(57)【要約】【課題】ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させる。【解決手段】寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１２４で寄託されているパエニバチルス（Paenibacillus）属細菌であるパエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）を、キノン類及びグリセロールを含む培養液中にて、この培養液に接触させた電極に還元電位を印加しながら培養するようにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１２４で寄託されているパエニバチルス（Paenibacillus）属細菌であるパエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）を、キノン類及びグリセロールを含む培養液中にて、前記培養液に接触させた電極に還元電位を印加しながら培養することを特徴とするグリセロール代謝促進方法。
【請求項２】
グルコース及び／又はグルコース多量体が実質的に含まれていない前記培養液を用いて実施される、請求項１に記載のグリセロール代謝促進方法。
【請求項３】
前記グリセロールとして、アルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく使用する、請求項１又は２に記載のグリセロール代謝促進方法。
【請求項４】
前記パエニバチルス属細菌を前記培養液中に高密度充填して非増殖条件下で高密度培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグリセロール代謝促進方法。
【請求項５】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１２４で寄託されているパエニバチルス（Paenibacillus）属細菌であるパエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）を、キノン類及びグリセロールを含む培養液中にて、前記培養液に接触させた電極に還元電位を印加しながら培養する工程と、
前記培養液からエタノールを回収する工程と
を含むことを特徴とするエタノール生産方法。
【請求項６】
グルコース及び／又はグルコース多量体が実質的に含まれていない前記培養液を用いて実施される、請求項５に記載のエタノール生産方法。
【請求項７】
前記グリセロールとして、アルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく使用する、請求項５又は６に記載のエタノール生産方法。
【請求項８】
前記パエニバチルス属細菌を前記培養液中に高密度充填して非増殖条件下で高密度培養する、請求項５〜７のいずれか１項に記載のエタノール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パエニバチルス（Paenibacillus）属細菌のグリセロール代謝促進方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、パエニバチルス（Paenibacillus）属細菌のグリセロール代謝促進方法と、この方法を利用したエタノール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、温室効果ガスの排出量削減や化石燃料依存からの脱却に向けた動きの一つとして、バイオマスを利用したバイオディーゼル燃料の生産が進められつつある。バイオディーゼル燃料とは、バイオマス由来の油脂類の主成分であるトリグリセライドをメタノールとエステル交換反応させることによって得られる、脂肪酸メチルエステルを主体とする液体燃料である。
【０００３】
ここで、図１８に示すように、バイオディーゼル燃料の生成過程においては、グリセロールが副産物として生じる。アルカリ触媒を用いたバイオディーゼル燃料の製造においては、バイオディーゼル燃料に対して約１０％のグリセロールが生成されるとされており（非特許文献１を参照）、その処理が懸案事項となっている。
【０００４】
このようなグリセロールの有効活用を図るべく、本件出願人である一般財団法人電力中央研究所は、グリセロールからエタノール等の有用物質を産生するグリセロール代謝能を有する微生物に着目した研究成果について、非特許文献２〜４において報告している。
【０００５】
非特許文献２では、湖沼汚泥より取得した環境微生物群を、グリセロールを炭素源として含む培養液中で−０．６Ｖ（vs. Ag/AgCl）の電位を与えながら電気培養を行うことで、顕著な微生物の増殖が生じ、グリセロールの減少に伴うエタノール生成が見られたことを報告している。また、エタノール生成は、−０．２Ｖ（vs Ag/AgCl）以下の還元電位を与える条件での電気培養を行った場合にのみ生じたことを報告している。さらに、電気培養により増殖した微生物が、パエニバチルス属の微生物であったことを報告している。
【０００６】
また、非特許文献３では、湖沼汚泥より取得した環境微生物群を、グリセロールを含む培養液で一定期間継代培養して得られた微生物群が、グリセロール純品だけでなく、アルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和してｐＨ７．０に調整したものを炭素源とした場合にもエタノール生成が生じることを報告している。また、−０．６Ｖ（vs. Ag/AgCl）の電位を与えながら電気培養を行うことで、エタノール生成がさらに促進されることを報告している。さらに、微生物群からグリセロール変換活性を有する微生物を単離した結果、パエニバチルス属の未同定株であったことを報告している。
【０００７】
さらに、非特許文献４では、非特許文献３で単離したパエニバチルス属の未同定株が、中和処理していないグリセロール廃液（ｐＨ９）を炭素源とした場合にも、優れたエタノール生成能力を発揮することを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】横山伸也他、「バイオマスエネルギー」、森北出版株式会社（２００９）
【非特許文献２】電力中央研究所報告  Ｖ１００３３
【非特許文献３】電力中央研究所報告  Ｖ１１０２９
【非特許文献４】電力中央研究所報告  Ｖ１２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献３で単離したパエニバチルス属の未同定株は、独立行政法人  産業技術研究所  特許生物寄託センターに、パエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）として、２０１１年５月１９日付けで寄託されている（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）。
【００１０】
パエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（以下、「ＮＳ−１株」と呼ぶこともある。）は、上記の通り、中和処理していないグリセロール廃液（ｐＨ９）を炭素源とした場合にも、優れたエタノール生成能力を発揮する細菌であり、産業上極めて有用な細菌であるといえる。
【００１１】
そこで、ＮＳ−１株の工業的利用に向けて、ＮＳ−１株に関するさらなる検討を行うことが望ましいと考えられる。特に、ＮＳ−１株を利用してグリセロールからエタノールを工業的に生産するに際し、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させて、エタノールの生産性を向上させる技術を確立しておくことは極めて有用であると考えられる。
【００１２】
そこで、本発明は、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させる方法を提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させて、エタノールの生産性を向上させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる課題を解決するため、本願発明者等は、ＮＳ−１株を電気培養することによって、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進することができないか検討した。まず、本願発明者等は、非特許文献２及び３を参考にして、環境微生物群からパエニバチルス属の微生物を選択的に増殖させることができた電気培養条件について鋭意検討した。その際、ＮＳ−１株を利用してグリセロールからエタノールを工業的に生産するに際しては、培養系の単純化及びコスト抑制を図ることが望ましいと考え、非特許文献２及び３の電気培養条件において必須であったセルロースの使用を省略して検討を行った。
【００１５】
その結果、非特許文献３及び４と同様に、電気培養の際に電子媒体物質としてＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ錯体を用いると、ＮＳ−１株が失活することを知見するに至った。電子媒体物質をＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ錯体に変更して同様の検討を行っても、ＮＳ−１株が失活してしまうことを知見するに至った。
【００１６】
そこで、本願発明者等がさらに鋭意検討を行った結果、電子媒体物質としてアントラキノン−２，６−ジスルホン酸（ＡＱＤＳ）を用いた場合には、培養液に接触させた電極に還元電位を印加する電気培養条件下において、ＮＳ−１株のグリセロール代謝が促進され、エタノールの生産が促進されることを知見するに至った。
【００１７】
本願発明者等は、上記知見から、ＮＳ−１株については、培養液中にキノン類とグリセロールのみを含ませて（つまり、セルロール等のグルコース多量体やグルコースを含ませることなく）、培養液に接触させた電極に還元電位を印加しながら培養すれば、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進して、エタノールの生産を促進できる可能性が導かれることを知見するに至り、さらに種々検討を重ねて、本発明に至った。
【００１８】
即ち、本発明のグリセロール代謝促進方法は、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１２４で寄託されているパエニバチルス（Paenibacillus）属細菌であるパエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）を、キノン類及びグリセロールを含む培養液中にて、この培養液に接触させた電極に還元電位を印加しながら培養するようにしている。
【００１９】
また、本発明のエタノール生産方法は、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１２４で寄託されているパエニバチルス（Paenibacillus）属細菌であるパエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）を、キノン類及びグリセロールを含む培養液中にて、この培養液に接触させた電極に還元電位を印加しながら培養する工程と、この培養液からエタノールを回収する工程とを含むようにしている。
【００２０】
ここで、本発明は、グルコース及び／又はグルコース多量体が実質的に含まれていない培養液を用いて実施されることが好ましい。
【００２１】
また、本発明においては、グリセロールとして、アルカリ触媒法によりバイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール廃液を中和処理することなく使用することが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明においては、ＮＳ−１株を培養液中に高密度充填して非増殖条件下で高密度培養することが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のグリセロール代謝促進方法によれば、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させることが可能になる。
【００２４】
しかも、培養液中にグルコース及び／又はグルコース多量体を含ませることを必須としないので、培養系の単純化及びコスト抑制を図りながら、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させることが可能になる。
【００２５】
本発明のエタノール生産方法によれば、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させて、エタノールの生産性を向上させることが可能になる。
【００２６】
しかも、培養液中にグルコース及び／又はグルコース多量体を含ませることを必須としないので、培養系の単純化及びコスト抑制を図りながら、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進させて、エタノールの生産性を向上させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の方法の概念を示す図である。
【図２】実施例において使用した電気培養装置の構成概略図である。
【図３】実施例１における培養試験期間中のＮＳ−１株の生育状況を示す図である。
【図４】実施例１における培養試験期間中の電流値変化を示す図である。
【図５】実施例１における培養試験期間中の培養液中グリセロール濃度変化を示す図である。
【図６】実施例１における培養試験期間中の培養液中エタノール濃度及び酢酸濃度変化を示す図である。
【図７】実施例２における培養試験期間中のＮＳ−１株の生育状況を示す図である。
【図８】実施例２における培養試験期間中の培養液中グリセロール濃度変化を示す図である。
【図９】実施例２における培養試験期間中の培養液中エタノール濃度及び酢酸濃度変化を示す図である。
【図１０】実施例３における培養試験期間中の培養液中グリセロール濃度及びエタノール濃度の変化を示す図である。
【図１１】実施例４における培養試験期間中の培養液中グリセロール濃度変化を示す図である。
【図１２】実施例４における培養試験期間中の培養液中エタノール濃度変化を示す図である。
【図１３】比較例１（電子媒体物質：Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ）における培養試験期間中のＮＳ−１株の生育状況を示す図である。
【図１４】比較例１（電子媒体物質：Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ）における培養試験後のＮＳ−１株の菌数を示す図である。
【図１５】比較例１（電子媒体物質：Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ）における培養試験後の培養液中エタノール濃度を示す図である。
【図１６】比較例２における培養試験期間中の培養液中グリセロール濃度変化を示す図である。
【図１７】比較例２における培養試験期間中の培養液中エタノール濃度及び酢酸濃度変化を示す図である。
【図１８】油脂からバイオディーゼルを生成する過程を示す化学反応式である。
【図１９】ＮＳ−１株の原子間力顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２９】
図１に、本発明のグリセロール代謝促進方法の概念図を示す。本発明のグリセロール代謝促進方法は、ＮＳ−１株２を、キノン類５及びグリセロール３を含む培養液４中にて、この培養液４に接触させた電極９に還元電位を印加しながら培養するようにしている。これにより、ＮＳ−１株２のグリセロール代謝が促進され、ＮＳ−１株２によるエタノール生産性が向上する。
【００３０】
＜ＮＳ−１株＞
ＮＳ−１株は、パエニバチルス属細菌であり、中性の環境下だけでなく、アルカリ性の環境下においてもグリセロールをエタノールに変換する機能を発揮する。上記の通り、ＮＳ−１株は、パエニバチルス  マセランス  ＮＳ−１株（Paenibacillus macerans NS-1）として、独立行政法人  産業技術研究所  特許生物寄託センターに２０１１年５月１９日付けで寄託されている（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２４）。
【００３１】
ＮＳ−１株について、コロニー形状を表１に、炭素源資化性を表２ａ及び表２ｂに、酵素活性を表３に示す。また、ＮＳ−１株の原子間力顕微鏡像を図１９に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
【表２ａ】
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【００３４】
【表２ｂ】
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【００３５】
【表３】
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【００３６】
また、ＮＳ−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３７】
尚、本発明は、ＮＳ−１株２を増殖条件下（増殖連動的）で培養して実施してもよいし、非増殖条件下（増殖非連動的）で培養（高密度培養）して実施してもよい。いずれの場合にも本発明によりグリセロール代謝促進効果が奏され、エタノール７の生産が促進される。
【００３８】
＜培養液＞
培養液４は、パエニバチルス属細菌の培養に適した培地成分を含むものを適宜使用することができる。例えば、ＮＨ４Ｃｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＫＣｌ等の無機塩類を主体とする培地成分を含む培養液等を適宜用いることができる。尚、土壌成分を抽出した土壌抽出液を培養液４に添加してもよい。これにより、ＮＳ−１株の生育が促進され得る。
【００３９】
尚、本発明は、グルコース及び／又はグルコース多量体を実質的に含まない培養液を使用することができる。ここでいう「グルコース及び／又はグルコース多量体を実質的に含まない培養液」とは、グルコース及び／又はグルコース多量体が培養液４に意図的に添加されておらず、培養液自体の不純物として及び／又は培養液への添加物中の不純物としてグルコース及び／又はグルコース多量体が含まれ得る培養液のことを意味している。
【００４０】
＜キノン類＞
キノン類５は、電子媒体物質として機能する物質である。具体的には、電極９に還元電位を印加することにより、キノン類５の酸化体５ａに電子が供給されて還元体５ｂとなり、この還元体５ｂによりＮＳ−１株２に電子が供給されて酸化体５ａに戻るものと考えられる。このような機能を有するキノン類としては、例えば、ベンゾキノン、ナフトキノン、アントラキノン、あるいはこれらの誘導体等が挙げられ、好適にはアントラキノンあるいはその誘導体が挙げられ、より好適にはアントラキノン−２，６−ジスルホン酸（ＡＱＤＳ）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００４１】
尚、酸化体及び還元体の両形態をとり得る電子媒体物質は、キノン類５以外にも存在するが、本願発明者等の実験によると、鉄錯体やマンガン錯体を用いて電気培養を実施しても、ＮＳ−１株２のグリセロール代謝を促進できないことがわかった。一方で、非特許文献２及び３のように、培養液４にセルロースを添加した場合には、マンガン錯体を用いても環境微生物群のうち、ある特定のパエニバチルス属細菌の選択的な増殖が起こる。つまり、ＮＳ−１株２のグリセロール代謝促進を、グルコース及び／又はグルコース多量体を培養液４に含めることなく、培養系の単純化及びコスト抑制を図りながら行うためには、電子媒体物質としてキノン類５を用いることが極めて有効である。
【００４２】
＜グリセロール＞
グリセロール３は、ＮＳ−１株２の炭素源として機能する物質である。グリセロール３は、不純物を含まない単体として培養液４に投入してもよいし、不純物が混入した実廃棄物をそのまま培養液４に投入してもよい。
【００４３】
ここで、上述の通り、ＮＳ−１株は、中性の環境下だけでなく、アルカリ性（ｐＨ９付近）の環境下においてもグリセロールをエタノールに変換する機能を発揮する。したがって、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるアルカリ性（ｐＨ９程度）のグリセロール廃液を、中和処理することなく、培養液４に投入してもよい。これにより、グリセロール純品を用いる場合よりも炭素源自体をコストダウンできることに加えて、中和処理に必要となる酸の使用や、中和処理を行うための作業工程を省略することができる。しかも、本発明によれば、グリセロール代謝を促進させることで、エタノール７の生産を促進させることができるので、未利用バイオマスであるグリセロールにエタノールの原料としての付加価値を与えて、その利用の拡大・促進を図ることができるという利点もある。
【００４４】
尚、培養液４中のグリセロール濃度は、５ｇ／Ｌ程度とすることが好適であるが、１０ｇ／Ｌ程度、１５ｇ／Ｌ程度、さらには２０ｇ／Ｌ程度まで濃度を上昇させても十分に処理可能と考えられる。
【００４５】
＜電気培養＞
培養液４には、電極９を接触させ、この電極９に還元電位を印加しながら培養を行う。還元電位とは、非通電時の培養液４の酸化還元電位よりも低い電位を意味している。例えば、非通電時の培養液の酸化還元電位が＋０．２Ｖであれば、＋０．２Ｖよりも低い電位（Ｘ＜＋０．２Ｖ）が還元電位となる。
【００４６】
電極９としては、例えば炭素板やグラッシーカーボン等の炭素電極、白金電極等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
還元電位の好適な範囲としては、銀・塩化銀電極電位基準で、−０．２Ｖ以下（Ｘ≦−０．２）、より好適には−０．４Ｖ以下（Ｘ≦−０．４）、さらに好適には−０．６Ｖ以下（Ｘ≦−０．６）である。但し、電位値が低すぎると、水の電気分解等の目的外の反応が進行して、投入した電気エネルギーの一部がグリセロール代謝に寄与しなくなり、無駄となり得るので、−１．２Ｖ以上（Ｘ≧−１．２）とすることが好適であり、−１．０Ｖ以上（Ｘ≧−１．０）とすることがより好適であり、−０．８Ｖ以上（Ｘ≧−０．８）とすることがさらに好適である。
【００４８】
電極９に還元電位を印加しながら培養を行うと、ＮＳ−１株のグリセロール代謝が促進される。したがって、グリセロールの消費速度が向上する。これにより、未利用バイオマスとしてその処理に苦慮していたバイオディーゼル燃料生成時の副産物であるグリセロールを、ＮＳ−１株２を利用して効率よく処理することができる。しかも、これに伴って、ＮＳ−１株によりエタノール７が産生される。このエタノール７を培養液４から例えば蒸留等の定法により回収する。これにより、グリセロールをエタノールに変換して回収することができる。
【００４９】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、グルコース及び／又はグルコース多量体を実質的に含まない培養液を使用して本発明を実施することができる旨を説明したが、本発明の効果が奏され得る範囲内で、培養液中にグルコース及び／又はグルコース多量体を添加しても構わない。例えば、セルロースを含む廃棄物等を培養液に添加して処理しながら、本発明を実施するようにしてもよい。また、本発明の効果が奏され得る範囲内で、グリセロール以外の炭素源物質や添加物等を添加しても構わない。
【実施例】
【００５０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞
電子媒体物質としてキノン類を使用した電気培養について検討した。
【００５２】
１．実験方法
（１）微生物
ＮＳ−１株（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１２４）を使用した。
【００５３】
（２）培養液
以下に示す組成の無機塩培地を用いた。
［無機塩培地組成（ｇ／Ｌ）］
・ＮＨ４Ｃｌ          ：０．５
・Ｋ２ＨＰＯ４         ：０．４
・ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ：０．４９
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ：０．０５
・ＫＣｌ             ：０．０５２
ｐＨ７．０
【００５４】
（３）電気培養装置
図２に示す電気培養装置１により実験を行った。培養容器２０は２５０ｍＬ容のガラスバイアル瓶（Ｄｕｒａｎ製）とし、培養液４の液面より下部に開口部を３つ設けた。開口部２０ａ及び２０ｂは培養液４の採取部とし、蓋の開閉により培養液４を採取可能とした。開口部２０ｃはポーラスな炭素電極（対電極１０）で塞ぎ、この板状の炭素電極の片側表面の下半分には２０％ナフィオン分散液（ＤＥ２０２１）を塗布し、さらにナフィオン膜（Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）Ｎ−１１７、デュポン社製）で覆うことでイオン交換膜６を形成し、イオン交換膜６によって開口部２０ｃが塞がれるようにした。作用電極９として板状の炭素電極（長さ７５ｍｍ、幅３５ｍｍ、厚さ２ｍｍ）を培養液４に浸した。培養液４は培養容器５の８分目程度まで入れた。培養容器２０には蓋３０をし、蓋３０の上面３０ａに弾性材料であるシリコーンゴムを備え、これに参照電極１１（東亜ＤＤＫ製、ＨＳ−２０５Ｃ）を貫通させて参照電極１１と培養液４とを接触させた。作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の電位制御装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、培養液４の電位を厳密に制御可能とした。
【００５５】
（４）電気培養の基本条件
電気培養試験は、培養温度３７℃、窒素雰囲気下で実施した。培養液４は撹拌子（不図示）により撹拌した。
【００５６】
（５）菌数計測
培養液４中の菌数計測は、微生物の懸濁密度と相関のある６６０ｎｍの吸光度を吸光度計により測定することにより行った。
【００５７】
（６）成分分析
培養液４に含まれる有機物の成分分析には、液体クロマトグラフィー（Lachrome Elite、日立製）を用いた。カラムは、Ｇｅｌｐａｃｋ（登録商標）（ＧＬ−Ｃ６１０Ｈ−Ｓ、７．８φ×３００ｍｍ）を使用し、０．１％リン酸をバッファーとして用い、ＲＩ検出器により信号を得た。計測時のオーブン温度は４０℃とし、カラム内の流速は０．５ｍＬ／分とした。測定には、フィルターを通過し、微生物及び含有固形分を除去した培養液１０μＬを使用した。
【００５８】
２．培養条件
培養液４に炭素源としてグリセロール純品を添加してグリセロール濃度を５ｇ／Ｌとし、電子媒体物質５としてＡＱＤＳ（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸）を添加してＡＱＤＳ濃度は２ｍＭとし、ＮＳ−１株の初期菌体密度１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（ＯＤ６６０＝０．００３）として、以下の３条件で培養試験を実施した。（ａ）は非通電条件下での培養試験であり、（ｂ）と（ｃ）は通電条件下での培養試験（電気培養試験）である。
（ａ）作用電極９の電位制御なし
（ｂ）作用電極９の電位：−０．６Ｖ（還元電位）
（ｃ）作用電極９の電位：＋０．６Ｖ（酸化電位）
【００５９】
３．試験結果
（１）生育状況
ＮＳ−１株の生育状況を図３に示す。＋０．６Ｖ（酸化電位）の通電条件下においては、非通電条件下と比較して、ＮＳ−１株の増殖が抑制され、最終到達菌体密度が１／２になることが明らかとなった。
【００６０】
これに対し、−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下においては、非通電条件下と比較して、ＮＳ−１株の増殖速度が向上し、最終到達菌体密度も約２倍に向上することが明らかとなった。
【００６１】
尚、図４に示すように、通電時に増殖に伴う顕著な電流変化は見られなかった。
【００６２】
以上の結果から、作用電極９の電位を還元電位に制御しながら電気培養を行うことによって、ＮＳ−１株の生育を促進できることが明らかとなった。
【００６３】
（２）電位制御がグリセロール代謝へ与える効果
培養期間中における培養液４のグリセロール濃度の変化を図５に示す。＋０．６Ｖ（酸化電位）の通電条件下においては、非通電条件下と比較して、グリセロールの消費が抑えられることが明らかとなった。
【００６４】
これに対し、−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下においては、非通電条件下と比較して、グリセロールの消費速度が大きく向上することが明らかとなった。
【００６５】
次に、ＮＳ−１株の主要代謝産物であるエタノールと酢酸について、培養期間中における培養液４中の濃度変化を図６に示す。エタノールについては、＋０．６Ｖ（酸化電位）の通電条件下において、非通電条件下と比較して、エタノールの生産が抑えられることが明らかとなった。
【００６６】
これに対し、−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下においては、非通電条件下と比較して、エタノールの生産速度が大きく向上し、最終的に培養液４中のエタノール濃度が２倍程度大きくなることが明らかとなった。
【００６７】
尚、酢酸濃度については、通電の有無及び電位条件に違いによる差は見られなかった。
【００６８】
以上の結果から、作用電極９の電位を還元電位に制御しながら電気培養を行うことによって、ＮＳ−１株のグリセロール代謝を促進できることが明らかとなった。
【００６９】
次に、通電による投入エネルギーに対し、通電により増産したエタノールの熱量（エネルギー）の比率（ΔＷEthanol／Ｗin）を、作用電極９の電位を−０．６Ｖ（還元電位）に制御した電気培養試験の結果から、以下の式により計算した。
ΔＷEthanol＝（エタノールの燃焼熱量）×（エタノールの増産量）
Ｗin＝Ｅap×Ｃ
ここで、エタノールの燃焼熱量は１３６７．６［ｋＪ／ｍｏｌ］である。エタノールの増産量は、通電時のエタノール生産量［ｍｏｌ］から非通電時のエタノール生産量［ｍｏｌ］を引いた場合である。Ｅapは極間電圧［Ｖ］である。Ｃは電気量［Ｃ］である。
計算した結果、ΔＷEthanol／Ｗinは１０．８となり、１を超える値となった。このことから、通電によるエタノールの増産効果は、エネルギー的にみても優れていることが明らかとなった。
【００７０】
＜実施例２＞
バイオディーゼル燃料を製造する際に副生されるグリセロール実廃液はｐＨ９付近の高アルカリ性であり、菌の生育を阻害することが考えられる。そこで、高アルカリ環境下（初期ｐＨ９．０）で培養試験を実施し、ＮＳ−１株のグリセロール変換活性について検討した。
【００７１】
培養液４のｐＨは、１Ｎ  ＮａＯＨを添加してｐＨ９．０に調整し、実施例１の条件（ａ）及び（ｂ）と同様の培養試験を実施した。
【００７２】
ＮＳ−１株の生育状況を図７に示す。尚、図７には、比較のために実施例１（培養液ｐＨ７．０）の結果も掲載した。図７に示す結果から、培養液４の初期をｐＨ９．０とした場合にも、ｐＨ７．０とした場合と同様に、−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下で生育促進効果が奏されることが明らかとなった。
【００７３】
次に、培養期間中における培養液４のグリセロール濃度の変化を図８に示す。またＮＳ−１株の主要代謝産物であるエタノールと酢酸について、培養期間中における培養液４中の濃度変化を図９に示す。尚、図８及び図９には、比較のために実施例１（培養液ｐＨ７．０）の結果も掲載した。図８及び図９に示す結果から、培養液４の初期をｐＨ９．０とした場合にも、ｐＨ７．０とした場合と同様に、−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下でグリセロール代謝促進効果が奏されることが明らかとなった。
【００７４】
＜実施例３＞
グリセロール純品に代えて、食品系の企業から排出された食用油からアルカリ触媒法によってバイオディーゼル燃料を生成した際に副産物として生じたグリセロール実廃液（ｐＨ９．９）を培養液４に１重量％添加し、実施例１の条件（ａ）及び（ｂ）と同様の培養試験を実施して、ＮＳ−１株のグリセロール変換活性について検討した。他の条件は実施例１と同様とした。使用したグリセロール実廃液の組成を表４に示す。
【００７５】
【表４】
2015154754.tif 000007
【００７６】
培養期間中における培養液４のグリセロール濃度とエタノール濃度の変化を図１０に示す。図１０に示す結果から、グリセロール実廃液を炭素源とした場合にも、−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下でグリセロール代謝促進効果が奏されることが明らかとなった。
【００７７】
＜実施例４＞
ＮＳ−１株をＯＤ６６０＝０．４程度となるように培養液４に高密度充填し、実施例１の条件（ａ）及び（ｂ）と同様の培養試験を実施して、非増殖条件下におけるＮＳ−１株のグリセロール代謝活性を評価した。
【００７８】
培養液４のグリセロール濃度の経時変化を図１１に示す。−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下において、非通電条件下と比較して、グリセロール消費速度が約２倍向上することが明らかとなった。
【００７９】
次に、培養液４のエタノール濃度の経時変化を図１２に示す。−０．６Ｖ（還元電位）の通電条件下において、非通電条件下と比較して、エタノールの生産速度が約２倍向上することが明らかとなった。エタノール生産速度を見積もると、約０．１ｍｏｌ／ｈであった。
【００８０】
以上の結果から、作用電極９に還元電位を印加しながら電気培養を行うことで、高密度培養に際してもグリセロール代謝促進効果が奏されることが明らかとなった。
【００８１】
尚、別の培養試験により、ＮＳ−１株を非通電条件下で且つ増殖条件下で培養した場合にはエタノール生産速度は約０．０１５ｍｍｏｌ／ｈであり、千葉県の湖沼汚泥から採取した環境微生物群を作用電極９に還元電位（−０．６Ｖ）を印加する通電条件下で且つ増殖条件下で培養した場合にはエタノール生産速度は約０．００７ｍｍｏｌ／ｈであったことから、本実施例のように、高密度培養条件下で作用電極９に還元電位を印加しながら電気培養を行うことで、極めて優れたエタノール生産性が発揮されることが明らかとなった。
【００８２】
＜比較例１＞
電子媒体物質５をＡＱＤＳからＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ（２ｍＭ）に変更して、実施例１と同様の電気培養試験を実施し、ＮＳ−１株の生育状況について検討した。
【００８３】
結果を図１３に示す。図１３中の「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、電子媒体物質５を培養液４に添加していない非通電条件下での培養試験結果である。電子媒体物質５をＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとした場合には、通電及び非通電によらず、ＮＳ−１株の生育が見られないことが明らかとなった。
【００８４】
次に、電子媒体物質５をＡＱＤＳからＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ（０．８８６ｍＭ）に変更して、実施例１の条件（ａ）及び（ｂ）と同様の電気培養試験を実施して、培養開始から８日後のＮＳ−１株の生育状況とグリセロール代謝活性について検討した。
【００８５】
ＮＳ−１株の生育状況を図１４に示す。電子媒体物質５をＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡとした場合には、通電及び非通電によらず、ＮＳ−１株の生育に差異が見られないことが明らかとなった。
【００８６】
培養液４中のエタノールの最終濃度を図１５に示す。電子媒体物質５をＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡとした場合には、通電及び非通電によらず、エタノールの生産量に差異が見られないことが明らかとなった。
【００８７】
尚、非特許文献２及び３では、培養液４中にセルロースとグリセロールを含ませて、電子媒体物質５をＭｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡとして作用電極９に還元電位を印加しながら電気培養を行うことで、パエニバチルス属細菌の選択的な増殖が起こっていた。しかし、比較例１で得られた結果から、培養液４にセルロースを含めないことによって、使用可能な電子媒体物質５が限定されることが明らかとなった。即ち、鉄錯体やマンガン錯体等は電子媒体物質５として不適であり、ＡＱＤＳ等のキノン類が電子媒体物質５として有効であることが明らかとなった。
【００８８】
＜比較例２＞
電気培養に代えて、還元剤の添加による還元環境を創出することで、ＮＳ−１株の増殖・代謝促進効果が得られるか検討した。
【００８９】
電子媒体物質５は培養液４に添加せず、代わりにＮａ２Ｓを６．４ｍＭとなるように培養液４に添加して、実施例１の（ａ）と同様の培養試験（非通電条件）を実施した。また、比較試験として、Ｎａ２Ｓを添加せずに実施例１の（ａ）と同様の培養試験（非通電条件）を実施した。尚、培養液４にＮａ２Ｓを６．４ｍＭ添加することで、培養液４の初期電位は−０．３８Ｖ（vs Ag/AgCl）となった。
【００９０】
培養液４のグリセロール濃度の変化を図１６に示し、培養液４のエタノール及び酢酸の濃度変化を図１７に示す。Ｎａ２Ｓを添加すると、ＮＳ−１株の生育が顕著に阻害され、グリセロール分解及びエタノール生産共に見られなかった。
【００９１】
以上の結果から、還元剤としてＮａ２Ｓを用いた還元環境の創出では、ＮＳ−１株のグリセロール代謝促進効果は得られないことが明らかとなった。
【符号の説明】
【００９２】
２  ＮＳ−１株
３  炭素源（グリセロール、グリセロール廃液）
４  培養液
５  電子媒体物質（キノン類）
７  有用物質
９  電極（作用電極）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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