(57)【要約】【課題】例えば早期腎症の尿検査法において、変性アルブミンや低分子タンパク質を検出するのみならず、微量タンパク質の高感度検出を可能とし、かつ各タンパク質種を均一に検出できる方法であって、さらに自動分析装置に容易に適応できる前記方法と、安価かつ通常のタンパク質測定試薬としても利用できる前記方法に使用するための試薬とを提供すること。【解決手段】液状の試料に含まれる総タンパク質を定量する方法であって、該試料をアルカリ性にするとともに金属を加えることによって、タンパク質に金属を配位させる工程と、得られた試料を中性にするとともに、さらにクロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターを加えることによって、タンパク質に配位した金属に金属キレーターをキレート結合させる工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状の試料に含まれる総タンパク質を定量する方法であって、
（Ａ）前記試料をアルカリ性にするとともに、金属を加えることによって、前記タンパク質に該金属を配位させる工程、および
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料を中性にするとともに、さらにクロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターを加えることによって、前記のタンパク質に配位した金属に該金属キレーターをキレート結合させる工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
液状の試料が、生体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が、尿である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質が、アルブミン、グロブリンおよびβ２ミクロアルブミンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
金属が、Ｃｕ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｚｎ、Ｖ、Ｍｏ、Ａｌ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＰｂおよびＰｄからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（Ａ）のアルカリ性が、ｐＨ１２〜１４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（Ｂ）の中性が、ｐＨ６．５〜７．５である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法に使用するための試薬であって、
金属および水酸化ナトリウムを含む第一試薬と、
クロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターならびにＨＥＰＥＳを含む第二試薬と
からなる、前記試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状の試料に含まれる総タンパク質を定量する方法および該方法において使用する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の腎疾患や尿路系疾患において、尿中総タンパク質を定量することは、その病態を把握し、また、治療の効果などを把握することが可能であるなど、臨床的意義は大きい。
２型糖尿病患者の増加に伴い、糖尿病性腎症による透析の導入件数が増加している。糖尿病性腎症は非常に緩やかな経過をたどり、ついには慢性腎不全に陥る疾患であるが、この腎症の程度を観察するには腎生検が最も確実な方法である。しかしながら、この方法は侵襲的で、患者への負担が大きいため、実際の臨床では、尿タンパク質や尿クレアチニンなどを測定する腎機能を反映する検査を用いることで、その進行度や治療の経過を把握しているのが現状である。
【０００３】
臨床検査において用いられる早期腎症の検査法として、尿中総タンパク質や尿中アルブミンの測定が行われている。尿中タンパク質測定法としては、例えば、比色法、比濁法、色素結合法などがあるが、近年では尿中総タンパク測定法としてピロガロールレッド（ＰＲ）に金属を配位した錯体を使用する比色法（例えばピロガロールレッド・モリブデン錯体法（ＰＲ−Ｍｏ法）、特許文献１）が広く用いられている。また、Ｆｅ（ＩＩＩ）やＢｅ（ＩＩ）に特異的な金属キレーターとして知られているクロマズロールＢを用いた比色法も報告されている（非特許文献１および２）。一方、比濁法、特に免疫比濁法として、例えば抗ヒトアルブミン抗体を使用して尿中のアルブミン量を測定する方法が、また、色素結合法としては、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）色素を使用して試料中の総タンパク質濃度を測定するブラッドフォード法等が知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平４−５３２６５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】千葉正志ら、クロマズロールＢ−ｃｏｍｐｌｅｘを利用した尿中たん白測定法、衛生検査、1987年、36巻、694-699頁
【非特許文献２】Yoshikazu Fujita et.al, Spectrophotometric Determination of Protein with Chromazurol B-Beryllium(II) Complex by Manual and Flow-Injection Methods, Analytical Sciences, 1992, Vol.8, 313-316
【非特許文献３】Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistory, 1976, 72,248-254
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
比濁法である尿中アルブミン測定法は、抗ヒトアルブミン抗体等の試薬が高価であり、変性したアルブミンへの反応性が良好とはいえないなどの問題を孕んでいる。また色素結合法であるブラッドフォード法は、特定のアミノ酸残基に色素が結合するため、タンパク質のアミノ酸組成により呈色強度が大きく異なってしまうという問題が知られている。
このように近年主流になっているＰＲ−Ｍｏ法等の比色法は、色素によるセル吸着が少なく、直線性が良好である等、従来の測定法に比べて利点が多く、自動分析装置にも応用可能であるため、一応の満足は得られていた。しかしながら、本発明者らが当該技術分野で研究を進める中で、前記比色法はいずれも、タンパク種、例えばアルブミンとα，β−グロブリンまたはγ−グロブリンとにおいて呈色に差を生じるため、早期腎症等の検査においてはその特異性ならびに定量性に改善の余地があるとの認識を持つに至った。
【０００７】
本発明の目的はしたがって、従来の比濁法や色素結合法に関連する問題がなく、かつ比色法に係る前記の問題を解決して各タンパク質の種類、量を問わずに高感度に検出できる、試料に含まれる総タンパク質の定量方法、およびその方法に使用するための試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく比色法によるタンパク質の検出法について鋭意検討を重ねる中で、タンパク質−金属−金属キレーターの三次元複合体が感度、選択性、簡便性等の点で優れること、またその形成に際しての金属キレーターの種類およびそのときのｐＨ環境が、三次元錯体の発色に影響することを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］液状の試料に含まれる総タンパク質を定量する方法であって、
（Ａ）前記試料をアルカリ性にするとともに、金属を加えることによって、前記タンパク質に該金属を配位させる工程、および
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料を中性にするとともに、さらにクロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターを加えることによって、前記のタンパク質に配位した金属に金属キレーターをキレート結合させる工程
を含む、前記方法。
［２］液状の試料が、生体試料である、［１］に記載の方法。
［３］生体試料が、尿である、［２］に記載の方法。
［４］タンパク質が、アルブミン、グロブリンおよびβ２ミクロアルブミンからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］金属が、Ｃｕ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｚｎ、Ｖ、Ｍｏ、Ａｌ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＰｂおよびＰｄからなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］工程（Ａ）のアルカリ性が、ｐＨ１２〜１４である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］工程（Ｂ）の中性が、ｐＨ６．５〜７．５である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の方法に使用するための試薬であって、
金属および水酸化ナトリウムを含む第一試薬と、
クロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターおよびＨＥＰＥＳを含む第二試薬と
からなる、前記試薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、液状の試料に含まれる総タンパク質のうち微量タンパク質であっても高感度に検出できるため、該試料に含まれる総タンパク質を高精度に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明に係る方法の工程（Ａ）において、アルカリ性の下、タンパク質の４アミノ酸（代表例としてグリシンを記載）と金属Ｍとが配位し、また、本発明に係る方法の工程（Ｂ）において、中性の下、当該タンパク質に配位した金属Ｍに金属キレーターであるクロマズロールＢがキレート結合するものと想定される反応様式を模式的に示した図である。
【図２】図２は、試験例２で得られた結果をプロットしたグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施形態について詳述する。
【００１３】
本発明は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、液状の試料に含まれる総タンパク質を定量する方法に関する。
工程（Ａ）：液状の試料をアルカリ性にするとともに、金属を加えることによって、前記タンパク質に該金属を配位させる工程。
工程（Ｂ）：工程（Ａ）で得られた試料を中性にするとともに、さらにクロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターを加えることによって、前記のタンパク質に配位した金属に該金属キレーターをキレート結合させる工程。
【００１４】
本発明の方法に係る工程（Ａ）を実施後、タンパク質のペプチド結合を構成する窒素原子と金属イオンとが、アルカリ性の試料中、図１に示すビウレット反応のように配位するものと考えられる。かかる配位はタンパク質の種類によらず均一に生じるが、例えば早期腎症等の尿検査ではタンパク質濃度が低いためビウレット反応による発色が十分に得られない。同工程（Ｂ）を実施後、中性の試料中では、金属Ｍが窒素から酸素（ペプチド結合を構成するカルボニル基由来）に配位する原子を変え、このようにタンパク質に配位した金属Ｍと金属キレーターであるクロマズロールＢとが三次元錯体を形成する（図１）。工程（Ａ）で金属Ｍと配位した窒素原子が工程（Ｂ）では電子供与体として作用し、クロマズロールＢとメタクロマジーを生じるため、かかる錯体の発色感度は高くなる。
その後、本発明の方法に含まれてもよい測定工程、すなわち、分光光度計により主波長／副波長＝６００ｎｍ／８００ｎｍにてブランクを対照に吸光度を測定し、各種タンパク質の反応率を測定する工程を実施することによって、液状の試料に含まれる総タンパク質を定量することができる。
【００１５】
対して、非特許文献２に記載のタンパク質−ベリリウム（ＩＩ）−クロマズロールＢの３元複合体の形成を含む比色法では、当該複合体の形成を一段階で、かつｐＨ４．５で行っている。一般的にＣＡＢは４６０ｎｍに吸収をもつキレート剤であり、タンパク質と結合すると長波長側にシフトするが、ｐＨが低くなるほどより長波長側に（例えば、ｐＨ５．８では５２０ｎｍに、ｐＨ３．０では５８０ｎｍに）極大吸収を示し、かつ吸光度が高くなることが知られている（非特許文献１）。しかしながら、本発明者らは、吸光度測定の際のｐＨが低い場合にタンパク質種により吸光度に差が生じやすくなるため、定量性が疑わしいことを初めて見出している。
【００１６】
「液状の試料」としては、好ましくは生体試料、例えば、尿、血清、血漿、髄液、固形組織、生体細胞などの生体抽出成分を適宜緩衝液等に溶解させたもの等が挙げられ、低侵襲性の観点から、尿が好ましい。
「総タンパク質」とは、液状の試料に含まれている各種タンパク質（変性、未変性を問わない）、ポリペプチド、オリゴペプチド、および、これらタンパク質またはポリペプチドの断片等の全てのタンパク質性成分を合わせたものをいう。定量対象とするタンパク質としては、例えば、アルブミン、γ-グロブリン、α，β-グロブリン等の尿蛋白が挙げられ、尿に多く含まれることから、アルブミンが好ましい。
【００１７】
工程（Ａ）における「液状の試料をアルカリ性にする」とは、その液性が酸性または中性の液状の試料を、例えば水酸化ナトリウム溶液を加える等、当業者に知られている任意の手段により、液性をアルカリ性に変化させることをいう。そのｐＨとしては、好ましくはｐＨ１２〜１４である。アルカリ性としてかかる範囲のｐＨとすることによって、金属との配位がタンパク質種によらないため好適である。
【００１８】
工程（Ａ）において使用する金属としては、遷移金属元素もしくは典型金属元素に分類される金属またはこれらの塩が好ましく、遷移金属としては、例えば、Ｃｕ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｄ等が挙げられ、典型金属としては、例えば、Ａｌ、Ｚｎ、Ｐｂ等が挙げられる。このうち好ましくはＣｕ、ＰｄおよびＰｂであり、より好ましくはＣｕである。また、これらの塩としては、ハロゲン化物または硫酸塩のような水溶性の高いものが好ましい。
【００１９】
工程（Ｂ）において使用する金属キレーターは、クロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳ（2-(5-Bromo-2-pyridylazo)-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]）から選択される少なくとも１種であり、このうち、タンパク質に配位した金属と特異的にキレート結合し、呈色し易い性状を有することから、クロマズロールＢが好ましい。
金属と金属キレーターとの組み合わせとしては、例えば、クロマズロールＳとＣｕとの組み合わせ、クロマズロールＢとＣｕとの組み合わせ、ピロガロールレッドとＰｂとの組み合わせ、ブロモピロガロールレッドとＰｂとの組み合わせ、５−Ｂｒ−ＰＡＰＳとＰｄとの組み合わせ等が挙げられ、この中でも好ましくは、クロマズロールＢとＣｕとの組み合わせである。
【００２０】
クロマズロールＢ（Chromeazurol B；2-Hydroxy-3-methyl-5-[(3,5-dichloro-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-ylidene)(3-carboxy-4-methylphenyl)methyl]benzoic acid）の構造式を以下に示す（（CAS 1796-92-5, MW 503.24 g/mol)）。クロマズロールＢはＣＡＢと略記することができる。
【化１】
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【００２１】
工程（Ｂ）における「工程（Ａ）で得られた試料を中性にする」とは、工程（Ａ）においてアルカリ性になった試料の液性を、例えばＨＥＰＥＳ溶液を加えるなど当業者に知られている任意の手段により、中性に戻すことをいう。中性としては、より高感度であり、かつタンパク質種により吸光度の差が生じにくい条件が望ましいことから、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、より好ましくはｐＨ７．０である。
【００２２】
工程（Ａ）は実施直後から、２０℃〜４５℃、好ましくは３７℃で、３〜１０分間、好ましくは５分間静置させ後、工程（Ｂ）を実施する。
工程（Ｂ）は実施直後から、２０℃〜４５℃、好ましくは３７℃で、３〜１０分間、好ましくは５分間静置させた後、吸光度を測定する。
【００２３】
また、本発明はさらに、前記方法に使用するための試薬であって、金属および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む第一試薬と、クロマズロールＢ、クロマズロールＳ、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよび５−Ｂｒ−ＰＡＰＳからなる群から選択される少なくとも１種の金属キレーターおよびＨＥＰＥＳを含む第二試薬とからなる前記試薬にも関する。
第一試薬に含まれる水酸化ナトリウムとしては、液状の試料と混合するにあたり、液状の試料をアルカリ性にするのに必要な量であればよく、液状の試料の量によって当業者が適宜決定することができる。
【００２４】
第一試薬に含まれる金属と第二試薬に含まれる金属キレーターとは、その重量比が８：１〜１：１、発色感度の観点から、好ましくは４：１〜１：１、特に好ましくは４：１となるように、それぞれの試薬に含まれる量を決定することができる。
また、第二試薬に含まれるＨＥＰＥＳとしては、アルカリ性にした液状の試料を中性に戻すのに必要な量であればよく、アルカリ性にした液状の試料の量によって当業者が適宜決定することができる。
第一試薬および第二試薬は、それぞれ別個に適切な容器に入れ、併せてキットの形態にしてもよい。当該キットは、各種の腎疾患または尿路系疾患、例えば腎症のための尿検査用であってもよい。
【実施例】
【００２５】
次に、本発明について、実施例および比較例によって、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に限定されるものではない。
＜試験例１＞試料が個々のタンパク質溶液
［実施例１］
液状の試料として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ−アルドリッチ社製）、γ−グロブリン（γ−Ｇｌｏ、シグマ−アルトドリッチ社製）およびα，β−グロブリン（α，β−Ｇｌｏ、シグマ−アルトドリッチ社製）をそれぞれ１００ｍｇ／１００ｍＬとなるように生理食塩水に溶解し、個々のタンパク質溶液として調製した。
【００２６】
第１および第２試薬を、表１に示す組成を有するように調製した。なお、ロッシェル塩（酒石酸ナトリウムカリウム）は、硫酸銅の析出を防ぐために加えた。
【表１】
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吸光度の測定には、日立７１７０形自動分析装置（（株）日立製作所製）を使用した。測定条件を表２に示す。
【表２】
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得られた結果は表６に示す。
【００２７】
［比較例１］（第一試薬のｐＨ７．０）
第１および第２試薬を、表３に示す組成を有するように調製した。
【表３】
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吸光度の測定には、日立７１７０形自動分析装置を使用した。測定条件を表４に示す。
【表４】
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得られた結果は表６に示す。
【００２８】
［比較例２］（ＰＲ−Ｍｏ法）
タンパク質を定量する試薬として、ＰＲ−Ｍｏ法の定量試薬（マイクロＴＰ−ＡＲ（２）、和光純薬（株）社製）を使用した。
吸光度の測定には、日立７１７０形自動分析装置を使用した。測定条件を表５に示す。
【表５】
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得られた結果は表６に示す。
【００２９】
各試料の吸光度とブランクの吸光度との差を求め、ＨＳＡに対する相対％に換算して表６に示す。
【表６】
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アルカリ性の下、Ｃｕとタンパク質との複合体を形成させた後、ｐＨ７．０でクロマズロールＢと反応させるという本発明の方法を使用したら、γ−グロブリンとの反応性が劇的に改善した。
【００３０】
＜試験例２＞試料が尿検体
尿中のタンパク質の測定を行い（実施例２）、対照法（ＰＲ−Ｍｏ法；比較例３）との比較を行った。
［実施例２］
液状の試料として、尿検体を４８検体準備した。
試料として尿検体を用いた以外は、実施例１と同様に吸光度を測定した。尿中の総タンパク質の濃度は、以下の計算式にて算出した。
タンパク質濃度（％）＝（尿検体の吸光度−生理食塩水の吸光度）／（ＨＳＡの吸光度−生理食塩水の吸光度）×１００
得られた結果は図２に示す。
【００３１】
［比較例３］（ＰＲ−Ｍｏ法）
試料として実施例２と同じ尿検体を用いた以外は、比較例２と同様に吸光度を測定し、実施例２と同様にして尿中の総タンパク質の濃度を算出した。
得られた結果を図２に示す。
【００３２】
図２において、ｘ軸は、比較例３で測定されたタンパク質濃度（ｍｇ／１００ｍｌ）を示し、ｙ軸は、実施例２で測定されたタンパク質濃度（ｍｇ／１００ｍｌ）を示す。従来法との相関性においてｙ＝１．２４１ｘ＋３０．９４、相関係数ｒ＝０．９４８と良好な相関性を示した。
【図１】
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【図２】
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