(57)【要約】【課題】ビームスプリッタの径を大きくすることなく、蛍光を取り込むことができる取り込み視野を広げることができる顕微鏡を提供する。【解決手段】顕微鏡１００は、明視野観察と蛍光観察とを切り替えて行う顕微鏡である。顕微鏡１００は、標本Ｓに励起光であるレーザ光を照射し、標本Ｓからの蛍光を平行光束に変換する対物レンズ１０８と、蛍光とレーザ光とを分離するビームスプリッタであるダイクロイックミラー１０６と、ダイクロイックミラー１０６と対物レンズ１０８の間の光路に挿脱自在に配置された、正のパワーを有する集光レンズ１０７を備える。集光レンズ１０７は、蛍光観察時に光路に挿入され且つ明視野観察時に光路から取り除かれる。【選択図】図２
2015132730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明視野観察と蛍光観察とを切り替えて行う顕微鏡であって、
標本に励起光を照射し、前記標本からの蛍光を平行光束に変換する対物レンズと、
蛍光と励起光とを分離するビームスプリッタと、
前記ビームスプリッタと前記対物レンズの間の光路に挿脱自在に配置された、正のパワーを有する集光レンズであって、蛍光観察時に光路に挿入され且つ明視野観察時に光路から取り除かれる集光レンズと、を備える
ことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の顕微鏡において、さらに、
前記励起光で前記標本を走査するスキャナと、
前記標本から生じた蛍光を検出する光検出器と、
前記対物レンズの瞳を前記光検出器にリレーする、前記集光レンズと、前記ビームスプリッタと前記光検出器の間に配置された光学系とからなる、瞳リレー光学系を備える
ことを特徴とする顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載の顕微鏡において、さらに、
明視野観察像を形成する結像レンズを備え、
前記結像レンズは、前記励起光の光路と前記蛍光の光路とから分岐した光路上であって、明視野観察時に前記対物レンズで平行光束に変換された光が入射する位置に配置される
ことを特徴とする顕微鏡。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
前記ビームスプリッタは、光路に対して挿脱自在に配置されていて、
前記顕微鏡は、さらに、前記集光レンズの挿脱とビームスプリッタの挿脱を連動させる機構を備える
ことを特徴とする顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の顕微鏡において、
前記機構は、蛍光キューブターレットである
ことを特徴とする顕微鏡。
【請求項６】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
前記集光レンズは、他の構成要素とは独立して光路に対して挿脱自在に配置される
ことを特徴とする顕微鏡。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡において、
前記ビームスプリッタは、ダイクロイックミラーである
ことを特徴とする顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡に関し、特に、照明光路と検出光路をダイクロイックミラーで分岐する顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
落射照明を採用した蛍光顕微鏡では、対物レンズと光検出器との間の光路中に照明光と検出光とを分離するダイクロイックミラーを備える構成が一般的である。このダイクロイックミラーには対物レンズによって平行光束に変換された蛍光が入射するが、その蛍光のうち軸外光についてはダイクロイックミラーでケラレが生じやすいことが知られている。これは、図１に示すように、軸上光Ｌ１は対物レンズ１の瞳から光軸ＡＸと平行に出射されるのに対して、軸外光Ｌ２は対物レンズ１の瞳から光軸ＡＸに対して角度（以降、瞳位置における出射角度、または、単位、出射角度と記す）を持って出射されるからである。瞳位置における出射角度は、光軸ＡＸから離れた位置から生じた蛍光（軸外光Ｌ２）ほど大きくなるため、光軸ＡＸから離れすぎた位置から生じた蛍光はダイクロイックミラー２から逸れてしまい、ダイクロイックミラー２でケラレが生じてしまう。図１の軸外光Ｌ２の上側の光線は、本来ダイクロイックミラー２で反射されず、枠等でケラレるが、仮想的にミラーがあるとして線種を変えて表している。
【０００３】
このように、従来の蛍光顕微鏡では、ダイクロイックミラーの径によって蛍光を取り込むことができる標本面上における範囲（以降、取り込み視野と記す。）が制限されてしまうことから、蛍光顕微鏡の取り込み視野が、対物レンズ自体が許容し得る取り込み視野に達せず、対物レンズの性能を十分に発揮することができないことがある。
【０００４】
このような技術的な課題には、例えば、軸外光がダイクロイックミラーから逸れてしまわないように、ダイクロイックミラーを対物レンズの近くに配置するといった対処が考えられる。しかしながら、対物レンズとダイクロイックミラーの間にはレボルバーなどの構造物が存在しているため、ダイクロイックミラーを対物レンズに近づけるのにも限界がある。
【０００５】
なお、特許文献１には、励起光と検出光を分離するビームスプリッタと検出光を検出器に伝達する光学系との間に、検出光の光束径を減ずるための付加光学系を備えた、レーザ走査型顕微鏡が開示されている。特許文献１に開示される付加光学系は、できるだけ大きな視野を検出器に結像できるようにするためのものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５１０１７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のような実情を踏まえ、本発明は、励起光と検出光を分離するダイクロイックミラーなどのビームスプリッタの径を大きくすることなく、蛍光を取り込むことができる取り込み視野を広げることができる顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様は、明視野観察と蛍光観察とを切り替えて行う顕微鏡であって、標本に励起光を照射し、前記標本からの蛍光を平行光束に変換する対物レンズと、蛍光と励起光とを分離するビームスプリッタと、前記ビームスプリッタと前記対物レンズの間の光路に挿脱自在に配置された、正のパワーを有する集光レンズであって、蛍光観察時に光路に挿入され且つ明視野観察時に光路から取り除かれる集光レンズと、を備える顕微鏡を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡において、さらに、前記励起光で前記標本を走査するスキャナと、前記標本から生じた蛍光を検出する光検出器と、前記対物レンズの瞳を前記光検出器にリレーする、前記集光レンズと、前記ビームスプリッタと前記光検出器の間に配置された光学系とからなる、瞳リレー光学系を備える顕微鏡を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の顕微鏡において、さらに、明視野観察像を形成する結像レンズを備え、前記結像レンズは、前記励起光の光路と前記蛍光の光路とから分岐した光路上であって、明視野観察時に前記対物レンズで平行光束に変換された光が入射する位置に配置される顕微鏡を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡において、前記ビームスプリッタは、光路に対して挿脱自在に配置されていて、前記顕微鏡は、さらに、前記集光レンズの挿脱とビームスプリッタの挿脱を連動させる機構を備える顕微鏡を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、第４の態様に記載の顕微鏡において、前記機構は、蛍光キューブターレットである顕微鏡を提供する。
【００１３】
本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡において、前記集光レンズは、他の構成要素とは独立して光路に対して挿脱自在に配置される顕微鏡を提供する。
【００１４】
本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第６の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡において、前記ビームスプリッタは、ダイクロイックミラーである顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ビームスプリッタの径を大きくすることなく、蛍光を取り込むことができる取り込み視野を広げることができる顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】従来の蛍光顕微鏡における対物レンズからダイクロイックミラーに向けて出射される軸上光と軸外光を示した図である。
【図２】本発明の実施例１に係る顕微鏡の構成を例示した図である。
【図３】本発明の実施例１に係る顕微鏡における対物レンズからダイクロイックミラーに向けて出射される軸上光と軸外光を示した図である。
【図４】本発明の実施例２に係る顕微鏡の構成を例示した図である。
【図５】本発明の実施例２に係る顕微鏡が備える蛍光キューブターレットの構成を例示した図である。
【図６】本発明の実施例３に係る顕微鏡の構成を例示した図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１７】
図２は、本実施例に係る顕微鏡１００の構成を例示した図である。顕微鏡１００は、明視野観察と蛍光観察を切り替えて行う顕微鏡である。
【００１８】
顕微鏡１００は、図２に示すように、レーザ光路上にある対物レンズ１０８の瞳の位置と光学的に共役な位置（瞳共役位置）にガルバノミラー１０２を備え、且つ、蛍光検出光路上にある対物レンズ１０８の瞳共役位置にノンデスキャン検出器（ＮＤＤ）としてＰＭＴ１１０を備えている。顕微鏡１００は、この構成により、蛍光観察時には２光子励起顕微鏡として機能する。なお、２光子励起顕微鏡は、非線形光学顕微鏡の一種であり、励起光であるレーザ光の照射により標本Ｓで２光子吸収を引き起こして２光子吸収過程で生じた蛍光を検出する顕微鏡である。
【００１９】
以下、顕微鏡１００の構成について、より詳細に説明する。顕微鏡１００は、励起光であるレーザ光を出射するレーザ１０１を備えている。顕微鏡１００は、レーザ１０１から標本Ｓまでの照明光路（レーザ光路）上に、ガルバノミラー１０２と、瞳投影レンズ１０３と、ミラー１０４と、ダイクロイックミラー１０６が内部に配置された蛍光キューブ１０５と、集光レンズ１０７と、対物レンズ１０８と、を備えている。
【００２０】
レーザ１０１は、例えば、フェムト秒またはピコ秒オーダーのパルス幅を有する高出力のレーザ光を出射するチタンサファイアレーザである。ガルバノミラー１０２は、レーザ１０１からのレーザ光を偏向することによりレーザ光で標本Ｓを走査するスキャナであり、対物レンズ１０８の瞳共役位置に配置されている。
【００２１】
瞳投影レンズ１０３は、集光レンズ１０７とともに、対物レンズ１０８の瞳をガルバノミラー１０２に投影する瞳リレー光学系を構成する。ミラー１０４は、レーザ光を対物レンズ１０８に向けて反射させるミラーである。ミラー１０４は、レーザ光の光路に対して挿脱自在に配置されていて、蛍光観察時に光路に挿入され、明視野観察時には光路から取り除かれる。
【００２２】
蛍光キューブ１０５は、図示しない励起フィルタやバリアフィルタなどの光学フィルタとともにダイクロイックミラー１０６を内部に収納したブロックである。蛍光キューブ１０５は、迷光を吸収する機構も備えている。なお、蛍光キューブ１０５は、光路に対して挿脱自在に配置されていても良く、蛍光観察時に光路に挿入され、明視野観察時には光路から取り除かれてもよい。
【００２３】
ダイクロイックミラー１０６は、蛍光と励起光とを分離するビームスプリッタの一種であり、波長によって蛍光と励起光を分離する。なお、ダイクロイックミラー１０６は、レーザ１０１からのレーザ光を透過させ、且つ、標本Ｓからの蛍光を反射させる光学特性を有するダイクロイックミラーである。
【００２４】
集光レンズ１０７は、他の構成要素とは独立してダイクロイックミラー１０６と対物レンズ１０８の間の光路に対して挿脱自在に配置された、正のパワーを有するレンズである。集光レンズ１０７は、蛍光観察時に光路に挿入され、且つ、明視野観察時に光路から取り除かれる。集光レンズ１０７は、瞳投影レンズ１０３とともに、対物レンズ１０８の瞳をガルバノミラー１０２に投影する瞳リレー光学系を構成し、且つ、後述するリレー光学系１０９とともに、対物レンズ１０８の瞳を後述するＰＭＴ１１０に投影する瞳リレー光学系を構成する。
【００２５】
対物レンズ１０８は、標本Ｓにレーザ光を照射し、且つ、標本Ｓからの蛍光を平行光束に変換する無限遠補正型の対物レンズである。対物レンズ１０８は、図示しないレボルバーに装着されていて、用途に応じて観察倍率の異なる対物レンズと切り替えて使用される。
【００２６】
顕微鏡１００は、さらに、ダイクロイックミラー１０６でレーザ光から分離された蛍光の検出光路（蛍光検出光路）上に、リレー光学系１０９と、光電子増倍管（ＰＭＴ）１１０を備えている。
【００２７】
リレー光学系１０９は、ダイクロイックミラー１０６とＰＭＴ１１０との間に配置されていて、集光レンズ１０７とともに、対物レンズ１０８の瞳をＰＭＴ１１０に投影する瞳リレー光学系を構成する。ＰＭＴ１１０は、標本Ｓから生じた蛍光を検出する光検出器である。ＰＭＴ１１０は、対物レンズの瞳共役位置に配置された、いわゆるノンデスキャン検出器（ＮＤＤ）である。
【００２８】
顕微鏡１００は、さらに、標本Ｓを下方から照明する図示しない透過照明手段と、明視野観察像を形成する結像レンズ１１１と、プリズム１１２と、接眼レンズ１１３と、図示しないディジタルカメラと、を備えている。
【００２９】
透過照明手段は、明視野観察時の照明手段であり、例えば、ランプ光源やコンデンサレンズなどから構成されている。透過照明手段は、照明光をコンデンサレンズの瞳位置に一旦集光して標本Ｓを下方から均一に照明する。結像レンズ１１１は、レーザ光路と蛍光検出光路の両方から分岐した明視野検出光路上であって、集光レンズ１０７及びミラー１０４が光路から取り除かれている明視野観察時に、標本Ｓを透過し対物レンズ１０８で平行光束に変換された光が入射する位置に配置されている。プリズム１１２は、結像レンズ１１１の像側に配置されて、結像レンズ１１１で収斂光束に変換された光を所定の割合で接眼レンズ１１３が配置された目視観察光路とディジタルカメラが配置されたカメラ光路とに導く。
【００３０】
顕微鏡１００では、蛍光観察時には、図３に示されるように、標本Ｓから生じた蛍光は、対物レンズ１０８で平行光束に変換された後、ダイクロイックミラー１０６に入射する前に、集光レンズ１０７の正のパワーにより収斂光束に変換される。これにより、集光レンズ１０７がない場合に比べて、蛍光は光束径が細い状態でダイクロイックミラー１０６に入射することになる。このため、顕微鏡１００によれば、ダイクロイックミラー１０６でのケラレの発生を抑制することができる。特に、光軸ＡＸから離れた位置でダイクロイックミラー１０６に入射する軸外光Ｌ２のケラレが改善されるため、ダイクロイックミラー１０６の径を大きくすることなく、蛍光を取り込むことができる取り込み視野を広げることができる。
【００３１】
なお、２光子励起顕微鏡では、標本Ｓを深部まで観察することが可能であるが、標本Ｓの深部から生じた蛍光は標本内で散乱しやすいため、蛍光が標本Ｓで広がりやすい。２光子励起顕微鏡として機能する顕微鏡１００は、上述したように、集光レンズ１０７の作用により蛍光を取り込むことができる標本面における取り込み視野を広げることができるため、散乱した蛍光も取り込むことが可能となるため、蛍光の検出効率を改善することができる。
【００３２】
また、顕微鏡１００は、ミラー１０４及び集光レンズ１０７を光路に対して挿脱することで、蛍光観察と明視野観察を切り替えて行うことができる。このため、顕微鏡１００によれば、蛍光観察を開始する前に、明視野観察で標本Ｓの位置決めなどを行うことができるため、蛍光観察をスムーズに開始することが可能となる。さらに、標本Ｓの位置決め等を行う明視野観察時には、集光レンズ１０７が光路から取り除かれるため、標本Ｓからの光が平行光束として結像レンズ１１１に入射する。このため、顕微鏡１００によれば、上述したように蛍光観察における取り込み視野を広げながら、明視野観察時には、従来と同様に良好な明視野観察像を形成することができる。
【実施例２】
【００３３】
図４は、本実施例に係る顕微鏡２００の構成を例示した図である。顕微鏡２００は、明視野観察と蛍光観察を切り替えて行う顕微鏡であり、蛍光観察時に２光子励起顕微鏡として機能する点は、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。
【００３４】
顕微鏡２００は、集光レンズ１０７が蛍光キューブ１２０内に収納されている点、及び、光軸ＡＸ上に配置される蛍光キューブを切り替える蛍光キューブターレット１３０を備える点が、実施例１に係る顕微鏡１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡１００と同様である。
【００３５】
蛍光キューブ１２０は、ダイクロイックミラー１０６、図示しない光学フィルタ（励起フィルタ、バリアフィルタ）及び迷光を吸収する機構を備えている点は実施例１に係る蛍光キューブ１０５と同様であるが、内部に集光レンズ１０７が収納されている点が蛍光キューブ１０５とは異なっている。集光レンズ１０７は、蛍光キューブ１２０内において、ダイクロイックミラー１０６と対物レンズ１０８の間に配置されている。
【００３６】
蛍光キューブターレット１３０は、図５に示すように、複数の蛍光キューブ（蛍光キューブ１２０、蛍光キューブ１２０ａ、蛍光キューブ１２０ｂ、蛍光キューブ１２０ｃ、蛍光キューブ１２０ｄ、蛍光キューブ１２０ｅ、蛍光キューブ１２０ｆ、蛍光キューブ１２０ｇ）が配置されたターレットである。蛍光キューブターレット１３０は、その回転により、光軸ＡＸ上に配置される蛍光キューブが切り替わるように構成されている。
なお、明視野観察は、蛍光キューブのいずれか１つを取り外しておく、または、集光レンズ１０７とダイクロイックミラー１０６のない空穴の開いたキューブを１つ配置し、蛍光キューブターレット１３０を回転させてその位置に合わせることにより行われる。
【００３７】
蛍光キューブターレット１３０の回転により、蛍光キューブ１２０が光路に対して挿脱されると、蛍光キューブ１２０内に配置された光学素子も光路に対して挿脱される。つまり、顕微鏡２００では、蛍光キューブ１２０内の集光レンズ１０７及びダイクロイックミラー１０６は、光路に対して挿脱自在に配置されていて、蛍光キューブターレット１３０は、集光レンズ１０７の挿脱とダイクロイックミラー１０６の挿脱を連動させる機構である。
【００３８】
顕微鏡２００によっても、実施例１に係る顕微鏡１００と同様に、集光レンズ１０７の作用により、ダイクロイックミラー１０６の径を大きくすることなく、蛍光を取り込むことができる取り込み視野を広げることができる。また、蛍光キューブターレット１３０の回転により、集光レンズ１０７とダイクロイックミラー１０６が同時に挿脱されるため、これらを別々に挿脱する実施例１に係る顕微鏡１００に比べて、観察方法を切り替える際の作業を簡素化することができる。なお、観察方法を切り替える際にミラー１０４を光路に対して挿脱する点は、顕微鏡１００と同様である。
【実施例３】
【００３９】
図６は、本実施例に係る顕微鏡３００の構成を例示した図である。顕微鏡３００は、明視野観察と蛍光観察を切り替えて行う顕微鏡であり、蛍光観察時に２光子励起顕微鏡として機能する点は、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡と同様である。
【００４０】
顕微鏡３００は、レーザ１０１とＰＭＴ１１０の位置関係が実施例２に係る顕微鏡２００とは反対になっている、つまり、ＰＭＴ１１０がレーザ１０１よりも上段に配置されている点が、顕微鏡２００と異なっている。
【００４１】
上記の位置関係を実現するために、顕微鏡３００は、レーザ１０１からのレーザ光を反射させ標本Ｓからの蛍光を透過させる光学特性を有するダイクロイックミラー１４１と正のパワーを有する集光レンズ１０７とを内部に収納した蛍光キューブ１４０を備えている。蛍光観察を行う際には、蛍光キューブターレット１３０を回転して、図６に示すように、蛍光キューブ１４０が光路に挿入される。
【００４２】
顕微鏡３００によっても、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡と同様に、集光レンズ１０７の作用により、ダイクロイックミラー１０６の径を大きくすることなく、蛍光を取り込むことができる取り込み視野を広げることができる。また、実施例２に係る顕微鏡と同様に、蛍光キューブターレット１３０の回転により、集光レンズ１０７とダイクロイックミラー１４１が同時に挿脱されるため、これらを別々に挿脱する実施例１に係る顕微鏡１００に比べて、観察方法を切り替える際の作業を簡素化することができる。なお、蛍光の検出効率の観点からは、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡のように、ＰＭＴ１１０がレーザ１０１よりも下段、つまり、標本Ｓにより近い位置に配置されていることが望ましい。
【００４３】
図６では、実施例２に係る顕微鏡２００と同様に、蛍光キューブ内に集光レンズ１０７が収納された構成が例示されているが、実施例１に係る顕微鏡１００と同様に、集光レンズ１０７を蛍光キューブ外に配置しても良い。これにより、蛍光キューブの切替えと集光レンズ１０７の挿脱を独立させることができるため、蛍光観察で使用される異なる仕様の複数の蛍光キューブがある場合であっても、蛍光キューブ毎に集光レンズ１０７を設ける必要なく、単一の集光レンズ１０７を共通して使用することができる。
【００４４】
上述した実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。各実施例に記載された顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【００４５】
例えば、上述した実施例では、２光子励起レーザ顕微鏡が例示されているが、本願発明の顕微鏡は、２光子励起レーザ顕微鏡に限られない。例えば、軸外光を取り込む顕微鏡であればよく、共焦点顕微鏡や標本Ｓを面照明する蛍光顕微鏡であってもよい。また、上述した実施例では、標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡が例示されているが、本願発明の顕微鏡は、正立顕微鏡に限られず、倒立顕微鏡であってもよい。
【００４６】
また、上述した実施例では、集光レンズ１０７が単レンズとして構成されている例が示されているが、集光レンズ１０７は、単レンズに限れず、全体で正のパワーを有していれば複数枚のレンズで構成されていても良い。また、上述した実施例では、集光レンズ１０７によってダイクロイックミラー１０６とリレー光学系１０９の間に中間像が形成される例を示したが、中間像は必ずしも集光レンズ１０７単体で形成されなくてもよい。例えば、ダイクロイックミラー１０６とリレー光学系１０９の間に更にレンズ（第２の集光レンズと記す。）を備えて、集光レンズ１０７と第２の集光レンズによって、第２の集光レンズとリレー光学系１０９の間に中間像が形成されてもよい。
【符号の説明】
【００４７】
１、１０８                  対物レンズ
２、１０６、１４１          ダイクロイックミラー
１００、２００、３００      顕微鏡
１０１                      レーザ
１０２                      ガルバノミラー
１０３                      瞳投影レンズ
１０４                      ミラー
１０５、１２０、１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ、１２０ｄ、１２０ｅ、１２０ｆ、１２０ｇ、１４０                蛍光キューブ
１０７                      集光レンズ
１０９                      リレー光学系
１１０                      ＰＭＴ
１１１                      結像レンズ
１１２                      プリズム
１１３                      接眼レンズ
１３０                      蛍光キューブターレット
ＡＸ                        光軸
Ｌ１                        軸上光
Ｌ２                        軸外光
Ｓ                          標本
【図１】
2015132730.tif 000003
【図２】
2015132730.tif 000004
【図３】
2015132730.tif 000005
【図４】
2015132730.tif 000006
【図５】
2015132730.tif 000007
【図６】
2015132730.tif 000008