(57)【要約】      （修正有）【課題】凝固診断の分野における、サンプル中の、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターを検出するための方法を提供する。【解決手段】ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９（配列番号１）のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを有する、単離された変異ＧＰＩｂαタンパク質および単離されたトロンビンとサンプルを接触させ、該変異ＧＰＩｂαタンパク質とトロンビンとの間の複合体形成を測定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＧＰＩｂαタンパク質および単離されたトロンビンとサンプルを接触させ、該ＧＰＩｂαタンパク質とトロンビンとの間の複合体形成を測定する、該サンプル中の、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターを検出するための方法であって、該ＧＰＩｂαタンパク質は変異しており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９（配列番号１）のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを有することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
変異ＧＰＩｂαタンパク質はＧ２３３Ｖ、Ｇ２３３Ｓ、Ｄ２３５Ｙ、Ｄ２３５Ｖ、Ｋ２３７Ｖ、Ｍ２３９ＶおよびＭ２３９Ｓからなる群からの少なくとも１つの置換を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルをリストセチンまたはボトロセチンと接触させない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
トロンビンおよび／またはＧＰＩｂαタンパク質は固相に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
トロンビンおよび／またはＧＰＩｂαタンパク質は、結合パートナー、好ましくは抗体を介して固相に結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
固相は粒子固相である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
トロンビンとＧＰＩｂαタンパク質との間の複合体形成が、粒子固相凝集に基づいて測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
固相は、非粒子固相であり、好ましくはマイクロタイトレーションプレート表面である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
変異しており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９（配列番号１）のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを有する単離されたＧＰＩｂαタンパク質を含む第１の試薬、ならびにトロンビンを含む第２の試薬を含む、請求項１に記載の方法を実行するためのアッセイキット。
【請求項１０】
第２の試薬は、トロンビンが結合している固相を含む、請求項９に記載のアッセイキット。
【請求項１１】
単離されたＧＰＩｂαタンパク質を検出するための１つまたはそれ以上の試薬をさらに含む、請求項９または１０に記載のアッセイキット。
【請求項１２】
単離されたＧＰＩｂαタンパク質を検出するための試薬は、単離された該ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な酵素標識抗体および該酵素の基質を含む、請求項１１に記載のアッセイキット。
【請求項１３】
第１の試薬は、単離されたＧＰＩｂαタンパク質が結合している固相を含む、請求項９に記載のアッセイキット。
【請求項１４】
トロンビンを検出するための１つまたはそれ以上の試薬をさらに含む、請求項９または１３に記載のアッセイキット。
【請求項１５】
トロンビンを検出するための試薬は、トロンビンに特異的な酵素標識抗体および該酵素の基質、またはトロンビンにより切断可能なシグナル基を有するペプチド基質のいずれかを含む、請求項１４に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は凝固診断の分野にあり、サンプル中の、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターを検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビン（第ＩＩａ因子）は、血漿中の血液凝固を活性化する機構および阻害機構の多くに関与し、したがって、主にフィブリン形成を含む二次止血の中心的な酵素である。一次止血におけるトロンビンの役割はそれほどよく研究および理解されてはいないが、内皮傷害の結果としての血小板活性化および血小板粘着を含む。トロンビンは血小板アクチベーターであり、血小板凝集を促進することが知られている。血小板表面の最も重要なトロンビン受容体はまず第一にＰＡＲ受容体（プロテアーゼ活性化受容体）であり、次に糖タンパク質Ｉｂ−Ｖ−ＩＸ受容体複合体である。糖タンパク質Ｉｂ−Ｖ−ＩＸ受容体複合体は、膜内在性タンパク質の糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）、膜内在性タンパク質の糖タンパク質ＩＸ（ＧＰＩＸ）および糖タンパク質Ｖを含む（非特許文献１）。
【０００３】
ＧＰＩｂは、ジスルフィド結合で互いに連結されている、見かけ上の分子量が約１４５ｋＤａの重鎖（同義語：アルファ鎖またはＧＰＩｂα）および見かけ上の分子量が約２２ｋＤａの軽鎖（同義語：ベータ鎖またはＧＰＩｂβ）からなる二本鎖分子である（非特許文献２）。
【０００４】
ＧＰＩｂαタンパク質はトロンビン結合部位を含むため、トロンビンの糖タンパク質Ｉｂ−Ｖ−ＩＸ受容体複合体への結合を引き起こす。ＧＰＩｂα鎖の断片の１つはグリコカリシンで、これは血小板膜中の、完全体の受容体からタンパク質分解的に切り出されたものである。グリコカリシンは血漿中において検出することができる。上昇した血漿中遊離グリコカリシン濃度は、血小板機能の破壊を示す（非特許文献３）。
【０００５】
トロンビンおよび血小板が動脈血栓症の発症において中心的役割を果たすこと、また一方で予防および治療用途の血小板凝集インヒビターが研究および使用されていることから、トロンビンおよび血小板の相互作用に限定した研究は大変興味深い。
【０００６】
したがって、患者のサンプル中の、血小板−トロンビン相互作用のモジュレーター、すなわちインヒビターまたはアクチベーターの検出を可能とする方法を得ることは望ましい。このような方法により血小板インヒビター療法のモニタリングが可能となり、または生理的破壊因子、例えば活性化もしくは阻害性の自己抗体などの検出すら可能となるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｃａｎｄｉａ，Ｅ．、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｈｉｓｔｏｒｙ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２、１２９：２５０〜２５６頁
【非特許文献２】Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．Ａ．ら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  α  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ：Ａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８７、８４：５６１５〜５６１９頁
【非特許文献３】Ｂｅｅｒ，Ｊ．Ｈ．ら．、Ｇｌｙｃｏｃａｌｉｃｉｎ：Ａ  Ｎｅｗ  Ａｓｓａｙ  −  Ｔｈｅ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９９４、８３（３）：６９１〜７０２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、サンプル中の、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターを特異的に検出するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、単離されたＧＰＩｂαタンパク質および単離されたトロンビンとサンプルを接触させ、該ＧＰＩｂαタンパク質とトロンビンとの間の複合体形成を測定することにより達成される。ここで、該ＧＰＩｂαタンパク質は変異しており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９（配列番号１）のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを有する。
【００１０】
「ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーター」という用語は、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用に影響を与える物質を包含する。ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のインヒビターは、トロンビンのＧＰＩｂαタンパク質への結合を低減する。ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のアクチベーターは、トロンビンのＧＰＩｂαタンパク質への結合を強化する。
【００１１】
サンプルがアクチベーターを含む場合、複合体形成は、標準サンプルに比べ強化される。
【００１２】
サンプルがインヒビター、例えば
・  例えばエキソサイトＩインヒビター（例えば、ヒルジン）もしくはエキソサイトＩＩインヒビター（例えば、ヘパリン）の群からの、治療的に投与されるトロンビンインヒビター（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．ら、Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２０１０、１０４．５：８９４〜９０２頁）、または
・  生理的なトロンビンインヒビター、例えば、トロンビンのＧＰＩｂαへの結合を妨げる、トロンビンに対する自己抗体など、または
・  治療的に投与されるＧＰＩｂαインヒビター、その例を挙げれば、抗ＧＰＩｂα抗体、例えば抗体４Ｈ１２（ＵＳ５４８６３６１Ａ）もしくは抗体ＳＺ２（Ｒｕａｎ，Ｃ．ら、Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｔｉｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳＺ  ２、ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｏｔｈ  ｒｉｓｔｏｃｅｔｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｂｌｏｏｄ  １９８７、６９（２）：５７０〜５７７頁）もしくはヒト化モノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体Ｆａｂ断片のＨ６Ｂ４−Ｆａｂ（Ｆｉｒｂａｓ，Ｃ．ら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｈｅｒ．２０１０、８（１２）：１６８９〜１７０１頁）、もしくはヒトＩｇＧ１に連結されたＧＰＩｂαアミノ末端のアミノ酸１〜２９０を含む組換えキメラ抗体のＧＰＧ−２９０（Ｙｅｕｎｇ，Ｊ．＆  Ｈｏｌｉｎｓｔａｔ，Ｍ．、Ｎｅｗｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２、３：３３〜４２頁）など、または
・  生理的なＧＰＩｂαインヒビター、例えば、ＧＰＩｂαのトロンビンへの結合を妨げる、ＧＰＩｂαに対する自己抗体など、または
・  トロンビンへの結合をめぐってＧＰＩｂαタンパク質と競合する、上昇したグリコカリシン濃度
を含む場合、複合体形成は、標準サンプルに比べ低減される。
【００１３】
したがって、本発明は、単離されたＧＰＩｂαタンパク質および単離されたトロンビンとサンプルを接触させ、該ＧＰＩｂαタンパク質とトロンビンとの間の複合体形成を測定する、該サンプル中の、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターを検出するための方法を提供する。使用するＧＰＩｂαタンパク質は変異しており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９（配列番号１）のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを有する。
【００１４】
前記方法が血小板を使用せずに間に合わせている点は有利である。動物またはヒトの血液からの血小板試薬の製造は高価かつ不便で、また品質が一定であることは保証されない。
【００１５】
「サンプル」という用語は、血液、血漿または血清など、特にヒトおよび動物由来の生物学的液体を包含する。
【００１６】
「標準サンプル」という用語は、本発明の方法においてサンプルとして使用すると、健常者または健常者集団でのＧＰＩｂ−トロンビン相互作用に対応する測定値を与える基準物質を包含する。ここで、この健常者または健常者集団ではＧＰＩｂ−トロンビン相互作用がＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターによる影響を受けていない。適切な基準物質は、その例を挙げれば、一般には少なくとも２０人の明らかな健常者由来の体液から構成されるプール、例えば標準血漿プールまたは標準血清プールである。
【００１７】
本発明の方法で使用するＧＰＩｂαタンパク質は、遺伝子組換え、または合成により産生したＧＰＩｂαタンパク質とすることができる。組換えＧＰＩｂαタンパク質の産生に適しているのは既知の原核または真核生物発現系であり、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中で、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））中で、植物細胞、動物細胞またはヒト細胞の培養物中での発現などである。合成ＧＰＩｂαタンパク質の産生に適しているのは、インビトロのタンパク質合成のための既知の手法であり、例えば固相合成（例えば、メリフィールド合成）などである。本発明の方法で使用するＧＰＩｂαタンパク質は、ヒト細胞の培養物中、好ましくはヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）培養物中で産生した、遺伝子組換えにより産生したＧＰＩｂαタンパク質であるのが好ましい。
【００１８】
ＧＰＩｂαタンパク質は、好ましくはアッセイ体積中のＧＰＩｂαが０．５〜５０μｇ／ｍＬ、特に好ましくはアッセイ体積中のＧＰＩｂαが１〜１０μｇ／ｍＬ、非常に特に好ましくはアッセイ体積中のＧＰＩｂαが５μｇ／ｍＬの最終濃度となるような量をアッセイ体積に添加する。
【００１９】
本発明の方法で使用するＧＰＩｂαタンパク質はＮ末端で、同種のヒトＧＰＩｂαシグナル配列、ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号２、アミノ酸残基−１６〜−１とも称する）と融合させることができる。代わりに、使用するＧＰＩｂαタンパク質はＮ末端で、異種のシグナル配列、すなわち、ヒトＧＰＩｂαポリペプチド中に通常は存在しないポリペプチドであって、しかし選択した発現系で遺伝子組換えにより発現させたＧＰＩｂαタンパク質の発現および／または分泌に正の影響を与える前記シグナル配列と融合させることもできる。適切な、異種のシグナル配列は例えば、ＭＰＬＱＬＬＬＬＬＩＬＬＧＰＧＮＳＬＱＬＷＤＴＷＡＤＥＡＥＫＡＬＧＰＬＬＡＲＤＲＲ（配列番号３）である。
【００２０】
さらには、本発明の方法で使用するＧＰＩｂαタンパク質はＣ末端で、例えば遺伝子組換えにより発現させたタンパク質のアフィニティー担体への結合を可能にし、そうして例えば遺伝子組換えにより発現させたＧＰＩｂαタンパク質の精製を可能にする１つまたはそれ以上のアフィニティータグと融合させることができる。１２アミノ酸を超えない長さの小さなアフィニティータグが好ましい。Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ−ＭｙｃタグおよびＳｔｒｅｐタグからなる群からのアフィニティータグが特に好ましい。アフィニティータグに対し高いアフィニティーで結合する適切なアフィニティー担体は、例えば特異的抗体、固定カチオン（例えば、Ｈｉｓタグに対しアフィニティーを有するＮｉ２＋）または他の種類の結合パートナー（例えば、Ｓｔｒｅｐタグに対しアフィニティーを有するストレプトアビジン）である。
【００２１】
使用する単離されたＧＰＩｂαタンパク質は変異しており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを含む。これら変異ＧＰＩｂαタンパク質は、各場合で位置２３３、２３５、２３７および２３９のうちの二ヶ所に置換Ｘａａを含むのが好ましい。野生型ＧＰＩｂαタンパク質の使用は、驚くべきことにＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のモジュレーターを検出するのに適していないことが見出された。
【００２２】
ＧＰＩｂα鎖の、位置２３３のグリシン残基および位置２３９のメチオニン残基の置換Ｘａａは、バリン残基（Ｇ２３３ＶおよびＭ２３９Ｖ）またはセリン残基（Ｇ２３３ＳおよびＭ２３９Ｓ）からなるのが好ましい。この二ヶ所の位置における異なる置換Ｘａａの、所望のあらゆる組合せが可能である。Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖの組合せが特に好ましい。位置２３５のアスパラギン酸残基の置換Ｘａａは、好ましくはチロシン残基（Ｄ２３５Ｙ）からなる。位置２３７のリシン残基の置換Ｘａａは、好ましくはバリン残基（Ｋ２３７Ｖ）からなる。上述の諸変異は、ＶＷＦに対し顕著により高いアフィニティーを有し、野生型ＧＰＩｂαタンパク質よりも強くＶＷＦと相互作用することが知られている機能獲得型変異である。リストセチン、ボトロセチンまたはリストセチンと同等の物質のいずれもアッセイ体積に添加しない。
【００２３】
本発明の方法で使用するトロンビンは、組換えヒトトロンビンもしくはウシトロンビン、または天然供給源から単離されるヒトトロンビンもしくはウシトロンビンとすることができる。
【００２４】
本発明の方法の、好ましい一実施形態では、トロンビンおよび／またはＧＰＩｂαタンパク質は固相に結合している。
【００２５】
「結合している」という用語は広く解釈でき、例えば共有および非共有結合、直接および間接的な結合、表面への吸着、ならびに、くぼみ内への封入を包含する。共有結合の場合、単離されたＧＰＩｂαタンパク質は、化学結合を介して固相に結合させる。非共有結合の一例は表面吸着である。固相への直接結合に加え、単離されたＧＰＩｂαタンパク質、またはトロンビンは、他の特異的結合パートナーとの特異的相互作用を介して、例えば抗体もしくは抗体断片と、好ましくは抗ＧＰＩｂα抗体もしくは抗トロンビン抗体と、または抗アフィニティータグ抗体、単離されたタンパク質がアフィニティータグを有する場合、との特異的な相互作用を介して固相に間接的に結合させることもできる。
【００２６】
本発明の文脈では「固相」という用語は、水に不溶性の多孔質および／または非多孔質物質からなる物品であって、例えば容器、管、マイクロタイトレーションプレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ビーズ、微小粒子、棒、細片、フィルターまたはクロマトグラフィー紙などの非常に多種多様な異なる形態をとり得る前記物品を含む。一般には、固相表面は親水性であるか、または親水性にすることができる。固相は、非常に多種多様な異なる物質、例えば有機および／または無機物質、合成物質、天然物質および／または天然物質を改変したものからなっていてよい。固相物質の例は、ポリマー、例えばセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレートまたはナイロン；ラテックス；セラミックス；ガラス；金属、特に金および銀などの貴金属；マグネタイト；ならびにこれらの混合物または組合せなどである。「固相」という用語は明示的に、細胞、特に血小板（トロンボサイト）を包含しない。したがって、いずれの場合も、固相はトロンボサイトを含まない（ｎｏｎｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｉｃ）固相である。
【００２７】
固相は、例えばサンプル構成成分が固相に非特異的に結合するのを抑制もしくは防止するために、または例えば、粒子固相の懸濁安定性における、保存安定性における、形状付与の安定性における、またはＵＶ光、微生物もしくは破壊的に作用する他の試剤に対する耐性における向上を実現するために、例えばタンパク質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機物ポリマーまたはそれらの混合物から構成される１つまたはそれ以上の相から構成される被覆を有していてよい。
【００２８】
単離されたＧＰＩｂαタンパク質をトロンビンと接触させると、これら２つの成分から構成される複合体が形成される。添加した、患者のサンプルが、前記複合体形成に影響を与える物質、例えばＧＰＩｂインヒビターもしくはトロンビンインヒビターまたはＧＰＩｂアクチベーターもしくはトロンビンアクチベーターを含む場合、標準に対し変化した複合体形成が測定される。標準は、適切な基準物質中、例えば標準プール血漿中でのＧＰＩｂ−トロンビン相互作用を決定することにより決定し、例えば、基準の１００％として定義することができる。個人由来のサンプルにおいて測定したＧＰＩｂ−トロンビン相互作用を次に、基準値に対して値を定めることができる。
【００２９】
本発明の方法の一実施形態では、２つの成分、すなわちＧＰＩｂαおよび／またはトロンビンのうち少なくとも一方は、粒子固相、好ましくはラテックス粒子に結合している。トロンビンと、ＧＰＩｂαタンパク質と、その結合している固相との間の複合体形成はこの場合、粒子固相の凝集を測定することにより決定することができる。複合体形成と相関するこの凝集反応を定量的に決定するためには、例えば粒子凝集体上での光散乱を、散乱光強度を測定（比ろう法）または媒質の濁度を測定（比濁法）することにより利用することができる。
【００３０】
本発明の方法の別の実施形態では、２つの成分、すなわちＧＰＩｂαおよびトロンビンはそれぞれ第１および第２のシグナル形成系成分に結合している、または結合している状態になる。これら第１および第２のシグナル形成系成分は互いに極めて近傍に持ち寄られると、検出可能なシグナルを生じるように協調する。これら成分間の協調はエネルギー移動、すなわち、成分間におけるエネルギーの直接移動を特に意味するものと理解されたい。その例としては、光放射または電子放射による移動、および活性化学分子、例えば寿命の短い一重項酸素などを介する移動も挙げられる。エネルギー移動は、１つの成分から別の成分へ起こり得る；しかしもう１つの可能性は、それを介してエネルギー移動が進行する、異なる諸物質のカスケードである。例えば諸成分は、エネルギードナーおよびエネルギーレシピエントから構成される対、例えば光増感剤および化学発光剤（ＥＰ−Ａ２−０５１５１９４、ＬＯＣＩ（登録商標）法）または光増感剤および蛍光体（ＷＯ−Ａ１−９５／０６８７７）または放射性ヨウ素＜１２５＞および蛍光体、または蛍光体および蛍光クエンチャーなどであってよい。
【００３１】
本発明の方法の別の実施形態では、トロンビンは、非粒子固相、好ましくはマイクロタイタープレート表面に結合している。トロンビンとＧＰＩｂαタンパク質との間の複合体形成はこの場合、トロンビンを介して固相と結合するＧＰＩｂαの量を測定することにより決定することができる。トロンビンを介して固相と結合したＧＰＩｂαの量を測定するためには、例えば、シグナル形成系成分に直接または間接的に結合している抗ＧＰＩｂα抗体を使用し、これにより結合ＧＰＩｂαの量を定量できるようにすることが可能である。代わりに、ＧＰＩｂαタンパク質は、非粒子固相に結合していてもよく、トロンビンとＧＰＩｂαタンパク質との間の複合体形成は、ＧＰＩｂαタンパク質を介して固相と結合するトロンビンの量を測定することにより決定することができる。ＧＰＩｂαを介して固相と結合したトロンビンの量を決定するためには、例えば、シグナル形成系成分に、またはトロンビンにより切断可能なシグナル基、例えば発色性、発蛍光性もしくは起電性（ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｉｃ）シグナル基を有するペプチド基質に直接または間接的に結合している抗トロンビン抗体を使用することが可能である。
【００３２】
本発明は、本発明の方法を実行するためのアッセイキットであって、変異しており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列と比べた場合、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、位置２３３、２３５、２３７および２３９（配列番号１）のうち少なくとも一ヶ所に置換Ｘａａを有する単離されたＧＰＩｂαタンパク質を含む第１の試薬、ならびにトロンビンを含む第２の試薬を含む、前記アッセイキットをさらに提供する。各場合で位置２３３、２３５、２３７および２３９のうち少なくとも二ヶ所、特に好ましくは位置２３３および２３９に置換Ｘａａを有する単離された変異ＧＰＩｂαタンパク質を含む試薬を含むアッセイキットが特に好ましい。ＧＰＩｂα鎖の、位置２３３のグリシン残基および位置２３９のメチオニン残基の置換Ｘａａは、バリン残基（Ｇ２３３ＶおよびＭ２３９Ｖ）からなるのが非常に特に好ましい。別の好ましいアッセイキットは、各場合で位置２３３、２３５および２３９に置換Ｘａａを有する単離された変異ＧＰＩｂαタンパク質を含む試薬を含む。ＧＰＩｂα鎖の、位置２３３のグリシン残基および位置２３９のメチオニン残基の置換Ｘａａは、バリン残基（Ｇ２３３ＶおよびＭ２３９Ｖ）またはセリン残基（Ｇ２３３ＳおよびＭ２３９Ｓ）からなり、位置２３５のアスパラギン酸残基の置換Ｘａａは、チロシン残基（Ｄ２３５Ｙ）からなるのが好ましい。
【００３３】
前記アッセイキットの一実施形態では、第２の試薬は、トロンビンが結合している固相を含むことができる。このようなアッセイキットは、酵素および該酵素に対する基質、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体および発色基質テトラメチルベンジジンで直接または間接的に標識された抗ＧＰＩｂα抗体または抗タグ抗体を例えば含む、単離されたＧＰＩｂαタンパク質を検出するためのさらなる１つの試薬、またはさらなる２つ以上の試薬をさらに含むのが好ましい。
【００３４】
前記アッセイキットの別の実施形態では、第１の試薬は、変異ＧＰＩｂαタンパク質が結合している固相を含むことができる。このようなアッセイキットは、酵素および該酵素に対する基質、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体および発色基質テトラメチルベンジジンで直接または間接的に標識された抗トロンビン抗体を例えば含む、トロンビンを検出するためのさらなる１つの試薬、またはさらなる２つ以上の試薬をさらに含むのが好ましい。代わりに、トロンビンを検出するために、トロンビンにより切断可能なシグナル基を有するペプチド基質を使用することも可能である。
【００３５】
試薬は液体または凍結乾燥された形態で提供することができる。試薬が凍結乾燥物として存在する場合、アッセイキットは、凍結乾燥物を懸濁するために必要な溶媒、例えば蒸留水または適切な緩衝液などをさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】様々な濃度の異なる抗ＧＰＩｂ抗体のもとでの、反応体積の吸収の測定値［Ａ］を示す図である。抗体ＶＭ１６ｄ、ＳＺ２および４Ｈ１２はトロンビン−ＧＰＩｂ相互作用を濃度依存的に阻害する（実施例１を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
〔実施例１〕
サンプル中の阻害性のＧＰＩｂ抗体の検出
マイクロタイタープレートをヒトトロンビンに対する抗体で被覆した。ヒトトロンビンはシグマ−アルドリッチから入手した（Ｔ７００９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ハンブルク、ドイツ）。１μｇ／ｍＬトロンビンを含むグリセリン緩衝溶液（８ｍＬの蒸留水、８７．７ｍｇのＮａＣｌ、６９ｍｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、８１３μＬの濃度８７％のグリセリン、１８μＬのＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍｇのウシアルブミン、１ｍｇのウシＩｇＧ、２ｍｇのフェノール、１８．６ｍｇのチトリプレックスＩ、ｐＨ６．８に約４３μＬの１０Ｎ  ＮａＯＨを用いて調整した）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。続いて３００μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄した。
【００３８】
位置２３３のグリシン残基および位置２３９のメチオニン残基を各場合でバリン残基に置換した（Ｇ２３３Ｖ、Ｍ２３９Ｖ）、遺伝子組換えにより産生したＦｌａｇタグ融合ＧＰＩｂαタンパク質（アミノ酸１〜２６８）を使用した。このＧＰＩｂαタンパク質から、１０μｇ／ｍＬを含むグリセリン緩衝溶液２００μＬを、各場合で阻害性の抗ＧＰＩｂα抗体４Ｈ１２、ＳＺ２およびＶＭ１６Ｄまたは対照抗体ＡＫ２を様々な濃度で含むグリセリン緩衝液２００μＬと混合し、室温で１時間１０分インキュベートした。これらのＧＰＩｂαタンパク質／抗体混合物から各場合で１００μＬを、ピペットでマイクロタイタープレートのウェルに移し、室温で１時間インキュベートした。続いて３００μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄した。
【００３９】
結合Ｆｌａｇタグ融合ＧＰＩｂαタンパク質を定量的に検出するために、０．０６μｇ／ｍＬ抗Ｆｌａｇ  Ｍ２ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ハンブルク、ドイツ）を含むグリセリン緩衝溶液１００μＬを、各場合で各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。３００μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄した後、発色性ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド）溶液１００μＬおよび過酸化水素を各ウェルに添加し、２０分間インキュベートした。反応を停止し、反応体積の吸収を、波長４５０ｎｍの光を用いＥＬＩＳＡプレートリーダー中で基準波長６５０ｎｍを使用して測定した。
【００４０】
吸収の測定値を図１に示す。
【００４１】
トロンビンのＧＰＩｂαタンパク質への結合に影響を与えず、しかしむしろＶＷＦのＧＰＩｂαタンパク質への、リストセチンにより誘導される結合を阻害することが知られている抗ＧＰＩｂ抗体ＡＫ２を対照抗体として使用した（Ｗａｒｄ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｍｏｃａｒｈａｇｉｎ、ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｂｒａ  ｖｅｎｏｍ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂα．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ／ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｒ−２７６−Ｇｌｕ−２８２  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂα  ａｓ  ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  α−ｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６、３５：４９２９〜４９３８頁）。
【００４２】
抗ＧＰＩｂ抗体４Ｈ１２は、トロンビンのＧＰＩｂαタンパク質への結合を非常に強く阻害することが知られている（Ｇｒａｌｎｉｃｋ、ＵＳ５４８６３６１Ａ）。
【００４３】
抗ＧＰＩｂ抗体ＳＺ２（Ｒｕａｎ，Ｃ．ら、１９８７）は、阻害性の抗血小板治療物質として開発中である（Ｙｅｕｎｇ，Ｊ．＆  Ｈｏｌｉｎｓｔａｔ，Ｍ．、２０１２）。
【００４４】
抗ＧＰＩｂ抗体ＶＭ１６ｄも同様に、トロンビンのＧＰＩｂへの結合を阻害する抗体として知られている（Ｄｕｂｏｉｓ，Ｃ．ら、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＧＰＩｂα  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩｉｂβ３  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｆｉｂｒｉｎ  ｉｎ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｆｌｏｗｉｎｇ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００４、９１：２３３〜２３７頁）。
【００４５】
図１から明らかなように、本発明の方法において４Ｈ１２、ＳＺ２およびＶＭ１６ｄはＧＰＩｂα−トロンビン相互作用を濃度依存的に阻害する。したがって、本発明の方法は、サンプル中の、ＧＰＩｂ−トロンビン相互作用のインヒビターを検出するのに適している。
【図１】
2015172577.tif 000003
【配列表】
2015172577000001.app
【外国語明細書】
2015172577000001.pdf