(57)【要約】      （修正有）【課題】従来のものとは異なる分泌型ルシフェラーゼを提供する。【解決手段】既知の変異１９kDa発光触媒蛋白質において、動物培養細胞内で発現したときに分泌シグナルを持たなくても細胞外へ分泌する新たなルシフェラーゼ変異体。ルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、ルシフェラーゼ変異体の製造方法、キット、発光反応を行う方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)から選択されるルシフェラーゼ変異体：
(a) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
(b) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列において1〜17個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(c) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【請求項２】
前記(b)〜(d)のルシフェラーゼ変異体が、それぞれ、以下の(b−1)〜(d−1)に記載のものである、請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体：
(b−1) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(c−1) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(d−1) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【請求項３】
前記(a)のルシフェラーゼ変異体が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8および配列番号:10から選択されるアミノ酸配列を含有するものである、請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項5記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項6記載の形質転換体を培養し、請求項1〜3のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、請求項1〜3のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
【請求項８】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体、請求項4に記載のポリヌクレオチド、請求項5に記載の組換えベクターおよび請求項6に記載の形質転換体から選択される少なくとも１つを含む、キット。
【請求項９】
さらにルシフェリンを含む、請求項8に記載のキット。
【請求項１０】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項9に記載のキット。
【請求項１１】
セレンテラジン類がbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンである、請求項10記載のキット。
【請求項１２】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
【請求項１３】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
セレンテラジン類がbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
請求項4記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
【請求項１６】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
セレンテラジン類がbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
請求項1〜3のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を可視化する方法。
【請求項１９】
ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
セレンテラジン類がh−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンである、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビルシフェラーゼの触媒ドメイン蛋白質の変異遺伝子とその使用方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物発光は、ルシフェリン（発光基質）−ルシフェラーゼ（発光を触媒する酵素）反応と呼ばれる生体内における化学反応にもとづく現象である。国内外で古くからルシフェリンやルシフェラーゼの同定研究をはじめ、分子レベルでの発光メカニズムの解明など、数多くの研究が行われてきた。海洋性発光生物の中で、深海に生息するエビ由来のオプロフォーラス（Oplophorus gracilirostris）ルシフェラーゼは、体外へ放出される分泌型ルシフェラーゼである（非特許文献1）。
【０００３】
オプロフォーラスルシフェラーゼは分子量35 kDaの蛋白質と19 kDaの蛋白質より構成される106 kDa蛋白質である。発光を触媒するドメインは、19 kDa蛋白質にあり、発光基質はセレンテラジンであり、セレンテラジン系ルシフェラーゼに分類される（特許文献1、非特許文献２）。他のセレンテラジン系ルシフェラーゼと異なる点は、基質の特異性が広く、セレンテラジンの類縁体も良い発光基質になることである（非特許文献２）。19 kDa蛋白質遺伝子を常温および低温で大腸菌内発現させた場合、多くは不溶性蛋白質として発現する（非特許文献３）。低温発現系でプロテインA由来のZZドメインとの融合蛋白質として発現すると、可溶性蛋白して発現することが出来る（非特許文献４）。また、動物培養細胞で発現した場合、細胞外へほとんど分泌しないことが報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
近年、１９kDa蛋白質へのアミノ酸の16カ所の変異導入により、天然１９kDa蛋白質より高い活性を示す変異１９kDa発光触媒蛋白質が開示され、細胞外へ分泌することが示された(特許文献２、非特許文献４、５)。また、天然型セレンテラジンを発光基質とするよりセレンテラジン誘導体が高い活性を示すことも示された（非特許文献４、５）。
【０００５】
セレンテラジンを発光基質とする発光反応系は発光基質と酸素のみで発光反応が進むため、現在、セレンテラジン系ルシフェラーゼ遺伝子を用いた動物培養細胞系でのレポーターアッセイが汎用されている。細胞内でのレポーターアッセイには311個のアミノ酸よりなるレニラルシフェラーゼが使用される。細胞外でのレポーターアッセイには、17個のアミノ酸よりなる分泌シグナルペプチド配列と168個のアミノ酸よりなる分泌型ルシフェラーゼであるガウシアルシフェラーゼが使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2002−320482号公報
【特許文献２】特表2012−525819号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】O. Shimomura et al. (1978) Biochemistry 17: 994−998.
【非特許文献２】S. Inouye et al. (2000) FEBS Lett. 481: 19−25.
【非特許文献３】S. Inouye & S. Sasaki (2007) Protein Express. Purif. 56: 261−268.
【非特許文献４】M.P.Hall et al. (2012) ACS Chem Biol. 7: 1848−1857.
【非特許文献５】S. Inouye et al. (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23−28.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記状況の下に、従来のものとは異なる分泌型ルシフェラーゼが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、既知の変異１９kDa発光触媒蛋白質について検証をおこない、動物培養細胞内で発現したときに分泌シグナルを持たなくても細胞外へ分泌する新たなルシフェラーゼ変異体などを創出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のルシフェラーゼ変異体、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、ルシフェラーゼ変異体の製造方法、キット、発光反応を行う方法などを提供する。
［1］  以下の(a)〜(d)から選択されるルシフェラーゼ変異体：
(a) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
(b) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列において1〜17個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(c) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
［2］  前記(b)〜(d)のルシフェラーゼ変異体が、それぞれ、以下の(b−1)〜(d−1)に記載のものである、上記［1］に記載のルシフェラーゼ変異体：
(b−1) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(c−1) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(d−1) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
［3］  前記(a)のルシフェラーゼ変異体が、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8および配列番号:10から選択されるアミノ酸配列を含有するものである、上記［1］に記載のルシフェラーゼ変異体。
［4］  上記［1］〜［3］のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
［5］  上記［4］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
［6］  上記［5］記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
［7］  上記［6］記載の形質転換体を培養し、上記［1］〜［3］のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、上記［1］〜［3］のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
［8］  上記［1］〜［3］のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体、上記［4］に記載のポリヌクレオチド、上記［5］に記載の組換えベクターおよび上記［6］に記載の形質転換体から選択される少なくとも１つを含む、キット。
［9］  さらにルシフェリンを含む、上記［8］に記載のキット。
［10］  ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記［9］に記載のキット。
［11］  セレンテラジン類がbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンである、上記［10］記載のキット。
［12］  上記［1］〜［3］のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
［13］  ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記［12］記載の方法。
［14］  セレンテラジン類がbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンである、上記［13］記載の方法。
［15］  上記［4］記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
［16］  ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記［15］記載の方法。
［17］  セレンテラジン類がbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンである、上記［16］記載の方法。
［18］
上記［1］〜3のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を可視化する方法。
［19］  ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記［18］記載の方法。
［20］  セレンテラジン類がh−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンである、上記［19］記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、従来のものとは異なる分泌型ルシフェラーゼ変異体を提供する。本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、動物細胞内で発現したときに、小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経由せずに細胞外へ分泌する新規ルシフェアーゼ変異体であり、その分泌経路の可視化に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】pColdIIベクターを用いてnanoKAZのアミノ末端欠失体を発現した大腸菌粗酵素液のSDS−PAGE分析の結果を示す図である。
【図２】pCold−ZZ−Pベクターを用いてnanoKAZのアミノ末端欠失体を発現した大腸菌粗酵素液のSDS−PAGE分析の結果を示す図である。
【図３】分泌シグナル配列を有するnanaKAZ 遺伝子を用いて樹立したpcDNA3− GLsp−nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現株を用いた実験における、ブレフェルジンAによるnanoKAZ蛋白質の分泌阻害を示す様子を表す図である。白丸はブレフェルジンA添加の場合であり、黒丸はブレフェルジンA無添加の場合である。
【図４】分泌シグナル配列を有さないnanaKAZ 遺伝子を用いて樹立したpcDNA3− nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現株を用いた実験における、ブレフェルジンAによるnanoKAZ蛋白質の分泌阻害を示さない様子を表す図である。白丸はブレフェルジンA添加の場合であり、黒丸はブレフェルジンA無添加の場合である。
【図５】nanoKAZの分泌を可視化した明視野画像と発光イメージング画像である。a およびbは、それぞれ、pcDNA3−GLsp−nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現細胞の明視野画像と発光イメージング画像である。cおよびdは、それぞれ、pcDNA3− nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現細胞の明視野画像と発光イメージング画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
1．本発明のルシフェラーゼ変異体
本発明のルシフェラーゼ変異体とは、オプロフォーラスルシフェラーゼの分子量19 kDaの蛋白質の変異体である。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体は、配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体と実質的に同質の活性を有するルシフェラーゼ変異体を意味する。
【００１４】
実質的に同質の活性とは、ルシフェラーゼ活性、動物細胞内で発現したときに分泌シグナルを持たなくても細胞外へ分泌する活性などから選択される少なくとも１つの活性を意味する。
【００１５】
「ルシフェラーゼ活性」とは、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）を基質とする発光活性、すなわち、ルシフェリン（例えば、セレンテラジン類）が酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成する反応を触媒する活性、を意味する。なお、励起状態で生成したオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。
【００１６】
このような活性は、例えば、Inouye, S. & Shimomura, O. (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 233,349−353に記載の方法によって測定することができる。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体をルシフェリンと混合することにより発光反応を開始させ、発光測定装置を用いて発光活性を測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えばLuminescencer−PSN AB2200(アトー社製)、またはCentro 960 luminometer (ベルトール社製)を使用することができる。
【００１７】
本発明で用いられるルシフェリンとしては、本発明のルシフェラーゼ変異体の基質となるルシフェリンであればよい。本発明で用いられるルシフェリンとしては、具体的にはイミダゾピラジノン環を主骨格とするセレンテラジン類が挙げられる。
【００１８】
セレンテラジン類は、セレンテラジンまたはその類縁体のことを意味する。セレンテラジン類縁体としては、例えば、bis−セレンテラジン、6h−f−セレンテラジン、deoxyfurane−セレンテラジン(フリマジン(furimazine))、h−セレンテラジン、hcp−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、f−セレンテラジン、fcp−セレンテラジン、n−セレンテラジン、MeO−セレンテラジン、e−セレンテラジン、cl−セレンテラジン、ch−セレンテラジン、3iso−セレンテラジン、3meo−セレンテラジン、cf3−セレンテラジン、i−セレンテラジン、et−セレンテラジン、me−セレンテラジン、3me−セレンテラジン、αmeh−セレンテラジン 8−(1−naphthyl)−セレンテラジン、8−(2−naphthyl)−セレンテラジン、8−(2−thienyl)−セレンテラジン、6,8−di(2−thienyl)−セレンテラジン、8−(4−hydroxyphenyl)−セレンテラジン、8−(2−benzothienyl)−セレンテラジン、8−(b−styryl)−セレンテラジン、8−phenyl−セレンテラジン、6−deoxy−セレンテラジン、8−(3−thienyl)−セレンテラジン、および8−(3−benzo[b]thienyl)−セレンテラジンがあげられる。セレンテラジン類の中でも、本発明のいくつかの態様では、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが特に好ましい。本発明の別のいくつかの態様では、h−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンが特に好ましい。
【００１９】
これらのセレンテラジン類は、公知の方法で合成してもよく、あるいは、市販のものを入手することもできる。
【００２０】
セレンテラジン類の合成方法としては、例えば、Shimomura et al. (1988) Biochem. J. 251, 405−410、Shimomura et al. (1989) Biochem. J. 261, 913−920、Shimomura et al. (1990) Biochem. J. 270, 309−312、Nakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38:6405−6406、WO2010/090319号公報、Inouye et al.(2010) Anal. Biochem.407, 247−252, もしくはInouye et al. (2013) Biocchem. Biophys. Res. Commun. 437, 23−28に記載の方法またはそれに準ずる方法が挙げられる。また、フリマジンは、Hall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848−1857に記載の方法により製造することができる。
【００２１】
また、セレンテラジン類の市販品に関しては、例えば、JNC株式会社製のセレンテラジン、cf3−セレンテラジンおよびh−セレンテラジン；ビオチウム(Biotium)社製のhcp−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、f−セレンテラジン、fcp−セレンテラジンおよびn−セレンテラジン；プロルミ社(Prolume)社製のbis−セレンテラジンならびにプロメガ社製のセレンテラジン、フリマジンおよびh−セレンテラジンを挙げることができる。
【００２２】
「ルシフェリンを基質とする発光活性」は、好ましくは、セレンテラジン類を基質とする発光活性である。「セレンテラジン類を基質とする発光活性」は、本発明の好ましい態様では、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンを基質とする発光活性である。「セレンテラジン類を基質とする発光活性」は、本発明の別の好ましい態様では、h−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンを基質とする発光活性である。
【００２３】
「動物細胞内で発現したときに分泌シグナルを持たなくても細胞外へ分泌する活性」とは、動物細胞内で発現したときに、分泌シグナルを持たないにもかかわらず、その発現蛋白質が、小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経由せずに細胞外へ分泌することを意味する。「細胞外へ分泌する」とは、具体的には、発現蛋白質のうち、5%以上、10%以上または20%以上の量(重量)の蛋白質が細胞外へ分泌することを意味する。「動物細胞」は、具体的には、後述のものが挙げられる。また、「分泌シグナル」は、nanoKAZ蛋白質の分泌情報が存在する領域を除く、具体的にはアミノ末端から1〜4アミノ酸の領域を除く、分泌シグナルである。
【００２４】
「配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体と実質的に同質の活性を有するルシフェラーゼ変異体」は、例えば、下記の(a)〜(d)から選択されるルシフェラーゼ変異体である。
【００２５】
(a) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体；
(b) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列において1〜17個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(c) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体；
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し、および前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列が配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものであるアミノ酸配列を含有し、かつ、ルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
【００２６】
上記(a)〜(d)において「配列番号:2のアミノ酸配列において1〜4番目のアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸が欠失し」とは、配列番号:2のアミノ酸配列中の1〜4番目の位置において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失があることを意味する。好ましくは、1番目のアミノ酸、1〜2番目の全てのアミノ酸、1〜3番目の全てのアミノ酸、または1〜4番目の全てのアミノ酸が欠失している。
上記「少なくとも1つのアミノ酸が欠失」における「少なくとも1つ」は、具体的には、1個、2個、3個または4個であり、好ましくは、1個または2個であり、より好ましくは、1個である。
【００２７】
上記(b)〜(d)において「前記1〜4番目のアミノ酸を除くアミノ酸配列」とは、上記(b)〜(d)のルシフェラーゼ変異体中のそれぞれのアミノ酸配列において、変異前の配列番号:2の5〜169番目のアミノ酸配列に対応する部分のアミノ酸配列を意味する。
【００２８】
上記(b)において「1〜17個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加した」とは、同一配列中の任意かつ1〜17個のアミノ酸配列中の位置において、1〜17個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味する。
【００２９】
上記「1〜17個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加した」における「1〜17個」の範囲は、例えば、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個または1個である。欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。このような蛋白質は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012)；Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)；Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)； Gene, 34, 315 (1985)； Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３０】
配列番号：2の5〜169番目のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換位置としては、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目および166番目の位置以外の位置であれば、特に限定されないが、例えば、13番目、14番目、15番目、25番目、30番目、36番目、70番目、83番目、106番目、128番目、番目153番目、156番目, 157番目、159番目、162番目、163番目および169番目からなる群から選択される1〜複数個の位置をあげることができる。特には、13番目、14番目、153番目、159番目、163番目および169番目からなる群から選択される1〜複数個の位置をあげることができる。
【００３１】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；
C群：アスパラギン、グルタミン；
D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸；
E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３２】
上記(c)において、「90％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「90％以上」の範囲は、例えば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99．1％以上、99．2％以上、99．3％以上、99．4％以上、99．5％以上、99．6％以上、99．7％以上、99．8％以上、99．9％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST(例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)参照)の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００３３】
上記(d)において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：2の5〜169番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド(例えば、DNA)をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0mol／LのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(Saline−sodium citrate)溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol／L塩化ナトリウム、15mmol／Lクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012)、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987−1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３５】
「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド(例えば、DNA)が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３６】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents(GEヘルシケア社製)を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００３７】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：2の塩基配列からなるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、または99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。
【００３８】
本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8または配列番号:10のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体であり、より好ましくは、配列番号:4、配列番号:6または配列番号:8のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体であり、さらに好ましくは、配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体である。
【００３９】
本発明のルシフェラーゼ変異体は、さらに他のペプチド配列をN末端および／またはC末端、好ましくはN末端に含んでいてもよい。他のペプチド配列としては、精製のためのペプチド配列、本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチド配列、抗体認識可能なエピトープ配列などからなる群から選択される少なくとも1つのペプチド配列を挙げることができる。他のペプチド配列は、好ましくは、精製のためのペプチド配列である。本発明の別の好ましい態様では、他のペプチド配列は、精製のためのペプチド配列、および本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するための配列からなる群から選択される少なくとも1つの配列である。
【００４０】
精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が4残基以上、好ましくは6残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン S−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列またはプロテインAのアミノ酸配列などが挙げられる。
【００４１】
本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチドとしては、例えば式（Z）nで表されるポリペプチドを挙げることができる。式（Z）nで表されるポリペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、例えば、特開2008−99669号公報に記載している。
【００４２】
抗体認識可能なエピトープ配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。
【００４３】
本発明のいくつかの態様のルシフェラーゼ変異体は、さらに他のペプチド配列として、分泌シグナル配列を含まない。「分泌シグナル配列」としては、ガウシアルシフェラーゼの分泌配列などが挙げられる。
【００４４】
本発明のルシフェラーゼ変異体の取得方法については特に制限はない。本発明のルシフェラーゼ変異体としては、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え蛋白質であってもよい。本発明のルシフェラーゼ変異体を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t−ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明のルシフェラーゼ変異体を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を適当な発現系に導入することにより、本発明のルシフェラーゼ変異体を作製することができる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、本発明のルシフェラーゼ変異体の発現系での発現などについては、後記する。
【００４５】
2．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、前述した本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT−PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドには、以下の(i)〜(iv)のポリヌクレオチドが含まれる。
(i) 前記(a)のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(ii) 前記(b)のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(iii) 前記(c)のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(iv) 前記(d)のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【００４７】
あるアミノ酸配列に対して、1〜複数個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271−275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468−500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441−9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350−367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488−492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763−2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441−9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。
【００４８】
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの5’端に持つ1組のプライマーを用いたPCR（例えば、HoS. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
【００４９】
また欠失変異体の一種である蛋白質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、その蛋白質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の5’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび3’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、その蛋白質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたPCRを行うことにより取得できる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドとして、好ましくは、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8または配列番号:10のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。より好ましくは、配列番号:4、配列番号:6または配列番号:8のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。さらに好ましくは、配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５１】
配列番号:2のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:1の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:3の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号:6のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:5の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号:8のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:7の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号:10のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:9の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５２】
本発明いくつかの態様のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7および配列番号:9の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであり、より好ましくは、配列番号:3、配列番号:5または配列番号:7の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号:3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドである。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに他のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを、5’末端および／または3’末端、好ましくは5’末端に含んでいてもよい。他のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、精製のためのペプチド配列、本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチド配列、抗体認識可能なエピトープ配列などからなる群から選択される少なくとも1つのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５４】
精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００５５】
本発明のルシフェラーゼ変異体を可溶性蛋白質として発現するためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば式（Z）nで表わされるポリペプチドを挙げることができる。式（Z）nで表わされるポリペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００５６】
抗体認識可能なエピトープ配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている抗体認識可能なエピトープ配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる
【００５７】
本発明のいくつかの態様のポリヌクレオチドは、さらに他のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとして、分泌シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含まない。「分泌シグナル配列」としては、前記したものなどを挙げることができる。
【００５８】
3.本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、および酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)があげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、および昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)があげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)、pcDNA3ベクター、PICZ aベクター(インビトロジェン社製)なども好適に使用することができる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH1プロモーター、GALプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
【００６０】
また、低温で発現誘導可能なプロモーターも好適に使用することができる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック遺伝子のプロモーター配列が挙げられる。コールドショック遺伝子としては、例えば、大腸菌コールドショック遺伝子(例えば、cspA、cspB、cspG、cspI、およびcsdA)、Bacillus caldolyticusコールドショック遺伝子(例えば、Bc−Csp)、Salmonella entericaコールドショック遺伝子(例えば、cspE)、およびErwinia carotovoraコールドショック遺伝子(例えば、cspG)が挙げられる。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、なかでも、cspAプロモーター、cspBプロモーター、cspGプロモーター、cspIプロモーター、csdAプロモーターなどを好適に使用することができる。
【００６１】
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列(SD配列)、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子があげられる。
【００６２】
形質転換体の作成
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、初代培養細胞（primary cell culture）、iPS細胞、培養細胞株（CHO細胞、HEK293細胞, HL−60 細胞, HeLa細胞, MDCK細胞, NIH3T３細胞, PC12細胞）などがあげられる。昆虫細胞としては、Sf9、Sf21などがあげられる。
【００６３】
組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法(Virology, 52, 456−457 (1973))、リポフェクション法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987))、エレクトロポレーション法(EMBO J., 1, 841−845 (1982))などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、Bio/Technology, 6, 47−55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(本発明のポリヌクレオチド)を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００６４】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターおよび形質転換体
発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。
【００６５】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターとは、具体的には、次のプロモーター配列、およびコード配列を含有する発現ベクターを意味する：
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列；および
(2)本発明のポリヌクレオチドを含有するコード配列。
【００６６】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列とは、宿主細胞を増殖させる培養条件から、温度を下げることによって蛋白質の発現を誘導可能なプロモーター配列を意味する。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック蛋白質をコードする遺伝子(コールドショック遺伝子)のプロモーターが挙げられる。コールドショック遺伝子のプロモーターとしては、前記したものが挙げられる。
【００６７】
本発明で用いられる低温で発現誘導可能なプロモーターが発現誘導しうる温度としては、通常30℃以下、好ましくは25℃以下、より好ましくは20℃以下、特に好ましくは15℃以下である。ただし、より効率良く発現を誘導させるため、通常は5℃以上、好ましくは10℃以上、特に好ましくは約15℃で発現誘導させる。
【００６８】
本発明の低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを作製する場合、本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターとしては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)などを好適に使用することができる。これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性蛋白質として産生させることができる。
【００６９】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターを導入する宿主としては、原核細胞が好ましく、さらに大腸菌が好ましく、特にBL21株、JM109株が好ましく、なかでもBL21株が好ましい。BL21株及びJM109株は、例えばNovagenから入手することができる。
【００７０】
低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度は、通常25〜40℃、好ましくは30〜37℃である。発現誘導させる温度は、通常4〜25℃、好ましくは10〜20℃、より好ましくは12〜18℃、特に好ましくは15℃である。
【００７１】
4．本発明のルシフェラーゼ変異体の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、本発明のルシフェラーゼ変異体の製造方法を提供する。本発明のルシフェラーゼ変異体は、例えば、前記形質転換体を本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド（DNA）が発現可能な条件下で培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
【００７２】
形質転換体の培養
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明のルシフェラーゼ変異体が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明のルシフェラーゼ変異体が蓄積される。
【００７３】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。
【００７４】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
【００７５】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や0.5％(w/v)カザミノ酸を含有するSD培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７６】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約5〜20％(v/v)の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, 122, 501 (1952)），DMEM培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７７】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した10％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6．2〜6．4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００７８】
なお、低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を細胞増殖させる培養温度および発現誘導させる温度は、前記した通りである。
【００７９】
本発明のルシフェラーゼ変異体の分離・精製
上記培養物から、本発明のルシフェラーゼ変異体を分離・精製することによって、本発明のルシフェラーゼ変異体を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のルシフェラーゼ変異体の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
【００８０】
具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のルシフェラーゼ変異体の粗抽出液を得ることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により本発明のルシフェラーゼ変異体を含む抽出液を得ることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のルシフェラーゼ変異体を含む培養上清を得ることができる。
【００８１】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のルシフェラーゼ変異体の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明のルシフェラーゼ変異体が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、S−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインAのアミノ酸の配列を含有する場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
【００８２】
5.本発明のルシフェラーゼ変異体の利用
発光による検出マーカーとしての利用
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリン存在下、発光による検出マーカー(以下、「本発明の検出マーカー」)として利用することができる。本発明の検出マーカーは、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。
【００８３】
本発明のルシフェラーゼ変異体は、例えば、目的蛋白質との融合蛋白質として発現させ、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入することによって、前記目的蛋白質の分布を測定するために利用することもできる。このような目的タンパク質などの分布の測定は、発光イメージング等の検出法などを利用して行うこともできる。なお、本発明のルシフェラーゼ変異体は、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることもできる。
【００８４】
用いる発光基質（ルシフェリン）は、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが特に好ましい。bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンは、セレンテラジンの約10倍の発光活性を示し、かつグローに発光する。
【００８５】
レポーター蛋白質としての利用
本発明のルシフェラーゼ変異体は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。この場合、本発明のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体を発現する細胞の培養容器にルシフェリンを添加すること、前記細胞とルシフェリンとを混合すること、前記細胞をルシフェリンの存在下で培養することが含まれる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサー)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン（発光基質）存在下、本発明のルシフェラーゼ変異体に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。さらに、発現したルシフェラーゼ変異体をセレンテラジン類と反応させ、生成する発光を高感度検出装置により可視化、画像化することもできる。
【００８６】
用いるルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが特に好ましい。bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンは、セレンテラジンの約10倍の発光活性を示し、かつグローに発光する。
【００８７】
用いる細胞は、動物細胞であるのが好ましい。動物細胞の場合であっても、本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、細胞外に分泌する。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、レポーター遺伝子として利用することができる。
【００８９】
発光反応を可視化する方法
本発明のルシフェラーゼ変異体は、発光活性を可視化する方法に用いることができる。「発光活性を可視化する」ことにより、例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体が細胞から分泌されるときの分泌の様子を観察することができる。本発明のルシフェラーゼ変異体は、後述の実施例で実証されているように、小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経由せずに細胞外へ分泌する。
【００９０】
発光反応を可視化する方法は、具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体を発現する細胞の培養容器にルシフェリンを添加すること、前記細胞とルシフェリンとを混合すること、前記細胞をルシフェリンの存在下で培養することが含まれる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を含むベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン（発光基質）存在下、本発明のルシフェラーゼ変異体に由来する発光を検出することにより、発光反応を可視化することができる。このとき、発光の検出は、例えば、高感度検出装置により行う。
【００９１】
用いるルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、h−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンが特に好ましい。h−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンは、セレンテラジンの１０倍の発光活性を示し、かつ、発光の減衰が早い。
【００９２】
用いる細胞は、動物細胞であるのが好ましい。動物細胞の場合であっても、本発明の好ましい態様のルシフェラーゼ変異体は、細胞外に分泌する。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチドは、上述のようにして、発光反応を可視化する方法に利用することができる。
【００９４】
アミューズメント用品の材料
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンが酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成される反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。よって、本発明のルシフェラーゼ変異体は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
【００９５】
用いるルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが特に好ましい。bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンは、セレンテラジンの約10倍の発光活性を示し、かつグローに発光する。
【００９６】
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法
本発明のルシフェラーゼ変異体は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
【００９７】
例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体をドナーとして使用し、蛍光物質(例えば、有機化合物、および蛍光蛋白質)をアクセプターとして使用して、両者の間で生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)を起こすことによりドナーとアクセプターとの間の相互作用を検出することができる。
【００９８】
本発明のある態様では、アクセプターとして使用する有機化合物は、Hoechst3342、Indo−1、DAP1などである。本発明の別の態様では、アクセプターとして使用する蛍光蛋白質は、緑色蛍光蛋白質(GFP)、青色蛍光蛋白質(BFP)、変異GFP蛍光蛋白質、フィコビリンなどである。これらの有機化合物および蛍光蛋白質は、市販のものを入手可能である。
【００９９】
本発明の好ましい態様において、解析する生理機能は、オーファン受容体(特にG蛋白質共役受容体)、アポトーシス、または遺伝子発現による転写調節などである。また、本発明の好ましい態様において、分析する酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼまたはリン酸化酵素などである。
【０１００】
BRET法による生理機能の解析は、公知の方法で行うことができ、例えば、Biochem. J. 2005, 385, 625−637、またはExpert Opin. Ther Tarets, 2007 11: 541−556に記載の方法に準じて行うことができる。また、酵素活性の測定も、公知の方法で行うことができ、例えば、Nature Methods2006, 3:165−174、またはBiotechnol.J. 2008, 3:311−324に記載の方法に準じて行うことができる。
用いる発光基質（ルシフェリン）は、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましく、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが特に好ましい。bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンは、セレンテラジンの約10倍の発光活性を示し、かつグローに発光する。
【０１０１】
6.本発明のキット
本発明は、本発明ルシフェラーゼ変異体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにルシフェリンを含んでいてもよい。
【０１０２】
ルシフェリンは、前述の通り、セレンテラジン類であるのが好ましい。本発明のいくつかの態様では、bis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが特に好ましい。本発明の別のいくつかの態様では、h−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンが特に好ましい。
【０１０３】
本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。本発明のキットには、さらに、ハロゲン化物イオンを含む塩などを含んでいてもよい。
【０１０４】
本発明のキットは、上述したレポーター蛋白質もしくはレポーター遺伝子を用いた測定、発光による検出マーカー、BRET法による生理機能の解析または酵素活性の測定などに利用することができる。また、後述の発光反応方法に用いることもできる。
【０１０５】
7.発光反応方法
発光活性
本発明のルシフェラーゼン変異体は、ルシフェリンを酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンを基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。この活性を、本明細書において、「発光活性」と称することがある。
【０１０６】
発光反応
本発明のルシフェラーゼ変異体を用いた、ルシフェリンを基質とする発光反応は、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、ルシフェリンを収容した容器に本発明のルシフェラーゼ変異体を添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体を収容した容器にルシフェリンを添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを混合することが含まれる。反応条件としては、オプロフォーラスルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
【０１０７】
具体的には、反応溶媒としては、Tris−HCl緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液、水、などが用いられる。
【０１０８】
反応温度は、通常約4℃〜約40℃、好ましくは約4℃〜約25℃である。
反応溶液のpHは、通常約5〜約10、好ましくは約6〜約9、より好ましくは約7〜約8、特に好ましくは約7.5である。
【０１０９】
ルシフェリンとしては、前述の通り、セレンテラジン類が好ましい。本発明のいくつかの態様では、特にbis−セレンテラジンまたは6h−f−セレンテラジンが好ましい。本発明の別のいくつかの態様では、特にh−セレンテラジンまたはf−セレンテラジンが好ましい。
【０１１０】
ルシフェリンは、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキシド等の極性溶媒や、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコールの溶液として反応系に加えてもよい。
【０１１１】
発光活性の活性化
本発明のルシフェラーゼ変異体の、ルシフェラーゼ活性は、ハロゲン化物イオン、非イオン性界面活性剤などにより活性化され得る。
【０１１２】
ハロゲン化物イオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどがあげられ、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンが好ましい。
【０１１３】
ハロゲン化物イオンの濃度は、通常約10μM〜約100mM、好ましくは約100μM〜約50mM、特に好ましくは約1mM〜約20mMである。
【０１１４】
反応系にハロゲン化物イオンを添加する方法としては、塩として添加する方法などがあげられる。用いられる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩などがあげられる。より具体的には、NaF、NaCl、NaBr、NaI、KF、KCl、KBr、KI、CaF2、CaCl2、CaBr2、CaI2、MgF2、MgCl2、MgBr2、MgI2などがあげられる。
【０１１５】
非イオン性界面活性剤の市販品（商品名）としては、Tween20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)、Tween80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート)、TritonX−100(ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル)、Brij−58 (ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル)、Nonidet P−40 (エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル））などがあげられ、Tween20、TritonX−100などが好ましい。これらは、例えば、和光純薬工業株式会社、東京化成工業株式会社およびシグマアルドリッチから購入できる。
【０１１６】
非イオン性界面活性剤の濃度は、通常約0.0002%(w/v)〜約0.2%(w/v)、好ましくは約0.001%(w/v)〜約0.1%(w/v)、特に好ましくは約0.05%(w/v)〜約0.02%(w/v)である。
【０１１７】
なお、本明細書に記載した全ての文献および刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０１１８】
実施の形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【０１１９】
なお、本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。
【０１２０】
発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【０１２１】
以下に実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。
【０１２２】
実施例1：16ヶ所の変異を有する変異19k OLase遺伝子(dnKAZ)の調製法
Inouye et al (2013) Biochem. Biophys.Res.Commun. 437: 23−28に記載のpCold−ZZ−P−nanoKAZを鋳型として以下のプライマーを用いて、PCR法により遺伝子増幅した。
【０１２３】
プライマーnanoKAZ−1N/EcoRI（配列番号：19：5’ gcgGAATTCTTCACCCTGGAGGACTTCGTCGGC 3’： アンダーラインEcoRI 配列）
プライマーnanoKAZ−3C/XbaI（配列番号:20：5’ gccTCTAGATTAGGCCAGGATTCTCTCGCACAGTCT 3’：アンダーラインXbaI 配列）
【０１２４】
ここで、pCold−ZZ−P−nanoKAZの塩基配列を配列番号:11に示し、アミノ酸配列を配列番号:12に示す。
【０１２５】
実施例2：ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を使用してdnKAZを分泌発現するベクター
dnKAZ発現ベクターの構築は以下の通りである。先ず、動物培養細胞での新規発現ベクターpcDNA3−GLspを構築した。具体的には、pcDNA3−GLucベクター（プロルミ社製）よりガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を以下のプライマーを用いてPCR法により取得した。
【０１２６】
プライマーGLsp−1R/EcoRI （配列番号：21：5' ggc GAA TTCGGT GGG CTT GGC CTC GGC CAC 3'、アンダーラインEcoRI 配列）
T７プライマー（配列番号：22：5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3'）
【０１２７】
それをHindIII/EcoRIで消化後、得られた断片を、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)の制限酵素部位であるHindIII/EcoRI部位に挿入することにより、新規発現ベクターpcDNA3−GLspを構築した。すなわち、新規発現ベクターは、CMVのプロモーターに制御され、その下流にコザック配列、ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列、マルチクローニングサイト配列を有する。
【０１２８】
次に、新規発現ベクターpcDNA3−GLspを用いたdnKAZ発現ベクターの構築は以下の通りである。実施例1で調製したDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、pcDNA3−GLspのEcoRI−XbaI 部位に連結することによって、発現ベクターpcDNA3−GLsp−dnKAZを構築した。なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
【０１２９】
実施例3: アミノ末端領域のアミノ酸配列を欠失したnanoKAZ遺伝子断片の調製法
アミノ末端領域のアミノ酸配列を欠失したnanoKAZ遺伝子断片の調製法は、以下の手法で行った。
実施例2で作製したpcDNA3−GLsp−dnKAZを鋳型として、2種のPCRプライマーを用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR法（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施した。
例えば、1アミノ酸欠失変異体ΔN2T−nKAZ遺伝子を作製する場合は、pcDNA3−GLsp−dnKAZを鋳型として、以下の2種のプライマーを用いてPCR法を実施した。
【０１３０】
D2−nKAZ−15N/EcoRI（5’gccGAATTCAAGC TTGGTACCAC CATGGTCACCCTGGAGG ACTTCGTCGG CGAC 3’アンダーラインEcoRI 配列およびKpnI配列）（配列番号：23）
nanoKAZ−3C/XbaI（5’gccTCTAGA TTAGGCCAGG ATTCTCTCGC ACAGTCT 3’）（配列番号：20）
【０１３１】
その結果、nanoKAZ(配列番号:2)のアミノ酸配列の1番目のアミノ酸フェニルアラニンを欠失した領域をコードする遺伝子（ΔN2T−nKAZ）を増幅した。ここで、naoKAZの塩基配列を配列番号:1に示す。また、ΔN2T−nKAZの塩基配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号:3および配列番号:4に示す。
【０１３２】
以下同様にして、表2に記載の鋳型およびプライマーを用いて、アミノ酸を欠失したnanoKAZ遺伝子領域を取得した。取得した遺伝子領域のnanoKAZのアミノ末端欠失体における、欠失したアミノ酸を表1に記載する。
【０１３３】
ここで、ΔN3L−nKAZの塩基配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号:5および配列番号:6に示す。ΔN4E−nKAZの塩基配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号:7および配列番号:8に示す。ΔN5D−nKAZの塩基配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号:9および配列番号:10に示す。
【０１３４】
表１. nanoKAZのアミノ末端欠失体のアミノ酸配列
【表１】
2015122982.tif 000002
【０１３５】
表２.  nanoKAZ蛋白質のアミノ末端の欠失に使用した鋳型とPCRプライマーのリスト
【表２−１】
2015122982.tif 000003
【０１３６】
【表２−２】
2015122982.tif 000004
【０１３７】
実施例4： pCold IIベクターによるnanoKAZのアミノ末端欠失体の大腸菌発現ベクターの構築
実施例3で得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、発現ベクターpColdII(タカラバイオ社)の制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結する事によって、pCold−ΔN5D−nKAZ、pCold−ΔN6F−nKAZ、pCold−ΔN7V−nKAZ、pCold−ΔN8G−nKAZ、pCold−ΔN9D−nKAZ、pCold−ΔN10W−nKAZのnanoKAZのアミノ末端欠失体発現ベクターを構築した。
【０１３８】
また、実施例1に記載のpCold−ZZ−P−nanoKAZを常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化後、同様に発現ベクターpColdIIの制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結して、pCold−nanoKAZベクターを構築した。DNAシークエンサー（ABI社製）にて塩基配列を決定する事により、インサートDNAの確認を行った。pCold−nanoKAZの塩基配列を配列番号:13に示し、アミノ酸配列を配列番号:14に示す。
【０１３９】
実施例5：nanoKAZのアミノ末端欠失体の大腸菌での発現と粗酵素液の調製
nanoKAZのアミノ末端欠失体を大腸菌において発現させるため、実施例4で作製した組換えプラスミドを用いた。宿主大腸菌株としてBL21（Novagen, Madison, WI）を用いた。組換えプラスミドを含むBL21株をアンピシリン（50μｇ／ｍL）を含有する5 mLのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（以降LB培地と記載）で、37℃で18時間、培養した。この種培養0.1mLを、10 mLのＬＢ培地に植菌し、３時間培養した。その後、氷中で、１時間冷却した。その培養液に、最終濃度が0.1 mMとなるようにＩＰＴＧを加えた後、さらに15℃で17時間培養した。培養後、1 mLの培養液を回収し、10,000 rpmで2分間の遠心分離により大腸菌を回収し、0.5 mLの30 ｍＭ Tris−HCl (pH7.6)−10 mM EDTA(和光純薬製)(以降TEと記載)中に懸濁した。Branson  model  250  sonifire（Danbury, CT）を用い、3秒間の超音波処理することにより大腸菌を破壊し、粗酵素液を調製した。粗酵素液5 μLをSDS−PAGE分析に供し、蛋白質の発現を確認した（図1）。
【０１４０】
ここで、図1中のMおよび1〜7は次の通りである。M: 分子量サイズマーカー、1: nanoKAZ、2: ΔN5D−nKAZ、3: ΔN6F−nKAZ、4: ΔN7V−nKAZ、5: ΔN8G−nKAZ、6: ΔN9D−nKAZおよび7: ΔN10W−nKAZ。
【０１４１】
実施例6：ZZ融合nanoKAZのアミノ末端欠失体の大腸菌発現ベクターの構築
nanoKAZのアミノ末端欠失体を可溶性蛋白質として発現させるために、発現ベクターpCold−ZZ−X（Inouye & Sahara, Protein Express. Purif. (2009) 66:52−57に記載）を使用した。この発現ベクターのEcoRI／XbaI制限酵素部位に、実施例3で取得したDNA断片を制限酵素EcoRI/XbaIにて消化、連結し、pCold−ZZ−P−ΔN2T−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN3L−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN4E−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN5D−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN6F−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN7V−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN8G−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN9D−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN10W−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN15G−nKAZ、pCold−ZZ−P−ΔN20Q−nKAZの11種類のZZ融合nanoKAZのアミノ末端欠失体発現ベクターを構築した。
【０１４２】
実施例7：ZZ融合nanoKAZのアミノ末端欠失体の大腸菌での発現と粗酵素液の調製
ZZ融合nanoKAZのアミノ末端欠失体を大腸菌において発現させるため、実施例6で作製した組換えプラスミドを用いた。宿主大腸菌株としてBL21（Novagen, Madison, WI）を用いて、実施例5と同様の方法で粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液5μLをSDS−PAGE分析に供し、蛋白質の発現を確認した(図2)。
ここで、図2中のMおよび1〜12は次の通りである。M: 分子量サイズマーカー、1: ZZ−P−nanoKAZ、2: ZZ−P−ΔN2T−nKAZ、3: ZZ−P−ΔN3L−nKAZ、4: ZZ−P−ΔN4E−nKAZ、5: ZZ−P−ΔN5D−nKAZ、6: ZZ−P−ΔN6F−nKAZ、7: ZZ−P−ΔN7V−nKAZ、8: ZZ−P−ΔN8G−nKAZ、9: ZZ−P−ΔN9D−nKAZ、10: ZZ−P−ΔN10G−nKAZ、11: ZZ−P−ΔN15G−nKAZおよび12: ZZ−P−ΔN20Q−nKAZ。
【０１４３】
実施例8：nanoKAZのアミノ末端欠失体およびZZ融合nanoKAZのアミノ末端欠失体粗酵素液の発光活性測定法
実施例5および7にて得られた粗酵素液を氷中にて1時間以上静置後、TEにて50倍希釈した。その粗酵素液1 μLを、1μg のセレンテラジン（JNC社製）を含む100μLのTEに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)を百分率(%)で表記した。
【０１４４】
大腸菌での発現において、アミノ末端の8個以上のアミノ酸欠失により、nanoKAZ蛋白質の発光活性の低下が著しい。しかし、5個までのアミノ酸欠失では、40〜60％の発光活性を有することから、nanoKAZのアミノ末端領域は、発光活性に直接影響がないことが明らかとなった。
【０１４５】
表３. nanoKAZのアミノ末端欠失体粗酵素液の発光活性
【表３】
2015122982.tif 000005
【０１４６】
実施例9：ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を使用してアミノ酸欠失nanoKAZ変異体を分泌発現するベクター
大腸菌でのnanoKAZのアミノ末端欠失体の発現により、アミノ末端から9番目までのアミノ酸欠失体(ΔN10W−nKAZ)においても検出可能な発光活性が認められた。これらの欠失体が、動物培養細胞において、分泌発現可能か確かめるために、動物培養細胞でnanoKAZのアミノ末端欠失体を発現するベクターを構築した。
【０１４７】
具体的には、実施例3で得られたnanoKAZのアミノ末端欠失体遺伝子断片を常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、実施例2で作製したpcDNA3−GLspベクターのEcoRI−XbaI 部位に連結することによって、発現ベクターpcDNA3−GLsp−ΔN2T−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN3L−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN4E−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN5D−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN6F−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN7V−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN8G−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN9D−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN10W−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN15G−nKAZ、pcDNA3−GLsp−ΔN20Q−nKAZを構築した。
【０１４８】
また、実施例1に記載のpCold−ZZ−P−nanoKAZを常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化後、同様に発現ベクターpcDNA3−GLspベクターの制限酵素EcoRI/XbaI部位に連結して、pcDNA3−GLsp−nanoKAZベクターを構築した。
なお、DNA シークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。pcDNA3−GLsp−nanoKAZの塩基配列を配列番号:15に示し、アミノ酸配列を配列番号:16に示す。
【０１４９】
実施例10：動物培養細胞へのベクターの導入および測定用酵素の調製法
（１）発現プラスミドの精製
実施例9にて得られた組換えプラスミドを用いて以下の実験を行った。組換えプラスミドは大腸菌JM83より、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製し、滅菌水に溶解した。同様にして、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター（pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製）を使用した。
【０１５０】
（２）トランスフェクションおよび測定用酵素の調製法
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO−KI株を、10％(v/v)牛胎児血清（バイオウエスト社製）を含むHam’s F−12培地（和光純薬社製）(以降Ham’s−F12培地と記載することもある)にて培養した。CHO−K1細胞を1 x 10５ 細胞/ウエル/2 mL培地にて6 ウエルプレートに播種し(n = 2)、インキュベーター中37 ℃、5 %(v/v) CO2にて培養した。24時間後、精製した組換えプラスミドをFuGene HD（プロメガ社製）トランスフェクションキットを用いて、CHO−K1細胞にトランスフェクションし、次の実験に用いた。具体的には、100μL の培地に、組換えプラスミド1μgとpGL4.13 [Luc2/sv40]内部標準ベクター0.1μgと、FuGene HD 3μLを加え、室温で15分間放置した。100μLのDNA−FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加した。44時間培養後、培養液を回収した。一方、細胞内で発現したKAZ変異体については、細胞を３mLの１x PBSで３回洗浄後、1 mLの１x PBSに懸濁し、氷上で超音波破砕処理して得られたものを、細胞抽出nanoKAZ欠失体酵素液とした。
【０１５１】
実施例11：動物培養細胞で分泌シグナル配列を有しないnanoKAZのアミノ末端欠失体発現ベクターの構築
実施例3で得られたnanoKAZのアミノ末端欠失体の遺伝子断片を制限酵素Asp718とXbaI で消化後、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)のAsp718−XbaI部位に挿入し、pcDNA3−ΔN2T−nKAZ、pcDNA3−ΔN3L−nKAZ、pcDNA3−ΔN4E−nKAZ、pcDNA3−ΔN5D−nKAZ、pcDNA3−ΔN6F−nKAZ、pcDNA3−ΔN7V−nKAZ、pcDNA3−ΔN8G−nKAZ、pcDNA3−ΔN9D−nKAZ、pcDNA3−ΔN10W−nKAZ、pcDNA3−ΔN15G−nKAZ、pcDNA3−ΔN20Q−nKAZベクターを構築した。
【０１５２】
また、実施例1に記載のpCold−ZZ−P−nanoKAZを常法により制限酵素Asp718/XbaIにて消化後、同様に発現ベクターpcDNA3ベクターの制限酵素Asp718/XbaI部位に連結して、pcDNA3−nanoKAZベクターを構築した。pcDNA3−nanoKAZの塩基配列を配列番号:17に示し、アミノ酸配列を配列番号:18に示す。
【０１５３】
実施例12：動物培養細胞へのベクターの導入および測定用酵素の調製法
（１）発現プラスミドの精製
実施例11にて得られた組換えプラスミドを実施例10と同様にして精製し、滅菌水に溶解した。同様にして、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター（pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製）を使用した。
【０１５４】
（２）トランスフェクションおよび測定用酵素の調製法
実施例10と同様の方法にて、nanoKAZのアミノ末端欠失体の培養液と細胞抽出nanoKAZのアミノ末端欠失体酵素液を得た。
【０１５５】
実施例13：動物培養細胞発現nanoKAZのアミノ末端欠失体の発光活性測法
実施例10および12で得られた培養液および細胞抽出液5μLを、1μg のセレンテラジン（JNC社製）を含む100μLのTEに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、60秒間で測定し、最大発光強度(Imax)を百分率(%)で表記した。
【０１５６】
その結果、ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナルを有するnanoKAZのアミノ末端欠失体では、細胞質内でΔN2T−nKAZからΔN8G−nKAZまで、培養液でΔN2T−nKAZからΔN6F−nKAZまで発光活性が認められた。
【０１５７】
一方、分泌シグナルを有しないnanoKAZのアミノ末端欠失体では、アミノ末端から4アミノ酸を欠失したΔN5−nKAZまでは、培養液への分泌が認められたが、アミノ末端から5個以上のアミノ酸を欠失したnanoKAZ欠失体からは、培養液中への分泌は認められなかった。アミノ末端領域のアミノ酸を少なくとも1個、最大で4個欠失したnanoKAZ欠失体は、分泌シグナルを持たなくても細胞外へ分泌できることが明らかとなった。
【０１５８】
一方、トランスフェクションの効率を確認するための内部標準で使用したホタルルシフェラーゼについては、実施例10および12で得られた細胞抽出液5μLを、100μL の酵素アッセイ用試薬（プロメガ社）に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、10秒間での最大発光強度(rlu)を測定した。その結果、トランスフェクション効率は、ほぼ同一であることを確かめた。
【０１５９】
表４. nanoKAZのアミノ末端欠失体の培養液および細胞抽出液の発光活性
【表４】
2015122982.tif 000006
【０１６０】
実施例8での大腸菌での発現活性および実施例13での動物培養細胞による分泌確認実験より、アミノ末端から1、2、3 もしくは 4番目のアミノ酸までを欠失したnanoKAZ欠失体は、動物培養細胞内から培養液へ分泌することを確認した。この結果より、nanoKAZにおいて、アミノ末端から少なくとも1つ、最大で4つのアミノ酸配列が、細胞外への分泌に関与していることが明らかとなった。
【０１６１】
実施例14：ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を有するnanoKAZを安定発現するCHO−KI株の調製法
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO−KI株を、Ham’s F−12培地にて培養した。CHO−K1細胞を2 x 10５ 細胞/ウエル/2 mL培地にて6 cmシャーレに播種し(n = 2)、インキュベーター中37℃、5 %(v/v) CO2にて培養した。24時間後、実施例10にて精製したpcDNA3−GLsp−nanoKAZをFuGene HD（プロメガ社製）トランスフェクションキットを用いて、CHO−K1細胞にトランスフェクションした。
【０１６２】
トランスフェクションしたCHO−K1細胞をトリプシン処理し、5 mLのHam’s F−12培地に再懸濁後、0.5x105cellsの細胞懸濁液を10mLのHam’s F−12培地の入った10 cmシャーレ6枚に播種した。37℃、5% CO2インキュベータにて一晩培養後、50 mg/mL G418硫酸塩(カルビオケム製）を160μl （最終濃度800μg/mL）加える。37℃、5% CO2インキュベータにて7日培養した。
【０１６３】
7日後、形成したコロニー48個を滅菌済み爪楊枝で取り、50μLのトリプシンを予め加えておいた、96ウェルプレートに懸濁した。50μlのトリプシン−細胞懸濁液48ヶに、100μLのHam’s F−12培地を加え、1 mLのG418を含有したHam’s F−12培地 の入った24ウェルプレートに加えた。37℃、5% CO2インキュベータで、細胞が増殖するまで7日間程度培養した。
【０１６４】
細胞が増殖したところで、5μLの培養液を回収し、0.5μg のセレンテラジンを含む100μLのTEに加え、発光活性を測定した。高い発光活性を示した細胞株をトリプシン処理し、1 mLのG418含有Ham’s F−12培地に懸濁した。その細胞懸濁液50μLを1 mLのG418含有Ham’s F−12培地の入った24ウェルプレートに加え、37℃、5% CO2インキュベータで、細胞が増殖するまで5日間程度培養した。
【０１６５】
細胞が増殖したところで、同様に発光活性を測定し、高い発光活性を示した細胞株をトリプシン処理、1 mLのG418含有Ham’s F−12培地に懸濁した。その細胞懸濁液200μLを3 mLのG418含有Ham’s F−12培地の入った6ウェルプレートに加え、37℃、5% CO2インキュベータで、細胞が増殖するまで5日間程度培養した。
【０１６６】
細胞が増殖したところで、同様に発光活性を測定し、高い発光活性を示した細胞株をトリプシン処理、1 mLのG418含有Ham’s F−12培地に懸濁した。その細胞懸濁液500 μLを10mLのG418含有Ham’s F−12培地の入った10cmシャーレに加え、37℃、5% CO2インキュベータで、細胞が増殖するまで3〜5日間程度培養した。
【０１６７】
細胞が増殖したところで、同様に発光活性を測定し、高い発光活性を示すことを確認した。安定してガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を有するnanoKAZを発現するCHO−K1細胞株を取得した。
【０１６８】
実施例15：分泌シグナル配列を有しないnanoKAZを安定発現するCHO−KI株の調製法
トランスフェクションするプラスミドDNAを、実施例13で精製したpcDNA3−nanoKAZを使用したこと以外は、実施例14と同様の方法にて、安定して分泌シグナルを有しないnanoKAZを発現するCHO−K1細胞株を取得した。
【０１６９】
実施例16：ブレフェルジンA による分泌阻害の比較
実施例14および15で樹立した安定発現株を用いて、小胞輸送によりトランス−ゴルジネットワークを経て，開口分泌（エキソサイトーシス）を阻害するブレフェルジンAの効果を比較した。具体的には、安定株由来のそれぞれ2 x 10５ 細胞を3 mLの10% FBSを含むHam’s F−12培地の入った6ウェルプレートに加え、37℃、5% CO2インキュベーターで、48時間培養した。3 mLの10% FBSを含むHam’s F−12培地で2回洗浄後、ブレフェルジンA(和光純薬社製)の最終濃度が5μg／mLになるよう添加した。実験対照として、ブレフェルジンA未添加培養細胞を用いた。培養時間0,1，3,６時間ごとに、セレンテラジンを基質として、培養液中の発光活性を測定した。その結果を図3及び図４に示した。
【０１７０】
図３に示すように、分泌シグナル配列を有するnanaKAZ 遺伝子を用いて樹立したpcDNA3− GLsp−nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現株では、ブレフェルジンA未添加細胞に比べ、培養液へのnanoKAZ分泌は著しく阻害された。このことは、分泌シグナル配列を有するnanaKAZは、通常の小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経て分泌することが示された。
【０１７１】
一方、図４に示すように、分泌シグナル配列を有さないnanaKAZ 遺伝子を用いて樹立したpcDNA3− nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現株では、ブレフェルジンA添加の有無に寄らず、nanoKAZ蛋白質が分泌することから、通常の小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経て分泌するのではなく、別の経路で分泌することを示している。
【０１７２】
以上の結果および実施例8及び13のアミノ末端欠失nanoKAZ遺伝子発現実験の結果から、nanoKAZ蛋白質のアミノ末端から１〜４アミノ酸領域には、通常の分泌シグナルペプチド配列と異なる分泌情報が存在することが示された。
【０１７３】
実施例17： nanoKAZの分泌の可視化
実施例14および15で樹立した安定発現株を用いて、分泌可視化を行った。104 細胞を3 mL の10％FBSを含むMEM−alpha 培地（和光純薬社製）の35 mmガラスボトムプレート（イワキ社製）で、37℃、5% CO2インキュベーターで、48時間培養した。3 mL  のHBSS（和光純薬社製）で3回洗浄後、h−セレンテラジンの最終濃度が  3 μg/mL になるようにHBSSに溶解し、EM−CCDカメラ（ImagEM 1K:浜松ホトニクス社製）装着のIX81−ZDC 顕微鏡（オリンパス社製）下で、画像取得条件(1 x 1 ビニング, ファーストスキャン, EM−ゲインレベル 255, フォトンカウンチングレベル = 1, 画像取得時間 0.5 秒) でイメージング画像を取得した。h−セレンテラジン添加後、15秒後イメージング画像を図５に示した。a およびbは、pcDNA3−GLsp−nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現細胞の明視野画像と発光イメージング画像である。cおよびdは、pcDNA3− nanoKAZ/CHO−K1 細胞安定発現細胞の明視野画像と発光イメージング画像である。両者の発光イメージ画像bおよびdの比較から、小胞体からトランス−ゴルジネットワークを経て分泌するpcDNA3−GLsp−nanoKAZ/CHO−K1 細胞にくらべ、pcDNA3−nanoKAZ/CHO−K1細胞では、細胞表面に均一分布し、細胞外へ分泌されておりその分泌形式が異なることが示された。すなわち、実施例8及び13のアミノ末端欠失nanoKAZ遺伝子発現実験の結果から、nanoKAZ蛋白質のアミノ末端から１〜４アミノ酸領域には、通常の分泌シグナルペプチド配列と異なる分泌情報が存在し、その結果、可視化される分泌画像も異なることが明らかとなった。
【０１７４】
実施例18：nanoKAZアミノ末端欠失体の基質特異性
基質特異性実験に使用したnanoKAZアミノ末端欠失体の酵素溶液は、実施例11記載の方法で調製したアミノ末端欠失発現用pcDNA3ベクター（pcDNA3−ΔN2T−nKAZ、pcDNA3−ΔN3L−nKAZ、pcDNA3−ΔN4E−nKAZ、pcDNA3−ΔN5D−nKAZ、pcDNA3−ΔN6F−nKAZ）を用いて、実施例12記載の方法によりCHO−K1細胞にトランスフェクション後、48時間培養後の培養液を回収し凍結保存した。基質特異性実験に使用したセレンテラジン類縁体は、それぞれ論文記載の方法で合成した。具体的には、セレンテラジン (CTZ)、h−セレンテラジン(h−CTZ)、f−セレンテラジン(f−CTZ)、6h−f−セレンテラジン(6h−f−CTZ)は、Inouye et al (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23−28 に記載の方法で合成した。bis−セレンテラジン (bis−CTZ) はNakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett.. 38:6405−6406の記載の方法で合成した。
発光活性測定法は、氷上で凍結融解した培養液2μLを、1μgのセレンテラジンまたはその類縁体を含む100μLのTEに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置（アトー社製：ＡＢ2200）で、10秒間で測定し、基質セレンテラジンを用いたときのnanoKAZの最大発光強度(Imax)に対する相対活性値で表記した。その結果を表５に示す。
【０１７５】
【表５】
2015122982.tif 000007
【０１７６】
表５の結果から、nanoKAZ欠失体ΔN2T−nKAZ、ΔN3L−nKAZおよびΔN4E−nKAZにおいて、セレンテラジン（CTZ）を基質に使用した場合より、bis−CTZ, 6h−f−CTZ, h−CTZ およびf−CTZを基質に使用した場合に、約8倍〜15倍の高い発光活性を示し、特にh−CTZ およびf−CTZでは、10倍以上の活性を示すことが明らかとなった。さらに、nanoKAZ欠失体ΔN2T−nKAZにおいては、bis−CTZ, 6h−f−CTZ, h−CTZ およびf−CTZ に対して、nanoKAZより高い活性を示すことも明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
【０１７７】
[配列番号:1]nanoKAZの塩基配列である。
[配列番号:2]nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:3] ΔN2T−nKAZの塩基配列である。
[配列番号:4] ΔN2T−nKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:5] ΔN3L−nKAZの塩基配列である。
[配列番号:6] ΔN3L−nKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:7] ΔN4E−nKAZの塩基配列である。
[配列番号:8] ΔN4E−nKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:9] ΔN5D−nKAZの塩基配列である。
[配列番号:10] ΔN5D−nKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:11] pCold−ZZ−P−nanoKAZの塩基配列である。
[配列番号:12] pCold−ZZ−P−nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:13] pCold−nanoKAZの塩基配列である。
[配列番号:14] pCold−nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:15] pcDNA3−GLsp−nanoKAZの塩基配列である。
[配列番号:16] pcDNA3−GLsp−nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:17] pcDNA3− nanoKAZの塩基配列である。
[配列番号:18] pcDNA3− nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:19] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nanoKAZ−1N/EcoRI)。
[配列番号:20] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nanoKAZ−3C/XbaI)。
[配列番号:21] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(GLsp−1R/EcoRI)。
[配列番号:22] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(T７プライマー)。
[配列番号:23] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D2−nKAZ−15N/EcoRI)。
[配列番号:24] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D3−nKAZ−16N/ECoRI)。
[配列番号:25] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D4−nKAZ−17N/ECoRI)。
[配列番号:26] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D5nanoKAZ−4N/EcoRI)。
[配列番号:27] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D6nanoKAZ−8N/EcoRI)。
[配列番号:28] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D7nanoKAZ−9N/EcoRI)。
[配列番号:29] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D8nanoKAZ−10N/EcoRI)。
[配列番号:30] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D9nanoKAZ−11N/EcoRI)。
[配列番号:31] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D10nanoKAZ−5N/EcoRI)。
[配列番号:32] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D15nanoKAZ−6N/EcoRI)。
[配列番号:33] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(D20nanoKAZ−7N/EcoRI)。
【図３】
2015122982.tif 000008
【図４】
2015122982.tif 000009
【図１】
2015122982.tif 000010
【図２】
2015122982.tif 000011
【図５】
2015122982.tif 000012
【配列表】
2015122982000001.app