(57)【要約】      （修正有）【課題】藻類由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法の提供。【解決手段】宿主に下記のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。（ａ）特定な配列からなるアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。（１）特定な配列からなるアミノ酸配列の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。（２）特定な配列からなるアミノ酸配列の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。（３）特定な配列からなるアミノ酸配列の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。（４）特定な配列からなるアミノ酸配列の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記宿主が微生物である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が微細藻類である、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が大腸菌である、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
前記脂質が炭素数１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記脂質中に、炭素数１２の脂肪酸が５質量％以上含有される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項８】
前記宿主が微生物である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
前記微生物が微細藻類である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記微生物が大腸菌である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１１】
下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体及びこれを用いた脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されており、例えば、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の食品の中間原料や、その他各種の工業製品の添加剤、中間原料として利用されている。また、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。例えば、アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。
【０００３】
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California  bay））由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル−ＡＣＰ型チオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、珪藻網等でわずかに報告例があるのみである（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平７−５０１９２４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Voelker  TA,  Worrell  AC,  Anderson  L,  Bleibaum  J,  Fan  C,  Hawkins  DJ,  Radke  SE,  Davies  HM.,  “Fatty  acid  biosynthesis  redirected  to  medium  chains  in  transgenic  oilseed  plants”,  Science.  1992  Jul  3;257(5066),  p.72-74.
【非特許文献２】Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  (PtTE)  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列を改変したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、及びこれを用いた脂質の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を導入し脂質の生産能が向上した形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行い、ナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列にランダムな変異を導入し、複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を得た。そして、これらを用いて形質転換を行った結果、いくつかの形質転換体において、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体と比較して、脂質、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸の生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
また、本発明は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（以下、「本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体」ともいう。）に関する。
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の形質転換体は、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体に比べ、脂質、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸の生産能に優れる。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の脂質の製造方法は、炭素数１２又は１４の脂肪酸及びこれらを構成成分とする脂質の生産性に特に優れる。本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸及び脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。
【００１３】
１．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を一部改変したアミノ酸配列を有し、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。配列番号１は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼともいい、ＮｏＴＥとも略記する）のアミノ酸配列である。
アシル−ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
【００１４】
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体として、具体的には下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１５】
前記（ａ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を少なくとも有する。本発明者らは、配列番号１に示す野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列において、１２８位〜２８７位の領域は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能するために重要で、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すために必要十分な領域であることを見出した。配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。前記（ａ）のタンパク質は、このアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性にとって必要十分な領域を有し、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能する。
さらに、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列では、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列中の、配列番号１の１５０位、２００位、２２２位、及び２４５位から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が、下記（１）〜（４）のように置換されている。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）からグリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）に置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）からアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）からセリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、又はアスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）からアラニン（Ａｌａ；Ａ）に置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）からリジン（Ｌｙｓ；Ｋ）に置換。
例えば、前記（１）のアミノ酸置換を有する場合、（ａ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の１５０位に相当するアミノ酸であるグルタミン酸がグリシンで置換されたアミノ酸配列である。
【００１６】
以下、配列番号１の１５０位に相当するアミノ酸が、グリシンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｅ１５０Ｇ）、２００位に相当するアミノ酸が、アスパラギン酸に置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｎ２００Ｄ）、２２２位に相当するアミノ酸が、セリンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｎ２２２Ｓ）、２２２位に相当するアミノ酸が、アラニンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｎ２２２Ａ）、２４５位に相当するアミノ酸が、リジンに置換されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をＮｏＴＥ（Ｒ２４５Ｋ）、とそれぞれ略記する。
【００１７】
前記（ａ）のタンパク質は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の他に、他のアミノ酸配列を有していてもよい。他のアミノ酸配列としては、配列番号１の１位〜１２７位のアミノ酸配列若しくはその一部の配列、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド配列等が挙げられる。これらの配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。他のアミノ酸配列は、脂質生産性の観点から、配列番号１の１位〜１２７位のアミノ酸配列若しくはその一部の配列が好ましい。
【００１８】
前記（ａ）のタンパク質として好ましくは、配列番号１の１位〜１２８位の間の任意の位置から２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１の４９位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の５８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の７８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８７位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の９８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１０８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１１８位〜２８７位までのアミノ酸配列、又は配列番号１の１２８位〜２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。なお、配列番号１のアミノ酸配列、並びに配列番号１において４９位〜２８７位、５８位〜２８７位、７８位〜２８７位、８７位〜２８７位、８８位〜２８７位、９８位〜２８７位、及び１０８位〜２８７位、１２８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００１９】
また、前記（ａ）のタンパク質は、前記（１）〜（４）から選ばれるいずれか１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。
【００２０】
前記（ｂ）のタンパク質は、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列の一部に欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。ただし、欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸は、前記（ａ）において前記（１）〜（４）から選ばれるアミノ酸置換が施されたアミノ酸以外のアミノ酸である。例えば、（ａ）のタンパク質が前記（１）のアミノ酸置換を有する場合、（ｂ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の１５０位に相当するアミノ酸がアスパラギン酸からバリンで置換され、さらに、当該配列中の該置換が施された１５０位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である。
【００２１】
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部欠失等により変化した改変体を用いることができる。
アミノ酸配列に欠失等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。
【００２２】
前記（ｂ）のタンパク質において、「１又は数個のアミノ酸」は、脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。
【００２３】
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L,  Voelker  TA,  Hawkins  DJ.  “Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1995  Nov  7;92(23),  p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００２４】
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に合成等することもでき、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）からクローニングによって取得したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を遺伝子組み換え技術により改変したものを用いることで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を得ることができる。
【００２５】
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子
前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子として具体的には、下記（Ａ）及び（Ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列において、下記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（i）  配列番号２の４４８位〜４５０位の塩基がグルタミン酸をコードする塩基からグリシンをコードする塩基に置換。
（ii）  配列番号２の５９８位〜６００位の塩基がアスパラギンをコードする塩基からアスパラギン酸をコードする塩基に置換。
（iii）  配列番号２の６６４位〜６６６位の塩基がアスパラギンをコードする塩基からセリンをコードする塩基、又はアスパラギンをコードする塩基からアラニンをコードする塩基に置換。
（iv）  配列番号２の７３３位〜７３５位の塩基がアルギニンをコードする塩基からリジンをコードする塩基に置換。
（Ｂ）  （Ａ）のＤＮＡの塩基配列において、塩基置換された塩基以外の１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２６】
配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス  オキュラータ由来の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。
【００２７】
前記（Ａ）のＤＮＡは、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列に相当する塩基配列の他に、他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、配列番号２の１位〜３８１位の塩基配列若しくはその一部の配列、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド配列をコードする塩基配列等が挙げられる。これらの配列は、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列の５’末端側に付加されることが好ましい。他の塩基配列は、脂質生産性の観点から、配列番号２の１位〜３８１位の塩基配列若しくはその一部の配列が好ましい。
【００２８】
前記（Ａ）のＤＮＡとして好ましくは、配列番号２の１位〜３８２位の間の任意の位置から８６４位までの塩基配列において前記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。より好ましくは、配列番号２の塩基配列、配列番号２の１４５位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の１７２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２３２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２５９位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２６２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の２９２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の３２２位〜８６４位までの塩基配列、配列番号２の３５２位〜８６４位までの塩基配列、又は、配列番号２の３８２位〜８６４位までの塩基配列において前記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２９】
前記（Ａ）のＤＮＡは、前記（i）〜（iv）から選ばれるいずれか１つの塩基置換を有することが好ましい。
【００３０】
前記（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列において、「１又は数個の塩基」は、脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。
欠失等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００３１】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子の調製方法の一例としては、まず、ナンノクロロプシス  オキュラータ（Nannochloropsis oculata）  NIES2145株よりクローニングした野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２で示される塩基配列）を、In-Fusion（登録商標）  HD  Cloning  Kit（Clonthech,  Mountain  View,  California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列において前記（１）〜（４）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９４℃で３０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃で約３０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７２℃で約７０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル行うことが挙げられる。
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
【００３２】
３．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体に比べ、脂質の生産能、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体と比べ、脂質中の脂肪酸組成が改変される。なお、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００３３】
本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００３４】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ  エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis  sp．、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００３５】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（前記非特許文献２参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian,  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America,  Dec  27;108(52),  2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００３６】
プロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子（チューブリン、アクチン、ユビキチン等）のプロモーター、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００３７】
上記ベクターにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００３８】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００３９】
４．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
【００４０】
培養又は生育条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養又は生育条件を使用できる。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００４１】
一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００４２】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００４３】
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００４４】
本発明の製造方法では、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を用いることで、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた場合と比べ、脂質の生産性、特に炭素数１２又は１４の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性を有意に向上させることができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、炭素原子数１２〜１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数１２〜１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、炭素原子数１２の脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがよりさらに好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
採取された総脂質成分中の炭素原子数１２〜１４の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは２５質量％以上である。さらに、採取された総脂質成分中に含まれる炭素原子数１２の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは５質量％以上、より好ましくは７質量％以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
【００４５】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００４６】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質を開示する。
【００４７】
＜１＞  宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（ａ）  配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１）  配列番号１の１５０位のアミノ酸がグルタミン酸からグリシンに置換。
（２）  配列番号１の２００位のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に置換。
（３）  配列番号１の２２２位のアミノ酸がアスパラギンからセリン又はアラニンに置換。
（４）  配列番号１の２４５位のアミノ酸がアルギニンからリジンに置換。
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００４８】
＜２＞  前記宿主が微生物である、＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞  前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類である、＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞  前記微生物が大腸菌である、＜２＞項記載の製造方法。
＜５＞  前記脂質が炭素数１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜６＞  前記脂質中に、炭素数１２の脂肪酸が５質量％以上含有される、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜７＞  前記（ａ）のタンパク質が、配列番号１の１位〜１２８位の間の任意の位置から２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜８＞  前記（ａ）のタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１の４９位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の５８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の７８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８７位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の８８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の９８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１０８位〜２８７位までのアミノ酸配列、配列番号１の１１８位〜２８７位までのアミノ酸配列、又は配列番号１の１２８位〜２８７位までのアミノ酸配列において前記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
【００４９】
＜９＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜１０＞  前記宿主が微生物である、＜９＞項記載の形質転換体。
＜１１＞  前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類である、＜１０＞項記載の形質転換体。
＜１２＞  前記微生物が大腸菌である、＜１０＞項記載の形質転換体。
＜１３＞  前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
【００５０】
＜１４＞  前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
【００５１】
＜１５＞  宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
＜１６＞  宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【００５２】
＜１７＞  脂質を製造するための、＜９＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
＜１８＞  前記脂質が炭素数１２の脂肪酸又はそのエステルである、＜１７＞項に記載の形質転換体の使用。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５４】
実施例
１．野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号２に示す塩基配列からなる野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＮｏＴＥ）遺伝子を鋳型として、下記表１に示す配列番号３及び配列番号４のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号２の２５９位〜８６４位までの塩基配列からなるＮｏＴＥ遺伝子断片を取得した。なお、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子は人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)（Stratagene社製、配列番号１７）を鋳型として、下記表１に示す配列番号５及び６のプライマー対を用いたＰＣＲ反応によりpBluescriptII  SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ＮｏＴＥ遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、ＮｏＴＥ遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端側１位〜８６位までのアミノ酸配列を除去し、８７位〜２８７位のアミノ酸配列で構築した。
【００５５】
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体発現プラスミドの構築
前記１．で構築したＮｏＴＥ遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号７及び配列番号８のプライマー対を用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号２の４４８位〜４５０位の塩基をＧＡＧからＧＧＧに置換することでコードする１５０位のアミノ酸をグルタミン酸からグリシンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｅ１５０Ｇ）発現プラスミドを取得した。
同様にして、配列番号９及び配列番号１０のプライマー対を用いて、配列番号２の５９８位〜６００位の塩基をＡＡＴからＧＡＴに置換することでコードする２００位のアミノ酸をアスパラギンからアスパラギン酸に変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｎ２００Ｄ）発現プラスミドを取得した。
配列番号１１及び配列番号１２のプライマー対、配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いて、配列番号２の６６４位〜６６６位の塩基をＡＡＣからＧＣＣに置換することでコードする２２２位のアミノ酸をアスパラギンからアラニンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｎ２２２Ａ）発現プラスミド、配列番号２の６６４位〜６６６位の塩基をＡＡＣからＡＧＣに置換することでコードする２２２位のアミノ酸をアスパラギンからセリンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体（Ｎ２２２Ｓ）発現プラスミドをそれぞれ取得した。
配列番号１５及び配列番号１６のプライマー対を用いて、配列番号２の７３３位〜７３５位の塩基をＣＧＣからＡＡＧに置換することでコードする２４５位のアミノ酸をアルギニンからリジンに変異させた、ＮｏＴＥ改変体発現（Ｒ２４５Ｋ）プラスミドをそれぞれ取得した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
３．ＮｏＴＥ遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
前記で構築したＮｏＴＥ遺伝子発現プラスミド、及び各ＮｏＴＥ改変体発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath  et  al，  Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。前記培養液２０μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記４．の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
【００５８】
４．大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの７−ペンタデカノンを５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置した。その後さらに、０．５ｍＬのクロロホルム及び０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍにて１５分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
【００５９】
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。測定条件を以下に示す。
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）、
移動相：高純度ヘリウム、
カラム内流量：１．０ｍＬ／分、
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）、
平衡化時間：１分間、
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１），
圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分，
注入量１μＬ、
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、
検出器温度：３００℃
【００６０】
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
ＮｏＴＥ遺伝子導入株、５つのＮｏＴＥ改変体導入株、及び陰性対照であるプラスミドベクターｐＢＳ導入株での総脂肪酸量（脂質量）及び総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を、表２及び３に示す。なお、表中の脂肪酸組成において、Ｃｘとあるのは炭素原子数ｘの脂肪酸を、ｘ：ｙとあるのは炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
表２から明らかなように、５つのＮｏＴＥ改変体導入株では、ＮｏＴＥ遺伝子導入株に比べて、総脂肪酸生産量が増加した。また、５つのＮｏＴＥ改変体導入株では、ＮｏＴＥ遺伝子導入株に比べて、総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の含有率が高かった。このことから、これらのＮｏＴＥ改変体は、野生型ＮｏＴＥに比べてＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の選択性が向上していることがわかった。
【配列表】
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