(57)【要約】【課題】少なくとも1つの活性薬剤をニューロン細胞に送達し、それにより、リポソームのような合成小胞中にカーゴ分子を設置し、抗体のようなビオチン化タンパク質を合成小胞に結合してタンパク質結合合成小胞を形成し、それによりタンパク質がニューロン細胞の表面に発現するレセプターを認識し、カーゴ分子がニューロン細胞中に送達されるまでタンパク質結合合成小胞を細胞に暴露する方法が提供される。【解決手段】無数のカーゴ分子が、カルパインインヒビターおよびカスパーゼインヒビターを含む本発明の合成小胞により送達される。タンパク質は、例示的に、グルタミン酸、グリシン、ドーパミン、ニコチン、ムスカリン、アセチルコリン、またはセロトニンなどのようなリガンドに対する細胞レセプターを標的とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子を、合成小胞内に配置する工程；
ビオチン化タンパク質を前記合成小胞に結合させ、タンパク質結合合成小胞を形成する工程であって、前記タンパク質はニューロン細胞の表面に発現するレセプターを認識する工程；
前記少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子が前記ニューロン細胞中に送達されるまで、前記細胞を前記タンパク質結合合成小胞に暴露する工程
を含む、活性薬剤分子カーゴをニューロン細胞中に送達する方法。
【請求項２】
前記タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子が、カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビターまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記合成小胞がリポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記レセプターが、グルタミン酸、グリシン、ドーパミン、ニコチン、ムスカリン、アセチルコリン、またはセロトニンを含む群より選択されるリガンドに対する細胞性レセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子が、そこにビオチン化タンパク質を結合させる前に、前記合成小胞に搭載される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記合成小胞が、その間にアビジンまたはストレプトアビジンを有する前記ビオチン化タンパク質に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ニューロン細胞が、in vitroまたはex vivoにある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ニューロン細胞が、in vivoにある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニューロン細胞が、被験者の中枢神経系中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ニューロン細胞が、被験者の末梢神経系中にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
容量および外部表面を有する合成小胞；
前記合成小胞の容量中にある少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子、
前記合成小胞の外部表面に結合したビオチン化抗体であって、ニューロン細胞の表面に発現するレセプターを認識する抗体
を含む組成物。
【請求項１３】
前記レセプターが、グルタミン酸、グリシン、ドーパミン、ニコチン、ムスカリン、アセチルコリン、またはセロトニンを含む群より選択されるリガンドに対する細胞性レセプターである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リガンドがグルタミン酸である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記合成小胞が、リポソーム、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)、またはポリカプロラクトンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ビオチン化抗体と前記合成小胞の間に、アビジンまたはストレプトアビジン中間体をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記合成小胞がビオチン化されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子が、カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビターまたはそれらの組み合わせである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１２に記載の組成物を被験者に投与する工程を含む、CNS細胞の疾患、傷害、または状態を治療する方法。
【請求項２０】
前記状態が、外傷性脳損傷である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子がアポトーシスまたは腫瘍症インヒビターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アポトーシスまたは腫瘍症インヒビターが、カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビターまたはそれらの組み合わせを含む群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療が、外傷を蒙ったCNSに前記アポトーシスまたは腫瘍症インヒビターを送達することによるものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
合成小胞を形成する工程、および
ビオチン化ホスファチジルエタノールアミンを、前記外部表面のみにとりこませる工程
を含む、請求項１２の化合物を製造する方法。
【請求項２５】
前記合成小胞を形成する間、前記少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子が存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体を前記合成小胞に結合させる前に、アビジンまたはストレプトアビジンを前記抗体に結合させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
1種以上の許容可能な担体、賦形剤、またはビヒクルに結合した、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組成物を、活性成分として含む配合物。
【請求項２８】
ニューロン細胞に対して活性薬剤カーゴ分子を細胞内送達するための薬剤を調製するための、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
ニューロン細胞に対して活性薬剤カーゴ分子を送達するための、その使用のための説明書とともに、活性成分として請求項１２に記載の組成物を含む、商業用パッケージ。
【請求項３０】
実施例のいずれかにおいて、本明細書に実質的に記載される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2008年4月17日に出願された米国仮特許出願第61/045,748号の優先権に基づくものであり、その内容が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、全般的に、中枢神経系(CNS)または末梢神経系(PNS)の細胞を標的とする合成小胞、ならびに、特に抗体の標的となるレセプターを発現する細胞に、小胞中に含まれる分子を送達するための合成小胞に結合した抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
毎年、約270,000人が軽いものから重度のものまでの外傷性脳損傷(TBI)を負っている。TBIは、「物理的外力に起因する脳へ獲得される負傷であり、...認識、言語、記憶、注意力、論理的思考、抽象的思考、判断、問題解決、感覚的、知覚的および運動能力、社会心理的行動、物理的機能、情報処理、ならびに会話のような、１つ以上の分野の傷害をもたらす」。TBIは、移動時の事故、暴力行動、スポーツ障害、外科的手術、または病気を例示的に含むタイプの傷害に起因する可能性があり、アルコールが物理的傷害発生の半分以上に関係している。
【０００４】
TBIは、先進国において、45歳以下の人の死亡および身体障害の主因である(McAllister, 1992)。米国で見積もられる150万人の頭部外傷のうち、500,000人は入院がおそらく必要であり、80,000人は何らかの形の慢性的身体障害という結果となる(Langlois et al., 2006)。疾病管理センター(CDC) は、少なくとも530万人の米国人、または約2%の集団は、TBIの結果、現在日常的生活活動に介助が長期的に必要である(Langlois et al., 2006)。さらに、TBIのための総保健費用は、毎年350万ドルに達している(Max et al., 1991)。この形態の傷害が蔓延し、重篤であるにもかかわらず、効果的な治療は未だ開発されていない。
【０００５】
TBIは、アルツハイマー病およびパーキンソン病、ボクサー認知症、および外傷後認知症のような多くの長期的傷害を伴う。TBIに由来する全ての損傷が、傷害の時点で発症するわけではないが、第二の損傷を介して発症する可能性がある。第二の脳損傷は、例えば、最初の傷害後に脳への酸素の欠乏のような代謝過程の結果である可能性がある。第二の脳損傷の主因は、脳全体にわたるグルタミン酸レベルの上昇である。グルタミン酸は、脳細胞の表面に見出すことができるグルタミン酸レセプターに結合し、カルシウムを内部液、細胞質に流入させる。過剰のカルシウムが流入した場合、最終的に細胞を殺傷する複数のイベントをもたらす。これらのイベントは、複数の種類の活性酸素、ミトコンドリア障害、過剰のプロテアーゼおよびホスホリパーゼ活性化、ならびにカルシウム誘導カルシウム放出の増大を含む。これらのイベントは全て、ネクローシスおよびアポトーシス（二つの形態のプログラム化細胞死）に至る(Wang and Yuen (1994). Trends Pharmacol. Sci. 15, 412-419)。同様のCNSおよびPNS細胞障害、損傷または死亡もまた、脳卒中、くも膜下出血、てんかん、発作、神経障害痛、頭痛、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症のような他のヒト疾患において発症しうる。
【０００６】
第二の傷害イベントが発症するのを防止する、または軽減することができる複数の薬剤が存在する。そのようなファミリーの薬剤の一つは、プロテアーゼインヒビターを含む。プロテアーゼインヒビターに伴う問題の一つは、それらが細胞保護性であることが知られているにもかかわらず、生理学的な不安定性のために薬物動態および活力が乏しいことである。さらに、患者は、過剰量のこれらの薬剤に身体がさらされる場合、無数の望ましくない副作用を蒙るリスクがある。最後に、同時に複数の薬剤を投与することは困難である。物理的または化学的ストレス後の脳細胞に対して応答性の生化学的プロモーターまたは阻害シグナルを解明することにより、一種以上の一連の予想される有効な化合物の効果を解明することができる。例として、カルシウム活性化細胞質プロテアーゼカルパインが、ネクローシス前の細胞障害において活性化され、一方カスパーゼはアポトーシス前の細胞障害において活性化され、脳細胞の鍵となる構造タンパク質を分解し、TBIの一部として組織自己消化に至る現象に関わっている。
【０００７】
これらの問題は、標的となる、および/または保護する送達物の使用により解決される潜在性を有している。例えば、癌の研究者は、癌治療の有効性を増大させる一方で、同時に副作用イベントのリスクまたは他の副作用を減少させるように、癌細胞を区別して殺すような細胞のタイプ、または細胞の表現型に特異的であることができる化学療法において使用するための標的となりうる分子の開発を試みてきた。しかし、TBIは、先行技術によって適切に認識されない特別な問題を提供する。例えば、生理学的に正常であるニューロン組織を認識することができる、あるいは一次または二次介在物にさらされる、送達系が必要である。さらに、他の組織タイプを区別しつつ標的ニューロン組織に位置することができ、必要のある患者に容易に投与することができる送達系が必要である。最後に、神経媒体は特異的であり、他の組織に比較して区別できるチャレンジを提供する。
【０００８】
そして、細胞特異性を有し、輸送中にカーゴ分子を保護しつつ、被験者においてCNSおよびPNS細胞にカーゴ分子を送達するための組成物および方法に対する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国仮特許出願第61/045,748号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】McAllister, 1992
【非特許文献２】Langlois et al., 2006
【非特許文献３】Max et al., 1991
【非特許文献４】Wang and Yuen (1994). Trends Pharmacol. Sci. 15, 412-419
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ニューロン細胞中に少なくとも1つの活性薬剤カーゴ分子を送達し、それによりリポソームのような合成小胞内にカーゴ分子を配置し、抗体のようなビオチン化タンパク質を合成小胞に結合させ、タンパク質結合合成小胞を形成し、それによりタンパク質は、ニューロン細胞の表面に発現したレセプターを認識し、カーゴ分子がニューロン細胞に送達されるまで、タンパク質結合合成小胞を露出する方法が提供される。無数のカーゴ分子が、カルパインインヒビターおよびカスパーゼインヒビターを含む本発明の合成小胞により送達される。タンパク質は、例示的に、グルタミン酸、グリシン、ドーパミン、ニコチン、ムスカリン、アセチルコリン、またはセロトニンなどのようなリガンドに対する細胞性レセプターを標的とする。
【００１２】
本発明の方法において、カーゴ分子は、ビオチン化タンパク質に結合する前に、任意に前記合成小胞に付与される。また、合成小胞は、任意にその間にアビジンまたはストレプトアビジン中間体を有するビオチン化タンパク質に結合している。in vitro、ex vivo、またはin vivoで神経細胞を露出し、細胞は任意に被験者の中枢神経系または末梢神経系に存在する。
【００１３】
さらに、体積および合成小胞の体積中にカーゴ分子を有する外部表面を有する合成小胞である組成物、ニューロン細胞の表面に発現したレセプターを認識する、合成小胞の外部表面に結合したビオチン化抗体も提供される。抗体は、好ましくはグルタミン酸、グリシン、ドーパミン、ニコチン、ムスカリン、アセチルコリン、またはセロトニンなどのようなリガンドに対する細胞性レセプターに特異的である。好ましくは、リガンドはグルタミン酸である。好ましくは、カーゴ分子は、カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビター、またはそれらの組み合わせである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の組成物は、好ましくは、リポソーム、ポリカプロラクトン(PCL)、またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)である。さらに合成小胞は、好ましくは、その間にアビジンまたはストレプトアビジン中間体を有するビオチン化タンパク質に結合している。好ましくは、合成小胞はビオチン化している。
【００１５】
さらに、それにより本発明の組成物を被験者に投与することによりCNS細胞の疾患、損傷または状態を治療する方法が提供される。好ましくは、前記状態は外傷性脳傷害である。カーゴ分子は、好ましくは、カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビター、またはそれらの組み合わせのようなアポトーシスインヒビターである。本発明の化合物の送達は、好ましくは外傷を蒙ったCNS細胞にアポトーシスインヒビターを送達する。
【００１６】
合成小胞を形成し、前記外部表面のみにビオチン化ホスファチジルエタノールアミンを取り込む工程を含む、本発明の化合物を製造する方法も提供される。好ましくは、カーゴ分子は、合成小胞を形成する間存在する。また、抗体が合成小胞に結合する前に、アビジンまたはストレプトアビジンが抗体に結合しているのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の方法を説明する概略図である。
【図２】神経細胞の表面に発現するレセプターの抗体認識を示すウェスタンブロットである。
【図３】細胞表面に対する抗体結合を示す顕微鏡写真である。
【図４】カーゴ分子がカプセル化されたリポソームに対するストレプトアビジンのカップリングを示す顕微鏡写真である。
【図５】免疫リポソームの神経細胞表面への結合および内部化を示す顕微鏡写真である。
【図６】チャレンジされた神経におけるSBDP形成の抑制を示す電気泳動ゲルである。
【図７】それぞれ、チャレンジされた細胞における全長αII-スペクトリンの量、および投与された本発明のリポソームの量を示す、棒グラフおよび電気泳動ゲルである。
【図８】神経細胞における免疫リポソームの結合および取り込みを示す顕微鏡写真である。
【図９】チャレンジされた神経細胞に免疫リポソームを投与することによる神経細胞死の減少を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、抗体を使用する細胞への小胞の標的化による、合成小胞の内部カーゴの細胞への送達の利用性を有する。例えば細胞イメージングを容易にする染料を使用する一方、治療により、ネガティブ状態または疾患を伴う細胞への標的送達および治療が提供される。細胞により小胞が内部化され、小胞カーゴが、細胞をプログラム化細胞死（インヒビター）、または他の障害性病理（DNA、siRNA、治療）から保護する、あるいは細胞増殖および置換（幹細胞、または幹細胞の増殖および/もしくは分化を促進する薬剤）の促進のような特異的な機能を発揮するであろう。
【００１９】
「抗体」の語は、特定の空間的および極性配置で細胞表面に発現された種に、特異的に結合し、それに相補的であることにより定義される免疫グロブリンを指し、抗体に対する標的種として細胞表面レセプターを特異的に含む。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、宿主の免疫化および結成の回収（ポリクローナル）のような当業者に既知の技術により、あるいは継続的にハイブリッド細胞系統を調製し、分泌タンパク質を回収することにより（モノクローナル）、あるいは天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードする、核酸またはその変異対バージョンをクローニングおよび発現することにより、調製することができる。全長抗体、その断片（例えばFabまたはF(ab')2）、あるいはその工学的バリアント（例えばsFv）を使用することができる。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスのいずれかを含む免疫グロブリンクラスのいずれかであることができる。
【００２０】
抗体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、脂質、カーゴ分子、または、本発明の成分として有用な他の分子を、任意に標識化する。当業者は、本明細書で機能しうる無数の標識を認識する。標識および標識化キットは、任意にInvitrogen Corp, Carlsbad, CAより市販されている。標識は例示的に、蛍光標識、ビオチン、ペルオキシダーゼ、放射性ヌクレオチド、金コロイド、磁気粒子、酵素、または当業者に公知の他の標識を含む。
【００２１】
「合成小胞」の語は、そこにカーゴを運搬することができる、50ナノメートルから5,000ナノメートルの直径を有する中空構造を指す。本明細書で機能しうる合成小胞は、例示的に、リポソーム、およびポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)で形成されるものを含む。リポソームは、カプセル化された水性容量を含有する脂質二重層からなる完全閉鎖構造物である。任意に、単層およびミセルもまた、本発明の範囲内にある。好ましくは、合成小胞は、二重層リポソームである。リポソームは、水相により分離される多くの同心脂質二重層を含んでよく（多ラメラ小胞、またはMLV）、あるいは単一膜二重層（単ラメラ小胞）からなってよい。
【００２２】
本発明で使用されるリポソームは、種々の組成物および内部含有物を有することができ、多ラメラ、単ラメラ、または他のタイプのリポソーム、あるいは一般的に、（既知の、または最近開発された）脂質含有粒子の形態であることができる。例えば、脂質含有粒子は、ステロイドリポソーム（U.S. Pat. No. 599,691）、アルファ−トコフェロール含有リポソーム（U.S. Pat. No. 786,74）、安定多ラメラリポソーム(SPLV)（U.S. Pat. No. 4,522,803）、単相小胞 (MPV)（U.S. Pat. No. 4,588,578）、または脂質マトリックス担体(LMC)（U.S. Pat. No. 4,610,868）の形態であることができ、その該当する部分が参照されて本明細書に取り込まれる。本発明で使用されるリポソームのクラスには、好ましくは、調製される溶質分散環境（solute distribution environment）に実質的に等しい溶質分散を有することにより特徴づけられるサブクラスのリポソームである。このサブクラスは、"Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles" Mayer et al. Biochimica et Biophysica Acta 817:1983-196 (1985)に記載されているように、安定多ラメラリポソーム(SPLV)、単相小胞 (MPV)、および凍結溶解多ラメラ小胞(FATMLV)と規定されてよい。SPLVタイプリポソームの特定の安定性は、溶質平衡に伴う低いエネルギー状態より生じると考えられる。
【００２３】
あるいは、巨大単ラメラリポソーム(LUV)を製造するために使用する、逆相蒸発、注入手順、および合成洗剤希釈のような技術を使用して、リポソームを製造することができる。リポソームを製造するためのこれらおよび他の技術のレビューを、文献Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, 第1章に見出すことができ、その該当する部分が参照されて本明細書に取り込まれる。
【００２４】
好ましい実施態様において、リポソームは非対称二重層である。例示的に、リポソーム二重層は、対称二重層を製造し、その後ビオチン化PEのような成分を順次非対称二重層の表面を形成する外部膜層に添加して、形成される。この方法は、前に形成された、および任意に前に付加された対称小胞を、カーゴ分子の粒子の内部ボリューム内への負荷を最適化する一方、同時に小胞凝集効果を減少させる慣用技術を使用して形成することができる。
【００２５】
合成小胞は、任意に、リポソームの表面内に取り込まれるビオチン−リン脂質、PLGA小胞の表面に取り込まれるビオチン−ポリ酸、またはPCL小胞の表面に取り込まれるビオチン−ポリ酸からなる。小胞は、任意に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、PEG化リン脂質、スフィンゴミエリン、それらの修飾物、ならびにリン酸化されているかいないかのいずれかである当業者に公知の他の脂質を例示的に含む無数のリン脂質部分より製造される。リン脂質は、ダイズ、卵、または他の起源を例示的に含む種々の起源に例示的に由来する。合成小胞は、任意にリン脂質層中の1種以上のステロールで配合されている。好ましくはステロールはコレステロールであるが、エルゴステロール、ラノステロール、β-シトステロース、スティグマステロールなどのような他のステロールでもあってよい。ステロールの修飾物もまた同様に機能しうることがさらに理解される。
【００２６】
合成小胞は、任意に固体脂質ナノ粒子(SLN)、またはナノ構造化脂質担体(NLC)であり、これらは2つの主なタイプの脂質ナノ粒子である。
【００２７】
グルタミン酸レセプター、代謝型グルタミン酸レセプター(mGluR)、ならびに、グルタミン酸、グリシン、ドーパミン、ニコチン、ムスカリン、アセチルコリン、およびセロトニンを例示的に含むリガンドを認識するレセプターのような細胞発現タンパク質に対する抗原を認識するビオチン化抗体または抗体免疫原断片を生成する。好ましくは、レセプターは、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを例示的に含む神経およびグリア細胞のような神経細胞上に見出される。そして、ビオチン化抗体およびビオチン化合成小胞に同時に結合するように、ストレプトアビジンまたはアビジンを導入して、抗体を合成小胞に連結する。好ましい実施態様において、合成小胞は、抗体または他のタンパク質に結合する前に、細胞送達のための1種以上のタイプのカーゴ分子ですでに前負荷されている。
【００２８】
あるいは、合成小胞は任意に、濃度勾配に応答して、ラメラを貫通する膜貫通電位を生成するような方法で調製される。この濃度勾配は、ナトリウム/カリウム電位またはpHにより生成してよい。内部電位対外部電位の差は、イオン化可能なカーゴ分子で合成小胞を負荷する、実現可能なメカニズムである。その後、膜貫通電位に応答して、前に形成された合成小胞を遅らせて負荷することが理解される。そして、これらの合成小胞は、二糖トレハロースおよびスクロースのような1種以上の保護等の存在下で脱水され、その脱水条件下で保存され、その後順次、イオン性カーゴ分子を蓄積するイオン勾配および関連する能力を維持したまま水素化される。
【００２９】
免疫リポソームがそのサブセットである「免疫合成小胞」は、例示的に、
(i) リポソームに、蛍光染料（Hoechst-33258、デキストラン-フルオレセイン、およびデキストラン-ローダミングリーン）のようなカーゴ分子をカプセル化させ、
(ii) リポソームを、リポソーム表面に取り込まれるビオチン化リン脂質を使用してストレプトアビジンに連結し、その後
(iii) この構造物を、合成小胞あたり少なくとも一つのビオチン化抗体を接合する
ことにより製造される。ストレプトアビジンは、好ましくは、ビオチン−ストレプトアビジン結合抗体をビオチン化合成小胞にさらす前に、ビオチン化タンパク質または抗体に接合または結合している。
【００３０】
抗体は、好ましくは、工程(i)の間に取りこまれるストレプトアビジンに結合することにより、2つの神経特異的レセプター（グルタミンレセプターサブタイプN-メチル-D-アスパラギン酸レセプター-1 (NMDA-R1)またはグリシンレセプター）のうちの一つに特異的である。その後免疫リポソーム調製物を、培養ラット大脳皮質または小脳顆粒神経、あるいは分化した神経PC-12細胞をインキュベートし、ここで免疫リポソームを、リポソームに連結した抗体を介する神経表面レセプターへの結合能、ならびに任意に細胞間空間または標的細胞の細胞質へカーゴ分子を送達する能力について調査する。リポソーム全体は、カプセル化された蛍光染色または他のカーゴ分子が神経細胞の内部に放出されるように、任意に内部化されていてよい。
【００３１】
本発明の、複数の異なるタイプのリポソームを、任意に種々のタイプの抗体、リポソーム構造成分（脂質）、およびカプセル化分子（カーゴ分子）を伴って製造する。好ましくは、2つのタイプの抗体、NMDAレセプター抗体およびグリシンレセプター抗体が使用される。両方のレセプターが、CGN、あるいはin vivoのヒトまたは動物ニューロンのようなニューロン細胞の表面に見出される。リポソームは任意に、カーゴ分子の存在下または非存在下のいずれかで形成される。蛍光染料のタイプは、例示的に、Hoechst-33258、デキストラン-ローダミングリーン、およびデキストランFITCを含む。空のリポソームは、例示的に染料Hoechst-33258およびデキストラン-ローダミングリーンを取り込み、自己形成リポソームが、カプセル化染料デキストランFITCの存在下で形成された。
【００３２】
【表１】
2015044859.tif 000002
【００３３】
それぞれのタイプの抗体を、任意に、テキサスレッド分子とストレプトアビジンに結合し、その後リポソーム表面のビオチン化リン脂質（ホスファチジルエタノールアミン）を介して染料カプセル化リポソームに連結する。他の染料または標識化分子もまた、本明細書で機能しうることが理解される。同様に、ビオチンアンカーを有する他の脂質分子が本明細書で機能しうる。ビオチンが好ましいリンカー分子である一方、他のアンカーメカニズムが同様に機能しうる。
【００３４】
抗体を本発明の小胞に結合するための別のアンカー機構が同様に機能しうる。例示的に、アンカー機構は、Lesermanら (Liposome Technology, III, 1984, CRC Press, Inc., Ca., p. 29-40; Nature, 288, p. 602-604, 1980)およびMartinら(J. Biol. Chem., 257, p. 286-288, 1982)により記載されたものを含み、それらには、チオール化IgGまたはタンパク質Aを、脂質小胞に共有結合し、チオール化抗体およびFab'断片をそれぞれリポソームに接着させる方法が記載されている。これらのプロトコールおよび種々の改変(Martin et al, Biochemistry, 20, p. 4229-4238, 1981; and Goundalkar et al., J. Pharm. Pharmacol. 36, p. 465-466, 1984)は、カップリングの最も多用途なアプローチを示す。アクチノマイシンDを含有するアビジン連結およびアビジン、ならびにビオチン化連結リン脂質リポソームは、神経節-N-トリオシルセラミドを発現する腫瘍細胞に標的化することに成功している(Urdal et al., J. Biol. Chem., 255, p. 10509-10516, 1980)。Huangら(Biochim. Biophys. Acta., 716, p. 140-150, 1982)は、マウスモノクローナル抗体の主要組織適合抗原H-2 (K)への結合、またはモロニー白血病ウイルス(Molony Leukemia Virus)の主要等タンパク質に対するヤギ抗体のパルミチン酸への結合を示している。これらの脂肪酸修飾IgGはリポソームに取り込まれ、これらのリポソームの適切な抗原を発現する細胞に対する結合を特徴づけた。また、本発明には、N-[4-(p-マレイミドフェニル)ブチリル]ホスファチジルエタノールアミン(MPB-PE)およびN-[3(2-ピリジルジチオ)プロプリオニル]ホスファチジルエタノールアミン(PDP-PE)を使用する共有結合カップリング、ならびにU.S. Pat. No. 5,171,578に記載された他の方法が含有される。
【００３５】
カーゴ活性薬剤分子は、例示的に、治療薬、薬剤、化粧品、治療薬剤、生物活性化合物などを含む。カーゴ分子の特定の例は、例示的に、染料、アポトーシスおよび腫瘍症インヒビター、抗炎症剤、抗腫瘍剤、低分子干渉RNA(siRNA)、DNA、酵素、栄養物質、抗精神病薬、細胞増殖因子（例えば、脳由来神経増殖因子(BDNF)および神経増殖因子(NGF)）、ならびにそれらの組み合わせを含む。本発明で機能しうる治療剤は、例示的に、TBIのようなニューロン損傷のリスクにある被験者、またはニューロン損傷の犠牲者の治療結果を変化させる、好ましくは改善するために機能しうる、いずれかの分子、化合物、ファミリー、抽出物、溶液、ドラッグ、プロドラッグ、または他の機構である。治療剤は、任意に、アゴニストまたはアンタゴニストのようなムスカリン性コリンレセプターモジュレーターである。アゴニストまたはアンタゴニストは、直接または間接的なものであってよい。間接的なアゴニストまたはアンタゴニストは、任意に、アセチルコリンまたは他のムスカリン性レセプター関連分子を分解または合成する分子であり、これらの分子は、アルツハイマー病の治療に現在使用されている。コリン性模倣体または同様の分子が、本明細書で機能しうる。本明細書で機能しうる治療剤の例示的リストは、ジシクロミン、スコプラミン、ミラメリン、N-メチル-4-ピペリジニルベンジレートNMP、ピロカルピン、ピレンゼピン、アセチルコリン、メタコリン、カルバコール、ベタネコール、ムスカリン、オキソトレモリンM、オキソトレモリン、タプシガルジン、カルシウムチャンネルブロッカーまたはアゴニスト、ニコチン、キサノメリン、BuTAC、クロザピン、オランザピン、セビメリン、アセクリジン、アレコリン、トルテロジン、ロシベリン、IQNP、インドールアルカロイド、ヒンバシン、シクロステレッタミン、それらの誘導体、それらのプロフォラッグ、およびそれらの組み合わせを含む。治療剤は、任意に、カルパインまたはカスパーゼの活性レベルを変動させうる分子である。そのような分子およびその投与は、当業者に公知である。
【００３６】
好ましくは、カーゴ分子は、発光性および蛍光染料、ならびにカルパインおよびカスパーゼインヒビターを含む。好ましくは、カスパーゼインヒビターは、カスパーゼ-3インヒビターである。カルパインおよびカスパーゼインヒビターを、EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJのような、当業者に公知の起源より取得することができる。カスパーゼインヒビターの例示的例は、Z-D-DCB、Z-VAD(OMe)-FMK、Ac-VAD-CHO、Boc-Asp(OMe)-CH2F、Z-Val-Ala-Asp-CH2F、Ac-Val-Asp-Val-Ala-Asp-CHO、Bl-9B12、Z-Asp(OCH3)-Glu(OCH3)-Val-Asp(OCH3)-FMK、Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO、それらの修飾物、それらの組み合わせ、または当業者に公知の他のインヒビターを含む。カルパインインヒビターの例示的例は、SJA6017、Z-Val-Phe-CHO、Z-Leu-Leu-Tyr-CH2F、Z-Leu-Nva-CONH-CH2-2-ピリジル、Z-Leu-Abu-CONH(CH2)3-モルフォリン (Abu = a-アミノブチル酸)、Mu-Val-HPh-CH2F (Mu = モルフォリノウレイジル; HPh = ホモフェニルアラニル)、それらの修飾物、それらの組み合わせ、または当業者に公知の他のインヒビターを含む。本発明のカルパインおよびカスパーゼ送達性活性薬剤インヒビターは、US 2008/0311036；WO08/0809969；WO08/048121；US2007/105917；および US 7,001,770 B1に詳述されているものを含む。
【００３７】
同時に2つ以上のカーゴ分子を取り込むことが、そのような化合物が相補的または相乗的効果を生み出す場合、特に望ましくあってよい。しかし、相補的または相乗的効果は必要とされてはいない。リポソーム中の投与される薬物の量は、一般的に有利薬物と同じであってよいであろう。しかし、単位投与の頻度が減少してよい。
【００３８】
これらの調製物を、疾患または損傷を治療するために、被験者に投与してよい。被験者は、例示的に、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ヒト、ラットおよびマウスを含む。本発明から最も便益を蒙る被験者は、外部損傷（例えば銃創、自動車事故、スポーツ傷害、揺さぶられっ子症候群）、虚血性イベント（例えば、脳卒中、脳出血、心不全）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、プリオン関連疾患、他の形態の認知症）、てんかん、薬物乱用（例えば、アンフェタミン、エクスタシー/MDMA、またはエタノールに由来する）、ならびに、糖尿病性神経障害、化学療法誘導神経障害および神経障害痛のような末梢神経系病理に起因する脳の負傷の被害者のような、異常神経状態を有すると推測される、または異常神経状態が進行するリスクがある被験者である。本発明は好ましくはヒト被験者に関するので、本発明の方法に好ましい被験者は人間である。
【００３９】
本明細書で使用される傷害は、細胞または分子の統合性、活性、レベル、ロバストネス、または状態における変動、あるいはイベントへ追跡可能な他の変動である。傷害は、例示的に、肉体的、機械的、化学的、生物学的、機能的、伝染性、または細胞または分子特性の他のモジュレーターを含む。イベントは例示的に、衝撃（打撃）のような肉体的外傷、または血管の封鎖または漏出のいずれかの結果である脳卒中のような生物学的異常である。イベントは、任意に伝染性物質による伝染である。当業者は、傷害またはイベントの語により包含される無数のイベントを認識する。
【００４０】
傷害は任意に、打撃（percussive impact）のような物理的イベントである。衝撃は、頭蓋組織に衝撃を残すか、その漏出をもたらす頭部のショックをもたらす打撃傷害の一種である。実験的に、ヒトにおける重篤なTBIに同等な、1.6 mm抑制深度で制御皮質打撃(controlled cortical impact (CCI))を例示的に含む複数打撃法を使用する。この方法は、Cox, CDら, J Neurotrauma, 2008; 25(11):1355-65に詳細に記載されている。衝撃外傷を生じる他の方法も同様に機能しうることが理解される。
【００４１】
TBIはまた、脳卒中の結果であってよい。虚血性脳卒中は、任意に、齧歯類において中大脳動脈閉塞(MCAO)によりモデル化されている。例えば、UCHL1タンパク質レベルは、さらに重度のMCAOチャレンジに重症化する軽度のMCAOに続いて増大する。軽度のMCAOチャレンジは、一時的であり、24時間以内に対照レベルに戻る、2時間以内のタンパク質レベルの増大をもたらしてよい。対照的に、重度のMCAOチャレンジは、傷害後2時間以内にタンパク質レベルの増大をもたらし、72時間以上にわたり、統計的に有意なレベルを示し続けてよい。
【００４２】
あるいは、連結した合成小胞調製物を、診断アッセイに使用してよい。本明細書で「診断」の語は、傷害または疾患のような神経的または他の状態の存在または非存在を認識することを意味する。診断は、任意に、特定のバイオマーカーの比率またはレベルを検出する、または存在しないアッセイの結果を指す。任意に、診断は、本発明の化合物の投与前、投与中、または投与後に検出可能な生物学的マーカーの存在または非存在である。
【００４３】
本明細書で「投与する」または「さらす、暴露する」の語は、治療剤または他のカーゴ分子を、被験者に送達することを意味する。治療剤は、当業者によって特定の被験者に適切であると決定される毛糸で投与される。例えば、治療剤は、経口、非経口（例えば静脈内）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、腫瘍内、吸入により、または経皮投与される。必要な治療剤の正確な量は、年齢、体重、および被験者の一般状態、治療される神経状態、使用する特定の治療剤、その投与モード、などに応じて、被験者により異なるであろう。適切な量は、本明細書に与えられる慣用的な実験のみを使用して、または必要以上の経験を伴わない当業者の知識により、当業者により決定されてよい。
【００４４】
投与モードにより、被験者の部位、および活性薬剤分子が送達される細胞を決定してよい。例えば、伝染の特定部位への送達は、（伝染が外部、例えば目、皮膚、耳の中のような領域に、あるいは傷または火傷のような苦痛における場合であれば）局所適用、あるいは、上皮または皮膚粘膜材料（例えば、経鼻、経口、経腟、直腸、胃腸、粘膜など）を介する吸収により、最も容易に達成されてよい。そのような局所投与は、クリームまたは軟膏の形態であってよい。本発明の組成物を、単独で投与することができるが、一般に意図する投与経路および標準的医薬慣習の点から選択される薬剤担体と混合して投与されるであろう。それらは非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内または皮下に注射されてよい。非経口投与のために、それらは、他の溶質、例えば、溶液を等張にするために十分な塩またはグルコースを含んでよい、無菌水溶液の形態でもっともよく使用される。
【００４５】
経口投与のために、本発明のリポソーム組成物を、錠剤、カプセル、ドロップ、トローチ、粉末、シロップ、水性溶液および懸濁液などの形態で使用することができる。錠剤の場合、使用できる担体は、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩を含む。デンプンのような種々の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクのような光沢剤が、錠剤で一般に使用される。カプセル形態の経口投与のために、使用できる希釈剤はラクトースおよび高分子ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用に必要である場合、ある甘味料および/または芳香剤を添加することができる。
【００４６】
髄腔内の送達経路は、血液脳バリアの通過を妨げることを認識する、中枢神経系-大脳の細胞にカーゴ分子を送達することが特に好ましい。静脈内経路による末梢神経細胞への送達が好ましくあってよい。本発明の組成物を、経口、局所、非経口、吸入または噴霧により、舌下、経皮、口腔投与を介して、点眼剤として、あるいは他の手段により、投与する。
【００４７】
リポソーム送達のための慣用的なアジュバンド、および薬剤配合剤を使用して、被験者への投与に適する医薬を形成する。被験者は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、ウサギ、またはたの家畜動物である。
【００４８】
本発明の方法はまた、多器官傷害を診断および治療するためにも提供される。多器官は、例示的に、脳、脊髄などのような神経組織のサブセット、または大脳皮質、海馬などのような脳の特定部位を含む。複数の傷害は、例示的に、カスパーゼ誘導SBDPの存在により検出可能なアポトーシス細胞死、あるいはカルパイン誘導SBDPの存在により検出可能な膨張細胞死を含む。
【００４９】
本発明の方法における多器官傷害の治療は、例示的に、最初の器官傷害に応答して活性が変化するタンパク質の活性を制御するために有効な少なくとも1つの治療アンタゴニストまたはアゴニストを被験者に投与し、第二の器官傷害に応答して活性が変化するタンパク質の活性を制御するために有効な少なくとも1つの治療アンタゴニストまたはアゴニストを被験者に投与することにより達成される。
【００５０】
図１は、（神経保護薬物のような）保護剤の、ニューロンまたは（グリア細胞、ミクログリア細胞、またはオリゴデンドロサイトのような）他のCNSまたはPNS細胞を標的として送達するためのナノ担体として免疫リポソームを使用する、in vivo、in vitro、またはex vivoの例示的な方法を示す。図１は、(i) ビオチン−アビジン−ビオチン結合を使用することによる、ニューロンを標的とするシャトル装置を製造する、抗体にリポソームをカップリングする工程、(ii) 抗体とリポソームの両方にビオチンを接着する工程、(iii) ストレプトアビジンの分子を介して、抗体とリポソームが相互に接着する工程、(iv) 染料または他のカーゴ分子を、リポソーム内にカプセル化する工程、ならびに(v) 抗体を、内容物を時間が経つと細胞質に放出する、リポソーム内部化を促進する細胞表面レセプターに結合する工程を示す。
【００５１】
抗体結合合成小胞の標的としてCNSまたはPNSに送達するための異なる神経疾患に関する他の潜在的神経レセプターは、グルタミン酸/NMDA（タイプ：イオンチャンネル型）；グルタミン酸/カイニン酸（タイプ：イオンチャンネル型）；グルタミン酸/AMPA（非NMDA）（タイプ：イオンチャンネル型）；mGluR (L-AP4, ACPD, L-QA) （タイプ：代謝調節型）；グリシン；ドーパミン；ニコチン酸アセチルコリン；およびセロトニン/5-HT3を例示的に含む。
【００５２】
本発明により追跡可能な疾患または傷害のような無数の障害の例示的例は、TBI；脳卒中；脊髄損傷；くも膜下出血；パーキンソン病；注意力欠如障害/高血圧疾患；精神分裂症；薬物/アルコール依存症；重症筋無力症；アルツハイマー病；注意力欠如障害；うつ病；精神分裂症；乳幼児突然死症候群；および片頭痛を含む。
【００５３】
慣用的な生物学的技術に関する方法が、本明細書に記載される。そのような技術は、一般に当業者に公知であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (周期的な更新を伴う)のような方法論の論文に詳細に記載されている。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降、およびイムノブロット）は、例えばCurrent Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley & Sons, New York, 1991；およびMethods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al., John Wiley & Sons, New York, 1992に記載されている。
【００５４】
本発明の種々の態様は、以下の非限定的な実施例に説明される。実施例は、説明的な目的のためのみであり、本発明の実行のいずれかに対する制限ではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更および改変を行うことができることが理解されるであろう。実施例が一般的に、哺乳動物細胞、組織、または被験者に対するものである一方、当業者は、同様の技術および当業者に公知の他の技術により、ヒトのような他の哺乳動物に実施例を容易に読み換えられることを認識する。本明細書に示される薬剤は、哺乳動物種間で一般に交差反応性であり、あるいは同様の特性を有する他の薬剤が市販されており、当業者はそのような薬剤を取得してよい場合を容易に理解する。
【００５５】
実施例１：薬剤および抗体標的認識
使用する例示的な物質および薬剤は、任意に以下の通りである。当業者に認識されるように、他の薬剤が、本発明実行および使用するために同様に機能しうることが理解される。そのような薬剤を取得するための場所は、Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)、EMD Chemical, Inc., VWR Scientific (West Chester, PA)、およびSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)などを含む生物学的薬剤サプライヤーに由来するように、同様に当業者に公知である。物質および試薬は、例示的に、PBS溶液、3.7%ホルマリンS溶液、トリス-グリシン電気泳動バッファー(Invitrogen)、ゲルトランスファーバッファー(Invitrogen)、プレキャスト電気泳動ゲル(Invitrogen)、ウェスタンブロットフィルターペーパーおよびポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜(Invitrogen)、メタノール、Tween-20 (TBST)を有するトリス緩衝液(Sigma)、ラット一次小脳顆粒ニューロン、非脂肪ドライミルク、NMDA-レセプター1(NMDA-R1)（細胞外ループ）一次抗体(Chemicon, #MAB363)、グリシンレセプター（グリシン-R）一次抗体(Gene Tex Inc.; #GTX30177)、抗ウサギIgG-ビオチン化種特異的ロバ二次抗体(Amersham)、抗マウスIgG-ビオチン化種特異的ヒツジ二次抗体(Amersham)、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ接合三次抗体(Amersham)、NBTおよびBCIPホスファターゼ基質(KPL)、SURELINK Chromophoricビオチンラベリングキット(Pierce)、細胞培養培地、DMEM溶液(Sigma)、ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids)、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミン(Avanti Polar Lipids)、コレステロール(Avanti Polar Lipids)、クロロホルム、デキストラン-ローダミングリーン、デキストランFITC(Sigma; #46945)、Hoechst 33258染料(Sigma)、HEPESバッファー、液体窒素、リポソーム抽出キット、COATSOMEエンプティリポソーム（ニュートラル）(NOF America corp.)、テキサスレッド接合ストレプトアビジン(Rockland Inc.; #a003-09)、ならびに膜(M.W. 20,000カットオフ)を有する透析キット(Millipore)を含む。
【００５６】
レセプター標的に結合する抗体。
【００５７】
NMDA-R（レセプター）およびグリシン-R抗体の反応性を、ラット小脳顆粒上ニューロン溶解物に存在するNMDA-Rおよびグリシン-Rに対して試験した。タンパク質は、任意に過剰量のNMDA、細胞内タンパク質溶解、および腫瘍症（ネクローシス）またはアポトーシスのような細胞死を引き起こすことにより細胞に毒性である薬剤で処理する溶解CGNより抽出される。対照CGN細胞からの溶解物を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動、それに続くPVDF膜上のイムノブロットにかける。膜を、抗NMDR-R、抗グリシン-R、ならびに（対照として）抗αII-スペクトリンおよびβ-アクチンをプローブ化する。図２にみられるように、適切なレセプタータンパク質を標的とする抗体が、細胞膜上に局在した。同様の技術を使用して、神経細胞骨格タンパク質アルファII-スペクトリンのタンパク質分解産物(SBDP)を試験する。特異的なSBDPが、ネクローシス、アポトーシス、および自己貪食細胞死の形態である神経細胞死と関連している（Wang (2000) Trends Neurosci.  23, 20-26; Sadasivan, S., Waghray, A., Larner, S.F., et al.  (2006) Apoptosis  11(9):1573-1582）（図２）。CGN溶解物中にそれぞれ、抗NMDR-R抗体により、120 kDaのタンパク質バンドを示すNMDA-Rが検出され、一方抗グリシン-R抗体により、60 kDaのタンパク質バンドを示すグリシン-Rが検出される（図２）。これらの分子量は、それぞれのレセプターに対する文献に報告されたものと一致する。さらに、対照として作用するαII-スペクトリンおよびβ-アクチンが、それぞれ280 kDaおよび43 kDaのタンパク質として検出される（図２）。この実験により、NMDR-Rおよびグリシン-R抗体の両方が、CGN細胞中のそれぞれのレセプターを特異的に標的とすることができることを示す。
【００５８】
実施例２：免疫細胞化学による、CGN細胞の表面のNMDA/グリシンレセプターの抗体認識
表面発現NMDAレセプターまたはグリシンレセプターを標的とする抗体を、CGN細胞を使用する免疫細胞化学により確認する。CGNを、7日間ガラスカバースリップ上で増殖させる。その後それらを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、4°Cで10分間4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、その後、室温で30分間TBST中で5%通常ヤギ血清で固定して、抗体の非特異結合を防止する。
【００５９】
細胞を、2つの実験群に分割する。一つの群を、約1分間冷メタノールで洗浄し、細胞膜を破壊して、細胞を抗体が浸透できるようにする。別の群では、抗体が細胞膜を通過できないように、細胞膜を完全なままにしておく。両方の群を、NMDAおよびグリシンレセプター一次抗体(1/500)と一晩インキュベートし、その後洗浄し、暗中で1時間、FITC二次抗体(1/1,000)とインキュベートする。細胞の核をDAPI溶液で染色し、細胞を顕微鏡で観察した。
【００６０】
NMDA-R抗体は、小脳顆粒ニューロン(CGN)（黄色矢印）の非浸透性細胞表面の細胞表面のNMDA-Rに結合する。Glycine-R抗体もまた、同様に機能する（結果は示さず）。DAPIは細胞核を示す（赤矢印）（図３）。（メタノールで処理しない）浸透化していない膜の細胞に抗体が結合できることは、抗体が細胞表面に局在するレセプターの位置に結合することができることを示す。
【００６１】
実施例３：ビオチンの抗体へのカップリング
本発明の抗体は、当業者に既知の方法でビオチン化される。簡単には、抗体を１ｘ修飾バッファー（100 mMリン酸、150 mM NaCl, pH 7.2-7.4）中に移す。ビオチン溶液を、25 μL DMF（ジメチルホルムアミド）あたり、0.5 mgのビオチンの濃度で調製する。0.8 μLのビオチン溶液を、抗体溶液に添加し、回転撹拌器上で2時間、室温でインキュベートする。インキュベート後、溶液をスピンフィルターに移し、12,000 x g、30分間で4回遠心し、非結合ビオチン分子を濾過した。フィルターを通過しなかった残りの溶液を、さらに使用するまで4°Cで保存する。
【００６２】
実施例４：染料−カプセル化リポソームの構築
沸騰フラスコ中で、50 mgのホスファチジルコリンと0.0128 mgのコレステロールを、2 mLのクロロホルムに添加することにより生成した溶液を使用して、リポソームを製造する。溶液を、全ての成分が完全に溶解するまで撹拌する。クロロホルムが蒸発し、ホスファチジルコリンとコレステロールの薄層が沸騰フラスコの底面に形成するまで、沸騰フラスコを、50°Cから60°C水浴槽中で側面を半分つからせて回転する。フラスコを、一晩真空中に設置し、クロロホルムの残渣を除去する。層の形成は、ホスファチジルコリンとコレステロールが一様に分散し、溶液中に再溶解する際に塊状にならないであろうことを保証する。その後、染料溶液を、染料（デキストラン−FITC）をHEPESバッファー（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）と組み合わせることにより生成し、リン脂質を組み合わせる。沸騰フラスコを、リン脂質の相が完全に染料溶液中に溶解するまで、半分つかる角度で回転させる。その後溶液を、液体窒素に2分間注入して凍結し、5分間温浴槽中で溶解させ、30秒ボルテックスし、その後、形成したリン脂質の塊を破砕するように全工程を4回繰り返した。染料溶液をカプセル化するリポソームを、孔のサイズが減少する（400nm, 200 nm, 100 nm）一連の膜を介して、各膜に10回、リン脂質−染料溶液を突出させて形成する。膜を介した突出により、リン脂質は、球状形態の脂質二重層を形成し、同時に球の中空内に、染料分子をカプセル化する。その後染料カプセル化リポソームを、沸騰フラスコ中でビオチン化ホスファチジルエタノールアミン（1%）と組み合わせることによりビオチン化する。この工程により、ビオチン化抗体に接合した、リン脂質二重層の外面にビオチン化分子を有するリポソームが製造される。
【００６３】
実施例５：事前調製(pre-made)リポソーム中への染料のカプセル化
別のセットのリポソームを、無水状態で購入した事前調製中空リポソームより製造する。これらのリポソームを、実施例４の染料溶液、または蒸留水および染料（デキストラン-ローダミングリーンおよびHoechst-33258）を、中空リポソームに添加し、その後ゆっくりと撹拌してリポソーム中に溶液を分散させることにより保存する。これらのリポソームをまた、実施例４に記載されたものと同じ、蛍光アビジン分子を伴う処理によりビオチン化する。両方のセットのリポソームを、残った染料分子からリポソームを分離する高速遠心分離を使用し、その後リポソーム中の染料の量および結合に成功したストレプトアビジンを測定する分光光度計を使用して、適切なカプセル化について試験する。染料は、リポソーム中に上手く取り込まれる（図４参照）。
【００６４】
実施例６：抗体に対するリポソームの接合
リポソームを、実施例１および２の抗体（NMDAレセプターおよびグリシンレセプター抗体）に接合させ、in vitro、ex vivo、またはin vivoでNMDAおよびグリシンレセプターを標的とすることができる免疫リポソームを生成する。接合を、ビオチン化リポソームとビオチン化抗体との間のストレプトアビジンの架橋を形成することにより実行する。ストレプトアビジンは、ビオチン分子に対して4個の結合部位を有する。ビオチン化リポソーム、ビオチン化抗体およびストレプトアビジンを、適切な比率で混合することにより、本発明の化合物を生成する。免疫リポソームを、ストレプトアビジンと抗体の混合物を組み合わせることにより形成する。溶液を、撹拌器上に5分間設置し、抗体上のビオチンを、ストレプトアビジンに接合する（ストレプトアビジンは、蛍光測定により接合を確認するために接着したテキサスレッド染料の分子を有する）。その後、実施例４または５のビオチン化染料カプセル化リポソームを混合物に添加し、それをその後撹拌器上に5分間設置し、リポソーム上のビオチンを、抗体上のビオチンによって占められていないストレプトアビジン結合部位に接合する。最後の分子を、任意に染料カプセル化免疫リポソームと称する。過剰の非結合アビジンおよびリポソームを、PBSで毎時間置換しつつ、4時間、PBS中に浸した透析膜中で濾過する。残りの溶液を、染料の蛍光、およびその後ストレプトアビジンの蛍光を調査する分光光度計を使用して、染料とストレプトアビジンに対して試験する。
【００６５】
表２Ａは、各セットの免疫リポソームにおける染料分子の蛍光を示し、表２Ｂは、各セットの免疫リポソーム上におけるストレプトアビジンに関連するテキサスレッド分子により放射される蛍光を示す。両方の表は、リポソーム中の染料と、ストレプトアビジン上のテキサスレッド染料との両方に対して、全てのセットのリポソームにおける有意な量の蛍光を示す。全ての遊離浮遊染料およびストレプトアビジンは、透析膜を介する濾過の際に除去されたため、この蛍光は、染料の取り込みが成功し、ストレプトアビジンのリポソームへの結合を示す。
【００６６】
【表２】
2015044859.tif 000003
【００６７】
免疫リポソームの蛍光顕微鏡画像は、テキサスレッド連結ストレプトアビジンは、グリシン-R抗体を有するデキストラン−ＦＩＴＣカプセル化リポソーム（図４Ａ）、ならびに（NMDA-R抗体を有する）Hoechst-33258カプセル化リポソーム（図４Ｂ）と同じ局在であることを示す。他の免疫リポソームも、同様の結果を有している。2つの画像を重ねると、染料の蛍光の重なりは、黄色またはオレンジ色を示す。そして、ストレプトアビジンとリポソームの接合が成功する。
【００６８】
この方法は、予想外にかつ驚くべきことに、抗体とのカップリングの前のリポソームの凝集または沈殿を回避し、以前に達成できた（米国特許第5,171,578号参照）抗体/リポソームの比率をより高くする。
【００６９】
実施例７：小脳顆粒ニューロン(CGN)細胞と免疫リポソームの特異的結合
ニューロン細胞との免疫リポソームの特異的結合を、CGN細胞レセプターに対して本発明の免疫リポソームをカップリングすることにより達成する。免疫リポソームを、コンタミネーションを防止する無菌フュームフード下の12穴プレート中のCGN細胞の培養物に添加する。その後CGNを、5% CO2中1時間、37°Cでインキュベートする。1時間、4時間、および24時間の間隔で、細胞をインキュベーターから除去し、リポソーム培地を除いて保存する。残りの細胞を、免疫リポソームを含まない培地で2回洗浄する。最初の1時間の後、細胞を顕微鏡下で観察し、写真を撮影する。リポソーム培地を、顕微鏡観察後に地監視、細胞を再びインキュベートする。その後前記方法を4時間と24時間の間隔で繰り返す（図５Ａ、Ｂ）。1時間後、リポソームが、細胞の表面のそれぞれのレセプターに接着する。その証拠は、細胞の蛍光アウトラインにある。重ねた蛍光画像は、ＦＩＴＣ−デキストランと、ＣＧＮの位相差画像とのものである。蛍光は、細胞膜上のレセプターに結合する抗体を介して細胞表面に接着したリポソーム内のＦＩＴＣ染料分子に由来する。培地はすでに除去され、細胞は新しい培地で洗浄されているため、これらは遊離浮遊リポソームではない。
【００７０】
これらの結果は、リポソームは、標的抗体の使用を介して細胞表面への接着に成功することができることを示す（図５Ｃ）。6時間後、細胞の位置に相当する、デキストラングリーンおよびアビジン−デキストラン蛍光とともに示されるように、リポソームはCGN細胞（黄色矢印）により内部化される。エンドサイトーシスと同様の方法で、リポソーム脂質二重層が、細胞の膜と融合する際に、リポソームの含有物は放出される。これらの結果は、リポソームが細胞表面に結合するだけでなく、それらが細胞中に染色カーゴ含有物を放出することができることを示唆する。
【００７１】
実施例８：カルパインおよびカスパーゼインヒビターカーゴ分子の送達により、NMDA誘導αII-スペクトリン分解が減少する
カルパインインヒビター(SJA6017)およびカスパーゼインヒビター(Z-D-DCB) (Wang 2000)を、実施例４または５における染料に設置されるニューロレセプター標的免疫リポソーム内にカプセル化する。これらのリポソームを、実施例６の免疫リポソームを形成するために使用し、実施例７のCGN細胞に結合させ、ここで細胞を、興奮性毒、グルタミン酸アナログ、NMDAまたはニューロトキシン（スタウロスポリン）の存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を溶解し、スペクトリン分解産物(SBDP)の存在を、ウェスタンブロッティングにより検出する。
【００７２】
図６で観察されるように、カルパインインヒビター(SJA6017)およびカスパーゼインヒビター(Z-D-DCB)のようなプロトタイプの神経保護薬剤を、神経レセプター標的免疫リポソーム中にカプセル化し、ニューロンに送達する場合、SBDPの存在は対照に比較して減少する。健康なラットPC-12細胞において、αII-スペクトリンは、強い全長αII-スペクトリンバンドと少ないスペクトリン分解産物バンド(SBDP 150/145およびSBDP120)としてイムノブロット上で主に存在する。STS (Staurosporin)のみで12時間処理した細胞は、全長αII-スペクトリンをほとんど提示せず、しかし強いSBDP 150/145およびSBDP120バンドを提示した（図６）。デンシトメトリー解析を実行する場合、STS処理細胞は、対照細胞に比較して、全長αII-スペクトリンにおいて急激な減少を劇的に示す。カスパーゼインヒビターおよびカルパイン＋カスパーゼインヒビター負荷化免疫リポソームにより、分化PC-12細胞において神経毒アポトーシス誘導スタウロスポリン(STS: 0.5 μM, 24時間)により誘導される分解からの全長αII-スペクトリンの保護を顕著に上昇させる。
【００７３】
陰性対照として提供される空の免疫リポソームならびにデキストラン−免疫リポソームもまた、微量の全長αII-スペクトリンを提示し、顕著なレベルの細胞死を示す。対照的に、全長αII-スペクトリンは、カスパーゼインヒビターおよびカルパインとカスパーゼを組み合わせたインヒビター (p < 0.05, スチューデントのT-検定)で負荷した免疫リポソームの存在下で顕著に保護され、細胞死の防止に対する測定として、細胞骨格の分解の防止における薬物負荷免疫リポソームの能力を示す。これらのデータは、神経保護または神経損傷の継続防止を、カルパインおよびカスパーゼインヒビターのニューロンへの特異的な送達により達成することを示す。
【００７４】
対照およびスタウロスポリン(STS)のみの条件を除き、PC-12細胞を、免疫リポソームに4時間暴露し、その後神経毒STSチャレンジに12時間暴露する。スタウロスポリンの神経毒性は、NMDAレセプター経路を介すること（Jantas-Skotniczna et al., 2006; Jantas et al., 2008）、ならびにそれがカルパインとカスパーゼ両方の細胞死経路を活性化すること（Nath et al,., 1996; Wang et al., 1998）が以前に確立されているため、スタウロスポリンを神経毒チャレンジとして使用する。
【００７５】
図８は、薬物/染料負荷免疫リポソームが、デキストラングリーン標識染料およびテキサスレッドアビジンをモニタリングする分化PC-12細胞に結合し、細胞内に取り込まれる。図８Ａは、デキストラングリーン負荷免疫リポソームが、1時間までにPC-12細胞表面に容易に接着し、4時間までに細胞の細胞質中に取り込まれることを示す。図８Ｂは、カルパインおよびカスパーゼインヒビター負荷免疫リポソームが同様に振舞うことを示す（テキサスレッドアビジンにより検出）。
【００７６】
実施例１０：カルパインおよびカスパーゼインヒビターの免疫リポソーム送達により、細胞を損傷より保護する
PC-12およびCGN細胞を、実施例８および９のようにカルパイン＋カスパーゼインヒビターに暴露する。細胞死を、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイを使用して定量する。100μLの量の細胞培地を各ウェルから回収し、遠心チューブに移し、14,000 x gで3分間遠心する。各チューブからの50μLの上清を、50μLのLDHアッセイ溶液(Promega)と96穴プレートのウェルに移し、プレートを暗中に設置して30分間反応を進行させる。波長490 nmの吸収を、分光光度計(Molecular Device Spectramax 190)で測定し、細胞死を定量化する。細胞質酵素LDHの細胞外液(ECF)（すなわち細胞培地）への放出は、細胞死の量に比例した(Koh and Choi, 1987)。
【００７７】
染料またはカルパイン＋カスパーゼインヒビターのいずれかで負荷する免疫リポソームのみ、またはその組み合わせを、CGNの細胞培養中の培地に添加し、その後37°Cのインキュベーションに戻す。1時間および4時間の間隔で、CGNの細胞培養プレートをインキュベーターより除去し、細胞を洗浄して遊離浮遊リポソームを除去した後、蛍光顕微鏡観察を実行する。
【００７８】
対照細胞に比較して、STS処理細胞、ならびに空のリポソームをおよびデキストラン負荷路歩ソーム使用する陰性対照は、細胞培地中の高濃度のLDHにより示される、有意でかなりのレベルの細胞死を示す（図９）。カルパインインヒビター、カスパーゼインヒビター、および組み合わせたカルパインとカスパーゼインヒビターで負荷した免疫リポソームに暴露した細胞は、STS-仲介細胞死に対する有意な神経保護を示す（統計的有意性：*p<0.05, **p<0.01）。合計で、これらのデータは、NMDA-R標的免疫リポソームナノシステムが、分化PC-12細胞内に神経保護薬物を送達し、それらの神経保護機能を発揮させるために有効であることを示す。
【００７９】
実施例１１：免疫リポソームの投与は、被験者の脳におけるアポトーシスマーカーをin vivoで減少させる
実施例４または５のように調製する免疫リポソーム中で、実施例８のようにカルパインインヒビター(SJA6017)およびカスパーゼインヒビター(Z-D-DCB)と配合する免疫リポソームを、TBIまたはMCAOのいずれかによる脳損傷の前（10分から6時間）または後（直後から4時間）、被験者細胞培養物に投与する。
【００８０】
TBI損傷モデルのIn vivoモデル：制御皮質衝撃(CCI)装置を使用して、以前に報告されているように(Pike et al, 1998)ラットでTBIをモデル化する。成体オス(280-300 g) Sprague-Dawleyラット(Harlan: Indianapolis, IN) を、1:1 O2/N2Oのキャリアガス中4%イソフルランで麻酔し（4分間）、同じキャリアガス中の2.5%イソフルラン中に保持する。コア体温を、直腸サーミスタープローブにより継続的にモニターし、ラットの下に、調節可能な温度制御加熱パッドを設置することにより、37±1°Cに維持する。動物を、うつ伏せで定位固定フレームにマウントし、耳と門歯バーにより固定する。中心線頭蓋切開および軟組織の反転後、片方（衝撃の部位と同じ側）の開頭術(7 mm直径)を、中央の縫合線、ブレグマとラムダの間の中間に隣接して実行する。硬膜を、大脳皮質にわたり完全に維持する。脳の外傷を、速度3.5 m/秒、1.6 mm圧縮および150m秒滞留時間で、5 mm直径アルミニウム衝撃部材チップ（圧縮空気シリンダー中に収容する）に右側（同側）大脳皮質を衝突させることにより生成する。偽傷害対照動物を、同様の外科的手順にかけたが、衝突傷害は受けさせなかった。適切な傷害前または傷害後マネージメントを、フロリダ国際大学の動物ケアおよび使用委員会により設定されたガイドライン、および実験動物のケアと使用のためのガイドに詳述された、国立衛生研究所(National Institutes of Health)ガイドラインとのコンプライアンスを守って実行する。さらに、動物保護法、ならびに動物および動物に関する実験に関する連邦の他の法律および規制に対するコンプライアンスを守り、「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC Publication, 1996 edition」に記載された原則に忠実に、研究を実行する。
【００８１】
中大脳動脈閉塞(MCAO)外傷モデル：ラットを、イソフルラン麻酔（誘導チャンバーを介して5%イソフルラン、その後ノーズコーンを介して2.5%イソフルラン）かでインキュベートし、ラットの右総頸動脈(CCA)を、外頸動脈および内頸動脈(ECAおよびICA)分岐レベルで、中心頚部切開にさらす。ICAを、翼突口蓋分岐の吻方向に従わせ、ECAを、長軸および上顎分岐で結紮および切除する。その後3-0ナイロン縫合を、ECAスタンプ上の切開を介してICAに導入し（縫合の跡は可視的に血管壁を通じてモニタリングされる）、中大脳動脈の始原をブロックする前大脳動脈の狭窄において留まるまで、頸動脈分岐部からおよそ20 mmの頸動脈管を介して進行させる。その後皮膚切開を閉鎖し、血管内の縫合を30分間または2時間留置した。その後ラットを、短時間再麻酔し、縫合フィラメントを後退させ、再灌流させる。偽MCAO手術に対して、同一の手順を実行し、しかしフィラメントを内−外頸動脈分岐部から10 mmだけ進行させ、ラットを殺処分するまで留置する。全ての外科手順の間、動物を、高温加熱ブランケット(Harvard Apparatus, Holliston, MA, U.S.A.)により37±1°Cに維持する。各実験の結論において、ラットの脳が検視においてくも膜下出血の病理的証拠を示す場合、それらは実験から除外されることに注意することが重要である。適切な傷害前または傷害後マネージメントを、全ての動物ケアおよび使用ガイドラインとのコンプライアンスを守って実行する。
【００８２】
損傷後、損傷の領域から脳組織を調製する。損傷後適切な時点（2、6、24時間および2、3、5日）で、動物を麻酔して、すぐに断頭術により殺処分する。脳をすばやく除去し、氷冷PBSでリンスし、半分に分割する。右半球（衝撃領域および海馬周辺の大脳皮質）をすばやく切片化し、氷冷PBSでリンスし、液体窒素で即時凍結し、使用するまで-80°Cで保存する。免疫組織化学のために、脳をすぐにドライアイススラリー中で凍結し、SUPERFROST PLUS GOLD(登録商標)(Fisher Scientific)スライド上で、クライオスタット(20μm)で切片化し、その後使用するまで-80°Cで保存する。左半球に対して、右側と同じ組織を回収する。ウェスタンブロット解析のために、脳サンプルを小モルタルで粉末化し、ドライアイス上ですりつぶして微粉末にする。その後粉末化脳組織粉末を、50 mM Trisバッファー (pH 7.4), 5 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM DTT, 1xプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Biochemicals)中、4°Cで90分間、溶解させる。その後脳溶解物を4°Cで5分間、15,000 x gで遠心し、清澄化して不溶性デブリを除去し、即時凍結し、使用するまで-80°Cで保存する。
【００８３】
ゲル電気泳動およびエレクトロブロッティングに対して、神経組織を実施例８に記載されているように調製する。清澄化して溶解した脳組織サンプル(7 μl)を、蒸留H2O中、0.25 M トリス (pH 6.8)、0.2 M DTT、8% SDS、0.02% ブロモフェノールブルー、および20%グリセロールを含む2Xドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のために調製する。レーンあたり２０マイクログラム(20 μg)のタンパク質を、規定どおりに、130 Vで2時間、10-20%トリス/グリシンゲル(Invitrogen, Cat #EC61352)にかける。電気泳動後、分離タンパク質を、39 mMグリシン、48 mMトリス-HCl (pH 8.3)、および5%メタノールを含むトランスファーバッファー中で、セミドライトランスファーユニット(Bio-Rad)中、周辺温度で2時間、20Vの低電圧でポリビニリデンフルオリド(PVDF)膜に横方向でトランスファーする。電気トランスファー後、膜を、TBSおよび0.05% Tween-2 (TBST)中5%無脂肪乳中周辺温度でブロッキングし、その後、説明書に推薦されるように、5%無脂肪乳を含むTBST中、1:2000で希釈した一次SBDP抗体と、4oCで一晩インキュベートする。その後、TBSTで3回洗浄し、ビオチン化連結二次抗体(Amersham, Cat # RPN1177v1)と周辺温度で2時間インキュベートし、ストレプトアビジン接合アルカリホスファターゼ(BCIP/NBT reagent: KPL, Cat # 50-81-08)と30分間インキュベートした。全長SBDPタンパク質の分子量を、レインボーカラー分子量スタンダード(Amersham, Cat # RPN800V)を使用して評定した。全長αII-スペクトリンおよびSBDPタンパク質レベルの半定量評定を、コンピューターアシスト濃度スキャン(computer-assisted densitometric scanning) (Epson XL3500 scanner)およびImageJソフトウェア(NIH)による画像解析により実行した。
【００８４】
脳溶解物中のSBDP145のレベルは、対照実験におけるゆるやかな（30分）衝撃に対して、重篤な（2時間）MCAO衝撃後の実験における全ての時間点において、有意に(p<0.05)増大する。同様に、SBDP120は、CSF中の傷害後、24時間から72時間の間の重篤なMCAO後に有意な評定を示す。カルパインおよびカスパーゼインヒビターを含む本発明の免疫リポソームは、TBIまたはMCAOにより損傷したニューロンにおけるSBDPのレベルを低下させ、in vivoにおける神経保護または治療効果を示す。
【００８５】
以下の参考文献は、それぞれの文献の内容が全体的かつ明白に含まれるように、本明細書に参照して取り込まれる。
【００８６】
［参考文献］
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2015044859.tif 000005
2015044859.tif 000006
【００８７】
本明細書で言及された特許および文献は、本発明が関連する、当業者のレベルの指標である。これらの特許および文献は、それぞれ個々の出願および出版が、特異的かつ個別に、本明細書に詳細に表現されるのと同程度に参照され、本明細書に取り込まれる。
【００８８】
前の記述は、本発明の特定の実施態様を例示するが、その実用を制限することを意図するものではない。その同等物全てを含む以下の請求項は、本発明の範囲を規定することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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