(57)【要約】【課題】  接合型を有さないａ／α型酵母から、変異原を用いることなく、簡便で効率的かつ確実にａ型もしくはα型酵母を製造する方法を提供すること。【解決手段】  本発明の接合能を有する酵母のスクリーニング方法は、所望の選択圧に対応したマーカー遺伝子を、ａ型細胞特異的又はα型細胞特異的に発現させることで、優良な形質を有するａ／α型の酵母からＬＯＨにより派生したａ型もしくはα型酵母を選抜する工程を含む。得られた形質転換株を少なくとも片方の親株として用いることで、優良な形質を有する任意の酵母との交雑株を効率的に製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
接合型を有さない酵母から、接合能を有する酵母を製造する方法であって、選択マーカー遺伝子をプロモーターの下流に挿入した発現ベクターを用いて形質転換し、選択マーカー遺伝子に対応した選択圧のもとでａ型又はα型酵母を選抜する工程を含む方法。
【請求項２】
前記酵母が、醸造用酵母又はパン酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択マーカー遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)属酵母由来のＵＲＡ３遺伝子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターが、ＹＣｐ型のプラスミドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ａ型酵母が選抜対象であるとき、前記プロモーターが、ａ型特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、請求項１〜４のいずれかに記載した方法。
【請求項６】
前記プロモーターがＰSTE2である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記α型酵母が選抜対象であるとき、前記プロモーターが、α型特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーターがＰSTE3である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターと同一又は別異の発現ベクターを用いて、α２遺伝子又はａ１遺伝子をａ型又はα型酵母細胞内で発現させてａ１−α２複合体を形成させることにより、自己倍数化を抑制する工程を設けることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記選択マーカー遺伝子が制御下にあるプロモーターが、酵母の一倍体細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターがＰHOである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載した方法により製造した接合能を有する酵母を、少なくとも片方の親株として、酵母の交雑株を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載した方法により製造した酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の交雑を行なうための、酵母菌株を育種する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は古来より人類の日常生活と密接に関わり合ってきた。清酒，ワイン，ビール等の酒精飲料、及びパン、味噌，醤油等の発酵食品の製造に加えて、近年のバイオテクノロジーの発達により医薬品の製造にも関わるに至っている。(以降、「飲料・食品・医薬品等の製品の製造などの産業上有用な用途に用い得る酵母」を「実用酵母」とも表示する)。
【０００３】
酵母の有効利用に際しては、優秀な酵母を育種することが不可欠である。これまでに様々な育種法が用いられて、実用酵母菌株の改良が行われてきた。とりわけ交雑育種法は古くから広く用いられてきた方法である。交雑育種法とは、異なる二つの菌株(親株)について人為的に交雑を行い、所望の形質を有する交雑株を選抜する方法であり、両親株の優良形質を併有する株を得るために有効な方法である。酵母の交雑には接合を利用するため、交雑の両親株として用いる二株は互いに接合する性質(以降「接合能」とも表示する)、すなわち、それぞれａ型とα型の接合型を持つことが必要である。
【０００４】
なお酵母には、基本数の染色体を有する一倍体、基本数の２倍の染色体を有する二倍体、基本数のＮ倍(Ｎは自然数を表す)の染色体を有するＮ倍体のように、倍数性の異なる様々な細胞が存在する。ここで、酵母の接合型を決定する遺伝子座(以後、「ＭＡＴ座」とも表記する)が、ａ/ａ/ａ/ａのようにａのみから構成される場合をａ型、α/α/αのようにαのみから構成される場合をα型、ａ/ａ/α/α/αのようにａとαを含んで構成される場合をａ／α型と定義すると、いかなる倍数性を有する酵母の接合型も、上述のａ型、α型、またはａ／α型のいずれかに分類することができる。以下、倍数性を明示する場合を除き、「ａ型」、「α型」、および「ａ／α型」は、上述の定義に従って表記するものとする。また一倍体のａ型、α型を明示する表記は、ａ型(一倍体)、α型(一倍体)とする。高次倍数体のａ型、α型を明示する場合も、同様の形式で記載する。
【０００５】
実用酵母の多くは二倍体、あるいは四倍体などの高次倍数体であり、通常は接合能を持たないａ／α型の接合型を持つ。そこでかかる酵母から減数分裂を経て胞子を形成させることで、接合能を有するａ型もしくはα型の減数分裂分離体が取得される。ところが、実用酵母の中には胞子形成能が著しく低い菌株も多数存在するため、ａ型もしくはα型の酵母の製造には多大な労力を要する。
【０００６】
近年、酵母細胞内で接合型変換遺伝子(ＨＯ)を発現させることにより、酵母の接合型をａ型(二倍体)もしくはα型(二倍体)酵母に変換し、接合能を持たない酵母に接合能を付与する技術(特許文献１)が開発された。しかし、この方法によると、ａ型(二倍体)及びα型(二倍体)酵母が同時に生成されるため、増殖の過程で両者が接合して自己倍数化が起こることが避けられない。その結果、所望の接合型を持つ目的酵母同士の交雑体の出現頻度は低くなる。
本発明者らは、最近、酵母の接合の制御機構に着目し、接合型変換遺伝子(ＨＯ)発現により変換されたａ型(二倍体)細胞内ではα２遺伝子を、またα型(二倍体)細胞内ではａ１遺伝子を強制的に発現させることで、ａ型(二倍体)酵母及びα型(二倍体)酵母それぞれの自己倍数化を抑制することに成功して自己倍数化抑制に基づく酵母育種法技術を確立し、特許出願をしている(非特許文献１，特願２０１３−０１４８６３)。これらの技術により、胞子形成のない酵母であっても、親株の接合型座位を除く全ての遺伝的背景を継承したａ型(二倍体)又はα型(二倍体)型の酵母を自己倍数化することなく安定して提供することができ、交雑法を適用することで望みの交雑体を得ることが可能となった。しかしながら、本発明者らの自己倍数化抑制方法によってもＨＯ遺伝子発現による接合能の付与工程は必須である。ＨＯが作用するためには、対象とする酵母の接合型座位(以下、「ＭＡＴ座位」とも表示する)に特定の配列が必要であり、わずか１塩基の変異がある場合においても、ＨＯが作用できなくなることが知られている(非特許文献２)。すなわち、かかる手法は一定の限定された範囲の酵母にしか適用することができない。
【０００７】
一方、ヘテロ接合性の消失(Loss of Heterozygosity：以後、「ＬＯＨ」とも表示する)を利用することで、ａ型もしくはα型の接合能を有する酵母を製造する技術(非特許文献３)も開発されている。ＬＯＨとは、二倍体もしくは高次倍数体細胞において染色体再配置が生じることで、特定の遺伝子座が異なった対立遺伝子(もしくは配列)からなる状態(以後、「ヘテロ接合型」とも表示する)から、同一の遺伝子配列を有する状態(以後、「ホモ接合型」とも表示する)へと変化する現象を指す。ＬＯＨは一般的に1/104以下の低頻度でしか生じないことが知られているが(非特許文献４)、非特許文献３の方法では酵母に対してＵＶ照射を行うことで、ＬＯＨの頻度を1/10程度にまで上昇させることが可能であることを示している。
すなわち、この技術を用いれば、酵母のＭＡＴ座位に高頻度のＬＯＨを生じさせることが可能であり、ａ／α型の酵母から、ａ型又はα型の酵母を容易に製造することが可能となる。
【０００８】
しかしながら、非特許文献５で指摘しているように、ＬＯＨの頻度を増加させるために利用したＵＶ照射は、同時に他の遺伝子座に対して望まざる変異を惹起するリスクを有している。すなわち優良な形質を有する酵母を親株としたにもかかわらず、かかる形質が、製造したa型又はα型の酵母に継承されるとは限らない。したがって製造した交雑体の集団から所望の形質を有する酵母株を選別する作業が不可欠となる。
【０００９】
また、ＵＶ照射を用いずに、染色体中の特定の遺伝子座をホモ化させる技術(特許文献２)も開発されている。この技術では、相同組換え法により、酵母の相同染色体のいずれか一方の遺伝子座に選択マーカー遺伝子を導入したのち、ＬＯＨにより選択マーカー遺伝子が脱落した酵母を選抜することで、遺伝子座のホモ化が達成される。この技術を、ａ型(二倍体)もしくはα型(二倍体)の接合能を有する酵母製造に適用しようとすると、酵母の接合型を決定するＭＡＴ座位に選択マーカー遺伝子を導入する必要がある。
【００１０】
しかし、酵母の染色体上には、ＭＡＴ座位の擬似遺伝子とも呼べるＨＭＬおよびＨＭＲ座位と呼ばれるサイレント型の遺伝子座位が存在し、これらＨＭＬおよびＨＭＲ座位は、ＭＡＴ座位と数百塩基対にわたって同一の上流および下流配列を有している。そのため、ＭＡＴ座位を標的として選択マーカー遺伝子を導入しても、ＭＡＴ座位ではなくＨＭＬ座位及び／又はＨＭＲ座位に導入されてしまう可能性がかなりの高確率で存在する。したがって、他の遺伝子座位を標的とする場合に比べてＭＡＴ座位への導入効率は大幅に低いことが予想され、さらに選抜工程後にはＭＡＴ座位に正しく導入されたか否かの煩雑な確認工程も必須になる。
【００１１】
以上のように、所望の形質を有する異なった実用酵母から、それぞれの形質を継承したａ型とα型の酵母の組み合わせを獲得するには依然甚大な労力が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１０−２２０４８１号公報
【特許文献２】特開２００９−１７８１０４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Nobuo Fukuda, et. al., 2013. ACS Synth Biol, in press, DOI: 10.1021/sb400016j
【非特許文献２】Bryan L. Ray, et. al., 1991, Mol Cell Biol., Vol.11, 5372-5380.
【非特許文献３】Shinji Hashimoto, et. al., 2006, Appl Microbiol Biotechnol., Vol.69, 689-696.
【非特許文献４】Mina Hiraoka, et. al., 2000, Genetics. Vol.156, 1531-1548.
【非特許文献５】Ryosuke Yamada, et. al., 2010, Appl Microbiol Biotechnol，Vol.88, 849-857.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、接合型を持たないａ／α型の酵母から、変異原を用いることなく、効率的かつ確実にａ型又はα型の酵母を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、接合型に依存した酵母細胞の増殖制御技術を導入することで、ａ／α型の酵母からＬＯＨによって自然に派生したａ型又はα型の酵母を選択的に取得できることを見出した。所望の選択圧に対応した選択マーカー遺伝子を、酵母のａ型細胞特異的又はα型細胞特異的な遺伝子発現ベクターに挿入したのち、かかるベクターを優秀な形質を有する酵母に対して予め導入しておくことで、低頻度のＬＯＨにより生成したａ型又はα型の酵母を選別することに成功し、本発明を完成するに到った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下を包含する。
〔１〕  接合型を有さない酵母から、接合能を有する酵母を製造する方法であって、選択マーカー遺伝子をプロモーターの下流に挿入した発現ベクターを用いて形質転換し、選択マーカー遺伝子に対応した選択圧のもとでａ型又はα型酵母を選抜する工程を含む方法。
〔２〕  前記酵母が、醸造用酵母又はパン酵母である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕  前記選択マーカー遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)属酵母由来のＵＲＡ３遺伝子である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕  前記発現ベクターが、ＹＣｐ型のプラスミドである、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  前記ａ型酵母が選抜対象であるとき、前記プロモーターが、ａ型特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載した方法。
〔６〕前記プロモーターがＰSTE2である、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕  前記α型酵母が選抜対象であるとき、前記プロモーターが、α型特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕  前記プロモーターがＰSTE3である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕  前記選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターと同一又は別異の発現ベクターを用いて、α２遺伝子又はａ１遺伝子をａ型又はα型酵母細胞内で発現させてａ１−α２複合体を形成させることにより、自己倍数化を抑制する工程を設けることを特徴とする、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕  前記選択マーカー遺伝子が制御下にあるプロモーターが、酵母の一倍体細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターである、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  前記プロモーターがＰHOである、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕  前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載した方法により製造した接合能を有する酵母を、少なくとも片方の親株として、酵母の交雑株を製造する方法。
〔１３〕  前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載した方法により製造した酵母。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、優良な形質を有するａ／α型の酵母から、望まざる変異のリスクを回避して、ａ型又はα型の酵母を簡便で効率良く、かつ確実に製造することができる。製造した酵母を用いて交雑育種を行えば、両親株の優良な形質を併有する交雑株を効率的に育種することが可能となると考えられる。すなわち、本発明の製造方法は、従来法では交雑育種ができなかった、又は困難であった実用酵母の交雑育種の効率性を著しく高めることを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】接合能を有する酵母のスクリーニング方法の模式図                      （Ａ）ａ型酵母をスクリーニングする方法の模式図                              （Ｂ）α型酵母をスクリーニングする方法の模式図
【図２】マーカー遺伝子ＵＲＡ３を挿入したＹＥｐ型(マルチコピー型)ベクターを用いた場合の酵母の挙動                                                        （Ａ）ａ型特異的プロモーターＰSTE2を用いたベクターｐＨＹ−２Ｕの遺伝子地図  （Ｂ）ｐＨＹ−２Ｕを導入した各接合型の酵母細胞の増殖特性を示すグラフ        （Ｃ）α型特異的プロモーターＰSTE3を用いたベクターｐＬＹ−３Ｕの遺伝子地図  （Ｄ）ｐＬＹ−３Ｕを導入した各接合型の酵母細胞の増殖特性を示すグラフ
【図３】マーカー遺伝子ＵＲＡ３を挿入したＹＣｐ型(シングルコピー型)ベクターを用いた場合の酵母の挙動                                                      （Ａ）ａ型特異的プロモーターＰSTE2を用いたベクターｐＬＳ−２Ｕの遺伝子地図  （Ｂ）ｐＬＳ−２Ｕを導入した各接合型の酵母細胞の増殖特性を示すグラフ        （Ｃ）α型特異的プロモーターＰSTE3を用いたベクターｐＨＳ−３Ｕの遺伝子地図  （Ｄ）ｐＨＳ−３Ｕを導入した各接合型の酵母細胞の増殖特性を示すグラフ
【図４】２種類のベクターを共用したα型特異的なＵＲＡ３遺伝子発現手法、及びかかる手法を用いた場合の酵母の挙動                                            （Ａ）ＰHOを用いたＵＲＡ３遺伝子発現ベクターｐＨＳ−ＨｏＵ、及びＰSTE2を用いたα２遺伝子発現ベクターｐＬ３Ｇ−２αの遺伝子地図                          （Ｂ）ｐＨＳ−ＨｏＵ及びｐＬ３Ｇ−２αを導入した各接合型の酵母細胞の増殖特性を示すグラフ
【図５】ａ型酵母、及びα型酵母のスクリーニングの実施結果                    （Ａ）ａ型(二倍体)酵母のスクリーニングにおいて、Ｕｒａ欠損寒天プレート上でからａ型(二倍体)酵母からなるコロニーの生育を示す写真(ＯＤ600＝１に調整した酵母懸濁液１ｍｌを塗布)                                                        （Ｂ）ａ型(二倍体)酵母として単離した酵母が発する蛍光強度を示すグラフ        （Ｃ）α型(二倍体)酵母のスクリーニングにおいて、Ｕｒａ欠損寒天プレート上でα型(二倍体)酵母からなるコロニーの生育を示す写真(ＯＤ600＝０.１に調整した酵母懸濁液１ｍｌを塗布)                                                        （Ｄ）α型(二倍体)酵母として単離した酵母が発する蛍光強度を示すグラフ        （Ｅ）異なる栄養要求性を有する親株との接合により生成した交雑体酵母の生育を示す写真
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．本発明の特徴について
本発明は、接合型を有さないａ／α型の酵母から、ａ型又はα型の接合能を有する酵母を製造する方法に関する。本発明の製造方法は、接合型に依存した発現特性を有するプロモーターに連結した選択マーカー遺伝子を、酵母細胞にベクターを用いて導入して、ａ型又はα型の酵母を選抜する工程を含むことを特徴とし、この工程を含んでいる限り、当業者に公知のもののうち技術的に適用可能な全ての工程を包含することを排除しない。また、親株と本発明の製造方法により得られた酵母株の遺伝子型あるいは表現型は、接合型に関連する部分以外は不変であることが好適であるが、接合型に関連する部分以外の遺伝子型あるいは表現型が変化することを除外しない。
本発明の製造方法における「ａ型又はα型酵母を選抜する工程」としては、酵母の増殖に関与する選択マーカー遺伝子を、酵母の接合型によって制御されるプロモーター又は一倍体特異的な発現特性を有するプロモーターの下流に挿入して発現させる。特定の選択圧の存在下において、ベクターを用いて導入した選択マーカー遺伝子の発現の有無を利用して、所望の接合型の酵母のみを生育させる工程である限り特に制限されない。
上記の選択マーカー遺伝子としては、例えば、ブラストサイジン耐性遺伝子(ＢＳＲ遺伝子)や、Ｇ４１８耐性遺伝子(ｋａｎＭＸ４遺伝子)、又はヒスチジン合成遺伝子(ＨＩＳ３遺伝子)やロイシン合成遺伝子(ＬＥＵ２遺伝子)、ウラシル合成遺伝子(ＵＲＡ３遺伝子)を好適に例示することができる。本発明の実施態様では、例示のためにサッカロミセス・セレビシエ属酵母由来のＵＲＡ３遺伝子を用いて説明しているが、これに限られるものではない。
サッカロミセス・セレビシエ属酵母由来のＵＲＡ３遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列を有するＵＲＡ３遺伝子を好適に例示することができる。なお、酵母細胞内で発現させることによって、かかる酵母にウラシル合成能を付与し得る遺伝子である限り、上記好適として例示した配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。なお、本発明において「１もしくは数個」とは、１〜５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個であり、全長の塩基配列の８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲内での変異があるか、または改変が施されていることを表す。
したがって、本発明における好ましいＵＲＡ３遺伝子は、例えば、酵母細胞内で発現させることによって、かかる酵母にウラシル合成能を付与し得る遺伝子であって、かつ下記の(１)〜(２)のいずれかから選択される塩基配列を有する遺伝子であると表すことができる。
（１）配列番号１に示される塩基配列、
（２）配列番号１に示される塩基配列の１個若しくは数個の塩基残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列、
【００２０】
２．本発明の適用可能な「酵母」について
上記の「酵母」としては、飲料、食品、医薬品等の製品の製造などの産業上有用な用途に用い得る酵母(実用酵母)、具体的には、サッカロミセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する酵母を好適に例示することができ、飲料や食品の製造に用い得る酵母をさらに好適に用いることができ、飲料や食品の製造に用いることができ、かつ、サッカロミセス(Saccharomyces)属に属する酵母を特に好適に用いることができる。上記の「飲料や食品の製造に用い得る酵母」としては、下面発酵酵母、上面発酵酵母、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、ウイスキー酵母などの醸造用酵母や、パン酵母などを好適に例示することができる。
【００２１】
３．本発明における接合能を有する酵母の製造方法について
（３−１）方法の概略
ａ／α型の酵母を培養して増殖を繰り返していくと、大部分の細胞は母細胞と同じくａ／α型の接合型を維持しているが、ＭＡＴ座位にＬＯＨを生じることで、わずかにａ型及びα型の酵母が出現する。しかしながらＬＯＨの頻度の低さに加えて、出現したａ型及びα型は接合して再びａ／α型酵母を形成してしまうため、培養した細胞群におけるａ型もしくはα型酵母の割合は、極めて低い水準に留まることとなる。
そこで、本発明では、ａ／α型の酵母からａ型酵母のみを選択しようとする場合には、ａ型特異的プロモーターの制御下に選択マーカー遺伝子(例えばＵＲＡ３遺伝子)を繋ぎ、反対にα型酵母のみを選択しようとする場合には、α型特異的プロモーターの制御下に選択マーカー遺伝子を繋いだベクターを酵母に導入し、かかる酵母を一晩以上培養したのち、選択培地(例えばウラシル欠損培地)に塗布することで、望みの接合型(ａ型又はα型)を持つ酵母のコロニーを取得することができる。その際に、さらにａ型もしくはα型特異的プロモーターに標識遺伝子(例えばＧＦＰ遺伝子)を繋いだベクターも同時に挿入しておくと、標識強度を指標に、陽性又は偽陽性の判別が可能となる。
【００２２】
（３−２）本発明で用いられるプロモーターについて
所望の接合型を持つ酵母の細胞内で選択マーカー遺伝子(例えばＵＲＡ３遺伝子)を発現させ得るプロモーターである限り、特に制限されないが、一般に、ａ型特異的に発現させる場合においては、ａ型特異的な発現特性を有するプロモーター(以後、「ａ型特異的プロモーター」とも表示する)を、α型特異的に発現させる場合においては、α型特異的な発現特性を有するプロモーター(以後、「α型特異的プロモーター」とも表示する)が用いられる。
「ａ型特異的プロモーター」としては、ＰSTE2(非特許文献１参照)又はＰSTE6(特許文献１参照)などを好適に例示することができ、「α型特異的プロモーター」としてはＰSTE3(非特許文献１参照)、ＰMFA1(参考文献１参照)、又はＰMFA2(参考文献１参照)などを好適に例示することができる。
そして、これらプロモーターを選択マーカー遺伝子の上流に連結した酵母用ベクター(好ましくは、酵母で自律複製可能なプラスミド)を用いて、常法により酵母細胞内に導入する。
【００２３】
さらに本発明において、下記の「自己倍数化抑制技術(非特許文献５)」を利用して、人為的にａ１−α２複合体を形成する場合には、一倍体特異的な発現特性を有するプロモーター(以後、「一倍体特異的プロモーター」とも表示する)を用いることができる。「一倍体特異的プロモーター」としては、ＰSTE18(参考文献２参照)又はＰHO(参考文献３参照)などを好適に例示することができる。
自己倍数化が抑制されている場合のａ型酵母細胞内で選択マーカー遺伝子(例えばＵＲＡ３遺伝子)を発現させる場合においては、ａ型特異的プロモーターの「ＰSTE2(配列番号２)」が特に好ましく、α型酵母細胞内で発現させる場合においては、一倍体特異的プロモーターの「ＰHO(配列番号３)」が特に好ましい。
自己倍数化が抑制されていない場合のａ型酵母細胞内で選択マーカー遺伝子(例えばＵＲＡ３遺伝子)を発現させる場合においては、ａ型特異的プロモーターの「ＰSTE2」が特に好ましく、α型酵母細胞内で発現させる場合においては、一倍体特異的プロモーターの「ＰSTE3(配列番号４)」が特に好ましい。
【００２４】
なお、選択マーカー遺伝子を発現させ得る限り、上記好適として例示したプロモーター配列において１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する改変型プロモーターを用いることもできる。
したがって、本発明における好ましいプロモーターは、例えば、下記の(１)〜(４)のいずれかから選択される塩基配列を有するものであると表すことができる。
（１）配列番号２に示される塩基配列、
（２）配列番号２に示される塩基配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列。
（３）配列番号３に示される塩基配列、
（４）配列番号３に示される塩基配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列。
（５）配列番号４に示される塩基配列、
（６）配列番号４に示される塩基配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列。
【００２５】
（３−３）ａ型もしくはα型酵母の選抜方法
前述のように、所望の接合型を持つ酵母に、選択マーカー遺伝子(例えばＵＲＡ遺伝子)を発現させるベクターを導入して得られた形質転換体を培養し、選択圧をかける(例えばウラシルを欠損する寒天培地上に塗布する)ことで、ａ型もしくはα型酵母を単離することができる。本発明において、単離した酵母細胞が所望の接合型を持つか否かの確認は、標識を観察する(例えば、ＧＦＰ蛍光の有無を観察する)ことによって、容易に確認することができる。
ここで、標識遺伝子としては、例えば、蛍光標識遺伝子、発色標識遺伝子、発光標識遺伝子を好適に例示することができる。蛍光標識遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質(ＤｓＲｅｄ)、シアン色蛍光タンパク質(ＣＦＰ)などが挙げられる。発色標識遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)などが挙げられる。発光標識遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ(ｌｕｃ)などが挙げられる。本発明の実施態様では、例示のためにＧＦＰ遺伝子(配列番号５)を用いて説明しているが、これに限られるものではない。
当該標識遺伝子は、ａ型酵母を単離する場合はａ型特異的プロモーターの制御下に、またα型酵母を単離する場合はα型特異的プロモーターの制御下に組み込んだベクターを用いる。なお、自己倍数化が抑制されている場合は「一倍体特異的プロモーター」を用いることができる。
その際のベクターとしては、本発明の選択マーカー遺伝子を導入するためのベクターと同一のベクター(好ましくは、酵母で自律複製可能なプラスミド)に組み込まれていてもよい。
【００２６】
（３−４）「自己倍数化抑制技術」について
本発明において、接合能を有する酵母を製造するにあたり、「接合を制御する遺伝子」を酵母細胞内で発現させる方法、具体的には本発明者らが先に開発した「自己倍数化抑制技術(非特許文献１)」を併用することが好ましい。
ａ型酵母はａ１遺伝子を、α型酵母はα２遺伝子を、ａ／α型酵母はａ１遺伝子とα２遺伝子を元来発現している。ａ／α型酵母の細胞内で共発現されたａ１及びα２は、ａ１−α２複合体を形成して一倍体特異的プロモーターのリプレッサーとして機能する(参考文献１)。本発明者らが開発した自己倍数化抑制技術(非特許文献１)は、ａ型酵母及びα型酵母それぞれでα２遺伝子及びａ１遺伝子を人為的に発現させてａ１−α２複合体を形成させる技術である。一倍体特異的プロモーターの下流に存在し、ａ型又はα型の一倍体細胞内で特異的に発現する酵母の接合を誘起する遺伝子群(以降、「ｈｓｇ」とも表示する)は、前記ａ１−α２複合体によって発現が抑制されるので、ａ型酵母又はα型酵母であるにもかかわらず、かかる酵母の接合能を抑制することが可能となる。
【００２７】
ここで典型的なａ１遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシエ酵母由来の配列番号６に示されるアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号：CAA24622)をコードするａ１遺伝子が、またα２遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシエ酵母由来の配列番号７に示されるアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号：DAA07518)をコードするα２遺伝子を示すことができる。なお、酵母の接合型変換の際に生成する対型酵母の接合能を欠失し得る限り、上記好適として例示した配列において１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加された配列を有する変異体、あるいは改変体を用いることもできる。なお、本発明において「１もしくは数個」とは、１〜５０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個であり、全長のアミノ酸配列の８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲内での変異があるか、または改変が施されていることを表す。
したがって、本発明における好ましい接合を制御する遺伝子は、例えば、酵母細胞内で発現させることによって、かかる酵母の接合型変換の際に生成する対型酵母の接合能を欠失し得る遺伝子であって、かつ下記の(１)〜(４)のいずれかから選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であると表すことができる。
（１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、
（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
（３）配列番号７に示されるアミノ酸配列、
（４）配列番号７に示されるアミノ酸配列の１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列。
その他の「接合を制御する遺伝子」としては、GPA1(GenBankアクセッション番号：NP_011868)、SST2(GenBankアクセッション番号：NP_013557)、DIG1(GenBankアクセッション番号：NP_015276)などをα２遺伝子、ａ１遺伝子などに代替して用いても良い。
【００２８】
（３−５）ａ／α型酵母からａ型又はα型酵母が出現する機構について
本発明において、ａ型又はα型酵母は、ａ／α型酵母の細胞分裂の過程で出現する。主な機構として、上述のＬＯＨが挙げられるが、これに限られるものではない。例えば、母細胞と娘細胞の分裂時において、染色体が不均等分配されることによって生じる「染色体喪失」なども、ａ／α型酵母からａ型又はα型酵母が出現する機構として含む。この場合、出現したａ型又はα型酵母は、もとのａ／α型酵母とは異なる倍数性をもつこともある。例えば、ａ／α型(二倍体)酵母からａ型(一倍体)又はα型(一倍体)酵母が出現することもある。
上述のように、ａ／α型酵母(親株)と製造した酵母株の遺伝子型あるいは表現型(接合型に関連する部分以外)は不変であることが好適であるため、製造したａ型又はα型酵母は親株と同じ倍数性を持つことが好ましいが、異なる倍数性をもつことを除外しない。
【００２９】
（３−６）図１に示された本発明の実施の態様
具体的な本発明の態様として、図１を参照して説明する。(なお、図１では、ａ型特異的プロモーターとして「ＰSTE2」を、α型特異的プロモーターとして「ＰSTE3」を、一倍体特異的プロモーターとして「ＰHO」を用い、選択マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を選択し、かつＧＦＰ遺伝子で標識する場合であり、非特許文献１の「自己倍数化抑制技術」を用いた場合を例示している。ただし、本発明は当該態様には限定されない。
【００３０】
図１Ａのａ型酵母のスクリーニングでは、ａ型特異的プロモーター(ＰSTE2)制御下でＵＲＡ３遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を発現させることにより、ウラシルを欠損する寒天培地上でａ型酵母のコロニーを単離することが可能となる。また単離したコロニーはａ型特異的プロモーターの作用によりＧＦＰを発現するため、蛍光強度の高さが陽性細胞群であることを示す。一方、図１Ｂに示すα型酵母のスクリーニングでは、α型特異的プロモーター(ＰSTE3)制御下でＵＲＡ３及びＧＦＰ遺伝子を発現させることにより、ウラシルを欠損する寒天培地上でα型酵母のコロニーを単離することができ、ＧＦＰ蛍光強度を指標に、酵母の接合型を確認することができる。
【００３１】
４．酵母の形質転換
（４−１）酵母への導入方法
上記構築物の酵母への導入は、上記構築物をベクターに組み込んで、そのベクターを酵母へ導入する。ベクターの酵母への導入方法としては、エレクトロポレーション法、金属処理法、プロトプラスト法等の技術的に適用可能な当業者に公知の全ての方法を用いることができる。
その際、用いるベクターとしては、ゲノムＤＮＡに組み込まれるタイプのプラスミドは適さず、酵母細胞内で自律複製可能なプラスミドを用いる。
本発明で用いる「酵母細胞内で自律複製可能なプラスミド」としては、ＹＣｐタイプ、ＹＥｐタイプ、ＹＲｐタイプのプラスミドを例示することができる。
ＹＥｐタイプ及びＹＲｐタイプのプラスミドは多コピー型プラスミドであり、遺伝子の高発現が可能であるため、自己倍数化抑制のためのａ１又はα２遺伝子の発現や、また接合型を評価するためのＧＦＰ遺伝子の発現に用いることが好ましい。
一方、単コピープラスミドであるＹＣｐタイプは、遺伝子の発現量は制限されるが、同時に漏出性の遺伝子発現を低減することができるため、選択マーカー遺伝子(例えばＵＲＡ３)の発現に用いることが特に好ましい。すなわち、ＹＣｐタイプのプラスミドを選択マーカー遺伝子の発現に用いることで、接合能を有する酵母をスクリーニングする際のバックグランドが大幅に低減できる。
【００３２】
（４−２）不要なプラスミドの脱落方法
本発明の製造方法は、「所望の接合型を持つ酵母を選抜した後」、又は、「単離された酵母を他の酵母と接合させた後」に、不要となったプラスミド、すなわち、「ＵＲＡ３遺伝子を発現させるための構築物を組み込んだプラスミド」や、「ＧＦＰ遺伝子を発現させるための構築物を組み込んだプラスミド」、又は「酵母細胞内でａ１遺伝子又はα２遺伝子を発現させるための構築物を組み込んだプラスミド」を脱落させる工程をさらに含んでいることが好ましく、これらの構築物を全て脱落させる工程をさらに含んでいることがより好ましい。かくしてプラスミドを脱落させた株は、その酵母の染色体ＤＮＡに外来ＤＮＡ(前述のプラスミド)の痕跡を全く残さないため、かかる株は上述のように、現行の法規制で規定するところの組換え体生物等には該当しないと解釈される。したがって、接合前のかかる酵母は、飲料や食品にも制限無く利用することができる交雑株を得るための交雑育種の母本として好適に用いることができ、接合後のかかる酵母は、飲料や食品にも制限無く利用することができる点で好ましい。
【００３３】
上記のプラスミドを酵母から脱落させる方法としては、特に制限されないが、そのプラスミドを保持させる方向の選択圧をかけない条件でその酵母を培養した後、そのプラスミドに含まれる選択マーカー遺伝子を持たなくなった細胞を選択することにより、プラスミドを脱落した株を容易に得ることができる。
【００３４】
５．本発明の交雑株を製造する方法
本発明の交雑株を製造する方法としては、本発明の製造方法により製造された所望の接合型を持つ酵母(以降、「本発明による酵母」とも表示する)を、少なくとも片方の親株として交雑を行なう工程を含む。かかる酵母の交雑方法としては特に制限されず、両方の親株を混合して培養する等の公知の方法を用いることができる。なお、両方の親株のそれぞれに別個の選択マーカー遺伝子(好ましくは薬剤耐性遺伝子)を導入しておくと、それらの両方の選択マーカー遺伝子を併せ持つ株を選別することで、交雑株を容易に単離することが可能となる。上記のマーカー遺伝子としては、例えば、ブラストサイジン耐性遺伝子(ＢＳＲ遺伝子)や、Ｇ４１８耐性遺伝子(ｋａｎＭＸ４遺伝子)、又はヒスチジン合成遺伝子(ＨＩＳ３遺伝子)やロイシン合成遺伝子(ＬＥＵ２遺伝子)、ウラシル合成遺伝子(ＵＲＡ３遺伝子)を好適に例示することができる。上記の本発明の交雑株を製造する方法においては、本発明による酵母同士を両親株として交雑してもよいし、本発明による酵母でない方の親株として、元々ａ型もしくはα型の接合能を有している株を用いても良い。後記実施例では、同一の親株に別個のマーカー遺伝子を導入したのち、創製したａ型(二倍体)及びα型(二倍体)酵母を接合させて四倍体酵母を作成したが、当業者に公知の形態の内、技術的に適用可能ないかなる形態も排除しない。
【００３５】
上記の本発明の交雑株を製造する方法を用いると、従来法では実用的な交雑育種ができなかった、又は困難であった酵母(例えば実用酵母)について、両親株の優良な形質を併有する交雑株(以降、「本発明による交雑株」とも表示する)を著しく効率的に育種することが可能となる。上記の本発明による交雑株として、例えば、醸造用酵母として優良な形質を２つ以上併有する交雑株や、パン酵母として優良な形質を２つ以上併有する交雑株を例示することができる。醸造用酵母として優良な形質としては、高発酵性、硫化水素低生産性、高度凝集性、亜硫酸高生産性、アルコール高耐性を好適に例示することができる。
【００３６】
（参考文献）
参考文献１：Botstein D, et. al., 2004, Genetics, Vol.166, 653-660.
参考文献２：Kentaro Furukawa, et. al., 2011, PLoS One, Vol.6, e26584.
参考文献３：Brenda J. Andrews, et. al., 1989, Cell. Vol.57, 21-29.
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００３８】
（実験方法）
（１）培地の調製
１％(w/v)酵母エキストラクト、２％(w/v)ペプトンおよび２％(w/v)グルコースを含むＹＰＤ培地、０.６７％(w/v)アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース(Becton Dickinson社製)及び２％(w/v)グルコースを含むＳＤ培地で酵母を培養した。ＳＤ培地には選択マーカー遺伝子に対応するアミノ酸および核酸を適宜添加した。２％(w/v)寒天をこれらの培地に添加してＹＰＤおよびＳＤの固体培地を調製した。
【００３９】
（２）酵母の調製
酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のメチオニン要求性ａ型(一倍体)株ＢＹ４７４１(参考文献４参照)、リジン要求性α型(一倍体)株ＢＹ４７４２(参考文献４参照)、及び以下の実施例で作製した酵母株、並びに酵母株に導入したプラスミドの情報を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2015000046.tif 000002
【００４１】
（３）蛍光測定
図１に示すように、緑色蛍光タンパク質をコードするＧＦＰ遺伝子を酵母の接合型を示すためのレポーター遺伝子として用いた。酵母形質転換体を、ＳＤ培地を用いて３０℃で１８時間培養したのち、集菌および洗浄して滅菌水で再懸濁した。菌体濃度ＯＤ600＝５.０となるように調整した酵母懸濁液１００μＬの蛍光強度をマイクロプレートリーダーInfinite200(Tecan Japan社製)を用いて測定した。励起フィルタセンター波長を４８５ｎｍ(フィルタ帯域幅２０ｎｍ)に、蛍光フィルタセンター波長を５３５ｎｍ(フィルタ帯域幅２５ｎｍ)に設定し、ゲインを５０に固定して測定を行った。
【００４２】
（４）増殖アッセイ
ａ型、α型、およびａ／α型の酵母を、ウラシル含有培地(＋Ｕｒａ)又はウラシル欠損培地(−Ｕｒａ)を用いて、それぞれ初期菌体濃度ＯＤ600＝０.０３から、３０℃にて培養した。各培養時間において酵母培養液のＯＤ600を測定することで、各接合型の酵母の増殖特性を評価した。
【００４３】
（５）接合アッセイ
酵母の接合能を評価するため、ａ型およびα型の酵母の栄養要求性の違いを利用して、接合体のみが生育可能となるよう作成した寒天培地を用いて増殖アッセイを実施した。ａ型及びα型酵母株をそれぞれ初期菌体濃度ＯＤ600＝０.１で１ｍＬのＹＰＤ培地に播種し、３０℃にて１.５時間共培養した。菌体を回収して洗浄したのち、滅菌蒸留水に再懸濁した。ＯＤ600＝１.０、０.１および０.００１の酵母懸濁液を調製し、接合体のみが生育することができる寒天培地上に１０μＬずつスポットして、３０℃で２日間培養したのち、コロニー形成の有無を調べた。
【００４４】
（実施例１）ＹＥｐ型プラスミドを用いたＵＲＡ３遺伝子の発現例
（１−１）ａ型細胞特異的ＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドの構築
ＵＲＡ３遺伝子をプライマー１(配列番号８)及びプライマー２(配列番号９)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＲＳ３１６(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)を鋳型として増幅し、プラスミドｐＨＹ−２ＧＡ(非特許文献１参照)のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＨＹ−２Ｕとした。
【００４５】
（１−２）α型細胞特異的ＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドの構築
ＵＲＡ３遺伝子をプライマー３(配列番号１０)及びプライマー２(配列番号９)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＲＳ３１６を鋳型として増幅し、プラスミドｐＬＹ−３ＧＣ(非特許文献１参照)のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＬＹ−３Ｕとした。
【００４６】
（１−３）ＹＥｐ型ＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドを有する各接合型の酵母細胞の増殖アッセイ
ａ型細胞としてＢＹ４７４１を、α型細胞としてＢＹ４７４２を、ａ／α型細胞としてＢＹ４７４３を選択し、それぞれｐＨＹ−２Ｕ(図２Ａ)あるいはｐＬＹ−３Ｕ(図２Ｃ)を酢酸リチウム法(参考文献５参照)により導入した形質転換体を創製した。各形質転換体を１８時間培養した後のＯＤ600の測定結果をそれぞれ図２ＢおよびＤに示す。図中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００４７】
この結果、プラスミドｐＨＹ−２Ｕを導入してＳＤ−Ｕｒａ培地で培養した場合、ａ型細胞はＵＲＡ３遺伝子を発現して増殖することに成功したが、α型及びａ／α型細胞も明らかにＯＤ600の値が増大することを確認した(図２Ｂ)。一方で、プラスミドｐＬＹ−３Ｕを導入してＳＤ−Ｕｒａ培地で培養した場合、α型細胞のみならずα型及びａ／α型細胞もＵＲＡ３遺伝子を発現して増殖することを確認した(図２Ｄ)。以上のように、ＹＥｐ型ＵＲＡ３発現プラスミドを酵母細胞に導入すると、所望しない接合型を持つ酵母細胞もＳＤ−Ｕｒａ培地で生育してしまうことが示された。ＹＥｐ型プラスミドは、１細胞当たり数十コピー維持されるため、ＰSTE2およびＰSTE3が有する遺伝子発現の漏出性が増長されたと推察される。そこで漏出性遺伝子発現の増長を回避するため、以下に示すように、１細胞当たり１コピーしか維持されないＹＣｐ型プラスミドの利用を試みた。
【００４８】
（実施例２）ＹＣｐ型プラスミドを用いたＵＲＡ３遺伝子の発現例
（２−１）ａ型細胞特異的ＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドの構築
ＰSTE2−ＵＲＡ３を含むＤＮＡ断片をプライマー４(配列番号１１)及びプライマー５(配列番号１２)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＨＹ−２Ｕを鋳型として増幅し、プラスミドｐＲＳ３１５(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＬＳ−２Ｕとした。
【００４９】
（２−２）α型細胞特異的ＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドの構築
ＰSTE3−ＵＲＡ３を含むＤＮＡ断片をプライマー４(配列番号１１)及びプライマー５(配列番号１２)を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＬＹ−３Ｕを鋳型として増幅し、プラスミドｐＲＳ３１３(文部科学省ＮＢＲＰ「酵母」より提供された)のＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＨＳ−３Ｕとした。
【００５０】
（２−３）ＹＣｐ型ＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドを有する各接合型の酵母細胞の増殖アッセイ
酢酸リチウム法により、ｐＬＳ−２Ｕ(図３Ａ)あるいはｐＨＳ−３Ｕ(図３Ｃ)を、それぞれＢＹ４７４１、ＢＹ４７４２又はＢＹ４７４３に導入した形質転換体を創製した。各形質転換体を２４時間まで培養したときの、各培養時間におけるＯＤ600の測定結果をそれぞれ図３ＢおよびＤに示す。図中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００５１】
この結果、プラスミドｐＬＳ−２Ｕを導入してＳＤ−Ｕｒａ培地で培養した場合には、ａ型細胞のみがＵＲＡ３遺伝子を発現して増殖することに成功し、α型及びａ／α型細胞のＯＤ600の値は２４時間後までほとんど変化しないことが確認された(図３Ｂ)。一方、プラスミドｐＨＳ−３Ｕを導入してＳＤ−Ｕｒａ培地で培養した場合には、α型細胞がＵＲＡ３遺伝子を発現して増殖可能であることに対して、少なくとも培養１８時間後まではα型及びａ／α型細胞の増殖が抑制されていることを確認した(図３Ｄ)。しかしながら培養２１時間後以降、α型及びａ／α型細胞のＯＤ600の値がわずかに上昇していくことが示された。以上のように、ＹＣｐ型ＵＲＡ３発現プラスミドを酵母細胞に導入することで、漏出性の遺伝子発現を著しく低減することに成功した。
【００５２】
ただしＰSTE3の漏出性は若干であるが明らかに残存していることから、α型酵母のスクリーニングにおいて偽陽性を生じることが予想される。なおＰSTE2およびＰSTE3の漏出性の差異については、参考文献１に示されるａ型特異的プロモーターとα型特異的プロモーターの発現制御様式の差異に起因すると推察される。ＰSTE2はリプレッサーα２によって直接抑制されるが、ＰSTE3にはリプレッサーが存在せず、アクチベーターα１の発現量によって下流の遺伝子発現が調節される。またａ１−α２複合体はα１のリプレッサーとして機能することが知られている(参考文献１参照)。図３Ｄでは、α型細胞に比べてａ／α型酵母の方がＰSTE3の漏出性が低いことが示されたが、これはａ／α型細胞内のａ１−α２複合体がα１の発現を抑制することにより、間接的にＰSTE3の漏出性を低減したものと推察される。しかしながらａ／α型細胞においても、やはり培養２４時間後にはＯＤ600の値に上昇傾向が見られることから、ＰSTE3の漏出性を完全に抑制することは困難であると予想される。そこで以下に示すように、ａ１−α２複合体が直接的にリプレッサーとして作用することが可能な、一倍体特異的プロモーターＰHOをＰSTE3の代替として用いる手法を試みた。
【００５３】
（２−４）ＰHOを用いたＵＲＡ３遺伝子発現プラスミドの構築
ＰHOをプライマー６(配列番号１３)及びプライマー７(配列番号１４)を用いて、ＰＣＲによりＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡを鋳型として増幅し、プラスミドｐＨＳ−３ＵのＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩ部位間に挿入して、プラスミドｐＨＳ−ＨｏＵとした。
【００５４】
（２−５）ＰSTE2−α２発現プラスミドおよびＰHO-ＵＲＡ３発現プラスミドを有する各接合型の酵母細胞の増殖アッセイ
酢酸リチウム法により、ｐＬ３Ｇ−２αおよびｐＨＳ−ＨｏＵ(図４Ａ)を、それぞれＢＹ４７４１、ＢＹ４７４２又はＢＹ４７４３に導入した形質転換体を創製した。各形質転換体を２４時間まで培養したときの、各培養時間におけるＯＤ600の測定結果をそれぞれ図４Ｂに示す。図中のエラーバーは、３度の独立した実験結果における標準偏差を示す。
【００５５】
ａ／α型細胞では元来有するａ１−α２複合体がＵＲＡ３遺伝子の発現を抑制し、ａ型細胞では元来有するａ１に加えて、導入したα２遺伝子が発現して、ａ１−α２複合体を形成することで、ＵＲＡ３遺伝子の発現が抑制される。一方、α型細胞ではＰHOが機能してＵＲＡ３遺伝子を発現することで、ＳＤ−Ｕｒａ培地での生育が可能となると期待される。図４Ｂが示すように、３種類の形質転換体の中で、ＳＤ−Ｕｒａ培地で培養した場合、α型細胞のみが増殖可能であることが確認された。したがって、図１に示すように、ａ型細胞のスクリーニングにおいてはＰSTE2を用いてＵＲＡ３遺伝子を発現する方法を、α型細胞のスクリーニングにおいてはＰHOを用いてＵＲＡ３遺伝子を発現する方法を適用することが効果的である。
【００５６】
（実施例３）ａ型もしくはα型酵母のスクリーニング実施例
（３−１）ａ型酵母のスクリーニング
ａ／α型酵母であるＢＹ４７４３に対して、ｐＨ２Ｇ−Ｐａ１およびｐＬＳ−２Ｕを、酢酸リチウム法により導入した形質転換体を創製した。得られた形質転換体をＳＤ＋Ｕｒａ培地で２４時間培養し、滅菌水で洗浄したのちＳＤ−Ｕｒａ寒天培地に塗布して、３０℃で２日間培養することでコロニーを形成させた(図５Ａ)。
【００５７】
（３−２）接合型の確認(ａ型)
ａ型酵母のスクリーニングにおいて得られたコロニー(図５Ａ)を、ＳＤ−ＵＲＡ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った結果を図５Ｂに示す。表１に示すようにｐＨ２Ｇ−Ｐａ１にコードされるＧＦＰ遺伝子はａ型細胞で特異的に発現される。図５Ｂに示すように、得られたコロニーは全て緑色蛍光を発することが確認された。すなわちａ／α型のＢＹ４７４３からＬＯＨにより派生したａ型細胞を、選択的に取得することに成功した。このうち最も蛍光強度の高いコロニーを選択して、ＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＨ２Ｇ−Ｐａ１及びｐＬＳ−２Ｕが脱落したものを選択してＢＹ４７４３Ａ株(表１)とした。具体的には、ヒスチジンを含まない培地及びロイシンを含まない培地のどちらにおいても生育できないものを、両プラスミドが脱落したコロニーであると判別した。
【００５８】
（３−３）α型酵母のスクリーニング
ａ／α型酵母であるＢＹ４７４３に対して、ｐＬ３Ｇ−２αおよびｐＨＳ−ＨｏＵを、酢酸リチウム法により導入した形質転換体を創製した。得られた形質転換体をＳＤ＋Ｕｒａ培地で２４時間培養し、滅菌水で洗浄したのちＳＤ−Ｕｒａ寒天培地に塗布して、３０℃で２日間培養することでコロニーを形成させた(図５Ｃ)。
【００５９】
（３−４）接合型の確認(α型)
α型酵母のスクリーニングにおいて得られたコロニー(図５Ｃ)を、ＳＤ−ＵＲＡ培地で一晩培養した後、蛍光強度の測定を行った結果を図５Ｄに示す。表１に示すようにｐＬ３Ｇ−２αにコードされるＧＦＰ遺伝子はａ型細胞で特異的に発現される。図５Ｄに示すように、得られたコロニーは全て緑色蛍光を発することが確認された。すなわちａ／α型のＢＹ４７４３からＬＯＨにより派生したα型細胞を、選択的に取得することに成功した。
このうち最も蛍光強度の高いコロニーを選択して、ＹＰＤ培地で一晩培養したのち、酵母を回収し、洗浄後、蒸留水に再懸濁した。ＹＰＤ固体培地上に希釈した酵母懸濁液を塗布して、３０℃で２日間培養することにより形成したコロニーの中から、プラスミドｐＬ３Ｇ−２α及びｐＨＳ−ＨｏＵが脱落したものを選択してＢＹ４７４３ＡＬ株(表１)とした。具体的には、ヒスチジンを含まない培地及びロイシンを含まない培地のどちらにおいても生育できないものを、両プラスミドが脱落したコロニーであると判別した。
【００６０】
（３−５）交雑体の作製
ＢＹ４７４３に対して、ｐＨ２Ｇ−Ｐａ１またはｐＬ３Ｇ−２αを、酢酸リチウム法により導入した形質転換体を創製した。同様に、ＢＹ４７４３Ａに対してｐＨ２Ｇ−Ｐａ１導入した形質転換体、およびＢＹ４７４３ＡＬに対してｐＬ３Ｇ−２αを導入した形質転換体を創製した。得られた形質転換体をＳＤ＋Ｕｒａ培地で２４時間培養したのち、２種類のＢＹ４７４３形質転換体の組み合わせ、又はＢＹ４７４３ＡおよびＢＹ４７４３ＡＬ形質転換体の組み合わせを、ＹＰＤ培地で混合培養したのち、ヒスチジン及びロイシンを含まず、２０ｍｇ／Ｌのウラシル、２０ｍｇ／Ｌのリジンを含む交雑体選択用ＳＤ固体培地(ＳＤ−Ｈｉｓ、Ｌｅｕプレート)に酵母懸濁液を塗布して３０℃で２日間培養した。ＳＤ−Ｈｉｓ、Ｌｅｕプレート上でのコロニー生育の観察結果を図５Ｅに示す。この結果、接合能を有さないＢＹ４７４３では交雑体が形成されなかったことに対して、本技術を用いて製造したＢＹ４７４３Ａ(ａ型)およびＢＹ４７４３ＡＬ(α型)は交雑体を形成可能であることが確認された。
【００６１】
（参考文献）
参考文献４：Brachmann CB, et. al., 1998, Yeast. Vol14：115-132.
参考文献５：Gietz D, et. al., 1992, Nucleic Acids Res. Vol20：1425.
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、従来法では実用的な交雑育種ができなかった又は困難であった酵母の交雑育種の効率性を著しく高めることを可能とするものであり、飲料・食品等の製品の製造などの産業上有用な用途に用い得る酵母(実用酵母)の交雑育種の分野において非常に有効に利用することができる。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：ＵＲＡ３遺伝子(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号２：ＰSTE2(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号３：ＰHO(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号４：ＰSTE3(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号５：ＧＦＰ遺伝子
配列番号６：ａ１タンパク質(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号７：α２タンパク質(Saccharomyces cerevisiae)
配列番号８：プライマー１(Ｆ)ＵＲＡ３遺伝子増幅
配列番号９：プライマー２(Ｒ)ＵＲＡ３遺伝子増幅
配列番号１０：プライマー３(Ｆ)ＵＲＡ３遺伝子増幅
配列番号１１：プライマー４(Ｆ)ｐＲＳシリーズのプラスミドにおけるＭＣＳ増幅
配列番号１２：プライマー５(Ｒ)ｐＲＳシリーズのプラスミドにおけるＭＣＳ増幅
配列番号１３：プライマー６(Ｆ)ＰHO増幅
配列番号１４：プライマー７(Ｒ)ＰHO増幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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