(57)【要約】【課題】  小型で安価、かつ作業者への病原体の暴露も抑制し、操作も容易な核酸抽出装置および核酸抽出方法を提供する。【解決手段】  核酸抽出装置は、前記検体を収容する容器およびフィルタを備えた分離手段と、前記分離手段に接続する加圧手段と、前記分離手段に連結可能となる回収手段と、前記検体を分注する分注手段と、前記分注手段を駆動する駆動手段と、前記加圧手段、前記駆動手段および前記加圧手段の制御を行う制御手段と、を備え、前記制御手段は、前記分注手段を駆動して前記分離手段に前記検体を分注し、前記加圧手段により前記分離手段を加圧して前記検体と前記核酸を分離する。【選択図】図３
2015139398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体から核酸を抽出する核酸抽出装置であって、
前記検体を収容する容器およびフィルタを備えた分離手段と、
前記分離手段に接続する加圧手段と、
前記分離手段に連結可能となる回収手段と、
前記検体を分注する分注手段と、
前記分注手段を駆動する駆動手段と、
前記加圧手段、前記駆動手段および前記加圧手段の制御を行う制御手段と、
を備え、
前記制御手段は、
前記分注手段を駆動して前記分離手段に前記検体を分注し、
前記加圧手段により前記分離手段を加圧して前記検体と前記核酸を分離する、
ことを特徴とする核酸抽出装置。
【請求項２】
前記加圧手段は、
設定圧閾値を超える圧力まで前記分離手段を加圧した後、前記分離手段を前記圧力下で所定時間保持し、その後減圧する加減圧サイクルを、前記分離手段に分注された一の前記検体について複数回実行する、
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
【請求項３】
前記加圧手段は、前記所定時間の経過後であっても前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、前記分離手段を減圧する、
ことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出装置。
【請求項４】
前記所定時間の経過後であっても前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、エラーを報知するエラー報知手段を備える、
ことを特徴とする請求項２または請求項３に記載の核酸抽出装置。
【請求項５】
前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、追加の前記加減圧サイクルを実行する、
ことを特徴とする請求項４に記載の核酸抽出装置。
【請求項６】
前記回収手段に対応した他の回収手段と、
プライマー溶液を保持するプライマー保持手段と、を備え、
前記制御手段によって、前記分注手段を駆動して、前記回収手段に存在する分離された前記核酸および、前記プライマー保持手段で保持される前記プライマー溶液を前記他の回収手段に分注される、
ことを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸抽出装置。
【請求項７】
一の前記回収手段に対して前記他の回収手段および前記プライマー保持手段は複数設けられ、
該プライマー保持手段にはそれぞれ異なるプライマー溶液が保持される、
ことを特徴とする請求項６に記載の核酸抽出装置。
【請求項８】
前記分注手段のチップを自動で交換するチップ交換手段を備える、
ことを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに記載の核酸抽出装置。
【請求項９】
前記分離手段は、固相抽出カラムである、
ことを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれかに記載の核酸抽出装置。
【請求項１０】
検体から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、
前記検体を収容する容器およびフィルタを備えた分離手段に前記検体を分注する工程と、
前記分離手段を複数回加圧して前記検体から前記核酸を分離する工程と、
前記分離手段から排出される流出液を回収して前記核酸を抽出する工程と、
を具備することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項１１】
前記分離手段に分注された一の前記検体について、設定圧閾値を超える圧力で前記分離手段を加圧した後、前記分離手段を前記圧力下で所定時間保持し、その後減圧する加減圧サイクルを、複数回実行する、
ことを特徴とする請求項１０に記載の核酸抽出方法。
【請求項１２】
前記所定時間の経過後であっても前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、前記分離手段を減圧する、
ことを特徴とする請求項１１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１３】
前記分離手段は、固相抽出カラムである、
ことを特徴とする請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【請求項１４】
抽出した前記核酸にプライマー溶液を添加する工程を具備する、
ことを特徴とする請求項１０〜請求項１３のいずれかに記載の核酸抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体から核酸を抽出し、また核酸を含む溶液を調製する核酸抽出装置および核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸（デオキシリボ核酸：ＤＮＡ（deoxyribonucleic  acid）またはリボ核酸：ＲＮＡ（ribonucleic  acid））の抽出方法としては、磁気ビーズを用いて分離する方法（例えば、特許文献１参照）や、抽出カラムを遠心して分離する方法（例えば、特許文献２参照、以下抽出カラム遠心分離法という。）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００９−５０９５４９号公報
【特許文献２】特開２００９−１３１２６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、磁気ビーズを用いる分離方法では、高コストである上、例えば、喀痰など粘性が高い検体の場合において核酸の回収率が低いという問題があった。
【０００５】
これに対し、抽出カラム遠心分離法は、抽出カラム内に核酸を固定化し、残液等を遠心力によって取り除くことで、最終的に核酸を抽出する方法である。このため、粘性が高い検体であっても核酸の分離が容易であるが、遠心分離機が必須となり、装置の大型化・複雑化が避けられない。また、その装置は高価であるため、抽出コスト低減には限界があった。
【０００６】
また上記の方法によって抽出した核酸を解析し、喀痰中の病原体が同定される。具体的には、抽出カラム遠心分離法等によって抽出されたある患者の核酸を、複数の容器に分注し、そこに、例えば、複数種の異なるプライマー溶液（所定のプライマー、ＰＣＲ試薬、酵素および緩衝溶液等で調製した溶液）をそれぞれへ分注した後、それらをＰＣＲ反応し解析することで、病原体を同定する。
【０００７】
しかし、従来は、核酸および各プライマー溶液の分注作業は手作業で行われており、また患者毎に複数のプライマー溶液の分注が必要であった。このような方法では、単純作業の繰り返しによってミスが生じ易く、作業者に病原体が感染する恐れもあった。また分注作業は、個別の作業は単純であるが、プライマー溶液および患者毎にチップ交換をする必要があり、分注の数が多くなるため、作業全体としては繁雑で手間のかかる作業である。このため、チップの交換忘れや、プライマー（溶液）の混合などによるコンタミネーションが発生するなどの問題が生じた。
【０００８】
本発明は、小型で安価、かつ作業者への病原体の暴露も抑制し、操作も容易な核酸抽出装置および核酸抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の手段によって、上記課題を解決したものである。
【００１０】
（１）本発明は、検体から核酸を抽出する核酸抽出装置であって、前記検体を収容する容器およびフィルタを備えた分離手段と、前記分離手段に接続する加圧手段と、前記分離手段に連結可能となる回収手段と、前記検体を分注する分注手段と、前記分注手段を駆動する駆動手段と、前記加圧手段、前記駆動手段および前記加圧手段の制御を行う制御手段とを備え、前記制御手段は、前記分注手段を駆動して前記分離手段に前記検体を分注し、前記加圧手段により前記分離手段を加圧して前記検体と前記核酸を分離することを特徴とする核酸抽出装置である。
【００１１】
（２）また、本発明は上記発明に関連して、前記加圧手段は、設定圧閾値を超える圧力まで前記分離手段を加圧した後、前記分離手段を前記圧力下で所定時間保持し、その後減圧する加減圧サイクルを、前記分離手段に分注された一の前記検体について複数回実行する、ことを特徴とするものである。
【００１２】
（３）また、本発明は上記発明に関連して、前記加圧手段は、前記所定時間の経過後であっても前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、前記分離手段を減圧する、ことを特徴とするものである。
【００１３】
（４）また、本発明は上記発明に関連して、前記所定時間の経過後であっても前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、エラーを報知するエラー報知手段を備える、ことを特徴とするものである。
【００１４】
（５）また、本発明は上記発明に関連して、前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、追加の前記加減圧サイクルを実行する、ことを特徴とするものである。
【００１５】
（６）また、本発明は上記発明に関連して、前記回収手段に対応した他の回収手段と、プライマー溶液を保持するプライマー保持手段と、を備え、前記制御手段によって、前記分注手段を駆動して、前記回収手段に存在する分離された前記核酸および、前記プライマー保持手段で保持される前記プライマー溶液を前記他の回収手段に分注される、ことを特徴とするものである。
【００１６】
（７）また、本発明は上記発明に関連して、一の前記回収手段に対して前記他の回収手段および前記プライマー保持手段は複数設けられ、該プライマー保持手段にはそれぞれ異なるプライマー溶液が保持される、ことを特徴とするものである。
【００１７】
（８）また、本発明は上記発明に関連して、前記分注手段のチップを自動で交換するチップ交換手段を備える、ことを特徴とするものである。
【００１８】
（９）また、本発明は上記発明に関連して、前記分離手段は、固相抽出カラムである、ことを特徴とするものである。
【００１９】
（１０）また、本発明は、検体から核酸を抽出する核酸抽出方法であって、前記検体を収容する容器およびフィルタを備えた分離手段に前記検体を分注する工程と、前記分離手段を複数回加圧して前記検体から前記核酸を分離する工程と、前記分離手段から排出される流出液を回収して前記核酸を抽出する工程と、を具備することを特徴とする核酸抽出方法である。
【００２０】
（１１）また、本発明は上記発明に関連して、前記分離手段に分注された一の前記検体について、設定圧閾値を超える圧力で前記分離手段を加圧した後、前記分離手段を前記圧力下で所定時間保持し、その後減圧する加減圧サイクルを、複数回実行する、ことを特徴とするものである。
【００２１】
（１２）また、本発明は上記発明に関連して、前記所定時間の経過後であっても前記分離手段に加えられた圧力が前記設定圧閾値を下回らない場合に、前記分離手段を減圧する、ことを特徴とするものである。
【００２２】
（１３）また、本発明は上記発明に関連して、前記分離手段は、固相抽出カラムである、ことを特徴とするものである。
【００２３】
（１４）また、本発明は上記発明に関連して、抽出した前記核酸にプライマー溶液を添加する工程を具備する、ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、小型で安価、かつ作業者への病原体の暴露も抑制し、操作も容易な核酸抽出装置および核酸抽出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本実施形態に係る核酸抽出装置の外観斜視図である。
【図２】本実施形態の核酸抽出装置の主要部分を抜き出して示す概略図である。
【図３】本実施形態の核酸抽出装置内の基台の上面図である。
【図４】本実施形態の核酸抽出部を示す図であり、（ａ）正面図であり、（ｂ）側面図である。
【図５】本実施形態の核酸抽出部の動作を示す概要側面である。
【図６】分注部を示す図であり、（ａ）正面図であり、（ｂ）側面図である。
【図７】本実施形態の核酸抽出装置を用いた核酸抽出方法の一例を示すプロトコル図である。
【図８】加圧部のエラー検出機構について説明する図であり、（ａ）正常時の状態を示す図であり、（ｂ）カラム詰まりによるエラーを検出した状態の図である。
【図９】表示部に表示される画面遷移の一例である。
【図１０】表示部に表示される画面遷移の一例である。
【図１１】従来技術に係る抽出カラム遠心法を用いた核酸抽出方法と本実施形態の核酸抽出方法によって病原体の同定を行った結果である。
【図１２】従来技術に係る抽出カラム遠心法を用いた核酸抽出方法と本実施形態の核酸抽出方法を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態に係る核酸抽出装置および核酸抽出方法について詳細に説明する。
【００２７】
図１は、本実施形態に係る核酸抽出装置１０の外観斜視図である。核酸抽出装置１０は、ハウジング１と、表示部２と、核酸抽出部３と、プライマー処理部４と、分注部５と、制御部ＣＴを有する。なお、図１では説明の便宜上制御部ＣＴを核酸抽出装置１０の外部に示しているが、制御部１０は、核酸抽出装置１０の内部に設けられるものである。
【００２８】
ハウジング１には、前面扉１１が設けられている。前面扉１１は例えば左右端に設けられたスライダー（不図示）によって上下方向にスライド開閉可能となっている。
【００２９】
表示部２は、所定の情報を表示するとともに、入力も可能とするタッチパネルであり、ハウジング１の前面（例えば、前面扉１１の下方）に設けられる。
【００３０】
ハウジング１の内部の基台１２には、核酸抽出部３とプライマー処理部４が設けられている。また、ハウジング１の天井部分には、分注部５がハウジング１内を上下左右前後方向に移動自在に懸垂している。分注部５は、複数の分注シリンダ５０と、これらを保持するシリンダ保持部５１と、駆動部５２を備えている。
【００３１】
核酸抽出部３は、加圧部３１と分離部３２とここでは不図示の移動機構を備えている。加圧部３１は分離部３２を加圧し、これにより、検体中に含まれる核酸を分離・抽出する。なお、本実施形態の検体は例えば患者の喀痰であり、抽出する核酸は例えば、喀痰内のＤＮＡ（病原体を含む）である。
【００３２】
プライマー処理部４は、プライマー溶液分注用のチューブ（以下、ＰＣＲ（polymerase  chain  reaction）チューブという。）を保持するＰＣＲチューブ保持部４１と、複数のプライマー溶液を収容するプライマー保持部４２を備えている。プライマー処理部４では、核酸抽出部３にて抽出された核酸がＰＣＲチューブに分注されるとともに、各種プライマー溶液が各ＰＣＲチューブに分注される。このときプライマー溶液にはＰＣＲに必要な所定のプライマー、ＰＣＲ試薬、酵素および緩衝溶液等が既に含まれている。
【００３３】
図２は、本実施形態の加圧部３１と、分離部３２の一部を抜き出して示す概略図である。分離部３２は、固相抽出カラム３２１および、核酸の回収用チューブ３２４を有する。固相抽出カラム３２１は、例えば、カラムＣＭ内にガラス繊維や荷電樹脂などからなるフィルタ（メンブレン）Ｆを備えたものであり、フィルタＦへの核酸の吸着性を利用して検体と核酸を分離する。すなわち、親水的な性質を持つ核酸は、疎水性の高い溶液中ではフィルタＦに吸着し、疎水的な性質を持つタンパク質や脂質などはそのまま流れ落ち易い状態となる。
【００３４】
加圧部３１は、加圧用カラムキャップ３１１、加圧チューブ３１２、加圧シリンジ３１３、圧力センサ３１５などからなる。加圧用カラムキャップ３１１は固相抽出カラム３２１の上方を密閉する。そして加圧用カラムキャップ３１１には加圧チューブ３１２の一端が連結し、加圧チューブ３１２の他端は、加圧シリンジ３１３に連結している。加圧シリンジ３１３は、円筒形のシリンジ３１３ａと可動式のプランジャ３１３ｂからなり、加圧チューブ３１２を介して固相抽出カラム３２１を加圧する。また、例えば加圧チューブ３１２には圧力センサ３１５が取り付けられ、固相抽出カラム３２１の圧力（固相抽出カラム３２１に加えられる圧力）を測定できるようになっている。
【００３５】
本実施形態の核酸抽出部３では、固相抽出カラム３２１のカラムＣＭ内に、喀痰などの検体を分注し、加圧部３１により加圧することで、病原体を含む核酸がフィルタＦに吸着し、廃液がフィルタＦを通過して固相抽出カラム３２１の外部に流出する。廃液は、廃液用のチューブに排出してもよいし、廃液槽に排出してもよい。その後、固相抽出カラム３２１を核酸の回収用チューブ３２４上に配置し、核酸の回収用溶液または蒸留水を固相抽出カラム３２１に分注して加圧すると、フィルタＦに吸着していた核酸が回収用チューブ３２４に回収される。
【００３６】
また、核酸抽出装置１０は、検体の固相抽出カラム３２１への分注、加圧部３１による加圧、および抽出した核酸のＰＣＲチューブへの分注、さらに当該ＰＣＲチューブへのプライマー溶液の添加までを、全て自動化し、連続処理することができる。
【００３７】
図３〜図６は、核酸抽出装置１０内の構成を示す図であり、図３が、基台１２の上面図である。図４が核酸抽出部３を抽出して示す図であり、図４（ａ）が正面図、図４（ｂ）が側面図である。図５が核酸抽出部３の動作の様子を示す外観側面図である。図６が分注部５を抽出して示す図であり、図６（ａ）が正面図、図６（ｂ）が側面図である。
【００３８】
図３に示すように、核酸抽出部３と、プライマー処理部４とは基台１２の同一面上に併設されている。
【００３９】
核酸抽出部３の分離部３２は、固相抽出カラム３２１と、固相抽出カラム３２１を複数個（ここでは４個）横並びで保持するカラム保持部３２２と、廃液槽３２３と、回収用チューブ３２４と、回収用チューブ３２４を保持する回収用チューブ保持部３２５とを有する。加圧部３１は、加圧用カラムキャップ３１１と、加圧用カラムキャップ３１１を保持するキャップ保持部３１６と、ここでは不図示の加圧チューブ、加圧シリンジ、圧力センサなど（図２参照）を有する。また、核酸抽出部３は、キャップ保持部３１６を上下（基台１２に対して垂直）方向に移動する第１移動機構３３と、カラム保持部３２２を上下方向に移動すると共に、カラム保持部３２２および回収用チューブ保持部３２５をそれぞれ、前後（基台１２に対して水平）方向に移動する第２移動機構３４を備える。
【００４０】
固相抽出カラム３２１は、第２移動機構３４によって加圧用カラムキャップ３１１の下方に移動可能であり、加圧用カラムキャップ３１１により密閉される。
【００４１】
廃液槽３２３は、固相抽出カラム３２１から排出される廃液を回収する槽であり、第２移動機構３４によって固相抽出カラム３２１の下方に移動可能である。また、回収用チューブ３２４は、分離された核酸を回収するチューブであり、第２移動機構３４によって廃液槽３２３とは異なるタイミングで、固相抽出カラム３２１の下方に移動可能である。
【００４２】
ここでは一例として、カラム保持部３２２は４つの固相抽出カラム３２１を一度に保持可能であり、これに対応して、加圧用カラムキャップ３１１、回収用チューブ３２４、検体用チューブ２０（２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃ，２０Ｄ）もそれぞれ４個設けられている。すなわち、一度に４種の検体（４人分の検体）の核酸抽出作業を並列処理することができるようになっている。
【００４３】
プライマー処理部４は、ＰＣＲチューブ保持部４１と、プライマー保持部４２を備えている。ＰＣＲチューブ保持部４１で保持されるＰＣＲチューブ４３は、１つの検体に対して複数個（例えば１２個から１６個）準備され、これらがマトリクス状に配列されて１つのブロックＢを構成している。すなわちここでは、４つの検体に対応して、４ブロック（Ｂ１〜Ｂ４）のＰＣＲチューブ保持部４１が配置されている。プライマー保持部４２は、複数個（例えば１６個）のプライマーチューブ４４を備え、これらがマトリクス状に配列されて複数種類（例えば１６種類）の異なるプライマー溶液が保持されている。１ブロックのＰＣＲチューブ４３の数は、プライマー保持部４２のプライマーチューブ４４の数に対応しているか、それ以上の数である。
【００４４】
基台１２には、分注部の分注シリンダ（ここでは不図示）の先端に着脱可能なチップ５４をマトリクス状に立てて配列保持するチップラック（チップホルダ）６（６ａ、６ｂ）を備える。チップは例えば、１０００μＬ用チップ５４１と、２０μＬ用チップ５４２がある。チップラック６ａには１０００μＬ用チップが保持され、チップラック６ｂには２０μＬ用チップが保持される。
【００４５】
また、廃棄チップを収納する廃棄チップ置場８、試薬槽９、複数の検体用チューブ２０を配列保持する検体置場２１が設けられている。検体置場２１は、撹拌機能と温度調節機能を有している。
【００４６】
図４を参照して、核酸抽出部３についてさらに説明する。同図では、加圧部３１と分離部３２とがいずれも初期位置にある状態を示している。また同図（ｂ）では右を前方（手前）側とし、左を後方（奥）側としている。
【００４７】
同図（ａ）（ｂ）に示すように、初期位置では、上下（基台１２に垂直）方向の位置関係において、キャップ保持部３１６および各加圧用カラムキャップ３１１（３１１Ａ、３１１Ｂ、３１１Ｃ、３１１Ｄ）が上段に、カラム保持部３２２および各固相抽出カラム３２１（３２１Ａ、３２１Ｂ、３２１Ｃ，３２２１Ｄ）が中段に、回収用チューブ保持部３２５、各回収用チューブ３２４（３２４Ａ、３２４Ｂ、３２４Ｃ、３２４Ｄ）および回収用チューブ３２４の奥部（後部）側に位置する廃液槽３２３が下段に配置される。
【００４８】
また、同図（ｂ）に示すように、初期位置では、前後（水平）方向の位置関係において、キャップ保持部３１６および加圧用カラムキャップ３１１が最後部（最奥部）に、回収用チューブ３２４および回収用チューブ保持部３２５が最前部（作業者側）に、そして、カラム保持部３２２、固相抽出カラム３２１および廃液槽３２３が最奥部と最前部の中間部に配置される。また、初期位置では、固相抽出カラム３２１の上方は開放され、回収用チューブ３２４の上方も開放されている。なお、キャップ保持部３１６は、回転軸３１６Ｃを中心に破線矢印方向に回動可能となっている。
【００４９】
第１移動機構３３は、キャップ保持部３１６を上下（基台１２に対して垂直）方向に移動させる。キャップ保持部３１６の移動の範囲は距離Ｖである。第２移動機構３４は、カラム保持部３２２を上下方向に移動させる。カラム保持部３２２の移動の範囲は距離Ｖ２である。つまりこの例では、第１移動機構３３が、初期位置から下方に距離Ｖ１（Ｖ１＜Ｖ）までキャップ保持部３１６を移動させる間は、カラム保持部３２２は停止しているが、キャップ保持部３１６の移動量が距離Ｖ１を超えると、第１移動機構３３がキャップ保持部３１６を移動させるとともに、第２移動機構３４がカラム保持部３２２を初期位置から下方に移動させる。両者の移動量は距離Ｖ２である。つまり垂直方向においては、キャップ保持部３１６が単独で移動する場合と、キャップ保持部３１６とカラム保持部３２２とが同期して移動する場合とがある。
【００５０】
第２移動機構３４はまた、カラム保持部３２２を前後（基台１２に対して水平）方向に移動させる。カラム保持部３２２の移動の範囲は距離Ｈ１である。第２移動機構３４はさらに、回収用チューブ保持部３２５を前後方向に移動させる。回収用チューブ保持部３２５の移動の範囲は距離Ｈである。つまり、第２移動機構３４は、初期位置から後方に距離Ｈ１までカラム保持部３２２と回収用チューブ保持部３２５を一体的に移動させる。距離Ｈ１を超えると、カラム保持部３２２の移動は停止するが、回収用チューブ保持部３２５は、距離Ｈ１を超えても後方に移動可能である。距離Ｈ１を超えたあとの回収用チューブ保持部３２５の移動量は距離Ｈ２である。つまり、第２移動機構３４は、水平方向に２段階で回収用チューブ保持部３２５を移動させる。
【００５１】
図５は、第１移動機構３３，第２移動機構３４による、加圧用カラムキャップ３１１、固相抽出カラム３２１、廃液槽３２３，回収用チューブ３２４の移動の態様を示す、図４（ｂ）に対応する側面概要図である。なお同図において、第１移動機構３３，第２移動機構３４、キャップ保持部３１６およびカラム保持部３２２の図示は省略している。また同図では右を前方（手前）側とし、左を後方（奥）側としている。
【００５２】
図５（ａ）に示す初期位置では、加圧用カラムキャップ３１１は上段且つ最後部に位置し、固相抽出カラム３２１は中段且つ中間部に位置し、回収用チューブ３２４は下段且つ最前部に位置する。廃液槽３２３は下段で回収用チューブ３２４の後方且つ固相抽出カラム３２１の直下に位置する。第１の移動状態では、第２移動機構３４（ここでは不図示）によって固相抽出カラム３２１と廃液槽３２３とが後方に向かって移動する。これらの移動量は距離Ｈ１である。
【００５３】
これにより、同図（ｂ）に示すように加圧用カラムキャップ３１１の直下に固相抽出カラム３２１が位置し、固相抽出カラム３２１の直下に廃液槽３２３が位置する。なお、回収用チューブ３２４も廃液槽３２３の移動に伴って後方に移動する（距離Ｈ１）が、図示のごとく回収用チューブ３２４の上方は開放されている。固相抽出カラム３２１と廃液槽３２３の移動は同時であってもよいし、同時でなくても良い。両者が後方に距離Ｈ１で移動した結果、図５（ｂ）に示すように垂直方向において、加圧用カラムキャップ３１１と固相抽出カラム３２１の鉛直方向の軸中心が略一致し、廃液槽３２３がこれらの直下に位置するようになればよい。
【００５４】
第２の移動状態では、第１移動機構３３（ここでは不図示）によって加圧用カラムキャップ３１１が下方に向かって移動する。加圧用カラムキャップ３１１の移動量が距離Ｖ１に達すると、中段に位置する固相抽出カラム３２１の上端と当接する（同図（ｃ））。
【００５５】
第１移動機構３３は同図（ｄ）に示すように、さらに加圧用カラムキャップ３１１を下方に向かって移動させ、これに伴って第２移動機構３４（不図示）が固相抽出カラム３２１を下方に向かって移動させる。これらの移動量は、距離Ｖ２である。つまり、固相抽出カラム３２１は加圧用カラムキャップ３１１によって密閉された状態で、距離Ｖ２を移動する。
【００５６】
その後、例えば上下方向の移動のみ初期位置（図５（ｂ））に戻った後、第３の移動状態に遷移する。第３の移動状態では、第２移動機構３４（不図示）によって回収用チューブ３２４（および廃液槽３２３）が後方に向かって移動する。これらの移動量は距離Ｈ２である。
【００５７】
これにより、同図（ｅ）に示す用に、加圧用カラムキャップ３１１の直下に固相抽出カラム３２１が位置し、固相抽出カラム３２１の直下に回収用チューブ３２４が位置する。廃液槽３２３も回収用チューブ３２４の移動に伴って後方に移動する（距離Ｈ２）が、図示のごとく廃液槽３２３上方は開放されている。なお、固相抽出カラム３２１と廃液槽３２３（回収用チューブ３２４）は同図（ａ）に示す初期位置に戻ってもよく、その場合は固相抽出カラム３２１が後方に移動し（移動量は距離Ｈ１）、回収用チューブ３２４も後方に移動する（移動量は距離Ｈ１＋Ｈ２＝Ｈ）。なおこれらの移動は同時であってもよいし、同時でなくても良い。つまり、固相抽出カラム３２１が後方に移動（移動量は距離Ｈ１）し、回収用チューブ３２４も後方に移動（移動量は初期位置から距離Ｈ，または、第２の移動状態の位置から距離Ｈ２）した結果、図５（ｅ）に示すように垂直方向において、加圧用カラムキャップ３１１、固相抽出カラム１３および回収用チューブ３２４の鉛直方向の軸中心が略一致するようになればよい。
【００５８】
第４の移動状態では、第１移動機構３３（ここでは不図示）によって加圧用カラムキャップ３１１が下方に向かって移動する。加圧用カラムキャップ３１１の移動量が距離Ｖ１に達すると、中段に位置する固相抽出カラム３２１の上端と当接する（同図（ｆ））。
【００５９】
第１移動機構３３は、さらに加圧用カラムキャップ３１１を下方に向かって移動させ、これに伴って第２移動機構３４（不図示）が固相抽出カラム３２１を下方に向かって移動させる。これらの移動量は、距離Ｖ２である。つまり、固相抽出カラム３２１は加圧用カラムキャップ３１１によって密閉された状態で、距離Ｖ２を移動し、固相抽出カラム３２１の下端は、回収用チューブ３２４に内包される（同図（ｇ））。
【００６０】
一例として、キャップ保持部３１６は、初期位置に向かって（上方に）付勢手段（例えばコイルばねなど）によって付勢されており、カラム保持部３２２も初期位置に向かって（上方に）付勢手段（例えばコイルばねなど）によって付勢されている。従って、第１移動機構３３および第２移動機構３４を付勢力に抗って下方へ押圧することで、キャップ保持部３１６およびカラム保持部３２２は下方に移動し、押圧が解除されると、キャップ保持部３１６およびカラム保持部３２２は初期位置に復帰する。しかしこれに限らず、モータなどによって初期位置に復帰させるものとしてもよい。また第２移動機構３４の水平方向の移動は、モータなどによって行われる。
【００６１】
次に図６を参照して、分注部５について説明する。
【００６２】
分注部５は、複数（ここでは例えば８本）の分注シリンダ５０を保持するシリンダ保持部５１と、駆動部５２とを有する。駆動部５２は、複数の分注シリンダ５０を個別に移動させる第１駆動部５２１と、分注部５を一体的に移動させる第２駆動部５２２を有する。ここでは、シリンダ保持部５１が前方（手前側）に１０００μＬ用の分注シリンダ５０１を４本保持し、後方側（奥側）に２０μＬ用の分注シリンダ５０２を４本保持する場合を例に示している。
【００６３】
分注部５は、図１に示すハウジング１の天井部に設けた案内レールに沿ってコンピュータによるシーケンス制御にしたがって３次元空間を自由に移動制御される。さらに、分注部５の各分注シリンダ５０は、個別にあるいは複数本同時に、分注部５に対して上下方向または前後方向に移動可能となっている。分注シリンダ５０はその先端に交換可能なチップ５４が取り付けられている。すなわち、１０００μＬ用の分注シリンダ５０１には１０００μＬ用のチップ５４１が取り付けられ、２０μＬ用の分注シリンダ５０２には２０μＬ用のチップ５４２が取り付けられている。チップ５４は、分注シリンダ５０の先端部分に押し込むことによって係合可能であり、チップ５４と分注シリンダ５０を逆方向に引き離すと容易に離脱可能となっている。
【００６４】
図３を参照して、チップ５４を分注シリンダ５０に取り付ける場合は、チップラック６の孔部に分注シリンダ５０を挿入する。これにより、チップラック６内に収容されたチップ５４が、分注シリンダ５０の先端に押し込まれ、取り付けられる。一方、チップ５４を離脱する場合は、廃棄チップ置場８に分注シリンダ５０を挿入する。廃棄チップ置場８には、チップ５４の径より大径の大孔部８１ｂとチップ５４の径より小径の小孔部８１ｓとが連続した離脱部８１が設けられており（図３参照）、大孔部８１ｂに分注シリンダ５０を挿入し、そのまま小孔部８１ｓまで分注シリンダ５０を移動させて分注シリンダ５０を上昇させると、小孔部８１ｓによってチップ５４のみ上昇が規制され、分注シリンダ５０の先端から離脱する。なお、離脱部８１も、チップ５４１、５４２のサイズに対応して２つのサイズが備えられている。このようにして、チップ５４の着脱も自動で行うことができる。
【００６５】
シリンダ保持部５１の後端部分には加圧用カラムキャップ３１１を押下する押圧部５５が設けられている。
【００６６】
このように、この核酸抽出装置１０は、核酸抽出部３および分注部５の駆動部５２が、核酸抽出処理プログラムによって核酸抽出部３および分注部５を所定の位置に移動して、検体から核酸を抽出する核酸抽出処理、および核酸を含む溶液を調製する処理が実行できるようになっている。
【００６７】
すなわち、制御部ＣＴは、分注部５を駆動して固相抽出カラム３２１に検体を分注し、核酸抽出部３において固相抽出カラム３２１を加圧して検体と核酸を分離する。また、制御部ＣＴは、分注部５を駆動して、分離された核酸を各ブロックのＰＣＲチューブ４３に分注し、さらに各ＰＣＲチューブ４３に各種プライマー溶液を分注する。なお、核酸抽出装置１０の内部には蛍光灯、および殺菌灯なども配備されている。
【００６８】
次に、図７のプロトコル図を参照して、本実施形態の核酸抽出装置１０で実行される核酸抽出処理の手順を説明する。なお、図７における括弧内の数字は、処理のステップを示すものとする。また、ステップＰ１、ステップＰ２は操作者が手作業で行う前処理工程であり、ステップ１以降のステップが核酸抽出装置１０で自動実行される処理である。この例ではステップＰ１、Ｐ２を作業者が手動で行う場合を例に説明するが、これらもプログラムに組み込むことで、核酸抽出装置１０によって自動実行することが可能となる。
【００６９】
なお、図７のプロトコル図は、患者の喀痰から核酸を抽出する場合の核酸抽出処理を例に示している。また、以下の説明における核酸抽出装置１０の各構成の符号は、図１〜〜図６に示した各構成を示すものとする。
【００７０】
＜前処理工程＞
【００７１】
ステップＰ１では、４本の検体用チューブ２０（２０Ａ〜２０Ｄ）に、タンパク質分解（消化処理）のためにプロテアーゼを２３μＬ分注する。検体用チューブ２０は、例えば患者毎に準備される（図３参照）。
【００７２】
ステップＰ２では、各検体用チューブ２０のそれぞれに、検体を２００μＬ分注する。検体は、患者Ａ〜患者Ｄの喀痰であり、検体用チューブ２０Ａに患者Ａ、検体用チューブ２０Ｂに患者Ｂ、検体用チューブ２０Ｃに患者Ｃ、検体用チューブ２０Ｄに患者Ｄ、の喀痰がそれぞれ分注される。検体用チューブ２０は、核酸抽出装置１０の検体置場２１に載置する。
【００７３】
また、チップが十分に収容されたチップラック６（６ａ、６ｂ）を載置するとともに、新たな固相抽出カラム３２１をカラム保持部３２２に、新たな回収用チューブ３２４を回収用チューブ保持部３２５に、新たなＰＣＲチューブ４３をＰＣＲチューブ保持部４１に、それぞれ載置する。また、試薬槽９および、プライマー溶液（所定のプライマー、ＰＣＲ試薬、酵素、緩衝溶液、ｄＮＴＰ（４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(ｄＡＴＰ,ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ,ｄＴＴＰ)を混合したもの）および、水を調製した溶液）を入れたプライマーチューブ４４を、核酸抽出装置１０の所定位置に載置する。
【００７４】
＜核酸抽出工程（制御部ＣＴによる自動運転）＞
【００７５】
ステップ１では、核酸抽出装置１０を初期化する。制御部ＣＴは、加圧部３１、分離部３２を図４に示す初期位置に移動する。また制御部ＣＴは、第２駆動部５２２を駆動して分注部５を初期位置に移動する。分注部５の初期位置は例えば、チップラック６ａの上方とする。
【００７６】
制御部ＣＴは、第１駆動部５２１を駆動して、分注部５を下降させて各分注シリンダ５０１（５０１Ａ、５０１Ｂ、５０１Ｃ、５０１Ｄ）の先端をチップラック６ａ内に挿入し、分注シリンダ５０１の先端に１０００μＬ用のチップ（第１番目のチップ５４１）を装着する（図３参照）。以下、第１駆動部５２１、第２駆動部５２２についての説明は省略するが、分注部５を移動する場合には、第２駆動部５２２を駆動し、分注シリンダ５０を一括であるいはそれぞれに移動する場合には、第１駆動部５２１を駆動する。
【００７７】
その後制御部ＣＴは、分注部５を試薬槽９上の所定の位置に移動し、各分注シリンダ５０１のそれぞれにバッファＡＬを２００μＬ吸引する。
【００７８】
制御部ＣＴは分注部５を検体置場２１に移動し、各検体用チューブ２０Ａ〜２０Ｄ上方に各分注シリンダ５０１（５０１Ａ、５０１Ｂ、５０１Ｃ、５０１Ｄ）をそれぞれ配置する。そして、各分注シリンダ５０１を下降して、検体用チューブ２０Ａ〜２０ＤにそれぞれバッファＡＬの全量を吐出する。その後制御部ＣＴは、分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、各分注シリンダ５０１を下降させて第１番目のチップ５４１を離脱、廃棄した後、分注部５を初期位置へ移動する。
【００７９】
ステップ２では検体用チューブ２０Ａ〜２０ＤのそれぞれについてバッファＡＬと検体の混合液を１５秒間攪拌する。続くステップ３では、これらを５６℃の温度下で所定時間（１０分から１２０分間、好適には、１０分から一昼夜）インキュベート（培養）する。既述のごとく検体置場２１は、撹拌機能と温度調節機能を有している。
【００８０】
ステップ４では、各分注シリンダ５０１に新たなチップ５４を装着する（チップを交換する）。すなわち制御部ＣＴは、分注部５をチップラック６ａ上に移動し、下降させて各分注シリンダ５０１に、第２番目のチップ５４１（１０００μＬ用チップ）を装着する。その後制御部ＣＴは、分注部５を試薬槽９上に移動し、エタノールを２００μＬ吸引して検体用チューブ２０Ａ〜２０Ｄの上方に分注部５を移動する。制御部ＣＴは、検体用チューブ２０Ａ〜２０Ｄのそれぞれにエタノールを全量吐出する。その後、制御部ＣＴは、分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、各分注シリンダ５０１を下降させて第２番目のチップ５４１を離脱、廃棄した後、分注部５を初期位置に移動する。ステップ５では、制御部ＣＴは、検体用チューブ２０Ａ〜２０Ｄを１５秒間攪拌する。
【００８１】
次にステップ６では、制御部ＣＴは、分注部５をチップラック６ａ上に移動し、下降させて各分注シリンダ５０１に新たな第３番目のチップ５４１（１０００μＬ用チップ）を装着し、分注部５を検体用チューブ２０Ａ〜２０Ｄの上方に移動する。制御部ＣＴは、分注部５を下降し、各分注シリンダ５０１により検体用チューブ２０Ａ〜２０Ｄ内の混合液を吸引する。その後制御部ＣＴは、固相抽出カラム３２１の上方に分注部５を移動し、各固相抽出カラム３２１（３２１Ａ、３２１Ｂ、３２１Ｃ、３２１Ｄ）にそれぞれ、混合液を全量吐出する。その後、制御部ＣＴは、分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、分注シリンダ５０１を下降させて第３番目のチップ５４１を離脱、廃棄する。
【００８２】
次に制御部ＣＴは、各固相抽出カラム３２１が対応する各加圧用カラムキャップ３１１（３１１Ａ、３１１Ｂ、３１１Ｃ、３１１Ｄ）の直下に位置し、廃液槽３２３が固相抽出カラム３２１の下方に位置するようにカラム保持部３２２と回収用チューブ保持部３２５を後方に移動する（図５（ａ）（ｂ）に示す第１の移動状態）。そして、分注部５をキャップ保持部３１６の上方に移動した後に下降させ、分注部５の押圧部５５によってキャップ保持部３１６を下方に移動させる。これにより加圧用カラムキャップ３１１が下降し、対応する固相抽出カラム３２１と当接する（図５（ｂ）（ｃ）に示す第２の移動状態）。制御部ＣＴが分注部５をさらに下降させると、加圧用カラムキャップ３１１によって固相抽出カラム３２１が密閉された状態で、両者がさらに下方に移動する（図５（ｄ））。
【００８３】
ステップ７では、制御部ＣＴは加圧部３１の加圧シリンジ３１３を制御して、密閉された固相抽出カラム３２１のそれぞれに所定の空気圧を加え、設定圧閾値を超える圧力まで圧力を増加させて、第一の加圧を行う。その後制御部ＣＴは、加圧（圧力の増加）を停止するとともに、固相抽出カラム３２１に対して設定圧閾値を超える圧力の印加状態を、所定時間維持する。加圧および所定時間の加圧停止により、各固相抽出カラム３２１は、少なくとも一部の核酸がフィルタに吸着し、廃液が廃液槽３２３に排出（溶出）される。これにより、各固相抽出カラム３２１に加えられていた圧力は所定時間内に減圧（自然減圧）し、設定圧閾値を下回る。制御部ＣＴが、加圧部３１の押圧を解除すると、各加圧用カラムキャップ３１１および各固相抽出カラム３２１が上昇する。固相抽出カラム３２１が初期位置で停止した後も加圧用カラムキャップ３１１はさらに上昇し、初期位置に復帰するとともに固相抽出カラム３２１の上方が開放される。これにより、固相抽出カラム３２１は大気圧下に開放され、固相抽出カラム３２１に印加されていた圧力が減少する。なお本実施形態において、「加圧」とは圧力を増加させている状態をいい、「加圧の停止」とは圧力の増加（変化）を停止する状態をいい、「減圧」とは圧力を減少させている状態をいう。また本実施形態の「減圧」は、固相抽出カラム３２１を大気圧下に開放することによって、設定圧閾値を超える圧力から大気圧に戻す（圧力を減少させる）場合を例に説明するが、減圧には、大気圧への開放に代えて（あるいはこれに加えて）吸引することによって設定圧閾値を超える圧力から圧力を減少させる場合も含まれる。
【００８４】
ステップ８では、制御部ＣＴは、再び分注部５の押圧部５５によってキャップ保持部３１６を下方に移動させる。これにより加圧用カラムキャップ３１１が下降し、固相抽出カラム３２１が密閉される。この状態で加圧部３１の加圧シリンジ３１３を制御して、密閉された固相抽出カラム３２１のそれぞれに所定の空気圧を加えて（圧力を増加させて）、第二の加圧を行う。制御部ＣＴは、設定圧閾値を超えて設定した圧力の印加状態を所定時間維持する（加圧（圧力の増加）を停止する）（図５（ｂ）〜（ｄ））。
【００８５】
第二の加圧の加圧設定（加圧（送気）速度、送気量）、は、一例として第一の加圧の加圧設定と同等であり、また加圧を維持する時間（加圧停止の時間）も、第一の加圧と同等である。第一の加圧では、検体を含む混合液の全量を溶出することができず、検体中に核酸が残存する場合がある。しかし、本実施形態では、第二の加圧（および第二の加圧停止）を行うことにより、各固相抽出カラム３２１に検体を含む混合液が残っている場合であっても、全てが溶出され、検体中の核酸がフィルタに吸着し、廃液が廃液槽３２３に排出される。これにより、各固相抽出カラム３２１に印加された圧力は減圧（自然減圧）する。制御部ＣＴが、加圧部３１の押圧を解除すると、加圧用カラムキャップ３１１および固相抽出カラム３２１が上昇する。固相抽出カラム３２１が初期位置で停止した後も加圧用カラムキャップ３１１はさらに上昇し、初期位置に復帰するとともに固相抽出カラム３２１の上方が開放され、固相抽出カラム３２１は大気圧下に開放されて、固相抽出カラム３２１に印加された圧力が減少する。その後制御部ＣＴは、分注部５，加圧部３１および分離部３２を初期位置に復帰させる。
【００８６】
このように本実施形態では、各固相抽出カラム３２１をそれぞれ設定圧閾値を超える圧力まで加圧した後、加圧を停止して各固相抽出カラム３２１を設定圧閾値を超える圧力で所定時間保持し、その後減圧する加減圧サイクルを、各固相抽出カラム３２１に分注され、移された一の検体について複数回（ここでは２回）実行することにより、検体から核酸を抽出するものである。第一の加圧と第二の加圧を行うことで、確実に各固相抽出カラム３２１中の検体の全量を溶出させ、検体中の核酸をフィルタＦに吸着させることができる。
【００８７】
ステップ９では、制御部ＣＴは、分注部５をチップラック６ａ上に移動し、下降させて各分注シリンダ５０１に、第４番目のチップ５４１（１０００μＬ用チップ）を装着する。その後制御部ＣＴは、分注部５を試薬槽９上に移動し、バッファＡＷ１（洗浄液）を５００μＬ（７５０μＬ）吸引した後、分注部５をカラム保持部３２２上に移動し、各固相抽出カラム３２１にバッファＡＷ１の全量を吐出する。その後、制御部ＣＴは、分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、分注シリンダ５０１を下降させて第４番目のチップ５４１を離脱、廃棄した後、分注部５を初期位置に移動する（図３参照）。
【００８８】
ステップ１０では、制御部ＣＴは、固相抽出カラム３２１が加圧用カラムキャップ３１１の直下に位置し、廃液槽３２３が固相抽出カラム３２１の下方に位置するようにカラム保持部３２２と回収用チューブ保持部３２５を後方に移動する（図５（ｂ））。そして、分注部５をキャップ保持部３１６の上方に移動した後に下降させ、分注部５の押圧部５５によってキャップ保持部３１６を下方に移動させる。これにより加圧用カラムキャップ３１１が下降し、固相抽出カラム３２１が密閉された状態で、両者がさらに下方に移動する（図５（ｃ）（ｄ））。
【００８９】
そして制御部ＣＴは、加圧部３１の加圧シリンジ３１３を制御して、密閉された各固相抽出カラム３２１に所定の空気圧を加えて（圧力を増加させて）、第三の加圧を行い、各固相抽出カラム３２１のフィルタを洗浄する。核酸はフィルタに吸着したまま、バッファＡＷ１により洗浄され、洗浄液が廃液槽３２３に排出される（図５（ｄ））。その後制御部ＣＴは、加圧部３１の押圧を解除し、加圧用カラムキャップ３１１を上昇させて固相抽出カラム３２１の上方を開放する。キャップ保持部３１６は初期位置に復帰する。
【００９０】
ステップ１１では、制御部ＣＴは、分注部５をチップラック６ａ上に移動し、下降させて各分注シリンダ５０１に、第５番目のチップ５４１（１０００μＬ用チップ）を装着する。その後、制御部ＣＴは分注部５を試薬槽９上に移動し、バッファＡＷ２（洗浄液）を５００μＬ（７５０μＬ）吸引し、分注部５をカラム保持部３２２上に移動して各固相抽出カラム３２１にバッファＡＷ２の全量を吐出する。バッファＡＷ１とバッファＡＷ２はアルコール濃度が異なる洗浄液である。その後、制御部ＣＴは分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、各分注シリンダ５０１を下降させて第５番目のチップ５４１を離脱、廃棄し、分注部５を初期位置に移動する（図３参照）。
【００９１】
ステップ１２では、制御部ＣＴは、固相抽出カラム３２１が加圧用カラムキャップ３１１の直下に位置し、廃液槽３２３が固相抽出カラム３２１の下方に位置するようにカラム保持部３２２と回収用チューブ保持部３２５を後方に移動する（図５（ｂ））。そして、分注部５をキャップ保持部３１６の上方に移動した後に下降させ、分注部５の押圧部５５によってキャップ保持部３１６を下方に移動させる。これにより加圧用カラムキャップ３１１が下降し、固相抽出カラム３２１が密閉された状態で、両者がさらに下方に移動する（図５（ｃ）（ｄ））。
【００９２】
そして制御部ＣＴは、加圧部３１の加圧シリンジ３１３を制御して、密閉された各固相抽出カラム３２１に所定の空気圧を加えて（圧力を増加させて）、第四の加圧を行い、各固相抽出カラム３２１のフィルタを洗浄する。核酸はフィルタに吸着したまま、バッファＡＷ２により洗浄され、洗浄液が廃液槽３２３に排出される。その後制御部ＣＴは、加圧部３１の押圧を解除し、加圧用カラムキャップ３１１を上昇させて固相抽出カラム３２１の上方を開放する。キャップ保持部３１６は初期位置に復帰する。
【００９３】
ステップ１３では、制御部ＣＴは、固相抽出カラム３２１が加圧用カラムキャップ３１１の直下に位置し、４つの回収用チューブ３２４（３２４Ａ、３２４Ｂ、３２４Ｃ、３２４Ｄ）がそれぞれ対応する固相抽出カラム３２１の直下に位置するようにカラム保持部３２２と回収用チューブ保持部３２５を後方に移動する（図５（ｄ）（ｆ）に示す第４の移動状態）。
【００９４】
ステップ１４では、制御部ＣＴは、分注部５をチップラック６ａ上に移動し、下降させて各分注シリンダ５０１に第６番目のチップ５４１（１０００μＬ用チップ）を装着し、分注部５を試薬槽９上に移動してバッファＡＥ（回収用溶液）または蒸留水を５００μＬ吸引する。引き続き制御部ＣＴは、分注シリンダ５０１を各固相抽出カラム３２１上に移動してそれぞれに回収用溶液または蒸留水の全量を吐出する。その後、固相抽出カラム３２１は，室温で１分〜５分、静置される。制御部ＣＴは、分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、分注シリンダ５０１を下降させて第６番目のチップ５４１を離脱、廃棄し、分注部５を初期位置に移動する。
【００９５】
ステップ１５では、分注部５をキャップ保持部３１６の上方に移動した後に下降させ、分注部５の押圧部５５によってキャップ保持部３１６を下方に移動させる。これにより加圧用カラムキャップ３１１が下降し、固相抽出カラム３２１が密閉された状態で、両者がさらに下方に移動し、加圧用カラムキャップ３１１により固相抽出カラム３２１が密閉される（図５（ｅ）（ｆ））。
【００９６】
そして制御部ＣＴは、加圧部３１の加圧シリンジ３１３を制御して、密閉された各固相抽出カラム３２１に所定の空気圧を加えて（圧力を増加させて）、第五の加圧を行う。これにより、各固相抽出カラム３２１のフィルタに吸着していた核酸がバッファＡＥまたは蒸留水とともに対応する回収用チューブ３２４に排出され、５００μＬの核酸精製溶液が得られる（図５（ｇ））。
【００９７】
制御部ＣＴは、加圧部３１の押圧を解除し、分離部３２および分注部５を初期位置に移動する。
【００９８】
＜プライマー溶液分注工程（制御部ＣＴによる自動運転）＞
【００９９】
以降の工程では、得られた核酸精製溶液にプライマー溶液を分注する。
【０１００】
すなわち、ステップ１６では、制御部ＣＴは、分注部５をチップラック６ｂ上に移動し、下降させて各分注シリンダ５０２に第７番目のチップ５４２（２０μＬ用チップ）を装着する（図２参照）。そして、制御部ＣＴは、上方が開放されている各回収用チューブ３２４（３２４Ａ、３２４Ｂ、３２４Ｃ、３２４Ｄ）の上方に分注部５を移動する。制御部ＣＴは、各回収用チューブ３２４から核酸精製溶液を吸引し、ＰＣＲチューブ４３に吐出する。回収用チューブ３２４Ａの核酸精製溶液は、ブロックＢ１の全ＰＣＲチューブ４３に吐出され、回収用チューブ３２４Ｂの核酸精製溶液は、ブロックＢ２の全ＰＣＲチューブ４３に吐出され、回収用チューブ３２４Ｃの核酸精製溶液は、ブロックＢ３の全ＰＣＲチューブ４３に吐出され、回収用チューブ３２４Ｄの核酸精製溶液は、ブロックＢ４の全ＰＣＲチューブ４３に吐出される。この例では、ブロックＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４はそれぞれ異なる検体の核酸が抽出されている。
【０１０１】
その後、ブロックＢ１からブロックＢ４の各ＰＣＲチューブ４３に各種プライマー溶液が分注される。すなわち、制御部ＣＴは、分注部５を廃棄チップ置場８に移動し、分注シリンダ５０１を下降させて第７番目のチップ５４２を離脱、廃棄し、分注部５をチップラック６ｂ上に移動し、例えば、左端部の分注シリンダ５０２Ａのみを下降させて、第８番目のチップ５４２（２０μＬ用チップ）を装着する。そして、プライマー保持部４２の上方に分注部５を移動して分注シリンダ５０２Ａでプライマー溶液（第１のプライマー溶液）を吸引し、ブロックＢ１の１番目のＰＣＲチューブ４３に吐出する。その後、左端部の分注シリンダ５０２Ａの第８番目のチップ５４２（２０μＬ用チップ）を廃棄し、第９番目のチップ５４２（２０μＬ用チップ）を装着する。そして、プライマー保持部４２の上方に分注部５を移動して分注シリンダ５０２Ａで次のプライマー溶液（第２のプライマー溶液）を吸引し、ブロックＢ１の２番目のＰＣＲチューブ４３に吐出する。以降、プライマー溶液毎に分注シリンダー５０２Ａのチップを交換し、プライマー保持部４２の複数のプライマー溶液（例えば、１６種類のプライマー溶液）を、ブロックＢ１、すなわち患者Ａの核酸精製溶液が分注された１６のＰＣＲチューブ４３に分注する。そしてブロックＢ２〜Ｂ４についても同様に処理する。なお、検体が１種類の場合もあるため、本実施形態ではブロック毎にプライマー溶液の分注を行う場合を例に説明したが、プライマー溶液の分注はどのような順序で行っても良い。
【０１０２】
以上のようにして自動運転が終了すると、患者（検体）毎の核酸精製溶液に１６種のプライマー溶液が分注された混合溶液が、４患者分、調製される。
【０１０３】
作業者は、核酸抽出装置１０が停止した後、プライマー保持部を取り出し、リアルタイムＰＣＲ工程で増幅させて、２３０ｎｍ、２６０ｎｍ、２８０ｎｍについて吸光度測定を行う。
【０１０４】
このように、本実施形態によれば、操作者が、検体毎に用意された検体用チューブに、プロテアーゼを検体を分注した以降は、核酸抽出工程からプライマー溶液分注工程までを核酸抽出装置１０によって自動連続処理できる。なお、既述のごとく、ステップＰ１、Ｐ２の前処理工程も自動化が可能である。
【０１０５】
また、図７では、ステップ１以降を核酸抽出装置１０による自動制御とした。しかし、ステップ３のインキュベーションの工程が長時間（例えば２時間以上）の場合には、装置稼働率が低下する。従って、破線で示すステップ４以降を自動制御するプログラムとしてもよい。
【０１０６】
本実施形態は、一例として、特許４６６５２０３号に記載のＨＩＲＡ―ＴＡＮ（Human  cell-controlled  Identification  of  the  Respiratory  Agent  from  TAN(痰)）法の前処理に用いて好適である。ＨＩＲＡ―ＴＡＮ法とは、呼吸器感染症の診断に利用されている迅速診断法である。ＨＩＲＡ―ＴＡＮ法は、種々の肺炎起炎菌と人細胞に特異的な定量ＰＣＲ増幅反応を利用して病原体を同定する判定手法であるため、各プライマー溶液に対する操作、すなわち同定しようとする菌種の数だけのプライマー溶液や、ＰＣＲ溶液の準備、検体（患者の喀痰）の分注操作が必要になる。この手法において、例えば、プライマー溶液が１６種存在する場合、一患者に対して用意するＰＣＲチューブは１６本、プライマー溶液分注操作も１６回、検体の分注操作も１６回必要となり、非常に煩雑な操作になる上、単純作業の繰り返しによるミス、コンタミネーションの発生や、操作者への感染等の問題が生じる。
【０１０７】
本実施形態では、これらの操作を自動化することにより、複雑な操作でのミスの回避、コンタミネーションによるミスの回避、操作者への感染や負担の軽減が可能となり、ひいては判定コストの低減を実現できる。
【０１０８】
また、核酸抽出工程において、遠心分離機が不要となるので、装置の小型化、低価格化が実現する。さらに、核酸抽出工程では、操作も複雑で工程が多く、時間も要するため、自働化が望まれる部分であったが、本実施形態によれば、自動化によって操作時間の短縮、結果の再現性向上を実現できる。
【０１０９】
＜カラム詰まりの検出＞
【０１１０】
以上説明したように、本実施形態は、固相抽出カラム３２１を加圧して核酸を抽出するものであるが、固相抽出カラム３２１の圧力を監視することで、カラム詰まりを検出することができる。
【０１１１】
図８は、加圧部３１のエラー検出機能について説明する図であり、図８（ａ）が正常時の状態を示す図であり、図８（ｂ）がカラム詰まりによるエラーを検出した状態の図である。
【０１１２】
図８（ａ）に示すように、核酸抽出部３（加圧部３１）が正常に動作している場合は、加圧部３１の加圧（圧力増加）の開始から所定の第一の時間Ｔ１内に設定圧閾値を超え、最大圧力に達する。そして加圧を停止し、その状態で所定の第二の時間Ｔ２が経過すると、固相抽出カラム３２１の検体が溶出し、それとともに固相抽出カラム３２１内が減圧（自然減圧）されて、所定の第三の時間Ｔ３内に、設定圧閾値を下回る。
【０１１３】
しかし、検体の粘性が特に高い場合など、固相抽出カラム３２１のカラム詰まり（フィルタ詰まり）が生じた場合、同図（ｂ）に示すように、第二の時間Ｔ２を経過しても、固相抽出カラム３２１内の圧力が減圧（自然減圧）せず、設定圧閾値を下回らなくなる場合がある。
【０１１４】
本実施形形態では、加圧部３１の圧力センサ３１５によって、第二の時間Ｔ２内に固相抽出カラム３２１内の圧力が設定圧閾値を下回らないこと（設定圧閾値を超えた圧力が固相抽出カラム３２１に印加されている時間が第二の時間Ｔ２を超えたこと）を検出すると、核酸抽出装置１０の運転を一時停止し、加圧部３１による固相抽出カラム３２１の密閉状態を開放して大気圧に戻す。そして、その場合にはエラー表示を表示部等に表示し（さらには音声を出力してもよい）てカラム詰まりであることを報知する。エラーの報知後は、ステップ７〜８の追加の加減圧サイクルを自動実行する。なお、エラーの報知後は、核酸抽出装置１０の運転を停止し、操作者のエラーの解除（例えば、解除ボタンの操作など）を条件として、ステップ７〜８の追加の加減圧サイクルを実行するようにしてもよい。
【０１１５】
従来の抽出カラム遠心法では、所定の時間の遠心分離処理が終了後、作業者がチューブ内の廃液の排出量を目視してカラム詰まりを判断していた。この場合、毎回の遠心分離作業が終了しない限り、カラム詰まりの判定ができず、作業時間の増加を招く一因となっていた。これに対し本実施形態では、固相抽出カラム３２１を加圧（圧力の増加）、および加圧停止（一定圧力下での保持）後、一般的な溶出時間（第二の時間Ｔ２）を経過してもなお、設定圧閾値の圧力を下回らない場合は、直ちにカラム詰まりと判断できるので、カラム詰まりが生じた場合の作業時間を大幅に短縮することができる。
【０１１６】
なお、加圧部による加圧速度および保持時間、カラム詰まりと判断する際の第二の時間Ｔ２、設定圧閾値、処理回数は、検体の種類や分量などによって適宜選択できる。例えば、固相抽出カラム３２１を加圧（圧力の増加）、および加圧停止（一定圧力下での保持）減圧処理（大気圧への開放）の加減サイクルを５回行い、５回目のカラム圧力によるカラム詰まり判断を行ってもよい。また、検体が少量である場合や、また多量である場合には溶出時間（第二の時間Ｔ２）を短く、もしくは長く設定してもよい。
【０１１７】
図９および図１０は、表示部に表示される画面遷移の一例である。
【０１１８】
表示部２は種々のスイッチやキーが設けられ、これらを操作することで種々の制御条件を入力したり、プログラムを変更したりできるようになっている。本実施形態の核酸抽出装置１０は、スタンドアロン操作が可能である。
【０１１９】
表示部２からは制御部ＣＴへも制御条件が入力できるようになっており、これにより制御部ＣＴ内部のデータ格納部のデータやプログラムを書き換え変更して設定できる。表示部２から入力される制御条件に応じてプログラムが実行され、核酸抽出処理の手順が実行される。
【０１２０】
さらに表示部２には、作業手順や現在実行中の作業なども表示できる。また、各種パラメータ設定も可能である。パラメータ設定の一例としては、固相抽出カラム３２１のろ過設定（各加圧工程毎の送気量、送気速度、限界圧等の設定）や、攪拌設定（攪拌時間、攪拌速度、加速度等の設定）がある。また自動運転が正常に終了したことを知らせる正常終了表示、例えばチップ不足等によって強制終了したことを知らせるエラー表示、何らかの異常の発生によって運転が非常停止中であることを知らせる非常停止表示等の表示も行う。また、例えば加圧処理中には、表示部の表示切り替えによって、ろ過圧カレントグラフの表示も可能である。ろ過圧カレントグラフは、加圧部の加圧センサをモニタリングするセンサによって、リアルタイムで加圧状態を表示するものである。
【０１２１】
図１１は、従来手法の一例として抽出カラム遠心法によって核酸（ここではＤＮＡ）を調製して病原体の同定を行った実験と、本実施形態の核酸抽出装置１０によって核酸（ここではＤＮＡ）を調製して病原体の同定を行った実験の結果をまとめた図である。表の左が従来手法の結果であり、右が本実施形態の自動調製の結果である。なお、従来手法では遠心機を用いることから遠心法という場合があり、本実施形態では固相抽出カラムに圧縮した空気を送ることから遠心法に対して圧送法という場合がある。
【０１２２】
従来手法（遠心法）では、複数の検体について手動で核酸抽出のための分注作業を行い、遠心分離機を用いてＤＮＡを抽出した後、各検体のＤＮＡ精製溶液に、手動で１検体毎に複数のプライマー溶液を分注し、ＰＣＲ分析を行った。これに対し、本実施形態の核酸抽出装置１０による圧送法では上述のごとく、これら複数の検体について自動化処理を行った。なお、図７のステップＰ１〜ステップ３の工程までは共通の作業として手動で行った。
【０１２３】
また、病原体の同定には、従来手法も本実施形態も、急性呼吸器感染の起炎病原体を鑑別するＨＩＲＡ−ＴＡＮ法を採用した。ＨＩＲＡ−ＴＡＮ法を簡単に説明すると、鑑別対象となる病原体が、気道定着病原体であり、まず対象の気道分泌物（例えば、患者の喀痰）を含む検体から抽出した核酸（例えば、ＤＮＡ）中の、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数を測定し、抽出したＤＮＡ中の、病原体に由来する遺伝子のコピー数を測定する。そして、対象の細胞に由来する遺伝子のコピー数に対する、病原体に由来する遺伝子のコピー数の相対数を算出する。この工程を複数の対象について行い、各々の対象について相対数を得る。そして、各々の対象の相対数と、各々の対象の臨床診断結果との比較により、臨床診断において起炎病原体陽性となる相対数の下限値；及び／又は臨床診断において起炎病原体陰性となる相対数の上限値を鑑別基準値と決定し、鑑別基準値と遺伝子のコピー数の相対数とに基づいて、病原体が起炎病原体であるか否かを鑑別する手法である。
【０１２４】
ＨＩＲＡ−ＴＡＮ法では、検体中の遺伝子（病原体）の相対コピー数を、ＰＣＲ分析において、一定の蛍光強度に達した時点のサイクル数（Ｃｔ値：Cycle  threshold）で表す。そして、図１１に示すΔＣｔがヒト細胞を内部コントロールとした病原体細胞の相対量であって、コントロール（比較対象）であるヒト細胞のＣｔ値（Ｃｔｈｕｍａｎ）から、ある病原体のＣｔ値（Ｃｔｐａｔｈｏｇｅｎ）を差し引いた値（すなわち、−（Ｃｔｐａｔｈｏｇｅｎ−Ｃｔｈｕｍａｎ）である。また、ここでは肺炎症例における病原体の同定を行っており、これらの病原体の鑑別基準値（Positive  cutoff  value）は、ＬｙｔＡ＞−４、Ｐ．ａｅｒ＞−２、ＫＰＮＥ＞−４、ＨＩＮＦ＞−１、ＭＣＡＴ＞０とした。
【０１２５】
この結果、全検体のうち、破線で示す検体３０５のみが異なる判定となっており、従来法の判定結果が正答であると仮定した場合における、遠心法と比較した本実施形態の圧送法の正答率（合致率）は９５％であった。ただし、検体３０５において、遠心法によるΔＣｔは−４．０３で陰性であり、圧送法によるΔＣｔは−３．８７で陽性である。この場合、病原体ＬｙｔＡの鑑別基準値が−４であり、いずれも鑑別基準値に近く、判定が難しい例であるとは言える。しかし、ＨＩＲＡ−ＴＡＮ法における、ΔＣｔは過去の被験者統計解析によるものであり、必然的に誤差を含むため、より陽性値に近い結果の方が実際的に好ましい。これらを考慮すると、遠心法のΔＣｔ（−４．０３）は偽陽性であるともいえる。従って、これを陽性と判定した本実施形態の圧送法の方が優れているといえる。
【０１２６】
図１２も、従来手法の遠心法と本実施形態の圧送法の比較を示す図であり、病原体の同定を行った結果である。
【０１２７】
なお、従来手法と本実施形態の調製方法において、上記のステップＰ１〜３は共通に行っている。
【０１２８】
患者（検体）の数は５０人であり、治療対象となる定着型病原体数、および治療対象となる非定着型病原体数は、従来手法も本実施形態の場合もいずれも同数である。
【０１２９】
また、光の吸収率（吸光度）による平均ＤＮＡ純度（Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ）は、従来方法が１．７６であり、本実施形態も１．７３であってほぼ近い値となった。なお、この値は、１．８でＤＮＡ純度が良好であるとされる。また、平均ヒト細胞コピー数（Ｃｔｈｕｍａｎ値、図ではＣｔ値）は、従来手法が２４．０５に対して、本実施形態では２４．１１であった。
【０１３０】
この結果からも本実施形態は、治療対象と判定する患者数が従来方法と完全一致し（もちろん患者も一致している）、平均ＤＮＡ純度およびヒト細胞コピー数（Ｃｔ値）も略一致しているといえ、本実施形態の調製方法の正確性が実証できた。
【０１３１】
さらに、核酸抽出から結果報告の平均時間（１検体あたりの時間（ｈ））は、従来手法が４時間であるのに対し、本実施形態では３時間であった。ここで、核酸抽出から結果報告の平均時間のうちの２時間は、検体の酵素反応に必要な時間であって、両者に必須な（共通な）時間である。従って、この時間を除いた平均時間で比較すると、従来手法が２時間であるのに対し、本実施形態では１時間となり、本実施形態によれば、従来と比較して判定時間を半減することができるという顕著な効果が現れた。
【０１３２】
加えて、本実施形態では、操作者への病原体の暴露が少なく、再現性も高めることができ、操作者の作業時間の解放による判定コストも大幅に低減できる。
【０１３３】
また、遠心分離機が不要となるため、装置の小型化、低価格化が実現する。
【０１３４】
以上、本発明を実施形態により詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものでなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等があっても本発明の範囲に含まれるものである。
【０１３５】
すなわち、上記の実施形態では核酸抽出部３とプライマー処理部４とを１つの核酸抽出装置１０内に納めた場合を例に説明したが、核酸抽出部のみを有する核酸抽出装置であってもよい。また、核酸抽出部３とプライマー処理部４とが別体であって、連続処理が可能なように製造ライン化された核酸抽出装置であってもよい。またＰＣＲ蛍光分析装置も核酸抽出装置１０に含めて１ユニット化したものであってもよい。
【０１３６】
また、上記の実施形形態において前処理工程（ステップＰ１，Ｐ２）を自動プログラムに組み込むことで、ステップ１から自動制御することができる。
【０１３７】
また、自動制御プログラムを書き換えることで種々の操作が可能となる。例えば、上記の実施形態では４検体を同時処理する場合を例に説明したが、１検体〜３検体の同時処理としてもよい。また、目的に応じて、核酸抽出処理のみ自動化し、プライマー溶液分注は手作業で行うプログラムを保持させたり、又はその逆のプログラムを保持させることもでき、操作者が適宜選択して実施することも可能となる。
【０１３８】
また、固相抽出カラム３２１の加減圧サイクルの減圧について、加圧用カラムキャップ３１１を開放し、固相抽出カラム３２１を大気圧下に開放することによって、設定圧閾値を超える圧力から大気圧に戻す（減圧する）場合を例に説明したが、これに限らず、固相抽出カラム３２１を大気圧下に開放することに代えて（あるいはこれに加えて）、核酸抽出部３に引圧手段（例えば、吸引装置など）を設け、固相抽出カラム３２１を引圧する（吸引する）ことによって設定圧閾値を超える圧力から圧力を減少させるようにしてもよい。
【０１３９】
また、カラム詰まりの検出における減圧についても、加圧用カラムキャップ３１１を開放し、固相抽出カラム３２１を大気圧下に開放することによって減圧する場合に限らず、固相抽出カラム３２１を大気圧下に開放することに代えて（あるいはこれに加えて）、核酸抽出部３に引圧手段（例えば、吸引装置など）を設け、固相抽出カラム３２１を引圧する（吸引する）ことによって設定圧閾値を超える圧力から減圧するようにしてもよい。
【０１４０】
また、上記実施例では核酸として、検体中のＤＮＡを抽出する場合を例に説明したが、これに限らず、ＲＮＡの抽出にも適用できる。また上記実施例では患者の喀痰から病原体を同定するための前処理に用いるＤＮＡの抽出を例に説明したが、これに限らず、例えば血液中のＤＮＡ（またはＲＮＡ）の抽出や、食品中のＤＮＡ（またはＲＮＡ）の調製などにも広く適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、核酸の分析による病原体の同定の前処理として、核酸を調製する場合などに用いることができる。
【符号の説明】
【０１４２】
１  ハウジング
２  表示部
３  核酸抽出部
４  プライマー処理部
５  分注部
６  チップラック
８  廃棄チップ置場
９  試薬槽
１０  核酸抽出装置
２０  検体用チューブ
３１  加圧部
３２  分離部
３３  第１移動機構
３４  第２移動機構
４１  チューブ保持部
４２  プライマー保持部
５０  分注シリンダ
５４  チップ
３１１  加圧用カラムキャップ
３１２  加圧チューブ
３１３  加圧シリンジ
３１３ａ  シリンジ
３１３ｂ  プランジャ
３１５  圧力センサ
３１６  キャップ保持部
３２１  固相抽出カラム
３２３  廃液槽
３２４  回収用チューブ
３２５  回収用チューブ保持部
５２１  第１駆動部
５２２  第２駆動部
【図１】
2015139398.tif 000003
【図３】
2015139398.tif 000004
【図４】
2015139398.tif 000005
【図５】
2015139398.tif 000006
【図６】
2015139398.tif 000007
【図１１】
2015139398.tif 000008
【図１２】
2015139398.tif 000009
【図２】
2015139398.tif 000010
【図７】
2015139398.tif 000011
【図８】
2015139398.tif 000012
【図９】
2015139398.tif 000013
【図１０】
2015139398.tif 000014