(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便で高い抗体価を与えるインフルエンザウイルスワクチンの製造方法を提供する。【解決手段】カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された、インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子を含む核酸コンストラクト、該核酸コンストラクトを含有するプラスミドベクター及びトランスジェニックカイコ、該プラスミドベクターをカイコ卵に挿入することを含む、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を絹糸中に産生するトランスジェニックカイコの製造方法、インフルエンザウイルスワクチンの製造方法、トランスジェニックカイコによって産生されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、該タンパク質を有効成分として含有する、インフルエンザウイルスワクチン組成物、該組成物を投与することを含むインフルエンザの予防方法又は治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された、インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子を含む核酸コンストラクトであって、前記インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子は膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落している、核酸コンストラクト。
【請求項２】
前記プロモーター領域が、セリシン１プロモーター、セリシン２プロモーター、又はセリシン３プロモーターである、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子が三量体化ドメインをコードするＤＮＡと結合している、請求項１又は請求項２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトを含有する、プラスミドベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のプラスミドベクターをカイコ卵に挿入することを含む、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を絹糸中に産生するトランスジェニックカイコの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトが染色体に組み込まれた、トランスジェニックカイコ。
【請求項７】
インフルエンザウイルスワクチンの製造方法であって、
請求項６に記載のトランスジェニックカイコが産生した絹糸からインフルエンザウイルスＨＡを抽出すること、及び、
抽出されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をインフルエンザウイルスワクチンとして調製することを備える方法。
【請求項８】
トランスジェニックカイコによって産生されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質であって、膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落しているタンパク質。
【請求項９】
トランスジェニックカイコが、請求項６に記載のトランスジェニックカイコである、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載のタンパク質を有効成分として含有する、インフルエンザウイルスワクチン組成物。
【請求項１１】
インフルエンザの予防方法又は治療方法であって、請求項１０に記載の組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザワクチンの製造分野に関する。より具体的には、本発明はインフルエンザワクチンの製造分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、インフルエンザワクチンは胚を有する鶏卵にウイルスを接種し、増殖させることにより製造されてきた。しかし、本方法は、時間、労働力、及び費用を要することが問題となっていた。また、ワクチンの製造に鶏卵を使用することにより、好ましくない免疫応答を引き起こすという問題があった。より簡便で安全なワクチン製造方法を提供するため、培養昆虫細胞にインフルエンザウイルスエンベロープの糖鎖結合膜タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を遺伝子組換え体として生産させる方法（特許文献１及び非特許文献１）が報告されている。しかし、本方法では完全長の膜タンパク質としてＨＡタンパク質を発現させることから、細胞膜画分からの分離及び精製が必要であり、操作が煩雑であるという問題があった。
【０００３】
この問題を解決するため、膜結合ドメインを欠落させたＨＡタンパク質（ｓＨＡ）を培養上清に分泌させ、簡便に精製する方法が開発されている。しかし、ｓＨＡは膜結合ドメインが存在しないため複合体を形成しない。天然のＨＡタンパク質は三量体を形成していることから、より自然のＨＡタンパク質に近い構造とするために、ｓＨＡのＣ末端にバクテリオファージＴ４フィブリチンの三量体形成ドメイン（ｆｏｌｄｏｎ）の配列（非特許文献２及び非特許文献３）、及びＧＣＮ４ｐＩＩ三量体形成リピート配列（非特許文献４）等を挿入することにより、ｓＨＡタンパク質を三量体化することが試みられてきた。実際に、従来の報告においては、単量体（ｓＨＡ）よりも三量体の方が抗原性が高いことが示されていた（非特許文献２、３及び４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０００−５１３９２２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｌｅｎａ  Ｆｅｓｈｃｈｅｎｋｏら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１２）１２：７７
【非特許文献２】Ｃｈｉｈ−Ｊｅｎ  Ｗｅｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００８）８２（１３）：６２００−６２０８
【非特許文献３】Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｆら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１２）７（８）：ｅ４３６０３
【非特許文献４】Ｗｅｌｄｏｎ，ＷＣら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１０）５（９）：ｅ１２４６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より簡便で品質管理の容易な、高い抗体価を与えるインフルエンザウイルスワクチンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、より簡便な手法で高い抗体価を与えるインフルエンザウイルスワクチンの製造について鋭意検討した結果、カイコの絹糸（繭）に分泌させたワクチンが、非常に高い抗体価を示すことを見出し、本発明を完成させた。特に、本発明者らは、カイコの絹糸（繭）に分泌されたワクチンは、多量体の形成の有無にかかわらず高い抗体価を提示することを見出した。よって、本発明は、カイコの絹糸（繭）に分泌させることにより、従来よりも簡便かつ安価に高い抗体価を呈するワクチンを製造できることに基づく。
【０００８】
よって、本発明は、トランスジェニックカイコに膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落しているＨＡタンパク質を発現させることによる、インフルエンザワクチンの製造方法を提供するものである。具体的には、本発明は以下の発明を含む：
（１）  カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された、インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子を含む核酸コンストラクトであって、前記インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子は膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落している、核酸コンストラクト。
（２）  前記プロモーター領域が、セリシン１プロモーター、セリシン２プロモーター、又はセリシン３プロモーターである、前記（１）に記載の核酸コンストラクト。
（３）  前記インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子が三量体化ドメインをコードするＤＮＡと結合している、前記（１）又は（２）に記載の核酸コンストラクト。
（４）  前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトを含有する、プラスミドベクター。
（５）  前記（４）に記載のプラスミドベクターをカイコ卵に挿入することを含む、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を絹糸（繭）に産生するトランスジェニックカイコの製造方法。
（６）  前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトが染色体に組み込まれた、トランスジェニックカイコ。
（７）  インフルエンザウイルスワクチンの製造方法であって、
前記（６）に記載のトランスジェニックカイコが産生した絹糸（繭）からインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を抽出すること、及び、
抽出されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をインフルエンザウイルスワクチンとして調製することを備える方法。
（８）  トランスジェニックカイコによって産生されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質であって、膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落しているタンパク質。
（９）  トランスジェニックカイコが、（６）に記載のトランスジェニックカイコである、（８）に記載のタンパク質。
（１０）  （８）又は（９）に記載のタンパク質を有効成分として含有する、インフルエンザウイルスワクチン組成物。
（１１）  インフルエンザの予防方法又は治療方法であって、（１０）に記載の組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法。
【０００９】
一態様において、本発明は、カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された、インフルエンザウイルスＨＡ遺伝子を含む核酸コンストラクトに関する。
【００１０】
本明細書において、「カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域」とは、カイコの絹糸腺細胞内で連結された遺伝子を発現させることができるプロモーター領域であれば特に限定されるものではない。カイコの絹糸腺細胞は、後部絹糸腺細胞、中部絹糸腺細胞、及び前部絹糸腺細胞を含み、好ましくは、中部絹糸腺細胞である。候補プロモーター領域が、カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすか否かは、候補プロモーター領域の下流に蛍光遺伝子等の標識遺伝子を結合させた核酸コンストラクトを含むベクターを、カイコの卵に導入してトランスジェニックカイコを作製し、当該トランスジェニックカイコが産生する絹糸（繭）中において標識遺伝子発現産物が検出された場合に、当該候補プロモーターはカイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターであると判定することにより決定することができる。カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域として、好ましくは、絹タンパク質遺伝子プロモーターであり、例えば、セリシン遺伝子プロモーター（セリシン１遺伝子プロモーター、セリシン２遺伝子プロモーター、及びセリシン３遺伝子プロモーター）又はフィブロイン遺伝子プロモーター（フィブロイン重鎖遺伝子プロモーター、フィブロイン軽鎖遺伝子プロモーター、及びフィブロヘキサメリンプロモーター）である。カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域として、より好ましくは、セリシン１遺伝子プロモーター、セリシン２遺伝子プロモーター、及びセリシン３遺伝子プロモーターであり、最も好ましくは、セリシン１遺伝子プロモーターである。
【００１１】
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）としては、少なくともＨ１からＨ１８の１８種類のサブタイプが存在することが報告されているが、本明細書におけるＨＡは、いかなるサブタイプであってもよい。例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３がヒト感染型であることが確認されているが、Ｈ５の変異型もヒトに感染することが報告されている。ＨＡとしては、例えば、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＨＡを挙げることができ、具体的には、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／Ｏｋｉｎａｗａ／２４８／２００９）のＨＡ（配列番号１）を挙げることができる。本明細書において、「ＨＡ」は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを意味し、特にそのように解釈することが不整合である場合を除き、いかなるタイプのヘマグルチニンをも含み得るものであり、例えば、後述する膜結合ドメインが欠落したヘマグルチニンや三量体化ドメインが結合したヘマグルチニンをも含む。
【００１２】
本発明のＨＡ遺伝子は、好ましくは、膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落している。膜結合ドメインが欠落したＨＡタンパク質は、膜内に埋め込まれることなく細胞外に分泌され得る（ＨＡ遺伝子は、シグナルペプチドをコードする領域を有しているため）。本明細書において、特に、野生型のＨＡタンパク質から膜貫通領域以降のＣ末端が欠落したＨＡタンパク質を可溶化ＨＡタンパク質（ｓＨＡ）と呼ぶことがある。
【００１３】
ある態様において、本発明は、カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された、ＨＡ遺伝子を含む核酸コンストラクトであって、前記ＨＡ遺伝子は膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落しており、かつ、三量体化ドメインをコードするポリヌクレオチドと結合している核酸コンストラクトに関する。本発明のＨＡ遺伝子は、膜貫通領域をコードするポリヌクレオチドを欠落させた後、三量体化ドメインをコードするポリヌクレオチドと結合させることにより、多量体を形成しやすくなる。三量体化ドメインとは、当該ドメインを有することによりＨＡタンパク質の凝集を誘導して主に三量体を形成させることができるドメインを意味する。三量体化ドメインは、三量体に加えて三量体以外の多量体を形成させてもよい。例えば、本発明の膜貫通領域をコードするポリヌクレオチドが欠落したＨＡ遺伝子は、膜貫通領域が存在していた位置に三量体化ドメインが結合しているＨＡ遺伝子であってもよい。候補ドメインが三量体化ドメインであるか否かは、例えば、次の方法で確認することができる。当該候補ドメインを膜貫通領域を欠落させたＨＡ遺伝子に結合させ、プロモーター等の必要な領域と結合させた後にベクターに組み込み、ホスト細胞に導入し、当該遺伝子を発現可能な条件で該ホスト細胞を培養して当該遺伝子を発現させた後に、得られた発現産物について、ＳＤＳサンプルバッファーを加えた後、加熱処理を行わずに、電気泳動及びウェスタンブロッティングを行い、ＨＡタンパク質の三量体に該当する分子量の位置にバンドが確認された場合には、当該候補ドメインは三量体化ドメインであるとして判定することができる。三量体化ドメインとしては、例えば、Ｔ４ファージフィブリチン三量体化ドメイン（Ｆｏｌｄｏｎ）（配列番号２）、及びＧＣＮ４ｐＩＩヘプタリピート配列（配列番号３）等を挙げることができる。
【００１４】
また、本発明の核酸コンストラクトは、プロモーター領域やＨＡ遺伝子に加え、遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドを有することができる。例えば、本発明の核酸コンストラクトは、様々な種類のエンハンサー、フィブロイン重鎖遺伝子の−１８６０〜−１１２７の領域、及び／又は、−５０００〜−３８４８の領域（特開２００４−３４４１２３）、バキュロウイルスｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎをコードするポリヌクレオチド（米国特許公開公報２００８／０３０１８２３）、バキュロウイルス・ポリヘドリンの５’非翻訳領域を構成するポリヌクレオチド（特開２００８−１２５３６６）、及び／又は、バキュロウイルスＩＥ１をコードするポリヌクレオチド（米国特許公開公報２００８／０３０１８２３）等を含むことができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、前記核酸コンストラクトを含有するプラスミドベクターに対するものである。プラスミドベクターは、カイコ細胞に導入し、維持することができるベクターであれば特に制限されない。好ましくは、本発明のプラスミドベクターは、カイコの卵に導入することにより、前記ＨＡタンパク質を絹糸（繭）中に産生するトランスジェニックカイコを作製することができるプラスミドベクターである。候補プラスミドベクターが、カイコの卵に導入することにより、前記ＨＡタンパク質を絹糸（繭）中に産生するトランスジェニックカイコを作製することができるか否かは、該プラスミドベクターをカイコの卵に導入してトランスジェニックカイコを作製し、当該トランスジェニックカイコが産生する絹糸（繭）中におけるＨＡタンパク質を検出した場合には、前記ＨＡタンパク質を絹糸（繭）に産生するトランスジェニックカイコを作製することができるプラスミドベクターであると判定することにより行うことができる。好ましくは、本発明のプラスミドベクターは、遺伝子が導入された個体を容易に識別するために、眼や神経系、あるいは表皮などのカイコの細胞内において活性化するプロモーター（例えば、３ＸＰ３プロモーター）の下流に制御可能に標識遺伝子（例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が結合した発現カセットを有する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、前記核酸コンストラクトが染色体に組み込まれた、トランスジェニックカイコに関する。本発明のトランスジェニックカイコは、前記核酸コンストラクトとは別に組み込まれた、遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていてもよい。本発明のトランスジェニックカイコは、その絹糸（繭）中にＨＡタンパク質を産生することができる。好ましくは、本発明のトランスジェニックカイコは、その絹糸（繭）中（好ましくは、セリシン層）にＨＡタンパク質を分泌することができる。候補トランスジェニックカイコが絹糸（繭）中にＨＡタンパク質を産生するか否かは、該候補トランスジェニックカイコが産生した絹糸（繭）中のＨＡタンパク質を抗ＨＡタンパク質抗体等を用いて検出し、検出された場合には該候補トランスジェニックカイコが絹糸（繭）中にＨＡタンパク質を産生すると判定することにより行うことができる。また、候補トランスジェニックカイコが絹糸（繭）中（好ましくは、セリシン層）にＨＡタンパク質を分泌するか否かは、該候補トランスジェニックカイコが産生した絹糸（繭）からの抽出したセリシン層中のＨＡタンパク質を抗ＨＡタンパク質抗体等を用いて検出し、検出された場合には該候補トランスジェニックカイコが絹糸（繭）中（好ましくは、セリシン層）にＨＡタンパク質を分泌すると判定することにより行うことができる。
【００１７】
更に別の態様において、本発明は、前記トランスジェニックカイコによって産生されたＨＡタンパク質に関する。該ＨＡタンパク質は、好ましくは、膜結合ドメインをコードするポリヌクレオチドが欠落している。トランスジェニックカイコによって産生されたＨＡタンパク質は、前記三量体化ドメインを有していてもよいし、有していなくてもよい。また、トランスジェニックカイコによって産生されたＨＡタンパク質は、単量体、三量体、多量体のいずれの状態であってもよい。
【００１８】
別の態様において、本発明は、前記トランスジェニックカイコによって産生されたＨＡタンパク質を有効成分として含有する、インフルエンザウイルスワクチン組成物に関する。本ワクチン組成物は、前記ＨＡタンパク質（以下、「抗原」ということがある）の他、追加成分、及び医薬的に許容される担体を含むことができる。追加成分としては、アジュバント、及び抗インフルエンザウイルス剤等の抗インフルエンザウイルス作用を増強させる成分を挙げることができる。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルション、水中油エマルション、水中油中エマルション、アクリルまたはメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸、アルケニル誘導体、カルボマー、ブロックコポリマーを挙げることができる。また、抗ウイルス剤としては、ザナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、及びラニナミビル等のノイラミターゼ阻害剤、アマンタジン、リマンタジン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤等を挙げることができる。本発明の組成物が含有する医薬的に許容される担体としては、医薬品として用いることが許可されている溶媒、分散剤、コーティング剤、安定剤（アルブミン、エチレンジアミン四酢酸アルカリ塩）、希釈剤（水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等）、保存剤、賦形剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤（塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等）、吸収遅延剤を含む。
【００１９】
例えば、本発明の組成物は、非経口投与または経口に適する剤形とすることができる。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤などが挙げられ、注射剤には、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形が含まれる。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗原タンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。また、非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製される。例えば、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルド・シリンジ）の場合、投薬単位剤形（例えば、０．１〜２ｍＬ、又は０．２５〜１ｍＬ）当たり通常０．０１〜５００μｇ、又は０．１〜１００μｇの抗原タンパク質が含有されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の製造方法により製造されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、その多量体構造に依存することなく高い抗原性を発揮することから、効果の強く、かつ、製造が容易なワクチンの製造を可能とするものである。すなわち、本発明の製造方法により製造されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、その多量体形成の有無にかかわらず高い抗原性を発揮することから、多量体の形成の程度がワクチンとしての性能に影響することがないため、多量体形成の量や割合等について制御又は検査する必要がない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／Ｏｋｉｎａｗａ／２４８／２００９）より得られたヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子の塩基配列、及びその模式図を示す。塩基配列において四角で囲まれた配列は膜貫通領域を示す。「ＨＡ１」は、ＨＡ１サブユニットを、「ＨＡ２」は、ＨＡ２サブユニットを示す。模式図は、上から順に野生型「ＨＡ」、野生型ＨＡの膜貫通領域を欠損させた領域に三量体化ドメイン（Ｆｏｌｄｏｎ）を結合させた「ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ」、野生型ＨＡの膜貫通領域を欠損させた「ｓＨＡ」を示す。「ＴＭ」は膜貫通領域を示す。
【図２】トランスジェニックカイコの繭から抽出したＨＡをＣＢＢ染色（上）、及びウェスタンブロッティング（下）により確認した写真を示す。両写真において、カラムは左から順に野生型ＨＡ、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ、及びｓＨＡのそれぞれについて、１：全抽出液、２：ＰＢＳ処理抽出液、３：ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ処理抽出液、及び、４：非加熱のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ処理抽出液を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
１．核酸コンストラクトの作製
本発明のカイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された、ＨＡ遺伝子を含む核酸コンストラクトは、カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域をコードするポリヌクレオチドと、ＨＡ遺伝子とを、当業者が周知の遺伝子組換え技術により結合させて作製することができる。カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域のポリヌクレオチドは、例えば、カイコ細胞より抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、目的のプロモーターに対応するプロモーターを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。例えば、セリシン１遺伝子プロモーターの取得方法が、米国特許公開公報２００８／０３０１８２３に記載されている。
【００２３】
また、ＨＡ遺伝子は、インフルエンザウイルスより取得したＨＡ遺伝子をテンプレートとして、目的とするＨＡ遺伝子に応じて設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅させるにより得ることができる。該ＰＣＲにおいて、膜貫通領域の直前の配列に対応するプライマーを用いることにより、膜貫通領域が欠損したＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。また、膜貫通領域が欠損し、三量体化ドメインを有するＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、前記膜貫通領域が欠損したＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び三量体化ドメインをコードするポリヌクレオチドを鋳型として、ＨＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端側の核酸配列に対応するプライマーと三量体化ドメインをコードするポリヌクレオチドのＣ末端側の核酸配列に対応するプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより得ることができる。
【００２４】
本発明の核酸コンストラクトが、エンハンサー、フィブロイン重鎖遺伝子の−１８６０〜−１１２７の領域、及び／又は、−５０００〜−３８４８の領域、バキュロウイルスｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎをコードするポリヌクレオチド、バキュロウイルス・ポリヘドリンの５’非翻訳領域を構成するポリヌクレオチド、及び／又は、バキュロウイルスＩＥ１をコードするポリヌクレオチド等を含む場合、当業者周知の方法により（例えば、制限酵素切断部位を利用することにより）これらのポリヌクレオチドとカイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結されたＨＡ遺伝子とを結合させることにより得ることができる。例えば、本発明の核酸コンストラクトは、特開２００４−３４４１２３、米国特許公開公報２００８／０３０１８２３、特開２００８−１２５３６６などに記載された方法に従って、作製することができる。
【００２５】
２．ベクターの作製
本発明の前記核酸コンストラクトを含有するプラスミドベクターは、所望のベクターに前記核酸コンストラクト又はその構成成分を組み込むことにより得ることができる。ベクターは、トランスジェニックカイコを作製可能なプラスミドベクターであれば特に限定されず、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来するＤＮＡ型トランスポゾンpｉｇｇｙＢａｃを組み込んだプラスミドベクター（Ｔａｍｕｒａ，Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：８１−８４（２０００））を挙げることができる。例えば、ベクターとして、ｐＰＩＧＡ３ＧＦＰ（Ｔａｍｕｒａ，Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：８１−８４（２０００））やｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：５２−５６（２００３））を挙げることができる。また、本発明のベクターは、例えば、米国特許公開公報２００８／０３０１８２３に記載された方法により作製されたベクター（ｐＭＳＧ１．１ＭＧ）の制限酵素切断部位に前記核酸コンストラクトを挿入することによっても作製することができる。
【００２６】
３．トランスジェニックカイコの作製
一態様において、本発明は、前記プラスミドベクターをカイコ卵に挿入することを含む、ＨＡタンパク質を絹糸（繭）（好ましくは、セリシン層）中に産生（分泌）するトランスジェニックカイコの製造方法に関する。具体的には、本発明のトランスジェニックカイコの製造方法は、前記プラスミドベクターを産卵後２〜８時間のカイコ卵（カイコ胚）に注入し、孵化したカイコの成虫を交配してＦ１卵塊を得、標識遺伝子の発現等を指標に本発明の核酸コンストラクトが組み込まれたトランスジェニックカイコをスクリーニングすることを含む。
【００２７】
また、本発明のトランスジェニックカイコは、本発明の核酸コンストラクトとは別に、前記遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドを導入してもよい。例えば、本発明のプラスミドベクターとは異なるプラスミドベクターに遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドを組み込み、これを本発明のプラスミドベクターと同時にまたは別々にカイコ卵に注入してもよい。あるいは、上述の方法により得られた本発明の核酸コンストラクトが組み込まれたトランスジェニックカイコを、遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドが組み込まれたトランスジェニックカイコと交配させることにより、本発明の核酸コンストラクトと、前記遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドが導入されたトランスジェニックカイコを得ることもできる。
【００２８】
４．ＨＡタンパク質の製造
ＨＡタンパク質は、前記トランスジェニックカイコに繭を作らせ、当該繭中に産生されたＨＡタンパク質を、産生条件（例えば、使用したプロモーター）に応じて適宜抽出することにより得ることができる。例えば、セリシン１プロモーターを使用した場合、繭を０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ又は１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００含有ＰＢＳ等に浸漬させ、室温で１時間撹拌した後、溶解液からＨＡタンパク質を適宜精製することにより得ることができる。また、フィブロインプロモーターを使用し、ＨＡタンパク質をフィブロインとの融合タンパク質として産生させた場合には、特開２００６−１６３２３号記載の方法に準じて抽出することができる。
【００２９】
５．ワクチン組成物の製造
一態様において、本発明はインフルエンザワクチン組成物の製造方法に関する。本発明は、インフルエンザウイルスワクチン組成物の製造方法であって、前記トランスジェニックカイコが産生した絹糸からＨＡタンパク質を抽出すること、及び、抽出されたＨＡタンパク質をインフルエンザウイルスワクチンとして調製することを備える方法を含む。また、本発明は、インフルエンザウイルスワクチン組成物の製造方法であって、前記トランスジェニックカイコが産生した繭を溶解させること、溶解した繭からインフルエンザウイルスＨＡを抽出すること、及び、抽出されたＨＡタンパク質をインフルエンザウイルスワクチンとして調製することを備える方法を含む。ＨＡタンパク質は上述の方法により得ることができ、ワクチン組成物の調製は、当業者周知の方法により、前記ＨＡタンパク質と前記医薬的に許容される担体を混合し、必要に応じてガラスアンプル、シリンジ、ガラスバイアル等に封入することにより行うことができる。また、ワクチン組成物は必要に応じて、ＨＡタンパク質を含有するワクチンが封入された容器の他、パッケージ、説明書等を含むことができる。
【００３０】
６．予防方法・治療方法
また、本発明は、インフルエンザの予防方法又は治療方法であって、前記ワクチン組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。投与量は、投与対象、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、投与対象がヒトの場合、０．０１〜０．５μｇを皮下に注射することにより投与することができる。投与回数は、１回又は０．５〜８週間の間隔をおいて２回とすることができる。また、投与ルートは、好ましくは皮下である。
【００３１】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）  インフルエンザヘマグルチニン発現ベクターの作製
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／Ｏｋｉｎａｗａ／２４８／２００９）より得られたヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子（配列番号１）を鋳型としたＰＣＲを行うことにより、ＨＡの開始メチオニンから細胞膜貫通ドメインの直前までをコードする分泌型ＨＡ（ｓＨＡ）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を得た。用いたプライマーの配列は、ｐｒｉｍｅｒ１：５’−ＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴ−３’（下線部が開始メチオニン）（配列番号４）およびｐｒｉｍｅｒ２：５’−ＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号５）である。さらに、開始コドンの上流にカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリン遺伝子の５’−ＵＴＲを付加するため、ｐｒｉｍｅｒ３：５’−ＡＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧ−３’（配列番号６）を使用した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ−ベクターに挿入した後、さらに、制限酵素ＮｒｕＩを用いて切り出し、特許文献（特開２００８−６７６１２）に記載したｐＭＳＧ１．１ＭＧの制限酵素ＮｒｕＩサイトに挿入し、トランスジェニックカイコ作製用ベクター（ｓＨＡ／ｐＭＳＧ）を作製した。
【００３３】
次に、Ｔ４ファージ  フィブリチンの三量体化ドメイン（Ｆｏｌｄｏｎ）遺伝子を鋳型とし、塩基配列が５’−ＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＴＴＡＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号７）（ｐｒｉｍｅｒ４）および５’−ＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＧＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡ−３’ （配列番号８）（ｐｒｉｍｅｒ５）であるプライマーを用いたＰＣＲによりＦｏｌｄｏｎ遺伝子のＰＣＲ産物を回収し、さらにｓＨＡをコードする塩基配列を鋳型とし、前記ｐｒｉｍｅｒ１および塩基配列が５’−ＡＧＧＡＡＴＡＴＡＡＣＣＡＡＴＣＣＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＣＡＧＧＣＴＴ−３’（配列番号９）であるプライマー（ｐｒｉｍｅｒ６）を用いたＰＣＲによりｓＨＡ遺伝子のＰＣＲ産物を回収した。両ＰＣＲ産物を混合し、前記ｐｒｉｍｅｒ１および前記ｐｒｉｍｅｒ５をもちいたＰＣＲにより、ｓＨＡタンパク質のＣ末端側にＦｏｌｄｏｎを融合したタンパク質（ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。さらに、開始コドンの上流にカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリン遺伝子の５’−ＵＴＲを付加するため、ｐｒｉｍｅｒ３を使用した。ｓＨＡの場合と同様に、得られたＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ−ベクターに挿入した後、ｐＭＳＧ１．１ＭＧの制限酵素ＮｒｕＩサイトに挿入し、トランスジェニックカイコ作製用ベクター（ｓＨＡ−ｆｏｌｄｏｎ／ｐＭＳＧ）を作製した。
【００３４】
（実施例２）  トランスジェニックカイコの作出
ｓＨＡ／ｐＭＳＧおよびｓＨＡ−ｆｏｌｄｏｎ／ｐＭＳＧをＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  １２１４５）で精製した後、それぞれをヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ｓＨＡ／ｐＭＳＧまたはｓＨＡ−ｆｏｌｄｏｎ／ｐＭＳＧと、ｐＨＡ３ＰＩＧの濃度がそれぞれ２００μｇ／ｍｌなるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０，５ｍＭ  ＫＣｌ）に溶解した。これらのベクター混合液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約１５〜２０ｎｌの液量で微量注入した。ｓＨＡ／ｐＭＳＧベクターについて３２８個の卵に、ｓＨＡ−ｆｏｌｄｏｎ／ｐＭＳＧベクターについては８８２個の卵に微量注入をおこなった。
【００３５】
ベクターＤＮＡ（ｓＨＡ／ｐＭＳＧおよびｓＨＡ−ｆｏｌｄｏｎ／ｐＭＳＧ）を微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ、それぞれ１８７、および２２４個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し、それぞれ４３、および、５５グループのＦ１卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を、それぞれ２０、および１８グループ得ることができた。得られた卵塊を孵化させ飼育したところ、それぞれ１９、および９グループの卵塊に由来するトランスジェニックカイコは、正常に繭を作り蛹となり、さらに羽化して生殖能力を有した成虫になった。そこで、野生型のカイコと交配して、トランスジェニック系統を樹立した。
【００３６】
樹立したｓＨＡ遺伝子またはｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ遺伝子を有するトランスジェニックカイコを、ＢｍＮＰＶ由来のトランスアクチベーターであるＩＥ１遺伝子を発現するカイコ（特開２０１２−１８２９９５）と交配した。ＩＥ１遺伝子から合成されるＩＥ１タンパク質は、ｐＭＳＧ１．１ＭＧに含まれるＢｍＮＰＶ由来のｈｒ３エンハンサーや、セリシン１プロモーターに作用し、組換えタンパク質の発現量を増加させることが知られている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０６，８６０−８７０（２０１０））。交配して得られた、ｓＨＡおよびＩＥ１を発現するカイコ（ｓＨＡ／ＩＥ１）、またはｓＨＡ−ＦｏｌｄｏｎおよびＩＥ１を発現するカイコ（ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ／ＩＥ１）を飼育し繭を作らせた。
【００３７】
（実施例３）  トランスジェニックカイコの繭に含まれるＨＡの解析
野生型カイコおよびトランスジェニックカイコ（ｓＨＡ／ＩＥ１およびｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ／ＩＥ１）の繭糸をハサミで断片化した後、８Ｍ尿素溶液中（８  Ｍ  Ｕｒｅａ、５０  ｍＭトリス塩緩衝液ｐＨ８．０、２％  ２−メルカプトエタノール）で、８０℃、５分間加温してセリシン層を全溶解した抽出液を調製した。また、繭糸に含まれるｓＨＡまたはｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎの抽出条件を検討するため、繭糸を、ＮａＣｌ濃度を０．５ＭとしたＰＢＳ、または０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む上記ＰＢＳに浸漬させ、室温で１時間攪拌した後、遠心分離により抽出液を回収した。
【００３８】
それぞれの抽出液を電気泳動してウエスタンブロット解析を行った。抽出液を２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプルバッファーと混合し、５分間９５℃で加熱した。また、ＨＡの三量体形成を確認するため、ＳＤＳサンプルバッファーと混合した後、加熱処理をしない試料も調製した。これらの試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５，１９７０）に供した。泳動後、ゲル中のタンパク質をＣＢＢ−Ｒ２５０で染色した。また、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１００３５−１００３８，１９８７）に準じて、泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＩＰＶＨ０００１０）に転写した。このＰＶＤＦ膜をブロッキング液（５％Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で３７℃において１時間処理した後に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した抗Ｈ１Ｎ１マウス抗血清と４℃で１晩反応させた。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＩＢＬ１７６０１）と３７℃で約１時間反応させた。最後に、抗体が反応したタンパク質をＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  ＲＰＮ２１０６）を用いて検出した。
【００３９】
ＣＢＢ染色の結果、ｓＨＡ／ＩＥ１およびｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ／ＩＥ１の繭を、８Ｍ尿素を含む緩衝液で処理した試料において、野生型カイコ繭を同様に処理した場合には見られない、約６０ｋＤａのバンドが検出された。これらのバンドは、ウエスタンブロットにより、抗Ｈ１Ｎ１抗体と反応したことから、組換え産物であるｓＨＡまたはｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎであることが確認された。それぞれの繭糸をＰＢＳまたは０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで処理した抽出液を解析した結果、ｓＨＡは０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて比較的抽出効率良く抽出されたが、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳに対しても溶解性は高くなかった。抽出液を非加熱で電気泳動すると、ｓＨＡについては熱処理したものと比較して変化はなかったが、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎについては三量体と推定されるバンド（約３００ＫＤａ）が検出された。この結果から、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎは、三量体化ドメインであるＦｏｌｄｏｎを介して、三量体を形成したことが確認された。
【００４０】
（実施例４）  ｓＨＡおよびｓＨＡ−ｆｏｌｄｏｎの精製
ｓＨＡ／ＩＥ１の繭を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた２０ｍＭトリス塩緩衝液ｐＨ７．４中で攪拌し、繭からｓＨＡを抽出した。この抽出液に、飽和度３０％の硫酸アンモニウムを加え、室温で１時間インキュベートした後、１０，０００ｒｐｍで１５分遠心して上清を回収した。次に、回収した上清に飽和度７０％になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃，一晩インキュベーションした後、遠心し、ｓＨＡを含む沈殿を回収した。沈殿を、緩衝液（３０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））に溶解し、さらに同緩衝液に対して透析を行った。このサンプルを、陰イオン（ＤＥＡＥ）カラムにアプライし、そのフロースルーを回収した。最後に、精製されたｓＨＡをＰＢＳに対して透析した。
【００４１】
ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎについても、ｓＨＡと同様に、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ／ＩＥ１の繭を１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた２０ｍＭトリス塩緩衝液ｐＨ７．４で処理することによりｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎを抽出し、抽出液に３０％飽和硫安を加えて上清を回収し、さらに７０％飽和硫安を加えて、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎを含む沈殿を回収した。沈殿を、緩衝液（３０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．３））に溶解した後、同緩衝液に透析し、陽イオン（ＳＰ）カラムに供した。緩衝液でカラムを洗浄後、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液を流してｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎを溶出し、ＰＢＳに対して透析を行い、ｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎを精製した。
【００４２】
（実施例５）  マウスへの免疫および抗体価の測定
精製したｓＨＡ（６６μｇ／ｍＬ）およびｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ（５２μｇ／ｍＬ）を、それぞれ０．５ｍＬずつ、ＳＰＦ４週令のｄｄＹマウス雌５匹に腹腔内注射をした。接種後から１４日、２１日後に追って０．５ｍｌずつ腹腔内接種を行った。２８日目に心臓穿刺法で採血し、定法により血清を分離した。
【００４３】
血清中の抗体価の測定は、赤血球凝集抑制試験により行った。上記方法によりｓＨＡまたはｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎの接種後に採取したマウス血清を、ＲＤＥＩＩ「生研」（デンカ生研）を用いてＲＤＥ処理を行った。処理後の血清を２倍ずつ希釈した希釈系列（各２５μＬ／ウェル）を作製し、これに、１６ＨＡ価／５０μｌになるように希釈したＨ１Ｎ１ウイルス（Ａ／ｏｋｉｎａｗａ／２４８／２００９）抗原液を２５μＬ加えて、室温で３０分間静置した。同様に、Ｈ５Ｎ３ウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−Ｑ／Ｆ１９／３／９７）抗原液を血清希釈系列に加えたウェルも用意した。各ウェルに、０．５％赤血球浮遊液を各箇所に５０μｌずつ加えた。室温で６０分間静置した後、赤血球の凝集抑制が見られたウェルを確認し、凝集抑制が見られた最大希釈倍率を、その血清の抗体価とした。
【００４４】
測定の結果を表１に示す。Ｈ１Ｎ１ウイルスに対するｓＨＡおよびｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎ接種後の血清中の抗体価は、どちらとも２０４８と測定された。Ｈ５Ｎ３ウイルスに対しては、どちらも赤血球凝集を抑制しなかった。このように、ｓＨＡおよびｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎを接種したマウスにおいて、非常に高い抗体価の抗ＨＡ抗体の産生が誘導された。ｓＨＡおよびｓＨＡ−Ｆｏｌｄｏｎにおいて、誘導された抗体価の違いは確認されなかった。
【００４５】
【表１】
2015149927.tif 000002
【図１】
2015149927.tif 000003
【図２】
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【配列表】
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