(57)【要約】      （修正有）【課題】治療用途、診断用途、または研究用途に有用であり得るＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖（またはセンス鎖）において、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する２本鎖ＲＮＡ複合体を製造するためのアミダイトモノマー、および該モノマーを使用したオリゴマーの製造方法の提供。【解決手段】例えば、下式のモノマー群から選択されるアミダイドモノマー。2015078196.tif 000044【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸であって、前記センス鎖の５’末端における最後の３つの位置のうちのいずれか１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる、核酸。
【請求項２】
前記センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸であって、前記アンチセンス鎖の５、６、７、および８位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、前記アンチセンス鎖の前記位置は、前記アンチセンス鎖の５’末端において１位から始まるように数えられる、核酸。
【請求項５】
前記センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
前記２本鎖領域は、１９または２０個の塩基対を有する、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、各々２１または２２ヌクレオモノマー長である、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸は、平滑末端または３’末端オーバーハングを有する、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記アンチセンス鎖は、配列番号１２、３４、５６、７８、１００、１２４、または１４７のうちの任意の１５個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１１】
センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸であって、前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の位置および前記センス鎖の３’末端の最後の位置は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる、核酸。
【請求項１２】
前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる、請求項１１に記載の核酸。 
【請求項１３】
センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸であって、前記センス鎖の２１、２２、および２３位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、前記センス鎖の前記位置は、前記センス鎖の５’末端において１位から始まるように数えられる、核酸。
【請求項１４】
センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸であって、前記アンチセンス鎖の１８、１９、２０、２１、および２２位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、前記センス鎖の前記位置は、前記アンチセンス鎖の３’末端において１位から始まるように数えられる、核酸。
【請求項１５】
前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む、請求項１３または１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む、請求項１３または１４に記載の核酸。
【請求項１７】
前記アンチセンス鎖は、配列番号１６９、１８５、２０１、２１７、または２３３のうちの任意の１５個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する、請求項１１、１３、または１４に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオモノマーである、請求項１〜６および１１〜１４のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１９】
前記ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪ：
【化１】
2015078196.tif 000043
から選択され、Ｒは、水素、アルキル基、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、糖類、およびポリペプチドからなる群から選択され、
塩基は、任意のプリン、ピリミジン、またはその誘導体もしくは類似体である、請求項１〜６および１０〜１３のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２０】
２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーからなる群から選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１〜６および１０〜１３のうちのいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２１】
細胞内の遺伝子の発現を低減するための方法であって、請求項１〜６および１０〜１３のうちのいずれか１項に記載の核酸を調製することと、前記細胞を前記核酸で処理することと、を含む、方法。
【請求項２２】
ヒトにおける疾患を治療するための方法であって、前記疾患は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓病、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌から選択され、請求項１〜６および１０〜１３のうちのいずれか１項に記載の核酸を調製することと、前記核酸を前記ヒトに投与することと、を含む、方法。
【請求項２３】
リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓病、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌を含む疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項１〜６および１０〜１３のうちのいずれか１項に記載の核酸の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖において、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する２本鎖ＲＮＡ複合体に関する。本発明のＲＮＡ複合体は、治療用途、診断用途、または研究用途に有用であり得る。この複合体は、アンチセンス鎖および連続のまたは不連続のパッセンジャー鎖（「センス鎖」）を含む遺伝子発現を下方制御することができる、短干渉ＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ二重鎖）を含む。これらの鎖のうちの少なくとも１つは、本発明の１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有し、それは３’末端に、５’末端に、３’末端および５’末端の両方に、ならびに／または内部に位置してもよい。
【０００２】
配列表
本出願は、２００９年１１月２７日に作成され、０８−１９ＰＣＴ．ｔｘｔと名付けられた、９８，５７４バイトのサイズのＡＳＣＩＩファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と共に提出される配列表を含み、該配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子の発現をサイレンシングする手段を提供する。それは、基礎研究に、遺伝的および生化学的経路、ならびに個々の遺伝子および遺伝子産物の機能を研究する方法を提供する。結果として、ＲＮＡｉは、製薬業界における標的検証のための重要なツールとなっており、その異常発現が疾病状態または病態に関連付けられる遺伝子に対するＲＮＡ干渉を媒介することができるＲＮＡ複合体に基づく薬物を開発することを目標として、多大な投資が為されている。
【０００４】
しかしながら、ＲＮＡ複合体がＲＮＡｉ治療薬として機能する能力は、配列特異性または「オフターゲット」効果、効能、ヌクレアーゼ安定性、および非特異的サイトカイン誘導等の問題によって制限されている。
【０００５】
本発明は、ＲＮＡ複合体のＲＮＡｉ活性を改善する一方で、同時にＲＮＡｉにおけるＲＮＡ複合体に関連する不利な問題を最小化または排除するための、化合物、組成物、方法、および使用を提供する。とりわけ、本出願は、改善された効力およびヌクレアーゼ安定性を有し、「オフターゲット」効果および／またはサイトカイン誘導を低減もしくは排除したＲＮＡ複合体を作製し、かつ使用するための、新規化合物および組成物を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＲＮＡ誘導遺伝子調節または遺伝子分析、特にＲＮＡ干渉に関連して使用される、ＲＮＡ鎖に組み込まれた１つ以上のヒドロキシメチル置換モノマーを含むＲＮＡ複合体を提供する。故に、本発明の目的は、典型的に使用されるＲＮＡ複合体と比較して、低減されたオフターゲット効果を有するＲＮＡ複合体を提供することである。別の目的は、ＲＮＡ複合体に低減されたインターフェロン応答を提供することである。さらに別の目的は、ＲＮＡ複合体に、細胞培養物中または体内での酵素分解への安定性に関する改善された特性を提供することである。さらに別の目的は、非修飾ＲＮＡ複合体と比較して、細胞培養物中または体内で亢進された遺伝子調節機能、例えば、遺伝子サイレンシング効果を示すＲＮＡ複合体を提供することである。またさらなる目的は、特定の器官または組織を標的とし、かつ細胞膜を透過することができるＲＮＡ複合体を提供することである。本発明はまた、ヒドロキシメチル置換モノマーの、オリゴヌクレオチドへの組み込みに好適 
なモノマー、およびそれらの合成方法も提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでセンス鎖の５’末端における最後の３つの位置のうちのいずれか１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる。
【０００８】
別の態様では、核酸は、センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【０００９】
さらに別の態様では、核酸は、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでアンチセンス鎖の５、６、７、および８位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、アンチセンス鎖の位置は、アンチセンス鎖の５’末端における１位から始まるように数えられる。
【００１１】
別の態様では、核酸は、センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００１２】
さらに別の態様では、核酸は、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００１３】
別の態様では、核酸は、１９〜２０個の塩基対の２本鎖領域を有する。
【００１４】
別の態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々２１〜２２ヌクレオモノマー長である。
【００１５】
別の態様では、核酸は、平滑末端または３’末端オーバーハングを有する。
【００１６】
別の態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１２、３４、５６、７８、１００、１２４、または１４７のうちの任意の１５個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。関連する態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１２、３４、５６、７８、１００、１２４、または１４７のうちの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００１７】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでアンチセンス鎖の３’末端の最後の位置およびセンス鎖の３’末端の最後の位置は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる。
【００１８】
別の態様では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる。
【００１９】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでセンス鎖の２１、２２、および２３位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、センス鎖の位置は、センス鎖の５’末端における１位から始まるように数えられる。
【００２０】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでアンチセンス鎖の１８、１９、２０、２１、および２２位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、センス鎖の位置は、アンチセンス鎖の３’末端における１位から始まるように数えられる。
【００２１】
別の態様では、核酸は、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００２２】
別の態様では、核酸は、センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００２３】
別の態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１６９、１８５、２０１、２１７、または２３３のうちの任意の１５個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００２４】
関連する態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１６９、１８５、２０１、２１７、または２３３のうちの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００２５】
別の態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオモノマーである。
【００２６】
別の態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪ：
【００２７】
【化１】
2015078196.tif 000002
【００２８】
【化２】
2015078196.tif 000003
から選択され、ここでＲは、水素、アルキル基、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、糖類、およびポリペプチドからなる群から選択され、塩基は、あらゆるプリン、ピリミジン、またはその誘導体もしくは類似体である。
【００２９】
別の態様では、核酸は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーからなる群から選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む。
【００３０】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される通りに核酸を調製することおよび細胞を核酸で治療することを含む、細胞内の遺伝子の発現を低減する方法を提供する。
【００３１】
一態様では、本発明は、ヒトにおける疾患を治療する方法を提供し、該疾患は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓病、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌から選択され、本明細書に記載される核酸を調製することおよび核酸をヒトに投与することを含む。
【００３２】
一態様では、本発明は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓病、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌を含む疾患を治療するための薬剤の調製における、本明細書の記載に従った核酸の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＲＮＡ複合体に組み込まれるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの異なる構造の例が示される。モノマーＡは、比較のために示され、そのリボース骨格を有する天然ＲＮＡモノマーである。本発明のＲＮＡ複合体に含まれるモノマーＢ〜Ｅの特徴は、それらがヒドロキシメチル基である置換基（「遊離ヒドロキシメチル基」）を含有することである。遊離ヒドロキシメチル基は、例えば、環状リボース骨格のＣ４’原子または非環状リボースベース構造のＣ１’原子において結合される。本発明のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、各々がリン原子に結合される他の酸素原子を含有し、故にヌクレオチド間結合の形成に活性がある（図１を参照）。これらの他の酸素原子のうちの１つ以上は、ヒドロキシ基の一部であり得、それは本発明のＲＮＡ複合体のＲＮＡ鎖のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーのうちの１つ以上が、３’または５’末端に位置する場合に当てはまる。本発明のＲＮＡ複合体のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーのうちの１つがＲＮＡ鎖の３’末端および／または５’末端に位置する場合、あらゆる終端に位置する天然ＲＮＡモノマーについて当てはまり得るように、このモノマーのヒドロキシル基は、リン酸化され得る。本発明のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーに、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、グアニン、またはあらゆる他の既知の天然もしくは合成核酸塩基または核酸塩基類似体（図１で「塩基」として指定される）等の核酸塩基が結合される。
【図２】ヒドロキシメチル置換モノマーの誘導体化、官能化、および共役させられた変異体が示される。ヒドロキシメチル置換２’、３’−セコ−モノマーＤの誘導体化、官能化、および共役させられた変異体（図１を参照）が例として示される。モノマーＦは、エーテル結合を介して結合される基Ｒを含有する。モノマーＧは、チオエーテル結合を介して結合される基Ｒを含有する。モノマーＨは、アミド結合を介して結合される基Ｒを含有する。モノマーＩは、アミノ結合を介して結合される基Ｒを含有する。モノマーＪは、ピペラジノユニットを介して結合される基Ｒを含有する。かかるモノマーのうちの１つ、または複数を、本発明のＲＮＡ複合体へ組み込むことによって、ＲＮＡ複合体の特性を調節することができる。例えば、生体内安定性の増加、ＲＮＡ標的能力または特異的送達特性の増加を導入することができ、検出目的で蛍光性基を結合させることができる。
【図３】オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ複合体のモノマーであり得る、ヒドロキシメチル置換モノマー（モノマーＣおよびモノマーＤ）のうちの２つの構造。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の一態様で説明される特定の特徴は、本発明の他の態様にも適用する。例えば、ＲＮＡ複合体に関して説明される特徴は、オリゴヌクレオチド、および適切な場合にはＲＮＡ二重鎖にも適用し得る。
【００３５】
ｓｉＲＮＡ二重鎖または１本鎖ＲＮＡの形態でのＲＮＡ複合体は、細胞内の標的核酸の種々の修飾を媒介することができる。このプロセスにおいて、複合体のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖が、アンチセンス鎖と相補的な配列のストレッチを有する標的核酸とハイブリッド形成することができるため、ガイドとして作用する。
【００３６】
標的核酸を標的とする前に、アンチセンス鎖はしばしば、標的核酸に対して作用し得るＲＮＡガイドタンパク質複合体（ＲＧＰＣ）に組み込まれる。ＲＮＡガイドタンパク質複合体の一例は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）である。他のかかるＲＧＰＣが存在することが考えられ、また本発明のＲＮＡ複合体は、これらの他のＲＧＰＣと共に使用される場合、またはいかなるＲＧＰＣとも相互作用しない場合でさえ、有利となるであろうことが考えられる。
【００３７】
本発明の１つの目的は、生物学的媒体内（血清、体内、細胞培養内）での核酸分解に向けて、ＲＮＡ複合体を安定化することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、２本鎖ＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング効果を改善することである。この改善は、全て天然非修飾ＲＮＡ複合体と比較して、例えば、効力の増加、オフターゲット効果の低減、免疫刺激の低減、貯蔵安定性の増加、血清等の生物学的媒体における安定性の増加、活性期間の増加、および薬物動態学的特性の増加に関連し得る。
【００３９】
本発明のさらに別の目的は、１本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの遺伝子サイレンシング効果を改善することである。この改善は、全て天然非修飾ＲＮＡ複合体と比較して、例えば、効力の増加、オフターゲット効果の低減、免疫刺激の低減、貯蔵安定性の増加、血清等の生物学的媒体における安定性の増加、活性期間の増加、および薬物動態学的特性の増加に関連し得る。
【００４０】
本発明の別の目的は、ＲＮＡ複合体の生物学的媒体内での十分な安定性を確保することである。故に目的は、非修飾ＲＮＡ複合体と比較して、細胞培養物中または体内で亢進された遺伝子調節機能、例えば、遺伝子サイレンシング効果を示すＲＮＡ複合体を提供することである。
【００４１】
本発明のＲＮＡ複合体のＲＮＡ鎖は、天然ＲＮＡヌクレオチド、遺伝子サイレンシング活性と適合することが知られるＲＮＡ修飾［Ｎａｗｒｏｔ  ａｎｄ  Ｓｉｐａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，６，９１３−９２５］、およびヒドロキシメチル置換モノマー（図１）を含んでもよい。ホスホジエステル結合が個々のモノマーを結合させてもよいが、ホスホロチオエート結合等の修飾結合、および当業者に既知の他の結合［Ｎａｗｒｏｔ  ａｎｄ  Ｓｉｐａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，６，９１３−９２５］が、代わりに使用されてもよい。
【００４２】
本明細書に開示されるＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖は、本明細書でガイド鎖とも称される）およびパッセンジャー鎖（パッセンジャー鎖は、本明細書でセンス鎖とも称される）からなるｓｉＲＮＡ二重鎖を共に構成する２本の鎖を含んでもよく、１本鎖ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ）、官能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）、または小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびその前駆体ＲＮＡ、ＲＮＡａ分子、マイクロＲＮＡ擬態分子等の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）もまた、例えば、マイクロＲＮＡを標的とするのに有用な１本鎖アンチセンス分子と同様に、本明細書で本発明のＲＮＡ複合体として考えられる。
【００４３】
本発明の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む（図１を参照）。本明細書に従った１つのかかる例としては、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、より好ましくはＤ〜Ｊからなる群から選択される非環状モノマーが挙げられる。故に、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーに関して第一の態様で説明される実施形態は、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーに関連する他の実施形態についても当てはまるであろう。
【００４４】
本発明の好ましい一実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体は、１本鎖ＲＮＡ構造である。
【００４５】
本発明の好ましい一実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体は、１本鎖アンチセンス分子として作用することによって遺伝子発現を阻害することができる１本鎖ＲＮＡ構造である。
【００４６】
本発明の好ましい一実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体は、マイクロＲＮＡを官能的に擬態する１本鎖ＲＮＡ構造である。
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体は、ｓｉＲＮＡ構造である。
【００４８】
したがって、一実施形態では、ｓｉＲＮＡ構造のアンチセンス鎖は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【００４９】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ構造のパッセンジャー鎖は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【００５０】
さらに別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ構造の切れ目の入ったパッセンジャー鎖の第１および第２のＲＮＡ分子は、各々１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含有する。
【００５１】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでセンス鎖の５’末端における最後の３つの位置のうちのいずれか１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる。
【００５２】
別の態様では、核酸は、センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００５３】
さらに別の態様では、核酸は、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００５４】
別の態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでアンチセンス鎖の５、６、７、および８位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、アンチセンス鎖の位置は、アンチセンス鎖の５’末端における１位から始まるように数えられる。
【００５５】
別の態様では、核酸は、センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００５６】
さらに別の態様では、核酸は、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００５７】
別の態様では、核酸は、１９または２０個の塩基対の２本鎖領域を有する。
【００５８】
別の態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々２１または２２ヌクレオモノマー長である。
【００５９】
別の態様では、核酸は、平滑末端または３’末端オーバーハングを有する。
【００６０】
別の態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１２、３４、５６、７８、１００、１２４、または１４７のうちの任意の１５個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００６１】
関連する態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１２、３４、５６、７８、１００、１２４、または１４７のうちの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００６２】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでアンチセンス鎖の３’末端の最後の位置およびセンス鎖の３’末端の最後の位置は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる。
【００６３】
別の態様では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められる。 
【００６４】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでセンス鎖の２１、２２、および２３位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、センス鎖の位置は、センス鎖の５’末端における１位から始まるように数えられる。
【００６５】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含む核酸を提供し、ここでアンチセンス鎖の１８、１９、２０、２１、および２２位のうちの１つ以上は、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められ、センス鎖の位置は、アンチセンス鎖の３’末端における１位から始まるように数えられる。
【００６６】
別の態様では、核酸は、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００６７】
別の態様では、核酸は、センス鎖の３’末端の最後の２つの位置のうちの１つまたは両方が、同一のまたは異なるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーによって占められることをさらに含む。
【００６８】
別の態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１６９、１８５、２０１、２１７、または２３３のうちの任意の１５個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００６９】
関連する態様では、アンチセンス鎖は、配列番号１６９、１８５、２０１、２１７、または２３３のうちの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオモノマーに相当する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の隣接するヌクレオモノマーの領域を有する。
【００７０】
別の態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオモノマーである。
【００７１】
別の態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪ：
【００７２】
【化３】
2015078196.tif 000004
から選択され、ここでＲは、水素、アルキル基、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、糖類、およびポリペプチドからなる群から選択され、塩基は、あらゆるプリン、ピリミジン、またはその誘導体もしくは類似体である。
【００７３】
別の態様では、核酸は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーからなる群から選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む。
【００７４】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される通り核酸を調製することおよび細胞を核酸で治療することを含む、細胞内の遺伝子の発現を低減する方法を提供する。
【００７５】
一態様では、本発明は、ヒトにおける疾患を治療する方法を提供し、該疾患は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓病、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌から選択され、本明細書に記載される核酸を調製することおよび核酸をヒトに投与することを含む。
【００７６】
一態様では、本発明は、リウマチ性関節炎を含む炎症性疾患、高コレステロール血症を含む代謝性疾患、肝疾患、脳炎、骨折、心臓病、肝炎およびインフルエンザを含むウイルス性疾患、ならびに癌を含む疾患を治療するための薬剤の調製における、本明細書の記載に従った核酸の使用を提供する。
【００７７】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域を含むｄｓＲＮＡである、遺伝子の発現を下方制御する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供し、ここで１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端から数えてセンス鎖の１または２位のうちの１つ以上の位置にある。
【００７８】
例示目的にすぎないが、センス鎖の位置は、次のように説明されてもよく、ここでＸは、ヌクレオモノマー（ヌクレオシドまたはヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー）を表し、数字は、鎖におけるそのヌクレオモノマーの位置を表す。ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体については、ｎは、５〜１４（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４）であってもよく、ダイサー長ＲＮＡ複合体については、ｎは、１５〜３０（または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０）であってもよい。センス鎖におけるヌクレオモノマーの位置を決定するための同様の手順が、アンチセンス鎖に適用されてもよい。
５’  Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘｎ    ３’
この例では、ヌクレオモノマーＸ１は、１位を占め、Ｘ２は、２位を占める。
【００７９】
関連する態様では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の２個のヌクレオモノマーおよびセンス鎖の３’末端の最後の２個のヌクレオモノマーは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーである。
【００８０】
例示目的にすぎないが、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの位置は、次の通り表されてもよく、ここでＸは、ヌクレオモノマー（ヌクレオシドまたはヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー）を表し、ｎは、位置を表す。ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体については、ｎは、１３〜２２（または１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、もしくは２２）であってもよく、ダイサー長ＲＮＡ複合体については、ｎは、２３〜３８（または２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、もしくは３８）であってもよい。
５’  Ｘｎ−Ｘ（ｎ＋１）−Ｘ（ｎ＋２）  ３’
この例では、最後のヌクレオモノマーは、Ｘ（ｎ＋２）位によって表され、最後から２番目のヌクレオモノマーは、Ｘ（ｎ＋１）位によって表され、鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれにせよ）の３’末端の最後の２個のヌクレオモノマーは、Ｘ（ｎ＋１）およびＸ（ｎ＋２）によって表される。
【００８１】
関連する態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、または８位のうちの１つ以上の位置にある。
【００８２】
関連する態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位にある。
【００８３】
関連する態様では、２本鎖領域は、１９〜２０個の塩基対を有する。
【００８４】
関連する態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々２１個または２２個のヌクレオモノマーを有する。
【００８５】
関連する態様では、ｄｓＲＮＡは、３’末端オーバーハングを有する。
【００８６】
関連する態様では、ｄｓＲＮＡは、平滑末端を有する。
【００８７】
別の態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含むｄｓＲＮＡである、遺伝子の発現を下方制御する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供し、ここでアンチセンス鎖の３’末端の最後の２個のヌクレオモノマーおよびセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオモノマーは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーである。
【００８８】
別の態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖、２５〜４０個の塩基対を有する２本鎖領域を含むｄｓＲＮＡである、遺伝子の発現を下方制御する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を提供し、ここで１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ダイサー酵素によってｄｓＲＮＡのプロセスを阻害するセンス鎖の１つ以上の位置にある。
【００８９】
関連する態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端から数えてセンス鎖の２１、２２、または２３位のうちの１つ以上の位置にある。
【００９０】
関連する態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の３’末端から数えてアンチセンス鎖の１８、１９、２０、２１、または２２位のうちの１つ以上の位置にある。
【００９１】
本発明の一態様では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの数は、１０個である。本発明の他の実施形態では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２、または１個である。
【００９２】
別の態様では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーである。
【００９３】
本発明の一態様では、アンチセンス鎖における全てのヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、１、２、３、４、５、６、７、および／または８位に存在し、ここで位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えられる。さらにより好ましくは、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて２、３、４、５、６、および／または７位に存在するか、またはマイクロＲＮＡのいわゆる種領域に相当する位置に存在する。別の態様では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて４、５、６、７および／または８位に存在する。別の態様では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて６、７および／または８位に存在する。別の態様では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のＲＮＡと比較して、ＲＮＡのマイクロＲＮＡ活性を低減するアンチセンス鎖内の位置に存在する。故に、前述の領域におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの存在は、アンチセンス鎖がマイクロＲＮＡとして作用することを妨げることができ、それはアンチセンス鎖がｓｉＲＮＡとして機能するように意図される場合に、オフターゲット効果を低減する。
【００９４】
好ましい実施形態では、少なくとも１個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位のうちのいずれか１つの位置に存在し、ここでの位置はアンチセンス鎖の５’末端から数えられる。ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位のうちのいずれか１つの位置に存在することがさらにより好ましく、ここでの位置はアンチセンス鎖の５’末端から数えられる。別の実施形態では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位の全ての位置に存在する。一実施形態では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位のみに存在し、アンチセンス鎖の残りの位置には存在しない。
【００９５】
さらにより好ましくは、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から数えて９、１０、および／または１１位に存在し、好ましくは、オリゴヌクレオチドの残りの位置には存在しない。別の態様では、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のＲＮＡと比較して、ＲＮＡのマイクロＲＮＡ活性を亢進するアンチセンス鎖内の位置に存在する。前述の領域におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの存在により、アンチセンス鎖がマイクロＲＮＡとして作用するように誘導され得る、すなわちｓｉＲＮＡ効果が最小限となり、マイクロＲＮＡ効果がはるかに高くなることを確実にする。
【００９６】
同様に、本発明の別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの数は、１０個である。本発明の他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２、または１個である。
【００９７】
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の全てのヌクレオチドは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーである。
【００９８】
ある態様では、ｄｓＲＮＡのセンス（パッセンジャー鎖）は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。ある態様では、ｄｓＲＮＡのセンス（パッセンジャー鎖）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。ある態様では、ｄｓＲＮＡのセンス（パッセンジャー鎖）全体は、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【００９９】
ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、１、２、３、４、５、６、７、および／または８位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、１、２、３、および／または４位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、１、２および／または３位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、５、６、７、および／または８位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、７および／または８位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のＲＮＡと比較して、ＲＮＡのセンス鎖のＲＮＡｉ活性を低減するＲＮＡのセンス鎖内の位置に存在する。
【０１００】
ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、および／または１１位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。
【０１０１】
ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および／または３２位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の５’末端から数えられる。ある態様では、センス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および／または１０位に存在し、ここでの位置は、センス鎖の３’末端から数えられる。
【０１０２】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖の両方は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含有する。
【０１０３】
一態様では、本発明は、標的核酸の核酸修飾を媒介することができるＲＮＡ複合体を提供する。かかるＲＮＡ複合体は、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ前駆体（プレマイクロＲＮＡ）であり得る。
【０１０４】
本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖およびアンチセンス鎖とハイブリッド形成されるパッセンジャー鎖を含むコア２本鎖領域を含む。
【０１０５】
本構成で言及される標的核酸は、複合体のアンチセンス鎖に対して有意な相補性を有する核酸である。好ましくは、相補性は、複数のヌクレオチドのストレッチにわたって完全である。
【０１０６】
故に、一実施形態では、相補性は、２５ヌクレオチドのストレッチにわたって完全である。
【０１０７】
他の実施形態では、相補性は、それぞれ２４ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、９ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、または６ヌクレオチドのストレッチにわたって完全である。
【０１０８】
一実施形態では、相補性のストレッチは、１個のミスマッチを含む。他の実施形態では、相補性のストレッチは、それぞれ２個のミスマッチ、３個のミスマッチ、または４個のミスマッチを含む。１個のミスマッチとは、例えば、ＧがＡの反対である場合等、塩基対を形成することができないような相補性のストレッチにおける領域のことである。より多くのミスマッチが存在する場合、それらは互いに隣接してもよく、相補性のストレッチの異なる領域において間隔をあけてもよい。
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＲＮＡ複合体は、コア２本鎖領域を含み、それは実質的に２本鎖領域である。ＲＮＡ複合体における１本鎖領域は、主に複合体のオーバーハングに関連する。
【０１１０】
故に、一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の２本鎖領域は、１個のミスマッチを含む。他の実施形態では、２本鎖領域は、それぞれ２個のミスマッチ、３個のミスマッチ、および４個のミスマッチを含む。
【０１１１】
本明細書で使用される「標的核酸」という用語は、標的切断または立体封鎖等、アンチセンス鎖によって誘導される調節を受けるようなあらゆるＲＮＡ／ＤＮＡを包含する。標的ＲＮＡ／ＤＮＡは、例えばゲノムＤＮＡ、ゲノムウイルスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレ−ｍＲＮＡ、または非コードＲＮＡであり得る。
【０１１２】
本明細書で使用される「結合」という用語は、２つの化学成分の間の直接的な共有結合（例えば、ＲＮＡおよびヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー）、または２つの化学成分の間の、例えばリンカーを介する間接的な共有結合のいずれかを包含する。
【０１１３】
本明細書で使用される「オーバーハング」（例えば、３’末端オーバーハングまたは３’オーバーハング）という用語は、全てのヌクレオチド、非ヌクレオチド（例えば、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー）、またはヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの組み合わせを含有し得るＲＮＡ複合体の不対領域を意味する。
【０１１４】
本明細書で使用される「ヌクレオモノマー」という用語は、（２）第２の部分に共有結合される（１）塩基を含む部分を意味する。ヌクレオモノマーは、結合されて核酸内の標的塩基配列または相補的塩基配列に配列特異的方法で結合するオリゴマーを形成し得る。
【０１１５】
本明細書で使用される「ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー」、「ヒドロキシメチルヌクレオモノマー」、「ヒドロキシメチルモノマー」、「非環状ヌクレオモノマー」、「非環状モノマー」、「非環状ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー」という用語は、全体にわたって交換可能に使用され得る。
【０１１６】
本明細書で使用される「ＲＩＳＣ長」または「ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体」という用語は、２５個未満の塩基対を有する核酸分子を意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される「ダイサー長」または「ダイサー長ＲＮＡ複合体」という用語は、２５個以上の塩基対、概して、２５〜４０個の塩基対を有する核酸分子を意味する。
【０１１８】
本発明の好ましい標的核酸は、ｍＲＮＡである。したがって、一実施形態では、ＲＮＡ複合体によって媒介される核酸修飾は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの分解を媒介する。別の好ましい実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの翻訳阻害を媒介する。別の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの翻訳阻害および分解の両方を媒介する。
【０１１９】
他の好ましい実施形態では、標的核酸は、非コードＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ＯＳＵ（非常に小さいＲＮＡ）、またはｒＲＮＡである。
【０１２０】
さらに別の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。かかる実施形態では、好ましい核酸修飾は、ＤＮＡメチル化およびＤＮＡ欠失を含む。
【０１２１】
本発明のＲＮＡ複合体のサイズは、本発明の１つ以上の目的を依然として果たしながら、変化させられ得る。これは、例えば、特定の対象物のオフターゲット効果が低減させられる場合に適用する。
【０１２２】
故に、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、１０塩基対、１１塩基対、１２塩基対、１３塩基対、１４塩基対、１５塩基対、１６塩基対、１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対、２０塩基対、２１塩基対、２２塩基対、２３塩基対、２４塩基対および２５塩基対、２６塩基対、２７塩基対、２８塩基対、２９塩基対、３０塩基対、３５塩基対、４０塩基対、４２塩基対、４５塩基対、５０塩基対、５５塩基対、６０塩基対、または６２塩基対の群から選択される幾つかの塩基対を含んでもよい。
【０１２３】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、１５〜４０個の塩基対を含む。
【０１２４】
別の好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、１８〜２２個の塩基対または２５〜３０個の塩基対を含む。
【０１２５】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、４０塩基対よりも長くさえあるが、幾つかの細胞中では、より長鎖の２本鎖ＲＮＡ複合体の導入が、インターフェロン依存性非特異的応答を誘導し得ることが知られる。かかる一実施形態では、複合体が、ＲＧＰＣに関与する前に、より短鎖の２本鎖ＲＮＡ複合体にプロセスされることが企図される。ダイサー等のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様酵素が、プロセシングを遂行し得る。ダイサーはまた、４０塩基対よりも短い２本鎖ＲＮＡをプロセスし、かかるＲＮＡ複合体（ダイサー基質と称される）は、プロセシングなしにＲＩＳＣに入るｓｉＲＮＡと比較して、種々の利点を有する。したがって、一実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、ダイサー基質である。
【０１２６】
別の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、１本鎖であり、２本鎖領域を有さない。
【０１２７】
さらに別の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、１本鎖であるが、１つ以上の２本鎖領域を含有するように折り畳まれる。かかる実施形態は、例えば、マイクロＲＮＡおよびそれらの機能を擬態するのに有用である。
【０１２８】
さらに別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、１０塩基対よりも短く、故に１〜９塩基対を含む。
【０１２９】
本発明の一実施形態では、ＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、２本を超えるＲＮＡ鎖によって構成される。
【０１３０】
本発明の一実施形態では、ＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、３本のＲＮＡ鎖によって構成される。
【０１３１】
本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域は、４本以上のＲＮＡ鎖によって構成される。
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、オーバーハングを含む。本文脈で使用されるとき、オーバーハングは、２本鎖領域に続く、短い１本鎖領域に言及する。
【０１３３】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、３’−オーバーハングを含む。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、３’−オーバーハングを含む。
【０１３５】
さらに別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、５’−オーバーハングを含む。
【０１３６】
さらに別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、５’−オーバーハングを含む。
【０１３７】
好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖は、３’−オーバーハングを含む。
【０１３８】
本発明のｓｉＲＮＡ複合体のオーバーハングは、複合体の基本的機能を阻害することなく、種々の長さであることができる。故に、一実施形態では、オーバーハングは、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、および８ヌクレオチド、ならびに／または１ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、２ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、３ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、４ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、５ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、６ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、７ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、および８ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー長、ならびにそれらの組み合わせを含むオーバーハングの群から選択される。
【０１３９】
本発明のＲＮＡ複合体の最も好ましいオーバーハングは、それぞれ１、２、および３ヌクレオチド長またはヌクレオモノマー長を含むオーバーハングである。
【０１４０】
一実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖のオーバーハングは、パッセンジャー鎖のオーバーハングと同一の長さを有する。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖のオーバーハングは、パッセンジャー鎖のオーバーハングと同一の長さを有さない。
【０１４２】
本発明のＲＮＡ複合体のさらに別の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、少なくとも１つの平滑末端を含む。「平滑末端」は、２本鎖核酸の末端に言及し、それはいかなる突出するヌクレオチド、すなわち、同位置における２本鎖核酸末端の両鎖も有さない。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、両末端で平滑末端である。
【０１４４】
ある態様では、ＲＮＡ複合体は、平滑末端に共有結合される１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する、少なくとも１つの平滑末端を有する。ある態様では、ｄｓＲＮＡは、各々が各平滑末端に共有結合される１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する、２つの平滑末端を有する。ある態様では、平滑末端は、平滑末端に共有結合される１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれを超えるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する。ある態様では、平滑末端は、平滑末端に共有結合される２個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する。ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ホスホロチオエート結合を用いて、ＲＮＡ複合体の平滑末端に結合される。
【０１４５】
ある態様では、共有結合は、ホスホロチオエート結合である。
【０１４６】
明確にすることを目的として、ＲＮＡ複合体の平滑末端と、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの結合との間の関係を理解するために、次の構造が使用されてもよい（Ｘは、あらゆるヌクレオシドであり、Ｈは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーであり、ｎは、１３〜３８であり、ｍは、各発現について独立して０〜８である）。センス鎖のＸは、アンチセンス鎖のＸと塩基対を形成し、故に平滑末端を有する二重鎖領域を形成する。
【０１４７】
下のＲＮＡ複合体では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー（Ｈ）は、センス鎖の３’末端、またはアンチセンス鎖の３’末端、またはセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端の両方、またはセンス鎖の５’末端、またはアンチセンス鎖の５’末端、またはセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方、またはセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の５’末端、またはセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端、またはセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に結合（例えば、ホスホジエステル結合または本明細書に開示されるもしくは当業者に既知のあらゆる他の結合）されてもよい。より詳細な実施形態を下で提供する。
５’    （Ｈ）ｍ−Ｘ−（Ｘ）ｎ−Ｘ−（Ｈ）ｍ  ３’    センス鎖
３’    （Ｈ）ｍ−Ｘ−（Ｘ）ｎ−Ｘ−（Ｈ）ｍ  ５’    アンチセンス鎖
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端に共有結合される。 
【０１４８】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の３’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の３’末端に共有結合される。
【０１４９】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端に共有結合される。
【０１５０】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合される。
【０１５１】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端に共有結合される。
【０１５２】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端および３’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端および３’末端に共有結合される。
【０１５３】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合される。
【０１５４】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に共有結合される。
【０１５５】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に共有結合される。
【０１５６】
ある態様では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合される。ある態様では、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合される。
【０１５７】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１５８】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、１個以上の非環状ヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１５９】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、１個以上の非環状ヌクレオモノマーを含み、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６０】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで１個以上の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６１】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで１個以上の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６２】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで１個以上の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６３】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで１個以上の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここで１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合され、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６４】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで少なくとも２個の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６５】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで少なくとも２個の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここで１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。 
【０１６６】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで少なくとも２個の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここで１、２、および／または３個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６７】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで少なくとも１個の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここで１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合され、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１、２、および／または３位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６８】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで２個の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここで１、２、３、および／または４個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１６９】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで２つ以上の非環状ヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここで少なくとも１個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１７０】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、および／または８位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１７１】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖において非環状ヌクレオモノマーを含まない同一のｄｓＲＮＡ（すなわち、ヌクレオチド間で見出されるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有さないｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖）と比較して、ｄｓＲＮＡのマイクロＲＮＡ活性を低減するアンチセンス鎖内の位置にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１７２】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、第１の不連続のパッセンジャー鎖および第２の不連続のパッセンジャー鎖を含む不連続の鎖（不連続のパッセンジャー鎖）であり、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の不連続のパッセンジャー鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の不連続のパッセンジャー鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１７３】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、第１の不連続のパッセンジャー鎖および第２の不連続のパッセンジャー鎖を含む不連続の鎖（不連続のパッセンジャー鎖）であり、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の不連続のパッセンジャー鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の不連続のパッセンジャー鎖の５’末端に共有結合され、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１７４】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、第１の不連続のパッセンジャー鎖および第２の不連続のパッセンジャー鎖を含む不連続の鎖（不連続のパッセンジャー鎖）であり、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の不連続のパッセンジャー鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の不連続のパッセンジャー鎖の５’末端に共有結合される。
【０１７５】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、不連続のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで不連続のセンス鎖（不連続のパッセンジャー鎖）は、第１の鎖および第２の鎖を含み、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の５’末端に共有結合される。
【０１７６】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、不連続のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで不連続のセンス鎖（不連続のパッセンジャー鎖）は、第１の鎖および第２の鎖を含み、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の鎖の５’末端に共有結合される。
【０１７７】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、不連続のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで不連続のセンス鎖（不連続のパッセンジャー鎖）は、第１の鎖および第２の鎖を含み、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第１の鎖の５’末端に共有結合される。
【０１７８】
ある態様では、本発明の平滑末端ｄｓＲＮＡは、不連続のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで不連続のセンス鎖（不連続のパッセンジャー鎖）は、第１の鎖および第２の鎖を含み、ここで非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の鎖の３’末端に共有結合され、非環状ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、ここでヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡの第２の鎖の５’末端に共有結合される。
【０１７９】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、約２５〜約３０個のヌクレオモノマーを含み、アンチセンス鎖は、約２５〜約３０個のヌクレオモノマーを含み、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および／または２６位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１８０】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、約２５個〜約３０個のヌクレオモノマーを含み、アンチセンス鎖は、約２５個〜約３０個のヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて６、７、８、９、１０、１１、および／または１２位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１８１】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、約２５個のヌクレオモノマーを含み、アンチセンス鎖は、約２７個のヌクレオモノマーを含み、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて２１および／または２２位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１８２】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、約２５個のヌクレオモノマーを含み、アンチセンス鎖は、約２７個のヌクレオモノマーを含み、ここでアンチセンス鎖は、センス鎖の５’末端から数えて６および／または７位にヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０１８３】
本明細書に開示される態様のうちのいずれにおいても、ＲＮＡ複合体は、２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマーを含む。関連する態様では、ＲＮＡ複合体は、０〜１２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマー（または０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマー）を含む。関連する態様では、ＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、０〜１２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマー（または０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマー）を含む。関連する態様では、ＲＮＡ複合体のガイド鎖は、０〜６個の２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマー（または０、１、２、３、４、５、もしくは６個の２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマー）を含む。ある態様では、ヒドロキシメチル置換モノマーは、２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマーである。
【０１８４】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでＲＮＡ複合体は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、トール様受容体３（ＴＬＲ３）に対する親和性が低い。
【０１８５】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでｄｓＲＮＡのトール様受容体３（ＴＬＲ３）に対する親和性は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して低減される。
【０１８６】
ある態様では、本発明のＲＮＡ複合体は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでＲＮＡ複合体は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、トール様受容体３（ＴＬＲ３）を活性化させる能力が低い。 
【０１８７】
ある態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡによってトール様受容体３（ＴＬＲ３）の活性を低減させる方法を提供し、該方法は、ＴＬＲ３を活性化するｄｓＲＮＡを特定すること、ｄｓＲＮＡを１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーで修飾すること、ならびにｄｓＲＮＡの、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーでの修飾が、１個以上の非環状ヌクレオモノマーを含まない同一のｄｓＲＮＡと比較してＴＬＲ３の活性を減少させるかどうかを決定するために、ＴＬＲ３活性検定および／または遺伝子発現検定を行うことを含む。
【０１８８】
ある態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡによってＭＤＡ−５遺伝子の活性を低減させる方法を提供し、該方法は、ＭＤＡ−５を活性化するｄｓＲＮＡを特定すること、ｄｓＲＮＡを１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーで修飾すること、ならびにｄｓＲＮＡの、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーでの修飾が、１個以上の非環状ヌクレオモノマーを含まない同一のｄｓＲＮＡと比較してＭＤＡ−５の活性を減少させるかどうかを決定するために、ＭＤＡ−５活性検定および／または遺伝子発現検定を行うことを含む。
【０１８９】
ある態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡによってＲＩＧ−Ｉ遺伝子の活性を低減させる方法を提供し、該方法は、ＲＩＧ−Ｉを活性化するｄｓＲＮＡを特定すること、ｄｓＲＮＡを１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーで修飾すること、ならびにｄｓＲＮＡの、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーでの修飾が、１個以上の非環状ヌクレオモノマーを含まない同一のｄｓＲＮＡと比較してＲＩＧ−Ｉの活性を減少させるかどうかを決定するために、ＲＩＧ−Ｉ活性検定および／または遺伝子発現検定を行うことを含む。
【０１９０】
ある態様では、本発明は、細胞を、それによって１つ以上のＴＬＲ経路が阻害または低減される非環状ヌクレオモノマーと接触させることによって、例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、およびＴＬＲ１１を含む細胞内の１つ以上のトール様受容体（ＴＬＲ）経路を阻害または低減する方法を提供する。ある態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、共に結合されるか（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５個、またはそれを超える）、または核酸に組み込まれる（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）。ある態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、均一母集団（すなわち、プリンまたはピリミジンを含む）であるか、または不均一母集団（すなわち、プリンおよびピリミジンの両方）である。ある態様では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ＴＬＲアンタゴニストである。ある態様では、非環状ヌクレオモノマーはＴＬＲに結合する。ある態様では、細胞内の１つ以上のＴＬＲ経路を阻害または低減するヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪであり得る。ある態様では、細胞内の１つ以上のＴＬＲ経路を阻害または低減するヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪであり得る。ある態様では、細胞内の１つ以上のＴＬＲ経路を阻害または低減するヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＤであり得る。
【０１９１】
好ましい本発明のＲＮＡ複合体は、全体的構造において、より長鎖の２本鎖ＲＮＡ複合体のダイサープロセシングの産物に類似する。別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、上述の通りダイサー基質である。
【０１９２】
本発明の他の好ましいＲＮＡ複合体は、コア２本鎖領域が、１８〜２２個の塩基対を含み、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖が、各々１〜３個のヌクレオチド３’−オーバーハングを含むような複合体である。
【０１９３】
本発明のＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、複合体の機能を阻害することなく、種々の長さを有することができる。故に、好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、それぞれ８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、２６ｍｅｒ、２７ｍｅｒ、２８ｍｅｒ、２９ｍｅｒ、３０ｍｅｒ、３１ｍｅｒ、３２ｍｅｒ、３３ｍｅｒ、３４ｍｅｒ、３５ｍｅｒ、３６ｍｅｒ、３７ｍｅｒ、３８ｍｅｒ、３９ｍｅｒ、４０ｍｅｒ、４１ｍｅｒ、４２ｍｅｒ、４３ｍｅｒ、４４ｍｅｒ、４５ｍｅｒ、４６ｍｅｒ、４７ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、４９ｍｅｒ、５０ｍｅｒ、５１ｍｅｒ、５２ｍｅｒ、５３ｍｅｒ、５４ｍｅｒ、５５ｍｅｒ、５６ｍｅｒ、５７ｍｅｒ、５８ｍｅｒ、５９ｍｅｒ、６０ｍｅｒ、６１ｍｅｒ、または６２ｍｅｒである。例えば、１９ｍｅｒとは、ヌクレオチドもしくはヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、またはそれらの組み合わせであってもよい１９個のモノマーのアンチセンス鎖であることを理解されたい。
【０１９４】
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の次の群から選択される：１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、および２３ｍｅｒ。
【０１９５】
本発明の一実施形態では、ｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、不連続である。本発明のｓｉＲＮＡ複合体の一実施形態では、パッセンジャー鎖は、複数の別個のＲＮＡ分子を含む。ＲＮＡ分子の数は、１、２、３、４、５、または６個であってもよい。
【０１９６】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の個々のＲＮＡ分子の長さは、４モノマーを超える。他の実施形態では、パッセンジャー鎖の個々のＲＮＡ分子の長さは、それぞれ５モノマー、６モノマー、７モノマー、８モノマー、９モノマー、１０モノマー、１１モノマー、および１２モノマーである。
【０１９７】
他の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の個々のＲＮＡ分子の長さは、それぞれ５モノマー、６モノマー、７モノマー、８モノマー、９モノマー、１０モノマー、１１モノマー、および１２モノマー未満である。
【０１９８】
本発明の一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の不連続のパッセンジャー鎖は、第１および第２のＲＮＡ分子を含み、それは共に不連続のパッセンジャー鎖を形成し、ここで第１のＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の下流部分とハイブリッド形成され、第２のＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の上流部分とハイブリッド形成される。
【０１９９】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、不連続である。アンチセンス鎖の好ましい不連続性は、パッセンジャー鎖の好ましい不連続性と同一である。
【０２００】
本発明のｓｉＲＮＡ複合体の鎖のうちの１つの不連続性は、切れ目であり得る。切れ目とは、ホスホジエステル結合の欠損によって引き起こされ、しかしながら、２本鎖核酸がヌクレオチドを欠損することのない、２本鎖核酸の鎖における不連続性であると理解されたい。故に、切れ目の反対の塩基は、切れ目の入った鎖上の塩基と依然としてハイブリッド形成される。
【０２０１】
本発明のｓｉＲＮＡ複合体の鎖のうちの１つの、別の不連続性は、別の切れ目であり、それは、ホスホジエステル結合以外に、糖‐リン酸骨格における１つの結合欠損または１つを超える結合欠損によって引き起こされ、しかしながら、２本鎖核酸がヌクレオチドを欠損することのない、２本鎖核酸の１本の鎖における不連続性であると理解される。故に、切れ目の反対の塩基は、切れ目の入った鎖上の塩基と依然としてハイブリッド形成されてもよい。
【０２０２】
ギャップは、本発明のＲＮＡ複合体のＲＮＡ鎖が、少なくとも１個のヌクレオチドもしくはヌクレオシドまたは核酸塩基が２本鎖核酸において欠損しているような不連続性を有すると説明され得る場合の候補として使用される。
【０２０３】
好ましくは、ＲＮＡ複合体の５’末端は、リン酸化されるか、リン酸化のために利用可能である。リン酸化のために利用可能とは、５’−ヒドロキシ基が、例えば、直接的共役によってまたは５’−ヒドロキシ基付近の他の基との他の共役（それは５’−ヒドロキシ基がリン酸化されるのを妨げる）によって、ブロックされていないことを意味する。
【０２０４】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体のＲＮＡ分子は、５’末端リン酸塩および３’−ヒドロキシ基を含む。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の第２のＲＮＡ分子は、５’末端リン酸塩および３’−ヒドロキシ基を含む。
【０２０６】
さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端リン酸塩および３’−ヒドロキシ基を含む。
【０２０７】
本発明の幾つかの実施形態では、ＲＮＡ複合体が、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド以外のヌクレオチド類似体を含むことが好ましい。ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド以外の、かかるヌクレオチド類似体は、下で「代替的修飾ヌクレオチド」と称される。
【０２０８】
代替的修飾ヌクレオチドの使用は、複数の理由により好まれ得る。それらは、例えば、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のコア２本鎖領域の融点を上昇させるために使用され得る。
【０２０９】
代替的修飾ヌクレオチドの使用は、アンチセンス鎖と標的核酸との間で形成される２本鎖構造の融点を上昇させるために、好まれ得る。
【０２１０】
したがって、一実施形態では、アンチセンス鎖は、代替的修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、代替的修飾ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の第１および第２のＲＮＡ分子は、各々代替的修飾ヌクレオチドを含有する。本発明の一実施形態では、ＲＮＡ複合体における代替的修飾ヌクレオチドの数は、１０個である。本発明の他の実施形態では、ＲＮＡ複合体におけるヌクレオチド類似体の数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２、または１個である。本発明の一実施形態では、アンチセンス鎖における代替的修飾ヌクレオチドの数は、１０個である。本発明の他の実施形態では、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド類似体の数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２、または１個である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、代替的修飾ヌクレオチド、または代替的修飾ヌクレオチドおよびヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの組み合わせである。
【０２１１】
同様に、本発明の別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖におけるヌクレオチド類似体の数は、１０個である。本発明の他の実施形態では、パッセンジャー鎖におけるヌクレオチド類似体の数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２、または１個である。 
【０２１２】
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の全てのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、または代替的修飾ヌクレオチドおよびヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの組み合わせである。
【０２１３】
一実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方は、代替的修飾ヌクレオチドを含有する。
【０２１４】
一実施形態では、ＲＮＡ複合体の代替的修飾ヌクレオチドは同一、すなわちそれらは、例えば、全てＬＮＡまたは全て２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡである。別の実施形態では、同一のＲＮＡ複合体において、種々の異なる代替的修飾ヌクレオチドが使用される。
【０２１５】
一実施形態では、ＲＮＡ複合体は、ホスホロチオエート結合を含む。
【０２１６】
別の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、天然ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合の混合物を含む。
【０２１７】
本発明の好ましいヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーの群から選択されるヌクレオチド類似体であるが、他のモノマーもまた使用され得る［Ｎａｗｒｏｔ  ａｎｄ  Ｓｉｐａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，６，９１３−９２５］。
【０２１８】
一実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、共役基によって官能化される。共役基は、本発明のＲＮＡ複合体の特性を変化、拡張、または改善させる、当業者に既知の基である。かかる基は、細胞内分布、器官内分布、組織内分布、二重鎖融点、標的親和性、生体内安定性、ハイブリダイゼーションのシグナル伝達等を調節するのに有用であり得る。
【０２１９】
一実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、ヒドロキシメチル置換基の共役基とメチレン基との間のエーテル結合によって官能化される。図２（モノマーＦ）を参照されたい。
【０２２０】
一実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、本発明のＲＮＡ複合体に組み込まれる前に、当業者に既知の方法を用いて、チオエーテル官能性に変換される。図２（モノマーＧ）を参照されたい。
【０２２１】
別の実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、本発明のＲＮＡ複合体に組み込まれる前に、当業者に既知の方法を用いて、メルカプトメチル官能性に変換される。図２（モノマーＧ、Ｒ＝Ｈ）を参照されたい。このメルカプト官能性は、当業者に既知の方法を用いて、例えば、ＲＮＡ合成の間、そのアセチル誘導体として適切に保護される。
【０２２２】
一実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、本発明のＲＮＡ複合体に組み込まれる前に、当業者に既知の方法を用いて、アミン官能性に変換される。図２（モノマーＩ、Ｒ＝Ｈ）を参照されたい。このアミン官能性は、当業者に既知の方法を用いて、例えば、ＲＮＡ合成の間、そのトリフルオロアセチル誘導体またはＦｍｏｃ誘導体として適切に保護される。
【０２２３】
一実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミド結合共役基の結合のためのハンドルとして作用する。これは、例えば上述の通り、ヒドロキシメチル置換基のヒドロキシルユニットを、アミンユニットへ変換させること、および例えば、このアミノ基を、当業者に既知の方法を用いて、アミド結合形成による共役基によってさらに誘導化することを含む。これは、当業者に既知の方法を用いて、ＲＮＡ合成前、またはＲＮＡ合成後に行われてもよい（図２、モノマーＨ）。
【０２２４】
一実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミノ結合共役基の結合のためのハンドルとして作用する。これは、例えば上述の通り、ヒドロキシメチル置換基のヒドロキシルユニットを、アミンユニットへ変換させること、および例えば、このアミノ基を、当業者に既知の方法を用いて、アミン結合形成による共役基によってさらに誘導化することを含む。これは、当業者に既知の方法を用いて、ＲＮＡ合成前、またはＲＮＡ合成後に行われてもよい（図２、モノマーＩ）。
【０２２５】
さらなる一実施形態では、共役に使用されるアミン基は、アミノ基、ピペラジノ基、またはジアミノアルキル基である。かかるモノマーは、アミン誘導体化モノマーと呼ばれる。これらの基の各々は、さらに誘導体化または共役させられ得る（図２、モノマーＪ）。
【０２２６】
一実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、天然ＲＮＡ複合体と比較して、低減されたオフターゲット効果を有する。
【０２２７】
好ましい一実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖において、本発明の少なくとも１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。
【０２２８】
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖のいわゆる種領域、すなわちアンチセンス鎖の５’末端から第１〜１２位のうちの少なくとも１つに組み込まれるか、またはその周囲にある、本発明の少なくとも１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第２〜１０位のうちの少なくとも１つに組み込まれる、本発明の少なくとも１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第３〜８位のうちの１つに組み込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第７または第８位の１つに組み込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第７位に組み込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第９〜１６位に組み込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第９〜１１位に組み込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から第９〜１０位に組み込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、天然ＲＮＡ複合体と比較して、低減された免疫応答を生成する。
【０２２９】
さらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、天然ＲＮＡ複合体と比較して、持続的な効果を有する。
【０２３０】
さらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、天然ＲＮＡ複合体と比較して、増加された効果を有する。したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡ複合体は、例えば、標的ｍＲＮＡのより効率的な分解によって、またはｍＲＮＡのより効率的な翻訳阻害によって、天然ＲＮＡ複合体よりも、ＲＮＡｉをより効果的に媒介する。
【０２３１】
さらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、ヒトもしくは動物の特定の器官または組織に効率的に送達される。
【０２３２】
またさらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、細胞膜を効率的に透過することができる。またさらに別の実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、天然ＲＮＡ複合体よりも、細胞膜をより効率的に透過することができる。一実施形態では、本発明のＲＮＡ複合体は、ＲＮＡ複合体のヒトの体内における保持を増加させる血漿タンパク質に結合することができる。
【０２３３】
一実施形態では、ＲＮＡ複合体は、標的核酸の発現を下方制御する平滑末端２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であってもよく、該ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖、１９〜２４塩基対の２本鎖領域、ならびにｄｓＲＮＡの少なくとも１つの平滑末端に結合される１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。関連する実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、独立して１９個以上のヌクレオモノマーを有する。別の関連する実施形態では、センス鎖は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。さらに別の実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端から１、２、３、４、および／または５位にある。関連する実施形態では、アンチセンス鎖は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。関連する実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から４、５、６、７、８、９および／または１０位にある。
【０２３４】
別の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、標的核酸の発現を下方制御する平滑末端２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であってもよく、該ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖、２５〜３０塩基対の２本鎖領域、ならびにヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む１つの３’末端オーバーハングを含む。関連する実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、独立して２５〜３５個のヌクレオモノマーを有する。さらに別の実施形態では、センス鎖は、２５個のヌクレオモノマーを有し、アンチセンス鎖は、２７個のヌクレオモノマーを有する。さらに別の実施形態では、センス鎖は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。別の実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ダイサー酵素によるｄｓＲＮＡの切断を低減するか、または妨げる。関連する実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、ｄｓＲＮＡのダイサー切断部位の側面に位置する。別の実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、センス鎖の５’末端から１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および／または３２位にある。関連する実施形態では、アンチセンス鎖は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。関連する実施形態では、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および／または１７位にある。関連する実施形態では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオモノマーである。
【０２３５】
本明細書で使用されるとき、「二機能性ＲＮＡ複合体」または「二機能性ｄｓＲＮＡ」という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有するＲＮＡ複合体を意味し、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖は、各々同一の標的ＲＮＡの異なる領域（すなわち、第１の領域および第２の領域）と相補的であるか、または各々少なくとも２つの異なる標的ＲＮＡの領域と相補的である。
【０２３６】
一実施形態では、ＲＮＡ複合体は、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の各々の５’末端から５、６、７、および／または８位において、２つの平滑末端およびヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを有する二機能性ＲＮＡ複合体であってもよい。
【０２３７】
一実施形態では、二機能性ＲＮＡ複合体は、２つの平滑末端、センス鎖、およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から５、６、７、および／または８位においてヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、および／または８位においてヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでセンス鎖は、標的ＲＮＡの第１の領域と相補的であり、アンチセンス領域は、標的ＲＮＡの第２の領域と相補的であり、ここで第１の領域および第２の領域は、標的ＲＮＡの非重複領域である。関連する実施形態では、標的ＲＮＡの第１および第２の領域は、部分的に重複する。
【０２３８】
一実施形態では、二機能性ＲＮＡ複合体は、２つの平滑末端、センス鎖、およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、センス鎖の５’末端から５、６、７、および／または８位においてヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、および／または８位においてヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含み、ここでセンス鎖は、第１の標的ＲＮＡの第１の領域と相補的であり、アンチセンス領域は、第２の標的ＲＮＡ第２の領域と相補的であり、ここで第１の標的ＲＮＡおよび第２の標的ＲＮＡは、異なる標的ＲＮＡであるか、あるいは９５％未満の相同性、または９０％の相同性、または８５％の相同性、または８０％の相同性、または７５％の相同性、または７０％の相同性、または６５％の相同性、または６０％の相同性、または５５％の相同性、または５０％の相同性を有する。関連する実施形態では、第１および第２の標的ＲＮＡは、同一の細胞内経路にある。
【０２３９】
ＲＮＡ複合体を調製する方法
本発明の別の態様は、コア２本鎖領域を含むＲＮＡ複合体が形成され、該ＲＮＡ複合体が対応する細胞内ＲＮＡのＲＮＡ干渉を媒介することができるような条件下で、アンチセンス鎖を、パッセンジャー鎖を用いて培養することを含む、本発明の２本鎖ＲＮＡ複合体を調製する方法である。
【０２４０】
本発明の別の態様では、標的ｍＲＮＡの発現を制御する１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体を調製する方法であり、各々１５〜４０個のヌクレオモノマーを有する少なくとも２つの核酸鎖を合成するステップ、および合成された核酸鎖を、２本鎖領域を有する平滑末端ＲＮＡ複合体を形成するのに好適な条件下で組み合わせるステップを含み、ここで各鎖の３’末端は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０２４１】
本発明の別の態様では、標的ｍＲＮＡの発現を制御する１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー含むＲＮＡ複合体を調製する方法であり、各々１８〜３０個のヌクレオモノマーを有する少なくとも２つの核酸鎖を合成するステップ、および合成された核酸鎖を、２本鎖領域を有する平滑末端ＲＮＡ複合体を形成するのに好適な条件下で組み合わせるステップを含み、ここで各鎖の３’末端は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０２４２】
この態様の代替的実施形態では、ＲＮＡ複合体は、本発明（第１０の態様）のＲＮＡ二重鎖によって置換される。
【０２４３】
本発明のさらに別の態様は、細胞内または有機体内の標的核酸の核酸修飾を媒介する方法であり、標的核酸の修飾が生じ得るような条件下で、細胞または有機体を本発明のＲＮＡ複合体と接触させるステップを含み、それによって標的核酸の修飾を媒介する。
【０２４４】
好ましい実施形態では、標的核酸の核酸修飾を媒介する方法は、体外で行われる。好ましい実施形態では、標的核酸の核酸修飾を媒介する方法は、体内で、すなわち動物において、ヒトにおいて、または非ヒト動物において行われる。好ましい実施形態では、標的核酸の核酸修飾を媒介する方法は、細胞培養物中で行われる。さらに別の実施形態では、方法は、単離された細胞上で行われる。
【０２４５】
好ましい実施形態では、方法の核酸修飾は、ＲＮＡ干渉、標的ｍＲＮＡの好ましい分解、または標的ｍＲＮＡの翻訳阻害もしくは制御性非コードＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）の阻害である。
【０２４６】
別の実施形態では、核酸修飾は、ＤＮＡメチル化である。
【０２４７】
この態様の代替的実施形態では、ＲＮＡ複合体は、本発明のオリゴヌクレオチド（第９の態様）または本発明のＲＮＡ二重鎖（第１０の態様）のいずれかによって置換される。
【０２４８】
本発明の第４の態様は、遺伝子機能を試験する方法を含む。本発明の別の態様は、細胞内または有機体内の遺伝子の機能を試験する方法であり、該方法は、遺伝子に相当する本発明のＲＮＡ複合体を、細胞内または有機体内へ導入し、それによって試験細胞または試験有機体を生成するステップ、標的核酸の修飾が生じ得る条件下で試験細胞または試験有機体を維持するステップ、およびステップｂで生成された試験細胞または試験有機体の表現型を観察するステップ、および任意に、観察される表現型を、適切な対照細胞または対照有機体の表現型と比較し、それによって遺伝子の機能についての情報を提供するステップを含む。本発明のＲＮＡ複合体は、添付の実施例に概説される通り、例えば、トランスフェクションを用いて、細胞内に導入され得る。有機体または細胞の表現型は、例えば、タンパク質レベルを査定するためにプロテオミクスを用いて、またはＲＮＡレベルを査定するためにマイクロアレイを用いて、観察されてもよい。また、より明確な表現型、例えば、１個の具体的な遺伝子の発現が使用されてもよい。遺伝子の機能について得られた情報は、遺伝子産物が、具体的な疾患に関連した治療介入に好適な標的であるかどうかを決定するために使用されてもよい。故に、ある種の遺伝子産物が、例えば、癌の特異的サブタイプに侵されることが知られる、ある種の生化学的経路内で作用することが示される場合、遺伝子産物は、前述の癌の特異的サブタイプの治療のための治療介入に好適な標的であり得る。
【０２４９】
細胞内または有機体内の遺伝子の機能を試験する方法の好ましい実施形態では、該方法の核酸修飾は、ＲＮＡ干渉、標的ｍＲＮＡの好ましい分解、または標的ＲＮＡの翻訳阻害である。
【０２５０】
別の実施形態では、核酸修飾は、ＤＮＡメチル化である。
【０２５１】
細胞内または有機体内の遺伝子の機能を試験する方法の好ましい実施形態では、該方法は、細胞培養内で、体外または体内で行われる。
【０２５２】
さらに別の実施形態では、該方法は、単離された細胞上で行われる。
【０２５３】
この態様の代替的実施形態では、ＲＮＡ複合体は、本発明（第９の態様）のオリゴヌクレオチドまたは本発明（第１０の態様）のＲＮＡ二重鎖のいずれかによって置換される。
【０２５４】
本発明の第５の態様では、薬剤を評価する方法が提供される。本発明の別の態様は、薬剤が遺伝子産物に対して作用するかどうかを査定する方法であり、該遺伝子に相当する本発明のＲＮＡ複合体を、細胞内または有機体内へ導入し、それによって試験細胞または試験有機体を生成するステップ、標的核酸の修飾が生じるような条件下で、試験細胞または試験有機体を維持するステップ、薬剤を試験細胞内または試験有機体内へ導入するステップ、試験細胞または有機体の表現型を観察するステップ、および任意に、観察される表現型を、適切な対照細胞または対照有機体の表現型と比較し、それによって薬剤が遺伝子産物に対して作用するかどうかについての情報を提供するステップを含む。
【０２５５】
薬剤が遺伝子または遺伝子産物に対して作用するかどうかを査定する方法の好ましい実施形態では、該方法の核酸修飾は、ＲＮＡ干渉、標的ＲＮＡの好ましい分解、または標的ＲＮＡの翻訳阻害である。別の実施形態では、核酸修飾の修飾は、ＤＮＡメチル化である。
【０２５６】
薬剤が遺伝子産物に対して作用するかどうかを査定する方法の好ましい実施形態では、該方法は、細胞培養内で、体外または体内で行われる。さらに別の実施形態では、方法は、単離された細胞上で行われる。この態様の代替的実施形態では、ＲＮＡ複合体は、本発明（第９の態様）のオリゴヌクレオチドまたは本発明（第１０の態様）のＲＮＡ二重鎖のいずれかによって置換される。
【０２５７】
本発明の第６の態様では、薬学組成物が提供される。本発明のさらに別の態様は、ＲＮＡ複合体および薬学的に許容される希釈剤、担体、またはアジュバントである。本発明のＲＮＡ複合体が、特異的遺伝子および遺伝子産物を標的とするように設計され得ることは当業者に明らかであろう。ＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を標的とし、タンパク質を標的としないことを理解されたい。しかしながら、タンパク質等の遺伝子産物のレベルは、それがｍＲＮＡである場合、または非コードＲＮＡが修飾される場合に、例えば、ＲＮＡ分解または翻訳阻害によって、間接的に影響を受け得る。またタンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、ＤＮＡメチル化のために、影響を受け得る。
【０２５８】
この態様の代替的実施形態では、ＲＮＡ複合体は、本発明（第９の態様）のオリゴヌクレオチドまたは本発明（第１０の態様）のＲＮＡ二重鎖のいずれかによって置換される。
【０２５９】
本発明の第７の態様では、薬剤の使用が提供される。故に、別の態様は、薬剤として使用するための、本発明のＲＮＡ複合体である。ＲＮＡ複合体の特異性は、アンチセンス鎖の配列内に排他的に存在するため、いったん治療標的が検証されると、当業者は、標的のレベルおよび活性に影響を及ぼすＲＮＡ複合体を設計することができる。連続のパッセンジャー鎖を含む天然ＲＮＡ複合体については、パッセンジャー鎖が誘導体配列として作用することに起因して、オフターゲット効果の問題が依然として存在する。
【０２６０】
この態様の代替的実施形態では、ＲＮＡ複合体は、本発明（第９の態様）のオリゴヌクレオチドまたは本発明（第１０の態様）のＲＮＡ二重鎖のいずれかによって置換される。
【０２６１】
本発明の第８の態様では、モノマーが提供される。本発明の態様は、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの組み込みに好適なモノマー、およびそれらの容易に利用可能な出発物質からの調製方法である。本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのチミン−１−イル誘導体は、ＤＮＡ鎖に組み込まれており、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成のためのそれらのホスホラミダイト形成ブロックの調製手順が報告されている［Ｋ．Ｄ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１４９３、Ｈ．Ｔｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９５，５１，１０３８９、Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１９］。
【０２６２】
ほとんどの場合、本発明のＲＮＡ複合体は、当業者に既知であるような自動オリゴヌクレオチド合成によって調製されるであろう。本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの、本発明のＲＮＡ複合体への組み込みは、ａ）自動ＲＮＡ合成器上のＲＮＡ合成、ｂ）ＲＮＡ処理、ｃ）ＲＮＡ精製、およびｄ）ＲＮＡ単離のための標準方法に従う［Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１］。ヒドロキシメチル置換ＲＮＡオリゴヌクレオチド（＝ＲＮＡ鎖）およびＲＮＡ複合体は、ＲＮＡ合成のための標準技術を用いて、ホスホラミダイト誘導体を用いて合成され得る。
【０２６３】
好ましい実施形態では、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのホスホラミダイト誘導体の調製方法は、リボヌクレオシド、例えば塩基アデニン、グアニン、シトシン、および５−メチルシトシンのために、例えば、ベンゾイル基、イソブチリル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、または当業者に既知の他の標準塩基保護基等の塩基保護基を含有するリボヌクレオシドのＯ５’−ＤＭＴ保護誘導体から始まる。
【０２６４】
好ましい実施形態では、本発明は、２’，３’−切断炭素−炭素結合（リボヌクレオシド命名）を有するモノマーＤおよびＥの組み込みに好適なモノマー形成ブロックを調製する方法を含む。
【０２６５】
他の好ましい実施形態では、本発明は、２’，３’−切断炭素−炭素結合を有し、加えてヒドロキシ基以外で、例えばその２’−炭素原子（リボヌクレオシド命名）における官能性または基を担持するＦ〜Ｊ等のモノマーの組み込みに好適なモノマー形成ブロックを調製する方法を含む。
【０２６６】
本発明の好ましい実施形態では、モノマーＤのホスホラミダイト誘導体の調製方法は、主要なステップの中でも、２’，３’−グリコール切断、得られた中間体の還元、選択的Ｏ２’−保護、およびＯ３’−ホスフィチル化を含む。
【０２６７】
好ましい実施形態では、２’，３’−グリコール切断は、例えば、試薬として過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化切断を用いて行われる。
【０２６８】
別の好ましい実施形態では、過ヨウ素酸ナトリウム切断後の中間体の還元は、例えば、水素化ホウ素ナトリウムによって影響を受ける対応するジオールに還元される。
【０２６９】
モノマーＤの本発明のＲＮＡ複合体への組み込みのために、２’−ヒドロキシ基（リボヌクレオシド命名）を保護する必要がある。本発明の好ましい実施形態では、これは、ベンゾイル化によって行われる。保護の選択性を最適化するために、１当量を若干上回るのみのベンゾイル化試薬（塩化ベンゾイルまたは例えば、無水ベンゾイル）、すなわちＯ３’−ベンゾイル化に相対的なＯ２’−ベンゾイル化の量を使用することが有益であり得る。好ましい一実施形態では、ベンゾイル化は、室温未満で行われる。別の有用な実施形態では、ベンゾイル化は、０℃未満、またはさらに−５０℃未満でも行われる。
【０２７０】
別の好ましい実施形態では、Ｏ２’−保護は、アセチル化によって、または有機合成の分野に精通する者に既知のアシル化試薬を用いてアシル化を行うことによって行われる。
【０２７１】
別の好ましい実施形態では、Ｏ２’−保護は、シリル化試薬および有機合成の分野に精通する者に既知の方法を用いるシリル化によって行われる。好ましいシリル化保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルまたはトリイソプロピルオキシメチルである。
【０２７２】
好ましい実施形態では、後に続くホスフィチル化反応は、いわゆる「ＰＣｌ」試薬［ＰＣｌ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）］またはいわゆる「ビス−アミダイト」 
試薬［Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）２］のいずれかを用いて行われる。
【０２７３】
モノマーＤのホスホラミダイト誘導体の調製方法の好ましい実施形態では、出発物質は、リボヌクレオシド、例えば塩基アデニン、グアニン、シトシン、および５−メチルシトシンのために、例えば、ベンゾイル基、イソブチリル基、アセチル基、フェノキシアセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、または当業者に既知の他の標準塩基保護基等の塩基保護基を含有するリボヌクレオシドのＯ５’−ＤＭＴ保護誘導体である。
【０２７４】
本発明の好ましい実施形態では、モノマーＥのホスホラミダイト誘導体の調製の方法は、主要なステップの中でも、２’，３’−グリコール切断、得られた中間体の還元、選択的Ｏ３’−保護、およびＯ２’−ホスフィチル化を含む。Ｏ３’−保護は、例えば、シリル化もしくはアシル化によって、または最初にＯ２’−ベンゾイル化、次いでＯ３’−シリル化、および次いでＯ２’−脱ベンゾイル化等の組み合わせによって行われ得る。当業者に明白であろうが、他の保護基もまた適用され得る。
【０２７５】
別の好ましい実施形態では、２’，３’−切断炭素−炭素結合を有し、加えてヒドロキシ基以外で、例えばその２’−炭素原子（リボヌクレオシド命名）における官能性または基を担持するＦ〜Ｊ等のモノマーの組み込みに好適なモノマー形成ブロックを調製する方法は、主要なステップの中でも、リボヌクレオシド（例えばＯ５’−ＤＭＴ保護リボヌクレオシド）２’，３’−グリコール切断から出発し、得られた中間体の還元、選択的Ｏ３’−保護、２’−ヒドロキシ基の変換、Ｏ３’−脱保護、およびＯ３’−ホスフィチル化を含む。Ｏ３’−保護は、例えば、シリル化もしくはアシル化によって、または最初にＯ２’−ベンゾイル化、次いでＯ３’−シリル化、および次いでＯ２’−脱ベンゾイル化等の両方の組み合わせによって行われ得る。当業者に明白であろうが、他の保護基もまた適用され得る。２’−ヒドロキシ基の、アミノ基、アシル化アミノ基、アルキル化アミノ基、ジアルキル化アミノ基ルバモイル化アミノ基、ピペラジノ基、アシル化ピペラジノ基、アルキル化ピペラジノ基カルバモイル化ピペラジノ基、メルカプト基、アシル化メルカプト基、アルキル化メルカプト基、ジスルフィド基、アシル化ヒドロキシ基、アルキル化ヒドロキシ基、カルバモイル化ヒドロキシ基等の別の基、またはこれらの基の置換誘導体および／または保護誘導体への変換は、有機合成の分野に精通する者に既知の方法および手順を用いて行われ得る。かかる方法および手順は、２’−ヒドロキシ基の活性誘導体上の置換反応、またはアシル化反応もしくはカルバモイル化反応を含む。かかる方法および手順はまた、Ｏ２’−アルキル化反応、およびアミノ基またはメルカプト基等の他のＣ２’結合基の組み込み後のアルキル化反応を含む。さらに別の可能性としては、アルデヒド官能性を得るための（それは例えば、求核での反応によってさらに修飾され得る）、またはカルボキシ官能性を得るための（それは例えば、カルボキシ官能性の活性エステル等の活性誘導体への変換後、求核での反応によってさらに修飾され得る）、２’−ヒドロキシ基の酸化がある。
【０２７６】
本発明の別の実施形態では、Ｆ〜Ｊ等のモノマー（Ｏ２’原子がホスフィチル化されるように、「逆性」を除き（例えば、モノマーＤおよびＥは「逆性」と考えられ得る）、Ｃ３’原子がヒドロキシ基以外の官能性に結合されるように、別の基に変換されるのは３’−ヒドロキシ基である）の組み込みに好適なモノマー形成ブロックを調製する方法は、主要なステップの中でも、リボヌクレオシド（例えばＯ５’−ＤＭＴ保護リボヌクレオシド）２’，３’−グリコール切断から出発し、得られた中間体の還元、選択的Ｏ２’−保護、３’−ヒドロキシ基の変換、Ｏ２’−脱保護、およびＯ２’−ホスフィチル化を含む。Ｏ２’−保護は、例えば、シリル化もしくはアシル化、またはその両方の組み合わせによって行われ得る。当業者に明白であろうが、他の保護基もまた適用され得る。３’−ヒドロキシ基の、アミノ基、アシル化アミノ基、アルキル化アミノ基、ジアルキル化アミノ基ルバモイル化アミノ基、ピペラジノ基、アシル化ピペラジノ基、アルキル化ピペラジノ基、カルバモイル化ピペラジノ基、メルカプト基、アシル化メルカプト基、アルキル化メルカプト基、ジスルフィド基、アシル化ヒドロキシ基、アルキル化ヒドロキシ基、カルバモイル化ヒドロキシ基等の別の基、またはこれらの基の置換誘導体および／または保護誘導体への変換は、有機合成の分野に精通する者に既知の方法および手順を用いて行われ得る。かかる方法および手順は、３’−ヒドロキシ基の活性誘導体上の置換反応、またはアシル化反応もしくはカルバモイル化反応を含む。かかる方法および手順はまた、Ｏ３’−アルキル化反応、およびアミノ基またはメルカプト基等の他のＣ３’結合基の組み込み後のアルキル化反応を含む。さらに別の可能性としては、アルデヒド官能性を得るための（それは例えば、求核での反応によってさらに修飾され得る）、またはカルボキシ官能性を得るための（それは例えば、カルボキシ官能性の活性エステル等の活性誘導体への変換後、求核での反応によってさらに修飾され得る）３’−ヒドロキシ基の酸化がある。
【０２７７】
一実施形態では、２’−Ｃ−ピペラジノ誘導体は、２’−ヒドロキシ基を脱離基（例えば、メシル酸塩誘導体）に変換し、続いて非常に過剰のピペラジンで反応させることによって調製される。これは例えば、構造アミダイトＪのホスホラミダイトの合成へのステップとして行われ得る（下の図を参照）。
【０２７８】
さらに別の実施形態では、本発明は、天然核酸塩基とは異なるＣ１’原子（リボヌクレオシド命名）において基または官能性を担持する、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの組み込みに好適なモノマー形成ブロックを調製する方法を含む。かかる基または官能性は、保護基を含有してもよく、例えば、天然核酸塩基以外で、ピレン、ペリレン、フルオロフォア、水素、アルキル、反応基、および複素環を含む。
【０２７９】
さらに別の実施形態では、本発明は、ホスホラミダイト誘導体の代わりに、Ｈ−ホスホン酸誘導体として構成される、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの組み込みに好適なモノマー形成ブロックを調製する方法を含む。
【０２８０】
ホスホラミダイト（＝アミダイト）形成ブロック（ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチル、塩基＝天然核酸塩基、ＣＥｔＯ＝シアノエトキシ）に関して、本発明の幾つかの好ましい実施形態の構造例を下に示す。
【０２８１】
【化４】
2015078196.tif 000005
【０２８２】
【化５】
2015078196.tif 000006
本発明の第９の態様では、非環状オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の第９の態様は、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むオリゴヌクレオチドである。説明および実施例の節から明らかであろうが、かかるオリゴヌクレオチドは、種々の用途および利点を有する。
【０２８３】
好ましい実施形態では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオモノマーである。ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、驚くべきことに、ＲＮＡｉ機構の基質細胞内酵素であることが見出されており、場合によっては、これらのオリゴヌクレオチドは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まない同一のオリゴヌクレオチドよりも好ましい基質でさえある。
【０２８４】
好ましくは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、モノマーＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪからなる群から選択される（図１を参照）。当業者に明白であろうが、Ｇ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、およびＪは全て、モノマーＤの合成前駆体から作製され得る。図２に示される通り、非環状モノマーは、コレステロール誘導体、アルキル、フルオロフォア、ポリアミン、アミノ酸、糖類、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリペプチド等の共役基を担持する誘導体に転換され得る。かかる共役基は、オリゴヌクレオチドが、細胞内、器官内、または有機体内の標的ｍＲＮＡの活性を調節するために使用される場合に、例えば、より好ましい生体内安定性および／または生体内分布のために有用であり得る。
【０２８５】
オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１０〜４０ヌクレオモノマーである。１８〜３０ヌクレオモノマーの長さがさらにより好ましい。
【０２８６】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、５個未満のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー以外の５個のヌクレオモノマー当たり、１個以下のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー以外の８個のヌクレオモノマー当たり、１個以下の非環状モノマーがさらにより好ましい。ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの数が多くなりすぎる場合、本発明のオリゴヌクレオチドの相補的核酸に対する結合親和性が損なわれる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜５個のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含む。
【０２８７】
好ましい実施形態では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドの１、２、３、４、５、６、７、および／または８位に存在し、より好ましくは２、３、４、５、６、および／または７位に存在する。位置は、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えられる。これらの位置は、マイクロＲＮＡのいわゆる種領域に相当するため、これらの領域におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドがマイクロＲＮＡとして作用することを低減するか、または妨げるであろう。これは、例えば、オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのガイド鎖として機能することが意図される場合に関連性がある。
【０２８８】
好ましい実施形態では、アンチセンス鎖における全てのヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および／または１６位に存在し、ここで位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えられる。さらにより好ましくは、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは、９、１０、および／または１１位に存在する。故に、前述の領域におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの存在は、アンチセンス鎖がマイクロＲＮＡとして作用するように誘導し、すなわちｓｉＲＮＡ効果が最小限となり、マイクロＲＮＡ効果がはるかに高くなるようにする。
【０２８９】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、８個を超える連続ＤＮＡモノマーのＤＮＡ配列を含まない。６個以下の連続ＤＮＡモノマーがさらにより好ましく、および最も好ましくは４個以下の連続ＤＮＡモノマーである。連続ＤＮＡモノマーは典型的に、オリゴヌクレオチドが相補的ＲＮＡに結合される場合に、ＲＮアーゼＨを活性化させることを可能にし、それはＲＮＡの分解をもたらす。本発明の幾つかの実施形態では、これは望ましくない。故に、さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡモノマーを全く含有しない。
【０２９０】
他の実施形態では、ＲＮアーゼＨ活性は望ましく、オリゴヌクレオチドが４個を超える連続ＤＮＡモノマーを含むことが好ましく、より好ましくは６個を超えるＤＮＡモノマー、および最も好ましくは８個を超えるＤＮＡモノマーを含むことが好ましい。
【０２９１】
さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０％超のＲＮＡモノマーを含む。高度のＲＮＡモノマーは、例えば、ＲＩＳＣ等の細胞内酵素のために基質または誘導体（または補因子）として機能することによって、ＲＮＡ相互作用タンパク質との相互作用を促進する。
【０２９２】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのモノマーの８０％超がＲＮＡモノマーであることが好ましい。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドのモノマーの９０％超がＲＮＡモノマーであることが好ましい。
【０２９３】
オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオモノマー類似体を含んでもよい。かかる一実施形態では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーおよびＲＮＡモノマーは、全てのヌクレオモノマーの８０％超を構成する。別の実施形態では、非環状モノマーおよびＲＮＡモノマーは、全てのヌクレオモノマーの９０％超を構成する。
【０２９４】
オリゴヌクレオチドが、ヌクレオモノマー類似体を含む場合、それらは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーからなる群から選択されることが好ましい。ヌクレオチド類似体は典型的に、結合親和性を調節し、生体内安定性を増加させ、また概して、オリゴヌクレオチドにさらなる薬物様特性を与えるために使用される。
【０２９５】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個のＬＮＡヌクレオチド類似体を含む。ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーは典型的に、相補的核酸と塩基対になる本発明のオリゴヌクレオチドの融点（すなわち結合親和性）を低下させ、ＬＮＡヌクレオモノマーは、この融点の低下に対抗するために使用されてもよい。すなわち一実施形態では、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの数は、ＬＮＡヌクレオモノマーの数と同一である。
【０２９６】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非環状モノマーおよびＲＮＡモノマーのみを含む。
【０２９７】
別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー、ＲＮＡモノマー、およびＬＮＡヌクレオチド類似体のみを含む。
【０２９８】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、チオリン酸結合、ボラノリン酸結合、エチルホスホン酸結合、ホスホロアミド酸結合、およびホスホトリエステル結合からなる群から選択される１つ以上の結合を含む。ホスホロチオエート結合および／またはボラノリン酸結合が最も好ましい。これらの結合は、オリゴヌクレオチドの生体内安定性を改善し、またオリゴヌクレオチドの生体内分布に対するプラス効果を有することも示されている。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、前述のヌクレオチド間結合の５０％超、さらにより好ましくは７５％超を含む。一実施形態では、全てのヌクレオチド間結合が前述のタイプのヌクレオチド間結合である。
【０２９９】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチドと塩基対にならず、すなわち本発明のオリゴヌクレオチドは、１本鎖である。
【０３００】
さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと相補的な標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ依存性翻訳抑制または分解を媒介することができる。当業者であれば、ＲＩＳＣがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）のことであると認識し、この実施形態において、オリゴヌクレオチドが、ＲＩＳＣのための誘導体配列として作用し、それによってＲＩＳＣをＲＮＡオリゴヌクレオチド（典型的には、本発明のオリゴヌクレオチドと部分的なまたは完全な相補性を持つｍＲＮＡである）に誘導することを理解するであろう。オリゴヌクレオチドがＲＩＳＣを部分的相補性のｍＲＮＡ標的に誘導する場合、オリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ擬態として見なされ得る。オリゴヌクレオチドがＲＩＳＣを完全相補性のｍＲＮＡ標的に誘導する場合、それは１本鎖または２本鎖ｉＲＮＡとして見なされ得る。
【０３０１】
ＲＩＳＣ依存性は、ＲＩＳＣ構成要素をコードするｍＲＮＡに対抗するｓｉＲＮＡを用いて、ＲＩＳＣの構成要素をノックアウトすることによって、細胞株において査定され得、ノックアウト細胞株におけるオリゴヌクレオチドの活性を評価する。かかる実験は、当業者に周知である。
【０３０２】
本発明の第１０の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ二重鎖が提供される。本発明の第１０の態様は、本発明に従った第１のオリゴヌクレオチド、および第２のオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ二重鎖である。好ましい実施形態では、ＲＮＡ二重鎖の第２のオリゴヌクレオチドもまた、本発明のオリゴヌクレオチドである。第１の態様で、本発明のＲＮＡ複合体に関連して説明される実施形態はまた、第１０の態様のＲＮＡ二重鎖に適用可能である。
【０３０３】
好ましくは、本発明のＲＮＡ二重鎖は、１５〜４０個である幾つかの塩基対を含み、好ましい実施形態では、幾つかの塩基対は、１８個の塩基対、１９個の塩基対、２０個の塩基対、２１個の塩基対、２２個の塩基対、および２３個の塩基対の群から選択される。
【０３０４】
さらに別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、２５〜３０である幾つかの塩基対を含み、より好ましくは２６〜２８個、および最も好ましくは２７個の塩基対を含む。かかるＲＮＡ二重鎖は、ダイサー基質ＲＮＡと称されてもよい。 
【０３０５】
好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡ二重鎖は、オーバーハングを含む。別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、２つのオーバーハングを含む。さらに別の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、３’−オーバーハングを含む。さらに別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、３’−オーバーハングを含む。好ましくは、オーバーハングの長さは、１〜８ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、オーバーハングの長さは、１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、および３ヌクレオチド長を含むオーバーハングからなる群から選択される。
別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、少なくとも１つの平滑末端を含む。別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、両末端において平滑末端である。
【０３０６】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、１８〜２２塩基対の２本鎖領域を含み、ここで第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、各々１〜３ヌクレオチドの３’−オーバーハングを含む。かかるＲＮＡ二重鎖は、標準ｓｉＲＮＡ（短干渉ＲＮＡ）として認識されるであろう。
【０３０７】
一実施形態では、ＲＮＡ二重鎖１本の鎖は、第１の態様で詳述される通り、不連続である。
【０３０８】
一実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ二重鎖の第１および第２のオリゴヌクレオチドと相補的な標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができ、すなわちＲＮＡ二重鎖は、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはプレマイクロＲＮＡとして機能する。
【０３０９】
一実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを含む同一のＲＮＡ二重鎖と比較して、低減されたオフターゲット効果を誘導しながら、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができる。
【０３１０】
別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーが特異的に、ｓｉＲＮＡ二重鎖の誘導体（アンチセンス）鎖の５〜１０位に位置する場合（位置は、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えられる）、低減されたオフターゲット効果を誘導しながら、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができる。
【０３１１】
別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーが特異的に、ｓｉＲＮＡ二重鎖の誘導体（アンチセンス）鎖の６〜８位に位置する場合、低減されたオフターゲット効果を誘導しながら、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができる。別の実施形態では、ガイド鎖において１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含むＲＮＡ二重鎖は、マイクロＲＮＡタイプの効果をガイドするガイド鎖の低減された能力を有する。
【０３１２】
一実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを含む同一のＲＮＡ二重鎖と比較して、増加された効力を有する、ＲＮＡ標的化、例えば、遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡ干渉を媒介することができる。
【０３１３】
一実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを含む同一のＲＮＡ二重鎖と比較して、持続的な効力を有する、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができる。
【０３１４】
一実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを含む同一のＲＮＡ二重鎖と比較して、ＲＮＡ二重鎖が改善された生体内安定性を有する、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができる。
【０３１５】
さらに別の実施形態では、ＲＮＡ二重鎖は、非環状モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを含む同一のＲＮＡ二重鎖と比較して、ＲＮＡ二重鎖が低減された免疫刺激を有する、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することができる。
【０３１６】
本発明のＲＮＡ複合体は、種々の遺伝子に対して標的化され得る。標的として好適なヒト遺伝子の例としては、とりわけＴＮＦ、ＦＬＴ１、ＶＥＧＦファミリー、ＥＲＢＢファミリー、ＰＤＧＦＲファミリー、ＢＣＲ−ＡＢＬ、およびＭＡＰＫファミリーが挙げられる。標的として好適なヒト遺伝子、およびそれらに対する核酸配列の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３３３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３３９号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３４０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３４１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３５０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３５３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３５６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３５７号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３６０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３６２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３６５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３６６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３６９号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７４号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７７号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３７８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３８０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３８１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３８２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３８３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３８５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５３８６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５０５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５１１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５１５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５１６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５１９号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５２４号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５２６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５２７号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５３２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５３３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５４２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５４８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５５０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５５１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５５４号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５５６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５６０号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５６３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５９７号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５５９９号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６０１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６０３号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６０４号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６０６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６０８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６１１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６１２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６１５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６１８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６２２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６２５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６２７号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６３１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６３５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６４４号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６４９号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６５１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６６２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６７２号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６７６号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６７８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６９５号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６９７号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５６９８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５７０１号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５７０４号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５７０８号、ＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５７０９号、およびＰＣＴ／ＵＳ第０８／５５７１１号に開示される例が挙げられ、全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３１７】
実施例
実施例１
本発明のＲＮＡ複合体の合成
本発明のヒドロキシメチル置換モノマーＲＮＡ複合体の、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成のためのホスホラミダイト形成ブロックの調製手順が報告されている［ｔｈｙｍｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；Ｋ．Ｄ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１４９３、Ｈ．Ｔｈｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９５，５１，１０３８９、Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１９］。
【０３１８】
これらのヒドロキシメチル置換モノマーの、本発明のＲＮＡ複合体への組み込みは、ａ）自動ＲＮＡ合成器上のＲＮＡ合成、ｂ）ＲＮＡ反応処理、ｃ）ＲＮＡ精製、およびｄ）ＲＮＡ単離のための標準方法に従う［Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１］。これは、ヒドロキシメチル置換ＲＮＡオリゴヌクレオチド（＝ＲＮＡ鎖）およびＲＮＡ複合体が、ＲＮＡ合成のための標準技術を用いて、既知のホスホラミダイト誘導体を用いて合成され得ることを示す。
【０３１９】
ＬＮＡは、１つ以上の２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−結合リボヌクレオチド（ＬＮＡヌクレオチド）を含有するオリゴヌクレオチドである［Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１，７４−８１］。ＬＮＡ修飾ｓｉＲＮＡは、１つ以上のＬＮＡモノマーを含有するｓｉＲＮＡ構造である。市販のＬＮＡホスホラミダイトの使用によって、ＬＮＡヌクレオチドを本発明のＲＮＡ複合体に組み込むために、既知の方法が使用されている［Ｐｆｕｎｄｈｅｌｌｅｒ，Ｓoｒｅｎｓｅｎ，Ｌｏｍｈｏｌｔ，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｋｏｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．”Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４，ｖｏｌ．２８８（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），１２７−１４５．，Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．］。
【０３２０】
ヒドロキシメチル置換ｓｉＲＮＡ（「ヒドロキシメチル置換低分子干渉ＲＮＡ」）は、１個以上のヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含有するｓｉＲＮＡ構造である（ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの構造については、図１を参照されたい）。例示されるモノマーを下に示す。
【０３２１】
【化６】
2015078196.tif 000007
次の実施例は、ヒドロキシメチル置換ＲＮＡ複合体の設計を例示し、本明細書に明確に開示されていない他のＲＮＡ構造の設計に限定していない。故に、例えば、平滑末端ｓｉＲＮＡ二重鎖、本明細書で例示されるｓｉＲＮＡ二重鎖より短鎖のまたは長鎖のｓｉＲＮＡ二重鎖、１本鎖アンチセンスＲＮＡ分子（ＲＮＡ複合体）、ならびにアンチセンス鎖および不連続のパッセンジャー鎖を含むＲＮＡ複合体（「パッセンジャー鎖」もまた「センス鎖」と呼ばれ得る）がある。
【０３２２】
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルのホスホラミダイト誘導体例の調製手順は、実施例１１、特許出願ＰＣＴ／ＵＳ第２００８／０６４４１７号に開示され、該出願内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２３】
実施例２
ＲＮＡ複合体におけるヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換パターン
ヒドロキシメチルヌクレオモノマー（例えば、モノマーＤ）の、ＲＮＡ複合体における特定の位置への組み込みは、遺伝子サイレンシング活性、サイトカイン誘導、鎖活性、「オフターゲット」効果、ＲＮＡ複合体の熱安定性、およびダイサー基質ＲＮＡ複合体の場合、ＲＮＡ複合体のダイサープロセシングに影響を及ぼす。
【０３２４】
ＲＩＳＣ  ＲＮＡ複合体およびダイサーＲＮＡ複合体におけるヒドロキシメチルヌクレオモノマーの例示的置換パターンを下に提供する。ＲＮＡ複合体（２本鎖ＲＮＡ）の各鎖のヌクレオモノマーの数（すなわち、配列非依存性）は、Ｘ’またはＨ’の連鎖によって表わされる。各「Ｘ」は、独立しておよび各発現について、あらゆるヌクレオシド（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、またはそれらのあらゆる類似体もしくは誘導体）であり得る一方で、各「Ｈ」は、独立しておよび各発現について、非ヌクレオチドヒドロキシメチルヌクレオモノマー（例えば、あらゆる核酸塩基を有するモノマーＤ）であり得る。各ケースにおいて、各鎖の間の塩基対に起因して、センス鎖およびアンチセンス鎖は、アニールされ２本鎖領域を形成する。これらの図表の目的は、ＲＮＡ複合体の、配列非依存性のヒドロキシメチルヌクレオモノマーでの置換パターンを示すことである。
【０３２５】
ＲＩＳＣ  ＲＮＡ複合体のヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換パターン
下の各ＲＮＡ複合体について、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々２１ヌクレオモノマー長であり（センス鎖が２２ヌクレオモノマー長である、モチーフ番号Ｐ−１およびＰ−１／Ｇ７を除く）、ヌクレオシドまたは非ヌクレオチドヒドロキシメチルヌクレオモノマーのいずれかを含む（例えば、モノマーＤ）。各複合体は、「モチーフ番号」で識別され、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーまたは「Ｈ」の位置が提供される。各鎖における各「Ｈ」の位置は、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーが位置する鎖の５’末端から数えることによって決定される。本明細書に開示されるあらゆるＲＮＡ複合体について、−１位（マイナス１）または１位は、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーが、その鎖の最も３’側のヌクレオモノマー（またはその鎖の３’末端における最後のヌクレオモノマー）であることを示す。下のＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体について、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの２１および２２位は、ヌクレオモノマーが、鎖の鎖５’末端から数えて最後の２つの位置を占めることを示す。
【０３２６】
【化７】
2015078196.tif 000008
【０３２７】
【化８】
2015078196.tif 000009
【０３２８】
【化９】
2015078196.tif 000010
ダイサーＲＮＡ複合体のヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換パターン
下の各ＲＮＡ複合体について、センスは、２５ヌクレオモノマー長であり、アンチセンス鎖は、２７ヌクレオモノマー長であり（２５／２７ｍｅｒ）、ヌクレオシドまたは非ヌクレオチドヒドロキシメチルヌクレオモノマーのいずれかを含む（例えば、モノマーＤ）。各複合体は、「モチーフ番号」で識別され、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーまたは「Ｈ」の位置が提供される。各鎖における各「Ｈ」の位置は、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーが位置する鎖の５’末端から数えることによって決定される。
【０３２９】
モチーフ１０を有するＲＮＡ複合体は、１つの平滑末端および２５塩基対の二重鎖領域を有し、このうち２個の非ヌクレオチドヒドロキシメチルヌクレオモノマーは、アンチセンス鎖の５’末端に（またはアンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の２６および２７位において；ヒドロキシメチルヌクレオモノマーは、鎖５’末端から数えて鎖の最後の２つの位置を占める）結合され、１個の非ヌクレオチドヒドロキシメチルヌクレオモノマーは、センス鎖の３’末端に（またはセンス鎖の５’末端から数えてセンス鎖の２５位において；ヒドロキシメチルヌクレオモノマーは、鎖５’末端から数えてその鎖の最後の位置を占める）結合される。
【０３３０】
【化１０】
2015078196.tif 000011
【０３３１】
【化１１】
2015078196.tif 000012
実施例３
ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体における
ヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換の位置特異的効果
上の実施例に表わされる置換パターン（モチーフ）を、異なる配列特異的ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体に適用した。これらのＲＮＡ複合体を下の表１〜７に提供する。下の表の配列におけるヒドロキシメチル置換モノマーは、「ｕｎａＨ」として識別され、ここでＨは、核酸塩基に対する一文字のコードである（例えば、「ｕｎａＣ」は、シトシンがヒドロキシメチル置換モノマーを含むことを示す）。
【０３３２】
【表１】
2015078196.tif 000013
【０３３３】
【表２】
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【０３３４】
【表３】
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【０３３５】
【表４】
2015078196.tif 000016
【０３３６】
【表５】
2015078196.tif 000017
【０３３７】
【表６】
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【０３３８】
【表７】
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ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性
ヒドロキシメチルモノマーを含有するＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体（例えば、モノマーＤ）の遺伝子サイレンシング活性（または「ノックダウン活性」）を試験した。
【０３３９】
手短に述べると、ＨｅＬａ細胞中のトランスフェクションについて、マルチウェルプレートを、１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中の約５，０００個のＨｅＬａ細胞／ウェルで播種し、３７oＣ／５％ＣＯ２で一晩培養した。トランスフェクションの直前に、ＨｅＬａ細胞媒体を無血清ＤＭＥＭに交換した。標的遺伝子の約１，０００個の塩基対の挿入、およびＲＮＡ複合体（ＭＡＰＫ１４ＲＮＡ複合体を２．５ｎＭで検定したことを除いて、上で特定された全てのＲＮＡ複合体について、２５ｎＭ、２．５ｎＭ、および０．２５ｎ）を含有する、無血清ＤＭＥＭに希釈されたｐｓｉＣＨＥＣ（商標）−２ベクターを、製造業者の指示に従って、希釈Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（ＬＦ２Ｋ）トランスフェクション試薬と混合し、次いで室温で２０分間培養した。例示的トランスフェクション混合物調製は、９３μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ、３μＬのＲＮＡ複合体、標的を含有する４μＬのｐｓｉＣＨＥＣ（商標）−２プラスミド、および１００・μＬの希釈ＬＦ２Ｋ（すなわち、９８．６μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと共に１．４・μＬのＬＦ２Ｋ）を含む。ＬＦ２Ｋ／ｐｓｉＣＨＥＣ（商標）−２−［標的遺伝子挿入］をＲＮＡ複合体溶液とともに、ＨｅＬａ細胞に添加し、次いで３７℃、５％ＣＯ２で４．５時間培養した。共トランスフェクションのトランスフェクション後（約２２時間）、細胞をトリプシン処理し、１ｍＬ当たり１０５細胞の濃度で１０％ＦＢＳを含有する抗生物質のないＤＭＥＭに懸濁した。
【０３４０】
ＨｅＬａ細胞をＲＮＡ複合体でトランスフェクトし、ｐｓｉＣＨＥＣ（商標）−２ベクターを、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼレポーター活性について、最初にＤｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を１０分間振とうしながら添加し、次いで発光シグナルをＶＩＣＴＯＲ３（商標）１４２０Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ）上で定量化することによって検定した。ホタル発光を測定した後、ホタル反応を停止処理すると同時にウミシイタケルシフェラーゼ反応を開始するために、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を１０分間振とうしながら添加し、次いでそれをＶＩＣＴＯＲ３（商標）１４２０Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で定量化した。各ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体についての遺伝子サイレンシング活性を下の表に示す。全ての試料を、同一実験で実験されたそれぞれのｄｓＲＮＡ  ＱＮｅｇ（ＱＩＡＧＥＮ）陰性対照試料に正規化した。つまり、Ｑｎｅｇ値を１００％活性（すなわち、ノックダウンなし）として設定し、９５％信頼区間（ＣＩ）を設けた。
【０３４１】
手短に述べると、ＨｅｐＧ２細胞（ＡｐｏＢ３４１０ＲＮＡ複合体）中のトランスフェクションについて、マルチウェルプレートに、１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中の約１５，０００個の細胞／ウェルで播種した。トランスフェクション混合物は、ＯｐｔｉＭＥＭ中のＲＮＡｉＭＡＸ（０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、または５ｎＭ  ＲＮＡ濃度）と組み合わされたＲＮＡ複合体（ＡｐｏＢ３４１０ＲＮＡ複合体）を含んだ。トランスフェクション混合物を、プレートされたＨｅｐＧ２細胞（総容量７５μＬ）で２４時間培養した。ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞から採取し、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＡｐｏＢおよび陰性対照ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡについて、発現のレベルを決定した。下の表は、Ｑｎｅｇ陰性対照ｓｉＲＮＡと比較した、トランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞中のＡｐｏＢメッセージのノックダウンの割合を要約する。
【０３４２】
下の表８〜１４について、割合が低いほど、標的ＲＮＡのノックダウンが大きいことを示す（１００％はノックダウンなしを示す）。下の表１４について（ＡｐｏＢ３４１０ＲＮＡ複合体）、割合が高いほど、ノックダウンが大きいことを示す（０％はノックダウンなしを示す）。
【０３４３】
【表８】
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【０３４４】
【表９】
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【０３４５】
【表１０】
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【０３４６】
【表１１】
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【０３４７】
【表１２】
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【０３４８】
【表１３】
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【０３４９】
【表１４】
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上の表８〜１４に示されるＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体についての遺伝子サイレンシング活性は、異なる配列および遺伝子標的を有する多数のｓｉＲＮＡに適用された、モチーフ２２、３１、３２、およびＧ７のヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換パターンが、同一の配列を有するがヒドロキシメチルヌクレオモノマーモノマーを含まないＲＮＡ複合体と比較して、概してそのＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性を維持および／または改善したことを示す。さらに、ＩＣＡＭ−１遺伝子に向けられたＲＮＡ複合体におけるモチーフＰ−１、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３のヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換パターンは、同一の配列を有するがヒドロキシメチルヌクレオモノマーモノマーを含まないＲＮＡ複合体と比較して、概してそのＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性を維持および／または改善した。
【０３５０】
ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体の鎖特異的活性
ヒドロキシメチルモノマー（例えば、モノマーＤ）を含有するＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体の鎖特異的サイレシング活性（または「ノックダウン活性」）を試験した。
【０３５１】
ＳＯＳ１、およびＩＣＡＭ−１特異的ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体を、それらの対応する「逆方向」ｐｓｉＣＨＥＣ（商標）−２ベクタープラスミドに対して試験した（すなわち、プラスミド発現ＲＮＡ、これは、アンチセンス鎖の代わりにセンス鎖と相補的であり、故にＲＮＡ複合体の各鎖の役割は逆になる）。「逆方向」プラスミドの場合において、「センス」鎖は、ＲＩＳＣベースの遺伝子サイレンシング活性のためのガイド鎖として作用し、「アンチセンス」鎖パッセンジャー鎖として作用する。明確さを目的として、「順方向」ｐｓｉＣＨＥＣ（商標）−２ベクタープラスミドについては、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣベースの遺伝子サイレンシング活性のためのガイド鎖として作用し、センス鎖は、パッセンジャー鎖として作用する。「順方向」および「逆方向」ベクタープラスミドの両方に対するＲＮＡ複合体のサイレシング活性を比較することによって、ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびセンス鎖のサイレシング活性が決定され得る。
【０３５２】
この例のために、「順方向」プラスミドに対するＩＣＡＭ−１ＲＮＡ複合体のガイド鎖（ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖）のサイレシング活性を表１３に示し、「逆方向」プラスミドに対するＩＣＡＭ−１ＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖（ＲＮＡのセンス鎖複合体）のサイレシング活性と比較した（表１５を参照）。ＳＯＳ１特異的ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体について、「順方向」プラスミドに対するガイド鎖のサイレシング活性を表１１に示し、表１６に示すように、パッセンジャー鎖（「逆方向プラスミド」）のサイレシング活性と比較した。
【０３５３】
【表１５】
2015078196.tif 000027
表１３（「逆方向」プラスミドに対するＩＣＡＭ−１ＲＮＡ複合体）および表１５（「順方向」プラスミドに対するＩＣＡＭ−１ＲＮＡ複合体）の結果を比較することによって、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーの、鎖特異的ＲＮＡｉ活性に及ぼす位置特異的効果を観察する。例えば、対逆方向プラスミド実験（表１５、対５７％遺伝子サイレンシング活性でそれぞれ７９％、８６％、９９％、および９１％）におけるＩＣＡＭ１：１３８３−非修飾（２５ｎＭ  ＲＮＡで）での、ＲＩＳＣ長ＩＣＡＭ１：１３８３ＲＮＡ複合体のモチーフ（Ｐ−１）、（Ｐ１）、（Ｐ２）、および（Ｐ３）の相対的サイレシング活性を、順方向プラスミド実験（表１３、対８７％遺伝子サイレンシング活性でそれぞれ５３％、５５％、６０％、および８１％）における同一のモチーフと比較する。また、順方向プラスミド実験（表１３、それぞれ１０５％対８７％）における対ＩＣＡＭ１：１３８３−非修飾（２５ｎＭ  ＲＮＡで）での、ＲＩＳＣ長ＩＣＡＭ１：１３８３ＲＮＡ複合体のモチーフ（Ｇ２）の相対的サイレシング活性を、逆方向プラスミド実験（表１５、対５７％遺伝子サイレンシング活性でそれぞれ６１％）における同一のモチーフと比較する。各例において、ガイド鎖として機能するＲＮＡ複合体の鎖は、その鎖の５’末端から１、２、２、および３位におけるヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの組み込み後、標的に対して低減されたＲＮＡｉ活性を有するか、ＲＮＡｉ活性を有さない。
【０３５４】
【表１６】
2015078196.tif 000028
表１１（「順方向」プラスミドに対するＳＯＳ１：３６４ＲＮＡ複合体）および表１６（「逆方向」プラスミドに対するＳＯＳ１：３６４ＲＮＡ複合体）の結果を比較することによって、ヒドロキシメチルヌクレオモノマーの、鎖特異的ＲＮＡｉ活性に及ぼす位置特異的効果を観察する。例えば、逆方向プラスミド実験（表１６、対５．５％遺伝子サイレンシング活性でそれぞれ４５．８％および１０．５％）における対ＳＯＳ１：３６４−非修飾（２．５ｎＭ  ＲＮＡで）での、ＲＩＳＣ長ＳＯＳ１：３６４ＲＮＡ複合体のモチーフ（２４）および（２７）の相対的サイレシング活性を、順方向プラスミド実験（表１１、対５９．１％遺伝子サイレンシング活性でそれぞれ２７％および８６．５％）における同一のモチーフ（対非修飾で２４および２７）と比較する。各例において、ガイド鎖として機能するＲＮＡ複合体の鎖は、その鎖の５’末端から２位における、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの組み込み後、標的に対して低減されたＲＮＡｉ活性を有するか、ＲＮＡｉ活性を有さない。
【０３５５】
したがって、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを、
ヒドロキシメチルヌクレオモノマー（例えば、センス鎖またはパッセンジャー鎖）を含有する鎖の５’末端から数えて、鎖の−１、１、２、および／または３位（特に２位）またはその周辺に配置することは、ＲＮＡ複合体におけるその鎖のサイレシング活性を低減または除去する（すなわち、パッセンジャー鎖または非標的鎖の望ましくないＲＮＡｉ活性に起因して生じ得る、あらゆる潜在的な「オフターゲット」効果を低減または除去する）。
【０３５６】
さらに、結果として、ＲＮＡ複合体の１本鎖の−１、１、２、および／または３位のうちの１つ以上の位置に１つ以上のヒドロキシメチルヌクレオモノマーを導入することがその鎖のＲＮＡｉ活性を低減または除去する一方で、もう１本の鎖はＲＮＡｉ活性に対して依然として高い活性を有することが示される。
【０３５７】
ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体の「オフターゲット」効果
ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を妨害するために使用される有力な技術であるが、この方法の望ましくない結果は、それが非標的遺伝子の発現にも影響を及ぼし得ることである（いわゆる「オフターゲット」効果）。
【０３５８】
ヒドロキシメチルヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体および含まないＲＮＡ複合体の「オフターゲット」効果の程度を試験した。この研究において、ＡｐｏＢ：３４１０ＲＮＡ複合体を、パッセンジャー鎖の「オフターゲット」活性を決定するために使用した。非修飾ＡｐｏＢ：３４１０ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体を、モチーフ（Ｐ−１／Ｇ７）を有する同一の配列と比較した。 
【０３５９】
手短に述べると、本発明の前述のプロトコルおよび方法に従って、ＨｅｐＧ２細胞を培養した。製造業者のプロトコルに従って、ＧＥＮＥＣＨＩＰ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０マイクロアレイ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）を用いて、マイクロアレイ分析を行った。２倍以上の変化（上昇または低下）が遺伝子発現レベルで観察された場合、「オフターゲット」遺伝子効果をカウントした。
【０３６０】
結果として、「オフターゲット」効果の１０倍を超える低減が示された。非修飾ＡｐｏＢ：３４１０ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体について、３８９個の遺伝子が２倍以上の発現変化レベルを有した一方で、モチーフ（Ｐ−１／Ｇ７）を有するＡｐｏＢ：３４１０ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体については、３５個の遺伝子のみが２倍以上の発現変化レベルを有した。両方の場合においても、ＡｐｏＢ標的メッセージは、約９５％低減された。
【０３６１】
ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体の体内での遺伝子サイレンシング
ヒドロキシメチルヌクレオモノマーを含むＲＮＡ複合体および含まないＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性を体内で試験した。この研究においては、ＡｐｏＢが標的であった。ＲＮＡ複合体を、それぞれ５０：２８：２０：２のモル％比で、ＤＩＬＡ２アミノ酸化合物（または（Ｅ）−アミノ（（４−（ヘキサデシルアミノ）−３−（オクタデカ−９−エンアミド）−４−オキソブチル）アミノ）メタンイミニウム）、ＣＨＥＭＳ（ヘミコハク酸コレステロール）、およびＤＭＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ（２ｋＤａ  ＰＥＧを用いた１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）を含有する製剤として、それぞれ、０．５ｍｇ／ｋｇ（１日当たり３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、１ｍｇ／ｋｇ（または１日当たり６０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、および２ｍｇ／ｋｇ（または１日当たり１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに静脈内投与した。１群当たり５匹のマウスを使用し、２００μＬ／用量の容量で各グループに投薬した。
【０３６２】
この研究において、前述のＲＮＡ複合体ＡｐｏＢ：１０１６９およびＡｐｏＢ：１０１６９（３１）、および下のＲＮＡ複合体を投与した。下の配列内のヌクレオチドの前に来る「ｍ」は、そのヌクレオシドに対する２’−Ｏ−メチル修飾の存在を示す。
【０３６３】
ＤＸ４２２７（ＡｐｏＢ）：
５’−ＧＧＡＡＵＣｍＵｍＵＡｍＵＡｍＵｍＵｍＵＧＡＵＣｍＣＡｓＡ−３’
２１ｍｅｒセンス鎖（配列番号１５７）
５’−ｍＵｍＵＧＧＡＵｍＣＡＡＡｍＵＡｍＵＡＡＧＡｍＵＵＣｍＣｓｍＣｓＵ−３’
２１ｍｅｒアンチセンス鎖（配列番号１５８）
ＤＸ３８３８（Ｇ１４９８；陰性対照ＲＮＡ複合体）：
５’−ｍＧｍＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＡＣＡＡｄＴｄＧ
２５ｍｅｒセンス鎖（配列番号１５９）
５’−ｍＣｍＡＵＵＧＵＣＵＣＣＧＡＡＧＡＡＡＵＡＡＧＡＵＣＣＵＵ
２７ｍｅｒアンチセンス鎖（配列番号１６０）
マウスの各群について、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの低下の割合および血清コレステロールレベルにおける対応する低下の割合（下の表１６におけるＲＮＡ複合体識別子の各行は、５匹のマウスの群についてのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルおよび血清コレステロールレベルの低下の平均割合を表す）を下の表に示す。ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡにおける低下の割合は、ＰＢＳのみの対照との比較による。
【０３６４】
【表１７】
2015078196.tif 000029
表１６のデータは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーが位置する（または１９個の塩基対二重鎖領域ならびにセンス鎖およびアンチセンス鎖の各３’末端に結合された２個の非ヌクレオチドヒドロキシメチルヌクレオモノマーを有する平滑末端構造）鎖の５’末端から数えてセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々の２０および２１位においてヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー（モノマーＤ）を含むＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体が、ＰＢＳのみと比較して、体内でのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを９５％低下させることを示す。代わりにＴＴを含む３’末端オーバーハングを含む同一のＲＮＡ複合体は、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを８０％低下させた。さらに、マウスにおいて、体重の有意な変化は示されず、また特記すべき毒性は観察されなかったことから、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー（モノマーＤ）を含むＲＮＡ複合体が、安全かつ効果的な治療薬として使用され得ることが示される。要約すると、結果として、ＲＮＡ複合体における非環状ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの組み込みが、ＲＮＡ複合体の体内での遺伝子サイレンシング活性を亢進させることが示される。
【０３６５】
実施例４
ダイサー長ＲＮＡ複合体における、
ヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換の位置特異的効果
上の実施例２に表される置換パターン（モチーフ）を、異なる配列特異的ダイサー長ＲＮＡ複合体に適用した。これらのＲＮＡ複合体を下の表１８〜２２に提供する。下の表の配列におけるヒドロキシメチル置換モノマーは、「ｕｎａＨ」として識別され、ここでＨは、核酸塩基に対する一文字のコードである（例えば、「ｕｎａＣ」は、シトシンがヒドロキシメチル置換モノマーを含むことを示す）。
【０３６６】
【表１８】
2015078196.tif 000030
【０３６７】
【表１９】
2015078196.tif 000031
【０３６８】
【表２０】
2015078196.tif 000032
【０３６９】
【表２１】
2015078196.tif 000033
【０３７０】
【表２２】
2015078196.tif 000034
ダイサー長ＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性
ヒドロキシメチルモノマーを含有するダイサー長ＲＮＡ複合体（例えば、モノマーＤ）の遺伝子サイレンシング活性（または「ノックダウン活性」）を試験した。
【０３７１】
本発明で前述される通り、ＨｅＬａ細胞中でトランスフェクションを行い、本発明で前述される通り、デュアルルシフェラーゼレポーター活性を、ダイサー長ＲＮＡ複合体の各々についての遺伝子サイレンシング活性を決定するために使用した。ダイサー長ＲＮＡ複合体についての遺伝子サイレンシング活性を下の表２２〜２５に示す。全ての試料を、同一実験で実験されたそれぞれのｄｓＲＮＡ  Ｑｎｅｇ（ＱＩＡＧＥＮ）陰性対照試料に正規化した。つまり、Ｑｎｅｇ値を１００％活性（すなわち、ノックダウンなし）として設定し、９５％信頼区間（ＣＩ）を設けた。
【０３７２】
【表２３】
2015078196.tif 000035
【０３７３】
【表２４】
2015078196.tif 000036
【０３７４】
【表２５】
2015078196.tif 000037
【０３７５】
【表２６】
2015078196.tif 000038
【０３７６】
【表２７】
2015078196.tif 000039
上の表２２〜２５に示される、ＲＩＳＣ長ＲＮＡ複合体についての遺伝子サイレンシング活性は、異なる配列および遺伝子標的を有する多数のｓｉＲＮＡに適用された、モチーフ３、７、９、および１０のヒドロキシメチルヌクレオモノマー置換パターンが、同一の配列を有するがヒドロキシメチルヌクレオモノマーモノマーを含まないＲＮＡ複合体と比較して、概してそのＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング活性を維持および／または改善したことを示す。
【０３７７】
ダイサー長ＲＮＡ複合体のサイトカイン誘導
ヒドロキシメチルモノマー（例えば、モノマーＤ）を含有するダイサー長ＲＮＡ複合体のサイトカイン誘導を試験した。
【０３７８】
手短に述べると、ヒト抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって、保存されたヒト血液から単離した。細胞を、１０％ＦＢＳ、１Ｘ  ＮＥＡＡ、および１Ｘ  Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＩＭＤＭ媒体中で培養した。ＰＢＭＣを、１００μＬの増殖培地中で、１ウェル当たり３２０，０００個の細胞でプレートした。ＰＢＭＣを、１００ｎＭの上の表のＲＮＡ複合体のうちの１つおよび０．２５μＬのＲＮＡｉＭＡＸのＯｐｔｉＭＥＭ中混合物（最終トランスフェクション媒体は約１２０μＬであった）で４時間トランスフェクトした。各トランスフェクションを３回行なった。４時間のトランスフェクション後、増殖培地を各ウェルに、２５０μＬの最終容量になるまで添加した。トランスフェクトされた細胞を２４時間培養し、その後、上清を収集した。細胞および細胞破片を遠心分離によって除去し、浄化された上清を−２０℃で凍結し、その後、サイトカイン誘導について検定した。収集された上清中のヒトＩＦＮ−αのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した（ＰＢＬ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌヒトＩＦＮアルファキット、カタログ番号４１００−２、製造業者のプロトコルに従った）。一般的な免疫応答を示すために、ヒトＩＦＮ−αのレベルを使用した。ダイサー長ＲＮＡ複合体でトランスフェクトされたヒトＰＢＭＣ中のヒトＩＦＮ−αレベルを下の表２８および２９に示す。
【０３７９】
【表２８】
2015078196.tif 000040
【０３８０】
【表２９】
2015078196.tif 000041
５個の異なる遺伝子を標的とする５個の異なるダイサー長ＲＮＡ複合体に適用されたモチーフ２、３、４、８、および１０は、ヒドロキシメチル置換モノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、サイトカイン誘導を低減および／または除去した。
【０３８１】
ＥＬＩＳＡ検定の結果として、任意のダイサー長ＲＮＡ複合体の両ダイサー切断部位（例えば、修飾モチーフ２）の側面に位置するヒドロキシメチル置換モノマーは、ヒトＰＢＭＣ中のヒトＩＦＮ−α産生を誘導しないことが示される（ＲＮＡ複合体の非修飾形態と比較して）。ダイサー長ＲＮＡ複合体のセンス鎖の（センス鎖の５’末端から数えて）２１および２２位、センス鎖の２および６位における、ヒドロキシメチル置換モノマーの導入は、ヒドロキシメチル置換モノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、ヒトＩＦＮ−α発現を排除または低減する。ダイサー長ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖の６および７またはアンチセンス鎖の８位における、ヒドロキシメチル置換モノマーの導入は、ヒドロキシメチル置換モノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、ヒトＩＦＮ−α発現を排除または低減する。ダイサー長ＲＮＡ複合体のセンス鎖の２５位およびアンチセンス鎖の２６および２７位における、ヒドロキシメチル置換モノマーの導入は、ヒドロキシメチル置換モノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、ヒトＩＦＮ−α発現を排除または低減する。また、ダイサー長ＲＮＡ複合体のセンス鎖の２１および２２位およびアンチセンス鎖の６および７位における、ヒドロキシメチル置換モノマーの導入は、ヒドロキシメチル置換モノマーを含まない同一のＲＮＡ複合体と比較して、ヒトＩＦＮ−α発現を排除または低減する。
【０３８２】
サイトカイン応答およびヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの、ＲＮＡ複合体を「マスク」する能力、またはサイトカイン誘導を排除もしくは低減する能力をさらに調査するために、ＴＬＲ３（トール様受容体３）、ＭＤＡ５（ＩＦＩＨ１）、およびＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子１）活性を試験した。
【０３８３】
ＴＬＲ３は、自然免疫系のパターン認識受容体のトール様受容体ファミリーの一員である。それは、２本鎖ＲＮＡを、例えばＲＮＡウイルスから認識する。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡを認識し、ＮＦ−κＢを活性化して、タイプＩインターフェロン（サイトカイン）の産生を増加させ、次いでその後、他の細胞にシグナル伝達してそれらの抗ウイルス防御を増加させる。
【０３８４】
ＭＤＡ−５およびＲＩＧ−Ｉもまた、２本鎖ＲＮＡを認識し、ウイルス感染、例えばＲＮＡウイルスに対する「センサー」として機能する。
【０３８５】
手短に述べると、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、２％血清および増殖サプリメント（ＥＧＭ−２ＢＵＬＬＥＴＫＩＴ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＥＧＭ−２増殖培地中の４８ウェルプレートに、１ウェル当たり４５，０００個の細胞でプレートした。細胞を約２４時間培養した後、ＨＵＶＥＣを、５０ｎＭのＲＮＡ複合体（ＦｌｕＡ１：２２４２  ２５／２７、Ｇ３７８９Ｄ−ｓｉＲＮＡまたはＦｌｕＡ１：２２４２  ２５／２７−１０）のうちの１つおよびＲＮＡｉＭＡＸ（陽性対照Ｐｏｌｙ  Ｉ：ＣまたはＲＮＡｉＭＡＸのみ（ＲＮＡなし））の混合物で４時間トランスフェクトした。各トランスフェクションを３回行った。４時間のトランスフェクション後、２００μＬのＥＧＭ−２増殖培地を各ウェルに添加した。トランスフェクトされた細胞を２４時間培養し、その後、溶解物および上清を収集した。製造業者のプロトコル（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ）に従って、ＴＬＲ３、ＭＤＡ−５、およびＲＩＧ−ＩのレベルをＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ検定によって測定した。ＴＬＲ３、ＭＤＡ−５、およびＲＩＧ−Ｉ発現のレベルを下の表３０に示す。全てのレベルは、ＰＰＩＡ発現レベルに正規化されている。
【０３８６】
【表３０】
2015078196.tif 000042
上の表３０に示される発現レベルは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーを含まないダイサー長ＲＮＡ複合体（ＦｌｕＡ１：２２４２  ２５／２７、Ｇ３７８９非修飾）が、ＴＬＲ３、ＭＤＡ−５、およびＲＩＧ−Ｉ発現レベルを、ＲＮＡｉＭＡＸのみでのそれらのレベルを上回って誘導し、陽性対照Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに匹敵することを示す。対照的に、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマー（モチーフ１０）を有する同一のダイサー長ＲＮＡ複合体は、ＴＬＲ３、ＭＤＡ−５、またはＲＩＧ−Ｉ発現レベルを誘導しない。故に、ヒドロキシメチル置換ヌクレオモノマーの戦略的配置は、ダイサー長ＲＮＡ複合体を、２本鎖ＲＮＡに対する免疫応答の活性をサポートする細胞受容体から「マスク」することができる。
【０３８７】
ダイサー酵素によるダイサー長ＲＮＡ複合体のプロセシング
ダイサー酵素による、ヒドロキシメチル置換モノマーを含むダイサー長ＲＮＡ複合体のプロセシングを試験した。
【０３８８】
非修飾、または修飾モチーフ２、３、もしくは４（修飾モチーフの説明については、実施例２を参照されたい）を含有する、ダイサー長ＲＮＡ複合体Ｇ３７８９、Ｇ８２８２、Ｇ１４９８、ＳＯＳ１、およびＡｐｏＢを、ダイサー酵素を用いて体外で培養し、ＨＰＬＣによって生成し、ダイサー酵素によるプロセシングの量を決定するために、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０３８９】
手短に述べると、非修飾および修飾ＲＮＡ複合体を、センス鎖およびアンチセンス鎖の適切な比率を緩衝剤中で混合することによって４０μＭで調製し、９５℃に１分間加熱し、次いで再び室温に徐々に冷却させた。ＲＮＡ複合体を、３７℃で２４時間ダイサー酵素に供した。２４時間の培養期間後、試料を、６００ｍＬの水を用いて浮遊透析膜で１時間脱塩した。次いで試料をＨＰＬＣバイアルに充填し、ＬＣ−ＭＳ上に注入した。ＨＰＬＣパラメータは次の通りであった：０．２ｍＬ／分の流速、ＸＴｅｒｒａ（登録商標）カラムＭＳ  Ｃ１８  ２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ、カラム温度６５℃、移動相Ａ：１００ｍＭ  ＨＦＩＰ、７ｍＭ  ＴＥＡ、ｐＨ８．１、移動相Ｂ：１００％メタノール、プレカラム容量を含まず４０分にわたって２〜１４％の勾配、注入量は１５μＬであった。ＬＣ−ＭＳパラメータは次の通りであった：負イオンモード、キャピラリー３．０ｋＶ、コーン４０Ｖ、脱溶媒和温度３００℃、脱溶媒和流速（Ｎ２）６００Ｌ／時間、源温度９０℃、１．５秒にわたって３００〜１９５０ｍ／ｚの取り込み。質量スペクトルデータを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ（登録商標））によって作成されたＭａｘＥｎｔ（登録商標）（最大エントロピー）ソフトウェアを用いてデコンボリューション処理した。
【０３９０】
５個の異なる遺伝子を標的とする、５個の異なるダイサー長ＲＮＡ複合体に適用されるモチーフ２、３、および４は、ダイサー酵素によるプロセシングを妨げる。
【０３９１】
データは、ヒドロキシメチル置換モノマーが、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方内、または１本の鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）内にあるかどうかに関わらず、ダイサー酵素が、ダイサー切断部位の側面に位置するヒドロキシメチル置換モノマーを有するダイサー長ＲＮＡ複合体をプロセスしなかったことを示す。非修飾ＲＮＡ複合体は、ダイサー酵素によって切断された。試験された、ヒドロキシメチル置換モノマーを有する全ての修飾ダイサー長ＲＮＡ複合体は、遺伝子サイレンシング活性を保持し（上を参照）、ＲＮＡ複合体がダイサー酵素によってプロセスされない場合でも、これらのＲＮＡ複合体が依然としてＲＮＡｉ活性に対して活性であり、標的遺伝子発現を低減させることを示した。
【０３９２】
故に、センス鎖の５’末端から数えて、センス鎖の２１および２２位においてヒドロキシメチル置換モノマーを有するダイサー長ＲＮＡ複合体（モチーフ３）は、ダイサー酵素によってプロセスされない。さらに、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の６および７位においてヒドロキシメチル置換モノマーを含むＲＮＡ複合体（モチーフ４）は、ダイサー酵素ダイサー酵素によってプロセスされない。センス鎖の５’末端から数えて、センス鎖の２１および２２位においてヒドロキシメチル置換モノマーを含み、かつアンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の６および７位においてヒドロキシメチル置換モノマーを含むＲＮＡ複合体は、ダイサー酵素によってプロセスされない（モチーフ２）。
【図１】
2015078196.tif 000045
【図２】
2015078196.tif 000046
【図３】
2015078196.tif 000047
【配列表】
2015078196000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月5日(2014.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴマーの製造に用いるためのアミダイトモノマーであって、以下のモノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ
【化１】
2015078196.tif 000048
から選択される構造を有する非環状２’−３’−セコ−モノマーのアミダイト形態を含み、
式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、糖類、およびポリペプチドからなる群から選択され、
前記オリゴマーは、非環状２’−３’−セコ−モノマーおよびリボヌクレオチドモノマーを含み、
塩基は、核酸塩基である、アミダイトモノマー。
【請求項２】
前記アミダイトがホスホラミダイトである、請求項１に記載のアミダイトモノマー。
【請求項３】
前記オリゴマーが１５〜４０個のモノマーを含む、請求項１または２に記載のアミダイトモノマー。
【請求項４】
前記オリゴマーが１〜５個の非環状２’−３’−セコ−モノマーを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項５】
前記オリゴマーがホスホロチオエート結合またはボラノホスフェート結合を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項６】
前記オリゴマーが、該オリゴマーの一部に相補的な標的ヌクレオチド配列のＲＩＳＣ依存性翻訳抑制または分解を媒介することが可能なものである、請求項１〜５のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項７】
前記オリゴマーが、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域、ならびに少なくとも１つのオーバーハングを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項８】
前記オリゴマーが、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域、ならびに少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項９】
前記オリゴマーが、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに１５〜２４個の塩基対を有する２本鎖領域、ならびに１つの平滑末端および１つのオーバーハングを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項１０】
オリゴマーの製造に用いられる際の、請求項１〜９のいずれかに記載のアミダイトモノマー。
【請求項１１】
以下の工程を含む、オリゴマーの製造方法：
以下のモノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ
【化２】
2015078196.tif 000049
から選択される構造を有する非環状２’−３’−セコ−モノマーのアミダイト形態を含むアミダイトモノマーを提供する工程であって、
式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、糖類、およびポリペプチドからなる群から選択され、
前記オリゴマーは、非環状２’−３’−セコ−モノマーおよびリボヌクレオチドモノマーを含み、
塩基は、核酸塩基である、工程；
該アミダイトモノマーを合成支持体にカップリングさせる工程； および
１個以上のさらなるアミダイトモノマーおよび１個以上のリボヌクレオチドアミダイトモノマーを、支持体上のモノマーにカップリングさせることにより、オリゴマーを形成させる工程。
【請求項１２】
前記アミダイトがホスホラミダイトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴマーが１５〜４０個のモノマーを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴマーが１〜５個の非環状２’−３’−セコ−モノマーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴマーがホスホロチオエート結合またはボラノホスフェート結合を含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴマーが、該オリゴマーの一部に相補的な標的ヌクレオチド配列のＲＩＳＣ依存性翻訳抑制または分解を媒介することが可能なものである、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴマーが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーからなる群から選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のいずれかに記載の方法を実行することによって製造されるオリゴマー。
【外国語明細書】
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【配列表】
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