(57)【要約】【課題】免疫反応容器や固相表面へ、簡便かつ高い結合率で化学結合し、微量な生体成分を十分な感度で測定可能にし得るブロッキング効果の優れたポリマー、及びその製造方法を提供する。【解決手段】ホスホリルコリン基を含有する構成単位と、免疫反応容器や固相表面への化学結合率を高くするためのスペーサーとして十分な長さのアルキル鎖及びアミノ基を含有する構成単位とを有する、重量平均分子量２０，０００〜２００，０００のポリマーとする。また、ホスホリルコリン基含有モノマーと、アルキル鎖及びエポキシ基含有モノマーを共重合させた後、エポキシ基を開環する製造方法とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１ａ）及び（１ｂ）で表される構成単位を有する、重量平均分子量２０，０００〜２００，０００のポリマー
【化１】
2015117269.tif 000014
［式（１ａ）及び（１ｂ）中、Ｘは、下記式（２ａ）又は（２ｂ）で表される基を示し、ａ及びｂは、当該２つの構成単位の構成比を示す数字であり、（ｂ／（ａ＋ｂ））×１００＝５〜５０である。］
【化２】
2015117269.tif 000015
【請求項２】
式（３ａ）で表される２−メタクリロイルオキシエチル−２−トリメチルアンモニオエチルホスフェートと、式（３ｂ）で示される４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテルとを含む単量体組成物を重合させた後、式（３ｃ）で示される２−アミノエタンチオールを反応させることを特徴とする請求項１記載のポリマーの製造方法。
【化３】
2015117269.tif 000016
【請求項３】
請求項１記載のポリマーを０．１〜２０質量％含有する診断薬用ブロッキング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定反応における非特異反応の抑制、即ち標識抗体あるいは抗原の非特異的吸着、あるいは検体中の蛋白質の固相への吸着等の防止に有用な新規ポリマー、その製造方法及び該ポリマーを利用した診断薬用ブロッキング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾病の早期発見のために、臨床検査、診断薬の分野において、免疫反応を利用した測定方法が広く行われている。その中で、検査の高感度化が求められており、臨床検査、診断薬の感度向上は大きな課題になっている。微量の生体成分を、免疫反応を利用して測定する際の検出感度を左右する要因の一つとして、測定対象となる抗体、抗原もしくは測定に利用するこれらの標識体の、免疫反応容器や固相表面への非特異的吸着が挙げられる。また、同時に血清などの生体分子が混在する状況下での測定では、それらの共存物質が免疫反応容器や固相表面へ非特異的に吸着することによるノイズの発生も、高感度化を妨げる要因となっている。
【０００３】
これらの非特異的吸着を防止するために、従来から、免疫反応容器や固相表面を、免疫反応に関与しないアルブミン、カゼイン、ゼラチンといった生物由来の蛋白質でブロッキングする方法が行われている。また、特許文献１はブロッキング剤としてポリビニルアルコールを、特許文献２は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体を用いる方法を開示している。
これらのブロッキング方法は、免疫反応容器や固相表面へブロッキング剤を物理吸着させることにより効果を発現させており、ある程度、免疫反応容器や固相表面への非特異的吸着を回避することは可能だが、まだ十分ではない。
また、特許文献３には、反応活性基とホスホリルコリン基を持つ表面処理剤が開示されており、当該表面処理剤を免疫反応容器や固相表面への非特異的吸着を抑制するために使用することも可能であるが、蛋白質が免疫反応容器や固相表面に存在する状況下では、ブロッキング性能が十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平４−１９５６１号公報
【特許文献２】特開平７−８３９２３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／００２０２１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫反応を利用した測定方法においては、測定中に免疫反応容器や固相表面の洗浄を行うことが一般的であるため、特許文献１及び２の方法では、この洗浄の際に免疫反応容器や固相表面からブロッキング剤が剥がれてしまい、効果を十分に発現できないという問題がある。
また、特許文献３の表面処理剤のブロッキング性能が十分ではない理由として、高分子主鎖から反応活性基までの距離が短く、立体障害により免疫反応容器及び固相の表面への結合率が低くなるためであることを本発明者らは見出した。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、免疫反応容器や固相表面へ、簡便かつ高い結合率で化学結合し、微量な生体成分を十分な感度で測定可能にし得るブロッキング効果の優れたポリマー及びその製造方法、並びに当該ポリマーを含有する診断薬用ブロッキング剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ホスホリルコリン基を持ち、免疫反応容器や固相表面への化学結合率を高くするためのスペーサーとして十分な長さのアルキル鎖を持つ、免疫反応などを利用した診断における十分なブロッキング効果を発現するポリマーの開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、式（１ａ）及び（１ｂ）で表される構成単位を有する、重量平均分子量２０，０００〜２００，０００のポリマーが提供される。
【化１】
2015117269.tif 000002
［式（１ａ）及び（１ｂ）中、Ｘは、下記式（２ａ）又は（２ｂ）で表される基を示し、ａ及びｂは、当該２つの構成単位の構成比を示す数字であり、（ｂ／（ａ＋ｂ））×１００＝５〜５０である。］
【化２】
2015117269.tif 000003
【０００９】
また、式（３ａ）で示される２−メタクリロイルオキシエチル−２−トリメチルアンモニオエチルホスフェート（以後、ＭＰＣと略称する）と、式（３ｂ）で示される４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（以後、４−ＨＢＡＧＥと略称する）とを含む単量体組成物を重合させた後、式（３ｃ）で示される２−アミノエタンチオール（以後、ＡＥＴと略称する）を反応させることを特徴とする、上記ポリマーの製造方法が提供される。
【化３】
2015117269.tif 000004
【００１０】
さらに、上記ポリマーを所定量含有する診断薬用ブロッキング剤が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリマーは、免疫測定反応等において、使用物質あるいは不純物等の、免疫反応容器や固相表面への非特異的吸着に対し、高い防止効果を発揮するという効果を有する。従って、本発明のポリマーを含有する診断薬用ブロッキング剤は、免疫測定反応等に対して感度が極めて高いという効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態である合成例１に係るポリマーの赤外線吸収スペクトル（ＩＲスペクトル）を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態である合成例１に係るポリマーの1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明のポリマーは、上記式（１ａ）及び（１ｂ）で表される構成単位を有する、重量平均分子量が２０，０００以上、好ましくは８０，０００以上、また、２００，０００以下、好ましくは１２０，０００以下のポリマーである。重量平均分子量が２０，０００未満の場合は、ポリマーの精製が困難であり、２００，０００を超える場合は、製造時の粘性が高くなりすぎ取り扱いが困難となるおそれがある。
なお、本発明のポリマーは、本発明の効果が発揮される範囲内において、式（１ａ）及び（１ｂ）以外の構成単位を有してもよい。すなわち、上記式（３ａ）及び（３ｂ）の単量体（モノマー）以外に、他のモノマーも含めて共重合させ、さらに、式（３ｃ）の化合物でエポキシ基を開環させたポリマーであってもよい。
【００１４】
式（１ｂ）において、Ｘは、式（２ａ）及び（２ｂ）で表される基を示す。また、ａ及びｂは、式（１ａ）及び（１ｂ）の２つの構成単位の構成比、すなわち対応するモノマーのモル比を表し、（ｂ／（ａ＋ｂ））×１００＝５〜５０を満たすものである。
ここで、ａ及びｂは、当該構成単位の構成比を表しているのみであって、本発明のポリマーが式（１ａ）で表されるブロックと、式（１ｂ）で表されるブロックとからなる、ブロックポリマーのみを意味するものではない。本発明のポリマーは、式（３ａ）と式（３ｂ）のモノマー（ＭＰＣ及び４−ＨＢＡＧＥ）がランダムに共重合されたランダム共重合体であってもよく、ブロック共重合体であってもよく、あるいは、ランダム部とブロック部が混在する共重合体であってもよい。また、交互共重合体部が存在してもよい。なお、正確に言えば、これらの共重合体が式（３ｃ）のＡＥＴと反応し、エポキシ基が開環したものが本発明のポリマーである。また、上記した通り、これらの共重合体中には、ＭＰＣ及び４−ＨＢＡＧＥ以外のモノマー由来部が存在してもよい。
【００１５】
「（ｂ／（ａ＋ｂ））×１００」の値は、好ましくは１０以上であり、また、好ましくは４０以下である。「（ｂ／（ａ＋ｂ））×１００」の値が５未満の場合、本発明のポリマーが免疫反応容器や固相表面にコーティングされにくく、当該値が５０を超える場合、抗原や抗体、検出する蛋白質の安定性が低下する可能性がある。
【００１６】
次に本発明のポリマーの製造方法例について説明する。
本発明のポリマーは、例えば、式（３ａ）で示されるＭＰＣと、式（３ｂ）で示される４−ＨＢＡＧＥとを、ＭＰＣ及び４−ＨＢＡＧＥの合計量に対して４−ＨＢＡＧＥをモル比で５〜５０％の割合で含む単量体組成物を重合させて、式（４）に示される共重合体を得た後、式（３ｃ）で示されるＡＥＴを反応させることにより得ることができる。
【００１７】
上記単量体組成物の重合反応は、例えば、ラジカル重合開始剤の存在下、窒素、二酸化炭素、アルゴン、ヘリウム等の不活性ガスで反応系内を置換して、又は当該雰囲気において、ラジカル重合、例えば、塊状重合、懸濁重合、乳化重合、溶液重合等の公知の方法により行うことができる。得られる重合体の精製等の観点から、溶液重合が好ましい。この重合反応により、式（４）で示される構成単位を有する共重合体が得られる。なお、式（４）の共重合体は、上記の通り、ランダム共重合体であってもよく、ブロック共重合体であってもよく、あるいは、ランダム部とブロック部が混在する共重合体であってもよい。また、交互共重合体部が存在してもよい。
また、ａ及びｂは、（ｂ／（ａ＋ｂ））×１００＝５〜５０を満たすものである。該共重合体を精製する場合、その精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
【００１８】
【化４】
2015117269.tif 000005
【００１９】
ラジカル重合開始剤としては、アゾ系ラジカル重合開始剤、有機過酸化物、過硫酸化物が挙げられる。アゾ系ラジカル重合開始剤としては、例えば、２，２−アゾビス（２−アミノプロピル）二塩酸塩、２，２−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ジメチル−２，２’−アゾビスイソブチレート、１−（（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ）ホルムアミド、２，２’−アゾビス（２−メチル−Ｎ−フェニルプロピオンアミヂン）ジハイドロクロライド、２，２’−アゾビス（２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−プロピオンアミド）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミド）ジハイドレート、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−（ヒドロキシメチル）プロピオニトリル）等のアゾ系ラジカル重合開始剤が挙げられる。また、過酸化物としては、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、コハク酸ペルオキシド（＝サクシニルペルオキシド）、グルタルペルオキシド、サクシニルペルオキシグルタレート、ｔ−ブチルペルオキシマレート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ジ−２−エトキシエチルペルオキシカーボネート、３−ヒドロキシ−１，１−ジメチルブチルペルオキシピバレート等の有機過酸化物が挙げられる。さらに、過硫酸化物としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸化物が挙げられる。
これらのラジカル重合開始剤は単独で用いても混合物で用いてもよい。重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００質量部に対して通常０．００１〜１０質量部、好ましくは０．０１〜５．０質量部である。
【００２０】
上記単量体組成物の重合反応は、溶媒の存在下で行うことができる。該溶媒としては、単量体組成物を溶解し、反応しないものが使用でき、例えば、水、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、含窒素系溶媒が挙げられる。アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等；ケトン系溶媒としては、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等；エステル系溶媒としては、酢酸エチル等；エーテル系溶媒としては、エチルセロソルブ、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン等；含窒素系溶媒としては、アセトニトリル、ニトロメタン等が挙げられる。好ましくは、水、アルコール又はそれらの混合溶媒が挙げられる。
重合反応時の温度は、使用する重合開始剤や溶媒の種類によって、また所望の分子量によって適宜適した温度を選択すればよいが、４０〜１００℃の範囲が好ましい。
【００２１】
以上の様にして得られる式（４）で表される共重合体は、次のエポキシ基の開環反応の前に精製してもよく、精製せず、続けて開環反応を行ってもよい。
【００２２】
式（４）で表される共重合体と、式（３ｃ）で表されるＡＥＴとの反応によるエポキシ基の開環は、溶媒中、加熱反応させることで行うことができる。得られる本発明の一実施形態に係るポリマーは、式（５）で表すことができ、当該ポリマーを精製する場合、再沈殿法、透析法、限外濾過法等の一般的な精製方法を採用することができる。式（５）中のａ、ｂ及びＸは、式（１ａ）及び（１ｂ）中のそれらと同じである。
【化５】
2015117269.tif 000006
【００２３】
該溶媒としては、式（４）で表される共重合体とＡＥＴとを溶解し、反応しないものが使用でき、例えば、プロトン性溶媒であるメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールが挙げられ、特に、ｎ−プロパノールが反応性の点から好ましい。
【００２４】
開環反応時の式（４）で表される共重合体の溶液濃度は４〜３０質量％が好ましい。３０質量％を超えると、反応液の粘度が高くなり、反応が十分に進行しないおそれがある。また、４質量％未満であると反応溶媒の量が増えてしまい、製造効率が低下するおそれがある。
【００２５】
式（４）で表される共重合体とＡＥＴとを反応させる場合、その仕込み量比は、式（４）で表される重合体中のエポキシ基とＡＥＴとのモル比率「エポキシ基:ＡＥＴ」を、１：３〜１００とすることが好ましい。該ＡＥＴのモル比が１００を超える場合は経済的でなく、３未満であると副反応が生じ、目的とする本発明の一実施形態に係るポリマーが得られない可能性がある。
【００２６】
式（４）で表される共重合体とＡＥＴとを反応させる方法としては、該共重合体に、ＡＥＴを添加する方法と、ＡＥＴに、式（４）で表される共重合体を添加する方法がある。前者の場合、ＡＥＴはあらかじめ溶媒に溶解させて添加してもよいし、そのまま添加してもよいが、徐々に添加すると副反応が生じ、所望の水溶性のポリマーが得られない可能性があることから、一括添加することが好ましい。
【００２７】
また、反応温度は４０〜１００℃が好ましい。４０℃未満であると反応が十分に進行せず、また１００℃を超えると、得られるポリマーの分解が生じるおそれがある。
反応時間は、３時間以上４８時間以下が好ましい。３時間未満であると、反応が十分に進行しない。また、４８時間を超えると、副反応が生じ、得られるポリマーの純度が低下する可能性がある。
また、反応時は、反応容器内を窒素やアルゴンなどの不活性ガスに置換することにより、ＡＥＴのチオール基が酸化してジスルフィドとなることを防ぎながら反応させることが好ましい。
前記反応終了後、得られた反応液を再沈殿法、透析法、限外濾過法などの一般的な精製方法を用いることで目的の式（５）で示されるポリマーを得ることができる。
【００２８】
つづいて、本発明の診断薬用ブロッキング剤について説明する
本発明の診断薬用ブロッキング剤は、本発明のポリマーを０．１〜２０質量％含有する溶液状であり、水溶液であることが好ましい。溶液中のポリマーの濃度が０．１質量％未満では、本発明のポリマーが免疫反応容器や固相表面にコーティングされにくく、また２０質量％を超えると溶液の粘度が増加し、ハンドリングが悪くなるおそれがある。
【００２９】
なお、本発明の診断薬用ブロッキング剤には、共存する試薬等の安定性や抗原と抗体との反応を阻害しない試薬であれば通常この分野で用いられるその他の試薬類が含有可能である。例えば、緩衝剤、反応促進剤、糖類、蛋白質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等が挙げられる。例えば、緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。例えば、反応促進剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等が挙げられる。例えば、糖類としては、スクロース、マルトース等が挙げられる。例えば、蛋白質としては、グロブリン、アルブミン、水溶性ゼラチン等が挙げられる。例えば、塩類としては、塩化ナトリウム等が挙げられる。例えば、界面活性剤としては、Triton X、Tween 20等が挙げられる。例えば、防腐剤としては、サリチル酸、安息香酸、アジ化ナトリウム等が挙げられる。また、その濃度は、用いる試薬により、公知の条件から適宜選択して用いることができる。
【００３０】
本発明の診断薬用ブロッキング剤は、免疫反応容器や固相表面に、本発明のポリマー中に存在するアミノ基に対して反応性を有する官能基を存在させ、これらを化学結合させることで本発明のポリマーを、当該免疫反応容器や固相表面に固定化する方法により使用することができる。
【００３１】
免疫反応容器や固相表面に導入する官能基としては、例えば、カルボキシル基、エポキシ基、イソシアネート基が挙げられる。また、免疫反応容器や固相表面にアミノ基、水酸基等のアミノ基とは反応を示さない官能基のみしか存在しない場合には、例えば、ジイソシアネート、ジエポキシ等の多官能性試薬を用いて、アミノ基と反応し得る官能基に変換させることにより、アミノ基に対して反応性を有する表面とすることができる。
化学結合させる方法は、その官能基の種類や量により、公知の条件から適宜選択して行うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中の各種測定は以下に示す方法に従って実施した。
【００３３】
＜ポリマー中のアミノ基の定量＞
ポリマー中のアミノ基の定量は、２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（以下、ＴＮＢＳと略す）を用いたＴＮＢＳ法により行う。
０．１、０．２、０．３、０．４、及び０．５ｍＭのアミノエタノール（ＭＥＡ）標準溶液及び０．０２５ｗｔ％のポリマー試料溶液を調製し、それぞれ０．５ｍＬずつテストチューブに採取する。調製した溶液及び純水のブランク溶液に１１３ｍＭのホウ酸緩衝液４ｍＬ、１１．４ｍＭのＮａ2ＳＯ3水溶液１ｍＬ、３．８ｍＭのＴＮＢＳ水溶液１ｍＬを加え、３７℃で１時間反応を行う。反応終了後、紫外可視分光光度計を用いて波長４２０ｎｍで吸光度ｄの測定を行う。
（検量線及び傾きの算出）
ｘ軸にＭＥＡ濃度、ｙ軸に吸光度ｄをとり、各濃度の標準溶液の吸光度ｄから検量線を作成し、最小二乗法により得られる原点を通る直線の傾きｃを算出する。
【００３４】
（ポリマー中のアミノ基含量の算出）
ポリマー試料溶液の吸光度ｄから、下記数式（１）によりポリマー試料溶液のアミノ基濃度ｙ（Ｍ）を算出する。
【数１】
2015117269.tif 000007
【００３５】
算出したアミノ基濃度ｙ（Ｍ）を用いて、下記数式（２）よりアミノ基含量ｘ（ｍｏｌ％）を算出する。ｘは、式(５)に示すポリマー中における、(１ｂ)で表される構成単位のｍｏｌ％に相当する。
【数２】
2015117269.tif 000008
ここで、ｚ（ｇ）： 使用したポリマー量、ＰＷ（Ｌ）：使用した水の量、ＭＰＣ分子量：２９５．２７、４−ＨＢＡＧＥ＋ＡＥＴの分子量：２７７．１５とすると、数式（２）は、下記数式（３）となる。
【数３】
2015117269.tif 000009
上記数式（３）よりポリマー試料溶液中のアミノ基含量ｘ（ｍｏｌ％）を求めることができる。
また、ポリマー中のＭＰＣ由来部と（４−ＨＢＡＧＥ−ＡＥＴ）由来部との組成比（モル比）（ａ：ｂ）は、次の比例式で表される。
ａ：ｂ＝（１００−ｘ）：ｘ
【００３６】
＜重量平均分量の測定＞
得られたポリマー５ｍｇを、０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液１ｇへ溶解し、ＧＰＣにより重量平均分量を測定する。測定条件は以下の通りである。
装置：ＲＩ−８０２０（東ソー社製）、ＤＰ−８０２０（東ソー社製）、ＳＤ−８０２２（東ソー社製）、ＡＳ−８０２０（東ソー社製）、８６５−ＣＯ（ＪＡＳＣＯ社製）、カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（ＧＳＭ−７００）、移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液、標準物質：プルラン、検出：視差屈折率計ＲＩ−８０２０（東ソー社製）、重量平均分子量（Ｍｗ）の算出：分子量計プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、試料溶液注入量：１００μＬ、測定時間：３０分間。
【００３７】
合成例１
ＭＰＣ；２２．０５ｇ（０．０７５ｍｏｌ）、４−ＨＢＡＧＥ；９．９６ｇ（０．０５０ｍｏｌ）を、ｎ−プロパノール（ＮＰＡ）；１６２．１４ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの４つ口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、６０℃でｔ−ブチルパーオキシネオデカノエート（ＰＢ−ＮＤ）の１０ｗｔ％ＮＰＡ溶液を５．８６ｇ加えて４時間重合反応後、７０℃に昇温し、さらに２時間反応させポリマーを得た。続いてこの重合液（式（４）で表されるポリマー溶液）２００ｇに、ＡＥＴ；３８．４０ｇ（０．５０ｍｏｌ）を溶解させて昇温し、７５℃で４時間攪拌した。反応終了後、透析精製し、無色透明のポリマー水溶液を得た。得られたポリマーについて、ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲ、元素分析、アミノ基定量、重量平均分子量の測定を行った。結果を以下及び表１に示す。なお、ＩＲ、1Ｈ  ＮＭＲの測定チャートは図１及び図２に示す。
【００３８】
＜合成例１のポリマー＞
（ＩＲ）
３４０２ｃｍ-1（−ＯＨ）、２９５６ｃｍ-1（−ＣＨ）、１７２４ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）、１４８０ｃｍ-1（−ＣＨ）、１２３０ｃｍ-1（Ｐ＝Ｏ）、１０８５ｃｍ-1（−ＯＰＯＣＨ2−）、９６７ｃｍ-1（−Ｎ+（ＣＨ3）3）
（1Ｈ  ＮＭＲ）
０．７０−１．４５ｐｐｍ（−ＣＨ3）、１．４５−２．６０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｃ−、−ＣＨ2−ＣＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、２．６０−３．２０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−）、３．２０−３．４０ｐｐｍ（−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．４０−３．６５ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ）、３．６５−３．８０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．８５−４．００ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−）、４．００−４．１５ｐｐｍ（−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−）、４．１５−４．４０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−Ｐ−、−ＯＣＯ−ＣＨ2−）
（元素分析）
実測値：Ｃ；４７．６１％、Ｈ；７．８７％、Ｎ；４．８８％
理論値：Ｃ；４７．５０％、Ｈ；７．７８％、Ｎ；４．８６％
（アミノ基定量）
検量線及び傾きの算出：
各ＭＥＡ標準溶液の吸光度ｄから算出された検量線の傾きｃは、１．４１１１となった。
ポリマー０．０２５０ｇを０．１Ｌの純水に溶解させ、紫外可視分光光度計を用いて吸光度の測定を行い、上記数式（２）及び（３）を用いてアミノ基濃度及び含量を算出した。結果を以下及び表２に示す。
吸光度ｄ：０．４８９９
アミノ基濃度ｙ（Ｍ）：３．５×１０-4Ｍ
アミノ基含量ｘ（ｍｏｌ％）：４０ｍｏｌ％
（重量平均分子量）：７０，０００
以上の結果より、合成例１で得られたポリマーは、式（１ａ）に示されるＭＰＣに基づく比率が６０ｍｏｌ％、式（１ｂ）で示されるアミノ基を有する構成単位に基づく比率が４０ｍｏｌ％で、ｘは、式（２ａ）、（２ｂ）に示される構造の比が９：１である、重量平均分子量が７０，０００のポリマーである。
【００３９】
合成例２
ＭＰＣ；２４．８０ｇ（０．０８４ｍｏｌ）、４−ＨＢＡＧＥ；７．２０ｇ（０．０３６ｍｏｌ）を、ＮＰＡ；１６２．１４ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの４つ口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、６０℃でＰＢ−ＮＤの１０ｗｔ％ＮＰＡ溶液を５．８６ｇ加えて４時間重合反応後、７０℃に昇温し、さらに２時間反応させポリマーを得た。続いてこの重合液（式（４）で表されるポリマー溶液）２００ｇにＡＥＴ；２７．７７ｇ（０．３６ｍｏｌ）を溶解させて昇温し、７５℃で４時間攪拌した。反応終了後、透析精製し、無色透明のポリマー水溶液を得た。得られたポリマーについて、合成例１と同様に各測定を行った。結果を以下及び表１に示す。
【００４０】
＜合成例２のポリマー＞
（ＩＲ）
３４０２ｃｍ-1（−ＯＨ）、２９５６ｃｍ-1（−ＣＨ）、１７２４ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）、１４８０ｃｍ-1（−ＣＨ）、１２３０ｃｍ-1（Ｐ＝Ｏ）、１０８５ｃｍ-1（−ＯＰＯＣＨ2−）、９６７ｃｍ-1（−Ｎ+（ＣＨ3）3）
（1Ｈ  ＮＭＲ）
０．７０−１．４５ｐｐｍ（−ＣＨ3）、１．４５−２．６０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｃ−、−ＣＨ2−ＣＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、２．６０−３．２０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−）、３．２０−３．４０ｐｐｍ（−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．４０−３．６５ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ）、３．６５−３．８０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．８５−４．００ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−）、４．００−４．１５ｐｐｍ（−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−）、４．１５−４．４０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−Ｐ−、−ＯＣＯ−ＣＨ2−）
（元素分析）
実測値：Ｃ；４７．７０％、Ｈ；７．８３％、Ｎ；４．７８％
理論値：Ｃ；４６．７９％、Ｈ；７．６９％、Ｎ；４．８３％
（アミノ基定量）
ポリマー０．０２５０ｇを０．１Ｌの純水に溶解させ、紫外可視分光光度計を用いて吸光度の測定を行い、上記数式（２）及び（３）を用いてアミノ基濃度及び含量を算出した。傾きｃは、合成例１の値を使用した。結果を以下及び表２に示す。
吸光度ｄ：０．３６５２
アミノ基濃度ｙ（Ｍ）：２．６×１０-4Ｍ
アミノ基含量ｘ（ｍｏｌ％）：３０ｍｏｌ％
（重量平均分子量）：９０，０００
以上の結果より、合成例２で得られたポリマーは、式（１ａ）に示されるＭＰＣに基づく比率が７０ｍｏｌ％、式（１ｂ）で示されるアミノ基を有する構成単位に基づく比率が３０ｍｏｌ％で、ｘは、式（２ａ）、（２ｂ）に示される構造の比が９：１である、重量平均分子量が９０，０００のポリマーである。
【００４１】
合成例３
ＭＰＣ；２７．３７ｇ（０．０９３ｍｏｌ）、４−ＨＢＡＧＥ；４．６３ｇ（０．０２３ｍｏｌ）を、ＮＰＡ；１６２．１４ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの４つ口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、６０℃でＰＢ−ＮＤの１０ｗｔ％ＮＰＡ溶液を５．８６ｇ加えて４時間重合反応後、７０℃に昇温し、さらに２時間反応させポリマーを得た。続いてこの重合液（式（４）で表されるポリマー溶液）２００ｇにＡＥＴ；１７．８８ｇ（０．２３ｍｏｌ）を溶解させて昇温し、７５℃で４時間攪拌した。反応終了後、透析精製し、無色透明のポリマー水溶液を得た。得られたポリマーについて、合成例１と同様に各測定を行った。結果を以下及び表１に示す。
【００４２】
＜合成例３のポリマー＞
（ＩＲ）
３４０２ｃｍ-1（−ＯＨ）、２９５６ｃｍ-1（−ＣＨ）、１７２４ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）、１４８０ｃｍ-1（−ＣＨ）、１２３０ｃｍ-1（Ｐ＝Ｏ）、１０８５ｃｍ-1（−ＯＰＯＣＨ2−）、９６７ｃｍ-1（−Ｎ+（ＣＨ3）3）
（1Ｈ  ＮＭＲ）
０．７０−１．４５ｐｐｍ（−ＣＨ3）、１．４５−２．６０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｃ−、−ＣＨ2−ＣＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、２．６０−３．２０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−）、３．２０−３．４０ｐｐｍ（−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．４０−３．６５ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ）、３．６５−３．８０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．８５−４．００ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−）、４．００−４．１５ｐｐｍ（−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−）、４．１５−４．４０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−Ｐ−、−ＯＣＯ−ＣＨ2−）
（元素分析）
実測値：Ｃ；４５．８９％、Ｈ；７．７８％、Ｎ；４．８２％
理論値：Ｃ；４６．０８％、Ｈ；７．６１％、Ｎ；４．８０％
（アミノ基定量）
ポリマー０．０２５０ｇを０．１Ｌの純水に溶解させ、紫外可視分光光度計を用いて吸光度の測定を行い、上記数式（２）及び（３）を用いてアミノ基濃度及び含量を算出した。傾きｃは、合成例１の値を使用した。結果を以下及び表２に示す。
吸光度ｄ：０．２４１９
アミノ基濃度ｙ（Ｍ）：１．７×１０-4Ｍ
アミノ基含量ｘ（ｍｏｌ％）：２０ｍｏｌ％
（重量平均分子量）：１００，０００
以上の結果より、合成例３で得られたポリマーは、式（１ａ）に示されるＭＰＣに基づく比率が８０ｍｏｌ％、式（１ｂ）で示されるアミノ基を有する構成単位に基づく比率が２０ｍｏｌ％で、ｘは、式（２ａ）、（２ｂ）に示される構造の比が９：１である、重量平均分子量が１００，０００のポリマーである。
【００４３】
合成例４
ＭＰＣ；２９．７６ｇ（０．１０ｍｏｌ）、４−ＨＢＡＧＥ；２．２４ｇ（０．０１１ｍｏｌ）を、ＮＰＡ；１６２．１４ｇに溶解し、温度計と冷却管を付けた５００ｍＬの４つ口フラスコに入れて３０分間窒素を吹き込んだ。その後、６０℃でＰＢ−ＮＤの１０ｗｔ％ＮＰＡ溶液を５．８６ｇ加えて４時間重合反応後、７０℃に昇温し、さらに２時間反応させポリマーを得た。続いてこの重合液（式（４）で表されるポリマー溶液）２００ｇにＡＥＴ；８．６４ｇ（０．１１ｍｏｌ）を溶解させて昇温し、７５℃で４時間攪拌した。反応終了後、透析精製し、無色透明のポリマー水溶液を得た。得られたポリマーについて、合成例１と同様に各測定を行った。結果を以下及び表１に示す。
【００４４】
＜合成例４のポリマー＞
（ＩＲ）
３４０２ｃｍ-1（−ＯＨ）、２９５６ｃｍ-1（−ＣＨ）、１７２４ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）、１４８０ｃｍ-1（−ＣＨ）、１２３０ｃｍ-1（Ｐ＝Ｏ）、１０８５ｃｍ-1（−ＯＰＯＣＨ2−）、９６７ｃｍ-1（−Ｎ+（ＣＨ3）3）
（1Ｈ  ＮＭＲ）
０．７０−１．４５ｐｐｍ（−ＣＨ3）、１．４５−２．６０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｃ−、−ＣＨ2−ＣＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）、２．６０−３．２０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−）、３．２０−３．４０ｐｐｍ  （−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．４０−３．６５ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−Ｓ）、３．６５−３．８０ｐｐｍ（−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．８５−４．００ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−Ｓ−）、４．００−４．１５ｐｐｍ（−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−）、４．１５−４．４０ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−Ｐ−、−ＯＣＯ−ＣＨ2−）
（元素分析）
実測値：Ｃ；４５．４７％、Ｈ；７．５５％、Ｎ；４．７４％
理論値：Ｃ；４５．３９％、Ｈ；７．５３％、Ｎ；４．７７％
（アミノ基定量）
ポリマー０．０２５０ｇを０．１Ｌの純水に溶解させ、紫外可視分光光度計を用いて吸光度の測定を行い、上記数式（２）及び（３）を用いてアミノ基濃度及び含量を算出した。傾きｃは、合成例１の値を使用した。結果を以下及び表２に示す。
吸光度ｄ：０．１２０２
アミノ基濃度ｙ（Ｍ）：８．５×１０-5Ｍ
アミノ基含量ｘ（ｍｏｌ％）：１０ｍｏｌ％
（重量平均分子量）：１１０，０００
以上の結果より、合成例４で得られたポリマーは、式（１ａ）に示されるＭＰＣに基づく比率が９０ｍｏｌ％、式（１ｂ）で示されるアミノ基を有する構成単位に基づく比率が１０ｍｏｌ％で、ｘは、式（２ａ）、（２ｂ）に示される構造の比が９：１である、重量平均分子量が１１０，０００のポリマーである。
【００４５】
【表１】
2015117269.tif 000010
【００４６】
【表２】
2015117269.tif 000011
【００４７】
実施例１
＜非特異的吸着防止効果＞
（１）ポリスチレンプレート表面のブロッキング（カルボキシル基との化学結合）
合成例１のポリマーを、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライドを含むリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）に、終濃度が１０質量％なるように溶解させ、診断薬用ブロッキング剤を調製した。同様に、合成例１のポリマーの終濃度が５質量％、１質量％になる診断薬用ブロッキング剤をそれぞれ調製した。
調製した上記各濃度の診断薬用ブロッキング剤を、表面にカルボキシル基を有するポリスチレン製９６穴プレートに、２００μＬ／ｗｅｌｌになるよう加え、３７℃のプレートインキュベーター内で、２時間反応させた。反応終了後、アスピレーターで液を除去した。その後、０．０５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を４回繰り返し、プレート表面の洗浄を行った。洗浄後、デシケーター内で一晩乾燥させ、合成例１のポリマーをプレート表面に結合させた。
【００４８】
（２）蛋白質の非特異的吸着防止効果の評価
上記（１）で、その表面を合成例１のポリマーでブロッキングしたプレートに０．５ｗｔ％ペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃のプレートインキュベーター内で、１時間反応させた。反応後、アスピレーターで液を除去した。
その後、０．０５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、直ちにアスピレーターで水溶液を除去する工程を４回繰り返し、プレート表面の洗浄をおこなった。洗浄後、０．２ｍｇ／ｍＬの３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジンを含む０．０１ｗｔ％のクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートし残存する蛋白質による発色反応を行い、２Ｎの硫酸で発色反応を停止した。波長４５０ｎｍに対する吸光度を測定し、蛋白質の非特異的吸着防止効果について評価を行った。なお、蛋白質の非特異的吸着防止効果は、下記数式（４）から求められる蛋白質吸着率（％）により評価した。
数式（４）中の測定Ｂｌａｎｋ吸光度値は、一定量のペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を含むリン酸緩衝液を発色させた際の吸光度を表し、標準酵素液分注量はＢｌａｎｋ吸光度を測定した際に使用したペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体を含むリン酸緩衝液の量（μＬ）を表す。評価結果を表３に示す。
【数４】
2015117269.tif 000012
【００４９】
実施例２〜４
合成例２〜４のポリマーを表３に示した濃度とし、実施例１と同様にして実施例２〜４の診断薬用ブロッキング剤を調製した。さらに、実施例１と同様にして非特異的吸着防止効果を評価した。結果を表３に示す。
【００５０】
比較例１
各合成例のポリマーの代わりに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて、非特異的吸着防止効果の評価を行った。ＢＳＡ濃度及び評価結果を表３に示す。
【００５１】
比較例２
各合成例のポリマーの代わりに、ＭＰＣと３−（２−アミノエチルスルファニル）−２−ヒドロキプロピルメタクリレートとの共重合体（共重合体Ｂ）、及びＭＰＣと２−（２−アミノエチルスルファニル）−３−ヒドロキプロピルメタクリレートとの共重合体（共重合体Ｃ）、の混合物を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて、非特異的吸着防止効果の評価を行った。共重合体ＢとＣの混合物の濃度、並びに評価結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
2015117269.tif 000013
【００５３】
表３から明らかなように、実施例１〜４の本発明の実施形態に係るポリマーを使用したブロッキング剤は、比較例のブロッキング剤に比較して蛋白質の吸着率が極めて低く、非特異的吸着を顕著に防止していることが判る。
【図１】
2015117269.tif 000017
【図２】
2015117269.tif 000018