(57)【要約】      （修正有）【課題】機能性タンパク質によって装飾された金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）の作製のための新規な酵素的アプローチの提供。【解決手段】標的タンパク質によって装飾された金属ナノ粒子を生成する方法であって、（ａ）標的タンパク質と、コファクターとしてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを使用する酵素と、金属結合特性を示すポリペプチドとの三機能性融合タンパク質を調製する工程、及び（ｂ）融合タンパク質と金属ナノ粒子とを反応及び／又は相互作用させる工程を含む機能性タンパク質によって装飾された金属ナノ粒子の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質によって装飾された金属ナノ粒子を生成する方法であって、
（ａ）前記目的のタンパク質と、コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する酵素と、金属結合特性を示すポリペプチドとの融合タンパク質を調製する工程、および
（ｂ）前記融合タンパク質と前記ナノ粒子とを反応および／または相互作用させる工程
を含む方法。
【請求項２】
コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する酵素が、デヒドロゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デヒドロゲナーゼが、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびアミノ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
融合タンパク質が、組換え的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
金属が、金、白金、パラジウム、銀、銅および鉄からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質で装飾された金属ナノ粒子を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）は、その化学的安定性、生物適合性ならびに独特の光学および電子的特性ゆえに、広く使用されているナノ物質の１つである。１バイオテクノロジーの研究分野において、Ａｕ  ＮＰは、種々の生物分子によって修飾されてきており、得られたナノバイオ物質は、Ａｕ  ＮＰの固有の特性と一緒になって独特の機能をもたらす。２，３これらの生物分子の中で、タンパク質は、Ａｕ  ＮＰにコロイド安定性と生物活性との両方を付与することができるので非常に重要である。４，５タンパク質−Ａｕ  ＮＰの能力は、生物画像化ツール、生物診断センサー、薬物送達キャリアおよび生物電極において実証されている。
【０００３】
典型的に、タンパク質−Ａｕ  ＮＰの作製のためには多工程を要し；これらの工程には、金イオンの化学的還元、およびそれに続く、別々に調製されたタンパク質との混合が含まれることがある。Ａｕ  ＮＰは、物理的吸着、静電結合または化学結合を用いて、タンパク質分子により機能性を付与することができる。６，７しかし、これらの機能性付与方法は、Ａｕ  ＮＰにおけるタンパク質の方向性を正確に制御することができず、それにより、タンパク質のランダムな配列およびその機能性の低下をもたらす。８近年、バイオテンプレートとしてのペプチドおよびタンパク質の使用に基づく代替のアプローチが、水溶液におけるバイオ−無機ハイブリッドの作製のために提唱されている。９-１１このアプローチは、無機物質上へのテンプレート生物分子の容易且つ直接的な固定化をもたらす。タンパク質−Ａｕ  ＮＰはまた、組換えタンパク質にペプチドタグを導入することによっても生成される。プロテインＡ−固定化Ａｕ  ＮＰのＢ−ドメインバリアントのワンポット作製が報告されたが、１２このプロセスは、生物分子の強烈な還元剤であるＮａＢＨ４の使用を必要としていた。
【０００４】
生理学的条件下での有機−無機ナノ構造の合成のための天然の系もまた、使用されている。１３金属ナノ粒子の環境にやさしい合成のために、種々の微生物がこれまでに利用可能である。１４，１５例えば、バーティシリウム属（Verticillium sp.）によるＡｕ  ＮＰの微生物合成は、直径およそ２０ｎｍのＡｕ  ＮＰを、ＡｕＣｌ４−水溶液から微生物還元条件下で生成した。１４ナノ構造の形成のメカニズムは完全に理解されていないが、電子供与性補酵素およびグルタチオンなどの生物材料は、生物における生物還元プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【０００５】
我々は、Ａｕ  ＮＰの形成は、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）−媒介型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）再生反応において開始され得ることを報告した。15近年、我々は、大腸菌（Escherichia coli）ＧＬＤと金結合ペプチドタグ標識タンパク質との組み合わせによる、タンパク質−Ａｕ  ＮＰの作製を研究した。１６この研究の過程において、我々は、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が、金結合ペプチドよりもＡｕ  ＮＰ表面に対して高い親和性を示したこと、および、大腸菌（E. coli）ＧＬＤを用いて合成したＡｕ  ＮＰにおいて１つのＣ末端システインの導入が、目的のタンパク質の安定的な捕捉を可能にしたことを見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明において、我々は、機能性タンパク質によって装飾された金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）の作製のための新規な酵素的アプローチを開発しようした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下を提供する：
（１）目的のタンパク質によって装飾された金属ナノ粒子を生成する方法であって、
（ａ）前記目的のタンパク質と、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する酵素との融合タンパク質を調製する工程、および
（ｂ）前記融合タンパク質と前記ナノ粒子とを反応および／または相互作用させる工程
を含む方法。
【０００９】
（２）コファクターとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する酵素が、デヒドロゲナーゼである、（１）に記載の方法。
【００１０】
（３）デヒドロゲナーゼが、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびアミノ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される少なくとも１つである、（２）に記載の方法。
【００１１】
（４）融合タンパク質が、組換え的に発現される、（１）に記載の方法。
（５）金属が、金、白金、パラジウム、銀、銅および鉄からなる群より選択される少なくとも１つである、（１）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】組換えＢｓＧＬＤ−媒介型タンパク質−Ａｕ  ＮＰコンジュゲートの作製の概略図を示す。
【図２】合成Ａｕ  ＮＰを示す。（Ａ）酵素的ＮＡＤＨのＢｓＧＬＤ−媒介型再生を介して合成されたＡｕ  ＮＰのＵＶ−可視光スペクトル。（Ｂ）（１）タンパク質１、（２）タンパク質２および（３）タンパク質３を用いて合成したＡｕ  ＮＰのＴＥＭ画像。
【図３】ＥＬＩＳＡにおけるタンパク質１、２および３−Ａｕ  ＮＰによるＯＶＡの検出を示す。
【図４】精製ＢｓＧＬＤ（１〜３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％  ポリアクリルアミド）分析を示す。１、２および３の理論分子量は、それぞれ、４２．０、４２．１および４９．３  ｋＤａであった。
【図５】ＢｓＧＬＤ（１〜３）の触媒活性を示す。
【図６】種々の緩衝液条件下でのＢｓＧＬＤ  １の酵素活性を示す。
【図７】以下により種々の緩衝溶液およびｐＨ値を用いて合成したＡｕ  ＮＰ溶液のＵＶ−可視光スペクトルおよびサンプル画像を示す（スペクトルおよび画像は４８ｈ後に測定および撮影した）：（Ａ）ＢｓＧＬＤ  １、（Ｂ）ＢｓＧＬＤ  ２、（Ｃ）ＢｓＧＬＤ  ３。［ＢｓＧＬＤ］＝１μＭ、［グリセロール］＝５０ｍＭ、［ＮＡＤ＋］＝４００μＭ、［ＨＡｕＣｌ４］＝０．２５ｍＭ。
【図８】以下によるＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰコンジュゲートの、５０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ９．５）中で測定したＵＶ−可視光吸収スペクトルを用いて評価した安定性を示す：（Ａ）ＢｓＧＬＤ  １、（Ｂ）ＢｓＧＬＤ  ２、（Ｃ）ＢｓＧＬＤ  ３。Ａｕ  ＮＰは、４８ｈにわたって実施した酵素的ＢｓＧＬＤ反応を介して合成した。Ａｕ  ＮＰ溶液中のＮａＣｌ濃度は、以下：（ａ）０ｍＭ、（ｂ）１２５ｍＭ、（ｃ）２５０ｍＭ、（ｄ）５００ｍＭ、（ｅ）１Ｍおよび（ｆ）１．５Ｍに調整し、吸収スペクトルは２ｈ後に測定した。（Ｄ）ＳＰＲバンド対ＮａＣｌ濃度についてのこれらのλｍａｘ値の吸収相対値。
【図９】精製１−、２−または３−Ａｕ  ＮＰから引き離したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。染色バンドは、タンパク質がＡｕ  ＮＰ上に固定化されたことを示した。
【図１０】本研究において実施したＥＬＩＳＡアッセイの概略図である。
【図１１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。１、ＩＰＴＧ（＋）；２、ＩＰＴＧ（−）；３、ＩＰＴＧの可溶性画分（＋）；４、ＩＰＴＧの不溶性画分（＋）；Ｍ、マーカー
【図１２】（ａ）種々の条件下でＩＰＴＧ誘導した組換え大腸菌（E. coli）ＢＬ２１細胞のＵＶ／可視光スペクトル、（ｂ）サンプル（ｉ）の可溶性画分のＵＶ／可視光スペクトルを示す。
【図１３】（ａ）ＩＰＴＧ誘導した組換え大腸菌（E. coli）によって細胞内で合成したＡｕ  ＮＰのＴＥＭ画像、（ｂ）（ａ）において選択された領域の拡大画像のＴＥＭ画像、（ｃ）組換え大腸菌（E. coli）細胞から抽出したＡｕ  ＮＰのＴＥＭ画像を示す。
【図１４】ＩＰＴＧ誘導した組換え大腸菌（E. coli）によって合成したＡｕ  ＮＰによる、ＥＬＩＳＡにおけるＯＶＡの検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、目的のタンパク質（標的タンパク質）によって装飾された金属ナノ粒子の作製についての新規な酵素的アプローチが、開発された。本発明の１つの実施形態において、タンパク質−Ａｕ  ＮＰの作製のためのワンポットの１タンパク質構成要素系が開示され、これは、Ａｕ  ＮＰ上に標的タンパク質（活性タンパク質）を呈示することができる（図１）。
【００１４】
我々はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをコファクターとして使用する酵素を選択した。ワンポットの１タンパク質系を実現するために、３つの異なる機能性を有する三機能性融合タンパク質を設計した。
【００１５】
金属ナノ粒子は、標的タンパク質およびＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）をコファクターとして使用する酵素を含む融合タンパク質と金属ナノ粒子とを反応および／または相互作用させることによって、得られ得る。本発明において使用される金属としては、金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）および鉄（Ｆｅ）からなる群より選択される少なくとも１つが挙げられる。これらの金属は、市販されている。本発明において使用される、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨをコファクターとして使用する酵素としては、非限定で以下が挙げられる：デヒドロゲナーゼ、例えば、グリセロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼまたはアミノ酸デヒドロゲナーゼ。
【００１６】
本発明において使用される融合タンパク質は、第１の機能エレメントとして目的のタンパク質（「標的タンパク質」と呼ぶ）、第２の機能エレメントとして触媒的ＮＡＤＨ再生酵素（「触媒構成要素」と呼ぶ）、および第３の機能エレメントとして金結合タンパク質／ペプチド部分（「ＴＡＧ」と呼ぶ）を含む。本発明の融合タンパク質は、少なくとも、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＰＤＨをコファクターとして使用しなければならない触媒構成要素を含む。従って、本発明は、１つまたは複数の標的タンパク質に融合したアミノ酸残基を含む単離された融合タンパク質の特徴を有する。標的タンパク質は、当該分野で周知の方法によって、触媒構成要素に、組換え的に融合されても、化学結合（例えば、共有結合、イオン結合、疎水性結合およびファンデルワールス力）されてもよい。
【００１７】
本明細書中で開示される融合タンパク質のそれぞれは、１つまたは複数のＴＡＧを有することが企図される。本発明に従うＴＡＧは、金属結合特性を有する４つ以上のアミノ酸、例えばヒスチジンおよびシステインを含む。このＴＡＧは、一続きのアミノ酸残基、例えば、約４と約２０との間のアミノ酸残基長であるヒスチジンおよび／またはシステインであってもよい。ＴＡＧは、触媒構成要素のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。従って、融合タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、触媒構成要素のＮ末端、および触媒構成要素のＣ末端におけるＴＡＧ（例えば、ヒスチジンタグ）を介して、標的タンパク質を含む。Ｃ末端に融合したＴＡＧを有する触媒構成要素を含む融合タンパク質は、特に有用な実施形態である。１つの非常に特定の実施形態において、図面においてＢｓＧＬＤ−Ｈ６、ＢｓＧＬＤ−Ｈ６ＣおよびｐＧＢｓＧＬＤ−Ｈ６Ｃについての配列例において見られる通り、一続きの６つのヒスチジンおよび１つのシステインを有するＴＡＧが使用される。ＴＡＧを含むヒスチジンおよびシステインは、図１において、それぞれ「Ｈ」および「Ｃ」と示される。
【００１８】
本発明はまた、本明細書中で記載される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。従って、任意の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列は、対応するＢｓＧＬＤ−Ｈ６、ＢｓＧＬＤ−Ｈ６ＣおよびｐＧＢｓＧＬＤ−Ｈ６Ｃ融合タンパク質を発現する組換え分子を作製するために使用することができる。詳細な実施形態において、本発明は、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００１９】
本発明の融合タンパク質はまた、融合タンパク質の同定、合成または精製を容易にするために適切なポリペプチドリンカーまたは他の配列に融合またはコンジュゲートしていてもよい。具体的には、第１ポリペプチド構成要素と第２ポリペプチド構成要素とを、および／または第２ポリペプチド構成要素と第３ポリペプチド構成要素とを、各ポリペプチドが所望の活性を有することを確実にする十分な距離によって分離するために、ペプチドリンカー配列が使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、融合タンパク質内に、例えば触媒構成要素と標的タンパク質との間に、当該分野で周知の標準技術を用いて組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、柔軟に拡張された立体配置を採用するその能力、および触媒構成要素、標的タンパク質またはＴＡＧにおける機能的部分と相互作用し得る二次構造を採用しない能力に基づいて、選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、ポリ−Ｇｌｙ、ポリ−Ｈｉｓ、ポリ−Ａｓｎ、ポリ−Ｓｅｒおよびポリ−Ｐｒｏ残基を含む。
【００２０】
本発明の融合タンパク質は、当該分野で周知の組換え技術または化学的コンジュゲート化を含む標準的方法を用いて調製することができる。本発明の核酸およびタンパク質を単離し特性決定するために有用な技術は、当業者に周知であり、過度の実験を必要とせずに、標準的分子生物学および生化学のマニュアルを考慮に入れて使用するための好適なプロトコールを選択することができる。例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012」を参照されたい。
【００２１】
簡潔にいうと、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター内に集められ、ライゲーションされ得る。例えば、触媒構成要素をコードするＤＮＡ配列の５’末端は、ペプチドリンカーを含むもしくは含まずに、抗体結合ドメインなどの標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列の３’末端に、配列の読み取り枠が一致するようにライゲーションされる。このことにより、全ての構成要素ポリペプチドの生物活性を保持する１つの融合タンパク質への翻訳が可能になる。ライゲーションされたＤＮＡ配列は、プロモーターを含む好適な転写もしくは翻訳の調節エレメントに、作動可能に連結される。
【００２２】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を所望の様式で調節するため、または本発明の発現された融合タンパク質を所望の様式でプロセシングするためのその能力について選択することができる。本発明において、宿主細胞、例えば大腸菌（Escherichia  coli）、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などは、本発明の融合タンパク質が確実に正確にプロセシングされるように選択することができる。
【００２３】
組換え融合タンパク質もしくはポリペプチドを細胞質中に発現するまたは培養培地中に組換え融合タンパク質もしくはポリペプチドを分泌する好適な宿主／ベクター系から回収した上清は、市販のフィルターを用いてまず濃縮してもよい。濃縮の後、この濃縮物は、疎水性相互作用に基づく精製のために、アフィニティーカラム、イオン交換樹脂もしくはカラムなどの好適な精製カラムに適用することができる。１回または複数回の逆相ＨＰＬＣ工程を、組換えポリペプチプドをさらに精製するために使用することができる。
【００２４】
本発明において、精製された組換えポリペプチドは、金属イオンと混合して、その酵素的反応／相互作用を用いて機能性タンパク質の存在下で金属ナノ粒子（ＮＰ）と組換えポリペプチドとのコンジュゲートを合成することができる。本発明の融合タンパク質は、ＮＡＤ＋を１μＭ〜５０００μＭ（好ましくは４００μＭ）の濃度で、およびグリセロールを１ｍＭ〜１０００ｍＭ（好ましくは１００ｍＭ）の濃度で含む水溶液に、０．０１μＭ〜２５μＭ、好ましくは１μＭの終濃度にて添加してもよい。金属供給源（例えば、０．５ｍＭのＡｕＣｌ４−）の添加後、この反応混合物は、４〜８０℃（使用される酵素の触媒特性に依存した最適温度）にて、６〜９６時間（好ましくは４８ｈ）インキュベートする。インキュベーション後、精製手順を使用してもよい。
実施例
【実施例１】
【００２５】
詳細には、本発明において、機能性タンパク質で装飾された金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）の作製のための新規な酵素的アプローチを、Ｎ末端タンパク質ＧドメインおよびＣ末端（Ｈｉｓ）６Ｃｙｓタグによってタグ標識した、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来の組換えグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＢｓＧＬＤ）を含む融合タンパク質を使用して、開発した。組換えＢｓＧＬＤは、グリセロールを基質として用いるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの触媒的還元を介したＡｕ  ＮＰの合成を促進し、組換えＢｓＧＬＤは、ＩｇＧ抗体に対するタンパク質Ｇの結合能の結果として、Ａｕ  ＮＰ上に自己固定化した。
【００２６】
我々は、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のＧＬＤ（ＢｓＧＬＤ）を選択した。何故なら、その結晶構造が公知で利用可能であり、ＢｓＧＬＤは大腸菌（E. coli）ＧＬＤよりも高い熱安定性を示すからである。１７
【００２７】
ワンポットの１タンパク質系を実現するために、３つの異なる機能性を有する組換えＢｓＧＬＤを設計した；これらの機能性は、抗体結合機能（タンパク質Ｇ、ｐＧのＢ１ドメイン）、触媒的ＮＡＤＨ再生機能（ＢｓＧＬＤ）、および金結合機能（Ｈｉｓ６Ｃｙｓ、Ｈ６Ｃ）であった（表１におけるエントリー３）。タンパク質スキャフォールドにおける２つの機能を分離するために、ｐＧドメインをＢｓＧＬＤのＮ末端に導入し、Ｈ６ＣタグをＢｓＧＬＤのＣ末端に導入した。この機能性のそれぞれを調査するため、また、タンパク質１および２も調製した。
【００２８】
【表１】
2015163063.tif 000002
【００２９】
タンパク質１〜３の純度および分子量を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて検証した（図４）。単一バンドが、理論的分子量に対応する位置で観察された。これは、全ての組換えタンパク質が、成功裏に調製されたことを示唆する。調製したＢｓＧＬＤの中で１の触媒活性が最も高いが、最も低い活性を示した３でも、タンパク質１の触媒活性の約８０％を保持した（図５）。さらに、タンパク質の触媒活性は、ｐＨ条件が中性から塩基性に変化するに従って、徐々に増大した（図６）。
【００３０】
Ａｕ  ＮＰの形成における緩衝液およびｐＨの変化の効果を調査するため、我々は、Ａｕ  ＮＰ合成におけるＢｓＧＬＤ−媒介型ＮＡＤＨ再生の実行可能性を試験した。それぞれ、組換えＢｓＧＬＤ（１μＭ）、ＮＡＤ＋（４００μＭ）およびグリセロール（１００ｍＭ）を、ＡｕＣｌ４−（０．２５ｍＭ）に、種々の緩衝液条件および７．０〜１１．０のｐＨ値において添加し、３７℃にて４８ｈにわたってインキュベートした。この結果は、Ａｕ  ＮＰの形成は、ＢｓＧＬＤの活性に依存することを示した（図７）。Ｇｌｙ−ＮａＯＨ緩衝液中でｐＨ１０．０にて合成されたＡｕ  ＮＰは、強い赤みがかった色を示し、約５２３ｎｍにおける吸光度の増大を示した。これは、Ａｕ  ＮＰの局在表面プラズモン共鳴バンドに帰するものである。これらの結果に基づき、我々は、さらなる実験のために、Ｇｌｙ−ＮａＯＨ緩衝溶液を選択した（ｐＨ９．５）。次に、我々は、タンパク質２および３も、Ａｕ  ＮＰを作製するために使用できるか否かを試験した。タンパク質２または３（１μＭ）、ＮＡＤ＋（４００μＭ）およびグリセロール（１００ｍＭ）を、ＡｕＣｌ４−（０．５ｍＭ）に、５０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨ緩衝液中にてｐＨ９．５で添加し、この溶液を３７℃にて４８ｈにわたってインキュベートした。４８ｈ後、両方の種類のＢｓＧＬＤを含む溶液とも、赤みがかった色を示し、似通ったＵＶ−可視光スペクトルを示した（図２Ａ）。ＳＰＲバンドについてのλｍａｘ値は、タンパク質１、２および３について、それぞれ５３０、５２５および５２７ｎｍであった。これらの結果は、組換えＢｓＧＬＤ（１〜３）の全てが、グリセロールによるＮＡＤＨの再生を触媒化することを示し、Ｈｉｓ-タグ、Ｈ６ＣまたはｐＧの付加は、Ａｕ  ＮＰの形成に悪い影響を及ぼさないことを示唆した。
【００３１】
Ａｕ  ＮＰをさらに分析するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を行った（図２Ｂ）。図２Ｂにおいて示されるように、１〜３を用いて調製したＡｕ  ＮＰは、それぞれ１２．１±１０．８、１２．２±９．１および１１．６±９．５ｎｍの平均直径を示した（平均直径を計算するために測定した粒子の数は、それぞれｎ＝２０５、１６９および１９３であった）。
【００３２】
組換えタンパク質へのシステイン残基の導入は、Ａｕ−Ｓ結合を介して、Ａｕ  ＮＰの安定的な固定化を容易にすることが示されている。18これに基づき、我々は、塩の添加の際の分散安定性を評価することによって、Ｈｉｓ−タグの隣のＣ末端システイン残基の添加の効果を調査した。タンパク質２および３を使用して調製したＡｕ  ＮＰは、１を用いて調製したＡｕ  ＮＰと比べて、高いイオン濃度の溶液において優れた安定性を示した（図８）。１つのＣｙｓの導入の効果は、有意ではなかったが、最も高い安定性は、タンパク質３を用いて達成された。
【００３３】
次に、我々は、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて合成したＡｕ  ＮＰを特性決定した。１〜３を用いて調製したＡｕ  ＮＰのＤＬＳ測定からの結果は、それぞれ、粒子が４０．９、４０．８および４４．７ｎｍの平均直径を有したことを示した（表２）。ＤＬＳを用いて測定した粒子径は、ＴＥＭ分析において測定したものよりも一貫して大きいという事実は、当該のタンパク質によって全ての種類のＡｕ  ＮＰが覆われていることを示唆した。Ａｕ  ＮＰ上に結合したタンパク質の機能性を調査するために、Ａｕ  ＮＰ溶液を、ウサギ抗オボアルブミン（ＯＶＡ）ＩｇＧ抗体と、Ａｕ  ＮＰ合成におけるタンパク質１〜３の初期濃度に基づいて１／１のタンパク質／抗体比を用いて混合した。ＤＬＳ測定は、抗体の添加の際に、４４．７ｎｍから５７．１ｎｍへ３−Ａｕ  ＮＰコンジュゲートの平均直径の増大が起きたことを示した（タンパク質３、表１）。対照的に、１−Ａｕ  ＮＰおよび２−Ａｕ  ＮＰ（ｐＧドメインを有さない）の平均直径は、変化しなかった（タンパク質１および２、表１）。これらの結果は、タンパク質３のｐＧドメインを介して、Ａｕ  ＮＰ上に抗体が捕捉されたことを明らかに示している。従って、タンパク質１〜３はＡｕ  ＮＰ上に固定化され、タンパク質３は抗体に対するその結合活性を維持した。さらに、Ａｕ  ＮＰ上に、各タンパク質の存在を確認した。タンパク質−固定化Ａｕ  ＮＰを精製し（実施例を参照されたい）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した（図９）。タンパク質を、メルカプトエタノールおよびＳＤＳ（チオール基を介してＡｕ  ＮＰに結合したタンパク質を取り除く）の存在下での熱変性によりＡｕ  ＮＰから引き離した。
【００３４】
【表２】
2015163063.tif 000003
【００３５】
最後に、我々は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてＩｇＧ−結合Ａｕ  ＮＰの機能性を調べた（図１０）。このＥＬＩＳＡにおいて、ＯＶＡを、モデル抗原として使用した（実施例を参照されたい）。精製したＡｕ  ＮＰを、１％カゼインＮａを用いてブロックし、次いで、ＥＬＩＳＡに適用した。３−Ａｕ  ＮＰのみが、強いシグナルを発した（図３）。１−Ａｕ  ＮＰおよび２−Ａｕ  ＮＰは、非常に弱いシグナルしか呈さなかった。ＥＬＩＳＡ系における任意のエレメントの非存在もまた、ほとんどシグナルを示さなかった。これらの結果は、Ａｕ  ＮＰ表面上に呈示されるｐＧドメインを介して３−Ａｕ  ＮＰにおいてＩｇＧの特異的固定化が達成されたことを、明らかに示した。
【００３６】
（結論）
３つの異なる機能を有する組換えＢｓＧＬＤを、Ａｕ  ＮＰ上に機能性タンパク質を呈示するための自己固定化スキャフォールドとして使用した。提唱した手順は、ＢｓＧＬＤの触媒特性ゆえに塩基性ｐＨ条件を必要とするが、得られたタンパク質−Ａｕ  ＮＰ（具体的には、ｐＧ−ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰ）は、そのＩｇＧ結合能を維持し、且つ水性媒体中での優れた安定性を示した。これは、Ｃ末端Ｈ６Ｃタグを介した、Ａｕ  ＮＰ表面のＢｓＧＬＤによる被覆に起因する可能性が高かった。ここで示した酵素的ワンポット１タンパク質アプローチにより、生理学的条件下での有機−無機材料の効率的な生成が可能である。さらに、分光学的特性決定により、タンパク質装飾されたＡｕ  ＮＰの化学的および／または物理学的特性の見識が得られる。２１，２２
【００３７】
（材料および方法）
１．バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＢｓＧＬＤ）の調製
組換えＢｓＧＬＤタンパク質を発現させるために、発現プラスミドを、大腸菌（E. coli）ＪＭ１０９から抽出し、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換させた。形質転換後、単一のコロニーを、寒天プレート（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加されている）から選別し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２０ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中に植菌した。この培地を、振盪インキュベーター内で３７℃にて一晩培養した。この培養培地を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地中に入れ、次いで、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．５〜０．６に達するまで、３７℃にてさらに培養した。その後、ＢｓＧＬＤタンパク質の発現を、終濃度０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドの添加により誘導し、その後、１６ｈにわたって２５℃にて振盪した。次いで、細胞を、５８００ｇおよび４℃にて１０分間の遠心分離を用いて回収した。細胞を３回洗浄し、次いで、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。この懸濁液を、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃にて保存した。凍結細胞懸濁液を、氷上で完全に融解し、次いで、処理と処理の間に５分の間隔をあけた３×５分間の超音波処理に供した。５８００gおよび４℃にて１０分間の遠心分離を用いて上清を回収し、次いで、２０８００gおよび４℃にて１５分間、さらに遠心分離した。孔径０．４５μｍ、その後０．２５μｍの膜フィルターを通して、上清を濾過した。濾過した上清を、まず、結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて平衡化したＮｉ-ＮＴＡカラムに適用し、このカラムをカラム床容積の５倍の結合緩衝液を用いて洗浄した。次いで、組換えタンパク質を、溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて溶出した。溶出物を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによってモニタリングし、タンパク質画分を回収した。次いで、ＰＤ−１０カラムを脱塩および緩衝液交換カラムとして用いて、溶媒を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に替えた。得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準としたＢＣＡアッセイを用いて測定した。組換えタンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて決定した。
【００３８】
ＢｓＧＬＤのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、以下の通りである：
【００３９】
1: BsGLD-His6
MGSENLYFQGGGGSGGGSMAAERVFISPAKYVQGKNVITKIANYLEGIGNKTVVIADEIVWKIAGHTIVNELKKGNIAAEEVVFSGEASRNEVERIANIARKAEAAIVIGVGGGKTLDTAKAVADELDAYIVIVPTAASTDAPTSALSVIYSDDGVFESYRFYKKNPDLVLVDTKIIANAPPRLLASGIADALATWVEARSVIKSGGKTMAGGIPTIAAEAIAEKCEQTLFKYGKLAYESVKAKVVTPALEAVVEANTLLSGLGFESGGLAAAHAIHNGFTALEGEIHHLTHGEKVAFGTLVQLALEEHSQQEIERYIELYLSLDLPVTLEDIKLKDASREDILKVAKAATAEGETIHNAFNVTADDVADAIFAADQYAKAYKEKHRKHHHHHH (配列番号５)
【００４０】
ATGGGATCCGAAAACCTGTATTTCCAAGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCAGCATGGCCGCTGAACGTGTTTTCATTTCTCCAGCTAAGTACGTGCAGGGCAAAAACGTCATCACGAAAATTGCAAATTATTTGGAAGGGATTGGGAATAAGACGGTTGTTATCGCTGACGAAATTGTATGGAAAATCGCCGGACATACTATCGTGAATGAACTTAAAAAAGGTAACATCGCGGCCGAAGAGGTCGTCTTTTCCGGTGAAGCATCCCGCAATGAGGTGGAGCGCATTGCTAATATCGCGCGCAAAGCCGAGGCTGCCATTGTAATTGGTGTAGGTGGCGGGAAAACGCTGGACACCGCCAAGGCTGTTGCAGATGAATTAGATGCGTATATTGTAATTGTGCCCACCGCCGCTAGCACGGACGCGCCGACCTCAGCTCTGTCAGTGATTTACTCAGATGACGGTGTTTTTGAAAGCTATCGTTTTTATAAGAAAAACCCGGATTTAGTTTTAGTCGACACCAAGATCATCGCGAACGCCCCACCTCGCCTGCTGGCTTCCGGTATTGCTGATGCACTGGCCACCTGGGTTGAGGCTCGTAGCGTGATTAAATCAGGCGGCAAAACCATGGCTGGCGGTATCCCAACGATCGCGGCAGAAGCGATTGCCGAAAAATGTGAACAGACGCTTTTTAAATACGGGAAATTGGCGTACGAAAGCGTTAAAGCGAAGGTCGTAACTCCGGCGCTGGAAGCGGTGGTCGAGGCTAATACCCTGTTATCTGGGTTAGGTTTTGAGTCAGGTGGCTTAGCAGCCGCACATGCTATTCATAATGGTTTCACGGCACTGGAAGGAGAAATCCATCATCTGACTCATGGTGAGAAAGTGGCTTTTGGCACGCTGGTTCAGCTGGCGCTGGAAGAGCATTCCCAACAGGAAATTGAGCGCTACATTGAGTTATACCTCTCTCTGGATTTGCCGGTTACGTTAGAGGATATTAAACTGAAAGATGCGTCTCGTGAAGACATTCTGAAAGTTGCGAAAGCGGCCACCGCTGAGGGCGAGACGATTCATAACGCGTTCAACGTGACCGCCGATGATGTAGCAGACGCAATTTTTGCCGCCGACCAATACGCAAAAGCGTATAAAGAAAAACATCGCAAGCACCATCACCACCATCAT (配列番号８)
【００４１】
2: BsGLD-His6Cys
MGSENLYFQGGGGSGGGSMAAERVFISPAKYVQGKNVITKIANYLEGIGNKTVVIADEIVWKIAGHTIVNELKKGNIAAEEVVFSGEASRNEVERIANIARKAEAAIVIGVGGGKTLDTAKAVADELDAYIVIVPTAASTDAPTSALSVIYSDDGVFESYRFYKKNPDLVLVDTKIIANAPPRLLASGIADALATWVEARSVIKSGGKTMAGGIPTIAAEAIAEKCEQTLFKYGKLAYESVKAKVVTPALEAVVEANTLLSGLGFESGGLAAAHAIHNGFTALEGEIHHLTHGEKVAFGTLVQLALEEHSQQEIERYIELYLSLDLPVTLEDIKLKDASREDILKVAKAATAEGETIHNAFNVTADDVADAIFAADQYAKAYKEKHRKHHHHHHC (配列番号６)
【００４２】
ATGGGATCCGAAAACCTGTATTTCCAAGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCAGCATGGCCGCTGAACGTGTTTTCATTTCTCCAGCTAAGTACGTGCAGGGCAAAAACGTCATCACGAAAATTGCAAATTATTTGGAAGGGATTGGGAATAAGACGGTTGTTATCGCTGACGAAATTGTATGGAAAATCGCCGGACATACTATCGTGAATGAACTTAAAAAAGGTAACATCGCGGCCGAAGAGGTCGTCTTTTCCGGTGAAGCATCCCGCAATGAGGTGGAGCGCATTGCTAATATCGCGCGCAAAGCCGAGGCTGCCATTGTAATTGGTGTAGGTGGCGGGAAAACGCTGGACACCGCCAAGGCTGTTGCAGATGAATTAGATGCGTATATTGTAATTGTGCCCACCGCCGCTAGCACGGACGCGCCGACCTCAGCTCTGTCAGTGATTTACTCAGATGACGGTGTTTTTGAAAGCTATCGTTTTTATAAGAAAAACCCGGATTTAGTTTTAGTCGACACCAAGATCATCGCGAACGCCCCACCTCGCCTGCTGGCTTCCGGTATTGCTGATGCACTGGCCACCTGGGTTGAGGCTCGTAGCGTGATTAAATCAGGCGGCAAAACCATGGCTGGCGGTATCCCAACGATCGCGGCAGAAGCGATTGCCGAAAAATGTGAACAGACGCTTTTTAAATACGGGAAATTGGCGTACGAAAGCGTTAAAGCGAAGGTCGTAACTCCGGCGCTGGAAGCGGTGGTCGAGGCTAATACCCTGTTATCTGGGTTAGGTTTTGAGTCAGGTGGCTTAGCAGCCGCACATGCTATTCATAATGGTTTCACGGCACTGGAAGGAGAAATCCATCATCTGACTCATGGTGAGAAAGTGGCTTTTGGCACGCTGGTTCAGCTGGCGCTGGAAGAGCATTCCCAACAGGAAATTGAGCGCTACATTGAGTTATACCTCTCTCTGGATTTGCCGGTTACGTTAGAGGATATTAAACTGAAAGATGCGTCTCGTGAAGACATTCTGAAAGTTGCGAAAGCGGCCACCGCTGAGGGCGAGACGATTCATAACGCGTTCAACGTGACCGCCGATGATGTAGCAGACGCAATTTTTGCCGCCGACCAATACGCAAAAGCGTATAAAGAAAAACATCGCAAGCACCATCACCACCATCATTGC (配列番号９)
【００４３】
3: pG-BsGLD-His6Cys
MWSHPQFEKGSTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEGSENLYFQGGGGSGGGSMAAERVFISPAKYVQGKNVITKIANYLEGIGNKTVVIADEIVWKIAGHTIVNELKKGNIAAEEVVFSGEASRNEVERIANIARKAEAAIVIGVGGGKTLDTAKAVADELDAYIVIVPTAASTDAPTSALSVIYSDDGVFESYRFYKKNPDLVLVDTKIIANAPPRLLASGIADALATWVEARSVIKSGGKTMAGGIPTIAAEAIAEKCEQTLFKYGKLAYESVKAKVVTPALEAVVEANTLLSGLGFESGGLAAAHAIHNGFTALEGEIHHLTHGEKVAFGTLVQLALEEHSQQEIERYIELYLSLDLPVTLEDIKLKDASREDILKVAKAATAEGETIHNAFNVTADDVADAIFAADQYAKAYKEKHRKHHHHHHC (配列番号７)
【００４４】
ATGTGGTCCCACCCGCAGTTCGAAAAAGGTTCTACCTATAAACTTGTCATTAACGGTAAAACCTTGAAAGGCGAAACAACGACTGAAGCGGTGGATGCCGCCACTGCAGAAAAAGTATTTAAACAGTACGCCAACGACAACGGCGTGGACGGCGAGTGGACCTATGATGACGCCACCAAAACGTTCACCGTCACCGAAGGATCCGAAAACCTGTATTTCCAAGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCAGCATGGCCGCTGAACGTGTTTTCATTTCTCCAGCTAAGTACGTGCAGGGCAAAAACGTCATCACGAAAATTGCAAATTATTTGGAAGGGATTGGGAATAAGACGGTTGTTATCGCTGACGAAATTGTATGGAAAATCGCCGGACATACTATCGTGAATGAACTTAAAAAAGGTAACATCGCGGCCGAAGAGGTCGTCTTTTCCGGTGAAGCATCCCGCAATGAGGTGGAGCGCATTGCTAATATCGCGCGCAAAGCCGAGGCTGCCATTGTAATTGGTGTAGGTGGCGGGAAAACGCTGGACACCGCCAAGGCTGTTGCAGATGAATTAGATGCGTATATTGTAATTGTGCCCACCGCCGCTAGCACGGACGCGCCGACCTCAGCTCTGTCAGTGATTTACTCAGATGACGGTGTTTTTGAAAGCTATCGTTTTTATAAGAAAAACCCGGATTTAGTTTTAGTCGACACCAAGATCATCGCGAACGCCCCACCTCGCCTGCTGGCTTCCGGTATTGCTGATGCACTGGCCACCTGGGTTGAGGCTCGTAGCGTGATTAAATCAGGCGGCAAAACCATGGCTGGCGGTATCCCAACGATCGCGGCAGAAGCGATTGCCGAAAAATGTGAACAGACGCTTTTTAAATACGGGAAATTGGCGTACGAAAGCGTTAAAGCGAAGGTCGTAACTCCGGCGCTGGAAGCGGTGGTCGAGGCTAATACCCTGTTATCTGGGTTAGGTTTTGAGTCAGGTGGCTTAGCAGCCGCACATGCTATTCATAATGGTTTCACGGCACTGGAAGGAGAAATCCATCATCTGACTCATGGTGAGAAAGTGGCTTTTGGCACGCTGGTTCAGCTGGCGCTGGAAGAGCATTCCCAACAGGAAATTGAGCGCTACATTGAGTTATACCTCTCTCTGGATTTGCCGGTTACGTTAGAGGATATTAAACTGAAAGATGCGTCTCGTGAAGACATTCTGAAAGTTGCGAAAGCGGCCACCGCTGAGGGCGAGACGATTCATAACGCGTTCAACGTGACCGCCGATGATGTAGCAGACGCAATTTTTGCCGCCGACCAATACGCAAAAGCGTATAAAGAAAAACATCGCAAGCACCATCACCACCATCATTGC (配列番号１０)
【００４５】
２．ＧＬＤの酵素活性分析および溶媒条件の効果
調製したＧＬＤの触媒活性を、２５℃で、ＧＬＤ（１μＭ）、ＮＡＤ＋（４００μＭ）およびグリセロール（１００ｍＭ）を水溶液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ８．０）に添加した後に、ＵＶ／可視光スペクトロメーター（Ｕｂｅｓｔ−５７０、  ＪＡＳＣＯ、日本、東京）を用いて測定した。ＧＬＤの触媒活性を、３４０ｎｍでの吸光度によって追跡されるＮＡＤＨ形成によって評価した（図５）。さらに、２５℃にて、ＧＬＤ活性を、ＧＬＤ（１μＭ）、ＮＡＤ＋（４００μＭ）およびグリセロール（１００ｍＭ）を水溶液（５０ｍＭ  種々の緩衝液、ｐＨ６．０〜１１．０）に加えた後、種々の緩衝液およびｐＨ条件下で測定した（図６）。
【００４６】
３．タンパク質装飾したＡｕ  ＮＰの調製
ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰコンジュゲート（１−、２−および３−Ａｕ  ＮＰ）を、機能性タンパク質の存在下で、その酵素反応／相互作用を用いて合成した。ＢｓＧＬＤを（１μＭの終濃度で）、ＮＡＤ＋（４００μＭ）およびグリセロール（１００ｍＭ）の５０ｍＭのＧｌｙ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）中水溶液に加えた。ＡｕＣｌ４−（０．５ｍＭ）の添加後、この反応混合物を、３７℃にて４８ｈにわたってインキュベートした。得られたＡｕ  ＮＰを精製するため、赤色のＡｕ  ＮＰ溶液を、遠心分離フィルターユニット（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を用いて、４０００ｇにて３分、４℃で遠心分離した。次いで、残渣を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の２０ｍＭ水溶液を用い、限外濾過手順を繰り返すことによって５回洗浄し、最後に、同じ緩衝溶液中に再懸濁させた。
【００４７】
４．タンパク質装飾したＡｕ  ＮＰの特性決定
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）分析のために、全てのサンプルを、炭素でコーティングした銅グリッド上に置き、次いで、減圧条件下で乾燥させた。ＴＥＭ実験を、ＪＥＭ-２０１０装置（ＪＥＯＬ、日本、東京）を、１２０ｋＶで作動させて用いて実施した。Ａｕ  ＮＰの平均直径を、１サンプルあたり１６９〜２０５のＮＰの直径を測定することによって、ＩｍａｇｅＪを用いて計算した。また、粒子径を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を温度制御と共に用いて、評価した。各ランを、２５℃にて記録した。結合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。未結合のタンパク質を除去して溶液を濃縮するために、タンパク質−Ａｕ  ＮＰ溶液を、４℃にて遠心分離フィルターユニット（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ）に適用した。次いで、各サンプルを、ＳＤＳ  ２×サンプル緩衝液（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４ｗｔ％  ＳＤＳ、２０ｗｔ％  グリセロール、０．０１ｗｔ％  ブロモフェノールブルー、および１２ｗｔ％  ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させ、９４℃にて３０分間加熱して、結合タンパク質を引き離し、変性させた。上清を、１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上にロードした。
【００４８】
５．酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）における、タンパク質−ＡｕＮＰの標的タンパク質結合能の評価
ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰコンジュゲート（１−、２−および３−Ａｕ  ＮＰ）を、その酵素反応を用いて調製した。３７℃にて４８ｈのインキュベーションの後、機能性ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰ溶液を、遠心分離フィルターユニット（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を用いた限外濾過により精製し、残渣を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を用いて洗浄した。Ａｕ  ＮＰの濃度を、ＵＶ／可視光分光法を用いて測定した。次いで、ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰコンジュゲートを、１×ＰＢＳ中１％カゼインＮａ（ｐＨ７．４、ブロッキング溶液として作用する）を用いて希釈し、λｍａｘ、ＳＰＲ結合＝０．０５の吸光度を得て（図３に関して）、この溶液を４℃で保存した。
【００４９】
９６ウェルポリスチレンプレートを、１００μＬ／ウェルのＯＶＡ抗原水溶液（５．０  ｍｇ／ｍＬ）で被膜し、次いで、４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて各ウェルにつき５回洗浄し、次いで、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ中カゼインＮａ（１．０ｗｔ％）で３７℃にて１．５ｈブロックした。次いで、このプレートを再びＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬ／ウェルのウサギ抗−ＯＶＡ  ＩｇＧ（０．１μｇ／ｍＬ）を添加した；この後、３７℃にて１．５ｈにわたりインキュベートした。プレートを洗浄した後、５０μＬ／ウェルの表面をブロックした機能性ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰを各ウェルに加え、このプレートを３７℃にて１．５ｈインキュベートした。このプレートを洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ−標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を加え、このプレートを３７℃にて１．５ｈにわたってインキュベートした。洗浄後、１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジンＥＬＩＳＡ溶液（ＳｉｇｍａまたはＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を各ウェルに加え、３７℃にて３０分間インキュベートした。計５０μＬ／ウェルの１．０Ｍ  ＨＣｌを加え、終点光学濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を用いて、４１５ｎｍにて測定した。
【実施例２】
【００５０】
組換え大腸菌（E. coli）細胞によるＡｕ  ＮＰの調製
１．実験手順
１-１．ｐＧ−ＢｓＧＬＤを有する組換え大腸菌（E. coli）の調製
ｐＧ−ＢｓＧＬＤをコードするプラスミドベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を有する組換え大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１株を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を添加した１０ｍＬのＬＢ培地中で、振盪インキュベーター内で３７℃にて培養した。一晩培養物を使用して、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を添加した１ＬのＬＢ培地中に植菌した。この細胞を、３７℃で、０．５〜０．６の光学濃度（ＯＤ６００）まで増やした。ＯＤ６００がこの値まで達したときに、温度を２５℃まで下げ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭまで加えた。この培養物を、さらに１６ｈにわたってインキュベートした。この細胞を、５８００ｇおよび４℃での１０分間にわたる遠心分離によって回収し、洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．５）で３回洗浄した。ｐＧ-ＢｓＧＬＤの発現を、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染料を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。
【００５１】
１-２．大腸菌（E. coli）細胞によるＡｕ  ＮＰの合成
洗浄した細胞を、５０ｍＭグリシン−Ｎａ緩衝液（ｐＨ  ９．５）中に再懸濁させ、１．０のＯＤ６００まで希釈した。ＮＡＤ＋およびグリセロールを、この細胞懸濁液に、それぞれ終濃度４００μＭおよび１０ｍＭまで加えた。ＡｕＣｌ４−（０．２５ｍＭ）の添加後、反応混合物を、３７℃にて７２ｈにわたってインキュベートした。Ａｕ  ＮＰの合成を、ＵＶ／可視光スペクトル測定および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）分析によって確認した。
【００５２】
１-３．タンパク質装飾したＡｕ  ＮＰの調製および特性決定
大腸菌（E. coli）によるＡｕ  ＮＰの合成の後、細胞を、１０分間にわたる５８００ｇおよび４℃での遠心分離によって回収し、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ｐＧ−ＢｓＧＬＤで装飾したＡｕ  ＮＰを細胞から抽出するために、洗浄した細胞を、１０分間にわたる５８００ｇおよび４℃での遠心分離によって再び回収した。このペレットを、２０ｍＬの洗浄緩衝液中に再懸濁し、次に、氷上で超音波処理した。１０分間にわたる５８００ｇおよび４℃での、ならびに５分間にわたる２０４００ｇおよび４℃での遠心分離の後に、Ａｕ  ＮＰを含む上清を、孔径０．２０μｍの膜フィルターを通して濾過した。得られたＡｕ  ＮＰを精製するために、この溶液を、５分間にわたって５８００ｇおよび４℃で、遠心分離フィルターユニット（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を用いて遠心分離した。その後、Ａｕ  ＮＰを含む得られた懸濁溶液を、ＵＶ／可視光スペクトル測定およびＴＥＭ分析によって観察した。
【００５３】
ＴＥＭ分析について、全てのサンプルを、炭素でコーティングした銅グリッド上に置き、次いで、減圧条件下で乾燥させた。ＴＥＭ実験を、１２０ｋＶで操作して実施した。
【００５４】
１-４．酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるｐＧ−ＢｓＧＬＤ−ＡｕＮＰの機能性の評価
タンパク質−Ａｕ  ＮＰの濃度を、ＵＶ／可視光分光法を用いて測定した。次いで、タンパク質−Ａｕ  ＮＰコンジュゲートを、１×ＰＢＳ中２％  ＢＳＡ（ｐＨ７．４、ブロッキング溶液として作用する）を用いて希釈してλｍａｘ、ＳＰＲ結合＝０．０５の吸光度を得て、この溶液を４℃にて保存した。
【００５５】
９６ウェルポリスチレンプレートを、１００μＬ／ウェルの抗原（オボアルブミン、ＯＶＡ）の水溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）で被膜し、次いで、４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて各ウェルにつき５回洗浄し、次いで、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ中２％  ＢＳＡで３７℃にて２ｈブロックした。次いで、このプレートを、再びＰＢＳＴで洗浄し、１００μＬ／ウェルのウサギ抗−ＯＶＡ  ＩｇＧ（０．０５μｇ／ｍＬ）を添加した；この後、３７℃にて２ｈにわたりインキュベートした。プレートを洗浄した後、１００μＬ／ウェルの表面をブロックした機能性ｐＧ−ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰを各ウェルに加え、このプレートを３７℃にて５ｈインキュベートした。このプレートを洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ−標識したウサギ抗モルモットＩｇＧ抗体（１．６×１０−２μｇ／ｍＬ）を加え、このプレートを３７℃にて２ｈにわたってインキュベートした。洗浄後、１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン溶液を各ウェルに加え、３７℃にて３０分間インキュベートした。計５０μＬ／ウェルの１．０Ｍ  ＨＣｌを加え、終点光学濃度を、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにて測定した。
【００５６】
２．結果および考察
２-１．組換え大腸菌（E. coli）におけるｐＧ−ＢｓＧＬＤの発現
我々は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、ｐＧ−ＢｓＧＬＤの発現を確認した（図１１）。図１１において、レーン１、２、３および４は、ＩＰＴＧ誘導した細胞、ＩＰＴＧ誘導していない細胞、ＩＰＴＧ誘導した細胞の可溶性画分、およびＩＰＴＧ誘導した細胞の不溶性画分に、それぞれ対応する。図１１におけるレーン１および３に示されるように、ｐＧ−ＢｓＧＬＤ（４９．３ｋＤａ）の発現は成功裏であり、このタンパク質は可溶性画分に存在することを確認した。
【００５７】
２-２．大腸菌（E. coli）細胞によるＡｕ  ＮＰの合成および特性決定
図１２（ａ）は、種々の条件下でＩＰＴＧ誘導した組換え大腸菌（E. coli）ＢＬ２１のＵＶ／可視光スペクトルを示す。ＮＡＤ＋とグリセロールとの両方を加えられたサンプル（ｉ）のみが、Ａｕ  ＮＰの表面プラズモンバンドに由来する最大５４０ｎｍの明らかな吸収を示した。他のサンプルは、無視できるレベルのＡｕ  ＮＰ形成しか示さなかった。この結果は、Ａｕ  ＮＰ形成は、ＢｓＧＬＤ−媒介型ＮＡＤＨ再生に支配されたことを示す。
【００５８】
図１２（ｂ）は、サンプル（ｉ）の可溶性画分のＵＶ／可視光スペクトルを示す。この溶液は、Ａｕ  ＮＰの表面プラズモンバンドに由来する最大５４０ｎｍの明らかな吸収を示した。この結果は、組換え大腸菌（E. coli）細胞によって合成されるＡｕ  ＮＰが、細胞からの回収プロセスの間、および孔径０．２０μmの膜フィルターによる濾過の後も、水分散性を保持するのに十分に安定であることを示した。
【００５９】
大腸菌（E. coli）細胞におけるＡｕ  ＮＰの形成をさらに確認するために、ＴＥＭ分析を行った。組換え大腸菌（E. coli）細胞のＴＥＭ画像は、細胞内でＡｕ  ＮＰが生成され、蓄積されることを示唆する（図１３（ａ）、（ｂ））。図１３（ｃ）は、大腸菌（E. coli）細胞から抽出されたＡｕ  ＮＰのＴＥＭ画像を示す。この粒子は、２０ｎｍよりも小さく、およそ１０ｎｍであることが観察された。
【００６０】
２-３．ＥＬＩＳＡによるｐＧ−ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰの機能性の評価
Ａｕ  ＮＰに対するｐＧの  ＩｇＧ結合親和性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。ｐＧ−ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰコンジュゲートを限外濾過によって精製し、２％  ＢＳＡでブロックし、ＯＶＡの検出のために適用した。本研究において実施されたＥＬＩＳＡアッセイの概略図を、図１０に示す。図１４に示されるように、ｐＧ−ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰは、全ての構成要素の存在下で強いシグナルを呈する。ＥＬＩＳＡ系における何らかの構成要素の非存在は、ほとんどシグナルを示さない。これらの結果は、Ａｕ  ＮＰ表面上に呈示されたｐＧドメインを介したｐＧ−ＢｓＧＬＤ−Ａｕ  ＮＰに対するＩｇＧの特異的固定化は、達成されたことを示した。従って、我々は、ｐＧ−ＢｓＧＬＤを有する組換え大腸菌（E. coli）細胞を用いることによって、Ａｕ  ＮＰの調製に成功した。
【００６１】
（参考文献）
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【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１〜７；合成ポリペプチド
配列番号８〜１０；合成ＤＮＡ
【図１】
2015163063.tif 000004
【図２】
2015163063.tif 000005
【図３】
2015163063.tif 000006
【図４】
2015163063.tif 000007
【図５】
2015163063.tif 000008
【図６】
2015163063.tif 000009
【図７】
2015163063.tif 000010
【図８】
2015163063.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2015163063000001.pdf