(57)【要約】【課題】キトサン混合物からキトサンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製する方法を提供すること。【解決手段】式（Ｉ）：2015147751.tif 000005（式中、ｎは、２〜９の整数を示す。）で表されるキトサン混合物から、ｎが５〜９の整数であるキトサンオリゴ糖を単離精製する方法であって、  （１）該キトサン混合物の水溶液に両親媒性アニオンを加え、沈殿物を形成する工程；  （２）工程（１）で得られた沈殿物を有機溶媒に溶解し、不溶物を除去する工程；  （３）工程（２）で得られた有機溶液に塩酸を加え、沈殿物を形成する工程；および  （４）工程（３）で得られた沈殿物を回収する工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2015147751.tif 000004
（式中、ｎは、２〜９の整数を示す。）
で表されるキトサン混合物から、ｎが５〜９の整数であるキトサンオリゴ糖を単離精製する方法であって、
（１）該キトサン混合物の水溶液に両親媒性アニオンを加え、沈殿物を形成する工程；
（２）工程（１）で得られた沈殿物を有機溶媒に溶解し、不溶物を除去する工程；
（３）工程（２）で得られた有機溶液に塩酸を加え、沈殿物を形成する工程；および
（４）工程（３）で得られた沈殿物を回収する工程
を含む、方法。
【請求項２】
両親媒性アニオンがビス（２−エチルヘキシル）ホスフェートまたはビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機溶媒がアルコール類である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
単離精製されたｎが５〜９の整数であるキトサンオリゴ糖の純度が６０％以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンオリゴ糖の単離精製方法に関する。より詳細には、本発明は、キトサン混合物からキトサンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチンは、かにやえびなどの甲殻類の殻の主要な構成成分であり、これらの殻からたんぱく質やカルシウムを取り除いて精製される。キトサンは、キチンを苛性ソーダで脱アセチル化することにより製造されている。その誘導体を含め、それらの応用に関する研究は、本来廃棄される生物資源を有効利用する意味を持つ。また、その応用の途としては、健康食品や農業資材への利用などが知られている。
キトサンは、簡単に言えば、グルコサミンの重合体であり、塩酸塩の形態での化学構造は、式（Ｉ）：
【０００３】
【化１】
2015147751.tif 000002
【０００４】
で表すことができる（以下、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎと略す場合がある。ｎは重合度を示す）。ここで、キトサンオリゴ糖は本来ｎ＝５〜９程度のものを意味する。通常のキトサンはこれよりｎが大きく、水に溶けにくいため用途は限られる。一方、キトサンオリゴ糖は水に易溶のため、古くから機能性薬剤としての応用に興味が持たれている。ゆえに、これまで実験室的ないしは工業的にキトサンオリゴ糖が得られているが、従来技術ではｎ＝５〜９程度の（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎを主成分とする試料の調製は容易でなく、ｎ＝２〜９の（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎの混合物で、なおかつ、キチンオリゴ糖やタンパクの混入が懸念される試料をキトサンオリゴ糖と称しているのが実情であった。しかしながら、こうした試料を用いた植物病理学的研究から、キトサンオリゴ糖にエリシター（植物に病害抵抗反応を誘導する）活性が示唆されており（非特許文献１〜７）、純度の高いキトサンオリゴ糖試料が強く望まれている。
【０００５】
通常、天然物の単離精製はカラム精製といった、言わば物理的な分離法により行われる（特許文献１）。同法は一般にコストと時間を要し、純度と収率の両立にも難がある。ゆえに、従来技術では純度の高いキトサンオリゴ糖を得ることは現実的ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２９５０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mol. Plant Microbe Interact., 7, 531 (1994)
【非特許文献２】Appl. Biochem. Microbiol., 42, 200 (2006)
【非特許文献３】Plant Physiol. Biochem., 47, 724 (2009)
【非特許文献４】Curr Top Med Chem., 9, 1546 (2009)
【非特許文献５】Carbohydr. Polym., 81, 70 (2010)
【非特許文献６】Carbohydr. Polym., 82, 1 (2010)
【非特許文献７】Mar. Drugs., 27, 1482 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明は、キトサンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
キトサンオリゴ糖は酸性ないし中性溶液中では、多価陽イオン（ＧｌｃＮＨ＋）ｎとして存在する。本発明者らはこれまで、染料固着剤など、繊維用薬剤として用いられる多価陽イオンについて、対アニオンを置換することで従来型とは異なる物性とし、これに伴い新規応用の途を見出す試みを行ってきた（特許第５０１９３２５号；高分子論文集、２００８、６５、５８７）。その知見を（ＧｌｃＮＨ＋）ｎに適用したところ、（１）市販のキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎは２〜９の整数］の水溶液に両親媒性アニオン（Ｘ−）を加えると、（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎ（ｎは２〜９の整数）の沈殿物が得られる；（２）該沈殿物を有機溶媒と混合すると、ｎ＝５〜９の（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎは有機溶媒に再溶解するが、ｎ＝２〜４のものは溶解しにくい；（３）得られた有機溶液に塩酸を加えることで、ｎ＝５〜９の（ＧｌｃＮＨ＋）ｎは（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎとして再沈殿し、これを回収できる；との知見を得た。これらの操作により、キチンオリゴ糖やタンパクといった不純物も除去できることを認めたことから本発明に至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］式（Ｉ）：
【００１１】
【化２】
2015147751.tif 000003
【００１２】
（式中、ｎは、２〜９の整数を示す。）
で表されるキトサン混合物から、ｎが５〜９の整数であるキトサンオリゴ糖を単離精製する方法であって、
（１）該キトサン混合物の水溶液に両親媒性アニオンを加え、沈殿物を形成する工程；
（２）工程（１）で得られた沈殿物を有機溶媒に溶解し、不溶物を除去する工程；
（３）工程（２）で得られた有機溶液に塩酸を加え、沈殿物を形成する工程；および
（４）工程（３）で得られた沈殿物を回収する工程
を含む、方法；
［２］両親媒性アニオンがビス（２−エチルヘキシル）ホスフェートまたはビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートである、［１］に記載の方法；
［３］有機溶媒がアルコール類である、［１］または［２］に記載の方法；
［４］単離精製されたｎが５〜９の整数であるキトサンオリゴ糖の純度が６０％以上である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法は、キトサンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製することができ、また、キチンオリゴ糖やタンパクといった不純物も除去することができる。さらに、本発明の方法は、従来のカラム精製と比較して短時間（例えば、１時間以内；カラム精製は、通常１日以上）で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の好適な実施の形態として、実施例の操作手順を示す。
【図２】図２は、キトサン混合物［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝２〜９の整数］２１．５ｍｇを１ｍＬの純水に溶解した水溶液のクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、実施例１でキトサン混合物２１．５ｍｇから分離精製したキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を１ｍＬの純水に溶解した水溶液のクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、実施例２で分離精製したキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を１ｍＬの純水に溶解した水溶液のクロマトグラム（破線）および実施例３で分離精製したキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を１ｍＬの純水に溶解した水溶液のクロマトグラム（実線）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法は、以下の工程を含む。
（１）上記式（Ｉ）（式中、ｎは、２〜９の整数を示す。）で表されるキトサン混合物の水溶液に両親媒性アニオンを加え、沈殿物を形成する工程；
（２）工程（１）で得られた沈殿物を有機溶媒に溶解し、不溶物を除去する工程；
（３）工程（２）で得られた有機溶液に塩酸を加え、沈殿物を形成する工程；および
（４）工程（３）で得られた沈殿物を回収する工程。
【００１６】
工程（１）：
キトサン混合物［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝２〜９の整数］の水溶液に両親媒性アニオン（Ｘ−）を加えることにより、沈殿物［（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎ；ｎ＝２〜９の整数］を形成する。
両親媒性アニオンとしては、沈殿物［（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎ；ｎ＝２〜９の整数］を形成し得、かつ、工程（２）において、該沈殿物のうち、ｎ＝５〜９のものは有機溶媒に溶解するが、ｎ＝２〜４のものは有機溶媒に溶解しないものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、ビス（２−エチルヘキシル）ホスフェート、ビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネート、ドデシル硫酸アニオンなどが挙げられ、ビス（２−エチルヘキシル）ホスフェートおよびビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートが好ましい。両親媒性アニオンのカウンターカチオンとしては、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋などが挙げられる。また、それらの遊離酸形態に塩基性物質（例えば、酢酸ナトリウムなど）を共存させて用いても良い。
健康食品への利用における安全性の観点から、ビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネート（Ｎａ＋塩）がより好ましい。
両親媒性アニオンの使用量は、通常、キトサン混合物の重量１ｇに対し、４．７〜９．４ｍｍｏｌである。使用量が例えば４．７ｍｍｏｌ未満であると、不足分に応じてｎ＝２〜９の（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎの収率が低下する。両親媒性アニオンは、水または有機−水混合溶媒の溶液、ないしは水または有機−水混合溶媒の懸濁液の形態でキトサン混合物の水溶液に添加できる。ここで、有機溶媒としては、例えば、エタノール、アセトンなどが挙げられる。
形成した沈殿物の分離方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離、濾過などが挙げられる。
【００１７】
工程（２）：
工程（１）で得られた沈殿物［（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎ；ｎ＝２〜９の整数］を有機溶媒に溶解し、不溶物［（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎ；ｎ＝２〜４の整数］を除去する。この工程により、沈殿物［（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］は有機溶媒に溶解して溶液を形成する。
有機溶媒としては、ｎ＝５〜９の沈殿物を溶解するが、ｎ＝２〜４の沈殿物は溶解しないものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、アルコール類（エタノール、イソプロパノールなど）が挙げられる。
健康食品や農業資材などへの利用における安全性の観点から、エタノールが好ましい。
有機溶媒の使用量は、通常、キトサン混合物の重量１ｇに対し、５０〜５０００ｍＬである。使用量が例えば５０ｍＬよりも少ないと、ｎ＝５〜９の（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎの収率が低下し、５０００ｍＬよりも多いと、ｎ＝２〜４の（ＧｌｃＮＨ＋Ｘ−）ｎの除去率が低下する。
不溶物を除去する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離、濾過などが挙げられる。
【００１８】
工程（３）：
工程（２）で得られた有機溶液に塩酸を加えることにより、沈殿物［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を形成する。
塩酸の使用量は、通常、キトサン混合物の重量１ｇに対し、４．７〜４７ｍｍｏｌである。使用量が例えば４．７ｍｍｏｌより少ない、または４７ｍｍｏｌより多いと、ｎ＝５〜９の（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎの収率が低下する。
【００１９】
工程（４）：
工程（３）で得られた沈殿物［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を回収する。
回収方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、遠心分離、濾過などが挙げられる。
このようにして、キトサン混合物［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝２〜９の整数］から所望のキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を単離精製することができる。
【００２０】
また、工程（４）で回収した沈殿物に対し、工程（１）から（４）を繰り返すことにより、ｎ＝３〜４の（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎの除去率を高め、より精製されたキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を得ることができる。この場合、両親媒性アニオン、有機溶媒および塩酸の使用量は、初回の工程（１）〜（４）における使用量の半分程度でよい。
【００２１】
さらに、必要に応じて、工程（４）で回収した沈殿物を塩酸に溶解し、有機溶媒（例えば、エタノール）を加えて沈殿物を形成し、混合物を遠心分離し、上澄み液を除去し、得られた沈殿物を減圧下で乾燥することにより、さらに精製されたキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］を得ることができる。
【００２２】
本発明の方法により単離精製されたキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］の純度は、クロマトグラムの面積比から算出して、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上である。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
遠心分離は、日立工機社製遠心分離機ＣＦ１５ＲＸＩＩを用いて行った。
クロマトグラムは、以下の条件で測定した。
ＨＰＬＣ装置：東ソー株式会社、ＬＣ−８０２０
カラム：ＴＳＫ−ゲルアミド−８０カラム（４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．  Ｘ  ２５０ｍｍ）
温度：３０℃
移動相：０．２５ｍｏｌ／Ｌ  Ｈ３ＰＯ４水溶液／アセトニトリル（体積比４２／５８）
流速：０．８ｍＬ／分
検出：２１０ｎｍでの吸光度（Ａ２１０）
【００２４】
以下に記載する実施例の操作手順を図１に示す。
【００２５】
実施例１
工程（１）：
Ａｌｄｒｉｃｈ社のビス（２−エチルヘキシル）リン酸（３２．２ｍｇ）を０．０２ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）と混合し、ビス（２−エチルヘキシル）ホスフェートアニオン（ＢＥＨＰ−）溶液を調製した。
遠心分離管中、キトサン混合物（ヤヱガキ醗酵技研株式会社の市販キトサンオリゴ糖、商品名：Ｙ．Ｈ．キトサンオリゴ糖）の２１．５ｍｇを１ｍＬの純水に溶かした水溶液に、上記で調製したＢＥＨＰ−溶液１０ｍＬを加え、沈殿物が形成した。混合物を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去して沈殿物を得た。
【００２６】
上記キトサン混合物の水溶液のクロマトグラムを図２に示す。（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝２〜９の整数）を含むことが確認できるが、顕著な不純物ピークが見られると共に、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝５〜９の整数）のピークには不純物に由来すると思われるベースライン信号（破線）の印加も示唆される。また、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝２〜４の整数）の含有率が高い。
なお、単離精製前のキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］の純度（すなわち、キトサン混合物中のキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］の含有率）は、クロマトグラムの面積比から算出して、４５％であった。
【００２７】
工程（２）：
遠心分離管中、工程（１）で得られた沈殿物にエタノール（１０ｍＬ）を加え、混合物を３分間振盪し、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄み液を得た。
【００２８】
工程（３）および（４）：
遠心分離管中、工程（２）で得られた上澄み液に５ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μＬ）を加え、沈殿物が形成した。混合物を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去して沈殿物を回収した。
【００２９】
さらなる精製：
遠心分離管中、工程（４）で回収した沈殿物を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１００μＬ）に溶解し、エタノール（１０ｍＬ）を加え、沈殿物が形成した。混合物を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去して沈殿物を得た。得られた沈殿物を減圧（１０ｍｍＨｇ）下、５０℃で１時間乾燥し、キトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］（７．０ｍｇ）を得た。
【００３０】
得られたキトサンオリゴ糖を１ｍＬの純水に溶解した水溶液（７．０ｇ／Ｌ）のクロマトグラムを図３に示す。図２（キトサン混合物の水溶液のクロマトグラム）と比較して、不純物ピークは顕著に減少し、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝２）のピークはもはや観察されない。また、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝３または４）のピークも顕著に減少している。一方、図２のベースラインを考慮すれば、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝５〜９の整数）のピークの減少は顕著に認められず、これらの含有量が向上したと言える。
なお、得られたキトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］の純度は、クロマトグラムの面積比から算出して、７３％であった。
【００３１】
実施例２
実施例１の工程（１）〜（４）と同様にして得られた沈殿物に対し、以下の通り工程（１）〜（４）を繰り返した。
遠心分離管中、実施例１の工程（１）〜（４）と同様にして得られた沈殿物を０．５ｍＬの純水に溶かした水溶液に、実施例１の工程（１）で調製したＢＥＨＰ−溶液５ｍＬを加え、沈殿物が形成した。混合物を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去して沈殿物を得た。
遠心分離管中、上記で得られた沈殿物にエタノール（５ｍＬ）を加え、混合物を３分間振盪し、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄み液を得た。
遠心分離管中、上記で得られた上澄み液に５ｍｏｌ／Ｌ塩酸（５０μＬ）を加え、沈殿物が形成した。混合物を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去して沈殿物を回収した。
上記で回収した沈殿物を、実施例１のさらなる精製と同様にして精製し、キトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］（６．４ｍｇ）を得た。
【００３２】
実施例３
実施例１の工程（１）〜（４）をさらに繰り返したこと以外は実施例２と同様にして、キトサンオリゴ糖［（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ；ｎ＝５〜９の整数］（５．９ｍｇ）を得た。
【００３３】
実施例２および３で得られたキトサンオリゴ糖を１ｍLの純水に溶解した水溶液（それぞれ、６．４ｇ／Ｌおよび５．９ｇ／Ｌ）のクロマトグラムを図４に示す（実施例２：破線；実施例３：実線）。図３（実施例１で得られたキトサンオリゴ糖の水溶液のクロマトグラム）と比較して、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝３または４）のピークがさらに減少している。一方、（ＧｌｃＮＨＣｌ）ｎ（ｎ＝５〜９の整数）のピークの実質的な減少は認められず、これらの含有量がさらに向上したと言える。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の方法は、キトサンオリゴ糖を高純度および高収率で単離精製することができ、また、キチンオリゴ糖やタンパクといった不純物も除去することができる。さらに、本発明の方法は、従来のカラム精製と比較して短時間（例えば、１時間以内；カラム精製は、通常１日以上）で行うことができる。
【図１】
2015147751.tif 000006
【図２】
2015147751.tif 000007
【図３】
2015147751.tif 000008
【図４】
2015147751.tif 000009