(57)【要約】【課題】カルシウム結合ペプチドを含む組成物の提供。【解決手段】配列（Ｘ−Ｙ−Ｚ）ｎ、式中、Ｘはアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、アラニンおよびグルタミンから選択されるアミノ酸であり、ＹおよびＺはアラニン、セリン、スレオニン、ホスホセリン、ホスホスレオニン、およびそれらの誘導体から選択されるアミノ酸であり、このペプチドを含む化合物群が開示できる。これらの化合物は、石灰化した表面に堅固にしかも特異的に結合する特性を有し、歯および骨の表面の再鉱化、骨および歯の欠陥の診断、骨および歯の欠陥の治療、石灰化の同定、局在化、または操作が望まれる、インビトロおよびインビボの両方、ならびに産業的、合成の、医学的、歯学的、および研究用途における石灰化した堆積物の存在および局在の分析を含む様々な用途に該化合物を役立たせる。【選択図】図６
2015147779.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のカルシウム結合ペプチドを含む組成物であって、該カルシウム結合ペプチドの各々が、配列（Ｘ−Ｙ−Ｚ）ｎを含み、Ｘは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、アラニンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、ＹおよびＺは、アラニン、セリン、スレオニン、ホスホセリン、およびホスホスレオニンから選択されるアミノ酸であり、ｎは、１〜４０の数であり、該カルシウム結合ペプチドはリン酸カルシウムに結合する、組成物。
【請求項２】
前記１以上のカルシウム結合ペプチドが、約３〜約１００個のアミノ酸長を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｎが、２〜８個の数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｘが、アスパラギン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＹおよびＺが、セリンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記カルシウム結合ペプチドが、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記カルシウム結合ペプチドが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記カルシウム結合ペプチドが、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記カルシウム結合ペプチドが、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記カルシウム結合ペプチドが、結合体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記結合体が、発蛍光団、発色団、アフィニティータグ、抗原タグ、放射性標識、またはスピン標識からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記結合体が、ペプチド、タンパク質、糖質、核酸、脂質、有機化合物、無機化合物、または有機金属化合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記結合体が、抗癌化合物または抗菌化合物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗菌化合物が、抗菌ペプチドである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記抗菌ペプチドが、アミノ酸リンカー配列を介して、前記１以上のカルシウム結合ペプチドに連結される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥を治療する方法であって、請求項１に記載の組成物を該被験体に投与することを含み、該投与が、歯の再鉱化をもたらす、方法。
【請求項１７】
被験体における骨密度の減少によって特徴付けられる骨の欠陥を治療する方法であって、請求項１に記載の組成物を該被験体に投与することを含み、該投与が、骨密度の増加をもたらす、方法。
【請求項１８】
被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥を特定する方法であって、請求項１に記載の組成物を該被験体に投与することを含み、該組成物中の前記カルシウム結合ペプチドが、検出可能なマーカーに結合体化し、該カルシウム結合ペプチドは、脱塩した歯の表面に優先的に結合する、方法。
【請求項１９】
被験体における骨の脱塩によって特徴付けられる骨の欠陥を特定する方法であって、請求項１に記載の組成物を該被験体に投与することを含み、該組成物中の前記カルシウム結合ペプチドが、検出可能なマーカーに結合体化し、該カルシウム結合ペプチドが、脱塩した骨の表面に優先的に結合する、方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願は、２００５年９月８日に出願された、米国仮特許出願第６０／７２２，０７１号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／７２２，０７１号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
背景
石灰化表面に特異的に結合する化合物には、テトラサイクリン、カルセイン、およびアリザリンなどの小蛍光分子、および象牙質リンタンパク質（ｄｅｎｔｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＤＰＰ、多くの場合、ホスホホリンと呼ばれる）およびアメロゲニンなどの巨大カルシウム結合タンパク質が含まれる。ＤＰＰは、象牙質細胞外マトリックスに見出される主要な非コラーゲン性タンパク質の１つであって、象牙質の鉱化過程でのヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ：ＨＡ）の核生成に関係していると長期間思われてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。ヒトＤＰＰは、象牙質シアロリンタンパク質（ｄｅｎｔｉｎ  ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＤＳＰＰ）のタンパク質分解的切断から誘導される。ヒトＤＰＰは、多数のＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒアミノ酸のリピート（非特許文献５）から主としてなる非常に柔軟であり（非特許文献６）、非常にリン酸化された（非特許文献１）タンパク質である。ＤＰＰの生化学的特徴は、幅広く調査されている。これらの調査により、固相化したＤＰＰは、ヒドロキシアパタイトの核生成の比率を顕著に増加させ、この効果は、溶液中のＤＰＰまたは脱リン酸化されたＤＰＰでは見られないことが明らかになった。さらに、高濃度のＤＰＰは、ＨＡ結晶成長を阻害することが示されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｌｅｅ，Ｓ．Ｌ．ら、１９８０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  １６：２３１−２４０
【非特許文献２】Ｌｕｓｓｉ，Ａ．ら、１９８８，Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  ３３：６８５−６９１
【非特許文献３】Ｖｅｉｓ，Ａ．ら、１９９８，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ  １０６  Ｓｕｐｐｌ  １：２３４−２３８
【非特許文献４】Ｈａｏ，Ｊ．ら、２００４，Ｂｏｎｅ  ３４：９２１−９３２
【非特許文献５】Ｇｕ，Ｋ．ら、２０００，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｓｃｉ  １０８：３５−４２
【非特許文献６】Ｃｒｏｓｓ，Ｋ．Ｊ．ら、２００５，Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  ６６：５９−６７
【非特許文献７】Ｓａｉｔｏ，Ｔ．ら、２０００，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １５：１６１５−１６１９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
ある種の態様では、１以上のカルシウム結合ペプチドを含む組成物が提供される。これらのカルシウム結合ペプチドは、３個のアミノ酸のリピート配列（Ｘ−Ｙ−Ｚ）ｎ、式中、Ｘは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、アラニンまたはグルタミンであり、ＹおよびＺは、アラニン、セリン、スレオニン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンであり、ｎは、１〜４０の数である、を含み、該カルシウム結合ペプチドはリン酸カルシウムに結合する。これらの態様のうちある種の態様では、カルシウム結合ペプチドは、約１〜約４０回の３個のアミノ酸のリピート（即ち、ｎ＝１〜４０）を含み、約３〜約１２０個のアミノ酸長を有する。これらの態様のうちある種の態様では、ｎは、２〜８の数である。ある種の態様では、Ｘは、アルパラギン酸であり、ＹおよびＺは、セリンである。これらの態様のうちある種の態様では、カルシウム結合ペプチドは、配列番号１２〜１５のいずれかに記載されるアミノ酸配列を有してもよい。
【０００５】
ある種の態様では、本明細書中に提供されるカルシウム結合ペプチドは、１以上の結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）または部分に連結することができる。これらの態様のうちある種の態様では、前記結合体または部分は、例えば、発蛍光団、発色団、アフィニティータグ、抗原タグ、放射性標識、またはスピン標識などの検出可能なマーカーである。ある種の他の態様では、前記結合体または部分は、ペプチド、タンパク質、糖質、核酸、脂質、有機化合物、無機化合物、または有機金属化合物である。ある種の他の態様では、前記結合体または部分は、例えば、抗癌もしくは抗菌剤または化合物などの治療剤である。前記結合体または部分が抗菌剤であるこれらの態様のうちある種の態様では、該抗菌剤は、抗菌性ペプチド配列であってもよい。ある種の態様では、前記結合体または部分は、アミノ酸リンカーを介してカルシウム結合ペプチドに連結することができる。
【０００６】
ある種の態様では、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチドを含む組成物を投与することによって、被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥を治療する方法が提供される。本明細書中に開示されるように、これらのカルシウム結合ペプチドの投与は、歯の表面の再鉱化を誘導することができる。
【０００７】
ある種の態様では、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチドを含む組成物を投与することによって、被験体における骨の脱塩または骨密度の減少によって特徴付けられる骨の欠損を治療する方法が提供される。本明細書中に開示されるように、これらのカルシウム結合ペプチドの投与は、骨表面の再鉱化および骨密度の増加を誘導することができる。
【０００８】
ある種の態様では、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチド、該ペプチドは検出可能なマーカーに結合体化される、を含む組成物を投与し、次に、裸眼または検出装置のいずれかを用いて、このマーカーを検出することによって、被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥を同定する方法が提供される。本明細書中に開示されるように、これらのカルシウム結合ペプチドは、脱塩を示している歯の部分に選択的または優先的に結合することができる。
【０００９】
ある種の態様では、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチド、該ペプチドは検出可能なマーカーに結合体化される、を含む組成物を投与し、次に、裸眼または検出装置のいずれかを用いて、このマーカーを検出することによって、被験体における骨の脱塩によって特徴付けられる骨の欠損を同定する方法が提供される。本明細書中に開示されるように、これらのカルシウム結合ペプチドは、脱塩を示している骨の部分に選択的または優先的に結合することができる。
【００１０】
ある種の態様では、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチド、該ペプチドは検出可能なマーカーに結合体化される、を含む組成物を投与し、次に、裸眼または検出装置のいずれかを用いて、このマーカーを検出することによって、被験体における骨または歯以外の組織における石灰化を同定する方法が提供される。本明細書中に開示されるように、これらのカルシウム結合ペプチドは、カルシウムおよびシュウ酸カルシウムに結合することができる。この方法を用いて同定され得る石灰化には、例えば、動脈プラーク、腎臓結石、および種子骨が含まれる。ある種の態様では、例えば、該ペプチドを治療用部分と結合体化させ、該ペプチドを用いて、該治療用部分を石灰化部位に標的化することによって、該ペプチドがこれらの不適切な石灰化を処置するために用いることができる。
【００１１】
ある種の態様では、歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠損、または骨の脱塩によって特徴付けられる骨の欠損の治療に使用するための、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチドを含む組成物が提供される。ある種の態様では、これらの組成物を用いて、脱塩によって特徴付けられる歯または骨の欠陥を検出または診断することができる。
【００１２】
ある種の態様では、本明細書中に開示されるカルシウム結合ペプチドを含む組成物を含むキットが提供される。これらの態様のうちある種の態様では、前記キットは、使用または投与のための取扱説明書を含む。ある種の態様では、これらのキットは、歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥、または骨の脱塩によって特徴付けられる骨の欠陥を治療するために用いることができる。ある種の態様では、これらの組成物を用いて、脱塩によって特徴付けられる歯または骨の欠陥を検出または診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒドロキシアパタイトおよび歯の表面に対するＤＳＳおよびＤＳＳ変異ペプチドの結合親和性。Ａ−Ｃ．０〜１００μＭの範囲の濃度の蛍光標識したペプチドは、０．３ｍｇのヒドロキシアパタイトのナノクリスタル（比表面積＝１００ｍ２／ｇ）とともに１０分間インキュベートし、次に、遠心分離によってヒドロキシアパタイトを取り除いた。ヒドロキシアパタイトの除去の前後における混合物中のペプチド量は、Ａｂｓ４８０により決定した。等温線をプロットし、ラングミュア等式に適合させ、ヒドロキシアパタイト表面に対するペプチドの親和性を反映する定数であるＫＡを導き出した。Ｄ．矢状方向に切断したヒトの歯を１２．５μＭの５（６）のカルボキシフルオレセイン標識した６ＤＳＳペプチドとともに１０分間インキュベートし、次に、リンスした。歯の表面に結合しているペプチドは、青色レーザー照射（λ＝４８８ｎｍ）およびＦＩＴＣ発光フィルターを用いて、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって視覚化した。左側、明色領域：象牙質。右側、暗色領域：エナメル質。
【図２】鉱化したマウス骨髄結節（ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｎｏｄｕｌｅ：ＭＢＭＮ）への６ＤＳＳペプチドの結合。マウス骨髄培養物は、コンフルエントになるまで成長させ、次に、２．５μＭの混ぜ合わせた対照ペプチドまたは２．５μＭの６ＤＳＳを用いて、３週間処理した。培養物は、ＦＩＴＣフィルターセットを用いた蛍光顕微鏡によって撮像された。Ａ．６ＤＳＳで処理した培養由来の鉱化したＭＢＭＮの明視野。Ｂ．（Ａ）において示される領域の蛍光画像。中心結節塊の強い染色（明色化）は、蛍光標識した６ＤＳＳペプチドによる結合を示す。Ｃ．混ぜ合わせた対照ペプチドを用いて処理した培養物由来の鉱化したＭＢＭＮの明視野画像。Ｄ．（Ｃ）で示される領域の蛍光画像は、ＭＢＭＮへの対照ペプチドの結合の欠損、および試料内の自家蛍光の欠損の両方を図示する。
【図３】固定化８ＤＳＳペプチドとＣａＨＰＯ４との相互作用。ストレプトアビジン被覆したポリスチレンビーズは、ビオチン結合体化した８ＤＳＳ（ＡおよびＣ）または結合体化していないビオチン（Ｂ）および（Ｃ）とともにインキュベートした。ビーズを洗浄し、ＰＢＳ＋１ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＮａＨＰＯ４の溶液中で、撮像する前の１２日間インキュベートした。Ａ．ＤＳＳ被覆ビーズの周囲に堆積した非晶質なリン酸カルシウムの凝集体の明視野顕微鏡写真。有意な大きさの全てのリン酸カルシウム凝集体は、１以上のビーズと関連していた。Ｂ．代表的なビオチンブロックしたビーズ（ＤＳＳペプチドなし）の明視野画像。有意量の沈殿物は、これらのビーズには関連しなかった。Ｃ．外部周囲にリン酸カルシウムがより秩序良く付着したＤＳＳ被覆ビーズの位相差顕微鏡写真（物体の球中心に着目されたい）。これらの物体は、（Ｄ）に図示されるように、対照試料（ビオチンブロックされた、ＤＳＳペプチドなし）では見られなかった。スケールバー＝４μｍ。
【図４】ＤＳＳペプチドを用いた歯表面の再鉱化。抽出したヒトの歯は、矢状方向に切断し、１９％ＥＤＴＡゲルで１時間脱塩し、次に、脱イオン水に浸し、超音波処理して余分な破片を除去した。指示した通りに試料を処理し、次に、走査電子顕微鏡によって撮像した。スケールバー＝５０μｍ。Ａ．脱塩した対象試料。Ｂ．８ＤＳＳで１時間処理し、リンスし、クウェル減感剤（Ｑｕｅｌｌ  Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を用いて再鉱化した。Ｃ．バッファーのみで処理し、クウェル減感剤を用いて再鉱化した。Ｄ．処理せずに、クウェル減感剤を用いて再鉱化した。
【図５】エナメル質（上段）および象牙質（下段）表面でのヒドロキシアパタイトの核生成。表面は、実施例６に記載されるように、表示によって指示したように、調製および処理し、その後、走査電子顕微鏡によって撮像した。上段グループ（上段の２列）は、エナメル質試料を表し、下段グループ（下段の２列）は、象牙質試料を表す。各グループ内では、上の列は、処理前に脱塩されていない試料を表し、下の列は、リン酸を用いた処理によって脱塩された試料を表す。走査電子顕微鏡写真を示し、スケールバー＝１０μＭである。左カラム：核生成および結晶成長前にいずれの処理にも晒していない試料。中央カラム：核生成および結晶成長前にバッファーのみに晒した試料。右カラム：核生成および結晶成長前に、１２．５μＭの８ＤＳＳペプチドに晒した試料。結晶成長は、初期の核生成を示す。
【図６】８ＤＳＳペプチド結合の組織特異性および鉱化状態へのその依存性。脱塩したヒトの歯の試料および脱塩していないヒトの歯の試料は、実施例９に記載されるように、１２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した８ＤＳＳペプチドとともにインキュベートされ、切片がリンスされ、ＣＬＳＭによって撮像された。左パネルは、脱塩した組織に対する８ＤＳＳペプチドの結合パターンを示す。主要な結合は、脱塩したエナメル質（Ｅ）に対するものであって、象牙質（Ｄ）に対してはほとんどない。反対のパターンは、脱塩していない試料において観察され、そこでは、主要な結合は、象牙質（Ｄ）に対するものであって、エナメル質（Ｅ）に対してはほとんどないかまたは全くない。象牙質−エナメル質の接合部、即ち、表示したＤＥＪは、両ケースにおいて明確に区分されている。
【図７】骨の鉱化。ラットの大腿は、共通の組織プロトコールにより、屠殺した動物から得られた。試料を脱塩し、リンスし、超音波処理して破片を除去した。試験試料は、８ＤＳＳペプチドで１時間処理され、リンスされ、クウェル減感剤を用いて再鉱化された。Ｃ．バッファーのみで処理し、実施例８に記載されるように、クウェル減感剤を用いて再鉱化され、次に、走査電子顕微鏡により撮像された。ＳＥＭ画像を示す。上段：未処理試料、鉱物によって完全に覆われた骨表面を示す。中段：脱塩した試料、鉱物層の除去によって晒されたハバース管を示す。下段：８ＤＳＳおよびクウェル減感剤（水性ＣａＣｌ２／Ｋ２ＨＰＯ４溶液）で処理された骨、鉱物層の再構築を示す。
【図８】ＤＳＳペプチドおよび変異体の結合における組織特異性を示す蛍光顕微鏡写真。成人の歯は、脱塩せずに１２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識したペプチドに晒され、頻繁に洗浄され、ＣＬＳＭによって撮像された。各切片について、複数のスキャンが自動モードで収集され、まとめられて、大部分の場合において切片全体を包含するのには十分である１３×１３ｍｍの領域に相当する画像のパネルを生じさせる。各切片に用いられるペプチドは、各パネルの下に表示され、各パネル内には、歯が配向し、画像の上側に向って歯根があり、下側に向って歯冠がある。組織層は、次のように表示される：ＲＴＤ＝根端象牙質（Ｒｏｏｔ  Ｔｉｐ  Ｄｅｎｔｉｎ）、ＣＰＤ＝髄周象牙質（Ｃｉｒｃｕｍｐｕｌｐａｌ  Ｄｅｎｔｉｎ）；ＭＤ＝マントル象牙質（Ｍａｎｔｌｅ  Ｄｅｎｔｉｎ）；Ｐ＝歯髄腔壁（Ｐｕｌｐ  Ｃａｖｉｔｙ  Ｗａｌｌ）；ＤＥＪ＝象牙質−エナメル質接合（Ｄｅｎｔｉｎ−Ｅｎａｍｅｌ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）；Ｅ＝エナメル質（Ｅｎａｍｅｌ）；ＢＥ＝基底エナメル質（Ｂａｓａｌ  Ｅｎａｍｅｌ）；ＣＥ＝皮質エナメル質（Ｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｅｎａｍｅｌ）；ＣＬ＝齲蝕病変（Ｃａｒｉｏｕｓ  Ｌｅｓｉｏｎ）；ＰＢ＝歯周骨（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｂｏｎｅ）。
【図９】歯の齲蝕病変に対するＤＳＳペプチドおよび変異体の特異的結合を示す蛍光顕微鏡写真。成人の歯は、脱塩せずに１２．５ｕＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識したペプチドに晒され、頻繁に洗浄され、ＣＬＳＭによって撮像された。顕微鏡およびカメラセットは、各試料に対して別々に最適化された。各パネルは、齲蝕病変を包含する歯の切片の領域を示す。各パネルの右側の白色痕跡は、歯の表面の位置を特定し、矢印は、染色された病変の位置を示す。
【図１０】様々な無機リン酸塩沈殿物に結合する８ＤＳＳの相対レベル。１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）は、それぞれ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＳＯ４、ＣｕＳＯ４、およびＳｒＣｌ２の１００ｍＭ溶液と合わせた。懸濁液は、１２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した８ＤＳＳペプチドの存在下で、約０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で各リン酸塩から調製された。室温で１０分間のインキュベーション後、試料を洗浄し、蛍光顕微鏡で撮像した。各試料の無機リン酸塩粒子の蛍光染色の強度は、実施例１１に記載されるように、ＧＩＭＰ（ｗｗｗ．ｇｉｍｐ．ｏｒｇ）を用いたピクセル強度値を測定することによって評価した。標準化した蛍光値をここにプロットした。Ｘ軸上には、様々な無機リン酸塩沈殿物が特定される。Ｙ軸上には、相対的蛍光強度値がプロットされる。
【図１１】シュウ酸カルシウムへの８ＤＳＳペプチドの結合。シュウ酸カルシウム結晶を１２．５μＭの８ＤＳＳペプチドに晒し、洗浄し、実施例１２に記載されるように蛍光顕微鏡により撮像した。図の左側は、染色していないシュウ酸カルシウム結晶を示す。明視野画像（上段）は、結晶の存在を確認し、同じ領域（下段）の蛍光画像は、これらの条件下で、シュウ酸カルシウムが可視蛍光を持たないことを確認する。図の右側は、５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した８ＤＳＳペプチドを用いて染色したシュウ酸カルシウム結晶を示す。明視野画像（上段）は、結晶の存在を確認し、同じ領域の蛍光画像（下段）は、標識したペプチドによる結晶の明染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
下記の発明の説明は、発明の種々の態様を例示することを単に意図する。このように、検討されている特定の修飾は、本発明の範囲の限定として構築されるべきではない。種々の同等物、変更物、および修飾物は、本発明の範囲から逸脱することなしに実施され得ること、およびこのような同等の態様は本明細書中に含まれるべきであることは、当業者に明確となる。
省略形
下記の省略形が本明細書中に使用される：ＢＥ、基底エナメル質（ｂａｓａｌ  ｅｎａｍｅｌ）；ＣＥ、皮質エナメル質（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｅｎａｍｅｌ）；ＣＬ、齲蝕病変（ｃａｒｉｏｕｓ  ｌｅｓｉｏｎ）；ＣＬＳＭ、共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）；ＣＰＤ、髄周象牙質（ｃｉｒｃｕｍｐｕｌｐａｌ  ｄｅｎｔｉｎ）；Ｄ、象牙質（ｄｅｎｔｉｎ）；ＤＥＪ、象牙質−エナメル質接合（ｄｅｎｔｉｎ−ｅｎａｍｅｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）；ＤＰＰ、象牙質リンタンパク質（ｄｅｎｔｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）；Ｅ、エナメル質（ｅｎａｍｅｌ）；ＤＳＰＰ、象牙質シアロリンタンパク質（ｄｅｎｔｉｎ  ｓｉａｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）；ＨＡ、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）；ＭＤ、マントル象牙質（ｍａｎｔｌｅ  ｄｅｎｔｉｎ）；ＭＩＣ、最小阻害濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）；Ｐ、歯髄腔壁（ｐｕｌｐ  ｃａｖｉｔｙ  ｗａｌｌ）；ＰＢ、歯周骨（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｂｏｎｅ）；ＳＥＭ、走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）；ＲＴＤ、根端象牙質（ｒｏｏｔ  ｔｉｐ  ｄｅｎｔｉｎ）；λ、励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）。
【００１５】
アミノ酸は、下記に記載される標準的な方式を用いて省略される。
【００１６】
【化１】
2015147779.tif 000003
例えばＤ−Ａｌａの「Ｄ」接頭辞によって他に指示がなければ、本明細書中に記載されるペプチド中のアミノ酸およびアミノアシル残基のアルファ−炭素の立体化学は、天然の立体配置であるかまたは「Ｌ」立体配置である。
【００１７】
カルシウム結合ペプチド
脱灰された組織の直接的な再鉱化に現在利用可能な化合物は、遊離したまたはタンパク質が結合したリン酸カルシウムおよび／またはフッ化ナトリウムの様々な製剤から主になる。生物組織中での石灰化の増大は、一般的に、骨および歯の前駆細胞における細胞シグナリングを操作することによって、あるいはカルシウム強化食物、食事栄養食品、または遊離したもしくはタンパク質が結合したカルシウムに富んだ他の処置薬を用いて、全カルシウム濃度を増加させることによって達成される。従来の研究では、再鉱化を増大するために歯の表面にリン酸カルシウムを補強する製剤が記載されている（米国特許第６，７８０，８４４号を参照されたい）。しかしながら、カルシウムを直接的および特異的に標的化することによる石灰化の増大は示されていない。
【００１８】
ＤＰＰ中に見出されるＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒモチーフの変異体から作られた一連の小カルシウム結合ペプチドが、本明細書中に開示されている。これらのペプチドは、リン酸カルシウム表面に堅固にしかも特異的に結合することが示されている。さらに、これらのペプチドは、このような表面にリン酸カルシウムを補強し、それらのリン酸化状態に関わらずに石灰化した表面に蛍光ラベルを付着させるための結合部分として使用されることが示されている。
【００１９】
本明細書中に開示されているペプチドは、一般的に、ＤＳＳペプチドと呼ばれ、ＤＰＰの３個のアミノ酸Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒモチーフもしくはそれらの変異体の様々な数および／または組み合わせから構成されている。利用することが可能な３個のアミノ酸のリピートの例には、限定されないが、Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＤＳＳ、配列番号１）、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＥＳＳ、配列番号２）、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（ＤＴＴ、配列番号３）、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（ＥＴＴ、配列番号４）、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＮＳＳ、配列番号５）、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（ＮＴＴ、配列番号６）、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＱＳＳ、配列番号７）、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（ＱＴＴ、配列番号８）、およびそれらの変異体が挙げられる。あるいは、またはこれらのリピート配列に加えて、本明細書中に開示されているペプチドは、これらのリピートの小さな変異体を含んでもよく、限定されないが、Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（ＤＳＴ、配列番号９）、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ（ＤＡＡ、配列番号１０）、またはＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（ＡＳＴ、配列番号１１）が含まれる。３個のアミノ酸のリピート内の１以上のアミノ酸残基は、化学的に修飾することができる。例えば、該ペプチドは、リン酸基の追加によって水酸基が修飾されている１以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基を含むことが可能である。これらのペプチドは、３個から５０個を越えるアミノ酸長で変化することができる。
【００２０】
石灰化した表面に対する、本明細書中に開示されているペプチドの結合親和性は、リピートの組成および数を変更することによって調節可能である。例えば、１以上のＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号１）リピートの含有によって、ペプチドの結合親和性が増加し、それは、この配列が試験した任意のリピート中で最大の親和性を示すためである。３個のアミノ酸のリピートの数を増加させることによって、該ペプチドの結合親和性を増加させることもできる。６を超えるリピートを含むペプチドは、より少ないリピートを有するペプチドよりも大きな結合親和性を示す。ある種の態様では、本明細書中に開示されているペプチドは、ヒドロキシアパタイトに対する結合親和性（ＫＡ）が１５，０００Ｍ−１を超えてもよい。ある種の態様では、この結合親和性は５０，０００Ｍ−１を超えてもよく、他の態様では１００，０００Ｍ−１を超え、他の態様では２００，０００Ｍ−１を超え、他の態様では３００，０００Ｍ−１を超えてもよい。
【００２１】
ある種の態様では、前記ペプチドは、３個のアミノ酸のリピート配列の一部ではない１以上の追加のアミノ酸を含むことが可能である。例えば、ある種の態様では、該ペプチドのリピート部分は、追加の官能性を有するアミノ酸配列、例えば、２ｃ−４、ＰＬ１３５、またはｂ−３４ペプチド配列などの抗菌性ペプチド配列に融合されてもよい。ある種のこれらの態様では、該ペプチドのリピート部分は、リンカー配列、例えば、トリグリシン配列を介して追加のアミノ酸配列に融合されてもよい。
【００２２】
ある種の態様では、本明細書中に開示されているペプチドは、配列（Ｘ−Ｙ−Ｚ）ｎ、式中、Ｘは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、アラニンおよびグルタミンから選択されるアミノ酸であり、ＹおよびＺは、アラニン、セリン、スレオニン、ホスホセリン、ホスホスレオニン、およびそれらの誘導体から選択されるアミノ酸であり、ｎは、１〜２０の数である、を含む。ある種の態様では、ｎは１〜１５であり、他の態様では、ｎは１〜１０であり、ある種の態様では、ｎは３〜８である。
【００２３】
本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドは、処置条件に応じて、脱塩したエナメル質、および脱塩した象牙質と脱塩していない象牙質との両方でリン酸カルシウム結晶の成長を増すことが示されている。同様に、該ペプチドは、骨の再鉱化を誘導することが示されている。このようにして、ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物を用いて、浮遊しているリン酸カルシウム粒子を石灰化した表面に補強することによって鉱化を増大させることができる。これらのペプチドは、石灰化した表面および／または浮遊しているリン酸カルシウム凝集体に結合することが可能である。石灰化した表面および浮遊している凝集体の同時結合は、石灰化した表面近傍のリン酸カルシウム濃度を結果として増加させ、該表面の再鉱化の増大へと導く。前記ペプチドの大きさおよび結合親和性を調節することによって、該表面に結合したカルシウム量を変更することができる。ある種の態様では、歯の再鉱化は、結果として、完全であるかまたは部分的な象牙質細管の閉塞をもたらす。
【００２４】
本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物を用いて、歯を再鉱化し、歯の脱塩を阻害するかまたは遅らせ、歯の損傷、欠陥、病気、もしくは異常を治療し、歯の表面でもしくはその下で鉱物層を形成させ、歯の鉱物密度を変更し、例えば、鉱物密度を増加させるかもしくは減少させ、または歯部位を密封することが可能である。同様に、これらの組成物を用いて、骨の欠陥、傷害、腫瘍、異常成長、病気、もしくは骨の喪失を治療し、骨の表面でもしくはその下で鉱物層の形成を引き起こし、または、例えば密度を増加もしくは減少させることによって骨の密度を変更することができる。これらの態様では、上述した１以上のカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、影響を受けている骨または複数の骨の部位でまたはその近傍で適用される。ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物を用いて、石灰化、石灰質病変、または動脈プラークを含む、骨以外の組織および臓器における鉱化した欠陥を治療することができる。
【００２５】
状態を「治療すること」またはその「治療」とは、本明細書中で使用するとき、該状態を妨げるかもしくは修復すること、該状態の開始もしくは発症速度を遅延させるかもしくは遅らせること、該状態の発症の危険性を低下させること、該状態と関連した症状の発症を妨げるかもしくは遅延させること、該状態と関連した症状を低減させるかもしくは終わらせること、該状態の完全なもしくは部分的な退行を生じさせること、またはそれらのいくつかの組み合わせを意味し得る。
【００２６】
ある種の態様では、本明細書中に開示しているカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、所望の化学部分または粒子が石灰化した表面、例えば骨および歯の表面に特異的に接着するための手段として用いることが可能である。遊離したまたはタンパク質が結合したカルシウムの製剤で口腔を溢れさせることに頼る、歯の表面の再鉱化への現在のアプローチとは異なって、これらの化合物は、リン酸カルシウム凝集体が歯の表面に特異的に付着するようにさせ、したがって、カルシウムおよびリン酸塩の局所濃度を増加させ、このリン酸カルシウムが歯の所定領域に取り込まれるようになるという可能性を増加させる。石灰化した組織の傷害または疾患に対する現在の製剤治療は、ある画分が石灰化した表面と相互作用するであろうと期待して、対象とする治療化合物の遊離溶液を用いて、直接的（局所的）投与または全身投与のいずれかによって、所望の表面の領域を取り囲むことに依存する。
【００２７】
ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、不適切な石灰化のためのインサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）およびインビボアッセイ用に用いることができる。例えば、これらの組成物を用いて、石灰化、石灰性病変、または例えば動脈プラーク、腎臓結石、もしくは種子骨を含む、骨以外の組織および臓器における鉱化した欠陥を診断し、特定し、突き止め、または治療することができる。石灰化の存在を測定するために現在使用されているアッセイには、色素結合法、放射性同位体の取り込み、Ｘ線透過分析、および定量化学分析が挙げられる。これらの方法の各々は、ある種の欠点に悩まされている。色素結合法では、試料は、テトラサイクリン、カルセイン、またはアリザリンなどのカルシウムキレート化蛍光色素に晒され、対象とする組織に該色素の取り込みが視覚化される。この色素をインビボに導入させることはできるが、シグナルの視覚化は、対象とする組織の切除を必要とする。固定された組織の銀イオンによる処置（フォン・コッサ（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色）は、石灰化の部位を同定するために用いることもできるが、この方法は、インビボでは適用することができず、顕著なレベルのバックグラウンド染色を被る。４５Ｃａなどの放射性同位元素の取り込みによって、インビボでの石灰化の位置および速度についての正確であり、定量的な情報が与えられるが、実験被験体を高レベルの電離放射線に晒すという欠点を有する。Ｘ線透過分析は、高空間分解能を与え、生存動物で行うことは可能であるが、Ｘ線画像で見ることができる様々な他の特徴の中でカルシウム沈着を一意的に同定することができない。カルシウム沈着のインビトロでの定量化学分析は、存在する鉱物のタイプおよび量の直接的な測定を与えるが、これらの方法は、大きな労力を伴うものであり、結果として、関与している組織の位置および構造についての情報を失うことになる。
【００２８】
ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、蛍光的にまたは別の方法で標識され、対象とする組織において石灰化した領域を視覚化する改良された手段として利用可能である。これらのペプチドは、容易に、高収率で合成することができ、現在利用可能な方法と比較して、改善された安全性、毒性、および使用容易性を有する。該ペプチドの配列または組成は、特異組織または表面タイプに対するペプチドの相対的親和性を変化させるために変更することが可能である。これによって、該ペプチドは、象牙質、エナメル質、骨、および他の石灰化した組織または表面の間、ならびに、健常および疾患組織の間を識別できるようになる。この特性によって、これらの化合物は、石灰化した組織における損傷または病変に対するプローブとして使用可能となる。前記ペプチドは、単独で用いられてもよく、または石灰化を検出するための他に知られている方法と併用して用いられてもよい。蛍光を保持しながらカルシウムイオンをキレートすることができるものに限定される、現在利用可能なカルシウムを結合している発蛍光団と対比して、本明細書中に記載されているペプチドは、任意の発蛍光団に付着可能である。これは、石灰化した表面を標識するために使用され得る色のパレットを大きく拡張し、それぞれ個々の実験に対する発光波長および検出技術の正確な調整を可能にする。これらのペプチドを蛍光、発色、放射活性、ＮＭＲ−活性、または他の色素もしくは指示薬で結合体化し、生物試料をこれらの結合体で処理することによって、試料を固定し、大幅に妨害することなしにインサイチューおよびインビボで石灰化の程度を定量的に観察することが可能になる。高い特異性および高い結合率により、このような結合体は、フォン・コッサ／銀イオン染色法よりも低いバックグラウンド染色を与えることができる。これらのカルシウム結合ペプチドに付着され得る広範囲な標識は、結合条件および検出法に関して非常に大きな柔軟性を提供し、それによって、生物学的、生物医学的、生物工学的、環境的、および他のリサーチが実行され得る容易性および特性が大いに増加される。
【００２９】
本明細書中に記載されているペプチドは、診断薬として大きな可能性を有するが、これは、視覚的または放射線観察に主として依存する、石灰化した組織の傷害、感染、腫瘍または他の病変を同定する現在の方法とは異なって、本明細書中に開示されているペプチドを用いて、ヒトの目に頼ることなしに、このようなイベントを検出することができるからである。本明細書中に開示されているＤＳＳペプチドは、脱塩したエナメル質および脱塩していない象牙質を特異的に標的にすることが示された。特に、これらのペプチドは、虫歯病変に選択的に結合する能力を示している。さらに、種々のＤＳＳペプチド変異体は、例えば、根端象牙質、基底エナメル質、マントル象牙質、皮質エナメル質、およびエナメル質表面などの歯の構造の正確な小部分（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）を標的にする能力を示している。種々の検出可能な部分、例えば、蛍光、発色、放射活性、ＮＭＲ−活性または他の色素もしくは指示薬に結合体化したカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、歯の特定部分を標的化するために、ならびに脱塩または他の損傷を示す歯の特定部分を同定するために被験体に投与することができる。前記ペプチドのアミノ酸組成は、特定のタイプの組織または組織損傷が標的化され得るように選択されてもよい。これらのペプチドの使用は、あまりにも小さすぎて見られなかったかまたは他には分かりにくかったかもしれない領域を含む損傷を受けた領域の特異的な同定を可能にし、これらの病変に対する診断の容易さおよび正確さが非常に高まる。同様に、ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、Ｘ線、コンピュータ断層撮影、または磁気共鳴画像のための造影剤として用いることができる。
【００３０】
ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、骨、歯、または他の石灰化した組織の表面に治療化合物を標的化するために用いることが可能である。例えば、ペプチドは、抗菌化合物、骨および歯の発達調節剤、または該ペプチドに付着されてもよい任意の他の化合物と結合体化することが可能である。治療化合物とこれらのペプチドの１つとの結合体化を用いて、石灰化した表面に治療化合物を局在化することができ、該化合物の局所濃度の増加および有効性の増大をもたらす。対象とする組織に該化合物を局在化することによって、これらのペプチドは、所望の効果を達成するのに必要とされる化合物濃度を減少させることになる。有効性の改善に加えて、対象とする組織に治療化合物を特異的に標的化することは、該化合物の潜在的な損傷効果から標的ではない組織を救う。該ペプチドの組成または長さは、組織の傷害領域または疾患領域に特異的な標的化を可能にするように調整されてもよい。
【００３１】
ある種の態様では、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物を用いて、例えば、細菌感染などの微生物感染を治療することができる。これらの態様では、該ペプチドは、例えば、２ｃ−４、ｂ−３４、またはＰＬ−１３５ペプチド（それぞれ、配列番号：２６、３０、および３２）などの抗菌性ペプチドに連結されてもよい。
【００３２】
カルシウムまたはリン酸カルシウムに選択的に結合する、本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドの能力に基づいて、これらのペプチドを含む組成物は、飲料水、廃水、工業用溶液、食物、飲料、研究用途、カルシウムの存在の決定が望まれる任意の溶液中のカルシウムを検出するためのセンサーに組み込まれてもよい。同様に、これらの組成物を用いて、例えば、産業用途、製造用途、医療用途、研究用途、家庭用途、または個人的用途におけるカルシウム鉱物の沈着を調節することができる。さらに、これらの組成物を使用して、例えば、細胞培養、組織、実験動物、試験的なヒト被験体、または他の研究用途における種々のカルシウム鉱物の存在または量を測定することができる。
【００３３】
本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドは、直接的であるかまたは間接的に、１以上の結合体または部分に共有結合的または非共有結合的に連結され得る。このような結合体は、部分であって、限定されないが、他のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、核酸、脂質、有機化合物、無機化合物、有機金属化合物、例えば抗癌剤または抗菌剤などの治療用部分が含まれる。本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドに連結し得る結合体または部分の他の例には、例えば、発蛍光団、発色団、アフィニティータグ、放射性標識、またはスピン標識などの検出可能なマーカーが挙げられる。さらに、カルシウム結合ペプチドまたは付着した結合体もしくは部分の１以上の原子は、放射活性またはＮＭＲ活性同位元素と置換されてもよい。カルシウム結合ペプチドと結合体または部分との間の連結は、該ペプチドのアミノ末端、該ペプチドのカルボキシ末端で、または該ペプチドの内部を通して生じてもよい。ある種の態様では、該ペプチドは、例えば、トリグリシンリンカー配列などのアミノ酸リンカーを介して結合体または部分に連結することが可能である。
【００３４】
本明細書中に開示されているカルシウム結合ペプチドを含む組成物は、当該技術分野において知られている任意の方法によって投与することができる。このような方法には、限定されないが、経口、非経口、経皮、エアロゾル、または腸内が含まれる。「経口」投与は、歯磨き粉、ゲル、うがい薬、口内洗浄剤、丸薬、錠剤、カプセル、ゲル、または粉末を用いて達成することができる。あるいは、前記組成物は、食物、チューインガム、キャンディ、または飲料に取り込ませることが可能である。「非経口」とは、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心内、皮内、筋内、腹腔内、肺内、髄腔内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜的、または経気的を含む注射と一般的に関連している投与経路を意味する。「経皮的」投与は、局所的クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、もしくは軟膏（ｓａｌｖｅ）を用いて、または経皮貼布を用いて達成することができる。前記組成物が歯の状態を治療するかまたは鉱物密度などの歯の特徴を変更するために用いられているそれらの態様では、該組成物は、影響を受けているかまたは標的の歯の部位でまたはその近傍に投与されてもよい。同様に、前記組成物が骨の状態を治療するかまたは骨の特徴を変更するために用いられているそれらの態様では、該組成物は、影響を受けるかまたは標的の骨の部位でまたはその部位の近傍に投与されてもよい。
【００３５】
下記の実施例は、請求された発明をより良く説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図されるべきではない。特定の材料が言及される範囲は、単に例示の目的のためであり、本発明を限定することは意図されない。当業者は、創作力を発揮することなく、しかも本発明の範囲から逸脱することなしに、同等な手段または反応物質を生み出すことができる。多くの変形が、本発明の範囲内で依然として維持されながら、本明細書中に記載された手順においてなし得ることが理解される。このような変形は本発明の範囲内に含まれることが本発明者らによって意図されている。
【実施例】
【００３６】
実施例１：カルシウムヒドロキシアパタイトへのＤＳＳペプチドの結合
２回（２ＤＳＳ、配列番号１２）、４回（４ＤＳＳ、配列番号１３）、６回（６ＤＳＳ、配列番号１４）、または８回（８ＤＳＳ、配列番号１５）のＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＤＳＳ）リピートを含む４種のＤＳＳペプチドを生成した。ペプチドを蛍光で標識し、種々の濃度の標識ペプチド（０〜１００μＭ）は、比表面積が１００ｍ２／ｇである、固定量（０．３ｍｇ）のヒドロキシアパタイト・ナノクリスタル（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．）と混合された。試料を１０分間インキュベートし、その後、遠心分離によってヒドロキシアパタイトを除去した。この混合物中のペプチド量は、４８０ｎｍの分光学的吸光度（蛍光標識のピーク吸光度）によって、ヒドロキシアパタイトの除去の前後で測定された。結合したペプチド量は、最終（Ａｆ）および初期（Ａｉ）吸光度と初期濃度（Ｐ０）との比［Ｐ結合＝（Ａｆ／Ａｉ）Ｐ０］を比較することによって計算した。平衡状態で非結合のペプチドの濃度に対してヒドロキシアパタイト表面積１ｍ２当り結合したペプチド量を説明するプロットを作成した。得られた等温線は、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）等温線（ｘ／ｍ＝（ＫＡＮＭａｘＣｅｑ）／（１＋ＫＡＣｅｑ））（Ｃａｌｉｓ  １９９５）に適合させ、結合親和性（ＫＡ）および結合力（ＮＭａｘ）の組み合わせに関して分子の結合活性を記述する。ＫＡは、ヒドロキシアパタイト表面に対するペプチドの親和定数を表す。この式中、ｘ／ｍは、ヒドロキシアパタイトの単位表面積当りの結合したペプチドのモル量を表し、ＮＭａｘは、最大表面濃度（ｍｏｌ／ｍ２）を表し、Ｃｅｑは、平衡状態での非結合ペプチドのモル濃度を表す。ラングミュア等温線は、１）全ての結合部位が該ペプチドに対して同じ親和性を有し、２）該ペプチドが該表面上で単層を形成するが、より高いレベルに蓄積できないという条件で、表面への分子の結合を示す。実験データへのラングミュア等温線の優れた当てはめは、これらの条件を有効にし、これらの親和定数は、ペプチド間の比較のために用いられた。図１Ａに示されるように、ヒドロキシアパタイトに対する種々のペプチドの結合親和性は、ＤＳＳのリピート数の増加に伴って増加した（２ＤＳＳ、ＫＡ＝５７，０００Ｍ−１；４ＤＳＳ、ＫＡ＝９４，０００Ｍ−１；８ＤＳＳ、ＫＡ＝３００，０００Ｍ−１）。
【００３７】
いくつかの変異ＤＳＳペプチドを試験し、結合親和性における種々のアミノ酸の変更による効果を測定した。これらの変異ペプチドには、第１位置でより長い側鎖を含む４回リピートのペプチド（４ＥＳＳ、配列番号１６）、第２および第３位置でより立体障害的なヒドロキシル基を含む３種の４回リピートのペプチド（４ＤＴＴ、配列番号１７；４ＮＴＴ、配列番号１８；および４ＥＴＴ、配列番号１９）、第１位置で帯電した基を欠損している４回リピートのペプチド（４ＮＳＳ、配列番号２０）、第１位置で帯電した基を欠損している８回リピートのペプチド（８ＡＳＳ、配列番号２１）、ならびに第２および第３位置でヒドロキシル基を欠損している２種の８回リピートのペプチド（８ＤＡＡ、配列番号２２；８ＮＡＡ、配列番号２３）が含まれた。これらの変異体の各々の結合等温線と同サイズのＤＳＳ含有ペプチドの等温線との比較によって、負に帯電した残基（４ＮＳＳ、ＫＡ＝４１，０００Ｍ−１；４ＮＴＴ、ＫＡ＝１８，０００Ｍ−１；８ＡＳＳ、ＫＡ＝１７０，０００Ｍ−１）の排除（図１Ｂ、１Ｃ）、またはセリン残基をスレオニンもしくはアラニンで置換すること（４ＤＴＴ、ＫＡ＝１６１，０００Ｍ−１；４ＥＴＴ、ＫＡ＝６１，０００Ｍ−１；８ＤＡＡ、ＫＡ＝３００，０００Ｍ−１）（図１Ｂ、１Ｃ）によって、結合活性が有意に減少することが測定された。第一部位での酸性残基と複数のセリンの両方の置換は、結合親和性のほぼ全体の喪失（４ＮＴＴ；８ＮＡＡ、ＫＡ＝２０，０００Ｍ−１）へと導いた（図１Ｂ、１Ｃ）。アスパラギン酸残基をグルタミン酸残基で置換することにより、結合親和性の僅かな減少（４ＥＳＳ、ＫＡ＝８１，０００Ｍ−１）だけが引き起こされた（図１Ｂ）。これらのデータは、酸性残基およびセリンリピートの両方がヒドロキシアパタイト表面に対するこれらのペプチドの親和力に不可欠であることを示唆する。ＤＳＳは、ヒドロキシアパタイト結合活性を生じさせるための最適なリピート配列であることが判明し、前記変異ペプチドの全てがインビトロにおいてヒドロキシアパタイトへの結合が著しい減少することが示された。
【００３８】
部分的にリン酸化された４回リピートのＤＳＳペプチド（４ＤＳＰＳ、配列番号２５）も試験し、４ＤＳＳの結合活性と似たヒドロキシアパタイトに対する結合活性を有することが示された（ＫＡ＝８３，０００Ｍ−１に対して、４ＤＳＳではＫＡ＝９４，０００Ｍ−１）。しかしながら、４ＤＳＰＳペプチドは、ＨＡ表面上に、非常に多数の利用可能な結合部位を有していた（４ＤＳＰＳではＮＭａｘ＝１．２×１０−７ｍｏｌ／ｍ２に対して、４ＤＳＳでは５．８×１０−８ｍｏｌ／ｍ２）。
【００３９】
実施例２：歯へのＤＳＳペプチドの結合
生物組織へのＤＳＳペプチドの結合を測定するために、矢状方向に切断したヒトの歯は、１０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＨＥＰＰＥＳ、ｐＨ７．０を含む１２．５μＭの５（６）カルボキシフルオレセイン標識した６ＤＳＳペプチドの溶液中で１０分間インキュベートされた。対照試料は、ペプチドを含めずに調製された。試料を処理後にリンスし、青色レーザー照射（励起波長（λ）＝４８８ｎｍ）およびＦＩＴＣ発光フィルターを用いて共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）によって撮像した。強い蛍光染色は、６ＤＳＳが歯の表面に結合することを示した（図１Ｄ）。模擬処理した対照切片は蛍光を示さなかった。ペプチド結合は、象牙質に限定され（図１Ｄ、明色の領域、左側）、エナメル質領域では結合は見られなかった（図１Ｄ、暗色の領域、右側）。
【００４０】
実施例３：鉱化されたマウスの骨髄結節へのＤＳＳペプチドの結合
マウスの骨髄培養物は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でコンフルエントになるまで成長させ、次に、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸４ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を含むａＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中の２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した６ＤＳＳまたは２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識したペプチド＃３−１（スクランブルされた対照ペプチド、配列番号２４）のいずれかを用いて３週間連続して処理された。培養物は、ＦＩＴＣ励起／発光フィルターセットを用いて蛍光顕微鏡により撮像し、明視野および蛍光画像の両方を得た。強い染色がＤＳＳ処理した試料で観察され、それは、図２Ｂの中心結節塊に示される明色によって指示された。対照試料では染色は観察されず（図２Ｃ、２Ｄ）、６ＤＳＳペプチドがマウスの骨髄培養物中の鉱化している結節に特異的に結合することを示した。
【００４１】
実施例４：固相化したＤＳＳペプチドによるリン酸カルシウム（ＣａＨＰＯ４）の蓄積
４μｍの平均径を有するストレプトアビジン被覆したポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  Ｐ．Ｌ．Ｃ．）は、ビオチン結合体化した８ＤＳＳペプチドまたは非結合体化ビオチンのいずれかとともにインキュベートされた。ビーズをＰＢＳで洗浄し、未結合ペプチド（または対照ビーズの場合には未結合ビオチン）を除去し、撮像前の１２日間、ＰＢＳ＋１ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＮａＨＰＯ４の溶液中でインキュベートした。図３Ａに図示されるように、ほぼ全てのＤＳＳペプチド被覆したビーズは、沈殿した非晶質なリン酸カルシウムの大きな凝集体に取り込まれた。有効サイズの全てのリン酸カルシウム凝集体は、１以上のビーズと関連していた。比較すると、ビオチンブロックした対照試料では、ほぼ全てのビーズは凝集せず、沈殿物と関連がなかった（図３Ｂ）。ペプチド被覆したビーズのいくつかは、実験中、より秩序ある鉱物層で覆われるようになり（典型的には図３Ｃに示される）、被覆していない／ビオチンブロックした対照ビーズは、鉱物を蓄積しなかった（図３Ｄ）。
【００４２】
実施例５：ＤＳＳペプチドによる分解した象牙質表面の再鉱化
摘出したヒトの歯は、矢状方向に切断され（Ａｃｃｕｔｏｍ−５０、ＣＡ−２３１ダイヤモンドブレード）、１９％エチレンジアミノテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）ゲルを用いて１時間脱塩し、その後、脱イオン水に浸水させ、超音波処理して過剰の破片を除去した。試料を５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）中の１２．５μＭの８ＤＳＳペプチドで処理されるか、バッファーだけ（ペプチドなし）で処理されるか、または未処理のままであった。１時間後、試料をクウェル減感剤（Ｐｅｎｔｒｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）、塩化カルシウムおよびリン酸カリウムの水溶液からなる再鉱化溶液で１５分間再鉱化させた。走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって撮像する前に試料を十分にリンスした。ＤＳＳ処理した象牙質試料は、連続層のリン酸カルシウム沈殿物を蓄積し、象牙質細管を完全に閉塞させた（図４Ｂ）。模擬処理した試料および未処理の試料は、非常に低いレベルの鉱物沈殿物の蓄積を示し、象牙質細管は完全に露出されたままであった（図４Ａ、４Ｃ、４Ｄ）。
【００４３】
実施例６：ＤＳＳペプチドによる歯のエナメル質および象牙質におけるヒドロキシアパタイトの核生成
最終的には組織の再鉱化をもたらし得る、種々の組織調製物にＤＳＳを適用することがＨＡ核生成を促進するかどうかを決定するために、（正常な臨床診療中に摘出後に得られた）矢状方向に切断された成人の歯は、ストレウルス（Ｓｔｒｅｕｒｓ）研削砥石を用いて研磨され、核生成実験のために調製された。切断の半分は、３５％リン酸を用いて１５分間脱塩され、次に、脱イオン水で十分にリンスされた。他の半分は、未処理のままであった。その後、全ての試料は、５分間超音波で処理され、切断および研削および／または脱塩から出る余分な破片を除去した。試料は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー溶液（ｐＨ７．０）に溶解した１２．５μＭの８ＤＳＳで処理されるか、バッファー溶液のみに処理されるか、または未処理のままであった。次に、模擬体液（ＳＢＦｎ）に試料を４時間浸し、これは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶の核生成を加速することを意味した。核生成工程に続いて、核生成したＨＡ結晶を成長させるために、マグネシウムおよび重炭酸塩不含溶液（ＳＢＦｇ）に浸した。表１は、血漿と比較したＳＢＦｎおよびＳＢＦｇの組成を示す。両方の溶液は、ｐＨ６．８に調整された。ＳＥＭによる視覚化を容易にするために、結晶を成長させて、核生成した結晶を増幅させた。
【００４４】
【表１】
2015147779.tif 000004
脱塩していない、未処理の、バッファー処理したエナメル質の表面は、大部分が非晶質のままであり、これは、結晶成長がほとんどないかまたは全くない（したがって、核生成がほとんどないかまたは全くない）ことを示した（図５、上段の２列）。しかしながら、有意な結晶成長（早期および強固な核生成を示す）は、８ＤＳＳペプチドに晒された脱塩したエナメル質において観察された（図５、上段の２列）。これは、ＤＳＳペプチドが脱塩したエナメル質を特異的に認識し、その脱塩したエナメル質表面上でヒドロキシアパタイト成長の核とし得ることを示す。
【００４５】
脱塩していない象牙質の表面は、未処理およびバッファー処理した試料において、ある程度の結晶成長を示した。しかしながら、最も著しい成長、したがって、最も早期であり、最も強固な核生成は、８ＤＳＳペプチドで処理した試料で発生した（図５、下段の２列）。実施例５は、脱塩した象牙質上の象牙質細管を閉塞するのに十分なリン酸カルシウムの厚い層の堆積を引き起こす、既存の再鉱化処方計画とともに、ＤＳＳペプチドの能力を示すが、これらの結果は、僅かに異なる処理で、結晶の核生成が脱塩されてない象牙質上で主に発生することを示す。このようにして、採用した特定の処置計画に依存して、ＤＳＳペプチドを用いて、脱塩した象牙質上のリン酸カルシウムの層を堆積させるか、または十分に鉱化した表面上でヒドロキシアパタイト結晶成長の強固な核生成を引き起こすことが可能である。これは、ＤＳＳペプチドを用いて、例えば、象牙質細管の露出に起因する歯の過敏症を治療するか、機械的に創面切除した象牙質に関連した虫歯を再鉱化するか、または破砕した象牙質表面を修復することができることを意味する。
【００４６】
実施例７：ＤＳＳペプチド結合の組織特異性：
矢状方向に切断したヒトの歯は、０．５ＭのＥＤＴＡとともに１５分間インキュベートすることによって脱塩されるかまたは脱塩しないままであった。次に、試料は、１２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した８ＤＳＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０の溶液中で１０分間インキュベートされた。対照試料は、ペプチドなしでインキュベートされた。次に、切片をリンスし、同じレーザーとカメラセットを用いてＣＬＳＭによって撮像した。
【００４７】
脱塩した試料では、ＤＳＳペプチド結合は、エナメル質で主に観察され（図６、左パネル、Ｅ）、象牙質ではほとんど結合しないかまたは全く結合しなかった（図６、左パネル、Ｄ）。実施例１で検討した結果と一致して、反対のパターンが、脱塩していない試料で観察され、ここで、該ペプチドは、象牙質と主に結合し、エナメル質とはほとんど結合しないかまたは全く結合しないことが示された（図６、右パネル、ＤとＥとを比較）。象牙質−エナメル質接合は、脱塩した試料および脱塩していない試料の両方で明確に区別された（図６、ＤＥＪ）。脱塩していないエナメル質に有意な結合は示さないが、脱塩した歯の切片のエナメル質部分に特異的に結合するＤＳＳペプチドの能力は、ＤＳＳペプチドが、脱塩したエナメル質を特異的に認識し、脱塩したエナメル質の表面上でヒドロキシアパタイト成長を核にし得るという実施例６の見解と一致している。
【００４８】
実施例８：骨の再鉱化
歯の組織について観察された再鉱化の結果が骨まで拡張可能かどうかを決定するために、ラットの大腿を共通の組織プロトコールで屠殺した動物から得た。試験試料は、１９％ＥＤＴＡゲルで１時間脱塩され、次に、脱イオン水に浸し、超音波処理して余分な破片を除去した。その後、試験試料は、８ＤＳＳで１時間処理され、リンスされ、試料の半分は、実施例５に記載されるように、クウェル減感剤（Ｐｅｎｔｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ）を用いて再鉱化された。次に、全ての試料は、ＳＥＭ用に調整され、実施例５のように撮像した。組織表面を覆っている鉱物の連続層が未処理のラットの大腿で観察された（図７、上段パネル）。脱塩した試料では、ハバース（Ｈａｖｅｒｓｉａｎ）管が明らかに露出していた（図７、中段パネル）。しかしながら、８ＤＳＳおよびクウェル減感剤による処置に続いて、鉱物表面が回復し、該管の閉塞が観察された（図７、下段パネル）。このようにして、ＤＳＳペプチドは、歯の組織と同じく、骨の再鉱化を促進することができる。
【００４９】
実施例９：ヒトの歯におけるＤＳＳペプチドの組織特異的結合：
歯の組織へのＤＳＳペプチド結合の組織特異性を調べるために、ヒトの歯の切片をＤＳＳペプチドおよび変異体に晒し、次に、実施例２に記載されたようにＣＬＳＭによって撮像した。これらの実験のために利用した該ペプチドは、８ＤＳＳ、８ＡＳＳ、８ＤＡＡ、８ＮＡＡ、４ＤＳＳ、４ＥＳＳ、４ＮＳＳ、４ＤＴＴ、４ＥＴＴ、４ＮＴＴ、および６ＤＳＳであった。正常な臨床診療中に摘出されたヒトの歯の矢状方向の切片を研磨し、次に、１０ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０を含む適切な５（６）カルボキシフルオレセイン標識したペプチド（１２．５μＭ）の溶液中で１０分間インキュベートした。対照試料は、ペプチドなしに調製された。処理後、試料を頻繁に洗浄し、青色レーザー照射（λ＝４８８ｎｍ）およびＦＩＴＣ発光フィルターを用いて、各試料に対して同一のカメラおよび顕微鏡セットを有するＣＬＳＭによって撮像された。各切片について、複数のスキャンは、自動モードで収集され、整理されて、大部分の場合において全切片を包含するのに十分である１３×１３ｍｍの領域に相当する画像のパネルを生じさせた。実施例１において結合親和性結果によって示唆されるように、配列（ＤＳＳ）ｎを含むペプチドは、歯の表面への最高レベルの結合を示し、６ＤＳＳおよび８ＤＳＳは、最大レベルの染色を示した。これらの実験結果は、図８に記載される。８ＤＳＳ、６ＤＳＳ、および４ＤＳＳはマントル象牙質に主に結合し、象牙質−エナメル質接合ははっきりと描かれ、根端象牙質または基底エナメル質への結合は低いかもしくは全くなく、皮質エナメル質またはエナメル質表面のいずれかへの結合は検出できなかった。有意な結合も歯髄腔の端に見られた。８ＡＳＳ、４ＥＳＳ、および４ＮＳＳは、同じパターンを示したが、結合はより低いレベルであった。８ＤＡＡは、この結合パターンとは正反対を示し、根端の象牙質および皮質エナメル質に、ならびに象牙質−エナメル質接合および歯髄腔壁に主に結合した。８ＤＡＡは、マントル象牙質、髄周象牙質、および基底エナメル質にほとんど結合しないかまたは全く結合しないことが示された。４ＤＴＴおよび４ＥＴＴは、４ＤＳＳおよび４ＥＳＳと同様の結合パターンを示したが、レベルが急減した。８ＮＡＡは、いずれの健常組織にはほとんど結合を示さず、その試料に存在する齲蝕病変に幾分結合した（下記の実施例１０を参照されたい）。４ＮＴＴは、試料に付着した歯根骨の断片に強力に結合することが示されたが、健常な歯の組織への結合レベルは非常に低かった。これらの結果は、歯の特定の層が特定のペプチドを用いて高い特異性で標的化され得ることを示唆している。
【００５０】
実施例１０：歯の齲蝕病変へのＤＳＳペプチドの優先的結合：
脱塩したエナメル質からなる明らかな齲蝕病変を含むヒトの歯の切片を研磨し、実施例２に記載したプロトコールを用いて、５（６）−カルボキシフルオレセイン標識したＤＳＳペプチドおよび変異体に晒した。切片を頻繁に洗浄し、青色レーザー照射（λ＝４８８ｎｍ）およびＦＩＴＣ発光フィルターを用いて、各ペプチドから検出されるシグナルを最適化するために各試料について調整した顕微鏡およびカメラセットを有するＣＬＳＭによって撮像した。画像を調べ、健常組織対虫歯組織におけるペプチド結合の相対レベルを特定した。４ＥＳＳ、４ＮＳＳ、８ＤＡＡ、８ＮＡＡ、４ＥＴＴ、４ＤＳＳ、８ＡＳＳ、８ＤＳＳ、および６ＤＳＳは、齲蝕病変に対して非常に特異的な結合を示し、周辺の健常なエナメル質にはほとんど結合しないかまたは全く結合しなかった（図９；これらの病変のいくつかは、同様に図８に見られる）。他のペプチドは試験しなかったが、これらの結果に基づいて、齲蝕病変への結合が推測される。これらのペプチドのうち、４ＥＳＳ、４ＮＡＡ、８ＤＳＳ、６ＤＳＳ、４ＤＳＳ、８ＤＡＡ、および８ＡＳＳは、例外的に齲蝕病変の強い染色を示し、周辺のエナメル質には相対的に弱い（多くの場合、全くない）結合であった。齲蝕病変に結合するこれらのペプチドの能力は、健常なエナメル質の十分に鉱化した表面にはほとんど結合しないかまたは全く結合しないことを示し、これらのペプチドを用いて、歯の象牙質の虫歯または歯の病変を同定し得ることを示す。エナメル質分解の部位での再鉱化するそれらのペプチドの能力が与えられると（実施例６）、それらは、健常な組織表面上で不適切な核生成を引き起こすことなしに、虫歯または傷害部位などのエナメル質分解の部位で再鉱化を開始するために用いることも可能である。
【００５１】
実施例１１：リン酸カルシウムへのＤＳＳペプチドの選択的結合：
マグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、およびストロンチウムのリン酸塩は、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）と１００ｍＭの前述の金属イオンの塩化物または硫化物（それぞれ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＳＯ４、ＣｕＳＯ４、およびＳｒＣｌ２）の溶液とを組み合わせることによって調製した。沈殿物を即座に回収し、脱イオン水で２回洗浄し、保存のために乾燥させた。ペプチド結合の分析に対して、懸濁液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した８ＤＳＳペプチドを含む溶液で約０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で各リン酸塩から作製された。各試料を室温で１０分間インキュベートし、次に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０および１０ｍＭのＮａＣｌの溶液で２回洗浄し、同じバッファーに再懸濁し、蛍光顕微鏡で撮像した。同一の顕微鏡およびカメラセットを各試料について使用し、試料間で定量的な比較を可能にした。各試料について、明視野および蛍光画像は、一視野から集められた。各試料における無機リン酸塩粒子の蛍光染色の強度は、下記の通り、ＧＩＭＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｉｍｐ．ｏｒｇ）を用いてピクセル強度を測定することによって評価された。目安として明視野画像を用いて、リン酸塩凝集体に対応する蛍光画像の範囲を選択し、これらの領域のピクセル画像を記録した。これらは、バックグラウンド領域（任意の凝集体を含まないことが分かっている領域）について記録した強度と比較した。次に、これらのデータは、染色強度（Ｉ染色）とバックグラウンド強度（Ｉバックグラウンド）との比として表され、等式：相対蛍光＝（Ｉ染色／Ｉバックグラウンド）＊（Ｉ染色−Ｉバックグラウンド）を用いて、（非常に低レベルの染色を有する試料中に存在する高いノイズレベルに対して補正するために）染色強度とバックグラウンド強度との間の差の絶対等級を掛けた。低レベルの染色はＮｉＨＰＯ４凝集体に見られるが、最高レベルの染色は、ＣａＨＰＯ４および化学的に類似したＳｒＨＰＯ４凝集体に見られた（図１０）。これは、ＤＳＳペプチドの結合が無機沈殿物との非特異的表面付着現象ではなく、むしろ、ＤＳＳペプチドがリン酸カルシウム沈殿物とリン酸ストロンチウム沈殿物とを区別し得る限りでも、リン酸カルシウムとの非常に選択的な相互作用を伴うことを示す。
【００５２】
実施例１２：シュウ酸カルシウムへのＤＳＳペプチドの結合：
シュウ酸カルシウムは、以前に記載された方法（Ｗａｎｇ  ２００６）を用いて調製された。シュウ酸カルシウムの結晶は、脱イオン水で洗浄され、次に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１０ｍＭのＮａＣｌ、および１２．５μＭの５（６）−カルボキシフルオレセイン標識した８ＤＳＳペプチドを含む溶液に再懸濁させた。結晶懸濁液を室温で１０分間インキュベートした。次に、結晶を遠心分離によって回収し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０および１０ｍＭのＮａＣｌの溶液で２回洗浄し、実施例１１に記載したように蛍光顕微鏡によって視覚化した。標識したペプチドの存在は、結果として、シュウ酸カルシウム凝集体の顕著な染色をもたらした（図１１）。シュウ酸カルシウムは、腎臓結石（腎結石症）に存在する最も一般的な化合物であるため（Ｃｏｅ  ２００５）、これらの結果は、ＤＳＳペプチドを用いて診断または治療用途において腎臓結石を標的にすることができ、該ペプチドが腎臓結石の成長を調節し得ることを示唆する。
【００５３】
実施例１３：ＤＳＳペプチド−抗菌化合物の融合体の抗菌活性：
治療用化合物を鉱化した表面に送達させる標的部分として機能するＤＳＳペプチドの適合性を決定するために、Ｎ−末端（ＤＳＳ）４、（ＤＳＳ）５、または（ＤＳＳ）６ペプチド、トリグリシン（ＧＧＧ）リンカー、および２ｃ−４抗菌ペプチド（配列番号２６）（Ｊ．Ｈｅ、非公開）を含むペプチドを合成した。これらの融合タンパク質の配列は、それぞれ、配列番号２７〜２９に記載されている。嫌気性プランクトン細菌に対するこれらのペプチドの抗菌活性は、以前に記載されたアッセイ（Ｑｉ  ２００５）の変形によって測定した。簡潔に言えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ菌株ＵＡ１５９細胞をＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ（ＴＨ）ブロス培地中に約１×１０５ｃｆｕ／ｍＬまで希釈し、懸濁したヒドロキシアパタイト・ナノクリスタル（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，０．０３％ｗ／ｖ）、または対照試料については、等量の脱イオン水と混合した。アリコートを９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）に移した。次に、連続希釈したペプチドを作製し、前記細菌に添加した。各ペプチドの最小阻害濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＩＣ）は、波長６００ｎｍで細胞懸濁液の吸光度によって測定されるように、約２４時間のインキュベーション後、細菌成長を完全に阻害するペプチド濃度を同定することによって決定した。ペプチド２ｃ−４は、単独で、プランクトン様Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対して２μＭのＭＩＣを示す。（ＤＳＳ）４部分と結合体化し、ペプチド４ＤＳＳ−２ｃ４を生成すると、そのＭＩＣは５２．５μＭに上昇し、有効性の顕著な喪失は、０．０３％（ｗ／ｖ）のヒドロキシアパタイトの添加によって影響を受けない。しかしながら、実施例１に示したように、（ＤＳＳ）４部分は、より多くのＤＳＳリピートを有するペプチドよりもヒドロキシアパタイトに対して低い親和性を示し、高い正電荷の２ｃ−４ペプチドは、高い負電荷の（ＤＳＳ）４部分と相互作用して活性を幾分阻害するかもしれない。それにもかかわらず、ある程度の抗菌活性は、このペプチドによって保持される。
【００５４】
あるいは、ペプチド６ＤＳＳ−ｂ−３４（配列番号３１）を生成するための（ＤＳＳ）６部分とｂ−３４抗菌ペプチド（配列番号３０）（Ｊ．Ｈｅ、非公開）との結合体化は、親ペプチド（６ＤＳＳ−ｂ−３４ではＭＩＣ＝３．１μＭに対して、ｂ−３４では５．６μＭ）の結合体化よりも抗菌活性における改善をもたらす。０．０３％ＨＡの追加は、６ＤＳＳ−ｂ−３４の抗菌活性を幾分減少させるが、得られた１２．５μＭのＭＩＣは、なお、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓに対して著しい活性を示す。なお別の代替において、ペプチドＰＬ−１３５（配列番号３２）（Ｒ．Ｌｅｈｒｅｒ、非公開）は、培地単独でのプランクトン様Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対して２１μＭのＭＩＣを示す。ペプチド５ＤＳＳ−ＰＬ１３５（配列番号３３）を生成するためにこのペプチドと（ＤＳＳ）５部分との結合体化により、培地単独でのＳ．ｍｕｔａｎｓに対するその抗菌活性を＞１７０μＭまで減少させる。該培地に０．０３％ヒドロキシアパタイトの懸濁液を添加することにより、大半のこの活性の回復をもたらし、ＭＩＣを４２．５μＭまで減少させる。
【００５５】
これは、他の化合物がＤＳＳペプチドと結合体化されると、それらの活性を維持し得ることを示す。さらに、これは、ＤＳＳペプチド標的の存在下で顕著な活性を唯一有する化合物が容易に生成され得ることを示し、石灰化した（骨、歯など）表面で唯一活性的であり、他の環境では不活性である化合物を開発する容易な手段を示唆する。このような化合物は、鉱化した組織障害に対する治療的アプローチの安全性および有効性を増大させる大きな進歩を示すことになる。
【００５６】
上述したように、前記は、本発明の種々の態様を説明するために意図されるに過ぎない。上記で検討した具体的な変形は、本発明の範囲に関する制限として解釈されるべきではない。種々の同等物、変更、および変形は、本発明の範囲から逸脱することなく実施されてもよく、このような同等な態様は、本明細書中に含まれるべきであることが理解されることは当業者に明確である。本明細書中に引用された全ての参照文献は、あたかも本明細書中に十分に記載されているかのように、参照により援用される。
【００５７】
【数１】
2015147779.tif 000005
【図１】
2015147779.tif 000006
【図２】
2015147779.tif 000007
【図３】
2015147779.tif 000008
【図４】
2015147779.tif 000009
【図８】
2015147779.tif 000010
【図９】
2015147779.tif 000011
【図５】
2015147779.tif 000012
【図６】
2015147779.tif 000013
【図７】
2015147779.tif 000014
【図１０】
2015147779.tif 000015
【図１１】
2015147779.tif 000016
【配列表】
2015147779000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月17日(2015.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム結合ペプチドを含む組成物であって、該カルシウム結合ペプチドのアミノ酸配列が、配列（Ｘ−Ｙ−Ｚ）ｎを含み、Ｘは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸であり、ＹおよびＺは、セリンおよびホスホセリンから選択されるアミノ酸であり、ｎは、３〜１５の数であり、該ペプチドはリン酸化されているかまたはリン酸化されておらず、該カルシウム結合ペプチドはリン酸カルシウムに結合する、組成物。
【請求項２】
ｎが、２〜８個の数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｘが、アスパラギン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＹおよびＺが、ホスホセリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記カルシウム結合ペプチドが、アミノ酸配列（ＤＳＰＳ）4（配列番号２５）を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記カルシウム結合ペプチドが、結合体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記結合体が、発蛍光団、発色団、アフィニティータグ、抗原タグ、放射性標識、またはスピン標識からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記結合体が、ペプチド、タンパク質、糖質、核酸、脂質、有機化合物、無機化合物、または有機金属化合物からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記結合体が、抗菌化合物である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗菌化合物が、抗菌ペプチドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗菌ペプチドが、アミノ酸リンカー配列を介して、前記１以上のカルシウム結合ペプチドに連結される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥を治療するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
被験体における骨密度の減少によって特徴付けられる骨の欠陥の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
被験体における骨密度の減少によって特徴付けられる骨の欠陥を治療するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥の特定に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物であって、該ペプチドが検出可能なマーカーに結合体化している、前記組成物。
【請求項１７】
被験体における歯の脱塩によって特徴付けられる歯の欠陥を特定するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、該ペプチドが検出可能なマーカーに結合体化している、前記使用。
【請求項１８】
被験体における骨の脱塩によって特徴付けられる骨の欠陥の特定に使用するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物であって、該ペプチドが検出可能なマーカーに結合体化している、前記組成物。
【請求項１９】
被験体における骨の脱塩によって特徴付けられる骨の欠陥を特定するための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、該ペプチドが検出可能なマーカーに結合体化している、前記使用。
【請求項２０】
請求項１に記載の組成物を含むキット。