(57)【要約】【課題】  生理活性を有するヒトオメンチン-1の部分ペプチド、及び当該ペプチドを有効成分とする医薬を提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物及び該ペプチドを有効成分として含む心臓疾患治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるヒトオメンチン−１のアミノ酸配列の部分ペプチドであって、アミノ酸１４８から１５１のうちの１つで始まり、アミノ酸１６１から１６５のうちの１つで終わる部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項２】
部分ペプチドが、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。（ａ） Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号２）
（ｂ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn（配列番号３）
（ｃ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号４）
【請求項３】
部分ペプチドの誘導体が、下記（ｄ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の部分ペプチドの誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（ｄ） Cys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号５）
（ｅ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp-NH2（配列番号６）
（ｆ） Ac-Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号７）
（ｇ） Cys Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号８）
（ｈ） Cys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn Cys（配列番号９）
ここで、Ac-Trpは、Ｎ−アセチルトリプトファンを示す。
【請求項４】
部分ペプチドの誘導体が、配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸１４８から１５１のうちの１つで始まり、アミノ酸１６１から１６５のうちの１つで終わるポリペプチドのＮ末端とＣ末端の両方にシステインを付加してなるアミノ酸配列からなり、前記Ｎ末端とＣ末端に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合により形成される環状構造を有する、請求項１に記載の部分ペプチドの誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項５】
部分ペプチドの誘導体が、下式（１）〜（３）のいずれか：
【化１】
2015151386.tif 000005
で示される環状ペプチドである、請求項４に記載の部分ペプチドの誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を含有する医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とするアポトーシス抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする心臓疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項９】
心臓疾患が、心筋梗塞又は心臓肥大である請求項８に記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な生理活性ペプチド又はその誘導体に関する。また、本発明は、この生理活性ペプチドを有効成分とする医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における心疾患による死亡数は年間約２０万人であり、脳梗塞や脳出血などの脳血管疾患による死亡数の約１２万人を加えた、いわゆる循環器病による年間死亡数は約３２万人に上り、癌による年間死亡数の約３６万人に匹敵する（非特許文献１）。国民医療費でみても、循環器病は癌の２倍近くになり、寝たきり介護を受けている人の約４５％が循環器病患者であると言われている。急性心筋梗塞だけに限っても、その発症数は年間約１５万人と推定され、その内の約３０％が死に至っている。また、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心疾患の継続的な医療を受けている患者数は約９０万人と推定される。これらの心疾患において、心臓カテーテル治療が効果を上げているが、治療効果が得られないケースも度々見受けられる。発症から６時間以上経過した症例や肥満症、糖尿病の患者においては、特に心筋梗塞サイズの縮小が見込めないため、予後不良の経過をたどるケースも多い。従って、現行の心臓カテーテル治療に加え、補助的な治療としての薬剤の開発が望まれている。そして、このような薬剤の開発にあたっては、心筋梗塞発症時における心筋細胞死のメカニズムを十分に考慮することが必要である。従来、急性心筋梗塞における心筋細胞死は、ネクローシスのみならず一部アポトーシスを介する可能性が報告されており、さらに心筋梗塞慢性期におけるアポトーシスによる残存心筋細胞の脱落が、心室リモデリングや心不全の増悪に関与している可能性も示唆されている。よって、心筋アポトーシスを阻害する薬剤は、心臓カテーテルによる治療効果の増大に大きく貢献すると期待される。
【０００３】
一方、近年、脂肪組織が単にエネルギー貯蔵器官としてだけでなく、肥満に関連した疾患の病因に直接又は間接的に影響を及ぼす、アディポカイン又はアディポサイトカインと呼ばれる生理活性物質を産生する分泌組織としても機能していることを示唆する証拠が蓄積している（非特許文献２）。オメンチン−１（インテレクチン−１とも呼ばれる）は、ヒト内臓脂肪組織中に多く存在するアディポサイトカインのひとつであるが（非特許文献３、４）、ヒトの血流中にも検出され（１００〜８００ｎｇ/ｍｌ）、肥満患者において低下していることが明らかとなっている（非特許文献５、６）。さらに、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、内皮機能障害、頸動脈アテローム性動脈硬化症や冠状動脈疾患を含む肥満に関連した疾病において血中オメンチンレベルが抑制されていることから（非特許文献７〜１１）、代謝性疾患のリスク因子の新たなバイオマーカーとなる可能性も指摘されている（非特許文献１２）。オメンチン−１を脂肪細胞に添加するとブドウ糖の取り込みが増強されることや、単離された血管において血管拡張が促進されること、さらに培養内皮細胞においてオメンチン−１がサイトカイン刺激による炎症を抑制することが報告されている（非特許文献３、１３、１４）。また、オメンチン−１は内皮細胞の機能を刺激し、内皮ＮＯ合成酵素依存的な機序を介した虚血誘導性再血管化を促進することも明らかとなってきている（非特許文献１５）。
【０００４】
さらに、オメンチンの医薬用途への応用について、特許文献１においてオメンチン及びその部分ペプチドが、肥満、炎症、アテローム、心血管疾患及び代謝疾患（糖尿病、高脂血症、高血圧、高血糖及び前糖尿病）の治療薬となることが開示されている。そして、前記文献には、前記部分ペプチドの好ましい具体例として、４つの配列が記載されている。
【０００５】
しかしながら、オメンチンそれ自体は、３１３個のアミノ酸からなる巨大なタンパク質であり、製剤化にあたり様々な制約があることから、実用化が困難である。また、特許文
献１は、オメンチン−１自体のグルコース輸送増強作用等の生物活性データは示しているものの、上記部分ペプチドの作用を示すデータついてはなんら開示していない。さらに、当該部分ペプチドのアミノ酸配列から、どのような生物学的作用を有するかを予測することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０４２８２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】平成２４年(２０１２) 人口動態統計の年間推計 厚生労働省
【非特許文献２】Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., and Walsh, K., Nat. Rev. Immunol., 11, 85-97 (2011)
【非特許文献３】Yang, R. Z., Lee, M. J., Hu, H., Pray, J., Wu, H. B., Hansen, B. C., Shuldiner,A. R., Fried, S. K., McLenithan, J. C., and Gong, D. W., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 290, E1253-1261 (2006)
【非特許文献４】Tsuji, S., Uehori, J., Matsumoto, M., Suzuki, Y., Matsuhisa, A., Toyoshima, K., and Seya, T., J. Biol. Chem., 276, 23456-23463 (2001)
【非特許文献５】de Souza Batista, C. M., Yang, R. Z., Lee, M. J., Glynn, N. M., Yu, D. Z., Pray, J., Ndubuizu, K., Patil, S., Schwartz, A., Kligman, M., Fried, S. K., Gong, D. W., Shuldiner, A. R., Pollin, T. I., and McLenithan, J. C., Diabetes 56, 1655-1661 (2007)
【非特許文献６】Shibata, R., Takahashi, R., Kataoka, Y., Ohashi, K., Ikeda, N., Kihara, S., Murohara, T., and Ouchi, N., Hypertens. Res.. 34, 1309-1312 (2011)
【非特許文献７】Pan, H. Y., Guo, L., and Li, Q., Diabetes Res. Clin. Pract. 88, 29-33 (2010)
【非特許文献８】Moreno-Navarrete, J. M., Ortega, F., Castro, A., Sabater, M., Ricart, W., and Fernandez-Real, J. M., Obesity 19, 1552-559 (2011)
【非特許文献９】Liu, R., Wang, X., and Bu, P., Diabetes Res. Clin. Pract. 93, 21-25 (2011)
【非特許文献１０】Zhong, X., Zhang, H. Y., Tan, H., Zhou, Y., Liu, F. L., Chen, F. Q., and Shang, D. Y., Acta. Pharmacol. Sin. 32, 873-878 (2011)
【非特許文献１１】Yamawaki, H., Tsubaki, N., Mukohda, M., Okada, M., and Hara, Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 668-672 (2010)
【非特許文献１２】Shibata, R., Ouchi, N., Takahashi, R., Terakura, Y., Ohashi, K., Ikeda, N., Higuchi, A., Terasaki, H., Kihara, S., and Hara, Y., Diabetol. Metab. Syndr. 4, 37-40 (2012)
【非特許文献１３】Yamawaki, H., Kuramoto, J., Kameshima, S., Usui, T., Okada, M., and Hara, Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 339-343 (2011)
【非特許文献１４】Shibata, R., Ouchi, N., Kihara, S., Sato, K., Funahashi, T., and Walsh, K., J. Biol. Chem. 279, 28670-28674 (2004)
【非特許文献１５】Maruyama S, Shibata R, Kikuchi R, Izumiya Y, Rokutanda T, Araki S, Kataoka Y, Ohashi K, Daida H, Kihara S, Ogawa H, Murohara T, and Ouchi N., J. Biol. Chem. 287, 408-417 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アポトーシス抑制作用を有するペプチドを有効成分として含む心臓疾患治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、オメンチン−１の心血管疾患、特に心筋梗塞に対する作用を明らかにするために鋭意検討した結果、オメンチン−１がアポトーシス抑制作用を有すること、当該作用は、オメンチン−１の１４８付近のアミノ酸から１６５付近のアミノ酸からなる部分ペプチドにおいても同様に認められること、さらには、前記部分ペプチドを環状化することにより、当該作用が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の発明に関する。
［１］配列番号１で表されるヒトオメンチン−１のアミノ酸配列の部分ペプチドであって、アミノ酸１４８から１５１のうちの１つで始まり、アミノ酸１６１から１６５のうちの１つで終わる部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［２］部分ペプチドが、下記（ａ）〜(ｃ)のいずれかのアミノ酸配列からなる、前記［１］に記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（ａ） Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号２）
（ｂ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn（配列番号３）
（ｃ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号４）
［３］部分ペプチドの誘導体が、下記（ｄ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、前記［１］に記載の部分ペプチドの誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
（ｄ） Cys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号５）
（ｅ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp-NH2（配列番号６）
（ｆ） Ac-Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号７）
（ｇ） Cys Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号８）
（ｈ） Cys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn Cys（配列番号９）
ここで、Ac-Trpは、Ｎ−アセチルトリプトファンを示す。
［４］部分ペプチドの誘導体が、配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸１４８から１５１のうちの１つで始まり、アミノ酸１６１から１６５のうちの１つで終わるポリペプチドのＮ末端とＣ末端の両方にシステインを付加してなるアミノ酸配列からなり、前記Ｎ末端とＣ末端に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合により形成される環状構造を有する、前記［１］に記載の部分ペプチドの誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［５］部分ペプチドの誘導体が、下式（１）〜（３）のいずれか：
【化１】
2015151386.tif 000002
で示される環状ペプチドである、前記［４］に記載の部分ペプチドの誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を含有する医薬組成物。
［７］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とするアポトーシス抑制剤。
［８］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする心臓疾患の予防及び／又は治療剤。
［９］心臓疾患が、心筋梗塞又は心臓肥大である前記［８］記載の予防及び／又は治療剤。
［１０］アポトーシスを抑制するのに十分な量の前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を細胞と接触させる工程を含む、アポトーシスを抑制する方法。
［１１］有効量の前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を、必要とする患者に投与する工程を含む、心臓疾患の予防及び／又は治療方法。
［１２］心臓疾患が、心筋梗塞又は心臓肥大である前記［１１］記載の方法。
［１３］アポトーシスを抑制する剤を製造するための、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物の使用。
［１４］心臓疾患を予防及び／又は治療するための医薬を製造するための、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物の使用。
［１５］心臓疾患が、心筋梗塞又は心臓肥大である前記［１４］記載の使用。
［１６］アポトーシスを抑制するための、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［１７］心臓疾患を予防及び／又は治療するための、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
［１８］心臓疾患が、心筋梗塞又は心臓肥大である、前記［１］〜［５］のいずれかに記
載の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のヒトオメンチン−１の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物は優れたアポトーシス抑制作用を有し、新たな心臓疾患治療剤として応用可能なものである。またこの応用は、心筋梗塞、心肥大、狭心症などの心臓疾患に留まらず、脳梗塞、動脈硬化、さらには肥満症、糖尿病、高血圧、高脂血症などのいわゆる生活習慣病や悪性腫瘍など幅広い疾患に応用されることが期待される。本発明により、オメンチン-１の生物活性をより効果的に発揮できる医薬をより簡便、安価に提供することができ、また製品の品質管理を容易にすることができることから、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は各部分ペプチド及びその誘導体によるラット初代培養心筋細胞の低酸素誘導性アポトーシスに対する作用について測定した結果を示す図である。
【図２】図２は式（１）の環状ペプチドによるマウス心筋虚血再灌流障害モデルにおける心筋梗塞巣の減少についてＡＡＲ／ＬＶ（虚血領域／左室領域）、ＩＡ／ＡＡＲ（梗塞領域／虚血領域）、ＩＡ／ＬＶ（梗塞領域／左室領域）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で使用される。以下に本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１４】
「オメンチン」とは、内臓脂肪のひとつである大網脂肪細胞組織（omental fat）のｃＤＮＡ解析から発見された３１３個のアミノ酸配列（４０ｋＤａ）からなるアディポサイトカインで、別の組織から発見されたインテレクチン−１（Intelectin-1）、ラクトフェリン受容体（Intestinal lactoferrin receptor）、内皮レクチンＨＬ−１（endotherial
lectin HL-1）などと同一のポリペプチドである。内臓脂肪の間質血管細胞で合成され、大網脂肪組織から分泌される。Ｎ末端に疎水性のシグナル配列を持ち、分泌タンパクは２９６アミノ酸（３３ｋＤａ）である。マウスでは、胚発生時に小腸上皮、胃、腎臓、卵巣、脳等に普遍的に発現することが報告されており、また成体では、腸管の他に心筋での発現が報告されている。一方、ヒト、サルでは皮下脂肪よりも内臓脂肪組織に多く発現し、皮下脂肪では殆ど検出されない。他に肺、小腸、大腸、心臓、胸腺に発現している。ヒト血清中のオメンチンは３量体構造をとっている。
【００１５】
「アポトーシス」とは、細胞死の制御の重要な生理機構（プログラム細胞死）で、形態学的には核クロマチンの凝集と細胞萎縮が起こり、いくつかの断片に分解された後、周囲の貪食能を持つ細胞や局所に隣接した貪食細胞に取り込まれて消去される。一般にこの過程は炎症反応を伴わない。ほとんどあらゆる種類の心臓疾患の原因あるいは進行にアポトーシスが深くかかわっていることが過去の報告（例えば、Gottlieb RA, et al., J Clin. Invest., 94, 1621-1628(1994)、Narula J, et al., N. Engl. J. Med., 335, 1182-1189(1996)等）から示唆されている。ＤＮＡの断片化、クロマチンの凝集、アポトーシス関連因子等を測定することで、アポトーシスを検出することができ、例えば後述する実験例１や実験例２の方法で測定することができる。
【００１６】
「心臓疾患」としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、不整脈、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、弁膜症などを挙げることができる。
【００１７】
「オメンチン−１の部分ペプチド」とは、オメンチン−１の全長配列から切り出された部分配列を意味し、本明細書では特に、オメンチン−１の１４８位のGly（グリシン）か
ら１６５位のCys（システイン）までの１８アミノ酸配列及びこの１８アミノ酸からさらに任意に切り出された部分配列を意味する。より好ましくは、本発明の部分ペプチドには、下記（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸配列：
（ａ) Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号２）
（ｂ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn（配列番号３）
（ｃ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号４）
からなるペプチドが包含される。
【００１８】
「部分ペプチドの誘導体」とは、実質的に本発明のポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性、すなわちアポトーシス抑制作用を有するポリペプチドを意味する。該ポリペプチドの誘導体のＮ末端をアセチル基等のアシル基やその他の修飾基で修飾した修飾ポリペプチド、該ポリペプチドの誘導体のＣ末端のカルボキシル基をカルボキシレート、アミド又はエステル等に変換したポリペプチド、該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸を付加したポリペプチドやＮ末端及びＣ末端にシステインを導入してＳ−Ｓ結合で環化した環状化ポリペプチドも本発明に包含される。さらに、血中半減期の延長を狙ってＰＥＧ化されたポリペプチドや、糖鎖が付加されたポリペプチドも本発明に包含される。より好ましくは、本発明の部分ペプチドの誘導体には、下記（ｄ）〜（ｈ）のアミノ酸配列：
（ｄ） Cys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号５）
（ｅ） Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp-NH2（配列番号６）
（ｆ） Ac-Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号７）
（ｇ） Cys Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号８）
（ｈ） Cys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn Cys（配列番号９）
（ここで、Ac-Trpは、Ｎ−アセチルトリプトファンを示す）
からなるペプチドが包含される。中でも、配列番号５のアミノ酸配列からなるものが好ましい。
【００１９】
また、本発明の部分ペプチドは、環化することにより活性が飛躍的に向上する。したがって、例えば、本発明の部分ペプチドとのＮ末端とＣ末端の両方にシステインを付加し、該システイン残基間にジスルフィド結合を形成して環化したものを使用することが好ましい。このような環状ペプチドとして、下式（１）〜（３）で表わされるものが挙げられる。
【化２】
2015151386.tif 000003
【００２０】
「製薬上許容される塩」としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩、又は酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩等が用いられる。
【００２１】
「溶媒和物」としては、本発明のペプチドに対し、任意の数の溶媒分子と配位していてもよい。好ましくは水和物が挙げられる。
【００２２】
「医薬組成物」とは、少なくとも、本発明のポリペプチド、その製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物を含有していればよい。
【００２３】
「予防及び／又は治療」とは、前述の医薬組成物を投与することにより特定疾患、例えば、心筋梗塞、心肥大、心不全等の心臓疾患の発症を予防するか又は発症した心臓疾患を治療すること、及びその両方を行うことを意味する。
【００２４】
本発明の部分ペプチドの製造方法については特に制限なく、そのアミノ酸配列を基に公知のペプチド合成法に従って製造することができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。例えば固相合成法では、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等のペプチド化合物を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチド化合物を製造することができる。固相合成法のために、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）等のペプチド合成機器が市販されている。固相合成法において用いるレジンについては特に制限なく、例えばＲｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＡＭ  Ｒｅｓｉｎ、Ｆｍｏｃ−ＡＡ−Ｗａｎｇ  Ｒｅｓｉｎ、ＡＡ−２−Ｃｌ−Ｔｒｔ  Ｒｅｓｉｎを用いることができる。また、液相合成法の場合は、Ｎ−保護アミノ酸誘導体を一残基ずつ段階的に縮合していく方法でペプチド化合物
を製造することができる。保護基の有無などによってジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）法、活性エステル法、混合酸無水物法等が使用できる。また、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）試薬、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の縮合剤を用いる方法によっても、目的とするペプチド化合物を製造することができる。
【００２５】
本発明の部分ペプチドの誘導体の製造方法については特に制限なく、当該技術分野で通常用いられている方法により製造することができる。例えば、ペプチドのアミノ基に対する無水酢酸又はアセチルクロリドとのアシル化反応や、ペプチドのカルボキシル基に対するアンモニアによるアミド化反応等により誘導体を製造することができる。また、ポリペプチドの構成アミノ酸であるシステインの保護基を除去した後、空気酸化やヨウ素酸化といった手法を用いることで、ジスルフィド結合をもつ環状化ペプチドを製造することもできる。
【００２６】
また、本発明ペプチドのアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法により、本発明の部分ペプチドを製造することもできる。
【００２７】
製造した本発明ペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの組合せ等の処理操作が挙げられる。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、前記オメンチン−１の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物が含有されていればよい。例えば本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドのみから構成されてもよく、また、本発明の部分ペプチド、その誘導体、それらの製薬上許容される塩又はそれらの溶媒和物及び医薬担体からなる組成物の形態であってもよい。用いることができる医薬担体は特に制限されず、製薬上許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、溶解補助剤等を用いることができる。
【００２９】
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軟質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどが挙げられる。
【００３０】
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００３１】
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ、ポリエチレングリコール６０００などが挙げられる。
【００３２】
着色剤の好適な例としては、食用赤色２号及び３号、食用黄色４号及び５号、食用青色１号及び２号などの食用色素等の水溶性着色タール色素、それらのアルミニウム塩である不溶性レーキ色素、β-カロチン、クロロフィル、ベンガラ等の天然色素などが挙げられる。
【００３３】
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、軟質無水ケイ酸、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
【００３４】
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
【００３５】
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、キシリトール、果糖などが挙げられる。
【００３６】
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３７】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口製剤、注射剤又は経皮製剤などで投与可能である。経口製剤としては、錠剤（舌下錠、口腔内崩壊剤を含む）、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。また、注射剤としては、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、脊髄腔内注射、硬膜外注射、局所注射などが挙げられる。また、経皮製剤としては、貼付剤、軟膏剤、散布剤などが挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤又は徐放性製剤などの放出制御製剤（徐放性マイクロカプセルを含む）であってもよい。
【００３８】
経口製剤を製造する場合は、活性成分に、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤又は滑沢剤などを添加して圧縮形成することにより製造される。さらに、味のマスキング、腸溶化あるいは徐放化を目的として、自体公知の方法により、経口製剤にコーティングを行ってもよい。また、注射剤を製造する場合は、活性成分を分散剤、保存剤、等張化剤などと共に、水性溶剤あるいは油性溶剤などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、必要に応じて溶解補助剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、無痛化剤、防腐剤等の添加剤を用いてもよい。さらに、経皮製剤を製造する場合は、活性成分を固状、半固状又は液状の組成物とすることにより製造される。例えば固状の組成物は、活性成分をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造される。半固状の組成物は、水性又は油性のゲル剤あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調整剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、静脈内投与の場合、成人一人当たり約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇを一日一回ないし数回投与し、より好ましくは、注射剤により、成人一人当たり１ｍｇ〜３００ｍｇを一日１〜３回投与する。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例は例示のために
提供されたものであり、本発明の実施形態を限定するものではない。
＜製造例１＞オメンチン−１の各種部分ペプチドの製造
特表２００５−５３８９６１号公報の実施例１に記載の方法と同様にして、下記実施例１〜３及び比較例１〜４のペプチドを固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により製造した。各実施例及び比較例の部分ペプチドの製造においては、カップリング試薬として１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／ＨＯＢｔを使用した。また、各々の段階の脱保護反応及びペプチド鎖の伸長反応の終了は、ニンヒドリン試験により確認した。
【００４１】
各実施例及び比較例で製造した部分ペプチドの検定は、高速液体クロマトグラフィー（条件については各実施例及び比較例に詳述）による純度の算出と分子量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により行った。その結果、各実施例及び比較例で製造した部分ペプチドの純度はいずれも９５％以上であり、分子量分析の結果も理論値とよく一致した。これらの結果から、各部分ペプチドが正しく製造されたことが確認された。
【００４２】
［実施例１］  Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号２、又はＧＷ−１４）
・ＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、２８％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１１．３分（純度：９５．５％）
・ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７１７．２（理論値：１７１７．０）
【００４３】
［実施例２］  Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn（配列番号３、又はＷＮ−１４）
・ＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、１５％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１３．２分（純度：９５．３％）
・ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８１６．７（理論値：１８１７．１）
【００４４】
［実施例３］  Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号４、又はＷＷ−１２）
ＨＰＬＣ［カラム：ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８−５（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、１５％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：８．１分（純度：９６．５％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５４７．１（理論値：１５４６．８）
【００４５】
［比較例１］  Ala Lys Asp Leu Gly Ile Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro（配列番号１３、又はＡＰ−１４）
ＨＰＬＣ［カラム：ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８−５（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、１６％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１７．１分（純度：９７．６％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５６２．０（理論値：１５６１．８）
【００４６】
［比較例２］  Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn Ser Ser Leu Leu Arg Tyr（配列番号１４、又はＳＹ−１４）
ＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、２５％Ｂ  ２５分；流
速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：８．５分（純度：９５．４％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７７５．５（理論値：１７７５．０）
【００４７】
［比較例３］  Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn Ser Ser Leu Leu（配列番号１５、又はＮＬ−１４）
ＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、２５％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：９．１分（純度：９７．７％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１６９８．５（理論値：１６９８．０）
【００４８】
［比較例４］  Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Arg Asn Ser Ser Cys（配列番号１６、又はＶＳ−１４：特許文献１記載の部分ペプチド）
ＨＰＬＣ［カラム：ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８−５（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、２８％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１１．３分（純度：９５．９％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７７１．２（理論値：１７７１．０）
【００４９】
＜製造例２＞オメンチン−１の各種部分ペプチド誘導体の製造
以下に詳述する方法によって、実施例４〜６の部分ペプチド誘導体を製造した。
また、各実施例で製造した部分ペプチド誘導体の検定は、高速液体クロマトグラフィー（条件については各実施例に詳述）による純度の算出と分子量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により行った。その結果、各実施例で製造した部分ペプチド誘導体の純度はいずれも９５％以上であり、分子量分析の結果も理論値とよく一致した。これらの結果から、各部分ペプチド誘導体が正しく製造されたことが確認された。
【００５０】
［実施例４］  Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp-NH2（配列番号６、又はＷＷＮ−１２）
固相合成に使用するレジンとしてメチルベンズヒドリルアミンレジン（ＭＢＨＡレジン）を使用し、さらにカップリング試薬として１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／ＨＯＢｔを使用し、特表２００５−５３８９６１号公報の実施例１６に記載の方法と同様にして、目的のペプチド誘導体を得た。
ＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、１５％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１４．２分（純度：９５．５％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５４５．１（理論値：１５４５．８）
【００５１】
［実施例５］  Ac-Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp（配列番号７、又はＡＷＷ−１２）
製造例１の実施例３に記載の方法に従って製造したＷＷ−１２を無水酢酸中で撹拌し、目的のペプチド誘導体を得た。
ＨＰＬＣ［カラム：Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、２０％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１２．１分（純度：９５．５％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５８９．２（理論値：１５８８．８）
【００５２】
［実施例６］
【化３】
2015151386.tif 000004
【００５３】
製造例１記載の方法と同様の方法でCys Trp His Val Pro Asn Lys Ser Pro Met Gln His Trp Cys（配列番号５）を製造した。製造した前記ペプチドを水に溶解して０．１％水溶液とし、弱塩基性条件下、Ｈ2Ｏ2存在下、３０分間攪拌し、目的のペプチド誘導体を得た。
ＨＰＬＣ［カラム：ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８−５（２５０  Ｘ  ４．６  ｍｍ）；溶媒系Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ）、Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ）、１２％Ｂ  ２５分；流速：１ｍＬ／分；検出２２０ｎｍのＵＶ］
保持時間：１１．５分（純度：９６．８％）
ＭＳ（ｍ／ｚ）：１７５１．１（理論値  １７５１．１）
【００５４】
＜実験例１＞ラット心筋細胞の低酸素刺激アポトーシス誘導実験
新生仔ラットより心筋細胞を採取し、９６穴プレートの各穴に一穴あたり５×１０4細胞ずつ播き込み、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（終濃度１０μＭ）を加えたダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２培地（シグマ−アルドリッチ社製）にて２４時間培養後、ＦＣＳ及びＢｒｄＵを除いた同培地に置換し、１６時間培養した。オメンチン−１組換えタンパク質（Enzo Life Sciences社製）又は製造例１、２で合成した各部分ペプチド又はその誘導体（１５０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、低酸素条件下で１２時間培養後、さらに通常大気条件下にて２４時間培養し、ＤＮＡ断片化をＥＬＩＳＡ（ロッシュ・ダイアグノシス社製）により測定して、アポトーシス抑制作用を評価した。低酸素刺激は、細胞を播種したプレートをアネロパック・ケンキ５％（三菱ガス化学社製）に入れ、３７℃、ＣＯ2インキュベーター内に静置して行った。
【００５５】
オメンチン−１、実施例１、２、６又は比較例１〜４で合成した各部分ペプチド又はその誘導体を添加したときの評価結果を図１に示す。比較例１〜３（ＡＰ−１４、ＳＹ−１４、ＮＬ−１４）の部分ペプチドを予め添加した細胞ではアポトーシスの抑制は認められなかったのに対し、オメンチン−１又は実施例１、２の部分ペプチド（ＧＷ−１４、ＷＮ−１４）あるいは比較例４の部分ペプチド（ＶＳ−１４）を予め添加した細胞ではアポトーシスの抑制が認められた。抑制の程度は、実施例１、２の部分ペプチド（ＧＷ−１４、ＷＮ−１４）及び比較例４の部分ペプチド（ＶＳ−１４）でオメンチン−１と同等であり、実施例６の環状ペプチド（ＣＷＷＣ）では顕著であった。
また、実施例３〜５で合成した各部分ペプチド又はその誘導体についても、実施例１、２で合成した各部分ペプチドと同等のアポトーシスの抑制が認められた。
【００５６】
＜実験例２＞マウス心筋虚血再灌流障害モデル
Ｃ５７ＢＩ／６Ｊマウスの冠動脈の左前下行枝を結紮し、心筋梗塞モデルを作製した（例えば、Circulation., 126(14), 1728-38 (2012)）。ペントバルビタールを腹腔内投与（５０ｍｇ／ｋｇ）して麻酔したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、８〜１０週齢）に挿管後、左前下行枝冠状動脈をｓｎａｒｅ ｏｃｃｌｕｄｅｒを使って、６０分間縫合結紮し、その後緩め、実施例６の環状ペプチド（ＣＷＷＣ、１５０μｇ／匹）を右頚静脈より投与した。再灌流の２４時間後、再結紮し、非虚血性組織を決定するためにエバンスブルー
をマウスに全身投与した。屠殺後、心臓を取り出し、トリフェニルテトラゾリウムクロライドで処理し、梗塞巣を決定した。左心室（ＬＶ）領域、危険（ＡＡＲ）領域及び梗塞部域（ＩＡ）をＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトを用いた平面面積測定によって評価した。心筋梗塞の指標として、ＩＡ／ＡＡＲ、ＩＡ／ＬＶ比を求めた。
結果を図２に示す。実施例６の環状ペプチド（ＣＷＷＣ）を投与することにより、対照群に比し、虚血領域に対する梗塞発生の割合が有意に減少した。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により抗アポトーシス活性を有する新規な生理活性ペプチドが提供される。本発明ペプチドは、ヒトオメンチン−１の部分ペプチド及びその誘導体であり、オメンチン−１に比して顕著な抗アポトーシス活性を示すことから、心臓疾患治療剤の有効成分として極めて有用であり、産業上の利用可能性を有している。
【図１】
2015151386.tif 000006
【図２】
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【配列表】
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