(57)【要約】【課題】高速かつ確実に合焦可能な顕微鏡システムを提供する。【解決手段】顕微鏡システムは、対物レンズを備えた撮像手段と、カバーガラス、封入層、および、スライドガラスを含むプレパラートを搭載可能なステージと、カバーガラスの第１の厚さと第１の屈折率、および、封入層の第２の厚さと第２の屈折率を測定する測定手段と、測定手段により測定されたデータに基づいて対物レンズとプレパラートとの間の距離を決定する制御手段とを有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズを備えた撮像手段と、
カバーガラス、封入層、および、スライドガラスを含むプレパラートを搭載可能なステージと、
前記カバーガラスの第１の厚さと第１の屈折率、および、前記封入層の第２の厚さと第２の屈折率を測定する測定手段と、
前記測定手段により測定されたデータに基づいて前記対物レンズと前記プレパラートとの間の距離を決定する制御手段と、を有することを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
前記撮像手段は、前記制御手段により決定された前記距離を小さくしながら複数の画像を取得することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
【請求項３】
前記測定手段から前記撮像手段に前記プレパラートを搬送する搬送手段を更に有し、
前記測定手段は、前記撮像手段により前記複数の画像が取得されている間、別のプレパラートの測定を行うことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記制御手段は、前記対物レンズの焦点を前記スライドガラスと前記封入層との境界面に合わせるように制御することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記測定手段は、前記スライドガラスの上に前記カバーガラスおよび前記封入層を設けていない状態で、前記対物レンズと前記スライドガラスとの間の第１の距離を測定し、
前記制御手段は、前記第１の距離、前記第１の厚さ、前記第２の厚さ、前記第１の屈折率、および、前記第２の屈折率に基づいて、前記対物レンズと前記カバーガラスとの間の第２の距離を決定することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記第１の距離をＷ、前記第２の距離をＷ’（ｘ，ｙ）、前記第１の厚さをｄ１（ｘ，ｙ）、前記第２の厚さをｄ２（ｘ，ｙ）、前記第１の屈折率をｎ１、前記第２の屈折率をｎ２、座標を（ｘ，ｙ）とそれぞれするとき、
前記制御手段は、
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を満たすように、前記第２の距離Ｗ’（ｘ，ｙ）を決定することを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記測定手段は、前記スライドガラスの上に前記カバーガラスおよび前記封入層を設けていない状態で、前記対物レンズと前記スライドガラスとの間の第１の距離を測定し、
前記制御手段は、前記第１の距離、前記第１の厚さ、前記第２の厚さ、前記第１の屈折率、および、前記第２の屈折率に基づいて、前記対物レンズと前記スライドガラスとの間の第３の距離を決定することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記第１の距離をＷ、前記第３の距離をＷ’’（ｘ，ｙ）、前記第１の厚さをｄ１（ｘ，ｙ）、前記第２の厚さをｄ２（ｘ，ｙ）、前記第１の屈折率をｎ１、前記第２の屈折率をｎ２、座標を（ｘ，ｙ）とそれぞれするとき、
前記制御手段は、
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を満たすように、前記第３の距離Ｗ’’（ｘ，ｙ）を決定することを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡システム。
【請求項９】
前記測定手段は、複数の波長の光線を前記プレパラートに垂直に入射させ、該複数の波長の光線のそれぞれの光線の反射率に基づいて、前記第１の厚さおよび前記第２の厚さを測定することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の顕微鏡システム。
【請求項１０】
プレパラートを構成するカバーガラスの第１の厚さと第１の屈折率、および、該プレパラートを構成する封入層の第２の厚さと第２の屈折率を測定する測定ステップと、
前記測定ステップにて測定されたデータに基づいて対物レンズと前記プレパラートとの間の距離を決定する制御ステップと、をコンピュータに実行させるように構成されていることを特徴とするプログラム。
【請求項１１】
前記制御ステップにて決定された前記距離を小さくしながら複数の画像を取得する撮像ステップを更にコンピュータに実行させるように構成されていることを特徴とする請求項１０に記載のプログラム。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のプログラムを記憶していることを特徴とする記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病理学的な検体観察を目的としたデジタル顕微鏡システムの研究開発が盛んに行われている。しかし、検体が封入されたプレパラートの撮影は必ずしも容易ではない。特に、試料全面にピントがあった「全焦点画像」の取得は、ユーザである病理医サイドから求められる最も基本的な要求であり、最も困難な技術的課題である。
【０００３】
試料全面にピントが合った画像（合焦画像）を取得することが難しい原因は、試料の非平坦性にある。特許文献１には、試料の各領域（ｘ，ｙ）においてｚ方向に焦点位置を上下させ、最もピントが合っているところを探索してから撮像することを繰り返す方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−３４６５２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、動作の高速性が要求されるデジタル顕微鏡システムにおいては、より素早くかつ確実に合焦位置を決定する方法が求められる。
【０００６】
そこで本発明は、高速かつ確実に合焦可能な顕微鏡システムおよびプログラムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面としての顕微鏡システムは、対物レンズを備えた撮像手段と、カバーガラス、封入層、および、スライドガラスを含むプレパラートを搭載可能なステージと、前記カバーガラスの第１の厚さと第１の屈折率、および、前記封入層の第２の厚さと第２の屈折率を測定する測定手段と、前記測定手段により測定されたデータに基づいて前記対物レンズと前記プレパラートとの間の距離を決定する制御手段とを有する。
【０００８】
本発明の他の側面としてのプログラムは、プレパラートを構成するカバーガラスの第１の厚さと第１の屈折率、および、該プレパラートを構成する封入層の第２の厚さと第２の屈折率を測定する測定ステップと、前記測定ステップにて測定されたデータに基づいて対物レンズと前記プレパラートとの間の距離を決定する制御ステップと、をコンピュータに実行させるように構成されている。
【０００９】
本発明の他の目的及び特徴は、以下の実施例において説明される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高速かつ確実に合焦可能な顕微鏡システムおよびプログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施例における顕微鏡システムの模式図である。
【図２】本実施例におけるプレパラートの模式図である。
【図３】本実施例における対物レンズの位置の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施例について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
本実施例は、デジタル顕微鏡システム（デジタルスライドスキャナ）などに使用する被検サンプルであるプレパラートに封入された無染色試料を、顕微鏡（光学顕微鏡）で観察する際などに適用可能である。デジタルスライドスキャナとは、生物学や病理学的検査などで使用するプレパラートを高速でスキャンし、高解像度なデジタルデータに変換する装置である。本実施例は、例えば、開口数（ＮＡ）の大きい投影光学系を備えたデジタルスライドスキャナの高速な自動合焦を支援する機構として実施される。
【００１４】
まず、従来から用いられている自動合焦の問題点について説明する。スライドスキャナは、通常、合焦平面の高さを変化させながら試料の画像のコントラストを測定する。そしてスライドスキャナは、コントラストが最大となる高さの同定により、試料に合焦したとみなす。これを、コントラスト型オートフォーカスという。このタイプのオートフォーカス機構の問題点として、出発点でボケが大きく焦点が合っていないと判定された場合、実際の合焦平面が上方（カバーガラス方向）にあるのか、または下方にあるのかわからないということが挙げられる。すなわち、その次の動作において上方にスキャンすべきかまたは下方にスキャンすべきか、一般にはわからない。このように、次のスキャン方向が所望のコントラストを増加させるものである確実性はない。また、仮に一方の方向へ動かしてコントラストが増加した場合でも、コントラストが最大となる位置は、コントラストが最大となる位置を通過してコントラストが減少し始めたのを検出しない限りわからない。すなわち、この方法では、探索における行き過ぎが必須であり、それを修正する手間がかかる。
【００１５】
スライドスキャナにおいて合焦すべき高さは、水平座標（ｘ，ｙ）の関数である。従って、このような確実性のないピント合わせをｘｙ平面の全てに対して行おうとする場合、その時間的コストは極めて大きく、高速性というユーザのニーズを損ねる。
【００１６】
これらの問題を解決するため、本実施例は、プレパラート試料の本撮像を行う前に、封入層とスライドガラス上端との境界面を高速に検出し、その境界面に仮合焦する光学顕微鏡システムを提供する。試料は、必ずスライドガラスよりもカバーガラス方向（上方）にある。このため、封入層とスライドガラス上端との境界面の位置を検出することができれば、その境界面からカバーガラス方向にだけ探索を行えばよい。また、プレパラートは、基本的に、試料がスライドガラスに密着している状態を理想として作成される。従って、境界面の位置を検出することができれば、その直上付近において、求めるべきベストフォーカス位置が存在する可能性が高いため、探索を効率的に行うことができる。効率性をより向上させるため、仮合焦動作は、別のプレパラートが本撮像を行っている間に実行されることが好ましい。
【００１７】
図１を参照して、本実施例における顕微鏡システムの構成について説明する。図１は、顕微鏡システム１００（光学的顕微鏡システム）の模式図である。
【００１８】
図１において、１０１は搬入トレイ（収納手段）である。搬入トレイ１０１には、撮像対象のプレパラートが収納される。本実施例において、プレパラートは、カバーガラスおよび封入層を備えて構成されている。搬入トレイ１０１の容量の範囲において、複数のプレパラートを同時に投入（収納）することができる。１０２は測定機構（測定手段）である。測定機構１０２は、プレパラートを構成するカバーガラスの厚さ（第１の厚さ）および封入層の厚さ（第２の厚さ）を測定する。また測定機構は、カバーガラスの屈折率（第１の屈折率）および封入層の屈折率（第２の屈折率）を測定する。
【００１９】
１０３は、対物レンズを備えた撮像機構（撮像手段）である。撮像機構１０３は、対物レンズ１０６、制御機構１０７（制御手段）、および、電動ステージ１０８（ステージ）を備えている。制御機構１０７は、測定機構１０２により測定されたデータ（測定結果）に基づいて対物レンズ１０６とプレパラート（例えば、カバーガラスの上端）との間の距離（すなわち対物レンズ１０６とプレパラートとの間の相対位置）を調節（決定）する。電動ステージ１０８は、カバーガラス、封入層、および、スライドガラスを含むプレパラートを搭載可能に構成されている。また撮像機構１０３は、調節された対物レンズ１０６の位置からカバーガラス方向（上方向）に対物レンズ１０６を移動させながら、複数の画像を取得する。すなわち撮像機構１０３は、制御機構１０７により決定された距離を小さくしながら複数の画像を取得する。
【００２０】
１０４は搬出トレイ（搬出手段）である。搬出トレイ１０４には、撮像機構１０３による撮像が終了したプレパラートが排出される。搬入トレイ１０１、測定機構１０２、撮像機構１０３、および、搬出トレイ１０４は、それぞれ、搬送機構１０５（搬送手段）により連結されている。搬送機構１０５は、搬入トレイ１０１から測定機構１０２へ、測定機構１０２から撮像機構１０３へ、また、撮像機構１０３から搬出トレイ１０４へプレパラートを搬送するように構成されている。
【００２１】
本実施例の顕微鏡システム１００では、前述のように最初と最後のそれぞれのプレパラートを除き、あるプレパラートが撮像機構１０３で本撮像されている間にその次のプレパラートは測定機構１０２において測定される。すなわち測定機構１０２は、撮像機構１０３により複数の画像が取得されている間、別のプレパラート（例えば、撮像対象である次のプレパラート）の測定を行う。ただし、本実施例はこれに限定されるものではない。顕微鏡システムの構造によっては、測定機構１０２と撮像機構１０３とが空間的に同一の場所を占め、二つの機能が同一の場所にて実行されることも可能である。この場合、測定機構１０２と撮像機構１０３とを連結する搬送機構１０５は省略される。本実施例は、このような構成の顕微鏡システムにも適用可能である。
【００２２】
次に、図２を参照して、測定機構１０２で行われる処理についてモデルを用いて具体的に説明する。図２は、プレパラート２００の模式図である。本実施例では、プレパラート２００を図２で模式的に示されるような多層膜としてモデル化を行う。
【００２３】
図２において、２０１はカバーガラスである。カバーガラス２０１は、プレパラート２００の最上部に設けられている。本実施例において、カバーガラス２０１の厚さ（第１の厚さ）をｄ１（ｘ，ｙ）とする。前述のように、カバーガラス２０１の厚さｄ１（ｘ，ｙ）は、厚さ分布の不均一性により、水平座標（ｘ，ｙ）の関数となる。カバーガラス２０１の厚さは、一般的な製品の規格値はあるものの、０．１２〜０．１７ｍｍ程度の製造誤差を含む。また、カバーガラス２０１の屈折率（第１の屈折率）をｎ１とする。カバーガラス２０１の屈折率ｎ１は比較的安定した値であり、典型的にはｎ１＝１．５２６程度であり、ほぼ既知である。
【００２４】
２０２は試料、２０３は封入層である。封入層２０３は、カバーガラス２０１の下に設けられている。封入層２０３中のある高さ（位置）において、試料２０２がホルマリンなどの封入剤で封入されている。前述のように、試料２０２の高さは水平座標（ｘ，ｙ）の関数であり、既知ではない。本実施例において、試料２０２を含む封入層２０３の厚さ（第２の厚さ）をｄ２（ｘ，ｙ）とする。封入層２０３の厚さｄ２（ｘ，ｙ）も水平座標（ｘ，ｙ）の関数であり、その関数形はプレパラート２００ごとに異なる未知数である。一方、試料２０２と封入層２０３を構成する封入剤の屈折率ｎ２（第２の屈折率）は、通常、同様の値となるように設定されるため、同一視できる。例えば、典型的な封入剤としてホルマリンを用いる場合、ｎ２＝１．３７７程度である。２０４はスライドガラス（スライドガラス基盤）である。スライドガラス２０４は、プレパラート２００の最下部に設けられている。
【００２５】
本実施例において、測定機構１０２が実質的に行う作業は、前述の未知数である、カバーガラス２０１の厚さｄ１（ｘ，ｙ）と封入層２０３の厚さｄ２（ｘ，ｙ）との同定である。このため測定機構１０２は、一種の多層膜厚測定器であるとみなすことができる。測定機構１０２にて測定が終了したプレパラート２００は、搬送機構１０５により撮像機構１０３へ搬送され、本撮像が行われる。本実施例において、測定機構１０２は、未知数であるカバーガラス２０１の厚さｄ１（ｘ，ｙ）および封入層２０３の厚さｄ２（ｘ，ｙ）を特定する。これにより、撮像機構１０３の対物レンズ１０６を、封入層２０３とスライドガラス２０４の上端との境界面２０５に容易に仮合焦させることができる。すなわち制御機構１０７は、対物レンズ１０６の焦点をスライドガラス２０４と封入層２０３との境界面２０５に合わせるように制御する。
【００２６】
次に、図３を参照して、対物レンズ１０６の動作を具体的に説明する。図３は、本実施例における対物レンズ１０６の位置の変化を示す図である。図３において、Ｗは、スライドガラス２０４の上に何も搭載していない場合の、スライドガラス２０４と対物レンズ１０６との間の距離である。
【００２７】
ここで、ｄ１（ｘ，ｙ）、ｄ２（ｘ，ｙ）、ｎ１、ｎ２を用いて、対物レンズ１０６とカバーガラス２０１との間の距離Ｗ’（ｘ，ｙ）を、以下の式（１）のように定義する。
【００２８】
【数１】
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【００２９】
近軸理論によれば、対物レンズ１０６とカバーガラス２０１との間の距離をＷ’（ｘ，ｙ）だけ離すことにより、対物レンズ１０６の焦点を封入層２０３とスライドガラス２０４との境界面２０５に仮に合わせる（仮合焦させる）ことができる。
【００３０】
式（１）において、スライドガラス２０４と対物レンズ１０６との間の距離Ｗは、光学的測定により容易に得ることができる。また、ｄ１（ｘ，ｙ）、ｄ２（ｘ，ｙ）、ｎ１、ｎ２を特定することにより、機械的測定により、対物レンズ１０６とカバーガラス２０１との間の距離を、Ｗ’（ｘ，ｙ）に調整することができる。
【００３１】
このように測定機構１０２は、スライドガラス２０４の上にカバーガラス２０１および封入層２０３を設けていない状態で、対物レンズ１０６とスライドガラス２０４との間の距離Ｗ（第１の距離）を測定する。そして制御機構１０７は、距離Ｗ（第１の距離）、第１の厚さ、第２の厚さ、第１の屈折率、および、第２の屈折率に基づいて、対物レンズ１０６とカバーガラス２０１との間の距離（第２の距離）を決定する。
【００３２】
また、この方法と同値の表現として、対物レンズ１０６とスライドガラス２０４の上端面との間の距離Ｗ’’（ｘ，ｙ）を、以下の式（２）のように定義することができる。
【００３３】
【数２】
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【００３４】
対物レンズ１０６とスライドガラス２０４の上端面との間の距離をＷ’’（ｘ，ｙ）だけ離すことにより、対物レンズ１０６の焦点を封入層２０３とスライドガラス２０４との境界面２０５に仮に合わせる（仮合焦させる）ことができる。
【００３５】
式（２）においても、スライドガラス２０４と対物レンズ１０６との間の距離Ｗは、光学的測定により容易に得ることができる。また、ｄ１（ｘ，ｙ）、ｄ２（ｘ，ｙ）、ｎ１、ｎ２を特定することにより、機械的測定により、対物レンズ１０６とスライドガラス２０４との間の距離を、Ｗ’’（ｘ，ｙ）に調整することができる。
【００３６】
このように測定機構１０２は、スライドガラス２０４の上にカバーガラス２０１および封入層２０３を設けていない状態で、対物レンズ１０６とスライドガラス２０４との間の距離（第１の距離）を測定する。そして制御機構１０７は、第１の距離、第１の厚さ、第２の厚さ、第１の屈折率、および、第２の屈折率に基づいて、対物レンズ１０６とスライドガラス２０４との間の距離（第３の距離）を決定する。
【００３７】
このような構成により、撮像機構１０３は、対物レンズ１０６の焦点を封入層２０３とスライドガラス２０４との境界面２０５に仮に合わせた状態（仮合焦状態）から、試料２０２のコントラストが最も高い状態になるように探索（走査）を開始することができる。本実施例において、試料２０２は、確実に境界面２０５よりもカバーガラス２０１の方向（カバーガラス方向：図３中の上方向）にある。このため撮像機構１０３は、カバーガラス方向にのみ探索（走査）を行えばよい。そして撮像機構１０３は、調節された位置（仮合焦状態の位置）からカバーガラス方向に対物レンズ１０６を移動させながら、複数の画像を取得する。この間、測定機構１０２は、搬入トレイ１０１により運び込まれた別のプレパラートに対して予備測定を行う。本実施例の顕微鏡システム１００は、以上の工程を繰り返すように動作する。
【００３８】
次に、測定機構１０２がカバーガラス２０１の厚さｄ１（ｘ，ｙ）と封入層２０３の厚さｄ２（ｘ，ｙ）とを同定する方法について詳述する。ただし、ここで説明される方法は１つの具体例に過ぎず、その他の方法を用いてもよい。
【００３９】
薄膜に入射した光線の反射率Ｒを求める理論は周知であり、例えば、非特許文献１に詳述されている。例えば、波長λでカバーガラス２０１に垂直に入射する光の反射率Ｒは、スライドガラス２０４の屈折率をｎｓとするとき、以下の式（３）のように表される。
【００４０】
【数３】
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【００４１】
式（３）において（および、以降の説明において）、以下の式（４）、（５）のように定義される。
【００４２】
【数４】
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【００４３】
【数５】
2015118227.tif 000007
【００４４】
式（５）において、ｋ＝２π／λと定義される。また、式（４）、（５）において、ｉ＝1、２、…、Ｓであり、Ｚ０は真空のインピーダンスである。
【００４５】
これらの式と屈折率に関する既知の情報とを用いて、波長フィルタなどを用意して、複数の波長（２種類の波長）の光に対する反射率を測定し、電子計算により前述の連立方程式を解くことにより、ｄ１（ｘ，ｙ）とｄ２（ｘ，ｙ）とを同定することができる。このように測定機構１０２は、複数の波長の光線をプレパラート２００に垂直に入射させ、複数の波長の光線のそれぞれの光線の反射率に基づいて、第１の厚さｄ１（ｘ，ｙ）および第２の厚さｄ２（ｘ，ｙ）を測定する。
【００４６】
本実施例の顕微鏡システム１００は、顕微鏡またはデジタルスライドスキャナなどに適して用いられ、生物学や病理学的観察の分野において有用である。また、本実施例の顕微鏡システム１００は、通常の光学顕微鏡に付加的に追加して用いることができる。
【００４７】
［その他の実施形態］
本発明は、以下の処理を実行することによっても実現される。すなわち、上述した実施形態の機能を実現するソフトウエア（プログラム）を、ネットワーク又は各種記憶媒体を介してシステム或いは装置に供給し、そのシステム或いは装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ等）がプログラムを読み出して実行する処理である。この場合、顕微鏡システムの制御方法の手順が記述されたコンピュータで実行可能なプログラムおよびそのプログラムを記憶した記憶媒体は本発明を構成する。
【００４８】
本実施例の顕微鏡システムは、プレパラートの封入層とスライドガラスの上端との境界面に仮合焦した状態を迅速に素早く作り出すことができる。このため本実施例によれば、高速かつ確実に合焦可能な顕微鏡システムおよびプログラムを提供することができる。
【００４９】
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。
【符号の説明】
【００５０】
１００  顕微鏡システム
１０２  測定機構
１０３  撮像機構
１０７  制御機構
１０８  電動ステージ
【図２】
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【図３】
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【図１】
2015118227.tif 000012