さらに安定性を向上させることが可能であることが明らかになった。また、変異体１７〜３３のＡＣＳは、配列番号１に示すアミノ酸配列における５２８番目、２２８番目、５４１番目、及び／又は５５３番目のアミノ酸が置換されていることから、該アミノ酸の置換が安定性の向上に大きく関与していることも明らかになった。
【００９９】
【表４】
2015163050.tif 000009
【０１００】
（３−３）ＡＣＳ変異体の耐熱性の評価３
実施例２で得られた上清（野生型ＡＣＳ又はＡＣＳ変異体含有）を１．５ｍＬのプラスチックチューブに５０μＬずつ分注し、該プラスチックチューブを６０℃に調節したウォーターバスに投入し、１５分間、熱処理した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後の残存活性（％）を算出し、安定性の指標とした。
【０１０１】
得られた結果を表５に示す。この結果から、変異体３４〜４０のＡＣＳは、野生型ＡＣＳ及び（３−２）で安定化の認められたＥ４２０Ｎ／Ａ５２８Ｖに比べて安定性が格段に向上していることが確認された。
【０１０２】
【表５】
2015163050.tif 000010
【０１０３】
（３−４）ＡＣＳ変異体の耐熱性の評価４
実施例２で得られた上清（野生型ＡＣＳ又はＡＣＳ変異体含有）を１．５ｍＬのプラスチックチューブに５０μＬずつ分注し、該プラスチックチューブを６０℃に調節したウォーターバスに投入し、１８分間、熱処理した。熱処理前後の活性を上述の方法により求め、熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後の残存活性（％）を算出し、安定性の指標とした。
【０１０４】
得られた結果を表６に示す。この結果から、変異体４１〜４４のＡＣＳは、野生型ＡＣＳ及び（３−３）で安定化の認められた変異体４０のＳ２２８Ｔ／Ｌ４６０Ｉ／Ａ５２８Ｖに比べて安定性が格段に向上していることが確認された。また、変異体４１〜４４のＡＣＳは、いずれも、配列番号１に示すアミノ酸配列における２２８番目、４６０番目および５２８番目のアミノ酸が置換を有していることから、２２８番目、４６０番目および５２８番目のアミノ酸置換を少なくとも含む多重変異が、ＡＣＳの安定性の向上の上で、特に有効であることが明らかになった。
【０１０５】
【表６】
2015163050.tif 000011
【配列表】
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