(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定する方法の提供。【解決手段】生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程とを含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
生体試料が血漿、透析廃液または尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が血漿である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生体試料が透析廃液である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が尿である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
血漿が血液透析患者由来の血漿である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
透析廃液が血液透析患者由来の透析廃液である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
透析廃液が血液透析濾過患者由来の透析廃液である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
透析廃液が腹膜透析患者由来の透析廃液である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
尿が腎不全患者由来の尿である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
尿がタンパク尿である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
工程（１）が、メタノールを用いてタンパク質を沈殿させることにより除去する工程である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
高速液体クロマトグラフに使用するカラムが、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用、およびπ-π相互作用により分離するカラムである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
カラム担体の官能基が、ペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法、より詳細には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用した生体試料（例えば、血漿、透析廃液、尿）中のビオチンまたはその関連物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチンは、ビタミンＢ群に属する水溶性ビタミンの一種であり、ビタミンＢ７またはビタミンＨとも呼ばれている。ビオチンは、生体内でカルボキシラーゼ反応の補酵素として、呼吸系、β-酸化、脂肪酸生合成などにおいて機能することが知られている。
【０００３】
近年、ビオチンと種々の疾患との関係が明らかになりつつある。例えば、ビオチンは、アトピー性皮膚炎、掌蹠膿疱症等の皮膚疾患の治療に有効であること、血液透析による四肢の痙攣に対する抑制・予防効果があること、肝硬変患者における高アンモニア血症改善、耐糖能およびインスリン抵抗性の改善、血圧上昇抑制などの効果があることが知られている。他にも、先天的なビオチン代謝酵素欠損や抗痙攣薬の長期投与、特殊調製粉乳の摂取乳児等にビオチン欠乏症が発症することが知られている（特許文献１、非特許文献１〜１０など）。
したがって、健康管理や疾患の診断、ビオチンの体内動態に関する研究のため、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することが必要とされている。
【０００４】
一方、ビオチンの測定法としては、微生物学的定量法、結合アッセイ法、ＨＰＬＣ法、光学的測定法などが知られている。しかしながら、微生物学的定量法は精度が低い、操作が煩雑で時間を要することなどの問題があり、結合アッセイ法はビオチン関連物質（例えば、ビオチン代謝物）とも非特異的に反応するなどの問題があり、光学的測定法およびＨＰＬＣ法は感度が低いなどの問題がある（非特許文献１１）。
また、ＨＰＬＣ法で感度を高めるため、プレカラムやポストカラムによる誘導体化などが採用されているが（特許文献２など）、工程が煩雑であり、簡便ではなかった。
【０００５】
また、高速液体クロマトグラフ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）または高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いたビオチンの測定法も知られている（非特許文献１２〜２３）。しかしながら、これらの文献に記載の測定法は、主として食品などを対象としたものであり、また、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開２０１２／０２９６５５号
【特許文献２】特開２０１２-１２２７６９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tohoku J Exp Med. (2012) 227 217-223.
【非特許文献２】Acta Pediatr Scand. (1988) 77 762-3.
【非特許文献３】診断と治療、80巻 1397-1402 1992
【非特許文献４】医学のあゆみ、Vol.186 No.2 156-7 1998
【非特許文献５】Ren Fail. (1996) 18(1) 131-137
【非特許文献６】J Clin Biochem Nutr. (1995) 18， 35-42.
【非特許文献７】British Journal of Nutrition. (2008) 99， 756-63
【非特許文献８】ビタミン、86巻、12号、678-84、2012
【非特許文献９】Adv Pediatr. (1991) 1-21
【非特許文献１０】Neulrology. (1997) 49 1444-7
【非特許文献１１】A Government Chemist Programme Report LGC Limited 2011.9
【非特許文献１２】Agro Food Ind Hi-Tech. (2010) 21(6) 39-41.
【非特許文献１３】Anal Bioanal Chem. (2010) 397(2) 471-81.
【非特許文献１４】Chromatographia. (2009) 69 629-35.
【非特許文献１５】Rapid Commun Mass Spectrom. (2008) 22(13) 2029-43.
【非特許文献１６】J Chromatogr Sci. (2008) 46 225-32.
【非特許文献１７】Anal Bioanal Chem. (2007) 387 2441-2448.
【非特許文献１８】J Chromatography A. (2007) 1142 231-35.
【非特許文献１９】Curr Eye Res. (2006) 31(10) 797-809.
【非特許文献２０】J Chromatography B. (2006) 831 8-16.
【非特許文献２１】Anal Commun. (1996) 33 159-162.
【非特許文献２２】ASEAN Food Journal. (1991) 6(4) 163-4.
【非特許文献２３】J Chromatogr. (1984) 303(1) 272-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定する方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体試料中のタンパク質を除去した後、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定することで、生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
したがって、本発明は、以下の態様を含む。
［１］  生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法。
［２］  生体試料が血漿、透析廃液または尿である、上記［１］に記載の方法。
［３］  生体試料が血漿である、上記［２］に記載の方法。
［４］  生体試料が透析廃液である、上記［２］に記載の方法。
［５］  生体試料が尿である、上記［２］に記載の方法。
［６］  血漿が血液透析患者由来の血漿である、上記［３］に記載の方法。
［７］  透析廃液が血液透析患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［８］  透析廃液が血液透析濾過患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［９］  透析廃液が腹膜透析患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［１０］  尿が腎不全患者由来の尿である、上記［５］に記載の方法。
［１１］  尿がタンパク尿である、上記［５］に記載の方法。
［１２］  工程（１）が、メタノールを用いてタンパク質を沈殿させることにより除去する工程である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］  高速液体クロマトグラフに使用するカラムが、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用、およびπ-π相互作用により分離するカラムである、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］  カラム担体の官能基が、ペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を含む、上記［１２］に記載の方法。
［１５］  生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定法によれば、生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができる。
すなわち、本発明の測定法の感度は、市販されている代表的な結合アッセイキットと同等の感度でビオチンおよびビオチン関連物質を測定が可能である。また、ＨＰＬＣでの分離に加えて、ＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）で分子量によるフィルタリングも行なっているので、微生物学的定量法や結合アッセイなどのように、ビオチンとビオチン関連物質（ビオチン代謝物など）との交差性はほとんどないと考えられる。
また、試料の前処理は、除タンパク質法であり、従来のＨＰＬＣによるビオチン血漿測定法の前処理において使用されていた誘導体化などが不要であるので、容易かつ短時間で前処理を行うことができる。
従来のＨＰＬＣ法では、ヒト血漿の場合、ビオチンの保持時間は早いものでも７〜８分であり、１検体の測定にほとんどが数十分から１時間程度の時間を要していたが、本発明の測定法では、１検体の分析サイクルは５分程度（ビオチンの保持時間は２分未満）と短いため、効率的な多検体処理が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】血漿試料および検量線試料（０．１ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す（分析カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３）。Ａ：検量線試料中ビオチンピーク（定量下限（ＬＬＯＱ）、０．１ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ヒト血漿中ビオチンピーク、Ｃ：検量線試料中ｒａｃビオチン-ｄ４内標準物質（ＩＳ）ピーク（２ｎｇ／ｍＬ）、Ｄ：ヒト血漿中ｒａｃビオチン-ｄ４ ＩＳピーク
【図２】検量線の結果を示す（分析カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３）。
【図３】ビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のＭＲＭクロマトグラムを示す（分析カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３）。Ａ：ビオチンのＭＲＭクロマトグラム（添加量０．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ｒａｃビオチン-ｄ４のＭＲＭクロマトグラム（添加量２ｎｇ／ｍＬ）
【図４】血漿試料および検量線試料（０．０５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。Ａ：検量線試料中ビオチンピーク（ＬＬＯＱ、０．０５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ヒト血漿中ビオチンピーク、Ｃ：検量線試料中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク（４０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄ:ヒト血漿中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク
【図５】検量線の結果を示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。
【図６】ビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のＭＲＭクロマトグラムを示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。Ａ: ビオチンのＭＲＭクロマトグラム（添加量０．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ｒａｃビオチン-ｄ４のＭＲＭクロマトグラム（添加量４０ｎｇ／ｍＬ)
【図７】血液透析患者血漿中のビオチン測定における、固定相がＯＤＳ（Ｃ１８）であるカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３）を用いた分析法とペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）カラム（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ）を用いた分析法によるＭＲＭクロマトグラムの比較を示す。
【図８】血液透析廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。Ａ：検量線試料中ビオチンピーク（０．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ビオチン測定用血液透析廃液（ＨＤ３）中ビオチンピーク、Ｃ：検量線試料中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク（４０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄ: 妨害ピーク確認用血液透析廃液（ＨＤ３）中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク
【図９】血液透析濾過廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。Ａ：検量線試料中ビオチンピーク（０．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ビオチン測定用血液透析濾過廃液（ＨＤＦ廃液）中ビオチンピーク、Ｃ：検量線試料中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク（４０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄ: 妨害ピーク確認用血液透析濾過廃液（ＨＤＦ廃液）中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク
【図１０】腹膜透析廃液試料中および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。Ａ：検量線試料中ビオチンピーク（０．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ビオチン測定用腹膜透析廃液（ＰＤ廃液）中ビオチンピーク、Ｃ：検量線試料中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク（４０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄ: 妨害ピーク確認用腹膜透析廃液（ＰＤ廃液）中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク
【図１１】尿試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す（分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ）。Ａ：検量線試料中ビオチンピーク（２．０ｎｇ／ｍＬ）、Ｂ：ビオチン測定用尿（尿３）中ビオチンピーク、Ｃ：検量線試料中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク（４０ｎｇ／ｍＬ）、Ｄ: 妨害ピーク確認用 尿中（尿３）中ｒａｃビオチン-ｄ４（ＩＳ）ピーク
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法に関するものである。
【００１４】
本発明における「生体試料」とは、ヒト、動物、または植物から得られる、尿、血液、血漿、組織、細胞などの材料を含む試料を意味し、本発明の方法により測定可能な試料であれば特に限定されない。なかでも、血漿および尿が好ましく、血漿が特に好ましい。さらに、透析廃液のように、生体由来成分が含まれる試料も本発明の「生体試料」として好適に用いられる。
なかでも、ヒト由来の生体試料が好ましい。ヒトとしては、健常者であっても、種々の疾患を患う患者、例えば、腎不全患者、血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者などであってもよいが、ビオチン量の欠乏および過剰による影響を受けやすいことから、特に血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者が挙げられる。
血漿は、血液に含まれる液体成分の一つで血液の５５％を占める。血清とフィブリノーゲンから成り、物質の輸送、ガス交換、血液凝固、免疫に関与するほか、浸透圧や水素イオン濃度の調節などによって内部環境を整えるのに重要な役割を果たしている。
本発明における「血漿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物の血液由来のものが挙げられる。また、その調製方法も特に限定されず、従来既知の方法を用いることができる。好ましくは、採血後、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡ-２Ｎａ、ＥＤＴＡ-２Ｋ等）入りのプラスチックチューブに移し、氷冷化で保存し、４℃で遠心分離後、採取する。なかでも、ヒトの血漿が好ましい。ヒトとしては、健常者、血液透析患者、ビオチン欠乏症患者等が挙げられ、特に血液透析患者が挙げられる。
透析廃液は、血液浄化療法により透析患者血液中の老廃物の除去や電解質濃度の調整等を行った後の透析液であり、透析患者血液中の低分子代謝物等が含まれている。血液透析患者は合併症として貧血症状を有しており、採血は最小限にすることが望ましいとされている。そのため、非侵襲性に採取可能な透析廃液で透析患者の血中代謝物濃度を測定することは患者に負担を与えることがなく、さらに、高分子フィルターを通過した除蛋白試料であることから分析が容易であるといった利点がある。しかしながら、これまで透析廃液中のビオチンを測定した例はなかった。
本発明における「透析廃液」としては、特に限定されず、腎不全患者、血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者などの血液浄化療法が必要な患者に対する、血液透析、腹膜透析、血液濾過、血液透析濾過（ＨＤＦ）、持続的血液透析濾過などの血液浄化療法から生じる廃液が挙げられる。
尿は、腎臓において血液が濾過されることにより作られる排泄物であり、体内で生産される老廃物の除去や体内の水分量を調整する働きを持つ。成分のほとんどが水分であり、他に尿素や電解質等を含む。
本発明における「尿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物由来のものが挙げられる。なかでも、ヒトの尿が好ましい。ヒトとしては、健常者、排尿が確認される初期の腎不全患者や血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者等が挙げられ、特に腎不全患者が挙げられる。
【００１５】
ビオチンは、下記の構造式で示される化合物（分子式：Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４４．３１）であり、ビタミンＢ群に属する水溶性ビタミンの一種であり、ビタミンＢ７またはビタミンＨとも呼ばれている。
ビオチンの構造式：
【化１】
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本発明における「ビオチン関連物質」としては、例えば、ビオチンスルフォキシド、ビオチンスルフォン、ビスノルビオチン、ビスノルビオチンメチルケトン、ビオシチン、α-デヒドロビオチン、ホモビオチン、ノルビオチンなどのビオチンの代謝物、誘導体、類縁体などが挙げられる。
また、上記「ビオチン」および「ビオチン関連物質」の各種の塩も本発明の測定法の対象となる。
【００１６】
上記工程（１）は、生体試料中に含まれるタンパク質を除去する工程である。試料中にタンパク質が多量に存在すると、上記工程（２）におけるビオチンまたはビオチン関連物質の測定が困難になるためである。工程（１）としては、特に限定されないが、例えば、タンパク質の変性による不溶化、物理的な除去、浸透制限充填剤の利用などの方法が挙げられる。
「タンパク質の変性による不溶化」としては、例えば、過塩素酸、トリクロロ酢酸、メタリン酸のような酸の添加；アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノールのような有機溶媒の添加；加熱；冷却などの方法が挙げられる。
「物理的な除去」としては、例えば、メンブレンフィルターなどを使用した限外ろ過、透析チューブなどを使用した透析、超遠心分離などが挙げられる。
上記タンパク質を除去方法は、１種の方法のみでも２種以上の方法を組み合わせてもよい。
【００１７】
工程（１）としては、タンパク質と結合したビオチンを遊離させる点から、特に、有機溶媒の添加によりタンパク質を不溶化（沈殿）させ、除去することが好ましい。有機溶媒としては、特に、ビオチンの回収率の点から、メタノールが好ましい。
生体試料中に有機溶媒（例えばメタノール）を添加してタンパク質を除去する場合、例えば、以下の手順および条件で行うことが好ましい。
まず、生体試料中に対して所定量のメタノールを混合し、該混合物を所定の時間撹拌する。メタノールの添加量は生体試料の量に基づいて定めることができる。通常、生体試料に対して、メタノールを通常等量〜１００倍量、好ましくは等量〜１０倍量使用するが、生体試料の使用量、除タンパク効率、上清採取量および蒸発乾固後の再溶解量の点から、好ましくは生体試料５０〜５００μＬに対して、メタノールを生体試料の３〜１０倍量使用することができる。撹拌時間および温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間は１０秒〜１分間、温度は１５〜３０℃とすることができる。その後、遠心分離して沈殿を除き、上清を採取する。遠心分離は、特に限定されないが、例えば、８，０００〜１５，０００×ｇで、４℃〜３０℃、１０〜１５分間の条件で行うことができる。
【００１８】
上記工程（２）は、工程（１）で得られたタンパク質除去後の試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法（以下、「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ」と称する）を用いて測定する工程である。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、試料をＨＰＬＣで分離し、溶出成分をイオン化室に導入し、イオン化してマススペクトルを得、これを第１段目の質量分析計（ＭＳ）でイオン（分子イオンの付加体）を選択し、コリジョンセルと呼ばれる衝突室で不活性ガスを衝突させてイオンを解離させて、第２段目のＭＳで分析する方法である。
【００１９】
本発明におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳに使用する機器としては、特に限定されず、例えば、液体クロマトグラフ用の機器としては、Ｎｅｘｅｒａ（島津製作所製）、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（ウォーターズ製）などが挙げられ、タンデム質量分析用の機器としては、例えば、ＱＴＲＡＰ ５５００（エービー・サイエックス製）、ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
【００２０】
上記工程（２）におけるＨＰＬＣ用のカラムとしては、例えば、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用から選択される少なくとも１種の作用により分離するカラムが挙げられる。
疎水性相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてオクタデシル基を含むカラム（Ｃ１８カラム）、具体的には、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣＴＭ ＨＳＳ Ｔ３（ウォーターズ製）、ＹＭＣ―Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（ワイエムシィ製）などが挙げられる。
双極子-双極子相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてフッ素が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラム、具体的には、Ｆｌｕｏｆｉｘ-ＩＩ １２０Ｅ（和光純薬工業製）、Ｆｌｕｏｐｈａｓｅ ＲＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、Ｆｌｕｏｐｈａｓｅ ＷＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
π-π相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基として芳香環基（フェニル基、ビフェニル基など）を含むカラム、具体的には、Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｆｌｕｏｒｏ―Ｐｈｅｎｙｌカラム（ウォーターズ製）、Ａｌｌｕｒｅ Ｂｉｐｈｅｎｙｌ カラム（レステック製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｐｈ―３（ジーエルサイエンス製）、ＹＭＣ―Ｐａｃｋ Ｐｈ（ワイエムシィ製）、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ （ウォーターズ製）などが挙げられる。
疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラム、具体的には、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５（シグマ-アルドリッチ製）、ＴＣＩ Ｓｔｅｌｌａ ＰＦＰ（東京化成製）、Ｋｉｎｅｔｅｘ２．６μｍミニボアカラム（フェノメネクス製）、ＣＡＰＣＥＬＬ ＣＯＲＥ（資生堂製）、Ｐｕｒｓｕｉｔ ＰＦＰ（アジレント・テクノロジー製）、ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ ＰＦＰ ＸＰ Ｃｏｌｕｍｎ（ウォーターズ製）、ＹＭＣ―Ｔｒｉａｒｔ ＰＦＰ（ワイエムシィ製）、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
本発明においては、ビオチンおよびビオチン関連物質と他の成分とを明確に分離することができることから、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用により分離するカラムが好ましく、特にカラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラムが好ましい。
【００２１】
ＨＰＬＣの条件は、特に限定されず、使用するカラムに応じて、移動相、流速、カラム温度、などを決定すればよい。
例えばカラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラムを使用する場合、例えば以下の条件で行うことが好ましい。
移動相としては、ギ酸、酢酸等の揮発性の酸および／またはギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなど揮発性の塩を用いて、ｐＨを２〜８に調整した溶液と、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒との混液を使用することができる。カラム温度および流速並びに試料注入量は特に限定されないが、カラムや装置の性能に合わせて、カラム温度は２０〜５０℃、流速は０．２〜０．６ｍＬ/ｍｉｎ、試料注入量は１〜２０μＬの条件で行うことができる。
【００２２】
本発明の測定法は、上記工程（１）および（２）の二工程のみを必須工程とするものであり、従来のＨＰＬＣによるビオチン血漿測定法の前処理において使用されていた誘導体化などの工程が不要であるので、生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができる。本発明の測定法では、１検体の分析サイクルは、通常、５分程度である。したがって、効率的な多検体処理が可能であり、健康管理や疾患の診断、ビオチンの体内動態に関する研究において、有利に使用することができる。
【００２３】
本発明はまた、生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キットに関する。
当該キットに使用するための試薬（１）および機器（２）としては、上記本発明の測定法に使用する試薬および機器が挙げられる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の測定法を、実施例を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
１. 標準溶液および内標準溶液の調製
１．１ 標準原液
ビオチン（分子式：Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４４．３１、サンケミカル株式会社製）１０ｍｇを正確に量り、メタノールでメスフラスコにて１０ｍＬとし超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ/ｍＬの標準原液を調製した。
ビオチンの構造式：
【化２】
2015118029.tif 000004
１．２ 検量線用標準溶液
標準原液を下表１に従いシリコンコーティングされたガラス試験管を用いてメタノールで希釈し、検量線用標準溶液を調製した。
【００２６】
【表１】
2015118029.tif 000005
【００２７】
１．３． 内標準原液および内標準溶液
ｒａｃ ビオチン-ｄ４（分子式：Ｃ１０Ｈ１２Ｄ４Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４８．３４、トロントリサーチケミカルズ製）の１ｍｇ入り製品の容器にメタノールを１ｍＬ添加し、超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ／ｍＬの内標準原液を調製した。
ｒａｃ ビオチン-ｄ４の構造式：
【化３】
2015118029.tif 000006
この内標準原液２００μＬを２０ｍＬのメスフラスコに採取して、メタノールで２０ｍＬにメスアップし、１０μｇ／ｍＬの内標準溶液（ＩＳＳ-１）を調製した。
ＩＳＳ-１を下表２に従いメスフラスコを用いてメタノールで希釈し、内標準溶液（ＩＳＳ-３）を調製した。なお、調製量の増減は可とし、必要量に応じて同比率にて調製した。
【００２８】
【表２】
2015118029.tif 000007
【００２９】
２. 分析法検証用試料の調製
２．１． 検量線用試料
検量線用標準溶液ＳＳ-５〜ＳＳ-１０を３０μＬずつ採取し、Ｄ-ＰＢＳ（-）（細胞培養用、和光純薬工業製） ３００μＬを添加し、検量線用試料を調製した（調製濃度２、１、０．５、０．４、０．２および０．１ｎｇ／ｍＬ）。
ブランク試料およびゼロ試料はメタノール３０μＬにＤ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加した。
２．２. 血漿試料
正常ヒト血漿・プール（コスモバイオ製、抗凝固剤：ヘパリンナトリウム、以下、「ヒト血漿」と称する）３００μＬにメタノール３０μＬを添加し、血漿試料を調製した。
２．３. ビオチン添加血漿試料
検量線用標準溶液ＳＳ-４（１００ｎｇ／Ｌ）をメタノールで２倍に希釈して５０ｎｇ/ｍＬ溶液を調製後、１０ｍＬのメスフラスコに１００μＬ採取し、ヒト血漿で正確にメスアップしたビオチン濃度０．５ｎｇ／ｍＬの溶液３００μＬにメタノールを３０μＬを添加し、ビオチン添加血漿試料を調製した。
【００３０】
３. 試料前処理法
以下の手順で試料の前処理を行った。
（１）検量線用試料、ゼロ試料およびビオチン添加血漿試料には内標準溶液ＩＳＳ-３を３０μＬ添加した。ブランク試料および血漿試料にはメタノールを３０μＬ添加した。
（２）各試料にメタノールを１．２ｍＬ添加し、血漿を含まない試料は約５〜１０秒間、血漿を含む試料は約１分間撹拌した。
（３）血漿を含まない試料は１ｍＬを採取し、血漿を含む試料は４℃、１０，０００ｒｐｍ（９１７５×ｇ）で１０分間遠心し、上清を１ｍＬ採取した。
（４）５０℃で窒素ガスによる蒸発乾固を行い、残渣に１０％メタノール２００μＬを添加し、超音波洗浄器で１５分間溶解した。
（５）溶解後、ＨＰＬＣバイアルに移し、血漿を含まない試料はそのままＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。血漿を含む試料は０．２μｍのフィルター（マイレクス-ＬＨフィルターユニット、フィルター直径４ｍｍ、フィルター孔径０．２０μｍ、ＰＴＦＥ、親水性、ミリポア製）でろ過後、ＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。
【００３１】
４. 分析条件
分析には以下の機器を使用した。
【００３２】
【表３】
2015118029.tif 000008
【００３３】
４．１. ＨＰＬＣの移動相の調製
ギ酸アンモニウム６３０．６ｍｇを正確に量り、精製水でメスフラスコにて１０００ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム溶液を調製した。これにギ酸を添加してｐＨ３．０に調整して移動相Ａ液とした。
４．２. ＨＰＬＣ条件
分析カラム：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8μm、2.1×100mm)（ウォーターズ製）
ガードフィルター：KrudKatcher Ultra In-Line Filter（フェノメネクス製）
カラム温度：50℃
移動相：A液：10mmol/Lギ酸アンモニウム（pH 3.0）、B液：アセトニトリル
タイムプログラム：
0→1.5min：20%B
1.5→3.0min：80%B
3.0→5.0min：20%B（分析サイクル：5分）
流速：0.4mL/min
４．３. オートサンプラー条件
オートサンプラー設定温度：4℃
洗浄溶媒：10％メタノール
注入量：15μL
４．４. ＭＳ/ＭＳ条件
イオン化法：ESI法（ポジティブイオンモード）
イオンスプレイ電圧：5500V
ターボヒーター：700℃
カーテンガス：30psi
ネブライザーガス：30psi
デソルベーションガス：80psi
測定法：MRM
モニターイオン：
ビオチン：m/z 245＞227（CE19）
rac biotin-d4：m/z 249＞231（CE19） 
【００３４】
５. 濃度算出法
検量線用試料（６濃度：０．１、０．２、０．４、０．５、１および２ｎｇ／ｍＬ、各濃度ｎ＝１）を調製し、測定した。測定には内標準物質（ＩＳＳ-３）とのピーク面積比による内標準法により行った。定量値は、Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｅｒ．１．６．１（エービー・サイエックス製）により算出した。検量線の重み付けには１／ｘ２を用いた。
【００３５】
６. 結果
６．１. 血漿試料
図１に血漿試料および検量線試料（０．０５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す。内標準物質について、血漿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった。
６．２. 検量線
図２に典型的な検量線の結果を示す。０．１〜２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、検量線の直線性は３回の測定において相関係数（ｒ）がそれぞれ０．９９９６、０．９９９６および０．９９９８、相対誤差（％ＲＥ）はそれぞれ-２．０〜＋３．０％、-２．８〜＋２．４％、-２．３〜＋１．５％であり、判断基準（ｒ：０．９９以上、％ＲＥ：定量下限濃度で±２０％以内、その他で±１５％以内）を満たしていた。また、定量限界値は０．１ｎｇ／ｍＬであった。
６．３. ビオチンおよびｒａｃ ビオチン-ｄ４添加血漿試料
図４にビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のクロマトグラムを示す。
また、表４に得られたビオチン添加血漿試料の定量値から血漿試料（ブランク）の定量値の平均値を差し引き、真度（％ＲＥ）、精度（％ＣＶ）および回収率（％）を下記式（１）〜（３）により算出した結果を示した。０．５ｎｇ／ｍＬ添加試料において、精度（％ＣＶ）は２．２％、真度（％ＲＥ）は-３．４％であり、判断基準（％ＣＶ：１５．０％以下、％ＲＥ：±１５．０％以内）を満たしていた。
【数１】
2015118029.tif 000009
【００３６】
【表４】
2015118029.tif 000010
【００３７】
実施例２
１. 標準溶液および内標準溶液の調製
１．１. 標準原液
ビオチン１０ｍｇを正確に量り、メタノールでメスフラスコにて１０ｍＬとし超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ／ｍＬの標準原液を調製した。
１．２. 検量線用標準溶液
標準原液を下表５に従いシリコンコーティングされたガラス試験管を用いてメタノールで希釈し、検量線用標準溶液を調製した。
【００３８】
【表５】
2015118029.tif 000011
【００３９】
１．３. 内標準原液および内標準溶液
実施例１で調製した内標準溶液（ＩＳＳ-１）２００μＬを５ｍＬのメスフラスコに採取して、メタノールで５ｍＬにメスアップし、４００ｎｇ／ｍＬの内標準溶液（ＩＳＳ-４）を調製した。
【００４０】
２. 分析法検証用試料の調製
２．１. 検量線用試料
検量線用標準溶液ＳＳ-５〜ＳＳ-７およびＳＳ-９〜ＳＳ-１１を３０μＬずつ採取し、Ｄ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加し、検量線用試料を調製した（調製濃度２、１、０．５、０．２、０．１および０．０５ｎｇ／ｍＬ）。
ブランク試料およびゼロ試料はメタノール３０μＬにＤ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加した。
２．２. 血漿試料
ヒト血漿３００μＬにメタノール３０μＬを添加し、血漿試料を調製した。
２．３. ビオチン添加血漿試料
検量線用標準溶液ＳＳ-４（１００ｎｇ／Ｌ）をメタノールで２倍に希釈して５０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製し、１０ｍＬのメスフラスコに１００μＬ採取し、ヒト血漿で正確にメスアップしたビオチン濃度０．５ｎｇ／ｍＬの溶液３００μＬにメタノールを３０μＬ添加し、ビオチン添加血漿試料を調製した。
【００４１】
３. 試料前処理法
以下の手順で試料の前処理を行った。
（１）検量線用試料、ゼロ試料およびビオチン添加血漿試料には内標準溶液ＩＳＳ-４を３０μＬ添加した。ブランク試料および血漿試料にはメタノールを３０μＬ添加した。
（２）各試料にメタノールを１．２ｍＬ添加し、血漿を含まない試料は約５〜１０秒間、血漿を含む試料は約１分間撹拌した。
（３）血漿を含まない試料は１ｍＬを採取し、血漿を含む試料は４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を１ｍＬ採取した。
（４）５０℃で窒素ガスによる蒸発乾固を行い、残渣に１％ギ酸/メタノール（９/１）２００μＬを添加し、超音波洗浄器で１５分間溶解した。
（５）溶解後、ＨＰＬＣバイアルに移し、血漿を含まない試料はそのままＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。血漿を含む試料は０．４５μｍのフィルター（マイレクス-ＬＨフィルターユニット、フィルター直径４ｍｍ、フィルター孔径０．４５μｍ、ＰＴＦＥ、親水性、ミリポア製）でろ過し、ＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。
【００４２】
４. 分析条件
分析には以下の機器を使用した。
【００４３】
【表６】
2015118029.tif 000012
【００４４】
４．１. ＨＰＬＣの移動相の調製
ギ酸アンモニウム６３０．６ｍｇを正確に量り、精製水でメスフラスコにて１０００ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム溶液を調製した。また、ギ酸５００μＬをメスフラスコを用いて精製水で１０ｍＬとして、５％ギ酸溶液を調製した。ギ酸アンモニウム溶液１０００ｍＬに５％ギ酸溶液を２．８ｍＬ添加して撹拌し、ｐＨが約４．１であることを確認し、これを移動相Ａ液とした。
４．２. ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ascentis Express F5 HPLC Column (2.7μm、2.1×100mm)（シグマ-アルドリッチ製）
ガードフィルター：KrudKatcher Ultra In-Line Filter（フェノメネクス製）
カラム温度：50℃
移動相：A液：10mmol/Lギ酸アンモニウム（pH4.1）、B液：アセトニトリル
タイムプログラム：
0→2.5min：7%B
2.5→4.0min：70%B
4.0→5.0min：7%B（分析サイクル：5分）
流速：0.6mL/min
４．３. オートサンプラー条件
オートサンプラー設定温度：4℃
洗浄溶媒：10%メタノール
注入量：20μL
４．４. ＭＳ/ＭＳ条件
イオン化法：ESI法（ポジティブイオンモード）
イオンスプレイ電圧：5500V
ターボヒーター：700℃
カーテンガス：30psi
ネブライザーガス：30psi
デソルベーションガス：80psi
測定法：MRM
モニターイオン：
ビオチン：m/z 245 > 227 (CE19) 
rac ビオチン-d4：m/z 249 > 231 (CE19) 
【００４５】
５. 濃度算出法
検量線用試料（６濃度：０．０５、０．１、０．２、０．５、１および２ｎｇ／ｍＬ、各濃度ｎ＝１）を調製し、測定した。測定には内標準物質（ＩＳＳ-４）とのピーク面積比による内標準法により行った。定量値は、Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｅｒ.１.６．１（エービー・サイエックス）により算出した。検量線の重み付けには１／ｘ２を用いた。
【００４６】
６. 結果
６．１. 血漿試料
図４に血漿試料および検量線試料（０．１ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質について、血漿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった。
６．２. 検量線
図５に典型的な検量線の結果を示した。０．０５〜２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、検量線の直線性は３回の測定において相関係数（ｒ）がそれぞれ０．９９９７、０．９９９３および０．９９９７、相対誤差（％ＲＥ）はそれぞれ-４．０〜＋２．０％、-４．０〜＋３.２％、-３．５〜＋２．３％であり、判断基準（ｒ：０．９９以上、％ＲＥ：定量下限濃度で±２０％以内、その他で±１５％以内）を満たしていた。また、定量限界値は０．０５ｎｇ／ｍＬであった。
６．３. ビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料
図６にビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のクロマトグラムを示す。
また、表７に得られたビオチン添加血漿試料の定量値から血漿試料（ブランク）の定量値の平均値を差し引き、真度（％ＲＥ）、精度（％ＣＶ）および回収率（％）を上記式（１）〜（３）により算出した結果を示した。０．５ｎｇ／ｍＬ添加試料において、精度（％ＣＶ）は２．２％、真度（％ＲＥ）は-３．４％であり、判断基準（％ＣＶ：１５．０％以下、％ＲＥ：±１５．０％以内）を満たしていた。
【００４７】
【表７】
2015118029.tif 000013
【００４８】
実施例３
健常人および透析患者の血漿中ビオチン濃度を固定相がオクタデシルシリル（ＯＤＳ）（Ｃ１８）であるカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３、ウォーターズ製）を用いた分析法（以下、「ＯＤＳ法」）、ペンタフルオロフェニル(ＰＦＰ)カラム（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ、シグマ-アルドリッチ製）を用いた分析法（以下、「ＰＦＰ法」）により測定した。
【００４９】
１. 実験方法
血漿試料は、健常人および透析患者より採血し、分離した血漿３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調製は、ＯＤＳ法、ＰＦＰ法共に実施例２の条件にて行った。また、分析方法は、ＯＤＳ法は実施例１、ＰＦＰ法は実施例２の条件にしたがって測定した。
試料前処理法については、検量線用試料、ゼロ試料および血漿試料には内標準溶液（ＩＳＳ-３）を３０μＬ添加し、ブランク試料にはメタノールを３０μＬ添加した。その後は実施例２の３．（２）〜（５）の手順に従い行った。
【００５０】
２. 結果
２．１. ビオチンピークの分離
図７に示されるように、ＯＤＳ法では、ＭＲＭクロマトグラム上でビオチンのピークに夾雑ピークが重なりピークの分離が困難であった。特に透析患者の血漿においてこの傾向が強く見られた。一方、ＰＦＰ法を用いた場合、ビオチンのピークを分離することができた。
２．２. イオン化抑制
表８に示されるように、ＯＤＳ法では、マトリックス効果によるイオン化抑制が強く、内標準物質で比較すると、透析患者の血漿において、標準液のピーク面積に対して５０％以下の面積値となる血漿試料が散見されたが、ＰＦＰ法ではイオン化抑制が改善された。これにより、低濃度の血漿中ビオチンピークを検出することができた。
２．３. 定量限界値
上記のように、ＰＦＰ法は、ＯＤＳ法に比べてビオチンピークの分離およびイオン化抑制の点で改善されていた。これにより、ビオチンの定量限界値は、ＯＤＳ法が０．１ｎｇ／ｍＬであるのに対して、ＰＦＰ法は０．０５ｎｇ／ｍＬであり、高感度であった。
【００５１】
【表８】
2015118029.tif 000014
【００５２】
実施例４
血液透析患者の血液透析（ＨＤ）廃液中ビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
血液透析廃液試料は、血液透析患者の血液透析廃液（ＨＤ廃液１〜４）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調製および分析方法は、実施例２の条件にて行った。また、試料前処理法については、検量線試料およびビオチン測定用血液透析廃液試料には内標準物質（ＩＳＳ-４）３０μＬを、妨害ピーク確認用血液透析廃液試料についてはメタノール３０μＬを添加し、以後は実施例２の３．（２）〜（５）に従い行った。
２. 結果
２．１. 血液透析廃液試料中妨害ピークの確認
図８に血液透析廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。また、内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、血液透析廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図８Ｄ）。
２．２. 血液透析廃液試料中ビオチン濃度
表９に血液透析廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
【００５３】
【表９】
2015118029.tif 000015
【００５４】
実施例５
血液透析濾過（ＨＤＦ）廃液中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
血液透析濾過試料は血液透析濾過患者の廃液（ＨＤＦ廃液）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。また、試料前処理法については実施例４に従って行った。
２. 結果
２．１. 血液透析濾過試料中妨害ピークの確認
図９に血液透析濾過廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、血液透析濾過廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図９Ｄ）。
２．２. 血液透析濾過廃液試料中ビオチン濃度
表１０に血液透析濾過廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
【００５５】
【表１０】
2015118029.tif 000016
【００５６】
実施例６
腹膜透析廃液中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
腹膜透析廃液試料は、腹膜透析患者の廃液（ＰＤ廃液）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。試料前処理法は、実施例４の条件にて行った。
２. 結果
２．１. 腹膜透析廃液試料中妨害ピークの確認
図１０に腹膜透析廃液試料および検量線試料（２.０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、腹膜透析廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図１０Ｄ）。
２．２. 腹膜透析廃液試料中ビオチン濃度
表１１に腹膜透析廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
【００５７】
【表１１】
2015118029.tif 000017
【００５８】
実施例７
尿中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。尿試料は、血液透析患者の尿（尿１：透析治療歴約１年の糖尿病患者、尿２：透析治療歴約３年の非糖尿病患者）および蛋白尿（尿３：尿蛋白２＋）各３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。試料前処理法は、実施例４の条件にて行った。
２. 結果
２．１. 透析廃液試料中妨害ピークの確認
図１１に尿試料および検量線試料（２.０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、尿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図１１Ｄ）。
２．２. 尿試料中ビオチン濃度
表１２に尿中ビオチン濃度の測定結果を示した。
【００５９】
【表１２】
2015118029.tif 000018
【図１】
2015118029.tif 000019
【図２】
2015118029.tif 000020
【図３】
2015118029.tif 000021
【図４】
2015118029.tif 000022
【図５】
2015118029.tif 000023
【図６】
2015118029.tif 000024
【図７】
2015118029.tif 000025
【図８】
2015118029.tif 000026
【図９】
2015118029.tif 000027
【図１０】
2015118029.tif 000028
【図１１】
2015118029.tif 000029