(57)【要約】【課題】  蛍光ガイド下手術用の可搬型デジタルイメージングシステムを提供する。【解決手段】  本システムは、光源、蛍光検出器、デジタル信号出力部、記憶装置及び処理装置を備える可搬型プローブを含む。本システムはまた、前記可搬型プローブ及び表示部と通信するコンピューターを含む。前記可搬型プローブは、蛍光プローブの前記光源の光を前記蛍光標識を含む組織に照射して、手術野内にある蛍光標識を含む組織を励起する。前記コンピューターは、前記可搬型プローブの前記デジタル信号出力部から送られたデジタル信号を受信して処理するとともに、前記表示部と通信して、前記手術野のリアルタイム像の可視化像を表示部に表示させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源、蛍光検出器及びデジタル信号出力部を含む可搬型プローブを手術野に向ける工程と、
蛍光標識を含む組織に前記光源の光を照射し、手術野内の前記蛍光標識を含む組織を励起する工程と、
前記可搬型プローブの前記デジタル信号出力部から送られた、蛍光標識を含む組織の画像データを受信するとともに、表示部と通信するコンピュータに従って、前記手術野のリアルタイム像の可視化像を前記表示部に表示する工程と、
を備える蛍光ガイド下手術用の可搬型イメージング装置の使用方法。
【請求項２】
蛍光標識で所望の組織を標識する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光標識は、発蛍光団である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光標識は、蛍光抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記可搬型プローブは、可搬型デジタル顕微鏡である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ガンの治療を行う工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ガンの治療を行う工程は、ヒトの腫瘍を切除する工程を含む、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リアルタイム像の可視化像を表示する工程は、前記蛍光検出器を操作し、前記蛍光標識を含む組織への光の照射に応答して、前記蛍光標識を含む組織によって放射された光子を検出する工程を含む、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記可搬型プローブの操作に応じた前記光子検出の結果をデジタル信号化する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記可搬型プローブの前記デジタル信号出力部を介して前記デジタル信号を前記コンピュータに送り、前記コンピュータが前記信号を処理して前記手術野のリアルタイム像の可視化像を前記表示部に表示させる工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光源、蛍光検出器、デジタル信号出力部、記憶装置及び処理装置を備える可搬型プローブと；
前記可搬型プローブと通信するコンピュータと、ここで前記コンピュータは記憶装置と前記処理装置と；
表示部と；を備え、
前記可搬型プローブは、前記光源の光を手術野内の蛍光標識を含む組織に照射し、前記手術野内にある蛍光標識を含む組織を励起し；
前記コンピュータは、前記可搬型プローブの前記デジタル信号出力部から送信されたデジタル信号を受信して処理するとともに、前記表示部と通信し、前記表示部に前記手術野のリアルタイム像の可視化像を表示させる；
蛍光ガイド下手術用可搬型デジタルイメージングシステム。
【請求項１３】
蛍光標識をさらに備え、前記所望の組織は前記蛍光標識で標識される、ことを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記可搬型プローブは、可搬型デジタル顕微鏡である、ことを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記可搬型プローブの前記光源は、予め定められた波長の範囲内の光を発生する、ことを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記光源の予め定められた波長は、前記蛍光標識を含む組織を励起し、かつ、周囲の組織を傷つけない波長である、ことを特徴とする請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記可搬型プローブの前記蛍光検出器は、前記蛍光標識を含む組織に照射された光に応答して前記蛍光標識を含む組織から放射された光子を検出する、ことを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記可搬型プローブは、前記可搬型プローブの操作に応じた光子の検出結果をデジタル信号化する、ことを特徴とする請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記デジタル信号出力部は、デジタル信号を前記コンピュータに送信する、ことを特徴とする請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記コンピュータは、前記デジタル信号を処理し、前記処理されたデジタル信号を前記表示部に送り、前記手術野の前記リアルタイム像の可視化像を表示部に表示させる、ことを特徴とする請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１２年１２月２４日に出願された、「蛍光ガイド下外科手術（ＦＧＳ）のための可搬型デジタルイメージングシステム」と題する、米国出願番号６１，７４５，７３０の優先権の利益を享受するものであり、前記出願は参考文献として本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
この発明は、蛍光ガイド下外科手術（「ＦＧＳ」）用の可搬型蛍光撮像装置の使用に関する。特に、本願発明はガンのＦＧＳにおける可搬型デジタル蛍光撮像装置の使用を含む。
【背景技術】
【０００３】
固形悪性腫瘍の患者が長期に生存できるか否かは、主として原発腫瘍を外科的に完全に切除できるか否かに依存している。さらに、外科治療後の術後補助治療及び最適な治療方針の決定には正確な診断が必要であるが、こうした診断は転移性腫瘍の存在と拡大の早期確認とに依存している。従って、外科手術中の手術野において、原発腫瘍や転移性腫瘍を完全に視認可能とすることは、固形腫瘍を有する患者の治療にとって非常に重要なことである。
【０００４】
蛍光ガイド下外科手術は、腫瘍の同定及び切除術を向上させる。一励起光によって明るい蛍光を発しているガンを視認することは、一般的な無影灯下における手術（「ＢＬＳ」）と比較して、術中に腫瘍を視認可能とすることの強力な補助となる。細胞内の蛍光標識を用いた原発性及び転移性の腫瘍の標識は、様々な技術を用いて行われており、レトロウイルスを用いた蛍光タンパク質の遺伝子導入、蛍光色素分子や蛍光抗体がこれに含まれる。適切な波長の光源によって蛍光標識が励起されると、その標識により視覚的な解像度が飛躍的に高くなる。放出された蛍光をデジタル信号に変換することで解像度はさらに上がり、コンピュータの画面やその他標準的なモニターで見ることができる。固定型の蛍光イメージングシステムは一般的にこの目的で使用されている。
【０００５】
これら蛍光イメージングシステムは、実験室での実験用小動物に対するＦＧＳの際には簡単に使用される。しかし、人間のガン患者を治療する際に、病院の手術室やその他病院の施設で使用するには非現実的である。例えば、Olympus OV-１００は、小動物の生体内の蛍光分子のイメージング用であるが、その像の大きさは、50cm×54cm×１００cmというキャビネットの大きさによって制限される。また、その動物の全身を装置の中に入れる必要があり、倍率0.14倍で視野は6.3cm以下となる （http://www.metamouse.com/OV１００%20brochure.pdf)。外科医が滅菌状態を維持したまま手術野中の対象部位にこうした装置を使用するのが理想的であるが、手術着と手術用手袋とを着用しているときに、彼らがこのような装置を使用することは出来ない。非腫瘍組織ではない正常組織の温存を最適化するに際し、原発腫瘍や転移巣を完全に切除する上で、手術中にこれら装置を外科医が使用することは必須である。さらに、固定化イメージングシステムでは、標識されていない組織の自家蛍光によるバックグラウンドが有意に上昇し、標識組織及び非標識組織の境界について解像度の低下や曖昧さをもたらす。蛍光標識を使用する意義は、これらを正確に区別できることにある。例えば、悪性の固形腫瘍患者の治療の機会を最適なものとするためには、正常な体細胞の切除を最低限にしなければならず、標識されていない正常組織や器官の機能の温存を図る。
【０００６】
ＦＧＳが病院でルーチンに用いられるようになり、実験室でのその使用を増やすためには、改良されたイメージングシステムが必要である。
【０００７】
ここで出願人によって開示されている引用文献は、全ての関連する先行技術が記載されていることが担保されているわけではなく、記載されている日付や表現については出願人が利用可能な情報に基づくものであり、日付や内容の正確性について担保するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明の実施態様は、蛍光ガイド下外科手術用及び蛍光ガイド下でのガンの手術用の可搬型デジタル蛍光イメージング装置とその使用方法に関するものである。一般的に言えば、本システム及び方法は、術野に可搬型プローブを向け術野の範囲内の蛍光標識を含む組織を励起させ、手術野のリアルタイムの視覚化像をディスプレイ上に表示するものである。
【０００９】
一の実施態様には、蛍光ガイド下外科手術用の可搬型イメージング装置の使用方法が含まれている。前記使用方法には、可搬型プローブを手術野に向けることが含まれており、前記可搬型プローブは光源、蛍光検出器とデジタル信号出力部とを含んでいる。前記使用方法はまた、手術野内にある蛍光標識を含む組織を、可搬型プローブの光源に応答して照射し、標識を励起することも含む。その後、可搬型プローブのデジタル信号出力部から送られた蛍光標識した組織の画像データを受信したコンピュータに従って、視覚化された手術野のリアルタイム画像を表示部上に表示することもまた、当該使用方法に含まれている。
【００１０】
本出願においては、「スクリーン」、「モニター」又はその他関連する用語が使用されるが、本願発明の実施態様においては、ＦＧＳ中の視覚化のために、これら如何なる種類や数の表示部が使用されてもよい。
【００１１】
別の実施態様には、蛍光ガイド下外科手術用の可搬型デジタルイメージングシステムが含まれる。前記システムは、光源、蛍光検出器、デジタル信号出力部、記憶装置及び処理装置を含む可搬型プローブを備えている。また前記システムはまた、可搬型プローブと通信するコンピュータを備えており、前記コンピュータは、記憶装置及び処理装置、並びに表示部を備えている。前記可搬型プローブの光源からの光を前記蛍光標識を含む組織に照射することにより、手術野の蛍光標識した組織が励起される。さらに前記コンピュータは、前記可搬型プローブの出力部から送られたデジタル信号を前記コンピュータが受信して処理し、前記手術野のリアルタイムの可視化像を表示部に表示させる。
【００１２】
本発明の前述した特長及び他の特長並びに利点について、以下に示す具体的な実施態様の詳細の説明及び例示した図によって明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
特許又は出願のファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含む本特許又は出願公開公報のカラーコピーは、必要な費用を支払うことによって米国特許庁から提供される。
【００１４】
【図１】図１は、蛍光標識した細胞を含む組織のリアルタイムデジタルイメージング用手持ちプローブを例示する概略図である。
【００１５】
【図２】図２は、本発明を実施するための工程を表したフローチャートである。
【００１６】
【図３】図３は、ＦＧＳ用の可搬型イメージングシステムの実施例を表した一連の写真であり、対応する２つの固定型イメージングシステムを比較して示す。
【００１７】
【図４】図４は、ＦＧＳ中で使用するための可搬型イメージングシステムの実施例を用いて撮影した、遺伝子を標識したMiaPaCa-2-ＧＦＰ腫瘍であり、対応する２つの固定型イメージングシステムの画像を対照して示したものである。
【００１８】
【図５】図５は、ＦＧＳ用の可搬型イメージングシステムの実施例を用いて、イメージングシステムで撮影した蛍光性抗ＣＥＡ抗体で標識したBxPC3腫瘍の画像であり、対応する２つの固定型イメージングシステムの画像を対照して示したものである。
【図６】図６は、ＦＧＳ中で使用するための可搬型イメージングシステムの実施例を用いて、蛍光性抗CA19-9抗体によるPDOX（登録商標）腫瘍を撮影した画像であり、対応する２つの固定型イメージングシステムの画像を対照して示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
感染症の予防と治療のためのワクチンと抗生物とが発見されて以来、45歳以上の成人にとって、がんが主要な死因となった。毎年、心臓病のみがこれよりも多い死因となっている。死因となる最も一般的な種類を含む殆どの細胞型−肺、乳房、結腸及び膵臓を含む−が、最初に固形の原発腫瘍を形成する。もしこの腫瘍が治療されなければ、ガンが進行する。生長している、侵襲性の原発腫瘍は、隣接する体内の構造物を圧迫して浸潤し、それらの機能を妨げる。個々のがん細胞は原発腫瘍から離れ、リンパ管を経由して局所リンパ節へ転移するか、又は血管を経由して遠隔器官、主として肺、肝臓、脳、及び骨髄に転移する。
【００２０】
固形腫瘍を形成する圧倒的多数のがんにおいて、すべてのがん細胞を外科的に完全に切除することが、治癒のための唯一の機会を与える。完全な切除には、切除された原発腫瘍の全周の周辺部に、がん細胞のないマージンを取ることが必要である。また、二次転移性腫瘍の同定と典型的な切除も必要である。原発腫瘍の切除及び転移がんの同定と切除といういずれの切除においても、手術野内の原発腫瘍とあらゆる局所的な転移性の疾病の正確な位置及び広がりを明確にする際に、外科医は、肉眼による視野及び触覚による制約を受ける。しかしながら、人間の五感では、十分な正確さを有する切除の完全性を判断することはできない。このように、手術時に、がんのマージンを正確に規定し、創傷床に残存している腫瘍を可視化し、そして転移がんを同定するという外科医の能力が、がん手術の成功を決定付け得る。手術室では、外科医の感覚を補完するものが必要になる。
【００２１】
画像診断法（Ｘ線透視法、可搬型単純Ｘ線写真、及び術中超音波などを含む）は、疾病の広がりを判断したり、外科的切除をガイドする補助として、長きに渡って外科的診察の際に用いられてきた。これらの診断方法は、生体器官周辺への腫瘍の近接と腫瘍との関係とを規定するのには有用ではあるが、原発腫瘍又は局所転移腫瘍の広がりを直接的かつリアルタイムに可視化したものを提供することはできない。むしろ、それらは、腫瘍の塊の大雑把な範囲を不正確に示唆するに過ぎない。外科医はどこが腫瘍の終端で、どこからが非腫瘍組織の始まりなのかをだいたいの範囲を評価するしかない。
【００２２】
外科的マージンに腫瘍細胞が存在しないことを確かめるために切除された腫瘍の凍結組織切片−切除された検体の周辺全体を取り囲む非腫瘍細胞の連続した縁は、がん細胞が完全に切除されていることを示唆する−は、定評のある広く使用されている技術である。この検査は手術中に行われるが、検査される組織切片は、手術室から離れたところにある病院内の別の場所に移動される。上述した画像診断法とは異なり、この技術は、その切片中の前記マージンにある１個のがん細胞を顕微鏡精度で正確に同定することはできるが、これは不完全な切除を示唆する。しかし、再度であるが、検査用に切除された組織の選別は外科医の補助具を使用しない視覚と触覚とよって判断される。加えて、凍結切片による外科的マージンの評価は、検査された切片の数及び切除された検体上での位置によって制約され、病理学者によって顕微鏡観察用に調製される。そして、外科医ではなく病理学者が、前記検体のどこを切片にするかということを正確に決定する。それゆえ、その技術の正確さはサンプリング誤差を生じ可能性がある。最後に、一般的に外科医は、直接的な評価よりも、検査をする病理学者による顕微鏡を用いた組織病理学による正確な解説に、どうしても依存せざるを得ない。
【００２３】
これら画像診断法では、手術している外科医が手術中に関心を持つ、がん化組織又はその他の組織の高解像度のリアルタイムの改善された直接的な視覚化像を、提供をすることはできない。
【００２４】
蛍光イメージングは，がんのナビゲーションに最適であり、放射線イメージング及び手術中の無影検査（bright-light inspection）や触診と比較して、高解像度かつ高感度である （Van Damら、 Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting:  first in-human results.  Nat. Med. 17, 1315-19 （2011)) 。外科的マージンが陰性であるということが、がん患者にとって治癒と延命を成し遂げるのに必須である。ヒトすい臓がんの同所性モデルマウスにおいて、ＦＧＳによって手術成績が改善し、再発率が減少した（Metildi, C.C.ら、Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models.  J. Am. Coll. Surg. 215, 126-35 （2012)) 。このことは、大腸がんにおいても当てはまる （Metildi, C.A.ら、 Fluorescence-guided surgery of human colon cancer increases complete resection resulting in cures in an orthotopic nude mouse model.  J. Surg. Res. 179, 87-93 （2013).)。
【００２５】
発色団分子、蛍光タンパク質及び蛍光抗体を含む蛍光標識は、すべて個々の細胞を標識するのに用いられてきた。主な蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質である（「ＧＦＰ」）。ＧＦＰ及び関連蛍光タンパク質は相同タンパク質のファミリーであり、発光スペクトルの範囲が442〜645nm、又はそれ以上である。これらは大きさ25〜30kDaであり、分子内発色団を形成しており、発光に際して補因子や基質を必要としない。これらの蛍光タンパク質は非常に高い蛍光係数を示し、モル吸光係数は6,500から95,000までの範囲である。加えて、量子収率も非常に高く、0.24から0.8の範囲である。これらの性質によって、蛍光タンパク質は非常に明るく発光する。ＧＦＰの大きな二光子吸収は生体内での応用に重要である。別の重要な特徴は、ファミリーの多くのメンバーの間でスペクトルに違いがあり、これにより、１セットの多色蛍光タンパク質を組み合わせて、生体内での多機能イメージング用に同時に用いることができる。これら全てを組み合わせることで、蛍光タンパク質は生体内での細胞イメージング用に最適化できる。可視スペクトルの青色領域内にある適当な励起波長の光にさらすと、ＧＦＰ標識細胞は非常に強く光る （Hoffman, R.M.  The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.  Nature Reviews Cancer 5, 796-806 （2005).)。ＧＦＰによる蛍光標識には、生体内での他の光学イメージング法よりも重要な利点がある。ＧＦＰは非常に強いシグナルを示し、その像は完全な暗闇を必要とせず、極めてシンプルな装置によってキャプチャーされる。蛍光タンパク質は多くの色を作り出し、複数のイベントの撮像を可能にしている。加えて、ＧＦＰの蛍光は、前記発色団がタンパク質の三次元構造によって保護されているため、外部環境からの影響を比較的受けない （Hoffman, R.M.  The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.  Nature Reviews Cancer 5, 796-806 （2005).)。
【００２６】
前臨床では、ＦＧＳ用の最も期待できる腫瘍標識手法では、腫瘍特異的レトロウイルスを利用して腫瘍細胞にＧＦＰ遺伝子をトランスフェクトするか、又は腫瘍特異的蛍光抗体を利用する（Bouvet, M., and Hoffman, R.M.  Glowing tumors make for better detection and resection.  Sci. Transl. Med. 3, 110sf10, 2011).)。全ての種類の腫瘍はテロメラーゼを発現しているから、テロメラーゼ依存性アデノウイルスを使用してＧＦＰを腫瘍に特異的に送達する遺伝子標識手法は、幅広い応用の可能性を示している （Kishimoto, H.,ら、In vivo internal tumor illumination by telomerase-dependent adenoviral ＧＦＰ for precise surgical navigation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 14514-17 （2009); Kishimoto, H., ら、Selective metastatic tumor labeling with green fluorescent protein and killing by systemic administration of telomerase-dependent adenoviruses.  Molecular Cancer Therapeutics 8, 3001-08 （2009); Kishimoto, H.,等、Tumor-selective adenoviral-mediated ＧＦＰ genetic labeling of human cancer in the live mouse reports future recurrence after resection.  Cell Cycle 10, 2737-41 （2011).) 。この遺伝的に安定な標識手法はまた、がんの再発の検出を可能にし、これは潜在的に大きな利点となる。しかし、ウイルスベクターは、ヒトのRNA翻訳に使用する前に、ヒトにおける安全性について更に試験をしなくてはならない （Fujiwara, T.,ら、Phase I trial of intratumoral administration of OBP-301, a novel telomerase-specific oncolytic virus, in patients with advanced solid cancer. Evaluation of biodistribution and immune response. J. Clin. Oncol. 26, 3572, 2008).) 。
【００２７】
ＦＧＳは、無影灯手術（ＢＬＳ）ではできない多くのがんの手術を可能にする。ＦＧＳの臨床的応用に関して、以下の３つの重要な課題がある：１）適切な腫瘍の標識；２）手術室用の簡素かつ可搬型のイメージングシステム；３）その技術を開発するための患者とよく似た症状を持つモデルマウス；である。腫瘍の蛍光標識及び患者とよく似た症状を持つ前記モデル動物の技術は、先行技術において幅広く記載されているが、前記蛍光標識を撮像するための固定型光源や検出システムは、上述した理由、及び他の理由により、臨床使用は非実用的である。本発明は、先行技術の装置では満たされないが、ＦＧＳに使用できるシンプルで強力な可搬型リアルタイムイメージング装置の条件を満たしている。
【００２８】
可搬型イメージングシステムで得られた格別の結果が、本発明の様々な実施態様に記載されている。手持ちのプローブは非常に軽い。可搬型蛍光イメージングシステムは比較的安価であり、1,000ドル未満で入手できる。逆に、固定型イメージングシステムは、一般的に25,000ドル〜20万ドルの間で販売されている。加えて、可搬型イメージングシステムは、病院の手術室や他の施設において使用するには非実用的な、大型で扱いにくく非常に高価なイメージングシステムより性能が優れている。このように、開示された方法及び可搬型システムを使用した様々な実施態様によって、がんやその他の疾患を治療するためにＦＧＳが幅広く画期的に行えるようになった。
【００２９】
本発明の実施態様には、腫瘍の蛍光ガイド手術を含む蛍光ガイド手術のための可搬型デジタル蛍光イメージング装置を用いるシステム及び方法が含まれている。一般的に、上記システム及び方法は、外科分野用の可搬型プローブの使用を含み、手術野の蛍光標識を含んだ組織を励起し、画面上に手術野のリアルタイムの視覚化像を画面に表示する。本発明は、固定型蛍光イメージングシステムのような先行技術のシステムを用いたことで生ずる前述問題及びその他の問題を克服することができる。臨床応用及び実験的応用の双方において、蛍光標識された原発腫瘍や転移腫瘍の手術中及び臨床場面での幅広いリアルタイムイメージングを促進するように設計されている。リアルタイム蛍光イメージングの幅広い使用は、がん患者の診断や治療において、研究者、外科医、その他医療従事者への大きな支援となるだろう。本発明は、研究者及び臨床医の双方にとって、固定型イメージングシステムを使用する場合より、ＦＧＳの有用性を広げている。
【００３０】
図１は、蛍光ガイド下外科手術用の可搬型デジタルイメージングシステム１００の模式図である。このシステム１００は、蛍光標識された細胞を含む組織のリアルタイムのデジタルイメージング用の可搬型プローブ１０を含んでいる。前記可搬型プローブ１０は、光源１２、蛍光検出器１４及びデジタル信号出力部１６を備えている。前記可搬型プローブ１０は、合理的な大きさと重さであり、操作者が片手に持てるように設計されていてもよい。組織へのダメージを避けるために、光源１２より放射される光の波長は、可視スペクトラムまたは近赤外スペクトラムの範囲でなくてはならない。ＧＦＰ又は関連する蛍光タンパク質を蛍光標識として利用する実施態様では、必要な励起光源１２は、典型的には、可視光の青色領域の範囲内になり、この光にさらされた組織には全く無害である。励起光源１２は、可搬型プローブ１０の光源１２が蛍光標識を含む組織に向けられた方向に光を照射し、外科手術野の範囲内で、前記蛍光標識を含む組織を励起する。これにより、可搬型プローブ１０で照射された前記手術野の範囲内にある全ての蛍光標識が光を放射する。前記蛍光標識から放射された光は、可搬型プローブ１０に含まれる前記蛍光検出器１４によって検出される。
【００３１】
可搬型プローブ１０はまた、記憶装置及び処理装置が含んでいる。ファームウェアはその記憶装置内に格納され、その処理装置によって実行されることにより、光子の検出結果をデジタル信号化する。少なくともこの方法では、可搬型プローブ１０は、光子の検出結果をデジタル信号化する。デジタル信号が生成されると、そのデジタル信号は、可搬型プローブ１０からコンピュータ２０にデジタル信号出力部１６を介して送られる。コンピュータ２０は、記憶装置２２と処理装置２４とを備え、記憶装置２２に格納されたソフトウェアを処理装置２４が実行して、可搬型プローブ１０から送られたデジタル信号を処理し、前記手術野内の蛍光標識を含む組織のリアルタイム像の視覚化像を表示部２６に表示する。本発明を実施している外科医又はその他の者は、可搬型プローブ１０の使用に対応してスクリーン上に映し出された手術野のリアルタイム像の可視化像を観察することができる。前記表示部は、コンピュータの画面又は内視鏡手術のために、現在、手術室で一般的に使用されている別のビデオモニター画面等の標準的なビデオモニターであってもよく、手術室又は別の臨床領域の中で応用されるもの、又は研究室もしくは別の実験に使用するものであってもよい。
【００３２】
図２は、ＦＧＳ用の可搬型デジタルイメージングシステムを使用する方法３０のフローチャートである。方法３０は、手術野に可搬型プローブを向けるステップ３１を含み、ここで、前記プローブは、光源、蛍光検出器及びデジタル信号出力部を備えている。方法３０は、ステップ３１の後に実行されるステップ３２を含んでおり、ステップ３２では、前記プローブが光源の光を前記組織に照射し、前記手術野内にある蛍光標識を含む組織を励起する。前記方法３０は、手術野のリアルタイム像の視覚化像をスクリーン上に表示するステップ３３を含み、この像は、前記可搬型プローブのデジタル信号出力部から送られた、蛍光標識を含む組織の画像データを受信したコンピュータが、モニターと通信を行うことにより表示される。
【００３３】
前記方法３０は、１種以上の蛍光プローブを用いる所望の細胞の術前標識を行なうことをさらに含んでもよい。本発明の実施形態では、蛍光プローブはＧＦＰであるが、これは例示でありこれに限定されない。別の蛍光標識を、本発明の他の実施態様で使用してもよい。
【００３４】
標的細胞を術前標識した後に、前記方法３０を前述したように術中で使用してもよい。前記手術野には、前記組織、器官及びイメージングのための領域をすべて露出させるように準備する。その後、前記可搬型プローブを滅菌野に持ってきて、方法３０を行う。前記プローブそれ自体は滅菌され、滅菌済みの鞘に収納されるか、又は手術中の滅菌性が確保されなくならないように、もしくは他の標準的な注意事項に違反することのないように、手術で使用するために準備されるようにしてもよい。
【００３５】
前記方法３０は、蛍光標識を含む組織を切除することをさらに含んでもよい。前記方法３０は、前記可搬型プローブを動かして前記光源からの光を手術野内の様々な蛍光標識を含んだ組織へ向けることを含んでもよい。さらに、前記方法は、切除用の蛍光標識を含む組織のより鮮明な可視化像の所望のイメージを表示するために、光源からの光を様々な角度で手術野に向けることを含む。前記方法３０は、外科医によって手術室で利用されてもよく、病院もしくは別の臨床の場で、又は研究室その他の実験的応用の場で使用されてもよい。
【００３６】
前記方法３０は、ガン患者用モデルマウスで実施してもよい。以前に開発されたＦＧＳでは、固定型蛍光イメージングシステムの使用によって、同所移植モデルマウスにおいてヒトの腫瘍の切除が向上すること、及び、ＢＬＳと比較して、無病生存率を含めた結果が大きく改善されたことが示された。例え、小型の実験動物を対象とした実験室ではあっても、前記方法３０と可搬型プローブ１０とにより、固定型蛍光イメージングシステムを使用した場合に生じる前述した問題を解決することができた。前記方法３０で利用される前記可搬型プローブ１０は、非常に大きくてかさばる固定型システムに比べて、より扱いやすく使用しやすい。可搬型プローブ１０は、対応する固定型蛍光イメージングシステムを使用する場合に比べて、非常に簡便に操作できるだけでなく、読み出しがコンピュータの画面上に直接映し出されるので、特殊なフィルター又はフィルターゴーグル（filter goggle）を必要としない。しかも、前記可搬型プローブ１０を使用することで、自家蛍光のバックグラウンドを減らすことができる。
【００３７】
前記方法３０は、ヒトの患者から外科的に切除した直後に、NOD/SCIDマウスの皮下に最初に移植して樹立した結腸がん患者の腫瘍検体を用いて実施してもよい。前記患者の腫瘍は、NOD/SCIDから摘出し、ヌードマウスに同所移植した。ヒト結腸ガンの腫瘍片を同所移植してから８週間後に、Alexa 448等の発蛍光団（fluorophore、これに限定されるわけではない）とコンジュゲートしたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を、担癌マウスに、開腹手術の２４時間前に、単回静脈内投与する。原発の結腸腫瘍の切除は、前記可搬型プローブ１０を用いて行った。ＦＧＳの間、前記方法３０のプロセスの後に、原発腫瘍がディスプレイ上ではっきりと視認された。
【００３８】
ヌードマウスに同所移植された結腸ガンへのＦＧＳにおける可搬型プローブの使用は、実施例だけを挙げた。方法３０は、実験動物及びヒトの双方で固形腫瘍を形成する別の細胞型で使用されることを意図した。方法３０は、原発腫瘍又は転移腫瘍を完全に切除することを目的として使用され得た。さらに、方法３０は、手術中若しくは経皮的のいずれかにおいて、転移腫瘍の存在と位置とを同定することができた。
【００３９】
図３は、ＦＧＳに使用される可搬型イメージングシステムを、これに対応する２つの固定型イメージングシステムと対比して示した一連の写真である。（Ａ）Dino-Liteデジタルカメラ及びDino-Lite可搬型イメージングシステムの写真。（Ｂ）Dino-Lite可搬型イメージングシステムの写真。（Ｃ）Dino-Liteデジタルカメラの拡大写真。カメラの寸法は10.5cmｘ3.2cm、重さはわずか105gである。（Ｄ）Olympus製のOV100 Small Animal Imaging Systemの写真。（Ｅ）Olympus製のMVX10 Macro Viewの写真。
【００４０】
図４は、遺伝子を標識したMiaPaCa-2-GFPの腫瘍の写真である。ＦＧＳ用の可搬型イメージングシステムの例を使用した場合と、これに対応する２つの固定型イメージングシステムを使用した場合とを対比して示した。原発のMiaPaCa-2-GFP腫瘍を、OV100を用いて0.14倍で撮像（Ａ）、Dino-Liteを用いて30倍で撮像（Ｂ）、及びMVX10を用いて1.6倍で撮像（Ｃ）した場合とを示した。ＢＬＳ手術後に残った腫瘍を、OV100を用いて0.14倍及び0.56倍で撮像（それぞれ、Ｄ及びＥ）、Dino-Liteを用いて30倍及び（Ｆ）、MVX10を用いて1.6倍（Ｇ）で示した。（Ａ）中の白枠は（Ｂ）及び（Ｃ）に表示した領域を示し、（Ｄ）中の白枠は、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）に表示した領域を示す。また、白い矢印は無影手術（「ＢＬＳ」）後に検出された残存腫瘍を示す。これらの画像は、本願発明の一例に過ぎず、請求項の範囲を限定することものではないと理解されるべきである。
【００４１】
図５は、蛍光抗ＣＥＡ抗体で標識されたBxPC3の腫瘍の画像である。ＦＧＳ用の可搬型イメージングシステムの例を用いた場合と、これに対応する２つの固定型イメージングシステムを使用した場合とを対比して示した。蛍光抗ＣＥＡ抗体で標識されたBxPC3の原発腫瘍を、OV100を用いて0.14倍で撮像（Ａ）、Dino-Liteを用いて30倍で撮像（Ｂ）、及びMVX10を用いて1.6倍で撮像（Ｃ）した場合を示した。ＢＬＳ手術後に残った腫瘍を、OV100を用いて0.14倍及び0.56倍で撮像（それぞれ、Ｄ及びＥ）、Dino-Liteを用いて30倍で撮像（Ｆ）、及びMVX10を用いて1.6倍で撮像（Ｇ）した結果を示した。（Ａ）中の白枠は、（Ｂ）及び（Ｃ）に表示した領域を示し、（Ｄ）中の白枠は、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）に表示した領域を示している。また、白い矢印はＢＬＳ後に検出された残存腫瘍を示す。これらの画像は、本願発明の一例に過ぎず、請求項の範囲を限定することものではないと理解されるべきである。
【００４２】
図６は、蛍光抗-CA19-9抗体で標識された、PDOX（登録商標）膵臓腫瘍の画像である。ＦＧＳ用の可搬型イメージングシステムの例を用いた場合と、これに対応する２つの固定型イメージングシステムを使用した場合とを対比して示した。原発のPDOX（登録商標）腫瘍を、OV100を用いて0.14倍及び0.56倍で撮像（それぞれ、Ａ及びＢ）、Dino-Liteを用いて30倍で撮像（Ｃ）、及びMVX10を用いて1.6倍で撮像（Ｄ）した場合とを示した。MVX10を用いた3.2倍での観察では、残存腫瘍からの信号は全く検出されなかった（Ｇ）。OV100を用いた0.89倍での観察では、残存腫瘍をバックグラウンドから区別することができなかった（Ｅ）。Dino-Liteを用いた50倍での観察では、残存腫瘍をバックグラウンドから明確に区別することができた（Ｆ）。（Ａ）中の白枠は、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に表示した領域を示している。白い破線で囲まれた領域は、ＢＬＳ後の推定残存腫瘍領域を示す。これらの画像は、本願発明の一例に過ぎず、請求項の範囲を限定することものではないと理解されるべきである。
【００４３】
術後に、前記外科的切除床を可搬型若しくは固定型イメージングシステムを用いて撮像することもでき、外科的切除の更なる解析、及び切除の完全性を確認することができる。加えて、腫瘍マージン中に腫瘍細胞が存在しないことを確認するために、前記切除された検体の組織学的評価を行うこともできる。
【００４４】
さらに別の本発明の実施態様では、前記可搬型プローブ１０を用いて、ヒトの結腸がん細胞を同所移植後２週間のマウスにＦＧＳを行なった。マウスに麻酔をかけ、腹部を滅菌した。そして、正中切開により小腸を露見させ、方法３０を用いた原発結腸腫瘍のＦＧＳを、表示部と接続した前記可搬型プローブ１０を用いて行った。ここで、腫瘍の切除をガイドする方法３０に従って前記可搬型装置１０を使用して、リアルタイム画像が生成された。
【００４５】
本発明の別の実施態様においては、がんの再発や進行を評価するために、非侵襲性の可搬型蛍光イメージングシステムを使用した。再発を縦方向に評価し、そして術後のがんの進行を監追跡するために、ヒトの固形腫瘍の異種移植片のその後の切除を、週に１回、ヌードマウスの非侵襲的撮像を行なった。マウスの全身を前記可搬型プローブを用いて外観検査し、再発腫瘍をモニター上でリアルタイムの可視化像によって同定した。
【００４６】
また別の実施態様においては、ＧＦＰ標識を使用する。このＧＦＰ標識は、OBP-401（ＧＦＰ発現性のテロメラーゼ依存性複製可能アデノウイルス）を用いることによって、ＧＦＰ遺伝子を悪性組織中に導入し、悪性組織中で選択的にこれを活性化させることによって作製する。手術をナビゲートするこの強力な補佐役によって、ヌードマウスモデルにおいて、広範囲に播種したがんの切除という難しい外科手術をそれが代表するということが示された。HCT-116株（ヒト結腸ガン）を、腹腔内に播種されたヒト結腸癌及びウイルスを腹腔内に注入することによって標識されたモデルの１例として使用した。悪性組織だけが強く蛍光を発した。腹腔内の播種性がんのヌードマウスモデルにおいて、OBP-401によるＧＦＰ標識された全ての腫瘍結節の切除は、可搬型ＦＧＳで可能となった。この実施態様及び他の実施態様で使用された可搬型のデジタルイメージングシステムの手持ちのプローブコンポーネントは、現在使用されている固定型イメージングシステムと比較して、実質的に非常にわずかな自家蛍光しか発生させず、癌組織と正常組織との間のコントラストを高め、切除をガイドする精度を高めた。
【００４７】
さらに別の本発明の実施態様では、蛍光標識を蛍光抗体として実施した。ヒトの結腸ガンの細胞型を使用した本実施態様では、外科手術直後に結腸ガンをNOC/SCIDマウスの皮下に移植して、患者の結腸腫瘍を最初に樹立した。前記腫瘍を、その後、NOC/SCIDマウスから摘出し、ヌードマウスに同所移植し、患者由来同所異種移植（PDOX（登録商標)）モデルを作製した。同所移植の８週間後、開腹の24時間前に、PDOXモデルにAlexa488をコンジュゲートしたモノクローナル抗ＣＥＡ抗体を単回静脈内投与して送達した。モニターと接続したデジタル信号出力部を備える手持ち式の可搬型イメージング装置を使用し、蛍光標識のリアルタイムの可視化像を表示した。前記可搬型装置は使いやすく、短時間で操作ができ、固定式のイメージングシステムと比較して、標識組織及び非標識組織の区別をすることを難しくする自家蛍光によるバックグラウンドも少ない。本実施態様では、本発明を実施したときに、開腹手術時に、原発腫瘍がはっきりと視認できた。
【００４８】
前述した実施態様及び実施例は、本発明及びその実用的応用を最もよく説明するため、及び当業者が本発明を製造し使用することを可能にするために示したものである。しかしながら、当業者は、前述した記載及び実施例は、例示及び実施例のみを示すためであることが理解できるだろう。前述した記載は、開示された厳密な発明の形態を網羅しているわけでも限定しているわけでもない。上述したような多くの修正又はバリエーションが、上記の教示を考慮すると可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【外国語明細書】
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