(57)【要約】【課題】基質特異性の異なる複数のビフェニルジオキシゲナーゼを発現する微生物菌体を組み合わせ用いることによって効率よくポリ塩化ビフェニル類を分解、無害化する。【解決手段】ビフェニル環の異なる位置に二原子酸素添加反応しうる少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を発現し、かつポリ塩化ビフェニル類に対する分解活性を有する微生物菌体を含むポリ塩化ビフェニル類分解用組成物。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフェニル環の異なる位置に二原子酸素添加反応しうる少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を発現し、かつポリ塩化ビフェニル類に対する分解活性を有する微生物菌体を含むポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１種類のビフェニルジオキシゲナーゼが、ポリ塩化ビフェニルに対するビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有し、他の１種類のビフェニルジオキシゲナーゼが、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する請求項１に記載のポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
【請求項３】
コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体と、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体とを含む請求項１又は２に記載のポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
【請求項４】
前記コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体が、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むか、又は前記各アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつそれらの複合体がポリ塩化ビフェニル分解活性を有する相同タンパク質を含む、請求項３に記載のポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
【請求項５】
前記バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体が、配列番号６、７、９及び１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むか、又は前記各アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつそれらの複合体がポリ塩化ビフェニル分解活性を有する相同タンパク質を含む、請求項３又は４に記載のポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
【請求項６】
前記少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼが別々の菌体内で産生され、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体よりもビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体を多く含む請求項１〜５の何れか一項に記載のポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物と、ポリ塩化ビフェニル類とを接触させる工程を含むポリ塩化ビフェニルの無害化方法であって、
前記組成物中のビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体と、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体との配合割合を、前記ポリ塩化ビフェニル類の構成成分に合わせて調整することを特徴とするポリ塩化ビフェニルの無害化方法。
【請求項８】
水性媒体中で、請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物と、ポリ塩化ビフェニル類を含む油性成分とを混合する工程と、
前記混合物に通気及び攪拌する工程と、
を含むことを特徴とするポリ塩化ビフェニルの無害化方法。
【請求項９】
前記水性媒体及び／又は前記混合物にマイクロバブルを供給することを含む請求項８に記載のポリ塩化ビフェニルの無害化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）分解用組成物及びこれを用いてＰＣＢｓを無害化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
難分解性有機塩素化合物の一種であるポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）は、化学的に安定な性質から幅広い産業分野で用いられたが、生体への蓄積性や内分泌系に対する撹乱作用を示すことが明らかとなって以来、国際的にその製造や使用が禁じられている。我が国で輸入・製造販売されたＰＣＢｓは、およそ５５,０００トンと推定されているが、この推定値は１００％ＰＣＢｓ濃度における表記である。ＰＣＢ廃棄物の区分けは、ＰＣＢ濃度が５,０００ｐｐｍを越えるものを（高濃度）ＰＣＢ廃棄物、５,０００ｐｐｍ以下を低濃度ＰＣＢ廃棄物とする。さらに詳細に低濃度ＰＣＢ廃棄物を区分けすると、廃棄物の処理及び清掃に関する法律施行規則の第６条の２４の２で規定される無害化処理に係る特例の対象となる産業廃棄物のうち低濃度ＰＣＢ廃棄物とは、低濃度ＰＣＢ廃油、低濃度ＰＣＢ汚染物、低濃度ＰＣＢ処理物の３種類を指し、これらが微量ＰＣＢ汚染廃電気機器等、低濃度ＰＣＢ含廃棄物の二区分にそれぞれ含まれる。平成２４年１２月１２日付けでポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法施行令の一部が改正された。具体的に、ＰＣＢ廃棄物を保管する事業者は、平成３９年３月３１日までにＰＣＢ廃棄物を自ら処分し、又は処分を他人に委託しなければならないと定められた。とりわけＰＣＢ廃棄物の中でも、この微量ＰＣＢ汚染廃電気機器等については、行政において使用あるいは保管に関する正確な数量は未だ正確に把握されておらず、今後も意図しない大量の廃棄物が顕在化される可能性を秘めている。
【０００３】
ＰＣＢ廃棄物の分解、無害化方法としては、従来からの焼却法に加えて、脱塩素化分解法、水熱酸化分解法、水素供与物質による還元熱化学分解法、紫外線照射法等による光分解法等の物理的あるいは化学的処理が知られている。これらのうち、紫外線分解法は、ＰＣＢｓを極性有機溶媒中に溶かして紫外線を照射することにより脱塩素化し、残留するＰＣＢｓを微生物処理によって無害化するものであり、常温、常圧処理できるため安全性が高く、その実用化が期待されたが、紫外線による脱塩素化に長時間を要したため、広く利用されることはなかった。しかしながら、純粋に微生物のみで構成される触媒によってＰＣＢｓを無害化することができれば、常温、常圧における穏和かつ安全な反応により、副生する分解物の安全性も高い、環境に調和した極めて有用な処理法になると想定できる。
【０００４】
ＰＣＢｓは、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称をいう。置換塩素の数（１〜１０）及び置換位置の違いにより理論上２０９種類と多くの異性体が存在することが知られている。これまでにＰＣＢｓを分解する菌として多くのビフェニル資化菌が分離され、例えばシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）ＫＦ７０７株からｂｐｈ遺伝子がクローン化され詳細に解析された。米国のＧＥ社で分離されたＰＣＢｓ分解菌バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans) ＬＢ４００株は、塩素置換の多い広範囲のＰＣＢｓを分解できる。ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株はグラム陽性菌であるが、ＰＣＢｓ分解遺伝子は複数の巨大な線状プラスミドに存在する。これらの微生物は、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）をはじめとする一連のビフェニル分解に関与する酵素群を発現する。すなわち、初発反応である酸素分子のビフェニル環への導入は、末端ジオキシナーゼ（ＢｐｈＡ１／ＢｐｈＡ２）とＮＡＤＨからの電子伝達に関与するフェレドキシン（ＢｐｈＡ３）とフェレドキシン還元酵素（ＢｐｈＡ４）とから構成されるビフェニルジオキシゲナーゼ複合体によって触媒される。末端ジオキシゲナーゼは鉄・硫黄を含むタンパク質であり、大サブユニット（ＢｐｈＡ１）と小サブユニット（ＢｐｈＡ２）の二つのサブユニットで構成されている。
【０００５】
非特許文献１によれば、これらのＰＣＢｓ分解菌は、その分解能に基づいて大きく２つに分類されている。広い基質特異性を有する菌株は、２，５，２’，５’−テトラクロロビフェニルのようなオルト−メタ置換ＰＣＢ異性体に作用し、ビフェニル環の３,４位を酸化する。この３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有するＰＣＢｓ分解菌は比較的稀であり、４，４’−ジクロロビフェニルのような二重パラ置換ＰＣＢ異性体に対する活性が弱い。これに対し、４，４’−ジクロロビフェニルに対し優れた分解活性を示す２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有するＰＣＢｓ分解菌は、比較的基質特性は狭いものの自然界に広く存在する様々な微生物から分離されている。そして、各種のＰＣＢｓ分解菌における基質特異性について検討された結果、ＢｐｈＡ１における少数のアミノ酸の違いによりこれらの基質特異性が制御されているとの報告がある。例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudononasu pseudoalcaligenes)ＫＦ７０７株とバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)ＬＢ４００株とでは、ＢｐｈＡ１を構成する４５９個のアミノ酸のうちの２０個のアミノ酸が相違するが、ＢｐｈＡ２は僅か１個のアミノ酸が違うのみで、ＢｐｈＡ３およびＢｐｈＡ４は同一である（特許文献１参照）。そして、これら２種類のＢｐｈＡ１をコードする遺伝子をＤＮＡシャフリングにより組換えて種々のキメラ遺伝子を作製し、それらを発現させた組換え大腸菌は、元の菌株に比べて特定のＰＣＢ異性体に対して増強された分解活性を示すのみならず、ベンゼンやトルエンなどの単環の芳香族化合物に対しても分解活性を示すことが明らかにされている（例えば、特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００６】
本出願人らは、米沢市内及びその近郊で採取した土壌や浄水場の活性汚泥から採取した試料を用い、ビフェニルを炭素原とした合成培地でビフェニル分解菌をスクリーニングした結果、新規な微生物であるコマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株（以下、「ＹＵ１４−１１１株」と称する場合がある。）を単離した（特許文献２参照）。この新規微生物は、コマモナス・テストステロニ由来として従来報告されているＴＫ１０２株とは、ｂｐｈオペロンの塩基配列が異なり、アミノ酸配列の相同性もＢｐｈＡ１で約９２％、ＢｐｈＡ２で約８８％と低かった。このため、ＰＣＢ異性体に対する基質特異性も異なり、２〜５塩素置換ＰＣＢｓに対する分解活性を有するなど、より多くの異性体を分解する特性を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−６９９６７号公報
【特許文献２】特開２０１３−１７９８９０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mondello F. et al., Applied and Environmental Microbiology Vol.63, No.8, p.3096-3103
【非特許文献２】T.Kumamaru et al., Nature Biotechnology Vol.16, 663-666 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本出願人らの分析によれば、ビフェニルを炭素原として生育する土壌細菌から得られるビフェニルジオキシゲナーゼであっても、細菌の種類や株によってＰＣＢ異性体に対する基質特異性が異なり、複数のＰＣＢ異性体が混入した実際の廃棄物を処理するためには単一のビフェニルジオキシゲナーゼだけでは困難である。そこで、微生物分類学上で異なる属種に特定される、少なくとも２種以上の微生物を配合、複合化させて用いることで、単独のＰＣＢｓ分解菌ではなし得なかった多種類のＰＣＢ異性体群の分解率をＰＣＢ異性体全体として向上させた複合微生物製剤を見出し、特願２０１３−５８８５０としてすでに出願している。
【００１０】
本発明は、上記微生物製剤に係る発明をさらに進展させたものであって、ＰＣＢ分解の初発酵素であるビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）の基質特異性に着目し、ビフェニル環への二原子酸素添加反応について、基質特異性の異なる複数のビフェニルジオキシゲナーゼを発現する菌体を組み合わせて用いることによって効率よくＰＣＢｓを分解、無害化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明の第一の視点において、ビフェニル環の異なる位置に二原子酸素添加反応しうる少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を発現し、かつポリ塩化ビフェニル類に対する分解活性を有する微生物菌体を含むポリ塩化ビフェニル分解用組成物が提供される。前記少なくとも１種類のビフェニルジオキシゲナーゼは、ポリ塩化ビフェニルに対するビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有し、他の少なくとも１種類のビフェニルジオキシゲナーゼが、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有することが好ましい。
１つの実施形態において、本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体と、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の他の視点において、上記本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物と、ポリ塩化ビフェニル類とを接触させる工程を含むポリ塩化ビフェニルの無害化方法が提供される。当該方法において、前記組成物中のビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体と、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体との配合割合を、前記ポリ塩化ビフェニル類の構成成分に合わせて調整することが好ましい。
１つの実施形態において、上記接触させる工程は、水性媒体中で、本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物と、ポリ塩化ビフェニル類を含む油性成分とを混合する工程と、前記混合物に通気及び攪拌する工程と、を含むことが好ましい。さらに前記水性媒体及び／又は前記混合物に酸素マイクロバブルを供給することがより好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＰＣＢｓ分解用組成物は、基質特異性の異なる少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を含むことにより、複数のＰＣＢ異性体が混入した実際の廃棄物を効率よく分解し、無害化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体発現プラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）の構造を示す。
【図２】（Ａ）ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）又はｐＥＴ−１５ｂベクターで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養して発現させた総タンパク質を、ゲル濃度１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果を示す。（Ｂ）ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）又はｐＥＴ−１５ｂベクターで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で発現させたビフェニルジオキシゲナーゼ複合体を含む菌体の懸濁液（濃度ＯＤ６６０＝１０）と、カネクロールＫＣ−３００（５ｐｐｍ）とを２４時間接触反応させた後の分解率を示した結果を示す。ｐＥＴ−１５ｂベクターのみを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、（Ａ）と同様にコントロールである。
【図３】ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株における発現誘導条件として、最終濃度０．１（Ａ）、または０．２ｍＭ（Ｂ）のＩＰＴＧを添加した際のＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌株の生育曲線と、経時的に採取した菌体によるＰＣＢｓ分解率の結果を示す。
【図４】ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株における発現誘導条件として、ＩＰＴＧ添加時の培養液の濁度とＰＣＢｓ分解率との関係を調べた結果を示す。
【図５】ビフェニルジオキシゲナーゼ複合体を発現する菌体を用いてカネクロールＫＣ−３００を分解したときの残存ＰＣＢ異性体を、ＧＣ−ＭＳ法で分析した結果を示す。
【図６】ビフェニルジオキシゲナーゼ複合体を発現する２種類の菌体の複合化（配合）割合とＰＣＢｓ分解率との関係を調べた結果を示す。
【図７】ビフェニルジオキシゲナーゼ複合体を発現する２種類の菌体の複合化（配合）割合とＰＣＢｓ分解率との関係をさらに詳細に調べた結果を示す。
【図８】実施例６におけるＰＣＢｓ分解装置を用いて、ＰＣＢｓ汚染絶縁油を分解したときの残存ＰＣＢｓ量の経時変化を示すグラフである。
【００１５】
配列の簡単な説明
配列番号１は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡ４のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ１及びＢｐｈＡ２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号６は、バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号９は、バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のＢｐｈＡ４のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＰＣＲプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号１２は、ＰＣＲプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号１３は、ＰＣＲプライマー３の塩基配列を示す。
配列番号１４は、ＰＣＲプライマー４の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明に係るポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）分解用組成物、及びこれを用いてＰＣＢｓを無害化する方法についてそれぞれ詳細に説明する。
【００１７】
［基質特異性の異なるビフェニルジオキシゲナーゼの組み合わせ］
本発明では、好気性微生物におけるＰＣＢｓ分解系の最初の酵素、すなわち、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）について、基質特異性の異なる少なくとも２種類を組み合わせることを特徴とする。ＢｐｈＡは４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４）から構成されており、そのうちの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）が二原子酸素添加反応の基質特異性に関与していると考えられる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、少なくともＢｐｈＡ１の構造が異なり、それによってＰＣＢｓに対する基質特異性の異なった少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を組み合わせて用いることができる。
【００１８】
本発明において、前記少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼは、少なくとも１種のポリ塩化ビフェニルに対して、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性及び／又はビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する。したがって、２種類のＢｐｈＡを組み合わせる場合、１種類のＢｐｈＡは、ポリ塩化ビフェニルに対するビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有し、他の１種類のＢｐｈＡは、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有することが好ましい。これら２種類のＢｐｈＡを含む限り、さらに別の基質特異性を有する酵素、例えば、ビフェニル−１，２−ジオキシゲナーゼ活性を有するＢｐｈＡが存在してもよい。また、同じビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性であっても基質となるＰＣＢ異性体の種類によって異なる活性を有する複数の酵素を含有していてもよい。
【００１９】
ここで、「ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性」とは、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対して当該ビフェニル環の２位と３位に二原子酸素添加反応を行うことができる酵素活性である。例えば、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡは、２，４’，５−トリクロロビフェニルや２，４，４’−トリクロロビフェニルに対する２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有することが分っている。一方、「ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性」とは、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対して当該ビフェニル環の３位と４位に二原子酸素添加反応を行うことができる酵素活性である。例えば、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼは、２，５，４’−トリクロロビフェニルや２，５，２’，５’−テトラクロロビフェニルに対して、２，５−ジクロルリングの３，４−位に酸素分子を導入することができる。
【００２０】
本発明において、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する好ましいビフェニルジオキシゲナーゼは、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のビフェニル分解酵素複合体である。コマモナス・テストステロニは、シュードモナス属の近縁種であるが、１６Ｓ ｒＤＮＡ解析の結果、現在では別の属として分類されている。これまでに同じコマモナスに属するＴＫ１０２株等、種々のビフェニル分解菌が単離されているが、本出願人は、これらと異なる新規なビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する複数の菌株を見出し、その中の１つをコマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株（ロット番号ＹＵ１４−１１−０３、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２１５）として、２０１２年１月２７日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託している。ＹＡＺ２株は、実質的にＹＵ１４−１１１株と同一のＢｐｈＡを有する別の単離された菌株であり、複数の容器に分注して、凍結した状態で保管用のマスターセルバンクに保存されている。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、前記コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体は、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むか、又は前記各アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつそれらの複合体がポリ塩化ビフェニル分解活性を有する相同タンパク質を含む。すなわち、当該相同タンパク質は、例えば、ビフェニル分解活性を害さない範囲内において配列番号１〜４に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもの（以下「相同体」又は「ホモログ」と称する場合もある。）ということもできる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
アミノ酸配列の「同一性パーセント（％）」は、参照ポリペプチド配列に対して、配列をアラインし、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するために、ギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないとした場合の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の範囲内の様々な方法、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者であれば、配列をアラインするための適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。
【００２２】
ビフェニルジオキシゲナーゼの基質特異性については、特許文献１等において、詳細に検討されている。これによれば、シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudononasu pseudoalcaligenes)ＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ１遺伝子を用いてランダムプライマー法により種々の突然変異を導入し、特定のアミノ酸置換を有する変異体ＢｐｈＡ１の基質特性を解析したところ、ＢｐｈＡ１タンパク質の３７６番目のアミノ酸をスレオニンからアスパラギンに置換することによって、２，５，４’−トリクロロビフェニルに対する３，４−ジオキシゲナーゼ活性を獲得することが示されている。
【００２３】
したがって、本発明に係るビフェニルジオキシゲナーゼは、自然界の微生物からビフェニル分解酵素遺伝子をクローン化し、これらに部位特異的突然変異誘発法等によって変異を導入することで、基質特異性を改変したＢｐｈＡであってもよい。すなわち、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対してビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性、及びビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性の何れか一方を有すればよく、異なるＰＣＢ異性体について、それぞれ２，３−ジオキシゲナーゼ活性、及び３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有していてもよい。なお遺伝子に変異を導入する方法には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えば、エラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A. L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001等に記載されている。これらの手法によって作製された突然変異遺伝子を、もとの微生物のゲノムＤＮＡと置換するか、プラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡにクローン化して宿主微生物に導入し、新規な微生物を作製することも可能である。本発明の方法に使用しうるＰＣＢｓ分解菌は、このような方法により、当業者であれば容易に入手しうると考えられる。
【００２４】
一方、本発明において、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する好ましいビフェニルジオキシゲナーゼは、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼである。１つの実施形態において、前記バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体は、配列番号６、７、９及び１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を含むか、又は前記各アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつそれらの複合体がポリ塩化ビフェニル分解活性を有する相同タンパク質を含む。
【００２５】
ここで、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡ複合体を構成する配列番号１〜４に記載のそれぞれのアミノ酸配列に対し、他の微生物株由来の酵素についてＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから得られる公知のアミノ酸配列に基づいて配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣを用いてホモロジー検索を行った結果を下記表１に示す。
【００２６】
【表１】
2015139432.tif 000003
【００２７】
上記ホモロジー検索で使用した各酵素のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの以下のアクセッション番号から入手することができる（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３、及びＢｐｈＡ４の順に示す。）。ＹＵ１４−１１１株；ＢＡＭ０５５３６、ＢＡＭ０５５３７、ＢＡＭ０５５３８、ＢｐｈＡ４は未発表、ＬＢ４００株；ＡＡＢ６３４２５、ＹＰ＿５５６４０８、ＹＰ＿５５６４０６、ＹＰ＿５５６４０５、ＫＦ７０７株；ＡＡＡ２５７４３、ＡＡＡ２５７４４、ＡＡＡ２５７４６、ＡＡＡ２５７４７、ＲＨＡ１株；ＢＡＡ０６８６８、ＢＡＡ０６８６９、ＢＡＡ０６８７０、ＢＡＡ０６８７１。
表１に示した結果によれば、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡ複合体に対して、その他の菌株由来の酵素の配列同一性は８０％以下であり、ある程度の構造の違いを有すると考えられる。このような構造の変化は、ＰＣＢ異性体に対する基質特異性の多様性を生み出し、これら複数の酵素を配合して複合化させることでＰＣＢ異性体を効率よく分解しうると推測される。
したがって、１つの好ましい実施形態において、本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体と、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体とを含む。あるいは、これらの酵素の各アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつそれらの複合体がポリ塩化ビフェニル分解活性を有する相同タンパク質であってもよい。
【００２８】
［ビフェニルジオキシゲナーゼの微生物菌体内発現］
本発明では、上述した種々のビフェニルジオキシゲナーゼを含む微生物を天然からスクリーニングによって単離し、それぞれの酵素を発現する菌体を混合して用いることもでき、あるいは公知のゲノム情報に基づいて作製した遺伝子を、遺伝子組み換え技術を用いて好ましい宿主に導入して発現させることができる。この場合、上記少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼは、１つの菌体内で同時に発現させてもよいし、あるいは別々の細胞内で発現した２種類の微生物を混合して用いてもよい。
【００２９】
ビフェニル資化微生物をスクリーニングする場合は、ゲノム上にビフェニル分解酵素群（ＢｐｈＡ複合体）の遺伝子を有し、生育速度の速い微生物であればよく、このような微生物は通常ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことにより見出される。天然にビフェニル分解酵素を産生する微生物としては、シュードモナス属、コマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属等に属する多くの細菌があるが、ビフェニル資化性菌のスクリーニング段階でビフェニル分解活性の一つの指標となる黄橙色を示すメタ開裂物質（例えば、2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienote）を速やかに生産し、且つ生育速度が速い微生物を選択することで、ＰＣＢｓ分解活性に優れる微生物の取得が期待できる。
【００３０】
一方、人工的に作製した遺伝子を微生物に導入し、発現させる方法は当技術分野で公知である。本発明の一実施形態においては、ｂｐｈＡ１遺伝子を含む組換えベクターを用いて微生物を形質転換する。また別の実施形態においては、ｂｐｈＡ１遺伝子と他の遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４）を含む組換えベクターを用いて形質転換する。さらに別の実施形態においては、ｂｐｈＡ１遺伝子を含む組換えベクターと他の遺伝子を含む組換えベクターを用いて微生物を共形質転換する。目的のＢｐｈＡ複合体を発現する微生物を作製する限り、組換えベクターに含まれる遺伝子の種類、形質転換の順序などは特に限定されるものではない。
【００３１】
本発明において使用する組換えベクターは、適当なベクターに上記遺伝子、例えばｂｐｈＡ１を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主微生物中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ファージミドなどが挙げられ、直鎖状であっても環状であってもよい。また、シャトルベクターを用いることもできる。
【００３２】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４、ｐＲＫ４０１、ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００３３】
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製された遺伝子を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、目的のポリペプチドが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明において使用するベクターには、プロモーター、目的の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、選択マーカーなどを連結することができる。プロモーターは、大腸菌等の宿主微生物中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【００３４】
微生物の形質転換は、上記組換えベクターを、目的とするポリペプチドが発現し得るように宿主微生物中に導入することにより行うことができる。ここで、宿主微生物としては、特に限定されるものではなく、例えば、エッシェリヒア属に属する微生物、好ましくは大腸菌（E. coli）、ならびに、天然に芳香環水酸化酵素を発現することが知られているシュードモナス（Pseudomonas）属、コマモナス（Comamonas）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、及びラルストニア（Ralstonia）属等に属する微生物を挙げることができる。具体的な微生物の例としては、大腸菌ＪＭ１０９株、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）、バークホルデリア（Burkholderia）属ＬＢ４００株（Erickson,B.D., Mondello,F.J.,Nucleotide sequencing and transcriptional mapping of the genes encoding biphenyl dioxgenase, a multicomponent polychlorinated-biphenyl-degrading enzyme in Pseudomonas strain LB400. J. Bacteriol., 174, 2903-2912, 1992）、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）、ロドコッカス・グロベルラス（Rodococcus globerulus）、ラルストニア・オキサラティカ（Ralstonia oxalatica）等を挙げることができる。また、放線菌であるストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌においても、上記遺伝子を導入・発現させることも可能であり、そのような形質転換した組換え微生物も用いることができる（Chun,H.K.,Ohnishi,Y.,Shindo,K.,Misawa,N.,Furukawa, K., Horinouchi, S., Biotransformation of flavone and flavanone by Streptomycelividans cells carrying shuffled biphenyl dioxygenase genes. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic, 21, 113-121, 2003）。これらの微生物は、ＡＴＣＣやＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。ただし、本発明で利用可能な微生物は上記のものに限定されず、目的のポリペプチドを発現させることができる微生物であればどのようなものでも利用することができる。
【００３５】
外来遺伝子を微生物に導入・発現する方法は常法により行うことができる（例えば、Sambrook,J.,Russell, D. W., "Molecular cloning -A laboratory manual", Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。例えば、微生物への組換えベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。形質転換体の選択もまた、当技術分野で公知の方法、例えば薬剤耐性遺伝子を利用した選択等を用いて行うことができる。
【００３６】
［ポリ塩化ビフェニル分解活性を有する微生物の培養方法］
以下に、培養方法及びＰＣＢｓ分解方法への使用について詳細に説明する。最初に、高いＰＣＢｓ分解活性を有する微生物の培養法について述べる。培地は、K. Kimbara et.al. Agric. Biol. Chem., 52 (11), 2885-2891, 1988に記載の方法を参考に、ｐＨが６．８〜７．０までとなるように調整した合成培地が良く、さらにビフェニルを炭素源として０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に３段階の前培養を行うことが、微生物を適切に生育する上で望ましい。手順は、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、前に述べたビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地を２〜３ｍｌまで入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ菌体量としてＯＤ６６０＝０．１〜０．８までとなるように、−８０℃以下で凍結保存した微生物株を、できるだけ速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養し、次に培地量で５倍以上の容積のフラスコなどに入れた、同じくビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７〜３０ｍｌに、その全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養し、さらに培地量の５倍以上の容積のフラスコなどにビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７０〜３００ｍｌに、全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型で良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地２．７〜３Ｌまでに対し、ビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように加えて、そこへ、前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。微生物の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるが、さらにビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるよう、継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的により高塩素化されたＰＣＢｓの分解活性を獲得した微生物が得られる。培養中の培養液のｐＨは、微生物の最終収量に影響を与えるため、その範囲は７．０〜９．０までとするのが望ましく、ｐＨの調整には、必要に応じて、アンモニウム塩を０．０２％〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように断続的に加えるのが良く、硫酸アンモニウムでも良い。また硫酸アンモニウムの添加は、培養中に窒素源も消費する場合において望ましい。最終の培養液のＯＤ６６０＝２．５〜３．０までで、湿重量が１５〜２０ｇまでの高活性なＰＣＢｓ分解微生物が得られる。
【００３７】
次に、ＰＣＢｓ分解活性を有する微生物を速やかに高い回収率で得られる培養法について述べる。培地はＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈを改変したイースト・エキストラクト２．４％とトリプトン１．２％を主成分とし、リン酸水素二ナトリウム塩とリン酸二水素ナトリウム塩それぞれ７０ｍＭを、６対４の比率で配合した緩衝成分を含み、オートクレーブによる滅菌の後にｐＨ６．８〜７．０で調整したものが望ましい。前に述べたＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ改変培地へビフェニルを追加炭素源として０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、予めジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に３段階の前培養を行う事が望ましく、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）までのビフェニルを含む合成培地２〜３ｍｌまでを入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ、ＯＤ６６０＝０．１〜０．９までとなるように−８０℃以下で凍結保存した微生物株を速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．６〜０．８まで培養し、次に培地に対し５倍程度の容積のフラスコなどに入れた同じく０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）のビフェニルを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ改変培地２７〜３０ｍｌまでにその全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．６〜０．９まで培養し、さらに培地に対し５倍程度の容積のフラスコなどに入れた同じく０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）までのビフェニルを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ改変培地３００ｍｌに、全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．６〜０．８まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備しその翼形状はタービン型でも良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地２．７〜３Ｌまでに対し、ビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように加えて、そこへ前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。微生物の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるか、さらにビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは予めジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的に、ＯＤ６６０＝１４〜２０までで、湿重量が１００〜１５０ｇまでのＰＣＢｓ分解微生物が得られる。
【００３８】
誘導性プロモーターを含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。
【００３９】
［ポリ塩化ビフェニル分解用組成物の調製方法］
このようにして得られたＰＣＢｓ分解用微生物を含む培養物は、そのまま粉体にするか、水や界面活性剤などを含む分散媒で洗浄して、菌体を回収することができる。培養後の培養液をそのまま利用することもできるし、減圧濃縮することもできる。また、遠心分離による集菌や密度勾配遠心法、二相分離法などを行い、高濃度にＰＣＢｓ分解用微生物を分離回収することができる。各種分散媒でＰＣＢｓ分解微生物を分散した懸濁液を用いてもよい。
【００４０】
液剤組成物を製造する際に、上記培養物に、必要に応じて、保存性や安定性の向上を目的とした物質を追加することもできる。例えば、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、緩衝剤などを添加することができる。
【００４１】
粉体組成物であれば、上記培養物から得られる微生物菌体を乾燥させる必要がある。菌体の乾燥方法としては、自然乾燥や凍結乾燥、スプレードライなどで生菌のまま粉末化することができる。この際、スキムミルク等の保護剤を用いることが望ましい。また、製剤化のために増量剤などの任意の物質を添加することができる。例えば、賦形剤としては、例えば、乳糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、白糖等の糖類、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン等のデンプン類、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、沈降炭酸カルシウム等の無機塩類の他、脱脂米糠、大豆粉、おから、ピーナッツの皮、フスマ、もみがら粉、炭酸カルシウム、糖、澱粉、ビール酵母、小麦粉等、飼料安全法で認可されている任意の賦形剤があげられる。これらの賦形剤は１種のみならず２種以上併用してもよい。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、微生物菌体は、生理食塩水あるいは２０ｍＭのリン酸緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム塩を用いるのが良い。また、菌体に対し糖アルコール等の賦形剤を加えて、糖アルコールはアルファ、ベータあるいはデルタ型のマンニトールでも良く、最終的に−２０〜−８０℃までに調温された冷凍庫等で保存でき、乾燥粉体化させた場合は、１５〜２５℃の常温で保存できるＰＣＢｓ分解乾燥菌体が得られる。
【００４３】
前述したそれぞれの方法で得られた菌体は、ＰＣＢｓを効率よく分解するよう適切な配合率で複合化させた組成物であることが望ましく、但し、菌体を乾燥させる前の湿菌体の状態でＰＣＢｓを効率よく分解するよう適切な配合率で複合化させ、この複合体に対し糖アルコール等の賦形剤を加えて、ＰＣＢｓ分解複合組成物としてもよい。
好ましい実施形態では、前記少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼは、別々の菌体内で産生され、無害化すべきＰＣＢｓを最も効率よく分解するためにそれぞれの配合比率を調整して用いることができる。例えば、ビフェニル環の２位と５位に塩素化されたＰＣＢｓを多く含む場合は、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体よりもビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体を多く含む方が、ＰＣＢｓ分解の最初の段階の反応速度を上げる点で好ましいと考えられる。
【００４４】
本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物は少なくとも２種類、あるいはそれ以上の菌体を含み、その１つはコマモナス属に属し、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を示すＰＣＢｓ分解菌を用いることが好ましい。コマモナス属に属するＰＣＢｓ分解菌は、グラム陰性細菌であるため、グラム陽性菌に較べて多くの刺激性の高い有機化合物や薬剤に対する耐性が高い。これは細胞壁の構成において、グラム陰性菌ではグラム陽性菌と共通のペプチドグリカン層の外側にさらに外膜が存在してその耐性を維持しているためである。また、コマモナス属は細菌細胞を積極的に分裂する発酵型細菌であるため、大量培養によって多量の細菌を得易いという性質を有している。すなわち、ＰＣＢｓにも強い耐性の細菌を多量に用いて（多量のＰＣＢｓ分解酵素）、多くのＰＣＢ異性体を分解し、残ったＰＣＢ異性体を別の菌株由来の酵素で分解させる方法に適している。
【００４５】
自然界からビフェニル資化菌をスクリーニングすると、圧倒的にビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌株が優占であることから、２，３−ジオキシゲナーゼ活性はビフェニルを効率的に分解するために優れていると考えられる。ビフェニル資化菌によるＰＣＢｓ分解は共代謝によるものであるため、あらかじめ、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼをビフェニルで多量に菌体内に誘導させた組成物が、ＰＣＢｓ分解に効果的であると云える。またこの現象は、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼが、基質となるＰＣＢ異性体との結合能力において優れているとも考えられる。これに対し、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する酵素は、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼに較べて、ＰＣＢ異性体に対する基質特異性が広いことが知られている。ＰＣＢｓは多種類の異性体から構成されているため、単独種のビフェニルジオキシゲナーゼだけではこれらを完全に分解することは困難である。したがってＰＣＢｓを効率よく分解するためには、前記のビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼを含む組成物中に、ＰＣＢ異性体に対する基質特異性が広いビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼを配合することが必須となる。さらに詳しくは、無害化すべきＰＣＢｓの構成成分の存在比率に合わせて、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体と、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体との配合割合を調整することが好ましい。すなわち、長期間保管された後のＰＣＢｓ汚染油のように脱塩素化が進行して比較的低塩素置換ＰＣＢｓを多く含むＰＣＢｓ汚染油を分解する場合は、これらを分解可能なビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体を多く含み、一方、比較的高塩素置換ＰＣＢｓを多く含むＰＣＢｓ汚染油を分解する場合には、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体を多く含む組成物を用いることができる。典型的なＰＣＢｓの分解反応に用いる本発明の組成物は、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体よりもビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する菌体を多く含むことが好ましい。
【００４６】
［ポリ塩化ビフェニルの分解反応］
本発明のＰＣＢｓの分解方法は、上記微生物を培養して得られた菌体を含む組成物とＰＣＢｓとを接触させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、このようにして得られた組成物を、比較的低濃度のＰＣＢｓ汚染油と接触させたときに高いＰＣＢｓ分解活性を発揮することができる。本明細書において、用語「無害化」とは、生体に対する毒性を低下させることを意味し、必ずしもＰＣＢｓを完全に分解する必要はないが、環境中に放出された場合でも生物への悪影響を軽減できるように、好ましくはＰＣＢｓについて一般的に安全であると認められるか、あるいは法律等で定められた基準値を下回るような濃度まで低下させることをいう。
【００４７】
本発明で対象となるＰＣＢｓとしては、ビフェニル化合物に塩素原子が置換した化合物が含まれ、その置換塩素原子の数は１〜１０個である。平均置換塩素原子数は、一般に２〜６個である。本発明では、これらのＰＣＢｓから選択された少なくとも一種類を用いることができ、それぞれ単独で又は二種類以上を任意に組み合わせたものも用いることができる。一般に、ＰＣＢｓは単一化合物として存在せずに、塩素原子の数や置換位置が異なる混合物として存在する。従って、塩素原子の数及び置換位置の組み合せからして、理論上２０９種類の異性体が存在し、市販品には、およそ７０から１００種類、あるいはこれらを越える数の異性体が混在している。
【００４８】
本発明の分解あるいは無害化の方法で処理できるＰＣＢｓとしては、特徴的には、３，４，４’，５−テトラクロロビフェニルや３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３，３’，４，４’−ペンタクロロビフェニル、２，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２’，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニルに加えて、２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニルや２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ＰＣＢｓは、通常ＰＣＢ単体の配合物として市販されており、これがコンデンサーやトランスに使用されている。その具体例としては、鐘淵化学工業（株）（現カネカ）が製造販売したカネクロールＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）やＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロロべンゼン＝６０／４０（質量比）の配合物）や、三菱モンサント（株）が製造販売したアロクロール１２５４（５４％Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等も挙げられる。
【００５０】
本発明に係るＰＣＢｓの分解反応は、ＰＣＢｓを含む油性成分と、上記ＰＣＢｓ分解用組成物及び場合により界面活性剤を含む水性媒体と、を混合してエマルジョン化する工程と、前記エマルジョンを通気、攪拌する工程と、を含む。分解すべきＰＣＢｓは、エマルジョン全量に対し０．０５〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ程度含むことができ、当該エマルジョン中に、本発明の組成物を０．２〜２０重量％、好ましくは２〜１２重量％程度添加することにより行うことができる。エマルジョン化しない場合は、トリトンＸ−１００等の界面活性剤０．００５％を加え、さらに必要な場合は超音波を加えて均質化させる。さらにエマルジョン化を促進するために、あらかじめＰＣＢｓを含む油の粘性を下げる処理（例えば、アルコール化等）を行っても良い。反応条件は、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは約３０℃に調温し、ｐＨは６〜９とし、攪拌した状態で約１２〜７２時間処理することが好ましい。このような処理は、密閉式で攪拌できる反応装置を用いて行うことができ、すなわち小型の専用装置を用いて行うことが好ましい。ポリ塩化ビフェニル類分解反応装置が小型化できることにより、微量ＰＣＢｓを保管するような貯蔵所でも直接処理作業を行うことができる。
【００５１】
［マイクロバブルの供給］
本発明では、上記ポリ塩化ビフェニル類の分解反応系内にマイクロバブルを供給することによってＰＣＢｓの分解、無害化を促進することができる。ここで、用語「マイクロバブル」とは、概ね直径１ｍｍ以下、好ましくは直径１００μｍ以下の気泡をいう。外部から酸素や空気等の気体を供給して気泡を形成してもよいし、水性媒体中に溶存している酸素や空気等を用いてもよいが、水性媒体の溶存酸素濃度を高めるためには、酸素ガスを外部から供給しつつマイクロバブルを発生させることが好ましい。マイクロバブルは体積当たりの表面積が広く浮上速度も極めて遅いため、効果的に酸素等の気体を液体に溶解させることができる。また、電荷を帯びることで液中に均一に分散し、水性媒体中で油性成分のエマルジョン化を促進する。マイクロバブルは負の表面電荷を有するため、一般に正の表面電荷を持つ微生物菌体等との相互作用を介して、これらを水性媒体中で均一に分散させることが可能になる。
【００５２】
水性媒体にマイクロバブルを分散させる工程は、ＰＣＢｓを含む油性成分との混合前であってもよいし、あるいは、水性媒体とＰＣＢｓを含む油性成分とを混合した後に、これらの混合液中へマイクロバブルを発生させてもよい。マイクロバブルを発生させる方法は、微小孔を有する管又は多孔質体を通じて気体を液体中に噴出させる方法、噴流や旋回流中で生じるせん断力を利用して気相を液相に巻き込む方法、超音波を利用して気液界面振動させて微細な気泡を生成させる方法等いずれの方法を用いてもよい。
【００５３】
本発明のＰＣＢｓの分解方法では、少なくとも水性媒体中における飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を当該水性媒体に含有させることが好ましく、そのため酸素ガスを流しながら超音波処理を行うことによりマイクロバブルを発生させることが好ましい。以下、これを酸素マイクロバブルと呼ぶ。水溶液中の飽和溶存酸素濃度は、気圧、水温、溶存塩濃度等によって変化するが、大気圧下、３０℃における蒸留水中の溶存酸素濃度は約７．５ｍｇ／Ｌである。本発明の方法において、水性媒体中の溶存酸素濃度は、３０℃において、少なくとも初期濃度で約８ｍｇ／Ｌであり、１５ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２５ｍｇ／Ｌ（ｐｐｍ）以上がさらに好ましい。１つの実施形態において、上記超音波発生法により酸素マイクロバブルを水性媒体中へ充填した場合、その溶存酸素濃度は実測値で２８ｍｇ／Ｌ程度である。一般に水性媒体中に溶解した高濃度状態の酸素は、周辺環境中の酸素濃度と均衡を保とうとする性質から減少に転じると考えられる。したがって、ＰＣＢｓ分解用組成物によるＰＣＢｓの分解反応を最適化するためには、２８ｍｇ／Ｌ程度まで上昇した溶存酸素濃度を維持することが望ましく、適宜マイクロバブル発生器により連続、あるいは断続的に酸素マイクロバブルを供給し続けることが望ましい。
【実施例】
【００５４】
以下に本発明の詳細について実施例等を挙げて説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５５】
［実施例１］Burkholderia xenovorans ＬＢ４００株のビフェニルジオキシゲナーゼ発現用プラスミドの構築
ビフェニルジオキシゲナーゼの中には、ビフェニル-２，３-ジオキシゲナーゼ（以下、２，３-ジオキシゲナーゼ）活性ならびにビフェニル-３，４-ジオキシゲナーゼ（以下、３，４-ジオキシゲナーゼ）活性がある。本出願人らが、これまでに国内で取得した２００株以上の環境微生物のビフェニルジオキシゲナーゼを調べたところ、全てが２，３-ジオキシゲナーゼ活性であった。よって本出願人らは、３，４-ジオキシゲナーゼ活性をもつ酵素を取得することが、本発明を完成させる上で重要であると考えた。
【００５６】
上記理由から、３，４-ジオキシゲナーゼ活性をもつ酵素の取得を目的に、遺伝子組換えに用いるプラスミドを作製するに及んだ。モチーフとなった遺伝子は、Burkholderia xenovorans ＬＢ４００株（以下、ＬＢ４００株）のＢｐｈＡ１Ａ２あるいはＢｐｈＡ３Ａ４の遺伝子を含む、２１２０ｂｐ（配列番号５）あるいは１，６００ｂｐ（配列番号８）のＤＮＡ配列を使用した。これらのＤＮＡ配列は有機化学合成法で作製した人工遺伝子を用い、それぞれをクローニングベクターｐＵＣ５７（Thermo Fisher Scientific）へ挿入したプラスミド、ｐＵＣ５７−ｂｐｈＡ１Ａ２（ＬＢ４００）あるいはｐＵＣ５７−ｂｐｈＡ３Ａ４（ＬＢ４００）を鋳型として、以下に記載したプライマー１と２、あるいはプライマー３と４の組合せにより、９４℃、３分→［９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→６８℃、２分（２８サイクル）］→６８℃、３分の反応条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲに必須なＤＮＡポリメラーゼは、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ）を使用することが望ましい。その理由は、ＰＣＲ反応で起き得る誤った遺伝子置換の発生を抑えることで、高品質なプラスミドを構築できるからである。
【００５７】
上記に記載したプライマー１から４までの各配列は、以下のとおりである。
Primer 1: 5’-ATGCATTCTAGATATTTTTTCCGCCCTGCCAAG-3’（下線：制限酵素ＸｂａＩ認識配列、配列番号１１）
Primer 2: 5’-ATGCATCCATGGCGTGCTGGGCTAGAAGAACAT-3’（下線：制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、配列番号１２）
Primer 3: 5’-ATGCATCCATGGCCCAGGCGATTTAACCCTTTTA-3’（下線：制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、配列番号１３）
Primer 4: 5’-ATGCATCATATGCGCATCAATTCGGTTTGGC-3’（下線：制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、配列番号１４）
【００５８】
上記のＰＣＲで得られたＬＢ４００株のＢｐｈＡ１Ａ２あるいはＢｐｈＡ３Ａ４の遺伝子を含むＤＮＡ断片をそれぞれ、ＸｂａＩとＮｃｏＩあるいはＮｃｏＩとＮｄｅＩで切断した後、ゲル抽出法により精製し、プラスミドベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｂａＩ−ＮｃｏＩまたはＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ切断部位へ、それぞれ挿入した。
上記のように、あらかじめｐＥＴ−１５ｂ−ｂｐｈＡ１Ａ２（ＬＢ４００）およびｐＥＴ−１５ｂ−ｂｐｈＡ３Ａ４（ＬＢ４００）をそれぞれ作製し、挿入した各ＤＮＡ配列にＰＣＲ反応で起き得る誤った遺伝子置換が無いことを確認した後、ｂｐｈＡ３Ａ４（ＬＢ４００）を含むＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片を切り出してｐＥＴ−１５ｂ−ｂｐｈＡ１Ａ２下流のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ部位に挿入し、最終的なＬＢ４００株のＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４発現用プラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）（図１）を得た。
【００５９】
［実施例２］組換え大腸菌体による酵素タンパク質の発現とＰＣＢｓ分解活性の確認
上記で作製したプラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１．０％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）、あるいはＬＢ培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）、あるいはＴＢ培地（１．２％トリプトン、２．４％酵母エキス、０．８％グリセロール、５４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）を用いて、温度３０℃で、波長６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ６６０）が０．６〜２０となるまで培養した。培養には三角フラスコ（岩城硝子）、望ましくは羽根付き三角フラスコ（シバタ医理化）を用いることで、培地に至適な溶存酸素濃度を与えることができ、最適なＰＣＢｓ分解活性を示すビフェニルジオキシゲナーゼを持つ微生物触媒を得られる。
【００６０】
これらフラスコを用いた際の実培養液の容量は、フラスコ容積の２０％以下とした。ＯＤ６６０＝０．６〜２０の適当なタイミングで、誘導剤であるイソプロピル−s−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧ）を最終濃度０．０５〜０．５ｍＭとなるように添加した後、さらに培養を続け、３０分〜５時間後に遠心分離で集菌した組換え大腸菌体を２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、同様な緩衝液へ再度懸濁した。この組換え大腸菌体の懸濁液を最終濃度がＯＤ６６０＝１０となるように調整し、商用ＰＣＢであるカネクロールＫＣ−３００（カネカ）、あるいはアロクロール１２４２（三菱モンサント）を含む類似の標準品、望ましくはカネクロールＫＣ−３００で調製したＰＣＢｓ溶液を、最終濃度５〜４０ｐｐｍとなるように加え、温度３０℃で３〜２４時間、５０ｒｐｍの速度で転倒撹拌することでＰＣＢｓを分解させた。
【００６１】
反応後の溶液中に残存するＰＣＢｓ量は、ガスクロマトグラフィー質量分析計（Agilent Technologies 7890A/5975C）（以下、ＧＣ／ＭＳ）を用いて測定した。ＧＣ／ＭＳの分析条件は、日本機械学会、第２３回環境工学総合シンポジウム２０１３講演論文集、Ｎｏ．１３−１５に掲載の「ビフェニルジオキシゲナーゼ高発現細菌製剤の超音波利用型マイクロバブルによる触媒反応制御（著者：原富次郎、幕田寿典、高塚由美子、佐野克典、新國時生）」にしたがった。分析手順は、反応溶液に適量の塩酸を加えて反応を停止させた後、内部標準物質としたアントラセンを、反応開始時点のＰＣＢｓ濃度５ｐｐｍに対して１．６ｐｐｍとなるように添加し、反応溶液の１から２倍量、望ましくは２倍量の酢酸エチル（和光純薬工業、特級品）で液液抽出した。抽出繰返し回数は２回以上が望ましい。次に、反応溶液中の残存ＰＣＢｓが移行した有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、ＧＣ／ＭＳの検出限界感度に応じて、適宜、酢酸エチルで希釈しＧＣ／ＭＳへ注入した。この場合のＧＣ／ＭＳの検出限界は１０ｐｐｔ以下であることが望ましい。
【００６２】
ＰＣＢｓの定量データは次の手順により解析した。ＧＣ／ＭＳで計測した試料中のＰＣＢｓのピーク総面積を、同様にコントロールとして計測したＰＣＢｓ標準品の総面積で除算し、さらにこの値を、内部標準物質としたアントラセン面積を用いて補正することで、正しいＰＣＢｓの濃度を算出することができる。最後に、このＰＣＢｓ濃度を用いてＰＣＢｓの分解率を導いた。これらＰＣＢｓ濃度およびＰＣＢｓ分解率を求める計算式は、以下の通りである。
【００６３】
ＰＣＢｓ濃度［ｐｐｍ］＝コントロール標準品ＰＣＢｓ濃度［ｐｐｍ］×（試料中ＰＣＢｓ総面積値／コントロールＰＣＢｓ総面積値）×（コントロール中アントラセンの面積値／試料中アントラセンの面積値）
ＰＣＢｓ分解率［％］＝｛（分解前のＰＣＢｓ濃度［ｐｐｍ］−  分解後のＰＣＢｓ濃度［ｐｐｍ］）／分解前のＰＣＢｓ濃度［ｐｐｍ］｝×１００
【００６４】
以下に本試験結果について説明する。
図２（Ａ）は、ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）あるいはｐＥＴ−１５ｂベクターのみを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、アンピシリンを添加した２×ＹＴ培地で、温度３０℃で培養し、ＯＤ６６０＝０．６で最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加する直前（０時間）、および添加してから、１、３、および５時間後に経時的に採取したＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の総タンパク質を、ゲル濃度１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した結果を示す。ｐＥＴ−１５ｂベクターのみを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、組換え酵素タンパク質を発現していないコントロールである。
【００６５】
一方の図２（Ｂ）は、ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）あるいはｐＥＴ−１５ｂベクターのみを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、２×ＹＴ培地、温度３０℃で培養し、ＯＤ６６０＝０．６で最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加した時の生育曲線と、同じくＩＰＴＧを添加してから、１、３、および５時間後に採取したＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の懸濁液（濃度ＯＤ６６０＝１０）と、カネクロールＫＣ−３００（５ｐｐｍ）とを２４時間接触反応させた後の分解率を示した結果を示す。ｐＥＴ−１５ｂベクターのみを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、図２（Ａ）と同様にコントロールである。
【００６６】
図２（Ａ）は、コントロールであるｐＥＴ−１５ｂ形質転換体には確認できない約５５ｋＤａ、約４５ｋＤａ、および約２５ｋＤａのタンパク質の発現をＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体で発現していることを示し、即ちこれらは、それぞれＢｐｈＡ１（分子量約５１．５ｋ）、ＢｐｈＡ４（約４３．０ｋ）、およびＢｐｈＡ２（約２５．０ｋ）に相当すると推測し得た。しかしながら、分子量が約１２．０ｋのＢｐｈＡ３は、この泳動条件ではその小さな分子量が原因となり、そのバンドが泳動先端に位置したために、明確な存在を確認することができなかった。この結果から、ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、およびＢｐｈＡ４に相当したタンパク質の発現量は、ＩＰＴＧ添加後の誘導時間の経過とともに明らかに増加することを確認した。
【００６７】
続いて図２（Ｂ）は、ｐＥＴ−１５ｂベクターのみを形質転換した大腸菌体では分解活性が全く検出されなかったのに対し、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌株ではＩＰＴＧ添加から、１、３、および５時間後の全ての菌体で活性を検出することを示した。しかもＩＰＴＧ添加後１時間の菌体は、ＰＣＢｓの分解率が２４時間で３２．３％と、３および５時間後の菌体（それぞれによる分解率は２１．８％および１９．６％）より高い分解活性を示した。
【００６８】
以上の結果は、ＩＰＴＧ添加後の組換えタンパク質発現量の経時的増加に反して分解活性が低下する様を明示したが、本出願人らは、ＰＣＢｓ分解活性が組換えタンパク質発現量に依存するのではなく、ＢｐｈＡ１からＢｐｈＡ４に渡る４種類のサブユニットタンパク質が、活性に至適なバランスで発現することが本発明を強く支持する上で重要と考えた。
【００６９】
［実施例３］組換え酵素タンパク質の発現誘導条件に関する詳細な検討
上記の実施例２は、組換え酵素タンパク質を発現した大腸菌体のＰＣＢｓ分解活性が、ＩＰＴＧ添加後の誘導時間の違いにより異なる傾向を示した。そこで本出願人らは、ＩＰＴＧ添加量の違いを基にその誘導時間とＰＣＢｓ分解活性との関係性についてより詳細な検討を加え、ＰＣＢｓ分解に至適な３，４−ビフェニルジオキシゲナーゼ活性をもつ微生物触媒を製造し得るための条件を検討した。
【００７０】
上記の実施例２と同様の方法で、ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、アンピシリンを含む２×ＹＴ培地を用いて温度３０℃で培養し、ＯＤ６６０＝０．６で最終濃度０．１あるいは０．２ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加した。ＩＰＴＧ添加後もさらに培養を続け、３０、６０、９０、および１２０分後に菌体をそれぞれ採取した。採取した全ての菌体はリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、同様の緩衝液で濃度ＯＤ６６０＝１０となるよう懸濁液を調整して、濃度５ｐｐｍのカネクロールＫＣ−３００を用いた２４時間の分解試験へ供した。
【００７１】
以下に本試験結果を説明する。
図３には、最終濃度０．１、または０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加した際のＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌株の生育曲線と、経時的に採取した菌体によるＰＣＢｓ分解率の結果を示した。
その結果は、ＩＰＴＧの最終濃度が０．１ｍＭと０．２ｍＭの場合でＰＣＢｓ分解活性の大きな違いを示した。具体的には、ＩＰＴＧ濃度の違いにより菌体の生育曲線には大きな差は認めなかったが、ＩＰＴＧ濃度０．２ｍＭでは、誘導時間にかかわらずＰＣＢｓ分解率は極めて高く７５％を越えた（３０、６０、９０、および１２０分後にそれぞれ、７７．４％、７６．０％、７８．２％、および７５．９％）のに対し、ＩＰＴＧ濃度０．１  ｍＭではＰＣＢｓ分解率はいずれも５０％未満（３０、６０、９０、および１２０分後にそれぞれ、４３．３％、１７．１％、９．０％、および０％）に留まった。よって、至適なＩＰＴＧ濃度は０．２ｍＭであろうと推定した。さらに図３を検討すると、ＩＰＴＧ  至適濃度であろう０．２ｍＭでは、誘導開始から１２０分後までの菌体全てが安定かつ高いＰＣＢｓ分解活性を示し、中でも９０分後の菌体が７８．２％と極めて高い分解率を示していることが判った。
【００７２】
これらの結果は、ＩＰＴＧの最終濃度を０．２ｍＭとし、且つ９０分間の誘導を行った場合に、極めて安定で、高いＰＣＢｓ分解活性を保持した遺伝子組換え型ビフェニルジオキシゲナーゼ微生物触媒を生産できることを明示した。本出願人らは、この誘導条件が、上記の実施例２で仮説を立てた“ＢｐｈＡ１からＢｐｈＡ４に渡る４種類のサブユニットタンパク質がＰＣＢｓ分解活性に至適に発現した状態”を示唆していると考えた。
【００７３】
以上の結果により、高活性なＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体を得られる至適な誘導剤ＩＰＴＧ濃度と、誘導時間に関する情報を得ることができたため、さらに、菌株の生育中におけるＩＰＴＧ添加時の最適な濁度値についても調査をおこなった。
【００７４】
実施例２と同様の方法で、ｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、アンピシリンを含む２×ＹＴ培地を用いて３０℃で培養した。ＯＤ６６０が、０．６、１．０、あるいは３．０になった時点で、ＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍＭとなるように添加し、９０分間の誘導時間の後に菌体を採取してリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、同様の緩衝液へ再懸濁した。菌体の最終濃度をＯＤ６６０＝１０となるよう懸濁液を調整した後、カネクロールＫＣ−３００を最終濃度５ｐｐｍとなるように添加し、温度３０℃で２４時間分解させた。
本分解反応試験後の残存ＰＣＢｓ量を、上記の実施例２に記載した方法により分析し、その解析結果を図４および表２に示した。
【００７５】
【表２】
2015139432.tif 000004
【００７６】
以下に結果を説明する。
図４および表２より、ＩＰＴＧを添加する菌体生育のタイミングをＯＤ６６０＝０．６、１．０、あるいは３．０としたいずれの場合においても、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体は安定して高い分解活性を示すことが分かり、ＰＣＢｓ分解率はそれぞれ、７５．８±７．０％、８７．２±１．１％、および８９．３±２．３％であった。
この結果から、“ＢｐｈＡ１からＢｐｈＡ４に渡る４種類のサブユニットタンパク質がＰＣＢｓ分解活性に至適に発現した状態”の微生物触媒を得る誘導条件は、ＩＰＴＧの濃度とＩＰＴＧ添加後の誘導時間に依存し、ＩＰＴＧ添加時のＯＤ６６０値の違いによる影響はほとんど無いと考えた。
また、本微生物触媒をより大量に製造するという観点から、あらためて上記の結果を検討してみると、高水準のＰＣＢｓ分解活性を維持した微生物触媒として培養終了時に得られた菌体量は、ＩＰＴＧをＯＤ６６０＝０．６で添加した時に得られた菌体量に比較して、ＯＤ６６０＝１．０の時には約４倍、ＯＤ６６０＝３．０の時には約７倍と増加した。すなわち本発明は、菌生育中の濁度値が高い時点にＩＰＴＧを添加することで、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体のＰＣＢｓ分解活性を高い水準としたまま、微生物触媒として大量生産することができる、極めて効率的な生産プロセスを含むものにもなった。
【００７７】
［実施例４］ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現組換え菌体のＰＣＢｓ異性体分解特性の評価
上記の実施例２で作製したＬＢ４００株のＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４発現組換え菌体が示す２，３−ジオキシゲナーゼ活性ならびに３，４−ジオキシゲナーゼ活性を確認する。確認する際に用いるコントロール菌体は、２，３−ジオキシゲナーゼ活性を示す特願２０１３−０５８８５０に記載のコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株を用いた。
【００７８】
本実施例の試験に用いたＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の調製は、上記の実施例２と同様におこなった。とりわけ組換えタンパク質の発現誘導条件は、添加するＩＰＴＧの最終濃度を、上記の実施例３で得た結果を踏まえて０．２ｍＭとなるようにし、集菌は９０分後におこなった。一方、２，３−ジオキシゲナーゼ活性のみを有する菌株には、野生型のコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株をビフェニルを含む合成培地で培養して得られた菌体を用い、必要量をリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、同緩衝液に再懸濁したものを使用した。これら２種類の菌株の懸濁液について、それぞれ最終濃度をＯＤ６６０＝１０に調整した後、カネクロールＫＣ−３００を５ｐｐｍとなるように添加し、温度３０℃で２４時間分解させた。本分解反応後の残存ＰＣＢｓは、上記の実施例２に記載したＧＣ−ＭＳ法と同様な方法で分析し、解析結果は図５に示した。
【００７９】
以下に結果を説明する。
図５より、反応後に残存するＰＣＢ異性体は、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌株とＹＡＺ２株とでは大きく異なり、ＹＡＺ２株がカネクロールＫＣ-３００に含まれるＰＣＢ異性体のうち、２，２’，３，６-テトラクロロビフェニル（ピーク番号１９）や、２，２’，５，５’-テトラクロロビフェニル（ピーク番号２１）、２，２’，４，５’-テトラクロロビフェニル（ピーク番号２２）、２，２’，４，４’-テトラクロロビフェニル、および２，２’，４，５-テトラクロロビフェニル（ピーク番号２３）をほとんど分解できなかったのに対し、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体はこれらのＰＣＢ異性体をほぼ完全に分解した。一方、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体は、２，４，４’，５-テトラクロロビフェニル（ピーク番号３２）をほとんど分解できなかったのに対し、ＹＡＺ２株はこの異性体をほぼ完全に分解した。
【００８０】
この結果から、２，２’，４，４’-テトラクロロビフェニルを分解できるＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体には、２，３-ジオキシゲナーゼ様活性が確認でき、また２，３-ジオキシゲナーゼが分解できない塩素置換構造をとり、且つ３，４位が塩素置換されていない構造をとる２，２’，５，５’-テトラクロロビフェニルを完全に分解したことは、３，４-ジオキシゲナーゼ活性もあると考えることができ、本発明においてプラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を作製することで、これまでに本出願人らが自然界から取得した野生株にはない、まったく新しい基質特異性を持った微生物触媒の候補を獲得することができた。
【００８１】
［実施例５］ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体とコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株の複合化によるＰＣＢｓの分解
上記の実施例２で作製したＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体と、特願２０１３−０５８８５０に記載のコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株を複合した場合のＰＣＢｓ分解率と、それぞれ単一株での場合のＰＣＢｓ分解率を比較し、複合化が有為であることの検証を試みた。さらに、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の複合量比の変化でＰＣＢｓ分解率へどのような影響を与えるかも検討した。
【００８２】
上記の実施例４と同様なＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体とコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株の懸濁液を用い、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体ならびにＹＡＺ２株をそれぞれ単独、またＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体およびＹＡＺ２株の複合量比をＯＤ６６０の濁度で、８対２、５対５、２対８と調整した微生物触媒と５ｐｐｍのカネクロールＫＣ−３００とを、温度３０℃で２４時間にわたり接触反応させた。反応後の残存ＰＣＢｓは、上記の実施例２に記載したＧＣ−ＭＳ法と同様な方法で分析し、解析結果は図６および表３に示した。
【００８３】
【表３】
2015139432.tif 000005
【００８４】
以下に結果を説明する。
図６および表３より、菌体の複合比別にＰＣＢｓの分解率を比較すると、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体単独の時では８３．１％±１．６、ＹＡＺ２株単独の時では７１．０％±３．３であるのに対し、複合化菌体触媒ではいずれも９０％を上回った（ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体のＯＤ６６０が８、５、および２の時に、それぞれ９７．６％±０．１、９７．０％±０．４、９４．０％±０．６）。本解析は分析回数ｎ＝３として行なった。
この結果は、ＰＣＢｓを効率良く分解するためには基質特異性の異なる微生物を複合させた触媒が非複合時より有為であることを示し、その最適な複合量比は、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体をＹＡＺ２株よりも多くする傾向、望ましくはＯＤ６６０の濁度比で８対２であることを示唆した。
【００８５】
上記の複合量比に関して、より詳細に検討を試みた。
【表４】
2015139432.tif 000006
【００８６】
図７および表４では、ＹＡＺ２株の複合量をＯＤ６６０＝２に固定した際の、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体のＰＣＢｓ分解における最適な複合量を検討した。具体的に、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌株の菌体量については、ＯＤ６６０＝８、６、または４と変化させた。その結果、ＯＤ６６０＝８の場合は９５．２％±０．７、ＯＤ６６０＝６の場合は９２．７％±３．１、ＯＤ６６０＝４の場合は９１．９％±１．５と、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌株の菌体量の減少に伴ってＰＣＢｓ分解率は低下し、ＯＤ６６０＝８の場合が最も高い分解率を示した。ＧＣ−ＭＳのクロマトグラムのデータからは、２，２’，６−トリクロロビフェニルや、２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニル、２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，４，−テトラクロロビフェニル、２，３，４’，６−テトラクロロビフェニル、および２，３’，４’，６−テトラクロロビフェニルを含む異性体の残存量が、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の複合量の減少に伴って増加することを確認した。これらは、ＹＡＺ２株では分解が困難な異性体である。よってこの現象から、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体は、ＹＡＺ２株よりも多くの種類のＰＣＢ異性体を分解する能力を有することが示唆された。
この結果は、複合微生物触媒の複合量比がＯＤ６６０の濁度値で、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体が８、ＹＡＺ２株が２である場合がＰＣＢｓ分解に最適であることを示した。
【００８７】
［実施例６］酸素マイクロバブル発生機構搭載型の小型ＰＣＢｓ分解装置を用いた試験
ＰＣＢ異性体の分解特性が異なる２種類のジオキシゲナーゼを発現する、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現大腸菌株と野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株を複合化した微生物触媒を使用し、多様なＰＣＢ異性体類の分解効率について、酸素マイクロバブル発生機構を搭載した小型分解装置を用いて検証した。本実施例で用いた小型分解装置は、特願２０１３−１４１３８３の図３及び図４に記載した装置と同様のものである。
【００８８】
ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の調製は、上記の実施例４と同様に行い、アンピシリンを含む２×ＹＴ培地を用いて、温度３０℃、ＯＤ６６０＝４．０〜５．０、望ましくは５．０まで培養し、ＩＰＴＧを終濃度０．２ｍＭとなるように添加してから９０分後に集菌した。集菌した菌体は緩衝液で洗浄後、洗浄と同様の緩衝液に再懸濁したものを使用した。一方、野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株の調製は、特許文献２に記載の方法と同様に作製した製剤を必要量はかりとり、上記と同様の緩衝液で洗浄後、同緩衝液に再懸濁したものを使用した。
【００８９】
本検討において、酸素マイクロバブルを発生させることができる小型分解装置は、加圧法でマイクロバブルを発生することができる機構を搭載するものを用いた。以下に、反応操作の手順を説明する。
最初に、上記の小型分解装置に搭載しているＰＣＢｓ分解反応槽内へ、あらかじめ加圧法で酸素マイクロバブルを充填させた、溶存酸素濃度が２０ｐｐｍ以上、望ましくは２８ｐｐｍ以上のリン酸ナトリウム緩衝液を導入した。その次に、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現大腸菌体と野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株菌体を、ＯＤ６６０の濁度比で１９対１から１２対８まで、望ましくは１６対４となるよう複合した製剤を投入した。続けて、ＰＣＢｓ汚染絶縁油（ＰＣＢｓ最終濃度４０ｐｐｍ）および、最終濃度０．００１から０．０１％、望ましくは０．００５％の界面活性剤トリトンＸ−１００を投入し、反応液の最終容量を１Ｌとして分解反応させた。反応中の反応槽温度は３０±２℃を維持した。反応中の溶存酸素の濃度は、あらかじめ分圧を高めてある反応槽へ追加するように、酸素ガスを連続的あるいは断続的に供給することで、その濃度を２０〜４０ｐｐｍ、望ましくは２８ｐｐｍ以上に保つよう調整した。酸素の追加法は、反応槽下方からの酸素ガスの曝気、あるいは反応槽の側面下部に設けた酸素マイクロバブル充填口を改良した径１マイクロメーター以下の細孔をできるだけ複数貫通させたＰＴＦＥ製のスパージャを用いた。最適な反応、すなわち反応液中のＰＣＢｓと複合微生物触媒の分散および接触反応を最適に行うため撹拌した。撹拌力は、撹拌翼による物理的撹拌力、あるいは酸素曝気や酸素マイクロバブルの浮上力も用いつつ、４０ｒｐｍ相当の撹拌力を与えた。
【００９０】
ＰＣＢｓと複合微生物触媒を接触開始してから５分、１時間、３時間、６時間、および２４時間後のそれぞれの時点で反応溶液の一部を採取し、残存ＰＣＢｓ量の経時的変化を実施例２と同様にＧＣ−ＭＳ法を用いて測定した結果を図８および表５に示した。
【００９１】
【表５】
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【００９２】
測定の結果、反応開始１時間後には、当初投入した４０ｐｐｍのＰＣＢｓは９．０±０．２ｐｐｍまで急速に減少し、３時間後にはさらに３．０±０．１ｐｐｍまで減少した。分解率で表すと９２．６±０．４％と極めて高い分解効率を示した。さらに、反応開始６時間後には、１．２±０．１ｐｐｍ（分解率９６．９±０．３％）まで分解が進み、２４時間後には、０．３±０．０ｐｐｍ（分解率９９．２±０．０％）まで安定して分解し、環境省の定める卒業判定基準である０．５ｐｐｍを下回る極めて高活性および高効率な分解性能を示した。以上の解析は、分析回数ｎ＝３で行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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