(57)【要約】【課題】  本発明は、心臓前駆細胞・心臓幹細胞群を共通して制御することができ、胚性幹細胞から心臓前駆細胞への分化・誘導を運命づける制御因子を見出すことを課題とする。本発明はまた、そのような制御因子を使用して、高効率で心臓前駆細胞・心臓幹細胞を提供することができる方法を開発することもまた、課題とする。【解決手段】  本発明の発明者らは、心臓細胞において特徴的に発現している候補因子のスクリーニング研究を行ってきた。そして、心筋細胞に特徴的なマーカーとの共発現などの検索の結果から、最終的に15種の候補因子をピックアップし、それらの中から特に2つの因子が心臓幹細胞に共通する因子であることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞において発現された場合に、心臓前駆細胞または心臓幹細胞への分化・誘導を方向付ける機能を有する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列、を有するタンパク質。
【請求項２】
SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 3のヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 5のヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO: 7のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
未分化細胞が、初期胚細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞から選択される、請求項1または2に記載のタンパク質。
【請求項４】
未分化細胞において、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を発現する細胞を選択することを特徴とする、心臓前駆細胞または心臓幹細胞を取得する方法。
【請求項５】
未分化細胞が、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 3のヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 5のヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO: 7のヌクレオチド配列、を発現させて作成されたものである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
未分化細胞が、初期胚細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞から選択される、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
細胞の選択を、セルソーターにより行う、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
心筋細胞マーカーの産生をさらに検出する、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
心筋細胞マーカーが、Islet1、Nkx2-5、α-心臓アクチン、Brachyury T（BryT）、Flk1、Sca-1、c-kit、PDGFRa、Mesp1、Gscからなる群から選択される、請求項4〜8のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、これまで単離報告された心臓前駆細胞・心臓幹細胞を共通して制御することができ、胚性幹細胞から心臓前駆細胞に運命づけることができる制御因子を提供することに関する。本発明はまた、そのような制御因子を使用して、高効率に心筋前駆細胞・心臓幹細胞を誘導する方法を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
新生児における先天性心疾患や、成人における心不全などの心疾患は、比較的高頻度で発症する重篤な疾患であり、細胞が損傷または壊死することにより機能部分が失われるか、または形態学的に損失するという深刻な症状を伴うことが知られている。特に、心不全は、成人の死亡率では第2位の疾患であり、その原因解明と機能回復を目指した心臓/心筋再生研究は重要な課題とされている。
【０００３】
そのような心疾患に対する治療法は、損傷領域や損失部分を、生きている細胞で補うことであるが、心臓は再生能力の低い組織であることから、自らの力で回復することは難しい。そのため、これまでは、鬱血性心不全・房室ブロック時に投与されるβ遮断薬、血管拡張剤のACE阻害剤、Ca拮抗剤、強心剤等多くの薬剤が開発・使用されてきた。しかし、先天性心疾患、心筋梗塞による心室細胞損傷・壊死領域を患う患者の予後においては、外科的手術を行うか、または負担のかかる活動を控えるしか、現時点では対処する方法がない。
【０００４】
このような患者を治療するため、分化細胞や幹細胞を移植する方法が、有効なツールの一つであると考えられており、これまでも、骨格筋芽細胞移植や骨髄細胞移植、胚性幹細胞移植等の手法が試みられてきた。しかしながら、低接着性、低分化効率、他細胞分化への危険性等の問題があるために、著しい効果は報告されていない。心臓に移植された胚性幹細胞はテラトーマを形成することも知られており、実用化のためには、そのような癌化のリスクをクリアすることも必要である。また、将来性が期待されているiPS細胞においても、胚性幹細胞と同様な危険性が考えられている。そのため、このような幹細胞が示すリスクを解消しなければならないことが、臨床応用には大きな壁となっている。
【０００５】
この様なリスクを解消する方法の一つとして、心筋シート法が考案されている。この方法も将来性が期待できる方法であるが、患者本来の細胞群との不整脈発症の危険性とシート層構造への機能的な課題、単一心筋層が故の問題点が残されている。つまり、心筋細胞のみの移植は急性期には一過的な症状改善が見受けられ有効的な手段であるが、長期的な改善には疾患部位にあった心臓構成細胞を効率良く誘導し秩序良く配置する方法を考えなくてはならない。2011年に、線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導する方法が考案されたが、分化転換の効率が低く、成熟心筋には分化することが難しく、また分化転換に要する時間が非常に長い等の課題がクリアされていない。
【０００６】
近年、マウス胚やヒトにおいての心臓前駆細胞（Islet1陽性、Wt1・Tbx18陽性）の存在や、成人期の心臓に心筋細胞や血管系の細胞に分化しうる組織幹細胞（Sca-1陽性、c-Kit陽性）が存在することなど、心臓再生にはたらく心臓前駆細胞・心臓幹細胞の存在が明らかとなった。しかしながら、このような心臓前駆細胞・心臓幹細胞は、胚性幹細胞や人工幹細胞から分化させる場合に、分化制限があり、効率よく心筋細胞を誘導することができない。一方で、効率よく心臓前駆細胞を増殖・移植できれば、多くの心筋梗塞併発者や先天性心疾患の患者を救うことができる。
【０００７】
さらに、胚性幹細胞、骨髄細胞、臍帯血に含まれる幹細胞と、心臓前駆細胞との相違を理解することは、体性幹細胞の臨床応用のために大いに役に立つものと思われる。その為には、今まで単離報告された心臓前駆細胞・心臓幹細胞群を共通して制御することができ、胚性幹細胞から心臓前駆細胞への分化・誘導を運命づける制御因子を見出すことが重要である。
【０００８】
しかしながら、これまでのところ、心臓幹細胞研究では造血幹細胞の場合の様な絶対的な細胞表面抗原、誘導因子・維持因子が確立されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、心臓前駆細胞・心臓幹細胞群を共通して制御することができ、胚性幹細胞から心臓前駆細胞への分化・誘導を運命づける制御因子を見出すことを課題とする。本発明はまた、そのような制御因子を使用して、高効率で心臓前駆細胞・心臓幹細胞を提供することができる方法を開発することもまた、課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の発明者らは、心臓細胞において特徴的に発現している候補因子のスクリーニング研究を行ってきた。そして、心筋細胞に特徴的なマーカーとの共発現などの検索の結果から、最終的に15の候補因子をピックアップし、それらの中から特に2つの因子が心臓幹細胞に共通する因子であることを見出した。
【００１１】
具体的には、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を有するタンパク質が未分化細胞において発現された場合に、その未分化細胞が、将来的に心臓前駆細胞または心臓幹細胞への分化・誘導を方向付けられ、将来的に高確率で心臓の細胞に分化することを見出した。
【００１２】
このような知見に基づいて、本発明は一態様において、未分化細胞において発現された場合に、心臓前駆細胞または心臓幹細胞への分化・誘導を方向付ける機能を有する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を有するタンパク質を提供することができることを示した。
【００１３】
本発明の別の態様において、未分化細胞において、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を発現する細胞を選択することを特徴とする、心臓前駆細胞または心臓幹細胞を取得する方法を提供できることもまた示した。
【発明の効果】
【００１４】
心臓前駆細胞・心臓幹細胞は、胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞と比較して、分化・誘導が進んだフェーズにあり、移植した場合にも癌化せず、心臓構成細胞に分化するという特徴を有する。また、成体においても、心臓細胞に分化することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、見出された15種の遺伝子のうち、遺伝子A〜Eの発現を、Islet1遺伝子、Mlc2a遺伝子の発現と比較した図である。
【図２】図2は、遺伝子Cおよび遺伝子Dが、中胚葉マーカー因子の発現ピークよりも後期に、かつ、心筋マーカーの発現ピークよりは早期に、一峰性のピークを生じることを示す図である。
【図３】図3は、遺伝子Cと遺伝子Dのダブルホモノックアウトマウスの胚における表現型観察を行った結果を示す図である。
【図４】図4は、遺伝子C／遺伝子Dのダブルノックアウトマウスでは、Islet1陽性細胞も消失していたことを示す図である。
【図５】図5は、遺伝子Cと胚性心臓前駆細胞マーカーの代表であるIslet1とNkx2-5との発現様式の比較を示す図である。
【図６】図6は、GFP陽性細胞を胚性心臓前駆細胞特異的な細胞表面抗原であるcKitとPDGFRaで展開した結果を示す。
【図７】図7は、in vitro胚性幹細胞分化系を用いて、心筋細胞を誘導することができるかについて検討した結果を示す図である。
【図８】図8は、遺伝子Cを発現した後に得られた拍動性の細胞から採取した電位変化を示す図である。
【図９】図9は、拍動している細胞の中に、ペースメーカー細胞として機能している細胞も存在していることを示す図である。
【図１０】図10は、一度遺伝子C／遺伝子Dを発現した細胞が、心室全域に分化していることを示す図である。
【図１１】図11は、一度遺伝子C／遺伝子Dを発現した細胞が、心室全域に分化していることを示す図である。
【図１２】図12は、遺伝子Cの発現部位と、Isleet1の発現部位が重複していること、そして遺伝子Cの発現後にIslet1の発現が生じていることを示唆する図である。
【図１３】図13は、遺伝子Cを発現させた細胞には、その後PDGFRa、cKitなどの典型的な心筋マーカーをも発現することを示す図である。
【図１４】図14は、心筋への分化が、細胞内で発現される遺伝子Cの濃度に依存していることを示す図である。
【図１５】図15は、胚発生中の心臓における心臓前駆細胞の領域は、これまで知られていた領域よりも広範囲に及んでいることが示された。
【図１６】図16は、遺伝子Cが心臓内皮細胞において発現されていることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
心筋細胞のマーカーとして、これまでも多数の表面マーカーが調べられてきた。そのような心筋細胞のマーカーとして、Islet1、Nkx2-5、α-心臓アクチン、Brachyury T（BryT）、Flk1、Sca-1、c-kit、PDGFRa、Mesp1、Gscなどが知られている。
【００１７】
このうち、心臓の細胞は中胚葉性由来の細胞であることに基づいて、Flk1＋の細胞を選抜したのち、Islet1＋、Nkx2-5 weak、トロポニン（cTnt）−、そしてTbx5−という性質を有する細胞をさらに選抜することにより、心筋の前駆細胞・幹細胞を単離することを目指した。
【００１８】
そして、このようにして得られた細胞において、既知の心筋細胞マーカー以外のマーカー分子の中から、未分化細胞から心筋細胞への分化・誘導に重要な働きを有する制御因子を見出すことを目指して、強く発現している遺伝子をマイクロアレイ解析した結果、興味深い15個の遺伝子を単離することに成功した。
【００１９】
これらの15個の遺伝子の発現パターンをさらに詳細に確認し、初期胚における既知の中胚葉系マーカー（例えば、BryT、Mesp1、Gscなど）の発現ピークと同じか少し後の時期に、かつその後にピークを迎える心筋細胞マーカー（例えば、Islet1、Tbx5、Nkx2-5）などの発現ピークよりも前に発現ピークを迎えるという条件で、遺伝子発現が顕著に上昇している遺伝子の選抜を行い、特にこの条件にあう分子として、遺伝子Cおよび遺伝子Dという2種類の遺伝子を同定するに至った。
【００２０】
これらの遺伝子Cおよび遺伝子Dを解析したところ、遺伝子Cは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列またはSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、このタンパク質はSEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列またはSEQ ID NO: 3のヌクレオチド配列によりコードされていることが明らかになった。また、遺伝子Dは、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、このタンパク質はSEQ ID NO: 5のヌクレオチド配列またはSEQ ID NO: 7のヌクレオチド配列によりコードされていることが明らかになった。遺伝子Cと遺伝子Dは、互いに非常に類似した配列を有していた。
【００２１】
これらの遺伝子が、胚発生のあいだに心臓の発生にどのように関与するのかを調べるため、遺伝子Cまたは遺伝子Dを欠失したノックアウト動物を作出した。これらの動物の胚発生を行わせたところ、野生型と比較して、心臓の発生が顕著に抑制されることが明らかになった。このような特徴的な心臓発生の抑制は、心筋細胞マーカーであるIslet1のノックアウト動物の場合に生じた心臓発生の抑制と非常によく似た形態を示した。
【００２２】
このような結果から、遺伝子Cおよび遺伝子Dは、胚発生初期に発現量が一過性に増加し、心臓の発生に重要な機能を果たしていることが示された。
【００２３】
これらの知見から、本発明は一態様において、未分化細胞において発現された場合に、心臓前駆細胞または心臓幹細胞への分化・誘導を方向付ける機能を有する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列またはSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列（遺伝子C）またはSEQ ID NO: 6のアミノ酸配列またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列（遺伝子D）を有するタンパク質を提供することができることを示した。
【００２４】
このSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO: 8のアミノ酸配列を有するタンパク質は、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 3のヌクレオチド配列、SEQ ID NO: 5のヌクレオチド配列、またはSEQ ID NO: 7のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である。
【００２５】
本発明において未分化細胞という場合、生体内における初期胚細胞だけではなく、in vitro系において未分化の幹細胞（例えば、胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞）が含まれる。例えば、初期胚という場合、胚発生の中での現象としては、遺伝情報を正確に複製し、同時に細胞の状態を未分化な状態から分化を誘導する状態へと急激に変換させる時期であり、例えば、マウス、ラットにおいては受精後2〜5日の時期のことをいう。また、in vitro系の未分化な細胞としては、例えば、胚性幹細胞に対して心筋誘導処理を行い、その開始後3〜5日の時期にある細胞のことをいう。
【００２６】
本発明の遺伝子Cおよび遺伝子Dは、中胚葉系細胞マーカーとして知られているBrachyury T（BryT）、Mesp1、およびGscなどとほぼ同じタイミングで発現される。一方、心筋細胞マーカーとして知られているIslet1、Nkx2-5、およびα-心臓アクチンなどのマーカーと比較して、早い時期に発現される。
【００２７】
本発明の別の態様において、未分化細胞において、遺伝子Cのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 4）または遺伝子Dのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 6またはSEQ ID NO: 8）を発現する細胞を選択することを特徴とする、心臓前駆細胞または心臓幹細胞を取得する方法を提供できることもまた示した。
【００２８】
上述したように、遺伝子Cまたは遺伝子Dは、心筋の形成に中心的な役割を果たす遺伝子であることが明らかになった。そのため、未分化な細胞であっても、これらの遺伝子が発現していることをきっかけにして、高い確率で心臓幹細胞・心臓前駆細胞を経て、心筋細胞へと分化する細胞を選抜することができることが明らかになった。
【００２９】
このような細胞の選択は、特定したい心筋細胞表面マーカーを利用して、セルソーターにより行うことができる。たとえば、目的とする心筋細胞表面マーカーに対する抗体に対して検出可能な標識を複合化させ、その標識を利用して、細胞を選別することができる。あるいは、目的とする心筋細胞表面マーカーの遺伝子に対してGFPなどの標識タンパク質をコードする遺伝子を融合し、細胞にトランスフェクトし、その細胞内で発現させた標識タンパク質を利用して細胞を選抜することもできる。
【００３０】
本発明においては、遺伝子Cまたは遺伝子Dを検出することに加えて、心筋細胞マーカーとして一般的に知られているマーカー分子の産生をさらに検出することにより、心臓前駆細胞・心臓幹細胞をさらに高確率で選抜することができる。一般的に、生体の発生においてある分子が機能を果たしている場合、一つの分子が複数の役割を果たしていることがしばしば知られている。そのため、遺伝子Cや遺伝子Dについても、心臓の発生以外の場面で使用されている可能性が否定できない。そこで、他の心筋細胞マーカーを同時に使用して調べてみれば、より正確に心臓前駆細胞・心臓幹細胞を選抜することが可能になる。
【００３１】
このような心筋細胞マーカーとしては、Islet1、Nkx2-5、α-心臓アクチン、Brachyury T（BryT）、Flk1、Sca-1、c-kit、PDGFRa、Mesp1、Gscなどを例としてあげることができる。
【実施例】
【００３２】
本明細書は、以下において、さらに詳細に本発明を説明する。
【００３３】
実施例1：心臓前駆細胞・心臓幹細胞共通に発現する因子の選別法
1-1：Flow Cytometryを用いた候補因子の単離
本実施例において、心臓前駆細胞は中胚葉性由来であることから、3つの細胞マーカーを組み合わせることで目的とする細胞の単離を行った。
【００３４】
Flk1は、様々な前駆細胞マーカーであり、そして心臓前駆細胞マーカーでもあることから、細胞マーカーの一つとして、Flk1陽性である細胞を単離する必要がある。次に、別の二つの心臓前駆細胞マーカーIslet1（神経運動ニューロンの幹細胞マーカーでもある）とWt1（造血幹細胞マーカーとして知られている）の遺伝子座上に蛍光タグ（YFPまたはEGFP）をノックインしたトランスジェニックマウスを用いて、YFP陽性またはGFP陽性である細胞群を選別した。
【００３５】
このような細胞群のなかで、強く発現している遺伝子をマイクロアレイ解析した結果、興味深い15種の遺伝子を単離することに成功した。すなわち、定量RT-PCRの結果、この細胞群はIslet1強陽性、Nkx2-5弱陽性、Tbx5陰性、心トロポニン陰性であることが確認され、第二心臓予定領域にて発現する特徴的な転写因子群あるいはエピジェネティック因子群の全15種の遺伝子で強い発現が観察された。
【００３６】
1-2：胚発生過程における組織学的解析
1-1において見出された15種の各遺伝子の組織における発現パターンを、組織学的に確認したところ、胚発生過程で心臓前駆細胞が多く存在するIslet1発現領域と酷似していた（図1）。図1は、15種の遺伝子のうち、遺伝子A〜Eの発現を、Islet1遺伝子、Mlc2a遺伝子の発現と比較したものである。
【００３７】
この結果、遺伝子A〜Eはいずれも、第2心臓予定領域（図1の遺伝子A〜Eの組織写真の赤線により囲った部分）にて強く発現しており、この発現場所は、Islet1 遺伝子の発現場所と類似していた。これらの遺伝子のうち、遺伝子CおよびDは、特に胚発生初期から発現することが明らかになった。
【００３８】
1-3：ES細胞分化誘導系における時系列的な発現変化
次にこれらの遺伝子がES細胞分化系においても心臓誘導時期以前に発現し、筋分化後に減少していくのかを確かめるため、この実施例においては、ES細胞を用いて心筋誘導を引きこしてから、主要遺伝子の時系列的な発現パターンを調べた。その結果、中胚葉マーカー因子として知られている因子（(BryT、Mesp1、Gsc）の発現ピークは、ES細胞への心筋誘導を行った後、非常に初期（3〜4日後）の段階で一過性のピークを生じることが明らかになり、一方心筋細胞マーカーとして知られているIslet1遺伝子の発現ピークは、心筋誘導から5〜6.5日目ころに生じることがわかった（図2（A））
これに対して、1-1において得られた15種の遺伝子を調べたところ、特に遺伝子CおよびDが、中胚葉マーカー因子（BryT、Mesp1、Gsc）の発現ピークよりも後期に、かつ、Islet1の発現ピークよりは早期に、一峰性のピークを生じることが見出された。遺伝子CおよびDの発現の時系列的な変化は、中胚葉マーカーよりも後期に発現され、一方心筋マーカー（Tbx5やα-心臓アクチン、Nkx2-5）の発現が上昇し、心筋分化が起る誘導6日目以降は発現が減少し、その後計測限界以下となり消失する、という、特徴的な変化を示した（図2（B））。
【００３９】
これらの発現結果から、遺伝子CおよびDは心臓誘導（誘導6日目）以前に働くと考えられ、すなわちこれらの遺伝子を誘導初期に発現する細胞は、心臓幹細胞の定義に沿うものであると考えた。
【００４０】
1-4：遺伝子Cおよび遺伝子Dノックアウトマウスの作製と形態異常からの考察
次に、遺伝子Cおよび遺伝子Dを発現する細胞が心臓幹細胞であるなら、これらの遺伝子を破壊することにより、心臓形成に異常が生じなければならない。よって、本実施例においては、遺伝子Cおよび遺伝子Dについての遺伝子ノックアウトマウスを作製し、ハイ発生時の形態観察を行うとともに、遺伝子発現の経時的変化を調べた。遺伝子Cおよび遺伝子Dに関しては、Baygenome gene trapラインマウスにより遺伝子破壊マウスの作製を試みた。
【００４１】
遺伝子Cと遺伝子Dは同じファミリーに属する因子であることから、遺伝子Cと遺伝子Dのダブルホモノックアウトマウスを作製し、胚における表現型観察を行った。図3（B）の右図で示すように、遺伝子C／遺伝子Dのダブルノックアウト（DKO）マウスは、流出路と右室予定領域が完全欠損し、胚性9.5日までに致死となった。このような表現型は、心臓前駆細胞マーカーIslet1のノックアウトマウス（Islet1 KOマウス）のそれと酷似していた（図3（A））。
【００４２】
実際、遺伝子C／遺伝子Dのダブルノックアウトマウスでは、正常動物において存在していた心臓（図4（A））の流出路におけるIslet1陽性細胞が、Islet1のノックアウトのノックアウトマウス（図4（B））と同様に、消失していた（図4（C））。これらのことから、遺伝子Cおよび遺伝子Dは、機能的な観点から見て、Islet1の上流に位置する遺伝子であると考えられた。
【００４３】
1-5：遺伝子Cと胚性心臓前駆細胞Islet1/Nkx2-5との発現様式
これらの結果から、遺伝子Cおよび遺伝子Dが心臓前駆細胞・幹細胞特異的に発現するのか否かを判断するために、次に2つの実験系を構築した。1）内在性の遺伝子Cおよび遺伝子Dの発現様式の観察を行うための実験系。2）遺伝子Cおよび遺伝子Dの遺伝子座にGFPをノックインしたトランスジェニックマウスを作製し、GFP陽性細胞を単離した後、再培養する必要性を確認するための実験系。
【００４４】
本実施例ではまず、遺伝子Cと胚性心臓前駆細胞マーカーでの代表であるIslet1とNkx2-5との発現様式の観察をおこなった。ノックインマウスに関しては、遺伝子CについてはノックインGFPマウスを作製し、一方遺伝子DについてはlacZノックインマウスを作製した。
【００４５】
遺伝子Cに対する抗体で内在性の発現様式を調べたところ、第2心臓予定領域（SHF）にて発現するIslet1（図5（B）赤色）と酷似していた（遺伝子Cは図5（A）緑色）。Nkx2-5（図5（C）白色）よりもSHFで広く発現しており、心臓前駆細胞マーカーの可能性が示唆された。図5（D）〜（F）は、それぞれの傾向の重ね合わせ画像を示しており、図5（D）は遺伝子CとIslet1との重ね合わせ画像を、図5（E）はIslet1とNkx2-5との重ね合わせ画像を、そして図5（F）は遺伝子C、Islet1そしてNkx2-5の重ね合わせ画像を、それぞれ示している。
【００４６】
実施例2：心臓前駆細胞の培養と高効率心臓分化方向の開発
2-1：ノックインGFPマウスからのGFP陽性細胞の単離と培養による評価
遺伝子C陽性細胞が心臓前駆細胞として性質を持っているのか明らかにするために、本実施例においては、GFPノックインマウスを作製し、GFP陽性細胞をFACSを用いて単離することを試みた。
【００４７】
GFP陽性細胞を胚性心臓前駆細胞特異的な細胞表面抗原であるcKitとPDGFRaで展開したところ、GFP+、GFP+；cKit+、GFP+；PDGFRa+の3パターンに分かれた（図6（A））。興味深いことに、GFP+陽性細胞ではIslet1の強い発現が見受けられた（図6（B））。このことから、遺伝子C／遺伝子D陽性細胞は、既知の心臓幹細胞マーカーに共通の因子であることが分かった。さらに、遺伝子C／遺伝子D陽性細胞をセルソーターで選別単離後、再培養すると拍動する心筋：心トロポニン陽性細胞が90%の確率で分化してきた。
【００４８】
2-2：遺伝子C／遺伝子D陽性細胞分化系による効率よい心筋誘導方法の樹立
本実施例においては、in vitro胚性幹細胞分化系を用いて、心筋細胞を誘導することができるかについて検討した。ES細胞に対して、遺伝子C-EGFPをトランスジェニックして、組換え細胞を作製した。
【００４９】
この細胞を図7（A）に示すスケジュールで培養したところ、培養10日目の時点で、遺伝子C／遺伝子D陽性細胞が心筋分化するのか調べた。その結果、遺伝子Cを発現した細胞は、2-1と同様に、ほとんどの細胞においてトロポニン（cTnt）についても陽性であることが示され（図7（B）上）、一方、遺伝子Cを発現しなかった細胞ではcTnt陽性細胞は非常に限られていることがわかった（図7（B）下）。
【００５０】
さらに、拍動性のコロニーの細胞の由来を確認したところ、拍動しているコロニーのうち80％が遺伝子Cを発現下細胞であることも示された（図7（C））。
【００５１】
また、遺伝子C-GFPを発現した細胞をセルソーターにより選抜し、培養を行った場合、培養0日目では発現していなかった心筋マーカーや心臓前駆細胞マーカーが、培養4日目には発現していることが明らかになった（図7（D））。
【００５２】
したがって、これらの結果から、遺伝子C／遺伝子Dを初期に発現した細胞は、その後心筋細胞マーカーや心臓前駆細胞マーカーなどを発現し、かつ機能的にも正常な心筋最奥と同じ機能を有するに至ることが明らかになり、将来的には遺伝子C／遺伝子D陽性細胞を収集して、移植することにより、臨床応用を行うことが期待される。
【００５３】
次に、このようにして得られた拍動性の細胞から電位変化を採取したところ、一定のリズムで拍動を繰り返していることが明らかになった（図8左側）。この拍動している細胞に対して、IK1（膜静止電位の維持活動電位のプラトー層の形成に作用する内向き整流K+電流）の阻害剤であり、心筋毒性を有する、塩化バリウム（BaCl2）を0.2 mM添加したところ、拍動がほぼ停止した（図8中程）。そしてその後、塩化バリウムを洗浄除去したところ、拍動が再開され、再開後の拍動も一定のリズムで繰り返されていることがわかった（図8右側）。さらに拍動している細胞の状況を詳細に検討したところ、ペースメーカー細胞として機能している細胞も存在しており（図9）、遺伝子Cを発現した細胞は、洞結節にも分化しうる細胞であることが明らかになった。
【００５４】
2-3：遺伝子C、遺伝子Dの心臓形成領域と分化細胞
マウスでは遺伝子C／遺伝子D遺伝子座にcreERを挿入し、レポーターマウスと呼ばれるROSA-RFP（またはlacZ）と交配することで、遺伝子Cまたは遺伝子Dを発現した細胞の分化後の系譜をすることが可能である。これにより、実際生体内でどこの細胞に分化したのか、明らかに出来る。
【００５５】
この方法を用いて一度遺伝子C／遺伝子Dを発現した細胞のその後の分化状態追跡を行なったところ、心室全域に分化していることが示された（図10および図11）。つまり、遺伝子C／遺伝子D陽性細胞は心臓前駆細胞・心臓幹細胞共通に必須な因子であり、これを指標にすることで、効率よく心臓構成細胞を樹立できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明が実用化されれば、心筋損傷患者・先天性心疾患患者を救うための、細胞ソースまたはバイオパーツを供給することができるようになる。
【００５７】
これまでも、心臓疾患の治療のために、人工心臓やペースメーカ機器、人工弁などの人工パーツは既に利用されてきたが、これらの人口パーツを使用する場合に、ほぼ5年おきに交換を迫られていたり、恒常的に取り付けておかないといけないなどの問題点が指摘されていた。これに対して、生体パーツであれば、患者個人の組織から構築するため、免疫拒絶問題を生じることもなく、経年劣化の問題もない。また、心臓前駆細胞・心臓幹細胞は保存が可能であり、かつ、サイトカイン応答が良いため必要時に応じて使用可能であるといった効果も期待できる。
【００５８】
また、本発明の遺伝子Cが発現することにより、そのような細胞が、効率よく、心筋はじめ、ペースメーカー細胞まで、心臓構成細胞に分化する。この細胞を利用することにより、より心筋分化を促進する因子や、ペースメーカー誘導因子、心臓平滑筋、心内皮に分化させる因子のスクリーニングに効果的である。また、心筋誘導後負荷をかけ肥大化を引き起こし、その影響をレスキュー出来る因子のスクリーニングにも利用できる。
【００５９】
さらに、本発明の方法を用いることにより、心疾患患者本人の皮膚または線維芽細胞から心臓幹細胞を樹立することができるという大きなメリットも存在する。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
SEQ ID NO: 1：マウス由来の遺伝子Cをコードするヌクレオチド配列；
SEQ ID NO: 2：マウス由来の遺伝子Cのアミノ酸配列；
SEQ ID NO: 3：ヒト由来の遺伝子Cをコードするヌクレオチド配列；
SEQ ID NO: 4：ヒト由来の遺伝子Cのアミノ酸配列。
【００６１】
SEQ ID NO: 5：マウス由来の遺伝子Dをコードするヌクレオチド配列；
SEQ ID NO: 6：マウス由来の遺伝子Dのアミノ酸配列；
SEQ ID NO: 7：ヒト由来の遺伝子Dをコードするヌクレオチド配列；
SEQ ID NO: 8：ヒト由来の遺伝子Dのアミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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