(57)【要約】【課題】ＳＡＡのｍＲＮＡを標的にし、それによってＳＡＡのｍＲＮＡの発現を干渉する干渉ＲＮＡの提供。【解決手段】ＳＡＡの発現を伴う緑内障における血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を阻害するためのＲＮＡ干渉が提供される。対象の眼において血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を該対象の眼に投与する工程を包含し；該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む方法もまた提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
センスヌクレオチド配列とアンチセンスヌクレオチド配列とを含む干渉ＲＮＡの有効量を含む組成物であって、該アンチセンス配列が、以下：
CUUUGCCACUCCUGCCCCA（配列番号37）、
UCGGAAGUGAUUGGGGUCU（配列番号38）、
UUUGUCUGAGCCGAUGUAA（配列番号39）、
AACCAGGCCCGUGAGAAGC（配列番号40）、
CUGAGCCGAUGUAAUUGGC（配列番号41）、
GCCACUCCUGCCCCAUUUA（配列番号69）、
CCCCCGAGCAUGGAAGUAU（配列番号42）、
CUCUGGCAUUGCUGAUCAC（配列番号43）、
GCCUGUGAGUCUCUGGAUA（配列番号44）、
GCCACUCCUGCCCCAUUUA（配列番号45）、
GCCAGCAGGUCGGAAGUGA（配列番号46）、
AGUCUCUGGAUAUUCUCUC（配列番号47）、
UUUAUUGGCAGCCUGAUCG（配列番号48）、
UUGCUGAUCACUUCUGCGG（配列番号49）、
CUGGAUAUUCUCUCUGGCA（配列番号50）、
UCUGCCACUCCUGCCCCAU（配列番号51）、
AACCCCUUGGAGAGCCUCC（配列番号52）、
UGCCCAUGUCCCCAACCCC（配列番号53）、
AUAGAGAUAUCUGUUUGAA（配列番号54）、
CGAGCAUAGAGAUAUCUGU（配列番号55）、
CUUUGGGCAGCAUCAUAGU（配列番号56）、
AGACACCCCCAGGUCCUCU（配列番号57）、
CCUGGAACGGCUGAUGAGU（配列番号58）、
CCAAAUAAAUAGUAGUCUA（配列番号59）、
UCCAAUACAGUGCUGCUGU（配列番号60）、
CUCAGCUUUCUCGUUGGAC（配列番号61）、
CCAUUCCUCAGCUUUCUCG（配列番号62）、
CCGGCCCCAUUCCUCAGCU（配列番号63）、
CUUUGCCACUCCGGCCCCA（配列番号64）、または
UCUGAAGCGGUCGGGGUCU（配列番号65）
を含む、組成物。
【請求項２】
緑内障を有する被験体を処置するための請求項１に記載の組成物であって、該被験体の眼に投与されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、緑内障、特に原発性開放隅角緑内障における血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の発現を阻害する干渉ＲＮＡ組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
緑内障は、特定の臨床徴候を共有する、視神経障害の混成群である。緑内障における視力の喪失は、視野、神経線維層の欠損、および視神経頭（ＯＮＨ）の進行性吸角法における特徴的な変化により臨床的に診断される、神経網膜内の網膜神経節細胞の選択的な死が原因となっている。緑内障の発症における主要な危険因子の一つには、高眼圧（眼内圧（ＩＯＰ）の上昇）の存在がある。適切な眼内圧は、眼の形状を維持し、眼房水を無血管組織の角膜や水晶体に流すことを可能にする圧力勾配をもたらすために必要となる。ＩＯＰは又、正常なＩＯＰであると思われがちな症状を対象が有する、正常眼圧緑内障の原因に関与すると思われる。
【０００３】
緑内障に関連するＩＯＰの上昇は、前眼房の虹彩角膜角度に位置する小さな特殊組織である、小柱網（ＴＭ）内の眼房水の流出耐性の上昇によるものである、。ＴＭ細胞の緑内障の変化には、ＴＭ細胞の喪失、並びにタンパク質性プラーク様物質を含む細胞外破片の沈着および蓄積が含まれる。さらに、緑内障のＯＮＨにおいて発生する変化もある。緑内障の眼においては、ＯＮＨグリア細胞における形態および移動度の変化が見られる。ＩＯＰの上昇および一過性虚血発作の反応としては、ＯＮＨ細胞外マトリックスの組成における変化、並びにグリア細胞および網膜神経節細胞の軸索形態の変化が見られる。
【０００４】
原発性緑内障は、解剖学的または生理学的基礎をなす眼内の体液の流れに障害をもたらす。続発性緑内障は、眼または既存の疾患に対する障害または外傷の結果として発生する。慢性または単性緑内障としても知られる原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、全ての原発性緑内障の９０％を占める。ＰＯＡＧは、小柱網の変性を特徴とし、眼からの体液の排出に対して異常に高い耐性をもたらす。このような耐性の変化が、ＩＯＰの上昇をもたらし、通常眼により生成される体液を上昇した耐性を超えて駆動させることが必要となる。
【０００５】
現在の抗緑内障療法には、眼房水形成抑制剤またはブドウ膜強膜流出促進剤の使用によるＩＯＰの低下、レーザー線維柱帯形成術、または排水を向上させるろ過手術である線維柱帯切除術が含まれる。薬学的な抗緑内障手法は、種々の好ましくない副作用を示す。例えば、ピロカルピン等の縮瞳薬は、視野のぼやけやその他のネガティブな視覚的副作用を引き起こす。又、炭酸脱水素抑制剤の全身投与は、吐き気、消化不良、疲労および代謝性アシドーシスを引き起こす。さらに、特定のβ−遮断薬は、肺組織中のβ−２受容体に対する効果に起因する重大な肺の副作用を伴うことが多くなっている。交感神経興奮薬は、頻脈、不整脈および高血圧を引き起こす。このようなネガティブな副作用は、対象の服薬率の低下や治療の終了をもたらす場合がある。
【０００６】
さらに重要なことに、現在の抗緑内障療法は、小柱網の病理的損傷、視神経、並びに依然として改善が見られない網膜神経節細胞および軸索の喪失に直接対処するものではない。緑内障の重要度、および以前の治療方法の欠点を鑑みると、緑内障の進行の内在的な原因に対処する緑内障の治療方法の改善が望まれているように思われる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ＳＡＡのｍＲＮＡを標的にし、それによってＳＡＡのｍＲＮＡの発現を干渉する干渉ＲＮＡを対象とする。本発明の干渉ＲＮＡは、ＳＡＡ関連緑内障の治療に有用である。
【０００８】
本発明の実施形態は、対象の眼において血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法を提供する。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する二本鎖（ｄｓ）ｓｉＲＮＡまたは一本鎖（ｓｓ）ｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を対象の眼に投与することを包含する。
【０００９】
二本鎖ｓｉＲＮＡは、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および少なくともほぼ完全に連続した相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。さらに、アンチセンス配列は、ＳＡＡ１、ＳＡＡ２およびＳＡＡ４をそれぞれコード化するＤＮＡのセンス配列である、配列番号１、配列番号２または配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００３３１、ＢＣ０２０７９５およびＮＭ＿００６５１２）に対応するｍＲＮＡの部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。このような組成物を投与することによって、対象の眼における血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を減衰させる。
【００１０】
干渉ＲＮＡが一本鎖である場合、干渉ＲＮＡは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
本発明の一実施形態において、アンチセンスｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている。本発明の別の実施形態において、アンチセンス配列は、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている。本発明の更なる実施形態において、アンチセンス配列は、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５または３４３から開始する配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている。本発明の尚更なる実施形態において、アンチセンス配列は、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている。
【００１２】
本発明の更なる実施形態は、治療を必要とする対象における血清アミロイドＡ関連緑内障を治療する方法である。この方法は、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を患者の眼に投与することを包含し、該干渉ＲＮＡは、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。アンチセンス配列は、生理学的条件下で、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。それによって、血清アミロイドＡ関連緑内障が治療される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
対象の眼において血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を弱める方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を該対象の眼に投与する工程を包含し；
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み；
該アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの一部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有し；
それによって、血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現が減衰される、方法。
（項目２）
前記対象が緑内障を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記対象が緑内障を発症する危険性がある、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも２１〜２３ヌクレオチドの領域を有し、前記センス配列および該アンチセンス配列のそれぞれの３’末端に追加のＴＴ配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記センスヌクレオチド配列および前記アンチセンスヌクレオチド配列が、ループヌクレオチド配列により結合されている、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記組成物が局所、硝子体内または経強膜の経路を介して投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５、３４３から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記アンチセンス配列が、
【化１】
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を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記干渉ＲＮＡが、塩基部分、糖部分またはリン酸部分に修飾を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
さらに、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む第二干渉ＲＮＡを、前記対象の眼に投与することを含み；
該第二干渉ＲＮＡのアンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの第二部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、該アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記組成物が、それぞれ１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも４種の干渉ＲＮＡの混合物の有効量、および薬学的に許容可能な担体を含み、
各干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および４種の該干渉ＲＮＡのそれぞれの該センス配列とアンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み；
該混合物のアンチセンス配列が、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
対象の眼において血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を該対象の眼に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有するヌクレオチド配列を含み、
それによって、血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現が減衰される、方法。
（項目１６）
前記組成物が局所、硝子体内または経強膜の経路を介して投与される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５、３４３から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
さらに、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する第二のヌクレオチド配列を含む第二の干渉ＲＮＡを、前記対象の眼に投与することを含む、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、それぞれ１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも４種の干渉ＲＮＡの混合物の有効量を含み、
該混合物が、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する第一、第二、第三および第四のヌクレオチド配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目２３）
治療を必要とする対象において血清アミロイドＡ関連緑内障を治療する方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を該対象の眼に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み；
該アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの一部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有し；
それによって、血清アミロイドＡ関連緑内障が治療される、方法。
（項目２４）
前記組成物が局所、硝子体内または経強膜の経路を介して投与される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５、３４３から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
さらに、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む第二干渉ＲＮＡを、前記対象の眼に投与することを含み；
該第二干渉ＲＮＡのアンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの第二部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、該アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
前記組成物が、それぞれ１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも４種の干渉ＲＮＡの混合物の有効量、および薬学的に許容可能な担体を含み、
各干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および４種の該干渉ＲＮＡのそれぞれの該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み；
該混合物のアンチセンス配列が、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡの部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
治療を必要とする対象において血清アミロイドＡ関連緑内障を治療する方法であって、
１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を該対象の眼に投与することを含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有するヌクレオチド配列を含み、
それによって、血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現が減衰される、方法。
（項目３２）
前記組成物が局所、硝子体内または経強膜の経路を介して投与される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５、３４３から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３１に記載の方法。
（項目３７）
さらに、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する第二のヌクレオチド配列を含む第二の干渉ＲＮＡを、前記対象の眼に投与することを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３８）
前記組成物が、それぞれ１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも４種の干渉ＲＮＡの混合物の有効量を含み、
該混合物が、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する第一、第二、第三および第四のヌクレオチド配列を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３９）
対象の眼において血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を減衰させるための医薬品の製造における、組成物の使用であって、
該組成物が、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量、および薬学的に許容可能な担体を含み、
該干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み、
該アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの一部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、使用。
（項目４０）
前記アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも２１〜２３ヌクレオチドの領域を有し、前記センス配列および該アンチセンス配列のそれぞれの３’末端に追加のＴＴ配列を含む、項目３９に記載の使用。
（項目４１）
前記センスヌクレオチド配列および前記アンチセンスヌクレオチド配列が、ループヌクレオチド配列により結合されている、項目３９に記載の使用。
（項目４２）
前記組成物が、局所、硝子体内または経強膜の経路を介した投与のために調製されている、項目３９に記載の使用。
（項目４３）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３９に記載の使用。
（項目４４）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３９に記載の使用。
（項目４５）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５、３４３から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３９に記載の使用。
（項目４６）
前記アンチセンス配列が、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目３９に記載の使用。
（項目４７）
前記アンチセンス配列が、
【化２】
2015044858.tif 000004
を含む、項目３９に記載の使用。
（項目４８）
前記干渉ＲＮＡが、塩基部分、糖部分またはリン酸部分に修飾を含む、項目３９に記載の使用。
（項目４９）
前記組成物が、さらに、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む第二干渉ＲＮＡを含み；
該第二干渉ＲＮＡのアンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの第二部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、該アンチセンス配列が、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれに対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、項目３９に記載の使用。
（項目５０）
前記組成物が、それぞれ１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも４種の干渉ＲＮＡの混合物の有効量、および薬学的に許容可能な担体を含み、
各干渉ＲＮＡが、センスヌクレオチド配列、アンチセンスヌクレオチド配列、および４種の該干渉ＲＮＡのそれぞれの該センス配列と該アンチセンス配列との間の少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含み；
該混合物のアンチセンス配列が、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡの一部分に生理学的条件下でハイブリダイズし、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、項目３９に記載の方法。
（項目５１）
対象の眼において血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡの発現を減衰させるための医薬品の製造における、組成物の使用であって、
該組成物が、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する干渉ＲＮＡの有効量、および薬学的に許容可能な担体を含み、
該干渉ＲＮＡが、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有するヌクレオチド配列を含む、使用。
（項目５２）
前記組成物が、局所、硝子体内または経強膜の経路を介した投与のために調製されている、項目５１に記載の使用。
（項目５３）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２３０、３５７、３６２、３８０、４４７、４７０、５２７、５３１、５４８または５５７から始まる配列番号１に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目５１に記載の使用。
（項目５４）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド４３、１７０、１７５、１９３、２６０、２８３、３３９または３７０から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目５１に記載の使用。
（項目５５）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド２５２、２７１、２７６、３２５、３４３から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目５１に記載の使用。
（項目５６）
前記干渉ＲＮＡが、ヌクレオチド１５３、１６６、２２２、２２７、２５１、２６８、２９７、３３５、３５６、３８４、３９０、３９６、４０６または４２３から始まる配列番号３に対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的にするように設計されている、項目５１に記載の使用。
（項目５７）
前記組成物が、さらに、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する第二ヌクレオチド配列を含む第二干渉ＲＮＡを含む、項目５１に記載の使用。
（項目５８）
前記組成物が、それぞれ１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも４種の干渉ＲＮＡの混合物の有効量を含み、
該混合物が、それぞれヌクレオチド１７５、２５２、２７６および３２５から始まる配列番号２に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する第一、第二、第三および第四のヌクレオチド配列を含む、項目５１に記載の使用。
（項目５９）
前記対象が血清アミロイドＡ関連緑内障を有する、項目３９〜５８のいずれか１項に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＳＡＡ  ｍＲＮＡを標的にするＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＮＴＭ  ７６５正常小柱網細胞における、ｓｉＲＮＡの内因性ＳＡＡ  ｍＲＮＡに対する効果を調べるための、ＳＡＡ２  ｍＲＮＡ／１８ｓ  ｒＲＮＡ比のＱＰＣＲ解析結果を提供する。小柱網細胞は、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ＃１試薬を使用して、３種の異なる濃度で２４時間、１００ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。対照：対照；処理１：０．０５μｌ／１００μｌウェルでの処理１；処理２：０．２μｌ／１００μｌウェルでの処理２；処理３：０．４μｌ／１００μｌウェルでの処理３。
【図２】図２は、ＳＡＡ  ｍＲＮＡを標的にするＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたＧＴＭ６８６正常小柱網細胞における、ｓｉＲＮＡの内因性ＳＡＡ  ｍＲＮＡに対する効果を調べるための、ＳＡＡ２  ｍＲＮＡ／１８ｓ  ｒＲＮＡ比のＱＰＣＲ解析結果を提供する。小柱網細胞は、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ＃１試薬を使用して、３種の異なる濃度で２４時間、１００ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。対照：対照；処理１：０．０５μｌ／１００μｌウェルでの処理１；処理２：０．２μｌ／１００μｌウェルでの処理２；処理３：０．４μｌ／１００μｌウェルでの処理３。＊：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定によると、対照および処理１の両方に対してｐ＜０．０５。
【図３】図３は、正常（ＮＴＭ  ７６５−０４）および緑内障（ＧＴＭ  ６８６−０３）小柱網細胞の増殖および形態に対するＳＡＡ  ｓｉＲＮＡ処理の効果の、リアルタイム電子検出システム（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ）による監視結果を提供する。細胞は、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ＃１試薬を使用して、３種の異なる濃度で４８時間、ＳＡＡ  ｍＲＮＡを標的にするＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ｓｉＲＮＡ  １００ｎＭでトランスフェクションした。Ｔ１：０．０５μｌ／１００μｌウェル；Ｔ２：０．２μｌ／１００μｌウェル；Ｔ３：０．４μｌ／１００μｌウェル。
【図４】図４は、ｓｉＲＮＡで処理したＮＴＭ  ７６５正常小柱網細胞の細胞可溶化物中の内因性ＳＡＡタンパク質レベルについてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を提供する。細胞は、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ＃１試薬を使用して、３種の異なる濃度で４８時間、ＳＡＡ  ｍＲＮＡを標的にするＳＡＡ  ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ｓｉＲＮＡ  １００ｎＭでトランスフェクションした。処理１：０．０５μｌ／１００μｌウェルでの処理１；処理２：０．２μｌ／１００μｌウェルでの処理２；処理３：０．４μｌ／１００μｌウェルでの処理３。
【図５】図５は、ｓｉＲＮＡで処理したＧＴＭ  ６８６緑内障小柱網細胞の細胞可溶化物中の内因性ＳＡＡタンパク質レベルについてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を提供する。細胞は、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ＃１試薬を使用して、３種の異なる濃度で４８時間、ＳＡＡ  ｍＲＮＡを標的にするＳＡＡ  ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ｓｉＲＮＡ  １００ｎＭでトランスフェクションした。処理１：０．０５μｌ／１００μｌウェルでの処理１；処理２：０．２μｌ／１００μｌウェルでの処理２；処理３：０．４μｌ／１００μｌウェルでの処理３。分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次いでＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較検定によると、対照に対して、＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
「ＲＮＡｉ」と呼ばれるＲＮＡ干渉は、小型一本鎖または二本鎖ＲＮＡ分子により生じる標的遺伝子の発現を減少させる方法である。干渉ＲＮＡには、二本鎖または一本鎖の何れかの小型干渉ＲＮＡ（ｄｓ  ｓｉＲＮＡまたはｓｓ  ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等が含まれる。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡ干渉は、ｄｓＲＮＡ前駆体を長さ約２０〜２５ヌクレオチドの小型ＲＮＡに切断することによりインビボで起こると思われる。切断は、ＲＮａｓｅＩＩＩ−ＲＮＡヘリカーゼ・ダイサーにより達成される。ｓｉＲＮＡの「センス」鎖、即ち、標的ｍＲＮＡ配列と全く同じ配列を有する鎖を除去し、標的ｍＲＮＡに相補的な「アンチセンス」鎖を残して、ｍＲＮＡの発現を減少させる機能を果たす。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）として知られるタンパク質複合体をｍＲＮＡへ導くと、この複合体がＲＩＳＣのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質によりｍＲＮＡを切断し、それによってこのｍＲＮＡによりタンパク質の産生を減少させると思われる。干渉ＲＮＡは触媒性であり、ｍＲＮＡの発現の減少は、ｍＲＮＡに対する干渉ＲＮＡの準化学量により達成することができる。ｍＲＮＡの発現の減少は又、転写および翻訳機序を介して生じる場合もある。
【００１５】
本発明は、眼疾患における血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の発現を阻害する干渉ＲＮＡの使用に関する。本発明によると、外因によりもたらされるｓｉＲＮＡが、眼構造のＳＡＡのサイレンシングをもたらす。本発明者等は以前に、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が、緑内障のＴＭ組織および細胞において有意にアップレギュレートされることを示した（２００３年１２月１７日に出願された係属中の米国特許出願ＵＳＳＮ  ６０／５３０，４３０  “Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｌａｕｃｏｍａ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｇｌａｕｃｏｍａ  Ａｇｅｎｔｓ”）。本発明者等は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）により、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップを使用して確認される異なるｍＲＮＡの発現を、並びにＳＡＡ  ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＳＡＡタンパク質レベルの上昇を確認した（全体が参考として本明細書に組み入れられる、前述の係属中の米国特許出願）。
【００１６】
本明細書で引用される核酸配列は、特に指示がない限り、５’から３’の方向に記述される。本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）またはＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）に存在するプリンまたはピリミジン塩基を含む、ＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはその修飾形態の何れかを指す。本明細書に提示される干渉ＲＮＡは、「Ｔ」塩基がＲＮＡに天然に生じないにもかかわらず、Ｔ塩基を、特に３’末端に含む場合がある。「核酸」は、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含し、一本鎖分子または二本鎖分子を指してもよい。二本鎖分子は、ＡとＴの塩基、ＣとＧの塩基、およびＡとＵの塩基のワトソン・クリック型塩基対合により形成される。二本鎖分子の鎖は、互いに部分的に、実質的にまたは完全に相補的である場合があり、二重鎖ハイブリッドを形成するが、その結合力は、塩基配列の相補性の性質および程度によって異なる。ｍＲＮＡ配列は、それをコード化するＤＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖配列を知ることによって、容易に判定される。例えば、配列番号１は、血清アミロイドＡ１  ｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。例えば、配列番号１は、結合組織増殖因子のｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。ｍＲＮＡの配列は、ＤＮＡのセンス鎖の配合と同一であるが、「Ｔ」塩基は「Ｕ」残基に置換されている。従って、血清アミロイドＡ１  ｍＲＮＡ配列は、配列番号１から既知であり、血清アミロイドＡ２  ｍＲＮＡ配列は、配列番号２から既知であり、血清アミロイドＡ４  ｍＲＮＡ配列は、配列番号３から既知である。
【００１７】
血清アミロイドＡ  ｍＲＮＡ：ヒト血清アミロイドＡは、１１番染色体の短腕に位置する遺伝子によってコード化される、異なった形で発現する多数のアポリポタンパク質を含む。ＳＡＡのイソフォームは４種類ある。全米バイオテクノロジー情報センター（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースには、血清アミロイドＡ１のメッセンジャーＲＮＡの対応するＤＮＡを、参照番号ＮＭ＿０００３３１としており、以下ではこれを配列番号１とする。血清アミロイドＡ１のコード配列は、ヌクレオチド２２５〜５９３である。
【００１８】
ＳＡＡ１：配列番号１
【００１９】
【化３】
2015044858.tif 000005
上述のＳＡＡ１  ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライス形態、対立形態、またはそれらの同族である。同族は、配列番号１と相同である別の哺乳類由来の血清アミロイドＡ１  ｍＲＮＡである。配列番号１と関係するＳＡＡ１核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００９１１７（マウス由来）、ＮＭ＿１９９１６１（ヒト転写物変異体２）、ＢＣ００７０２２．１、ＢＧ５３３２７６．１、ＢＧ５６７９０２．１、ＢＱ６９１９４８．１、ＣＤ１０２０８４．１、Ｍ１０９０６．１、Ｍ２３６９８．１、Ｘ５１４３９．１、Ｘ５１４４１．１、Ｘ５１４４２．１、Ｘ５１４４３．１およびＸ５６６５２．１の配列である。
【００２０】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースには、血清アミロイドＡ２のメッセンジャーＲＮＡの対応するＤＮＡ配列を、参照番号ＮＭ＿ＢＣ０２０７９５としており、以下ではこれを配列番号２とする。血清アミロイドＡ２のコード配列は、ヌクレオチド３８〜４０６である。
【００２１】
ＳＡＡ２：配列番号２
【００２２】
【化４】
2015044858.tif 000006
上述のＳＡＡ２  ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライス形態、対立形態、またはそれらの同族である。同族は、配列番号２と相同である別の哺乳類由来の血清アミロイドＡ２  ｍＲＮＡである。配列番号２と関係するＳＡＡ２核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０３０７５４（ヒト）、ＢＣ０５８００８．１、Ｊ０３４７４．１、Ｌ０５９２１．１、Ｍ２３６９９．１、Ｍ２３７００．１、Ｍ２６１５２．１，Ｘ５１４４０．１、Ｘ５１４４４．１、Ｘ５１４４５．１およびＸ５６６５３．１の配列である。
【００２３】
配列番号１および配列番号２のタンパク質生成物（ＳＡＡ１およびＳＡＡ２）は、急性期反応物質として知られ、Ｃ反応性タンパク質と類似しており、それらは炎症性サイトカインによって劇的にアップレギュレートされる。ＳＡＡ１およびＳＡＡ２タンパク質は、アミノ酸レベルで９３．５％同一であり、遺伝子は、ヌクレオチドレベルで９６．７％同一である。
【００２４】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースには、血清アミロイドＡ４のメッセンジャーＲＮＡの対応するＤＮＡ配列を、参照番号ＮＭ＿００６５１２としており、以下ではこれを配列番号３とする。血清アミロイドＡ４のコード配列は、ヌクレオチド７６〜４６８である。
【００２５】
ＳＡＡ４：配列番号３
【００２６】
【化５】
2015044858.tif 000007
ＳＡＡ４は、低レベルで構成的に発現される遺伝子である。上述のＳＡＡ４  ｍＲＮＡ配列の等価物は、代替的なスプライス形態、対立形態、またはそれらの同族である。同族は、配列番号３と相同である別の哺乳類由来の血清アミロイドＡ４  ｍＲＮＡである。配列番号３と関係するＳＡＡ核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ００７０２６、Ｍ８１３４９．１およびＳ４８９８３．１である。
【００２７】
ｍＲＮＡの発現の減衰：本明細書で使用される「ｍＲＮＡの発現の減少」という語句は、細胞内における標的遺伝子の完全なｍＲＮＡ転写レベルを減少させる干渉ＲＮＡの量を投与し、それによって、スクランブル配列を有する対照ＲＮＡよりも、タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を減らすことを意味する。ｍＲＮＡの発現の減少は、一般的にｍＲＮＡの「ノックダウン」と呼ばれている。５０％〜１００％を含むおよびそららの間の発現量のノックダウンが、本明細書の実施形態にで考慮される。しかし、このようなノックダウンレベルが本発明の目的において達成されることが必要なわけではない。又、２組の干渉ＲＮＡは、個別ではノックダウンにおける効果が弱い場合があるものの、一緒に投与すると、遥かに有効になる場合もある。一実施形態において、個々のｄｓ  ｓｉＲＮＡは、７０％までのノックダウンに有効である。別の実施形態において、複数のｄｓ  ｓｉＲＮＡは、７０％までのノックダウンに共に有効である。
【００２８】
ノックダウンは、一般的に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）増幅法によりｍＲＮＡレベルを判定するか、またはウェスタン・ブロット若しくは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベルを判定することによって測定される。タンパク質レベルを分析することで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるｍＲＮＡ分解と、翻訳阻害の両方を評価することができる。ノックダウンを測定する更なる技法には、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイ、および蛍光標識活性化細胞分析が含まれる。
【００２９】
ＳＡＡの阻害は又、例えば眼内圧の改善、視野喪失の改善、または視神経頭の変化の改善のような緑内障の症状の改善を観察することによっても、ヒトまたは哺乳動物において推測される。
【００３０】
本発明の実施形態の干渉ＲＮＡは触媒的に作用する。即ち、干渉ＲＮＡは、標的ＲＮＡを準化学量で阻害することができる。アンチセンス治療と比べると、治療効果をもたらすために必要となる干渉ＲＮＡが有意に少ない。
【００３１】
二本鎖干渉ＲＮＡ：本明細書で使用される二本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）は、センスヌクレオチド配列およびアンチセンスヌクレオチド配列を有しており、該センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、少なくともほぼ完全に連続した相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を含む。干渉ＲＮＡの長さは、１９〜４９ヌクレオチドを含み、長さ１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドを含む場合がある。ｄｓ  ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、生理学的条件下で、配列番号１、配列番号２または配列番号３の部分にハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３それぞれのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する。
【００３２】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、細胞内でＲＩＳＣ複合体に結合し、アンチセンスＲＮＡの配列と相補的な配列においてｍＲＮＡの配列と特異的に結合するようにこの結合した複合体を誘導し、それによってこの結合した複合体によるｍＲＮＡのその後の切断を可能にすることから、このアンチセンス鎖はｓｉＲＮＡの活性誘導剤である。
【００３３】
ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技法は、ロックフェラー大学のウェブサイトより入手可能なＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ”（２００４年５月６日改訂）により、Ａｍｂｉｏｎのウェブサイトに掲載されるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃５０６，”ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，”  Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．により、Ｇ／Ｃ含有量の最小３０％、最大５５％の検索パラメータを使用するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎウェブサイトにより、およびＤｈａｒｍａｃｏｎウェブサイトにより提示される。標的配列は、ｍＲＮＡのコード領域または５’若しくは３’非翻訳領域に位置する場合がある。
【００３４】
ＳＡＡ１のＤＮＡ標的配列の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド５３１〜５４９に存在する：
５’−ＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧ−３’      配列番号４。
【００３５】
配列番号４の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、それぞれの鎖に３’ＵＵオーバーハングを有する、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、以下の通りである：
【００３６】
【化６】
2015044858.tif 000008
。
【００３７】
３’オーバーハングは、複数の「Ｕ」残基、例えば、２、３、４、５および６個の間およびそれらを含む複数の「Ｕ」残基を有する場合がある。５’末端も又ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する場合がある。配列番号４の対応するｍＲＮＡ配列を標的にし、それぞれの鎖に３’ＴＴオーバーハングを有する、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、以下の
通りである：
【００３８】
【化７】
2015044858.tif 000009
。
【００３９】
二本鎖ｓｉＲＮＡの鎖は、ヘアピンループにより結合されて、以下のように一本鎖ｓｉＲＮＡを形成する場合がある：
【００４０】
【化８】
2015044858.tif 000010
。
【００４１】
Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、または当業者に既知の修飾形態である。ヌクレオチドＮの数は、３〜２３、または５〜１５、または７〜１３、または４〜９、または９〜１１の間およびそれらを含む数であるか、或いはヌクレオチドＮの数は９である。
【００４２】
表１には、配列番号１、配列番号２および配列番号３のＳＡＡ  ＤＮＡ標的配列の例を一覧にする。これらから上述の方法により本発明のｓｉＲＮＡが設計されている。
【００４３】
【表１】
2015044858.tif 000011
上の例で引用されているように、当業者は、配列番号１、配列番号２または配列番号３における配列部位を参照し、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれと相補的またはほぼ相補的なヌクレオチドを追加または欠失することによって、表１に示す標的配列情報をもとに、表１に示す配列よりも長さが長いまたは短い干渉ＲＮＡを設計することができる。
【００４４】
ｄｓ  ｓｉＲＮＡまたはｓｓ  ｓｉＲＮＡにより誘導される標的ＲＮＡ切断反応は、極めて配列特異的である。一般的に、標的ｍＲＮＡの部分と同一のセンスヌクレオチド配列と、ｍＲＮＡセンス配列と全く相補的なアンチセンス部分とを含有するｓｉＲＮＡは、ＳＡＡ  ｍＲＮＡを阻害するｓｉＲＮＡの実施形態である。しかし、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡの間の１００％配列相補性は、本発明を実施する上で必要ではない。従って、本発明は、遺伝子突然変異、系統多型現象、または進化的分岐に起因すると予測される配列変形を考慮する。例えば、標的配列に対する挿入、欠失または一点突然変異を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効である。
【００４５】
本発明の特定の実施形態において、アンチセンス配列は、ＣＵＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＵＧＣＣＣＣＡ（配列番号３７）またはＵＣＧＧＡＡＧＵＧＡＵＵＧＧＧＧＵＣＵ（配列番号３８）を含み、アンチセンス配列は、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。
【００４６】
本発明の更なる実施形態において、アンチセンス配列は、ＵＵＵＧＵＣＵＧＡＧＣＣＧＡＵＧＵＡＡ（配列番号３９）、ＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧＵＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号４０）、ＣＵＧＡＧＣＣＧＡＵＧＵＡＡＵＵＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＵＧＧＡＡＧＵＡＵ（配列番号４２）、ＣＵＣＵＧＧＣＡＵＵＧＣＵＧＡＵＣＡＣ（配列番号４３）、ＧＣＣＵＧＵＧＡＧＵＣＵＣＵＧＧＡＵＡ（配列番号４４）、ＧＣＣＡＣＵＣＣＵＧＣＣＣＣＡＵＵＵＡ（配列番号４５）、ＧＣＣＡＧＣＡＧＧＵＣＧＧＡＡＧＵＧＡ（配列番号４６）を含む、アンチセンス配列は、配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分、または配列番号２に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。
【００４７】
本発明の別の実施形態において、アンチセンス配列は、ＡＧＵＣＵＣＵＧＧＡＵＡＵＵＣＵＣＵＣ（配列番号４７）、ＵＵＵＡＵＵＧＧＣＡＧＣＣＵＧＡＵＣＧ（配列番号４８）、ＵＵＧＣＵＧＡＵＣＡＣＵＵＣＵＧＣＧＧ（配列番号４９）、ＣＵＧＧＡＵＡＵＵＣＵＣＵＣＵＧＧＣＡ（配列番号５０）、ＵＣＵＧＣＣＡＣＵＣＣＵＧＣＣＣＣＡＵ（配列番号５１）またはＧＣＣＡＣＵＣＣＵＧＣＣＣＣＡＵＵＵＡ（配列番号６９）を含み、アンチセンス配列は、配列番号２に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする。
【００４８】
前述の方法には、アンチセンス配列が、ＡＡＣＣＣＣＵＵＧＧＡＧＡＧＣＣＵＣＣ（配列番号５２）、ＵＧＣＣＣＡＵＧＵＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号５３）、ＡＵＡＧＡＧＡＵＡＵＣＵＧＵＵＵＧＡＡ（配列番号５４）、ＣＧＡＧＣＡＵＡＧＡＧＡＵＡＵＣＵＧＵ（配列番号５５）、ＣＵＵＵＧＧＧＣＡＧＣＡＵＣＡＵＡＧＵ（配列番号５６）、ＡＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＵＣＣＵＣＵ（配列番号５７）、ＣＣＵＧＧＡＡＣＧＧＣＵＧＡＵＧＡＧＵ（配列番号５８）、ＣＣＡＡＡＵＡＡＡＵＡＧＵＡＧＵＣＵＡ（配列番号５９）、ＵＣＣＡＡＵＡＣＡＧＵＧＣＵＧＣＵＧＵ（配列番号６０）、ＣＵＣＡＧＣＵＵＵＣＵＣＧＵＵＧＧＡＣ（配列番号６１）、ＣＣＡＵＵＣＣＵＣＡＧＣＵＵＵＣＵＣＧ（配列番号６２）、ＣＣＧＧＣＣＣＣＡＵＵＣＣＵＣＡＧＣＵ（配列番号６３）、ＣＵＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＧＧＣＣＣＣＡ（配列番号６４）、またはＵＣＵＧＡＡＧＣＧＧＵＣＧＧＧＧＵＣＵ（配列番号６５）を含み、アンチセンス配列が、配列番号３に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズする実施形態が含まれる。
【００４９】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列は、ｍＲＮＡの標的配列と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドを有する。本明細書で使用される「ほぼ完全な」という表現は、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部分と、ｓｉＲＮＡのアンチセンス配列が「実質的に相補的」であり、ｓｉＲＮＡのセンス配列が「実質的に同一」であることを意味する。当業者に知られている「同一性」とは、配列間のヌクレオチドの順番をマッチングすることによって決定される、ヌクレオチド配列間の配列関係の程度を指す。一実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列と８０％の、および８０％〜１００％の相補性を有するアンチセンスＲＮＡは、ほぼ完全に相補的であると考えられ、本発明で使用することができる。「完全な」連続した相補性は、隣接した塩基対の標準的なワトソン・クリック型塩基対合である。「少なくともほぼ完全な」連続した相補性には、本明細書で使用される「完全な」相補性が含まれる。同一性または相補性を判定するコンピュータ法は、ヌクレオチド配列の最高のマッチング程度を提供するように設計されており、例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４３０−４１０）、並びにＦＡＳＴＡである。
【００５０】
配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応するｍＲＮＡの標的配列は、ｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域、およびｍＲＮＡのコード領域にある場合がある。
【００５１】
二本鎖干渉ＲＮＡの一方または両方の鎖は、１〜６個のヌクレオチドからなる３’オーバーハングを有する場合があり、これらのヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドまたはこれらの混合物である場合がある。このオーバーハングのヌクレオチドは塩基対ではない。本発明の一実施形態において、干渉ｄｓ  ＲＮＡは、ＴＴまたはＵＵの３’オーバーハングを含む。
【００５２】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、上述の２本の一本鎖の二重形成において見られる場合もあれば、相補性の領域が塩基対であり、ヘアピンまたはループにより共有結合して一本鎖を形成する、単一分子である場合がある。ヘアピンは、ダイサーと呼ばれるタンパク質により細胞内で切断され、二つの個別の塩基対ＲＮＡ分子の干渉ＲＮＡを形成すると考えられる。
【００５３】
干渉ＲＮＡは、１個以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換または修飾により天然に生じるＲＮＡとは異なる場合がある。非ヌクレオチド物質は、５’末端、３’末端または内部の何れかで干渉ＲＮＡと結合する場合がある。そのような修飾は一般的に、干渉ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を向上させるため、細胞取り込みを改善するため、細胞標的化を増強するため、干渉ＲＮＡの追跡を助けるため、または安定性をさらに向上させるために設計される。例えば、干渉ＲＮＡは、オーバーハングの末端にプリンヌクレオチドを含む場合がある。例えば、ピロリジンリンカーによりコレステロールをｄｓ  ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に結合することも、ｓｉＲＮＡに安定性をもたらす。更なる修飾には、例えば、３’末端ビオチン分子、細胞侵入特性を有することが知られているペプチド、ナノ粒子、ペプチド模倣薬、蛍光染料、またはデンドリマーが含まれる。
【００５４】
ヌクレオチドは、分子のその塩基部分、その糖部分、またはそのリン酸部分が修飾され、本発明の実施例において機能する場合がある。修飾には、例えば、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ、ハロ、ヒドロキシル、チオール基、またはこれらの組み合わせによる置換が含まれる。ヌクレオチドは、より安定性のある類似体で置換される場合があり、例えば、Ｕを２’デオキシ−Ｔに置換したり、２’ＯＨが、例えば、２’アミノ若しくは２’メチル基、２’メトキシエチル基、または２’−０，４’−Ｃメチレン架橋で置換されるような糖修飾を有する場合がある。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジン類似体の例には、キサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシン、並びにＯ−およびＮ−修飾ヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドのリン酸基は、リン酸基の１個以上の酸素を水素または硫黄で置換することによって修飾される場合がある（ホスホロチオエート）。修飾は、機能の改善、例えば、安定性若しくは透過率の改善、または局在化若しくは標的化に有用である。
【００５５】
配列番号１の部分に相補的でないアンチセンスｓｉＲＮＡの領域が存在する場合もある。非相補性領域は、相補性領域の３’末端、５’末端、またはその両末端に見られる場合がある。
【００５６】
干渉ＲＮＡは、合成により生成され、例えば、インビトロ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットにより生成される場合がある。トランスフェクトされたｓｉＲＮＡとして良好に機能する干渉ＲＮＡは、インビボで発現されたｓｉＲＮＡとしても良好に機能する。
【００５７】
干渉ＲＮＡは、保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイドおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成され、例えば、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（米国テキサス州オースチン）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールスバッド）、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（米国コロラド州ラファイエット）のような民間の供給業者から得る場合がある。干渉ＲＮＡは、例えば、溶媒または樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせにより精製される。或いは、干渉ＲＮＡは、試料の処理に起因する損失を回避するために、殆ど精製せずに使用される場合がある。
【００５８】
干渉ＲＮＡは、当業者に既知のＵ６若しくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、またはＳＰ６、Ｔ３若しくはＴ７プロモーターのような構成的または誘導的プロモーターを使用した、組み換えプラスミドからの発現により、対象に提供される場合がある。例えば、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）製のｐｓｉＲＮＡＴＭは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターによる細胞内のｓｉＲＮＡの生成を可能にする。組み換えプラスミドから発現された干渉ＲＮＡは、標準的な技法によって単離される場合がある。
【００５９】
干渉ＲＮＡの発現に使用するウイルスベクターは、例えば、上に記載したプラスミド用のプロモーターを使用して、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクチニアウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等から誘導される場合がある。ウイルスベクターの選択、ベクターによる干渉ＲＮＡの発現方法、およびウイルスベクターの送達方法は、当業者の技能の範囲内に含まれる。
【００６０】
干渉ＲＮＡの発現は又、ＰＣＲによるヒトＨ１、ヒトＵ６またはマウスＵ６プロモーターを用いた発現カセットによるＳＩＬＥＮＣＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ［米国テキサス州オースティン］）（ＳＥＣ）を使用することによってももたらされる。サイレンサー発現カセットは、ヘアピンｓｉＲＮＡテンプレートをフランキングするプロモーターおよびターミネイター配列を含むＰＣＲ生成物である。細胞へトランスフェクションすると、ヘアピンｓｉＲＮＡは、ＰＣＲ生成物から発現され、特異的サイレンシングを誘導する。
【００６１】
生理学的条件下でのハイブリダイゼーション：「ハイブリダイゼーション」とは、一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が相補的またはほぼ相補的な塩基配列と相互作用して、ハイブリッドと呼ばれる水素結合複合体が一本鎖核酸により形成されるようにする技法を意味する。ハイブリダイゼーション反応は敏感で選択的であるため、対象となる特定の配列は低濃度で存在する試料中でも同定される。ハイブリダイゼーションの特異性（即ち、厳密性）は、例えば、インビトロでのプレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液における塩またはホルムアミドの濃度、並びにハイブリダイゼーション温度により制御され、当該技術においてもよく知られている。特に、厳密性は、塩の濃度を減衰させる、ホルムアミドの濃度を増大させる、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増加する。
【００６２】
例えば、厳密性の高い条件は、約５０％のホルムアミドにおいて３７℃〜４２℃の温度で生じることができる。厳密性の低い条件は、約３５％〜２５％のホルムアミドにおいて３０℃〜３５℃で生じることができる。ハイブリダイゼーションの厳密性の条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙに示されている。厳密なハイブリダイゼーション条件の更なる例には、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間保持後、洗浄；または１ＸＳＳＣ中７０℃若しくは１ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション後、０．３ＸＳＳＣ中７０℃で洗浄；または４ＸＳＳＣ中７０℃、若しくは４ＸＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション後、１ＸＳＳＣ中６７℃で洗浄という条件が含まれる。ハイブリダイゼーションの温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低い。ここでＴｍは、長さ１９〜４９塩基対のハイブリッドの場合、以下の計算式を使用して求められ：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）；式中、Ｎは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝剤中のナトリウムイオンの濃度である。
【００６３】
本発明の実施形態において、高厳密性条件下でインビトロにおいてＳＡＡ  ｍＲＮＡによりハイブリダイズする干渉ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下でインビボにおいて特異的に結合する。高厳密性条件下で核酸とハイブリダイズしない関連する核酸の同定および単離は、厳密性の低い条件下で実施される。
【００６４】
一本鎖干渉ＲＮＡ：上述の通り、干渉ＲＮＡは、最終的に一本鎖として機能する。ｓｓ
ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡよりも効能は低いものの、ｍＲＮＡサイレンシングを行うことが見出されている。従って、本発明の実施形態は又、一本鎖ｓｉＲＮＡが、生理学的条件下で、配列番号１、配列番号２または配列番号３の部分とハイブリダイズし、配列番号１、配列番号２または配列番号３のそれぞれのハイブリダイズする部分と少なくともほぼ完全に連続して相補性の少なくとも１９ヌクレオチドの領域を有する、ｓｓ  ｓｉＲＮＡの投与も定める。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、上述のｄｓ  ｓｉＲＮＡの場合と同様に、１９〜４９ヌクレオチドの長さを有する。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、５’リン酸を有するか、またはｉｎ  ｓｉｔｕ若しくはインビボにおいて５’位でリン酸化される。「５’リン酸化」という用語は、例えば、５’糖のＣ５ヒドロキシル（例えば、５’リボース若しくはデオキシリボース、またはそれらの類似体）にエステル結合を介して結合するリン酸基を有する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを記述するために使用される。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、一リン酸、二リン酸または三リン酸基を有する場合がある。
【００６５】
ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、ｄｓ  ｓｉＲＮＡの場合と同様に、化学的にまたはベクターを介して合成される。５’リン酸基がキナーゼによって添加される場合もあれば、５’リン酸がＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果として得られる場合もある。送達はｄｓ  ｓｉＲＮＡの場合と同様である。一実施形態において、保護末端およびヌクレアーゼ耐性修飾を有するｓｓ  ｓｉＲＮＡは、サイレンシングのために投与される。ｓｓ  ｓｉＲＮＡは、保存のために乾燥させる場合もあれば、水溶液に溶解させる場合もある。この溶液は、アニーリングを阻害するためまたは安定化させるために、緩衝剤または塩を含有する場合がある。
【００６６】
ヘアピン干渉ＲＮＡ：ヘアピン干渉ＲＮＡは、一本鎖であり、１本の鎖の中にセンスとアンチセンスの両方の配列を含有する。ＤＮＡベクターによる発現のため、センスｓｉＲＮＡ配列に対応する少なくとも１９ヌクレオチドの対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、短いスペーサーにより逆相補性アンチセンス配列と結合している。選択した発現ベクターに必要な場合は、３’末端Ｔおよびヌクレオチド形成制限部位を加える場合がある。得られたＲＮＡ転写物は、それ自体が折り畳んで、ステムループ構造を形成する。
【００６７】
投与様式：干渉ＲＮＡは、眼周囲、結膜、テノン下、前房内、硝子体内、網膜下、眼球後部、または小管内注入のような眼組織注入により；カテーテルまたはその他の留置デバイス、例えば網膜ペレット、眼内インサート、坐剤、または多孔性、非多孔性若しくはゼラチン状物質を含むインプラントを使用した眼への直接適用により；局所点眼剤または軟膏により；盲嚢中の、または強膜に隣接（経強膜的）若しくは眼の中に移植した徐放デバイスにより、眼に直接送達する場合がある。前房内注入は、作用物質が小柱網に到達するように、角膜を通して前眼房内に達成される場合がある。小管内注入は、シュレム管に排出する静脈収集チャンネルの中に、またはシュレム管の中に送達する場合がある。
【００６８】
対象：緑内障の治療を必要とするまたは緑内障を発症する危険性がある対象は、ＳＡＡの発現または活性に関連する緑内障、即ち、ＳＡＡ関連緑内障を有する、またはその病態を有する危険性があるヒトまたはその他の哺乳動物である。このような疾患に関連する眼の構造には、例えば、網膜、脈絡膜、水晶体、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経頭、強膜、眼房、ガラス体腔、毛様体が含まれる場合がある。
【００６９】
製剤および投与量：医薬製剤は、本発明の干渉ＲＮＡまたはその塩を、水、緩衝剤、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトール等のような生理学的に許容可能な眼用担体と混合して、９９重量％まで含有する。
【００７０】
本発明の干渉ＲＮＡは、液剤、懸濁剤または乳剤として投与される。以下は、本発明に包含される可能性ある配合の例である。
【００７１】
【表２】
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一般的に、本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの有効量は、眼部位におけるまたは該部位に隣接する、２００ｐＭ〜１００ｎＭ、または１ｎＭ〜５０ｎＭ、または５ｎＭ〜約２５ｎＭの細胞間濃度を含む。局所組成物は、熟練した臨床医の日常的な裁量に従って、１日１〜４回眼の表面に送達される。製剤のｐＨは、ｐＨ４〜９またはｐＨ４．５〜ｐＨ７．４である。
【００７２】
正確なレジメは臨床医の裁量に委ねられているが、干渉ＲＮＡは、１日１〜４回それぞれの眼に１滴点眼するか、または臨床医の指示に従って投与される場合がある。製剤の有効量は、例えば、対象の年齢、人種および性別、または緑内障の重篤度のような要因により異なる場合がある。一実施形態において、干渉ＲＮＡは眼に局所送達され、治療用量で小柱網、網膜または視神経頭に到達し、それによってＳＡＡ関連疾患過程を改善する。
【００７３】
許容可能な担体：眼に許容可能な担体は、多くても全くまたは殆ど眼に刺激を与えることがなく、必要に応じて適切な保存をもたらし、本発明の１つ以上の干渉ＲＮＡを同一投与で送達する担体を意味する。本発明の実施形態の干渉ＲＮＡの投与に許容可能な担体には、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国ウィスコンシン州マディソン］）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴＴＭ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ［米国イリノイ州シカゴ］）またはポリリジンのようなポリカチオン、リポソーム、またはコレステロールのような脂肪溶解剤が含まれる。リポソームは、標準的な小胞形成脂質およびコレステロールのようなステロールから形成され、これには、例えば内皮細胞表面抗原に対する結合親和性を有するモノクローナル抗体のような標的分子が含まれる場合がある。さらに、リポソームはペグ化リポソームとなる場合がある。
【００７４】
眼への送達では、干渉ＲＮＡは、眼科学的に許容可能な防腐剤、共溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、または水性で無菌の眼科用懸濁液若しくは溶液を形成する水と混合される場合がある。眼科用溶液製剤は、生理学的に許容可能な等張水性緩衝剤に抑制剤を溶解することによって調製される場合がある。さらに、眼科用溶液には、抑制剤の溶解を助ける眼科学的に許容可能な界面活性剤が含まれる場合がある。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のような粘度上昇剤を本発明の組成物に添加して、化合物の保持率を改善する場合もある。
【００７５】
眼科用無菌軟膏製剤を調製するには、干渉ＲＮＡを、鉱油、液状ラノリンまたは白色ワセリンのような適切なビヒクル中の防腐剤と混合させる。眼科用無菌ゲル製剤は、他の眼科用製剤の技術で既知の方法に従って、例えばＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＥ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ［米国ノースカロライナ州シャーロット］）等の組み合わせから調製した親水性基剤中に干渉ＲＮＡを懸濁することによって調製される場合がある。例えば、ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．［米国テキサス州フォートワース］）は眼内注入に使用される場合がある。本発明の他の製剤は、干渉ＲＮＡが眼にあまり浸透しない場合に、ｃｒｅｍｅｐｈｏｒおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ［米国ミズーリ州セントルイス］）のような浸透促進剤を含有する場合がある。
【００７６】
キット：本発明の実施形態は、細胞におけるＳＡＡ  ｍＲＮＡの発現を減衰させる試薬を含むキットを提供する。キットは、干渉ＲＮＡに対応する二つの相補性一本鎖ＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列にそれぞれ作動可能に結合する、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターのような二つの異なるプロモーターを有するＤＮＡテンプレートを含有する。ＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートから転写され、アニールされて、標的ｍＲＮＡの発現を減衰させるのに有効な二本鎖ＲＮＡを形成する。キットは場合により、ＤＮＡテンプレートからＤＮＡ配列を増幅する増幅プライマー、およびＲＮＡを合成するヌクレオチド三リン酸（即ち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）を含有する。場合により、キットは、それぞれ、ＤＮＡテンプレートのプロモーターに結合することができ、且つプロモーターが作動可能に結合するヌクレオチド配列を転写することができる、二つのＲＮＡポリメラーゼ、サイズ排除カラムのような、一本鎖ＲＮＡを精製する精製カラム、１つ以上の緩衝剤、例えば一本鎖ＲＮＡをアニーリングして二本鎖ＲＮＡを生じる緩衝剤、および二本鎖ＲＮＡを精製するＲＮＡｓｅ  ＡまたはＲＮＡｓｅ  Ｔを含有する。
【００７７】
例えば、ヒト小柱網（ＴＭ）細胞内で内因性ＳＡＡ発現のレベルをノックダウンするＳＡＡ干渉ＲＮＡの能力は、以下の通り実施する。ＧＴＭ３またはＨＴＭ−３（Ｐａｎｇ，Ｉ．Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３：５１−６３を参照）と呼ばれる形質転換ヒトＴＭ細胞系のトランスフェクションを、本明細書で引用されるＳＡＡ干渉ＲＮＡ（１００ｎＭ）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールスバッド］）の標準的なインビボ濃度を１：１（ｗ／ｖ）の比率で使用して達成する。スクランブルおよびラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を対照として使用する。
【００７８】
ＱＰＣＲ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）フォワードおよびリバースプライマー、並びに標的部位を包含するプローブセットを、ｍＲＮＡ切断の程度を評価するために使用する。このようなプライマー／プローブセットは、例えば、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［米国カリフォルニア州フォスターシティー］）によって合成される場合がある。
【００７９】
非特異的で標的を外す効果の機会を減らすために、ＳＡＡ  ｍＲＮＡの発現を阻害する可能な限り低いｓｉＲＮＡ濃度を、ｓｉＲＮＡについて判定する。ＳＡＡ  ｍＲＮＡノックダウンは、適切なプライマー／プローブセットを使用するＱＰＣＲ増幅により評価する。ＧＴＭ３細胞におけるＳＡＡ  ｓｉＲＮＡの用量反応を、例えば、０、１、３、１０、３０および１００ｎＭの用量範囲のｓｉＲＮＡにより２４時間治療を行った後、ＧＴＭ３細胞で観察する。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）を使用して、勾配変化、Ｓ字型用量反応アルゴリズム、および頂点拘束１００％によりフィッティングする。試験を行った特定のｓｉＲＮＡについてＩＣ５０を得る。
【００８０】
実施例１
小柱網細胞におけるＳＡＡをサイレンシングする干渉ＲＮＡ
本研究では、正常なおよび緑内障のヒト小柱網（ＴＭ）細胞における内因性ＳＡＡ発現のレベルをノックダウンするＳＡＡ干渉ＲＮＡの能力を試験する。
【００８１】
正常（ＮＴＭ７６５−０４−ＯＤ，ｐ５）および緑内障（ＧＴＭ６８６−０３−ＯＳ，ｐ６）ＴＭ細胞系のトランスフェクションを、ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ＳＡＡ干渉ＲＮＡプール（１００ｎＭ）およびＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）  ＃１トランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．［米国イリノイ州シカゴ］）の標準的なインビボ濃度を使用して実施した。ＳＭＡＲＴＰＯＯＬ（登録商標）  ＳＡＡ干渉ＲＮＡは、配列番号１１、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０の配列識別子を有するＳＡＡ  ｍＲＮＡ領域を標的にするように設計された、四つの相同的な二本鎖ｓｉＲＮＡのプールを含み、三つの異なる濃度（処理１：０．０５μｌ／１００μｌウェル；処理２：０．２μｌ／１００μｌウェル；処理３：０．４μｌ／１００μｌウェル）で２４または４８時間にわたり３回使用した。対照は処理しなかった。
【００８２】
ｍＲＮＡレベルに対する効果：ＳＡＡ  ｍＲＮＡのＱＰＣＲ解析では、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＴＭ  ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ［米国テキサス州オースティン］）を使用して２４時間処理した細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ［米国カリフォルニア州フォスターシティー］）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＱＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび７７００  ＳＤＳ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して３回実施した。マルチプレックスＱＰＣＲでは、リボソームＲＮＡ（１８ｓ  ｒＲＮＡ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を標準化対照として使用した。ＱＰＣＲ解析は、２組のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ／プライマーセット（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施し、第一のセット（Ｐ４２３）はＳＡＡ  ｃＤＮＡ配列のコード領域を標的にし、第二のセット（Ｐ４２８）は非コード領域を標的にする。
【００８３】
図１に示す通り、Ｐ４２３プライマーセットを使用した処理３の条件下でｓｉＲＮＡ処理したＮＴＭ７６５−０４正常細胞には、１８ｓ  ｒＲＮＡと比べて約３５％のＳＡＡ  ｍＲＮＡの阻害が認められた。図２に示す通り、Ｐ４２３プライマーセットを使用した処理３の条件下でｓｉＲＮＡ処理したＧＴＭ６８６−０３緑内障細胞には、１８ｓ  ｒＲＮＡと比べて約４１％のＳＡＡ  ｍＲＮＡの阻害が認められた。同様の結果はプライマーセットＰ４２８を使用しても得られた。
【００８４】
ＳＡＡタンパク質レベルに対する効果：４８時間処理した細胞から調製した細胞可溶化物中の内因性ＳＡＡタンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して調べた。
【００８５】
処理１、処理２および処理３のｓｉＲＮＡ処理したＧＴＭ６８６緑内障細胞全てでは、約６６％のＳＡＡタンパク質の減少が認められたが（図５）、ＮＴＭ６７５細胞では認められなかった（図４）。内因性ＳＡＡタンパク質レベルは、何れの小柱網細胞系でも極めて低く、特にＮＴＭ７６５正常細胞で低かった。
【００８６】
細胞増殖および形態に対する効果：ＴＭ細胞形態に対するＳＡＡ  ｓｉＲＮＡの効果を、リアルタイム電子検出システム（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ、ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）により監視した。図３に示す通り、ｓｉＲＮＡ処理より、ＴＭ細胞の増殖または形態に対する毒性作用は認められなかった。
【００８７】
本明細書に引用する参考文献は、これらが本明細書の記載内容の補足となる例示的な手順またはその他の詳細を示す限りにおいて、参考として明確に組み入れられる。
【００８８】
本発明の開示内容に照らして、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される実施形態の明白な変更を行えることを理解する。本明細書に開示される全ての実施形態は、本発明の開示内容に照らして、過度の実験を行うことなく実行および実施することができる。本発明の全ての範囲は、本開示内容およびその同等の実施形態に記載されている。本明細書は、本発明が権利を受ける保護の全範囲を過度に狭めるものとして解釈されるべきではない。
【００８９】
本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、特に指示がない限り、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つ以上」の意味をとる。
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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