(57)【要約】      （修正有）【課題】トルコギキョウの抽出物を含む医薬組成物及びスキンケア組成物の提供。【解決手段】トルコギキョウの植物全体、又はトルコギキョウの根、葉を伴う茎、及び／又は花を、Ｃ１−Ｃ６アルコール、水、及びこれらの組み合わせからなる極性溶媒により抽出して調製される抽出物を含有し、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルの捕捉、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）活性の阻害、及び／又はエラスターゼ活性の阻害に有効である、医薬組成物及びスキンケア組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トルコギキョウの抽出物の治療有効量を含む、医薬組成物。
【請求項２】
トルコギキョウの抽出物の有効量を含む、スキンケア組成物。
【請求項３】
１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルを捕捉し、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の活性を阻害し、及び／又はエラスターゼの活性を阻害するための、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記マトリックスメタロプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）である、
請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
皮膚を改善し、修復し、及び／又は手入れするための、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項６】
皮膚の老化を抑制するための、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
皮膚のしわの形成を抑制し、皮膚のしわを減少させ、皮膚を引き締め、及び／又は皮膚の弾力性を増加するための、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項８】
前記抽出物が、トルコギキョウの極性溶媒による抽出物であり、前記極性溶媒が、アルコール、水、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記極性溶媒が、Ｃ１−Ｃ６アルコール、水、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記極性溶媒が、メタノール、エタノール、水、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記トルコギキョウが、アレナ品種、アッベ品種、ロベラ品種、及び／又はボヤージュ品種のトルコギキョウである、
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記トルコギキョウが、アッベ品種である、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記トルコギキョウの抽出物が、トルコギキョウの植物全体、又はトルコギキョウの根、葉を伴う茎、及び／又は花を抽出して調製される、
請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記トルコギキョウの抽出物が、トルコギキョウの葉を伴う茎を抽出して調製される、
請求項１３に記載の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の改善、修復、及び／又は手入れのためのトルコギキョウ（Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）抽出物の使用に関し、特に１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルの捕捉、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）活性の阻害、及び／又はエラスターゼ活性の阻害のためのトルコギキョウ抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚及び筋肉の弾力性の維持に関与する主成分である。動物性コラーゲンは、約２１種類に分類できることが知られている。コラーゲンの種類は、組織によって異なるが、Ｉ型コラーゲンが最も豊富に存在し、最も広く利用することができる。皮膚組織のコラーゲンにおいて、Ｉ型コラーゲンがその８０％、ＩＩＩ型コラーゲンが２０％を占める。真皮において、線維芽細胞が、主にＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを産生する。
【０００３】
皮膚の上層から下層は、表皮、真皮、及び皮下組織である。ヒトの自然な老化過程には、皮膚の弛緩、しわの形成、皮膚の色素沈着が含まれ、加齢と共に徐々に現れる。皮膚の老化の原因は、内生要因と外生要因に分けることができる。内因性の老化は、加齢、ホルモンレベルの低下、及び免疫能の低下による人体の自然な老化過程である。外因性の老化は、日光、公害、フリーラジカル損傷、喫煙等の外生要因に起因する。
【０００４】
内因性及び外因性の老化要因は全て、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路のリン酸化を促進することができ、その結果、真皮中のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）濃度が上昇する。ＭＭＰｓは、コラーゲンを分解し、皮膚のコラーゲン含有量を減少させる可能性がある。コラーゲンによるサポートなしでは、皮膚の外観はたるみ、角質層は厚くなり、黒ずんでしわの多い皮膚になる。その一方で、上記の老化要因は、エラスターゼの発現を増加させる可能性がある。エラスターゼは、皮膚のエラスチンを分解し、それにより結合組織の弾力性が低下し、垂れ下がったしわの多い皮膚になる。さらに、スーパーオキシドアニオンを含む有機物及び無機物、過酸化物、フリーラジカル（ＤＰＰＨラジカル等）といった細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）もまた、コラーゲン及びエラスチンを変性させ、機能を喪失させる可能性がある。
【０００５】
研究により、ワレモコウ（Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の根からとれるジユグリコシドＩは、ＭＭＰ−１の発現を阻害できること、イワヒバ（Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ  ｔａｍａｒｉｓｃｉｎａ）からとれるスマフラボン（ｓｕｍａｆｌａｖｏｎｅ）及びアメントフラボンもまた、ＭＭＰ−１の発現を阻害できることが示された。しかしながら、ＭＭＰｓの活性を阻害し、より良い老化防止効果をもたらすことができる成分に対するニーズは、今なお高い。
【０００６】
本発明の発明者らは、一般に装飾花として使用されるトルコギキョウの抽出物が、ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉、ＭＭＰｓ活性の阻害、及び／又はエラスターゼ活性の阻害に有効であることを発見した。従って、トルコギキョウの抽出物は、コラーゲン及びエラスチンの分解及び変性を有効に低減／防止することができるため、例えば、皮膚の老化防止のための、皮膚の改善、修復、及び／又は手入れに使用することができる。また、トルコギキョウの残り物（例えば、根、茎、葉等）の抽出物も、上記の有効性を示すことができるため、トルコギキョウの経済効果を改善することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、トルコギキョウの抽出物の治療有効量を含む医薬組成物を提供することである。好ましくは、トルコギキョウの抽出物は、トルコギキョウをアルコール及び／又は水で抽出して調製する。
【０００８】
本発明の別の目的は、トルコギキョウの抽出物の有効量を含むスキンケア組成物を提供することである。好ましくは、トルコギキョウの抽出物は、トルコギキョウをアルコール及び／又は水で抽出して調製する。
【０００９】
技術の詳細及び本発明のために実施された好ましい実施形態を、以下の段落において、当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明のいくつかの実施形態を詳細に説明する。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施形態で実施することができるものであり、本明細書に記載の実施形態に限定されるべきではない。また、本明細書において別段の定めがない限り、本明細書（特に特許請求の範囲）に記載の表現「ａ」、「ｔｈｅ」等は、単数形及び複数形の両方を含むべきである。さらに、本明細書で使用される用語「有効量」は、疑いのある被験体（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ｓｕｂｊｅｃｔ）が治療を受けている症状を、この被験体が投与される場合に、少なくとも部分的に軽減することができる化合物量を指す。本明細書で使用される用語「被験体」は、ヒト及びヒト以外の動物を含む哺乳類を指す。
【００１１】
上述の通り、細胞内のフリーラジカル（例えば、ＤＰＰＨフリーラジカル等）、及び皮膚中のＭＭＰｓとエラスターゼの両者は、コラーゲン及びエラスチンの機能を損傷させる可能性がある。従って、細胞内のフリーラジカルの捕捉、及び／又は皮膚中のＭＭＰｓ及びエラスターゼの活性の阻害を行うことができれば、皮膚の老化症状を有効に改善することができる。
【００１２】
トルコギキョウは、ユーストマ、リシアンサス、プレイリーゲンティアン、テキサスブルーベルとしても知られる。ユーストマ属の多年生植物は、中南米が原産である。一般に、大半の商用トルコギキョウは、装飾花として使用される。現在までに約２００品種のトルコギキョウが存在する。トルコギキョウの研究は、栽培や、花色に影響する成分の分析に主に重点が置かれている。本発明の発明者らは、トルコギキョウの抽出物が、ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉、ＭＭＰｓ活性の阻害、及び／又はエラスターゼ活性の阻害に有効であることを発見した。その結果、トルコギキョウの抽出物は、コラーゲン及び／又はエラスチンの損傷を防止及び／又は改善する可能性がある。そのため、本発明は、有効量のトルコギキョウ抽出物を含む医薬組成物及びスキンケア組成物を提供する。
【００１３】
本発明のトルコギキョウ抽出物を得るために使用されるトルコギキョウの品種について、特別な制限はない。例えば、アレナ品種、アッベ（Ａｂｂｅ）品種、ロベラ品種、及び／又はボヤージュ品種のトルコギキョウが本発明で使用されてもよい。本発明の一つの好ましい実施形態において、所望のトルコギキョウ抽出物を得るために、アッベ品種のトルコギキョウを使用する。
【００１４】
本発明のトルコギキョウ抽出物を得るために使用されるトルコギキョウの部分について、特別な制限はない。例えば、トルコギキョウの根、茎（葉と共に）、及び／又は花が本発明で使用されてもよい。本発明の一つの好ましい実施形態において、トルコギキョウ抽出物を調製するために、トルコギキョウの茎を原材料として使用する。
【００１５】
好ましくは、本発明のトルコギキョウ抽出物は、抽出においてアルコール及び／又は水等の極性溶媒を使用することにより提供される。例えば、極性溶媒は、Ｃ１−Ｃ６アルコール（メタノール、エタノール、エタンジオール、プロパノール、イソプロパノール、プロパンジオール、ブタノール、イソブタノール、ブタンジオール、ペンタノール、イソペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール等）、水、又はこれらの組み合わせとすることができる。より好ましくは、極性溶媒は、Ｃ１−Ｃ４アルコール、水、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明のいくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、及び／又は水を、抽出溶媒として使用する。抽出溶媒としてメタノールを使用した際に、より高い収率を得ることができた。
【００１６】
溶媒抽出ステップを行う前に、所望によりトルコギキョウ原料（即ち、トルコギキョウの一部又はトルコギキョウ全体）を前処理して、抽出効果を改善してもよい。そのような前処理として、これらに限定されるものではないが、洗浄、乾燥、粉砕等が挙げられる。例えば、トルコギキョウ原料を、洗浄して堆積物を除去し、オーブンで乾燥させ、粉砕機で粉砕した後、溶媒で抽出することができる。また、超音波発振器等を用いた撹拌を、所望により溶媒抽出過程と共に行ってもよい。その後、試料に対して遠心分離、濾過、及び真空下での濃縮等を行い、乾燥トルコギキョウ抽出物を得ることができる。
【００１７】
本発明のトルコギキョウ抽出物は、ＤＰＰＨフリーラジカルを捕捉することができるため、ＤＰＰＨフリーラジカルによる損傷からコラーゲン及びエラスチンを防ぐことによる、皮膚の老化症状の改善に有効である。また、体内のＤＰＰＨフリーラジカルを捕捉することにより、白内障、糖尿病、心血管疾患、ヒト皮膚線維症、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、アテローム性動脈硬化症、関節炎、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病等を治療又は予防する効果が得られることが知られている。従って、ＤＰＰＨフリーラジカルを捕捉する作用を有する本発明のトルコギキョウ抽出物は、ＤＰＰＨフリーラジカル活性と密接に関係する、及び／又はＤＰＰＨフリーラジカルに刺激される上記の疾患を治療又は予防するための薬剤の提供に使用することができる。
【００１８】
また、本発明のトルコギキョウ抽出物は、ＭＭＰｓ活性の阻害に有効であるため、ＭＭＰｓによるコラーゲンの分解を防ぐことにより、皮膚の老化症状を有効に改善することができる。
【００１９】
ＭＭＰｓは、主にコラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ、マトリリシン、膜貫通型ＭＭＰ等のタイプに分類することができる。最も一般的なＭＭＰｓとして、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）、マトリックスメタロプロテアーゼ−７（ＭＭＰ−７）、マトリックスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１０（ＭＭＰ−１０）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１１（ＭＭＰ−１１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２（ＭＭＰ−１２）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１３（ＭＭＰ−１３）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１４（ＭＭＰ−１４）等が挙げられる。本発明のトルコギキョウ抽出物は、ＭＭＰ−２及び／又はＭＭＰ−９の活性阻害に特に有効である。
【００２０】
ＭＭＰｓは、腫瘍の成長及び転移において重要な役割を果たすことが知られている。本発明のトルコギキョウ抽出物は、ＭＭＰｓ活性を有効に阻害し、かつ、ＭＭＰｓによるコラーゲンの分解を有効に防ぐことができるため、腫瘍の成長及び／又は転移を阻害及び／又は防止するための薬剤の提供に使用することができる。
【００２１】
また、本発明のトルコギキョウ抽出物は、エラスターゼ活性を阻害する効果を有するため、エラスターゼによるエラスチンの分解を防ぐことができ、皮膚の老化症状の改善に対してさらに高い効果を示すことができる。
【００２２】
エラスターゼ活性の上方制御は、乳癌、創傷の慢性閉塞、急性肺障害、急性呼吸促迫症候群、全身性炎症反応症候群、及び嚢状線維症に関連していることが知られている。本発明のトルコギキョウ抽出物は、エラスターゼ活性を阻害する効果を有し、エラスターゼによるエラスチンの分解を防ぐため、乳癌、創傷の慢性閉塞、急性肺障害、急性呼吸促迫症候群、全身性炎症反応症候群、及び嚢状線維症等のエラスターゼ活性の上方制御に関連した疾患を治療する薬剤の調製にさらに使用することができる。
【００２３】
上述の通り、また、本明細書の実施例で説明するように、本発明のトルコギキョウ抽出物は、ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉、ＭＭＰｓ活性の阻害、及び／又はエラスターゼ活性の阻害に有効であるため、上記の機構に関連した疾患を治療するための薬剤に加えて、コラーゲン及びエラスチンの機能への損傷を防ぐことにより皮膚を改善、修復、及び／又は手入れする薬剤又はスキンケア製品を得るために使用することができる。本発明により提供される薬剤及びスキンケア製品は、例えば、コラーゲン及びエラスチンの機能への損傷を防ぐことによる、皮膚のしわ形成の予防、皮膚のしわの減少、皮膚の引き締め、及び／又は皮膚の弾力性の増加のために使用することができる。
【００２４】
本発明のトルコギキョウ抽出物を使用して製造される薬剤は、実用的な要件に応じて、特に制限なく任意の適した形態にすることができる。例えば、本薬剤は、軟膏、クリーム、又はゲル等の局所使用のための形態で提供することができる。また、本薬剤は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、抽出液、溶液、シロップ、懸濁液、乳濁液、チンキ剤、静脈注射剤、粉末注射剤、懸濁注射剤、粉末懸濁注射剤等の一般的な薬剤の形態にすることもできる。
【００２５】
本発明のトルコギキョウ抽出物を使用して製造される薬剤の用量は、投与される被験体の年齢及び投与目的（例えば、皮膚のしわの減少、皮膚の弾力性の増加、又は疾患の治療）に応じて調整することができる。また、本発明に係る薬剤は、被験体の要求に応じて、様々な投与回数で適用することができる。本薬剤は、最終形態及び投与目的に応じて、他の成分を含有することができる。例えば、皮膚用局所薬剤を調製する際に、任意の適切で適量の乳化剤、香料、及び皮膚の状態を改善することができるその他の有効成分を、加えたその他の成分の種類及び量によって本発明のトルコギキョウ抽出物に悪影響が及ばない限り、加えることができる。
【００２６】
本発明のトルコギキョウ抽出物を使用して製造されたスキンケア製品は、特に制限なく任意の適した形態にすることができる。例えば、乳濁液、クリーム、及びゲル等の局所使用のための形態、又は、健康食品、美容飲料等の飲食料品として提供することができる。
【００２７】
本発明によれば、スキンケア製品の用量は、投与される被験体の年齢及び投与目的（例えば、皮膚の引き締め又は皮膚の弾力性の増加）に応じて調整することができる。また、本発明に係るスキンケア製品は、被験体の要求に応じて、様々な投与回数で適用することができる。その他の成分の種類及び量は、スキンケア製品の最終形態に応じて、加えたその他の成分の種類及び量によって本発明のトルコギキョウ抽出物に悪影響が及ばない限り、調整することができる。
【００２８】
以下の通り、具体的な実施例を用いて本発明をさらに詳細説明する。尚、以下の実施例は、本発明を説明するためだけに提供するものであり、これらにより本発明の範囲を制限するものではない。本発明の範囲は、この後の特許請求の範囲において説明する。
【００２９】
［実施例］
［実験材料］
後述の実施例で使用した材料及び薬剤の入手元を、以下に示す。
（１）アレナ品種のトルコギキョウ：台灣糖業社農業事業部（ｔｈｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ  Ｓｕｇａｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）より提供。
（２）アッベ品種、ロベラ品種、及びボヤージュ品種のトルコギキョウ：台湾嘉義県（Ｃｈｉａｙｉ  ｃｏｕｎｔｒｙ  ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ）の農業経営者、蕭（Ｘｉａｏ）氏より提供。
（３）ＨＰＬＣに使用したメタノール：メルク社（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）から購入、ＨＰＬＣグレード又は同等製品。
（４）抽出に使用したメタノール：メルク社から購入、ＡＣＳグレード又は同等製品。
（５）エタノール：９５％、台灣糖業社バイオテクノロジー事業部（ｔｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｉｗａｎ  Ｓｕｇａｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）より提供。
（６）純水：Ｍｉｌｌ−Ｑ（ＭＱ水）グレード又は同等製品。
（７）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：９９％、アルファエイサー社（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）（カタログ番号：１０６３７４）。
（８）エラスターゼアッセイキット：インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｅｎｚ  Ｃｈｅｋ（登録商標）（カタログ番号：ｅ１２０５６）。
（９）１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）：ＡＣＳグレード、≧９９．９％、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。
（１０）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：ＡＣＳグレード、≧９９．９％、Ｊ．Ｔ．ベーカー社（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）、（カタログ番号：９２２４）。
（１１）容量フラスコ：１Ｌ、５００ｍＬ、及び５ｍＬ。
（１２）超音波発振器：１５０Ｗ、デルタ（Ｄｅｌｔａ）  Ｄ１５０Ｈ。
（１３）最小必須培地（ＭＥＭ）：インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）（カタログ番号：４１５００−０３４）。
（１４）ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１００×）（ＰＳＧ）：インビトロジェン社（カタログ番号：１０３７８−０１６）。
（１５）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）：ハイクローン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。
（１６）ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）：インビトロジェン社（カタログ番号：１１３６０−０７０）。
（１７）０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ：インビトロジェン社（カタログ番号：１５４０００５４）。
（１８）組換え体ＴＮＦ−α（１０μｇ）：Ｒ＆Ｄ社（Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）（カタログ番号：２１０−ＴＡ−０１０）。
（１９）チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）：シグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）（カタログ番号：Ｍ５６５５）。
（２０）９６穴培養プレート：ＢＤ社（ＢＤ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。
（２１）カゼイン：シグマ社。
（２２）ゼラチン：ＵＳＢ社（ＵＳＢ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。
（２３）ＭＭＰ−１／−２／−９標準：Ｒ＆Ｄ社。
（２４）ニトロセルロース膜（ＮＣ膜）：パール社（Ｐａｌｌ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。
（２５）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：アクロス社（Ａｃｒｏｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）。
【００３０】
［試料の前処理］
（１）抽出材料：異なる品種のトルコギキョウ
以下の手順を、異なる品種のトルコギキョウに対して行い、異なる品種の抽出材料を得た：粉塵除去及び洗浄の後、トルコギキョウの根及び茎を５０℃のオーブンで一定重量となるまで乾燥させ、粉砕機にて３０メッシュを通過できるようになるまで粉砕した。
【００３１】
（２）抽出材料：異なる部分のトルコギキョウ
以下の手順を、アレナ品種のトルコギキョウの異なる部分（即ち、花、茎、及び根）に対して行い、異なる部分の抽出材料を得た：粉塵除去及び洗浄の後、トルコギキョウの各部分を５０℃のオーブンで一定重量となるまで乾燥させ、粉砕機にて３０メッシュを通過できるようになるまで粉砕した。
【００３２】
［調製例］
Ａ．異なる比率のメタノール及び水の混合物を抽出溶媒として用いたトルコギキョウ抽出物の調製
試料の前処理（１）で得たアレナ品種の抽出材料について、５バッチ（各バッチ５．０ｇ）を秤量した。この５バッチを別々に５０ｍＬチューブに入れ、それぞれ５０ｍＬの１００％メタノール、７５％メタノール、５０％メタノール、２５％メタノール、及び純水（即ち、メタノールなし）と混合した。試料を、超音波発振器を用いて室温にて９０分間抽出した後、遠心分離（２０００×ｇ）し、濾過し、及び一定重量となるまで真空下で濃縮したことにより、異なる濃度のメタノールで抽出したトルコギキョウ抽出物を得た。
異なる濃度のメタノールを抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウ抽出物の調製収率を、表１に示す。表中、１００％メタノールでの抽出結果が最も良い。
【００３３】
表１  異なる濃度のメタノールを抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウ抽出物の調製結果
【表１】
2015151397.tif 000002
*：収率（％）＝抽出物の重量（ｇ）×１００％／５ｇトルコギキョウ抽出材料
【００３４】
Ｂ．９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物の調製
試料の前処理（１）で得た４品種それぞれの抽出材料について、約５０．０ｇを秤量し、平底フラスコに入れ、それぞれ５００ｍＬの９５％エタノール水溶液と混合した。試料を、超音波発振器（２００ＲＰＭに設定）を用いて室温にて３時間抽出した後、遠心分離（２０００×ｇ）し、濾過し、及び一定重量となるまで真空下で濃縮したことにより、異なる品種のトルコギキョウ抽出物を得た。
９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物の調製収率を、表２に示す。表中、アレナ品種トルコギキョウの調製結果が最も良い（２６．９％）。
【００３５】
表２  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物の調製結果
【表２】
2015151397.tif 000003
*：収率（％）＝抽出物の重量（ｇ）×１００％／５０ｇトルコギキョウ抽出材料
【００３６】
Ｃ．９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたトルコギキョウの異なる部分の抽出物の調製
試料の前処理（２）で得たアレナ品種の異なる部分の抽出材料について、約５．０ｇを秤量し、５０ｍＬチューブに入れ、５０ｍＬの９５％エタノール水溶液と混合した。試料を、超音波発振器を用いて室温にて３時間抽出した後、遠心分離（２０００×ｇ）し、濾過し、及び一定重量となるまで真空下で濃縮したことにより、トルコギキョウの異なる部分の抽出物を得た。
９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたアレナ品種の異なる部分の抽出物の調製収率を、表３に示す。表中、アレナ品種の茎の調製結果が最も良い（１４．９％）。
【００３７】
表３  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウの異なる部分の抽出物の調製結果
【表３】
2015151397.tif 000004
*：収率（％）＝抽出物の重量（ｇ）×１００％／５ｇトルコギキョウ抽出材料
【００３８】
Ｄ．水を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物の調製
試料の前処理（１）で得た４品種それぞれの抽出材料について、約２５ｇを秤量し、５００ｍＬの血清瓶（ｓｅｒｕｍ  ｂｏｔｔｌｅ）に入れ、それぞれ２５０ｍＬの沸騰している純水と混合した。血清瓶を沸騰水の入ったポットに入れ、試料をガラス棒で４０分間撹拌することにより、試料を抽出した。抽出後、抽出液を遠心分離（２０００×ｇ）及び濾過し、濾液に純水を加えて総量を２５０ｍＬにした。その後、一定重量となるまで真空下にて試料を濃縮し、水を抽出溶媒として用いた異なる品種の抽出物を得た。
水を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物の調製収率を、表４に示す。表中、アッベ品種トルコギキョウの水抽出の調製結果が最も良い（２１．１％）。
【００３９】
表４  異なる品種のトルコギキョウ水抽出物の調製結果
【表４】
2015151397.tif 000005
*：収率（％）＝抽出物の重量（ｇ）×１００％／２５ｇトルコギキョウ抽出材料
【００４０】
実施例１：エラスターゼ活性の測定
１−１．器具及び装置
（１）マルチモードマイクロプレートリーダー：ＳＹＮＥＲＧＹ  ＭＸ、バイオテック社（ＢＩＯＴＥＫ）。
（２）９６穴培養プレート：蛍光実験用ブラックマトリックス、グライナー社（Ｇｒｅｉｎｅｒ）。
【００４１】
１−２．反応試薬の調製
（１）１×反応緩衝液：この溶液は、６ｍＬの１０×反応緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭアジ化ナトリウムを含む）を５４ｍＬのＭＱ水で希釈することにより調製した。
（２）０．０４ｍＭエラスターゼ阻害剤（Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン（ＮＭＡＡＰＶＣＫ）、分子量：５０３）：試薬キットを構成するＮＭＡＡＰＶＣＫ（５００μｇ）を５０μＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、ＮＭＡＡＰＶＣＫストック（１０ｍｇ／ｍＬ）を得た。使用前に、１０μＬのＮＭＡＡＰＶＣＫストックを１×反応緩衝液で５００倍希釈した。
（３）１００μｇ／ｍＬ ＤＱ（登録商標）エラスチン（ウシ首靱帯由来、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬコンジュゲート）：試薬キットを構成するエラスチン（１μｇ）を１ｍＬのＭＱ水に溶解し、エラスチンストック（１ｍｇ／ｍＬ）を得た。使用前に、エラスチンストックを１×反応緩衝液で１０倍希釈した。
（４）０．５活性単位／ｍＬ エラスターゼ（ブタ膵腺由来）：試薬キットを構成するエラスターゼ（５０活性単位）を０．５ｍＬのＭＱ水に溶解し、エラスターゼストック（１００活性単位／ｍＬ）を得た。使用前に、エラスターゼストックをＭＱ水で２００倍希釈した。
【００４２】
１−３．試験用試料の調製
（１）アルコール抽出試料：調製例Ａ、Ｂ、及びＣで得たトルコギキョウ抽出物をＤＭＳＯに溶解した後、１×反応緩衝液で５．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した（試験における最終濃度は、２．０ｍｇ／ｍＬであった）。各抽出物の希釈濃度は、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、及び０．５ｍｇ／ｍＬであった。
（２）水抽出試料：調製例Ｄで得たトルコギキョウ抽出物を水に溶解した後、１×反応緩衝液で３０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した（試験における最終濃度は、１２．０ｍｇ／ｍＬであった）。各抽出物の希釈濃度は、１５．０ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、３．７５ｍｇ／ｍＬ、及び１．８７５ｍｇ／ｍＬであった。
【００４３】
１−４．試験方法
（１）９６穴培養プレートにおいて、対照群として５０μＬの１×反応緩衝液を、陽性対照群として５０μＬの０．０４ｍＭ ＮＭＡＡＰＶＣＫ（最終濃度は、０．０１ｍＭであった）を、或いは５０μＬの実施例１−３で得た試料を、個々の穴に加えた。各実験を３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った。
（２）１００μＬのエラスターゼ（０．５活性単位／ｍＬ）を各穴に加えた（エラスターゼの最終濃度は、０．２５活性単位／ｍＬであった）。
（３）エラスターゼの基質であるエラスチン（１００μｇ／ｍＬ）を５０μＬずつ各穴に加えた（エラスチンの最終濃度は、２５μｇ／ｍＬであった）。
（４）反応を室温で２時間行い、各試料の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、発光波長：５３０ｎｍ）を検出することにより、阻害率を計算した。
（５）阻害率：
＝１００％×（対照群の蛍光強度−試料群の蛍光強度）÷対照群の蛍光強度
【００４４】
１−５．実験結果
（Ａ）異なる比率のメタノール及び水の混合物を抽出溶媒として用いたトルコギキョウ抽出物のエラスターゼ阻害能
調製例Ａで得たアレナ品種トルコギキョウ抽出物の濃度５ｍｇ／ｍＬにおけるエラスターゼ阻害効果を、表５に示す。結果から、全ての抽出物がエラスターゼの阻害に有効であり、１００％メタノールを抽出溶媒として用いて調製した抽出物が最も良いことが分かる。
【００４５】
表５  異なる比率のメタノール及び水の混合物を抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウ抽出物のエラスターゼ阻害効果
【表５】
2015151397.tif 000006
【００４６】
（Ｂ）９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物のエラスターゼ阻害能
調製例Ｂで得た異なる品種のトルコギキョウ抽出物の濃度５ｍｇ／ｍＬにおけるエラスターゼ阻害効果を、表６に示す。結果から、全ての抽出物がエラスターゼの阻害に有効であることが分かる。
【００４７】
表６  ９５％メタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物のエラスターゼ阻害効果
【表６】
2015151397.tif 000007
【００４８】
（Ｃ）９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたトルコギキョウの異なる部分の抽出物のエラスターゼ阻害能
調製例Ｃで得たトルコギキョウの異なる部分の抽出物のエラスターゼ阻害効果を、表７に示す。結果から、アレナ品種トルコギキョウの全ての部分がエラスターゼの阻害に有効であり、茎の抽出物でより良いことが分かる。
【００４９】
表７  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウの異なる部分の抽出物のエラスターゼ阻害効果
【表７】
2015151397.tif 000008
【００５０】
（Ｄ）異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のエラスターゼ阻害能
調製例Ｄで得た異なる品種のトルコギキョウ水抽出物の濃度３０ｍｇ／ｍＬにおけるエラスターゼ阻害効果を、表８に示す。結果から、全ての水抽出物がエラスターゼの阻害に有効であることが分かる。
【００５１】
表８  異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のエラスターゼ阻害効果
【表８】
2015151397.tif 000009
【００５２】
実施例２：ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性の測定
２−１．器具及び装置
（１）ＥＬＩＳＡリーダー：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４。
（２）９６穴平底培養プレート：ＵＶ−ＳＴＡＲ  ＰＬＡＴＥ（グライナー社、ＲＥＦ６５５８０１）。
【００５３】
２−２．反応試薬の調製
１ｍＭ ＤＰＰＨ溶液の調製：この溶液は、９．８５８ｍｇのＤＰＰＨを計量して２５ｍＬメスフラスコに入れ、フラスコ上の２５ｍＬの標線に達するまでメタノールを加えることにより調製した。
【００５４】
２−３．試験用試料の調製
（１）アルコール抽出試料：調製例Ｂ及びＣで得たトルコギキョウ抽出物をメタノールに溶解した後、メタノールで１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した（試験における最終濃度は、５．０ｍｇ／ｍＬであった）。各抽出物の希釈濃度は、５．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、及び０．５ｍｇ／ｍＬであった。
（２）水抽出試料：調製例Ｄで得たトルコギキョウ水抽出物を水に溶解した後、水で５．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した（試験における最終濃度は、２．５ｍｇ／ｍＬであった）。各抽出物の希釈濃度は、２．５ｍｇ／ｍＬ、１．２５ｍｇ／ｍＬ、０．６３ｍｇ／ｍＬ、及び０．３１ｍｇ／ｍＬであった。
【００５５】
２−４．試験方法
実施例２−３で得た各試料溶液１００μＬを、ＤＰＰＨ溶液１００μＬと共に９６穴培養プレートの穴にそれぞれ加えた。同時に、対照群（分析する試料溶液は、メタノール１００μＬに置き換えた）及びブランク群（試料溶液１００μＬをメタノール１００μＬに加えることにより調製）を調製した。試料は、９６穴培養プレートを穏やかに振盪して均一に混合した。９６穴培養プレートを暗所に３０分間置いた。その後、試料の最終吸光度（Ａ）を波長５１７ｎｍで測定し、記録した。
ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉率Ｄ
＝（Ａ対照群−Ａ試料群−Ａブランク）／Ａ対照群
Ａ試料群を、分析する試料を加えた後の吸光度、Ａ対照群を、試料を加えていない場合の吸光度、Ａブランクを、ブランク群の吸光度とした。各試料の試験は、３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行い、実験誤差が小さくなるように平均値を得た。
【００５６】
２−５．実験結果
（Ａ）９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物のＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能
調製例Ｂで得た異なる品種のトルコギキョウ抽出物の濃度１０ｍｇ／ｍＬにおけるＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能を、表９に示す。結果から、全ての抽出物がＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉に有効であることが分かる。
【００５７】
表９  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物のＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能
【表９】
2015151397.tif 000010
【００５８】
（Ｂ）９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたトルコギキョウの異なる部分の抽出物のＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能
調製例Ｃで得たアレナ品種トルコギキョウの異なる部分の抽出物の濃度１０ｍｇ／ｍＬにおけるＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能を、表１０に示す。結果から、全ての抽出物がＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉に有効であり、茎の抽出物の活性がより良いことが分かる（９２．９％）。
【００５９】
表１０  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウの異なる部分の抽出物のＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能
【表１０】
2015151397.tif 000011
【００６０】
（Ｃ）異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能
調製例Ｄで得た異なる品種のトルコギキョウ水抽出物の濃度５ｍｇ／ｍＬにおけるＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能を、表１１に示す。結果から、全ての水抽出物がＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉に有効であることが分かる。
【００６１】
表１１  異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能
【表１１】
2015151397.tif 000012
【００６２】
実施例３：ＭＭＰｓ活性の阻害効果
３−１．細胞培養
血清含有培地（即ち、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）中のヒト皮膚線維芽細胞株（ＷＳ１）（ＢＣＲＣ  ６０３００）の１×１０４細胞（０．１ｍＬ）を、９６穴培養プレートに播いた。ＷＳ１細胞を３時間接着させた後、上清を除去した。調製例Ｂ、Ｃ、及びＤで得た各抽出物を、血清含有培地で１．０ｍｇ／ｍＬ、１０−１ｍｇ／ｍＬ、１０−２ｍｇ／ｍＬ、１０−３ｍｇ／ｍＬ、又は１０−４ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、０．２μｍ濾過膜で濾過し、濾液０．１ｍＬをＷＳ１細胞に加えて、細胞溶液を得た。２４時間後、細胞溶液の上清を除去した。調製例Ｂ、Ｃ、及びＤで得た各抽出物を、ＤＭＥＭ培地（１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α、無血清）で１．０、１０−１、１０−２、１０−３、又は１０−４ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、０．２μｍ濾過膜で濾過し、濾液０．１ｍＬを細胞に加えた。３時間後、上清を集め、ＭＭＰ−２／−９のザイモグラフィー分析用試料として−８０℃で保管した。
【００６３】
３−２．細胞毒性分析
血清含有培地及びＭＴＳの混合物（１００μＬ：１０μＬ）を、実施例３−１の９６穴培養プレートに保持された細胞に加え、培養プレートを３７℃で３時間保存した。その後、培養プレート中の各試料のＯＤ５５０ｎｍにおける吸光度を検出し、以下のように細胞生存率を計算した。
相対細胞生存率（％）＝１００％×試料の吸光度／ＷＳ１の吸光度
【００６４】
３−３．ＭＭＰ−２／−９のザイモグラフィー分析
（１）電気泳動ゲルの調製及び電気泳動分析
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルを、０．２％ｇのエラスチン／カゼインを基質溶液として用いて調製した。４μＬの試料ダイ（試料ダイ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％ＳＤＳ、０．４％ブロモフェノールブルー、４０％グリセロール）を２０μＬの各試料（即ち、実施例３−１で収集した上清）に加え（試料ダイ：試料（ｖ／ｖ）＝１：５）、室温で１０分間、均一に混合した後、混合物を電気泳動ゲルにロードし、８０Ｖの一定電圧で電気泳動分析した。
【００６５】
（２）ザイモグラフィー分析
電気泳動分析後、ゲルを洗浄緩衝液Ｉ（２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３ｍＭ ＮａＮ３）に浸し、洗浄のため室温で６０分間振盪した。その後、ゲルを洗浄緩衝液ＩＩ（２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、３ｍＭ ＮａＮ３、５μＭ ＺｎＣｌ２）に浸し、洗浄のため室温で４０分間振盪した。その後、ゲルを反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３ｍＭ ＮａＮ３、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＺｎＣｌ２）に３７℃で１８時間浸した。
【００６６】
（３）染色、脱染、及びバンド分析
上記のザイモグラフィー分析が完了した後、ゲルを染色液（０．５％クマシーブルーＲ２５０）に６０分間浸した後、脱染液（３０％メタノール、１０％酢酸）に浸し、ゲル上に透明なバンドが現れるまで振盪した。その後、ゲルを逆浸透水に浸し、１０分間振盪した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ画像処理システムにより透明なバンドの光学密度を定量化し、ＭＭＰ−２／−９の活性を分析した。
【００６７】
３−４．実験結果
（Ａ）９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物のＭＭＰｓ阻害効果
調製例Ｂで得た異なる品種のトルコギキョウ抽出物のＭＭＰ−２／−９に対する細胞毒性及び阻害効果を、表１２に示す。結果から、全ての抽出物がＭＭＰ−２／−９の阻害に有効であることが分かる。
【００６８】
表１２  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いた異なる品種のトルコギキョウ抽出物のＭＭＰ−２／−９阻害効果（阻害率、％）
【表１２】
2015151397.tif 000013
*：試料の最も高い非毒性濃度での阻害率
【００６９】
（Ｂ）９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたトルコギキョウの異なる部分の抽出物のＭＭＰｓ阻害効果
調製例Ｃで得たアレナ品種トルコギキョウの異なる部分の抽出物のＭＭＰ−２／−９に対する細胞毒性及び阻害効果を、表１３に示す。結果から、全ての抽出物がＭＭＰ−２／−９の阻害に有効であることが分かる。
【００７０】
表１３  ９５％エタノール水溶液を抽出溶媒として用いたアレナ品種トルコギキョウの異なる部分の抽出物のＭＭＰ−２／−９に対する阻害効果（阻害率、％）
【表１３】
2015151397.tif 000014
*：試料の最も高い非毒性濃度での阻害率
【００７１】
（Ｃ）異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のＭＭＰｓ阻害効果
調製例Ｄで得た異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のＭＭＰ−９に対する細胞毒性及び阻害効果を、表１４に示す。結果から、全ての水抽出物がＭＭＰ−９の阻害に有効であることが分かる。
【００７２】
表１４  異なる品種のトルコギキョウ水抽出物のＭＭＰ−９に対する阻害効果（阻害率、％）
【表１４】
2015151397.tif 000015
*：試料の最も高い非毒性濃度での阻害率
【００７３】
上記の結果により、トルコギキョウの異なる品種及び異なる部分の全てのアルコール抽出物及び水抽出物が、ＤＰＰＨフリーラジカルの捕捉、ＭＭＰｓ活性の阻害、及びエラスターゼ活性の阻害に有効であることが分かる。
【００７４】
上記の実施例は、本発明の原理及び有効性を例示的に説明するために使用するものであって、本発明を限定するために使用するものではない。当業者は、記載された発明の開示及び示唆に基づいて、その技術的原理及び精神を逸脱することなく、種々の変更及び置換を行ってもよい。従って、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に定義する通りとする。
【００７５】
本出願は、２０１４年２月１０日に台湾特許庁に出願された台湾特許出願第１０３１０４２３５号に基づく優先権を主張する。この特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。