(57)【要約】【課題】パルプを含む液体培地を用いてトリコデルマ属菌を培養するセルラーゼの製造方法において、製造工程を複雑化させることなくセルラーゼの生産量を増大させることが可能なセルラーゼの製造方法を提供すること。【解決手段】水溶性糖類を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属菌を培養する工程を包含するセルラーゼの製造方法であって、該水溶性糖類を含む液体培地は、炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む原料液体培地にセルラーゼを加え、酵素反応させて水溶性糖類を生成させることにより得られたものである、セルラーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性糖類を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属菌を培養する工程を包含するセルラーゼの製造方法であって、
該水溶性糖類を含む液体培地は、炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む原料液体培地にセルラーゼを加え、酵素反応させて水溶性糖類を生成させることにより得られたものである、セルラーゼの製造方法。
【請求項２】
前記パルプの原料液体培地中における濃度が６％Ｗ/Ｖ以上である請求項１に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
前記水溶性糖類の水溶性糖類を含む液体培地中における濃度が１重量％以上である請求項１又は２に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項４】
前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の原料液体培地中における濃度が３５ｍＭ以上である請求項１〜３のいずれか一項に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項５】
前記紙類が上質紙、更紙、コピー用紙、新聞紙及びダンボール紙からなる群から選択される少なくとも一種である請求項１〜４のいずれか一項に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項６】
前記トリコデルマ属菌が、トリコデルマ・リーセイである請求項１〜５のいずれか一項に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項７】
培養の過程において水溶性糖類を含む液体培地に対してパルプを追加しない請求項１〜６のいずれか一項に記載のセルラーゼの製造方法。
【請求項８】
炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む原料液体培地にセルラーゼを加え、酵素反応させて水溶性糖類を生成させることにより得られる、トリコデルマ属菌を培養するために用いられる液体培地。
【請求項９】
前記パルプの原料液体培地中における濃度が６％Ｗ/Ｖ以上である請求項８に記載の液体培地。
【請求項１０】
前記水溶性糖類の水溶性糖類を含む液体培地中における濃度が１重量％以上である請求項８又は９に記載の液体培地。
【請求項１１】
前記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の原料液体培地中における濃度が３５ｍＭ以上である請求項８〜１０のいずれか一項に記載の液体培地。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のセルラーゼを用いることを特徴とするセルロース資源の分解または糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセルラーゼの製造方法に関し、特に、炭素源として紙由来のパルプを含む液体培地を用いてトリコデルマ属菌を培養することによりセルラーゼを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース資源を有効利用するために、近年、セルロースを効率的に分解する方法が探索されている。自然界ではセルロースは主として微生物によって分解されており、細菌や糸状菌などの様々な微生物がセルロース分解酵素を生産することが知られている。
【０００３】
これらの微生物は菌体外にセルロース分解酵素を分泌し、セルロースはその作用により、主に、セロオリゴ糖、セロビオースを経てグルコースへと分解される。セルロース分解酵素は、一般に、セルラーゼと呼ばれている。
【０００４】
人工的にセルラーゼを製造しようとする場合、セルラーゼを分泌する微生物としては、トリコデルマ属が知られており、広く利用されている。そして、トリコデルマ属に属する微生物（以下「トリコデルマ属菌」という。）を炭素源及び窒素源などの栄養を含む培地を用いて培養し、セルラーゼを分泌させる方法も知られている。
【０００５】
特許文献１には炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプを含む液体培地を用いてトリコデルマ属菌を培養することによりβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼを製造する方法が記載されている。紙は入手が容易かつ安価であり、この方法によれば、高活性のセルラーゼを安価に製造することが可能である。
【０００６】
しかしながら、工業的規模で実施するためには未だセルラーゼの供給能力を増強する必要があり、セルラーゼの生産量を安定して増大させる技術が要求される。
【特許文献１】国際公開第２０１０／７０７４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
セルラーゼの生産量を向上させるためにはトリコデルマ属菌の生育を促進する必要がある。そのための手段として、培地を高濃度化してトリコデルマ属菌の栄養を豊富にすることが有効である。他方では、培地は、培養時に通気を提供する必要があり、空気を取り込むことができる良好な攪拌性を有する必要がある。
【０００８】
紙類は水を含むと糊状になり、高粘度化する。それゆえ、従来のパルプを含む液体培地は、紙類の含有量を増大させて培地を高濃度化すると攪拌性が低下し、トリコデルマ属菌の生育が阻害されてセルラーゼの生産量が却って低下する。
【０００９】
通常使用される通気撹拌培養装置の攪拌能力を考慮すると、液体培地のパルプの初期濃度は約５％以下が好ましい。この場合、セルラーゼの生産量を増大させるためには、トリコデルマ属菌の培養がある程度進行した後に、液体培地にパルプを追加する必要がある。培養の途中でパルプを追加することは製造工程を複雑化し、また雑菌によって液体培地が汚染される原因にもなる。
【００１０】
本発明は上記従来の問題を解決するものであり、その目的とするところは、パルプを含む液体培地を用いてトリコデルマ属菌を培養するセルラーゼの製造方法において、製造工程を複雑化させることなくセルラーゼの生産量を増大させることが可能なセルラーゼの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、水溶性糖類を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属菌を培養する工程を包含するセルラーゼの製造方法であって、
該水溶性糖類を含む液体培地は、炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む原料液体培地にセルラーゼを加え、酵素反応させて水溶性糖類を生成させることにより得られたものである、セルラーゼの製造方法を提供する。
【００１２】
ある一形態においては、上記パルプの原料液体培地中における濃度が６％Ｗ/Ｖ以上である。
【００１３】
ある一形態においては、上記水溶性糖類の水溶性糖類を含む液体培地中における濃度が１重量％以上である。
【００１４】
ある一形態においては、上記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の原料液体培地中における濃度が３５ｍＭ以上である。
【００１５】
ある一形態においては、上記紙類が上質紙、更紙、コピー用紙、新聞紙及びダンボール紙からなる群から選択される少なくとも一種である。
【００１６】
ある一形態においては、上記トリコデルマ属菌が、トリコデルマ・リーセイである。
【００１７】
ある一形態においては、培養の過程において水溶性糖類を含む液体培地に対してパルプを追加しない。
【００１８】
また、本発明は、炭素源として加熱処理もアルカリ処理も行わない紙類由来のパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素またはアミノ態窒素を含む原料液体培地にセルラーゼを加え、酵素反応させて水溶性糖類を生成させることにより得られる、トリコデルマ属菌を培養するために用いられる液体培地を提供する。
【００１９】
ある一形態においては、上記パルプの原料液体培地中における濃度が６％Ｗ/Ｖ以上である。
【００２０】
ある一形態においては、上記水溶性糖類の水溶性糖類を含む液体培地中における濃度が１重量％以上である。
【００２１】
ある一形態においては、上記アンモニア態窒素またはアミノ態窒素の原料液体培地中における濃度が３５ｍＭ以上である。
【００２２】
また、本発明は、上記いずれかに記載の方法により製造されたセルラーゼを提供する。
【００２３】
また、本発明は、上記セルラーゼを用いることを特徴とするセルロース資源の分解または糖化方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の方法によれば、パルプを含む液体培地を用いてトリコデルマ属菌を培養するセルラーゼの製造方法において、製造工程を複雑化させることなくセルラーゼの生産量を増大させることが可能である。本発明の方法で得られるセルラーゼはβ−グルカナーゼ活性及びキシラナーゼ活性が高く、バガス又は稲わら等のキシランを含む天然セルロース資源の糖化に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
液体培地
本発明の液体培地は、水溶性糖類を含み、トリコデルマ属菌が生育する栄養を含む水性液である。本発明の液体培地は、炭素源として紙類由来のパルプ、及び窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地（例えば、マンデル培地）を原料として用いて調整される。本発明の液体培地を調製するための原料になる液体培地（以下「原料液体培地」という。）の一例を以下に示す。
【００２６】
紙類：６ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：０．１４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、コーンスティープリカー：２ｍＬ、ツイーン８０：０．１ｍＬ、微量元素液（Ｈ３ＢＯ４  ６ｍｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ、ＦeＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＣuＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＭnＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ液）：０．１ｍＬ、水：１００ｍＬを含む（燐酸または水酸化ナトリウムでｐＨ４．８に調整）
【００２７】
本発明の液体培地を調製するために、原料液体培地にセルラーゼを添加し、酵素反応させる。セルラーゼと反応することによってパルプは加水分解する。その結果、液体培地は粘度が低下し、培地の攪拌性が向上する。また、パルプが短繊維化及び糖化され、短繊維、オリゴ糖や多糖、キシロース等の低分子の糖、またはその他、水溶性糖類が生成される。
【００２８】
酵素反応の結果、本発明の液体培地は０．１重量％以上、好ましくは０．５重量％以上、より好ましくは１重量％以上の水溶性糖類を含有する。本発明でいう水溶性糖類は、液体培地の上清中に含まれる水溶性の糖類をいう。水溶性糖類の濃度が１重量％以上の場合にセルラーゼの生産量が顕著に向上する。
【００２９】
水溶性糖類の濃度の上限は、一般に１０重量％、好ましくは７重量％、より好ましくは５重量％である。水溶性糖類の濃度を１０重量％を超えて高めるためには多量の酵素あるいは長時間の酵素反応が必要になり、コスト高あるいは生産効率が低下する。
【００３０】
セルラーゼは少なくともエンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ、およびβ−グルコシダーゼを含み、中性〜アルカリ性領域、好ましくは、ｐＨ７〜１０で活性を持つものであればよく、特に限定されない。例えば、セルラーゼ酵素剤を使用してよい。セルラーゼの添加量は、パルプの重量に対して１〜２００Ｖ／Ｗ％であり、２．５〜１８０Ｖ／Ｗ％が好ましく、３０〜１００Ｖ／Ｗ％が特に好ましい。
【００３１】
セルラーゼの添加量が、パルプの重量に対して１Ｖ／Ｗ％未満であると、酵素反応に長時間を要し、処理効率が低下する。また、セルラーゼの添加量が、パルプの重量に対して２００Ｖ／Ｗ％を超えると、多量の酵素が必要になる割には処理効率がそれほど向上しないので、コスト面で問題がある。
【００３２】
酵素反応の反応条件は、ｐＨは中性〜アルカリ性領域（ｐＨ７〜１０）、温度４０〜５０℃程度が好ましい。反応時間はパルプを含む液体培地の粘度が低下して、攪拌性が良好になるように設定する。また、反応時間はセルラーゼ酵素剤の使用量を考慮して、水溶性糖類の濃度が好ましい値になるように設定する。酵素反応の反応時間は、例えば１分〜５時間、好ましくは５分〜２時間である。
【００３３】
パルプとは紙類の製造原料に用いられる繊維をいう。パルプの種類は化学パルプ及び古紙パルプのようなセルロース純度が高いものが好ましい。好ましいパルプは、紙類を分解、切断などして得られる紙類由来のパルプである。つまり、本願明細書のパルプは無形化された紙類をいう。
【００３４】
好ましい紙類の具体例としては、上質紙、更紙、コピー用紙、新聞紙及びダンボール紙などが挙げられる。紙類は好ましいパルプが含まれているものであればよく、印刷や筆記がなされたものや一般に古紙と呼ばれているものでもよい。例えば古書、雑誌及び使い古したノートの頁、チラシ、封筒、便箋、葉書、ティッシュ紙なども使用できる。
【００３５】
原料液体培地中のパルプの濃度は、酵素の生産効率を考慮すると高ければ高いほどよい。すなわち、その上限は、酵素反応後の液体培地が良好な撹拌性を示す限度の量である。なお、原料液体培地の攪拌混合を容易にするために、紙類はシュレッダーにより、裁断して用いることが好ましい。
【００３６】
原料液体培地中のパルプの濃度は１％Ｗ／Ｖ以上、好ましくは３％Ｗ／Ｖ以上、より好ましくは６％Ｗ／Ｖ以上である。パルプの濃度が１％Ｗ／Ｖ未満であるとセルラーゼの生産量があまり増大しない場合がある。
【００３７】
セルラーゼによる酵素反応を行わない場合、パルプを６％Ｗ／Ｖ以上の濃度で含む培地は粘度が上昇し、可攪拌性が低下する。その場合、通常使用される通気撹拌培養装置では、液体培地中に空気を十分に巻き込むことができず、そのまま培養に使用するとセルラーゼの生産量が低下する可能性が高くなる。セルラーゼによる酵素反応を行う場合、パルプを６％Ｗ／Ｖ以上の濃度で含む培地は、水溶性糖類の濃度が１重量％以上になるまでに要する反応時間が比較的短時間である。
【００３８】
原料液体培地中のパルプの濃度は、攪拌装置の性能に応じて２０％Ｗ／Ｖ以下、好ましくは１５％Ｗ／Ｖ以下、より好ましくは１０％Ｗ／Ｖ以下でありうる。一般的には、原料である液体培地中のパルプの濃度は４〜１５％Ｗ／Ｖ、好ましくは６〜１２％Ｗ／Ｖである。
【００３９】
パルプは天然に存在する分子構造をそのまま保持している天然セルロース材料である。本発明の原料液体培地は、炭素源として、パルプと組み合わせて、又はパルプに代えてパルプ以外の天然セルロース材料を使用してもよい。好ましい天然セルロース材料には、ビール粕、麦茶抽出粕、小麦ふすま、リンゴの絞り粕等のような果実の絞り粕などが挙げられる。これらの天然セルロース材料の製造方法及び使用方法は、例えば、特開２０１１−４１５４０号に具体的に説明されている。パルプ以外の天然セルロース材料の使用量は、酵素反応後の液体培地が良好な撹拌性を示す程度の量であれば、特に限定されない。
【００４０】
アンモニア態窒素とはアンモニア又はアンモニア由来のアンモニウム塩に含まれている窒素をいう。また、アミノ態窒素とはアミン又はアミン由来のアミノ化合物に含まれている窒素をいう。アンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む化合物は、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸二アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア水、尿素、アミノ酸およびその塩（例えば、グルタミン酸ナトリウム）である。
【００４１】
これらのうち、窒素源として本発明の液体培地に用いるのに特に好ましい化合物は、硫酸アンモニウムである。その理由は、コストが低く入手が容易だからである。
【００４２】
アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の液体培地中における濃度は、アンモニウムのモル数として３５〜６６０ｍＭである。好ましくは、５０〜５８０ｍＭである。濃度が３５ｍＭ未満であるとセルラーゼ、特にβ−グルカナーゼの生産量があまり増大しない場合がある。また、この初期濃度が６６０ｍＭを超えると酵素の生産性が低下する。また、アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の液体培地中における濃度は、液体培地中のパルプの濃度に応じて、増減させることが好ましい。
【００４３】
本発明の原料液体培地は、窒素源として、アンモニア態窒素又はアミノ態窒素と組み合わせて、又はこれらに代えて廃菌体を使用してもよい。廃菌体とは、酵素のように微生物を増殖させて生産する物質の生産において、目的とする成分を採取した後に残される菌体や培地などの残渣、あるいはその加工物をいう。廃菌体の製造方法及び使用方法は、例えば、特開２０１１−４１５４０号に具体的に説明されている。廃菌体の使用量は、セルラーゼの生産量が向上する程度の量であれば、特に限定されない。
【００４４】
セルラーゼの製造方法
トリコデルマ属菌はセルロースの糖化に必要なセルラーゼの生産菌として知られている。本発明に使用するトリコデルマ属菌はセルラーゼを生産するものであれば特に限定されない。好ましいトリコデルマ属菌はトリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデである。特に好ましくは、トリコデルマ・リーセイである。
【００４５】
糸状菌トリコデルマ・リーセイおよびトリコデルマ・ビリデの菌学的性質は、例えば、イー・ジー・シモンズ，アブストラクト・セカンド・インターナショナル・マイコロジカル・コングレス（E.G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress） 米国フロリダ州タンパ，１９７７年８月，６１８頁）に記載されている。
【００４６】
液体培養には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、上記水溶性糖類を含む液体培地を使用して、培養温度２０〜３３℃好ましくは、２８〜３０℃、培養ｐＨ４〜６で、４〜１０日間培養する。
【００４７】
ついで、要すればこの培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去して、トリコデルマ属菌培養上清液が得られる。トリコデルマ属菌培養液または培養上清液には目的とするセルラーゼ、すなわちβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼが高濃度で含まれている。
【００４８】
得られる培養液または培養上清液のβ−グルカナーゼ活性は２５Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは４０Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上である。また、この培養液または培養上清液のキシラナーゼ活性は６０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１００Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは１４０Ｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１６０Ｕ／ｍｌ以上である。培養液または培養上清液のβ−グルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性のいずれかが上記下限より低下すると、天然に存在する多様なセルロース資源の有効利用という目的に対する効果が低くなる。
【００４９】
尚、上記キシラナーゼ活性は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、５４０ｎｍの吸光度の増加で定量することができる。
【００５０】
より具体的には１％キシラン基質溶液（シグマ社製 Xylan, from oat spelts を２００ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解）１．９ｍｌに培養液または培養上清液0.1ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（０．７５％ジニトロサリチル酸、１．２％水酸化ナトリウム、２２．５％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、０．３％乳糖１水和物を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止する。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱する。続いて、室温まで冷却した後、５４０ｎｍの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量する。１単位のキシラナーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表す。
【００５１】
セルロース資源の分解または糖化方法
本発明の方法により得られたセルラーゼは、セルロース資源を分解または糖化するのに有用である。ここでいうセルロース資源は、合成セルロースもしくは天然セルロース資源のどちらでも良い。合成セルロースとは、セルロース粉末として、流通しているものを表す。天然セルロース資源とは、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕、木材などが挙げられる。本発明は、β-グルカナーゼおよびキシラナーゼを同時に高生産できるため、特に、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕などの天然セルロース資源の糖化に優れている。
【００５２】
セルロース資源の分解または糖化方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース資源を水性媒体中に懸濁させ、上記培養液または培養上清液を添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。セルロース分解活性を示す上記培養液または培養上清液の代わりにその乾燥物、または乾燥物を水に分散もしくは溶解した液を用いてもよい。
【００５３】
セルロース原料は、予め脱リグニンしておくことが好ましい。懸濁方法、攪拌方法、上記混合液の添加方法、添加順序、それらの濃度等の反応条件は、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整される。
【００５４】
その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は３０〜７０℃、ｐＨは３〜７の範囲でよい。また、この圧力、温度、ｐＨについても、上記同様、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、常圧で、酢酸またはリン酸緩衝液中で、温度５０〜６０℃、ｐＨ４〜６の範囲で行うことが好ましい。反応時間は一般に６〜１４７時間、好ましくは２４〜７２時間である。
【００５５】
セルロースの糖化により、グルコースを含有する水溶液が得られる。得られた水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００５６】
上記の方法で精製されたグルコースを主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１
（前培養）
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株をポテトデキストロース(ＰＤ)寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させた。生理食塩水に懸濁した胞子1×１０６個をセルロース原料（ジャストファイバー：International Fiber Corporation社製）：８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１．４ｇ、ポリペプトン(DIFCO社製)：１ｇ、酵母エキス(DIFCO社製):０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．３ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：１ｍＬ、微量元素液［Ｈ３ＢＯ４  ６ｍｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解及び懸濁した液]：１ｍＬを含む５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、３日間振とう培養して、前培養液を得た。
【００５９】
（水溶性糖類を含む液体培地の製造）
５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに普通紙：６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：１．５ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１．６８ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、コーンスティープリカー：２ｍＬ、ツイーン８０：０．１ｍＬ、上記微量元素液：０．１ｍＬ、水：１００ｍＬを入れて原料液体培地を調製した。普通紙はシュレッダー（カール社製「デスクパーサーＤＳ−４１００」）で２ｍｍ×７ｍｍに裁断して使用した。この原料液体培地にセルラーゼ液（ナガセケムテックス社製「セルラーゼＳＳ」（商品名）、ＣＭＣ活性：１６００ＣＮＵ／ｇ）を２．５％Ｖ／Ｖ添加し、５０℃で５分間振とうした後、オートクレーブで加熱して酵素反応を停止させた。得られた液体培地に含まれる水溶性糖類をフェノール硫酸法にて単糖に分解し、濃度を測定した。以下詳細を示す。
【００６０】
（水溶性糖類濃度の測定）
サンプルとして採取した液体培地を、遠心分離し(20000G、10min:トミー精工社製)、その上清を適切な倍率に希釈し、500ｍＬの希釈液に5%フェノール溶液500mL加え、攪拌した。次いで、濃硫酸2.5mLを添加し、攪拌した。室温に20分以上放置後、分光光度計（型版UV-1800、島津製作所社製）で、溶液の490nmの吸光度を測定した。なお、グルコースで作製したスタンダードを基に、各サンプル培地の水溶性糖類の重量％濃度を算出した。水溶性糖類濃度の測定結果を表１に示す。
【００６１】
（本培養）
水溶性糖類を含む液体培地を含む５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに前培養液５ｍＬを接種して、２８℃、１８０ｒｐｍ、７日間振とう培養した。７日目に培養液を遠心分離し、上清液を得た。得られた上清液の酵素活性を次に説明する操作によって測定した。酵素活性の測定結果を表１に示す。
【００６２】
（酵素活性の測定）
β-グルカナーゼ活性は、メガザイム社製のβ‐グルカナーゼ測定キットを用い、色素標識したβ-グルカンを基質とした酵素分解によって生じた染色断片を吸光度測定した。具体的には、アゾ大麦グルカン基質溶液0.1mＬに培養液0.1mＬを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、停止液〔4％酢酸ナトリウム、0.4％酢酸亜鉛、80％メチルセルソルブを含む（pＨ５）〕0.6mＬを加えて5分放置し、反応を停止した。続いて遠心分離した後、上澄液を590nmの吸光度測定した。１単位のβ-グルカナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
【００６３】
キシラナーゼ活性は、oat spelts 由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量した。より具体的には1％キシラン基質溶液［シグマ社製 Xylan, from oat spelts を200ｍM酢酸緩衝液（ｐH4.5）に溶解］1.9ｍＬに培養液0.1ｍＬを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（0.75％ジニトロサリチル酸、1.2％水酸化ナトリウム、22.5％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、0.3％乳糖１水和物を含む）4mＬを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。1単位のキシラナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
【００６４】
実施例２〜８
酵素反応の反応時間及び酵素の添加量を表１に示すとおり変更すること以外は実施例１と同様にして液体培地を製造し、液体培地の水溶性糖類濃度を測定し、トリコデルマ・リーセイの培養を行い、培養液の酵素活性を測定した。水溶性糖類濃度及び酵素活性の測定結果を表１に示す。
【００６５】
実施例９
原料液体培地に含有させる普通紙の量を３ｇに変更し、酵素反応の反応時間及び酵素の添加量を表１に示すとおり変更すること以外は実施例１と同様にして液体培地を製造し、液体培地の水溶性糖類濃度を測定し、トリコデルマ・リーセイの培養を行い、培養液の酵素活性を測定した。水溶性糖類濃度及び酵素活性の測定結果を表１に示す。
【００６６】
比較例１
水溶性糖類を含む液体培地の代わりに原料液体培地を使用すること以外は実施例１と同様にしてトリコデルマ・リーセイの培養を行い、培養液の酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を表１に示す。
【００６７】
比較例２
水溶性糖類を含む液体培地の代わりに原料液体培地を使用すること以外は実施例９と同様にしてトリコデルマ・リーセイの培養を行い、培養液の酵素活性を測定した。酵素活性の測定結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
表１の結果より、トリコデルマ・リーセイを培養する液体培地に含まれる水溶性糖類の濃度が１重量％以上の場合にβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの生産量が顕著に向上することが理解される。