(57)【要約】【課題】複合タンパク質等のヘテロ多量体の構成物質の構成比を簡便に精度よく算出する。【解決手段】複合タンパク質が構成物質毎に分解された試料を液体クロマトグラフィのカラム１３に導入し、構成物質を分離したあとに普遍応答性を有する荷電化粒子検出器１７により検出する。ピーク強度算出部２２は、この検出信号に基づいて作成されたクロマトグラムに現れるピークを検出してその強度を求める。この強度は物質の物性や構造に依存せず、質量濃度にのみ依存する。クロマトグラムピークに対応する物質を質量分析計１８で検出してマススペクトルを取得し、分子量算出部２４は該物質の分子量を算出する。ピーク強度を分子量で除すると構成物質のモル数に相当する値が求まるから、モル比算出部２５は各物質のモル数相当値からモル比を計算する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のタンパク質が結合してなる、又はタンパク質とタンパク質以外の物質とが結合してなる複合タンパク質を含むヘテロ多量体を分析する分析方法であって、
a)分析対象であるヘテロ多量体を少なくとも構成物質に分解したあとにその複数の構成物質をそれぞれ分離する分離ステップと、
b)前記分離ステップにより分離された各構成物質をそれぞれ、普遍応答性を有する第１検出器により検出する第１検出ステップと、
c)前記分離部ステップにより分離された各構成物質をそれぞれ、質量分析計である第２検出器により検出する第２検出ステップと、
d)前記第１検出ステップにおいて得られた検出信号に基づき各構成物質に対する信号強度を算出するとともに、前記第２検出ステップにおいて得られた検出信号に基づき各構成物質の分子量を推定し、各構成物質の信号強度と分子量とからヘテロ多量体の構成物質の構成比を計算するデータ処理ステップと、
を有することを特徴とするヘテロ多量体の分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のヘテロ多量体の分析方法であって、
前記第１検出器は、荷電化粒子検出器、又は蒸発光散乱検出器であることを特徴とするヘテロ多量体の分析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヘテロ多量体の分析方法であって、
前記ヘテロ多量体はヘテロメリックタンパク質であり、該ヘテロメリックタンパク質の酵素消化物を前記分離ステップにおいてサブユニット毎に分離することを特徴とするヘテロ多量体の分析方法。
【請求項４】
複数のタンパク質が結合してなる、又はタンパク質とタンパク質以外の物質とが結合してなる複合タンパク質を含むヘテロ多量体を分析する分析装置であって、
a)少なくとも構成物質に分解された状態である分析対象のヘテロ多量体について、その複数の構成物質をそれぞれ分離する分離部と、
b)前記分離部で分離された各構成物質をそれぞれ検出する普遍応答性を有する第１検出器と、
c)前記分離部で分離された各構成物質をそれぞれ検出する質量分析計である第２検出器と、
d)前記第１検出器で得られた検出信号に基づき各構成物質に対する信号強度を算出するとともに、前記第２検出器で得られた検出信号に基づき各構成物質の分子量を推定し、各構成物質の信号強度と分子量とからヘテロ多量体の構成物質の構成比を計算するデータ処理部と、
を備えることを特徴とするヘテロ多量体の分析装置。
【請求項５】
請求項４に記載のヘテロ多量体の分析装置であって、
前記第１検出器は、荷電化粒子検出器、又は蒸発光散乱検出器であることを特徴とするヘテロ多量体の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合タンパク質等のヘテロ多量体の分析方法及びそのための分析装置に関し、さらに詳しくは、液体クロマトグラフィ及び質量分析を用いた、ヘテロ多量体の分析方法及び分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
複合タンパク質は複数のタンパク質、或いはタンパク質とタンパク質以外の物質、例えば糖、核酸、脂質、色素、金属、リン酸などとが組み合わさって形成された複合体である。例えば、二つ以上の異なるタンパク質が会合してヘテロマ複合体を形成した複合タンパク質は、ヘテロメリックタンパク質と呼ばれる。こうした複合タンパク質は生体内での様々な機能発現に関与する重要な物質であると考えられており、複合タンパク質の構成成分の同定やその構成比の把握は生命科学分野、医療分野、創薬分野などにおいて極めて重要である。そのため、複合タンパク質の解析手法に対する要望は非常に強いが、簡便で且つ正確な解析法は未だに存在しないのが実状である。
【０００３】
例えば、従来、複合タンパク質の解析には専ら、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）やＸ線結晶構造解析が用いられている。しかしながら、ＮＭＲによるタンパク質の構造解析には、同位体元素15Ｎや13Ｃで標識したタンパク質の作製といった面倒な作業が必要である、NOE correlated Spectroscopy（ＮＯＥＳＹ）などの経験と熟練を要する測定法を用いる必要がある、データ処理がかなり煩雑で処理能力の高いコンピュータを必要とする、サンプルを大量に必要とする、といった問題がある。また、Ｘ線結晶構造解析も、メチオニンのセレノメチオニン置換といった面倒な作業が必要である、経験や熟練を要する単結晶化処理が必要である、データ処理がかなり煩雑で処理能力の高いコンピュータを必要とする、サンプルを大量に必要とする、といった、ＮＭＲと同様の問題を有している。
【０００４】
これに対し、ＮＭＲやＸ線結晶構造解析よりも高感度である質量分析を利用したタンパク質構造解析法として、非特許文献１には、クロスリンカ（架橋）を利用したヘテロメリックタンパク質の構造解析法が開示されている。この方法を簡単に説明すると、まず、適当なクロスリンカを用いて特定のペプチドを架橋したあとに消化酵素によりペプチド結合を切断する。そうして得られたペプチド断片混合物を質量分析して、得られたマススペクトルを解析することにより、架橋されたペプチド断片を含むペプチド断片を同定し、その結果から元のヘテロメリックタンパク質の構造を推定する。しかしながら、この方法では、適切なスペーサ長や反応性を有するクロスリンカを使用する必要があって作業が面倒である、リンカで結合されたペプチド由来のピークがマススペクトルに現れるのでマススペクトルはかなり複雑になり解析が難しい、といった問題がある。
【０００５】
また、特許文献１には、水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換によるタンパク質構造解析法が開示されている。タンパク質に存在するヘテロ原子に結合した水素は、重水に溶解すると重水素に交換され、その交換速度は、残基側鎖の極性基に存在する水素原子と主鎖のアミド水素とで大きく異なる。また、折り畳まれた状態のタンパク質の内部にあるアミノ酸は外部の水と接触しにくいため、立体構造の外側（表面）に位置するアミド水素は交換速度が速く、内部に位置するアミド水素は交換速度が遅い。そこで、こうした性質を利用して重水素化効率を解析することによって、タンパク質の構造等を解析することができる。しかしながら、この方法では、異なる重水素化時間で以てＨ／Ｄ交換を何度も繰り返し、そのたびに質量分析を行わなければならないために、作業が煩雑で測定時間もかなり掛かるという問題がある。
【０００６】
さらに、非特許文献２には、イオン移動度／質量分析（ＩＭ−ＭＳ）を用いたヘテロメリックタンパク質の解析法が開示されている。この方法は、ヘテロメリックタンパク質がガス中を通過するときのイオン移動度が通常のタンパク質とは異なることを利用した解析法である。しかしながら、この方法では、イオン源、イオン移動度測定部及び質量分析部において安定であるようなヘテロメリックタンパク質しか測定できない、つまりは、弱い相互作用で以て結合していて途中で分離してしまうようなヘテロメリックタンパク質は測定することができない、イオン移動度からヘテロメリックタンパク質の構造を推定する計算が非常に煩雑である、といった問題がある。
【０００７】
また、上記各手法に比べて格段に簡便な構造解析法として、検出器に紫外可視吸光検出器を用いた液体クロマトグラフィも広く利用されている。しかしながら、分析したい複合タンパク質の構成要素の全てが紫外可視吸収特性を示すわけではないため、分析対象が限られる。また、タンパク質やペプチドに限ってみても、これら物質ではアミド結合の吸収を利用しているが、その吸収強度は必ずしも高くないため、検出感度や検出精度を高くするのが難しいという問題がある。さらに、吸収強度（シグナル強度）はアミド結合の数（ペプチドの長さ）の関数であるので、個々の構成要素であるタンパク質の個数の比率（モル比）は測定することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−３２８７６７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ラプシルバー（Rappsilber J.）、「ザ・ビギニング・オブ・ア・ビューティフル・フレンドシップ：クロス-リンキング/マス・スペクトロメトリ・アンド・モデリング・オブ・プロテインズ・アンド・マルチ-プロテイン・コンプレックセズ（The beginning of a beautiful friendship: Cross-linking/mass spectrometry and modeling of proteins and multi-protein complexes）」、ジャーナルオブストラクチュラルバイオロジー（Journal of Structural Biology）、2011年、173、pp.530-540
【非特許文献２】「ストラクチュラル・モデリング・オブ・ヘテロメトリック・プロテイン・コンプレックセズ・フロム・ディスアセンブリ・パスウェイズ・アンド・イオン・モビリティ-マス・スペクトロメトリ（Structural Modeling of Heteromeric Protein Complexes from Disassembly Pathways and Ion Mobility-Mass Spectrometry）」、ストラクチャ（Structure）、2012年、20、pp.1596-1609
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その主な目的は、ヘテロメリックタンパク質を含む複合タンパク質の構成成分の同定とその構成比の調査を、簡便に、つまりは煩雑で時間を要する作業や特段の経験や熟練を要する作業を行うことなく、高い精度で行うことができるヘテロ多量体の分析方法及び分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために成された本発明に係る分析方法は、複数のタンパク質が結合してなる、又はタンパク質とタンパク質以外の物質とが結合してなる複合タンパク質を含むヘテロ多量体を分析する分析方法であって、
a)分析対象であるヘテロ多量体を少なくとも構成物質に分解したあとにその複数の構成物質をそれぞれ分離する分離ステップと、
b)前記分離ステップにより分離された各構成物質をそれぞれ、普遍応答性を有する第１検出器により検出する第１検出ステップと、
c)前記分離部ステップにより分離された各構成物質をそれぞれ、質量分析計である第２検出器により検出する第２検出ステップと、
d)前記第１検出ステップにおいて得られた検出信号に基づき各構成物質に対する信号強度を算出するとともに、前記第２検出ステップにおいて得られた検出信号に基づき各構成物質の分子量を推定し、各構成物質の信号強度と分子量とからヘテロ多量体の構成物質の構成比を計算するデータ処理ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１２】
また上記課題を解決するために成された本発明に係る分析装置は、上記分析方法を実施する装置であり、複数のタンパク質が結合してなる、又はタンパク質とタンパク質以外の物質とが結合してなる複合タンパク質を含むヘテロ多量体を分析する分析装置であって、
a)少なくとも構成物質に分解された状態である分析対象のヘテロ多量体について、その複数の構成物質をそれぞれ分離する分離部と、
b)前記分離部で分離された各構成物質をそれぞれ検出する普遍応答性を有する第１検出器と、
c)前記分離部で分離された各構成物質をそれぞれ検出する質量分析計である第２検出器と、
d)前記第１検出器で得られた検出信号に基づき各構成物質に対する信号強度を算出するとともに、前記第２検出器で得られた検出信号に基づき各構成物質の分子量を推定し、各構成物質の信号強度と分子量とからヘテロ多量体の構成物質の構成比を計算するデータ処理部と、
を備えることを特徴としている。
【００１３】
ヘテロ多量体とは、互いに異なる構成物質が共有結合、水素結合などによって結合した複合体を指し、ヘテロ二量体、三量体、四量体等を含む。複合タンパク質、タンパク質−核酸複合体、核酸−糖複合体などは、生体関連のヘテロ多量体である。例えば複合タンパク質において、上記「構成物質」とは、互いに結合している各タンパク質や、タンパク質に結合している糖鎖、脂質などである。
【００１４】
また「普遍応答性を有する」とは、酸性、塩基性、中性、分子の大きさ、イオン性などの物質の構造や性質（化学的性質、物理的性質）には依存せず、物質の重量（重量％）、換言すれば質量濃度のみに依存した信号を出力することを意味する。普遍応答性を有する第１検出器としては、荷電化粒子検出器（Charged Aerosol Detector＝ＣＡＤ）、又は蒸発光散乱検出器（Evaporative Light Scattering Detector＝ＥＬＳＤ）などを用いることができる。特に、荷電化粒子検出器は、普遍応答性が強く、高感度で、ダイナミックレンジも広い（直線性が高い）ことから、本発明に係る分析方法及び分析装置に好適である。
【００１５】
また、分離ステップを実行する分離部としては、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）やキャピラリ電気泳動（ＣＥ）などを用いることができるが、扱いの容易さなどから液体クロマトグラフィが好適である。
【００１６】
第２検出器としては、オンラインで、つまり分離ステップにより分離された物質を略リアルタイムで質量分析する場合には、エレクトロスプレイイオン源（ＥＳＩ）や大気圧化学イオン源などの大気圧イオン源を備えた質量分析計を用いればよい。他方、オフラインで、つまり分離ステップにより分離された物質を一旦収集して、あとから質量分析する場合には、第２検出器としては、マトリクス支援レーザ脱離イオン源などを備えた質量分析計を第２検出器として用いればよい。この場合、分離ステップにより分離された物質を含む溶液をスポッティング装置などにより分取してサンプルを調製し、該サンプルに対して質量分析を実行すればよい。
なお、いずれの場合でも、質量分析計はタンデム四重極型質量分析計やイオントラップ飛行時間型質量分析計などの、ＭＳ／ＭＳ分析（ＭＳn分析）が可能な質量分析計を用いることができる。
【００１７】
本発明に係るヘテロ多量体の分析方法において、荷電化粒子検出器などの第１検出器では、複合タンパク質などのヘテロ多量体を構成する全ての構成物質の重量に応じた強度の信号がそれぞれ得られる。第１検出器では、紫外可視吸光検出器とは異なり、光を吸収しない物質も検出が可能である。一方、第２検出器では、例えば第１検出器で検出された構成物質（これ自体は通常未知である）毎のマススペクトルが得られる。インソース分解が起こりにくいイオン化法を用いれば、マススペクトルには構成物質の分子量を反映した分子量関連イオンピークが現れるから、これを抽出し、その質量電荷比m/zを調べることで構成物質の分子量を高い確度で推定できる。
【００１８】
或る一つの構成物質の重量つまり質量濃度と分子量とが判明すれば、その質量濃度を分子量で除することにより、その構成物質のモル数が得られる。そこで、データ処理部により実行されるデータ処理ステップでは、第１検出器及び第２検出器でそれぞれ得られた結果に基づき、上記のような演算処理を行うことで、ヘテロ多量体の各構成物質のモル比、つまりは構成比を計算する。これにより、ヘテロ多量体を構成する物質（例えばタンパク質やタンパク質に結合しているタンパク質以外の物質）の構成比を求めることができる。また、構成物質が未知である場合、例えば分子量から構成物質を同定することができる。
【００１９】
なお、分離ステップでは分析対象であるヘテロ多量体の構成物質をその物質種毎に分離する必要があるから、液体クロマトグラフィやキャピラリ電気泳動などの分離手法を用いる場合には、予めヘテロ多量体を構成物質毎に分解し、そうした構成物質の混合物に対して上記分離手法を適用すればよい。ヘテロ多量体がヘテロメリックタンパク質である場合には、該ヘテロメリックタンパク質を適宜の酵素（例えばトリプシンリシルエンドペプチダーゼ等の特異的エンドペプチダーゼ）で消化することで、タンパク質同士やタンパク質とそれ以外の物質との結合を切断し、その消化物（構成物質つまりはサブユニットの混合物）を分離ステップにおいてサブユニット毎に分離するようにすればよい。これにより、ヘテロメリックタンパク質のサブユニット構成比を算出することができる。
また、分析対象のヘテロ多量体が、生体関連ヘテロ多量体以外の、化学工業分野、医薬分野等のヘテロ多量体であっても、構成物質同士の結合様式に応じて切断方法を当業者が適宜選択し、構成物質毎に分解し、得られた構成物質の混合物に対して上記分離手法を適用すればよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るヘテロ多量体の分析方法及び分析装置に利用されている技術、即ち、液体クロマトグラフィなどの分離手法、荷電化粒子検出器などの普遍応答性を有する第１検出器による成分検出、質量分析計である第２検出器による成分検出、などはいずれも特殊なものでなく、測定の実行に際して煩雑で熟練を要するような作業は不要である。また、また、第１検出器や第２検出器により得られるデータは単純なクロマトグラムデータやマススペクトルデータであり、構成物質の構成比を算出するに際し、複雑で経験や熟練を要するようなデータ解析は不要である。そのため、本発明に係るヘテロ多量体の分析方法及び分析装置によれば、経験や熟練に乏しい分析者であっても簡便に、複合タンパク質等のヘテロ多量体の構成物質のモル濃度やモル比などを精度よく求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係るヘテロ多量体の分析方法を実施する分析装置の一実施例である複合タンパク質解析システムの概略構成図。
【図２】図１に示した複合タンパク質解析システムにおいてグラジエント分析を行うときの分離部の構成図。
【図３】本発明に係るヘテロ多量体の分析方法の一実施例における複合タンパク質の構成物質のモル比算出の原理説明図。
【図４】本実施例の複合タンパク質解析システムにおいて荷電化粒子検出器で得られた検出信号に基づいて作成されたクロマトグラムの一例を示す図。
【図５】本実施例の複合タンパク質解析システムにおいて質量分析計で得られた検出信号に基づいて作成されたマススペクトルの一例を示す図。
【図６】図５中のm/z-1378.4019のイオンをプリカーサイオンとして得られるＭＳ／ＭＳスペクトルの一例を示す図。
【図７】図４〜図６に示した結果に基づいて計算されるαサブユニット、βサブユニットの構成比を示す図。
【図８】本実施例の複合タンパク質解析システムで用いた荷電化粒子検出器の普遍的応答性の検証結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に係るヘテロ多量体の分析方法を実施する分析装置の一実施例である複合タンパク質解析システムについて、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例の複合タンパク質解析システムの概略構成図、図２は図１に示した複合タンパク質解析システムにおいてグラジエント分析を行うときの分離部の構成図、図３はこのシステムで実施される複合タンパク質の構成物質のモル比算出のための原理説明図である。
【００２３】
本実施例の複合タンパク質解析システムは、分析対象である試料に含まれる複数の物質を分離する分離部と、分離された各物質を検出する検出部と、その検出結果に基づくデータ処理により、試料に含まれる各物質のモル数及びそれら物質のモル比を計算する処理部と、を含む。ここで、分析対象物質は典型的には、ヘテロメリックタンパク質、糖タンパク質、糖ペプチド、リポタンパク質、核タンパク質、金属タンパク質、リンタンパク質などの複合タンパク質であるが、それ以外に、タンパク質−核酸複合体、核酸−糖複合体などの各種の生体関連ヘテロ多量体を分析対象とすることができる。また、生体関連物質に限らず、化学工業分野、医薬分野などにおけるヘテロ多量体も分析対象とすることができ、それらの構成物質としては普遍応答性を有する検出器で検出できる物質であればよく、具体的には不揮発性物質、半揮発性物質であればよい。これらとしては、界面活性剤、天然又は合成ポリマ、低分子化合物等、様々な化合物を挙げることができる。
【００２４】
図１に示す複合タンパク質解析システムにおいて、分離部は、移動相溶液が貯留された移動相容器１０、該移動相を送給する送液ポンプ１１、移動相中に試料を注入するインジェクタ１２、試料中の物質を分離するカラム１３、及び、カラム１３出口からの溶出液を２系統に分岐するスプリッタ１６、を含む液体クロマトグラフィである。この液体クロマトグラフィは、逆相モード、サイズ排除モード等、試料中の物質の回収率が良好であるものが好ましい。また、分離手法は液体クロマトグラフィでなく、キャピラリ電気泳動など他の手法であってもよい。
【００２５】
上記スプリッタ１６により分岐された溶出液は、第１検出器である荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）１７と第２検出器である質量分析計（ＭＳ）１８とに導入される。第１検出器は、物質の構造や性質に依存せずにほぼ均一な応答性を有する、普遍応答性の強い検出器であることが必須であり、荷電化粒子検出器のほかに蒸発光散乱検出器等でもよい。特に荷電化粒子検出器は普遍応答性が強く、しかも高感度でダイナミックレンジも広いことから好適である。一方、質量分析計１８は質量分析結果から測定対象物質の分子量を推定し易いものである必要があり、そのために、ＥＳＩイオン源やＭＡＬＤＩイオン源など、イオン化に際してイオンの解離が生じにくいソフトなイオン化法を用いた質量分析計が好適である。
なお、質量分析計１８はＭＳ／ＭＳ分析を実行しない通常の質量分析計でもよいが、後述するようにＭＳ／ＭＳイオンサーチ法などによりペプチド同定を行う場合には、三連四重極型質量分析計やイオントラップ飛行時間型質量分析計など、ＭＳ／ＭＳ分析（又はｎが２以上であるＭＳn分析）を実行可能な質量分析計を用いればよい。
【００２６】
荷電化粒子検出器１７及び質量分析計１８による検出信号はいずれもデータ処理部２０に入力される。データ処理部２０は、クロマトグラム作成部２１、ピーク強度算出部２２、マススペクトル作成部２３、分子量算出部２４、モル比算出部２５、クロマトグラム修正部２６などの機能ブロックを含み、その処理結果を表示するための表示部３０がデータ処理部２０に接続されている。実際には、データ処理部２０に含まれる上記各機能は、パーソナルコンピュータやワークステーションをハードウエア資源とし、それらに予めインストールされた専用の処理ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現するようにすることができる。なお、当然のことながら、本実施例のシステムは各部の動作を制御する制御部も備えるが、これについては記載を省略している。
【００２７】
本実施例の複合タンパク質解析システムにおける特徴的な測定及びその結果に基づく解析動作を、図３を参照して説明する。
ここでは、図３（ａ）に示すように、１個のα分子（サブユニット）に２個のβ分子（サブユニット）が結合した複合タンパク質を分析対象物質として考える。この複合タンパク質に対し適宜の酵素などを用いた前処理によって、分子同士の結合を切断し、α分子とβ分子の混合物を試料として用意する。この試料をインジェクタ１２から移動相中に注入してカラム１３に導入する。カラム１３を通過する間にα分子とβ分子とは分離され、時間的にずれてカラム１３から溶出する。荷電化粒子検出器１７は溶出液中の物質の物性等に依らず、重量濃度に応じた検出信号を出力する。
【００２８】
荷電化粒子検出器１７において、被検出物の重量濃度Ｘと検出器の応答であるピーク強度Ａとの関係は次の(1)式で表される。
Ａ＝ａ・Ｘb      …(1)
ここで、ａ、ｂは定数である。ただし、複合タンパク質などを対象とする分析はnmolやpmolといった低濃度の測定であり、このような測定では、(1)式は(2)式で近似できる。
Ａ＝ａ＋ｂ・Ｘ      …(2)
即ち、ピーク強度Ａは被検出物の重量濃度Ｘに比例する。
【００２９】
クロマトグラム作成部２１は、荷電化粒子検出器１７において時々刻々と得られる検出信号に基づいてクロマトグラムを作成する。図３（ｂ）にそのクロマトグラムの一例を示す。クロマトグラムには、分子αの保持時間ｔ1の位置に分子αの重量濃度を反映した高さ（ピーク強度）ＡαのピークＰαが現れ、分子βの保持時間ｔ2の位置に分子βの重量濃度を反映した高さ（ピーク強度）ＡβのピークＰβが現れる。ピーク強度算出部２２はクロマトグラム上に現れるこうしたピークを検出し、そのピーク強度又はピーク面積をそれぞれ算出する。
【００３０】
一方、質量分析計１８では所定の質量電荷比範囲に亘るスキャン測定を繰り返し実行するか、或いは、少なくともクロマトグラムに現れたピークの出現位置においてスキャン測定を実行する。なお、後者のように、ピーク出現位置においてのみスキャン測定を実施するためには、溶出液が質量分析計１８に導入されるタイミングを荷電化粒子検出器１７に導入されるタイミングよりも遅らせるように流路系を構成すればよい。いずれにしても、マススペクトル作成部２３は質量分析計１８から得られる検出信号に基づいて、クロマトグラム上のピークの元となった物質（この例では分子α又は分子β）が反映されたマススペクトルを作成する。一般に、マススペクトルには、元の分子に１個のプロトンが付加したプロトン付加イオンピークなどの分子量関連イオンピークが高い強度で出現する。そこで、分子量算出部２４はマススペクトル上から分子量関連イオンピークを抽出し、そのピークの位置から分子量Ｍを推定する。いま例えば、ピークＰαに対する分子αの分子量がＭα、ピークＰβに対する分子βの分子量がＭβと推定されたものとする。
【００３１】
(2)式から、クロマトグラム上の各ピークの強度Ａをその化学種の分子量Ｍで除すると、次の(3)式が得られる。
Ａ／Ｍ＝ａ／Ｍ＋ｂ・（Ｘ／Ｍ）      …(3)
即ち、これはモル数に比例することになり、モル数相当の値であるといえる。
そこで。モル比算出部２５は、ピーク毎のピーク強度の情報と分子量に関する情報とを受け、ピークＰαに対する分子αとピークＰβに対する分子βとのモル比Ｐを次の(4)式により計算する。
Ｐ＝（Ａα／Ｍα）：（Ａβ／Ｍβ）      …(4)
こうした計算によって、図３（ａ）に示した複合タンパク質の例では、分子αと分子βとのモル比Ｐが１：２であると求まる。
【００３２】
こうして得られた結果をそのまま数値として出力してもよいが、ここでは、クロマトグラム修正部２６が算出されたモル比に応じてピークの強度を修正したクロマトグラムを作成する。即ち、上記例では、モル比が１：２であるから、ピークＰβの高さに２（＝２／１）を乗じることで、モル比に応じて強度の調整を実施する。その結果、クロマトグラムは図３（ｃ）に示すように修正されることになる。こうして修正されたクロマトグラムをモル比の数値とともに表示部３０の画面上に表示し、分析者に結果を知らせる。これによって、分析者は複合タンパク質を構成する分子の構成比（モル比）を容易に把握することができる。なお、実際には、ピーク高さから求まる強度Ａに代えて、ピーク面積（ピーク開始点から終了点までの強度の積算値）を用いたほうが、より精度の高いモル数やモル比を求めることができる。
【００３３】
複合タンパク質を構成する物質が未知である場合には、算出した分子量を例えばデータベースに照らすことでその物質を同定し、その同定結果を併せて表示すればよい。また、複合タンパク質に含まれるタンパク質やペプチドが未知である場合には、後述するように質量分析計１８においてＭＳ／ＭＳ分析（又はｎが３以上のＭＳn分析）を行い、その結果をＭＳ／ＭＳイオンサーチなどの手法に供してペプチドの同定や構造推定を行うようにするとよい。
複合タンパク質を構成する物質が未知である場合には、後述するように質量分析計１８においてクロマトグラム上の各ピークに対するＭＳ／ＭＳ分析（又はｎが３以上のＭＳn分析）を行い、その結果をＭＳ／ＭＳイオンサーチなどの手法に供してペプチドの同定や構造推定を行うようにするとよい。酵素消化等を用いて各構成要素をばらばらにして測定する方法は各構成要素からの複数のペプチド断片等を荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）及びＭＳで検出することが可能であるため、信頼性の高い結果が得られるという利点がある。
【００３４】
なお、荷電化粒子検出器は一般に普遍応答が強いと言われているものの、試料溶媒の粘性や表面張力等の変化によって、その普遍応答性が損なわれることがある。そのため、グラジエント分析など、荷電化粒子検出器に導入される液中の溶媒組成が分析中に動的に変化する分離手法を用いる場合には注意を要する。具体的な対応策としては、グラジエント分析における溶媒組成の変化は既知であるから、その変化に伴う荷電化粒子検出器の応答の変化を算術的に、つまり信号処理によって補正ことが考えられる。こうした補正により実質的に荷電化粒子検出器の普遍応答性を確保することは従来から提案されていることである。
【００３５】
また、図２に示すように、グラジエント分析のための分離部と別に、逆グラジエントのための手段を設けてもよい。即ち、図２に示したシステムでは、移動相容器１０Ａ、１０Ｂからそれぞれ送液ポンプ１１Ａ、１１Ｂで吸引された移動相Ａ、Ｂが混合されてインジェクタ１２を経てサンプル分離用カラム１３Ａに導入される。これに対し、移動相容器１０Ｃ、１０Ｄからそれぞれ送液ポンプ１１Ｃ、１１Ｄで吸引された移動相Ｂ、Ａが混合されて、サンプル分離用カラム１３Ａと全く同じ特性のダミーカラム１３Ｂに導入される。そして、サンプル分離用カラム１３Ａ出口からの溶出液とダミーカラム１３Ｂ出口からの溶出液とがミキシングティー１５で均一に混合されてスプリッタ１６へ送られる。送液ポンプ１１Ａ、１１Ｂの送液流量を調整することで移動相Ａ、Ｂの混合比率が決まるが、この混合比率の逆の混合比率となるように送液ポンプ１１Ｃ、１１Ｄの送液流量は調整される。このため、ミキシングティー１５で均一に混合され荷電化粒子検出器１７に導入される試料溶液の溶媒組成は一定に維持され、荷電化粒子検出器１７の普遍応答性が担保される。
【００３６】
次に、図１に示した本実施例の複合タンパク質解析システムに図２に示した分離部を適用したシステムを用いた実験例について説明する。
この実験では、質量分析計１８として、島津製作所製のマトリクス支援レーザ脱離イオン化イオントラップ飛行時間型質量分析計（製品名：AXIMA Resonance）を用い、ＭＡＬＤＩ分析用のターゲットプレートには株式会社島津製作所製AXIMAシリーズ用SUS304ターゲットプレート、マトリクスにはゲンチジン酸（和光純薬工業株式会社製のＤＨＢ）を用いた。
【００３７】
［実験例１］
この実験例１では、ヘテロメリックタンパク質の一種であるヒトヘモグロビン（ＨＨＢ；シグマ-アルドリッチ社製、Hemoglobin human、lyophilized powder）をトリプシン（プロメガ社製、Sequencing Grade Modified Trypsin）で消化して得られた混合物を分析対象とし、ヒトヘモグロビンのサブユニット（分子）の構成比が算出可能であるか否かを検証した。ＨＨＢは、互いに異なるアミノ酸配列を有する二つのサブユニット、即ち、αサブユニットとβサブユニットとが１：１の構成比で結合してヘテロメリックタンパク質が構成されたものである。
【００３８】
＜測定及び解析手順＞
（１）５０[mM]の炭酸水素アンモニウム溶液にＨＨＢを８．０５[μg/μL]となるように溶解し、このＨＨＢ溶液２０[μL]に対し、８０[μL]のアセトニトリルを添加した。
（２）さらに、２００[mM]の２-メルカプとエタノールとを含む５０[mM]炭酸水素アンモニウム溶液を１[μL]添加し、８０℃で４５分間加温してＨＨＢ溶液とした。
（３）３００[μL]の５０[mM]炭酸水素アンモニウム溶液に、２[μg/μL]となるようにトリプシンを溶解し、このトリプシン溶液を２０[μg/μL]だけ採取して、（２）のＨＨＢ溶液に添加して３７℃で２４時間加温してＨＨＢを消化した。
（４）０．５[μL]のヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）を加えることで消化反応を停止させ、８０℃に加温しながら遠心エバポレータを用いて脱溶媒を行った。
（５）１００[μL]の０．０１[v/v％]ヘプタフルオロ酪酸／水を加えてＨＨＢ消化物を溶解させ、これを分析対象の試料とした。
【００３９】
（６）図２に示したグラジエント分析のための液体クロマトグラフィの移動相Ａとしては０．０１[v/v％]のＨＦＢＡ／水、移動相Ｂとしては０．０１[v/v％]のＨＦＢＡ／アセトニトリルを用い、カラムはサンプル分離用カラム１３Ａ、ダミーカラム１３Ｂ共に非多孔性C18カラムであるPresto FF-C18、３×２５０[mm]（インタクト社製）を用いた。カラム温度は８０℃、移動相流速は０．２８[ml/min]で、送液ポンプ１１Ａ、１１Ｂを使用してグラジエント分析（０−１分：Ｂ濃度１．５％、１−６０分：Ｂ濃度１．５−４０％、６０−８０分：Ｂ濃度４０−８０％、８０−８５分：Ｂ濃度８０−１．５％）を行った。また、溶媒組成による荷電化粒子検出器１７の応答性変化を回避するために、送液ポンプ１１Ｃ、１１Ｄも同様にグラジエント（０−１分：Ｄ濃度１．５％、１−６０分：Ｄ濃度１．５−４０％、６０−８０分：Ｄ濃度４０−８０％、８０−８５分：Ｄ濃度８０−１．５％）を行い、荷電化粒子検出器１７に導入される溶出液中の溶媒組成が変化しないように留意した。そして、（５）のＨＨＢの消化物のうち０．５[μL]をインジェクタ１２から移動相中に注入し、サンプル分離用カラム１３Ａで分離された測定対象物質をオンラインで荷電化粒子検出器１７により検出した。
【００４０】
（７）スプリッタ１６でスプリットされた溶出液を、質量分析計１８で分析するために１０秒間隔で分取した。
（８）（７）で分取された溶出液のうち、荷電化粒子検出器１７による検出信号に基づいて作成されるクロマトグラム上でピークが観測された保持時間に対応する溶出液のみを選択し、その選択された溶出液にマトリクスを加えてそれぞれサンプルを調製した。そして、各サンプルについて、質量分析計１８によりイオン解離を行わない質量分析を実施するとともに、その質量分析で得られるマススペクトル上の有意な各ピークに対応するイオンをプリカーサイオンとしたＭＳ／ＭＳ分析をそれぞれ実施した。
（９）荷電化粒子検出器１７による検出信号に基づくクロマトグラム上のピークの面積は、島津製作所社製のデータ処理用ソフトウエアであるLabSolutionsにより求めた。また、質量分析計１８において得られたＭＳ／ＭＳスペクトルから抽出したピーク情報を、マトリクス・サイエンス社製のマスコット（Mascot）に搭載されているＭＳ／ＭＳイオンサーチに供することにより、マススペクトル上の各ピークに対応したペプチドを同定するとともに、その分子量を取得した。
【００４１】
＜実験結果＞
図４は、この実験例１で得られたヒトヘモグロビンに対するクロマトグラムである。上述したように、逆グラジエントを利用しているため、グラジエント分析による液体クロマトグラフィを実行しているものの、クロマトグラム上の各ピークの面積は測定対象中の各測定物質の質量濃度に応じたピーク面積となっている。
【００４２】
この図４に示したクロマトグラム上のａ１〜ａ４、ｂ１〜ｂ４の各ピークについて、質量分析計１８により質量分析及びＭＳ／ＭＳ分析を行った。図５は図４中にｂ２で示したピーク（保持時間：２７．５分）についてのマススペクトルである。図６は図５中で信号強度が最も大きい（つまりはｂ１のピークに対応する物質の分子量関連イオンである可能性が高い）ピーク（m/z:１３７８．４０１９）をプリカーサイオンとしたＭＳ／ＭＳスペクトルである。このＭＳ／ＭＳスペクトルから収集したピーク情報に対するＭＳ／ＭＳイオンサーチの結果、これは、ＨＨＢのβサブユニットに由来するトリプシン消化断片、［Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala Ala Tyr Gln Lys］であると同定された。
【００４３】
図７は図４中のａ１〜ａ４、ｂ１〜ｂ４の各ピークのピーク面積、及びＭＳ／ＭＳイオンサーチにより同定されたアミノ酸配列をまとめたものであり、（ａ）にはＨＨＢのαサブユニット由来のトリプシン消化断片、（ｂ）にはβサブユニット由来のトリプシン消化断片をまとめてある。また図７には、それぞれのピーク面積をその分子量で除した値（モル数相当値）も示してある。αサブユニット由来の消化断片ではモル数相当値の平均は１４１．２、βサブユニット由来の消化断片ではモル数相当値の平均は１２１．４となっている。この比、つまりはモル比はおおよそ１：１となっており、実際のＨＨＢのサブユニット構成比と一致しているといえる。これによって、ヘテロメリックタンパク質のサブユニット構成比の推定が十分に可能であることが確認できた。
【００４４】
なお、厳密にいえば、荷電化粒子検出器では測定対象物質の質量濃度に対しその応答信号をプロットすると、一次式の直線ではなく２次式の放物線状となる。しかしながら、狭い範囲では両者の関係は直線であるとみなすことができる。そのため、単純にαサブユニット由来の消化断片のピーク面積／分子量とβサブユニット由来の消化断片のピーク面積／分子量とを比較しても、実質的に問題となることはない。
【００４５】
［実験例２］
この実験例２では、カラムによる物質の分離を行うことなく、フローインジェクション法による試料注入を行い、荷電化粒子検出器の普遍応答性を確認した。
【００４６】
＜測定及び解析手順＞
（１）測定対象としては以下の６種類のペプチドを用いた。なお、全てシグマ-アルドリッチ社製である。
（Ａ）アンジオテンシンＩ（Ang Ｉ）；モノアイソトピック質量１２９５．６８
（Ｂ）アンジオテンシンII（Ang II）；モノアイソトピック質量１０４５．５４
（Ｃ）繊維素ペプチドＢ（Glu-1-Fib）；モノアイソトピック質量１５６９．６７
（Ｄ）Ｎ-アセチル-レニン基質 テトラデカペプチド（N-Ac Renin）；モノアイソトピック質量１７９９．９４
（Ｅ）副腎皮質刺激ホルモンフラグメント（ACTH 18-39）；モノアイソトピック質量２４６４．２０
（Ｆ）副腎皮質刺激ホルモンフラグメント（ACTH 7-38）；モノアイソトピック質量３６５６．９３
【００４７】
（２）（１）に記載の６種のペプチドを、０．０１[v/v％]であるＨＦＢＡを含む５０[v/v％]アセトニトリル／水に１００[μg/μL]となるようにそれぞれ溶解させた。
（３）０．０１[v/v％]であるＨＦＢＡを含む５０[v/v％]アセトニトリル／水を移動相とし、０．２[mL/min]の流速で供給する移動相中にインジェクタから１[μL]のサンプルを注入した。
【００４８】
図８は、１００[ng]の上記６種類のペプチドをフローインジェクション法を用いて荷電化粒子検出器で検出したときのクロマトグラム上に現れるピークの面積の平均値、及び標準偏差である。それぞれのペプチドのピーク面積を比較すると、約２０％以内の誤差に収まっている。これにより、荷電化粒子検出器はペプチドの物性に依らず普遍応答することが確認できた。したがって、実験例１のような結果は、その実験に用いられた複合タンパク質のみならず、サブユニット（構成物質）が相違する他の構成の複合タンパク質においても十分に得ることができるといえる。
【００４９】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５０】
１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ…移動相容器
１１、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ…送液ポンプ
１２…インジェクタ
１３、１３Ａ、１３Ｂ…カラム
１５…ミキシングティー
１６…スプリッタ
１７…荷電化粒子検出器
１８…質量分析計
２０…データ処理部
２１…クロマトグラム作成部
２２…ピーク強度算出部
２３…マススペクトル作成部
２４…分子量算出部
２５…モル比算出部
２６…クロマトグラム修正部
３０…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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