(57)【要約】【課題】生物による安全な方法で、効率的にパラアミノ安息香酸を生産する方法を提供すること。【解決手段】パラアミノ安息香酸を生産する方法が提供される。この方法は、パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物を、炭素基質を含む培地において培養する工程を含む。パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物は、ＰａｂＡＢ複合体タンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換微生物であっても、またはＰａｂＡタンパク質およびＰａｂＢタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を共導入して得られた形質転換微生物であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラアミノ安息香酸を生産する方法であって、
パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物を、炭素基質を含む培地において培養する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物が、ＰａｂＡＢ複合体タンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換微生物であるか、またはＰａｂＡタンパク質およびＰａｂＢタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を共導入して得られた形質転換微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換微生物が、ＰａｂＣタンパク質をコードする遺伝子をさらに導入して得られた形質転換微生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記形質転換微生物が原核生物である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記原核生物が細菌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、エシェリキア属に属する細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、大腸菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌が、放線菌類に属する細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、ストレプトマイセス・リビダンスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地が、単糖、二糖、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１つの炭素基質を含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記単糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、およびアラビノースからなる群より選択される少なくとも１つの糖である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラアミノ安息香酸の生産方法に関する。より詳細には、微生物を用いて、パラアミノ安息香酸を効率よく生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラアミノ安息香酸（ｐ−アミノ安息香酸または「ＰＡＢＡ」、あるいは４−アミノ安息香酸とも呼ばれる）は、繊維・プラスチック原料として有用性が大きく期待される。しかし、従来のパラアミノ安息香酸の生産方法は、石油を原料とした化学法によるものであった。
【０００３】
ＰＡＢＡは、微生物における葉酸の生合成の中間体として知られている。ＰＡＢＡの微生物中のその役割および生合成経路について、種々の研究が進められている（非特許文献１〜７）。ＰＡＢＡは、微生物が保有するシキミ酸経路にて合成され得るコリスミ酸から合成される。例えば、大腸菌（Escherichia coli）において、コリスミ酸から４−アミノ安息香酸の変換において、ｐａｂＡとｐａｂＢと称される２つの遺伝子が関与することが示されている（非特許文献２）。ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）において、パラアミノ安息香酸シンターゼ（ＰＡＢＡシンターゼ）が、コリスミ酸から４−アミノ安息香酸の変換を触媒することが示されている（非特許文献３）。さらに、コリスミ酸からのＰＡＢＡの合成には、パラアミノ安息香酸シンターゼ（ＰＡＢＡシンターゼ）に加えて、さらなる酵素４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸リアーゼの作用が関与することが報告されている（非特許文献４〜７）。
【０００４】
ＰＡＢＡシンターゼは、２つの異種サブユニットからなる複合体であり、ＰａｂＡＢとも称される。大腸菌においては、これらのサブユニットＰａｂＡおよびＰａｂＢをコードするそれぞれ遺伝子が、別個に発現されている（非特許文献４および５）。放線菌においては、複合体の形態のＰａｂＡＢをコードする遺伝子が発現されている（非特許文献６および７）。
【０００５】
ＰＡＢＡシンターゼを過剰発現するように形質転換酵母を作出した、ＰＡＢＡの生産に関する研究が報告されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biotechnology，1951年，62巻，221-230頁
【非特許文献２】Journal of Biotechnology，1970年，102巻，767-773頁
【非特許文献３】Journal of General Microbiology，1985年，131巻，1279-1287頁
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci., USA，1990年，87巻，9391-9395頁
【非特許文献５】The Journal of Biological Chemistry，1989年，264巻，8597-8601頁
【非特許文献６】Microbiology，1996年，142巻，1345-1355頁
【非特許文献７】Microbiology，2001年，147巻，2113-2126頁
【非特許文献８】Journal of Biotechnology，2013年，163巻，184-193頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生物による安全な方法で、効率よくパラアミノ安息香酸を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、パラアミノ安息香酸を生産する方法であって、
パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物を、炭素基質を含む培地において培養する工程を含む、方法を提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、上記パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物は、ＰａｂＡＢ複合体タンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換微生物、またはＰａｂＡタンパク質およびＰａｂＢタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を共導入して得られた形質転換微生物である。
【００１０】
１つの実施形態では、上記形質転換微生物は、ＰａｂＣタンパク質をコードする遺伝子をさらに導入して得られた形質転換微生物である。
【００１１】
１つの実施形態では、上記形質転換微生物は原核生物である。
【００１２】
１つの実施形態では、上記原核生物が細菌である。
【００１３】
１つの実施形態では、上記細菌は、エシェリキア属に属する細菌である。
【００１４】
１つの実施形態では、上記細菌は、大腸菌である。
【００１５】
１つの実施形態では、上記細菌は、放線菌類に属する細菌である。
【００１６】
１つの実施形態では、上記細菌は、ストレプトマイセス・リビダンスである。
【００１７】
１つの実施形態では、上記培地は、単糖、二糖、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１つの炭素基質を含む。
【００１８】
１つの実施形態では、上記単糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、およびアラビノースからなる群より選択される少なくとも１つの糖である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、微生物発酵を利用することで、パラアミノ安息香酸を生物による安全な方法で、効率よく生産することが可能となる。本願発明の方法においては、特に大腸菌またはストレプトマイセス・リビダンスを宿主微生物として用いる場合、グルコースなどの単糖、マルトースなどの二糖などのバイオマス由来の糖類に加えて、グリセロールなどのバイオマス由来の化合物を原料として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＰＡＢＡ−９株（Ａ）およびＰＡＢＡ−２５株（Ｂ）の発酵培養の間のグルコースおよび発酵生産物の経時変化を示すグラフである。
【図２】ＰＡＢＡ−２４株を用いた第１の培養（Ａ）および第２の培養（Ｂ）におけるグルコースおよび発酵生産物の経時変化を示すグラフである。
【図３】ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株のＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図４】ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株およびコントロールのストレプトマイセス・リビダンス株について、炭素基質として５％（w/v）グルコースを添加したＴＳＢ培地で培養した発酵における培養上清中のＰＡＢＡ濃度（ｍＭ）の経日変化を示すグラフである。
【図５】炭素基質として、グルコース（Ａ）、マルトース（Ｂ）、スクロース（Ｃ）、フルクトース（Ｄ）、グリセロール（Ｅ）、ガラクトース（Ｆ）、アラビノース（Ｇ）、セロビオース（Ｈ）およびキシロース（Ｉ）を用いた場合について、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株およびコントロールのストレプトマイセス・リビダンス株のそれぞれの培養による発酵における培養上清中のＰＡＢＡ濃度（ｍＭ）の経日変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、パラアミノ安息香酸を生産する方法を提供する。この方法は、パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物を、炭素基質を含む培地において培養する工程を含む。
【００２２】
パラアミノ安息香酸シンターゼ（ｐ−アミノ安息香酸シンターゼまたは「ＰＡＢＡシンターゼ」ともいう）は、コリスミ酸から４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸への生成を触媒する活性を有する酵素である。パラアミノ安息香酸シンターゼは、ＰａｂＡＢとも称される複合体タンパク質であり、２つのサブユニットであるＰａｂＡおよびＰａｂＢを有する。パラアミノ安息香酸シンターゼは、由来微生物に依存して、ＰａｂＡタンパク質とＰａｂＢタンパク質とが融合したＰａｂＡＢ複合体タンパク質として、またはＰａｂＡタンパク質およびＰａｂＢタンパク質のそれぞれの単一ユニットの形態にて存在し得る。ＰａｂＡタンパク質は、グルタミンアミドトランスフェラーゼ活性を有し、グルタミンからアンモニアを発生させ得、ＰａｂＢタンパク質は、コリスミ酸へアンモニアをアミノ基として挿入させ得る。
【００２３】
ＰａｂＡＢ、ＰａｂＡ、およびＰａｂＢは、上記の酵素活性（触媒作用）を奏する限り、異なる名称で知られるタンパク質であってもよい。例えば、ＰａｂＡとしてＴｒｐＧタンパク質（アントラニル酸シンターゼＴｒｐＥＧの一方のサブユニット）、ＰａｂＢとしてＴｒｐＥタンパク質（アントラニル酸シンターゼＴｒｐＥＧの他方のサブユニット）を用いてもよく、本明細書中で「ＰａｂＡ」、「ＰａｂＢ」という場合は、これらもまた包含する。本明細書中で「ＰａｂＡＢ」という場合は、ＰａｂＡとＰａｂＢとの組み合わせ、ＴｒｐＧとＰａｂＢとの組み合わせ、ＰａｂＡとＴｒｐＥとの組み合わせ、およびＴｒｐＧとＴｒｐＥとの組み合わせを包含する。
【００２４】
パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物は、ＰａｂＡＢタンパク質をコードする遺伝子を宿主微生物に導入して得られた形質転換微生物であってもよく、またはＰａｂＡタンパク質およびＰａｂＢタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を共導入して得られた形質転換微生物であってもよい。本明細書中では、それぞれＰａｂＡＢタンパク質、ＰａｂＡタンパク質およびＰａｂＢタンパク質をコードする遺伝子を、ｐａｂＡＢ、ｐａｂＡ、およびｐａｂＢともいう。
【００２５】
「導入」とは、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター中の発現を目的とする遺伝子が宿主細胞に導入されるだけでなく、宿主細胞で発現されることも含む。「形質転換」は、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入して発現させることにより宿主の遺伝的形質を変えること、またはその操作をいう。遺伝子導入によるその酵素の「発現」または「発現増強」は宿主に依存し得、「発現」は、本来その遺伝子を保有していない宿主に遺伝子を導入することで、形質転換微生物が酵素活性を有するようになることをいい、「発現増強」は、その遺伝子を保有する宿主に遺伝子を（好ましくは過剰発現するように）導入することで、形質転換微生物にて酵素活性を増強させることをいうが、これらは厳密に区別される必要はない。
【００２６】
１つの実施形態では、上記パラアミノ安息香酸シンターゼは、エシェリキア属（Escherichia）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、コクリア属（Kocuria）、バチルス属（Bacillus）、オーシャンバチルス属（Oceanobacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、サッカロポリスポラ属（Saccharopolyspora）などからなる群より選択される属に属する微生物に由来する。
【００２７】
１つの実施形態では、上記パラアミノ安息香酸シンターゼは、大腸菌（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、コクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、オーシャンバチルス・イヘヤエンシス（Oceanobacillus iheyensis）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・ヴェネズエラ（Streptomyces venezuelae）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea）などからなる群より選択される微生物に由来する。コリネバクテリウム・グルタミカムとしては、ＡＴＣＣ１３０３２株、Ｒ株、およびＳＹＰＳ−０６２株のいずれに由来するものでもよい。
【００２８】
パラアミノ安息香酸シンターゼに関する遺伝子としては、例えば、大腸菌由来ｐａｂＡ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．（以下、「遺伝子登録番号」ともいう）ＡＡＡ５８１５７．１）およびｐａｂＢ（遺伝子登録番号ＡＡＣ７４８８２．１）、コリネバクテリウム・エフィシエンスｐａｂＡＢ（遺伝子記号ＣＥ１０５９、遺伝子登録番号ＢＡＣ１７８６９．１）、ロドコッカス・エリスロポリスｐａｂＡＢ（遺伝子登録番号ＢＡＨ３２５５６．１）、コクリア・リゾフィラｐａｂＡＢ（遺伝子記号ＫＲＨ＿２３１３０、遺伝子登録番号ＢＡＧ３０６６０．１）、バチルス・スブチリスｐａｂＡ（遺伝子登録番号ＣＡＢ１１８５１．１））およびｐａｂＢ（遺伝子登録番号ＣＡＢ１１８５０．１）、シュードモナス・フルオレセンスｔｒｐＧ（遺伝子登録番号ＡＡＹ９４８１６．１）およびｐａｂＢ（遺伝子記号ＰＦＬ＿１８５６、遺伝子登録番号ＡＡＹ９１１４４．１）、シュードモナス・プチダｔｒｐＧ（遺伝子登録番号ＡＡＮ６６０５０．１）およびｐａｂＢ（遺伝子登録番号ＡＡＮ６７９４２．１）、オーシャンバチルス・イヘヤエンシスｐａｂＡ（遺伝子記号ＯＢ０７０１、遺伝子登録番号ＢＡＣ１２６５７．１）およびｐａｂＢ（遺伝子記号ＯＢ０７０２、遺伝子登録番号ＢＡＣ１２６５８．１）、ストレプトマイセス・アベルミチリスｐａｂＡＢ（遺伝子番号ＳＡＶ１１７８）、ストレプトマイセス・ヴェネズエラｐａｂＡＢ（遺伝子番号ＳＶＥＮ０９２０）、サッカロポリスポラ・エリスレアｐａｂＡＢ（遺伝子番号ＳＡＣＥ４０３６）などが挙げられる。
【００２９】
上記パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物は、ＰａｂＣタンパク質をコードする遺伝子をさらに導入して得られた形質転換微生物であってもよい。ＰａｂＣタンパク質は、アミノデオキシコリスミ酸リアーゼであり、アミノデオキシコリスミ酸リアーゼは、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸からピルビン酸を脱離し、ＰＡＢＡへの生成を触媒する活性を有する酵素である。ＰａｂＣタンパク質をコードする遺伝子をさらに宿主微生物に導入することにより、アミノデオキシコリスミ酸リアーゼを発現または発現増強し得る。１つの実施形態では、アミノデオキシコリスミ酸リアーゼは、エシェリキア属、ストレプトマイセス属、サッカロポリスポラ属などからなる群より選択される属に属する微生物に由来する。１つの実施形態では、アミノデオキシコリスミ酸リアーゼは、大腸菌、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・セリカラー、サッカロポリスポラ・エリスレアなどからなる群より選択される微生物に由来する。アミノデオキシコリスミ酸リアーゼに関する遺伝子としては、例えば、大腸菌由来ｐａｂＣ（遺伝子登録番号ＡＡＣ７４１８０．１）、ストレプトマイセス・グリセウス由来ｐａｂＣ２（遺伝子番号ＳＧＲ６０３６）およびｐａｂＣ１（遺伝子番号ＳＧＲ６３３１）、ストレプトマイセス・アベルミチリス由来ｐａｂＣ２（遺伝子番号ＳＡＶ６８５２）およびｐａｂＣ１（遺伝子番号ＳＡＶ１５６３）、サッカロポリスポラ・エリスレア由来ｐａｂＣ（遺伝子番号ＳＡＣＥ７１１１）などが挙げられる。
【００３０】
また、微生物が通常有するグルコース代謝経路において生成されるホスホエノールピルビン酸からシキミ酸経路に分岐するために作用する酵素をさらに発現または発現増強するように、宿主微生物を形質転換してもよい。このような酵素として、例えば、大腸菌においては、Ｄ−アラビノヘプツロン酸７リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰ）を用いることができ、そのコードする遺伝子は、例えば、ａｒｏＦ（遺伝子登録番号ＡＡＣ７５６５０）である。１つの実施形態では、上記パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物は、このような酵素をコードする遺伝子をさらに導入して得られた形質転換微生物であってもよい。１つの実施形態では、上記パラアミノ安息香酸シンターゼを発現または発現増強するように形質転換された微生物は、このような酵素をコードする遺伝子を、ＰａｂＣタンパク質（アミノデオキシコリスミ酸リアーゼ）をコードする遺伝子とともに導入して得られたものであってもよい。
【００３１】
本発明においては、宿主微生物は特に限定されない。シキミ酸経路を有する微生物が好ましい。１つの実施形態では、宿主微生物は原核生物である。１つの実施形態では、上記原核生物は細菌である。１つの実施形態では、上記細菌は、エシェリキア属に属する細菌であり、例えば、大腸菌である。別の実施形態では、上記細菌は、放線菌類に属する細菌であり、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）である。
【００３２】
各酵素をコードする遺伝子は、宿主微生物において内因性であってもよいし、外因性であってもよい。また、公知のこれらの酵素をコードする遺伝子を適宜利用することができ、上述に例示した酵素およびコードする遺伝子に限定されない。遺伝子としては、由来を問わないで利用することができる。すなわち、遺伝子は、上記以外に、動物、植物、真菌（カビなど）、細菌などの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、当業者であれば、各種遺伝子データベース（例えば、ＮＣＢＩなど。放線菌の場合、ストレプトマイセス・セリカラーA3(2)ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ５７８０１，ＰＲＪＮＡ２４２）、ストレプトマイセス・グリセウス  グリセウス亜種（Streptomyces griseus subsp.griseus）ＮＢＲＣ１３３５０ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ５８９８３，ＰＲＪＤＡ２００８５）、ストレプトマイセス・アベルミチリスＭＡ−４６８０ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＲＪＮＡ５７７３９，ＰＲＪＮＡ１８９）、サッカロポリスポラ・エリスレアＮＲＲＬ２３３８ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ６２９４７，ＰＲＪＥＡ１８４８９）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG、http://www.genome.jp/kegg/）およびGenome Project of Streptomyces avermitilis、http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp/に公開されたゲノム情報も利用され得る。）のホームページにアクセスすることにより適宜入手することができる。
【００３３】
本発明で用いられる遺伝子は、各酵素活性を有する限りにおいて、データベースなどにおいて開示される配列情報または本願明細書中に具体的に記載された各種遺伝子の配列と一定の関係を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このような実施形態としては、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換もしくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上１０個以下程度、より好ましくは、１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、各酵素活性を有する限りにおいていずれの置換であってもよいが、例えば、保存的置換が挙げられ、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００３４】
他の実施形態としては、本発明で用いられる遺伝子は、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。配列同一性は、好ましくは７４％以上、より好ましくは７８％以上、なおより好ましくは８０％以上であり、なおより好ましくは８５％以上であり、なおさらに好ましくは、９０％以上であり、なおさらにより好ましくは９５％以上、なおさらにより好ましくは９８％以上である。
【００３５】
本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３６】
さらに他の実施形態として、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と例えば、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、なおより好ましくは７８％以上、なおより好ましくは８０％以上、なおより好ましくは８５％以上、なおより好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が例えば、１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が例えば、１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。さらなる他の実施形態として、開示される塩基配列と例えば、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、なおより好ましくは７８％以上、なおより好ましくは８０％以上、なおより好ましくは８５％以上、なおより好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有し、本発明で発現または発現増強しようとする酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００３７】
このような遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、各種生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリーなどに由来する核酸を鋳型とし、本発明で発現または発現しようとする酵素をコードする遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００３８】
また、遺伝子は、例えば、開示されるまたは公知のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法または Gapped duplex法等の公知手法またはこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K（タカラバイオ株式会社製）やMutant-G（タカラバイオ株式会社製）)などを用いて、あるいは、タカラバイオ株式会社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異が導入される。
【００３９】
遺伝子は、宿主微生物での発現を最適にするように、コドンが最適化されてもよい。コドンの最適化は、当業者が通常用いる任意の手段、装置を用いて実施され得る。
【００４０】
宿主微生物において、酵素またはタンパク質をコードする遺伝子の発現が増強されている形態は特に限定されない。これら遺伝子の発現を増強する改変が行われる前に比べて、これらのタンパク質の生産量または活性の増大、あるいは、後述するようにＰＡＢＡ生産能力の増強が確認されればよい。遺伝子の発現が増強されている実施形態としては、例えば、内因性のいずれかの遺伝子がより強力なプロモーター（構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれであってもよい）の制御下に連結された実施形態が挙げられる。また、追加的に内因性および／または外因性のいずれかの遺伝子が導入されている実施形態が挙げられる。追加的に導入されたいずれかの遺伝子は好ましくは構成的プロモーターなど強力なプロモーターで作動可能に保持されている。発現の増強について、本明細書中においては「過剰発現」ともいう。
【００４１】
また、これらの遺伝子のいずれかの遺伝子の発現が増強されている実施形態としては、いずれかの遺伝子の複数コピーが発現可能に保持されている実施形態が挙げられる。この場合、コピー数は特に限定しないが、２以上であることが好ましい。
【００４２】
遺伝子またはＤＮＡの導入、または形質転換のための方法は、形質転換を行う宿主微生物に応じて適宜選択され、当業者が通常用いる手法が用いられ得る。宿主微生物の種類に依存して、ファージ、コスミド、プラスミドなどのベクターの宿主微生物への導入による遺伝子の導入、宿主微生物の染色体ＤＮＡへの遺伝子の挿入、宿主微生物の遺伝子と相同組換えを起こして染色体ＤＮＡに取り込ませるなどの方法が用いられ得る。エレクトロポレーション法、塩化カルシウム法、プロトプラスト融合法、接合伝達法などが挙げられる。形質転換用に市販されているキットを用いて行うことができる。大腸菌に関しては、「λ−ファージのＲｅｄ組換え酵素、酵母のフリパーゼ、およびＰ１ファージを用いた手法」（Komaら，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2012年，93巻，815-829頁）が好ましく用いられ得る。
【００４３】
遺伝子を用いて遺伝子発現カセットを構築し得る。遺伝子発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するプロモーター、ターミネーター、オペレーター、エンハンサーなどのいわゆる調節因子を含み得る。調節因子は、発現させる遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものであってもよく、当業者によって適宜選択され得る。プロモーターとしては、大腸菌の場合は、例えば、Ｔ７プロモーターなどを用いることができ、放線菌の場合は、例えば、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）プロモーター（特に、Streptoverticillium cinnamoneum（ストレプトベティシリウム・シナモネウム）由来のＰＬＤプロモーター：Oginoら，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2004年，64(6)巻，823-828頁）などを用いることができる。発現カセットは、遺伝子発現の目的に応じて、必要な機能配列（例えば、シャイン・ダルガルノ配列（SD配列））をさらに含むこともできる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
【００４４】
各種塩基配列を含むＤＮＡの合成および連結は、当業者が通常用い得る手法で行われ得る。
【００４５】
遺伝子または該遺伝子を含む発現カセットを含む、ファージ、プラスミドなどの形態のベクターを調製し得る。必要に応じて、ベクターは、上述したような調節配列を含み得る。ベクターはまた、適切な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などの選択用マーカー遺伝子を含むことが好ましい。選択用マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子などが挙げられ、これらはいずれも当業者には周知である。大腸菌以外の微生物の場合、例えば、宿主微生物（例えば、放線菌）と大腸菌とのシャトルベクターを用いることができる。このシャトルベクターは、当該宿主微生物および大腸菌の複製開始点および選択マーカーなどを有する。接合型プラスミドもまた用いられ得る。放線菌宿主用プラスミドベクターの例として、pUC702（Oginoら，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2004年，64(6)巻，823-828頁）、pTONA4（特開２００９−１５３５１６号公報）、pTYM18（HIROYASU ONAKAら、THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS，2003年，第56巻，第11号，950-956頁）が挙げられる。１つの実施態様では、ベクターは、高発現型プロモーター、例えば、放線菌宿主の場合ＰＬＤプロモーターを含むように構築され得る。
【００４６】
宿主微生物においていずれかの酵素またはタンパク質をコードする遺伝子が発現されているまたは発現が増強されているかは、形質転換微生物が上記各種実施形態を保持しているかどうかを検出する、あるいは形質転換微生物におけるいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現量、当該タンパク質のｍＲＮＡ発現量、形質転換微生物が産生したタンパク質の活性などのいずれかが、形質転換前と比較して増加または減少しているかどうかを調べることにより評価することができる。発現増強の場合、増加の程度は、こうした発現量などが発現増強前に比較して、好ましくは１０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは５０％以上であり、なおより好ましくは７０％以上である。
【００４７】
ＰＡＢＡを生産する方法は、上記形質転換微生物を、炭素基質を含む培地で培養する工程（本明細書中において、発酵工程ともいう）を含む。
【００４８】
炭素基質は、形質転換微生物が利用することができる物質または化合物である限り、限定されない。炭素基質としては、形質転換微生物に依存し得るが、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖（例えば、３〜１０数程度の単糖から構成される）などの糖に加え、さらにグリセロールなどの炭水化物以外の物質が挙げられる。１つの実施形態では、培地は、炭素基質として、単糖、二糖、グリセロールなどの少なくとも１つを含む。単糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノースなどが挙げられる。二糖は、上記の各種の同一または異種の２つの単糖からなり得、例えば、マルトース、セロビオース、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。例えば、炭素基質としてグルコースを含有する培地とは、形質転換微生物が発酵の培養時にグルコースを用いることができる培地形態を意味し、その形態は特に限定されない。例えば、グルコースにて構成されるオリゴ糖または多糖（例えば、デンプン、セルロース）を、これらの糖を分解可能な酵素を共に培地に含んでもよく（酵素分解にてグルコースが培地中に生じ得る）、または発酵前にこれらの糖を予め分解処理したもの（分解処理物中にグルコースが含まれ得る）を培地に加えてもよい。炭素基質として、例えば、培養前または培養の間に、デンプンおよびセルロースを酵素等により分解（糖化）して得られ得る単糖（グルコース）または二糖形態（マルトース、セロビオース）、あるいは単糖および二糖を含む混合物を、用いてもよい。グルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースなどは、例えば、ヘミセルロースの分解によっても得られ得る。炭素基質は、植物バイオマス中のセルロースおよびヘミセルロースの分解または糖化処理による生成物であってもよい。また、単糖、二糖、グリセロールなどの各種物質を含む混合物の例として、サトウキビ由来の廃糖蜜（スクロース、フルクトース、グルコースなどを含む）が挙げられる。グリセロールは、バイオディーゼル燃料製造の副産物として入手することもできる。炭素基質は、形質転換微生物に応じて適宜選択され得る。培地中の炭素基質の含有量は、その種類または用いる形質転換微生物に依存して適宜設定し得る。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．１（w/v）％〜３０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．１（w/v）％〜２０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．１（w/v）％〜１５（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．１（w/v）％〜１０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．５（w/v）％〜３０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．５（w/v）％〜２０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．５（w/v）％〜１５（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、０．５（w/v）％〜１０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、１（w/v）％〜３０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、１（w/v）％〜２０（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、１（w/v）％〜１５（w/v）％である。１つの実施形態では、培地中の炭素基質の含有量は、１（w/v）％〜１０（w/v）％である。炭素基質は、培地中に逐次添加してもよい。培地の炭素基質以外の組成は、用いる形質転換微生物の培養に通常用いる組成を用いることができる。
【００４９】
発酵工程では、宿主微生物に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。例えば、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。気泡塔型培養槽を用いた培養も用いられ得る。通気条件は、宿主微生物に依存して、嫌気条件下、微好気条件下、および好気条件などから適宜選択することができる。培養温度は、宿主微生物に依存して適宜選択し得、例えば、宿主微生物が大腸菌の場合、例えば、１５℃〜４６℃、好ましくは、２５℃〜４３℃の範囲、そして宿主微生物が放線菌の場合、例えば、２０℃〜３０℃、好ましくは、２６℃〜２８℃の範囲とすることができる。培養時間は必要に応じて設定され、そのような時間は宿主微生物に依存して適宜選択し得、例えば、宿主微生物が大腸菌の場合、例えば、１時間〜５日程度、好ましくは、１０時間〜３日程度、そして宿主微生物が放線菌の場合、例えば、２日〜２０日程度、好ましくは、４日〜１０日程度とすることができる。ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリなどを用いて適宜行うことができる。宿主微生物が大腸菌の場合、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。必要に応じて、イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）などの誘導因子を添加してもよい。放線菌の場合、チオストレプトン、カナマイシン、ネオマイシンなどの抗生物質を培地に添加、または寒天に含有させて培養プレートに重層してもよい。
【００５０】
発酵工程の実施により、形質転換微生物によってＰＡＢＡが生産される。発酵終了後、培養液からＰＡＢＡ含有画分を回収する工程、さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもでき、これらの工程およびそれらに要する手段は、当業者によって適宜選択される。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１：大腸菌におけるパラアミノ安息香酸生産の評価）
（１−１：大腸菌における各種パラアミノ安息香酸生合成酵素遺伝子の発現増強によるパラアミノ安息香酸生産の評価）
遺伝子の増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で行った。ＰＣＲの酵素にはPhusion Hot Start DNA Polymerase（FINNZYMES製）を用い、方法は取扱説明書に従った。なお、アニーリング温度は５０℃、サイクル数は２５とした。鋳型ＤＮＡには各種微生物のゲノムＤＮＡを用いた。クローニングした遺伝子、用いたプラスミドベクター、鋳型ＤＮＡの由来微生物、および遺伝子増幅のためのプライマーは表１〜３に示すものを用いた。
【００５３】
【表１】
2015000015.tif 000002
【００５４】
【表２】
2015000015.tif 000003
【００５５】
【表３】
2015000015.tif 000004
【００５６】
増幅した遺伝子を適当な制限酵素で一晩消化し、同様に消化したプラスミドベクターに定法に基づいて連結した後に大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。Ex Taq DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いたコロニーＰＣＲ法を行うことにより、形質転換体が目的の遺伝子を有するかどうか確認した。コロニーＰＣＲの反応液の調製および反応条件は、取扱説明書に従った。反応液にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１．５（ｗ／ｖ）％添加し、各コロニーを鋳型ＤＮＡとして用いた。プライマーには、プラスミドベクターのクローニングサイトの上流に位置するT7P（TAATACGACTCACTATAGGG：配列番号３５）、ACYCDuetUP1（GGATCTCGACGCTCTCCC：配列番号３６）、またはDuetUP2（TTGTACACGGCCGCATAATC：配列番号３７）と下流に位置するT7T（GCTAGTTATTGCTCAGCGG：配列番号３８）とのセットを用いた。得られた目的の形質転換体からの組換えプラスミドの調製には、PureYield Plasmid Miniprep System（プロメガ株式会社製）を用いた。
【００５７】
コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）YS-314のｐａｂＡＢ遺伝子（cepabAB、遺伝子記号ＣＥ１０５９、遺伝子登録番号ＢＡＣ１７８６９．１）の塩基配列を大腸菌発現用に最適化し（Operon社に委託）、cepabAB-MOD遺伝子を得た。cepabAB-MOD遺伝子の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列を配列番号３９および４０にそれぞれ示す。これらは、最適化前のcepabAB遺伝子の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列に対して、それぞれ７８％および１００％の配列同一性を有する。cepabAB-MOD遺伝子をｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴのNdeI-XhoIサイトに連結し、ｐＴＥＩ２３を得た（表３）。
【００５８】
ａｒｏＦ遺伝子に関しては、ｐＡＲＯ７（Komaら、Appl. Microbiol. Biotechnol，2012年，93巻，815-829頁）を鋳型とした。さらに、１４７番目のアスパラギン酸（ＧＡＴ）をアスパラギン（ＡＡＴ）に置換することでフィードバック阻害を脱感作したもの（aroFfbr）をクローニングした。
【００５９】
大腸菌の染色体ＤＮＡへの遺伝子導入は、「λ−ファージのＲｅｄ組換え酵素、酵母のフリパーゼ、およびＰ１ファージを用いた手法」（Komaら、Appl. Microbiol. Biotechnol，2012年，93巻，815-829頁）にて行った。すなわち、カナマイシン耐性遺伝子の下流に連結した目的遺伝子をλ−ファージのＲｅｄ組換え酵素を用いて大腸菌BW25113(DE3)株の染色体上に導入した（１遺伝子導入株）。つぎに、Ｐ１ファージを用いて複数の１遺伝子導入株の遺伝的形質を統合することで、多遺伝子導入株を作製した。必要に応じてカナマイシン耐性遺伝子を酵母のフリパーゼを用いて除去した。作製した組み換え体の遺伝子型を表４〜７に示す。
【００６０】
【表４】
2015000015.tif 000005
【００６１】
【表５】
2015000015.tif 000006
【００６２】
【表６】
2015000015.tif 000007
【００６３】
【表７】
2015000015.tif 000008
【００６４】
菌株をＬＢ−Ｇ培地（１Ｌあたり８ｇグルコース、１０ｇポリペプトン（日本製薬株式会社製）、５ｇ粉末酵母エキスD-3（日本製薬株式会社製）、１０ｇ塩化ナトリウム、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整）を用いて振とう培養機ＴＣ−３００（高崎科学器械株式会社製）で、２００ｒｐｍ、２７℃で１８時間前培養した。Ｍ９Ｍ培地（１Ｌあたり１０ｇグルコース、６ｇリン酸水素二ナトリウム、３ｇリン酸二水素カリウム、０．５ｇ塩化ナトリウム、２ｇ塩化アンモニウム、１ｍｍｏｌ硫酸マグネシウム、１０ｍｇチアミン、１００μｍｏｌ塩化カルシウム、５０μｍｏｌ硫酸鉄、１μｍｏｌ硫酸亜鉛、１μｍｏｌ塩化コバルト）に対して１％相当を植菌し、振とう培養機BioShaker FH23（タイテック株式会社製）で、２５０ｒｐｍ、３７℃で４時間培養した。４時間後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、振とう培養機ＴＣ−３００で、２００ｒｐｍ、２７℃でさらに４４時間培養した。
【００６５】
培養後、ＯＤ６６０、グルコース濃度、生産物量を測定した。ＯＤ６６０の測定には分光光度計UV-160A（株式会社島津製作所製）を用いた。グルコース濃度の測定にはグルコースCII−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いた。生産物量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。適当に希釈した培養液１ｍＬを１．５ｍＬチューブに入れ、ＨＰＬＣ用試料とするため２００μＬのメタノールと５０μＬの１Ｍ塩酸を混合し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後の上清をコスモナイスフィルター（ナカライテスク株式会社製）でろ過した後に分析に供した。カラムにはCOSMOSIL 5C18-MS-II 3.0×150mm（ナカライテスク株式会社製）を用いた。分析条件は次の通りとした。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液Ａ、０．１％トリフルオロ酢酸を含む８０容量％メタノール溶液を溶離液Ｂとし、溶離液ＡとＢの比率を５分間のグラジエントで８０：２０から０：１００とし、さらに溶離液Ｂを１５分間流した。流速は１ｍＬ／分とした。この条件下で、ＰＡＢＡは約３．４分後に溶出した。生産物の検出にはフォトダイオードアレイSPD-10A（株式会社島津製作所製）を用いた。ＰＡＢＡは２２２ｎｍ、チロシンは２２２ｎｍ、フェニルアラニンは２０６ｎｍの波長を用いて検出した。
【００６６】
Ｔ７プロモーターに連結した大腸菌由来のａｒｏＦｆｂｒ、ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、ｐａｂＣ遺伝子を大腸菌に導入し高発現させ、その時のＰＡＢＡ生産量を測定した。ａｒｏＦｆｂｒ、ｐａｂＡ、およびｐａｂＢ、または、ａｒｏＦｆｂｒ、ｐａｂＢ、およびｐａｂＣの３遺伝子を同時に高発現した場合にＰＡＢＡの蓄積が認められた（表８）。ａｒｏＦｆｂｒ、ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、およびｐａｂＣの４遺伝子を同時に高発現した場合に最も高いＰＡＢＡ生産が確認された。
【００６７】
【表８】
2015000015.tif 000009
【００６８】
（１−２：パラアミノ安息香酸シンターゼＰａｂＡＢ発現増強大腸菌による発酵におけるパラアミノ安息香酸生産）
大腸菌由来のｐａｂＡおよびｐａｂＢ遺伝子の染色体への導入コピー数について検討した。１〜３コピーの導入において、コピー数の増加に伴ってＰＡＢＡ生産量が増加した（表９）。
【００６９】
【表９】
2015000015.tif 000010
【００７０】
外来生物種由来のｐａｂＡおよびｐａｂＢホモログ遺伝子を染色体に導入した大腸菌におけるＰＡＢＡ生産を検討した。コリネバクテリウム・エフィシエンスのＰＡＢＡ合成系遺伝子cepabAB-MODを過剰発現するＰＡＢＡ−２５株において最も高いＰＡＢＡ生産量が観察された（表１０）。
【００７１】
【表１０】
2015000015.tif 000011
【００７２】
ＰＡＢＡ−２５株（コリネバクテリウム・エフィシエンスのＰＡＢＡ合成系遺伝子cepabAB-MODを過剰発現する）およびＰＡＢＡ−９株（大腸菌のＰＡＢＡ合成系遺伝子（ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、およびｐａｂＣ）を過剰発現する）について、生産速度解析を行った。
【００７３】
図１は、ＰＡＢＡ−９株（Ａ）およびＰＡＢＡ−２５株（Ｂ）の発酵培養の間のグルコースおよび発酵生産物の経時変化を示すグラフである。図中の記号は以下を表す：白丸  ＯＤ６６０；白三角  グルコース；黒丸  ＰＡＢＡ；黒三角  フェニルアラニン；および黒四角  チロシン。「ｒp，max」は最大容量生産速度（Maximum volumetric productivity、培養容量単位時間あたりのＰＡＢＡ生産量：μｍｏｌ・Ｌ−１・分−１）を表し、「ｑp，max」は最大比生産速度（Maximum specific productivity、菌体（ＣＤＷ）単位時間あたりのＰＡＢＡ生産量：μｍｏｌ・ｇ−１ＣＤＷ・分−１）を表す。その結果、ＰＡＢＡ−２５株は、ＰＡＢＡ−９株と比較して、菌体のＰＡＢＡ生産能力を表す指標の一つである最大比生産速度（ｑｐ，ｍａｘ）は９倍であった。
【００７４】
（１−３：パラアミノ安息香酸シンターゼＰａｂＡＢ発現増強大腸菌による発酵条件の検討）
ＰＡＢＡ−９株およびＰＡＢＡ−２５株を、Ｍ９Ｍ培地および２Ｍ９Ｍ−Ｙ培地（Ｍ９Ｍ培地のリン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、および塩化アンモニウム濃度を２倍とし、１（ｗ／ｖ）％粉末酵母エキスD-3を添加したもの）で培養し、ＰＡＢＡ生産量を比較した（表１１）。前培養した菌株を培地に１％相当植菌し、３７℃で２時間（２Ｍ９Ｍ−Ｙ培地の場合）または４時間（Ｍ９Ｍ培地の場合）培養した。１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して、２７℃または３７℃で、培養開始から４８時間後まで培養した。両株ともに２Ｍ９Ｍ−Ｙ培地を用いて２７℃で培養した時にＰＡＢＡの生産量は向上した。ただし、２Ｍ９Ｍ−Ｙ培地を用いても、３７℃で培養した場合には生産量は大幅に低下した。
【００７５】
【表１１】
2015000015.tif 000012
【００７６】
２Ｍ９Ｍ−Ｙ培地でのＰＡＢＡ生産量が高かったことから、本培地を用いてグルコースと塩化アンモニウムを逐次添加しながらＰＡＢＡ−２４株（コリネバクテリウム・エフィシエンスのＰＡＢＡ合成系遺伝子cepabAB-MODを過剰発現する）を培養した。なお、培養液量は１００ｍＬとし、培養栓にはキャップタイプのシリコセンを用いた。ＬＢ−Ｇ培地で前培養した菌株を２Ｍ９Ｍ−Ｙ培地に１％相当植菌し、３７℃で２時間培養した。１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２７℃でさらに培養した。なおその際に、培地にはｐＨの低下を防ぐ目的で５（ｗ／ｖ）％炭酸カルシウムを添加した。培養液のＯＤ６６０とグルコース濃度を適時測定しながら、表１２に示すように、グルコース（「Ｇｌｃ」）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）および粉末酵母エキスD-3の添加を行った。この培養を便宜上「第１の培養」という。第１の培養におけるグルコース消費およびＰＡＢＡ生産の経時変化を図２の（Ａ）に示す。
【００７７】
【表１２】
2015000015.tif 000013
【００７８】
その結果、ＯＤ６６０は２６程度まで増加し、１０ｍＭ以上のＰＡＢＡ生産量を確認した（図２（Ａ））。しかしながら、２４時間以降ＯＤ６６０の増加は見られず、ＰＡＢＡのさらなる生産も観察されなかった。
【００７９】
通気量を増やすために培養液量を２０ｍＬに減らし、さらに培養栓を綿栓に変更し、表１３に示すように、グルコース（「Ｇｌｃ」）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）および粉末酵母エキスD-3を逐次添加して培養した。この培養を便宜上「第２の培養」という。第２の培養におけるグルコース消費およびＰＡＢＡ生産の経時変化を図２の（Ｂ）に示す。
【００８０】
【表１３】
2015000015.tif 000014
【００８１】
その結果、ＯＤ６６０は６０に達し、ＰＡＢＡ生産量は３０ｍＭに達した（図２（Ｂ））。
【００８２】
なお、図２は、ＰＡＢＡ−２４株を用いた第１の培養（Ａ）および第２の培養（Ｂ）におけるグルコースおよび発酵生産物の経時変化を示すグラフであり、図中の記号は以下を表す：白丸  ＯＤ６６０；白三角  グルコース；黒丸  ＰＡＢＡ；黒三角  フェニルアラニン；および黒四角  チロシン。
【００８３】
（１−４：パラアミノ安息香酸シンターゼＰａｂＡＢ発現増強大腸菌による種々の炭素基質を用いた発酵におけるパラアミノ安息香酸生産）
ＰＡＢＡ−２５株を５ｍＬのＬＢ−Ｇ培地で前培養し、Ｍ９Ｍ培地のグルコースを以下の表１４および１５に示す炭素基質に変更した培地５ｍＬに、１％相当の前培養した菌株を植菌し、３７℃で４時間培養した。終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２７℃でさらに７日間培養し、３日目および７日目にサンプリングした。菌の増殖（ＯＤ６６０）を分光光度計で測定し、生産物量をＨＰＬＣで定量した。３日目の結果を表１４および７日目の結果を表１５に示す。
【００８４】
【表１４】
2015000015.tif 000015
【００８５】
【表１５】
2015000015.tif 000016
【００８６】
ガラクトース、キシロース、およびマルトースを用いた場合は、グルコースを用いた場合（５．１ｍＭ）と同程度のＰＡＢＡの生産を確認した。グリセロールまたはフルクトースを用いた場合は、培養時間を延長することにより、グルコースとほぼ同等のＰＡＢＡ生産量であった。スクロースを用いた場合は、ＰＡＢＡの生産量が低かったが、これは、スクロースを分解しにくいためと考えられる。アラビノース、セロビオース、およびラクトースは、本実施例にて使用した株ではこれらの糖を利用できず、菌株が増殖せず、ＰＡＢＡの生産がみられなかった。本来大腸菌はアラビノースおよびラクトースを利用できるが、用いた菌株の遺伝子型がΔaraBADAH33（アラビノース利用能欠失）およびΔlacZWJ16（βガラクトシダーゼ活性欠失）であったためである。
【００８７】
（実施例２：放線菌におけるパラアミノ安息香酸生産の評価）
（２−１：放線菌における各種パラアミノ安息香酸生合成酵素の発現増強によるパラアミノ安息香酸生産の評価）
大腸菌からのプラスミド調製を含め、遺伝子操作技術全般はMolecular Cloning A Laboratory Manual 2nd Edition (1989)に従い、放線菌の遺伝子操作技術はPractical Streptomyces Genetics (John Innes Foundation,2000)に従った。ＰＣＲ全般にはKOD FX DNA polymerase（東洋紡株式会社製）を使用し、目的ＤＮＡのゲルからの切り出し、抽出および精製にはWizard SV Gel Extraction Kit（Promega社製）を使用した。入手先を特に記載していない材料としては、当業者が通常入手可能なものを使用した。
【００８８】
遺伝子操作に用いた大腸菌は、E.coli Novablueであり、放線菌遺伝子発現に用いた放線菌−大腸菌シャトルベクターは、pUC702-promoter-PLD（Ogino Cら、Appl. Microbiol. Biotechnol.、2004年、第64巻、第6号、823-828頁：ストレプトベティシリウム・シナモネウムのゲノムから得られたホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子およびプロモーター領域（ＰＬＤプロモーター）、シグナル領域、ターミネーター領域をpUC702へ組込んだプラスミド）から成熟ＰＬＤを切り出し、pUC702-universalとして用いた。用いた宿主放線菌は、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）１３２６株（ＮＢＲＣ  １５６７５）である。
【００８９】
各種放線菌のゲノムからパラアミノ安息香酸生合成酵素遺伝子を選択した。これらの放線菌に由来するパラアミノ安息香酸生合成酵素遺伝子は、公開されている放線菌ゲノム情報ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ５７８０１，ＰＲＪＮＡ２４２）、ストレプトマイセス・グリセウス  グリセウス亜種ＮＢＲＣ１３３５０ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ５８９８３，ＰＲＪＤＡ２００８５）、ストレプトマイセス・アベルミチリスＭＡ−４６８０ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ５７７３９，ＰＲＪＮＡ１８９）、サッカロポリスポラ・エリスレアＮＲＲＬ２３３８ゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＰＲＪＮＡ６２９４７，ＰＲＪＥＡ１８４８９）、およびGenome Project of Streptomyces avermitilis、http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp/）に基づいて選択した。
【００９０】
以下の表１６に示すパラアミノ安息香酸生合成酵素遺伝子を選択した。上の２種はｐ−アミノ安息香酸シンターゼをコードする遺伝子ｐａｂＡＢであり、下の２種はｐ−アミノデオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子ｐａｂＣ２である。ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis、「ＳＡＶ」）MA-4680のゲノム情報よりｐａｂＡＢ（遺伝子番号ＳＡＶ１１７８）およびｐａｂＣ２（遺伝子番号ＳＡＶ６８５２）、サッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopolyspora erythraea、「ＳＡＣＥ」）ＮＲＲＬ２３３８のゲノム情報よりｐａｂＡＢ（遺伝子番号ＳＡＣＥ４０３６）、そしてストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus、「ＳＧＲ」）ＩＦＯ１３３５０のゲノム情報よりｐａｂＣ２（遺伝子番号ＳＧＲ６０３６）を選択した。
【００９１】
放線菌のゲノムの抽出のために、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）より、ストレプトマイセス・グリセウスのグリセウス亜種ＮＢＲＣ１３３５０、ストレプトマイセス・アベルミチリスＮＢＲＣ  １４８９３、ストレプトマイセス・ビオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）ＮＢＲＣ  １５１４６（ストレプトマイセス・アベルミチリスＡ３（２）に相当）、サッカロポリスポラ・エリスレアＮＢＲＣ  １３４２６を入手し、ＮＢＲＣの記述に従う懸濁培地および培養培地を用い、トリプケースソイブイヨン（ＴＳＢ）培地（Becton, Dickinson and Co.,製）１０ｍＬを含むコイル入り試験管内で２８℃、１８０ｒｐｍにて３〜５日培養した。ゲノム抽出はWizard SV Gel Extraction Kit（Promega社製）を用いて行った。
【００９２】
それぞれ対応するプライマー対を用いてＰＣＲ法により単離し、得られた各種遺伝子を、対応する制限酵素で消化したプラスミドベクターpUC702-universalにIn-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック製）を用いて挿入した。一例として、ＳＡＣＥ４０３６の場合、プライマー対IF-SACE4036-BamHI-F5：TTCGTTTAAGGATGCAGGATCCATGCGGACACTGATCATCGACAAC（配列番号４１）およびIF-SACE4036-SphI-R5：GGCGCTCAGTCGTCTCAGCATGCTCACGAGGCCACCTCCGCCTTGT（配列番号４２）を用いてＰＣＲ法により単離し、得られた遺伝子ＳＡＣＥ４０３６を、対応する制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ（New England Biolab社製）で消化したプラスミドベクターに挿入した。それぞれ得られたプラスミドベクターを表１６中のプラスミド名の通り命名した。
【００９３】
【表１６】
2015000015.tif 000017
【００９４】
上記プラスミドベクターを放線菌ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株（ＮＢＲＣ  １５６７５）に導入して形質転換を行った。形質転換体は、Ｒ２ＹＥ培地で１日培養後、ベクターが保有する選択マーカーに対応する薬剤チオストレプトン（２００μｇ／ｍＬ）を含む０．７％アガー３ｍＬをＲ２ＹＥ培地３０ｍＬに重層させた選択培養によって取得した。放線菌の培養および形質転換体の取得（プロトプラスト融合法）は特開２０１１−２２３９８１号公報に記載と同様の方法により行った。
【００９５】
上記各プラスミドベクターを導入して得られた各放線菌形質転換体を、チオストレプトン（Ｔｓ）５μｇ／ｍＬを含むトリプケースソイブイヨン（ＴＳＢ：Becton, Dickinson and Co.,製）培地５ｍＬを入れた試験管中で２８℃、２００ｒｐｍにて３日間培養した（前培養）。次いで、これらの放線菌形質転換体を５％（w/v）グルコースおよび２０μｇ／ｍＬチオストレプトンを添加したＴＳＢ培地１０ｍＬおよびコイルを入れた試験管内で２８℃、２００ｒｐｍにて１２日間培養した後、培養上清を回収し、ＨＰＬＣに供した。ＰＡＢＡについて、ＨＰＬＣシステムProminence（株式会社島津製作所製）にて、カラムはChorester 4.6μm I.D.×150mm（ナカライテスク株式会社製）を用い、２０容量％メタノールおよび０．１容量％酢酸緩衝液を溶媒とし、カラム温度３０℃および流速１．０ｍｌ／分で分離し、紫外部吸光検出系SPD-20A（株式会社島津製作所製）によりＵＶ２５４ｎｍの波長で検出した。
【００９６】
表１６のいずれのプラスミドを用いて形質転換した放線菌ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株においても、ＰＡＢＡの生産を確認した。
【００９７】
図３は、サッカロポリスポラ・エリスレア（ＳＡＣＥ）由来ＰａｂＡＢを発現増強するように形質転換したストレプトマイセス・リビダンス１３２６株（本明細書中においては、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）ともいう）のＨＰＬＣのクロマトグラムである。最上部がＰＡＢＡサンプルであり、上から２番目（「ＳＡＣＥ４０３６（Ｓ１２）」）および３番目（「ＳＡＣＥ４０３６（Ｓ１５）」）が、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）の結果を表す。矢印の位置は、ＰＡＢＡのピークの位置を示す。図３より明らかなように、ＳＡＣＥ４０３６（Ｓ１２）およびＳＡＣＥ４０３６（Ｓ１５）ともに、ＰＡＢＡのピークを確認した。
【００９８】
（２−２：パラアミノ安息香酸シンターゼＰａｂＡＢ発現増強放線菌によるグルコースを炭素基質とする発酵におけるパラアミノ安息香酸生産）
表１６のサッカロポリスポラ・エリスレア（ＳＡＣＥ）由来ＰａｂＡＢを発現するように形質転換したストレプトマイセス・リビダンス１３２６株について、フラスコ内での培養にてグルコースを炭素基質とする発酵によるＰＡＢＡ生産量を観察した。コントロール株として、pUC702を空ベクターとして形質転換した放線菌ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株を用いた。
【００９９】
ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株およびコントロール株を上記２−１と同様に前培養を行った後、５％グルコースおよび２０μｇ／ｍＬチオストレプトンを添加したＴＳＢ培地３０ｍＬを含むフラスコ内で２８℃、２００ｒｐｍにて９日間培養した（本培養）。本培養を開始した翌日から毎日培養上清を回収し、ＨＰＬＣに供した。ＰＡＢＡについては上記２−１と同様にして検出し、グルコースについては、Shim-pack SPR-Pb（7.8mm×250mm、株式会社島津製作所製）を用いて、水を溶媒とし、カラム温度８０℃および流速０．６ｍＬ／分で分離し、示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製）を用いて検出した。
【０１００】
図４は、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株およびコントロール株のそれぞれについて、炭素基質として５％（ｗ／ｖ）グルコースを添加したＴＳＢ培地で培養した発酵における培養上清中のＰＡＢＡ濃度（ｍＭ）の経日変化を示すグラフである。黒四角はストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株のＰＡＢＡ生産量（ｍＭ）、そして白四角はコントロール株のＰＡＢＡ生産量（ｍＭ）を表す。そして黒三角はストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株のグルコース消費量（ｇ／Ｌ）もまた併せて示す（図４中の黒三角）。
【０１０１】
図４より明らかなように、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株は、コントロール株と比較して３倍強のＰＡＢＡ生産量を示した。ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）は、５０ｇ／Ｌグルコースを用いた培養５日後にはグルコースを全て消費し、最終的にグルコース１ｇ当たりで換算して０．２２重量％のＰＡＢＡを生産した。
【０１０２】
（２−３：パラアミノ安息香酸シンターゼＰａｂＡＢ発現増強放線菌による種々の炭素基質を用いた発酵におけるパラアミノ安息香酸生産）
ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株について、上記２−２と同様に前培養を行った後、４（ｗ／ｖ）％各種炭素基質および２０μｇ／ｍＬチオストレプトンを添加したＴＳＢ培地２５ｍＬを含む２００ｍＬ容量のバッフル付きフラスコ内にて２８℃および１８０ｒｐｍの条件下にて１０日間本培養を行って発酵させ、発酵開始から１日毎に培養上清を採取し、採取した上清をＨＰＬＣに供し、ＰＡＢＡ濃度を測定した。以下の炭素基質を用いた：グルコース、マルトース、スクロース、フルクトース、グリセロール、ガラクトース、セロビオース、アラビノースおよびキシロース。セロビオースについては、１（ｗ／ｖ）％炭素基質および２０μｇ／ｍＬチオストレプトンを添加したＴＳＢ培地２５ｍＬを用いた。結果を図５に示す。
【０１０３】
図５は、炭素基質としてグルコース（Ａ）、マルトース（Ｂ）、スクロース（Ｃ）、フルクトース（Ｄ）、グリセロール（Ｅ）、ガラクトース（Ｆ）、アラビノース（Ｇ）、セロビオース（Ｈ）およびキシロース（Ｉ）を用いた場合について、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株およびコントロールのストレプトマイセス・リビダンス株のそれぞれの培養による発酵における培養上清中のＰＡＢＡ濃度（ｍＭ）の経日変化を示すグラフである。黒丸は、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株のＰＡＢＡ生産量（ｍＭ）、そして白丸はコントロール株のＰＡＢＡ生産量（ｍＭ）を表す。
【０１０４】
図５より明らかなように、ストレプトマイセス・リビダンス（ＳＡＣＥ４０３６）株は、用いたいずれの炭素基質においても、経時的にＰＡＢＡの生産増大を示した。特に、フルクトースおよびグリセロールにおいて、グルコースと比較して顕著に高い生産量を示した。ガラクトースにおいても、グルコースと比較して高い生産を示した。セロビオース、アラビノース、およびキシロースなどのバイオマス由来糖を用いた場合においても、ＰＡＢＡの生産を観察することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
パラアミノ安息香酸は、繊維・化学品原料として有用な物質であり、ビルディングブロックとして活用が期待される。本発明の方法によれば、宿主微生物の発酵を利用することにより、生物による安全な方法で、比較的安価にパラアミノ安息香酸を生産することが可能となる。放線菌、大腸菌などの宿主微生物を用いることにより、原料物質として、単糖、二糖などの糖に加え、さらにグリセロールのような糖以外の炭素基質を使用することが可能である。植物バイオマスに由来する物質を原料に有効に用いることができる。また、廃糖蜜を原料に用いることが期待される。グリセロールは、バイオディーゼル燃料製造の副産物として生成されるが、廃棄されることが多く、本発明によりグリセロールの有効な用途も広がる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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