(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、慢性的な下痢を誘導した過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製する方法を提供することである。【解決手段】  本発明者らは、免疫低下によって腸内細菌の異常増殖おきること、および腸内細菌の異常増殖が過敏性腸症候群下痢型の発症につながることに着目した。このことから、動物に免疫抑制剤を投与することで慢性的な下痢が誘導されることを見出し、本発明を完成させた。【選択図】図１
2015000001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物に、免疫抑制剤を投与することを特徴とする、慢性の下痢を誘導する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られる、慢性の下痢が誘導された、過敏性腸症候群下痢型モデル動物。
【請求項３】
請求項１に記載の方法により、慢性の下痢が誘導された非ヒト哺乳動物を取得することを含む、過敏性腸症候群下痢型モデル動物の作製方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製し、その過敏性腸症候群下痢型モデル動物に被験物質を投与し、さらに該動物における、下痢症状、腸運動性、内臓痛覚過敏からなる群から選ばれた少なくとも１種類以上を評価することを特徴とする、過敏性腸症候群下痢型を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により得られる、慢性の下痢が誘導された、免疫不全疾患による下痢のモデル動物。
【請求項６】
請求項１に記載の方法により得られる、慢性の下痢が誘導された非ヒト哺乳動物を取得することを含む、免疫不全疾患による下痢のモデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下痢型の過敏性腸症候群モデル動物の作製方法、および下痢型の過敏性腸症候群の治療に有効なプロピオン酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管機能異常症（Functional Gastrointestinal disorders:FGIDs）は器質的疾患を有さない消化管疾患の一群である。消化管の運動や知覚といった機能の異常が原因となり、罹患部位によって腹痛や嘔気、嘔吐、腹部膨満感、下痢や便秘のような排便異常など様々な症状をきたす。
FGIDsに含まれる過敏性腸症候群（Irritable bowel syndrome: IBS）は下部消化管の機能異常によって起こり、その病態生理は腸管の運動異常であることが分かっている。その症状は、腹痛や腹部不快感（排便によって軽快することを特徴とする）、便通の異常（下痢、便秘、下痢・便秘の混合）、便性の異常（粘液の混入、硬さの異常）、腹部膨満感などが観察される。下痢型では腸管通過時間の短縮、便秘型では腸管通過時間の延長が認められる。
従来、ストレスがIBSの原因とされていたが、近年では腸内細菌叢の乱れもIBSの原因として注目されている（非特許文献１〜6）。
【０００３】
IBS下痢型の病態モデル動物としては、恐怖条件付けストレス誘発排便亢進モデル、拘束ストレス誘発排便亢進モデル、セロトニン誘発下痢モデル（特許文献１）、ヒマシ油誘発下痢などが知られている。しかし、実際のIBSで観察されるような慢性の下痢を再現できる病態モデル動物がさらに求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１４０４１５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】DuPont A.W. and DuPont H.L., Nat Rev Gastroenterol Hepatol 8, 523-531,2011
【非特許文献２】Al-Khatib K. and Lin H.C., Gut and Liver 3(1), 14-19, 2009
【非特許文献３】Posserud I. et al, Gut 56, 802-808, 2007
【非特許文献４】Lee H.R. and Pimentel M., Curr Gastroenterol Rep 8(4), 305-311, 2006
【非特許文献５】Van Citters G.W. and Lin H.C., Curr Gastroenterol Rep 7(4),  317-320,2005
【非特許文献６】Malinen E., et al, Am J Gastroenterol 100(2), 373-382, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、慢性的な下痢を誘導した過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、免疫低下によって腸内細菌の異常増殖おきること、および腸内細菌の異常増殖が過敏性腸症候群下痢型の発症につながることに着目した。このことから、動物に免疫抑制剤を投与することで慢性的な下痢が誘導されることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
具体的には、マウスを用いたin vivo試験において、免疫抑制剤を投与した後に下痢が誘導され、さらに腸管バリア機能の低下、免疫機能の低下・破綻、腸内総菌数の増加、及び腸内細菌叢の構成の乱れが観察された。これらの現象の多くはヒトの過敏性腸症候群下痢型患者において特徴的に見られることが報告されている（非特許文献１〜6）。従って、本発明の方法により慢性的な下痢を誘導した過敏性腸症候群下痢型のモデル動物を作製することができた。また、本発明の方法により、過敏性腸症候群下痢型の病態を改善しうる素材を見出すこともできた。さらに、本発明の方法は、免疫が抑制された状態（免疫不全疾患など）で起きる下痢症状のモデル動物を作製することも可能である。
【０００９】
すなわち、本発明は、
[１]  非ヒト哺乳動物に、免疫抑制剤を投与することを特徴とする、慢性の下痢を誘導する方法、
[２]  免疫抑制剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤からなる群から選ばれた少なくとも１種類以上である、前記[１]に記載の方法、
[３]  免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤である、前記[２]に記載の方法、
[４]  免疫抑制剤が、タクロリムスである、前記[３]に記載の方法、
[５]  一日当たりの免疫抑制剤の投与量が、0.6〜50mg/kg body weightである、前記[１]〜[４]のいずれか１つに記載の方法、
[６]  免疫抑制剤の投与期間が、連続した5〜25日である、前記[１]〜[５]のいずれか１つに記載の方法、
[７]  非ヒト哺乳動物が、齧歯類又はウサギ類である、前記[１]〜[６]のいずれか１つに記載の方法、
[８]  非ヒト哺乳動物が、マウスである、前記[７]に記載の方法、
[９]  前記[１]〜[８]のいずれか１つに記載の方法により得られる、慢性の下痢が誘導された、過敏性腸症候群下痢型モデル動物、
[１０]  前記[１]〜[８]のいずれか１つに記載の方法により、慢性の下痢が誘導された非ヒト哺乳動物を取得することを含む、過敏性腸症候群下痢型モデル動物の作製方法、
[１１]  前記[１０]に記載の方法により過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製し、その過敏性腸症候群下痢型モデル動物に被験物質を投与し、さらに該動物における、下痢症状、腸運動性、内臓痛覚過敏からなる群から選ばれた少なくとも１種類以上を評価することを特徴とする、過敏性腸症候群下痢型を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法、
[１２]  過敏性腸症候群下痢型の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法である、前記[１１]に記載のスクリーニング方法、
[１３]  過敏性腸症候群下痢型の予防用食品及び／又は治療用食品のスクリーニング方法である、前記[１１]に記載のスクリーニング方法、
[１４]  前記[１]〜[８]のいずれか１つに記載の方法により得られる、慢性の下痢が誘導された、免疫不全疾患による下痢のモデル動物、
[１５]  前記[１]〜[８]のいずれか１つに記載の方法により得られる、慢性の下痢が誘導された非ヒト哺乳動物を取得することを含む、免疫不全疾患による下痢のモデル動物の作製方法、
[１６]  免疫抑制剤の投与で誘導される慢性の下痢を抑制する、Propionibacterium freudenreichii ET-3株（受託番号：FERM
BP-8115）、
[１７]  過敏性腸症候群下痢型を抑制する、Propionibacterium freudenreichii ET-3株（受託番号：FERM BP-8115）、
[１８]  免疫不全疾患による下痢を抑制する、Propionibacterium freudenreichii ET-3株（受託番号：FERM BP-8115）、からなる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によって、慢性的な下痢を誘導したIBS下痢型のモデル動物を作製することができる。また、得られたモデル動物を用いてIBS下痢型の予防／治療により有効な素材をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、糞便の性状を評価した結果。グラフは便性スコアのmean±SE(n=5)を表す。＊＊：p<0.01  vs.  control群（Student's  t-test）。
【図２】実施例１において、血中LPS濃度およびIL-6濃度を測定した結果。グラフはmean±SE(n=5)を表す。＊：p<0.05  vs.  control群（Student's  t-test）。
【図３】実施例２において、糞便の性状を評価した結果。グラフは便性スコアのmean±SE(n=5)を表す。＊＊：p<0.01  vs.  control群（Student's  t-test）。
【図４】実施例２において、血中サイトカイン濃度を測定した結果を示す。グラフはmean±SE(n=5)を表す。＃：p<0.1、＊：p<0.05（Student's  t-test）。
【図５】実施例２において、脾臓の免疫細胞ポピュレーションを解析した結果を示す。グラフは存在比のmean±SE(n=5)を表す。＊：p<0.05（Student's  t-test）。
【図６】実施例２において、血中LPS濃度を測定した結果を示す。グラフはmean±SE(n=5)を表す。＊：p<0.05（Student's  t-test）。
【図７】実施例２において、Bacterial Translocationを検出した結果を示す。グラフはBacterial Translocationの陽性率を表す。
【図８】実施例２において、回腸組織におけるoccludinの遺伝子発現量を測定した結果を示す。グラフはGAPDHに対するoccludinのmRNA発現量について、mean±SE(n=5)を表す。＊：p<0.05（Student's  t-test）。
【図９】実施例３において、糞便の性状を評価した結果。グラフは便性スコアのmean±SD(n=7)を表す。＊＊：p<0.01  vs.  control群（Student's  t-test）。
【図１０】実施例３において、腸内細菌叢を次世代シーケンサーで解析した結果。グラフはmean±SD(n=7)を表す。＊：p<0.05、＊＊：p<0.01（Student's  t-test）。
【図１１】実施例３において、腸内細菌叢をｑ−ＰＣＲで解析した結果。グラフはmean±SD(n=7)を表す。＊：p<0.05、＊＊：p<0.01（Student's  t-test）。
【図１２】実施例３において、盲腸内容物のsIgAを測定した結果。グラフはmean±SE(n=7)を表す。 ＊：p<0.05（Student's  t-test）。
【図１３】実施例３において、回腸組織におけるReg3γの遺伝子発現量を測定した結果を示す。グラフはGAPDHに対するReg3γのmRNA発現量について、mean±SE(n=7)を表す。＊：p<0.05（Student's  t-test）。
【図１４】実施例３において、回腸組織のoccludinタンパク質量を測定した結果を示す。グラフはβ-actinに対するoccludinタンパク質量について、mean±SE(n=7)を表す。
【図１５】実施例３において、血中のgranulysin濃度を測定した結果。mean±SE(n=7)を表す。＊：p<0.05、＊＊：p<0.01（Student's  t-test）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できるものである。
【００１３】
本発明は、非ヒト哺乳動物に、免疫抑制剤を投与することを特徴とする、慢性の下痢を誘導する方法に関する。また、本発明は、前記方法により慢性の下痢が誘導された過敏性腸症候群下痢型モデル動物に関する。あるいは、本発明は、前記方法により慢性の下痢が誘導された過敏性腸症候群下痢型モデル動物の作製方法に関する。そして、本発明は、前記方法により慢性の下痢が誘導された過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製し、その過敏性腸症候群下痢型モデル動物に被検物質を投与し、これを評価することを特徴とする、過敏性腸症候群下痢型を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
免疫抑制剤は、免疫系のはたらきを抑制する効果があり、移植臓器の拒絶抑制や自己免疫疾患の治療、炎症性疾患の治療などに使用されている。免疫抑制剤は、その作用機序からアルキル化剤（シクロフォスファミドなど）、代謝拮抗剤（アザチオプリンなど）、カルシニューリン阻害剤（FK506、シクロスポリンなど）などに分類することができる。
【００１５】
FK506は免疫抑制剤の１つであり、別名をタクロリムス（Tacrolimus）、化学名を（3S, 4R, 5S, 8R, 9E, 12S, 14S,
15R, 16S, 18R, 19R, 26aS）-5, 19-Dihydroxy-3-｛（1E）-2-［（1R,3R, 4R）-4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl］-1-methylethenyl｝-14,
16-dimethoxy-4, 10, 12,18-tetramethyl-8-（ prop-2-en-1-yl ）-15, 19-epoxy-5, 6,
8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,24, 25, 26, 26a-hexadecahydro-3H-pyrido［2,
1-c］［1, 4］oxaazacyclotricosine-1, 7, 20, 21（4H,23H）-tetrone monohydrateという。FK506のCas
No.は104987-11-3である。
FK506は、ヘルパーT細胞にてFK506結合タンパク質と複合体を形成し、カルシニューリンの活性化を阻害する。こうして、T細胞（特にヘルパーT細胞）の活性化を強く阻害して臓器移植の拒絶を抑えるほか、T細胞からのサイトカイン産生（IL-12、IFNγ）を抑制し潰瘍性大腸炎の治療にも適用されている。FK506の副作用の１つに激しい下痢症状がある。
【００１６】
腸炎の後などに免疫が低下すると、腸内細菌の異常増殖 がおきることが知られている。そして、腸内細菌の異常増殖が過敏性腸症候群の発症につながることも多数報告されている。また、腸内細菌が異常増殖すると、栄養不良や腸粘膜の損傷がおこることも知られている。さらに、異常増殖した腸内細菌が、本来腸内細菌が常在しない小腸にも移行する可能性も生じる。
免疫が低下すると、腸内細菌叢を構成する細菌も変化し、腸内細菌叢が悪化する。このときストレスや腸粘膜の損傷などにより腸管バリア機能が破綻すると、病原性細菌等がBacterial
Translocationをおこしやすくなり、感染症のリスクも高くなる。
【００１７】
本発明の方法では、非ヒト哺乳動物に免疫抑制剤を投与することで、慢性の下痢を誘導することができる。発明者らがマウスにFK506を投与したところ、下痢の誘導、腸管バリア機能の低下、血中IL-6濃度の亢進、血中Th1型サイトカイン（IL-12、IFNγ）の低下、ヘルパーT細胞数の減少、腸内総菌数の増加、腸内Lactobacillus属占有率の低下、腸内Bacteroides
fragilis groupの増加、回腸Reg3γレベルの低下および血中granulysinレベルの低下が観察された。
この結果は、FK506投与による免疫機能低下、腸管バリア機能の低下、および腸内細菌叢の悪化を示すものであり、その結果腸運動性が亢進して下痢が発生したものと考えられる。また、これらの現象の多くはヒトの過敏性腸症候群下痢型患者において特徴的に見られることが報告されている（非特許文献１〜6）。従って、本発明の方法で慢性的な下痢を誘導した過敏性腸症候群下痢型のモデル動物を作製することができたといえる。
【００１８】
本発明の方法は、非ヒト哺乳動物に免疫抑制剤を投与する工程を含む。本発明で使用できる非ヒト哺乳動物は、齧歯類（ラット、マウス、モルモットなど）、ウサギ、イヌなど、実験動物として一般的に使用されているものを挙げることができるが、これらの例に限定されない。
【００１９】
本発明の方法にて用いる免疫抑制剤は、使用する非ヒト哺乳動物の種類や、評価する病態の程度、投与経路などにより、適宜選択することができる。本発明の方法で用いる免疫抑制剤の具体的な例として、アルキル化剤（シクロフォスファミドなど）、代謝拮抗剤（アザチオプリンなど）、カルシニューリン阻害剤（FK506、シクロスポリンなど）などを挙げることができるが、これらの例に限定されない。免疫機能を抑制するものであればどのような免疫抑制剤を使用してもよく、免疫抑制剤の一種類あるいは複数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００２０】
本発明の方法において、免疫抑制剤の投与量、投与頻度、投与期間は、免疫抑制剤の種類、使用する非ヒト哺乳動物の種類や、評価する病態の程度、投与経路などにより適宜調整することができる。例えば、後述の実施例ではICR系マウスを用いて、FK506を1mg/kg
body weightの用量で1回/日、14日間腹腔内投与したところ、投与4日目から下痢症状が急激に増悪し、投与日数が多くなるに従って症状が悪化した。さらにFK506投与後を14日目には腸管バリア機能の低下、血中IL-6濃度の亢進、血中Th1型サイトカイン（IL-12、IFNγ）の低下、ヘルパーT細胞数の減少、腸内総菌数の増加、腸内Lactobacillus属占有率の低下、腸内Bacteroides
fragilis groupの増加、回腸Reg3γレベルの低下および血中granulysinレベルの低下が観察された。
本発明の方法において、一日当たりの免疫抑制剤の投与量の例として腹腔内投与の場合0.6〜50mg/kg body weight、好ましくは0.8〜10mg/kg
body weight、
より好ましくは0.9〜5mg/kg body weightを挙げることができる。また、免疫抑制剤の投与期間の例として5〜25日間、好ましくは10〜21日間を挙げることができる。免疫抑制剤の投与は連続した投与でもよく、間欠投与であってもよい。
本発明の方法において、使用する投与経路は使用する非ヒト哺乳動物の種類や、評価する病態の程度、免疫抑制剤の種類などにより適宜調整することができる。例えば、経口投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など、いずれを使用してもかまわない。
【００２１】
本発明の方法では、非ヒト哺乳動物に免疫抑制剤を投与することで、腸内細菌の異常増殖を誘導することもできる。本発明の方法において、細菌の異常増殖を誘導することができる腸の例として、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、直腸）を挙げることができる。さらに、非ヒト哺乳動物に免疫抑制剤を投与することで、腸内細菌の異常増殖を誘導して、過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製することもできる。
【００２２】
本発明では、免疫抑制剤の投与に加えて、他の方法を組み合わせて慢性の下痢を起こすこともできる。例えば、公知のストレス負荷（恐怖条件付けストレス誘発排便亢進モデル、拘束ストレス誘発排便亢進モデルなど）、一酸化窒素合成酵素阻害剤（L-NAMEなど）の投与、デキストラン硫酸ナトリウムの投与などの方法と組み合わせることが可能である。
【００２３】
さらに、本発明は、非ヒト哺乳動物に免疫抑制剤を投与することで慢性の下痢が誘導された過敏性腸症候群下痢型モデル動物を作製し、その過敏性腸症候群下痢型モデル動物に被検物質を投与し、これを評価することを特徴とする、過敏性腸症候群下痢型を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。
過敏性腸症候群下痢型の病態として、下痢症状（糞便の性状の悪化、糞便量の増加、排便回数の増加など）、腸運動性の異常、内臓痛覚過敏などがある。本発明において、過敏性腸症候群下痢型を促進又は抑制する物質を評価する項目の例に、下痢症状、腸運動性および内臓痛覚過敏などを挙げることができるが、この例に限定されない。本発明において、被検物質を投与することによって、下痢症状の改善、腸運動性の改善および内臓痛覚過敏の改善のうち少なくとも１つが満たされた場合、被検物質が過敏性腸症候群下痢型を抑制したということができる。
【００２４】
免疫は、ストレス、炎症性疾患、免疫不全疾患などの様々な要因で抑制されることが知られている。免疫不全疾患は、先天性免疫不全疾患および後天性免疫不全疾患（薬剤療法（免疫抑制剤、癌の化学療法剤、放射線療法など）や慢性疾患（HIV感染、肝炎、癌など）などで生じる）に分類することができる。いずれも免疫システムに異常を来たすため、患者は感染症を起こしやすく、癌に対する抵抗力も低下する。免疫不全疾患の症状の１つに重篤な下痢が知られている。本発明のモデル動物は、免疫が抑制された状態で起きる下痢を再現することもできる。また、本発明のモデル動物を用いて、免疫が抑制された状態で起きる下痢を対象とし、これを促進又は抑制する物質をスクリーニングすることもできる。
【００２５】
本発明者らは本発明のスクリーニング方法を用いて、Propionibacterium freudenreichii ET-3株（以降、ET-3ともいう）に過敏性腸症候群下痢型を抑制する効果があることを見出した。具体的には、ET-3の生菌体を経口投与したマウスでは、FK506の投与で生じた下痢症状が改善された。他に、ET-3生菌体の投与によって、腸管バリア機能の回復、血中Th1型サイトカインレベルの回復、腸内細菌叢の改善、内因性抗菌ペプチドの産生改善および自然免疫機能の回復などの効果が得られた。
本発明者らは、Propionibacterium freudenreichii ET-3株を独立行政法人産業技術総
合研究所特許生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（１）寄託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
（２）連絡先：〒305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番１  中央第６
（３）受託番号：FERM BP-8115
（４）識別のための表示： ET-3
（５）原寄託日：平成１３年８月９日
（６）ブタペスト条約に基づく寄託への移管日：平成１４年７月１１日
上記Propionibacterium freudenreichii ET-3株はエメンタールチーズから単離されたグラム陽性短桿菌であり、DHNA(2,4-dihydroxy-2-naphthoicacid)やACNQ(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone)の生産能を有することを特徴とする。
【００２６】
ET-3の生菌体の１日当たりの摂取量は年齢、症状、体重、用途、投与経路などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、ET-3菌体の乾燥重量に換算して経口投与の場合成人１日当たり0.1〜10000mgを摂取することができ、好ましくは1〜5000mg、さらに好ましくは10〜500mgを摂取することができる。
【００２７】
ET-3の生菌体は医薬品または飲食品いずれの形態でも利用することができる。例えば、本発明の栄養組成物を医薬品として直接投与することにより、または特定保健用食品などの特別用途食品、栄養機能食品、栄養補助食品、流動食やサプリメントとして直接摂取ことにより、慢性の下痢、免疫が抑制された状態で起きる下痢、または過敏性腸症候群下痢型を改善することが期待される。
【００２８】
以下、本発明に関して実施例を挙げて説明するが、本発明は、これにより限定されるも
のではない。
【００２９】
[実施例１：免疫抑制剤による下痢の誘導]
（免疫抑制剤）FK506 (Tacrolimus)
FK506（アステラス製薬）を生理食塩水で懸濁して20、40、80μg/mlの濃度に調製し、これを動物に投与した。
【００３０】
（動物実験）
5週齢雄性ICRマウス（日本クレア）20匹を、CRF-1飼料給餌にて1週間個別飼育し、環境馴化させた。馴化期間後、体重を指標にマウスをcontrol群、0.5mg/kg（低用量）投与群、1.0mg/kg（中用量）投与群および2.0mg/kg（高用量）投与群の４群（各群n=5）に群分けした。群分けしたマウスは、床敷きを用いず、ポリ濾紙(ワットマンベンチコートプラス)及びステンレス製金網(16mesh、目開き1.2mm)を敷いたケージ内で飼育した。
群分けした日（day0）より、各群に表１に示す免疫抑制剤を14日間投与した。control群には、免疫抑制剤の投与容量と同容量の生理食塩水を投与した。
各マウスの糞便はステンレス製金網を通してポリ濾紙で受け、金網に付着した糞便及び金網を通過して濾紙に付着した糞便の全てを目視にて毎日観察した。
【００３１】
【表１】
2015000001.tif 000003
【００３２】
（測定）
・糞便の性状：day1〜14の各日の糞便目視観察し、下記4段階の便性スコアで評価した。
１．通常便
２．軟便(便形状を保つが、水分含量の多い便)
３．泥状便(便形状を保たず、金網の隙間に付着する便)
４．水様便(ほぼ液体状で、金網を通過する便)
【００３３】
・血中LPS濃度：
day14の血液から無菌的に血清を調製し、エンドスペシーES-50Mセット(生化学バイオビジネス社製)およびトキシカラーDIA-MPセット(生化学バイオビジネス社製)を用い、付属のプロトコルに従ってリポ多糖（LPS）の濃度を測定した。
・血中サイトカイン濃度：
day14の血液から血清を調製し、Bio-plexTM(登録商標) Pro Mouse 
Cytokine 23-plex Assay、M60-009RDPD (BIO-RAD社製)を用い、付属のプロトコルに従ってIL-6を測定した。
【００３４】
（結果）
糞便の性状に関する結果を図１に示す。FK506を1mg/kg body weightおよび2mg/kg body weightの投与でday14に顕著な下痢症状が誘導された。
血中LPS濃度に関する結果および血中IL-6濃度に関する結果を図２に示す。FK506を1mg/kg body weightを投与した群はcontrol群よりも有意に高いLPS濃度を示した。
また、血中IL-6はFK506を2mg/kg body weightを投与した群はcontrol群よりも有意に高いIL-6濃度を示した。
【００３５】
[実施例２：プロピオン酸菌の有効性試験]
（被検物質）Propionibacterium freudenreichii  ET-3株の生菌体
ET-3を嫌気条件下GAM培地で30℃、72時間、静置培養し、遠心分離(8000×g、15分間)で集菌した。生理食塩水で2回、蒸留水で1回洗浄した生菌体を蒸留水に懸濁し、速やかに‐80℃で保存して凍結乾燥し、生菌体の乾燥重量を算出した。乾燥した生菌体を蒸留水で懸濁して6mg/mlの濃度に調製し、これを動物に投与した。
（免疫抑制剤）FK506 (Tacrolimus)
FK506（和光純薬）を生理食塩水で懸濁して40μg/mlの濃度に調製し、これを動物に投与した。
【００３６】
（動物実験）
5週齢雄性ICRマウス（日本クレア）15匹を、CRF-1飼料給餌にて1週間個別飼育し、環境馴化させた。馴化期間後、体重を指標にマウスをcontrol群、FK506群およびFK506+ET-3群の3群（各群n=5）に群分けした。群分けしたマウスは、床敷きを用いず、ポリ濾紙(ワットマンベンチコートプラス)及びステンレス製金網(16mesh、目開き1.2mm)を敷いたケージ内で飼育した。
群分けした日（day0）より、各群に表２に示す免疫抑制剤および被検物質を１日１回14日間投与した。免疫抑制剤又は被検物質を投与しない群には、免疫抑制剤又は被検物質の投与容量と同容量の生理食塩水又は蒸留水を投与した。
各マウスの糞便はステンレス製金網を通してポリ濾紙で受け、金網に付着した糞便及び金網を通過して濾紙に付着した糞便の全てを目視にて毎日観察した。
免疫抑制剤および被検物質の投与開始から2週間後（day14）に、マウスをイソフルラン麻酔下で全採血した後に屠殺した。解剖して脾臓、腸間膜リンパ節、盲腸、および回腸を摘出した。
【００３７】
【表２】
2015000001.tif 000004
【００３８】
（測定）
・糞便の性状：
day1〜14の各日の糞便の性状を目視観察し、下記4段階の便性スコアで評価した。
１．通常便
２．軟便(便形状を保つが、水分含量の多い便)
３．泥状便(便形状を保たず、金網の隙間に付着する便)
４．水様便(ほぼ液体状で、金網を通過する便)
・血中サイトカイン濃度：
day14の血液から血清を調製し、Bio-plexTM(登録商標) Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay、M60-009RDPD
(BIO-RAD社製)を用い、付属のプロトコルに従って各種サイトカイン濃度を測定した。測定項目は、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-αの23種類である。
・血中LPS濃度：
day14の血液から無菌的に血清を調製し、エンドスペシーES-50Mセット(生化学バイオビジネス社製)およびトキシカラーDIA-MPセット(生化学バイオビジネス社製)を用い、付属のプロトコルに従ってリポ多糖（LPS）の濃度を測定した。
【００３９】
・脾臓の免疫細胞ポピュレーション：
day14の脾臓から細胞を調製し、NK細胞、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、B細胞、マクロファージ、及び樹状細胞のマーカーをそれぞれDX5、CD4、CD8、B220、CD11b、及びCD11cとして各表面抗原陽性細胞数をFACS
CaliburTMフローサイトメーター(Becton, Dickinson and Company製)でカウントして各免疫細胞の比率を検出した。
・Bacterial Translocation：
無菌的に採取したday14の腸間膜リンパ節をホモジナイズし、嫌気性菌検査用BL培地で混尺し、37℃嫌気条件下で72時間(BL培地)培養した。さらに、次式に従って嫌気性菌の陽性率を算出した。
陽性率（％）＝（嫌気性菌を検出した検体数／全ての検体数）×１００
【００４０】
・回腸におけるタイトジャンクションに係る遺伝子発現量：
タイトジャンクションを構成する膜タンパク質であるoccludinについて、遺伝子発現量を測定した。
常法に従ってday14の回腸からRNAを抽出し、PrimeScript RT reagent Kit、及びSYBR Premix Ex Taq,
Perfect Real Time(タカラバイオ社製)を用い、付属のプロトコルに従ってcDNA合成及びq-PCR法による解析を行った。ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた。
【００４１】
（結果）
図３に、糞便の性状を評価した結果を示す。図３(a)に示されるように、FK506群では下痢が誘導され、投与4日目（day4）以降はさらに便性スコアが高くなった。その結果、投与期間全体の平均においても、FK506群はcontrol群よりも有意に高い便性スコアを示した（図３(b）)。一方で、FK506+ET-3群ではFK506群よりも便性スコアの上昇が抑えられ、投与期間全体の平均においても有意に低い便性スコアを示した。
このことから、FK506を1mg/kg body weight投与した群では顕著な下痢が誘導され、ET-3生菌を3mg/body共投与することによって、FK506で誘導された下痢が抑制されることがわかった。
【００４２】
図４に、血中サイトカイン濃度の測定結果を示す。FK506群はcontrol群よりも有意に低いIL-12(p70)値を示し、IL-12(p40)、IFN-γについてもcontrol群より低い傾向を示した。一方で、FK506+ET-3群ではFK506群よりもIL-12(p40)、IL-12(p70)およびIFN-γが有意に高くなった。
このことから、FK506を投与した群ではTh1型サイトカインが低下し、ET-3生菌を共投与することによって、FK506で低下したTh1型サイトカインが回復することがわかった。
【００４３】
図５に、脾臓の免疫細胞ポピュレーションの解析結果を示す。FK506群はcontrol群よりもCD4+T細胞数が有意に低くなったが、他の群では有意な差を認めなかった。
このことから、FK506を投与した群ではヘルパーＴ細胞の割合が低下することがわかった。
【００４４】
図６に、血中LPS濃度の測定結果を示す。FK506群はcontrol群よりも有意に高いLPS濃度を示したが、FK506+ET-3群では有意な差を認めなかった。
このことから、FK506を投与した群では腸管バリア機能が低下することがわかった。
【００４５】
図７に、Bacterial Translocationの検出結果を示す。
嫌気性菌について、FK506群はcontrol群の約4倍高いBacterial  Translocation陽性率を示した。
一方で、FK506+ET-3群ではFK506群の約1/2まで陽性率が低下した。
このことから、FK506を投与した群では腸管バリア機能が低下し、ET-3生菌を共投与することによって、腸管バリア機能が一部回復することがわかった。
【００４６】
図８に、回腸組織におけるoccludinの遺伝子発現量を測定した結果を示す。
occludinは腸管のタイトジャンクションの構成因子である。
FK506群はcontrol群よりも遺伝子発現量が有意に低くなったがが、FK506+ET-3群では有意な差を認めなかった。
このことから、FK506を投与した群では腸管バリア機能が低下し、ET-3生菌の共投与によって腸管バリア機能の低下が抑制されることがわかった。
【００４７】
[実施例３：プロピオン酸菌の有効性試験]
（被検物質）Propionibacterium freudenreichii  ET-3株の生菌体
ET-3を嫌気条件下GAM培地で30℃、72時間、静置培養し、遠心分離(8000×g、15分間)で集菌した。生理食塩水で2回、蒸留水で1回洗浄した生菌体を蒸留水に懸濁し、速やかに‐80℃で保存して凍結乾燥し、生菌体の乾燥重量を算出した。乾燥した生菌体を蒸留水で懸濁して6mg/mlの濃度に調製し、これを動物に投与した。
（免疫抑制剤）FK506 (Tacrolimus)
FK506（和光純薬）を生理食塩水で懸濁して40μg/mlの濃度に調製し、これを動物に投与した。
【００４８】
（動物実験）
5週齢雄性ICRマウス（日本クレア）21匹を、CRF-1飼料給餌にて1週間個別飼育し、環境馴化させた。馴化期間後、体重を指標にマウスをcontrol群、FK506群およびFK506+ET-3群の3群（各群n=7）に群分けした。群分けしたマウスは、床敷きを用いず、ポリ濾紙(ワットマンベンチコートプラス)及びステンレス製金網(16mesh、目開き1.2mm)を敷いたケージ内で飼育した。
群分けした日（day0）より、各群に表２に示す免疫抑制剤および被検物質を１日１回14日間投与した。免疫抑制剤又は被検物質を投与しない群には、免疫抑制剤又は被検物質の投与容量と同容量の生理食塩水又は蒸留水を投与した。
各マウスの糞便はステンレス製金網を通してポリ濾紙で受け、金網に付着した糞便及び金網を通過して濾紙に付着した糞便の全てを目視にて毎日観察した。
免疫抑制剤および被検物質の投与開始から約2週間後（day15）に、マウスをペントバルビタール麻酔下で全採血した後に屠殺した。解剖して脾臓、腸間膜リンパ節、盲腸、回腸および結腸を摘出した。
【００４９】
（測定）
・糞便の性状：
day1〜15の各日の糞便の性状を目視観察し、下記4段階の便性スコアで評価した。
１．通常便
２．軟便(便形状を保つが、水分含量の多い便)
３．泥状便(便形状を保たず、金網の隙間に付着する便)
４．水様便(ほぼ液体状で、金網を通過する便)
・糞便中の菌叢：
day15の糞便を採取し、Miseqモデルの次世代シーケンサー(Illumina)により、Lactobacillus、Bacteroides
fragilis groupの占有率（％）を測定し、さらに各菌属特異的プライマーを用いたq-PCR法により表３に示す菌の菌数を測定した。
【００５０】
【表３】
2015000001.tif 000005
【００５１】
・盲腸内容物中の分泌型IgA量：
day15の盲腸内容物を採取し、
Macielらの方法（Maciel M. et al, Braz J Med Biol  Res
37(6): 817-826, 2004）
を参考にして、抽出を行った。
マウスの盲腸内容物20mgを1.5mlチューブに採取してPBS 1mlを添加して混合、遠心分離（3000×g 10min）した。
上清800μlにprotease  inhibitor  cocktail(SIGMA）を2μl添加し混合し、測定まで-80℃保存した。
この混合液を希釈したものについて、Secretory IgA ELISA(Eagle
Biosciences)を用い、
付属のプロトコルに従って分泌型IgA(sIgA)を測定した。
【００５２】
・回腸におけるReg3γ遺伝子発現量：
常法に従ってday15の回腸からRNAを抽出し、PrimeScript RT reagent Kit、及び
SYBR Premix Ex Taq, Perfect Real Time(タカラバイオ)を用い、付属のプロトコルに従って
cDNA合成及びq-PCR法による解析を行った。ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いた。
【００５３】
・回腸におけるタイトジャンクションに係るタンパク質量：
Allprotect Tissue Reagent(QIAGEN)を用い、付属のプロトコルに従って各組織からタンパク質を抽出した。Pierce
BCA Protein Assay Kit (Thermo scientific)で総タンパク質量を測定し、タンパク質量を揃えてSDS-PAGEを行った。Rabbit
anti-Occludin抗体 (Invitrogen)でoccludinを、Rabbit polyclonal Antibody to beta Actin
(IMGENEX)でβ−actinを、それぞれ付属のプロトコルに従ってWestern Blotting法にて測定した。Occludinタンパク質量は、occludinの測定値をβ−actinの測定値で除して表した。
【００５４】
・血中のgranulysin濃度：
day15の血液から血清を調製し、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＴＳＺ  ＥＬＩＳＡ）を用い、付属のプロトコルに従ってgranulysinの濃度を測定した。
得られた結果の統計解析は、Student's  t-testで行った。
【００５５】
（結果）
図９に、糞便の性状を評価した結果を示す。図９(a)に示されるように、FK506群では下痢が誘導され、投与4日目（day4）以降はさらに便性スコアが高くなった。その結果、投与期間全体の平均においても、FK506群はcontrol群よりも有意に高い便性スコアを示した（図９(b）)。一方で、FK506+ET-3群ではFK506群よりも便性スコアの上昇が抑えられ、投与期間全体の平均においてもFK506群に対して有意に低い便性スコアを示した。
このことから、FK506を1mg/kg body weight投与した群では顕著な下痢が誘導され、ET-3生菌を3mg/body共投与することによって、FK506で誘導された下痢が抑制されることがわかった。
【００５６】
図１０および図１１に、day15の糞便中の菌叢を解析した結果を示す。FK506群は、control群と比較して総菌数が有意に高くなった（図１１）。また、Bacteroides
fragilis groupの占有率および菌数においても、FK506群はcontrol群と比較して有意に高い値を示したが、FK506+ET-3群では有意な差を認めなかった（図１０および図１１）。一方で、Lactobacillus属の占有率において、FK506群は、control群と比較して有意に低い値を示した（図１０）。ビフィズス菌の菌数についは、FK506+ET-3群はcontrol群と比較して有意に高い値を示した（図１１）。
このことから、FK506を投与した群では腸内細菌叢の乱れが生じ、ET-3生菌を共投与することによって、腸内細菌叢が改善することがわかった。
【００５７】
図１２に、盲腸内容物中の分泌型IgA量の測定結果を示す。FK506+ET-3群は、control群およびFK506群と比較して有意に高いsIgA量を示した。このことから、ET-3生菌を投与することによって、sIgAの分泌が高まることがわかった。
【００５８】
図１３に、回腸組織のReg3γの遺伝子発現量を測定した結果を示す。Reg3γは、腸管上皮細胞が産生する抗菌ペプチドである。FK506群は、control群と比較してReg3γの遺伝子発現量が有意に低くなった。一方で、FK506+ET-3群は、FK506群に対して有意に高いg
Reg3γ遺伝子発現量を示した。
このことから、FK506を投与した群では内因性抗菌ペプチドReg3γの遺伝子発現量が低下し、ET-3生菌を共投与することによって回復することがわかった。
図１４に、回腸組織のoccludinタンパク質量を測定した結果を示す。いずれの群間においても、有意な差を認めなかった。
【００５９】
図１５に、血清中のgranulysin濃度を測定した結果を示す。
granulysinは、ナチュラルキラー（NK）細胞、細胞障害性Ｔ細胞が産生する細胞障害性顆粒内タンパク質であって、NK活性と強く相関することが知られている。FK506群は、control群と比較してgranulysinの濃度が有意に低くなった。一方で、FK506+ET-3群は、FK506群に対して有意に高いgranulysin濃度を示した。
このことから、FK506を投与した群では自然免疫機能が低下し、ET-3生菌を共投与することによって、自然免疫機能が回復することがわかった。
【００６０】
以上の結果から、FK506の投与により、下痢症状の誘導、腸管バリア機能の低下、血中Th1型サイトカイン（IL-12、IFNγ）レベルの低下、ヘルパーT細胞数の減少、腸内細菌叢の乱れ、腸内細菌の増加、内因性抗菌ペプチドの産生低下および自然免疫機能の低下が生じることがわかった。また、FK506と共にET-3生菌を共投与することで、下痢症状の改善、腸管バリア機能の回復、血中Th1型サイトカインレベルの回復、免疫賦活、腸内細菌叢の改善、内因性抗菌ペプチドの産生改善および自然免疫機能の回復などの効果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の方法によって、慢性的な下痢を誘導することができるので、過敏性腸症候群や免疫不全症候群等の慢性下痢を予防・治療するために有効な物質をスクリーニングすることができる。
【図１】
2015000001.tif 000006
【図２】
2015000001.tif 000007
【図３】
2015000001.tif 000008
【図４】
2015000001.tif 000009
【図５】
2015000001.tif 000010
【図６】
2015000001.tif 000011
【図７】
2015000001.tif 000012
【図８】
2015000001.tif 000013
【図９】
2015000001.tif 000014
【図１０】
2015000001.tif 000015
【図１１】
2015000001.tif 000016
【図１２】
2015000001.tif 000017
【図１３】
2015000001.tif 000018
【図１４】
2015000001.tif 000019
【図１５】
2015000001.tif 000020
【配列表】
2015000001000001.app