(57)【要約】【課題】侵襲性のより小さい方法で採取したサンプルにおいて、前頭側頭型認知症を検出するか又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別できる方法及びそのためのキットの提供すること。【解決手段】本発明は、対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする前頭側頭型認知症を検出するか又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法を提供する。本発明はまた、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする前頭側頭型認知症の検出用又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別用のキットを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする前頭側頭型認知症を検出するか又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法。
【請求項２】
前記定量が、遷移金属イオンに結合した遷移金属イオン結合性アルブミンを定量することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記定量が、遷移金属イオンを介して支持体上に不動化された遷移金属イオン結合性アルブミンを定量することにより行われる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記遷移金属イオンが銅イオン(II)、ニッケルイオン(II)、亜鉛イオン(II)、鉄イオン(II)及びコバルトイオン(II)からなる群より選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記遷移金属イオンが銅イオン(II)である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする前頭側頭型認知症の検出用又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別用のキット。
【請求項７】
前記遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段が、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質である請求項６に記載のキット。
【請求項８】
支持体を更に含み、該支持体に前記遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質が固定されている請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質が抗アルブミン抗体である請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
前記遷移金属イオン結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質が遷移金属イオンである請求項７〜９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前頭側頭型認知症を検出するか又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法及びそのためのキットに関する。より具体的には、本発明は、対象者の血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする前頭側頭型認知症を検出するか又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、変性疾患(約80％)と脳血管障害(約20％)とに分類され、変性疾患(約80％)の内訳はアルツハイマー型認知症(アルツハイマー病：約50％)、前頭側頭型認知症(約15％)及びレビー小体病(約15％)である。
アルツハイマー型認知症では、主に、側頭葉内側や頭頂葉の萎縮が目立つ一方、前頭側頭型認知症では前頭葉や側頭葉前方の萎縮が目立つ。
前頭側頭型認知症は、性格変化と社交性の消失が初期からみられ、アルツハイマー型認知症において初期からみられる記憶障害・見当識障害は目立たない。進行に伴い、自制力低下(粗暴、短絡、相手の話を聞かず一方的にしゃべる)、感情鈍麻、異常行動(浪費、過食・異食、収集、窃盗、徘徊、他人の家に勝手に上がり込む)などがはっきりし、人格変化(無欲・無関心)、感情の荒廃が高度になる。
【０００３】
前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別は、治療方針決定のために重要である。しかし、前頭側頭型認知症は、アルツハイマー型認知症と臨床症状の一部が重複しており、鑑別が難しい。従来、鑑別は、特定の薬剤を用いる画像診断(例えば、ピッツバーグ大学により開発されたアミロイドβ蛋白の凝集体を描写する薬剤「PiB」を用いるPiB-PET)や複数のバイオマーカーの組合せについての髄液検査(特許文献１)が必要であった。
しかし、PiB-PET画像診断は、大型で高価な装置を必要とし、費用も非常に高額である。また、髄液検査は、髄液採取時の侵襲性が大きく、患者の心理的及び身体的負担が大きい。いずれもスクリーニングには適さず、また日常的に簡単に行えるものでない。
【０００４】
ところで、タウ蛋白は常に神経細胞内で生成されて細胞外に排出される(非特許文献１)。このタウ蛋白の凝集体が、前頭側頭型認知症患者及びアルツハイマー型認知症患者では、脳内に蓄積することが知られている。
血液中のタウ蛋白を検出・定量することにより、アルツハイマー型認知症を検出する試みは既になされている(特許文献２及び３)が、前頭側頭型認知症に関しては報告例はない。特許文献１においても、前頭側頭型認知症患者の脳内での存在量が健常人に比べて増加していることが示されているに過ぎず、しかも前頭側頭型認知症の検出には他の２種以上のマーカーと組み合わせる必要があると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2002-519702号公報
【特許文献２】特開2002-40023号公報
【特許文献３】国際公開WO2004/016655
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Neuroscience, 2011, 31: 13110-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、侵襲性のより小さい方法で採取したサンプルにおいて、前頭側頭型認知症を検出し、又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別できる方法及びそのためのキットの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前頭側頭型認知症患者ではアルツハイマー型認知症患者に比べてアルブミンがタウ蛋白と結合し難い状態(劣化状態)にあり、そのためタウ蛋白を輸送(排出)できず、脳内に蓄積することを見出している。本発明らはまた、タウ蛋白に結合したアルブミン(すなわち、タウ蛋白結合性アルブミン)の血中量が、前頭側頭型認知症患者群においてアルツハイマー型認知症患者群に比べ有意に少ないことも見出し、血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体を定量することで前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法を開発している(特願2013-12177)。
更なる研究の結果、本発明者は、タウ蛋白-アルブミン複合体の形成に、遷移金属イオンに対するアルブミンの結合性が関与していることを突き止め、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする前頭側頭型認知症を検出するか又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法である。
本発明はまた、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする前頭側頭型認知症の検出用又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別用のキットでもある。
【発明の効果】
【００１０】
検査サンプルとして、採取時の侵襲性が小さい血液サンプルを用いるため、サンプル採取が容易であり、被検者の負担を軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一形態における遷移金属イオン結合性アルブミンの測定原理を説明する図である。
【図２】血液中の銅イオン結合性アルブミン及び銅イオン非結合性アルブミンの存在を示すカラムクロマトグラフである。
【図３】非認知症患者由来血清及び前頭側頭型認知症(FTD)患者由来血清中、銅イオンの存在下又は不在下でのタウ蛋白-アルブミン複合体形成の有無を示すグラフである。
【図４】実施例における測定データを説明する統計学的グラフ(箱ひげ図)である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜前頭側頭型認知症の検出法及びアルツハイマー型認知症との鑑別法＞
本発明の検出法及び鑑別法は、対象者の血液サンプルにおいて遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量することを特徴とする。
「対象者」は、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含むが、好ましくはヒトである。特定の実施形態において、対象者は、認知症を発症している患者、とりわけその認知症が前頭側頭型であるかアルツハイマー型であるかの鑑別を要する認知症患者であり得る。
「血液サンプル」は、全血サンプル、血清サンプル又は血漿サンプルである。
「アルブミン」は、本発明に関しては、血清アルブミンをいう。本発明においては、単に「アルブミン」と表記したときは、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、遷移金属イオン結合性アルブミン及び遷移金属イオン非結合性アルブミンの両方を含む通常の意味でのアルブミンを意図するものとする。
「遷移金属イオン」は、本発明に関しては、アルブミンに結合し得る遷移金属のイオン、特に二価イオンをいう。遷移金属としては、特に、銅、ニッケル、亜鉛、鉄、コバルトが挙げられる。遷移金属イオンは、好ましくは銅イオン(II)、ニッケルイオン(II)及び亜鉛イオン(II)から選択され、特に好ましくは銅イオン(II)である。
【００１３】
血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの定量は、イムノアッセイ、電気泳動法、クロマトグラフィー、色素結合法、質量分析法及びこれらの組合せなど種々の方法により行うことができる。
遷移金属イオン結合性アルブミンは、遷移金属イオンに結合した形態(遷移金属イオン-アルブミン複合体)で定量してもよい。
【００１４】
定量は、測定対象の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを、それぞれ、非測定対象の遷移金属イオン非結合性アルブミン又は遷移金属イオン結合性アルブミンと空間的に分離した状態で行うことが好ましい。
上記分離又は非測定対象のアルブミンの除去は、電気泳動法(例えば等電点電気泳動法)や、測定対象のアルブミンを固相に不動化することにより達成できる。
測定対象のアルブミンの不動化は、例えば、該アルブミンに結合可能な物質が固定された固相(支持体)を用いて行うことができる。より具体的には、例えば、遷移金属イオン結合性アルブミンは、遷移金属イオンを固定した支持体を用いて不動化し得る。
遷移金属イオン非結合性アルブミンと遷移金属イオン結合性アルブミンとは、例えば、遷移金属イオンの存在下に等電点電気泳動法を行うことで、遷移金属イオンに結合していないアルブミンと遷移金属イオンに結合したアルブミンとの間の等電点の差に基いて分離することができる。或いは、遷移金属イオンを固定した固相上を通過させることにより、通過画分と吸着画分(又は溶出画分)として分離可能である。
【００１５】
定量に際して、非測定対象のアルブミンが測定対象のアルブミンと位置的に分離されている場合(非測定対象のアルブミンが測定系から除去されている場合も含む)には、測定対象のアルブミンの定量に、遷移金属イオン結合性アルブミン及び遷移金属イオン非結合性アルブミンの両方を区別することなく定量する方法を使用しても差し支えない。
例えば、遷移金属イオン非結合性アルブミンは、遷移金属イオン固定化固相を充填したカラムを通過させることなどによりサンプル中から遷移金属イオン結合性アルブミンを吸着・除去した後であれば、アルブミン一般についての定量法を用いて定量可能である。
【００１６】
不動化されたか又は分離された測定対象のアルブミンの定量は、当該分野において公知のアルブミン定量法により行うことができる。
例えば、色素結合法では、アルブミンと反応して発色するか又は色調が変化する試剤を使用する。このような試剤としては、例えば、ブロムクレゾールグリーン(BCG)やブロムクレゾールパープル(BCP)が挙げられる。
【００１７】
イムノアッセイでは、アルブミンに対する抗体(抗アルブミン抗体)を使用する。
本発明において、「抗体」とは、完全抗体及びその抗原結合部位を有するフラグメント(単鎖抗体(scFv)、Fab抗体、F(ab')2抗体、Fab'抗体を含む)をいう。抗体は、既知の抗体であってもよいし、新たに作製された抗体であってもよい。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。使用する抗アルブミン抗体は、アルブミン(特に対象者由来のアルブミン、すなわち対象者がヒトである場合にはヒト由来アルブミン)に特異的に結合することが好ましいが、定量系における当該物質の検出に影響を与えない限り、交差反応性は許容され得る。
【００１８】
特定の蛋白又はペプチドに結合する抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、そのような抗体は、当該蛋白又はペプチドを、単独で又は適切なキャリア(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ジフテリア毒素、破傷風毒素)に結合させて、必要に応じてアジュバント(例えば、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム又はリン酸化アルミニウム(ミョウバン))と共に、１回又はそれ以上(皮下、静脈内、腹腔内などに)投与した動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、ダチョウなど抗体産生に使用できる動物)の血清から、例えばアフィニティークロマトグラフィーのような精製法を用いて精製することにより(例えば、免疫グロブリン画分又は精製抗体として)取得することができる。精製することなく、全血清(抗血清)をそのまま用いてもよい。
【００１９】
モノクローナル抗体を作製する方法もまた当該分野において公知である(例えば、Kohler and Milstein(Nature, 256:495-497, 1975；Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。簡潔には、当該蛋白又はペプチドで免疫した動物の脾臓細胞(Ｂ細胞)を、細胞融合法により適切な骨髄腫細胞と融合して不死化細胞(ハイブリドーマ)を作製し、所望の結合能を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このハイブリドーマを、インビトロ又はインビボ(例えば、マウス腹腔内)で増殖させて産生抗体を取得してもよい。
【００２０】
抗アルブミン抗体は、対象哺乳動物のアルブミンを認識する一方で、(例えばブロッキング剤などの他の試剤中に含まれ得る)その他の哺乳動物のアルブミンを認識しないことが好ましい。より好ましくは、抗アルブミン抗体は、ヒトアルブミンを認識するが、ウシ、ウサギ、ヤギ及び/又はヒツジのアルブミンを認識しない抗体である。このような抗ヒトアルブミン抗体は、標識又は非標識の抗ヒト血清アルブミン-マウスモノクローナル抗体又は抗ヒト血清アルブミン-ウサギ(ヤギ、ヒツジなど)ポリクローナル抗体若しくは血清として国内外の供給業者から入手可能であり、又は上記の方法で容易に作製することができる。
【００２１】
抗体は、検出可能な標識が付されていることが好ましい。抗体の標識は、当該分野で公知であり、使用する検出手段に応じて適宜選択できる。例えば、標識には、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発色物質、発光物質などが使用できる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ(特にHRP)、β-ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ(特にアルカリホスファターゼ)、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼなどが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉが挙げられる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Cy2、Cy3などが挙げられる。発色物質としては、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェリンなどが挙げられる。
【００２２】
不動化されたアルブミンはまた、アルブミンに特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドを用いて定量することも可能である。
アプタマーは、特定の標的を認識する一本鎖核酸(DNA、RNA又は核酸アナログ(例えばLNA))である。特定の標的に特異的に結合し得るアプタマーを作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、ランダムな塩基配列(例えば30〜150塩基)を有する核酸群を作製し、この中から対象の標的を特異的に認識するものを、例えばSELEX法などのスクリーニング法により選定する。
【００２３】
アルブミンに特異的に結合し得るペプチドは、例えば、WO96/14416[特表平10-509311号公報]やWO2009/016043[特表2010-534486号公報]に記載のような細菌由来のアルブミン結合性ドメインを含むものや、WO2008/096158[特表2010-518062号公報]に記載のような抗アルブミン抗体由来の可変ドメインを含むものである。
アルブミンに特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドは、検出可能な標識が付されていることが好ましい。例えば、標識には、上記のような放射性同位体、蛍光物質、発色物質、化学発光物質などが用いられる。核酸標識法は当該分野で公知である。
【００２４】
標識からのシグナルの測定は、分光光度計、蛍光光度計、CCDカメラ、CMOSカメラ、フォトダイオード、光電子増倍管などから適宜選択したものを、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に使用して行うことができる。
【００２５】
定量を、上記のような色素結合法、イムノアッセイ、アプタマーを用いる方法などにより行う場合、特に、当該方法を実施するためのキット(後述)を用いて行う場合には、簡便かつ安価で、比較的迅速な検出が可能になる。このため、本発明の方法は、臨床検査用の設備・機器の充実した病院や検査機関のみならず、診療所や医院においても比較的容易に実施できる。とりわけ、遷移金属イオン結合性アルブミンを、遷移金属イオンと抗アルブミン抗体とを用いて定量する場合には、(抗タウ蛋白抗体のような)高価な試剤を必要としないので特に安価に実施できる。
【００２６】
後述する実験・実施例から明らかなように、前頭側頭型認知症患者からの血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン量は、非認知症患者及びアルツハイマー型認知症患者の血液サンプル中の量より有意に低い一方、血液サンプル中の総アルブミン量は３群間で有意差はない。よって、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン量又は遷移金属イオン非結合性アルブミン量は、前頭側頭型認知症の検出用又は前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別用の指標として有用である。
【００２７】
具体的には、本発明の方法は、例えば下記のように実施する。
本具体的実施形態では、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンを不動化するために、遷移金属イオンが固定された支持体を用いる。
血液サンプルは、予め、希釈剤(例えば緩衝液)で希釈してもよい。緩衝液は、当該分野において公知のものから適宜選択するが、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸-クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液などである。緩衝液は、必要に応じて、NaCl、界面活性剤(例えば、Tween 20、Triton X-100)及び/又は防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)を含んでいてもよい。緩衝液の具体例は、PBS、PBS-T、TBS又はTBS-Tである。
希釈は、総アルブミン量に対する遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量(比)を測定するため、総アルブミン量が所定値となるように行なってもよい。
【００２８】
血液サンプルを支持体と、該サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンが支持体上の遷移金属イオンと結合するに適切な条件(例えば、温度：20℃〜40℃、より好ましくは25〜38℃；時間：５〜120分間、より好ましくは10〜90分間、より好ましくは30〜60分間)下に接触させる(インキュベーション；図１Ａ)。インキュベーションの間に、サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンは支持体上の遷移金属イオンと結合する一方、遷移金属イオン非結合性アルブミンは結合できない(図１Ｂ)。
【００２９】
インキュベーション後、支持体上に不動化されなかった物質(遷移金属イオン非結合性アルブミンを含む)を除去するために、洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)で、支持体を１回以上洗浄する。
この時点で、サンプル中の遷移金属イオン非結合性アルブミンは除去され、遷移金属イオン結合性アルブミンのみが支持体上に不動化される(図１Ｃ)。よって、支持体上に不動化されたアルブミンの量は、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量を反映する。
【００３０】
支持体上に不動化されたアルブミンは、BCG法、BCP法、BCP改良法のような色素結合法を用いて定量することができる。
【００３１】
或いは、支持体上に不動化されたアルブミンは、イムノアッセイにより、例えば下記のように定量することができる。
標識抗アルブミン抗体を(遷移金属イオン結合性アルブミンが不動化された)支持体と、抗アルブミン抗体とアルブミンとの結合に適切な条件(例えば、温度：20℃〜40℃、より好ましくは25〜38℃；時間：５〜120分間、より好ましくは10〜60分間)下に接触させる(図１Ｄ)。
支持体を洗浄液で１回以上洗浄することにより未結合の抗アルブミン抗体を除去する。
抗アルブミン抗体に付された標識に応じた方法により、標識からのシグナルを定量する。例えば、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に、マイクロプレートリーダーを用いて測光する。
【００３２】
支持体上に不動化されたアルブミンを定量する前、間又は後に、使用する定量方法(遷移金属イオン結合性アルブミンに結合可能な物質)に応じて、ブランク及び標準物質(標準溶液)を用いて標準曲線(検量線)を作成してもよい。
【００３３】
上記の実施形態では、支持体上に不動化した遷移金属イオン結合性アルブミンを色素結合法又はイムノアッセイにより定量する方法について具体的に説明したが、サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンは、他の方法(例えばウェスタンブロッティングなど)によっても定量可能であることは言うまでもない。
また、上記のイムノアッセイを用いる形態では、抗アルブミン抗体及び遷移金属イオンを使用する形態を説明したが、遷移金属イオン結合性アルブミン若しくは遷移金属イオン非結合性アルブミンに特異的に結合する抗体や遷移金属イオン-アルブミン複合体に対する抗体が開発されれば、そのような抗体を、抗アルブミン抗体及び/又は遷移金属イオンに代えて使用できることは当業者であれば容易に理解できる。
【００３４】
好ましい場合には、測定したアルブミン量と、同一対象者からの別のサンプルにおいて測定した総アルブミン(遷移金属イオン結合性アルブミン＋遷移金属イオン非結合性アルブミン)量とから、当該血液サンプルにおける比(遷移金属イオン結合性アルブミン量又は遷移金属イオン非結合性アルブミン量)/(総アルブミン量)を求める。
【００３５】
対象者の血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を下回っているか又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を上回っているとき、当該対象者は、前頭側頭型認知症である蓋然性が高いと判断できる。
また、対象者が認知症の症状を発症しているとき、対象者(すなわち認知症患者)の血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を下回っているか又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を上回っている場合、当該認知症患者は前頭側頭型認知症である蓋然性が高いと判断できる。反対に、認知症患者の血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を上回っているか又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を下回っている場合、当該認知症患者はアルツハイマー型認知症である蓋然性が高いと判断できる。
閾値(カットオフ値)は、統計学的に有意な数の、前頭側頭型認知症であると確定診断された患者と非認知症患者及び/又はアルツハイマー型認知症であると確定診断された患者とについての測定データに基づいて決定できる。
【００３６】
本発明の検出法は、認知症の症状も徴候も示していない対象者の血液サンプルについて実施することにより、前頭側頭型認知症を発症するリスクを評価する方法としても利用することができる。血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を下回っているか又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を上回っている場合には、当該対象者は前頭側頭型認知症を発症するリスクが高いと推定できる。血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を下回っていないものの非認知症患者の平均値より低く閾値に近いレベルにあるか又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が所定の閾値を上回っていないものの非認知症患者の平均値より高く閾値に近いレベルにある場合には、当該対象者は前頭側頭型認知症を発症するリスクが比較的高いと推定できる。一方、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミンの量若しくは比又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量若しくは比が非認知症患者の平均値に近ければ、当該対象者は前頭側頭型認知症を発症するリスクが低いと推定できる。
本発明の方法は、小さい侵襲性で実施し得るので、例えば定期健康診断に際して実施することにより、将来的な罹患のリスクを推定することができる。その結果、予防に向けた取り組みを早期に喚起することが可能になる。
【００３７】
本発明の方法はまた、前頭側頭型認知症の治療を受けている対象者(患者)からの２以上の時点での血液サンプルについて実施して、血液サンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを経時的に定量し比較することにより、前頭側頭型認知症の進行又は改善をモニターする方法としても利用することができる。より後の時点のサンプル中の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量又は比が、より前の時点のサンプル中と比較して、それぞれ増加又は減少しているとき、前頭側頭型認知症から回復傾向にあると推定でき、逆にそれぞれ減少又は増加しているとき、前頭側頭型認知症が進行中であると推定できる。
【００３８】
経時的な定量は、例えば、５、10、15若しくは20日ごと、１、２若しくは３週間ごと、１、２、３、４、５若しくは６ヶ月ごと、１、２、３、４若しくは５年ごとに行う。
患者が前頭側頭型認知症の治療を受けている場合には、この方法は、当該治療の有効性を評価するために利用できる。治療は、薬物療法に限られず、例えば食事療法、運動療法のような非薬物療法、及び薬物療法と非薬物療法との組合せを含む。
【００３９】
＜前頭側頭型認知症の検出用又はアルツハイマー病との鑑別用のキット＞
本発明の検出キット及び鑑別キットは、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段を含んでなり、測定対象サンプルが血液サンプルであることを特徴とする。
本キットは、上述した本発明の方法の実施に適切である。
【００４０】
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンを定量する手段は、好ましくは、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質である。
【００４１】
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、例えば、アルブミンと反応して発色するか又は色調が変化する試剤(例えば、BCGやBCP)、上記のような抗アルブミン抗体、上記のようなアルブミンに特異的に結合し得るアプタマー、上記のようなアルブミンに特異的に結合し得るペプチドであり得、好ましくは抗アルブミン抗体である。
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、遷移金属イオンでもあり得る。
【００４２】
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、溶液形態で提供されてもよいし、蛋白又はペプチドである場合には、凍結乾燥形態で提供されてもよい。
キットが、支持体(固相)を更に含む場合には、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は該支持体に固定された状態で提供されてもよい。
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質はまた、必要であれば、上記のような標識が付されていてもよい。或いは、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、(ストレプト)アビジン-ビオチンのような結合対の一方のパートナー(例えば、ビオチン)が付着されており、他方のパートナー(例えば、(ストレプト)アビジン)が付着した標識と結合可能にされていてもよい。
【００４３】
キットに含まれる、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質は、好ましくは１種又は２種であり、より好ましくは２種(例えば、遷移金属イオンと抗アルブミン抗体との組合せ)である。
【００４４】
本発明のキットは、好ましくは、上記のような遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質が固定された支持体を更に含んでなる。
支持体の形態は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ、粒子、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップなどであり得る。
【００４５】
支持体の材料は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂(例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン)、セルロース及びその誘導体(例えば、ニトロセルロース)などであり得る。
支持体への遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質の固定は、物理的吸着、共有結合若しくは非共有結合(イオン結合、静電結合、疎水性相互作用など)のいずれであってもよい。
【００４６】
支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用できるが、例えば対象の哺乳動物以外の哺乳動物の血清アルブミン(対象がヒトである場合、例えばウシ血清アルブミン(BSA))、脱脂粉乳、カゼインなどであり得る。
遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質が固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル)又は非還元多糖類(例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース)などでコーディングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上の遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンに結合可能な物質を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。
【００４７】
本発明のキットは、必要に応じて、標識シグナル生成剤(例えば発色剤)及び/又は反応停止液を更に含んでいてもよい。
標識シグナル生成剤は、標識に応じて公知のものから適宜選択できる。例えば、標識がペルオキシダーゼである場合には、TMB、DAB、o-フェニレンジアミン(OPD)、2,2-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)などであり得、アルカリホスファターゼである場合には、p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)、4-メチルウンベリフェリルリン酸(4-MUP)などであり得る。
反応停止液は、例えば、硫酸又は水酸化ナトリウムであり得る。
【００４８】
本発明のキットはまた、標準曲線(検量線)作成用の標準溶液、任意に標準溶液希釈剤を含んでいてもよい。
本発明のキットはまた、洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)や、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材(例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール)を含んでいてもよい。
本発明のキットは、上記のように、前頭側頭型認知症を発症するリスクを評価するため、及び/又は前頭側頭型認知症の進行若しくは改善をモニターするため、及び/又は前頭側頭型認知症治療の有効性を評価するためにも使用することができる。
【実施例】
【００４９】
＜予備実験１＞
非認知症患者の血清を10倍希釈したサンプルを、銅イオン固定化固相を充填したアフィニティカラム(Hitrap IMAC HP)に流し、先ず通過画分を回収し、次いでグラジエント(20〜500mMイミダゾール)下で溶出画分を回収した。図２にクロマトグラムを示す。
電気泳動及びCBB染色により、通過画分(銅イオンに結合しない画分)及び溶出画分(銅イオンに結合する画分)の両方ともが、分子量66kDaのアルブミンを含んでいることが確認された。このことから、血清アルブミンには、銅イオンに結合できるものと結合できないものが存在すると理解できる。
【００５０】
＜予備実験２＞
５例の非認知症患者血清(正常血清)と５例の前頭側頭型認知症(FTD)患者血清に、二価金属キレート化剤としてEDTA(エチレンジアミン四酢酸)を添加した後、PD-25バッファー交換カラムにて、二価金属イオンをキレートしたEDTA(キレート化合物)を除去した。
この状態の血清サンプル及びそれぞれに銅イオンを終濃度16μMになるように加えたサンプル中におけるタウ蛋白-アルブミン複合体の有無を、タウ抗体及びHRP標識アルブミン抗体を用いたサンドイッチELISA法で吸光度測定(450nm)にて観察した。
【００５１】
結果を図３に示す。
金属イオンを除去した正常血清及びFTD血清においては、吸光度はネガティブコントロールレベル(図中、破線で示す)と同程度であった。よって、タウ蛋白-アルブミン複合体はほとんど形成されなかったと考えられる。
これに対し、銅イオンの存在下では、正常血清の吸光度は有意に上昇し、タウ蛋白-アルブミン複合体が有意な量で形成されたと考えられる一方、FTD血清の吸光度は僅かに上昇したに過ぎず、複合体の形成は僅かであったと考えられる。
【００５２】
ところで、銅イオンに限らず種々の遷移金属イオンがアルブミン及び/又はタウ蛋白に結合することが知られている(例えば、Prog. Food Nutr. Sci., 1987, 11(3-4): 366-400；Biochm. Soc. Trans., 2008, 36(Pt 6); 1317-21；J. Biol. Chem., 2009, 284(50): 34648-57；Biopolymers, 2005, 79(2):74-85)。
したがって、上記結果から、タウ蛋白-アルブミン複合体の形成には、銅イオンのような遷移金属イオンの存在が必要であると考えられる。
また、予備実験１の結果を併せて考えると、FTD血清中では、正常血清中と比べて、銅イオンのような遷移金属イオンに結合できないアルブミンの割合が高い(換言すれば、遷移金属イオンに結合するアルブミンの割合が低い)ことに起因して、タウ蛋白-アルブミン複合体が少ないと考えられる。
こうして、遷移金属イオン結合性アルブミン又は遷移金属イオン非結合性アルブミンの量を測定することで、前頭側頭型痴呆症患者の検出及びアルツハイマー型痴呆症患者との鑑別が可能であると考えられたので、以下で検証した。
【００５３】
＜実施例＞
いずれもインフォームドコンセントが得られた16例の非認知症(Ｎ)患者、20例の前頭側頭型認知症(FTD)患者及び26例のアルツハイマー型認知症(AD)患者から血清を採取した。FTD患者の確定診断はThe Lund and Manheshter groupsによるFTDの臨床診断基準によった。AD患者の確定診断は神経心理学的診断及び画像診断、その他認知症を来す疾患の除外診断によった。
【００５４】
採取したサンプルを３つに小分けして、１つを総アルブミン濃度の測定に、２つを銅イオン結合性アルブミンの定量に使用した。
BCP改良法で測定した総アルブミン濃度は、Ｎ患者群で3.944±0.280mg/dl、FTD患者群で3.979±0.324mg/dl、AD患者群で4.048±0.295mg/dlであり、各群間で有意差はなかった。
【００５５】
一方、銅イオン結合性アルブミンの定量のために、個々の血清サンプルをトリス緩衝液で300倍に希釈した。
この希釈溶液を、銅イオンを固定した96穴マイクロプレート(Thermo Fisher Scientific Inc.)にウェルあたり100μl投入し、37℃で１時間保温した。その後、未結合のものを洗い流すため、トリス緩衝液/Tween 20にて４回洗浄し、30000倍希釈の抗ヒトアルブミンポリクローナルHRP結合抗体を投入し、37℃で１時間インキュベートした。再度、未結合のものを洗い流すため、トリス緩衝液/Tween 20にて４回洗浄した。
【００５６】
その後、TMB/H2O2溶液を各ウェルに投入して発色反応を開始させ、15分後にTMB stop solutionを添加して発色反応を停止させた。
マイクロプレートリーダーにて450nmのフィルターを用いて0.1秒間測光して、吸光度を求めた。
結果を、図４に箱ひげ図として示す。結果は、同一サンプルについて独立して行った２回の測定データの平均として示す。
独立した２群のｔ検定により、FDT患者群とＮ患者群との間で、銅イオン結合性アルブミンの血中量の差は95％の信頼区間で有意であった(p<0.001)。FDT患者群とAD患者群との間でも、差は95％の信頼区間で有意であった(p<0.001)。
したがって、銅イオン結合性アルブミンの血中量は、FTDの検出及びFTDとADとの鑑別に利用できることが判明した。具体的には、FTDとADとの鑑別について吸光度のカットオフ値を0.65に設定すると、感度90％(95％信頼区間：74〜94％)、特異度86％(95％信頼区間：76〜91％)と共に80％を超えており、よって鑑別法としての実用性が証明される。
また、各群間で総アルブミン量に差がなかったことから、FTD患者群においては、銅イオン結合性アルブミン量の減少量に応じて、銅イオン非結合性アルブミン量が増加したものと考えられる。よって、銅イオン非結合性アルブミンの血中量も、FTDの検出及びFTDとADとの鑑別に利用可能であると考えられる。
【００５７】
上記の実施形態及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的形態及び例のみに限定されるものではない。本明細書に記載された具体的な構成、手段及び方法は、本発明の要旨を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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