(57)【要約】【課題】本発明は比活性の高いカタラーゼタンパク質を製造することを解決課題とする。【解決手段】本発明では、アウランチオキトリウム属、シゾキトリウム属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属、トラウストキトリウム属、パリエチキトリウム属、ボツリオキトリウム属、シソイドキトリウム属、アルトルニア属、ジャポノキトリウム属、又はアプラノキトリウム属に属する微生物から選択される少なくとも1種を培養することにより、カタラーゼ活性の比活性が高いタンパク質を製造する。【選択図】図3
2015149912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アウランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属、シゾキトリウム(Schizochytrium)属、ウルケニア(Ulkenia)属、オブロンギキトリウム(Oblongichytrium)属、トラウストキトリウム(Thraustochytrium)属、パリエチキトリウム(Parietichytrium)属、ボツリオキトリウム(Botryochytrium)属、シソイドキトリウム(Sicyoidochytrium)属、アルトルニア(Althornia)属、ジャポノキトリウム(Japonochytrium)属、又はアプラノキトリウム(Aplanochytrium)属に属する微生物から選択される少なくとも1種を培養し、該微生物にカタラーゼ活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を含む、カタラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記微生物が、アウランチオキトリウム・リマシナム(Aurantiochytrium limacinum)、シゾキトリウム・アグレガタム(Schizochytrium aggregatum)、トラウストキトリウム・ロゼウム(Thraustochytrium roseum)、トラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)、又はトラウストキトリウム・ストリアタム(Thraustochytrium striatum)に属する微生物から選択される少なくとも1種である、請求項1の方法。
【請求項３】
前記微生物が、アウランチオキトリウム・リマシナム SR21 ATCC MYA-1381(Aurantiochytrium limacinum SR21 ATCC MYA-1381)株、アウランチオキトリウム・リマシナム mh0186(Aurantiochytrium limacinum mh0186)株(FERM P-19755)、アウランチオキトリウム sp. ATCC26185(Aurantiochytrium sp. ATCC26185)株、アウランチオキトリウム sp. ATCC20888(Aurantiochytrium sp. ATCC20888)株、シゾキトリウム・アグレガタム ATCC28209(Schizochytrium aggregatum ATCC28209)株、トラウストキトリウム・ロゼウム ATCC28210(Thraustochytrium roseum ATCC28210)株、トラウストキトリウム・アウレウム ATCC34304(Thraustochytrium aureum ATCC34304)株、トラウストキトリウム・ストリアタム ATCC24473(Thraustochytrium striatum ATCC24473)株、及びウルケニア sp. ATCC28207(Ulkenia sp. ATCC28207)株から選択される少なくとも1種である、請求項1の方法。
【請求項４】
前記培養工程が、過酸化水素を含有する培地を用いて前記微生物を培養する工程である、請求項1〜3のいずれか1項の方法。
【請求項５】
前記培養工程は、前記微生物を培養して遊走細胞を出現させることを含み、
前記方法は更に
出現した前記遊走細胞を回収する遊走細胞回収工程と、
回収された前記遊走細胞からカタラーゼ活性を有するタンパク質を回収するタンパク質回収工程とを含む、請求項1〜4のいずれか1項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来する、カタラーゼ活性を有するタンパク質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カタラーゼとは、過酸化水素を酸素と水とに分解する反応を触媒する酵素であり、産業的に幅広く利用されている。
【０００３】
産業用のカタラーゼの生産方法としては、マイクロコッカス（Micrococcus）属等の細菌又はアスペルギルス（Aspergillus）属等の真菌であるカタラーゼ生産微生物を用いて生産する方法が知られている（特許文献1、2）。
【０００４】
一方、海洋性真核微生物であるヤブレツボカビ類は、細胞内に著量の油脂を蓄積することが知られている。ヤブレツボカビ類が蓄積する油脂には、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸が高濃度で含まれる（特許文献3）。従来、ヤブレツボカビ類のカタラーゼ産生能については検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平9-47285号公報
【特許文献２】特開2006-304786号公報
【特許文献３】特開2005-287380号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物を用いてカタラーゼを製造する場合、微生物体内で生産されたカタラーゼを微生物体から抽出し分離する必要がある。Micrococcus属細菌は菌体が硬く破砕が容易でないため、菌体内で生産されたカタラーゼを効率的に抽出し分離することが困難である。また、従来の細菌または真菌由来のカタラーゼは比活性（タンパク質単位重量あたりの酵素活性）が十分に高いとは言えず、より高比活性のカタラーゼが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヤブレツボカビ類に分類される微生物、すなわち、アウランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属、シゾキトリウム(Schizochytrium)属、ウルケニア(Ulkenia)属、オブロンギキトリウム(Oblongichytrium)属、トラウストキトリウム(Thraustochytrium)属、パリエチキトリウム(Parietichytrium)属、ボツリオキトリウム(Botryochytrium)属、シソイドキトリウム(Sicyoidochytrium)属、アルトルニア(Althornia)属、ジャポノキトリウム(Japonochytrium)属、又はアプラノキトリウム(Aplanochytrium)属に属する微生物から選択される少なくとも1種を培養することにより、カタラーゼ活性の比活性が高いタンパク質を容易に製造できることを見出した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、カタラーゼ活性が高いタンパク質を効率的に製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株による過酸化水素の分解に伴い発生する酸素の気泡を示す写真である。
【図２】図2は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の培養時間と培養系中の乾燥菌体重量との関係を示す図である。
【図３】図3は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の培養時間とカタラーゼ活性との関係を示す図である。
【図４】図4は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の培養時間と培地中のグルコース濃度との関係を示す図である。
【図５】図5は、ヤブレツボカビ類に属する微生物の粗酵素抽出液のカタラーゼ活性を示す図である。
【図６】図6は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の培養時間と培養系中の乾燥菌体重量との関係を示す図である。
【図７】図7は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の培養時間と培養系中に残存するグルコース濃度との関係を示す図である。
【図８】図8は、過酸化水素添加時期が異なる3つの試験区における、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の粗酵素抽出液のカタラーゼ活性の経時変化を示す図である。
【図９】図9は、図8に示す3つの区のデータのうち、過酸化水素を培養開始36時間後に添加した区と、培養開始60時間後に添加した区でのデータのみを抜粋し、拡大して示す図である。
【図１０】図10は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株を500ml坂口フラスコ中で培養したときの、用いるGY液体培地の容量とカタラーゼ活性との関係を示す図である。
【図１１】図11は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株を500ml坂口フラスコ中で50mlまたは100mlのGY液体培地中で培養したときの、グルコース枯渇後のカタラーゼ活性の経時変化を示す図である。図中の矢印はグルコース枯渇時を示す。
【図１２】図12は、Aurantiochytrium limacinum mh0186株の栄養細胞と遊走細胞のカタラーゼ活性を示す図である。図12において、アスタリスクは統計的有意差を示す（Student-t test, P<0.05）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（カタラーゼ活性）
本発明においてカタラーゼ活性とは過酸化水素分解活性と同義である。カタラーゼ活性は、20℃で1分間に1.0μmolの過酸化水素を分解する活性を1単位とする。
【００１１】
（本発明に使用する微生物）
本発明のカタラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、アウランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属、シゾキトリウム(Schizochytrium)属、ウルケニア(Ulkenia)属、オブロンギキトリウム(Oblongichytrium)属、トラウストキトリウム(Thraustochytrium)属、パリエチキトリウム(Parietichytrium)属、ボツリオキトリウム(Botryochytrium)属、シソイドキトリウム(Sicyoidochytrium)属、アルトルニア(Althornia)属、ジャポノキトリウム(Japonochytrium)属、又はアプラノキトリウム(Aplanochytrium)属に属する少なくとも1種の微生物を培養し、該微生物にカタラーゼ活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本明細書では、前記微生物を「ヤブレツボカビ類」と称することがある。背景技術として説明した通りヤブレツボカビ類は高度不飽和脂肪酸を産生する海洋性真核微生物である。
【００１３】
ヤブレツボカビ類としては特に、Aurantiochytrium属、Schizochytrium属、Ulkenia属、Oblongichytrium属、Thraustochytrium属、Parietichytrium属、又はBotryochytrium属に属する少なくとも1種の微生物が好ましい。
【００１４】
Aurantiochytrium属に属する微生物としては、アウランチオキトリウム・リマシナム(Aurantiochytrium limacinum)に属する少なくとも1種が挙げられる。Aurantiochytrium属に属する微生物の具体的な株としては、Aurantiochytrium limacinum SR21 ATCC MYA-1381、Aurantiochytrium limacinum mh0186(受託番号FERM P-19755)、Aurantiochytrium sp. ATCC26185、又はAurantiochytrium sp. ATCC20888が好ましく用いられる。
【００１５】
Schizochytrium属に属する微生物としては、シゾキトリウム・アグレガタム(Schizochytrium aggregatum)に属する少なくとも1種が挙げられる。Schizochytrium属に属する微生物の具体的な株としては、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Schizochytrium sp. SEK210（受託番号NBRC 102615）、又はSchizochytrium sp. SEK345（受託番号NBRC 102616）が好ましく用いられる。
【００１６】
Ulkenia属に属する微生物としては、ウルケミア・アモエボイデア(Ulkenia amoeboidea) に属する少なくとも1種が挙げられる。Ulkenia属に属する微生物の具体的な株としては、Ulkenia amoeboidea SEK214（受託番号NBRC 104106）、又はUlkenia sp. ATCC28207が好ましく用いられる。
【００１７】
Thraustochytrium属に属する微生物としては、トラウストキトリウム・ロゼウム(Thraustochytrium roseum)、トラウストキトリウム・アウレウム(Thraustochytrium aureum)、又はトラウストキトリウム・ストリアタム(Thraustochytrium striatum) に属する少なくとも1種が挙げられる。Thraustochytrium属に属する微生物の具体的な株としては、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Thraustochytrium aureum ATCC34304、Thraustochytrium striatum ATCC24473、又はThraustochytrium striatum NE03が好ましく用いられる。
【００１８】
Parietichytrium属に属する微生物としては、パリエチキトリウム・サルカリアナム(Parietichytrium sarkarianum) に属する少なくとも1種が挙げられる。Parietichytrium属に属する微生物の具体的な株としては、Parietichytrium sarkarianum SEK351（受託番号NBRC 104108）、Parietichytrium sarkarianum SEK364（受託番号FERM BP-11298、受領番号FERM ABP-11298）、又はParietichytrium sp. SEK358(受託番号FERM BP-11405)が好ましく用いられる。
【００１９】
Botryochytrium属に属する微生物としては、ボツリオキトリウム・ラジアタム(Botryochytrium radiatum) に属する少なくとも1種が挙げられる。Botryochytrium属に属する微生物の具体的な株としてはBotryochytrium radiatum SEK353（受託番号NBRC 104107）が好ましく用いられる。
【００２０】
Oblongichytrium属に属する微生物の具体的な株としてはOblongichytrium sp. SEK347（受託番号NBRC 102618）が好ましく用いられる。
【００２１】
本発明に用いる微生物の範囲には、現在前記の属又は種に分類されることが明らかになっている微生物だけでなく、現在は他の属又は種に分類されている、或いは分類が明らかでないが、分子進化的には前記の属又は種のいずれかに分類されるべき微生物も含まれる。
【００２２】
上記の具体的な株のうち、Aurantiochytrium limacinum mh0186株は、特開2005-287380号公報において開示され、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第6）に受託番号FERM P-19755として平成16年3月29日に国内寄託されているSchizochytrium sp. M-8株と同一である。FERM P-19755の寄託当時にSchizochytrium属とされていた属が、Schizochytrium属、Aurantiochytrium属およびOblongichytrium属へと再編成された（Rinka Yokoyama, Daiske Honda (2007) MycoscienceTaxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov. Mycoscience, 48, 199-21）。Aurantiochytrium limacinum mh0186株は、特開2005-287380号公報に開示のSchizochytrium sp. M-8株の取得方法(ヤブレツボカビ科M-8株は以下のようにして取得した。まず、石垣島のマングローブ林で採取した海水・落葉を300ml三角フラスコに入れ、松花粉（ここでは宮崎市周辺海岸にて採取したものを用いた）を約0.05g添加した。室温にて1週間放置し、水面の松花粉を含むように海水を採取し、シャーレ中に調製したポテトデキストロース寒天培地上に0.1mlを塗布した。28℃で5日間培養し、クリーム色でつやのないコロニーをピックアップして新しい寒天培地上に塗布した。3日後、増殖した微生物を顕微鏡下で観察し、ラビリンチュラ類であることを細胞のサイズ、形態から判断してスラント培地に保存した。）にて入手可能である。
【００２３】
Aurantiochytrium limacinum SR21 ATCC MYA-1381、Aurantiochytrium sp. ATCC26185、Aurantiochytrium sp. ATCC20888、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Ulkenia sp. ATCC28207、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Thraustochytrium aureum ATCC34304、及びThraustochytrium striatum ATCC24473は、American Type Culture Collection（ATCC)から入手可能である。
【００２４】
Schizochytrium sp. SEK210（受託番号NBRC 102615）、Schizochytrium sp. SEK345（受託番号NBRC 102616）、Ulkenia amoeboidea SEK214（受託番号NBRC 104106）、Parietichytrium sarkarianum SEK351（受託番号NBRC 104108）、Botryochytrium radiatum SEK353（受託番号NBRC 104107）、及びOblongichytrium sp. SEK347（受託番号NBRC 102618）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されており、一般に入手可能である。
【００２５】
Parietichytrium sarkarianum SEK364（受託番号FERM BP-11298、受領番号FERM ABP-11298）、及びParietichytrium sp. SEK358(受託番号FERM BP-11405)は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、一般に入手可能である。
【００２６】
Thraustochytrium striatum NE03は本発明者らが鹿児島県の沿岸域にて分離したものである(参考文献：「新奇なアスタキサンチン生産性ラビリンチュラThraustochytrium sp.NE03」著者：長野直樹、田岡洋介、倉村智世、林 雅弘（宮崎大農） 資料名：マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集 巻：12th ページ：109、 発行年：2009年05月30日)。当該株は実施例に示す方法により入手可能である。
【００２７】
（微生物の培養）
本発明の方法は、前記微生物を培養し、微生物にカタラーゼ活性を有するタンパク質を生産させる培養工程を特徴とする。
【００２８】
培養工程では、ヤブレツボ類を培養するのに適した固定培地、液体培地等を培地として用いる。培地としては特に限定されないが、通常用いられる培地としては例えばGY培地（日本水産学会誌、68巻、5号、674-678（2002））、B1寒天平板培地（Appl. Microbiol. Biotechnol., 72, 1161-1169 (2006)）等が知られており、これらを適宜使用することができる。
【００２９】
培養工程における培養条件は特に限定されないが、典型的には、前記微生物を適当な培地を用いて1日〜2週間程度、好ましくは2〜12日間、より好ましくは3〜10日間、25〜35℃にて培養する。必要に応じて振とう条件下で培養を行う。培養中の明暗条件は特に限定されないが、通常は暗条件で行う。
【００３０】
グルコース等の炭素源を培養開始時に含む培地（開始時のグルコース等の炭素源濃度は典型的には10〜50g/L培地）を用いる場合、前記微生物は、培地中の炭素源を消費して増殖し、次第に培地中の炭素源が少なくなる（例えば炭素源濃度5g/L培地以下）と前記微生物体内においてカタラーゼ活性を有するタンパク質の量が増加する。すなわち、培養工程においては、前記微生物を、グルコース等の炭素源を培養開始時に10〜50g/Lの濃度で含む培地を用いて培養し、該培地中の炭素源濃度が5g/L以下になるまで培養を続けることにより、効率的にカタラーゼ活性を有するタンパク質を生産することが可能である。好ましくは、培地中の炭素源濃度が5g/L以下になってから更に1時間以上、好ましくは5時間以上継続する。培養時間の上限は特に限定されないが、典型的には、培地中の炭素源濃度が5g/L以下になってから7時間以内に培養を終了する。
【００３１】
本発明者らは、前記微生物を過酸化水素存在下において培養することで、前記微生物によるカタラーゼ活性を有するタンパク質の生産量が顕著に高まることを見出した。そこで培地としては、過酸化水素を含有する培地を用いることが特に好ましい。好ましくは、過酸化水素濃度が1〜50mM、好ましくは5〜10mMとなるように添加された培地を用いる。
【００３２】
本発明者らはまた、前記微生物の遊走細胞の細胞内におけるカタラーゼ活性が、栄養細胞の細胞内におけるカタラーゼ活性よりも顕著に高いことを見出した。そこで、本発明の好適な実施形態では、前記培養工程が、前記微生物を培養して遊走細胞を出現させることを含み、更に、前記培養工程の後に、出現した前記遊走細胞を回収する遊走細胞回収工程と、回収された前記遊走細胞からカタラーゼ活性を有するタンパク質を回収するタンパク質回収工程を行う。遊走細胞を出現させる培養条件としては、例えば培地中の炭素源が枯渇した後(具体的には、培地中の炭素源濃度が5g/L以下になった後)に更に培養を継続させる、好ましくは1時間以上、より好ましくは3〜10時間培養を継続する方法や、培養後に培養菌体を遠心分離等で回収し、回収された菌体を人工海水に懸濁させ、好ましくは1時間以上、より好ましくは3〜10時間振とうする方法が挙げられる。遊走細胞の回収は、遊走細胞と栄養細胞が混在する培養系から、相対的に高められた濃度で遊走細胞を回収することを指す。回収手段としては、培養系の遠心分離等の任意の手段が採用できる。タンパク質の回収は、後述する手段を採用できる。
【００３３】
（タンパク質の回収）
培養された微生物が生産するカタラーゼ活性を有するタンパク質は、主に前記微生物の体内に蓄積する。
【００３４】
前記微生物の培養物、培養上清画分、菌体含有画分、菌体破砕物、菌体抽出液(粗酵素抽出液)等に含まれた状態のカタラーゼ活性を有するタンパク質をそのまま利用することも可能である。
【００３５】
前記微生物の培養物、培養上清画分、菌体含有画分、菌体破砕物、菌体抽出液(粗酵素抽出液)等から、より高濃度のカタラーゼ活性を有するタンパク質を回収する手段としては、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、硫安分画、硫酸ナトリウム分画、塩化ナトリウム分画等の塩析、透析、あるいは等電点電気泳動等の一般的な手段を1つ又は複数組み合わせて使用できる。
【００３６】
本発明により得られるカタラーゼ活性を有するタンパク質は、過酸化水素処理を必要とする産業、例えば食品工場由来の廃液、半導体産業の洗浄廃液等の廃液処理に利用することができる。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実験1
実験1方法
カタラーゼ産生能スクリーニング
表1に示すヤブレツボカビ類に分類される微生物の18株を用い、定法に従いカタラーゼテストを実施した。すなわち、供試株をB1寒天平板培地上で28℃、5日間生育させてコロニーを形成させ、形成されたコロニーを3％過酸化水素水に浸漬し、カタラーゼ活性による過酸化水素の分解に伴う酸素の気泡の発生の有無を確認した。気泡の発生が確認できたものをカタラーゼ活性陽性株と判定した。
【００３８】
Aurantiochytrium limacinum mh0186株(FERM P-19755)は上記「発明の実施のための形態」にて示した入手経路で入手した。
【００３９】
Aurantiochytrium limacinum SR21 ATCC MYA-1381、Aurantiochytrium sp. ATCC26185、Aurantiochytrium sp. ATCC20888、Schizochytrium aggregatum ATCC28209、Ulkenia sp. ATCC28207、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Thraustochytrium aureum ATCC34304、及びThraustochytrium striatum ATCC24473は、American Type Culture Collection（ATCC)から入手した。
【００４０】
Schizochytrium sp. SEK210（受託番号NBRC 102615）、Schizochytrium sp. SEK345（受託番号NBRC 102616）、Ulkenia amoeboidea SEK214（受託番号NBRC 104106）、Parietichytrium sarkarianum SEK351（受託番号NBRC 104108）、Botryochytrium radiatum SEK353（受託番号NBRC 104107）、Oblongichytrium sp. SEK347（受託番号NBRC 102618）、Parietichytrium sarkarianum SEK364（受託番号FERM BP-11298、受領番号FERM ABP-11298）、及びParietichytrium sp. SEK358(受託番号FERM BP-11405)は、甲南大学理工学部生物学科系統分類学研究室(本多大輔教授）から分与を受けたものを用いた。
【００４１】
Thraustochytrium striatum NE03は以下の方法により本発明者らが分離したものを用いた。すなわち、鹿児島県中之島の沿岸海水を50ml遠沈管に40ml程度収容し、研究室に持ち帰った。株の回収は乾熱滅菌した松花粉を遠沈管内の海水表面一面に散布し、25℃、暗条件下で一週間静置させた。一週間の静置後、松花粉を含む表層の海水をピペットマンで100μl回収し、抗生物質（ストレプトマイシン・ペニシリン）含有B1寒天平板培地（グルコース 5g, 酵母エキス 2g, ポリペプトン 2g, 100μl ビタミン混合液, 50%濃度人工海水 100ml[pH 6.8]）上に塗抹し、28℃で5日間培養した。培養後、寒天表面に生成した橙色のシングルコロニーを白金耳でピックアップし、新鮮な同培地上に画線培養した。この作業を3回繰り返し、株の純粋化を行った。純化した株をGY培地にて、28度、5日間、130rpmで培養した。増殖した菌体を凍結保存溶液（10％グリセリン、5%トレハロース）に懸濁させ、-80℃下で凍結保存した。
【００４２】
フラスコ培養試験
カタラーゼテストを基に選抜したA. limacinum mh0186株を、過酸化水素濃度が異なる（0 mM, 5 mM, 10mM）GY培地（グルコース30g、酵母エキス10g、人工海水1000 ml [pH 7.0]）で培養（28℃、110rpm、120時間）し、培地中のグルコース濃度、細胞の増殖性を示す乾燥菌体重量、及び細胞内カタラーゼ活性を経時的に測定した。
【００４３】
グルコース濃度、乾燥菌体重量、及び細胞内カタラーゼ活性の測定は、下記実験2の試験管培養試験及びフラスコ培養試験と同じ方法により行った。
【００４４】
実験1結果
カタラーゼ産生能スクリーニング
試験した18株でカタラーゼ活性陽性が示され、特にA. limacinum mh0186株において、顕著な気泡発生が確認された。具体的な結果を表1に示す。
【００４５】
表1における「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」、「＋＋＋＋」はそれぞれ、菌体から発生した酸素の気泡量を目視観察した評価結果である。気泡の発生が特に強いものを＋＋＋＋、強いものを＋＋＋、中程度のものを＋＋、微弱なものを＋とした。図１には、気泡の発生が特に強いA. limacinum mh0186株を観察した写真を示す。
【００４６】
【表１】
2015149912.tif 000003
【００４７】
フラスコ培養試験
培養試験結果のうち細胞の増殖性を示す乾燥菌体重量の経時変化を図2に示し、粗酵素液のカタラーゼ活性の経時変化を図3に示し、培地中のグルコース濃度の経時変化を図4に示す。図2〜4において横軸は培養時間を示す。
【００４８】
培養開始時の培地中の過酸化水素濃度が0mMの試験区（0mM試験区）では、培養48時間で培養系中のグルコースが枯渇し定常期に達した。グルコース飢餓に伴い、培養48時間で735 Unitであったカタラーゼ活性は急激に上昇し、培養120時間では5,850 Unitを示した。
【００４９】
培養開始時の培地中の過酸化水素濃度が5 mMの試験区（5mM試験区）では、増殖が遅延し、培養48時間後から増殖が示された。培養24時間で急激なカタラーゼ活性の上昇が見られ7,562 Unitに達したが、その後減少した。0mM試験区と同様に定常期後半、すなわちグルコース枯渇に伴いカタラーゼ活性の増加が見られた。
【００５０】
培養開始時の培地中の過酸化水素濃度が10mMの試験区（10mM試験区）では、増殖が著しく抑制された。一方で培養60時間後以降、カタラーゼ活性は急激に上昇し、0mM試験区および5mM試験区と比較して有意に高い値を示し、培養120時間後では73,110 Unitを示した。
【００５１】
実験1考察
スクリーニング試験により選抜したmh0186株の細胞内のカタラーゼ活性は、グルコース飢餓状態で著しく高まることが確認された。
【００５２】
また培養液への過酸化水素添加（終濃度 5mM）により、人為的にカタラーゼ活性を高めることができた。また増殖に影響を及ぼすほどの高濃度（終濃度10 mM）の過酸化水素を添加することにより、カタラーゼ活性著しく高めることが可能であった。10mM試験区での培養120時間後の73,110 Unitは現在汎用されているMicrococcus属由来のカタラーゼやその他研究報告（たとえばNakayama et al., Journal of Bioscience and Bioengineering (2008) 106, 554-558）の値と比較しても著しく高い。
【００５３】
実験2
実験2方法
試験管培養試験
実験1のカタラーゼ産生能スクリーニング試験においてカタラーゼ産生能が確認された18株（具体的な株名は上記表1参照）をB1寒天培地で3日間、28℃で培養した。生育したコロニーを十分に加熱滅菌した白金耳で18mmφ試験管（GY液体培地8 ml）に植菌して3日間、28℃、130 rpmで振盪培養（RECIPRO SHAKER NR-10、TAITEC社）した。GY液体培地は、グルコース3g、酵母エキス1g、50％人工海水100ml、pH6.8の組成のGY液体培地を、オートクレーブを用いて121℃、20分間で滅菌処理し、濾過滅菌したビタミン混合液（ビタミンB1  200mg、ビタミンB2  1mg、ビタミンB12  1mg、蒸留水100ml）を培地量の0.1v/v%添加したものを使用した。以上の作業を前培養とした。
【００５４】
本培養では、18mmφ試験管（GY液体培地8ml）に前培養液を400μl植菌し、前培養と同条件で振盪培養を行った。本培養開始3日後に培養液を回収した。回収された培養液を5,000g、4℃、5分間の条件で遠心分離（MX-201、TOMY社）した。上清を除去後、沈降物である固形分に洗浄用バッファー(50 mM Tris-HCl, 20 mM MgSO4 [pH 8.0]) を加えて遠心洗浄を2回行った。洗浄後の固形分に対し凍結し次いで融解する操作を2回繰り返し、その後に氷冷下で5分間ソニケーション処理をした。その後、10,000rpm、4℃、30分間の条件で遠心分離を行って、上清を回収した。これを粗酵素抽出液としてカタラーゼ活性の測定に用いた。
【００５５】
カタラーゼ活性は、Ichiseの方法（N. Ichise et al. (2008) H2O2 tolerance of Vibrio rumoiensis S-1T is attributable to the cellular catalase activity, Journal of Bioscience and Bioengineering, 106, 39-45, The Society for Biotechnology, Japan.）に従って行った。粗酵素抽出液3μl、50 mM リン酸カリウムバッファー[pH 7.0]及び30 mM H2O2を混合して総容量1mlとし、分光光度計（V-530、日本分光社）を用いて20℃で反応させて波長240nmの吸光度の減少値を求めた。今回の測定では、酵素活性の1 unitは、20℃、1分間で1.0μmolの過酸化水素を分解する酵素量と定義した。また同粗酵素抽出液中のタンパク質含量をLowry法で測定し、タンパク質1mg当りの酵素活性に換算した。
【００５６】
フラスコ培養試験（過酸化水素添加試験）
過酸化水素を培養培地に添加する時期を変えることにより、添加後の増殖速度並びにカタラーゼ活性誘導パターンが大きく変動する可能性がある。そこで、本実験では異なる培養フェーズで過酸化水素を培地に添加し、その影響を評価した。
【００５７】
定法に従い前培養を行った。本培養は、500ml坂口フラスコ（GY液体培地100ml）を用いた。GY液体培地はグルコース3g、酵母エキス1g、50％人工海水100ml、pH6.8の組成のGY液体培地を、オートクレーブを用いて121℃、20分間で滅菌処理し、濾過滅菌したビタミン混合液（ビタミンB1  200mg、ビタミンB2  1mg、ビタミンB12  1mg、蒸留水100ml）を培地量の0.1 v/v%添加したものを使用した。電動ピペッターを用いて前培養液5mlを植菌し、28℃、130rpmで振盪培養した。経時的に培養液の回収を行った。3つの試験区を用意し、それぞれ培養開始12時間後、36時間後、60時間後において終濃度が5 mM になるようにして過酸化水素を添加した。そして、乾燥菌体重量、グルコース濃度及びカタラーゼ活性を求めた。
カタラーゼ活性は上述の試験管培養試験と同じ方法により測定した。
【００５８】
乾燥菌体重量の測定は以下の方法で行った。すなわち、回収した菌体を乾燥機内にて、105℃で3〜6時間恒量になるまで乾燥した後、重量を測定した。そして、培養液1L当たりに含まれる乾燥菌体重量を算出した。
【００５９】
グルコース濃度は、市販のグルコース定量キット（グルコースCIIテストワコー、和光純薬）を用いて分析した。
【００６０】
培地量の変化によるカタラーゼ活性
本実験では、A. limacinum mh0186株を用いて培養試験を行い、同一容器における異なる培地量がカタラーゼ活性へ与える影響を検討した。
【００６１】
本培養は、500ml容坂口フラスコを用いた。3つの試験区を用意し、添加するGY液体培地の量をそれぞれ50ml、100ml、200mlとした。GY液体培地はオートクレーブを用いて121℃、20分間で滅菌処理し、濾過滅菌したビタミン混合液（ビタミンB1  200mg、ビタミンB2  1mg、ビタミンB12  1mg、蒸留水100ml）を培地量の0.1 v/v%添加したものを使用した。電動ピペッターを用いて本培養液の5 v/v%に当る前培養液を植菌し、28℃、130rpmで振盪培養した。経時的に培養液の回収を行った。培養液中のグルコース濃度を簡易的に求めるために新ウリエースGa（TERUMO）を使用し、培養液中のグルコース濃度の低下（0〜5g/L以下）が確認されてから培養液の回収を行った。上述の方法に従い、菌体内カタラーゼ活性を求めた。
【００６２】
栄養細胞と遊走細胞のカタラーゼ活性の比較
上述の方法に従い、mh0186株を、坂口フラスコを用い、GY液体培地で培養した。グルコースが枯渇する頃に培養液を回収し、光学顕微鏡下で遊走細胞の出現を確認した。培養液を低速遠心（500g, 10 min）した後、10分間室温で静置した。主として栄養細胞から成る沈殿物を吸い込まないよう、主として遊走細胞から成る上清液をパスツールピペットで丁寧に回収した。上清液及び遠心沈殿物中の細胞をリン酸緩衝液で遠心洗浄し、それぞれを遊走細胞画分、栄養細胞画分として、上述の方法に従い、カタラーゼ活性を測定した。
【００６３】
実験2結果
試験管培養試験
試験に用いたヤブレツボカビ類18株の全てがカタラーゼ陽性であることが確認できた。
【００６４】
図5に、供試18株のカタラーゼ活性の結果を示す。Oblongichytrium sp. SEK347株において、最も高い活性が示された。
【００６５】
フラスコ培養試験（過酸化水素添加試験）
A. limacinum mh0186株の経時的な乾燥菌体重量変化を図6に示す。培養開始12時間後に過酸化水素を添加した区では、培養開始60時間後で最大値9.17g/Lを示し、その後値は減少した。培養開始36時間後に過酸化水素を添加した区では、培養開始60時間後で最大値8.36g/Lを示し、その後値は減少した。培養開始60時間後に過酸化水素を添加した区では、培養開始60時間後で最大値9.03g/Lを示し、その後値は減少した。
【００６６】
GY液体培地中の経時的なグルコース濃度変化を図7に示す。培養開始12時間後に過酸化水素を添加した区では、培養開始時で27.45g/Lを示し、60時間後で0.006g/Lを示した。培養開始36時間後に過酸化水素を添加した区では、培養開始時で27.96g/Lを示し、60時間後で0.013g/Lを示した。培養開始60時間後に過酸化水素を添加した区では、培養開始時で27.39g/Lを示し、60時間後で0.013g/Lを示した。
【００６７】
過酸化水素添加時期が異なる3つの区での、培養菌体のカタラーゼ活性の経時変化を図8に示す。図9には、図8に示す3つの区のデータのうち、過酸化水素を培養開始36時間後に添加した区と、培養開始60時間後に添加した区でのデータのみを抜粋し、拡大して示す。図8及び9において矢印は過酸化水素の添加時を示す。いずれの試験区においても過酸化水素の添加後にカタラーゼ活性の上昇が認められた。
【００６８】
培地量の変化によるカタラーゼ活性
GY液体培地中のグルコース濃度が低下（0〜5g/L以下）した際のA. limacinum mh0186株のカタラーゼ活性を図10に示した。培地量50ml試験区では培養開始48時間後にグルコース濃度の低下が確認された。その時のカタラーゼ活性は約4,000 unitであった。培地量100ml試験区では培養開始60時間後にグルコース濃度の低下が確認された。その時のカタラーゼ活性は約6000 unitであった。培地量200mlの試験区では培養開始192時間後にグルコース濃度の低下が確認された。その時のカタラーゼ活性は約12000 unitであった。  
【００６９】
GY液体培地中のグルコース濃度が低下（0〜5g/L以下）してからの、A. limacinum mh0186株の経時的なカタラーゼ活性変化を図11に示した。培地量50ml試験区では、培養時間48時間から132時間において最大値は約8000 unit、最小値は約4000 unitを示した。培地量100ml試験区では、培養時間48時間から132時間において最大値は約6000unit、最小値は約2000 unitを示した。
【００７０】
好気性生物では、呼吸のために取り入れた酸素の数％が活性酸素に変化すると言われている。このことから、微生物の場合、培養環境中の酸素が呼吸に必要な一定濃度まで高まれば、増殖率は高まるものの、細胞内に蓄積する過酸化水素等の活性酸素の生成も高まる。このように蓄積した過酸化水素を除去するためのカタラーゼの活性も上昇することが推測される。一般的に微生物を振とう培養する際は、同一体積の培養器（例えば三角フラスコ）に対し添加する培地量が少なければ少ないほど、空気と接する表面積が増え、培地中への酸素の溶け込みも向上する。しかしながら本結果は、このことに反して、最も培地量が少ない50ml試験区において、カタラーゼ活性は最小値を示した。これは使用した坂口フラスコの形状に起因していると推察される。坂口フラスコは細長い導入口を有し、その根元から垂直に広がった形状を示している。この形状の坂口フラスコに一定量の培地を添加し、振とう培養を行うと、左右に振られた培地が両肩にぶつかり、効率的に空気を巻き込んで、培地中への酸素供給量を高める。しかしながら培地量が少ない場合、培地は両肩にぶつかることなく、左右に振られるため、培地中への酸素の溶解量が極端に減少すると思われる。このことから、本試験では、カタラーゼ活性は、培地量が最も少ない50mlの試験区で最小値を示し、培地量が最も多い200mlの試験区で最大値を示したと考えられる。
【００７１】
栄養細胞と遊走細胞のカタラーゼ活性
遊走細胞画分に含まれる遊走細胞数は総細胞数に対して98％を示し、栄養細胞画分に含まれる栄養細胞数が総細胞数に対して97％を示した。各画分のカタラーゼ活性の測定結果を図12に示した。図12において、アスタリスクは統計的有意差を示す（Student-t test, P<0.05）。栄養細胞と遊走細胞のカタラーゼ活性はそれぞれ7179 unit、21229 unitであり、遊走細胞の活性は栄養細胞と比較して約3倍の活性値を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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