(57)【要約】【課題】免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できる免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットを提供する。【解決手段】本発明の免疫抑制剤の評価方法は、生体組織由来の膵島を、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程Ａと、免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織由来の膵島を、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程Ａと、
免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、
免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、
を有することを特徴とする免疫抑制剤の評価方法。
【請求項２】
前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触したインシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ１を有する請求項１に記載の免疫抑制剤の評価方法。  
【請求項３】
前記工程Ｃ１は、さらに免疫抑制剤に接触した内因性及び／又は外因性Ｐｄｘ１遺伝子のメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程を含む請求項２に記載の免疫抑制剤の評価方法。
【請求項４】
前記生体組織由来の膵島は、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島である請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫抑制剤の評価方法。
【請求項５】
前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した外因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性を蛍光タンパク質の発する蛍光の強度を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ２を有する請求項４に記載の免疫抑制剤の評価方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物がブタである請求項４又は５に記載の免疫抑制剤の評価方法。
【請求項７】
分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを備えたことを特徴とする免疫抑制剤評価キット。
【請求項８】
更に、免疫抑制剤に接触した遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を測定するメチル化測定キットを備えた請求項７に記載の免疫抑制剤評価キット。
【請求項９】
更に、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を備えた請求項７又は８に記載の免疫抑制剤評価キット。
【請求項１０】
前記トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物がブタである請求項９に記載の免疫抑制剤評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットに関するものである。  
【背景技術】
【０００２】
インシュリン依存状態の１型糖尿病患者には、生活の質を改善させるべく膵ランゲルハンス島（以下、膵島ともいう。）移植療法が行われている。膵島移植を受けた患者数は２００５年まで増加したが、この年を境に漸減した(非特許文献１参照。)。
該文献１にて、１）移植膵島の生着率の低さ、２）免疫抑制剤の副作用、３）免疫抑制剤の膵島への影響、が問題点としてあげられた。１）に対するよい策がない現時点において、２）、 ３）への対応が現実的である。細胞治療が盛んな北米では、新しい免疫抑制剤の組み合わせにもとり組んできているものの、移植細胞機能の長期維持はなされていないばかりか、副作用は相変わらず高率に出現し、時には致死的となる場合があった。
【０００３】
免疫抑制剤は膵島移植療法の目的に反し、骨髄抑制、口腔内潰瘍、下痢、浮腫、蛋白尿、感染など、様々な副作用を引き起こす事があり、患者の生活の質を落とすばかりか、時には命をも脅かす。また免疫抑制剤自身が、インシュリンｍＲＮＡの転写を阻害し、膵島の機能低下を引き起こす事が判明してきている （非特許文献２参照。）。
これまで膵島移植における免疫抑制剤の使用法は、エドモントンプロトコール (非特許文献３参照。) をもとに改善、改良を加えたもので、免疫抑制剤の影響の評価は、事後的に臨床判断のもと検証せざるを得なかった。
また、基礎研究等における免疫抑制剤の評価方法としては、単離した膵島を従来の２次元培養法により培養し、免疫抑制剤を添加して評価する方法や、単離した膵島を移植した免疫不全マウスに免疫抑制剤を投与する方法が挙げられる（非特許文献２、４〜５参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｙａｎ ＥＡ，ｅｔ．ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，（２００５） ｖｏｌ．５４，ｐｐ．２０６０−２０６９．
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＤ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ.，（２００９） ｖｏｌ．１８，ｐｐ．８３３−８４５．
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ,ｅｔ．ａｌ．，Ｎ. Ｅｎｇｌ. Ｊ. Ｍｅｄ.，（２０００） ｖｏｌ．３４３，ｐｐ．２３０−２３８．
【非特許文献４】Ｔｒｕｏｎｇ Ｗ,ｅｔ．ａｌ．，Ａｍ. Ｊ. Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ.，（２００７） ｖｏｌ．７，ｐｐ．２０３１−２０３８．
【非特許文献５】Ｍｅｒａｎｉ Ｓ,ｅｔ．ａｌ．，Ｉｓｌｅｔｓ，（２０１１） ｖｏｌ．３，ｐｐ．３３８−３４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記非特許文献に記載の免疫抑制剤の評価方法では、ヒト体内の膵島で生じる現象を捕捉するという点では未だ改良の余地があった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できる免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、生体類似三次元培養システムを構築することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系であっても、高い正診率が得られる免疫抑制剤の評価方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の免疫抑制剤の評価方法、及び免疫抑制剤評価キットを提供するものである。
【０００９】
（１）生体組織由来の膵島を、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程Ａと、
免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、
免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、
を有することを特徴とする免疫抑制剤の評価方法。
（２）前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触したインシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ１を有する前記（１）に記載の免疫抑制剤の評価方法。  
（３）前記工程Ｃ１は、更に免疫抑制剤に接触した内因性及び／又は外因性Ｐｄｘ１遺伝子のメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程を含む前記（２）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
（４）前記生体組織由来の膵島は、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島である前記（１）から（３）のいずれかに記載の免疫抑制剤の評価方法。
（５）前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した外因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性を蛍光タンパク質の発する蛍光の強度を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ２を有する前記（４）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
（６）前記トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物がブタである前記（４）又は（５）に記載の免疫抑制剤の評価方法。
【００１０】
（７）分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを備えたことを特徴とする免疫抑制剤評価キット。
（８）更に、免疫抑制剤に接触した遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を測定するメチル化測定キットを備えた前記（７）に記載の免疫抑制剤評価キット。
（９）更に、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を備えた前記（７）又は（８）に記載の免疫抑制剤評価キット。
（１０）前記トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物がブタである前記（９）に記載の免疫抑制剤の選別方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＦＫ５０６含有培地で培養中における膵島のＰｄｘ１−Ｖｅｎｕｓの蛍光強度の測定結果を示す。
【図２】図２は、Ｐｄｘ１−Ｖｅｎｕｓ導入膵島の蛍光画像を示す。
【図３】図３は、ＦＫ５０６含有培地で培養した後の膵島のインシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜免疫抑制剤の評価方法＞
本実施形態の免疫抑制剤の評価方法は、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程Ａと、免疫抑制剤を培地に添加する工程Ｂと、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程Ｃと、を有する。
本実施形態の評価方法は、免疫抑制剤を患者に投与する前に、生じる副作用を予見し、副作用の少ない免疫抑制剤を選別するための方法又は最適投与用量を決定するための方法である。以下、各工程について具体的に説明する。
【００１４】
工程Ａは、生体組織由来の膵島を、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する培地で培養する工程である。工程Ａにおいて用いられる生体組織由来の膵島としては、移植に用いられるヒト由来の膵島；移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島が好ましい。簡便に入手可能で、ヒトの臓器サイズに近い観点からブタ由来の膵島がより好ましい。
更に、簡便にかつ客観的に免疫抑制剤の膵島への影響を評価する観点から、前記生体組織由来の膵島は、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島であることが好ましい。簡便に入手可能で、ヒトの臓器サイズに近い観点から、係るトランスジェニック非ヒト動物の宿主動物は、ブタであることが好ましい。ブタ膵島は糖尿病患者に対し、ニュージーランドでＰｈａｓｅＩ  ｔｒｉａｌ、ロシアでＰｈａｓｅＩ／ＩＩａ  ｔｒｉａｌとして臨床試験に使われている。ブタの膵島で再現性のある検討は、ヒトへの臨床情報を収集するには好都合である。
【００１５】
Ｐｄｘ１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ１）遺伝子は、膵臓の発生期に発現する転写因子ＰＤＸ１をコードする遺伝子である。転写因子ＰＤＸ１は、ヒトインシュリンプロモーターの転写因子結合部位に結合し、インシュリンの発現を制御する。
従って、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターと、その下流にレポーターとしての蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片を導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物は、蛍光を発する膵島を有する。そして、膵島が蛍光を発していることは、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターが正常に機能していることを意味し、転写因子ＰＤＸ１を介してインシュリンが正常に発現していることを意味する。
【００１６】
Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニックブタ（以下、Ｐｄｘ１−蛍光タンパク質Ｔｇブタともいう。）の作製方法としては、特に限定されず、従来公知の方法が挙げられる。導入遺伝子断片が異なる以外は、例えば、特開２００８−１５４５２０号公報に記載の方法にて、トランスジェニックブタを作製できる。
上述したように、Ｐｄｘ１遺伝子は、膵臓の発生期に発現する遺伝子であるため、Ｐｄｘ１−蛍光タンパク質Ｔｇブタは、膵臓(主として膵島)特異的に蛍光タンパク質を発現している。
【００１７】
蛍光タンパク質としては特に限定されず、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ等の緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）；ＥＢＦＰ等の青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｎ, ＢＦＰ ）； ＥＣＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ等のシアン蛍光タンパク質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＣＦＰ）；ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ等赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＲＦＰ）；ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ等の黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ, ＹＦＰ）、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ等の橙色蛍光タンパク質、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ等の赤外光の蛍光を発する蛍光タンパク質が挙げられる。観察に適した明るさが得られ、かつ簡便に入手できる点から、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが好ましい。
【００１８】
また、膵臓の発する蛍光を指標に、フローサイトメトリーやセルソーターを用いて、精製することができる。
膵臓から膵島を精製する方法としては、密度勾配遠心法等、従来公知の方法が挙げられる。
ＳＤＩ法、ＡＴＰ法、ＭＴＴ ａｓｓａｙ法等の従来の試験方法では、混在してくる他の細胞が原因で、不均一な染色から結果を判定しなければならず、過小評価となる問題点を含んでいた。本実施形態において、蛍光信号により膵島のみを評価対象として用いることにより、係る問題点を解決することができる。
【００１９】
工程Ａに用いられる培地は、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温で流動性のあるゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを含有する。温度感応性ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度は、膵島の熱的損傷を防ぐ温度範囲が好ましく、４℃〜４０℃がより好ましい。係るゾル−ゲル転移温度を示す温度感応性ハイドロゲルとしては、その水溶液が曇点を有する高分子と親水性高分子を結合してなる共重合体が挙げられる。
曇点とは、濃度１重量％程度の透明な高分子の水溶液を例えば、１℃／分程度の速度で、徐々に加熱した時、はじめて白濁を生じる温度を言う。本実施形態においては、温度感応性ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度を４℃〜４０℃とするためには、この曇点が５４℃〜４０℃であることが好ましい。すなわち、その水溶液が曇点を有する高分子は、曇点より低い温度では水に溶解するが、曇点より高い温度では非水溶性となり水から析出する。
【００２０】
その水溶液が曇点を有する高分子としては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン、ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミドなどのポリＮ置換アクリルアミド誘導体、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド、ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミドなどのポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体、ポリプロピレンオキサイドなどのポリアルキレンオキサイド、ポリビニルメチルエ−テル、ポリビニルアルコ−ル部分酢化物などが挙げられる。
【００２１】
その水溶液が曇点を有する高分子は単独でも、他の単量体と共重合させて得たものでも良い。共重合する単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的にポリＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体の曇点は親水性単量体と共重合すると上昇し、疎水性単量体と共重合すると下降する。従って、これらを選択することによっても、所望の曇点を有する高分子を得ることができる。
【００２２】
親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレ−ト、ヒドロキシエチルアクリレ−ト、ヒドロキシメチルメタアクリレ−ト、ヒドロキシメチルアクリレ−ト、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸など、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレ−ト、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレ−ト、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられる。
【００２３】
疎水性単量体としては、エチルアクリレ−ト、メチルメタクリレ−ト、ｎ−ブチルメタクリレ−ト、グリシジルメタクリレ−ト等のアクリレ−ト誘導体およびメタクリレ−ト誘導体，Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミドなどのＮ置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられる。
【００２４】
親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロ−ス、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコ−ル、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレ−ト、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレ−ト、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレ−ト、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩などが挙げられる。
【００２５】
上記の中から、本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、温度感応性高分子であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと親水性高分子ポリエチレングリコールの共重合体が好ましい。
【００２６】
本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルの高分子は、転移温度の低温側では流動性のある水溶液、高温側では流動性を失ってハイドロゲルとなる昇温時ゲル化タイプの熱可逆ゾル−ゲル転移を示す。
すなわち、共重合体中の曇点を有する高分子部分の曇点より低い温度では、該曇点を有する高分子部分、親水性高分子部分ともに水溶性であるので、該共重合体は完全に水に溶解する。しかし、この水溶液の温度を該曇点より高い温度に昇温すると、該曇点を有する
高分子部分が非水溶性となって凝集し分子間会合が起こる。一方、親水性高分子部分は該曇点より高い温度においても水溶性を保つので、該曇点を有する高分子部分間の凝集が巨視的な相分離に至ることを防止し、安定なハイドロゲルが形成される。
【００２７】
本実施形態に用いられるハイドロゲル形成性の高分子における、その水溶液が曇点を有する高分子（Ａ）と親水性高分子（Ｂ）を結合してなる共重合体中の（Ａ）の含有量は、１０〜９０重量％の範囲であることが好ましく、３０〜７０重量％の範囲であることがより好ましい。
曇点を有する高分子（Ａ）の含有量が１０重量％以上の場合、該曇点を有する高分子部分間の凝集力が弱すぎず、該曇点より高い温度でもハイドロゲルとなりやすくなる。高分子（Ａ）の含有量が９０重量％以下の場合、曇点を有する高分子部分間の凝集力が強すぎず、系全体が巨視的な相分離を起こすことなく、安定なハイドロゲルが得られやすくなる。
【００２８】
工程Ａにおいて、温度感応性ハイドロゲルをゾル−ゲル転移温度より低い温度で、培地と混合し、更に膵島を混入し、ゾル−ゲル転移温度より高い温度でこれら混合物をゲル状態とする。
工程Ａにおいて用いられる培地としては、細胞培養に用いられる従来公知のものが挙げられる。
【００２９】
本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、膵島を低温ゾル状態で包埋できるため、包埋時の熱的損傷を回避できる。
更に前記温度感応性ハイドロゲルは、分子内に疎水性部分を有するため、温度の上昇と共に疎水性部分間の結合力が強くなり、三次元網目構造を形成する。また、親水性部分は水溶性を保っているため、温度感応性ハイドロゲルが凝集することなく、含水ゲルの状態が保たれる。従って、工程Ａにおいて、生体類似三次元培養システムにより、膵島を生体内に近い状態で３次元培養することができる。
また、マトリゲル等の生体からの培養基材は、含まれる未知の増殖因子により、免疫抑制剤の純粋な評価に影響を及ぼす可能性、あるいは牛海綿状脳症などの病変形成が懸念される。本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、生体からの培養基材を含まない高分子化合物であるため、係る懸念は皆無で、目的とした細胞のみを純粋に評価でき、薬剤選択後には薬剤の様々な濃度の設定ができる利点を有する。
【００３０】
このように、本実施形態に用いられる温度感応性ハイドロゲルは、低温のゾル状態で細胞を分散させ、培養温度に加熱するだけでゲル化させることができるので、簡単に生体内と類似の三次元環境を作ることができる一方、低温化させ、ゲルからゾルへ転移させることで細胞や組織にダメージを与えることなく回収が可能である。
【００３１】
工程Ｂは、免疫抑制剤を培地に添加する工程である。免疫抑制剤を添加するタイミングは、特に限定されないが、膵島含有培地をゲル状態とした後が好ましい。膵島がゲルに包埋された状態を確認後、速やかにいくつかの濃度に分けた免疫抑制剤含有の培養液を添加する。即ち工程Ａと工程Ｂは同日に行われることが好ましい。
培地に添加される免疫抑制剤としては、特に限定されず、副腎皮質ステロイド、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系薬剤、カルシニューリン阻害剤、サイクリン依存性カイネース阻害剤、抗胸腺細胞グロブリン、ＣＤ抗原に対するモノクローナル抗体が挙げられる。
具体的には、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメサゾン、デキサメサゾン、シクロフォスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノレート、ミゾリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、マイトマイシンＣ、シクロスポリン、ＦＫ５０６、シロリムス、ラパマイシン、アトガム、チモグロブリン、Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブが例示され、ミコフェノレート、アザチオプリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、バシキキシマブ、ダクリツマブ、インフリキシマブ、グスペリムス、抗リンパ球グロブリン、エタネルセプト、ミコフェノール酸モフェチル、ダクリズムマブ等が挙げられる。
工程Ａにおいて、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島を用いる場合には、上述した免疫抑制剤の中から、患者にとって副作用の少ないものをスクリーニングすることができる。また、実際に膵島移植に至った患者においても、移植に使われるごく一部の膵島を本システムで解析することにより、患者に最も適した免疫抑制剤の選択が可能となる。すなわち、移植開始時は、各施設における免疫抑制剤のレジュメを使用せざるをえないが、本実施形態の免疫抑制剤の評価方法を用いた解析結果が出次第、各患者に最適な免疫抑制剤を選択できるテーラーメード治療となる。
また、工程Ａにおいて、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を用いる場合には、例えば開発候補品の中から副作用の少ない免疫抑制剤をスクリーニングすることができる。
選択される免疫抑制剤は、単剤でもよく、複数の免疫抑制剤の組み合わせであってもよい。
工程Ａにより、免疫抑制剤の膵島への影響を最小に抑える薬剤を探索、濃度、組み合わせを検証し、膵島移植に使用する最適な免疫抑制剤の選定を行うことができる。
【００３２】
工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を評価する工程である。工程Ｃにおける評価方法としては、免疫抑制剤の有する副作用を評価できる工程であれば特に限定されない。工程Ｃにおける免疫抑制剤に接触した膵島の状態とは、インシュリンｍＲＮＡの転写阻害等、膵島の機能低下の状態が挙げられる。
【００３３】
前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した内因性及び／又は外因性Ｐｄｘ１遺伝子、及び／又はインシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ１を有することが好ましい。
遺伝子の転写制御は、プロモーター領域のメチル化と関連している。エピジェネティックな遺伝子解析は、膵島の短時間の培養のみで、長期の膵島の挙動を捕らえることができるため、短時間培養という時間的限界を補うことができる。
【００３４】
工程Ｃ１において、後述するＰｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入された膵島を用いずともよい。工程Ｃ１は、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島の状態を評価するのに適している。
なお、膵島移植は、膵島から分泌されるインシュリンにより、糖尿病患者の血糖値をコントロールする治療法であり、工程Ｃ１において、インシュリン遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に、膵島の状態を評価すると、膵島が適切にインシュリンを産生しているか否かを評価できるため、特に好ましい。
また、工程Ｃ１において、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入された膵島を用いる場合には、さらに内因性及び／又は外因性遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に、膵島の状態を評価することが好ましい。
また、工程Ｃ１において、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島を用いる場合には、さらに内因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターのメチル化の割合を指標に、膵島の状態を評価することが好ましい。
【００３５】
工程Ｃ１におけるメチル化測定方法としては、特に限定されず、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑ−ＭＳＰ）、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、ＤＮＡメチル化解析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）等が挙げられる。
【００３６】
上述したように、工程Ｃ１によれば、短時間の培養のみで長期の膵島の挙動を捕らえることができる。
【００３７】
また、前記工程Ｃは、免疫抑制剤に接触した外因性Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性を蛍光タンパク質の発する蛍光の強度を指標に膵島の状態を評価する工程Ｃ２を有することが好ましい。
上述したように、前記蛍光タンパク質の発する蛍光の強度の低下は、インシュリンｍＲＮＡの転写阻害を反映している。さらに、蛍光強度の測定は、細胞を固定する必要がないため、工程Ｃ２によれば、免疫抑制剤に接触した膵島の状態を生細胞の状態でｒｅａｌ−ｔｉｍｅに測定できる。工程Ｃ２は、迅速性、簡便性、再現性等の観点から優れている。
ｔｒａｃｅｒのない膵島で同様に行う場合、腺房細胞、膵管細胞の混入は避けられず、正確性を欠いてしまう。さらには膵島を確認するためには染色の行程が必要で、毎回、膵島を固定するなど、煩雑であるうえ、生細胞の状態での測定は不可能である。
【００３８】
＜免疫抑制剤評価キット＞
本実施形態の免疫抑制剤評価キットは、分子内に疎水性部分と親水性部分とを有し、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す温度感応性ハイドロゲルを備えたものであり、具体的には、上述した＜免疫抑制剤の評価方法＞で、膵島の生体類似三次元培養に用いられる試薬を含むものが挙げられる。
本実施形態の免疫抑制剤評価キットは、培養対象が、移植に用いられるヒト由来の膵島や移植を受ける患者のｉＰＳ細胞を分化してなる膵島の場合には、メチル化測定キットを備えていることが好ましい。また、短時間の培養のみで、長期の膵島の挙動を捕捉するという観点からも、メチル化測定キットを備えていることが好ましい。
【００３９】
また、簡便にかつ客観的に免疫抑制剤の膵島への影響を評価する観点から、本実施形態の免疫抑制剤評価キットは、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターとその下流に蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する導入遺伝子断片が導入されてなるトランスジェニック非ヒト動物由来の膵島を備えたものであることが好ましい。臨床試験での実績があるという観点から、トランスジェニック非ヒト動物の宿主動物は、ブタであることが好ましい。
このように、本実施形態の免疫抑制剤の評価方法に必要な試薬等をキット化することにより、免疫抑制剤の評価をより簡便にかつ客観的に行うことができる。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
[Ｐｄｘ−１−Ｖｅｎｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタの作製]
ｍｏｕｓｅ ｍＰｄｘ１ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｖｅｎｕｓ  ｃＤＮＡ、及びｐｏｌｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇａｎａｌを有するｒａｂｂｉｔ  β−グロブリン  遺伝子配列を備えた導入遺伝子断片を作製した（配列番号１参照。）。導入遺伝子断片を用いて、特開２００８-１５４５２０号公報に記載の方法にて、Ｐｄｘ−１−Ｖｅｎｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタを作製した。
【００４２】
[Ｐｄｘ−１−Ｖｅｎｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタからの膵島の単離]
上述した方法で作製したｔｒａｎｓｇｅｎｉｃブタから膵島を以下の方法で単離した。ブタの生体内をヘパリン化後、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液を大動脈からかん流、十二指腸、膵臓を摘出した。十二指腸を切離し、膵臓をトリミング後、膵管よりコラゲナーゼを注入した。
膵臓をＬｉｂｅｒａｓｅ ＤＬ （Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）含有溶液を用いて膨張させ、Ｒｅｃｏｒｄｉ  ｃｈａｍｂｅｒを用いて、３７℃で消化した。消化プロセスを目視で確認しながら、適宜ジチゾン染色を行い、膵島に付着する細胞が最も適切に分離された時点で、１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、２５ｍｍ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、及び１００ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有した冷却したＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を加えて、消化反応を停止させた。膵島は、それぞれ、１．１１０ｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）、１．０８４ｇ／ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、１．０７７ｇ／ｍＬ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社製）の密度を有する不連続Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により精製された。遠心分離後、ＲＰＭＩと１．０７７の界面から膵島を回収した。回収した膵島は、ハンドピックアップにより精製した。
単離した膵島を１０％非働化ブタ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、及び１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＣＭＲＬ１０６６培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１晩培養した。ジチゾン染色の結果から、精製した膵島の純度は９５％以上であった。
【００４３】
[ＦＫ５０６の調製]
０．０１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのＦＫ５０６（分子量８０４；タクロリムス、フジマイシン、プログラフトとしても知られている。；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．１％エタノールに溶解した。１００μｇ／ｍＬのＦＫ５０６を１％エタノールに溶解した。
【００４４】
[ＴＧＰ含有培地の調製]
凍結乾燥した温度感応性ハイドロゲル（以下、ＴＧＰともいう。メビオール社製）を４℃２４時間混和しながら、１０％非働化ブタ血清、及び１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有ＣＭＲＬ１０６６培地に溶解した。ＴＧＰの終濃度を８重量％に合わせた。
冷却したＴＧＰ含有培地を９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の各ウェルに５０μＬずつ添加した。次いで、単離した膵島１個ずつをＴＧＰ含有培地に埋め込み、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で３０分インキュベートし、ＴＧＰ含有培地をゲル化させた。
次いで、ＦＫ５０６含有培地５０μＬを各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。膵島をＦＫ５０６含有培地で培養した後、細胞の蛍光強度を３日おきに評価した。評価の際、ＦＫ５０６の１濃度当たり、８個の膵島を用いた。未処理群をコントロールとした。
【００４５】
[Ｐｄｘ１−Ｖｅｎｕｓの蛍光強度及び細胞生存率の測定]
ＦＫ５０６含有培地で培養中の膵島Ｐｄｘ１の転写活性を測定した。詳細には、４９０ｎｍの波長におけるＶｅｎｕｓの吸光度をマルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。各ウェルの吸光度は、８連で測定した。結果を図１に示す。
また、膵島の生存率を評価するために、膵島をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色し、ＣＣＤカメラ付きの位相差顕微鏡（オリンパス社製）で、Ｖｅｎｕｓの緑色発光及びＰＩ染色像を観察した。結果を図２に示す。
【００４６】
図１に示すように、培養１２日後までどの処理群においてもＰｄｘ１−Ｖｅｎｕｓの蛍光強度は上昇し、以後蛍光強度は減少していた。培養３０日後、４５日後において、ＦＫ５０６処理群は、未処理群と比較して蛍光強度の減少の度合いが高かった。
これらのことから、ＦＫ５０６処理群においては、Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターの転写活性が抑制されていること、即ち、膵臓特異的に働くＰｄｘ１遺伝子のプロモーターに制御されている遺伝子群の発現が抑制されることが確認された。
また、図２に示すように、ＦＫ５０６処理群及び未処理群のどちらにおいてもＰＩ染色の度合いに差がみられなったことことから、細胞死が転写活性に影響を与えていないことが確認された。
【００４７】
[Ｐｄｘ１遺伝子のプロモーターのメチル化解析]
各膵島のゲノムＤＮＡの抽出と亜硫酸水素ナトリウム反応は、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。亜硫酸水素ナトリウムで処理されたＤＮＡを、ＢｉｏＴａｑ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させた。増幅に用いたプライマーは、以下の通りである。
インシュリン用プライマー
Ｉｎｓ−Ｂｉｓ−Ｆ：５’−ＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＡ−３’
Ｉｎｓ−Ｂｉｓ−Ｒ：５’−ＡＴＴＡＡＴＣＡＣＴＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴ−３’
Ｐｄｘ１−ｖｅｎｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ用プライマー
ｍＰｄｘ１−Ｂｉｓ−Ｆ：５’−ＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＧＧＴＡＴ−３’
ｍＰｄｘ１−Ｂｉｓ−Ｒ：５’−ＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴ−３’
ＰＣＲは、９５℃１０分；９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を４０サイクル；７２℃２分のプログラムで行った。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込んだ後、シークエンシングを行い、Ｐｄｘ１遺伝子とインシュリン遺伝子のプロモーター領域のメチル化解析を行った。
【００４８】
[Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓｉ（ＣＯＢＲＡ）ａｓｓａｙ]
ＣＯＢＲＡ  ａｓｓａｙによるＤＮＡメチル化解析は、ブタ肝臓で低メチル化状態にあるｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１(ＩＧＦＢＰ１)、(ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １, ｇｒｏｕｐ  Ｈ,  ｍｅｍｂｅｒ  ３(Ｎｒ１ｈ３)遺伝子に注目した従来法に基づいて行った（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ. １９９７  Ｊｕｎ  １５;２５（１２）:２５３２−４.参照）。上記特異的プライマーを用いて遺伝子増幅した後、増幅産物をＨｐｙＣＨ４ＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）で３７℃３時間消化、又はＴａｑＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）で６５℃３時間消化した。次いで、消化物を電気泳動により解析した。
ＤＮＡのメチル化の割合は、以下の式を用いて計算された。
見積もられるメチル化の割合（％）＝１００×ＩＣ／（ＩＣ＋ＩＵＣ）
ここで、ＩＣ及びＩＵＣは、それぞれ、消化されたバンド及び消化されなかったバンドの強度を示す。バンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて決定した(http://rsb.info.nih.gov/ij/参照)。結果を図３に示す。
図３に示すように、ＦＫ５０６処理群においては、インシュリン遺伝子のプロモーター領域のメチル化が促進されていた一方、未処理群においては、インシュリン遺伝子のプロモーター領域のメチル化が促進されていなかったことから、ＦＫ５０６処理群においては、メチル化を介してインシュリン遺伝子のプロモーター領域の転写活性が抑制されていることが確認された。
【００４９】
以上、本発明によれば、免疫抑制剤の膵島への影響を客観的に評価でき、副作用の低減に寄与できることが明らかである。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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