(57)【要約】【課題】哺乳類における、抗癌特性および使用法、抗ウイルス特性および使用法、抗原虫特性および使用法、および、抗細菌特性および使用法といった、哺乳類の疾病に使用するための医薬特性を有する組成物を提供する。【解決手段】医薬品としての使用のための化学組成物は、生物学的に許容される銅化合物、また鉄のような他の成分を含んでもよく、製薬上許容される担体中で、苦しんでいる細胞へ輸送される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患およびヒト免疫不全ウイルス性疾患の治療に医薬品として使用する化学組成物であって、
少なくとも生物学的に許容される銅化合物から主としてなるコアと、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記銅化合物は不溶性の銅化合物であり、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項２】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患およびヒト免疫不全ウイルス性疾患の治療に医薬品として使用する化学組成物であって、
水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれる、少なくとも生物学的に許容される銅化合物から主としてなるコアと、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項３】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患およびヒト免疫不全ウイルス性疾患の治療に医薬品として使用する化学組成物であって、
銅−鉄化合物から主としてなる１つのコアと、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記銅は、水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれ、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項４】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患およびヒト免疫不全ウイルス性疾患を対象とする医薬の化学組成物であって、
水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれる、少なくとも生物学的に許容される銅化合物からなるコアと、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項５】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患およびヒト免疫不全ウイルス性疾患を治療するための医薬の化学組成物であって、
１つのコア粒子を形成して治療効果での相乗作用をもたらす銅と鉄との成分からなる化合物と、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記銅は、水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれ、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項６】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患および患者におけるヒト免疫不全ウイルス性疾患を治療するための医薬の製造における、少なくとも生物学的に許容される銅化合物からなる少なくとも１種のコアの化学組成物のコロイド溶液の使用であって、前記銅は、水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれ、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されている、コロイド溶液の使用。
【請求項７】
癌の治療に医薬品として使用する化学組成物であって、
水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれる銅化合物から主としてなるコアと、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記銅化合物が少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項８】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患およびヒト免疫不全ウイルス性疾患の治療に医薬品として使用する化学組成物であって、
コアと製薬上許容される担体とを含み、
該コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、
前記コアが生物学的に許容される銅化合物を含み、
該銅化合物が、水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれ、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのコーティング材料が、脂質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、リポソームおよびこれらの組合せからなる群より選ばれる物質から形成される、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのコーティング材料が、グルコース、サッカライド、ポリサッカライド、デキストラン、リポソーム、これらの誘導体およびこれらの組合せからなる群より選ばれる物質から形成される、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１１】
リポソームコートが前記少なくとも１つのコーティング材料を被包している、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのコーティング材料が前記化学組成物を被包している、請求項１０に記載の化学組成物。
【請求項１３】
前記コアが水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−酸化鉄または水酸化銅−オキシ水酸化鉄からなる群より選ばれる銅−鉄化合物を含む、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１４】
前記銅化合物のコアが主として水酸化銅、酸化銅、水酸化銅−水酸化鉄または水酸化銅−オキシ水酸化鉄から形成される、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのコーティング材料が主としてデキストランから形成される、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１６】
前記製薬上許容される担体が無菌の水性担体である、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項１７】
前記コア粒子が、少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されている、請求項５に記載の化学組成物。
【請求項１８】
前記医薬が、前記化学組成物を非経口、経口、経皮若しくは吸入により投与する形態であるか、または前記化学組成物を移植可能なポリマーデポー剤により投与する形態である、請求項６に記載の使用。
【請求項１９】
細胞のイメージングのために前記化学組成物に磁性粒子が添加される、請求項６に記載の使用。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのコーティング材料が、主として１種以上のリポソームからなる、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項２１】
前記コアが鉄をさらに含んでいる、請求項１、２、４、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項２２】
前記コアが相乗作用をもたらす銅および鉄の化合物を含んでいる、請求項１〜４、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項２３】
前記鉄が水酸化鉄、酸化鉄またはオキシ水酸化鉄の形状である、請求項３または５に記載の化学組成物。
【請求項２４】
さらに標的化剤を含んでいる、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項２５】
前記標的化剤が前記化学組成物の前記コアを標的とするマーカーである、請求項２４に記載の化学組成物。
【請求項２６】
前記標的化剤が磁性粒子を含んでいる、請求項２４または２５に記載の化学組成物。
【請求項２７】
さらに哺乳類の血液循環中に残留する製薬上許容される物質を含んでいる、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのコーティング材料が、前記コアの表面に吸着されるかまたは前記コアと複合体形成される、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項２９】
哺乳類の前記ウイルス性疾患がＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、マールブルグウイルス、エボラウイルスおよびオルトポックスウイルスである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項３０】
医薬品として用いられる、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項３１】
哺乳類における癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシア、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、ベクター媒介性疾患、真菌病、微生物媒介性疾患および患者におけるヒト免疫不全ウイルス性疾患の治療用の医薬品の製造のための請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物の使用。
【請求項３２】
前記ウイルスがＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、マールブルグウイルス、エボラウイルスおよびオルトポックスウイルスから選ばれる、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記原虫性疾患がマラリア、トリコモナス症、エントアメーバ症またはリーシュマニア症である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
前記医薬品が前記化学組成物のコロイド溶液の形状である、請求項３１〜３３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３５】
前記医薬品が哺乳類におけるインスリン強化療法、放射線増感剤療法または細胞の磁気イメージングと一緒に哺乳類の完全静脈栄養として使用するのに好適である、請求項３１〜３３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項３６】
請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物と、再分布剤とを含む製薬上許容される製品。
【請求項３７】
前記再分布剤が鉄デキストランまたは鉄グルコースを含んでいる、請求項３６に記載の製品。
【請求項３８】
請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物、および製薬上の活性物質を含む、これらを順次個別にまたは同時に使用するためのキット。
【請求項３９】
前記活性物質が再分布剤である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記活性物質が請求項３７に記載された再分布剤である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
患者への非経口、経口、経皮または吸入投与に適した形状である、請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物。
【請求項４２】
請求項１〜５、７、８のいずれか１つに記載の化学組成物を含む移植可能なポリマーデポー剤。
【請求項４３】
癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害、形質細胞ディスクラシアの予防のために、少なくとも１つの発癌性ウイルスを標的とする医薬品として使用する化学組成物であって、
水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、塩基性硫酸銅、三塩基性硫酸第二銅、二塩基性硫酸銅、水酸化銅−水酸化鉄、水酸化銅−オキシ水酸化鉄、クエン酸銅、リン酸銅、キュプロバム、銅藍、ブロシャン銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、コルネタイト、ジハイドライト、リン銅鉱、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩、ブロシャン銅鉱、水藍石またはカルカンサイトからなる群より選ばれる銅化合物から主としてなるコアと、
製薬上許容される担体と、
を含み、前記コアが少なくとも１つのコーティング材料で被包、被覆、囲包、吸着、複合体形成または結合されており、前記化学組成物は、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、又は頭蓋内投与される場合にコロイド溶液を形成する、化学組成物。
【請求項４４】
前記発癌性ウイルスが発癌性肝細胞ウイルスであり、前記癌が肝臓癌である、請求項４３に記載の化学組成物。
【請求項４５】
前記化学組成物がＢ型肝炎ウイルス感染の治療に使用される、請求項４３に記載の化学組成物。
【請求項４６】
前記化学組成物がＣ型肝炎ウイルス感染の治療に使用される、請求項４３に記載の化学組成物。
【請求項４７】
前記発癌性ウイルスが人乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）であり、前記癌が子宮癌である、請求項４３に記載の化学組成物。
【請求項４８】
前記発癌性ウイルスがエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）であり、前記癌がバーキットリンパ腫である、請求項４３に記載の化学組成物。
【請求項４９】
前記発癌性ウイルスがヒトＴ細胞白血球ウイルス（ＨＴＬＶ−１）であり、前記癌が成人Ｔ細胞白血病リンパ腫である、請求項４３に記載の化学組成物。
【請求項５０】
癌、細胞増殖性疾患、乾癬、脊髄異形成障害、過剰増殖性障害および形質細胞ディスクラシアを予防する医薬品の製造のための請求項４３〜４９のいずれか１つに記載の化学組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、薬剤組成物、使用法、および製造法に関する。これらの組成物は癌、肝炎またはＨＩＶのようなウイルス性感染症、エボラのような感染性ウイルス性疾患、微生物媒介性の症状、マラリア、および天然痘、および、細菌を含めた感染性微生物によって引き起される他の疾患を含め、哺乳類における広く多様な疾患および感染症の治療のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
本文において言及された全ての特許、科学論文、および他の文献は、下文に全て複写されているように、参考として本文に含まれている。癌は、身体内の新たな細胞の迅速かつ制御されない増殖であり、ヒトを含めた動物における死の主な原因である。この増殖は、多細胞生物の正常な発生およびホメオスタシスに必須の生理学的プロセスである、アポトーシスの正常なレベルをはるかに上回る。（ステラー（Stellar）著、Science、１９９５年、第２６７巻、ｐ．１４４５−１４４９）。
【非特許文献１】ステラー（Stellar）著、Science、１９９５年、第２６７巻、ｐ．１４４５−１４４９
【０００３】
しばしば放射線療法および外科手術と一緒に使用される化学療法は、今日使用されている標準的な癌治療法である。化学療法は一般に、癌細胞を破壊する薬物治療または薬物を意味するものと理解される。現在、癌を治療するために様々な組合せで使用されている１００を超える薬物がある（米国癌学会著（The American Cancer Society）、「Consumers Guide to Cancer Drugs（癌治療薬の消費者ガイド）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２０００年）。「これらの全ての薬物には共通した一つの特徴がある。それらが作用するのは、それらが毒物であるからである。」（モス（Moss）著、「Questioning Chemotherapy（化学療法を問う）」、エキノックス・プレス（Equinox Press）、２０００年、ｐ．７７）。化学療法薬は非常に毒性であり、典型的には狭い治療指数を有する。これらの薬剤は悪性細胞に対しほとんど特異性を示さず、正常細胞と悪性細胞との間を事実上識別することはできない。結果として、全ての細胞および組織、および特に、骨髄細胞、精原細胞、および胃腸の陰窩上皮細胞といった、迅速に増殖する細胞は非常に攻撃されやすい。（バキラン（Baquiran）著、「Cancer Chemotherapy Handbook（癌の化学療法ハンドブック）」、リッピンコット（Lippincott）、２００１年、ｐ．８５）。さらに、化学療法の副作用が恐ろしいものとなる可能性があることは、当業者にとり、また、彼らに対して実行された技術を受けるべき充分に不運な者にとり、周知の通りである。（米国癌学会著（The American Cancer Society）、「Consumers Guide to Cancer Drugs（癌治療薬の消費者ガイド）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２０００年）。また、（バキラン（Baquiran）著、「Cancer Chemotherapy Handbook（癌の化学療法ハンドブック）」、リッピンコット（Lippincott）、２００１年、ｐ．８５）；（チュー（Chu）＆デビータ（Devita）著、「Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual（医師用癌化学療法薬マニュアル）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２００３年）；ラーンス・アームストロング（Lance Armstrong）著、「It's Not About the Bike（それは自転車についてではない）」、バークレイ・パブリッシング（Berkley Publishing）、２０００年）、キング（King）、キング（King）、およびパールロース（Pearlroth）著、「Cancer Combat（癌戦闘）」、バンタム・ブックス（Bantam Books）、１９９８年）；（リッチ（Rich）著、「The Red Devil（赤い悪魔）」、スリー・リバーズ・プレス（Three Rivers Press）、１９９９年）；および（マルキオーネ（Marchione）著、「Hopes in cancer drug dashed（打ち砕かれた癌治療薬における希望）」、ミルウォーキー・ジャーナル・センチネル（Milwaukee Journal Sentinel）、２００２年５月２２日）も参照のこと。化学療法を含めた現在の癌療法は、一般に充実性腫瘍にはうまく作用しない。（モス著、「（Questioning Chemotherapy）化学療法を問う」改訂版、エキノックス・プレス（Equinox Press）、２０００年、ｐ．１８）、および（マスターズ（Masters）およびコベール（Koberle）著、Curing Metastatic Cancer : Lessons from Testicular Germ-Cell Tumours（転移癌の治療：精巣の胚細胞腫瘍からの教訓）、Nature Reviews、２００３年７月、第３巻、第７号）。
【非特許文献２】米国癌学会著（The American Cancer Society）、「Consumers Guide to Cancer Drugs（癌治療薬の消費者ガイド）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２０００年
【非特許文献３】モス（Moss）著、「Questioning Chemotherapy（化学療法を問う）」、エキノックス・プレス（Equinox Press）、２０００年、ｐ．７７）
【非特許文献４】バキラン（Baquiran）著、「Cancer Chemotherapy Handbook（癌の化学療法ハンドブック）」リッピンコット（Lippincott）、２００１年、ｐ．８５
【非特許文献５】米国癌学会著（The American Cancer Society）、「Consumers Guide to Cancer Drugs（癌治療薬の消費者ガイド）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２０００年
【非特許文献６】バキラン（Baquiran）著、「Cancer Chemotherapy Handbook（癌の化学療法ハンドブック）」、リッピンコット（Lippincott）、２００１年、ｐ．８５
【非特許文献７】チュー（Chu）＆デビータ（Devita）著、「Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual（医師用癌化学療法薬マニュアル）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２００３年
【非特許文献８】ラーンス・アームストロング（Lance Armstrong）著、「It's Not About the Bike（それは自転車についてではない）」、バークレイ・パブリッシング（Berkley Publishing）、２０００年
【非特許文献９】キング（King）、キング（King）、およびパールロース（Pearlroth）著、「Cancer Combat（癌戦闘）」、バンタム・ブックス（Bantam Books）、１９９８年
【非特許文献１０】リッチ（Rich）著、「The Red Devil（赤い悪魔）」、スリー・リバーズ・プレス（Three Rivers Press）、１９９９年
【非特許文献１１】マルキオーネ（Marchione）著、「Hopes in cancer drug dashed（打ち砕かれた癌治療薬における希望）」、ミルウォーキー・ジャーナル・センチネル（Milwaukee Journal Sentinel）、２００２年５月２２日
【非特許文献１２】モス著、「（Questioning Chemotherapy）化学療法を問う」改訂版、エキノックス・プレス（Equinox Press）、２０００年、ｐ．１８
【非特許文献１３】マスターズ（Masters）およびコベール（Koberle）著、Curing Metastatic Cancer : Lessons from Testicular Germ-Cell Tumours（転移癌の治療：精巣の胚細胞腫瘍からの教訓）、Nature Reviews、２００３年７月、第３巻、第７号
【０００４】
化学療法薬に対し、耐性が生じる可能性があり、薬剤を、あるタイプの癌には作用するがその他には作用しないか、または全く作用しないようさせる。耐性は、これまでに開発された全ての単一の化学療法薬について証明されている。この耐性は、先天的、後天的、または緊急的な耐性であってよい。（チュー（Chu）＆デビータ（Devita）著、「Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual（医師用癌化学療法薬マニュアル）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２００３年）。さらに、化学療法薬を併用することが、結果として優れた反応率をもつレジメンを生じるものと一般的には考えられてきた。しかしながら一つの研究は、連続してあるいは併用して転移性乳癌に使用された化学療法薬が、生存に関して同等の結果をもたらし、生活の質が測定されたことを証明した。（スレッジ（Sledge）ら著、「Phase III, Trial of Doxorubicin, paclitaxel, and the combination of doxorubicin and paclitaxel as front-line chemotherapy for metastatic breast cancer : an intergroup trial（第ＩＩＩ相、転移性乳癌の最先端化学療法としての、ドキソルビシン、パクリタキセル、および、ドキソルビシンおよびパクリタキセル併用の試験：インターグループ・トライアル）」、J. of Clin. Oncology、２００３年２月、第２１巻、第４号、ｐ．５８８−５９２）。
【非特許文献１４】チュー（Chu）＆デビータ（Devita）著、「Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual（医師用癌化学療法薬マニュアル）」、ジョーンズ・アンド・バートレット・パブリッシャーズ（Jones and Bartlett Publishers）、２００３年
【非特許文献１５】スレッジ（Sledge）ら著、「Phase III, Trial of Doxorubicin, paclitaxel, and the combination of doxorubicin and paclitaxel as front-line chemotherapy for metastatic breast cancer : an intergroup trial（第ＩＩＩ相、転移性乳癌の最先端化学療法としての、ドキソルビシン、パクリタキセル、および、ドキソルビシンおよびパクリタキセル併用の試験：インターグループ・トライアル）」、J. of Clin. Oncology、２００３年２月、第２１巻、第４号、ｐ．５８８−５９２
【０００５】
加えて、より新しい４つの化学療法レジメンおよび薬物を利用している研究が、１１％という２年生存率、および実質的な毒性を提示した。反応および生存率は、進行した非小細胞肺癌用に、異なるレジメンで治療された４群の間で有意に異なることはなかった。（シラー（Schiller）ら著、「Comparison of Four Chemotherapy Regimens for Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer（進行した非小細胞肺癌用の４つの化学療法レジメンの比較）」、The N. Eng. J. of Med.、２００２年１月、第３４６巻、第２号、ｐ．９２−９８）。
【非特許文献１６】シラー（Schiller）ら著、「Comparison of Four Chemotherapy Regimens for Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer（進行した非小細胞肺癌用の４つの化学療法レジメンの比較）」、The N. Eng. J. of Med.、２００２年１月、第３４６巻、第２号、ｐ．９２−９８
【０００６】
癌細胞は高いグルコース取込みおよび代謝を有することが周知であり、結果として生じる増強された解糖は、悪性の形質転換の指標として役立つことが可能である。（メーヴァ（Mehvar）著、「Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agants（治療用およびイメージング用薬剤の、標的化および持続化された送達のためのデキストラン）」、J. of Controlled Release、２０００年、第６９巻、ｐ．１−２５）；（エスナー（Essner）ら著、「Advances in FDG PET Probes in Surgical Oncology（外科腫瘍学におけるＦＤＧ−ＰＥＴの進歩）」、Cancer Jour.、２００２年、第８巻、ｐ．１００−１０８）。癌細胞は、グルコースを高率で利用および代謝し、（高い酸素濃度の存在下であっても）主として乳酸塩を形成する。（ワールブルグ（Warburg）著、「On The Origin of Cancer Cells（癌細胞の起源について）」、Science、１９５６年２月、第１２３巻、第３１９１号、ｐ．３０９−３１４）。それ故乳酸塩は、癌細胞においては、対応する正常組織におけるよりもはるかに高レベルで検出される。（リベンゾン−セガル（Rivenzon-Segal）ら著、「Glycolysis as a metabolic marker in orthotopic breast cancer, monitored by in vivo 13C MRS（インビボの１３Ｃ ＭＲＳによりモニターされた正所性乳癌における代謝マーカーとしての解糖）」、Amer. J. Phys. Endocrinology Metabolism、２００２年、第２８３巻、Ｅ６２３−Ｅ６３０）；また（リー（Lee）およびピーダーセン（Pedersen）著、「Glucose Metabolism in Cancer（癌のグルコース代謝）」、J. of Bio. Chem.、２００３年１０月、第２７８巻、第４２号、ｐ．４１０４７−４１０５８）；（ゲイテンビー（Gatenby）およびガウリンスキー（Gawlinski）著、「The glycolysis phenotype in carcinogenesis and tumor invasion: insights through mathematical models（発癌および腫瘍浸潤における解糖表現型：数学的モデルによる洞察）」、Cancer Res.、２００３年７月、第６３巻、第１４号、ｐ．３８４７−５４）；（デガーニ（Degani）著、「The American Society of Clinical Oncology（米国臨床腫瘍学会）」、Intn'l J. of Cancer、２００３年、１１月、第１０７巻、ｐ．１７７−１８２）；（ワールブルグ（Warburg）著、「The Prime Cause and Prevention of Cancer（癌の主原因と予防）」、コンラッド・トリルチ（Konrad Triltsch）、１９６９年、ｐ．６）も参照のこと。グルコースは、典型的には、グルコース輸送体ファミリーの一つを介した促進拡散により、ほとんどの細胞へ入る。（カッツング（Katzung）著、「Basic & Clinical Pharmacology（基礎および臨床薬理学）」、マグローヒル社（McGraw Hill Co. Inc.）、２００１年、ｐ．７１５）。これらのグルコース輸送体に不適合であるグルコースの形状は、エンドサイトーシスとしても公知の食作用により、食作用系の細胞かまたは組織に付随した細胞のいずれかによって摂取されることが可能である。細網内皮系（「ＲＥＳ」）または単核食細胞系（「ＭＰＳ」）としても公知の食作用系は、散在性の系であって、組織の固定されたマクロファージ、肝臓、脾臓、リンパ節、および骨髄を、造血組織の繊維芽細胞様細網細胞とともに含む。
【非特許文献１７】メーヴァ（Mehvar）著、「Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agants（治療用およびイメージング用薬剤の、標的化および持続化された送達のためのデキストラン）」、J. of Controlled Release、２０００年、第６９巻、ｐ．１−２５
【非特許文献１８】エスナー（Essner）ら著、「Advances in FDG PET Probes in Surgical Oncology（外科腫瘍学におけるＦＤＧ−ＰＥＴの進歩）」、Cancer Jour.、２００２年、第８巻、ｐ．１００−１０８
【非特許文献１９】ワールブルグ（Warburg）著、「On The Origin of Cancer Cells（癌細胞の起源について）」、Science、１９５６年２月、第１２３巻、第３１９１号、ｐ．３０９−３１４
【非特許文献２０】リベンゾン−セガル（Rivenzon-Segal）ら著、「Glycolysis as a metabolic marker in orthotopic breast cancer, monitored by in vivo 13C MRS（インビボの１３Ｃ ＭＲＳによりモニターされた正所性乳癌における代謝マーカーとしての解糖）」、Amer. J. Phys. Endocrinology Metabolism、２００２年、第２８３巻、Ｅ６２３−Ｅ６３０
【非特許文献２１】リー（Lee）およびピーダーセン（Pedersen）著、「Glucose Metabolism in Cancer（癌のグルコース代謝）」、J. of Bio. Chem.、２００３年１０月、第２７８巻、第４２号、ｐ．４１０４７−４１０５８
【非特許文献２２】ゲイテンビー（Gatenby）およびガウリンスキー（Gawlinski）著、「The glycolysis phenotype in carcinogenesis and tumor invasion: insights through mathematical models（発癌および腫瘍浸潤における解糖表現型：数学的モデルによる洞察）」、Cancer Res.、２００３年７月、第６３巻、第１４号、ｐ．３８４７−５４
【非特許文献２３】デガーニ（Degani）著、「The American Society of Clinical Oncology（米国臨床腫瘍学会）」、Intn'l J. of Cancer、２００３年、１１月、第１０７巻、ｐ．１７７−１８２
【非特許文献２４】ワールブルグ（Warburg）著、「The Prime Cause and Prevention of Cancer（癌の主原因と予防）」、コンラッド・トリルチ（Konrad Triltsch）、１９６９年、ｐ．６
【非特許文献２５】カッツング（Katzung）著、「Basic & Clinical Pharmacology（基礎および臨床薬理学）」、マグローヒル社（McGraw Hill Co. Inc.）、２００１年、ｐ．７１５
【０００７】
グルコースは、腫瘍細胞の増殖および転移を開始し、促進し、駆動し、かつ増幅する。腫瘍細胞に好まれる嫌気性解糖は、ＡＴＰを産生するためには非常に非効率かつ原始的なプロセスであり、膨大な量のグルコースを必要とする。したがって、科学界は現在、腫瘍細胞からグルコースを奪う方向で研究している。（ヴァン・ダング（Van Dang）ら著、The Proc. of the Nat'l. Acad. of Sci.、１９９８年、第９５巻、ｐ．１５１１−１５１６）。（ペデルセン（Pedersen）著、「Inhibiting glycolysis and oxidative phosphorylation, 3-BrPA abolishes cell ATP production（解糖および酸化的リン酸化の阻害、３−ＢｒＰＡは細胞のＡＴＰ産生を廃止する）」、Reuters News、２００２年７月１８日）。ヒト骨肉腫および非小細胞肺癌の異種移植モデルに対するインビボのマウス研究は、解糖阻害剤２−デオキシ−Ｄ−グルコースが、アドリアマイシンまたはパクリタキセルとの併用において、有意に低速な腫瘍増殖を生じる結果となることを見出した。（マシェク（Maschek）ら著、「2-deoxy-D-glucose increases the efficacy of adriamycin and paclitaxel in human osteosarcoma and non-small cell lung cancers in vivo（２−デオキシ−Ｄ−グルコースはインビボで、ヒト骨肉腫および非小細胞肺癌におけるアドリアマイシンおよびパクリタキセルの有効性を高める）」、Cancer Res.、２００４年、第６４巻、第１号、ｐ．３１−３４）。さらに、糖新生を阻害する抗悪液質薬、硫酸ヒドラジンを用いて、陽性の臨床結果が見出されている。（モス（Moss）著、「Cancer Therapy（癌療法）」、エキノックス・プレス（Equinox Press）、１９９２年、ｐ．３１６）。癌細胞のグルコースを奪うことに向けられた多くの食事改善法もまた研究されてきた。（クイリン（Quillin）著、「Beating Cancer with Nutrition（栄養学で癌に勝つ）」、ニュートリション・タイムズ・プレス（Nutrition Times Press）、１９９８年、ｐ．２２５）；クイリン（Quillin）著、「Cancer's Sweet Tooth（癌の甘い物好き）」、ニュートリション・サイエンス・ニュース（Nutrition Science News）、２０００年４月）；および（ハウザー（Hauser）＆ハウザー（Hauser）著、「Cancer-Treating Cancer with Insulin Potentiation Therapy（癌−インスリン強化療法による癌治療）」、ビューラ・ランド・プレス（Bhulah Land Press）、２００１年）。
【非特許文献２６】ヴァン・ダング（Van Dang）ら著、The Proc. of the Nat'l. Acad. of Sci.、１９９８年、第９５巻、ｐ．１５１１−１５１６
【非特許文献２７】ペデルセン（Pedersen）著、「Inhibiting glycolysis and oxidative phosphorylation, 3-BrPA abolishes cell ATP production（解糖および酸化的リン酸化の阻害、３−ＢｒＰＡは細胞のＡＴＰ産生を廃止する）」、Reuters News、２００２年７月１８日
【非特許文献２８】マシェク（Maschek）ら著、「2-deoxy-D-glucose increases the efficacy of adriamycin and paclitaxel in human osteosarcoma and non-small cell lung cancers in vivo（２−デオキシ−Ｄ−グルコースはインビボで、ヒト骨肉腫および非小細胞肺癌におけるアドリアマイシンおよびパクリタキセルの有効性を高める）」、Cancer Res.、２００４年、第６４巻、第１号、ｐ．３１−３４
【非特許文献２９】モス（Moss）著、「Cancer Therapy（癌療法）」、エキノックス・プレス（Equinox Press）、１９９２年、ｐ．３１６
【非特許文献３０】クイリン（Quillin）著、「Beating Cancer with Nutrition（栄養学で癌に勝つ）」、ニュートリション・タイムズ・プレス（Nutrition Times Press）、１９９８年、ｐ．２２５
【非特許文献３１】クイリン（Quillin）著、「Cancer's Sweet Tooth（癌の甘い物好き）」、ニュートリション・サイエンス・ニュース（Nutrition Science News）、２０００年４月
【非特許文献３２】ハウザー（Hauser）＆ハウザー（Hauser）著、「Cancer-Treating Cancer with Insulin Potentiation Therapy（癌−インスリン強化療法による癌治療）」、ビューラ・ランド・プレス（Bhulah Land Press）、２００１年
【０００８】
銅（Ｃｕ）は、必須微量元素であり、細菌から哺乳類にいたる生物体において生命に必要である。銅は、癌、特に充実性腫瘍の増殖の必要条件である血管新生を促進し、かつそれに必須のコファクターである。（ブリュワ（Brewer）著、「Handbook of Copper Pharmacology and Toxicology（銅の薬理学および毒性学ハンドブック）」、フマナ・プレス（Humana Press）、２００２年、第２７章）；（ブレム（Brem）著、「Angiogenesis and Cancer Control : From Concept to Therapeutic Trial（血管新生および癌制御：概念から治験まで）」、Cancer Control Jour.、１９９９年、第６巻、第５号、ｐ．４３６−４５８）。血管新生は一般に成体では必要とされないことから、銅の除去、銅減少療法、または銅を与えないでおくことによる血管新生の阻害が、さらなる腫瘍増殖を阻害するための可能なメカニズムとして探求されてきた。（ブリュワ（Brewer）上記）；またブリュワ（Brewer）らの米国特許第６，７０３，０５０号も参照のこと。銅は血管新生および増殖のための必須のコファクターであることから、多くのタイプの腫瘍は、銅を大いに必要とし、かつ銅を封鎖する。（ブリュワ（Brewer）著、「Copper Control as an Antiangiogenic Anticancer Therapy : Lessons from Treating Wilson's Disease（抗血管新生抗癌療法としての銅制御：ウィルソン病の治療からの教訓）」、Exp. Bio. and Med.、２００１年、第２２６巻、第７号、ｐ．６６５−６７３）。銅へのこの親和力と、腫瘍の開始、増殖、および転移を促進する銅の作用とのゆえに、科学界は腫瘍細胞に銅を与えないでおく方法および医薬品を開発し続けている。（ブレム（Brem）上記）；ブリュワ（Brewer）上記）；（ブリュワ（Brewer）ら著、「Treatment of Metastatic Cancer with Tetrathiomolybdate , an Anticopper , Antiangiogenesis Agent : Phase I Study（抗銅、抗血管新生薬、テトチオモリブデートによる転移性癌の治療：第Ｉ相調査）」、Clin. Can. Res.、２０００年、第６巻、ｐ．１−１０）；（レッドマン（Redman）著、「Phase II Trial of Tetrathiomolybdate in Patients with Advanced Kidney Cancer（進行性腎臓癌の患者におけるテトラチオモリブデートの第ＩＩ相試験）」、Clin. Cancer Res.、２００３年、第９巻、ｐ．１６６６−１６７２）；（パン（Pan）ら著、「Copper Deficiency Induced by Tetrathiomolybdate Suppresses Tumor Growth and Angiogenesis（テトラチオモリブデートにより誘導された銅欠乏症は腫瘍増殖および血管形成を抑制する）」、Cancer Res.、２００２年、第６２巻、ｐ．４８５４−４８５９）；（テクノス（Teknos）ら著、「Inhibition of the Growth of Squamous Cell Carcinoma by Tetrathiomolybdate-Induced Copper Suppression in a Murine Model（マウスモデルにおけるテトラチオモリブデート誘導性の銅抑制による扁平上皮細胞の増殖阻害）」、Arch. of Otolaryngology : Head And Neck Surgery、Oncolink Cancer News、Reuters、２００３年、第１２９巻、ｐ．７８１−７８５）；（ヨシジ（Yoshiji）ら著、「The Copper Chelating Agent, trientine, suppress tumor development and angiogenesis in the murine hepatocellular carcinoma cells（銅キレート剤トリエンチンは、マウス肝細胞癌の細胞における腫瘍発育および血管新生を抑制する）」、Int'l J. of Cancer、２００１年１２月、第９４巻、ｐ．７６８−７７３）；（ヨシジ（Yoshiji）ら著、「The copper chelating agent,Trientine attentuate liver enzymes-altered preneoplastic lesions in rats by angiogenesis suppression（銅キレート剤トリエンチンは、ラットにおいて血管新生の抑制により、肝酵素変異性の前新生物病巣を弱める）」、Oncology Rep.、２００３年、第１０巻、第５号、ｐ．１３６９−７３）；（プレム（Brem）ら著、「Penicillamine and Reduction of Copper for Angiosuppressive Therapy of Adults with Newly Diagnosed Glioblastoma（新規に神経膠芽細胞腫と診断された成体の血管新生抑制療法のためのペニシラミンおよび銅低減）」、Ｈ．リー・モフィット・がんセンター＆研究所（H. Lee Moffit Cancer Center & Research Inst.）、１９９９年）；（サグリパンティ（Sagripanti）およびクレマー（Kraemer）著、「Site-specific Oxidative DNA Damage at Polyguanosines Produced by Copper Plus Hydrogen Peroxide（銅プラス過酸化水素によって発生されたポリグアノシンにおける部位特異酸化的ＤＮＡ損傷）」、J. of Biol. Chem.、１９８９年、第２６４巻、第３号、ｐ．１７２９−１７３４）。
【特許文献１】米国特許第６，７０３，０５０号
【非特許文献３３】ブリュワ（Brewer）著、「Handbook of Copper Pharmacology and Toxicology（銅の薬理学および毒性学ハンドブック）」、フマナ・プレス（Humana Press）、２００２年、第２７章
【非特許文献３４】ブレム（Brem）著、「Angiogenesis and Cancer Control : From Concept to Therapeutic Trial（血管新生および癌制御：概念から治験まで）」、Cancer Control Jour.、１９９９年、第６巻、第５号、ｐ．４３６−４５８
【非特許文献３５】ブリュワ（Brewer）著、「Copper Control as an Antiangiogenic Anticancer Therapy : Lessons from Treating Wilson's Disease（抗血管新生抗癌療法としての銅制御：ウィルソン病の治療からの教訓）」、Exp. Bio. and Med.、２００１年、第２２６巻、第７号、ｐ．６６５−６７３
【非特許文献３６】ブリュワ（Brewer）ら著、「Treatment of Metastatic Cancer with Tetrathiomolybdate , an Anticopper , Antiangiogenesis Agent : Phase I Study（抗銅、抗血管新生薬、テトチオモリブデートによる転移性癌の治療：第Ｉ相調査）」、Clin. Can. Res.、２０００年、第６巻、ｐ．１−１０
【非特許文献３７】レッドマン（Redman）著、「Phase II Trial of Tetrathiomolybdate in Patients with Advanced Kidney Cancer（進行性腎臓癌の患者におけるテトラチオモリブデートの第ＩＩ相試験）」、Clin. Cancer Res.、２００３年、第９巻、ｐ．１６６６−１６７２
【非特許文献３８】パン（Pan）ら著、「Copper Deficiency Induced by Tetrathiomolybdate Suppresses Tumor Growth and Angiogenesis（テトラチオモリブデートにより誘導された銅欠乏症は腫瘍増殖および血管形成を抑制する）」、Cancer Res.、２００２年、第６２巻、ｐ．４８５４−４８５９
【非特許文献３９】テクノス（Teknos）ら著、「Inhibition of the Growth of Squamous Cell Carcinoma by Tetrathiomolybdate-Induced Copper Suppression in a Murine Model（マウスモデルにおけるテトラチオモリブデート誘導性の銅抑制による扁平上皮細胞の増殖阻害）」、Arch. of Otolaryngology : Head And Neck Surgery、Oncolink Cancer News、Reuters、２００３年、第１２９巻、ｐ．７８１−７８５
【非特許文献４０】ヨシジ（Yoshiji）ら著、「The Copper Chelating Agent, trientine, suppress tumor development and angiogenesis in the murine hepatocellular carcinoma cells（銅キレート剤トリエンチンは、マウス肝細胞癌の細胞における腫瘍発育および血管新生を抑制する）」、Int'l J. of Cancer、２００１年１２月、第９４巻、ｐ．７６８−７７３
【非特許文献４１】ヨシジ（Yoshiji）ら著、「The copper chelating agent,Trientine attentuate liver enzymes-altered preneoplastic lesions in rats by angiogenesis suppression（銅キレート剤トリエンチンは、ラットにおいて血管新生の抑制により、肝酵素変異性の前新生物病巣を弱める）」、Oncology Rep.、２００３年、第１０巻、第５号、ｐ．１３６９−７３
【非特許文献４２】プレム（Brem）ら著、「Penicillamine and Reduction of Copper for Angiosuppressive Therapy of Adults with Newly Diagnosed Glioblastoma（新規に神経膠芽細胞腫と診断された成体の血管新生抑制療法のためのペニシラミンおよび銅低減）」、Ｈ．リー・モフィット・がんセンター＆研究所（H. Lee Moffit Cancer Center & Research Inst.）、１９９９年
【非特許文献４３】サグリパンティ（Sagripanti）およびクレマー（Kraemer）著、「Site-specific Oxidative DNA Damage at Polyguanosines Produced by Copper Plus Hydrogen Peroxide（銅プラス過酸化水素によって発生されたポリグアノシンにおける部位特異酸化的ＤＮＡ損傷）」、J. of Biol. Chem.、１９８９年、第２６４巻、第３号、ｐ．１７２９−１７３４
【０００９】
銅はまた、ＤＮＡを損傷するといった方法で癌増殖を促進することもある。（サグリパンティ（Sagripanti）、上記１９９９年）。細胞における銅の破壊的な活性は、ＤＮＡへ結合すること、還元剤および過酸化水素の存在下にＤＮＡを切断すること、細胞機能の非特異的破壊、およびハーバー・ワイス（Harber-Weiss）反応を通したヒドロキシルフリーラジカルの発生を含む。（ティオファニデス（Theophanides）ら著、「Copper and Carcinogenesis（銅と発癌）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology）、２００２年、第４２巻、ｐ．５７−６４）。銅はまた、反応性酸素種（「ＲＯＳ」）の形成においても役割を果たす。（サグリパンティ（Sagripanti）著、「DNA Damage Mediated by Metal Ions with Special Reference to Copper and Iron（特に銅および鉄に関連した、金属イオンにより仲介されるＤＮＡ損傷）」、Metal Ions Biol. Syst.、１９９９年、第３６巻、ｐ．１７９−２０９）。
【非特許文献４４】ティオファニデス（Theophanides）ら著、「Copper and Carcinogenesis（銅と発癌）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology）、２００２年、第４２巻、ｐ．５７−６４
【非特許文献４５】サグリパンティ（Sagripanti）著、「DNA Damage Mediated by Metal Ions with Special Reference to Copper and Iron（特に銅および鉄に関連した、金属イオンにより仲介されるＤＮＡ損傷）」、Metal Ions Biol. Syst.、１９９９年、第３６巻、ｐ．１７９−２０９
【００１０】
銅の使用はまた、癌の治療に関して、多くの米国特許において同様に開示されてきた：米国特許第４，９５２，６０７号は、哺乳類細胞において、スーパーオキシドジスムターゼ様の活性を示す銅錯体を開示している；米国特許第５，１２４，３５１号は、ニトリロ三酢酸の銅キレートか、またはビス−チオセミカルバゾンの銅キレートの使用を開示している；米国特許第５，６３２，９８２号は、標的細胞に対する使用に関して、表面膜タンパク質受容体インターナライズ薬、特にＴＮＦと一緒の、銅キレートの使用を開示している；また米国特許第６，７０６，７５９号は、ジチオカルバメート誘導体および銅の使用を開示している。
【特許文献２】米国特許第４，９５２，６０７号
【特許文献３】米国特許第５，１２４，３５１号
【特許文献４】米国特許第５，６３２，９８２号
【特許文献５】米国特許第６，７０６，７５９号
【００１１】
癌細胞と正常細胞との間に、鉄の必要量に関して量的な差異があることもまた公知であるが、その理由は、増強された鉄の獲得が、腫瘍細胞の増殖および転移を開始し、促進し、かつ増幅するからである。鉄は、酸素輸送からＤＮＡ合成および電子伝達までの範囲にわたる数多くの生物学的プロセスにとり必須の遷移金属である。鉄はまた、ＤＮＡ損傷性の反応性酸素種の生成と、宿主細胞の防御の抑制とを含む、発癌機構にも関与している。（デソイズ（Desoize）編、「Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｍｅｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ：  Ｐａｒｔ  Ｉ  _  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（金属および金属化合物における癌：パートＩ−発癌）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．１−３）；（ガラリス（Galaris）ら著、「The Role of Oxidative Stress in Mechanisms of Metal-induced Carcinogenesis（金属誘導性発癌の機構における酸化的ストレスの役割）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．９３−１０３）；（ワインバーグ（Weinberg）著、「Cancer and Iron : a Dangerous Mix（癌と鉄：危険な配合物）」、Iron Disorders Insight、１９９９年、第２巻、第２号、ｐ．１１）：（ワインバーグ（Weinberg）著、「The Development of Awareness of the Carcinogenic Hazard of Inhaled Iron（吸入された鉄の発癌性災害という意識の発展）」、Oncology Res.、１９９９年、第１１巻、ｐ．１０９−１１３）；（ワインバーグ（Weinberg）著、「Iron Therapy and Cancer（鉄療法と癌）」、Kidney Int'l、１９９９年、第５５巻、第６０号、ｐ．Ｓ１３１−１３４）；（ワインバーグ（Weinberg）著、「The Role of Iron in Cancer（癌における鉄の役割）」、Eur. J. Cancer Prevention、１９９６年、第５巻、ｐ．１９−３６）；（ワインバーグ（Weinberg）著、「Iron in Neoplastic Disease（新生物疾患における鉄）」、Nutrition Cancer、１９９３年、第４巻、第３号、ｐ．２２３−３３）；（スティーブンズ（Stevens）ら著、「Body Iron Stores and the Risk of Cancer（身体の鉄貯蔵と癌のリスク）」、N. Eng. J. of Med.、１９８８年、第３１９巻、第１６号、ｐ．１０４７−１０５２）。
【非特許文献４６】デソイズ（Desoize）編、「Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｍｅｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ：  Ｐａｒｔ  Ｉ  _  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（金属および金属化合物における癌：パートＩ−発癌）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．１−３
【非特許文献４７】ガラリス（Galaris）ら著、「The Role of Oxidative Stress in Mechanisms of Metal-induced Carcinogenesis（金属誘導性発癌の機構における酸化的ストレスの役割）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．９３−１０３
【非特許文献４８】ワインバーグ（Weinberg）著、「Cancer and Iron : a Dangerous Mix（癌と鉄：危険な配合物）」、Iron Disorders Insight、１９９９年、第２巻、第２号、ｐ．１１
【非特許文献４９】ワインバーグ（Weinberg）著、「The Development of Awareness of the Carcinogenic Hazard of Inhaled Iron（吸入された鉄の発癌性災害という意識の発展）」、Oncology Res.、１９９９年、第１１巻、ｐ．１０９−１１３
【非特許文献５０】ワインバーグ（Weinberg）著、「Iron Therapy and Cancer（鉄療法と癌）」、Kidney Int'l、１９９９年、第５５巻、第６０号、ｐ．Ｓ１３１−１３４
【非特許文献５１】ワインバーグ（Weinberg）著、「The Role of Iron in Cancer（癌における鉄の役割）」、Eur. J. Cancer Prevention、１９９６年、第５巻、ｐ．１９−３６
【非特許文献５２】ワインバーグ（Weinberg）著、「Iron in Neoplastic Disease（新生物疾患における鉄）」、Nutrition Cancer、１９９３年、第４巻、第３号、ｐ．２２３−３３
【非特許文献５３】スティーブンズ（Stevens）ら著、「Body Iron Stores and the Risk of Cancer（身体の鉄貯蔵と癌のリスク）」、N. Eng. J. of Med.、１９８８年、第３１９巻、第１６号、ｐ．１０４７−１０５２
【００１２】
金属の抜取りのための細胞内鉄キレート剤、鉄の取込みを妨害するためのガリウム塩の使用、および鉄の取込みを阻止するための、腫瘍上のトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体の利用を含めた異なるアプローチを用いて、数多くの医薬品が腫瘍細胞に対する鉄の供給を調節および制限するべく開発されてきた。たとえば、その全てが本文中に含まれている米国特許第６，５８９，９６号は、癌細胞から鉄を奪うための、癌に対する化学療法薬としての鉄キレート化剤の使用を教示している。また、（腫瘍細胞が高レベルのトランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）を発現し、かつトランスフェリンから鉄（Ｆｅ）を凄まじい速度でインターナライズすることを開示している、クウォク（Kwok）ら著、「The Iron Metabolism of Neoplastic Cells : alterations that facilitate proliferation?（新生物細胞の鉄代謝：増殖を促進する変更？）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．６５−７８）；（デソイズ（Desoize, B）編、「Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｐａｒｔ  ＩＩ  _  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（癌と金属および金属化合物、パートＩＩ−癌治療）、「Critical Reviews In Oncology/Hematology 、２００２年、第４２巻、ｐ．２１３−２１５」；（コルリー（Collery）ら著、「Gallium in Cancer Treatment（癌治療におけるガリウム）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology 、２００２年、第４２巻、ｐ．２８３−２９６）；（ワインバーグ（Weinberg）著、「Development of Clinical Methods of Iron Deprivation for Suppression of Neoplastic and Infectious Diseases（新生物性および感染性疾患の抑制のための鉄剥脱の臨床方法の開発）」、Cancer Investigation 、１９９９年、第１７巻、第７号、ｐ．５０７−５１３）；（ワインバーグ（Weinberg）著、「Human Lactoferrin : a Novel Therapeutic with Board Spectrum Potential（ヒトのラクトフェリン：ボードスペクトルポテンシャルをもつ新規な治療薬）」、Pharmacy & Pharmacology、２００１年１０月、５３）；（リチャードソン（Richardson）著、「Iron Chelators as therapeutic agents for the Treatment of Cancer（癌治療のための治療薬としての鉄キレート化剤）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．２６７−２８１）も参照のこと。
【特許文献６】米国特許第６，５８９，９６号
【非特許文献５４】クウォク（Kwok）ら著、「The Iron Metabolism of Neoplastic Cells : alterations that facilitate proliferation?（新生物細胞の鉄代謝：増殖を促進する変更？）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．６５−７８
【非特許文献５５】デソイズ（Desoize, B）編、「Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｐａｒｔ  ＩＩ  _  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（癌と金属および金属化合物、パートＩＩ−癌治療）、「Critical Reviews In Oncology/Hematology 、２００２年、第４２巻、ｐ．２１３−２１５
【非特許文献５６】コルリー（Collery）ら著、「Gallium in Cancer Treatment（癌治療におけるガリウム）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology 、２００２年、第４２巻、ｐ．２８３−２９６
【非特許文献５７】ワインバーグ（Weinberg）著、「Development of Clinical Methods of Iron Deprivation for Suppression of Neoplastic and Infectious Diseases（新生物性および感染性疾患の抑制のための鉄剥脱の臨床方法の開発）」、Cancer Investigation 、１９９９年、第１７巻、第７号、ｐ．５０７−５１３
【非特許文献５８】ワインバーグ（Weinberg）著、「Human Lactoferrin : a Novel Therapeutic with Board Spectrum Potential（ヒトのラクトフェリン：ボードスペクトルポテンシャルをもつ新規な治療薬）」、Pharmacy & Pharmacology、２００１年１０月、５３
【非特許文献５９】リチャードソン（Richardson）著、「Iron Chelators as therapeutic agents for the Treatment of Cancer（癌治療のための治療薬としての鉄キレート化剤）」、Critical Reviews In Oncology/Hematology、２００２年、第４２巻、ｐ．２６７−２８１
【００１３】
鉄デキストラン複合体が血液系へ投与されると、ＲＥＳ系のクリアランス率を上回るか下回る用量では、鉄の細胞毒性はデキストランシース（鞘）またはシェル（殻）によって阻止される。（ローレンス（Lawrence）著、「Development and Comparison of Iron Dextran Products（鉄デキストラン製品の開発および比較）」、J. of Pharm. Sci. & Tech., １９９８年、第５２巻、第５号、ｐ．１９０−１９７）；（コックス（Cox）著、「Structure of an iron-dextran complex（鉄−デキストラン複合体の構造）」、J. of Pharma & Pharmac, １９７２年、第２４巻、ｐ．５１３−５１７）；（ヘンダーソン＆ヒルマン（Henderson & Hillman）著、「Characteristics of Iron Dextran Utilization in Man(ヒトにおける鉄デキストラン利用の特徴)」、Blood、１９６９年、第３４巻、第３号、ｐ．３５７−３７５）；米国特許第５，６２４，６６８号」。鉄デキストランは血漿中に留まることが可能であって、何週間も体中を不活発に往来し、その間に食作用系および癌細胞により血漿から除去される。
【特許文献７】米国特許第５，６２４，６６８号
【非特許文献６０】ローレンス（Lawrence）著、「Development and Comparison of Iron Dextran Products（鉄デキストラン製品の開発および比較）」、J. of Pharm. Sci. & Tech., １９９８年、第５２巻、第５号、ｐ．１９０−１９７
【非特許文献６１】コックス（Cox）著、「Structure of an iron-dextran complex（鉄−デキストラン複合体の構造）」、J. of Pharma & Pharmac, １９７２年、第２４巻、ｐ．５１３−５１７
【非特許文献６２】ヘンダーソン＆ヒルマン（Henderson & Hillman）著、「Characteristics of Iron Dextran Utilization in Man(ヒトにおける鉄デキストラン利用の特徴)」、Blood、１９６９年、第３４巻、第３号、ｐ．３５７−３７５
【００１４】
銅および鉄は、基本的な代謝プロセスにおいて酸化還元反応を触媒する酵素のコファクターとしてのその機能の故に、全ての生物体にとり必須の微量元素である。（マッサロ（Massaro）編、「Handbook of Copper Pharmacology and Toxicity（銅の薬理学および毒性学ハンドブック）」、フマナ・プレス（Humana Press）、２００２年、第３０章、ｐ．４８１）。研究は、鉄のみの化合物を用いて検出される利用に比較して、有意に増加した鉄の利用を生じる結果となる、鉄と銅との間の相乗的相互作用を示してきた。（マッサロ（Massaro）、第３０章、上記）。血漿タンパク質トランスフェリンに対し鉄を結合するためには、Ｆｅ２＋からＦｅ３＋への酸化が必要である。この酸化は、マルチ銅フェロキシダーゼ、ヘファエスチン、またはセルロプラスミンによって仲介されてよい。ヘファエスチンは、トランスフェリン上への負荷のための血漿内への移出に先立ち、Ｆｅ２＋をＦｅ３＋へ酸化するべく、腸細胞の表面において、フェロポーチン１と一緒に作用してもよい。セルロプラスミンのさらなる重要な役割は、セルロプラスミンが合成される肝臓のような組織からの、鉄の動員である。セルロプラスミンは６個の銅原子を含有することが可能であり、肝臓から分泌され、組織への送達のための全血清銅の少なくとも９５％を運ぶことが可能である。加えて、セルロプラスミンはそのフェロキシダーゼ活性によって、肝臓からの、また組織への送達のための、鉄の放出を仲介する。このように、銅および鉄の双方が造血系、特に赤血球形成を支援している。各々は、赤血球の形成に必須である。
【非特許文献６３】マッサロ（Massaro）編、「Handbook of Copper Pharmacology and Toxicity（銅の薬理学および毒性学ハンドブック）」、フマナ・プレス（Humana Press）、２００２年、第３０章、ｐ．４８１
【００１５】
米国癌学会（The American Cancer Society）レポート、「Cancer Facts and Figures 2003（癌データ、２００３年）」は、「癌は、異常細胞の制御されない増殖および広がりによって特徴づけられる一群の疾患である。……２００３年には、米国で約１，３３４，１００の新たな癌症例が診断されると予想され、５５６，５００の癌死亡が２００３年に予想されている。」と開示している。本発明は、これに制限されないが、口腔および咽頭、消化系、呼吸系、骨および関節、軟組織、皮膚、乳房、生殖系、泌尿系、眼および眼窩、脳および他の神経系、内分泌系、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、および他の不特定の原発部位といった、上記「Cancer Facts and Figures 2003（癌データ、２００３年）」、第４頁に開示された癌の治療を包含する。本発明による治療はまた、基底および扁平上皮細胞皮膚癌、およびインシトゥの癌腫、過増殖性疾患、脊髄異形成障害、および、骨髄または稀には他の組織における形質細胞の増殖によって特徴づけられる、形質細胞ディスクラシアも包含する。これらの臨床上の異常性についての記載は、マークマン医師（Markman M.D.）により、「Basic Cancer Medicine（基礎癌内科学）」、Ｗ．Ｂ．サンダース社（W. B. Saunders Co.）、１９９７年、第１０３頁に開示されている。
【非特許文献６４】マークマン医師（Markman M.D.）により、「Basic Cancer Medicine（基礎癌内科学）」、Ｗ．Ｂ．サンダース社（W. B. Saunders Co.）、１９９７年、第１０３頁
【００１６】
最小で細胞死を果たし、癌細胞の複製を防止し、かつ、古典的で数多くの致命的な化学療法の副作用を回避するために、身体の全ての細胞に栄養を与える生体適合性の材料を用いる有効な化学療法薬を開発することは有利であろう。かかる治療薬は、多くの医薬品によって引き起される、組織抵抗性および特異性の欠如という問題を回避することができ、それにより、以前には管理不能であった多くの癌を、患者を衰弱させるかまたは死亡させることなく、破壊するかまたは不能にする。
【００１７】
ウイルス性疾患に関しては、肝炎が最も重要な実例である。肝炎は、一般に、ウイルス感染によって引き起され、多くの異なる系統を含むであろう。Ｃ型肝炎は最も一般的な系統であり、血液を介した最大の感染症であり、米国では慢性肝疾患の最も重要な原因の一つである。Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）病は、肝臓の炎症を引き起す疾患である。ＨＣＶは、フラビウイルス科およびヘパシウイルス属の単鎖ＲＮＡウイルスであり、少なくとも６つの遺伝子型と、５０を超えるＨＣＶのサブタイプとを有する。Ｃ型肝炎は、米国における肝臓移植の、ならびに急性ウイルス性肝炎の１５パーセント、慢性肝炎の６０〜７０％、および、肝硬変、末期肝臓疾患、および、肝細胞癌を含めた肝臓ウイルス性疾患の５０％までの主な原因である。米国疾病管理予防センター（U.S. Center for Disease Control and Prevention）は、米国人口の約１．８パーセントかまたは３９０万人のアメリカ人がＨＣＶに感染されており、これらのうちのほとんどの症例が診断未確定であると報告している。世界的には、世界保健機構（World Health Organization）は、世界の人口の約３パーセントである１億７千万人が、慢性的にＨＣＶに感染されており、さらに３〜４百万人が毎年新たに感染している。
【００１８】
Ｃ型肝炎感染の経過は、ＨＩＶ感染に関連した免疫不全により加速される可能があり、それにより肝硬変の発生率が増加する。Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）との同時感染もまた、強められた慢性Ｃ型肝炎の重篤さ、および肝硬変への加速された進行と関連づけられてきた。さらに、ＨＢＶの同時感染は、肝細胞癌の発症のリスクを増大するように思われる。（たとえば、同時感染情報に関しては、イーメディスン・コム・インク（eMedicine. Com, Inc）を参照のこと）。
【００１９】
Ａ型肝炎は、ピコルナウイルス科、ヘパトウイルス属の、非エンベロープ、プラス鎖ＲＮＡウイルスである、Ａ型肝炎ウイルス（「ＨＡＶ」）によって引き起される。ＨＡＶは、肝細胞中で複製しながら肝臓の機能を妨害する。病理学的損傷の結果として、肝臓は炎症性になる。ＨＡＶは感染性肝炎の主原因であることが見出されている。
【００２０】
Ｂ型肝炎は、４２ｎｍの部分的に二重鎖の環状ＤＮＡゲノムを含有するエンベロープのあるウイルスであり、かつヘパドナウイルス科に分類される、Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」）によって引き起される。Ｂ型肝炎は、重篤で一般的な肝臓の感染性疾患であり、世界中で数百万の人々を冒している。ＨＢＶは血清肝炎の主要な原因であると信じられている。肝炎デルタウイルス（「ＨＤＶ」）は、それ自身のビリオンコートとしてＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を使用したことから、伝播に関してＨＢＶに依存することが示された。この抗原は、その細胞内局在性において、Ｂ型肝炎コア抗原（「ＨｂｃＡｇ」）に類似している。その存在は常にＨＢＶ感染と関連していたが、ＨＢcＡｇと共存することはめったになかった。ＨＤＶ感染は、ＨＢＶとの同時感染としてか、または慢性ＨＢＶ感染をもつ人の重感染として獲得されることが可能である。ＨＢＶ−ＨＤＶ同時感染をもつ人は、ＨＢＶのみに感染された人に比較して、より重篤な急性疾患および、より高い劇症肝炎のリスク（２〜２０％）を有することがある。しかしながら、慢性ＨＢＶ感染は、ＨＢＶ−ＨＤＶ同時感染をもつ人ではさほど頻繁に起こらないように見える。ＨＤＶの重感染を獲得する慢性ＨＢＶの保因者は、通常、慢性ＨＤＶ感染を発症する。ＨＤＶの重感染をもつ慢性ＨＢＶ保因者についての長期間の研究では、慢性ＨＢＶ感染のみの患者の１５％〜３０％に比較して、７０％〜８０％が肝硬変のある慢性肝疾患の証拠を現していた。
【００２１】
Ｅ型肝炎は、非エンベロープ、球形、プラス鎖ＲＮＡウイルスである、Ｅ型肝炎ウイルス（「ＨＥＶ」）によって引き起される。いくつかの異なる株が単離され、部分的にキャラクタライズされ、分子クローニングされた（１９９０−９２）。当初はカリシウイルス科に分類されたが、それらは現在分類不能である。ＨＥＶは、１５〜４０才の成人において、一過性の急性ウイルス性肝炎を引き起す。症候性ＨＥＶ感染は、小児ではまれである。小児ではＨＥＶ感染は頻繁ではあるが、ほとんどが無症候性および無黄疸性である。
【００２２】
Ａ型肝炎およびＢ型肝炎を予防するためのワクチンが存在する。欠損ウイルスによって引き起されたＤ型肝炎は、ＨＢＶなしでは無害である。Ａ型肝炎およびＥ型肝炎の双方は、一過性であり、ほとんどの症例において、一定期間の後に終わる。Ｃ型肝炎は、しかしながら、欠損性でも一過性でもなく、感染を予防するためのワクチンは現在存在していない。
【００２３】
典型的な徴候と、急性ウイルス性肝炎の症状とをもつ患者の中には、これらのタイプのウイルス性肝炎のいずれの血清マーカーももたないものがあり、非ＡＢＣＤＥ肝炎を有するとして分類される。最近、非ＡＢＣＤＥ肝炎をもつ患者において新たなウイルスが発見された。
【００２４】
慢性肝炎、特にＣ型肝炎をもつ人々のための現在の治療オプションは、通常、ライフスタイルの変更と厳密な薬物レジメンを組合せている。肝臓の代謝性の役割の故に、疾病の進行の速度を左右する上で、食事制限は重要な役割を最も果たしやすい。Ｃ型肝炎に感染された人の病的な肝臓は、ナトリウム、脂肪、および特に、投薬の有効性を低下させるアルコールを含めた、いくつかの生成物の過剰によって特に影響され得る。多くの通常の治療の失敗と、薬物レジメンに関連した副作用の重さとの故に、Ｃ型肝炎に感染された人の中には、本草学および植物学、リラクゼーション、および精神治癒の使用を包含し得る別の治療法へ転向する人もいる。
【００２５】
インターフェロンは、Ｃ型肝炎の通常の薬物療法の主力である。インターフェロンは天然に生じる糖タンパク質であり、ウイルス感染に応答して細胞によって分泌される。インターフェロンは、細胞表面の特定の受容体へ結合し、タンパク質−タンパク質相互作用の複雑なカスケードにより細胞内シグナリングを開始し、遺伝子転写の迅速な活性化をもたらす。インターフェロンに刺激された遺伝子は、感染細胞におけるウイルス複製の阻害、細胞増殖の阻害、および免疫制御を含めた多くの生物学的作用を調整する。インターフェロンアルファの種々の組換え型、およびインターフェロンアルファ−２ｂ、および天然には生じない組換え型のＩ型インターフェロンが、ウイルス性Ｃ型肝炎を治療するべく承認されている。しかしながらインターフェロンは、イライラ、抑うつ、不安、および自殺行為、白血球および血小板の数の減少、心臓の問題、全身性エリテマトーデスを含めた、結果として自己免疫疾患を生じる可能性がある体器官の問題といった、身体的および心理的副作用の双方を引き起すことが公知である。インフルエンザ様の副作用もまた一般的である。インターフェロンは、免疫系による破壊からの保護として、また体内でより長い滞留時間を与えることから、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）をリジンへの安定なアミド結合を介してインターフェロン分子へ結合することにより、しばしばＰＥＧ化される。リバビリンは、肝炎の治療のためにインターフェロンとしばしば併用され、ウイルスの増殖の防止において何らかの効果をもつと信じられている。
【００２６】
感染症は、毎年１０００万を超える人を殺しており、その９０パーセントをこえる人は発展途上世界に局在している。マラリアおよび他の、ベクター媒介性疾患は、世界中で約１０億人に感染している。こうした数値は現在、マラリアが薬剤耐性株の寄生体の出現、寄生体を媒介する殺虫剤耐性である蚊の出現、環境変化、および人口増加といった要因に基づく再燃を受けていることから、増加することが予想されている。
【００２７】
ほとんどの抗感染マラリア薬は、ヒト宿主とは有意に異なる原虫代謝という局面を妨害する。マラリア原虫のプラスモディウム（Plasmodium）種が、ヒトに感染する。熱帯熱マラリア（P. falciparum）寄生体は、ヒトにおける最も致死性の形状のマラリアの原因であり、かつ最も一般的な種である。三日熱マラリア（P. vivax）、卵形マラリア（P. ovale）、および四日熱マラリア（P. malariae）を含めた他の種は、毒性の低いタイプの疾病を引き起こすことがある。蚊は、スポロゾイトとしても公知の寄生体を、哺乳類の皮下組織内へ、または時には直接血流中へ注入する。寄生性スポロゾイトは次に肝臓まで移動し、そこで侵襲の前にいくつかの肝細胞を通過すると信じられている。その後寄生体の発生が始まる。スポロゾイト上のコリセプターが侵襲を仲介する。コリセプター、トロンボスポンジンは、あるドメインを介し、洞様毛細血管内皮およびクッパー細胞への付着成長において、肝細胞上のヘパリン硫酸プロテオグリカンに特異的に結合する。各スポロゾイトは、肝細胞の内側で一度に数万のメロゾイトに発育し、肝臓からの放出に際し、それらは各々赤血球（erythrocyte）（または赤血球（red blood cell「ＲＢＣ」）に侵入することが可能である。プラスモディウムは、そのライフサイクルの相の間中、宿主赤血球に感染しており、そのことがマラリアの症状を誘発する。寄生体は、侵入、増殖、および感染された赤血球からの放出からなる４８時間のサイクルを有する。このサイクルの間に寄生体は、宿主赤血球細胞膜の透過性に大きな増加を引き起し、寄生体が宿主の血流から栄養物を獲得し、老廃物を放出できるようにする。マラリア寄生体は、宿主細胞中のヘモグロビンの８０％までを分解させる。この分解はリソソーム食胞中で起こり、少なくともアスパラギン酸プロテアーゼ（プラスメプシン）、システインプロテアーゼ・ファルシパイン−２、および、メタロペプチダーゼを含めた多くの付加的なペプチダーゼを含む。その結果は、大量のＦｅ（ＩＩ）へムの放出を含み、それはＦｅ（ＩＩＩ）ヘマチンへ迅速に酸化され、凝集したヘムダイマーからなる構造格子を含んでなるヘモゾインと呼ばれる不活性色素として隔離される。
【００２８】
寄生体のその宿主内での生存には、いくつかの代謝上の適応が必要であり、そのことがそれを化学療法的攻撃に影響されやすくしており、いくつかの薬物標的が、異質のオルガネラ構造の機能に対して標的化されることが可能である。キノリン、芳香族アルコール抗マラリア薬、および、アルテミシニンおよび他の抗マラリア過酸化物は、食胞内で濃縮され、ヘムとの相互作用によってそれらの活性を及ぼすと信じられている。キノリンは、その芳香族性の平面構造の互い違いのスタッキングを介してヘムへ結合することにより、ヘモゾインの有効な形成を混乱または妨害し、その結果としてヘム介在性の毒性を寄生体に対して生じ、脂質の過酸化を誘導することがあると信じられている。アルテミシニンは、最もありそうなことにはＦｅ（ＩＩ）ヘムとの相互作用を介して、そのペルオキシド結合の酸化還元的切断を食胞内で受けることが可能である。これらの相互作用は、寄生体に対し致命的なフリーラジカル誘導性の損傷を生成すると信じられている。しかしながら、厳密な生成の機構および寄生体死の機構は分かっていない。
【００２９】
しかしながら、耐性は、多くの一般に流通されている薬物、特に安価なタイプを発生している。さらに、実際問題として、普通に市販されている安価な薬物に対し広く行渡った耐性をすでに有しているかもしれない国では、大多数の抗マラリア感染薬を用いてマラリア患者を治療するコストは、ほとんどの地域社会または家族にとり手頃ではないといってよい。
【００３０】
抗マラリア治療を得るために生体適合性の材料を用いており、原虫を殺すと同時に、赤血球、白血球、血小板の産生を支援し、広範にわたる鉄欠乏症および貧血症に対処し、炭水化物を供給し、かつ、身体にとって天然である成体材料から構成され、全ての正常細胞を養う、有効な薬剤を開発することは有利であろう。
【００３１】
一般には「エボラ」と呼ばれるエボラ出血熱は、ヒトおよび非ヒト霊長類に感染する最も致死的なウイルス性疾患の一つである。エボラウイルスによって引き起されるこの感染症は、１９７６年に初めてそれが発見されたザイールの川にちなんで名づけられた。その発見以来、様々な株のウイルスが５０〜９０パーセントの死亡率で流行を引き起してきた。
【００３２】
エボラウイルスは、フィロウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスの一員であり、関連性はあるが、より致死性の低い出血性疾患、マーブルグウイルスに類似している。粒子は多形性であるが、基本的な構造は長く糸状であり、本質的には杆状であって、ウイルスはしばしば「Ｕ」字型を呈する。粒子は長さ１４，０００ｎｍまでが可能であり、直径平均は８０ｎｍである。エボラウイルスは糖タンパク質に包埋された外側の脂質膜と、ウイルスＲＮＡを取囲む内側のウイルスカプシドとからなる。ウイルスゲノムは、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡからなり、それ自身では非感染性であり、ポリアデニル化されておらず、直線的な遺伝子配列をもつ。全ビリオン、すなわちタンパク質シェルによって取囲まれたＲＮＡからなる完全なウイルス粒子が、ウイルスの感染性の形状を構成する。たとえば、米国疾病管理センター（United States Center for Disease Control）（「ＣＤＣ」）のウェブサイトを参照。
【００３３】
ウイルスは未知の機構によって細胞に侵入し、感染された細胞の細胞質内で、ウイルスはそのＲＮＡを転写し複製する。感染が進行するにつれて、感染された細胞の細胞質は「顕著な封入体」を生じ、それは高度に構造化されるようになることが可能な、ウイルスヌクレオカプシドを含有する。ウイルスは次に集合し、宿主細胞から出芽し、感染された細胞の外膜からそのリポタンパク質コートを得る。
【００３４】
エボラの４つの異なる株が存在することが公知であり、それらのうち３つがヒトにおいて疾病を引き起こす。それらの大発生の場所にちなんで、それらはエボラ・ザイール（Ebola-Zaire）（致死率９０％）、エボラ・スーダン（Ebola-Sudan）（致死率５０％）、およびエボラ・アイボリーコースト（Ebola-Ivory Coast）（１症例が報告された。患者は生存）。４番目、エボラ・レストン（Ebola-Reston）は、非ヒト霊長類で疾病を引き起こしたが、ヒトにおいてはなかった。エボラ出血熱の確認された症例は、アフリカの数カ国において、ならびに、研究所作業員が針刺し事故の結果として疾病になった英国において報告されている。エボラ・レストンウイルスは、米国および伊国で、研究施設へ輸入されたサルにおいて重篤な疾病および死を引き起した。これらの大発生の間に、数名の研究員がウイルスに感染していったが、発病はしなかった。エボラは、典型的には散発性の大発生において出現し、通常は、注射針の不適切な殺菌を介したヘルスケア・セッティングの中で広がる。散発的な、隔離された症例はよく起きているが（エボラ・アイボリーコーストのように）、未承認および未報告になることがある。エボラウイルスの天然の保有者は、分からないままである。
【００３５】
フィロウイルスの病因論についてはほとんど知られていない。しかしながら、エボラがリンパ組織の機能に重要な細胞を攻撃することは公知である。ウイルスは、皮膚下の疎性結合組織の中の、線維芽細胞様細網細胞（「ＦＲＣ」）において、またリンパ節中のＦＲＣ導管において検出可能である。このことは、エボラが迅速に血液中に入ることを可能にし、かつ高内皮細静脈におけるリンパ球の帰巣の破壊をもたらす。フィロウイルスについてのスタンフォード大学（Stanford University）ウェブサイトを参照のこと。出血(hemorraghic)熱の特質から、感染に対する宿主の免疫応答についてはほとんど分かっていない。産生された抗体は、主としてウイルスの表面糖タンパク質を攻撃する。死亡する患者は、通常、死ぬ時点ではウイルスに対する有意な免疫応答を発達させていなかったことが知られている。たとえば、米国疾病管理センター（United States Center for Disease Control）のウェブサイトを参照。抗エボラ抗体は、モルモットにおいて検出されているが、ヒトに対するその伝達の証拠はない。カナダ研究所安全局（Canadian Office of Laboratory Safety ）ウェブサイトを参照のこと。
【００３６】
エボラを、わずか数日感染していただけの個体において診断することは困難であるが、その理由は、目の充血および皮膚発疹といった初期症状が、このウイルスに非特異的であって、はるかに頻繁に発生する疾病の他の患者において見られることからである。抗原捕捉酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）試験、ＩｇＭ  ＥＬＩＳＡ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびウイルス単離は、症状開始数日以内のエボラ出血熱（ＨＦ）の症例を診断するために使用可能である。疾病の経過の後期か、または回復後に試験された人は、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体について試験されることが可能である。この疾病はまた、ウイルス単離、免疫組織化学試験、またはＰＣＲを用いることにより、死亡した患者において遡及的に診断されることも可能である。
【００３７】
エボラの既知の治療法はどれもこれまで成功していない。現在の治療法は、腎機能および電解質バランスを維持すること；および、出血およびショックの抑制に努めることに向けられている；回復期血清の輸液もまた有益であるといってよい。免疫系を増強するインターフェロン、および抗ウイルス薬リババリン（ribavarin）を含めた標準的な抗ウイルス療法は、エボラウイルスに対して有効であることが証明されていない。カナダ研究所安全局（Canadian Office of Laboratory Safety ）ウェブサイトを参照のこと。患者がより長く生き続けられるほど、より多くの時間が天然の免疫応答を発達させるために与えられることから、回復のチャンスは大きくなる。今日まで、ヒトに使用するために承認されたエボラ用ワクチンはない。
【００３８】
ワクチン研究センター（Vaccine Research Center）（ＶＲＣ）の研究者らは、米陸軍感染症医学研究所（US Army Medical Research Institute for Infectious Diseases）（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）、および疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）（ＣＤＣ）とともに、非ヒト霊長類において、エボラウイルス感染症のための潜在的に有効なワクチン戦略を開発してきた。２００３年、ＶＲＣはエボラ感染症を予防するべくデザインされたＤＮＡワクチンの初の人体試験を開始した。もし、エボラウイルスからの３つの遺伝子を含有するこのＤＮＡワクチンがヒトにおいて安全であることが証明されるなら、ワクチンは、保健医療従事者、軍人、および、起こりうるバイオテロリズム攻撃への最初の対応者を保護するための長期間の予防薬の一部として将来的に利用可能となるであろう。
【００３９】
天然痘（スモールポックス）は、「人の業績の天頂および天底の双方」を表すと言われている。それは、ひとたび何百万人もの死および損傷を引き起せば、政治およびイデオロギーの境界を超越して一致団結した広範囲の努力を通じて首尾よく撲滅される、唯一の疾病である。こうした努力の故に、この一度に高い死亡率の感染の自然発生した症例は、１９７７年１０月２６日以降起きたとの記録はない（最後の自然発生した症例は、ソマリアの病院のワクチン未接種の料理人であった）。天然痘は、１９８０年、世界保健機構（ＷＨＯ）により、撲滅されたと公式に宣言された。これにもかかわらず、または、もしかしたらこのことの故に、その撲滅後２０年を超えて、天然痘は今一度まさに現実の脅威である。
【００４０】
公式には、天然痘は研究目的のみのため、疾病管理予防センター（Center for Disease Control and Prevention）、米国ジョージア州アトランタ、および、ロシア国立ウイルス学・バイオテクノロジー研究センター、ロシア連邦ノボシビルスク地域コルツォボ、の２ヶ所に存在する。世界の他の地域における秘密の備蓄の程度は分からないままである。しかしながら、テロリストまたはならず者国家が、これまでに考え出された最も破壊性の可能性のある生物兵器の一つとして、このウイルスを解き放つかもしれないという懸念はある。天然痘は、感染された人の咳からの呼吸器分泌物（空中浮遊飛沫）により、または感染された皮膚病巣との直接的な接触を介して、人から人へまき散らされることから、天然痘は生物兵器としてエアロゾルの形状で散布されることも可能であろう。
【００４１】
レンガ型によって特徴づけられるポックスウイルスは、光学顕微鏡で見ることのできる最大の動物ウイルスであり、いくつかの細菌よりも大きい。天然痘は、ポックスウイルス（Poxviridae）科、コルドポックスウイルス（Chordopoxvirinae）亜科、オルトポックスウイルス（Orthopoxvirus）属の一員であるバリオライルスによって引き起される。この属の他のメンバーは、牛痘、ラクダ痘、およびサル痘を含む。ビリオンはＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを含有する；この酵素が必要であるのは、ウイルスが細胞質中で複製しかつ、核内に局在する細胞ＲＮＡポリメラーゼにアクセスすることができないことからである。ポックスウイルスは、核を必要とせずに細胞の細胞質中で複製可能であることが知られている唯一のウイルスである。
【００４２】
天然痘（variola major）および軽症型天然痘（variola minor）という２つの主要な形状の天然痘が存在する。似たような病変を示しながら、より一般的ではない軽症型天然痘では、この疾病は非常に穏やかな経過をとり、約１パーセントの症例死亡率を有する。比較して、天然痘は全症例の約３０パーセントが致死性である。天然痘にはまた、出血性および悪性という２つの稀な形状がある。常に致死性の形状である前者においては、発疹は粘膜および皮膚内への出血を伴う。悪性天然痘は、膿疱期まで発達せず、柔らかく扁平のまま残っている病巣によって特徴づけられる。それはほとんどいつも致死性である。
【００４３】
ウイルスの侵入は通常、気道および局所リンパ節を通して達成され、それに続きウイルスは血液中に入る（第一次ウイルス血症）。細胞への侵入および脱外被の後、ビリオンのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが初期ｍＲＮＡを合成し、それは初期の非構造タンパク質−主として、ウイルス複製における次の段階に必要な酵素−へ翻訳される。ウイルスＤＮＡは、典型的な半保存様式で複製され、その後に後期の構造タンパク質が合成され、それが子孫ビリオンを形成することとなる。ビリオンは集められ、それらが細胞から放出される際、細胞膜から出芽することによってそれらのエンベロープを獲得する。内部臓器は感染される。次いでウイルスは血液中に再び入り（第二次ウイルス血症）、皮膚へ広がる。こうした事象は、患者がまだ元気に見える潜伏期間の間に起こる。天然痘の潜伏期間は、７から１７日までであり、最も一般的には１２と１４日の間である。この期間の間は、ウイルス放出の形跡はない。本人は健康であるように見え、健康を感じており、他者を感染させる可能性はない。
【００４４】
既存のワクチンは有効であることが証明されているが、しかし高発生率の有害副作用も有している。このリスクは充分に高く、もし実際の暴露のリスクがないか、またはほとんどないなら、ワクチン接種は認可されない。ワクチン接種された１００万人毎に一人が、種痘性湿疹、進行性種痘疹、全身性種痘疹、および種痘後脳炎を含めた副作用で死ぬと推定されている。現在、ウイルスに感染した人のための既知の抗ウイルス治療法はないことから、予防は天然痘に対処するための唯一の有効な方法である。
【００４５】
天然痘は、根絶前は、ワクチン未接種の人で３０％の死亡率を保持していた。研究者は、ワクチン接種された個体が約１０年間にわたり免疫性を保持すると推定しているが、その持続時間は完全には評価されていない。米国における一般住民のワクチン接種は、１９８０年以降は中止されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４６】
本開示は、哺乳類における、抗癌特性およびその使用法、抗ウイルス特性およびその使用法、抗原虫特性およびその使用法、および、抗細菌特性およびその使用法といった、哺乳類の疾病に使用するための医薬特性を有する組成物に関する。医薬品としての使用のための化学組成物は、生物学的に許容される銅化合物、また鉄のような他の成分を含んでもよく、製薬上許容される担体中で、苦しんでいる細胞へ輸送される。たとえば、化合物は、少なくとも生物学的に許容される銅化合物のコアから形成されてよく、それは、銅化合物コアを取囲むかまたはコートし、かつ、コアの周囲環境との即時の化学的相互作用を防止するシースで被包されてもよい。組成物は、患者への投与のための製薬上許容される担体と組合わされており、単独で、または通常の治療と併用して使用されてよい。
【００４７】
また、生物学的に許容される銅化合物コアを有する組成物を、該銅化合物コアを被包するシースおよび、製薬上のキャリアとともに患者に対し投与することにより、疾病を治療するための方法も開示される。患者は、疾病のレベルおよび／または存在を測定するべく、定期的にモニターされる。組成物は、モニタリングの結果に基づき、医師により医学的に必要であると決められた間隔で、再投与されてもよい。
【００４８】
以下の、開示された態様についての詳細な記述、および添付された図面およびクレームを綿密に調べた後は、当業者には、本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点が、限定されることなく明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】鉄デキストラン単独および組成物単独および併用による、２４時間の前培養の後の、ＨＴ２９ヒト結腸腺腫細胞系によるＲＯＳの放出のグラフである。
【図２Ａ】ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図２Ｂ】ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、用量反応の図表である。
【図２Ｃ】組成物単独を用いたＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図２Ｄ】ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の平均％阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図２Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の図表である。
【図２Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図３Ａ】ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図３Ｂ】ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた図表である。
【図３Ｃ】組成物単独を用いたＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図３Ｄ】ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図３Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の図表である。
【図３Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図４Ａ】ＭＣＦ７乳房細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図４Ｂ】ＭＣＦ７乳房細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図４Ｃ】組成物単独を用いたＭＣＦ７乳房細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図４Ｄ】ＭＣＦ７乳房細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図４Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＭＣＦ７乳房細胞の図表である。
【図４Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＭＣＦ７乳房細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図５Ａ】ＺＲ−７５−１乳房細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図５Ｂ】ＺＲ−７５−１乳房細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図５Ｃ】組成物単独を用いたＺＲ−７５−１乳房細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図５Ｄ】ＺＲ−７５−１乳房細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図５Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＺＲ−７５−１乳房細胞単独の図表である。
【図５Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＺＲ−７５−１乳房細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図６Ａ】ＰＣ−３前立腺細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図６Ｂ】ＰＣ−３前立腺細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図６Ｃ】組成物単独を用いたＰＣ−３前立腺細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図６Ｄ】ＰＣ−３前立腺細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図６Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＰＣ−３前立腺細胞の図表である。
【図６Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＰＣ−３前立腺細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図７Ａ】ＤＬＤ−１結腸細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図７Ｂ】ＤＬＤ−１結腸細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図７Ｃ】組成物単独を用いたＤＬＤ−１結腸細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図７Ｄ】ＤＬＤ−１結腸細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図７Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＤＬＤ−１結腸細胞の図表である。
【図７Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＤＬＤ−１結腸細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図８Ａ】ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図８Ｂ】ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図８Ｃ】組成物単独を用いたＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図８Ｄ】ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図８Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の図表である。
【図８Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図９Ａ】ＣＡＫＩ−１腎細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図９Ｂ】ＣＡＫＩ−１腎細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図９Ｃ】組成物単独を用いたＣＡＫＩ−１腎細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図９Ｄ】ＣＡＫＩ−１腎細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図９Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＣＡＫＩ−１腎細胞の図表である。
【図９Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＣＡＫＩ−１腎細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図１０Ａ】ＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図１０Ｂ】ＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図１０Ｃ】組成物単独を用いたＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図１０Ｄ】ＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図１０Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞の図表である。
【図１０Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図１１Ａ】ＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図１１Ｂ】ＳＢＮ−７５ＣＳＮ細胞の、対照、組成物単独、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独を用いた、用量反応の図表である。
【図１１Ｃ】組成物単独を用いたＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図１１Ｄ】ＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞の平均パーセント阻害に対しプロットされた、組成物プラスベース化合物の濃度のグラフである。
【図１１Ｅ】対照、組成物プラスベース化合物、ベース化合物単独、およびドキソルビシン単独による、ＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞の図表である。
【図１１Ｆ】組成物プラスベース化合物を用いたＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞の、ＩＣ50値についての図表である。
【図１２Ａ】ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図１２Ｂ】ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞データの、アッセイされた毒性値の図表である。
【図１２Ｃ】ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞データの、ＩＣ50を提供する。
【図１３Ａ】ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞の平均％阻害に対してプロットされた、組成物単独の濃度のグラフである。
【図１３Ｂ】ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞データの、アッセイされた毒性値を示す。
【図１３Ｃ】ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞データの、ＩＣ50を提供する。
【図１４】使用された細胞系および本開示の結果の表である。
【図１５Ａ】サル血漿において時間を追って検出された、鉄デキストランから派生された元素鉄の相当量の濃度についての表の部分である。
【図１５Ｂ】サル血漿において時間を追って検出された、鉄デキストランから派生された元素鉄の相当量の濃度についての表の部分である。
【図１５Ｃ】サル血漿において時間を追って検出された、鉄デキストランから派生された元素鉄の相当量の濃度についての表の部分である。
【図１６】サル血漿において時間を追って検出された、鉄デキストランから派生された元素鉄の一回量の投与の表である。
【図１７】標準化された５−２細胞系抗ウイルス評価用の９６ウエルプレートフォーマットの表である。
【図１８】抗ウイルス評価のための、標準化された５−２細胞系抗ウイルス評価９６ウエルプレートフォーマットの表である。
【図１９】ルシフェラーゼに基づく評価を用いた、ＨＣＶに対する組成物４の、インビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図２０】ルシフェラーゼに基づく評価を用いた、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンに対する組成物ＨＰの、インビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図２１】ルシフェラーゼに基づく評価を用いた、ＨＣＶに対するヒトインターフェロンアルファ２ｂの、インビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図２２】ルシフェラーゼに基づく評価を用いた、ＨＣＶに対するリバビリンの、インビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図２３】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図２４】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図２５】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図２６】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図２７】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図２８】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図２９】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３０】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３１】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３２】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３３】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３４】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３５】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３６】組成物４およびベース化合物の効果についての３Ｄグラフ表示を示している。
【図３７】抗ウイルスＨＢＶ評価用の、標準化された５−２細胞系抗ウイルス評価９６ウエルプレートフォーマットの表である。
【図３８】抗ウイルスＢＶＤＶ評価用の、標準化された５−２細胞系抗ウイルス評価９６ウエルプレートフォーマットの表である。
【図３９】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４０】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、３ＴＣのインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４１】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、ベース化合物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４２】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物およびベース化合物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４３】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物およびベース化合物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４４】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物およびベース化合物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４５】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物およびベース化合物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４６】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４７】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、３ＴＣのインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４８】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、３ＴＣのインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図４９】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物ＨＰおよびベース化合物のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図５０】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、３ＴＣのインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図５１】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物４のインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図５２】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、３ＴＣのインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図５３】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、３ＴＣのインビトロの抗ウイルススクリーンの結果を示している。
【図５４】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物のインビトロの抗ウイルススクリーンおよびＸＴＴアッセイの結果を示している。
【図５５】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、インターフェロンアルファ２ｂのインビトロの抗ウイルススクリーンおよびＸＴＴアッセイの結果を示している。
【図５６】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、組成物４のインビトロの抗ウイルススクリーンおよびＸＴＴアッセイの結果を示している。
【図５７】ＨｅｐＧ２．１５細胞におけるウイルス産生に対する、インターフェロンアルファ２ｂのインビトロの抗ウイルススクリーンおよびＸＴＴアッセイの結果を示している。
【図５８】カニクイザル一次肝細胞の細胞毒性評価実験の抗ウイルススクリーンの結果を示す。
【図５９】マイコバクテリウム・tubercoloisを用いた、組成物のインビトロの活性についての、１０μｇ／ｍｌの組成物が９０％のバチルスを殺生している実験結果の表を示す。
【図５９Ａ】マイコバクテリウム・tubercoloisを用いた、組成物のインビトロの活性についての、１０μｇ／ｍｌの組成物が９０％のバチルスを殺生している実験結果の表を示す。
【図６０】マイコバクテリウム・tubercolois杆菌の阻害のパーセントを、組成物の濃度に関して示している。
【図６１】ベースと一緒に使用された組成物濃度の表を示している。
【図６２】ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図６２Ａ】ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図６３】ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価のための、パラメータの表を示す。
【図６４】ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価の、抗ウイルス試験の値を示す。
【図６５】図６２、６２Ａ、６３、および６４に表示されたデータのグラフを示している。
【図６６】２番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図６６Ａ】２番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図６７】図６６および６６Ａのデータに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価のための、パラメータの表を示す。
【図６８】２番目のプレート関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価のための、抗ウイルス試験の値を示す。
【図６９】図６６、６６Ａ、６７、および６８に表示されたデータのグラフを示している。
【図７０】３番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図７０Ａ】３番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図７１】図７０および７０Ａのデータに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価のための、パラメータの表を示す。
【図７２】２番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価についての、抗ウイルス試験の値を示す。
【図７３】図７０、７０Ａ、７１、および７２に表示されたデータのグラフを示している。
【図７４】４番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図７４Ａ】４番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価を示す。
【図７５】図７４および７４Ａのデータに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価のための、パラメータの表を示す。
【図７６】２番目のプレートに関する、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼに基づく抗ウイルス評価についての、抗ウイルス試験の値を示す。
【図７７】図７４、７４Ａ、７５、および７６に表示されたデータのグラフを示している。
【図７８】４μｇ／ｍｌの＃２５および０．８μｇ／ｍｌの＃４によってスパイクされた、化合物＃２３６の、新鮮なヒトＰＢＭＣのＨＩＶ−１臨床分離株に対する活性を示す。
【図７９】＃２５および＃４のスパイクを用いた、または用いない、ウイルス対照の比較である。
【図８０】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害を示す。
【図８０Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害を示す。
【図８１】図８０および８０Ａのデータについての評価を示す。
【図８２】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害の図表である。
【図８３】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害のデータである。
【図８３Ａ】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害のデータである。
【図８４】図８３および８３Ａのデータについての評価を示す。
【図８５】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害のグラフである。
【図８６】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害である。
【図８６Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害である。
【図８７】図８６および８６Ａのデータについての評価を示す。
【図８８】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害のグラフである。
【図８９】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｍｄｒ複製の阻害を示しているデータである。
【図８９Ａ】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｍｄｒ複製の阻害を示しているデータである。
【図９０】図８９および８９Ａのデータについての評価を示す。
【図９１】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ＲＯＪＯ複製の阻害のグラフである。
【図９２】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｇ９１０．６．２．３複製の阻害の図表である。
【図９２Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｇ９１０．６．２．３複製の阻害の図表である。
【図９３】図９２および９２Ａのデータについての評価を示す。
【図９４】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｇ９１０．６．２．３複製の阻害のグラフである。
【図９５】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｇ９１０．６．２．３複製の阻害についてのデータである。
【図９５Ａ】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｇ９１０．６．２．３複製の阻害についてのデータである。
【図９６】図９５および９５Ａのデータについての評価を示す。
【図９７】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｇ９１０．６．２．３複製の阻害についてのグラフである。
【図９８】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害を示している。
【図９８Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害を示している。
【図９９】図９８および９８Ａのデータについての評価を示す。
【図１００】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害のグラフである。
【図１０１】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害のグラフである。
【図１０１Ａ】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害のグラフである。
【図１０２】図１０１および１０１Ａのデータについての評価を示す。
【図１０３】デキストラン硫酸対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害のグラフである。
【図１０４】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害である。
【図１０４Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害である。
【図１０５】図１０４および１０４Ａのデータについての評価を示す。
【図１０６】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害の図表である。
【図１０７】ＡＺＴによる、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害。
【図１０７Ａ】ＡＺＴによる、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害。
【図１０８】図１０７および１０７Ａのデータについての評価を示す。
【図１０９】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ５２−５２複製の阻害のグラフである。
【図１１０】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｔｅｋｉ複製の阻害についてのデータである。
【図１１０Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｔｅｋｉ複製の阻害についてのデータである。
【図１１１】図１１０および１１０Ａのデータについての評価を示す。
【図１１２】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害のグラフである。
【図１１３】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｔｅｋｉ複製の阻害についてのデータである。
【図１１３Ａ】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｔｅｋｉ複製の阻害についてのデータである。
【図１１４】図１１３および１１３Ａのデータについての評価を示す。
【図１１５】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｔｅｋｉ複製の阻害を示している。
【図１１６】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害についてのデータである。
【図１１６Ａ】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害についてのデータである。
【図１１７】図１１６および１１６Ａのデータについての評価を示す。
【図１１８】４μｇ／ｍｌの化合物＃２５および０．８μｇ／ｍｌの化合物＃４と一緒の化合物＃２３６による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害のグラフである。
【図１１９】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害についてのデータである。
【図１１９Ａ】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害についてのデータである。
【図１２０】図１１９および１１９Ａのデータについての評価を示す。
【図１２１】ＡＺＴ対照による、ＰＢＭＣにおけるＨＩＶ−１ ｂｒ／９２／０２６複製の阻害のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本開示は、数多くの哺乳類の疾患の治療において使用されてよい組成物に関する。たとえば組成物は、正常細胞と癌細胞との間の化学的変異および要求性を選択的に活用して、哺乳類における癌性細胞の増殖を阻害および／または防止することが可能である。ほとんどの癌治療は焦点が定められておらず、治療にあたって癌性細胞ばかりでなく健康な細胞にも有害に作用するが、その理由は伝統的な治療法における特異性の欠如のためである。開示された組成物のこれらの化学的変異および要求性を利用し、癌細胞を標的にする能力は、治療薬を所望の細胞へ集中させ、哺乳類の健康な細胞に対する影響を制限するようにする。開示された化学組成物は、それ故、副作用の低減された、より低毒性の化学治療薬を提供する。本開示は、癌細胞、細胞増殖性疾患（前癌細胞、および乾癬などといった）、過剰増殖性疾患、脊髄異形成障害、形質細胞ディスクラシア、充実性腫瘍、液性腫瘍、および転移性疾患に対し、グルコース、銅、および鉄化合物を添加して、腫瘍細胞を殺すことおよび／またはそれらの増殖を止めることにより、腫瘍を萎縮させることに関する。与えないでおくこと、制限すること、限定すること、および調整することに関する研究の主題が、回帰的に、腫瘍の開始、促進、および増殖、および癌細胞の転移を阻止することを意図したにもかかわらず、下文の実施例では、組成物は有効な抗癌剤であることが示されている薬剤を用いている。
【００５１】
開示された組成物は、抗ウイルス薬としても使用されて、哺乳類に存在しているウイルスを減らすかまたは破壊するべく使用されてよい。かかるウイルスは、とりわけ、肝炎系、たとえば、Ｃ型肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎、およびＥ型肝炎、ならびに他の感染性ウイルス、ウイルス感染細胞、および、天然痘のようなウイルス性疾患、その系統および、サル痘、牛痘、ラクダ痘のような関連する疾患；ならびに他の感染性ウイルス、ウイルス感染細胞、および、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、肝炎、およびエボラといったウイルス性疾患を含んでよい。かかるウイルスは、特に、エボラ・ザイール、エボラ・スーダン、およびエボラ・アイボリーコースト、およびエボラ・レストンを含めたエボラウイルス、およびマールブルグ（Marburg）ウイルス、ならびに他の感染性ウイルス、ウイルス感染細胞、および、天然痘、肝炎、およびＨＩＶのようなウイルス性疾患の系統を含む。開示された組成物は、強力な殺ウイルス剤であることが可能であり、特定の理論または機構に束縛されなければ、殺ウイルス作用は、上述のように、ウイルスＤＮＡを破壊しかつウイルスエンベロープを破裂させるべく機能するものと信じられている。開示された組成物はまた、細菌または原虫、細胞構造または細胞壁を有する任意の病原体、および／または、哺乳類における結核のような、一部に細胞内ライフサイクルをもつ任意の病原体といった、細胞内病原体を治療するためにも有効であり、かつそのための薬剤として使用されてよい。
【００５２】
本開示はまた、哺乳類におけるベクター−および微生物−媒介性の疾患を阻害および／または予防することができ、かつ典型的には哺乳類へ投与されることとなる組成物にも関係する。開示された組成物は、ベクター−または微生物−媒介性の疾患に感染された哺乳類の、寄生性の負荷を低減または除去することが可能であり、それらの疾患は、たとえば、原虫、蠕虫（寄生虫）、グラム陽性およびグラム陰性（スピロヘータのような）を含めた細菌、真菌（全身性感染を引き起す真菌を含む）、およびウイルスといった、好気性および嫌気性の双方の微生物によって引き起される疾患を含む。これらの微生物はしばしば、命を脅かす疾病を媒介し、世界中の多くの場所、特に開発途上国において、大規模に命を奪い続ける。多くの微生物のライフサイクルは、昆虫ベクターおよび脊椎動物宿主を必要とする。ランブル鞭毛虫のような他のタイプは、乏しい、または汚染された水源を介してうつされることがある。開発途上地域では、飲用の新鮮な水の不足および、疾病媒介性のベクターの継続的な存在が特に問題である。開示された組成物は、原虫および原虫に感染した細胞を破裂させることにより、たとえば、プラスモディウム、トリコモナス（Trichomonas）、エントアメーバ（Entamoeba）、およびリーシュマニア（Leishmania）などといった原虫の存在を減らすこと、および／または除去することにおいて有効である。ブドウ状球菌、または嫌気性マイコプラズマのような細菌細胞、真菌細胞、ウイルス、および他の微生物もまた、微生物の外側の層を破壊すること、および宿主細胞を破裂させることにより除去され、および／またはその数が効果的に制限されかつ低下されてよい。開示された組成物は、製薬上許容される、生理学的に有利な、かつコスト効率のよい方式で、マラリア、および微生物によって引き起される他の疾患のための治療法として投与可能である。多くの医薬品のコストは、しばしば、開発途上国における治療の決定要因であり、開示された組成物のような有効かつコスト効率のよい医薬品は、そのような地域において治療を提供し、疾病を除去することが可能である。
【００５３】
組成物は、少なくとも、固定銅（fixed copper）化合物コア、または固定銅（fixed copper）−鉄化合物コアのナノ粒子か、または２つの組合せからなる。これらのコアは、癌細胞を標的化するためにも機能する、保護シースまたはジャケットにより、被包されるか、コートされるか、吸着されるかまたは複合体形成などされてもよい。このシースまたはジャケットは、グルコースまたはリポソームのような材料の任意の組合せでよく、また任意に、結果として生じるグルコース被包コアがリポソームでコートされてもよい。もう一つの態様においては、コアはデキストランのみか、または任意のグルコースまたは糖をベースとする物質の組合せによって被包されてもよい。別法として、リポソーム被包コアがその後に外側のデキストランシースでコートされてもよい。
【００５４】
遷移金属として、銅および鉄はヒドロキシルラジカルを含めた反応性酸素種を発生することが可能である。Ｃｕ+、Ｆｅ2+、Ｓｎ3+、Ｃｏ2+、およびＮｉ2+を含めた遷移金属が、生体系においてフリーラジカル反応の触媒作用を引き起すことが証明されていることは、広く認識されている。それ故癌細胞は消化および断片化によって破壊されることが可能であり、それは銅または鉄による酸化、および／または触媒されたフリーラジカルの化学反応によって達成され得る。Ｃｕ+は、ＤＮＡのグアニン−シトシン塩基対と結合し、ヒドロキシルイオンによる攻撃の特徴である、局所のフリーラジカル障害をＤＮＡに対して引き起す。銅は、脂質、タンパク質、および特にＤＮＡおよびその塩基対に対するフリーラジカル障害の促進剤である。（アルオマ（Aruoma）、「Copper ion-dependent damage to the base pairs in DNA in the presence of hydrogen peroxide（過酸化水素の存在下でのＤＮＡ中の塩基対に対する銅イオン依存性の障害）」、Biochem. Jour., １９９１年、第２７３巻、ｐ．６０１−４）。酸素種の発生に加えて、遷移金属、銅および鉄は、多くのインビトロの哺乳類の研究において証明されているように、哺乳類における癌細胞の増殖および複製に対する制限栄養物であってもよい。
【非特許文献６５】アルオマ（Aruoma）、「Copper ion-dependent damage to the base pairs in DNA in the presence of hydrogen peroxide（過酸化水素の存在下でのＤＮＡ中の塩基対に対する銅イオン依存性の障害）」、Biochem. Jour., １９９１年、第２７３巻、ｐ．６０１−４
【００５５】
コアとしての使用のための適当な銅化合物は、任意の生物学的に許容される銅化合物であり、水酸化銅、酸化銅、オキシ塩化銅、塩基性炭酸銅、硫酸銅、塩基性硫酸銅、亜酸化銅、水酸化銅−水酸化鉄、銅−酸化鉄、クエン酸銅、グリシン酸銅、グルコン酸銅、リン酸銅、キュプロバム（cuprobam）、キュプリックサリチライト（cupric salicylite）、銅藍、銅−硫酸第二銅（cupro-cupric sulfate）、硫酸第一銅、硫酸第一銅ヘミハイドライトを含めた任意の固定銅（fixed coppers）、塩基性硫酸第二銅、鉱物ブロシャンタイト銅鉱、ラング石、マラカイト、藍銅鉱、チージライト（Cheesylite）、コルネタイト、ジハイドライト（dihydrite）、リベセナイト、ホスホロカルサイト、シュードリベセナイト、シュードマラカイト、タージライト（tagilite）、アントレル鉱、銅藍、マーシュ石、赤銅鉱、輝銅鉱、ロゴイスキーの塩（Rogojski's salt）、ブロシャン銅鉱、水藍石、およびカルカンサイトなどといった、任意の天然の銅含有鉱物、または、ナントコ石、またはドレロファン（dolerophane）のような、天然に生じる任意の銅鉱物を含むが、これに制限されない。また、たとえば銅化合物については、「Merck's Manual（メルクマニュアル）第１３版」、メルク・アンド・カンパニー（Merck & Co.）、２００１年、および「Hawley's Condensed Chemical Dictionary（ホーリーの簡約化学辞典）第１４版」、ジョン・ウィリー＆サンズ・インク（John Wiley & Sons, Inc）、２００１年も参照のこと。固定銅（fixed copper）、水酸化銅は、コアを形成するための好ましい化合物である。もう一つの態様においては、コアはまた、銅および鉄の双方の細胞毒性を増強する相乗効果を与えるべく、水酸化銅−水酸化鉄で構成されてもよい。一つの態様においては、生体系においてフリーラジカル反応の触媒作用を引き起すことが可能な、任意の生体適合性の形状の銅化合物が、開示された組成物のためのコア金属として使用されてよい。本文において定義された生物学的に許容される銅化合物は、有害作用がほとんど、または全くなしに、生体系とともに、および生体系の中で、使用されてよい銅化合物であり、すなわち、それが導入された生体系を、任意の有害な方法で、明らかに変更するか、または明らかに侵すことはない。
【００５６】
さらなる態様においては、酸化銅、水酸化銅−水酸化鉄、またはもう一つの固定銅（fixed copper）および鉄の組合せが、組合せの相乗効果を与えるためのコアとして使用されてもよい。任意の生体適合性の鉄化合物が、銅コアと一緒に使用されてよく、たとえば、これに制限されないが、Ｆｅ3+、およびその塩、水酸化鉄、オキシ水酸化鉄、酸化鉄、鉄グルコース、クエン酸鉄、フェリチン、フマル酸第一鉄、および硫酸第一鉄などを含み、鉄飽和されたヒトのホロトランスフェリンを含め、生物学的環境へ鉄を負荷する。
【００５７】
カニクイザル（Macaca fascicularis（種））について行なわれた代謝クリアランス速度の実験は、鉄デキストランから派生した大用量の鉄元素の安全な使用を示している。（全ての実験は、動物の権利保護法および規則（Animal Welfare Act and Regulations）を遵守して行なわれた。）鉄デキストランから派生された、体重１ｋｇあたり４００ｍｇおよび５００ｍｇ用量の鉄元素は、静脈内注入によりカニクイザルへ安全に投与された。鉄デキストランは、延長された血漿滞留時間を示したが、それは、開示された組成物をほとんど負の副作用なしに血漿へ再分布するための食作用系のデコイ（おとり）として機能する。投与された鉄デキストランは、サルの血漿中に少なくとも１２０時間、ミリグラムレベルで残存する。鉄デキストランの一回用量もまた、負の副作用、すなわち腹部の腫脹がほとんどなく、別々にサルへ投与された。（その全てが本文中に含まれている、米国特許出願第１０／８８８，５７６号参照のこと）。サルモデルは、高い代謝速度の故に、ヒトに比較してはるかに素早く系から鉄デキストランを取除く。それ故ヒトでは、たとえばヘンダーソン（Henderson）＆ヒルマン（Hillman）（１９６９年）のような研究において示されているように、より長い血漿滞留時間が予想される。
【特許文献８】米国特許出願第１０／８８８，５７６号
【００５８】
好ましくは開示された組成物のナノ粒子は、少なくとも一つのシースまたはコートによって、被包されるか、取囲まれるか、複合体形成されるか、または吸着され、かつ結合することが可能であり、それは好ましくは、グルコース、糖類、多糖類、たとえばデンプン、セルロース、デキストラン、アルギニド、キトサン、ペクチン、ヒアルロン酸、プルラン（細菌の多糖類）、デキストラン、カルボキシアルキルデキストラン、およびカルボキシアルキルセルロースなどといった、糖物質から構成される。これらのデキストランは、たとえば、メーヴァ（Mehvar）、上記（２０００年）；および「Recent Trends in the Use of Polysaccharides for Improve Delivery of Therapeutic Agents : Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Perspectives（治療薬の改良送達のための多糖類の使用における最近の傾向：薬物動態学および薬力学的展望）」、Curr. Pharm. Biotech.、２００３年、第４巻、ｐ．２８３−３０２)、によって開示されたもの、および、モーギミ（Moghimi）ら、「Long-Circulating and Target-Specific Nanoparticles : Theory to Practice（長期循環性および標的特異性のナノ粒子：実施のための理論）」、Pharm. Rev.、２００１年、第５３巻、第２号、ｐ．２８３−３１８)、どちらも、その全てが本文中に含まれている、によって開示されたようなデキストランで覆われたリポソームを含むことが可能である。シースは、開示された組成物のコアをコートに入れるか、または被包し、コアと周囲の環境との化学的相互作用を防止し、コアの分解および、銅化合物からの銅および／または鉄の、および／またはコアからの銅−鉄化合物の発散を阻止する。シースの厚さは、所望であれば当業者により変更されてよい。シースは主として、身体により必ずしも外来物質として認識されない物質から構成されることから、身体は組成物に対する耐性を発生させる見込みは少ない。一つの態様においては、シースは、マクロース（macrose）としても公知の高分子量多糖類、デキストランから構成可能である。デキストランは、シースとしての使用のための理想的な候補であり、その理由は、それが血漿代用物質または拡張剤としてしばしば哺乳類へ投与されること、一般的には哺乳類の系によって拒絶されないこと、および血漿中に延長された期間にわたり残留可能であることからである。ポリマーシェル、シース、またはジャケットの形成のための、他の生体適合性の材料は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、および脂質などを含むことが可能である。さらなるシース材料は、たとえば、その全てが本文中に含まれている、米国特許第６，０９６，３３１号および米国特許第６，５０６，４０５号を含む。別法として、前文に挙げられた２以上の材料の組合せがシースを形成するべく使用されてもよい。
【特許文献９】米国特許第６，０９６，３３１号
【特許文献１０】米国特許第６，５０６，４０５号
【非特許文献６６】「Recent Trends in the Use of Polysaccharides for Improve Delivery of Therapeutic Agents : Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Perspectives（治療薬の改良送達のための多糖類の使用における最近の傾向：薬物動態学および薬力学的展望）」、Curr. Pharm. Biotech.、２００３年、第４巻、ｐ．２８３−３０２
【非特許文献６７】モーギミ（Moghimi）ら、「Long-Circulating and Target-Specific Nanoparticles : Theory to Practice（長期循環性および標的特異性のナノ粒子：実施のための理論）」、Pharm. Rev.、２００１年、第５３巻、第２号、ｐ．２８３−３１８
【００５９】
もう一つの態様においては、開示された組成物は、リポソームコートで被覆されるか、または被包されることが可能である。このリポソームコートは、コアを被包するソールシースであってもよく、あるいは、前文に挙げられた材料の１つまたは組合せによる第２コートであってもよい。ＰＥＧリポソームポリマーコーティングは、その全てが本文中に含まれている、アルツァ・コーポレーション（Alza Corporation）、「Delivery Times, Issues and Opportunities（送達時間、問題点、および可能性）」、第２巻、第１号、による研究により、食作用系の取込みを低減させること、および長い滞留時間を提供することが示されている。血漿中の滞留時間は、静脈内注射の少なくとも数日〜数週間の間、被包された薬物を放出することなく延長されることが可能であり、そのことは薬物の投与頻度を減少させる。各々、その全てが本文中に含まれている、米国特許第６，４６５，００８号；米国特許公開  ＵＳ２００２／０１７２７１１８１；米国特許公開  ＵＳ２００１／００５１１８３８１を参照のこと。
【特許文献１１】米国特許第６，４６５，００８号
【特許文献１２】米国特許公開  ＵＳ２００２／０１７２７１１８１
【特許文献１３】米国特許公開  ＵＳ２００１／００５１１８３８１
【００６０】
別法としてコアは、癌細胞、細胞増殖性疾患（前癌細胞、および乾癬など）、充実性腫瘍、液性腫瘍、および転移性疾患を標的とする標的化剤またはマーカーの使用により、細胞特異部位へ輸送されてもよい。生体系内で医薬用に利用可能な任意の標的化剤またはマーカーが、癌細胞の特異的な部位へコアを積極的に輸送するべく使用されてよい（たとえば、ジュリアーノ（R. C. Juliano）、「Targeted Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology（標的化薬物送達、実験薬理学ハンドブック）」、第１００巻、ボーン（G. V. R.）ら編、シュプリンガー・フェアラーク（Springer Verlag）参照のこと）。たとえば、癌性細胞の表面部位または細胞表面受容体へ結合する分子、界面活性剤、リガンド、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、および特異な化学的化合物などは、癌細胞を標的化するための標的化剤またはマーカーとして使用されてよい。これらの標的化剤またはマーカーは、コアを被包する少なくとも一つのシースの代わりに、または一緒に使用されてもよい。
【００６１】
一つの実施例として、肝細胞の細胞表面部位または細胞表面受容体に対する結合性分子、界面活性剤、リガンド、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、および特異な化学的化合物などは、感染された細胞を標的化するための標的化剤またはマーカーとして使用されてよい。これらの標的化剤またはマーカーは、コアを被包する少なくとも一つのシースの代わりに、または一緒に使用されてもよい。
【００６２】
もう一つの、エボラに関する実施例においては、標的化剤は、エボラのビリオン表面上にあることが知られている唯一のタンパク質である、ＥＢＯＶ糖タンパク質のような保存された部位、および保存されたヘリカーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびウイルスＲＮＡの非翻訳領域に特異的である。これらは全て、ウイルス複製の重要な段階に関係しており、それ故、標的化剤のための論理的な部位であるといってよい。エボラエンベロープ糖タンパク質はすでにマップされており、保存された領域は標的として使用されてよい。完全長のエンベロープ糖タンパク質は、血管を侵すことによりインビボにおいて毒性の作用を誘導することから、このようなウイルスエンベロープ糖タンパク質の毒性は、ヒトの疾患において重大な役割を果たしている。
【００６３】
さらにもう一つの実施例においては、標的化剤は、肝細胞およびＢリンパ球上に発現された受容体（ＣＤ−８１）のための結合部位を含んでいるＣ型肝炎エンベロープタンパク質Ｅ２、および高度に保存されたＣ型肝炎ウイルス特異的ヘリカーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびウイルスＲＮＡの両端の非翻訳領域、５′−ＵＴＲおよび３′−ＵＴＲに特異的である。これらは全て、ウイルス複製の重要な段階に関係しており、それ故、標的化剤のための論理的な部位であるといってよい。細胞表面のへパラン硫酸プロテオグリカン（「ＨＳＰＧ」）は、ヘパリンと肝臓由来の高度に硫酸化されたヘパラン硫酸とによって用量依存性の様式で阻害されることが可能な、ＨＣＶエンベロープ−標的細胞相互作用の仲介において重要な役割を果たすことも見出されている。細胞のＨＳＰＧに対するＥ２のドッキングは、ＨＣＶと細胞表面との間の相互作用における最初の段階といってよく、受容体介在性の侵入および感染の開始を生じる結果となる。（バース（Barth, H.）ら、「Cellular Binding of Hepatitis C Virus Envelope Glycoprotein E2 Requires Cell Surface Heparan Sulfate（Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の細胞結合は細胞表面のヘパラン硫酸を必要とする）」、J. Biol. Chem.、２００３年、第２７８巻、第４２号、ｐ．４１００３−４１０１２）、それゆえ、この部位に特異的な標的化剤は、細胞表面受容体を阻止し、細胞の感染を防止するであろう。同様に、Ｅ２のためのＣＤ８１結合部位は、大きい細胞外ループドメイン中に局在化され、かつこの相互作用に必須のアミノ酸残基が同定されており、特異的な標的化剤のための理想的な部位といってよい。（ロッカセッカ（Roccasecca, R.）、「Binding of Hepatitis C Virus E2 Glycoprotein to CD81 Is Strain Specific and Is Modulated by a Complex Interplay between Hypervariable Regions 1 and 2（Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質のＣＤ８１に対する結合は株特異的であり、超可変領域１および２間の複雑な相互作用により調整される）」、Jour. of Virology、２００３年、第７７巻、第３号、ｐ．１８５６−１８６７）。
【非特許文献６８】バース（Barth, H.）ら、「Cellular Binding of Hepatitis C Virus Envelope Glycoprotein E2 Requires Cell Surface Heparan Sulfate（Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の細胞結合は細胞表面のヘパラン硫酸を必要とする）」、J. Biol. Chem.、２００３年、第２７８巻、第４２号、ｐ．４１００３−４１０１２
【非特許文献６９】ロッカセッカ（Roccasecca, R.）、「Binding of Hepatitis C Virus E2 Glycoprotein to CD81 Is Strain Specific and Is Modulated by a Complex Interplay between Hypervariable Regions 1 and 2（Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質のＣＤ８１に対する結合は株特異的であり、超可変領域１および２間の複雑な相互作用により調整される）」、Jour. of Virology、２００３年、第７７巻、第３号、ｐ．１８５６−１８６７
【００６４】
たとえば、赤血球細胞表面部位または細胞表面受容体、界面活性剤、リガンド、抗体、タンパク質、ペプチド、酵素、および特異な化学的化合物などに対する結合性分子が、マラリア感染細胞を標的化するための標的化剤またはマーカーとして使用されてよい。こうした標的化剤またはマーカーは、コアを被包する少なくとも一つのシースの代わりに、または一緒に使用されてよい。
【００６５】
対応する天然痘の実例では、標的化剤は、エンベロープ糖タンパク質のような保存された部位、および保存されたヘリカーゼ、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、およびウイルスＲＮＡの非翻訳領域に対して特異的である。これらは全て、ウイルス複製の重要な段階に関係しており、それ故、標的化剤のための論理的な部位といってよい。
【００６６】
開示された組成物全体のナノ粒子サイズは、約１ｎｍ〜約１０，０００ｎｍでよい。さらに好ましい態様においては、粒子サイズは約１５ｎｍ〜約５００ｎｍでよい。粒子サイズに関して最も好ましい態様は、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍである。
【００６７】
薬物のない空のリポソームは、食作用系に対し、デコイ、プラセボ担体、または再分布剤として機能するべく、患者に対し組成物自身と同時投与されるか、または先立つか、その間中、またはその後に投与されてもよく、組成物が血漿中に延長された時間にわたり残留するようにする。空のリポソームデコイ、またはプラセボ担体は、食作用系を占拠し、また、開示された組成物を肝臓内および脾臓内の細胞によるクリアランスから遠ざけて再分布させ、したがって血漿中の開示された組成物を延長された期間にわたって濃縮させる。ポリマーシェル用に使用された生体適合性材料は、またデコイとして、単独で、またはリポソームと併用して使用されてよい。
【００６８】
鉄デキストランもまた、代表的な生体適合性鉄化合物の実例であり、その鉄は、少なくとも２つの異なる経路を介して組織を負荷し、かつ再分布剤として、開示された組成物に有利に作用する。第１は、延長されたヒト血漿滞留時間を介した、癌細胞による食作用である。第２は、食作用系による鉄デキストランのプロセシングを介したトランスフェリン飽和度の増加である。腫瘍細胞内での鉄デキストランの細胞内代謝は、周囲の酸性度を増大させ、そのことは開示された組成物の破壊をさらに促進する。本特許出願の目的のためには、食作用およびエンドサイトーシスは、膜小胞の形成による、微粒子状の材料を含めた材料の、細胞内への取込みとして定義され、本文においては同等の用語として使用されている。
【００６９】
一つの態様においては、開示された組成物プラス、鉄デキストランプラス、空のリポソームが、癌患者のための完全静脈栄養（「ＴＰＮ」）へ添加されてよい。開示された組成物は、必須微量元素である銅を含んでおり、鉄、ならびにグルコース、および／または、患者の身体の要求条件に寄与するための脂肪であるリポソームを含んでもよい。このように、組成物はまた、患者の完全静脈栄養に対しても重要な貢献を提供する。
【００７０】
なおもう一つの態様においては、組成物はインスリン強化療法（「ＩＰＴ」）とともに、鉄デキストランを用いて、または用いずに、本発明のこれらの薬剤の摂取を腫瘍細胞内に促進するべく使用されてよい。（ハウザー（Hauser）＆ハウザー（Hauser）著、「Cancer-Treating Cancer with Insulin Potentiation Therapy（癌−インスリン強化療法による癌治療）」、ビューラ・ランド・プレス（Bhulah Land Press）、２００１年、第２６７頁）。さらに、他のインスリン強化剤もまた組成物の効果を増幅するべく添加されてよく、潜伏性に感染された休止期記憶リンパ球および、聖域内のものを含めて他の潜伏性に感染された細胞を活性化する。
【非特許文献７０】ハウザー（Hauser）＆ハウザー（Hauser）著、「Cancer-Treating Cancer with Insulin Potentiation Therapy（癌−インスリン強化療法による癌治療）」、ビューラ・ランド・プレス（Bhulah Land Press）、２００１年、第２６７頁
【００７１】
いかなる特定の理論または作用機序にも制限、保持、または束縛されないなら、再分布剤すなわち鉄デキストランは、空のリポソームと一緒に、またはリポソームなしに、系に侵入し、不活性な実体として身体中を往来し、食細胞系および／または癌細胞によって血漿から除去されると信じられている。組成物はプロドラッグとして機能し、血漿内では不活性であり、癌細胞の中では細胞内活性をもつ。組成物は、再分布薬またはプラセボ担体とともに使用されると、用量レベルに依存して、何日もの間哺乳類の血漿内に残存する。（鉄−デキストランは、特に、用量が食作用系のクリアランス速度を超えて投与された場合、数週間にわたり血漿中に残存可能であることが公知である。食作用系による鉄デキストランのプロセシングは、一日最大量までに律速され、そのバランスをその後の使用についてそのまま残す。）シースは、それが糖をベースとする物質であり、かつ哺乳類の系によって拒絶されないことから、食作用系によって直ちに外来物質として認識されることはないといってよく、組成物が、ほとんどの治療よりも長い間哺乳類の循環中に残存できるようにし、標的細胞とさらに接触しやすくなるようにし、伝統的な化学治療薬よりも少ない用量でより大きい効果を提供する。組成物は、任意の生物学的経路により、身体中を循環し、いかなる細胞タイプとも接触することがある。ほとんどの部分では、糖のような増殖のために必要な分子を貪食するために高い親和性を有する癌細胞がそうするように、食作用系が組成物を摂取する。正常な健康細胞は、一般に組成物とごくわずかに相互作用する。食作用系によって摂取された組成物は、肝臓を通り、グルコース、鉄、および銅を貯蔵する肝細胞において大いに処理され、後にそれらの適当なタンパク質担体を介して放出され、身体の細胞を養い育てる。糖、銅、および鉄は、食細胞系にとり周知の身体の要求物質であるが故に、食作用系はそれらを処理するか、輸送するか、貯蔵するか、または、ほとんど毒性のないそれらを除去することができるのに対し、組成物は癌細胞を殺し、同時に身体の細胞を養い育てる。
【００７２】
組成物が癌細胞によって貪食されるか、または他の手段により細胞へ侵入すると、組成物は、癌細胞に共通である嫌気性解糖プロセスによって生じた乳酸を含んでいる、細胞の酸性環境に対して暴露される。細胞中に存在してもよい任意の鉄デキストランもまた、鉄デキストラン化合物の破壊の間に、周囲の酸性度の一因となる。糖のシースは代謝され、開示された組成物のコアは酸性の条件下に破壊され、少なくとも遊離のイオン、フリーラジカル、および反応性酸素種（「ＲＯＳ」）を発生させる。遊離の遷移金属イオンと一緒に摂取されたフリーラジカルは、細胞に対して細胞毒性作用を有しており、ＤＮＡ損傷性フリーラジカルおよびＲＯＳを発生させる。フリーラジカルおよびＲＯＳは細胞の複製を妨害し、最終的には細胞死を引き起す。対照的に、正常な健康細胞は一般に、乳酸産生なしに好気的にグルコースを処理する。それ故もし正常細胞によって貪食されれば、シースは容易には破壊されず、金属コアはシース中に安全に被包されたまま残り、そのことがコアの細胞毒性を和らげる。
【００７３】
組成物は理想的には、マラリアおよび類似の微生物媒介性疾患の治療剤として適しているが、その理由は、プラスモディウムがそのライフサイクルの一部として宿主哺乳類の中にいるとき組成物が肝臓によってプロセスされることからである。ひとたび哺乳類が感染すると、スポロゾイト期のプラスモディウムが哺乳類の肝臓に感染し、そこでそれらは無性生殖的に繁殖する。肝臓中のスポロゾイトはシゾントへ成熟し、それは後に破裂してメロゾイトを放出する。それ故、組成物およびスポロゾイトの双方が、宿主哺乳類の肝臓を通して進行するはずであることから、組成物は肝臓における寄生虫の負荷と接触し、低下および／または除去することができる。肝臓におけるこの最初の複製の後、寄生虫は赤血球内で無性増殖を受ける。この増殖がメロゾイトを産生し、それが赤血球に感染する。リング期トロフォゾイトは、シゾントへ成熟し、それは破裂してメロゾイトを宿主の血流中へ放出する。（寄生虫のあるものは、有性の赤血球期へと分化する。）「血液期」の寄生虫は、疾病の臨床症状発現の原因である。
【００７４】
血中にある間、すなわち、血液期の間は、プラスモディウムはエネルギーの主要供給源としてグルコースを活発に発酵する。解糖の代謝プロセスは、グルコースを乳酸塩へ転換し、プラスモディウムは本質的に、他の生物に見られるものと同様のプロセスを使用する。プラスモディウムおよび他の寄生虫は、高率の解糖を示し、未感染の赤血球より７５倍多くグルコースを利用する。プラスモディウムによって利用されるグルコースの約８５％が、乳酸塩へ転換される。高い乳酸デヒドロゲナーゼ（「ＬＤＨ」）活性は、解糖経路において先にグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼによって産生されるＮＡＤＨからの、ＮＡＤ+の再生に機能すると信じられている。解糖の正味の結果は、ＡＴＰを産生することである。それ故、感染された細胞は組成物の糖シースに対し、天然の親和性を有しており、その解糖プロセスを続けるべく迅速に組成物を摂取する。
【００７５】
解糖中間体のあるものは、合成目的のために使用されることがある。好気性代謝もまた、乳酸塩に先行する解糖中間体であるピルビン酸塩の、トリカルボン酸サイクルによる二酸化炭素および水素原子への異化を含む。水素原子はＮＡＤ+のＮＡＤＨへの還元によって捕捉される。捕捉された水素からの電子は、電子伝達体の連鎖へ入れられ、最終的に分子状酸素へ伝達されて水を形成する。ＡＴＰは、酸化的リン酸化プロセスにより、電子運搬を通じてエネルギーを捕捉することによって生成される。血中にある間、プラスモディウムは、グルコースの乏しい宿主環境における以外は、完全なトリカルボン酸サイクルを示さない。それゆえ、組成物は、全てがグルコースに対する親和性を有しているマラリア感染細胞の圧倒的多数と接触し、かつ相互作用することができる。
【００７６】
いくつかのプラスモディウム種は、長期間にわたって肝臓中に生残り、数週間または数年もの後に、血流に侵入することにより再発を引き起すことが知られている。それ故、組成物の予防的投与はまた、高リスク区域に住着いた無症状の哺乳類においても有用であるといってよい。
【００７７】
組成物がマラリア感染細胞によって貪食されるか、または他の手段によって細胞へ侵入すると、組成物は、マラリア感染細胞に共通である嫌気性解糖プロセスによって生じた乳酸を含め、細胞の酸性環境に対して暴露される。細胞中に存在してもよい任意の鉄デキストランもまた、鉄デキストラン化合物の破壊の間に周囲の酸性度の一因となる。糖シースは代謝され、開示された組成物のコアは酸性の条件下に破壊され、少なくとも遊離のイオン、フリーラジカル、および、過酸化水素化合物を含めて、反応性酸素種（「ＲＯＳ」）を発生させる。遊離の遷移金属イオンと一緒に摂取されたフリーラジカルは、細胞に対して細胞毒性作用を有しており、ＤＮＡ損傷性フリーラジカルおよびＲＯＳを発生させる。フリーラジカルおよびＲＯＳは細胞の複製を妨害し、最終的には細胞死を引き起す。対照的に、正常な健康細胞は一般に、乳酸産生なしに好気的にグルコースをプロセスする。それ故、もし正常細胞によって貪食されれば、シースは容易には破壊されず、金属コアはシース中に安全に被包されたまま残り、そのことがコアの細胞毒性を和らげる。
【００７８】
銅は、強力な殺ウイルス剤として当業者に周知である。インビトロの試験は、銅が過酸化水素とともに、事実上あらゆる微生物に苦しんでいる哺乳類の代理モデルを殺すことを示している。（サグリパンティ（Sagripanti）ら著、「Virus Inactivation by Copper or Iron Ions alone and in the Presence of Peroxide（単独および過酸化物の存在下での銅または鉄イオンによるウイルス不活性化）」、Applied and Environ. Microbio、１９９３年、第５９巻、第１２号、ｐ．４３７４−４３７６；サグリパンティ（Sagripanti）ら著、「Metal-based Formulations with High Microbicidal Activity（金属を主成分とする高い抗微生物活性をもつ製剤）」、Applied and Environ. Microbio、１９９２年、第５８巻、第９号、ｐ．３１５７−３１６２を参照）。開示された組成物はまた、強力な殺ウイルス剤として有効であることが示されており、特定の理論または機構に束縛されることがなければ、殺ウイルス作用が上述のように機能してウイルスＤＮＡを破壊し、ウイルスエンベロープを破裂させると信じられている。開示された組成物は、たとえば、肝細胞癌に関するＨＢＶおよびＨＣＶ、子宮頚癌に関するＨＰＶ、バーキットリンパ腫に関するＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、および白血病の一病型に関するＨＴＬＶ１といった、癌を引き起すことが公知のウイルスを破壊するために有用であることが可能である。したがって、開示された組成物は、鉄−デキストランベースを付加して、または付加なしに、細胞が完全に形質転換するようになる前の前癌期において活性がある。開示された組成物は、中枢神経系および脳を含めて、身体中を有利に往来してよい。
【非特許文献７１】サグリパンティ（Sagripanti）ら著、「Virus Inactivation by Copper or Iron Ions alone and in the Presence of Peroxide（単独および過酸化物の存在下での銅または鉄イオンによるウイルス不活性化）」、Applied and Environ. Microbio、１９９３年、第５９巻、第１２号、ｐ．４３７４−４３７６
【非特許文献７２】サグリパンティ（Sagripanti）ら著、「Metal-based Formulations with High Microbicidal Activity（金属を主成分とする高い抗微生物活性をもつ製剤）」、Applied and Environ. Microbio、１９９２年、第５８巻、第９号、ｐ．３１５７−３１６２
【００７９】
鉄組成物および／または鉄デキストラン組成物の投与は、増強された細胞毒性のため、銅と鉄との間の相乗的相互作用を提供するべく、開示された組成物と組合されてよい。銅と鉄との間の相乗作用は当業者に周知であり、文献に記述されている。たとえば、その全てが本文中に含まれている、殺真菌剤および殺細菌剤としての使用のための銅組成物と鉄組成物との相乗作用の使用を開示している米国特許第５，２０２，３５３号を参照のこと。鉄組成物および／または鉄デキストラン組成物はまた、開示された組成物を再分布させかつ、組成物に患者の血漿中でのより長い滞留時間を可能にするべく投与されてもよい。より優れた細胞毒性および、引き延ばされた血漿滞留時間のためには、元素の鉄塩のものよりもはるかに高い用量の鉄デキストランが用いられてよい。鉄レベルが大きいほど、組成物の相乗的細胞毒性は大きい。この技術においては、食作用系がより小さい粒子を最初に血漿循環から除去することは周知であることから、組成物よりも直径の小さい鉄デキストランの組合せが、より長い血漿滞留時間を可能にする。鉄デキストランおよび開示された組成物のコアの直径は、これらの粒子の血漿時間を所望のように操作するべく変更されてよい。一つの態様においては、鉄デキストランは、食作用系のクリアランスレベルを超えて投与されることが可能であり、それがデコイ、プラセボ担体、または再分布剤として役立ち、延長された期間にわたり組成物が血漿中に残存できるようにする。（ヘンダーソン（Henderson）＆ヒルマン（Hillman）著、「Characteristics of Iron Dextran Utilization in Man（ヒトにおける鉄デキストラン利用の特徴づけ）」、Blood、１９６９年、第３４巻、第３号、ｐ．３５７−３７５を参照）。開示された組成物が延長された期間にわたり血漿中に残存できるようにするための、食作用系のクリアランス速度を超えた用量における鉄デキストランのこの使用は、この技術では再分布（肝臓および脾臓から離れて血漿への）として公知である。一般に、少用量（５０〜５００ｍｇ）の鉄デキストランは、約３日以内に取除かれ、大用量（＞５００ｍｇ）の鉄デキストランは、しかしながら、１０〜２０ｍｇ／時間という一定速度で取除かれ、典型的には３週間もの長さにわたり、鉄デキストランの増大された血漿濃度に対応づけられる。開示された組成物を血漿へ再分布するための、食作用系のためのデコイとして役立ってもよい他の薬剤は、これに制限されないが、プルラン、デキストラン硫酸、空のリポソーム、および、その全てが本文中に含まれている、米国特許第６，５０６，４０５号、および米国特許第６，０９６，３３１号によって教示されたものを含む。
【特許文献１４】米国特許第５，２０２，３５３号
【特許文献１５】米国特許第６，５０６，４０５号
【特許文献１６】米国特許第６，０９６，３３１号
【非特許文献７３】ヘンダーソン（Henderson）＆ヒルマン（Hillman）著、「Characteristics of Iron Dextran Utilization in Man（ヒトにおける鉄デキストラン利用の特徴づけ）」、Blood、１９６９年、第３４巻、第３号、ｐ．３５７−３７５
【００８０】
カニクイザル（Macaca fascicularis種）について行なわれた代謝クリアランス速度の実験は、鉄デキストランから派生した大量の元素鉄の安全な使用を示している。（全ての実験は、動物の権利保護法および規則（Animal Welfare Act and Regulations）を遵守して行なわれた。）鉄デキストランから派生された、体重１ｋｇあたり４００ｍｇおよび５００ｍｇ用量の元素鉄は、静脈内注入によりカニクイザルへ安全に投与された。鉄デキストランは、延長された血漿滞留時間を示しており、このことは、開示された組成物をほとんど負の副作用なしに血漿へ再分布するための食作用系のデコイとして役立つ。図１５Ａ、Ｂ、およびＣに示されるように、投与された鉄デキストランは、サルの血漿中に少なくとも１２０時間にわたり、ミリグラムレベルで残存した。一回量の鉄デキストランもまた、図１６に示されるように、負の副作用、すなわち腹部の腫脹がほとんどなく、別々にサルへ投与された。サルモデルは、高い代謝速度の故に、ヒトに比較してはるかに素早く系から鉄デキストランを取除く。それ故ヒトでは、たとえばヘンダーソン（Henderson）＆ヒルマン（Hillman）（１９６９年）のような研究において示されているように、より長い血漿滞留時間が期待される。
【００８１】
鉄デキストラン化合物を用いるか、または用いない組成物の副作用は、標準的に投与された化学療法の周知の副作用に比較してはるかに少ないが、開示された組成物は付加的な治療薬と併用して使用されることが可能である。開示された組成物および鉄デキストランは、銅および鉄の分解副産物を有しており、それは赤血球、白血球、および血小板の生物生産を支援している。組成物は造血系を支援することから、その使用は、一般に使用される化学療法薬によって標準的に引き起される、周知の痛烈な疲労、感染のリスク、および骨髄（および他の素早く増殖する細胞）に対する細胞毒性の化学療法の副作用を制限するか、または取除く。さらに、骨髄回復を加速するためのコロニー刺激因子、および重い骨髄抑制の防止のための、赤血球のためのコロニー刺激増殖因子、エリスロポエチンといった、補助的医薬品の使用およびそれらの重篤な副作用が制限されることが可能である。こうした薬物の使用の必要性が制限され得ることから、患者の生活の質が改善されてよい。
【００８２】
診断目的のためには、組成物は、標的化された磁性の担体で標識されてもよく、癌細胞のイメージングを可能にし、かつ外来の磁石により腫瘍を標的化することを含めたさらなる医学的治療を決定するための情報を提供できるようにする。（ジョンソン（Johnson）著、「An Innovative Drug Delivery Technology（革新的な薬物送達技術）」、Magnetics Business & Technology Magazine, (２００２年)）。放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）などといった、広く多様な他の標識が使用されてよく、かつ当業者には周知である。
【非特許文献７４】ジョンソン（Johnson）著、「An Innovative Drug Delivery Technology（革新的な薬物送達技術）」、Magnetics Business & Technology Magazine, (２００２年)
【００８３】
開示された組成物、鉄デキストラン、および空のリポソームは、全て生体適合性の材料から形成されることから、他の化学療法薬に比較して、延長された期間にわたり、全てが投与されてよい。有効な用量または有効な量は、癌の特定のタイプ、投与のレジメン、被験者の体重、細胞増殖の攻撃性、および前の化学療法によって被験者が負に影響された程度についての当業者の評価次第で変更することが可能である。一般に、治療上有効な量は、原発性または転移性の腫瘍を減少させるか、または、最少量でさらなる増殖を防止する量である。
【００８４】
開示された組成物は、薬剤組成物として、製薬上の担体と組合せて患者へ投与されることが可能である。製薬上の担体は、医学的に適格の患者への組成物送達に適した、任意の適合性の非毒性物質であることが可能である。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体が、担体に含められてよい。製薬上許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた薬剤化合物中へ取込まれてよい。一つの態様においては、組成物は、滅菌水、または脱イオン水、および遊離のデキストラン、薬物なしのデキストランと組合わされ、無菌のコロイド懸濁液を形成してもてよい。
【００８５】
開示された組成物は、経口、静脈内、皮下、腹膜内、包膜内、筋肉内、頭蓋内、吸入、局所、トランスデルマール（transdermal）、座剤（直腸）、ペッサリー（膣）、または、移植可能なポリマーの開示された組成物で飽和されたデポー剤、またはウエハ、たとえばギラデル・ウエハ（Giladeru water（登録商標））といった、多様な方法で患者へ投与されてよい。好ましくは、薬剤化合物は非経口的に、たとえば、皮下、筋肉内、または静脈内へ投与されてよい。したがって、開示された組成物は、非経口投与のために、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された溶液を含んでもよい。多様な水性担体、たとえば、水、緩衝化された水、０．４％食塩水、および０．３％グリシンなどが使用可能である。これらの溶液は無菌であり、一般に粒子状物質がない。これらの化合物は、通常の周知の滅菌技術によって滅菌されてよい。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、および、もし感受性の患者に必要であれば、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなどの毒性調整剤などといった、生理的条件に近づけるために必要とされるような、製薬上許容される補助的物質を含有してもよい。これらの製剤中の開示された組成物の濃度は、幅広く可変であって、たとえば、約０．１ｍｇ未満から約５ｍｇまでの、担体１ｍｌあたりの組成物に由来する元素銅の相当量であり、１０ｍｇまたは１５ｍｇ以上程度までに達する。開示された組成物の好ましい濃度は、１ｍｌの担体あたりの組成物に由来する元素銅の相当量で約５ｍｇであり、選ばれた投与の特定の方式に従って、主として液体の体積、および粘度などに基づき選択されることとなる。開示された組成物による使用のために好ましいｐＨ範囲は、約７と約８．５の間であり、さらに好ましいｐＨ範囲は、約７．５と約８．０の間である。
【００８６】
非経口的に投与可能な化合物を調製するための実際の方法、および患者、典型的には哺乳類への投与のために必要な調整は、当業者には周知かまたは明らかであろうが、さらに詳細には、たとえば、参考文献として本文中に含まれている、「Remington's Pharmaceutical Science: The Science and Practice of Pharmacy（レミントンの薬学：調剤の科学および実践）」、第２０版、Lippincott, Williams & Wilkins、(２０００年)、に記述されている。
【００８７】
開示された組成物は、特異性のために癌療法を標的化するという非常に切迫した問題を扱っている一方で、化学療法の恐ろしい副作用を大いに制限するかまたは除去していることが認識されるであろう。さらに、開示された組成物は、特に鉄デキストランとともに使用された場合、薬剤耐性という問題を克服することができる。開示された組成物は、鉄デキストラン負荷を用いて、または用いずに使用されてよく、充実性腫瘍、液性腫瘍（血液）、ならびに転移癌に対し非常に有効な治療を達成する一方、低用量で高い活性および結果を生じることから、コスト効果の高い薬剤を提供する。開示された組成物は、化学療法薬としてそれだけで、鉄デキストランとともに、および／または通常の癌療法と併用して、投与されるべくデザインされている。最も重要なことには、組成物の、高度に標的化されかつ高度に効率的な、細胞を殺す割合が、任意の医療施設に利用可能とされ得る高いコスト効率で、数えきれない生命を救うことが可能である。たとえば、開示された組成物は、鉄負荷を用いて、または用いずに、肝細胞癌を治療するために非常によく適合している。肝細胞癌（「ＨＣＣ」）は最も一般的な、肝臓の原発性癌であり、世界中で毎年５５０，０００を超える死を引き起している。これまで、ＨＣＣには有意に効果的な治療法が存在していなかった。（ナカムラ（Nakamura）＆チョティ（Choti）著、「Management of Hepatocellular Carcinoma（肝細胞癌の管理）」、Oncology, 14(7) (2000)）。開示された組成物は、しかしながら、血流中へ投入され、肝動脈を通行してよく、正常な肝細胞および癌性肝細胞を組成物に対し暴露させる。肝細胞はデキストランを、使用するためまたは、グルコースをグリコゲンとして貯蔵するために分解し、組成物に由来する銅および鉄もまた貯蔵してもよい。したがってＨＣＣ細胞は、開示された組成物によって引き起される細胞毒性の対象である。貯蔵されないいかなる過剰の銅も、胆管および他の身体系を通して排出されてよい。肝細胞からの銅および鉄は、患者の身体の細胞を養うためのトランスフェリンおよびセルロプラスミンを含む、各々のタンパク質担体へ結合される。
【非特許文献７５】ナカムラ（Nakamura）＆チョティ（Choti）著、「Management of Hepatocellular Carcinoma（肝細胞癌の管理）」、Oncology, 14(7) (2000)
【００８８】
開示された組成物が、効率のよい安全な治療を提供するマラリア療法という非常に切迫した問題を扱っている一方で、概して最も高い率のベクターおよび微生物媒介性の疾病に苦しんでいる開発途上領域に対し、コストを利用可能なままにしていることもまた認識されよう。開示された組成物は鉄デキストラン負荷を用いるか、または用いずに、マラリア、他の、原虫、細菌、真菌、またはウイルス起源の寄生虫症に対する高度に有効な治療を達成するべく使用されてよい。開示された組成物は、抗マラリア薬としてそれだけで、鉄デキストランとともに、および／または通常の療法と併用して、投与されるべくデザインされている。最も重要なことには、組成物は高度に効率的であり、冒された細胞に向けて高度に標的化されており、任意の医療施設に利用可能とされ得る高いコスト効率で、数えきれない生命を救うことが可能である。マラリア原虫のライフサイクルは、宿主の肝臓内で４８時間以内に複製すること、および組成物は肝臓を介して処理されることから、組成物は、感染がさらなる段階へ進行できる以前に、微生物を制限および／または除去することができる。貯蔵されないいかなる過剰の銅も、胆管または他の身体系を通して排出されてよい。肝臓の肝細胞からの銅および鉄は、患者の身体の細胞を養うためのトランスフェリンおよびセルロプラスミンを含む、各々のタンパク質担体へ結合される。
【００８９】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図したものであって、制限するためのものではない。それらは使用できたものの中で典型的なものではあるが、当業者に周知の他の方法も代替えとして使用されてよい。
【実施例１】
【００９０】
インビトロのヒトの腫瘍のスクリーンが、開示された組成物、および鉄デキストランのベース化合物と組合わされた組成物の、抗増殖効果を評価するべく用いられた。最大の発生率、発生率の最大の増加、最大の死亡率をもつ癌か、または治療に対し高度に耐性のある癌のモデルを表しているヒト腫瘍細胞系が選ばれた。試験は、当業者に周知の標準的な組織培養技術および、分析用の3Ｈ−チミジンアッセイを用いて行なわれた。
【００９１】
（実験デザイン）
本実験は、開示された組成物単独の、および、ベース化合物との組合せにおける、および、種々の化学療法と併用して用いられる、多くの癌の治療における主力である陽性対照としての、商品名アドリアマイシン（Adriamycin）によっても知られているドキソルビシンの、抗増殖および細胞毒性効果を評価するべくデザインされた（ヒト腫瘍細胞系、ＣＡＫＩ−１腎臓、ＤＬＤ−１結腸、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ黒色腫、ＭＣＦ７乳房、ＮＣＩ−Ｈ２３肺、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺、  ＯＶＣＡＲ−３卵巣、ＰＣ−３前立腺、ＳＮＢ−７５ＣＮＳ、ＺＲ−７５−１乳房、およびＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞、については、チュー（Chu）およびデビータ（Devita）、「Cancer Chemotherapy Drug Manual（癌化学療法薬マニュアル）2003」、Jones and Bartlett Publishers、２００３年、ｐ．１３８−１３９を参照のこと）。図１４を参照のこと。全ての実験について、細胞は収穫され、遠心分離されて培地が除去され、新鮮な完全培地中に懸濁された。試料が採取され、細胞密度が測定された。全ての細胞カウントは、コールター（Coulter）・モデルＺ1セルカウンター（ベックマン・コールター・インク（Beckman Coulter, Inc.）、カリフォルニア州、フラートン（Fullerton））を用いて測定され、生存率はヨウ化プロピジウム染色および、それに続くコールターＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（ベックマン・コールター・インク、カリフォルニア州、フラートン）での分析により測定された。全ての細胞系は、各々完全培地中に、ウエルあたり５×１０3細胞で播種された。翌日、細胞は、８つの希釈度の、組成物のみ、および鉄デキストランのベース組成物と組合された組成物（６０μｇ／ｍＬ、これは鉄デキストランに由来する元素鉄の相当量である）を投薬された。全ての鉄デキストラン量は、鉄デキストランに由来する元素鉄のおよその相当量として測定される。鉄デキストランのベース化合物もまた、対照として単独で行なわれた。プレートは処理の開始４日後に分析された。
【非特許文献７６】チュー（Chu）およびデビータ（Devita）、「Cancer Chemotherapy Drug Manual（癌化学療法薬マニュアル）2003」、Jones and Bartlett Publishers、２００３年、ｐ．１３８−１３９
【００９２】
組成物は以下のように形成された：硝酸銅（９９．９９９％）の無機銅塩、４．８５４ｇは、２０ｍｌの脱イオン水（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）からの分子生物学試薬）中に溶解されるか、または蒸留水もまた使用可能であった。この溶液は約２時間還流された。銅塩溶液は、２ｇの酸化デキストランか、または２ｇの水素化されたデキストランと低温で反応された。（臨床グレードのデキストラン、平均分子量６４，０００〜７８，０００のＤ４７５１は、シグマ・アルドリッチから購入された。）この溶液は、０．２ｍｌの、該溶液中０．５ＭのＮａＯＨの添加に先立ち、１時間還流された。さらに２時間の還流の後、溶液は半分に分けられた。溶液の半分は、２ｇの酸化デキストランと混ぜ合わされ、４０ｍｌの水が添加され、その後に２時間の還流段階が続けられた。溶液の２番目の半分は、水素化されたデキストランと混ぜ合わされ、４０ｍｌの水が添加され、その後に２時間の還流段階が続けられた。溶液は次いで、各々０．１ｍｌの０．５  ＮａＯＨと混ぜ合わされ、還流はさらに２時間続けられた。溶液は静置されて室温に冷却された。結果として得られたＣｕ（ＯＨ）2−デキストランナノ粒子の溶液は、制御された方式で沈殿され、これにおいて各Ｃｕ（ＯＨ）2ナノ粒子は、最終溶液への１２０ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨの添加により、デキストラン分子によってカバーされる。溶液の水分は真空中で蒸発されて、溶液中の銅濃度を増加した。大きい粒子をもつ沈殿は遠心分離され、Ｃｕ（ＯＨ）2−デキストランナノ粒子の水溶液を調製した。溶液中の最終銅濃度は、典型的には約５ｍｇ／ｍｌであり、最終ｐＨは約７．５から約８．５の範囲であり、原子吸光分析法および／または誘導結合プラズマ分光法によってアッセイされた。Ｃｕ（ＯＨ）2−デキストランナノ粒子の粒子サイズは、レーザー光散乱により測定された。粒子サイズは、酸化デキストランについては約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲内であり、水素化デキストランについては約２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であった。粒子サイズを測定した後、溶液は遊離の銅イオンについて、銅電極を用いて検査された。銅特異電極は、４つの既知の銅濃度溶液でキャリブレートされた。これらの濃度は以下の通りであった：  ．１ｍｏｌ／リットル、．０１ｍｏｌ／リットル、．００１ｍｏｌ／リットル、および  ．０００２ｍｏｌ／リットル（〜１ｐｐｍ）。４つの標準のＣｕ２＋溶液のミリボルトの読取り値は、各々：
【表１】
2015044861.tif 000002
であった。
これらの銅溶液のｍＶの読取り値は、典型的には１３０ｍＶ未満であり、そのことは溶液中の遊離Ｃｕ２＋の濃度が１ｐｐｍ未満であって、検出のレベルよりもしばしば低いことを示唆している。（一つの参考点として、環境保護局は飲料水中の１．３ｐｐｍの銅を許可しており、たとえば、安全な水、および銅を含む飲料水の可能な汚染物質についての米国環境保護局のウェブサイトを参照のこと。）全ての試料中の開示された組成物のコロイド懸濁液には、ほとんど遊離の銅は検出されず、典型的には検出のレベル１ｐｐｍをほぼ下回っていた。酸化デキストランと用いて調製された水酸化銅溶液は、ｐＨ８．５であった。水素化デキストランを用いて形成された溶液は、何ら遊離の銅イオンを示さず、典型的には検出レベル１ｐｐｍを下回っていた。
【００９３】
（水酸化銅−水酸化鉄ナノ粒子の調製）
（ａ）試料１の調製
銅塩、２．４２８ｇの硝酸銅（９９．９９９％純粋、アルファ．エイサー（Alfa Aesar）、カタログ＃１０６９９）は、０．２ｇのＦｅＣｌ3，６Ｈ2Ｏ（純度９７〜１０２％、アルファ．エイサー、カタログ＃１２４９７）、および４．０ｇの水素化デキストランと混ぜ合わされた。これらの成分は７０ｍｌの脱イオン水（シグマ・アルドリッチからの分子生物学試薬）中に溶解された。この溶液は次に、約３時間還流された。溶液は９２．８ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨ（フィッシャー（Fisher）ＡＣＳ、カタログ＃Ｓ３１８−３）の、溶液への添加に先立ち、静置して冷却された。溶液の最終ｐＨは、８．５であった。６日後、ｐＨは６．８５に低下し、１．７ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液が添加されてｐＨを８．５に調整した。溶液中の銅および鉄濃度の分析は、原子吸光分析法（「ＡＡ」）および／誘導結合プラズマ分光法（「ＩＣＰ」）によって行なわれた。溶液はシリンジフィルタで濾過され、暗緑色の溶液が無菌のバイアル内へ貯蔵された。鉄オキシ水酸化物もまた、この、または任意の試料中の水酸化鉄のための基質として用いられてよい。
【００９４】
（ｂ）試料２の調製
銅塩、２．４２８ｇの硝酸銅（９９．９９９％純粋、アルファ．エイサー、カタログ＃１０６９９）は、０．４ｇのＦｅＣｌ3，６Ｈ2Ｏ（純度９７〜１０２％、アルファ．エイサー、カタログ＃１２４９７）、および４．２ｇの水素化デキストランと混ぜ合わされた。これらの成分は７５ｍｌの脱イオン水（シグマ・アルドリッチからの分子生物学試薬）中に溶解された。この溶液は次に、約３時間還流された。溶液は１０２．２ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨ（フィッシャーＡＣＳ、カタログ＃Ｓ３１８−３）の溶液中の添加に先立ち、静置して冷却された。溶液の最終ｐＨは、８．５であった。６日後、ｐＨは７．４に低下し、１．６ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液が添加されてｐＨを８．５に調整した。溶液中の銅および鉄濃度の分析は、ＡＡおよび／ＩＣＰによって行なわれた。溶液は遠心分離され、わずかにくもりのある暗緑色の溶液が無菌のバイアル内へ貯蔵された。
【００９５】
（ｃ）試料３の調製
銅塩、２．４２８ｇの硝酸銅（９９．９９９％純粋、アルファ．エイサー、カタログ＃１０６９９）は、０．２ｇのＦｅＣｌ3，６Ｈ2Ｏ（純度９７〜１０２％、アルファ．エイサー、カタログ＃１２４９７）、１．２ｇの水素化デキストラン、および２．８ｇのデキストラン（ＭＷ＝１５，０００）と混ぜ合わされた。これらの成分は７０ｍｌの脱イオン水（シグマ・アルドリッチからの分子生物学試薬）中に溶解された。この溶液は次に、約３時間還流された。溶液は８３．２ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨ（フィッシャーＡＣＳ、カタログ＃Ｓ３１８−３）の、溶液への添加に先立ち、静置して冷却された。溶液の最終ｐＨは、８．５であった。６日後、ｐＨは７．６４に低下し、０．６ｃｃの０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液が添加されてｐＨを８．５に調整した。溶液中の銅および鉄濃度の分析は、ＡＡおよび／ＩＣＰによって行なわれた。溶液は遠心分離され、暗緑色の溶液が無菌のバイアル内へ貯蔵された。
【００９６】
（実験デザインＩ）
（細胞系および標準的な薬剤）
細胞系は、標準的な組織培養法を用いて増殖され、投薬に先立ちマイクロタイタープレートに播種された。対照群は、ベース化合物（６０μｇ／ｍＬ）のみの処理、完全培地の対照、および陽性対照（ドキソルビシン、１μＭ）を含んでいた。組成物の各濃度レベルにつき、各細胞系の８つの重複試料が処理された。
【００９７】
（細胞培養）
以下の実験に使用された細胞系は、以下の表１にリストされている。組成物は、挙げられた充実性腫瘍および液性腫瘍について試験されたが、しかし任意のタイプの癌に有効に使用されてよい。細胞系は無菌条件下に増殖され、ＨＥＰＡ濾過ＣＯ2組織培養インキュベータ中で、５％ＣＯ2および湿度９５％を用いて、３７℃においてインキュベートされた。各細胞系は、実験での使用のため、毎週〜週２回か、またはそれより頻繁に継代培養された。
【００９８】
（3Ｈ（トリチウム）−チミジンアッセイ）
腫瘍系に対する化合物の抗細胞効果は、3Ｈ−チミジンのＤＮＡ取込みアッセイにより査定された。トリチウムチミジンは、１ｍＣｉのストックとして購入され、培地中で１：２５に希釈された。収穫の１日前に、２５μＬ（１μＣｉ）の希釈された3Ｈ−チミジンが各ウエルへ添加され、プレートは一晩インキュベートされた。翌朝、細胞はスカトロン・セルハーベスター（Skatron cell harvester）（モレキュラー・デバイス・コーポレーション（Molecular Device Corporation）、カリフォルニア州、サニーベイル（Sunnyvale））を用いて、グラスファイバーフィルター上に収穫された。フィルターは次に、シンチレーションバイアルに入れられ、シンチレーションカクテルが添加された（ベックマン・コールター・インク、カリフォルニア州、フラートン）。バイアルは次にベックマンＬＳ６０００ＩＣ液体シンチレーションカウンター（ベックマン・コールター・インク、カリフォルニア州、フラートン）で読取られ、データは１分間あたりのカウント（ＣＰＭ）として記録された。データは、処理のためロータス（Lotus）１２３へ移された。
【００９９】
全ての細胞系について、細胞は収穫され、遠心分離されて培地が除去され、新鮮な完全培地中に懸濁された。試料が採取され、細胞密度が測定された。全ての細胞カウントは、コールター・モデルＺ1セルカウンター（ベックマン・コールター・インク、カリフォルニア州、フラートン）を用いて測定され、生存率はヨウ化プロピジウム染色で測定された。分析は次いで、コールターＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメーター（ベックマン・コールター・インク、カリフォルニア州、フラートン）で行なわれた。全ての細胞系は、各々完全培地中に、ウエルあたり５×１０3細胞で播種された。２日目、細胞は、８つの希釈度の、開示された組成物のみで、または、６０μｇ／ｍＬの濃度のベース組成物と組合されて洗浄された。対照は、ベース化合物のみを用いた洗浄により行なわれた。最初の処理の４日後に、プレートが分析された。結果は、下に要約されている：
【表２】
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【０１００】
以下に記述された、腫瘍細胞系に対して行なわれた実験は、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞を除いて、表１の結果とともに呈示されている。組成物プラス、６０μｇ／ｍｌのベース化合物は、１００％の細胞を殺す結果を生じたが、ＣＡＫＩ−１腎臓系は例外であり、それは９９％の細胞を殺す結果となった。さらに、必要であれば、増加されたベース化合物のさらなる添加は、細胞毒性を増大させる。１０μｇ／ｍｌまでの組成物のみに対して耐性であった３つの細胞系、すなわち、ＮＣｌ−Ｈ２３肺、ＺＲ−７５−１乳房、およびＰＣ−３前立腺においては、組成物に対する６０μｇ／ｍｌのベース化合物の添加により、耐性は完全に克服され、１００％の細胞を殺す結果となった。ベース化合物に対し暴露された全ての細胞系について、開示された組成物と併用されたベース化合物の、相乗性の細胞毒性効果により、ＩＣ50は有意に低下され、ベース化合物の添加による増強された細胞殺生を証明した。ベース化合物に対し暴露された全ての細胞系について、ベース化合物を用いた組成物は、乳癌および他の癌の治療における主力の化学療法薬であって当業者には多くの重い副作用をもつことが周知の、ドキソルビシンの細胞殺生に等しいか、または上回っていた。
【０１０１】
（実施例２）
図１、２４時間のインキュベーションの後のＨＴ２９ヒト結腸腺腫細胞系によるＲＯＳ（反応性酸素種）の放出。
【０１０２】
データは、ＨＴ２９細胞の、１０μｇ／ｍＬの開示された組成物、６０μｇ／ｍＬの組成物プラスベース化合物、および、６０μｇ／ｍＬの鉄デキストランベース化合物単独を用いた、２４時間のインキュベーション後に得られた。アッセイは、細胞がその中で増殖しているウエルへ添加された、非蛍光性基質の添加に左右される。ＲＯＳが存在すれば、基質は破壊されて蛍光性の産物を形成する。図１のデータは、組成物が、対照の新鮮な培地およびベース化合物のレベルを超えて、ＲＯＳを産生することを証明している。データはさらに、ベース化合物と併用された開示された組成物による、開示された組成物またはベース化合物単独のそれを超えた、増大されたＲＯＳの産生を証明している。開示された組成物およびベース化合物の組合せは、がん患者に対し放射線療法がそうするように、有意な量のＲＯＳを生成したが、それは一般にＤＮＡ損傷性のフリーラジカルの発生によりその細胞毒性作用を及ぼすと信じられている。放射線療法との併用可能な、開示された組成物とベース化合物との併用は、放射線によって発生される、癌を殺すフリーラジカルの量を増加させることが可能であり、放射線単独を上回る細胞殺生を及ぼす。このことはこの技術において、放射線の細胞毒性作用を増幅および強化する化合物、放射線増感剤として公知である。
【０１０３】
（実施例３）
図２Ａは、ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞に対する開示された組成物の平均阻害濃度のグラフを開示している。阻害濃度５０（「ＩＣ50」）は、実験処置において使用された細胞の５０％以上に対して阻害性または有効性である、使用された組成物または化合物の濃度として定義される。開示された組成物は、ＮＣｌ−Ｈ２３肺細胞へ適用された場合、約１０μｇ／ｍｌの非常に有効なＩＣ50レベルを有する。図２Ｂは、開示された組成物、ベース化合物、ドキソルビシン、および対照の、培地およびＭＴＳ試薬（プロメガ（Promega）、米国ウィスコンシン州マジソン）の双方における、ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の吸収値を提供する。ＭＴＳ試薬はテトラゾリウム塩であり、約４９０ｎｍにおける光の放射を用いて、生きた細胞へ適用されると、着色された化合物、ホルマザンへ転換される。開示された組成物は、１０μｇ／ｍＬの用量において、培養されたＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の４０パーセントを阻害した。ドキソルビシンは高い阻害活性を示すが、インビボで用いられた場合多くの有害な副作用をもつこともまた公知であり、開示された組成物はこれを引き起すことがない。吸収値の単位もまた示されており、いくらかのバックグラウンドの吸収も生じることが推定され、典型的には４時間のインキュベーションの後で０．２〜０．４単位の間の範囲内である。図２Ｃは、異なるＩＣレベルに関して開示された組成物の予測される理論的な吸収レベルを開示している。
【０１０４】
図２Ｄに示されるように、ＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞は、ベース化合物の添加された３μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬ用量の組成物の双方に対し、ほとんどまた全く耐性を示さなかった。ベース化合物の添加された組成物のこの組合せは、結果として、インビトロでの９９〜１００％を超える細胞阻害を生じる結果となり、それはドキソルビシンのものと等しい。ベース化合物と合わせた組成物の濃度は、６０μｇ／ｍＬであった。図２Ｅは、組成物プラスベース化合物の組合せについての吸収値および阻害パーセントを示しており、１０μｇ／ｍＬの低用量においてＮＣＩ−Ｈ２３肺細胞の１００％阻害を示した。図２Ｆは、実験に関する回帰アウトプットの統計的結果を示している。
【０１０５】
（実施例４）
図３Ａは、１０μｇ／ｍＬの濃度における、開示された組成物の高い活性および細胞毒性による、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の９０％を超える阻害を示している。開示された組成物はまた３μｇ／ｍＬの濃度において高度に有効であって、９０％の阻害率があり、わずか１μｇ／ｍＬの濃度でほぼ５０％の細胞阻害があった。開示された組成物はまた、非常に低い用量で有意な阻害パーセントを示す。図３Ｂは、示されているように、多様な用量からの吸収値単位、ならびにいろいろな用量についての阻害パーセントを提供しており、それらは非常に高かった。図３Ｃは、組成物の１．１８３μｇ／ｍＬという低い用量におけるＩＣ50、および回帰アウトプットの統計解析を開示している。
【０１０６】
本実施例は、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞に対する組成物プラスベース化合物の毒性の効果を試験する。これらの試験の結果は、図３Ｄ、３Ｅ、および３Ｆに示されている。図３Ｄは、開示された組成物にベース化合物が添加されているＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞の、組成物それ自体の結果に比較して、増大された細胞殺生を示している。図３Ａに示されるように、１０μｇ／ｍｌの化合物が、結果として１００％の細胞殺生を生じるために適用された。ベース化合物が組成物へ添加された場合、１μｇ／ｍｌの組成物プラスベース化合物が、図３Ｄに示されるように、結果として１００％の細胞殺生を生じた。組成物プラスベース化合物の濃度は、非常に効率的な０．１３１μｇ／ｍｌでＩＣ50阻害を生じる結果となり、結果として実験細胞のＩＣ50阻害を生じるための組成物単独の濃度は、１．１８３μｇ／ｍｌであった。図３Ｅは、示されているように、多様な用量からの吸収値単位、ならびにいろいろな用量についての阻害パーセントを提供しており、それらは非常に高かった。組成物とベース化合物との併用は、ＮＣＩ−Ｈ４６０肺細胞に対する毒性活性においては非常に有効であることが示された。
【０１０７】
（実施例５）
本実施例は、ＭＣＦ７乳房細胞に対する組成物単独の毒性の効果を試験する。図４Ａは、開示された組成物の、ＭＣＦ７乳房細胞に対する非常に高い活性を示している。組成物は、１０μｇ／ｍＬにおいて９０％を超える細胞の阻害を、３μｇ／ｍＬで６０％を超える阻害を示した。図４Ｂは、開示された組成物プラス培地およびＭＴＳに関する吸収値を提供する。図４Ｃは、計算されたＩＣ50、２．２１３μｇ／ｍＬ、および３．０００および１．０００濃度に関する回帰アウトプットを提供する。
【０１０８】
図４Ｄ、４Ｅ、および４Ｆは、ベース化合物と併用された組成物の、ＭＣＦ７乳房細胞に対する毒性作用を試験している。これらの試験は、図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに示されたような開示された組成物単独に比較して、この細胞系へのベース化合物の添加による増強された細胞殺生を示している。図４Ａは、１０μｇ／ｍｌが９０％細胞殺生に必要であったことを示している。ベース化合物との併用において試験された場合には、わずか３μｇ／ｍｌ組成物が１００％の細胞殺生に必要とされ、同じ細胞系についてＩＣ50を０．９７２μｇ／ｍｌに低下させる。
【０１０９】
（実施例６）
図５Ａは、ＺＲ−７５−１乳房細胞に対する、開示された組成物の毒性作用を図式化している。これらの試験は、１０μｇ／ｍＬで約３５％の、ＺＲ−７５−１乳房細胞の阻害を示している。この細胞系は、約１０μｇ／ｍｌまでの濃度において、組成物に対する耐性を示した。吸収値および阻害パーセントは、図５Ｂおよび５Ｃに示されている。
【０１１０】
図５Ｄは、ＺＲ−７５−１乳房細胞に対する、開示された組成物とベース化合物との組合せの、非常に高い活性を開示している。この組合せのＩＣ50は、驚くべき濃度であることが見出され、約２．０３１μｇ／ｍＬと計算された。ＺＲ−７５−１乳房細胞の耐性は、組成物へのベース化合物の添加により本質的に除去された。１０μｇ／ｍｌの組成物プラスベース化合物は、この細胞系に関し、結果として約１００％の細胞殺生を生じ、ほとんど副作用やマイナスの面がなく治療上非常に有効である。図５Ｅは、３μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ用量において有意な阻害をもつ、本実験の吸収値および阻害パーセントを提供する。図５Ｆは、約２．０３１μｇ／ｍｌという低濃度の、計算されたＩＣ50率および、実験についての回帰アウトプットを開示している。
【０１１１】
（実施例７）
図６Ａは、ＰＣ−３前立腺細胞に対する、組成物の毒性試験の結果を示している。ＰＣ−３前立腺細胞は、約１０μｇ／ｍＬまでの濃度の組成物に対し耐性を、０．０１μｇ／ｍＬではいくらかの細胞阻害を示す。１０μｇ／ｍＬの用量は、結果として前立腺細胞の１７％阻害を生じる。図６Ｂおよび６Ｃは、前立腺細胞に対する組成物の実験について、吸収値および統計的結果を提供する。
【０１１２】
図６Ｄは、ＰＣ−３前立腺細胞に対する、組成物プラスベース化合物の毒性の効果を示している。ＰＣ−３前立腺細胞の耐性は、ベース化合物の添加により本質的に除去される。ベース化合物の添加は、図６Ａの組成物単独に比較して増強された細胞殺生を、この細胞系に対するこれらの試験において示している。ベース化合物と併用された組成物の１０μｇ／ｍｌの濃度は、結果として１００％の細胞殺生を生じ、ＩＣ50は１．８６９μｇ／ｍｌの濃度で極めて低かった。３μｇ／ｍｌのように低い濃度が、結果としてこの細胞系の約９０％の阻害を生じた。図６Ｅおよび６Ｆは、この実験の吸収値および統計的結果を提供する。
【０１１３】
０．０１μｇ／ｍｌの濃度レベルにおいて、図６Ａおよび６Ｄの双方において見出される異常な結果の原因は決定されなかった。
【０１１４】
（実施例８）
図７Ａは、ＤＬＤ−１結腸細胞に対する、組成物の高い毒性効果を示している。組成物は、非常に低い濃度を含め、全ての濃度において有意な細胞殺生を示した。結果として生じる阻害パーセントは、図７Ｂに示されたように、非常に高く、１０μｇ／ｍＬの濃度で９５％のＤＬＤ−１結腸細胞の阻害であった。図７Ｃは、実験結果の統計解析を提供する。
【０１１５】
図７Ｄは、ＤＬＤ−１結腸細胞に対する、ベース化合物と併用された組成物による、毒性実験の結果を提供する。これらの試験は、組成物単独に比較して、ベース化合物の添加による増強された細胞殺生を示した。図７Ａおよび７Ｂに示された、１０μｇ／ｍｌの組成物単独による９５％の細胞殺生に比較して、図７ＤおよびＥに示されるように、３μｇ／ｍｌという極めて低い濃度の組成物プラスベース化合物が、１００％の細胞殺生に必要とされた。ＩＣ50は、ベース化合物の添加により、同じ細胞系について、組成物単独の１．４３０μｇ／ｍｌのＩＣ50から、０．１９６μｇ／ｍｌへ低下された。
【０１１６】
（実施例９）
図８Ａは、ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞に対する、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、および１０μｇ／ｍＬのかなり低い濃度における組成物の、９０％阻害率を超える高い毒性の効果を開示している。これらの実験の吸収値および統計的結果は、図８Ｂおよび８Ｃに示されている。
【０１１７】
ＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞に対する、ベース化合物と併用された組成物の毒性効果は、図８Ｄに示されている。これらの試験は、組成物単独に比較して、ベース化合物の添加による増強された細胞殺生を示した。組成物とベース化合物との組合せは、結果として３μｇ／ｍｌの濃度で１００％の細胞殺生を生じたのに対し、組成物単独では、結果として９５％の細胞殺生を生じるために１０μｇ／ｍｌを要した。組成物およびベース化合物の組合せについてのＩＣ50は、非常に低い濃度の０．２９９μｇ／ｍＬまで低下された。
【０１１８】
（実施例１０）
ＣＡＫＩ−１腎細胞に対する組成物の毒性効果は、図９Ａに示されている。組成物はこの細胞系に対し、低い用量であっても非常に高い活性を示した。阻害パーセントは、２０．３％阻害には０．０１μｇ／ｍＬのような低い濃度で、細胞系の８３．６％阻害には１０μｇ／ｍｌの濃度において、組成物の有意な活性を示した。図９Ｂおよび９Ｃ参照。
【０１１９】
組成物プラスベース化合物の併用は、図９Ｄに示されたように、ＣＡＫＩ−１腎細胞に対し非常に高い活性を示した。これらの試験は、図９Ａに示されたような組成物単独の使用に比較して、ベース化合物の添加による増強された細胞殺生を示している。１０μｇ／ｍｌの濃度の組成物は、結果として９９％の細胞殺生を生じた。ＩＣ50は、この細胞系について、１．４４μｇ／ｍＬであった組成物単独のＩＣ50とは異なり、ベース化合物の添加により、１．１３８μｇ／ｍＬへ低下された。ＣＡＫＩ−１腎細胞に対する実験においては、組成物および、組成物プラスベース化合物の双方が、低いＩＣ50率で非常に有意な活性を示した。
【０１２０】
（実施例１１）
図１０Ａは、ＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞に対する組成物の毒性効果を示す。実験は、組成物の高い活性を示し、１０μｇ／ｍＬの濃度において、この細胞系の約８２％の阻害を生じる結果となった。図１０Ｂは、実験についての吸収率および阻害パーセントと、３μｇ／ｍＬにおけるいくらかの阻害を示している。図１０Ｃは、６．７１８μｇ／ｍＬの計算されたＩＣ50を含め、結果についての統計的解析を提供している。
【０１２１】
図１０Ｄは、ＬＯＸ ＩＭＶＩ黒色腫細胞に対する、組成物プラスベース化合物の高い活性を示している。ベース化合物と組合された組成物には、非常に低い用量におけるものを含めて、この細胞系に対し高い毒性作用があった。これらの試験は、図１０Ａに示された組成物単独の使用に比較して、この細胞系へのベース化合物の添加によって増強された細胞殺生を示している。３μｇ／ｍｌ濃度の組成物は、結果として１００％の細胞殺生を生じたが、図１０Ａに示されたように、組成物単独による８２％の細胞殺生には１０μｇ／ｍｌを要した。組成物単独のＩＣ50は６．７１８μｇ／ｍＬであったが、ベース化合物の添加により、同じ細胞系について０．５１３μｇ／ｍＬまで低下された。
【０１２２】
（実施例１２）
組成物の毒性は、ＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞に対して試験された。結果は図１１Ａに示されており、組成物の非常に高い活性を示す。１０μｇ／ｍＬの濃度は、結果として１００％のＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞の阻害を生じ、わずか３μｇ／ｍＬの濃度が、この細胞系の約８５％の阻害を生じる結果となった。図１１Ｂおよび１１Ｃは、吸収値および結果の統計的解析を提供する。
【０１２３】
図１１Ｄは、組成物プラスベース化合物の、ＳＢＮ−７５ＣＮＳ細胞に対する高い毒性効果を開示している。組成物とベース化合物との組合せは、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、および１０μｇ／ｍＬの用量において、非常に好首尾の１００％阻害率を生じる結果となった。これらの結果は、この細胞系へのベース化合物の添加により、組成物単独の使用に比較して増強された細胞殺生を示している。１μｇ／ｍｌの濃度の化合物プラスベース組成物は、１００％細胞殺生のための１０μｇ／ｍｌの組成物単独の濃度に比較して、１００％の細胞殺生を生じる結果となった。ＩＣ50は、同じ細胞系について、ベース化合物の添加により、０．０９５μｇ／ｍｌまで低下された。
【０１２４】
（実施例１３）
ＣＥＭ−ＳＳ細胞は、エイズ研究および参照試薬貯蔵所（EIDS Research and References Reagent Repository）（メリーランド州ベセスダ）から入手された。これらの細胞は、Ｔ−７５フラスコ内で、１０％ウシ胎児血清（熱不活性化）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプロマイシン、および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンとともに、ＲＰＭＩ−１６４０培地（フェノールレッドなし）を含む組織培養液中で継代された。トリチウムチミジンアッセイの１日前に、細胞は１：２に分割され、細胞毒性試験の時間にそれらが対数増殖期にあることを確認した。アッセイの日に、細胞は遠心分離により収集され、上記の組織培養液で２回洗浄され、ｍＬあたり５×１０4細胞に再懸濁され、新鮮な組織培養液中に再懸濁された。全細胞および生存率の計数は、血球計を用いて行なわれた。アッセイに先立つ細胞生存率は、トリパンブルー色素排出により測定され、そうであるべき９５％を超えていた。培養物は、３７℃、５％ＣＯ2において、６日間インキュベートされた。
【０１２５】
組成物単独の、ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞に対する高い毒性効果は、図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃに示されている。これらの図は、５．８７μｇ／ｍＬのＩＣ50および、１０μｇ／ｍＬの用量における約９８％の高度に有効な細胞殺生率を示している。
【０１２６】
（実施例１４）
組成物単独の、ＣＥＭ−ＳＳ白血病細胞に対する高い活性は、図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃに示されている。これらの図は、４．９７５μｇ／ｍＬのＩＣ50および、１０μｇ／ｍＬの用量における約１００％の高度に有効な細胞殺生率を示している。
【０１２７】
（実験デザインＩＩ）
本実験は、単独および、鉄デキストランのベース化合物との組合せにおける開示された組成物の、抗ウイルス効果および細胞毒性効果を、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンを用いてインビトロで評価するべくデザインされた。全ての鉄デキストラン量は、鉄デキストランから由来する元素鉄のおよその相当量として測定された。鉄デキストランのベース化合物はまた、対照として単独で実施された。このプロトコールはまた、所望により、哺乳類の治療のために有効な濃度を測定するべく、他のウイルス、細菌、および原虫の実験にも適用されてよい。
【実施例２】
【０１２８】
（材料および方法）
以下の実験は、無菌のコロイド溶液中に４．５２７ｍｇ／ｍｌの組成物を含んでいる組成物「ＨＰ」バリエーションとｐＨ７．８；および、無菌のコロイド溶液中に４．９３９ｍｇ／ｍｌの組成物を含んでいる組成物「４」バリエーションを用いて行なわれた。組成物−ＨＰおよび組成物−４の双方は、使用に先立ち、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．８〜８．０に調整された。ベース化合物は、５０ｍｇ／ｍｌの無菌のコロイド溶液であった。
【０１２９】
（ＨＣＶ ＲＮＡレプリコン）
細胞系ＥＴ（ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＥＴ）が使用された。ＥＴは、安定なルシフェラーセ（「ＬＵＣ」）レポーターを含んでいる新規なＨＣＶ ＲＮＡレプリコンであって、この特殊な構築物はまだ学術文献に記述されていない。それは細胞系５−２（１）に類似しているが、細胞系をより強健にし、かつ、抗ウイルススクリーニング用の安定なＬＵＣ発現を提供する付加的な修飾を含んでいる。このレプリコンの構造は、以下に図によって示されている。
【０１３０】
細胞系ＥＴのＨＣＶ ＲＮＡレプリコンの構造は、ＨＣＶ（５′）の５′非翻訳領域（「ＮＴＲ」）（「ＩＲＥＳ」）を含んでおり、それはホタルルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ」）、ユビキチン（「Ｕｂｉｑ」）、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（「Ｎｅｏ」）融合タンパク質の産生を駆動する。ユビキチン切断は、ＬＵＣおよびＮｅｏ遺伝子を放出する。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳエレメント（Ｅ−Ｉ）は、ＨＣＶ構造タンパク質、ＮＳ３−ＮＳ５の翻訳を制御する。ＮＳ３タンパク質はＨＣＶポリプロテインを切断し、成熟したＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂを放出し、それらはＨＣＶの複製に必要である。レプリコンの３′末端には、ＨＣＶの基準の３′NＴＲがある。（一定の縮尺で描かれていない）。
【０１３１】
ＬＵＣレポーターは、ＨＣＶ複製の間接的な目安として使用される。ＬＵＣレポーターの活性はＨＣＶ ＲＮＡレベルに正比例し、かつ陽性対照、抗ウイルス化合物は、ＬＵＣまたはＲＮＡエンドポイントのいずれかを用いて同等に挙動する。ＬＵＣエンドポイントの使用は、ＨＣＶ ＲＮＡよりもさらに経済的であり、化合物のライブラリをスクリーンするためのハイスループット適用に使用可能である。
【０１３２】
ＨＣＶ ＲＮＡレプリコン抗ウイルス評価アッセイは、５つの半対数濃度の各々における化合物の影響を調べた。プレートレイアウトは、以下の図１７および１８に示されている。ヒトインターフェロンアルファ−２ｂは、陽性対照化合物として実施毎に含まれていた。ＥＴ系のサブコンフルエントな培養物は、細胞数の分析（細胞毒性）または抗ウイルス活性専用の、９６ウエルプレート内へ播種され、翌日、組成物およびベース化合物の双方のバリエーションが適当なウエルへ添加された。細胞は、まだ細胞がサブコンフルエントである７２時間後に処理された。化合物のＩＣ50およびＩＣ90値は、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコン誘導性のＬＵＣ活性から、ステディ・グロー試薬（steady-glo reagent）（プロメガ（Promega））を用いて得られた。化合物のＴＣ50およびＴＣ90値は、細胞数および細胞毒性の比色指示薬、サイト・トックス−１細胞増殖アッセイ（Cyto Tox-1 cell proliferation assay）（プロメガ）を用いて計算された。化合物のＴＩ50およびＴＩ90値は、スプレッドシートから計算された。
【０１３３】
（結果）
（ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンの抗ウイルス評価）
組成物「ＨＰ」のバラエティは、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンに対し、ベース化合物の添加なしに、弱い〜中程度の抗ウイルス活性を有していた。結果は、ＩＣ（阻害濃度）〜０＝０．７７〜μｇ／ｍＬ；ＴＣ（毒性濃度）〜０＝６．２３μｇ／ｍｌ、およびＴＩ（治療指数、これにおいてＴＩ＝ＴＣ50／ＩＣ50）＝８．１において検出された。図２０参照。組成物４バリエーションは、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンに対し、ベース化合物の添加なしに、弱い〜中程度の抗ウイルス活性を示し、ＩＣ〜０＝０．８４μｇ／ｍｌ；ＴＣ〜０＝６．５２〜μｇ／ｍｌ；およびＴＩ＝７．７を有した。図１９参照。陽性対照、ヒトインターフェロンアルファ−２ｂの結果は、図２１に示されている。また図２２も参照のこと。
【０１３４】
（組成物４およびベース化合物の至適濃度の実験）
組成物４はベース化合物と組合わされ、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンにおいて抗ウイルス活性および細胞毒性を測定した。薬物希釈のマトリックス（組成物４およびベース化合物）は、１．５６３〜５０μｇ／ｍｌのベース化合物に対し、０．１９５〜５０〜μｇ／ｍｌの組成物４の範囲にわたり、プレート上に配列された。この実験の結果は、図２３から３７までに示されている。包括的効果曲線（−１００〜１００％有効性プロット）においては、抗ウイルス効果は６．２５μｇ／ｍｌ以上の用量において明白であった。
【０１３５】
組成物４は、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼ（「ＬＵＣ」）の５０〜７５％阻害範囲を示した。組成物の用量ｐｆが１２．５〜μｇ／ｍｌを超えて増加されると、レプリコンＬＵＣ活性の７５〜１００％を阻害する。
【０１３６】
ベース化合物と一緒の組成物の活性範囲が分析される場合（５０〜１００％有効性プロット）、組成物が６．２５μｇ／ｍｌを超えて増加されると、活性に用量依存性の増加があることが明らかに示されており、ベース化合物の濃度が約１２．５〜μｇ／ｍｌ以上から増加するにつれ、傾向はより高い活性に向かうことが示された（３Ｄ曲線のピーク、コンタープロットの左上の４つのボックス）。図２２、２４、２６、２８、および３２参照。
【０１３７】
化合物毒性の包括的な評価（０〜１５０％生存率／毒性曲線）においては、組成物は１２．５〜μｇ／ｍｌを超えると毒性となり、さらに濃度が増すにつれ、５０％〜０％の生存率となるように見える。
【０１３８】
曲線の細胞毒性部分（０〜５０％生存率）は、用量が６．２５〜μｇ／ｍｌを超えるにつれて、ベース化合物の濃度に関係なく明らかな組成物用量依存性が、毒性において増加するかどうかを測定するべく分析された。１２．５％を超える組成物濃度では、大多数の細胞が死んだ。
【０１３９】
生存率／毒性曲線の生存部分（５０〜１００％生存率）は、組成物が１２．５〜μｇ／ｍｌから６．２５μｇ／ｍｌまで低減された際のますます増える生存率の増加と、それに続く、薬物濃度がさらに低減される際の生存率のさらに劇的な増加を測定するべく分析された。
【０１４０】
（組成物４およびベース化合物の至適濃度の実験）
本発明者らが興味をもったものについて用量濃度の範囲が試験された。化合物４とベース化合物との組合せのマトリックスは、５．５〜１３μｇ／ｍｌの組成物４と、５０〜１０５０μｇ／ｍｌのベース化合物とを用いて配列された。図３３から３６までを参照。ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンルシフェラーゼ活性のパーセント阻害は、８．５〜μｇ／ｍｌから５．５〜μｇ／ｍｌまでの組成物４では着々と増加し、５５０〜μｇ／ｍｌのベース化合物と併用されると正に影響された。
【０１４１】
細胞生存率は、特に組成物４のより高い濃度において、組成物ベース化合物の濃度が５０〜μｇ／ｍｌを超えて増加すると素早く低下した。
【０１４２】
（結論）
組成物ＨＰ（ＴＩ＝８．１）および組成物４（ＴＩ＝７．７）は、ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンに対し、インビボにおいて弱い〜中程度の活性があった。これらの薬物の併用が結果としてそれらの活性の増加を生じるかどうかを調べるため、組成物４およびベース化合物の濃度を変えるマトリックスが利用された。これらの実験の結果は、組成物４およびベース化合物の至適混合物が、５０μｇ／ｍｌのベース化合物と一緒の約６〜７μｇ／ｍｌの組成物４、となることを見出した。
【実施例３】
【０１４３】
（材料および方法）
以下の実験は、無菌のコロイド溶液中に４．５２７ｍｇ／ｍｌの組成物を含んでいる組成物「ＨＰ」バリエーション、およびｐＨ７．８；および、無菌のコロイド溶液中に４．９３９ｍｇ／ｍｌの組成物を含んでいる組成物「４」バリエーションを用いて行なわれた。組成物−ＨＰおよび組成物−４の双方は、使用に先立ち、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．８〜８．０に調整された。ベース化合物は、５０ｍｇ／ｍｌの無菌のコロイド溶液であった。
【０１４４】
（テトラゾリウム色素還元アッセイ）
細胞生存率は、テトラゾリン含有色素混合物セル・タイター（Cell Titer）９６（登録商標）（プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）を用いて染色することにより測定された。混合物は、代謝活性のある細胞のミトコンドリア酵素により、可溶性のホルマザン産物へ代謝され、細胞数の迅速な量的分析を可能にする。培地はプレートから除去され、１００μＬの新鮮な培地および１０μＬのセル・タイター９６（登録商標）で置換えられた。プレートは３７℃で４時間再インキュベートされ、モレキュラー・デバイズ（Molecular Device）Ｖｍａｘプレートリーダーにより、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍにおいて分光光度法により読取られた。組成物の添加のない対照ウエルに比較した、組成物処理されたウエルのパーセント細胞生存率は、社内のコンピュータプログラムを用いて計算された。
【０１４５】
（ＨＢＶ抗ウイルス評価アッセイ）
ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）ａｙｗｌ株を産生するＨｅｐＧ２  ２．２．１５細胞は、コラーゲンコートされた９６ウエルマイクロタイタープレートに、２％ウシ胎児血清を補足されたＤＭＥＭ培地を用いて、２．５×１０4／ウエルの密度で播種された。細胞の播種の１日後、ウエルは洗浄され、培地は、半対数シリーズで培地中に希釈された試験化合物を含有する完全培地で置換えられた（代表的なプレートレイアウトについては図３７を参照のこと）。培地は、組成物の最初の添加の３日後に、新たに希釈された化合物を含有する新鮮な培地で一度置換えられた。３ＴＣ（ラミブジン）は、陽性対照化合物として使用された。
【０１４６】
試験化合物の最初の投与の６日後、細胞培養上清が収集された。組織培養上清中に存在するビリオン関連ＨＢＶ ＤＮＡは次に、ＨＢＶａｙｗｌ株由来のプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。続いて、ＰＣＲ増幅されたＨＢＶ ＤＮＡは、増幅されたＨＢＶ ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションに続く、クエンチされた蛍光プローブ分子のエキソ型核酸分解から結果として生じる蛍光シグナルの増加をモニターすることにより、タクマン（TaqMan）量的ＰＣＲアッセイにおいてリアルタイムで検出された。標準曲線は、ＨＢＶａｙｗｌプラスミドＤＮＡを用いて作成された。試料はＰＣＲにより二重に分析され、標準曲線の範囲内に入る試料の平均値が、ＨＢＶ ＤＮＡのコピー数を割当てるべく使用された。
【０１４７】
ＯＤ（光学密度）値は、細胞生存率の結果から得られ、リアルタイムのＰＣＲによって得られたビリオンＤＮＡのコピー数は、ＤＮＡコピー数のパーセントを計算する社内のコンピュータプログラムを用いて分析され、試料ＩＣ50の抗ウイルス活性を計算するべく使用された。細胞生存率データは、ＴＣ50を計算するべく使用された。治療指数（ＴＩ）は、ＴＣ／ＩＣから計算された。これらの結果は、グラフにより表示されている。図３９〜４０参照。付加的なスプレッドシートが、データからＩＣ50、ＴＣ90、およびＴＩ90値を測定するべく用いられた。
【０１４８】
（ＢＶＤＶ抗ウイルス評価アッセイ）
マディン・ダービー（Madin-Darby）ウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞は、Ｔ−７５フラスコ内へ継代された。アッセイの前日、細胞はトリプシン処理され、ペレット化され、計数され、９６ウエル平底組織培養プレート内の組織培養液中に、ウエルあたり１００μｌの体積中に１×１０4／ウエルで再懸濁された。細胞の播種の１日後、ウエルは洗浄され、培地は、半対数シリーズで培地中に希釈された種々の濃度の試験化合物を含有する完全培地（２％リンパ液）で置換えられた（代表的なプレートレイアウトについては図２２を参照のこと）。あらかじめ力価の測定された、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のアリコートは、各実験の直前にフリーザー（−８０℃）から移された。ウイルスは組織培養液中へ希釈されて、各ウエルへ添加されるウイルスの量が、感染後６〜７日で完全な細胞殺生を生じるようにした。
【０１４９】
細胞の生存率は、薬物添加後６〜７日に、テトラゾリン含有色素混合物セル・タイター（Cell Titer）９６（登録商標）（プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）を用いて染色することにより測定された。混合物は、代謝活性のある細胞のミトコンドリア酵素により、可溶性のホルマザン産物へ代謝され、細胞数の迅速な量的分析を可能にする。培地はプレートから除去され、１００ｇｌの新鮮な培地および１０ｐ．１のセル・タイター９６（登録商標）で置換えられた。プレートは３７℃で４時間再インキュベートされ、モレキュラー・デバイズ（Molecular Device）Ｖｍａｘプレートリーダーにより、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍにおいて分光光度法により読取られた。組成物の添加のない対照ウエルに比較した、組成物処理されたウエルのパーセント細胞生存率は、社内のコンピュータプログラムを用いて計算され、それはウイルスの細胞変性性効果におけるパーセント減少と、対照値に比較された各薬物濃度における細胞数とを図表化する。プログラムは、ＢＶＤＶの細胞変性性効果を５０％まで減少させる薬物の阻害濃度（ＩＣ50）、および細胞の５０％を殺す毒性濃度（ＴＣ50）を内挿する。
【０１５０】
（Cynmolgousサルの一次肝細胞培養物における組成物の細胞毒性）
高い生存率および代謝活性をもつカニクイザルの一次肝細胞の２４ウエルプレートは、セドラ・コーポレーション（Cedra Corporation）によって調製された。実験が開始されたとき、細胞は〜８５％コンフルエントであった。組成物の細胞毒性は、半対数シリーズで無血清培地（ＳＦＭ）中に希釈された、薬物の６つの濃度において査定され、１００μｇ／ｍｌは高い試験濃度として使用された。４つの未処理の対照ウエルは、ＳＦＭのみを含有していた。組成物および培地は、添加後２および５日に交換された。添加後７日に、組成物および培地は除去され、ウエルは培地ですすがれた。セル・タイター９６（登録商標）（プロメガ）が、ウエル中の新鮮な培地へ添加され、吸収は上記のように測定された。各組成物濃度のウエルの平均吸収は、未処理の細胞対照と相対的にプロットされ、ＴＣ50値が、これらの曲線から外挿された。図５８参照。
【０１５１】
（結果）
（ＨＢＶ抗ウイルス評価）
化合物組成物ＨＰは、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５アッセイにおいて、ＨＢＶに対し多少の抗ウイルス活性を示し、ＩＣ50＝１１μｇ／ｍｌ、ＴＣ50＝６４μｇ／ｍｌ、およびＴＩ＝５．８であった。ＨＢＶ抗ウイルス評価実験の生データは、図３９〜４１に示されている。
【０１５２】
ベース化合物を組成物ＨＰと一緒に組合せることの効果は、図４２〜５０に示されている。ベース化合物は、５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、または６０μｇ／ｍｌにおいて、各々３つの濃度、１μｇ／ｍｌ、３．１６μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの組成物ＨＰとともに使用された。ベース化合物単独および組成物ＨＰ単独もまた試験された。抗ウイルス活性または細胞毒性はほとんど識別されなかった。
【０１５３】
上記の実験において抗ＨＢＶ抗ウイルス活性が期待されたことから、ベース化合物の濃度が変更された。組成物ＨＰの抗ＨＢＶ抗ウイルス活性に対する、２００μｇ／ｍｌのベース化合物の効果が試験された。抗ウイルス活性はほとんど識別されなかった。ＴＣ50＝２６μｇ／ｍｌの組成物ＨＰプラス２００μｇ／ｍｌのベース、が観察された。この実験に関する生のデータは、図４９〜５０に示されている。化合物−４の抗ＨＢＶ抗ウイルス活性もまた試験された。化合物は、アッセイにおいてほんのわずかばかり活性があった、図４１〜４３参照。
【０１５４】
（ＢＶＤＶ抗ウイルス評価）
組成物ＨＰはＭＤＢＫ細胞において毒性であり、ＴＣ５０＝０．９７ｐｇ／ｍｌであった。組成物４は、ＢＶＤＶに対し、妥当な抗ウイルス活性を示し（図４０〜４１参照）、ＴＣ50＝１７．３、ＩＣ50＝２．６、ＴＩ＝６．７であった。組成物−ＨＰは、ＢＶＤＶに対し低い抗ウイルス活性を示し、ＩＣ50は達成されなかった。図５４〜５５参照。
【０１５５】
（カニクイザルの一次肝細胞における細胞毒性）
組成物ＨＰは、カニクイザルの一次肝細胞培養物により、中程度のＴＣ50＝２０μｇ／ｍｌを示した。一次肝細胞実験に関する生のデータは、図５８に示されている。
【０１５６】
図５９〜８５は、ベースの添加のある、またはない、種々の濃度の組成物の効果を実証するためのさらなる実験を開示している。
【０１５７】
たとえば、図５９〜６１は、結核菌（mycobacterium tuberculosis）を用いた、組成物のインビトロの活性の実験結果を示している。
【０１５８】
さらに、図６２〜７７は、Ｃ型肝炎ウイルスに関するような、抗ウイルス評価を示す。
【０１５９】
さらに、図７８〜１２０は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関する抗ウイルス活性を示す。
【０１６０】
（議論）
組成物ＨＰおよび組成物４は、弱い〜中程度の抗ＨＢＶ抗ウイルス活性をインビトロで示した。組成物−ＨＰに対するベースの添加は、その抗ウイルス活性をほとんど増強しなかった。化合物組成物−ＨＰは、ＢＶＤＶに対しインビトロでほんど抗ウイルス活性を示さなかったが、一方組成物４は、ＢＶＤＶに対し中程度の抗ウイルス活性を示した。組成物ＨＰは、カニクイザルの一次肝細胞培養物物を用いて、ＴＣ50＝２０μｇ／ｍｌを示した。
【実施例４】
【０１６１】
組成物の抗ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）活性は、標準的なＰＢＭＣに基づく細胞ウイルスアッセイ系か、またはＣＥＭＳＳに基づく抗ＨＩＶ−１細胞ウイルスアッセイ系において、種々の濃度のベースの不在および存在下に評価された。組成物、ベース、および組成物プラスベースの抗ウイルス活性は、ＨＩＶ−１ＲＦ感染されたＣＥＭ−ＳＳ細胞において評価された。組成物を用いた、または用いないベースは、抗ウイルス活性については、本発明者らの標準的な慢性ＨＩＶ−１感染（ＣＥＭＳＫ１またはＣＥＭＲＦ）アッセイにおいて、また細胞（ＣＥＭＳＫ１）が長期間処理された場合には活性について評価された。ＴＮＦαによる誘導に先立ち、化合物で前処理され、後にＨＩＶ−１で感染されたＵ１細胞に対する活性もまた評価された。
【０１６２】
（材料および方法）
（新鮮なヒト末梢血細胞における組成物の抗ＨＩＶ活性の評価）
（ＰＢＭＣ単離およびブラスティング）
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、正常な、肝炎およびＨＩＶ−１陰性のドナーから、フィコール・ハイパック勾配分離によって得られる。簡単にいえば、抗凝固血は、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋のないダルベッコ（Dulbecco）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈され、５０ｍｌの遠心管内の１４ｍＬのリンパ球分離用培地上に重層される。管は次に６００×ｇで３０分間遠心分離される。層状のＰＢＬは、結果として生じた境界面から静かに吸引され、続いて低速遠心分離によりＰＢＳで２回洗浄された。単核細胞は計数されトリパンブルー色素排除により生存率が測定され、１５％ＦＢＳ（熱不活化）、２ｍＭ  Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを、２μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）とともに補足された、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に、１×１０6細胞／ｍＬで再懸濁される。細胞は３７℃、５ＣＯ2において、４８〜７２時間培養される。インキュベーションの後、細胞は遠心分離により集められ、１５％ＦＢＳ（熱不活化）、２ｍＭ  Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを、２０Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ−２（ＲアンドＤシステムズ（R & D Systems）、ミネソタ州ミネアポリス）とともに補足されたＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄され、再懸濁される。ＩＬ−２は、ＰＨＡ細胞誘発刺激により開始される細胞分裂を維持するべく、培地中に含められる。培養物は次いで、新鮮なＩＬ−２含有培地を用いた３日毎の、１／２培養体積の交換まで維持される。
【０１６３】
（ＰＢＭＣアッセイ）
最低２名のドナーからの、ＰＨＡおよびＩＬ−２でブラストされたヒト末梢血単核細胞は、計数され、トリパンブルー色素排除により生存率が測定され、同じ比率に混合される。ＨＩＶ感染と、一次リンパ球集団のＰＨＡおよびＩＬ−２に対する全体的な応答とにおける、量的および質的差異からの結果として生じる個々のドナー間に見られる変動性を最少化するべく、プールされたドナーが使用される。細胞は、１５％ウシ胎児血清（熱不活化）、２ｍＭ  Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ＭＬストレプトマイシン、および１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、およびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）を補足された、フェノールレッドなしのＲＰＭＩ−１６４０中に１×１０6細胞／ｍＬで再懸濁される。５０マイクロリットルの細胞は、次に、９６ウエル丸底マイクロタイター培養プレート内の内側の６０ウエルへ、サザンリサーチ研究所（Southern Research Institute）の感染症研究部（Infectious Disease Research department）によって開発された標準的なフォーマットで分配される。各プレートは、細胞対照ウエル（細胞のみ）、ウイルス対照ウエル（細胞プラスウイルス）、および実験ウエル（薬物プラス細胞プラスウイルス）を含有する。連続的に希釈された化合物がマイクロタイタープレートへ、それに続き、適当にプレタイターされたＨＩＶ−１株が添加される。本文に提示された研究は、ＨＩＶのＲＯＪＯ株を使用した。ＲＯＪＯはサザンリサーチ研究所の研究室において特別に分離および開発された、ＨＩＶの低継代の小児科臨床分離株である。化合物の毒性試験用には、全ての試料は、ウイルスなしの重複測定プレートを用いて三重にアッセイされる。ウエルあたりの最終体積は２００：μＬである。検定物は、加湿された雰囲気下に３７℃、５％ＣＯ2において６日間インキュベートされ、その後に、ＲＴ活性の分析用に上清が集められ、シスタープレートはＭＴＳ色素還元により細胞生存率用に分析される。ウエルはまた顕微鏡検査され、任意の異常が記録された。
【０１６４】
（確立された細胞系における化合物の抗ＨＩＶ活性の評価）
（修正されたＨＩＶサイトプロテクションアッセイ）
ＣＥＭ−ＳＳ細胞（1ｍｌあたり５×１０4細胞）は、Ｔ２５フラスコ内で化合物の存在下に、０．００５〜０．０１の範囲にわたる感染多重度で、ＨＩＶ−１RFウイルスにより感染された。１、２．５、５、１０、２０、３２μｇ／ｍｌの組成物、０．７５μｇ／ｍｌのベース１、および組成物プラスベース１の濃度が評価された。感染６日後に、ウイルス複製は、ＲＴの検定により無細胞上清において査定された。細胞は次に洗浄され、化合物の非存在下および存在下に再懸濁された。続く、洗浄後６日および１２日に、ウイルス複製は、ＲＴおよび細胞外ｐ２４の検定により、無細胞上清において査定された。
【０１６５】
（慢性的に感染された細胞における化合物の抗ＨＩＶ活性の評価）
（標準的な慢性アッセイ）
２万５千（２．５×１０3）個の慢性的に感染されたＣＥＭＲＦ細胞は、９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルあたり１００μｌの組織培養液中に播種された。旧来の、および新規の組成物は、０．１、１、および１０μｇ／ｍｌのベース１の非存在下および存在下に評価された。３７℃における、５％ＣＯ2インキュベータ内での６日間のインキュベーションの後、ウイルス複製はＲＴの検定により無細胞上清において査定され、細胞生存率はトリチウムチミジン取込みにより査定された。
【０１６６】
（修正された慢性アッセイ）
慢性的に感染されたＣＥＭＳＫ１細胞は、１、２．５、５、１０、２０、および３２μｇ／ｍｌの組成物、０．７５μｇ／ｍｌベース１、および組成物プラスベース１を用いて、７、１４、２１、および２８日のいずれかにわたり培養された。処理の後、ウイルス複製はＲＴおよび細胞外ｐ２４の検定により無細胞上清において査定され、細胞生存率はトリチウムチミジン取込みにより査定された。この同時点で細胞は収集され、洗浄されて化合物を除去し、薬物の不在下にさらに１４日間培養された。洗浄後７日に、トリチウムチミジン取込みによりウイルス複製が査定された。洗浄後１４日に、ウイルス複製は、ＲＴおよび細胞外ｐ２４の検定により、無細胞上清において査定され、細胞生存率はトリチウムチミジン取込みにより査定された。
【０１６７】
（潜伏感染された細胞における組成物の抗ＨＩＶ活性の評価）
Ｕ１細胞は、エイズ研究および参照試薬プログラム（AIDS Research and Reference Reagent Program）から入手され、標準的な培養条件下に維持された。アッセイの２４時間前、細胞は、１０％ウシ胎児血清（熱不活化）、２ｍＭ  Ｌグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ＭＬストレプトマイシンを補足された培地（フェノールレッドなしのＲＰＭＩ−１６４０培地）中で１：２に分割された。Ｕ１細胞はＴ２５フラスコ内で、１、２．５、５、１０、２０、および３２μｇ／ｍｌの組成物、０．７５μｇ／ｍｌベース１、組成物プラスベース１の存在下に、１、３、６、９、および１２日間にわたり培養された。アッセイ時には、２．５×１０４細胞／ｍＬは、１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦαを含有する培地を用いて、９６ウエルプレート中に播種された。培養物は５日間インキュベートされ、無細胞上清が収穫された。化合物の毒性は、トリチウムチミジンの取込みにより測定された。ウイルス複製は、ＲＴ、細胞内ｐ２４、および細胞外ｐ２４の検定により、無細胞上清において査定された。
【０１６８】
（トリチウムチミジン捕捉に対する化合物の効果の評価）
慢性ＣＥＭＳＫ１細胞（１０5）は、３７℃で一晩のインキュベーションの前か、またはインキュベーションに続くチミジン取込みの検定のための収穫に先立ち、９６ウエルマイクロタイタープレートの適当なところへ播種された。組成物（３２μｇ／ｍｌ）、ベース１（１μｇ／ｍｌ）、および組成物プラスベース１が評価された。評価された変動条件は、以下の表に要約されている。
【表３】
2015044861.tif 000004
【０１６９】
（3Ｈチミジン取込み）
特別の実験において、細胞の生存率は、［3Ｈ］チミジンの細胞ＤＮＡへの取込みにより測定された。アッセイ終了の２４時間前、ウエルあたり０．１μＣｉ（５ｍＣｉ／ｍｌ）の［3Ｈ］チミジンが添加された。取込みは、Ｈ2Ｏによる細胞の溶解および、スカトロン・ハーベスタ（Skatron harvester）を用いたガラス繊維フィルタ上への捕捉の後に、ウォラク・マイクロベータ・カウンター（Wallac Microbeta counter）で測定された。
【０１７０】
（細胞生存率のためのＭＴＳ染色）
特定のアッセイには、アッセイの終わりに、プレートは可溶性のテトラゾリウムを主成分とする色素ＭＴＳ（セルタイター（CellTiter（登録商標）））試薬 プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）で染色され、細胞生存率を測定し、化合物の毒性を定量化した。ＭＴＳは、代謝活性のある細胞のミトコンドリア酵素により、可溶性のホルマザン産物へ代謝され、細胞生存率および化合物の細胞毒性の迅速な量的分析を可能にする。この試薬は単一な安定した溶液であり、使用前に調製を必要としない。アッセイの終わりに、ウエルあたり２０μＬのＭＴＳ試薬が添加される。ウエルはＨＩＶサイトプロテクションアッセイ用には一晩、単核細胞／マクロファージおよびＰＢＭＣ用には３７℃で４時間インキュベーションされる。インキュベーション時間は、各細胞タイプにおける最適な色素還元のため、経験的に決められた時間に基づき選択された。接着性のプレートシーラーが蓋の代わりに使用され、シールされたプレートは数回反転されて可溶性のホルマザン産物を混合し、プレートはモレキュラー・デバイシズ・Ｖマックス・プレートリーダ（Molecular Devices Vmax Plate reader）により、４９０ｎｍにおいて分光光度法により読取られた。
【０１７１】
（逆転写酵素アッセイ）
逆転写酵素活性は、無細胞上清において測定された。トリチウムチミジン三リン酸（ＮＥＮ）（ＴＴＰ）は、蒸留されたＨ2Ｏ中に５Ｃｉ／ｍＬで再懸濁された。ポリｒＡおよびオリゴｄＴは、−２０℃に保持された保存溶液として調製された。ＲＴ反応緩衝液は、毎日新たに調製され、１２５μＬの１．０Ｍ ＥＧＴＡ、１２５μＬのｄＨ2Ｏ、１１０μｌの１０％ＳＤＳ、５０μＬの１．０Ｍトリス（ｐＨ７．４）、５０μＬの１．０Ｍ ＤＴＴ、および４０μＬの１．０Ｍ ＭｇＣｌ2からなる。これら３つの溶液は、ＴＴＰ ２、ポリｒＡ：オリゴｄＴ １、および反応緩衝液 １の割合で混ぜ合わされた。この反応混合物１０μＬは丸底マイクロタイタープレートに入れられ、１５μＬのウイルス含有上清が添加され、混合された。プレートは３７℃において、プレートの水没を防ぐための堅固な支えのついた水槽中で、６０分間インキュベートされた。反応の後、反応体積はＤＥ８１紙の紙片上へスポットされ、各々５％リン酸ナトリウム緩衝液中で５分間にわたり５回、各々蒸留水中で１分間にわたり２回、各々７０％エタノール中で１分間にわたり２回洗浄され、次に乾燥された。オプティ−フルオルＯ（Opti-Fluor O）が各試料へ添加され、取込まれた放射能はウォラク（Wallac）１４５０マイクロベータプラス（Mirobetaplus）液体シンチレーションカウンタを利用して定量された。
【０１７２】
（Ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡキットは、コールター・エレクトロニクス（Coulter Electronics）から購入された。アッセイは製造業者の指示に従って行なわれる。各試料中のｐ２４項減の量を正確に定量化するため、対照曲線は、アッセイ毎に描かれる。データは、モレキュラー・デバイシズ・Ｖマックス・プレートリーダを用いて、４５０ｎｍにおける分光光度法により得られる。終濃度は、モレキュラー・デバイシズ・ソフト・マックス（Molecular Devices Soft Max）ソフトウェアパッケージを用いて、光学密度から計算される。
【０１７３】
（データ解析）
自社のコンピュータプログラムを用いて、ＩＣ50（ウイルス複製の５０％阻害）、ＴＣ50（細胞生存率における５０％減少）、および治療指数（ＴＩ、ＩＣ50／ＴＣ50）が与えられる。データのグラフ表示付きの、抗ウイルス活性および毒性の双方に関する生のデータは、個々の化合物の活性を要約したプリントアウトにおいて提供された。本発明者らは、ＡＺＴを個々のアッセイのための適切な陽性対照化合物とした。
【０１７４】
（結果）
（予備実験）
（ＣＥＭ−ＳＳ培養物における細胞毒性）
組成物は単独で、およびベースまたは水素化されたベースと一緒に、ＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する毒性について評価された。２つの方法が細胞毒性を測定するべく用いられた：ＭＴＳ色素の添加の後に光学密度の測定変更、および［3Ｈ］チミジン取込み。化合物の細胞毒性は、以下の表１に提示されている。これらのアッセイにおいて得られた生のデータは、付録１に提示されている。
【表４】
2015044861.tif 000005
【０１７５】
（ＰＢＭＣ培養物における有効性）
組成物、ベース１、ベース２、ベース３、および組成物プラス各々の個々のベース（１０００、３００、２００、１００、６０、３０、２０、１０、５、１μｇ／ｍｌ）は、野生型ウイルスに感染されたＰＢＭＣにおいて活性に関し評価された。ＡＺＴは陽性の抗ウイルス対照化合物として各アッセイにおいて使用され、予想された抗ＨＩＶ活性を示した（１〜１０ｎＭ）。抗ウイルス効果は化合物の、無細胞上清中のウイルス関連性の逆転写酵素活性の発現を低減する能力の検定によって評価された。組成物は、ＲＯＪＯ臨床ＨＩＶ−１分離株に対し、０．０７〜１．４μｇ／ｍｌの範囲のＥＣ50で、ＨＩＶの複製を阻害した。単一療法として評価された場合、ベース１から３までが、ある範囲の抗ウイルス活性を見せ、各々１４８７０、１、および８２６０の治療指数を与えた。
【０１７６】
上記の記述においては、いくつかの用語が好ましい態様を説明するべく使用されている。しかしながら、この用語は単に代表的であるに過ぎないこと、および本発明の範囲を制限することを意図していないことから、使用された用語によって何ら無用の制限が造られるべきではない。
【０１７７】
添付された特許請求の範囲において言及されているように、本発明の範囲を離れることなく、本発明に対し他の変更が行なわれてよいことがさらに理解される。  
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図５９Ａ】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６２Ａ】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６６Ａ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７０Ａ】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７４Ａ】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
2015044861.tif 000130
【図７９】
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【図８０】
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【図８０Ａ】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８３Ａ】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８６Ａ】
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【図８７】
2015044861.tif 000142
【図８８】
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【図８９】
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【図８９Ａ】
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【図９０】
2015044861.tif 000146
【図９１】
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【図９２】
2015044861.tif 000148
【図９２Ａ】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９５Ａ】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９８Ａ】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０１Ａ】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０４Ａ】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０７Ａ】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１０Ａ】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
2015044861.tif 000176
【図１１３Ａ】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
2015044861.tif 000180
【図１１６Ａ】
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【図１１７】
2015044861.tif 000182
【図１１８】
2015044861.tif 000183
【図１１９】
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【図１１９Ａ】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図２３】
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【図２４】
2015044861.tif 000189
【図２５】
2015044861.tif 000190
【図２６】
2015044861.tif 000191
【図２７】
2015044861.tif 000192
【図２８】
2015044861.tif 000193
【図２９】
2015044861.tif 000194
【図３０】
2015044861.tif 000195
【図３１】
2015044861.tif 000196
【図３２】
2015044861.tif 000197
【図３３】
2015044861.tif 000198
【図３４】
2015044861.tif 000199
【図３５】
2015044861.tif 000200
【図３６】
2015044861.tif 000201