(57)【要約】【課題】カビ毒低減機能を有する植物の作製方法およびその利用等を提供する。【解決手段】本発明にかかるカビ毒低減機能を有する植物の作製方法は、植物において、（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とするカビ毒低減機能を有する植物の作製方法：
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の作製方法により得られたことを特徴とするカビ毒低減機能を有する植物。
【請求項３】
上記植物がイネ科の穀物である、請求項２に記載の植物。
【請求項４】
上記イネ科の穀物がコムギ、オオムギ、エン麦またはトウモロコシである、請求項３に記載の植物。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または当該遺伝子にコードされるタンパク質を用いて、カビ毒を低減させる方法：
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
上記カビ毒が、トリコテセン系カビ毒である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記トリコテセン系カビ毒が、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）またはニバレノール（ＮＩＶ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または当該遺伝子にコードされるタンパク質を有効成分とする、カビ毒低減剤。
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビ毒低減機能を有する植物の作製方法およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌であるフザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）を原因菌とする麦類赤かび病は、コムギ、オオムギ、エン麦、トウモロコシ等の多くのイネ科主要穀物に感染する病害であり、最重要病害のひとつとして知られる。赤かび病菌は、ありふれた腐生菌で、世界中の麦作地帯に分布しており、特に開花期から登熟期に雨の多い地域で被害が大きい。この赤かび病菌が穂に感染することによって、粒の肥大の阻害や穂全体の枯れが引き起こされ、穀粒の商品価値が損なわれるのみならず、赤かび病菌が産生するトリコテセン系カビ毒が、食品の安全性の観点から問題とされている。
【０００３】
トリコテセン系カビ毒は、ｐＨの変化や熱に対して安定であるため無毒化することが困難であり、人畜が摂取すると吐き気、嘔吐、腹痛といった中毒症状を引き起こし、状況によっては死に至る極めて危険性の高い毒素である。トリコテセン系カビ毒は、非常に多様な分子種が存在し、その構造から大きく４つのグループに分けられる。赤かび病菌の中には数多くのstrainがあり、それぞれが産生するトリコテセン系カビ毒の分子種が決まっている。これらのうち、汚染の報告例が多いのはタイプＡとタイプＢの２つである。
【０００４】
タイプＡには、非常に毒性の強いＴ２トキシン等が含まれるが、汚染範囲が限られている。一方、タイプＢのトリコテセン系カビ毒には、デオキシニバレノール（Deoxynivalenol；ＤＯＮ）やニバレノール（Nivalenol；ＮＩＶ）等が含まれる。タイプＢの毒性はタイプＡほど強くないが、汚染範囲が広範であるため、被害はより深刻である。例えば、我が国においては、２００２年５月、厚生労働省により小麦粒中に含まれるＤＯＮの濃度を１．１ｐｐｍ以下とする暫定基準値が設けられている。
【０００５】
このように、一定基準を超えてトリコテセン系カビ毒を含有する赤かび病罹病穀物は醸造、加工、飼料等いかなる形態でも利用することができず廃棄される。その一方で、食の安全性に対する意識が高まっているため、赤かび病発生を抑える農薬は極力使用しない栽培が求められている。
【０００６】
このような環境のなか、赤かび病の抵抗性品種の開発が世界規模で解決すべき緊急の課題となっており、これまでに、本発明者らは、赤かび病菌、特にＤＯＮまたはＮＩＶ等のタイプＢのトリコテセン系カビ毒を産出する赤かび病原菌に対する感受性または抵抗性に関与する遺伝子を複数見出し、上記遺伝子の発現を抑制するまたは増大させる工程を含むことで赤かび病抵抗性植物を作製する方法を開発している（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１７２５６２号公報（２０１１年９月８日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した技術は優れたものではあるが、これだけでは十全とはいえない。赤かび病原菌を死滅させたとしても、上述したように、トリコテセン系カビ毒は、ｐＨの変化や熱に対して安定であるため無毒化することが困難であり、食品中にトリコテセン系カビ毒が残存するという問題がある。
【０００９】
本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたものであり、その目的は、トリコテセン系カビ毒を低減させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、トリコテセン系カビ毒の低減に対して有効な遺伝子および当該遺伝子にコードされるタンパク質を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）植物において、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子を発現させる工程を含むことを特徴とするカビ毒低減機能を有する植物の作製方法：
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１２】
（２）（１）に記載の作製方法により得られたことを特徴とするカビ毒低減機能を有する植物。
【００１３】
（３）上記植物がイネ科の穀物である、（２）に記載の植物。
【００１４】
（４）上記イネ科の穀物がコムギ、オオムギ、エン麦またはトウモロコシである、（３）に記載の植物。
【００１５】
（５）下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または当該遺伝子にコードされるタンパク質を用いて、カビ毒を低減させる方法：
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１６】
（６）上記カビ毒が、トリコテセン系カビ毒である、（５）に記載の方法。
【００１７】
（７）上記トリコテセン系カビ毒が、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）またはニバレノール（ＮＩＶ）である、（６）に記載の方法。
【００１８】
（８）下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または当該遺伝子にコードされるタンパク質を有効成分とする、カビ毒低減剤。
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、赤かび病のカビ毒、特にＤＯＮまたはＮＩＶ等のタイプＢのトリコテセン系カビ毒を低減させる機能を有する植物が得られるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】赤かび病菌のＰＨ−１菌株由来のＴＥＨ１タンパク質のアミノ酸配列（FG01737.1）、赤かび病菌のＺＥＡ１菌株由来のＴＥＨ１タンパク質（ＴＥＨ１）であって、FG01737.1と相同性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質の配列（ＴＥＨ１）、およびFG01737.1とＴＥＨ１（ＺＥＡ１菌株由来）とに共通してみられる特徴的なアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＰＨ−１菌株由来のＴＥＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列(FG01737.1)、ＺＥＡ１由来のＴＥＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（ＴＥＨ１）、およびFG01737.1とＴＥＨ１とに共通してみられる特徴的な塩基配列を示す図である。
【図３】赤かび病菌のＰＨ−１菌株由来のタンパク質（FG01737.1）のホモログタンパク質の一次構造を示す図である。
【図４】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株の形質転換体について、ハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬ添加ＰＤＡ培地における各菌株の様子を示す図である。
【図５】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株の形質転換体について、ＳＮ培地における分生子の様子を示す図である。
【図６】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株の形質転換体について、ＳＮＡ培地における気中菌糸の様子を示す図である。
【図７】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株の形質転換体のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図８】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株の形質転換体のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す図である。
【図９】ＤＯＮの生合成に関与する遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
【図１０】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株の形質転換体における、カビ毒の質量分析の結果を示す図である。
【図１１】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株を接種したシロイヌナズナの様子を示す図である。
【図１２】野生型（ＷＴ）菌株およびＴＥＨ１過剰発現株を接種したシロイヌナズナにおいて、赤かび病菌のｇＤＮＡ量を解析した結果示す図である。
【図１３】ＤＯＮ含有ＭＳ寒天培地で育てた、播種後１週間のＴＥＨ１を発現する形質転換シロイヌナズナ株と野生株の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
【００２２】
＜１．カビ毒低減機能を有する植物の作製方法＞
本発明に係るカビ毒低減機能を有する植物の作製方法は、植物において、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子を発現させる工程を含むものであればよく、その他の工程、条件、材料等については特に限定されない。
（ａ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号１または２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号３または４に記載される塩基配列からなる遺伝子。
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２３】
上記（ａ）〜（ｅ）の遺伝子は、カビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードしているため、植物においてこれらの遺伝子を発現させることにより、植物のカビ毒低減機能を付与または高めることができる。
【００２４】
本発明のカビ毒低減機能を有する植物の作製方法によって、赤かび病のカビ毒、特にＤＯＮまたはＮＩＶ等のタイプＢのトリコテセン系カビ毒を低減させる機能を有する植物を得ることができる。
【００２５】
まず、上記（ａ）の遺伝子について具体的に説明する。
【００２６】
配列番号１は、赤かび病菌（F.graminearum）のＰＨ−１菌株由来のＴＥＨ１タンパク質のアミノ酸配列を示す（FG01737.1）。上記タンパク質は、４０３個のアミノ酸残基からなるタンパク質であるが、これまで機能については十分にわかっていなかった。今回、本発明者らは、本タンパク質がカビ毒を低減させる機能を有することを見出した。図１に配列番号１、２のアミノ酸配列を示す。配列番号２は、赤かび病菌の１つの菌株であるＺＥＡ１由来のＴＥＨ１タンパク質であって、配列番号１と相同性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質の配列を示す（図中、「ＴＥＨ１」と示す）。なお、図１のconsensusの配列は、配列番号１で示されるアミノ酸と配列番号２で示されるアミノ酸配列とに共通してみられる特徴的なアミノ酸配列を示す。
【００２７】
上記（ｂ）の遺伝子は、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関して、機能的に同等（同一および／または類似）である変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等を意図しており、カビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については特に限定されない。ここで欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、上記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいい、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、より好ましくは７アミノ酸以内、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、５、４、３、２または１アミノ酸）である。変異を導入したタンパク質が植物に所望の形質を付与するか否かは、当該タンパク質をコードする遺伝子を発現させて、その植物がカビ毒に対して低減機能を示すは否かを調べることによって判断することができる。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変位を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００２８】
変異するアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。
【００２９】
上記（ｃ）の遺伝子は、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関して、機能的に同等である変異体、誘導体、バリアントまたはホモログ、オルソログ等を意図しており、カビ毒を低減させる機能を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については特に限定されない。アミノ酸配列の相同性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990) を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝１００、wordlength ＝１２とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝５０、wordlength ＝３とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【００３０】
上記（ｄ）の遺伝子について、配列番号３は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のFG01737.1タンパク質（ＰＨ−１菌株由来ＴＥＨ１タンパク質）をコードする遺伝子の塩基配列（Open Reading Frame：ＯＲＦ）を示す。同様に、配列番号４は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴＥＨ１タンパク質（ＺＥＡ１菌株由来）をコードする遺伝子の塩基配列（ＯＲＦ）を示す。図２に配列番号３、４の塩基配列を示す。図２のconsensusの配列は、配列番号３で示される塩基と配列番号４で示される塩基配列とに共通してみられる特徴的な塩基配列を示す。
【００３１】
上記（ｅ）の遺伝子は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意図する。
【００３２】
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一例を示すと、0.25M Na2HPO4、pH7.2、7％SDS、1mM EDTA、1×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が60〜68℃、好ましくは65℃、さらに好ましくは68℃の条件下で16〜24時間ハイブリダイズさせ、さらに20mM Na2HPO4、pH7.2、1％SDS、1mM EDTAからなる緩衝液中で温度が60〜68℃、好ましくは65℃、さらに好ましくは68℃の条件下で15分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/mL変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００３３】
図３に、上記（ｂ），（ｃ），または（ｅ）の遺伝子がコードするタンパク質の一例として挙げられる、配列番号１（FG01737.1）のホモログタンパク質の一次構造を示す。網掛している部分は、FG01737.1タンパク質のＮ末端モチーフを示す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。勿論、同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００３５】
また、本発明に利用する遺伝子・タンパク質を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；東洋紡製，Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech製，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【００３６】
また、本発明に利用する遺伝子は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
【００３７】
本発明の方法の対象となる植物としては、赤かび病に感染する植物であれば特に制限されないが、イネ科の穀物が好ましく、ムギ類植物がより好ましい。より具体的には、例えばイネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、エン麦、アワ、モロコシ、シロイヌナズナ等が挙げられ、これらの中でも、コムギ、オオムギ、エン麦またはトウモロコシがより好ましい。
【００３８】
また、本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、細胞、カルス、それを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書中において「カビ毒」とは、カビ菌が生産する二次代謝産物の中で、ヒトまたは家畜に対して中毒を引き起こす有毒物質であり、本明細書中においては特に赤かび病菌が生産する有毒物質を意図している。上記カビ毒の具体的な例としては、赤かび病菌が生産するタイプＢのトリコテセンカビ毒が挙げられる。上記タイプＢのトリコテセンカビ毒の中でも、本発明が対象とするカビ毒としては、デオキシニバレノール（Deoxynivalenol；ＤＯＮ）またはニバレノール（Nivalenol；ＮＩＶ）が好ましい。本発明が対象とするカビ毒がＤＯＮまたはＮＩＶである場合、本発明におけるカビ毒低減機能がより高い効果を示す。
【００４０】
本明細書中「赤かび病」とは、フザリウム・グラミネアラムを原因菌とする麦類赤かび病を意図している。
【００４１】
本明細書中において、カビ毒を「低減」させるとは、上記カビ毒の濃度を減少させることを意図している。カビ毒の減少には、いったん生成されたカビ毒を分解等することにより減少させる場合のほか、カビ毒の生合成に関与する遺伝子群の発現抑制等により、カビ毒の生成自体を阻害する場合も含まれる。
【００４２】
本明細書中「遺伝子を発現させる工程」とは、対象とする植物内において、上記遺伝子がコードするタンパク質が産出されるか、または当該タンパク質の産出量を増加させる工程であればよく、結果として、上記遺伝子を発現させた植物が、カビ毒を低減させる機能を有すればよい。
【００４３】
「遺伝子の発現させる」とは、対象とする植物内において、上記遺伝子がコードするタンパク質の産生量が増大すればよく、外部から遺伝子を形質導入する場合を含む。その増大の程度としても、特に制限はなく、結果として、上記遺伝子が発現した植物が、カビ毒を低減させる機能を有すればよい。
【００４４】
外部から遺伝子を形質導入する場合であれば、公知の方法を利用でき、具体的な方法は限定されないが、例えば後述する組換えベクターを植物に導入し、本遺伝子を発現させることにより、カビ毒を低減させる機能を有する植物を作出することができる。
【００４５】
「組換えベクター」とは、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子を含むものであればよいが、適当なプロモーター等も含み、植物内で本遺伝子を発現できるものであることが好ましい。この際、使用するプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを例示できるが、それ以外にもノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のＰＲタンパク質プロモーターなども使用できる。
【００４６】
本発明のカビ毒低減機能を有する植物の作製方法では、上記組換えベクターを植物に導入し、上記遺伝子を発現させることにより、カビ毒を低減させる機能を有する植物を作出することができる。本発明のカビ毒低減機能を有する植物の作製方法において、組換えベクターを植物に導入する方法としては、従来公知の方法を利用でき、例えば、アグロバクテリウムを用いた手法を例示できるが、それ以外にも、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティカルガン法、マイクロインジェクション法などによっても、導入することができる。
【００４７】
本発明のカビ毒低減機能を有する植物の作製方法は、カビ毒低減機能を有する植物を選抜する工程を含むことが好ましい。上記選抜する工程を含むことによって、得られる植物が、上記機能を有することを容易に確認することができる。上記選抜する工程は、上記遺伝子が発現されているか否かを判定するものであればよく、具体的な方法は特に限定されない。
【００４８】
＜２．カビ毒低減機能を有する植物＞
本発明に係るカビ毒低減機能を有する植物とは、上述の方法にて得られる植物であればよく、その他の構成は特に限定されない。換言すれば、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子が発現している植物ともいえる。
【００４９】
本発明のカビ毒低減機能を有する植物は、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、果実等）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、植物細胞、カルス等のいずれをも包含する。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
【００５０】
また、一旦、染色体内の上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子が発現された形質転換植物が得られれば、上記植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。上記植物またはその子孫、あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に上記植物を量産することもできる。また、本発明のカビ毒低減機能を有する植物は、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子である「Ｔ１世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。
【００５１】
＜３．カビ毒を低減させる方法＞
本発明に係るカビ毒を低減させる方法は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または当該遺伝子にコードされるタンパク質を用いる方法であればよく、その他の構成は特に限定されない。
【００５２】
本発明者らは、配列番号１等で示される赤かび病菌由来のタンパク質が、カビ毒を低減させる機能を有することを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。カビ毒は、その化学構造にエポキシ環を有する。これまで、上記エポキシ環に対してアセチル化またはグリコシル化を行うことによって当該エポキシ環を化学修飾しても、カビ毒の毒性をなくすことができなかった。本発明者らは、カビ毒を産出する赤かび菌自体が有する上記タンパク質が、カビ毒のエポキシ環を加水分解し、カビ毒を代謝していることを見出した。
【００５３】
本発明の方法によって、カビ毒を低減させることができるため、カビ毒に侵されていない植物を提供する、あるいはカビ毒にいったん侵された植物からカビ毒を低減させることができる。また、本発明の方法によって、カビ毒の発生を予防することもできる。
【００５４】
本発明の方法によって低減させるカビ毒は、上述の通り、トリコテセン系カビ毒であることが好ましく、トリコテセンカビ毒の中でも、タイプＢのトリコテセンカビ毒で例えば、ＤＯＮ、ＮＩＶなどを挙げることができる。
【００５５】
本発明の方法を用いることができる植物は、カビ毒を産出する赤かび病に罹病性のある植物であればよく、特に限定されず、上述した各種イネ科の穀物に対して好適に用いることができる。
【００５６】
その他、＜１．カビ毒低減機能を有する植物の作製方法＞と共通する構成は、上記＜１．カビ毒低減機能を有する植物の作製方法＞の記載を援用する。
【００５７】
＜４．カビ毒を低減させる機能を有するタンパク質・遺伝子の利用＞
本発明に係るカビ毒低減剤は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または当該遺伝子にコードされるタンパク質を有効成分とするものであればよく、その他の構成、形態はとくに限定されない。
【００５８】
かかるカビ毒低減剤は、植物に適用されるものであり、植物成長調節剤等の公知の植物に適用される薬剤に許容される担体成分を含有する組成物として提供され得る。また、カビ毒低減剤は、上記遺伝子または当該遺伝子を含む組換え発現ベクターと、植物を形質転換するための各種試薬等とを含むキットの態様で提供されてもよい。また、本カビ毒低減剤は、上記＜３＞欄で説明した方法に用いることもできる。当該方法は、カビ毒低減剤の散布や植物への注入、また形質転換技術などにより行うことができる。
【００５９】
本発明のカビ毒低減剤は、すでにカビ毒に侵されている植物に対して用いてもよいし、カビ毒に侵されていない植物に対して用いてもよい。カビ毒に侵されていない植物に対して、本発明のカビ毒低減剤を用いることによって、上記植物がカビ毒に侵される可能性を減少させることができる。
【００６０】
その他、＜１．カビ毒低減機能を有する植物の作製方法＞と共通する構成は、上記＜１．カビ毒低減機能を有する植物の作製方法＞の記載を援用する。
【００６１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００６２】
また、本発明において、カビ毒低減機能を有することが実験的に確認されたのはシロイヌナズナだけであるが、本発明は、赤かび病に感染する植物一般、特にイネ科植物、さらにはムギ類植物に広く適用できると考えられる。これは以下の理由による。
【００６３】
まず、赤かび病菌は、広くイネ科植物、特にムギ類植物に感染するが、シロイヌナズナにも感染する。そして、その感染形態・病徴は、ムギ類植物のコムギとシロイヌナズナとにおいてほぼ共通することが知られている（Urban et al., Plant J., 32: 961, 2002）。特に、赤かび菌が産生するタイプＢのトリコテセン系カビ毒の作用として、タンパク質合成阻害や根の伸長阻害が知られているが、これらカビ毒の作用はシロイヌナズナとコムギにおいて同様に引き起こされる（Masuda et al., J. Exp. Bot. 58:1617, 2007）。
【００６４】
また、本発明において、カビ毒を低減させる機能を有する遺伝子は、カビ毒由来の遺伝子である。そのため、シロイヌナズナにおいてカビ毒が低減することを実験的に確認していれば、カビ毒に侵されている植物がシロイヌナズナでなくても、カビ毒に対して同様の効果が得られることは当業者であれば容易に理解できる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例において、本発明における配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を「ＴＥＨ１」、配列番号４で示される塩基配列からなるＴＥＨ１をコードする遺伝子を「ｔｅｈ１」と称する。
【００６６】
＜１．ＴＥＨ１を用いて作製した形質転換体＞
まず、赤かび病菌（F.graminearum）の菌株ＺＥＡ１のゲノムからクローニングしたｔｅｈ１を赤かび病菌に導入し、ＴＥＨ１を過剰発現する赤かび病菌の形質転換体（以下「ＴＥＨ１過剰発現株」と称する。）を作製した。
【００６７】
具体的な実験手順は以下の通りである。
【００６８】
赤かび病菌（F.graminearum）の菌株ＺＥＡ１から全ＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲを行い、ＴＥＨ１をコードするｔｅｈ１遺伝子を増幅した。なお、ＴＥＨ１のＣ末端部分にＨＡタグが付加された融合タンパク質が発現するように、９アミノ酸残基のＨＡペプチド配列をコードする塩基配列を組み込んだリバースプライマーを設計した。増幅した塩基配列を、ｐＵＣ１８をバックボーンとした糸状菌形質転換プラスミドに組み込んだ。組み込まれたｔｅｈ１は、糸状菌で構成的に発現調節されるとされているAspergillus nidulans由来のトリプトファン合成酵素遺伝子プロモーターとターミネーターによって調節されている。また、形質転換体の選抜マーカーとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子を用いた。このベクターをＺＥＡ１の菌体から調整したプロトプラストと混ぜ合わせ、ＰＥＧ法を用いて形質転換を行った。
【００６９】
図４は、形質転換体をハイグロマイシン１００μｇ／ｍＬ添加したＰＤＡ培地における各菌株の生育の様子を示す図である。図４（Ａ）は野生型ＷＴの菌株の様子を示したものであり、図４（Ｂ）〜図４（Ｄ）がＴＥＨ１過剰発現株の様子を示したものである。同図より、ｔｅｈ１を赤かび病菌に導入できたことがわかる。
【００７０】
図５は、野生型およびＴＥＨ１過剰発現株のＳＮ培地における分生子の様子を示す図である。図５（Ａ）が、野生型の分生子の様子を示すものであり、図５（Ｂ）が、ＴＥＨ１過剰発現株の分生子の様子を示すものである。同図より、ＴＥＨ１を過剰発現させた形質転換体は、野生型と比べて、特に形態的な異常は認められないことがわかる。
【００７１】
図６は、野生型およびＴＥＨ１過剰発現株のＳＮＡ培地における気中菌糸の様子を示す図である。図６（Ａ）が野生型の気中菌糸の様子を示すものであり、図６（Ｂ）がＴＥＨ１過剰発現株の気中菌糸の様子を示すものである。同図に示すように、ＴＥＨ１を過剰発現させた形質転換体は、野生型と比べて、外観上、特に差異は認められないことがわかる。
【００７２】
＜２．赤かび病菌中におけるＴＥＨ１の発現＞
赤かび病菌（F.graminearum）のゲノムからクローニングしたｔｅｈ１を赤かび病菌に導入し、作製した赤かび病菌の形質転換体中において、ＴＥＨ１の過剰発現を確かめるために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法およびＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによって確認した。
【００７３】
具体的な実験手順は以下の通りである。
【００７４】
ＰＤＡ培地上で３日間生育した野生株とＴＥＨ１過剰発現株の菌体から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写を行った後、それぞれのプライマーを用いてＰＣＲを行った。図７にＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。上段にＴＥＨ１遺伝子、下段にコントロールとして用いたβ−チューブリン遺伝子の結果を示す。ＷＴは野生株であり、＃１〜＃３はＴＥＨ１過剰発現株である。図７に示すように、形質転換体中において、ＴＥＨ１のｍＲＮＡの高発現を確認することができた。
【００７５】
ＰＤＡ培地上で３日間生育した野生株とＴＥＨ１過剰発現株の菌体から全タンパク質を抽出し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって展開後メンブレンに転写し、ＨＡタグ配列を検出することで、ＴＥＨ１タンパク質の発現を確認した。
【００７６】
図８にＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。図８の上段は、ＨＡ抗体による検出の結果を示すものであり、矢印はＴＥＨ１の推定分子量（４６．９ｋＤａ）を示す。図８の下段は、ポンソーＳ染色による検出の結果を示すものである。図８に示すように、ｔｅｈ１を赤かび病菌に導入し、作製した赤かび病菌の形質転換体中において、ＴＥＨ１タンパク質が高発現していることを確認することができた。
【００７７】
＜３．赤かび病菌（ＤＯＮ）の生合成に関与する遺伝子に対するＴＥＨ１の影響＞
ＴＥＨ１過剰発現株において、ＴＥＨ１が、ＤＯＮの生合成に関与すると報告されている１４種類の遺伝子に対する影響の有無を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、形質転換体における上記１４種類の遺伝子の発現を解析した。
【００７８】
具体的な実験手順は以下の通りである。
【００７９】
ＰＤＡ培地上で３日間生育した野生株とＴＥＨ１過剰発現株の菌体から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマーを用いて逆転写を行った後、それぞれのプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００８０】
図９に結果を示す。ＷＴは野生株、♯１−３は過剰発現体を示す。β-tubulinをコントロールとして用いた。図９の左側の７種類の遺伝子の結果が示すように、ＴＥＨ１過剰発現株と野生株（ＷＴ）とを比較すると、ＴＥＨ１過剰発現株では、ＤＯＮの生合成経路に関与する遺伝子の多くの発現が低下していることがわかった。また、図９の右側の７種類の遺伝子の結果が示すように、positive regulatorの発現はやや抑制されており、negative regulatorの発現は増加していることがわかった。またtransporterであるＴＲＩ１２の発現も抑制されていた。さらに、機能未知のＴＲＩ１４，ＴＲＩ９の発現も抑制されていることがわかった。この結果より、ＴＥＨ１の過剰発現により、ＤＯＮの生合成に関与する遺伝子の発現が低下することがわかる。
【００８１】
＜４．質量分析を用いたＴＥＨ１の機能評価＞
ＴＥＨ１がカビ毒を分解することを確認するために、野生株（ＷＴ）およびＴＥＨ１過剰発現株のそれぞれにおいて、カビ毒である３Ａ−ＤＯＮの質量分析を行った。
【００８２】
具体的な実験手順は以下の通りである。
【００８３】
図１０に野生株（ＷＴ）およびＴＥＨ１過剰発現株のそれぞれについての質量分析の結果を示す。野生株及びＴＥＨ１過剰発現株をＰＤＡ培地上で1週間生育させ、菌糸を回収・破砕後、アセトニトリルと水からなる溶媒でカビ毒を抽出し、カラム(MycoPrep#227)を用いて精製し、質量分析計(MALDI TOF TOF)を用いて、分析を行った。図１０Ａが、野生株（ＷＴ）、図１０Ｂが、ＴＥＨ１過剰発現株の質量分析計での解析結果を示すものである。図１０Ａと図１０Ｂとを比較すると、ＴＥＨ１過剰発現株では、３６０〜３６４ｍ／ｚに確認される３アセチルデオキシニバレノール(３Ａ−ＤＯＮ)由来のピークが減少していることが確認できた（図中、黒矢印で示すピーク）。一方、ＴＥＨ１過剰発現株では、３４１ｍ／ｚ付近に新たなピークが確認できたが、本ピークは３Ａ−ＤＯＮの分解産物であると推定される（図中、白抜きの矢印で示すピーク）。この結果から、ＴＥＨ１がカビ毒を分解することがわかる。
＜５．シロイヌナズナを用いたＴＥＨ１の機能評価１＞
赤かび病菌のＴＥＨ１過剰発現株と、コントロールとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を導入した菌株のそれぞれを接種したシロイヌナズナの葉の様子を観察した。
【００８４】
具体的な実験手順は以下の通りである。
【００８５】
SN培地液体で３日間振とう培養したＧＦＰ株とＴＥＨ１過剰発現株から、ガーゼによって菌体を取り除き、遠心によって回収した分生子をＰＢＳバッファーにて３回洗浄した。単離した分生子を１００，０００個／ｍｌの濃度に再懸濁し、約４週間育てたシロイヌナズナの葉に針なしのシリンジを用いて注入接種を行った。接種後、密閉容器で３日間保湿した後、病徴の観察とリアルタイムＰＣＲにより菌と植物のゲノム量を測定した。
【００８６】
図１１は、赤かび病菌分生子を葉に注入接種してから３日後のシロイヌナズナの葉の病徴を示す図である。図１１Ａが、ＧＦＰを導入した赤かび病菌を接種したシロイヌナズナの葉であり、図１１Ｂが、ＴＥＨ１過剰発現株を接種したシロイヌナズナの葉を示している。図１１Ａと図１１Ｂとを比較すると、ＴＥＨ１過剰発現株を接種したシロイヌナズナでは、赤かび病による病徴（赤かび病菌の増殖による枯死や気中菌糸の発生）を抑制されていた。この結果より、ＴＥＨ１がカビ毒を分解することで、赤かび病菌の病原性が低下することがわかる。
【００８７】
＜６．シロイヌナズナを用いたＴＥＨ１の機能評価２＞
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を導入した赤かび病菌とＴＥＨ１過剰発現株を接触させたシロイヌナズナのｇＤＮＡ量を確認した。
【００８８】
具体的な実験手順は以下の通りである。
【００８９】
上記の病徴観察と同様に赤かび病菌を接種した植物試料を準備し、リアルタイムＰＣＲにより赤かび菌のＥＦ１α遺伝子と植物のＡＣＴ２遺伝子を増幅することにより、接種サンプルに含まれる菌と植物それぞれのゲノム量を測定した。菌のｇＤＮＡ量が多い程、シロイヌナズナでの高い増殖能、すなわち高い病原性を示すことになる。
【００９０】
図１２に結果を示す。図１２の縦軸は、シロイヌナズナの葉の全ｇＤＮＡにおける赤かび病菌のｇＤＮＡの割合である。ＧＦＰを導入した赤かび病菌（図中、ＺＥＡ１ＧＦＰと示す）を接種させたシロイヌナズナに比べて、ＴＥＨ１過剰発現株（図中、＃3と示す）を接種させたシロイヌナズナは、赤かび病菌のｇＤＮＡ量が顕著に少ないことがわかる。これより、ＴＥＨ１過剰発現株では、植物における増殖能(病原性)が低下していることがわかる。
【００９１】
＜７．ＴＥＨ１を発現する形質転換シロイヌナズナを用いたＴＥＨ１の機能評価＞
トリコテセン系カビ毒の中でも最も問題になっているデオキシニバレノール（ＤＯＮ）を含む培地にて、ＴＥＨ１を発現する形質転換シロイヌナズナと野生型のシロイヌナズナを生育させ、ＴＥＨ１の機能を評価した。
【００９２】
赤かび病菌(ＺＥＡ菌株)由来のｔｅｈ１遺伝子のコード領域をカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの下流に置いた融合遺伝子を作製し、アグロバクテリウムを用いた、シロイヌナズナ(Columbia-0)へ形質転換を行った。遺伝子組換体をカナマイシン(５０μｇ/ｍｌ)で選抜し、得られた耐性植物について、ｔｅｈ１遺伝子の導入を確認した。さらに、これらの複数の遺伝子組換え系統において、実際にｔｅｈ１遺伝子が高発現していることを確認した。野生型(Col-0)とＴＥＨ１過剰発現株の種子を滅菌し、トリコテセンのＤＯＮを含むＭＳ培地で生育させて、ＤＯＮ耐性について調べた。植物細胞でもＴＥＨ１によるＤＯＮの分解活性が見られれば、ＴＥＨ１過剰発現株では、ＤＯＮによる生育阻害が野生株よりも緩和されることが期待される。
【００９３】
図１３に、ＤＯＮ含有ＭＳ寒天培地で育てた、播種後１週間のＴＥＨ１を発現する形質転換シロイヌナズナ株と野生株の結果を示す。図１３の左は写真を示し、右は各系統における根の長さの測定データをグラフ化したものである。なお、図中、ＴＨＥ１ｏｘ♯３７及びＴＨＥ１ｏｘ♯３３はＴＥＨ１を発現する形質転換シロイヌナズナ株であり、ＷＴは野生型を示す。
【００９４】
同図に示すように、ＴＥＨ１を発現するシロイヌナズナは、野生型に比べて、根の伸長も２倍以上優れており、ＤＯＮの影響を受けにくいことがわかる。これより、ＴＥＨ１を発現する形質転換シロイヌナズナは、赤かび病菌の毒素が存在する場合でも生育できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明によれば、カビ毒が低減した安全性の高い植物を提供することができるため、農業、食品産業等に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１０】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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