(57)【要約】【課題】良好な超解像画像を生成可能にする。【解決手段】光源から発せられた励起レーザ光を標本Ｓに照射する対物レンズ１９と、対物レンズ１９により励起レーザ光が照射された標本Ｓにおける同一範囲からの蛍光を繰り返し検出して標本Ｓの同一範囲の画像データを複数取得し、取得した標本Ｓの同一範囲の複数の画像データを加算して得られた加算画像データに対して高周波成分を強調する制御本体部とを備える標本観察装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズによりレーザ光が照射された前記標本からの戻り光を検出して画像データを取得する画像データ取得部と、
該画像データ取得部により前記標本における同一範囲からの戻り光を繰り返し検出して該同一範囲の画像データを複数取得させる制御部と、
前記画像データ取得部により取得された前記同一範囲の複数の画像データを加算する画像データ処理部と、
該画像処理データ部により得られた加算画像データに対して高周波成分を強調する画像演算処理部とを備える標本観察装置。
【請求項２】
前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に開口するコンフォーカル開口部と、
前記対物レンズによりレーザ光が照射された前記標本からの戻り光を集光し、前記コンフォーカル開口部の開口位置に前記戻り光のスポットを投影するコンフォーカルレンズとを備え、
前記コンフォーカル開口部の開口が、前記コンフォーカルレンズにより投影された前記戻り光のスポットの径寸法よりも小さい径寸法を有する請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項３】
前記対物レンズにより前記標本に照射するレーザ光を該標本上で主走査方向およびこれに交差する副走査方向に走査させる走査部を備え、
前記制御部が、前記走査部により前記主走査方向における同一の走査ライン上でレーザ光を所定の回数繰り返し走査させた後に前記副走査方向の位置を変えて次の走査ラインに移動する動作を繰り返させ、前記画像データ取得部により前記同一の走査ラインごとに画像データを複数取得させる請求項１または請求項２に記載の標本観察装置。
【請求項４】
ライン状のレーザ光を発生する前記光源を備え、
前記画像取得部が、ライン状のレーザ光が照射された前記標本から戻る戻り光を撮影するライン状に形成された撮像素子を備える請求項１または請求項２に記載の標本観察装置。
【請求項５】
周期的に配列されたスリット状またはピンホール状の開口を有し、前記対物レンズに入射するレーザ光を制限するマスクと、
該マスクを中心軸回りに高速回転させる駆動部とを備え、
前記画像取得部が、前記標本から戻る戻り光を撮影する２次元撮像素子を備える請求項１に記載の標本観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの解読以降、癌などの疾患機序や心臓・脳神経といった各臓器の発生／分化機序が分子レベルで解明されるようになっている。そして、顕微鏡を用いて細胞などの生体サンプルを観察する場合には、タンパクやＤＮＡ／ＲＮＡなど、分子レベルの挙動を観測することが求められている。このため、光学分解能を上回る超解像観察の重要性が増々高まっている。
【０００３】
従来、超解像観察を行う装置として、画像演算処理により、標本の画像データに対して高周波成分を強調することで、超解像成分が可視化された超解像画像を生成する標本観察装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−７８４０８号公報
【特許文献２】特開２０１３−２００８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１および特許文献２に記載の標本観察装置のように、標本の画像データに対して高周波成分を強調する場合において、画像データにおける高周波成分の比率が小さいと高周波成分を効率的に強調することができず、良好な超解像画像を生成することができないという問題がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、良好な超解像画像を生成可能にすることができる標本観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズによりレーザ光が照射された前記標本からの戻り光を検出して画像データを取得する画像データ取得部と、該画像データ取得部により前記標本における同一範囲からの戻り光を繰り返し検出して該同一範囲の画像データを複数取得させる制御部と、前記画像データ取得部により取得された前記同一範囲の複数の画像データを加算する画像データ処理部と、該画像処理データ部により得られた加算画像データに対して高周波成分を強調する画像演算処理部とを備える標本観察装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、標本から発せられたレーザ光が対物レンズにより標本に照射され、標本から戻る戻り光が画像データ取得部により検出されて標本の画像データが取得される。そして、制御部により、画像データ取得部によって繰り返し検出されて取得された標本における同一範囲の複数の画像データが画像データ処理部によって加算される。
【０００９】
これにより、標本上の同一範囲について、１度のレーザ光の照射では十分な光量が得られず画像データにノイズが重畳してしまう場合であっても、画像データを加算した分だけ輝度が増大してノイズが平滑化された高周波成分の比率が大きい画像が得られる。したがって、画像データ処理部により得られる画像を元画像として画像演算処理部により画像演算処理を施すことで、元画像の高周波成分が効率的に強調されて超解像成分が可視化された良好な超解像画像を生成することが可能になる。
【００１０】
上記発明においては、前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に開口するコンフォーカル開口部と、前記対物レンズによりレーザ光が照射された前記標本からの戻り光を集光し、前記コンフォーカル開口部の開口位置に前記戻り光のスポットを投影するコンフォーカルレンズとを備え、前記コンフォーカル開口部の開口が、前記コンフォーカルレンズにより投影された前記戻り光のスポットの径寸法よりも小さい径寸法を有することとしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、コンフォーカル開口部により、戻り光の中心部分のみが通過して周囲の部分は遮断されるので、画像データ取得部により高周波成分の比率が高い画像データが取得され、画像データ処理部により標本の同一範囲について高周波成分の比率がより向上した元画像が得られる。これにより、画像演算処理により、元画像の高周波成分をより効率的に強調して超解像成分が可視化されたより良好な超解像画像を生成することが可能になる。
【００１２】
上記発明においては、前記対物レンズにより前記標本に照射するレーザ光を該標本上で主走査方向およびこれに交差する副走査方向に走査させる走査部を備え、前記制御部が、前記走査部により前記主走査方向における同一の走査ライン上でレーザ光を所定の回数繰り返し走査させた後に前記副走査方向の位置を変えて次の走査ラインに移動する動作を繰り返させ、前記画像データ取得部により前記同一の走査ラインごとに画像データを複数取得させることとしてもよい。
【００１３】
このように構成することで、標本として細胞を用いた場合であっても、１点にレーザ光を照射し続けないので光毒性や蛍光飽和が起きるのを防ぐことができる。また、同一範囲を繰り返し走査する時間間隔が長すぎないので、細胞の経時変化や装置の温度ドリフトの影響を低減することができる。したがって、画像データ処理部により、ノイズが少なく高周波成分の比率が高い元画像を生成することができる。
【００１４】
なお、１画素単位で標本の同一範囲からの戻り光を繰り返し検出して画像データを取得すると、レーザ光が標本の１点に照射され続けるため、光毒性の影響が顕著になり、また、蛍光分子が飽和状態に陥りやすい。一方、１画面フレーム単位で標本からの戻り光を繰り返し検出して画像データを取得すると、細胞の経時的な変化や装置の温度ドリフトの影響などが大きく、同一範囲の画像データが変化してしまう。
【００１５】
上記発明においては、ライン状のレーザ光を発生する前記光源を備え、前記画像取得部が、ライン状のレーザ光が照射された前記標本から戻る戻り光を撮影するライン状に形成された撮像素子を備えることとしてもよい。
【００１６】
このように構成することで、光源から発せられたライン状のレーザ光が対物レンズによってライン照明される領域を、スキャナによる主走査方向の走査ラインと同様のものとみなすことができる。したがって、ライン状に形成された撮像素子により、標本におけるライン照明された同一範囲からの戻り光を繰り返し検出されて得られた複数の画像データを画像データ処理部により加算することで、スキャナを用いることなく、高周波成分の比率が高い加算画像を簡易に生成することができる。
【００１７】
上記発明においては、周期的に配列されたスリット状またはピンホール状の開口を有し、前記対物レンズに入射するレーザ光を制限するマスクと、該マスクを中心軸回りに高速回転させる駆動部とを備え、前記画像取得部が、前記標本から戻る戻り光を撮影する２次元撮像素子を備えることとしてもよい。
【００１８】
このように構成することで、駆動部によってマスクを高速回転させることにより、スキャナを用いることなく、マスクの開口を通過して対物レンズによって標本に照射されるレーザ光が走査される。また、２次元撮像素子により、レーザ光が走査された標本の走査範囲の画像データが取得される。これにより、２次元撮像素子により取得された１フレーム分の複数の画像データを画像データ処理部により加算することで、高周波成分の比率が高い加算画像を簡易に生成することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、良好な超解像画像を生成することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係る標本観察装置を示す概略構成図である。
【図２】図１のシステム制御ＰＣの概略構成図である。
【図３】図１の走査型レーザ顕微鏡を正面から見た図である。
【図４】図３の走査型レーザ顕微鏡を側面から見た図である。
【図５】図３の走査型レーザ顕微鏡を上方から見た図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態に係る標本観察装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る標本観察装置１は、図１〜図５に示すように、走査型レーザ顕微鏡３と、走査型レーザ顕微鏡３の制御等を行うシステム制御ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）５とを備えている。
【００２２】
走査型レーザ顕微鏡３は、生体細胞組織のような標本Ｓに励起レーザ光を照射する顕微鏡本体１０と、顕微鏡本体１０により励起レーザ光が照射された標本Ｓより集光された蛍光を検出し光強度信号を取得する第１検出ユニット３０および第２検出ユニット４０とを備えている。
【００２３】
顕微鏡本体１０は、標本Ｓを載置するステージ１１（図３〜５参照）と、励起レーザ光を発生する光源（図示略）と、光源から発せられた励起レーザ光を走査するスキャナ（走査部）１３と、スキャナ１３により走査された励起レーザ光を集光する瞳投影レンズ１５と、瞳投影レンズ１５により集光された励起レーザ光を平行光に変換する結像レンズ１７と、平行光に変換された励起レーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ１９とを備えている。
【００２４】
また、顕微鏡本体１０には、対物レンズ１９により集光されて結像レンズ１７、瞳投影レンズ１５およびスキャナ１３を介して励起レーザ光の光路を戻る蛍光（戻り光）を光路から分岐させるダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により分岐された蛍光をリレーするリレーレンズ２３と、対物レンズ１９の焦点位置と光学的に共役な位置に開口する絞り（コンフォーカル開口部）２５と、リレーレンズ２３によりリレーされた蛍光の光路を切り替える光路切り替えミラー２７とが備えられている。
【００２５】
スキャナ１３は、図３〜５に示す走査ユニット（ＳＵ）７に収容されている。また、スキャナ１３は、互いに対向して配置されて相互に直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を備えている。このスキャナ１３は、２枚のガルバノミラーを揺動させて励起レーザ光を偏向することで、標本Ｓ上で励起レーザ光を２次元的（Ｘ軸方向およびＹ軸方向）に走査することができるようになっている。
【００２６】
一方のガルバノミラーの揺動速度は、他方のガルバノミラーの揺動速度に対して十分に速く設定されている。高速側のガルバノミラーは標本Ｓ上における主走査方向（Ｘ軸方向）の走査のために使用され、低速側のガルバノミラーは標本Ｓ上における走査位置を副走査方向（Ｙ軸方向）に送るために使用される。これら２枚のガルバノミラーは、図示しないモータにより軸線回りに揺動させられるようになっている。
【００２７】
ダイクロイックミラー２１は、光源からの励起レーザ光をスキャナ１３に向けて反射する一方、標本Ｓからの蛍光をリレーレンズ２３に向けて透過させるようになっている。
リレーレンズ２３は、ダイクロイックミラー２１を透過した蛍光を集光して絞り２５の開口位置に蛍光のスポットを結像して投影するコンフォーカルレンズ２４Ａと、コンフォーカルレンズ２４Ａにより結像投影された蛍光を第１検出ユニット３０および第２検出ユニット４０へ導く検出光導入レンズ２４Ｂとにより構成されている。
【００２８】
絞り２５は、システム制御ＰＣ５により、開口径を変更することができるようになっている。本実施形態においては、絞り２５は、コンフォーカルレンズ２４Ａにより投影される蛍光のスポット、すなわち、コンフォーカルスポットの径寸法よりも若干小さい開口径に設定されている。
【００２９】
光路切り替えミラー２７は、リレーレンズ２３によりリレーされた蛍光の光路に挿脱可能に配置されている。この光路切り替えミラー２７は、蛍光の光路に挿入されると、リレーレンズ２３からの蛍光を第１検出ユニット３０に向けて反射するようになっている。蛍光の光路から光路切り替えミラー２７が外されると、リレーレンズ２３からの蛍光がそのまま第２検出ユニット４０に入射するようになっている。
【００３０】
第１検出ユニット３０は、走査ユニット７に内蔵されている。この第１検出ユニット３０は、リレーレンズ２３により導かれた蛍光を検出してその光量に応じた大きさの光強度信号を出力するマルチアルカリＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、画像データ取得部）３１と、マルチアルカリＰＭＴ３１にＨＶ（Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ、印加電圧）を印加する第１ＨＶ電源３３と、マルチアルカリＰＭＴ３１から出力された光強度信号を増幅する第１増幅器３５とを備えている。
マルチアルカリＰＭＴ３１は、サイドオン型のＰＭＴであり、蛍光を受光して光電変換するマルチアルカリ光電面（図示略）を備えている。
【００３１】
第２検出ユニット４０は、図３〜５に示す高感度検出ユニット（ＨＳＤ：Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）９に収容されている。この第２検出ユニット４０は、リレーレンズ２３により導かれた蛍光を検出してその光量に応じた大きさの光強度信号を出力するＧａＡｓＰ−ＰＭＴ（Ｇａｌｌｉｕｍ  Ａｒｓｅｎｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｄｅ−ＰＭＴ、画像データ取得部）４１と、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１にＨＶを印加する第２ＨＶ電源４３と、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１から出力された光強度信号を増幅する第２増幅器４５とを備えている。
ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１は、ヘッドオン型のＰＭＴであり、ＧａＡｓＰ化合物を使用した光電面（図示略）を備えている。このＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１は、マルチアルカリＰＭＴ３１よりも感度が高く、画像データにノイズが少ない。
【００３２】
システム制御ＰＣ５は、図２に示すように、装置の設定、画像データの取得および処理等を行う制御本体部（画像データ取得部、制御部、画像データ処理部、画像演算処理部）５１と、制御本体部５１に対してユーザに指示を入力させる入力部５３と、標本Ｓの画像等を表示するモニタ５５とを備えている。
【００３３】
制御本体部５１は、入力部５３に入力されるユーザの指示に従い、スキャナ１３の走査条件の設定、絞り２５の開口径の設定、光路切り替えミラー２７の挿脱、第１増幅器３５および第２増幅器４５の増幅ゲインの設定、第１ＨＶ電源３３および第２ＨＶ電源４３のＨＶの設定等を行うようになっている。
【００３４】
また、制御本体部５１は、スキャナ１３を制御するとともに、第１増幅器３５または第２増幅器４５から送られてくる光強度信号をスキャナ１３の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換して、標本Ｓの画像データを取得するようになっている。また、制御本体部５１は、取得した画像データをモニタ５５に表示するようになっている。
【００３５】
また、制御本体部５１は、スキャナ１３および検出ユニット３０，４０により、標本Ｓにおける同一範囲からの蛍光を繰り返し検出して同一範囲の画像データを複数取得するようになっている。具体的には、制御本体部５１は、スキャナ１３の高速側のガルバノミラーにより主走査方向における同一の走査ライン上で励起レーザ光を繰り返し走査させて、同一の走査ラインごとに複数の画像データを取得するようになっている。
【００３６】
また、制御本体部５１は、取得した標本Ｓの同一範囲の複数の画像データを加算して加算画像（加算画像データ）を生成するようになっている。そして、制御本体部５１は、生成した加算画像を元画像としてこれに高周波成分を強調する画像演算処理を施すことにより、光学分解能を上回る超解像画像を生成するようになっている。
【００３７】
このように構成された標本観察装置１の作用について説明する。
本実施形態に係る標本観察装置１によりマルチアルカリＰＭＴ３１を用いて標本Ｓの画像データを取得する場合は、制御本体部５１により、第１ＨＶ電源３３のＨＶゲイン、第１増幅器３５の増幅器ゲインを設定する。そして、制御本体部５１により、蛍光の光路に光路切り替えミラー２７を挿入し、光源から励起レーザ光を発生させる。
【００３８】
光源から発せられた励起レーザ光は、ダイクロイックミラー２１により反射された後、スキャナ１３により偏向されて瞳投影レンズ１５により集光され、結像レンズ１７により平行光に変換されて対物レンズ１９により標本Ｓに照射される。これにより、スキャナ１３の揺動動作に応じて標本Ｓ上で励起レーザ光が２次元的に走査される。
【００３９】
励起レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生する蛍光は、対物レンズ１９により集光され、結像レンズ１７、瞳投影レンズ１５、スキャナ１３を介して励起レーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２１を透過して光路から分岐される。ダイクロイックミラー２１を透過した蛍光は、リレーレンズ２３によりリレーされて絞り２５を通過し、光路切り替えミラー２７により反射されて第１検出ユニット３０に入射する。
【００４０】
第１検出ユニット３０においては、マルチアルカリＰＭＴ３１により蛍光が検出され、検出した蛍光の量に応じた大きさの光強度信号が出力される。マルチアルカリＰＭＴ３１から出力された光強度信号は、第１増幅器３５により増幅されて、システム制御ＰＣ５の制御本体部５１に送られる。
【００４１】
制御本体部５１においては、入力された光強度信号がスキャナ１３の走査位置に対応する画素毎に輝度情報に変換され、標本Ｓの画像データが取得される。取得された画像データはモニタ５５に表示される。
【００４２】
次に、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１を用いて標本Ｓの画像データを取得する場合は、制御本体部５１により、第２ＨＶ電源４３のＨＶゲイン、第２増幅器４５の増幅器ゲインを設定する。そして、制御本体部５１により、蛍光の光路から光路切り替えミラー２７を外し、マルチアルカリＰＭＴ３１を用いた場合と同様に顕微鏡本体１０により標本Ｓ上で励起レーザ光を走査させる。
【００４３】
標本Ｓにおいて発生した蛍光は、対物レンズ１９により集光されて励起レーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２１を透過してリレーレンズ２３によりリレーされた後、光路切り替えミラー２７を介さずに第２検出ユニット４０に入射する。
【００４４】
第２検出ユニット４０においては、ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１により蛍光が検出されて光強度信号が出力され、第２増幅器４５により光強度信号が増幅されて制御本体部５１に送られる。そして、制御本体部５１により、その光強度信号に基づいて標本Ｓの画像データが取得される。取得された画像データはモニタ５５に表示される。
【００４５】
次に、超解像画像を生成する場合について説明する。
本実施形態に係る標本観察装置１により超解像画像を生成する場合は、画像データに含まれるノイズが少ないＧａＡｓＰ−ＰＭＴ４１を用いて標本Ｓの画像データを取得することが望ましい。
【００４６】
この場合、制御本体部５１により、画像データの加算回数、および、スキャナ１３による走査方法（ラインスキャン）の画像取得パラメータも設定する。そして、光源から励起レーザ光を発生させ、制御本体部５１により画像取得パラメータに基づいてスキャナ１３を制御する。
【００４７】
具体的には、高速側のガルバノミラーを主走査方向に繰り返し搖動させて、主走査方向における同一の走査ライン上で励起レーザ光を所定の回数だけ繰り返し走査させる。主走査方向における同一の走査ラインが所定の回数だけ走査されたら、低速側のガルバノミラーを搖動させて副走査方向に走査位置をずらし、主走査方向の走査ラインを次の走査ラインに移動させる。この動作を繰り返えす。
【００４８】
これにより、制御本体部５１によって、標本Ｓにおけるスキャナ１３の副走査方向の全域にわたり、主走査方向における同一の走査ラインごとに画像データがそれぞれ複数取得される。そして、制御本体部５１により、取得した標本Ｓにおける同一範囲の複数の画像データが加算されて加算画像が生成される。
【００４９】
次いで、制御本体部５１により、生成した加算画像に対して高周波成分を強調する画像演算処理が施される。これにより、超解像成分が可視化された超解像画像が生成される。
【００５０】
ここで、生体細胞組織のように生体分子に蛍光標識した細胞を標本Ｓとして観察する場合、１度の走査では十分な検出光量が得られず、ざらざらしたノイズ（ランダムノイズ）が重畳した画像データが取得されることが多い。このような画像データに対して、高周波成分を強調する処理を適用すると、ノイズが強調された画像になってしまい、良好な超解像画像を得ることができない。
【００５１】
本実施形態においては、制御本体部５１により、標本Ｓにおける同一範囲ごとに画像データをそれぞれ複数取得してこれらを加算することで、標本Ｓ上の同一範囲について、画像データを加算した分だけ輝度が増大してノイズが平滑化された高周波成分の比率が大きい加算画像が得られる。
【００５２】
したがって、本実施形態に係る標本観察装置１によれば、同一範囲の画像データを複数加算して生成した加算画像を元画像として画像演算処理を施すことで、元画像の高周波成分が効率的に強調されて超解像成分が可視化された良好な超解像画像を生成することができる。
【００５３】
また、主走査方向における同一の走査ライン上で励起レーザ光を繰り返し走査させて画像データを複数取得することで、標本Ｓとしての生体細胞組織に対して励起レーザ光を１点に照射し続けなくて済み、光毒性や蛍光飽和（サチュレーション）が起きるのを防ぐことができる。また、同一範囲を繰り返し走査する時間間隔が長くなりすぎず、細胞の経時変化や装置の温度ドリフトの影響を低減することができる。したがって、ノイズが少なく高周波成分の比率が高い元画像を生成することができる。
【００５４】
なお、本実施形態の比較例として、例えば、１画素単位で標本Ｓの同一範囲からの蛍光を繰り返し検出して画像データを取得した場合は、励起レーザ光が標本Ｓの１点に照射され続けるため、光毒性の影響が顕著になり、また、蛍光分子が飽和状態に陥りやすい。そのため、元画像を取得できず、超解像画像を生成することができない。
【００５５】
また、例えば、１画面フレーム単位で標本Ｓからの蛍光を繰り返し検出して画像データを取得した場合は、細胞の経時的な変化や装置の温度ドリフトの影響などが大きくなり、標本Ｓにおける同一範囲であってもフレーム毎に画像データが変化してしまう。そのため、これを加算して得られる元画像はぼけてしまい、良好な超解像画像を生成することができない。
【００５６】
また、本実施形態においては、制御本体部５１が画像データの取得と、標本Ｓにおける同一範囲の画像データの複数取得と、画像データの加算処理と、加算画像の画像演算処理とを行うこととしたが、これに代えて、例えば、システム制御ＰＣ５が、画像データを取得する画像データ取得部と、画像データ取得部により標本Ｓにおける同一範囲の画像データを複数取得させる制御部と、同一範囲の複数の画像データを加算する画像データ加算部と、加算画像の高周波成分を強調する画像演算処理を行う画像演算処理部とを備えることとしてもよい。
【００５７】
本実施形態は以下のように変形することができる。
すなわち、本実施形態においては、絞り２５を、コンフォーカルスポットの径寸法よりも若干小さい開口径に設定することとしたが、第１変形例としては、例えば、絞り２５の開口径を、コンフォーカルスポットの径寸法の１／２の大きさに設定することとしてもよい。
【００５８】
このようにすることで、リレーレンズ２３によりリレーされる蛍光の内、光束の中心部分のみが絞り２５を通過し、周囲の部分は絞り２５により遮断される。これにより、コンフォーカルスポットの中心のピーク付近の蛍光が検出されるので、高周波成分の比率を適度に含み、かつ、検出ロスも少なくて済む。
【００５９】
したがって、制御本体部５１により、高周波成分の比率が高い画像データを取得し、標本Ｓの同一範囲について高周波成分の比率をより向上させた元画像を生成することができる。これにより、画像演算処理によって、元画像の高周波成分を効率的に強調して超解像成分が可視化されたより良好な超解像画像を生成することができる。
【００６０】
なお、本変形例の比較例として、絞り２５の開口径をコンフォーカルスポットの径寸法とほぼ同じ大きさに設定した場合は、コンフォーカルスポットのほぼ全部の蛍光量を検出することができ検出ロスがほとんどないが、画像データにおける高周波成分の比率が小さくなる。そのため、良好な超解像画像を生成することができない。
【００６１】
また、絞り２５の開口径をコンフォーカルスポットの径寸法よりも大幅に小さい大きさ（例えば、１／８以下程度）に設定した場合は、画像データにおける高周波成分の比率が大きくなるが、コンフォーカルスポットのごく一部の蛍光しか検出することができず、検出ロスが大きい。そのため、良好な超解像画像を生成することができない。
【００６２】
第２変形例としては、例えば、スキャナ１３を採用せず、光源として、ライン状のレーザ光を発生する光源（図示略）を採用するとともに、画像取得部として、ライン状のレーザ光が照射された標本Ｓからの蛍光を撮影するライン状に形成された撮像素子（図示略）を備えることとしてもよい。
【００６３】
この場合、撮像素子として、蛍光のライン方向にスポット分解能を持つ然るべき検出器、例えば、ＣＣＤラインカメラまたは光学マルチチャネル分析器等を採用することとすればよい。また、撮像素子の撮像領域をコンフォーカルスポットに対応する線形像のおよそ１／２の幅に設定することとしてもよい。
【００６４】
このようにすることで、光源から発せられたライン状のレーザ光が対物レンズ１９によってライン照明される領域を、スキャナ１３による主走査方向の走査ラインと同様のものとみなすことができる。したがって、ライン状に形成された撮像素子により、標本Ｓにおけるライン照明された同一範囲からの蛍光を繰り返し検出して画像データを複数取得し、制御本体部５１により、これら同一範囲の複数の画像データを加算することで、スキャナを用いることなく、高周波成分の比率が高い加算画像を簡易に生成することができる。
【００６５】
本変形例においては、例えば、特開２００６−２５９３７７号公報に開示されているＴＤＩ（Ｔｉｍｅ  Ｄｅｌａｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）モードによる加算積分を採用することとしてもよい。
【００６６】
第３変形例としては、例えば、スキャナ１３を採用せず、周期的に配列されたスリット状またはピンホール状の開口を有するマスク（図示略）と、マスクを中心軸回りに高速回転させるモータのような駆動部（図示略）とを備えることとしてもよい。また、画像取得部として、標本Ｓからの蛍光を撮影するＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）やＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）のような２次元撮像素子を採用することとしてもよい。
【００６７】
この場合、対物レンズ１９の手前にマスクを配置して、対物レンズ１９に入射する励起レーザ光をマスクにより制限することとすればよい。また、制御本体部５１は、１画面フレーム単位で標本Ｓからの蛍光を繰り返し検出して画像データを取得することとすればよい。
【００６８】
このようにすることで、駆動部によってマスクを高速回転させながら励起レーザを発生させることにより、スキャナ１３を用いることなく、マスクの開口を通過して対物レンズ１９によって標本Ｓに照射されるレーザ光が走査される。そして、２次元撮像素子により、レーザ光が走査された標本Ｓの走査範囲の画像データが取得される。これにより、２次元撮像素子により取得された１フレーム分の複数の画像データを制御本体部５１により加算することで、高周波成分の比率が高い加算画像を簡易に生成することができる。
【００６９】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、上記実施形態においては、コンフォーカル開口部として絞り２５を例示して説明したが、これに代えて、口径が異なる複数のピンホールを採用することとしてもよい。この場合、制御本体部５１により、光路上に配置するピンホールを切り替えることとすればよい。
【００７０】
また、上記実施形態においては、制御本体部５１が、取得した画像データを単に加算することとしたが、例えば、画像データの加算方法として、既に取得した画像データに新たに取得した画像データを加算して平均値を算出するカルマンフィルター方式を採用することとしてもよい。
【符号の説明】
【００７１】
１    標本観察装置
１３    スキャナ（走査部）
１９    対物レンズ
２４Ａ    コンフォーカルレンズ
２５    絞り（コンフォーカル開口部）
３１    マルチアルカリＰＭＴ（画像データ取得部）
４１    ＧａＡｓＰ−ＰＭＴ（画像データ取得部）
５１    制御本体部（画像データ取得部、制御部、画像データ処理部、画像演算処理部）
Ｓ    標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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