(57)【要約】【課題】光センシングシステムにより、対物レンズを介さずに細胞培養面をイメージングした画像を用いて、高密度領域に至る細胞培養密度を簡易に測定する方法の提供。【解決手段】細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサアレイを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、細胞集密部の光学パターンに基づき計測される細胞占有面積率を指標として細胞培養密度を測定する、細胞解析方法。【選択図】図１
2015154728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサアレイを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、細胞集密部の光学パターンに基づき計測される細胞占有面積率を指標として細胞培養密度を測定する、細胞解析方法。
【請求項２】
下記式により、細胞占有面積率から細胞培養密度を算出する、請求項１記載の細胞解析方法。
【数１】
2015154728.tif 000008
【請求項３】
細胞占有面積率が、下記式により算出される、請求項１又は２記載の細胞解析方法。
【数２】
2015154728.tif 000009
【請求項４】
培養容器内に存在する培養細胞の細胞情報をピクセルデータとして取得するフォトセンサアレイ、細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む細胞解析装置によって光学パターンが撮像される、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞解析方法。
【請求項５】
培養容器内に存在する培養細胞の細胞情報をピクセルデータとして取得するフォトセンサアレイ、細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞解析を行うための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光センシングによる細胞解析方法及びそれに用いる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん研究や再生医療の分野では、細胞を培養、増殖させて薬剤効果や遺伝子機能を評価することがよく行われている。例えば、がん研究では、細胞浸潤アッセイ、血管新生動態解析、抗がん剤評価、再生医療では、幹細胞増殖評価等において、細胞アッセイが汎用されている。
斯かる細胞アッセイにおいては、細胞の形状変化、増殖率などの細胞集団の時間変化に関する情報を得る細胞キネティック解析が行われる。細胞キネティック解析を行なう場合、細胞培養密度は主たる指標であり、例えはがん細胞アッセイにおいては、抗がん剤などの因子の影響を確認するために必須であり、また幹細胞アッセイでは培養中の幹細胞が正常な増殖能力を示すことを確認する上で必須の指標である。
したがって、培養容器内の細胞集団に対して、細胞培養密度の時間経過を追跡することが求められる。
【０００３】
従来、細胞密度や細胞数の測定は、培養容器内の細胞の顕微鏡観察により行われることが多く、例えば、観察対象を移動させる自動ステージと結像光学系を組み合わせた方法（特許文献１）や、低倍率での顕微鏡撮像に適した照明を組み合わせた方法（特許文献２）が知られているが、一度に撮像される顕微鏡視野はその拡大倍率に伴い小さくなっており、一度に広範囲の培養状態を確認することが困難であると云う問題がある。また、高密度領域における細胞密度計測については、専用プログラムが開発されているが、これらのソフトウェアプログラムは、顕微鏡画像を前提としたものであり、レンズレスイメージングで得られる画像に対しては、解析プログラムの十分な検討はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−６０５１９号公報
【特許文献２】特開２０１１−８１０８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、光センシングシステムにより、対物レンズを介さずに細胞培養面をイメージングした画像（「レンズレス画像）とも称する）を用いて、高密度領域に至る細胞培養密度を簡易に測定する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、細胞培養面に近接させたフォトセンサアレイを用いて、細胞培養面を透過照明下で撮像して得られるレンズレス画像において、細胞集密部の光学パターンが計測対象領域に対して占める割合（細胞占有面積率）が、実際の細胞培養密度と良好に相関し、これを指標として細胞培養密度を測定できることを見出した。
細胞培養密度は、一般には、顕微鏡画像中で得られる明確な輪郭を持つ細胞像を前提とし、その計数によって算出されるものである。しかし、飛躍的な計測視野の拡大を実現するレンズレス画像においては、顕微鏡と同様に個別の細胞像を計数していくことは、特に高密度領域において困難であった。上記相関関係は、培養容器底面に占める細胞集密部に由来する散乱パターンの検出を前提とするものであり、これは細胞培養面全体の透過光情報を近接したフォトセンサアレイで取得、画像化することで、新たに見出されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の１）〜５）に係るものである。
１）細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサアレイを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、細胞集密部の光学パターンに基づき計測される細胞占有面積率を指標として細胞培養密度を測定する、細胞解析方法。
２)下記式により、細胞占有面積率から細胞培養密度を算出する、上記１）の細胞解析方法。
【０００８】
【数１】
2015154728.tif 000003
【０００９】
３）細胞占有面積率が、下記式により算出される、上記１）又は２）の細胞解析方法。
【００１０】
【数２】
2015154728.tif 000004
【００１１】
４）培養容器内に存在する培養細胞の細胞情報をピクセルデータとして取得するフォトセンサアレイ、細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む細胞解析装置によって光学パターンが撮像される、上記１）〜３）の細胞解析方法。
５）培養容器内に存在する培養細胞の細胞情報をピクセルデータとして取得するフォトセンサアレイ、細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む、上記１）〜４）の細胞解析を行うための装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の装置によれば、従来の顕微鏡システムでは困難であった培養容器上の全細胞の迅速計測が可能である。そして、本発明の細胞解析方法によれば、高密度領域に至る細胞培養密度を、迅速且つ簡易に測定できる。したがって、本発明は、がん研究や再生医療の産業化の進行に伴って求められる、癌細胞浸潤アッセイや幹細胞増殖評価で必要とされる経時的な細胞集団の解析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の細胞解析装置の全体構成を示す断面図。
【図２】細胞解析装置の概念図とスキャン画像。上段：集光レンズを配置した細胞解析装置の概念図（ａ）とそれを用いて撮像した画像（ｂ）、下段：集光レンズを使用しない細胞解析装置の概念図（ｃ）とそれを用いて撮像した画像（ｄ）
【図３】本発明の細胞解析装置により撮像した画像と顕微鏡画像の撮像領域の比較。（ａ）：顕微鏡画像、（ｂ）：レンズレス画像
【図４】本発明の細胞解析装置により撮像した画像と顕微鏡画像の比較。（ａ）：顕微鏡画像、（ｂ）：レンズレス画像
【図５】本発明の細胞解析装置により撮像した画像と顕微鏡画像の比較（１２〜６０時間）。上段：レンズレス画像、下段：顕微鏡画像
【図６】レンズレス画像と顕微鏡画像の輝度極大点計数に基づく細胞培養密度の関係を示すグラフ。
【図７】細胞占有面積率（％）と実際の細胞培養密度との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の細胞解析方法は、対物レンズを介さない光センシングシステムにより、細胞培養面を透過照明下で撮像して得られる画像（「レンズレス画像」）を解析するものである。
当該細胞解析に用いられる装置は、光センシングシステムとして、培養容器内に存在する培養細胞の細胞情報をピクセルデータとして取得するフォトセンサアレイが採用され、これと、細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置から構成される。図１に、一実施形態である細胞解析装置の構成例を示す。
【００１５】
図１に示されるように、培養容器１の近接、ここでは下部にフォトセンサ２が配置され、培養容器１の上方には、透過照明光源３と集光レンズ４が配置されている。
ここで、培養容器としては、細胞の平面接着培養ができるものであればく、例えばディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート等が使用できる。
【００１６】
フォトセンサアレイとしては、ラインセンサが使用される。ラインセンサには、光電変換素子が線状に一列又は複数列に配置されたものがあるが、本発明においてはその何れでもよい。ラインセンサによる一次元走査撮像によれば、培養容器の全領域を高分解能で撮像することが可能である。
ここで、用いられる光電変換素子としては、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等のイメージ素子が使用可能であり、１０μｍ／ｐｉｘｅｌ以下の解像度を有するものが好ましい。
【００１７】
また、当該センサ又は培養容器には、被写体（培養容器）又はセンサを移動するための移動手段５が適宜設けられる。
【００１８】
透過照明光学系は、光源としてＬＥＤを用いるのが好ましく、波長４００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲のＬＥＤを用いるのがより好ましい。
【００１９】
また、ＬＥＤを光源として用いた場合、集光レンズとして両凸レンズを用い、平行光照射条件下での撮像とするのが好ましい。非平行光照射条件で、ラインスキャンした場合、取得画像における受光領域は長方形状であるが（図２（ｄ））、集光レンズを配置して平行光照射条件で撮像を行うことにより、取得画像においてレンズ有効径に対応する円形状の受光領域が得られ（図２（ｂ））、レンズ径を拡大することにより、計測対象容器全面の撮像が可能となる(図３（ｂ）)。したがって、集光レンズとしては、例えば、有効径６０ｍｍ、焦点距離６３ｍｍの球面凸レンズを用い、光源を焦点距離の位置に置くことができる。
【００２０】
演算装置は、取得されたピクセルデータを演算処理等するための装置（コンピュータ）であり、後述する細胞占有面積率、細胞培養密度を演算処理するためのプログラムの他、照明光の強度やレンズの焦点位置、センサの駆動位置等を制御するためのプログラムを含むことができる。
【００２１】
斯様に、本発明の細胞解析装置によれば、対物レンズによる拡大を行わず、ラインセンサによる一次元走査撮像（レンズレスイメージング）を行うことで、計測対象容器全面の広域イメージングが可能である（図３（ｂ）、図４（ｂ）参照）。そして、その画像は、細胞増殖と共に細胞占有面積が増加し、顕微鏡画像と同様に、細胞増殖の追跡が可能である（図５上段参照）。
【００２２】
尚、本発明の細胞解析方法において、解析対象となる細胞の種類は特に限定されず、試験の目的に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、哺乳動物細胞であり、哺乳動物としては、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、羊、齧歯類（例えば、マウスやラット、ウサギ、リス、クマ）、霊長類（例えば、チンパンジー、サル、ゴリラ、ヒト）、およびそれらのトランスジェニック種を含む。斯かる細胞は、初代培養哺乳動物細胞、樹立された哺乳動物細胞、付着細胞、不死化細胞株、幹細胞由来の分化細胞、幹細胞または組織から新たに単離した細胞等、何れのものでも良い。
【００２３】
本発明の細胞解析装置により撮像されるレンズレス画像を用いることにより、細胞数が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の低密度領域においては、画像中、任意の閾値設定より指定した局所領域内で最も輝度の高い箇所、すなわち画像中の輝度極大箇所の検出により、細胞像を計数し、細胞培養密度を計測することができる。
【００２４】
一方、細胞数が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２を超える細胞集密部（高密度領域）については、輝度極大箇所の検出閾値が適切に設定できないため、個々のシグナル計数の誤差が大きくなり（図６）、上記の方法によっては正確な測定は不可能である。
斯かる場合において、本発明者らは、下記式によって算出される、細胞集密部の光学パターンが計測対象領域に対して占める割合（細胞占有面積率）に着目した。
【００２５】
【数３】
2015154728.tif 000005
【００２６】
ここで、細胞集密部（ｐｘ）は、培養容器底面に存在する細胞に由来してレンズレス画像中に発生した散乱パターンが生じている領域のピクセル数である。散乱パターンの周縁部は、細胞の存在しない背景に比べて輝度の低い領域に囲まれるため、その内側のピクセル数が計測される。また、計測対象領域（ｐｘ）は、画像中の培養容器底面に対応する領域のピクセル数である。
そして、斯かる細胞占有面積率（％）と、顕微鏡観察によって測定された細胞培養密度との関係を検討・解析したところ、図７に示すように、細胞占有面積率と細胞培養密度には、良好な相関があることを見出した。
【００２７】
すなわち、得られたレンズレス画像より、細胞集密部（ｐｘ）の面積と、計測対象領域（ｐｘ）の面積を求め、細胞占有面積率（％）を算出して、以下の関係式を用いることにより、高密度領域における細胞培養密度を測定することができる。式中のａは、計測対象細胞種による係数であり、性状の大きく異なる細胞種を対象とした計測の際には補正した数値を用いることで対応できる。
【００２８】
【数４】
2015154728.tif 000006
【００２９】
斯くして得られる、細胞培養密度の測定によれば、培養容器内の細胞集団に対して、細胞培養密度の時間経過を追跡することが可能となり、がん細胞アッセイにおける抗がん剤などの因子の影響評価や、幹細胞アッセイにおける培養中の幹細胞が正常な増殖能力を示すことの確認が実施できるようになる。
【実施例】
【００３０】
実施例１  レンズレスラインスキャンによる画像の取得
ラインセンサ（解像度：５．３μｍ／ｐｉｘｅｌ）、集光レンズ（焦点距離：３０ｍｍ，有効径：２２ｍｍ）、ＬＥＤ（波長：４６５ｎｍ）を用い、ＨｅＬａ細胞を接着培養した直径３５ｍｍの培養ディッシュを計測対象としてラインセンサの上部に配置し、レンズレスラインスキャンによる撮像系を構築した。
ＬＥＤを点光源とみなしてレンズの焦点位置に配置し、平行光照射条件で撮像を行ったところ（図２（ａ））、取得画像において、レンズ有効径２２ｍｍに対応する円形状の受光領域であった（図２（ｂ））。
一方、培養ディッシュ上方に設置したＬＥＤによる、集光レンズを用いない非平行光照射条件でラインスキャン撮像を行ったところ（図２（ｃ））、取得画像における受光領域は長方形状であった（図２（ｄ））。
さらに、照明に使用するレンズの有効径を６０ｍｍに拡大したレンズレスラインスキャンシステムにより撮像したところ、ＩＮＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒを用いて取得した計測対象ディッシュ全面の明視野顕微鏡画像（対物レンズ倍率：４倍，視野数：２３×１７，図３（ａ））に対応する広域のホールディッシュ撮像が可能であった（図３（ｂ））。
また、同領域の明視野顕微鏡画像（図４（ａ））と比較したところ、レンズレスラインスキャンによる取得画像において、細胞透過光像が確認された（図４（ｂ））。
【００３１】
実施例２  レンズレス画像に基づくＨｅＬａ細胞の増殖追跡の実施
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，１％ＰＳ，１％ＮＥＡＡ）を加えた培養ディッシュ（直径３５ｍｍ）にＨｅＬａ細胞を３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播種し、３７℃で１２時間インキュベートすることで底面に接着させた。培養中のディッシュに対し、ＬＥＤ（波長：４６５ｎｍ）点光源と両凸レンズ（レンズ径：６０ｍｍ）を用いて調節した平行光照射下で、ラインセンサを走査させることで、レンズレス画像を取得した。同様の計測を１２時間毎に播種後６０時間後まで実施した。
得られたレンズレス画像において、接着培養細胞に由来するシグナルが確認され、時間経過にともなって細胞占有面積が増加する様子を観察可能であった（図５）。
【００３２】
実施例３  細胞培養密度の測定
上記レンズレス画像において、細胞は中心部が周辺より明るいパターンとして可視化される。そこで、顕微鏡画像と同様に、輝度極大点の計数に基づく、細胞密度計測を試みた。その結果、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２を超える密度領域については個々のシグナル計数の誤差が大きくなることが確認された（図６）。
そこで、レンズレス画像中で得られる細胞集密部の計測対象領域に対して占める割合を以下により算出した。
【００３３】
【数５】
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【００３４】
一方、実際の細胞培養密度を同領域の顕微鏡画像中の細胞像を計数することで計測した。
その結果、当該細胞占有面積率（％）が、実際の細胞培養密度と高い相関を持つことが示唆された (図７)。
【符号の説明】
【００３５】
１  培養容器
２  フォトセンサ
３  透過照明光源
４  集光レンズ
５  移動手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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