(57)【要約】  【課題】光センシングシステムにより、対物レンズを介さずに培養細胞をイメージングした画像を用いて、広域に点在するコロニー形成の同時多並列なモニタリングを可能とする細胞解析方法及び装置の提供。  【解決手段】細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、培地中に形成される細胞コロニーをモニタリングする、細胞解析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、培地中に形成される細胞コロニーをモニタリングする、細胞解析方法。
【請求項２】
細胞コロニーの形成の有無、又は細胞コロニーのサイズ若しくは立体形状が測定される、請求項１記載の細胞解析方法。
【請求項３】
２次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む細胞解析装置によって光学パターンが撮像される、請求項１又は２記載の細胞解析方法。
【請求項４】
２次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞解析を行うための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光センシングによる細胞解析方法及びそれに用いる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物等の細胞のコロニー形成評価は、従来、目視確認や顕微鏡観察に基づいて実施されている。例えば寒天培地希釈法は、２倍系列希釈の薬剤液添加寒天培地に前培養した試験菌液を塗沫し、細菌なら１８−２０時間、真菌なら４８時間培養した際のコロニー形成の有無を目視確認する方法で、試験菌の発育が完全に阻止された最小濃度の評価に用いられる。しかしながら、目視確認可能な大きさのコロニー形成までには長い内容時間を要することから、その実施効率は著しく制限されている。
【０００３】
また、コロニー形成評価には、目視確認可能な大きさのコロニー形成を待たずに、光学顕微鏡を用いて微小段階のコロニーを観察するマイクロコロニー法がある。斯かる方法では計測の迅速化が達成されているが、顕微鏡観察は対物レンズによる拡大像を利用するため、一度の観察視野は制限されることになる。そのため、広域を計測するためには、自動制御ステージなどの外部装置及び専用ソフトウェアを付設して、スキャニングを行う必要がある。しかしながら、この方法では、時間分解能や測定面積に制限があることから、計測スループット性は著しく制限され、同時に多数の菌体増殖能を評価することは困難である。特に薬剤感受性評価においては、変異によって薬剤耐性を獲得した菌体の有無の確認が重要となるため、同時に多数の菌体増殖能を評価できないことは問題である。
【０００４】
一方、ＣＣＤ等の撮像素子上の容器で培養した細胞を撮像する技術（特許文献１）、撮像素子表面に固定化した抗体に対象を捕捉し直接検出する技術（特許文献２）等が報告されている。これらは、光検出素子を用いて、細胞の形態変化情報を撮像することが行われているが、微小なコロニーの形成や成長を同時多並列にモニタリングするものではなく、コロニー形成の判定やサイズ計測を実施可能とするプログラムについても何ら報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−３１１８７９号公報
【特許文献２】特開２０１０−３８５９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、光センシングシステムにより、対物レンズを介さずに培養細胞をイメージングした画像を用いて、広域に点在するコロニー形成の同時多並列なモニタリングを可能とする細胞解析方法及び装置を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、培地中に形成される細胞コロニーをモニタリングする、細胞解析方法。
２）細胞コロニーの形成の有無、又は細胞コロニーのサイズ若しくは立体形状が測定される、上記１）の細胞解析方法。
３）２次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む細胞解析装置によって光学パターンが撮像される、上記１）又は２）の細胞解析方法。
４）２次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む、上記１）〜３）の細胞解析を行うための装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞解析方法によれば、従来の顕微鏡システムでは困難であった、広域に点在するコロニー形成の同時多並列なモニタリングが可能となり、迅速かつ正確なコロニー形成アッセイが可能となる。例えば、薬剤感受性評価において、同時に多数の菌体増殖能を評価することで、低頻度変異によって薬剤耐性を獲得した菌体の有無の確認が可能になる高精度化とコロニー形成判定の迅速化が両立できる。
また、本発明の細胞解析方法では、細菌の培養経過を高い時間分解能で経時的に記録することが可能であり、時間経過に伴う変化を生じないバックグラウンドに対して、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして判別することにより、コロニー形成の迅速な判定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の細胞解析装置の全体構成を示す断面図。
【図２】コロニー撮像画像。上段：顕微鏡画像、下段：フォトセンサ画像左：播種後培養初期段階、中央：播種後培養中期段階、右：播種後培養後期段階
【図３】フォトセンサ画像と顕微鏡画像におけるコロニーサイズの関係を示すグラフ。
【図４】フォトセンサ画像上のコロニー像（０時間〜７時間）。
【図５】フォトセンサ画像上のコロニーサイズ（抗菌薬存在下）の経時的変化を示すグラフ。
【図６】コロニーの立体形状の変化を示す画像。上段：顕微鏡画像、下段：フォトセンサ画像。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の細胞解析方法は、対物レンズを介さない光センシングシステムにより、細胞培養面を透過照明下で撮像して得られる画像（「レンズレス画像」）を解析するものである。
当該細胞解析に用いられる装置は、フォトセンサを有する撮像装置と、前記撮像装置の受光面上に載置される培養チャンバーと、培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系と、演算装置とを含む。図１に、一実施形態である細胞解析装置の構成例を示す。
【００１１】
図１に示されるように、フォトセンサ１の受光面の上部に、培養チャンバー２が載置されている。培養チャンバー２は、内部に細胞をプレーティングした培地が格納されている。培養チャンバーは、細胞を培養でき、外部から撮像が可能な容器であれば素材や形状は限定されず、例えば、プラスチック製やガラス製のディッシュやプレート上にも作製できる。
図１には、スライドガラス３とカバーガラス４を、スペーサー５を介して重ね合わせて作製されたチャンバーを示した。スライドガラスとカバーガラスにより培養チャンバーを形成する場合は、例えばスライドガラスにスペーサーシールを貼り、そこに培地を流し込んだ後、固化し、当該培地上に測定対象の細胞をプレーティングし、カバーガラスを載せることにより、作製できる。
【００１２】
ここで、用いられる培地としては、対象の細胞の生育に必要な栄養分を満たした透過性のある半固形ゲル状培地または固形培地であればよく、例えばアガロース含有培地やメチルセルロース含有培地等を用いることができる。
【００１３】
本発明に用いられる撮像装置は、培養細胞に対して透過光を照射した場合に、当該細胞由来の光シグナルを撮像できるものであればよく、例えば、固体撮像デバイスとしてＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の撮像素子を用いたフォトセンサが用いられる。斯かるフォトセンサとしては、素子が格子状その他の配置で平面状に敷き詰められた二次元フォトセンサ（エリアセンサ）が使用される。これにより、広域を一括撮像することが可能となる。
【００１４】
ニ次元フォトセンサは検出素子サイズが１０μｍ四方以下であることが好ましい。
【００１５】
透過照明光学系は、光源としてＬＥＤを用いて構成されるのが好ましく、波長域４００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲のＬＥＤを用いて構成されるのがより好ましい。コロニーの解析に十分なコントラストを得るための条件として、赤色、緑色ＬＥＤではなく、５００ｎｍより短い波長の光源を用いることが望ましく、かつ、細胞への障害が予測される４００ｎｍ未満の紫外光を避けた青色光を用いることが望ましい。
【００１６】
演算装置は、取得されたピクセルデータを演算処理等するための装置（コンピュータ）であり、後述するコロニー像のサイズや立体形状を計測するプログラムの他、照明光の強度等を制御するためのプログラムを含むことができる。
【００１７】
上記の細胞解析装置を用いて取得されるフォトセンサ画像によれば、その高輝度部と低輝度部から構成される光学パターンによってコロニー像が特定できる（図２）。また、当該コロニー像のサイズ（ピクセル数）は、実際のコロニーサイズと相関する（図３）。また、フォトセンサ画像のコロニー像をコロニーサイズとして計測することで、経時的に変化するコロニーをモニタリングすることができる（図４，図５）。そして、当該モニタリングは、フォトセンサの受光領域中に点在する全コロニーについて、同時多並列的に可能である。すなわち、広域を対象とした細胞の培養経過をモニタリングすることにより、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして検出することが可能であり、コロニー形成の迅速な判定が可能である。ここで、モニタリングとは、細胞コロニーの形成の有無、又は細胞コロニーのサイズ若しくは立体形状を測定することにより、コロニーを追跡又は解析することを意味する。
また、本発明のフォトセンサ画像中のコロニー像においては、菌体の単層ないし軽度の積層部分は高輝度部として、多層集積した中心部分は低輝度部として、さらに異なる積層状態の境界部では帯状の低輝度部として、それぞれ可視化される（図７）。したがって、得られたフォトセンサ画像中のコロニー像の光学パターンから、コロニーの立体形状の推定が可能となる。
【００１８】
尚、本発明の細胞解析方法において、解析対象となる細胞の種類は、コロニーを形成する細胞であれば特に限定されない。例えば、一般細菌、病原性細菌等の細菌類、カビ、酵母等の真菌類、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等の動物細胞に対して、適用することができる。
【実施例】
【００１９】
実施例１  ＣＭＯＳセンサを用いた広域イメージング系の構築
（１）培養チャンバーの作製
スライドガラス（厚さ：１．２ｍｍ）に９ｍｍ角のスペーサーシール（厚さ：３００μｍ）を２枚重ねて貼り、４．０％（ｗ／ｖ）低融点アガロース添加ＬＢ培地を流し込み、２０分間室温で放置することでＬＢ寒天培地を固化し、培養チャンバーを作製した。
【００２０】
（２）細菌の培養
ＬＢ液体培地中３７℃で１２時間振とう培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ８７３９株の懸濁液を遠心（８０００ｇ，２４℃，５ｍｉｎ）した後、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、菌体濃度が１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈調製した。培養チャンバーの寒天培地上に菌体懸濁液１μＬ（含有細胞数：１００  ｃｅｌｌｓ）を滴下し、プレーティングを行った。プレーティングした寒天培地にカバーガラス（厚さ：１７０μｍ）を載せ、インキュベートした（３７℃）。
【００２１】
（３）イメージング系の構築
Ｅ．ｃｏｌｉを培養した上記培養チャンバーを、プレーティング面を下にしてＣＭＯＳセンサ（ｐｉｘｅｌ  ｓｉｚｅ：３．２μｍ，受光領域：６．６ｍｍ×４．９ｍｍ）の保護ガラス上に設置した状態で、波長４６５ｎｍのＬＥＤ光照射下で撮像する広域イメージング系を構築した（図１）。
【００２２】
（４）コロニー像の取得
受光領域全面に対応する６．６ｍｍ×４．９ｍｍの透過光画像を取得した結果、高輝度部と低輝度部から構成される光学パターンが観察された（図２下段）。同位置の明視野顕微鏡画像（図２上段）と比較したところ、Ｅ．ｃｏｌｉコロニー由来の像であることが確認された。
さらに、ＣＭＯＳセンサ画像で得られたコロニー像と明視野顕微鏡画像におけるコロニー像に対し、その辺縁に外接する円を描き、その直径をコロニーサイズとして計測した。
その結果、ＣＭＯＳセンサを用いた広域イメージング系によって、実際のコロニーサイズと相関のあるコロニー像の取得が可能であることが示された（図３）。
【００２３】
実施例２  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ８７３９株に対するコロニー形成モニタリング
コロニー形成モニタリングを実施するために、培養チャンバーの厚さ６００μｍの寒天培地上でＥ．ｃｏｌｉを培養し、室温かつＬＥＤ光源を用いた波長４６５ｎｍの光照射下で、５分間隔で７時間、計８４枚の画像を取得した。
菌体のプレーティング直後（ｔ＝０ｈ）には像が観察されていなかった位置から、約２時間後にＥ．ｃｏｌｉコロニー由来と考えられる像が観察された（図４）。その後、時間経過に伴い、ＣＭＯＳセンサ画像中のコロニー像の拡大が確認された。広域を対象としたＥ．ｃｏｌｉの培養経過をモニタリングすることにより、時間経過に伴う変化を生じないバックグラウンドや矢印で示した不純物に対して、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして検出することが可能であった。この手法により、約２−３時間でコロニー形成判定を行うことが可能であった。また、ＣＭＯＳセンサの受光領域（６．６ｍｍ×４．９ｍｍ）中に点在する全コロニーについて、それぞれのサイズ変化を同時多並列に追跡可能であった。
【００２４】
実施例３  抗菌薬存在条件下におけるＥ．ｃｏｌｉコロニー形成評価
種々の抗菌薬濃度条件下でのコロニー形成評価を行うために、抗菌薬ストレプトマイシン（ＳＭ，終濃度＝０，２，４，８，１６μｇ／ｍＬ）含有の１．５％（ｗ／ｖ）低融点アガロース添加ＬＢ培地を流し込み、２０分間室温で放置することでＬＢ寒天培地を固化させた培養チャンバーを作製した。各寒天培地上に菌体懸濁液１μＬ（含有細胞数：１００  ｃｅｌｌｓ）を滴下し、カバーガラス（厚さ：１７０μｍ）を載せた。
Ｅ．ｃｏｌｉをプレーティングした寒天培地をＣＭＯＳセンサの保護ガラス上に設置し、室温で保持し、ＬＥＤ光源を用いた波長４６５ｎｍの光照射下で、１時間ごとに計９時間、画像を取得した。このとき、プレーティングを行った時間をｔ＝０ｈとした。
終濃度が０，２，４，８μｇ／ｍＬのＳＭ含有ＬＢ寒天培地上において、プレーティング直後には像が観察されなかった位置から、ｔ＝４ｈでＥ．ｃｏｌｉコロニー像が観察された。
【００２５】
各ＣＭＯＳセンサ画像上におけるコロニー由来像の面積のピクセル数をコロニーサイズとして計測した（図６）。終濃度２μｇ／ｍＬのＳＭ含有ＬＢ寒天培地においては、非含有条件下と同様に約２４００  ｐｘまでコロニーサイズの増加が確認された。終濃度４μｇ／ｍＬにおいては、ｔ＝９ｈにおいてコロニーサイズは１３６９  ｐｘとなった。一方、終濃度８μｇ／ｍＬにおいては、ｔ＝４ｈでコロニー由来像を確認して以降、サイズの増大は確認されなかった。終濃度１６μｇ／ｍＬにおいてはコロニー由来像が観察されなかった。
比較のために、１０ｃｍディッシュを用いて作製したＳＭ含有寒天培地上にＥ．ｃｏｌｉをプレーティングし、１２時間インキュベートしたのち、目視確認を行う従来法を実施した結果、終濃度８，１６μｇ／ｍＬのＳＭ条件では目視可能なコロニーは確認されなかった。一方で、終濃度０，２，４μｇ／ｍＬ条件ではコロニーが確認された。これは、広域イメージング系においてＥ．ｃｏｌｉの増殖が確認されたＳＭ含有濃度条件と一致するものであった。
以上より、広域イメージング系を用いて異なる培養条件におけるコロニーサイズ推移を評価することが可能であった。また、その評価結果が従来法の目視判定結果と相関をもつことが確認された。
【００２６】
実施例４  コロニー立体情報とＣＭＯＳセンサシグナルの相関性
実施例１の培養において、培養チャンバー上に形成されたコロニーの高さを計測したところ、４．５時間培養したコロニーは８μｍ、５．５時間培養したコロニーは１１μｍ、７．５時間のコロニーについては１４μｍとなり、培養経過に伴うコロニーの高さの上昇が確認された。また、顕微鏡観察により、菌体が単層状態から積層状態へと推移していくコロニーの立体形状の変化が確認された。
一方で、ＣＭＯＳセンサ画像中の対応するコロニー像においても、高輝度部と低輝度部から構成される光学パターンの推移が観察された（図７）。菌体の単層ないし軽度の積層部分は、高輝度部として可視化された。また、多層集積した中心部分に対応した低輝度領域が生じ、さらに異なる積層状態の境界部では帯状の低輝度部が確認された。
これより、ＣＭＯＳセンサ画像中のコロニー由来光学パターンから、コロニーの立体形状の推定が可能であることが示唆された。
【符号の説明】
【００２７】
１  フォトセンサ
２  培養チャンバー
３  スライドガラス
４  カバーガラス
５  スペーサー
６  透過照明光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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