(57)【要約】      （修正有）【課題】塩類を含む糖鎖試料または複合糖質試料から塩類を除去する、糖鎖試料または複合糖質試料の効率的な調製方法を提供する。【解決手段】各種抽出操作や液体クロマトグラフィー等で分離・回収を行った試料に、エタノール等の有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させ、精製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖試料または複合糖質試料を調製する方法であって、糖鎖または複合糖質と塩類とを含む試料に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させ、沈殿を回収することを含む方法。
【請求項２】
糖鎖試料または複合糖質試料を調製する方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）糖鎖または複合糖質を含む試料を、塩類を含む溶離液を用いる液体クロマトグラフィーに供し、試料に含まれる糖鎖または複合糖質を分離する工程
（ｂ）分離された糖質または複合糖質と塩類とを含む溶離液に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿を回収する工程
【請求項３】
塩類が塩化リチウムである、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
有機溶媒がエタノールである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖試料または複合糖質試料を調製する方法に関し、糖鎖分析において支障をきたす塩類が除去された糖鎖試料または複合糖質試料を効率的に調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは、単糖およびこれらの誘導体が鎖状に連なった分子の総称であり、非常に多様性に富み、生物が有する様々な機能に関与する物質である。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。これらの高分子の糖鎖または他の生体分子と結合した複合糖質が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖または複合糖質と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学と密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
【０００３】
糖鎖や複合糖質の中には未だに解析が困難なものが存在する。例えば、微量な多糖類、プロテオグリカンの分離または分析は困難を極める。近年、糖鎖を鋭敏に検出する方法として、質量分析やキャピラリー電気泳動が盛んに行われている。しかしながら、これらの分析を糖鎖または複合糖質について行う際には、糖鎖に含まれる塩類が問題となる。試料に塩類が残留している場合は、分析の感度の低下、分離の低下が生じ、微量な糖鎖や複合糖質のシグナルを検出できない。従って、これらの分析を行う際には、糖鎖試料中の塩類を極力減らす必要がある。
【０００４】
これまでに、一部のＮ型糖鎖の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）においては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の逆相モードや順相モードを組み合わせて糖鎖に含まれる塩類を極力除去した上で質量分析を行うことで、分析感度の低下などを防止することが可能になってきた。
【０００５】
しかしながら、溶離液に塩類の添加が必要なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）やイオン交換クロマトグラフィーなどにより試料の分離を行うことが一般的な多糖類やプロテオグリカンについては、試料を含む溶液に含まれる塩類のために、上記クロマトグラフィーによる分離後に質量分析やキャピラリー電気泳動による分析を行うことが依然として困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、塩類が含まれる糖鎖試料または複合糖質試料から、塩類を除去して糖鎖または複合糖質を効率的に分離して回収しうる、糖鎖試料または複合糖質試料の調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、まず、糖鎖試料を、塩類を含む溶解液を用いた液体クロマトグラフィーに供して糖鎖の分離を行い、その後、特定のフラクションについて質量分析を行った。しかしながら、質量分析において、糖鎖に由来するシグナルが検出されなかった。そこで、本発明者らは、シグナルが検出できない原因として質量分析に供した糖鎖試料に含まれる塩類に着目し、糖鎖試料から塩類を除去するとともに糖鎖を効率的に分離して回収する方法につき鋭意検討を行った。
【０００８】
その結果、本発明者らは、液体クロマトグラフィー後に回収された塩類を含む糖鎖試料に有機溶媒を添加することにより、塩類を有機溶媒に溶解させる一方、糖鎖を沈殿させることができ、こうして調製した糖鎖試料を用いれば、質量分析において糖鎖を効率的に検出しうることを見出した。
【０００９】
従って、本発明は、塩類を含む糖鎖試料から塩類を除去して糖鎖を効率的に分離して回収しうる方法に関し、より詳しくは以下を提供するものである。
【００１０】
[１]糖鎖試料または複合糖質試料を調製する方法であって、糖鎖または複合糖質と塩類とを含む試料に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させ、沈殿を回収することを含む方法。
【００１１】
[２]糖鎖試料または複合糖質試料を調製する方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）糖鎖または複合糖質を含む試料を、塩類を含む溶離液を用いる液体クロマトグラフィーに供し、試料に含まれる糖鎖または複合糖質を分離する工程
（ｂ）分離された糖質または複合糖質と塩類とを含む溶離液に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿を回収する工程
[３]塩類が塩化リチウムである、[１]または[２]のいずれかに記載の方法。
【００１２】
[４]有機溶媒がエタノールである、[１]から[３]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、脱塩された糖鎖試料または複合糖質試料を効率的に調製することが可能となった。これにより、塩類を含む溶液を用いる各種抽出操作や液体クロマトグラフィーで糖鎖や複合糖質を分離した後に質量分析などを行う場合でも、効率的に糖鎖や複合糖質を検出することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】グルコースオリゴマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析により分離し、紫外吸収で検出した結果を示すクロマトグラムの図である。
【図２】図１のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析において、溶出時間１０分から２分刻みで液を分取し、オルシノール-硫酸法で呈色させて吸光度を測定した結果を示す図である。
【図３】図２のフラクション１０から塩化リチウムを除去し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを実施した結果を示すクロマトグラムの図である。
【図４】図２のフラクション１１から塩化リチウムを除去し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを実施した結果を示すクロマトグラムの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、糖鎖試料または複合糖質試料を調製する方法であって、糖鎖または複合糖質と塩類とを含む試料に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させ、沈殿を回収することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明における「糖鎖または複合糖質と塩類とを含む試料」としては特に制限はない。各種抽出操作（例えば、液液抽出、固液抽出、固相抽出）や液体クロマトグラフィーにより、試料中の糖鎖または複合糖質の分離を行う場合には、糖鎖または複合糖質の分離を向上させるために溶液に塩類が添加されることがある。従って、「糖鎖または複合糖質と塩類とを含む試料」としては、例えば、各種抽出操作や液体クロマトグラフィーの後に回収される溶液が挙げられる。
【００１７】
液体クロマトグラフィーとしては、試料中の糖鎖または複合糖質の分離を行うことが可能なものであれば特に制限はないが、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）やイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。液体クロマトグラフィーに用いる、糖鎖または複合糖質の分離のためのカラムとしては特に制限はないが、例えば、ＴＳＫｇｅｌカラム（東ソー株式会社製）などの市販品を用いることが可能である。
【００１８】
こうして回収された試料に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させ、沈殿を回収することで、脱塩された糖鎖試料または複合糖質試料を調製することができる。
【００１９】
本発明における塩類としては、糖鎖または複合糖質の分離を向上させるものであれば特に制限はないが、特に塩化リチウムが好ましい。
【００２０】
本発明における有機溶媒としては、上記塩類を溶解させ、かつ、糖鎖または複合糖質を沈殿させることができるものであれば特に制限はないが、特にエタノールが好ましい。添加する有機溶媒の濃度は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
【００２１】
糖鎖または複合糖質と塩類とを含む試料は、有機溶媒を添加する前に、極力水分を除去することが好ましい。水分の除去は、例えば、遠心エバポレーターを用いて実施することができる。有機溶媒の添加後、振盪し、遠心することにより、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに、糖質または複合糖質を沈殿させることができる。
【００２２】
本発明の一つの態様として、液体クロマトグラフィーに供した試料の脱塩を行う場合は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことができる。
（ａ）糖鎖または複合糖質を含む試料を、塩類を含む溶離液を用いる液体クロマトグラフィーに供し、試料に含まれる糖鎖または複合糖質を分離する工程
（ｂ）分離された糖質または複合糖質と塩類とを含む溶離液に有機溶媒を添加して、塩類を有機溶媒に溶解させるとともに糖鎖または複合糖質を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿を回収する工程
以上により調製された糖鎖試料または複合糖質試料は、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳ）、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）などの公知の方法により、糖鎖の分析（例えば、糖鎖の構造や量の分析）に供することができる。糖鎖の分析においては、必要に応じて、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＭｏｄ、Ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ(Ｒ)など）を参照することができる。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
【００２４】
グルコースが１個以上結合した混合物であるグルコースオリゴマーを、表１に示す条件でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析を行い紫外吸収（２８０ｎｍ）で検出すると図１に示すようなクロマトグラムが得られた。
【００２５】
【表１】
2015210165.tif 000002
【００２６】
１０分から２分刻みで液を分取し、オルシノール-硫酸法で呈色させ４０５ｎｍの吸光度を測定しプロットすると図２に示すようフラクション１０、１１で糖が検出されていることが分かる。次に、糖が検出されたフラクション１０（保持時間２８〜３０分）、１１（保持時間３０〜３２分）に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを実施した。しかしながら、グルコースオリゴマーに由来するシグナルは検出できなかった。
【００２７】
本発明者らは、シグナルが検出できなかった原因として糖鎖試料に含まれる塩化リチウム（ＬｉＣｌ）に着目した。そこで、糖が検出されたフラクション１０（保持時間２８〜３０分）、１１（保持時間３０〜３２分）を遠心エバポレーターで水分を除去した後、９９％以上の濃度のエタノール５ｍＬを添加して塩化リチウムを溶解させ、遠心により糖鎖を沈殿させた。塩化リチウムを含む上清を除去することにより、糖鎖を含む沈殿を回収した。こうして調製した、塩化リチウムを除去したフラクション１０、１１の成分を水に溶解し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを実施した（フラクション１０：図３、フラクション１１：図４）。フラクション１０のＭＳスペクトルにおいて、シグナル強度が強い５つのｍ／ｚ値  ８３５．７、９９７．８、１１６０．０、１３２２．１、１４８４．３は、表２に示すようにグルコースオリゴマーに由来するシグナルと一致する。フラクション１１のＭＳスペクトルにおいても、シグナル強度が強い５つのｍ／ｚ値  ８３５．８、９９８．０、１１６０．２、１３２２．３、１４８４．５は、表３に示すようにグルコースオリゴマーに由来するシグナルと一致する。これらの結果より、塩化リチウムを除去した後、糖鎖のシグナルが検出されることが判明した。
【００２８】
【表２】
2015210165.tif 000003
【００２９】
【表３】
2015210165.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３０】
以上説明したように、本発明によれば、脱塩された糖鎖試料または複合糖質試料を効率的に調製することが可能となる。これにより、例えば、糖鎖試料または複合糖質試料について、各種抽出操作や液体クロマトグラフィー後の質量分析などを効率的に行うことが可能となる。従って、本発明は、広く糖鎖分析において有用である。
【図２】
2015210165.tif 000005
【図３】
2015210165.tif 000006
【図４】
2015210165.tif 000007
【図１】
2015210165.tif 000008