(57)【要約】【課題】非特異的吸着が抑制され、磁力により容易に分離・回収することができる、生体分子捕捉粒子を提供すること。【解決手段】超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、下記構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａとを含む磁性粒子：（ａ）下記一般式（１）で表される構造単位；（ｂ）下記一般式（２）で表される構造単位；（ｃ）下記一般式（３）で表される構造単位：2015044956.tif 000023【選択図】図１
2015044956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、下記構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａとを含む磁性粒子：
（ａ）下記一般式（１）で表される構造単位：
（ｂ）下記一般式（２）で表される構造単位：
（ｃ）下記一般式（３）で表される構造単位：
【化１４】
2015044956.tif 000017
（式中、Ｒ１ａは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｍは２〜６の整数である）；
【化１５】
2015044956.tif 000018
（式中、Ｒ１ｂは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ２ｂは水素原子又はＯＲ（Ｒは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す）基であり、ｎは２〜１８の整数である）；
【化１６】
2015044956.tif 000019
（式中、Ｒ１ｃは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｑは２〜１０の整数であり、Ｒ２ｃは生体分子固定可能な官能基である）。
【請求項２】
超常磁性ナノ粒子が、酸化鉄を含有する微粒子である、請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項３】
超常磁性ナノ粒子が、Ｆｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３から選択される少なくとも１種のナノ粒子を含む、請求項１又は２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
疎水性ポリマーを構成するモノマーが、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項５】
共重合体Ａにおける構造単位（ａ）の構成割合が３５〜９５モル％であり、構造単位（ｂ）の構成割合が１〜５０モル％であり、構造単位（ｃ）の構成割合が１〜３０モル％である、請求項１〜４のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項６】
生体分子固定可能な官能基が、カルボキシル基若しくはその活性エステル基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基又はブロモアセトアミド基である、請求項１〜５のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項７】
疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子を含み、水と溶け合わない溶媒と、下記構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａを含む水とを乳化させ：
（ａ）下記一般式（１）で表される構造単位：
（ｂ）下記一般式（２）で表される構造単位：
（ｃ）下記一般式（３）で表される構造単位：
【化１７】
2015044956.tif 000020
（式中、Ｒ１ａは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｍは２〜６の整数である）；
【化１８】
2015044956.tif 000021
（式中、Ｒ１ｂは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ２ｂは水素原子又はＯＲ（Ｒは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す）基であり、ｎは２〜１８の整数である）；
【化１９】
2015044956.tif 000022
（式中、Ｒ１ｃは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｑは２〜１０の整数であり、Ｒ２ｃは生体分子固定可能な官能基である）；
得られた乳化液から水と溶け合わない溶媒を除去して得られる磁性粒子。
【請求項８】
水と溶け合わない溶媒が、疎水性ポリマーを溶解する、請求項７に記載の磁性粒子。
【請求項９】
乳化において、超常磁性ナノ粒子１００重量部に対して、疎水性ポリマー０．０１〜２０００重量部と共重合体Ａ  ２〜２０００重量部とを使用する、請求項７又は８に記載の磁性粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁力により容易に分離し回収することができ、非特異的な吸着が抑制された磁性粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子を特定の粒子に捕捉させることは、生体分子の分離、精製、測定、検出等を行う手段として非常に有用である。生体分子を特定の粒子に捕捉させることによって、例えば、感染症や癌のバイオマーカーやホルモン等の検査対象物質を患者から検出して診断すること、核酸やタンパク質等の特定の生体分子を分離・定量すること、特定の細菌や細胞を分離することができる。
【０００３】
そのため、生体分子を捕捉することができる粒子（生体分子捕捉粒子）について広く検討が行われている。例えば特許文献１には、磁性粒子表面に重合開始基を導入し、当該重合開始基を重合開始源としてリビング重合反応を行い、磁性粒子表面にポリマーをグラフト化して得られた磁性ポリマー粒子が開示されている。磁性粒子をポリマーで被覆することによって、ポリマーの有する各種機能を磁性粒子に付与することができる。
【０００４】
ところで、このような生体分子捕捉粒子について問題となるのが、生体分子捕捉粒子が捕捉することを目的としていない非対象物を捕捉してしまう、非特異的吸着である。非特異的吸着は、非対象物と生体分子捕捉粒子との物理的・化学的な相互作用によって起こる現象である。
【０００５】
このような非特異的吸着により、精製や分離が不十分となったり、測定結果が不正確となる可能性がある。そこで非特異的吸着を低減するために従来行われているのが、ブロッキングと言われる方法である。ブロッキングは、生体分子捕捉物質を粒子上に固定化した後に、夾雑物の吸着量が少ないアルブミンやカゼイン等のバイオ分子系ブロッキング剤で粒子表面を被覆する方法である。しかし、ブロッキング剤の被覆効果が十分得られない場合や、ブロッキング剤の変質等によってその作用が経時的に変化し非特異的吸着が発生する場合がある。このため、ブロッキング剤による非特異的吸着の低減は不十分なものであった。
【０００６】
このような背景のもと、非特異的吸着をさらに低減させるため、粒子を各種機能性ポリマーで処理する技術が開発された。
【０００７】
例えば特許文献２には、非磁性体核粒子を磁性体層で被覆し、さらにその磁性体層を、２，３−ジヒドロキシプロピル基を含むポリマー（その水酸基の一部が、トシルオキシ基又はカルボキシアルキルカルボニルオキシ基に変換されている）層で被覆した磁性粒子が開示されている。２，３-ジヒドロキシプロピル基の存在により非特異的吸着が抑制される。さらに前記ポリマー層における各種官能基を、生体分子捕捉物質と結合させることによって、前記磁性粒子に生体分子捕捉機能を導入することができる。なお、磁性粒子は磁力により容易に分離・回収することができることから、この分野において広く利用されている。
【０００８】
また、ホスホリルコリン基を有するポリマーに非特異的吸着を抑制する作用があることが知られている。例えば特許文献３には、生体分子捕捉物質が固定化されたマイクロ粒子であって、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単位と、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合されてなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子が、表面に被覆されていることを特徴とするマイクロ粒子が開示されている。
【０００９】
さらに、ホスホリルコリン基を有するポリマーを利用した技術として、酸化チタン粒子の表面が、下記式（Ｉ）で表され、下記式（ＩＩ）で表される構造単位を含んでもよいホスホリルコリン基含有ポリマーにより被覆されてなる、ポリマー被覆粒子も開発された（特許文献４）。
【００１０】
【化１】
2015044956.tif 000003
【００１１】
【化２】
2015044956.tif 000004
【００１２】
式（Ｉ）におけるトリエトキシシラン基は水酸基を有する酸化チタン粒子とシランカップリング反応を起こし、これによりホスホリルコリン基含有ポリマーが酸化チタンに固定される。このようなポリマー被覆粒子は、核粒子が比重の大きい粒子であるため、分離目的の物質と結合させた後、自然沈降により回収し分析することができ、あるいは自然沈降に代えて又は自然沈降に続いて、遠心分離処理をすることができるとされている。しかしながら自然沈降では回収に時間を要するし、遠心分離処理は大掛かりな装置を必要とするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−３２８３０９号公報
【特許文献２】特開２００７−２８８１３３号公報
【特許文献３】特開２００６−２０１０９１号公報
【特許文献４】特開２００７−２２８８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、非特異的吸着が抑制され、磁力により容易に分離・回収することができる、生体分子捕捉粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、特定の構造単位を有する共重合体とを、例えば乳化を利用して、これらを何らかの相互作用により結びつかせた磁性粒子が、非特異的吸着が抑制され、磁力により容易に分離・回収することができる、生体分子捕捉粒子として利用可能であることを見出し、本発明を完成するにいたった。
【００１６】
すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
１．超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、下記構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａとを含む磁性粒子：
（ａ）下記一般式（１）で表される構造単位：
（ｂ）下記一般式（２）で表される構造単位：
（ｃ）下記一般式（３）で表される構造単位：
【００１７】
【化３】
2015044956.tif 000005
（式中、Ｒ１ａは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｍは２〜６の整数である）；
【００１８】
【化４】
2015044956.tif 000006
（式中、Ｒ１ｂは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ２ｂは水素原子又はＯＲ（Ｒは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す）基であり、ｎは２〜１８の整数である）；
【００１９】
【化５】
2015044956.tif 000007
（式中、Ｒ１ｃは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｑは２〜１０の整数であり、Ｒ２ｃは生体分子固定可能な官能基である）。
【００２０】
２．超常磁性ナノ粒子が、酸化鉄を含有する微粒子である、上記１に記載の磁性粒子。
【００２１】
３．超常磁性ナノ粒子が、Ｆｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３から選択される少なくとも１種のナノ粒子を含む、上記１又は２に記載の磁性粒子。
【００２２】
４．疎水性ポリマーを構成するモノマーが、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である、上記１〜３のいずれかに記載の磁性粒子。
【００２３】
５．共重合体Ａにおける構造単位（ａ）の構成割合が３５〜９５モル％であり、構造単位（ｂ）の構成割合が１〜５０モル％であり、構造単位（ｃ）の構成割合が１〜３０モル％である、上記１〜４のいずれかに記載の磁性粒子。
【００２４】
６．生体分子固定可能な官能基が、カルボキシル基若しくはその活性エステル基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基又はブロモアセトアミド基である、上記１〜５のいずれかに記載の磁性粒子。
【００２５】
７．疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子を含み、水と溶け合わない溶媒と、下記構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａを含む水とを乳化させ：
（ａ）下記一般式（１）で表される構造単位：
（ｂ）下記一般式（２）で表される構造単位：
（ｃ）下記一般式（３）で表される構造単位：
【００２６】
【化６】
2015044956.tif 000008
（式中、Ｒ１ａは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｍは２〜６の整数である）；
【００２７】
【化７】
2015044956.tif 000009
（式中、Ｒ１ｂは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、Ｒ２ｂは水素原子又はＯＲ（Ｒは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す）基であり、ｎは２〜１８の整数である）；
【００２８】
【化８】
2015044956.tif 000010
（式中、Ｒ１ｃは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、ｑは２〜１０の整数であり、Ｒ２ｃは生体分子固定可能な官能基である）；
得られた乳化液から水と溶け合わない溶媒を除去して得られる磁性粒子。
【００２９】
８．水と溶け合わない溶媒が、疎水性ポリマーを溶解する、上記７に記載の磁性粒子。
【００３０】
９．乳化において、超常磁性ナノ粒子１００重量部に対して、疎水性ポリマー０．０１〜２０００重量部と共重合体Ａ  ２〜２０００重量部とを使用する、上記７又は８に記載の磁性粒子。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、磁力により容易に分離・回収可能で、生体分子を固定化（捕捉）することができ、かつ生体分子の非特異的な吸着が抑制された磁性粒子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、実施例１で得られた磁性粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の磁性粒子について詳細に説明する。
【００３４】
≪磁性粒子≫
本発明の磁性粒子は上記の通り、超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、特定の構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａとを含む。以下、これら各成分及び本発明の磁性粒子の製造方法等について説明する。
【００３５】
＜超常磁性ナノ粒子＞
超常磁性ナノ粒子としては、粒径２０ｎｍ以下、好ましくは粒径５〜２０ｎｍの酸化鉄を含有する微粒子が代表的であり、より具体的な例としては、ＭＦｅ２Ｏ４（Ｍ＝Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等）で表されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表されるマグネタイト、あるいはγ−Ｆｅ２Ｏ３が挙げられる。これらの中でも、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４から選択される少なくとも１種のナノ粒子が好ましい。さらにこのような磁性体は、チタンカップリング剤、シランカップリング剤若しくは高級脂肪酸等の公知の疎水化処理剤により処理されたものであってもよい。
【００３６】
このような超常磁性ナノ粒子の存在により、本発明の粒子は磁性を有し、磁力により容易に分離や回収を行うことができる。
【００３７】
本発明の磁性粒子（１００重量％中）における超常磁性ナノ粒子の含有量は、前記粒子に十分な磁性を付与する観点から、好ましくは１０〜９０重量％である。前記超常磁性ナノ粒子の含有量は、磁性粒子についてTG-DTA測定を行い、600℃まで昇温したときの重量減少量（ポリマー成分の重量に対応）を磁性粒子の重量から差し引くことで算出することができる。
【００３８】
＜疎水性ポリマー＞
疎水性ポリマーは、水性溶媒との親和性に乏しいポリマーであり、疎水性ポリマーをコアに用いることにより、本発明の磁性粒子に機械的強度や耐熱性を付与することができる。疎水性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、スチレン、α―メチルスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー、（メタ）アクリロニトリル等のニトリル基含有モノマー、炭素数４以上のアルキル基を有するメタクリル酸エステル、エチレン及びプロピレン等のα−オレフィン類、ブタジエン等のジエン類等が挙げられる。好ましくは、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である。疎水性ポリマーは、一種のモノマーからなるホモポリマーであっても、二種以上のモノマーからなるコポリマーであってもよい。
【００３９】
本発明の磁性粒子の製造において、疎水性ポリマーは超常磁性ナノ粒子の少なくとも一部を被覆し、粒子形態の形成に寄与するものと考えられる。このような点から、疎水性ポリマーは、磁性粒子の製造において、超常磁性ナノ粒子１００重量部に対して通常０．０１〜２０００重量部使用する。
【００４０】
＜構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａ＞
本発明の磁性粒子は、上記特定の構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体Ａを含む。
前記構造単位（ａ）中の、ホスホリルコリン構造が非特異的吸着の低減をもたらし、
前記構造単位（ｂ）は前記共重合体Ａに疎水性を付与して、本発明の磁性粒子の製造の際に、共重合体Ａが超常磁性ナノ粒子や疎水性ポリマーと相互作用して、これら三成分の複合体である本発明の磁性粒子が形成されやすくし、
前記構造単位（ｃ）は生体分子固定可能な官能基を有しており、本発明の磁性粒子に生体分子捕捉能力を付与することができる。以下、これら各構造単位について説明する。
【００４１】
（構造単位（ａ））
構造単位（ａ）は下記一般式（１）で表される：
【００４２】
【化９】
2015044956.tif 000011
【００４３】
式中、Ｒ１ａは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を意味する。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒ１ａは、好ましくは水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは水素原子又はメチル基である。
【００４４】
ｍはアルキレン基の炭素数を意味し、２〜６の整数である。
【００４５】
式（１）で表される構造単位となるモノマーとしては、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（２−エチルアクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、２−（２−プロピルアクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、２−（２−ブチルアクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン等が挙げられる。本発明の磁性粒子の非特異的吸着抑制効果の観点から、好ましくは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が用いられる。例えばＭＰＣは、公知の方法（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ｖｏｌ．  ２２，  Ｎｏ．  ５，（Ｍａｙ  １９９０），  ｐｐ．  ３５５−３６０参照）により調製することにより、あるいは東京化成工業（株）等の試薬供給業者より入手することができる。
【００４６】
本発明の磁性粒子における共重合体Ａにおいて、構造単位（ａ）は１種類であっても、構造の異なる２種類以上が存在していてもよい。
【００４７】
（構造単位（ｂ））
構造単位（ｂ）は下記一般式（２）で表される：
【化１０】
2015044956.tif 000012
【００４８】
式中、Ｒ１ｂは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を意味する。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒ１ｂは、好ましくは水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは水素原子又はメチル基である。
【００４９】
Ｒ２ｂは水素原子又はＯＲ基を意味する（Ｒは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す）。脂肪族炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基等があげられ、芳香族炭化水素基としては、フェニル基等が挙げられる。
【００５０】
ｎはアルキレン基の炭素数を意味し、２〜１８の整数である。また、Ｒ２ｂは（ＣＨ２）ｎで表されるアルキレン基における、エステル基から最も離れたメチレン基に結合している必要はなく、アルキレン基を構成するいずれのメチレン基に結合していてもよい。
【００５１】
式（２）で表される構造単位となるモノマーとしては、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸２−エトキシエチル、メタクリル酸２−エトキシプロピル、メタクリル酸２−フェノキシエチル、メタクリル酸２−ブトキシエチル等が好ましく挙げられる。
【００５２】
また本発明の磁性粒子における共重合体Ａにおいて、構造単位（ｂ）は１種類であっても、構造の異なる２種類以上が存在していてもよい。
【００５３】
（構造単位（ｃ））
構造単位（ｃ）は下記一般式（３）で表される：
【化１１】
2015044956.tif 000013
【００５４】
式中、Ｒ１ｃは水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を意味する。炭素数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒ１ｃは、好ましくは水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは水素原子又はメチル基である。
【００５５】
ｑはエチレンオキシ基の繰り返し単位数を意味し、２〜１０の整数である。
【００５６】
Ｒ２ｃは、生体分子固定可能な官能基であり、標的となる生体分子に特異的に相互作用する基であれば特に制限されない。その具体例としては、カルボキシル基若しくはその活性エステル基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基又はブロモアセトアミド基等が挙げられる。
【００５７】
前記活性エステル基とは、カルボニルオキシ基に電子吸引性の基や嵩高い基が結合してなるエステル基である。このようなエステル結合はアミノ基、チオール基及び水酸基などによって容易に求核置換反応等の反応を受けるので、この活性エステル基の部分に生体分子を反応させることにより、本発明の磁性粒子に生体分子を固定することができる。カルボキシル基及びエポキシ基等も同様に反応性の高い基で、この部分に生体分子を反応させることができる。なお、生体分子に活性エステル基、カルボキシル基やエポキシ基等と反応し得る部位が無い場合には、公知の方法で、例えばアミノ基のようなこれらの基と反応し得る基を生体分子に導入すればよい。
【００５８】
前記活性エステル基は、例えば下記式（ｃ）又は（ｄ）の構造で示される基である。
【００５９】
【化１２】
2015044956.tif 000014
【００６０】
式（ｃ）及び式（ｄ）において、Ｒ′およびＲ″はそれぞれ独立して一価の有機基であり、直鎖状、分岐状又は環状のいずれであってもよい。また、式（ｄ）において、二つのＲ″はそれらが結合するＮとともに環を形成してもよい。
【００６１】
このような活性エステル基の具体例として、下記構造の基が挙げられる。
【化１３】
2015044956.tif 000015
【００６２】
これらの他に、活性エステル基として、ペンタフルオロフェノールのエステル基、チオフェノールのエステル基；５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基及びＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等の複素環ヒドロキシ化合物のエステル基；並びにシアノメチルエステル基が挙げられる。
【００６３】
式（３）で表される構造単位となるモノマーとしては、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル(ポリ)オキシエチレンメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニルジ（エチレングリコール）メタクリレート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｄｉ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｙｌｃｏｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、ＰＥＮＨＳ）等が好ましく挙げられる。例えばＭＥＯＮＰは、公知の方法（例えば、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４，  ５，  ３４２−３４７参照）により調製することができ、ＰＥＮＨＳは、公知の方法（例えば、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ３８（２０１２）２０９−２１４参照）により調製することができる。
【００６４】
また本発明の磁性粒子における共重合体Ａにおいて、構造単位（ｃ）は１種類であっても、構造の異なる２種類以上が存在していてもよい。
【００６５】
（共重合体Ａ）
本発明に使用される共重合体Ａは、以上説明した各種構造単位（ａ）〜（ｃ）を有する共重合体であって、これらのブロック共重合体であってもランダム共重合体であってもよい。
【００６６】
前記共重合体Ａにおける構造単位（ａ）〜（ｃ）について、全構造単位に対する各々の構造単位の構成割合は、構造単位（ａ）が好ましくは３５〜９５モル％であり、構造単位（ｂ）が好ましくは１〜５０モル％であり、構造単位（ｃ）が１〜３０モル％である（ただし、構造単位（ａ）〜（ｃ）の構成割合の合計は１００モル％である）。なお、共重合体Ａにおける各構造単位の構成割合は、核磁気共鳴分光法により測定可能である。
【００６７】
以上説明した共重合体Ａは、本発明において１種単独で使用しても２種以上を併用してもよい。また、前記共重合体Ａは、本発明の磁性粒子に良好な非特異的吸着低減機能及び生体分子捕捉機能を付与し、かつ前記磁性粒子の製造において疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子と相互作用して適切に粒子の形態を形成する観点から、磁性粒子の製造において、超常磁性ナノ粒子１００重量部に対して２〜２０００重量部使用することが好ましい。
【００６８】
（共重合体Ａの製造方法）
本発明に使用される共重合体Ａは、以上説明した構造単位（ａ）〜（ｃ）を形成するモノマー化合物を、好ましくは上記した構造単位の構成割合となる量で混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により製造することができる。前記共重合体Ａをラジカル重合により製造する場合、たとえば、アルゴン等の不活性ガス雰囲気にて、３０〜９０℃で溶液重合を行うことができる。
【００６９】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。
【００７０】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、ラジカル重合において通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；及び、過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；などが使用可能である。
【００７１】
ラジカル重合反応により得られた共重合体Ａは、例えば当該共重合体の貧溶媒を使用した再沈殿法により回収することができる。
【００７２】
［磁性粒子の製造方法］
本発明の磁性粒子は、例えば以下のような方法により製造することができる。
【００７３】
疎水性ポリマーを水と溶け合わない溶媒に溶解し、このポリマー溶液に公知の疎水化処理剤により処理された超常磁性ナノ粒子を分散する。このようにして得られた油相と、水溶性の乳化剤を含む水とを混合し、公知の乳化機を用いて乳化することにより、油滴が水に分散する水中油型（Ｏ／Ｗ型）エマルションを形成する。次いで、真空下、ゆっくりと前記水と溶け合わない溶媒を蒸発処理することにより本発明の磁性粒子を得ることができる。この際水の少なくとも一部が蒸発してもよい。
【００７４】
前記溶媒は水と溶け合わないことに加えて、乳化を実施するため、さらに疎水性ポリマーを溶解することができる。そのような溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素化脂肪族炭化水素や、トルエン、キシレン、ベンゼン等の芳香族炭化水素溶媒等の有機溶媒が挙げられる。
【００７５】
上記乳化機としては、ディスパーミキサー、ホモミキサー、高圧ホモジナイザー、超音波分散機等を用いることができる。
【００７６】
上記水溶性の乳化剤としては、共重合体Ａを用いる。共重合体Ａは構造単位（ａ）の親水性部分と、構造単位（ｂ）の疎水性の部分を持ち、乳化剤として機能する。
【００７７】
当該乳化に付する疎水性ポリマー、超常磁性ナノ粒子及び共重合体Ａの量を調整することによって、得られる本発明の磁性粒子におけるこれら３成分の含有量を調整することができる。例えば乳化における各成分の使用量を、超常磁性ナノ粒子１００重量部に対して、疎水性ポリマー０．０１〜２０００重量部と共重合体Ａ  ２〜２０００重量部にすることで、好適に本発明の磁性粒子を得ることができる。
【００７８】
［磁性粒子の特性］
例えば上記のごとく乳化を利用して得られる本発明の磁性粒子において、エマルションを形成する際、共重合体Ａは親水性の構造単位（ａ）を外側に、疎水性の構造単位（ｂ）を内側にしたミセルを形成していると考えられる。本発明で得られる磁性粒子では、共重合体Ａの構造単位（ａ）が表面又はその近傍に配置され、構造単位（ｂ）は疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子と相互作用しており、共重合体Ａが疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子の少なくとも一部を被覆した粒子の形態をなしているものと考えられる。
【００７９】
また共重合体Ａは、特許文献４の発明のように酸化チタンとのカップリング反応を経ずとも磁性粒子中で十分に固定され、その機能を発揮する。
【００８０】
このような各種成分を含む本発明の磁性粒子は、超常磁性ナノ粒子の存在により磁性を有し、磁力により容易に分離・回収することができる。具体的には、溶媒１ｍＬ中に磁性粒子２ｍｇ程度が分散しているスケールならば、表面磁力密度約４３００ガウスのネオジム−鉄−ボロン磁石を用いて磁場をかけることによって、１０〜６０秒程度で、水中の特定の個所に磁性粒子を集め、容易に回収することができる。
【００８１】
［磁性粒子の用途］
本発明の磁性粒子は、磁性粒子の表面又はその近傍には共重合Ａの構造単位（ｃ）に生体分子固定可能な官能基を有することから、生体分子を固定化することができる。この生体分子固定官能な官能基は、標的となる生体分子に特異的に相互作用する基であれば特に制限されない。前記特異的な相互作用は物理的な相互作用であっても化学的な相互作用であってもよい。また、前記生体分子固定可能な官能基で固定化した生体分子がさらに別の生体分子に特異的に相互作用する分子であれば、前記固定化した生体分子を介して、さらに別の生体分子を固定化することができる。
【００８２】
本発明の磁性粒子は、ホスホリルコリン構造及び生体分子固定可能な官能基を含む共重合体Ａが粒子表面又はその近傍に配置されることから、非特異的吸着が抑制されると考えられる。前記磁性粒子を使用した場合には、生体分子と反応せずに残留する官能基もあると考えられるが、このように残留している官能基は不活性化（例えばアルカリ化合物処理やアミノ化合物処理）することで、非特異的吸着の低減効果を貫徹することができる。
【００８３】
本発明の磁性粒子は、標的ではない生体分子の非特異的吸着が生じ難い、優れた生体分子捕捉粒子として利用することができる。より具体的には本発明の磁性粒子を利用して、感染症や癌のバイオマーカーやホルモン等の検査対象物質を患者から検出して診断を行ったり、核酸やタンパク質等の特定の生体分子を分離・定量したり、特定の細菌や細胞を分離することができる。
【００８４】
そのような生体分子の具体例としては、核酸、アプタマー、タンパク質、ペプチド、糖鎖および糖タンパク質が挙げられる。前記タンパク質としては、例えば酵素、抗体、抗原等が挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００８６】
＜共重合体Ａの作製＞
以下の実施例で使用した共重合体Ａ１及びＡ２は、以下の通りにして製造した。
【００８７】
（共重合体Ａ１の製造方法）
溶媒としてエタノール１５ｍＬを含むガラス管において、アルゴン置換を行った後、モノマーである２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ｎ-ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）及びｐ-ニトロフェニルオキシカルボニル-ポリオキシエチレンメタクリレート（ＭＥＯＮＰ、オキシエチレン基の繰り返し単位数は平均値４．５）を仕込み、ラジカル重合開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ））を添加して、６０℃で２４時間、ラジカル重合を行った。
【００８８】
なお、重合は酸素阻害を防ぐために空気中の酸素が混入しないようにガラス管を密封して行い、ラジカル重合における全モノマー濃度は０．５ｍｏｌ／Ｌ（ＭＰＣ：１．８１０６ｇ，ＢＭＡ：０．１１４０ｇ，ＭＥＯＮＰ：０．３２１８ｇ）であり、開始剤濃度は０．００２５ｍｏｌ／Ｌ（ＡＩＢＮ：５．９ｍｇ）であった。
【００８９】
以上のラジカル重合により得られた重合溶液について、クロロホルム-エーテル混合溶媒（２：８）を用いた再沈殿を行った。次いで真空乾燥によって溶媒を除き、共重合体Ａ１を獲得した。仕込み組成ＭＰＣ：ＢＭＡ：ＭＥＯＮＰ＝８０：１０：１０（モル比）に対して、共重合体Ａ１中の組成はＭＰＣ：ＢＭＡ：ＭＥＯＮＰ＝９２：７：１（モル比）であった。
【００９０】
（共重合体Ａ２の作製方法）
ＭＥＯＮＰをＮ−スクシンイミジルオキシカルボニルジ（エチレングリコール）メタクリレート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｄｉ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｙｌｃｏｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ、ＰＥＮＨＳ）に変更し、ラジカル重合における全モノマー濃度を１．０ｍｏｌ／Ｌ（ＭＰＣ：３．５８９０ｇ，ＢＭＡ：０．２１５２ｇ，ＰＥＮＨＳ：０．４６９４ｇ）に、開始剤濃度を０．００５ｍｏｌ／Ｌ（ＡＩＢＮ：１２．１ｍｇ）に変更した以外は、上記共重合体Ａ１の製造と同様にして共重合体Ａ２を製造した。
【００９１】
仕込み組成ＭＰＣ：ＢＭＡ：ＰＥＮＨＳ＝８０：１０：１０（モル比）に対して、共重合体Ａ２中の組成はＭＰＣ：ＢＭＡ：ＰＥＮＨＳ＝７９：１６：５（モル比）であった。
【００９２】
［実施例１］磁性粒子の製造
以下に示す方法により、実施例１の磁性粒子を製造した。
【００９３】
クロロホルム４ｍＬ中に疎水性コート酸化鉄（粒径約１０ｎｍ）２００．０ｍｇ及びポリスチレン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）２０３．９ｍｇを添加した溶液と、水２０ｍＬ中に溶かした共重合体Ａ１  ２１．１ｍｇの溶液とを混合し、超音波分散機にて乳化させた。得られた乳化液から減圧によりクロロホルムを除去することにより実施例１の磁性粒子を得た。
【００９４】
図１に、得られた磁性粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。直径が５０〜５００ｎｍの粒子の生成が確認できる。
【００９５】
［実施例２］磁性粒子の製造
ポリスチレンの使用量を２００．０ｍｇに変更し、さらに共重合体Ａ１を共重合体Ａ２に変更した以外は実施例１と同様にして、実施例２の磁性粒子を製造した。
【００９６】
［比較例１］
比較例１の磁性粒子として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＭｙＯｎｅＣａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．、親水性ポリマー被覆磁性粒子）を用意した。
【００９７】
＜特異的捕捉の評価＞
（実施例１及び２の磁性粒子へのプロテインＡの結合）
実施例１及び２の磁性粒子２ｍｇをそれぞれ１．２Ｍ  リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に分散させ、磁性粒子を磁気分離により回収して上澄みを除去し、再度１．２Ｍ  リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に分散、磁気分離による回収・上清除去を２回繰り返した。
【００９８】
上清と分離した磁性粒子を１ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製，ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｏｌｕｂｌｅ，Ｃｏｗａｎ  ｓｔｒａｉｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，≧９５％（ＨＰＬＣ）を１．２Ｍ  リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈したもの）に加え、３７℃で回転攪拌機にて一晩攪拌した。
【００９９】
磁性粒子を磁気分離にて回収し、再度１．２Ｍ  リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）に分散、磁気分離による回収・上清除去を２回繰り返した後、０．１Ｍ  ２−アミノエタノール（溶媒：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５））を添加し、室温下、回転攪拌機にて１時間撹拌し、磁性粒子を構成する共重合体Ａ（Ａ１及びＡ２）におけるＭＥＯＮＰ又はＰＥＮＨＳの不活性化を行った。磁気分離にて上清を除去し、磁性粒子をＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で洗浄後、更にＰＢＳ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で洗浄を行った。
【０１００】
（比較例１の磁性粒子へのプロテインＡの結合）
比較例１の磁性粒子２ｍｇを１５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させ、磁性粒子を磁気分離により回収して上澄みを除去し、再度１５ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）に分散、磁気分離による回収・上清除去を２回繰り返した。
【０１０１】
磁気分離により上清と分離した磁性粒子に４０ｍｇ／ｍＬの水溶性カルボジイミドを加え、室温で回転攪拌機にて２０分間攪拌した。磁性粒子を磁気分離にて回収し、上清を除去後、１ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製，ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｏｌｕｂｌｅ，Ｃｏｗａｎ  ｓｔｒａｉｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ，≧９５％（ＨＰＬＣ）を１５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈）を加え、室温で回転攪拌機にて一晩攪拌した。
【０１０２】
（ウサギ抗体ＩｇＧの特異的捕捉の評価）
上記処理（磁性粒子へのプロテインＡの結合）を行った実施例１及び２の磁性粒子、並びに比較例１の磁性粒子を磁気分離にて回収、上清を除去後、その磁性粒子に５倍希釈したウサギ血清（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＲＩＥＳ．ＩＮＣ．ｓｅｉＳｅｒｕｍ，Ｒａｂｂｉｔ，ＮｏｒｍａｌをＰＢＳ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で希釈したもの。ウサギ抗体ＩｇＧを含んでいる）を加え、室温で回転攪拌機にて１時間攪拌した。
【０１０３】
前記磁性粒子を磁気分離にて回収し、ＰＢＳ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で洗浄後、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．８）を加え、室温で回転攪拌機にて１５分攪拌した。当該緩衝液は酸性であるため、ＩｇＧとプロテインＡとの間の結合が切断され、また磁性粒子に非特異的吸着が発生している場合には、非特異的吸着した物質も磁性粒子から分離されていると考えられる。
【０１０４】
その後磁性粒子と反応液（主に前記グリシン−ＨＣｌ緩衝液であり、ＩｇＧや、存在する場合には非特異的吸着した物質が含まれている）とを磁気にて分離し、反応液における２８０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の測定には株式会社日立ハイテクフィールディング製の分光光度計（Ｕ−３５００）を用いた。この吸光度には主として磁性粒子に特異的に捕捉されたウサギ抗体ＩｇＧの量が反映される。この吸光度とウサギ抗体ＩｇＧのモル吸光係数（Ａ２８０（１ｍｇ／ｍＬ）≒１．４）から反応液中のウサギ抗体ＩｇＧ量を算出した。算出されたウサギ抗体ＩｇＧ量（磁性粒子に捕捉された量）を下記表１に示した。
【０１０５】
＜非特異的吸着の評価＞
さらに、上記＜特異的捕捉の評価＞にて、実施例１及び２の磁性粒子並びに比較例１の磁性粒子について得られた各反応液５μＬとサンプルバッファー（４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，１００ｍＭ  ＤＴＴ，０．０１％ ＢＰＢ，０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）５μＬをボルテックスミキサーにてよく混合し、チューブヒーターにて９０℃で３分間加熱した。株式会社バイオクラフト製スラブ電気泳動装置、和光純薬株式会社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「スーパーセップＴＭエース、１２．５％、１７ウェル」、および泳動バッファー（Ｔｒｉｓ  ３ｇ，グリシン１４．３ｇ，ＳＤＳ  １ｇを純水で１Ｌに希釈したもの）を用いて、ゲル１レーンあたり１０μｌをアプライし、電気泳動を行った。染色は一般的なＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色法で行った。染色されたゲルをスキャナーでスキャンして画像化した。
【０１０６】
染色されたゲルの画像において、実施例１及び２についてはウサギ抗体ＩｇＧのサブユニットを構成する蛋白質に相当する分子量約２５ｋＤａと５０ｋＤａ付近にバンドが明瞭に確認され、その他の部分にはバンドが確認されなかったが、比較例１についてはこれらのバンドのほかに６０〜７５ｋＤａ付近にもバンドが確認され、非特異的吸着が起こっていることが確認された。以上の結果を下記表１にまとめた。
【０１０７】
＜磁気応答性＞
実施例１および２の磁性粒子、並びに比較例１の磁性粒子各２ｍｇをＰＢＳ緩衝液１ｍＬに分散させ、磁石を近づけてから、液の色が透明になるまでの時間（磁性粒子を完全に回収するまでの時間）を測定した。結果を下記表１に示す。磁石としては、表面磁力密度約４３００ガウスのネオジム−鉄−ボロン磁石を用いた。
【０１０８】
【表１】
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【図１】
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