(57)【要約】【課題】胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）媒介状態を治療するための組成物および方法を提供すること【解決手段】約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された水性流体の投与を含む、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するための方法を提供する。帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、好ましくは、細胞膜電位および／または伝導性の調節を提供するのに十分な量において、流体中に安定的に構成される。ＴＳＬＰ発現および／または活性の調節または下方制御を含む、ある態様は、本明細書に開示されるようなＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するための有用性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）およびＴＳＬＰ媒介状態に関し、より具体的には、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体媒介状態（例えば、免疫系の疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、および食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬、ＩｇＥ媒介疾患、ならびに鼻炎結膜炎）に関する。特に好ましい態様は、本明細書に開示される少なくとも１つの界面動電的に生成された流体（ガス富化（例えば、酸素富化）界面動電的に生成された流体を含む）を含む、治療組成物を投与することによる、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体媒介状態の調節（例えば、治療）に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、共に２００８年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／１０７，４８０号および同第６１／１０７，４５３号、ならびに２００８年１０月２４日に出願の米国一般特許出願第１２／２５８，２１０号の優先権の利益を主張するものであり、これらはともに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）。胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）は、樹状細胞媒介Ｔｈ２型炎症反応を引き起こし、アレルギー性炎症のマスタースイッチと考えられる、ＩＬ−７様サイトカインである。ＴＳＬＰは、ＢおよびＴ細胞の両方の発生および成熟への統合成長因子である。特に、マウスＴＳＬＰは、Ｂリンパ球産生を支持し、Ｂ細胞増殖に必要とされる。マウスＴＳＬＰは、Ｔ細胞受容体γ（ＴＣＲγ）遺伝子座の再配置の制御において重要な役割を果たし、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞に対する実質的な刺激作用を有する。例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照のこと。
【０００３】
ＴＳＬＰは、ＩＬ−７と同様のサイトカイン活性を有する。例えば、ＴＳＬＰは、Ｂ細胞増殖反応の刺激においてＩＬ−７に取って代わることができる（非特許文献１、上記を参照）。ＴＳＬＰおよびＩＬ−７は、標的細胞に対して同様の効果を媒介するが、それらは、異なる伝達経路を有するように思われ、それらの生物学的反応は異なる可能性がある。例えば、ＴＳＬＰは、ＳＴＡＴ５の活性を調節するが、いかなるＪａｎｕｓファミリーチロシンキナーゼメンバーも活性化しない（非特許文献４）。
【０００４】
樹状細胞およびＴＮＦ産生に対するＴＳＬＰの効果。ヒトＴＳＬＰおよびヒトＴＳＬＰ受容体が２００１年にクローン化された後、ヒトＴＳＬＰは、未熟ＣＤ１１ｃ＋骨髄樹状細胞を強く活性化したことがわかった（例えば、非特許文献５、および非特許文献６を参照のこと）。Ｔｈ２細胞は、概して、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１０を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞として、免疫学の教科書および文献に定義される。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞等のＴｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、および時に、ＴＮＦを産生する。ＴＳＬＰ−ＤＣがインビトロでナイーブ同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために使用される時、特有の型のＴｈ２細胞が産生され、それは、古典的なＴｈ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３、ならびに大量のＴＮＦを産生するが、ＩＬ−１０またはインターフェロン−γはほとんどまたは全く産生しない（非特許文献５、上記を参照）（また、例えば、非特許文献６を参照のこと）。ＴＮＦは、典型的には、Ｔｈ２サイトカインと見なされない。しかしながら、ＴＮＦは、喘息気道において顕著であり、ＴＮＦ分泌の増加と相関する遺伝子型は、喘息のリスクに関連する。非特許文献７、および非特許文献８を参照
されたい。
【０００５】
ＴＳＬＰは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において、ＴＮＦスーパーファミリータンパク質ＯＸ４０Ｌを発現するように、ヒトｍＤＣを誘発する（非特許文献９）。ＴＳＬＰ−ＤＣによるＯＸ４０Ｌの発現は、炎症Ｔｈ２細胞の同化に重要である。したがって、ＴＳＬＰ活性化ＤＣは、Ｔｈ１極性化サイトカインの産生を誘発することなく、ＯＸ４０Ｌを上方制御することにより、Ｔｈ２許容微小環境を作成する。同上。
【０００６】
ＴＳＬＰ発現、アレルゲン特異的反応、および喘息。初期の研究は、ＴＳＬＰ  ｍＲＮＡがヒト一次皮膚ケラチン生成細胞、気管支上皮細胞、平滑筋細胞、および肺線維芽細胞ｓによって高度に発現されたことを示した（非特許文献６）。ＴＳＬＰは、表皮の頂端層のケラチン生成細胞中で主に発現されるため、これは、ＴＳＬＰ産生が完全に分化したケラチン生成細胞の特徴であることを示唆する。アトピー性皮膚炎の患者におけるＴＳＬＰ発現は、原位置でのランゲルハンス細胞の移動および活性化に関連しており、これは、ＴＳＬＰが、その後に流入領域リンパ節に移動し得るこれらの細胞の活性化、および主要アレルゲン特異的反応に直接寄与し得ることを示唆する。同上。より近年の研究では、原位置ハイブリダイゼーションにより、ＴＳＬＰ発現が喘息気道において増加し、Ｔｈ２誘引性ケモカインの発現および疾病重症度の両方と相関しており、ＴＳＬＰと喘息との間の関連性を提供したことが示された（非特許文献１０）。
【０００７】
ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）およびアレルギー性喘息。ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）は、約５０ｋＤａのタンパク質であり、共通γ鎖との有意な類似点を有する。ＴＳＬＰＲは、新規の１型サイトカイン受容体であり、ＩＬ−７Ｒａ（ＣＤ１２７）と組み合わせると、例えば、非特許文献１１に記載されるように、ＴＳＬＰ受容体複合体を構成する。ＴＳＬＰＲは、そのカルボキシル末端の近くにチロシン残基を有し、これは、ＴＳＬＰと関わり合ったときに、リン酸化されたＳＴＡＴ５と結びつき、複数の生物学的機能を媒介できる（非特許文献１２）。
【０００８】
ヒトＴＳＬＰＲは、単球およびＣＤ１１ｃ＋樹状細胞により発現され、ＴＳＬＰ結合が、ＴＨ２細胞誘引性ケモカインＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２の発現を誘発する。さらに、上述のように、樹状細胞のＴＳＬＰＲ誘発活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ホメオスタシスの調節に必要であり得る、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４、−５、および−１３の分泌の増加を間接的にもたらす。マウスにおいて、ＴＳＬＰＲの欠乏は、リンパ球数に影響しない。しかしながら、ＴＳＬＰＲおよび共通γ鎖の欠乏は、共通γ鎖のみが不足したマウスと比較して、より少ないリンパ球数をもたらす。非特許文献５、および非特許文献６を参照のこと。
【０００９】
研究は、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰＲが、マウスのアレルギー性疾患の開始において重要な役割を果たすことを発見した。一研究において、皮膚でＴＳＬＰを過剰発現するように操作されたマウスは、炎症性浸潤を含む湿疹様皮膚病変、循環するＴｈ２細胞の劇的増加、および血清ＩｇＥの上昇を特徴とするアトピー性皮膚炎を発症することが実証された（非特許文献１３）。研究は、ＴＳＬＰがマウスにおいてＤＣを直接的に活性化し得ることを示唆した。Ｌｉらによって実施された別の研究において、グループは、皮膚でＴＳＬＰを過剰発現しているトランスジェニックマウスが、ＴＳＬＰとアトピー性皮膚炎の発症との間の関連性を強固なものにする、アトピー性皮膚炎を発症することを確認した。
【００１０】
別の一連の研究は、ＴＳＬＰが、インビボでマウスのアレルギー性気道炎症の開始に必要であることを実証した。一研究において、Ｚｈｏｕらは、ＴＳＬＰ導入遺伝子の肺特異的発現が、白血球（Ｔｈ２細胞を含む）の大量浸潤、杯細胞過形成、および上皮下線維症、ならびに血清ＩｇＥレベルの増加を特徴とするアレルギー性気道炎症（喘息）を誘発することを実証した（非特許文献１４）。しかしながら、対照的に、ＴＳＬＰＲを欠いているマウスは、吸入させた抗原に反応する喘息を発症しなかった（非特許文献１４、上記を参照、および非特許文献１５）。したがって、これらの研究は合わせて、ＴＳＬＰがマウスのアレルギー性気道炎症の開始に必要であることを実証する。
【００１１】
さらに、Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎらにより実施された研究において、上皮細胞由来のＴＳＬＰがヒトのＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応を誘発することが実証されたが、これは、ＴＳＬＰが上皮細胞とＤＣとの界面におけるアレルギー性炎症のマスタースイッチに相当することを示唆している（非特許文献１６）。
【００１２】
近年の研究において、ＴＳＬＰＲを阻害することによるＤＣ機能の調節が、マウスの重症度を低めることが示された（非特許文献１７）。別の一連の研究において、ＴＳＬＰＲがＤＣにおいて発現されるだけでなく、マクロファージ、マスト細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞上でも発現されることが実証された（非特許文献１８、および非特許文献１９）。アレルギー性炎症におけるＣＤ４＋Ｔ細胞または他のエフェクター細胞に対するＴＳＬＰＲ中和の直接的効果を除外するために、Ｌｉｙｕｎ  Ｓｈｉらは、ナイーブマウスの気道に養子移入する前に、ＯＶＡ負荷ＤＣをインビトロで抗ＴＳＬＰＲを用いて処理する実験を実施した。すでに、ＯＶＡ−ＤＣが強い好酸球性気道炎症を誘発し、ＩＬ−４およびＩＬ−５などのＴｈ２サイトカインの大量産生を伴うことがわかっている（非特許文献２０、および非特許文献２１）。しかしながら、抗ＴＳＬＰＲでのＯＶＡ−ＤＣの事前処理は、好酸球およびリンパ球浸潤、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５レベルの有意な低下をもたらし、ＴＳＬＰＲがＤＣによって感作されたアレルギー性疾患に果たす役割をさらに明らかにした。この結果もまた、ＤＣ上のＴＳＬＰＲの遮断が気道炎症を制御するのに役立つことを裏付ける（非特許文献１７、上記を参照）。
【００１３】
様々な生理学的および病理学的過程にＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲの役割が関係していると見なす実験が増加してきている。ＴＳＬＰの生理学的役割は、特にＢおよびＴ細胞の増殖、発生、および成熟を刺激することにおける、免疫系の調節を含む。ＴＳＬＰは、アレルギー性喘息、およびアレルギー性疾患を軽減するためのＴＳＬＰ受容体機能の局所的抗体媒介性遮断の病理生物学において重要な役割を果たす。したがって、ＴＳＬＰとＴＳＬＰ受容体との間の相互作用は、アレルギー性炎症、アトピー性皮膚炎またはアトピー性湿疹の患者の皮膚病変、アレルギー性喘息、および喘息等の多くの生理学的疾病過程において重要であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ，２２：３２１−３２８，１９９４
【非特許文献２】Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：１０−１６，１９９６
【非特許文献３】Ｃａｎｄｅｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７：９−１４，１９９７
【非特許文献４】Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：６７７−６８３，１９９９
【非特許文献５】Ｒｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３３６−３４３，２００１
【非特許文献６】Ｓｏｕｍｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：６７３−６８０，２００２
【非特許文献７】Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ．，２５：１０３８−１０４４，１９９５
【非特許文献８】Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｍ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．，Ｈｕｍ．ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．，６：５５１−５５４，１９９７
【非特許文献９】Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：１２１３−１２２３
【非特許文献１０】Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：８１８３−８１９０，２００５
【非特許文献１１】Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：５９−６４，２０００
【非特許文献１２】Ｉｓａｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：３２８８−３２９４，２００２
【非特許文献１３】Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：５４１−５４９，２００５
【非特許文献１４】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１０４７−１０５３，２００５
【非特許文献１５】ＡＡｌ−Ｓｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：８２９−８３９，２００５
【非特許文献１６】Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２６９−２７３，２００６
【非特許文献１７】Ｌｉｙｕｎ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２０２−２１０，２００８
【非特許文献１８】Ｒｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８：６７２０−６７２４，２００７
【非特許文献１９】Ｏｍｏｒｉ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｚｉｅｇｌｅｒ  Ｓ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８：１３９６−１４０４，２００７
【非特許文献２０】Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１２６１−１２７１
【非特許文献２１】Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６：５５１−５５９，２０００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
特定の態様は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体の、それを必要とする哺乳動物への投与を含む、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するための方法を提供する。ある態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
【００１６】
特定の方法の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体中で主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、流体中に存在する溶解した酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。特定の態様では、全ての溶解酸素は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する。
【００１７】
特定の方法の態様では、イオン水溶液は、食塩溶液を含む。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、超酸素化である。
【００１８】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子の形態を含む。
【００１９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露を含む。特定の実施形態では、局在界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む。特定の態様では、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露は、流体を生成するために使用されるデバイスの界面動電効果を誘起する構造特性への流体の曝露を含む。
【００２０】
特定の態様では、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態は、アレルギー性炎症を含むがこれに限定されない、免疫系の疾病または疾患を含む。特定の態様では、アレルギー性炎症は、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、ＩｇＥ媒介疾患、鼻炎結膜炎、および食物アレルギーのうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態は、例えば、関節リウマチおよび乾癬のうちの少なくとも１つを含む、炎症性関節炎を含む。
【００２１】
ある態様では、方法は、併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療剤が患者に投与される。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、抗コリン作用薬、コルチコステロイド、全身性コルチコステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン修飾薬、メチルキサンチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、ホルモテロール、サルメテロール、ならびにイプラトロピウムおよびチオトロピウム等の抗コリン作用薬を含む、β２アゴニスト；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む、コルチコステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含む、ロイコトリエン修飾薬；クロモリンおよびネドクロミルを含む、マスト細胞安定剤；テオフィリン、イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む複合薬を含む、メチルキサンチン；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む、抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む、免疫系修飾剤；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；ならびにそれらの組み合わせからなる気管支拡張薬からなる群から選択される。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤であり、特定の実施形態では、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤は、２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化するＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびにＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００２２】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質もしくは構成成分の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性のうちの少なくとも１つを改変することを含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを改変することを含む。ある態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある実施形態では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、例えば、Ｇタンパク質ａサブユニットと相互作用し、Ｇタンパク質ａサブユニットは、Ｇａｓ、Ｇａｉ、Ｇａｑ、およびＧａ１２からなる群から選択される少なくとも１つを含み、特定の実施形態では、少なくとも１つのＧタンパク質ａサブユニットは、Ｇａｑである。
【００２３】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、例えば、全細胞伝導性を調節することを含み、全細胞伝導性を調節することは、全細胞伝導性の線形または非線形の電圧依存性寄与のうちの少なくとも１つを調節することを含む。
【００２４】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、免疫系の疾病または疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、ＩｇＥ媒介疾患、鼻炎結膜炎、食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、および乾癬からなる群から選択される、少なくとも１つの状態または症状に関連する、細胞内シグナル変換の調節を含む。
【００２５】
特定の方法の態様は、細胞ネットワークまたは層への界面動電流体の投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む。特定の実施形態では、細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、細胞ネットワークまたは層は、肺上皮、気管支上皮、および腸上皮からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【００２６】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。
【００２７】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、例えば、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、分子酸素により、安定化された溶媒和電子の形態を含む。
【００２８】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する、界面動電的に改変された流体の能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００２９】
特定の態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。
【００３０】
特定の態様では、治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された水性流体の投与を含む、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体の、それを必要とする哺乳動物への投与を含む、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するための方法。
（項目２）
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、前記流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、前記イオン水性流体中に安定的に構成される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、前記流体中で主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、前記流体中に存在する溶解した酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である、項目１に記載の方法。
（項目５）
全ての溶解酸素は、前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記イオン水溶液は、食塩溶液を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記流体は、超酸素化である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記流体は、溶媒和電子の形態を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の曝露を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記局在界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の曝露は、前記流体を生成するために使用されるデバイスの界面動電効果を誘起する構造特性への前記流体の曝露を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態は、免疫系の疾病または疾患を含む、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記免疫系の疾病または疾患は、アレルギー性炎症を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記アレルギー性炎症は、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、ＩｇＥ媒介疾患、鼻炎結膜炎、および食物アレルギーのうちの少なくとも１つを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態は、炎症性関節炎を含む、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記炎症性関節炎は、関節リウマチおよび乾癬のうちの少なくとも１つを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
併用療法を含み、少なくとも１つの追加の治療剤が、前記患者に投与される、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記少なくとも１つ追加の治療剤は、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、抗コリン作用薬、コルチコステロイド、全身性コルチコステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン修飾薬、メチルキサンチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記少なくとも１つ追加の治療剤は、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、ホルモテロール、サルメテロール、ならびにイプラトロピウムおよびチオトロピウム等の抗コリン作用薬を含む、β２アゴニスト；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む、コルチコステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含む、ロイコトリエン修飾薬；クロモリンおよびネドクロミルを含む、マスト細胞安定剤；テオフィリン、イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む複合薬を含む、メチルキサンチン；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む、抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む、免疫系修飾剤；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；ならびにそれらの組み合わせからなる気管支拡張薬からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記少なくとも１つ追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤である、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤は、２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化するＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよび前記ＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびにＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質もしくは構成成分の立体配座、リガンド結合活性、および触媒活性のうちの少なくとも１つを改変することを含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを改変することを含む、項目２に記載の方法。
（項目２４）
前記膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質ａサブユニットと相互作用する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記Ｇタンパク質ａサブユニットは、Ｇａｓ、Ｇａｉ、Ｇａｑ、およびＧａ１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記少なくとも１つのＧタンパク質ａサブユニットは、Ｇａｑである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、全細胞伝導性を調節することを含む、項目２に記載の方法。
（項目３０）
全細胞伝導性を調節することは、前記全細胞伝導性の線形および非線形の電圧依存性寄与のうちの少なくとも１つを調節することを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む、項目２に記載の方法。
（項目３２）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む、項目２に記載の方法。
（項目３３）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む、項目２に記載の方法。
（項目３４）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、免疫系の疾病または疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、ＩｇＥ媒介疾患、鼻炎結膜炎、食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、および乾癬からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する、細胞内シグナル変換の調節を含む、項目２に記載の方法。
（項目３５）
細胞ネットワークまたは層への前記界面動電流体の投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞ネットワークまたは層は、肺上皮、気管支上皮、および腸上皮からなる群から選択される少なくとも１つを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、前記流体中の前記酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含む、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記界面動電的に改変された水性流体は、分子酸素により、安定化された溶媒和電子の形態を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する前記能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、またはそれ以上の期間持続する、項目２に記載の方法。
（項目４３）
前記界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む、項目１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖｅｒａ  ６０およびＳｏｌａｓ）が、それぞれ、約９０％および５０％で、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を低下させた一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果のみあったことを示す。さらに、非界面動電的対照加圧ポット流体ＰＰ６０は、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体発現の約５０％の低下をもたらした。
【図２】本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖｅｒａ  ６０およびＳｏｌａｓ）が、それぞれ、約８０％および７０％で、気管支上皮細胞のＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを阻害する一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果のみあったことを示す。さらに、非界面動電的対照加圧ポット流体ＰＰ６０は、ＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルの約３０％の低下をもたらした。
【図３Ａ】２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、かつ異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図３Ｂ】２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、かつ異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図３Ｃ】２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、かつ異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図４Ａ】図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、かつ２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。
【図４Ｂ】図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、かつ２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。
【図４Ｃ】図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、かつ２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。
【図５Ａ】異なる外部食塩水を用いて、かつ異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図５Ｂ】異なる外部食塩水を用いて、かつ異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図５Ｃ】異なる外部食塩水を用いて、かつ異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図５Ｄ】異なる外部食塩水を用いて、かつ異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、一連のパッチクランプ実験の結果を示す。
【図６Ａ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ  ６０（パネルＣおよびＤ）に対して、２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図６Ｂ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ  ６０（パネルＣおよびＤ）に対して、２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図６Ｃ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ  ６０（パネルＣおよびＤ）に対して、２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図６Ｄ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ  ６０（パネルＣおよびＤ）に対して、２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図７Ａ】上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の希釈の効果を評価した、パッチクランプ実験の結果を示す。
【図７Ｂ】上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の希釈の効果を評価した、パッチクランプ実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された水性流体の投与を含む、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するための方法を提供する。帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、好ましくは、細胞膜電位および／または伝導性の調節を提供するのに十分な量において、流体中に安定的に構成される。ＴＳＬＰ発現および／または活性の調節または下方制御を含むある態様は、本明細書に開示されるような、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態（例えば、免疫系の疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、および食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬、ＩｇＥ媒介疾患、ならびに鼻炎結膜炎）を治療するための有用性を有する。
【００３３】
界面動電的に生成された流体：
本明細書で使用する「界面動電的に生成された流体」とは、本明細書に詳細される、例示的な混合デバイスにより、本明細書の実施例のために生成された出願者の本発明の界面動電的に生成された流体を指す（第ＵＳ２００８０２１９００８８号および国際公開第２００８／０５２１４３号も参照のこと、双方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示され、示されるデータにより示されるように、界面動電流体は、先行技術に関連する含酸素非界面動電流体（例えば、加圧ポットの含酸素流体等）を含む、先行技術に関連する非界面動電流体である、新規の根本的に異なる流体を示す。本明細書の様々な態様に開示されるように、界面動電的に生成された流体は、以下のものを含むが、これらに限定されない、独特かつ新規の物理的および生物学的特性を有する。
【００３４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む。
【００３５】
特定の態様では、界面動電的に生成された流体とは、本明細書に記載される、デバイス機能局在効果等の流体力学的に誘起された、局在（例えば、全流体容量に対して不均一）界面動電効果（例えば、電圧／電流パルス）の存在下で生成される流体を指す。特定の態様では、前記流体力学的に誘起された、局在界面動電効果は、本明細書に開示され、論じられるように、表面に関連した二重層および／または荷電電流効果と組み合わせる。
【００３６】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、その中に溶解されるレポーター溶質（例えば、トレハロース）の１３Ｃ−ＮＭＲ線幅を調節するのに適している。ＮＭＲ線幅効果は、特定の実施例において、本明細書に記載される、例えば、試験流体において溶質の「回転」を測定するための間接法である。
【００３７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖのうちのいずれか１つでの独特の矩形波ボルタンメトリーのピーク差異；−０．９ボルトでのポーラログラフピーク；ならびに−０．１９および−０．３ボルトでの、ポーラログラフピークの不在のうちの少なくとも１つを特徴とし、これらは、特定の実施例において、本明細書に開示されるように、界面動電的に生成された流体に対して特有である。
【００３８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞膜伝導性（例えば、本明細書に開示されるパッチクランプ試験において測定されるように、全細胞伝導性の電位依存性寄与）を改変するのに適している。
【００３９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶解酸素の量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、大気圧で、またはほぼ大気中の酸素レベルで、溶解酸素の１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満を有する。
【００４０】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、約８ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、場合により、本明細書で、「Ｓｏｌａｓ」と称される。
【００４１】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子（例えば、分子酸素により安定化された）、ならびに界面動電的に修飾された、および／または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、ある実施形態では、溶媒和電子、および／または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
【００４２】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル変換の調節を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する（例えば、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性を改変する）のに適しており、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、β２アドレナリン受容体、ブラジキニン受容体等）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある態様では、影響を受けたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質ａサブユニット（例えば、Ｇａｓ、Ｇａｉ、Ｇａｑ、およびＧａ１２）と相互作用する。
【００４３】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル変換を調節するのに適しており、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。
【００４４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書で記載される、様々な生物学的活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素および他のタンパク質、ならびに細胞内シグナル経路の調節）を特徴とする。
【００４５】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書に示されるように、アルブテロールおよびブデソニドとの相乗効果を示す。
【００４６】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる。
【００４７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）のＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを阻害する。
【００４８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の生物学的効果は、本明細書に示されるように、β遮断薬、ＧＰＣＲ遮断薬、およびカルシウムチャネル遮断薬は、（例えば、制御性Ｔ細胞機能における）界面動電的に改変された水性流体の活性に影響を及ぼすことを示す、ジフテリア毒素により阻害される。
【００４９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の物理的および生物学的効果（例えば、細胞内シグナル変換の調整を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する能力）は、密閉された容器内（例えば、密閉された気密性容器内）において、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００５０】
したがって、更なる態様は、前記界面動電的に生成された溶液および界面動電的に改変された含酸素流体または溶液を生産する方法を提供し、方法には、相対運動において、２つの離間した表面間で流体物質の流れを提供し、それらの間に混合容量を画定することであって、混合容量内およびそれを通して流動流体物質の単一パスの滞留時間は、０．０６秒を超える、または０．１秒を超える、ことと、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を物質に溶解し、流体または溶液を界面動電的に改変するのに適する条件下で、混合容量内で流動流体物質に酸素（Ｏ２）を導入することと、を含む。ある態様では、酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、物質に注入される。特定の実施形態では、表面積の容量に対する比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００５１】
なお更なる態様は、界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を生産する方法を提供し、方法には、２つの離間した表面間で流体物質の流れを提供し、それらの間に混合容量を画定することと、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、物質に、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を注入するのに適する条件下で、混合容量内で流動流体に酸素を導入することと、を含む。ある態様では、混合容量内で流動流体物質の滞留時間は、０．０６秒以上、または０．１秒以上である。特定の実施形態では、表面積の容量に対する比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００５２】
特定の態様では、投与された本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む。ある実施形態では、界面動電的に改変された流体は、超酸素化（例えば、それぞれ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの溶解酸素を含む、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、およびＲＮＳ−６０）である。特定の実施形態では、界面動電的に改変された流体は、非超酸素化（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準的食塩水中の環境レベルの溶解酸素）を含む、ＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓ）である。ある態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の塩分、中性、ｐＨ等は、流体の界面動電産生時に確定され、滅菌流体は、適切な経路により投与される。代替として、流体の塩分、中性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つは、流体の投与前に、投与経路に生理学的に適合するように、適切に調整される（例えば、滅菌食塩水または適切な希釈剤を用いて）。好ましくは、流体の塩分、中性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤および／または食塩溶液および／または緩衝組成物はまた、界面動電流体である、またはそうでなければ、相溶性である。
【００５３】
特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、食塩（例えば、任意の好適なアニオン／対イオン構成成分とともに、１つ以上の溶解塩、例えば、アルカリ金属塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ等）、アルカリ土類塩（例えば、Ｍｇ、Ｃａ）等、遷移金属塩（例えば、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ等））を含む。特定の態様は、混合塩界面動電流体（例えば、様々な組み合わせおよび濃度でのＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ等）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、標準食塩水（例えば、約０．９％  ＮａＣｌまたは約０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの濃度で、食塩を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の伝導性は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、または少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍである。特定の態様では、本明細書に開示される、生物活性塩安定化ナノ構造（例えば、塩安定化された酸素含有のナノ構造）の形成を可能にするという条件で、本発明の界面動電的に改変された流体を調製するために、任意の塩が使用されてもよい。
【００５４】
特定の態様に従って、帯電安定化したガス含有ナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、例えば、上記のように、流体のイオン構成成分を改変することによって、および／または流体のガス構成成分を改変することによって、調整（例えば、増加、減少、同調等）することができる。好ましい態様では、本発明の界面動電流体を調製するために、酸素が使用される。さらなる態様では、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素、およびキセノンから選択される少なくとも１つの他のガスとともに、酸素の混合物が使用される。
【００５５】
例示的な好ましい実施形態：
特定の態様は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体の、それを必要とする哺乳動物への投与を含む、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態を治療するための方法を提供する。ある態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
【００５６】
ある方法の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体中で主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、流体中に存在する溶解した酸素分子の分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。特定の態様では、全ての溶解酸素は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する。ある実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する。
【００５７】
特定の方法の態様では、イオン水溶液は、食塩溶液を含む。ある態様では、界面動電的に改変された水性流体は、超酸素化である。
【００５８】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子の形態を含む。
【００５９】
ある態様では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露を含む。ある実施形態では、局在界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む。特定の態様では、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露は、流体を生成するために使用されるデバイスの界面動電効果を誘起する構造特性への流体の曝露を含む。
【００６０】
特定の態様では、ＴＳＬＰ媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態は、アレルギー性炎症を含むがこれに限定されない、免疫系の疾病または疾患を含む。特定の態様では、アレルギー性炎症は、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、ＩｇＥ媒介疾患、鼻炎結膜炎、および食物アレルギーのうちの少なくとも１つを含む。ある実施形態では、媒介またはＴＳＬＰＲ媒介疾病または状態は、例えば、関節リウマチおよび乾癬のうちの少なくとも１つを含む、炎症性関節炎を含む。
【００６１】
ある態様では、方法は、併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療剤が患者に投与される。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、抗コリン作用薬、コルチコステロイド、全身性コルチコステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン修飾薬、メチルキサンチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、ホルモテロール、サルメテロール、ならびにイプラトロピウムおよびチオトロピウム等の抗コリン作用薬を含む、β２アゴニスト；ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む、コルチコステロイド；モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジロートンを含む、ロイコトリエン修飾薬；クロモリンおよびネドクロミルを含む、マスト細胞安定剤；テオフィリン、イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む複合薬を含む、メチルキサンチン；ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む、抗ヒスタミン剤；タクロリムスおよびピメクロリムスを含む、免疫系修飾剤；シクロスポリン；アザチオプリン；ミコフェノール酸モフェチル；ならびにそれらの組み合わせからなる気管支拡張薬からなる群から選択される。特定の態様では、少なくとも１つ追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤であり、特定の実施形態では、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤は、２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化するＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびにＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００６２】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質もしくは構成成分の立体配座、リガンド結合活性、および触媒活性のうちの少なくとも１つを改変することを含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを改変することを含む。ある態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある実施形態では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、例えば、Ｇタンパク質ａサブユニットと相互作用し、Ｇタンパク質ａサブユニットは、Ｇａｓ、Ｇａｉ、Ｇａｑ、およびＧａ１２からなる群から選択される少なくとも１つを含み、ある実施形態では、少なくとも１つのＧタンパク質ａサブユニットは、Ｇａｑである。
【００６３】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、例えば、全細胞伝導性を調節することを含み、全細胞伝導性を調節することは、全細胞伝導性の線形または非線形の電圧依存性寄与のうちの少なくとも１つを調節することを含む。
【００６４】
ある方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む。ある方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む。ある方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む。ある方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、免疫系の疾病または疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、ＩｇＥ媒介疾患、鼻炎結膜炎、食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、および乾癬からなる群から選択される、少なくとも１つの状態または症状に関連する、細胞内シグナル変換の調節を含む。
【００６５】
特定の方法の態様は、細胞ネットワークまたは層への界面動電流体の投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む。ある実施形態では、細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、細胞ネットワークまたは層は、肺上皮、気管支上皮、および腸上皮からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【００６６】
ある方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。
【００６７】
ある方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、例えば、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。ある態様では、界面動電的に改変された水性流体は、分子酸素により、安定化された溶媒和電子の形態を含む。
【００６８】
ある態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する、界面動電的に改変された流体の能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００６９】
ある態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。
【００７０】
特定の態様では、治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む。
【００７１】
例示的な関連した分子間相互作用：
通常、量子的特性は、１０−１０メートル未満の素粒子に属すると考えられ、一方、日常生活の巨視的世界は、ニュートンの運動の法則に従い、素粒子が運動するという点において、古典的であると称される。
【００７２】
最近、分子は、希釈と共に大きさが増加するクラスターを形成するように記載されている。これらのクラスターは、直径において、数マイクロメートルを測定し、希釈と共に非線形に大きさが増加することが報告されている。直径で１００ナノメートルを測定する量子のコヒーレントドメインが、純水中に発生すると仮定され、コヒーレントドメインにおける水分子の集団振動が、最終的に、電磁場変動に固定される相になり得、水中で安定振動を提供し、水の集合構造を変化させる水中の溶解物質に特異的な長続きするコヒーレント振動の励起の形態において、「記憶」の一形態を提供し、これは、同様に、発達する特異的なコヒーレント振動を決定し得る。これらの振動は、連結する磁場相により安定化される場合、希釈する際の水は、更に、「種（ｓｅｅｄ）」コヒーレント振動を運び得る。分子のクラスターの大きさが増加すると、その電磁的な特徴が、対応して増幅され、水により運ばれるコヒーレント振動を増強する。
【００７３】
溶解分子のクラスターサイズの変化、および水の詳細な微視的構造にもかかわらず、コヒーレント振動の特異性は、なお、存在し得る。水の特性の変化を考慮するための１つのモデルは、結晶化に関与する考慮に基づいている。
【００７４】
ナノスケールケージを形成する、簡易プロトン化水クラスターは、出願者の以前の特許出願である国際公開第２００９／０５５７２９号に示される。プロトン化水クラスターは、一般に、Ｈ＋（Ｈ２０）ｎの形態をとる。幾つかのプロトン化水クラスターは、電離層等に自然発生する。任意の特定の理論に拘束されるわけではないが、特定の態様に従って、水クラスターまたは構造の他の型（クラスター、ナノケージ等）が可能であり、これには、本発明の出力物質に与えられる、酸素および安定化した電子を含む構造が含まれる。酸素原子は、得られる構造に取り込まれ得る。セミ結合ナノケージの化学反応は、酸素および／または安定化した電子を、長期間、溶解したままにすることが可能である。医薬化合物等の他の原子または分子は、徐放目的のためにケージされ得る。溶液物質および溶解化合物の特異的化学反応は、これらの物質の相互作用により異なる。
【００７５】
混合デバイスにより処理された流体は、クラスター構造において流体の分析と一致する異なる構造特性を示すと、実験を介してすでに示されている。例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号を参照のこと。
【００７６】
帯電安定化したナノ構造（例えば、帯電安定化した酸素含有のナノ構造）：
本出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号の「二重層効果」、「滞留時間」、「注入速度」、「気泡サイズ測定」においてすでに記載されるように、界面動電混合デバイスは、複合体と第１の物質および第２の物質の独特の、非線形流体動的相互作用、本明細書に記載される、新規の界面動電効果を提供する効果的に膨大な表面積（デバイスの面積および１００ｎｍ未満の例外的に小さい気泡の面積を含む）と接触して混合する複合体を提供する、動的乱流をおよそミリ秒で作成する。また、絶縁回転子および固定子を含む、特別に設計された混合デバイスを用いて、機能局在界面動電効果（電圧／電流）を示した。
【００７７】
当該技術分野においてよく認識されるように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、水溶液中で、極めて不安定であることが知られている。特定の態様によれば、出願の界面動電効果（例えば、特定の態様では、溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、出力物質（例えば、食塩溶液、イオン溶液）内で、驚くほど安定化される。実際には、本明細書に記載される、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ）の特性および生物活性の安定性は、気密性容器内において、数ヶ月間、維持され得、本発明の溶液の特性および活性を生成する、および／または維持する、および／または媒介するように役立てることに、溶解ガス（例えば、酸素）の関与を示す。有意に、電荷再分配および／または溶媒和電子は、流体により生細胞（例えば、哺乳類細胞）と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、本発明の界面動電イオン水性流体中に安定的に構成される（例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号からの細胞パッチクランプの実施例２３を参照のこと、および本明細書に開示されるように）。
【００７８】
本発明の界面動電流体（例えば、界面動電食塩溶液）の安定性および生物学的適合性を説明するために、「分子間相互作用」の項において本明細書で記載されるように、出願者は、水分子と水中に溶解された物質（例えば、酸素）の分子との間の相互作用が、水の集合構造を変化させ、ナノスケールケージクラスターを提供することが提案され、これには、本発明の出力物質に与えられる、酸素および／または安定化した電子を含むナノ構造が含まれる。機構に拘束されるわけではないが、特定の態様では、ナノ構造の構造は、それらが、溶解ガス（例えば、酸素）を（少なくとも、形成および／または安定性および／または生物活性のために）含む；細胞膜もしくはその関連した構成要素と接触した際に、界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ食塩流体）が、電荷および／または電荷効果を調節する（例えば、与えるまたは受容する）のを可能にする；ならびに、特定の態様では、生物学的に関連した形態において、溶媒和電子の安定化を提供する（例えば、運ぶ、持つ、捕獲する）。
【００７９】
特定の態様によれば、本開示により支持されるように、イオンまたは食塩（例えば、標準食塩水、ＮａＣｌ）溶液において、本発明のナノ構造は、帯電安定化した水和殻内で、少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を含み得る、帯電安定化したナノ構造（例えば、平均直径１００ｎｍ未満）を含む。追加の態様によれば、帯電安定化した水和殻は、少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を持つケージまたは空隙を含み得る。更なる態様によれば、好適な帯電安定化した水和殻の供給によって、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、溶媒和電子（例えば、安定化した溶媒和電子）を更に含み得る。
【００８０】
機構または特定の理論に拘束されるわけではないが、この優先日後、周囲（大気）気体と平衡状態にある水性液体中のイオンにより安定化された帯電安定化超微粒気泡が、提案されている（Ｂｕｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，１０４：４８６−４９８，２００７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の態様によれば、出願者の新規の界面動電流体は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の新規の生物学的活性形態を含み、このような構造の新規の配列、クラスター、または会合を更に含み得る。
【００８１】
帯電安定化した超微粒気泡モデルによれば、水構造の短距離分子秩序は、ガス分子の存在により破壊され（例えば、非吸着イオンと初期に複合した溶解ガス分子は、短距離秩序の欠陥をもたらす）、これは、イオン性液滴の濃縮を提供し、欠陥は、水分子の第１および第２の配位圏により取り囲まれ、配位圏において、それぞれ、６および１２の空孔を占める、吸着イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ＋イオンの「スクリーニングシェル（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｈｅｌｌ）」の捕捉）および非吸着イオン（例えば、第２の配位圏を占めるＣｌ−イオン）により代替的に充填される。不飽和イオン溶液（例えば、不飽和食塩溶液）において、この水和した「細胞核」は、第１および第２の配位圏が、それぞれ、６つの吸着イオンおよび５つの非吸着イオンにより充填されるまで、安定した状態を保ち、次いで、ガス分子を含有する内部空隙を生成するクーロン爆発を受け、吸着イオン（例えば、Ｎａ＋イオン）は、得られる空隙の表面に吸着され、一方、非吸着イオン（またはそれらの幾つかの部分）は、溶液に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎら、上記を参照）。このモデルにおいて、ナノ構造における空隙は、その表面に吸着されたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）間でのクーロン爆発により崩壊されない。空隙含有のナノ構造の安定性は、空隙／気泡表面への同電荷との溶解イオンの選択的吸着、および溶解ガスと気泡内部のガスとの間の拡散平衡によるものであると仮定され、負の静電圧（得られる電気二重層により与えられる外部からの静電圧）は、界面張力に対して安定補償を提供し、気泡内部のガス圧力は、周囲圧力により均衡を保つ。モデルによれば、このような超微粒気泡の形成は、イオン構成成分を必要とし、ある態様では、粒子間の衝突媒介した会合は、より大きな秩序クラスター（配列）の形成を提供し得る（同上）。
【００８２】
帯電安定化した超微粒気泡モデルは、粒子が、ガス超微粒であり得ることを示唆するが、周囲大気と平衡状態にあるイオン溶液中のこのような構造の自然形成のみ企図し、酸素が、このような構造を形成することができるかどうかに関して、特性化されておらず、かつ未特定のままであり、同様に、溶媒和電子が、このような構造により会合および／または安定化され得るかどうかに関しても、未特定のままである。
【００８３】
特定の態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む本発明の界面動電流体は、新規であり、超微粒気泡モデルに従って、仮定非界面動電、大気の帯電安定化超微粒気泡構造とは基本的には異なる。注目すべきは、対照食塩溶液は、本明細書に開示される生物学的特性を持たないが、その一方で、出願者の帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の新規の生物学的活性形態を提供するという事実に、少なくとも一部分において由来する、本結論は、避けられない状態である。
【００８４】
本発明の特定の態様によれば、出願者の新規の界面動電デバイスおよび方法は、大気と平衡状態にあるイオン流体、またはいずれの非界面動電的に生成された流体中で自発的に発生し得る、または発生し得ない、任意の量を超えて、かなりの量の帯電安定化したナノ構造を含む、新規の界面動電的に改変された流体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む。追加の態様では、帯電安定化したナノ構造は、全て、もしくは実質的に全ての帯電安定化した酸素含有のナノ構造である、または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、界面動電流体中で主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。
【００８５】
なお更なる態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、溶媒和電子を含む、または持ち得、それによって、新規の安定化した溶媒和電子担体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、電極の新型（または逆電極）を提供し、単一の有機配位カチオンを有する従来の溶質電極と対照的に、むしろ、空隙または酸素原子を含有する空隙周辺に安定的に配列された複数のカチオンを有し、配列されたナトリウムイオンは、有機分子によってよりはむしろ、水の水和殻によって配位される。特定の態様によれば、溶媒和電子は、水分子の水和殻により収容され得る、または好ましくは、全てのカチオンにわたって分布するナノ構造の空隙内で収容され得る。ある態様では、本発明のナノ構造は、複数の配列したナトリウムカチオンにわたって溶媒和電子（一連のナトリウム原子および少なくとも１つの酸素原子にわたって分布する溶媒和電子）の分布／安定化を提供するだけでなく、空隙中の閉じ込め（ｃａｇｅｄ）酸素分子と溶媒和電子の会合または部分会合を提供することにより、溶液中の新規の「スーパー電極」を提供する。したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電流体と関連して現在開示される、「溶媒和電子」は、水分子による直接水和を含む従来のモデルにおいて溶媒和され得ない。代替として、乾燥電極塩を用いた限定された例では、本発明の界面動電流体中の溶媒和電子は、水溶液中の高度な秩序配列を安定化させるために、「格子接着（ｌａｔｔｉｃｅ  ｇｌｕｅ）」を提供するように複数の帯電安定化したナノ構造にわたって分布され得る。
【００８６】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用することが可能である。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用することが可能である。
【００８７】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、帯電および／または帯電効果提供者（送達）として、ならびに／または帯電および／または帯電効果受容者として、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用する。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、帯電および／または帯電効果提供者として、ならびに／または帯電および／または帯電効果受容者として、細胞膜と相互作用する。
【００８８】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、本発明の界面動電流体の観察された安定性および生物学的特性と一致し、かつ説明し、イオン水溶液（例えば、食塩溶液、ＮａＣｌ等）中の安定化した溶媒和電子を提供する、新規の電極（または逆電極）を更に提供する。
【００８９】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノバブルを実質的に含み、その形態をとる、またはそれを発生させることができる。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有クラスターは、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の相対的に大きい配列、および／または帯電安定化した酸素含有ナノバブルもしくはそれらの配列の形成を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、疎水性表面と接触した際に、疎水性ナノバブルの形成を提供することができる。
【００９０】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、実質的に、少なくとも１つの酸素分子を含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、実質的に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれ以上の酸素分子を含む。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、約２０ｎｍ×１．５ｎｍのナノバブル（例えば、疎水性ナノバブル）を含む、または発生し、約１２個の酸素分子（例えば、酸素分子の大きさ（約０．３ｎｍ×０．４ｎｍ）、理想気体の仮定、およびｎ＝ＰＶ／ＲＴの適用に基づき、ここで、Ｐ＝１ａｔｍ、Ｒ＝０．０８２□０５７□ｌ．ａｔｍ／ｍｏｌ．Ｋ；Ｔ＝２９５Ｋ；Ｖ＝ｐｒ２ｈ＝４．７×１０−２２Ｌ、ここで、ｒ＝１０×１０−９ｍ、ｈ＝１．５×１０−９ｍ、およびｎ＝１．９５×１０−２２モル）を含む。
【００９１】
ある態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、このようなナノ構造、またはそれらの配列にある流体中に存在する、酸素分子の割合は、０．１％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。好ましくは、この割合は、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、または約２０％以上である。追加の態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の実質的な大きさ、またはそれらの配列は、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、および１ｎｍ未満からなる群から選択される大きさである。好ましくは、この大きさは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
【００９２】
ある態様では、本発明の界面動電流体は、溶媒和電子を含む。更なる態様では、本発明の界面動電流体は、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列を含み、これらは、溶媒和電子、および特異な電荷分布（極性、対称、非対称の電荷分布）のうちの少なくとも１つを含む。ある態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列は、常磁性を有する。
【００９３】
対照的に、本発明の界面動電流体に関連して、対照加圧ポット含酸素流体（非界面動電流体）等は、このような界面動電的に生成された帯電安定化した生物学的活性ナノ構造および／または生物学的活性帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列を含まず、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調整が可能である。
【００９４】
ガス富化流体を生成するシステム
現在開示されるシステムおよび方法は、最小の受動的損失を伴う高濃度で、ガス（例えば、酸素）を安定的に富化させることが可能である。このシステムおよび方法は、多種多様の流体に、高い割合で、多種多様のガスを富化するために効果的に使用され得る。例示のみとして、室温で、一般に、溶解酸素の約２〜３ｐｐｍ（１００万分の１）のレベルを有する、脱イオン水は、開示されたシステムおよび／または方法を用いて、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約１５ｐｐｍ、少なくとも約２０ｐｐｍ、少なくとも約２５ｐｐｍ、少なくとも約３０ｐｐｍ、少なくとも約３５ｐｐｍ、少なくとも約４０ｐｐｍ、少なくとも約４５ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約５５ｐｐｍ、少なくとも約６０ｐｐｍ、少なくとも約６５ｐｐｍ、少なくとも約７０ｐｐｍ、少なくとも約７５ｐｐｍ、少なくとも約８０ｐｐｍ、少なくとも約８５ｐｐｍ、少なくとも約９０ｐｐｍ、少なくとも約９５ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、またはいずれかの値以上もしくはそれらの間の範囲の溶解酸素のレベルを達成することができる。特定の例示的な実施形態に従って、酸素富化水は、溶解酸素の約３０〜６０ｐｐｍのレベルで生成され得る。
【００９５】
表１は、酸素富化食塩溶液（表１）で処置された治癒創傷、および本発明のガス富化酸素富化食塩溶液のサンプルにおいて得られた、様々な分圧測定を示す。
【００９６】
【表１】
2015044869.tif 000002
ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ媒介状態
ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰＲアゴニスト／拮抗剤：自然発生的な物質により通常刺激される細胞受容体に対する親和性を有し、かつ細胞受容体における生理学的活性を刺激し、それによって、生化学的反応を誘発する薬剤。ＴＳＬＰ受容体アゴニストは、ＴＳＬＰ受容体に対する親和性を有し、ＴＳＬＰのその受容体との結合により誘発される活性を刺激する。例えば、ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受容体アゴニストは、ＴＳＬＰ受容体に結合し、かつ細胞内シグナル伝達を誘発する分子である。対照的に、「拮抗剤」は、自然発生的な物質により通常刺激される細胞受容体の活性を阻害する薬剤である。したがって、ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受容体拮抗剤は、ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰ受容体に結合し、ＴＳＬＰのＴＳＬＰ受容体への結合を阻害する、および／またはＴＳＬＰのその受容体との結合により通常誘発される活性を阻害する。例えば、ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受容体拮抗剤は、ＴＳＬＰまたはＴＳＬＰ受容体に結合し、例えば、ＴＳＬＰのＴＳＬＰ受容体への結合を遮断することにより、結合を軽減または防止することができる。あるいは、ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰ受容体拮抗剤は、ＴＳＬＰ受容体に結合し、ＴＳＬＰのその受容体との結合により通常誘発され得る、下流シグナル伝達を軽減または防止することができる。アゴニストおよび拮抗剤は、リガンド様ポリペプチド、抗体、およびその断片または部分配列等のポリペプチドを含む、種々のクラスの分子を含むことができる。アゴニストおよび拮抗剤はまた、融合ポリペプチド、抗体、ペプチド、（約２０アミノ酸未満の長さのペプチド等）、および小分子を含むこともできる。例示的な拮抗剤としては、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびに２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化し、それによって、生理学的な受容体二量体または高次オリゴマーを模倣する、ＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチド等の、ＴＳＬＰ受容体融合タンパク質が挙げられる。受容体が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、一本鎖融合を利用することができる。
【００９７】
抗体：エピトープ（例えば、ＴＳＬＰもしくはその断片、またはその断片のＴＳＬＰ受容体等の抗原）を特異的に認識および結合する、少なくとも１つの軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む、ポリペプチドリガンド。これは、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’．ｓｕｂ．２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）等の、当該技術分野においてよく知られている、完全免疫グロブリンおよびそれらの変異体および部分を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合される一方で、ｄｓＦｖにおいて、鎖は、鎖の会合を安定化するために、ジスルフィド結合を導入するように突然変異している、融合タンパク質である。用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）等の遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１．）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照のこと。典型的には、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域はまた、「ドメイン」としても知られている）。組み合わせて、重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域により遮断される「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースは、現在オンラインで管理されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種の中で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素である軽鎖および重鎖の複合フレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲを配置および整列させる働きをする。抗体としては、モノクローナル抗体、ヒト化抗体等が挙げられる。
【００９８】
ＴＳＬＰ拮抗剤としては、とりわけ、小分子拮抗剤、ＴＳＬＰに対する抗体、ＴＳＬＰ受容体に対する抗体、および２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化し、それによって、生理学的な受容体二量体または高次オリゴマーを模倣する、ＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチド等の、ＴＳＬＰ受容体融合タンパク質が挙げられる。ＴＳＬＰは、Ｉ型サイトカイン受容体スーパーファミリーメンバー（赤血球生成促進因子受容体スーパーファミリーメンバーとしても知られている）、ＴＳＬＰＲに直接結合することが示されている。ＴＳＬＰＲは、クローン化されている。ＴＳＬＰに対する機能的高親和性受容体は、２つのポリペプチド、ＴＳＬＰＲおよびＩＬ−７受容体α鎖を含むことが実証されている。したがって、ＴＳＬＰおよびＩＬ−７の両方は、それらの受容体の一構成成分としてＩＬ−７Ｒαを共有する。しかしながら、これらの受容体は、ＴＳＬＰ受容体がＴＳＬＰＲをさらに含有する一方で、ＩＬ−７受容体は、様々なサイトカイン受容体のシグナル伝達構成成分である、共通サイトカイン受容体γ鎖をさらに含有するという点で独特である。ＴＳＬＰＲ（およびこの受容体鎖のＦｃ融合）は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第２００２／０１６０９４９号に記載されている。
【００９９】
ＴＳＬＰポリペプチドに対する抗体は、当該技術分野で知られている。さらに、抗ＴＳＬＰＲ抗体は、市販されている（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．，ｃａｔ．ｎｏ．ＭＡＢ９８１、ＤＮＡＸ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）。抗体はまた、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＬＲＴＭ．ＳｕｉｔｅのＷｅｌｌｉｎｇプロット（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により判定される増加した抗原性の領域等、特異的エピトープの付与によって、ＴＳＬＰ受容体またはＴＳＬＰに対して調製される。ＴＳＬＰ受容体の配列、およびヒトＴＳＬＰ受容体における増加した抗原性の領域は、米国特許公開第２００３／０１８６８７５号に開示される。医薬組成物（上記を参照のこと）は、概して、治療有効量のＴＳＬＰ拮抗剤を含み、また、追加の薬剤も含むことができる。医薬組成物の調製は、上記に開示される。
【０１００】
兆候
ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰＲは、免疫系の疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、アレルギー性喘息、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、乾癬、ＩｇＥ媒介疾患、および鼻炎結膜炎が挙げられるがこれに限定されない、多くの種類のアレルギー性状態に関与すると考えられる。ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応へのＴＳＬＰの関与は、Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕによる近年の再調査を含む、いくつかの文献に示されている（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：７０９−７１４，２００５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０１】
アレルギー性気道炎症。近年の研究は、ＴＳＬＰがインビボでマウスのアレルギー性気道炎症の開始に必要であることを実証した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１０４７−１０５３，２００５）。一研究において、Ｚｈｏｕらは、ＴＳＬＰ導入遺伝子の肺特異的発現が、白血球（Ｔｈ２細胞を含む）の大量浸潤、杯細胞過形成、および上皮下線維症、ならびに血清ＩｇＥレベルの増加を特徴とするアレルギー性気道炎症（喘息）を誘発することを実証した。さらに、近年の研究は、アレルゲン刺激が喘息マウスの気道におけるＴＳＬＰの急速な蓄積を引き起こすことを示した（Ｌｉｙｕｎ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２０２−２１０，２００８）。これらの結果は、ＴＳＬＰがアレルギー性気道炎症の病因において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、アレルギー性気道炎症および同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０２】
アレルギー性炎症。近年の再調査は、アレルギー性炎症、例えば、アレルギー性皮膚炎におけるＴＳＬＰの役割を調査する研究からの結果を要約および記載する（Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，２００８）。具体的に、研究は、アトピー性皮膚炎を有する患者における正常皮膚および非病変皮膚が検出可能なＴＳＬＰタンパク質を有しない一方で、急性および慢性アトピー性皮膚炎病変から採取される皮膚が、ＴＳＬＰの高い発現を有することを示している。別の研究において、ＴＳＬＰＲを欠いているマウスを構築し、アレルギー性皮膚炎に対する効果に対して検査した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０５：１１８７５−１１８８０，２００８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｈｅらは、ＴＳＬＰＲを欠いているマウスにおけるアレルゲンに起因する皮膚炎が、野生型と比較して有意に低下したことを発見した。さらに別の研究において、皮膚でＴＳＬＰを過剰発現するように操作されたマウスは、炎症性浸潤を含む湿疹様皮膚病変、循環するＴｈ２細胞の劇的増加、および血清ＩｇＥの上昇を特徴とするアトピー性皮膚炎を発症することが実証された（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：５４１−５４９，２００５）。研究は、ＴＳＬＰがマウスにおいてＤＣを直接的に活性化し得ることを示唆した。Ｌｉらによって実施された別の研究において、グループは、皮膚でＴＳＬＰを過剰発現しているトランスジェニックマウスが、ＴＳＬＰとアトピー性皮膚炎の発症との間の関連性を強固なものにする、アトピー性皮膚炎を発症することを確認した。これらの結果は、ＴＳＬＰがアレルギー性炎症、例えば、アレルギー性皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎および湿疹）の病因において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、アレルギー性炎症、例えば、アレルギー性皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎および湿疹）、ならびに同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０３】
乾癬。近年の研究は、ＴＳＬＰが急性乾癬の患者から採取される皮膚生検において、実質的により高い発現を有したことを示した（Ｇｕｔｔｍａｎ−Ｙａｓｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１９：１２１０−１２１７，２００７）。この結果は、ＴＳＬＰが乾癬の病因において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。したがって、ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、乾癬および同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０４】
アレルギー性喘息。近年、研究は、アレルゲン刺激が喘息マウスの気道におけるＴＳＬＰの急速な蓄積を引き起こすことを示した（Ｌｉｙｕｎ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２０２−２１０，２００８）。同研究において、ＴＳＬＰＲを阻害することによるＤＣ機能の調節がマウスの重症度を低めることが示された。これらの結果は、ＴＳＬＰがアレルギー性喘息の病因において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。したがって、ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、アレルギー性喘息および同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０５】
閉塞性気道疾患。近年の研究は、ＣＯＰＤがＴＳＬＰの気管支粘膜発現の増加に関連することを実証した（Ｙｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８１：２７９０−２７９８，２００８）。ＣＯＰＤは、閉塞性気道疾患の一種である。この結果は、ＴＳＬＰが閉塞性気道疾患、例えば、ＣＯＰＤの病因において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。したがって、ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、閉塞性気道疾患、例えば、ＣＯＰＤを治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０６】
食物アレルギー。腸の樹状細胞は、ナイーブＴ細胞を刺激し、それらをＯＸ４０Ｌ依存的に、ＴＨ２反応に偏らせることがわかった（Ｂｌａｚｑｕｅｚ  ＡＢ，Ｂｅｒｉｎ  ＭＣ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｈ２  ｓｋｅｗｉｎｇ  ｖｉａ  ＯＸ４０Ｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０：４４４１−４４５０，２００８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、近年の再調査は、腸におけるＴＳＬＰの存在および免疫ホメオスタシスの調節におけるその役割を考察している（Ｉｌｉｅｖ  ＩＤ，Ｍａｔｔｅｏｌｉ  Ｇ，Ｒｅｓｃｉｇｎｏ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｙｉｎ  ａｎｄ  ｙａｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０４：２２５３−２２５７，２００７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの結果は、ＴＳＬＰが食物アレルギーにおいて重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。したがって、ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、食物アレルギーおよび同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０７】
炎症性関節炎。近年の研究は、他の形態の関節炎の患者から得られる滑液と比較して、関節リウマチ（ＲＡ）の患者から得られる滑液検体において、ＴＳＬＰのレベルの増加を発見した（Ｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｉｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．，３５７：９９−１０４，２００７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。同研究は、抗ＴＳＬＰ中和抗体の使用が、マウスにおいて抗ＩＩ型コラーゲン抗体により誘発される、ＴＮＦ−ａ依存性実験的関節炎を改善したことを発見した。これらの結果は、ＴＳＬＰがＲＡ等の炎症性関節炎において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体がＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。したがって、ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、炎症性関節炎および同様の状態、例えば、ＲＡを治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０８】
アレルギー性鼻炎。近年の研究において、Ｍｏｕらは、アレルギー性鼻炎（ＡＲ）を患っていた全試験患者の鼻粘膜において、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において、ＴＳＬＰが存在したことを発見した（Ｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｔｏ−ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｃａ，１２９：２９７−３０１，２００９、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、ＴＳＬＰレベルは、ＡＲの重症度と密接に相関していた。これらの結果は、ＴＳＬＰがＡＲおよび／または鼻炎結膜炎の病因において重要な役割を果たすことを示す。ここで、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、関連モデル系において、ＴＳＬＰを有意に下方制御したことを示す。したがって、ある実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、ＡＲ、アレルギー性鼻炎結膜炎、および同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０９】
治療方法
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害する、または予防することを指し、かつこれらの意味を含意し、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」とは、本明細書に定義されるように、治療の行為を指す。
【０１１０】
「治療有効量」は、疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害する、または予防するために十分である、本明細書に提供される本発明を実践する経過において利用されるいずれかの化合物の任意の量である。
【０１１１】
本明細書のある実施形態は、ある状態または疾患と関連する炎症の少なくとも１つの症状を予防するまたは緩和することによる対象に対する治療組成物および治療方法に関する。炎症性疾患と関連する多くの状態または疾患は、ステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、およびレフルノミド等を含む免疫抑制剤、アスピリン、アセトアミノフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤等の非ステロイド系抗炎症剤、金剤、ならびに抗マラリア治療剤を用いて治療されている。
【０１１２】
投与経路および形態
本明細書で使用されるとき、「対象」は、いずれかの生物体、好ましくは、動物、更に好ましくは、哺乳類、およびなお更に好ましくは、ヒトを指し得る。
【０１１３】
特定の例示的な実施形態では、本発明のガス富化流体は、治療組成物が、炎症の少なくとも１つの症状を予防する、または緩和するように、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、治療組成物として機能し得る。本発明の治療組成物は、それを必要とする対象に投与することができる、組成物を含む。ある実施形態では、治療組成物製剤はまた、担体、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、香料、および結合剤からなる群から選択される、少なくとも１つの添加剤も含み得る。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容可能な担体」および「担体」は、概して、非毒性の、不活性固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入物質、またはあらゆる型の製剤補助物質を指す。医薬的に許容可能な担体としての機能を果たし得る物質の幾つかの限定されない例としては、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖類；コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン；セルロース、およびその誘導体である、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックス等の賦形剤；ピーナッツオイル、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の相溶性潤滑剤、があり、考案者の判断に従って、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料、および香料であり、保存料および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。特定の態様では、このような担体および賦形剤は、本発明のガス富化流体または溶液であり得る。
【０１１５】
本明細書に記載の医薬的に許容可能な担体としては、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤が、当業者には既知である。一般に、医薬的に許容可能な担体は、治療剤に対して化学的に不活性であり、使用条件下で、有害な副作用または毒性がない。医薬的に許容可能な担体は、ポリマーおよびポリマーマトリクス、ナノ粒子、超微粒気泡等を含み得る。
【０１１６】
本発明の治療ガス富化流体に加えて、治療組成物は、追加の非ガス富化水または他の溶媒等の不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの組み合わせを更に含み得る。当業者により明らかであるように、特定の治療組成物の新規の改善された製剤、新規のガス富化治療流体、および新規のガス富化治療流体を送達する新規の方法は、同一の、同様の、または異なる組成物のガス富化流体と１つ以上の不活性希釈剤を差し替えることにより得られ得る。例えば、従来の水は、ガス富化流体を提供するために、水もしくは脱イオン水に酸素を混合することにより生成されたガス富化流体により差し替える、または補完され得る。
【０１１７】
ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、１つ以上の治療剤と組み合わせ得る、および／または単独で使用され得る。特定の実施形態では、ガス富化流体を抱合することは、脱イオン水、食塩溶液等の当該技術分野において既知の１つ以上の溶液を、１つ以上のガス富化流体と差し替えることを含み、それによって、対象に送達するための改善された治療組成物を提供し得る。
【０１１８】
ある実施形態は、本発明のガス富化流体、医薬組成物、もしくは他の治療剤、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは溶媒、ならびに少なくとも１つの医薬担体もしくは希釈剤を含む、治療組成物を提供する。これらの医薬組成物は、前述の疾患または状態の予防および治療、ならびに上記のように、療法において、使用され得る。好ましくは、担体は、医薬的に許容可能でなければならず、適合する、即ち、組成物中の他の成分において有害効果がないものでなければならない。担体は、固体または液体であり得、好ましくは、単位用量の製剤、例えば、活性成分の０．０５〜９５重量％を含有し得る錠剤として、製剤化される。
【０１１９】
可能な投与経路としては、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、大槽内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸、局所（経皮、膣内、眼球内、耳内、鼻腔内、吸入、および移植可能なデバイスまたは物質の注射または挿入を含む）が含まれる。
【０１２０】
投与経路
特定の対象に対する投与の最適な手段は、治療される疾患もしくは状態の性質および重症度、または使用される治療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療剤の性質により異なる。ある実施形態では、経口または局所投与が好ましい。
【０１２１】
経口投与に好適な製剤は、それぞれ既定量の活性化合物を含有する、錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、トローチ剤、もしくはゲルコーティングされたアンプルのような個別単位として、粉末もしくは顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、提供し得る。
【０１２２】
舌下または口腔投与等による経粘膜的方法に好適な製剤は、活性化合物および一般に香味ベース、例えば、砂糖およびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤、パッチ剤、錠剤等、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースアカシアのような不活性ベース中に活性化合物を含むパステル剤を含む。
【０１２３】
非経口投与に好適な製剤は、一般に、既定濃度の活性ガス富化流体および可能な別の治療剤を含有する滅菌水溶液を含み、溶液は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液を含んだ等張液である。非経口投与に好適な更なる製剤は、界面活性剤およびシクロデキストリン等の生理学的に好適な共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤を含む。水中油型乳剤はまた、ガス富化流体の非経口投与用の製剤に好適であり得る。このような溶液は、好ましくは、静脈内投与されるが、皮下または筋肉内注射により投与されてもよい。
【０１２４】
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤は、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、吸収性固形物質、潅水等を含む。製剤は、座薬ベースを形成する１つ以上の固体担体、例えば、ココアバター中に、活性成分を含む、単位用量座薬として提供するのが好ましい。代替として、本発明のガス富化流体を用いた結腸洗浄は、結腸または直腸投与用に製剤化され得る。
【０１２５】
局所、眼球内、耳内、または鼻内投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ゲル剤（ヒドロゲル等）、スプレー剤、分散性粉末および顆粒、エマルジョン、流動噴射剤を用いたスプレー剤またはエアロゾル（例えば、リポソームスプレー剤、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤等）、ならびに油を含む。このような製剤に好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせを含む。経鼻または鼻腔内投与は、定量のこれらの製剤またはその他のいずれかを含み得る。同様に、耳内または眼球内は、点滴剤、軟膏、刺激流体（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  ｆｌｕｉｄ）等を含み得る。
【０１２６】
本発明の製剤は、あらゆる好適な方法、一般に、液体もしくは微粉化した固体担体、またはその双方を有する活性化合物を、ガス富化流体と、必要とされる比率で均一かつ緊密に任意に混合し、次いで、必要であれば、得られた混合物を所望の形状に付形することにより調製され得る。
【０１２７】
例えば、錠剤は、活性成分の粉末または顆粒、および１つ以上の任意成分、例えば、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む均質混合物を圧縮するか、または粉末活性成分および本発明のガス富化流体の均質混合物を成形することにより調製し得る。
【０１２８】
吸入による投与に好適な製剤は、種々の型の定量加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含む。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
【０１２９】
口からの肺投与に関しては、気管支樹への送達を確実にするために、粉末または液滴の粒度は、一般に、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。鼻投与に関しては、鼻腔における保留を確実にするために、１０〜５００μＭの粒度が好ましい。
【０１３０】
定量吸入器は、液化噴射剤中の治療剤の懸濁液または溶液製剤を一般に含有する加圧エアロゾルディスペンサーである。ある実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明のガス富化流体は、標準液化噴射剤に加えて、またはその代わりに、使用され得る。使用の際に、これらのデバイスは、計量した量、一般に１０〜１５０μＬを送達するように適合させた弁を経て製剤を放出して、治療剤およびガス富化流体を含有する微粒子噴霧を生じる。好適な噴射剤は、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物を含む。
【０１３１】
製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、エタノール界面活性剤、例えば、オレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、酸化防止剤、および好適な風味剤を更に含有し得る。ネブライザーは、商業的に入手可能なデバイスであり、それは、狭いベンチュリ穴を通る圧縮ガス（一般に空気または酸素）の加速によるか、あるいは超音波撹拌のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療エアロゾルミストに変換するデバイスである。ネブライザーで用いるのに好適な製剤は、ガス富化流体中の別の治療剤からなり、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満を含む。加えて、他の担体は、蒸留水、滅菌水、または希釈水性アルコール溶液等を利用し、好ましくは、例えば、塩化ナトリウム等の塩の添加により、体液と等張にされるものであり得る。任意の添加剤は、特に、製剤が滅菌調製されていない場合は、防腐剤を含み、メチルヒドロキシ−ベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、および界面活性剤を含み得る。
【０１３２】
吸入による投与に好適な製剤は、吸入器により送達されるか、または鼻からの吸入により鼻腔に取り入れられ得る微粉砕散剤を含む。吸入器において、散剤を、一般にゼラチンまたはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに入れ、それらを原位置で突き刺すかまたは開けて、散剤が、吸入時にデバイスから引き出される空気によるか、または手動ポンプにより送達される。吸入器において採用される散剤は、活性成分だけからなるか、または活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトース、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。
【０１３３】
活性成分は、一般に、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。上に具体的に言及された成分に加えて、本発明の製剤は、課題となる製剤の型を考慮して、当業者には既知の他の薬剤を含み得る。例えば、経口投与に好適な製剤は、香味料を含み得、経鼻投与に好適な製剤は、香料を含み得る。
【０１３４】
本発明の治療組成物は、個々の治療剤として、あるいは、治療剤と組み合わせて、調合薬と共に使用可能なあらゆる従来の方法により投与され得る。
【０１３５】
当然のことながら、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびにその投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態、および体重；症状の性質および範囲；同時治療の種類；治療頻度；ならびに所望の効果のような既知の要因により異なり得る。活性成分の１日投与量は、体重の１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量であることが期待され得る。
【０１３６】
用量形態（投与に好適な組成物）は、単位あたり活性成分の約１ｍｇ〜約５００ｍｇを包含する。これらの医薬組成物では、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づいて、約０．５〜９５重量％の量で存在し得る。
【０１３７】
軟膏、ペースト剤、フォーム剤、咬合剤（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、クリーム剤、およびゲル剤はまた、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、シリカ酸、およびタルク、またはこれらの混合物のような賦形剤も含有し得る。散剤およびスプレー剤はまた、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物のような賦形剤も含有し得る。ナノ結晶抗菌性金属の溶液は、エアロゾル医薬品を製造するために日常的に使用される既知の手段のいずれかによりエアロゾルまたはスプレー剤に変換され得る。概して、このような方法は、通常、不活性担体ガスを用いて、溶液の容器を加圧すること、または加圧するための手段を提供すること、および小さい穴から加圧したガスを通過させることを含む。スプレー剤は、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガス等の常用の噴射剤を更に含有し得る。加えて、ミクロスフェアまたはナノ粒子は、対象に治療化合物を投与するために必要とされるいずれかの経路において、本発明のガス富化治療組成物または流体と共に採用され得る。
【０１３８】
注射用製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量を密閉した容器中に存在し得、使用直前に、滅菌液体賦形剤、またはガス富化流体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。注射可能な組成物のために効果的な医薬担体の必要条件は、当業者には公知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照のこと。
【０１３９】
局所投与に好適な製剤としては、本発明のガス富化流体および任意に追加の治療および香味、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性ベース中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むパステル剤；好適な液体キャリア中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むうがい薬または含嗽液；ならびにクリーム剤、エマルジョン、ゲル剤等が挙げられる。
【０１４０】
追加として、直腸投与に好適な製剤としては、乳化ベースまたは水溶性ベースのような様々なベースと混合することにより座薬として示され得る。膣内投与に好適な製剤としては、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、または活性成分に加えて、当該技術分野で適切であることが知られているキャリア等を含有するスプレー剤として示され得る。
【０１４１】
好適な医薬キャリアは、本分野における標準的な参照テキスト「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）」に記載されている。
【０１４２】
本発明の文脈において、対象、特に、動物、具体的には、ヒトに投与される用量は、適当なタイムフレーム上で動物の治療反応をもたらすのに十分であるべきである。当業者は、投与量が、動物の状態、動物の体重、ならびに治療されるべき状態を含む、様々な要因により異なり得ることを理解されよう。好適な用量は、所望の反応に影響を及ぼすことが知られている、対象における、治療組成物の濃度をもたらし得るものである。
【０１４３】
用量の大きさはまた、投与の経路、タイミングおよび頻度、ならびに治療組成物の投与および所望の生理的効果を伴い得る、いかなる副作用の存在、性質、および範囲によっても決定され得る。
【０１４４】
組み合わせの化合物は、（１）共製剤における化合物の組み合わせにより同時に、または（２）別々の医薬製剤において、交代で、即ち、連続的に、順次に、並行で、または同時に、送達することにより、投与され得ることが認識されよう。交互の治療において、第２、および任意に第３の活性成分の投与の遅延が、活性成分の組み合わせの相乗的な治療効果の利益を損失するべきではない。（１）あるいは（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態によれば、理想的には、組み合わせは、最も有効な結果を達成するように投与されるべきである。（１）あるいは（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態では、理想的には、組み合わせは、活性成分のそれぞれのピーク血漿濃度を達成するために投与されるべきである。組み合わせ共製剤の投与による１日に１回１錠レジメン（ｏｎｅ  ｐｉｌｌ  ｏｎｃｅ−ｐｅｒ−ｄａｙ  ｒｅｇｉｍｅｎ）は、炎症性神経変性疾患に罹患している何人かの患者に実行可能であり得る。ある実施形態によれば、組み合わせの活性成分の効果的なピーク血漿濃度は、約０．００１〜１００μＭの範囲であり得る。最適なピーク血漿濃度は、特定の患者について処方される製剤および投与レジメンにより達成され得る。本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体は、同時に与えられるか、または順次与えられるかいずれにせよ、個々に、複数で、または任意のこれらの組み合わせで、投与され得ることもまた理解されよう。概して、交互の治療（２）の間、有効投与量の各化合物は連続的に投与され、共製剤治療（１）においては、有効投与量の２つ以上の化合物が、一緒に投与される。
【０１４５】
本発明の組み合わせは、単位投薬形態において、医薬製剤として適宜に表され得る。都合の良い単位投与製剤は、それぞれ、１ｍｇ〜１ｇの任意の量（例えば、１０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定されない）で活性成分を含む。例えば、グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）と組み合わせた、本発明の流体の相乗効果は、広い比にわたって、例えば、１：５０〜５０：１（本発明の流体：グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド））で実現され得る。１つの実施形態では、比は、１：１０〜１０：１の範囲であり得る。別の実施形態では、丸剤、錠剤、キャプレット、またはカプセル剤のような共製剤の組み合わせ投与形態における、グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）に対する本発明の流体の重量／重量比は、約１、即ち、ほぼ等量の本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）であり得る。他の例示的な共製剤では、より多いか、または少ない本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）が存在し得る。１つの実施形態では、各化合物は、単独で使用される場合に抗炎症活性を示す量で組み合わせて利用され得る。前記組み合わせの化合物の他の比および量は、本発明の範囲内で企図される。
【０１４６】
単位投与形態は、本発明の流体および、例えば、グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）、またはこれらのうちのいずれかの生理学的に機能的な誘導体、ならびに医薬的に許容可能な担体を更に含み得る。
【０１４７】
治療で使用するのに必要とされる本発明の組み合わせ中の活性成分の量は、治療されている状態の性質、ならびに患者の年齢および状態を含む、様々な要因に従って変化し、最終的には、主治医または健康管理者の自由裁量であることが、当業者には、認識されよう。考慮されるべき要因としては、投与経路および製剤の性質、動物の体重、年齢および全身状態、ならびに治療されるべき疾患の性質および重症度が挙げられる。
【０１４８】
同時投与または順次投与のための単位投与形態にある任意の２つの活性成分と、第３の活性成分とを組み合わせることも可能である。３つの部分の組み合わせは、同時にまたは順次に投与され得る。順次投与される場合、組み合わせは、２つまたは３つの投与物で投与され得る。ある実施形態によれば、本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）の３つの部分の組み合わせは、任意の順序で投与され得る。
【０１４９】
特定の態様に従って、本発明の界面動電的に改変された流体は、本明細書に開示される表示の例示的な属を含むがこれに限定されない、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ媒介状態を治療するための実質的な有用性を有する。さらなる態様によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、例示的な属の様々な亜属を治療するための有用性を有し、属の少なくとも１つの表示は、亜属のそれぞれから除外される。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
（本発明の界面動電的に改変された流体およびアルブテロールの相乗効果を示した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、ヒト気管支収縮（ヒト喘息モデル）の当該技術分野において認識されている動物モデルにおいて、生体内でアルブテロールを用いて、相乗延長効果（例えば、気管支収縮の抑制）を提供し、したがって、患者のアルブテロール使用量の減少を提供する。本実施例において開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０１５１】
第１の実験。第１の実験において、メタコリン誘発された気管収縮と共に気道機能における気管支拡張剤の効果について、１６匹のモルモットを評価した。最適用量の決定後、各動物は、１動物あたり２５０μＬにおいて、標的用量の１２．５μｇの硫酸アルブテロールを送達するように、５０μｇ／ｍＬで投薬された。試験は、体重およびベースラインＰｅｎＨ値に対して無作為化ブロック設計であった。２つの群（ＡおよびＢ）には、１つまたは２つの希釈剤中の５０μｇ／ｍＬ硫酸アルブテロールの２５０μＬの気道内注入を与えた：Ａ群は、酸素を添加せずに、本発明のデバイスを通過させた脱イオン水であり、一方、Ｂ群は、本発明のガス富化水であった。各群は、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏ  ｓｐｒａｙｅｒを用いて、溶液と共に気管内に投薬された。加えて、動物は、各治療群がプレチスモグラフおよび記録ユニットを供給するネブライザー内で均一に示されるように、ＢＵＸＣＯプレチスモグラフユニットにわたって階層化された。アルブテロールを投与してから２時間後、それらのベースラインＰｅｎＨ値の少なくとも７５％を示した動物は、データ分析には含まれなかった。この除外基準は、気管支拡張剤を用いた気管支保護を観察するための欠陥が、投与エラーと関連し得る過去の試験に基づく。結果として、対照群から１匹の動物が、データ分析から除外された。動物は、５０％超の気管支収縮があると、動物は、保護されていないと見なされた。Ｂ群の動物のうちの５０％は、１０時間まで（試験が終了する時点）、気管支収縮から保護された。
【０１５２】
第２の実験。オスのモルモットにおける、硫酸アルブテロールの単独投与、または希釈剤として投与する際、メタコリン誘発された気管支収縮に対する本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）の保護効果を評価するために、大量の動物を用いて、追加の一連の実験を行った。
【０１５３】
材料および方法。モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）からのハートレー系アルビノ、Ｃｒｌ：（ＨＡ）ＢＲであった。体重：処置の開始時で、約３２５±５０ｇ。群数は、１群あたり７匹のオス動物を有する、３２匹であった（加えて、２４匹の予備が、動物の同一バッチを形成する）。食事；全ての動物は、指定された処置時を除いては、標準の認定されたペレット式の市販の実験食（ＰＭＩ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  ５０２６；ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）を自由に摂食させた。投与経路は、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを介した気道内注入および全身吸入を介したメタコリン刺激であった。気管内経路は、試験物質／対照溶液への肺暴露を最大限にするように選択された。全身吸入刺激は、上気道過敏性反応（即ち、気管支収縮）を引き起こすために、メタコリン刺激に対して選択されている。処置の継続は、１日であった。
【０１５４】
実験設計。全ての動物は、ＴＡ／対照投与してから２時間後、メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）の吸入暴露を行った。全ての動物は、２５０μＬの用量容量を受容した。したがって、硫酸アルブテロールは、（対照物質および４つの試験物質において）０、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬの濃度まで希釈された。投薬する３０分前、４つの異なる濃度（０、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬ）の硫酸アルブテロール溶液は、これらの４つの試験物質溶液（ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）のそれぞれにおいて、ｌ  Ｏｘストック（５００μｇ／ｍＬ）中で作製された。これらの濃度の硫酸アルブテロールはまた、非界面動電的に生成された対照流体（対照１）中でも作製された。投与溶液は、適切な希釈の各ストック溶液を作製することにより調製された。全てのストックおよび投与溶液は、調製されるとすぐに、氷上で維持した。試験／対照物質を作製してから１時間以内に、投与を完了した。メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）の溶液は、投与日に調製した。
【０１５５】
各動物に、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを用いて、試験または対照物質の気道内注入を行った。動物は、一晩絶食させ、イソフルレンを用いて麻酔をかけ、喉頭を、喉頭鏡（または好適な代替物）下で可視化し、マイクロ噴霧器（ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ）の先端を気管に挿入した。試験物質または対照物質の用量容量の２５０μＬ／動物を投与した。メタコリンエアロゾルは、Ｂｕｘｃｏバイアス流動ポンプからの空気が供給されたエアロネブ超音波ネブライザーを用いて、混合チャンバの空気吸入口に生成された。同様に、この混合チャンバは、４つの個々の全身無拘束プレチスモグラフを供給し、わずかに負圧下で動作されたそれぞれは、排気ラインに位置する仕切り弁によって維持した。真空ポンプを使用して、必要とされる流速で、吸入チャンバを排出した。
【０１５６】
試験の主相を開始する前に、１２匹の予備動物を、３つの群（ｎ＝４／群）に割り付けて、動物が、重症であるが、非致命的急性気管支収縮を誘発するようにメタコリンに暴露され得る、最大暴露期間を決定した。４匹の動物は、３０秒間、メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）に暴露され、エアロゾルを開始してから１０分後まで、呼吸パラメータを測定した。メタコリンネブライザー濃度および／またはエアロゾル化の暴露時間は、Ｐｅｎｈの一過性増加を特徴とするように、重症であるが、非致命的急性／可逆性気管支収縮を誘発するように適切に調整された。
【０１５７】
試験物質投与前（１日目）、また、投薬してから２、６、１０、１４、１８、２２、および２６時間後の時点で、動物をチャンバ内に入れ、メタコリンへのエアロゾル刺激の開始後、換気パラメータ（１回換気量、呼吸速度、誘導分時排出量）およびｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ  Ｐｅｎｈを、Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  ＸＡシステムを用いて、１０分間測定した。動物がチャンバ内にいる時点で、ベースラインの値は、１分間記録され、次いで、メタコリンネブライザー濃度の５００μｇ／ｍＬを、３０秒間、エアロゾル化し、動物は、換気パラメータを連続的に評価した際、更に１０分間、エアロゾルに暴露された。Ｐｅｎｈは、気管支収縮の指標として使用され、Ｐｅｎｈは、ピーク吸気流、ピーク呼気流、および呼気時間から得られた誘導値である。Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流／ピーク吸気流）＊（呼気時間／呼気容量の６５％を呼気するため時間−１）。
【０１５８】
メタコリン刺激の事前投与時、重症の急性気管支収縮を示さなかった動物は、差し替えられた。投与してから２時間後、それらのベースラインＰｅｎｈＰｅｎｅｓ値の少なくとも７５％を示す、どの動物も、データ分析には含まれなかった。呼吸パラメータは、２０秒法として記録された。非生理的であると見なされたデータは、更に分析から除外された。Ｐｅｎｈの変化は、１５分間にわたりプロットされ、Ｐｅｎｈ値は、濃度曲線下面積として表された。数値データは、群平均値および標準偏差（規定通りに）の算出がなされた。
【０１５９】
結果。本実験からの結果は、アルブテロールの不在下で、本発明の界面動電的に生成された流体の投与は、２６時間まで測定した際、ベースライン％平均のＰｅｎＨ値における明らかな効果がなかったことを示した。しかしながら、驚いたことには、本発明の界面動電的に生成された流体中で製剤化されたアルブテロールの投与（２５μｇのアルブテロール／動物群に対して代表的なデータを示す）（試験した全ての酸素レベルで；周囲、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍ）は、対照流体と比較して、アルブテロールの抗気管支収縮作用の顕著な延長を生じた。つまり、メタコリンの結果は、少なくとも２６時間で、アルブテロールの気管支拡張の延長を示した。出願者はまた、ＲＤＣ１６７６と生理食塩水対照との間の全ての酸素レベルで一貫した差異があったことを示した。全て４つのＲＤＣ１６７６流体を合成すると、全処置と生理食塩水との差異であるｐ値は、０．０３であった。
【０１６０】
したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された溶液は、アルブテロールとの相乗的延長作用を提供し、故に、患者のアルブテロール使用量の軽減を提供し、更に効率的な費用効率が高い薬物使用、より少ない副作用を可能にし、かつ患者が治療され、アルブテロールによる治療に反応し得る期間を増大させる。
【０１６１】
実施例２
（サイトカイン発現に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を示した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、対照流体と比較して、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣ  クラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、ならびにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）の産生を低下させ、対照流体と比較して、抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰ）を増加させた。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０１６２】
特定の態様では、ヒト混合リンパ球は、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ酸素富化流体または対照流体中のＴ３抗原またはＰＨＡで刺激し、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｂ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−ａ、ＲＡＮＴＥＳ、レプチン、ＴＮＦ−β、ＴＦＧ−β、およびＮＧＦの変化を評価した。示されるように、試験した、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣ  クラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、ならびにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）は、試験流体対対照流体において、減少した。対照的に、試験した抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−ａ、ＴＩＭＰ）は、試験流体対対照流体において、増加した。
【０１６３】
さらに、出願者は、アレルギー性超過敏反応を評価するために、オボアルブミン感作を含む、当該技術分野において認識されているモデル系を使用した。研究されたエンドポイントは、反応の特定の細胞学的成分および細胞成分、ならびにタンパク質およびＬＤＨの血清学測定であった。エオタキシン、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１Ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−Ａ、およびＶＣＡＭの分析を含む、サイトカイン分析を行った。
【０１６４】
簡潔に述べると、オスのＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットに、１日目、２日目、および３日目のそれぞれで１回、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）（２００ｍｇ／ｍＬ）を含有する溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）中で０．５ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）グレードＶ（Ａ５５０３−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。研究は、２×２要因配置無作為化（４群）の処置であった。免疫反応を生じさせるまでの２週間の待機期間後、ラットは、暴露されるか、あるいは、ＲＤＣ１６７６−００（Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ社独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水）、あるいはＲＤＣ１６７６−０１（更に添加された酸素を用いて、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ社独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水）のいずれかを用いて、１週間、処置された。１日１回の１週間の処置の終了時に、２つの群は、半分に分けられ、各群において、ラットの５０％は、吸入により食塩水あるいはＯＶＡ刺激のいずれかを受容した。
【０１６５】
具体的には、初期シリアル化してから１４日後、１２匹のラットを、連続７日間、毎日３０分間、吸入によりＲＤＣ１６７６−００に暴露した。システムを通る気流速度を、１０リットル／分で設定した。計１２匹のラットを、噴霧物質をエアロネブの１２のサブチャンバに入れ、均一に分布させる単一ポートを有する、パイチャンバ中に整列させた。
【０１６６】
初期シリアル化してから１５日後、１２匹のラットを、連続７日間、毎日３０分間、超音波噴霧によりＲＤＣ１６７６−０１に暴した。気流はまた、１０リットル／分で設定され、同一のネブライザーおよびチャンバを使用した。第１に、ＲＤＣ１６７６−００を噴霧し、ＲＤＣ１６７６−０１を噴霧する前に、エアロネブチャンバを完全に乾燥させた。
【０１６７】
最終の噴霧処置をしてから約２時間後、ＲＤＣ１６７６−００群からの６匹のラットを、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（モデル１Ａ−１Ｂ）を用いて、気管内注入により送達されるＯＶＡ（食塩水中１％）で、再刺激した。ＲＤＣ１６７６−００群からの他の６匹のラットを、気管内注入により送達される対照群として食塩水で刺激した。翌日、手順をＲＤＣ１６７６−０１群で繰り返した。
【０１６８】
再刺激してから２４時間後、各群において全てのラットは、ペントバルビタールナトリウムを過剰摂取させることにより安楽死させた。全血サンプルは、下大静脈から採血し、２つの別個の採血管のＱｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  ＴｕｂｅおよびＱｉａｇｅｎ  ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｔｕｂｅに入れた。このモデルにおいて、肺の炎症と関連することで既知のサイトカイン発現のマーカーの変化を評価するために、肺の臓器を処置して、ＲＴ−ＰＣＲのための気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体および肺組織を得た。肺の右側上の４つの肺葉の整合性を保つために、片側洗浄技術を採用した。左「大」葉を洗浄し、一方、４つの右葉は、縛られ、ＴＲＩ−ｚｏｌ（登録商標）を直ちに入れられ、均質化され、更なる処置のために実験室に送られた。
【０１６９】
ＢＡＬ分析。肺洗浄物を、収集し、細胞を沈殿させるために、４℃で、６００〜８００ｇで、１０分間遠心分離を行った。浮遊物を、新しい管に移し、−８０℃で冷凍させた。気管支洗浄液（「ＢＡＬ」）を、２つのアリコートに分取した。第１のアリコートを沈降させ、浮遊物を破砕したドライアイス上で急冷凍し、−８０℃中に入れ、更なる処置のために実験室に出荷した。存在するタンパク質およびＬＤＨの量は、それぞれ、血清タンパク質のレベル（タンパク質は、本実験等の場合、刺激される際、膜を漏出する血清成分である）および細胞死を示す。独自の試験側は、対照物よりもわずかに少ないタンパク質を示した。
【０１７０】
気管支洗浄液の第２のアリコートは、総タンパク質およびＬＤＨ含有量について評価し、細胞学的検査に供された。処置群は、総細胞が、食塩水対照群よりも多いことを示した。更に、対照群に対して処置群において、好酸球の増加があった。対照群に対して処置群において、わずかに異なる多形核球細胞もあった。
【０１７１】
血液分析。１つの管に１．２〜２．０ｍＬの血液を移すことにより、全血を分析し、少なくとも３０分間、血液を凝固させた。残りの血液サンプル（約３．５〜５．０ｍＬ）は、ＴＲＩ−ｚｏｌ（登録商標）またはＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）を用いて、ＲＮＡ抽出のために保存した。次に、凝固させた血液サンプルを、室温で、１２００ｇで、１０分間、遠心分離を行った。血清（浮遊物）を除去し、２つの新しい管に入れ、血清を−８０℃で保存した。
【０１７２】
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢ−１２６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用するＲＮＡ抽出に関しては、０．２ｍＬの全血または血漿あたり２０μＬの５Ｎ酢酸が補完される、０．７５ｍＬのＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＢＤに、０．２ｍＬの全血または血漿を添加した。管を振盪し、−８０℃で保存した。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）を利用して、管を、約２時間、室温でインキュベートした。次いで、管をそれらの側に置き、−２０℃の冷凍庫で２４時間保存し、次いで、長期保存のため、−８０℃へ移動させた。
【０１７３】
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにより、マイクロビーズ分析は、抗体関連の結合反応に対する基質として利用され、これは、光度ユニットにおいて、読み出され、定量化標準と比較することができる。各血液サンプルは、２つのサンプルとして同時に検査した。測定ユニットは、光度ユニットであり、群は、ＯＶＡ刺激された対照群、ＯＶＡ刺激された処置群、および食塩水刺激された独自の流体による処置群に分けられた。
【０１７４】
アジレント遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ試薬（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）中に浸水した。簡潔に述べると、約１ｍＬのＴＲＩ試薬を、各管中の５０〜１００ｍｇの組織に添加した。サンプルは、ガラス製Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ試薬中で均質化された。サンプルは、−８０℃で保存した。
【０１７５】
血液サンプルからの結果。各血液サンプルは、２つのサンプルに分けられ、サンプルは、同時に検査した。測定のユニットは、光度のユニットおよび群であり、左から右に向かって、ＯＶＡ刺激された対照、ＯＶＡ刺激されたＲｅｖａｌｅｓｉｏ処置、次いで、食塩水刺激された処置、および食塩水刺激されたＲｅｖａｌｅｓｉｏ処置である。概説を容易にするために、ＲＤＣ１６７６−０１群は共に、グレー影付き背景で強調表示され、一方、食塩水対照処置群は、影なし背景である。
【０１７６】
概して、２つの左の群と比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群データの広がりは、若干大きく、一方、全体として、ＲＤＣ１６７６−０１群の特定のサイトカインレベルは、対照処置群のサンプルよりも小さく、一般に、２群間での約３０％の数値の差異がある。概して、最右の２つの群を比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群は、ＲＤＣ１６７６−００群と比較して、わずかに高い数値を有する。
【０１７７】
出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＲＡＮＴＥＳ（ＩＬ−８スーパーファミリー）のレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったと判定した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、食塩水のみで暴露された群により産生されたものと比較して、ＭＣＰ−１をより低いレベルで産生させたことを示した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＴＮＦαのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったと判定した。
【０１７８】
さらに、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＭＩＰ−１αのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったことを示した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、食塩水のみで暴露された群により産生されたものと比較して、ＩＬ−１αをより低いレベルで産生させたことを示した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＶｃａｍのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったことを観察した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＩＬ−１βのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったことを観察した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、食塩水のみで暴露された群により産生されたものと比較して、エオタキシンおよびＭＣＰ−３をより低いレベルで産生させたことを示した。
【０１７９】
要約すると、既知の感作に対する炎症反応のこの標準アッセイは、少なくとも血液サンプルにおいて、著しい臨床的かつ血清学的作用を生じた。加えて、著しい数の対照動物が、プロセスにおいて、生理学的にストレスを感じ、危うく死亡するところであったが、ＲＤＣ１６７６−０１処置群のいずれも、このような臨床的なストレス効果を示さなかった。次いで、これは、ＲＤＣ１６７６−０１処置群と、ＯＶＡ刺激群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群との間で約３０％の差異を有する、サイトカインの血中濃度において、反映された。対照的に、ＲＤＣ１６７６−０１処置群と、ＯＶＡ無刺激群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群との間でのサイトカイン、細胞、および血清学的プロファイルの小量、かつごくわずかな変化があり、これは、流体自体の最小限のベースラインの変化を単に示すと考えられる。
【０１８０】
実施例３
（Ｔ細胞増殖を調節するための本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、比較的に低下した増殖により示されるように、制御性Ｔ細胞機能を改善した。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０１８１】
Ｔ細胞を制御するための本明細書に開示される特定の実施形態の能力を、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することにより研究した。一般に、これらの刺激を受けたＴ細胞は増殖する。しかしながら、制御性Ｔ細胞の導入において、通常のＴ細胞増殖は、抑制される。
【０１８２】
方法。簡潔に述べると、選別に使用されるＦＩＴＣ共役型抗ＣＤ２５（ＡＣＴ−１）抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。使用した他の抗体は、以下の通りであった。ＣＤ３（可溶条件に対してＨＩＴ３ａ）、ＧＩＴＲ（ＰＥ共役型）、ＣＤ４（Ｃｙ−５およびＦＩＴＣ共役型）、ＣＤ２５（ＡＰＣ共役型）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ａ（ＰＥ共役型）、ＦｏｘＰ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇＧ１（イソタイプ制御）、およびＸＣＬ１抗体。全ての抗体は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【０１８３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｒｏｓｅｔｔｅキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、末梢全血から単離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、および抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体でインキュベートした。細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ｎＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５反応性Ｔ細胞にＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、フローサイトメトリーにより選別された。
【０１８４】
丸底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、抑制アッセイを行った。指示されたように、３．７５×１０３  ＣＤ４＋ＣＤ２５陰性反応性Ｔ細胞、３．７５×１０３  自己Ｔ制御性、３．７５×１０４  同種照射ＣＤ３減損ＰＢＭＣを添加した。全てのウェルは、抗ＣＤ３（５．０ｕｇ／ｍＬで、クローンＨＩＴ３ａ）で補完した。Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清で補完したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、３７℃で、７日間、培養された。インキュベーションが終了する１６時間前、１．０ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを、各ウェルに添加した。プレートは、Ｔｏｍｔｅｃ細胞ハーベスターを用いて収穫し、３Ｈ−チミジン組み込みは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒシンチレーションカウンターを用いて決定した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＳｔｅｍＳｅｐヒトＣＤ３＋Ｔ細胞枯渇（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、次いで、４０Ｇｙの照射を用いて、Ｔ細胞から枯渇した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなった。
【０１８５】
制御性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８条件で刺激を受け、次いで、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｒｅｄ生存能の染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに表面マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７で染色した。細胞は、Ｌｙｚｅ／Ｆｉｘ  ＰｈｏｓＦｌｏｗ（登録商標）緩衝液中で固定し、変性Ｐｅｒｍｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（登録商標）中で透過した。次いで、細胞をそれぞれの特定の選択された分子に対して抗体で染色した。
【０１８６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、統計的分析を行った。両側不対スチューデントｔ検定を使用することにより２群間の比較を行った。１方向ＡＮＯＶＡを使用することにより３群間の比較を行った。０．０５未満のＰ値が、有意であると見なされた（両側）。２群間の相関は、ｒ値が、０．７を上回るか、または−０．７未満である場合、スピアマン係数を介して統計的に有意であることを決定した（両側）。
【０１８７】
結果。制御性Ｔ細胞の増殖は、ディーゼル排出微粒子状物質（ＥＰＡからのＰＭ）で細胞を刺激することにより研究された。出願者は、ＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）で刺激された細胞が分泌されたＩＬ−１０の低下を生じた一方で、本開示の流体の存在下で、ＰＭに曝露される細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された産生またはわずかに低下した産生を生じたと判定した。更に、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、先端ジフテリア毒素分子；標準市販濃度の１：５０の希釈）を、本発明の流体サンプルに滴定し、ＩＬ−１０の増加のＲｅｖ媒介された効果を遮断した。Ｒｅｖのみによる処置が、食塩水および培地対照と比較して、より高いＩＬ−１０レベルを生じたことに留意されたい。同様の結果を、それぞれ、ＧＩＴＲ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ａ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、およびＦｏｘｐ３で得た。
【０１８８】
出願者はまた、トリプターゼを評価する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）から得られる、ＡＡ  ＰＢＭＣデータを得た。ＡＡ  ＰＢＭＣデータは、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された細胞が、高レベルのトリプターゼを示した際、上記のＴ制御性細胞データと一致したが、一方、本開示の流体の存在下で、ＰＭによる処置した細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照のものと同様に有意に低いトリプターゼレベルを生じた。Ｔ制御性細胞からのデータと一致して、ＤＴ３９０への暴露は、トリプターゼレベルにおけるＲｅｖ媒介効果を遮断し、ＰＭのみ（−Ｒｅｖ、Ｒｅｖなし、Ｓｏｌａｓなし）に見られたように、細胞中に上昇したレベルのトリプターゼを生じた。Ｒｅｖのみによる処置は、食塩水および培地対照と比較してより低いトリプターゼレベルを生じた。
【０１８９】
要約すると、出願者は、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌａｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、増殖の低下を観察し、アッセイにおいて、比較的に低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖが、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示す。更に、証拠は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断がＴｒｅｇ機能におけるＲｅｖｅｒａの活性に影響を及ぼすことを示す。
【０１９０】
実施例４
（本発明の界面動電的に改変された流体とブデソニドとの間の相乗効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、アレルギー喘息に対する当該技術分野において認識されている動物モデルにおいて、インビボでブデソニドを用いて、相乗抗炎症効果を提供した。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０１９１】
出願者は、最初に、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットオボアルブミン感作モデルにおいて、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ−１６７６−０３）の気道抗炎症特性を評価するために実験を行った。Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは、気道機能における試験材料の効果を決定するための当該技術分野において認識されているモデルであり、この系統は、例えば、アレルギー喘息のモデルとして幅広く使用されている。このモデルにおいてオボアルブミン感作により誘発された気道病変および生化学的変化は、ヒトに観察されたものと類似している（Ｅｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ８８：９５１−６０，１９９１、Ｓｉｒｏｉｓ  ＆  Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２６：９−１５，２００１）。吸入経路は、試験材料または対照溶液への肺暴露を最大限にするように選択された。オボアルブミン感作動物は、オボアルブミン刺激する前の７日間、ブデソニド単独で、または試験材料ＲＤＣ  １６７６−０３と組み合わせて、処置された。刺激してから６時間および２４時間後、全血数ならびに幾つかの炎症性および抗炎症サイトカインのレベル、ならびに様々な呼吸パラメータを測定して、様々な炎症性パラメータにおける試験材料を投与する任意の有益な効果を推定した。
【０１９２】
材料および方法：
実験の開始時で、約２７５±５０ｇの体重がある、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットの系統Ｂｎ／Ｃｒｌを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｋｉｎｇｓｔｏｎから取得した。全ての動物研究は、ＰＣＳ−ＭＴＬ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を得て行われた。研究時、動物の使用およびケアは、ＵＳＡ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｕｎｃｉｌならびにＣａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅのガイドラインに従って行われた。
【０１９３】
感作。実験の１日目に、動物（各処置群において１４匹の動物）は、１ｍＬの０．９％  塩化ナトリウムあたり２ｍｇ  オボアルブミン／１００ｍｇ  水酸化アルミニウムの新しく調製された溶液の１ｍＬの腹腔内注射の投与により感作され、次いで、３日目に注射を繰り返した。
【０１９４】
処置。処置初期感作から１５日後、動物に、対照（生理食塩水）または試験溶液（界面動電的に生成された流体ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ−１６７６−０３）への噴霧暴露を施し、連続７日間、１日１回１５分間、単独で、またはブデソニドと組み合わせて投与した。動物は、約２０Ｌの全身チャンバ中で投薬され、試験環境は、Ｂｕｘｃｏバイアス流動ポンプからの空気が供給されたエアロネブ超音波ネブライザーを用いて、チャンバの空気入口に生成された。気流速度は、１０リットル／分で設定された。
【０１９５】
オボアルブミン刺激。２１日目に、試験溶液で処置してから２時間後、全ての動物は、１％  オボアルブミン噴霧溶液で、１５分間、刺激された（気流２Ｌ／分で全身チャンバ中）。
【０１９６】
サンプル収集。オボアルブミン刺激してから６および２４時間の時点で、血液サンプルは、全および差動血液細胞数、ならびに様々な炎症性および抗炎症サイトカインのレベルを測定するために、採血された。加えて、オボアルブミン刺激してから６および２４時間直後、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ  Ｐｅｎｈおよび１回換気量を、Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  ＸＡシステムを用いて、１０分間測定した。
【０１９７】
結果：
好酸球数：予想されるように、ブデソニドによる処置（「ＮＳ＋ブデソニド７５０μｇ／Ｋｇ」；細かい斜線の棒グラフ）は、生理食塩水「ＮＳ」単独での対照による処置と比較して、刺激された動物における全好酸球数を低下させた。追加として、本発明の流体「ＲＤＣ１６７６−０３」単独による処置は、好酸球数を有意に低下させなかったが、それでもなお、好酸球数を低下させる際、ブデソニドとの実質的な相乗効果（「ＲＤＣ１６７６−０３＋ブデソニド７５０μｇ／Ｋｇ」）を示した。同様に、好酸球率はまた、同様の傾向を示した。ＲＤＣ１６７６−０３またはブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇ単独では、刺激された動物において、好酸球率において有意な効果を有さなかったが、組み合わせた２つは、好酸球率を有意に低下させた。
【０１９８】
したがって、出願者は、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−０３）は、ヒトアレルギー喘息に対する当該分野において認識されているラットモデルにおいて、好酸球数（「好酸球率」および全数）を有意に低下させるように、ブデソニドと組み合わせて、実質的な相乗的有用性を有すると判定した。
【０１９９】
呼吸パラメータ：
出願者はまた、オボアルブミン刺激から６および２４時間後、直後に測定されるように、Ｐｅｎｈおよび１回換気量における試験流体の観察された効果を示した。Ｐｅｎｈは、ピーク吸気流、ピーク呼気流、および呼気時間から得られた誘導値であり、ｐｅｎｈ値の低下は、肺機能の有益な結果を反映する。
【０２００】
Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流／ピーク吸気流）＊（呼気時間／呼気容量の６５％を呼気するため時間−１）。
【０２０１】
ブデソニド（５００および７５０ｕｇ／ｋｇの双方で）単独での、または試験流体のいずれかとの組み合わせによる処置は、刺激直後のＰｅｎｈ値に有意に影響を及ぼさなかった。しかしながら、刺激から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独での、またはブデソニド５００もしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせによる処置を行った動物は、Ｐｅｎｈ値の大幅な低下を示した。この低下の範囲は、刺激してから２４時間後には消失したが、ブデソニドおよびＲＤＣ流体の相乗効果の傾向は、この時点で更に観察された。
【０２０２】
１回換気量は、呼気終末位から吸気中の肺に吸い込まれる空気容量であり、これは、安静呼吸の間の呼気中、受動的に肺を排気される。ブデソニド単独により処置される動物は、刺激直後、１回換気量の変化がないことを示した。しかしながら、ＲＤＣ１６７６−０３単独では、この初期時点でさえ、１回換気量における有意な促進効果があった。さらに、ブデソニド（５００および７５０ｕｇ／ｋｇの双方）と組み合わせたＲＤＣ１６７６−０３は、この時点で、１回換気量の測定における更になお顕著な効果があった。刺激から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独では、１回換気量の有意な増加を生じるのに十分であり、単独で、または組み合わせた、治療レジメンへのブデソニドの添加は、１回換気量における更なる効果がなかった。しかしながら、これらの早期時点で観察された任意の効果は、２４時間の時点までに消失した。
【０２０３】
総合すれば、刺激してから６時間後、１回換気量の増加およびＰｅｎｈ値の低下により証明されるように、これらのデータは、ＲＤＣ１６７６−０３単独で、またはブデソニドと組み合わせて、気道炎症の著しい緩和を提供したことを示す。
【０２０４】
サイトカイン分析：
上記で論じられた生理学的パラメータに見られる効果の機構を分析するために、多数の炎症性ならびに抗炎症サイトカインは、刺激してから６および２４時間後、次いで、生理学的測定の直後、採血された血液サンプルにおいて測定された。
【０２０５】
出願者は、Ｒｅｖ  ６０（またはＲＤＣ１６７６−０３）単独では、刺激してから６および２４時間後の双方で、有意にエオタキシンの血液レベルを低下させたことを観察した。ブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇはまた、これらの時点の双方で、血液エオタキシンレベルを軽減したが、一方、ブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇ単独は、後の時点で、顕著な効果があった。しかしながら、試験溶液Ｒｅｖ  ６０単独では、双方の時点で、ブデソニドの双方の濃度よりも更に著しく強力な（血液エオタキシンレベルを低下させる際）効果を示した。エオタキシンは、喘息の肺およびアレルギー反応における他の組織（例えば、クローン病の腸）に好酸球を蓄積し、かつ好酸球を誘引することで知られている、小量のＣ−Ｃケモカインである。エオタキシンは、Ｇタンパク質共役型受容体ＣＣＲ３に結合する。ＣＣＲ３は、Ｔｈ２リンパ球、好塩基球およびマスト細胞等の多くの細胞型により発現されるが、Ｔｈ２リンパ球によるこの受容体の発現は、これらの細胞が、好酸球動員を調節する際、特定の対象となる。幾つかの研究は、喘息肺における、エオタキシンおよびＣＣＲ３の産生増加、ならびにこれらの分子と気道過敏性との間の関連を構築することを示している（Ｅｏｔａｘｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｌｕｎｇ，Ｄｏｌｏｒｅｓ  Ｍ  Ｃｏｎｒｏｙ  ａｎｄ  Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｊ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１，２：１５０−１５６において総説）。
【０２０６】
総合すれば、これらの結果は、ＲＤＣ１６７６−０３単独での、またはブデソニドと組み合わせた処置が、オボアルブミン刺激から２４時間後、総好酸球数および血中濃度を著しく低下させることができることを強く示唆する。これは、刺激してから早ければ６時間後に観察された、血液中のエオタキシンレベルの大幅な低下と相関する。
【０２０７】
２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンγの血液レベルはまた、Ｒｅｖ  ６０単独での、またはブデソニドと組み合わせた処置の結果として、刺激してから６時間後に、著しく増強される。出願者は、インターフェロンγおよびＩＬ１０における効果を、それぞれ観察した。Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせたＲｅｖ６０は、刺激してから最長６時間、刺激された動物において、ＩＬ１０の血液レベルを著しく増加させた。同様に、Ｒｅｖ  ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇもしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせたＲｅｖ  ６０は、刺激してから６時間後、ＩＦＮγの血液レベルを著しく増加させた。これらの抗炎症サイトカインの増加は、刺激してから６時間後に見られる、生理学的呼吸パラメータに見られる有益な効果を、少なくともある程度、十分に説明し得る。これらのサイトカインにおける効果は、刺激してから２４時間後、もはや観察されなかった（データは示さず）。
【０２０８】
ＲａｎｔｅｓまたはＣＣＬ５は、循環型Ｔ細胞により発現したサイトカインであり、Ｔ細胞、好酸球および好塩基球に対して走化性であり、炎症性部位に白血球を動員するのに積極的な役割を果たす。Ｒａｎｔｅｓはまた、例えば、好酸球カチオン性タンパク質を放出する好酸球を活性化する。好酸球の密度を変化させ、好酸球を低濃度にし、これは、一般的な細胞活性化の状態を示すと考えられる。Ｒａｎｔｅｓはまた、好酸球に対して特異的な酸化的代謝の強力な活性剤でもある。
【０２０９】
出願者は、Ｒａｎｔｅｓの全身レベルは、Ｒｅｖ  ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇもしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせて処置された動物において、刺激してから６時間後、著しく低下したが、２４時間後は、低下しなかったことを観察した。前と同様に、ブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇおよびＲｅｖ  ６０の明らかな相乗効果があった。同様の下方傾向は、ＫＣまたはＩＬ８、ＭＣＰ３、ＩＬ１ｂ、ＧＣＳＦ、ＴＧＦｂ、ならびにＮＧＦ等の多くの他の炎症性サイトカインにおいて観察され、Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニドと組み合わせて処置された動物において、刺激してから６時間後、あるいは２４時間後のいずれかで観察された。
【０２１０】
実施例５
（細胞間密着結合に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞間密着結合を調節することが示された。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０２１１】
特定の態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、細胞間密着結合を調節するための実質的な有用性を有し、これには、肺および全身送達と関連するもの、ならびに例示的なポリペプチドサケカルシトニン（ｓＣＴ）を含む、ポリペプチドのバイオアベイラビリティが挙げられる。
【０２１２】
実施例の要約。サケカルシトニン（ｓＣＴ）は、３，４３２ダルトンの分子量を有する、３２個のアミノ酸ペプチドである。カルシトニンの肺送達は、モデル系（例えば、げっ歯類モデル系、ラットモデル系等）において、肺薬物送達（例えば、気管内薬物送達）を強化するための方法を調査するために、広範囲にわたって研究されている。特定の例示的な態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、細胞間密着結合、例えば、ラットモデル系において、肺および全身送達と関連するもの、ならびにｓＣＴのバイオアベイラビリティを調節する（例えば、強化する）ために実質的な有用性を有する。
【０２１３】
方法：
気管内薬物送達。特定の実施形態によれば、ｓＣＴは、本発明の治療流体中で製剤化され、気管内薬物送達デバイスを用いて、ラットに投与される。ある態様では、げっ歯類気管内薬物送達のために設計されたＰｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｒａｙｅｒデバイスを使用して、良好な肺送達を可能にさせるが、当該技術分野において理解されるように、ペプチドの不良な全身バイオアベイラビリティをもたらす比較的低い肺胞沈着がある。特定の態様によれば、この当該分野において認識されているモデル系を使用して、本発明の拡散処理した治療流体が、細胞間密着結合（肺および全身送達と関連するもの、ならびにポリペプチドのバイオアベイラビリティを含む）を調節する（例えば、強化する）ために実質的な有用性を有することを確認した。
【０２１４】
動物群および用量。ある態様では、ラットは、以下の３つの群のうちの１つに割り付けられる（１群あたりｎ＝６）：ａ）滅菌食塩水、ｂ）Ｏ２富化しない基礎液（「基礎液」）、またはｃ）本発明の拡散処理された治療流体（「本発明の富化ベースの溶液」）。本発明の富化ベースの溶液は、例えば、０．９％  食塩水中で酸素を注入することにより形成される。好ましくは、基礎液は、上皮細胞の低浸透圧崩壊の可能性を最小化するように、約０．９％  食塩水を含む。ある実施形態では、ｓＣＴは、基礎液および本発明の富化ベースの溶液において、別々に再構成され、６０分以内で、それぞれの動物群に気道内注入により送達される（１動物あたり２００μＬ中の１０μｇ  ｓＣＴ）。
【０２１５】
アッセイ。特定の態様では、血液サンプル（例えば、２００μＬ）を採取し、投薬する前、ならびに投薬してから５、１０、２０、３０、６０、１２０、および２４０分後、ＥＤＴＡコーティングされた管に挿入する。血漿を、収穫し、ＥＬＩＳＡを用いて、ｓＣＴのアッセイを行うまで、−７０℃以下で保存した。
【０２１６】
アジレント遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ試薬（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）中に浸水した。簡潔に述べると、約１ｍＬのＴＲＩ試薬を、各管中の５０〜１００ｍｇの組織に添加した。サンプルは、ガラス製Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ試薬中で均質化された。サンプルは、−８０℃で保存した。
【０２１７】
結果：
密着結合の強化。出願者は、ＲＤＣ１６７６−０１（更に添加された酸素を用いて、本開示の独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水、本開示のガス富化界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））が、全身送達およびｓＣＴのバイオアベイラビリティを低下させたことを観察した。特定の態様によれば、全身送達の低下は、ｓＣＴの吸着の低下に由来し、肺密着結合の強化に由来する可能性が最も高い。ＲＤＣ１６７６−００は、本開示の方法に従って処理したが、酸素化されていない、滅菌食塩水を示す。
【０２１８】
追加として、特定の態様によれば、密着結合関連タンパク質は、肺組織中で上方調節された。出願者は、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４、および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）のそれぞれの上方調節を示した。
【０２１９】
実施例６
（全細胞伝導性に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において行われたパッチクランプ分析により示されるように、全細胞伝導性を減少させた。本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０）で灌流された気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において行われたパッチクランプ分析は、ＲＮＳ−６０への暴露が、全細胞伝導性の低下をもたらしたことを明らかにした。さらに、全細胞伝導性を劇的に増加させたｃＡＭＰ刺激「カクテル」での刺激はまた、全細胞伝導性の薬物感受性部分も増加させ、これは、基本条件下で観察されたものよりも１０倍高かった。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０２２０】
パッチクランプ研究を行い、膜構造、膜電位、または膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、ならびにカルシウム依存性細胞伝達システムのうちの少なくとも１つの調節により細胞内シグナル変換を調節するための本発明の界面動電的に生成された流体の有用性を更に確認した。
【０２２１】
要約。出願者は、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して、本開示の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ、ガス富化した界面動電的に生成された流体）で増加したことを示した。追加として、出願者は、微粒子状物質（ＰＭ）で刺激されたＴ制御性細胞の文脈において、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌａｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、Ｔ制御性細胞の増殖の低下があり、例えば、アッセイにおいて、比較的低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖは、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示した。更に、本発明の流体への暴露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された、または若干低下した産生を生じた。同様に、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイルの文脈において、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への暴露は、食塩水および培地対照のレベルと同様の有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことを示した。追加として、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０）効果は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断が、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能における界面動電的に生成された流体の活性に影響を及ぼすことを示す。更に、追加の態様によれば、出願者は、本発明の流体に暴露されると、密着結合関連タンパク質が、肺組織中で上方調節されたことを示した。出願者は、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４、および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）のそれぞれの上方調節を示した。パッチクランプ研究を行い、前記有用性を更に調査および確認した。
【０２２２】
材料および方法：
気管支上皮細胞株Ｃａｌｕ−３は、パッチクランプ研究に使用した。Ｃａｌｕ−３気管支上皮細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＨＴＢ−５５）は、実験する時まで、ガラス製のカバースリップ上に１０％  ＦＢＳで補完した、１：１のＨａｍ  Ｆ１２とＤＭＥＭ培地の混合物において、増殖させた。簡潔に述べると、全細胞電圧クランプデバイスを使用して、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水、場合によっては、「薬物」と称される）に暴露された、Ｃａｌｕ−３細胞における効果を測定した。
【０２２３】
パッチクランプ法を利用して、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性における試験材料（ＲＮＳ−６０）の効果を評価した。具体的には、全細胞電圧クランプは、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｎ−メチルＤ−グルカミンでｐＨを７．４まで調整）からなる浸液中で、気管支上皮細胞株Ｃａｌｕ−３上で行った。基礎電流は、ＲＮＳ−６０が細胞に灌流された後、測定された。
【０２２４】
更に具体的には、パッチピペットは、２段階のＮａｒｉｓｈｉｇｅ  ＰＢ−７  ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｐｕｌｌｅｒを用いて、ホウケイ酸ガラス（Ｇａｒｎｅｒ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き上げ、次いで、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＭＦ−９マイクロフォージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＵＳＡ，Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ，ＮＹ）を用いて、６〜１２メガオームの抵抗までファイヤーポリッシュされた。ピペットは、１３５  ＫＣｌ、１０  ＮａＣｌ、５  ＥＧＴＡ、１０  Ｈｅｐｅｓを含有する細胞内液（ｍＭ中）で充填され、ＮＭＤＧ（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）を用いてｐＨを７．４まで調整した。
【０２２５】
培養されたＣａｌｕ−３細胞は、以下の細胞外溶液（ｍＭ）：１３５  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１．２  ＣａＣｌ２、０．５  ＭｇＣｌ２、および１０  Ｈｅｐｅｓ（遊離酸）を含有する、チャンバ中に入れ、ＮＭＤＧを用いてｐＨを７．４まで調整した。
【０２２６】
細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の４０Ｘ  ＤＩＣ対物レンズを用いて見た。細胞接着型ギガシールを構築した後、軽度の吸引を適用して、全細胞構成に侵入し、全細胞構成を得た。侵入直後、細胞は、−１２０、−６０、−４０、および０ｍＶで電圧クランプされ、±１００ｍＶ間の電圧ステップ（５００ｍｓ／ステップ）で刺激された。対照条件下で、全細胞電流を収集した後、同一の細胞を、上記の対照流体と同一の細胞外溶質およびｐＨを含む、試験流体を用いて、浴槽を通して灌流し、異なる保持電位で全細胞電流を、同一のプロトコルを用いて記録した。
【０２２７】
電気生理学的データは、Ａｘｏｎ  Ｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器を用いて取得し、１０ｋＨｚで低域フィルタリングして、１４００Ａ  Ｄｉｇｉｄａｔａ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてデジタル化した。ｐＣＬＡＭＰ  １０．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、データを取得し、分析した。電流（Ｉ）−電圧（Ｖ）関係（全細胞伝導性）は、ステップに、約４００ミリ秒で実際の電流値、対保持電位（Ｖ）をプロットすることにより得た。Ｉ／Ｖ関係の傾きは、全細胞伝導性である。
【０２２８】
薬物および薬品。示される時にはいつでも、細胞は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（５００ｍＭ）、ＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン、２００ｍＭ）、およびホルスコリン（１０ｍＭ）を含有する、ｃＡＭＰ刺激カクテルで刺激された。Ｈ２Ｏ溶液中の２５ｍＭ  ストックからｃＡＭＰ類似体８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を使用した。１０ｍＭ  ホルスコリンおよび２００ｍＭ  ＩＢＭＸストック溶液の双方を含有するＤＭＳＯ溶液からホルスコリン（Ｓｉｇｍａ）およびＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。
【０２２９】
パッチクランプの結果：
出願者は、基礎（ｃＡＭＰなし）条件下で、０ｍＶの保持電位から＋／−１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により得た複合「差分」透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、少量ではあるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映する。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体）により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。過分極条件下で、全細胞伝導性の低下があった。
【０２３０】
さらに、出願者は、基礎条件下で、−４０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により、複合差分透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、少量ではあるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映した。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体）により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。値は、０ｍＶ  プロトコルを用いて得たものと比較的同様であった。
【０２３１】
出願者は、基礎条件下で、−６０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により、複合差分透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、微量であるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映した。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。値は、０ｍＶ  プロトコルを用いて得たものと比較的同様であった。
【０２３２】
出願者はまた、基礎条件下で、−１２０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により、複合差分透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、微量であるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映した。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。値は、０ｍＶ  プロトコルを用いて得たものと比較的同様であった。
【０２３３】
さらに、出願者は、ｃＡＭＰ刺激された条件下で、様々な保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて得られる、全細胞電流を判定した。代表的な透写図は、ｎ＝５細胞の平均である。代表的な透写図（対照であり、次いで、ｃＡＭＰ刺激し、次いで、薬物含有溶液で灌流した後の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下（ｃＡＭＰのみ）での値からの薬物＋ｃＡＭＰの試験平均値の減算により、複合「差分」透写図（０ｍＶおよび−４０ｍＶにおける電圧プロトコルに対応する）を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、全ての条件下で、高線形であり、試験条件による、伝導性の変化を反映した。
【０２３４】
出願は、ｃＡＭＰ刺激された条件下で、様々な保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示した。代表的な透写図（対照であり、次いで、ｃＡＭＰ刺激し、次いで、薬物含有溶液で灌流した後の全細胞透写図）は、ｎ＝５細胞の平均で作製した。対照条件下（ｃＡＭＰのみ）での値からの薬物＋ｃＡＭＰの試験平均値の減算により、複合「差分」透写図（−６０ｍＶおよび−１２０ｍＶにおける電圧プロトコルに対応する）を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、全ての条件下で、高線形であり、試験条件による、伝導性の変化を反映した。
【０２３５】
出願者はまた、ｃＡＭＰ活性化電流における保持電位の効果を示した。全細胞伝導性における薬物（本発明の界面動電的に生成された流体、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）の効果は、異なる電圧プロトコル（０、−４０、−６０、−１２０ｍＶの保持電位）下で観察された。基礎条件下で、薬物感受性全細胞電流は、全ての保持電位（電圧感度の低い寄与）で同一であった。しかしながら、ｃＡＭＰ活性化条件において、薬物感受性電流は、更に高く、印加した電圧プロトコルに対して感受性があった。電流−電圧関係は、高度に非線形である。これは、減算された電流において更に観察され、０ｍＶでの全細胞伝導性の寄与は、各プロトコルに対して更に減算された（ｎ＝５）。
【０２３６】
実施例の概要。したがって、特定の態様によれば、データは、基礎条件下で、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）の少量ではあるが、一貫した効果があることを示す。全細胞伝導性における薬物の効果を増強するために、実験はまた、ｃＡＭＰ刺激「カクテル」での刺激後、薬物を灌流することにより行われ、これは、全細胞伝導性を劇的に増加させた。興味深いことに、このプロトコルはまた、全細胞伝導性の薬物感受性部分も増加させ、これは、基礎条件下で観測されたものよりも１０倍高かった。追加として、ｃＡＭＰ刺激の存在下で、薬物は、様々な電圧プロトコルに対して異なる効果を示し、界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性の寄与に影響を及ぼすことを示す。伝導性の線形成分の減少もあり、これは、別の経路（例えば、イオンチャネル、電位依存陽イオンチャネル等）の阻害への薬物の少なくとも１つの寄与を更に示唆している。
【０２３７】
特定の態様では、機構に拘束されるわけではないが、出願者のデータは、原形質膜から遮断されるか、または回収される、チャネルの変化を生成する、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）と一致する。
【０２３８】
出願者の他のデータを総合すれば、本発明の特定の態様は、膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、およびカルシウム依存性の細胞内シグナリングシステムのうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞内シグナル変換を調節するための組成物および方法を提供し、これは、ＧＰＣＲおよび／またはｇタンパク質、ならびにＴＳＬＰが挙げられるが、これらに限定されない、膜構造（例えば、膜および／または膜タンパク質、受容体、または他の成分）の電気化学および／または立体構造の変化を与えるための本発明の界面動電的に生成された溶液の使用を含む。追加の態様によれば、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個々の伝達成分の半減期等に依存して、持続し得る。
【０２３９】
実施例７
（全細胞伝導性に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）で灌流されたＣａｌｕ−３細胞において行われたパッチクランプ分析は、（ｉ）ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓへの暴露が、全細胞伝導性の増加をもたらした、（ｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露が、１５分間のインキュベーション時間で明らかな、非線形伝導性の増加を生じた、および（ｉｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露が、カルシウム透過性チャネルにおけるＲＮＳ−６０食塩水の効果を生じたことを示した。出願者は、パッチクランプ研究を行い、本明細書に記載される、全細胞電流を調節するための有用性を含む、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。２セットの実験を行った。
【０２４０】
第１のセットの実験のデータの概要は、Ｓｏｌａｓ食塩水を用いて得た全細胞伝導性（電流−電圧関係）は、双方のインキュベーション時間（１５分間、２時間）、および全ての電圧プロトコルに対して、高度な線形であることを示す。しかしながら、Ｓｏｌａｓを用いた、更に長時間のインキュベーション（２時間）が、全細胞伝導性を増加させたことは明らかである。ＲＮＳ−６０への細胞の暴露は、デルタ電流（Ｒｅｖ−Ｓｏｌ減算）に示されるように、非線形伝導性の増加を生じ、これは、１５分間のインキュベーション時間でのみ明らかである。この非線形電流におけるＲＮＳ−６０の効果は、消失し、その代わりに、２時間のインキュベーション時間での高度な線形がある。全ての電圧プロトコルで存在するが、非線形全細胞伝導性の寄与は、上で観察されるように、電圧感受性があった。
【０２４１】
第２のセットの実験のデータの概要は、非線形電流において、ＲＮＳ−６０食塩水の効果があることを示し、これは、外液中の高カルシウムにおいて明らかにされた。非線形全細胞伝導性の寄与は、電圧感受性ではあるが、双方の電圧プロトコルに存在し、カルシウム透過性チャネルにおけるＲＮＳ−６０食塩水の効果を示す。
【０２４２】
第１のセットの実験（伝導性の増加、および非線形電圧調節された伝導性の活性化）
第１のセットの実験のための方法。一般的なパッチクランプ法に関しては、上記を参照のこと。以下の第１のセットの実験において、パッチクランプ研究を行い、基礎条件下で、Ｃａｌｕ−３細胞を用いて、０ｍＶ保持電位、−１２０ｍＶ、あるいは−６０ｍＶのいずれかからステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。
【０２４３】
いずれの場合にも、全細胞伝導性は、１５分間、あるいは２時間のいずれかでインキュベートされた細胞から得た、電流−電圧関係から得た。本研究において、群は、ＳｏｌａｓあるいはＲＮＳ−６０食塩水溶液に対して、既定の時間で得た。得られたデータは、５〜９個の細胞に対して、平均値±ＳＥＭ全細胞電流として表す。
【０２４４】
結果。図３Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。結果は、ＲＮＳ−６０（黒丸）は、Ｓｏｌａｓ（白丸）よりも全細胞伝導性におけるより大きな効果があることを示す。実験において、同様の結果が、３つの電圧プロトコルにおいて、および１５分および２時間のインキュベーション時点で見られた。
【０２４５】
図４Ａ〜Ｃは、３つの電圧プロトコル（「デルタ電流」））（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。これらのデータは、ＲＮＳ−６０を用いた１５分間の時点で、２時間の時点で、不在する非線形電位依存性成分があることを示した。
【０２４６】
前の実験等の場合、「生理」食塩水を用いたデータは、参照として使用された、非常に一貫した、時間依存性伝導性を得た。本結果は、ＳｏｌａｓあるいはＲＮＳ−６０食塩水のいずれかと群を一致させることにより得られ、基礎条件（ｃＡＭＰなし、または任意の他の刺激なし）下で、ＲＮＳ−６０食塩水へのＣａｌｕ−３細胞の暴露は、時間依存性効果を生成し、より短期のインキュベーション時間（１５分間）で、電圧調節された伝導性の活性化と一致することを示す。この現象は、２時間のインキュベーション時点では明らかではなかった。本明細書の他の箇所で記載されるように、線形成分は、伝導性が、ｃＡＭＰ「カクテル」での刺激により増加する際、更に明らかである。それでもなお、２時間のインキュベーション時間は、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ食塩水の双方に対してより高い線形伝導性を示し、この場合、ＲＮＳ−６０食塩水は、Ｓｏｌａｓ単独と比較して、全細胞伝導性が倍になった。この証拠は、全細胞伝導性への少なくとも２つの寄与、即ち、非線形電圧調整された伝導性および線形伝導性の活性化が、ＲＮＳ−６０食塩水により影響を受け、これは、更に長時間のインキュベーション時間で、更に明らかである。
【０２４７】
第２のセットの実験（カルシウム透過性チャネルにおける効果）
第２のセットの実験のための方法。一般的なパッチクランプ法に関しては、上記を参照のこと。以下の第２のセットの実験において、なお更なるパッチクランプ研究を行い、基礎条件下で、Ｃａｌｕ−３細胞を用いて、０ｍＶあるいは−１２０ｍＶのいずれかの保持電位からステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。
【０２４８】
いずれの場合にも、全細胞伝導性は、いずれかの食塩水を用いて、１５分間、インキュベートされた細胞から得た電流−電圧関係から得た。全細胞伝導性へのカルシウム透過性チャネルの寄与があるかどうか、および全細胞伝導性のこの部分が、ＲＮＳ−６０食塩水を用いたインキュベーションにより影響を受けるかどうかを決定するために、細胞は、インキュベーション期間後、生理食塩水中にパッチされた（高ＮａＣｌの外部溶液を伴うが、内部溶液は、高ＫＣｌを含有する）。次いで、外部食塩水は、ＮａＣｌをＣｓＣｌにより置換した溶液と置換し、主要な外部陽イオンを置換することにより、伝導性の変化があるかどうかを判定した。これらの条件下で、同一の細胞は、次いで、カルシウム入力ステップが、更に明らかにされるように、増加濃度のカルシウムに暴露された。
【０２４９】
結果：図５Ａ〜Ｄは、異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。これらの実験において、１５分間の一時点を使用した。Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）に関して、結果は、１）外部溶液として、ＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角印）を用いて、対照（ひし形印）と比較した際、線形挙動と共に全細胞伝導性が増加したこと、ならびに２）２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（丸印）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（三角印）の双方で、ＣａＣｌ２は、非線形法において、全細胞伝導性を増加させたことを示す。ＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）に関して、結果は、１）外部溶液として、ＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角印）を用いて、対照（ひし形印）と比較した際、全細胞伝導性における効果がほとんどなかったこと、ならびに２）４０ｍＭでのＣａＣｌ２（三角印）は、非線形法において、全細胞伝導性を増加させたことを示す。
【０２５０】
図６Ａ〜Ｄは、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（ひし形印）および４０ｍＭ  ＣａＣｌ２（四角印）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。結果は、ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０溶液は共に、カルシウム誘発された非線形全細胞伝導性を活性化したことを示す。ＲＮＳ−６０（投与量反応性を示す）を用いた場合の効果が、より大きく、ＲＮＳ−６０を用いた場合のみ、より高いカルシウム濃度で増加した。更に、より高いカルシウム濃度で、非線形カルシウム依存性伝導性はまた、電圧プロトコルにより増加した。
【０２５１】
この第２のセットの実験のデータは、Ｃａｌｕ−３細胞中で得られた全細胞伝導性データに対して、ＲＮＳ−６０食塩水およびＳｏｌａｓ食塩水の効果を更に示す。データは、いずれかの食塩水を用いた１５分間のインキュベーションは、全細胞伝導性における明らかな効果を生じることを示し、これは、ＲＮＳ−６０を用いた場合、最も明らかであり、外部カルシウムが増加する際、ＲＮＳ−６０食塩水は、全細胞伝導性のカルシウム依存性非線形成分を増加させることをさらに示す。
【０２５２】
蓄積された証拠は、イオンチャネルのＲｅｖａｌｅｓｉｏ食塩水による活性化を示唆し、これは、基底細胞伝導性への異なる寄与をなす。
【０２５３】
出願者の他のデータ（例えば、出願者の他の実施例のデータ）を総合すれば、本発明の特定の態様は、膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、脂質成分、または細胞により置換可能な細胞内成分（例えば、カルシウム依存性の細胞シグナリングシステム等のシグナル経路）のうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞内シグナル変換を調節するための組成物および方法を提供し、これには、ＧＰＣＲおよび／またはｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない、膜構造（例えば、膜および／または膜タンパク質、受容体、または他の膜成分）の電気化学および／または立体構造の変化を与えるための本発明の界面動電的に生成された溶液の使用を含む。追加の態様によれば、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個々の伝達成分の半減期等に依存して、持続し得る。
【０２５４】
実施例８
（全細胞伝導性に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を調査し、用量反応曲線を生成した）
要約。本実施例において、出願者は、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の希釈の効果を評価した。
【０２５５】
方法。一般的なパッチクランプ法に関しては、上記を参照のこと。以下の実験において、パッチクランプ試験を行い、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩流体（ＲＮＳ−６０）の有用性を更に確認した。具体的に、実験は、本発明の界面動電的に生成された食塩流体の希釈の効果を評価した。溶液は、１００％（Ｒｅｖ）、７５％（３：４）、５０％（１：１）、２５％（４：３）、および０％（Ｓａｌ）の濃度で、生理食塩水中で本発明の界面動電的に生成された食塩流体を希釈することによって作製した。
【０２５６】
結果。図７ＡおよびＢは、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、希釈された界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。パネルＡは、グラフに示されるように、各希釈されたサンプルに対する全細胞伝導性の電圧対電流を示す（Ｒｅｖ、３：４、１：１、４：３、およびＳａｌ）。パネルＢは、生理食塩水への希釈を比較する、希釈量対電流の変化を示す。結果は、ＲＮＳ−６０溶液の作用機構が、線形線量反応の形で生じることを示す。
【０２５７】
実施例９
（本発明の界面動電的に生成された流体、ならびに非界面動電的対照加圧ポット流体による一次気管支上皮細胞（ＢＥＣ）の処置は、気道炎症性経路のＭＭＰ９およびＴＳＬＰの２つの主要なタンパク質の発現および／または活性の軽減を生じた）
要約。出願者は、ここで、（Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー、Ｏｃｔｅｔ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＥＤ）（ｆｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）を用いて）、生理食塩水と比較して、本開示の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ；ガス富化界面動電的に生成された流体）の存在下で、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合が濃度依存性であり、結合親和性が増加したことを示している。追加として、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、標準の市販源）で刺激されたＴ制御性細胞の文脈において、出願者のデータは、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、Ｔ制御性細胞の増殖の低下を示し、例えば、アッセイにおいて、比較的低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖは、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示した。更に、本発明の流体への暴露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された産生または若干低下した産生を生じた。同様に、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイルの文脈において、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への暴露は、食塩水および培地対照のレベルと同様の有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことを示した。追加として、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、先端ジフテリア毒素分子；標準市販濃度の１：５０の希釈）は、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能への界面動電的に生成された流体の活性が機能する効果のβ遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断をもたらした。更に、出願者は、本発明の流体に暴露されると、密着結合関連タンパク質（例えば、ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４、および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１））が、肺組織中で上方調節されたことを示した。更に、パッチクランプ試験に示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ；例えば、Ｃａｌｕ−３）において、全細胞伝導性の調節（例えば、過分極条件下で）に影響を及ぼし、追加の態様によれば、全細胞伝導性の調節は、イオンチャネルの調節を反映する。
【０２５８】
本実施例において、出願者は、気道炎症性経路の２つの主要なタンパク質の産生の効果を測定するために、追加の実験を行うことによりこれらの発見を拡大している。具体的には、ＭＭＰ９およびＴＳＬＰは、一次気管支上皮細胞（ＢＥＣ）においてアッセイされた。
【０２５９】
材料および方法：
市販の一次ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＣ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，ＧｅｒｍａｎｙからのＨＢＥｐＣ−ｃ）を、これらの研究のために使用した。約５０，０００細胞を、約８０％の密集度に到達するまで、１２ウェルプレートの各ウェル中に平板培養した。次いで、ＦＡＣＳ分析のために引き上げられる前に、ディーゼル排出微粒子状物質（ＤＥＰまたはＰＭ）と共に、１：１０の希釈（１ｍＬの気道上皮成長培地中の１００μＬ）で、生理食塩水、対照流体Ｓｏｌａｓ、非界面動電的対照加圧ポット流体、または試験流体Ｒｅｖｅｒａ  ６０を用いて、細胞を、６時間処置した。ＭＭＰ９およびＴＳＬＰ受容体抗体は共に、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得し、製造業者の仕様書のように使用した。
【０２６０】
結果：
図１および２において、ＤＥＰは、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、標準の市販源）単独に曝露された細胞を示し、「ＮＳ」は、生理食塩水単独に曝露された細胞を示し、「ＤＥＰ＋ＮＳ」は、生理食塩水の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を示し、「Ｒｅｖｅｒａ  ６０」とは、試験材料にのみに曝露された細胞を指し、「ＤＥＰ＋Ｒｅｖｅｒａ  ６０」とは、試験材料Ｒｅｖｅｒａ  ６０の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を指す。加えて、「Ｓｏｌａｓ」および「ＤＥＰ＋Ｓｏｌａｓ」は、それぞれ、対照流体Ｓｏｌａｓ単独、または微粒子状物質と組み合わせた対照流体に曝露された細胞を示す。「ＰＰ６０」は、非界面動電的対照加圧ポット流体に曝露された細胞を示し、「ＤＥＰ＋ＰＰ６０」は、非界面動電的対照加圧ポット流体の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を指す（すなわち、６０ｐｐｍの溶解酸素を有する）。
【０２６１】
図１は、試験材料Ｒｅｖｅｒａ  ６０が、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を約９０％低下させることを示す。Ｓｏｌａｓは、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現の５５％の低下をもたらしたが、一方、生理食塩水は、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現の同様のレベルの低下を生じなかった（約２０％の低下）。更に、非界面動電的対照加圧ポット流体ＰＰ６０は、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現の５０％の低下をもたらした。
【０２６２】
ＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる本発明のＲｅｖｅｒａ  ６０、Ｓｏｌａｓ、およびＰＰ６０溶液の効果は、ＴＳＬＰが、アレルギー喘息の病理生物学において極めて重要な役割を果たし、ＴＳＬＰ受容体機能の局所抗体媒介遮断がアレルギー性疾患を緩和したことを示す、近年の研究結果を考慮すると、重大な発見である（Ｌｉｕ，ＹＪ，Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ｍａｓｔｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：２６９−２７３，２００６、Ａｌ−  Ｓｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＳＬＰ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｓｔｈｍａ  ｍｏｄｅｌ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０２：８２９−８３９，２００５、およびＳｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＴＳＬＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｉｒｗａｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，Ａｕｇ  ２９．（Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ））。
【０２６３】
同様に、図２は、ＤＥＰ媒介されたＭＭＰ９の増加における、Ｒｅｖｅｒａ  ６０、Ｓｏｌａｓ、非界面動電的対照加圧ポット流体（ＰＰ６０）、および生理食塩水の効果を示す。具体的には、Ｒｅｖｅｒａ  ６０は、気管支上皮細胞において、ＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルの約８０％を阻害し、Ｓｏｌａｓは、約７０％の阻害効果があり、一方、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果の約２０％の低下があった。更に、非界面動電的対照加圧ポット流体ＰＰ６０は、ＤＥＰ誘発された細胞表面付着ＭＭＰ９レベルの発現の約３０％の低下をもたらした。ＭＭＰ−９は、喘息において、気道炎症および気管支リモデリングに関与する主要なプロテイナーゼのうちの１つである。近年では、ＭＭＰ−９のレベルは、健常な対照対象と比較して、安定した喘息に罹患する患者において、有意に増加し、急性喘息患者においてさらに高いことを示している。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の侵入および気道過敏性の誘発に重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘発し、保持するのに重要な役割を果たし得ることを示す（Ｖｉｇｎｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｕｔｕｍ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｒａｔｉｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｉｒｆｌｏｗ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １５８：１９４５−１９５０，１９９８、Ｈｏｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｈａｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０４：３５６−３６３，１９９９、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ａｓｔｈｍａ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７２：５５９−５６５，２００５、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ  ｃａｎ  ｂｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０８：１０２１−１０２６，２００１、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ＶＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓｔｈｍａ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１１１：１２７８−１２８４）。
【０２６４】
したがって、追加の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された流体は、ＴＳＬＰ受容体の発現を調節するため（例えば、低下させる）、ならびに／またはＭＭＰ−９の発現および／または活性を阻害するために、実質的な治療的有用性を有し、これには、例えば、炎症および喘息の治療のためを含む。
【０２６５】
さらなる態様によれば、非界面動電的対照加圧ポット流体（すなわち、６０ｐｐｍの溶解酸素）は、ＴＳＬＰ受容体の発現を調節するため（例えば、低下させる）、ならびに／またはＭＭＰ−９の発現および／または活性を阻害するために、実質的な治療的有用性を有し、これには、例えば、炎症および喘息の治療のためが含まれる。機構に拘束されるわけではないが、出願者の収集データは、本システムにおける非界面動電的対照加圧ポット流体は、出願者の界面動電的に生成された流体の機構とは異なる機構によって媒介される。これは、効果が比較的小さいためだけではなく、非界面動電的対照加圧ポット流体が、出願者の界面動電的に生成された流体による活性を示す他のアッセイにおいて、活性を示さなかったためでもある。それでもなお、本システムにおける非界面動電的対照加圧ポット流体の本明細書に開示された活性の出願者の発見は、本明細書に開示されるように、喘息および関連する状態との関連におけるそのような加圧ポット流体のための新規の使用を表す。
【０２６６】
したがって、特定の態様に従って、出願者の界面動電的に生成された流体の投与を含む本発明の方法は、免疫系の疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、および食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、ならびに乾癬からなるＴＳＬＰ媒介群から選択される、少なくとも１つの疾病または状態の治療に適用可能である調節（ＴＳＬＰ発現および／または活性の下方制御）を提供する。
【０２６７】
本明細書に開示される結果は、上皮細胞−ＤＣの干渉におけるアレルギー性炎症のマスタースイッチとしのＴＳＬＰの当該技術分野において認識されている役割と完全に一致しており（Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２６９−２７３，２００６）、ＴＳＬＰＲに欠けているマウスの表現型とさらに一致しており（例えば、吸入抗原に反応して、喘息を発症しない；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照、およびＡｌ−Ｓｈａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：８２９−８３９，２００５）、結果は、抗ＴＳＬＰＲでＯＶＡ−ＤＣを前処理することから得られた（例えば、好酸球およびリンパ球浸潤、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５レベルの有意な低下をもたらす）。
【０２６８】
現在開示される対象物はさらに、ＴＳＬＰＲがＤＣに感作されたアレルギー性疾患において果たす役割を明らかにし、出願者の界面動電的に生成された流体の投与を含む新規の組成物および方法を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2015044869.tif 000017
【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【外国語明細書】
2015044869000001.pdf