(57)【要約】【課題】本発明の目的は、基質特異性に優れたケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨを用いた血糖センサの安定性を高めることである。【解決手段】（Ａ）ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、（Ｂ）電子伝達体、（Ｃ）増粘剤、（Ｄ）グリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質、を含むグルコース定量用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）を含むグルコース定量用組成物。
（Ａ）ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ
（Ｂ）電子伝達体
（Ｃ）増粘剤
（Ｄ）グリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質。
【請求項２】
ケカビ科由来糸状菌が、ムコール属に属する糸状菌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
増粘剤がスメクタイトである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
電子伝達体がフェリシアン化カリウムである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を反応層に備えるグルコース測定用センサ。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物または項５に記載のセンサを用いてグルコースを定量する方法。
【請求項７】
ケカビ科由来糸状菌由来ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、電子伝達体、増粘剤を少なくとも含む組成物に、グリシルグリシン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質を添加することを特徴とする、前記組成物の安定性向上方法。
【請求項８】
ケカビ科由来糸状菌がムコール属に属する糸状菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増粘剤がスメクタイトである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
電子伝達体がフェリシアン化カリウムである、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース定量用組成物の安定化方法、および、安定なグルコース定量用組成物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度の測定は、糖尿病患者が適当な血糖コントロールを行うにあたって必要不可欠である。日常的に血糖値をチェックするために使われるのは簡易型自己血糖測定キットであり、グルコースオキシダーゼ（以下ＧＯＤとも記載）もしくはグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を利用したものが知られている。ＧＯＤは血糖測定用酵素として古くから用いられているが、溶存酸素が測定値に影響を与えることから、近年ではＧＤＨを用いたものが主流となってきている。ＧＤＨを原料としたグルコースセンサは、ＧＤＨの以下の反応を利用して血液中のグルコース濃度を測定するものである。
Ｄ−グルコース  ＋  電子伝達体（酸化型）  →
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  電子伝達体（還元型）
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているＧＤＨとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱとも記載）依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下ＦＡＤとも記載）依存型の３種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤとも記載）などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるＮＡＤ等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、ＰＱＱ依存型ＧＤＨはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型ＧＤＨ（以下ＦＡＤ−ＧＤＨと記載）が浸透しつつある。
【０００３】
またさらに、アスペルギルス属由来ＧＤＨ（特許文献１、２）やペニシリウム属由来ＧＤＨ（特許文献３）などに見られる、キシロース作用性を解消したケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨも近年見出され、特許出願がなされている（特許文献４〜６）。こうしたＧＤＨを使用した血糖センサも鋭意検討・開発されているものと推察される。
【０００４】
血糖センサの特性としてグルコース以外の糖類に反応しない高い基質特異性を持たせることは、正確な血糖値を得るために重要な事柄であるが、作成したセンサの保存安定性もまたセンサの開発にあたって重視される事柄である。酵素は蛋白質であることから、低温で保存されることが好ましいが、製造されたセンサストリップは製造後の流通・販売並びに購入者による保管の間冷蔵されるケースは少なく、さらには夏場の高温や多湿にさらされる可能性も高い。こうした環境に耐えうるセンサストリップを作製するための試みとして、例えば酵素自身の熱安定性を向上させる試みがなされている。またさらに、添加剤としてウシ血清アルブミンなどの蛋白質、塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの無機塩、トレハロースなどの糖類を共存させることによるグルコース測定用酵素の安定化についても検討がなされている。
【０００５】
一方、血糖センサにおいて重要な事柄の一つとして、サンプル溶液によるセンサストリップ上の組成物の溶解性が高いことが挙げられる。現在市販されている血糖センサの多くは５秒程度のごく短い時間にサンプル中グルコース濃度の定量を完了する。この間にサンプル溶液はセンサストリップに設けられた流路を通って電極部に到達し、電極上に固定化された酵素を含む組成物を溶解させ、酵素がサンプル中のグルコースを酸化して得られた電子がメディエーターを介して電極へと渡るという一連の工程が完了しなければならない。この際、組成物の溶解速度はこれら一連の工程の中でボトルネックとなりうる部分であり、酵素を含む組成物の溶解しやすさは重要である。またさらに、仮に溶解後の溶け残り（不溶物）が発生すれば、溶液の速やかな混合や電子の電極までの到達を妨げる要因ともなり極めて不都合である。
【０００６】
上記のような問題を解消する方策として、たとえばウシ血清アルブミンなどのタンパク質、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、トレハロースといった物質を添加することにより、センサにおけるＦＡＤ−ＧＤＨの安定性を向上させる方法が見出され、特許出願がなされている（特許文献７）。しかし、上記はキシロースに対する作用性を有するアスペルギルス属由来ＧＤＨに対して効果を認められたものであり、あらゆるＦＡＤ−ＧＤＨに対して効果を有するとは考えがたい。特許文献７において使用されているＧＤＨは、特許文献４〜６に記載されるようなキシロース作用性のないケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨとはアミノ酸配列の同一性が低く、その構造や表面の電荷など化学的性質が異なっているものと推察される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４４９４９７８
【特許文献２】特許４２９２４８６
【特許文献３】米国特許７４９４４９４
【特許文献４】特許４６４８８９３
【特許文献５】特開２０１３−９０６２１
【特許文献６】特開２０１３−１１６１０２
【特許文献７】特開２００８−１５４５７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の目的は、基質特異性に優れたケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨを用いた血糖センサの安定性を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、センサ上のケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨおよび電子伝達体を含む組成物中に特定の添加剤を加えることでセンサの保存安定性を高めることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
以下の（Ａ）〜（Ｄ）を含むグルコース定量用組成物。
（Ａ）ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ
（Ｂ）電子伝達体
（Ｃ）増粘剤
（Ｄ）グリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質。
項２．
ケカビ科由来糸状菌が、ムコール属に属する糸状菌である、項１に記載の組成物。
項３．
増粘剤がスメクタイトである、項１または２に記載の組成物。
項４．
電子伝達体がフェリシアン化カリウムである、項１〜３のいずれかに記載の組成物。
項５．
項１〜４のいずれかに記載の組成物を反応層に備えるグルコース測定用センサ。
項６．
項４に記載の組成物または項５に記載のセンサを用いてグルコースを定量する方法。
項７．
ケカビ科由来糸状菌由来ＦＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、電子伝達体、増粘剤を少なくとも含む組成物に、グリシルグリシン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質を添加することを特徴とする、前記組成物の安定性向上方法。
項８．
ケカビ科由来糸状菌がムコール属に属する糸状菌である、項７に記載の方法。
項９．
増粘剤がスメクタイトである、項７または８に記載の方法。
項１０．
電子伝達体がフェリシアン化カリウムである、項７〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨを用いたグルコースセンサの安定性を向上させることができ、結果として十分な保存安定性を有し、かつグルコース以外の糖類の存在による測定値への影響を受けないグルコースセンサを作製することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（グルコース定量用組成物）
本発明の実施形態の一つは、以下の（Ａ）〜（Ｄ）を含むことを特徴とする、グルコース測定用組成物である。
（Ａ）ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨ
（Ｂ）電子伝達体
（Ｃ）増粘剤
（Ｄ）グリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質。
【００１３】
本発明に用いるＦＡＤ−ＧＤＨとしては、ケカビ科糸状菌に由来し、かつＦＡＤを補酵素とし、かつグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する酵素であれば特に限定しない。ケカビ科糸状菌の好適な例としてはムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アクチノムコール属（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、パラシテラ（Ｐａｒａｓｉｔｅｌｌａ）属、ザイゴリンカス（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）属、ディクラノフォラ（Ｄｉｃｒａｎｏｐｈｏｒａ）属、スピネラス（Ｓｐｉｎｅｌｌｕｓ）属、スポロディニエラ（Ｓｐｏｒｏｄｉｎｉｅｌｌａ）属、リゾパス（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、クラミドアブシジア（Ｃｈｌａｍｉｄｏａｂｓｉｄｉａ）属およびサーモムコール（Ｔｈｅｒｍｏｍｕｃｏｒ）属に属する糸状菌などが挙げられる。より好適には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アクチノムコール属（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属に属する糸状菌であり、さらに好適にはムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する糸状菌であり、最も好適にはムコール・プライニー（Ｍｕｃｏｒｐｒａｉｎｉｉ）もしくはムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）である。
【００１４】
また別の観点から、本発明に用いるＦＡＤ−ＧＤＨの好適な例としては、配列番号１もしくは配列番号３に示すアミノ酸配列からなるＧＤＨであり、もしくは配列番号１もしくは配列番号３に示すアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＧＤＨである。
【００１５】
本発明に用いる電子伝達体としては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、場合によっては発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、９，１０−フェナントレンキノン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。
好ましくは、フェリシアン化物塩由来であり、さらに好ましくは、フェリシアン化カリウムである。
【００１６】
本発明に用いる増粘剤としては、塗布した組成物をグルコースセンサの反応層上に保持するに必要な粘性を担保できる物質であれば特に限定しないが、例えばプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ−γ−グルタミン酸、カルボシキメチルセルロース、ポリビニルピロリドンおよび粘土が好適な例として挙げられる。粘土としては、カオリナイト構造やパイロフィライト構造を持つもの、たとえば、パイロフィライト（Ｐｙｒｏｐｈｙｌｌｉｔｅ）、マイカ（Ｍｉｃａ）、スメクタイト（Ｓｍｅｃｔｉｔｅ）、バーミキュライト（Ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ）、クロライト（Ｃｈｌｏｒｉｔｅ）、カオリナイト（Ｋａｏｌｉｎｉｔｅ）、ハロイサイト（Ｈａｌｌｏｙｓｉｔｅ）などが挙げられる。これらの中でも、スメクタイトが好適な増粘剤の例として挙げられる。スメクタイトはさらにモンモリロナイト（Ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）、バイデライト（Ｂｅｉｄｅｌｉｔｅ）、ノントロナイト（Ｎｏｎｔｒｏｎｉｔｅ）、サポナイト（Ｓａｐｏｎｉｔｅ）、ヘクトライト（Ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）などに分類される。なお、スメクタイトは合成スメクタイトであってもよく、例えば、「ルーセンタイト」シリーズ（コープケミカル株式会社製）などの市販品を入手できる。
【００１７】
増粘剤の組成中への添加量は、上記組成物の安定性を高める効果の認められる範囲であれば特に限定しないが、液状での濃度として好ましくは０．０１％以上５％以下であり、より好ましくは０．１％以上１％以下である。また、加温または凍結乾燥等を経ることによる固体状の組成においては、好ましい添加量は０．５％以上７０％以下であり、より好ましくは４．５％以上３０％以下である。
【００１８】
グリシルグリシン、ソルビトールおよびアドニトール（ａｄｏｎｉｔｏｌ）からなる群より選ばれる１以上の物質の組成中への添加量は、上記組成物の安定性を高める効果の認められる範囲であれば特に限定しないが、液状での濃度として好ましくは０．１％以上１０％以下であり、より好ましくは０．２％以上２％以下である。また、加温または凍結乾燥等を経ることによる固体状の組成においては、好ましい添加量は１％以上８０％以下であり、より好ましくは２％以上５０％以下である。
【００１９】
本発明の組成物において、グリシルグリシン、ソルビトールまたはアドニトールと、増粘剤との組合せは特に限定されないが、好ましくはグリシルグリシンとカルボキシメチルセルロール、グリシルグリシンとスメクタイト、グリシルグリシンとポリビニルピロリドン、ソルビトールとカルボキシメチルセルロール、ソルビトールとスメクタイト、ソルビトールとポリビニルピロリドン、アドニトールとカルボキシメチルセルロール、アドニトールとスメクタイト、アドニトールとポリビニルピロリドンである。これら組合せの中で、より好適にはグリシルグリシンとスメクタイト、ソルビトールとスメクタイト、またはアドニトールとスメクタイトである。
【００２０】
上記の組成物の中には、さらに緩衝剤成分、界面活性剤等を含んでいてもよく、あるいはＧＤＨを保持するための担体を含んでもよい。該担体にはＧＤＨを吸着させるための官能基および該官能基と該担体とを繋ぐスペーサーを有していてもよい。
【００２１】
上記の組成物に緩衝能を持たせる場合においては、バッファー成分を使用してもよい。バッファー成分としてはリン酸塩、ホウ酸塩、酢酸や各種ジカルボン酸等の有機酸塩、アミノ酸、トリス塩酸塩、ＧＯＯＤのバッファー等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
また、上記の組成物は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、エマルゲン４３０等に代表される界面活性剤をさらに含んでもよい。
【００２３】
上記組成物は液状であってもよく、また乾燥し固体化した状態であってもよい。固体化の方法は、加温により水分を蒸発させる方法、常温以上の温度で風乾する方法、真空状態に置くことで水分を蒸発させる方法、凍結した状態で真空に置いて水分を除去する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
（グルコース測定用センサ）
本発明の別の実施形態は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）を含む上記のグルコース測定用組成物がグルコースセンサ上の反応層中に存在する、グルコース測定用センサである。
（Ａ）ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨ
（Ｂ）電子伝達体
（Ｃ）増粘剤
（Ｄ）グリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質。
【００２５】
本発明のグルコース測定用センサは、比色式であってもよく、また電気化学式であってもよい。また該グルコース測定用センサにはグルコースに応答して得られたシグナル強度から血糖値を算出するための演算装置並びに算出された血糖値を表示するためのディスプレイを具備していてもよい。さらに該グルコース測定用センサは、反応層上に検体となる血液もしくは血液の希釈液を滴下するタイプであってもよいが、被検者の皮膚を窄孔し血液を採取するための針及び／または血液を移送させる流路を具備するかまたは装着可能であってもよい。比色式センサの場合はさらに吸光度を測定するための光源ランプおよび光度計を具備していてもよい。電気化学式センサの場合は作用極と対極を有しているかこれら電極上にＧＤＨおよび電子伝達体を保持したチップを装着できるタイプであってもよい。電極としては、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、電子伝達体とともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００２６】
本発明の方法によるグルコース濃度の測定は、比色式グルコースセンサの場合にあっては例えば以下のようにして行うことができる。すなわち安定化剤としてのグルコースセンサ上の反応層にはグリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質に加え、ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、そして反応促進剤としてポリグルタミン酸を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を組成物中に含有させる。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子伝達体もしくは電子伝達体より電子を受け取ることで重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化より、あらかじめ標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブを元に試料中のグルコース濃度を算出することができる。この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、たとえば２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子伝達体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子伝達体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用する電子伝達体および発色試薬はこれらに限定されない。
【００２７】
また、本発明の方法によるグルコース濃度の測定は、電気化学式センサの場合にあっては以下のようにして行うことができる。グルコースセンサ上の電極に接続された反応層にはすなわち安定化剤としてのグルコースセンサ上の反応層にはグリシルグシリン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質に加え、ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、そして反応促進剤としてポリグルタミン酸を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。この組成物にはさらにｐＨ緩衝剤等を含んでいてもよい。ここにグルコースを含む試料を加えて反応させ、さらに電極に一定の電圧を印加する。電流をモニタリングし、電圧印加開始から一定時間に蓄積される電流を積算するかあるいは電圧印加開始から一定時間を経過したある時点での電流値を測定する。この値を元に、標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００２８】
（グルコース定量用組成物の安定化方法）
本発明の別の実施形態は、ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、増粘剤を少なくとも含んでなる組成物に、グリシルグリシン、ソルビトールおよびアドニトールからなる群より選ばれる１以上の物質を添加することを特徴とする、前記組成物の安定性向上方法である。
【００２９】
安定性の評価方法
本発明に述べる組成物は、４０℃ないし５０℃という高温状態における安定性に優れている。本明細書において、組成物の安定性は、組成物を５０℃に１時間置いた後に維持される、前記組成物をグルコースと反応させて得られるシグナル強度の割合で評価する。ここでシグナル強度とはＧＤＨがグルコースを酸化させることにより発生する電子の量に比例して発生する計測可能な発色・退色もしくは電流の数値である。すなわち組成物の安定性の向上とは、加温処理後に維持されるシグナル強度の割合が増大することを意味する。
【００３０】
ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定例
本明細書において、ＦＡＤ−ＧＤＨ活性測定は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｄ−グルコース、０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＣＰＩＰ、ｐＨ６．５）２．９ｍＬを石英セルにいれ、３７℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液０．１ｍＬを加えて混和し、３７℃で５分反応させ、この間７００ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に３７℃５分インキュベートして７００ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率  ］／（４．５×１．０×０．１）
なお、ここで
３．０    ：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
４．５    ：ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０    ：光路長（ｃｍ）
０．１    ：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。
【００３１】
タンパク質の定量および比活性の算出例
本発明に述べるタンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定したものである。すなわち、２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０の範囲となるように酵素溶液を蒸留水で希釈し、蒸留水を用いてゼロ点補正を行った吸光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定する。本発明に述べるタンパク質濃度は、１Ａｂｓ≒１ｍｇ／ｍｌと近似し、吸光度の測定と測定した溶液の希釈倍率とを乗じた値で示したものである。また、本発明に述べる比活性とは、本測定方法によるタンパク質量として１ｍｇあたりのＧＤＨの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、この際のＧＤＨ活性は、上記活性測定例に従って測定することにより得られる値である。
【００３２】
以下、本発明を具体的に実施例として示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
＜実施例１＞
ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨの調製
ムコール・プライニー由来ＦＡＤ−ＧＤＨとして、特許文献４に記載のアミノ酸配列を参考に配列番号２に記載の配列からなる合成ＤＮＡを作製した。また、ムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤ−ＧＤＨとして、特許文献６に記載のアミノ酸配列を参考に配列番号４に記載の配列からなる合成ＤＮＡを作製した。これら合成ＤＮＡは、既に公開となっている特許文献（ＷＯ２０１３／０８０８８１）に記載される宿主（クリプトコッカス・エスピー・Ｓ−２．Ｕ−５株）に、概特許に記載のとおりのフローで形質転換を行った。なお、形質転換の際にベクターとしてｐＣｓＵＸを使用し、配列番号２および４の遺伝子はそれぞれ５‘末端側をクリプトコッカス・エスピー・Ｓ−２株由来キシラナーゼの分泌シグナルと融合し、かつ３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）を付加した状態で概ベクターのＭｌｕＩ／ＳｐｅＩサイトに挿入した。ベクターｐＣｓＵＸの概要及びキシラナーゼ分泌シグナルの配列も、上記特許文献に記載されている。このようにして作製した形質転換体は、２００ｍＬ容のバッフル付きフラスコ中のＹＭ培地６０ｍＬに植菌し、温度２５℃、回転速度１８０ｒｐｍで２日間培養し、培養液全量を６Ｌの生産培地（５％酵母エキス、２％キシロース、０．０２％アデカノール）に加え、３０℃で通気攪拌培養した。培養液を高速冷却遠心機（日立ハイテク製ＣＲ２２型）にセットした連続遠心用ローター（型番：Ｒ１０Ｃ）に通液し、５０００ｒｐｍで回転させることにより菌体を沈降させ、培養液上清を得た。この溶液を分子量５００００カット限外ろ過膜を用いて加水濃縮することにより１０００倍以上になるよう加水し、最終的に液量２Ｌまで濃縮した。この溶液に０．４飽和となるよう硫酸アンモニウムを溶解し、０．４飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ  ＨＳ（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、硫酸アンモニウム濃度が０となるまでグラジエント溶出を行い、ＧＤＨ活性を有する画分を集めた。この溶液を分子量５００００カット限外ろ過膜を用いて１０ｍＬまで濃縮し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファーで緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００に通液し、ゲルろ過を行った。得られた精製酵素の比活性は、ムコール・プライニー由来が１８６Ｕ／ｍｇ、ムコール・ヒエマリス由来が１５０Ｕ／ｍｇであった。
【００３４】
＜実施例２＞
電気化学式センサにおけるシグナル強度の残存率向上（１）
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．５）を作製した（対照組成）。
５ｍＭ  ＡＣＥＳ
５ｍＭ  コハク酸ナトリウム
２５ｍＭ  フェリシアン化カリウム
５００Ｕ／ｍｌ  ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨ（実施例１で作製したもの）
０．２５％  合成スメクタイト（商標名：ルーセンタイトＳＷＮ（コープケミカル株式会社製））
さらに上記組成に０．５％のグリシルグリシン、ソルビトール、もしくはアドニトールのいずれか１つを加えた溶液を作製した。
上記溶液５μＬを、３電極を具備するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ−ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、室温（２５℃）で十分乾燥させてセンサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に１０ｍＭの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．３Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングした。また、これらセンサチップを５０℃で１時間加温した後に同様に反応し電流値をモニタリングして、加温前の電流値との比率（シグナル残存率）を求めた。結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2015139376.tif 000002
【００３６】
対照組成に対し、グリシルグリシン、ソルビトール、もしくはアドニトールを加えて作製したセンサチップではいずれもシグナル残存率が向上した。
【００３７】
電気化学式センサにおけるシグナル強度の残存率向上（２）
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．５）を作製した（対照組成）。
５ｍＭ  ＡＣＥＳ
５ｍＭ  コハク酸ナトリウム
２５ｍＭ  フェリシアン化カリウム
５００Ｕ／ｍｌ  ケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨ（実施例１で作製したもの）
０．２５％  合成スメクタイト（商標名：ルーセンタイトＳＷＮ（コープケミカル株式会社製））
さらに上記組成にソルビトール、もしくはアドニトールを０．０５%、０．５％、２％含む溶液を作製した。
上記溶液５μＬを、３電極を具備するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ−ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、室温（２５℃）で十分乾燥させてセンサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に１０ｍＭの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．３Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングした。また、これらセンサチップを５０℃で１時間加温した後に同様に反応し電流値をモニタリングして、加温前の電流値との比率（シグナル残存率）を求めた。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
2015139376.tif 000003
【００３９】
対照組成に対し、グリシルグリシン、ソルビトール、もしくはアドニトールを加えて作製したセンサチップではいずれも上記濃度範囲でシグナル残存率が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、血糖値測定用試薬、血糖センサ並びにグルコース濃度定量キットとしての供給が可能である。特に、ケカビ科糸状菌に由来する基質特異性の高いＧＤＨを原料としたグルコースセンサの安定性を高める方法として有効である。
【配列表】
2015139376000001.app