(57)【要約】【課題】全細胞百日咳抗原を含む混合ワクチンの提供。【解決手段】本発明では、（ａ）Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨｅｐＢ−Ｈｉｂ抗原と（ｂ）１つ以上の髄膜炎菌結合体抗原を含むワクチンを研究している。これらのワクチンについての多数の改良およびバリエーションを発見している。上記ワクチンは、２つの成分：（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原を含む第１の成分と；（ｂ）Ｈｉｂ結合体と１つ以上の髄膜炎菌結合体を含む第２の成分を一緒に混合することによって、使用時に即座に調製することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明は、１つ以上の病原体に由来する複数の抗原の混合物が含まれているワクチンである、混合ワクチンの分野にある。その結果、ワクチンの投与によって、１つ以上の病原体に対して被験体を同時に免疫化することができる。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
混合ワクチンにより、患者には、投与される注射の回数が減少するという利点がもたらされる。これは、承諾が多く得られるとの臨床的利点につながる（例えば、非特許文献１（参考文献１）の第２９章を参照のこと）。
【０００４】
特に懸念される（特に、子供において）６種類の病原体は、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリアの原因）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）（破傷風／開口障害の原因）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳）、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨｅｐＢ」、ウイルス性肝炎）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（「Ｈｉｂ」、細菌性髄膜炎および肺炎の原因）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（髄膜炎菌性髄膜炎および敗血症）である。
【０００５】
これらの病原体のそれぞれに対するワクチンは公知であり、同時に混合して投与するための５種類の「Ｄ」、「Ｔ」、「Ｐ」、「ＨｅｐＢ」、および「Ｈｉｂ」成分の全てが含まれている５価のワクチンは、ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／Ｈｉｂの名称でＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって販売されている。この５価のワクチンの中の「Ｐ」成分は、全細胞百日咳（「Ｐｗ」）抗原をベースとする。このワクチンのＤＴＰとＨｅｐＢ成分はバイアルの中の混合溶液の中にあるが（そして、この４価のＤＴＰｗ−ＨｅｐＢ混合物は、「ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ」製品として別々に市販されている）、Ｈｉｂ成分は凍結乾燥された状態であり、別のバイアルの中に含まれている。ＤＴＰｗ−ＨｅｐＢ溶液は、使用時にＨｉｂ成分を再構成させるために使用され、これにより、バイアルの中に５価のワクチンが即座に形成される。
【０００６】
ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／Ｈｉｂは髄膜炎菌感染から防御することはできない。
【０００７】
特許文献１（参考文献２）の実施例３にはヒトでの臨床試験の結果が開示されている。ここで、４価のＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ製品が、Ｈｉｂに由来する、ならびに、髄膜炎菌の血清群ＡおよびＣ（「ＭｅｎＡ」および「ＭｅｎＣ」）に由来する結合された莢膜糖と即座に混合された。著者らにより、この５価の混合物によって個々の抗原に対する良好な免疫応答が誘導され、そしてこれに対しては幼児も十分な耐容を示したことが報告された。Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣ成分の完全な詳細は提供されていない。同様の情報が非特許文献２（参考文献３）および非特許文献３（参考文献４）に報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／００２４９号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編）、第４版、２００４、ＩＳＢＮ：０−７２１６−９６８８−０
【非特許文献２】Ｇａｔｃｈａｌｉａｎら（２００４）Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅのアブストラクトＳＩ−６８
【非特許文献３】Ｇａｔｃｈａｌｉａｎら（２００４）Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅのアブストラクトＳＩ−６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ菌ｂ型（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の６種類全てに対する防御のためのさらに改良された混合ワクチンを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨｅｐＢ−Ｈｉｂが含まれており（ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／Ｈｉｂ製品の中と同様に）、そして、１つ以上の髄膜炎菌結合体抗原もまた含まれている、ワクチンの研究に基づく。
【００１２】
これらのワクチンについての多数の改良とバリエーションが発見されており、これらは本発明の主題である。
【００１３】
本発明のワクチンには以下が含まれる：
（ｉ）ジフテリアトキソイド、「Ｄ」；
（ｉｉ）破傷風トキソイド、「Ｔ」；
（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、「ｗＰ」；
（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、「ＨＢｓＡｇ」；
（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖
（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖。
【００１４】
髄膜炎菌の糖は、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹの１つ以上に由来し得る。一般的な命名法では、これらの４種類の血清群は、「ＭｅｎＡ」、「ＭｅｎＣ」、「ＭｅｎＷ１３５」、および「ＭｅｎＹ」と呼ばれる。結合体抗原は、通常、本明細書中では「ＭｅｎＡ−Ｘ」などと呼ばれ、ここで、「Ｘ」は結合体のキャリアタンパク質を示す。したがって、特異的なキャリアタンパク質との結合体は、「ＭｅｎＡ−ＣＲＭ」または「ＭｅｎＣ−Ｄ」など呼ばれる。
【００１５】
好ましいワクチンには、少なくとも血清群Ｃについての髄膜炎菌結合体が、そして好ましくは、血清群ＡとＣの両方についての髄膜炎菌結合体が含まれる。したがって、好ましいワクチンは６価（Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ）または７価（Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＡ−ＭｅｎＣ）である。
【００１６】
上記に列挙された抗原（ｉ）から（ｖｉ）に加えて、さらなる抗原もまた存在する場合があり、例えば、８価、９価、１０価などのワクチンが得られる。
【００１７】
本発明のワクチンは、製造の間に液体の形態で調製することができ（すなわち、全ての抗原が水溶液または懸濁液の中に存在している場合）、また、これらは、２つの成分：（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原を含む第１の成分と；（ｂ）Ｈｉｂ結合体と１つ以上の髄膜炎菌結合体を含む第２の成分を一緒に混合することによって、使用時に即座に調製することもできる。２つの成分は、好ましくは別の容器（例えば、バイアルおよび／または注射器）の中にあり、そして本発明によって、成分（ａ）と成分（ｂ）が含まれているキットが提供される。第１の容器の内容物は、好ましくは水性であり、第２の容器の内容物は、好ましくは凍結乾燥されており、その結果、本発明のワクチンは、凍結乾燥された成分を、水性のＤ−Ｒ−ｗＰ−ＨＢｓＡｇ成分で再構成することによって調製することができる。
【００１８】
（１）Ｈｉｂ結合体の重量比
Ｈｉｂ結合体は周知であるが、これらはさまざまな形態で供給される。例えば、参考文献１の表１４−７には、４種類の異なるＨｉｂ結合体の特徴が提供されている。この表では、糖：キャリアの重量比が、「ＰＲＰ−Ｄ」での１．４：１（過剰量の糖）から「ＰＲＰ−ＯＭＰ」での０．０６：１（過剰量のタンパク質）の間で変化することが報告されている。これらの結合体は全て、混合ワクチンにおいて使用されているが、本発明の１つの態様では、髄膜炎菌結合体が含まれている混合ワクチンでの使用に特異的な重量比の範囲が選択される。
【００１９】
Ｈｉｂ結合体におけるキャリアタンパク質対糖の重量比は、混合ワクチンの効力において重要な役割を担うことが報告されている。参考文献５にしたがうと、キャリアタンパク質が抗原としても存在している混合ワクチン（例えば、破傷風トキソイドが、本発明におけるように、キャリアとして、かつ抗原として使用される場合）においては、Ｈｉｂ結合体は、１：０．３から１：２の間の糖：キャリアの重量比を有しているはずである。
【００２０】
対照的に、本発明にしたがうと、糖対キャリアの重量比はこの範囲を超えてもよく、そして１：２から１：４の範囲の間である。この範囲にあるＨｉｂ結合体は、小児用の混合ワクチンにおいて髄膜炎菌結合体と混合されると優れた免疫原性を示し、そして、キャリアタンパク質がまた遊離の抗原としても存在している場合（例えば、キャリアタンパク質が破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドである場合）にもなお、どのような免疫緩衝によっても損なわれることはない。実際、さらなるキャリアタンパク質が、例えば、破傷風またはジフテリアに対する免疫性に関係している可能性がある。
【００２１】
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、糖に対して過剰な重量のキャリアを有していることを特徴とする。ここで、キャリア対糖の重量比は、２：１から４：１の間である。
【００２２】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程（この場合、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体は糖に対して過剰な重量のキャリアを有しており、２：１から４：１の間のキャリア対糖の重量比を有している）；および（ｃ）Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を結合体成分と混合して、混合ワクチンを得る工程が含まれることを特徴とする。
【００２３】
Ｈｉｂ結合体は過剰な重量のキャリアタンパク質を有する。重量比は２：１から４：１であり、好ましくは、２．５：１から３．５：１の間である。２．８：１から３．２：１の間の重量比を使用することができ、そして、約３：１の重量比が好ましい。したがって、１０μｇ（糖として測定される）の典型的な用量では、本発明の組成物には、２０〜４０μｇの間のキャリア、好ましくは、約３０μｇのキャリアが含まれるであろう。この割合は、参考文献５の教示とは正反対である。
【００２４】
Ｈｉｂ結合体についてのキャリアタンパク質は、好ましくは、破傷風トキソイドであり、そして１０μｇのＨｉｂ糖については、組成物には、Ｈｉｂ結合体に由来する２０〜４０μｇの破傷風トキソイドと、さらに、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）感染を防御するための「Ｔ」抗原としてのさらなる破傷風トキソイドが含まれ得る。
【００２５】
好ましい組成物およびプロセスでは、血清群Ｃの髄膜炎菌結合体が使用される。より好ましい組成物およびプロセスでは、血清群ＡとＣの両方に由来する異なる髄膜炎菌結合体が使用される。これらは、好ましくは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄキャリアに結合されるが、これらはまた、破傷風トキソイドキャリア、ジフテリアトキソイドキャリア、またはＣＲＭ１９７キャリアに結合される場合もある。
【００２６】
（２）Ｈｉｂ結合体の中でのキャリア／糖の結合
参考文献１の表１４−７に示されているように、多種多様な結合化学反応が、Ｈｉｂ結合体を生じるために使用されている。いくつかの結合体は糖が活性化されることによって形成され、いくつかはキャリアが活性化されることによって、そしていくつかは両方が活性化されることによって形成される。糖の活性化には、周期的なもの（ｐｅｒｉｏｄｉａｔｅ）および炭水化物が、「ＨｂＯＣ」製品の中で使用され、そしてＡＤＨ、ＣＮＢ、およびカルボジイミドＨＣｌが、「ＰＲＰ−Ｔ」製品の中で使用される。これらの結合体は全て、混合ワクチンにおいて使用されているが、本発明の１つの態様では、髄膜炎菌結合体が含まれている混合ワクチンにおいて使用される特異的なタイプの結合が選択される。
【００２７】
本発明にしたがうと、多糖が、臭化シアンを使用して最初に活性化され得、その後、アジピン酸リンカーに対してカップリングされ得、そしてこのリンカー−糖構成要素が、キャリアタンパク質と、具体的には、破傷風トキソイドキャリアタンパク質と反応され得る。
【００２８】
第１の工程には、以下に示されるようなＨｉｂ糖上の遊離の−ＯＨ基のシアニル化（ｃｙａｎｙｌａｔｉｏｎ）が含まれる：
【００２９】
【化２】
2015034178.tif 000003
この反応は、臭化シアン（ＣＮＢｒ）を使用して行われる。簡単に説明すると、ＣＮＢｒが、酸性条件（通常は、ｐＨ１０から１２）下で糖と反応される。この高いｐＨでは、シアン酸エステルが、糖のヒドロキシル基を用いて形成される。この高いｐＨはヒドロキシル基をイオン化して、シアン酸イオン上のヒドロキシルイオンの求核攻撃を可能にする。高いｐＨの理由から、様々な副反応が起こる可能性があるが、シアン酸エステルの形成だけが本発明の主題である。
【００３０】
シアン酸エステルは、キャリアへの連結のためのスペーサーを提供するために、２官能性試薬（ヘテロ二官能性、または好ましくは、ホモ二官能性）と反応される。本発明にしたがうと、アジピン酸ヒドラジドスペーサーを使用することができる。これは、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤＨ）：
【００３１】
【化３】
2015034178.tif 000004
を使用することによって簡単に行うことができる。
【００３２】
シアン酸エステルとのＡＡＤＨ反応（イミドカルバメート結合を形成させるための）の機構は以下のように説明することができる：
【００３３】
【化４】
2015034178.tif 000005
その後、活性化された糖は、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）：
【００３４】
【化５】
2015034178.tif 000006
の存在下で破傷風トキソイドキャリアと反応される。
【００３５】
ＥＤＡＣは、通常、その塩酸塩の形態：
【００３６】
【化６】
2015034178.tif 000007
で使用される。
【００３７】
ＥＤＡＣにより、アジピン酸リンカーの遊離の末端にあるカルボキシル基がキャリアタンパク質（通常は、アミノ酸側鎖上の遊離の−ＳＨ、−ＮＨ２、または−ＯＨ）と反応することが可能になり、以下のように説明することができる結合体が形成される。式中、−Ｘ−は、キャリアを起源とする−Ｓ−、−Ｏ−、または−ＮＨ−である：
【００３８】
【化７】
2015034178.tif 000008
水性条件下では、Ｃ＝ＮＨをＣ＝Ｏに転換させることができ、カルバミン酸塩が得られる：
【００３９】
【化８】
2015034178.tif 000009
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、（ａ）臭化シアンでインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖を活性化させて、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルに対してアジピン酸ヒドラジドスペーサーを付加して、活性化された糖を得る工程；および（ｃ）カルボジイミド縮合によって、キャリアタンパク質に対して活性化された糖をカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
【００４０】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている混合ワクチンも提供される。これは、（ｖ）のインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体に、以下の２つの構造の１つを有しているリンカーが含まれていることを特徴とする：
【００４１】
【化９】
2015034178.tif 000010
式中、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−からなる群より選択される。カルバミン酸塩が好ましい。Ｈｉｂ結合体についてのキャリアタンパク質は、好ましくは、破傷風トキソイドである。
【００４２】
好ましい組成物およびプロセスでは、血清群Ｃの髄膜炎菌結合体が使用される。より好ましい組成物およびプロセスでは、血清群ＡとＣの両方に由来する異なる髄膜炎菌結合体が使用される。これらは、好ましくは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄキャリアに結合される。
【００４３】
Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣ結合体の混合物は、他のワクチンとの混合のために、または単独でワクチンとしてのいずれかのために使用される。したがって、本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、（ａ）臭化シアンでインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖を活性化させて、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルに対してアジピン酸ヒドラジドスペーサーを付加して、活性化された糖を得る工程；および（ｃ）カルボジイミド縮合によって、キャリアタンパク質に対して活性化された糖をカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
【００４４】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、（ｉ）のインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体に、以下の２つの構造の１つを有しているリンカーが含まれていることを特徴とする：
【００４５】
【化１０】
2015034178.tif 000011
式中、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−からなる群より選択される。カルバミン酸塩が好ましい。
【００４６】
（３）髄膜炎菌結合体の中での直接のキャリア−糖の結合
上記Ｈｉｂ結合体は、スペーサーによってキャリアタンパク質に結合体化される。対照的に、髄膜炎菌結合体の中では直接の結合を使用することが好ましい。直接の結合は、髄膜炎菌結合体に、具体的には、プロテインＤがキャリアとして使用される場合、および（それらが免疫原性となり得る任意の可能性のある境界をリンカーが越えてしまうことを回避するため）Ｈｉｂ結合体が直接の結合を使用しない場合に場合には、特に適していることが明らかにされている。
【００４７】
直接の結合の状況では、髄膜炎菌の糖の中の−ＯＨ基が最初にシアニル化されて（例えば、上記）、シアン酸エステルが得られる。その後、−ＯＣＮ基は、キャリアの中の側鎖（例えば、遊離の−ＮＨ２基、遊離の−ＳＨ基、または遊離の−ＯＨ基）に直接結合させるために使用される。リジン側鎖の中の遊離の−ＮＨ２に対する結合が好ましい。
【００４８】
直接の結合の機構は以下のように説明することができる：
【００４９】
【化１１】
2015034178.tif 000012
そして、この反応の結合産物は以下のように説明することができる：
【００５０】
【化１２】
2015034178.tif 000013
適切な条件下で、Ｃ＝ＮＨをＣ＝Ｏに転換させることができ、これによりカルバミン酸塩が得られる：
【００５１】
【化１３】
2015034178.tif 000014
シアニル化剤として臭化シアンを使用するよりもむしろ、シアニル化反応は、有機シアニル化試薬（例えば、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム試薬（「ＣＤＡＰ」）を使用して行われることが好ましい。有機シアニル化試薬は、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート、ｐ−ニトロフェニルシアネート（「ｐＮＰＣ」）、およびＮ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート（「ＣＴＥＡ」）からなる群より選択することができる。これらの試薬を使用することは、活性化反応を中性のｐＨで行うことができることを意味する。中性のｐＨは、多糖の安定性および完全性を保持することを助けることができる。具体的には、中性のｐＨは、−ＯＡｃ基を保持することを助けることができる（下記を参照のこと）。好ましい方法においては、シアニル化試薬は、非求核性緩衝液の中で（例えば、生理食塩水、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、水、およびいくつかの有機溶媒の中で）、ｐＨ６〜８で使用される［６］。ＣＤＡＰはアセトニトリルの中に溶解させることができ、そして、水性の糖溶液に添加することができる。結合後、反応は、全ての反応していないシアン酸塩基をブロックするグリシンの添加によって停止させることができる。
【００５２】
髄膜炎菌血清群Ａの結合体に関しては、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、血清群Ａの結合体が、（ａ）血清群Ａの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。ワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれる場合もある。
【００５３】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、血清群Ａの結合体が、（ａ）血清群Ａの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程が含まれるプロセスによって生産されることを特徴とする。
【００５４】
髄膜炎菌血清群Ｃの結合体に関しては、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、血清群Ｃの結合体が、（ａ）血清群Ｃの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。ワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれる場合もある。
【００５５】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、血清群Ｃの結合体が、（ａ）血清群Ｃの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程が含まれるプロセスによって生産されることを特徴とする。
【００５６】
本発明によってはまた、血清群Ａの結合体と血清群Ｃの結合体の両方がこの様式で調製され、その後混合される、ワクチンおよびプロセスも提供される。Ｈｉｂ結合体もまた添加することができ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣの３種類全てが含まれている結合体混合物を得ることができる。
【００５７】
（４）血清群Ｃの結合体のＯ−アセチル化
髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜糖は、通常は、Ｃ−７またはＣ−８残基にＯ−アセチル（ＯＡｃ）基を有している、シアル酸のα２→９結合ホモポリマーである。
【００５８】
【化１４】
2015034178.tif 000015
いくつかのＭｅｎＣ株（侵襲的単離物の約１２％）は、このＯＡｃ基が含まれていない多糖が生産する。ＯＡｃ基の存在またはこれが存在しないことにより、特有のエピトープが生じ、糖に対する抗体結合の特異性が、Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ−）株および脱Ｏ−アセチル化（ＯＡｃ＋）株に対するその殺菌作用に影響を与える場合がある［７〜９］。認可されているＭｅｎＣ結合体ワクチンには、ＯＡｃ−（ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（登録商標））とＯＡｃ＋（Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（登録商標）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（登録商標））糖の両方が含まれる。
【００５９】
本発明にしたがうと、ＯＡｃ＋株またはＯＡｃ−株のいずれを使用することもできる。
【００６０】
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、（ｖｉ）の血清群Ｃの莢膜糖の中の少なくとも５０％のシアル酸残基が、Ｃ−７またはＣ−８の位置でＯ−アセチル化されていることを特徴とする。
【００６１】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、血清群Ｃの莢膜糖がＯＡｃ＋株に由来することを特徴とする。
【００６２】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、（ｖｉｉ）の血清群Ｃの莢膜糖の中のシアル酸残基がＯ−アセチル化されていないことを特徴とする。
【００６３】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、血清群Ｃの莢膜糖がＯＡｃ−株に由来することを特徴とする。
【００６４】
これらのワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖もまた含まれる場合がある。
【００６５】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程が含まれていることを特徴とする。ここで、（ｖｉｉ）の血清群Ｃの莢膜糖の中に存在している少なくとも５０％のシアル酸残基が、Ｃ−７またはＣ−８の位置でＯ−アセチル化されている。
【００６６】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程が含まれていることを特徴とする。ここで、（ｖｉｉ）の血清群Ｃの莢膜糖の中に存在しているシアル酸残基は、Ｏ−アセチル化されていない。
【００６７】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程が含まれていることを特徴とする。ここで、血清群Ｃの莢膜糖の中に存在しているシアル酸残基は、ＯＡｃ−株に由来する。
【００６８】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程が含まれていることを特徴とする。ここで、血清群Ｃの莢膜糖は、ＯＡｃ＋株に由来する。
【００６９】
これらのプロセスによって作成されたワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖もまた含まれる場合がある。
【００７０】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、ＭｅｎＣ結合体の中のシアル酸残基がＯ−アセチル化されていないことを特徴とする。
【００７１】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、ＭｅｎＣ莢膜糖がＯＡｃ−株に由来することを特徴とする。
【００７２】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、ＭｅｎＣ結合体の中のシアル酸残基の少なくとも５０％が、Ｃ−７またはＣ−８の位置でＯ−アセチル化されていることを特徴とする。
【００７３】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、ＭｅｎＣ莢膜糖がＯＡｃ＋株に由来することを特徴とする。
【００７４】
血清群Ｃの結合体の中のシアル酸残基の少なくとも５０％がＯ−アセチル化されている場合には、最少の割合（％）がさらに高い、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である場合がある。
【００７５】
血清群Ｃの結合体の生産に好ましい株は、好ましくは、血清群１６の、好ましくは、血清学的サブタイプＰ１．７ａ，１のＯＡｃ＋株である。したがって、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，１  ＯＡｃ＋株が好ましい。
【００７６】
（５）血清群Ａの結合体のＯ−アセチル化
髄膜炎菌血清型Ａの莢膜糖は、Ｃ−３およびＣ−４の位置に部分的なＯ−アセチル化を有している、α１→６リン酸結合されたＮ−アセチル−マンノサミンのホモポリマーである：
【００７７】
【化１５】
2015034178.tif 000016
Ｃ−３位置でのアセチル化は、７０〜９５％程度の高さであり得る。糖を精製するために使用される条件によって、脱−Ｏ−アセチル化（例えば、塩基性条件下で）が生じ得るが、本発明は、ＯＡｃを保持することを追及する。
【００７８】
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、血清群Ａの莢膜糖の中のマンノサミン残基の少なくとも５０％が、Ｃ−３位置でＯ−アセチル化されていることを特徴とする。ワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれる場合もある。
【００７９】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程が含まれていることを特徴とする。ここで、血清群Ａの莢膜糖の中のマンノサミン残基の少なくとも５０％が、Ｃ−３位置でＯ−アセチル化されている。
【００８０】
このプロセスによって作成されたワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖もまた含まれる場合がある。
【００８１】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物も提供される。これは、血清群Ａの莢膜糖の中のマンノサミン残基の少なくとも５０％が、Ｃ−３位置でＯ−アセチル化されていることを特徴とする。
【００８２】
血清群Ａの結合体の中のマンノサミン残基の少なくとも５０％がＯ−アセチル化されている場合には、最少の割合（％）がさらに高い、例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である場合がある。
【００８３】
（６）結合体の用量
Ｈｉｂ−結合体抗原は生産することが高価であり、それらの使用を節約するための様々なストラテジーが開発されている［１０〜１２］。１つのアプローチによっては、標準的な１０μｇ／用量よりも少ない用量（通常はごく少量、例えば、１／２、１／３、１／４など）の２用量の結合体が投与される［１０、１２］。例えば、参考文献１２においては、Ｈｉｂ−結合体は、５μｇ／用量、または３．３３μｇ／用量で、すなわち、通常の用量の１／２または１／３で投与された。
【００８４】
同じアプローチが、ＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンの中のＨｉｂ結合体にまで拡大されている。例えば、参考文献１３では、ＤＴｗＰワクチンと組み合わせられた、全用量、１／２用量、および１／３用量のＨｉｂ−結合体の使用が比較されており、抗ＰＲＰ体の幾何平均濃度は、ＤＴＰとＨｉｂの別々の投与と比較して、混合ＤＴＰ−Ｈｉｂワクチンを投与した患者においては減少したが、許容される防御抗Ｈｉｂ免疫応答は全ての場合に見られた。参考文献１４では、ＤＴｗＰの１０用量のバイアルを用いて１用量のＨｉｂを再構成させることによって、１０倍稀釈のＨｉｂ−結合体の投与量が使用された。参考文献２には、ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ（登録商標）ＤＴｗＰ−ＨＢｓＡｇワクチンを使用した、全用量、１／２用量、または１／４用量の凍結乾燥されたＨｉｂ−結合体の再構成が開示されている。
【００８５】
混合ワクチンの中の髄膜炎菌結合体についての同様の投与実験は、報告されていない。
【００８６】
本発明の混合ワクチンについては、Ｈｉｂおよび髄膜炎菌結合体の８μｇから１２μｇの間の量（糖として測定される）が選択されている。この量は、１単位の用量の中に存在する場合も、また、ワクチン１ミリリットルあたりに存在する場合もある。
【００８７】
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、ワクチンに、８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの間のインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖が含まれていることを特徴とする。血清群Ａおよび血清群Ｃの両方についての髄膜炎菌結合体が含まれていることが好ましい。
【００８８】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている混合ワクチンも提供される。これは、ワクチンに、８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの間の髄膜炎菌血清群Ａの莢膜糖が含まれていることを特徴とする。このワクチンには、好ましくは、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖も含まれる。
【００８９】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンも提供される。これは、ワクチンに、８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの間の髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜糖が含まれていることを特徴とする。このワクチンには、好ましくは、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖も含まれる。
【００９０】
本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、ワクチンに、単位用量あたり８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの間のインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖が含まれていることを特徴とする。血清群Ａおよび血清群Ｃの両方の髄膜炎菌結合体が含まれていることが好ましい。
【００９１】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている混合ワクチンも提供される。これは、ワクチンに、単位用量あたり８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの間の髄膜炎菌血清群Ａの莢膜糖が含まれていることを特徴とする。このワクチンには、好ましくは、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖も含まれる。
【００９２】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンも提供される。これは、ワクチンに、単位用量あたり８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの間の髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜糖が含まれていることを特徴とする。このワクチンには、好ましくは、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖も含まれる。
【００９３】
好ましくは、ワクチンには、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣ結合体の３種類の全てについて、（１ミリリットルあたりまたは単位用量あたり）８μｇから１２μｇの間の糖用量が含まれる。
【００９４】
（７）本発明のワクチンを調製するための即時プロセス
上記のように、本発明のワクチンは、２つの成分：（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原を含む第１の成分と；（ｂ）Ｈｉｂ結合体と少なくとも１つ以上の髄膜炎菌結合体を含む第２の成分を一緒に混合することによって、使用時に即座に調製することができる。２つの成分は、好ましくは別々にパッケージされ、したがって、一般的には、本発明によって、（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原を含む第１の成分と；（ｂ）Ｈｉｂ結合体と少なくとも１つ以上の髄膜炎菌結合体を含む第２の成分が含まれているキットが提供される。このアプローチにより、特に、混合されている場合に、ＨｉｂとＭｅｎＡ結合体についての具体的な問題である、水性での保存条件の間に起こり得る結合体の脱重合が回避される。
【００９５】
２つの成分（ａ）と（ｂ）は、別々に（例えば、別々のバイアルの中に）パッケージされる。第１のバイアルの内容物（Ｄ−Ｔ−ｗＰ−ＨＢｓＡｇが含まれる）は、好ましくは水性であり、第２のバイアルの内容物（結合体が含まれる）は、好ましくは凍結乾燥されており、その結果、本発明のワクチンは、凍結乾燥された成分を水性の成分で再構成することによって調製することができる。したがって、本発明により、本発明のワクチン組成物を調製するためのプロセスが提供される。これには、（ａ）水性形態の中に、Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を提供する工程；（ｂ）凍結乾燥された形態の中にＨｉｂと髄膜炎菌結合体が含まれている第２の成分を提供する工程；ならびに、（ｃ）第１の成分と第２の成分を混合してワクチンを得る工程が含まれる。混合工程は、通常は、使用時に行われるであろう。
【００９６】
本発明によってはまた、本発明のキットを調製するためのプロセスも提供される。これには、（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を得るまたは調製する工程；（ｂ）Ｈｉｂと髄膜炎菌結合体が含まれている第２の成分を得るまたは調製する工程；ならびに、（ｃ）キットの形態の中に２つの成分を組み合わせる工程が含まれる。
【００９７】
さらに具体的に、本発明により以下が提供される：
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、糖に対して過剰な重量のキャリアを有しており、２：１から４：１の間であるキャリア対糖の重量比を有していることを特徴とする。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程（これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、糖に対して過剰な重量のキャリアを有しており、２：１から４：１の間であるキャリア対糖の重量比を有していることを特徴とする）；ならびに、（ｃ）キットの形態の中に２つの成分を組み合わせる工程が含まれる。
−  （ｉ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、（ａ）臭化シアンでインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖を活性化させて、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルに対してアジピン酸ヒドラジドスペーサーを付加して、活性化された糖を得る工程；および（ｃ）カルボジイミド縮合によって、キャリアタンパク質に対して活性化された糖をカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体に、以下の２つの構造の１つを有しているリンカーが含まれていることを特徴とする：
【００９８】
【化１６】
2015034178.tif 000017
式中、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−からなる群より選択される。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ｉ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程；ならびに、（ｉｉｉ）キットの形態の中に２つの成分を組み合わせる工程が含まれる。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体が、（ａ）臭化シアンでインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖を活性化させて、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルに対してアジピン酸ヒドラジドスペーサーを付加して、活性化された糖を得る工程；および（ｃ）カルボジイミド縮合によって、キャリアタンパク質に対して活性化された糖をカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程；ならびに、（ｉｉｉ）キットの形態の中に２つの成分を組み合わせる工程が含まれる。これは、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体に、以下の２つの構造の１つを有しているリンカーが含まれていることを特徴とする：
【００９９】
【化１７】
2015034178.tif 000018
式中、−Ｘ−は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−からなる群より選択される。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ｉ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程が含まれる。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの結合体を、（ａ）血清群Ａの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程が含まれる。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの結合体を、（ａ）血清群Ｃの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ｉ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程が含まれる。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの結合体を、（ａ）血清群Ａの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルを二官能性リンカーと反応させて、活性化された糖を得る工程；および（ｃ）活性化された糖をキャリアタンパク質にカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ｉ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分を調製する工程；（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分を調製する工程が含まれる。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの結合体を、（ａ）血清群Ｃの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）シアン酸エステルを二官能性リンカーと反応させて、活性化された糖を得る工程；および（ｃ）活性化された糖をキャリアタンパク質にカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの結合体の中のシアル酸残基の少なくとも５０％が、Ｃ−７またはＣ−８の位置でＯ−アセチル化されていることを特徴とする。
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの結合体の中のシアル酸残基がＯ−アセチル化されていないことを特徴とする。
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖がＯＡｃ＋株に由来することを特徴とする。
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖がＯＡｃ−株に由来することを特徴とする。
−  （ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれている第１の成分；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖とキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている第２の成分が含まれているキット。これは、血清群Ｃの莢膜糖の中のマンノサミン残基の少なくとも５０％が、Ｃ−３の位置でＯ−アセチル化されていることを特徴とする。
−  本発明のキットを調製するためのプロセスであって、これには、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、キットの第１の成分を得る工程；ならびに、（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖、キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、およびキャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖を混合して、キットの第２の成分を得る工程が含まれる。
【０１００】
キットの第１の成分は、好ましくは、ＤＴＰｗ成分をＨＢｓＡｇ成分と混合することによって作成される。キットの第２の成分は、好ましくは、（１）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖；（２）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（３）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている、３価の結合体成分である。
【０１０１】
（８）本発明のワクチンの調製のためのプロセス
本発明の好ましい７価のワクチンには、７種類の抗原性成分Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ−Ｘ、ＭｅｎＡ−Ｘ、およびＭｅｎＣ−Ｘが含まれる。これらは、原則として任意の順序で混合することができるが、上記に記載されたように、第１の成分（Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、およびＨＢｓＡｇ抗原が含まれる）と第２の成分（Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣ結合体が含まれる）が調製されること、および２つの成分が使用時に混合されることが特に好ましい。
【０１０２】
さらに、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分は、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分がＨＢｓＡｇ成分と混合されることによって調製されることが好ましい。この混合の順序（すなわち、Ｄ、Ｔ、またはＰｗ抗原のいずれかの前にＨＢｓＡｇが添加されるのではなく、既存のＤＴＰｗ混合物に対してＨＢｓＡｇが添加される）は、特に、ワクチンの個々の成分がアルミニウム塩に吸着される場合に、混合ワクチンの作成に特に有用であることが明らかになっている。これは、Ｄ−Ｔ−ＨＢｓＡｇ混合物が最初に作成され、その後、Ｐｗストック溶液が添加される参考文献１５に開示されている混合の順序とは異なる。これはまた、Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ混合物がＤ−Ｔ混合物と混合される、参考文献１６の混合の順序とも異なる。
【０１０３】
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖（「Ｈｉｂ−Ｘ」）、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖（「ＭｅｎＡ−Ｘ」）、および（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖（「ＭｅｎＣ−Ｘ」）含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスが提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）Ｈｉｂ結合体を少なくとも１つの髄膜炎菌結合体と混合して、混合された結合体成分を得る工程；および（ｃ）４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を混合された結合体成分と混合して、混合ワクチンを得る工程が含まれることを特徴とする。
【０１０４】
３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分には、好ましくは、リン酸アルミニウムアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。最も好ましくは、これには、リン酸アルミニウムアジュバントと水酸化アルミニウムアジュバントの両方が含まれる。
【０１０５】
１価のＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される［１７］。ＤトキソイドおよびＴトキソイドは、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。
【０１０６】
混合された結合体成分には、好ましくは、ＨｉｂとＭｅｎＡ、ＨｉｂとＭｅｎＣ、またはＨｉｂとＭｅｎＡとＭｅｎＣに由来する結合体が含まれる。
【０１０７】
ＩＮＦＡＮＲＩＸ  ＨＥＸＡ（登録商標）のようなワクチンの状況とは異なり、結合体成分の中の３種類の結合体はいずれも、アルミニウム塩に吸着されていないことが好ましく［２］、より好ましくは、結合体成分にはアルミニウム塩は含まれない。最も好ましい結合体成分はアジュバントされていない（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）。しかし、これらには、糖（例えば、ラクトースおよび／またはスクロース）が含まれる場合がある。
【０１０８】
４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは、水性の形態であり、３価の結合体成分は、好ましくは、工程（ｃ）での水性のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分による再構成のための凍結乾燥された形態である。４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を作成するためには、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分とＨＢｓＡｇ成分は、好ましくは、混合される際には、いずれも水性の形態である。
【０１０９】
３価の結合体成分を調製するためには、３種類の結合体を任意の順序で、例えば、３種類を全て一緒に加える、または２種類（例えば、ＭｅｎＡとＭｅｎＣ、ＭｅｎＡとＨｉｂ、ＭｅｎＣとＨｉｂ）を混合し、その後第３の成分を添加することによって混合することができる。
【０１１０】
（９）アルミニウムアジュバント
抗原が含まれることに加えて、本発明のワクチンには、通常、少なくとも１つのアルミニウム塩アジュバントが含まれる。ワクチンには、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムアジュバントの両方が含まれ得る。
【０１１１】
本発明により、（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原を含み、そして水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む第１の成分；および（ｂ）（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖と（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖を含む第２の成分が含まれているキットが提供される。
【０１１２】
第１の成分の中では、ＨＢｓＡｇは、好ましくは、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。ＤトキソイドおよびＴトキソイドは、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。第１の成分は、好ましくは、ＤＴＰｗ成分をＨＢｓＡｇ成分と混合することによって作成される。ＤＴＰｗ成分には、好ましくは、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方が含まれる。ＨＢｓＡｇ成分には、好ましくは、リン酸アルミニウムが含まれる。
【０１１３】
第２の成分の中では、いずれの結合体もアルミニウム塩には吸着されていないことが好ましく、より好ましくは、第２の成分にはアルミニウム塩は含まれない。最も好ましい第２の成分はアジュバントされていない（ｕｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）。しかし、これらには、糖（例えば、ラクトース、または好ましくは、スクロース）が含まれる場合がある。
【０１１４】
第１の成分は、好ましくは水性の形態であり、そして第２の成分は、好ましくは凍結乾燥された形態である。したがって、第１の成分は、本発明のワクチンを得るための第２の成分を再構成するために使用することができる。
【０１１５】
（１０）スペーサーを用いる髄膜炎菌結合体の中でのキャリア−糖結合
上記のＨｉｂ結合体は、スペーサーによってキャリアタンパク質に結合体化される。スペーサーはまた、髄膜炎菌結合体においても使用することができるが、直接の結合が好ましい（上記を参照のこと）。スペーサーがシアニル化と組み合わせて使用される場合は、一般的な反応図式は上記のようなシアン酸エステルを調製することである。次いで、エステルは、ニ官能性リンカー（好ましくは、ホモ二官能性リンカー）の１つの官能基との反応によって活性化されて、キャリアへの結合を残したまま他の官能基が遊離される。
【０１１６】
したがって、本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、（ｖｉ）の血清群Ａの結合体を、（ａ）血清群Ａの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルを二官能性リンカーと反応させて活性化された糖を得る工程；および（ｃ）活性化された糖をキャリアタンパク質に対してカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。ワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれる場合もある。
【０１１７】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、血清群Ａの結合体が、（ａ）血清群Ａの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルを二官能性リンカーと反応させて活性化された糖を得る工程；および（ｃ）活性化された糖をキャリアタンパク質に対してカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって生産されることを特徴とする。
【０１１８】
本発明により、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている混合ワクチンが提供される。これは、（ｖｉｉ）の血清群Ｃの結合体を、（ａ）血清群Ｃの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルを二官能性リンカーと反応させて活性化された糖を得る工程；および（ｃ）活性化された糖をキャリアタンパク質に対してカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって得ることができることを特徴とする。ワクチンにはまた、（ｖｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖が含まれる場合もある。
【０１１９】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、（ｉｉｉ）の血清群Ｃの結合体が、（ａ）血清群Ｃの莢膜糖をシアニル化して、シアン酸エステルを得る工程；（ｂ）シアン酸エステルを二官能性リンカーと反応させて活性化された糖を得る工程；および（ｃ）活性化された糖をキャリアタンパク質に対してカップリングさせる工程が含まれるプロセスによって生産されることを特徴とする。
【０１２０】
本発明によってはまた、血清群Ａの結合体と血清群Ｃの結合体の両方がこの様式で調製され、その後混合される、ワクチンおよびプロセスも提供される。
【０１２１】
任意の適切な二官能性リンカーを、それが、シアニル化された髄膜炎菌糖への共有結合のための１つの官能基と、キャリアへの結合のための１つの官能基を有しているという条件で使用することができる。２つの官能基は、それに対する結合が所望される基に応じて、同じである場合も（すなわち、ホモ二官能性リンカー）、また、これらは異なる場合もある（すなわち、ヘテロ二官能性リンカー）。
【０１２２】
（１１）保存剤の添加のためのプロセス
ワクチンには、通常は、危険な微生物の増殖を防ぐために保存剤が含まれる。様々な成分を混合することによって形成される混合ワクチンにおいては、当業者は、保存剤を含める場所および時点を選択しなければならない。本発明にしたがうと、様々な成分に様々な保存剤が含まれる。
【０１２３】
したがって、本発明によって、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖、および（ｖｉｉ）水銀保存剤が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスが提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程（この場合、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分には保存剤も含まれている）；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程；および（ｃ）Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を混合された結合体成分と混合して、混合ワクチンを得る工程が含まれることを特徴とする。
【０１２４】
本発明により、本発明のキットを調製するためのプロセスが提供される。これには、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して（この場合、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分には水銀保存剤が含まれている）、キットの第１の成分を得る工程；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖をキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖を混合ｓｉｔｅ、キットの第２の成分を得る工程が含まれる。
【０１２５】
これらのプロセスにおいては工程（ａ）の代わりとして、キットの第１の成分を、（ｉ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分、（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ、および（ｉｉｉ）別の保存剤を混合することによって調製することができる。この場合、（ｉｉｉ）の保存剤は（ｉｉ）を示さない。
【０１２６】
水銀保存剤（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）は、チオマーサル（チメロサールまたはメルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）としても知られている）あるいはチメルホナート（ｔｉｍｅｒｆｏｎａｔｅ）であり得る。混合された結合体成分（およびキットの第２の成分）には、保存剤が含まれる場合も、また、含まれない場合もある。これには、保存剤が含まれないことが好ましい。１価のＨＢｓＡｇ成分には、保存剤が含まれる場合も、また、含まれない場合もある。水銀保存剤が使用される場合は、精製されたＨＢｓＡｇを透析することができ（例えば、システインで）、その後、混合ワクチンを作成するために使用することができる［１８］。
【０１２７】
混合された結合体成分には、好ましくは、Ｈｉｂ結合体、ＭｅｎＡ結合体、およびＭｅｎＣ結合体が含まれる。
【０１２８】
本発明によってはまた、（ｉ）ジフテリアトキソイド（「Ｄ」）、（ｉｉ）破傷風トキソイド（「Ｔ」）、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原（「Ｐｗ」）、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖、および（ｖｉｉ）２−フェノキシエタノール保存剤が含まれている混合ワクチンを調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程（この場合、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分には２−フェノキシエタノールは含まれない）；（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）結合体と髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）結合体を混合し、混合された結合体成分を得る工程；および（ｃ）Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を混合された結合体成分と混合して、混合ワクチンを得る工程が含まれることを特徴とする。
【０１２９】
本発明により、本発明のキットを調製するためのプロセスが提供される。これには、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して（この場合、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分には２−フェノキシエタノールは含まれない）、キットの第１の成分を得る工程；および（ｂ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の莢膜糖をキャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖を混合して、キットの第２の成分を得る工程が含まれる。
【０１３０】
これらのプロセスにおいては工程（ａ）の代わりとして、キットの第１の成分を、（ｉ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分、（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ、および（ｉｉｉ）別の２−フェノキシエタノール保存剤を混合することによって調製することができる。この場合、（ｉｉｉ）の保存剤は（ｉ）を示さない。
【０１３１】
混合された結合体成分（およびキットの第２の成分）には、２−フェノキシエタノール保存剤が含まれる場合も、また、含まれない場合もある。保存剤が含まれないことが好ましい。１価のＨＢｓＡｇ成分には、２−フェノキシエタノール保存剤が含まれる場合も、また、含まれない場合もある。
【０１３２】
（１２）結合体からの不純物の除去
結合化学反応は、必ずしも正確、または化学量論的であるわけではなく、最終的なワクチン生成物の中には望ましくない副生成物が生じる可能性がある。本発明により、混合された結合体成分を調製する際のこれらの副生成物を評価および／または除去するための方法が提供される。この成分は、本発明のワクチンを作成するために使用することができ、また、本発明のキットの成分として使用することもできる。
【０１３３】
本発明により、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスが提供される。これは、このプロセスに、ＥＤＡＣを使用して破傷風トキソイドに対してＨｉｂ莢膜糖を結合させ、その後、ＥＤＵを除去する工程；（ｂ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＡ莢膜糖を結合させ、その後、ＤＭＡＰを除去する工程；（ｃ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＣ莢膜糖を結合させ、その後、ＤＭＡＰを除去する工程；ならびに、（ｄ）工程（ａ）によるＨｉｂ結合体、工程（ｂ）によるＭｅｎＡ結合体、および工程（ｃ）によるＭｅｎＣ結合体を混合して、結合体混合物を得る工程が含まれることを特徴とする。
【０１３４】
混合工程の後、結合体混合物を凍結乾燥させて、例えば、本発明のキットにおいて使用される成分を得ることができる。凍結乾燥の前には、３価の成分のｐＨは、例えば、６．０±０．５の範囲内に、または約６．１に低下させることができる。
【０１３５】
「ＥＤＡＣ」は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであり、カルボン酸と第１級アミンが含まれている生物学的物質を架橋させるために使用されている水溶性カルボジイミドである（上記を参照のこと）。これは、通常は、塩酸塩として使用されるであろう。
【０１３６】
「ＥＤＵ」は、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）尿素であり、これは、ＥＤＡＣカップリングの可溶性の反応産物である：
【０１３７】
【化１８】
2015034178.tif 000019
ＥＤＵと過剰のＥＤＡＣはいずれも、稀酸または水での洗浄によって結合反応後に除去することができる［１９］。
【０１３８】
「ＣＤＡＰ」試薬には、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウム基が含まれ、これはシアニル化試薬として使用される。これらは、テトラフルオロホウ酸塩として使用されることが好ましい：
【０１３９】
【化１９】
2015034178.tif 000020
「ＤＭＡＰ」は、４−ジメチルアミノ−ピリジンであり、これは、ＣＤＡＰシアニル化の反応産物である：
【０１４０】
【化２０】
2015034178.tif 000021
ＤＭＡＰは、ゲル濾過、ゲル透過クロマトグラフィーなどによって除去することができる。ゲル透過クロマトグラフィーカラムは、結合体、未反応のキャリア、未反応の糖、未反応のＣＤＡＰ、未反応のグリシン、およびＤＭＡＰを１回の実行で分離するために使用することができ、これにより、精製された結合体が得られる。
【０１４１】
結合反応には、上記のようなリンカーなどの使用（例えば、Ｈｉｂ−Ｔの調製のためのアジピン酸ヒドラジドスペーサーの使用）が含まれる場合がある。
【０１４２】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、ＥＤＡＣを使用してキャリアタンパク質に対してＨｉｂ莢膜糖を結合させる工程；（ｂ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＡ莢膜糖を結合させ、その後、ＤＭＡＰを除去する工程；（ｃ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＣ莢膜糖を結合させる工程；（ｄ）工程（ａ）によるＨｉｂ結合体、工程（ｂ）によるＭｅｎＡ結合体、および工程（ｃ）によるＭｅｎＣ結合体を混合して、結合体混合物を得る工程；ならびに、（ｅ）結合体混合物からＥＤＵおよび／またはＤＭＡＰを除去する工程が含まれることを特徴とする。
【０１４３】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、ＥＤＡＣを使用して破傷風トキソイドに対してＨｉｂ莢膜糖をカップリングさせ、その後、ＥＤＵをアッセイする工程；（ｂ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＡ莢膜糖をカップリングさせ、その後、ＤＭＡＰを除去する工程；および（ｃ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＣ莢膜糖をカップリングさせ、その後、ＤＭＡＰをアッセイする工程が含まれることを特徴とする。このプロセスには、通常は、（ｄ）工程（ａ）によるＨｉｂ結合体、工程（ｂ）によるＭｅｎＡ結合体、および工程（ｃ）によるＭｅｎＣ結合体を混合して、結合体混合物を得る工程；ならびに、（ｅ）結合体混合物からＥＤＵおよび／またはＤＭＡＰを除去するさらなる工程が含まれるであろう。
【０１４４】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、ＥＤＡＣを使用して破傷風トキソイドに対してＨｉｂ莢膜糖をカップリングさせる工程；（ｂ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＡ莢膜糖をカップリングさせる工程；ならびに、（ｃ）ＣＤＡＰ試薬を使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＣ莢膜糖をカップリングさせる工程；（ｄ）工程（ａ）によるＨｉｂ結合体、工程（ｂ）によるＭｅｎＡ結合体、および工程（ｃ）によるＭｅｎＣ結合体を混合して、結合体混合物を得る工程；ならびに、（ｅ）結合体混合物中のＥＤＵおよび／またはＤＭＡＰをアッセイする工程が含まれることを特徴とする。
【０１４５】
本発明によってはまた、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａの莢膜糖、および（ｉｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃの莢膜糖が含まれている結合体混合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、このプロセスに、ＥＤＡＣを使用してキャリアタンパク質に対してＨｉｂ莢膜糖を結合させる工程；（ｂ）ＥＤＡＣを使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＡ莢膜糖を結合させる工程；（ｃ）ＥＤＡＣを使用してタンパク質キャリアに対してＭｅｎＣ莢膜糖を結合させる工程；（ｄ）工程（ａ）によるＨｉｂ結合体、工程（ｂ）によるＭｅｎＡ結合体、および工程（ｃ）によるＭｅｎＣ結合体を混合して、結合体混合物を得る工程；ならびに、（ｅ）結合体混合物からＥＤＵを除去する工程が含まれることを特徴とする。
【０１４６】
ＥＤＡＣ／ＥＤＵプロトコールは、破傷風トキソイドがキャリアタンパク質である場合に特に適している。ＣＤＡＰ／ＤＭＡＰプロトコールは、プロテインＤがキャリアタンパク質である場合に特に適している。
【０１４７】
（１３）特徴的な特性の組み合わせ
上記のセクション（１）から（１２）には、本発明の様々な特徴的な特性が含まれている。
【０１４８】
【化２１】
2015034178.tif 000022
これらの１２個の特徴的な特性はそれぞれ独立しているものであるが、これらはまた互いに組み合わせることもできる。したがって、本発明によっては、特性（１）から（１２）の全ての可能な２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、および１１種類の組み合わせ、さらには、１２個の特性のすべての組み合わせが提供される。
【０１４９】
特に好ましい組み合わせとしては、以下が挙げられる：
ａ．（１）と（２）
ｂ．（１）と（２）と（６）
ｃ．（１）と（２）と（１２）
ｄ．（１）と（２）と（６）と（１２）
ｅ．（３）と（４）
ｆ．（３）と（５）
ｇ．（３）と（４）と（５）
ｈ．（３）と（４）と（６）
ｉ．（３）と（５）と（６）
ｊ．（３）と（４）と（５）と（６）
ｋ．（８）と（９）
ｌ．（８）と（１１）
ｍ．（１２）と組み合わせたａ．からｌ．のいずれか
ｎ．（７）と組み合わせたａ．からｍ．のいずれか
ｏ．（８）と組み合わせたａ．からｎ．のいずれか
ｐ．（９）と組み合わせたａ．からｏ．のいずれか
ｑ．（１１）と組み合わせたａ．からｐ．のいずれか。
【０１５０】
組み合わせｅ．とｆ．（したがって、ｇ．、ｈ．、ｉ．、およびｊ．）が有効である。なぜなら、ＣＤＡＰが使用される場合には、髄膜炎菌糖上の壊れやすいアセチル基を保持することができるからである。組み合わせｋ．が有効である。なぜなら、アジュバントと抗原を混合する正確な順序が、吸着に、したがって、効力と、長期にわたる安定性に重要であり得るからである。組み合わせｌ．は、これが生産の間の複数の段階で保存剤を添加することの必要性を最小限とするので、有効である。
【０１５１】
（１４）ジフテリアトキソイド
ジフテリアは、グラム陽性の胞子を形成しない好気性細菌であるジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって引き起こされる。この微生物は、プロファージによってコードされるＡＰＤ−リボシル化エキソトキシン（「ジフテリア毒素」）を発現する。これは、もはや毒性はないが、なおも抗原性であり、注射後に特異的な抗毒素抗体の生産を刺激することができるトキソイドを生じるように、（例えば、ホルマリンまたはホルムアルデヒドを使用して）処理することができる。ジフテリアトキソイドは、参考文献１の第１３章にさらに詳細に開示されている。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されたものである。ジフテリアトキソイドは、増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地、またはＬｉｎｇｇｏｕｄ  ＆  Ｆｅｎｔｏｎ培地）（これには、ウシ抽出物が補われる場合がある）の中でジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）を増殖させること、その後の、ホルムアルデヒド処理、限外濾過、および沈殿によって得ることができる。トキソイド材料は、その後、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスによって処理することができる。
【０１５２】
ジフテリアトキソイドは、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着される。
【０１５３】
好ましくは、ジフテリアトキソイド成分には、いずれの水銀保存剤も実質的には含まれない。
【０１５４】
ジフテリアトキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表現することができる。例えば、ＮＩＢＳＣによって、「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １９９９」［２０，２１］が提供されている。これには、アンプルあたり１６０ＩＵが含まれている。別のＩＵシステムとしては、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「限界凝集量（ｌｉｍｅｓ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」）は、１国際単位の抗毒素と混合した場合に、最適な凝集混合物を生じるトキソイドの量と定義される［２２］。例えば、ＮＩＢＳＣによって、「Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ，Ｐｌａｉｎ」［２３］が供給されており、これには、アンプルあたり３００ＬＦが含まれている。また、「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆｏｒ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［２４］も供給されており、これには、アンプルあたり９００ＬＦが含まれている。
【０１５５】
ウシ材料が、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）の培養に使用される場合には、これらは、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、または、他の伝染性の海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない供給源から得られなければならない。
【０１５６】
本発明のワクチンの中でのジフテリアトキソイド対破傷風トキソイドの割合は、通常、２：１から３：１の間（Ｌｆ単位で測定）であり、好ましくは、２．４：１から２．６：１の間であり、より好ましくは、２．５：１である。
【０１５７】
本発明のワクチンの中のジフテリアトキソイドの量は、通常、少なくとも３０ＩＵ／用量である。
【０１５８】
（１５）破傷風トキソイド
破傷風は、グラム陽性の胞子を形成する細菌である破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｅｔａｎｉ）によって引き起こされる。この微生物は、エンドペプチダーゼ（「破傷風毒素」）を発現する。これは、もはや毒性はないが、なおも抗原性であり、注射後に特異的な抗毒素抗体の生産を刺激することができるトキソイドを生じるように処理することができる。破傷風トキソイドは、参考文献１の第２７章にさらに具体的に開示されている。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されたものである。破傷風トキソイドは、増殖培地（例えば、ウシカゼインに由来するＬａｔｈａｍ培地）の中で破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）を増殖させること、その後の、ホルムアルデヒド処理、限外濾過、および沈殿によって得ることができる。物質は、その後、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスによって処理することができる。
【０１５９】
破傷風毒素は、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着させることができるが、これは必ずしも必要ではない（例えば、破傷風トキソイド全体の０〜１０％の吸着を使用することができる）。
【０１６０】
好ましくは、破傷風トキソイド成分には、いずれの水銀保存剤も実質的には含まれない。
【０１６１】
破傷風トキソイドの量は、国際単位（ＩＵ）で表現することができる。例えば、ＮＩＢＳＣによって、「Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｂｓｏｒｂｅｄ  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２０００」［２５，２６］が提供されている。これには、アンプルあたり４６９ＩＵが含まれている。別のＩＵシステムとしては、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「限界凝集量」）は、１国際単位の抗毒素と混合した場合に、最適な凝集混合物を生じるトキソイドの量と定義される［２２］。例えば、ＮＩＢＳＣによって、「Ｔｈｅ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｆｏｒ  Ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ」［２７］が供給されており、これには、アンプルあたり１０００ＬＦが含まれている。
【０１６２】
ウシ材料が、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）の培養に使用される場合には、これは、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）に、または、他の伝染性の海綿状脳症（ＴＳＥ）に感染していない供給源から得られたものでなければならない。
【０１６３】
本発明のワクチンの中での破傷風トキソイド対ジフテリアトキソイドの割合は、通常、１：２から１：３の間（Ｌｆ単位で測定）であり、好ましくは、１：２．４から１：２．６の間であり、より好ましくは、１：２．５である。
【０１６４】
本発明のワクチンの中の破傷風トキソイドの量は、通常、少なくとも６０ＩＵ／用量である。
【０１６５】
（１６）細胞性百日咳抗原
ワクチンの中の百日咳抗原は、細胞性（全細胞）または無細胞性のいずれかである。本発明では、不活化された百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞の形態の細胞性百日咳抗原が使用される。細胞性百日咳抗原の調製は十分に解説されている（例えば、参考文献１の第２１章を参照のこと）。例えば、これは、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の第Ｉ相培養物の不活化によって得ることができる。
【０１６６】
細胞性百日咳抗原は、リン酸アルミニウムアジュバント上に吸着させることも、また、リン酸アルミニウムアジュバントと混合することもできる。
【０１６７】
ｗＰ抗原の量は、国際単位（ＩＵ）で表現することができる。例えば、ＮＩＢＳＣによって、「Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｆｏｒ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ」［２８］が提供されている。これには、アンプルあたり４６ＩＵが含まれている。個々のアンプルには、８リットルのＭ／１５  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ’ｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で稀釈された、１０リットルの細菌懸濁液を含む水溶液の２．０ｍｌのアリコートの凍結乾燥された残渣（Ｕ．Ｓ．Ｏｐａｃｉｔｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄに関して１８０混濁単位（ｏｐａｃｉｔｙ  ｕｎｉｔ）に等しい）が含まれている。ＩＵシステムの代わりとして、「ＯＵ」単位（「混濁単位」）もまた使用される（例えば、４ＯＵはおよそ１ＩＵであり得る）。
【０１６８】
本発明のワクチンの中のｗＰ抗原の量は、通常は、少なくとも４ＩＵ／用量である。
【０１６９】
（１７）Ｂ型肝炎表面抗原
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こすことが知られている病原菌の１つである。ＨＢＶビリオンは、外側のタンパク質外殻またはキャプシドに取り囲まれている内部コアから構成されている。ウイルスのコアには、ウイルスＤＮＡのゲノムが含まれる。キャプシドの主要な成分は、ＨＢＶ表面抗原、またはより一般的には、「ＨＢｓＡｇ」として知られているタンパク質であり、これは、約２４ｋＤａの分子量の２２６個のアミノ酸である。全ての存在しているＢ型肝炎ワクチンにはＨＢｓＡｇが含まれており、この抗原がワクチン接種を受ける人に対して投与されると、これは抗ＨＢｓＡｇ抗体の生産を刺激し、抗ＨＢｓＡｇ抗体はＨＢＶ感染を防御する。
【０１７０】
ワクチンの製造のためには、ＨＢｓＡｇを２つの方法で作成することができる。第１の方法には、慢性Ｂ型肝炎のキャリアの血漿から粒子の形態で抗原を精製することが含まれる。なぜなら、大量のＨＢｓＡｇが、ＨＢＶ感染の間に肝臓の中で合成され、血流中に放出されるからである。第２の方法には、組み換えＤＮＡ法によってタンパク質を発現させることが含まれる。本発明の方法とともに使用されるＨＢｓＡｇは、いずれの方法でも調製することができるが、組み換えによって発現されたＨＢｓＡｇを使用することが好ましい。具体的には、ＨＢｓＡｇは、酵母（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはハンゼヌラ属（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ）（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）））の中での発現によって調製されることが好ましい。
【０１７１】
酵母によって発現されたＨＢｓＡｇは、通常は、グリコシル化されていない。
【０１７２】
ＨＢｓＡｇは、一般的には、実質的に球形の粒子（約２０ｎｍの平均直径）の形態であり、これには、リン脂質が含まれている脂質マトリックスが含まれる。酵母によって発現されたＨＢｓＡｇ粒子には、ホスファチジルイノシトールが含まれている場合があり、これは、自然界に存在しているＨＢＶビリオンの中には見られない。この粒子にはまた、免疫システムを刺激するために、毒性のない量のＬＰＳも含まれる場合がある［２９］。
【０１７３】
ＨＢｓＡｇは、好ましくは、ＨＢＶサブタイプａｄｗ２に由来する。
【０１７４】
ＨＢｓＡｇは、最終的なワクチンの中では（例えば、周知のＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（登録商標）製品においてそうであるように）水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることができ、また、吸着させないままとすることもできるが、一般的には、本発明のプロセスにおいて使用される前に、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着されるであろう［１７］。
【０１７５】
ＨＢｓＡｇの量は、通常、マイクログラムで表現される。
【０１７６】
ワクチンの用量あたりのＨＢｓＡｇの典型的な量は、１０μｇである。
【０１７７】
（１８）Ｈｉｂ結合体
本発明のワクチンにおいて使用されるインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型抗原には、Ｈｉｂ莢膜糖抗原が含まれる。インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型に由来する糖抗原は周知である（例えば、参考文献１の第１４章）。Ｈｉｂ糖は、（特に、子供において）その免疫原性を高めるために、キャリアタンパク質に結合体化される。Ｈｉｂ莢膜糖の調製は十分に解説されている（例えば、参考文献３０から３９）。
【０１７８】
参考文献１の表１４−７に示されているように、多種多様の連結キャリアタンパク質がＨｉｂ結合体において使用されている。ＰＲＰ−Ｄ製品では、ジフテリアトキソイドキャリアタンパク質が使用されており、このキャリアは本発明にしたがって使用することもできる、ＨｂＯＣ製品では、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質が使用されており、このキャリアもまた、本発明にしたがって使用することができる。ＰＲＰ−ＯＭＰ製品では、キャリアとして、血清群Ｂの髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体が使用されており、このキャリアもまた、本発明にしたがって使用することができる。ＰＲＰ−Ｔ製品では、破傷風トキソイドキャリアタンパク質が使用されており、このキャリアもまた、本発明にしたがって使用することができる。インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）プロテインＤ（下記を参照のこと）もまた、Ｈｉｂ結合体のキャリアとして使用することができる。
【０１７９】
本発明にしたがって使用される好ましいＨｉｂ結合体では、キャリアタンパク質として破傷風トキソイドが使用され、一般的に「ＰＲＰ−Ｔ」と呼ばれる生成物が得られる。これは、ＨＩＢＥＲＩＸ（登録商標）製品の中に存在している結合体である。
【０１８０】
Ｈｉｂ結合体中のキャリアタンパク質は、好ましくは、髄膜炎菌結合体の中のキャリアタンパク質とは異なるが、いくつかの実施形態においては、同じキャリアを使用することができる。
【０１８１】
結合体の糖部分には、Ｈｉｂ細菌から調製された全長のポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）が含まれる場合があり、そして／または、これには、全長のＰＲＰの断片が含まれる場合もある。
【０１８２】
１：５（すなわち、過剰なタンパク質）から５：１（すなわち、過剰な糖）までの糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）（例えば、１：２から５：１の間の比、そして１：１．２５から１：２．５の間の比）の結合体を使用することができる。しかし、好ましいワクチンにおいては、糖対キャリアタンパク質の重量比は、１：２．５から１：３．５の間である。
【０１８３】
破傷風トキソイドが、抗原およびキャリアタンパク質の両方として存在するワクチンにおいては、結合体の中での糖対キャリアタンパク質の重量比は、１：０．３から１：２の間であり得る［５］。
【０１８４】
抗原として含まれる破傷風トキソイドは度外視するとして、結合していないキャリアは、好ましくは、組成物全体の中のキャリアタンパク質の全量のうちのわずか５％であり、より好ましくは、２重量％未満である。
【０１８５】
Ｈｉｂ抗原の投与によっては、好ましくは、≧０．１５μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度、より好ましくは、≧１μｇ／ｍｌが生じる。これらは、標準的な許容される限界反応である。
【０１８６】
Ｈｉｂ結合体の量は、一般的には、選択されるキャリアを理由とするばらつきを回避するために、糖の質量（すなわち、全量が記載される用量よりも多い場合の結合体（キャリア＋結合体）の用量）について提供される。ワクチンの用量あたりのＨｉｂ糖の典型的な量は、１０μｇである。
【０１８７】
Ｈｉｂ結合体は、本発明にしたがうそれらの使用の前に凍結乾燥される場合がある。また、さらなる成分が、例えば、安定剤として凍結乾燥の前に添加される場合もある。含められる好ましい安定剤は、ラクトース、スクロース、およびマンニトール、ならびにそれらの混合物（例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など）である。したがって、最終的なワクチンには、ラクトースおよび／またはスクロースが含まれる場合がある。スクロース／マンニトール混合物の使用によって、乾燥プロセスの速度を早めることができる。
【０１８８】
（１９）髄膜炎菌結合体
本発明のワクチンにおいて使用される髄膜炎菌抗原には、キャリアタンパク質に結合体化された莢膜糖抗原が含まれる。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する糖抗原は周知である：２価のワクチンＭＥＮＣＥＶＡＸ  ＡＣ（登録商標）および４価のワクチンＭＥＮＣＥＶＡＸ  ＡＣＷＹ（登録商標）は、何年も前から知られている［４０、４１］。さらに、血清群Ｃに対する結合体ワクチンは、ヒトでの使用について承認されており、そして、これにはＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）［４２］、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（登録商標）、およびＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（登録商標）が含まれる。血清群Ａに由来する結合体と血清群Ｃに由来する結合体の混合物が公知であり［４３，４４］、そして血清群Ａおよび血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに由来する結合体の混合物が報告されている［４５〜４８］。
【０１８９】
本発明の製品およびプロセスにおいて使用される髄膜炎菌糖は、血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および血清群Ｙの１つ以上（例えば、ＡとＣ、ＡとＷ１３５、ＡとＹ、ＣとＷ１３５、ＣとＹ、Ｗ１３５とＹ、ＡとＣとＷ１３５、ＡとＣとＹ、ＣとＷ１３５とＹ、ＡとＣとＷ１３５とＹ）に由来し得る。少なくとも血清群Ｃの糖を使用することが好ましく、そして、血清群Ａと血清群Ｃの両方に由来する糖を使用することが好ましい。
【０１９０】
本発明では、任意の適切な髄膜炎菌結合体を、任意の適切な結合化学反応および任意の適切なスペーサーと共に使用することができる（特異的な詳細が提供されている場合を除く）。
【０１９１】
ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）およびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（登録商標）製品では、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質が使用されており、このキャリアタンパク質もまた、本発明にしたがって使用することができる。ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（登録商標）製品では、破傷風トキソイドキャリアタンパク質が使用されており、このキャリアもまた、本発明にしたがって使用することができる。髄膜炎菌結合体について特に好ましいキャリアタンパク質は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のプロテインＤであり、これは、いずれの既存の承認されている結合体ワクチンの中にも存在していない。このタンパク質は、参考文献４９および５０に詳細に記載されており、結合体の中でのキャリアタンパク質としてのその使用は、参考文献５１に記載されている。用語「プロテインＤ」には、参考文献５１に開示されているように、自然界に存在している全長のタンパク質の断片と、全長のプロテインＤまたはこれらの断片のいずれかを含む融合タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の断片とプロテインＤの断片の融合体）もまた含まれる。断片は、非Ｔ依存性抗原に結合すると、非Ｔ依存性糖抗原をＴ依存性抗原へと変換させる能力を保持しているであろう。典型的な断片には、プロテインＤの少なくともＮ末端の１／３が含まれるであろう。タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で簡単に発現させることができ［５０］、この組み換え体材料が本発明での使用に好ましい［５１］。
【０１９２】
プロテインＤキャリアが使用される場合は、結合体は「ＭｅｎＡ−Ｄ」および「ＭｅｎＣ−Ｄ」と呼ばれる。
【０１９３】
異なる髄膜炎菌結合体は異なるキャリアタンパク質を使用するべきであることが好ましいが（参考文献５２を参照のこと）、これらの異なるキャリアは互いに同じであるべきであることが好ましく、例えば、組成物中の全ての髄膜炎菌結合体は、破傷風トキソイドキャリアを使用するべきであるか、または組成物中の全ての髄膜炎菌結合体はプロテインＤキャリアを使用するべきである、などである。
【０１９４】
髄膜炎菌結合体中のキャリアタンパク質は、Ｈｉｂ結合体中のキャリアタンパク質とは異なることが好ましいが、いくつかの実施形態においては、同じキャリアを使用することができる。
【０１９５】
結合体の糖部分には、髄膜炎菌から調製された全長の糖が含まれる場合があり、そして／または、これには、全長の糖の断片が含まれる場合もある。
【０１９６】
１：１０（すなわち、過剰のタンパク質）から１０：１（すなわち、過剰の糖）の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）（例えば、１：５から５：１の間の比、１：２．５から２．５：１の間の比、または１：１．２５から１．２５：１の間の比）を有している髄膜炎菌結合体を使用することができる。
【０１９７】
髄膜炎菌結合体の投与によっては、好ましくは、少なくとも４倍、そして好ましくは、少なくとも８倍の関連する血清群についての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）力価（ｓｅｒｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｓｓａｙ  ｔｉｔｒｅ）の上昇が生じる。ＳＢＡ力価は、ベビーラットの補体またはヒトの補体を使用して測定することができる［５３］。
【０１９８】
髄膜炎菌結合体の濃度は、一般的には、選択されるキャリアを理由とするばらつきを回避するために、糖の質量（すなわち、全量が記載される用量よりも多い場合の結合体（キャリア＋結合体）の用量）について提供される。ワクチンの用量あたりの個々の髄膜炎菌糖の典型的な量は、約５μｇまたは１０μｇである。
【０１９９】
髄膜炎菌結合体は、本発明にしたがうそれらの使用の前に凍結乾燥される場合がある。さらなる成分がまた、例えば、安定剤として凍結乾燥の前に添加される場合もある。含められる好ましい安定剤は、ラクトースおよび／またはスクロースである。したがって、最終的なワクチンには、ラクトースおよび／またはスクロースが含まれる場合がある。
【０２００】
（２０）結合体混合物
本発明により、結合体混合物と、それらを調製するためのプロセスが提供される。これらには、通常、（ｉ）Ｈｉｂ結合体、（ｉｉ）ＭｅｎＡ結合体、および（ｉｉｉ）ＭｅｎＣ結合体の混合物が含まれる。結合体混合物は、それら自体をワクチンとして使用することができ、そしてまた、混合ワクチンを作成するために他の抗原と混合するための成分として使用することもできる。
【０２０１】
結合体混合物には、３種類以上の結合体を含めることができるが、これは好ましくは、３価の結合体混合物である。髄膜炎菌の血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに由来する結合された莢膜糖が含まれている５価の結合体混合物もまた、調製することができる。
【０２０２】
結合体混合物は、好ましくは、凍結乾燥された形態である。
【０２０３】
結合体混合物には、以下の抗原のいずれも含まれないことが好ましい：ジフテリアトキソイド；百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原；ポリオウイルス抗原；ＨＢｓＡｇ。
【０２０４】
好ましくは、結合体はいずれもアルミニウム塩に吸着されておらず［２］、アルミニウム塩が含まれないことがさらに好ましい。最も好ましい混合された結合体成分は、アジュバント化されていない。しかし、これらには、糖（例えば、ラクトース、または好ましくは、スクロース）が含まれる場合がある。
【０２０５】
（２１）アジュバント
抗原性の成分に加えて、本発明のワクチンには、通常、少なくとも１種類のアルミニウム塩アジュバントが含まれるであろう。上記のように、ワクチンには、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含めることができる。両方が含まれる場合には、２種類のアジュバントの重量比は、およそ１：１であり、例えば、約１．５８：１．６の水酸化アルミニウム：リン酸アルミニウムの比である。
【０２０６】
アルミニウムアジュバントは、通常、「水酸化アルミニウム」または「リン酸アルミニウム」アジュバントのいずれかと呼ばれるが、これらは、便宜上の名称である。なぜなら、いずれも、存在している実際の化合物についての正確な記述ではないからである（例えば、参考文献５４の第９章を参照のこと）。本発明では、アジュバントとして一般的に使用される「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントのいずれを使用することもできる。
【０２０７】
「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、通常、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常は、少なくとも部分的に結晶である。オキシ水酸化アルミニウムは、式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができ、これは、他のアルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３）とは、赤外線（ＩＲ）スペクトルによって、具体的には１０７０ｃｍ−１の吸収帯と３０９０〜３１００ｃｍ−１の強い肩部分の存在によって、区別することができる（参考文献５４の第９章）。
【０２０８】
「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、通常、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、これには、多くの場合には、少量の硫酸塩（すなわち、硫酸ヒドキシリン酸アルミニウム）も含まれている。これらは、沈殿によって得ることができ、そして沈殿の際の反応条件および濃度は、塩の中のヒドロキシルのリン酸での置換の程度に影響を与える。ヒドロキシリン酸塩は、一般的には、０．３から１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有している。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在による厳密なＡｌＰＯ４によって区別することができる。例えば、３１６４ｃｍ−１のＩＲスペクトル帯（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造上のヒドロキシルの存在を示す（参考文献５４の第９章）。
【０２０９】
アジュバントは、任意の適切な形態をとることができる（例えば、ゲル、結晶、不定形など）。
【０２１０】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、通常、０．３から１．２の間であり、好ましくは、０．８から１．２の間、より好ましくは、０．９５±０．１である。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる、０．８４から０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有している不定形のヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、特に、ヒドロキシリン酸塩については、通常、不定形である。リン酸アルミニウムは、通常は、粒子状である。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後は、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。
【０２１１】
リン酸アルミニウムのＰＺＣは、ヒドロキシルのリン酸塩での置換の程度と逆比例しており、この置換の程度は、沈殿による塩の調製のために使用される反応条件および反応物の濃度に応じて変化し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のリン酸イオンの濃度を変化させることによって（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）、または、ヒスチジン緩衝液のような緩衝液の添加によって（ＰＺＣをより塩基性にする）も変化される。本発明にしたがって使用されるリン酸アルミニウムは、通常、５．０から７．０の間のＰＺＣを有しており、より好ましくは、５．５から６．０の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有している。
【０２１２】
リン酸アルミニウムは、好ましくは、それに対して抗原が添加される水溶液の形態で使用される（ＮＢ：これは、一般的には、「溶液」としての水性のリン酸アルミニウムを意味するが、正確な物理化学的観点からは、塩は不溶性であり、懸濁液を形成する）。必要な濃度となるように、そして抗原性組成物の添加の前に確実に均質な溶液とするためには、リン酸アルミニウムを稀釈することが好ましい。
【０２１３】
抗原の添加前のＡｌ３＋の濃度は、一般的には、０から１０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましい濃度は、２から６ｍｇ／ｍｌの間である。
【０２１４】
本発明のワクチンを調製するために使用されるリン酸アルミニウム溶液には、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液）が含まれる場合があるが、これは必ずしも必要ではない。リン酸アルミニウム溶液は、好ましくは、滅菌のものであり、発熱物質を含まない。リン酸アルミニウム溶液には、遊離の水性のリン酸イオンが含まれる場合があり、例えば、１．０から２０ｎＭの間の濃度、好ましくは、５から１５ｍＭの間の濃度、そしてより好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在する。リン酸アルミニウム溶液にはまた、塩化ナトリウムも含まれる場合がある。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、０．１から１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であり、より好ましくは、約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在により、抗原の吸着の前のｐＨの補正測定が可能となる。
【０２１５】
抗原がアジュバントに「吸着」されると記載される場合は、抗原の少なくとも５０％（重量）が吸着されること、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上が吸着されることが好ましい。いくつかの実施形態においては、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドはいずれも、全てが吸着される、すなわち、上清の中では検出されない。ＨＢｓＡｇの全ての吸着もまた好ましい。
【０２１６】
（２２）ワクチンのさらなる成分
抗原とアジュバントなどと同様に、本発明の混合ワクチンにはさらなる成分が含まれる場合がある。これらの成分は様々な供給源のものであり得る。例えば、これらは、本発明のプロセスの間に混合される抗原性成分の１つの中に存在する場合があり、また、抗原性成分とは別のプロセスの間に添加される場合もある。
【０２１７】
最終的なワクチン生成物の張力を制御するためには、生理学的な塩、例えば、ナトリウム塩を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましい。これは、最終的なワクチン生成物の中に、１から２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。
【０２１８】
抗原の吸着の性質の理由から、最終的なワクチン生成物は、濁った外観を有している懸濁液であり得る。この外観は、微生物の混入を容易に見ることができないことを意味しており、したがって、ワクチンには、抗菌剤が含まれることが好ましい。ワクチンが多用量の容器の中にパッケージされる場合には、これは特に重要である。含められる好ましい抗菌剤は、２−フェノキシエタノールとチメロサールである。しかし、本発明のプロセスの間には、水銀保存剤（例えば、チメロサール）を使用しないことが好ましい。しかし、微量の存在は、プロセスの間に使用される抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ）がこのような保存剤で先に処理されている場合には、不可避である場合がある。しかし、安全性のためには、最終的なワクチン生成物に含まれる水銀は、約２５ｎｇ／ｍｌ未満であることが好ましい。より好ましくは、最終的なワクチン生成物には、検出できるほどのチメロサールは含まれない。これは、一般的には、本発明のプロセスにおけるその添加の前に抗原調製物から水銀保存剤を除去することによって、または、個々の抗原性成分の調製の間にチメロサールを使用することを避けることによって、この基準に達することができる。
【０２１９】
チメロサールのような物質と同様に、個々の抗原に由来する他の残留成分もまた、本発明のプロセスによって生産される最終的なワクチンの中に微量で存在する場合がある。例えば、ホルムアルデヒドがジフテリア、破傷風、および百日咳のトキソイドを調製するために使用される場合には、最終的なワクチン生成物が、微量のホルムアルデヒド（例えば、１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは、＜５μｇ／ｍｌ）を保持している場合がある。遊離のアミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システインおよび／またはシスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリンおよび／またはヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、および／またはバリン）、ビタミン（例えば、コリン、アスコルビン酸など）、リン酸ニナトリウム、リン酸一カリウム、カルシウム、グルコース、硫酸アデニン、フェノールレッド、酢酸ナトリウム、塩化カリウムなども、それぞれ≦１００μｇ／ｍｌ（例えば、≦５０μｇ／ｍｌ、≦１０μｇ／ｍｌ）で最終的なワクチンの中に保持される場合がある。抗原調製物の中にもともと存在している、最終的なワクチンのさらなる可能な成分は、抗原の完全ではない（ｌｅｓｓ−ｔｈａｎ−ｔｏｔａｌ）精製によって生じる。したがって、少量の百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、およびサッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タンパク質、ならびに／あるいはゲノムＤＮＡが存在する場合がある、これらの残留成分の量を最少にするためには、抗原調製物が、本発明のプロセスにおいて使用される抗原の前にそれらを除去するために処理されることが好ましい。
【０２２０】
アルミニウム塩が最終的なワクチンの中に存在する場合には、Ａｌ３＋として表されるアルミニウムの全量は、好ましくは、≦２ｍｇ／ｍｌ（例えば、１．２〜１．５ｍｇ／ｍｌの間、または約１．４ｍｇ／ｍｌ；あるいは、０．４〜０．８ｍｇ／ｍｌの間、または約０．６ｍｇ／ｍｌ）である。
【０２２１】
本発明のプロセスの間には、所望される最終的な濃度を得るための成分の稀釈は、通常、ＷＦＩ（注射用蒸留水）を用いて行われるであろう。
【０２２２】
抗原、特に、結合体抗原の間での緩衝を防ぐためには、ポリアニオン系ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸）を含めることができる［５５］。
【０２２３】
（２３）混合ワクチンのパッケージング
通常の使用においては、本発明のプロセスは、パッケージング、ならびに、その後の流通および投与に適している大量の混合ワクチンを提供するために使用されるであろう。上記の濃度は、最終的なパッケージングされたワクチンの中での典型的な濃度であり、大量のワクチンの中でのそのような濃度はより高い場合がある（例えば、稀釈により最終濃度が下がるので）。
【０２２４】
したがって、本発明のプロセスには、使用される容器へのワクチンのパッケージングのさらなる工程が含まれる場合がある。適切な容器としては、バイアル、および使い捨ての注射器（好ましくは、滅菌のもの）が挙げられる。
【０２２５】
ワクチンがバイアルにパッケージされる場合には、これらは好ましくは、ガラス製であるか、またはプラスチック材料製である。バイアルは、好ましくは、それにワクチンが添加される前に滅菌される。ラテックスに敏感な患者に伴う問題点を回避するために、バイアルは、ラテックスを含まない栓でシールすることができる。バイアルには、単回用量のワクチンが含まれる場合があり、また、これには、１用量以上（例えば、１０用量）が含まれる（「多用量」バイアル）場合もある。多用量のバイアルを使用する場合には、個々の用量は、バイアルの内容物の汚染を避けることに注意を払いながら、徹底的な無菌条件下で滅菌の注射針および注射器で、引き抜かれるべきである。好ましいバイアルは、無色のガラス製である。
【０２２６】
ワクチンが注射器にパッケージされる場合には、注射器には通常、針は取り付けられていないが、別に、針が、組立および使用のために注射器と共に供給される場合がある。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージ、および５／８インチ２５ゲージの針が一般的である。シリンジは、記録を容易にするためのロット番号と内容物の期限日をその上に印刷することができる剥離式のラベルが取り付けられて提供される場合がある。注射器のプランジャには、吸引の際に偶然にプランジャが外れてしまうことを防ぐためのストッパーがあることが好ましい。注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャを有している場合がある。使い捨ての注射器には、単回用量のワクチンが含まれる。注射器には、一般的には、針の取り付けの前に先端をシールするためのチップキャップがあり、そしてチップキャップは、ブチルゴム製が好ましい。注射器と針が別々にパッケージされている場合には、針には、ブチルゴム製の保護カバーが取り付けられていることが好ましい。灰色のブチルゴムが好ましい。好ましい注射器は、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（登録商標）として市販されているものである。
【０２２７】
ガラス製の容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合には、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもむしろホウケイ酸ガラス製の容器を使用することが好ましい。
【０２２８】
別々に含まれる場合には、結合体抗原は、通常、別々の容器の中で凍結乾燥（凍結乾燥）され、その結果、パッケージされたワクチンには、少なくとの２つの別の容器が含まれるであろう。患者への投与の前に、凍結乾燥された材料が、他の容器からの液体で再構成され、稀釈されるであろう。したがって、通常は、結合体の容器はバイアルであり、そして他方の容器には、バイアルまたは予め充填された注射器の中に液体が含まれるであろう。第２の容器の液体内容物は、凍結乾燥された結合体抗原の粉末を含むバイアルの中に移され、それによって、患者への投与のために結合体抗原が再構成される。
【０２２９】
凍結乾燥された結合体のための容器は、好ましくは、予め充填された注射器をキャップの中に差し込むことができ、注射器の内容物を、その中の凍結乾燥された材料を再構成するためにバイアルの中に放出することができ、そしてバイアルの内容物を注射器の中に戻し入れることができるように、適応されたキャプ（例えば、Ｌｕｅｒ  ｌｏｃｋ）を有しているバイアルである。バイアルから注射器を取り外した後、針を取り付けることができ、ワクチンを患者に投与することができる。キャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置することができ、結果として、シールまたはカバーを取りはずせば、キャップを利用することができる。
【０２３０】
本発明の混合ワクチンは、好ましくは、０．５ｍｌの用量で患者に投与される。したがって、本発明のプロセスには、大量のワクチンのうちの０．５ｍｌの試料を取り出し、容器の中にパッケージングする工程が含まれる場合がある。多用量の状況については、多用量が取り出され、そして１つの容器の中に一緒にパッケージされる。ワクチンが凍結乾燥された成分とともにキットとして提示される場合には、再構成後の最終的な用量は、好ましくは、０．５ｍｌである。本明細書中の０．５ｍｌの用量との記載は、０．５ｍｌ±０．０５ｍｌを意味すると理解されるべきである。
【０２３１】
ワクチンがその中にパッケージされる容器は、通常、その後、流通用の箱の中（例えば、ダンボール箱の中）に梱包され、そして箱には、ワクチンの詳細（例えば、その商品名、ワクチンの中の抗原のリスト（例えば、「ジフテリア、破傷風、不活化全細胞百日咳、およびＢ型肝炎組み換え体、吸着ワクチン」など））、提示容器（例えば、「使い捨ての予め充填されているＴｉｐ−Ｌｏｋ注射器（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  Ｔｉｐ−Ｌｏｋ  Ｓｙｒｉｎｇｅｓ）」または「１０×０．５ｍｌの単回用量のバイアル（１０×０．５ｍｌ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｓｅ  Ｖｉａｌ）」、その用量（例えば、それぞれ，０．５ｍｌの用量を１つ含む）、注意事項（例えば、「小児への投与に限る（Ｆｏｒ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｎｌｙ）」、有効期限など）がラベルされるであろう。個々の箱には、１つ以上のパッケージされたワクチン（例えば、５個のパッケージされたワクチンまたは１０個のパッケージされたワクチン）（具体的には、バイアル）が含まれるであろう。ワクチンが注射器の中に含まれている場合は、パッケージには注射器の絵が表示される場合がある。
【０２３２】
ワクチンは、ワクチンについての詳細（例えば、投与についての説明書）、ワクチンの中の抗原についての詳細などが含まれている説明書（ｌｅａｆｌｅｔ）と一緒に（例えば、同じ箱の中に）パッケージされる場合がある。説明書にはまた、注意事項（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に簡単に使用することができるアドレナリンの溶液を保存しておくこと）なども含まれる場合がある。
【０２３３】
パッケージされたワクチン材料は、滅菌されていることが好ましい。
【０２３４】
パッケージされたワクチン材料には、好ましくは、発熱物質は含まれず、例えば、用量あたり＜１  ＥＵ（内毒素単位、標準的測定値）、好ましくは、用量あたり＜０．１  ＥＵが含まれる。
【０２３５】
パッケージされたワクチン材料には、グルテンが含まれないことが好ましい。
【０２３６】
任意の水性のパッケージされたワクチン材料のｐＨは、好ましくは、６から８の間であり、例えば、６．５から７．５の間である。したがって、本発明のプロセスには、パッケージングの前に大量のワクチンのｐＨを調整する工程が含まれる場合がある。
【０２３７】
パッケージングされたワクチンの中の水性の材料は、好ましくは、濁った白色の懸濁液である。
【０２３８】
パッケージされたワクチンは、好ましくは、２℃から８℃の間で保存される。凍結はされるべきではない。
【０２３９】
（２４）ワクチンの投与
本発明の最終的な混合ワクチンは、ヒトへの、特に、子供への投与に適している。ワクチンについての典型的な投与スケジュール、または十分な効力を有するための順序には、一次免疫スケジュールの中での１用量以上の投与が含まれるであろう。典型的な一次免疫スケジュールには、６週から９週齢の年齢の子供に投与される最初の用量を含む、約６から８週間の間隔で投与される３回の用量が含まれるであろう。６週齢、１０週齢、および１４週齢での３用量の一次スケジュールが好ましく、これには、１８ヶ月齢での４回目の用量が続く場合がある。
【０２４０】
ワクチンはまた、様々なワクチンの一次免疫スケジュールを完了させるために使用される場合もある。
【０２４１】
本発明により、患者において免疫応答を惹起させるための方法が提供され、これには、本発明の組成物を患者に投与する工程が含まれる。
【０２４２】
本発明によってはまた、医薬品として使用される本発明の組成物も提供される。
【０２４３】
本発明によってはまた、患者を免疫化するための医薬品の製造における、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖の使用も提供される。
【０２４４】
本発明によってはまた、患者を免疫化するための医薬品の製造における、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の使用も提供される。この場合、医薬品は、結合体混合物を再構成するために使用される。
【０２４５】
本発明によってはまた、患者を免疫化するための医薬品の製造における、（ｉ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、および（ｉｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖の使用も提供される。この場合、医薬品は凍結乾燥され、そして少なくとも１つのさらなる抗原を含む水性のワクチンによる再構成の後に、投与される。
【０２４６】
様々な医薬品のさらなる特異的な特性は上記に提供されている。好ましい医薬品はワクチンである。
【０２４７】
医薬品は、通常、患者に直接投与されるであろう。直接の送達は、非経口注射によって（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または組織の間質空間）、あるいは、直腸投与、経口投与、膣投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与、耳への投与、肺投与、または他の粘膜への投与によって、行うことができる。しかし、一般的には、これらは、筋肉内注射によって投与される。好ましい注射部位は、前外側の大腿、または上腕三角筋である。
【０２４８】
これらの用途、方法、および医薬品は、好ましくは、上記の病原体に対する免疫化のためのものである。患者は好ましくはヒトであり、子供（例えば、２〜４歳ぐらいの幼児、乳児）、１３歳から１９歳、または成人であり得るが、一般的には、子供であろう。好ましい患者は、０〜３６ヶ月の間、例えば、（０〜２４ヶ月の間、０〜１２ヶ月の間、または０〜６ヶ月の間）の月齢である。
【０２４９】
異なる抗原の効力をチェックするための方法は当該分野で公知である。
【０２５０】
本発明のワクチンは、経口ポリオワクチン（例えば、３価の経口ポリオワクチン（例えば、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルス、および３型ポリオウイルスが含まれている））と実質的に同時に投与することができる。初めて本発明のワクチンが投与される子供は、以前に経口ポリオワクチンおよび／またはカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）ワクチンが投与されている場合がある。
【０２５１】
したがって、免疫化に好ましい患者のグループとしては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：（ａ）以前に経口ポリオワクチンを投与された子供；（ｂ）以前にＢＣＧワクチンを投与された子供；（ｃ）経口ポリオワクチンとＢＣＧワクチンの両方を以前に投与された子供；（ｄ）Ｄ、Ｔ，Ｐｗ，ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ結合体の全てと、少なくとも１つの髄膜炎菌結合体がこれまでに投与されていない、グループ（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の子供；ならびに（ｅ）経口ポリオワクチン、ＢＣＧ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ結合体と、少なくとも１つの髄膜炎菌結合体が以前に投与された子供。これらの子供は、上記の年齢のグループ（例えば、０〜３６ヶ月、０〜２４ヶ月、０〜１２ヶ月、または０〜６ヶ月）のいずれかであり得る。
【０２５２】
したがって、本発明により、上記のグループ（ａ）から（ｅ）の１つの患者を免疫化するための医薬品の製造における、（ｉ）ジフテリアトキソイド、（ｉｉ）破傷風トキソイド、（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖、（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜糖の使用が提供される。
【０２５３】
本発明のワクチンにアルミニウムをベースとするアジュバントが含まれる場合には、保存の間に成分の沈殿が生じる場合がある。したがって、ワクチンは、患者への投与の前に振られなければならない。振られたワクチンは、濁った白色の懸濁液であろう。
【０２５４】
一般論
用語「含まれている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「から構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味することができる。例えば、Ｘが「含まれている」組成物は、Ｘだけから構成される場合も、また、別のものが含まれている場合（例えば、Ｘ＋Ｙ）もある。
【０２５５】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合がある。必要に応じて、用語「実質的に」は、本発明の定義から「実質的に」除外される場合がある。
【０２５６】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２５７】
結合技術についての一般的情報は、参考文献３９に見ることができる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）ジフテリアトキソイド、「Ｄ」；
（ｉｉ）破傷風トキソイド、「Ｔ」；
（ｉｉｉ）細胞性百日咳抗原、「ｗＰ」；
（ｉｖ）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、「ＨＢｓＡｇ」；
（ｖ）キャリアタンパク質に結合体化されたインフルエンザ菌ｂ型（「Ｈｉｂ」）莢膜糖；および
（ｖｉ）キャリアタンパク質に結合体化された少なくとも１つの髄膜炎菌莢膜糖、
を含むワクチン組成物であって、ここで、前記インフルエンザ菌ｂ型莢膜糖および前記髄膜炎菌莢膜糖は、それぞれ破傷風トキソイドキャリアタンパク質に結合体化される、ワクチン組成物。
（項目２）
前記成分（ｖｉ）が、髄膜炎菌の血清群ＡおよびＣに由来する糖を含む、項目１に記載のワクチン。
（項目３）
前記成分（ｉｖ）の結合体が過剰重量のキャリアを有し、糖対キャリアの重量比が１：２と１：４の間である、項目１に記載のワクチン。
（項目４）
前記成分（ｉｖ）の結合体は、（ａ）臭化シアンでインフルエンザ菌ｂ型莢膜糖を活性化させてシアン酸エステルを得る工程；（ｂ）前記シアン酸エステルに対してアジピン酸ヒドラジドスペーサーを付加して活性化された糖を得る工程；および（ｃ）カルボジイミド縮合によって、キャリアタンパク質に対して前記活性化された糖をカップリングさせる工程を含むプロセスによって得ることができる、項目１〜３のいずれかに記載のワクチン。
（項目５）
前記成分（ｉｖ）の結合体が、以下の構造：
【化１】
2015034178.tif 000023
を有するリンカーを含む、項目１〜４のいずれかに記載のワクチン。
（項目６）
前記成分（ｖｉ）の結合体は、（ａ）髄膜炎菌莢膜糖をシアニル化してシアン酸エステルを得る工程；および（ｂ）前記シアン酸エステルをタンパク質キャリアに対して直接カップリングさせる工程を含むプロセスによって得ることができる、項目１〜５のいずれかに記載のワクチン。
（項目７）
前記髄膜炎菌莢膜糖が血清群Ａに由来する、項目６に記載のワクチン。
（項目８）
前記髄膜炎菌莢膜糖が血清群Ｃに由来する、項目６に記載のワクチン。
（項目９）
前記成分（ｖｉ）の結合体が、ＯＡｃ＋髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜糖を含む、項目１〜８のいずれかに記載のワクチン。
（項目１０）
前記成分（ｖｉ）の結合体が、ＯＡｃ−髄膜炎菌血清群Ｃの莢膜糖を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１１）
前記成分（ｖｉ）の結合体が、髄膜炎菌血清群Ａの莢膜糖を含み、そのマンノサミン残基の少なくとも８０％がＣ−３位置でＯ−アセチル化される、項目１〜１０のいずれかに記載のワクチン。
（項目１２）
前記ワクチンが、８μｇ／ｍｌと１２μｇ／ｍｌの間の前記成分（ｉｖ）の結合体を含む、項目１〜１１のいずれかに記載のワクチン。
（項目１３）
前記ワクチンの単位用量が、８μｇと１２μｇの間の前記成分（ｉｖ）の結合体を含む、項目１〜１２のいずれかに記載のワクチン。
（項目１４）
前記ワクチンが、８μｇ／ｍｌと１２μｇ／ｍｌの間の前記成分（ｖｉ）の結合体を含む、項目１〜１３のいずれかに記載のワクチン。
（項目１５）
前記ワクチンの単位用量が、８μｇと１２μｇの間の前記成分（ｖｉ）の結合体を含む、項目１〜１４のいずれかに記載のワクチン。
（項目１６）
前記ワクチンが、リン酸アルミニウムアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントの両方を含む、項目１〜１５のいずれかに記載のワクチン。
（項目１７）
前記ＨＢｓＡｇがリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される、項目１〜１６のいずれかに記載のワクチン。
（項目１８）
前記ジフテリアトキソイドが水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、項目１〜１７のいずれかに記載のワクチン。
（項目１９）
前記破傷風トキソイドが水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、項目１〜１８のいずれかに記載のワクチン。
（項目２０）
前記ワクチンが、水銀保存剤および２−フェノキシエタノール保存剤を含む、項目１〜１９のいずれかに記載のワクチン。
（項目２１）
Ｌｆ単位で測定した破傷風トキソイド対ジフテリアトキソイドの比が、２：１と３：１との間である、項目１〜２０のいずれかに記載のワクチン。
（項目２２）
前記ＨＢｓＡｇがグリコシル化されておらず、リン脂質とホスファチジルイノシトールとを含む脂質マトリックスを含む粒子の形態である、項目１〜２１のいずれかに記載のワクチン。
（項目２３）
前記ＨＢｓＡｇはＨＢＶサブタイプａｄｗ２に由来する、項目１〜２２のいずれかに記載のワクチン。
（項目２４）
前記ワクチンが０．５ｍｌの用量で患者に投与される、項目１〜２３のいずれかに記載のワクチン。
（項目２５）
項目１〜２４のいずれかに記載のワクチンを調製するためのプロセスであって、（ａ）３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を１価のＨＢｓＡｇ成分と混合して、４価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を得る工程；（ｂ）Ｈｉｂ結合体と少なくとも１つの髄膜炎菌結合体を混合して、混合された結合体成分を得る工程；および（ｃ）前記Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ成分を前記混合された結合体成分と混合して、前記ワクチンを得る工程を含む、プロセス。
（項目２６）
前記３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分が、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む、項目２５に記載のプロセス。
（項目２７）
前記３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分の中のＤ成分およびＴ成分が、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される、項目２６に記載のプロセス。
（項目２８）
前記１価のＨＢｓＡｇ成分がリン酸アルミニウムアジュバントに吸着される、項目２５〜２７のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２９）
前記混合された結合体成分がアジュバント化されていない、項目２５〜２８のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３０）
前記３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分が水銀保存剤を含む、項目２５〜２９のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３１）
前記水銀保存剤がチメロサールである、項目３０に記載のプロセス。
（項目３２）
前記混合された結合体成分が水銀保存剤を含まない、項目２５〜３１のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３３）
前記ワクチンは２−フェノキシエタノール保存剤を含むが、前記３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分は２−フェノキシエタノール保存剤を含まない、項目２５〜３２のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３４）
前記Ｈｉｂ結合体が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを使用して破傷風トキソイドキャリアに対してＨｉｂ糖を結合体化させること；その後、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）尿素を除去することによって調製される、項目２５〜３３のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３５）
前記髄膜炎菌結合体が、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムを使用して髄膜炎菌糖を破傷風トキソイドキャリアに結合させること；その後、４−ジメチルアミノ−ピリジンを除去することによって調製される、項目２５〜３４のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３６）
（ａ）Ｄ、Ｔ、ｗＰ、およびＨＢｓＡｇ抗原を含む第１の成分と；（ｂ）Ｈｉｂ結合体と髄膜炎菌結合体を含む第２の成分を含み、前記２つの成分が別々の容器の中に存在する、項目１〜２４のいずれか１項に記載のワクチン組成物を調製するためのキット。
（項目３７）
前記第２の成分中の結合体が凍結乾燥される、項目３６に記載のキット。
（項目３８）
前記第２の成分が、ラクトース、スクロース、および／またはマンニトールを含む、項目３７に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１−１】図１は、組成物中でのＨＢｓＡｇの安定性についてのウェスタンブロットの結果を示す。図１Ａにおいては、レーンは：（１）Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＬＳＢ）；（２）ＭＷマーカー；（３〜５）１μｇの３種類の異なる対照ＨＢｓＡｇ調製物；（６〜８）３種類の異なる５価のロットの上清；（９〜１０）ＬＳＢである。図１Ｂにおいては、レーンは：（１）ＭＷマーカー；（２〜４）１μｇの３種類の異なる対照ＨＢｓＡｇ調製物；（５〜７）２〜８℃で２週間保存した、３種類の異なる５価のロットの上清；（８〜１０）３６〜３８℃で２週間保存した、３種類の異なる５価のロットの上清である。
【図１−２】図１は、組成物中でのＨＢｓＡｇの安定性についてのウェスタンブロットの結果を示す。図１Ａにおいては、レーンは：（１）Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＬＳＢ）；（２）ＭＷマーカー；（３〜５）１μｇの３種類の異なる対照ＨＢｓＡｇ調製物；（６〜８）３種類の異なる５価のロットの上清；（９〜１０）ＬＳＢである。図１Ｂにおいては、レーンは：（１）ＭＷマーカー；（２〜４）１μｇの３種類の異なる対照ＨＢｓＡｇ調製物；（５〜７）２〜８℃で２週間保存した、３種類の異なる５価のロットの上清；（８〜１０）３６〜３８℃で２週間保存した、３種類の異なる５価のロットの上清である。
【図２】図２は、５価の組成物についての経時的なｐＨの変化を示す。
【図３】図３は、８価の組成物中でのＨＢｓＡｇの安定性についてのウェスタンブロットの結果を示す。図３Ａおよび３Ｂにおいては、：レーン１にはＭＷマーカーが含まれ；レーン２には、１μｇ／ｍｌのＨＢｓＡｇ対照が含まれ；レーン３には、８価の組成物の上清が含まれる。図３Ｂにおいては、レーン４には、ＬＢＳが含まれ；レーン５には、レーン２と同じ対照が含まれ；レーン６には、ＤＯＣ／ＴＣＡ抽出物が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【０２５９】
発明を実施するための形態
８価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＣ−ＭｅｎＷ１３５−ＭｅｎＹワクチン
酵母によって発現されたＨｂｓＡｇ、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および全細胞性百日咳抗原を、アルミニウム塩アジュバントの懸濁液に添加した。混合物のｐＨを調整し、その後、Ｈｉｂ−ＣＲＭ１９７結合体を添加した。その結果、これは、アルミニウムアジュバントを吸着するようにはならなかった。このプロセスによって、以下の組成を有している５価のワクチンが得られた：
【０２６０】
【化２２】
2015034178.tif 000024
追加実験において、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および血清群Ｙのそれぞれに由来する別の髄膜炎菌ＣＲＭ１９７結合体を、８価のワクチンを得るために、ＣＲＭ−Ｈｉｂ成分の後で添加した。
【０２６１】
【化２３】
2015034178.tif 000025
ワクチンの安定性および効力についての重要なパラメーターは、Ｈｉｂ結合体の加水分解の割合であり、臨床上の限界は、２５％の遊離の糖（参考文献５６には、２０％では臨床的な免疫原性に影響はないことが報告されている）。このパラメーターは、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって５価のワクチンにおいて測定した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによっては、ピコモルレベルで、結合していない炭水化物の直接的な定量が可能であり、これには、最小限の分離と仕上げ（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）しか伴わない。分析は、遊離の糖の量に焦点を絞っている。
【０２６２】
糖は以下についてアッセイした：
（ａ）全量、μｇ／ｍｌ
（ｂ）上清中の（すなわち、吸着されていない）量、μｇ／ｍｌ
（ｃ）遊離の状態である量（ＣＲＭ１９７−Ｈｉｂ結合体の加水分解）、μｇ／ｍｌ
値（ｃ）は、（ｄ）（ｂ）の割合として、または（ｅ）理論上の糖濃度の合計（２０μｇ／ｍｌ）の割合としてのいずれかで表される。結果は以下である：
【０２６３】
【化２４】
2015034178.tif 000026
最大２５％の遊離の糖が臨床的に許容される。全ての値はこの限界値よりも下であり、２〜８℃で４週間までについては、６．５％より下であった。熱応力条件（３６〜３８℃で４週間）下では、より高いレベルが見られたが、それでもなお、２５％の値よりは下であり、最大値は、ロット１についての１１．６％であった。多価Ｈｉｂワクチンについての以前の研究では、３６〜３８℃での１ヶ月の保存によっては、２〜８℃での２年間の保存よりも多量のＣＲＭ−Ｈｉｂの加水分解が生じたことが示されている。したがって、許容される加水分解は、通常の保存条件下で少なくとも２年間の時間のスケールにわたって期待することができる。
【０２６４】
遊離の糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を、２〜８℃での６ヶ月間の後にもまた行った。データは以下である：
【０２６５】
【化２５】
2015034178.tif 000027
したがって、４週間と比較しても６ヶ月間では遊離の糖の割合はわずかしか増加せず、値はなおも２５％の値よりも下であった。したがって、ＣＲＭ１９７−Ｈｉｂは３種類の処方物のうちでも極めて安定である。
【０２６６】
図２Ａは、２〜８℃で保存した３つのロットについて、６ヶ月間にわたる５価のワクチンの中でのｐＨの変化を示す。図２Ｂは、３６〜３８℃で保存した３種類のロットについての４週間のｐＨの変化を示す。２〜８℃では、ｐＨは６ヶ月間安定であったが、熱応力条件下では、２週間後には０．１ｐＨ単位のわずかな低下があり、４週間後にはさらにわずかに低下した。それでもなお、全てのｐＨ値は、６．０〜７．０の許容される範囲内に留まった。
【０２６７】
３種類の５価のロットの全ての浸透圧は、３１２から３１５ｍＯｓｍ／Ｋｇの間であり、注射することができるワクチンについての重要な許容範囲２４０〜３６０ｍＯｓｍ／Ｋｇの中にあった。
【０２６８】
抗原の効力と免疫原性の評価は、混合ワクチンの効力を評価するために重要である。５価のワクチンの中でのジフテリア抗原、破傷風抗原、および百日咳抗原の効力を評価し、ＣＲＭ−ＨｉｂとＨＢｓＡｇの両方の免疫原性を試験した。ＥＬＩＳＡ分析を、免疫化後の特異的抗体のレベルを評価するために行った。ＨＢｓＡｇの免疫原性は、マウスモデルと、ＨＢＶ効力について使用される様々な免疫化スケジュールを使用して行った。
【０２６９】
ＤＴＰ効力の値は以下であった：
【０２７０】
【化２６】
2015034178.tif 000028
これらの３種類の抗原のそれぞれについて、効力の試験の結果は、全てが許容される下限を有意に上回っており、これらの結果は、これらの３種類の抗原の良好な効力を示している。
【０２７１】
ＨＢｓＡｇの免疫原性を評価するために、１０匹のＣＤ１マウスのグループに、０日目と１４日目に、皮下注射（０．５ｍｌ、生理食塩水中に１：４に稀釈した）によって５価のワクチンを投与した。マウスを２１日目に放血させ、そして、ＨＢｓＡｇ特異的抗体を、（ａ）「Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ  Ａｎｔｉ−ＨＢｓ  ＩＩ」試験（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）または（ｂ）「Ａｕｓａｂ  ＥＩＡ」試験（Ａｂｂｏｔｔ）のいずれかを使用してＥＬＩＳＡによって評価した。これらのＥＬＩＳＡ試験は異なる形式であり、ＨＢｓＡｇに対して異なる感度を有している。したがって、幾何平均力価（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ  Ｔｉｔｒｅ）値を、２つの試験の間で比べることはできない。しかし、それぞれの試験の範囲では、血清についてのＧＭＴの値は最適であった。結果は以下であった：
【０２７２】
【化２７】
2015034178.tif 000029
この種類のマウスでの免疫原性アッセイを行って得られたＧＭＴ値は全て、文献に報告されている値よりも高い。レスポンダーの割合は、約１００％の最適レベルでは、いずれの抗原についても一貫して高かった。
【０２７３】
Ｈｉｂ免疫原性を評価するために、８匹のＣＤ１マウスのグループに、０日目、１０日目、および２０日目に、皮下注射（０．５ｍｌ、生理食塩水中に１：４に稀釈した）によって５価のワクチンを投与した。マウスを３４日目に放血させ、Ｈｉｂ特異的抗体を、ＥＬＩＳＡによって評価した。結果は以下であった：
【０２７４】
【化２８】
2015034178.tif 000030
アルミニウムアジュバントに対するＨＢｓＡｇの吸着は、ワクチンの免疫原性にとって重要な要素であり、このパラメーターを免疫ブロットによって測定した。したがった免疫ブロットの手順は、原則的には以下のとおりであった：１ｍｌの容量のワクチン上清をＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させ、ＬＳＢで変性させ、その後、１２％のアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした；１μｇの各ロットのＨＢｓＡｇを対照としてロードした；ヤギ抗ＨＢｓＡｇ抗体調製物（１：１０００に稀釈した）を一次抗体として使用し、そして抗ヤギＰＯＤ結合体（１：２５００に希釈した）を二次抗体として使用した。
【０２７５】
５価のワクチンについての結果を図１に示す。図１Ａのレーン６〜８は、時間０では組成物中に検出できる可溶性のＨＢｓＡｇはないことを示しており、そして図１Ｂおよび１Ｃのレーン５〜１０によって、これが、２〜８℃または３６〜３８℃での２週間および４週間の保存後にもそのままであり続けることが確認される。３種類の異なるロットの中では、約９９％のＨＢｓＡｇが、これらの様々な条件下でアジュバント上に吸着したままであった。
【０２７６】
さらに別の安定性についてのアッセイを、２〜８℃での６ヶ月間の保存後に行った（図１Ｄ）。吸着は、これらの３種類のロットのそれぞれについて、約９９％維持された。
【０２７７】
図１で使用したポジティブ対照には、１μｇのＨＢｓＡｇが含まれていた。Ｓペプチド（２４ｋＤａ）に相当する１つのバンドが見られ、加えて、凝集物の特徴であるバンド（約４５ｋＤａ）も見られた。Ｐｒｅ−Ｓ２は見られなかった。
【０２７８】
８価のワクチンもまた、同様の方法でＨＢｓＡｇの吸着について試験した。１ｍｌの試料を、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を新しいチューブに取り、そしてＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させた。ペレットを、２００μｌの抽出緩衝液の中に再度懸濁させ、５分間沸騰させ、そして１３００ｒｏｍで１０分間遠心分離した。２０μｌのこの抽出物と、ＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させた上清を、ウェスタンブロットのために１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした。
【０２７９】
図３Ａは、時間０での８価のワクチンを示し、図３Ｂは、２〜８℃での８ヶ月間の保存後のワクチンを示す。図３Ｂのレーン３および６の中で有意な染色が全く見られなかった（対照レーン２および５の中において１μｇのＨＢｓＡｇを用いた場合に見られるよりも確実に少ない染色）ことは、ＨＢｓＡｇの吸着が、この保存期間を通じて安定なままであったことを示している。
【０２８０】
７価のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ−Ｈｉｂ−ＭｅｎＡ−ＭｅｎＣワクチン
５種類の抗原性成分を以下のようにまとめる：
−３価のＤ−Ｔ−Ｐｗ成分：Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分を調製した。これには、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着されたジフテリアトキソイド、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着された破傷風トキソイド、およびリン酸アルミニウムを有している全細胞性百日咳抗原が含まれている。この成分には、チメロサールが含まれているが、２−フェノキシエタノールは含まれていない。
【０２８１】
−ＨＢｓＡｇ成分：ＨＢｓＡｇを、組み換え体サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から発現させ、そして精製した。精製したタンパク質を、リン酸アルミニウム抗原上に吸着させた［１７］。
【０２８２】
Ｈｉｂ結合体成分：ＨＩｂ多糖を、Ｈｉｂ、２０７５２株から調製し、臭化シアンでの活性化とアジピン酸ヒドラジドスペーサーを用いた誘導の後、約１：３の糖：キャリアの重量比で、カルボジイミド縮合によって破傷風トキソイドに共有結合させた。ＥＤＡＣを含む反応の後、ＥＤＵレベルを測定した。
【０２８３】
−ＭｅｎＡ結合体成分：血清群Ａの髄膜炎菌から莢膜糖を精製し、そして、ＣＤＡＰ技術を使用して、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）プロテインＤに共有結合させた。ＣＤＡＰを含む反応の後、残留しているＤＭＡＰ含有量を測定し、そして、Ｃ−３位置でのＯＡｃ基の保持を確認した。破傷風トキソイドキャリアを使用する結合体もまた、これもまたＣＤＡＰ結合体によって調製した。
【０２８４】
−ＭｅｎＣ結合体成分：ＯＡｃ＋血清群Ｃの髄膜炎菌から莢膜糖を精製し、そして、ＣＤＡＰ技術を使用して、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）プロテインＤに共有結合させた。ＣＤＡＰを含む反応の後、残留しているＤＭＡＰ含有量を測定した。ＯＡｃ−株からもまた、結合体を調製した。破傷風トキソイドキャリアを使用する結合体もまた、これもまたＣＤＡＰ結合体によって調製した。
【０２８５】
Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分を、ＨＢｓＡｇ成分と混合し、この４価の混合物を、栓のあるバイアルの中に水性形態でパッケージした。ＨＢｓＡｇレベルは、１０μｇ／用量である。
【０２８６】
３種類の結合体を、参考文献２に記載されるように、混合し、そして凍結乾燥させた。凍結乾燥された粉末を、栓のあるバイアルの中にパッケージした。個々の結合体は、５μｇ／用量で存在する。この用量の２倍のそれぞれの結合体を含む混合物もまた調製した。結合体混合物には、アジュバントは含まれていない。
【０２８７】
２つのバイアルを、箱の中に一緒にパッケージした。
【０２８８】
患者への投与のために、水性のＤ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ材料を注射器の中に引き抜き、これを、凍結乾燥された結合体のバイアルの中に注入した。凍結乾燥させた材料が再度活性化された後、これを、注射器の中に引き抜いて戻し、患者への投与のために準備した。
【０２８９】
乳児には、６週目、１０週目、および１４週目に、３用量の最初のワクチン接種を、筋肉内注射によって投与した。比較のために、１４０人の乳児には、ＧＳＫのＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／Ｈｉｂワクチンを投与した。このワクチンは優れた免疫原性を示す。
【０２９０】
追跡試験においては、乳児に、６週目、１０週目、および１４週目に７価のワクチンを投与した。対照患者には、ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／ＨｉｂまたはＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／ＨｉｂとＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣワクチンのいずれかを投与した。血清中の抗体濃度を、この最初のワクチン接種の過程の前と、１ヵ月後に測定した。応答型の局所的および全身的な有害事象は８日間記録し、応答型ではない有害事象はそれぞれのワクチン用量の後３０日間記録した。最初の過程の後には、ＴＲＩＴＡＮＲＩＸ−ＨｅｐＢ／Ｈｉｂの対照グループでの１００％と比較して、７価のワクチンを投与した患者のうちの９９％〜１００％が、≧０．１５μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰレベルに達した。（Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃを投与した被験体の１００％に対して）７価のワクチンを投与した患者のうちの９９％〜１００％が、≧１：８のＳＢＡ−ＭｅｎＣ力価を有していた。（Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃが投与された被験体の＜１０％に対して）７価のワクチンを投与した被験体のうちの少なくとも９７．７％は、≧１：８のＳＢＡ−ＭｅｎＡ力価を有していた。７価のワクチンによって誘導されたジフテリア抗原、破傷風抗原、およびＢ型肝炎抗原に対する血清防御レベル、ならびに、抗百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）トキソイド濃度は高く、これは対照ワクチンと同程度であった。臨床的に関係している応答型／非応答型の有害事象の発病率は低く、そして、全てのグループに均等に分布していた。ワクチン接種に関係する重篤な深刻な事象は報告されなかった。７価のワクチンは優れた免疫原性、および良好な安全性プロフィールを示し、このことは、これがＭｅｎＡおよびＭｅｎＣの流行地で生活している乳児の最初のワクチン接種に適している混合ワクチンであることを示唆している。
【０２９１】
さらなる実験においては、１０ヶ月齢の乳児における、ワクチンのＨｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣ成分に対する免疫記憶と抗体持続を評価した。７価のワクチンで感作した乳児におけるＨｉｂ、ＭｅｎＡ、およびＭｅｎＣに対する抗体持続と免疫記憶は優れていた：１０μｇの各結合体によって、高いレベルの対応する抗体が誘発され、このことは、結合体ワクチンによる感作が不適切であることを示している。なぜなら、これは、感作されていない（ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについて）低年齢の幼児における応答よりも高く、Ｈｉｂｅｒｉｘ（登録商標）（Ｈｉｂについて）と同様であるからである。
【０２９２】
本発明は例示だけのために記載されており、修飾を、本発明の範囲および精神の中にありながら行うことができることが理解されるであろう。
【０２９３】
（参考文献（その内容は、参考として本明細書に援用される））
【０２９４】
【表１】
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【０２９５】
【表２】
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【図２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図３】
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【外国語明細書】
2015034178000001.pdf