(57)【要約】【課題】  肝星細胞を活性化状態から沈静化状態へ誘導しうる化合物のスクリーニング方法、および当該化合物を成分とする医薬品組成物を提供すること。【解決手段】  肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、VIP受容体に被験化合物を接触させる工程と、被験化合物がVIP受容体に結合するかどうか、または被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体を活性化する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法が開示される。また、人工VIP受容体アゴニストを有効成分として含む肝細胞の線維化調節剤、ならびに脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤も提供される。【選択図】  図１３
2015149907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）VIP受容体に被験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体に結合するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体に結合する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法。
【請求項２】
肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体を活性化する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法。
【請求項３】
前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が細胞内cAMPレベルを測定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がcAMP応答要素に作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記細胞内cAMPレベルを測定する工程がレポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
レポーター遺伝子が、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ホスファターゼまたは蛍光タンパク質をコードするいずれかひとつ以上の遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現を測定する工程を含む請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記病態マーカー遺伝子が、ACTA2、COL1a1、DESMIN、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFα、またはTIMP1のいずれか一つ以上の遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が前記細胞中のVIP受容体シグナルカスケードの活性化を測定する工程を含む請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナルカスケードの活性化が、アデニルシクラーゼ、タンパク質キナーゼAもしくはcAMP応答要素結合タンパク質の活性化、またはホスホジエステラーゼの抑制である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程；
（ａ）VIP受容体に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体に結合するかどうかを決定する工程、
を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の工程；
（ａ）VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程、
を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、細胞内cAMPレベルを測定する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞がcAMP応答要素に作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記細胞内cAMPレベルを測定する工程がレポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
レポーター遺伝子が、アルカリ性ターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ターゼまたは蛍光タンパク質をコードするいずれかひとつ以上の遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現を測定する工程を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記病態マーカー遺伝子が、ACTA2、COL1a1、DESMIN、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFα、またはTIMP1のいずれか一つ以上の遺伝子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、前記細胞中のVIP受容体シグナルカスケードの活性化を測定する工程を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記シグナルカスケードの活性化が、アデニルシクラーゼ、タンパク質キナーゼAもしくはcAMP応答要素結合タンパク質の活性化、またはホスホジエステラーゼの抑制である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
人工VIP受容体アゴニストを有効成分として含む肝細胞の線維化調節剤。
【請求項２０】
前記人工VIP受容体アゴニストが、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[Arg15, 20, 21 Leu17]-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392またはPACAP (6-38)である、請求項１９に記載の調節剤。
【請求項２１】
前記人工VIP受容体アゴニストが、抗VIP受容体抗体である請求項１９に記載の調節剤。
【請求項２２】
人工VIP受容体アゴニストを有効成分として含む脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤。
【請求項２３】
前記人工VIP受容体アゴニストが、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[Arg15, 20, 21 Leu17]-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392またはPACAP (6-38)である、請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
前記人工VIP受容体アゴニストが、抗VIP受容体抗体である請求項２２に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患の治療剤のスクリーニング方法、当該方法によってスクリーニングされた化合物を有効成分として含む脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患の治療剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
先進国において生活習慣に起因する健康問題のひとつに、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis; NASH）を経由する非ウィルス性の肝線維化、肝硬変、肝癌発症がある。NASHおよび肝繊維化の進展には肝星細胞の活性化が関与しているのではないか、活性化状態にある肝星細胞を沈静化（de-activated）状態へと変化させることができれば病態の進展抑止と肝臓機能の回復につながるのではないかと考えられている。
【０００３】
肝星細胞はレチノイド（Vitamin A）を含む脂肪滴と特徴的な星状の突起構造を有する。肝星細胞は門脈血が類洞を介して肝小葉内へ流れ込む際の血流透過性を制御している。肝臓が障害を受けると肝星細胞は活性化し、その脂肪滴（レチノイド）は減少、線維芽細胞や筋線維芽細胞に類似した形態にその形を変え、コラーゲンなどの細胞外マトリックス生成を亢進する（非特許文献１）。細胞外マトリックス生成の亢進は肝臓が損傷を受けた際の組織修復プロセスに役立つとされている。一方、何らかの刺激により細胞外マトリックスが定常的に過剰生成され続けると、肝細胞索と類洞壁間のDisse腔と呼ばれる間隙に細胞外マトリックスが沈着するようになり、本来基底膜を有しない類洞に基底膜様構造物が出現する。この進展過程が肝繊維化である。肝線維化が進むと、類洞の毛細血管化 （capillarization）が起こり、結果、門脈から肝臓への血流量は減少し、類洞血と肝細胞間の物質交換は著しく障害される。肝臓へ流入する血液の80%は門脈由来であり、肝動脈由来はわずか20％である。ゆえに肝臓が正常に機能にする上で肝星細胞が適正な制御状態にあることは重要である。
【０００４】
脂肪肝へ変遷時、肝実質細胞は脂肪を蓄積するが、肝星細胞は脂肪滴（レチノイド）を消失する。肝星細胞はその活性化に伴い、脂肪細胞への分化時に活性化される転写因子群の発現が抑制される（非特許文献2）。逆に脂肪細胞分化カクテルの添加やPPARγ遺伝子強制発現など脂肪細胞様の状態を誘導することで不活性化状態を維持できることが示されている（非特許文献3）。
【０００５】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。なお、これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Friedman, S.L. Hepatic Stellate Cells: Protean, Multifunctional, and Enigmatic Cells of Liver. 2007. Physiol Rev. 88:125-172
【非特許文献２】Tsukamoto, H. et al. Fat paradox of steatohepatitis. J Gastroenterol Hepatol. 2007. 23 Suppl 1:S104-7
【非特許文献３】She, H. et al. Adipogenic Transcriptional Regulation of Hepatic Stellate Cells. J Biol Chem. 2005. 280: 4959-4967
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
肝星細胞を活性化状態から沈静化状態へ誘導することができれば、NASHの進展を抑制できる可能性がある。肝星細胞が活性化状態から沈静化状態へ遷移する際の遺伝子発現変化を解析し、トリガーとなるシグナルカスケードを推定する。また、推定シグナルカスケードを動作させる化合物を例示し、当該化合物を成分とする医薬品組成物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行い、活性化肝星細胞が沈静化する際の機構としてcAMPシグナルカスケードの活性化が重要であることを見出した。より具体的には、Gタンパク質共役受容体（GPCR）クラスに属するVIP 受容体に対するリガンドである血管作動性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide; VIP)、細胞内cAMP濃度を高める作用のあるホスホジエステラーゼ阻害剤やアデニレートサイクレース活性化剤が活性化星細胞の沈静化誘導剤として有用であることを同定した。
【０００９】
より具体的には以下の発明が提供される：
〔１〕肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）VIP受容体に被験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体に結合するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体に結合する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法；
〔２〕肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体を活性化する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法；
〔３〕前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が細胞内cAMPレベルを測定する工程を含む、〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記細胞がcAMP応答要素に作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記細胞内cAMPレベルを測定する工程がレポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む〔３〕に記載の方法；
〔５〕レポーター遺伝子が、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ホスファターゼまたは蛍光タンパク質をコードするのいずれかひとつ以上の遺伝子である、〔４〕に記載の方法；
〔６〕前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現を測定する工程を含む〔３〕に記載の方法；
〔７〕前記病態マーカー遺伝子が、ACTA2、COL1a1、DESMIN、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFα、またはTIMP1のいずれか一つ以上の遺伝子である、〔６〕に記載の方法；
〔８〕前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が前記細胞中のVIP受容体シグナルカスケードの活性化を測定する工程を含む〔３〕に記載の方法；
〔９〕前記シグナルカスケードの活性化が、アデニルシクラーゼ、タンパク質キナーゼAもしくはcAMP応答要素結合タンパク質の活性化、またはホスホジエステラーゼの抑制である〔８〕に記載の方法；
〔１０〕以下の工程；
（ａ）VIP受容体に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体に結合するかどうかを決定する工程、
を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法；
〔１１〕以下の工程；
（ａ）VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程、
を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法；
〔１２〕前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、細胞内cAMPレベルを測定する工程を含む、〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記細胞がcAMP応答要素に作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記細胞内cAMPレベルを測定する工程がレポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む〔１２〕に記載の方法；
〔１４〕レポーター遺伝子が、アルカリ性ターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ターゼまたは蛍光タンパク質をコードするいずれかひとつ以上の遺伝子である、〔１３〕に記載の方法；
〔１５〕前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現を測定する工程を含む〔１１〕に記載の方法；
〔１６〕前記病態マーカー遺伝子が、ACTA2、COL1a1、DESMIN、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFα、またはTIMP1のいずれか一つ以上の遺伝子である、〔１５〕に記載の方法；
〔１７〕前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が、前記細胞中のVIP受容体シグナルカスケードの活性化を測定する工程を含む〔１１〕に記載の方法；
〔１８〕前記シグナルカスケードの活性化が、アデニルシクラーゼ、タンパク質キナーゼAもしくはcAMP応答要素結合タンパク質の活性化、またはホスホジエステラーゼの抑制である〔１７〕に記載の方法；
〔１９〕人工VIP受容体アゴニストを有効成分として含む肝細胞の線維化調節剤；
〔２０〕前記人工VIP受容体アゴニストが、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[Arg15, 20, 21 Leu17]-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392またはPACAP (6-38)である、〔１９〕に記載の調節剤；
〔２１〕前記人工VIP受容体アゴニストが、抗VIP受容体抗体である〔１９〕に記載の調節剤；
〔２２〕人工VIP受容体アゴニストを有効成分として含む脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤；
〔２３〕前記人工VIP受容体アゴニストが、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[Arg15, 20, 21 Leu17]-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392またはPACAP (6-38)である、〔２２〕に記載の調節剤；
〔２４〕前記人工VIP受容体アゴニストが、抗VIP受容体抗体である〔２２〕に記載の治療剤。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】MDI添加による肝星細胞活性化マーカーであるACTA2の遺伝子発現変動を示した図である。
【図２】cAMP応答性の転写因子結合モチーフ（ATF5＿CREB3およびCREB1）がMDI処理ではコントロール群に対して常に高いスコアを示す図である。実線が対照群、破線がMDI処理群を示す。
【図３】MDIまたはIBMX（M）添加により変化した72時間後のE14C12細胞の形態像を示す写真である。
【図４】MDIまたはIBMX（M）添加の48時間後におけるE14C12細胞内のcAMPの誘導（cAMP-GloTM Max Assayを使用して得られた発光量の減少）を示す図である。
【図５】MDIの各構成成分薬剤の添加40 および72時間後におけるE14C12細胞内のACTA2およびCOL1A1の遺伝子発現の変化量を示す図である。各時間での薬剤未添加における遺伝子発現量を対照とした相対発現量を示す。
【図６】Forskolinの添加48時間後におけるE14C12細胞内の細胞内cAMPの増加を示す図である。
【図７】薬剤非投与E14C12細胞群のCOL1A1発現量と比較したForskolin投与E14C12細胞群のCOL1A1発現相対量を示す図である。
【図８】Gs共役GPCRに対するリガンドであるアデノシン、CGRP、プロスタサイクリンおよびVIPが各々添加されてから72時間後 E14C12細胞内の肝星細胞の活性化マーカーACTA2およびCOL1A1の相対発現量を表す図である。
【図９】Gs共役GPCRに対するリガンドであるアデノシン、CGRP、プロスタサイクリンおよびVIPが各々添加されたE14C12細胞内のcAMP含量の変化を示す図である。各薬剤の添加48時間後に、cAMP-GloTM Max Assay（Promega）を用いてE14C12細胞内のcAMPが測定された。
【図１０】MDIおよびVIPの各添加72時間後のE14C12細胞の形態像を示す写真である。
【図１１】CDAHFDモデルマウスの肝臓におけるマッソントリクローム染色像を示した写真である。CDAHFDの負荷 3週後および6週後のマウスにおいてNASH様病変像が確認された。
【図１２】CDAHFDモデルにおけるNASH病態マーカー遺伝子（COL1a1、DESMIN、ACTA2、TGFβ、MMP13、TNF α、TIMP）の発現量を示した図である。CDAHFDモデルにおけるNASH病態マーカー遺伝子（COL1a1、DESMIN、ACTA2、TGFβ、MMP13、TNF α、TIMP）の発現量は3週間CE-2が給餌されたマウスにおける同遺伝子発現レベルに対する相対比で示した。
【図１３】CDAHFD7週間負荷時の病態マウス由来肝星細胞におけるVIP受容体の発現を示す図である。VIPR1およびVIPR2の遺伝子発現をGAPDH遺伝子発現レベルに対する相対比で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｉ．定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる化学的用語および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。
【００１２】
不定冠詞
「一つの（a）」および「一つの（an）」という不定冠詞は、本発明において、一つのまたは二つ以上の（すなわち少なくとも一つの）その不定冠詞の文法上の対象をいう。例えば「一つの（a）要素」は、一つの要素または二つ以上の要素を意味する。
【００１３】
および/または
本明細書において、「および/または」の用語の意義は、成句「および/または」の前後の用語の組合せであって、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「ADORA2B、CALCRL、および/またはPTGIRが発現する」とは以下の組合せのバリエーションが含まれる；
(a) ADORA2Bが発現する、(b) CALCRLが発現する、(c) PTGIRが発現する、(d) ADORA2BおよびCALCRLが発現する、(e) ADORA2BおよびPTGIRが発現する、(f) CALCRLおよびPTGIRが発現する、(g) ADORA2BおよびCALCRLおよびPTGIRが発現する。
【００１４】
アゴニスト
「アゴニスト」とは、受容体、特に本発明においてVIPR1（vasoactive intestinal peptide receptor 1）（別名としてVPAC1）および/またはVIPR2（vasoactive intestinal peptide receptor 2）（別名としてVPAC2）等のVIP受容体を活性化するいかなる化合物をも意味する。
【００１５】
ポリペプチド
「ポリペプチド」とは、天然もしくは人工であるを問わず受ける修飾（例えば、リン酸化、脱アミド化、ポリグルタミル化、またはグリコシル化）またはその長さに関わらず、ペプチド結合によって結合した任意の組合せのアミノ酸の鎖を意味する。
【００１６】
ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」とは、天然もしくは人工であるを問わず受ける修飾またはその長さに関わらず、リン酸ジエステル結合によって結合した任意の組合せのヌクレオチドの鎖を意味する。
【００１７】
応答要素
「応答要素」とは、作用可能に連結されるDNA配列からの転写のレベルを制御することが可能なDNA配列を意味する。応答要素のこの定義には、エンハンサーおよび同定されたまたは未同定であるによらず応答要素を含むプロモータが含まれる。例えば、VIP受容体をコードするポリヌクレオチドの応答要素とは、VIP受容体遺伝子の転写レベルを制御することが可能なDNA配列である。当該応答要素には、細胞外からの刺激やホルモン、サイトカイン等に応答して転写活性化を受ける遺伝子のプロモータまたはエンハンサーに存在する特定の転写調節因子が特異的に結合する塩基配列も包含される。
【００１８】
作用可能に連結
DNA配列等に関して「作用可能に連結」とは、その核酸が他の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合における、プレシーケンス（presequence）または分泌リーダー（分泌シグナルともいう）の部分をコードするDNAは、そのポリペプチドをコードするDNAと作用可能的に結合している。プロモータまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結」とは、結合したDNA配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読取り枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は適切な制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、本技術分野において周知の方法によって使用される。例えばOverlap Extension PCRの手法（Higuchiら（Nucleic Acids Res. (1988) 16 (15), 7351-7367））によっても連結された核酸が作製され得る。
【００１９】
レポーター遺伝子
「レポーター遺伝子」とは、その生成物を定性的、好ましくは定量的に検出することが可能なコード配列を意味し、レポーター遺伝子は、測定すべき信号に応答性のある異種プロモータまたはエンハンサー要素と作用可能に連結され得る。
【００２０】
VIP受容体
本発明において、「VIP受容体（本明細書において、VIPRとも指称される）」とは、VIP（vasoactive intestinal peptide）が結合可能であって、当該結合によって活性化され得る受容体をいうが、そのような受容体の非限定な一態様としてVIP受容体1（本明細書にイおいてVIPR1またはVPAC1とも指称される）およびVIP受容体2（本明細書においてVIPR2またはVPAC2とも指称される）が例示される。VIP受容体が由来する生物種は本発明において特に限定されないが、非限定な一態様としてヒト、アカゲザル、ウシ、ブタ、アナウサギ、ラット、マウス、テンジクネズミ、シチメンチョウ、ニワトリ、キンカチョウ、ノバリケン、ウズラ、ニジマス、ゼブラフィッシュ等が例示される。そのような生物種由来のVIPR1（VPAC1）およびVIPR2（VPAC2）のポリペプチドの構造を、当業者は表１に記載されるデータベース登録番号で登録されたアミノ酸配列から確認することが可能である。VIP受容体の「活性化」は、VIP受容体が介在するシグナルカスケードの活性化を介してVIP受容体を発現する細胞の細胞機能を増加または減少させ得ることを意味する。VIPの結合によってVIPRが活性化され得るか否かは後述されるようにVIPRを発現する細胞の細胞機能がVIPの結合によって増加または減少したか否かを検出することによっても確認することが可能である。VIP類似体の結合によってVIPRが活性化されたか否かは、後述されるようにVIPRを発現する細胞の細胞機能がVIP類似体の結合によって増加または減少したか否かを検出することによっても確認することが可能である。また、VIPまたはVIP類似体の結合によってVIPRが活性化され得るか否かは、後述されるようなVIPRを発現する細胞の細胞機能の増加または減少等の直接的な検出の代わりに、VIPRを発現する細胞の細胞機能の増加または減少をもたらす、物理化学的、生化学的を問わず前記直接的な検出の代替として評価され得る指標の増加または減少を検出することによっても確認することもまた可能である。
【００２１】
【表１】
2015149907.tif 000003
【００２２】
「VIP受容体」という用語には、前記の公知のポリペプチドの欠損型および/または変異型のポリペプチドが含まれる。例えば、そのような欠損および/または変異型のポリペプチドの非限定な一態様として、受容体ポリペプチド中の、VIP等のリガンド結合またはVIP等のリガンドが介在するシグナルカスケードに必要のない領域が削除または修飾されたポリペプチドが例示され得る。例えば、そのような欠損および/または変異型のポリペプチドの非限定な一態様として、前記のように例示された公知のVIP受容体のポリペプチド配列に一またはそれ以上の同類のアミノ酸残基の変異を含むポリペプチドが例示され得る。ポリペプチド配列中の特定のアミノ酸残基が、当該アミノ酸と同様の構造または特性を有する異なるアミノ酸残基に置換（同類置換）された変異が、静止変化（silent change）、すなわち、機能を顕著に変えない変化を引き起こす可能性があることは本技術分野で周知であり、同類置換をもたらすアミノ酸置換の手法は本技術分野で周知である。例えば、GPCRは、他の疎水性アミノ酸残基とともに細胞膜成分である脂肪に配向しGPCRおよび/または細胞膜の機能を維持するような膜貫通型αヘリックス中のアミノ酸残基の置換を許容できることは本技術分野においてよく知られている。欠損および/または同類アミノ酸置換等の変異により天然に存在するポリペプチド配列とは異なるVIP受容体1は、本発明のVIP受容体の定義に含まれる。欠損および/または同類アミノ酸置換等の変異により天然に存在するポリペプチド配列とは異なるVIP受容体2は、本発明のVIP受容体の定義に含まれる。
【００２３】
例えば、前記のような変異を含むポリペプチドを天然に存在するVIP受容体のポリペプチド配列との対比においてパーセント同一性で表すことも可能である。非限定な一態様として、天然に存在するVIP受容体のポリペプチドと対比した際に得られるパーセント同一性が99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、68％、66％、64％、62％、60％、58％、56％、54％、52％、50％であるポリペプチドを含むVIP受容体が例示され得る。
【００２４】
「パーセント同一性」とは、以下のように計算される、二つの配列が共通に有するヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率を意味する。特異的配列（クエリー）のパーセント同一性を計算するには、ジェネティクスコンピュータグループ社（Genetics Computer Group, Inc.）から入手可能なベストフィット（BestFit）比較コンピュータプログラムである、ウィスコンシンパッケージ（Wisconsin Package）、バージョン10.1を用いて、クエリー配列の比較対象部分を対照配列と比較することも可能である。このプログラムは、スミス（Smith）およびウォーターマン（Waterman）ら（Advances in Applied Mathematics (1981) 2, 482-489）のアルゴリズムを使用する。パーセント同一性は、例えばベストフィットプログラムに関する以下の初期設定パラメータ：スコアリングマトリックス（scoring matrix）がblosum62.cmp、ギャップクリエーションペナルティ（gap creation penalty）が8、ギャップエクステンションペナルティ（Gap extension penalty）が2で計算され得る。配列をリファレンス配列と比較する際、クエリー配列の比較対象部分は、VIP受容体の配列が使用される。例えば、クエリーがVIP受容体融合ポリペプチドである場合には、パーセント同一性スコアを計算するために、同融合ポリペプチド配列中のVIP受容体部分だけを整列（align）させる。また、同様のコンピュータプログラムとしてClustalW（Thompsonら（Nucleic Acids Res. (1994) 22 (22) 4673-80）、Larkinら（Bioinformatics (2007) 23, 2947-2948））等も適宜使用され得る。
【００２５】
本発明において、前記例示以外の種に由来するVIP受容体もまた使用され得るが、特に哺乳動物由来のVIP受容体が有用である。本技術分野の当業者は、前記例示のVIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列から取得されるプローブまたはPCRプライマーを使用することによって、cDNAまたは当該プローブのポリヌクレオチド配列と同一性の高い（相同な）ゲノム配列が、公知のクローニング方法を用いて、プローブとして用いられたポリヌクレオチド配列が得られた生物種と同じ種または代替的な種から単離することもまた可能である。このようなVIP受容体は、本発明のVIP受容体の定義に含まれる。そのように単離されたポリペプチド配列を前記のような比較コンピュータプログラムを用いて公知のVIR受容体ポリペプチド配列と対比して得られたパーセント同一性によって表すことも可能である。
【００２６】
さらに、VIP受容体の対立遺伝子変異型またはスプライス変異型が特定の種に存在し得るが、これらの変異型が本発明でも有用である。このようなVIP受容体の変異型は、本発明のVIP受容体の定義に含まれる。「対立遺伝子変異型」とは、遺伝子または遺伝子生成物の変異形態を意味する。多数の遺伝子が個体群中に二つまたはそれ以上の対立形態で存在し、多数の対立遺伝子を有する遺伝子もあることが当業者に周知である。こうした遺伝子変異型は公共のデータベースであるJSNP データベース（www.snp.ims.u-tokyo.ac.jp/）、dbSNPデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）、GWAS centralデータベース（www.hgvbaseg2p.org/）等からも取得され得る。
【００２７】
「スプライス変異型」とは、代替的なエクソンが使用された結果得られるmRNAまたは当該mRNAから翻訳されたポリペプチドをいう。特定の細胞系統に応じて、または単一の細胞系統であっても、mRNAが僅かに異なる形態でスプライス変異型として発現されることがある。その結果発現されるmRNAから翻訳されるポリペプチド配列が互いに異なることは本技術分野の当業者には認識されている。
【００２８】
本発明においては、VIP受容体として、VIP受容体融合ポリペプチド（またはVIP受容体融合タンパク質）を用いることができる。VIP受容体融合ポリペプチドは、VIPR1（VPAC1）若しくはVIPR2（VPAC2）ポリペプチド、またはVIPR1（VPAC1）若しくはVIPR2（VPAC2）ポリペプチド断片の、非VIP受容体ポリペプチドとの融合体である。公知の方法を用いて、本技術分野の当業者は、これらのVIP受容体融合ポリペプチドを製造することが可能である。これらのVIP受容体融合ポリペプチドの構造（すなわちそのポリペプチド配列）は、天然に存在するVIP受容体の構造とは異なるが、本発明においてVIP受容体と同様に有用である。VIP受容体1（VPAC1）融合ポリペプチドは、本発明においてVIP受容体1（VPAC1）の定義の範囲に含まれ、VIP受容体2（VPAC2）融合ポリペプチドは、VIP受容体2（VPAC2）の定義の範囲に含まれる。「融合」とは、一つのハイブリッドポリペプチドをコード化するように、二つまたはそれ以上のDNAコード配列を作用可能に連結することを意味する。従って、「融合ポリペプチド」とは、そのようなハイブリッドポリペプチドを指す。
【００２９】
本明細書で「融合ポリペプチド」に関し使用される場合、融合されるポリペプチドをそれぞれコードする二つのDNA配列は、その間の連結の結果、（１）フレームシフト変異の移入を引き起こさず、（２）プロモータ領域がコード配列の転写を方向づける能力に干渉せず、または（３）連結されたDNAに対応するRNA転写産物をタンパク質に翻訳する能力に干渉しない場合に、「作用可能に連結する」といわれる。例えば、コード配列および応答要素は、コード配列の転写を調節配列の影響下または制御下におくように作用可能に連結される。従って、プロモータ領域は、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、そのDNA配列の転写をもたらすことができる場合に、コード配列と作用可能に連結することとなる。「プロモータ」とは、転写の開始、および遺伝子またはコード領域からの転写量（transcription rate）を制御するDNA配列を意味する。
【００３０】
「機能的VIP受容体」とは、生体内または生体外で、VIPまたはVIP類似体に結合する受容体であって、VIP等のリガンドの結合の結果活性化される受容体をいう。本発明において機能的VIP受容体もVIP受容体に含まれ得る。
【００３１】
VIP（血管作動性腸管ペプチド、Vasoactive intestinal peptide）
本発明において「VIP」とは、VIP受容体に結合可能であって、当該結合によってVIP受容体を活性化し得るペプチドをいうが、そのようなペプチドの非限定な一態様として消化管、膵臓、そして脳の視床下部の視交叉上核を含む生体内で生成するペプチドが例示される。VIPが由来する生物種は本発明において特に限定されないが、非限定な一態様としてヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、キンカチョウ、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等が例示される。そのような生物種由来のVIPのペプチドの構造を、当業者は表２に記載されるデータベース登録番号で登録されたアミノ酸配列から確認することが可能である。VIPの結合によってVIP受容体が活性化されたか否かは後述されるようにVIP受容体を発現する細胞がVIPの結合によって活性化されたか否かを検出することによって確認することが可能である。なお、本明細書においてVIPのペプチドおよびVIPのポリペプチドは相互交換的に用いられる。例えば、「VIPのペプチドの構造」とは、「VIPのポリペプチドの構造」と同義である。
【００３２】
【表２】
2015149907.tif 000004
【００３３】
「VIP類似体」とは、VIPと同様の機能を有するポリペプチド、すなわちVIP受容体に結合可能であって、当該結合によってVIP受容体を活性化し得るポリペプチドをいい、例えば表２に例示される公知のポリペプチドの欠損型および/または変異型のポリペプチドが含まれる。例えば、そのような欠損および/または変異型のポリペプチドの非限定な一態様として、VIP受容体等に対する結合またはに必要のないVIPポリペプチドの領域が削除または修飾されたポリペプチドが例示され得る。例えば、そのような欠損および/または変異型のポリペプチドの非限定な一態様として、例えば表２に例示される公知のVIPの配列に一またはそれ以上の同類のアミノ酸残基の変異を含むポリペプチドが例示され得る。欠損および/または同類アミノ酸置換等の変異により天然に存在するポリペプチド配列とは異なるVIPは、本発明のVIP類似体の定義に含まれる。例えば、前記のような変異を含むポリペプチドを天然に存在するVIPポリペプチド配列との対比においてパーセント同一性で表すことも可能である。非限定な一態様として、天然に存在するVIPポリペプチド配列と対比した際に得られるパーセント同一性が99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、68％、66％、64％、62％、60％、58％、56％、54％、52％、50％であるポリペプチド配列を含むVIP類似体が例示され得る。
【００３４】
本発明において、前記例示以外の種、特に哺乳動物由来のVIPが有用である。本技術分野の当業者は、前記例示のVIPをコードするポリヌクレオチド配列から取得されるプローブまたはPCRプライマーを使用することによって、cDNAまたは当該プローブのポリヌクレオチド配列と同一性の高い（相同な）ゲノム配列が、公知のクローニング方法を用いて、プローブとして用いられたポリヌクレオチド配列が得られた生物種と同じ種または代替的な種から単離することも可能である。このようなVIPは、本発明のVIP類似体の定義に含まれる。そのように単離されたポリペプチド配列を前記のような比較コンピュータプログラムを用いて公知のVIPポリペプチド配列と対比して得られたパーセント同一性によって表すことも可能である。
【００３５】
さらに、VIPの対立遺伝子変異型またはスプライス変異型が特定の種に存在し得るが、これらの変異型が本発明でも有用である。このようなVIPの変異型は、本発明のVIP類似体の定義に含まれる。また、VIP、またはVIPのポリペプチド断片の、非VIPポリペプチドとの融合体は、VIP融合ポリペプチド（またはVIP融合タンパク質）と呼ばれる。公知の方法を用いて、本技術分野の当業者は、これらのVIP融合ポリペプチドを製造することが可能である。これらのVIP融合ポリペプチドの構造（すなわちそのポリペプチド配列）は、天然に存在するVIPの構造とは異なるが、本発明においてVIPと同様に有用である。VIP融合ポリペプチドは、本発明においてVIP類似体の定義の範囲に含まれる。
【００３６】
非限定なVIP類似体の一態様として、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（PACAP-27）、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド（PHI）、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド（PHV）、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[(Arg15, 20, 21 Leu17)-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2]、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553（Peptides (1997) 18 (3)  403-408）、Ro25-1392（J. Pharmacol. Exp. Ther. (1997) 281 (2) 629-633）、またはPACAP (6-38)が例示され得る。本発明において好適に使用される非限定なVIP類似体の一態様として、PACAP-27、PACAP-38、PHI、PHV、Ro25-1553、Ro25-1392、および [Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]が例示され得る。
【００３７】
VIP受容体アゴニスト
「VIP受容体アゴニスト」とは、VIPR1（VPAC1）および/またはVIPR2（VPAC2）等のVIP受容体、すなわちVIPR1（VPAC1）若しくはVIPR2（VPAC2）、またはその両方を活性化することが可能な化合物または分子をいう。VIP受容体の活性化は、本明細書で以下に説明するような手法を用いることによって測定することが可能である。「人工VIP受容体アゴニスト」とはVIP受容体アゴニストから天然に存在し得るVIP（血管作動性腸管ペプチド、Vasoactive intestinal peptide）を除いたVIP受容体アゴニストをいう。
【００３８】
抗体
「抗体」とは、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合領域を含む分子を意味する。本発明においてVIP受容体抗体とは、VIP受容体の一つまたはそれ以上のエピトープに選択的に結合する抗体をいうが、その構造は前記抗原結合領域が含まれるあらゆる構造の抗体分子が包含される。そのような構造は本明細書のＶＩ.「VIP受容体に対して結合する抗体の調製」において例示されている。「精製抗体」とは、それが生来付随するタンパク質および自然発生有機分子から、部分的または完全に分離された抗体を意味する。好ましくは、乾燥重量で少なくとも60％が抗体、より好ましくは少なくとも75％が抗体、さらに好ましくは少なくとも90％が抗体、最も好ましくは少なくとも99％が抗体である精製抗体が調製され得る。
【００３９】
「キメラ抗体」とは、二つまたはそれ以上の異なる抗体分子由来、すなわち異なる動物種由来の構造、同じ動物種であっても異なるアイソタイプの構造を含有する抗体を意味する。キメラ抗体には、相補的決定領域移植として知られる技術によって作製される「ヒト化抗体」として知られる抗体も含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
結合
本発明において、VIP受容体アゴニストとVIP受容体との「結合」は、VIP受容体アゴニストとVIP受容体の間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用等が含まれ得る。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得るが、間接的な物理的相互作用（結合）は、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因することも可能である。直接的な物理的相互作用（結合）とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらない相互作用で合って、他の実質的な化学中間体の形成を伴わない、相互作用をいう。VIP受容体アゴニストとVIP受容体の結合は結合親和性等の値を決定することによって、複数の組合せを含むVIP受容体アゴニストとVIP受容体との結合が相対的に評価され得る。「結合親和性」とは、リガンドが受容体と相互作用する活性を意味し、特異的なVIPリガンド−VIP受容体相互作用に関する解離定数に反比例する。解離定数は、標準的な飽和、競合、若しくは動的な結合評価を介して直接的に、または機能的アッセイおよびエンドポイントに関する薬理学的評価を介して間接的に測定することが可能である。
【００４１】
阻害
「阻害」とは、特定のプロセスまたは活性を部分的または完全に阻止することを意味する。例えば、完全または部分的に星細胞を沈静化する場合、その化合物は、星細胞を阻害する。
【００４２】
調節
「調節」とは、文法的なすべての形において、増加、減少、または維持することを意味し、例えば星細胞の活性化を調節するとは、星細胞の活性化の程度を増加、減少もしくは維持し、または星細胞の活性化の機能を増加、減少もしくは維持することを意味する。
【００４３】
選択的アゴニスト
「選択的アゴニスト」とは、アゴニストが、ある受容体（類）に、比較される対照の受容体に比べて大きい結合親和性を有することを意味するもので、それが対照の受容体に関して結合親和性を全く示さないことではない。例えば、VIP受容体アゴニストがVIP受容体1（VPAC1）選択的である場合には、VIP受容体1（VPAC1）に対する結合親和性がVIP受容体2（VPAC2）に対する結合親和性よりも顕著に大きいことを意味し、その結合親和性の差異は例えば105％以上、好ましくは110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、特に好ましくは130％以上、135％以上、140％以上、145％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、150倍以上、200倍以上、250倍以上、300倍以上、350倍以上、400倍以上、450倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、2000倍以上、3000倍以上、4000倍以上、5000倍以上、6000倍以上、7000倍以上、8000倍以上、9000倍以上、104倍以上、105倍以上、106倍以上、107倍以上、108倍以上、109倍以上、1010倍以上であり得る。
【００４４】
好適な選択的アゴニストの非限定な一態様として、PACAP-38（バッケムバイオサイエンス、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]（Gourletら（Peptides (1997) 18, 1539-1545）、[Ala11, 22, 28] VIP（Nicoleら（J. Biol. Chem. (2000) 275, 24003-24012））、Ro25-1392（Xiaら（J. Pharmacol. Exp. Ther. (1997) 281, 629-633））、Ro25-1553（Gourletら（Peptides (1997) 18, 1539-1545）、Gourletら（Peptides (1997) 18, 403-408））等が例示され得る。
【００４５】
治療的に有効
「治療的に有効」とは、処置を受けるヒトまたは非ヒト哺乳類を含む被験体で医学的に望ましい結果をいう。例えば、脂肪肝および/または非アルコール性脂肪肝炎の場合には血清中の中性脂肪量、総コレステロール値、GOT（AST）もしくはGPT（ALT）値の上昇の抑制または減少、超音波検査もしくはCTスキャン等の画像検査による所見の消失等が例示され得る。例えば、非アルコール性脂肪肝炎の場合には、血清中のヒアルロン酸値の上昇、CTスキャン等の画像検査による所見の消失、または肝生検試料における肝細胞への脂肪沈着、中心静脈周囲の細胞の線維化、もしくは肝細胞周囲性線維化の抑制等が例示され得る。
【００４６】
肝疾患
本発明の方法において、「肝疾患」は、好ましくは、肝線維症及び肝硬変を引き起こす任意の肝臓の疾患であってよい。そのような疾患は、当技術分野において周知である（例えばBataller, 前掲を参照）。好ましくは、肝疾患は、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、自己免疫性肝疾患（例えば自己免疫性肝炎及び原発性胆汁性肝硬変）、遺伝性肝臓代謝異常（例えばヘモクロマトーシス(hematochromatosis)）、ウィルソン病、α1アンチトリプシン欠損症、及び薬物若しくは毒素誘導性肝疾患の群から選択される。最も好ましい肝疾患は、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝疾患及び非アルコール性脂肪肝疾患である。
【００４７】
線維化は、通常は炎症又は他の損傷の結果として、線維性の結合組織が器官に広がる病的状態である。「肝線維症」という用語は、当業者に知られている。肝線維症（liver fibrosis）（本明細書では肝線維症（hepatic fibrosis）とも称される）は、重大な肝組織損傷の結果として、肝臓に線維性組織が異常に蓄積される慢性肝疾患である。進行中の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質（大部分はコラーゲン）の蓄積は、肝臓構造を歪める（概説について、例えばBatallerおよびBrenner（J. Clin. Invest. (2006) 115 (2) 209-217）が参照され得る。）。「肝線維症」という用語は、本明細書で用いる場合、好ましくは、「肝硬変」が除外され得る。
【００４８】
肝臓の線維化の主な要因には、慢性のHCV感染、アルコール中毒、及びNASHが含まれる。細胞外マトリックスタンパク質の蓄積は、線維痕の形成により肝臓の組織学的完全性を崩壊させる。この線維状物質の初期分布は、肝臓損傷の原因に左右される。慢性ウィルス性肝炎においては、線維化組織は当初は門脈路の周囲に位置するが、他方アルコール誘導肝炎及びNASHにおいては、それは中心周囲領域及び類洞周囲領域に位置する。線維症の肝臓病は、コラーゲン沈着から、架橋線維化、明白な肝硬変へと明らかに進行する。肝細胞を再生成する結節が成長したときに、肝硬変であると認定される。
【００４９】
肝線維症は、周知の方法によって診断することができる。さらに、肝線維症は、線維化の程度に応じて様々な病期に分類することができる。肝線維症の病期は、例えば周知の基準、例えばMetavirスコアシステムによる線維化スコア1（最小瘢痕）、2（瘢痕が生じ、血管を含む肝臓における領域の外に延びている）、3（架橋線維症が広がり、線維症を含む他の領域に接続している）または4（肝硬変又は肝臓の進行した瘢痕）等のスコア化が可能である。またIshakスコア（ステージ1から4）もしくはKnodellスコア（スコア1-4、5-8、9-12又は13-18）を用いて評価することも可能である（Theinら（Hepatology  2008）48 (2) 418-431）またはMorraら（Exp. Rev. Mol. Diagn. (2007) 7 (5) 481-490）もまた参照され得る）。細胞外マトリックスタンパク質の特異的染色を用いて、コンピュータ式形態学的解析を使用して線維化の程度を定量することが可能である（BatallerおよびBrenner（前掲）。
【００５０】
「肝硬変」という用語は、当業者に理解されている。本明細書で用いる場合、その用語は、好ましくは、正常な微小循環、全体の血管構造、及び肝臓構造が、線維中隔が包囲している再生した又は再生中の実質性結節によって可変的に破壊され、改変されている肝疾患を意味する。肝硬変は、肝線維症の進行期に生じる。従って、肝硬変は、肝臓の正常な構造を破壊する、進行性、線維化性かつ結節性の状態である。肝硬変では、肝組織は、非生存瘢痕組織及び再生結節に置き換えられ、結果として肝機能の低下が生じる。従って、肝硬変は、肝臓が炎症を起こし、瘢痕組織及び再生結節が形成する場合に生じる。従って、肝硬変は、密な線維性組織に囲まれた再生結節の形成を伴う、肝臓における構造上の歪みがあるまで、病因となる線維化が進行する場合に生じる（Harrison's Principles of Internal Medicine, 第17版, A. Fauci編, Mcgraw-Hill Professional、特に第302章を参照）。
【００５１】
上に記載されるように、肝硬変は肝線維症から発達しうる。本発明の方法において、肝硬変は、好ましくは、再生した結節の存在の点で、及び正常な肝臓構造の歪みの点で、肝線維症とは異なる。
【００５２】
肝硬変は、Child-Pugh分類システム（Child-Pughスコア又はChild-Turcotte-Pughとも称される）によって等級付けすることができる。このシステムは、肝硬変の5つの変数、すなわち腹水、ビリルビンとアルブミンの血漿濃度、プロトロンビン時間、及び脳症の程度の評価に基づく。それにより、肝疾患を有する患者を、肝硬変の重症度に応じて、3つの群（Child A、B及びC）に割り当てることが可能となる（Pughら（Br. J. Surg. (1973) 60, 646-649）。したがって、肝硬変に罹患している被験体は、好ましくは、Child-Pugh分類システムによってChild A、B又はCに等級付けされる肝疾患に罹患している。
【００５３】
肝硬変は、血流に対する増加した肝臓内抵抗と門脈圧亢進症、腹水、腎不全、肝性脳症及び静脈瘤出血を引き起こす。肝硬変の患者は、病的状態の発現前に長期にわたりかなり無症候性である場合がある（代償性肝硬変）。肝硬変は、肝細胞癌（HCC（hepatocellular carcinoma）の殆どの場合に関係する。HCCの約18,000の新規の症例が2005年の米国において発生すると予測されている（ThomasおよびZhu（J. Clin. Oncol. (2005) 23 (13) 2892-2899））。HCCの発生率は過去30年にわたって2倍になっており、今も上昇し続けている。これは、C型肝炎の感染者数が多いことと初期感染とHCCの進展の間に数十年間という長いインターバルがあることとによる。NASHに関連する肝硬変は、また、米国において増加しており、急成長するHCCの蔓延に著しく寄与しうる。HCCは主として肝細胞障害の結果進展し、これは、炎症、肝細胞再生、肝臓マトリックス・リモデリング、線維化、そして最終的には肝硬変に至る。
【００５４】
ＩＩ．肝星細胞の調節におけるVIP受容体の役割
本発明の開示によって、従来技術における情報を参酌すれば、以下のことが教示されることが、本技術が属する技術分野の当業者には認識される。本明細書で開示された結果は、VIP受容体アゴニストが、肝星細胞の沈静化を誘発、および/または、肝線維化を阻害することを示しており、従って肝線維化プロセスにおけるVIP受容体の調節的役割または機能が実証される。特定の理論に拘束されるものではないが、VIP受容体アゴニストが肝星細胞の沈静化および肝線維化に及ぼす効果は、肝星細胞への直接的な効果によるものと考えられる。ただし、この効果を、全体または一部分で、VIP受容体アゴニストの非肝臓組織への分泌促進効果を通じて媒介することもまた可能である。
【００５５】
図1〜13では、VIP受容体1またはVIP受容体2に対するアゴニストが、有意に肝星細胞の沈静化、または肝線維化モデルにおける線維化の防止を引き起こすことを実証する実験の結果が示されている。
【００５６】
具体的には、図1においては、CAGE解析によって求められた、MDIカクテルの存在下で培養された不死化肝星細胞E14C12における、肝星細胞活性化マーカーとして知られているACTA2の遺伝子発現が抑制されたことが示されている。MDIカクテル（メチルイソブチルキサンチン（Methylisobutylxanthine）、デキサメタゾン（Dexamethasone）およびインスリン（Insulin））は、その接触により肝星細胞を沈静化状態に留めることができることが知られている薬剤である。
【００５７】
図2においては、モチーフ活性スコアの算出の結果、ATF＿CREB3およびCREB1というcAMP応答性の転写因子結合モチーフがMDIとの接触により不死化肝星細胞E14C12において非常に特徴的な活性化パターンを示し、MDI処理群ではコントロール群と比較して常に高いことが示されている。
【００５８】
図3においては、MDIカクテル、およびその構成成分であるメチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾンならびにインスリンの各薬剤が個別に存在する条件下において不死化肝星細胞E14C12を培養したときの細胞形態像を観察した結果、メチルイソブチルキサンチンが単独に存在する条件下において培養された不死化肝星細胞E14C12に対して強い毒性効果が表れ、細胞が伸長した状態から収縮した状態に変化したことが示されている。
【００５９】
図4においては、MDIカクテル、およびその構成成分であるメチルイソブチルキサンチン、デキサメタゾンならびにインスリンの各薬剤が個別に存在する条件下において不死化肝星細胞E14C12を培養したときの同細胞中のcAMP濃度の上昇によるPKA活性の上昇を当該活性の上昇と反比例の関係にある発光量の減少で検出したところ、MDIカクテルの存在下またはメチルイソブチルキサンチンの単独での存在下において培養された同細胞でPKA活性が上昇、すなわちcAMP濃度が増加したことが示されている。
【００６０】
図5においては、メチルイソブチルキサンチン単独、またはデキサメタゾンおよび/またはインスリンと組合せでの存在下において不死化肝星細胞E14C12を培養したときの同細胞中における肝星細胞の活性化マーカーであるACTA2およびCOL1A1の相対発現量を決定したところ、メチルイソブチルキサンチン単独、またはデキサメタゾンおよび/またはインスリンと組合せでの存在下において肝星細胞の活性化マーカーであるACTA2およびCOL1A1の相対発現量が抑制されたことが示されている。すなわち図4の結果と併せるとcAMPシグナルカスケードの活性化が肝星細胞の沈静化のトリガーとなる可能性が示されている。
【００６１】
図6においては、アデニル酸シクラーゼを活性化して細胞内cAMP濃度を増加させる薬剤であるフォルスコリン（Forskolin）の存在下において不死化肝星細胞E14C12を培養したときの同細胞中における細胞内cAMP濃度の増加を決定したところ、Forskolinの濃度依存的に同細胞における細胞内cAMP濃度が増加したことが示されている。
【００６２】
図7においては、アデニル酸シクラーゼを活性化して細胞内cAMP濃度を増加させる薬剤であるForskolinの存在下において不死化肝星細胞E14C12を培養したときの同細胞中における肝星細胞の活性化マーカーであるCOL1A1の相対発現量を決定したところ、Forskolinの濃度依存的に同細胞におけるCOL1A1の相対発現量が減少したことが示されている。
【００６３】
図8においては、遺伝子発現頻度解析によって肝星細胞での発現が確認された4つのGs共役GPCR（ADORA2B、CALCRL、PTRIRおよびVIPR）に対する各アゴニスト；アデノシン、CGRP、プロスタサイクリンおよびVIPの存在下で培養された不死化肝星細胞E14C12における肝星細胞の活性化マーカーであるACTA2およびCOL1A1の相対発現量を決定したところ、VIP存在下で培養された同細胞におけるACTA2およびCOL1A1の相対発現量が強く抑制され、高濃度のプロスタサイクリン存在下で培養された同細胞におけるACTA2およびCOL1A1の相対発現量が部分的に抑制されたことが示されている。
【００６４】
図9においては、遺伝子発現頻度解析によって肝星細胞での発現が確認された4つのGs共役GPCR；ADORA2B、CALCRL、PTRIRおよびVIPRに対する各アゴニスト；アデノシン、CGRP、プロスタサイクリンおよびVIPの存在下で培養された不死化肝星細胞E14C12におけるcAMP濃度の増加を決定したところ、VIP存在下で培養された同細胞におけるcAMP濃度が増加し、高濃度のアデノシンまたはプロスタサイクリン存在下で培養された同細胞におけるcAMP濃度が弱く増加したことが示されている。
【００６５】
図10においては、MDIカクテル、またはVIPが存在する条件下において不死化肝星細胞E14C12を培養したときの細胞形態像を観察した結果、MDIカクテル、またはVIPが存在する条件下で培養された同細胞がともに収縮した状態に変化したことが示されている。また、MDIカクテルが存在する条件下で培養された同細胞の細胞密度の減少が示されたのに対して、VIPが存在する条件下で培養された同細胞では細胞密度の減少が示されなかった。よって、MDIカクテルが存在する条件下において培養された不死化肝星細胞E14C12に観察された強い毒性効果をもたらすことなく、VIPが活性化状態にある肝星細胞E14C12を沈静化することが可能なことが示された。
【００６６】
図11においては、1週間馴化された5週例のC57BL6/Jマウスに超高脂肪CDAA飼料（CDAHFD）を一定期間給餌された病態モデルの肝臓切片のマッソントリクローム染色像において、明らかな脂肪肝および炎症像が観察され投与後6週間以降では顕著な線維化が検出されたことが示された。
【００６７】
図12においては、図11で明らかな脂肪肝および炎症像が観察され投与後6週間以降では顕著な線維化が検出された病態モデルの肝臓における、線維化マーカー遺伝子Acta2 ならびにCol1a1、炎症マーカーTGFβおよびTNFαの顕著な発現亢進が示された。また、投与後6週間以降では肝星細胞マーカーであるDesminの顕著な発現亢進が認められたことから、投与後6週間以降で検出された顕著な線維化は、肝星細胞の増殖および活性化によるものであると考察された。
【００６８】
図13においては、図11で明らかな脂肪肝および炎症像が観察され投与後6週間以降では顕著な線維化が検出された病態モデルでのCDAHFDが7週間負荷された肝臓におけるVIP受容体の発現量を正常マウスのそれと比較した場合において、正常マウスの肝星細胞ではVIP受容体1が選択的に発現しているのに対して、病態マウスの肝星細胞ではVIP受容体1の発現の減少とともにVIP受容体2の発現の顕著な亢進が示された。図8から10の結果よりVIPRのアゴニストによって肝星細胞の沈静化が誘導できることから、VIPR1もしくはVIPR2にのみ選択的、あるいまたは両方に選択的なアゴニストが、肝星細胞の沈静化を誘導し肝臓の線維化を治療することが考察された。
【００６９】
ＩＩＩ．VIP受容体、VIPもしくはVIP類似体、またはVIP受容体を発現する細胞株の調製
VIPR1（VPAC1）、VIPR2（VPAC2）、VIPおよびVIP類似体は、抗体の作製、本発明のスクリーニングアッセイでの被験物質としての使用、および脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患の治療のための医薬品試薬としての使用を含めて、様々な使用に関して調製することが可能であるが、本明細書に記載された特定の態様に限定されるものではない。本発明の特定の実施形態には、精製ポリペプチドが有用であり、他の実施形態である当該ポリペプチドを発現する細胞株もまた有用であることが、本技術分野の当業者には明白である。例えば、VIP受容体の構造的及び機能的特徴を保持することが重要な場合、例えばVIP受容体を活性化する候補化合物を同定するスクリーニング方法等の場合には、機能的VIP受容体を発現する細胞が好適に使用され得る。
【００７０】
VIPおよびVIP類似体は組換え手法によって製造してもよいが、これらは短鎖のポリペプチドであるので、本技術分野で周知の技術を用いた直接合成法によって好適に取得され得る。さらに、これらの分子の多くは市販されている。また、組換え発現法によってVIPおよびVIP類似体を単離する場合には、後述されるVIP受容体の組換え発現で使用される手法を用いることによって発現されたVIPおよびVIP類似体を、組換え細胞の培養液から単離および精製することが可能である。本発明の方法に特に有用であるのは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ニワトリ、キンカチョウ、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルを含めた種由来のVIP受容体であるが、これらに限定されない。
【００７１】
VIP受容体の構造的及び機能的特徴を保持する目的でVIP受容体ポリペプチドを発現する細胞株が用いられる場合、例えば内在的に（endogeneously）VIP受容体を発現する細胞、内在性VIP受容体の発現を増加させるように刺激された細胞、またはVIP受容体を発現するように遺伝子操作された細胞株が好適に使用され得る。細胞株がVIP受容体を発現するかどうかを決定するための方法は、本技術分野で周知であり、例えば、適切な抗体によるVIP受容体ポリペプチドの検出、VIP受容体ポリペプチドをコードするmRNAの検出（例えばDNAプローブもしくはプライマーを用いたノーザンブロットまたはPCR増幅）、またはVIP受容体ポリペプチドに選択的な薬剤の結合の測定（例えば、放射性同位体標識されたVIP）等によって細胞株におけるVIP受容体の発現が確認され得る。
【００７２】
VIPR1、VIPR2、またはこれらのポリペプチドを発現する細胞株の調製に際して、本技術分野において組換えDNA技術が好適に用いられる。組換えVIPR1またはVIPR2を発現するには、一つまたはそれ以上の応答要素の制御下にVIPR1またはVIPR2等の対象のポリペプチドをコード化する核酸が配置されるように発現ベクターが調製される。いくつかの種由来のVIPR1およびVIPR2をコードするゲノムまたはcDNA配列は、表１に記載されたデータベース登録番号で登録されたレコードから取得することが可能である。この公的に利用可能な配列情報を用いて、VIPR1またはVIPR2をコードする核酸分子を単離する手段の一つは、天然のDNAプローブ、または本技術分野で周知の方法、例えば適切なライブラリからの配列のPCR増幅によって人工的に合成されたDNAプローブによる、ゲノムDNAまたはcDNAライブラリのスクリーニングである。その他の方法は、目的とするVIPR1またはVIPR2をコードするポリヌクレオチド配列の部分配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特定の組織（骨格筋など）から単離されたmRNAを鋳型として直接的にcDNAをPCR増幅することである。このように単離されたmRNAは、市販されている。本技術分野の当業者には、さらに、公知のVIP受容体のポリヌクレオチド配列の部分配列を含む核酸プローブを使用することによって、相同なcDNAまたは他の種からのゲノム配列を、公知の方法を用いて得ることも可能である。本発明の方法に特に有用であるのは、ヒト、アカゲザル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ、テンジクネズミ、ノバリケン、ニワトリ、シチメンチョウ、キンカチョウ、ウズラ、ニジマスおよびゼブラフィッシュを含めた種由来のVIP受容体であるが、これらに限定されない。
【００７３】
次いで、本技術分野において周知の方法によって、単離された対象のVIP受容体をコードする核酸分子が適切な発現ベクターに連結される。その際に、後述される精製または形質転換された宿主細胞の選択を目的として、VIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列にタグをコードする配列をインフレームで連結することも可能である。本技術分野の当業者はこのような複数種類のタグをコードするポリヌクレオチドを適宜使用することが可能である。このようなタグの非限定な一態様としてHis、FLAG、HA、myc、GST、MBP等のエピトープタグやプロテインタグ等が例示され得る。このようにして調製される発現ベクターが宿主細胞中で発現し、VIP受容体を発現する宿主細胞は、スクリーニングアッセイで直接的に使用され得るし、または、VIP受容体を発現する宿主細胞から単離されたVIP受容体がスクリーニングアッセイで使用され得る。
【００７４】
本発明の目的で使用できる宿主発現ベクター系としては、VIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換させた細菌（例えば、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B．subtilis））などの微生物；VIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換させた酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia））；VIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス（baculovirus））で感染させた昆虫細胞系；VIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、タバコモザイクウィルス）で感染させた、またはVIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）によって形質転換させた植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）若しくは哺乳類ウィルス由来のプロモータ（例えば、レトロウィルスLTR）を含有し、さらにVIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含有する組換え発現構造を有する哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、HEK293、NIH3T3）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
前記のように作製されたVIP受容体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することによって対象のポリペプチドが産生される。VIP受容体は膜結合分子であるので、宿主細胞膜から精製、またはVIP受容体を細胞膜中に固定して使用、すなわち、細胞全体または細胞の膜断片を使用することが可能である。本技術分野の当業者に周知の方法によって、適切な界面活性剤または脂質ミセルを用いてこのような発現細胞系からのVIP受容体が精製または濃縮され得る。
【００７６】
細菌を宿主細胞として用いる発現系では、発現するVIP受容体の使用用途に応じた多種類の発現ベクターが好適に選択される。例えば、VIP受容体に結合する抗体を作製する目的でVIP受容体ポリペプチドを大量に産生する場合、高レベルのポリペプチドの発現が可能なベクターが望ましい。このようなベクターを構築し、VIP受容体融合ポリペプチドに選択的なカラムやVIP受容体融合ポリペプチドに含まれるエピトープタグに特異的に結合する抗体が連結されたアフィニティカラムなどの選択的な精製技術、およびVIP受容体ポリペプチドに非選択的な精製技術を含めた様々な方法によって、本技術分野の当業者はVIP受容体またはVIP受容体融合ポリペプチドを精製することが可能である。
【００７７】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる発現系では、バキュロウィルスＡ．カリフォルニカ核多角体病ウィルス（AcNPV）が、ヨトウガ（S. frugiperda）細胞で異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。この場合、VIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、当該ウィルスの複製には必須でない領域にAcNPVプロモータの制御下に配置されてクローニングされる。次いで、この組換えウィルスを、挿入されたVIP受容体の遺伝子を発現させる細胞に感染させ、当該細胞から本技術分野の当業者に公知の多くの技術のうちの一つによってVIP受容体ポリペプチドが精製される。
【００７８】
哺乳類細胞を宿主細胞として用いる発現系では、ウィルスベクターを基盤とする多種類の発現系から適宜選択される発現系が使用され得る。これらの発現系の使用には、しばしば、挿入されたVIP受容体をコードするポリヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために、ベクターの骨格中に特定の開始信号が含有される必要がある。これは、内在性の開始信号を含まないVIP受容体をコードする遺伝子の一部分、例えばコード領域のみのポリヌクレオチドを使用する場合に特に重要である。挿入されたポリヌクレオチド配列のコード領域の内外でのこうした開始信号の配置、ならびに転写および翻訳促進要素の付加、および組換えポリペプチドの精製は、本技術分野の当業者に周知の多種類の方法の一つによって実施される。哺乳類細胞を宿主細胞として用いる発現系では、組換えポリペプチドの必須な翻訳後修飾を可能とする適切な細胞系を選択することもまた重要である。このような修飾、例えば、開裂、リン酸化反応、グリコシル化等には、当該修飾を触媒する酵素を含有する適切な宿主細胞の選択が必要である。このような宿主細胞としては、CHO、HEK293、NIH3T3、COSなどが例示されるが、これらに限定されるものではなく、本技術分野の当業者には例示以外の多種類の宿主細胞が周知である。
【００７９】
組換えポリペプチドの長期的な高発現のためには、安定発現系による発現が好ましい。例えば、VIP受容体を安定的に発現する細胞株が作製され得る。本技術分野の当行者は、電気穿孔法、リン酸カルシウムトランスフェクション、またはリポソーム媒介トランスフェクション等の周知の方法に従って、VIP受容体を安定的に発現する細胞株を作製することが可能である。これは、通常、適切な発現制御要素（例えば、プロモータ配列、エンハンサー配列、転写終止端配列、ポリアデニル化部位、および/または翻訳開始部位等）および選択マーカー、および対象のVIP受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞をトランスフェクションすることによって作製され得る。選択マーカーは、対象のVIP受容体をコードするポリヌクレオチドと同じベクター内に含有されることも、また当該ベクターと共にトランスフェクションする別個のベクター上に含有されることも可能である。発現ベクター中の選択マーカーは選択に対する耐性を宿主細胞に与えることができるため、ベクターを安定的にその染色体に組み入れた細胞のみが当該選択に耐性となり当該選択下において生育することが可能となるため、その後クローニングされ細胞株に拡張することができるようなコロニーを形成することが可能となる。非限定な別の一態様では、発現ベクターに含まれるマーカーの物理的特質を用いることによって選択することが可能なマーカーを発現する細胞もまた作製され得る。例えば、当該マーカーが緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質である場合には、当該蛍光タンパク質の発現によって蛍光を発する細胞を、蛍光活性細胞分類（FACS）分析を用いて選択することもまた可能である。
【００８０】
本技術分野の当業者は、対象のVIP受容体をコードするポリヌクレオチドが組み入れられた所望の細胞を選択することが可能となるよう、トランスフェクションに適した細胞系のタイプを選択することができる。例えば、選択マーカーが、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの場合、選択に適した細胞のタイプは、それぞれ、tk欠失、hgprt欠失、またはaprt欠失細胞である。または、選択マーカーが、メトトレキサート、ミコフェノリン酸、G-418、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える、（すなわち、それぞれdhfr、gpt、neo、またはhygro遺伝子である）場合には、野生型細胞を使用することが可能である。このような組換え型細胞株は、VIP受容体の活性に影響を及ぼす被験物資の同定に有用である。
【００８１】
ＩＶ．VIP受容体活性化の決定
本発明の１つの観点は、VIP受容体に被験化合物を接触させ、被験化合物がVIP受容体に結合するかどうか、またはVIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程を含む、肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法である。本発明の方法における「被験化合物」は特に限定なく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、化合物ライブラリ、遺伝子ライブラリの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物または動物細胞抽出物等が使用され得る。上記被験化合物は必要に応じて適宜標識して使用され得る。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることが可能である。また、上記被験化合物に加えて、これらの被験化合物が複数種混合された混合物も含まれ得る。
【００８２】
また、本発明において「接触」または「接触させる」は、VIP受容体の形態に応じて種々の態様で行われる。例えば、VIP受容体が精製されたVIP受容体の場合、精製標品に被験化合物を添加することにより「接触させる」ことができる。また、細胞に発現した状態又は細胞抽出液に発現したVIP受容体の場合、それぞれ、細胞の培養液又は当該細胞抽出液に被験化合物を添加することにより「接触させる」ことができる。被験化合物がポリペプチドの場合、例えば、当該ポリペプチドをコードするDNAを含むベクターを、VIP受容体が発現している細胞へ導入する、又は当該ベクターをVIP受容体が発現している細胞抽出液に添加することで「接触させる」ことも可能である。また、例えば、酵母又は動物細胞等を用いたツーハイブリッド法を利用することも可能である。
【００８３】
本発明の方法における第一の態様では、VIP受容体と被験化合物との結合が検出される。検出方法としては、特に制限はない。VIP受容体と被験化合物との結合は、例えば、VIP受容体ポリペプチドに結合した被験化合物に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識等定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。化合物の受容体への結合を決定する方法は、当該技術分野では周知である。通常、このアッセイには、被験化合物を含むまたは含まない環境で受容体に結合することがわかっている標識化合物と共に、VIP受容体をインキュベートする工程と、結合した標識化合物の量を決定する工程とを含む。本明細書に記載されるように、VIP受容体は、ある形態の単離VIP受容体であり得る。標識化合物は、好ましくは定量的に測定できるように、VIPまたはいかなるVIP類似体の標識（例えば、125I標識、ユーロピウム標識、フルオレセイン標識、GFP標識、35S-メチオニン標識）であり得る。このような標識技術は、当該技術分野では周知である。VIP受容体に結合する被験化合物は、受容体に結合する標識リガンドの量を低減させるので、対照試料（試験化合物を含まない）からのものに比べて標識物質からの信号レベルが低下する。この技術の変形された一態様では、Gタンパク質非連結剤を含むまたは含まない環境で結合する受容体（例えば、グアニンヌクレオチド類似体、すなわちGpppNHpを含むまたは含まない環境で結合）によって、アゴニストとアンタゴニストが区別され得る。キーン「Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells in Receptor Signal Transduction Protocols」（Humana Press、チャリス編集）にはこうした結合活性の測定方法が記載されている。
【００８４】
VIPR1またはVIPR2に特異的に結合する（すなわち、一つのタイプの受容体には結合するが他のタイプには結合しない）化合物を区別することが望まれる場合は、上述のアッセイは、VIP受容体の一方だけを発現する細胞もしくは当該細胞由来の膜を使用して実施、またはアッセイを特定の受容体の組換え細胞によって実施され得る。二つ以上の形態のVIP受容体を発現する細胞は、対象外のVIP受容体遺伝子を不活性または無効にするために、相同組換えを用いて修飾され得る。あるいは、二種類以上のVIP受容体を含有する場合、アッセイで得られる信号から、対象外の受容体によって産生されたバックグラウンド信号が差し引かれ得る。バックグラウンド反応は、アンチセンス、抗体、または選択的拮抗薬を使用することによって、対象外のVIP受容体からの信号を排除することを含めて、多数の方法によって決定され得る。
【００８５】
本態様では、このように、VIP受容体と結合する被験化合物が選択される。選択された化合物には、VIP受容体を活性化する化合物が含まる。
【００８６】
本発明の方法における第二の態様では、VIP受容体を発現する細胞に被検化合物を接触させる。第二の態様では、次いでVIP受容体の発現レベルを測定する。VIP受容体の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、VIP受容体遺伝子のmRNAを含むRNAを定法に従って抽出し、このRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法又はRT-PCR法を実施することによって遺伝子の転写レベルの測定を行うことも可能である。さらに、DNAアレイ技術を用いて、遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【００８７】
また、VIP受容体遺伝子からコードされるVIP受容体を含む画分を定法に従って回収し、VIP受容体の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、VIP受容体遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。また、VIP受容体に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、VIP受容体の発現を検出することにより、VIP受容体遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【００８８】
VIP受容体の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかまたは両方を利用することが可能である。抗VIP受容体抗体は、当業者に周知の方法によって調製され得る。ポリクローナル抗体の調製の場合には、例えば、次のようにして取得することができる。VIP受容体、あるいはVIP受容体とGSTとの融合ポリペプチドとして大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントポリペプチドまたはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫して得られた血清から、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、VIP受容体やその合成ペプチドがカップリングされたアフィニティカラム等により精製することにより抗VIP受容体ポリクローナル抗体が調製され得る。また、モノクローナル抗体の調製の場合には、例えば、VIP受容体又はその部分ペプチドが免疫されたマウス等の小動物より摘出された脾臓をすりつぶして分離された細胞細胞とマウスミエローマ細胞がポリエチレングリコール等の試薬を用いてまず融合させられる。その結果得られる融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、VIP受容体に結合する抗体を産生するクローンが選択される。次いで、得られたハイブリドーマが腹腔内に移植されたマウスから回収された腹水中のモノクローナル抗体が、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、VIP受容体や合成ペプチドがカップリングされたアフィニティカラム等により精製された抗VIP受容体モノクローナル抗体が調製され得る。
【００８９】
また、市販されている抗VIP受容体抗体も適宜使用され得る。このような市販されている抗VIPR1抗体の非限定な一態様として、抗VIPR1ポリクローナル抗体D01（Abnova）、K-19（Santa Cruz）等が例示され得る。このような市販されている抗VIPR1抗体の非限定な一態様として、抗VIPR1モノクローナル抗体AS58（Santa Cruz）等が例示され得る。このような市販されている抗VIPR2抗体の非限定な一態様として、抗VIPR2ポリクローナル抗体（Acris Antibodies、AP10557PU-N）等が例示され得る。このような市販されている抗VIPR2抗体の非限定な一態様として、抗VIPR2モノクローナル抗体Clone 476031、AS69（Sigma-Aldrich）等が例示され得る。
【００９０】
第二の態様では、次いで、被験化合物を接触させていない場合と比較して、VIP受容体の発現レベルを調節する被験化合物が選択される。選択された化合物には、VIP受容体の発現、特にVIPR2の発現を減少させる化合物が含まれる。
【００９１】
本発明の方法における第三の態様としては、VIP受容体をコードするDNAのプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が作用可能に連結したDNAを有する細胞又は細胞抽出液を用いてVIP受容体の活性化を検出する方法が提供される。「レポーター遺伝子」とは、他の遺伝子、とりわけ当該他の遺伝子の応答要素を評価するために一般的に使用される、細胞株において内因的に発現されない遺伝子をいう。レポーター遺伝子の発現によって、当該レポーター遺伝子を有する細胞の表現型が変化する。上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ（β-ガラクトシダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子（AP）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（SEAP）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）及び全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP等）、橙色蛍光タンパク質（KusabiraOrange、mOrange）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青色蛍光タンパク質（BFP））遺伝子等を挙げることができる。上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）及びGFP遺伝子等を挙げることができる。VIP受容体をコードするDNAのプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が作用可能に連結したDNAを有する細胞又は細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製され得る。
【００９２】
次に、前記細胞または前記細胞抽出液に被験化合物を接触させる。次いで、前記細胞または前記細胞抽出液におけるレポーター遺伝子の発現が測定される。レポーター遺伝子の発現は、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定され得る。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合は、当該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによってレポーター遺伝子の発現を測定することが可能である。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ、または胎盤アルカリ性ホスファターゼである場合は、遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色または蛍光化合物の励起光を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合は、遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合は、遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質の遺伝子である場合は、当該蛍光タンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を測定することが可能である。
【００９３】
本発明の方法における第三の態様では、被験化合物を接触させていない場合と比較して、VIP受容体の発現レベルを調節する被験化合物が選択される。選択された化合物には、VIP受容体特にVIPR2の発現レベルを減少させる化合物が含まれる。
【００９４】
本発明の方法における第四の態様では、VIP受容体が介在するシグナルカスケードの活性化を測定する、より具体的にはVIP受容体が介在するシグナルカスケードの結果、生じる生理活性物質のレベルを測定することによりVIP受容体の活性化を決定する。VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させていない場合と比較して、被験化合物を当該細胞に接触させた場合の当該レベルが変動することに基づいて、当該被験化合物がVIP受容体を活性化するか否かを決定することが可能である。VIP 受容体はGタンパク質共役受容体（GPCR）クラスに属する分子であり、VIP受容体の活性化によりGαs、Gαq、またはGαiから選択される少なくともひとつのGタンパク質の介在するシグナルカスケードが活性化され得る。アデニル酸シクラーゼの活性化はcAMPの形成を触媒し、次いでタンパク質キナーゼAの活性化、細胞内のカルシウム放出、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPキナーゼ）の活性化を含むシグナルカスケードの活性化をもたらす。また、VIP受容体のアゴニストによる活性化の後に細胞内イノシトール3リン酸の合成を強化することでVIP受容体がGαiまたはGαqに対して結合することも示唆されている。よって、細胞内カルシウム、細胞内イノシトール3リン酸、または細胞内cAMPが上記の生理活性物質の非限定な一態様として例示され得る。
【００９５】
例えば、VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させた後で、調製された細胞の溶解物がcAMP誘導の分析のために提供される。cAMPは、Gαs活性化に応答して誘導される。GαsがVIP受容体以外の受容体によって活性化され得ること、被験化合物がVIP受容体を通してまたは他の機構によってその効果を与え得ることを参酌して、二つの対照アッセイが、被験化合物がVIP受容体の活性化によって細胞内cAMPのレベルを増加させるかどうかを決定するのに実施され得る。一つの対照アッセイは、被験化合物に接触させた前記細胞内cAMPレベルと、対照化合物（すなわち、被験化合物を溶解させるのに用いられたたベヒクル）に接触させた細胞内cAMPレベルとを比較するアッセイである。被験化合物が対照化合物に対して相対的に細胞内cAMPレベルを増加させる場合、これは、被験化合物がいくつかの機構によって細胞内cAMPを増加させることを示す。もう一つの対照アッセイは、VIP受容体を発現する細胞内cAMPレベルと、VIP受容体を発現しないことを除いて本質的に同一の細胞株の細胞内cAMPレベルとを、両方の細胞株を被験化合物に接触させて、比較するものである。被験化合物が、VIP受容体を発現しない細胞株に対して相対的に、VIP受容体を発現する細胞株における細胞内cAMPレベルを増加させる場合、これは、被験化合物がVIP受容体の活性化によって細胞内cAMPレベルを増加させることを示す。
【００９６】
これらの生理活性物質を測定するための周知の方法のほか市販のキット等も好適に使用され得る。例えば、細胞内cAMPレベルを測定するために、酵素増幅法を用いた高感度蛍光測定法（杉山ら（Anal. Biochem. (1994) 218, 20-25）のほか、AlphaScreen cAMP キット（Perkin Elmer）、cAMP HunterTM eXpressキット（DiscovRx）、cAMP-GloTM assayキット（Promega）等が適宜使用され得る。イノシトール3リン酸レベルを測定するために、D-myo-Inositol 1,4,5-Triphosphate (IP3) HitHunterTM Fluorescence Polarizationアッセイキット（GE Healthcare）、Inositol 1,4,5,-Trisphosphate (IP3) ELISAキット（antibodies-online）等が適宜使用され得る。細胞内カルシウムレベルを測定するために、FLIPR Calcuim 5アッセイキット（Molecular Device）、Calcium Colorimetricアッセイキット（Bio Vision）、HitHunterR Calcium アッセイキット（DiscovRx）等が適宜使用され得る。
【００９７】
本発明の方法における第五の態様においては、VIP受容体が介在するシグナルカスケードに関与する少なくとも一つの応答要素、例えば、cAMP応答要素（CRE）にレポーター遺伝子が作用可能に連結されたDNAを有する細胞又は細胞抽出液を用いてVIP受容体の活性化を決定する。「レポーター遺伝子」とは、他の遺伝子、とりわけ当該他の遺伝子の応答要素を評価するために一般的に使用される、細胞株において内因的に発現されない遺伝子をいう。レポーター遺伝子の発現によって、当該レポーター遺伝子を有する細胞の表現型が変化する。上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ（β-ガラクトシダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子（AP）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（SEAP）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）及び全ての蛍光タンパク質遺伝子（緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP等）、橙色蛍光タンパク質（KusabiraOrange、mOrange）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青色蛍光タンパク質（BFP））遺伝子等を挙げることができる。VIP受容体が介在するシグナルカスケードに関与する少なくとも一つの応答要素、例えば、cAMP応答要素にレポーター遺伝子が作用可能に連結されたDNAを有する細胞または細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製され得る。
【００９８】
本発明の方法における第五の態様では、VIP受容体が介在するシグナルカスケードの活性化を測定するために、VIP受容体が介在するシグナルカスケードに関与する少なくとも一つの応答要素、例えば、cAMP応答要素（CRE）にレポーター遺伝子が作用可能に連結されたDNAを有する細胞又は細胞抽出液が使用される。より具体的には、前記細胞に被験化合物を接触させていない場合と比較して、被験化合物を接触させた場合のレポーター遺伝子の発現を比較することで、VIP受容体が介在するシグナルカスケードの活性化が測定される。その結果、VIP受容体が介在するシグナルカスケードに関与する少なくとも一つの応答要素、例えば、cAMP応答要素に作用可能に連結されたレポーター遺伝子の発現を調節する被験化合物が選択される。選択された化合物には、VIP受容体が介在するシグナルカスケードに関与する少なくとも一つの応答要素、例えば、cAMP応答要素（CRE）に作用可能に連結されたレポーター遺伝子の発現を調節する化合物が含まれる。前記の細胞はまた、例えばCREに作用可能に連結されたレポーター遺伝子の強い誘導を検出することを目的として、VIPまたはVIP類似体による誘導を最大限にするために、以下の多数の特徴から選択される特徴を有する細胞が好適に用いられる；(a) 低い天然レベルのcAMP、(b) VIP受容体と相互作用できるGタンパク質、(c) 高レベルのアデニリルシクラーゼ、(d) 高レベルのタンパク質キナーゼA、(e) 低レベルのホスホジエステラーゼ、および(f) 高レベルのcAMP応答要素結合タンパク質が有利である。VIPまたはVIP類似体に対する応答を高めるために、宿主細胞を操作して、望ましい因子の発現量をより多くし、または望ましくない因子の発現量をより少なくすることができる。加えて、CREに作用可能に連結されたレポーター遺伝子の誘導のための代替的な経路を排除して、対照レベルを低下させることができる。
【００９９】
本発明の方法における第六の態様では、VIP受容体を発現する細胞に被検化合物を接触させる。第六の態様では、次いで前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現レベルが測定される。非限定な病態マーカーの一態様として、ACTA2（NM＿001613）、ANXA2（NM＿001002857）、ARNT2（NM＿014862）、COL1A1（NM＿000088）、COL3A1（NM＿000090）、COL4A1（NM＿001845）、CPEB1（NM＿030594）、CTGF（NM＿001901）、CTHRC1（NM＿138455）、CXCL2（NM＿002089）、Desmin（NM＿001927）、EDN1（NM＿001955）、FOXF1（NM＿001451）、HAMP（NM＿021175）、HSPA1A（NM＿005345）、IGFBP6（NM＿002178）、KRT18（NM＿000224）、LOXL2（NM＿002318）、MMP13（NM＿002427）、MRGPRF（NM＿145015）、P311（NM＿004772）、 SYP（NM＿003179）、TGFB1（NM＿000660）、TGFB2（NM＿003238）、TIMP1（NM＿003254）、TNFα（NM＿000594）、およびTUBB（NM＿178014）から選択される少なくとも一つの病態マーカーが適宜選択され得る。
【０１００】
病態マーカー遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、病態マーカー遺伝子のmRNAを含むRNAを定法に従って抽出し、このRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法又はRT-PCR法を実施することによって遺伝子の転写レベルの測定を行うことも可能である。さらに、DNAアレイ技術を用いて、遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【０１０１】
また、病態マーカー遺伝子からコードされる病態マーカーを含む画分を定法に従って回収し、病態マーカーの発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、病態マーカー遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。また、病態マーカーに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、病態マーカーの発現を検出することにより、病態マーカー遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【０１０２】
病態マーカーの検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれかまたは両方を利用することが可能である。抗病態マーカー抗体は、当業者に周知の方法によって調製され得る。ポリクローナル抗体の調製の場合には、例えば、次のようにして取得することができる。病態マーカー、あるいは病態マーカーとGSTとの融合ポリペプチドとして大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントポリペプチドまたはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫して得られた血清から、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、等により精製することにより抗病態マーカーポリクローナル抗体が調製され得る。また、モノクローナル抗体の調製の場合には、例えば、病態マーカー又はその部分ペプチドが免疫されたマウス等の小動物より摘出された脾臓をすりつぶして分離された細胞細胞とマウスミエローマ細胞がポリエチレングリコール等の試薬を用いてまず融合させられる。その結果得られる融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、病態マーカーに結合する抗体を産生するクローンが選択される。次いで、得られたハイブリドーマが腹腔内に移植されたマウスから回収された腹水中のモノクローナル抗体が、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー等により精製された抗病態マーカーモノクローナル抗体が調製され得る。
【０１０３】
また、市販されている抗病態マーカー抗体も適宜使用され得る。このような市販されている抗病態マーカー抗体の非限定な一態様として、抗ACTA2抗体（1A4 (asm-1)モノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific）、1D11-2B9モノクローナル抗体（Lifespan Biosciences））、抗Col1a1抗体（5D8-G9モノクローナル抗体（EMD Millipore）、LS-B6723モノクローナル抗体（Lifespan Biosciences）、3G3モノクローナル抗体（Abnova））、抗DESMIN抗体（DE-B-5モノクローナル抗体（EMD Millipore）、D33モノクローナル抗体（Lifespan Biosciences）、DE-U-10モノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific））、抗CTGF抗体（2154-60モノクローナル抗体（Lifespan Biosciences）、RB14436モノクローナル抗体（Aviva Systems Biology）、2C11モノクローナル抗体（Abnova））、抗TGFβ抗体（TB21モノクローナル抗体（EMD Millipore）、1D11モノクローナル抗体（AbD Serotec）、4F9C10,1B11B7モノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific））、抗MMP13抗体（VIIIA2モノクローナル抗体（EMD Millipore）、3B11モノクローナル抗体（AbD Serotec）、LIPCO IID1モノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific））、抗TNFα抗体（2C8モノクローナル抗体（EMD Millipore）、52B83モノクローナル抗体（Lifespan Biosciences）、2TNF-H33モノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific）、M1-C4モノクローナル抗体（Abnova））、抗TIMP1抗体（102D1モノクローナル抗体（EMD Millipore）、T3モノクローナル抗体（AbD Serotec）、3A4モノクローナル抗体（Thermo Fisher Scientific）、2A5モノクローナル抗体（Abnova））等のモノクローナル抗体や上記マーカーに結合するものとして市販されるポリクローナル抗体が例示され得る。
【０１０４】
第六の態様では、次いで、被験化合物を接触させていない場合と比較して、病態マーカーの発現レベルを減少させる被験化合物が選択される。選択された化合物には、病態マーカーの発現を減少させる化合物が含まれる。
【０１０５】
Ｖ．VIP受容体に対して結合する抗体の調製
VIP受容体の一つまたはそれ以上のエピトープに選択的に結合する抗体も、本発明に包含される。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリを用いて産生される分子、トランスジェニックマウスで産生されるヒト抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、および上述のいずれかの抗体が結合するエピトープに結合する抗体が例示され得る。治療的な使用を企図する場合、キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましく、ヒト抗体もまた好ましい。
【０１０６】
抗体は、被験化合物の評価、例えばVIP受容体ポリペプチドの活性化に関して、本明細書で説明する化合物スクリーニングスキームと組み合わせて使用でき、または、このような抗体を、遺伝子治療技術と組み合わせて使用し、細胞内で、またはこれらの遺伝子を導入する患者の組織内で直接、例えばVIP受容体の発現を評価することができる。加えて、本発明の抗体は、肝線維化、肝硬変、肝臓癌の処置で有用である。VIP受容体に選択的な抗体は、VIP受容体アゴニストである一群の抗体を同定するために、本発明の方法によってスクリーニングすることが可能である。加えて、VIPまたはVIP類似体に特異的な抗体に対して生成される抗イディオタイプ抗体は、VIP受容体アゴニストとして有用な可能性があり、抗VIP受容体抗体と同様に、本発明の方法によってVIP受容体を活性化する能力を指標にしてスクリーニングすることが可能である。
【０１０７】
抗体を作製するために、当該技術分野で周知の方法によって、VIP受容体、VIP若しくはVIP類似体、抗VIP抗体、抗VIP類似体抗体、またはこれらの免疫原性断片で注射することにより、様々な宿主動物を免疫化することが可能である。抗イディオタイプ抗体の調製では、免疫原は、抗VIP抗体または抗VIP類似体抗体である。抗イディオタイプ抗体の産生については、例えば米国特許第4,699,880号に記載されており、同米国特許は参考として本明細書に組み込まれ得る。適切な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、およびウマが挙げられるが、これに限るものではない。免疫化技術は、当該技術分野で周知である。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から精製することができ、またはモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によって作製することができる。これらの技術には、クーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）の周知のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術が含まれるが、これに限るものではない。モノクローナル抗体は、κまたはλ軽鎖を含有する、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgDを含めて、いかなる免疫グロブリンのクラスも使用され得る。
【０１０８】
ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性のため、ヒトの患者の治療的処置に使用する際に、非ヒト抗体に対してはキメラ抗体が好ましい。キメラ抗体を産生および使用する技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、バズワニ（Vaswani）ら（Ann. Allergy Asthma Immunol. (1998) 81, 105-119）、ファラー（Farah）ら（Crit. Rev. Eukaryot. Gene Express. (1998) 8 (3-4) 321-356）、米国特許第5,807,715号、同第4,816,397号、同第4,816,567号、および同第5,824,307号に記載されている。
【０１０９】
完全ヒト抗体は、非ヒト抗体よりも免疫原性が低いので、ヒト患者の治療的処置にさらに望ましい。このような抗体を、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は実質的に発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現できる、トランスジェニックマウスを用いて産生することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばVIP受容体のすべてまたは一部分によって通常の様式で免疫される。抗原に対する指向性のあるモノクローナル抗体は、これらの免疫化したトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて得られる。この技術は、米国特許第5,874,299号、同第5,877,397号、同第5,569,825号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、および同第6,075,181号に詳細に記載されている。ヒト免疫グロブリンをハイブリドーマ細胞の培養によって直接得る代替案として、ハイブリドーマ細胞を、その後の発現または遺伝子操作のための組換え重鎖および軽鎖部位配列源として使用することができる。高レベルの適切なmRNAが利用可能であるので、このような抗体産生細胞からの遺伝子の単離は、容易である。再生し、再配置した部位は、所望通りに操作することができる。例えば、一定領域をなくすか、若しくは異なるイソタイプのもので置き換えることができ、または単鎖Fv領域をコード化するために様々な領域を連結させることができる。このような技術については、PCT国際公開特許WO1996/033735およびWO1996/034096に記載されている。
【０１１０】
ＶＩ．被験化合物の選択
本発明の別の観点は、VIP受容体に被験化合物を接触させ、被験化合物がVIP受容体に結合するかどうか、またはVIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法である。本発明の方法に従ってスクリーニングの対象となる被験化合物を取得する非限定な方法としては、被験化合物が天然化合物の場合、植物や動物からの抽出等により取得され得る。被験化合物が有機化合物、無機化合物の場合には、化学合成等により取得され得る。また、被験化合物がタンパク質、ペプチド等の単一化合物の場合、タンパク質、ランダムペプチドライブラリのメンバおよびD-またはL-型アミノ酸から成る順列組合わせ的化学由来の分子ライブラリからの単離等により取得され得る。また、可溶性ペプチド等のペプチド、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、抗イディオタイプ、または単鎖抗体、ならびにFab、F(ab')2及びFab発現ライブラリ断片、ならびにこれらの抗体が結合するエピトープに結合する抗体を含むが、これには限定されない）、有機および無機分子を含めた生物学的活性材料を含めて公知の化合物ライブラリからも取得されるが、これに限られない。被験化合物としてはその構造が単一な化合物が含まれるが、これには限定されず構造が互いに異なる場合には、化合物ライブラリの作製、遺伝子ライブラリの発現、細胞の抽出、陸上または海洋であるかを問わず、微生物、動物または植物の、真核または原核を問わず細胞からの抽出、もしくはこれらの細胞の培養等によって、構造の互いに構造の異なる被験化合物の混合物が取得されれ得る。
【０１１１】
上記に加え、コンピュータモデルおよびサーチ技術により、VIP受容体のリガンド結合部位の構造的な情報、または既に同定したVIP受容体のアゴニストの構造的な情報を用いることによって、被験化合物の理論的な選択も可能である。被験化合物のこのような理論的な選択により、治療用候補化合物を同定するためにスクリーニングしなければならない被験化合物の数を減らすことも可能である。VIP受容体はGPCRであるためVIP受容体ポリペプチド配列が、潜在的なリガンドのスクリーニングのために使用できる結合部位のモデルの生成を可能にする。このプロセスは、いくつかの様式で達成することができる。最も確固たる手法は、テンプレート（バクテリオロドプシンまたはロドプシン結晶構造または他のGPCRモデルから得られる）に対するVIP受容体配列のアラインメントの作成、アミノ酸構造の変換、および分子構造学によるモデルのリファイニングを伴うものである。強い配列のアラインメントを得られない場合、疎水性ヘリックスのモデル構築によって、モデルを生成することもできる。次いで、既知のロドプシン構造の一般的なレイアウトから開始する他のものに対して相対的に各ヘリックスを回転させ移動することによって、これらを組み合わせる。残基と残基の好ましい接触が達成されるようにこれら残基の変異残基の接触を示すデータも使用することができ、互いのヘリックスに対して相対的な位置を決めることが可能である。このプロセス中、既知のリガンドの、ヘリックス内の結合部位空洞内へのドッキングを用いて、リガンドの結合を安定化させる相互作用を発生させることによって、ヘリックスの位置決めに役立たせることもできる。モデルは、分子力学を用いた最適化、ならびに標準的な相同性モデリング技術を用いた細胞内および細胞外ループのループ構築によって完成させることが可能である。GPCRの構造およびモデリングに関する一般的な情報は、シェーンベルグら（Mol. Cell. Endocrinol. (1999) 151, 181-193）、フラワー（Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422, 207-234）、およびセクストン（Cur. Opin. Drug Discov. Dev. (1999) 2 (5) 440-448）に記載されている。
【０１１２】
また、VIP受容体1（Sunら（Proc. Natl. Acad. Sci. (2007) 104, 7875-7880）およびKumarら（PLOoS ONE (2011) 6, e19682））およびVIP受容体2（PDB ID: 2X57）のエクトドメインの構造は、X線結晶解析、NMR等で解析されており、これらの構造モデルをそのまま使用することも可能である。
【０１１３】
モデルを完成させた後は、いくつかの既存のコンピュータプログラムの一つを用いることによって、例えば潜在的リガンドのスクリーニングに使用することができる。これらの最も一般的なものは、DOCKプログラム（UCSF分子設計インスティテュート（UCSF Molecular Design Institute）である。その変異型のいくつかのものにおいては、立体的適合および結合部位への大まかな静電相補性のために、市販および/または特製化合物のデータベースをスクリーニングすることができる。しばしば、DOCKで優れた得点の分子が、リガンドになる高い可能性を有することがわかっている。使用できるその他のプログラムは、FLEXX（トライポス）である。このプログラムはかなり遅いので、化合物のより小規模のデータベースを通す検索に通常制限されている。FLEXX内のスコアリングスキームは、より詳細にわたっており、通常、DOCKよりも結合能力の優れた推測が得られる。FLEXXは、DOCKの提案を確認するために、または既知のリガンド若しくはテンプレートから組み合わせて生成される化合物のライブラリを調査するために最もよく使用される。
【０１１４】
ＶＩＩ．肝星細胞の機能または肝線維化を調節する候補化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明の方法では、大量処理用途が主に企図されるが、この方法でわずか一つの被験化合物が使用されることも、スクリーニングという用語に包含される。VIP受容体を活性化し、VIP受容体若しくはVIP受容体シグナルトランスダクション経路のアゴニストが誘発する活性化を持続若しくは増大させ、VIP受容体遺伝子の発現を調節し、またはVIPもしくはVIP類似体遺伝子の発現を増加させ得る被験化合物を、本明細書では「候補化合物」と呼ぶ。このような候補化合物を使用して、肝星細胞の機能を調節することができる。また、このような候補化合物を使用して、肝線維化を調節することができる。ただし、より典型的には、生体外スクリーニングのこの最初の段階では、追加的な段階のスクリーニングでさらに精査するに値する化合物、すなわち候補化合物を、より狭い範囲で選択するための手段を提供する。本発明の使用が、一つまたはそれ以上の被験化合物の群から、さらなる精査に値する化合物の部分集合を同定するためのものであることが、当事者には認識される。また、本発明の方法が、他の候補化合物に対して相対的に、特定の候補化合物の予想される有用性をランク付けするのに有用であることも、当技術の習熟者には認識される。例えば、10 nMでVIP受容体を活性化する候補化合物は、1000 nMでVIP受容体を活性化する（しかし10 nMでは活性化しない）ものより関心が高い。このような情報を用いて、当技術の習熟者は、さらなる精査に関してスクリーニングの最初の段階で同定された候補化合物の部分集合を選択することができる。非限定な一例であるが、200 nM未満の濃度でVIP受容体を活性化する化合物には肝線維化の動物モデルでさらに試験を実施し、閾値より高いものにはそれ以上の試験を実施しない。また、被験化合物群の選択方法、および陽性のものの選択方法に応じて、被験化合物のある割合だけが候補化合物として同定され、この割合が非常に小さいものであることも、当事者には認識され得る。
【０１１５】
上記の説明を踏まえて、「ＶＩ．被験化合物の選択」で記載された手順で選択された被験化合物が有するVIP受容体の活性化の能力を、「ＩＶ．VIP受容体活性化の決定」で説明された方法で決定することもまた可能である。より具体的には；
〔Ａ〕肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）VIP受容体に被験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体に結合するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体に結合する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法、
〔Ｂ〕肝細胞の線維化を調節する候補化合物を同定するための方法であって、
（ａ）VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させる工程と、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程を含み、当該VIP受容体を活性化する被験化合物を、肝細胞の線維化を調節する候補化合物として同定する方法、
〔Ｃ〕以下の工程；
（ａ）VIP受容体に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体に結合するかどうかを決定する工程、
を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法、
〔Ｄ〕以下の工程；
（ａ）VIP受容体を発現する細胞に被験化合物を接触させる工程、
（ｂ）前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程、
を含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤のスクリーニング方法、
が提供される。
【０１１６】
上記〔Ｂ〕、および〔Ｄ〕の方法において、前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程の非限定な一態様として、細胞内cAMPレベルを測定する工程を包む方法が例示され得る。この場合において、前記細胞がcAMP応答要素に作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記細胞内cAMPレベルを測定する工程がレポーター遺伝子の発現を測定する工程を含む方法が非限定な一態様として例示され得る。上記のレポーター遺伝子の非限定な一態様として、アルカリ性ホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、成長ホルモン、胎盤アルカリ性ホスファターゼまたは蛍光タンパク質をコードするのいずれかひとつ以上の遺伝子が例示され得る。
【０１１７】
また、上記〔Ｂ〕、および〔Ｄ〕の方法において、前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程の別の非限定な一態様として、前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現を測定する工程を含む方法が例示され得る。この場合において、前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程が前記細胞中の病態マーカー遺伝子の発現を測定する工程を含む方法が非限定な一態様として例示され得る。上記の病態マーカー遺伝子の非限定な一態様として、ACTA2、COL1a1、DESMIN、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFα、またはTIMP1のいずれか一つ以上の遺伝子が例示され得る。
【０１１８】
さらに、上記〔Ｂ〕、および〔Ｄ〕の方法において、前記被験化合物が前記VIP受容体を活性化するかどうかを決定する工程のさらに別の非限定な一態様として、前記細胞中のVIP受容体シグナルカスケードの活性化を測定する工程を含む方法が例示され得る。上記のシグナルカスケードの活性化が、アデニルシクラーゼ、タンパク質キナーゼAもしくはcAMP応答要素結合タンパク質の活性化、またはホスホジエステラーゼの抑制のいずれかひとつ以上から選択されるシグナルカスケードの活性化が例示され得る。
【０１１９】
ＶＩＩＩ．肝線維化の動物モデル
ＶＩＩで選択された候補化合物を非ヒト動物に投与し、例えば、肝細胞の形態の変化の観察、肝星細胞検出マーカーの発現の抑制、肝星細胞の活性化マーカー、肝線維化マーカー、および/または炎症マーカー等の肝星細胞の活性化および/または沈静化または肝線維化と相関のある生化学または遺伝子マーカー等を評価することによって、当該動物の応答を監視する。肝星細胞の沈静化を誘導し、または肝線維化のいかなる側面も防止する候補化合物は、ヒトの脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌を処置するために有望な治療用候補と考えるべきであり、本明細書では治療用候補化合物と呼ばれる。候補化合物が肝星細胞の沈静化および肝線維化の抑制を調節する能力の評価に加えて、毒性等の望ましくない副作用も、このようなスクリーニングで検出することが可能である。許容不可能な高レベルの副作用がないことを、治療用候補化合物の選択のためのさらなる基準として使用することが可能である。
【０１２０】
四塩化炭素（CCl4）処置ラット肝線維化モデル等いくつかの肝線維症に関する様々な動物モデルが当該技術分野で知られているが、本発明の非限定な一態様として、NASH病態モデルとして、1週間馴化された5週齢のC57BL6/J（JmsSLC）マウスをに超高脂肪CDAA（choline-deficient and amino acid-defined）飼料（CDAHFD）を一定期間給餌することにより作出される動物モデルが例示され得る。当該モデルの病態評価は、血漿中のAST、ALT値、病理切片、肝臓におけるNASH病態マーカー遺伝子（Acta2、Col1a1、Desmin、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFa、TIMP1）の発現量によって評価され得る。詳細には、血漿は尾静脈より採取したされヘパリン処理済ヘマトクリット管に回収された全血80μLをヘパリン処理済ヘマトクリット管に回収し、遠心分離して得られた血漿を用いた血液生化学値がオートアナライザー（Toshiba, TBA-120FR）を用いて計測される。10%中性緩衝ホルマリン液中で室温2日間固定された肝外側左葉を、定法によりパラフィン包埋したブロックからミクロトームで5μm厚に薄切して病理切片が作出される。当該薄切切片をHE染色およびマッソントリクローム染色することにより、肝臓での線維化程度が評価される。NASH病態マーカー遺伝子の発現量は、肝外側右葉の一部から抽出されるTotal RNAを鋳型として用いる、qRTPCRにより評価される。病態マウス由来の肝星細胞は実施例に記載された方法に加え、De Minicisら（Gastroenterology (2007) 132, 1937-1946）に記載されている方法で炎症細胞を除去して単離される。正常および病態モデルのマウスから単離された初代肝星細胞はType 1 Collagenコート6well plate（IWAKI, 4810-010）に播種され、20時間後に回収された細胞から抽出されたTotal RNAを鋳型として用いる、qRTPCR法により前述NASH病態マーカー遺伝子、VIPR1、およびVIPR2の発現が解析され得る。
【０１２１】
ＩＸ．脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患
また、本発明の別の態様では、ＶＩＩで記載されるスクリーニングアッセイによって同定された肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤が提供される。そのような調節剤として人工VIP受容体アゴニストを有効成分として含む肝細胞の線維化調節剤が例示され得る。人工VIP受容体アゴニストとしては、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[Arg15, 20, 21 Leu17]-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392またはPACAP (6-38)が例示され得る。また、人工VIP受容体アゴニストの別の非限定の一態様としては、抗VIP受容体抗体が例示され得る。
【０１２２】
さらに、本発明の別の態様では、ＶＩＩで記載されるスクリーニングアッセイによって同定された肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤を有効成分として含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤もまた提供される。脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤の有効成分として含まれる調節剤として人工VIP受容体アゴニストが使用され得る。人工VIP受容体アゴニストとしては、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[Arg15, 20, 21 Leu17]-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392またはPACAP (6-38)が例示され得る。また、人工VIP受容体アゴニストの別の非限定の一態様としては、抗VIP受容体抗体が例示され得る。
【０１２３】
また、本発明においては、肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤を有効成分として含む、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤は、肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤を対象に投与する工程を含む脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌を治療する方法、または、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌の治療剤の製造における肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤の使用と表現することも可能である。
【０１２４】
脂肪肝、脂肪性肝炎、肝線維症、および肝硬変は、多くの代謝性異常の結果であると考えられている。NASHの主要な所見を包括する詳細で統一的な病態生理学上の定説は未だ出現していないが、病因に関する確からしいパラダイムは「二段ヒット」仮説である（Dayら（Gastroenterology (1998) 114 (4) 842-845））。第一の「ヒット」は肝細胞での脂肪の蓄積であり、これは高脂血症、糖尿病、及び肥満を含む多くの症状に起因しうる。脂肪酸の酸化の抑制、肝臓への脂肪酸の送達の増加、および/または超低比重リポタンパク質の合成若しくは分泌の減少もまた、脂肪蓄積に何らかの役割を果たし得る。第二の「ヒット」は、特徴的な炎症、肝細胞腫大及び細胞死、さらにこれらに伴う線維化に至る現象である。
【０１２５】
ある主要な理論によれば、インスリン抵抗性の増加による肝臓の酸化ストレスの増加、遊離脂肪酸代謝の増加、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性の増加、シトクロムP-4502E1の活性の増加、鉄貯蔵の増加、及び／又はアンチオキシダント活性の減少により、肝臓星細胞が活性化され、前炎症性サイトカインの生成及び進行性の炎症が続くと考えられている（AgrawalおよびBonkovsky（J. Clin. Gastroenterol (2002) 35 (3) 253-261））。
【０１２６】
インスリン抵抗性と高インスリン血症はNASHにおける主要な異常である（Neuschwander-TetriおよびCaldwell（Hepatology (2003) 37 (5) 1202-1209）、Sanyal（Am. J. Gastroenterol. (2001) 96 (2) 274-276）。インスリン抵抗性の主要な機序は、余分な遊離脂肪酸によって信号伝達する、インスリン受容体サブストレート１（IRS-1）のダウンレギュレーションである場合がある。脂肪酸は、IRS-1のチロシンリン酸化を減少させる。インスリン感受性もペプチドメディエータによって制御される。脂肪組織、特に静脈血が肝臓に直接に流れる腸間膜の脂肪は、代謝活性を下流に制御するサイトカイン及びペプチドホルモンの生産の豊富な源である。
【０１２７】
酸化ストレスとミトコンドリアの機能障害はNASHにおける肝細胞性障害の中心的機序として取り込まれている（Caldwell（Clin. Liver Dis. (2004) 8 (3) 595-617））。酸化ストレスのマーカーとNASHの間の関連付けは、脂肪肝疾患の動物モデルにおいてなされた（KoteishおよびMaeDiehl（Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. (2002) 16 (5) 679-690））。脂肪肝における多数の可能な酸化ストレス源は、シトクロムP450ペルオキシソームのベータ酸化、ミトコンドリアの電子リーク及び動員された炎症細胞を含め、ある役割を果たす場合がある。
【０１２８】
遊離脂肪酸のレベルの増加は、インスリン抵抗性を媒介するだけでなく、肝細胞に直接に有毒となりうる（Neuschwander-TetriおよびCaldwell（Hepatology (2003) 37 (5) 1202-1209）。循環する脂質レベルを調節する一つの機序は、末梢における貯蔵脂肪の代謝である。リポジストロフィー（Garg（２０００）Am. J. Med. (2000) 108 (2), 143-152））、脂肪組織を形成する能力の部分的または完全な欠落によって特徴づけられる遺伝障害は、肝臓脂肪症、NASH、及び肝硬変に関係する（GargおよびMisra（J. Clin. Endocrinol. Metab. (2002) 87 (7) 3019-3022））。先天性全身性リポジストロフィーは、末梢脂肪の喪失、重度の肝臓脂肪症、及び肝硬変の著しいリスクによって特徴づけられる。
【０１２９】
エネルギー代謝もまた、NASHにおいてある役割を果たす場合がある。アデノシン三リン酸は細胞の完全性を維持するために必要であり、したがってその喪失が肝細胞性の障害を起こしやすいのかもしれない。肝臓のATPレベルは、NASHでは減少している（Cortez-Pintoら（JAMA (1999) 282 (17) 1659-1664））。ミトコンドリア障害が、恐らくは、NASHにおける肝細胞性ATPの貯蔵レベル減少の一つの原因であると考えられている（Caldwellら（Clin. Liver Dis. (2004) 8 (3) 595-617））。電子顕微鏡による研究により、不確かな組成の結晶構造がミトコンドリアのマトリクスであると同定された（CaldwellらJ. Hepatol. (1999) 31 (3) 430-434））。ミトコンドリア障害は、ミトコンドリアDNAの変形及び喪失に至る場合がある。ミトコンドリアDNAの損傷又は喪失は、アルコールによる肝臓損傷（Mansouriら（J. Hepatol. (1997) 27 (1) 96-102））及び老化（Van RemmenおよびRichardson（Exp. Gerontol. (2001) 36 (7) 957-968））において生じる。ある限定的データによれば、ミトコンドリアDNA損傷がNASHでも生じることが示唆されている（CaldwellらJ. Hepatol. (1999) 31 (3) 430-434））。
【０１３０】
肝臓線維化の主な要因には、慢性のHCV感染、アルコール中毒、及びNASHが含まれる。細胞外マトリックスタンパク質の蓄積は、線維痕の形成により肝臓の組織学的完全性を崩壊させる。この線維状物質の初期分布は、肝臓損傷の原因に左右される。慢性ウィルス性肝炎においては、線維化組織は当初は門脈路の周囲に位置するが、他方アルコール誘導肝炎及びNASHにおいては、それは中心周囲領域及び類洞周囲領域に位置する。線維症の肝臓病は、コラーゲン沈着から、架橋線維化、明白な肝硬変へと明らかに進行する。肝細胞を再生成する結節が成長したときに、肝硬変であると認定される。肝線維化はＶＩＩＩにおいて例示される動物モデルを用いて実験的に誘導することが可能であり、こられの動物モデルを用いて、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患を処置するために個体に投与され得る候補化合物の薬理学的な活性を確認することも可能である。
【０１３１】
肝硬変は、血流に対する増加した肝臓内抵抗と門脈圧亢進症、腹水、腎不全、肝性脳症及び静脈瘤出血を引き起こす。肝硬変の患者は、病的状態の発現前に長期にわたりかなり無症候性である場合がある（代償性肝硬変）。肝硬変は、肝細胞癌（HCC：hepatocellular carcinoma）の殆どの場合に関係する。HCCの約18,000の新規の症例が2005年の米国において発生すると予測されている（ThomasおよびZhu（J. clin. Oncol. (2005) 23 (13) 2892-2899））。HCCの発生率は過去30年にわたって2倍になっており、今も上昇し続けている。これは、C型肝炎の感染者数が多いこととHCCの進展の間に数十年間という長いインターバルがあることとによる。NASHに関連する肝硬変は、また、米国において増加しており、急成長するHCCの蔓延に著しく寄与しうる。HCCは主として肝細胞障害のコンテキストにおいて進展し、これは、炎症、肝細胞再生、肝臓マトリックス・リモデリング、線維化、そして最終的には肝硬変に至る。
【０１３２】
Ｘ．医薬組成物の配合および使用方法
本発明の方法によって肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤として同定される候補化合物または治療用候補化合物は、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患を処置するための有効成分として個体に投与することが可能である。VIP受容体のアゴニストを用いて、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患を阻害することができる。必ずしも、有効な化合物が、対象のVIP受容体1、VIP受容体2またはVIP受容体のサブタイプに完全な特異性を示す必要はない。例えばPACAP1型受容体等、影響を受ける他の受容体の特異的拮抗薬を、有効であるが特異性のないアゴニストと併せて共投与できることが企図される。あるいは、投薬量のみ、または投薬計画の調節によって、この特異性の欠如に対処することも可能な場合がある。
【０１３３】
本発明の方法によって肝星細胞の機能または肝線維化の調節剤として同定される候補化合物または治療用候補化合物は、VIP受容体またはVIP受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させる化合物と組み合せて投与され得る。これらは、公知の化合物、例えばテオフィリンであってもよく、または本発明のスクリーニング方法によって、これらの化合物がVIP受容体またはVIP受容体シグナルトランスダクション経路の活性化を持続または増大させることを同定してもよい。
【０１３４】
用量の決定
VIP受容体を活性化する化合物の安全性および治療的有効性は、生体外または生体内技術を用いる標準的な手順によって決定することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましいが、副作用のレベルが許容可能であれば、治療指数の低い化合物も有用である。生体外および生体内の毒性学的および薬理学的技術から得られるデータを使用して、有用な可能性のあるヒトの用量範囲を配合することができる。好ましい用量は、化合物の循環濃度が、許容可能な安全性を備えて、治療的に最大限になる範囲内にある。化合物の循環濃度は、投薬形態、投薬後の時間、投与経路などに応じて変更することができる。副作用が許容可能であれば、この範囲から外れる用量も有用である。患者の年齢や体重などの事項を用いて、従来の様式でこのような事項を決定することができる。薬理遺伝学的手法が、臨床群における化合物の選択、用量、および投薬計画の最適化に有用な可能性がある。
【０１３５】
本発明においてVIP受容体を活性化する化合物の非限定な一態様として、VIP類似体が挙げられる。非限定なVIP類似体の一態様として、PACAP-27、PACAP-38、ヘロデルミン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド（PHI）、ペプチドヒスチジンメチオニンアミド、ペプチドヒスチジンバリンアミド（PHV）、成長ホルモン放出ホルモン、セクレチン、グルカゴン、(Arg15, Arg21) VIP、[Ala11, 22, 28] VIP、[(Arg15, 20, 21 Leu17)-VIP-Gly-Lys-Arg-NH2]、[Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]、多重結合VIP融合タンパク質、Ro25-1553、Ro25-1392、またはPACAP (6-38)が例示され得る。本発明において好適に使用される非限定なVIPの一態様として、VIP、PACAP-27、PACAP-38、PHI、PHV、Ro25-1553、Ro25-1392、および [Lys15, Arg16, Leu27, VIP (1-7), GRF (8-27)-NH2]等の人工VIP受容体アゴニストが例示され得る。
【０１３６】
配合および使用
本発明による脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、非ウィルス性の肝線維症、肝硬変、肝癌等の肝線維化に伴う疾患の処置で使用するための医薬組成物は、製薬上許容可能な担体および賦形剤を使用し、従来の方法を用いて配合することが可能である。本発明の組成物は、単位剤形で提供することが好ましい。本明細書で使用する時、「単位剤形」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験者への投与に適切な、優れた医療慣習に基づく一回用量のVIP受容体作動薬を含有する本発明の組成物である。医薬組成物は、例えば、経鼻投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、皮膚投与、経口投与、または直腸投与による供給のために配合することが可能である。経口投与の場合、医薬組成物は、薬理学的に活性な化合物すなわち有効成分、およびこれに限定されないが、結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、または湿潤剤を含む添加物を含有する錠剤またはカプセル剤形であることが可能である。錠剤は、コーティングすることが可能である。経口投与のための液体製剤には、有効成分、およびこれに限定されないが、懸濁剤、乳化剤、非水性ベヒクル、防腐剤、緩衝塩、香料、着色剤、甘味剤などを含む添加物を含有する、シロップ、懸濁液、または使用前に液体で再構成される乾燥製品が含まれるが、これに限るものではない。経口投与用の医薬組成物は、口、胃、または腸管における有効成分の放出を制御するように配合することが可能である。
【０１３７】
吸入投与の場合、本発明に従って使用するための化合物は、液体、粉末、ゲル、または、事前測定または非事前測定用量の加圧または非加圧噴射剤を利用するエアロゾル噴霧の形態によって供給することが可能であるが、これに限るものではない。有効成分は、適切な充填剤、ベヒクル、防腐剤、緩衝剤などと併せて配合することが可能である。非経口投与の場合、有効成分は、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと合わせて配合することが可能で、ボーラス注射または注入のための懸濁液、溶液、エマルション、すぐに構成可能な粉末などとして調製することも可能である。これらの化合物の投薬は、皮下注射針、高圧装置などを含め、様々な技術によって投与することが可能である。直腸投与の場合、有効成分は、座薬、浣腸などとして供給するために、許容可能な生理学的担体、防腐剤などと併せて配合することが可能である。皮膚投与の場合、有効成分は、ローション、皮膚軟化剤などを含む許容可能な生理学的担体と併せて配合することが可能であり、またはパッチタイプの手段に組み込むことも可能である。長期的な投与の場合、有効成分、およびこれに限定されないが、ポリマー、疎水性材料、樹脂などの適切な添加物は、これに限定されないが、筋肉内または皮下の位置を含む多数の部位に注射または埋め込むための持続性製剤として配合することが可能である。加えて、有効成分は、分配装置によって投与することが可能である。
【０１３８】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【０１３９】
［実施例１］  不死化肝星細胞株E14C12の樹立
医薬基盤研究所 JCRB細胞バンクより入手された肝星細胞株LI90（JCRB0160）に対して、レトロウィルスベクターを用いてhTERT、HPV16 E6、E7をLI90に導入して不死化細胞株E14C12が樹立された。
【０１４０】
E14C12は10%のウシ胎児血清（Bovogen SFBS-C）、ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM（Sigma）中、37℃、5%CO2の条件にて維持された。細胞は、Accutaseを用いて剥離された。剥離された細胞に血清を含む培地を添加してプロテアーゼ不活化するために遠心分離によってAccutaseを含む培地を除去した後に、同培地にE14C12が懸濁された。タイプIコラーゲンコートフラスコ（IWAKI）に4-9x103/cm2の細胞密度で播種されたE14C12が、2〜3日毎に継代して培養された。
【０１４１】
［実施例２］  脂肪細胞分化誘導MDIカクテルによるE14C12の沈静化の誘導と遺伝子発現解析
10 cm径のタイプIコラーゲンコートディッシュ（IWAKI）に5x104細胞のE14C12が播種された。6日間培養後、活性化したE14C12細胞に対し、MDI（Methylisobutylxanthine/ Dexamethasone/ Insulin）カクテルを添加することで沈静化が誘導された。MDIカクテルは最終濃度1 mM IBMX（Sigma）、2μM デキサメタゾン（Sigma）、2μM インスリン（Sigma）となるように培養メディウムを用いて調製された。対照群に対しては0.25%のDMSOを含む培養メディウムが添加された。MDIカクテルの添加後、0、0.5、1、2、4、8、16、24、48、72時間のタイムポイントでトータルRNAが抽出された。QIAGEN miRNeasy mini kitを使用してトータルRNAが精製された。抽出されたRNAの品質はAgilent 2100 Bioanalyzerで確認された。
【０１４２】
Kanamori-Katayamaら（Genome Res. (2011) 21, 1150-1159）に記載の方法に基づき、一分子シーケンサーによる発現遺伝子の5'末端タグ解析（Cap analysis of gene expression; CAGE）が行われた。5μgのトータルRNAを鋳型としてSuperScriptIII（Life Technologies）とランダムプライマー（N15）を用いてcDNAが合成された。5'末端キャップ構造は過ヨウ素酸ナトリウムで酸化された後、ビオチンで標識された。単鎖RNA部分はRNaseIで消化されたのち、RNA/cDNAハイブリッド分子がストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉された。洗浄後にRNaseHおよびRNaseIによる処理、および熱処理を加えられたビーズから、単鎖cDNAを遊離させた。Terminal deoxynucleotidyl transferaseを用いたdATPテイリングの後、ダイデオキシヌクレオチドを加えて末端がブロックされた。末端がブロックされたポリAテイリングcDNAをHeliScope フローセルチャンネルにロードし、dT50表面にアニールさせた。製造者マニュアルに従いHeliscope Single Molecular Sequencerを用いてシーケンシングされた。
【０１４３】
承認リード長（20-70塩基）に関する制限を除き、Lipsonら（Nat. Biotechnol. (2009) 27, 652-658）と同様な方法にて、すべての生リードがフィルタリングされた。各リードはhelisphere パッケージ中のindexDPgenomicを用いてアライメントされた。参照配列としてヒトゲノムアセンブリhg19（GRCh37）とヒトリボゾーム配列（GenBank U13369）が使用された。
【０１４４】
Kanamori-Katayamaらに記載された方法に基づきCAGEタグクラスター（プロモータ）を決定して、遺伝子発現量が算出された。染色体上同一ストランドで1 bp以上オーバーラップしたCAGEタグをクラスター化して、プロモータが決定された。さらに同一ストランド400 bp以内にあるプロモータをクラスター化して、プロモータ領域と決定された。RefSeq配列5'末端から500 bp以内にアラインされたプロモータ領域のCAGEタグ数から遺伝子発現量が算出された。発現量は百万リードあたりのタグ数（tpm; tags per million）に規格化された。
【０１４５】
図１に一分子シークエンサーにより検出した肝星細胞活性化マーカーであるACTA2の遺伝子発現変動を示した。ACTA2の遺伝子発現はMDI添加により抑制された。
【０１４６】
プロモータ領域とその上流300bp及び下流100bp内に存在する転写因子結合モチーフと遺伝子発現量に基づいて、転写因子の下流の遺伝子の発現制御の程度を推定できることが、The FANTOM Consortium and the Riken Omics Science Center（Nat. Genet. (2009) 41, 553-562）において報告されている。以下の実施例では、この推定値がモチーフ活性化スコアと記載される。本発明では、この推定値をより正確に決定するため、疎部分最小二乗法とブートストラップ法を組み合わせたブートストラップ疎部分最小二乗法を用いることでバギングと呼ばれる学習法の枠組みに基づき、モチーフ活性化スコアが算出された。疎部分最小二乗法、ブートストラップ法ならびにバギングは、Chunら（Journal of the Royal Statistical Society Series B. (2010) 72, 3-25）およびBreiman（Machine Learning (1996) 24, 123-140）にそれぞれ記載されている。遺伝子発現プロファイルは値１、転写因子結合モチーフは値２、潜在変数は値３、重み係数は値４と表される。各値において、pは遺伝子数、sはサンプル数、mは転写因子結合モチーフ数、kは隠れ変数の数を表す。式１に基づいて疎部分最小二乗法により、潜在変数と重み係数が学習される。
【０１４７】
【数１】
2015149907.tif 000005
（pは遺伝子数、sはサンプル数を表す。）
【数２】
2015149907.tif 000006
（pは遺伝子数、mは転写因子結合モチーフ数を表す。）
【数３】
2015149907.tif 000007
（mは転写因子結合モチーフ数、kは隠れ変数の数を表す。）
【数４】
2015149907.tif 000008
（mは転写因子結合モチーフ数を表す。）
【数５】
2015149907.tif 000009
式１で表されるDβがモチーフ活性化スコアに相当する。ブートストラップ疎部分最小二乗法では、ブートストラップ回数をBとすると、式２によってモチーフ活性化スコアが算出される。
【数６】
2015149907.tif 000010
【０１４８】
算出されたモチーフ活性化スコアに基づいて、コントロール群とMDI処理群間で特徴的なパターンを持つモチーフを検出するために、elastic net正則化によるロジスティック回帰学習による特徴選択が行われた。elastic net正則化によるロジスティック回帰学習は、Friedmanら（Stat. Softw. (2010) 33, 1-22）に記載されている。elastic net正則化によるロジスティック回帰学習は、コントロール群とMDI処理群を表すクラスラベルを値５、モチーフ活性化スコアを値６、重み係数を値７とした場合に、式３のロジスティック回帰モデルを学習する学習法である。
【数７】
2015149907.tif 000011
【数８】
2015149907.tif 000012
【数９】
2015149907.tif 000013
【数１０】
2015149907.tif 000014
【０１４９】
elastic net正則化によるロジスティック回帰学習によって得られた０でない重み係数（w）を持つモチーフとその重み係数を降順に表３で示した。
【０１５０】
【表３】
2015149907.tif 000015
【０１５１】
表３より、ATF5＿CREB3とCREB1というcAMP応答性の転写因子結合モチーフがMDI処理により非常に特徴的なパターンを示していることが示唆された。このことを視覚的に把握するために、図２において折れ線グラフを示した。実線がコントロール群、破線がMDI処理群を示しており、図２よりMDI処理群ではコントロール群に対して、常に高いスコアを示していた。
【０１５２】
［実施例３］  IBMX添加によるE14C12細胞の沈静化
MDIは脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化誘導トリガーとして汎用される試薬カクテルである。MDIカクテル添加により肝星細胞を沈静化状態に留めることができるとの報告がある（非特許文献3）。MDI添加による静止化誘導の指標である細胞形態の変化、マーカー遺伝子の変動がひとつの薬剤の作用で説明できるのかが検討された。35mmディッシュに播種された7.5x104のE14C12細胞を、4日間培養したのち、薬剤が単独もしくは併用にて各ディッシュに添加された。添加された薬剤の終濃度はM（Methylisobutylxanthine; 本文中IBMX とも略する）が1 mM、D（Dexamethasone）が2μM、I（Insulin）が2μMだった。
【０１５３】
薬剤添加後、24、48、72時間と継時的に細胞形態が観察された。IBMX添加により細胞形態が変化した。72時間後の細胞形態像を図3に示した。IBMX単独の添加はMDIカクテル添加に比較して強い細胞毒性を示した。IBMX処理により細胞密度は著しく減少するとともに、細胞形態は伸長した状態から収縮した状態に変化した。
【０１５４】
薬剤添加の48時間後に細胞内のcAMP含量が測定された。cAMPの間接的な測定には、cAMP-GloTM Max Assay（Promega）が使用された。本測定法において、細胞内cAMP濃度が上昇するとPKAが活性化され、PKA活性の上昇が発光量と反比例関係にある。図4は発光量の減少、つまりcAMPの誘導が示されている。MDIカクテルの添加、およびIBMX単独の添加の群のいずれにおいても、濃度依存的に細胞内cAMP含量の増加が認められた。
【０１５５】
薬剤添加40時間、72時間後に回収されたE14C12細胞から単離されたRNAを用いて肝星細胞の活性化マーカーの遺伝子発現変動がリアルタイムPCR法を用いて解析された。RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて同細胞からトータルRNAが調製された。ThermoScript RT-PCR（Life Technologies）を用いて添付マニュアルに従い上記トータルRNAから cDNAが合成された。ABI Prism7900HTリアルタイムPCRシステムを用いて、GAPDH、ACTA2、COL1A1遺伝子の発現が解析された。使用したプライマーを表４に示した。
【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
GAPDH発現量で補正されたACTA2およびCOL1A1の発現量ΔCtがそれぞれ決定され、薬剤処理していない細胞サンプルに対する相対発現変化量ΔΔCt値が決定された。図５に、薬剤添加の40および72時間後のACTA2およびCOL1A1の遺伝子発現変化量を示した。IBMX（M）単独もしくは他薬剤との混合液（MDI、MD、MI）の添加でACTA2およびCOL1A1の発現が抑制された。以上から、IBMXを添加することで、細胞形態変化に加え、肝星細胞活性化マーカーACTA2およびCOL1A1の発現が抑制されたことが確認された。
【０１５８】
IBMXは非特異的なホスホジエステラーゼ阻害作用を有する化合物である。実施例２のモチーフアクティビティ解析ではMDI処理によるATF5/CREB3、CREB1活性亢進が示唆された。細胞内cAMP濃度の上昇、これに伴うPKA活性化がMDIカクテルによる肝星細胞の静止化誘導メカニズムではないかとの仮定のもと、細胞透過型cAMPであるdi-butyryl cAMP（0.5mM）を培地に添加したところ、24時間後、一過的な細胞形態変化が認められた。
【０１５９】
［実施例４］  Forskolin添加によるE14C12細胞の沈静化
Forskolinはアデニル酸シクラーゼを活性化させて、細胞内cAMPを増加させる試薬である。ForskolinがcAMPを誘導し、マーカー遺伝子の変動が起きるかどうかが検討された。Forskolinの添加48時間後の細胞内cAMPの増加を図６に示した。Forskolinの添加により、濃度依存的に細胞内cAMP含量の増加が認められた。薬剤添加の48時間後の活性化マーカーの発現変化が実施例３と同様のリアルタイムPCR法で解析された。薬剤非投与群のCOL1A1発現量と比較した、Forskolin投与群のCOL1A1発現相対量を図７に示した。Forskolin添加により活性化マーカーCOL1A1の遺伝子発現が濃度依存的に抑制された。
【０１６０】
［実施例５］  VIPリガンド添加によるE14C12細胞の沈静化
実施例2、3および4の結果はcAMPシグナルカスケードの活性化が肝星細胞沈静化のトリガーとなる可能性を示唆した。Gタンパク質共役受容体（GPCR）シグナルは細胞の運命の決定する制御機構に関わっている。cAMPシグナルカスケードを活性化する、Gsタンパク質と共役するGPCRを通じて肝星細胞沈静化誘導ができないか検討された。一分子シーケンサーによる遺伝子発現頻度情報より、4つのGs共役GPCR、すなわちADORA2B、CALCRL、PTGIRおよびVIPR1が星細胞に発現していることが確認された。35 mmディッシュに7.5x104細胞が播種された後に4日間培養されたE14C12細胞に対して、ADORA2B、CALCRL、PTGIRおよびVIPR1に対する活性型リガンドであるアデノシン（adenosine）、CGRP（calcitonin gene-related peptide）、プロスタサイクリン（prostacyclin）およびVIP（vasoactive intestinal peptide）を各々添加して72時間後の肝星細胞の活性化マーカーの発現変化が実施例3同様のリアルタイムPCR法で解析された。GAPDH発現量で補正されたACTAおよびCOL1A1発現量ΔCtを図８に示した。VIP添加により活性化マーカーACTA2およびCOL1A1の遺伝子発現が顕著に抑制された。高濃度（5μM）のプロスタサイクリン添加でマーカーACTA2の発現が抑制され、わずかなCOL1A1の発現が抑制され、軽度の細胞形態変化が認められた。プロスタサイクリンは中性条件下で物質半減期が非常に短い（〜minオーダー）。部分的な効果はこの短い半減期を反映したものかもしれない。アデノシンおよびCGRPには静止化効果は認められなかった。
【０１６１】
図9にアデノシン、CGRP、プロスタサイクリンおよびVIPの各添加によるcAMP含量の変化を示した。各薬剤の添加48時間後に、cAMP-GloTM Max Assay（Promega）を用いてE14C12細胞内のcAMPが測定された。VIPの添加によって、細胞内cAMP含量の増加が認められた。プロスタサイクリンとアデノシンの添加によっても濃度依存的なcAMP含量の増加が認められたが、VIPに比べ高濃度領域での低いcAMP誘導であった。CGRPの添加では細胞内cAMPの増加は認められなかった。
【０１６２】
図10にMDIおよびVIPの各添加72時間後の細胞形態像を示した。VIP添加により細胞は収縮して丸い形態へと変化した。MDIによる細胞形態変化は細胞密度減少を伴うのに対し、VIPは細胞毒性を示さなかった。上記結果は、VIPが活性化状態にある肝星細胞E14C12を沈静化したことを示す。
【０１６３】
［実施例６］  VIPリガンド添加による初代マウス肝星細胞の沈静化
Senooら（Connective Tissue (1993) 25, 129-137）に記載されたラット肝星細胞単離法を改変した方法を用いてマウス初代星細胞が単離された。詳細には、まずジエチルエーテルにより麻酔された16週齢C57BL/6J（JmsSLC）マウス4匹から、剖出された肝門脈の基部に23G血管用留置針が留置された。脱血のため、ペリスタポンプを用いて前記留置針よりPBSが低流速で環流された後、肝臓の膨張を確認した段階で腹大動脈が切除されPBSが15-20分間最大流速で環流された。次に肝細胞を単一化するため、37℃に温められた0.05%（w/v）Collagenase（WAKO）を含むHanks緩衝液（GIBCO）が流速5 mL/minで15分間環流された。胆管系が除去された肝臓がハサミで細切された後DMEM培地（SIGMA）に懸濁された。100μmのセルストレーナーを通過した当該懸濁液の濾液が遠心分離により肝臓実質細胞画分と肝非実質細胞画分に分離された。このようにして得られた肝非実質細胞画分をPercoll密度勾配遠心分離により分画して、肝星細胞層が得られた。すなわち10%（v/v）Percollを含むHam's F12（MP Biomedicals）培地と細胞解離用緩衝液（Invitrogen）を用いて調製された0.580 g/mL Percoll超遠心用緩衝液１と非実質細胞画分およびDensity Marker Beads（GE Healthcare）との混合液を40,000 x gで20分間遠心して、比重1.02-1.07 g/mLの画分が回収された。このようにして得られた細胞懸濁液と細胞解離用緩衝液を用いて調製された0.435 g/mL Percoll超遠心用緩衝液2を再度40,000 x gで20分間遠心して、比重1.05-1.07 g/mLの肝星細胞画分が回収された。細胞解離用緩衝液を用いて洗浄された同各分からPercoll液が除去された後、生細胞数が計測された。Type 1 Collagenコート24 well plate（Iwaki）に15,000 cells/cm2の細胞密度で肝星細胞が播種された。播種7日後、E14C12細胞を不活性化することが確認されているMDIカクテルおよび10 nM、100 nM のVIPに暴露された肝星細胞から暴露の0、24、48時間後にTotal RNAが回収された。前記回収されたTotal RNAを鋳型とするqRTPCR法（ABI Prism）により、線維化マーカー遺伝子であるActa2およびCol1a1の発現変化が評価された。前記において、Total RNAはRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて抽出された。また、qRTPCRは表５に記載された配列のプライマーを用いたSYBR Green法で実施された。結果はGapdhの発現量で補正されたActa2および Col1a1発現量ΔCtがそれぞれ決定され、播種1日後のActa2およびCol1a1発現量に対する相対発現変化量ΔΔCt値が決定された。
【０１６４】
【表５】
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【０１６５】
表６に播種1、7日後および対照群、MDI処置群、VIP処置群における薬剤処置後24時間（1日）後および48時間（2日）後のActa2およびCol1a1の相対発現変化量を示した。
【０１６６】
【表６】
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【０１６７】
播種7日後、Acta2およびCol1a1の発現量は播種1日後と比較して、それぞれ119倍および1269倍高く、いずれの線維化マーカー遺伝子の顕著な発現亢進が認められたことから、肝星細胞の十分な活性化が確認された。薬剤処置の24時間後にはActa2の発現は対照群に対しMDI処置群が49%、VIP 10 nM処置群が95%、VIP 100 nM処置群が62%であった。48時間後ではいずれの群においても対照群に対しActa2の顕著な発現抑制は認められなかった。一方、Col1a1の発現はMDI処置群では24時間後および48時間後ともに対照群に対して発現抑制は認められなかったが、VIP 10 nM処置群では24時間後および48時間後でそれぞれ65%および49%であり、VIP 100 nM処置群では24時間後および48時間後でそれぞれ56%および57%であった。以上より、Acta2およびCol1a1の発現量を指標とした、VIPリガンド添加による星細胞の沈静化はマウス初代肝星細胞においても確認され、その作用はMDIによる効果よりも強いと考えられた。
【０１６８】
［実施例７］  正常およびNASH病態モデルから由来する初代マウス肝星細胞でのVIP受容体発現の解析
VIP受容体はVIPR1（VPAC1）、VIPR2（VPAC2）の2種類が報告されており、種々の臓器での発現、作用が報告されている（Harmarら（Br. J. Pharmacol. (2012) 166, 4-17））。一方、四塩化炭素（CCl4）処置ラット肝線維化モデルにおいてVIP投与によってコラーゲン領域比率およびαSMA発現の抑制の観察が報告されているものの（http://mt.china-papers.com/2/?p=120643）、VIP受容体の発現パターンと肝星細胞活性化の関係性は、十分に研究されていない。そこで本発明者らは、正常マウスおよびNASH病態モデルマウスより単離された肝星細胞におけるVIP受容体の発現を解析した。
【０１６９】
NASH病態モデルは、1週間馴化された5週齢のC57BL6/J（JmsSLC）マウスに超高脂肪CDAA（choline-deficient and amino acid-defined）飼料（CDAHFD）を一定期間給餌ことにより作出された。血漿中のAST、ALT値、病理切片、肝臓におけるNASH病態マーカー遺伝子（Acta2、Col1a1、Desmin、CTGF、TGFβ、MMP13、TNFa、TIMP1）の発現量によってモデルの病態が評価され、対照として正常食（CE-2）を同期間負荷した正常マウスが用いられた。詳細には、尾静脈より採取されヘパリン処理済ヘマトクリット管に回収された全血80μLを遠心分離して血漿が得られた。血液生化学値はオートアナライザー（Toshiba）を用いて計測された。病理切片は10%中性緩衝ホルマリン液中で室温2日間固定された肝外側左葉を、定法によりパラフィン包埋したブロックからミクロトームで5μm厚に薄切して病理切片が作出された。薄切切片をHE染色およびマッソントリクローム染色することにより、肝臓での線維化程度が評価された。NASH病態マーカー遺伝子の発現量は、肝外側右葉の一部から抽出されたTotal RNAを鋳型として用いる、qRTPCRにより評価された。Total RNAの抽出およびqRTPCRの結果の解析は実施例６に記載された方法と同様に行われた。qRTPCRに使用されたプライマーを表５に示した。病態マウス由来の肝星細胞は実施例６に記載された方法に加え、De Minicisら（Gastroenterology (2007) 132, 1937-1946）に記載されている方法で炎症細胞を除去して単離された。正常および病態モデルのマウスから単離された初代肝星細胞はType 1 Collagenコート6well plate（IWAKI）に播種された。播種20時間後に回収された細胞から抽出されたTotal RNAを鋳型として用いるqRTPCR法によりVIPR1およびVIPR2の発現が解析された。
【０１７０】
肝障害マーカーである血漿中のASTならびにALT値はCDAHFDの3週給餌時においてそれぞれ180.1±16.9ならびに609.3±122.5 U/L、および同飼料の6週給餌時においてそれぞれ369.6±16.9ならびに609.3±122.5 U/Lであった。これらは、同週齢の正常群（3週時においてASTならびにALT値がそれぞれ 40.1±9.3ならびに34.8±13.3 U/Lおよび6週時においてそれぞれ31.8±2.4および18.6±1.9 U/L）と比較して顕著に高値であったことから、CDAHFDモデルはヒトにおけるNASH臨床病変を解析するのに妥当なモデルであると考えられた。図１１に病態モデルにおけるマッソントリクローム染色像（左：正常マウス、中：CDAHFDマウス（3週）、右CDAHFDマウス（6週））、および図１２に病態モデルにおける病態マーカー遺伝子の発現量（3週間CE給餌時の遺伝子発現レベルに対する相対比）を示した。
【０１７１】
C57BL/6JマウスにCDAHFDを3または6週間給餌することで、明らかな脂肪肝および炎症像が観察され、6週間以降では顕著な線維化が検出された。またCDAHFDモデルの肝臓においては線維化マーカー遺伝子Acta2、Col1a1、炎症マーカー遺伝子TGFβ、TNFαの顕著な発現亢進が認められ、病理像と一致していると考えられた。また6週負荷時に肝星細胞マーカーであるDesminの顕著な発現亢進が認められたことから、CDAHFDモデル肝臓で認められた線維化組織像は、肝星細胞の増殖および活性化によるものであると推察された。
【０１７２】
次に肝線維化が顕著に確認される、すなわち肝星細胞が十分に活性化していると考えられるCDAHFD7週間負荷時の病態マウス由来肝星細胞におけるVIP受容体の発現が、同週齢の正常マウス由来肝星細胞におけるそれと比較された。
【０１７３】
静止化状態と考えられる正常マウス由来肝星細胞においては、VIPR1が選択的に発現していることが認められた。一方、病態マウス由来肝星細胞においては、VIPR1の発現減少とともにVIPR2の顕著な発現亢進が認められた（図１３）。以上より、活性化肝星細胞においてはVIPR1および2どちらのVIP受容体についても発現が確認され、実施例6の結果よりVIPリガンドを介した肝星細胞の沈静化が誘導できることから、VIPR1もしくはVIPR2にのみ選択的、または両方に選択的なアゴニストは、肝星細胞の沈静化を誘導可能であると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015149907.tif 000029
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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