(57)【要約】【課題】ＰＣＲクランピング法、具体的には植物検体中の細菌叢解析のためのＰＣＲクランピング法において、より汎用性の高い方法を提供する。【解決手段】植物由来のＤＮＡのＰＣＲ反応を阻害し、かつ微生物由来のＰＣＲ反応を阻害しない１種以上のＰＮＡプローブであって、前記ＰＮＡプローブが、植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３'末端側より３０塩基以上下流の位置およびリバースプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３'末端側より３０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有するものを使用すると上記課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲクランピング法であって、
植物由来のＤＮＡのＰＣＲ反応を阻害し、かつ微生物由来のＤＮＡのＰＣＲ反応を阻害しない１種以上のＰＮＡプローブを使用し、
前記ＰＮＡプローブが、植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基以上下流の位置およびリバースプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有する前記方法。
【請求項２】
植物検体中の細菌叢解析のための請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＲ反応がＤＮＡの変性工程、前記ＤＮＡに対するＰＮＡのアニーリング工程、前記ＤＮＡに対するプライマーのアニーリング工程及びプライマーの伸長反応工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＮＡのアニーリング工程とプライマーのアニーリング工程が同一工程である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＮＡのＴｍ値が伸長反応温度よりも５℃以上高い、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＮＡプローブの塩基長が１３〜２５merである、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＮＡプローブが細菌由来のＤＮＡに対して両端以外に合計２塩基以上の変異がある、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＮＡ濃度がプライマー濃度に対して０．１〜５０倍量である、請求項１〜７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
植物由来のＤＮＡがミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡからなる群から選択される、請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
植物が小麦である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＮＡプローブが配列番号１〜１７９から選択される配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１〜１７９から選択される配列を有するＰＮＡプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＮＡを用いたＰＣＲクランピング法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、検体中の菌叢解析方法として、検体を一般生菌用寒天培地上で生育したコロニーからＤＮＡを抽出して、菌種を同定する方法が採用されてきた。そのため、培地で培養されない菌は検出できなかった。そこで近年、検体中から直接ＤＮＡを抽出し、次世代シーケンサーなどを用いて解析する手法も行なわれている。
【０００３】
微生物の種類（菌叢）を解析する方法としては、１６ＳｒＲＮＡをターゲットとしてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡの塩基配列を相同性検索プログラムを用いて、公共の塩基配列データベースに登録されているデータと比較することで同定する手法が広く用いられている。この方法においては、多種多様な細菌群を同時に増幅するための、ユニバーサルプライマーが複数報告されている。
【０００４】
しかし、この方法を植物検体中の菌叢解析に適用する場合には、植物由来のＤＮＡの混入が障害となる。すなわち、植物由来のＤＮＡ中には細菌のＤＮＡと非常に相同性の高い領域があり、細菌由来のＤＮＡをＰＣＲ増幅する場合、同時に植物由来のＤＮＡも増幅され、その解析が妨げられる。そのため、植物由来のＤＮＡが増幅しないような特殊なプライマーを設計する必要があったが、このような特殊なプライマーを用いた場合、特定の細菌由来のＤＮＡを増幅することができない可能性もある。
【０００５】
そこで、植物検体中の菌叢解析をより容易に行うためにＰＮＡ（ペプチド核酸：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）によるＰＣＲクランピング法を用いて植物由来のＤＮＡ（ミトコンドリア、及び葉緑体）の増幅を抑制し、微生物由来のＤＮＡのみをＰＣＲ増幅する方法が提案されている（非特許文献１）。
【０００６】
ＰＣＲクランピング法は、ＰＮＡをＰＣＲ法に組み合わせた方法である。ＰＮＡ骨格構造は、一般的に Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン分子によってらせん構造を有し、塩基と骨格構造との立体的距離及び結合している各塩基間の距離がＤＮＡにおけるものと同じになるように設計されている。このことによりＤＮＡが相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対し、ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成するように、ＰＮＡも相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対し二重鎖を作ることができる。ＰＮＡはＤＮＡよりも高い融解温度（Ｔｍ）を有し、ＰＮＡ／ＤＮＡの結合はＤＮＡ／ＤＮＡの結合よりも強い。またＰＮＡのＴｍは数個の塩基配列の変異によって大きく影響を受けるため、これらの性質を利用し点変異の検出プローブとして用いられている。例えば非特許文献２及び非特許文献３には、野生型の塩基配列に相補的なＰＮＡの存在下、ＰＣＲ反応を行うことにより、野生型塩基配列の増幅を抑制し、変異型塩基型配列の増幅を促進することによる塩基配列の変異の検出方法が開示されている。
【０００７】
非特許文献１の方法は、微生物ＳＳＵｒＤＮＡ（＝１６ＳｒＤＮＡ）用プライマーと植物由来のＤＮＡのアニーリングを、プライマーとほぼ同じ領域において植物由来のＤＮＡに特異的に結合する、つまりはプライマーと競合するＰＮＡにより阻害することで微生物由来のＤＮＡのみをＰＣＲ増幅する方法である。原理の概略を図１に示す。
【０００８】
非特許文献１において使用するＰＮＡはプライマーとほぼ同じ領域で、かつプライマーよりも数塩基だけ下流に設計される。そのため使用するプライマーごとにＰＮＡを設計する必要がある。そしてＰＮＡは植物由来のＤＮＡと相補的であり、かつ微生物のＤＮＡとは配列が異なる必要があるため、逆にプライマーをどこに設計するかについても制限を受けることになる。
また非特許文献１の方法ではプライマーとＰＮＡの結合位置がほぼ同じ領域であるため、配列特異性が低いプライマーがＰＮＡよりも先に植物ＤＮＡに結合してしまった場合に、ＰＣＲ反応が進んでしまいＰＣＲ反応を阻害できないだけでなく、ＰＣＲ産物にエラーが入り以降のサイクルでＰＮＡが結合できなくなってしまう。そこでプライマーより先にＰＮＡを植物由来のＤＮＡに確実にアニーリングする必要があり、ＰＣＲの反応条件においてＰＮＡのみをアニーリングする工程を、プライマーをアニーリングする工程とは別により高温側に設定する必要がある。
また、プライマーをアニーリングする工程はＰＮＡのみをアニーリングする工程よりも温度が低いため、ＰＮＡが非特異的に微生物ＤＮＡにアニーリングするリスクが高まる。その為プライマーの細菌ＤＮＡへの結合がＰＮＡよりも強くなければならない。ＰＮＡやプライマーの非特異結合を避けるために、それぞれの工程の温度は厳密に設定される必要がある。
以上のように非特許文献１の方法においては、ＰＮＡ及びプライマーの設計に制限が多く、ＰＣＲ反応条件の設定の最適化も煩雑であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「ＰＮＡ−ＰＣＲクランピング技術を用いた植物根圏の糸状菌フロラ解析法の確率」平成１７年度〜平成１８年度科研費補助金（基盤研究（Ｃ））研究成果報告書  平成１９年５月  研究代表者  境  雅夫  鹿児島大学農学部准教授
【非特許文献２】T. TAKIYA et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 96, No.6, p588-590, 2003
【非特許文献３】「ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウィルス：peptide nucleic acid mediated PCR clamping(PMPC)法によるポリメラーゼＹＭＤＤモチーフ塩基配列の高感度検出」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＰＣＲクランピング法において、公知のユニバーサルプライマーを含む多種のプライマーを使用することが出来る、より汎用性が高い方法であって、ＰＣＲ反応の条件についてもより簡略化した方法を提供することを目的とする。好ましくは植物検体中の細菌解析のためのＰＣＲクランピング法において、公知の細菌検出用ユニバーサルプライマーを含む多種のプライマーを使用することが出来る、より汎用性が高い方法であって、ＰＣＲ反応の条件についてもより簡略化した方法を提供することを目的とする。
【００１１】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）ＰＣＲクランピング法であって、植物由来のＤＮＡのＰＣＲ反応を阻害し、かつ微生物由来のＤＮＡのＰＣＲ反応を阻害しない１種以上のＰＮＡプローブを使用し、前記ＰＮＡプローブが、植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基以上下流の位置およびリバースプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有する前記方法。
（２）植物検体中の細菌叢解析のための前記（１）に記載の方法。
（３）ＰＣＲ反応がＤＮＡの変性工程、前記ＤＮＡに対するＰＮＡのアニーリング工程、前記ＤＮＡに対するプライマーのアニーリング工程及びプライマーの伸長反応工程を含む前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＰＮＡのアニーリング工程とプライマーのアニーリング工程が同一工程である、前記（３）に記載の方法。
（５）ＰＮＡのＴｍ値が伸長反応温度よりも５℃以上高い、前記（１）〜（４）いずれか１項に記載の方法。
（６）前記ＰＮＡプローブの塩基長が１３〜２５merである、前記（１）〜（５）いずれか１項に記載の方法。
（７）前記ＰＮＡプローブが細菌由来のＤＮＡに対して両端以外に合計２塩基以上の変異がある、前記（１）〜（６）いずれか１項に記載の方法。
（８）ＰＮＡ濃度がプライマー濃度に対して０．１〜５０倍量である、前記（１）〜（７）いずれか１項に記載の方法。
（９）植物由来のＤＮＡがミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡからなる群から選択される、前記（１）〜（８）いずれか１項に記載の方法。
（１０）植物が小麦である、前記（９）に記載の方法。
（１１）前記ＰＮＡプローブが配列番号１〜１７９から選択される配列を有することを特徴とする前記（１０）に記載の方法。
（１２）配列番号１〜１７９から選択される配列を有するＰＮＡプローブ。
【発明の効果】
【００１２】
植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基以上下流の位置およびリバースプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有するように設計されたＰＮＡを使用する本発明の方法により、プライマーのアニーリングに影響を及ぼすこと無く、植物由来のＤＮＡ（植物検体中に含まれるミトコンドリアや葉緑体を含むプラスチドなどの各種植物小器官のＤＮＡ）の増幅を抑制し、微生物由来のＤＮＡのみをＰＣＲ増幅することができる。本発明の方法において、プライマーは公知のユニバーサルプライマーを含む多種のプライマーを用いることができ、ＰＮＡの配列を変更することで任意の植物由来のＤＮＡ配列のＰＣＲ反応を抑制できる。またＰＮＡをアニールさせる領域は、細菌ＤＮＡと植物ＤＮＡ間で少なくとも合計２塩基以上の違い（特異性）があればよく、比較的設計が容易で汎用性がある。
また、本発明はＰＣＲ反応において特にＰＮＡのみをアニーリングする工程を導入することなしに、植物由来のＤＮＡの増幅を抑制し、微生物由来のＤＮＡのみをＰＣＲ増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】非特許文献１の方法の原理である。
【図２】本発明の方法の原理である。
【図３】細菌のリボソームＲＮＡの構成と、プライマーの位置の例である。
【図４】小麦葉緑体と主要な細菌とのアライメントの結果である。
【図５】小麦ミトコンドリアと主要な細菌とのアライメントの結果である。
【図６】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅結果である。
【図７】ＰＮＡを用いたＰＣＲクランピングの結果である。
【図８】第３のＰＮＡを用いたＰＣＲクランピングの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図２を参照して本発明の原理を説明する。
（１）葉緑体遺伝子に対し、特異的なＰＮＡ（葉緑体ＰＮＡ）を加えることにより、ＰＮＡが同遺伝子上にハイブリダイズ（結合）するため、プライマーの伸長反応が停止し、葉緑体遺伝子は増幅しない。
（２）ミトコンドリア遺伝子に対し、特異的なＰＮＡ（ミトコンドリアＰＮＡ）を加えることにより、ＰＮＡが同遺伝子上にハイブリダイズするため、プライマーの伸長反応が停止し、ミトコンドリア遺伝子が増幅しない。
（３）細菌遺伝子に対し、葉緑体遺伝子又はミトコンドリア遺伝子に特異的なＰＮＡを加えても、細菌遺伝子とはハイブリダイズしない。そのため、プライマーの伸長反応が行われ、細菌遺伝子のみを増幅することができる。
【００１５】
（植物由来のＤＮＡ）
本発明において、植物由来のＤＮＡとは、植物検体中に含まれるミトコンドリアや葉緑体を含むプラスチドなどの各種植物小器官のＤＮＡである。
【００１６】
（ＰＮＡの設計）
ＰＮＡは、４種の各塩基が結合しているＰＮＡモノマーのオリゴマー又はポリマーである。すなわち、ＰＮＡモノマーは塩基とＮ−（２−アミノエチル）−グリシンという二つの部分からなり、これが一つのユニットとして繰り返されてＰＮＡとなる。そしてＰＮＡにおけるモノマーは塩基（Ａ：アデニン、Ｔ：チミン、Ｇ：グアニン及びＣ：シトシン）に応じて４種類となる。
【００１７】
本発明において使用するＰＮＡは常法によって製造することができる。ＰＮＡの塩基長は１３〜２５塩基が適当であり、好ましくは１６〜２２塩基、より好ましくは１８〜２０塩基である。
【００１８】
ＰＮＡの向き（orientetion）は、植物由来のＤＮＡのセンス側、アンチセンス側どちらでも構わない。
【００１９】
本発明において使用するＰＮＡは、植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より約３０塩基以上、好ましくは約５０塩基以上下流の位置およびリバースプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３'末端側より約３０塩基以上、好ましくは約５０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖又はアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有するように設計する。
植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基未満又はリバースプライマーがアニーリングする領域のプライマーの３’末端側より３０塩基未満の領域に含まれるセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有するように設計すると、ＰＮＡが植物由来のＤＮＡにアニーリングする前にＰＮＡがアニーリングする領域までＰＣＲ反応が進む可能性があり、ＰＮＡによりＰＣＲ反応を十分阻害できない為不適である。
【００２０】
ＰＣＲにおけるプライマーの伸長反応において、植物由来のＤＮＡに一旦アニーリングしたＰＮＡが乖離することを防ぐため、ＰＮＡのＴｍは伸張反応温度よりも約５℃以上高いことが好ましい。これはＰＣＲ反応において伸張反応工程とアニーリング工程が同一の工程で行われる場合も同様である。ここで伸張反応温度とはＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させる反応時の温度をいう。
なお、ＰＮＡのＴｍは以下の式に従って計算することができる。
Ｔｍ＝０．９４×（Ａの数）＋２．４７×（Ｃの数）＋５．５３×（Ｇの数）−０．０８×（Ｔの数）＋３５
【００２１】
ＰＮＡの塩基配列は、阻害対象ＤＮＡである植物由来のＤＮＡに対し特異的に結合させるために、植物由来のＤＮＡに対し少なくとも９〜２１merの（両末端の２塩基を除く）連続した配列が相補的であり、かつ細菌由来のＤＮＡに対して、両末端以外に２塩基以上の挿入、欠損を含む変異が存在することが好ましい。
【００２２】
ＰＮＡの濃度はプライマー濃度に対して、好ましくは０．１〜５０倍量、より好ましくは０．５〜１０倍量、さらに好ましくは１〜４倍量である。
【００２３】
（プライマーについて）
本発明で用いるプライマーは、細菌由来のＤＮＡと結合し、かつ植物由来のＤＮＡとも結合し増幅させるものであれば特に限定されない。好ましくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域内の配列を増幅するものである。
細菌のリボソームＲＮＡは１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡから構成され、細菌の菌叢解析には、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（約１５００bp）が一般的に用いられている。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子には、Ｖ１〜Ｖ９の可変領域が存在し、可変領域の塩基配列は細菌の種毎に異なるため、その塩基配列を調べることによって菌種を同定することができる。
また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は近縁の菌種間での配列保存領域が多いため、近縁種や亜種の識別が困難である場合など、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子よりも配列多型が多いＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子（ｇｙｒＢ）の配列を使用することもできる。
【００２４】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域内の配列を増幅するプライマーの例を以下に示すが、これに限定されるものではない。
2015100322.tif 000002
＊Ｆはフォワードプライマー、Ｒはリバースプライマー、数字は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の位置を示す
文献：Turner, S., Pryer, K.M., Miao, V.P.W., and Palmer, J.D. 1999. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. Journal of Eukaryotic Microbiology 46: 327-338.
Lane, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, pp. 115-175.
Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., and Lane, D.J. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173: 697-703.
Hodkinson, B.P., and Lutzoni, F. 2009. A microbiotic survey of lichen-associated bacteria reveals a new lineage from the Rhizobiales. Symbiosis 49: 163-180.
例えば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の上流５００bp：V１〜V３領域を増幅するプライマーセット（５Fおよび５３５R：株式会社ファスマック製）を使用して１６ＳｒＲＮＡ遺伝子上の一部を増幅することができる。
ｇｙｒＢ領域内の配列を増幅するプライマーの例としては以下のようなものがあるが、これに限定されるものではない。
プライマーUP-1 (5´-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3´)
プライマーUP-2r (5´-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3´)
文献：Yamamoto, S., S. Harayama (1995) PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains. Appl.Environ. Microbiol., 61, 1104-1109
【００２５】
本発明の他の実施態様は、植物検体中の菌叢解析方法である。具体的には、（１）植物検体から試料中に存在する細菌類のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出し、ＲＮＡの場合は逆転写反応によりcＤＮＡに変換した後、ゲノムＤＮＡもしくはcＤＮＡ鋳型とし、（２）所定のプライマー及びＰＮＡを使用する本発明のＰＣＲクランピング法に付し、（３）得られたＰＣＲ産物を公知の手法を用いて解析すること、例えばＰＣＲ産物をクローニング及びシークエンスし、既知の細菌ＤＮＡと相同性検索することで構成される。
なお（２）におけるＰＣＲクランピング法は、上述のように予め植物検体に混入することが予測される所定の植物由来ＤＮＡについて設計したもの使用しても良い。またさらにその結果から予期せず増幅されたさらなる植物由来ＤＮＡについてＰＮＡを設計して用いても良い。
【００２６】
（植物検体）
本発明に使用することができる植物検体は、１種以上の細菌のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する植物由来のものであれば、植物の種類や部位等特に制限はない。例えば、小麦の場合、粒状もしくはそれを粉砕した粉状の試料にＰＢＳ溶液を加え、ホモジナイザーにて懸濁し、その懸濁液（小麦洗液）からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出したものを使用する。
【００２７】
本発明によれば、試料中に存在する細菌類のゲノムＤＮＡやＲＮＡを抽出する方法としては、公知のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ抽出法がそれぞれ使用され得る。例えばプロテアーゼＫなどの細胞壁分解酵素で処理する方法やガラスビーズによる物理的破壊方法などにより抽出する方法があるがこれに限定されない。また抽出用の試薬として市販されているものを適宜使用することができる。抽出されたゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡは公知の方法により精製してもよい。
【００２８】
上記の抽出方法によって抽出されたゲノムＤＮＡやＲＮＡは、次いで、本発明のＰＣＲクランピング法に付される。
【００２９】
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲ反応の条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。ＰＣＲ反応はＤＮＡの変性工程、ＤＮＡへのＰＮＡのアニーリング工程、ＤＮＡへのプライマーのアニーリング工程、伸長反応工程を含む。例えば、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  ＴａｑTM（宝酒造）を用いて、チューブあたり鋳型ＤＮＡ２０ｎg、添付の１０×Ｅｘ Ｔａｑ バッファー２μl、ｄＮＴＰｓ各５nmol、各プライマー２０ｐｍｏｌ、各ＰＮＡ４０ｐｍｏｌ、Taq ＤＮＡポリメラーゼ１.０Uを滅菌蒸留水で全量２０μｌとし、例えば、変性：９６℃、１分；アニーリング：５０℃、０．５分；伸長：７２℃、１分の反応を４０サイクル行う、等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
従来のＰＣＲクランピング法と異なり、本発明の方法はＰＣＲ反応においてＰＮＡのアニーリング工程及びプライマーのアニーリング工程を同一の工程とすることが出来る。ＰＮＡはプライマーよりもTm値が高く設定されているため、プライマーがアニールする時点ではすでにPNAが十分にアニールしており、植物由来ＤＮＡのＰＣＲ反応の阻害が可能である。
【００３１】
なお、上記「ＰＮＡの設計」の項でも述べたようにＰＣＲの伸長反応において、植物由来のＤＮＡに一旦アニーリングしたＰＮＡが乖離することを防ぐ観点から、ＰＮＡのＴｍは伸長反応温度よりも約５℃以上高いことが好ましい。同じ観点から伸長反応工程とアニーリング工程を同一の工程としても良く、この場合においてもＰＮＡのＴｍは伸長反応温度（＝アニーリング温度）よりも約５℃以上高いことが好ましい。
【００３２】
（クローニングとシークエンス）
ＰＣＲ増幅によって得られたＰＣＲ産物は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製した後、好ましくは、適当なベクター中にクローニングされる。クローニング方法についても特に限定されず、公知の方法で行われる。増幅断片を挿入されたベクターで大腸菌を形質転換し、LB寒天などの固形培地上にプレートし、得られたコロニーから抽出したＤＮＡを鋳型として、常法に従ってシークエンシング反応を行い、各クローンの塩基配列を決定する。また、ＰＣＲ産物を直接次世代シーケンサーで解析することもできる。
【００３３】
（相同性検索）
決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベースおよび相同性検索プログラムを用いて、既知の細菌ＤＮＡ配列、例えば既知の細菌１６ＳｒＤＮＡ配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高い相同性を示す既知配列を抽出することができる。例えば、得られた塩基配列をNCBI（National Center for Biotechnology Information）の公共の塩基配列データベース（GenBank）に登録されているリボソームＲＮＡの塩基配列と、相同性検索プログラムとしてBlast （Basic Local Alignment Search Tool）を用いて相同性検索を行い、その検索結果より菌種を同定する。また、上記以外の遺伝子配列データベース、公知の相同性検索プログラムを用いることもできる。
【００３４】
（検出可能な菌の種類）
本発明の細菌叢解析方法において、検出可能な菌の種類は、その菌の細菌叢解析方法において利用する遺伝子配列が既知のものであれば特に制限されない。本発明においては、例えば、最初に阻害対象の植物由来ＤＮＡと代表的な数種の細菌ＤＮＡ配列のアライメントの結果をもとにＰＮＡの候補配列を選抜し、適当な遺伝子配列データベースおよび相同性検索プログラムを用いて、その選抜されたＰＮＡの候補配列と既知の細菌ＤＮＡ配列のアライメントを検討し、最初の選抜に用いた数種の細菌以外の細菌と相同性の高い候補配列を排除することにより検出可能な菌の種類を増やすことが出来る。
例えば小麦由来の検体について細菌叢解析を行う場合には、阻害対象の小麦由来ＤＮＡとして代表的な小麦ミトコンドリアＤＮＡ又は小麦葉緑体ＤＮＡと従来の方法によって小麦検体から検出されることが知られている代表的な細菌（パエニバチルス属（Paenibacillus、パンテア属（Pantoea）、エンテロバクター属（Enterobacter）、クルトバクテリウム属（Curtobacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas））とのアライメントを検討し、その結果をもとにＰＮＡの候補配列を選抜し、遺伝子配列データベースおよび相同性検索プログラムを用いて、その選抜されたＰＮＡの候補配列と既知の細菌ＤＮＡ配列のアライメントを検討し、最初の選抜に用いた数種の細菌以外の細菌と相同性の高い候補配列を排除することにより検出可能な菌の種類を増やすことが出来る。
【実施例】
【００３５】
以下本発明を具体的に説明する為に実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００３６】
１．方法
（１）ＰＮＡの設計
小麦の葉緑体（chloroplast）およびミトコンドリア（mitochondrion）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と５種類の細菌、パエニバチルス属（Paenibacillus）、パンテア属（Pantoea）、エンテロバクター属 （Enterobacter）、クルトバクテリウム属（Curtobacterium）及び シュードモナス属（Pseudomonas）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のアライメントの結果を図４及び図５に示す。
この結果を基に、以下の（a）〜(c)の条件によりＰＮＡの候補配列を決定した。
（a）ＰＮＡの連続した配列が植物由来のＤＮＡに対して相補的であり、かつ細菌由来のＤＮＡに対して、両末端以外に合計２塩基以上の挿入、欠損を含む変異が存在すること。
（b）ＰＮＡの配列が、植物由来のＤＮＡにおいて、フォワードプライマー又はリバースプライマーがアニーリングする領域の各プライマーの３'末端側よりそれぞれ約３０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有すること。
（c）ＰＮＡのＴｍが後述するＰＣＲの伸長反応温度（７２℃）よりも約５℃以上高いこと。
ＰＮＡの候補配列の例を以下の表に列挙する。
【００３７】
【表１】
2015100322.tif 000003
2015100322.tif 000004
【００３８】
【表２】
2015100322.tif 000005
2015100322.tif 000006
【００３９】
上記候補配列のなから、以下のものを選択し、ＰＮＡを合成した。
葉緑体用
配列番号１  (chl２１７R２０)  N'-CTAGCTAATCAGACGCGAGC (Tm ８２.９℃)
ミトコンドリア用
配列番号４６  (mit１６１F１８)  N'-GGCCTCCGTTTGCTGGAA  (Tm ８２.０℃)
【００４０】
（２）ＤＮＡ抽出
小麦粒（１CWおよびDNS）２５ｇに１０倍量のPBS溶液を加え、回転式ホモジナイザーで懸濁し、その懸濁液（小麦粒洗液）からDNeasy Plant kits（QIAGEN社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【００４１】
（３）ＰＣＲ増幅反応（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅）
下記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の細菌検出用共通プライマー（５Ｆ、５３５Ｒ：株式会社ファスマック製）を用いて、下記のＰＣＲ反応組成、ＰＣＲ温度条件でＰＣＲ増幅反応を行なった。得られた増幅産物は３%アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した。
【００４２】
プライマー配列：（フォワード）  ５F    ５'-TGGAGAGTTTGATCCTGGCT-３'
（リバース）    ５３５R  ５'-TATTACCGCGGCTGCTG-３'
【００４３】
ＰＣＲ反応組成：
試薬                          液量
滅菌水                      Ｘ*μL
TaKaRa Ex Taq[ ５U／μL]     ０.２μL
１０×Ex Taq Buffer          ２.０μL
dNTPs[２.５mM each]          ２.０μL
プライマーミックス
（５Fと５３５Rの混合液）
[ 各１０ μM]                ２.０μL
ＰＮＡ溶液 [１０μM]         ４.０μL（コントロールには添加しない）
ＤＮＡ溶液 [１０ng／μL]     ２.０μL
合計                        ２０μL
*反応液の合計量が２０μLになるように滅菌水は調整。
【００４４】
ＰＣＲ温度条件：
温度            時間          サイクル数
９６℃          ２分          １サイクル
↓
変性：９６℃        ０.５分      ４０サイクル
アニーリング：５０℃        ０.５分
伸長：７２℃        １分
↓
７２℃        ５分          １サイクル
【００４５】
（４）クローニングおよびコロニー形成
定法に従い、得られた増幅産物をＰＣＲ２.１-TOPOプラスミドベクターに挿入（クローニング）し、そのプラスミドをXL１０-Goldコンピテントセル（大腸菌）に導入した。コンピテントセルをLB寒天培地に播種し、一晩培養してコロニーを形成させた。
【００４６】
（５）塩基配列分析
得られたコロニーのうち各々約５０個について、以下のプライマーを用いてプラスミドＤＮＡを増幅させ、カラム精製した後、片側のプライマー（M１３ Rev）を用いてシークエンス反応を行なった。
【００４７】
プラスミド増幅用プライマー（フォワード） M１３ Fw：GTAAAACGACGGCCAGT
（リバース）   M１３ Rev：CAGGAAACAGCTATGAC
【００４８】
ＰＣＲ温度条件：（プラスミドの増幅）
温度          時間          サイクル数
９６℃        ２分          １サイクル
↓
９６℃        ０.５分      ４０サイクル
５２℃        ０.５分
７２℃        １分
↓
７２℃        ５分          １サイクル
【００４９】
（６）相同性検索
得られた塩基配列とNCBI（National Center for Biotechnology Information）の塩基配列データベース（GenBank）に登録されているリボソームＲＮＡの塩基配列とをBlast （Basic Local Alignment Search Tool）を用いて相同性検索を行い、その検索結果より細菌の菌種を同定した。
【００５０】
（７）菌叢解析
相同性検索の結果より、菌種を目レベルで分類し、上位９菌種とそれ以外の計１０種に整理し、各々の菌種の割合を求めた。
【００５１】
２．結果
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅
ＰＮＡを添加せずに、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅を行った結果、３本の増幅バンド（約５５０bp、約５００bp、約４５０bp）が得られた（図６）。それぞれの増幅バンドの塩基配列についてBlastを用いて相同性検索をおこなった結果、約５５０bpのバンドは小麦ミトコンドリア、約５００bpのバンドは細菌、約４５０bpのバンドは小麦葉緑体由来のものだった。
なお、細菌由来のバンドは極めて増幅が悪く、試験によっては全く検出できなかった。また、ミトコンドリアのバンドに隠れて、細菌由来のバンドのみを得ることは困難だった。
【００５２】
（２）ＰＮＡを用いたＰＣＲクランピング法
葉緑体特異的ＰＮＡおよびミトコンドリア特異的ＰＮＡの両方を添加して１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅を行った。ＰＮＡを加えたことで葉緑体およびミトコンドリア由来の増幅産物は得られず、代りに２本の増幅バンド（約５００bp、約４１０bp）が得られた（図７）。それぞれの増幅バンドの塩基配列をBlastを用いて相同性検索した結果、約５００bpは細菌由来、約４１０bpは小麦由来の新たなバンドであった。このバンドは、葉緑体やミトコンドリア以外の領域から増幅したＤＮＡであって、１６ＳｒＲＮＡとは全く相同性のない塩基配列だった。（以後これを第三の小麦バンドと呼ぶ）。
【００５３】
（３）第三の小麦用ＰＮＡを加えたＰＣＲクランピング法
さらに第三の小麦バンドについても、その塩基配列から特異的なＰＮＡを設計し、それを葉緑体特異的ＰＮＡおよびミトコンドリア特異的ＰＮＡと同時に加えてＰＣＲした結果、第三の小麦バンドも消失し、細菌（約５００bp）のみの遺伝子増幅産物を得ることができた。（図８）。
【００５４】
なお第三の小麦バンドのDNA配列から以下の（a）〜(c)の条件によりＰＮＡの候補配列を決定した。
（a）ＰＮＡの連続した配列が第三の小麦バンドＤＮＡに相補的であること。なお第三の小麦バンドＤＮＡの塩基配列は各細菌由来のＤＮＡに対してホモロジーが50％以下であるため、小麦バンドＤＮＡに相補的な配列を有するＰＮＡは細菌由来のＤＮＡには結合しない。
(b)ＰＮＡの配列が、第三の小麦バンドのＤＮＡにおいて、フォワードプライマー又はリバースプライマーがアニーリングする領域の各プライマーの３'末端側よりそれぞれ約３０塩基以上下流の位置で挟まれる領域に含まれるセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列と相補的な配列を有すること。
(c)ＰＮＡのＴｍが後述するＰＣＲの伸長反応温度（７２℃）よりも約５℃以上高いこと。
ＰＮＡの候補配列の例を以下の表に列挙する。
2015100322.tif 000007
2015100322.tif 000008
上記候補配列のなから、以下のものを選択し、ＰＮＡを合成した。
第三の小麦バンド用
配列番号１２２(3rd-PNA 297F16)  N'- GTGATCCTGGCATGGT (Tm ７７．１℃)
【００５５】
ＰＣＲ反応条件は、以下の条件を除き、上記「ＰＣＲ増幅反応（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅）」における条件と同じである。
ＰＣＲ反応組成：
試薬                          液量
滅菌水                      Ｘ*μL
TaKaRa Ex Taq[ ５U／μL]   ０.２μL
１０×Ex Taq Buffer        ２.０μL
dNTPs[２.５mM each]        ２.０μL
プライマーミックス
（５Fと５３５Rの混合液）
[ 各１０ μM]               ２.０μL
ＰＮＡ溶液 [１０μM]        ４.０μL
ＤＮＡ溶液 [１０ng／μL]    ２.０μL
合計                        ２０μL
*反応液の合計量が２０μLになるように滅菌水は調整。
*コントロールには第三の小麦バンド用ＰＮＡは添加しない。ただし、上記の葉緑体用とミトコンドリア用ＰＮＡはすべてに添加した。
【００５６】
（４）菌叢解析結果
従来法（一般生菌用の寒天培地にて２日間培養して得られたコロニーの菌叢結果）とほぼ同一の結果を得ることが出来た。エンテロバクター目（Enterobacteriales）、スフィンゴモナス目（Sphingomonobadales）、キサントモナス目（Xanthomonadales）、シュードモナス目（Pseudomonadales）等が検出され、特に検体中の主要な細菌は両方の方法共にエンテロバクター目（Enterobacteriales）であり一致していた。
【図４−１】
2015100322.tif 000009
【図４−２】
2015100322.tif 000010
【図５−１】
2015100322.tif 000011
【図５−２】
2015100322.tif 000012
【図１】
2015100322.tif 000013
【図２】
2015100322.tif 000014
【図３】
2015100322.tif 000015
【図６】
2015100322.tif 000016
【図７】
2015100322.tif 000017
【図８】
2015100322.tif 000018
【配列表】
2015100322000001.app