(57)【要約】【課題】  共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、試料溶液中に粒子が混在する場合に、検出信号が周期的に発生しているか否かによって並進拡散速度の互いに異なる粒子を区別して検出する手法を提供すること。【解決手段】  本発明による試料溶液中の発光粒子の光を検出する光分析技術は、試料溶液内に於いて顕微鏡の光検出領域の位置を移動させながら検出された光検出領域からの光の時系列光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて検出される発光粒子の信号のうち、光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群を第一の発光粒子の信号として識別し、ランダムな時間に発生した信号を第二の発光粒子の信号として識別する。【選択図】図２
2015094625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、
前記検出された発光粒子の信号のうち、前記時系列の光強度データの時間に沿って前記光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群を前記発光粒子のうちの第一の発光粒子の信号として識別し、前記時系列の光強度データの時間に於いてランダムな時間に発生した信号を前記発光粒子のうちの第二の発光粒子の信号として識別する過程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群の数とランダムな時間に発生した信号の数とをそれぞれ別々に計数して、前記第一の発光粒子の濃度と前記第二の発光粒子の濃度とを決定する過程を含む方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、前記第一の発光粒子の濃度が、前記光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の数を前記光検出領域の通過した延べ体積で除した値として算定される方法。
【請求項４】
請求項１又は２の方法であって、前記第一の発光粒子が、ボルツマン定数ｋＢと、絶対温度Ｔと、溶媒粘性度ηと、光検出領域の移動周期τとを用いた条件：
ｒ１＞［（ｋＢ・Ｔ／３πη）・τ］１／３
を満たす半径ｒ１の粒子であり、前記第二の発光粒子が、ボルツマン定数ｋＢと、絶対温度Ｔと、溶媒粘性度ηと、光検出領域の半径ａとその移動周期τとを用いた条件：
ｒ２＜（ｋＢ・Ｔ／３πη）（τ／ａ２）
を満たす半径ｒ２の粒子である方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの方法であって、前記第二の発光粒子が前記第一の発光粒子の一部が遊離した粒子であり、前記第一の発光粒子の信号の検出数と前記第二の発光粒子の検出数とに基づいて前記第一の発光粒子の一部を解離させる反応の進行の度合いを判定する過程を含む方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかの方法であって、前記第一の発光粒子が前記第二の発光粒子が第三の粒子に結合して形成される粒子であり、前記第一の発光粒子の信号の検出数と前記第二の発光粒子の検出数とに基づいて前記第二の発光粒子が第三の粒子に結合する反応の進行の度合いを判定する過程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の分析を可能にする単一発光粒子検出方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献２)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献３）などが知られている。
【０００３】
更に、本願出願人は、特許文献４〜９に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。
【０００４】
また、上記の走査分子計数法のいくつかの態様に於いて、複数の種類の粒子が混在している試料溶液の場合に、それらの種類を識別して粒子を検出することが可能である。例えば、或る態様に於いては、互いに異なる種類の発光粒子からの検出光の波長特性又は偏光特性の違いを検出することにより、種類毎の発光粒子の検出が可能である（特許文献７）。また、別の態様に於いては、同一の発光粒子について複数回に亘って信号を検出し、それらの信号の発生時刻の変化又は信号強度の変化を利用して決定される並進拡散特性によって、発光粒子の種類の識別が可能となる（特許文献６、９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特許第４０２３５２３号
【特許文献３】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献４】国際公開第２０１１／１０８３６９
【特許文献５】国際公開第２０１１／１０８３７０
【特許文献６】国際公開第２０１２／０５００１１
【特許文献７】国際公開第２０１２／０７０４１４
【特許文献８】国際公開第２０１２／０９９２３４
【特許文献９】国際公開第２０１３／０６９５０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上記の走査分子計数法に於いて、光強度の測定に際して、光検出領域を或る経路に沿って循環させる場合、並進拡散の速い粒子は、光検出領域にて一度検出された後、光検出領域が前記の経路を一周する間に拡散によって、光検出領域の通過領域から逸脱し、検出されなくなる。一方、並進拡散が遅い粒子は、光検出領域の循環の間、略同じ位置に留まり、従って、数回に亘って検出される場合がある。より詳細に述べれば、循環経路での光検出領域の一周期に於ける拡散による移動距離が光検出領域の寸法に比して長い粒子は、光検出領域の循環に於いて、一度のみ検出され、循環経路での光検出領域の一周期に於ける拡散による移動距離が光検出領域の寸法に比して短い粒子は、光検出領域の循環に於いて数回に亘って周期的に検出されることとなる。従って、試料溶液中に並進拡散速度の互いに異なる粒子が混在する場合、検出された信号が周期的に発生した信号であるか（その信号の光検出領域の一周期前及び／又は一周期後に別の信号が存在しているか）、非周期的に発生した（単発の）信号であるかを判断することによって、信号に対応する粒子が並進拡散の遅い粒子であるか並進拡散の速い粒子であるかを区別できることとなる。
【０００７】
かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法に於いて、試料溶液中に並進拡散速度の互いに異なる粒子が混在する場合に、検出された信号が周期的に発生しているか否かによって粒子の種類の区別する新規な光分析技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの態様によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を所定の経路に沿って周期的に移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、検出された発光粒子の信号のうち、時系列の光強度データの時間に沿って光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群を発光粒子のうちの第一の発光粒子の信号として識別し、時系列の光強度データの時間に於いてランダムな時間に発生した信号を発光粒子のうちの第二の発光粒子の信号として識別する過程とを含む方法によって達成される。
【０００９】
かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、光検出部は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
【００１０】
上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。従って、逐次的に検出された光強度データに於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。
【００１１】
かかる構成に於いて、光検出領域が所定の経路に沿って周期的に循環させられるとき、既に触れた如く、並進拡散が速く、光検出領域にて一度検出された後に光検出領域の所定の経路を一周する周期時間に於いて光検出領域の通過領域から逸脱する粒子の場合、その信号は、時系列光強度データの時間軸上でランダムな時間に単発的に発生する（以下、そのようなランダムな時間に単発的に発生する信号を「非周期信号」と称する。）。一方、並進拡散が遅く、光検出領域にて最初に検出された後、光検出領域が数回に亘って所定の経路を循環する間、略同じ位置に留まる粒子の場合、その信号は、時系列光強度データの時間軸上で光検出領域の循環周期に略一致した周期にて周期的に発生する（以下、そのような光検出領域の循環周期にて周期的に発生する信号を「周期信号」と称する。）。そこで、本発明に於いては、上記の如く、時系列光強度データ上にて個別に検出された発光粒子の信号のうち、時系列光強度データの時間に沿って光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群を、第一の発光粒子（並進拡散が遅い粒子）の信号として識別し、時系列の光強度データの時間に於いてランダムな時間に発生した信号を、第二の発光粒子（並進拡散が速い粒子）の信号として識別する。かかる構成によれば、それぞれの発光粒子の信号が非周期信号であるか周期信号であるかを判定することによって、２種類の発光粒子を区別して検出できることとなる。なお、周期信号の群の検出は、例えば、特許文献６、９等に記載された方法によって達成されてよい（「周期信号の群」とは、周期信号として判定され、同一の発光粒子の信号である複数の信号を意味としている。本明細書に於いて、一つの「周期信号の群」は、一つの発光粒子に対応する複数の周期信号であるものとする。）そして、かかる周期信号の群の検出の処理過程に於いて、周期信号であると判定されなかった信号が、非周期信号として決定されてよい。
【００１２】
上記の構成に於いて、非周期信号に対応する第二の発光粒子として検出される粒子は、光検出領域の移動周期τの間に光検出領域の寸法（半径ａ）より長い距離移動できる粒子である。例えば、粒子が半径ｒ２の球状体に近似でき、拡散係数が、ｋＢ・Ｔ／６πηｒ２［ｋＢ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒粘性度］で与えられる場合、粒子は、
ｒ２＜（ｋＢ・Ｔ／３πη）（τ／ａ２）
を満たす粒子であってよい。一方、周期信号に対応する第一の発光粒子として検出される粒子は、光検出領域が数回に亘って経路を周回しても光検出領域の経路から逸脱しない粒子であるところ、より確実に周期的に検出可能とする場合、粒子は、好適には、光検出領域の移動周期τの間にその位置が殆ど動かない粒子、即ち、拡散による移動距離が自身の半径よりも小さい粒子である。かくして、例えば、粒子が半径ｒ１の球状体に近似でき、拡散係数が、ｋＢ・Ｔ／６πηｒ１［ｋＢ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒粘性度］で与えられる場合、粒子は、
ｒ１＞［（ｋＢ・Ｔ／３πη）・τ］１／３
を満たす粒子であってよい。
【００１３】
また、上記の構成によれば、周期信号の群の数と非周期信号の数が、それぞれ、光測定中に検出された第一の発光粒子の数と第二の発光粒子の数であると考えられ、それらの信号の群の数又は信号の数に基づいて、第一の発光粒子の濃度又は第二の発光粒子の濃度の決定が可能である。そこで、上記の本発明に於いては、更に、光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の群の数とランダムな時間に発生した信号の数とをそれぞれ別々に計数して、第一の発光粒子の濃度と第二の発光粒子の濃度とを決定する過程が含まれていてよい。この点に関し、実施形態の欄にて後述される如く、周期信号に対応する第一の発光粒子の濃度は、光検出領域の移動周期と略同じ周期にて複数回発生した信号の数（周期信号の総数）を光検出領域の通過した延べ体積（所定の経路の体積×周回数）で除した値として算定することが可能である。
【００１４】
かくして、上記の本発明の方法によれば、端的に述べれば、並進拡散が遅い粒子と並進拡散が速い粒子とを別々に区別して検出できることとなる。従って、一つの態様として、例えば、或る反応によって、或る発光粒子の一部が遊離し、前記の発光粒子本体から遊離した発光粒子の一部の拡散速度が前記の遊離元の発光粒子（本体）の拡散速度に比して大幅に速くなる系の場合、発光粒子本体と、遊離した発光粒子の一部とを別々の検出できることとなる。そこで、本発明の実施形態の一つとして、第二の発光粒子が第一の発光粒子の一部が遊離した粒子であり、第一の発光粒子の信号の検出数と第二の発光粒子の検出数とに基づいて第一の発光粒子の一部を解離させる反応の進行の度合いを判定する過程が含まれていてよい。この場合、例えば、実施例１の如く、第一の発光粒子又は発光粒子本体として、任意に態様にて発光部位（第二の発光粒子）を担持するビーズを採用すると、発光部位のビーズからの分離を惹起させる反応の有無又は進行度合いが、第二の発光粒子の検出数の増加又は第一の発光粒子の検出数の減少の有無又は度合いなどから判定可能となる。
【００１５】
また、別の態様として、例えば、或る発光粒子が拡散の遅い別の粒子に結合する系の場合、別の粒子に結合していない発光粒子と別の粒子に結合した粒子とを同時に区別して検出できることとなる。そこで、本発明の実施形態の一つとして、第一の発光粒子が第二の発光粒子が第三の粒子に結合して形成される粒子であり、第一の発光粒子の信号の検出数と第二の発光粒子の検出数とに基づいて第二の発光粒子が第三の粒子に結合する反応の進行の度合いを判定する過程が含まれていてよい。この場合、例えば、実施例２の如く、第三の粒子としてビーズを採用し、第二の発光粒子としてビーズに結合していない発光粒子を、第一の発光粒子としてビーズに結合した発光粒子を、それぞれ、割り当てれば、発光粒子のビーズへの結合を惹起させる反応の有無又は進行度合いが、第二の発光粒子の検出数の減少又は第一の発光粒子の検出数の増加の有無又は度合いなどから判定可能となる。
【００１６】
上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。試料溶液に対する光検出領域の位置の移動方法及び態様、時系列光強度データに於ける光強度値から各発光粒子の信号の抽出もしくは検出する方法及び態様、絶対な濃度値を決定するためのパラメータを決定する方法及び態様等は、特許文献４〜９等に記載されている方法及び態様と同様であってよい。
【発明の効果】
【００１７】
既に述べた如く、今までの走査分子計数法に於いても、試料溶液中に混在する複数の種類の発光粒子を、それらの種類を識別して検出することは可能であった。例えば、特許文献７に記載の方法の場合には、発光粒子の光を複数の波長帯域の成分又は複数の偏光成分を別々に且つ同時に計測し、検出された成分の強度比等を参照して各信号に対応する発光粒子の種類を識別又は同定することが可能である。また、特許文献６、９に記載の方法の場合には、一つの発光粒子の信号を複数回検出し、それらの信号発生時間の変化又は強度の変化から得られる位置の変化を用いて決定される並進拡散特性（拡散係数）によって発光粒子の種類が識別又は同定される。一方、本発明では、発光粒子の信号が周期的に発生したか否かによって、発光粒子の種類の区別が為される。従って、本発明の方法の場合に於いては、識別可能な発光粒子の種類の数は、原理的に、２種類であるところ、本発明の方法による種類の識別は、一つの波長成分の光を検出するだけで達成可能である。また、単に、信号が周期的に発生したか否かを判定するだけで、発光粒子の種類の識別が可能なので、複雑の演算処理を必要としない点で有利である。なお、本発明の方法は、上記特許文献に記載された発光粒子の種類の識別又は同定を行う手法と組み合わされてよく、その場合には、識別又は同定が可能な発光粒子の種類の数を増やすことが可能となる。
【００１８】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。図２（Ｃ）は、走査分子計数法に従って試料溶液内にて移動される光検出領域とその循環する通過領域の模式図であり、並進拡散の速い粒子βと並進拡散の遅い粒子αの挙動を説明する図である。図２（Ｄ）は、並進拡散の速い粒子βと並進拡散の遅い粒子αが混在する試料溶液に於いて得られる時系列光強度データの模式図である。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）は、本発明を利用して実行可能な実験例に於ける粒子の構造変化のモデル図（上）と、検出される信号数の変化（グラフ図）を示している。図３（Ａ）は、ビーズに連結した発光部位が切断される反応の例であり、図３（Ｂ）は、ビーズに発光粒子が結合する反応の例である。
【図４】図４は、本発明に従って実行される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図５】図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図６】図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図７】図７（Ａ）〜（Ｆ）は、実施例１に於いて用いた反応系に於ける分子の構造変化のモデル図である。
【図８】図８（Ａ）〜（Ｃ）は、実施例１に於ける信号の検出結果を示している。図８（Ａ）は、周期信号の検出数と群の検出数であり、図８（Ｂ）は、周期信号の一つの群当たりの検出数であり、図８（Ｃ）は、非周期信号の検出数である。棒グラフの値とエラーバーは、５回の測定の平均値と標準偏差である。
【図９】図９（Ａ）〜（Ｄ）は、実施例２に於いて用いた反応系に於ける分子の構造変化のモデル図である。
【図１０】図１０（Ａ）〜（Ｂ）は、実施例２に於ける信号の検出結果を示している。図１０（Ａ）は、周期信号の検出数であり、図１０（Ｂ）は、非周期信号の検出数である。棒グラフの値とエラーバーは、５回の測定の平均値と標準偏差である。
【符号の説明】
【００２０】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、特許文献４〜９に記載の走査分子計数法又はＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光性粒子又は蛍光色素等の発光標識が付加された粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス様分布となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のス��ージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００２３】
更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の走査軌道又は試料溶液の位置の移動経路は、円形、楕円形等の閉じた循環経路であってよく、任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
【００２４】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、光をダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ１４ａを用いて波長成分によって分割して別々に検出できるようになっていてよい。
【００２５】
コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
【００２６】
本発明の光分析技術の原理
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データに於いて検出される発光粒子の信号が周期信号であるか否かを判定して、周期信号と非周期信号とを別々の種類の発光粒子に対応するものとして計数し又は種々の分析に用いる。以下、走査分子計数法及び周期信号と非周期信号とを識別して種々の分析に利用可能とする本発明の原理について説明する。
【００２７】
１.走査分子計数法の原理
「走査分子計数法」（特許文献４〜９）では、基本的には、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。なお、発光粒子の光の検出は、例えば、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより為されてよい。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００２８】
２．周期信号と非周期信号の検出
既に述べた如く、上記の光検出領域ＣＶを、図２（Ｃ）に例示されている如く、或る経路に沿って循環させる場合に於いて、並進拡散の速い粒子βであって、該粒子が光検出領域ＣＶに一度包含された後、光検出領域ＣＶが経路を一周して戻ってくるまでの時間τに、図中の矢印の如く、光検出領域ＣＶの通過領域から逸脱しているほど、その移動速度が高い粒子の場合、それらの信号は、時系列光強度データ上に於いて、各粒子について一度のみ検出され、図２（Ｄ）にて白抜きのパルス信号βにて示されている如く、ランダムに出現することとなる。一方、並進拡散が遅い粒子αであって、該粒子が光検出領域ＣＶに一度包含された後、光検出領域ＣＶが経路を数回に亘って循環する間、略同じ位置又は領域に留まるほど、その移動速度が低い粒子の場合、それらの信号αは、図２（Ｄ）にて黒塗りのパルス信号αにて示されている如く、光検出領域ＣＶの移動周期τに略等しい周期にて周期的に数回（最初の場所から大きく移動するまでの間）に亘って出現する群となる。即ち、周期的に発生する一群の信号は、同一の発光粒子の信号であると考えられる。（図２（Ｄ）は、二組の周期信号の群α、α２が発生している。）
【００２９】
従って、光検出領域ＣＶを或る経路に沿って循環させながら得られた時系列光強度データ上に於いて、周期的に発生する信号（周期信号）は、並進拡散が遅い粒子αの信号であると判定でき、非周期的に発生する信号、即ち、前後に光検出領域ＣＶの移動周期τだけずれた時間に別の信号が発生していない信号（非周期信号）は、並進拡散の速い粒子βの信号であると判定できることとなる。かくして、本発明に於いては、時系列光強度データ上にて発光粒子の信号として検出された信号のうち、周期信号の群（前後に光検出領域ＣＶの移動周期τだけずれた時間に別の信号が発生している信号の群）として発生した「周期信号」と、「非周期信号」とに区別し、「周期信号」と「非周期信号」とが、それぞれ、別々の種類の発光粒子に対応する信号であると同定される。そして、例えば、「周期信号」と「非周期信号」との数を別々に計数すれば、別々の種類の発光粒子の濃度又はその指標値の算定やその他の特性などが検出可能となる。
【００３０】
上記の如く、光検出領域ＣＶを所定の経路に沿って循環させ、「周期信号」であるか「非周期信号」であるかによって、並進拡散が遅い粒子と並進拡散の速い粒子と区別する場合、並進拡散が遅い粒子の信号の発生が周期的となり、並進拡散の速い粒子の発生が非周期的となるように、粒子の並進拡散移動の速さと光検出領域ＣＶの移動周期τとの関係が調整される。
【００３１】
具体的には、粒子の拡散係数Ｄと時間ｔに於ける粒子の一次元の変位ｘ（ｔ）の関係は、アインシュタイン−スモルコフスキー(Einstein-Smoluchowski)の式より、
＜ｘ（ｔ）＞２＝２Ｄｔ      …（１）
により与えられるので、光検出領域ＣＶの移動周期τに於ける並進拡散が遅い粒子（拡散係数Ｄα）と並進拡散が速い粒子（拡散係数Ｄβ）の変位ｘは、それぞれ、
＜ｘ＞２＝２Ｄατ      …（２）
＜ｘ＞２＝２Ｄβτ      …（３）
［なお、Ｄα＜Ｄβ］
となる。ここに於いて、まず、並進拡散が速い粒子の信号の発生が非周期的であるとき、その移動距離は光検出領域ＣＶの寸法（半径＝ａ）より大きいこととなるので、
＜ａ＞２＜２Ｄβτ      …（４）
が満たされる。即ち、光検出領域ＣＶの移動周期τは、
τ＞＜ａ＞２／２Ｄβ      …（５）
を満たすべきである。なお、粒子の形状が球状とみなすことができ、拡散係数Ｄβが
Ｄβ＝ｋＢ・Ｔ／６π・η・ｒ２      …（６）
で表されるとき（ここで、ｋＢ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：溶媒粘性度、ｒ２：粒子半径）、粒子半径ｒ２は、
ｒ２＜（ｋＢ・Ｔ／３πη）（τ／ａ２）      …（７）
の条件を満たすこととなる。一方、並進拡散が遅い粒子の信号の発生が周期的であるとき、その位置が、殆ど動かないこと、即ち、拡散による移動距離が、自身の寸法（半径ｒ１）を超えないことが好ましい。その場合、式（２）から、
＜ｒ１＞２＞２Ｄατ      …（８）
の条件が満たされるので、光検出領域ＣＶの移動周期τは、
τ＞＜ｒ１＞２／２Ｄα      …（９）
を満たすべきである。なお、粒子の形状が球状とみなすことができ、拡散係数Ｄαが
Ｄα＝ｋＢ・Ｔ／６π・η・ｒ１      …（１０）
で表されるとき、粒子半径ｒ１は、
ｒ１＞［（ｋＢ・Ｔ／３πη）・τ］１／３      …（１１）
の条件を満たすこととなる。
【００３２】
実験に於いては、光検出領域ＣＶの移動周期τは、試料溶液中に含まれる観測対象となる並進拡散が遅い粒子と並進拡散が速い粒子の拡散係数又は拡散移動距離を考慮して、上記の条件（５）、（８）又は（７）、（１１）が満たされるよう適宜設定されることが好ましい。
【００３３】
３．本発明の利用例の原理
上記の光検出領域ＣＶを所定の経路に沿って循環させて得られた発光粒子の信号について、「周期信号」であるか「非周期信号」であるかを判断することによって、粒子の種類を区別する手法の利用に於いて、例えば、並進拡散が遅い粒子として、ポリスチレンビーズや磁気ビーズなどのこの分野でしばしば利用される固相担体粒子や細胞等が採用され、並進拡散が速い粒子として、生体分子や色素分子などが採用されてよい。図３（Ａ）〜（Ｂ）は、本発明の方法の利用例の態様の例に於ける粒子のモデルを模式的に描いた図である。
【００３４】
例えば、利用例の一つの態様に於いては、図３（Ａ）を参照して、まず、同図左上に示されている如く、発光部位を有する分子等（発光分子等）ＦＤが結合又は付着されたビーズＢが調製される。かかる発光分子等ＦＤを有するビーズＢが存在する試料溶液について、走査分子計数法による粒子の検出を行った場合、同図左下に示されている如く、原則として、ビーズＢに対応する周期信号のみが検出されるか、周期信号が多く検出されることが期待される。そして、ここに於いて、かかる発光分子等ＦＤを有するビーズＢに対して発光分子等ＦＤがビーズＢから切断又は解離する反応を作用させると、発光分子等ＦＤが切断又は解離し、同図右上に示されている如く、ビーズＢから遊離することとなる。この状態に於いて、走査分子計数法による粒子の検出を行った場合、同図右下に示されている如く、遊離した発光分子等ｆＦＤに対応する非周期信号の増大が期待される。（付着した発光分子等ＦＤの全てが遊離したビーズＢが生ずる場合には、更に、周期信号の減少が生ずる。）即ち、かかる態様によれば、作用させた反応の前後に於いて、ビーズＢ上に結合又は付着した発光分子等ＦＤが切断又は解離されたか否か又はその反応の進み具合が検出できることとなる。この態様を利用すれば、任意の分子に於ける任意の切断又は解離反応の有無又はその進行度合いを検出できることとなる。
【００３５】
利用例の別の態様に於いては、図３（Ｂ）を参照して、まず、同図左上に示されている如く、遊離した発光分子等ｆＦＤと、ビーズＢとがそれぞれ、調製される。この状態に於いて、走査分子計数法による粒子の検出を行った場合、遊離した発光分子等ｆＦＤに対応する非周期信号が多く検出されることとなる（ビーズが発光しない場合）。そして、ここに於いて、遊離した発光分子等ｆＦＤがビーズＢに結合又は付着する反応を惹起させると、同図右上に示されている如く、発光分子等ｆＦＤがビーズＢ表面に結合又は付着することとなる。この状態に於いて、走査分子計数法による粒子の検出を行った場合、同図右下に示されている如く、遊離した発光分子等ｆＦＤの減少に対応して非周期信号の検出数が減少し、発光分子等ＦＤが付着したビーズＢに対応する周期信号の検出数の増大が期待される。即ち、かかる態様によれば、作用させた反応の前後に於いて、遊離した発光分子等ｆＦＤがビーズＢ上に結合又は付着したか否か又はその反応の進み具合が検出できることとなる。この態様を利用すれば、任意の分子に於ける任意の結合又は付着反応の有無又はその進行度合いを検出できることとなる。
【００３６】
処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定及び発光粒子の検出・計数処理、及び（３）濃度の算出等の分析が実行される。
【００３７】
（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。また、特に、本発明に於いては、上記の如く、並進拡散が遅い粒子と並進拡散が速い粒子との信号を一つの時系列光強度データから抽出することが可能であるので、試料溶液に並進拡散が遅い粒子と並進拡散が速い粒子とが混在していてよい。既に触れた如く、並進拡散が遅い粒子は、やや大きめの粒子、例えば、ポリスチレンビーズや磁気ビーズなどのこの分野でしばしば利用される固相担体粒子や細胞等であってよく、並進拡散が速い粒子は、生体分子及びその他の任意の分子であってよい。更に、上記の「３．本発明の利用例の原理」に於いても触れたように、本発明によれば、或る分子の任意の処理前後の変化を検出可能である。従って、試料溶液は、任意の処理前の溶液及び／又は任意の処理後の溶液であってよい。
【００３８】
（２）試料溶液の光強度の測定
図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順、励起光を光検出領域に照射する手順（必要な場合のみ）及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射（必要な場合のみ）及び光強度の測定が開始される。測定が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７によるミラー７（ガルバノミラー）の駆動又はステージ位置変更装置１７ａによるステージの駆動によって、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を測定する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００３９】
光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、一般的には、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。図５（Ｃ）上段参照。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４０】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ａの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ａ）２＝６Ｄ・Δτ      …（１２）
から、
Δτ＝（２ａ）２／６Ｄ      …（１３）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ａ／Δτ＝３Ｄ／ａ      …（１４）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、ａが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００４１】
また、既に述べた如く、本発明に於いては、光検出領域の移動周期が、並進拡散が遅い粒子が光検出領域の通過領域を逸脱するのに要する時間よりも短く、且つ、並進拡散が速い粒子が光検出領域の通過領域を逸脱するのに要する時間よりも長くなるよう設定される。光検出領域の移動周期は、光検出領域の循環する経路長を移動速度で除した値となるので、上記の移動周期が達成されるよう、移動速度は、経路長と合わせて適宜調節される。
【００４２】
（３）光強度の分析
上記の処理により時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、周期信号及び非周期信号の抽出、濃度の算出等の分析が実行される。
【００４３】
（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図５（Ｃ）参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、即ち、例えば、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定される光強度の時間変化プロファイルを有するとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（１５）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（１５）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００４４】
時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４−ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００４５】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００４６】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。また、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００４７】
（ii）周期信号・非周期信号の抽出（図４−ステップ１７０）
時系列光強度データ上に於ける発光粒子のパルス信号の検出が為されると、それらのパルス信号のうちから、周期信号・非周期信号の抽出が為される。上記までの説明から理解される如く、並進拡散の遅い粒子の信号は、光検出領域の移動周期に（完全に一致しないが）概ね等しい周期にて連続的に出現する。そこで、並進拡散の遅い粒子の信号の抽出は、光検出領域の移動周期に概ね等しい周期にて連続的に出現する信号を任意の手法又はアルゴリズムにより選択することにより為されてよい。具体的な周期信号の抽出の処理は、例えば、特許文献６、９等に記載された方法によって達成されてよい。具体的には、例えば、時系列光強度データに於いて、まず、最初の信号の発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した信号が存在するか否かが探索される。もし最初の信号に、光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した別の信号が無ければ、その最初の信号は、非周期信号であると判定される。一方、最初の信号の発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した信号が存在した場合には、それらの信号は、同一の発光粒子の信号の群、即ち、一つの周期信号の群に属する信号として選択される。次いで、上記の周期信号の群として選択されなかった信号のうちの最初の信号について、その信号の発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した周期的な信号が存在するか否かが探索され、そのような周期的な信号が存在すれば、一つの周期信号の群に属する信号として選択される。以上の操作を繰り返すことにより、一回の光計測にて得られた時系列光強度データに於いて、周期信号の群が複数個検出されることとなる。そして、かかる過程に於いて、或る信号について、その発生時間から光検出領域の移動周期の略整数倍の時間に於いて発生した信号が無いときには、その信号は、非周期信号であると判定される。
【００４８】
（３）濃度の算出等の分析
上記の一連の処理によって非周期信号と周期信号との判別が為されると、それぞれの信号数を計数することにより、非周期信号に対応する並進拡散の速い発光粒子と周期信号に対応する並進拡散の遅い発光粒子の濃度値の算出が可能となる。非周期信号の場合、その数は、並進拡散の速い発光粒子の検出数となり、周期信号の場合、その群の数が、並進拡散の遅い発光粒子の検出数となる。そして、発光粒子の濃度は、それぞれ、発光粒子の検出数を光検出領域の通過した領域の体積で除した値により与えられる。
【００４９】
この点に関し、光検出領域を所定の経路に沿って循環させる場合、光検出領域は、同一の空間領域を繰り返し通過することとなるところ、その空間領域の物質（粒子）は、拡散により時間と共に入れ替わると考えることができる。かくして、並進拡散の速い発光粒子の場合、光検出領域が所定の経路を一周する毎に、空間に存在する粒子が入れ替わると想定されるので、光検出領域が体積Ｖの経路をｎ回循環したときの非周期信号の検出数がＮであるとき、発光粒子濃度ｃは、
ｃ＝Ｎ／ｎＶ      …（１６）
により与えられる。ここで、光検出領域の通過した領域の延べ体積ｎＶは、光検出領域の半径ａ（球形として近似した場合である。）、移動速度ｕ及び計測時間ｔを用いて、
ｎＶ＝πａ２ｕｔ      …（１７）
となるので、発光粒子濃度ｃは、
ｃ＝Ｎ／πａ２ｕｔ      …（１８）
により算出される。一方、並進拡散の遅い発光粒子の場合、一つの周期信号の群の信号数がｋ個だったとすると、光検出領域が所定の経路をｋ回循環すると、空間に存在する粒子が入れ替わると考えることができる（実際の計測に於いて、一つの周期信号の群の信号数には、ばらつきがあるので、ｋの値は、一群当たりの信号数の平均値であると考えてよい。）。従って、光検出領域が体積Ｖの経路をｎ回循環したときに通過した領域の正味の体積Ｕは、
Ｕ＝ｎＶ／ｋ      …（１９）
であると考えられる。従って、光検出領域が体積Ｖの経路をｎ回循環したときの周期信号の群の数がＪであるとき、発光粒子濃度ｃは、
ｃ＝Ｊ／（ｎＶ／ｋ）      …（２０）
により与えられる。ところで、周期信号の総数Ｍは、Ｊ×ｋであるので、結局、発光粒子濃度ｃは、
ｃ＝Ｍ／ｎＶ      …（２１）
となり、周期信号の総数Ｍを光検出領域の通過した領域の延べ体積ｎＶで除した値により算出できることとなる。なお、上記の濃度の算出に於いて、光検出領域が循環する経路の体積の決定は、特許文献４〜９に記載されている方法と同様の方法によって理論的に又は実験的に為されてよい。
【００５０】
上記の一連の処理に於いて、光計測は、一定の計測時間に亘って又は一定検出数まで実行されてよい。また、試料溶液に対して、任意の処理（加熱・物の添加・光照射など）を行う前後に於いて測定を行うことにより、二種類の粒子の検出数の変化から、与えられた処理に対する作用効果を観測することが可能となる。更に、粒子の状態が時間と共に変化する試料溶液について、任意のタイミングで複数回測定を実行することにより、粒子の状態の経時変化の観測が可能となる。
【００５１】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００５２】
蛍光標識されたＤＮＡ（並進拡散の速い発光粒子）が表面に結合されたビーズ（並進拡散の遅い発光粒子）に対して、ＤＮＡを制限酵素で切断する処理を行い、遊離した蛍光標識されたＤＮＡとビーズとが別々に検出可能であることを検証した。
【００５３】
観測対象の粒子としては、図７（Ａ）に描かれている如く、一本鎖のＤＮＡ分子（標的ＤＮＡ（Ｔ））に、その一部と相補的な塩基配列を有し５’末端に蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎが修飾されたプローブＤＮＡ（Ｐ）と、標的ＤＮＡ（Ｔ）の一部と相補的な塩基配列を有し３’末端にビオチンが修飾されたプローブＤＮＡ（Ｒ）とを会合させた試験ＤＮＡ（Ａ）と、前記のプローブＤＮＡ（Ｐ）とプローブＤＮＡ（Ｒ）とを、図７（Ｂ）に描かれている如く、一本鎖のＤＮＡであって標的ＤＮＡ（Ｔ）とは塩基配列の一部が異なった擬標的ＤＮＡ（Ｔｘ）に同様に会合させ塩基対の非会合領域ｍＭを有する試験ＤＮＡ（Ｂ）とを調製した。そして、これらの試験ＤＮＡを、図７（Ｃ）、（Ｄ）に描かれている如く、表面にステレプトアビジン修飾が為された磁気ビーズ上にて（アビジン−ビオチン結合により）結合させ、しかる後に、制限酵素を作用させた。この場合、塩基対の非会合領域ｍＭのない試験ＤＮＡ（Ａ）は、制限酵素による切断反応によって切断され、これにより、蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎを担持するＤＮＡが遊離することとなる（図中、ｆＦＤ）。一方、塩基対の非会合領域ｍＭのある試験ＤＮＡ（Ｂ）は、制限酵素による切断反応は生じず、蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎは、ＤＮＡを介して磁気ビーズ上に連結されたままとなる。従って、上記の本発明による操作分子計数法による計測に於いて、試験ＤＮＡ（Ａ）を含む試料溶液では、周期信号と非周期信号とがそれぞれ有意に検出される一方（制限酵素によるＤＮＡの切断効率は、１００％ではないので、ビーズも発光粒子として検出される。）、試験ＤＮＡ（Ｂ）を含む試料溶液では、周期信号のみ有意に検出されることが期待される。
【００５４】
実際の実験に於いて、標的ＤＮＡ（Ｔ）、擬標的ＤＮＡ（Ｔｘ）、プローブＤＮＡ（Ｐ）、プローブＤＮＡ（Ｒ）として、下記の塩基配列を有するものを準備した。
標的ＤＮＡ（Ｔ）：GACTGAATATAAACTTGTGGAGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT
擬標的ＤＮＡ（Ｔｘ）：AGACTGAATATAAACTTGTGGAGCATGGGAAAGTCCCCTCAACT
プローブＤＮＡ（Ｐ）：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC
プローブＤＮＡ（Ｒ）：
ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG
そして、これらのＤＮＡを、それぞれ、１０ｎＭとなるように反応溶液(10mM  Tris-HCl,  400mM  NaCl,  0.05%  Triton X-100）に溶解して、標的ＤＮＡ（Ｔ）とプローブＤＮＡ（Ｐ）とプローブＤＮＡ（Ｒ）を含む試料溶液（Ａ）と、擬標的ＤＮＡ（Ｔｘ）とプローブＤＮＡ（Ｐ）とプローブＤＮＡ（Ｒ）を含む試料溶液（Ｂ）とを調製した。これらの溶液は、サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分インキュベート後、２５℃まで温度を落とし３０分インキュベートした。その後、２００μＬのこれらの溶液に対して２μｇ(16amol相当)の磁気ビーズ(estapor（登録商標)BE-M08/0,3:millipore)を添加し、室温で５分間振とうさせて、アビジン−ビオチン結合によりＤＮＡをビーズに結合させた。なお、磁気ビーズは、洗浄溶液(10mM  Tris-HCl,  400mM  NaCl,  0.05%  Triton
X-100）にて３回洗浄したものを用いた。しかる後、ＤＮＡの結合したビーズを、それぞれ、１００μＬの洗浄溶液で５回洗浄した後、０．２５Ｕの制限酵素ＳｃｒＦ１（Newengland  Biolabs:R0110S）を含む反応溶液２０μＬを加えて３７℃にて１分間の加熱処理を行った。
【００５５】
光測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。光強度の計測に於いては、励起光は、６４２ｎｍのレーザー光（出力１ｍＷ）を用い、検出光波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて６５０〜９００ｎｍとした。測定は、２０秒間に亘って、試料溶液中に於ける光検出領域をミラー偏向器によって１５ｍｍ／ｓの速度にて移動しながら（移動周期６６６６μ秒）、５回、行った。なお、フォトンカウンティングのＢＩＮ  ＴＩＭＥは１０μ秒とした。かくして、得られた時系列のフォトンカウントデータに於ける発光粒子の信号の検出処理に於いては、まず、スムージング処理(Savisky-Golay法に従って１３のデータ点にて移動平均を取る処理を５回繰り返した。)を行い、スムージングされたデータの一次微分値を用いてパルス状信号の存在する領域（パルス存在領域）を特定した。そして、かかる特定されたパルス存在領域に対して最小二乗法によりガウス関数をフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定し、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜２００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス状信号を、発光粒子の信号の特徴を有する信号として判別した。そして、各信号について、光検出領域の移動周期６６６６μ秒（光検出領域の移動周期）の整数倍±５０μ秒に信号が存在する信号を周期信号として抽出し、単発の信号を非周期信号として抽出した。
【００５６】
図８（Ａ）〜（Ｃ）は、上記の実験に於いて検出された周期信号及び非周期信号の数を示している。まず、周期信号の検出数（図８（Ａ）の白抜き棒グラフ）及び周期信号の群数（図８（Ａ）の黒塗り棒グラフ）について、標的ＤＮＡ（Ｔ）から成る試験ＤＮＡ（Ａ）を含む試料溶液Ａ（Ｔ）と、擬標的ＤＮＡ（Ｔｘ）から成る試験ＤＮＡ（Ｂ）を含む試料溶液Ｂ（Ｔｘ）とに於いて、検出数に有意な差は見られなかった。また、一つの周期信号の群当たりの信号数についても、大きな差が見られなかった（エラーバーの範囲が重複した。）。これに対し、図８（Ｃ）を参照して、非周期信号の検出数については、試料溶液Ａ（Ｔ）は、有意に検出されたのに対して、試料溶液Ｂ（Ｔｘ）では、ほとんど検出されなかった。周期信号は、ビーズに対応し、非周期信号は、遊離ＤＮＡに対応すると考えられるので、上記の結果は、標的ＤＮＡ（Ｔ）から成る試験ＤＮＡ（Ａ）については、制限酵素による切断反応が生じたが、擬標的ＤＮＡ（Ｔｘ）から成る試験ＤＮＡ（Ｂ）については、切断反応が生じなかったことを示しており、これにより、本発明の方法により、ビーズと遊離ＤＮＡとが別々に検出可能であり、また、ＤＮＡの制限酵素による切断反応の有無が検出可能であることが示された。また、上記の結果に於いて、式（１６）により算出される遊離ＤＮＡの濃度は、１．４ｐＭであり、式（２１）により算出されるビーズの濃度は、２．４ｐＭ（試料溶液Ａ）、２．５ｐＭ（試料溶液Ｂ）であった。（光検出領域の半径は、２μｍと概算し、循環回数は、３０００回と概算した。）試料溶液の調製時のビーズの使用量から算定されるビーズの濃度は、４ｐＭであるので、上記の結果は、式（２１）によって、周期信号に対応する粒子の濃度が概算可能であることを示している。
【実施例２】
【００５７】
蛍光標識されたビオチンが、アビジン−ビオチン反応によりストレプトアビジン修飾されたビーズの表面に結合する系に於いて、遊離した蛍光標識されたビオチン（並進拡散の速い発光粒子）と、表面に蛍光標識されたビオチンが結合したビーズ（並進拡散の遅い発光粒子）とが別々に検出可能であることを検証した。
【００５８】
図９（Ａ）〜（Ｄ）を参照して、試料として、蛍光標識されたビオチン（蛍光標識ビオチンＦＤｂ）とストレプトアビジンｓＡにて表面が修飾されたビーズ（修飾ビーズ）Ｂと、ストレプトアビジンの修飾のないビーズ（未修飾ビーズ）Ｂとを用意し、蛍光標識ビオチンＦＤｂを修飾ビーズＢと未修飾ビーズＢとのそれぞれに添加した。そうすると、未修飾ビーズＢの場合には、ビオチンＦＤｂは遊離したままの状態で、未修飾ビーズＢには吸着せず（図９（Ｃ））、修飾ビーズＢの場合には、ビオチンＦＤｂはビーズ表面に吸着し（図９（Ｄ））、ビーズは発光粒子として検出可能となる。従って、上記の本発明による操作分子計数法による計測に於いて、蛍光標識ビオチンＦＤｂと未修飾ビーズＢとを含む試料溶液では、実質的に非周期信号のみが検出され、蛍光標識ビオチンＦＤｂと修飾ビーズＢとを含む試料溶液では、非周期信号と周期信号とがそれぞれ有意に検出されること（蛍光標識ビオチンＦＤｂの全てがビーズＢに吸着しないため）が期待される。
【００５９】
実験に於いて、反応溶液（10mM  Tris-HCl,  400 mM  NaCl,  0.05%  Triton X-100）中で１ｐＭ  ＡＴＴＯ４８８−ビオチンと１ｍｇ/ｍＬ（３７０ｆＭ）のステレプトアビジン修飾ポリスチレンビーズ（sphero（登録商標）:SVP-20-5)とを混合させた試料溶液ｓＡＰＢと、反応溶液中で１ｐＭ  ＡＴＴＯ４８８−ビオチンと１ｍｇ/ｍＬ（３７０ｆＭ）の（ステレプトアビジン修飾のない）ポリスチレンビーズ（sphero（登録商標）: CP-20-10)とを混合させた試料溶液ＰＢとを調製した。
【００６０】
光測定及び信号の検出は、実施例１と同様に行った。ただし、励起光には、４８８ｎｍの１ｍＷのレーザー光を用い、バンドパスフィルターにより５１０−５６０ｎｍの蛍光を検出した。
【００６１】
図１０（Ａ）、（Ｂ）を参照して、結果に於いて、同図から理解される如く、周期信号については、試料溶液ｓＡＰＢに於いて高い検出数が得られ、試料溶液ＰＢに於いては、検出数はわずかであった。一方、非周期信号に於いては、試料溶液ｓＡＰＢ及び試料溶液ＰＢの双方について、有意な検出数が得られ、試料溶液ｓＡＰＢの検出数は、試料溶液ＰＢの検出数よりも大幅に低かった。濃度に換算すると、遊離した蛍光標識ビオチンＦＤｂの濃度は、試料溶液ＰＢでは、６９０ｆＭであり、試料溶液ｓＡＰＢでは、２２０ｆＭであった。試料溶液ＰＢの溶液に於いては、蛍光標識ビオチンのビーズへの結合は、わずかな非特異的な吸着によるものであると考えられるので、上記の遊離した蛍光標識ビオチンＦＤｂの濃度の差は、蛍光標識ビオチンＦＤｂがビーズに吸着したことによる遊離した蛍光標識ビオチンＦＤｂの減少のためであると考えられる。また、修飾ビーズＢのみが発光粒子として有意に検出されたことは、アビジン−ビオチン反応により蛍光標識ビオチンＦＤｂがビーズに吸着したことを示唆している。即ち、本発明の方法により、アビジン−ビオチン反応の有無が検出可能であることが示された。
【００６２】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、本発明の教示に従って、走査分子計数法に於いて周期信号と非周期信号とを区別して検出することにより、並進拡散の遅い粒子と並進拡散の速い粒子とを区別して検出することが可能となり、これにより、粒子の結合又は解離状態或いはそれらの反応の有無を顕著に検出できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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