(57)【要約】【課題】検体中に含まれる、互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無をより正確に判定する方法等を提供する。【解決手段】本発明は、（１）検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無を判定する方法であって、以下の工程：（ａ）前記複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列を有するプローブが搭載されたマイクロアレイに、前記複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させ、得られる検出結果に基づいて、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式と、当該複数種の核酸の有無を判断し得る閾値とを作成する工程；並びに、（ｂ）前記複数種の核酸の有無と存在比が不明な前記検体を、前記マイクロアレイに接触させ、得られた検出結果を、前記（ａ）の工程で作成した数式に代入し、及び／又は前記（ａ）の工程で作成した閾値と比較することにより、当該検体における前記複数種の核酸の存在比及び／又は前記複数種の核酸の有無を判定する工程を含む、前記方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列を有するプローブが搭載されたマイクロアレイに、前記複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させ、得られる検出結果に基づいて、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式と、当該複数種の核酸の有無を判断し得る閾値とを作成する工程；並びに、
（ｂ）前記複数種の核酸の有無と存在比が不明な前記検体を、前記マイクロアレイに接触させ、得られた検出結果を、前記（ａ）の工程で作成した数式に代入し、及び／又は前記（ａ）の工程で作成した閾値と比較することにより、当該検体における前記複数種の核酸の存在比及び／又は前記複数種の核酸の有無を判定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記（ａ）の工程が、前記接触及び／又は前記検出を、異なる核酸量及び／又は異なるストリンジェンシーの条件で行うことにより複数種の前記数式及び／又は前記閾値を作成することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は前記複数種の核酸の有無を判定するために使用されるプログラムであって、コンピュータに、
（ａ）前記複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列を有するプローブが搭載されたマイクロアレイに、前記複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させて得られる検出結果に基づいて、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式と、当該複数種の核酸の有無を判断し得る閾値とを作成する手段；及び
（ｂ）前記複数種の核酸の有無と存在比が不明な前記検体を、前記マイクロアレイに接触させて得られた検出結果を、前記（ａ）で作成された数式に代入し、及び／又は前記（ａ）で作成された閾値と比較することにより、当該検体における前記複数種の核酸の存在比及び／又は前記複数種の核酸の有無を判定する手段
を実行させるための前記プログラム。
【請求項４】
前記（ａ）の手段が、前記接触及び／又は前記検出を、異なる核酸量及び／又は異なるストリンジェンシーの条件で行った結果に基づいて、複数種の前記数式及び／又は前記閾値を作成する手段である、請求項３記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを用いて、検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無を判定する方法、並びに当該判定に使用されるプログラム等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイとは、担体上に多数のプローブを高密度に、互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に固定化したものである。マイクロアレイ上に搭載されるプローブは、その塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子をハイブリダイゼーションによってキャプチャーするためのセンサーとして働くものである。
【０００３】
マイクロアレイとしては、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体、あるいはゲル担体に、プローブを固定化したもの等が知られている。例えば、光照射で選択的に除去される保護基を有する物質を用い、フォトリソグラフィー技術と固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域（反応部位）に選択的にプローブＤＮＡを合成（マスキング）することによって、マイクロアレイを作製することができる。また、あらかじめＰＣＲや人工的な合成によって別途作製したプローブＤＮＡを含む溶液を、スポッターまたはアレイヤーにより数ｎｌから数ｐｌの微小体積で基板となるチップ表面に並べ、当該基板上の特定領域に固定することによって、マイクロアレイを作製することができる。
【０００４】
さらには、貫通孔基板を使用したマイクロアレイも知られている。例えば、複数本の中空繊維を繊維軸方向に規則正しく配列し、各中空繊維にプローブを固定した後、中空繊維配列体を横切断することにより製造することができる（特許文献１）。
【０００５】
上記のマイクロアレイを使用した核酸分子の検出は、核酸マイクロアレイに、検査対象となる核酸試料を配列特異的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション後に個々のプローブ、及びそれに配列特異的に結合した核酸分子とのハイブリッドを、蛍光物質等によりシグナルを検出することにより行われる。この検出により、複数のプローブに対応する核酸試料中の核酸分子を、一度に検査することができる。よって、複数の核酸塩基配列に関する発現量又は特定の核酸塩基配列の配列自体を解析するために広範に利用される。
【０００６】
従来の核酸マイクロアレイによる検出では、予め設定した適切な条件下でハイブリダイゼーションを実施し、次いで洗浄工程により、核酸マイクロアレイ表面に残存した核酸試料、その他不要物等の除去を行い、プローブと特異的なハイブリッドを形成している核酸試料のみを検出する。プローブは、配列解析、機能解析等を行うために、検出対象となる所望の核酸の塩基配列と相補的又は同一の塩基配列となるように設計される。プローブとしては、ｃＤＮＡ等の比較的長鎖の核酸や、短鎖の合成オリゴ核酸等が使用される。合成オリゴ核酸をプローブとして使用する場合、ヒトやマウスなど、遺伝子情報の知見が蓄積している生物については、それらの塩基配列情報を用い、各配列の相同性や機能などに着目した上で、合成オリゴ核酸の配列を設計し、プローブを作製する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３５１０８８２号
【特許文献２】特開２００８−３５８０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、例えば生体由来の検体を用いる場合、検出対象となる核酸と相同性の高い塩基配列を有する核酸が、複数存在することがある。
例えば、塩基鎖長が２０塩基程度であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの塩基数の少ない核酸の場合、塩基配列の違いが、数塩基程度しかない場合も多い。また、SNPsといわれるような一塩基変異を見分けたい場合、検出したいと考えている核酸と、それ以外の核酸では、一塩基の違いしかない場合がある。
このような場合、プローブと標的核酸配列間の特異性を維持させ、プローブを設計することは非常に困難となる。よって、ハイブリダイゼーションによる検出結果は、完全相補のみならず、例えば一塩基違いの配列のシグナルも含まれることもある。
プローブの配列と部分的にマッチするさまざまなターゲットが結合してしまうことを、非特異的な結合、以下「クロスハイブリダイゼーション」と呼ぶが、このクロスハイブリダイゼーションによるシグナル値が、目的のターゲットがプローブに結合した真のシグナル値に加算されるため、測定値においてノイズ成分が含まれる。特にサンプル中の目的のターゲットの濃度が低い場合には、真のターゲットに起因するシグナル成分と、クロスハイブリダイゼーションの影響によるシグナル成分とを区別することが困難であり、測定結果の信頼度を下げる大きな要因となっている。
そこで、未知のサンプルを測定した際、真のシグナル値とクロスハイブリダイゼーションによるシグナル値を分離する試みがなされている。例えば、事前に、個々のプローブに対して、完全に相補な核酸を個別に反応させて、事前にプローブ間の反応の関係性を数式化しておき、未知のサンプルからデータを得た際にはその数式により補正することで、核酸の存在比率を推定する方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、この方法では、補正の仕方によって核酸が存在しない場合においても、計算上、シグナルが残存し、シグナルのどの範囲までが核酸の有無を示しているのか明確ではなかった。
このような状況下において、検体中に含まれる、互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無をより正確に判定する方法等の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す判定方法やプログラム等を提供するものである。
【００１０】
（１）検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列を有するプローブが搭載されたマイクロアレイに、前記複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させ、得られる検出結果に基づいて、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式と、当該複数種の核酸の有無を判断し得る閾値とを作成する工程；並びに、
（ｂ）前記複数種の核酸の有無と存在比が不明な前記検体を、前記マイクロアレイに接触させ、得られた検出結果を、前記（ａ）の工程で作成した数式に代入し、及び／又は前記（ａ）の工程で作成した閾値と比較することにより、当該検体における前記複数種の核酸の存在比及び／又は前記複数種の核酸の有無を判定する工程
を含む、前記方法。
上記（１）の方法は、例えば、前記（ａ）の工程が、前記接触及び／又は前記検出を、異なる核酸量及び／又は異なるストリンジェンシーの条件で行うことにより複数種の前記数式及び／又は前記閾値を作成することを含むものであってもよい。
【００１１】
（２）検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無を判定するために使用されるプログラムであって、コンピュータに、
（ａ）前記複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列を有するプローブが搭載されたマイクロアレイに、前記複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させて得られる検出結果に基づいて、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式と、当該複数種の核酸の有無を判断し得る閾値とを作成する手段；及び
（ｂ）前記複数種の核酸の有無と存在比が不明な前記検体を、前記マイクロアレイに接触させて得られた検出結果を、前記（ａ）で作成された数式に代入し、及び／又は前記（ａ）で作成された閾値と比較することにより、当該検体における前記複数種の核酸の存在比及び／又は前記複数種の核酸の有無を判定する手段
を実行させるための前記プログラム。
上記（２）のプログラムは、例えば、前記（ａ）の手段が、前記接触及び／又は前記検出を、異なる核酸量及び／又は異なるストリンジェンシーの条件で行った結果に基づいて、複数種の前記数式及び／又は前記閾値を作成する手段であるものであってもよい。
【００１２】
なお、上記（２）のプログラムにおける（ａ）及び（ｂ）の手段の詳細については、上記（１）の方法における（ａ）及び（ｂ）の工程に関して後述する具体的説明が適宜適用され得る。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、従来のマイクロアレイを用いた実験ではクロスハイブリダイゼーションが避けられず、特異的かつ配列特異的に測定することができなかった、互いに相同性が高い複数種の核酸の存在比率やそのような複数種の核酸の有無を、より正確に判定することが可能となった。特に、上記複数種の核酸の有無を判断し得る閾値を設定することにより、検体中における上記複数種の核酸の有無を適切に評価することが可能となった。また、このような判定をするために使用されるプログラムを用いることにより、人為的な誤りがなく、より正確に検体の解析を行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】P-hsa-let-7eプローブにおけるクロスハイブリダイゼーションの検出状況を示すグラフである。
【図２】P-hsa-let-7bプローブにおけるクロスハイブリダイゼーションの検出状況を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１６】
本発明は、以下の工程を含む、検体中に含まれる互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在比及び／又は当該複数種の核酸の有無を判定する方法である。
【００１７】
（ａ）前記複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列を有するプローブが搭載されたマイクロアレイに、前記複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させ、得られる検出結果に基づいて、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式と、当該複数種の核酸の有無を判断し得る閾値とを作成する工程。
【００１８】
（ｂ）前記複数種の核酸の有無と存在比が不明な前記検体を、前記マイクロアレイに接触させ、得られた検出結果を、前記（ａ）の工程で作成した数式に代入し、かつ前記（ａ）の工程で作成した閾値と比較することにより、当該検体における前記複数種の核酸の有無及び／又はその存在比を判定する工程。
【００１９】
以下、順次、各工程を説明する。
【００２０】
まず、前記（ａ）工程では、互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の各々に特異的にハイブリダイズし得る塩基配列（好ましくは、完全相補な塩基配列）を有するプローブが搭載されるように調製されたマイクロアレイを用いる。
【００２１】
ここで、互いに相同性の高い塩基配列を有する核酸とは、少なくとも平均して１５塩基内に互いに１〜２塩基程度の違いがある核酸であることが好ましい。特に好ましくは1塩基の違いがある核酸である。例えば、ｍＲＮＡにおける、同一遺伝子由来のバリアントや、ホモログ、ｍｉＲＮＡの同一ファミリー種、遺伝子多型（SNPs）等が挙げられる。また、パーフェクトマッチとミスマッチのハイブリダイゼーション効率に少しでも差が認められるのであれば、ＲＮＡ、ＤＮＡを問わず、どのような核酸でもよい。
【００２２】
マイクロアレイは、複数の区画にオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ等のプローブを固定し、遺伝子の発現パターンのモニタリング、新規遺伝子のスクリーニング、遺伝子変異、多型の検出等を行うことができるデバイスを意味する。マイクロアレイの形態は様々なものが知られている。例えば、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定したマイクロアレイ、ガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定したマイクロアレイ等が知られている。また、貫通孔型マイクロアレイも知られている（特許第３５１０８８２号公報参照）。
【００２３】
本発明においては、後述する数式を作成する過程と、未知のサンプルを使用する過程において、プローブと検体量との比の違いから由来するバイアスを低減するために、プローブ固定化量（搭載量）が多いマイクロアレイが好適に使用される。また、洗浄、検出を繰り返すため、シグナル検出時にマイクロアレイ表面を乾燥させずに検出できるマイクロアレイが好適に使用される。
【００２４】
このようなマイクロアレイとしては、基板に複数の貫通孔が存在し、それら貫通孔にゲルを介してプローブが固定されているマイクロアレイが好適に使用される。そのようなマイクロアレイとしては、特開２０００−６０５５４号公報に記載のマイクロアレイや、貫通孔型マイクロアレイが例示できる。貫通孔型マイクロアレイとしては、Ｇｅｎｏｐａｌ ＴＭ、（三菱レイヨン社：http://www.mrc.co.jp/genome/about/process.html 、特許第３５１０８８２号公報参照）に示されるように作製されたものを用いることができる
【００２５】
次いで、前記（ａ）工程では、上述のごとく調製されたマイクロアレイに、前述した複数種の核酸をそれぞれ個別に接触させる（すなわち、１つのマイクロアレイに１種の核酸を接触させることを、核酸の種類分だけ同様に行う。）。そして、マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズしたハイブリットを検出（シグナル検出）し、その検出データに基づいて、検体中に含まれる前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式を作成する。
【００２６】
ここで、上述のハイブリットを検出するとは、具体的には、例えば、互いに相同性が高い、つまりクロスハイブリダイゼーションする可能性が高いグループを構成する核酸Ａ及び核酸Ｂが存在する場合に、核酸Ａと核酸Ｂをそれぞれ単独でマイクロアレイに対してハイブリダイゼーションさせ、核酸Ａをハイブリダイゼーションさせた際の、プローブＡ及びプローブＢのシグナル強度を検出し、次に、新たなマイクロアレイに対して、同様に核酸Ｂをハイブリダイゼーションさせた際の、プローブＡ及びプローブＢのシグナル強度を検出することをいう。なお、プローブＡ及びプローブＢは、それぞれ、核酸Ａ及び核酸Ｂに対するプローブである。
【００２７】
また、多くのハイブリダイゼーションは、核酸量や洗浄時のストリンジェンシー条件の違いによって、配列依存的にハイブリダイゼーション効率が変わるため、複数回異なる条件で検出した結果を取得し、検出回数に応じた前記数式及び閾値を作成することもできる。よって、同一のマイクロアレイにおける異なる検出結果が多いほど、結果の信頼性が向上する。
【００２８】
上述のようにして得られた検出結果に基づく、前記複数種の核酸の存在比が算出可能な数式の作成手順について、以下に、具体的に説明する。
すなわち、まず、核酸Ａをハイブリダイゼーションした際の、プローブＡのシグナル強度をＡ、プローブＢのシグナル強度をＢ’としたとき、Ｘ軸にシグナル強度Ａ、Ｙ軸にシグナル強度Ｂ’をプロットし、最小２乗法により、切片がゼロの回帰式を作成し、傾きの数値を算出するとともに、その傾きの９５％信頼区間の上限、下限の傾き値を算出する。
同様に、核酸Ｂをハイブリダイゼーションした際の、プローブＡのシグナル強度をＡ’、プローブＢのシグナル強度をＢとしたとき、Ｘ軸にシグナル強度Ｂ、Ｙ軸にシグナル強度Ａ’をプロットし、最小２乗法により、切片がゼロの回帰式を作成し、傾きの数値を算出するとともに、その傾きの９５％信頼区間の上限、下限の傾き値を算出する。
【００２９】
その後、上記の傾きの上限値、または下限値を含む行列を作成し、その逆行列を求める。後述するが、上記の傾きを求めた際と同一条件でハイブリダイゼーションした、核酸Ａと核酸Ｂを共に含む検体についての検出結果（シグナル強度）の値のベクトルに、この逆行列を、左から乗算することにより、核酸Ａと核酸Ｂの検体中の存在比（存在割合）を推定的に判定することができる。
【００３０】
また、前記複数種の核酸の存在の有無を判断し得る閾値については、上記の逆行列を、核酸Ａ及び核酸Ｂを個別にハイブリダイゼーションして得られた検出結果（シグナル強度）の値のベクトルに、左から乗算することにより、本来検出されるべきでない核酸（例えば、核酸Ａを単独でハイブリダイゼーションさせた場合の核酸Ｂのこと）についての、計算上の存在比（存在割合）の最大値を、前記複数種の核酸の存在の有無を判断するための閾値として用いることができる。
【００３１】
上記においては、互いに相同性の高い塩基配列を有する２種類の核酸（核酸Ａ及び核酸Ｂ）に対して説明したが（より具体的には、後述する実施例に記載する内容及びプロセスも参照し得る）、そのような相同性の高い塩基配列を有する核酸の種類が３種類以上存在する場合においても、当該説明は同様に適用可能である。
【００３２】
次に、前記（ｂ）工程では、互いに相同性の高い塩基配列を有する複数種の核酸の存在の有無及びその存在比が不明な検体をマイクロアレイに接触させ、ハイブリッドを検出し、前記（ａ）工程で作成した数式に検出結果を代入し、かつ、前記（ａ）工程で作成した閾値と比較する。それにより、マイクロアレイに接触させた検体中における、前記複数種の核酸の存在の有無と、その存在比（存在割合）を推定的に判定（算出）することができる。
【００３３】
具体的には、互いに相同性の高い塩基配列を有する核酸Ａと核酸Ｂを共に含む検体についての検出結果（シグナル強度）の値のベクトルに、前述した逆行列を左から乗算することにより、プローブＡとＢにおけるいわゆるデータ補正された後の検出結果を求め、これらを予め設定していた閾値と比較することにより、核酸Ａ及び核酸Ｂの両者の存在の有無とその存在比を推定的に判定（算出）することができる。
【００３４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【実施例１】
【００３５】
例として、ヒトのｍｉＲＮＡ配列である、hsa-let-7bとhsa-let-7eのmature配列のオリゴＤＮＡの存在の有無と存在比率を推定する閾値、数式を作成した。
【００３６】
（１）検体調製
Sanger instituteのmiRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/)によると、hsa-let-7b
及びhsa-let-7eの配列は以下のとおりである。
【００３７】
hsa-let-7b： ugagguaguagguugugugguu（配列番号１）
hsa-let-7e： ugagguaggagguuguauaguu（配列番号２）
【００３８】
これらの配列は、２塩基の違いしかないため（下線を付した塩基を参照）、完全相補なプローブを設計して核酸マイクロアレイに搭載した場合、単に検体をハイブリダイゼーションしただけでは、互いのプローブに互いの標的となる核酸がクロスハイブリダイゼーションしてしまう。よって、実際の検出結果に基づくのみでは、それぞれの核酸の存在の有無や、存在比を正確に判断し測定することは、極めて困難である。
【００３９】
まず、ＤＮＡ自動合成装置により、下記の合成オリゴＤＮＡ（P-hsa-let-7b及びP-hsa-let-7e）を合成し、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調製した。
P-hsa-let-7b： TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT（配列番号３）
P-hsa-let-7e： TGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT（配列番号４）
【００４０】
次に、下記表１に従い、検体１〜６を調製した。
【００４１】
【表１】
2015139443.tif 000002
【００４２】
調製した検体１〜６からそれぞれ１６μｌ取り、PlatinumBright Nucleic Acid Labeling Kit(クレアテック社)を用いて、キット付属のプロトコールに従って反応を行い、続きてキット付属のカラムを用いて精製し、およそ２０μｌの蛍光標識された核酸を得た。
【００４３】
これらの蛍光標識液からそれぞれ１μｌを新しいチューブに分取し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー  ４８μｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ４８μｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０水溶液  ２０μｌ、ミリＱ水  ８３μｌ加えて、計２００μｌとし、ハイブリ検体１〜６を作製した。
【００４４】
（２）マイクロアレイの作製
＜プローブの調製＞
以下の配列を持つプローブを、特許第4022149号に示す方法により、末端にビニル基をもつ核酸として作製した。
【００４５】
hsa-let-7b AS： AACCACACAACCTACTACCTCA（配列番号５）
hsa-let-7e AS： AACTATACAACCTCCTACCTCA（配列番号６）
【００４６】
hsa-let-7b ASは、上述のP-hsa-let-7bに対して完全相補な配列であり、hsa-let-7e AS
は、上述のP-hsa-let-7eに対して完全相補な配列である。
これらのプローブを搭載したＤＮＡマイクロアレイ（貫通孔型オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（ＧｅｎｏｐａｌＴＭ）、三菱レイヨン社製）を作製した。
【００４７】
（３）ハイブリダイゼーション操作
前記（１）で調製したハイブリ検体１〜６を、それぞれ７０℃で２分間、熱した後に、10,000rpmで１５秒間遠心処理を行い、ハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションは、５０℃、遮光条件下で２時間行った。
洗浄は、最終的な組成が０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０であるバッファー溶液を用いて５０℃で４０分間洗浄後、さらに最終的な組成が０．２４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．２４Ｍ ＮａＣｌであるバッファー溶液を用いて５０℃で１０分間洗浄した。
【００４８】
検出は、冷却ＣＣＤカメラ方式の蛍光検出装置（横河電機社製：MB-V1）を用いて行い、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイの各プローブスポットを画像化及び数値化した。数値化後、プローブがない領域の蛍光強度を差し引き、シグナル強度とした。各検体の各プローブにおけるシグナル強度の結果を、下記表２に示した。
【００４９】
【表２】
2015139443.tif 000003
【００５０】
ここで、検体１〜３についての検出結果、及び、検体４〜６についての検出結果を、それぞれグラフ化し、切片がゼロとして最小二乗法により傾きの範囲を算出し、クロスハイブリダイゼーションしている割合を推定した。
【００５１】
図１は、X軸をP-hsa-let-7bプローブにおけるシグナル強度の値、Y軸をP-hsa-let-7eプローブにおけるシグナル強度の値として、検体１〜３についての検出結果をプロットし、グラフ化したものである。P-hsa-let-7eプローブにおいて、およそ５０％程度クロスハイブリダイゼーションしていることが分かる。
回帰分析を行ったところ、図１のグラフにおける傾きの９５％信頼区間は０．３６９４〜０．６３３４２３という下限及び上限となった。なお、この「傾きの９５％信頼区間」については、具体的には、例えば、Excel 2010（Microsoft）を用いて、「データ」メニューを選択後、さらに「データ分析」、続いて「回帰分析」を選択する。その後、入力Y範囲、入力X範囲に図１のY、Xの値を選択し、「定数に０を指定」、「有意水準」のチェックボックスにチェックを入れ結果を出力させる。すると下限 95%、上限 95%の範囲が得られる。
【００５２】
図２は、X軸をP-hsa-let-7eプローブにおけるシグナル強度の値、Y軸をP-hsa-let-7bプローブにおけるシグナル強度の値として、検体４〜６についての検出結果をプロットし、グラフ化したものである。P-hsa-let-7bプローブにおいて、およそ１０％程度クロスハイブリダイゼーションしていることが分かる。
回帰分析を行ったところ、図２のグラフにおける傾きの９５％信頼区間は０．０８１０４〜０．１３３６６２という下限及び上限となった。なお、この「傾きの９５％信頼区間」については、具体的には、図１の説明と同様にExcel 2010（Microsoft）等を用いて求めることができる。
【００５３】
上記の上限９５％の傾きの値と下限９５％の傾きの値を用いて、２×２の行列を作成し、その逆行列１、２を算出した。
【００５４】
【表Ａ】
2015139443.tif 000004
【００５５】
【表Ｂ】
2015139443.tif 000005
【００５６】
その後、これらの逆行列１及び２を、前記表２の各々の結果に左から乗算して、補正シグナル値を算出し、実際に実験で入れた割合と比較した。
行列１の逆行列は、例えば、Excel 2010（Microsoft）を用いて求めることができる。具体的には、Excelファイルを開いて、セルN3、N4、O3、O4にそれぞれ行列１の値を入力する。その後、逆行列を出力したい領域を選択し（この場合２×２の領域：例えばセルQ3：R4を選択し）、その後、関数のアイコンをクリックしてMINVERSE関数を選択して「OK」を押す。そうすると、配列の入力を促されるので、セルN3、N4、O3、O4を選択する。その後、Ctrl+Shift+Enterを押すと、出力に選んだセルに行列１の逆行列が得られる。同様にして、行列２の逆行列を求めることもできる。
逆行列を求めた後、表２の各々の結果に対して補正シグナル値を算出できる。例えば、表２の検体１をハイブリダイゼーションした結果（表２の1列目）を見ると、
（P- hsa-let-7bプローブ、P- hsa-let-7eプローブ）＝（20213、10811）
であるが、このベクトルに対して逆行列１を左から乗算することにより補正することができる。より具体的には、Excel 2010のMMULT関数を使用することにより、補正シグナル値：
（P- hsa-let-7bプローブ、P- hsa-let-7eプローブ）＝（20504、−2177）
を得ることができる（表３の1列目）。同様にして、表３、表４に記載の残りの補正シグナル値を得ることもできる。
【００５７】
【表３】
2015139443.tif 000006
【００５８】
【表４】
2015139443.tif 000007
【００５９】
上記表３は、逆行列１で補正した結果、上記表４は、逆行列２で補正した結果を示す。
表４中の検体１〜３の結果を見ると、実際にはP-hsa-let-7eは存在していないにもかかわらず、下限９５％の傾きを使用して作成した逆行列による補正では最大１５％存在すると算出されている。
同様に、表４中の検体４〜６の結果を見ると、実際にはP-hsa-let-7bは存在していないにもかかわらず、下限９５％の傾きを使用して作成した逆行列による補正では最大３％存在すると算出されている。
そこで、本実施例では、これら１５％、３％を、データ補正後のP-hsa-let-7e及びP-hsa-let-7bの両核酸の存在の有無を判断する閾値に設定した。
【００６０】
（４）未知検体における、P-hsa-let-7e及びP-hsa-let-7bの両核酸の存在比、存在の有無の判定
未知検体の検出データ（シグナル強度）を得た後、それに下記逆行列３を左から乗算して補正データを算出し、前述の閾値１５％、３％を上回れば、存在するものとする。
【００６１】
【表Ｃ】
2015139443.tif 000008
【００６２】
（５）推測値の実証
上述の推定方法を確認するために、モデル検体を用いて検証した。下記表５に従い、モデル検体を調製し、前述と同様の方法で蛍光標識、ハイブリダイゼーション反応を行い、検出データ（シグナル強度）を取得した。取得したデータとそれに基づく存在比を、下記表６に示す。
【００６３】
【表５】
2015139443.tif 000009
【００６４】
【表６】
2015139443.tif 000010
【００６５】
表６のシグナル強度の結果から逆行列３を用いて補正したシグナル強度とそれに基づく存在比を、下記表７に示した。ここで、逆行列３を用いてデータ補正したプロセスについては前述の方法と同様である。
表７に示すように、補正後のシグナル強度に基づく存在比は、実存在比により近いものであった。また、閾値１５％、３％を上回っていることから、P-hsa-let-7e及びP-hsa-let-7bの両核酸が検体中に共に存在していると判断することができた。
【００６６】
【表７】
2015139443.tif 000011
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
【図１】
2015139443.tif 000012
【図２】
2015139443.tif 000013
【配列表】
2015139443000001.app