(57)【要約】【課題】生体試料中の疾患関連自己抗体を、より高感度に検出することができる検出方法、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供する。【解決手段】生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法であって、エバネッセント波励起蛍光法を用いることを特徴とする検出方法、疾患関連抗原が固定された基板と、疾患関連自己抗体に対する抗体とを含む、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット、及び、疾患関連抗原が固定された基板と、前記基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段と、前記エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段と、を備える、疾患関連自己抗体検出用検出装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法であって、エバネッセント波励起蛍光法を用いることを特徴とする、検出方法。
【請求項２】
前記生体試料中の疾患関連自己抗体を、基板上に固定された疾患関連抗原と反応させる工程と、前記基板上に前記疾患関連抗原を介して捕捉された前記疾患関連自己抗体に結合する、蛍光物質で標識された二次抗体を反応させる工程と、前記基板上の蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程と、前記基板上の蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記蛍光物質で標識された二次抗体が、グロブリンタイプ又はサブクラス特異的に反応する、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体である、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体である、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、請求項７又は８に記載の検出方法。
【請求項１０】
エバネッセント波励起蛍光法を用いて、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキットであって、疾患関連抗原が固定された基板と、疾患関連自己抗体に対する抗体とを含む、キット。
【請求項１１】
前記疾患関連自己抗体に対する抗体が、蛍光物質で標識されている、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体であり、前記疾患関連抗原が、難治性疾患関連抗原である、請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体であり、前記難治性疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、前記腫瘍関連抗原が、ｐ５３タンパク質である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
疾患関連自己抗体検出用検出装置であって、疾患関連抗原が固定された基板と、前記基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段と、前記エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段と、を備える、検出装置。
【請求項１９】
前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体であり、前記疾患関連抗原が、難治性疾患関連抗原である、請求項１８に記載の検出装置。
【請求項２０】
前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体であり、前記難治性疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項１９に記載の検出装置。
【請求項２１】
前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、前記腫瘍関連抗原がｐ５３タンパク質である、請求項２０に記載の検出装置。
【請求項２２】
前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、請求項２１に記載の検出装置。
【請求項２３】
前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、請求項２２に記載の検出装置。
【請求項２４】
前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、請求項２２又は２３に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法、キット及び検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患の存在や進行度の指標として、現在、生体試料中の様々な疾患関連抗原が測定されている。例えば、腫瘍マーカーとして、様々な腫瘍関連抗原が測定されている。しかしながら、癌患者では、腫瘍関連抗原が増加する前に、様々な腫瘍関連抗原に対する自己抗体が増加することが明らかにされてきた（例えば、非特許文献１〜３を参照）。そこで、腫瘍関連抗原を検出するよりも、腫瘍関連抗原に対する自己抗体を検出した方が癌の早期発見につながる場合がある。癌に限らず、他の疾患においても、疾患関連自己抗体（疾患関連抗原に対する自己抗体）は、疾患の早期発見につながる新たな疾患マーカーである。
【０００３】
近年、腫瘍マーカーとして、血液中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出する検査方法が保険適用の対象として認可された。現在、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）のみによって行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. M. A. WHITEHOUSE and E. J. HOLBOROW, Br Med J, 4, 511-513, 1971
【非特許文献２】Imai H., et al., Clin Cancer Res, 1, 417-424, 1995
【非特許文献３】Murray A., et al., Ann Oncol, 21, 1687-1693, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、発明者らは、ＥＬＩＳＡ法による疾患関連自己抗体の検出は、検出感度が不十分な場合があることを見出した。
【０００６】
そこで、本発明は、生体試料中の疾患関連自己抗体を、より高感度に検出することができる検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
（１）生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法であって、エバネッセント波励起蛍光法を用いることを特徴とする、検出方法。
（２）前記生体試料中の前記疾患関連自己抗体を、基板上に固定された疾患関連抗原と反応させる工程と、前記基板上に前記疾患関連抗原を介して捕捉された前記疾患関連自己抗体に結合する、蛍光物質で標識された二次抗体を反応させる工程と、前記基板上の蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程と、前記基板上の蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む、（１）に記載の検出方法。
（３）前記蛍光物質で標識された二次抗体が、グロブリンタイプ又はサブクラス特異的に反応する、（２）に記載の検出方法。
（４）前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体である、（４）に記載の検出方法。
（６）前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体である、（５）に記載の検出方法。
（７）前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、（６）に記載の検出方法。
（８）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、（７）に記載の検出方法。
（９）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、（７）又は（８）に記載の検出方法。
（１０）エバネッセント波励起蛍光法を用いて、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキットであって、疾患関連抗原が固定された基板と、疾患関連自己抗体に対する抗体とを含む、キット。
（１１）前記疾患関連自己抗体に対する抗体が、蛍光物質で標識されている、（１０）に記載のキット。
（１２）前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体であり、前記疾患関連抗原が、難治性疾患関連抗原である、（１０）又は（１１）に記載のキット。
（１３）前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体であり、前記難治性疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、（１２）に記載のキット。
（１４）前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、前記腫瘍関連抗原が、ｐ５３タンパク質である、（１３）に記載のキット。
（１５）前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、（１４）に記載のキット。
（１６）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、（１５）に記載のキット。
（１７）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、（１５）又は（１６）に記載のキット。
（１８）疾患関連自己抗体検出用検出装置であって、疾患関連抗原が固定された基板と、前記基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段と、前記エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段と、を備える、検出装置。
（１９）前記疾患関連自己抗体が、難治性疾患関連自己抗体であり、前記疾患関連抗原が難治性疾患関連抗原である（１８）に記載の検出装置。
（２０）前記難治性疾患関連自己抗体が、腫瘍関連自己抗体であり、前記難治性疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原である、（１９）に記載の検出装置。
（２１）前記腫瘍関連自己抗体が、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、前記腫瘍関連抗原がｐ５３タンパク質である、（２０）に記載の検出装置。
（２２）前記ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体である、（２１）に記載の検出装置。
（２３）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインである、（２２）に記載の検出装置。
（２４）前記野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部が、ｐ５３タンパク質のリン酸化部位又はアセチル化部位である、（２２）又は（２３）に記載の検出装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、生体試料中の疾患関連自己抗体を、より高感度に検出することが可能な検出方法を提供することができる。また、本発明により、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果をまとめたグラフである。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による検出結果の相関関係を示すグラフである。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による検出結果の相関関係を示すグラフである。
【図４】図４（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ異なる患者に由来する癌組織の免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。「Ｎ」は、ヘマトキシリンで染色された核を示し、「ｐ５３」は、ＤＡＢの発色により検出されたｐ５３タンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法］
１実施形態において、本発明は、生体試料中の疾患関連自己抗体の検出方法であって、エバネッセント波励起蛍光法を用いることを特徴とする、検出方法を提供する。
【００１１】
（エバネッセント波励起蛍光法）
例えばガラス基板に入射する励起光の入射角を大きくし、全反射を起こさせると、全反射面の逆側の界面からエバネッセント光と呼ばれる光が約数百ｎｍ滲みだす。エバネッセント波励起蛍光法とは、この原理を応用した蛍光検出方法であり、エバネッセント場に蛍光色素を置いて、エバネッセント光で蛍光を励起することにより、ガラス基板の表面付近に存在する蛍光色素だけが蛍光を発し、蛍光観察における背景光を劇的に減らすことができる検出方法である。
【００１２】
１実施形態において、上述の検出方法は、生体試料中の疾患関連自己抗体を、基板上に固定された疾患関連抗原と反応させる工程と、前記基板上に前記疾患関連抗原を介して捕捉された前記疾患関連自己抗体に結合する、蛍光物質で標識された二次抗体を反応させる工程と、前記基板上の蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程と、前記基板上の蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程と、を含む。疾患関連抗原は自己成分のみならず、菌体成分やウイルス抗原等、外来性分子であってもよい。
【００１３】
生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物等が挙げられる。生体試料としては、例えば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、鼻孔液、唾液等が挙げられる。
【００１４】
疾患関連自己抗体とは、生体試料中に含まれる、疾患関連抗原に対する抗体を意味する。疾患関連自己抗体としては、グロブリンタイプ（クラス）が、ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＡ型、ＩｇＤ型、ＩｇＥ型の抗体が挙げられ、ＩｇＧ及びＩｇＡ型では、サブクラス特異的な抗体も挙げられる。
【００１５】
疾患関連自己抗体を検出するための蛍光標識二次抗体には、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体が挙げられ、抗ヒトＩｇＧ及びＩｇＡ抗体では、それぞれのサブクラスに特異的に反応する抗体も挙げられる。
【００１６】
二次抗体に標識される蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＡＭＣＡ、ＰｅｒＣＰ、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）、アロフィコエリトリン（ＡＰＣ）、テキサスレッド、プリンストンレッド、量子ドット、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が挙げられる。
【００１７】
（疾患関連抗原が固定された基板と生体試料とを接触させて、基板上に前記蛍光物質で標識された二次抗体を用いて疾患関連自己抗体を捕捉する工程）
基板は、エバネッセント波励起蛍光法用のものに、疾患関連抗原を固定したものである。基板としては、例えばガラスやプラスチック等の化成品が挙げられる。疾患関連抗原としては、悪性腫瘍の他、例えば厚生労働省が難病（難治性疾患）と指定する、消化器系疾患（潰瘍性大腸炎など）、呼吸器系疾患（特発性間質性肺炎など）、循環器系疾患（特発性拡張型心筋症など）、腎・泌尿器系疾患（ＩｇＡ腎症など）、血液系疾患（特発性血小板減少性紫斑病など）、免疫系疾患（全身性エリテマトーデスなど）、内分泌系疾患（クッシング症候群など）、代謝系疾患（アミロイドーシスなど）、神経・筋疾患（パーキンソン病関連疾患など）、皮膚・結合組織疾患（膿疱性乾癬など）、骨・関節系疾患（特発性大腿骨頭壊死症など）等で自己抗体が産生されるタンパク質が挙げられる。疾患関連抗原には、これらのタンパク質（自己成分）の他、例えば菌体成分やウイルス抗原等、外来性分子も含まれる。
【００１８】
自己抗体が産生される腫瘍関連抗原としては、例えばｐ５３、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１等、多くのタンパク質が挙げられる。疾患関連抗原は、生体試料から精製されたタンパク質であってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞等の宿主細胞内、又は、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等の無細胞発現系で発現された組換えタンパク質であってもよい。
【００１９】
腫瘍関連抗原を基板に固定する方法としては、物理吸着による方法、エポキシ基、スクシンイミド基やマレイミド基等の反応基を有する化学リンカーを使用する方法等が挙げられる。
【００２０】
疾患関連抗原が固定された基板と生体試料とを接触させると、生体試料中に含まれる疾患関連自己抗体が基板上に固定された疾患関連抗原に結合する。これによって、疾患関連自己抗体を基板上に捕捉することができる。次に、その抗体に結合する蛍光標識二次抗体を反応させる。
【００２１】
（前記蛍光物質をエバネッセント波により励起する工程）
続いて、疾患関連自己抗体を介して、基板上に固定された蛍光標識二次抗体の蛍光物質をエバネッセント波により励起する。この工程には、例えば、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ  １２００、グライコテクニカ社製）が使用できる。
【００２２】
（蛍光物質から放出された蛍光を検出する工程）
続いて、蛍光物質から放出された蛍光を検出する。エバネッセント波励起蛍光法は、測定が終始溶液状態で行なわれる均一系アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）であるため、検出工程中に洗浄等のＢ／Ｆ分離（Ｂｏｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）操作が不要である。このため、例えば、結合力の弱い低親和性抗体の検出にも影響を与えない。Ｂ／Ｆ分離を組み入れた測定も可能であり、Ｂ／Ｆ分離で疾患関連抗原への結合に影響を受けないような中〜高親和性抗体の場合には、一層の高感度化が可能となる。血清サンプル中の疾患関連自己抗体量は、それに結合する蛍光標識二次抗体量に比例するため、蛍光強度を数値化し、疾患関連自己抗体を定量することができる。なお、ＥＬＩＳＡ法等の、固相化された抗体等を用いて反応、洗浄が行なわれる検出方法は、不均一系アッセイ（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）と呼ばれる。
【００２３】
１実施形態において、疾患関連自己抗体は、難治性疾患関連自己抗体でもよいし、腫瘍関連自己抗体でもよい。また、腫瘍関連自己抗体は、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であってもよい。
【００２４】
（ｐ５３タンパク質）
ｐ５３タンパク質は、全長３９３アミノ酸からなり、Ｎ末端ドメイン、コアドメイン、Ｃ末端ドメインの３つの領域から構成されている。コアドメインはＤＮＡ結合に関与する領域であり、癌に認められるｐ５３タンパク質の変異のほとんどがこの領域に集中していることが知られている。
【００２５】
１実施形態において、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体は、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体であってもよい。多くの癌患者の血清サンプル中に検出される、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する抗原エピトープ部位は、ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はＣ末端ドメインに存在することが知られている。そこで、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインであってもよい。ｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１のアミノ酸配列のうち、１〜１０１残基がＮ末端ドメインであり、１０２〜２９２残基がコアドメインであり、２９３〜３９３残基がＣ末端ドメインである。
【００２６】
１実施形態において、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する抗原エピトープ部位は、リン酸化やアセチル化などの修飾を受けた個所もあり得る。そこで、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が認識する野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、例えばリン酸化もしくはアセチル化等、修飾されたドメインであってもよい。
【００２７】
ｐ５３タンパク質は多彩な活性によって遺伝子の異常から生体を守る機能を担っている。ｐ５３タンパク質の機能としては、遺伝子に異常が発生した細胞における、遺伝子転写制御を介した細胞周期進行の制御、遺伝子修復酵素の活性化、アポトーシス誘導能等が挙げられる。ｐ５３遺伝子に突然変異が生じると、これらのｐ５３タンパク質の機能が欠損し、腫瘍の発生に至るというメカニズムが考えられている。
【００２８】
大腸、胃、乳腺、肺、脳、食道等の多くのヒトの腫瘍において、ｐ５３遺伝子が突然変異を起こしていることが見出されている。また、多くの腫瘍組織においてｐ５３タンパク質の異常な蓄積が観察されている。さらに癌高発症家系において、ｐ５３遺伝子に変異が見られることが報告されている。
【００２９】
一方、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、腫瘍の徴候として、癌患者の血清中に見られることが知られている。ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の出現とｐ５３遺伝子の変異には、非常に高い相関があることが示されている。また、正常細胞にはｐ５３タンパク質はごく微量しか存在しないが、ｐ５３遺伝子に突然変異が生じることにより、ｐ５３タンパク質の半減期が延長し、変異ｐ５３タンパク質が細胞核内に蓄積することが示唆されている。
【００３０】
［生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキット］
１実施形態において、本発明は、エバネッセント波励起蛍光法を用いて、生体試料中の疾患関連自己抗体を検出するためのキットであって、疾患関連抗原が固定された基板と、疾患関連自己抗体に対する抗体とを含む、キットを提供する。
【００３１】
（抗疾患関連自己抗体に対する抗体）
上述したように、本実施形態に係るキットにおける疾患関連自己抗体に対する抗体は、蛍光物質で標識されていてもよい。また、上述したように、本キットにおける疾患関連自己抗体は、難治性疾患関連自己抗体であり、基板に固定された疾患関連抗原は難治性疾患関連抗原であってもよい。また、上述したように、本キットにおける難治性疾患関連自己抗体は、腫瘍関連自己抗体であり、基板に固定された疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原であってもよい。また、上述したように、本キットにおける腫瘍関連自己抗体は、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体であり、基板に固定された腫瘍関連抗原は、ｐ５３タンパク質であってもよい。また、上述したように、本キットにおけるｐ５３タンパク質に対する自己抗体は、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体であってもよく、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインであってもよい。また、例えばリン酸化やアセチル化など、修飾されたものでもよい。
【００３２】
本実施形態に係るキットは、生体試料や抗疾患関連自己抗体に対する抗体を希釈するための緩衝液を更に含んでいてもよい。
【００３３】
［抗疾患関連自己抗体検出用検出装置］
１実施形態において、本発明は、疾患関連自己抗体検出用検出装置であって、疾患関連抗原が固定された基板と、前記基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段と、前記エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段と、を備える、検出装置を提供する。
【００３４】
検出装置は、疾患関連自己抗体検出用であり、疾患関連抗原は、難治性疾患関連抗原でもよい。また、検出装置は、腫瘍関連自己抗体検出用であり、疾患関連抗原が、腫瘍関連抗原であってもよい。また、検出装置は、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体検出用であり、腫瘍関連抗原がｐ５３タンパク質であってもよい。また、本検出装置が検出対象とするｐ５３タンパク質に対する自己抗体は、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部に対する抗体であってもよい。また、本検出装置が検出対象とするｐ５３タンパク質に対する自己抗体が、抗原として認識する、野生型完全長ｐ５３タンパク質の少なくとも一部は、野生型完全長ｐ５３タンパク質のＮ末端ドメイン又はコアドメイン又はＣ末端ドメインであってもよい。また、野生型完全長ｐ５３タンパク質が、例えばリン酸化やアセチル化など、修飾されたものでもよい。
【００３５】
（疾患関連抗原が固定された基板）
本実施形態の検出装置において、疾患関連抗原が固定された基板の材質、固定される疾患関連抗原、固定方法等は、上述した基板と同様であってもよい。
【００３６】
（基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段）
基板の表面にエバネッセント波を発生させる照射手段（発生手段）としては、全反射によりエバネッセント波を発生させるものであればよい。このような照射手段として、具体的には、例えば、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ  １２００、グライコテクニカ社製）のエバネッセント波照射部を使用することができる。エバネッセント波の光源としては、レーザー、ＬＥＤ、水銀ランプ、ハロゲンランプ等が挙げられる。照射するエバネッセント波の波長は、光源やダイクロックミラー、フィルター等を変更することにより、変更可能であることが好ましい。
【００３７】
（エバネッセント波により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段）
エバネッセント波の発生（照射）により励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出する検出手段としては、例えばＣＣＤカメラが挙げられる。検出装置は、基板の蛍光画像を取得し、基板上の特定のスポットの蛍光強度を数値化するプログラムを備えていてもよい。このような検出手段として、具体的には、例えば、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ  １２００、グライコテクニカ社製）の蛍光検出部を使用することができる。
【実施例】
【００３８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実験例１］
乳癌患者及び健常者を対象とし、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法でｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出し比較した。
【００４０】
（ｐ５３タンパク質に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出）
乳癌患者６４人から血清サンプルを採取した。これらの血清サンプル中に存在する、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。測定には、現在日常の臨床検査で使用されている測定キット（ＭＥＳＡＣＵＰ  ａｎｔｉ−ｐ５３テスト、株式会社医学生物学研究所製）を使用した。野生型完全長ｐ５３タンパク質を固定化したプラスチックプレートのウェルに、検査対象の血清を添加して反応させ、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体でｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出した。
【００４１】
その結果、後述するように、６４サンプル中１０サンプルでｐ５３タンパク質に対する自己抗体が検出された。また、残りの５４サンプルからはｐ５３タンパク質に対する自己抗体が検出されなかった。
【００４２】
（ｐ５３タンパク質に対する自己抗体のエバネッセント波励起蛍光法による検出）
上述したＥＬＩＳＡ法で検査対象としたものと同一の６４人の血清サンプルについて、エバネッセント波励起蛍光法によりｐ５３タンパク質に対する自己抗体を検出した。また、健常者２０人についても同様に測定し、カットオフ値をノンパラメトリックな９５パーセンタイルで設定した。
【００４３】
まず、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ  １２００、グライコテクニカ社製）用のガラス基板のウェルに、野生型完全長ｐ５３タンパク質（産業総合研究所、Ｅｎｔｒｙ  ｃｌｏｎｅ  ＩＤ；ＦＬＪ９２９４３ＡＡＡＦ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で４ｎＬずつスポット状に滴下し、基板上のエポシキ基とｐ５３タンパク質のアミノ基とを反応させ固定化した。続いて、ガラス基板を界面活性剤添加リン酸緩衝液で洗浄後、界面活性剤添加リン酸緩衝液にて１０倍希釈した上述の血清サンプルを１ウェルあたり１００μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。続いて、１ウェルあたり１００μＬずつ、１００倍希釈したＣｙ３標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製、型番１０９−１６５−０９８）を添加し、室温で０．５時間反応させた。続いて、エバネッセント波励起蛍光法による蛍光検出装置（商品名：ＧｌｙｃｏＳｔａｔｉｏｎ（商標）Ｒｅａｄｅｒ  １２００、グライコテクニカ社製）でＣｙ３の蛍光を検出し、蛍光強度を数値化した。
【００４４】
図１は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による、血清サンプル中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果をまとめたグラフである。２０００ＲＬＵ（相対蛍光単位）をカットオフ値とし、２０００ＲＬＵ以上の蛍光が検出されたサンプルを陽性、２０００ＲＬＵ未満の蛍光が検出されたサンプルを陰性と判断した。
【００４５】
表１は、図１と同じ結果を表にしたものである。ＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性でも、エバネッセント波励起蛍光法で測定すると陽性となる例が存在することが明らかとなった。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
（ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による、ｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果の相関）
上述したｐ５３タンパク質に対する自己抗体の検出結果について、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による検出結果の相関関係を検討した。図２及び図３は、ＥＬＩＳＡ法及びエバネッセント波励起蛍光法による検出結果の相関関係を示すグラフである。図２及び図３において、横軸は、ＥＬＩＳＡ法による検出結果を、抗体量（Ｕ／ｍＬ）で示したものであり、縦軸はエバネッセント波励起蛍光法で測定された蛍光の強度を、相対蛍光単位（ＲＬＵ）で示したものである。図２及び図３は、同一の検出結果を異なるスケールで示したものである。
【００４８】
その結果、ＥＬＩＳＡ法によりｐ５３タンパク質に対する自己抗体が高濃度に検出された血清サンプルは、エバネッセント波励起蛍光法でもｐ５３タンパク質に対する自己抗体が高濃度に検出されており、相関関係が認められた。また、ＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性の血清サンプルであっても、エバネッセント波励起蛍光法で測定すると蛍光強度が幅広く分布していることが示された。
【００４９】
［実験例２］
（癌組織の免疫染色）
血清サンプル中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性であり、エバネッセント波励起蛍光法による検出結果が陽性であった乳癌患者６例の癌組織を抗ｐ５３抗体で免疫染色し、ｐ５３の発現を検討した。癌組織の組織切片に、抗ヒトｐ５３抗体（Ｃｌｏｎｅ：ＤＯ−７，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ７００１，Ｄａｋｏ）を反応させた。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識高分子ポリマー試薬（ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）＋Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４０６１，Ｄａｋｏ）を二次抗体として反応させた。次に、３，３’−ジアミノベンジジン−４ＨＣｌ（ＤＡＢ）基質溶液（Ｓｔａｂｌｅ  ＤＡＢ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＡ０１１８Ｌ，ファルマ）を反応させて発色させた。続いて、ヘマトキシリン染色を行い、光学顕微鏡で観察した。
【００５０】
図４（ａ）及び（ｂ）は、血清中抗ｐ５３自己抗体がＥＬＩＳＡ法陰性、エバネッセント波励起蛍光法陽性例のそれぞれ異なる患者２例に由来する乳癌組織のｐ５３タンパク質に対する免疫染色の結果を示す光学顕微鏡写真である。「Ｎ」は、ヘマトキシリンで染色された核を示し、「ｐ５３」は、ＤＡＢの発色により検出されたｐ５３タンパク質を示す。図４の結果から、これらの組織では、ｐ５３タンパク質の発現が異常に上昇していることが確認された。すなわち、血清サンプル中のｐ５３タンパク質に対する自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出結果が陰性であり、エバネッセント波励起蛍光法による検出結果が陽性であった患者において、癌組織におけるｐ５３タンパク質の異常発現が確認され、エバネッセント波励起蛍光法による検出の有効性が確認された。加えて、図４に示す２例を含む同様の結果乖離例で免疫染色が可能だった合計６例は、すべて乳癌組織中でｐ５３タンパク質の異常発現が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、抗ｐ５３タンパク質自己抗体検出での実験例で判るように、生体試料中の抗疾患関連自己抗体を、種々の微量抗体測定時汎用されているＥＬＩＳＡ法より、高感度に検出することが可能な検出方法を提供することができる。また、本発明により、生体試料中の抗疾患関連自己抗体を検出するためのキット及び抗疾患関連自己抗体検出用検出装置を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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