(57)【要約】【課題】基板上に形成されたリポソームを基板から簡便に離脱させることができる、リポソームの剥離方法を提供すること。【解決手段】リポソームの剥離方法は、表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された基板の導電性領域上に形成されたリポソームの剥離方法であり、導電性領域に-5V〜-15Vのパルス状の電圧を0.5秒〜５秒間印加してリポソームを導電性領域から離脱させる。【効果】表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された基板上に形成されたリポソームを、外力を加えることなく完全な形で容易に剥離することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された基板の導電性領域上に形成されたリポソームの剥離方法であって、前記導電性領域に-5V〜-15Vのパルス状の電圧を0.5秒〜５秒間印加してリポソームを前記導電性領域から離脱させる、リポソームの剥離方法。
【請求項２】
前記基板は、底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有し、該凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板であり、前記リポソームは、前記凹部内に形成され、前記パルス状の電圧は、前記底面に印加する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記凹部が、１枚の基板上に複数個形成されており、各凹部に前記リポソームがそれぞれ形成されている請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記複数の凹部のうち、所望の凹部にのみ電圧を印加してリポソームを離脱させる請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記凹部の直径が３μm〜１００μmである請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記基板は平板状であり、該基板上に１個又は複数個のリポソームが形成される請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記基板上に形成されているリポソームがドーム状であり、前記基板から離脱したリポソームが球状である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上に形成されたリポソームを、基板から離脱させる、リポソームの剥離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、球状の脂質二重膜内に溶液が包合された自己組織化構造である。直径が数μm〜数百μmのものはジャイアント（巨大）リポソームと呼ばれる（非特許文献１）。ジャイアントリポソームは、内部に種々の物質を包合することができるので、薬剤送達系(DDS)や化粧料に広く用いられている。また、生体膜は、リポソームと同様、脂質二重膜から形成されているので、生体膜に担持される各種タンパク質を模してリポソームに各種タンパク質を担持させ、それらのタンパク質に対する結合性や作用を調べることが創薬スクリーニングにおいて行われている。すなわち、リポソームは、創薬スクリーニングにおいて、模擬細胞として用いられている（非特許文献２）。
【０００３】
従来、リポソームの製造方法としては、静置水和法（gentle hydration)やエレクトロフォーメーション(electroformation)法が広く用いられている（非特許文献１、３）。しかしながら、これらの方法により製造されるリポソームは、基板からの剥離が容易ではない、直径のバラツキが大きいという問題がある。また、有機溶媒と水の界面において、脂質の自己組織化能を利用してリポソームを形成する方法も知られている（非特許文献４）。しかしながら、この方法では、有機溶媒がリポソーム中に包合されてしまう恐れがあるという問題がある。
【０００４】
一方、フォトリソグラフィーの手法を用い、基板上に形成した凹部の開口の外周縁部にのみ選択的に脂質溶液をコーティングし、形成された脂質膜からエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法（特許文献１）や、フォトリソグラフィーの手法を用い、基板上に脂質溶液をパターニングし、形成された脂質膜からエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法（特許文献２）も知られている。これらの方法は、均一な直径を有するリポソームを製造する上で有効であるが、脂質溶液のパターニングのためのフォトリソグラフィープロセスが煩雑であるため、手間とコストがかかるという問題がある。また、基板に設けられたマイクロチャネルに脂質溶液を塗布して脂質膜をコーティングし、形成された脂質膜からエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法も知られている（非特許文献３）。この方法は簡便であるが、形成されたリポソームの直径のバラツキが大きいという問題がある。また、種々の表面形状や置換基を有するシリコン基板上でエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法（非特許文献４）も知られているが、やはりリポソームのサイズの均一性において満足することができない。
【０００５】
本願発明者らは、均一なサイズのジャイアントリポソームを簡便に形成する方法を発明し、特許出願した（特許文献３）。この方法は、底面が導電性材料で形成された凹部を有し、凹部の底面以外の表面部分は絶縁性材料で形成した基板を準備し、凹部の底面と脂質溶液との間に直流高電圧を印加しながらこの基板に対向するノズルから脂質溶液を噴霧する（エレクトロスプレー）ことにより、脂質溶液が導電性の凹部底面に選択的に飛んで凹部底面を脂質溶液でコーティングすることができ、コーティングされた脂質膜を原料として、凹部内で水和法やエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させることを含む（特許文献３、非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2009/069609 A1
【特許文献２】特開2007-98323号公報
【特許文献３】特開2012-76022号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】P.L. Luisi, et al., Giant Liposomes, John Willy and Sons Ltd., New York, 2000
【非特許文献２】A. Karlsson, et al., Nature 2001, 409, 150-2
【非特許文献３】K. Kuribayashi, et al., Meas. Sci. Technol. 2006, 17, 3121-6
【非特許文献４】M . Le Berre, et al., Langmuir 2008, 24, 2643-9
【非特許文献５】MEMS 2011, Cancun, MEXICO, January 23-27, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の方法により基板上に形成されたリポソームは、静置水和法やエレクトロフォーメーション法により形成されたものも、上記特許文献３記載の方法により、基板上の複数の凹部内に形成されたものも、基板からの剥離が容易ではなく、剥離に時間がかかり、また、外力を用いて剥離しようとすると、リポソームが破壊される場合が少なくない。もし、基板からリポソームを簡便に剥離することができれば、リポソームをDDSや化粧品等に利用することが可能になり、また、創薬スクリーニングにおいても、解析方法の自由度が増大するので有利である。
【０００９】
本発明の目的は、基板上に形成されたリポソームを基板から簡便に離脱させることができる、リポソームの剥離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、基板の導電性領域上に形成されたリポソームが、特定の大きさのパルス状の電圧を特定の時間、該導電性領域に印加することにより、外力を用いることなく容易に剥離することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された基板の導電性領域上に形成されたリポソームの剥離方法であって、前記導電性領域に-5V〜-15Vのパルス状の電圧を0.5秒〜５秒間印加してリポソームを前記導電性領域から離脱させる、リポソームの剥離方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された基板上に形成されたリポソームを、外力を加えることなく完全な形で容易に剥離することができる。剥離したリポソームは、回収してDDSや化粧品用に利用したり、解析したりすることができる。また、１枚の基板上に複数の導電性領域上にリポソームが形成されている場合には、所望の導電性領域にのみ電圧を印加してリポソームを離脱させることが可能になり、創薬スクリーニングの自由度が向上し、リポソームを利用した反応の経時的変化等を容易に調べることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のリポソームの剥離方法により凹部から離脱するリポソームの様子を模式的に示す図である。
【図２】本発明の参考例で実施したリポソームの製造方法に用いた基板の作製方法を説明するための模式断面図である。
【図３】本発明の参考例で実施したエレクトロスプレー法を説明するための模式図である。
【図４】本発明の参考例で実施した水和法を説明するための模式断面図である。
【図５】(a)は、本発明の実施例で印加したパルス電圧を示す図である。(c)、(d)は、電圧印加後のリポソームの様子を示す。(e)は、離脱後のリポソームをガラス毛管の吸引で移動している写真である。
【図６】本発明の実施例で測定した、電圧印加前のリポソームの直径(c)と離脱後のリポソームの直径(d)を示す図である。(a)は電圧印加前、(b)は電圧印加後のリポソームの様子を示す写真である。
【図７】本発明の実施例で行った、静置水和法にリポソームを形成した金基板にパルス電圧を印加する前後の状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のリポソームの剥離方法においては、表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された基板を用いる。本発明の好ましい実施形態では、底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有する基板であって、前記凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板を用いる。ここで、「表面」は、リポソーム形成時に、脂質溶液を噴霧するノズルに対向する側の表面を意味する。導電性材料としては、導電性であれば何ら限定されないが、ITO（インジウムスズオキサイド）、単結晶シリコン、各種金属等を挙げることができる。絶縁性材料としては、絶縁性であれば何ら限定されず、各種樹脂やガラス、シリコン酸化物等の半導体や金属の酸化物を挙げることができる。絶縁性材料としては、後述のようにフォトリソグラフィーによりパターニングすることができるものが好ましく、パリレン（ポリ-p-キシリレン）樹脂やシリコン酸化物等が好ましい材料として例示できるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】
基板に設けられている凹部の数は１個でもよいが、リポソームの生産性を高めるために１枚の基板に複数の凹部を設けることが好ましく、数十個から数十万個の凹部を設けることが好ましい。
【００１６】
剥離されるリポソームの直径は、凹部の直径とほぼ同じ（わずかに大きい）になるので、凹部の直径は、リポソームの目的とする直径とほぼ同じでよく、従って、通常３μm〜１００μm、好ましくは５μm〜３０μm程度である。また、凹部が複数形成されている場合には、各凹部において生成されるリポソームの直径を均一にするためには、当然ながら凹部の直径を均一にしておく必要がある。凹部の深さは、特に限定されないが、通常0.5μm〜5μm、好ましくは0.5μm〜2μm程度である。凹部を複数設ける場合、隣接する凹部間の距離は、形成されたリポソーム同士の融合を防ぐために凹部の直径よりも大きくすることが好ましい。
【００１７】
上記した基板は、導電性材料から成る底板と、該底板上に被着された、絶縁膜から形成されたものであり、前記絶縁層には、１個又は複数の透孔が形成されており、該透孔の側面が前記凹部の側面を構成し、該透孔から露出する前記底板が前記凹部の底面を構成するものであってよい。
【００１８】
このような基板は、周知のフォトリソグラフィーにより容易に作製することができる（特許文献３、下記参考例参照）。
【００１９】
上記した凹部内でのリポソームの形成方法は、特許文献３や非特許文献５に記載されており、公知であり、下記参考例にも具体的に記載されている。
【００２０】
本発明の剥離方法では、凹部の導電性底面に-5V〜-15Vのパルス状の電圧を0.5秒〜５秒間印加してリポソームを底面から離脱させる。電圧は、好ましくは、-7V〜-12V、印加時間は、好ましくは0.7秒〜２秒である。電圧が-5Vよりも高い（絶対値が小さい）場合には、リポソームが離脱せず、-15Vよりも低い（絶対値が大きい）場合には、リポソームが破壊される。また、電圧の印加時間が0.5秒よりも短い場合には、リポソームが離脱せず、５秒を超える場合には、リポソームが破壊される。
【００２１】
上記パルス電圧を印加すると、他に外力を全く加えなくても、通常、１０秒以内にリポソームが凹部から離脱する。リポソームは、凹部内に付着している状態では、底面に開口したドーム状であり、凹部から離脱すると、開口部が閉じて球状になる。この様子を図１に模式的に示す。リポソームは、凹部から離脱しても単分散状態を維持している。図１の左の図に示すように、基板上に形成された各凹部内にそれぞれドーム状のリポソームが形成されている状態で、上記パルス電圧を印加すると、中央の図に示すように、リポソームが底面から離脱して開口部がつながり、球状のリポソームとなる。球状のリポソームは、再び基板上に戻るが、ガラス毛管での吸引等により容易に移動可能で、持ち上げることもできる（図１の右の図）。
【００２２】
基板上に凹部が複数個存在し、各凹部内にリポソームがそれぞれ形成されている場合、複数の凹部のうち、所望の凹部にのみ電圧を印加して選択的にリポソームを離脱させることも可能である。これは、各凹部の底面に適切に配線を施して、特定の任意の凹部の底面のみに電圧を印加することにより容易に行うことができる。選択的に所望のリポソームのみを凹部から剥離することができれば、創薬スクリーニングの自由度が向上し、リポソームを利用した反応の経時的変化等を容易に調べることが可能になる。
【００２３】
なお、特許文献３及び非特許文献５に記載されている、上記した基板の凹部にリポソームを形成する方法は、均一な粒径のリポソームを形成可能であるので好ましいが、本発明の剥離方法は、上記した凹部に形成されたリポソームの剥離に限定されるものではなく、表面の少なくとも一部が導電性材料で形成された、凹部を有さない基板上に形成されたリポソームの剥離にも適用可能である。この場合、基板表面の全面が導電性材料で形成されていてもよいし、基板表面の１個又は複数個の領域が導電性材料で形成されていてもよい。後者の場合には、各導電性領域上にリポソームを形成する。この場合には、上記と同様、所望のリポソームのみを剥離することができる。また、この場合、リポソームの形成方法としては、周知の静置水和法やエレクトロフォーメーション法等、基板上にリポソームを形成する公知のいずれの方法をも用いることができる。
【００２４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
参考例１  リポソームの形成
(1)  基板の作製
図２に模式的に示す方法により、本発明のリポソームの製造方法に用いる上記基板を作製した。すなわち、ITOプレート１０上に化学蒸着により厚さ１μmのパリレン樹脂膜１２をコーティングした（図２(1))。次いで、パリレン樹脂膜１２上にアルミニウム膜１４を蒸着し、さらにその上にフォトレジスト膜１６をコーティングした（図２(2))。直径が約１０μmの円形の透孔を多数有するフォトマスクをフォトレジスト膜上に置き、紫外線で露光、現像してフォトレジストとアルミニウム膜を選択除去した（図２(3))。次いで、酸素プラズマエッチングにより、パリレン樹脂を選択除去し、底面がITOプレート１０、側面が厚さ１μmのパリレン樹脂１２から成る凹部１８を形成した（図２(4))。
【００２６】
(2)  エレクトロスプレー法
図３に模式的に示すエレクトロスプレー法により、脂質溶液を噴霧した。容器２０は、先端部が内径１５μmのキャピラリー状になったガラス製シリンジであり、先端を基板から1cm離した位置で、先端が基板に対向するように配置した。容器２０内に収容した脂質溶液２２は、ジオレイルフォスファチジルコリン(DOPC)とジオレイルフォスファチジルセリン(DOPS)の1:1混合物をクロロホルムとメタノールの混合溶媒中に0.5mg/mLの濃度で溶解した溶液（さらに、1%ローダミンで標識したフォスファチジルエタノールアミン(PE)を含む）であった。脂質溶液内に電極を浸漬し、この電極を直流電圧電源のプラス極に接続し、一方、各凹部の底面を形成しているITOプレート１０を直流電圧電源のマイナス極に接続し、かつアースした。2kV/cmの直流電圧を印加しながら、容器内の脂質溶液をシリンジにて押し出して１分間にわたり噴霧した。噴霧量は、約1μLであった。これにより、脂質溶液は、電圧が印加されている凹部底面に選択的にコーティングされた。コーティングされた脂質溶液の溶媒は直ぐに蒸発し、その結果、各凹部底面は乾燥した脂質膜がコーティングされた。
【００２７】
(3)  水和法
次に図４に模式的に示す水和法により、リポソームを生成させた。すなわち、基板をウェル内に載置し、20mMショ糖溶液を凹部に加えて基板を20mMショ糖溶液に浸漬した。そのまま約１分間放置すると各凹部においてリポソームが１個ずつ生成した。
【００２８】
実施例１  リポソームの剥離
図５(a)に示すように、各凹部の底面に、-10Vのパルス電圧を１秒間印加した。高速共焦点蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果、各リポソームは、電圧印加開始1.19秒後で凹部から離脱し、球状となり、電圧印加開始3.02後で基板に戻ったが、基板に戻っても単分散の球状を維持しており、ガラス毛管での吸引で容易に移動可能であった（図５(c),(d),(e))。また、離脱前後のリポソームの直径の分布を測定した。図６(c)が電圧印加前、(d)が電圧印加後の直径のヒストグラムである。電圧を印加しても、リポソームの直径の均一性は概ね保たれていた。なお、図６(a)が電圧印加前のリポソーム、(b)が離脱後、基板上付近に戻ったリポソームを示す。
【００２９】
参考例２  リポソームの形成（その２）
金基板上に、ジオレイルフォスファチジルコリン(DOPC)とジオレイルフォスファチジルセリン(DOPS)の1:1混合物をクロロホルムとメタノールの混合溶媒中に0.5mg/mLの濃度で溶解した溶液（さらに、1%ローダミンで標識したフォスファチジルエタノールアミン(PE)を含む）を塗布した。次いで、基板を20mMショ糖溶液に浸漬した。そのまま約30分間放置すると、基板上に多数のリポソームが形成された。
【００３０】
実施例２  リポソームの剥離（その２）
参考例２において用いた金基板に、-10Vのパルス電圧を１秒間印加した。その結果、パルス電圧印加後、10秒以内にリポソームが基板から剥離した。剥離したリポソームは球状であった。結果を図７に示す。
【００３１】
実施例３
基板を銀基板に変更したこと以外は、参考例２と同様にリポソームを形成し、実施例２と同様にリポソームを剥離した。実施例２と同様な結果が得られた。
【００３２】
実施例４
基板をアルミニウム基板に変更したこと以外は、参考例２と同様にリポソームを形成し、実施例２と同様にリポソームを剥離した。実施例２と同様な結果が得られた。
【００３３】
実施例５
基板をITO基板に変更したこと以外は、参考例２と同様にリポソームを形成し、実施例２と同様にリポソームを剥離した。実施例２と同様な結果が得られた。
【符号の説明】
【００３４】
１０  ITOプレート
１２  パリレン樹脂膜
１４  アルミニウム膜
１６  フォトレジスト膜
１８  凹部
２０  容器
２２  脂質溶液
２４  エレクトロスプレー
２６  コーティングされた脂質膜
２８  ウェル
３０  水系媒体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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