(57)【要約】【課題】  蛋白質を効率的に容器に固相化する培養容器の製造方法、及びこれを行うための固相化装置を提供する。【解決手段】  蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、培養容器に、蛋白質の溶解している液滴を注入し、液滴を、培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、
前記培養容器に、前記蛋白質の溶解している液滴を注入し、
前記液滴を、前記培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる
ことを特徴とする培養容器の製造方法。
【請求項２】
軟包材から形成された前記培養容器に、気体を封入する工程と、
気体が封入された前記培養容器に、前記蛋白質の溶解している液滴を注入する工程と、
前記液滴を、前記培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる工程と、を有する
ことを特徴とする請求項１記載の培養容器の製造方法。
【請求項３】
前記液滴を移動させる領域が、前記培養容器の内面における対向する容器壁の片方のみであることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器の製造方法。
【請求項４】
前記気体を、前記培養容器内の底面積１ｃｍ２当たり０．１〜４ｍｌの範囲で、前記培養容器に封入することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
【請求項５】
前記蛋白質が、抗体又は細胞接着性タンパクであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養容器の製造方法。
【請求項６】
前記抗体が抗ＣＤ３抗体であることを特徴とする請求項５記載の培養容器の製造方法。
【請求項７】
前記細胞接着性タンパクがフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の培養容器の製造方法。
【請求項８】
蛋白質を培養容器の内面に固相化する固相化装置であって、
前記蛋白質の溶解している液滴、及び、培養容器を載置する積載台と、
前記積載台を動かして、前記培養容器内の前記液滴を、前記培養容器の内面上で移動させる駆動手段と、を備えたことを特徴とする固相化装置。
【請求項９】
前記駆動手段として、
前記積載台を、短手方向を中心軸として回転運動させ、前記液滴を、前記培養容器の内面上で、長手方向に移動させる長手方向移動用駆動手段と、
前記積載台を、長手方向を中心軸として回転運動させ、前記液滴を、前記培養容器の内面上で、短手方向に移動させる短手方向移動用駆動手段と、を備えた
ことを特徴とする請求項８記載の固相化装置。
【請求項１０】
前記培養容器の底面が半円筒形状を形成するように前記培養容器を保持するための、半円筒形状の凹部を有する保持部材を備え、前記保持部材が、前記積載台に固定され、又は、前記積載台と一体に形成されたことを特徴とする請求項８又は９記載の固相化装置。
【請求項１１】
前記保持部材の半円筒形状の中心軸の方向が、前記積載台の長手方向と同じ方向になるように、前記保持部材が前記積載台に固定され、又は、前記保持部材が前記積載台と一体に形成されたことを特徴とする請求項１０記載の固相化装置。
【請求項１２】
前記保持部材が、前記培養容器の底面が半円筒形状を形成するように前記培養容器を押圧するための押圧部を備えたことを特徴とする請求項１０又は１１記載の固相化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養技術に関し、特に蛋白質を固相化した培養容器の製造方法、及び固相化装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、ガス透過性フィルムからなる培養バッグに細胞と培養液を封入して、細胞を閉鎖系で大量培養することが行われている。
【０００３】
ところで、リンパ球を増殖させるためには、最初にリンパ球を活性化させる必要がある。リンパ球の活性化は、一般的に抗ＣＤ３抗体を用いて行われる。すなわち、抗ＣＤ３抗体が固相化された容器内でリンパ球の活性化が行われ、その後、抗ＣＤ３抗体が固相化されていない培養バッグに、活性化したリンパ球を封入して、リンパ球の増殖が行われていた。
このため、リンパ球の活性化に先立って、リンパ球の活性化のために用いる容器内に、抗ＣＤ３抗体を固相化（コーティング）する必要があった。
【０００４】
従来の固相化の方法としては、一般的に、フラスコ内の底面を、抗ＣＤ３抗体を含む溶液に浸して静置した後、その溶液を除去することにより、抗ＣＤ３抗体の固相化が行われていた。
具体的には、例えば特許文献１には、抗ＣＤ３抗体をフラスコ内の底面に均一に浸し、一晩冷蔵庫で保存後、抗ＣＤ３抗体を抜き取って、抗体固相化フラスコを調製することが記載されている（段落００３５〜００３６，図１）。
また、特許文献２には、抗ＣＤ３抗体を溶解した溶解液を容器の収容部に封入し、所定時間静置することで、抗ＣＤ３抗体を容器のフィルム表面に固相化することが記載されている（段落００１５，図１）。
【０００５】
【特許文献１】特許第４３９９７１０号公報
【特許文献２】特開２００７−１７５０２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これら従来の方法では、抗体を十分に固相化させるのに、長い静止時間を要するという問題があった。
また、従来の方法では、大半の抗体が容器内に吸着せずに溶液中に残存するため、固相化量に比べて多量の抗体を使用しなければならないという問題があった。例えば、後述するように、従来の方法により抗体を封入した容器を１時間静止した場合、容器内に吸着する抗体は、１０％程度であり、残りの約９０％が、容器に固相化されることなく廃棄されてしまうという問題があった。
【０００７】
ここで、抗体などの蛋白質は熱に弱く、高温で吸着させるとその機能が失われるため、容器に固相化することが難しい材料である。一方、少量の蛋白質を用いて、短時間で必要量の固相化を実現することが望ましい。また、抗体は一般に高価であることから、無駄に廃棄される量を低減させることが望ましい。
【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、容器内に蛋白質溶液の液滴を気体と共に封入し、この液滴を容器内面上で移動させることで、液滴の気液界面に集中する蛋白質分子が効率的に容器に吸着することを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、蛋白質を容器内面に固相化するにあたり、蛋白質溶液の液滴を、気体と共に容器内に封入し、該液滴を容器内面上で移動させることで、蛋白質を効率的に容器に固相化する培養容器の製造方法、及びこれを行うための固相化装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の培養容器の製造方法は、蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、前記培養容器に、前記蛋白質の溶解している液滴を注入し、前記液滴を、前記培養容器の内面上の一部又は全部に移動させる方法としてある。
また、本発明の固相化装置は、蛋白質を培養容器の内面に固相化する固相化装置であって、蛋白質の溶解している液滴、及び、培養容器を載置する積載台と、積載台を動かして、培養容器内の液滴を、培養容器の内面上で移動させる駆動手段と、を備えた構成としてある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、蛋白質を効率的に容器に固相化する培養容器の製造方法、及びこれを行うための固相化装置を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係る培養容器の製造方法における固相化の原理を説明するための図である。
【図２】本発明の実施形態に係る培養容器の製造方法により得られる抗体固相化培養バッグを示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る固相化装置を示す図（平面図）である。
【図４】本発明の実施形態に係る固相化装置を示す図（正面図）である。
【図５】本発明の実施形態に係る固相化装置による固相化の様子を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る固相化装置における保持手段を示す図（正面図及び側面図）である。
【図７】本発明の実施形態に係る固相化装置における保持手段の使用形態を示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係る培養容器（抗体固相化培養バッグ）の製造方法の実施例及び比較例を表す模式図である。
【図９】本発明の実施形態に係る培養容器（抗体固相化培養バッグ）の製造方法の実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る培養容器（抗体固相化フラスコ）の製造方法の実施例及び比較例を表す模式図である。
【図１１】本発明の実施形態に係る培養容器（抗体固相化フラスコ）の製造方法の実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。
【図１２】本発明の実施形態に係る培養容器（フィブロネクチン固相化培養バッグ）の製造方法の実施例及び比較例を表す模式図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る培養容器（フィブロネクチン固相化培養バッグ）の製造方法の実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の培養容器の製造方法、及び固相化装置の一実施形態について、詳細に説明する。
【００１３】
［培養容器の製造方法］
本実施形態の培養容器の製造方法は、蛋白質が固相化された培養容器の製造方法であって、培養容器に、蛋白質の溶解している液滴（ドロップ）を注入し、液滴を、培養容器の内面上の一部又は全部に移動させることを特徴とする。
最初に、本実施形態の培養容器の製造方法における、培養容器の内面に蛋白質を効率的に固相化させることを可能にする原理について、図１を参照して説明する。
【００１４】
蛋白質の溶解している溶液を静置させると、蛋白質は、その溶液の気液界面に吸着するという性質を有している（BUNSEKI  KAGAKU  Vol.59,No.6.pp.437-445(2010)）。そこで、本実施形態の培養容器の製造方法では、蛋白質の溶解している液滴を基材上で移動させ、気液界面に集中する蛋白質分子を積極的に基材に接触させている。
このように、液滴を容器内で転がして、容器内において気液界面を移動させることで、気・液・材の境界線上で、蛋白質が基材に吸着する。蛋白質が基材に吸着すると、新たに生じた気液界面に、液滴中の蛋白質が吸着する。そして、液滴が容器内面上で移動すると、蛋白質濃度の高い気液界面と、容器内面との接触によって、蛋白質が高確率で容器内面に吸着する。
これによって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、蛋白質を容器内面に効率的に固相化することが可能になっている。
また、例えば容器の底面のみに蛋白質を固相化させる場合には、容器の上面への蛋白質の吸着による蛋白質のロスを防止することも可能となる。
【００１５】
本実施形態において、培養容器は、細胞培養において用いられる容器全般を意味し、細胞の活性化、及び／又は、細胞の増殖に用いられる容器を含む。
本実施形態における培養容器の形態は、特に限定されず、軟包材からなる袋状の培養バッグや、ガラスやポリスチレン製のフラスコなどを好適に用いることができる。
例えば、容器内面に対向する容器壁を有する培養バッグを好適に用いることができ、この培養バッグの内面の片方又は両方の面における一部又は全部に蛋白質を固相化させて、本実施形態における培養容器を製造することができる。
【００１６】
具体的には、図２に示すように、培養バッグ１０における対向する内面の一方を、蛋白質２０を固相化した固相化面１１（図２（ｂ）の容器内底面）とし、培養バッグ内面のもう一方を、蛋白質２０を固相化していない非固相化面１２（図２（ｂ）の容器内上面）とすることができる。
なお、培養バッグ１０には、チューブ１３が備えられ、このチューブ１３を介して、培養バッグ１０内に蛋白質の溶解している液滴と気体を導入したり、あるいは除去したりすることができる。同図の例では、チューブ１３は、培養バッグ１０に２本備えられているが、１本又は３本以上備えられていても良い。
【００１７】
また、培養バッグ１０は、細胞培養に必要なガス透過性を有するフィルムを用いて形成することが好ましい。このような培養バッグ１０の材料として、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂を好適に用いることができる。
【００１８】
本実施形態において、培養バッグ１０に固相化する蛋白質２０としては、特に限定されず、例えば抗ＣＤ３抗体などの抗体や、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどの細胞接着性タンパクを用いることができる。抗ＣＤ３抗体は、リンパ球を活性化させるために好適に用いられる。また、細胞接着性タンパクは、培養基材上に接着性細胞を効率良く接着させるために好適に用いられる。
蛋白質２０として抗ＣＤ３抗体を固相化する場合、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度は、１０〜３００ｎｇ／ｃｍ２とすることが好ましい。抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度を１０ｎｇ／ｃｍ２以上とすれば、リンパ球を効果的に活性化させることができ、その後にリンパ球を効率的に増殖させることが可能になるためである。一方、抗ＣＤ３抗体の固相化の濃度が３００ｎｇ／ｃｍ２を超えると、培養バッグ１０内の培養液中に抗ＣＤ３抗体が浮遊して、リンパ球に過剰な刺激を与える場合があるため、好ましくない。
【００１９】
本実施形態における蛋白質を溶解させる液滴としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液を好適に用いることができる。
また、本実施形態における蛋白質の溶解している液滴の大きさ（液滴量）を、１ｃｃ〜２０ｃｃとすることが好ましい。培養バッグ１０の内面を液滴が移動するときに、液滴と内面との間に摩擦力が働くため、液滴の大きさが小さすぎると、適切に移動できないためである。また、液滴が大きすぎると、液滴中の蛋白質濃度が低下し、また液滴の体積当たりの気液界面の面積が減少するため、吸着効率が低下する。このような観点から、液滴の大きさを、１ｃｃ〜１０ｃｃとすることがより好ましく、１ｃｃ〜５ｃｃとすることがさらに好ましく、２ｃｃ前後とすることが一層好ましい。
【００２０】
本実施形態において、培養バッグ１０に封入する気体としては、特に限定されないが、不活性ガスとすることが好ましく、空気や窒素ガス等を用いることができる。このような気体を、例えば気体供給装置により、チューブ１３を介して培養容器１０に注入することができる。
また、培養バッグ１０に封入する気体の量は、培養容器１０内の底面積１ｃｍ２当たり０．１〜４ｍｌとすることがより好ましく、１〜３ｍｌとすることが一層好ましい。封入する気体の量をこのような範囲にすれば、培養バッグ１０の内面における対向する容器壁が接触することを防止できるため、培養バッグ１０内で、蛋白質２０の溶解している液滴を、効率的に移動させることが可能である。
【００２１】
培養バッグ１０は、例えば以下のように製造することができる。
まず、プラスチック押出成形装置を用いて低密度ポリエチレンを押出成形し、フィルムを形成する。そして、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから培養バッグ１０を製造する。培養バッグ１０は、図２に示すように、チューブ１３を取り付けて製造される。
次に、培養バッグ１０を積載台に載置して、所定の量の気体を封入すると共に、蛋白質２０を溶解した緩衝液を続けて封入する。そして、培養バッグ１０を揺動することなどによって、培養バッグ１０内の底面上で緩衝液の液滴を移動させる。これにより、緩衝液に含まれる蛋白質２０を、培養バッグ１０内の底面上に付着させて、蛋白質２０が固相化された培養バッグ１０を得ることができる。
【００２２】
［固相化装置］
次に、本実施形態の培養容器の製造方法において好適に用いることができる本実施形態の固相化装置、及びこの固相化装置において用いられる保持部材について、図３〜図７を参照して説明する。図３は、固相化装置の平面図を示し、図４は、同正面図を示している。図５は、固相化装置による固相化の様子を示している。図６は、保持手段の正面図及び側面図を示し、図７は、保持手段の使用形態を示している。
【００２３】
図３において、下側が固相化装置３０の正面側を、上側が固相化装置３０の背面側を、左側が固相化装置３０の左側を、右側が固相化装置３０の右側を、それぞれ示している。また、同図において、左右方向（後述する積載台の長手方向）をＸ軸方向、上下方向（同積載台の短手方向）をＹ軸方向としている。
固相化装置３０は、Ｘ軸方向移動用支持台３１と、Ｙ軸方向移動用支持台３６とを備えている。培養バッグ１０は、蛋白質の溶解している液滴、及び、所定量の気体を封入して、Ｙ軸方向移動用支持台３６に載置される。これらＸ軸方向移動用支持台３１とＹ軸方向移動用支持台３６とは、一体的に運動する。以下、Ｘ軸方向移動用支持台３１とＹ軸方向移動用支持台３６とを総称して積載台と称する場合がある。
【００２４】
Ｘ軸方向移動用支持台３１は、基台４０に固定されて立設する二つの支持柱３２により、長手方向の中央において正面側及び背面側の両側で支持されている。
また、Ｘ軸方向移動用支持台３１は、Ｘ軸方向移動用ギアボックス３４を介して、Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３（長手方向移動用駆動手段）に接続されている。
このＸ軸方向移動用サーボモータ３３を駆動することで、Ｘ軸方向移動用支持台３１は、Ｙ軸方向を中心軸として左回り及び右回りに交互に回転運動を行うことができる。これにより、Ｘ軸方向移動用支持台３１は、左右にいわゆるシーソー運動を行うことができる。
したがって、積載台に載置された培養バッグ１０内の蛋白質の溶解している液滴は、培養バッグ１０内を左端から右端まで左右に往復運動することができる。
【００２５】
このとき、Ｘ軸方向移動用支持台３１の回転運動の角度は、水平方向に対して、例えば−１０°〜＋１０°の範囲とすることができる。なお、図３，４において、左側が高くなる場合をマイナス（−）、右側が高くなる場合をプラス（＋）とする。
また、Ｘ軸方向移動用支持台３１の回転運動の速度は、培養バッグ１０内の蛋白質の溶解している液滴が、例えば５ｍ／分〜１５ｍ／分の速度で、培養バッグ１０内を移動する速度とすることができる。
【００２６】
Ｙ軸原点リミット検出センサ３５は、Ｙ軸の原点及びリミットを検出するために用いられる。
【００２７】
Ｙ軸方向移動用支持台３６は、Ｘ軸方向移動用支持台３１の左右端部に立設する二つの支持部により、短手方向の中央において左側及び右側の両側で支持されている。
また、Ｙ軸方向移動用支持台３６は、Ｙ軸方向移動用ギアボックス３８を介して、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７（短手方向移動用駆動手段）に接続されている。
このＹ軸方向移動用サーボモータ３７を駆動することで、Ｙ軸方向移動用支持台３６は、Ｘ軸方向移動用支持台３１と共に、Ｘ軸方向を中心軸として左回り及び右回りに交互に回転運動を行うことができる。これにより、積載台は、左右に（図３では上下に）いわゆるシーソー運動を行うことができる。
したがって、積載台に載置された培養バッグ１０内の蛋白質の溶解している液滴は、培養バッグ１０内を下端から上端まで移動することができる。
【００２８】
このとき、Ｙ軸方向移動用支持台３６の回転運動の角度は、水平方向に対して、例えば−５０°〜＋５０°の範囲とすることができる。なお、図３において、正面側が高くなる場合をマイナス（−）、背面側が高くなる場合をプラス（＋）とする。
また、Ｙ軸方向への液滴の移動は、液滴の大きさ以下の距離ずつ行うことが望ましい。このように液滴をＹ軸方向に移動させ、かつＸ軸方向に培養バッグ１０内を左端から右端まで移動させることで、液滴を培養バッグ１０内の底面全体に移動でき、液滴に含まれる蛋白質を培養バッグ１０に効率的に吸着させることが可能となる。
【００２９】
Ｘ軸原点リミット検出センサ３９は、Ｘ軸の原点及びリミットを検出するために用いられる。
【００３０】
次に、本実施形態の固相化装置３０を用いた培養バッグ１０の製造方法について説明する。
まず、培養バッグ１０を積載台に載置して、所定量の空気を封入し、続いて蛋白質の溶解している液滴を注入する。次いで、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７を駆動させて、図５に示すように、積載台をＸ軸方向を中心軸として、正面側に回転移動させ、液滴を培養バッグ１０内の正面側端部に移動させる。
次に、Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３を駆動させて、積載台をＹ軸方向を中心軸として左右に回転運動させて、液滴を培養バッグ１０内において、左端及び右端間で左右に移動させる。
【００３１】
次に、Ｙ軸方向移動用サーボモータ３７を駆動させて、積載台を背面側にわずかに回転移動させて、液滴を背面側に向けて少し移動させ、次いで、再度Ｘ軸方向移動用サーボモータ３３を駆動させて、積載台を左右に回転運動させて、液滴を培養バッグ１０内において、左端及び右端間で左右に移動させる。以上の動作を、液滴が培養バッグ１０内の背面側端部に移動して、左端及び右端間で左右に移動するまで繰り返し行う。
【００３２】
このように、固相化装置３０を用いて、培養バッグ１０内に蛋白質を吸着させることによって、蛋白質の固相化の効率を一層高めることが可能となる。
なお、本実施形態の固相化装置３０は、培養バッグ１０のみならず、フラスコやその他の容器に蛋白質を固相化する場合にも好適に用いることが可能である。
【００３３】
次に、本実施形態の固相化装置において用いられる保持部材について説明する。
保持部材は、培養容器の底面が半円筒形状を形成するように培養容器を保持するための部材であり、積載台に固定され、又は、積載台と一体に形成される。
図６に示すように、保持部材５０は、本体部５１、上蓋部５２、及び押圧部５３を備えている。
本体部５１は、培養バッグ１０を湾曲させて保持するための半円筒形状の凹部５１−１を備えている。この凹部５１−１を覆って上蓋部５２が本体部５１に取り付けられる。本体部５１への上蓋部５２の取り付け方法は特に限定されず、例えばネジ止めを行うことができる。
【００３４】
上蓋部５２には、培養バッグ１０を外面から押圧するための押圧部５３が取り付けられている。この押圧部５３を下方に移動させることで、本体部５１の凹部５１−１に配置された培養バッグ１０を押圧し、培養バッグ１０の底面を半円筒形状に安定させることができる。
上蓋部５２への押圧部５３の取り付けは、押圧部５３を下方に移動させて、培養バッグ１０を押圧できれば特に限定されないが、例えば上蓋部５２と押圧部５３とをネジ係合させて行うことができる。
【００３５】
また、押圧部５３の形状は、図６に示すような棒状に限定されず、その他の形状にしてもよい。例えば、押圧部５３の下方先端部を枝分かれさせたり、あるいは下方を曲面とする半球状にしたりすることにより、培養バッグ１０の底面を一層安定して半円筒形状に維持することも好ましい。
また、図６では、上蓋部５２に３個の押圧部５３を取り付けた状態を示しているが、押圧部５３の取り付け個数は特に限定されず、１，２個、又は４個以上であっても良い。
【００３６】
図７は、保持部材５０の使用形態を示しており、保持部材５０に培養バッグ１０を保持させる様子を表している。
まず、保持部材５０の本体部５１の凹部５１−１に培養バッグ１０を配置する（図７(a)(b)）。このとき、培養バッグ１０の底面が、凹部５１−１に沿って、曲面をなすように配置させる。
次に、本体部５１に上蓋部５２を取り付け、押圧部５３を下方に移動させる（図７(c)(d)）。これによって、培養バッグ１０の底面を半円筒形状に維持することができる。
【００３７】
保持部材５０は、凹部５１−１の半円筒形状の中心軸の方向が、積載台の長手方向と同じ方向になるように、固相化装置３０の積載台に固定して用いられる。また、保持部材５０を、このような位置関係で積載台と一体的に形成してもよい。
このような保持部材５０に、培養バッグ１０の底面を半円筒形状に維持して保持させ、培養バッグ１０内における液滴をＹ軸方向に移動させると、液滴は、常に保持部材５０における凹部５１−１の最下部に位置するため、液滴のＹ軸方向の移動を精密に制御することが可能となる。
【００３８】
以上説明したように、本発明の培養容器の製造方法によれば、蛋白質を培養容器内面に効率的に固相化することができ、固相化に要する時間を短縮できると共に、培養容器への吸着率を向上でき、少量の蛋白質で必要量の固相化を行うことが可能となる。このため、固相化されずに廃棄される蛋白質量を低減することが可能となる。また、本実施形態の固相化装置を用いることで、蛋白質の固相化の効率をより一層高めることが可能である。さらに、保持部材を用いることで、液滴の移動をより精密に制御でき、蛋白質の固相化の効率をさらに一層高めることが可能となる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の実施形態に係る培養容器の製造方法の実施例及び比較例について、図８〜図１３を参照して説明する。図８，１０，１２は、実施例及び比較例を表す模式図であり、図９，１１，１３は、実施例及び比較例の実験結果のグラフを示す図である。
【００４０】
［実験１：抗体固相化培養バッグの製造］
（実施例１）
プラスチック押出成形装置としてラボプラストミル（株式会社東洋精機製作所製）を用いて、低密度ポリエチレンを押出成形し、厚み１００μｍのフィルムを成形した。次いで、インパルスシーラーを用いて、このフィルムから１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。このバッグをγ線滅菌して実験に供した。
【００４１】
次に、このバッグを積載台に載置して、空気約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。このとき、このリン酸緩衝液の液滴が、バッグ内面の底面のみに接触するようにして行った。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上で移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させて、抗体固相化培養バッグを製造した。
【００４２】
固相化濃度の測定は、以下のように行った。
まず、培養容器内の液滴を除去し、固相化面に１％ドデシル硫酸ナトリウム（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社製）を含むリン酸緩衝液（同上）５００μlを接触させ、３０分間静置させた後、プレゼントミキサー（タイテック株式会社製）にて強い振動を当て、吸着した抗体を剥離した。剥離液中の抗体量をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定し、固相化面積で割ることで単位面積当たりの蛋白質吸着量（以下、吸着濃度という）を算出した。
【００４３】
実施例１の培養容器は、その内側の片面（底面）のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。実施例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、４１．５ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４４】
（実施例２）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、手作業によりバッグを２．５分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させた。次いで、バッグを上下に反転させ、再度手作業によりバッグを２．５分間揺動して、上記液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面（上下反転前の上面）上を移動させた。これにより、バッグ内壁の両面に抗体を吸着させて、抗体固相化培養バッグを製造した。
【００４５】
実施例２の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。実施例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、３１．２ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４６】
（比較例１）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、このリン酸緩衝液をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、抗体固相化培養バッグを製造した。
【００４７】
比較例１の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。比較例１の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、２６．１ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００４８】
（比較例２）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で封入した。そして、手作業によりバッグを５分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内を移動させて、バッグの内面に抗体を吸着させた。さらに、リン酸緩衝液１０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、抗体固相化培養バッグを製造した。
【００４９】
比較例２の培養容器は、その内側の両面に抗ＣＤ３抗体が固相化されている。比較例２の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、２３．８ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００５０】
図９に示すように、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２の培養容器底面への面積当たりの抗体の吸着効率（吸着濃度×２２５ｃｍ２／５００００ｎｇ×１００）は、それぞれ１９％、１４％、１２％、１１％であった。
すなわち、実施例１の方法によれば、固相化時間が１分間であるにも拘わらず、固相化時間６０分間の比較例１の結果に比べて、６０％程度吸着効率が大きくなっている。
一方、培養容器に気体を封入することなく液滴を移動させて固相化を行った比較例２では、比較例１の結果に比べて、吸着効率が小さかった。
【００５１】
また、実施例２の吸着効率が、実施例１の吸着効率より小さいのは、実施例２の吸着面積が、実施例１の吸着面積に比べて、２倍になっているためと考えられる。
さらに、実施例２と比較例２の結果を比べると、培養容器に気体を入れた上で、液滴を移動させて固相化を行うことにより、吸着効率を３０％程度向上できていることが分かる。
このように、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、従来よりも短時間で、より多くの抗体を培養容器に固相化することが可能になっている。また、従来よりも少量の抗体を用いて、より多くの抗体を培養容器に固相化することも可能になっている。
【００５２】
［実験２：抗体固相化フラスコの製造］
（実施例３）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で封入した。手作業によりフラスコを５分間２６℃の条件で揺動し、リン酸緩衝液の液滴を１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させて、フラスコ内の底面に抗体を吸着させ、抗体固相化フラスコを製造した。実施例３の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２７．９ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００５３】
（比較例３）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを入れ、底面全体に抗体溶液を行き渡らせて、２６℃で６０分間静置した。これによって、フラスコの底面に抗体を吸着させて、抗体固相化フラスコを製造した。比較例３の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２７．６ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００５４】
（比較例４）
浮遊培養用フラスコ８００（住友ベークライト，ポリスチレン製，底面積２２５ｃｍ２）に、５０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを入れ、底面全体に抗体溶液を行き渡らせて、２６℃で５分間静置した。これによって、フラスコの底面に抗体を吸着させて、抗体固相化フラスコを製造した。比較例４の抗体固相化フラスコの抗ＣＤ３抗体の濃度は、２１．８ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００５５】
図１１に示すように、実施例３、比較例３、及び比較例４のフラスコの面積当たりの抗体の吸着効率は、それぞれ１３％、１２％、１０％であった。
すなわち、比較例３に示されるように、従来の静置による抗体の固相化方法では、固相化時間６０分間で吸着効率が１２％であるのに対して、実施例３に示されるように、本実施形態の培養容器の製造方法では、固相化時間５分間で吸着効率を１３％にすることができている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、フラスコに蛋白質を固相化する場合でも、従来法より短時間で同等量の蛋白質を固相化できることが明らかとなった。
【００５６】
［実験３：フィブロネクチン固相化培養バッグの製造］
（実施例４）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を約６００ｍｌ封入すると共に、５０μgのヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、手作業によりバッグを１分間２６℃の条件で揺動して、リン酸緩衝液の液滴を、１０ｍ／分の速度でバッグ内の底面上を移動させ、バッグ内の底面に抗体を吸着させて、フィブロネクチン固相化培養バッグを製造した。
実施例４の培養容器は、その内側の片面（底面）のみにフィブロネクチンが固相化されている。実施例４の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、フィブロネクチンの吸着濃度は、５３．６ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００５７】
（比較例５）
実施例１と同様にして、１１ｃｍ×２２．５ｃｍ（約２２５ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグに空気を封入することなく、５０μgのヒト血漿由来フィブロネクチン（シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）１０ｍｌを封入し、リン酸緩衝液の液滴をバッグ内の上下両面に接触させて、２６℃で６０分間静置した。そして、リン酸緩衝液４０ｍｌで３回バッグ内の洗浄を行い、フィブロネクチン固相化培養バッグを製造した。
比較例５の培養容器は、その内側の両面にフィブロネクチンが固相化されている。比較例５の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、フィブロネクチンの吸着濃度は、３０．７ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００５８】
図１３に示すように、実施例４、及び比較例５の培養容器の面積当たりの抗体の吸着効率は、それぞれ２４％、１４％であった。
すなわち、蛋白質としてフィブロネクチンを用いた場合、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、従来法よりも７０％以上の吸着効率で、フィブロネクチンを培養容器に固相化することができている。
したがって、本実施形態の培養容器の製造方法によれば、抗体以外の蛋白質でも短時間で効率良く培養容器に固相化できることが明らかとなった。
【００５９】
［実験４：固相化装置を用いた抗体固相化培養バッグの製造］
（実施例５）
実施例１と同様にして、８ｃｍ×２０ｃｍ（約１６０ｃｍ２）のバッグを作製した。
次に、このバッグを固相化装置における保持部材に載置して、押圧部を用いて、底面が半円筒状になるように固定した。次いで、空気を約２８０ｍｌ封入すると共に、１０μgの抗ＣＤ３抗体（ミルテニーバイオテク株式会社製）を溶解したリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）２ｍｌを液滴の状態で続けて封入した。
そして、図５に示すように、固相化装置における積載台を、Ｙ軸方向に−５０°傾けて（Ｘ軸方向を中心軸として回転移動）、液滴を培養バッグ内の端部に寄せ、次いで積載台をＸ軸方向に−１０°〜１０°の範囲で回転させて（Ｙ軸方向を中心軸として回転移動）、液滴をＸ軸方向に移動させ、培養バッグ内の左端から右端まで左右に往復移動させた。
【００６０】
次に、積載台をＹ軸方向に１０°回転させて液滴を背面側に少し移動させ、次いで積載台を再度Ｘ軸方向に−１０°〜１０°の範囲で回転させて、液滴をＸ軸方向に移動させ、培養バッグ内の左端から右端まで左右に往復移動させた。
以上の動作を、Ｙ軸方向の回転角（Ｘ軸回転角）が５０°になるまで繰り返し、培養バッグの底面全体に液滴を移動させた。これを１サイクルとして、４サイクル行い（固相化時間３．５分、温度２６℃）、固相化量を測定した。
【００６１】
実施例５の培養容器は、その内側の片面（底面）のみに抗ＣＤ３抗体が固相化されている。実施例５の培養容器についての固相化濃度の測定の結果、抗ＣＤ３抗体の吸着濃度は、３０．１ｎｇ／ｃｍ２であった。
【００６２】
したがって、実施例５の培養容器の面積当たりの抗体の吸着効率（吸着濃度×１６０ｃｍ２／１００００ｎｇ×１００）は、４８％であった。これは、比較例１の培養容器の同吸着効率１２％に比べて、４倍となっている。
このように、本実施形態の固相化装置を用いて培養容器を製造することにより、短時間で、従来では実現できないレベルの高い吸着効率を示す培養容器を得られることが明らかとなった。
【００６３】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、培養容器の大きさ、及び蛋白質の種類等を実施例とは異なるものにするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、蛋白質が内面に固相化された培養容器を、短時間で効率的に製造するために、好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００６５】
１０  培養バッグ
１１  固相化面
１２  非固相化面
２０  蛋白質
３０  固相化装置
３１  Ｘ軸方向移動用支持台
３２  支持柱
３３  Ｘ軸方向移動用サーボモータ
３４  Ｘ軸方向移動用ギアボックス
３５  Ｙ軸原点リミット検出センサ
３６  Ｙ軸方向移動用支持台
３７  Ｙ軸方向移動用サーボモータ
３８  Ｙ軸方向移動用ギアボックス
３９  Ｘ軸原点リミット検出センサ
４０  基台
５０  保持部材
５１  本体部
５１−１  凹部
５２  上蓋部
５３  押圧部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2015122960.tif 000011
【図１０】
2015122960.tif 000012
【図１１】
2015122960.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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