(57)【要約】【課題】従来、（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニン（以下ＳＡＭと略する）の微生物による発酵を利用する方法では、ＳＡＭを大量に生産することは困難であった。本発明は、ＳＡＭを効率的に製造するために、ＳＡＭ生産微生物の、細胞内外のＳＡＭ蓄積量をさらに増大させる方法を提供することを目的とする。【解決手段】ＳＡＭ生産微生物を、培地中のポリペプトンの濃度が５ｇ／Ｌ以上およびマグネシウムイオン濃度が２．２ｍｍｏl／Ｌ以上の培地で培養することを特徴とする（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニン生産微生物を、培地中のポリペプトンの濃度が５ｇ／Ｌ以上およびマグネシウムイオン濃度が２．２ｍｍｏl／Ｌ以上の培地で培養することを特徴とする（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造方法。
【請求項２】
培地中にさらに添加する酵母エキスの濃度が２ｇ／Ｌ以下である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
培地中に酵母エキスを含まないことを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニン生産微生物が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、キャンディダ（Candida）属およびエシェリヒア(Escherichia)属からなる群から選択される微生物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用する（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造方法に関する。詳しくは特定の割合のポリペプトンおよびマグネシウムイオンを含む培地で微生物を培養することを含む（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニン（以下ＳＡＭと略する）は、生体組織に広く存在し、核酸、神経伝達物質、リン脂質、ホルモン、タンパク質などの合成・代謝におけるメチル基供与体、または、酵素活性化因子として数多くの生物反応に関与する物質である。また、ＳＡＭはアルコール性肝炎やその他の肝臓障害、鬱病、骨関節症、老人性痴呆症に対して有効であることが知られている（特許文献１、２、非特許文献１、２）。
微生物を用いたＳＡＭの製造方法として、例えば、酵母をメチオニン含有培地で培養することにより菌体内ＳＡＭ含量を高める製造方法が開示されている（特許文献３、４）。しかしながら、該文献に記載の方法では、酵母中のＳＡＭ含量を十分に高めることはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２６１３６１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／１４４２４４号
【特許文献３】特開昭５８−１４６２９１号
【特許文献４】特開昭５８−１３８３９３号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hepatology, 1990, 111, 65
【非特許文献２】J. Fam. Pract., 2002, 51, 425
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、従来、ＳＡＭのより効率的な製造方法が求められていた。本発明は、ＳＡＭ生産微生物の、細胞内外のＳＡＭ蓄積量を増大させ、ＳＡＭを大量生産しうる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するべく、微生物の代謝物の蓄積量を網羅的に定量解析する手段を着想し、検討を重ねた結果、ＳＡＭを生産することができる微生物を、ポリペプトンおよびマグネシウムイオンを特定の範囲内で含有し、汎用されている酵母エキスを低用量または全く含まない培地で培養することにより、細胞内外のＳＡＭを顕著に増加させることができることを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、次の［１］〜［４］に関する。
［１］（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニン生産微生物を、培地中のポリペプトンの濃度が５ｇ／Ｌ以上およびマグネシウムイオン濃度が２．２ｍｍｏl／Ｌ以上の培地で培養することを特徴とする（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニンの製造方法。
［２］培地中にさらに添加する酵母エキスの濃度が２ｇ／Ｌ以下である［１］に記載の製造方法。
［３］培地中に酵母エキスを含まないことを特徴とする［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］（Ｓ）−アデノシル−Ｌ−メチオニン生産微生物が、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、キャンディダ（Candida）属およびエシェリヒア(Escherichia)属からなる群から選択される微生物である［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、安価かつ簡便な方法で、ＳＡＭ生産微生物の細胞内外のＳＡＭ蓄積量を顕著に増加させることができ、ＳＡＭを大量生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のＳＡＭの製造法では、ＳＡＭ生産微生物を、ポリペプトンおよびマグネシウムイオンを特定の範囲内で含有する培地、具体的にはポリペプトン濃度が５ｇ／Ｌ以上およびマグネシウムイオン濃度が２．２ｍｍｏl／Ｌ以上の培地で培養することを特徴とする。
【００１０】
本発明で用いられる微生物としては、ＳＡＭを生産することのできる微生物であれば特に限定されないが、ＳＡＭをある程度高生産する微生物が好ましく、具体的にはＳＡＭを乾燥菌体重量あたり０．１重量％以上生産することのできる微生物が好ましく、０．５重量％以上生産することのできる微生物がより好ましく、1重量％以上生産することのできる微生物がさらに好ましい。
【００１１】
そのような微生物として、酵母や大腸菌が挙げられ、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ロドトルラ（Rhorotorula）属に属する酵母、エシェリヒア(Escherichia)属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する大腸菌などの微生物が好ましい例として挙げられる。この中でもサッカロマイセス属の微生物がより好ましい。また、これら微生物のうちでも、清酒酵母、パン酵母、ビール酵母、ワイン酵母等の食経験のあるものが好ましい。
【００１２】
清酒酵母の具体的な例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構によりＮＢＲＣ２３４６株として入手可能なサッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｋ−６株（清酒酵母協会６号）が挙げられる。
【００１３】
なお、本発明に用いる微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物のＳＡＭ生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した微生物も好ましく使用することができる。遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良する手段としては、遺伝子組換え（自己遺伝子の改良、増幅、破壊や、外来遺伝子の導入及び該遺伝子の改良、増幅を含む）や、変異源による変異誘発が挙げられるが、変異源による変異誘発が好ましい。
変異誘発処理は、任意の適当な変異源を用いて行うことができる。「変異源」なる語は、広義の意味において、例えば変異誘発効果を有する薬剤のみならず、ＵＶ照射のような変異誘発効果を有する処理も含む。適当な変異源の例として、エチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。常用の変異誘発技法に従えば、変異誘発に続き、より高いＳＡＭ生産能力を有する微生物の適切な選択を行うことができる。
【００１４】
このような高いＳＡＭ生産能力を有する微生物としては、例えば特開２００４−１８０５０９に記載された、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２、Ｐ−１９０７３またはＰ−１９０７４（これら３つの菌株は、２００２年１０月１８日に独立行政法人産業技術総合技術研究所特許生物寄託センターに寄託されている）やその親株、子孫株が好ましい例として挙げられる。
【００１５】
また、本発明で用いられるポリペプトンとしては、窒素、リン、硫黄の他、ミネラル、ビタミンなどの微量栄養素を含むものであれば特に限定されない。ポリペプトンの原料は特に限定されないが、カゼイン、心筋、ゼラチン、大豆、獣肉由来のものが好ましい。ポリペプトンの製造方法は特に限定されないが、酵素処理法によるものが好ましい。ポリペプトンの形態は特に限定されないが、粉末、細粒のものが好ましい。
【００１６】
本発明において、培養に使用される上記ポリペプトンの濃度は、ＳＡＭを高生産する観点から、５ｇ／Ｌ以上であれば特に限定されないが、ポリペプトン濃度が１０ｇ／Ｌ以上であるのが好ましい。その上限は特に限定されないが、通常５０ｇ／Ｌ以下であり、３５ｇ／Ｌ以下が好ましく、２０ｇ／Ｌ以下がより好ましい。
【００１７】
さらに本発明においては、培地中に無機塩としてマグネシウム塩を含有する。本発明で用いられるマグネシウム塩としては、硝酸塩、塩化物塩等特に限定されないが、硫酸マグネシウムやその水和物（例えば硫酸マグネシウム七水和物）が一般的に微生物の培養に使用されていることから、好ましい。
【００１８】
培地中に添加するマグネシウム塩の量としては特に限定されないが、ＳＡＭを高生産する観点から、マグネシウムイオン濃度として通常２．２ｍｍｏl／Ｌ以上、２．４ｍｍｏl／Ｌ以上が好ましく、２．６ｍｍｏl／Ｌ以上がより好ましい。すなわち、マグネシウム塩として硫酸マグネシウム七水和物を使用する場合、培地中に硫酸マグネシウム七水和物を、通常０．５ｇ／Ｌを超えて添加する、０．５５ｇ／Ｌ以上添加するのが好ましく、０．６ｇ／Ｌ以上添加するのがより好ましい。
その上限は特に限定されないが、マグネシウムイオン濃度として、通常２５ｍｍｏl／Ｌ以下であり、１０ｍｍｏl／Ｌ以下が好ましく、５ｍｍｏl／Ｌ以下がより好ましい。
【００１９】
本発明における培地は、上述のようにポリペプトンとマグネシウム濃度が特定の範囲で含まれていれば特に限定されないが、さらに酵母エキスを含んでいてもよい。
使用される上記酵母エキスの濃度は５ｇ／Ｌ以下であれば特に限定されないが、酵母エキス濃度として３ｇ／Ｌ以下が好ましく、２ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１．５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、含まない（０ｇ／Ｌ）のが特に好ましい。
【００２０】
酵母エキスとしては、窒素、リンの他、ミネラル、ビタミンなどの微量栄養素を含むものであれば特に限定されない。エキスの由来となる酵母は特に限定されないが、サッカロマイセス・セルビシエなどの醸造用酵母、パン酵母、又はキャンディダ・ユーティリスなどのトルラ酵母が好ましい。酵母エキスの製造方法は特に限定されないが、自己消化法や酵素処理法によるものが好ましい。酵母エキスの形態は特に限定されず、粉末、顆粒、粗粒、ペースト状のいずれをも使用できる。
【００２１】
本発明においては、ポリペプトンが１０ｇ／Ｌ以上、無機塩として添加されたマグネシウムイオン濃度が２．４ｍｍｏl／Ｌ以上（硫酸マグネシウム七水和物として０．６ｇ／Ｌ以上）の培地であって、酵母エキスを含まない培地で、ＳＡＭ生産微生物を培養するのがもっとも好ましい態様である。
【００２２】
本発明で用いられる培地は、上記ポリペプトン、マグネシウム塩、酵母エキス以外に、微生物の増殖に適した多量栄養素や微量栄養素を含む一般的な培地が使用できる。そのような栄養素としては、例えば、炭素源（例えば、グルコース、シュークロース、マルトース、デンプン、コーンシロップ、糖蜜等の炭水化物；メタノール、エタノール等のアルコール等）、窒素源（例えば、コーンスチープリカー、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、尿素等）、リン源（例えば、リン酸アンモニウム、リン酸等）、並びに、微量栄養素（例えば、カリウム、亜鉛、銅、鉄、マンガン、モリブデン、硫酸、塩酸等のミネラル；ビオチン、デスチオビオチン、ビタミンＢ１等のビタミン類）、メチオニンからなるが、これらに制限されるものではない。また、上記の栄養素は、適宜、組み合わせて用いられる。
【００２３】
培養時の温度は、通常、１５〜４５℃、好ましくは２０〜３７℃である。１５℃未満では、工業生産のために許容されるには微生物の増殖速度が低くなる傾向があり、４５℃を越える高温では、微生物の生存が傷害され易い傾向にある。
【００２４】
培養時のｐＨは、通常４〜９、好ましくは５〜８である。ｐＨ３以下及び、ｐＨ１０以上では、いずれも微生物の増殖が阻害され易い傾向がある。ｐＨを制御するために、酸、アルカリ問わず添加することができるが、酸としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、アルカリとしては、例えば炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の炭酸塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、アンモニア等を挙げることができる。これらは単独または２種以上混合して使用しても良い。
【００２５】
また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。培養は、所望のＳＡＭの生産量に達した時点で終了することができる。
【００２６】
培養時間は特に制限されないが、好ましくは、２０〜２００時間である。
【００２７】
上記の培養は、嫌気条件、好気条件のいずれでも実施可能であるが、微生物を効率良く増殖させるために好気条件が好ましい。ここで、「好気」なる語は、培養中に酸素の制限（酸素の欠乏）が生じないように酸素の供給が行われることを意味し、好ましくは、培養中に酸素の制限が実質的に生じないように酸素の供給が充分に行われることを意味する。培養は、通常は通気下、好ましくは通気攪拌下に行われる。
【００２８】
本発明では、ＳＡＭ生産微生物を用いて、上記のようにして、ポリペプトンおよびマグネシウム塩を適量添加した培地に、必要に応じて酵母エキスを添加し培養することで、培地当たり２００ｍｇ／Ｌ以上という高い値で、ＳＡＭを生産することができる。
【００２９】
本発明において、細胞内外のＳＡＭ蓄積量は、培養後の微生物を遠心分離にて集菌し、例えば、生理食塩水で洗浄した後、微生物を１０重量％過塩素酸に懸濁することでＳＡＭを抽出し、該抽出液中のＳＡＭ濃度を高速液体クロマトグラフ法により分析し、乾燥微生物重量あたりの含有量に換算することで求めることができる。
【００３０】
培養により得られた微生物菌体は、必要に応じて遠心分離、ろ過などの方法により、濃縮、あるいは培地成分と分離・洗浄してもよい。ＳＡＭを含有する微生物エキスは、上述した方法により培養された微生物菌体を破砕し、必要に応じて不溶分を遠心分離、ろ過などの方法により除去することにより得ることができる。微生物菌体の破砕方法は特に限定されないが、例えば、高圧分散処理などの高圧破砕により破砕する方法、ビーズミルなどの機械的破砕により破砕する方法、エタノールや酢酸エチルなどの有機溶媒を添加することにより破砕する方法、酸またはアルカリを添加することにより破砕する方法、界面活性剤を添加することにより破砕する方法、凍結融解により破砕する方法、加熱処理により破砕する方法、タンパク質分解酵素、細胞壁溶解酵素などを用いて破砕する方法、酵母中の酵素を利用して自己消化により破砕する方法などが挙げられる。好ましくは高圧分散処理などの高圧破砕により破砕する方法、有機溶媒を添加することにより破砕する方法、酸またはアルカリを添加することにより破砕する方法、加熱処理により破砕する方法が挙げられる。これらの破砕方法を２つ以上組み合わせて用いることもできる。
【００３１】
次いで、上述の方法により得られた微生物菌体、または微生物エキスを乾燥する。乾燥方法としては特に限定されないが、例えば噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、通気乾燥等を挙げることができる。また、これらの乾燥方法を２つ以上組み合わせて用いることもできる。噴霧乾燥としては、スプレードライ法が使用できる。減圧乾燥、通気乾燥における乾燥温度としては特に制限されないが、ＳＡＭの安定性を考慮すると６０℃以下が好ましい。下限は特に制限されない。
【００３２】
本発明で得られたＳＡＭを含有する微生物乾燥菌体または微生物エキスは、そのままあるいは加工して、食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、飲料、動物薬、飼料、化粧品、医薬部外品、医薬品、治療薬または予防薬等に使用できる。
【００３３】
本発明の組成物の加工形態としては、マイクロカプセル、ハードカプセル、ソフトカプセル等のカプセル剤（好ましくはマイクロカプセル、ソフトカプセル）、錠剤、散剤、チュアブル錠、顆粒剤、丸剤、シロップ、飲料等の経口投与形態や、クリーム、坐薬、練り歯磨き等の形態に更に加工しても使用しうる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例をあげて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｋ−６株（清酒酵母協会６号）を、酵母エキスの最終濃度が０、１．２５、２．５、５ｇ／Ｌ、ポリペプトンの最終濃度が０、１．２５、２．５、５、１０ｇ／Ｌとなる培地［グルコース５０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ（マグネシウム換算で２．４ｍｍｏl／Ｌ）、メチオニン１．５ｇ／Ｌ］４ｍＬに接種し、２４時間振とう培養した。得られた培養液に１０重量％過塩素酸を添加し、６０分間激しく振とうしてＳＡＭの抽出を行った。得られた溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、ＳＡＭ生産量を調べた。その結果を表１に示す。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ
移動相：０．５Ｍギ酸アンモニウム
流速：０．５ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【００３６】
【表１】
2015163054.tif 000002
【００３７】
［実施例２］
サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｋ−６株（清酒酵母協会６号）を、酵母エキスの最終濃度が０、１．２５、２．５、５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物の最終濃度が０．３、０．６、１．２ｇ／Ｌ（マグネシウムイオン１．２、２．４、４．８ｍｍｏｌ／Ｌ相当）となる培地［グルコース５０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、メチオニン１．５ｇ／Ｌ］４ｍＬに接種し、２４時間振とう培養した。得られた培養液に１０重量％過塩素酸を添加し、６０分間激しく振とうしてＳＡＭの抽出を行った。得られた溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、ＳＡＭ生産量を調べた。その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2015163054.tif 000003