(57)【要約】【課題】本発明は、光を用いて簡便に細胞を剥離する方法を提供する。【解決手段】細胞が接着した細胞接着面に１ｍｍ２当り４Ｊ以上の照射量の可視光を照射することを含んでなる、細胞培養表面からの細胞の剥離方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が接着した細胞接着面に１ｍｍ２当り４Ｊ以上の照射量の可視光を照射することを含んでなる、細胞培養表面からの細胞の剥離方法。
【請求項２】
照射量が、１ｍｍ２当り６．５Ｊ以上である、請求項１に記載の剥離方法。
【請求項３】
照射量が、１ｍｍ２当り８．５Ｊ以上である、請求項２に記載の剥離方法。
【請求項４】
可視光が、４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長の光である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞接着面が、細胞を剥離させるための光応答材料によりコーティングされていない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
光を収束させて細胞接着面の一部に照射する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞接着面を形成する容器壁が光透過性基板からなり、光を培養容器外部から照射する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培養容器が閉鎖系培養容器である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が多能性幹細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞剥離システムであって、
細胞接着面を有する細胞培養容器と、
細胞接着面に可視光を照射する細胞剥離用の光源と
を備え、
細胞培養容器は、細胞剥離用の光源から照射される光に対して透過性を有する容器壁を有し、
細胞剥離用の光源は、細胞培養容器の前記容器壁の外方に設けられ、容器壁を透過する光を該細胞接着面に対して照射することができる、
細胞剥離システム。
【請求項１１】
細胞剥離用の光源から照射される光が４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長の光である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
細胞接着面が、細胞を剥離させるための光応答材料によりコーティングされていない、請求項１０または１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着表面からの細胞剥離方法および細胞剥離システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の剥離には、セルスクレイパーやアスピレーターが用いられてきた。しかしこれらの方法では、細胞にアクセスする際に、微生物のコンタミネーションのリスクがあった。また、閉鎖系培養容器では、細胞に物理的にアクセスすることは困難なため、細胞の選択的な剥離は困難であった。
【０００３】
これに対して、細胞の接着面に光分解性コーティングを施した培養容器が開発され、光を照射することにより非接触で細胞を領域選択的に剥離する方法が開発されている。これらの方法の一つでは、培養容器表面の光分解性コーティングが光照射を受けると分解し、酸を発生することによって細胞を損傷して、それにより細胞を接着面から剥離させることができる（特許文献１）。また、別の方法では、光照射を受けると光応答性のゲルが溶解することによって、表面に接着する細胞を剥離させることができるものも開発されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１２５２１８号公報
【特許文献２】特開２０１２−８０８４４号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、光を用いて簡便に細胞を剥離する方法を提供する。
【０００６】
本発明者らは、１ｍｍ２当り４Ｊ以上の照射量の可視光を照射すると細胞接着面から細胞を剥離させることができることを見出した。この知見に基づき本発明が完成された。
【０００７】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）細胞が接着した細胞接着面に１ｍｍ２当り４Ｊ以上の照射量の可視光を照射することを含んでなる、細胞培養表面からの細胞の剥離方法。
（２）照射量が、１ｍｍ２当り６．５Ｊ以上である、上記（１）に記載の剥離方法。
（３）照射量が、１ｍｍ２当り８．５Ｊ以上である、上記（２）に記載の剥離方法。
（４）可視光が、４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長の光である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）細胞接着面が、細胞を剥離させるための光応答材料によりコーティングされていない、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）光を収束させて細胞接着面の一部に照射する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）細胞接着面を形成する容器壁が光透過性基板からなり、光を培養容器外部から照射する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）培養容器が閉鎖系培養容器である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）細胞が多能性幹細胞である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）細胞剥離システムであって、
細胞接着面を有する細胞培養容器と、
細胞接着面に可視光を照射する細胞剥離用の光源と
を備え、細胞培養容器は、細胞剥離用の光源から照射される光に対して透過性を有する容器壁を有し、
細胞剥離用の光源は、細胞培養容器の前記容器壁の外方に設けられ、容器壁を透過する光を該細胞接着面に対して照射することができる、
細胞剥離システム。
（１１）細胞剥離用の光源から照射される光が４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長の光である、上記（１０）に記載のシステム。
（１２）細胞接着面が、細胞を剥離させるための光応答材料によりコーティングされていない、上記（１０）または（１１）に記載のシステム。
【０００８】
本発明の方法では、細胞接着面には、光応答性素材などによるコーティングが施されて
いなくても細胞を細胞接着面から剥離することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、波長４２０ｎｍの光の照射による細胞の剥離を示す。
【図２】図２は、波長４０５ｎｍおよび４５０ｎｍの光の照射による細胞の剥離を示す。
【図３】図３は、本発明の第一の実施形態の細胞剥離システムを示す。
【図４】図４は、図３のＡ−Ａ断面を示す。
【図５】図５は、本発明の細胞剥離システムの変形例を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本発明で用いられる「細胞」は、接着培養に適用できる細胞であれば特に制限はなく、霊長類細胞や齧歯類細胞などの哺乳類細胞とすることができ、好ましくは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ若しくはヤギの細胞またはこれらに由来する細胞とすることができる。本発明で用いられる細胞はまた、由来する臓器や組織によらず特に制限無く用いることができるが、例えば、神経細胞、筋細胞、心細胞、肺細胞、腎臓細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞若しくは繊維芽細胞などの体細胞、これらの幹細胞、生殖細胞または多能性幹細胞とすることができ、好ましくは、多能性幹細胞とすることができる。本発明で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、ＳＴＡＰ細胞（刺激惹起性多能性獲得細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。本発明に用いる多能性幹細胞は、より好ましくは、霊長類または齧歯類などの哺乳類の多能性幹細胞であり、さらにより好ましくは、霊長類または齧歯類などの哺乳類のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり、最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。本発明では、接着面上で単層を形成して増殖する細胞または複層を形成して増殖する細胞のいずれを用いてもよい。
【００１１】
本発明で用いられる「接着面」は、細胞が接着している培養容器の表面を意味し、開放系培養容器の接着面または閉鎖系培養容器の接着面である。本発明で用いられる「接着面」は、特に限定されないが、細胞培養に適した表面であり、好ましくは光透過性の基板の表面である。容器壁として光透過性の基板を用いることにより、光を培養容器の外部から照射すれば、容器壁を透過した光により細胞を接着面から剥離することが可能となる。また、光透過性の基板は、少なくとも照射する光に対して透過性を有するものであればよい。細胞接着面を形成する基板は、膜などの伸縮性基板であってもよいし、非伸縮性の硬い基板であってもよい。基板は、例えば、プラスチック製、ガラス製または石英製の基板とすることができる。
【００１２】
本発明で用いられる「接着面」は、必ずしもコーティング処理が施されている必要はないが、細胞の接着効率を向上させる観点で、細胞接着用のコーティングが施されていることが好ましい。細胞接着用のコーティングとしては、特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、ヒアルロン酸、マトリゲル（商標）（ＢＤ社製）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（インビトロジェン社製）、プロネクチン（商標）（和光純薬社製）、接着性オリゴペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリリジン若しくはポリオルニチンなどの細胞外基質（ＥＣＭ）コーティングまたはポリマーコーティングなどのコーティングを挙げることができる。特に、多能性幹細胞の接着用のコーティングとしては、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル（商標）（ＢＤ社製）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）（インビトロジェン社製）またはプロネクチン（商標）（和光純薬社製）による表面コーティングが好ましく用いられる。細胞接着用のコーティングは、製造業者による取扱説明書に記載の方法やその他の周知の方法を用いて行うことができる。本発明によれば、フィーダー細胞は用いても用いなくてもよい。
【００１３】
本発明で用いられる「接着面」は、光照射により細胞と表面との結合を解離する光応答性コーティングが施されていなくてもよい。すなわち、本発明のある態様では、細胞接着面は、該細胞接着面から細胞を剥離させるための光応答性材料（例えば、光分解性材料）によるコーティングは施されていない。
【００１４】
本発明によれば、光を照射することにより、培養容器の細胞接着面から細胞を剥離させることができる。特に、培養容器の細胞接着面からの細胞の剥離は、細胞接着面に対して培養容器の内部（すなわち、細胞接着面側から）または外部（すなわち、細胞接着面の裏側から）から光を照射することにより行うことができる。
【００１５】
すなわち、本発明によれば、細胞そのものには直接触れることなく（すなわち、非接触的に）、培養容器の外部から光を照射することにより細胞を剥離させることができる。本発明によれば、培養容器の内部にアクセスすることなく細胞の剥離が可能なため、培養系でのコンタミネーション発生のリスクが極めて低い。また、培養容器の外部からの光照射は機械的な操作により行うことが可能であることから、本発明によれば培養容器の細胞接着面から細胞を剥離させる処置を自動化することも可能である。しかも、本発明によれば、光を領域選択的に照射することにより、細胞を接着面から領域選択的に剥離させることができる。細胞の剥離は、細胞接着面を形成する基板が光透過性の基板である細胞培養容器を用いれば、光の照射は培養容器の外部から行なうことができるため、開放系であるか閉鎖系であるかを問わず行うことができる。従って、本発明によれば、開放系培養または閉鎖系培養において、光照射により接着面から領域選択的に細胞を剥離させる方法が提供される。なお、本明細書において、「光を領域選択的に照射する」とは、目的とする領域のみに細胞剥離に必要とされる程度の強度の光を照射することを意味し、細胞が剥離しない程度の光がその領域外に照射されることは許容される。
【００１６】
本発明による細胞の剥離のために照射する可視光の周波数および照射量は、細胞が接着面から剥離する限りどのような範囲のものであってもよい。本発明の方法で照射する光は、好ましくは４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長の光であり、より好ましくは、４００ｎｍ〜４６０ｎｍの波長の光であり、例えば、４００ｎｍ〜４１０ｎｍ、４１０ｎｍ〜４３０ｎｍおよび／または４３０ｎｍ〜４６０ｎｍである。本発明の特定の態様では、照射する光は、４０５ｎｍ、４２０ｎｍまたは４５０ｎｍの波長の光である。また、本発明のある態様では、照射する光は、４１０ｎｍ〜４３０ｎｍであり、例えば、４２０ｎｍの波長の光である。この波長の光は、ＵＶよりも細胞に与えるダメージが少なく、照射領域外にもれた光が当たることによる剥離対象以外の細胞への影響が少ない。
【００１７】
細胞は、１ｍｍ２当り４Ｊ以上の光を照射することで細胞接着面から部分的に剥離する。細胞はまた、１ｍｍ２当り６．５Ｊ未満の光照射量では、培養面から完全には剥離しないが、その大部分は細胞接着面から剥離する。細胞はさらに、１ｍｍ２当り８．５Ｊを超える光照射量でほぼ完全に細胞接着面から剥離する。従って、細胞を剥離するために必要な光の照射量は、１ｍｍ２当り４Ｊ以上であることが好ましく、１ｍｍ２当り６．５Ｊ以上であることが好ましく、１ｍｍ２当り８．５Ｊを超えることがより好ましく、１ｍｍ２当り１０．９Ｊを超えることがさらに好ましく、１ｍｍ２当り１２．０Ｊ以上であることがさらにより好ましく、１ｍｍ２当り１３．６Ｊ以上であることがさらにより好ましい。より詳細には、本発明において細胞を剥離するために必要な光の照射量は、１ｍｍ２当り４Ｊ以上、４．１Ｊ以上、４．２Ｊ以上、４．３Ｊ以上、４．４Ｊ以上、４．５Ｊ以上、４．６Ｊ以上、４．７Ｊ以上、４．８Ｊ以上、４．９Ｊ以上、５．０Ｊ以上、５．１Ｊ以上、５．２Ｊ以上、５．３Ｊ以上、５．４Ｊ以上、５．５Ｊ以上、５．６Ｊ以上、５．７Ｊ以上、５．８Ｊ以上、５．９Ｊ以上、６．０Ｊ以上、６．１Ｊ以上、６．２Ｊ以上、６．３Ｊ以上、６．４Ｊ以上、６．５Ｊ以上、６．６Ｊ以上、６．７Ｊ以上、６．８Ｊ以上、６．９Ｊ以上、７．０Ｊ以上、７．１Ｊ以上、７．２Ｊ以上、７．３Ｊ以上、７．４Ｊ以上、７．５Ｊ以上、７．６Ｊ以上、７．７Ｊ以上、７．８Ｊ以上、７．９Ｊ以上、６．０Ｊ以上、８．１Ｊ以上、８．２Ｊ以上、８．３Ｊ以上、８．４Ｊ以上、８．５Ｊ以上、８．６Ｊ以上、８．７Ｊ以上、８．８Ｊ以上、８．９Ｊ以上、９．０Ｊ以上、９．１Ｊ以上、９．２Ｊ以上、９．３Ｊ以上、９．４Ｊ以上、９．５Ｊ以上、９．６Ｊ以上、９．７Ｊ以上、９．８Ｊ以上、９．９Ｊ以上、１０．０Ｊ以上、１０．１Ｊ以上、１０．２Ｊ以上、１０．３Ｊ以上、１０．４Ｊ以上、１０．５Ｊ以上、１０．６Ｊ以上、１０．７Ｊ以上、１０．８Ｊ以上、１０．９Ｊ以上、１１．０Ｊ以上、１１．１Ｊ以上、１１．２Ｊ以上、１１．３Ｊ以上、１１．４Ｊ以上、１１．５Ｊ以上、１１．６Ｊ以上、１１．７Ｊ以上、１１．８Ｊ以上、１１．９Ｊ以上、１２．０Ｊ以上、１２．１Ｊ以上、１２．２Ｊ以上、１２．３Ｊ以上、１２．４Ｊ以上、１２．５Ｊ以上、１２．６Ｊ以上、１２．７Ｊ以上、１２．８Ｊ以上、１２．９Ｊ以上、１３．０Ｊ以上、１３．１Ｊ以上、１３．２Ｊ以上、１３．３Ｊ以上、１３．４Ｊ以上、１３．５Ｊ以上、または１３．６Ｊ以上とすることができる。本発明の剥離方法では、もれた光が当たることによる剥離対象以外の細胞への影響を低減する観点では、光の照射量は、例えば、１ｍｍ２当り３０Ｊ以下とすることができ、１ｍｍ２当り２５Ｊ以下とすることができ、１ｍｍ２当り２０Ｊ以下とすることができ、または１ｍｍ２当り１５Ｊ以下とすることができる。本発明の方法では、照射後の細胞の剥離を確認して、さらに光を照射してもよい。
【００１８】
本発明の特定の態様では、照射する光が４１０ｎｍ〜４３０ｎｍ（例えば、４２０ｎｍ）であり、照射量が１ｍｍ２当り４Ｊ以上であり、好ましくは１ｍｍ２当り６．５Ｊ以上であり、より好ましくは１ｍｍ２当り８．５Ｊを超える。本発明のこの態様では、照射量は、１ｍｍ２当り１０．９Ｊ以上、１２．０Ｊ以上、または１ｍｍ２当り１３．６Ｊ以上であってもよい。
【００１９】
光源の出力は、細胞の剥離に必要とされる光照射量とその照射量を達成するために必要な時間とから計算することができる。光源の出力は、特に限定されないが、例えば、細胞の剥離に必要とされる光照射量を短期間（例えば、１０分以内）で与えるという観点では、１００ｍＷ以上、１５０ｍＷ以上または２００ｍＷ以上の出力を有していることが好ましい。
【００２０】
本発明による細胞の剥離のために照射する光は、細胞を領域特異的に剥離する目的では、収束させた光であることが好ましい。本発明では、細胞接着面に対して領域特異的に照射できる光であれば、様々な方法で収束させた光を照射することができる。そして、照射する領域は、剥離対象の細胞の領域に応じて適宜設定することができる。例えば、多能性幹細胞の培養においては、多能性幹細胞のコロニーは、通常は、直径１０μｍ〜２ｍｍの円形であることが多いが、細胞を細胞コロニー単位で剥離する必要が生じることがある。細胞を細胞コロニー単位で剥離するためには、光は、例えば、直径１０μｍ〜２ｍｍの円の領域に集中して照射できる程度に収束させた光であることが好ましい。
【００２１】
このようにして、本発明では、光は、照射したい領域の形状や大きさに合わせて収束させ、照射することができる。光を収束させるためには、レーザー光源を用いることができる。光源から照射された光をレンズや光ファイバーを用いて収束させてもよい。当業者であれば、周知の光収束技術により適宜光を収束させることができる。
【００２２】
本発明の細胞の剥離方法は、細胞接着面に細胞が接着した細胞培養容器を準備することをさらに含んでいてもよい。本発明の細胞の剥離方法は、光照射後、細胞をインキュベートすることを含んでもよい。インキュベートは通常の細胞の培養条件下で行なうことができる。インキュベート時間は、例えば、５時間以上、１０時間以上、１５時間以上、２０時間以上、１日以上または２日以上とすることができる。
【００２３】
本発明によれば、細胞培養容器と細胞剥離用の光源とを備えた細胞剥離システムが提供される。以下、図３および４により、本発明の細胞剥離システムを説明する。
【００２４】
第一の実施形態
本発明の第一の実施形態の細胞剥離システム１０は、図３および４に示されるように、細胞接着面を有する細胞培養容器２０Ａと細胞接着面に可視光を照射する細胞剥離用の光源３０とを備える。細胞培養容器２０Ａは、細胞剥離用の光源３０から照射される光に対して透過性を有する容器壁を有する。細胞剥離用の光源３０は、細胞培養容器２０Ａの前記容器壁の外方に設けられ、容器壁を透過する光を該細胞接着面２１に対して照射することができる。第一の実施形態の細胞剥離システム１０は、細胞培養容器の取り付けフレーム４０を備える。
【００２５】
細胞培養容器の取り付けフレーム４０は、細胞培養容器を載置できるフレームである。細胞培養容器の取り付けフレーム４０は、細胞培養容器を固定するものであってもよいし、固定しなくてもよい。但し、細胞培養容器の取り付けフレーム４０は、細胞剥離用の光源３０から照射される光が細胞接着面２１に到達するのを妨げない。具体的には、例えば、細胞培養容器の取り付けフレーム４０は、細胞剥離用の光源３０から照射される光に対して透過性を有していてもよい。例えば、細胞培養容器の取り付けフレーム４０は、細胞剥離用の光源３０から照射される光が細胞接着面２１に到達するのを妨げないように細胞培養容器の細胞接着面に対応する領域が開口部となっている（図４参照）。
【００２６】
第一の実施形態では、細胞培養容器２０Ａは、閉鎖系培養容器であり、培養室に細胞および培地を導入するための入口２５および培養室から細胞および培地を取り出すための出口２６を有する。あるいは、閉鎖系培養容器２０Ａは、入口と出口の用途を兼ね備えた入出口２７（図示せず）を有してもよい。細胞接着面は上記で定義した表面である。細胞剥離用の光源３０は、該細胞接着面の外方に設置され、該細胞接着面に対して光を照射することができる。
【００２７】
細胞剥離用の光源３０は、例えば、４００〜５００ｎｍの波長の光を照射する光源とすることができ、好ましくはレーザー光源またはＬＥＤ光源（例えば、４０５ｎｍ、４２０ｎｍまたは４５０ｎｍの波長の光を照射するレーザー光源またはＬＥＤ光源）とすることができる。細胞剥離用の光源３０は、光を収束させるためのレンズなどの収光手段３１または光ファイバー３２を備えている。光源３０の出力は、特に限定されないが、例えば、細胞の剥離に必要とされる光照射量を短期間（例えば、１０分以内）で与えるという観点では、１００ｍＷ以上の出力を有していることが好ましい。また、本発明の第一の実施形態の細胞剥離システム１０は、細胞への照射量を制御する照射量制御機構１Ａ（図示せず）を備えていてもよい。照射量制御機構１Ａは、照射量が所定の値に達すると光源３０による細胞への光照射を停止させることができる。照射量制御機構１Ａとしては、例えば、照射量または照射時間を入力する入力部１Ｂからの照射量に基づき、一定時間で自動的に照射をストップさせる信号を光源に送る信号送信手段などを用いることができる。
【００２８】
本発明の第一の実施形態の細胞剥離システム１０は、ある態様では、多能性幹細胞、好ましくはヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞の剥離用である。すなわち、ある態様では、本発明の第一の実施形態の細胞剥離システム１０において、細胞培養容器２０Ａの細胞接着面には、多能性幹細胞の接着用のコーティングが施されている。
【００２９】
本発明の第一の実施形態の細胞剥離システムを用いた細胞の剥離は、本発明の細胞の剥離方法により行なわれる。
【００３０】
変形例
次に、図５により、本発明の細胞剥離システムの変形例１５について説明する。本発明の細胞剥離システムの変形例１５では、細胞培養容器２０Ｂが、開放系培養容器または半開放系培養容器である以外は、本発明の細胞剥離システム１０と同一の構成を有する。図５において、図３および４に示す第一の実施形態の細胞剥離システムと同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【実施例】
【００３１】
実施例１：青色光照射による細胞接着表面からの細胞の剥離
本実施例では、光照射により細胞接着表面から細胞の剥離を試みた。
【００３２】
細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞を用いた。培地は、５ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）および１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲｅｐｒｏＦＦ２培地を用い、フィーダーフリーの条件で行った。
【００３３】
培養容器としては、
６穴プレート（MultiwellTM TC Plates − 6 well、ＢＤ社製、製品番号：353046）、
２４穴プレート（MultiwellTM TC Plates − 24 well、ＢＤ社製、製品番号：353047）、
閉鎖系培養容器（OptiCell（商標）、Thermo社製、製品番号：155331）
を用いた。培養容器の細胞接着面は、マトリゲル（商標）によりコーティングして培養に用いた。
【００３４】
光照射用の光源としては、４２０ｎｍの青色ＬＥＤ光源（ＨＯＹＡ社製、製品名Ｈ−１ＶＨ４−４２０ｎｍ）を用い、光を収束させて、２２５ｍＷ（１分当り２．７Ｊ／ｍｍ２）で光照射を実施した。培養容器の細胞接着面への光照射は、培養容器底面の裏側から培養容器内部に向けて行った。１Ｊ＝１Ｗ×１秒の計算で照射量を計算した。
【００３５】
細胞培養容器に細胞を播種し、コロニーを形成させた後、細胞接着表面に、それぞれ１ｍｍ２当り２．７Ｊから約０．５Ｊ刻みで１３．３Ｊまでの２４通りの強度の光を照射した。照射後、細胞培養容器を細胞培養用のインキュベーターに戻し、２０時間後、細胞の状態を観察した。剥離したか否かの判定は、細胞のディッシュ底面への接着状態を観察することにより行なった。
【００３６】
すると、１ｍｍ２当り３．６Ｊ未満の照射条件では細胞の剥離はほとんど観察されなかったが、１ｍｍ２当り４Ｊ以上の照射条件で光照射領域の一部の細胞の剥離が観察され、１ｍｍ２当り６．９Ｊ以上の照射条件で細胞の良好な剥離が観察され、１ｍｍ２当り８．７Ｊ以上の照射条件では、光の照射領域でのみ、細胞を細胞接着表面からほぼ完全に剥離させることができた（図１）。また、光照射領域外の細胞は剥離せずその後も良好に培養が可能であった（図１）。１ｍｍ２当り９．６Ｊを超える照射条件でも、同様に光の照射領域でのみ、細胞を細胞接着表面からほぼ完全に剥離させることができた（データ省略）。また、細胞の剥離は、インキュベートにより促進されることが観察された。なお、図１では、８．７Ｊ／ｍｍ２以上の照射条件でも、細胞の剥離が完全でないように見えるがこれは剥離して浮遊した細胞が写真に写り込んでいるためであって、実際には細胞は完全に剥離していることを接着面の詳細な観察により確認済である。
【００３７】
この結果は、４０５ｎｍや４５０ｎｍの波長の光源を用いてもほぼ同様の結果を再現することができた（図２の点線領域内）。４０５ｎｍの波長の光源としてはレーザー光源（ＧＩＧＡ  ＬＡＳＥＲ社製、製品名：Ｖｉｏｌｅｔ  Ｌａｓｅｒ  Ｐｏｉｎｔｅｒ  ５１０Ｖ））を用い、４５０ｎｍの波長の光源としては青色ＬＥＤ光源（ＨＯＹＡ社製、製品名：Ｈ−１ＶＨ４−４５０ｎｍ）を用いた。図２において、細胞に対する照射量は、４０５ｎｍでは６．２Ｊ／ｍｍ２、４５０ｎｍでは１３．６Ｊ／ｍｍ２であった。
【００３８】
同じ結果は、上記培養容器のいずれを用いても再現することができた（データ省略）。また、マウスＳＮＬ細胞をゼラチンコートした培養表面で培養した場合でも同様の結果が得られた（データ省略）。また、インキュベートにより細胞の剥離が促進された（データ省略）。
【００３９】
従って、細胞は、１ｍｍ２当り４Ｊ以上の光照射により領域特異的に細胞を接着表面から剥離できることが示された。また、照射領域以外の領域に接着した細胞には、領域特異的な細胞剥離による生理的影響は確認されなかった。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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