(57)【要約】      （修正有）【課題】心臓温虚血再灌流障害に有効な治療剤の提供。【解決手段】CD80又はCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80又はCD86ポリペプチドの少なくとも一方と、CD28ポリペプチドとの結合に干渉する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機低分子化合物、抗体又はその断片若しくは誘導体、可溶性受容体（可溶性CTLA4分子、好ましくはCTLA4Ig融合タンパク質）、及びアプタマーから選択される治療剤を用いて、心臓温虚血再灌流障害を処置する方法。【選択図】図１
2015117214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉する、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項２】
CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方が、抗原提示細胞(APC)に含まれ、CD28ポリペプチドが、Ｔ細胞に含まれる、請求項１に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項３】
細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項４】
細胞が、抗原提示細胞(APC)である、請求項３に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項５】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機小分子および化合物またはそれらの任意の２以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項６】
抗体またはその断片もしくは誘導体、可溶性受容体およびアプタマーからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項７】
抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、ナノボディまたはそれらの混合物である、請求項６に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項８】
可溶性受容体が、可溶性CTLA4分子、好ましくはCTLA4Ig融合タンパク質である、請求項６に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項９】
イントラボディまたはその断片もしくは誘導体、アンチセンス剤およびRNAi剤からなる群より選択される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１０】
治療剤が、第２治療剤と併用投与され、第２治療剤が、CD40ポリペプチドと相互作用でき、前記相互作用が、CD40ポリペプチドとCD40リガンド(CD40L)ポリペプチドとの結合に干渉する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１１】
CD40ポリペプチドが、抗原提示細胞(APC)に含まれ、CD40Lポリペプチドが、Ｔ細胞に含まれる、請求項10に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１２】
細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤と併用投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１３】
細胞が、抗原提示細胞(APC)である、請求項12に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１４】
第２治療剤が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機小分子および化合物またはそれらの任意の２以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項10〜13のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１５】
第２治療剤が、抗体またはその断片もしくは誘導体、可溶性受容体およびアプタマーからなる群より選択される、請求項10〜14のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１６】
第２治療剤が、イントラボディまたはその断片もしくは誘導体、アンチセンス剤およびRNAi剤からなる群より選択される、請求項12〜14のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１７】
抗凝固剤と併用投与される、請求項１〜16のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１８】
免疫抑制剤と併用投与される、請求項１〜16のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項１９】
心臓温虚血再灌流障害が、心筋梗塞、慢性心筋梗塞、急性心筋梗塞(STEMI)、心臓の虚血領域への血流の回復をねらいとした心筋梗塞の処置、心血管停止、冠動脈バイパス移植術、冠動脈形成術、一過性血管攣縮、急性冠症候群(NSTEMI)、心筋保護法または血管結紮術および心臓移植術中の再灌流の結果である、請求項１〜18のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【請求項２０】
心臓温虚血再灌流障害が、急性心筋梗塞の結果である、請求項１〜19のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して医薬分野に関し、より具体的には心臓の病気の処置の分野に関する。特に、本発明は、虚血再灌流障害、より具体的には心虚血再灌流障害、さらにより具体的には心臓温虚血再灌流障害(cardiac warm ischemia reperfusion injury)の処置において有用な治療用標的および治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓溶解療法または経皮的冠動脈形成術のような介入手順により心筋への血流を回復する(すなわち心臓再灌流)ことに焦点を当てる急性心筋梗塞(AMI)の現在の介入的処置は、梗塞サイズおよび死亡率の両方を低減することにより、AMIの臨床的転帰を著しく改善している。しかし、心臓再灌流は、梗塞の後に発生する心臓修復経路から生じる深刻な有害効果を逆説的に引き起こし、該効果は、左室リモデリングおよび心不全を導き得る。この損傷は、虚血再灌流障害(IRI)としばしばよばれ、重篤なAMIから生存した患者において観察される慢性の合併症の主な原因である。
【０００３】
IRIも、動脈バイパスグラフト化手順、心臓移植、および心筋への血流を一時的に停止し、その後血流を回復させることを含むその他の外科的手順を受ける患者において観察される。
IRIの精密な機構は完全にはまだわかっていないが、なかでも、全身炎症性応答の活性化が関与するようであり、このことは、虚血領域における既に損傷を受けた心筋細胞および内皮細胞に特に影響し、細胞および組織の損傷ならびに最終的に機能喪失をもたらす。
【０００４】
心血管疾患における炎症についての役割を示唆するいくつかの実験的および臨床的証拠が存在し、抗炎症剤が、心血管疾患の処置のために仮説として提案されている。例えば、WO2005/016266は、内因性B7分子を遮断する可溶性CTLA-4分子を用い、そのことによりＴ細胞応答を抑制する心血管疾患の処置を提案している。
【０００５】
ナイーブＴリンパ球の増殖およびエフェクター細胞へのそれらの分化は、抗原認識および抗原提示細胞(APC)上で発現される共刺激分子がもたらすさらなるシグナルを必要とする。抗原の認識は、外来細胞または組織の表面上で主要組織適合性複合体(MHC)と抗原が会合する場合に直接生じることができるか、または抗原が処理され、次いで抗原提示細胞(APC)の表面上でMHCと会合する場合に間接的に生じることができる。このような抗原提示MHC複合体を認識する休止Ｔリンパ球は、これらの複合体がＴ細胞受容体と会合することにより活性化される。このような活性化Ｔ細胞は、増殖して機能的になるためにさらなるシグナル(すなわち共刺激)を必要とする。最もよく定義されている共刺激経路は、B7:CD28経路およびCD40:CD40リガンド(CD40L)経路である。B7ファミリーの２つの既知のメンバーであるB7-1(CD80)およびB7-2(CD86)はAPC上で発現され、これらの発現は、微生物および自然免疫応答により増進される。大多数のＴリンパ球上で構成的に発現されるCD28によるB7の認識は、Ｔ細胞応答を開始すると考えられる。対照的に、CD80およびCD86と阻害受容体CTLA-4との結合は、Ｔ細胞応答を下方制御する。CD40は、APC上で構成的に発現され、CD40Lは、抗原認識の際にＴ細胞上で誘導される。CD40とCD40Lとの間の相互作用も、Ｔ細胞応答を増進する。
【０００６】
全梗塞サイズは、患者が心不全を発生する危険性の臨界的決定因子であるとみなされ、全般的に心血管疾患および特に急性心筋梗塞が西洋世界における筆頭の死亡原因であることを考慮すると、心虚血再灌流障害、より具体的には心臓温虚血再灌流障害の処置において有用なさらなる治療的標的に対する緊急の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2005/016266
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Ｔ細胞応答の阻害が、心臓温虚血再灌流障害の処置において有益な効果を有するという予期せぬ知見に気付いた。
特に、本発明者らは、単独または共刺激経路CD40:CD40Lとの組み合わせで、共刺激経路B7:CD28を、心臓温虚血再灌流障害の処置のための有用で見込みのある標的として提唱する。これらの知見を拡張して、本発明者らは、特に、心臓温虚血再灌流障害の処置のための価値のある標的としての共刺激分子CD80(B7-1)およびCD86(B7-2)を認識した。
【０００９】
よって、なかでも、以下の態様および実施形態が、本発明にしたがって提供される。
CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉する、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【００１０】
処置を必要とする対象者に、治療上有効量の治療剤を投与することを含み、該治療剤が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉する、処置を必要とする対象者における心臓温虚血再灌流障害を処置するための方法。
【００１１】
治療剤が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉する、心臓温虚血再灌流障害の処置用の医薬品の製造のための治療剤の使用。
【００１２】
細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【００１３】
処置を必要とする対象者に、治療上有効量の治療剤を投与することを含み、該治療剤が、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる、処置を必要とする対象者における心臓温虚血再灌流障害を処置するための方法。
【００１４】
治療剤が、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる、心臓温虚血再灌流障害の処置用の医薬品の製造のための治療剤の使用。
【００１５】
本発明の上記のおよびさらなる態様ならびに好ましい実施形態は、以下の項および添付の特許請求の範囲に記載される。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書に具体的に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】梗塞の少し後の対象者の血液中でのクレアチンキナーゼ(CKMB)測定による梗塞サイズの評価の例を示す。
【図２】梗塞の少し後の対象者の血液中での心臓トロポニンＩ(cTnI)測定による梗塞サイズの評価の例を示す。
【図３】磁気共鳴イメージング(MRI)による、経時的な駆出率(EF)の測定の例を示す。
【図４】磁気共鳴イメージング(MRI)による、経時的な左室拡張末期容積(LVEDV)の測定の例を示す。
【図５】MRIによる、経時的な左室収縮末期容積(LVESV)の測定の例を示す。
【図６】MRIによる、瘢痕サイズの測定の例を示す。
【図７】剖検での瘢痕サイズ評価の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明確に指図しない限り、単数および複数の言及の両方を含む。
用語「含む（comprising）」、「含む（comprises）」および「含む（comprised of）」は、本明細書で用いる場合、「含む（including）」、「含む（includes）」または「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的または拡張可能であり、さらなる言及されていないメンバー、要素または方法工程を除外しない。これらの用語は、特許用語において確立された意味を享受する「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」も包含する。
終点による数値範囲の言及は、それぞれの範囲内に包含されるすべての数値および画分とともに言及される終点を含む。
【００１８】
パラメータ、量、時間の期間などのような測定可能な値に言及する場合に本明細書において用いられる用語「約」または「およそ」は、特定の値のおよび特定の値から+/-10%以下、好ましくは+/-５%以下、より好ましくは+/-１%以下およびさらにより好ましくは+/-0.1%以下のような特定の値のおよび特定の値からの変動を包含することを意味する（このような変動が開示される発明を行うために適当である限り）。修飾語「約」または「およそ」が言及する値も、それ自体具体的および好ましく開示されると理解される。
【００１９】
１以上のメンバーまたはメンバーの群のうちの少なくとも１のメンバーのような用語「１以上」または「少なくとも１」との用語は、さらなる例示によりそれ自体明確であり、この用語は、なかでも、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーの任意の２以上、例えば前記メンバーの任意の≧３、≧４、≧５、≧６または≧７などおよび前記メンバーの全てまでについての言及を包含する。別の例では、「１以上」または「少なくとも１」は、１、２、３、４、５、６、７以上に言及しうる。
本明細書における本発明の背景についての議論は、本発明の関係を説明するために含まれる。これは、言及した材料のいずれかが、特許請求の範囲のいずれかの優先日におけるいずれかの国での発表された既知のまたは部分的な一般的共通認識であることを認めるものではない。
【００２０】
本開示を通して、様々な出版物、特許および公開された特許明細書は、同定する引用により参照される。本明細書で引用する全ての文書は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。特に、本明細書で具体的に言及するこのような文書の教示または部分は、参照により組み込まれている。
【００２１】
そうでないと定義しない限り、本発明を開示するために用いられる全ての用語は、技術的および科学的用語を含めて、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。さらなる手引きにより、用語の定義を、本発明の教示をよりよく理解するために含める。特定の用語を、本発明の具体的な態様または本発明の具体的な実施形態との関連で定義する場合、このような言外の意味を、そうでないと定義しない限り、本明細書を通して、すなわち本発明のその他の態様または実施形態との関係において当てはめることを意図する。
【００２２】
以下の文章では、本発明の異なる態様または実施形態をより詳細に定義する。このようにして定義されるそれぞれの態様または実施形態は、そうでないと明確に示さない限り、任意のその他の態様または実施形態と組み合わせてよい。特に、好ましいかまたは有利であると示される任意の特徴は、好ましいかまたは有利であると示される任意のその他の１以上の特徴と組み合わせてよい。
【００２３】
本明細書を通しての「一実施形態」、「ある実施形態」に対する言及は、該実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書を通して様々な場所で「一実施形態では」または「ある実施形態では」との句が現れることは、必ずしも全てが同じ実施形態に言及することではないが、全てが同じ実施形態に言及する可能性がある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、本開示から当業者にとって明らかなように、１以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わせてよい。さらに、本明細書に記載するいくつかの実施形態は、その他の実施形態に含まれるいくつかの特徴(しかしその他の特徴ではない)を含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、当業者に理解されるように、本発明の範囲内であることを意味し、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲では、請求される実施形態のいずれも、任意の組み合わせで用いることができる。
【００２４】
上で述べたように、本発明者らは、共刺激経路B7:CD28が、単独または共刺激経路CD40:CD40Lとの組み合わせで、心臓温虚血再灌流障害(本明細書においてCWIRIと省略する)の処置のための有用で有望な標的であると認識した。当該技術および本明細書で用いる場合、用語「共刺激経路」はＴ細胞共刺激経路を示し、抗原提示細胞の表面上に存在する非抗原分子(すなわち共刺激分子)と、Ｔ細胞上のそのそれぞれの結合パートナーとの相互作用(この相互は、主要組織適合性複合体(MHC)-抗原-Ｔ細胞受容体相互作用とともに、Ｔ細胞の増殖および分化を誘導するために必要である)のことをいう。したがって、本発明者らは、予期せぬことに、これらのＴ細胞応答の阻害が心臓温虚血再灌流障害の処置において有益な効果を有することに気付いた。
【００２５】
したがって、本発明のある態様は、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉する、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤に関する。
本発明の別の態様は、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞の表面上でのCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤に関する。
【００２６】
本明細書で用いる場合、用語「(薬)剤(agent)」は、任意の化学物質(例えば無機または有機)、生化学的もしくは生物学的物質、分子もしくは巨大分子(例えば生物学的巨大分子)、それらの組み合わせもしくは混合物、未決定の組成の試料、または細菌、植物、真菌もしくは動物細胞または組織のような生物学的材料から作製される抽出物のことをいう。好ましいが限定しない「(薬)剤」は、核酸、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ポリペプチドもしくはタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、抗体ならびにその断片および誘導体、アプタマー、フォトアプタマー、化学物質、好ましくは有機分子、より好ましくは有機小分子、脂質、炭水化物、多糖類などならびにこれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で用いる場合、用語「治療剤」は、「薬物」と交換可能に用いられ、疾患の処置、治癒、防止または診断において用いられる本明細書で教示する薬剤のことをいう。
【００２７】
本明細書で用いる場合、用語「処置する(treat)」、「処置する(treating)」または「処置」は、既に発生した疾患または状態の治療的処置、特にCWIRIの治療、および予防的または防止的措置を包含し、ここで、狙いは、望ましくない苦痛の出現の機会を防止または少なくすることであり、特にCWIRIの防止である。有益なまたは望ましい臨床結果は、限定することなく、心臓組織の損傷または傷害を妨げること、心臓組織の損傷または傷害の程度を減じること、心臓組織の損傷または傷害を悪化させないこと、損傷または傷害を受けた心臓組織をいやすこと、瘢痕サイズを低減させることなどを含み得る。「処置」は、処置を受けない場合に予期される生存と比較して生存が延長されることも意味し得る。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「虚血再灌流障害」は、組織または器官における虚血または酸素の欠如の期間の後に組織または器官に血液供給が戻った場合(すなわち再酸素負荷)に引き起こされる組織または器官の傷害のことをいう。説明のために、虚血期間中に血液に酸素および栄養分が存在しないことは、循環の回復が正常機能の回復よりもむしろ酸化ストレスの誘導により炎症および酸化的傷害をもたらす状態を創り出す。再灌流に伴う酸化ストレスは、患部組織または器官に対して傷害を引き起こすことがある。虚血再灌流障害は、よって、虚血事象中の酸素の枯渇と、その後の再酸素負荷とそれと同時の再灌流中の活性酸素種の発生とを生化学的な特徴とする。
【００２９】
虚血再灌流障害は、例えば、脳梗塞、心筋梗塞もしくは肺梗塞、静脈もしくは動脈の閉塞または再狭窄のような虚血性梗塞の後の血流の回復;このような梗塞、閉塞もしくは再狭窄の処置に伴う血流の回復;心血管停止の後の血流の回復;外傷の後の血流の回復;あるいは血液の供給が減じられていた組織または器官への血流を回復する１以上の外科的手順またはその他の治療的介入の結果により引き起こされることがある。このような外科的手順は、例えば、冠動脈バイパス移植術、冠動脈形成術、血管結紮術および器官移植術中の再灌流などを含む。
【００３０】
用語「温虚血再灌流障害」は、より具体的に、虚血の期間中に実質的に生理的な温度に維持または曝露されていた組織または器官における虚血再灌流障害のことをいう。生理的温度は、最も典型的に、正常体温のことをいう。例えば、ヒト対象者では、正常体温は、約36.00℃と約37.50℃との間の温度のことを具体的にいうことがある。生理的温度は、しかし、高熱、特に高熱の程度が生物の生存に適合する場合も包含し得る。例えば、ヒト対象者では、高熱は、約37.51℃と約41.00℃との間、好ましくは約37.51℃と約40.00℃との間、より好ましくは約37.51℃と約39.00℃との間、さらにより好ましくは約37.51℃と約38.50℃との間の温度を具体的にいうことがある。生理的温度は、低体温、特に低体温の程度が生物の生存に適合する場合も包含し得る。例えば、ヒト対象者では、低体温は、約24.00℃と約35.99℃との間、好ましくは約28.00℃と約35.99℃との間、より好ましくは約31.00℃と約35.99℃との間、さらにより好ましくは約32.00℃または約33.00℃または約34.00℃および約35.99℃、さらにより好ましくは約35.00℃と約35.99℃との間の温度を具体的にいうことがある。当業者は、温血動物、特に哺乳動物の生理的温度を、文献からまたは単純に温度測定により容易に確かめることができる。
【００３１】
例えば、温虚血再灌流障害は、虚血の期間中に組織または器官が体内に存在しているかまたは体から取り除かれない場合の再灌流の結果として起こることがある。別の例として、温虚血再灌流障害は、例えば組織または器官がその期間中に体から一時的に取り除かれた場合に組織または器官が虚血の期間中に冷蔵されなかった場合の再灌流の結果として生じることがある。この関係における冷蔵は、特に、組織または器官を約２℃と約８℃の間、例えば約４℃と約６℃との間の温度に維持する(組織または器官を該温度に曝露する)ことを意味し得る。
【００３２】
「心臓温虚血再灌流障害」の句は、よって、心臓組織または器官の温虚血再灌流障害を広く包含する。より具体的に、この句は、心臓の筋肉組織(心筋)の温虚血再灌流障害のことをいうことがある。本明細書で意図する心臓温虚血再灌流障害は、例えば心筋梗塞の結果であり得、これは、慢性心筋梗塞または好ましくは急性(すなわち突然および重症)心筋梗塞(STEMI)(心臓の虚血領域への血流の回復をねらいとした心筋梗塞の処置(例えば抗凝固療法)により悪化した可能性がある)、心血管停止、冠動脈バイパス移植術、冠動脈形成術、一過性血管攣縮、急性冠症候群(NSTEMI)、心停止法、血管結紮術および心臓移植術中の再灌流などであり得る。
【００３３】
したがって、あるいくつかの実施形態では、心臓温虚血再灌流障害は、心筋梗塞、慢性心筋梗塞、急性心筋梗塞(STEMI)、心臓の虚血領域への血流の回復をねらいとした心筋梗塞の処置、心血管停止、冠動脈バイパス移植術、冠動脈形成術、一過性血管攣縮、急性冠症候群(NSTEMI)、心停止法または血管結紮術および心臓移植術中の再灌流の結果であり得る。
したがって、あるいくつかの実施形態では、心臓温虚血再灌流障害は、急性心筋梗塞の結果であり得る。
【００３４】
用語「相互作用する」は、本明細書で用いる場合、２以上、例えば２の薬剤が互いに影響する行為またはプロセスのことをいう。本出願に記載する治療剤とCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方、または本出願に記載する第２治療剤とCD40ポリペプチドとのような薬剤間の相互作用は、共有的(すなわち原子間の電子対の共有を伴う１以上の化学結合により媒介される)、またはより典型的には非共有的(すなわち、例えば水素ブリッジ、双極性相互作用、ファンデルワールス相互作用のような非共有的な力により媒介される)であってよい。
典型的に、別の剤(これは、簡便のために「標的」ということがある)と相互作用する剤は、よって、前記別の剤(標的)と結合でき、例えば、本出願に記載する治療剤は、CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と結合できるか、または本出願に記載する第２治療剤は、CD40ポリペプチドと結合でき、より典型的には、KA≧１×105Ｍ-1、好ましくはKA≧１×106Ｍ-1、より好ましくはKA≧１×107Ｍ-1、さらにより好ましくはKA≧１×108Ｍ-1、さらにより好ましくはKA≧１×109Ｍ-1、さらにより好ましくはKA≧１×1010Ｍ-1またはKA≧１×1011Ｍ-1（ここで、KA=[A_T]/[A][T]、Ａは薬剤を示し、Ｔは標的を示す)の結合の親和性定数(KA)で前記別の剤と結合できる。KAの決定は、例えばバイオレイヤー干渉法(BLI)、平衡透析およびスキャッチャードプロット分析を用いて、当該技術において既知の方法により行うことができる。
【００３５】
好ましくは、薬剤と標的との間の相互作用(例えば結合)、例えば本出願に記載する治療剤とCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方との相互作用、または本出願に記載する第２治療剤とCD40ポリペプチドとの相互作用は、特異的または選択的であり、すなわち、剤は、無作為で関連しない分子または物質と実質的に相互作用(例えば結合)しない。このことにより、剤は、このような無作為で関連しない分子または物質の活性およびレベルを実質的に変更することもない。標的と剤との結合は、なかでも、従来の相互作用を調べる方法、例えば共免疫沈降、イムノアッセイ法、クロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、酵母ツーハイブリッド法またはそれらの組み合わせを用いて評価できる。
【００３６】
剤と標的との間の相互作用(例えば結合)、例えば本出願に記載する治療剤とCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方との相互作用、または本出願に記載する第２治療剤とCD40ポリペプチドとの相互作用は、前記標的の活性またはレベルまたはその両方を望ましくは変更する。「活性」への言及は、広く解釈され、任意のレベル(例えば分子、細胞および/または生理的)での標的の生物学的活性の任意の１以上の態様、例えば、限定することなく、例えば細胞、組織、器官または生物内でのその生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性、相互作用活性、リガンド活性、受容体活性または構造活性の任意の１以上の態様を全般的に包含し得る。例えばそして限定することなく、CD80またはCD86ポリペプチドの活性への言及は、リガンドとしてのCD80またはCD86ポリペプチドの活性、すなわち１以上の同族受容体、特にCD28ポリペプチドもしくはCTLA-4ポリペプチドまたはCD28およびCTLA-4ポリペプチドの両方と結合するそれらの能力、ならびに/あるいはシグナル伝達分子としてのCD80またはCD86ポリペプチドの活性、すなわち１以上の細胞シグナル伝達経路、特にB7:CD28共刺激経路に参加するそれらの能力のことを特にいうことがある。「レベル」への言及は、広く解釈され、例えば細胞、組織、器官または生物内での標的の量および/または利用可能性(例えばその生物学的活性を行うための利用可能性)を全般的に包含し得る。
【００３７】
特に、あるいくつかの態様において意図するように、本出願に記載する治療剤とCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方との相互作用は、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉し、すなわちCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方がCD28ポリペプチドと結合する能力に干渉する。このことにより、本出願に記載する治療剤とCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方との相互作用は、B7:CD28共刺激シグナルの生成、ならびにＴ細胞の増殖および分化を阻害または防止できる。「に干渉する」との句は、本明細書で用いる場合、「減少する」、「低減する」、「減じる」、「阻害する」、「混乱させる」または「乱す」のような用語と同義であることを意図し、干渉される結合の質的または量的な減少を示す。この用語は、任意の程度のこのような干渉を包含する。例えば、結合の減少が決定可能または測定可能な変数に影響する場合、干渉は、前記干渉がない参照状況と比較して、少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、97%、98%、99%または100%さえの(CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合の減少に相当する)前記変数の値の減少を包含し得る。ポリペプチドの結合、例えばCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合を測定するため、および薬剤がそのような結合に干渉する程度を測定するための適切な分子試験は、当業者にとって利用可能である。さらに、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に剤が干渉する程度を測定するための適切なインビトロ細胞試験は、一方向同種混合リンパ球反応(このような試験におけるある適切な評価項目は、EC50値である)におけるＴ細胞応答の誘導に干渉するこのような薬剤の能力を試験することを含み得る。
【００３８】
同様に、あるいくつかの実施形態において意図するように、本出願に記載する第２治療剤とCD40ポリペプチドとの相互作用は、CD40ポリペプチドとCD40リガンド(CD40L)ポリペプチドとの結合、すなわちCD40Lポリペプチドと結合できるCD40ポリペプチドの能力に干渉する。任意の程度のこのような相互作用を包含する。例えば、結合の減少が決定可能または測定可能な変数に影響する場合、干渉は、前記干渉がない参照状況と比較して、少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、97%、98%、99%または100%さえの(CD40ポリペプチドとCD40Lポリペプチドとの結合の減少に相当する)前記変数の値の減少を包含し得る。ポリペプチドの結合、例えばCD40ポリペプチドとCD40Lポリペプチドとの結合を測定するため、および薬剤がそのような結合に干渉する程度を測定するための適切な分子試験は、当業者にとって利用可能である。さらに、CD40ポリペプチドとCD40Lポリペプチドとの結合に薬剤が干渉する程度を測定するための適切なインビトロ細胞試験は、一方向同種混合リンパ球反応(このような試験におけるある適切な評価項目は、EC50値である)におけるＴ細胞応答の誘導に干渉するこのような薬剤の能力を試験することを含み得る。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「表面抗原分類80」または「CD80」またはB7-1は、Ｔ細胞活性化および生存のために必要な共刺激シグナルを提供する抗原提示細胞(APC)上で主に見出されるタンパク質のことをいう。この用語は、APCおよび任意のその他の細胞型、例えば内皮細胞において発現されるCD80を包含する。CD80は、Ｔ細胞表面上の２つの異なるタンパク質、CD28およびCTLA-4についてのリガンドである。
【００４０】
用語「抗原提示細胞」は、当業者に理解され、さらなる説明により、主要組織適合性複合体(MHC)分子(MHCクラスＩまたはII)もしくはその一部分、または１以上の非古典的MHC分子もしくはその一部分とともにその表面上で抗原(例えば特に外来(外因性)抗原)を提示して、例えば、MHC分子の関係においてＴ細胞に抗原を提示できる任意の細胞のことをいう。抗原提示細胞は、よって、適切には、タンパク質およびポリペプチドを、MHC分子の関係において提示され得るペプチドにプロセシングすることもできる。抗原提示細胞(APC)は、それらに限定されないが、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞を含み得る。用語「Ｔ細胞」は、当業者により理解され、さらなる説明により、様々な細胞媒介免疫反応に参加するある型の胸腺由来白血球のことをいう。この用語は、限定しないが、特に、標的細胞を溶解できるかまたはエフェクターもしくはヘルパー機能、例えばサイトカイン分泌(このことにより、標的細胞の死滅または抗標的エフェクター活性の発生もしくは増進をもたらすことができる)を提供できるCD8+またはCD4+Ｔ細胞のことをいうことがある。
【００４１】
例示的であるが非限定的なCD80 mRNAは、Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)アクセッション番号NM_005191.3(ピリオドの後の番号はGenbank配列バージョンを示す)の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD80 mRNAを含む。例示的であるが非限定的なCD80は、Genbankアクセッション番号NP_005182.1の下でアノテートされるアミノ酸配列を有するヒトCD80タンパク質(前駆体)を含む。
【００４２】
当業者は、いくつかの場合では、本明細書で言及する配列が前駆体のものであり(例えばプレタンパク質)、成熟タンパク質またはポリペプチドからプロセシングされてなくなる部分を含み得ることを認識できる。当業者は、言及される配列がそのようなアイソフォームの１つだけを示す場合でさえ、タンパク質またはポリペプチドの任意のそして全てのアイソフォームが本明細書に包含されることも認識できる。
【００４３】
本明細書で用いる場合、用語「表面抗原分類86」または「CD86」またはB7-2は、Ｔ細胞活性化および生存のために必要な共刺激シグナルを提供する抗原提示細胞上で主に見出されるタンパク質のことをいう。この用語は、APCおよび任意のその他の細胞型、例えば内皮細胞において発現されるCD86を包含する。CD86は、Ｔ細胞表面上の２つの異なるタンパク質、CD28およびCTLA-4についてのリガンドである。例示的であるが非限定的なCD86遺伝子は、Genbankアクセッション番号EF064748.1の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD86遺伝子を含む。例示的であるが非限定的なCD86 mRNAは、Genbankアクセッション番号U04343.3の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD86 mRNAを含む。例示的であるが非限定的なCD86タンパク質は、Genbankアクセッション番号ABK41931.1の下でアノテートされるアミノ酸配列を有するヒトCD86タンパク質を含む。
【００４４】
CD80およびCD86ポリペプチドは、集合的に「共刺激分子」とよばれ、これらの存在は、抗原性ペプチド(シグナル１)とともに、抗原反応性Ｔ細胞の効率的な刺激を得るために必要である(シグナル２)。共刺激分子の存在は、Ｔ細胞の表面上の受容体により感知される。
【００４５】
本明細書で用いる場合、用語「表面抗原分類28」または「CD28」は、Ｔ細胞活性化のために要求される共刺激シグナルを提供するＴ細胞上で発現される分子の１つのことをいう。CD28は、CD80およびCD86についての受容体である。例示的であるが非限定的なCD28遺伝子は、Genbankアクセッション番号NG_029618.1の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD28遺伝子を含む。例示的であるが非限定的なCD28 mRNAは、Genbankアクセッション番号NM_006139.3、NM _001243077.1またはNM_001243078.1の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD28 mRNAを含む。例示的であるが非限定的なCD28タンパク質は、Genbankアクセッション番号NP_006130.1、NP_001230006.1またはNP_001230007.1の下でアノテートされるアミノ酸配列を有するヒトCD28タンパク質(前駆体)を含む。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４」、「CTLA-4」、「CTLA4」、「表面抗原分類152」または「CD152」は、Ｔ細胞活性化のために要求される共刺激シグナルを提供するＴ細胞の表面上で発現される分子のことをいう。CTLA4は、CD80およびCD86についての受容体である。例示的であるが非限定的なCTLA4遺伝子は、Genbankアクセッション番号NG_011502.1の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCTLA4遺伝子を含む。例示的であるが非限定的なCTLA4 mRNAは、Genbankアクセッション番号NM_001037631.2またはNM_005214.4の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCTLA4 mRNAを含む。例示的であるが非限定的なCTLA4タンパク質は、Genbankアクセッション番号NP_001032720.1またはNP_005205.2の下でアノテートされるアミノ酸配列を有するヒトCTLA4タンパク質(前駆体)を含む。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「表面抗原分類40」または「CD40」は、活性化された抗原提示細胞上で発現されるCD40共刺激分子のことをいう。CD40は、Ｔ細胞上のCD154 (CD40L)と結合できる。例示的であるが非限定的なCD40遺伝子は、Genbankアクセッション番号DQ871604.1の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD40遺伝子を含む。例示的であるが非限定的なCD40 mRNAは、Genbankアクセッション番号NM_001250.4またはNM_152854.2の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD40 mRNAを含む。例示的であるが非限定的なCD40タンパク質は、Genbankアクセッション番号NP_001241.1またはNP_690593.1の下でアノテートされるアミノ酸配列を有するヒトCD40タンパク質(前駆体)を含む。
【００４８】
本明細書で用いる場合、用語「CD40L」、「CD40リガンド」、「表面抗原分類154」または「CD154」は、CD40と結合できるＴ細胞上で主に発現されるタンパク質のことをいう。例示的であるが非限定的なCD40L遺伝子は、Genbankアクセッション番号NG_007280.1の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD40L遺伝子を含む。例示的であるが非限定的なCD40L mRNAは、Genbankアクセッション番号NM_000074.2の下でアノテートされる核酸配列を有するヒトCD40L mRNAを含む。例示的であるが非限定的なCD40Lタンパク質は、Genbankアクセッション番号NP_000065.1の下でアノテートされるアミノ酸配列を有するヒトCD40Lタンパク質を含む。
【００４９】
本明細書で用いる場合、任意の１の核酸またはタンパク質への言及は、当該技術においてそれぞれの記載の下で一般的に知られる核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに相当する。これらの用語は、見出される任意の生物、特に動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくはヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくはヒトの核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。これらの用語は、特に、天然の配列を有する、すなわち自然で見出されるかまたは天然に由来する核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのものと１次配列が同じ核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。当業者は、天然配列が、種間の遺伝子多様性により異なる種間で異なり得ることを理解している。さらに、天然配列は、所定の種内の通常の遺伝子多様性(変動)により同じ種の異なる個体間または個体内で異なり得る。また、天然の配列は、転写後または翻訳後修飾により同じ種の異なる個体間または異なる個体内でさえ異なり得る。核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの任意のこのようなバリアントまたはアイソフォームを、本明細書において意図する。したがって、自然で見出されるかまたは天然に由来する核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの全ての配列は、「天然」とみなす。これらの用語は、生存している生物、器官、組織または細胞の一部分を形成する場合、生体試料の一部分を形成する場合、およびこのような供給源から少なくとも部分的に単離されている場合の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。これらの用語は、組換えまたは合成手段により生成される場合の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドも包含する。
【００５０】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、任意の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの本明細書における言及は、例えばリン酸化、グリコシル化、脂質化、メチル化、システイン化、スルホン化、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンからメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンへの酸化などを含む発現後修飾または化学的修飾を有するような前記核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの修飾形も一般的に包含し得る。
【００５１】
核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、好ましくはヒトであってよく、すなわち、それらの１次配列は、天然に存在するヒト核酸、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのまたは天然に存在するヒト核酸、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドに存在する対応する１次配列と同じであり得る。よって、この関係における修飾語「ヒト」は、その起源もしくは供給源よりもむしろそれぞれの核酸、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの１次配列に関する。例えば、このような核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、ヒト対象者の試料に存在するかもしくは試料から単離できるか、またはその他の手段(例えば組換え発現、無細胞翻訳または非生物学的ペプチド合成)により得ることができる。
【００５２】
任意の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの本明細書における言及は、それらの断片も包含し得る。核酸の「断片」という用語は、前記核酸の５'-および/または３'-末端欠失または切断形のことを一般的にいう。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「断片」という用語は、前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのＮ末端および/またはＣ末端欠失または切断形のことを一般的にいう。限定することなく、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの断片は、前記核酸のヌクレオチド配列または前記タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５%もしくは少なくとも約10%、例えば≧20%、≧30%もしくは≧40%、例えば好ましくは≧50%、例えば≧60%、≧70%もしくは≧80%またはより好ましくは≧90%もしくは≧95%を表し得る。
【００５３】
任意の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの本明細書における言及は、それらのバリアントも包含し得る。核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「バリアント」との用語は、配列(すなわちそれぞれヌクレオチド配列またはアミノ酸配列)が前記核酸、タンパク質またはポリペプチドの配列と実質的に同一(すなわち完全に同一でないがほとんど同一)である、例えば少なくとも約80%同一または少なくとも約85%同一、例えば好ましくは少なくとも約90%同一、例えば少なくとも91%同一、92%同一、より好ましくは少なくとも約93%同一、例えば少なくとも94%同一、さらにより好ましくは少なくとも約95%同一、例えば少なくとも96%同一、さらにより好ましくは少なくとも約97%同一、例えば少なくとも98%同一、最も好ましくは少なくとも99%同一である核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのことをいう。好ましくは、バリアントは、記載する核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの全体の配列を配列アラインメント(すなわち配列全体の同一性)に問い合わせた場合に記載する核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対してこのような程度の同一性を示し得る。別の通常は関連しない核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドとの核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの融合生成物も、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの断片およびバリアントに含まれる。
【００５４】
配列同一性は、それ自体で知られる、配列アラインメントを行い、配列同一性を決定するための適切なアルゴリズムを用いて決定できる。例示的であるが非限定的なアルゴリズムは、Altschulら、1990 (J Mol Biol 215: 403〜10)により最初に記載されたBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)に基づくもの、例えばTatusovaおよびMadden、1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247〜250)により記載された「Blast 2配列」アルゴリズム(例えば発表されたデフォルト設定またはその他の適切な設定を用いる(例えばBLASTNアルゴリズムについて:ギャップオープンコスト=５、ギャップ伸長コスト=２、ミスマッチペナルティ=-２、マッチ報酬=１、ギャップx_ドロップオフ=50、期待値=10.0、ワードサイズ=28、またはBLASTPアルゴリズムについて:行列=Blosum62、ギャップオープンコスト=11、ギャップ伸長コスト=１、期待値=10.0、ワードサイズ=３)を含む。
【００５５】
核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのバリアントは、前記核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのホモログ(例えばオルソログまたはパラログ)であってよい。本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、同じまたは異なる分類群からの２つの巨大分子間、特に２つの核酸、タンパク質またはポリペプチド間の構造的類似性であって、共通の祖先による類似性のことを一般的にいう。
【００５６】
本明細書が核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの断片および/またはバリアントに言及するかまたはそれを包含する場合、これは、好ましくは、「機能的」である、すなわちそれぞれの核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性または意図する機能性を少なくとも部分的に保持するバリアントおよび/または断片のことをいう。例えばそして限定することなく、アンチセンス剤またはRNAi剤の機能的断片および/またはバリアントは、前記剤の機能性、すなわち標的分子(遺伝子)の発現を低減または撤廃するその能力を少なくとも部分的に保持する。別の例としてそして限定することなく、CD80またはCD86ポリペプチドの機能的断片および/またはバリアントは、それぞれCD80またはCD86の生物学的活性、例えば、１以上の同族受容体、より具体的にはCD28および/もしくはCTLA-4と結合する能力、または１以上の細胞経路、より具体的にはＴ細胞の活性化のために必要な共刺激シグナルの発生に参加する能力などを少なくとも部分的に保持する。好ましくは、例えば生物学的活性を決定または測定するための適切な定量的試験を用いることにより、決定可能または測定可能な変数として生物学的活性を表現できる場合、機能的断片および/またはバリアントは、対応する核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと比較して、意図する生物学的活性または機能性の少なくとも約20%、例えば少なくとも30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、例えば少なくとも60%、より好ましくは少なくとも約70%、例えば少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%または約100%以上さえを保持し得る。
【００５７】
細胞によるポリペプチドの「発現」との用語は、細胞による前記ポリペプチドの生成のことをいう。一般的に知られるように、細胞によるポリペプチドの発現は、いくつかの連続的な分子機構、より具体的には、限定されないが、前記ポリペプチドをコードする遺伝子のRNAへの転写、ポリアデニル化ならびに当てはまる場合にはmRNAへのRNAのスプライシングおよび/またはその他の転写後修飾、細胞質へのmRNAの局在化、当てはまる場合にはmRNAのその他の転写後修飾、ポリペプチド鎖へのmRNAの翻訳、当てはまる場合にはポリペプチドの翻訳後修飾、ならびにポリペプチドの成熟立体構造へのポリペプチド鎖の折りたたみを伴う。区画に分けられたポリペプチド、例えば分泌ポリペプチドおよび膜貫通ポリペプチドについて、生成プロセスは、ポリペプチドの通行、すなわちポリペプチドが適当な細胞レベル以下の区画もしくはオルガネラ、膜、例えば細胞膜または細胞外に輸送される細胞機構をさらに伴う。
【００５８】
用語「ポリペプチドの発現を防止または阻害する」は、よって、細胞によるポリペプチドの生成の質的または量的な低減を達成することをいう。このような防止または阻害は、細胞により生成される成熟した生物学的に活性なポリペプチドの量が低減される限り、発現プロセスの任意の１以上の段階に影響できる。この用語は、任意の程度のこのような防止または阻害を包含する。例えば、例えばポリペプチドの量を決定または測定するための適切な定量試験を用いることにより、決定可能または測定可能な変数として細胞により発現されるポリペプチドの量の低減を表現できる場合、この用語は、前記防止または阻害がない参照状況と比較して少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、97%、98%、99%または100%さえの細胞により発現されるポリペプチドの量の低減を包含し得る。細胞により発現されるポリペプチドの量を測定するための多くの適切な試験、例えば定量的生化学的アッセイ法、イムノアッセイ法、質量分析法もしくはクロマトグラフィー法、またはそれらの組み合わせに基づくものが利用可能である。
【００５９】
好ましくは、ポリペプチドの発現の防止または阻害、例えばCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現の防止もしくは阻害、またはCD40ポリペプチドの発現の防止もしくは阻害は、特異的または選択的であり、すなわち、防止または阻害を行う剤が、無作為で無関係のポリペプチドの発現を実質的に防止または阻害しない。
【００６０】
なかでもCD80、CD86、CD28、CD40およびCD40Lを含む受容体またはリガンドのようなポリペプチドは、それらを発現する細胞の表面上(すなわち細胞膜上)に典型的に提示されて、それらの生物学的機能(同族受容体またはリガンドに結合して、シグナル伝達活性を実行する)を行う。したがって、用語「細胞の表面上のポリペプチドの提示を防止または阻害する」は、細胞の表面上での成熟した生物学的に活性なポリペプチドの提示の質的または量的な低減を達成することを示す。このような防止または阻害は、細胞の表面上で提示される成熟した生物学的に活性なポリペプチドの量が低減される限り、通行または移動プロセスの任意の１以上の段階に影響し得る。
【００６１】
例えば、例えば細胞表面上のポリペプチドの量を決定または測定するための適切な定量試験を用いることにより、測定可能な変数として細胞の表面上で提示されるポリペプチドの量の防止または阻害を決定可能または表現できる場合、この用語は、前記防止または阻害がない参照状況と比較して少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%、少なくとも約30%、例えば少なくとも約40%、少なくとも約50%、例えば少なくとも約60%、少なくとも約70%、例えば少なくとも約80%、少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%、例えば少なくとも約96%、97%、98%、99%または100%さえの細胞の表面上に提示されるポリペプチドの量の低減を包含し得る。細胞の表面上で発現されるポリペプチドの量を測定するための多くの適切な試験、例えば定量的生化学的アッセイ法、イムノアッセイ法、定量的蛍光活性化細胞選別法またはそれらの組み合わせに基づくものが利用可能である。
【００６２】
好ましくは、細胞の表面上のポリペプチドの提示の防止または阻害、例えば細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示の防止もしくは阻害、または細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示の防止もしくは阻害は、特異的または選択的であり、すなわち、防止または阻害を行う剤が、細胞の表面上の無作為で無関係のポリペプチドの提示を実質的に防止または阻害しない。
【００６３】
あるいくつかの実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる治療剤は、CD80ポリペプチドと相互作用できる治療剤であってよく、ここで、前記相互作用は、CD80ポリペプチドとCD28ポリペプチドとの結合に干渉する。
あるいくつかの実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる治療剤は、CD80ポリペプチドと相互作用できるがCD86ポリペプチドと相互作用できない治療剤であってよく、ここで、前記相互作用は、CD80ポリペプチドとCD28ポリペプチドとの結合に干渉する。
【００６４】
あるいくつかの実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる治療剤は、CD86ポリペプチドと相互作用できる治療剤であってよく、ここで、前記相互作用は、CD86ポリペプチドとCD28ポリペプチドとの結合に干渉する。
あるいくつかの実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる治療剤は、CD86ポリペプチドと相互作用できるがCD80ポリペプチドと相互作用できない治療剤であってよく、ここで、前記相互作用は、CD86ポリペプチドとCD28ポリペプチドとの結合に干渉する。
【００６５】
あるいくつかの実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる治療剤は、CD80ポリペプチドおよびCD86ポリペプチドと相互作用できる治療剤であってよく、ここで、前記相互作用は、CD80ポリペプチドおよびCD86ポリペプチドとCD28ポリペプチドとの結合に干渉する。
【００６６】
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、ここで、前記相互作用は、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と、CD28ポリペプチドおよびCTLA-4ポリペプチドとの結合に干渉する。
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、ここで、前記相互作用は、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と、CD28ポリペプチドとの結合に干渉するが、CTLA-4ポリペプチドとの結合に干渉しない。
【００６７】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤は、細胞によるCD80ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤であってよい。
【００６８】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤は、細胞によるCD80ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるがCD86ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できないか、または細胞の表面上でのCD80ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できるがCD86ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できない治療剤であってよい。
【００６９】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤は、細胞によるCD86ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD86ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤であってよい。
【００７０】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤は、細胞によるCD86ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるがCD80ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できないか、または細胞の表面上でのCD86ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できるがCD80ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できない治療剤であってよい。
【００７１】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤は、細胞によるCD80ポリペプチドおよびCD86ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80ポリペプチドおよびCD86ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤であってよい。
【００７２】
さらなる実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方は、細胞に含まれ、CD28ポリペプチドは、別の細胞に含まれてよい。
特に、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方は、抗原提示細胞(APC)に含まれ、CD28ポリペプチドは、Ｔ細胞に含まれてよく、そのことにより、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる本明細書に開示する治療剤の作用は、共刺激経路B7:CD28に干渉して、Ｔ細胞応答の阻害をもたらす。したがって、このような実施形態は、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤を提供し、ここで、治療剤は、抗原提示細胞に含まれるCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用は、抗原提示細胞に含まれるCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と、Ｔ細胞に含まれるCD28ポリペプチドとの結合に干渉する。
【００７３】
実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方は、内皮細胞に含まれ、CD28ポリペプチドは、Ｔ細胞に含まれてよく、そのことにより、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる本明細書に開示する治療剤の作用は、内皮とのＴ細胞の接着に干渉する。したがって、このような実施形態は、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤を提供し、ここで、治療剤は、内皮細胞に含まれるCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用は、Ｔ細胞に含まれるCD28ポリペプチドと、内皮細胞に含まれるCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方との結合に干渉する。
【００７４】
さらなる実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方は、抗原提示細胞(APC)に含まれてよく、そのことにより、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書に開示する治療剤の作用は、共刺激経路B7:CD28に干渉して、Ｔ細胞応答の阻害をもたらす。したがって、このような実施形態は、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤を提供し、ここで、治療剤は、抗原提示細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または抗原提示細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる。
【００７５】
実施形態では、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方は、内皮細胞に含まれてよく、そのことにより、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書に開示する治療剤の作用は、内皮とのＴ細胞の接着に干渉する。したがって、このような実施形態は、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤を提供し、ここで、治療剤は、内皮細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または内皮細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる。
【００７６】
あるいくつかの実施形態では、本明細書で意図する治療剤は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機小分子および化合物またはそれらの任意の２以上の組み合わせを含むか、それらから本質的になるかまたはそれらからなる群より選択できる。
【００７７】
用語「タンパク質」は、本明細書で用いる場合、１以上のポリペプチド鎖、すなわちペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマー鎖を含む巨大分子を一般的に包含する。この用語は、天然に、組換えにより、半合成的に、または合成的に生成されたタンパク質を包含し得る。この用語は、ポリペプチド鎖の１以上の発現と同時または発現後の修飾、例えば、限定することなく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Met除去、プロ酵素もしくはプレホルモンの活性形への変換などを有するタンパク質も包含する。この用語は、対応する天然タンパク質に相対してアミノ酸配列変動、例えばアミノ酸欠失、付加および/または置換を有するタンパク質バリアントまたは変異体もさらに含む。この用語は、全長タンパク質およびタンパク質の部分または断片の両方、例えばこのような全長タンパク質のプロセシングの結果として得られる天然に存在するタンパク質部分を企図する。
【００７８】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマー鎖を一般的に包含する。よって、タンパク質が単一ポリペプチド鎖のみで構成されている限り、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において交換可能に用いられて、このようなタンパク質を示す。この用語は、ポリペプチド鎖のいずれの最小限の長さにも限定されない。この用語は、天然に、組換えにより、半合成的に、または合成的に生成されたポリペプチドを包含し得る。この用語は、ポリペプチド鎖の１以上の発現と同時または発現後の修飾、例えば、限定することなく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Met除去、プロ酵素もしくはプレホルモンの活性形への変換などを有するポリペプチドも包含する。この用語は、対応する天然ポリペプチドに相対してアミノ酸配列変動、例えばアミノ酸欠失、付加および/または置換を有するポリペプチドバリアントまたは変異体もさらに含む。この用語は、全長ポリペプチドおよびポリペプチドの部分または断片の両方、例えばこのような全長ポリペプチドのプロセシングの結果として得られる天然に存在するポリペプチド部分を企図する。
【００７９】
用語「ペプチド」は、本明細書で用いる場合、好ましくは、50以下のアミノ酸、例えば45以下のアミノ酸、好ましくは40以下のアミノ酸、例えば35以下のアミノ酸、より好ましくは30以下のアミノ酸、例えば25以下、20以下、15以下、10以下または５以下のアミノ酸から本質的になる、本明細書で用いるポリペプチドのことをいう。
【００８０】
用語「ペプチド模倣物」は、対応するペプチドの位相幾何学的類似体である非ペプチド剤のことをいう。ペプチドのペプチド模倣物を合理的に設計する方法は、当該技術において知られている。例えば、手引きとして、硫酸化８マーペプチドCCK26〜33に基づく３つのペプチド模倣物および11マーペプチドサブスタンスＰに基づく２つのペプチド模倣物の合理的設計と、関連するペプチド模倣物設計原理とは、Horwell、1995 (Trends Biotechnol 13: 132〜134)に記載されている。
【００８１】
用語「核酸」は、本明細書で用いる場合、ヌクレオシド単位で本質的に構成される任意の長さのポリマー(好ましくは直鎖状ポリマー)のことを典型的にいう。ヌクレオシド単位は、複素環塩基と糖基とを共通して含む。複素環塩基は、なかでもプリンおよびピリミジン塩基、例えばアデニン(Ａ)、グアニン(Ｇ)、シトシン(Ｃ)、チミン(Ｔ)およびウラシル(Ｕ)を含むことができ、これらは、天然に存在する核酸、天然に存在する塩基(例えばキサンチン、イノシン、ヒポキサンチン)および化学的もしくは生化学的に修飾された(例えばメチル化)か、非天然であるかまたは誘導体化された塩基に広く普及している。例示的な修飾ヌクレオ塩基は、限定することなく、５置換ピリミジン、６-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリン(２-アミノプロピルアデニン、５-プロピニルウラシルおよび５-プロピニルシトシンを含む)を含む。特に、５-メチルシトシン置換は、核酸２重鎖安定性を増加させることが示されており、例えばアンチセンス剤において、さらにより具体的には２'-Ｏ-メトキシエチル糖修飾と組み合わせる場合に好ましい塩基置換であり得る。糖基は、なかでもペントース(ペントフラノース)基、例えば好ましくは天然に存在する核酸に共通するリボースおよび/もしくは２-デオキシリボースまたはアラビノース、２-デオキシアラビノース、トレオース、もしくはヘキソース糖基、ならびに修飾もしくは置換糖基(例えば、限定することなく、２'-Ｏ-アルキル化、例えば２'-Ｏ-メチル化または２'-Ｏ-エチル化糖、例えばリボース;２'-Ｏ-アルキルオキシアルキル化、例えば２'-Ｏ-メトキシエチル化糖、例えばリボース;または２'-Ｏ,４'-Ｃ-アルキレン連結、例えば２'-Ｏ,４'-Ｃ-メチレン連結もしくは２'-Ｏ,４'-Ｃ-エチレン連結糖、例えばリボース;２'-フルオロ-アラビノースなど)を含み得る。ヌクレオシド単位は、なかでも、天然に存在する核酸において共通するホスホジエステル連結、およびさらに修飾されたリン酸もしくはホスホネートに基づく連結、例えばホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、例えばメチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、例えばメチルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、例えばアルキルホスホトリエステル、ホスホロアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロモルホリデート、橋かけホスホロアミデート、橋かけメチレンホスホネート、橋かけホスホロチオエート;ならびにさらにシロキサン、カーボネート、スルファメート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、例えば３'-Ｎ-カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、３'-チオアセタールおよびスルホンヌクレオシド間連結を含む多数の既知のヌクレオシド間連結のいずれか１つにより互いに連結されてよい。好ましくは、ヌクレオシド間連結は、修飾リン酸ベースの連結、例えばより好ましくはホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート連結またはそれらの組み合わせを含むリン酸ベースの連結であってよい。用語「核酸」は、ポリマーを含有する任意のその他のヌクレオ塩基、例えば限定することなく、ペプチド核酸(PNA)、リン酸基を有するペプチド核酸(PHONA)、ロックド核酸(LNA)、モルホリノホス���ロジアミデート主鎖核酸(PMO)、シクロヘキサン核酸(CeNA)、トリシクロ-DNA (tcDNA)およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する主鎖区画を有する核酸(例えばKurreck 2003 (Eur J Biochem 270: 1628〜1644)を参照されたい)を含む核酸模倣物も包含する。「アルキル」は、本明細書で用いる場合、低級炭化水素部分、例えばC1〜C4直鎖状もしくは分岐鎖状、飽和もしくは不飽和の炭化水素、例えばメチル、エチル、エテニル、プロピル、１-プロペニル、２-プロペニルおよびイソプロピルを特に包含する。本明細書で意図する核酸は、天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはそれらの混合物を含み得る。修飾ヌクレオシドは、修飾複素環塩基、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間連結またはそれらの組み合わせを含み得る。用語「核酸」は、具体的にhnRNA、プレmRNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、増幅生成物、オリゴヌクレオチドおよび合成(例えば化学合成) DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドを含むDNA、RNAおよびDNA/RNAハイブリッド分子をさらに好ましく包含する。核酸は、天然に存在する、例えば天然に存在するかまたは自然から単離できるか、組換え、すなわち組換えDNA技術により生成され、かつ/または部分的もしくは完全に、化学的もしくは生化学的に合成できる。「核酸」は、２本鎖、部分的２本鎖または１本鎖であり得る。１本鎖である場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。さらに、核酸は、環状または直鎖状であり得る。核酸および特にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小型干渉RNAを含むRNAi剤は、ウラシル(Ｕ)塩基を含むと本明細書において示すことがある。Ｕは、このような(少なくともいくつかの)核酸および剤において、チミン(Ｔ)で場合によって置換されることがあることが認識される。例えば、２'-Ｏ-メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドはより「RNA様」であるので、このような分子においてＵを用いてかつそれを示すことがある。その他のアンチセンス化学、例えばペプチド核酸またはモルホリノ主鎖を用いて、Ｔ塩基が好ましく示されかつ用いられる。
【００８２】
用語「有機小分子」は、製薬において一般的に用いられる有機分子のものに匹敵するサイズを有する有機化合物を包含する。この用語は、生物学的巨大分子(例えばタンパク質、核酸など)を除外する。好ましい有機小分子は、約5000 Daまで、例えば約4000まで、好ましくは3000 Daまで、より好ましくは2000 Daまで、さらにより好ましくは約1000 Daまで、例えば約900、800、700、600または約500 Daまでのサイズの範囲である。
【００８３】
ある実施形態では、本明細書における治療剤として適切な有機小分子は、CD80と結合する、WO2005116033、WO2005046679、WO2003004495、WO2004048378およびWO 2004281011に記載される複素環化合物、例えばRhuDex(登録商標)(Medigene)を含み得る。
【００８４】
実施形態では、小分子は、式(I)もしくは(II)の化合物、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物であってよい:
【化１】
2015117214.tif 000003
(式中、
Ｘは、結合手または式-(Z)n-(Alk)-もしくは-(Alk)-(Q)n- ; -NH-C(O)-Alk-、-NH-C(O)-Alk-O-Alk-または-C(O)-NHの２価の基(式中、Ｑは、-Ｏ-、-Ｓ-または-NH-であり、ｎは、０または１であり、Alkは、場合によって置換されていてもよい２価の直鎖状もしくは分岐鎖状C1〜C12アルキレンもしくはC2〜C12アルケニレンもしくはC2〜C12アルキニレン基、または２価のC3〜C12炭素環式基であり、好ましくは、Alkは、C1〜C6アルキレンであり、これらのいずれの基も、１以上の-Ｏ-、-Ｓ-または-N(R8)-結合(式中、R8は、ＨまたはC1〜C4アルキル、C3〜C4アルケニル、C3〜C4アルキニルもしくはC3〜C6シクロアルキルを表す)を含有してよい)を表し、
Ｙは、式(Ｉ)において-Ｏ-、-Ｓ-または-N(R5)-を表し、Ｙは、式(II)において-Ｏ-、-Ｓ-、Ｎ-オキシドまたは-N(R5)-を表し(式中、R5は、ＨまたはC1〜C6アルキルを表す);
R1は、式(Ｉ)および(II)においてＨ;Ｆ; Cl ; Br ; -NO2 ; -CN ;ＦもしくはClで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルキル;またはＦで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルコキシを表し;
R2は、式(Ｉ)および(II)において、Ｈまたは場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルキル、C3〜C7シクロアルキルまたは場合によって置換されていてもよいフェニルを表し;
R3は、式(Ｉ)および(II)においてＨ;Ｆ; Cl ; Br ; -NO2 ; -CN ;ＦもしくはClで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルキル;またはＦで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルコキシを表し;
R4は、式(II)において-C(=O)NR6R7、-NR7C(=O)R6、-NR7C(=O)OR6、-NHC(=O)NHR6または-NHC(=S)NHR6を表す(式中、
R6は、Ｈまたは式-(Alk)b-Qの基を表し(式中、
ｂは、０または１であり、
Alkは、場合によって置換されていてもよい２価の直鎖状もしくは分岐鎖状C1〜C12アルキレン、C2〜C12アルケニレンもしくはC2〜C12アルキニレン基(これらは、１以上の非隣接-Ｏ-、-Ｓ-もしくは-N(R8)-基(式中、R8は、ＨまたはC1〜C4アルキル、C3〜C4アルケニル、C3〜C4アルキニルもしくはC3〜C6シクロアルキルを表す)が割り込んでいてもよい)であり、
Ｑは、Ｈ; -CF3 ; -OH; -SH ; -NR8R8(式中、それぞれのR8は、同じまたは異なってよく、エステル基;または場合によって置換されていてもよいフェニル、C3〜C7シクロアルキル、C5〜C7シクロアルケニルもしくは５〜８の環原子を有する複素環式環である)を表す)、
R7は、ＨまたはC1〜C6アルキルを表すか、またはそれらが結合する１以上の原子と一緒になった場合に、R6およびR7は、場合によって置換されていてもよい、５〜８の環原子を有する複素環式環を形成する))。
【００８５】
実施形態では、小分子は、式(III)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物であってよい:
【化２】
2015117214.tif 000004
(式中、Ｒは、OHであり、Ｗは、Ｆであり、Ｚは、Ｈであり、Ｘは、CHである)。
【００８６】
本発明において用いるために適切な小分子のさらなる例は、以下を含む:
[[３-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニルカルバモイル]-メトキシ]-酢酸、
Ｎ-[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニル]-スクシンアミド酸、
４-[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニルカルバモイル]-酪酸、
[[４-(-２--オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニルカルバモイル]-メトキシ]-酢酸、
４-[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニルカルバモイル]-２-フェニル-酪酸、
Ｎ-[３-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニル]-スクシンアミド酸、
２-[[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニルカルバモイル]-メチル]-安息香酸、
２-クロロ-４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
４-(６,８-ジメチル-3-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
４-(８-メトキシ-６-メチル-３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
４-(６,８-ジメトキシ-３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
４-(７,９-ジメトキシ-３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
４-(６-メチル-３-オキソ-８-トリフルオロメチル-３,５-ジヒドロピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
４-(７,９-ジクロロ-3-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニル]-プロピオン酸、
[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-フェニル]-酢酸、
４-(４-メチル-３-オキソ-3H-クロメノ[４,３-ｃ]ピラゾール-２-イル)-安息香酸、
４-(３-オキソ-3H-チオクロメノ[４,３-ｃ]ピラゾール-２-イル)安息香酸、
４-(５-メチル-３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)-安息香酸、
２-[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)ベンゾイルアミノ]-３-フェニル-プロピオン酸、および
２-[４-(３-オキソ-３,５-ジヒドロ-ピラゾロ[４,３-ｃ]キノリン-２-イル)ベンゾイルアミノ]-２-酢酸。
【００８７】
実施形態では、小分子は、式(IV)、(Ｖ)、(VI)もしくは(VII)の化合物、またはそれらのいずれかの薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物であってよい:
【化３】
2015117214.tif 000005
【００８８】
【化４】
2015117214.tif 000006
(式中、R1は、式(IV)においてＨ;Ｆ; Cl; Br; -NO2; CN;ＦもしくはClで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルキル;またはＦで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルコキシを表し、R1は、式(Ｖ)においてＨ;Ｆ;メチル、トリフルオロメチル、メトキシもしくはトリフルオロメトキシを表し、R1は、式(VI)および(VII)においてＨまたはC1〜C6アルキルを表し;
R2は、式(VII)においてＨまたはC1〜C6アルキルを表し;
R3は、式(IV)、(Ｖ)、(VI)および(VII)においてH;Ｆ; Cl; Br; -NO2; CN;ＦもしくはClで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルキル;またはFで場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルコキシを表し;
R4は、式(IV)、(Ｖ)、(VI)および(VII)においてカルボン酸基(-COOH)もしくはそのエステル、または-C(=O)NR6R7、-NR7C(=O)R6、-NR7C(=O)OR6、-NHC(=O)NR7R6もしくは-NHC(=S) NR7R6を表し(式中、
R6は、Ｈまたは式-(Alk)m-Qの基を表し(式中、
ｍは、０または１であり、
Alkは、場合によって置換されていてもよい２価の直鎖状もしくは分岐鎖状C1〜C12アルキレンもしくはC2〜C12アルケニレンもしくはC2〜C12アルキニレン基、または２価のC3〜C12炭素環式基(これらのいずれの基も、１以上の-Ｏ-、-Ｓ-または-N(R8)-結合(式中、R8は、ＨまたはC1〜C4アルキル、C3〜C4アルケニル、C3〜C4アルキニルもしくはC3〜C6シクロアルキルを表す)を含有してよい)であり、
Ｑは、H; -NR9R10 (式中、R9およびR10は独立して、Ｈ; C1〜C4アルキル; C3〜C4アルケニル; C3〜C4アルキニル; C3〜C6シクロアルキル; エステル基;場合によって置換されていてもよい炭素環式もしくは複素環式基を表すか、またはR9およびR10は、それらが結合する窒素と一緒になった場合に環を形成し、該環は、場合によって置換されていてもよい)を表す)、
R7は、ＨまたはC1〜C6アルキルを表すか、またはそれらが結合する１以上の原子と一緒になった場合に、R6およびR7は、場合によって置換されていてもよい、５、６もしくは７の環原子を有する単環式複素環式環を形成する)、
Ｘは、式(IV)、(Ｖ)、(VI)および(VII)において結合手または式-(Z)n-(Alk)-もしくは-(Alk)-(Q)n-(式中、Ｑは、-Ｏ-、-Ｓ-または-NH-を表し、Alkは、R6について定義されるとおりであり、ｎは、０または１である)を表し、
Ｙは、式(Ｖ)において-CH2-、-CH2CH2-または-CH2CH2CH2-であり、
Ｚは、式(IV)および(Ｖ)においてNまたはCRz (式中、Rzは、Ｈまたは場合によって置換されていてもよいC1〜C6アルキル、C3〜C7シクロアルキルもしくは場合によって置換されていてもよいフェニルである)を表し、
Arは、式(VI)および(VII)において場合によって置換されていてもよい、５〜10の環原子を有する単環式もしくは二環式の芳香族もしくは複素芳香族の基を表す)。
【００８９】
小分子は、構造(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)および(VII)のいずれか１つの任意の互変異性の形でもあり得る。
【００９０】
それが生じる文脈においてそうでないと明記しない限り、式(Ｉ)および(II)の任意の部分に用いられる用語「置換」は、以下の置換基の１以上で置換されることを意味し、すなわち、(C1〜C6)アルキル、トリフルオロメチル、(C1〜C6)アルコキシ(環が隣接環Ｃ原子上でメチレンジオキシまたはエチレンジオキシにより置換される特別な場合を含む)、トリフルオロメトキシ、(C1〜C6)アルキルチオ、フェニル、ベンジル、フェノキシ、(C3〜C8)シクロアルキル、-OH、-SH、-NH2、-Ｆ、-Cl、-Br、-CN、-NO2、オキソ(=O)、-COOH、-SO2OH、-CONH2、-SO2NH2、-CORA、-COORA、-SO2ORA、-NHCORA、-NHSO2RA、-CONHRA、-SO2NHRA、-NHRA、-NRARB、-CONRARBまたは-SO2NRARB (式中、RAおよびRBは、独立して、(C1〜C6)アルキル基である)。
【００９１】
それが生じる文脈においてそうでないと明記しない限り、式(IV)および(Ｖ)の任意の部分に用いられる用語「置換」は、例えば(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルケニル、(C2〜C6)アルキニル、フッ素置換(C1〜C6)アルキル、フッ素置換(C1〜C6)アルケニル、フッ素置換(C2〜C6)アルキニル、(C1〜C6)アルコキシおよびフッ素置換(C1〜C6)アルコキシ(環が隣接環Ｃ原子上でアルキレンジオキシ、例えばメチレンジオキシまたはエチレンジオキシにより置換される特別な場合を含む)、(C1〜C6)アルキルチオ、フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、-OH、-SH、-NH2、-Ｆ、-Cl、-Br、-CN、-NO2、オキソ(=Ｏ)、-COOH、-SO2OH、-CONH2、-SO2NH2、-CORA、-COORA、-SO2ORA、-NHCORA、-NHSO2RA、-CONHRA、-SO2NHRA、-NHRA、-NRARB、-CONRARBまたは-SO2NRARB (式中、RAおよびRBは、独立して、(C1〜C6)アルキルもしくは(C2〜C6)アルコキシ基、または５〜７員環の単環式炭素環式もしくは複素環式基であるか、あるいはRAおよびRBは、それらが結合する窒素と一緒になる場合に環を形成する)から選択される少なくとも１の置換基で置換されることを意味する。
【００９２】
それが生じる文脈においてそうでないと明記しない限り、構造(VI)および(VII)の任意の部分に用いられる用語「置換」は、例えば(C1〜C6)アルキル、トリフルオロメチル、(C1〜C6)アルコキシ(環が隣接環Ｃ原子上でアルキレンジオキシ、例えばメチレンジオキシまたはエチレンジオキシにより置換される特別な場合を含む)、トリフルオロメトキシ、(C1〜C6)アルキルチオ、フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、-OH、-SH、-NH2、-Ｆ、-Cl、-Br、-CN、-NO2、オキソ(=Ｏ)、-COOH、-SO2OH、-CONH2、-SO2NH2、-CORA、-COORA、-SO2ORA、-NHCORA、-NHSO2RA、-CONHRA、-SO2NHRA、-NHRA、-NRARB、-CONRARBまたは-SO2NRARB (式中、RAおよびRBは、独立して、(C1〜C6)アルキルもしくはC2〜C6アルコキシ基、または５〜７員環の単環式炭素環式もしくは複素環式基であるか、あるいはRAおよびRBは、それらが結合する窒素と一緒になる場合に環を形成する)から選択される少なくとも１の置換基で置換されることを意味する。
【００９３】
「置換」が(C3〜C8)シクロアルキル、フェニル、ベンジル、フェノキシまたはベンジルオキシにより置換されることを意味する場合、そのフェニル環は、それ自体、(C3〜C8)シクロアルキル、フェニル、ベンジル、フェノキシまたはベンジルオキシを除く上記のいずれかで置換されてよい。
【００９４】
本明細書で用いる場合、用語「アルキレン」は、２つの満たされていない原子価を有する直鎖状または分岐鎖状のアルキル鎖、例えば-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH(CH2CH3)CH2CH2CH3および-C(CH3)3のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「アルケニレン」は、２つの満たされていない原子価を有する直鎖状または分岐鎖状のアルケニル鎖、例えば-CH=CH-、-CH2CH=CH-、-C(CH3)=CH-および-CH(CH2CH3)CH=CHCH2-のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「アルキニレン」は、２つの満たされていない原子価を有する直鎖状または分岐鎖状のアルキニル鎖、例えば-C≡C-、-CH2C≡C-および-CH(CH2CH3)C≡CCH2-のことをいう。
【００９５】
本明細書で用いる場合、制限されていない用語「カルボシクリル」または「炭素環式」は、アリール、シクロアルキルおよびシクロアルケニルを含み、環原子が全て炭素の環系(単環式、二環式、三環式または橋かけ)のことをいう。
本明細書で用いる場合、制限されていない用語「シクロアルキル」は、環炭素間に単結合のみを含有する炭素環式環系のことをいう。
【００９６】
本明細書で用いる場合、制限されていない用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、「ヘテロアリール」を含み、特に、例えばピロリル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピリミジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、ベンゾフラニル、ピラニル、キヌクリジニル、アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタニル、ベンズイミダゾリル、メチレンジオキシフェニル、マレイミドおよびスクシンイミド基を含む、Ｓ、ＮおよびＯから選択される１以上のヘテロ原子を含有する、５〜８員環の芳香族または非芳香族複素環式環を意味する。
本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアリール」は、１以上のヘテロ原子を含有する５または６員の芳香環のことをいう。このような基の例示は、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニルである。
【００９７】
あるいくつかの実施形態では、本明細書に開示する治療剤、特にCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる治療剤は、抗体またはその断片もしくは誘導体、可溶性受容体およびアプタマーを含むか、それらから本質的になるかまたはそれらからなる群より選択できる。
本明細書で用いる場合、用語「抗体」は、その最も広い意味で用いられ、限定することなくキメラ、ヒト化、ヒト、組換え、トランスジェニック、グラフト化および単鎖抗体など、または興味対象の抗原と選択的に結合する１以上のドメインを含有するその任意の融合抗体、コンジュゲート、断片もしくは誘導体を含む、抗体全体のような任意の免疫学的結合剤のことを一般的にいう。用語「抗体」は、よって、免疫グロブリン分子全体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはこれらのいずれかの免疫学的に有効な断片を含む。この用語は、よって、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多価(例えば２、３またはそれより多い価数)および/または多重特異性抗体(例えば２重またはそれより多い特異性の抗体)、ならびに所望の生物学的活性(特に、興味対象の抗原と特異的に結合する能力)を示す限りは抗体断片、ならびにそのような断片の多価および/または多重特異性複合体を具体的に包含する。用語「抗体」は、免疫化を含む方法により作製される抗体のみを含むのでなく、興味対象の抗原上のエピトープと特異的に結合できる少なくとも１の相補性決定領域(CDR)を包含するように作製された任意のポリペプチド、例えば組換えにより発現されるポリペプチドも含む。よって、この用語は、それらがインビトロ、細胞培養またはインビボで生成されたかに関わらず、このような分子に対して用いられる。
【００９８】
用語「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体または従来の４鎖抗体に言及するために用いられるかに関わらず、完全サイズ抗体、その個別の鎖ならびにその全ての部分、ドメインまたは断片(それらに限定されないが、抗原結合ドメインまたは断片、例えばそれぞれVHHドメインもしくはVH/VLドメイン)を含む全般的な用語として用いる。さらに、用語「配列」は、本明細書で用いる場合(例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「VHH配列」または「タンパク質配列」のような用語における)、より限定された解釈を文脈が必要としない限り、関連するアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むと一般的に理解される。
【００９９】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合できる任意のポリペプチド決定因子を含む。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニルのような分子の化学活性表面基を含むことがあり、特定の３次元構造の特性および/または特定の電荷特性を有することがある。エピトープは、抗体と結合する抗原の領域である。抗体は、タンパク質および/または巨大分子の複合混合物において標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原と特異的に結合するという。
【０１００】
用語「結合領域」、「結合部位」または「相互作用部位」は、本明細書において、興味対象の抗原との結合を担う特定のアミノ酸残基の部位、部分、ドメインまたはひと続きの意味を有する。このような結合領域は、本明細書に記載する抗体の特定のアミノ酸残基から本質的になり、これらの残基は、標的分子と接触する。
【０１０１】
用語「特異性」は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質(例えば抗体)分子が結合できる異なる型の抗原または抗原決定基の数のことをいう。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および/または結合活性に基づいて決定できる。抗原結合タンパク質との抗原の解離についての平衡定数(KD)で表される親和性は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合の強さについての尺度であり、KDの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合の強さが強い(代わりに、親和性は、１/KDである親和性定数(KA)として表すこともできる)。当業者にとって明らかなように、親和性は、興味対象の具体的な抗原に応じて、それ自体知られる方法で決定できる。結合活性は、抗原結合分子(例えば抗体)と関係のある抗原との間の結合の強さの尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性と、抗原結合分子上に存在する関係する結合部位の数との両方に関係する。典型的に、抗原結合タンパク質(例えば抗体)は、10-5〜10-12モル/リットル(Ｍ)以下、好ましくは10-7〜10-12モル/リットル(Ｍ)以下、より好ましくは10-8〜10-12モル/リットルの解離定数(KD)で、かつ/または少なくとも107Ｍ-1、好ましくは少なくとも108Ｍ-1、より好ましくは少なくとも109Ｍ-1、例えば少なくとも1012Ｍ-1の会合定数(KA)で結合する。10-4Ｍより大きいいずれのKD値も、一般的に、非特異的結合を示すとみなされる。好ましくは、抗体は、500 nM未満、好ましくは200 nM未満、より好ましくは10 nM未満、例えば500 pM未満のKDで所望の抗原と結合する。抗原または抗原決定基との抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えばスキャッチャード分析ならびに/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)およびサンドイッチ競合アッセイならびに当該技術においてそれ自体知られるそれらの様々な変形を含むそれ自体知られる任意の適切な方法で決定できる。
【０１０２】
天然に存在するままの全長抗体は、ジスルフィド結合で相互連結された２つの重鎖(Ｈ)および２つの軽鎖(Ｌ)を含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、そこに含まれる相補性決定領域(CDR)により抗原認識を主に担う約100〜110アミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。
CDRには、フレームワーク領域(FR)とよばれるより保存された領域が散在している。各軽鎖可変領域(LCVR)および重鎖可変領域(HCVR)は、以下の順序: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのCDRおよび４つのFRで構成される。軽鎖の３つのCDRは、「LCDR1、LCDR2およびLCDR3」といい、重鎖の３つのCDRは、「HCDR1、HCDR2およびHCDR3」という。CDRは、抗原との特異的相互作用を形成する残基のほとんどを含有する。LCVRおよびHCVR領域内のCDRアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、公知のKabat番号付けの慣習に従い、これは、抗体の重鎖および軽鎖領域中の他のアミノ酸残基よりもさらに可変性である(すなわち超可変)アミノ酸残基の番号付けシステムのことをいう(Kabatら、Ann. NYAcad. Sci. 190:382〜93 (1971); Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH出版物第91-3242号(1991))。抗体の可変領域中のCDRの位置決めは、Kabat番号付けまたは単純に「Kabat」に従う。
【０１０３】
軽鎖は、カッパまたはラムダと分類され、当該技術において知られる特定の定常領域を特徴とする。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンと分類され、それぞれIgG、IgM、IgA、IgDまたはIgEとしての抗体のアイソタイプを規定する。IgG抗体は、サブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4にさらに分割できる。各重鎖の型は、当該技術において公知の配列を有する特定の定常領域を特徴とする。
あるいくつかの実施形態では、抗体は、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMクラスのいずれであってもよく、好ましくはIgGクラス抗体である。
【０１０４】
あるいくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、例えば抗血清またはそこから精製された(例えば親和性精製)免疫グロブリンであってよい。
他の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物であってよい。モノクローナル抗体は、より大きい選択性および再現性で特定の抗原または抗原内の特定のエピトープを標的にできる。
【０１０５】
本明細書で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」は、例えば任意の真核、原核またはファージクローンを含む単一コピーまたはクローンに由来する抗体のことをいい、それが生成される方法のことではない。モノクローナル抗体は、好ましくは、均一または実質的に均一な集団中に存在する。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、例えば組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えばCDRグラフト化もしくはそのような技術の組み合わせまたは当該技術において知られるその他の技術により生成できる。
【０１０６】
例えばそして限定することなく、モノクローナル抗体は、Kohlerら、1975 (Nature 256: 495)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製できるか、または組換えDNA法(例えばUS 4,816,567にあるような)により作製できる。モノクローナル抗体は、Clacksonら、1991 (Nature 352: 624〜628)およびMarksら、1991 (J Mol Biol 222: 581〜597)により記載されるような技術を用いるファージ抗体ライブラリーを用いて作製することもできる。
これらの後者の技術は、なかでもUS5837500、US5571698、US5223409、US7118879、US7208293およびUS7413537に記載されるファージディスプレイ技術に基づく。簡単に述べると、治療用候補分子、例えばヒト抗体断片(例えばFab)、ペプチドおよび小タンパク質は、バクテリオファージ(またはファージ)とよばれる小さい細菌性ウイルスの表面上に提示される。一連の提示された分子は、ライブラリーとして知られる。ファージディスプレイは、これらのライブラリーを検索して、興味対象の標的、例えば治療用標的と好ましくは高い特異性および/または親和性で結合する分子を同定することができる。ファージ抗体ライブラリーの非限定的な例は、HuCAL(登録商標)(ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー、Morphosys)、Ylanthia(登録商標)(Morphosys)、WO200070023に記載されるヒトFab断片ライブラリーおよびWO 1996040878に記載されるマカク抗体ライブラリーを含む。ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー(Morphosys)は、WO 199708320に記載されるようにして、ヒトゲノムにコードされる抗体の構造的レパートリーをカバーする合成コンセンサス配列を用いて調製されている。
【０１０７】
本発明における治療剤として用いるために適切なモノクローナル抗体の非限定的な例は、サルモノクローナル抗体7B6、16C10、7C10および20C9 (これらは、WO 1996040878に記載されるように、CD28ポリペプチドとのCD80および/またはCD86ポリペプチドの相互作用を阻害する); ECACCコレクションに第95060211号の下で寄託されている抗ヒトCD80モノクローナル抗体5B5D1、ECACCコレクションに第95060210号の下で寄託されている抗ヒトCD86モノクローナル抗体1G10H6D10、WO199401547に記載されるモノクローナル抗体B7-24 (これは、B7-1分子と特異的に結合するが、B7-2とは結合しない)を含む。
抗CD80抗体のさらなる例は、IDEC114 (Biogen Idec)およびガリキシマブ(Cancer and Leukemia Group B)を含む。
【０１０８】
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、抗体断片であってよい。
用語「抗体断片」または「抗原結合部分」は、全長抗体の一部分または領域、一般的にその抗原結合または可変ドメインを含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、sFv断片、単一ドメイン(sd)Fv、例えばVHドメイン、VLドメインおよびVHHドメイン、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、特に重鎖抗体;ならびに抗体断片から形成される多価および/または多重特異性抗体、例えばダイボディ(dibodies)、トリボディ(tribodies)およびマルチボディ(multibodies)を含む。上記の表示Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFvなどは、当該技術において確立された意味を有することを意図する。
【０１０９】
用語「抗原結合部分」または「抗原結合領域」は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片のことをいう。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により実行され得ることが示されている。これらは、２以上の異なる抗原と特異的に結合する二重特異性(bispecific)、二重特異性(dual specific)または多重特異性のフォーマットであってもよい。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、(i) Fab断片、すなわちVL、VH、CLおよびCHIドメインからなる一価断片; (ii) F(ab')2断片、すなわちヒンジ領域にてジスルフィド結合により連結された２つのFab断片を含む二価断片; (iii) VHおよびCHIドメインからなるFd断片; (iv)抗体の単一の腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v) dAb断片 (Wardら、Nature、341: 544〜546 (1989); PCTパンフレットWO 90/05144) (これは、単一可変ドメインを含む);ならびに(vi)単離相補性決定領域(CDR)を含む。さらに、Fv断片の２つのドメインであるVLおよびVHは別々の遺伝子によりコードされるが、これらは、VLおよびVH領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖となることを可能にする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合できる(単鎖Fv (scFv)として知られる(Birdら、Science、242: 423〜426 (1988);およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5879〜5883 (1988))。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」との用語に包含することを意図する。単鎖抗体のその他の形、例えばダイアボディも包含する。
【０１１０】
ダイアボディは、二価で二重特異性の抗体であり、VHおよびVLドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いており、よって、これらのドメインが、別の鎖の相補ドメインと強制的に対形成され、２つの抗原結合部位を創出する(Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci.、90: 6444〜6448 (1993); Poljakら、Structure 2: 1121〜1123 (1994))。このような抗体結合部分は、当該技術において知られている(KontermannおよびDubel編、Antibody Engineering (2001) Springer- Verlag. New York. 790頁(ISBN 3-540-41354-5))。
【０１１１】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１以上のその他のタンパク質またはペプチドとの共有的または非共有的会合により形成される、より大きい免疫接着分子の一部分であってよい。このような免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov, S.M.ら、Human Antibodies and Hybridomas、6: 93〜101 (1995))、ならびに二価のビオチン化scFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanovら、Mol. Immunol.、31: 1047〜1058 (1994))を含む。抗体部分、例えばFabおよびF(ab')2断片は、従来の技術、例えば抗体全体のそれぞれパパインもしくはペプシン消化を用いて、抗体全体から調製できる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、標準的な組換えDNA技術を用いて得ることができる。
【０１１２】
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、ナノボディ(Nanobody)(登録商標)であってよい。用語「ナノボディ(Nanobody)(登録商標)」および「ナノボディ(Nanobodies)(登録商標)」は、Ablynx NV (Belgium)の商標名である。用語「ナノボディ」は、当該技術において公知であり、本明細書で用いる場合、その最も広い意味において、(1)天然に存在する重鎖抗体、好ましくはラクダ科の動物に由来する重鎖抗体のVHHドメインを単離すること、(2)天然に存在するVHHドメインをコードするヌクレオチド配列の発現、(3)天然に存在するVHHドメインの「ヒト化」またはこのようなヒト化VHHドメインをコードする核酸の発現、(4)任意の動物種、特に哺乳動物種、例えばヒトからの天然に存在するVHドメインの「ラクダ化」、またはそのようなラクダ化VHドメインをコードする核酸の発現、(5)当該技術において記載される「ドメイン抗体」または「dAb」の「ラクダ化」、またはそのようなラクダ化dAbをコードする核酸の発現、(6)それ自体知られる、タンパク質、ポリペプチドまたはその他のアミノ酸配列を調製するための合成または半合成技術を用いること、(7)それ自体知られる核酸合成のための技術を用いてナノボディをコードする核酸を調製し、その後、そのようにして得られた核酸を発現させること、および/あるいは(8)上記の１以上の任意の組み合わせにより得られる免疫学的結合剤を包含する。「ラクダ科」は、本明細書で用いる場合、旧世界ラクダ科(カメラス・バクトリアヌス(Camelus bactrianus)およびカメラス・ドロマデリウス(Camelus dromaderius))および新世界ラクダ科(例えばラマ・パッコス(Lama paccos)、ラマ・グラマ(Lama glama)およびラマ・ビクナ(Lama vicugna))を含む。本発明において用いるために適切な例示的なナノボディは、WO2008071447パンフレットの371〜372頁の表B-1および372〜374頁の表B-2に記載されるB7-1および/またはB7-2に対して産生されたナノボディである。
【０１１３】
ナノボディのアミノ酸配列および構造は、それらに限定されないが、４つのフレームワーク領域または「FR」で構成されると考えることができ、これらは、当該技術および本明細書において、それぞれ「フレームワーク領域１」または「FR1」、「フレームワーク領域２」または「FR2」、「フレームワーク領域３」または「FR3」および「フレームワーク領域４」または「FR4」という。これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域または「CDR」で中断されており、これらは、当該技術において、それぞれ「相補性決定領域１」または「CDR1」、「相補性決定領域２」または「CDR2」および「相補性決定領域３」または「CDR3」という。ナノボディ中のアミノ酸残基の総数は、110〜120、好ましくは112〜115の範囲であり得る。しかし、ナノボディの部分、断片、類似体または誘導体は、このような部分、断片、類似体または誘導体が本明細書に概説するさらなる要件を満たし、好ましくは本明細書に記載する目的のために適切である限り、それらの長さおよび/またはサイズについて特に限定されないことに注意されたい。
【０１１４】
B7-1および/またはB7-2に対するナノボディについての好ましいCDR配列およびフレームワーク配列は、WO2008071447パンフレットの148および149頁の表A-1aに示されている。本発明において用いるために適切なナノボディは、前記表A-1aに列挙されるそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群、または前記表A-1aに列挙されるそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも１つと少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群、ならびに/あるいは前記表A-1aに列挙されるそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも１つから３、２または１だけのアミノ酸の違いを有するそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群から選択される、好ましくは前記表A-1aに列挙されるそれぞれCDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群から選択されるCDR1、CDR2およびCDR3配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは３つ全てを有してよい。好ましくは、本発明において用いるために適切なナノボディは、前記表A-1aに列挙されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を少なくとも有してよい。B7-1および/またはB7-2に対するナノボディについてのCDR配列の好ましい組み合わせ、フレームワーク配列の好ましい組み合わせ、およびフレームワークとCDR配列との好ましい組み合わせは、WO2008071447パンフレットの148および149頁の表A-1aに示されている。
【０１１５】
ナノボディのアミノ酸残基は、Kabatら(「Sequence of proteins of immunological interest"、US Public Health Services、NIH Bethesda、MD、公報第91号)により示されるVHドメインについての一般的な番号付けに従って番号付けされる。この番号付けに従って、ナノボディのFR1は、１〜30位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR1は、31〜35位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのFR2は、36〜49位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR2は、50〜65位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのFR3は、66〜94位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR3は、95〜102位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのFR4は、103〜113位のアミノ酸残基を含む。[この関係において、VHドメインおよびVHHドメインについての技術において公知であるように、それぞれのCDR中のアミノ酸残基の総数は変動することがあり、Kabat番号付けにより示されるアミノ酸残基の総数に相当しないことがあることに注意されたい(つまり、Kabat番号付けによる１以上の位置は、実際の配列において占められないことがあるか、または実際の配列が、Kabat番号付けにより許容される数よりも多くのアミノ酸残基を含有することがある)。このことは、一般的に、Kabatに従う番号付けが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに相当するかまたはしないことがあることを意味する。しかし、一般的に、Kabatの番号付けに従って、かつCDR中のアミノ酸残基の数に関わらず、Kabat番号付けに従う１位はFR1の開始に相当し、その逆もまた真であり、Kabat番号付けに従う36位はFR2の開始に相当し、その逆もまた真であり、Kabat番号付けに従う66位はFR3の開始に相当し、その逆もまた真であり、Kabat番号付けに従う103位はFR4の開始に相当し、その逆もまた真である。]。ラクダ科からのVHHドメインおよびナノボディに類似の方法で当てはめることができるVHドメインのアミノ酸残基の番号付けのための代替の方法は、Chothiaら(Nature 342、877〜883 (1989))により記載される方法、いわゆる「AbM定義」およびいわゆる「接触定義(contact definition)」である。しかし、本記載、特許請求の範囲および図面では、そうでないと記載しない限り、RiechmannおよびMuyldermansによりVHHドメインに対して当てはめられたKabatに従う番号付けに従う。
【０１１６】
ナノボディは、「ヒト化」されてよい。例えば、本発明において用いるために適切なヒト化ナノボディは、B7-1および/またはB7-2と結合でき、i) WO2008071447の371〜372頁の表B-1に列挙されるアミノ酸配列のうちの１つのヒト化バリアントであり、かつ/あるいはii)少なくとも１つの前記アミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し(アミノ酸同一性の程度を決定する目的のために、CDR配列を形成するアミノ酸残基は無視する)、iii)好ましくは、Kabat番号付けに従う11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位および108位のアミノ酸残基の１以上が、WO2008071447の259頁の表A-3で言及されるHallmark残基から選択される、ナノボディである。さらに、または代わりに、その他のおそらく有用なヒト化置換は、天然に存在するVHH配列のフレームワーク領域の配列を、１以上の密接に関連するヒトVH配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより確かめることができ、その後に、そのようにして決定された１以上の可能性のある有用なヒト化置換(またはそれらの組み合わせ)を前記VHH配列に導入し(それ自体知られる任意の方法で)、得られたヒト化VHH配列を、標的への親和性、安定性、発現の容易さおよびレベル、ならびに/またはその他の所望の特性について試験できる。このようにして、限定された程度の試行錯誤により、その他の適切なヒト化置換(またはそれらの適切な組み合わせ)を当業者が決定できる。また、上記に基づいて、ナノボディ(のフレームワーク領域)を部分的または完全にヒト化できる。
【０１１７】
重鎖抗体およびその可変ドメインについての一般的な記載のために、なかでも、以下の参考文献を参照する(これらは、一般的な背景技術として言及する): Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079およびWO 96/34103; UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231およびWO 02/48193; Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016およびWO 03/055527; Algonomics N.V.および出願人によるWO 03/050531; National Research Council of CanadaによるWO 01/90190; Institute of AntibodiesによるWO 03/025020 (= EP 1 433 793);ならびに出願人によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551および出願人によるさらなる公開された特許出願; Hamers-Castermanら、Nature 1993年６月３日; 363 (6428): 446〜8; Davies and Riechmann、FEBS Lett. 1994年２月21日; 339(3): 285〜90; Muyldermansら、Protein Eng. 1994年９月; 7(9): 1129〜3; DaviesおよびRiechmann, Biotechnology (NY) 1995年５月; 13(5): 475〜9; Gharoudiら、9th Forum of Applied Biotechnology、Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a 第Ｉ部: 2097〜2100; DaviesおよびRiechmann, Protein Eng. 1996年６月; 9(6): 531〜7; Desmyterら、Nat Struct Biol. 1996年９月; 3(9): 803〜11; Sheriffら、Nat Struct Biol. 1996年９月; 3(9): 733〜6; Spinelliら、Nat Struct Biol. 1996年９月; 3(9): 752〜7; Arbabi Ghahroudiら、FEBS Lett. 1997年９月15日; 414(3): 521〜6; Vuら、Mol Immunol. 1997年11〜12月; 34(16〜17): 1121〜31; Atarhouchら、Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177〜182; Nguyenら、J. Mol. Biol. 1998年１月23日; 275(3): 413〜8; Lauwereysら、EMBO J. 1998年７月１日; 17(13): 3512〜20; Frenkenら、Res Immunol. 1998年７〜８月; 149(6): 589〜99;
【０１１８】
Transueら、Proteins 1998年９月１日; 32(4): 515〜22; MuyldermansおよびLauwereys, J. Mol. Recognit. 1999年３〜４月; 12 (2): 131〜40; van der Lindenら、Biochim. Biophys. Acta 1999年４月12日; 1431(1): 37〜46.; Decanniereら、Structure Fold. Des. 1999年４月15日; 7(4): 361〜70; Ngyuenら、Mol. Immunol. 1999年６月; 36(8): 515〜24; Woolvenら、Immunogenetics 1999年10月; 50 (1〜2): 98〜101; RiechmannおよびMuyldermans、J. Immunol. Methods 1999年12月10日; 231 (1〜2): 25〜38; Spinelliら、Biochemistry 2000年２月15日; 39(6): 1217〜22; Frenkenら、J. Biotechnol. 2000年２月28日; 78(1): 11〜21; Nguyenら、EMBO J. 2000年３月１日; 19(5): 921〜30; van der Lindenら、J. Immunol. Methods 2000年６月23日; 240 (1〜2): 185〜95; Decanniereら、J. Mol. Biol. 2000年６月30日; 300 (1): 83〜91; van der Lindenら、J. Biotechnol. 2000年７月14日; 80(3): 261〜70; Harmsenら、Mol. Immunol. 2000年８月; 37(10): 579〜90; Perezら、Biochemistry 2001年１月９日; 40(1): 74〜83; Conrathら、J. Biol. Chem. 2001年３月９日; 276 (10): 7346〜50; Muyldermansら、Trends Biochem Sci. 2001年４月;26(4):230〜5; Muyldermans S.、J. Biotechnol. 2001年６月; 74 (4): 277〜302; Desmyterら、J. Biol. Chem. 2001年７月13日;276 (28): 26285〜90; Spinelliら、J. Mol. Biol. 2001年８月３日; 311 (1): 123〜9;
【０１１９】
Conrathら、Antimicrob Agents Chemother. 2001年10月; 45 (10): 2807〜12; Decanniereら、J. Mol. Biol. 2001年10月26日; 313(3): 473〜8; Nguyenら、Adv Immunol. 2001; 79: 261〜96; Muruganandamら、FASEB J. 2002年２月; 16 (2): 240〜2; Ewertら、Biochemistry 2002年３月19日; 41 (11): 3628〜36; Dumoulinら、Protein Sci. 2002年３月; 11 (3): 500〜15; Cortez-Retamozoら、Int. J. Cancer. 2002年３月20日; 98 (3): 456〜62; Suら、Mol. Biol. Evol. 2002年３月; 19 (3): 205〜15; van der Vaart JM.、Methods Mol Biol. 2002; 178: 359〜66; Vrankenら、Biochemistry 2002年７月９日; 41 (27): 8570〜9; Nguyenら、Immunogenetics 2002年４月; 54 (1): 39〜47; Renisioら、Proteins 2002年６月１日; 47 (4): 546〜55; Desmyterら、J. Biol. Chem. 2002年６月28日; 277 (26): 23645〜50; Ledeboerら、J. Dairy Sci. 2002年６月; 85 (6): 1376〜82; De Genstら、J. Biol. Chem. 2002年８月16日; 277 (33): 29897〜907; Ferratら、Biochem. J. 2002年９月１日; 366 (Pt 2): 415〜22; Thomassenら、Enzyme and Microbial Technol. 2002; 30: 273〜8; Harmsenら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002年12月; 60 (4): 449〜54; Joblingら、Nat Biotechnol. 2003年１月; 21 (1): 77〜80; Conrathら、Dev. Comp. Immunol. 2003年２月; 27 (2): 87〜103; Pleschbergerら、Bioconjug. Chem. 2003年３〜４月; 14 (2): 440〜8; Lahら、J. Biol. Chem. 2003年４月18日; 278 (16): 14101〜11; Nguyenら、Immunology. 2003年５月; 109 (1): 93〜101; Joostenら、Microb. Cell Fact. 2003年１月30日; 2 (1): 1; Liら、Proteins 2003年７月１日; 52 (1): 47〜50; Lorisら、Biol Chem. 2003年７月25日; 278 (30): 28252〜7;
【０１２０】
van Koningsbruggenら、J. Immunol. Methods. 2003年８月; 279 (1〜2): 149〜61; Dumoulinら、Nature. 2003年８月14日; 424 (6950): 783〜8; Bondら、J. Mol. Biol. 2003年９月19日; 332 (3): 643〜55; Yauら、J. Immunol. Methods. 2003年10月１日; 281 (1〜2): 161〜75; Dekkerら、J. Virol. 2003年11月; 77 (22): 12132〜9; Meddeb-Mouelhiら、Toxicon. 2003年12月; 42 (7): 785〜91; Verheesenら、Biochim. Biophys. Acta 2003年12月５日; 1624 (1〜3): 21〜8; Zhangら、J Mol Biol. 2004年１月２日; 335 (1): 49〜56; Stijlemansら、J Biol Chem. 2004年１月９日; 279 (2): 1256〜61; Cortez- Retamozoら、Cancer Res. 2004年８月15日; 64 (8): 2853〜7; Spinelliら、FEBS Lett. 2004年４月23日; 564 (1〜2): 35〜40; Pleschbergerら、Bioconjug. Chem. 2004年５〜６月; 15 (3): 664〜71; Nicaiseら、Protein Sci. 2004年７月; 13 (7): 1882〜91 ; Omidfarら、Tumour Biol. 2004年７〜８月; 25 (4): 179〜87; Omidfarら、Tumour Biol. 2004年９〜12月; 25(5〜6): 296〜305; Szynolら、Antimicrob Agents Chemother. 2004年９月;48(9):3390〜5; Saerensら、J. Biol. Chem. 2004年12月10日; 279 (50): 51965〜72; De Genstら、J. Biol. Chem. 2004年12月17日; 279 (51): 53593〜601; DoIkら、Appl. Environ. Microbiol. 2005年１月; 71(1): 442〜50; Joostenら、Appl Microbiol Biotechnol. 2005年１月; 66(4): 384〜92; Dumoulinら、J. Mol. Biol. 2005年２月25日; 346 (3): 773〜88; Yauら、J Immunol Methods. 2005年２月; 297 (1〜2): 213〜24; De Genstら、J. Biol. Chem. 2005年４月８日; 280 (14): 14114〜21; Huangら、Eur. J. Hum. Genet. 2005年４月13日; DoIkら、Proteins. 2005年５月15日; 59 (3): 555〜64; Bondら、J. Mol. Biol. 2005年５月６日;348(3):699〜709; Zarebskiら、J. Mol. Biol. 2005年４月21日。
【０１２１】
上記の参考文献において用いられる用語に従って、天然に存在する重鎖抗体に存在する可変ドメインは、従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン(これは、本明細書において「VHドメイン」という)および従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン(これは、本明細書において「VLドメイン」という)から区別するために、「VHHドメイン」ともよばれる。上記の従来技術において言及されるように、VHHドメインは、いくつかの独特な構造的特徴および機能的特性を有し、これらにより、単離VHHドメイン(および天然に存在するVHHドメインとこれらの構造的特徴および機能的特性が共通するそれに基づくナノボディ)およびこれを含有するタンパク質は、機能的抗原結合ドメインまたはタンパク質として用いるために非常に有利になる。特に、そしてそれらに限定することなく、VHHドメイン(軽鎖可変ドメインの存在なしで、かつ軽鎖可変ドメインといずれの相互作用をすることもなく、抗原と機能的に結合するように本来「設計」されている)およびナノボディは、単一の比較的小さい機能的抗原結合構造単位、ドメインまたはタンパク質として機能できる。このことにより、VHHドメインは、従来の４鎖抗体のVHおよびVLドメインから区別される(これらは、それら自体で、単一抗原結合タンパク質またはドメインとしての実際的な応用のために一般的に適切でないが、ある形または別のものと組み合わせて機能的抗原結合単位(例えば従来の抗体断片、例えばFab断片; VLドメインと共有結合したVHドメインからなるScFv断片におけるような)をもたらす必要がある)。
【０１２２】
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、ドメイン抗体(dAb)であってよい。用語「dAb」について、例えばWardら(Nature 1989年10月12日; 341 (6242): 544〜6)、Holtら、Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484〜490;ならびにDomantis LtdのWO 06/030220、WO 06/003388およびその他の公開された特許出願が参照される。哺乳動物起源でないので本発明の関係において必ずではないが好ましさがより少ない可能性があるが、単一ドメイン抗体または単一可変ドメインは、ある種のサメから導くことができる(例えばいわゆる「IgNARドメイン」、例えばWO 05/18629を参照されたい)ことにも注意すべきである。本発明において用いるために適切な例示的なdAbは、US 13/021,127に記載されるdAb、特に、D70Cを含むドメイン抗体1 h-239-891 (D70C)と同じエピトープと結合するドメイン抗体、より具体的には、第１抗原に対する結合特異性を有する第１単一可変ドメインと、第２抗原に対する結合活性を有する第２単一可変ドメインとを含むdAb(ここで、第１抗原は、CD28であり、第２抗原は、CD28以外の抗原であり、dAbは、US 13/021,127公報の請求項７に記載されている)を含む。
【０１２３】
さらなる実施形態では、抗体または抗体断片は、少なくとも２(例えば２、３、など)の結合部位を含む(それぞれは、異なる抗原または抗原決定基を指向する)多重特異性(例えば二重特異性、三重特異性などの抗体)であってよい。本発明において治療剤として用いるために適切な例示的な多重特異性抗体断片は、WO 1998003670に記載されるCD40とCD80およびCD86の両方と結合できる三重特異性ダイアボディ、ヒトCD40およびヒトCD86と結合できる二重特異性ダイアボディ、ならびにCD40、CD80およびCD86と結合できる三重特異性トリアボディを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、治療剤は、二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD-Ig(商標))であってよい。
【０１２５】
抗体との用語は、任意の動物種、好ましくは例えば鳥類および哺乳動物を含む脊椎動物種を起源とするかまたはそれに由来する１以上の部分を含む抗体を含む。限定することなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラまたはキジであってよい。これもまた限定することなく、抗体は、ヒト、ネズミ(例えばマウス、ラットなど)、ブタ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、サル(例えばカニクイザル)、ラクダ重鎖抗体も含むラクダ(例えばカメラス・バクトリアヌスおよびカメラス・ドロマデリウス)、リャマ重鎖抗体も含むリャマ(例えばラマ・パッコス、ラマ・グラマまたはラマ・ビクナ)、またはウマであってよい。
【０１２６】
抗体との用語は、本明細書で用いる場合、少なくとも２の動物種を起源とする「キメラ抗体」も包含する。より具体的には、用語「キメラ抗体(antibody)」または「キメラ抗体(antibodies)」は、ある種からの重鎖および軽鎖の可変領域配列と、別の種からの定常領域配列とを含む抗体、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウマまたはネコ定常領域と連結されたマウス重鎖および軽鎖の可変領域を有する抗体のことをいう。キメラ抗体は、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体からの対応する配列と同一または相同である重鎖および/または軽鎖の一部分を含むが、鎖の残りは、別の種から、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびに所望の生物学的活性を示すそのような抗体の断片における対応する配列と同一または相同である(例えば米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851〜6855 (1984)を参照されたい)。キメラ抗体は、ある種、例えばマウスまたはサルからのモノクローナル抗体のある部分、例えばFv領域をコードするDNAを、別の種、例えばヒトからの抗体生成DNAと併合することにより作製される。
【０１２７】
本発明において治療剤として用いるために適切なキメラ抗体の非限定的な例は、WO 1996040878に記載される、ヒトCD80および/またはCD86に特異的なサルモノクローナル抗体、特に16C10、7C10、20C9および7B6に由来する霊長類化抗体を含み、これらは、7C10サルモノクローナル抗体に由来する霊長類化抗体(この霊長類化抗体は、WO 1996040878の図8aおよび8bに示すアミノ酸配列を有する); 7B6サルモノクローナル抗体に由来する霊長類化抗体(この霊長類化抗体は、WO 1996040878の図9aおよび9bに示すアミノ酸配列を有する);および16C10サルモノクローナル抗体に由来する霊長類化抗体(この霊長類化抗体は、WO 1996040878の図4aおよび4bに示すアミノ酸配列を有する)を含む。これらの霊長類化抗体は、サル抗体の可変重鎖および軽鎖ドメインと、ヒト定常ドメインとを含む。
【０１２８】
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、「完全ヒト抗体」であってよい。本明細書で用いる場合、用語「完全ヒト抗体」は、コードする遺伝子情報がヒト起源である抗体のことをいう。したがって、用語「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にのみ由来する可変および定常領域を有する抗体のことをいう。用語「完全ヒト抗体」は、よって、他の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフト化された抗体を含まない。完全ヒト抗体は、上記のようなファージヒト抗体ライブラリーに由来するか、またはこれらは、LonbergおよびHusznar、1995 (Int. Rev. Immunol. 13 (1): 65〜93)に記載されるように、マウス免疫グロブリンコード領域を置き換えるように工学的に改変されたトランスジェニックマウスの免疫化により得ることができる。ファージディスプレイを用いて作製された完全ヒト抗体は、ヒト糖鎖パターンを有する抗体をもたらすヒト株化細胞での組換え発現により生成されることが好ましい。完全ヒト抗体の非限定的な例は、HuCAL(登録商標)抗体(Morphosys)である。HuCAL(登録商標)抗体を構築するための遺伝子情報をHuCAL(登録商標)抗体ライブラリー(Morphosys)から抽出して、ベクターの形でヒトPER.C6(登録商標)細胞に導入する(すなわちトランスフェクション)。トランスフェクションされた細胞は、遺伝子情報をタンパク質に翻訳する。タンパク質は糖鎖付加によりさらに改変され、得られた抗体分子は、細胞により培養培地中に最終的に分泌される。
【０１２９】
抗体との用語は、本明細書で用いる場合、非ヒト種に由来し、ヒトにおいて自然に生成される抗体との類似性が増加するようにそのタンパク質配列が改変されている抗体である「ヒト化抗体」も包含する。より具体的には、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例えばマウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VHおよび/またはVL配列の少なくとも一部分がより「ヒト様」になるように、すなわちヒト生殖系列可変配列により類似するように変更されている抗体のことをいう。ある型のヒト化抗体は、CDRグラフト化抗体であり、ここでは、非ヒトCDR配列がヒトVHおよびVL配列に導入されて、対応するヒトCDR配列を置き換えている。
【０１３０】
ヒト化抗体は、興味対象の抗原と免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク(FR)領域と、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域(CDR)とを含む抗体またはそのバリアント、誘導体、類似体もしくは断片である。ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのもの(すなわちドナー抗体)に相当し、全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、実質的に全て、または少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)を含む。ヒト化抗体は、少なくとも免疫グロブリン定常領域(Fc)の一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。ヒト化抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有することがある。抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3およびCH4領域も含み得る。代わりに、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖だけ、またはヒト化重鎖だけを含有することがある。例示的なヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインと、重鎖のヒト化可変ドメインとを含有する。
【０１３１】
また、例えば、ヒト化抗体は、ラクダ科、特にリャマ(例えばラマ・パッコス、ラマ・グラマまたはラマ・ビクナ)からの従来の抗体(すなわちジスルフィド結合で相互連結された２つの重鎖(Ｈ)および２つの軽鎖(Ｌ)を含む免疫グロブリン分子)に由来することがあり、その可変ドメインは、ヒト抗体の可変ドメインと高い程度のアミノ酸配列同一性を示す。このようなヒト化抗体の生成のための適切なプラットフォームは、WO 2011080350に記載されるSIMPLE Antibody (商標)プラットフォーム(ArGEN-X)である。したがって、ヒト化抗体は、ラクダ科VHドメインと、ラムダ軽鎖クラス(Vλ)またはカッパ軽鎖クラス(Vκ)のいずれかのラクダ科VLドメインとを含むことがあり、少なくとも１つのアミノ酸置換が前記VHドメインおよび/または前記VLドメインに存在することを特徴とし、前記アミノ酸置換は、以下から選択される:
(a)前記ラクダ科VHドメインにおけるアミノ酸置換であって、Kabatに従う、ラクダ科VHドメインのH1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94およびH108からなる群より選択される１以上の位置のアミノ酸が、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置で見出されるアミノ酸で置き換えられる、および
(b)前記ラクダ科VLドメインにおけるアミノ酸置換であって、ラムダ軽鎖クラス(Vλ)のラクダ科VLドメインについて、Kabatに従う、ラクダ科VλドメインのL1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84およびL103からなる群より選択される１以上の位置のアミノ酸が、ヒトVλドメイン配列中の対応する位置で見出されるアミノ酸で置き換えられ、カッパ軽鎖クラス(Vκ)のラクダ科VLドメインについて、Kabatに従う、ラクダ科VκドメインのK1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104およびK106からなる群より選択される１以上の位置のアミノ酸が、ヒトVκドメイン配列中の対応する位置で見出されるアミノ酸で置き換えられる。特に、ヒトVH3、VH1またはVH4に向かうヒト化について、WO 2011080350パンフレットの35頁の表４に記載されるそれぞれのアミノ酸の置き換えの１以上を行うことができ、ヒトVκ1、Vκ2、Vκ4、Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ5またはVλ6に向かうヒト化について、WO 2011080350パンフレットの38〜41頁の表５に記載されるそれぞれのアミノ酸の置き換えを行うことができる。このような抗体中のCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、場合によってCH4ドメインおよびCLドメインの１以上または任意の組み合わせは、そのアミノ酸配列に関して完全にまたは実質的にヒトであってよい。
【０１３２】
あるいくつかの実施形態では、治療剤は、イントラボディであってよい。用語「イントラボディ」は、細胞内抗体または抗体断片のことを一般的にいう。抗体、特に単鎖可変抗体断片(scFv)は、細胞内局在化のために改変できる。このような改変は、例えば、安定な細胞内タンパク質、例えばマルトース結合タンパク質との融合、または細胞内通行/局在化ペプチド配列、例えば小胞体保留もしくは回収シグナル配列KDELの付加を必然的に伴うことがある。
【０１３３】
当業者は、抗体が、１以上のアミノ酸欠失、付加および/または置換(例えば保存的置換)を(そのような変更がそれぞれの抗原の結合を保存する限り)含み得ることを理解している。例えば、米国特許第8,323,962号に記載されるように、変異を抗体に、特にFc領域に導入して、免疫原性について妥協することなくインビボ半減期を延長できる。
【０１３４】
抗体は、構成アミノ酸残基の１以上の天然または人工的な改変(例えばグリコシル化など)を含んでもよい。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を生成する方法は、組換え抗体またはその断片を生成する方法と同様に、当該技術において公知である(例えばHarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; HarlowおよびLane、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbour Laboratory, New York、1999、ISBN 0879695447;「Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques」、Zola編、CRC Press 1987、ISBN 0849364760;「Monoclonal Antibodies: A Practical Approach」、DeanおよびShepherd編、Oxford University Press 2000、ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology、第248巻:「Antibody Engineering: Methods and Protocols」、Lo編、Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照されたい)。
【０１３５】
場合によって提示担体と融合または共有的もしくは非共有的に連結、結合もしくは吸着した免疫化抗原(例えば本明細書に開示するCD80またはCD86ポリペプチド)を用いて、動物、例えば非ヒト動物、例えば実験動物または家畜を免疫化する方法、ならびに免疫血清からの抗体または細胞試剤の調製は、それ自体公知であり、本明細書の他の所で言及する文献に記載されている。免疫される動物は、任意の動物種、好ましくは温血種、より好ましくは例えば鳥類および哺乳動物を含む脊椎動物種を含み得る。限定することなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラまたはキジであってよい。これもまた限定することなく、抗体は、ヒト、ネズミ(例えばマウス、ラットなど)、ブタ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ、リャマまたはウマであってよい。用語「提示担体」または「担体」は、第２分子と結合した場合に、第２分子への免疫応答を、通常、さらなるＴ細胞エピトープをもたらすことにより増強する免疫原性分子のことを一般的にいう。提示担体は、(ポリ)ペプチド構造または非ペプチド構造、なかでもグリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模倣物、合成ポリマーなどであってよい。例示的で非限定的な担体は、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、多重C3dドメイン、破傷風毒素断片Ｃまたは酵母Ty粒子を含む。免疫化の後に、当該技術において公知の技術を用いて、動物からの抗体産生細胞を単離し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を作製するために用いてよい。
【０１３６】
組換え抗体またはその断片を生成する方法は、宿主生物または細胞を必要とする。用語「宿主細胞」および「宿主生物」は、原核生物、例えば細菌と、真核生物、例えば酵母、真菌、原生動物、植物および動物をともに含む細胞または生物に適切に言及し得る。抗体の生成のための宿主生物または細胞として、なかでも、単細胞生物、例えば細菌(例えば大腸菌(E. coli))および(培養)動物細胞(例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞)が企図される。細菌において抗体を生成することの利点は、なかでも、細菌細胞の取り扱いが比較的安全で単純であり、微生物の複製サイクルが迅速であることである。細菌は、単純な構造を有する抗体断片の生成のために特に適切である。原核細胞における全長免疫グロブリンまたはより複雑な抗体断片の生成のために、細菌細胞を、全長免疫グロブリンについてWO 2009021548に記載されるように少なくとも２つの核酸(それぞれが、抗体断片または免疫グロブリンの異なる部分、例えば重鎖または軽鎖をコードする)で形質転換してよい。細菌細胞では、抗体をコードする遺伝子情報が読み取られ、タンパク質に翻訳される。得られる抗体は、細胞膜周辺腔に蓄積され、細菌細胞の溶解により採集できる。さらなる分離ステップを行って抗体を精製してよい。WO 2009021548は、大腸菌ベースの分泌系について記載しており、ここでは、細菌は、抗体をコードする構築物中にシグナル配列を導入することにより、周囲の培養培地に抗体を放出する。このことにより、細胞培養培地から抗体を簡単かつ簡便に精製できる。抗体の生成のために用いることができる例示的な哺乳動物株化細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である。抗体の生成のために適切な例示的なヒト株化細胞は、ECACに第96022940号の下で寄託され、WO 2000063403に記載されるPER.C6(登録商標)株化細胞またはその誘導体を含む。ヒト株化細胞は、ヒト糖鎖付加パターンを有する抗体を生成するので、完全ヒト抗体の生成のために特に適切である。
【０１３７】
そうでないと記載しない限り、詳細に具体的に記載していない全ての方法、ステップ、技術および操作は、当業者に明らかなように、それ自体知られる方法で行うことができ、行われている。例えば、ここでもまた、標準的な参考書ならびに本明細書で言及する一般的な背景技術およびそこに引用されるさらなる参考文献が参照される。
【０１３８】
あるいくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、ナノボディまたはそれらの混合物であってよい。
【０１３９】
用語「可溶性受容体」は、細胞表面分子、例えば細胞表面受容体の可溶形(すなわち循環している、細胞と結合していない)、またはその断片もしくは誘導体のことを一般的にいう。例えば、細胞表面分子は、可溶性融合パートナー、例えば免疫グロブリン(Ig)部分またはその一部分を細胞外ドメインと結合させることにより、またはその膜貫通ドメインを除去することにより可溶性にできる。
本発明で特に意図するものは「可溶性CTLA-4分子」であり、これは、細胞表面非結合(すなわち循環している)CTLA-4分子、または、CD80および/もしくはCD86と結合するCTLA-4分子の任意の機能的断片のことをいい、CTLA4Ig融合タンパク質(例えばATCCアクセッション番号 68629で寄託されているDNAによりコードされる)(ここで、CTLA-4の細胞外ドメインは、免疫グロブリン(Ig)部分、例えばIgCガンマ1、IgCガンマ2、IgCガンマ3、IgCガンマ4、IgCミュー、IgCアルファ1、IgCアルファ2、IgCデルタもしくはIgCイプシロンまたはそれらの断片および誘導体と融合している);生物学的に活性または化学的に活性なタンパク質の一部分、例えばパピローマウイルスE7遺伝子生成物(CTLA4-E7)、メラノーマ関連抗原p97(CTLA4-p97)またはHIV envタンパク質(CTLA4-env gpl20) (米国特許第5,844,095号に記載されるように)と融合または連結されたCTLA-4の細胞外ドメインを有するタンパク質またはそれらの断片および誘導体;ハイブリッド(キメラ)融合タンパク質、例えばCD28/CTLA4Ig(米国特許第5,434,131号に記載されるように)またはその断片および誘導体;膜貫通ドメインが除去されたCTLA-4分子(Oaks, M. K.ら、2000. Cellular Immunology 201:144〜153)またはその断片および誘導体を含むが、それらに限定されない。CTLA4Ig分子の例は、なかでも、WO2005/016266に記載されている。「可溶性CTLA-4分子」は、その断片、部分または誘導体およびCTLA-4結合活性を有する可溶性CTLA-4変異分子(例えばL104EA29YIg)も含む。「L104EA29YIg」は、Igテイルと連結された、A29Y (チロシンアミノ酸残基が29位のアラニンを置換する)およびL104E (グルタミン酸アミノ酸残基が+104位のロイシンを置換する)のアミノ酸変更を有する野生型CTLA4の細胞外ドメインを含む可溶性CTLA4変異分子またはB7分子と結合するその一部分である融合タンパク質である(L104EA29YIgをコードするDNAは、2000年６月20日にATCC番号PTA-2104で寄託された)。
【０１４０】
可溶性CTLA-4分子の具体的な例は、CTLA-4の細胞外ドメインと融合した免疫グロブリンIgG1のFc領域で構成される分子、例えばアバセプト(Abacept)(Orencia(登録商標)として販売、Bristol Myers Squibb)、ベラタセプト(Belatacept)(Nulojix(登録商標)として販売、Bristol Myers Squibb)およびXPro9523 (Xencor)を含む。
例えば、Tanら(2005. Blood 106:2936〜2943)に記載されるCTLA4-KDEL融合タンパク質は、小胞体保留または回収シグナル配列KDELと融合したCTLA-4の細胞外ドメインを含む。CTLA4-KDEL融合タンパク質は、ERにおいて新しく合成されたCD80/86分子と結合し、それらが細胞表面に到達することを妨げる。
【０１４１】
あるいくつかの実施形態では、可溶性受容体は、可溶性CTLA4分子、好ましくはCTLA4Ig融合タンパク質であってよい。
【０１４２】
用語「アプタマー」は、１本鎖もしくは２本鎖のオリゴDNA、オリゴRNAもしくはオリゴDNA/RNA、または標的分子と特異的に結合できるそれらの任意の類似体のことをいう。有利には、アプタマーは、それらの標的に対してかなり高い特異性および親和性(例えば1×109Ｍ-1程度のKA)を示すことができる。アプタマー生成は、なかでも、US 5,270,163; EllingtonおよびSzostak 1990 (Nature 346: 818〜822); TuerkおよびGold 1990 (Science 249: 505〜510);または「The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications」、Klussmann編、Wiley-VCH 2006、ISBN 3527310592(参照により本明細書に組み込まれている)に記載されている。この用語は、フォトアプタマー、すなわち標的分子と共有結合または架橋できる１以上の光反応性官能基を含有するアプタマーも包含する。
【０１４３】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書に開示する治療剤は、イントラボディまたはその断片もしくは誘導体、アンチセンス剤、およびRNA干渉(RNAi)剤を含むか、それらから本質的になるかまたはそれらからなる群より選択できる。CD80もしくはCD86プレmRNAまたはmRNA配列中の配列領域と結合できる(アニールできる)アンチセンス剤が特に意図できる。CD80またはCD86 mRNAを標的にするように構成されたこのようなRNAi剤が特に意図できる。
いくつかの実施形態では、治療剤は、CD80および/またはCD86ポリペプチドを指向するイントラボディであって、これらの分子と細胞内で結合して、これらの分子が細胞表面に到達することを妨げることができるイントラボディであってよい。
【０１４４】
用語「アンチセンス」は、標的核酸、例えば標的DNA、hnRNA、プレmRNAまたはmRNA中の所定の配列と特異的にアニール(ハイブリダイズ)するように構成された剤(例えばオリゴヌクレオチド)のことを一般的にいい、前記標的核酸配列と相補的または実質的に相補的な核酸配列を典型的に含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。本発明において用いるために適切なアンチセンス剤は、それぞれの標的核酸配列と高いストリンジェンシー条件にてアニール(ハイブリダイズ)でき、生理的条件下で標的と特異的にハイブリダイズできる。
【０１４５】
核酸に関する用語「相補的」または「相補性」は、本明細書で用いる場合、許容塩(イオン強度)および温度条件下での、塩基対形成、好ましくはワトソン-クリック塩基対形成による１本鎖核酸同士の通常の結合のことをいう。例えば、相補的ワトソン-クリック塩基対形成は、ＡとＴ、ＡとＵまたはＧとＣの間で生じる。例えば、配列５'-Ａ-Ｇ-Ｕ-３'は、配列５'-Ａ-Ｃ-Ｕ-３'と相補的である。
【０１４６】
用語「結合する(bind)」または「結合する(binding)」は、本明細書で用いる場合、好ましくは、特異的結合、すなわちある剤が１以上の興味対象の標的、例えば１以上のプレmRNA分子またはその断片もしくはバリアントと、無作為または無関係のその他の分子を実質的に排除して、かつ場合によって構造的に関連するその他の分子を実質的に排除して結合(アニール)する場合のことをいう。ある剤と標的との結合は、なかでも、従来の相互作用を調べるための方法、例えばインシリコ配列分析または核酸ハイブリダイゼーション実験を用いて、例えば特異的ハイブリダイゼーションを例えば高ストリンジェンシー条件の下で確認して、評価できる。
【０１４７】
特異的結合は、ある剤がその意図する標的と排他的に結合することを必ずしも要求しない。例えば、ある剤は、意図する標的についての結合条件下での親和性が非標的分子についての親和性よりも少なくとも約２倍大きく、好ましくは少なくとも約５倍大きく、より好ましくは少なくとも約10倍大きく、さらにより好ましくは少なくとも約25倍大きく、さらにより好ましくは少なくとも約50倍大きく、さらにより好ましくは少なくとも約100倍または少なくとも約1000倍以上大きいならば、所定の興味対象のプレmRNAまたはその断片もしくはバリアントと特異的に結合するということができる。
【０１４８】
アンチセンス剤の配列は、標的配列と特異的に結合またはハイブリダイズするために、標的の配列と100%相補的である必要はない。標的核酸分子とのアンチセンス剤の結合が意図する結果(例えば利用性の喪失)を達成するように標的核酸配列の通常の機能に干渉し、かつ特異的結合が所望される条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置の場合に生理的条件下、およびインビトロアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で非標的配列とのアンチセンス剤の非特異的結合が回避されるように十分な程度の相補性がある場合に、アンチセンス剤は特異的にハイブリダイズ可能であるということができる。よって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定した特異的な結合がアンチセンス剤と核酸標的との間で生じるような十分な程度の相補性または精密な対形成を示すことがある。
【０１４９】
好ましくは、無関係の分子を超えて所望の標的に対するアンチセンス剤の特異性を確実にするために、前記アンチセンス剤の配列は、それぞれの標的配列と少なくとも約80%相補的、好ましくは少なくとも約90%相補的、より好ましくは少なくとも約95%相補的、例えば約96%、約97%、約98%、約99%および100%まで相補的であってよい。
本明細書で意図するアンチセンス剤は、好ましくは、アンチセンス分子、例えばより好ましくはアンチセンス核酸分子またはアンチセンス核酸類似体分子を含むかまたは示す。好ましくは、アンチセンス剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体のことをいうことがある。
【０１５０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、本明細書で定義する核酸(核酸類似体および模倣物を含む)オリゴマーまたはポリマーのことをいう。好ましくは、オリゴヌクレオチド、例えば具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、(実質的に)１本鎖である。本明細書で意図するオリゴヌクレオチドは、好ましくは約10と約100との間のヌクレオシド単位(すなわちヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体)の長さ、好ましくは約15と約50との間、より好ましくは約20と約40との間、これもまた好ましくは約20と約30との間であってよい。好ましくは、本明細書で意図するオリゴヌクレオチドは、１以上もしくは全ての天然に存在しない複素環塩基および/または１以上もしくは全ての天然に存在しない糖基および/または１以上もしくは全ての天然に存在しないヌクレオシド間連結を含んでよく、これらを含むことにより特性が改善でき、例えば細胞取り込みの増進、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加およびハイブリダイゼーション親和性の増加、ミスマッチに対する耐容性の増加などができる。さらに、本明細書で意図するオリゴヌクレオチドは、既知の技術に従って(例えば米国特許第5,149,797号を参照されたい)、RNアーゼＨを活性化しないように構成することができる。
【０１５１】
本明細書で教示するオリゴヌクレオチドのようなアンチセンス剤は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増進する１以上の部分またはコンジュゲートとさらにコンジュゲートできる(例えば共有的または非共有的、直接または適切なリンカーを介して)。このような部分は、それらに限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-Ｓ-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１,２-ジ-Ｏ-ヘキサデシル-rac-グリセロ-３-Ｈ-ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分を含む。
【０１５２】
ある剤の全ての位置が均一に改変されることは必要でなく、実際に、上記の改変の１より多くを、単一の剤またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにさえ組み込むことができる。キメラ化合物であるアンチセンス化合物がさらに含まれる。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、２以上の化学的に異なる領域(それぞれは少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドでできている)を含有するアンチセンス分子、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの領域を典型的に含有し、ここで、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および標的核酸のための結合親和性を増加するためのさらなる領域を授けるように改変される。
【０１５３】
RNAi (RNA干渉)剤は、アニールされた相補的鎖の２本鎖部分または領域(任意かつ潜在的に好ましい１本鎖突出の存在にもかかわらず)を典型的に含むか、それから本質的になるかまたはそれからなり、アニールされた相補鎖のうちの一方(センス鎖)は、下方制御される標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列(すなわちmRNAの少なくとも一部分)に相当する配列を有する。RNAi剤の他方の鎖(アンチセンス鎖)は、前記標的ヌクレオチド配列と相補的である。
RNAi剤の配列、例えばより具体的にはそのセンス鎖の配列は、下方制御される標的配列と完全に同一である必要はないが、標的配列とRNAi剤のヌクレオチド配列との間のミスマッチの数は、好ましくは、５塩基あたり１以下、または10塩基あたり１以下、または20塩基あたり１以下、または50塩基あたり１以下である。
【０１５４】
好ましくは、無関係の分子を超えて所望の標的に対するRNAi剤の特異性を確実にするために、前記RNAi剤の配列、例えばより具体的にはそのセンス鎖の配列は、それぞれの標的配列と少なくとも約80%同一、好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、例えば約96%、約97%、約98%、約99%および100%まで同一であってよい。
【０１５５】
RNAi剤は、別々のセンスおよびアンチセンス鎖で形成されてよいか、または代わりに、RNAi剤の２つのアニールされた鎖が共有的に連結される折り返しステム-ループまたはヘアピン設計をもたらす共通の鎖で形成されてよい。
【０１５６】
siRNA分子は、別々の実質的に相補的な鎖の２本鎖分子として典型的に生成、例えば合成されることがあり、ここで、各鎖は、約18〜約35塩基長、好ましくは約19〜約30塩基、より好ましくは約20〜約25塩基、さらにより好ましくは約21〜約23塩基である。
shRNAは、ヘアピン構造の形である。shRNAは、外因的に合成できるか、またはRNAポリメラーゼIIIプロモーターからインビボで転写することにより形成できる。好ましくは、shRNAは、宿主細胞または生物において工学的に改変して、所望の遺伝子の連続的で安定的な抑制を確実にできる。siRNAは、細胞においてヘアピンRNAをプロセシングすることにより生成できることが知られている。
本明細書で意図するRNAi剤は、それらの治療特性を改善するために、核酸およびオリゴヌクレオチドについて本明細書に記載する任意の改変を含むことができる。
【０１５７】
実施形態では、RNAi分子の少なくとも１つの鎖は、約１〜約６塩基長、例えば２〜４塩基、より好ましくは１〜３塩基の３'突出を有してよい。例えば、一方の鎖は３'突出を有してよく、他方の鎖は、平滑末端であってよいか、または３'突出を有してもよい。突出の長さは、各鎖で同じまたは異なってよい。３'突出は、分解に対して安定化できる。例えば、RNAは、プリンヌクレオチド、例えばＡまたはＧヌクレオチドを含めることにより安定化できる。代わりに、改変類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えばＵの３'突出を２'-デオキシチミジンで置換することは、耐容性があり、RNAiの効率に影響しない。
【０１５８】
例示的であるが非限定的なsiRNA分子は、以下の基準の任意の１以上、好ましくは全てを特徴とすることができる:
- 少なくとも約80%の配列同一性、例えばより具体的にはsiRNA分子のセンス鎖の標的mRNAに対する配列同一性、より好ましくは標的mRNAに対して少なくとも約90%または少なくとも約95%または少なくとも約97%の配列同一性;
- 成熟mRNA中に存在する標的遺伝子のある領域を標的にする配列を有する(例えばエキソンまたは代わりにスプライスされるイントロン);
- 標的遺伝子の３'端を標的にする嗜好性を示す。
【０１５９】
例示的なsiRNAは、以下の基準の１以上または全てをさらに特徴とすることができる:
- 16〜30塩基、好ましくは18〜23塩基、好ましくは19ヌクレオチドの２本鎖核酸の長さを有する;
- 約30と約50%の間のGC含量を有する;
- ３'端にTT(T)配列を有する; 
- ２本鎖の形をとるときに２次構造を示さない;
- 20℃未満のTm (融解温度)を有する;
- ヌクレオチドの配列中に、以下に示すヌクレオチドを有する(ここで、「ｈ」はＡ、Ｃ、Ｔ/ＵであるがＧではなく、「ｄ」はＡ、Ｇ、Ｔ/ＵであるがＣではなく、「ｗ」はＡまたはＴ/ＵであるがＧまたはＣではない):
【表１】
2015117214.tif 000007
【０１６０】
本明細書で意図するRNAi剤は、RNAi核酸分子またはRNAi核酸類似体分子、例えば好ましくは小型干渉核酸および小型干渉核酸類似体(siNA)、例えば小型干渉RNAおよび小型干渉RNA類似体(siRNA)を特に含むかまたは示すことがあり(すなわちそれらを含むかまたはそれらからなる群より選択できる)、なかでも、２本鎖RNAおよび２本鎖RNA類似体(dsRNA)、マイクロRNAおよびマイクロRNA類似体(miRNA)、ならびに小型ヘアピンRNAおよび小型ヘアピンRNA類似体(shRNA)をさらに示すことがある。
【０１６１】
アンチセンス剤およびRNAi剤の生成は、当該技術において知られる任意のプロセスにより、例えば、なかでも、部分的もしくは完全に化学合成により(例えば慣例的に知られる固相合成、修飾固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための例示的で非限定的な方法は、US 4,458,066に記載されている;別の例において、ジエチルホスホロアミダイトを出発物質として用い、Beaucageら、1981(Tetrahedron Letters 22: 1859〜1862)に記載されるようにして合成してよい)、または部分的もしくは完全に生化学的(酵素)合成により、例えばT7もしくはSP6 RNAポリメラーゼのような適切なポリメラーゼを用いて核酸構築物(鋳型)からのインビトロ転写により、または組換え核酸技術、例えば宿主細胞もしくは宿主生物中のベクターからの発現により行うことができる。ヌクレオチド類似体は、インビトロでの化学的または生化学的合成により導入できる。ある実施形態では、本発明のアンチセンス剤は、インビトロで合成され、生体起源のアンチセンス組成物、またはアンチセンス分子のインビトロ合成を駆動するように設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【０１６２】
あるいくつかの実施形態では、CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書で意図する治療剤は、少なくともCD80ポリペプチドと相互作用できるかまたは細胞による少なくともCD80ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上の少なくともCD80ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤と、少なくともCD86ポリペプチドと相互作用できるかまたは細胞による少なくともCD86ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上の少なくともCD86ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤とを含む組成物であってよい。
好ましくは、組成物は、少なくともCD80ポリペプチドと相互作用できる治療剤と、少なくともCD86ポリペプチドと相互作用できる治療剤、または、細胞による少なくともCD80ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できる治療剤と、細胞による少なくともCD86ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できる治療剤、または、細胞の表面上の少なくともCD80ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤と、細胞の表面上の少なくともCD86ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる治療剤とを含む。
【０１６３】
本明細書においては、少なくともCD80ポリペプチドと相互作用できる治療剤と、少なくともCD86ポリペプチドと相互作用できる治療剤とを含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための、少なくともCD80またはCD86ポリペプチドと相互作用できる組成物も開示される。本明細書においては、細胞による少なくともCD80ポリペプチドの発現を防止または阻害できる治療剤と、細胞による少なくともCD86ポリペプチドの発現を防止または阻害できる治療剤とを含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための、細胞による少なくともCD80またはCD86ポリペプチドの発現を防止または阻害できる組成物も開示される。本明細書においては、細胞の表面上の少なくともCD80ポリペプチドの提示を防止または阻害できる治療剤と、細胞の表面上の少なくともCD86ポリペプチドの提示を防止または阻害できる治療剤とを含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための、細胞の表面上のCD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止または阻害できる組成物も開示される。
【０１６４】
あるいくつかの実施形態では、CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書で意図する治療剤は、第２治療剤と併用投与でき、ここで、第２治療剤は、CD40ポリペプチドと相互作用でき、前記相互作用は、CD40ポリペプチドとCD40リガンド(CD40L)ポリペプチドとの結合に干渉する。
【０１６５】
好ましくは、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できる本明細書で意図する治療剤は、第２治療剤と併用投与でき、ここで、第２治療剤は、CD40ポリペプチドと相互作用でき、前記相互作用は、CD40ポリペプチドとCD40リガンド(CD40L)ポリペプチドとの結合に干渉する。
【０１６６】
治療剤および第２治療剤は、同時、別々または逐次的(任意の順序で)投与のための併用調製物として提供してよい。好ましくは、治療剤および第２治療剤は、同時に投与してよい。例えば、治療剤および第２治療剤を組成物、好ましくは医薬組成物に含めて、該組成物を対象者に投与してよい。したがって、本明細書で教示する治療剤および第２治療剤を含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において同時、別々または逐次的(任意の順序で)に用いるための医薬的組み合わせまたは組成物も本明細書において開示される。
【０１６７】
よって、心臓温虚血再灌流障害の処置を必要とする対象者に、治療上有効量の治療剤(該治療剤は、CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる)と、治療上有効量の第２治療剤(該第２治療剤は、CD40ポリペプチドと相互作用でき、該相互作用は、CD40ポリペプチドとCD40Lポリペプチドとの結合に干渉する)とを投与することを含む、前記対象者における心臓温虚血再灌流障害を処置するための方法も提供される。
【０１６８】
CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤と、CD40ポリペプチドと相互作用できる第２治療剤であって、該相互作用が、CD40ポリペプチドとCD40Lポリペプチドとの結合に干渉する第２治療剤との、心臓温虚血再灌流障害の処置において同時、別々または逐次的(任意の順序で)に用いるための併用調製物の製造のための使用も提供される。
【０１６９】
あるいくつかの実施形態では、CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書で意図する治療剤は、細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤と併用投与できる。
好ましくは、細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書で意図する治療剤は、細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤と併用投与できる。
【０１７０】
治療剤および第２治療剤は、同時、別々または逐次的(任意の順序で)投与のための併用調製物として提供してよい。好ましくは、治療剤および第２治療剤は、同時に投与してよい。例えば、治療剤および第２治療剤を組成物、好ましくは医薬組成物に含めて、該組成物を対象者に投与してよい。したがって、本明細書で教示する治療剤および第２治療剤を含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための医薬的組み合わせまたは組成物も本明細書において開示される。
【０１７１】
よって、心臓温虚血再灌流障害の処置を必要とする対象者に、治療上有効量の治療剤(該治療剤は、CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる)と、治療上有効量の第２治療剤(該第２治療剤は、細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる)とを投与することを含む、前記対象者における心臓温虚血再灌流障害を処置するための方法も提供される。
【０１７２】
CD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる治療剤と、細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤との、心臓温虚血再灌流障害の処置において同時、別々または逐次的(任意の順序で)に用いるための併用調製物の製造のための使用も提供される。
【０１７３】
さらなる実施形態では、CD40ポリペプチドはある細胞に含まれ、CD40Lポリペプチドは別の細胞に含まれることがある。
特に、CD40ポリペプチドは抗原提示細胞(APC)に含まれ、CD40LポリペプチドはＴ細胞に含まれることがあり、そのことにより、CD40ポリペプチドと相互作用できる本明細書で開示する第２治療剤の作用は、共刺激経路CD40:CD40Lに干渉し、Ｔ細胞応答の阻害に対して相加的または相乗的な様式で貢献する。
【０１７４】
さらなる実施形態では、CD40ポリペプチドは抗原提示細胞(APC)に含まれ、そのことにより、細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる本明細書に開示する第２治療剤の作用は、共刺激経路CD40:CD40Lに干渉し、Ｔ細胞応答の阻害に対して相加的または相乗的な様式で貢献する。
【０１７５】
あるいくつかの実施形態では、本明細書で意図する第２治療剤は、本明細書の他の場所で定義するように、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機小分子および化合物またはそれらの任意の２以上の組み合わせを含むか、それらから本質的になるかまたはそれらからなる群より選択できる。
【０１７６】
あるいくつかの実施形態では、本明細書で開示する第２治療剤、特にCD40ポリペプチドと相互作用できる第２治療剤は、本明細書の他の場所で定義するように、抗体またはその断片もしくは誘導体、可溶性受容体およびアプタマーを含むか、それらから本質的になるかまたはそれらからなる群より選択できる。
あるいくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、ナノボディまたはそれらの混合物であってよい。
【０１７７】
適切な抗CD40抗体は、例えば、XmAb(登録商標)5485 (Xencor)、PG102 (PanGenetics UK Limited、WO2007/129895)、ダセツズマブ(SGN-40、Seattle Genetics, Inc./ Genentec)、HCD122 (Novartis)、ASKP1240 (Astellas Pharma)、5D12またはその機能的等価物(DeBoerら、1992, J. Immunol. Methods 152:15〜23)ならびにFFP106、FFP104およびFFP102 (FFPharma)を含む。
【０１７８】
特定の実施形態では、抗CD40抗体は、WO2007/129895の請求項17〜22のいずれか１項で定義される抗体であってよい。より具体的には、抗CD40抗体は、アミノ酸配列:
FSX1SRYSVYWX2RQPPGKGX3EWX4GMMWGGGSTDYSTSLKSRLTISKDTSKSQVX5LKMNSLRTDDTAMYYCVRTDGDY (配列番号１)、好ましくは
QVKLQESGPGLVKPSETLSITCTVSGFSX1SRYSVYWX2RQPPGKGX3EWX4GMMWGGGSTDYSTSLKSRLTISKDTSKSQVX5LKMNSLRTDDTAMYYCVRTDGDYWGQGTTVTVSS (配列番号２)
(式中:
X1は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨ、好ましくはＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり; 
X2は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり; 
X3は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり; 
X4は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり；
X5は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨである)
を含み、
アミノ酸配列:
X6LGX7X8ASISCRSSQSLX9NSNGNTYLHWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV EAEDX10GVYX11CSQSTHVPWT (配列番号３)、好ましくは
ELQLTQSPLSLPVX6LGX7X8ASISCRSSQSLX9NSNGNTYLHWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDX10GVYX11CSQSTHVPWTFGGGTKLEIKR (配列番号４)
(式中:
X6は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷまたはＣであり;
X7は、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷまたはＣであり;
X8は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、ＷまたはＣであり;
X9は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍであり;
X10は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍであり;
X11は、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、ＷまたはＣである)
をさらに含むポリペプチドを含んでよい。
例えば、X1はＬであってよく、X2はＶであってよく、X3はＬであってよく、X4はＬであってよく、X5はＦであってよい。さらなる例では、X6はＴまたはＳであってよく、X7はＤまたはＱであってよく、X8はＱまたはＰであってよく、X9はＶまたはＡであってよく、X10はＶまたはＬであってよく、X11はＦまたはＹであってよく、好ましくはX6はＴであってよく、X7はＱであってよく、X8はＰであってよく、X9はＡであってよく、X10はＶであってよく、X11はＹであってよい。
【０１７９】
あるいくつかの実施形態では、細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる本明細書で開示する第２治療剤は、本明細書の他の場所で定義するように、イントラボディまたはその断片もしくは誘導体、アンチセンス剤およびRNA干渉(RNAi)剤を含むか、それらから本質的になるかまたはそれらからなる群より選択できる。CD40プレmRNAまたはmRNA配列中の配列領域と結合できる(アニールする)アンチセンス剤が特に意図できる。CD40 mRNAを標的にするように構成されたこのようなRNAi剤が特に意図できる。
【０１８０】
治療剤または第２治療剤が、発現可能な分子、例えば抗体またはその断片もしくは誘導体、タンパク質またはポリペプチド、ペプチド、核酸、アンチセンス剤あるいはRNAi剤である場合、剤そのものを対象者に導入できるか、または剤をコードする配列の発現を可能にする１以上の調節配列と作動可能に連結したアゴニストをコードする配列を含む組換え核酸により導入できる(例えば遺伝子療法または細胞療法)。
よって、剤は、例えばインビトロ、宿主細胞、宿主器官および/または宿主生物(発現構築物)におけるタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アンチセンス剤またはRNAi剤をコードする１以上の配列の発現を可能にする１以上の調節配列と作動可能に連結した１以上の所望のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アンチセンス剤またはRNAi剤をコードする配列を含む組換え核酸を含み得る。このような組換え核酸は、適切なベクターに含まれてよい。
【０１８１】
「コードする」により、核酸配列またはその一部分が、問題の生物の遺伝子コードにより特定のアミノ酸配列、例えば１以上の所望のタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列、または鋳型-転写生成物(例えばRNAまたはRNA類似体)の関係において別の核酸配列に対応することを意味する。
好ましくは、１以上のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸は、前記１以上のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする１以上のオープンリーディングフレーム(ORF)を含んでよい。「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、それら自体で知られる翻訳開始コドンで開始して、翻訳終結コドンで終わり、いずれの内部インフレーム翻訳終結コドンも含まず、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードできる連続するコードヌクレオチドトリプレット(コドン)のことをいう。よって、この用語は、当該技術において用いられる「コード配列」と同義であり得る。
【０１８２】
「作動可能な連結」は、調節配列と発現させようとする配列とが前記発現を許容するような様式で接続される連結である。例えば、配列、例えばプロモーターおよびORFは、前記配列間の連結の性質が(1)フレームシフト変異の導入をもたらさず、(2) ORFの転写を駆動するプロモーターの能力に干渉せず、(3)プロモーター配列から転写されるORFの能力に干渉しないならば、作動可能に連結されているということができる。
【０１８３】
発現のために必要な調節配列またはエレメントの厳密な性質は、発現環境により変動することがあるが、プロモーターおよび転写ターミネーターおよび場合によってエンハンサーを典型的に含む。
「プロモーター」または「エンハンサー」への言及は、その最も広い関係であると理解され、正確な転写開始および当てはまる場合には遺伝子発現もしくはその応答の正確な空間的および/または時間的制御のために要求される転写調節配列、例えば内部または外部(例えば外因性)刺激物質を含む。より具体的には、「プロモーター」は、RNAポリメラーゼが結合して転写を開始する、核酸分子、好ましくはDNA分子上の領域を示すことがある。プロモーターは、必ずではないが好ましくは、それが転写を制御する配列の上流、すなわち５'に位置する。典型的に、原核生物では、プロモーター領域は、プロモーター自体と、RNAに転写された場合にタンパク質合成の開始を合図する配列(例えばShine-Dalgarno配列)との両方を含有してよい。
実施形態では、本明細書で企図するプロモーターは、構成性または誘導性であってよい。
【０１８４】
用語「ターミネーター」または「転写ターミネーター」は、転写の終結を合図する転写単位の端にある配列エレメントのことを一般的にいう。例えば、ターミネーターは、興味対象のポリペプチドをコードするORFの下流、すなわち３'に通常位置する。例えば、組換え核酸が、例えば連続的に並び、一緒にマルチシストロンの転写単位を形成する２以上のORFを含有する場合、転写ターミネーターは、最も下流のORFに対して３'に位置することが有利である場合がある。
【０１８５】
用語「ベクター」は、核酸セグメントを挿入してクローニングする、すなわち増やすことができる核酸分子、典型的にDNAのことを一般的にいう。よって、ベクターは、１以上のユニーク制限部位を典型的に含有し、クローニングされた配列を複製できるように、規定された宿主または媒体生物において自己複製できる。ベクターは、限定することなく、適切であればプラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来ベクター、PAC、BAC、直鎖状核酸、例えば直鎖状DNA、ウイルスベクターなどを含み得る。発現ベクターは、そこに導入された核酸もしくはORFの発現を所望の発現系、例えばインビトロで、宿主細胞、宿主器官および/もしくは宿主生物において可能にし、かつ/または実行するように一般的に構成される。例えば、発現ベクターは、適切な調節配列を有利に含んでよい。
【０１８６】
他の場所で述べるように、剤は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含み得る。これは、宿主細胞または宿主生物において前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしてその発現のために構成された発現構築物で形質転換された宿主細胞または宿主生物による発現と、その後のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製により適切に得ることができる。
【０１８７】
用語「宿主細胞」または「宿主生物」は、適切には、原核生物、例えば細菌および真核生物、例えば酵母、真菌、原生生物、植物および動物の両方を包含する細胞または生物のことをいうことがある。宿主細胞として企図するものは、なかでも、単細胞生物、例えば細菌(例えば大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella tymphimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)またはバチルス・サチリス(Bacillus subtilis))、酵母(例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris))、(培養)植物細胞(例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)またはタバコ(Nicotiana tobaccum)から)および(培養)動物細胞(例えば脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、ヒト細胞または昆虫細胞)である。宿主生物として企図するものは、なかでも、多細胞生物、例えば植物および動物、好ましくは動物、より好ましくは温血動物、さらにより好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類であり、特に企図するものは、非ヒトである動物および動物の部類である。
【０１８８】
このようなタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、適切に単離してよい。特定の成分(例えば核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド)に関しての用語「単離」は、そのような成分が、その自然の環境の１以上のその他の成分から分離された形で存在する(例えば該その他の成分から分離されたか、または該その他の成分から分離して調製されたかかつ/もしくは維持されている)ことを一般的に示す。例えば、単離されたヒトまたは動物タンパク質または複合体は、それが天然に存在するヒトまたは動物の体から分離されて存在し得る。用語「単離」は、本明細書で用いる場合、修飾語「精製」も好ましくは包含できる。例えば、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに関しての用語「精製」は、絶対的な精製を必要としない。代わりに、これは、このような核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、他の核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対するそれらの豊富さ(質量または重量または濃度の点で簡便に表現される)が生体試料中よりも大きい、別個の環境にあることを示す。別個の環境は、単一媒質、例えば単一溶液、ゲル、沈殿物、凍結乾燥物などを示す。精製された核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、例えば実験室または組換え合成、クロマトグラフィー、分取電気泳動、遠心分離、沈殿、親和性精製などを含む既知の方法により得ることができる。
【０１８９】
簡便のために活性物質と集合的に示すことができる本開示の様々な治療剤またはその薬学的に許容される誘導体、例えばその薬学的に許容される塩は、１以上の薬学的に許容される担体/補形剤とともに医薬組成物または製剤として処方して投与してよい。このような医薬組成物または製剤は、キットに含まれてよい。
【０１９０】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書で用いる場合、当該技術におけるものと一貫し、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントにとって有害でないことを意味する。
本明細書で用いる場合、「担体」または「補形剤」は、任意のそして全ての溶剤、希釈剤、緩衝剤(例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水または場合によって、トリスHCl、酢酸もしくはリン酸緩衝液)、可溶化剤(例えばツイーン80、ポリソルベート80)、コロイド、分散媒質、賦形剤、充填剤、キレート化剤(例えばEDTAまたはグルタチオン)、アミノ酸(例えばグリシン)、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、芳香剤、増粘剤、デポー効果を達成するための剤、コーティング、抗真菌剤、保存剤(例えばチメロサール(商標)、ベンジルアルコール)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、等張化剤、吸収遅延剤、補助剤、増量剤(例えばラクトース、マンニトール)などを含む。薬学的な活性物質についてこのような媒質および剤(補形剤)を用いることは、当該技術において公知である。いずれかの従来の媒質または剤が活性物質と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図できる。適切な薬学的担体は、なかでも、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に記載されている。
【０１９１】
医薬組成物の処方において用いるための説明的で非限定的な担体は、例えば、水中油型または油中水型エマルジョン、静脈内(IV)の使用に適する有機共溶剤を含むかまたは含まない水性組成物、リポソームまたは界面活性剤含有小胞、なかでもポリ乳酸またはポリグリコール酸のようなポリマー化合物を含む粒子状調製物、マイクロスフェア、マイクロビーズおよびマイクロソーム、粉末、錠剤、カプセル剤、坐剤、水性懸濁剤、エアロゾルおよび当業者にとって明らかなその他の担体を含む。
薬学的担体は、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ごま油などを含む滅菌液体、例えば水および油を含み得る。
【０１９２】
医薬組成物は、本質的にいずれの投与経路、例えば、限定することなく、口腔投与(例えば口腔摂取または吸入)、鼻内投与(例えば鼻内吸入または鼻内粘膜投与)、肺(例えば粉剤またはエアロゾルの吸入または通気による)、非経口投与(例えば皮下、静脈内、動脈内、筋内、腹腔内、または胸骨内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えばくも膜下内もしくは脳室内投与)、骨内および/または病巣内投与、表皮および経皮または経粘膜(例えば口腔、舌下、鼻内)投与、局部投与(なかでも点眼投与を含む)、直腸、膣または気管内滴下などのためにも処方できる。このようにして、本明細書に記載する方法および活性物質、組成物または製剤により達成できる治療効果は、所定の用途の具体的な必要性に応じて、例えば、全身、局所、組織特異的などであり得る。
【０１９３】
例えば、口腔投与のために、医薬組成物は、丸剤、錠剤、ラッカー(lacquered)錠剤、被覆(例えば糖衣)錠剤、顆粒剤、ハードおよびソフトゼラチンカプセル剤、水性、アルコール性もしくは油性の液剤、シロップ剤、乳剤または懸濁剤の形に処方できる。例えば、限定することなく、口腔剤形の調製物は、適切な量の粉末の形の活性化合物を、場合によって微細に分割した１以上の固体担体と一緒に均一かつ十分にブレンドし、ブレンドを丸剤、錠剤またはカプセル剤に処方することにより適切に達成できる。例示的であるが非限定的な固体担体は、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類(例えばグルコース、マンノース、ラクトースまたはスクロース)、糖アルコール(例えばマンニトール)、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。医薬組成物を含有する圧縮錠剤は、活性成分を上記のような固体担体と均一かつ十分に混合して必要な圧縮特性を有する混合物を得て、次いで、混合物を適切な装置内で所望の形状およびサイズに圧縮することにより調製できる。成形錠剤は、適切な装置内で、不活性液体希釈剤を用いて湿潤にした粉末化合物の混合物を成形することにより作製できる。ソフトゼラチンカプセル剤および坐剤のために適切な担体は、例えば、脂肪、ワックス、半固形および液体のポリオール、天然油または硬化油などである。
【０１９４】
例えば、口腔または鼻のエアロゾルまたは吸入投与のために、医薬組成物は、例示的な担体とともに、例えば食塩水、ポリエチレングリコールもしくはグリコール、DPPC、メチルセルロースを含む溶液、あるいはベンジルアルコールまたはその他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増進するための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび/または当該技術において知られるその他の可溶化剤もしくは分散剤をさらに用いて、粉末分散剤を含む混合物において処方できる。エアロゾルまたはスプレーの形での投与のために適切な医薬製剤は、例えば、薬学的に許容される溶剤、例えばエタノールもしくは水またはそのような溶剤の混合物中の活性物質の液剤、懸濁剤または乳剤である。所望により、製剤は、その他の薬学的佐剤、例えば界面活性剤、乳化剤および安定化剤ならびに噴射剤もさらに含有できる。説明のために、使い捨て送達デバイス、噴霧器、呼吸作動式粉末吸入器、エアロゾル計量吸入器(MDI)または当該技術において利用可能な任意のその他の多数の噴霧器送達デバイスを用いることにより送達できる。さらに、ミストテントまたは気管内チューブによる直接投与も用いることができる。
【０１９５】
粘膜表面を介する投与のための担体の例は、具体的な経路、例えば口腔、舌下、鼻内などに依存する。口腔投与の場合、説明的な例は、医薬グレードのマンニトール、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み、マンニトールが好ましい。鼻内投与の場合、説明的な例は、ポリエチレングリコール、リン脂質、グリコールおよび糖脂質、スクロースならびに/またはメチルセルロース、増量剤、例えばラクトースおよび保存剤、例えば塩化ベンザルコニウムおよびEDTAを含むかもしくは含まない粉末懸濁物を含む。例えば、リン脂質１,２ジパルミトイル-sn-グリセロ-３-ホスホコリン(DPPC)を等張水性担体として用いてよい。
【０１９６】
例えば、非経口投与のために、医薬組成物は、適切な溶剤、希釈剤、可溶化剤または乳化剤などを含む液剤、懸濁剤または乳剤として処方するのが有利であり得る。適切な溶剤は、限定することなく、水、生理食塩水またはアルコール、例えばエタノール、プロパノール、グリセロール、さらに糖溶液、例えばグルコース、転化糖、スクロースもしくはマンニトール溶液、または代わりに上記の様々な溶剤の混合物である。注射用液剤または懸濁剤は、適切な非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶剤、例えばマンニトール、1,3-ブタンジオール、水、リンゲル液もしくは等張塩化ナトリウム溶液、または適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤、例えば合成モノまたはジグリセリドを含む滅菌で無刺激性の不揮発性油、およびオレイン酸を含む脂肪酸を用いて、当該技術において知られるように処方できる。活性物質は、凍結乾燥することもでき、得られた凍結乾燥物は、例えば注射用または注入用調製物の製造のために用いられる。例えば、静脈内使用のための担体のある説明的な例は、10%USPエタノール、40%USPプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール600およびバランスのUSP注射用水(WFI)の混合物を含む。静脈内使用のためのその他の説明的な担体は、10%USPエタノールおよびUSP WFI; USP WFI中の0.01〜0.1%トリエタノールアミン;またはUSP WFI中の0.01〜0.2%ジパルミトイルジホスファチジルコリン;および１〜10%スクアレンまたは非経口植物油の水中油型エマルジョンを含む。水または食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは、担体、好ましくは注射用液剤のための担体として用いることができる。皮下または筋内用の担体の説明的な例は、リン酸緩衝食塩水(PBS)、WFI中の５%デキストロースおよび５%デキストロース中の0.01〜0.1%トリエタノールアミンもしくはUSP WFI 中の0.9%塩化ナトリウム、または10%USPエタノール、40%プロピレングリコールの１対２もしくは１対４混合物およびバランスの５%デキストロースもしくは0.9%塩化ナトリウムのような許容される等張液;またはUSP WFI中の0.01〜0.2%ジパルミトイルジホスファチジルコリンおよび１〜10%スクアレンもしくは非経口植物油の水中油型エマルジョンを含む。
【０１９７】
水性製剤が好ましい場合、このような水性製剤は、１種以上の界面活性剤を含んでよい。例えば、組成物は、少なくとも１種の適切な界面活性剤、例えばリン脂質界面活性剤を含むミセル分散体の形であり得る。リン脂質の説明的な例は、ジアシルホスファチジルグリセロール、例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール(DPMG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)およびジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジミリストイルホスファチジルコリン(DPMC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)およびジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC);ジアシルホスファチジン酸、例えばジミリストイルホスファチジン酸(DPMA)、ジパルミトイルホスファチジン酸(DPPA)およびジステアロイルホスファチジン酸(DSPA);ならびにジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DPME)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)を含む。典型的に、水性製剤中の界面活性剤：活性物質のモル比は、約10:１〜約１:10、より典型的には５:１〜約１:５であるが、興味対象の具体的な目的に最も適する任意の有効量の界面活性剤を水性製剤中で用いてよい。
【０１９８】
あるいくつかの実施形態では、医薬組成物または製剤は、ボーラス静脈内注入のために構成してよく、かつボーラス静脈内注入として送達してよい。
【０１９９】
坐剤の形で直腸投与する場合、これらの製剤は、活性物質を適切な非刺激性の補形剤、例えばカカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコール(これらは、常温にて固体であるが、直腸の腔にて液状化および/または溶解して薬物を放出する)とともに混合することにより調製してよい。
【０２００】
マイクロカプセル、インプラントまたは杆体(rods)のための適切な担体は、例えば、グリコール酸および乳酸の共重合体である。
【０２０１】
当業者は、上記の記載が網羅的であるよりもむしろ説明的であることを認識する。実際に、多くのさらなる製剤技術ならびに薬学的に許容される補形剤および担体溶液が当該技術において公知であり、本明細書に記載する具体的な組成物を様々な処置計画において用いるための適切な投与および処置計画の発展についても同様である。
【０２０２】
さらに、動物細胞に核酸(例えばアンチセンスおよびRNAi剤)を導入するいくつかの公知の方法があり、これらのいずれも本発明において用いてよい。最も単純には、核酸を標的細胞/標的組織に直接注入できる。その他の方法は、レシピエント細胞と核酸を含有する細菌プロトプラストとの融合、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、塩化リチウム、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、カチオン性脂質もしくはリポソームのような組成物の使用、または受容体媒介エンドサイトーシス、微粒子銃での粒子射出(「遺伝子銃」法)、ウイルスベクターの感染、エレクトロポレーションなどを含む。核酸分子を標的細胞に送達するために適切なその他の技術または方法は、ポリ(乳酸-Co-グリコール酸)ポリマーマイクロスフェアからのNA分子の連続的送達、または生成物を送達するマイクロポンプへの保護(安定化) NA分子の直接注入を含む。別の可能性は、移植可能な薬物放出生分解性マイクロスフェアの使用である。様々な種類のリポソーム(イムノリポソーム、PEG化(イムノ)リポソーム)、カチオン性脂質およびポリマー、ナノ粒子またはデンドリマー、ポリ(乳酸-Co-グリコール酸)ポリマーマイクロスフェア、移植可能な薬物放出生分解性マイクロスフェアへのNAのカプセル化、ならびに保護剤、例えばヌクレアーゼ阻害剤であるオーリントリカルボン酸とのNAの同時注入も構想される。上記の異なる送達形態または方法の組み合わせも用いることができることも明確である。
【０２０３】
核酸、例えばアンチセンス剤およびRNAi剤の送達のためのさらなる方法は、以前に発表された方法を用いてよい。例えば、核酸の細胞内送達は、核酸分子と有効量のブロックコポリマーの混合物を含む組成物によるものであってよい。この方法の例は、US 2004/0248833に記載されている。
核への核酸の送達についてのその他の方法は、Mannら、2001 (Proc Natl Acad Science 98(1): 42〜47)およびGebskiら、2003 (Human Molecular Genetics 12(15): 1801〜1811)に記載されている。
ネイキッドDNAまたは脂質担体との複合体のいずれかの発現ベクターにより細胞に核酸分子を導入するための方法は、US 6,806,084に記載されている。
【０２０４】
核酸分子をコロイド分散系で送達することが望ましいことがある。コロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームまたはリポソーム製剤を含む脂質ベースのシステムを含む。リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達媒体として有用な人工膜小胞である。これらの製剤は、正味のカチオン、アニオンまたは中性電荷の特徴を有してよく、インビトロ、インビボおよびエクスビボ送達法の有用な特徴である。0.2〜4.0 PHI.mの範囲のサイズの大きい単層小胞(LUV)が、大きい巨大分子を含有する水性緩衝液の実質的なパーセンテージをカプセル化できることが示されている。RNAおよびDNAは、水性の内部にカプセル化でき、生物学的に活性な形で細胞に送達できる(Fraleyら、1981 (Trends Biochem ScL 6: 77)。
リポソームが有効な遺伝子移入媒体となるためには、以下の特徴が存在すべきである: (1)生物学的活性について妥協することなく、興味対象の核酸分子を高い効率でカプセル化すること; (2)非標的細胞と比べて標的細胞と優先的および実質的に結合すること; (3)小胞の水性内容物を標的細胞の細胞質に高い効率で送達すること;ならびに(4)遺伝子情報を正確かつ効率的に発現すること(Manninoら、1988 (Biotechniques 6: 682)。
【０２０５】
リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質と、通常、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。その他のリン脂質またはその他の脂質も用いてよい。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度および２価カチオンの存在に依存する。
【０２０６】
代わりに、核酸分子は、他の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を生成できる。適切な担体および希釈剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水を含む。組成物は、非経口、筋内、静脈内、皮下、眼内、口腔または経皮投与のために処方できる。
【０２０７】
記載する投与経路は、手引きのみであることを意図する。なぜなら、当業者は、任意の具体的な動物および状態のための最適な投与経路と任意の投与量とを容易に決定できるからである。インビトロおよびインビボの両方で細胞に機能的な新しい遺伝子材料を導入するための複数のアプローチが試みられている(Friedmann 1989 (Science 244: 1275〜1280))。これらのアプローチは、改変レトロウイルスで発現される遺伝子の組み込み(Friedmann 1989、既出; Rosenberg. Cancer Res. 1991、第51巻(18), 5074S〜79S);非レトロウイルスベクターへの組み込み(Rosenfeldら、Cell、1992、第68巻、143〜55; Rosenfeldら、Science、1991、第252巻、431〜4);またはリポソームによる異種プロモーター-エンハンサーエレメントと連結された導入遺伝子の送達(Friedmann 1989、既出; Brighamら、Am. J. Med. Sci.、1989、第298巻、278〜81; Nabelら、Science、1990、第249巻、1285〜8; Hazinskiら、Am. J. Resp. Cell. Molec. Biol.、1991、第4巻、206〜9; WangおよびHuang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1987、第84巻、7851〜5); リガンド特異的でカチオンベースの輸送システムとの共役(WuおよびWu. J. Biol. Chem.、1988、第263巻、14621〜4))またはネイキッドDNA、発現ベクターの使用(Nabelら、1990、既出; Wolffら、Science、1990、第247巻、1465〜8)を含む。組織への導入遺伝子の直接注入は、局所的発現のみを生じる(Rosenfeld. 1992、既出; Rosenfeldら、1991、既出; Brighamら、1989、既出; Nabel 1990、既出; Hazinskiら、1991、既出)。Brighamらのグループ(Am. J. Med. Sci.、1989、第298巻、278〜81; Clin. Res.、1991、第39巻、要約)は、DNAリポソーム複合体の静脈内または気管内の投与の後のマウスの肺のみのインビボトランスフェクションについて報告している。ヒト遺伝子療法手順の概説文献の例は、Anderson. Science、1992、第256巻、808〜13である。
【０２０８】
単位剤形で簡便に提示できる本明細書で開示する医薬製剤は、製薬業界において公知の従来の技術に従って調製できる。このような技術は、通常、活性成分を薬学的担体または補形剤と一緒にするステップを含み得る。一般的に、製剤は、活性成分を、液体担体もしくは微細に分割された固体担体またはそれらの両方と均一および十分に一緒にし、次いで、必要であれば生成物を成形することにより調製される。
【０２０９】
場合によって１以上の投与されるその他の活性化合物との組み合わせでの用いられる本活性剤の投与量または量は、個別の事例に依存し、慣例でそうであるように、最適な効果を達成するために個別の状況に適合される。よって、処置される障害の性質および重症度、ならびに処置されるヒトまたは動物の性別、年齢、体重、全身の健康状態、食餌、投与の形態および時間ならびに個別の応答性、用いる化合物の投与の経路、効力、代謝安定性および作用の持続期間、治療が急性または慢性または予防的であるか、あるいは他の活性化合物を本発明の剤に加えて投与するかに依存する。
【０２１０】
限定することなく、疾患の種類および重症度に依存して、典型的な１日投与量は、上記の因子に依存して約１ng/kg〜100 mg/kg体重以上の範囲であり得る。状態に応じて数日間以上にわたる反復投与のために、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続する。本明細書に記載する活性物質の好ましい投与量は、約0.05 mg/kg〜約10 mg/kg体重の範囲であり得る。よって、１回以上の約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kgまたは10 mg/kg (またはそれらの任意の組み合わせ)の用量を患者に投与してよい。このような用量は、間欠的、例えば毎週または２週間もしくは３週間ごとに投与してよい。
【０２１１】
ある実施形態では、医薬組成物は、約10 nMと約１μMの間、好ましくは約20 nMと約600 nMの間、例えば約100 nMまたは約200 nMまたは約300 nMまたは約400 nMまたは約500 nMの本明細書で教示するアンチセンス剤またはRNAi剤を含んでよい。
【０２１２】
あるいくつかの実施形態では、本明細書に記載する活性物質は、処置の間毎日投与してよい。あるいくつかの実施形態では、本明細書に記載する活性物質は、処置の間に少なくとも１日１回投与してよく、例えば本明細書に記載する活性物質は、処置の間に少なくとも１日２回投与してよく、例えば本明細書に記載する活性物質は、処置の間に少なくとも１日３回投与してよい。あるいくつかの実施形態では、本明細書に記載する活性物質は、例えば水性の飲用液中で処置の間継続して投与してよい。
【０２１３】
急性心筋梗塞に起因する心臓温虚血再灌流障害の処置のために、本明細書に開示する治療剤での処置を急性心筋梗塞の後できるだけ早く、例えば急性心筋梗塞の約0.5時間後、約１時間後、約２時間後、約６時間後、約12時間後もしくは約24時間後ほど早く、または心臓の虚血領域への血流を回復することをねらいとする心筋梗塞の任意の処置(例えば抗凝固療法)の前、同時もしくは後できるだけ早く、例えば心臓の虚血領域への血流を回復することをねらいとする処置の少なくとも約0.5時間前、約１時間前もしくは約２時間前、または例えば心臓の虚血領域への血流を回復することをねらいとする処置の約0.5時間後、約１時間後、約２時間後、約６時間後、約12時間後もしくは約24時間後に行うことが望ましいことがある。適切な抗凝固療法剤は、限定することなく、抗血栓剤、例えばヘパリンおよびクマリン、血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼならびに組織プラスミノゲンアクチベータ、ならびに抗血小板剤(antithrombocytics)を含む。
【０２１４】
したがって、本明細書に記載する治療剤と抗凝固剤とを含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において同時、別々または逐次的(任意の順序で)に用いるための医薬的組み合わせまたは組成物も本明細書において開示される。
したがって、あるいくつかの実施形態では、抗凝固剤と併用投与される、例えば同時、別々または逐次的に(任意の順序で)併用投与されるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書で意図する治療剤も開示される。あるいくつかの実施形態では、CD40と相互作用できるかまたは細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤の併用投与、例えば同時、別々または逐次的な(任意の順序で)併用投与も企図される。
【０２１５】
治療的介入、例えば外科的手順、例えば冠動脈バイパス移植術、冠動脈形成術、血管結紮術および心臓移植術中の再灌流などの結果としての心臓温虚血再灌流障害の処置のために、本明細書に記載する治療剤を、治療的介入の前に処置を受ける対象者に投与することが好ましいことがある。例えば、本明細書に記載する治療剤は、処置を受ける対象者に、治療的介入の例えば約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約５時間前、約12時間前、約24時間前または約48時間前に投与できる。本明細書に記載する治療剤は、処置を受ける対象者に、治療的介入の約５分前、約10分前、約15分前、約20分前、約30分前または約45分前に投与することもできる。本明細書に記載する治療剤は、治療的介入中に、処置を受けている対象者に投与することもできる。本明細書に記載する治療剤は、処置を受ける対象者に、治療的介入の後(すなわち介入後)、例えば治療的介入の約５分後、約10分後、約15分後、約20分後、約30分後、約45分後、約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約12時間後、約24時間後または約48時間後に投与することもできる。
【０２１６】
本明細書に記載する治療剤は、単独で、または当該技術において知られる心臓温虚血再灌流障害の処置のために有用な任意の１以上の活性物質、例えば１以上の免疫抑制剤と組み合わせて(併用療法)用いてよい。
したがって、本明細書に記載する治療剤と免疫抑制剤とを含む、心臓温虚血再灌流障害の処置において同時、別々または逐次的(任意の順序で)に用いるための医薬的組み合わせまたは組成物も本明細書において開示される。
【０２１７】
したがって、あるいくつかの実施形態では、免疫抑制剤と併用投与される、例えば同時、別々または逐次的に(任意の順序で)併用投与されるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用できるかまたは細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる本明細書で意図する治療剤も開示される。あるいくつかの実施形態では、CD40と相互作用できるかまたは細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤の併用投与、例えば同時、別々または逐次的な(任意の順序で)併用投与も企図される。
【０２１８】
用語「免疫抑制剤」は、本明細書で用いる場合、免疫応答を抑制する化合物または組成物を含むことを意味する。例示的な免疫抑制剤は、アザリオプリン、マクロライドおよびシクロスポリン、特にマクロライド、例えばピメクロリムス、タクロリムスおよびシロリムスならびにシクロスポリン例えばシクロスポリンＡを含む。代替の免疫抑制剤は、ムロモナブCD3、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アレムツズマブおよびその他の生物学的免疫抑制剤(例えばCD3、CD4またはCD8を標的にするもの)を含む。
【０２１９】
明記するときを除いて、「対象者」または「患者」は、交換可能に用いられ、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、さらにより好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは霊長類のことをいい、具体的に、ヒト患者および非ヒト哺乳動物および霊長類を含む。好ましい患者は、ヒト対象者である。よって、ある実施形態では、対象者はヒトである。
【０２２０】
本明細書で用いる場合、「処置を必要とする対象者」のような句は、ある状態の処置、特に心臓温虚血再灌流障害の処置により利益を受け得る対象者を含む。このような対象者は、限定することなく、前記状態と診断された対象者、前記状態にかかりやすいかもしくは状態を発生しやすい対象者、および/または前記状態を妨げようとする対象者を含み得る。本明細書において、心臓虚血に罹患しているかまたはかかりやすいかまたは心臓虚血を発生しやすい対象者、例えば心筋梗塞に罹患している対象者、または心筋への血流の一時的な停止を伴う心臓手術を受ける対象者を特に意図する。
【０２２１】
用語「治療上有効量」は、本明細書で用いる場合、研究者、獣医、医師またはその他の臨床医学者が調べている対象者において、なかでも処置される疾患または状態の症状の緩和を含み得る生物学的または医学的応答を惹起する活性化合物または薬剤の量のことをいう。本薬剤について治療上有効用量を決定するための方法は、当該技術において知られている。
用語「予防上有効量」は、対象者において、研究者、獣医、医師またはその他の臨床医学者が調べている障害の開始を阻害または遅延させる活性化合物または薬剤の量のことをいう。用語「治療上有効量」は、本明細書で用いる場合、研究者、獣医、医師またはその他の臨床家が調べている対象者において、なかでも処置される疾患または状態の症状の緩和を含み得る生物学的または医学的応答を惹起する活性化合物または薬剤の量のことをいう。本薬剤について予防上有効用量を決定するための方法は、当該技術において知られている。
【０２２２】
後続の項目は、本発明において開示されているある態様および実施形態のさらなる説明を提供する。
(ｉ) CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方と相互作用でき、前記相互作用が、CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方とCD28ポリペプチドとの結合に干渉する、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(ii) CD80またはCD86ポリペプチドの少なくとも一方が、抗原提示細胞(APC)に含まれ、CD28ポリペプチドが、Ｔ細胞に含まれる、項目(ｉ)に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(iii)細胞によるCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の発現を防止もしくは阻害できるか、または細胞表面上のCD80もしくはCD86ポリペプチドの少なくとも一方の提示を防止もしくは阻害できる、心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(iv)細胞が、抗原提示細胞(APC)である、項目(iii)に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(ｖ)タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機小分子および化合物またはそれらの任意の２以上の組み合わせからなる群より選択される、項目(ｉ)〜(iv)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(vi)抗体またはその断片もしくは誘導体、可溶性受容体およびアプタマーからなる群より選択される、項目(ｉ)〜(ｖ)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(vii)抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、ナノボディまたはそれらの混合物である、項目(vi)に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(viii)可溶性受容体が、可溶性CTLA4分子、好ましくはCTLA4Ig融合タンパク質である、項目(vi)に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(ix)イントラボディまたはその断片もしくは誘導体、アンチセンス剤およびRNAi剤からなる群より選択される、項目(iii)〜(ｖ)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(ｘ)治療剤が、第２治療剤と併用投与され、第２治療剤が、CD40ポリペプチドと相互作用でき、前記相互作用が、CD40ポリペプチドとCD40リガンド(CD40L)ポリペプチドとの結合に干渉する、項目(ｉ)〜(ix)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xi) CD40ポリペプチドが、抗原提示細胞(APC)に含まれ、CD40Lポリペプチドが、Ｔ細胞に含まれる、項目(ｘ)に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xii)細胞によるCD40ポリペプチドの発現を防止もしくは阻害できるかまたは細胞の表面上のCD40ポリペプチドの提示を防止もしくは阻害できる第２治療剤と併用投与される、項目(ｉ)〜(ix)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xiii)細胞が、抗原提示細胞(APC)である、項目(xii)に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xiv)第２治療剤が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、有機小分子および化合物またはそれらの任意の２以上の組み合わせからなる群より選択される、項目(ｘ)〜(xiii)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xv)第２治療剤が、抗体またはその断片もしくは誘導体、可溶性受容体およびアプタマーからなる群より選択される、項目(ｘ)〜(xiv)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xvi)第２治療剤が、イントラボディまたはその断片もしくは誘導体、アンチセンス剤およびRNAi剤からなる群より選択される、項目(xii)〜(xiv)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xvii)抗凝固剤と併用投与される、項目(ｉ)〜(xvi)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xviii)免疫抑制剤と併用投与される、項目(ｉ)〜(xvi)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xix)心臓温虚血再灌流障害が、心筋梗塞、慢性心筋梗塞、急性心筋梗塞(STEMI)、心臓の虚血領域への血流の回復をねらいとした心筋梗塞の処置、心血管停止、冠動脈バイパス移植術、冠動脈形成術、一過性血管攣縮、急性冠症候群(NSTEMI)、心筋保護法または血管結紮術および心臓移植術中の再灌流の結果である、項目(ｉ)〜(xviii)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
(xx)心臓温虚血再灌流障害が、急性心筋梗塞の結果である、項目(ｉ)〜(xix)のいずれか１項に記載の心臓温虚血再灌流障害の処置において用いるための治療剤。
【０２２３】
本発明に従って上記の実質的な利点をもたらす生成物、方法および使用が提供されることが明らかである。本発明を具体的な実施形態とともに記載したが、多くの代替、改変および変動が上記の記載に鑑みて当業者にとって明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲において、以下のような全てのそのような代替、改変および変動を取り込むことを意図する。
上記の態様および実施形態は、以下の非限定的な実施例によりさらに支持される。
【実施例】
【０２２４】
実施例１: CD80、CD86および/またはCD40遮断剤のスクリーニング
試験遮断剤(例えばペプチド、抗体、抗体断片、可溶性受容体、有機小分子など)を、ヒトCD80、ヒトCD86およびヒトCD40分子との結合について、バイオレイヤー干渉法(BLI)によりスクリーニングして、本発明の様々な実施形態において治療剤として有用であり得る遮断剤を同定する。簡単に述べると、融合タンパク質、CD86-Fc、CD80-FcおよびCD40-Fc (R&D systems、ミネソタから購入)を抗ヒトIgG Fc捕捉バイオセンサ(Fortebio、カリフォルニア)上に固定化する。試験遮断剤を、次いでウェルに加え、標的分子との結合をリアルタイムでOctet(登録商標)RED96システム(Fortebio、カリフォルニア)を用いて記録する。リアルタイム動態測定は、ka (会合速度定数)、kd (解離速度定数)、KD (解離定数)のようなインビトロでの結合特性を正確に決定することも可能にする。さらなる開発のために適切な候補であるとみなされる試験遮断剤は、KD (解離定数) = kd/ka ≦10-7Ｍで標的と結合するものである。
【０２２５】
実施例２: CD80/CD86とCD28との結合の阻害
試験遮断剤がCD80およびCD86とCD28との結合に干渉できるかを評価するために、Raji細胞(105細胞/ウェル)を、漸増濃度のCD80およびCD86試験遮断剤(例えばペプチド、抗体、抗体断片、可溶性受容体、有機小分子など)と１時間インキュベートする。次に、マウスIgG2 Fcと融合した組換えヒトCD28の細胞外ドメインからなる融合タンパク質(Ancell、ミネソタ、USAから購入)を飽和濃度にてウェルに加える(間に細胞を洗浄しない)。一晩のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、PE-コンジュゲート抗マウスIgG2a抗体(BD Biosciences、ベルギーから購入)で染色する。細胞を、次いで洗浄し、パラホルムアルデヒド中で固定し、BD FACSCanto(商標) IIを用いてフローサイトメトリーにより測定する。結合阻害のパーセンテージを、遮断剤を加えずに得られた陽性対照およびCD28融合タンパク質を加えずに得られた陰性対照の平均蛍光強度の値に基づいて算出する。各試験遮断剤のEC50は、結合曲線から算出する。さらなる開発のために適切な候補であるとみなされる試験遮断剤は、好ましくはEC50が≦１nMであるものである。
【０２２６】
実施例３: CD40とCD40Lとの相互作用の阻害
試験遮断剤がCD40とCD40リガンドとの結合に干渉できるかを評価するために、CD40発現CHO細胞(105細胞/ウェル)を、漸増濃度のCD40試験遮断剤(例えばペプチド、抗体、抗体断片、可溶性受容体、有機小分子など)と１時間インキュベートする。次に、Hisタグと融合した組換えヒトCD40Lの細胞外ドメイン(Acris Antibodies、カリフォルニア、USAから購入)を飽和濃度にてウェルに加える(間に細胞を洗浄しない)。１晩のインキュベーションの後に、細胞を洗浄し、PE-コンジュゲート抗hisタグ抗体(Miltenyi Biotec、オランダから購入)で染色する。細胞を、次いで洗浄し、パラホルムアルデヒド中で固定し、BD FACSCanto(商標) IIを用いてフローサイトメトリーにより測定する。結合阻害のパーセンテージを、遮断剤を加えずに得られた陽性対照およびCD40リガンドタンパク質を加えずに得られた陰性対照の平均蛍光強度の値に基づいて算出する。各試験遮断剤のEC50は、結合曲線から算出する。さらなる開発のために適切な候補であるとみなされる試験遮断剤は、好ましくはEC50が≦１nMであるものである。
【０２２７】
実施例４:ヒト標的化遮断剤の交差反応性
非ヒト霊長類モデルが心筋梗塞の背景においてヒト共刺激分子(CD80、CD86、CD40)を標的にする遮断剤の機能性を確証するために適当であることを証明するために、候補遮断剤と霊長類抗原提示細胞(APC)との結合を、フローサイトメトリーにより評価する。
【０２２８】
樹状細胞をアカゲザルおよびヒト血液から、商業的に入手可能なキット(Miltenyi Biotec、オランダから購入)を用いる磁気活性化細胞選別法により単離する。単離樹状細胞画分を、実施例１のような先行する実施例において選択した遮断剤の存在下でインキュベートする。ヒトAPCを陽性対照として用いる。前記遮断剤と樹状細胞との結合は、適当な検出系の使用により明らかにする。遮断剤が抗体である場合、蛍光色素様フィコエリスリンと結合した適当な２次抗体を用いる。遮断剤がc-mycタグを有するナノボディ(登録商標)である場合、抗c-mycタグモノクローナル抗体を用いた後に、c-mycタグ抗体に対する蛍光色素標識抗体を用いる。可溶性受容体由来の遮断剤、例えばCTLA4-Igを用いる場合、モノクローナルマウス抗ヒトIgG1抗体(Sigma、#I2513)を２次抗体として加えた後に、抗マウス蛍光色素標識抗体を加える。遮断剤の結合は、BD FACSCanto(商標)IIを用いるフローサイトメトリーにより分析する。蛍光強度および標識細胞のパーセンテージは、BD FACSDiva(商標)ソフトウェアを用いて評価する。
これらの実験により、本発明の様々な実施形態において治療剤として有用であり得るヒト共刺激分子(CD80、CD86、CD40)を標的にする多くの遮断剤が、非ヒト霊長類抗原提示細胞(APC)にも結合できることが確認される。よって、アカゲザルモデルは、このような遮断剤の機能性を確証するために適当である。
【０２２９】
実施例５:一方向同種混合白血球反応(MLR)
本発明の様々な実施形態において治療剤として有用であり得るヒト共刺激分子(CD80、CD86、CD40)を標的にする遮断剤のインビトロ機能性、すなわちＴ細胞応答の誘導に干渉する遮断剤の能力を、一方向同種混合リンパ球反応により評価する。ヒトおよびアカゲザルモデルの両方を試験する。
【０２３０】
刺激集団および応答集団と称する２の異なるドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)を、それぞれ、10%胎児ウシ血清(FBS)を補った200μLのRPMI1640培地(Gibco)中で少なくとも３日間共培養する。刺激集団を、マイトマイシンでの処理により不活性化した後に、ウェルに加えて、応答集団に対して外来アロ抗原を単にもたらすようにする。実施例１および２で選択した遮断剤を、単独、または組み合わせ(すなわち異なる共刺激分子を標的にする)でウェルに加える。各条件を３重に反復する。応答集団からのCD4+およびCD8+ Ｔ細胞の増殖を、共培養の期間にわたって培養培地に加えた[3H]-チミジンの取り込みにより測定する。IL-2分泌を培養上清に対してELISAを行うことにより並行して測定する。この目的のために、R&D systems(ミネアポリス、ミネソタ)からの商業的に利用可能なキットを製造者の推奨に従って用いる。シクロスポリンを、アッセイにおける陽性対照として用いる。漸増用量の各遮断剤を共培養培地に加えてEC50を決定する。
【０２３１】
最も低いEC50を有する遮断剤は、インビボでの最も効力が高い共刺激経路阻害剤であると期待される。ナノモルまたは好ましくはナノモル以下の範囲のEC50を有し、非ヒト霊長類およびヒトモデルにおいて同等の結果を示す遮断剤を、インビボ実験を行うために選択する。
【０２３２】
実施例６:心筋梗塞の非ヒト霊長類モデルにおける心臓温虚血再灌流障害のインビボ処置
材料および方法
動物モデル
地域の施設動物保護および使用委員会(Institutional Animal Care and Use Comittee)の承認の後に、21匹のマカカ・ムラッタ(Macaca Mulatta)アカゲザルを研究に含める。動物は、梗塞時に完全に成長しており、８〜10 kgの平均体重である。
【０２３３】
心筋梗塞および試験物質送達
感覚喪失の誘導の後に、左冠動脈回旋枝における90分間のバルーン膨張により心筋梗塞を誘導する。血流の閉塞を、蛍光透視法により確認する。動物は、必要に応じて除細動する。虚血期間の終わりに、バルーンを縮小し、虚血領域に再灌流させる。動物を、次いで、４つの処置群に無作為に分ける:陰性対照(ｎ=６)、シクロスポリン(ｎ=５)、CTLA4-Ig (R&D systemsから購入) (ｎ=５)およびモノクローナル抗CD40抗体(R&D systemsから購入)と組み合わせたCTLA4-Ig (ｎ=５)。再灌流の少し前に、動物に生理食塩水もしくは注射用水のボーラス静脈内注射(媒体あたりｎ=３)、25mg/mLの濃度で食塩水に溶解した体重１kgあたり2.5 mgのシクロスポリン(シクロスポリン群) (Piotら、2012)または25mg/mlの最終濃度に注射用滅菌水で希釈した体重１kgあたり10 mgのCTLA4-Ig (CTLA4-Ig群)または上記のようにして希釈した体重１kgあたり10 mgのCTLA4-Igと10 mgの抗CD40抗体との組み合わせ(CTLA4-Ig + CD40 Ab群)を与える。
【０２３４】
心筋酵素の測定
血液試料を再灌流時点から再灌流の72時間後まで反復して採取する。心臓バイオマーカー、特にクレアチンキナーゼMB (CKMB)および心臓トロポニンＩ(cTnI)の血液レベルを、製造者の推奨に従ってMeso Scale Discoveryアッセイキットを用いて測定する。これらの測定を用いて、心筋梗塞後の梗塞サイズを評価する。
【０２３５】
磁気共鳴イメージング(MRI)
研究の設計は、４回のMRI分析を含む。心筋梗塞の誘導前に対照MRIを行い、ベースラインMRIを、次いで、梗塞の３±１日後に行い、フォローアップMRIを梗塞後14±１日に行い、最終MRIを行った後に梗塞後42±２日で犠牲にする。Siemens Magnetom Sonata 1.5 Tesla MRI装置を用いる。MRI活性電極、SpO2およびパルスセンサを取り付ける。CP Body Array Flex Coilを動物の胸部に取り付ける。syngo MR A30ソフトウェアを用いて画像を取り込む。シネ短軸画像を、レトロゲート(retrogated)配列を用いる心臓の機能分析のために取り込む。基部から頂部まで約８mmの薄片でこれを反復する。0.2 mmol/kgの用量のガドテリドールを0.05 mM/mlの濃度で２ml/sの速度で画像取り込みのために静脈内注射する。血液酸素飽和度、粘膜の色および脈拍数を規則的にモニタリングする。得られた画像をMedis QMass MR Research Editionソフトウェアにエクスポートして、左室(LV)容積、左室駆出率(LVEF)、壁運動、壁肥厚および梗塞サイズについて分析する。
【０２３６】
剖検および組織採集
最終MRIの最後に(梗塞の42日後)、動物を、外科的麻酔レベルに到達するまで静脈内(IV)でプロポフォールを与え、次いで、飽和塩化カリウムの致死的注射を急速ボーラスとしてIVで投与することにより安楽死させる。死亡は、心電図(ECG)上の心停止または心室細動の観察により確認する。
【０２３７】
瘢痕重量の推定
犠牲にした後に、心臓を摘出する。心房および大動脈を、房室溝にて心室から切り離す。心室を次いですすぎ、頂部から開始して約１cmの厚さの薄片に切る。心臓の薄片を、次いで、ガラスパネルの間に挟み、薄片の画像を得る。梗塞領域を含有する薄片を、画像分析ソフトウェアを用いて梗塞領域の面積および全断面積について手動で輪郭を描くことにより分析する。各画像について、梗塞面積および全心室断面を測定し、これらの表面の間の比を算出する。梗塞重量および容積の推定は、この比を薄片重量および厚さと組み合わせることにより引き出す。
【０２３８】
結果
CTLA4-Igのインビボ効力を、急性心筋梗塞の非ヒト霊長類モデルにおいて評価する。実施例４および５から、ヒトCD80およびCD86分子ならびに抗CD40抗体を標的にするCTLA4-Igがうまく霊長類分子を標的にすることが期待される。シクロスポリンは、急性心筋梗塞に罹患している患者において瘢痕サイズの低減を誘導することがすでに示されているので、陽性対照として用いる。
【０２３９】
評価される評価項目についてあるいくつかの実験において期待できるCTLA4-IgまたはCTLA4-Igと抗CD40抗体との組み合わせについての実施例の結果を図１〜７に示す。一次評価項目は、再灌流の少し後(72時間まで)での心筋酵素心臓トロポニンＩ(図２)およびクレアチンキナーゼ(図１)の血中レベルまたはより長い時間間隔(２ヶ月まで)(図６)の磁気共鳴イメージング(MRI)により測定される梗塞サイズの低減である。組織学的評価も犠牲にするときに行う(図７)。２次評価項目は、左室拡張末期容積(図４)、左室収縮末期容積(図５)および駆出率(図３)の測定によるMRIにより評価される心臓機能の改善に焦点を当てる。
【０２４０】
よって、本発明のいくつかの実施形態によると、急性心筋梗塞の説明的な背景において、CTLA4-Ig(共刺激経路B7:CD28の遮断による)および抗CD40抗体との組み合わせで投与されるCTLA4-Igは、心臓温虚血再灌流障害を処置でき、よって、心臓機能の改善を誘導し、心臓リモデリングを低下させ、瘢痕サイズを低減させる。
【図１】
2015117214.tif 000008
【図２】
2015117214.tif 000009
【図３】
2015117214.tif 000010
【図４】
2015117214.tif 000011
【図５】
2015117214.tif 000012
【図６】
2015117214.tif 000013
【図７】
2015117214.tif 000014
【配列表】
2015117214000001.app
【外国語明細書】
2015117214000001.pdf