(57)【要約】【課題】コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる皮膚新生コラーゲン増加剤およびこれを含む飲食品の製造方法、ならびに皮膚新生コラーゲンの増加方法を提供するものである。【解決手段】コラーゲンペプチドと下記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを含有する、コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる皮膚新生コラーゲン増加剤。（Ａ）分解度５以上４０以下。（Ｂ）平均分子量２００以上６０００以下。（Ｃ）硫化水素量２ｐｐｍ以下。（Ｄ）かつアミノ酸スコア８０以上。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンペプチドと下記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを含有し、
コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる
皮膚新生コラーゲン増加剤。
（Ａ）分解度５以上４０以下。
（Ｂ）平均分子量２００以上６０００以下。
（Ｃ）硫化水素量２ｐｐｍ以下。
（Ｄ）アミノ酸スコア８０以上。
【請求項２】
請求項１記載の皮膚新生コラーゲン増加剤において、
前記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドが卵白ペプチドである、
皮膚新生コラーゲン増加剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品の製造方法。
【請求項４】
下記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドと、コラーゲンペプチドを摂取することを特徴とする、コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる
皮膚新生コラーゲンの増加方法。
（Ａ）分解度５以上４０以下。
（Ｂ）平均分子量２００以上６０００以下。
（Ｃ）硫化水素量２ｐｐｍ以下。
（Ｄ）アミノ酸スコア８０以上。
【請求項５】
請求項４記載の皮膚新生コラーゲンの増加方法において、
前記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドが卵白ペプチドである、
皮膚新生コラーゲンの増加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンペプチドと特定の要件を満たすペプチドを含有する、
コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる皮膚新生コラーゲン増加剤、およびこれを含む飲食品の製造方法、ならびに皮膚新生コラーゲンの増加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康や美容への関心が高まる中、しわ・たるみや肌荒れは、美容上の大きな悩みとなっている。これらの主たる原因は、真皮の必要なマトリックス成分である皮膚新生コラーゲンの減少である。
コラーゲン繊維を増加させるためには、繊維化する前のコラーゲン繊維前駆体である、皮膚新生コラーゲンを増加させることが重要である。
皮膚新生コラーゲンの増加に伴い、コラーゲン繊維も増加することが予想されるため、肌のしわやたるみを改善できることが期待される。
【０００３】
そこで、皮膚新生コラーゲンを増加させる方法としては、一般的に、コラーゲンやその加水分解物であるコラーゲンペプチドを摂取することが良いとされている。
そのため、近年、コラーゲンやコラーゲンペプチドが配合された健康食品や美容食品が多く市場に出回っている。
【０００４】
しかし、コラーゲンやコラーゲンペプチドは、皮膚新生コラーゲンの合成に必要なアミノ酸であるプロリンを含んでいるものの、アミノ酸バランスが偏っている。
したがって、コラーゲンやコラーゲンペプチドを摂取しても、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果は低いと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２６３６８９号公報
【特許文献２】特開２００８−１１８９６２号公報
【特許文献３】特開２００９−１８３２１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させることができる、
皮膚新生コラーゲン増加剤およびこれを含む飲食品の製造方法、ならびに皮膚新生コラーゲンの増加方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、コラーゲンペプチドと特定の要件を満たすペプチドを組合せて含有させることで、意外にもコラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）コラーゲンペプチドと下記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを含有し、
コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる
皮膚新生コラーゲン増加剤。
（Ａ）分解度５以上４０以下。
（Ｂ）平均分子量２００以上６０００以下
（Ｃ）硫化水素量２ｐｐｍ以下。
（Ｄ）アミノ酸スコア８０以上。
（２）（１）の皮膚新生コラーゲン増加剤において、
前記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドが卵白ペプチドである、
皮膚新生コラーゲン増加剤。
（３）（１）又は（２）の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品の製造方法。
（４）下記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドと、コラーゲンペプチドを摂取することを特徴とする、コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる
皮膚新生コラーゲンの増加方法。
（Ａ）分解度５以上４０以下。
（Ｂ）平均分子量２００以上６０００以下
（Ｃ）硫化水素量２ｐｐｍ以下。
（Ｄ）アミノ酸スコア８０以上。
（５）（４）の皮膚新生コラーゲンの増加方法において、
前記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドが卵白ペプチドである、
皮膚新生コラーゲンの増加方法。
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、コラーゲンペプチドと特定の要件を満たすペプチドを組合せて含有させることで、コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させる皮膚新生コラーゲン増加剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施例１の皮膚新生コラーゲン増加剤の確認試験において、皮膚新生コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの量を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明において、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。
【００１２】
＜本発明の特徴＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤は、コラーゲンペプチドと特定の要件を満たすペプチドを含有させることで、コラーゲンペプチドのみに比べ皮膚新生コラーゲンを増加させることに特徴を有する。
【００１３】
＜コラーゲンペプチド＞
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、一般的にコラーゲンペプチドとして市販されているものであれば特に限定されない。
本発明に用いるコラーゲンペプチドは、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果を得られ易いことから、平均分子量３００以上１万以下が良く、さらに、５００以上７０００以下が良い。
【００１４】
＜（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチド＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤は、必須成分として下記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを含有したものである。
（Ａ）分解度５以上４０以下。
（Ｂ）平均分子量２００以上６０００以下。
（Ｃ）硫化水素量２ｐｐｍ以下。
（Ｄ）アミノ酸スコア８０以上。
前記ペプチドの種類は、上記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たしていれば、特に限定されないが、例えば、卵白ペプチド、ホエイペプチド等が挙げられる。
特に、本発明の効果が現れ易いことから、卵白ペプチドが良い。
また、皮膚新生コラーゲン増加剤として継続的に摂取することで、皮膚新生コラーゲン増加効果を得られ易いことから、本発明に用いる上記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドは特有の硫黄臭やアミノ酸の苦味が少ないことが良い。
【００１５】
＜（Ａ）分解度＞
本発明に用いる上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドは、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果を得るため、分解度５以上４０以下とする必要があり、さらに７以上２０以下、９以上１５以下とすると良い。
前記ペプチドの分解度が４０より高いと、アミノ酸由来の苦みが強くなるため好ましくない。一方、分解度が５より低いと、得られたペプチドを水溶液にした際、沈殿物や濁りが発生しやすくなるため好ましくない。
【００１６】
＜分解度測定＞
本発明において、上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの分解度は、ホルモル滴定法にて測定された値である。
すなわち、まず、前記ペプチドをセミミクロケルダール法にて分析し、ペプチド中の全窒素含量を求める。さらに、前記ペプチドをホルモル滴定にて分析し、ペプチド中のアミノ態窒素含量（％）を求める。これらの値から、アミノ態窒素含量を全窒素含量で除することにより、分解度（％）を算出する。
【００１７】
＜（Ｂ）平均分子量＞
本発明に用いる上記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドは、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果を得るため、平均分子量２００以上６０００以下とする必要があり、さらに４００以上２０００以下、６００以上１５００以下とすると良い。
前記ペプチドの平均分子量が６０００より大きいと、ペプチドの製造時に不溶物が多く収率が低下する傾向にあるため好ましくない。
また、前記ペプチドの平均分子量が２００より小さいと、アミノ酸由来の苦みが強くなるため好ましくない。
【００１８】
＜平均分子量測定＞
本発明において、上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの平均分子量は、常法に則り、例えば、ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法や、ゲルろ過カラム及び紫外分光光度計で測定することができる。
【００１９】
＜（Ｃ）硫化水素量＞
本発明に用いる上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドは、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果を得るため、硫化水素量が２ｐｐｍ以下とする必要があり、さらに１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下とすると良い。
前記ペプチドの硫化水素量が２ｐｐｍを超えると、硫黄臭を強く感じる場合がある。
一方、前記ペプチドの硫化水素量が２ｐｐｍ以下であることにより、硫黄臭が低減されているため、抵抗無く継続的に摂取することが可能である。
【００２０】
＜硫化水素量測定＞
本発明において、上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの硫化水素量は、検知管式ガス測定器を用いて測定した値である。検知管式ガス測定器についてはＪＩＳＫ０８０４で規定されており、検知管式ガス採取器と検知管からなるガス測定器をいう。
【００２１】
＜（Ｄ）アミノ酸スコア＞
アミノ酸スコアとは、アミノ酸組成に基づく蛋白質の栄養評価法であり、食品に含まれる必須アミノ酸が必要量を満たしているか否かを示す指標である。本発明では、国連食料農業機構（ＦＡＯ）、世界保健機構（ＷＨＯ）、国連大学（ＵＮＵ）の合同委員会により１９８５年に提案された２-５歳児童のアミノ酸評価パターンに基づき算出した。
算出された値のうち、最低値をもってアミノ酸スコアとし、最低値が１００を上回る場合は１００とする。
【００２２】
本発明に用いる上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドは、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果を得るため、アミノ酸スコア８０以上とする必要があり、さらに９０以上とすると良い。
前記ペプチドのアミノ酸スコアが８０未満の場合、アミノ酸バランスが悪いため、本発明の効果が得られにくい。
【００２３】
＜（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの製造方法＞
本発明に用いる、上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを卵白ペプチドとした場合、卵白ペプチドの製造方法は、具体的には、液卵白１部に対し０．４部以上３部以下の水で希釈した卵白希釈液を、ｐＨ９以上１２以下、５５℃以上９０℃以下の条件下で加熱処理して卵白を変性させる前処理工程と、プロテアーゼにより加水分解処理する工程とを含むことができる。
【００２４】
上記の卵白希釈液における加水量は、液卵白１部に対し、０．４部以上３部以下とすると良く、さらに０．６部以上２．５部以下、０．８部以上２部以下とすると良い。
液卵白１部に対する加水量が０．４部未満である場合、加熱時に卵白が凝固し、後述するプロテアーゼによる加水分解処理ができない場合がある。
一方、液卵白１部に対する加水量が３部を超える場合、収率が低下する場合がある。また、加水分解処理後の卵白ペプチドを乾燥させる場合、作業コストが大きくなり望ましくない。
【００２５】
上記前処理工程におけるｐＨは９以上１２以下とすると良く、さらに９．５以上１１．５以下、１０以上１１以下とすると良い。
ｐＨが９未満であると、卵白ペプチドの硫黄臭が十分に低減されない。
一方、ｐＨが１２を超えると、加熱時に卵白が凝固し、後述するプロテアーゼによる加水分解処理ができない場合がある。また、ｐＨが１２以下の場合よりも硫黄臭が強くなる場合がある。なお、卵白ペプチドのｐＨ調整は、例えば、アルカリ性水溶液（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなど）を用いて行うことができる。
【００２６】
前処理工程における加熱温度は５５℃以上９０℃以下とすると良く、さらに６０℃以上８５℃以下、６５℃以上７５℃以下とすると良い。
加熱温度が５５℃未満であると、卵白ペプチドの硫黄臭が十分に低減されない。
一方、加熱温度が９０℃を超えると、加熱時に卵白が凝固し、後述するプロテアーゼによる加水分解処理ができない場合がある。
また、加熱温度が９０℃以下の場合よりも硫黄臭が強くなる場合がある。
【００２７】
処理工程における加熱時間は、卵白が適度に変性する条件であれば特に限定するものではないが、３分から６０分の範囲で適宜選択すればよい。
【００２８】
加水分解に用いるプロテアーゼは、特に限定するものではないが、例えば、ペプシン、キモトリプシン、トリプシン、パンクレアチンなどの動物由来プロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、フィシンなどの植物由来プロテアーゼ、微生物（乳酸菌、枯草菌、放線菌、カビ、酵母など）由来のエンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼならびにこれらの粗精製物および菌体破砕物等があげられ、これらの１種または２種以上を組合せて用いることができる。
【００２９】
＜コラーゲンペプチドと（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの含量＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤において、コラーゲンペプチドと上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの含量は、特に制限されないが、皮膚新生コラーゲンを増加させる効果が得られ易いことから、コラーゲンペプチドに対し上記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの割合が９：１から１：１とすると良く、さらに６：１から４：１とすると良い。
また、本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤は、コラーゲンペプチドと上記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを合計で、５％以上含有すると良く、さらに１０％以上９０％以下含有すると良い。
【００３０】
＜皮膚新生コラーゲン＞
皮膚新生コラーゲンとは、繊維化する前のコラーゲン繊維前駆体であり、可溶性コラーゲンともいう。
皮膚新生コラーゲンの増加に伴い、コラーゲン繊維も増加することが期待されるため、肌のしわやたるみを改善できることが予想される。
【００３１】
＜皮膚新生コラーゲンの間接的測定法である、ヒドロキシプロリンの測定法＞
本発明において、皮膚新生コラーゲンの値は、皮膚新生コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの値を測定することで間接的に求められる。
ヒドロキシプロリンの値は、皮膚新生コラーゲンを抽出し、ヒドロキシプロリン改良定量法により求められる（皮膚新生コラーゲンの抽出について：西本信一郎ら  日本食品科学工学雑誌  ４９（３）１９９‐２０２（２００２）。ヒドロキシプロリンの改良定量法について：永谷康典ら薬学雑誌１０６（１）４１−４６（１９８６））。
【００３２】
＜試薬の調製＞
０．５ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液は、ホウ酸３０．９ｇ及び塩化カリウム７４．６ｇを精製水７００ｍＬに溶解し、５ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウム溶液でｐＨを８．２に調製した後、精製水で１０００ｍＬとする。
０．２ｍｏｌ／ＬクロラミンＴ溶液はクロラミンＴ２．８ｇを２−メトキシエタノールに溶解し、１００ｍｌとする。
エーリッヒ試液は、ｐ―ジメチルアミノベンズアルデヒド３０ｇをエタノール５０ｍＬに加えたものに、硫酸―エタノール混合液を氷冷しながら徐々に加えて調製する。
【００３３】
＜試料の調製＞
除毛処理部位から得られた皮膚を細断した後に、１．２ｇを秤量し、０．１５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム溶液１０ｍＬを加えた。Ｐｈｙｓｃｏｔｒｏｎ型ホモゲナイザーにてホモゲナイズし、超音波にて粉砕した後、４℃で１２時間振とう抽出を行った。
その後、４００００×ｇ、４℃で１時間の遠心分離を行い、上清画分を得た。沈殿画分に０．５ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム溶液／０．５ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液（ｐＨ ３．６）を１０ｍＬ加えて、４℃で１２時間振とう抽出を行った。
その後、４００００×ｇ、４℃で１時間遠心分離を行い、上清画分を得て、これを先に得られた上清画分と合わせて透析チューブに詰めて蒸留水で透析し、透析内液を凍結乾燥で濃縮し、精製水で２ｍＬとした。
【００３４】
＜ヒドロキシプロリンの定量法＞
スクリューキャップ付遠沈管に塩化カリウム２ｇ及び０．５ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液１ｍＬを加える。これに、上記試料溶液又はヒドロキシプロリン標準溶液２ｍＬをそれぞれ加えた後、時々振り混ぜながら室温で１５分間、次いで、０℃で約１５分間放置する。
次に、０．２ｍｏｌ／ＬクロラミンＴ溶液１ｍＬを加え、時々振り混ぜながら０℃で２時間放置した後、３．６ｍｏｌ／Ｌチオ硫酸ナトリウム溶液２ｍＬ加えて、密封し、沸騰水中で３０分間加熱する。
水道水で室温まで冷却した後、トルエン３ｍＬを加え、メカニカルシェーカーを用いて２０分間激しく振盪する。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、トルエン層２ｍＬを分取し、これにエーリッヒ試液０．８ｍＬを加え、室温に３０分間放置する。
これらの試料につき、波長６５０ｎｍでベースラインを０に調製した後、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
対照には、トルエン２ｍＬにエーリッヒ試液０．８ｍＬを加え、同様に操作したものを使用する。
【００３５】
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を摂取することによって皮膚新生コラーゲンが増加する作用機序については必ずしも明らかではないが、アミノ酸バランスの優れたペプチドによって、コラーゲンペプチドのアミノ酸バランスの偏りが是正され、コラーゲンペプチドの体内利用率が改善されるためであると考察される。
【００３６】
＜その他の原料＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤は、コラーゲンペプチドと上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の原料を含むことができる。
具体的には、清水、賦形剤、抗酸化剤、防腐剤、湿潤剤、粘稠剤、緩衝剤、吸着剤、溶剤、乳化剤、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、水溶性高分子、増粘多糖類、甘味料、矯味剤、酸味料、アルコール類等が挙げられる。
【００３７】
＜皮膚新生コラーゲン増加剤の形態＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤の形態は特に限定されないが、例えば、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。
【００３８】
＜皮膚新生コラーゲン増加剤の摂取量＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤として摂取するコラーゲンペプチドおよび上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの量は、一日当たり１０ｍｇ以上１０ｇ以下、さらに５０ｍｇ以上５０００ｍｇ以下を目安とすることができる。
投与回数は、摂取者の皮膚状態の程度に応じて一日当たり一回もしくは複数回を選択できる。
【００３９】
＜皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品は、本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む。すなわち、本発明の飲食品はコラーゲンペプチドと上述した（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドを含む。
本発明の飲食品に含有するコラーゲンペプチドと上記（Ａ）乃至（Ｄ）を満たすペプチドの含有量は、両者を合計で、５％以上１００％以下とすると良く、さらに１０％以上９０％以下とすると良い。
【００４０】
＜皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品の形態＞
本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品の形態は特に限定されないが、例えば、加工食品であることができる。
加工食品としては、例えば、菓子類、豆類の調製品、マヨネーズ、ドレッシング類、酪農製品（乳飲料、発酵乳、乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料など）、加工卵製品、調理食品、飲料（清涼飲料など）等が挙げられる。
【００４１】
また、本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飲食品として、食品製剤（サプリメント）を調製することができる。
この場合、種々の食品素材または飲料品素材を添加することによって、例えば、粉末状、錠剤状、カプセル状、液状（ドリンク剤など）などの形態の食品製剤とすることができる。
また、この食品製剤には、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤などを適宜添加してもよい。
【００４２】
次に、本発明を実施例に基づき、さらに詳細に説明する。
なお、本発明はこれに限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
［調製例１］卵白ペプチドの調製
生卵白１部を等量の清水で希釈して得られた卵白希釈液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．５に調整した後、６５℃で３０分間加熱し前処理を行った。
前処理した卵白希釈液を塩酸水溶液でｐＨ７．０に調整した後、中性プロテアーゼ（スミチームＦＰ、新日本化学工業社製）２０００ユニットを添加し、４０℃で６時間加水分解処理を行った。
次いで、９０℃で１５分間加熱することでプロテアーゼの失活処理を行い、さらに、ろ過処理することで不要物を除去した後スプレードライで乾燥させ、調製例１の卵白ペプチドを得た。
得られた卵白ペプチドの分解度は９．０であった。
【００４４】
＜平均分子量＞
得られた卵白ペプチドの平均分子量を、以下のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法により測定したところ、平均分子量は８００であった。
【００４５】
具体的には、亜硝酸ナトリウム１２６ｍｇを精密に量り、精製水に溶かしたあと、精密に量った２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム二水和物１００ｍｇを加え、正確に２００ｍＬとし、ＴＮＢＳ試薬とした。
０．４ｇの卵白ペプチド（本品）を精密に量り、精製水に溶かし、正確に１００ｍＬとし、この溶液２ｍＬを正確に量り、精製水を加えて正確に１００ｍＬとした溶液を試料溶液とした。
あらかじめ１０５℃で３時間乾燥させたＬ−ロイシン０．６５６ｇを精密に量り、精製水に溶かし、正確に５００ｍＬとし、この溶液１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬならびに４ｍＬを正確に量り、それぞれに精製水を加えて正確に１００ｍＬとした溶液を標準溶液とした。
【００４６】
次に、試験管に精製水（対照）、前記試料溶液および標準溶液を０．５ｍＬずつ量りとり、０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液を２ｍＬそれぞれに加える。さらに前記ＴＮＢＳ試薬をそれぞれに加えて撹拌混合し、３７℃の恒温水槽中で２時間静置した。
その後、分光光度計で波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた吸光度から、精製水を用いて同様に操作した対照の吸光度を差し引いた値を試料溶液の吸光度とする。同様に標準溶液の吸光度から対照の吸光度を差し引き、吸光度を縦軸に、Ｌ−ロイシンの換算した乾燥物に対する濃度（μｍｏｌ  Ｌ−ロイシン当量／ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線（検量線）と試料溶液の吸収度との交点から試料溶液のアミノ態窒素濃度（μｍｏｌ  Ｌ−ロイシン当量／ｍＬ）を求めた。
ここで求められたアミノ態窒素濃度を式（１）に代入し、試料中のアミノ態窒素含量（ｍｍｏｌ  Ｌ−ロイシン当量／１００ｇ）を算出した。
さらに、本発明の卵白ペプチドの原料として使用する卵白の総タンパク含量（％）を求め（通常約１１％）、式（２）に代入し、卵白ペプチドの平均分子量を算出した。
【００４７】
式（１）  アミノ態窒素含量 ＝試料溶液のアミノ態窒素濃度×{（１００×１００）／（試料採取量ｇ×２）}×１０−３×１００
式（２）  平均分子量＝総タンパク含量／アミノ態窒素含量×１０００
【００４８】
＜硫化水素量＞
得られた卵白ペプチドの硫化水素量は０．２ｐｐｍであった。
【００４９】
具体的な測定方法は、得られた卵白ペプチド３ｇを５００ｍＬの三角フラスコに入れ、９７ｇの精製水を加えて溶解し、８０℃の恒温槽中で１０秒間振り混ぜた。ガラス管およびガス検知管（株式会社ガステック製、「気体検知管Ｎｏ．４ＬＢ硫化水素」）を差し込んだゴム栓を三角フラスコに取り付け、ガラス管の下端の位置は前記ペプチドの水溶液の液面に触れるようにする。ガス検知管にガス採取器（株式会社ガステック製、「気体採取器ＧＶ−１００」）を取り付け、ガス採取器を用いて１００ｍＬの気体を吸引し、ガス検知管の測定値を読み取り、これを硫化水素量とした。
【００５０】
＜アミノ酸スコア＞
得られた卵白ペプチドのアミノ酸スコアは１００であった。
【００５１】
アミノ酸スコアは、食品タンパク質の各必須アミノ酸含量を、アミノ酸評価パターンの当該アミノ酸の値で割って百分率で示した値であり、式（３）に則って算出した。
式（３）  アミノ酸スコア（％）＝食品タンパク質中の各必須アミノ酸含量（ｍｇ／ｇＮ）／アミノ酸評点パターンの当該アミノ酸量（ｍｇ／ｇＮ）×１００
【００５２】
［調製例２］卵白ペプチドの調製
調製例１の卵白ペプチドの製造方法において、前処理工程を除いた以外は、調製例１と同様の方法で卵白ペプチドを得た。
具体的には、生卵白１部を等量の清水で希釈して得られた卵白希釈液を塩酸水溶液でｐＨ７．０に調整した後、中性プロテアーゼ（スミチームＦＰ、新日本化学工業社製）２０００ユニットを添加し、４０℃で６時間加水分解処理を行った。
次いで、９０℃で１５分間加熱することでプロテアーゼの失活処理を行い、ろ過により不溶物を除去した後、スプレードライで乾燥させ、卵白ペプチドを得た。得られた卵白ペプチドの硫黄臭を評価したところ、硫黄臭はほとんど低減されておらず、皮膚新生コラーゲン増加剤としては適していなかった。
また、得られた卵白ペプチドは分解度が１３．４、平均分子量が８００、硫化水素量が３．０ｐｐｍ、かつアミノ酸スコアが１００であった。
【００５３】
［実施例１］
配合表１に記載された配合に基づいて、実施例１の皮膚新生コラーゲン増加剤を製造した。すなわち、ロッキングミキサーにコラーゲンペプチド（商品名「イクオスＨＤＬ−３０ＤＲ」。新田ゼラチン（株）製。平均分子量３０００）、上記調整例１で得られた卵白ペプチドを投入し、均一になるまで攪拌混合し、皮膚新生コラーゲン増加剤を得た。その後、アルミパウチ容器に５００ｇ充填、密封した。
【００５４】
［配合表１］
コラーゲンペプチド                                    ８４％
調整例１の卵白ペプチド                                １６％
合計                                                １００％
【００５５】
［試験例１］
皮膚新生コラーゲン増加効果を確認するため、ラットに本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を含む飼料を投与し、飼育し、皮膚新生コラーゲン量が増加しているか調べた。
【００５６】
試験飼料
・陰性対照：タンパク質不足食
ＡＩＮ−７６組成粉末飼料のカゼイン１／４量（５％）を配合したもの。
タンパク質配合割合５％
・被験物質１：コラーゲンペプチド添加食
陰性対照にコラーゲンペプチド（平均分子量３０００）５％を追加したもの。
タンパク質配合割合１０％
・被験物質２：実施例１添加食
陰性対照に実施例１の皮膚新生コラーゲン増加剤（５％）を追加したもの。
タンパク質配合割合１０％
【００５７】
ＳＤラット（雄性。５週齢。日本エスエルシー（株）から入手）を７日間馴化飼育した後、ラットの体重が均一になるように３群にわけ、被験物質１〜３を摂取量が等しくなるように２１日間与えた。２１日目に背部皮膚片を採取し、上述のヒドロキシプロリン改良定量法により、皮膚新生コラーゲン量の測定を行った。
結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2015151378.tif 000002
【００５９】
表１より、タンパク質不足食（陰性対照）とコラーゲンペプチド添加食（被験物質１）を比較すると、ヒドロキシプロリン量に有意差はないことが理解できる。
しかし、コラーゲンペプチド添加食（被験物質１）と皮膚新生コラーゲン増加剤添加食（被験物質２）を比較すると、被験物質に含まれるタンパク質の配合が同割合であるにも関わらず、
皮膚新生コラーゲン増加剤添加食（被験物質２）ではコラーゲンペプチドのみに比べヒドロキシプロリン量を増加させることが理解できる。
【００６０】
［試験例２］
試験例１において、皮膚タンパク質量及び皮膚の水分量についても調べたところ、
タンパク質不足食（陰性対照）では、皮膚タンパク質量３３．１ｍｇ/ｃｍ２、皮膚の水分量０．３１ｇであった。
コラーゲンペプチド添加食（被験物質１）では、皮膚タンパク質量３７．１ｍｇ/ｃｍ２、皮膚の水分量０．３６ｇであった。
皮膚新生コラーゲン増加剤添加食で（被験物質２）では、皮膚タンパク質量４０．０ｍｇ/ｃｍ２、皮膚の水分量０．３８ｇであった。
なお、皮膚タンパク質量は、デュマ法による燃焼窒素分析により算出し、皮膚の水分量は、皮膚の湿重量から乾燥質量を差し引いて、求めた。
【００６１】
３つの試験群の中で、皮膚新生コラーゲン増加剤添加食（被験物質２）が皮膚タンパク質量、皮膚の水分量ともに最も高いことが理解できる。
したがって、本発明の皮膚新生コラーゲン増加剤を摂取すると、皮膚新生コラーゲンが増加した結果、皮膚タンパク質量及び皮膚の水分量が増加したことが考えられ、肌のしわ・たるみの改善に寄与している可能性がある。
【００６２】
［実施例２］
配合表２に記載された配合に基づいて、実施例２のソフトカプセルを製した。すなわち、一錠が３００ｍｇとなるように、下記の配合を内容物に、ゼラチンを被包剤として、ソフトカプセル充填機により実施例２のソフトカプセルを製した。
【００６３】
［配合表２］
実施例１の皮膚新生コラーゲン増加剤                                  ３０％
オリーブ油                                                          ４０％
ミツロウ                                                            １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド                                            １０％
乳化剤                                                              １０％
合計                                                              １００％
【００６４】
［実施例３］
配合表３に記載された配合に基づいて、実施例３の散剤（顆粒剤）を製した。すなわち、下記の配合を流動層造粒機にて水と共に噴霧して実施例３の散剤を製した。
【００６５】
［配合表３］
実施例１の皮膚新生コラーゲン増加剤                      １０％
乳糖                                                    ６０％
トウモロコシデンプン                                    ２５％
ヒプロメロース                                            ５％
合計                                                  １００％
【００６６】
［実施例４］
配合表４に記載された配合に基づいて、実施例４の錠剤を製した。すなわち、下記の配合を流動層造粒機にて水と共に噴霧して乾燥させた後、打錠機にて打錠して実施例４の錠剤を製した。
【００６７】
［配合表４］
実施例１の皮膚新生コラーゲン増加剤                      ２５％
乳糖                                                    ２４％
結晶セルロース                                          ２０％
トウモロコシデンプン                                    １５％
デキストリン                                            １０％
乳化剤                                                    ５％
二酸化ケイ素                                              １％
合計                                                  １００％
【図１】
2015151378.tif 000003