(57)【要約】【課題】尿又は血液から採取でき、かつ、糸球体濾過量及び血清中クレアチニン濃度より早期から変動する腎不全のバイオマーカーを同定し、これにより、初期の腎不全を診断する技術を開発する。【解決手段】本発明の腎不全が疑われる被検者の血液、血漿、血清又は尿の分析方法は、被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］等からなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比か、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の百分率かを前記被検者の病態指標値として算出するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎不全が疑われる被検体の尿の分析方法であって、
該被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合の有意差をもった減少と、被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出するステップとを含む、分析方法。
【請求項２】
前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比又は、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記被検体の病態指標値を、健常者群の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者群の病態指標基準値と比較して、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値からの統計的有意差の有無を判定し、前記被検体の病態指標値が前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値と統計的有意差の有無を判定し、又は前記健常者群と前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群とに対し統計的に有意差が有る場合に、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と急性腎不全及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が、前記健常者群の病態指標基準値並びに前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値に統計的に有意差が有る場合に、前記健常者群の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記被検体の尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］からなるアミノ酸群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを、さらに判定するステップを含む、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
腎不全の検査方法であって、非検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ-アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合の減少と、被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出するステップとを含む、検査方法。
【請求項７】
前記アミノ酸群が、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］からなる、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む、腎不全が疑われる被検体の尿のサンプル分析システムであって、
前記記憶部は、健常者群の尿における病態指標基準値と、急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の尿における病態指標基準値とを記憶し、
前記分析測定部は、前記被検体の尿中のアミノ酸のうち、Ｄ−セリン及びＬ−セリンと、Ｄ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジンと、Ｄ−アスパラギン及びＬ−アスパラギンと、Ｄ−アルギニン及びＬ−アルギニンと、Ｄ−アロ−スレオニン及びＬ−スレオニンと、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸と、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニンと、Ｄ−プロリン及びＬ−プロリンと、Ｄ−バリン及びＬ−バリンと、Ｄ−アロ−イソロイシン及びＬ−イソロイシンと、Ｄ−フェニルアラニン及びＬ−フェニルアラニンと、Ｄ−リジン及びＬ−リジンとからなるアミノ酸群から選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量し、
前記データ処理部は、前記被検体の［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合の減少と被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出し、該被検体の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と統計的に有意差が無いときは前記被検体は腎不全の疑いが薄いことを前記被検体の病態情報と定義し、前記被検体の病態指標値が前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値と統計的に有意差が無いときは前記被検体は腎不全の疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義し、前記健常者群の病態指標基準値並びに前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値に統計的に有意差が有る場合に、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは前記被検体は早期腎不全の疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義し、
前記病態情報出力部は前記被検体の病態情報を出力する、被検体の尿の分析システム。
【請求項９】
前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比又は、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の百分率である、請求項８に記載の分析システム。
【請求項１０】
前記被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは、非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項８又は９に記載の分析システム。
【請求項１１】
前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ-アロ-スレオニン］及び［Ｌ−アロ-スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれ、
［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは、非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１２】
前記被検体の尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、[Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］のうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検体が、腎機能低下が始まる時期の状態である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項１０に記載の分析システム。
【請求項１３】
前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ-アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ-スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれ、
[Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］からなる群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検体が、腎機能低下が始まる時期の状態である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項１１に記載の分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿の分析方法と、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿のサンプル分析システムとに関し、具体的には、該被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］等からなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップを含む被検者の血液、血漿、血清又は尿の分析方法と、該被検者の血液、血漿、血清又は尿のサンプル分析システムであって、記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む、前記分析方法を実施するための血液、血漿、血清又は尿のサンプル分析システムとに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎不全（ＣＫＤ）はわが国の成人人口の約１３％に相当する１，３３０万人が罹患する疾患で、末期腎不全（ＥＳＫＤ）に至るリスクが高く、国民の健康を脅かしている。慢性腎不全は、糸球体濾過量で表される腎機能の低下があるか，もしくは腎臓の障害を示唆する所見が慢性的（３カ月以上）に持続するものすべてを包含する。慢性腎不全に有効な治療法はなく、慢性腎不全が進行して腎機能低下が進むと尿毒症の危険があり、人工透析や腎移植が必要となり、医療経済上大きな負担となる（非特許文献１）。慢性腎不全は自覚症状がない。そこで慢性腎不全の早期発見及び進行抑制のためには、腎不全の早期マーカーによる診断が必要である。しかし、糸球体濾過量で表される腎機能の変化が起こるより早い時期から腎機能障害の進行を正確に反映するバイオマーカーとして満足できるものは未だ存在しない。
【０００３】
急性腎不全（ＡＫＩ）の実験動物モデルは腎機能障害の初期を再現することができる。急性腎不全は、腎機能が数週間又は数日間に急激に低下する疾患である。この疾患のモデルとしては、外科的手法又は薬剤投与により誘発される急性腎不全実験モデルが知られている。急性腎不全診断のゴールドスタンダードは、尿生成量及び血清中クレアチニン濃度である。血清中クレアチニン濃度は、排尿の有無に関わらず、バイオプシーを行うことなく評価可能な点では優れている。しかし、糸球体濾過量が定常状態であることを必要とする。糸球体濾過量の小さな変動には鈍感である。急性腎不全の実験動物モデルでは比較的後期になって変化が明らかになる。そして、血清中クレアチニン濃度は、年齢、性別、筋肉量及び服用する医薬等の条件により変動するので、特異的なマーカーとはいえない（非特許文献２）。急性腎不全のマーカーとして、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腎障害分子（ＫＩＭ−１）、肝脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰｓ）、シスタチンＣ等のタンパク質と、ホモバニリン酸硫酸、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド等の代謝低分子化合物とが報告されている。しかし、これらのマーカーはいずれも腎不全の早期から検出されるものではない。
【０００４】
Ｄ−セリン及びＤ−アラニンは、腎不全患者の血清中濃度が健常者の血清中濃度より高く、Ｄ−体の濃度、及びＤ−体濃度／（Ｄ−体濃度＋Ｌ−体濃度）の比の双方が、クレアチニンと相関することから、腎近位尿細管機能障害のマーカーの候補となることが示唆されている（非特許文献３）。腎炎患者の血漿においてＤ−アミノ酸（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ）が高い傾向を示し、クレアチニン量と相関性を有することが開示されている（非特許文献９）。また、腎不全患者では血清中にＤ−アラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−グルタミン酸、及びＤ−アスパラギン酸が認められ、これにより、血清Ｄ−アミノ酸濃度の測定が、腎不全の診断等に有用であることが示唆された（非特許文献５）。Ｄ−セリン及びＤ−アラニンの尿中の濃度及びＤ−体及びＬ−体の合計に対するＤ−体の比が、各年代における健常人について調べられており、腎臓におけるＤ−セリンの取り扱いが異なることが示唆されている（非特許文献６）。Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン、アロＤ−スレオニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−プロリン及びＤ−フェニルアラニンからなるグループから選択される１種類又は２種類以上のアミノ酸が、腎臓病の病態指標値とすることができることが開示されているが（特許文献１）、この文献では、検体として、血液、血漿、尿などの体液を用いることを記載しているものの、実施例にて腎臓病における病態指標値を求めるために使用している検体は、血清のみであり、尿についてこれらのアミノ酸が腎臓病の病態指標値として使用できるか否かについては開示されていない。また、腎不全患者で、尿中のアラニン、バリン、プロリン、スレオニン、アスパラギン酸、及びアスパラギンのＤ−体比が有意に増加する一方で、メチオニンやセリンでは有意差がないことが知られている（非特許文献７）。しかしながら、この文献では、病態判定基準の示されていない腎不全患者（renal failure）で、各アミノ酸のＤ−体濃度／（Ｄ−体濃度＋Ｌ−体濃度）の比を算出しているものの、かかる比の増加を病期にかかわらず漫然と（漠然と）示しているに過ぎず、かかる比の変動が、腎不全の病態や他のバイオマーカーと関連することについては何ら記載も示唆もない。本願優先日後には、虚血再還流障害により、尿中のＤ／Ｌ−セリン比が経時的に減少することから、初期の虚血性腎障害の検出や病態分類が可能なバイオマーカーとなりうる点が示唆されている（非特許文献８）。腎近位尿細管にはＤ−アミノ酸の分解に関与するＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素が発現し、虚血再灌流ラットではＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素活性が低下することが知られている（非特許文献４）。一方生理的条件下では、Ｌ−セリンが再吸収されるのに対し、Ｄ−セリンはほとんど再吸収されない。しかし、Ｄ−セリンをはじめとするＤ−アミノ酸が腎不全の初期にどのように変動するかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１４０７８５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＫＤＩＧＯ  ２０１２  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  １  （２０１３）
【非特許文献２】Ｓｌｏｃｕｍ，  Ｊ．  Ｌ．ら、Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．  １５９：２７７  （２０１２）
【非特許文献３】Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １８：  １１３０（１９９５）
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．ら、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４２：  ３３７（２０１２）
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｄａら、北里医学  ２３：５１〜６２  （１９９３）
【非特許文献６】Ｙｏｎｇ  Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２１：（２）１５６-１６２（１９９８）
【非特許文献７】Ｍａｇｄａｌｅｎａ  Ｃ．  Ｗａｌｄｈｉｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  （２０１０）１１０３−１１１２
【非特許文献８】Ｊｕｍｐｅｊｉ  Ｓａｓａｂｅら、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，  ｖｏｌ．９，  Ｉｓｓｕｅ  １，  ｅ８６５０４
【非特許文献９】Ｎａｇａｔａ．Ｙ  Ｖｉｖａ  Ｏｒｉｇｉｎｏ  Ｖｏｌ．１８（Ｎｏ．２）  （１９９０）第１５回学術講演会講演要旨集
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
尿又は血液から採取でき、かつ、糸球体濾過量及び血清中クレアチニン濃度より早期から変動する腎不全のバイオマーカーを同定し、これにより、初期の腎不全を診断する技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿の分析方法を提供する。本発明の分析方法は、被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値は、有意差をもってＤ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎障害の病態と関連づけることができる。例えば少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比、或いはＤ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比や百分率を前記被検者の病態指標値として算出することができる。非特許文献７においては、病態判定基準の示されていない腎不全患者の尿中のアミノ酸が分析されているものの、アラニン、バリン、プロリン、スレオニン、及びアスパラギン酸について、Ｄ−アミノ酸比が有意に増加したことが示されている。したがって、腎不全患者の尿中で、Ｄ−アミノ酸の構成割合が減少することは、驚くべき発見である。
【０００９】
別の態様では、本発明の分析方法は、上述のアミノ酸群に、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれてもよい。したがって、本発明の分析方法は、被検者の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ-スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含んでもよい。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値は、有意差をもってＤ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎障害の病態と関連づけることができる。例えば少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比、或いはＤ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比や百分率を前記被検者の病態指標値として算出することができる。
【００１０】
本発明の別の態様では、腎不全の検査方法であって、非検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ−体の構成割合の減少と、被検体の腎不全とを関連づける病態指標値を算出するステップと
を含む、検査方法に関してもよい。ここで、検査方法とは、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行う方法に関する。
【００１１】
上述のアミノ酸群から、アミノ酸は任意に選択してもよいが、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］からなることがさらに好ましい。別の態様では、各アミノ酸の組合せが、上述のアミノ酸群から除かれてもよい。例えば、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］が除かれてもよいし、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］が除かれてもよいし、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］が除かれてもよいし、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］が除かれてもよいし、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］が除かれてもよいし、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］が除かれてもよいし、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］が除かれてもよいし、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］が除かれてもよいし、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］が除かれてもよいし、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］が除かれてもよいし、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］が除かれてもよいし、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］が除かれてもよいし、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］が除かれてもよいし、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］が除かれてもよいし、［Ｄ-アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］が除かれてもよいし、及び［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が除かれてもよい。
【００１２】
これらの病態指標値は、尿中クレアチニン濃度と同様に、腎虚血再灌流後に低下することが示された。尿中クレアチニン濃度の低下は、腎機能の低下を示すことから、腎不全のマーカーとして使用することができ、本願の病態指標値も、尿中クレアチニン濃度と同様に腎不全のマーカーとして使用することができる。なお、尿中の腎不全のマーカーであるＫＩＭ−１やＮＧＡＬは、腎機能の低下により、尿中の濃度が増加する。虚血再灌流モデル実験系では尿中クレアチニン濃度が虚血再灌流後８時間で有意差をもって低減し、尿中ＫＩＭ−１が虚血再灌流後２０時間で有意差をもって増加し、そして尿中ＮＧＡＬが虚血再灌流後８時間で有意差をもって増加した一方で（図２−Ｄ、Ｆ及びＧ）、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を使用して算出された病態指標値は、腎虚血再灌流後４時間後においてＰ＜０．０５の有意差をもって減少していることから、腎不全に対してより高い感度を有するということができる。したがって、早期腎障害に対してより高い感度を有する観点から、かかる病態指標値を使用することが好ましい。さらに好ましくは、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を使用して算出された病態指標値は、腎虚血再灌流後４時間後においてＰ＜０．０１の有意差をもって減少していることから、当該病態指標値をより感度の高いマーカーとして用いることができる。さらにより好ましくは［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値は、腎虚血再灌流後４時間後においてＰ＜０．００１の有意差をもって減少していることから、当該病態指標値を極めて感度の高いマーカーとして用いることができる。したがって、本発明の病態指標値は、従来の腎不全マーカーである血清クレアチニン等と同等であるか、又はそれよりも感度が高く、早い段階の腎不全の診断に用いることができる。早い段階の腎不全として、例えば、急性腎不全（ＡＫＩ）のＲＩＦＬＥ、ＡＫＩＮ、ＫＤＩＧＯといった各分類の初期病期の基準である血清クレアチニンが１．５〜２．０倍に上昇する状態、慢性腎不全（ＣＫＤ）ではＧＦＲで示される腎機能低下が始まる状態、または腎障害を有するが血清クレアチニンやＧＦＲに変化が現れる以前の非常に早期の状態が挙げられる。また、腎虚血再灌流後４時間後において有意差はないが、腎虚血再灌流後８時間以降において有意差を有する［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］からなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を使用して算出された病態指標値を、従来のクレアチニンなどと同等の感度のマーカーとして使用することができる。
【００１３】
１のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値を用いてもよいし、他のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値と組み合わせて、使用することもできる。例えば、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］からなる群から選ばれる１以上のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された極めて感度の高い病態指標値を、同群から選ばれるＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された他の極めて感度の高い病態指標値と組み合わせてもよい。また別の態様では、上記の極めて感度の高い病態指標値を、より感度の低い病態指標値、例えば［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］とからなる群から選ばれる１のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値と組み合わせて使用することができ、それにより、血清クレアチニンが１．５〜２．０倍に上昇を示す腎機能低下が現れる状態、もしくはそれ以前において、尿クレアチニン、尿中ＫＩＭ−１、尿中ＮＧＡＬと比較して鋭敏に腎障害を検出することが可能になる。
【００１４】
本発明の分析方法は、前記被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似か、前記被検者の病態指標値が前記急性腎不全患者又は慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するか、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む場合がある。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は、健常者群及び/又は腎不全患者群の病態指標値から予め閾値を設定することにより、被験者の病態指標値と閾値とを比較して、被験者が腎不全であるかを判定することができる。当業者であれば、健常者群や腎不全患者群の病態指標値から、閾値を適宜設定することができる。閾値としては、例えば健常者群又は腎不全患者群の平均値、中央値、Ｘパーセンタイル値を使用することができるがこれらに限定されるものではない。ここでＸは任意の数値を選択することができ、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７を適宜使用することができる。閾値は１つであってもよいし、腎不全の種類（急性、慢性）や原因（例えば、薬剤性腎症、糖尿病性腎症、IgA腎症、膜性腎症、腎硬化症など）、状態（早期、中期、後期）、並びに使用するアミノ酸若しくはその組合せに応じて複数設定することもできる。予め設定された閾値と、被験者の病態指標値とを比較することにより、被験者の腎不全の病態を判定、決定又は診断することが可能になる。
【００１６】
本発明の分析方法は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値が前記健常者の第二病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む場合がある。
【００１７】
本発明において、第一病態指標値として、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値を用いることができ、第二病態指標値として［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値を用いることができる。
【００１８】
前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれる場合には、第一病態指標値は、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ-アロ-スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］からなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の病態指標値を用いることができる。また、第二病態指標値は、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］に加えて、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］からなる群から選ばれる、少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値であってもよい。
【００１９】
本発明は、腎不全が疑われる被検者の血液又は尿のサンプル分析システムを提供する。本発明のサンプル分析システムは、記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む。前記記憶部は、健常者の血液、血漿、血清又は尿における病態指標基準値と、急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者の血液、血漿、血清又は尿における病態指標基準値とを記憶する。前記分析測定部は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿中のアミノ酸のうち、Ｄ−セリン及びＬ−セリンと、Ｄ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジンと、Ｄ−アスパラギン及びＬ−アスパラギンと、Ｄ−アルギニン及びＬ−アルギニンと、Ｄ−アロ−スレオニン及びＬ−スレオニンと、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸と、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニンと、Ｄ−プロリン及びＬ−プロリンと、Ｄ−バリン及びＬ−バリンと、Ｄ−アロ−イソロイシン及びＬ−イソロイシンと、Ｄ−フェニルアラニン及びＬ−フェニルアラニンと、Ｄ−リジン及びＬ−リジンとからなるグループから選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量する。前記データ処理部は、前記被検者の［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値は、Ｄ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる。
【００２０】
別の態様では、上記のアミノ酸対に加えて、Ｄ−グルタミン及びＬ−グルタミンと、Ｄ-スレオニン及びＬ−スレオニンと、Ｄ-アロ−スレオニン及びＬ−アロ−スレオニンと、Ｄ−ロイシン及びＬ−ロイシンが含まれていてもよい。したがって、別の態様では、前記分析測定部は、前記被検者の尿中のアミノ酸のうち、Ｄ−セリン及びＬ−セリンと、Ｄ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジンと、Ｄ−アスパラギン及びＬ−アスパラギンと、Ｄ−アルギニン及びＬ−アルギニンと、Ｄ−アロ−スレオニン及びＬ−スレオニンと、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸と、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニンと、Ｄ−プロリン及びＬ−プロリンと、Ｄ−バリン及びＬ−バリンと、Ｄ−アロ−イソロイシン及びＬ−イソロイシンと、Ｄ−フェニルアラニン及びＬ−フェニルアラニンと、Ｄ−リジン及びＬ−リジンと、Ｄ−グルタミン及びＬ−グルタミンと、Ｄ-スレオニン及びＬ−スレオニンと、Ｄ−アロ−スレオニン及びＬ−アロ−スレオニンと、Ｄ−ロイシン及びＬ−ロイシンとからなるグループから選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量する。前記データ処理部は、前記被検者の［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロスレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。ここで少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値は、Ｄ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる。
【００２１】
病態指標値とは、あるアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出可能であり、Ｄ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる値をいう。本発明のサンプル分析システムは、さらに、病態指標値として、例えばＤ−体及びＬ−体の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比や百分率を被検者の病態指標値と定義する。該被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いが薄いことを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるときは前記被検者は早期腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。前記病態情報出力部は前記被検者の病態情報を出力する。
【００２２】
本発明のサンプル分析システムにおいて、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。
【００２３】
本発明は、腎不全の診断方法を提供する。本発明の診断方法は、腎不全が疑われる被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。
【００２４】
別の態様では、本発明の診断方法は、上述のアミノ酸群に、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれてもよい。したがって、本発明の診断方法は、被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップとを含む。
【００２５】
ここで、少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値は、Ｄ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる。前記病態指標値は、少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比か、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比又は百分率を前記被検者の病態指標値として使用することができる。
【００２６】
本発明の診断方法は、前記被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は健常者の可能性が高いか、前記被検者が腎不全の疑いが薄いかであると診断し、前記被検者の病態指標値が前記急性腎不全患者又は慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は腎不全の疑いが濃いと診断し、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は早期腎不全の疑いがあると診断するステップをさらに含む場合がある。
【００２７】
本発明の診断方法は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は非常に早期の腎不全である疑いがあると診断するステップを含む。
【００２８】
本発明は、腎不全の治療方法を提供する。本発明の診断方法は、腎不全が疑われる被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から病態指標値を算出するステップと、前記被検者の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は健常者の可能性が高いか、前記被検者が腎不全の疑いが薄いかであると診断し、前記被検者の病態指標値が前記急性腎不全患者又は慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するとき、前記被検者は腎不全の疑いが濃いと診断し、前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は早期腎不全の疑いがあると診断するステップと、前記被検者は腎不全の疑いが濃いと診断されたとき、アンジオテンシン変換酵素、アンジオテンシンII受容体拮抗薬等を含むがこれらに限定されない高血圧治療薬と、αグルコシダーゼ阻害薬、インシュリン製剤等を含むがこれらに限定されない糖尿病治療薬と、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、小腸コレステロールトランスポーター阻害薬等を含むがこれらに限定されない脂質異常症治療薬と、遺伝子組換えヒトエリスロポエチン製剤を含むがこれらに限定されない貧血治療薬と、骨・ミネラル代謝異常の治療薬と、高尿酸血症の治療薬と、球形吸着炭内服薬を含むがこれらに限定されない尿毒症治療薬とを含む、腎不全の進行を抑制又は改善する治療薬を投与することによって前記被検者を治療するステップとを含む。
【００２９】
本発明の治療方法は、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるグループの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第一病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあり、かつ、前記被検者の血液、血漿、血清又は尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］とのうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検者の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検者は非常に早期の腎不全である疑いがあると診断するステップと、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを含むがこれに限定されない高カリウム血症の治療薬と、炭酸カルシウム又は酢酸カルシウムを含むがこれらに限定されない高リン酸血症の治療薬とを含む急性腎不全の治療薬を投与することによって前記被検者を治療するステップとを含む。
【００３０】
本発明における血液、血漿、血清及び尿中のＤ−アミノ酸濃度の測定は、当業者に周知ないかなる方法を用いて実施しても構わない。例えば、予めｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−システイン（Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ）その他の修飾試薬で立体異性特異的にＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡのような分析カラムを用いて１００ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）とアセトニトリルの混液をグラジエント溶離して分離する方法が、アスパラギン酸、セリン及びアラニンのＤ−体及びＬ−体の同時測定に用いることができる。また、予め４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）のような蛍光試薬でＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ等のような分析カラムを用いて立体異性非特異的に各アミノ酸を分離した後、Ｐｉｒｋｌｅ型キラル固定相カラム（例えばＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−２５００Ｓ又はＲ）を用いて光学分割して立体異性特異的に分離する方法が、プロリン、ロイシンその他のアミノ酸の微量測定に用いることができる（浜瀬健司及び財津潔、分析化学、５３巻、６７７−６９０（２００４））。本明細書における光学分割カラム系は、少なくとも光学分割カラムを用いる分離分析系をいい、光学分割カラム以外の分析カラムによる分離分析を含む場合がある。より具体的に、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々をマルチループユニットにおいて個別に保持するステップ、前記マルチループユニットにおいて個別に保持された前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に流路を通じて供給し、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むことを特徴とする光学異性体の分析方法を用いることにより、試料中のＤ-／Ｌ-アミノ酸濃度を測定することができる（特許第４２９１６２８号）。代替的には、アミノ酸の光学異性体を識別するモノクローナル抗体、例えばＤ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン酸等に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によってＤ−アミノ酸を定量することができる（特願２００８−２７６５０明細書）。
【００３１】
本明細書において、あるアミノ酸についてカギ括弧（［］）でくくる表記（例えば、［Ｄ−セリン］）は、当該アミノ酸の濃度を意味する。本発明ではアミノ酸の濃度に基づくパラメーター（病態指標値）として、例えばＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比と、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の百分率とが利用される。これらのパラメーターは、ある物質の濃度を別の物質の濃度で除算するため、血液、血清、血漿又は尿のような体液の体積が約分されてしまう。そのため、濃度の場合と異なり、これらのパラメーターでは体液量による補正が不要になるという利点がある。
【００３２】
本発明では、血液を濾過及び再吸収することによって血液中の成分の一部だけを特異的に除去して尿を生成する腎臓の機能が大きい役割を果たす。そのため本発明のアミノ酸濃度は、血液と尿とでは大きく異なる場合があるが、血液、血清及び血漿の間ではあまり大きな違いはない。アミノ酸は、血液細胞、血液凝固物等に特異的に濃縮されることは知られていないからである。そこで、本発明の実施例では血清中濃度が測定され、血清中濃度にもとづくパラメーターが被検者の病態指標値や、健常者や腎不全患者の病態指標基準値に用いられているが、血清中濃度のかわりに血液中濃度又は血漿中濃度が測定され、血液中濃度又は血漿中濃度にもとづくパラメーターが、被検者の病態指標値や健常者や腎不全患者の病態指標基準値に用いられてもかまわない。
【００３３】
本明細書において、「病態指標値」とは、個々のバイオマーカー分子の濃度ではなく、複数のバイオマーカーの濃度に基づいて計算可能な数値をいう。本明細書において用いられる病態指標値は、あるアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出可能であり、Ｄ−体の構成割合の減少を示す場合に、被検体を腎不全と関連づけることができる値をいう。病態指標値として、あるアミノ酸とそのエナンチオマーとの濃度比、例えば、あるアミノ酸のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比と、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の百分率とを含むがこれらに限定されない。
【００３４】
本明細書において、「病態指標基準値」とは、既存の診断技術によって診断された健常者と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者とについて得られる、バイオマーカー分子の病態指標値の平均値又は中央値をいう。病態指標値は特定の被検者のある特定の時点での数値であるが、病態指標基準値は、健常者と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者との複数から統計処理により得られた数値である。したがって、ある病態指標値がある病態指標基準値に類似するとは、当該病態指標値が前記病態指標基準値から統計的に有意差がないことをいう。例えば、ステューデントのｔ両側検定、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定等の統計学的手法が利用可能である。また、これらの検定における有意性の閾値Ｐ値が０．０５未満のとき、有意性があるとされる。
【００３５】
本発明における被検者の血液、血漿、血清又は尿の分析システムは、記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む。ここで記憶部は、既存の診断技術によって診断された健常者と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者とについて得られた血液、血漿、血清又は尿中のアミノ酸のエナンチオマー濃度データにもとづくパラメーターから得られた病態指標基準値を記憶するメモリを含む。前記記憶部には、前記健常者及び患者の人数と個人ごとのデータから統計処理により得られた有意性の閾値Ｐのデータを含む場合がある。前記分析測定部は、本明細書に説明されるアミノ酸エナンチオマー濃度を測定する２次元ＨＰＬＣシステムをロボット制御によって自動的に運転することができるいずれかの自動分析装置と、該自動分析装置を制御するための中央制御装置とを含む。前記データ処理部は、前記分析測定部で得られたアミノ酸エナンチオマー濃度から本明細書で説明されるパラメーターを計算する。該パラメーターから得られた被検者の病態指標値を、前記記憶部から呼び出された健常者及び患者の病態指標基準値と比較する。前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いが薄いことを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記慢性腎不全患者の病態指標基準値と類似するときは前記被検者は腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。前記被検者の病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるときは前記被検者は早期腎不全の疑いがあることを前記被検者の病態情報と定義する。このとき、前記有意性の閾値Ｐが前記記憶部から呼び出されて、前記被検者の病態指標値が前記健常者又は患者の病態指標基準値と類似する程度を判定するのに用いられる場合がある。データ処理部は従来技術のコンピュータと、該コンピュータに格納された病態情報処理ソフトウェアとを含む。前記病態情報出力部は、前記被検者の病態情報を液晶その他のディスプレイ画面に表示したり、プリンタに印刷出力したり、あるいは、インターネット又はＬＡＮ等を介して被検者の病態情報をデータとして送信したりする場合がある。
【００３６】
本発明において、分析又は検査される腎不全とは、腎機能が正常時より低下した状態であり、通常の意味で用いられる腎臓の障害の全てを含むものとする。限定されるものではないが、一般的に腎不全とは、腎機能が正常時の３０％を下回った状態をいい、急性腎不全と慢性腎不全に大別される。腎機能が低下する原因としては、免疫系の異常や薬に対するアレルギー、高血圧、糖尿病や、出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水など複数の因子があげられる。急性腎不全（ＡＫＩ）は、ＲＩＦＬＥ分類、ＡＫＩＮ分類、ＫＤＩＧＯ分類といった病期の分類が提唱されており、急性腎不全を、Ｒｉｓｋ（ステージ１）、Ｉｎｊｕｒｙ（ステージ２）、Ｆａｉｌｕｒｅ（ステージ３）、さらには持続期間に応じてＬｏｓｓとＥｎｄ  ｓｔａｇｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅに分類した。これらの分類は、どれも血清クレアチニンの量と尿量とを指標としており、例えばＲｉｓｋ（ステージ１）では、血清クレアチニンがベースラインから１．５〜２．０倍に上昇すること又は０．５ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が６時間以上であること、Ｉｎｊｕｒｙ（ステージ２）では、血清クレアチニンがベースラインから２．０〜３．０倍に上昇すること又は０．５ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が１２時間以上であること、Ｆａｉｌｕｒｅ（ステージ３）では、血清クレアチニンがベースラインから３．０倍以上に上昇すること又は０．３ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が２４時間以上であることを判断基準としている。一方で、これらの分類は、他の指標、例えばＧＦＲの変化量を併用することでより正確に急性腎不全の分類を可能にする。慢性腎不全（ＣＫＤ）は、日本腎臓学会のガイドライン（２００９）で病期ステージ１（腎障害を有するが腎機能は正常、ｅＧＦＲ≧９０）〜ステージ５（腎不全、ｅＧＦＲ＜１５）の診断基準が示されている。ここで指標となっている推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は血清クレアチニン値と年齢、性別より算出されるもので腎臓が老廃物を尿に排出する能力を示している。本発明の分析・検査方法では、これまでの腎機能マーカーよりも高感度で腎機能の低下を検出することが可能になる。したがって、従前のマーカーでは腎不全に分類されなかったようなリスク群に分類することも可能になり、例えば、上述の原因のようなＡＫＩ、ＣＫＤの危険因子を有するが、血清クレアチニンやＧＦＲにおいて明確な変動の見られないハイリスク群においても腎機能の低下を検出することが可能になる。
【００３７】
本発明において、被験者は、ヒトに限定されず、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなどを包含しうる。したがって、被験者は、被検体として表されてもよい。
【００３８】
本発明の分析方法は、慢性及び/又は急性腎不全の診断方法のための予備的なデーターを収集するために使用することができる。このような予備的データーを用いて医師が慢性及び/又は急性腎不全診断することができるが、かかる分析方法は、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行うこともできる。したがって、本発明の分析方法は、診断の予備的方法と言うこともできる。
【００３９】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−Ａ】偽手術又は虚血再灌灌流処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＤ−／Ｌ−セリンの２次元ＨＰＬＣ法により得られた典型的なクロマトグラム。
【図１−Ｂ】腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＤ−セリン濃度の変化を示すグラフ。
【図１−Ｃ】腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＬ−セリン濃度の変化を示すグラフ。
【図１−Ｄ】腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＬ−セリン濃度に対するＤ−セリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図１−Ｅ】腎虚血再灌灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のクレアチニン濃度の変化を示すグラフ。
【図１−Ｆ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のシスタチンＣ濃度の変化を示すグラフ。
【図２−Ａ】偽手術又は虚血再灌流処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＤ−／Ｌ−セリンの２次元ＨＰＬＣ法により得られた典型的なクロマトグラム。
【図２−Ｂ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＤ−セリン濃度の変化を示すグラフ。
【図２−Ｃ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−セリン濃度の変化を示すグラフ。
【図２−Ｄ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のクレアチニン濃度の変化を示すグラフ。
【図２−Ｅ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−セリン濃度に対するＤ−セリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図２−Ｆ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＫＩＭ−１濃度の変化を示すグラフ。
【図２−Ｇ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＮＧＡＬ濃度の変化を示すグラフ。
【図３−Ａ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−ヒスチジン濃度に対するＤ−ヒスチジン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｂ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アスパラギン濃度に対するＤ−アスパラギン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｃ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−セリン濃度に対するＤ−セリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｄ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アルギニン濃度に対するＤ−アルギニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｅ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−スレオニン濃度に対するＤ−アロ−スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｆ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−グルタミン酸濃度に対するＤ−グルタミン酸濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｇ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アラニン濃度に対するＤ−アラニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｈ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−プロリン濃度に対するＤ−プロリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｉ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−バリン濃度に対するＤ−バリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｊ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−イソロイシン濃度に対するＤ−アロ−イソロイシン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｋ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−フェニルアラニン濃度に対するＤ−フェニルアラニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図３−Ｌ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−リジン濃度に対するＤ−リジン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図４−Ａ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−ヒスチジン濃度及びＤ−ヒスチジン濃度の和に対するＤ−ヒスチジン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｂ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アスパラギン濃度及びＤ−アスパラギン濃度の和に対するＤ−アスパラギン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｃ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−セリン濃度及びＤ−セリン濃度の和に対するＤ−セリン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｄ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−ヒスチジン濃度及びＤ−アルギニン濃度の和に対するＤ−アルギニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｅ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−スレオニン濃度及びＤ−アロ−スレオニン濃度の和に対するＤ−アロ−スレオニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｆ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−グルタミン酸濃度及びＤ−グルタミン酸濃度の和に対するＤ−グルタミン酸濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｇ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アラニン濃度及びＤ−アラニン濃度の和に対するＤ−アラニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｈ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−プロリン濃度及びＤ−プロリン濃度の和に対するＤ−プロリン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｉ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−バリン濃度及びＤ−バリン濃度の和に対するＤ−バリン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｊ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−イソロイシン濃度及びＤ−アロ−イソロイシン濃度の和に対するＤ−アロ−イソロイシン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｋ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−フェニルアラニン濃度及びＤ−フェニルアラニン濃度の和に対するＤ−フェニルアラニン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図４−Ｌ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−リジン濃度及びＤ−リジン濃度の和に対するＤ−リジン濃度の百分率の変化を示すグラフ。
【図５−Ａ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−ヒスチジン濃度に対するＤ−ヒスチジン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｂ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アスパラギン濃度に対するＤ−アスパラギン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｃ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−セリン濃度に対するＤ−セリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｄ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アルギニン濃度に対するＤ−アルギニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｅ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−スレオニン濃度に対するＤ−アロ−スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｆ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−グルタミン酸濃度に対するＤ−グルタミン酸濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｇ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アラニン濃度に対するＤ−アラニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｈ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−プロリン濃度に対するＤ−プロリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｉ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−バリン濃度に対するＤ−バリン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｊ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−イソロイシン濃度に対するＤ−アロ−イソロイシン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｋ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−フェニルアラニン濃度に対するＤ−フェニルアラニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｌ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−リジン濃度に対するＤ−リジン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｍ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−グルタミン濃度に対するＤ−グルタミン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｎ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−スレオニン濃度に対するＤ−スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｏ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−メチオニン濃度に対するＤ−メチオニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｐ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アスパラギン酸濃度に対するＤ−アスパラギン酸濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｑ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−アロ−スレオニン濃度に対するＤ−アロ−スレオニン濃度の比の変化を示すグラフ。
【図５−Ｒ】腎虚血再灌流処理が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス尿中のＬ−ロイシン濃度に対するＤ−ロイシン濃度の比の変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００４２】
１．材料及び方法
（１）研究倫理
全ての実験は施設のガイドラインに従って実施され、該施設の動物実験委員会の承認を得て行われた。
【００４３】
（２）材料
アミノ酸のエナンチオマー及びＨＰＬＣ級のアセトニトリルはナカライテスク（京都）から購入された。ＨＰＬＣ級のメタノール、トリフルオロ酢酸、ホウ酸等は和光純薬（大阪）から購入された。水はＭｉｌｌ−ＱグラジエントＡ１０システムを用いて精製された。
【００４４】
（３）動物
動物はＳＰＦ環境、１２時間ずつの明暗サイクルの条件下で、自由に水及び飼料を摂取できるようにして飼育された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは日本クレア（東京）から購入された。本実施例で用いたＤ−アミノ酸オキシダーゼの点突然変異マウスは１８１位のグリシンがアルギニンに置換された突然変異体で、ｄｄＹ系統をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統に戻し交配された（Ｓａｓａｂｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９:６２７（２０１２））。セリンラセマーゼノックアウトマウスは、Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｙ．ら（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ４３：１９１９（２０１２））によって作成された。
【００４５】
（４）腎虚血再灌流処理
１２−１６週齢のオスマウスが腎虚血再灌流（以下、「ＩＲＩ」ともいう。）処理に供された。ＩＲＩ処理施術前にペントバルビタール麻酔下で右側腎は除去された。１２日後に、マウスはランダムに選ばれて、偽手術（Ｓｈａｍ）か、ＩＲＩ処置かに供された。ペントバルビタール麻酔下で、左側腎が体外に引き出され、クランプ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｅｒｒｅｆｉｎｅｓ、Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  Ｉｎｃ．、カナダ、バンクーバー）で動脈及び静脈が閉塞された。４５分後に血流循環が再開され、クランプは除去された。腎表面の色がもとどおりになることは肉眼で確認され、腎は体内に戻された。偽手術では、左側の腎が体外に引き出されたが、クランプによる血流閉塞は行われなかった。再灌流の４、８、２０及び４０時間後に、マウスはジエチルエーテルで麻酔され、大静脈から採血され、膀胱から採尿された。腎は摘出後、必要に応じて灌流固定された。血清はベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）マイクロテーナー中で１５００×ｇ、１０分間遠心により分離された。血清又は尿中のクレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルはＦｕｊｉＤＲＩ−ＣＨＥＭ４０００システム（富士フィルム、東京）を用いて測定された。
【００４６】
血清中のシスタチンＣ及び尿中のＫＩＭ−１及びＮＧＡＬはＲ＆Ｄシステムズ社製のマウスＥＬＩＳＡキットを用いて定量された。
【００４７】
（５）アミノ酸立体異性体の全分析
前記サンプルは、財津らが開発したＤ、Ｌ−アミノ酸一斉高感度分析システム（特許第４２９１６２８号）によるアミノ酸立体異性体の全分析に供された。各アミノ酸の分析条件の詳細は、ＭｉｙｏｓｈｉＹ．、ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，  ８７９：３１８４（２０１１）及びＳａｓａｂｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０９：６２７（２０１２）に説明される。簡潔には、血清及び尿中のアミノ酸は、ＮＢＤ−Ｆ（４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール、東京化成工業株式会社）で誘導体化され、ＨＰＬＣシステム（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ  ＳＩ−２、株式会社資生堂、の補足情報を参照せよ。）に供された。簡潔には、逆相分離用分析カラムは、自社製のモノリシックＯＤＳカラム（内径１．５ｍｍ×２５０ｍｍ、石英ガラス毛管に装填）が用いられた。蛍光検出は、励起波長４７０ｎｍ、検出波長５３０ｎｍで実行された。逆相分離の後、エナンチオ選択性カラムに移された。エナンチオマー分離には、キラルセレクターとして（Ｓ）−ナフチルグリシンを用いるスミキラルＯＡ−２５００Ｓカラム（２５０ｍｍ×１．５ｍｍ、自家充填、材料は株式会社住化分析センター製）が使用された。体液中のＤ−アミノ酸の濃度は生理学的にマイクロモルのオーダーに保たれている。本実施例で説明された２次元ＨＰＬＣシステムは、例えばセリンの立体異性体を区別して１ｆｍｏｌから１００ｐｍｏｌの範囲で定量的に測定できる。これは、健常者と腎不全患者とにおけるセリンのＤ−体及びＬ−体の濃度変化を識別するのに十分な感度であった（図示されない。）。
【００４８】
（６）統計処理
本明細書及び図面に記載の全ての数値は、平均±標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表示される。実験の統計学的解析には、ステューデントのｔ両側検定、一元配置分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、テューキーの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）等の統計学的手法が利用された。また、これらの検定におけるＰ値が０．０５未満のとき、有意性があると評価された。全ての解析はＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州、ラホヤ）が用いられた。
【００４９】
２．結果
（１）血清中Ｄ−セリン及びＬ−セリン濃度
図１−Ａは偽手術又は虚血再灌流処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス血清中のＤ−／Ｌ−セリンの２次元ＨＰＬＣ法により得られた典型的なクロマトグラムである。以下の実験では、偽手術に８匹、再灌流後４時間、８時間、２０時間及び４０時間にそれぞれ、５匹、９匹、６匹及び７匹についてマーカーが測定された。図１−Ａないし１−Ｆの棒グラフは平均値を表し、誤差棒は標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。本実施例のデータについては一元配置分散分析の後、テューキーの多重比較検定による統計解析が行われた。図１−Ａないし１−Ｆにおいて、＊はＰが０．０５未満を意味し、＊＊はＰが０．０１未満を意味し、＊＊＊はＰが０．００１未満を意味する。ＮＳは有意差がないことを意味する。図のＳｈａｍは偽手術処置マウスの濃度、ＩＲＩ４、ＩＲＩ８、ＩＲＩ２０及びＩＲＩ４０は、それぞれ再灌流後４、８、２０及び４０時間後のマウスの濃度を表す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、血清中のＤ−セリン濃度は再灌流後４時間及び８時間では有意な変動がみられなかったが、２０時間で上昇し、４０時間ではさらに上昇した（図１−Ｂ）。なお、図１−Ｂに示されたＤ−セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで３．７±０．３μＭ、ＩＲＩ４で３．４±０．３μＭ、ＩＲＩ８で４．３±０．４μＭ、ＩＲＩ２０で５．５±０．５μＭ、ＩＲＩ４０で１０．６±０．４μＭであった。血清中のＬ−セリン濃度は再灌流後４時間で激減し、その後はずっと低い値のままであった（図１−Ｃ）。図１−Ｃに示されたＤ−セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで１０６．１±５．０μＭ、ＩＲＩ４で４６．９±０．９μＭ、ＩＲＩ８で６１．５±５．６μＭ、ＩＲＩ２０で７０．６±７．５μＭ、ＩＲＩ４０で６４．７±２．２μＭであった。そのため、［Ｄ−セリン］／［Ｌ−セリン］はＬ−セリン濃度の低下に伴って上昇し、４０時間でもさらに上昇した（図１−Ｄ）。図１−Ｄに示された［Ｄ−セリン］／［Ｌ−セリン］の数値は、Ｓｈａｍで０．０３６±０．００４、ＩＲＩ４で０．０７４±０．００５、ＩＲＩ８で０．０７３±０．００９、ＩＲＩ２０で０．０８２±０．００９、ＩＲＩ４０で０．１６４±０．００８であった。血清中クレアチニン濃度は、再灌流後４時間から上昇し、４０時間ではさらに上昇した（図１−Ｅ）。図１−Ｅに示されたクレアチニン濃度の数値は、Ｓｈａｍで０．５９±０．０５ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ４で１．１０８±０．０４ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ８で１．８９±０．０９ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ２０で１．１４±０．２２ｍｇ／ｄｌ、ＩＲＩ４０で３．７３±０．０９ｍｇ／ｄｌであった。しかし血清中シスタチンＣ濃度は再灌流後４時間で上昇後、４０時間まで徐々に低下した（図１−Ｆ）。図１−Ｆに示されたシスタチンＣ濃度の数値は、Ｓｈａｍで０．８４±０．０１μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ４で１．６３±０．０８μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ８で１．３９±０．０９μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ２０で１．１９±０．０５μｇ／ｍＬ、ＩＲＩ４０で１．０６±０．１０μｇ／ｍＬであった。これらの実験から、［Ｄ−セリン］／［Ｌ−セリン］の比は再灌流後４時間で上昇し初め、４０時間まで単調増加するため、腎不全のマーカーとして有用であることが明かになった。ここで単調変化するマーカーであれば、ある数���を示すのは再灌流後の一時期だけであるが、ピーク又はボトムがある変動の場合では、ある数値を示すのは一時期だけでなく、もう１回又は２回以上存在する。そのため、マーカーの数値によって腎不全の進行段階を一義的に推定することができない。
【００５０】
（２）尿中Ｄ−セリン及びＬ−セリン
以下の実験では、偽手術に７匹、再灌流後４時間、８時間、２０時間及び４０時間にそれぞれ、５匹、５匹、５匹及び５匹についてマーカーが測定された。図２−Ａないし２−Ｊの棒グラフは平均値を表し、誤差棒は標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。本実施例のデータについては一元配置分散分析の後、テューキーの多重比較検定による統計解析が行われた。図２−Ａないし２−Ｇにおいて、＊はＰが０．０５未満を意味し、＊＊はＰが０．０１未満を意味し、＊＊＊はＰが０．００１未満を意味する。ＮＳは有意差がないことを意味する。血清中では虚血再灌流後の時間経過とともにＤ−セリン濃度は上昇したが、Ｌ−セリン濃度は低下した。しかし、尿中では逆に、虚血再灌流後の時間経過とともにＤ−セリン濃度が低下し（図２−Ｂ）、Ｌ−セリン濃度が上昇した（図２−Ｃ）。図２−Ｂに示されたＤ−セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで５２．０±７．６μＭ、ＩＲＩ４で２４．５±５．７μＭ、ＩＲＩ８で９．９±１．１μＭ、ＩＲＩ２０で３６．９±３．３μＭ、ＩＲＩ４０で２２．４±３．８μＭであった。図２−Ｃに示されたＬ−セリン濃度の数値は、Ｓｈａｍで１９．０±３．０μＭ、ＩＲＩ４で２３．６±２．７μＭ、ＩＲＩ８で６２．６±９．９μＭ、ＩＲＩ２０で１３６．１±１４．９μＭ、ＩＲＩ４０で９３．８±１２．１μＭであった。なお、尿中のクレアチニンは再灌流後８時間以降激減している（図２−Ｄ）。これは、クレアチニンの尿への流出が腎機能低下のために阻害されたためである。そして、クレアチニンは再灌流後４時間では偽手術マウスとあまり変わらないことから、腎機能低下は再灌流後４時間ではまだ顕著ではないが、尿中の［Ｄ−セリン］／［Ｌ−セリン］の比は４時間でも偽手術マウスの３分の１近くまで低下していた（図２−Ｅ）。そこで、尿中の［Ｄ−セリン］／［Ｌ−セリン］の比は、腎機能低下に先立って変動し、単調減少するため、腎不全の早期マーカーとして有用であることが示された。図２−Ｅに示される［Ｄ−セリン］／［Ｌ−セリン］の比の数値は、Ｓｈａｍで２．８２±０．１８、ＩＲＩ４で１．１０±０．２６、ＩＲＩ８で０．１６±０．０１、ＩＲＩ２０で０．２８±０．０２、ＩＲＩ４０で０．２５±０．０４であった。尿中のＫＩＭ−１濃度は、再灌流後２０時間で上昇したが、４０時間では減少した（図２−Ｆ）。尿中ＮＧＡＬ濃度は、再灌流後４時間では偽手術マウスと有意差がなく、８時間では上昇し、その後ほぼ変化はなかった（図２−Ｇ）。したがって、尿中セリン濃度にもとづくパラメーターは既存のいずれのマーカーよりも早い時期から腎不全に伴う変動をしめし、かつ、その変化が単調変化であるため、被検者が腎不全の進行のどの段階にあるのかの判断に有用である。
【００５１】
（３）尿中でのさまざまなアミノ酸エナンチオマーの濃度比の変化
尿中のマーカーが測定された図２−Ａないし２−Ｊの実験に用いられたマウスのうち２匹の尿について、さまざまなアミノ酸のエナンチオマーの対の濃度が測定された。図３−Ａないし図３−Ｌでは、マウス個体のＬ−体の濃度の平均値に対するＤ−体の濃度の平均値比が、偽手術マウスと、虚血再灌流処理後４、８、２０及び４０時間のマウスとについて棒グラフで示される。その結果、尿中の［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］（図３−Ｆ）と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］（図３−Ｊ）と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］（図３−Ｋ）とでは、Ｌ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比は、再灌流４時間後でも変動せず、８時間後以降は非常に低下していた。これに対し、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］（図３−Ａ）と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］（図３−Ｂ）と、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］（図３−Ｃ）と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］（図３−Ｄ）と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン（図３−Ｅ）と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］（図３−Ｇ）と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］（図３−Ｈ）と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］（図３−Ｉ）と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］（図３−Ｌ）との組合せでは、Ｌ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比は再灌流後４時間で大きく変動し、偽手術マウスと、再灌流８時間以降との中間の数値を示した。そこで、ある個体について［Ｄ−ヒスチジン］／［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］／［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］／［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］／［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］／［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］／［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］／［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−リジン］／［Ｌ−リジン］とのいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低ければ、［Ｄ−グルタミン酸］／［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］／［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］／［Ｌ−フェニルアラニン］とのうちいずれか少なくとも１つでは健常者と変わらない数値であっても、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態が検出できることになる。また、ある個体について、［Ｄ−ヒスチジン］／［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］／［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］／［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］／［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］／［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］／［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］／［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−リジン］／［Ｌ−リジン］とのうちいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低く、かつ、［Ｄ−グルタミン酸］／［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］／［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］／［Ｌ−フェニルアラニン］とのうちいずれか少なくとも１つも健常者の数値より低いときは、腎機能低下が始まる時期の状態が検出されることになる。このようにして異なるグループのアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の尿中濃度にもとづくパラメーターによって、被検者が腎不全の早期にあるかどうかだけでなく、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態か、それとも、腎機能低下が始まる時期の状態かまで区別することができる。
【００５２】
（４）尿中でのさまざまなアミノ酸エナンチオマーの全濃度に対するＤ−体濃度の百分率の変化
図４−Ａないし図４−Ｌでは、マウス個体のＬ−体の濃度の平均値とＤ−体の濃度の平均値の和に対するＤ−体の濃度の平均値の百分率が、偽手術マウスと、虚血再灌流処理後４、８、２０及び４０時間のマウスとについて棒グラフで示される。その結果、尿中の［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］（図４−Ｆ）と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］（図４−Ｊ）と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］（図４−Ｋ）とでは、Ｌ−体の濃度の平均値とＤ−体の濃度の平均値の和に対するＤ−体の濃度の平均値の百分率は、再灌流４時間後でも変動せず、８時間後以降は非常に低下していた。これに対し、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］（図４−Ａ）と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］（図４−Ｂ）と、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］（図４−Ｃ）と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］（図４−Ｄ）と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン（図４−Ｅ）と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］（図４−Ｇ）と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］（図４−Ｈ）と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］（図４−Ｉ）と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］（図４−Ｌ）との組合せでは、Ｌ−体の濃度の平均値とＤ−体の濃度の平均値の和に対するＤ−体の濃度の平均値の百分率は再灌流後４時間で大きく変動し、偽手術マウスと、再灌流８時間以降との中間の数値を示した。そこで、ある個体について［Ｄ−ヒスチジン］の［全ヒスチジン］に対する百分率と、［Ｄ−アスパラギン］の［全アスパラギン］に対する百分率と、［Ｄ−アルギニン］の［全アルギニン］に対する百分率と、［Ｄ−アロ−スレオニン］の［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］の和に対する百分率と、［Ｄ−アラニン］の［全アラニン］に対する百分率と、［Ｄ−プロリン］の［全プロリン］に対する百分率と、［Ｄ−バリン］の［全バリン］に対する百分率と、［Ｄ−リジン］の［全リジン］に対する百分率とのいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低ければ、［Ｄ−グルタミン酸］の［全グルタミン酸］に対する百分率と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］の［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］の和に対する百分率と、［Ｄ−フェニルアラニン］の［全フェニルアラニン］に対する百分率とのうちいずれか少なくとも１つでは健常者と変わらない数値であっても、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態が検出できることになる。
また、ある個体について、［Ｄ−ヒスチジン］の［全ヒスチジン］に対する百分率と、［Ｄ−アスパラギン］の［全アスパラギン］に対する百分率と、［Ｄ−アルギニン］の［全アルギニン］に対する百分率と、［Ｄ−アロ−スレオニン］の［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］の和に対する百分率と、［全アラニン］の［Ｌ−アラニン］に対する百分率と、［Ｄ−プロリン］の［全プロリン］に対する百分率と、［Ｄ−バリン］の［全バリン］に対する百分率と、［Ｄ−リジン］の［全リジン］に対する百分率とのうちいずれか少なくとも１つが健常者の数値より低く、かつ、［Ｄ−グルタミン酸］の［全グルタミン酸］に対する百分率と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］の［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］の和に対する百分率と、［Ｄ−フェニルアラニン］の［全フェニルアラニン］に対する百分率とのうちいずれか少なくとも１つも健常者の数値より低いときは、腎機能低下が始まる時期の状態が検出されることになる。このようにして異なるグループのアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の尿中濃度にもとづくパラメーターによって、被検者が腎不全の早期にあるかどうかだけでなく、腎機能低下が始まる以前の非常に早期の状態か、それとも、腎機能低下が始まる時期の状態かまで区別することができる。
【００５３】
（５）尿中でのさまざまなアミノ酸エナンチオマーの濃度比の変化
３〜７匹のマウスについて、虚血再灌流処理を行い、取得した尿について、さまざまなアミノ酸のエナンチオマーの対の濃度を測定した。図５−Ａ〜図５−Ｒでは、マウス個体のＬ−体の濃度の平均値に対するＤ−体の濃度の平均値比が、偽手術マウスと、虚血再灌流処理後４、８、２０及び４０時間のマウスとについて棒グラフで示し、統計的有意差の有無を調べた。その結果、尿中の［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］（図５−Ｊ）と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］（図５−Ｋ）と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］（図５−Ｒ）では、Ｌ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比は、再灌流４時間後でも変動せず（統計的有意差無し）、８時間後以降は非常に低下していた（有意差有り）。［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］（図５−Ｆ）と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］（図５−Ｉ）と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］（図５−Ｍ）、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］（図５−Ｎ）、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］（図５−Ｑ）とでは、再灌流４時間後でも変動したものの、統計的有意差が無く、８時間後以降は非常に低下していた（有意差有り）。［Ｄ−メチオニン］及び［Ｌ−メチオニン］（図５−Ｏ）と、［Ｄ−アスパラギン酸］及び［Ｌ−アスパラギン酸］（図５−Ｐ）とでは、変動の傾向が得られなかった。これに対し、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］（図５−Ａ）と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］（図５−Ｂ）と、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］（図５−Ｃ）と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］（図５−Ｄ）と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン（図５−Ｅ）と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］（図５−Ｇ）と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］（図５−Ｈ）と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］（図５−Ｌ）、との組合せでは、Ｌ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比は再灌流後４時間で大きく変動し（統計的有意差有り）、偽手術マウスと、再灌流８時間以降との中間の数値を示した。従来の腎不全の診断マーカーとして使用される尿中クレアチニンでは、マウス虚血再灌流モデルにおいて、虚血後４時間では、腎不全を検知できず、８時間以降で検知できていた（図２−Ｄ）ため、本願の［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］（図５−Ｎ）と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］（図５−Ｑ）と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニンと、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］（図５−Ｈ）と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］（図５−Ｌ）とはいずれも、尿中クレアチニンと同等又はそれ以上の感度の腎不全マーカーとして使用することができる。特に再還流後４時間において有意差をもって検知可能な［Ｄ−ヒスチジン］／［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］／［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］／［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］／［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アラニン］／［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］／［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］／［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数の病態指標値を用いれば、尿中クレアチニンよりも高い感度で腎不全を診断することを可能にする。その中でも特に、再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．０１の有意差を示す、［Ｄ−ヒスチジン］／［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］／［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−プロリン］／［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］／［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数の病態指標値は、より高い感度で腎不全を診断することができ、さらに再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．００１の有意差を示す、［Ｄ−ヒスチジン］／［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−プロリン］／［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］／［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数の病態指標値は、さらに高い感度で腎不全を診断することができる。病態指標値は、単独で用いられてもよいが、複数を組み合わせることにより、より信頼性の高い診断を可能にする。
【００５４】
また、本発明の病態指標値の中で、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニンと、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］のうちの何れかのＤ−体及びＬ−体の対の濃度を用いて算出された病態指標値は、尿中クレアチニンと同等又はそれ以上の感度の腎不全マーカーとして使用することができる。したがって、被検体における病態指標値が、健常者群の病態指標基準値に対し、統計的有意差を有し、かつ腎不全患者群の病態指標基準値に対し、統計的有意差を有する場合であって、健常者群の病態指標基準値と腎不全患者群の病態指標基準値との間にある場合、被検体は、は早期の腎不全の疑いがあると診断することができる。病態指標値の中でも特に、再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．０１の有意差を示す、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を使用して算出された病態指標値を用いることで、より早期の腎不全を診断することができる。さらに再灌流後４時間後において、偽手術群とｐ＜０．００１の有意差を示す、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなる群から選ばれる１又は複数のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された病態指標値により、さらに早い段階の腎不全を診断することができる。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
2015132598.tif 000005
【図１−Ｅ】
2015132598.tif 000006
【図１−Ｆ】
2015132598.tif 000007
【図２−Ａ】
2015132598.tif 000008
【図２−Ｂ】
2015132598.tif 000009
【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図２−Ｅ】
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【図２−Ｆ】
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【図２−Ｇ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図３−Ｄ】
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【図３−Ｅ】
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【図３−Ｆ】
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【図３−Ｇ】
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【図３−Ｈ】
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【図３−Ｉ】
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【図３−Ｊ】
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【図３−Ｋ】
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【図３−Ｌ】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図４−Ｃ】
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【図４−Ｄ】
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【図４−Ｅ】
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【図４−Ｆ】
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【図４−Ｇ】
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【図４−Ｈ】
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【図４−Ｉ】
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【図４−Ｊ】
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【図４−Ｋ】
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【図４−Ｌ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
2015132598.tif 000040
【図５−Ｃ】
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【図５−Ｄ】
2015132598.tif 000042
【図５−Ｅ】
2015132598.tif 000043
【図５−Ｆ】
2015132598.tif 000044
【図５−Ｇ】
2015132598.tif 000045
【図５−Ｈ】
2015132598.tif 000046
【図５−Ｉ】
2015132598.tif 000047
【図５−Ｊ】
2015132598.tif 000048
【図５−Ｋ】
2015132598.tif 000049
【図５−Ｌ】
2015132598.tif 000050
【図５−Ｍ】
2015132598.tif 000051
【図５−Ｎ】
2015132598.tif 000052
【図５−Ｏ】
2015132598.tif 000053
【図５−Ｐ】
2015132598.tif 000054
【図５−Ｑ】
2015132598.tif 000055
【図５−Ｒ】
2015132598.tif 000056
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月26日(2015.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎不全が疑われる被検体の尿の分析方法であって、
該被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合を示す病態指標値を算出するステップと、
当該病態指標値の有意差をもった減少と、被検体の腎不全とを関連づけるステップとを含む、分析方法。
【請求項２】
前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比又は、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記被検体の病態指標値を、健常者群の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者群の病態指標基準値と比較して、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値からの統計的有意差の有無を判定し、前記被検体の病態指標値が前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値と統計的有意差の有無を判定し、又は前記健常者群と前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群とに対し統計的に有意差が有る場合に、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と急性腎不全及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が、前記健常者群の病態指標基準値並びに前記急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値に統計的に有意差が有る場合に、前記健常者群の病態指標基準値と前記慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるかを判定するステップをさらに含む、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記被検体の尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］からなるアミノ酸群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるかを、さらに判定するステップを含む、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
腎不全の検査方法であって、被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ-アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度を測定するステップと、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合を示す病態指標値を算出するステップと、
当該病態指標値の有意差をもった減少と、被検体の腎不全とを関連づけるステップとを含む、検査方法。
【請求項７】
前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比又は、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の比である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記アミノ酸群が、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］からなる、請求項６又は７に記載の検査方法。
【請求項９】
記憶部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む、腎不全が疑われる被検体の尿のサンプル分析システムであって、
前記記憶部は、健常者群の尿における病態指標基準値と、急性腎不全患者及び／又は慢性腎不全患者群の尿における病態指標基準値とを記憶し、
前記分析測定部は、前記被検体の尿中のアミノ酸のうち、Ｄ−セリン及びＬ−セリンと、Ｄ−ヒスチジン及びＬ−ヒスチジンと、Ｄ−アスパラギン及びＬ−アスパラギンと、Ｄ−アルギニン及びＬ−アルギニンと、Ｄ−アロ−スレオニン及びＬ−スレオニンと、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸と、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニンと、Ｄ−プロリン及びＬ−プロリンと、Ｄ−バリン及びＬ−バリンと、Ｄ−アロ−イソロイシン及びＬ−イソロイシンと、Ｄ−フェニルアラニン及びＬ−フェニルアラニンと、Ｄ−リジン及びＬ−リジンとからなるアミノ酸群から選択される少なくとも１対のアミノ酸立体異性体を分離し定量し、
前記データ処理部は、前記被検体の［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から、Ｄ体の構成割合を示す病態指標値を算出し、
当該病態指標値が有意差をもって減少する場合に、被検体を腎不全と決定し、
前記病態情報出力部は前記被検体が腎不全であるか否かについての病態情報を出力する、被検体の尿の分析システム。
【請求項１０】
前記データ処理部が、該被検体の病態指標値を、健常者の病態指標基準値と、急性腎不全及び／又は慢性腎不全の患者の病態指標基準値と比較して、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と統計的に有意差が無いときは前記被検体は腎不全の疑いが薄いことを前記被検体の病態情報と定義し、前記被検体の病態指標値が前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値と統計的に有意差が無いときは前記被検体は腎不全の疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義し、前記健常者群の病態指標基準値並びに前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値に統計的に有意差が有る場合に、前記被検体の病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは前記被検体は早期腎不全の疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項９に記載の尿分析システム。
【請求項１１】
前記病態指標値が、前記少なくとも１種類のアミノ酸の対のＬ−体の濃度に対するＤ−体の濃度の比又は、Ｄ−体及びＬ−体の濃度の和に対するＤ−体の濃度の百分率である、請求項９又は１０に記載の分析システム。
【請求項１２】
前記被検体の尿における［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは、非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１３】
前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ-アロ-スレオニン］及び［Ｌ−アロ-スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれ、
［Ｄ−セリン］及び［Ｌ−セリン］と、［Ｄ−ヒスチジン］及び［Ｌ−ヒスチジン］と、［Ｄ−アスパラギン］及び［Ｌ−アスパラギン］と、［Ｄ−アルギニン］及び［Ｌ−アルギニン］と、［Ｄ−アラニン］及び［Ｌ−アラニン］と、［Ｄ−プロリン］及び［Ｌ−プロリン］と、［Ｄ−リジン］及び［Ｌ−リジン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ−スレオニン］とからなるアミノ酸群の少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第一病態指標値が前記健常者群の病態指標基準値と前記急性腎不全及び/又は慢性腎不全患者群の病態指標基準値との間にあるときは、非常に早期の腎不全である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の分析システム。
【請求項１４】
前記被検体の尿における［Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、[Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］のうちの少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検体が、腎機能低下が始まる時期の状態である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項１２に記載の分析システム。
【請求項１５】
前記アミノ酸群に、さらに［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ-アロ−スレオニン］及び［Ｌ−アロ-スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］が含まれ、
[Ｄ−グルタミン酸］及び［Ｌ−グルタミン酸］と、［Ｄ−バリン］及び［Ｌ−バリン］と、［Ｄ−アロ−イソロイシン］及び［Ｌ−イソロイシン］と、［Ｄ−フェニルアラニン］及び［Ｌ−フェニルアラニン］、［Ｄ−グルタミン］及び［Ｌ−グルタミン］と、［Ｄ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−アロ−スレオニン］及び［Ｌ−スレオニン］と、［Ｄ−ロイシン］及び［Ｌ−ロイシン］からなる群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の対の濃度から算出された前記被検体の第二病態指標値が前記健常者の病態指標基準値と前記慢性腎不全及び/又は急性腎不全患者の病態指標基準値との間にあるとき、前記被検体が、腎機能低下が始まる時期の状態である疑いがあることを前記被検体の病態情報と定義する、請求項１３に記載の分析システム。