(57)【要約】【課題】清酒酵母を用いた従来の醸造工程に改良を加えて、清酒酵母が生産するチオレドキシンを高濃度に含有する清酒、その他の醸造酒類、発泡性酒類、混成酒類等の酒類、又は発酵調味料の製造方法を提供する。【解決手段】清酒酵母を用いて酒類又は発酵調味料を醸造する工程において、醪の製造工程において、通常の醪発酵期間に２〜３日の追加発酵期間を付加し、該追加発酵期間を経た後に上槽することによって、上槽前の酵母死滅率が１０％以上となるように醪仕込みを行う。この仕込み条件には、使用酵母、品温経過、発酵中のアルコール濃度、及び発酵期間が含まれる。追加発酵期間によって醪のアルコール濃度を通常より高くし、より多くのアルコールストレスを清酒酵母に与えることにより、より多くのチオレドキシンを菌体外に放出させ、チオレドキシン高含有の酒類及び発酵調味料を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
清酒酵母を用いて製造する酒類又は発酵調味料の製造方法にあって、
醪の製造工程において、通常の醪発酵期間に２〜３日の追加発酵期間を付加し、前記追加発酵期間を経た後に上槽することによって、上槽前の酵母死滅率を１０％以上にすることを特徴とする酒類又は発酵調味料の製造方法。
【請求項２】
前記通常の醪発酵期間の終了時にアルコールを添加し、前記アルコールの添加後、前記追加発酵期間を経た後に上槽することによって、上槽前の酵母死滅率を増加させることを特徴とする請求項１に記載の酒類又は発酵調味料の製造方法。
【請求項３】
前記追加発酵期間の品温を１６〜２０℃にすることを特徴とする請求項１又は２に記載の酒類又は発酵調味料の製造方法。
【請求項４】
通常の醪発酵期間の末期に品温を１６〜２０℃にし、前記追加発酵期間を経た後に上槽することを特徴とする請求項１に記載の酒類又は発酵調味料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオレドキシンを高含有する清酒、その他の醸造酒類、発泡性酒類、混成酒類等の酒類及び発酵調味料を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、生体の酸化還元関連分子を制御し、抗ストレスタンパクでもあるチオレドキシンが注目されている。チオレドキシンの酸化還元活性を応用して、各種アレルゲンの中和、アレルギー予防、転写因子ＡＰ−１の活性化、皮質改善、粘膜障害保護、炎症疾患の予防又は治療を図る様々な技術が提案されている（例えば、特許文献１，２を参照）。食品又は医薬品用のチオレドキシンの製造には、長年に亘って食品に利用されている酵母を使用することが望ましいと考えられる（例えば、特許文献３を参照）。
【０００３】
上記特許文献１には、チオレドキシンを機能性食品素材として利用するために、酵母の培養においてストレス負荷を与え、酵母細胞中のチオレドキシン含有量を増加させる酵母の製造方法が開示されている。ストレス負荷とは、酵母に対して生理的条件と異なる生物学的刺激、生化学的刺激、化学的刺激、物理的刺激等を与えることであり、培地中に茶成分を添加して負荷培養する方法が例示されている。
【０００４】
上記特許文献２には、チオレドキシン高含有酵母からチオレドキシンを迅速かつ簡便に調製する方法が開示されている。この方法では、チオレドキシン高含有酵母の菌体を破砕して得た酵母抽出液を、限外濾過液を用いて濾過することにより、チオレドキシンを高濃度に含有する画分を分離する。
【０００５】
上記特許文献３には、同様に酵母から高純度のチオレドキシンを簡便かつ効率的に製造する方法が開示されている。この方法は、酵母の培養工程、チオレドキシンを酵母の菌体外に放出させる工程、及びチオレドキシンの回収工程とから構成される。この方法によれば、チオレドキシンは、酵母に対してストレス負荷処理を行うことにより、酵母を破砕することなく、酵母菌体外に選択的に放出させることができ、夾雑タンパク質の混在を大幅に低減して、高純度のチオレドキシンが得られる。ストレス負荷処理は、有機溶媒ストレス、ｐＨストレス、浸透圧ストレス、熱ストレス、酸素濃度ストレス、炭素源濃度ストレス、紫外線曝露、窒素源濃度ストレス、電気刺激等の細胞刺激を酵母に与えることにより行われる。
【０００６】
上記特許文献３の方法で使用する酵母は、チオレドキシン産生能を有する限り特に制限されないが、パン酵母、ビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母、醤油酵母等の食用酵母が安全なことから望ましい。清酒酵母については、２０％エタノール処理又は低ｐＨショックによるストレス負荷のいずれにおいても、チオレドキシンが菌体外に放出されることを確認したと報告されている。更に、清酒醸造の醪工程で、留後の培養液をサンプリングしたところ、留後２０日頃以降の発酵後期に培養液中のチオレドキシン漏出量が増加したことが確認されている。これは、酵母が産生したアルコールが発酵後期に培地に蓄積してストレス要因となり、チオレドキシンを選択的に酵母菌体外に放出したことを示している。
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−６７８１３号公報
【特許文献２】特開２００６−６７８５０号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００７／０３２４９０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
通常の醸造工程により製造される清酒等の醸造酒は、上述したアルコール抽出効果等による酵母由来のチオレドキシンを含有している可能性がある。しかしながら、現状では、製品酒中にチオレドキシンがほとんど含まれていない。
【０００９】
清酒醸造では、酵母や麹の働きにより米に含まれるデンプンを糖化し、更に糖質を発酵させることによりアルコールが生産され、得られた熟成もろみをそのまま又は醸造アルコールを添加して圧搾することにより、清酒を製造する。更に清酒醸造では、活性炭ろ過、限外ろ過、加熱殺菌、オリ下げ(除タンパク)処理等、目的とする製品酒に合わせて様々な処理が行われている。
【００１０】
本願発明者らは、このような清酒の仕込み方法や上槽後の様々な処理工程が、製品酒中にチオレドキシンがほとんど含まれていないようにしていると考えた。従来の清酒醸造方法において、その各工程でチオレドキシンの検出を行ったところ、次のような結果が得られた。先ず、チオレドキシンは上槽酒側に十分に抽出されず、大部分が酵母菌体内に蓄積されていることが分かった。更に、上槽酒中に抽出されたチオレドキシンも、製品酒中にはほとんど含まれておらず、活性炭ろ過、オリ下げ処理、限外ろ過等の各処理で減少したことが分かった。また、清酒等の酒類は、酒税法の適用によりチオレドキシン等の有効成分を添加できないので、チオレドキシン高含有酒の製造は実際上困難である。
【００１１】
そこで、本発明は、上述した従来の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、酵母を用いて清酒、その他の酒類、又は発酵調味料を醸造する従来の工程に改良を加えることにより、酵母が生産するチオレドキシンを高濃度に含有する清酒、その他の酒類、又は発酵調味料の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、清酒醸造において仕込み条件や各工程の処理条件を様々に変化させ、製品酒中に抽出され又は酵母菌体から放出されたチオレドキシンの検出を確認した。その結果は次のとおりである。
【００１３】
１．仕込み条件の異なる様々な貯蔵酒について、チオレドキシン（ＴＲＸ）含量を調査した。各貯蔵酒２００μＬからトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットによりチオレドキシンの検出を行い、検出したチオドキシンのバンドをデンシトメトリーにより数値化して比較した。その結果を以下の表１及び表２に示す。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
【表２】
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【００１６】
この結果から、清酒中に含まれるチオレドキシン含量は、仕込みの種類により、アルコール度数、使用酵母、使用白米の精米歩合、発酵醪の成分、醪末期での酵母死滅率が異なることによって、大きく差異を生じることが判明した。特に、表１ではNo.６，７の純米酒、No.１０の本醸造酒、表２ではNo.１４，１５の本醸造酒、No.１７〜２０の山廃仕込酒、辛口酒、普通酒は、チオレドキシン含量が高い。これに対し、表１のNo.１の大吟醸酒、No.２の純米大吟醸酒のように比較的低温で発酵させる清酒は、チオレドキシン含量が低い。これは、使用酵母や発酵温度等の発酵条件がチオレドキシン含量に与える影響が大きいことを示している。
【００１７】
また、同じ酵母を使用した純米酒（表１のNo.４〜９）でも、チオレドキシン含量が異なることが分かった。普通酒では、アルコール耐性を付与した酵母Ｄを使用したもの（表２のNo.２１，２３〜２５）は、チオレドキシン含量が低く、醪中のアルコール含量を低く維持して発酵を行った糖質カット酒（表１のNo.１３，表２のNo.２２）も、チオレドキシン含量が低くなることが分かった。これらは、上槽前の酵母死滅率が約２％以下のアルコール耐性酵母の使用、及び／又は低温経過による仕込みを避けることが、チオレドキシン高含有の清酒醸造に好ましいことを示している。
【００１８】
２．表１及び表２においてチオレドキシン含量が高かった辛口酒（表２のNo.１９）及び普通酒Ａ（表２のNo.２０）を用い、同じ種別間でロットの違いによるチオレドキシン含量について調査した。チオレドキシンの検出は、各貯蔵酒５０μＬからトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表３に示す。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
この結果から、同じ種別の清酒でも、ロットによってチオレドキシン含量が相違することが分かった。特に、醪末期のアルコール度数及び醪積算温度の双方が高い仕込みの場合（表３のNo.４，８）に、チオレドキシン含量が高くなった。また、酵母死滅率の高い仕込みの方がチオレドキシン含量が高くなる傾向が認められる。特に上槽前の酵母致死率が１０％以上であると、チオレドキシン含量が大幅に増加するので好ましい。
【００２１】
このように醪末期に酵母死滅率が高い醪を使用した普通酒では、酵母から放出されるチオレドキシンが多量となり、その結果、貯蔵酒中に多量のチオレドキシンが含まれていると考えられる。これらは、醪末期に酵母を死滅させる条件、即ち醪中のアルコール含量を高めたり醪の温度を高めることなどによって、チオレドキシン高含有の清酒が得られることを示している。
【００２２】
３．アルコール添加酒の場合、アルコール添加後すぐに上槽を行うのが通例である。ここでは、アルコール添加後にチオレドキシンの抽出期間として数日間置いて、アルコール添加が上槽酒へのチオレドキシン抽出にどの程度効果があるかを検討した。本醸造酒の醪をアルコール添加後に品温１２℃、１６℃、２０℃の条件で抽出期間を０〜２日間として、遠心分離による上槽を行った。チオレドキシンの検出は、各上槽酒２０μＬからサンプルを調製し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表４に示す。
【００２３】
【表４】
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【００２４】
この結果から、抽出期間をおくことによって、チオレドキシン含量が大幅に増加することを確認した。更に、抽出期間の品温が高い方が、日数も多い方がチオレドキシンの抽出量は増加した。これは、アルコール添加酒では、アルコール添加後に醪を上槽する前に１〜４日間の抽出期間を置くことによって、その際に品温を高くすることによって、チオレドキシン含量を大幅に増加させ得ることを示している。
【００２５】
４．表１及び表２において同じ使用酵母の純米酒でもチオレドキシン含量に差異が認められることから、その原因として、上槽酒のろ過工程でチオレドキシンが活性炭に吸着されるのではないかと考え、活性炭添加量がチオレドキシン含量に与える影響を検討した。異なる供給者から入手した市販の２種の活性炭（Ａ炭、Ｂ炭）を、添加量を変えて清酒（生酒）に添加し、室温で１時間接触させた後、ろ過により活性炭を取り除いてサンプルを得た。活性炭添加量が異なる各サンプルと活性炭無添加のサンプル（対照）とについて、ウェスタンブロットによりチオレドキシン含量を検討した。その結果を以下の表５に示す。
【００２６】
【表５】
2015177782.tif 000006
【００２７】
この結果、活性炭の添加量が増加するに連れて、チオレドキシン含量が大幅に減少することが認められた。別個の供給者から入手した種類の異なる活性炭（Ａ炭、Ｂ炭）のいずれも、ほぼ同様の試験結果を示した。これは、上槽酒中のチオレドキシンが活性炭に大幅に吸着されたことを示している。従って、チオレドキシン高含有酒を得るためには、活性炭ろ過を省略し又は活性炭添加量を必要最少限に抑えることが好ましい。
【００２８】
５．活性炭ろ過以外の原酒処理工程として、オリ下げ処理によるチオレドキシン含量の変化を検討した。オリ下げ操作は通例、貯蔵酒を製品化する際に、製品貯蔵中にタンパク質が沈澱するのを防ぐために行う除タンパク操作である。表２においてチオレドキシン含量が高かった辛口酒を使用し、オリ下げ処理前後のチオレドキシン含量をウェスタンブロットにより解析した。No.１をオリ下げ前、No.２をオリ下げ後、No.３を製品酒とし、各サンプル酒１ｍＬを用いてウェスタンブロットによるチオドキシン含量の比較を行った。その結果を以下の表６に示す。
【００２９】
【表６】
2015177782.tif 000007
【００３０】
この結果、オリ下げ処理を行うと、チオレドキシン含量が大幅に減少することが分かった。オリ下げ処理は、夾雑タンパクが大幅にカットされる点で有効であるが、それと同時にチオレドキシンもカットされることになる。従って、チオレドキシン高含有酒を得るためには、オリ下げ処理を省略することが好ましい。
【００３１】
６．別の原酒処理工程として、分画分子量１００００Ｄａの限外（ＵＦ）ろ過によるチオレドキシン含量の変化を検討した。限外ろ過は通例、生酒や生貯蔵酒等を製造する際に、常温流通できる安定な製品とするために酵素等のタンパク質を取り除く処理である。普通酒の上槽酒３００ｍＬを用いて限外ろ過を行い、そのろ液を２７０ｍＬ、濃縮液を３０ｍＬ回収した。上槽酒、限外ろ過後ろ液、及び限外ろ過後濃縮液のチオレドキシン含量をウェスタンブロットにより解析した。No.１を上槽酒、No.２を限外ろ過後ろ液、No.３を限外ろ過後濃縮液とし、各サンプル酒１ｍＬを用いてウェスタンブロット用のサンプルを調製した。その結果を以下の表７に示す。
【００３２】
【表７】
2015177782.tif 000008
【００３３】
この結果から、活性炭添加量を少なくしたことで活性炭ろ過によるチオレドキシンの減少は抑えられたが、チオレドキシンは限外ろ過後の濃縮液側に強く検出され、限外ろ過により酒中のチオレドキシンが限外ろ過膜にトラップされたことが明らかである。従って、チオレドキシン高含有酒を得るためには、限外ろ過を省略することが好ましい。
【００３４】
逆に、限外ろ過膜を適当に選択して濃縮することによって、清酒中のチオレドキシン含量を増加させ得ることが分かった。例えば、チオレドキシンよりも小さい分画分子量１００００Ｄａ以下の限外ろ過膜を用いることにより、チオレドキシンを高含有する清酒を製造することが可能である。
【００３５】
７．清酒以外の酒類（ビール、発泡酒、雑種類、その他発泡性酒類、米・米麹を原料とした清酒タイプの発酵調味料、米焼酎（乙類））に含まれるチオレドキシン含量を調査した。チオレドキシンの検出は、これら酒類の各貯蔵酒４００μＬ（発泡性の酒類は４００ｍｇ）からトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表８に示す。
【００３６】
【表８】
2015177782.tif 000009
【００３７】
この結果から、チオレドキシン含量に差は認められたが、発泡性酒類や清酒タイプの発酵調味料の市販酒中にもチオレドキシンが含まれることが確認された。特に清酒醪を原料とした発酵調味料には、多量のチオレドキシンが含まれていることが分かった。他方、蒸留酒である焼酎は、チオレドキシンが全く検出されなかった。これらの結果から、清酒に関する上記知見は、清酒以外の醸造酒類、発泡性酒類及び発酵調味料についても同様に適用できると考えられる。
【００３８】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
本発明によれば、上記目的を達成するために、清酒酵母を用いて製造する酒類又は発酵調味料の製造方法にあって、
醪の製造工程において、通常の醪発酵期間に２〜３日の追加発酵期間を付加し、前記追加発酵期間を経た後に上槽することによって、上槽前の酵母死滅率を１０％以上にすることを特徴とする酒類又は発酵調味料の製造方法が提供される。
【００３９】
通常の醪発酵工程では、醪中の発酵が進み過ぎると、製成酒及び発酵調味料の品質が低下するので、このような追加発酵期間を付加することは行われない。本発明の方法では、付加された追加発酵期間の間、醪中の清酒酵母が、高いアルコール濃度によるアルコールストレスを受けるので、酵母菌体内のチオレドキシンが効率良く菌体外に放出される。それにより、チオレドキシン高含有の清酒、その他の醸造酒類、発泡性酒類、混成酒類等の酒類又は発酵調味料を製造することができる。
【００４０】
或る実施例では、前記通常の醪発酵期間の終了時にアルコールを添加し、該アルコールの添加後、追加発酵期間を経た後に上槽することによって、上槽前の酵母死滅率を増加させる。通常、アルコール添加酒は、アルコール添加後に日数を置くと、製成酒及び発酵調味料の品質が低下するので、アルコール添加後直ぐに上槽する。本発明の方法では、アルコール添加と追加発酵期間の付加により、清酒酵母に与えるアルコールストレスをより大きくすることによって、より多量のチオレドキシンを酵母から抽出することができる。
【００４１】
別の実施例では、追加発酵期間の品温を１６〜２０℃にする。通常の醪発酵工程では、品温を１６〜２０℃に高くすると、製成酒及び発酵調味料の品質が低下するので、このようなことは行わない。本発明の方法では、清酒酵母にアルコールストレスに加えて熱ストレスを与えることによって、更により多量のチオレドキシンを酵母から抽出することができる。
【００４２】
更に別の実施例では、通常の醪発酵期間の末期に品温を１６〜２０℃にし、追加発酵期間を経た後に上槽する。通常の醪発酵工程では、通常の醪発酵期間の末期に品温を１６〜２０℃に高くすると、製成酒及び発酵調味料の品質が低下するので、このようなことは行わない。本発明の方法では、発酵の進んだ醪末期から品温を高くして、清酒酵母に熱ストレスを与えることによって、より多量のチオレドキシンを酵母から抽出し、高いチオレドキシン含量の酒類又は発酵調味料を製造することができる。
【００４３】
また、本発明の方法により製造された酒類又は発酵調味料に含まれるチオレドキシン含量は、上槽前の醪の酵母死滅率を検出することによって、その多少を判断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に、本発明による清酒の製造方法を好適な実施態様を用いて詳細に説明する。本発明の実施態様によれば、清酒醸造の常法通りに麹、酒母を作り、醪仕込みを行う。このとき、酒母の製造工程で使用する清酒酵母には、アルコール耐性の低いものを選択して仕込みを行う。少なくとも、例えば協会１１号のようなアルコール耐性酵母である清酒酵母の使用を避ける。これにより、酵母の発酵により醪中に蓄積したアルコール自体が酵母にアルコールストレスを与え、酵母の菌体内に蓄積されているチオレドキシンを選択的に菌体外に放出させる。
【００４５】
醪の製造工程では、通常行われる１０〜１５℃で仕込みを行う。しかしながら、醪末期の品温経過を２０℃前後の高温にすることによって、酵母に有効な熱ストレスを与えることができる。これにより、酵母の菌体内に蓄積されているチオレドキシンが、選択的に菌体外に放出される。
【００４６】
また、上槽までの発酵期間を通常よりも５〜１０日程度多くとることが好ましい。これにより、最高品温が１５℃前後又はそれ以下の場合でも、アルコールストレス及び熱ストレスがより多く酵母に与えられる。その結果、酵母菌体内のチオレドキシンを選択的に菌体外に放出させることができる。
【００４７】
一般に酵母の発酵は温度が高いほど活発で、清酒酵母では、２０〜２５℃の温度がアルコールの生成に最適とされている。他方、アルコール耐性が低い一般の清酒酵母は、醪中のアルコール濃度が１８％以上になると衰弱して死滅する。従って、特に醪末期の発酵条件、即ち品温、アルコール濃度、上槽までの日数を適当に設定することによって、酵母のアルコール発酵が活発になりかつ酵母へのアルコール負荷が増えて、醪中へのチオレドシンの放出が多くなる。
【００４８】
アルコール添加酒を製造する場合には、アルコールの添加後直ぐに上槽せず、醪をそのまま数日間、例えば１〜４日放置する。これにより、醪中の酵母に更にアルコール負荷を加えて、より多くのチオレドキシンを放出させる。このとき、品温を例えば２０℃前後に高くすることによって、醪中にチオレドキシンをより効果的に抽出することができる。
【００４９】
このようにして熟成した醪を上槽する。得られた上槽酒は、醪中に放出された多量のチオレドキシンを含有している。上槽酒中のチオレドキシン含量は、醪中の酵母に負荷されるストレスの程度に依存すると考えられるから、その多寡は、上槽前の酵母死滅率によって判定することができる。本発明によれば、上記各表に示す試験結果から、上槽前の酵母死滅率が５％以上、好ましくは１０％以上である場合に、上槽酒中のチオレドキシン含量が高く、チオレドキシン高含有の清酒を製造することかできる。
【００５０】
上槽後の原酒処理工程では、上槽酒中に抽出したチオレドキシンが失われないように処理しなければならない。活性炭ろ過は、チオレドキシンが活性炭に吸着されるので、省略することが望ましい。活性炭ろ過が必要な場合には、活性炭添加量を必要最小限にする。限外ろ過及びオリ下げ(除タンパク)処理は、同様にチオレドキシン含量が大幅に減少するので、省略すべきである。尚、限外ろ過は、チオレドキシンの分子量が約１２０００Ｄａであることを考慮すると、限外ろ過膜の分画分子量を小さく、好ましくは１００００Ｄａ以下に、より好ましくは４０００Ｄａ以下にすることによって、チオレドキシン含有清酒を濃縮することができる。
【００５１】
また、上述した本発明の清酒の製造方法は、清酒以外の醸造酒類、発泡性酒類、混成酒類や発酵調味料の製造に適用することができる。特に、米及び麹を用いて醸造される清酒タイプの発酵調味料は、上記実施態様の製造方法を略そのまま適用することができ、チオレドキシン高含有の発酵調味料が得られる。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
上述した本発明の清酒の製造方法に従って、実際に工場スケールで普通酒の仕込みを行い、チオレドキシンを高含有する清酒の醸造試験を実施した。醪日数１９日目でアルコール添加を行い、２２日目即ちアルコール添加後３日間保持した後に上槽した。
【００５３】
チオレドキシン含量がもろみ経過により及びアルコール添加後にどのように変化するかを検討した。チオレドキシンの検出は、経時的に醪をサンプリングし、遠心分離により上槽した後、上槽サンプル２５０μＬからトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表９に示す。尚、表９において各ＴＲＸバンドスコアは、No.８の上槽酒のバンドの強さを１００とした場合の比較値である。
【００５４】
【表９】
2015177782.tif 000010
【００５５】
この結果から、アルコール添加後は、２日目以降でチオレドキシン含量がアルコール添加前と比較して５０倍以上に増加し、それ以降はほぼ一定であることが認められた。これにより、アルコール添加後２〜３日の抽出期間を置くことによってチオレドキシン含量を大幅に増加させ得ることが確認された。
【００５６】
（実施例２）
様々な酵母品種を使用して、チオレドキシンを高含有する清酒の小仕込み試験を実施した。仕込み配合を以下の表１０に示す。最高品温１５℃で醪を経過させ、醪日数１８日目で上槽を行った。醪を等量に分け、その一方は純米酒として遠心分離により上槽を行い、他の一方は醪半量（総米８５ｇ）に対して４０％原料アルコール２７ｍＬを添加（アルコール添加率：１２５Ｌ／ｔ白米）し、１５℃、２時間静置後に遠心分離により上槽を行った。
【００５７】
【表１０】
2015177782.tif 000011
【００５８】
それぞれの上槽酒についてチオレドキシン含量を検討した。チオレドキシンの検出は、上槽サンプル５００μＬからトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表１１に示す。
【００５９】
【表１１】
2015177782.tif 000012
【００６０】
この結果を見ると、協会酵母の中では、No.４〜６の泡ナシ変異株の方がチオレドキシン含量が高い傾向にあり、アルコール生成や酵母死滅率の高い株ほどチオレドキシン含量が高い。No.７〜１０の酵母は、発酵経過が緩やかなＫＺ１２株と、発酵経過が緩やかでアルコール耐性の強いＫＺ０２株のチオレドキシン含量が低い。No.１１〜１６の黄桜吟醸酵母は、協会酵母と同様に、発酵力が弱くアルコール生成の低い吟醸１，４号のチオレドキシン含量が低く、アルコール生成や酵母死滅率が高い株ほどチオレドキシン含量が高い。これにより、チオレドキシン含量は、アルコール生成や酵母死滅率の高い酵母を選択した場合に高くなることが確認された。
【００６１】
（実施例３）
実施例２と同様の仕込み配合で、酵母ＫＺ０６を使用して、チオレドキシンを高含有する清酒の小仕込み試験を実施した。最高品温１２℃，１５℃，１８℃で醪を経過させ、醪日数２０日目で上槽を行った。また、これと同じ条件で仕込んだ醪を最高品温１２℃で醪日数１８日経過させ、上槽前２日間のみ１６℃、２０℃に昇温して上槽を行った。いずれの場合も、醪を等量に分け、その一方は純米酒として遠心分離により上槽を行い、他の一方は醪半量（総米８５ｇ）に対して４０％原料アルコール２７ｍＬを添加（アルコール添加率：１２５Ｌ／ｔ白米）し、１５℃、２時間静置後に遠心分離により上槽を行った。
【００６２】
それぞれの上槽酒についてチオレドキシン含量を検討した。チオレドキシンの検出は、上槽サンプル５００μＬからトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表１２に示す。
【００６３】
【表１２】
2015177782.tif 000013
【００６４】
この結果を見ると、最高品温が高いほど、チオレドキシン含量は高くなる傾向が認められる。また、最高品温１２℃で発酵させ、上槽前の２日間を高温で経過させた醪は、純米酒及びアルコール添加酒のいずれも、酵母死滅率が高く、最高品温が１２℃の場合の数倍程度の多量のチオレドキシンが検出された。これにより、チオレドキシン含量は、品温経過が高温であるほど増加することが確認された。
【００６５】
（実施例４）
実施例２と同様の仕込み配合で、酵母ＫＺ０６を使用して、チオレドキシンを高含有する清酒の小仕込み試験を実施した。最高品温１２℃，１５℃で醪を経過させ、醪日数２０日、２５日、３０日目で上槽を行った。それぞれの上槽酒についてチオレドキシン含量を検討した。チオレドキシンの検出は、上槽サンプル５００μＬからトリクロロ酢酸処理によりタンパク質成分を回収し、抗チオレドキシン抗体を用いたウェスタンブロットにより行った。その結果を以下の表１３に示す。
【００６６】
【表１３】
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【００６７】
この結果を見ると、いずれの最高品温でも、醪日数を延長することにより酵母死滅率が高くなり、それに対応してチオレドキシン含量が大幅に増加した。最高品温１２℃の場合、醪日数の延長によりで酵母死滅率が約２倍になり、それに対応してチオレドキシン含量が５日間で約３倍、１０日間で約６倍に増加した。また、最高品温１５℃の場合と比較すると、品温経過を高くすることによって、より高い抽出効果を得られることが認められる。これにより、チオレドキシン含量は、醪末期を高アルコール濃度で経過させることによって大幅に増加することが確認された。