(57)【要約】【課題】変異を有する遺伝子において、より信頼性の高い変異率を測定し得る方法の提供。【解決手段】核酸含有試料と、標的核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある蛍光プローブと、非発光性核酸プローブと、回収用プローブが結合した固相担体と、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲外であるインターカレータと含む溶液を調製し、当該溶液中で、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含み、回収用プローブを介して固相担体に固定された複合体を形成する工程と、前記溶液から固液分離処理により当該複合体を含む試料溶液を調製する工程と、調製された試料溶液中の、蛍光プローブの数と前記複合体の数とを算出する工程と、算出された前記蛍光プローブの数と前記複合体の数に基づいて変異率を算出する工程とを有する、標的核酸の変異率測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）核酸含有試料と、標的核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある蛍光プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブとは異なる位置で結合する非発光性核酸プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブが結合した固相担体と、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲外である蛍光性インターカレータとを含む溶液を調製し、当該溶液中で、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む、又は標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含み、前記回収用プローブを介して前記固相担体に固定された複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記溶液から固液分離処理により、前記複合体を回収し、当該複合体を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中の、前記蛍光プローブの数と前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数とを算出する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）において算出された、前記蛍光プローブの数と、前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数に基づいて、前記核酸含有試料中の標的核酸における、前記変異部位を含む標的核酸の存在比率を算出する工程と、
を有することを特徴とする、標的核酸の変異率測定方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）の後、前記工程（ｃ）の前に、
（ｅ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中の前記複合体を、前記固相担体から解離させた後、固液分離処理により、前記固相担体から分離して回収する工程、
を有する、請求項１に記載の標的核酸の変異率測定方法。
【請求項３】
前記工程（ｅ）において、前記複合体が前記蛍光プローブを含んでいる場合に、当該複合体から前記蛍光プローブも解離させ、固液分離処理により、前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体と前記蛍光プローブとを、前記固相担体から分離して回収する、請求項２に記載の標的核酸の変異率測定方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）が
（ａ’）核酸含有試料と、標的核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある蛍光プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブとは異なる位置で結合する非発光性核酸プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブが結合した固相担体とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブとを含む、又は標的核酸と前記非発光性核酸プローブとを含み、前記回収用プローブを介して前記固相担体に固定された複合体を形成する工程、
であり、前記工程（ｂ）が、
（ｂ’１）前記工程（ａ）の後、前記溶液から固液分離処理により前記複合体を回収し、当該複合体を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ’２）前記工程（ｂ’１）の後、前記試料溶液に、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲外である蛍光性インターカレータを添加し、前記複合体中の塩基対間に挿入させる工程、
である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的核酸の変異率測定方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）における、前記蛍光プローブの数と前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数との算出を、走査分子計数法、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は蛍光偏光強度分布解析法により行う、請求項２〜４のいずれか一項に記載の標的核酸の変異率測定方法。
【請求項６】
前記工程（ｅ）において、前記工程（ｂ）において調製された試料溶液を、前記標的核酸と前記非発光性プローブとが会合体を形成し得、かつ前記標的核酸と前記蛍光プローブ、及び前記標的核酸と前記回収用プローブとは会合体を形成できない温度でインキュベートすることにより、前記複合体から前記固相担体及び前記蛍光プローブを解離させる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の標的核酸の変異率測定方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）又は工程（ａ’）において、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブと、当該回収用プローブと結合し得る固相担体とを添加することにより、前記溶液を調製する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的核酸の変異率測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異を有する遺伝子において、変異型と、当該変異型を含む全ての遺伝子型とをそれぞれ別個に蛍光標識して検出することにより、変異率を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析において、一塩基変異等の塩基配列の変異やメチル化等の修飾による変異を解析する場合には、変異率（当該遺伝子の総量のうち、変異している遺伝子の存在比率）が重要になる。このため、遺伝子変異の解析においては、同一の核酸含有試料に対して、解析対象である標的遺伝子の総量と、標的遺伝子のうちの解析対象である変異型を有する変異遺伝子の量とを、それぞれ計測する必要がある。特に、生体由来の核酸含有試料の場合、試料自体の量が少量である場合が多く、このため、標的遺伝子と変異遺伝子の検出には、極微量の標的核酸を、高感度に検出可能な方法が好ましく、特に、一の核酸含有試料から、標的遺伝子と変異遺伝子の両方を高感度に検出できる方法が好ましい。そこで、標的遺伝子と変異遺伝子は、蛍光特性の異なる別個の蛍光プローブを用いた蛍光分析技術により検出される方法が汎用されている。例えば、一の核酸含有試料中の標的核酸を、特定の変異型に特異的に結合する第１の蛍光プローブと、全ての遺伝子型に結合し、前記第１の蛍光プローブとは蛍光波長の異なる第２の蛍光プローブとで標識し、第１の蛍光プローブからの蛍光量と、第２の蛍光プローブからの蛍光量とから、変異率を算出することができる。
【０００３】
一方で、近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている（一分子光検出技術）。そこで、そのような一分子光検出技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。特に、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）、蛍光強度分布分析（Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ）等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域（顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度かつ微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。
【０００４】
最近、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系等の溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、当該微小領域内を横切る発光粒子（光を発する粒子）を個別に検出する新規な方式の光分析技術（走査分子計数法）が提案されている（例えば、特許文献１〜３参照。）。走査分子計数法は、具体的には、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする技術である。
【０００５】
走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているため、ＦＩＤＡ等と同様に試料溶液の量は微量（例えば、数十μＬ程度）であってよく、また測定時間が短い。一方で、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理を要するＦＩＤＡ等と異なり、このような統計的処理が実行されない。このため、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。つまり、発光プローブによって標識された試料溶液中の標的粒子（観測対象粒子）を、走査分子計数法を利用して検出することにより、試料溶液中の標的粒子の濃度又は数密度が非常に低い場合であっても、標的粒子の状態又は特性を検出し解析することができる（例えば、特許文献４参照。）。このように、走査分子計数法やＦＣＳ等の一分子発光分析技術は、極微量の標的粒子を感度よく検出できることから、遺伝子変異の解析に好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１０８３６９号
【特許文献２】国際公開第２０１１／１０８３７０号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１０８３７１号
【特許文献４】国際公開第２０１２／０１４７７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一の試料溶液から複数の蛍光波長を検出する場合には、蛍光波長により、検出感度が異なるという問題がある。例えば、短波長側測定では、ラマン散乱に由来するノイズによってバックグラウンドシグナルが大きくなるため、長波長側と比較して感度が低くなるという問題が発生する。また、長高波長側測定では、測定装置の検出器によっては、よりノイズが大きくなる傾向がある。つまり、高感度に検出可能な蛍光波長域は限定されているが、複数の蛍光波長を検出に用いる場合には、それぞれを区別して検出するために、いずれか一方は、検出感度が不充分な蛍光波長を使用せざるを得ない。
【０００８】
本発明は、変異を有する遺伝子において、変異型と、当該変異型を含む全ての遺伝子型とをそれぞれ別個に蛍光標識して検出する方法において、変異型と全ての遺伝子型の両方を、高感度に検出することができ、より信頼性の高い変異率を測定し得る方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、変異型を含む標的核酸のうち、解析対象である変異型を検出感度の高い蛍光波長の蛍光プローブを用いて標識し、標的核酸の全型を、検出感度の低い蛍光波長のインターカレータを用いて標識することにより、変異型と、標的核酸の全遺伝子型とを、いずれも高感度に検出でき、この検出結果に基づくことにより、より信頼性の高い変異率を算出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る標的核酸の変異率測定方法は下記［１］〜［７］である。
［１］  （ａ）核酸含有試料と、標的核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある蛍光プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブとは異なる位置で結合する非発光性核酸プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブが結合した固相担体と、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲外である蛍光性インターカレータとを含む溶液を調製し、当該溶液中で、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む、又は標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含み、前記回収用プローブを介して前記固相担体に固定された複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記溶液から固液分離処理により、前記複合体を回収し、当該複合体を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中の、前記蛍光プローブの数と前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数とを算出する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）において算出された、前記蛍光プローブの数と、前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数に基づいて、前記核酸含有試料中の標的核酸における、前記変異部位を含む標的核酸の存在比率を算出する工程と、
を有することを特徴とする、標的核酸の変異率測定方法。
［２］  前記工程（ｂ）の後、前記工程（ｃ）の前に、
（ｅ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中の前記複合体を、前記固相担体から解離させた後、固液分離処理により、前記固相担体から分離して回収する工程、
を有する、前記［１］の標的核酸の変異率測定方法。
［３］  前記工程（ｅ）において、前記複合体が前記蛍光プローブを含んでいる場合に、当該複合体から前記蛍光プローブも解離させ、固液分離処理により、前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体と前記蛍光プローブとを、前記固相担体から分離して回収する、前記［２］の標的核酸の変異率測定方法。
［４］  前記工程（ａ）が
（ａ’）核酸含有試料と、標的核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある蛍光プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブとは異なる位置で結合する非発光性核酸プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブが結合した固相担体とを含む溶液を調製し、当該溶液中で、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブとを含む、又は標的核酸と前記非発光性核酸プローブとを含み、前記回収用プローブを介して前記固相担体に固定された複合体を形成する工程、
であり、前記工程（ｂ）が、
（ｂ’１）前記工程（ａ）の後、前記溶液から固液分離処理により前記複合体を回収し、当該複合体を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｂ’２）前記工程（ｂ’１）の後、前記試料溶液に、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲外である蛍光性インターカレータを添加し、前記複合体中の塩基対間に挿入させる工程、
である、前記［１］〜［３］のいずれかの標的核酸の変異率測定方法。
［５］
前記工程（ｃ）における、前記蛍光プローブの数と前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数との算出を、走査分子計数法、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は蛍光偏光強度分布解析法により行う、前記［２］〜［４］のいずれかの標的核酸の変異率測定方法。
［６］
前記工程（ｅ）において、前記工程（ｂ）において調製された試料溶液を、前記標的核酸と前記非発光性プローブとが会合体を形成し得、かつ前記標的核酸と前記蛍光プローブ、及び前記標的核酸と前記回収用プローブとは会合体を形成できない温度でインキュベートすることにより、前記複合体から前記固相担体及び前記蛍光プローブを解離させる、前記［３］〜［５］のいずれかの標的核酸の変異率測定方法。
［７］  前記工程（ａ）又は工程（ａ’）において、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブと、当該回収用プローブと結合し得る固相担体とを添加することにより、前記溶液を調製する、前記［１］〜［６］のいずれかの標的核酸の変異率測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る標的核酸の変異率測定方法は、変異型を含む標的核酸において、解析対象である変異型と、当該標的核酸の全型との両方を、蛍光分析により高感度に検出することができる。このため、当該変異率測定方法においては、一の核酸含有試料中の変異型の量と標的核酸の全型の総量との両方を精度よく測定することができ、結果として、より信頼性の高い変異率が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、全標的核酸を非発光性核酸プローブとＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅで標識した試料溶液のピーク数の計数結果を示した図である。
【図２】実施例１において、全標的核酸をＴＡＭＲＡ標識プローブで標識した試料溶液のピーク数の計数結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る標的核酸の変異率測定方法（以下、単に「本発明に係る変異率測定方法」ということがある。）は、一の核酸含有試料において、変異型を含む標的核酸のうち、特定の変異型の変異率を測定する方法である。本発明及び本願明細書において、「標的核酸」とは、変異型をはじめとする全ての型を含む核酸であり、「変異率」とは、標的核酸の総量（すなわち、標的核酸の総量）に対する、解析対象となる変異型の存在比率を意味する。例えば、標的核酸が、野生型と一種類の変異型が存在する遺伝子由来核酸であった場合、標的核酸には野生型と変異型の両方が含まれ、変異率は、野生型と変異型の総量に対する変異型の存在比率をいう。標的核酸が、野生型と複数種類の変異型が存在する遺伝子由来核酸でり、このうちの特定の変異型を検出対象とする場合、標的核酸には野生型と全種類の変異型が含まれ、変異率は、野生型と全種類の変異型の総量に対する検出対象の変異型の存在比率をいう。なお、標的核酸が含む変異型は、塩基の置換、欠損、挿入等の塩基配列の変異であってもよく、メチル化等の修飾による変異であってもよい。
【００１４】
本発明に係る変異率測定方法は、走査分子計数法等の一分子蛍光分析技術を利用することができ、これにより極微量の蛍光粒子をも感度よく検出できる。このため、本発明に係る変異率測定方法は、感度と精度の両方に優れていることが特に要求される臨床分野に好適に利用でき、中でも、標的核酸が、遺伝子多型を有する遺伝子や、腫瘍化等によるメチル化等の修飾を受け得る遺伝子に由来する核酸であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る変異率測定方法においては、標的核酸のうちの変異率を測定する対象である変異型（以下、「標的変異核酸」ということがある。）を、高感度に検出可能な蛍光波長域の蛍光プローブで標識して検出し、標的変異核酸を含む全ての型の標的核酸（以下、「全標的核酸」ということがある。）を、検出感度が比較的低い蛍光波長域のインターカレータで標識して検出することを特徴とする。本発明においては、標的変異核酸を含む全標的核酸の量を、蛍光性インターカレータの蛍光量から求め、標的変異核酸の量を、蛍光プローブの蛍光量から求め、これらに基づいて変異率を算出する。インターカレータは、一の標的核酸中の塩基対間に多数挿入し得るため、蛍光プローブを用いた場合よりも一の標的核酸当たりの蛍光輝度を増加させることができ、ノイズが大きい場合でも感度を上げることができる。このように、本発明に係る変異率測定方法は、標的変異核酸と全標的核酸とを異なる蛍光波長の蛍光で標識するにもかかわらず、両者を共に高感度に検出することができる。
【００１６】
本発明に係る変異率測定方法は、具体的には、下記工程（ａ）〜（ｄ）を有することを特徴とする。
（ａ）核酸含有試料と、標的核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある蛍光プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブとは異なる位置で結合する非発光性核酸プローブと、前記標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する回収用プローブが結合した固相担体と、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲外である蛍光性インターカレータとを含む溶液を調製し、当該溶液中で、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む、又は標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含み、前記回収用プローブを介して前記固相担体に固定された複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記溶液から固液分離処理により、前記複合体を回収し、当該複合体を含む試料溶液を調製する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された試料溶液中の、前記蛍光プローブの数と前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数とを算出する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）において算出された、前記蛍光プローブの数と、前記標的核酸と前記非発光性核酸プローブと前記蛍光性インターカレータとを含む複合体の数に基づいて、前記核酸含有試料中の標的核酸における、前記変異部位を含む標的核酸の存在比率を算出する工程。
【００１７】
本発明において用いられる蛍光プローブは、標的変異核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合するプローブである。当該蛍光プローブが、標的変異核酸と、変異部位を含む領域において特異的に結合することにより、標的変異核酸が当該蛍光プローブの有する蛍光により標識される。ここで、「標的変異核酸中の変異部位を含む領域と特異的に結合する」とは、当該蛍光プローブが、標的核酸のうち、当該領域が当該変異部位とは異なる核酸に対するよりも、有意に優先的に結合することを意味し、当該領域が当該変異部位である標的変異核酸以外の物質と全く結合しないものである必要はない。
【００１８】
本発明において用いられる蛍光プローブは、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある。蛍光波長が５８０ｎｍ以上であれば、ラマン散乱に由来するノイズによるバックグラウンドシグナルが小さく、高感度に検出することができる。また、蛍光の検出器の種類によっては、蛍光波長が非常に長い場合には、検出感度が低下する場合がある。蛍光波長が６８０ｎｍ以下であれば、検出器によって高感度に検出可能である。
【００１９】
本発明において用いられる蛍光プローブとしては、標的変異核酸の変異型が塩基配列の変異である場合には、例えば、標的変異核酸中の当該変異部位を含む領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド（以下、「オリゴヌクレオチド等」ということがある。）に蛍光物質を結合させたものや、当該領域と特異的に結合可能なタンパク質やペプチドに蛍光物質を結合させたものが挙げられる。標的変異核酸の変異型がメチル化等の修飾による変異である場合には、例えば、当該変異部位と特異的に結合するタンパク質やペプチド等（例えば、メチル化ＤＮＡ結合性タンパク質等）に蛍光物質を結合させたものや、当該変異部位を含む領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等に蛍光物質を結合させたものが挙げられる。
【００２０】
当該オリゴヌクレオチド等としては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
【００２１】
蛍光プローブが、オリゴヌクレオチド等に蛍光物質が結合したものである場合、当該蛍光物質としては、蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にあるものであれば特に限定されず、蛍光分析の分野で広く使用されている蛍光物質の中から適宜選択して用いることができる。「蛍光波長が５８０〜６８０ｎｍの範囲内にある」とは、蛍光スペクトルのピークが５８０〜６８０ｎｍの範囲内にあることを、意味する。蛍光波長が当該範囲内にある蛍光物質としては、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（５９０ｎｍ（Ｅｘ）／６１５ｎｍ（Ｅｍ））、ＤｓＲｅｄ（５５８ｎｍ（Ｅｘ）／５８３ｎｍ（Ｅｍ））、ＴＲＩＴＣ（５４３ｎｍ（Ｅｘ）／５８０（Ｅｍ））、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７Ｎ（６５０ｎｍ（Ｅｘ）／６６８ｎｍ（Ｅｍ））、Ｃｙ（登録商標）５（６５０ｎｍ（Ｅｘ）／６７０ｎｍ（Ｅｍ））等が挙げられる。
【００２２】
本発明において用いられる非発光性核酸プローブは、標的核酸と、前記蛍光プローブとは異なる位置で結合する核酸プローブであって、蛍光物質等の発光物質による標識がなされていないものである。標的核酸中の、前記蛍光プローブが結合する領域以外の領域は、全ての型で塩基配列は同一である。つまり、当該非発光性核酸プローブは、標的変異核酸を含む全ての標的核酸と結合する。
【００２３】
本発明において用いられる非発光性核酸プローブとしては、例えば、標的変異核酸中の前記蛍光プローブが結合する領域以外の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。当該オリゴヌクレオチド等は、当該標的核酸の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的核酸の部分塩基配列と１〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。なお、当該オリゴヌクレオチド等としては、蛍光プローブと同様に、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。
【００２４】
非発光性核酸プローブと標的核酸との会合体の塩基対間に、蛍光性インターカレータが挿入されることにより、全ての型の標的核酸が、蛍光性インターカレータによる蛍光によって標識される。ここで、蛍光性インターカレータの標的核酸に対する結合量（挿入量）は、非発光性核酸プローブが標的核酸と会合する領域の塩基対長に比例する。つまり、非発光性核酸プローブが標的核酸と会合する領域が長くなるほど、標的核酸一分子当たりの蛍光性インターカレータによる蛍光標識量が多くなり、高輝度化により、蛍光検出時にノイズ（バックグラウンドシグナル）との差がより明確で検出しやすくなる。このため、非発光性核酸プローブが標的核酸と会合する領域の長さは、使用する蛍光性インターカレータの種類、蛍光検出の方法、バックグラウンドシグナルの大きさ等を考慮して、ノイズとの差が明確にできる十分な長さとなるように適宜決定することができる。例えば、蛍光性インターカレータが挿入される塩基対長が、５０ｂｐ以上であることが好ましく、６０ｂｐ以上であることがより好ましく、１００ｂｐ以上であってもよい。一方で、挿入される蛍光性インターカレータの量が多すぎる場合には、蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、非発光性核酸プローブが標的核酸と会合する領域の長さは、４００ｂｐ以下が好ましい。
【００２５】
また、非発光性核酸プローブは、蛍光プローブとは別の領域で標的核酸と結合するため、一の標的核酸に、蛍光プローブと非発光性核酸プローブが共に会合（結合）する複合体を形成し得る。このため、蛍光検出時に、標的変異核酸が蛍光プローブと非発光性核酸プローブの両者と結合している場合、蛍光性インターカレータは、標的変異核酸と非発光性核酸プローブとの会合により形成された塩基対間と、標的変異核酸と蛍光プローブとの会合により形成された塩基対間との両方に挿入される。このため、蛍光プローブと非発光性核酸プローブと標的塩基核酸の複合体を検出する場合には、蛍光プローブが標的変異核酸と結合する領域の長さを考慮して、非発光性核酸プローブが標的核酸と会合する領域の長さを決定することが好ましい。
【００２６】
本発明において用いられる蛍光性インターカレータの蛍光波長は、５８０〜６８０ｎｍの範囲外である。当該範囲外の蛍光波長は、ノイズ等により検出感度が低いが、本発明においては、標的核酸一分子当たりに複数分子の蛍光性インターカレータが結合することにより、標的核酸一分子当たりの蛍光輝度を増加させて検出確率を上げ、感度を上げている。
【００２７】
中でも、蛍光プローブの蛍光との識別がより明確になるため、本発明において用いられる蛍光性インターカレータとしては、蛍光波長が５８０ｎｍ未満のものが好ましい。当該蛍光性インターカレータとしては、例えば、エチジウムブロマイド（２９５ｎｍ（Ｅｘ）／５９５ｎｍ（Ｅｍ））、アクリジンオレンジ（３，６−Ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−ａｃｒｉｄｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（５０２ｎｍ（Ｅｘ）／５２６ｎｍ（Ｅｍ））、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）（４８８ｎｍ（Ｅｘ）／６１５ｎｍ（Ｅｍ））、ＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（３４５ｎｍ（Ｅｘ）／４５５ｎｍ（Ｅｍ））、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２（３４３ｎｍ（Ｅｘ）／４８３ｎｍ（Ｅｍ））、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（４９８ｎｍ（Ｅｘ）／５２２ｎｍ（Ｅｍ））、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（４９２ｎｍ（Ｅｘ）／５１３ｎｍ（Ｅｍ））、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（４９５ｎｍ（Ｅｘ）／５３７ｎｍ（Ｅｍ））、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（登録商標）（５００ｎｍ（Ｅｘ）／５３０ｎｍ（Ｅｍ））、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（５０２ｎｍ（Ｅｘ）／５２２ｎｍ（Ｅｍ））、Ｒｉｂｏ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（５０２ｎｍ（Ｅｘ）／５２２ｎｍ（Ｅｍ））、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）（５０２ｎｍ（Ｅｘ）／５２２ｎｍ（Ｅｍ））、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（５００ｎｍ（Ｅｘ）／５２５ｎｍ（Ｅｍ））、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（５４７ｎｍ（Ｅｘ）／５７０ｎｍ（Ｅｍ））、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（５０４ｎｍ（Ｅｘ）／５２３）ｎｍ（Ｅｍ））、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅ（４４５ｎｍ（Ｅｘ）／４７０ｎｍ（Ｅｍ））、ＹＯＹＯ（登録商標）−１（４９１ｎｍ（Ｅｘ）／５０９（Ｅｍ））等が挙げられる。
【００２８】
本発明において用いられる回収用プローブは、標的核酸と結合し、かつ固相担体と結合するものである。当該回収用プローブは、標的核酸と前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは異なる位置で結合する。このため、非発光性核酸プローブと同様に、標的変異核酸を含む全ての標的核酸と結合する。
【００２９】
当該回収用プローブが標的核酸に結合することにより、標的核酸と前記蛍光プローブと前記非発光性核酸プローブとを含む複合体が、当該回収用プローブを介して固相担体に固定化される。本発明において用いられる回収用プローブとしては、固相担体と結合する部位を有しており、標的核酸と結合した状態でさらに固相担体と結合するものであって、標的核酸と、前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブとは独立して、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であれば、特に限定されるものではないが、蛍光検出時に、固相担体に固定化されていない状態で蛍光プローブ等を検出することも可能になるため、標的核酸との結合が可逆反応であり、かつ、前記非発光性核酸プローブよりも、標的核酸から解離しやすいものが好ましい。
【００３０】
回収用プローブとしては、例えば、標的変異核酸中の前記蛍光プローブ及び前記非発光性核酸プローブが結合する領域以外の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等であって、固相担体と結合する部位を有するものが挙げられる。当該オリゴヌクレオチド等は、当該標的核酸の部分塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、当該標的核酸の部分塩基配列と１〜数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。また、当該オリゴヌクレオチド等としては、蛍光プローブと同様に、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。
【００３１】
回収用プローブが標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等である場合には、例えば、標的核酸と非発光性核酸プローブとの会合体のＴｍ値を、標的核酸と回収用プローブとの会合体のＴｍ値よりも高くすることにより、回収用プローブを非発光性核酸プローブよりも、標的核酸から解離しやすくすることができる。例えば、標的核酸中の、非発光性核酸プローブとハイブリダイズする領域の長さよりも、回収用プローブとハイブリダイズする領域の長さを短くしたり、非発光性核酸プローブ中の標的核酸と塩基対を形成する塩基の一部又は全部を、天然の塩基対よりも塩基対間力が小さい核酸類縁体としたり、非発光性核酸プローブ中の標的核酸と塩基対を形成する塩基の一部又は全部を、天然の塩基対よりも塩基対間力が大きい核酸類縁体とすることにより、標的核酸と非発光性核酸プローブとの会合体のＴｍ値を、標的核酸と回収用プローブとの会合体のＴｍ値よりも高くすることができる。
【００３２】
本発明において用いられる固相担体としては、回収用プローブと直接又は間接的に結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。
【００３３】
固相担体の材質は、水又は測定に用いられる溶媒に不溶性であり、その表面に標的粒子と結合する物質を固定化できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、天然ゴムやポリスチレン、ポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリアクリル酸エステル、及びポリメタクリル酸エステル等のプラスチック；カオリン、炭素、カーボン、活性炭、ガラス、シリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ等の無機物；ゼラチン、リポソーム、及び血球等の天然有機高分子；磁性物質；等が挙げられる。
【００３４】
本発明において用いられる固相担体としては、核酸含有試料から標的核酸のみを簡便に単離し得ることから、磁性粒子、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート、プラスチック容器、ガラス容器、チップ基板が好ましく、磁性粒子がより好ましい。固相担体としては、具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等のプラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。
【００３５】
固相担体として用いられる磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に限定されるものではない。磁性粒子として、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロム等の金属からなる粒子や、あるいはコバルト、ニッケル、マンガン等を含む合金からなる粒子等が挙げられる。また、当該磁性粒子は、磁性体のみからなる粒子であってもよく、非磁性体粒子の内部に磁性体の微粒子を含有させた粒子であってもよく、非磁性体粒子の表面に磁性体の微粒子を固定化させた粒子であってもよい。このような非磁性体粒子として、例えば、疎水性重合体からなるラテックス粒子や、架橋した親水性重合体からなるラテックス粒子、ゼラチン、リポソーム等がある。
【００３６】
当該疎水性重合体としては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレート等が挙げられる。２〜４種類程度のモノマーの共重合体からなるラテックス粒子であってもよい。また、当該架橋した親水性重合体として、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメタクリレート、デキストラン等が挙げられる。
【００３７】
回収用プローブと固相担体は、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）のように、互いに特異的に結合する２物質を利用して結合させることができる。例えば、回収用プローブが、標的核酸と結合する部位に加えて、固相担体と結合する部位としてビオチンを有している場合には、アビジンやストレプトアビジンが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。また、回収用プローブが、固相担体と結合する部位として、グルタチオン、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、２以上の糖からなる糖鎖、４以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、親水性有機化合物、及び、それらの類縁体等を有している場合には、これらの物質に対する抗体、抗原、リガンド、若しくはレセプターが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。その他、回収用プローブと固相担体は、一の分子を形成していてもよい。具体的には、例えば、回収用プローブは、標的核酸と結合する部位以外で、固相担体表面に共有結合により付加されているものであってもよい。
【００３８】
本発明に係る変異率測定方法に供される核酸含有試料としては、核酸分子を含有する試料であれば、特に限定されるものではない。当該核酸含有試料として、例えば、動物等から採取した生体試料、培養細胞等から調製された試料、核酸合成反応後の反応溶液等が挙げられる。生体試料等そのものであってもよく、生体試料等から抽出・精製した核酸溶液であってもよい。
【００３９】
本発明に係る変異率測定方法においては、まず、工程（ａ）として、核酸含有試料と、標的変異核酸に特異的に結合する前記蛍光プローブと、全標的核酸と特異的に結合する前記非発光性核酸プローブと、前記回収用プローブが結合した固相担体と、前記蛍光性インターカレータとを含む溶液を調製する。回収用プローブと固相担体が、互いに結合する2分子からなる場合、当該溶液の調製においては、予め固相担体と結合させた状態の回収用プローブを添加してもよく、回収用プローブとこれに結合し得る固相担体をそれぞれ別個に添加して、当該溶液内で両者を結合させてもよい。
【００４０】
当該溶液中で、当該核酸含有試料に含まれていた標的核酸と、非発光性核酸プローブと、蛍光性インターカレータとを含み、回収用プローブを介して固相担体に固定された複合体を形成する。蛍光プローブは、標的変異核酸に特異的に結合する。このため、標的核酸が標的変異核酸の場合には、当該複合体は、さらに、蛍光プローブを含む。一方で、標的核酸が標的変異核酸以外の場合には、当該複合体は、標的核酸と非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータとは含むが、蛍光プローブは含まない。
【００４１】
核酸含有試料等を含む溶液は、適当な溶媒を用いて調製できる。当該溶媒としては、標的核酸（特に、標的変異核酸）、蛍光プローブ、蛍光性インターカレータ等を損なわない溶媒であれば、特に限定されるものではない。典型的には水溶液であるが、ホルムアミド等の有機溶媒その他の任意の液体であってもよい。具体的には、当該溶媒は、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。当該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
【００４２】
非発光性核酸プローブと標的核酸との結合反応、蛍光性インターカレータと標的核酸との結合反応、固相担体と結合した回収用プローブと標的核酸との結合反応、及び標的核酸が標的変異核酸の場合の標的変異核酸と蛍光プローブとの結合反応は、同時に行ってもよく、それぞれの結合反応を逐次的に行ってもよい。また、分析用プローブと固相担体とをそれぞれ別個に溶液中に添加し、当該溶液内で両者を結合させてもよい。例えば、溶媒中に、核酸含有試料と蛍光プローブと非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータと固相担体と結合した回収用プローブとを添加し、結合反応を行うことにより、固相担体に固定化した複合体を形成させることができる。また、溶媒中に、核酸含有試料と蛍光プローブと非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータと回収用プローブとを添加し、結合反応を行って複合体を形成させた後、当該溶液を固相担体に接触させ、当該複合体を回収用プローブを介して固相担体に固定化してもよい。なお、「溶液を固相担体に接触させる」とは、例えば、固相担体が多孔質膜の場合には、当該多孔質膜に溶液を透過させればよく、固相担体が容器の場合には、溶液を当該容器に注入すればよく、固相担体がチップ基板の場合には、溶液を当該チップ基板の表面に滴下したり、当該チップ基板を溶液中に浸漬させたりすればよい。
【００４３】
標的核酸と非発光性核酸プローブ等を結合させる場合には、溶液中の核酸分子等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。蛍光プローブや回収用プローブにおける標的核酸との結合部位がオリゴヌクレオチド等の場合にも、溶液中の核酸分子等を変性させた後に、これらを標的核酸と会合させることが好ましい。なお、「核酸分子又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。
【００４４】
変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、当該溶液を高温処理することにより、当該溶液中の核酸分子等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、会合体を形成する領域の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、当該溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
【００４５】
必要に応じて変性させた後、前記溶液中の標的核酸と、非発光性核酸プローブ、蛍光プローブ、及び回収用プローブを、それぞれ会合させて複合体を形成する。熱変性を行った場合には、高温処理後、当該溶液の温度を、標的核酸と、非発光性核酸プローブ等とが特異的にハイブリダイズできる温度（特異的会合条件）にまで低下させることにより、当該溶液中の両者を適宜会合させることができる。好ましくは、標的核酸等を含む溶液の温度を、標的核酸中のそれぞれのプローブとの結合領域のＴｍ値±３℃の温度程度まで低下させる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、当該溶液の塩濃度を、標的核酸と各プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、当該溶液中の標的核酸と各プローブとを適宜会合させることができる。
【００４６】
なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、当該溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
【００４７】
このように、特異的会合条件は、標的核酸や各プローブの種類ごとに異なり、実験的に決定されるものであるが、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、標的粒子結合部位の塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。温度がＴｍ値近傍の値である条件、例えばＴｍ値±３℃程度である条件を、特異的会合条件とすることができる。算出されたＴｍ値近傍において実験的に融解曲線を求めることにより、より詳細に特異的会合条件を決定することもできる。
【００４８】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、複合体を形成させる際に、前記溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、前記溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、当該溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
【００４９】
また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め前記溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
【００５０】
蛍光プローブ、非発光性核酸プローブ及び回収用プローブが、いずれも同じ溶液中に標的核酸と共存させるだけで標的核酸と結合させることができる場合には、必要に応じて所定時間当該溶液をインキュベートするだけで、当該溶液中で、標的核酸に結合させることができる。例えば、非発光性核酸プローブ中の標的核酸との結合部位がＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的核酸が２本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、非発光性核酸プローブと標的核酸とを結合させることができる場合がある。
【００５１】
次いで、工程（ｂ）として、前記工程（ａ）の後、前記溶液から固液分離処理により、前記複合体を回収し、当該複合体を含む試料溶液を調製する。この固液分離処理により、標的変異核酸と蛍光プローブを含む複合体を、標的変異核酸と結合していない遊離の蛍光プローブから分離して回収される。
【００５２】
固液分離処理としては、溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して静置したり、遠心分離処理を行うことにより、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよく、当該溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、当該溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、該容器の該磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。内壁が回収用プローブと結合する物質で被覆された容器が固相担体である場合、前記複合体を含む溶液を当該容器内に注入し、必要に応じてインキュベートした後、当該容器内の液体を排出する。固相担体がメンブレンやフィルターの場合、前記複合体を含む溶液を当該固相担体に透過させることにより、固相担体への前記複合体の固定化と、標的核酸と結合していない蛍光プローブからの前記複合体の分離回収を、一の操作で行うことができる。
【００５３】
回収された固相担体に適当な溶媒を添加することにより、固相担体と結合した複合体を含む溶液（懸濁液）が調製される。当該溶媒は、後の工程において蛍光プローブや蛍光性インターカレータから放出される蛍光の検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
【００５４】
回収された固相担体は、懸濁液を調製する前に、１〜数回、適当な溶媒等で洗浄処理を行ってもよい。当該溶媒としては、水やバッファー等の溶媒を用いて洗浄してもよい。当該バッファーは、洗浄効果を高めるために界面活性剤を含むことが好ましい。
【００５５】
本発明においては、工程（ａ）において、核酸含有試料と、蛍光プローブと、非発光性核酸プローブと、固相担体に結合した分析用プローブとを含み、蛍光性インターカレータは含まない溶液を調製し、固相担体に固定化した複合体を形成した後、固液分離処理により、遊離の蛍光プローブとは分離して固相担体に固定化された複合体を回収した後に、蛍光性インターカレータを添加して当該複合体中の塩基対間に蛍光性インターカレータを挿入させてもよい。蛍光性インターカレータは、塩基対間に挿入されないかぎり蛍光を発しないため、遊離の蛍光性インターカレータが蛍光分析時の試料溶液中に含まれていたとしても特段の問題はないためである。なお、この場合において、核酸含有試料等を含む溶液の調製や、当該溶液中における複合体の形成、並びに固液分離処理は、蛍光性インターカレータが含まれない以外は前記と同様に行うことができる。
【００５６】
こうして調製されたて固相担体に固定化された複合体は、そのまま工程（ｃ）に供してもよく、固相担体から分離された状態で工程（ｃ）に供してもよい。標的核酸と非発光性核酸プローブとを含む複合体は、固相担体から解離させた後に固液分離処理を行うことにより、固相担体から分離して回収することができる。この固相担体から分離回収された複合体を含む溶液を、試料溶液として工程（ｃ）に供する。
【００５７】
本発明においては、標的変異核酸を含む全標的核酸の量を、蛍光性インターカレータの蛍光量から求め、標的変異核酸の量を、蛍光プローブの蛍光量から求める。工程（ｃ）における蛍光検出を、走査分子計数法等の一分子蛍光分析法により行う場合には、蛍光性インターカレータと蛍光性プローブとが同一の分子から発されているよりも、別々の分子から発されているほうが、両者の量をより精度よく検出することができる。そこで、固定化された複合体が、蛍光プローブを含んでいる場合には、当該複合体から蛍光プローブも解離させ、固液分離処理により、標的核酸と非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータとを含む複合体と、蛍光プローブとを、固相担体から分離して回収してもよい。
【００５８】
当該複合体の固相担体からの解離は、分析用プローブを標的核酸から解離させたり、分析用プローブや、固相担体中の分析用プローブとの結合部位を分解することにより、行うことができる。分析用プローブや、固相担体中の分析用プローブとの結合部位を分解させる場合には、蛍光プローブや非発光性核酸プローブを分解させない分解酵素等を用いることが好ましい。例えば、蛍光プローブや非発光性核酸プローブにはペプチド結合がなく、分析用プローブや固相担体中の分析用プローブとの結合部位がペプチド結合を含む場合には、タンパク質分解酵素により、分析用プローブ等のみを分解することができる。また、分析用プローブが核酸プローブの場合、制限酵素部位が、分析用プローブ中にはあるが、非発光性核酸プローブ中には存在しない場合には、当該制限酵素部位を認識する制限酵素処理により、分析用プローブ等のみを分解することができる。
【００５９】
分析用プローブが、標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド等を含む場合であって、分析用プローブと標的核酸との会合体のＴｍ値を、標的核酸と非発光性核酸プローブとの会合体のＴｍ値よりも低くなるように設計した場合には、固相担体を含む溶液を、標的核酸と非発光性プローブとは会合体を形成し得るが、標的核酸と回収用プローブとは会合体を形成できない温度でインキュベートすることにより、標的核酸と非発光性プローブとを含む複合体、又は標的核酸と非発光性プローブと蛍光プローブとを含む複合体を、固相担体から解離させることができる。さらに、蛍光プローブと標的核酸との会合体のＴｍ値を、標的核酸と非発光性核酸プローブとの会合体のＴｍ値よりも低くなるように設計した場合には、固相担体を含む溶液を、標的核酸と非発光性プローブとは会合体を形成し得るが、標的核酸と回収用プローブ、及び標的核酸と蛍光プローブとは会合体を形成できない温度でインキュベートし、その後固液分離処理することにより、標的核酸と非発光性プローブとを含む複合体と、蛍光プローブとを、それぞれ独立した遊離の状態で含む溶液が得られ、この溶液を試料溶液として工程（ｃ）に供する。
【００６０】
その後、工程（ｃ）として、調製された試料溶液中の、蛍光プローブの数と標的核酸と非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータとを含む複合体の数とを算出する。蛍光プローブの数は、蛍光プローブから発される蛍光量に基づいて求める。また、標的核酸を含む複合体の数は、蛍光性インターカレータから発される蛍光量に基づいて求める。
【００６１】
試料溶液の蛍光量（蛍光強度）は、試料溶液中の全蛍光分子から発される蛍光強度を測定してもよい。試料溶液全体の蛍光強度は、蛍光プレートリーダー等の蛍光分光光度計等を用いて常法により測定することができる。試料溶液全体の蛍光強度は、当該試料溶液中に含まれている蛍光プローブの量や複合体の量に依存する。例えば、予め、濃度既知の蛍光プローブ溶液について蛍光量を測定し、溶液中の蛍光プローブの量と蛍光量との関係を調べた検量線を作成しておいた場合には、当該検量線に基づいて、当該試料溶液から測定された蛍光量から当該試料溶液中の蛍光プローブの数（又は、濃度）を算出することができる。濃度既知の非発光性核酸プローブと標的核酸とを用いて形成された会合体に蛍光性インターカレータを挿入させた溶液について蛍光量を測定し、同様に作成した検量線を用いることによって、当該試料溶液中の複合体の数（又は、濃度）を算出することができる。
【００６２】
試料溶液中の蛍光プローブや複合体が固相担体から遊離している場合には、工程（ｃ）においては、試料溶液中の一分子ごとに蛍光強度を測定してもよい。試料溶液中の一分子ごとに蛍光強度を測定する方法としては、走査分子計数法、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は蛍光偏光強度分布解析法が挙げられる。
【００６３】
本発明においては、蛍光プローブの数と複合体の数は、走査分子計数法により算出することが好ましい。走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっているため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となり、従前に比して、精度よく測定試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。例えば、本発明に係る変異率測定方法における遊離した蛍光プローブや複合体の検出を走査分子計数法により行い、それぞれが発する蛍光によって測定試料溶液中の粒子を個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する場合には、測定試料溶液の蛍光プローブや複合体の濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりもはるかに低い濃度（例えば、フェムトモル濃度オーダーやアトモル濃度オーダー）であっても、蛍光プローブや複合体を検出可能である。
【００６４】
一分子計測等の高感度測定、特に走査分子計数法では、固相担体等のような、溶液中における拡散運動が比較的遅い発光粒子の検出精度が低くなる場合がある。本発明においては、工程の途中で固相担体を用いた場合であっても、走査分子計数法による測定時には固相担体から分離された遊離の状態の発光プローブを検出対象とすることにより、蛍光一分子測定法を用いた場合であっても、固相担体の影響を排除して高精度に蛍光プローブや複合体を検出することができる。
【００６５】
走査分子計数法では、具体的には、得られた測定試料溶液中の蛍光プローブや複合体の分子数を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記測定試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域中の蛍光プローブや複合体から発される光を検出し、それぞれの分子数を算出する。
【００６６】
本発明及び本願明細書において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡において光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。なお、かかる領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
【００６７】
蛍光プローブや複合体の数の算出は、その他、例えば、ＦＩＤＡにより、共焦点光学系における焦点領域（光検出領域）に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、それぞれの分子数を算出することができる。
また、ＦＩＤＡ−ＰＯにより、共焦点光学系における焦点領域（光検出領域）に存在している分子の蛍光強度の偏光を検出した後、統計解析を行うことによって、蛍光プローブや複合体の分子数を算出することができる。
さらに、ＦＣＳにより、共焦点光学系における焦点領域（光検出領域）に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、蛍光プローブや複合体の分子数を算出することができる。
これらの測定方法により、測定試料溶液の蛍光プローブや複合体の濃度が、ピコモル濃度オーダーのように微量であっても、これらを検出可能である。
【００６８】
なお、このような分子の蛍光シグナルの時間変化の検出及び解析は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。
【００６９】
最後に、工程（ｄ）として、工程（ｃ）において算出された、蛍光プローブの数と、標的核酸と非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータとを含む複合体の数に基づいて、前記核酸含有試料中の全標的核酸に対する標的変異核酸の存在比率（変異率）を算出する。
本発明においては、２種類の蛍光標識をしているにもかかわらず、蛍光プローブの数と、標的核酸と非発光性核酸プローブと蛍光性インターカレータとを含む複合体の数を、共に精度よく算出できるため、信頼性の高い変異率が求められる。
【実施例】
【００７０】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
［実施例１］
野生型と変異型が表１に記載の塩基配列である標的核酸について、全標的核酸量（野生型と変異型の総量）に対する変異型の含有割合（変異率）を０％又は１０％とした標的核酸溶液を調製し、これらの変異率を、両者をそれぞれ特異的に結合可能な蛍光プローブにより標識して検出する従来法と、変異型のみを特異的に結合可能な蛍光プローブにより標識し、野生型を蛍光性インターカレータにより標識する本発明に係る変異率測定方法とにより求めた。
【００７２】
まず、本発明に係る変異率測定方法として、１ｎＭ（１ｎｍｏｌ／Ｌ）の標的核酸、２ｎＭの５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎが修飾された変異検出用蛍光プローブ、２ｎＭの非発光性核酸プローブ、２ｎＭの３’末端にビオチンが修飾されたビオチン化プローブ、及び２μＭのＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅとなるように、これらをｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：それぞれ終濃度）に溶解した。調製された溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間インキュベート後、２５℃まで冷却して３０分間インキュベートした。標的核酸溶液に代えて水を添加したものを対照とした。
【００７３】
また、従来法として、１ｎＭ（１ｎｍｏｌ／Ｌ）の標的核酸、２ｎＭの５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎが修飾された変異型検出用蛍光プローブ、２ｎＭの５’末端にＴＡＭＲＡが修飾された標的核酸検出用蛍光プローブ、及び２ｎＭの３’末端にビオチンが修飾されたビオチン化プローブとなるように、これらをｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。調製された溶液を、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間インキュベート後、２５℃まで冷却して３０分間インキュベートした。標的核酸溶液に代えて水を添加したものを対照とした。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
両法により調製されたこれらの溶液２００μＬと、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で３回洗浄した磁気ビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）Ｍｙｏｎｅ）１０μｇとを混合し、室温で５分間振とうさせながら反応させた。次いで、当該磁気ビーズを１００μＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ０．０１容量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を２０μＬ加えて５０℃で１分間加熱処理を行った。その後、磁石を用いて磁気ビーズを容器底に集めた上で、上清を全量回収した。当該上清を、１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを一度通した９６穴フィルター付きプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、製品名：ＭＡＨＶＮ４５１０）に入れ、９６穴ガラスボトムプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社製、製品名：７７０６−１３６５）に濾液を落とした。プレートの遠心は、いずれも１０００ｒｐｍで５分間行った。
【００７６】
続いて、走査分子計数法によって以下の条件で計測、解析した。共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた一分子蛍光測定装置ＭＦ−２０（オリンパス社製）を用いて測定を行い、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。励起に用いるレーザは短波長側として５４３ｎｍ、０．５ｍＷとし、長波長側として６４２ｎｍ、０．１ｍＷを用い、それぞれバンドパスフィルターを用いて、５４３ｎｍ励起で５６０〜６２０ｎｍ、 ６４２ｎｍ励起では６５０〜６９０ｎｍの蛍光を検出した。試料溶液中における光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させた。また、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定によって得られた時系列光強度データをスムージング後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似でき、強度が１以上となるもののピーク強度を抽出した。各試料溶液中、ＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎの蛍光を発する分子の分子数は、変異型の標的核酸の数であり、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ又はＴＡＭＲＡの蛍光を発する分子数を、全標的核酸の数（野生型と変異型の総和数）である。
【００７７】
図１に、本発明に係る変異率測定方法により、全標的核酸を非発光性核酸プローブとＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅで標識した試料溶液から計数されたピーク数を示した図である。また、図２は、従来法により、全標的核酸をＴＡＭＲＡ標識プローブで標識した試料溶液から計数されたピーク数を示した図である。図１及び２中、「ＤＮＡなし」は、標的核酸溶液に代えて水を添加した試料溶液の結果を、「０％」は、変異率０％の標的核酸溶液（すなわち、野生型の標的核酸のみを含む溶液）を添加した試料溶液の結果を、「１０％」は、変異率１０％の標的核酸溶液（すなわち、野生型の標的核酸が９０％、変異型の標的核酸が１０％含む溶液）を添加した試料溶液の結果をそれぞれ示す。また、白抜きカラムは全標的核酸の計数結果を、黒塗りカラムは変異型の標的核酸の計数結果を、それぞれ示す。
【００７８】
どちらの方法であっても、変異型の標的核酸（ＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎ）のピーク数は、変異率０％と１０％で明らかな差があり、当該蛍光プローブにより、標的核酸の特異的検出が可能であることが示された。一方で、全標的核酸をＴＡＭＲＡ標識プローブで標識した場合には、標的核酸を含まなかった対照区に比べて、変異率０％と１０％ではピーク数が出ているものの、変異率１０％の標的核酸溶液においては、ＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎのピーク数とほぼ同程度のピーク数しかなかった（図２）。これに対して、全標的核酸を非発光性核酸プローブとＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅで標識した場合には、ＴＡＭＲＡ標識プローブで標識した場合よりもピーク数が４倍になっていた（図１）。これは、ＴＡＭＲＡ標識プローブで標識した場合には、ノイズに埋もれて検出されるピーク数が少なくなったのに対して、本発明に係る変異率測定方法では、非発光性核酸プローブとＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅにより、一分子当たりの蛍光を高輝度化したことによって、ノイズにもかかわらず計数されるピーク数が増大したためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明に係る変異率測定方法により、一の核酸含有試料からより信頼性の高い変異率が得られるため、本発明に係る検出方法は、遺伝子変異解析等の標的核酸の濃度が微量である試料の解析・検査等の分野で特に好適に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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