(57)【要約】【課題】本発明は、新規なＰＡＩ−１阻害剤、及び当該ＰＡＩ−１阻害剤を用いてＰＡＩ−１活性を阻害する方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＰＡＩ−１（プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１）中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域とＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域との分子内相互作用を阻害する、ＰＡＩ−１阻害剤、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質とＰＡＩ−１とを結合させることにより、ＰＡＩ−１中の前記第１領域と前記第２領域との分子内相互作用を阻害する、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＩ−１（プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１）中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質からなることを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤。
【請求項２】
前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７１位のロイシンから３７９位のプロリンまでの領域である、請求項１に記載のＰＡＩ−１阻害剤。
【請求項３】
前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７２位のフェニルアラニンから３７６位のバリンまでの領域である、請求項１に記載のＰＡＩ−１阻害剤。
【請求項４】
前記第２領域が、ＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰＡＩ−１阻害剤。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載のＰＡＩ−１阻害剤。
【請求項６】
ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質からなることを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤。
【請求項７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１を、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質と結合させることにより、ＰＡ（プラスミノゲンアクチベータ）に対する阻害活性を低下させることを特徴とする、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。
【請求項８】
前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７１位のロイシンから３７９位のプロリンまでの領域である、請求項７に記載のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
【請求項９】
前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７２位のフェニルアラニンから３７６位のバリンまでの領域である、請求項７に記載のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
【請求項１０】
前記第２領域が、ＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域である、請求項７〜９のいずれか一項に記載のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
【請求項１１】
前記物質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項７に記載のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
【請求項１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１を、ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質と結合させることにより、ＰＡに対する阻害活性を低下させることを特徴とする、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。
【請求項１３】
被験物質と、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列からなる野生型ペプチドとの結合性を評価する工程と、
前記被験物質と、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列のうち、３７４位のグリシン残基のみが酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる変異型ペプチドとの結合性を評価する工程と、
変異型ペプチドとの結合性よりも、野生型ペプチドとの結合性の方が有意に強かった被検物質を、ＰＡＩ−１阻害剤の候補物質として選択する工程と、
を有することを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記野生型ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記変異型ペプチドが、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１３に記載のＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１（plasminogen activator inhibitor type 1（ＰＡＩ−１））における分子内相互作用を阻害することによりＰＡＩ−１活性を失活させるＰＡＩ−１阻害剤、及び当該ＰＡＩ−１阻害剤を用いてＰＡＩ−１活性を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＩ−１は、生体内に生理的に存在するプラスミノゲンアクチベータの特異的インヒビターであり、線維素溶解（線溶）活性発現を制御している。線溶活性の低下は、凝固活性の亢進や血小板活性化の亢進と同様に血栓症発症のリスクとなる。本発明者らによって、これまでに、血液の線溶活性が血漿中のｔＰＡ量とＰＡＩ−１量のバランスで決まること（非特許文献１及び２参照。）、肥満、高血圧、脂質異常、メンタルストレス等の心血管疾患のリスク時に血中ＰＡＩ−１濃度が増加することを報告した（非特許文献３及び４参照。）。メタボリック症候群等に伴い血漿中ＰＡＩ−１濃度が増加する事は他の施設からも多く報告されており、ＰＡＩ−１はこれらの病態時の血栓症発症の直接の原因因子として注目されている。また、ＰＡＩ−１は、急性相タンパクの一つであり、手術後に増加することや（非特許文献５参照。）、熱傷時に増加することが（非特許文献６参照。）報告されており、外傷や感染症合併時の微小血栓形成に伴う臓器障害の原因分子としても注目されている。また、炎症性細胞や腫瘍細胞の膜表面の特異受容体に結合したウロキナーゼ型ＰＡ（ｕＰＡ）に結合して細胞浸潤・増殖・転移を促進する機能も報告されている（非特許文献７及び８参照。）。
【０００３】
さらに、本発明者らは、最近、出血傾向を示すＰＡＩ−１欠損症例を見いだし、世界第２例目の症例として報告した（非特許文献９参照。）。また、血漿中のプラスミノゲンアクチベータインヒビター活性又は濃度を測定することにより、早産又は流産の発症危険度を調べられることを見出した（特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７３１９１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Urano，et al.，Thrombosis and Haemostasis，1990，vol.63，p.82−86．
【非特許文献２】Urano，et al.，Thrombosis and Haemostasis，1991，vol.66，p.474−478．
【非特許文献３】Urano，et al.，The Japanese Journal of Physiology，1993，vol.43，p.221−228．
【非特許文献４】Urano，et al.，Thrombosis Research，1994，vol.74，p.595−603．
【非特許文献５】Aoki，et al.，Surgery Today（Official Journal of the Japan Surgical Society），1994，vol.24，p.1039−1043．
【非特許文献６】Aoki，et al.，Burns，1998，vol.24，p.74−77．
【非特許文献７】Morita，et al.，International Journal of Cancer，1998，vol.78，p.286−292.
【非特許文献８】Abe，et al.，Cancer，1999，vol.86，p.2602−2611.
【非特許文献９】Iwaki，et al.，Journal of Thrombosis and Haemostasis，2011，vol.9，p.1200−1206．
【非特許文献１０】Nukuna，et al.，Journal of Biological Chemistry，2004，vol.279，p.50132−50141．
【非特許文献１１】Urano，et al.，European Journal of Biochemistry，1992，vol.209，p.985−992．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの知見から、メタボリック症候群等の血栓症の高リスク者における血栓症予防や、外傷や感染症時の多臓器不全予防、悪性腫瘍の増殖・浸潤・転移の抑制などを目的として、ＰＡＩ−１阻害薬の開発が試みられている。しかしながら、現時点ではまだいずれの阻害薬も市場に出ていないのが現状である。
【０００７】
本発明は、新規なＰＡＩ−１阻害剤、及び当該ＰＡＩ−１阻害剤を用いてＰＡＩ−１活性を阻害する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、新しく血漿中ＰＡＩ−１欠損症例を見出し、当該症例におけるＰＡＩ−１の変異を解析したところ、反応部位（Ｒ３４６−Ｍ３４７）のＣ末端側にあるＧ３７４Ｒ（３７４位のグリシンがアルギニンに置換された変異）の１アミノ酸置換変異体であり、このＧ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１は発現細胞内で多量体を形成していることを見出した。さらにＧ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１について解析を進めたところ、３７４位のグリシン残基（Ｇ３７４）及びその近傍の領域の分子内相互作用を阻害することにより、ＰＡＩ−１活性を失活させられることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のＰＡＩ−１阻害剤、ＰＡＩ−１活性の阻害方法、及びＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法を提供するものである。
（１）  ＰＡＩ−１（プラスミノゲンアクチベータインヒビター−１）中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質からなることを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤。
（２）  前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７１位のロイシンから３７９位のプロリンまでの領域である、前記（１）のＰＡＩ−１阻害剤。
（３）  前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７２位のフェニルアラニンから３７６位のバリンまでの領域である、前記（１）のＰＡＩ−１阻害剤。
（４）  前記第２領域が、ＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域である、前記（１）〜（３）のいずれかのＰＡＩ−１阻害剤。
（５）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、前記（１）のＰＡＩ−１阻害剤。
（６）  ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質からなることを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤。
（７）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１を、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む９以下のアミノ酸残基からなる第１領域又はＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域を含む第２領域に結合可能な物質と結合させることにより、ＰＡ（プラスミノゲンアクチベータ）に対する阻害活性を低下させることを特徴とする、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（８）  前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７１位のロイシンから３７９位のプロリンまでの領域である、前記（７）のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（９）  前記第１領域が、ＰＡＩ−１の３７２位のフェニルアラニンから３７６位のバリンまでの領域である、前記（７）のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１０）  前記第２領域が、ＰＡＩ−１の３１位のアスパラギンから３５位のセリンまでの領域である、前記（７）〜（９）のいずれかのＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１１）  前記物質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、前記（７）のＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１２）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ（但し、ヒトの生体内を除く。）において、ＰＡＩ−１を、ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質と結合させることにより、ＰＡに対する阻害活性を低下させることを特徴とする、ＰＡＩ−１活性の阻害方法。
（１３）  被験物質と、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列からなる野生型ペプチドとの結合性を評価する工程と、
前記被験物質と、ＰＡＩ−１中の３７４位のグリシン残基を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列のうち、３７４位のグリシン残基のみが酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなる変異型ペプチドとの結合性を評価する工程と、
変異型ペプチドとの結合性よりも、野生型ペプチドとの結合性の方が有意に強かった被検物質を、ＰＡＩ−１阻害剤の候補物質として選択する工程と、
を有することを特徴とする、ＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法。
（１４）  前記野生型ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜９アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記変異型ペプチドが、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、前記（１３）に記載のＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１活性の阻害方法を用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＡＩ−１活性を効果的に抑制することができる。このため、当該ＰＡＩ−１阻害剤は、血栓症や多臓器不全等のようなＰＡＩ−１活性に起因して生じる各種の疾患に対する予防や治療のための医薬用組成物として有用である。また、当該ＰＡＩ−１阻害剤は、より優れたＰＡＩ−１阻害剤の開発にも資する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトＰＡＩ−１のアミノ酸配列（配列番号５）を示した図である。
【図２】ヒトＰＡＩ−１の活性型の構造解析結果を示した図である。
【図３】ヒトＰＡＩ−１の潜在型の構造解析結果を示した図である。
【図４】実施例１において、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図５】実施例２において、各反応溶液における４０５ｎｍの吸光度の増加の測定結果を示した図である。
【図６】実施例２において、図５に示した結果から算出した各ペプチドのＰＡＩ阻害活性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ＰＡＩ−１は、セリンプロテアーゼインヒビター（serine protease inhibitor（Ｓｅｒｐｉｎ））スーパーファミリーの一つであり、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（urokinase type plasminogen activator（ｕＰＡ））及び組織型プラスミノゲンアクチベータ（tissue type plasminogen activator（ｔＰＡ））の主要な生理的な制御因子である。
【００１３】
ＰＡＩ−１には、反応部位ループ（反応部位を含むループ）が分子外に持ち上がっており、基質と結合可能な活性型（active form）と、ｕＰＡやｔＰＡとの相互作用により反応部位（ヒトＰＡＩ−１では、Ｒ３４６−Ｍ３４７）のペプチド結合が切断されて反応部位ループのＮ末端側が分子内のシャッター領域の間に入り込んで新たなβシートを形成する開裂型（cleaved form）と、反応部位が結合されることなく、反応部位ループのＮ末端側が分子内に入り込んで新たなβシートを形成する潜在型（latent form）とがある。シャッター領域とは、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５及びＳ６のβシート構造からなる領域であり、開裂型と潜在型においては、反応部位ループのＮ末端側はＳ３シートとＳ５シートの間に入り込み、新たにＳ４シートを形成する。３７９アミノ酸からなるヒトＰＡＩ−１のアミノ酸配列（配列番号５）を図１に示す。また、ヒトＰＡＩ−１の活性型の構造解析結果を図２に、潜在型の構造解析結果を図３に、それぞれ示す（非特許文献１０から引用。）。なお、図１のアミノ酸配列には、非特許文献１０において報告されているデータに基づき、各二次構造の情報も示した。
【００１４】
Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１を発現している症例では、Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１は発現細胞内で多量体を形成しており、血漿中ＰＡＩ−１は欠損している、Serpinopathyに分類される病態を示していた。一般的に、ＰＡＩ−１をはじめとするＳｅｒｐｉｎの多量体は、Ｓｅｒｐｉｎの反応部位ループが他分子のシャッター領域内にＳ４シートとして入り込み、これにより押し出された他分子の反応部位ループが、更に別のシャッター領域に入り込む事により形成される。したがって、多量体形成を示す分子異常の多くはシャッター領域に多い。しかしながら、Ｇ３７４は、シャッター領域ではなく、反応部位ループのＣ末端側の領域に存在している。つまり、ＰＡＩ−１のＧ３７４の変異は、機能不全又は機能欠損の新規に発見された変異である。
【００１５】
活性型ＰＡＩ−１において、Ｇ３７４及びその近傍の領域（ｓ２Ｂ：βシート２Ｂ）は、ｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）と互いに結合している。これに対してＧ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１では、疎水性アミノ酸であるグリシン残基が塩基性アミノ酸であるアルギニン残基に変異したことにより、分子内相互作用が損なわれる結果、活性型構造が維持できず、潜在型になっているのではないかと推察される。
【００１６】
＜ＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１活性の阻害方法＞
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１中のｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域又はＰＡＩ−１中のｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質からなることを特徴とする。活性型ＰＡＩ−１において、ｓ２Ｂは、ｓ１Ｂの一部と分子内相互作用により互いに結合する。ｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質（以下、「ｓ２Ｂ結合物質」ということがある。）又はｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域に結合可能な物質（以下、「ｓ１Ｂ結合物質」ということがある。）とＰＡＩ−１を結合させることにより、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、活性型の安定性が損なわれて潜在型となる結果、ＰＡＩ活性が阻害される。
【００１７】
ｓ２Ｂ結合物質及びｓ１Ｂ結合物質としては、ペプチドであってもよく、抗体等のタンパク質であってもよく、糖鎖や脂肪鎖等により修飾されたタンパク質又は核酸であってもよく、低分子化合物であってもよい。抗体としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよく、人工抗体であってもよい。また、ｓ２Ｂ結合物質としては、ｓ２Ｂを形成する領域と特異的に結合可能な物質が好ましく、ｓ１Ｂ結合物質としては、ｓ１Ｂを形成する領域と特異的に結合可能な物質が好ましい。また、ＰＡＩ−１に対する結合能を損なわない限度において、糖鎖修飾、脂質修飾、リン酸化、ペプチド修飾等の各種修飾が行われていてもよい。ｓ１Ｂ結合物質としては、例えば、ｓ２Ｂを形成する領域又はその部分領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられ、ｓ２Ｂを形成する領域中のヒトＰＡＩ−１のＦ３７２（３７２位のフェニルアラニン）からＶ３７６（３７６位のバリン）までの５アミノ酸からなる領域（ＦＭＧＱＶ領域、図１の最下段の四角で囲われた領域）に相当する領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
【００１８】
特に、ヒトＰＡＩ−１又はヒトＰＡＩ−１とのアミノ酸配列の相同性（配列同一性）が高い（例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上）ＰＡＩ−１に対する阻害剤の場合、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤は、ＰＡＩ−１中の部分領域のうち、Ｇ３７４を含む部分領域である第１領域、又はＰＡＩ−１のＮ３１（３１位のアスパラギン）からＳ３５（３５位のセリン）までの領域を含む第２領域に結合可能な物質からなることが好ましい。活性型ＰＡＩ−１において、第１領域と第２領域は、分子内相互作用により互いに結合する領域である。第１領域に結合可能な物質（以下、「第１領域結合物質」ということがある。）とＰＡＩ−１を結合させることにより、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、活性型の安定性が損なわれて潜在型となる結果、ＰＡＩ活性が阻害される。同様に、第２領域に結合可能な物質（以下、「第２領域結合物質」ということがある。）とＰＡＩ−１を結合させることにより、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、活性型の安定性が損なわれて潜在型となる結果、ＰＡＩ活性が阻害される。
【００１９】
本発明において、第１領域とは、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む９以下のアミノ酸残基からなる領域である。第１領域中におけるＧ３７４の位置は特に限定されるものではなく、領域の真ん中付近であってもよく、領域の端付近であってもよく、領域のＮ末端であってもよく、領域のＣ末端であってもよい。また、第１領域のアミノ酸長は、９以下であれば特に限定されるものではないが、３〜９アミノ酸であることが好ましく、３〜８アミノ酸であることがより好ましく、４〜６アミノ酸であることがさらに好ましく、５アミノ酸であることがよりさらに好ましい。なお、第１領域としては、Ｇ３７４のみであってもよい。
【００２０】
本発明における第１領域としては、ＰＡＩ−１のＦ３７２からＶ３７６までの５アミノ酸からなる領域（ＦＭＧＱＶ領域）を含む領域であることが好ましい。ＦＭＧＱＶ領域は、ｓ２Ｂ（βシート２Ｂ）を形成する領域内にある。中でも、ＰＡＩ−１のＬ３７１（３７１位のロイシン）からＰ３７９（３７９位のプロリン）までの領域のうちのＧ３７４を含む１〜９のアミノ酸からなる部分領域であることがより好ましく、ＰＡＩ−１のＬ３７１からＰ３７９までの領域のうちのＧ３７４を真ん中又はその近傍に含む１〜８のアミノ酸からなる部分領域であることがさらに好ましく、ＰＡＩ−１のＦ３７２からＶ３７６までの領域がよりさらに好ましい。
【００２１】
本発明において、第２領域は、ＰＡＩ−１のＮ３１からＳ３５までの５アミノ酸からなる領域（ＮＶＶＦＳ領域、図１の最上段の四角で囲われた領域）を含む領域である。ＮＶＶＦＳ領域は、ｓ１Ｂ（βシート１Ｂ）を形成する領域内にある。第２領域中におけるＮＶＶＦＳ領域の位置は特に限定されるものではなく、領域の真ん中付近であってもよく、領域の端付近であってもよく、領域のＮ末端であってもよく、領域のＣ末端であってもよい。また、第２領域は、ＮＶＶＦＳ領域を含むＰＡＩ−１の部分領域であれば特に限定されるものではないが、ｓ１Ｂを形成する領域内にあることが好ましい。本発明における第２領域としては、ＮＶＶＦＳ領域を含む１２以下のアミノ酸からなる領域であることが好ましく、ＮＶＶＦＳ領域を含む８以下のアミノ酸からなる領域であることがより好ましく、ＮＶＶＦＳ領域を真ん中又はその近傍に含む８以下のアミノ酸からなる領域であることがさらに好ましく、ＮＶＶＦＳ領域がよりさらに好ましい。
【００２２】
第１領域結合物質及び第２領域結合物質としては、ペプチドであってもよく、抗体等のタンパク質であってもよく、糖鎖や脂肪鎖等により修飾されたタンパク質又は核酸であってもよく、低分子化合物であってもよい。抗体としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体であってもよく、人工抗体であってもよい。また、第１領域結合物質としては、第１領域と特異的に結合可能な物質が好ましく、第２領域結合物質としては、第２領域と特異的に結合可能な物質が好ましい。
【００２３】
第１領域結合物質がペプチドの場合、第１領域結合物質としては、前記第２領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＮＶＶＦＳからなるペプチド（配列番号３）がより好ましい。
【００２４】
第２領域結合物質がペプチドの場合、第２領域結合物質としては、前記第１領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。具体的には、ＬＦＭＧＱＶＭＥＰ（ＰＡＩ−１のＬ３７１からＰ３７９までの領域と同一のアミノ酸配列、配列番号２）からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜８アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＦＭＧＱＶ（ＰＡＩ−１のＦ３７２からＶ３７６までの領域と同一のアミノ酸配列、配列番号１）からなるペプチドがより好ましい。
【００２５】
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤となる第１領域結合物質又は第２領域結合物質は、ＰＡＩ−１に対する結合能を損なわない限度において、糖鎖修飾、脂質修飾、リン酸化、ペプチド修飾等の各種修飾が行われていてもよい。
【００２６】
本発明に係るＰＡＩ−１活性の阻害方法は、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤を用いることを特徴とする。ＰＡＩ−１を、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤と結合させることにより、ＰＡに対する阻害活性を低下させることができる。本発明に係るＰＡＩ−１活性の阻害方法において、活性を阻害する対象となるＰＡＩ−１は、いずれの生物種由来のものであってもよいが、哺乳類由来のものが好ましく、ヒト、マウスやラット、サル等の実験動物、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜若しくは愛玩動物等に由来するものがより好ましく、ヒト由来のＰＡＩ−１が特に好ましい。また、活性を阻害する対象となるＰＡＩ−１は、生体中に存在するものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。
【００２７】
具体的には、ＰＡＩ−１に、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤を接触させることにより、両者を結合させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う場合には、ＰＢＳ（リン酸生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー等のバッファー中に、ＰＡＩ−１とＰＡＩ−１阻害剤とを共に含有させた状態で所定の時間インキュベートすることにより、両者を結合させることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合には、例えば、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤を静脈注射等により投与することによって、血液中のＰＡＩ−１にＰＡＩ−１阻害剤を結合させることができる。
【００２８】
本発明に係るＰＡＩ−１活性の阻害方法においては、本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤と共に、その他のＰＡＩ−１阻害剤を併用してもよい。その他のＰＡＩ−１阻害剤としては、ＰＡＩ−１のシャッター領域を標的とした阻害剤が挙げられる。
【００２９】
＜ＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法＞
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤のスクリーニング方法（以下、単に「本発明に係るスクリーニング方法」ということがある。）は、被験物質の中から、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む部分領域と同一のアミノ酸配列からなる野生型ペプチドとは結合するが、Ｇ３７４が変異した変異型ペプチドには結合しない若しくは極弱くしか結合しない物質を選択することを特徴とする。野生型ペプチドと結合する物質は、ＰＡＩ−１の前記第１領域と結合でき、ＰＡＩ−１分子内における第１領域と第２領域の相互作用が阻害される結果、ＰＡＩ活性を阻害できる可能性が高い。一方で、変異型ペプチドと結合する物質は、野生型ペプチドと結合可能であったとしても、野生型ペプチドとの結合は非特異的な結合である可能性が高く、ＰＡＩ−１阻害剤としては好ましくない。すなわち、野生型ペプチドと強く結合し、変異型ペプチドとはほとんど結合しない物質が、ＰＡＩ−１阻害剤として好適である可能性が高いといえる。
【００３０】
当該野生型ペプチドは、具体的には、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。当該変異型ペプチドは、具体的には、ＰＡＩ−１中のＧ３７４を含む３〜９のアミノ酸残基からなる第１領域と同一のアミノ酸配列のうち、Ｇ３７４のみが酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基）又は塩基性アミノ酸残基（アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基）に置換されているアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明に係るスクリーニング方法において用いられる野生型ペプチドと変異型ペプチドは、Ｇ３７４に相当するグリシン残基以外は同一であることが好ましい。
【００３１】
本発明に係るスクリーニング方法において用いられる野生型ペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基を含む３〜８アミノ酸の部分アミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。本発明に係るスクリーニング方法において用いられる変異型ペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち４番目のグリシン残基のみが酸性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基に置換されている３〜８アミノ酸の全長又は部分アミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
【００３２】
具体的には、被験物質と前記野生型ペプチドとの結合性を評価し、被験物質と前記変異型ペプチドとの結合性を評価した後、変異型ペプチドとの結合性よりも、野生型ペプチドとの結合性の方が有意に強かった被検物質を、ＰＡＩ−１阻害剤の候補物質として選択する。野生型ペプチドとの結合性と変異型ペプチドとの結合性の評価は、いずれを先に行ってもよく、同時に行ってもよい。
【００３３】
被験物質と野生型ペプチド又は変異型ペプチドの結合性の評価は、２つの物質が互いに結合している量について、定量的又は半定量的に測定可能な方法の中から適宜選択して実施することができる。当該方法としては、例えば、ＢＩＡＣＯＡ、免疫沈降法等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
なお、以下の実施例において用いた配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＭＧＱＶペプチド）及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＭＲＱＶペプチド）は、いずれもGenscript社により合成及び精製されたもの（ＨＰＬＣによる精製度が９９％以上）を購入したものを、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた状態で使用した。ヒト遺伝子組み換えＰＡＩ−１は、Oxford Biomedical Research社（米国）より購入したものを用い、ヒト遺伝子組み換え一本鎖ｔＰＡは、東洋紡第一製薬社より供与頂いたものを用い、ｕＰＡは三菱ウェルファーマ社より購入したものを用いた。Ｓ２４４４は、Chromogenix社より購入したものを用いた。
【００３６】
［実施例１］
ＦＭＧＱＶペプチド（野生型ＰＡＩ−１のＧ３７４を含む５アミノ酸からなる領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチド）と、ＦＭＲＱＶペプチド（Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１のＧ３７４を含む５アミノ酸からなる領域と同一のアミノ酸配列からなるペプチド）が、ＰＡＩ−１とｔＰＡとの高分子複合体形成に与える影響を調べた。
まず、ＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０を含む。）に、ＦＭＧＱＶペプチド（１０ｍＭ）又はＦＭＲＱＶペプチド（１０ｍＭ）とＰＡＩ−１（３μＭ）含有する反応溶液を調製し、室温で１時間震盪してプレインキュベーションした。次いで、当該反応溶液にｔＰＡを最終濃度が１μＭとなるように添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート後の反応溶液を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥすることにより、ｔＰＡ−ＰＡＩ−１高分子複合体が形成されたかどうかを確認した。ＦＭＧＱＶペプチド又はＦＭＲＱＶペプチドに代えて、等量の前記ＨＥＰＥＳバッファーを添加して同様にインキュベートしたものをコントロール１、等量のＤＭＳＯを添加して同様にインキュベートしたものをコントロール２とした。
【００３７】
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。図４中、レーン１はＰＡＩ−１のみを、レーン２はｔＰＡのみを、レーン３はコントロール１（バッファー添加）を、レーン４はコントロール２（ＤＭＳＯ添加）を、レーン５はＦＭＧＱＶペプチドを添加した反応溶液を、レーン６はＦＭＲＱＶペプチドを添加した反応溶液を、それぞれ泳動した結果である。この結果、ＦＭＧＱＶペプチドはｔＰＡ−ＰＡＩ−１高分子複合体形成を阻害したが、溶媒として使用したＤＭＳＯとＦＭＲＱＶペプチドは阻害しなかった。
【００３８】
［実施例２］
ＦＭＧＱＶペプチド及びＦＭＲＱＶペプチドが、ｕＰＡに対するＰＡＩ−１のＰＡＩ活性に与える影響を調べた。ｕＰＡに対するＰＡＩ活性は、非特許文献１１に記載の方法に準じて行った。
具体的には、ＰＡＩ−１（５ｎＭ）とＦＭＧＱＶペプチド又はＦＭＲＱＶペプチド（０、０．０３、０．０７、０．１３、０．２５、０．５、又は１．０ｍＭ）を含有する反応溶液を調製し、当該反応溶液を室温で１０分間プレインキュベーションした。次いで、当該反応溶液にｕＰＡを最終濃度が２ｎＭとなるように添加し、１０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート後の反応溶液の残存ｕＰＡ活性を、特異発色合成基質であるＳ２４４４（最終濃度０．４ｍＭ）を用いて、４０５ｎｍの吸光度の増加分として測定した。ＦＭＧＱＶペプチド又はＦＭＲＱＶペプチドに代えて、等量のＤＭＳＯを添加して同様にインキュベートし測定したものをコントロールとした。
【００３９】
各反応溶液における４０５ｎｍの吸光度の増加の測定結果を図５に示す。横軸はＳ２４４４添加後の反応時間、縦軸は４０５ｎｍの吸光度を示す。また、図６に、図５の結果から算出した各ペプチドのＰＡＩ阻害活性を示す。横軸は反応溶液に添加したペプチド濃度、縦軸はＰＡＩ−１阻害活性（ｕＰＡのみを添加した反応溶液におけるＳ２４４４水解能を１００％として算出した活性（％））を示す。この結果、ＦＭＧＱＶペプチドは濃度依存性にＰＡＩ−１のｕＰＡ活性阻害活性を抑制し、残存ｕＰＡ活性が検出できた。特に、１ｍＭのＦＭＧＱＶペプチド存在下では、ｕＰＡ残存活性はほぼＰＡＩ−１非存在時（図中、「ｕＰＡ  ａｌｏｎｅ」）と同等であった。一方、溶媒として使用したＤＭＳＯ及びＦＭＲＱＶペプチドは、ｕＰＡ活性阻害活性を阻害せず、残存ｕＰＡ活性が検出できなかった。
【００４０】
実施例１及び２の結果から、野生型のアミノ酸配列であるＦＭＧＱＶペプチドは、ｔＰＡ−ＰＡＩ−１高分子複合体形成を阻害し、ＰＡＩ−１のｕＰＡ活性阻害活性を抑制したが、Ｇ３７４Ｒ変異型ＰＡＩ−１のアミノ酸配列であるＦＭＲＱＶペプチドは、どちらの効果も示さなかった。ＦＭＧＱＶペプチドは、Ｇ３７４近傍と対応するｓ１ＢのＮＶＶＦＳ配列部位との結合を競合的に阻害し、高次構造を変化させてＰＡＩ−１活性を阻害したと推察された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明に係るＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１活性の阻害方法を用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＡＩ−１活性を効果的に抑制することができるため、当該ＰＡＩ−１阻害剤等は、血栓症や多臓器不全の予防や治療の分野や、より優れたＰＡＩ−１阻害剤の開発や製造等の分野で利用が可能である。
【図１】
2015147744.tif 000002
【図５】
2015147744.tif 000003
【図６】
2015147744.tif 000004
【図２】
2015147744.tif 000005
【図３】
2015147744.tif 000006
【図４】
2015147744.tif 000007
【配列表】
2015147744000001.app