(57)【要約】【課題】食害等を引き起こす害虫に対しても有効であり、害虫防除剤として有用な新たな抵抗性誘導剤、及び当該抵抗性誘導剤を用いた植物の害虫防除方法の提供。【解決手段】ロリオライド、エピロリオライド、又はこれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする、害虫抵抗性誘導剤；チョウ目昆虫又はハダニ類に対する抵抗性を誘導する、前記記載の害虫抵抗性誘導剤；前記いずれか記載の害虫抵抗性誘導剤を、植物体に接触又は吸収させることを特徴とする、植物の害虫防除方法；チョウ目昆虫又はハダニ類を防除する、前記記載の植物の害虫防除方法；並びに、前記植物体が、ナス科植物又はアブラナ科植物である、前記いずれか記載の植物の害虫防除方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロリオライド、エピロリオライド、又はこれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする、害虫抵抗性誘導剤。
【請求項２】
チョウ目昆虫又はハダニ類に対する抵抗性を誘導する、請求項１に記載の害虫抵抗性誘導剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の害虫抵抗性誘導剤を、植物体に接触又は吸収させることを特徴とする、植物の害虫防除方法。
【請求項４】
チョウ目昆虫又はハダニ類を防除する、請求項３に記載の植物の害虫防除方法。
【請求項５】
前記植物体が、ナス科植物又はアブラナ科植物である、請求項３又は４に記載の植物の害虫防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の病虫害抵抗性を増強させる化合物を有効成分として含有する害虫抵抗性誘導剤、及び当該化合物を利用した植物の害虫防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
作物の収量低下を招く病害虫の発生は、農業分野において深刻な問題である。指定有害動植物による被害の半数以上が害虫による被害であり、害虫防除は重要である。作物にかかる害虫の防除方法には様々な技術があるが、主に、殺虫剤等の化学農薬を使用する化学的防除法や、抵抗性品種や天敵を利用する方法等の生物学的防除法が用いられている。中でも、化学農薬は即効性があり、防除効果も高いため、多用されている。しかしながら、化学農薬には、不適切な使用による環境中への残留による生態系への影響や、同一薬剤の連続使用により薬剤抵抗性を持った害虫の出現の問題が懸念されている。また、環境保全や消費者の安全志向の観点からも、化学農薬の使用量の低減が求められている。これらのニーズに呼応して減農薬農業が実施されているが、通常使用量では顕在化しなかった病害虫の発生も問題となっている。
【０００３】
生物学的防除法の場合には、化学農薬によるこれらの問題は生じないが、別の問題がある。例えば、通常の品種にかえて抵抗性品種を栽培した場合には、抵抗性を打破する害虫の出現が問題となっている。このため、近年では抵抗性が崩壊することなく安定的に持続する特性を有する品種が求められている。また、天敵を利用する方法では、十分な効果を示す天敵の常時調達が困難である。
【０００４】
近年、環境保全型病害防除手法として病害抵抗性誘導物質が注目されている。病害抵抗性誘導物質は、化学農薬と異なり、病原体を直接殺すものではなく、植物が本来有する病害抵抗性を誘導・強化することで病害を防除するものである。広範囲な病原体に効果があり、その効果も長期間持続する特徴がある。植物の病害抵抗性の機構は種を超えて保存されていることから抵抗性誘導物質がその生理活性を示す植物種の範囲は広い。
【０００５】
ナス科植物であるトマトやアブラナ科植物であるシロイヌナズナなどを用いた研究により植物の病害抵抗性経路は、生きた植物細胞から栄養を得るウイルスなどの活物寄生性病原体に対して有効なサリチル酸経路と、宿主細胞を殺して栄養にする灰色カビ病菌などの殺生性病原体に対して有効なジャスモン酸・エチレン系との２つに大別できることが示されている（例えば、非特許文献１参照。）。いもち病菌は、両者の中間的な振る舞いを示す半活物寄生性病原体であるが、その抵抗性にはサリチル酸経路が関与する。例えば、現在までに、イネいもち病など一部の病気に対して有効な抵抗性誘導物質が実用化に成功している。
【０００６】
一方で、ロリオライドは、植物や藻類等の光合成を行う多くの生物種に存在しているモノテルペンラクトンである。植物等からメタノールやクロロホルム等の有機溶剤により抽出されたロリオライドは、抗酸化作用（例えば、非特許文献２参照。）や免疫抑制作用（例えば、特許文献１参照。）を有することが知られている。ロリオライドは、その他、β−カロテンの酸化等の各種合成反応によっても合成することができる（非特許文献３及び４、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−１３８１５６号公報
【特許文献２】特開昭５８−１６４５３８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｗａｚｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ−Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２０１２，ｖｏｌ．６（２），ｐ．２２１−２３０．
【非特許文献２】Ｙａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｌｇａｅ，２０１１，ｖｏｌ．２６（２），ｐ．２０１−２０８．
【非特許文献３】Ｇｌｏｒｉａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，ｖｏｌ．４６（４），ｐ．４０１−４０６．
【非特許文献４】Ｋｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍａｋｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２００２，ｖｏｌ．６５（１），ｐ．５７−５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在見つかっている抵抗性誘導物質のほとんどが活物寄生性病原体に効果を示すタイプであり、殺生性病原体や害虫に効果のある物質は全くといってよいほど知られていない。
【００１０】
なお、植物ホルモンのジャスモン酸は、植物の害虫抵抗性のシグナル伝達経路を活性化することから害虫に対する抵抗性誘導物質とみなすことができ、殺生性病原体や害虫への効果が期待できる。しかしながら、ジャスモン酸は、その施用によって生長抑制や分化異常などの農業上好ましくない形質を起こす可能性があることに加えて、製造コストが高いことから、現時点では実用レベルの防除剤候補にはなりえない。
【００１１】
そこで、本発明は、害虫に対して有効であり、害虫防除剤として有用な新たな抵抗性誘導剤、及び当該抵抗性誘導剤を用いた植物の害虫防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、害虫に対する抵抗性を誘導する物質を見出すべく、天然資源に焦点を絞り、病虫害抵抗性が誘発された植物を用いて探索を試みた結果、カロテノイドの一種であるロリオライド及びその異性体であるエピロリオライドが、直接的に殺虫活性を有さないにも関わらず、ナミハダニやハスモンヨトウといった害虫に対する優れた抵抗性能を植物に誘導することを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、ロリオライド、エピロリオライド、又はこれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする、害虫抵抗性誘導剤を提供する。
前記害虫抵抗性誘導剤としては、チョウ目昆虫又はハダニ類に対する抵抗性を誘導するものが好ましい。
本発明は、また、前記害虫抵抗性誘導剤を、植物体に接触又は吸収させることを特徴とする、植物の害虫防除方法を提供する。
前記植物の害虫防除方法においては、防除対象の害虫としては、チョウ目昆虫又はハダニ類が好ましく、防除される植物としては、ナス科植物又はアブラナ科植物が好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤は、植物体の害虫に対する抵抗性を誘起させて害虫防除効果を示す。このため、当該害虫抵抗性誘導剤及びこれを用いた植物の害虫防除方法は、抵抗性系統の出現のおそれが非常に小さく、環境保護の点からも好ましい害虫防除方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、トマト葉におけるナミハダニ産卵数に対するタバコモザイクウイルス感染タバコ葉から調製した粗抽出画分の２４時間処理の効果を示した図である。
【図２】実施例２において、トマト葉におけるナミハダニ産卵数に対する精製したロリオライドの２４時間処理の効果を示した図である。
【図３】実施例３において、トマト葉におけるナミハダニ生存数に対する精製したロリオライドの２４時間処理の効果（ナミハダニ雌成虫の生存率）を示した図である。
【図４】実施例４において、トマト葉におけるナミハダニ産卵数に対する精製したエピロリオライドの２４時間処理の効果を示した図である。
【図５】実施例５において、ロリオライドの殺ナミハダニ活性の有無を示した図である。
【図６】実施例６において、トマト葉におけるハスモンヨトウ生存数に対する精製したロリオライドの２４時間処理の効果（ハスモンヨトウの生存率）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤は、ロリオライド、エピロリオライド、又はこれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする。ロリオライド及びその異性体であるエピロリオライドは、下記式（１）及び（２）でそれぞれ表される化合物である。ロリオライド及びエピロリオライドは、殺虫活性は示さないが、植物の害虫防除活性を高めることができる。
【００１７】
【化１】
2015034152.tif 000002
【００１８】
本発明において用いられるロリオライド及びエピロリオライドは、天然物からの抽出物であってもよい。ロリオライド及びエピロリオライドは、カロテノイドの代謝産物であり、カロテノイド代謝経路を有する植物や藻類に多く含まれる。これらの植物や藻類からの抽出物には、多くの場合、ロリオライドとエピロリオライドは２：１の割合で含有されている。
【００１９】
ロリオライド及びエピロリオライドは、カロテノイド代謝経路を有する植物や藻類のうち、特にガマズミ（Viburnum  dilatatum）、センダン（Melia  azedarach）、トチュウ（Eucommia  ulmoides）、ローズマリー（Rosmarinus  officinalis）、サルビア（Salvia  splendens）、タイワンノイバラ（Rosa taiwanensis）、ドクムギ（Lolium  temulentum）、ツユクサ（Commelina  communis）、ジギタリス (Digitalis sp.)、ケール（Brassica  oleracea  var．  acephala）ヤナギモク（Sargassum  ringgoldianum  ssp.  coreanum）、ヒジキ（Sargassum  fusiforme）、エツキイワノカワ（Peyssonnelia  caulifera）等に多く含まれている。これらの植物や藻類からロリオライド及びエピロリオライドを抽出することができる。また、タバコモザイクウイルスの感染に伴って起こるタバコ（Nicotiana  tabacum）の過敏感反応の過程でロリオライド及びエピロリオライドの内生量は増加するため、過敏感反応が起きたタバコ葉からも、多くのロリオライドとエピロリオライドを得ることができる。
【００２０】
植物等からのロリオライド等の抽出は、有機溶剤を用いて常法により行うことができる（例えば、特許文献１、非特許文献２等参照）。具体的には、例えば、ロリオライド等を含む植物の葉や茎等の生鮮物や乾燥物から、メタノール、エタノール、クロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出する。植物等の乾燥物は、天日乾燥や自然乾燥等の乾燥処理を行ったものであってもよく、液体窒素による急速凍結を行ったものであってもよい。また、有機溶媒を添加する前に、予め細断又は粉砕しておくことも好ましい。得られた抽出物は、減圧蒸留等により濃縮した後、分液ロートを用いて有機溶媒層を分取することにより、ロリオライド等を含む粗抽出物を得ることができる。この粗抽出物は、そのまま、又は必要に応じて濃縮した後、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤の有効成分として使用できる。
【００２１】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤の有効成分としては、前記粗抽出物を、クロマトグラフィー法により精製した精製抽出物を用いることも好ましい。例えば、前記粗抽出物を、順相のシリカゲルクロマトグラフィーにかけてロリオライド等を含む画分を分離してもよい。前記粗抽出物をシリカゲルカラムにアプライし、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で溶出した場合には、ロリオライド等は、酢酸エチルの濃度が容量比で７５〜８５％を占めるヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で溶出される画分に溶出される。そこで、この画分を、そのまま、又は必要に応じて濃縮した後、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤の有効成分として使用できる。また、シリカゲルカラマトグラフィーにより得られたロリオライド等を含む画分を、さらに逆相クロマトグラフィーにかけることにより、ロリオライド及びエピロリオライドをより高純度に精製することができる。
【００２２】
本発明において用いられるロリオライド及びエピロリオライドは、合成品であってもよい。ロリオライド等は、公知の合成方法により合成することができる。例えば、ロリオライド又はエピロリオライドは、クロロホルムに溶解させたルテイン（キサントフィル）とメチレンブルーに対して光酸化反応させることによって合成することができる（非特許文献３参照。）。また、例えば、４−（２−ブテニリデン）−３，５，５−トリメチル−２−シクロヘキセン−１−オンから、オゾン分解し、得られた分解物を還元して２，６，６−トリメチル−４−オキソ−１−シクロヘキセニルアセトアルデヒドを得、これを酸化し、得られた，６，６−トリメチル−４−オキソ−１−シクロヘキセニル酢酸を還元後にラクトン化することにより、ロリオライド及びエピロリオライドが得られる（特許文献２参照。）。
【００２３】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤の有効成分とするロリオライド等は、溶媒和物であってもよく、塩として含有されていてもよい。溶媒和物としては、例えば、水、メタノール 、エタノール、酢酸エチル等の溶媒和物が挙げられる。また、塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩等の金属塩；酢酸塩、アンモニウム塩等の無機塩；ジベンジルアミン塩、グルコサミン塩、エチレンジアミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、テトラメチルアンモニア塩等の有機アミン塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤におけるロリオライド及びエピロリオライドの濃度は、植物体の害虫防除活性を誘起するために充分な濃度であればよく、防除対象である害虫の種類、害虫抵抗性誘導剤が使用（散布）される対象植物の種類、一度の散布時における散布量、散布頻度等を考慮して適宜決定される。なお、ロリオライドとエピロリオライドの害虫防除活性誘起作用はほぼ同等である。このため、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤としては、ロリオライドとエピロリオライドを任意の割合で混合したものであってもよい。例えば、害虫防除効果と一度の散布量との兼ね合いから、植物体への施用（散布）時における本発明に係る害虫抵抗性誘導剤中のロリオライドとエピロリオライドの合計濃度は、１０μＭ（ｍｏｌ／Ｌ）以上が好ましく、１００μＭ以上がより好ましく、３００μＭ以上がさらに好ましい。ロリオライド及びエピロリオライドの合計濃度が、１０μＭ未満のときには、害虫防除効果が十分に得られないおそれがある。一方で、ロリオライド及びエピロリオライドは光合成を行う生物種のほとんど全てにおいて生産される物質であり、多くの食品に含まれていることから、環境や人体に与える影響は小さいと推察される。このため、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤中のロリオライド及びエピロリオライドの合計濃度の上限値は、特に規定されないが、費用の点等から２０００μＭ以下が好ましく、１０００μＭ以下がより好ましく、７００μＭ以下がさらに好ましく、５００μＭ以下がよりさらに好ましい。
【００２５】
なお、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤は、植物体への施用時に希釈して使用する濃縮物であってもよい。例えば、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤のロリオライドとエピロリオライドの合計濃度を１ｍＭ〜１Ｍとした場合には、使用時に水やエタノール等の適当な溶媒で１００倍〜１０００００倍希釈して有効成分濃度を所望の濃度（例えば、１０μＭ程度）に調整して使用することができる。
【００２６】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤の剤型としては、特に限定されるものではなく、例えば、粉剤、粒剤、錠剤、水和剤、乳剤、水溶剤、油剤、エアロゾル剤等が挙げられる。本発明に係る害虫抵抗性誘導剤を農業園芸用として用いる場合には、植物体への散布等が容易であることから、水和剤、乳剤、水溶剤、油剤、エアロゾル剤、粉剤等が好ましく、植物体への吸収性の点から、水和剤、乳剤、水溶剤、エアロゾル剤がより好ましい。これらの製剤は、常法に従って製造することができる。例えば、有効成分（ロリオライド及び／又はエピロリオライド）を、不活性な液体（溶媒）又は固体の担体で希釈し、必要に応じてその他の添加剤をこれに加えて、各種製剤を製造する。当該添加剤としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯臭剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤が水溶剤や水和剤等の液状の剤型である場合、ロリオライド及び／又はエピロリオライドを溶解又は分散させる溶媒としては、ロリオライド等に対して不活性であり、かつ対象となる植物体に悪影響を及ぼしにくい溶媒が好ましい。当該溶媒としては、メタノール、エタノール、及び水などが適宜使用される。水溶剤の場合、例えば、ロリオライド、エピロリオライド、又はこれらの混合物を、メタノールやエタノールに溶解させ、得られた溶液を水で希釈することにより調製できる。
【００２８】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤は、ロリオライド及びエピロリオライドによる害虫防除活性誘起効果を阻害しない範囲内で、その他の殺虫剤や殺菌剤、除草剤、植物生長調節剤、肥料等を含有していてもよい。
【００２９】
ロリオライド及びエピロリオライドは、植物体の害虫防除活性、特に、食葉性害虫及び吸汁性害虫に対する防除活性を誘起し、これらの害虫に対する抵抗性を増強させることができる。このため、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤により処理された植物体では、食葉性害虫による食害やハダニ類による吸汁害が低減する。また、この害虫抵抗性誘導効果から、ロリオライド及びエピロリオライドは、チョウ目昆虫やハダニ類等の害虫に対する抵抗性誘導剤のリード化合物としての利用も期待できる。
【００３０】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤により防除対象となる害虫のうち、食葉性害虫としては、チョウ目の昆虫が好ましく、ハスモンヨトウ（Spodoptera  litura）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera  exigua）、ヨトウガ（Mamestra  brassicae）、シロシタヨトウ（Sarcopolia  illoba）、コナガ（Plutella  xylostella）、タマナギンウワバ（Autographa  nigrisigna）、ハイマダラノメイガ（Hellula  undalis）、タバコガ（Helicoverpa  assulta）、オオタバコガ（Helicoverpa  armigera）、又はモンシロチョウ（Pieris rapae）等がより好ましく、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウがさらに好ましい。また、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤により防除対象となる害虫のうち、吸汁性害虫としては、ハダニが好ましく、カンザワハダニ（Tetranychus  kanzawai）又はナミハダニ（Tetranychus  urticae）が好ましい。  
【００３１】
本発明に係る植物の害虫防除方法は、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤を、植物体に接触又は吸収させることを特徴とする。本発明に係る害虫抵抗性誘導剤を植物体に接触又は吸収させることにより、有効成分たるロリオライド等が植物体に作用し、当該植物体の病害抵抗性が増強され、食葉性害虫による食害やハダニ類による吸汁害を低減させることができる。
【００３２】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤は、防除活性誘起効果が充分に発揮されるため、植物体に吸収させることが好ましいが、植物体の表面に接触させるだけであってもよい。当該表面からもロリオライド等は植物体に作用し得るためである。
【００３３】
本発明に係る植物の害虫防除方法において、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤を、植物体に接触又は吸収させる方法は、特に限定されるものではなく、その他の農薬等を散布する方法と同様にして行うことができる。本発明に係る害虫抵抗性誘導剤が液状の剤型である場合には、そのまま、又は適宜水やエタノール等の適当な溶媒で希釈した後に、植物体の葉や茎等の表面に塗布する方法や、噴霧する方法が好ましい。塗布処理や噴霧処理は、通常の葉面散布と同様の方法で行うことができる。その他、液状の害虫抵抗性誘導剤又はその希釈液を、植物体が植えられている土壌にまいてもよい。害虫抵抗性誘導剤を土壌にまいた場合には、有効成分であるロリオライド等が根から植物体へ吸収される。また、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤が粉剤の場合には、そのまま、又は適宜水やエタノール等の適当な溶媒に分散させた分散液を、塗布処理や噴霧処理することができる。本発明に係る害虫抵抗性誘導剤が粒剤等の比較的大きな固形の場合には、植物体が植えられている土壌にまくことができる。
【００３４】
本発明に係る植物の害虫防除方法において、対象植物体に対する本発明に係る害虫抵抗性誘導剤の施用量は、対象植物体の種類、防除対象である害虫の種類、被害の程度、環境条件、害虫抵抗性誘導剤の有効成分含有量や剤型等を考慮して適宜決定される。本発明においては、充分な害虫防除効果が得られやすいため、植物体への施用時におけるロリオライドとエピロリオライドの合計濃度が、１０μＭ以上、好ましくは１００μＭ以上、より好ましくは３００μＭ以上となるように本発明に係る害虫抵抗性誘導剤を施用することが好ましい。
【００３５】
本発明に係る植物の害虫防除方法において、対象となる植物体としては、食害性害虫又は吸汁性害虫による害が生じ得る植物であれば特に限定されるものではないが、市場で取引される植物であることが好ましく、野菜類、花き類、果樹、チャ等の農作物や観葉植物がより好ましい。なかでも野菜類が好ましく、トマト、ナス、ピーマン、パプリカ、ジャガイモ、トウガラシ等のナス科の植物、及び、キャベツ、ブロッコリー、メキャベツ、カイワレダイコン、カブ、ダイコン、カリフラワー、コマツナ、タアサイ、チンゲンサイ、ナバナ、ハクサイ、ミズナ、ラディッシュ等のアブラナ科の植物がさらに好ましく、トマトがよりさらに好ましい。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例等に限定されるものではない。
【００３７】
［実施例１］
＜植物粗抽出画分２４時間処理のナミハダニ産卵数に対する防除効果の検定＞
ロリオライド及びエピロリオライドを、タバコモザイクウイルスを感染させたタバコモザイクウイルス抵抗性タバコ品種ＳａｍｓｕｎＮＮから抽出し、得られた粗精製物の植物の害虫抵抗性誘起効果を調べた。
【００３８】
まず、タバコ品種ＳａｍｓｕｎＮＮの葉に対して、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１Ｌあたり１０ｍｇのタバコモザイクウイルスを含むように調製したウイルス液を、カーボランダム（炭化ケイ素）とともに葉表面を擦ることによって接種した。擦った時点から３０分後に、葉の表面の余分なウイルス液を水で洗い流した後、接種した植物体全体を３０℃の恒温室内で４８時間栽培し、次いで２０℃の恒温室に移して引き続き４８時間栽培した。
【００３９】
（抽出）
栽培後のウイルスを接種させた葉を、液体窒素で急速に凍結し、乳鉢と乳棒を用いて抹茶状になるまで細かく砕いた。得られた破砕物に、葉新鮮重に対して重量（質量）比で４倍量のメタノールを加え、さらに乳棒ですり潰した。得られた摩砕液をビーカーに移し、４℃の冷蔵庫で２４時間静置させた。摩砕液を濾紙で濾過した後、濾液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で水層を得るまで濃縮した。得られた水層に、容量比で等量の酢酸エチルを混合し、分液ロートを用いて溶媒抽出を行った。分取した上層（酢酸エチル層）は、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮した。
【００４０】
（粗精製）
得られた濃縮物を１ｍＬのヘキサン酢酸エチル（６：１）混合溶媒（ヘキサンと酢酸エチルの容量比が６：１となる混合液）に溶解させ、得られた濃縮溶液を、その最上部に予め水とメタノールで洗浄した海砂を積層させた上でヘキサン酢酸エチル（６：１）混合溶媒で平衡化させておいた分取用シリカゲル６０（和光純薬社製）を充填したガラスクロマト管に添加し、カラム容量の３倍量のヘキサン酢酸エチル（６：１）混合溶媒を通液し、次いでヘキサン中の酢酸エチル濃度を段階的に上昇させた混合溶媒を順次通液し、最後にアセトンを通液することで溶出した。以降、ヘキサンと酢酸エチル濃度が容量比で６：１の混合溶媒で溶出された画分を［６／１］画分、ヘキサンと酢酸エチル濃度が容量比で３：１の混合溶媒で溶出された画分を［３／１］画分、ヘキサンと酢酸エチル濃度が容量比で１：１の混合溶媒で溶出された画分を［１／１］画分、ヘキサンと酢酸エチル濃度が容量比で１：３の混合溶媒で溶出された画分を［１／３］画分、ヘキサンと酢酸エチル濃度が容量比で１：６の混合溶媒で溶出された画分を［１／６］画分、アセトンで溶出された画分をアセトン溶出画分という。ロリオライド及びエピロリオライドは、［１／３］画分と［１／６］画分（酢酸エチル濃度が７５％〜８５％のヘキサン酢酸エチル混合溶媒溶出画分）に含まれていた。各溶出画分を、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮し、得られた濃縮物をメタノールに溶解させ、水によって最終濃度が１００ｐｐｍになるように希釈した。
【００４１】
次いで、３〜４週齢のトマト葉の第３、４、５位葉を、各溶出画分溶液に浸漬させ、２５℃±１℃の恒温室内に置いた。２４時間後、トマト葉を蒸留水で洗い、風乾した後、ガラス板（７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）上に置いた予め水を含ませた脱脂綿の上に載せ、さらにその上にアクリル製マンジャーセル（７．５ｃｍ×２．５ｃｍ、 セル内径：１．５ｃｍ）を載せた。セル内に３日齢の予め交尾した３０頭のナミハダニ雌成虫を置き、カバーガラスでセルを覆った後、２５℃±１℃、１５時間明期／９時間暗期条件下で制御した恒温室内に置いた。５日後に、トマト葉に産下された卵の数を計測した。各溶出画分溶液に代えて、０．１容量％のメタノール水溶液で２４時間同様に処理したものを、対照区とした。
【００４２】
図１に、トマトにおけるナミハダニ産卵数に対するタバコモザイクウイルス感染タバコ葉から調製した各溶出画分溶液の２４時間処理の効果を示す。ロリオライド及びエピロリオライドを含有する［１／３］画分と［１／６］画分で処理したトマト葉では、０．１容量％メタノールのみを処理した対照区と比較して、ナミハダニ産卵数の低下が認められた。
【００４３】
本実施例において示すように、ロリオライド及びエピロリオライドは、粗抽出物でも、精製したロリオライド等と同様に害虫防除効果を有する。つまり、ロリオライドやエピロリオライドなどのカロテノイドを多量に生産する植物の粗抽出物等は、直接的又は間接的に防除資材等として利用し得る。精製前の粗抽出物を利用できれば、より安価に有効成分を調製し得るため、経済的なインパクトも大きいと期待される。
【００４４】
［製造例１］
実施例１において得られた［１／３］画分と［１／６］画分（ロリオライド及びエピロリオライドを含有する粗抽出画分）から、ロリオライド及びエピロリオライドを精製した。
【００４５】
（精製）
まず、［１／３］画分と［１／６］画分を混合し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮した。得られた乾固物を少量のメタノールで溶解させ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用逆相カラム（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  Ｔ３  ＯＢＤ、１９ｍｍ（内径）×１５０ｍｍ（長さ）、Ｗａｔｅｒｓ社製）に注入した。水／メタノールを、当該カラムの溶出に用いる移動相とし、１分あたり１０ｍＬの流速にて１５分間にわたりメタノール濃度を３０容量％から１００容量％にリニアに上昇させるグラジエント溶出を行った。保持時間５．２〜６．５分の間に溶出された画分を分取し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮した。得られた乾固物を、少量のアセトニトリルで溶解させ、ＨＰＬＣ用逆相カラム（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ−１８、４．６ｍｍ（内径）×１５０ｍｍ（長さ）、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に注入した。水／アセトニトリルをカラムの溶出に用いる移動相とし、１分あたり０．８ｍＬの流速にて６０分間にわたりアセトニトリル濃度を２０％から１００％にリニアに上昇させるグラジエント溶出を行った。保持時間４９．０〜５２．０分の間に溶出された物質がロリオライド及びエピロリオライドであった。この結果、過敏感反応が起きたタバコ葉新鮮重１．５ｋｇからのロリオライドとエピロリオライドの収量は、それぞれ７．５ｍｇと２．９ｍｇであった。
【００４６】
［製造例２］
過敏感反応が起きたタバコ葉に代えて、過敏感反応を起こしていないタバコ葉を用いて、実施例１と同様にしてロリオライド及びエピロリオライドを含有する粗抽出画分（［１／３］画分と［１／６］画分）を得、次いでこの粗抽出画分から製造例１と同様にしてロリオライドとエピロリオライドを精製した。この結果、過敏感反応前のタバコ葉新鮮重１ｋｇからのロリオライドとエピロリオライドの収量は、それぞれ２１μｇと８．５μｇであった。
【００４７】
［製造例３］
過敏感反応が起きたタバコ葉に代えて、ガマズミ、トチュウ、及びヒジキをそれぞれ用いて、実施例１と同様にしてロリオライド及びエピロリオライドを含有する粗抽出画分（［１／３］画分と［１／６］画分）を得、次いでこの粗抽出画分から製造例１と同様にしてロリオライドとエピロリオライドを精製した。この結果、乾燥重１ｋｇのガマズミ、トチュウ、ヒジキから、それぞれロリオライドとエピロリオライドの混合物を１３．３ｍｇ、６．０ｍｇ、６．２ｍｇ得ることができた。
【００４８】
［製造例４］
ルテインから光酸化反応により、ロリオライドとエピロリオライドを合成した。
まず、ルテイン（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）５００ｍｇとメチレンブルー１０ｍｇを５００ｍＬのクロロホルムに溶解し、その溶液を１Ｌ容のナス型フラスコに入れ、３７Ｗの蛍光灯下で２４時間撹拌しながら光酸化反応を行った。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、得られた酢酸エチル抽出物をロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮した。
得られた濃縮物を１ｍＬのヘキサン酢酸エチル（６：１）混合溶媒（ヘキサンと酢酸エチルの容量比が６：１となる混合液）に溶解させ、得られた濃縮溶液から、実施例１の粗精製工程と同様にしてロリオライド及びエピロリオライドを含有する粗抽出画分（［１／３］画分と［１／６］画分）を得た。
【００４９】
（精製）
次いで、［１／３］画分と［１／６］画分を混合し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮した。得られた乾固物を少量のメタノールで溶解させ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用逆相カラム（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  Ｔ３  ＯＢＤ、１９ｍｍ（内径）×１５０ｍｍ（長さ）、Ｗａｔｅｒｓ社製）に注入した。水／メタノールを、当該カラムの溶出に用いる移動相とし、１分あたり１０ｍＬの流速にて１５分間にわたりメタノール濃度を３０容量％から１００容量％にリニアに上昇させるグラジエント溶出を行った。保持時間５．２〜６．５分の間に溶出された画分を分取し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下３０℃で完全に乾固するまで濃縮した。得られた乾固物を、少量のアセトニトリルで溶解させ、ＨＰＬＣ用逆相カラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ  ｐｒｅｐ  Ｃ１８、１０ｍｍ（内径）×１５０ｍｍ（長さ）、Ｗａｔｅｒｓ社製）に注入した。水とアセトニトリルが容積比で６０：４０の混合液をカラムの溶出に用いる移動相とし、１分あたり１ｍＬの流速にて通液し、ロリオライド及びエピロリオライドを含む画分を得た。この結果、生成物としてロリオライド２６ｍｇ、エピロリオライド２０ｍｇを得た。
【００５０】
［実施例２］
＜ロリオライド２４時間処理のナミハダニ産卵数に対する防除効果の検定＞
適量のロリオライドを、メタノールに添加して均一になるまで攪拌することにより、ロリオライドの濃度が１００ｍＭの薬剤濃縮溶液を調製した。ロリオライドは、製造例１で精製されたものを用いた。この薬剤濃縮溶液を、水によって最終濃度１、１０、１００、５００μＭになるよう希釈した。なお、対照区として０．１容量％メタノールのみを含む水溶液（０μＭ）を調製した。
【００５１】
次いで、３〜４週齢のトマト葉の第３、４、５位葉を、各濃度のロリオライド希釈液に浸漬し、２５℃±１℃の恒温室内に置いた。２４時間後、トマト葉を蒸留水で洗い、風乾した後、実施例１に記載の方法に従って３０頭のナミハダニ雌成虫を接種し、同じ栽培条件下で栽培した。５日後に、トマト葉に産下された卵の数を計測した。
図２に、トマトにおけるナミハダニ産卵数に対する精製したロリオライドの２４時間処理の効果を示す。１００μＭ及び５００μＭのロリオライド希釈液で処理したトマト葉では、０．１容量％メタノールのみを処理した対照区と比較して、ナミハダニ産卵数の低下が認められた。
【００５２】
［実施例３］
＜ロリオライド２４時間処理のナミハダニ生存数に対する防除効果の検定＞
３〜４週齢のトマト葉の第３、４、５位葉を、実施例２で調製した各濃度のロリオライド希釈液に浸漬し、２５℃±１℃の恒温室内に置いた。２４時間後、トマト葉を蒸留水で洗い、風乾した後、実施例１に記載の方法に従って３０頭のナミハダニ雌成虫を接種し、同じ栽培条件下で栽培した。５日後に、成虫の生死を判定し、生存数を計測した。
図３に、トマトにおけるナミハダニ生存数に対する精製したロリオライドの２４時間処理の効果（ナミハダニ雌成虫の生存率）を示す。５００μＭのロリオライド希釈液で処理したトマト葉では、０．１容量％メタノールのみを処理した対照区と比較して、ナミハダニ生存数の低下が認められた。
【００５３】
［実施例４］
＜エピロリオライド２４時間処理のナミハダニ産卵数に対する防除効果の検定＞
適量のエピロリオライドを、メタノールに添加して均一になるまで攪拌することにより、エピロリオライドの濃度が１００ｍＭの薬剤濃縮溶液を調製した。エピロリオライドは、製造例１で精製されたものを用いた。この薬剤濃縮溶液を、水によって最終濃度１、１０、１００、３００μＭになるよう希釈した。なお、対照区として０．１容量％メタノールのみを含む水溶液（０μＭ）を調製した。
【００５４】
次いで、３〜４週齢のトマト葉の第３、４、５位葉を、各濃度のエピロリオライド希釈液に浸漬し、２５℃±１℃の恒温室内に置いた。２４時間後、トマト葉を蒸留水で洗い、風乾した後、実施例１に記載の方法に従って３０頭のナミハダニ雌成虫を接種し、同じ栽培条件下で栽培した。５日後に、トマト葉に産下された卵の数を計測した。
図４に、トマトにおけるナミハダニ産卵数に対する精製したエピロリオライドの２４時間処理の効果を示す。１０μＭ及び３００μＭのエピロリオライド希釈液で処理したトマト葉では、０．１容量％メタノールのみを処理した対照区と比較して、ナミハダニ産卵数の低下が認められた。実施例２の結果と比較したところ、エピロリオライドはロリオライドとほぼ同等の防除活性を示した。
【００５５】
［実施例５］
＜ロリオライドの殺ハダニ活性の検定＞
実施例２で調製したロリオライドの濃度が１００ｍＭの薬剤濃縮溶液を、水によって最終濃度１０００μＭになるよう希釈した。なお、対照区として０．１容量％メタノールのみを含む水溶液（０μＭ）を調製した。
【００５６】
次いで、インゲンマメの葉片（１ｃｍ×１ｃｍ）に３日齢のナミハダニ雌成虫を載せ、５秒間、ロリオライド溶液中に完全に浸漬させた。風乾後、別途用意したインゲンマメ葉に浸漬処理したナミハダニを載せ、その葉を予め水を含ませた脱脂綿上に置き、２５℃±１℃、１５時間明期／９時間暗期条件下で制御した恒温室内に置いた。４８時間後、成虫の生死を判定し、生存数を計測した。１区当たり３０頭のナミハダニを用いた。
図５に、ナミハダニ生存数に対するロリオライド浸漬処理の効果を示す。ロリオライド処理区と対照区でナミハダニの生存数に差は認められなかったことから、ロリオライドは直接の殺ハダニ活性は有さないことが示された。
【００５７】
［実施例６］
＜ロリオライド２４時間処理のハスモンヨトウ生存数に対する防除効果の検定＞
実施例２で調製したロリオライドの濃度が１００ｍＭの薬剤濃縮溶液を、水によって最終濃度１、１０、１００、３００μＭになるよう希釈した。なお、対照区として０．１容量％メタノールのみを含む水溶液（０μＭ）を調製した。
【００５８】
次いで、３〜４週齢のトマト葉の第３、４、５位葉を、各濃度のロリオライド希釈液に浸漬し、２５℃±１℃の恒温室内に置いた。２４時間後、トマト葉を蒸留水で洗い、風乾した後、葉柄を予め蒸留水を満たした１．５ｍＬ容チューブに入れ、水分の蒸発を防ぐためにパラフィルムで上部開口部を覆った後、これらのチューブを円柱形プラスチック容器（１４ｃｍ（直径）×６．５ｃｍ（高さ））に置き、葉１組あたり１０頭のハスモンヨトウ孵化幼虫を葉面上に載せ、実施例１に記載と同じ栽培条件で栽培した。５日後に、幼虫の生死を判定し、生存数を計測した。葉２枚を１組として、１処理区あたり１０組を検定に供した。
図６に、トマトにおけるハスモンヨトウ生存数に対する精製したロリオライドの２４時間処理の効果（ハスモンヨトウの生存率）を示す。１０μＭ以上の濃度のロリオライド希釈液で処理したトマト葉では、０．１容量％メタノールのみを処理した対照区と比較して、ハスモンヨトウ生存数の低下が認められた。
【００５９】
[比較例１]
＜ジヒドロアクチニオディオライド２４時間処理のナミハダニ産卵数に対する防除効果の検定＞
ロリオライドの類縁化合物であるジヒドロアクチニオディオライド処理による防除効果を、実施例２に記載の方法に準じて行った。ジヒドロアクチニオディオライドは、下記式（３）で表される化合物である。検定においては、最終濃度１００、５００、又は、７００μＭのジヒドロアクチニオディオライド（Ark Pharm社製）及び０．１容量％メタノールを含む水溶液にトマト葉を浸漬した後、当該トマト葉にナミハダニ雌成虫を接種し、トマト葉に産下された卵の数を計測した。なお、０．１容量％メタノール水溶液で処理したトマト葉を対照とした。
ジヒドロアクチニオディオライドでトマト葉を処理した全ての場合において、ナミハダニの産卵数と対照における産卵数との間に有意差がなかった。この結果は、ロリオライドが有する防除効果にとってロリオライドの３位の水酸基の存在が重要であることを示している。
【００６０】
【化２】
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【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明に係る害虫抵抗性誘導剤及びこれを用いた植物の害虫防除方法は、虫害、特に食害や吸汁害に対して有効であり、かつ抵抗性系統を出現させるおそれが非常に小さく、また、従来の農薬よりも環境や人体への安全性も高い。このため、本発明に係る害虫抵抗性誘導剤及びこれを用いた植物の害虫防除方法は、特に農作物や観葉植物の栽培、中でも、ナス科植物及びアブラナ科植物の栽培等の分野において好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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