(57)【要約】【課題】本発明は、細胞シートを回収する際に収縮率を制御し、回収される細胞シートのサイズを制御するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、細胞シートを回収する方法であって、ａ）３つ以上の挿入部を備える回収器具を準備する工程、ｂ）細胞培養基材の表面に接着しており、その外周部分から内側に向かって延びるカット部を３つ以上有する細胞シートを準備する工程、およびｃ）細胞シートの外周部分から内側に向かって延びる３つ以上のカット部に、回収器具の３つ以上の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入された状態で、細胞シートを細胞培養基材から剥離する工程を含み、工程ｃ）における細胞シートの上面視で、カット部に挿入された３つ以上の挿入部のうち少なくとも１つは同一直線上に存在しない、前記方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞シートを回収する方法であって、
ａ）３つ以上の挿入部を備える回収器具を準備する工程、
ｂ）細胞培養基材の表面に接着しており、その外周部分から内側に向かって延びるカット部を３つ以上有する細胞シートを準備する工程、および
ｃ）細胞シートの外周部分から内側に向かって延びる３つ以上のカット部に、回収器具の３つ以上の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入された状態で、細胞シートを細胞培養基材から剥離する工程を含み、
工程ｃ）における細胞シートの上面視で、カット部に挿入された３つ以上の挿入部のうち少なくとも１つは同一直線上に存在しない、
前記方法。
【請求項２】
細胞シートを細胞培養基材から剥離した後、回収器具の挿入部が細胞シートに挿入された状態で、カット部に挿入された挿入部のうち少なくとも１つを他の挿入部に対して相対的に動かすことにより、細胞シートのサイズを変化させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞シートを細胞培養基材から剥離した後、回収器具の挿入部が細胞シートに挿入された状態で、細胞シートの細胞培養基材に接着していた面と反対の面に、ゼラチンゲル層を有するスタンプ型デバイスのゼラチンゲル層を接触させて、細胞シートをゼラチンゲル層に転写する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞シートを回収するための回収器具であって、
細胞シートに挿入するための３つ以上の挿入部を備え、
３つ以上の挿入部の少なくとも１つは同一直線上にない、
前記回収器具。
【請求項５】
３つ以上の挿入部を固定する固定部をさらに備え、
固定部は、少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動可能に構成される、請求項４に記載の回収器具。
【請求項６】
細胞シートを製造するための細胞培養基材であって、
細胞接着領域と、細胞接着領域の外周部分から内側に向かって延びる３つ以上の細胞非接着領域とを有する、
前記細胞培養基材。
【請求項７】
細胞シートを製造するための細胞培養基材と細胞シートを回収するための回収器具とを含むキットであって、
回収器具は、細胞シートに挿入するための３つ以上の挿入部を備え、３つ以上の挿入部は、細胞シート上の同一直線上にない挿入位置に挿入可能に構成され、
細胞培養基材が、細胞接着領域と、細胞接着領域の外周部分から内側に向かって延びる３つ以上の細胞非接着領域とを有し、
３つ以上の細胞非接着領域に、回収器具の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入可能に構成される、
前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞組織利用医薬品に関する分野、たとえば再生医療などの治療分野、創薬分野、診断分野、検査分野などで用いることができる、細胞シートの回収方法、回収器具、細胞培養基材およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から細胞生物学の分野では細胞培養が不可欠である。近年、幹細胞研究や再生医療研究が盛んになるに伴い、ますます細胞培養の技術開発の重要性が高まっている。
【０００３】
細胞をシート状に培養し、トリプシンなどの酵素を使用せずに温度を低下させるだけで細胞をシート状に回収する「細胞シート工学」という技術が再生医療分野で注目されている。その際に使用されるのが、温度応答性ポリマーを結合させた温度応答性培養基材である。特許文献１には、温度応答性ポリマーで基材表面を被覆した細胞培養基材上において、細胞を温度応答性ポリマーの上限臨界溶解温度未満または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度未満にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる方法が記載されている。
【０００４】
細胞シート工学によって得られる細胞シートは角膜や歯周組織などの再生医療で既に一定の治療効果も確認され欧州で既に臨床研究や治験が進められている。また、複数の種類からなる細胞シートを積層することによる三次元組織モデルの作製や血管組織を伴う成熟した組織を生体外で作製することも可能であり今後ますます本技術をベースにした研究や治療が期待される。
【０００５】
このような細胞シートを、目的とする患部（移植部位）に移植するには、例えば、細胞シートの端部をピンセット等で摘んで、細胞シートを包装容器から取り出し、患部まで移送し、その患部に移植（貼付）するといった一連の操作が必要となるが、細胞シートは、絶対的な物理的強度が低く、皺、破れ、破損などが生じ易いことから、この一連の操作には高度な技術が要求され、かつ細心の注意を払う必要がある。また、細胞シートを剥離して回収する際、細胞自身の収縮力により細胞シートが縮むため、細胞シートのサイズが細胞自身の収縮力に依存することとなり、任意に制御することができないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞シートを回収する際に収縮率を制御し、回収される細胞シートのサイズを制御するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、３つ以上のカット部を有する細胞シートと３つ以上の挿入部を有する回収器具を用い、細胞シートのカット部に回収器具の挿入部を挿入した状態で、細胞シートを細胞培養基材から剥離回収することにより、回収された細胞シートの収縮率を制御できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）細胞シートを回収する方法であって、
ａ）３つ以上の挿入部を備える回収器具を準備する工程、
ｂ）細胞培養基材の表面に接着しており、その外周部分から内側に向かって延びるカット部を３つ以上有する細胞シートを準備する工程、および
ｃ）細胞シートの外周部分から内側に向かって延びる３つ以上のカット部に、回収器具の３つ以上の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入された状態で、細胞シートを細胞培養基材から剥離する工程を含み、
工程ｃ）における細胞シートの上面視で、カット部に挿入された３つ以上の挿入部のうち少なくとも１つは同一直線上に存在しない、
前記方法。
（２）細胞シートを細胞培養基材から剥離した後、回収器具の挿入部が細胞シートに挿入された状態で、カット部に挿入された挿入部のうち少なくとも１つを他の挿入部に対して相対的に動かすことにより、細胞シートのサイズを変化させる工程をさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）細胞シートを細胞培養基材から剥離した後、回収器具の挿入部が細胞シートに挿入された状態で、細胞シートの細胞培養基材に接着していた面と反対の面に、ゼラチンゲル層を有するスタンプ型デバイスのゼラチンゲル層を接触させて、細胞シートをゼラチンゲル層に転写する工程をさらに含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）細胞シートを回収するための回収器具であって、
細胞シートに挿入するための３つ以上の挿入部を備え、
３つ以上の挿入部の少なくとも１つは同一直線上にない、
前記回収器具。
（５）３つ以上の挿入部を固定する固定部をさらに備え、
固定部は、少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動可能に構成される、（４）に記載の回収器具。
（６）細胞シートを製造するための細胞培養基材であって、
細胞接着領域と、細胞接着領域の外周部分から内側に向かって延びる３つ以上の細胞非接着領域とを有する、
前記細胞培養基材。
（７）細胞シートを製造するための細胞培養基材と細胞シートを回収するための回収器具とを含むキットであって、
回収器具は、細胞シートに挿入するための３つ以上の挿入部を備え、３つ以上の挿入部は、細胞シート上の同一直線上にない挿入位置に挿入可能に構成され、
細胞培養基材が、細胞接着領域と、細胞接着領域の外周部分から内側に向かって延びる３つ以上の細胞非接着領域とを有し、
３つ以上の細胞非接着領域に、回収器具の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入可能に構成される、
前記キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞シートを回収する際に収縮率を制御し、細胞シートのサイズを制御することが可能になり、細胞シートの積層体を簡便かつ迅速に製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞シート回収方法の一実施形態を上面図で示す概略図である。
【図２】本発明の細胞シート回収方法の一実施形態を断面図で示す概略図である。
【図３】本発明の回収器具の一実施形態の断面図を示す概略図である。
【図４】本発明の回収器具の一実施形態の斜視図を示す概略図である。
【図５】本発明の回収器具と細胞シートの一実施形態の断面図を示す概略図である。
【図６】本発明の回収器具と細胞シートの一実施形態の斜視図を示す概略図である。
【図７】本発明の細胞シートの一実施形態の上面図を示す概略図である。
【図８】発明の細胞シート回収方法の一実施形態を断面図で示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態において、本発明の細胞シートを回収する方法は、図１および図２に示すように、
ａ）３つ以上の挿入部１を備える回収器具２を準備する工程、
ｂ）細胞培養基材３の表面４に接着しており、その外周部分５から内側（以下では、「内側」の好適な例として中心部分６を定義して説明する）に向かって延びるカット部７を３つ以上有する細胞シート８を準備する工程、および
ｃ）細胞シート８の外周部分５から中心部分６に向かって延びる３つ以上のカット部７に、回収器具２の３つ以上の挿入部１がそれぞれ１つ以上挿入された状態で、細胞シート８を細胞培養基材３から剥離する工程を含む。なお、本明細書における細胞シートとは、典型的には細胞が単層で連結したシート状物を指すが、これに限らず、複数層で連結したシート積層物をも含む。
【００１３】
例えば図１に示すような、工程ｃ）における細胞シート８の上面視で、カット部７に挿入された３つ以上の挿入部１のうち少なくとも１つは同一直線上に存在しない。これは、挿入部がすべて同一直線上に存在しないように、細胞シートのカット部に挿入されることを意味する。したがって、細胞シートの剥離後に、３つ以上の挿入部が細胞シートを３点以上で、２次元的に把持することができ、細胞シートのサイズを制御することができる。挿入部のうち少なくとも１つが同一直線上存在しないように挿入される限り、同一直線上に存在するよう挿入される挿入部が３つ以上存在していてもかまわない。
【００１４】
細胞を回収するための回収器具は、３つ以上、好ましくは４つ以上、より好ましくは６つ以上の挿入部を備える。挿入部が多いほど、細胞シートを多くの点で把持することができるため、細胞シートをシート状に維持したまま安定して把持でき、細胞シートの密度をより精密に制御できる点で好ましい。図１および図２は、回収器具が４つの挿入部を備え、細胞シートが４つのカット部を有する場合の実施形態を示すものである。３つ以上の挿入部の少なくとも１つは同一直線上にない。好ましくは３つ以上の挿入部の端部が平面を形成するよう構成される。換言すれば、回収器具の３つ以上の挿入部は、細胞シート上の同一直線上にない挿入位置に挿入可能に構成される。したがって、３つ以上の挿入部が細胞シートを３点以上で、２次元的に把持することができ、細胞シートのサイズを制御することができる。
【００１５】
挿入部の形状は、細胞シートに挿入可能な限り特に制限されないが、好ましくは棒状または突起状である。棒状の場合も、その形状は特に制限されず、円柱状でも四角柱状等の多角柱状でもよい。一実施形態において挿入部は、図３および図４に示すように、端部がカーブした形状でもよい。細胞シートを把持する観点から、３つ以上の挿入部の各端部は、互いに外向きにカーブしていることが好ましい。端部がカーブした形状を有することにより、図５に示すように、細胞シートが細胞培養基材から剥離するときにカーブにそって収縮するため、細胞シートが回収器具から外れるリスクが少ない。すべての挿入部の端部がカーブしていてもよいし、一部の挿入部の端部のみカーブしていてもよい。一部の挿入部の端部のみカーブさせることで、細胞シート剥離後に、細胞シートの収縮率を部位ごとに変化させることができる。また、挿入部の端部は、ヘラ状に形成されていてもよい。これにより、細胞シートが回収器具から外れるリスクをより少なくすることができる。また、挿入部の端部は、細胞シートの損傷のリスクが少ない場合には鉤爪状であってもよい。
【００１６】
一実施形態において回収器具２は、３つ以上の挿入部１が固定された固定部９をさらに備える。固定部の形状は特に制限されないが、例えば、図１および２に示されるように、挿入部の一部を互いに連結して、挿入部の細胞シートへの挿入位置を規定するよう構成される。固定部の形状は、例えば、図１および図４に示すような円形または楕円形のリング状、三角形または四角形などの多角形のリング状、板状、あるいはＣ状などの形状が挙げられる。
【００１７】
一実施形態において固定部は、少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動可能に構成される。少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動させることにより、挿入部に把持された細胞シートを収縮または拡張することでき、細胞シートのサイズを変化させることができる。このような回収器具は、細胞シートに挿入部を挿入する前の段階でも、目的の細胞シートのサイズに合わせることができるため、汎用性が高い。例えば、図６に示すように、挿入部が円形のリング状の固定部に固定されている場合、円形のリングの外周の大きさを変化可能に構成することにより、少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動させることができる。例えば、リング状の固定部を同心円状に径を変化させることにより、固定部に連結された挿入部同士を相対的に移動させてもよい。その結果、挿入部に把持された細胞シートを収縮または拡張することができ、細胞シートのサイズを所望により変化させることができる。図６は、３つの挿入部１が円形のリング状の固定部９に固定されている実施形態である。または、固定部をゴムなどの弾性または柔軟性を有する材料で構成することにより、固定部を変形させることができ、挿入部を相対的に動かすこともできる。少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動させる手段は、上記に限らず、例えば、３つの挿入部が固定部に連結する連結部を頂点とする図形の重心を中心として、各連結部が重心から遠ざかる方向、あるいは重心に近づく方向に固定部をスライドさせ、それによって各挿入部の位置が相対的に変更可能な構成であってもよい。
【００１８】
細胞シート８は、外周部分５から内側、好ましくは中心部分６に向かって延びるカット部７を、３つ以上、好ましくは４つ以上、より好ましくは６つ以上備える。カット部が多いほど、細胞シートを多くの点で把持することができるため、細胞シートをシート状に維持したまま安定して把持できる点で好ましい。図１は、細胞シート８が、外周部分５から中心部分６に向かって延びるカット部７を４つ有する実施形態を示すものである。細胞シートに３つ以上のカット部を設け、回収器具の３つ以上の挿入部をカット部にそれぞれ挿入した状態で、細胞シートを細胞培養基材から剥離すると、細胞シートは中心に向かって収縮するが、細胞シートの収縮は、カット部の端が挿入部に引っかかったところで止まるため、細胞シートのそれ以上の収縮を防止できる。したがって、回収器具の挿入部の挿入位置を調整することにより、剥離後の細胞シートの収縮率や収縮後の形状等を制御することができる。
【００１９】
カット部の形状は、外周部分から中心部分に向かって延びる形状である限り特に制限されない。ここで、細胞シートの中心部分とは、細胞シートの重心をさす。外周部分とは、中心部分より外側であればよいが、中心部分と外縁の真ん中より外側をさす。カット部は、その端が回収器具の挿入部に引っかかるよう、細胞シートの外縁側は閉じている必要がある。外周部分から中心部分に向かって延びる形状は、厳密に細胞シートの中心、すなわち重心に向かう必要はなく、細胞シートが収縮する方向であれば、ある程度のずれがあってもよい。収縮する細胞シートを、カット部に挿入された挿入部によって３次元的に支持する観点から、複数のカット部のうち、少なくとも３つ以上のカット部は、延設方向が、互いに平行でないように形成される。好ましくは、３つ以上のカット部は、図１および図７に示すように、細胞シートの重心を中心として放射状に形成される。例えば外周に沿ったカット部の場合は、カット部の方向と細胞シートが収縮する方向とが異なるため、細胞シートがカット部に沿って収縮しにくく、細胞シートの収縮率を制御することが難しいと考えられる。
【００２０】
カット部は、好ましくは細胞シートの重心と外縁をつなぐ線上にあり、好ましくは重心から２０〜３０％外縁側の位置から始まり、８０〜９０％外縁側の位置で閉じる。あまり内側までカット部を形成しても、そこまで小さい細胞シートを回収する必要性が少ないと考えられる。また、あまり外縁側までカット部を形成すると、細胞シートの外縁で細胞シートが切断されてしまうおそれがある。
【００２１】
細胞シートが円形の場合、カット部は、好ましくは円の中心と円周をつなぐ半径上にあり、好ましくは円の中心から２０〜３０％外縁側の位置から始まり、８０〜９０％外縁側の位置で閉じる。カット部は、幅のないカット部であってもよいし、幅を有するカット部であってもよい。細胞シートは、収縮性と柔軟性を有することから、幅のないカット部にも、回収器具の挿入部を挿入することができる。一実施形態においてカット部は、図１に示すように、楕円形の形状である。一実施形態においてカット部は、図７に示すように、外周部分に近い側が中心に近い側よりも幅が広い形状であることが好ましい。細胞シートは、中心側よりも外周側の方が収縮率が高いため、細胞シートを剥離した後の収縮により、カット部による孔を埋めることができる。図７は、細胞シートが３つのカット部を有する場合の実施形態である。
【００２２】
細胞シートを構成する細胞としては、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞を用いることができる。接着性の細胞で細胞シートを構成することが好ましい。具体的には、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等を用いることができる。細胞は、１種類のみであってもよく、２種類以上用いるものであってもよい。細胞が由来する動物も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。
【００２３】
細胞シートは、細胞培養基材の表面に接着した状態で準備する。したがって、細胞培養基材は、その表面に細胞接着領域を有するものを使用することが好ましい。細胞接着領域を有する細胞培養基材に細胞を播種すると、細胞接着領域に細胞が接着して増殖することにより、細胞培養基材の表面に接着した細胞シートを得ることができる。細胞シートのカット部は、細胞シートが形成された後にカッター等により形成してもよい。あるいは、細胞接着領域と、細胞接着領域の外周部分から中心部分に向かって延びる３つ以上の細胞非接着領域とを有する細胞培養基材に細胞を播種し、細胞接着領域にのみ細胞を接着させて増殖させることにより、その外周部分から中心部分に向かって延びるカット部を３つ以上有する細胞シートを得ることができる。細胞接着領域の外周部分から中心部分に向かって延びる細胞接着領域のうち少なくとも３つは、延設方向が、互いに平行でないように形成される。すなわち、細胞非接着領域が細胞シートのカット部に対応し、目的の細胞シートと同じパターンの、細胞接着領域と細胞非接着領域のパターンを有する細胞培養基材を用いて細胞を培養することにより、目的のパターンを有する細胞シートを得ることができる。
【００２４】
細胞接着性は、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を指標に判断できる。細胞接着性の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本発明における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
【００２５】
一方、細胞非接着性とは、細胞が接着しにくい性質をいう。細胞非接着性は、表面の化学的性質や物理的性質等によって細胞の接着や伸展が起こりにくいか否かで決定される。細胞非接着性の表面は、上記で定義した細胞接着伸展率が６０％未満の表面であることが好ましく、４０％未満の表面であることがより好ましく、５％以下の表面であることが更に好ましく、２％以下の表面であることが最も好ましい。
【００２６】
細胞接着領域として、表面が細胞接着性から細胞非接着性に変化する領域を有する細胞培養基材が好ましく用いられる。そのような細胞培養基材は、基材上に刺激により細胞の接着性が変化する刺激応答性材料層を形成することにより製造できる。刺激応答性材料層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化する、すなわち細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な刺激応答性材料を含む層である。刺激応答性材料としては、温度応答性材料、ｐＨ応答性材料、イオン応答性材料、光応答性材料などを挙げることができる。なかでも温度応答性材料が、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００２７】
温度応答性材料として、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、細胞を剥離する時の温度では細胞非接着性を示す温度応答性ポリマーを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。
【００２８】
本発明に好適に使用できる温度応答性ポリマーとして、具体的にはアクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられ、より具体的にはポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。また、これらのポリマーを形成するためのモノマーが２種以上組み合わされて重合された共重合体であってもよい。
【００２９】
刺激応答性材料層の形成方法としては、特に限定されるものではない。具体的には、刺激応答性材料を含む組成物をスピンコート等の公知の塗布方法を用いて基材上に塗布する。刺激応答性材料のパターンを形成する場合は、フォトリソグラフィー法によりパターニングする方法や、グラビア印刷やフレキソ印刷、スクリーン印刷、インクジェット法などの公知のパターン塗布法を用いてパターン状に塗布する方法を使用できる。貫通孔（スルーホール）を有するメタルマスク等を介して、パターン状に刺激応答性材料層を電子線や紫外線処理することによって作製してもよい。
【００３０】
刺激応答性材料層を形成する基材を構成する材料は特に制限されず、金属、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、ならびに公知または市販のプラスチックを適用できる。プラスチックとしては、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、直鎖状（線状）低密度ポリエチレンなどのポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−アクリル酸エチル共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、エチレン−メチルメタクリル酸共重合体、エチレン−プロピレン共重合体、酸変性ポリオレフィン系樹脂、およびこれらの樹脂の混合物等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
細胞培養基材上に刺激応答性材料層のパターンを形成すると、播種した細胞は、その他の細胞非接着性領域には接着せず細胞接着性の刺激応答性材料層にのみ接着し、刺激応答性材料層のパターン形状と略同一または略相似形の細胞シートを形成することになる。そして、特定の刺激により刺激応答性材料層を細胞非接着性に変化させることにより、形成された細胞シートを剥離することができる。
【００３２】
細胞非接着性に変化しない細胞接着領域を有する細胞培養基材を用いる場合でも、トリプシン等の酵素を用いる方法など、当技術分野で公知の方法により、細胞シートを細胞培養基材から剥離することは可能である。
【００３３】
細胞シートの剥離は、外周部分から中心部分に向かって延びる３つ以上のカット部に、回収器具の３つ以上の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入された状態で行う。細胞シートは、細胞培養基材から剥離されると同時に収縮するが、回収器具の挿入部がカット部に挿入された状態で剥離することにより、挿入部に引っかかったところで収縮を止めることができる。したがって、細胞シートを目的のサイズに収縮させることが可能である。回収器具の挿入部は、細胞シートを剥離する際に細胞シートのカット部に挿入されていればよく、細胞培養基材上で細胞シートを作製してから回収基部の挿入部を挿入してもよいし、細胞培養基材上に回収器具を設置した状態で細胞を播種して培養することにより、挿入部が挿入された状態の細胞シートを作製してもよい。
【００３４】
回収器具の挿入部が細胞シートに挿入された状態において、回収器具の挿入部は、細胞シートを貫通していることが好ましい。貫通させることで、細胞シートをより安定的に把持することができる。一実施形態において、細胞培養基材は、細胞シートのカット部に対応する位置であって、回収器具の挿入部に対応する位置に凹部を有する。凹部を有することで、挿入部を細胞シートに貫通させやすい。
【００３５】
細胞シートを細胞培養基材から剥離した後、回収器具の挿入部が細胞シートに挿入された状態で、カット部に挿入された挿入部のうち少なくとも１つを他の挿入部に対して相対的に動かすことにより、細胞シートのサイズを変化させることができる（図６）。その場合、回収器具としては、３つ以上の挿入部が固定された固定部をさらに備え、固定部が、少なくとも１つの挿入部を他の挿入部に対して相対的に移動可能に構成されているものを用いることが好ましい。
【００３６】
一実施形態においては、図８に示すように、細胞シート８を細胞培養基材３から剥離した後、回収器具２の挿入部１が細胞シート８に挿入された状態で、細胞シートの細胞培養基材に接着していた面と反対の面に、ゼラチンゲル層１０を有するスタンプ型デバイス１１のゼラチンゲル層１０を接触させて、細胞シート８をゼラチンゲル層１０に転写してもよい。ゼラチンゲル層を有するスタンプ型デバイスは、例えば、スタンプ型支持体のスタンプ面にゼラチンゲル層が形成されたデバイスである。このスタンプ型デバイスのゼラチンゲル層に細胞シートを生着させることにより転写し、別の細胞シートにさらに転写する工程を繰り返すことで、積層化細胞シートを得ることができる。ゼラチンは３７℃以上で容易に溶解し除去できるので簡単に組織化（積層）された細胞シートのみを回収することができる。ゼラチンゲル層を有するスタンプ型デバイスについては、例えば、Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２８（２００７）４９３９−４６に記載されている。
【００３７】
本発明はまた、細胞シートを作製して回収するためのキットに関する。当該キットは、上述の細胞シートを製造するための細胞培養基材と細胞シートを回収するための回収器具とを含む。すなわち、当該キットに含まれる回収器具は、細胞シートに挿入するための３つ以上の挿入部を備え、３つ以上の挿入部は、細胞シート上の同一直線上にない挿入位置に挿入可能に構成され、細胞培養基材は、細胞接着領域と、細胞接着領域の外周部分から中心部分に向かって延びる３つ以上の細胞非接着領域とを有し、３つ以上の細胞非接着領域に、回収器具の挿入部がそれぞれ１つ以上挿入可能に構成される。キットには、本発明の方法により細胞シートを回収する手順を記載した説明書が添付されていることが好ましい。
【００３８】
本発明により、回収される細胞シートの収縮率を制御することが可能になり、トリミングすることなく、任意のサイズの細胞シートを回収することができる。また、細胞密度を制御することが可能となり、異なる細胞間で密度条件を揃えた検証が可能となる。
【符号の説明】
【００３９】
１：挿入部
２：回収器具
３：細胞培養基材
４：細胞培養基材の表面
５：細胞シートの外周部分 
６：細胞シートの中心部分
７：細胞シートカット部
８：細胞シート
９：回収器具の固定部
１０：ゼラチンゲル層
１１：スタンプ型デバイス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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