(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法の提供。【解決手段】式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその変異体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法。アミノ酸配列：Ｘｎ−Ｙ−Ｚ…（１）（Ｘ、Ｙ、Ｚは各々独立に特定のアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ａ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ  …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２  …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチド複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｃ）下記式（３）：
［（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３］２  …（３）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）で示されるポリペプチド複合体、
（ｄ）前記（ｃ）のポリペプチド複合体において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、かつ細胞内移行活性を有するポリペプチド複合体。
【請求項３】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ  …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｆ）前記（ｅ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２  …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
【請求項４】
以下の（ｇ）又は（ｈ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｇ）下記式（４）：
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ  …（４）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）のアミノ酸配列、
（ｈ）前記（ｇ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（５）：
［（ＷＡ−Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’−ＶＢ）３］２  …（５）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（４）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
【請求項５】
以下の（ｉ）又は（ｊ）の融合タンパク質複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｉ）下記式（６）：
［（ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ）３］２  …（６）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示される融合タンパク質複合体、
（ｊ）前記式（６）のＸｎ−Ｙ−Ｚで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された融合タンパク質複合体であって、かつ細胞内移行活性を有する融合タンパク質複合体。
【請求項６】
前記標的タンパク質が、分子量３０ｋＤａ以下のタンパク質である、請求項４又は５に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤を対象細胞に接触させる工程を含む、標的タンパク質の細胞内導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質の細胞内導入剤、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び標的タンパク質の細胞内導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、酵素反応やシグナル伝達、遺伝子発現の調整等の細胞の機能制御に重要な役割を果たしている。このため、細胞内へのタンパク質導入技術の開発が求められている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、ポリエチレンイミンを用いてタンパク質を細胞内に導入したことが記載されている。
【０００４】
一方、バクテリオファージＴ４由来の針タンパク質は、宿主である大腸菌の細胞膜を透過することが知られている（例えば、非特許文献２を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Futami J, et al., J. Biosci. Bioeng., 99, 95-103, 2005
【非特許文献２】N. Yokoi et al., Small, 6, 1873-1879, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の標的タンパク質の細胞内導入技術では、細胞に対する毒性が高い場合があった。また、細胞内への標的タンパク質の導入効率が十分でない場合があった。また、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体から標的タンパク質を放出させることが困難である場合があった。
【０００７】
そこで、本発明は、細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤を提供することを目的とする。本発明はまた、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の通りである。
［ｉ］以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ａ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ  …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２  …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
【０００９】
［ｉｉ］以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチド複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｃ）下記式（３）：
［（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３］２  …（３）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）で示されるポリペプチド複合体、
（ｄ）前記（ｃ）のポリペプチド複合体において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、かつ細胞内移行活性を有するポリペプチド複合体。
【００１０】
［ｉｉｉ］以下の（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ）下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ  …（１）
（式中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。）のアミノ酸配列、
（ｆ）前記（ｅ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（２）：
［（Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’）３］２  …（２）
（式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（１）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示す。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
【００１１】
［ｉｖ］以下の（ｇ）又は（ｈ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｇ）下記式（４）：
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ  …（４）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）のアミノ酸配列、
（ｈ）前記（ｇ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ下記式（５）：
［（ＷＡ−Ｘ’ｎ−Ｙ’−Ｚ’−ＶＢ）３］２  …（５）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’は、それぞれ、前記式（４）のＸ、Ｙ、Ｚで示されるアミノ酸配列において、０個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を示し、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示されるポリペプチド複合体が細胞内移行活性を有する、アミノ酸配列。
【００１２】
［ｖ］以下の（ｉ）又は（ｊ）の融合タンパク質複合体からなる標的タンパク質の細胞内導入剤。
（ｉ）下記式（６）：
［（ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ）３］２  …（６）
（式中、Ｗ及びＶは、標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数であり、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。）で示される融合タンパク質複合体、
（ｊ）前記式（６）のＸｎ−Ｙ−Ｚで示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された融合タンパク質複合体であって、かつ細胞内移行活性を有する融合タンパク質複合体。
【００１３】
［ｖｉ］前記標的タンパク質が、分子量３０ｋＤａ以下のタンパク質である、［ｉｖ］又は［ｖ］に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤。
【００１４】
［ｖｉｉ］［ｉｖ］〜［ｖｉ］のいずれか一項に記載の標的タンパク質の細胞内導入剤を対象細胞に接触させる工程を含む、標的タンパク質の細胞内導入方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤を提供することができる。本発明はまた、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの超遠心分析の結果を示す。
【図２】図２は、[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を導入したＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。「Ｎ」はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した核を示し、「Ｇ」はＧＦＰの蛍光を示す。
【図３】図３は、実験例２の結果を示すグラフである。（ａ）は、[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２のみをゲル濾過解析した結果を示し、（ｂ）は[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２をＨｅＬａ細胞に導入してから２４時間後の解析結果を示し、（ｃ）は[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２をＨｅＬａ細胞に導入してから４８時間後の解析結果を示し、（ｄ）はＨｅＬａ細胞のみの解析結果を示す。
【図４】図４（Ａ）は、マウス胎児の顕微鏡写真（明視野観察）であり、（Ｂ）は、マウス胎児の顕微鏡写真（ＧＦＰの蛍光観察）であり、（Ｃ）は、ＤＡＰＩで染色したマウス脳の組織切片の顕微鏡写真（蛍光観察）であり、（Ｄ）は、マウス脳の組織切片の顕微鏡写真（ＧＦＰの蛍光観察）である。
【図５】図５は、実施例２の結果を示す原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）観察画像である。（ａ）はｎが１である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像であり、（ｂ）はｎが５である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像であり、（ｃ）はｎが８である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
《標的タンパク質の細胞内導入剤》
バクテリオファージは、細菌や動物細胞に、核酸とともに必要なタンパク質を注入する。本発明の標的タンパク質の細胞内導入剤は、バクテリオファージが核酸やタンパク質を細胞に導入する機構を応用したものである。
【００１８】
１実施形態に係る標的タンパク質の細胞内導入剤は、下記式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる。
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ  …（１）
式（１）中、Ｘは配列番号１のアミノ酸配列を示し、Ｙは配列番号２〜５のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、Ｚは配列番号６〜９のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、ｎは１〜８の整数である。
【００１９】
式（１）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、バクテリオファージの尾（Ｔａｉｌ）の針部分（細胞内導入部）に基づいて設計されたものである。このポリペプチドは、後述するように安定な６量体を形成する。この６量体は、細胞にダメージを与えることなく細胞膜を貫通することができる。さらに、この６量体は、１００℃の温度環境下、ｐＨ２〜１１の環境下、有機溶媒を５０〜７０容量％含む溶媒中等の環境下でも非常に安定である。
【００２０】
式（１）中、ＸはバクテリオファージＴ４の三重らせんβヘリックスの部分のアミノ酸配列であり、この配列を繰り返すことにより、式（１）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの長さを調節することができる。ポリペプチドが長くなると、その分修飾可能な領域を増加させることができ、例えば金属錯体や蛍光色素等の追加的な機能を付加することが可能になる。Ｘのアミノ酸配列としては、配列番号１のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１１に示す。
【００２１】
式（１）中、Ｘｎにおけるｎは繰り返しの数を示す。例えば、ｎ＝２の場合、式（１）のアミノ酸配列は「Ｘ−Ｘ−Ｙ−Ｚ」のアミノ酸配列を意味する。
【００２２】
式（１）中、Ｙはバクテリオファージのニードル蛋白質のＣ末端部分のアミノ酸配列である。Ｙに使用可能なアミノ酸配列としては、例えば、バクテリオファージＴ４のｇｐ５のアミノ酸配列、バクテリオファージＰ２のｇｐＶのアミノ酸配列、バクテリオファージＭｕのｇｐ４５のアミノ酸配列、バクテリオファージφ９２のｇｐ１３８のアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、バクテリオファージＴ４のｇｐ５のアミノ酸配列として配列番号２のアミノ酸配列が、バクテリオファージＰ２のｇｐＶのアミノ酸配列として配列番号３のアミノ酸配列が、バクテリオファージＭｕのｇｐ４５のアミノ酸配列として配列番号４のアミノ酸配列が、バクテリオファージφ９２のｇｐ１３８のアミノ酸配列として配列番号５のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号２〜５のアミノ酸配列をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１２〜１５に示す。
【００２３】
式（１）中、ＺはバクテリオファージＴ４のｆｏｌｄｏｎと呼ばれる領域のアミノ酸配列、又は、バクテリオファージＰ２若しくはバクテリオファージＭｕ若しくはバクテリオファージφ９２のｔｉｐと呼ばれる領域のアミノ酸配列である。
【００２４】
ｆｏｌｄｏｎ又はｔｉｐは、バクテリオファージのフィブリチンと呼ばれる構造体の３量体化を促進する領域である。ｆｏｌｄｏｎ又はｔｉｐのアミノ酸配列を有することにより、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、３量体化して安定化すると考えられる。
【００２５】
バクテリオファージＴ４のｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列を配列番号６に、ｆｏｌｄｏｎをコードする塩基配列を配列番号１６に示す。バクテリオファージＰ２のｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号７に、バクテリオファージＰ２のｔｉｐをコードする塩基配列を配列番号１７に示す。バクテリオファージＭｕのｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号８に、バクテリオファージＭｕのｔｉｐをコードする塩基配列を配列番号１８に示す。バクテリオファージφ９２のｔｉｐのアミノ酸配列を配列番号９に、バクテリオファージφ９２のｔｉｐをコードする塩基配列を配列番号１９に示す。
【００２６】
式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、目的とする活性、すなわち、後述する６量体を形成した場合に、細胞内移行活性、すなわち、細胞膜を通過して細胞内に移行する活性を有している限り、変異を有していてもよい。例えば、式（１）で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。ここで、１若しくは数個とは、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。ここで、上記６量体はホモ６量体であってもヘテロ６量体であってもよい。
【００２７】
１実施形態において、本発明は、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸を提供する。式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、これをコードする核酸を遺伝子組換え技術により連結し、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞内で、あるいは大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現させることにより製造することができる。ここで、発現後に精製を容易にするために、ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側にヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等のペプチド鎖を付加してもよい。
【００２８】
《６量体》
式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、その構造特性に基づいて、自発的に３量体化する。さらにこの３量体２分子がＮ末端側で会合して６量体を形成する。ここで、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが形成した３量体を、式（７）：
（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３  …（７）
のように示し、この３量体２分子がＮ末端側で会合して形成した６量体を式（３）：
[（Ｘｎ−Ｙ−Ｚ）３]２  …（３）
のように示す。上述したように、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは変異を有していてもよい。また、上記の６量体はホモ６量体であってもヘテロ６量体であってもよい。以下の実施例で示すように、式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現させると、このポリペプチドは自然に自己会合して上記式（３）で示される６量体を形成する。この６量体のポリペプチド複合体は、細胞内移行活性、すなわち、細胞膜を通過して細胞内に移行する活性を有する。このため、このポリペプチド複合体に標的タンパク質を結合させることにより、標的タンパク質を対象細胞の細胞内に導入することが可能となる。
【００２９】
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入剤は、上記式（３）で示されるポリペプチド複合体からなる。
【００３０】
《標的タンパク質の細胞内導入剤への結合》
１実施形態において、細胞内導入剤への標的タンパク質の結合は、遺伝子組み換えにより、上述した式（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチドと標的タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を作製して発現させることによって行うことができる。ここで、核酸としては、上記の融合タンパク質を発現させることができる限り、使用する発現系に応じてＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００３１】
標的タンパク質としては、分子量３０ｋＤａ以下のタンパク質；ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質；Ａｓｃｌ１、Ａｔｏｈ１等の転写因子タンパク質が挙げられる。
【００３２】
標的タンパク質は、細胞内導入剤のＮ末端に結合してもＣ末端に結合してもよい。また、Ｎ末端とＣ末端の両方に結合してもよく、Ｎ末端とＣ末端の両方に、それぞれ異なる標的タンパク質を結合してもよい。細胞導入剤と標的タンパク質は、リンカーを介して結合してもよい。リンカーとしては、例えばアミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」、「ＤＶＥＤ」等からなるリンカーが挙げられる。
【００３３】
例えば、標的タンパク質が結合した細胞内導入剤のアミノ酸配列は、下記式（４）で示されるものであってよい。
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ  …（４）
【００３４】
式（４）中、Ｘｎ−Ｙ−Ｚで示される部分については、上述した通りである。式（４）中、Ｗは細胞内導入剤のＮ末端側に結合された標的タンパク質のアミノ酸配列を示し、Ｖは細胞内導入剤のＣ末端側に結合された標的タンパク質のアミノ酸配列を示す。式（４）において、Ａ及びＢは０又は１の整数であり、かつＡ及びＢが同時に０になることはない。すなわち、少なくとも細胞内導入剤のＮ末端側とＣ末端側のいずれか一方には標的タンパク質のアミノ酸配列が結合されている。
【００３５】
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入剤は、上記式（４）のアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる。
【００３６】
式（４）のアミノ酸配列をコードする核酸は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主細胞内で、あるいは大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現させることができる。式（４）のアミノ酸配列をコードする核酸の発現用ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ−１、動物細胞発現用のｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ、小麦胚芽抽出液発現用のｐＦ３Ａ等が挙げられる。ここで、発現後に精製を容易にするために、ポリペプチドのＮ末端側又はＣ末端側にヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等のペプチド鎖を付加してもよい。
【００３７】
標的タンパク質が結合した細胞内導入剤である融合タンパク質は、上述したいずれかの発現系で発現させると、自然に自己会合して、下記式（６）で示される６量体を形成する。式（６）中、ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢで示される部分については上述した通りである。この融合タンパク質の複合体を、対象細胞への標的タンパク質の導入に使用することができる。
［（ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ）３］２  …（６）
【００３８】
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入剤は、上記式（６）で示される融合タンパク質の複合体からなる。
【００３９】
１実施形態において、細胞内導入剤への標的タンパク質の結合は、化学修飾により行ってもよい。例えば、細胞内導入剤上のリシン残基又はシステイン残基と、標的タンパク質上のリシン残基又はシステイン残基とを、スクシンイミド基又はマレイミド基を有するリンカーによって連結する等の方法により、標的タンパク質を化学修飾で細胞内導入剤に結合させることができる。
【００４０】
《標的タンパク質の細胞内導入方法》
１実施形態において、標的タンパク質の細胞内導入方法は、標的タンパク質が結合した細胞内導入剤である、上記式（６）で示される融合タンパク質の複合体を、対象細胞に接触させる工程を含む。
【００４１】
対象細胞は、インビトロで培養された培養細胞であっても、生体内の細胞であってもよい。１実施形態において、生体はヒト以外の動物である。
【００４２】
１実施形態において、対象細胞に融合タンパク質の複合体を接触させる工程は、対象細胞である培養細胞の培地に上述の融合タンパク質の複合体を添加することによって行うことができる。例えば、融合タンパク質の複合体は、好ましくは終濃度０．５〜１．０μＭ、より好ましくは終濃度１．０〜５．０μＭの濃度で培地中に添加すればよい。
【００４３】
１実施形態において、対象細胞に融合タンパク質の複合体を接触させる工程は、対象細胞が存在する動物の組織に、融合タンパク質の複合体の懸濁液を注入することによって行うことができる。注入量は、対象細胞が存在する動物の組織に応じて適宜調整すればよい。例えば、マウス胎児の脳に注入する場合、１〜１０μＭの融合タンパク質の複合体を０．５〜１．０μＬ注入すればよい。
【００４４】
《標的タンパク質の細胞内での放出》
後述するように、本実施形態の方法により細胞内に導入された標的タンパク質は、細胞内で、容易に細胞内導入剤から開裂させ、放出することができる。例えば、上記式（４）のＷで示される標的タンパク質のアミノ酸配列中に、プロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配列を導入してもよい。このようなアミノ酸配列として、具体的には、ＳＳＶＰＰ、ＤＶＥＤ等のアミノ酸配列が挙げられる。アミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」は、キモトリプシンで切断することができる。また、アミノ酸配列「ＤＶＥＤ」は、カスパーゼ３で切断することができる。細胞内導入剤から切断され、放出された標的タンパク質は、細胞内で標的タンパク質本来の機能を発揮することができる。
【００４５】
ところで、例えばアミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」は、キモトリプシンにより切断されるが、サーモリシンでは切断されない。そこで、このようなプロテアーゼ特異的なアミノ酸配列を導入することにより、標的タンパク質の放出に酵素選択性を付与することもできる。
【実施例】
【００４６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）
＜「ＧＦＰ−ｇｐ５−ｆｏｌｄｏｎ」発現用プラスミドの作製＞
「ＧＦＰ−ｇｐ５−ｆｏｌｄｏｎ」（以下、「ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ」という場合がある。）発現用プラスミドを作製した。ここで、「ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ」とは、下記式（４）
ＷＡ−Ｘｎ−Ｙ−Ｚ−ＶＢ  …（４）
において、Ａ及びｎが１であり、Ｂが０であり、Ｗが標的タンパク質のアミノ酸配列、すなわち、「ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のアミノ酸配列（配列番号１０）」であり、Ｘが配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｙが「ｇｐ５のアミノ酸配列（配列番号２）」であり、Ｚが「ｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列（配列番号６）」であるポリペプチドである。なお、配列番号１０に示すＧＦＰのアミノ酸配列のＣ末端側には、プロテアーゼにより切断されやすいアミノ酸配列「ＳＳＶＰＰ」が導入されている。配列番号１０のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２０に示す。
【００４８】
より具体的には、次のようにして、ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ発現用プラスミドを作製した。まず、Ｔ４ファージのｗａｃ蛋白質の４６１から４８４残基目に対応する遺伝子をＴ４ファージゲノムよりＰＣＲで増幅してｐＵＣ１８にクローニングし、ｆｏｌｄｏｎをコードする遺伝子を得た。続いて、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理したプラスミドｐＥＴ２９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入し、プラスミドｐＭＴｆ１−３を得た。また、Ｔ４ファージのｇｐ５の４７４から５７５残基目に対応する遺伝子をＴ４ファージゲノムよりＰＣＲにより増幅してｐＵＣ１８にクローニングし、ｇｐ５をコードする遺伝子を得た。続いて、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで処理した上述のプラスミドｐＭＴｆ１−３に挿入し、プラスミドｐＫＡ１７６を得た。また、群馬大・高橋より提供されたＧＦＰ発現ベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ＧＦＰをコードする遺伝子を得、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで処理した上述のプラスミドｐＫＡ１７６に組み込み、プラスミドｐＫＮ１−１（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ発現用プラスミド）を得た。
【００４９】
＜ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの発現及び精製＞
作製したＧＦＰ−ｇｐ５ｆの発現用プラスミドを大腸菌に導入して大量に発現させて精製し、以下の実験に用いた。
【００５０】
＜ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの超遠心分析＞
上述のようにして調製したＧＦＰ−ｇｐ５ｆの超遠心分析を行った。より具体的には、１．２μＭのＧＦＰ−ｇｐ５ｆを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、Ｏｐｔｉｍａｌ  ＸＬ−Ｉ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  （Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて５００，０００ｒｐｍ、２０℃で分析を行った。
【００５１】
図１にＧＦＰ−ｇｐ５ｆの分析結果を示す。その結果、融合タンパク質ＧＦＰ−ｇｐ５ｆは、そのほとんどが自然に自己会合して、ＧＦＰ−ｇｐ５ｆの３量体（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３が２個会合した６量体[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の形態で存在していることが確認された。
【００５２】
（実験例１）
＜標的タンパク質の細胞への導入及び担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出＞
実施例１で調製した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を、ＨｅＬａ細胞の培地に０．８μＭの濃度で添加した。融合タンパク質複合体の添加１２時間後の細胞中のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。図２に蛍光顕微鏡写真を示す。図２中、「Ｎ」はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色した核を示し、「Ｇ」はＧＦＰの蛍光を示す。以上の結果から、ＧＦＰが効率よくＨｅＬａ細胞の細胞内に導入されたことが確認された。
【００５３】
（実験例２）
＜[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体の細胞内での開裂＞
実施例１で調製した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を、実験例１と同様にしてＨｅＬａ細胞の培地に添加し、細胞内に導入した。続いて、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いたゲル濾過解析により、細胞内に導入した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体の分子量の変化を経時的に解析した。具体的には、ＨｅＬａ細胞の培地に１．７μＭの濃度で[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２を添加し、２４時間後及び４８時間後に細胞を回収した。続いて、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞膜を破壊し、得られた溶液をＨＰＬＣで解析した。カラムにはＧＦ−５１０  ＨＱ（Ａｓａｈｉｐａｋ）を使用した。
【００５４】
図３は、ＨＰＬＣを用いたゲル濾過解析の結果を示すグラフである。図３中、横軸は溶出時間（分）を示し、縦軸は励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍの蛍光強度を示す。（ａ）は、[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体のみをゲル濾過解析した結果を示し、（ｂ）は[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２をＨｅＬａ細胞に導入してから２４時間後の解析結果を示し、（ｃ）は[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２をＨｅＬａ細胞に導入してから４８時間後の解析結果を示し、（ｄ）はＨｅＬａ細胞のみの解析結果を示す。溶出時間１２分付近のピークは[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２であり、溶出時間１５分付近のピークはＧＦＰである。細胞内に導入された[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質は、経時的に担体（細胞内導入剤）から開裂し、ほぼ４８時間後に完全に開裂したことが明らかとなった。この結果は、担体からの標的タンパク質の放出が容易であることを示す。
【００５５】
（実験例３）
＜動物実験＞
実験例１で調製した[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体を、マウス胎児に注入し、ＧＦＰの蛍光を観察した。具体的には、Ｅ１３．５でマウス胎児を子宮内から取り出し、側脳室に１０μＭの［（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３］２を１μＬ注射し、子宮内へと戻した。続いて２４時間後に胎児を取り出し、蛍光顕微鏡による解析を行った。図４に、顕微鏡写真を示す。図４（Ａ）は、マウス胎児の明視野観察の写真であり、（Ｂ）は、ＧＦＰの蛍光観察（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）の写真であり、（Ｃ）は、核染色試薬であるＤＡＰＩで染色したマウス脳の組織切片の蛍光観察（励起波長４０２ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）の写真であり、（Ｄ）は、マウス脳の組織切片におけるＧＦＰの蛍光観察（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）の写真である。この結果、マウスの脳内の細胞にＧＦＰが均一に導入されたことが明らかとなった。脳内の細胞にこのように均一にタンパク質を導入することは通常困難である。[（ＧＦＰ−ｇｐ５ｆ）３]２の融合タンパク質複合体の細胞内への導入効率が非常に高いことが確認された。
【００５６】
（実施例２）
＜長さの異なる細胞内導入剤の作製および確認＞
実施例１と同様にして、長さの異なる細胞内導入剤を作製し、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。より具体的には、下記式（１）：
Ｘｎ−Ｙ−Ｚ  …（１）
において、Ｘが配列番号１のアミノ酸配列であり、Ｙが「ｇｐ５のアミノ酸配列（配列番号２）」であり、Ｚが「ｆｏｌｄｏｎのアミノ酸配列（配列番号６）」であるポリペプチドであって、ｎが１、５及び８であるポリペプチドの発現用プラスミドをそれぞれ作製し、大腸菌で発現させた。得られた各長さのタンパク質（細胞内導入剤）を２μｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）に懸濁した。これらの各溶液をマイカ基板に載せ、４時間放置後に溶液中ＡＦＭによる観察を行った。結果を図５に示す。（ａ）はｎが１である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像であり、（ｂ）はｎが５である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像であり、（ｃ）はｎが８である細胞内導入剤のＡＦＭ観察画像である。上記式（１）のＸで示されるアミノ酸配列の繰り返し数を増加させることにより、細胞内導入剤の長さの伸長が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によれば、細胞に対する毒性が低く、細胞内への標的タンパク質の導入効率が高く、標的タンパク質の細胞内導入後に、担体（細胞内導入剤）からの標的タンパク質の放出が容易な、標的タンパク質の細胞内導入剤を提供することができる。本発明はまた、当該細胞内導入剤をコードする核酸及び当該細胞内導入剤を用いた標的タンパク質の細胞内導入方法を提供することができる。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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