(57)【要約】      （修正有）【課題】アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上する方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列における３１２位のヒスチジンに対応する位置、または別のアミノ酸配列における３１０位のヒスチジンに対応する位置のアミノ酸を共通に有するアマドリアーゼに対して、１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸もしくはリン酸エステルまたはこれらの塩を共存させることにより得られるアマドリアーゼ含有組成物。【効果】熱安定性、保存安定性等に優れたアマドリアーゼ含有組成物および糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼを含む組成物に２ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を含むことを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項２】
配列番号３０に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３０における３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼを含む組成物に２ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を含むことを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項３】
アマドリアーゼが糖化ジペプチドに作用するアマドリアーゼである請求項１または請求項２記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項４】
アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸もしくはリン酸エステルまたはこれらの塩を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項５】
ジカルボン酸がリンゴ酸、シュウ酸、マロン酸、スクシン酸、コハク酸、グルタル酸、α−ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、酒石酸、タルトロン酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、及びアスパラギン酸からなる群より選択され、
トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、及び２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸からなる群より選択され、
ポリカルボン酸がポリグルタミン酸からなる群より選択され、
リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、リン酸エステルがホスホグリセリン酸及びホスホエノールピルビン酸からなる群より選択される、請求項４に記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項６】
前記アマドリアーゼを含む組成物が、アセトアミドグリシン、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＡＤＡ（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、コラミン塩酸、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）、グリシンアミド、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）、ＡＭＰＳＯ（N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＢＳ（4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）及びこれらの混合物からなる群より選択されるグッド緩衝剤を含むものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項７】
緩衝剤の濃度が２０ｍＭ以上である、請求項６に記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。
【請求項８】
配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼおよび２ｍＭ以上のアニオンを含む、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。
【請求項９】
配列番号３０に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３０における３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼおよび２ｍＭ以上のアニオンを含む、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。
【請求項１０】
アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸もしくはリン酸エステルまたはこれらの塩を含有する、請求項８または請求項９に記載のアマドリアーゼ含有組成物。
【請求項１１】
ジカルボン酸がリンゴ酸、シュウ酸、マロン酸、スクシン酸、コハク酸、グルタル酸、α−ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、酒石酸、タルトロン酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、及びアスパラギン酸からなる群より選択され、
トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、及び２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸からなる群より選択され、
ポリカルボン酸がポリグルタミン酸からなる群より選択され、
リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、リン酸エステルがホスホグリセリン酸及びホスホエノールピルビン酸からなる群より選択される、請求項１０記載のアマドリアーゼ含有組成物。
【請求項１２】
アセトアミドグリシン、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＡＤＡ（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、コラミン塩酸、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）、グリシンアミド、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）、ＡＭＰＳＯ（N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＢＳ（4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）及びこれらの混合物からなる群より選択されるグッド緩衝剤を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ含有組成物。
【請求項１３】
緩衝剤の濃度が２０ｍＭ以上である請求項１２に記載のアマドリアーゼ含有組成物。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ組成物を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項１５】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマドリアーゼ含有組成物の安定化方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降「αＦＶＨ」と表す。）もしくはα−フルクトシルバリン（以降「αＦＶ」と表す。）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照。）。実際には、より正確な測定値を得る目的から、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。
【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう。）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。
【０００６】
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜１１参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
【０００７】
糖化ヘモグロビンを測定する目的で、アマドリアーゼを含有する測定用組成物や測定用キットを製造するにあたり、その保存性を向上させるという観点から、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させることが求められている。熱安定性を向上させることにより、長期保存が可能になり、あるいは、常温流通が可能になり、また、高温環境下での流通や使用が可能になることが期待される。
【０００８】
従来、アマドリアーゼの熱安定性を向上させるための技術としては、アマドリアーゼの数個のアミノ酸を置換することにより熱安定性を向上させる手法が挙げられる。具体的には、変異型Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０株由来アマドリアーゼおよび変異型Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ１８５４７株由来アマドリアーゼ、変異型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、変異型Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ株由来フルクトシルペプチドオキシダーゼが報告されている（例えば、特許文献１６、１７参照。）。中でも、特許文献１６において開示されている大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ３２）株が生産する変異型アマドリアーゼは、従来のアマドリアーゼと比較して非常に優れた熱安定性を示し、６０℃、３０分間の熱処理においても８１％の残存活性を維持することが示されている。また、特許文献１７において開示されているＰｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ株由来変異型フルクトシルペプチドオキシダーゼＩＥ３５３−Ｆ２８２Ｙは、５０℃、１０分間の熱処理において９２％の残存活性を維持することが示されている。また、変異を導入することなくある程度の熱安定性を有する天然型アマドリアーゼもいくつか見いだされている。具体的には、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ  ＮＢＲＣ７５９０株由来の真核型ケトアミンオキシダーゼは、４５℃、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ  ＹＨ９２３株由来の真核型ケトアミンオキシダーゼは、５０℃、３０分間の熱処理で８０％の残存活性を示している（例えば、特許文献９参照。）。また、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ株由来フルクトシルペプチドオキシダーゼは、５０℃、１０分間の熱処理で７５％の残存活性を示している（例えば、特許文献１７参照。）。さらに、アマドリアーゼそのものに対する改変ではなく、アマドリアーゼと共存させてその安定性を向上させるという観点からの検討もなされている。具体的には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．  ＮＩＳＬ  ９３３０株由来アマドリアーゼを含んだ溶液に、５ｍＭのエチレンジアミン４酢酸および３％のグリシンを添加した際は、３０℃、７日間保存後において７９％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献１８参照。）。また、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ＩＦＯ−９９７２株由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含んだ溶液に、３％のＬ−アラニン、３％のグリシンまたは３％のザルコシンを添加した際は、３７℃、２日間保存後において１００％の残存活性を維持していることが示されている（例えば、特許文献１９参照。）。
【０００９】
アマドリアーゼに変異を導入し界面活性剤耐性を向上させたことが報告されている（例えば、特許文献２０参照）。特許文献２０には、界面活性剤の存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は低下を軽減する化合物も記載されているが、特定の変異や特定の化合物によりアマドリアーゼの界面活性剤耐性が向上したとしても、熱安定性は必ずしも向上するとは限らない。
【００１０】
しかしながら、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法にはさらなる知見が求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２０１３／１００００６号
【特許文献１７】特開２０１０−１１５１８９号公報
【特許文献１８】特開２００６−３２５５４７号公報
【特許文献１９】特開２００９−０００１２８号公報
【特許文献２０】国際公開第２０１５／０２０２００号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  １０４−１１，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，  ３５８−６６，  ２０１０
【非特許文献３】Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０２，  ２４１−３，  ２００６
【非特許文献４】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２，  ４９９−５０５，  １９９６
【非特許文献５】Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８，３４４−５０，２００２
【非特許文献６】Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６，６２５−３２，２００４
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，  ４８７−９１，１９９５
【非特許文献８】Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４，  ８１３−８１９，  ２００７
【非特許文献９】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  １２５６−６１，  ２００２
【非特許文献１０】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  ２３２３−２９，  ２００２
【非特許文献１１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７，  ２７−３２，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上する方法、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、特定の位置に特定のアミノ酸を有する複数のアマドリアーゼに対して、ある種のアニオンを共存させることにより得られるアマドリアーゼ含有組成物が前記アニオンを共存させない場合と比較して、熱安定性が向上することを見出した。そして、このような特定のアニオンを共存させたアマドリアーゼ含有組成物を用いることにより、熱安定性が向上した糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
[１]  配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼを含む組成物に２ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を含むことを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[２]  配列番号３０に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３０における３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼを含む組成物に２ｍＭ以上のアニオンを共存させる工程を含むことを特徴とする、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[３]  アマドリアーゼが糖化ジペプチドに作用するアマドリアーゼである[１]または[２]記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[４]  アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸もしくはリン酸エステルまたはこれらの塩を含む、[１]〜[３]のいずれかに記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[５]  ジカルボン酸がリンゴ酸、シュウ酸、マロン酸、スクシン酸、コハク酸、グルタル酸、α−ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、酒石酸、タルトロン酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、及びアスパラギン酸からなる群より選択され、
トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、及び２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸からなる群より選択され、
ポリカルボン酸がポリグルタミン酸からなる群より選択され、
リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、リン酸エステルがホスホグリセリン酸及びホスホエノールピルビン酸からなる群より選択される、[４]に記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[６]  前記アマドリアーゼを含む組成物が、アセトアミドグリシン、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＡＤＡ（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、コラミン塩酸、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）、グリシンアミド、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）、ＡＭＰＳＯ（N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＢＳ（4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）及びこれらの混合物からなる群より選択されるグッド緩衝剤を含むものである、[１]〜[５]のいずれかに記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[７]  緩衝剤の濃度が２０ｍＭ以上である、[６]に記載のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させる方法。   
[８]  配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１における３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼおよび２ｍＭ以上のアニオンを含む、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。   
[９]  配列番号３０に示すアミノ酸配列と８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３０における３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼおよび２ｍＭ以上のアニオンを含む、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物。   
[１０]  アニオンが１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸、リン酸もしくはリン酸エステルまたはこれらの塩を含有する、[８]または[９]に記載のアマドリアーゼ含有組成物。   
[１１]  ジカルボン酸がリンゴ酸、シュウ酸、マロン酸、スクシン酸、コハク酸、グルタル酸、α−ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、酒石酸、タルトロン酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、及びアスパラギン酸からなる群より選択され、
トリカルボン酸がクエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、及び２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸からなる群より選択され、
ポリカルボン酸がポリグルタミン酸からなる群より選択され、
リン酸がリン酸塩及びピロリン酸塩からなる群より選択され、リン酸エステルがホスホグリセリン酸及びホスホエノールピルビン酸からなる群より選択される、[１０]記載のアマドリアーゼ含有組成物。   
[１２]  アセトアミドグリシン、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＡＤＡ（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、コラミン塩酸、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸）、グリシンアミド、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、トリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）、ＡＭＰＳＯ（N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＢＳ（4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）及びこれらの混合物からなる群より選択されるグッド緩衝剤を含む、[８]〜[１１]のいずれかに記載のアマドリアーゼ含有組成物。   
[１３]  緩衝剤の濃度が２０ｍＭ以上である[１２]に記載のアマドリアーゼ含有組成物。 
[１４]  [８]〜[１３]のいずれかに記載のアマドリアーゼ組成物を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法。   
[１５]  [８]〜[１３]のいずれかに記載のアマドリアーゼ組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供することができる。   
本発明のアマドリアーゼ含有組成物は、常温流通や長距離輸送等、酵素が処方されたキットがより過酷な温度条件にさらされることを想定した場合、あるいは、製造工程において加熱処理等を施すことが想定される酵素センサーとしての用途等を考えた場合等において、これまでに提案されたアマドリアーゼ含有組成物よりも、さらに優れた耐熱性、保存性を有することが期待され、糖化ヘモグロビン測定用組成物およびキットの流通において、また、センサー等の用途開発において、多大に貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】図１−１は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列のアライメントである。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ２酢酸またはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
【００１９】
本発明に用いるアマドリアーゼの種類は、限定されるものではなく、各種公知のアマドリアーゼを含み得るが、本発明に用いるアマドリアーゼは、対応する特定の位置のアミノ酸残基が特定の残基であることを特徴とする。具体的には、本発明に用いるアマドリアーゼは、配列番号１に記載のアマドリアーゼにおける３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであることを特徴とする。または、配列番号３０に記載のアマドリアーゼにおける３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであることを特徴とする。
【００２０】
一態様において、本発明に用いるアマドリアーゼは、配列番号１または配列番号３０に示されるアミノ酸配と高い配列同一性（例えば、８０％以上、好ましくは、８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼおよび配列番号１または配列番号３０に示されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを含む。
【００２１】
本発明のアマドリアーゼは例えば、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ属、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ属、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ属、Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属、Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ属、Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属、Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ属、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属などの生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよいし、上記以外の生物種に由来し、上述の対応する特定の位置に特定のアミノ酸残基を有するものでもよい。
【００２２】
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、特開２０１３−１７６３５１号において、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７と称する組換え体プラスミド（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５９３）を保持する大腸菌が生産するＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）に対し、基質特異性改善型変異（Ｅ９８Ａ、Ｇ１０３Ｈ、Ｓ１５４Ｎ、Ｇ２６３Ｍ）と熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、カルボキシ末端３アミノ酸欠失（ΔＰＴＳ１））を導入したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２の遺伝子にコードされている。なお、このＣＦＰ−Ｔ７は、天然型のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対し、２７２位、３０２位および３８８位に人為的な変異を順次導入することにより獲得した３重変異体である（国際公開２００７／１２５７７９号参照）。そして、当該アマドリアーゼの３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンである。
【００２３】
また、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、国際公開２００４／１０４２０３号において、ｐＰＯＳＦＯＤ９２３と称する組み換えプラスミドを保持する大腸菌が生産するＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来ケトアミンオキシダーゼ（ＣｃＦＸ）のアミノ酸配列である。そして、当該アマドリアーゼの３１０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンである。
【００２４】
上記の２つのアマドリアーゼにおいてアミノ酸の位置を示す番号は配列番号１または配列番号３０に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
【００２５】
なお、本明細書において、配列番号１または配列番号３０を例示しているが、これは本発明の効果が配列番号１または配列番号３０で示されるアマドリアーゼに限定的であることや、あるいは、これらの配列とは異なるアマドリアーゼに対する効果よりも顕著に大きいことを示すものではない。本発明の効果は、対応する特定の位置にヒスチジンを有する各種のアマドリアーゼに共通的にみられるものであるから、アマドリアーゼ活性を有し、対応する特定の位置にヒスチジンを有するアマドリアーゼ全般が、本発明に包含される。例えば、本明細書中に例示する配列番号１と配列番号３０のアマドリアーゼの間のアミノ酸の同一性は８０％である。このような同一性の程度を有する複数のアマドリアーゼにおいて、本発明の効果が確認されていることからも、本発明の効果が、配列番号１あるいは配列番号３０に対し、同一性が同等、若しくは、より高い他のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼについても当然に発揮されるとの蓋然性が高いことが理解される。
【００２６】
本発明に使用できるアマドリアーゼは、上述の通り、対応する特定の位置にヒスチジンを有することを特徴とし、それ以外の位置において、任意の各種変異等を含んでいても良い。例えば、それらの各種変異の中には、耐熱性向上や基質特異性向上、生産性向上等に寄与する変異が含まれ得るが、特段に人為的な変異を導入していない天然型酵素を用いる場合であれ、何らかの変異等を人為的に導入している場合であれ、本発明の効果が発揮され、その熱安定性が向上している限り、いかなるアマドリアーゼを用いる場合についても、本発明に包含される。本発明に使用できるアマドリアーゼは、公知の各種文献等に記載の方法で入手・製造できるほか、市販品に関しては適宜購入することもできる。
【００２７】
（アミノ酸配列の同一性）
アミノ酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００２８】
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１または配列番号３０に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。   
【００２９】
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えば、リップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００３０】
図１に種々の公知の生物種由来のアマドリアーゼの配列を例示する。配列番号１で示されるアミノ酸配列を最上段に示す。また、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を上から５段目に示す。図１に示される各種配列は、いずれも配列番号１の配列と７０％以上の同一性を有し、公知のアルゴリズムを用いて整列させた。図中に、本発明の変異体における変異点を示す。なお、配列番号３０の配列を基準にしても、対応する位置は変わらない。図１からＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる  。図１には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のアマドリアーゼ（配列番号１）、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ（配列番号２７）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２８）、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号２９）、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３０）、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号３１）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３２）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３３）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３４）、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３５）およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号３６）のアミノ酸配列を示してある。
【００３１】
（対応する位置）
本発明において、「配列番号１における３１２位のヒスチジン、または配列番号３０における３１０位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１または配列番号３０に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３１２位のヒスチジン、または配列番号３０のアマドリアーゼの３１０位のヒスチジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。
【００３２】
すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３１０位のヒスチジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３１３位のヒスチジン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３０８位のヒスチジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１２位のヒスチジン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１０位のヒスチジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３１２位のヒスチジンである。
【００３３】
（添加成分）
本発明は、上述の任意のアマドリアーゼに対し、任意の添加成分を共存させることにより、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上できることを特徴とする。これまでに、アマドリアーゼ自体を改変して熱安定性を向上させる試みや、あるいは、天然型の状態で比較的熱安定性が高いアマドリアーゼを探索する試みが多く行われてきた一方で、各種アマドリアーゼに対して効果的な熱安定性向上剤や、組成物として熱安定性が向上しているアマドリアーゼ含有組成物の知見は乏しかった。本発明は、特定の１変異体に限定的な知見ではなく、ある特定のアミノ酸残基に着目して、一定の同一性を有する複数のアマドリアーゼに共通の効果を奏する熱安定性向上成分として、アニオンが有効であることを見出した。
【００３４】
本発明において、アマドリアーゼと共存させるアニオンの濃度は、アマドリアーゼ含有組成物中、２ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、さらに好ましくは４０ｍＭ以上、特に好ましくは５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上であることを特徴とする。このような濃度でアニオンを共存させることにより、共存させない場合と比較して、アマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を良好に向上させることができる。なお、アマドリアーゼと共存させるアニオンの濃度は、後述する緩衝剤を用いる場合、当該緩衝剤の量に応じて変化させてもよい。
【００３５】
（アニオンの種類）
上記のアニオンを、単独で、あるいは複数組み合わせて、本発明に使用することができる。これらのアニオンを共存させることにより、特定モチーフを有する各種アマドリアーゼの熱安定性を向上させることができる。本発明におけるアニオンとしては、本発明のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させるものであれば特に制限は無く、例えば、カルボキシル基含有化合物、ハロゲン化合物、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、タンパク質、ペプチド、アミノ酸などが挙げられる。カルボキシル基含有化合物としては、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ポリカルボン酸化合物などが挙げられる。特に、本発明に用いる好ましいアニオンは、１種類以上のジカルボン酸、トリカルボン酸もしくはリン酸またはこれらの塩である。
【００３６】
また、本発明に用いるジカルボン酸は、本発明のアマドリアーゼ含有組成物の熱安定性を向上させるものであれば特に制限は無いが、例えば、一態様において、シュウ酸、マロン酸、スクシン酸、コハク酸、グルタル酸、α−ケトグルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、グルタコン酸、リンゴ酸、酒石酸、タルトロン酸、オキサロ酢酸、マレイン酸、ムコン酸、メサコン酸、シトラコン酸、メコン酸、３−３’ジメチルグルタル酸、イタコン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸等が好ましいジカルボン酸として例示される。また、一態様において、本発明に用いる好ましいトリカルボン酸としては、クエン酸、イソクエン酸、アコニット酸、トリメシン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸等が挙げられる。また、一態様において、本発明に用いる好ましいポリカルボン酸としては、ポリグルタミン酸等が挙げられる。さらに、一態様において、本発明に用いる好ましいリン酸塩としては、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩、ピロリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。さらに、一態様において、本発明に用いるアニオンとしては、リン酸及びカルボン酸を有するリン酸エステル、例えばホスホエノールピルビン酸またはホスホグリセリン酸を用いてもよい。
【００３７】
（アマドリアーゼ及びアニオンを含むアマドリアーゼ含有組成物）
上述のアニオンを各種任意のアマドリアーゼと共存させることにより、熱安定性が向上したアマドリアーゼ含有組成物及が得られる。   
本発明において、アニオンとアマドリアーゼを共存させる方法は、限定されるものではないが、例えば、溶液中で両成分を混合する方法が挙げられる。   
本発明のアマドリアーゼ及びアニオンを含むアマドリアーゼ含有組成物には、本発明の効果を妨げない限り、その他の各種目的で混合される任意の成分が添加されていてもよい。例えば、ｐＨ調整剤（緩衝剤）、界面活性剤による影響を低減する化合物等が挙げられる。
【００３８】
（アマドリアーゼ及びアニオンを含む糖化ヘモグロビン測定用組成物）
上述のアマドリアーゼ含有組成物に、その他の糖化ヘモグロビン測定試薬、糖化ヘモグロビン測定用キットに必要とされる各種成分をさらに組み合わせて、糖化ヘモグロビン測定用組成物を得ることができる。   
例えば、本発明のアマドリアーゼ含有組成物に対し、αＦＶＨ測定用試薬、αＦＶＨを切り出すためのプロテアーゼまたはペプチダーゼ、その他公知の安定化物質や緩衝溶液を組み合わせて、糖化ヘモグロビン測定用組成物を製造できる。
【００３９】
（本発明のアニオンを共存させることによる、熱安定性の向上）
本発明において、アニオンを共存させることによるアマドリアーゼの熱安定性の向上とは、アニオンを共存させないものと比較した場合に、例えば、５５℃、１０分間の熱処理後の熱安定性が向上していることをいう。具体的には、アニオンを共存させないものと比較して、本明細書中に記載の活性測定方法および熱安定性評価方法に記載した反応条件下で、所定の熱処理、例えば、「５５℃、１０分間」等の熱処理後の残存活性（％）が、本発明の変異を導入する前と比較して３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは４０％以上向上していることを特徴とする。
【００４０】
あるいは、一態様において、アニオンを共存させることによるアマドリアーゼの熱安定性が向上しているとは、アニオンを共存させることによるアマドリアーゼの残存活性（％）を、アニオンを共存させないもの残存活性（％）で割ることにより得られる値（残存活性比率）が、１より大きい、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、４以上、さらに好ましくは５以上、６以上、向上していることをいう。
【００４１】
このような、共存させることによりアマドリアーゼの熱安定性を向上させるアニオンを本明細書において、「アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤」、または単に「安定化剤」と呼ぶことがある。また本明細書においてアマドリアーゼまたはアマドリアーゼ含有組成物についていう安定化とは、特に断らない限り、当該アマドリアーゼの熱安定性を向上または維持することをいう。   
アマドリアーゼの活性測定および残存活性測定方法については後述する。
【００４２】
（アマドリアーゼ含有組成物中のアマドリアーゼの濃度）
本発明における、アマドリアーゼ含有組成物中のアマドリアーゼの濃度は限定されるものではないが、例えば、保存中あるいは糖化ヘモグロビン測定時における終濃度として、アニオン１０ｍＭ当たり０．０１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌである。   
ここで、測定時における終濃度、とは最終的に成分を希釈して糖化ヘモグロビン測定を行うときの濃度をいう。したがってキット中では、測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。
【００４３】
（緩衝剤）
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲で緩衝能を有する緩衝剤又は緩衝液を適宜加えてよい。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は１以上の緩衝剤を包含するものとする。緩衝液とは溶液のｐＨを一定範囲に保つ緩衝作用（緩衝能）のある溶液のことをいい、緩衝剤とは溶液に緩衝作用を付与する物質をいう。緩衝剤は、弱酸を例にとると、弱酸とその塩から構成され、この場合、当該塩を共役塩と呼ぶ。ある緩衝剤についての濃度は、当該緩衝剤のベースとなる化合物の単独形態とその共役塩の形態とを合計したベース化合物についての濃度をいう。例えば１００ｍＭのグッド緩衝剤というとき、これは終濃度として溶液に含まれるグッド緩衝剤化合物及びその共役塩を合計したグッド緩衝剤化合物濃度が１００ｍＭであることをいう。
【００４４】
本発明のキット又は組成物に用いることのできる緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤、リン酸及び／又はその塩を含むリン酸緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤又はリン酸ナトリウム緩衝剤、有機酸緩衝剤及び／又はその塩を含む有機酸緩衝剤、例えばトリカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むトリカルボン酸緩衝剤、例えばクエン酸及び／又はその塩を含むクエン酸緩衝剤、ホウ酸及び／又はその塩を含むホウ酸緩衝剤、ジカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むジカルボン酸緩衝剤、例えばリンゴ酸及び／又はその塩を含むリンゴ酸緩衝剤、モノカルボン酸緩衝剤及び／又はその塩を含むモノカルボン酸緩衝剤、例えば酢酸緩衝剤及び／又はその塩を含む酢酸緩衝剤等の緩衝剤、並びにそれらの混合物が挙げられる。
【００４５】
グッド緩衝剤（グッドバッファーともいう）は、一般にはNorman Goodらによって提唱された生化学実験に適した種々の緩衝剤等を指す。Goodらは1966年に12種類の緩衝剤を提唱した（Goodら、(1966)、Biochemistry 5 (2): 467-477）。その後、他にも緩衝剤が追加され、以下の20種が提唱されている：アセトアミドグリシン、ＡＣＥＳ（N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸）、ＡＤＡ（N-(2-アセトアミド)イミノ二酢酸）、ＢＥＳ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎ（N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、コラミン塩酸、ＥＰＰＳ（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸、ＨＥＰＰＳと呼ぶこともある）、グリシンアミド、ＨＥＰＥＳ（4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、ＨＥＰＰＳＯ（N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＥＳ（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)）、ＴＡＰＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸）、及びトリシン（N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン）（Goodら, (1972) Methods Enzymol. 24: 53-68；Goodら(1980) Anal. Biochem. 104 (2): 300-310）。上記の他にも、必ずしもGoodらによって提唱されたものではないが、ＡＭＰＳＯ（N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＡＢＳ（4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）、及びＤＩＰＳＯ（3-(N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）などの化合物もpKa等が評価され、いわゆるグッド緩衝剤として一般に受け入れられている。本明細書においてグッド緩衝剤というとき、この用語は、アセトアミドグリシン、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、コラミン塩酸、ＥＰＰＳ、グリシンアミド、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシン、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＢＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ及びこれらの混合物を包含するものとする。
塩としてはベース化合物のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩及びアンモニウム塩が挙げられるがこれに限らない。
【００４６】
本発明の緩衝剤は、適当な濃度で本発明のキット又は組成物に用いることができる。通常、本発明のキット又は組成物に添加する本発明の緩衝剤の量は、測定溶液での終濃度に基づいて算出することができる。ある実施形態において測定溶液における本発明の緩衝剤の終濃度は、好ましくは当該測定溶液に生じうるpH変化を緩衝するのに十分な濃度である。本発明の緩衝剤の終濃度は、例えば１ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍM以上、４０ｍM以上、例えば５０ｍＭ以上、１Ｍ以下、５００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、例えば１ｍＭ〜１Ｍ、５ｍＭ〜５００ｍＭ、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、２０ｍＭ〜３００ｍＭ、３０ｍＭ〜３００ｍＭ、４０ｍＭ〜３００ｍＭ、４０ｍＭ〜２００ｍＭ、５０ｍＭ〜２００ｍＭ、例えば５０ｍＭ〜１００ｍＭであり得る。
【００４７】
本発明の緩衝剤としてＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＴＥＳ緩衝剤またはＢＥＳ緩衝剤を用いる場合、その濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭ、例えば２０ｍＭ〜３００ｍＭ、例えば３０ｍＭ〜３００ｍＭ、例えば４０ｍＭ〜３００ｍＭ、例えば５０ｍＭ〜３００ｍＭ、例えば５０ｍＭ〜２００ｍＭであり得る。本発明の緩衝剤はそのｐＫａを考慮し、目的のｐＨを達成するために複数を適宜組み合わせてよい。組み合わせはＨＥＰＥＳ緩衝剤とＴＥＳ緩衝剤との組み合わせのようにグッド緩衝剤同士の態様に限られず、グッド緩衝剤と他の緩衝剤とを組み合わせてもよい。   
なお、組成物に用いる緩衝剤の量は、組成物にアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤も添加する場合、当該安定化剤の量に応じて変化させてもよい。
【００４８】
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
【００４９】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、フルクトシルバリンを基質として用いる。なお、酵素力価は、フルクトシルバリンを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。フルクトシルバリンは、阪上らの方法に基づき合成、精製することができる（特開２００１−９５５９８号公報参照）。
【００５０】
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液
４．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマンバイオケミファ社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１Ｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、同仁化学社製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度  ５ｍＭ）
フルクトシルバリン４１７ｍｇをイオン交換水に溶解して１０ｍｌに定容する。
【００５１】
Ｂ．測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡｓ）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔＡ０）を測定した。３７℃で１分間あたりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出する。   
活性（Ｕ／ｍｌ）＝  ｛（ΔＡｓ−ΔＡ０）×３．０×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．１）
ΔＡｓ  ：  反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔＡ０  ：  対照液の１分間あたりの吸光度変化
３９．２：  反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．５  ：  １ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
ｄｆ    ：  希釈係数
【００５２】
（熱安定性測定方法）
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液に約０．５Ｕ／ｍｌのアマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品が含まれる溶液を６００μｌ調製し、この希釈溶液１００μｌを５５℃にて１０分間加温する。上述のＢ．の方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、加熱前の活性を１００とした場合の残加熱後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求めることにより、熱安定性を評価する。
【００５３】
（緩衝剤評価方法）
上記の熱安定性測定方法において、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりに種々の緩衝剤を用いてアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことで、緩衝剤によるアマドリアーゼの活性残存への寄与を評価することができる。例えば５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）等を用いることができる。他の条件及び手順は上記の熱安定性測定方法と同様としうる。
【００５４】
（アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の評価方法）
上記の熱安定性測定方法において、種々の安定化剤をさらに添加してアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことで、当該安定化剤の作用を評価することができる。具体的には、例えば、５ｍＭの添加成分を安定化剤として評価するということは、上述の熱安定性測定法において、添加成分を共存させない状態で５５℃にて１０分間加温した際の残存活性（％）を１とした場合の、終濃度５ｍＭの添加成分を共存させた状態で加温した際の残存活性（％）の割合を比率として算出することで評価できる。添加成分がアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤として効果があるということは、該比率が、１より大きい、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、４以上、さらに好ましくは５以上、６以上、向上していることをいう。評価対象であるアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤が緩衝作用をも有する化合物である場合、緩衝剤を溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度で使用しつつ（例えばＨＥＰＥＳ緩衝剤を５００ｍＭ（ｐＨ  ７．０）にて使用）、該安定化剤を低濃度で、すなわち溶液のｐＨを変化させるには十分でない低濃度で用いることができる。溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度とは、当該溶液に添加する他の試薬に起因するｐＨ変動が生じることなく、ｐＨが一定の範囲に保たれる濃度のことをいう。ｐＨの設定値は、アマドリアーゼが安定に存在し得る範囲（例えば、ｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜８）ならばいずれでもよい。溶液に緩衝能を付与するには十分でない濃度とは、当該溶液に他の試薬を添加するとｐＨ変動が生じｐＨが一定範囲から逸脱する濃度をいう。これらの濃度は溶液に添加される他の試薬の種類及び量に応じて変化するが、当業者であれば慣用法により該濃度を適宜決定することができる。他の条件及び手順は上記の熱安定性測定方法と同様とする。
【００５５】
（併用作用）
緩衝剤と、本発明のアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤とを併用した場合のアマドリアーゼ安定作用（熱安定性）を評価するために、対応する特定の位置にヒスチジンを有するアマドリアーゼを含む溶液に、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤及び緩衝剤を、適宜濃度調整しつつ添加し、アマドリアーゼの残存活性を測定することもできる。他の条件及び手順は、上記の熱安定性測定方法と同様としうる。
【００５６】
緩衝剤と安定化剤とを併用した場合に、前記緩衝剤のみまたは安定化剤のみを用いた場合と比較してアマドリアーゼの熱安定性がさらに向上していることがある。このような併用により得られる熱安定性のさらなる向上を、本明細書において、相乗効果という。本発明のアマドリアーゼを含む組成物は適宜、上記の緩衝剤と上記の安定化剤とを併用し、所望の相乗効果を得ることができる。
【００５７】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【００５８】
[実施例１]
（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼに対する本発明の熱安定性向上効果の確認）
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡの調製およびアマドリアーゼの生産
配列番号１は基質特異性改善型変異（Ｅ９８Ａ、Ｇ１０３Ｈ、Ｓ１５４Ｎ、Ｇ２６３Ｍ）と熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙ、カルボキシ末端３アミノ酸欠失（ΔＰＴＳ１））を導入したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２の遺伝子にコードされている（特開２０１３−１７６３５１号公報参照、以下、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）。このＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１遺伝子（配列番号２）を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）株（特開２０１３−１７６３５１号公報参照）を、ＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。
【００５９】
次いで、前記培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、ＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を抽出して精製し、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１のＤＮＡ２．５μｇを得た。
【００６０】
得られた上記組換え体プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。その後、菌体をｐＨ７．０の０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、アマドリアーゼ粗酵素液１．５ｍｌを調製した。本アマドリアーゼは、本発明の配列番号１における３１２位のヒスチジンに対応するアミノ酸残基を有するアマドリアーゼの一例である。
【００６１】
（２）各種緩衝剤存在下におけるアマドリアーゼの熱安定性評価
ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．０）とリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）を用いた場合の、緩衝剤の濃度によるアマドリアーゼの熱安定性の変化に関し、検討を行った。
上記の方法により取得したＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１粗酵素液をサンプルとし、各種緩衝剤、具体的にはリン酸とリン酸カリウムとを含むリン酸緩衝剤（ｐＨ７．０）、ＨＥＰＥＳとそのナトリウム塩とを含むＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ７．０）を、複数の濃度で存在させた場合の熱安定性評価を行った。熱安定性の評価は、上述の「熱安定性測定法」および「緩衝剤評価方法」に従った。結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2015177790.tif 000002
【００６３】
表１に示す通り、本実施例の条件下では、リン酸緩衝剤の濃度を上昇させると、濃度依存的にＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の熱安定性が向上する傾向が確認された。一方、ＨＥＰＥＳ緩衝剤については、若干ながら濃度依存的な熱安定性向上の傾向がみられるとはいえ、リン酸緩衝剤を存在させた場合と比較すると、熱安定性向上効果は非常に乏しいことが確認された。例えば、リン酸緩衝液の場合、濃度１０ｍＭの場合には１８％であった残存活性が、濃度５００ｍＭでは７８％まで向上したのに対し、ＨＥＰＥＳ緩衝液の場合は、濃度１０ｍＭで存在させた場合の残存活性はわずか３．５％であり、濃度５００ｍＭにした場合でも残存活性は１０％にとどまった。
【００６４】
（３）各添加成分の共存下におけるアマドリアーゼの熱安定性評価
上記のように得られたアマドリアーゼの粗酵素液をサンプルとし、上述の「アマドリアーゼ活性の測定方法」「熱安定性評価方法」「アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の評価方法」法に従って、種々の添加成分を共存させた場合のアマドリアーゼの熱安定性評価を行った。   
【００６５】
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌに、終濃度の３０倍濃度の添加成分含有溶液または超純水を２０μｌ加えて、アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約０．５Ｕ／ｍｌとなるように混合し、総体積が６００μｌとなるように超純水を混合した。このうち、１００μｌを５５℃にて１０分間加温し、上述のＢ．の方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、上述の熱安定性評価方法に従って、残存活性（％）を求めることにより、熱安定性を評価した。さらに、添加成分含有溶液の代わりに超純水を混合した場合を基準として、上述のアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の評価方法に従って、各種添加成分が安定化剤となり得るか否かの評価を行った。
【００６６】
なお、安定化効果を評価する対象となる各種の成分を添加して、その熱安定化効果を評価する際には、各種評価対象成分を添加することによってアマドリアーゼを含有するサンプル溶液のｐＨが変化し、ｐＨの違いによる安定性の差異が熱安定性の評価に影響して正確な熱安定性が測定できなくなることを防ぐ目的で、添加成分を共存させてもサンプル溶液のｐＨが変化しないように、緩衝液として５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。実際に、各種の添加成分を共存させた時にもｐＨは７．０に維持されていることを確認した後、熱処理を行った。また、上記の（２）での検討により、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液は、緩衝能を有する一方で、アマドリアーゼの熱処理後の残存活性は１０％にとどまることが確認されている。
【００６７】
ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１粗酵素を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液に対し、種々の安定化効果の評価対象成分を共存させ、上記の熱安定性測定法に従って、熱安定性評価を行った。結果の一部を表２〜６に示す。
【００６８】
なお、表２〜６における「比率」とは、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。表２はリン酸を添加した場合、表３はクエン酸を添加した場合、表４はリンゴ酸を添加した場合、表５は酢酸を添加した場合、表６はＭＥＳを添加した場合の熱安定性評価の結果を示す。
【００６９】
【表２】
2015177790.tif 000003
【００７０】
表２に示す通り、本実施例の条件下では、リン酸を添加した際に、リン酸を添加しない場合と比較して、添加濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が高い、すなわち、熱安定性が向上していることが明らかとなった。特に、５ｍＭ  リン酸を添加した際に、５５℃、１０分間加温後の残存活性が２５．７％となり、リン酸を添加しない場合での残存活性が１０％であったのと比較して大幅に残存活性が向上した。以上のことから、５ｍＭ以上のリン酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示された。
【００７１】
また、表１、２を参照し、５０ｍＭ  リン酸緩衝液下における５５℃、１０分加温後のＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性を比較すると、リン酸を添加することなく５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液のみの場合では残存活性が１０％であり、リン酸を添加することなくリン酸緩衝液のみの場合では残存活性が３１％であった（表１）。そして、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液と５０ｍＭ  リン酸を共存させた場合には、残存活性が７４％と飛躍的に向上した（表２）。
【００７２】
リン酸を添加することにはアマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示され、その中でも、ＨＥＰＥＳとリン酸を共存させることによって、アマドリアーゼの熱安定性が顕著に向上する相乗効果が示された。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
同様に、表３に示す通り、本実施例の条件下では、クエン酸を添加し、熱処理を行った。なお、緩衝液中のｐＨを一定にするために、用いたクエン酸はｐＨ７．０に調製したものを用いた。その結果、クエン酸を添加しない場合と比較して、添加濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が高い、すなわち、熱安定性が向上していることが明らかとなった。特に、２ｍＭ  クエン酸を添加した際に、５５℃、１０分間加温後の残存活性が２６．５％となり、クエン酸を添加しない場合での残存活性が１０％であったのと比較して大幅に残存活性が向上した。以上のことから、２ｍＭ以上のクエン酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示された。
【００７５】
【表４】
2015177790.tif 000005
【００７６】
同様に、表４に示す通り、本実施例の条件下では、リンゴ酸を添加し、熱処理を行った。なお、緩衝液中のｐＨを一定にするために、用いたリンゴ酸はｐＨ７．０に調製したものを用いた。その結果、リンゴ酸を添加しない場合と比較して、添加濃度依存的に、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が高い、すなわち、熱安定性が向上していることが明らかとなった。特に、５０ｍＭ  リンゴ酸を添加した際に、５５℃、１０分間加温後の残存活性が３２．０％となり、リンゴ酸を添加しない場合での残存活性が１０％であったのと比較して大幅に残存活性が向上した。以上のことから、５０ｍＭ以上のリンゴ酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが示された。
【００７７】
【表５】
2015177790.tif 000006
【００７８】
【表６】
2015177790.tif 000007
【００７９】
一方、表５、６に示す通り、添加成分として酢酸、ＭＥＳを試験した結果、濃度５０ｍＭで共存させた場合の残存活性は、何ら添加成分を加えない場合と同様であり、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の熱安定性の向上効果はみられなかった。
【００８０】
以上より、リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸には、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが確認された。
【００８１】
[実施例２]
（人為的に特定アミノ酸に変異を導入することによる熱安定性向上効果の確認）
次に、実施例１で見出されたＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１に対する本発明に係るアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の効果が、３１２位のヒスチジンに起因するものであることを確認する目的で、３１２位のヒスチジンを別のアミノ酸へと置換する変異を導入させた改変型アマドリアーゼを作製し、その効果を確認した。また、比較例として、３１２位のヒスチジン以外のヒスチジン、具体的には２６位のヒスチジンと９０位のヒスチジンをアスパラギンへと置換する変異を導入させた改変型アマドリアーゼを作製し、本発明に係るアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の効果を確認した。具体的には、下記の手順により、各変異体を作製した。
【００８２】
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００８３】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
【００８４】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、実施例１（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３１２位のヒスチジンがフェニルアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｆ）を得た。
【００８５】
続いて、同様に配列番号１記載のアミノ酸配列の３１２位のヒスチジンを他のアミノ酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型として、表７に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号４〜２２）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３１２位のヒスチジンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドを得た。
【００８６】
続いて、同様に配列番号１記載のアミノ酸配列の２６位のヒスチジンをアスパラギンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２３、２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６位のヒスチジンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−２６Ｎ）を得た。
【００８７】
続いて、同様に配列番号１記載のアミノ酸配列の９０位のヒスチジンをアスパラギンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５、２６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９０位のヒスチジンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−９０Ｎ）を得た。
【００８８】
（２）アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の添加時における各種改変型アマドリアーゼの熱安定性評価
上記のようにして得られた２１種の改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、実施例１記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた各粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた熱安定性測定方法に従って、種々の酸を添加した際のアマドリアーゼの熱安定性を評価した。その結果、３１２位のヒスチジンをフェニルアラニン、チロシン、アスパラギン、スレオニン、システイン、トリプトファン、アルギニン、リジン、グルタミン、バリン、セリンに置換した変異体において、熱処理を５５℃にて１０分間加温で行ったところ、５０ｍＭ  リン酸を添加しても、残存活性が５％以下となり、熱安定性が著しく低下した。変異体の種類によって、安定化剤を添加しない場合の残存活性も変化することと、安定化剤の効果を一定の条件で比較しやすくする目的を考慮し、安定化剤を添加しない場合の残存活性を約８〜２０％とするために、必要に応じ熱処理の条件を変化させた。各変異体の具体的な熱処理温度は表７に示す通りであり、熱処理時間はいずれも１０分で行った。結果の一部を表７〜９に示す。
【００８９】
なお、本実施例では、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）株由来のアマドリアーゼであるＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を変異元酵素としたため、表中に記載の「変異」の記載には、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１に既に導入済みの各種変異点は含めず、上記変異元酵素が有している３１２位のヒスチジンを変異させた、その変異箇所のみを記載した。また、表中の「比率」は、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。
【００９０】
【表７】
2015177790.tif 000008
【００９１】
表７に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性の比率は、安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリン酸を添加した際に７．４であったのに対し、３１２位のヒスチジンを置換した各変異体は大幅に安定化剤の効果が減少した。例えば、Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｆの残存活性は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリン酸を添加した際に、１．５となり、安定化剤の添加による熱安定性向上効果はほとんどみられなかった。
【００９２】
３１２位のヒスチジンを、ヒスチジンとアミノ酸構造が類似しているフェニルアラニン、チロシン、アスパラギンに置換した変異体においては、安定化剤無添加の条件下で３１２位がヒスチジンであるアマドリアーゼと比較した時に、熱安定性が低下し、そのため熱処理条件も緩和して評価を行う必要が生じた。表７に示す通り、いずれのアミノ酸に置換した場合も、リン酸による熱安定性向上効果は大きく減少したことが示された。すなわち、これらの変異体においては、リン酸を添加しても十分な熱安定性を有するアマドリアーゼ含有組成物を得ることはできなかった。
【００９３】
さらに、３１２位のヒスチジンを、ヒスチジンとアミノ酸構造が類似していない他のアミノ酸に置換した変異体においては、熱安定性が一層低下し、そのため熱処理条件もさらに緩和して評価を行う必要が生じた。表７に示す通り、いずれのアミノ酸に置換した場合も、リン酸による熱安定性向上効果は大きく減少したことが示された。すなわち、これらの変異体においては、リン酸を添加しても十分な熱安定性を有するアマドリアーゼ含有組成物を得ることはできなかった。
【００９４】
すなわち、リン酸等の安定化剤を添加することによる熱安定性向上の効果は、３１２位のアミノ酸がヒスチジンであることに起因し、この位置のアミノ酸がヒスチジンでなくなることにより失われるか大幅に低減することが確認された。
【００９５】
一方、比較例として、アマドリアーゼのアミノ酸配列中の他の位置に存在するヒスチジンが、このような熱安定性向上効果に寄与している度合を検証する目的で、３１２位のヒスチジン以外のヒスチジン、具体的には２６位、９０位のヒスチジンそれぞれアスパラギンに置換した変異体を作製し、同様に評価を行った。その結果、安定化剤無添加の場合の残存活性をそれぞれ１とした場合、５０ｍＭのリン酸を添加した際の熱安定性向上効果はそれぞれ、６．０、５．１となり、リン酸による熱安定性向上の効果は、維持されていることを確認できた。
【００９６】
すなわち、リン酸等のアマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤を添加することによる熱安定性向上の効果は、３１２位のアミノ酸がヒスチジンであることに起因し、３１２位以外の位置のヒスチジンが別のアミノ酸に置換されることによる影響は少ないことが確認された。
【００９７】
なお、３１２位のヒスチジンをプロリン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、メチオニンに置換した変異体に関しては、アマドリアーゼの生産性が著しく低下したために、熱安定性を評価することができなかった。
【００９８】
【表８】
2015177790.tif 000009
【００９９】
表８に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性の比率は、安定化剤無添加を１とした場合、５０ｍＭのクエン酸を添加した際に、６．０であったのに対し、３１２位のヒスチジンを、ヒスチジンとアミノ酸構造が類似しているフェニルアラニン、チロシン、アスパラギンに置換した各変異体では大幅に減少した。例えば、Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｆの残存活性は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのクエン酸を添加した際に、１．５となり、安定化剤の添加による熱安定性向上効果はほとんどみられなかった。さらに、３１２位のヒスチジンを、ヒスチジンとアミノ酸構造が類似していない他のアミノ酸に置換した変異体においては、熱安定性が一層低下し、そのため熱処理条件もさらに緩和して評価を行う必要が生じた。表８に示す通り、いずれのアミノ酸に置換した場合も、クエン酸による熱安定性向上効果は大きく減少したことが示された。すなわち、これらの変異体においては、クエン酸を添加しても十分な熱安定性を有するアマドリアーゼ含有組成物を得ることはできなかった。
【０１００】
【表９】
2015177790.tif 000010
【０１０１】
表９に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性の比率は、安定化剤無添加を１とした場合、５０ｍＭのリンゴ酸を添加した際に、３．２であったのに対し、３１２位のヒスチジンを、ヒスチジンとアミノ酸構造が類似しているフェニルアラニン、チロシン、アスパラギンに置換した各変異体は大幅に安定化剤の効果が減少した。例えば、Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１−３１２Ｆの残存活性は安定化剤添加なしを１とした場合、５０ｍＭのリンゴ酸を添加した際に、１．５となり、安定化剤の添加による熱安定性向上効果はほとんどみられなかった。さらに、３１２位のヒスチジンを、ヒスチジンとアミノ酸構造が類似していない他のアミノ酸に置換した変異体においては、熱安定性が一層低下し、そのため熱処理条件もさらに緩和して評価を行う必要が生じた。表９に示す通り、いずれのアミノ酸に置換した場合も、リンゴ酸による熱安定性向上効果は大きく減少したことが示された。すなわち、これらの変異体においては、リンゴ酸を添加しても十分な熱安定性を有するアマドリアーゼ含有組成物を得ることはできなかった。
【０１０２】
以上のことから、３１２位のヒスチジンを別のアミノ酸に置換した場合には、リン酸、クエン酸、リンゴ酸による熱安定性向上効果は減少することが示された。すなわち、３１２位のアミノ酸がヒスチジンであるアマドリアーゼに特有の現象として、リン酸、クエン酸、リンゴ酸を添加した際に熱安定性が向上する効果が確認された。
【０１０３】
[実施例３]
（グッド緩衝液とアニオンの併用による熱安定性向上効果の確認）
上記、表１、２に示される通り、５０ｍM  リン酸緩衝液下におけるＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は３１％であり、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液下における残存活性は１０％であるのに対し、５０ｍＭ  リン酸を添加した５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液下における残存活性は７４％であった。したがって、リン酸とＨＥＰＥＳ緩衝液を併用することにより、相乗的にアマドリアーゼの熱安定性向上効果が得られるといえる。
【０１０４】
次に、ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度を変化させても、同様にリン酸等のアニオンとの併用作用による熱安定性向上効果が得られるか検証するために、ＨＥＰＥＳ緩衝液とリン酸の濃度をそれぞれ変化させ、上記の熱安定性測定法に従って、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の熱安定性向上効果を評価した。ただし、上記の熱安定性測定法においてＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は表１０に示す各濃度を用いて、熱安定性を評価した。
【０１０５】
【表１０】
2015177790.tif 000011
【０１０６】
表１０に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液下では４．６％、１０ｍＭ  リン酸緩衝液下では１８％であるのに対し、１０ｍＭ  リン酸添加を添加した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液下では４３％と向上した。さらに、５０ｍＭ  リン酸を添加した際に、ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度依存的にＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が向上していることが示された。したがって、２０ｍＭ以上のＨＥＰＥＳ緩衝液であれば、リン酸との相乗効果が確認された。
【０１０７】
続いて、ＨＥＰＥＳ緩衝液以外のグッド緩衝液においてもアニオン、例えばリン酸を添加した際にアマドリアーゼの熱安定性向上効果が得られるか検証した。
ＨＥＰＥＳ緩衝液以外のグッド緩衝液として、ＴＥＳ緩衝液及びＢＥＳ緩衝液を用いて上記と同様にＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の熱安定性を評価した。その結果を、表１１、１２に示す。
【０１０８】
【表１１】
2015177790.tif 000012
【０１０９】
表１１に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は、２０ｍＭ  ＴＥＳ緩衝液下では２０％、１０ｍＭ  リン酸緩衝液下では１８％であるのに対し、１０ｍＭ  リン酸添加を添加した２０ｍＭ  ＴＥＳ緩衝液下では４５％と向上した。さらに、５０ｍＭ  リン酸を添加した際に、ＴＥＳ緩衝液の濃度依存的にＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性が向上していることが示され、したがって、２０ｍＭ以上のＴＥＳ緩衝液であれば、ＨＥＰＥＳ緩衝液と同様にリン酸との相乗効果が得られていることを確認した。
【０１１０】
【表１２】
2015177790.tif 000013
【０１１１】
表１２に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は、２０ｍＭ  ＢＥＳ緩衝液下では１１％、１０ｍＭ  リン酸緩衝液下では１８％であるのに対し、１０ｍＭ  リン酸添加を添加した２０ｍＭ  ＢＥＳ緩衝液下では３４％と向上した。さらに、５０ｍＭ  リン酸を添加した５００ｍＭ  ＢＥＳ緩衝液下では５０％と向上した。したがって、２０ｍＭ以上のＢＥＳ緩衝液であれば、ＨＥＰＥＳ緩衝液やＴＥＳ緩衝液と同様にリン酸との相乗効果が得られていることを確認した。
【０１１２】
次に、リン酸以外のアニオン、例えばクエン酸を用いた際に、２０ｍＭのグッド緩衝液との相乗効果を検証した。ＨＥＰＥＳ緩衝液またはＴＥＳ緩衝液とクエン酸の濃度をそれぞれ変化させ、上記の熱安定性測定法に従って、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の熱安定性向上効果を評価した。ただし、上記の熱安定性測定法において５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりに、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および２０ｍＭ  ＴＥＳ緩衝液を用いて熱安定性を評価した。
【０１１３】
【表１３】
2015177790.tif 000014
【０１１４】
表１３に示す通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の残存活性は、添加したクエン酸の濃度依存的に高くなり、すなわち熱安定性が向上することが確認された。
【０１１５】
以上より、グッド緩衝液であるＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液及びＢＥＳ緩衝液において、リン酸やトリカルボン酸、例えばクエン酸と併用することにより、３１２位に対応する位置がヒスチジンであるアマドリアーゼの熱安定性が向上したことから、その他のグッド緩衝剤においても、さらには複数種の緩衝剤を混合した緩衝剤を用いた場合においても、同様に熱安定性向上効果を示すと考えられる。また、ＨＥＰＥＳ緩衝液とジカルボン酸、例えばリンゴ酸を併用した際にも、同様に熱安定性向上効果が示されたことから、リンゴ酸とその他のグッド緩衝剤や複数種の緩衝剤を混合した緩衝剤を併用して用いた場合にも、同様に熱安定性向上効果を示すと考えられる。
【０１１６】
[実施例４]
（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼにおける本発明の熱安定性向上効果の確認）
実施例１、２に示したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼにおける３１２位のヒスチジンに対応する同様のアミノ酸残基を有する別種のアマドリアーゼについても、本発明の熱安定性向上効果が奏されるか否かの検証を行った。別種の他のアマドリアーゼの一例として、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ（ＣｃＦＸ）に対し、上記の安定化剤による熱安定性向上効果を確認した。
【０１１７】
（１）Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの生産
配列番号３０はＣｃＦＸのアミノ酸配列であり、配列番号３０で示される４４０アミノ酸をコードし、且つ、大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号３７で示す１３２３ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成により、ｃＤＮＡを全合成することによって取得した。このとき、配列番号３７の５´末端、３´末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されたアミノ酸配列全長は図１のＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの配列と一致していることを確認した。
【０１１８】
続いて、取得した配列番号３７に示される遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＫＫ２２３−３ Ｖｅｃｔｏｒ（アマシャム・バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸを取得し、実施例１と同様の条件でＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ）株を得た。
【０１１９】
上記のようにして得られたＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ）株を実施例１の方法で培養して、粗酵素液１．５ｍｌを調製した。得られた粗酵素液をサンプルとし、実施例１に準じた活性測定方法に従ってケトアミンオキシダーゼの活性を確認した。
【０１２０】
（２）各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの熱安定性評価
熱安定性を向上させる安定化剤は実施例１および実施例２と同様のものを用い、実施例１および２と同様に、各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの熱安定性評価を行った。ただし、安定化剤を添加しない場合の残存活性を約８〜２０％とするために、熱処理を６０℃、１０分加温で行った。各種安定化剤を添加した際に、ｐＨの変化を防ぐ目的から、緩衝液は５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用い、安定化剤を添加した際のｐＨは実際に７．０を示すことを確認後に、熱処理を行った。結果の一部を表１４、１５に示す。本発明の効果の傾向を参照する目的で、実施例１に示したＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の結果も並べて示す。表中の「比率」は、添加成分を共存させなかった場合の残存活性（％）を１とした場合の、添加成分を共存させた場合の残存活性（％）の相対値である。
【０１２１】
【表１４】
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【０１２２】
ＣｃＦＸの６０℃、１０分加温後の残存活性は、８．４％であるのに対し、５０ｍＭ  リン酸を共存させた際の残存活性は、４６．５％であり、表１４に示す比率の通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１と同様にＣｃＦＸに対しても、リン酸を添加した際に、熱安定性向上効果が示された。
【０１２３】
【表１５】
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【０１２４】
ＣｃＦＸの６０℃、１０分加温後の残存活性は、８．４％であるのに対し、５０ｍＭ  クエン酸を共存させた際の残存活性は、５３．１％であり、表１５に示す比率の通り、本実施例の条件下では、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１と同様にＣｃＦＸに対しても、クエン酸を添加した際に、熱安定性向上効果が示された。
【０１２５】
したがって、リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸には、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼに限定されず配列番号１における３１２位のヒスチジンに対応する特定アミノ酸残基を共通して有する別種のアマドリアーゼの熱安定性を向上させる効果があることが確認された。
【０１２６】
続いて、リン酸と２０ｍＭのグッド緩衝液との相乗効果を検証するために、上記の熱安定性測定法に従って、ＣｃＦＸの熱安定性向上効果を評価した。ただし、上記の熱安定性測定法において５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりに、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および２０ｍＭ  ＴＥＳ緩衝液を用いて熱安定性を評価し、熱処理を５８℃、１０分加温で行った。
【０１２７】
【表１６】
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【０１２８】
表１６に示す通り、本実施例の条件下では、１０ｍＭ以上のリン酸を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液またはＴＥＳ緩衝液に添加することで、ＣｃＦＸの残存活性が高くなる、すなわち熱安定性が向上することが確認された。
【０１２９】
以上より、グッド緩衝液であるＨＥＰＥＳ緩衝液及びＴＥＳ緩衝液において、リン酸やトリカルボン酸、例えばクエン酸と併用することにより、３１２位に対応する位置がヒスチジンであるアマドリアーゼの熱安定性が向上したことから、その他のグッド緩衝剤においても、さらには複数種の緩衝剤を混合した緩衝剤を用いた場合においても、同様に熱安定性向上効果を示すと考えられる。
【０１３０】
ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１とＣｃＦＸのアミノ酸配列同一性は８０％であり、このような相同性を有する同種の酵素において、本発明の効果が共に確認されたことから、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１と８０％のアミノ酸配列同一性を有し、または、ＣｃＦＸと８０％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの３１２位のヒスチジンに対応するアミノ酸残基を持つアマドリアーゼは、本発明の効果を有するアマドリアーゼに包含される蓋然性が高い。
【０１３１】
（さらなる組成物の調製例）
アマドリアーゼとして、配列番号１における３１２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであるものを使用する。緩衝液としてＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液またはＢＥＳ緩衝液を２０〜５００ｍＭ、例えば５００ｍＭにて使用する（ｐＨ７．０）。安定化剤として、マレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、またはイソクエン酸を２ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば２０ｍＭにて使用する。以下に調製例を示す：
調製例１
アマドリアーゼ                    ０．５Ｕ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）  ５００ｍＭ
マレイン酸                        ２０ｍＭ
調製例２
アマドリアーゼ                    ０．５Ｕ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）  ５００ｍＭ
シトラコン酸                      ２０ｍＭ
調製例３
アマドリアーゼ                    ０．５Ｕ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）  ５００ｍＭ
マロン酸                          ２０ｍＭ
調製例４
アマドリアーゼ                    ０．５Ｕ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）  ５００ｍＭ
酒石酸                            ２０ｍＭ
調製例５
アマドリアーゼ                    ０．５Ｕ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）  ５００ｍＭ
コハク酸                          ２０ｍＭ
調製例６
アマドリアーゼ                    ０．５Ｕ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）  ５００ｍＭ
イソクエン酸                      ２０ｍＭ
【０１３２】
（アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の評価）
１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に約０．５Ｕ／ｍｌのアマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品が含まれ、かつ安定化剤が添加された溶液を６００μｌ調製する。また対照には安定化剤を添加しない。この溶液１００μｌを５５℃にて１０分間加温する。上述のＢ．の方法を用いて加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、加熱前の活性を１００とした場合の残加熱後の活性の割合、すなわち、残存活性（％）を求める。
安定化剤を添加せずに５５℃にて１０分間加温した際の残存活性（％）を１とした場合の、安定化剤を添加し加温した後の残存活性（％）の割合を比率として算出する。熱安定性の評価は、上述の「熱安定性測定法」および「アマドリアーゼの熱安定性を向上させる安定化剤の評価方法」に従う。
【０１３３】
配列の説明
配列番号１．  ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１のアミノ酸配列
配列番号２．  ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の遺伝子配列
配列番号３．  Ｈ３１２Ｆ導入プライマーＦｗ
配列番号４．  Ｈ３１２Ｘ導入プライマーＲｖ
配列番号５．  Ｈ３１２Ｙ導入プライマーＦｗ
配列番号６．  Ｈ３１２Ｎ導入プライマーＦｗ
配列番号７．  Ｈ３１２Ｔ導入プライマーＦｗ
配列番号８．  Ｈ３１２Ｃ導入プライマーＦｗ
配列番号９．  Ｈ３１２Ｗ導入プライマーＦｗ
配列番号１０．Ｈ３１２Ｒ導入プライマーＦｗ
配列番号１１．  Ｈ３１２Ｋ導入プライマーＦｗ
配列番号１２．  Ｈ３１２Ｑ導入プライマーＦｗ
配列番号１３．  Ｈ３１２Ｖ導入プライマーＦｗ
配列番号１４．  Ｈ３１２Ｓ導入プライマーＦｗ
配列番号１５．  Ｈ３１２Ｐ導入プライマーＦｗ
配列番号１６．  Ｈ３１２Ｇ導入プライマーＦｗ
配列番号１７．  Ｈ３１２Ａ導入プライマーＦｗ
配列番号１８．  Ｈ３１２Ｄ導入プライマーＦｗ
配列番号１９．  Ｈ３１２Ｅ導入プライマーＦｗ
配列番号２０．  Ｈ３１２Ｌ導入プライマーＦｗ
配列番号２１．  Ｈ３１２Ｉ導入プライマーＦｗ
配列番号２２．  Ｈ３１２Ｍ導入プライマーＦｗ
配列番号２３．  Ｈ２６Ｎ導入プライマーＦｗ
配列番号２４．  Ｈ２６Ｎ導入プライマーＲｖ
配列番号２５．  Ｈ９０Ｎ導入プライマーＦｗ
配列番号２６．  Ｈ９０Ｎ導入プライマーＲｖ
配列番号２７．  Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼ
配列番号２８．  Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号２９．  Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３０．  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３１．  Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号３２．  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号３３．  Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号３４．  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号３５．  Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号３６．  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号３７．  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【配列表】
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