(57)【要約】【解決課題】  蛍光寿命イメージング法に適した有機蛍光プローブを提供すること【解決手段】下記の一般式（Ｉ）：  【化１】2015034809.tif 000026で表される化合物又はその塩を含む、ｐＨを測定するための蛍光寿命イメージングプローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2015034809.tif 000024
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子、リン原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜４個のアルキル基で置換されていてもよく、
但し、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくともいずれかは、窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、又は置換されていてもよいアルキル基を示し；
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、又はラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基を示し；
Ｙは、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシル基、又はシアノ基を示し；
Ｚは、Ｏ、Ｓｉ、Ｇｅ又はＣを示し；
ｍは０〜５の整数を示し、ｍが２以上である場合は、Ｘは同一であっても異なっていてもよく；
ｎは０〜５の整数を示し、ｎが２以上である場合は、Ｙは同一であっても異なっていてもよく、ｍとｎの和は５以下の整数である。）
で表される化合物又はその塩を含む、ｐＨを測定するための蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項２】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が、窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している、請求項１に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項３】
下記の一般式（ＩＩ）：
【化２】
2015034809.tif 000025
（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｍ及びｎは、式（Ｉ）で定義したとおりであり；Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素又は置換されていてもよいアルキル基を示し（但し、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも一つは置換されていてもよいアルキル基である。）
で表される化合物又はその塩を含む、請求項２に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項４】
一般式（Ｉ）におけるＲ９及び／又はＲ１０が、それぞれ独立に置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基である、請求項３に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項５】
ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がカルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル基、アミノ基、アミノアルキル基、アミド基、マレイミド基、マレイミド基を有するアルキル基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項６】
ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基が、−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）（Ｘ’はラベル部位又は標的集積部位を導入する基を示し、Ｔは存在する場合は架橋基を示し、Ｓはラベル部位又は標的集積部位を示す。）で表され、ｍが１以上である請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項７】
Ｘ’のラベル部位又は標的集積部位を導入する基が、カルボニル基、アルキルカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基である請求項６に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項８】
Ｓが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド、ＳＮＡＰタグリガンド、弱塩基性アミン、片末端又は両末端に修飾基を有してもよいポリエチレングリコール基、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、アルキルアミノ基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体である請求項６又は７に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項９】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を抗体（癌抗体を含む）にラベル化した分子、各種リガンド・蛋白にラベル化した分子、又は当該化合物を糖ポリマーに化学的にラベル化した分子を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
【請求項１０】
細胞内の酸性領域の測定方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブを細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該プローブが細胞内で発する蛍光寿命を測定する工程
を含む方法。
【請求項１１】
細胞内酸性小器官の存在する酸性領域を測定する請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光寿命イメージングプローブ、より詳細には、酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブ、及び当該プローブを用いた蛍光寿命イメージング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内小器官の１つであるリソソームは、直径が約０．２〜０．５μｍの膜で包まれた袋状の構造で約４０種の加水分解酵素を含み、細胞外から取り込まれた物質や老化した細胞内小器官の細胞内消化が行われる。リソソームの膜にはＡＴＰアーゼが存在し、ＡＴＰの加水分解によって得られるエネルギーを駆動力とするＨ＋（プロトン）ポンプとなりＨ＋をリソソームに取り込んで、内腔を酸性に保っている。一般的にエンドソーム内はｐＨ５〜６程度、リソソーム内はｐＨ５程度に保たれているとされている。内腔の加水分解酵素は酸性環境で最大の活性を示し、それぞれがタンパク質、核酸、糖、リン脂質などを分解する。
このように、リソソームに代表される細胞内酸性小胞のｐＨは、小胞内部に含まれる酵素の活性やタンパク質の機能に大きく影響することが知られており、がん・炎症性疾患・免疫疾患・感染症の病因解明や治療法開発の上で非常に重要であることから、そのｐＨをリアルタイムに観測する手法の開発が求められている。
【０００３】
このような観測を実現するべく、現在までにｐＨに依存して蛍光強度が変化する蛍光プローブを用いた蛍光強度イメージングが用いられてきた（非特許文献１）。しかしながら、蛍光強度観察は観測している蛍光物質の濃度・局在性・光褪色・励起光強度など様々な要因により変化するため、蛍光強度の絶対値を蛍光顕微鏡下で定量評価することは難しい。特に、蛍光強度測定は細胞内に局在する蛍光プローブの濃度によって、その結果の解釈に限界が生じる。細胞内の各領域における蛍光プローブの濃度は、蛍光プローブの早い拡散、光褪色、細胞からの流出が生じ得ることにより、正確に把握できないからである。また、蛍光プローブの蛍光量子収率は局在する環境によって変化し得るので、たとえ局所における蛍光色素分子の蛍光強度が測定されても、その蛍光強度からｐＨを決定することは難しい（非特許文献２）。
【０００４】
そこで、これまで採用されてきた方法がレシオ法（二波長比率測定）である。レシオ法とは、２波長の光でＷａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ（二波長比率測定）プローブを励起し、各波長による蛍光強度比の演算による解析法で、プローブの細胞内局在濃度に依らず蛍光強度の測定をする方法である。この蛍光プローブはｐＨに応答してスペクトル（分光）特性を変化させるため、２つの波長で蛍光強度を計るとその比の値が標的分子濃度に応じて変化するため、蛍光プローブ濃度の測定値への影響を取り除くことができる。しかしながら、このレシオ法は焦点の位置が各波長で異なるという問題がある。
【０００５】
このような制約を克服したイメージング技法として、蛍光強度ではなく蛍光寿命を画像化する蛍光寿命イメージング法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＬＩＭ）が近年注目を集めている。
蛍光寿命イメージング法（ＦＬＩＭ）で測定する蛍光寿命は、分子が光励起されてから基底状態に戻る際に発する蛍光発光の強度が１／ｅに低下するまでの時間と定義され、各分子種が固有の値を持ち、また、蛍光プローブの濃度・局在性・光褪色・励起波長・励起光強度などの実験条件に依存しない。よって、これらの因子の影響を受けることなく、蛍光プローブの周囲の環境変化を直接精密に解析することが可能である。これらの特徴より、ＦＬＩＭは蛍光強度測定と比較して定量性に優れているという利点を有する。
【０００６】
蛍光寿命イメージング法に適した有機蛍光プローブに要求される性質として、（１）標的分子との結合もしくは反応の前後でそれぞれ取り得る分子フォームが区別可能な蛍光寿命を持つ、（２）観測可能な蛍光強度（明るさ）を持つ、（３）細胞内局在が可能、といった点が挙げられる。ＦＬＩＭ測定では蛍光減衰曲線から蛍光寿命を決定する必要があるため、蛍光タンパク質と比較して得られる光子数が多い、光褪色性に強いなどの性質を持つ有機蛍光色素の方が適していると考えられる。また、蛍光タンパク質は発現させられる細胞が限られているが、有機蛍光色素はどのような細胞へも適用できる。しかしながら現時点では、ＥＧＦＰや市販の蛍光プローブを用いたｐＨ測定が主に用いられ、未だＦＬＩＭに適したｐＨ蛍光プローブの積極的な開発はなされていないというのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，２００９，１５，１０４−１０９
【非特許文献２】Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の要求特性を満たすＦＬＩＭに適した有機蛍光プローブを提供することを目的としている。また、このような有機蛍光プローブを用いて、エンドサイトーシスに伴う顆粒内のｐＨ低下やリソソーム内のｐＨを正確に決定する方法を提供することを目的とする。更に、蛍光強度測定では厳密な決定が不可能であった生きた細胞内の微小環境の可視化・評価を可能とする蛍光寿命イメージング法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討を行った結果、ｐＨ感受性のローダミン誘導体がｐＨにより適切な蛍光寿命変化を示すことが明らかになり、生きた細胞の酸性小胞におけるｐＨを蛍光寿命イメージングで可視化及び評価可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、
［１］下記の一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2015034809.tif 000002
（式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、それぞれ独立に、水素又は置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子、リン原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜４個のアルキル基で置換されていてもよく、
但し、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくともいずれかは、窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成しており；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、又は置換されていてもよいアルキル基を示し；
Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、又はラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基を示し；
Ｙは、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシル基、又はシアノ基を示し；
Ｚは、Ｏ、Ｓｉ、Ｇｅ又はＣを示し；
ｍは０〜５の整数を示し、ｍが２以上である場合は、Ｘは同一であっても異なっていてもよく；
ｎは０〜５の整数を示し、ｎが２以上である場合は、Ｙは同一であっても異なっていてもよく、ｍとｎの和は５以下の整数である。）
で表される化合物又はその塩を含む、ｐＨを測定するための蛍光寿命イメージングプローブ。
［２］Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が、窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している、［１］に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［３］下記の一般式（ＩＩ）：
【００１２】
【化２】
2015034809.tif 000003
（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｍ及びｎは、式（Ｉ）で定義したとおりであり；Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素又は置換されていてもよいアルキル基を示し（但し、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも一つは置換されていてもよいアルキル基である。）
で表される化合物又はその塩を含む、請求項２に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［４］一般式（Ｉ）におけるＲ９及び／又はＲ１０が、それぞれ独立に置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基である、［３］に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［５］ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基がカルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル基、アミノ基、アミノアルキル基、アミド基、マレイミド基、マレイミド基を有するアルキル基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群から選択される少なくとも１つである［１］〜［４］のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［６］ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基が、−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）（Ｘ’はラベル部位又は標的集積部位を導入する基を示し、Ｔは存在する場合は架橋基を示し、Ｓはラベル部位又は標的集積部位を示す。）で表され、ｍが１以上である［１］〜［５］のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［７］Ｘ’のラベル部位又は標的集積部位を導入する基が、カルボニル基、アルキルカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、又はアルキニル基である［６］に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［８］Ｓが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド、ＳＮＡＰタグリガンド、弱塩基性アミン、片末端又は両末端に修飾基を有してもよいポリエチレングリコール基、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、アルキルアミノ基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体である［６］又は［７］に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［９］一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を抗体（癌抗体を含む）にラベル化した分子、各種リガンド・蛋白にラベル化した分子、又は当該化合物を糖ポリマーに化学的にラベル化した分子を含む、[１]〜[８]のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブ。
［１０］細胞内の酸性領域の測定方法であって、
（ａ）［１］〜［９］のいずれか１項に記載の蛍光寿命イメージングプローブを細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該プローブが細胞内で発する蛍光寿命を測定する工程
を含む方法。
［１１］細胞内酸性小器官の存在する酸性領域を測定する［１０］に記載の方法。
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のｐＨ感受性のローダミン誘導体は、ｐＨに応じて３つの分子フォームをとり、それぞれが固有の蛍光寿命を示す。特に、市販の蛍光色素とは異なり、酸性ｐＨにおいて適切な蛍光寿命変化を示すため、酸性小胞におけるｐＨ測定に適している。
また、本発明のｐＨ感受性のローダミン誘導体を癌抗体やデキストランなどの化学的にラベル化した分子を調製し、その寿命特性を検討した結果から高分子ラベル化してもローダミン誘導体の寿命特性は変わらないことが示された。
これらの結果から、本発明のｐＨ感受性のローダミン誘導体が蛍光寿命イメージングを用いたｐＨ測定に最適な分子であり、また、これを用いて生きた細胞内の酸性小胞におけるｐＨを予測することが可能であることが示された。従って、本発明のプローブに基づく蛍光寿命イメージング法は、今後の生物学的な現象の理解に貢献できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】化合物１の蛍光寿命の測定結果
【図２】化合物２の蛍光寿命の測定結果
【図３】化合物３の蛍光寿命の測定結果
【図４】化合物４の蛍光寿命の測定結果
【図５】化合物５の蛍光寿命の測定結果
【図６】比較例１〜３の色素の蛍光寿命の測定結果
【図７】化合物４の細胞内局在性の評価結果
【図８】化合物５の細胞内局在性の評価結果
【図９】化合物１、５−ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ４８８をＥｒｂｉｔｕｘにラベル化した場合の蛍光寿命の測定結果
【図１０】Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭ（化合物１）を用いたＦＬＩＭによる細胞内酸性小胞のｐＨ測定
【図１１】Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ａｌｅｘａ４８８を用いたＦＬＩＭによる細胞内酸性小胞のｐＨ測定
【図１２】化合物１（ＲｈＰＭ）、化合物１を抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にラベル化した場合、及びＡｌｅｘａ４８８の蛍光寿命の測定結果（ＰｉｃｏＨａｒｐ３００による計測）
【図１３】Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭを取り込ませたＡ４３１細胞内におけるｐＨによる蛍光寿命の変化の測定結果
【図１４】Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭを取り込ませたＡ４３１細胞内におけるｐＨキャリブレーションカーブ
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明においては、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブとしての機能を有する。
【００１６】
【化３】
2015034809.tif 000004
【００１７】
式（Ｉ）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは、それぞれ独立に、水素または置換されていてもよいアルキル基を示す。炭素数１〜１２個、好ましくは炭素数１〜６個、更に好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分岐鎖、環状、またはそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味する。好ましいアルキル基の具体例としては、炭素数１〜６個の低級アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などが挙げられる。
【００１８】
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂのアルキル基は置換されていてもよく、置換基としては、蛍光特性を示さない置換基であれば特に限定されることはなく、例えば、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、スルホ基、アルキルスルホネート基などが挙げられる。
【００１９】
また、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子、リン原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１〜６個のアルキル基で置換されていてもよい。
本発明においては、式（Ｉ）において、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの少なくともいずれかは、窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している。また、本発明においては、好ましくは、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの両方が、前記窒素原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している。
窒素原子、酸素原子、硫黄原子、ケイ素原子、リン原子を含む５〜７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、ピペラジン、Ｎ−アルキルピペラジン、モルホリン、ピペリジン、イミダゾリジン、オキサゾリジン、ピロリジンが挙げられるが、好ましくは、ピペラジン、Ｎ−アルキルピペラジンである。
【００２０】
式（Ｉ）において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素、ハロゲン、又は置換されていてもよいアルキル基を示す。ここで、アルキル基の種類、その置換基としては、上記Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂについて記載したものと同様である。
【００２１】
式（Ｉ）において、Ｘは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基、又はラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基を示す。また、式（Ｉ）において、ｍは０〜５の整数を示し、ｍが２以上である場合は、Ｘは同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、ｍは１〜２である。
【００２２】
式（Ｉ）において、Ｙは、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシル基、又はシアノ基を示す。また、ｎは０〜５の整数を示し、ｎが２以上である場合は、Ｙは同一であっても異なっていてもよい。ここで、ｍとｎの和は５以下の整数である。
【００２３】
式（Ｉ）において、Ｚは、Ｏ、Ｓｉ、Ｇｅ又はＣを示す。好ましくは、Ｚは、Ｏである。
【００２４】
本発明の１つの好ましい実施態様は、下記の一般式（ＩＩ）：
【００２５】
【化４】
2015034809.tif 000005
で表される化合物又はその塩を含む、蛍光寿命イメージングプローブである。
【００２６】
式（ＩＩ）において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ｍ及びｎは、式（Ｉ）で定義したとおりである。
Ｒ９、Ｒ１０は、それぞれ独立に、水素又は置換されていてもよいアルキル基を示し、但し、Ｒ９、Ｒ１０の少なくとも一つは置換されていてもよいアルキル基である。ここで、アルキル基の種類、その置換基としては、上記Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂについて記載したものと同様である。
好ましくは、Ｒ９及び／又はＲ１０が、それぞれ独立に置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基である。置換基としては、蛍光特性を示さない置換基であれば特に限定されることはなく、例えば、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、スルホ基、アルキルスルホネート基などが挙げられる。本発明においては、置換基を有するアルキル基として、３，３，３−トリフルオロプロピル基、３，３−ジフルオロプロピル基、３−フルオロプロピル基が特に好ましい。また、置換基を有さないアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基が好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００２７】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される本発明の化合物の態様として、（１）ｍ＝０、ｎ＝０、すなわち、式（Ｉ）のフェニル基が置換基を有さない場合、（２）ｍ＝０、ｎが１以上の場合、即ち、式（Ｉ）のフェニル基がハロゲン、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシル基、又はシアノ基を有する場合が挙げられる。かかる態様に含まれる化合物としては、特に式（ＩＩ）において、ローダミンを母核とし、分子内にＮ−アルキルピペラジニル基が導入されたものであり、酸性ｐＨにおいて適切な蛍光寿命変化を示すため、酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブとして好適に使用することができる。
【００２８】
また、本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の好ましい態様として、（３）ｍが１以上であり、Ｘがラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基である場合がある。この場合は、ｎは０であっても１以上であってもよく、ｍは１〜２がより好ましい。式（Ｉ）の化合物において分子内にラベル部位または標的集積部位を導入することにより、酸性細胞小器官内のｐＨダイナミックスの測定などが可能となることから、Ｘとして、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基を少なくとも１つ有すると、観察する細胞現象に合わせた酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブの設計が可能となる点で好ましい。
【００２９】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）のＸとして、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基とは、ラベル部位又は標的集積部位と反応することが可能な官能基を意味し、その例は、カルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アミノアルキル基、アミド基、アルキルアミノ基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボキシル基、カルボキシル基を有するアルキル基、ヒドロキシ基を有するアルキル基が好ましい。
【００３０】
また、本発明の式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物のもう一つの好ましい態様として、（４）ｍが１以上であり、Ｘがラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基である場合が挙げられる。ここで、ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基とは、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基を介してラベル部位又は標的集積部位が導入された置換基全体を意味する。ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基は、典型的には、−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）（Ｘ’はラベル部位又は標的集積部位を導入する基を示し、Ｔは存在する場合は架橋基を示し、Ｓはラベル部位又は標的集積部位を示す。）で表すことができる。ここで、好ましくは、ｍは１〜２である。この態様に含まれる化合物又はその塩は、酸性環境においてはじめて強蛍光性となるとともに、特定のタンパク質などをラベルすることができ、また、酸性小器官細胞内に局在させることができることから、細胞内酸性小胞が関わる種々の現象をリアルタイムに可視化することを可能とする。なお、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基の一部にラベル部位又は標的集積部位が導入された化合物、即ち、ラベル部位又は標的集積部位を導入することが可能な官能基と、ラベル部位又は標的集積部位を導入した置換基の両方を有する化合物も、本発明の上記（４）の態様に含まれる。
【００３１】
前記−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）の式において、Ｘ’はラベル部位又は標的集積部位を導入する基を示し、その例として、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アルキルカルボニル基が好ましい。
【００３２】
また、前記−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）の式において、Ｔは存在する場合は架橋基を示し、Ｘ’とＳを連結させるスペーサーとして働くものであればいずれの架橋基であってもよい。例えば、置換又は無置換の炭化水素基（アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基など）、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基など、及び複素環基（例えば、ピペリジニル基など）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記架橋基は、その片方または両方の端部に、Ｘ’、Ｓと結合することができる官能基を有してもよく、このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基などが挙げられる。
【００３３】
また、前記−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）の式において、Ｓはラベル部位又は標的集積部位を示し、その例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、ＳＮＡＰタグリガンド（例えば、ベンジルグアニン基（ＢＧ−ＮＨ２基））、アルキルアミノ基（例えば、エチレンジメチルアミンなど）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体などが挙げられる。また、Ｓのラベル部位又は標的集積部位には、片末端又は両末端に修飾基を有してもよいポリエチレングリコール基も含まれ、修飾基としてはアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基などが挙げられる。修飾基を有するポリエチレングリコール基の非限定的例として、３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸が挙げられる。
【００３４】
本発明の一つの好適な実施態様として、以下の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩を含む、酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブがある。
【００３５】
【化５】
2015034809.tif 000006
【００３６】
【化６】
2015034809.tif 000007
【００３７】
式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）において、Ｒ１a〜Ｒ８は、式（Ｉ）における意味と同じであり、Ｒ９〜Ｒ１０は、式（ＩＩ）における意味と同じであり、Ｘ’はラベル部位又は標的集積部位を導入する基を示し、Ｔは存在する場合は架橋基を示し、Ｓはラベル部位又は標的集積部位を示し、Ｙ、Ｚは、式（Ｉ）における意味と同じであり、ｍは１〜５の整数を示し、ｍが２以上である場合は、−（Ｘ’−Ｔ−Ｓ）は同一であっても異なっていてもよく、ｎは０〜５の整数を示し、ｎが２以上である場合は、Ｙは同一であっても異なっていてもよく、ｍとｎの和は５以下の整数である。）
式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）において、好ましくは、ｍは１〜２である。
【００３８】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の（４）の態様、あるいは式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）で表される化合物は、特定のタンパク質などをラベルすることができ、また、酸性小器官細胞内に局在させることができることから、細胞内酸性小胞が関わる種々の現象をリアルタイムに可視化することを可能となる。その非限定的例としては、ラベル部位としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを分子内に導入した場合には、これを糖ポリマーであるデキストランにラベルすることにより、本発明の蛍光プローブを細胞内酸性小胞に局在させることが可能になる。また、標的集積部位として弱塩基性アミンを分子内に導入した場合は、本発明の酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブを酸性小胞に集積させることが可能になる。また、ラベル部位としてＨａｌｏタグリガンドやＳＮＡＰタグリガンドを導入すると、ＨａｌｏタグやＳＮＡＰタグへの特異的なラベルが可能となる。具体的には、シナプス小胞マーカーであるＶＡＭＰ２にＨａｌｏタグを融合させたタンパク質（ＶＡＭＰ２−Ｈａｌｏタグ）を神経細胞に発現させ、そこへＨａｌｏタグリガンドを導入した本発明の蛍光プローブを添加することにより、蛍光プローブのシナプス小胞への特異的なラベリングが可能となる。
【００３９】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。また、上記化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。
【００４０】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、上記化合物に包含される。
【００４１】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物は、本願明細書の実施例及びＰＣＴ／ＪＰ２０１２／７２６８８、Ｗｕ，Ｌ．；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７３，８７１１−８７１８（２００８）、及びＧｒｉｍｍ，Ｊ．Ｂ．；Ｌａｖｉｓ，Ｌ．Ｄ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３，６３５４−６３５７（２０１１）の記載に基づいて製造することができる。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【００４２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物は、酸性ｐＨにおいて適切な蛍光寿命変化を示すため、酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブとして有用であり、酸性小胞におけるｐＨ測定に適している。また、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物を抗体（癌抗体を含む）、各種リガンド分子・蛋白、デキストランなどの糖ポリマーに化学的にラベル化した分子を調製し、その寿命特性を検討した結果から高分子ラベル化しても寿命特性は変わらないことが示された。更に、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物を癌抗体にラベル化し細胞内に取り込ませた分子は細胞内酸性小胞におけるｐＨ変化を検知できることが確認された。
従って、これらの化合物又はその塩は、がん治療抗体のがん細胞内への取り込みの可視化や、がん関連受容体のダウンレギュレーションを簡便に評価することが可能となり極めて有用である。
【００４３】
本発明の酸性ｐＨ応答性蛍光寿命イメージングプローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩ）及び（ＩＩａ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］
以下の式の化合物１（１−（９−（４−カルボキシフェニル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−４−メチルピペラジン−１−イウム）の蛍光寿命の測定を行った。
【００４６】
【化７】
2015034809.tif 000008
なお、化合物１はＰＣＴ／ＪＰ２０１２／７６２８８に記載された方法により合成した。
【００４７】
化合物１の蛍光寿命の測定結果を図１に示す。化合物１は、蛍光寿命においてｐＨ感受性を示し、蛍光寿命から求めるｐＫａも算出された。これより、化合物１は細胞内の酸性小胞が取り得ると言われているｐＨ５〜６．５の間で蛍光寿命が変化するという、酸性小胞ｐＨのＦＬＩＭ測定に適した分子骨格を有することが示された。
また、以下に示すように、化合物１は、Ｎｅｕｔｒａｌ  ｆｏｒｍの蛍光量子収率が非常に小さいため、蛍光寿命を測定できるのはＭｏｎｏ−ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ  ｆｏｒｍ（τ１）とＤｉ−ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ  ｆｏｒｍ（τ２）であると考えられる。
【００４８】
【化８】
2015034809.tif 000009
【００４９】
［実施例２］
化合物２（１−（９−（４−カルボキシフェニル）−６−（４−（３，３，３−トリフルオロプロピル）ピペラジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−ピペラジン−１−イウム）を以下のスキームにより合成した。
【００５０】
【化９】
2015034809.tif 000010
【００５１】
【化１０】
2015034809.tif 000011
【００５２】
（１）ＲｈＰ−Ｈの合成
アルゴンで洗浄したフレームドライしたフラスコ中で、ｔｅｒｔ−ブチル−４−臭素化安息香酸（１３２ｍｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液を−７８℃に冷却し、１Ｍのｓｅｃ−ブチルリチウム（０．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間攪拌した。同じ温度で、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶かしたＰｙ−ＰＢｏｃ（９６．６ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温まで加温し、一晩撹拌した。１ＭのＨＣｌ水溶液（２ｍＬ）を添加して反応をクエンチし、室温で攪拌を３０分間続けた。水を加え、全体をＤＣＭにより３回抽出した。有機溶媒を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−Ｃ１８，Ａ（Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  １％ＣＨ３ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ＴＦＡ）：Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ｗｉｔｈ  １％Ｈ２Ｏ）＝４０：６０  ｔｏ  ５：９５  ｆｏｒ  ２０ｍｉｎ）で精製し、純粋なＲｈＰ−Ｈを得た。
【００５３】
【化１１】
2015034809.tif 000012
【００５４】
（２）化合物２（ＲｈＰ−ｍＰＦ３）の合成
ＲｈＰ−Ｈ（１３．２ｍｇ、１９．８μｍｏｌ）を２ｍＬのＤＭＦ及び０．２ｍＬのメタノールに溶かした。得られた溶液に、ＤＩＰＥＡ（６９．６μＬ、４００μｍｏｌ）及び１，１，１−トリフルオロ−３−ヨードプロパン（２３．３μＬ、１９９μｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。得られた混合物を６０℃で１日撹拌した。溶媒を蒸発させ、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を１ｍＬ加えて、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。混合物を１ｍＬのＨＣｌ（１Ｍ）で中和し、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−Ｃ１８，Ａ（Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  １％ＣＨ３ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ＴＦＡ）：Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ｗｉｔｈ  １％Ｈ２Ｏ）＝９５：５  ｔｏ  ５：９５  ｆｏｒ  ２０ｍｉｎ）で精製し、赤色固体の化合物２を得た（１．０ｍｇ、２工程で８．９％）。
【００５５】
【化１２】
2015034809.tif 000013
【００５６】
化合物２の蛍光寿命の測定結果を図２に示す。化合物２では化合物１と同様にｐＨに依存した蛍光寿命変化が観測され、そのｐＫａは６．０と算出された。
【００５７】
【化１３】
2015034809.tif 000014
【００５８】
［実施例３］
化合物１のカルボキシル基にアミド基を介してエチレンジアミンを結合し、リソソーム局在性を持たせた化合物３（１−（９−（４−（（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバモイル）フェニル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−４−メチルピペラジン−１−イウム）についても、その蛍光寿命特性を検討した。その結果を図３に示す。
なお、化合物３はＰＣＴ／ＪＰ２０１２／７６２８８に記載されたスキーム４に従って合成した。
【００５９】
化合物３の蛍光寿命の測定結果を図３に示す。蛍光寿命のプロットから求められる化合物３のｐＫａ１（ｍ２）は約６．０となり、同じく蛍光寿命のプロットから求めた化合物１のｐＫａ１（ｍ２）とほぼ同じ値を示した。
【００６０】
［実施例４］
ローダミン誘導体のベンゼン環２位にヒドロキシメチル基を導入した化合物４（１−（９−（２−ヒロドキシメチル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−４−メチルピペラジン−１−イウム）を以下のスキームにより合成した。
【００６１】
【化１４】
2015034809.tif 000015
【００６２】
【化１５】
2015034809.tif 000016
【００６３】
２−ＣＯＯＨ  ＲｈＰＭの合成
３’，６’−ジブロモ−６Ｈ−スピロ［イソベンゾフランー１，９’−キサンテン］−３−オン（２００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（５ｍＬ）に、１−メチルピペラジン（１ｍＬ、９ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（０．３ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１００℃で１日撹拌した。沈殿物を濾過した後、溶媒を蒸発させた。残渣を、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ−Ｃ１８，Ａ（Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  １％ＣＨ３ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ＴＦＡ）：Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ｗｉｔｈ  １％Ｈ２Ｏ）＝９５：５  ｔｏ  ０：１００  ｆｏｒ  ３０ｍｉｎ）で精製し、純粋な２−ＣＯＯＨ  ＲｈＰＭを得た（１４０ｍｇ、６４％）。
【００６４】
【化１６】
2015034809.tif 000017
【００６５】
化合物４（ＨＭＲｈＰＭ）の合成
２−ＣＯＯＨ  ＲｈＰＭ（６４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（５ｍｌ）に一滴のＨ２ＳＯ４を添加した。得られた混合物を１日還流した後、溶媒を蒸発させた。残渣をＰＬＣで粗精製して２−ＣＯＯＨ  ＲｈＰＭのメチルエステル誘導体を得た。次に、残渣を１０ｍＬのＴＨＦに溶解し、０℃でＬｉＡｌＨを添加した。混合物を室温まで戻し、中間生成物（２ＣＯＯＨ  ＲｈＰＭのメチルエステル体）が消失するまで撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌを４ｍＬ添加して反応を止め、ＴＨＦを蒸発して除去した。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、溶液をロシェル塩の飽和溶液で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、乾固するまで蒸発させた。粗製中間体を５ｍＬのＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、ｐ−クロラニル（１当量）を添加し、１時間撹拌を続けた。残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−Ｃ１８，Ａ（Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  １％ＣＨ３ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ＴＦＡ）：Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ｗｉｔｈ  １％Ｈ２Ｏ）＝９５：５  ｔｏ  ０：１００  ｆｏｒ  ３０ｍｉｎ）で精製し、赤色固体の化合物４を得た（１９ｍｇ、３１％）。
【００６６】
【化１７】
2015034809.tif 000018
【００６７】
化合物４について、蛍光寿命特性を評価した。その結果を図４に示す。蛍光寿命のプロットから求められる化合物４のｐＫａ（ｍ２）は５．９と化合物１とほぼ同じ値を示した。
【００６８】
【化１８】
2015034809.tif 000019
【００６９】
［実施例５］
ローダミン誘導体のベンゼン環２位にヒドロキシエチル基を導入した化合物５（１−（９−（２−ヒロドキシエチル）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−３−イリデン）−４−メチルピペラジン−１−イウム）を以下のスキームにより合成した。
【００７０】
【化１９】
2015034809.tif 000020
【００７１】
化合物５の合成スキーム
【００７２】
【化２０】
2015034809.tif 000021
【００７３】
アルゴンで洗浄したフレームドライしたフラスコ中で、１−ブロモ−２−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）エチル）ベンゼン（１６５ｍｇ、０．６４０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液を−７８℃に冷却し、１Ｍのｓｅｃ−ブチルリチウム（０．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間攪拌した。同じ温度で、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶かした３，６−ビス（４−メチルピペラジン−１−イル）−９Ｈ−キサンテン−９−オン（５０ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温まで加温し、一晩撹拌した。１ＭのＨＣｌ水溶液（２ｍＬ）を添加して反応をクエンチし、室温で攪拌を３０分間続けた。水を加え、全体をＤＣＭにより３回抽出した。有機溶媒を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−Ｃ１８，Ａ（Ｈ２Ｏ  ｗｉｔｈ  １％ＣＨ３ＣＮ  ａｎｄ  ０．１％ＴＦＡ）：Ｂ（ＣＨ３ＣＮ  ｗｉｔｈ  １％Ｈ２Ｏ）＝９０：１０＜０−５分＞，９０：１０  ｔｏ  １０：９０＜５−２５分＞）で精製し、純粋なＨＥＲｈＰＭ（化合物５）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ:7.28 (dd, 1H, J =7.6, 1.2 Hz), 7.24 (td, 1H, J =7.6, 1.2 Hz) , 7.09 (m, 1H) , 6.77 (d, 2H, J =2.4 Hz), 6.72 (m,3H), 6.66 (dd, 2H, J =8.8, 2.4 Hz), 3.86(t, 2H, J =5.6 Hz), 3.25(t, 8H, J =4.8 Hz), 2.99(t, 2H, J =5.6 Hz), 2.6(t,8H, J =4.8 Hz), 2.34(s, 6H); 13C NMR (101MHz, MeOD) δ: 154.03, 153.36, 139.84, 137.08, 131.62, 130.95,129.28, 128.05, 127.17, 119.72, 116.81, 112.00, 103.53, 75.16, 60.22, 55.85, 46.12, 30.14; HRMS(ESI+): m/zcalcd for [M]+ 497.29110; found 497.29306 (-2.0mDa, -3.9ppm).
【００７４】
上記で得られた化合物５について、蛍光寿命特性を評価した。その結果を図５に示す。化合物５の蛍光寿命から求められたｐＫａ１は５．９と化合物１や化合物４とほぼ同じ値を示した。
【００７５】
【化２１】
2015034809.tif 000022
【００７６】
［比較例１〜３］
次に、既存のｐＨ感受性色素（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（比較例１）、Ｃａｒｂｏｘｙ  ＳＮＡＲＦ−１（比較例２）、Ｌｙｓｏ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１８９（比較例３））について、ｐＨ変化に伴う蛍光寿命を測定した。
【００７７】
【化２２】
2015034809.tif 000023
【００７８】
その結果、各色素の蛍光寿命は図６で示すように、ｐＨに依存した蛍光寿命の変化が観察された。さらに、蛍光寿命が変化するｐＨ域と蛍光寿命の変化幅は各々異なることがわかる。比較例１と比較例２については、アルカリ性で蛍光量子収率が大きくなることが知られており、蛍光寿命のｐＨによる変化もそれに従うが、いずれも光褪色耐性に乏しく、実使用に適さない。また、比較例２はｐＨ６から９にかけて吸収スペクトルの波形トップが長波側へと移動し、それに伴って観測される蛍光強度の波形トップも５８０ｎｍから６４０ｎｍへ変化し、観測する波長によって蛍光寿命が異なるといった複雑な挙動を示す。また、比較例３の結果に関しては、ｐＨ４から５の間に最長の約５．５ｎｓ前後の蛍光寿命を示すというＨａｉ−Ｊｕｉ  Ｌｉｎ氏らの計測データと一致し、ｐＨ４．５を挟んで酸性側と中性側に同じ蛍光寿命を示すことから、ｐＨと蛍光寿命が１対１に対応していないという問題などがある。これらの結果から、既存のｐＨ感受性色素は酸性ｐＨをＦＬＩＭで決定するといった目的には適さないことが示される。
【００７９】
［実施例６］
化合物４の細胞内局在性の評価
化合物４について、細胞のリソソームに局在するかどうかを確認するため、酸性のオルガネラに凝集するとされているＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ−ＤＮＤ２６と共染色してイメージングを行い、両者を比較した。
方法としては、チャンバー・スライド（８ウェル）に培養したＨｅＬａ細胞へ１μＭになるように化合物４を適用し、２時間後にそこへ更にＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ−ＤＮＤ２６を０．１μＭになるよう適用して、直後に共焦点顕微鏡でシークエンシャル撮影を行った。
その結果、ＨＭＲｈＰＭはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ−ＤＮＤ２６と共局在することがわかり、酸性小胞であるリソソームに局在することが確認できた（図７）。
【００８０】
［実施例７］
化合物５の細胞内局在性の評価
化合物５が細胞のリソソームに局在するかどうかを確認するため、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ−ＤＮＤ２６と共染色してイメージングを行った。
方法としては、チャンバー・スライド（８ウェル）に培養した細胞（Ａ４３１）へ１μＭになるように化合物５を適用し、１５０分後にそこへ更にＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ−ＤＮＤ２６を０．１μＭになるよう適用して、直後に共焦点顕微鏡でシークエンシャル撮影を行った。
その結果、化合物５はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ−ＤＮＤ２６と共局在していることがわかり、酸性小胞であるリソソームに局在することが確認できた（図８）。
【００８１】
［実施例８］
ラベル化有機蛍光色素を用いたＦＬＩＭによる細胞内酸性小胞のｐＨ測定
（１）まず初めに、抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にラベル化した色素のｐＨ変化に伴う蛍光寿命変化を測定した。ｐＨ感受性有機蛍光色素の化合物１とｐＨ非感受性有機蛍光色素の５−ＴＡＭＲＡとＡｌｅｘａ４８８をＥｒｂｉｔｕｘにラベル化した場合の蛍光寿命を計測した（図９）。
また、ＲｈＰＭとＡｌｅｘａ４８８については、ラベル化前の色素と蛍光寿命変化の比較を行った。その結果、Ｅｒｂｉｔｕｘにラベル化した色素のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける蛍光寿命は、ラベル化前とほぼ変化しないことがわかった。
【００８２】
（２）続いて、細胞内の酸性小胞にエンドサイトーシスで取り込まれて局在することが可能なＥｒｂｉｔｕｘにラベル化した色素をＡ４３１細胞に適用して、実際に細胞内酸性小胞での蛍光寿命を測定した（図１０及び図１１）。
方法としては、チャンバー・スライド（８ウェル−Ｉｂｉｄｉ）に培養したＡ４３１細胞へＥｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭ（抗体濃度６２ｎＭ、ＤＯＬ(degree of labelling) = 2.3）、Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ａｌｅｘａ４８８（抗体濃度６２ｎＭ、ＤＯＬ＝０．９）を適用し、３７℃で約２４時間のＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ後に、共焦点顕微鏡でＦＬＩＭ測定を行った。観察直前には、細胞の動きを穏やかにするため、終濃度２０μＭになるようにノコダゾールを添加した。次に、酸性小胞が中性化した場合の変化を見るため、１回目の観察後に終濃度１０ｍＭになるように塩化アンモニウムを加えて約１分後、再度ＦＬＩＭ測定を行った。その後、ＦＬＩＭの視野全体について、Ｔａｉｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ（３−２１ｎｓ）による１成分解析を行った。
使用細胞培養液：Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ無添加）、１０％ＦＢＳ
使用機器：共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  Ｘ）、ＦＬＩＭ装置（Ｐｉｃｏ  Ｈａｒｐ  ３００）
ＦＬＩＭ測定条件：Ｆｏｒｍａｔ：２５６×２５６、Ｓｐｅｅｄ：２００Ｈｚ、Ｐｉｎｈｏｌｅ：Ａｉｒｙ１、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：４０×１．２５、Ｌａｓｅｒ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：４０ＭＨｚ、Ａｃｑｕｉｒｅ  ｕｎｔｉｌ  ｍａｘ  １０００  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｐｅｒ  ｐｉｘｅｌ
測定波長等：
＜Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭ＞Ｅｘ．５４３ｎｍ、Ｅｍ．５６０−６３０ｎｍ，Ｆｉｌｔｅｒ：５４３ｎｍ
＜Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ａｌｅｘａ４８８＞Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５１０−６００ｎｍ、Ｆｉｌｔｅｒ：４８８ｎｍ
ＦＬＩＭデータ解析：ＳｙｍＰｈｏ  Ｔｉｍｅ
図１０から、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭを用いてＦＬＩＭによる測定を行った場合、塩化アンモニウムによる中和後に観測される細胞内での蛍光寿命は、中和前より約０．３〜０．４ｎｓ短くなっていることがわかる。このことより、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭは細胞内酸性小胞におけるｐＨ変化を確実に検知できることが確認された。
【００８３】
また、図１１から、Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ａｌｅｘａ４８８を用いてＦＬＩＭを行った場合、観測される細胞内酸性小胞内での蛍光寿命はほぼ一様となり、塩化アンモニウムによる中和後の蛍光寿命も大きくは変わっていないことがわかる。
【００８４】
［実施例９］
ｐＨ感受性色素の化合物１（ＲｈＰＭ）および化合物１を抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にラベル化した場合、ｐＨ非感受性色素のＡｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ４８８を抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にラベル化した場合の蛍光寿命をＰｉｃｏＨａｒｐ３００により計測した（図１２）。その結果、Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕでの測定結果とほぼ同じ値を示すことが示された。
【００８５】
方法：ｐＨ４〜７．４に０．５刻み（ｐＨ７．５はｐＨ７．４）で調整したＢｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ−ナトリウムリン酸バッファー）２００μlに各蛍光プローブ溶液を加えて、チャンバー・スライド（８ウェル−Ｉｂｉｄｉ）に注入し、共焦点顕微鏡を用いてＦＬＩＭ測定（Ｚｏｏｍ６．０：細胞観察時の倍率）を行った。その際、焦点はセルの底面から約５μｍ上に合わせた。その後、ＦＬＩＭの視野全体について、Ｔａｉｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ（３−２１ｎｓ）による１成分解析を行った。
使用機器：共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５Ｘ），ＦＬＩＭ装置（Ｐｉｃｏ  Ｈａｒｐ  ３００（ＰｉｃｏＱｕａｎｔ社製））
ＦＬＩＭ測定条件：Ｆｏｒｍａｔ：２５６×２５６，Ｓｐｅｅｄ：２００Ｈｚ，Ｐｉｎｈｏｌｅ：Ａｉｒｙ１，Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：４０×１．２５、Ｌａｓｅｒ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：４０ＭＨｚ、Ａｃｑｕｉｒｅ  ｕｎｔｉｌ  ｍａｘ  １０００  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｐｅｒ  ｐｉｘｅｌ
測定波長等：
＜化合物１，Ｅｒｂｉｔｕｘ−化合物１＞Ｅｘ．５４３ｎｍ、Ｅｍ．５６０−６３０ｎｍ、Ｆｉｌｔｅｒ：５４３ｎｍ
＜Ａｌｅｘａ４８８、Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ａｌｅｘａ４８８＞Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５１０−６００ｎｍ、Ｆｉｌｔｅｒ：４８８ｎｍ
ＦＬＩＭデータ解析：ＳｙｍＰｈｏ  Ｔｉｍｅ
【００８６】
［実施例１０］
化合物１を抗体（Ｅｒｂｉｔｕｘ）にラベル化したＥｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭを取り込ませたＡ４３１細胞を用い、細胞内におけるｐＨキャリブレーションを実施した。その結果、適用したバッファーのｐＨに伴い、細胞内における蛍光寿命が変化し、細胞内におけるｐＨキャリブレーションカーブを作成することに成功した（図１３、図１４）。
【００８７】
方法：チャンバー・スライド（８ウェル−Ｉｂｉｄｉ）に培養したＡ４３１細胞へＥｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭ（抗体濃度６２ｎＭ、ＤＯＬ＝２．３）を適用し、３７℃で約２４時間のＩｎｃｕｂａｔｉｏｎを行った。次に、ｐＨ４〜７．４に０．５刻み（ｐＨ７．５はｐＨ７．４）に調整したＢｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ−ナトリウムリン酸バッファー）に膜透過化処理のため２０μＭのナイジェリシンを加えたものを適用（同バッファーで２回の洗浄後）し、３７℃で１０分のＩｎｃｕｂａｔｉｏｎを行い、共焦点顕微鏡を用いてＦＬＩＭ測定（Ｚｏｏｍ６）を行った。その後、ＦＬＩＭの視野全体について、Ｔａｉｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ（３−２１ｎｓ）による１成分解析を行った。
使用細胞培養液：Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ無添加）、１０％ＦＢＳ
使用機器：共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５Ｘ）、ＦＬＩＭ装置（Ｐｉｃｏ  Ｈａｒｐ  ３００）
ＦＬＩＭ測定条件：Ｆｏｒｍａｔ：２５６×２５６、Ｓｐｅｅｄ：２００Ｈｚ，Ｐｉｎｈｏｌｅ：Ａｉｒｙ１、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：４０×１．２５，Ｌａｓｅｒ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：４０ＭＨｚ、Ａｃｑｕｉｒｅ  ｕｎｔｉｌ  ｍａｘ  １０００  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｐｅｒ  ｐｉｘｅｌ
測定波長等：
＜Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＲｈＰＭ＞Ｅｘ．５４３ｎｍ、Ｅｍ．５６０−６３０ｎｍ，Ｆｉｌｔｅｒ：  ５４３ｎｍ
ＦＬＩＭデータ解析：ＳｙｍＰｈｏ  Ｔｉｍｅ
【図１】
2015034809.tif 000027
【図２】
2015034809.tif 000028
【図３】
2015034809.tif 000029
【図４】
2015034809.tif 000030
【図５】
2015034809.tif 000031
【図６】
2015034809.tif 000032
【図７】
2015034809.tif 000033
【図８】
2015034809.tif 000034
【図９】
2015034809.tif 000035
【図１０】
2015034809.tif 000036
【図１１】
2015034809.tif 000037
【図１２】
2015034809.tif 000038
【図１３】
2015034809.tif 000039
【図１４】
2015034809.tif 000040