(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の発現を阻害するための組成物、及び方法の提供。【解決手段】安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）製剤中に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含有する組成物、該組成物を使用して、Ｅｇ５／ＫＳＰ及びＶＥＧＦの発現を阻害する方法、並びに該組成物を使用して、癌等の、Ｅｇ５／ＫＳＰ及びＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程を処置する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）遺伝子の発現を阻害するための、第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、細胞内のヒトＶＥＧＦの発現を阻害するための第２のｄｓＲＮＡとを含む、組成物であって、
前記第１のｄｓＲＮＡおよび前記第２のｄｓＲＮＡの両方が、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に製剤化され、
前記第１のｄｓＲＮＡは、第１のセンス鎖と第１のアンチセンス鎖とからなり、前記第１のセンス鎖は、第１の配列を含み、前記第１のアンチセンス鎖は、配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な第２の配列を含み、前記第１の配列は、前記第２の配列に相補的であり、前記第１のｄｓＲＮＡは、１５〜３０塩基対長であり、前記第２のｄｓＲＮＡは、第２のセンス鎖と第２のアンチセンス鎖とからなり、前記第２のセンス鎖は、第３の配列を含み、前記第２のアンチセンス鎖は、配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な第４の配列を含み、前記第３の配列は、前記第４の配列に相補的であり、それぞれの鎖は、１５〜３０塩基対長である、組成物。
【請求項２】
前記第１のアンチセンス鎖は、配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）に相補的な第２の配列を含み、第２のアンチセンス鎖は、配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）に相補的な第４の配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１のｄｓＲＮＡは、配列番号１５３４（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵＴＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３５（５’−ＡＧＵＵＡＧＵＵＵＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴＴ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなり、前記第２のｄｓＲＮＡは、配列番号１５３６（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３７（５’−ＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣＵＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
それぞれの鎖が、小文字「ｃ」もしくは「ｕ」で示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、小文字「ｓ」で示されるホスホロチオエートとを含むように、
前記第１のｄｓＲＮＡは、
配列番号１２４０（５’−ｕｃＧＡＧＡＡｕｃｕＡＡＡｃｕＡＡｃｕＴｓＴ−３’）
からなるセンス鎖と、
配列番号１２４１（５’−ＡＧＵｕＡＧＵＵｕＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴｓＴ）
からなるアンチセンス鎖とからなり、
前記第２のｄｓＲＮＡは、
配列番号１２４２（５’−ＧｃＡｃＡｕＡＧＧＡＧＡＧＡｕＧＡＧＣＵｓＵ−３’）
からなるセンス鎖と、
配列番号１２４３（５’−ＡＡＧＣＵｃＡＵＣＵＣＵＣＣｕＡｕＧｕＧＣｕｓＧ−３’）
からなるアンチセンス鎖とからなるように修飾される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１のｄｓＲＮＡおよび前記第２のｄｓＲＮＡは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１、２、または３に記載の組成物。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される終端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１のｄｓＲＮＡおよび前記第２のｄｓＲＮＡは、それぞれ少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドと、５’−ホスホロチオエート基を含む少なくとも１個のヌクレオチドとを含む、請求項１、２、および３に記載の組成物。
【請求項９】
それぞれのｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖が、１９〜２３塩基長である、請求項１〜３および５〜８に記載の組成物。
【請求項１０】
それぞれのｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖が、２１〜２３塩基長である、請求項１〜３および５〜８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖が２１塩基長であり、前記第２のｄｓＲＮＡの前記センス鎖が２１塩基長であり、前記第２のｄｓＲＮＡの前記アンチセンス鎖が２３塩基長である、請求項１〜３および５〜８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１のｄｓＲＮＡおよび前記第２のｄｓＲＮＡは、等モル比で存在する、請求項１〜１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＳＮＡＬＰは、ＤＬｉｎＤＭＡ、コレステロール、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡを含む、請求項１〜１２に記載の組成物。
【請求項１４】
表１７に列記される割合の構成成分を含む、請求項１〜１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、Ｅｇ５を発現する細胞と接触すると、Ｅｇ５の発現を少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または少なくとも９０％阻害する、請求項１〜１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、ＶＥＧＦを発現する細胞と接触すると、ＶＥＧＦの発現を少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または少なくとも９０％阻害する、請求項１〜１５に記載の組成物。
【請求項１７】
細胞への前記組成物の投与は、前記細胞内のＥｇ５およびＶＥＧＦの両方の発現を低下させる、請求項１〜１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、ｎＭ濃度で投与される、請求項１〜１７に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞への前記組成物の投与は、前記細胞内の単星（ｍｏｎｏ−ａｓｔｅｒ）の形成を増加させる、請求項１〜１８に記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳動物への前記組成物の投与は、前記哺乳動物における腫瘍成長の阻止、腫瘍成長の低下、または生存の延長からなる群から選択される、少なくとも１つの効果をもたらす、請求項１〜１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記効果は、体重の測定、臓器重量の測定、目視検査、ｍＲＮＡ分析、血清ＡＦＰ分析、および生存の監視からなる群から選択される、少なくとも１つのアッセイを使用して測定される、請求項１〜２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ソラフェニブをさらに含む、請求項１〜２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１のｄｓＲＮＡは、２つのオーバーハングを含有し、前記第２のｄｓＲＮＡは前記アンチセンスの３’にオーバーハングと、前記アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端とを含有する、上記請求項のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
細胞内のＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現を阻害するための方法であって、前記細胞に、請求項１〜２２に記載の組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
癌の処置を必要とする哺乳動物における腫瘍成長を阻止するか、腫瘍成長を低下させるか、または生存を延長させるための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１〜２２に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物は、肝臓癌を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物は、肝臓癌を有するヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ソラフェニブを投与するステップをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年３月５日出願の米国仮出願第６１／０３４，０１９号、および２００８年７月２４日出願の米国仮出願第６１／０８３，３６７号、および２００８年８月５日出願の米国仮出願第６１／０８６，３８１号、および２００８年１１月６日出願の米国仮出願第６１／１１２，０７９号、および２００９年２月６日出願の米国仮出願第６１／１５０，６６４号の利益を主張し、当該出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含有する組成物、ＳＮＡＬＰに製剤化される、遺伝子の組み合わせ、例えば、Ｅｇ５および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉の媒介におけるその使用、ならびに癌等の、Ｅｇ５およびＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程を処置するための、該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物内の細胞集団の維持は、細胞分裂およびプログラム細胞死の細胞過程によって司られる。正常な細胞内では、各過程の開始および終了に関連する細胞的事象が高度に調節されている。癌等の増殖性疾患では、これらの過程のうちの１つまたは両方が乱されている可能性がある。例えば、癌細胞は、おそらく突然変異によって、正の調節因子の過剰発現、または負の調節因子の喪失のいずれかを通じて、その細胞分裂周期の調節（チェックポイント制御）を失っている場合がある。
【０００４】
あるいは、癌細胞は、負の調節因子の過剰発現を通じてプログラム細胞死を経る能力を失っている場合がある。したがって、癌性細胞に対するチェックポイント制御およびプログラム細胞死の過程を回復する、新規化学療法薬を開発する必要がある。
【０００５】
ヒト癌の処置に対する一手法は、細胞周期の進行に必須であるタンパク質を標的とすることである。細胞周期が１つのフェーズから次のフェーズへと進むためには、特定の前提条件的な事象を完了しなければならない。適切な事象およびフェーズの順序を強制する、細胞周期内のチェックポイントが存在する。かかるチェックポイントの１つは、有糸分裂のメタフェーズ段階で生じる紡錘体チェックポイントである。有糸分裂における必須機能を有するタンパク質を標的とする小分子は、紡錘体チェックポイントを開始させて、細胞の有糸分裂を停止させることができる。細胞の有糸分裂を停止する小分子のうち、細胞内で抗腫瘍活性を提示するものも、アポトーシス、すなわちプログラム細胞死に関連する形態的変化を誘発する。したがって、癌の処置に効果的な化学療法薬は、チェックポイント制御およびプログラム細胞死を誘発するものであり得る。残念なことに、細胞内でこれらの過程を制御するために利用可能である化合物はわずかである。有糸分裂停止およびアポトーシスを引き起こすことで知られるほとんどの化合物は、チューブリン結合剤として作用する。これらの化合物は、微小管の動的不安定性を変化させ、有糸分裂紡錘体の機能／構造を間接的に変化させ、それによって有糸分裂の停止を生じさせる。また、これらの化合物のほとんどは、全ての微小管の構成成分であるチューブリンタンパク質を特異的に標的とするため、微小管が役割を有する多くの正常な細胞過程のうちの１つ以上に、影響を及ぼすことができる。したがって、増殖細胞に関連するタンパク質をより特異的に標的とする薬剤も必要である。
【０００６】
Ｅｇ５は、有糸分裂紡錘体に局在し、双極性有糸分裂紡錘体の形成および／または機能に必要であることが知られる、幾つかのキネシン様モータータンパク質のうちの１つである。近年、有糸分裂紡錘体の双極性を妨害する小分子が報告された（Ｍａｙｅｒ，Ｔ．Ｕ．ｅｔ．ａｌ．１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６（５４４１）９７１−４、参照により本明細書に組み込まれる）。より具体的には、該小分子は、微小管の単星状アレイ（ｍｏｎｏａｓｔｒａｌ  ａｒｒａｙ）が中心体の中心対から広がり、染色体が微小管の遠位端に付着する、異常な有糸分裂紡錘体の形成を誘発した。該小分子は、単星状アレイから「モナストロール」と呼ばれる。この単星状アレイの表現型は、Ｅｇ５モータータンパク質を免疫除去された有糸分裂細胞中で、すでに認められていた。この独特の単星状アレイの表現型が、Ｅｇ５の可能性のある阻害剤としてのモナストロールの同定を容易にした。実際、インビトロアッセイで、モナストロールが微小管のＥｇ５モーターによって駆動される運動性を阻害することがさらに示された。Ｅｇ５阻害剤であるモナストロールは、関連するキネシンモーター、または細胞内のゴルジ装置の運動を担う単独または複数のモーターに対する明白な効果はない。Ｅｇ５の免疫除去、またはＥｇ５のモナストロール阻害のいずれかを通じて、単星状アレイの表現型を提示する細胞は、細胞周期のＭフェーズを停止させる。しかしながら、Ｅｇ５の免疫除去または阻害のいずれかによって誘発される有糸分裂停止は、一時的である（Ｋａｐｏｏｒ，Ｔ．Ｍ．，２０００．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０（５）９７５−８０）。単星状アレイの表現型、およびモナストロールによって誘発される有糸分裂の細胞周期停止は、共に可逆的である。細胞は、正常な双極性の有糸分裂紡錘体を形成するように回復し、有糸分裂を完了して、細胞周期および正常な細胞増殖を継続する。これらのデータは、一時的な有糸分裂停止を誘発したＥｇ５の阻害剤は、癌細胞の増殖の処置に効果的ではない可能性を示唆している。それでもなお、モナストロールが有糸分裂停止を生じさせるという発見は興味深く、したがって、ヒト癌の処置に効果的である様態で、Ｅｇ５モータータンパク質を調節するために使用することができる化合物をさらに研究し、同定する必要がある。また、これらの化合物の他の抗新生物剤との併用を考察する必要がある。
【０００７】
ＶＥＧＦ（血管透過性因子、ＶＰＦとしても知られる）は、血管新生、上皮細胞増殖、および内皮細胞生存を刺激する多機能サイトカインである。ＶＥＧＦは、多岐にわたる組織によって産生され、その過剰発現または異常発現は、癌および加齢黄斑変性等の網膜障害、ならびに他の血管新生障害を含む、種々の障害を生じさせる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる、高度に保存された調節機序で遺伝子発現を遮断することが示された。国際公開ＷＯ第９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅら）は、線虫における遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。また、ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、国際公開ＷＯ第９９／５３０５０号、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、および国際公開ＷＯ第９９／６１６３１号、Ｈｅｉｆｅｔｚらを参照）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照）、ならびに哺乳動物（国際公開ＷＯ第００／４４８９５号、Ｌｉｍｍｅｒ、および独国特許ＤＥ第１０１  ００  ５８６．５号、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらを参照）を含む、他の生物において標的ＲＮＡを分解することが示されている。この自然機序は、現在、遺伝子の異常な、または望ましくない調節によって引き起こされる障害を処置するための、新規医薬品群の開発の焦点となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
細胞内のヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）およびヒトＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための、２個の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を有する組成物が開示される。該ｄｓＲＮＡは、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に製剤化される。また、該組成物を使用して、細胞内のＥｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦの発現を低下させるための方法、ならびに本発明の組成物を使用する疾患、例えば、肝臓癌の処置方法も開示される。
【００１０】
したがって、細胞内のヒトキネシンファミリーメンバー１１（Ｅｇ５／ＫＳＰ）遺伝子の発現を阻害するための第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、細胞内のヒトＶＥＧＦの発現を阻害するための第２のｄｓＲＮＡとを有する組成物が、本明細書に開示され、前記第１のｄｓＲＮＡおよび前記第２のｄｓＲＮＡは共に、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に製剤化され、前記第１のｄｓＲＮＡは、第１のセンス鎖と第１のアンチセンス鎖とからなり、前記第１のセンス鎖は、第１の配列を有し、前記第１のアンチセンス鎖は、配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な第２の配列を有し、前記第１の配列は、前記第２の配列に相補的であり、前記第１のｄｓＲＮＡは、１５〜３０塩基対長であり、前記第２のｄｓＲＮＡは、第２のセンス鎖と第２のアンチセンス鎖とからなり、前記第２のセンス鎖は、第３の配列を有し、前記第２のアンチセンス鎖は、配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な第４の配列を有し、前記第３の配列は、前記第４の配列に相補的であり、それぞれの鎖は、１５〜３０塩基対長である。
【００１１】
幾つかの実施形態において、第１のアンチセンス鎖は、配列番号１３１１（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵ−３’）に相補的な第２の配列を有し、第２のアンチセンス鎖は、配列番号１５３８（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）に相補的な第４の配列を有する。他の実施形態において、第１のｄｓＲＮＡは、配列番号１５３４（５’−ＵＣＧＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡＣＵＡＡＣＵＴＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３５（５’−ＡＧＵＵＡＧＵＵＵＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴＴ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなり、第２のｄｓＲＮＡは、配列番号１５３６（５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１５３７（５’−ＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣＵＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなる。さらなる実施形態において、それぞれの鎖が、小文字「ｃ」または「ｕ」で示される２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、小文字「ｓ」で示されるホスホロチオエートとを含むように、第１のｄｓＲＮＡは、配列番号１２４０（５’−ｕｃＧＡＧＡＡｕｃｕＡＡＡｃｕＡＡｃｕＴｓＴ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１２４１（５’−ＡＧＵｕＡＧＵＵｕＡＧＡＵＵＣＵＣＧＡＴｓＴ）からなるアンチセンス鎖とからなり、第２のｄｓＲＮＡは、配列番号１２４２（５’−ＧｃＡｃＡｕＡＧＧＡＧＡＧＡｕＧＡＧＣＵｓＵ−３’）からなるセンス鎖と、配列番号１２４３（５’−ＡＡＧＣＵｃＡＵＣＵＣＵＣＣｕＡｕＧｕＧＣｕｓＧ−３’）からなるアンチセンス鎖とからなるように、修飾される。
【００１２】
幾つかの実施形態において、第１のｄｓＲＮＡは、２つのオーバーハングを含有し、第２のｄｓＲＮＡは、アンチセンスの３’にオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端とを含有する。
【００１３】
第１のｄｓＲＮＡおよび第２のｄｓＲＮＡは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを有することができる。例えば、それぞれのｄｓＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、およびコレステリル誘導体もしくはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される終端ヌクレオチドからなる群から選択される、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを有することができる。該修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを有する非天然塩基の群から選択することができる。幾つかの実施形態において、第１のｄｓＲＮＡおよび第２のｄｓＲＮＡはそれぞれ、少なくとも１個の２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドと、５’−ホスホロチオエート基を有する少なくとも１個のヌクレオチドとを含む。
【００１４】
それぞれのｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖が、例えば、１９〜２３塩基長、または代替として、２１〜２３塩基長であり得る。一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は２１塩基長であり、第２のｄｓＲＮＡのセンス鎖は２１塩基長であり、第２のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は２３塩基長である。
【００１５】
幾つかの実施形態において、第１のｄｓＲＮＡおよび第２のｄｓＲＮＡは、等モル比で存在する。
【００１６】
本明細書に記載されるように、該ｄｓＲＮＡは、ＳＮＡＬＰＳとして製剤化される。幾つかの実施形態において、ＳＮＡＬＰ製剤は、ＤＬｉｎＤＭＡ、コレステロール、ＤＰＰＣ、およびＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡを含む。例えば、ＳＮＡＬＰは、表１７に列記される割合の構成成分を有し得る。
【００１７】
本発明の組成物を使用して、Ｅｇ５および／またはＶＡＧＦの発現を低下させることができる。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｅｇ５を発現する細胞と接触すると、Ｅｇ５の発現を少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または少なくとも９０％阻害する。他の実施形態において、本発明の組成物は、ＶＥＧＦを発現する細胞と接触すると、ＶＥＧＦの発現を少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または少なくとも９０％阻害する。細胞への該組成物の投与は、前記細胞内のＥｇ５およびＶＥＧＦの両方の発現を低下させることができる。該組成物は、ｎＭ濃度で投与される、請求項１〜１７に記載の化合物。
【００１８】
細胞への本発明の組成物の投与は、例えば、細胞内の単星（ｍｏｎｏ−ａｓｔｅｒ）の形成の増加をもたらすことができる。哺乳動物への該組成物の投与は、前記哺乳動物における腫瘍成長の阻止、腫瘍成長の低下、または生存の延長からなる群から選択される、少なくとも１つの効果をもたらすことができる。該効果は、体重の測定、臓器重量の測定、目視検査、ｍＲＮＡ分析、血清ＡＦＰ分析、および生存の監視からなる群から選択される、少なくとも１つのアッセイを使用して測定することができる。ｎＭ濃度で投与された時に、これらの効果を有する組成物が含まれる。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ソラフェニブを含む。
【００２０】
また、本発明の組成物を使用する方法も、本発明に含まれる。一実施形態は、細胞に本発明の組成物を投与することによって、細胞内のＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦの発現を阻害するための方法である。他の実施形態は、癌の処置を必要とする哺乳動物に該組成物を投与することによって、前記哺乳動物における腫瘍成長を阻止するか、腫瘍成長を低下させるか、または生存を延長させるための方法である。幾つかの実施形態において、哺乳動物は肝臓癌を有し、例えば、哺乳動物は、肝臓癌を有するヒトである。該方法は、ソラフェニブを投与するさらなるステップを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】Ｈｅｐ３ＢマウスモデルにおけるＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの投与後の、体重の割合としての肝重量を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図３】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図４】未処置対照動物の体重を示すグラフである。
【図５】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対する対照ルシフェラーゼＳＮＡＬＰ  ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図６】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、体重に対するＶＳＰ−ＳＮＡＬＰ  ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図７Ａ】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、マウスＧＡＰＤＨレベルに基準化したヒトＧＡＰＤＨレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図７Ｂ】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、血清ＥＬＩＳＡによって測定される血清ＡＦＰレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図８】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、マウスＧＡＰＤＨレベルに基準化したヒトＧＡＰＤＨレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図９】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルに基準化したヒトＫＳＰレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１０】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルに基準化したヒトＶＥＧＦレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１１Ａ】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルに基準化したマウスＶＥＧＦレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、ヒトＧＡＰＤＨレベルおよび血清ＡＦＰレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示す一連のグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、腫瘍ＫＳＰ、ＶＥＧＦ、およびＧＡＰＤＨレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、腫瘍ＫＳＰ、ＶＥＧＦ、およびＧＡＰＤＨレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、Ｈｅｐ３Ｂマウスモデルにおける、腫瘍ＫＳＰ、ＶＥＧＦ、およびＧＡＰＤＨレベルに対する、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、肝臓腫瘍を有するモデルにおける、生存に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。腫瘍細胞の播種後１８日（図１３Ａ）および２６日（図１３Ｂ）に処置が開始された。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、肝臓腫瘍を有するモデルにおける、生存に対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。腫瘍細胞の播種後１８日（図１３Ａ）および２６日（図１３Ｂ）に処置が開始された。
【図１４】血清アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルに対するＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡの効果を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ（Ａ）または２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ（Ｂ）を投与した担腫瘍動物（Ｈｅｐ３Ｂ細胞の埋め込み後３週間）の、ＨＥ染色した切片の画像である。２４時間後、担腫瘍肝葉を組織学的分析のために処理した。矢印は単星を示す。
【図１６】ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１の製造過程を図示する流れ図である。
【図１７】ＡＬＮ−ＶＳＰ０２のクライオ透過型電子顕微鏡（クライオ−ＴＥＭ）画像である。
【図１８】ＡＬＮ−ＶＳＰ０２の製造過程を図示する流れ図である。
【図１９】ＫＳＰに標的化されたｓｉＲＮＡを用いるＭＹＣ−癌遺伝子により起こされるデノボ肝臓癌のトランスジェニックマウスモデルの処置プロトコールを示す。
【図２０】ＳＮＡＬＰに製剤化されたｓｉＲＮＡおよびソラフェニブの投与の、生存に対する効果を図示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ｄｓＲＮＡを使用して、細胞もしくは哺乳動物内のＥｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための、組成物および方法を提供する。該ｄｓＲＮＡは、好ましくは安定な核酸粒子（ＳＮＡＬＰ）にパッケージ化される。また、本発明は、Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現によって引き起こされる、哺乳動物における肝臓癌等の病態および疾患を処置するための、組成物および方法も提供する。該ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる過程を通じて配列特異的分解を導く。
【００２３】
以下の詳細な説明は、Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子それぞれの発現を阻害するための、ｄｓＲＮＡを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびに癌等のこれらの遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を処置するための、組成物および方法を開示する。本発明で取り上げられる医薬組成物は、薬剤として許容される担体と共に、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、Ｅｇ５遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。また、本発明で取り上げられる医薬組成物は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＶＥＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡも含む。
【００２４】
したがって、本発明の特定の態様は、Ｅｇ５およびＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡと薬剤として許容される担体とを含有する医薬組成物、Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子それぞれの発現を阻害するために該組成物を使用する方法、ならびにＥｇ５およびＶＥＧＦ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を処置するために該医薬組成物を使用する方法を提供する。
【００２５】
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と、本項で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義が優先される。
【００２６】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」のそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書で交換可能に使用され、核酸塩基がチミン、例えば、デオキシリボチミン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｔｈｙｍｉｎｅ）である、デオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換可能であることを十分認識している。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換され得る。別の例では、オリゴヌクレオチドのいずれかの場所にあるアデニンおよびシトシンをそれぞれグアニンおよびウラシルと置換して、標的ｍＲＮＡと塩基対を形成するＧ−Ｕゆらぎを形成することができる。かかる置換部分を含む配列が、本発明の実施形態である。
【００２７】
本明細書で使用される「Ｅｇ５」は、ヒトキネシンファミリーメンバー１１を指し、これは、ＫＩＦ１１、Ｅｇ５、ＨＫＳＰ、ＫＳＰ、ＫＮＳＬ１、またはＴＲＩＰ５としても知られている。Ｅｇ５の配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３８３２、ＨＧＮＣ  ＩＤ：ＨＧＮＣ：６３８８、およびＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ番号：ＮＭ＿００４５２３として見出すことができる。「Ｅｇ５」および「ＫＳＰ」、ならびに「Ｅｇ５／ＫＳＰ」という用語は、交換可能に使用される。
【００２８】
本明細書で使用される、ＶＥＧＦは、血管透過性因子としても知られる、血管新生促進因子である。ＶＥＧＦは、少なくとも３つの異なるアイソフォームで存在する、ホモ二量体型の４５ｋＤａの糖タンパク質である。ＶＥＧＦのアイソフォームは、内皮細胞内に発現する。ＶＥＧＦ遺伝子は、１８９アミノ酸のタンパク質アイソフォームを発現する、８個のエクソンを含有する。１６５アミノ酸のアイソフォームは、エクソン６によってコードされる残基を欠き、一方１２１アミノ酸のアイソフォームは、エクソン６および７によってコードされる残基を欠く。ＶＥＧＦ１４５は、１４５個のアミノ酸を含有し、エクソン７を欠くと予測されるアイソフォームである。ＶＥＧＦは、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）またはＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）等の、内皮のチロシンキナーゼ受容体に結合することによって、内皮細胞に作用することができる。ＶＥＧＦＲ−２は、内皮細胞に発現し、内皮細胞の分化および脈管形成に関与する。３つ目の受容体、ＶＥＧＦＲ−３は、リンパ球新生に関与するとされている。
【００２９】
種々のアイソフォームは、異なる生物活性および臨床的意義を有する。例えば、ＶＥＧＦ１４５は、血管新生を誘発し、ＶＥＧＦ１８９と同様（しかしＶＥＧＦ１６５とは異なり）、ＶＥＧＦ１４５は、細胞外マトリックスに関連する硫酸ヘパリンに依存しない機序によって、細胞外マトリックスに効率的に結合する。ＶＥＧＦは、インビトロで内皮細胞分裂促進因子および化学誘引物質としての活性を提示し、インビボで血管透過性および血管新生を誘発する。ＶＥＧＦは、多岐にわたる種類の癌細胞によって分泌され、腫瘍に関連する脈管構造の発生を誘発することにより、腫瘍の成長を促進する。ＶＥＧＦの機能の阻害は、免疫不全モデルにおける、実験的な原発性腫瘍の成長ならびに転移の両方を制限することが示されている。ＶＥＧＦを対象とする種々のｄｓＲＮＡが、同時係属の米国出願第１１／０７８，０７３号および第１１／３４０，０８０号に記載され、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本明細書で使用される、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、Ｅｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ遺伝子の転写の間に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。
【００３１】
本明細書で使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって説明される、ヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される時の「相補的」は、当業者には理解されるように、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件には、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間５０℃もしくは７０℃、その後の洗浄が含まれ得る。生物内で遭遇され得る、生理的に適切な条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、２つの配列の相補性の試験に最も適切な、一連の条件を決定することができよう。
【００３３】
これには、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの塩基対形成が含まれる。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」と言及することができる。しかし、本明細書において、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」であると言及される場合、２つの配列は完全に相補的であり得るか、あるいはそれらの最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイズ時に、１個以上であるが、一般に４、３、または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に１つ以上の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本発明の目的上、やはり「完全に相補的」であるとして言及され得る。
【００３４】
また、本明細書で使用される、「相補的」な配列は、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、または完全にそれらから形成され得る。かかる非ワトソンクリック塩基対には、Ｇ−Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらが使用される文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に対して使用され得る。
【００３６】
本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む、対象となるｍＲＮＡ（例えば、Ｅｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦをコードする）の連続する部分に実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、Ｅｇ５をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、Ｅｇ５のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【００３７】
本明細書で使用される、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、逆平行で、上で定義されるように実質的に相補的である、２本の核酸鎖を含む二重鎖構造を指す。二重鎖構造を形成する２本の鎖は、より長い１つのＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、あるいはそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖がより長い１つの分子の一部であり、したがって二重鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の中断されていないヌクレオチド鎖によって接続される場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合的に接続される場合、該接続構造は、「リンカー」と称される。該ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二重鎖内に存在するいずれかのオーバーハングを差し引いた、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖内のヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれもしくは両方の鎖は、少なくとも１個の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾を含み、本明細書で開示されるか、または当該技術分野において既知であるあらゆる種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含むことができる。ｓｉＲＮＡ型分子内で使用される、このようないずれの修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
【００３８】
本明細書で使用される、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、不対ヌクレオチド、またはｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端がもう一方の鎖の５’末端を越えて延びるか、またはその逆である時に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出するヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その長さ全体にわたって二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。幾つかの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、二重鎖の一端にヌクレオチドオーバーハングを、そしてもう一端に平滑末端を有することができる。
【００３９】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される、「相補性の領域」という用語は、配列、例えば本明細書において定義される標的配列に実質的に相補的である、アンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、該ミスマッチは、該分子の内部または末端領域内にあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、終端領域内、例えば、５’および／または３’終端の６、５、４、３、もしくは２ヌクレオチド内にある。
【００４０】
本明細書で使用される、「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【００４１】
本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤が転写されるプラスミド等の核酸を含む、少量の水性内部をコーティングする、脂質の小胞を表す。
【００４２】
ｄｓＲＮＡについて言及する際、「細胞への導入」とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、支援を伴わない拡散過程もしくは細胞の能動的過程を通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によって発生し得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、ｄｓＲＮＡは、生命体の一部である「細胞に導入」することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達については、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射するか、または全身投与することができる。細胞へのインビトロでの導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当該技術分野において既知の方法が含まれる。
【００４３】
「発現停止させる」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、および「〜の発現を抑制する」等の用語は、それらがＥｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子について言及する限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子が転写され、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現が阻害されるように処置された第１の細胞もしくは細胞群から単離され得る、Ｅｇ５のｍＲＮＡおよび／またはＶＥＧＦのｍＲＮＡの量の低下によって明らかになる、Ｅｇ５遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。
【数１】
2015177801.tif 000002
【００４４】
代替として、阻害の程度は、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば細胞によって産生されるＥｇ５および／もしくはＶＥＧＦ遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えばアポトーシスを提示する細胞の数の低下に関して出されてもよい。原則的に、標的遺伝子の発現停止は、構成的に、またはゲノム工学によってのいずれか、ならびに任意の適切なアッセイによって、該標的を発現する任意の細胞において決定することができる。しかし、あるｄｓＲＮＡが特定の程度、Ｅｇ５遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、かかる参照の役割を果たす。
【００４５】
例えば、特定の場合において、Ｅｇ５遺伝子（またはＶＥＧＦ遺伝子）の発現は、本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。幾つかの実施形態において、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子は、本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。他の実施形態において、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子は、本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。以下の表および実施例は、種々のＥｇ５および／またはＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡ分子を種々の濃度で使用した、発現の阻害についての値を提供する。
【００４６】
Ｅｇ５の発現（またはＶＥＧＦの発現）の文脈において本明細書で使用される、「処置する」、「処置」等の用語は、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書で以下に列挙される他の病態のうちのいずれかに関連する限り（Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程以外）、「処置する」、「処置」等の用語は、かかる病態に関連する少なくとも１つの症状の軽減もしくは緩和、または肝細胞癌の進行の遅延等の、かかる病態の進行の遅延もしくは逆行を意味する。
【００４７】
本明細書で使用される、「治療上有効な量」および「予防上有効な量」という句は、Ｅｇ５および／もしくはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程の処置、阻止、もしくは管理、またはＥｇ５および／もしくはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程の明らかな症状において、治療的有用性を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、普通の開業医が容易に決定することができ、例えば、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程の種類、患者の病歴および年齢、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程のステージ、ならびに他のＥｇ５および／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程に抗する薬剤の投与等の、当該技術分野において既知の因子に依存して異なり得る。
【００４８】
本明細書で使用される、「医薬組成物」は、薬理学上有効な量のｄｓＲＮＡと、薬剤として許容される担体とを含む。本明細書で使用される、「薬理学上有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効量」は、目的とする薬理学的、治療的、または阻止的結果を産生するのに効果的なＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床的処置が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２５％の低下がある時に有効であると見なされる場合、該疾患または障害を処置するための薬物の治療上有効な量は、該パラメータにおける少なくとも２５％の低下をもたらすために必要な量である。
【００４９】
「薬剤として許容される担体」という用語は、治療薬を投与するための担体を指す。以下でより詳細に記載されるように、かかる担体には、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は、特に細胞培養基を除く。経口投与される薬物について、薬剤として許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の薬剤として許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが含まれ、コーンスターチおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含むことができ、一方潤滑剤が存在する場合は、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料でコーティングして、消化管内での吸収を遅らせることができる。
【００５０】
本明細書で使用される、「形質転換細胞」は、ベクターが導入されて、そこからｄｓＲＮＡ分子を発現することができる細胞である。
【００５１】
ＩＩ．二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
以下でより詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳動物内のＥｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、該ｄｓＲＮＡは、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を含む、アンチセンス鎖を含み、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、前記ｄｓＲＮＡは、前記Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子を発現する細胞と接触すると、前記Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する。
【００５２】
該ｄｓＲＮＡは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において既知の標準的な方法、例として、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるもの等の自動ＤＮＡ合成装置の使用によって、合成することができる。
【００５３】
該ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的である、２本の鎖を含む。該ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、Ｅｇ５および／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から派生した標的配列に実質的に相補的であり、概して完全に相補的である、相補性の領域を含み、もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、２本の鎖は、好適な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。一般に、二重鎖構造は、１５〜３０塩基対長であり、より一般には１８〜２５、さらに一般には１９〜２４、そして最も一般には１９〜２１塩基対長である。他の実施形態において、二重鎖構造は２５〜３０塩基対長である。
【００５４】
一実施形態において、二重鎖は１９塩基対長である。別の実施形態において、二重鎖は２１塩基対長である。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、二重鎖の長さは同一であってもよく、または異なってもよい。例えば、組成物は、１９塩基対の長さの二重鎖を有するＥｇ５を標的とする第１のｄｓＲＮＡと、２１塩基対の長さの二重鎖を有するＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡとを含むことができる。
【００５５】
同様に、標的配列に相補性の領域は、１５〜３０ヌクレオチド長であり、より一般には１８〜２５、さらに一般には１９〜２４、そして最も一般には１９〜２１ヌクレオチド長である。他の実施形態において、相補性の領域は２５〜３０ヌクレオチド長である。
【００５６】
一実施形態において、相補性の領域は１９ヌクレオチド長である。別の実施形態において、相補性の領域は２１ヌクレオチド長である。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、相補性の領域は同一であってもよく、または異なってもよい。例えば、組成物は、１９個のヌクレオチドの相補性の領域を有するＥｇ５を標的とする第１のｄｓＲＮＡと、２１個のヌクレオチドの相補性の領域を有するＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡとを含むことができる。
【００５７】
本発明のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、一般には１５〜３０、もしくは１８〜２５、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ヌクレオチド長である。他の実施形態において、それぞれの鎖は２５〜３０塩基対長である。二重鎖のそれぞれの鎖は、同一長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、各ｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖の長さは、同一であってもよく、または異なってもよい。例えば、組成物は、２１個のヌクレオチドのセンス鎖および２１個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を有する、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡと、２１個のヌクレオチドのセンス鎖および２３個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を有する、ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡとを含むことができる。
【００５８】
本発明のｄｓＲＮＡは、１個以上のヌクレオチドの１つ以上の単鎖のオーバーハングを含むことができる。一実施形態において、該ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４、一般には１または２個のヌクレオチドの、単鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖の３’末端および５’末端のそれぞれに、１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端のそれぞれに、１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。
【００５９】
少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端の対応物より予想外に優れた阻害特性を有し得る。幾つかの実施形態において、１つのみのヌクレオチドオーバーハングの存在により、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化される。１つのみのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、インビボ、ならびに種々の細胞、細胞培養基、血液、および血清内で特に安定および効果的であることが判明している。一般に、単鎖のオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’終端、または代替として、センス鎖の３’終端に位置する。該ｄｓＲＮＡは、一般にアンチセンス鎖の５’末端に位置する、平滑末端も有し得る。かかるｄｓＲＮＡは改善された安定性および阻害活性を有し得、したがって、低投薬量、すなわち、１日当たり受容者の体重１ｋｇにつき５ｍｇ未満の投与を可能にする。一般に、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１つ以上が、ヌクレオシドチオリン酸と置換される。
【００６０】
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の組成物は、Ｅｇ５を標的とする第１のｄｓＲＮＡと、ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡとを含む。第１および第２のｄｓＲＮＡは、同一のオーバーハング構造（例えば、それぞれの鎖のヌクレオチドオーバーハングの数等）を有してもよく、またはそれぞれのｄｓＲＮＡが異なる構造を有してもよい。一実施形態において、Ｅｇ５を標的とする第１のｄｓＲＮＡは、それぞれの鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含み、ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングと、アンチセンス鎖の５’末端（例えば、センス鎖の３’末端）に平滑末端とを含む。
【００６１】
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡによって標的とされるＥｇ５遺伝子は、ヒトＥｇ５遺伝子である。一実施形態において、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１〜３のアンチセンス配列のうちの１つの、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。具体的な実施形態では、該ｄｓＲＮＡの第１の配列は、表１〜３のセンス鎖のうちの１つから選択され、第２の配列は、表１〜３のアンチセンス配列からなる群から選択される。表１〜３に提供される標的配列のいずれかの箇所を標的とする代替のアンチセンス剤を、標的配列および隣接するＥｇ５配列を使用して、容易に決定することができる。幾つかの実施形態において、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡは、表１〜３に提供される配列群から選択される、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。２つの配列のうちの１つは、２つの配列のうちのもう一方に相補的であり、該配列のうちの１つは、Ｅｇ５遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、該ｄｓＲＮＡは２個のオリゴヌクレオチドを含み、１個のオリゴヌクレオチドは、表１〜３にセンス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、表１〜３にアンチセンス鎖として記載される。
【００６２】
ＶＥＧＦを標的とする第２のｄｓＲＮＡを使用する実施形態では、かかる薬剤は、実施例、表４ａおよび４ｂ、ならびに同時係属の米国出願第１１／０７８，０７３号および第１１／３４０，０８０号で例証され、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡは、表４ａに記載されるＶＥＧＦ標的配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的な、アンチセンス鎖を有する。他の実施形態において、ＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡは、表４ｂのアンチセンス配列のうちの１つ、または表４ｂのセンス配列のうちの１つを含むか、あるいは表４ｂの二重鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）のうちの１つを含む。
【００６３】
当業者は、２０〜２３、しかし具体的には２１個の塩基対の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘発に特に効果的であるとして称賛を得ていることをよく認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかし、他の者は、より短いもしくはより長いｄｓＲＮＡが、同様に効果的であり得ることを見出している。上記の実施形態では、表１〜３に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明のｄｓＲＮＡは、最低２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含むことができる。一端または両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表１〜３の配列のうちの１つを含むより短いｄｓＲＮＡが、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に効果的であり得ることは、妥当に予想され得る。したがって、表１〜３の配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を含み、本明細書で以下に記載されるＦＡＣＳアッセイにおいて、Ｅｇ５遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡと阻害の５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０％以下異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって企図される。表１〜３に提供される標的配列内で切断するさらなるｄｓＲＮＡを、Ｅｇ５配列および提供される標的配列を用いて容易に作製することができる。ＶＥＧＦを標的とするさらなるｄｓＲＮＡを、表４ａおよび４ｂ、実施例、ならびに同時係属の米国出願第１１／０７８，０７３号および第１１／３４０，０８０号で開示される配列を使用して同様の材料中に設計することができ、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
加えて、表１〜３に提供されるＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉに基づく切断の影響を受けやすい、Ｅｇ５のｍＲＮＡ内の部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の薬剤のうちの１つによって標的とされる配列内を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡをさらに含む。本明細書で使用される、第２のＲＮＡｉ剤は、第２のＲＮＡｉ剤が、第１のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内のいずれかの箇所でメッセージを切断する場合、第１のＲＮＡｉ剤の配列内を標的とすると言われる。かかる第２の薬剤は、一般に、Ｅｇ５遺伝子内の選択した配列に隣接する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に連結される、表１〜３に提供される配列のうちの１つからの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなる。例えば、配列番号１の最後の１５ヌクレオチドは、標的Ｅｇ５遺伝子から次の６ヌクレオチドと組み合わせて、表１〜３に提供される配列のうちの１つに基づく２１ヌクレオチドの単鎖薬剤を産生する。ＶＥＧＦを標的とするさらなるＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡを、表４ａおよび４ｂ、実施例、ならびに同時係属の米国出願第１１／０７８，０７３号および第１１／３４０，０８０号で開示される配列を使用して同様の材料中に設計することができ、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列との１つ以上のミスマッチを含有してもよい。好ましい実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、いずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば、相補性の領域の５’もしくは３’末端のいずれかから５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、Ｅｇ５遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、該ｄｓＲＮＡは、一般には、中央の１３個のヌクレオチド内にはいずれのミスマッチも含有しない。本発明内で記載される方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｄｓＲＮＡが、Ｅｇ５遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを判定することができる。Ｅｇ５遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、特にＥｇ５遺伝子内の特定の相補性の領域が、集団内に多型の配列多様性を有することが既知である場合、重要である。
【００６６】
修飾
また別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、安定性を亢進させるために化学修飾される。本発明の核酸は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるもの等の、当該技術分野において十分確立された方法によって、合成および／または修飾することができ、該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用である好ましいｄｓＲＮＡ化合物の具体例には、修飾された骨格、または非天然のヌクレオシド間結合を含有するｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾された骨格を有するｄｓＲＮＡには、該骨格にリン原子を保持するもの、および該骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、また当該技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたｄｓＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
【００６７】
好ましい修飾されたｄｓＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、２’−５’結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’へ、または２’−５’から５’−２’へ結合する、逆向きの極性を有するものが含まれる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
【００６８】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
その中にリン原子を含まない、好ましい修飾されたｄｓＲＮＡ骨格は、単鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１個以上の単鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２を混合した構成成分を有する他のもの、を有するものが含まれる。
【００７０】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
他の好ましいｄｓＲＮＡ模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の１つであるｄｓＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
【００７２】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡ、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−として表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。また、上述の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するｄｓＲＮＡも好ましい。
【００７３】
また、修飾されたｄｓＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分も含有することができる。好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が特に好ましく、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、またはｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であって、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。好ましいさらなる修飾には、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、ならびに、同様に、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
【００７４】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾を、ｄｓＲＮＡの他の位置、特に３’終端ヌクレオチドもしくは２’−５’結合ｄｓＲＮＡ内の糖の３’位、および５’終端ヌクレオチドの５’位で作製することもできる。また、ｄｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のうちのあるものは本出願によって共同所有され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７５】
また、ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される、「非修飾」もしくは「天然」の核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３で開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３で開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために、特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２度Ｃ増加させることが示されていて（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に好ましい。
【００７６】
上記の修飾された核酸塩基の特定のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第５，７５０，６９２号も、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
共役体
本発明のｄｓＲＮＡの別の修飾は、該ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させる、１つ以上の部分または共役体の該ｄｓＲＮＡへの化学的結合を伴う。かかる部分には、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４  ４  １０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９１，１０，１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）等の脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
かかるｄｓＲＮＡ共役体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
ある化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つ以上を単一化合物に、あるいはさらにはｄｓＲＮＡ内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。また、本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｄｓＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、ｄｓＲＮＡ化合物であり、特に２つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合のヌクレオチドから作製される、ｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には少なくとも１つの領域を含有し、該ｄｓＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を該ｄｓＲＮＡに付与するように、修飾される。ｄｓＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たすことができる。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率を大きく亢進させる。それ故、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、しばしばより短いｄｓＲＮＡによって匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、日常的に検出することができる。
【００８０】
特定の場合において、該ｄｓＲＮＡは、非リガンド基によって修飾されてもよい。多くの非リガンド分子が、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにｄｓＲＮＡに共役されており、かかる共役を行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）等の脂質部分が含まれている。かかるｄｓＲＮＡ共役体の調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列記されている。典型的な共役プロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基を、適切なカップリングもしくは活性化試薬を使用して、共役される分子と反応させる。共役反応は、依然として固体支持体に結合されたｄｓＲＮＡを用いて、または溶液相中でのｄｓＲＮＡの切断後のいずれかに実行することができる。典型的には、ＨＰＬＣによってｄｓＲＮＡ共役体を精製して、純粋な共役体が得られる。
【００８１】
一部の場合では、リガンドが多機能性であり得、および／またはｄｓＲＮＡを１つを超えるリガンドに共役することができる。例えば、ｄｓＲＮＡを、取り込みを改善するために１つのリガンドへ、そして遊離を改善するために第２のリガンドへ共役することができる。
【００８２】
ベクターによりコードされたＲＮＡｉ剤
本発明の別の態様では、Ｅｇ５およびＶＥＧＦに特異的なｄｓＲＮＡ分子が、ＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ（１９９６），１２：５−１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａらの国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、宿主ゲノムに統合される導入遺伝子として導入されて、受け継がれ得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように、構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【００８３】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、２つの個別の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、標的細胞に同時形質移入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターを用いて転写してもよい。好ましい実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復として発現される。
【００８４】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（概説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照））、またはアルファウイルス、ならびに当該技術分野において既知の他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。種々の遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび／またはインビボで導入するために、レトロウイルスが使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１６１４５、Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−１９、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７、Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０５３４５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ第９２／０７５７３号を参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入して発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰ等の好適なパッケージング細胞系に形質移入することによって、産生することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：５−１０、Ｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９）。感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）内の多岐にわたる細胞および組織を感染させるために、組換えアデノウイルスベクターを使用することができ（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、これは、感染に有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点も有する。
【００８５】
発現されるｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクターを使用することができ、例としては、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質もしくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いて該ベクターをシュードタイピングすることにより、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を適宜置換することによって、修正することができる。
【００８６】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。本発明のＡＡＶベクターは、ベクターが異なるキャプシドタンパク質の血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２のゲノム上に血清型２のキャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清型２のキャプシド遺伝子を、血清型５のキャプシド遺伝子と置換して、ＡＡＶ２／５ベクターを産生することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当該技術分野の技能内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１−８０１を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本発明における使用に好適な組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡの発現のために核酸配列を該ベクターに挿入するための方法、および該ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野の技能内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ  Ｍ  Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４、Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ  Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｗ  Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０、およびＲｕｂｉｎｓｏｎ  Ｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたく、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。特に好ましい実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現される。
【００８９】
本発明のｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【００９０】
本発明のｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願ＷＯ第９４／１３７８８号、および国際特許出願ＷＯ第９３／２４６４１号に記載され、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本発明のＤＮＡプラスミドもしくはウイルスベクターのいずれか内でｄｓＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ初期プロモーター、もしくはアクチンプロモーター、もしくはＵ１  ｓｎＲＮＡプロモーター）、または一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６  ｓｎＲＮＡもしくは７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター）、あるいは原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドもＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするという条件で、Ｔ７プロモーターであり得る。該プロモーターは、膵臓への導入遺伝子の発現を導くこともできる（例えば、ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２５１１−２５１５）を参照）。
【００９２】
さらに、導入遺伝子の発現は、、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、またはホルモンに感受性である調節配列等の、誘発可能な調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物内の導入遺伝子の発現を制御するために好適である、かかる誘発可能な発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘発物質、およびイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができよう。
【００９３】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に生き残る。代替として、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現すると、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与等によって全身的、患者から外植された標的細胞に投与後、該患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等によって、であり得る。
【００９４】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体（例えばＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、または非カチオン性脂質に基づく担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入される。１週間以上の期間にわたって、単一のＥｇ５遺伝子（もしくはＶＥＧＦ遺伝子）の異なる領域または複数のＥｇ５遺伝子（もしくはＶＥＧＦ遺伝子）を標的とする、ｄｓＲＮＡによって媒介されるノックダウンのための複数回の脂質の形質移入もまた、本発明によって企図される。本発明のベクターの宿主細胞への導入の成功は、種々の既知の方法を使用して監視することができる。例えば、一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカー等のレポーターを用いて示すことができる。エクスビボ細胞の安定な形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性等の、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性を提供するマーカーを使用して、保証することができる。
【００９５】
また、Ｅｇ５に特異的なｄｓＲＮＡ分子およびＶＥＧＦに特異的なｄｓＲＮＡ分子は、ベクターに挿入して、ヒト患者に対する遺伝子療法ベクターとして使用することができる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位固定注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達媒体が中に埋め込まれる徐放性マトリックスを含んでもよい。代替として、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、完全な遺伝子送達ベクターを無傷で産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含んでもよい。
【００９６】
ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、薬剤として許容される担体とを含有する医薬組成物、およびそれを投与するための方法を提供する。該ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物は、Ｅｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程、例えば、肝臓癌等の、Ｅｇ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害の処置に有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。
【００９７】
投薬量
本明細書で取り上げられる医薬組成物は、ＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するために十分な投薬量で投与される。一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、１日当たり受容者の体重１キログラムにつき０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲、一般には、１日当たり体重１キログラムにつき１〜５０ｍｇの範囲であろう。例えば、該ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【００９８】
該医薬組成物は、１日１回投与することができ、あるいは、該ｄｓＲＮＡは、１日にわたって適切な間隔で、２、３、またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として投与されてもよい。ＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦのレベルに対する単回用量の効果は長く続き、その結果、その後の用量は、７日以下の間隔で、または１、２、３、もしくは４週間以下の間隔で投与される。
【００９９】
幾つかの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、持続注入または放出制御製剤による送達を用いて投与される。その場合、各分割用量に含有されるｄｓＲＮＡは、１日当たりの総投薬量を達成するように、対応してより小さくなければならない。投薬量単位は、例えば、数日間にわたって該ｄｓＲＮＡの持続放出を提供する、従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる送達用に配合することができる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤を用いて使用され得る部位等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の１日量を含む。
【０１００】
当業者には、限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、総体的な健康、および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の処置には、単回処置または一連の処置が含まれ得る。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡに対する効果的な投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法を使用して、または本明細書のいずれかの箇所で記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。
【０１０１】
マウス遺伝学における進歩によって、ＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦの発現によって媒介される病理過程等の種々のヒト疾患の研究用に、多くのマウスモデルが生成されている。かかるモデルは、ｄｓＲＮＡのインビボ試験、ならびに治療上有効な用量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦを発現する導入遺伝子を保有する遺伝子導入マウスである。
【０１０２】
かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。
【０１０３】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の公式化に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なってもよい。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成する）を達成するように、公式化することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１０４】
それらの投与に加えて、上述のように、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現によって媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
【０１０５】
投与
本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるか、および処置される範囲に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的、噴霧器によってを含む、例えば、粉末もしくは噴霧剤の吸入もしくは吹送による経肺、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、ならびに真皮下、経口もしくは非経口、例えば、皮下であり得る。
【０１０６】
典型的には、高脂血症を有する哺乳動物を処置する場合、該ｄｓＲＮＡ分子は、非経手段を介して全身的に投与される。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内、もしくは脳室内投与が含まれる。例えば、ｄｓＲＮＡは、共役もしくは非共役、またはリポソームを用いて製剤化されているいないにかかわらず、患者に静脈内投与することができる。そのため、ｄｓＲＮＡ分子は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固形油基剤の溶液等の組成物に製剤化することができる。かかる溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含むことができる。非経口、くも膜下腔内、または脳室内投与については、ｄｓＲＮＡ分子を滅菌水溶液等の組成物に製剤化することができ、これも、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬剤として許容される担体）を含むことができる。製剤については、本明細書でより詳細に記載する。
【０１０７】
該ｄｓＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）等の特定の組織を標的とする様態で送達することができる。
【０１０８】
製剤
本発明の医薬製剤は、簡便に単位剤形で提示することができ、医薬産業において周知である従来の技法によって、調製することができる。かかる技法には、活性成分を１つもしくは複数の医薬用担体または１つもしくは複数の賦形剤と関連させるステップが含まれる。一般に、該製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、あるいはその両方と均一かつ密接に関連させ、次いで必要であれば該産物を成形することによって調製される。
【０１０９】
本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸等の考えられる多くの剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性、疎水性、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。
【０１１０】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化型固体および、自己乳化型半固体を含む種々の構成成分から生成することができるが、これらに限定されない。一態様には、高脂血症等の肝障害を処置する際に肝臓を標的とする製剤がある。
【０１１１】
さらに、ＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡは、他の分子、分子構造、もしくは核酸の混合物と混合、カプセル化、共役、または別様に関連させたｄｓＲＮＡを含有する組成物に製剤化することができる。例えば、ＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ剤を含有する組成物は、他の癌治療薬等の他の治療薬、またはＥＧ５／ＫＳＰおよび／またはＶＥＧＦ以外の遺伝子を標的とする１つ以上のｄｓＲＮＡ化合物を含有することができる。
【０１１２】
経口、非経口、局所、および生物学的製剤
経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは疎水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、またはミニタブレットが含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。幾つかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、１つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくはその薬剤として許容される塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。幾つかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が挙げられる。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されるか、または微小もしくはナノ粒子を形成するように複合されてもよい。ｄｓＲＮＡ複合剤には、ポリ−アミノ酸類；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、およびデンプン類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン類、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥ��Ｅ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
非経口、実質内（脳内への）、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、これも、限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬剤として許容される担体もしくは賦形剤等の緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有し得る。
【０１１４】
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、グリーム、ゲル、ドロップ剤、座薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジル（ＤＯＰＥ）エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、ならびにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、あるいはそれ、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。代替として、ｄｓＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、あるいはその薬剤として許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ｄｓＲＮＡ分子は、例えば、米国特許第６，２７１，３５９号に記載される生物学的または非生物学的手段として、哺乳動物に投与することができる。非生物学的送達は、制限されないが、（１）リポソームに本明細書で提供されるｄｓＲＮＡ酸分子を取り込むステップと、（２）ｄｓＲＮＡ分子を脂質もしくはリポソームと複合し、核酸−脂質もしくは核酸−リポソーム複合体を形成するステップとを含む、種々の方法によって達成することができる。該リポソームは、細胞をインビトロで形質移入するために一般的に使用される、カチオン性および中性の脂質から構成され得る。カチオン性脂質を負に荷電した核酸と複合（例えば、荷電関連）して、リポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの例には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ、およびＤＯＴＡＰが含まれるが、これらに制限されない。リポソームを形成するための手順は、当該技術分野において周知である。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））およびＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．））を含む、多くの親油性薬剤が市販されている。さらに、全身送達方法は、ＤＤＡＢまたはＤＯＴＡＰ等の市販のカチオン性脂質を使用して最適化することができ、これらはそれぞれ、ＤＯＰＥまたはコレステロール等の中性脂質と混合することができる。場合によっては、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６４７−６５２（１９９７））によって記載されるもの等のリポソームを使用することができる。他の実施形態では、ポリエチレンイミン等のポリカチオンを使用して、インビボおよびエクスビボ送達を達成することができる（Ｂｏｌｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１７２８（１９９６））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は、米国特許第６，２７１，３５９号、ＰＣＴ公開ＷＯ第９６／４０９６４号、およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００２−７に見出すことができる。
【０１１５】
生物学的送達は、制限されないが、ウイルスベクターの使用を含む種々の方法によって達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスベクター）を使用して、ｄｓＲＮＡ分子を肝臓細胞へ送達することができる。分子生物学の標準技法を使用して、本明細書で提供されるｄｓＲＮＡのうちの１つ以上を、核酸を細胞に送達するためにこれまでに開発されている、多くの異なるウイルスベクターのうちの１つに導入することができる。これらの結果として得られたウイルスベクターを使用して、例えば、感染によって、１つ以上のｄｓＲＮＡを細胞に送達することができる。
【０１１６】
製剤化されたｄｓＲＮＡの特徴づけ
インライン混合または押出を伴わない方法のうちのいずれかによって調製された製剤は、同様の様態で特徴づけることができる。例えば製剤は、典型的には、目視検査によって特徴づけられる。それらは、凝集物または沈降物のない、白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ（ＵＳＡ）を使用して、光散乱によって測定することができる。粒子は、４０〜１００ｎｍ等の約２０〜３００ｎｍの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総ｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料を、製剤を分裂させる界面活性剤、例えば、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在または不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）等のＲＮＡに結合する色素を用いてインキュベートすることができる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線に対する、該界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。捕捉された画分は、総ｓｉＲＮＡ含有量からｓｉＲＮＡを「含まない」含有量（界面活性剤の不在下のシグナルによって測定される）を差し引くことによって決定される。捕捉されたｓｉＲＮＡのパーセントは、典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤については、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
【０１１７】
リポソーム製剤
薬物の製剤化用に研究されて、使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織立った多くの界面活性剤の構造がある。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からの、それらが提示する特異性および作用の持続時間から、大きな関心を集めている。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１つまたは複数の二重層に配置された両親媒性脂質の小胞を意味する。
【０１１８】
リポソームは、親油性材料および水性の内部から形成される膜を有する、単層状または多層状の小胞である。水性部分が、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。非カチオン性のリポソームは、細胞壁とさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによってインビボで取り込まれる。
【０１１９】
哺乳動物の皮膚を無傷で横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ５０ｎｍ未満の直径を有する、一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【０１２０】
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性および生分解性である、リポソームは、広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができる、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を、代謝および分解から保護することができる、が含まれる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。
【０１２１】
リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するに従って、リポソームの内容物が細胞内へ出て、そこで活性薬剤が作用し得る。
【０１２２】
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として、広範な調査の焦点となっている。局所投与について、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。かかる利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多岐にわたる薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。
【０１２３】
幾つかの報告は、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物が、皮膚に投与されている。大半の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。
【０１２４】
リポソームは、広義の２つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互に作用し、安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面と結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０１２５】
ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合するのではなく、それを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質はともに同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が生じる。それでもなお、ＤＮＡの一部は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層へ送達するために、ｐＨ感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０１２６】
リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方アニオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質、および／またはホスファチジルコリン、および／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１２７】
幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス炎の軽減をもたらし、一方他の手段（例えば、溶液またはエマルジョンとして）を介したインターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤は水溶性投与より優れていると結論付けた（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
【０１２８】
また、非イオン性のリポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における、薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性のリポソーム製剤が、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果は、かかる非イオン性のリポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着の促進に効果的であることを示した（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０１２９】
また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、該用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれると、かかる特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１等の１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来すると、当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０１３０】
１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明されている。ともにＡｌｌｅｎらによる、米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開ＷＯ第８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧＭ１もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開ＷＯ第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０１３１】
１つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号、および第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧによって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに広げた。外部表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームが、欧州特許ＥＰ第０  ４４５  １３１  Ｂ１号および国際公開ＷＯ第９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。ＰＥＧによって誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号、および第５，３５６，６３３号）、ならびにＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許ＥＰ第０  ４９６  ８１３  Ｂ１号）によって記載されている。他の多くの脂質−ポリマー共役体を含むリポソームが、国際公開ＷＯ第９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（ともにＭａｒｔｉｎらによる）、ならびに国際公開ＷＯ第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開ＷＯ第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームについて記載している。
【０１３２】
核酸を含む多くのリポソームが当該技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらによる国際公開ＷＯ第９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらによる米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物にはｄｓＲＮＡが含まれ得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらによる米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。Ｌｏｖｅらによる国際公開ＷＯ第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
【０１３３】
トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体の興味を引く候補者である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適性（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復性であり、しばしば断片化されることなく標的に到達し、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に対して、表面エッジアクチベータ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームによって媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。
【０１３４】
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム等の製剤中に幅広い用途を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類および順位付ける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部基」としても知られる）の性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１３５】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に幅広い用途を見出し、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのうちで最も一般的な構成物質である。
【０１３６】
界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅ）、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスのうちで最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石鹸である。
【０１３７】
界面活性剤分子が正の荷電を保有する場合、それが水中に溶解または分散されると、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスで最も使用される構成物質である。
【０１３８】
界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。
【０１３９】
薬品、製剤、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１４０】
ＳＮＡＬＰ
一実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質（例えば、ＰＥＧ脂質共役体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。ＳＰＬＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれ、これには、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／０３６８３号に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、該核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、およびＰＣＴ公開ＷＯ第９６／４０９６４号に開示されている。
【０１４１】
一実施形態において、脂質の薬物に対する比率（質量／質量比率）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であろう。
【０１４２】
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ＤｉＬｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｌ，２−ジリノレニルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｔｈｉｏ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ（Ｄｉｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ）−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％、または約４０モル％からなり得る。
【０１４３】
別の実施形態では、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために、化合物、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成については、２００８年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
一実施形態において、脂質ｓｉＲＮＡ粒子には、４０％の２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、１０％のＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）が含まれ、粒径６３．０±２０ｎｍおよび０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比である。
【０１４５】
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
【０１４６】
粒子の凝集を阻害する共役された脂質は、例えば、制限されないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ共役体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を阻止する共役された脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％、または約２モル％であり得る。
【０１４７】
幾つかの実施形態において、該核酸脂質粒子には、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％、または約４８モル％のコレステロールがさらに含まれる。
【０１４８】
ＬＮＰ０１
一実施形態において、脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８−４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。それぞれエタノール中の原液を、ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌのように調製することができる。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６の原液を、例えば、４２：４８：１０のモル比に混合することができる。混合された脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％、および最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えば、酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中の）ｓｉＲＮＡ水溶液と混合することができる。脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）等のサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押出ステップは割愛されてもよい。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
【０１４９】
【化１】
2015177801.tif 000003
【０１５０】
ＬＮＰ０１製剤については、例えば、国際出願公開ＷＯ第２００８／０４２９７３号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、１つの液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された多相系である（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに密接に混合および分散される、２つの非混合性の液相を含む二相系である。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかの種類であり得る。水相が、大部分を占める油相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンと称される。あるいは、油相が、大部分を占める水相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）型エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相に加えてさらなる構成成分と、水相または油相のいずれか中の溶液として、またはそれ自体別個の相として存在し得る、活性薬物とを含有することができる。また、乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の医薬用賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。また、医薬用エマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンの場合等の、２つを超える相を含む、多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二元エマルジョンは提供しない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗ型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗ型エマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球内に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型エマルジョンを提供する。
【０１５２】
エマルジョンは、熱力学的安定性によってほとんどまたは全く特徴づけられない。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外相または連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段または製剤の粘度によってこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれも、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散された固体の４つのカテゴリーに分類することができる（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０１５３】
合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性の部分を含む。界面活性剤の、親水性の疎水性に対する比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製時の界面活性剤の分類および選択における、貴重なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性の異なるクラスに分類することができる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５）。
【０１５４】
エマルジョン製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏ型エマルジョンを形成するが、依然として無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を保持することができる、親水性を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、また粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。
【０１５５】
また、多岐にわたる非乳化材料もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０１５６】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）等の、天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周りに強い界面薄膜を形成し、外相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させる、コロイド溶液を形成する。
【０１５７】
エマルジョンは、しばしば、微生物の成長を容易に支持することができる炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等の多くの成分を含有するため、これらの製剤には、しばしば防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。また、製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤も一般的にエマルジョン製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化剤シナージスト、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。
【０１５８】
外皮、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献で概説されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の見地からの有効性から、非常に広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。鉱油基材の緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、ｏ／ｗ型エマルジョンとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
【０１５９】
本発明の一実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油、および単一の、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液中に分散し、次に十分な量の第４の構成成分、一般には中間鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される、系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化される、２つの非混和液の熱力学的に安定で等方的な、透明の分散物質としても記載されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ  １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、３〜５つの構成成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型、または水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の性質、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的な畳み込みに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０１６０】
相図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法についての包括的な知識を当業者にもたらしている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において、不水溶性薬物を可溶化する利点を提示する。
【０１６１】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独、または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜中に浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生成される空隙のために不規則な薄膜を作製することによって、界面流動性を増加させる役目を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用を伴わずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型のマイクロエマルジョン系が、当該技術分野において既知である。水相は、典型的には、水、該薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリ糖化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーンオイル等の材料が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１６２】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物吸収の亢進の見地から、特に興味深い。ペプチドを含む薬物の経口での生物学的利用能を亢進させるために、脂質基剤のマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型およびｗ／ｏ型の両方）が提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは、改善された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および透過性における変化による薬物吸収の潜在的な亢進、調製の容易さ、固形剤形を超える経口投与の容易さ、改善された臨床的効力、および低減した毒性の利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その構成成分が周囲温度で引き合わされると、自然発生的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを製剤化する際に特に有利であり得る。また、マイクロエマルジョンは、化粧用途および医薬用途の双方における活性構成成分の経皮送達に効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、消化管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の向上された体内吸収を促進し、ｄｓＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが期待される。
【０１６３】
また、本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を亢進させるための、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤を含有することができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスのそれぞれが、上述されている。
【０１６４】
浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を達成させるために、種々の浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬物は、イオン化および非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも、細胞膜を横断し得ることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を横断する拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。
【０１６５】
浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透促進剤の前述のクラスのそれぞれについて、以下により詳細に記載する。
【０１６６】
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）とは、水溶液中に溶解されると、溶液の表面張力または該水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収が亢進されるという結果をもたらす、化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、ならびにＦＣ−４３等のペルフルオロ化合物エマルジョンが含まれる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）。
【０１６７】
脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノおよびジ−グリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が含まれる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｙｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
【０１６８】
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。種々の天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁の天然に存在する構成成分のうちのいずれも、ならびにそれらの合成誘導体のうちのいずれもが含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸（もしくはその薬剤として許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ  ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
【０１６９】
キレート剤：本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収の亢進という結果をもたらす化合物として、定義することができる。本発明における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴づけられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とすることから、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
【０１７０】
非キレート非界面活性剤：本明細書で使用される、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性を示すが、それにもかかわらず消化器粘膜を通じてのｄｓＲＮＡの吸収を亢進する化合物として、定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２）、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
【０１７１】
また、細胞レベルでのｄｓＲＮＡの取り込みを亢進させる薬剤も、本発明の医薬用および他の組成物に添加することができる。また、例えば、カチオン性脂質、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ第９７／３０７３１号）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを亢進させることが知られている。
【０１７２】
グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば、２−ピロール、アゾン、ならびにテルペン、例えば、リモネンおよびメントンを含む他の薬剤を利用して、投与される核酸の浸透を亢進させてもよい。
【０１７３】
担体
本発明のｄｓＲＮＡは、薬剤として許容される担体または希釈剤中に製剤化することができる。「薬剤として許容される担体」（本明細書において「賦形剤」とも称される）とは、薬剤として許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。薬剤として許容される担体は液体または固体であり得、所望の容積、軟度、および他の適切な輸送および化学的性質を提供するように、計画された投与の様態を念頭において選択することができる。典型的な薬剤として許容される担体には、例として、制限されないが、水、食塩液、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチン、または硫酸カルシウム）、潤滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が含まれる。
【０１７４】
また、本発明の特定の組成物には、製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、生物活性のある核酸の分解、または循環からのその除去の促進によって、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程によって、核酸として認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との同時投与は、典型的には後者の物質を過剰に伴い、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与される場合、減少され得る（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
【０１７５】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬用担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための、薬剤として許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所定の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされた時に、所望の用量、軟度等を提供するように、計画された投与の様態を念頭において選択される。典型的な医薬用担体には、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
また、核酸と有害に反応しない、経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な薬剤として許容される有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬剤として許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
核酸の局所投与用の製剤には、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固形の油基剤中の核酸の溶液が含まれ得る。該溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない、経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な薬剤として許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
【０１７８】
好適な薬剤として許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
他の構成成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来認められる他の補助的な構成成分を、それらの当該技術分野において確立された使用量レベルで、さらに含有することができる。したがって、例えば、本組成物は、さらに、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬等の、適合性の、薬剤として活性な材料を含有してもよく、あるいは、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の、本発明の組成物の種々の剤形に物理的に製剤化するために有用な、さらなる材料を含有してもよい。しかし、かかる材料は、添加された時に、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨げないべきである。該製剤を滅菌し、所望される場合、補助的な薬剤、例えば、該製剤の１つまたは複数の核酸と有害に相互作用しない潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色物質、香味物質、および／または芳香物質等と混合してもよい。
【０１８０】
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。
【０１８１】
併用療法
一態様において、本発明の組成物を併用療法に使用することができる。「併用療法」という用語には、他の生物活性を有する成分（限定されないが、第２のおよび異なる抗新生物剤等）および非薬物療法（限定されないが、外科処置または放射線処置等）をさらに併用した、主題の化合物の投与が含まれる。例えば、本発明の化合物は、他の薬剤として活性な化合物、好ましくは本発明の化合物の効果を亢進させることができる化合物と併用して使用することができる。本発明の化合物は、他の薬物療法と同時に（単一調製物もしくは別個の調製物として）、または連続的に投与することができる。一般に、併用療法は、療法の単一周期またはその過程の間に２つ以上の薬物の投与を想定する。
【０１８２】
本発明の一態様において、主題の化合物は、種々の病状に関与するタンパク質キナーゼを調節する、１つ以上の別個の薬剤と併用して投与することができる。かかるキナーゼの例には、セリン／スレオニン特異的キナーゼ、受容体型チロシン特異的キナーゼ、および非受容体型チロシン特異的キナーゼが含まれ得るが、これらに限定されない。セリン／スレオニンキナーゼには、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、減数分裂特異的キナーゼ（ＭＥＫ）、ＲＡＦおよびオーロラキナーゼが含まれる。受容体キナーゼファミリーの例には、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｘｍｒｋ、ＤＥＲ、Ｌｅｔ２３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（例えば、ＦＧＦ−Ｒ１、ＧＦＦ−Ｒ２／ＢＥＫ／ＣＥＫ３、ＦＧＦ−Ｒ３／ＣＥＫ２、ＦＧＦ−Ｒ４／ＴＫＦ、ＫＧＦ−Ｒ）、肝細胞成長／散乱因子受容体（ＨＧＦＲ）（例えば、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＳＥＡ、ＳＥＸ）、インスリン受容体（例えば、ＩＧＦＩ−Ｒ）、Ｅｐｈ（例えば、ＣＥＫ５、ＣＥＫ８、ＥＢＫ、ＥＣＫ、ＥＥＫ、ＥＨＫ−Ｉ、ＥＨＫ−２、ＥＬＫ、ＥＰＨ、ＥＲＫ、ＨＥＫ、ＭＤＫ２、ＭＤＫ５、ＳＥＫ）、ＡｘＩ（例えば、Ｍｅｒ／Ｎｙｋ、Ｒｓｅ）、ＲＥＴ、ならびに血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）（例えば、ＰＤＧＦα−Ｒ、ＰＤＧβ−Ｒ、ＣＳＦ１−Ｒ／ＦＭＳ、ＳＣＦ−Ｒ／Ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦ−Ｒ／ＦＬＴ、ＮＥＫ／ＦＬＫ１、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２／ＳＴＫ−１）が含まれる。非受容体チロシンキナーゼファミリーには、ＢＣＲ−ＡＢＬ（例えば、ｐ４３ａｂｌ、ＡＲＧ）、ＢＴＫ（例えば、ＩＴＫ／ＥＭＴ、ＴＥＣ）、ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＰＳ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＢＭＸ、ＦＥＲ、ＣＤＫ、およびＳＹＫが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本発明の別の態様において、主題の化合物は、キナーゼ以外の生物学的標的または過程を調節する１つ以上の薬剤と併用投与することができる。かかる標的には、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ９０）、およびプロテオソームが含まれる。
【０１８４】
一実施形態において、主題の化合物は、Ｚｏｌｉｎｚａ、Ｔａｒｃｅｖａ、Ｉｒｅｓｓａ、Ｔｙｋｅｒｂ、Ｇｌｅｅｖｅｃ、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｓｐｒｙｃｅｌ、Ｎｅｘａｖａｒ、ソラフェニブ、ＣＮＦ２０２４、ＲＧ１０８、ＢＭＳ３８７０３２、Ａｆｆｍｉｔａｋ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＡＧ２４３２２、ＰＤ３２５９０１、ＺＤ６４７４、ＰＤ１８４３２２、Ｏｂａｔｏｄａｘ、ＡＢＴ７３７、およびＡＥＥ７８８等の、１つ以上の生物学的標的を阻害する抗新生物剤（例えば、小分子、モノクローナル抗体、アンチセンスＲＮＡ、および融合タンパク質）と併用することができる。かかる併用は、該薬剤のうちのいずれか単独によって達成される有効性を超えて、治療効果を亢進させることができ、抵抗性の突然変異体の出現を阻止または遅延させることができる。
【０１８５】
特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学療法剤と併用投与される。化学療法剤は、腫瘍学の分野における広範にわたる治療的処置を包含する。これらの薬剤は、腫瘍の縮小、外科処置後に残された残存する癌細胞の破壊、緩解の誘発、緩解の維持、および／または癌もしくはその処置に関連する症状の緩和を目的として、疾患の種々の段階で投与される。かかる薬剤の例には、アルキル化剤、例えば、マスタードガス誘導体（メクロレタミン、シクロホスファミド、クロランブシル、メルファラン、イホスファミド）、エチレンイミン（チオテパ、ヘキサメチルメラミン）、アルキルスルホネート（ブスルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびテモゾロマイド）、ニトロソウレア（カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、イホスファミドおよび金属塩（カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）；植物性アルカロイド、例えば、ポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、ならびにカンプトテカン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎ）類似体（イリノテカンおよびトポテカン）；抗腫瘍抗生物質、例えば、クロモマイシン（ダクチノマイシンおよびプリカマイシン）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、およびイダルビシン）、ならびに種々の抗生物質、例えば、マイトマイシン、アクチノマイシン、およびブレオマイシン；代謝拮抗薬、例えば、葉酸拮抗薬（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン）、ピリミジン拮抗薬（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン）、プリン拮抗薬（６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン）、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン、クロファラビン、チオグアニン、ネララビン、およびペントスタチン）；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（イロノテカン（Ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン）、およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド）；モノクローナル抗体（アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ）；ならびに種々の抗新生物剤、例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（ヒドロキシウレア）；副腎皮質ステロイド阻害剤（ミトタン）；酵素（アスパラギナーゼおよびペガスパルガーゼ）；微小管阻害剤（エストラムスチン）；ならびにレチノイド（ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ））が含まれるが、これらに限定されない。特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、抗癌剤補助療法薬（ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）と併用投与される。抗癌剤補助療法薬は、身体を保護するか、あるいは化学療法の副作用を最小���に抑えるように作用する。かかる薬剤の例には、アミホスチン、メスナ、およびデクスラゾキサンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本発明の一態様において、主題の化合物は、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線は、一般的に、内的（癌部位近傍に放射性材料を埋め込む）、あるいは光子（ｘ線もしくはガンマ線）または粒子放射線を用いる機械から外的に送達される。併用療法がさらに放射線治療を含む場合、放射線治療は、該治療薬と放射線治療との組み合わせの同時作用から有益な効果が達成される限り、いずれの好適な時期に行われてもよい。例えば、適切な場合には、有益な効果は、治療薬の投与から、おそらく数日またはさらには数週間、時間的に隔たっている時にも、依然として達成される。
【０１８７】
本発明の化合物は、免疫療法剤と併用され得ることが理解されよう。免疫療法の一形態は、腫瘍から離れた部位にワクチン組成物を投与することによる、宿主起源の活動性の、全身性腫瘍に特異的な免疫応答の生成である。単離腫瘍抗原ワクチン（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）および抗イディオタイプワクチンを含む、様々な種類のワクチンが提案されている。別の手法は、処置される対象からの腫瘍細胞、またはかかる細胞の誘導体の使用である（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：４８７によって概説されている）。米国特許第５，４８４，５９６号では、Ｈａｎｎａ  Ｊｒらは、腫瘍の外科的除去、コラゲナーゼによる細胞の分散、細胞の照射、および約１０７細胞の少なくとも３回の連続用量で患者にワクチン接種するステップを含む、切除可能な癌腫を処置して再発または転移を阻止するための方法を主張している。
【０１８８】
本発明の化合物は、１つ以上の補助治療薬と有利に併用され得ることが理解されよう。補助的療法に好適な薬剤の例には、ステロイド剤、例えば、コルチコステロイド（アムシノニド、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、酢酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、１７−プロピオン酸クロベタゾール、コルチゾン、デフラザコート、デスオキシメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、デキサメサゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、デソニド、フロ酸、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、およびプロピオン酸ハロベタゾール）；５ＨＴｉ作用薬、例えば、トリプタン（例えば、スマトリプタンもしくはナラトリプタン）；アデノシンＡ１作用薬；ＥＰリガンド；ＮＭＤＡモジュレーター、例えば、グリシン拮抗薬；ナトリウムチャネル遮断薬（例えば、ラモトリジン）；物質Ｐ拮抗薬（例えば、ＮＫｉ拮抗薬）；カンナビノイド；アセトアミノフェンもしくはフェナセチン；５−リポキシゲナーゼ阻害剤；ロイコトリエン受容体拮抗薬；ＤＭＡＲＤ（例えば、メトトレキサート）；ガバペンチンおよび関連化合物；三環系抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン）；ニューロン安定化抗てんかん薬（ｎｅｕｒｏｎｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  ｄｒｕｇ）；モノアミン作動性取り込み阻害剤（例えば、ベンラファキシン）；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）阻害剤、例えば、ｉＮＯＳもしくはｎＮＯＳ阻害剤；腫瘍壊死因子αの放出または作用の阻害剤；抗体療法、例えば、モノクローナル抗体療法；抗ウイルス薬、例えば、ヌクレオシド阻害剤（例えば、ラミブジン）もしくは免疫系調節因子（例えば、インターフェロン）；オピオイド鎮痛剤；局所麻酔薬；カフェインを含む刺激物質；Ｈ２−拮抗薬（例えば、ラニチジン）；プロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール）；制酸薬（例えば、アルミニウムもしくは水酸化マグネシウム；整腸剤（例えば、シメチコン）；充血除去剤（例えば、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、偽エフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、もしくはレボデスオキシエフェドリン（ｌｅｖｏ−ｄｅｓｏｘｙｅｐｈｅｄｒｉｎｅ））；鎮咳薬（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カラミフェン）、カルベタペンタン、もしくはデキストロメトルファン）；利尿薬；または鎮静型もしくは非鎮静型抗ヒスタミン剤が含まれる。
【０１８９】
本発明の化合物は、他の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと同時投与することができる。例えば、本発明の化合物は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡと同時投与することができる。一例では、ＡＤ−１２１１５をｃ−Ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡと同時投与することができる。ｃ−Ｍｙｃを標的としたｓｉＲＮＡの例は、米国特許出願第１２／３７３，０３９号に開示されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
Ｅｇ５およびＶＥＧＦ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を処置するための方法
本発明は、特に、例えば、腫瘍成長および腫瘍転移を阻害するための、肝臓癌等の癌の処置のための、Ｅｇ５遺伝子を標的とした１つと、ＶＥＧＦ遺伝子を標的とした１つとの少なくとも２つのｄｓＲＮＡを含有する組成物の使用に関する。例えば、医薬組成物等の組成物は、肝臓の癌中に生じ得るもの等の、肝内腫瘍のような固形腫瘍の処置のために使用することができる。また、Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡとＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡとを含有する組成物は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、神経膠腫、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫等の他の腫瘍および癌の処置、黒色腫のような皮膚癌の処置、ならびにリンパ腫および血液癌の処置に使用することができる。本発明は、異なる種類の癌、例えば、肝臓癌、乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、脳癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、神経膠腫、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、黒色腫、リンパ腫、および血液癌における腹水および胸水の蓄積を阻害するための、Ｅｇ５  ｄｓＲＮＡおよびＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡを含有する組成物の使用にさらに関連する。Ｅｇ５およびＶＥＧＦの発現に対する阻害効果により、本発明に従う組成物またはそこから調製される医薬組成物は、生活の質を向上させることができる。
【０１９１】
一実施形態において、ＡＦＰ発現に関連する腫瘍、またはＡＦＰを分泌する腫瘍、例えば、肝癌または奇形腫を有する患者が処置される。特定の実施形態において、患者は、悪性の奇形腫、内胚葉洞腫瘍（卵黄嚢癌）、神経芽細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、精巣癌、または卵巣癌を有する。
【０１９２】
さらに、本発明は、例えば、癌を処置するため、および／または腫瘍転移を阻止するために現在用いられているもの等の、他の医薬品および／または他の治療方法、例えば、既知の医薬品および／または既知の治療方法と併用して、例えば、癌を処置、または腫瘍転移を阻止するための、ｄｓＲＮＡまたはその医薬組成物の使用に関する。放射線療法、ならびにシスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェン等の化学療法剤との併用が好ましい。
【０１９３】
また、本発明は、特定のＲＮＡｉ剤共に、任意の従来の化学療法剤等の別の抗癌化学療法剤と併用して実践することもできる。特定の結合剤とそのような他の薬剤との組み合わせが、化学療法プロトコルを強化することができる。本発明の方法に組み込むことができる多くの化学療法プロトコルが、当業者の念頭に浮かぶであろう。アルキル化剤、代謝拮抗薬、ホルモンおよび拮抗薬、放射性同位体、ならびに天然産物を含む、いずれの化学療法剤を使用することもできる。例えば、本発明の化合物は、抗生物質、例えば、ドキソルビシンおよび他のアントラサイクリン類似体、ナイトロジェンマスタード、例えば、シクロホスファミド、ピリミジン類似体、例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシウレア、タキソール、およびその天然および合成誘導体等と併用投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性およびゴナドトロピン非依存性の細胞を含む、乳腺腺癌等の混合腫瘍の場合、本化合物を、リュープロライドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と併用投与することができる。他の抗腫瘍プロトコルには、別の処置様式、例えば、外科処置、放射線等とのテトラサイクリン化合物の併用が含まれ、本明細書で「補助抗腫瘍様式」とも称される。したがって、本発明の方法は、副作用を軽減し、有効性を高める利益を有して、このような従来のレジメンと併用することができる。
【０１９４】
Ｅｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための方法
また別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＥｇ５遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、標的Ｅｇ５遺伝子および標的ＶＥＧＦ遺伝子の発現が停止されるように、本発明で取り上げられる組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１９５】
一実施形態において、Ｅｇ５遺伝子の発現およびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するための方法は、１つは処置される哺乳動物のＥｇ５遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有し、もう１つはＶＥＧＦ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する、２つの異なるｄｓＲＮＡ分子を含有する組成物の投与を含む。処置される生物がヒト等の哺乳動物である場合、本組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸、ならびに局所（口腔および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口の経路を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。好ましい実施形態において、本組成物は、静脈内注入もしくは注射によって投与される。
【０１９６】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および化学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実践または試験に際して、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定するものではない。
【実施例】
【０１９７】
実施例１．ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられていない場合、かかる試薬は、分子生物学の用途に標準的な質／純度で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から得ることができる。
【０１９８】
ｓｉＲＮＡ合成
ｄｓＲＮＡのスクリーニングのために、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、および固体支持体として制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して、１μモルの規模で固相合成によって単鎖ＲＮＡを生成した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡを、対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））をそれぞれ用いて、固相合成によって生成した。これらの構成要素を、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるような、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込んだ。ヨウ素酸化剤溶液を、アセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ））の溶液と置き換えて、ホスホロチオエート結合を導入した。さらなる補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１９９】
確立された手順に従い、陰イオン交換ＨＰＬＣによって、粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を行った。収率および濃度を、分光光度計（ＤＵ  ６４０Ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ、（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した、２６０ｎｍの波長でのそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって判定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、３分間８５〜９０℃の水浴中で加温し、３〜４時間かけて室温に冷却することによって、二本鎖ＲＮＡを生成した。アニールされたＲＮＡ溶液は、使用するまで−２０℃で保管した。
【０２００】
共役体
以下は、３’−コレステロールで共役したｓｉＲＮＡ（本明細書で−Ｃｈｏｌ−３’と称される）の合成の予測的記載であり、ＲＮＡ合成のために適切に改質された固体支持体が使用された。改質された固体支持体は、以下のように調製した。
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ
【化２】
2015177801.tif 000004
【０２０１】
水酸化ナトリウムの４．７Ｍの水溶液（５０ｍＬ）を、水（５０ｍＬ）中のグリシンエチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の、撹拌して氷冷した溶液に添加した。次いで、エチルアクリレート（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、混合物を、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで、室温で撹拌した。１９時間後、該溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
【０２０２】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
【化３】
2015177801.tif 000005
【０２０３】
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ミリモル）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ミリモル）を該溶液に０℃で添加した。その後、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ミリモル）、およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ミリモル）を添加した。該溶液が室温になるようにし、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を５％塩酸水溶液、５％飽和重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて濃縮し、粗生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（５０％  ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
【０２０４】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ
【化４】
2015177801.tif 000006
【０２０５】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ミリモル）を、０℃のジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンに溶解した。この溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣に水を添加し、酢酸エチルで生成物を抽出した。この粗生成物をその塩酸塩に変換することによって精製した。
【０２０６】
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
【化５】
2015177801.tif 000007
【０２０７】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ミリモル）の塩酸塩をジクロロメタンに取り込んだ。この懸濁液を氷上で０℃に冷却した。この懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ミリモル）を添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ミリモル）を添加した。反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
【０２０８】
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
【化６】
2015177801.tif 000008
【０２０９】
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ミリモル）を３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリーにした。この混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ミリモル）のジエステルＡＤを２０分以内のうちに、撹拌しながらゆっくりと添加した。添加の間、温度は５℃未満に維持した。撹拌を０℃で３０分間継続し、１ｍＬの氷酢酸、その直後に４０ｍＬの水中の４ｇのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏを添加した。得られた混合物を２回、それぞれ１００ｍＬのジクロロメタンで洗浄し、合わせた有機抽出物を２回、それぞれ１０ｍＬのリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、５０ｍＬの３つの部分の冷たいｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液で抽出した。抽出液をリン酸でｐＨ３に調整し、４０ｍＬの５つの部分のクロロホルムで抽出し、合わせて乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用して、カラムクロマトグラフィーで精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステルを得た（３９％）。
【０２１０】
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
【化７】
2015177801.tif 000009
【０２１１】
メタノール（２ｍＬ）を、ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ミリモル）と、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ミリモル）との還流混合物に、１時間かけて滴下した。撹拌を還流温度で１時間継続した。室温に冷却後、１Ｎ  ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（３×４０ｍＬ）。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（１０％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製した（８９％）。
【０２１２】
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ
【化８】
2015177801.tif 000010
【０２１３】
ジオールＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ミリモル）を、真空内でピリジン（２×５ｍＬ）を用いて蒸発乾固した。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ミリモル）を撹拌しながら添加した。反応は、終夜室温で行われた。メタノールを添加して反応を停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。この有機層を１Ｍの飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。トルエンを蒸発させて残渣のピリジンを除去した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％  ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％  ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中Ｒｆ＝０．５）で精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０２１４】
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ
【化９】
2015177801.tif 000011
【０２１５】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ミリモル）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ミリモル）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ミリモル）と混合し、終夜４０℃の真空内で乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ミリモル）を添加し、この溶液をアルゴン雰囲気下で１６時間、室温で撹拌した。次いで、これをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をそのまま次のステップに使用した。
【０２１６】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ  ＡＩ
【化１０】
2015177801.tif 000012
【０２１７】
コハク酸ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ミリモル）を、ジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解した。その溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ミリモル）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ミリモル）を連続して添加した。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ミリモル）を添加した。反応混合物の色が鮮やかな橙色に変わった。この溶液を、手首動作式振盪機（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ  ｓｈａｋｅｒ）を使用して短く撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。懸濁液を２時間撹拌した。焼結漏斗を通してＣＰＧを濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続して洗浄した。無水酢酸／ピリジンを使用して未反応のアミノ基を遮蔽した。達成されたＣＰＧの装填を、ＵＶ測定値を取ることによって測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０２１８】
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド（ｂｉｓｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）基（本明細書で「５’−Ｃ３２−」と称される）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書で「５’−Ｃｈｏｌ−」と称される）を担持するｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体について、酸化ステップが、核酸オリゴマーの５’末端にホスホロチオエート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して行われたことを除いて、国際公開ＷＯ第２００４／０６５６０１号に記載されるように行った。
【０２１９】
Ｅｇ５遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ
初期スクリーニングセット
ｓｉＲＮＡ設計は、Ｅｇ５（ＫＩＦ１１、ＨＳＫＰ、ＫＮＳＬ１、およびＴＲＩＰ５としても知られる）を標的とするｓｉＲＮＡを同定するように行われた。Ｅｇ５に対するヒトｍＲＮＡ配列、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ番号：ＮＭ＿００４５２３を使用した。
【０２２０】
ヒトおよびマウスＥｇ５に交差反応性のｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。スクリーニング用に２４本の二重鎖を合成した。（表１ａ）。第２のスクリーニングセットは、ヒトＥｇ５、ならびにそのアカゲザル相同分子種を標的とする２６６個のｓｉＲＮＡで定義した（表２ａ）。拡大されたスクリーニングセットには、他の種のＥｇ５のいずれのｍＲＮＡにも的中する必要がない、ヒトＥｇ５を標的とする３２８個のｓｉＲＮＡを選択した（表３ａ）。
【０２２１】
ヒトおよび部分的にアカゲのＥｇ５  ｍＲＮＡの配列は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースからダウンロードし、これより先、このヒト配列を参照配列として使用した（ヒトＥＧ５：ＮＭ＿００４５２３．２、４９０８塩基対、およびアカゲＥＧ５：ＸＭ＿００１０８７６４４．１、８７８塩基対（ヒトＥＧ５の５’部分のみ））。
【０２２２】
表について：凡例：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ−リボヌクレオチド、Ｔ−デオキシチミジン、ｕ、ｃ−２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ｓ−ホスホロチオエート結合。
【０２２３】
表１ａ．Ｅｇ５／ＫＳＰのｄｓＲＮＡ二重鎖の配列
【表１−１】
2015177801.tif 000013
【０２２４】
表１ｂ．Ｅｇ５／ＫＳＰのｄｓ二重鎖の分析
【表１−２】
2015177801.tif 000014
【表１−３】
2015177801.tif 000015
【０２２５】
表２ａ．Ｅｇ５／ＫＳＰのｄｓＲＮＡ二重鎖の配列
【表２−１】
2015177801.tif 000016
【表２−２】
2015177801.tif 000017
【表２−３】
2015177801.tif 000018
【表２−４】
2015177801.tif 000019
【０２２６】
表２ｂ．Ｅｇ５／ＫＳＰのｄｓＲＮＡ二重鎖の分析
【表２−５】
2015177801.tif 000020
【表２−６】
2015177801.tif 000021
【表２−７】
2015177801.tif 000022
【表２−８】
2015177801.tif 000023
【表２−９】
2015177801.tif 000024
【０２２７】
表３．Ｅｇ５／ＫＳＰのｄｓＲＮＡ二重鎖の配列および分析
【表３−１】
2015177801.tif 000025
【表３−２】
2015177801.tif 000026
【表３−３】
2015177801.tif 000027
【表３−４】
2015177801.tif 000028
【表３−５】
2015177801.tif 000029
【表３−６】
2015177801.tif 000030
【０２２８】
ＶＥＧＦ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ
ＶＥＧＦ−Ａ１２１のｍＲＮＡ配列のエクソン１〜５内で４００個の標的配列を同定した。参照転写物は、ＮＭ＿００３３７６である。
【化１１】
2015177801.tif 000031
【０２２９】
表４ａには、同定された標的配列が含まれる。これらの配列を標的とする対応するｓｉＲＮＡを、生物情報学的スクリーニングに付した。
【０２３０】
該配列が、ＶＥＧＦ配列に対して特異的であり、いずれの他の遺伝子からの配列にも特異的でないことを確実にするために、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴ検索エンジンを使用して、Ｇｅｎｂａｎｋの該配列に対して標的配列を確認した。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ａｎｄ  Ｇｉｓｈ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０，１９９６に記載される。
【０２３１】
また、ｓｉＲＮＡは、サル、ラット、およびヒトＶＥＧＦ配列と交差反応するそれらの能力について、優先順位を付けた。
【０２３２】
これらの４００個の潜在的標的配列のうち、少数の主要候補を同定するために、８０個を実験的スクリーニングによる分析用に選択した。これらの８０個の標的配列に対して、合計１１４個のｓｉＲＮＡ分子を設計した（表４ｂ）。
【０２３３】
表４ａ．ＶＥＧＦ−１２１の標的配列
【表４−１】
2015177801.tif 000032
【表４−２】
2015177801.tif 000033
【表４−３】
2015177801.tif 000034
【表４−４】
2015177801.tif 000035
【表４−５】
2015177801.tif 000036
【０２３４】
表４ｂ：ＶＥＧＦを標的とする二重鎖
鎖：Ｓ＝センス、ＡＳ＝アンチセンス
【表４−６】
2015177801.tif 000037
【表４−７】
2015177801.tif 000038
【表４−８】
2015177801.tif 000039
【表４−９】
2015177801.tif 000040
【表４−１０】
2015177801.tif 000041
【表４−１１】
2015177801.tif 000042
【表４−１２】
2015177801.tif 000043
【表４−１３】
2015177801.tif 000044
【表４−１４】
2015177801.tif 000045
【０２３５】
実施例２．細胞増殖を介したＥｇ５  ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
Ｅｇ５の発現停止が、有糸分裂の停止を引き起こすことが示されているため（Ｗｅｉｌ，Ｄ，ｅｔ  ａｌ［２００２］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３３：１２４４−８）、ｓｉＲＮＡ活性のスクリーニングに細胞生死判別アッセイを使用した。ＨｅＬａ細胞（ウェル当たり１４０００個［スクリーニング１および３］、またはウェル当たり１００００個［スクリーニング２］））を９６ウェルプレートに播種し、３０ｎＭのウェル中最終ｓｉＲＮＡ濃度、ならびに５０ｎＭ（第１のスクリーニング）および２５ｎＭ（第２のスクリーニング）の最終濃度で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を同時に形質移入した。第３のスクリーニングで、二重鎖のサブセットを２５ｎＭで試験した（表５）。
【０２３６】
形質移入の７２時間後、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ）を培養基に添加し、その後４５０ｎｍでの吸光測定により、細胞増殖をアッセイした。対照（非形質移入）細胞の吸光度値を１００パーセントと見なし、ｓｉＲＮＡを形質移入したウェルの吸光度を対照の値と比較した。アッセイは、３回のスクリーニングのそれぞれについて、６回繰り返して行った。ｓｉＲＮＡのサブセットを種々のｓｉＲＮＡ濃度でさらに試験した。アッセイをＨｅＬａ細胞に行った（ウェル当たり１４０００個、上記と同一の方法、表５）。
【０２３７】
表５：２５ｎＭでの細胞生存率に対するＥｇ５標的二重鎖の効果。
【表５】
2015177801.tif 000046
【０２３８】
表５中で最も高い成長阻害を示した９つのｓｉＲＮＡ二重鎖を、ＨｅＬａ細胞中の種々のｓｉＲＮＡ濃度で再試験した。試験したｓｉＲＮＡ濃度は、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ、１１．１ｎＭ、３．７０ｎＭ、１．２３ｎＭ、０．４１ｎＭ、０．１４ｎＭ、および０．０４６ｎＭであった。アッセイは、６回繰り返して行い、細胞増殖の５０パーセントの阻害をもたらす各ｓｉＲＮＡの濃度（ＩＣ５０）を算出した。この用量反応分析は、各二重鎖について２回から４回行った。平均ＩＣ５０値（ｎＭ）を表６に示す。
【０２３９】
表６：ｓｉＲＮＡのＩＣ５０：ＨｅＬａ細胞中の細胞増殖
【表６】
2015177801.tif 000047
【０２４０】
実施例３．ｍＲＮＡ阻害を介したＥｇ５  ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
形質移入の直前に、ＨｅＬａ  Ｓ３（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２．２、ＬＣＧ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ（Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ））細胞を、７５μｌの成長培地（ＨａｍのＦ１２、１０％ウシ胎仔血清、１００ｕのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、全てＢｏｏｋｒｏｏｍ  ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より）中、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に１．５×１０４細胞／ウェルで播種した。形質移入は４回繰り返して行った。各ウェルについて、０．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を１２μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。１００μｌの形質移入容量中５０ｎＭであるｓｉＲＮＡ濃度について、１μｌの５μＭのｓｉＲＮＡをウェル当たり１１．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物と合わせて、再度室温で１５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体を完全に細胞に適用し（ウェル当たりそれぞれ２５μｌ）、細胞を２４時間、３７℃および加湿インキュベーター（Ｈｅｒｏｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｈａｎａｕ））中５％  ＣＯ２でインキュベートした。単回用量スクリーニングを一旦それぞれ５０ｎＭおよび２５ｎＭで行った。
【０２４１】
１００μｌの成長培地を含有する各ウェルに５０μｌの溶解混合物（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）からのＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ｂＤＮＡキットの内容物）を適用することによって細胞を収集し、５３℃で３０分間溶解した。その後、５０μｌの溶菌液をヒトＥｇ５およびヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセットでインキュベートし、製造業者のＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ用のプロトコルに従って進めた。最後に化学発光をＲＬＵ（相対光単位）としてＶｉｃｔｏｒ２−Ｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で測定し、ｈＥｇ５プローブセットで得られた値を、各ウェルについてそれぞれのＧＡＰＤＨ値に基準化した。Ｅｇ５を対象としたｓｉＲＮＡで得られた値を、１００％に設定された非特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＣＶを対象とした）と関連付けた（表１ｂ、２ｂ、および３ｂ）。
【０２４２】
スクリーニングからの効果的なｓｉＲＮＡを、用量反応曲線によってさらに特徴づけた。用量反応曲線の形質移入は、１００ｎＭ、１６．７ｎＭ、２．８ｎＭ、０．４６ｎＭ、７７ｐｉｃｏＭ、１２．８ｐｉｃｏＭ、２．１ｐｉｃｏＭ、０．３５ｐｉｃｏＭ、５９．５ｆＭ、９．９ｆＭ、および偽（ｓｉＲＮＡなし）の濃度で行い、上記プロトコルに従って、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを用いて１２．５μｌの最終濃度に希釈した。データ分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの拡張ソフトウェアであるＸＬ−ｆｉｔ  ４．２（ＩＤＢＳ（Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ））を使用し、用量反応モデル番号２０５を適用して行った（表１ｂ、２ｂ、および３ｂ）。
【０２４３】
優位なｓｉＲＮＡであるＡＤ１２１１５を、ＲｏｃｈｅからのＷＳＴ−増殖アッセイ（前述の通り）を適用することによって、さらに分析した。
【０２４４】
最も高い活性を示した表２からの３４個の二重鎖のサブセットを、１００ｎＭ〜１０ｆＭの範囲の最終濃度でＨｅＬａ細胞に形質移入することによってアッセイした。形質移入は４回繰り返して行った。各二重鎖について２回の用量反応アッセイを行った。各二重鎖について、ＫＳＰ  ｍＲＮＡの２０％（ＩＣ２０）、５０％（ＩＣ５０）、および８０％（ＩＣ８０）の低下を示す濃度を算出した（表７）。
【０２４５】
表７：ＨｅＬａ細胞中のＥｇ５／ＫＳＰ二重鎖の用量反応性ｍＲＮＡ阻害
ｐＭで示される濃度
【表７】
2015177801.tif 000048
【０２４６】
実施例４．ＬＮＰ０１製剤化ｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与後の幼若ラットにおける肝臓Ｅｇ５／ＫＳＰの発現停止
出生から約２３日齢まで、成長期ラット肝臓にＥｇ５／ＫＳＰ発現を検出することができる。二重鎖ＡＤ−６２４８を使用して、幼若ラットにおける、製剤化Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｓｉＲＮＡを用いた標的の発現停止を評価した。
【０２４７】
試験したＫＳＰ二重鎖
【化１２】
2015177801.tif 000049
【０２４８】
方法
動物の投薬。雄の幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１９日齢）に、尾静脈注射を介して単回用量の脂質様（「ＬＮＰ０１」）製剤化ｓｉＲＮＡを投与した。１０匹の動物の群に、１０ミリグラム／体重１キログラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量の、ＡＤ６２４８または非特異的ｓｉＲＮＡのいずれかを与えた。用量レベルとは、製剤中の、投与されたｓｉＲＮＡ二重鎖の量を指す。第３の群には、リン酸緩衝食塩水を与えた。動物は、ｓｉＲＮＡ投与の２日後に殺処理した。肝臓を解剖し、液体窒素中で急速冷凍し、粉末に微粉砕した。
【０２４９】
ｍＲＮＡ測定。全ての処置群からの肝臓の、Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｍＲＮＡのレベルを測定した。各肝臓粉末の試料（約１０ミリグラム）を、プロテイナーゼＫを含有する組織溶解緩衝液中で均質化した。各試料について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ分岐ＤＮＡアッセイ（ＧｅｎｏＳｐｅｃｔｒａ）を使用して、Ｅｇ５／ＫＳＰおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのレベルを３回繰り返して測定した。各試料について、Ｅｇ５／ＫＳＰの平均値を平均ＧＡＰＤＨ値に基準化した。各実験について、群平均を決定し、ＰＢＳ群に基準化した。
【０２５０】
統計分析。有意性は、ＡＮＯＶＡ、その後Ｔｕｋｅｙの事後検定によって決定した。
【０２５１】
結果
データ要約
Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｍＲＮＡの平均値（±標準偏差）を示す。ＰＢＳ群に対する統計的有意性（ｐ値）を示す（ｎｓ、有意でない［ｐ＞０．０５］）。
【０２５２】
表８．実験１
【表８】
2015177801.tif 000050
【０２５３】
肝臓Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｍＲＮＡにおける統計的に有意な低下が、１０ｍｇ／ｋｇの用量の製剤化ＡＤ６２４８を用いた処置後に得られた。
【０２５４】
実施例５．ＬＮＰ０１製剤化ＶＳＰの静脈内注入後のラット肝臓ＶＥＧＦの発現停止
２つのｓｉＲＮＡの等モル混合物を含む「脂質様」製剤をラットに投与した。本明細書で使用されるＶＳＰとは、１つはＥｇ５／ＫＳＰを対象とし、１つはＶＥＧＦを対象とする、２つのｓｉＲＮＡを有する組成物を指す。本実験には、ＶＥＧＦを対象とするＡＤ３１３３、およびＥｇ５／ＫＳＰを対象とするＡＤ１２１１５の二重鎖を使用した。Ｅｇ５／ＫＳＰの発現は、成熟ラット肝臓ではほとんど検出不可能であるため、ＶＥＧＦのレベルのみをｓｉＲＮＡ処置後に測定した。
【０２５５】
投与されたｓｉＲＮＡ二重鎖（ＶＳＰ）
【化１３】
2015177801.tif 000051
凡例：Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ−リボヌクレオチド、ｃ、ｕ−２’−Ｏ−Ｍｅリボヌクレオチド、ｓ−ホスホロチオエート。
【０２５６】
各鎖の非修飾型および各ｓｉＲＮＡの標的は、以下の通りである。
【化１４】
2015177801.tif 000052
【０２５７】
方法
動物の投薬。成熟した雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、大腿静脈への２時間の注入によって、脂質様（「ＬＮＰ０１」）製剤化ｓｉＲＮＡを投与した。４匹の動物の群に、５、１０、および１５ミリグラム／体重１キログラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量の製剤化ｓｉＲＮＡを与えた。用量レベルとは、製剤中の、投与されたｓｉＲＮＡ二重鎖の総量を指す。第４の群には、リン酸緩衝食塩水を与えた。動物は、ｓｉＲＮＡの注入の終了から７２時間後に殺処理した。肝臓を解剖し、液体窒素中で急速冷凍し、粉末に微粉砕した。
【０２５８】
製剤化手順
脂質様ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ  １４８７）（式１、上記）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製した。それぞれエタノール中の原液、ＮＤ９８（１３３ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（２５ｍｇ／ｍＬ）、ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６（１００ｍｇ／ｍＬ）を調製した。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６の原液を、４２：４８：１０モル比で合わせた。合わせた脂質溶液を、最終エタノール濃度が３５〜４５％、かつ最終酢酸ナトリウム濃度が１００〜３００ｍＭとなるように、ｓｉＲＮＡ水溶液（酢酸ナトリウム、ｐＨ５中）と迅速に混合した。混合すると、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子が自然発生的に形成された。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、場合によっては、サーモバレル押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出した。別の場合には、押出ステップは割愛された。エタノールおよび同時の緩衝液交換は、透析または接線流濾過のいずれかによって達成した。緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２に交換した。
【０２５９】
製剤の特徴づけ
標準的な方法、または押出を伴わない方法のうちのいずれかによって調製された製剤を同様に特徴づける。製剤は、まず目視検査によって特徴づける。それらは、凝集物または沈降物のない、白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ（ＵＳＡ））を使用して、動的光散乱によって測定する。粒子は、２０〜３００ｎｍ、理想的には４０〜１００ｎｍの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総ｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料を、製剤を分裂させる界面活性剤、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在または不在下、ＲＮＡに結合する色素、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてインキュベートする。製剤中の総ｓｉＲＮＡを、標準曲線に対する、該界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定する。捕捉された画分を、総ｓｉＲＮＡ含有量からｓｉＲＮＡを「含まない」含有量（界面活性剤の不在下のシグナルによって測定される）を差し引くことによって決定する。捕捉されたｓｉＲＮＡのパーセントは、典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤については、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好ましい範囲は、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、好ましくは少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、最も好ましくは少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。一例において、粒径のそれぞれは、Ｅｇ５  ｄｓＲＮＡ対ＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの少なくとも約１：１の比率を含む。
【０２６０】
ｍＲＮＡ測定。各肝臓粉末の試料（約１０ミリグラム）を、プロテイナーゼＫを含有する組織溶解緩衝液中で均質化した。各試料について、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ分岐ＤＮＡアッセイ（ＧｅｎｏＳｐｅｃｔｒａ）を使用して、ＶＥＧＦおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのレベルを３回繰り返して測定した。各試料について、ＶＥＧＦの平均値を平均ＧＡＰＤＨ値に基準化した。各実験について、群平均を決定し、ＰＢＳ群に基準化した。
【０２６１】
タンパク質測定。各肝臓粉末の試料（約６０ミリグラム）を、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。総タンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。各動物からの総タンパク質の試料を用い、ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＶＥＧＦのタンパク質レベルを決定した。各実験について、群平均を決定し、ＰＢＳ群に基準化した。
【０２６２】
統計分析。有意性は、ＡＮＯＶＡ、その後Ｔｕｋｅｙの事後検定によって決定した。
【０２６３】
結果
データ要約
各処置群について、ｍＲＮＡ（ＶＥＧＦ／ＧＡＰＤＨ）およびタンパク質（相対ＶＥＧＦ）の平均値（±標準偏差）を示す。各実験についての、ＰＢＳ群に対する統計的有意性（ｐ値）を示す。
【０２６４】
表９．
【表９】
2015177801.tif 000053
【０２６５】
肝臓ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡおよびタンパク質における統計的に有意な低下が、全ての３つのｓｉＲＮＡ用量レベルで測定された。
【０２６６】
実施例６．ヒト肝腫瘍のマウスモデルにおけるＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの評価。
これらの研究は、ＫＳＰ／Ｅｇ５を標的とするｄｓＲＮＡおよびＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡを含有するＶＳＰ  ｓｉＲＮＡカクテルを利用した。本明細書で使用されるＶＳＰとは、１つはＥｇ５／ＫＳＰを対象とし、１つはＶＥＧＦを対象とする、２つのｓｉＲＮＡを有する組成物を指す。本実験には、ＡＤ３１３３（ＶＥＧＦを対象とする）およびＡＤ１２１１５（Ｅｇ５／ＫＳＰを対象とする）の二重鎖を使用した。ｓｉＲＮＡカクテルをＳＮＡＬＰに製剤化した。
【０２６７】
研究の最大規模では、２０〜２５匹のマウスを利用した。肝臓癌を処置するｓｉＲＮＡ  ＳＮＡＬＰカクテルの有効性を試験するために、１ｘ１０＾６の腫瘍細胞を試験マウスの左側葉に直接注射した。切り込みを縫合によって閉じ、マウスを２〜５時間回復させた。マウスは４８〜７２時間以内に完全に回復した。ＳＮＡＬＰ  ｓｉＲＮＡ処置は、腫瘍の播種から８〜１１日後に開始した。
【０２６８】
利用したＳＮＡＬＰ製剤は、（ｉ）ＶＳＰ（ＫＳＰ＋ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡカクテル（１：１モル比））、（ｉｉ）ＫＳＰ（ＫＳＰ＋Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡカクテル）、および（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ＋Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡカクテル）であった。全ての製剤が、等量（ｍｇ）の各活性ｓｉＲＮＡを含有した。全てのマウスが総ｓｉＲＮＡ／脂質用量を与えられ、本来のクエン酸塩緩衝液条件を使用して、各カクテルを１：５７  ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ（１．４％  ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、５７．１％  ＤＬｉｎＤＭＡ、７．１％  ＤＰＰＣ、および３４．３％コレステロール）、６：１の脂質：薬物に製剤化した。
【０２６９】
ヒトＨｅｐ３Ｂ研究Ａ：ＶＳＰ−ＳＮＡＬＰの抗腫瘍活性
肝内播種によって、ヒト肝癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍をＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）／ベージュマウス内に確立した。群Ａ（ｎ＝６）の動物にはＰＢＳを投与し、群Ｂ（ｎ＝６）の動物にはＶＳＰ  ＳＮＡＬＰを投与し、群Ｃ（ｎ＝５）の動物にはＫＳＰ／Ｌｕｃ  ＳＮＡＬＰを投与し、群Ｄ（ｎ＝５）の動物にはＶＥＧＦ／Ｌｕｃ  ＳＮＡＬＰを投与した。
【０２７０】
ＳＮＡＬＰ処置は、腫瘍の播種から８日後に開始した。ＳＮＡＬＰは、３ｍｇ／ｋｇの総ｓｉＲＮＡを週２回（月曜日および木曜日）、合計６用量（累積で１８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）を投薬した。最後の用量は、２５日目に投与され、最終エンドポイントは２７日目であった。
【０２７１】
腫瘍量は、（ａ）体重、（ｂ）肝重量、（ｃ）２７日目に目視検査＋写真、（ｄ）ヒト特異的ｍＲＮＡの分析、および（ｅ）２７日目に血中アルファフェトプロテインレベルをアッセイした。
【０２７２】
以下の表１０は、播種した（左側）肝葉内で測定された腫瘍量の目視によるスコア化の結果を示す。スコア：「−」＝目に見える腫瘍はない、「＋」＝注射部位に腫瘍組織の形跡、「＋＋」＝肝葉から突出する個別的な腫瘍小結節、「＋＋＋」＝肝葉の両側に突出する大きな腫瘍、「＋＋＋＋」＝大きな腫瘍、肝葉全体に複数の小結節。
【０２７３】
表１０．
【表１０−１】
2015177801.tif 000054
【表１０−２】
2015177801.tif 000055
【０２７４】
体重の割合としての肝重量を図１に示す。
【０２７５】
体重を図２Ａ〜２Ｄに示す。
【０２７６】
本研究から、以下が結論付けられた。（１）ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰは、Ｈｅｐ３Ｂ  １Ｈモデルにおいて、強力な抗腫瘍効果を示した、（２）ＶＳＰカクテルの抗腫瘍活性は、主としてＫＳＰ構成成分に関連すると見られる、（３）抗ＫＳＰ活性は、単回用量の組織学的分析によって確認された、および（４）ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡは、本モデルにおける腫瘍成長の阻害に対して測定可能な効果を示さなかった。
【０２７７】
ヒトＨｅｐ３Ｂ研究Ｂ：ＶＳＰ処置による生存の延長
第２のＨｅｐ３Ｂ研究では、ＳＣＩＤ／ベージュマウスへの肝内播種によって、ヒト肝癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍を確立した。これらのマウスは、免疫介在性抗腫瘍効果に対する最低限の範囲である、リンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠失していた。群Ａ（ｎ＝６）のマウスは無処置であり、群Ｂ（ｎ＝６）のマウスにはルシフェラーゼ（ｌｕｃ）１９５５  ＳＮＡＬＰ（ロット番号ＡＰ１０−０２）を投与し、群Ｃ（ｎ＝７）のマウスには、ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰ（ロット番号ＡＰ１０−０１）を投与した。ＳＮＡＬＰは、１：５７  ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ、および６：１の脂質：薬物であった。
【０２７８】
ＳＮＡＬＰ処置は、腫瘍の播種から８日後に開始した。ＳＮＡＬＰは、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを週２回（月曜日および木曜日）、合計６用量（累積で１８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）を投薬した。最後の用量は２５日目に送達され、本研究の最終エンドポイントは２７日目であった。
【０２７９】
腫瘍量は、（１）体重、（２）２７日目に目視検査＋写真、（３）ヒト特異的ｍＲＮＡの分析、および（４）２７日目に測定される血中アルファフェトプロテインによってアッセイした。
【０２８０】
体重は、各投薬日（８、１１、１４、１８、２１、および２５日目）、および殺処理の日（図３）に測定した。
【０２８１】
表１１．
【表１１−１】
2015177801.tif 000056
【表１１−２】
2015177801.tif 000057
スコア：「−」＝目に見える腫瘍はない、「＋」＝注射部位に腫瘍組織の形跡、「＋＋」＝肝葉から突出する個別的な腫瘍小結節、「＋＋＋」＝肝葉の両側に突出する大きな腫瘍、「＋＋＋＋」＝大きな腫瘍、肝葉全体に複数の小結節。
【０２８２】
体重と腫瘍量との間の相関を図４、５、および６に示す。
【０２８３】
Ｈｅｐ３Ｂマウスへの単回用量のＶＳＰ  ＳＮＡＬＰ（２ｍｇ／ｋｇ）も、組織学的染色によって検査された肝臓組織試料において、有糸分裂紡錘体の形成をもたらした。
【０２８４】
腫瘍量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｐＲＴ−ＰＣＲ）（Ｔａｑｍａｎ）によって定量化した。種特異的Ｔａｑｍａｎアッセイによって、ヒトＧＡＰＤＨをマウスＧＡＰＤＨに基準化した。上記表中で巨視的観察によって示される腫瘍スコアは、ＧＡＤＰＨレベルと相関した（図７Ａ）。
【０２８５】
腫瘍によって分泌されるアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を測定するために、血清ＥＬＩＳＡを行った。以下に記載するように、ＡＦＰのレベルが処置後に低下すると、腫瘍は成長していない。ＶＳＰを用いた処置は、対照を用いた処置と比較して、数匹の動物においてＡＦＰレベルを低下させた（図７Ｂ）。
【０２８６】
ヒトＨｅｐＢ３研究Ｃ：
第３の研究では、ヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＢ３）をＳＣＩＤ／ベージュマウスの肝臓に直接注射し、２０日後に処置を開始した。群Ａの動物にはＰＢＳを投与し、群Ｂの動物には４ｍｇ／ｋｇのＬｕｃ−１９５５  ＳＮＡＬＰを投与し、群Ｃの動物には４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与し、群Ｄの動物には、２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与し、群Ｅの動物には１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与した。処置には単回の静脈内（ｉｖ）用量を用い、２４時間後にマウスを殺処理した。
【０２８７】
腫瘍量および標的の発現停止を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によってアッセイした。また、腫瘍スコアを上記のように目視で測定し、その結果を以下の表に示す。図８に示されるｈＧＡＰＤＨレベルは、以下の表に示される巨視的腫瘍スコアと相関する。
【０２８８】
表１２．
【表１２】
2015177801.tif 000058
スコア：「＋」＝不定の腫瘍取り込み／幾つかの小さな腫瘍、「＋＋」＝肝葉から突出する個別的な腫瘍小結節、「＋＋＋」＝肝葉の両側に突出する大きな腫瘍。
【０２８９】
ヒト（腫瘍由来）ＫＳＰの発現停止をＴａｑｍａｎ分析によってアッセイし、結果を図１０に示す。ｈＫＳＰ発現は、ｈＧＡＰＤＨに基準化した。約８０％の腫瘍のＫＳＰの発現停止が、４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰで観察され、有効性は１ｍｇ／ｋｇで明白であった。図９の透明のバーは、小さな（低ＧＡＰＤＨ）腫瘍からの結果を表す。
【０２９０】
ヒト（腫瘍由来）ＶＥＧＦの発現停止をＴａｑｍａｎ分析によってアッセイし、結果を図１０に示す。ｈＶＥＧＦ発現は、ｈＧＡＰＤＨに基準化した。約６０％の腫瘍のＶＥＧＦの発現停止が、４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰで観察され、有効性は１ｍｇ／ｋｇで明白であった。図１０の透明のバーは、小さな（低ＧＡＰＤＨ）腫瘍からの結果を表す。
【０２９１】
マウス（肝臓由来）ＶＥＧＦの発現停止をＴａｑｍａｎ分析によってアッセイし、結果を図１１Ａに示す。ｍＶＥＧＦ発現は、ｈＧＡＰＤＨに基準化した。約５０％の肝臓のＶＥＧＦの発現停止が、４ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰで観察され、有効性は１ｍｇ／ｋｇで明白であった。
【０２９２】
ヒトＨｅｐＢ３研究Ｄ：各ｄｓＲＮＡの腫瘍成長への寄与
第４の研究では、ヒトＨＣＣ細胞（ＨｅｐＢ３）をＳＣＩＤ／ベージュマウスの肝臓に直接注射し、８日後に処置を開始した。処置には、週２回、合計６用量の静脈内（ｉｖ）ボーラス注射を用いた。最後の用量は、２５日目に投与され、最終エンドポイントは２７日目であった。
【０２９３】
腫瘍量を、巨視的組織学、ヒト特異的ｍＲＮＡ分析（ｈＧＡＰＤＨ  ｑＰＣＲ）、および血中アルファフェトプロテインレベル（ＥＬＩＳＡによる血清ＡＦＰ）によってアッセイした。
【０２９４】
研究１では、群ＡをＰＢＳで処理し、群ＢをＳＮＡＬＰ−ＫＳＰ＋Ｌｕｃ（３ｍｇ／ｋｇ）で処理し、群ＣをＳＮＡＬＰ−ＶＥＧＦ＋Ｌｕｃ（３ｍｇ／ｋｇ）で処理し、群ＤをＡＬＮ−ＶＳＰ０２（３ｍｇ／ｋｇ）で処理した。
【０２９５】
研究２では、群ＡをＰＢＳで処理し、群ＢをＳＮＡＬＰ−ＫＳＰ＋Ｌｕｃ（１ｍｇ／ｋｇ）で処理し、群ＣをＡＬＮ−ＶＳＰ０２（１ｍｇ／ｋｇ）で処理した。
【０２９６】
ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルおよび血清ＡＦＰレベルの両方が、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２での処置後に低下することが示された（図１１Ｂ）。
【０２９７】
組織学研究：
肝内播種によって、ヒト肝癌Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍をマウス内に確立した。ＳＮＡＬＰ処置は、腫瘍の播種から２０日後に開始した。腫瘍担持マウス（群当たり３匹）を、２ｍｇ／ｋｇの総ｓｉＲＮＡの（ｉ）ＶＳＰ  ＳＮＡＬＰ、または（ｉｉ）対照（Ｌｕｃ）ＳＮＡＬＰの単回静脈（ＩＶ）用量で処置した。
【０２９８】
肝臓／腫瘍試料を、単回ＳＮＡＬＰ投与の２４時間後、従来のＨＥ組織学用に収集した。
【０２９９】
大きな巨視的腫瘍小結節（５〜１０ｍｍ）が、剖検において明白であった。
【０３００】
Ｈｅｐ３ＢマウスにおけるＡＬＮ−ＶＳＰの効果：
ＡＬＮ−ＶＳＰ（ＫＳＰ  ｄｓＲＮＡとＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡとのカクテル）処置は、腫瘍由来のＫＳＰおよびＶＥＧＦの腫瘍量および発現を低下させた。腫瘍量の尺度である、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルも、ＡＬＮ−ＶＳＰ  ｄｓＲＮＡの投与後下降することが観察された（図１２Ａ〜１２Ｃを参照）。目視での巨視的観察による腫瘍量の減少も、ＡＬＮ−ＶＳＰの投与後明白であった。
【０３０１】
ＡＬＮ−ＶＳＰの単回ＩＶボーラス注射も、有糸分裂紡錘体の形成をもたらし、これは、Ｈｅｐ３Ｂマウスからの肝臓組織試料中ではっきりと検出された。この観察は、細胞周期の停止を示した。
【０３０２】
実施例７．ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ処置動物に対するＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物の生存
癌対象の生存率に対するｓｉＲＮＡ  ＳＮＡＬＰの効果を試験するために、マウスの肝内播種によって腫瘍を確立し、マウスをＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡで処置した。これらの研究は、ＫＳＰ／Ｅｇ５およびＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡを含有する、ＶＳＰ  ｓｉＲＮＡカクテルを利用した。対照は、ｄｓＲＮＡを標的とするＬｕｃであった。このｓｉＲＮＡカクテルをＳＮＡＬＰに製剤化した。
【０３０３】
腫瘍細胞（ヒト肝癌Ｈｅｐ３Ｂ、１ｘ１０＾６）を、ＳＣＩＤ／ベージュマウスの左側葉に直接注射した。これらのマウスは、免疫介在性抗腫瘍効果に対する最低限の範囲である、リンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠失していた。切り込みを縫合によって閉じ、マウスを２〜５時間回復させた。マウスは４８〜７２時間以内に完全に回復した。
【０３０４】
全てのマウスが総ｓｉＲＮＡ／脂質静脈内（ｉｖ）用量を与えられ、本来のクエン酸塩緩衝液条件を使用して、各カクテルを１：５７  ｃＤＭＡ  ＳＮＡＬＰ（１．４％  ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、５７．１％  ＤＬｉｎＤＭＡ、７．１％  ＤＰＰＣ、および３４．３％コレステロール）、６：１の脂質：薬物に製剤化した。
【０３０５】
ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰ処置は、腫瘍の播種後、以下に示す日（１８日目または２６日目）に開始した。ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰは、１８日目または２６日目から３週間の間、週に２回、４ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。生存を監視し、動物は、ヒト代替エンドポイント（例えば、動物の体重、腹部膨満／変色、および全般的な健康）に基づいて、安楽死させた。
【０３０６】
腫瘍の播種後１８日目に開始した処置に関する生存データを、表１３、表１４、および図１３Ａにまとめる。
【０３０７】
表１３．Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ（生存）データ（生存の％）
【表１３−１】
2015177801.tif 000059
【表１３−２】
2015177801.tif 000060
【０３０８】
表１４．各動物につての生存日数。
【表１４−１】
2015177801.tif 000061
【表１４−２】
2015177801.tif 000062
【０３０９】
図１３Ａは、腫瘍の播種後の日数と対比した、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物およびＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ処置動物の平均生存率を示す。ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物の平均生存率は、ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ処置動物に対して約１５日延びた。
【０３１０】
表１５．処置前および処置の終了時の各動物の血清アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）濃度（μｇ／ｍｌでの濃度）
【表１５−１】
2015177801.tif 000063
【０３１１】
実験の経過中、血清ＡＦＰレベルを使用して腫瘍量を監視した。アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）は、胎児期の間に卵黄嚢および肝臓によって生成される主要な血漿タンパク質である。該タンパク質は、血清アルブミンの胎児対応物であると考えられており、ヒトＡＦＰおよびアルブミン遺伝子は、第４染色体上で同一転写方向に直列に存在する。ＡＦＰは、単量体型、ならびに二量体および三量体型で認められ、銅、ニッケル、脂肪酸、およびビリルビンに結合する。ＡＦＰレベルは、出生後徐々に低下し、８〜１２ヶ月で成人レベルに達する。正常成人のＡＦＰレベルは、低いが検出可能である。正常成人におけるＡＦＰの機能は知られておらず、成人におけるＡＦＰの発現は、しばしば肝癌および奇形腫等の一部の腫瘍と関連する。ＡＦＰは、精巣癌、卵巣癌、および悪性奇形腫を監視するために使用される腫瘍マーカーである。ＡＦＰを分泌する主な腫瘍には、内胚葉洞腫瘍（卵黄嚢癌）、神経芽細胞腫、肝芽腫、および肝細胞癌が含まれる。ＡＦＰを分泌する腫瘍を有する患者において、ＡＦＰの血清レベルは、しばしば腫瘍の大きさと相関する。血清レベルは、処置に対する応答の評価に有用である。典型的には、ＡＦＰレベルが処置後に低下すれば、腫瘍は成長していない。化学療法の直後のＡＦＰの一時的な増加は、腫瘍が成長しているのではなく、むしろ縮小している（そして腫瘍細胞が死ぬに従って、ＡＦＰを放出している）ことを示す場合がある。切除は、通常血清レベルの低下と関連する。図１４に示すように、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ処置動物の腫瘍量は、有意に減少した。
【０３１２】
埋め込み後２６、２９、３２、３５、３９、および４２日目に、ＳＮＡＬＰ−ｓｉＲＮＡ処置を用いて実験を繰り返した。そのデータを図１３Ｂに示す。ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ動物の平均生存率は、約１９日、すなわち３８％、ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ処置動物に対して約１５日延びた。
【０３１３】
実施例８．確立された腫瘍中での単星（Ｍｏｎｏ−ａｓｔｅｒ）の誘発
ＫＳＰの細胞分割の阻害は、組織切片中で容易に観察可能な単星の形成に通じる。ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ処置腫瘍中に単星形成が生じたかどうかを判定するために、腫瘍担持動物（Ｈｅｐ３Ｂ細胞の埋め込みの３週間後）に、尾静脈注射を介して２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−ＶＳＰを投与した。対照動物には、２ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃが与えられた。２４時間後、動物を殺処理し、腫瘍を担持する肝葉を組織学的分析用に処理した。ＨＥ染色した組織切片の典型的な画像を図１５に示す。広範な単星形成が、ＡＬＮ  ＶＳＰ０２処置（Ａ）腫瘍では明白であるが、ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃ処置（Ｂ）腫瘍では明白でない。後者では、正常な有糸分裂像が明白であった。単星の生成は、ＫＳＰ阻害に特有の特徴であり、ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰが、確立された肝臓腫瘍中で有意な活性を有することのさらなる根拠を提供する。
【０３１４】
実施例９．ＡＬＮ−ＶＳＰ０２（ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ）の製造過程および製品仕様
ＡＬＮ−ＶＳＰ０２製品は、注入を介するＩＶ投与用の滅菌脂質粒子製剤（ＳＮＡＬＰと称される）に製剤化された、２ｍｇ／ｍＬの原体ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１を含有する。原体ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１は、等モル比の２つのｓｉＲＮＡ（ＫＳＰを標的とするＡＬＮ−１２１１５およびＶＥＧＦを標的とするＡＬＮ−３１３３）からなる。該薬品は、１０ｍＬのガラス製バイアル中に５ｍＬの充填容積でパッケージ化される。
【０３１５】
本明細書では、以下の用語が使用される。
【表１５−２】
2015177801.tif 000064
*代替名称＝ＡＤ−１２１１５、ＡＤ１２１１５、＊＊代替名称＝ＡＤ−３１３３、ＡＤ３１３３
【０３１６】
９．１  原体ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１の調製
原体ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１の２つのｓｉＲＮＡ構成成分である、ＡＬＮ−１２１１５およびＡＬＮ−３１３３を、市販の合成機および原料を使用して化学的に合成する。製造過程は、ホスホラミダイト化学反応および５’Ｏジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基を使用し、２’ヒドロキシルをｔｅｒｔブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）で保護するか、または２’ヒドロキシルを２’メトキシ基（２’ＯＭｅ）で置換する、従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって、各二重鎖の２つの単鎖オリゴヌクレオチド（ＡＬＮ  １２１１５のＡ  １９５６２センスおよびＡ  １９５６３アンチセンス、ならびにＡＬＮ  ３１３３のＡ  ３９８１センスおよびＡ  ３９８２アンチセンス）を合成するステップからなる。制御細孔ガラスまたはポリスチレン等の固体支持体上でのホスホラミダイト法による、オリゴヌクレオチド鎖の構築。この周期は、５’脱保護、カップリング、酸化、およびキャップ形成からなる。それぞれのカップリング反応は、５（エチルチオ）１Ｈテトラゾール試薬を使用した、適切に保護されたリボ、２’ＯＭｅ、またはデオキシリボヌクレオシドアミダイトの活性化、その後の固定化し保護された支持ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの遊離５’ヒドロキシル基のカップリングによって、行われる。適切な数の周期後、最後の５’保護基を酸処理によって除去する。粗オリゴヌクレオチドを、シアノエチル保護基、ならびに核酸塩基保護基を同時に除去しながら、メチルアミン水溶液処理によって固体支持体から切断する。次いで、試薬を含有するフッ化水素を使用して２’Ｏ  ＴＢＤＭＳ基を切断して、粗オリゴリボヌクレオチドを得、これを強力な陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して精製し、その後、限外濾過を使用して脱塩する。精製された単鎖を分析して、二重鎖にアニールする前に、正確な分子量、分子配列、不純物プロファイル、およびオリゴヌクレオチド含有量を確認する。アニールした二重鎖中間体、ＡＬＮ  １２１１５およびＡＬＮ  ３１３３を、凍結乾燥して２０℃で保管するか、または１：１のモル比に混合し、該溶液を凍結乾燥して原体ＡＬＮ  ＶＳＰＤＳ０１を得るかのうちのいずれかを行う。二重鎖中間体を乾燥粉末として保管する場合は、混合前に水に再溶解する。等モル比は、ＨＰＬＣ法によって混合過程を監視することによって達成される。
【０３１７】
製造過程の流れ図を図１６に示す。
【０３１８】
仕様例を表１６ａに示す。
【０３１９】
ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１原体の最高１２ヶ月の安定試験の結果を、表１６ｃに示す。アッセイ方法は、物理的性質（外観、ｐＨ、水分）、純度（ＳＥＣおよび変性陰イオン交換クロマトグラフィーにより）、および効力（変性陰イオン交換クロマトグラフィー［ＡＸ−ＨＰＬＣ］により）を評価するように選択された。
【０３２０】
表１６ａ．ＡＬＮ−ＶＳＰＤＳ０１の仕様例
【表１６−１】
2015177801.tif 000065
【０３２１】
表１６ｂ：原体の安定性
【表１６−２】
2015177801.tif 000066
【０３２２】
９．２  薬品ＡＬＮ−ＶＳＰ０２（ＳＮＡＬＰ−ＶＳＰ）の調製
ＡＬＮ  ＶＳＰ０２は、２つのｓｉＲＮＡ（１：１のモル比の）と、等張緩衝液中の脂質賦形剤との滅菌製剤である。脂質賦形剤は、２つのｓｉＲＮＡと会合し、循環系での分解からそれらを保護し、標的組織へのそれらの送達を補助する。特定の脂質賦形剤およびそれぞれの定量的割合（表１７に示す）を、物理化学的性質、安定性、薬力学、毒性、および多数の異なる製剤の製品製造可能性を比較する反復的な一連の実験を通じて選択した。賦形剤ＤＬｉｎＤＭＡは、哺乳類細胞のエンドソーム中で認められように、低ｐＨで正に荷電されるが、全血のより中性のｐＨでは比較的荷電されない、滴定可能なアミノ脂質である。この特徴によって、低ｐＨで負に荷電したｓｉＲＮＡの効率的なカプセル化が容易になり、中空粒子の形成を阻止するが、なお、製剤緩衝液を使用前により中性の保存緩衝液と置き換えることによって、粒子荷電の調整（減少）が可能になる。粒子に物理化学的安定性を提供するために、コレステロールおよび中性脂質ＤＰＰＣを組み込む。ポリエチレングリコール脂質共役ＰＥＧ２０００  Ｃ  ＤＭＡは、薬品の安定性を補助し、使用案に最適な循環時間を提供する。ＡＬＮ  ＶＳＰ０２脂質粒子は、低い多分散値の、約８０〜９０ｎｍの平均直径を有する。典型的なクライオ透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ）の画像を図１７に示す。中性ｐＨでは、粒子は６ｍＶ未満のゼータ電位値を有し、本質的に荷電されていない。製造過程に基づく中空（取り込まれていない）粒子の証拠はない。
【０３２３】
表１７：ＡＬＮ−ＶＳＰ０２の定量的組成
【表１７】
2015177801.tif 000067
*  薬品中の２つのｓｉＲＮＡの１：１のモル比を、薬品粒子の粒経分布全体に維持する。
【０３２４】
脂質の溶液（エタノール中）およびＡＬＮ  ＶＳＰＤＳ０１原体（水性緩衝液中）を混合して希釈し、約８０〜９０ｎｍの平均粒経を有するｓｉＲＮＡ脂質粒子のコロイド分散液を形成する。次いで、この分散液を、０．４５／０．２μｍのフィルタを通して濾過し、濃縮し、接線流濾過で透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）した。製造過程中の試験および２．０ｍｇ／ｍＬへの濃度調整後、製品を滅菌濾過し、ガラス製バイアルに無菌充填し、栓をし、キャップをして、５±３℃に静置する。エタノールおよび全ての水性緩衝液の構成成分はＵＳＰ等級であり、使用された全ての水は、ＵＳＰの注射用蒸留水等級である。典型的なＡＬＮ−ＶＳＰ０２の過程を、図１８に流れ図で示す。
【０３２５】
表１８ａ：ＡＬＮ−ＶＳＰ０２仕様例
【表１８−１】
2015177801.tif 000068
【表１８−２】
2015177801.tif 000069
【０３２６】
９．４  容器／閉鎖システム
ＡＬＮ  ＶＳＰ０２薬品を、５ｍＬの充填容積で１０ｍＬのガラス製バイアル中にパッケージ化する。容器の閉鎖システムは、ＵＳＰ／ＥＰのＩ型ホウケイ酸塩ガラスバイアル、テフロン表面加工ブチルゴム栓、およびアルミニウム製フリップオフキャップからなる。該薬品は、５±３℃で保管される。
【０３２７】
９．５  薬品ＡＬＮ−ＶＳＰ０２の安定性
安定性データ（２５℃／６０％ＲＨ）を表１８ｂおよび１８ｃに示す。
【０３２８】
表１８ｂ：保管条件でのＡＬＮ−ＶＳＰ０２安定性例
【表１８−３】
2015177801.tif 000070
【表１８−４】
2015177801.tif 000071
【表１８−５】
2015177801.tif 000072
【０３２９】
表１８ｃ：２５℃／周囲湿度でのＡＬＮ−ＶＳＰ０２の安定性例
【表１８−６】
2015177801.tif 000073
【表１８−７】
2015177801.tif 000074
【表１８−８】
2015177801.tif 000075
【表１８−９】
2015177801.tif 000076
【０３３０】
実施例１０．ヒト癌細胞系におけるＡＬＮ−ＶＳＰ０２のインビトロ有効性
ヒト癌細胞系におけるＡＬＮ−ＶＳＰ０２処置の有効性を、ＫＳＰ  ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ、および処置後の細胞生存率の測定によって決定した。各細胞系中のＫＳＰおよびＶＥＧＦについて、ＩＣ５０（ｎＭ）値を決定した。
【０３３１】
表１９：細胞系
【表１９−１】
2015177801.tif 000077
【表１９−２】
2015177801.tif 000078
【０３３２】
１日目に完全培地中に、２日目に７０％の密度に達するように、細胞を９６ウェルプレートに蒔いた。２日目、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ血清減少培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：１１０５８−０２１）と交換し、細胞に、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２または対照ＳＮＡＬＰ−Ｌｕｃのいずれかを、１．８μＭで開始し、１０ｐＭに至るまでの濃度範囲で形質移入した。６時間後、培地を完全培地に変えた。各実験について、各細胞系に対して３つのプレートを複製した。
【０３３３】
形質移入の２４時間後に細胞を収集した。ＫＳＰレベルはｂＤＮＡを使用して測定し、ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルは、ヒトＴａｑＭａｎアッセイを使用して測定した。
【０３３４】
生存率は、製造業者の推奨に従って、４８および／または７２時間後にＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号：Ｇ８０８０）を使用して測定した。
【０３３５】
表２０に示すように、ＶＳＰ０２のｎＭ濃度は、複数のヒト細胞系におけるＫＳＰおよびＶＥＧＦの両方の発現の低下に効果的である。処置細胞の生存率は、
表２０：結果
【表２０−１】
2015177801.tif 000079
【表２０−２】
2015177801.tif 000080
【０３３６】
実施例１１．確立されたＨｅｐ３Ｂ肝内腫瘍における、ソラフェニブに対するＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの抗腫瘍有効性
確立されたＨｅｐ３Ｂ肝内腫瘍を担持するＳＣＩＤ／ベージュマウスにおいて、ソラフェニブに対する反復投与のＶＳＰ  ＳＮＡＬＰの抗腫瘍効果について研究した。ソラフェニブは、肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置用に承認された、タンパク質キナーゼの小分子阻害剤である。
【０３３７】
本明細書に記載の通り、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおける肝内播種によって、腫瘍を確立した。処置は、播種の１１日後に開始した。マウスに、ソラフェニブおよび対照ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰ、ソラフェニブおよびＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰ、またはＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰのみを処置した。対照マウスには、緩衝液のみ（ソラフェニブの代わりにＤＭＳＯ、およびｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰの代わりにＰＢＳ）を処置した。ソラフェニブは、月曜日から金曜日まで３週間の間、体重に従って１５ｍｇ／ｋｇを合計１５回の注射で腹腔内に投与した。ソラフェニブは、ＳＮＡＬＰの注射後、最低１時間投与した。ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰは、３週間の間（合計６用量）、１、４、７、１０、１４、および１７日目に、直前に記録された体重（１０ｍｌ／ｋｇ）に基づく３ｍｇ／ｋｇに従って、側部尾静脈を介して投与した。
【０３３８】
段階的な体重の減少、ならびに病態、腹部膨満／変色、および運動性を含む臨床的兆候を含む、腫瘍量の評価に基づいて、マウスを安楽死させた。
【０３３９】
生存率のデータを図２０に示す。ソラフェニブまたはＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰのみの投与と比較して、ＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰとソラフェニブとの同時投与によって、生存割合が増加した。ソラフェニブと比較して、ＶＳＰ  ｓｉＲＮＡ−ＳＮＡＬＰによって生存割合が増加した。
【０３４０】
実施例１２．ＡＤ−１２１１５およびＡＤ−３１３３の変異体を使用したＶＳＰのインビトロ有効性
Ｅｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦを標的とした２セットの二重鎖を設計し、合成した。各セットは、ＡＤ−１２１１５およびＡＤ−３１３３のいずれかの標的部位の各方向に１０個のヌクレオチドを並べた二重鎖を含む。
【０３４１】
各二重鎖の標的、センス鎖、およびアンチセンス鎖の配列を、以下の表に示す。
【０３４２】
本明細書に記載されるアッセイを使用して、発現の阻害について各二重鎖をアッセイする。該二重鎖は、単独で、および／または組み合わせて、例えば、Ｅｇ５／ＫＳＰ  ｄｓＲＮＡをＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡと組み合わせて投与される。幾つかの実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、本明細書に記載されるＳＮＡＬＰ製剤中で投与される。
【０３４３】
表２１：  ＶＥＧＦおよびＥｇ５／ＫＳＰを標的とするｄｓＲＮＡの配列（タイリング）
【表２１−１】
2015177801.tif 000081
【表２１−２】
2015177801.tif 000082
【表２１−３】
2015177801.tif 000083
【表２１−４】
2015177801.tif 000084
【０３４４】
実施例１３．単一平滑末端を有するＶＥＧＦを標的とするｄｓＲＮＡ
ＶＥＧＦを標的とした二重鎖のセットを設計し、合成した。セットは、ＡＤ−３１３３の標的部位の各方向に１０個のヌクレオチドを並べた二重鎖を含む。各二重鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に対応する末端に２塩基のオーバーハングを含み、アンチセンス鎖の５’末端に対応する末端にはオーバーハングがなく、例えば平滑末端である。
【０３４５】
これらの二重鎖のそれぞれの鎖の配列を、以下の表に示す。
【０３４６】
本明細書に記載されるアッセイを使用して、発現の阻害について各二重鎖をアッセイする。ＶＥＧＦ二重鎖は、単独で、および／またはＥｇ５／ＫＳＰ  ｄｓＲＮＡ（例えば、ＡＤ−１２１１５）と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、本明細書に記載されるＳＮＡＬＰ製剤中で投与される。
【０３４７】
表２２：ＶＥＧＦを標的とした平滑末端ｄｓＲＮＡの標的配列
【表２２】
2015177801.tif 000085
【０３４８】
表２３：ＶＥＧＦを標的とした平滑末端ｄｓＲＮＡの鎖配列
【表２３】
2015177801.tif 000086
【０３４９】
実施例１４．ヒトにおけるＥｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦ発現の阻害
ヒト対象に、Ｅｇ５／ＫＳＰおよびＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害するために、Ｅｇ５／ＫＳＰ遺伝子を標的とするＳＮＡＬＰに製剤化したｄｓＲＮＡ、およびＶＥＧＦ遺伝子を標的とするＳＮＡＬＰに製剤化したｄｓＲＮＡの両方を有する医薬組成物、例えば、ＡＬＮＶＳＰ０２を投与する。
【０３５０】
処置を必要とする対象を選択または同定する。対象は、癌、例えば、肝臓癌の処置を必要としていてもよい。
【０３５１】
ゼロ時点で、好適な第１の用量の組成物を対象に皮下投与する。組成物は、本明細書に記載の通り製剤化する。しばらくしてから、例えば、腫瘍成長の測定、血清ＡＦＰレベルの測定等によって、対象の病態を評価する。この測定には、前記対象におけるＥｇ５／ＫＳＰおよび／もしくはＶＥＧＦの発現、ならびに／またはＥｇ５／ＫＳＰおよび／もしくはＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの成功したｓｉＲＮＡ標的の産物の測定を伴ってもよい。また、他の関連する基準を測定してもよい。用量の回数および強度は、対象の必要性に従って調整する。
【０３５２】
処置後、対象の病態を、処置前に既存の病態と、または同様に罹患するが、無処置である対象の病態と比較する。
【０３５３】
当業者は、以下に添付する特許請求の完全な範囲において本発明を実践することを可能にする本開示内に具体的に記載されたものに加えて、方法および組成物に精通する。
【図１】
2015177801.tif 000087
【図２Ａ】
2015177801.tif 000088
【図２Ｂ】
2015177801.tif 000089
【図２Ｃ】
2015177801.tif 000090
【図２Ｄ】
2015177801.tif 000091
【図３】
2015177801.tif 000092
【図４】
2015177801.tif 000093
【図５】
2015177801.tif 000094
【図６】
2015177801.tif 000095
【図７Ａ】
2015177801.tif 000096
【図７Ｂ】
2015177801.tif 000097
【図８】
2015177801.tif 000098
【図９】
2015177801.tif 000099
【図１０】
2015177801.tif 000100
【図１１Ａ】
2015177801.tif 000101
【図１１Ｂ】
2015177801.tif 000102
【図１２Ａ】
2015177801.tif 000103
【図１２Ｂ】
2015177801.tif 000104
【図１２Ｃ】
2015177801.tif 000105
【図１３Ａ】
2015177801.tif 000106
【図１３Ｂ】
2015177801.tif 000107
【図１４】
2015177801.tif 000108
【図１５】
2015177801.tif 000109
【図１６】
2015177801.tif 000110
【図１７】
2015177801.tif 000111
【図１８】
2015177801.tif 000112
【図１９】
2015177801.tif 000113
【図２０】
2015177801.tif 000114
【配列表】
2015177801000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月8日(2015.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に本明細書に記載され、実施例および図面を参照して説明される発明。
【外国語明細書】
【０００１】
2015177801.tif 000115
2015177801.tif 000116
2015177801.tif 000117
2015177801.tif 000118
2015177801.tif 000119
2015177801.tif 000120
2015177801.tif 000121
2015177801.tif 000122
2015177801.tif 000123
2015177801.tif 000124
2015177801.tif 000125
2015177801.tif 000126
2015177801.tif 000127
2015177801.tif 000128
2015177801.tif 000129
2015177801.tif 000130
2015177801.tif 000131
2015177801.tif 000132
2015177801.tif 000133
2015177801.tif 000134
【０００２】
2015177801.tif 000135
2015177801.tif 000136
2015177801.tif 000137
2015177801.tif 000138
2015177801.tif 000139
2015177801.tif 000140
2015177801.tif 000141
2015177801.tif 000142
2015177801.tif 000143
2015177801.tif 000144
2015177801.tif 000145
2015177801.tif 000146
2015177801.tif 000147
2015177801.tif 000148
2015177801.tif 000149
2015177801.tif 000150
2015177801.tif 000151
2015177801.tif 000152
2015177801.tif 000153
2015177801.tif 000154
【０００３】
2015177801.tif 000155
2015177801.tif 000156
2015177801.tif 000157
2015177801.tif 000158
2015177801.tif 000159
2015177801.tif 000160
2015177801.tif 000161
2015177801.tif 000162
2015177801.tif 000163
2015177801.tif 000164
2015177801.tif 000165
2015177801.tif 000166
2015177801.tif 000167
2015177801.tif 000168
2015177801.tif 000169
2015177801.tif 000170
2015177801.tif 000171
2015177801.tif 000172
2015177801.tif 000173
2015177801.tif 000174
【０００４】
2015177801.tif 000175
2015177801.tif 000176
2015177801.tif 000177
2015177801.tif 000178
2015177801.tif 000179
2015177801.tif 000180
2015177801.tif 000181
2015177801.tif 000182
2015177801.tif 000183
2015177801.tif 000184
2015177801.tif 000185
2015177801.tif 000186
2015177801.tif 000187
2015177801.tif 000188
2015177801.tif 000189
2015177801.tif 000190
2015177801.tif 000191
2015177801.tif 000192
2015177801.tif 000193
2015177801.tif 000194
【０００５】
2015177801.tif 000195
2015177801.tif 000196
2015177801.tif 000197
2015177801.tif 000198
2015177801.tif 000199
2015177801.tif 000200
2015177801.tif 000201
2015177801.tif 000202
2015177801.tif 000203
2015177801.tif 000204
2015177801.tif 000205
2015177801.tif 000206
2015177801.tif 000207
2015177801.tif 000208
2015177801.tif 000209
2015177801.tif 000210
2015177801.tif 000211
2015177801.tif 000212
2015177801.tif 000213
2015177801.tif 000214
【０００６】
2015177801.tif 000215
2015177801.tif 000216
2015177801.tif 000217
2015177801.tif 000218
2015177801.tif 000219
2015177801.tif 000220
2015177801.tif 000221
2015177801.tif 000222
2015177801.tif 000223
2015177801.tif 000224
2015177801.tif 000225
2015177801.tif 000226
2015177801.tif 000227
2015177801.tif 000228
2015177801.tif 000229
2015177801.tif 000230
2015177801.tif 000231
2015177801.tif 000232
2015177801.tif 000233
2015177801.tif 000234
【０００７】
2015177801.tif 000235
2015177801.tif 000236
2015177801.tif 000237
2015177801.tif 000238
2015177801.tif 000239
2015177801.tif 000240
2015177801.tif 000241
2015177801.tif 000242
2015177801.tif 000243
2015177801.tif 000244
2015177801.tif 000245
2015177801.tif 000246
2015177801.tif 000247
2015177801.tif 000248
2015177801.tif 000249
2015177801.tif 000250
2015177801.tif 000251
2015177801.tif 000252
2015177801.tif 000253
2015177801.tif 000254
2015177801.tif 000255
2015177801.tif 000256
2015177801.tif 000257
2015177801.tif 000258
2015177801.tif 000259
2015177801.tif 000260
2015177801.tif 000261
2015177801.tif 000262
2015177801.tif 000263
2015177801.tif 000264
2015177801.tif 000265
2015177801.tif 000266
2015177801.tif 000267
2015177801.tif 000268
2015177801.tif 000269
【配列表】
2015177801000002.app