(57)【要約】【課題】工業レベルでの大量生産が困難なポリアミンコンジュゲートを簡便かつ高効率で製造する方法を提供する。【解決手段】桂皮酸類とポリアミンとのアミド合成反応によってポリアミンコンジュゲートを製造する方法において、桂皮酸類及びポリアミンを基質として使用して、有機溶媒中で酵素による触媒反応を行うことを特徴とする。好ましくは、前記有機溶媒は、アセトン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ｔ−ブタノール、１，４−ジオキサン、イソアミルエーテル、ｎ−ヘキサン、２−メチル−２−ブタノールおよびジイソプロピルエーテルからなる群から選ばれる有機溶媒またはその組み合わせである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
桂皮酸類とポリアミンとのアミド合成反応によってポリアミンコンジュゲートを製造する方法において、桂皮酸類及びポリアミンを基質として使用して、有機溶媒中で酵素による触媒反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記有機溶媒が、アセトン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ｔ−ブタノール、１，４−ジオキサン、イソアミルエーテル、ｎ−ヘキサン、２−メチル−２−ブタノールおよびジイソプロピルエーテルからなる群から選ばれる有機溶媒またはその組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記桂皮酸類が、桂皮酸類中のカルボキシ基を、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基またはビニル基にエステル交換して得られる、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸及びシナピン酸のアルキルエステルまたはビニルエステルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリアミンが、プトレシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、リパーゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリアミンコンジュゲートの新規な製造方法に関し、具体的には桂皮酸類およびポリアミンから生成されるポリアミンコンジュゲートを簡便かつ高収率で製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンは、２個以上の第１級アミノ基を有する脂肪族炭化水素の総称であり、全ての生物に普遍的に存在する天然物である。代表的なポリアミンとしては、プトレシン、スペルミジン及びスペルミンが挙げられる。ポリアミンの主な生理作用としては、（１）核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、（２）種々の核酸合成系の促進作用、（３）タンパク質合成系の活性化、（４）細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化、（５）活性酸素の消去、（６）細胞増殖の促進等が知られている。
【０００３】
ポリアミンは、細胞内で酸性物質と相互作用して存在し、細菌や動物細胞では大部分がＲＮＡと結合して存在している。従って、ポリアミンの生理作用は、主としてＲＮＡとの相互作用により起こると考えられている（非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、植物細胞においては、遊離のポリアミンと共に、桂皮酸、カフェ酸等の種々のフェニルプロパノイドや、その他の酸がポリアミンにアミド結合した化合物、すなわち、ポリアミンコンジュゲートが単離されている。これらのポリアミンコンジュゲートは、種々の科の植物に存在し、細胞内のポリアミン濃度を制御していると考えられ、花芽の発育促進、病原菌の感染抑制等の生理機能が報告されている（非特許文献２、３参照）。
【０００５】
このようなポリアミンコンジュゲートの生理機能は、未解明の点が多いが、桂皮酸類とポリアミンの機能を兼ね備えた素材として、その有用性が期待される。しかしながら、ポリアミンコンジュゲートは、従来は、植物からの単離または化学的合成により得られており、工業レベルでの大量生産は困難な状況である（非特許文献４、５参照）。従って、ポリアミンコンジュゲートの簡便で高収率の製造方法を開発することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】五十嵐一衛「神秘の生命物質−ポリアミン」、共立出版、１９９３
【非特許文献２】Ｍａｒｔｉｎ−Ｔａｎｇｕｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７，１９２７
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎ−Ｔａｎｇｕｙ，Ｊ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，３，３８１
【非特許文献４】Ｂａｇｎｉ，Ｎ．ａｎｄ  Ｔａｓｓｏｎｉ，Ａ．（２００１）Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，２０，３０１
【非特許文献５】Ｆｉｘｏｎ−Ｏｗｏｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，３１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みて創案されたものであり、その目的は、ポリアミンコンジュゲートの簡便で高収率の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために、酵素の触媒作用によるアミド合成交換反応について鋭意研究した結果、桂皮酸類とポリアミンとのアミド合成反応において、桂皮酸類及びポリアミンを基質として使用して、有機溶媒中で酵素による触媒反応を行うことにより、一工程の反応でポリアミンコンジュゲートを簡便かつ高収率で合成できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）の構成を有するものである。
（１）桂皮酸類とポリアミンとのアミド合成反応によってポリアミンコンジュゲートを製造する方法において、桂皮酸類及びポリアミンを基質として使用して、有機溶媒中で酵素による触媒反応を行うことを特徴とする方法。
（２）前記有機溶媒が、アセトン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ｔ−ブタノール、１，４−ジオキサン、イソアミルエーテル、ｎ−ヘキサン、２−メチル−２−ブタノールおよびジイソプロピルエーテルからなる群から選ばれる有機溶媒またはその組み合わせであることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）前記桂皮酸類が、桂皮酸類中のカルボキシ基を、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基またはビニル基にエステル交換して得られる、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸及びシナピン酸のアルキルエステルまたはビニルエステルからなる群から選択されることを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記ポリアミンが、プトレシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群から選択されることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記酵素が、リパーゼであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法は、従来の化学的合成法と異なり、酵素による触媒反応を利用しているので、ポリアミンコンジュゲートを一工程の反応で簡便かつ高効率で製造することができる。従って、本発明の製造方法は、桂皮酸類とポリアミンの生理機能を兼ね備えた素材としての有用性が期待されるポリアミンコンジュゲートの工業レベルでの生産に寄与するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】桂皮酸エチルとプトレシンを基質とし、２Ｍ２Ｂ中でリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２】精製標品１のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図３】精製標品１のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図４】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品１の開裂パターン。
【図５】精製標品１がＮ−桂皮酸プトレシンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図６】桂皮酸エチルとスペルミジンを基質とし、２Ｍ２Ｂ中でリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図７】精製標品２のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図８】精製標品２のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図９】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品２の開裂パターン。
【図１０】桂皮酸エチルとスペルミンを基質とし、２Ｍ２Ｂ中でリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１１】精製標品３のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図１２】精製標品３のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１３】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品３の開裂パターン。
【図１４】精製標品３がＮ，Ｎ’−ジ−桂皮酸スペルミンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図１５】ｐ−クマル酸メチルとプトレシンを基質とし、２Ｍ２Ｂ中でリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１６】精製標品４のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図１７】精製標品４のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１８】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品４の開裂パターン。
【図１９】精製標品４がＮ−ｐ−クマル酸プトレシンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図２０】ｐ−クマル酸メチルとスペルミジンを基質とし、２Ｍ２Ｂ中でリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図２１】精製標品５のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図２２】精製標品５のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図２３】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品５の開裂パターン。
【図２４】精製標品５がＮ１−ｐ−クマル酸スペルミジンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図２５】精製標品６のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図２６】精製標品６のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図２７】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品６の開裂パターン。
【図２８】精製標品６がＮ１，Ｎ１０−ジ−ｐ−クマル酸スペルミジンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図２９】ｐ−クマル酸メチルとスペルミンを基質とし、２Ｍ２Ｂ中でリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図３０】精製標品７のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図３１】精製標品７のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図３２】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品７の開裂パターン。
【図３３】精製標品７がＮ−ｐ−クマル酸スペルミンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図３４】精製標品８のＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図３５】精製標品８のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図３６】ＭＳ／ＭＳ分析のフラグメントイオンピークから推定される精製標品８の開裂パターン。
【図３７】精製標品８がＮ，Ｎ’−ジ−ｐ−クマル酸スペルミンであると同定されたＮＭＲ分析の結果。
【図３８】ｐ−クマル酸メチルとプトレシンを基質とし、種々の溶媒においてリパーゼを添加し、２４時間反応させた酵素反応液中のＮ−ｐ−クマル酸プトレシンの生成量。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のポリアミンコンジュゲートの製造方法は、桂皮酸類とポリアミンとのアミド合成反応において、桂皮酸類及びポリアミンを基質として使用して、有機溶媒中で酵素による触媒反応を行うことを特徴とする。
【００１３】
本発明で使用する桂皮酸類としては、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、シナピン酸等が挙げられる。これらの桂皮酸類は、ポリアミンとのアミド合成反応における形態として、カルボキシ基を、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基またはビニル基にエステル交換したアルキルエステルまたはビニルエステルであることが好ましい。
【００１４】
本発明で使用するポリアミンは、２個以上の第１級アミノ基を有する脂肪族炭化水素の総称であり、生体内に普遍的に存在する天然物である。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミン等が挙げられる。代表的なポリアミンとしては、プトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。
【００１５】
本発明で使用するポリアミンコンジュゲートは、上述の桂皮酸類とポリアミンがアミド合成反応によって生成されるアミド化合物の総称であり、ポリアミンアミドまたはポリアミン系アルカロイドと称されることもある。この場合、ポリアミンのアミノ基の数に応じて、アミドが形成されることから、１分子のポリアミンに１分子以上の桂皮酸類が結合したポリアミンコンジュゲートが１種類以上合成される。本発明の製造方法においては、桂皮酸類は、２種類以上を同時に用いても良い。従って、２種類以上の異なる桂皮酸類がポリアミンに結合したポリアミンコンジュゲートも、本発明の製造方法によって得られる製造物に包含される。
【００１６】
本発明で使用する有機溶媒としては、特に制限されないが、アセトン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ｔ−ブタノール、１，４−ジオキサン、イソアミルエーテル、ｎ−ヘキサン、２‐メチル‐２‐ブタノールおよびジイソプロピルエーテルが挙げられる。これらの有機溶媒は、１種のみでもよいし、２種以上の組み合わせにしてもよい。
【００１７】
本発明で使用する酵素としては、アミド合成反応において、桂皮酸類及びポリアミンを基質として、有機溶媒中で触媒反応を行うことができる酵素であれば、特に制限されないが、リパーゼが好ましい。
【００１８】
本発明の製造方法における酵素合成の反応は、有機溶媒中、桂皮酸誘導体とポリアミンに上述の酵素を作用させることにより行われる。基質である桂皮酸誘導体の濃度は、通常、１０ｍＭ〜２００ｍＭであり、好ましくは５０〜１５０ｍＭである。もう一方の基質であるポリアミンの濃度は、通常、１０ｍＭ〜２００ｍＭであり、好ましくは２５〜７５ｍＭである。桂皮酸類とポリアミンのモル比は、６：１〜１：１が好ましく、特に、３：１〜２：１の範囲が好ましい。
【００１９】
使用する酵素の量は、該アミド合成反応に対する生体触媒の活性の程度によって異なるが、通常、１０〜２００ｍｇ／ｍＬが好ましく、特に、６０〜１００ｍｇ／ｍＬが好ましい。
【００２０】
反応温度は、通常、３０〜６０℃で行うのが好ましい。酵素の失活、寿命低下、または反応速度への悪影響が無ければ６０℃以上、または３０℃以下の温度で行うことができる。反応は、減圧下、或いは０．１ＭＰａ以上の加圧状態でも反応を行うことができるが、通常は、常圧で行うことが好ましい。
【００２１】
反応時間は、適宜調整すればよいが、通常、１時間以上、９６時間以下程度とすることができる。該アミド合成反応に対する生体触媒の活性の程度によって異なるが、通常、２４時間が好ましい。
【００２２】
該アミド合成反応で生成するポリアミンコンジュゲートは、例えば、酢酸、メタノール等で抽出し、容易に分離することができる。また、分離したポリアミンコンジュゲートは、カチオン交換カラムやＨＰＬＣ逆相カラム等を用いることにより、高純度に精製することが可能である。この場合、精製の形態としては、適切な樹脂を用いて、カラムクロマトグラフィーのみならず、バッチ方式も適用できる。
【００２３】
また、水分が反応系中に多量に存在すると反応速度が低下するので、本発明のアミド合成反応を効率よく行うためには、水分は可能な限り反応系外に除くことが好ましい。例えば、モレキュラーシーブを用いる等の水分除去策を講じて、実質的に水分の存在しない条件下（水分含量：０．５重量％以下）で反応を行うことが望ましい。
【００２４】
上述の方法によって、桂皮酸誘導体とポリアミンからポリアミンコンジュゲートを簡便かつ高収率で製造することが可能になる。また、反応後の生成物の分離、回収も容易であり、工業レベルでの実施に適している。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）Ｎ−桂皮酸プトレシンの酵素合成
２−メチル−２−ブタノール（２Ｍ２Ｂ）中に１５０ｍＭ桂皮酸エチル、５０ｍＭプトレシンおよびｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅａｖｅｓ  ３Å  ２００ｍｇを含有する２．５ｍＬの反応液を６０℃にて１０分間予備加温した後、固定化リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５）１００ｍｇを加え、６０℃にて３５０ｒｐｍで２４時間攪拌した。反応開始２４時間後の反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による分析に供した。
【００２７】
ＨＰＬＣの分析用カラムにはＣｏｓｍｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ５Ｃ１８−ＰＡＱ（４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ、ナカライテスク）を用い、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水（Ａ）およびメタノール（Ｂ）を移動相としてリニアグラジェントモード（０％→８０％  Ｂ／５０分）で、２５℃にて流速１ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターして反応生成物を検出した。図１は、反応開始２４時間後の反応液を分析したＨＰＬＣの結果の一例を示す。溶出時間１５〜１６分後に検出されたピークは、酵素を添加して反応開始２４時間後に検出された反応生成物のピークである。
【００２８】
ＴＬＣにはＳＩＬＩＣＡ  ＧＥＬ  ６０  ＲＰ−１８  Ｆ２５４Ｓ  アルミプレート（ＭＥＲＣＫ）を使用し、メタノール：水：酢酸（７：３：０．２）で展開後、ＵＶ照射（２５４ｎｍ）およびニンヒドリン染色により、反応液中の桂皮酸類、ポリアミンおよびポリアミンコンジュゲートを検出する指標とした。上述の反応開始２４時間後の反応液をＴＬＣに供した結果、ＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示す新たなスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００２９】
反応生成物を得るため、反応液を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水２．５ｍＬに溶解し、以下の精製に供した。反応生成物を精製する分取用カラムとしてＣｏｓｍｏｓｉｌ  ＯＤＳ  ５Ｃ１８−ＰＡＱ（１０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ、ナカライテスク）を用い、反応液サンプル５００μＬを注入後、移動相をグラジェントモード（０％  Ｂにて１０ｍｌの後、１０％→３０％  Ｂにて６０ｍｌ）で、２５℃にて流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間１５〜１６分後に単一のピークとして検出された。本精製により、９．６ｍｇの精製標品１が得られた。
【００３０】
精製標品１のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ２１９に分子イオンピークが検出された（図２）。ｍ／ｚ  ２１９のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２０２，１３１，１０３にフラグメントイオンピークが検出された（図３）。これらの結果から、精製標品１は、Ｎ−桂皮酸プトレシン（ｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）の構造に帰属された（図４）。
【００３１】
さらに、精製標品１をＮＭＲで分析した結果、Ｎ−ｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅの構造に帰属された（図５）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品１は、Ｎ−桂皮酸プトレシン（Ｎ−ｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）であると同定された。
【００３２】
（実施例２）Ｎ１−桂皮酸スペルミジンの酵素合成
２Ｍ２Ｂ中に１５０ｍＭ桂皮酸エチル、５０ｍＭスペルミジンおよびｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅａｖｅｓ  ３Å  ２００ｍｇを含有する２．５ｍＬの反応液を６０℃にて１０分間予備加温した後、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５  １００ｍｇを加え、６０℃にて３５０ｒｐｍで２４時間攪拌した。反応開始２４時間後の反応液をＨＰＬＣおよびＴＬＣによる分析に供した。
【００３３】
図６は、実施例１と同様の操作で、反応生成物を分析したＨＰＬＣの結果の一例である。溶出時間３分後に検出されたピークは、酵素を添加して反応開始２４時間後に検出された反応生成物のピークである。さらに、実施例１と同様の操作で、２４時間後の反応液をＴＬＣに供した結果、ＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示す新たなスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００３４】
反応生成物を得るため、反応液を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水２．５ｍＬに溶解し、以下の精製に供した。実施例１と同様の操作で、ＨＰＬＣ分取用カラムを用い、反応液サンプル５００μＬを注入後、移動相をグラジェントモード（０％  Ｂにて５０ｍｌの後、０％→１００％  Ｂにて２０ｍｌ）で、２５℃にて流速３ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間３〜５分後に複数のピークとして検出された。本精製により、１．９ｍｇの精製標品２が得られた。
【００３５】
精製標品２のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ２７６に分子イオンピークが検出された（図７）。ｍ／ｚ  ２７６のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２５９，１８８，１３１にフラグメントイオンピークが検出された（図８）。スペルミジンには、５位のＮＨに炭素数の異なるアミノプロピル基とアミノブチル基が結合している。１分子の桂皮酸がスペルミジンとアミド結合する際には、１位と１０位のいずれかのアミノ基に桂皮酸が結合した２種類の桂皮酸スペルミジンが合成される可能性がある。ＨＰＬＣにおいて溶出時間３〜５分後に検出された複数のピークには、これら２種類の桂皮酸スペルミジンが含まれていると考えられる。以上の結果から、精製標品２は、Ｎ１−桂皮酸スペルミジン（Ｎ１−ｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）の構造に帰属された（図９）。
【００３６】
（実施例３）Ｎ，Ｎ’−ジ−桂皮酸スペルミンの酵素合成
２Ｍ２Ｂ中に１５０ｍＭ桂皮酸エチル、５０ｍＭスペルミンおよびｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅａｖｅｓ  ３Å  ２００ｍｇを含有する２．５ｍＬの反応液を６０℃にて１０分間予備加温した後、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５  １００ｍｇを加え、６０℃にて３５０ｒｐｍで２４時間攪拌した。反応開始２４時間後の反応液をＨＰＬＣおよびＴＬＣによる分析に供した。
【００３７】
図１０は、実施例１と同様の操作で、反応生成物を分析したＨＰＬＣの結果の一例である。溶出時間２０〜２１分後に検出されたピークは、酵素を添加して反応開始２４時間後に検出された反応生成物のピークである。さらに、実施例１と同様の操作で、反応開始２４時間後の反応液をＴＬＣに供した結果、ＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示す新たなスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００３８】
反応生成物を得るため、反応液を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水２．５ｍＬに溶解し、以下の精製に供した。実施例１と同様の操作で、分取用ＨＰＬＣカラムを用い、反応液サンプル５００μＬを注入後、移動相をグラジェントモード（１０％  Ｂにて４０ｍｌの後、１０％→７０％  Ｂにて１６０ｍｌ）で、２５℃にて流速３ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。複数のピークの中で最大のピークに相当する溶出画分を再度グラジェントモード（０％  Ｂにて４０ｍｌの後、１０％→４０％  Ｂにて１２０ｍｌ）で、２５℃にて流速３ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間２０分後に単一のピークとして検出された。本精製により、１１．７ｍｇの精製標品３が得られた。
【００３９】
精製標品３のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ４６３に分子イオンピークが検出された（図１１）。ｍ／ｚ  ２７６のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２５９，１８８，１３１にフラグメントイオンピークが検出された（図１２）。これらの結果から、精製標品３は、Ｎ，Ｎ’−ジ−桂皮酸スペルミン（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ）の構造に帰属された（図１３）。
【００４０】
さらに、精製標品３をＮＭＲで分析した結果、Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅの構造に帰属された（図１４）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品３は、Ｎ，Ｎ’−ジ−桂皮酸スペルミン（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｃｉｎｎａｍｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ）であると同定された。
【００４１】
（実施例４）Ｎ−ｐ−クマル酸プトレシンの酵素合成
２Ｍ２Ｂ中に１５０ｍＭ  ｐ−クマル酸メチル、５０ｍＭプトレシンおよびｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅａｖｅｓ  ３Å  ２０００ｍｇを含有する２５ｍＬの反応液を６０℃にて１０分間予備加温した後、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５  １０００ｍｇを加え、６０℃にて２８０ｒｐｍで２４時間攪拌した。反応開始２４時間後の反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析に供した。
【００４２】
図１５は、実施例１と同様の操作で、反応生成物を分析したＨＰＬＣの結果の一例である。溶出時間１３分後に検出されたピークは、酵素を添加して反応開始２４時間後に検出された反応生成物のピークである。さらに、実施例１と同様の操作で、２４時間後の反応液をＴＬＣに供した結果、ＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示す新たなスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００４３】
反応生成物を得るため、反応液を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水２０ｍＬに溶解し、以下の精製に供した。０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水で平衡化したＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（φ１．６ｘ１１ｃｍ，２０ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に反応液サンプルを流し、蒸留水で非吸着画分を除去した後、３Ｍ酢酸１００ｍＬで吸着成分を溶出した。３Ｍ酢酸で溶出した画分を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水５ｍＬに溶解し、ＨＰＬＣによる精製に供した。実施例１と同様の操作で、分取用カラムを用い、サンプル５００μＬを注入後、移動相をステップワイズモード（１０％  Ｂにて２０ｍｌの後、１００％  Ｂにて４０ｍｌ）で、２５℃にて流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。後半に最大のピークとして得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間１３分後に単一のピークとして検出された。本精製により、４８ｍｇの精製標品４が得られた。
【００４４】
精製標品４のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ２３５に分子イオンピークが検出された（図１６）。ｍ／ｚ  ２３５のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２１８，１４７，１１９にフラグメントイオンピークが検出された（図１７）。これらの結果から、精製標品４は、Ｎ−ｐ−クマル酸プトレシン（Ｎ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）の構造に帰属された（図１８）。
【００４５】
さらに、精製標品４をＮＭＲで分析した結果、Ｎ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅの構造に帰属された（図１９）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品４は、Ｎ−ｐ−クマル酸プトレシン（Ｎ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）であると同定された。
【００４６】
（実施例５）Ｎ１−ｐ−クマル酸スペルミジンの酵素合成
２Ｍ２Ｂ中に１００ｍＭ  ｐ−クマル酸メチル、７５ｍＭスペルミジンおよびｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅａｖｅｓ  ３Å  ２０００ｍｇを含有する２５ｍＬの反応液を６０℃にて１０分間予備加温した後、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５  １０００ｍｇを加え、６０℃にて２８０ｒｐｍで２４時間攪拌した。
【００４７】
図２０は、実施例１と同様の操作で、２４時間反応後の反応液を分析したＨＰＬＣの結果の一例である。溶出時間４分後および２４分後に検出されたピークは、酵素を添加して反応開始２４時間後に検出された反応生成物のピークである。さらに、実施例１と同様の操作で、反応開始２４時間後の反応液をＴＬＣに供した結果、ＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示す新たなスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００４８】
これらの反応生成物を得るため、反応液を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水２０ｍＬに溶解し、以下の精製に供した。０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水で平衡化したＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（φ１．６ｘ１１ｃｍ，２０ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に反応液サンプルを流し、蒸留水で非吸着画分を除去した後、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２Ｍおよび３Ｍ酢酸で吸着成分をそれぞれ１００ｍＬ溶出した。得られた溶出画分をＴＬＣに供した結果、０．２Ｍおよび０．５Ｍ酢酸の溶出画分にＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示すスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００４９】
０．２Ｍ酢酸で溶出した画分を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水５ｍＬに溶解し、実施例１と同様の操作で、分取用カラムを用い、５００μＬを注入後、移動相をステップワイズモード（１０％  Ｂにて２０ｍｌの後、１００％  Ｂにて６０ｍｌ）で、２５℃にて流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。後半に最大のピークとして得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間４〜５分後に単一のピークとして検出された。本精製により、８６ｍｇの精製標品５が得られた。
【００５０】
精製標品５のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ２９２に分子イオンピークが検出された（図２１）。ｍ／ｚ  ２９２のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２７５，２０４，１４７にフラグメントイオンピークが検出された（図２２）。これらの結果から、精製標品５は、Ｎ１−ｐ−クマル酸スペルミジン（Ｎ１−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）の構造に帰属された（図２３）。
【００５１】
さらに、精製標品５をＮＭＲで分析した結果、Ｎ１−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅの構造に帰属された（図２４）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品５は、Ｎ１−ｐ−クマル酸スペルミジン（Ｎ１−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）であると同定された。
【００５２】
（実施例６）Ｎ１，Ｎ１０−ジ−ｐ−クマル酸スペルミジンの酵素合成
実施例５のＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムによる精製において、０．５Ｍ酢酸で溶出した画分を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水５ｍＬに溶解し、実施例１と同様の操作で、分取用カラムに５００μＬを注入後、移動相をステップワイズモード（１０％  Ｂにて２０ｍｌの後、１００％  Ｂにて６０ｍｌ）で、２５℃にて流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。後半に最大のピークとして得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間２４〜２５分後に単一のピークとして検出された。本精製により、７７ｍｇの精製標品６が得られた。
【００５３】
精製標品６のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ４３９に分子イオンピークが検出された（図２５）。ｍ／ｚ  ４３９のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２９２，２０４，１４７にフラグメントイオンピークが検出された（図２６）。ｍ／ｚ  ４３９はＮ１，Ｎ１０−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅの分子イオンピークｍ／ｚ  ４３８より１大きいが、フラグメントイオンピークの解析から、ｍ／ｚ  ４３９を示す物質はＮ１，Ｎ１０−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅの５位のＮＨにプロトンが付加した物質と考えられる。これらの結果から、精製標品６は、Ｎ１，Ｎ１０−ジ−ｐ−クマル酸スペルミジン（Ｎ１，Ｎ１０−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）の構造に帰属された（図２７）。
【００５４】
さらに、精製標品６をＮＭＲで分析した結果、Ｎ１，Ｎ１０−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅの構造に帰属された（図２８）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品６は、Ｎ１，Ｎ１０−ジ−ｐ−クマル酸スペルミジン（Ｎ１，Ｎ１０−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）であると同定された。
【００５５】
（実施例７）Ｎ−ｐ−クマル酸スペルミンの酵素合成
２Ｍ２Ｂ中に１５０ｍＭ  ｐ−クマル酸メチル、７５ｍＭスペルミンおよびｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅａｖｅｓ  ３Å  ２０００ｍｇを含有する２５ｍＬの反応液を６０℃にて１０分間予備加温した後、Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４３５  １０００ｍｇを加え、６０℃にて２８０ｒｐｍで２４時間攪拌した。
【００５６】
図２９は、実施例１と同様の操作で、２４時間反応後の反応液を分析したＨＰＬＣの結果の一例である。溶出時間２〜３分後および１５〜１６分後に検出されたピークは、酵素を添加して反応開始２４時間後に検出された反応生成物のピークである。さらに、実施例１と同様の操作で、反応開始２４時間後の反応液をＴＬＣに供した結果、ＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示す新たなスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００５７】
これらの反応生成物を得るため、反応液を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水２０ｍＬに溶解し、以下の精製に供した。０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水で平衡化したＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（φ１．６ｘ１１ｃｍ，２０ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に反応液サンプルを流し、蒸留水で非吸着画分を洗浄した後、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍおよび３Ｍ酢酸で吸着成分をそれぞれ１００ｍＬ溶出した。溶出画分をＴＬＣに供した結果、０．２Ｍおよび０．５Ｍ酢酸の溶出画分にＵＶ吸収およびニンヒドリン陽性を示すスポットが認められた（結果は図示せず）。
【００５８】
０．２Ｍ酢酸で溶出した画分を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水５ｍＬに溶解し、実施例１と同様の操作で、分取用カラムに５００μＬを注入後、移動相をステップワイズモード（１０％  Ｂにて２０ｍｌの後、１００％  Ｂにて６０ｍｌ）で、２５℃にて流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。後半に最大のピークとして得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間４〜５分後に単一のピークとして検出された。本精製により、６０ｍｇの精製標品７が得られた。
【００５９】
精製標品７のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ３４９に分子イオンピークが検出された（図３０）。ｍ／ｚ  ２９２のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２７５，２０４，１２９にフラグメントイオンピークが検出された（図３１）。これらの結果から、精製標品７は、Ｎ−ｐ−クマル酸スペルミン（Ｎ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ）の構造に帰属された（図３２）。
【００６０】
さらに、精製標品７をＮＭＲで分析した結果、Ｎ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅの構造に帰属された（図３３）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品７は、Ｎ−ｐ−クマル酸スペルミン（Ｎ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ）であると同定された。
【００６１】
（実施例８）Ｎ，Ｎ’−ジ−ｐ−クマル酸スペルミンの酵素合成
実施例７のＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムによる精製において、０．５Ｍ酢酸で溶出した画分を減圧乾固し、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸水５ｍＬに溶解し、実施例１と同様の操作で、分取用カラムを用い、５００μＬを注入後、移動相をステップワイズモード（１０％  Ｂにて２０ｍｌの後、１００％  Ｂにて６０ｍｌ）で、２５℃にて流速５ｍｌ／ｍｉｎで流し、２５４ｎｍの吸光度をモニターし、フラクションコレクターにより溶出画分を回収した。後半に最大のピークとして得られた溶出画分は、上述のＨＰＬＣによる分析で溶出時間２４〜２５分後に単一のピークとして検出された。本精製により、９２ｍｇの精製標品８が得られた。
【００６２】
精製標品８のＥＳＩ−ＭＳの結果、ｍ／ｚ  ４９５に分子イオンピークが検出された（図３４）。ｍ／ｚ  ４３９のピークをＭＳ／ＭＳ分析すると、ｍ／ｚ  ２７５，２０４，１４７にフラグメントイオンピークが検出された（図３５）。これらの結果から、精製標品８は、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｐ−クマル酸スペルミン（Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ）の構造に帰属された（図３６）。
【００６３】
さらに、精製標品８をＮＭＲで分析した結果、Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅの構造に帰属された（図３７）。以上のＭＳおよびＮＭＲの分析結果から、精製標品８は、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｐ−クマル酸スペルミン（Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ）であると同定された。
【００６４】
（実施例９）各種の溶媒におけるＮ−ｐ−クマル酸プトレシンの酵素合成
１５０ｍＭ  ｐ−クマル酸メチルと５０ｍＭプトレシンを基質として、図３８に示すような種々の溶媒においてＮｏｖｏｚｙｍ  ４３５を１０ｍｇ添加し、酵素反応を行い、Ｎ−ｐ−クマル酸プトレシンの生成量を調べた（図３８）。沸点が７０℃以上のｔｅｒｔ−ブタノール、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、３−メチル−１−ブタノール（３Ｍ１Ｂ）およびイソアミルエーテルは６０℃で、沸点が７０℃以下のｎ−ヘキサン、クロロホルム、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、ジイソプロピルエーテルは４５℃で、２−メチル−２−ブタノール（２Ｍ２Ｂ）は両方の温度で反応を行った。その結果、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＴＨＦおよび２Ｍ２Ｂにおいて、Ｎ−ｐ−クマル酸プトレシンの特に高い生成量が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の方法によれば、ポリアミンコンジュゲートを簡便かつ高収率で製造することができる。また、本発明は、桂皮酸類とポリアミンの生理機能を兼ね備えた機能性素材としての有用性が期待されるポリアミンコンジュゲートの工業レベルでの生産に適している。さらに、本発明の方法によって製造されたポリアミンコンジュゲートは、医薬品、化成品、化粧品、食品等の用途で利用することができる。
【図１】
2015139433.tif 000002
【図２】
2015139433.tif 000003
【図７】
2015139433.tif 000004
【図１１】
2015139433.tif 000005
【図３】
2015139433.tif 000006
【図４】
2015139433.tif 000007
【図５】
2015139433.tif 000008
【図６】
2015139433.tif 000009
【図８】
2015139433.tif 000010
【図９】
2015139433.tif 000011
【図１０】
2015139433.tif 000012
【図１２】
2015139433.tif 000013
【図１３】
2015139433.tif 000014
【図１４】
2015139433.tif 000015
【図１５】
2015139433.tif 000016
【図１６】
2015139433.tif 000017
【図１７】
2015139433.tif 000018
【図１８】
2015139433.tif 000019
【図１９】
2015139433.tif 000020
【図２０】
2015139433.tif 000021
【図２１】
2015139433.tif 000022
【図２２】
2015139433.tif 000023
【図２３】
2015139433.tif 000024
【図２４】
2015139433.tif 000025
【図２５】
2015139433.tif 000026
【図２６】
2015139433.tif 000027
【図２７】
2015139433.tif 000028
【図２８】
2015139433.tif 000029
【図２９】
2015139433.tif 000030
【図３０】
2015139433.tif 000031
【図３１】
2015139433.tif 000032
【図３２】
2015139433.tif 000033
【図３３】
2015139433.tif 000034
【図３４】
2015139433.tif 000035
【図３５】
2015139433.tif 000036
【図３６】
2015139433.tif 000037
【図３７】
2015139433.tif 000038
【図３８】
2015139433.tif 000039