(57)【要約】【課題】細胞内ｃＡＭＰ濃度を時間的に自由自在に制御する方法を提供すること。【解決手段】光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子及び改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞であって、改変ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされる改変ルシフェラーゼは、ｃＡＭＰ結合ドメインが挿入されており、ｃＡＭＰのｃＡＭＰ結合ドメインへの結合により、改変ルシフェラーゼがルシフェリンと反応可能となるようタンパク質構造が変化し、改変ルシフェラーゼの発光量が増大する、細胞を利用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子及び改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞であって、改変ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされる改変ルシフェラーゼは、ｃＡＭＰ結合ドメインが挿入されており、ｃＡＭＰのｃＡＭＰ結合ドメインへの結合により、改変ルシフェラーゼがルシフェリンと反応可能となるようタンパク質構造が変化し、改変ルシフェラーゼの発光量が増大する、細胞。
【請求項２】
改変ルシフェラーゼ遺伝子は、配列番号４又は５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ存在下でルシフェラーゼの発光量が増大する性質を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
改変ルシフェラーゼ遺伝子は、配列番号６、７又は８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ存在下でＶｅｎｕｓの発光量が増大する性質を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞を準備する工程と、
前記細胞に光を照射する工程であって、光照射により光活性化アデニル酸シクラーゼはｃＡＭＰを産生し、産生されたｃＡＭＰに応じて改変ルシフェラーゼは発光する、工程と、
改変ルシフェラーゼの発光量を測定する工程と、
改変ルシフェラーゼの発光量に基づいて細胞内ｃＡＭＰ濃度変化を計測し、光照射条件と当該光照射条件下における細胞内ｃＡＭＰ濃度変化とを関連付けることにより、細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する工程と、
を含む方法。
【請求項５】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御する方法であって、
請求項４に記載の方法で決定された光照射条件で、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞に光を照射する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、細胞内情報伝達におけるセカンドメッセンジャーとして重要な役割を果たしている。細胞内情報伝達の概略は以下の通りである。Ｇタンパク質共役受容体にリガンドが結合すると、Ｇタンパク質のＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応が起こり、Ｇタンパク質のＧαサブユニットとＧβγサブニットが分離する。Ｇαサブユニットはアデニル酸シクラーゼを活性化し、アデニル酸シクラーゼはｃＡＭＰを産生する。ｃＡＭＰはＡキナーゼを活性化し、活性化したＡキナーゼは種々のタンパク質をリン酸化する他、低分子量Ｇタンパク質の活性調節因子であるＥｐａｃ（グアニンヌクレオチド交換因子）の活性化に働き、またｃＡＭＰ依存性イオンチャンネル（ＣＮＧ−ｃｈａｎｎｅｌ）の開閉も制御するなど、様々な細胞機能の調節に寄与することが知られている。
【０００３】
細胞内情報伝達のメカニズムを解明するため、細胞内ｃＡＭＰ濃度を強制的に上昇させる手段が考えられており、例えば、細胞膜透過性を向上させたｃＡＭＰアナログである８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ及びアデニル酸シクラーゼを直接活性化してｃＡＭＰの産生を高めるフォルスコリンが挙げられる。しかしながら、これらの試薬は、試薬を添加してから細胞内ｃＡＭＰ濃度が上昇するまで数分から数十分以上もの時間がかかる。また、ひとたび細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させた場合、数時間待たないとｃＡＭＰ濃度が減少せず、繰り返し実験を行うことができないという問題点がある。すなわち細胞内でのｃＡＭＰ濃度とその存在時間の調節精度には限界が存在するのである。さらに上記試薬類はいずれも液性因子であるため、体液・培養液内での拡散が不可避で、特定の細胞だけを狙ってのｃＡＭＰの調節は難しい。
【０００４】
細胞内ｃＡＭＰ濃度を強制的に上昇させる別の手段としてｃａｇｅｄ  ｃＡＭＰがある。細胞内にインジェクションされたｃａｇｅｄ  ｃＡＭＰは、光照射により分解しｃＡＭＰを細胞内に放出するため、光照射後すぐにｃＡＭＰ濃度を上昇させられるという利点がある。しかしながら、インジェクションは細胞へのストレスになるという問題点があり、また、最初にインジェクションした量しかｃＡＭＰを放出できないため、繰り返し実験を行うことができないという問題点がある。さらにｃａｇｅｄ  ｃＡＭＰは水への溶解度が低く有機溶剤の併用が不可避だが、この溶剤の細胞毒性も無視できない。またｃａｇｅｄ  ｃＡＭＰの開裂操作に用いる紫外線が細胞に傷害をもたらす危険も常に伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Stierlら、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 286, NO. 2, pp. 1181-1188,January 14, 2011
【非特許文献２】Isekiら、Nature, VOL. 415, pp. 1047-1051, February 28, 2002.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を時間的に自由自在に制御する方法を提供することである。すなわち、細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させたいときに上昇させ、減少させたいときに減少させ、一定の範囲に維持したいときに維持する、といったことが可能となる方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子及び改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を利用することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
光活性化アデニル酸シクラーゼは、ミドリムシの光逃避行動の光センサーとして発見されたタンパク質であり、暗所においては不活性な状態であり、光照射時のみアデニル酸シクラーゼ活性を有しｃＡＭＰを産生できる。また、上記改変ルシフェラーゼはｃＡＭＰ結合ドメインが挿入されており、ｃＡＭＰのｃＡＭＰ結合ドメインへの結合により、改変ルシフェラーゼがルシフェリンと反応可能となるようタンパク質構造が変化し、改変ルシフェラーゼの発光量が増大するよう設計されている。この２つのタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞に光を照射すると、光の照射量に応じて光活性化アデニル酸シクラーゼがｃＡＭＰを産生する。産生されたｃＡＭＰは改変ルシフェラーゼを活性化し、改変ルシフェラーゼが発光する。改変ルシフェラーゼの発光量をリアルタイムに測定することで、細胞内ｃＡＭＰ濃度をリアルタイムに検出することができる。検出したｃＡＭＰ濃度に基づいて、細胞に照射する光の強度及び照射間隔を調整することで、細胞内ｃＡＭＰ濃度を自由自在に制御することが可能となる。
【０００９】
すなわち、本発明は、光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子及び改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞であって、改変ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされる改変ルシフェラーゼは、ｃＡＭＰ結合ドメインが挿入されており、ｃＡＭＰのｃＡＭＰ結合ドメインへの結合により、改変ルシフェラーゼがルシフェリンと反応可能となるようタンパク質構造が変化し、改変ルシフェラーゼの発光量が増大する、細胞を提供する。
【００１０】
上記改変ルシフェラーゼ遺伝子は、配列番号４又は５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ存在下でルシフェラーゼの発光量が増大する性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であってよく、また、配列番号６、７又は８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ存在下でＶｅｎｕｓの発光量が増大する性質を有するタンパク質をコードする遺伝子であってよい。
【００１１】
また、本発明は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する方法であって、上記細胞を準備する工程と、上記細胞に光を照射する工程であって、光照射により光活性化アデニル酸シクラーゼはｃＡＭＰを産生し、産生されたｃＡＭＰに応じて改変ルシフェラーゼは発光する、工程と、改変ルシフェラーゼの発光量を測定する工程と、改変ルシフェラーゼの発光量に基づいて細胞内ｃＡＭＰ濃度変化を計測し、光照射条件と当該光照射条件下における細胞内ｃＡＭＰ濃度変化とを関連付けることにより、細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する工程と、を含む方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御する方法であって、上記方法で決定された光照射条件で、上記細胞に光を照射する工程を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞内のｃＡＭＰ濃度を自由自在に制御することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】様々な生物のＰＡＣのＢＬＵＦドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。星印は保存アミノ酸を表す。
【図２】様々な生物のＰＡＣのシクラーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列アライメントを示す図である。星印は保存アミノ酸を表す。
【図３】細胞に光照射（５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間）したときの、単一細胞におけるｃＡＭＰ感受性発光プローブの発光量を示すグラフである。縦軸は発光量すなわちｃＡＭＰ濃度を表し、横軸は光照射後の時間（分）を表す。
【図４】光照射（２μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間）を１０分間隔で３回繰り返したときの、単一細胞におけるｃＡＭＰ濃度の変化を表すグラフである。
【図５】照射する光の強度を０．２〜５．０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの範囲で変化させたときの、単一細胞におけるｃＡＭＰ濃度の変化を表すグラフである。
【図６】光照射（５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間）を４分間隔で繰り返したときの、単一細胞におけるｃＡＭＰ濃度の変化を表すグラフである。
【図７】（ａ）５．０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、３０秒間、４分間隔、（ｂ）０．９μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、３０秒間、２分間隔、（ｃ）０．２μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、３０秒間、１分間隔の条件で光照射を行った時の、単一細胞におけるｃＡＭＰ濃度の変化を表すグラフである。
【図８】照射する光の照射時間を１〜３２秒間の範囲で変化させたときの、単一細胞におけるｃＡＭＰ濃度の変化を表すグラフである。照射時間８秒間については３回測定を繰り返したところ、ｃＡＭＰ濃度の変化パターンが一致した（８ｓにおける、丸印、四角印及び星印）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子）
光活性化アデニル酸シクラーゼ（ＰＡＣ：Photoactivatedadenylyl cyclase又はPhotoactivated adenylate cyclase）遺伝子の由来は特に限定されず、真核生物由来でも、原核生物由来でもよい。真核生物として、例えば、ミドリムシ（Euglena gracilis）、Eutreptirlla，Eutreptia，Colacium及びKhawkinea等のユーグレナ目藻類、並びに鞭毛性アメーバNeagleria gruberi 等のNeagleria属微生物が挙げられる。原核生物として、例えば、Beggiatoa等のガンマプロテオバクテリア、Oscillatoria及びPseudanabaena等のシアノバクテリア、並びにTurneriella等のスピロヘータが挙げられる。
【００１６】
ＰＡＣとは、ＢＬＵＦ（ｓｅｎｓｏｒ  ｏｆ  Ｂｌｕｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｓｉｎｇ  ＦＡＤ）ドメイン及びシクラーゼ触媒ドメインを有する、天然又は人工的なタンパク質をいう。様々な生物においてＰＡＣをコードする遺伝子が見つかっており、ＰＡＣのアミノ配列全体の同一性は低く、例えば３０％以下の場合もあるが、すべてのＰＡＣは、ＢＬＵＦドメイン及びシクラーゼ触媒ドメインを保有している。
【００１７】
ＢＬＵＦドメインは、ＦＡＤが結合するドメインであり、ＦＡＤを利用した青色光の感知に関与するドメインである。様々な生物のＰＡＣのＢＬＵＦドメインのアミノ酸配列アライメントを図１に示す。ＢＬＵＦドメイン中に、すべての生物において共通したアミノ酸（保存アミノ酸）を見出すことができ（非特許文献２）、図１において星印で表されている。ＢＬＵＦドメイン全体の同一性は低くとも、保存アミノ酸が正しく配置されている限りＢＬＵＦドメインの機能を維持される。したがって、ＢＬＵＦドメインとは、これらの保存アミノ酸の一部又は全部が正しく配置されたドメインを意味する。ＢＬＵＦドメインの保存アミノ酸は、図１に示すように１５個存在する。ＢＬＵＦドメインは、好ましくは１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個の保存アミノ酸が正しく配置されており、最も好ましくは１５個の保存アミノ酸が正しく配置される。
【００１８】
シクラーゼ触媒ドメインは、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換するドメインである。様々な生物のＰＡＣのシクラーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列アライメントを図２に示す。シクラーゼ触媒ドメイン中に、すべての生物において共通したアミノ酸（保存アミノ酸）を見出すことができ（非特許文献２）、図２において星印で表されている。シクラーゼ触媒ドメイン全体の同一性は低くとも、保存アミノ酸が正しく配置されている限りシクラーゼ触媒ドメインの機能を維持される。したがって、シクラーゼ触媒ドメインとは、これらの保存アミノ酸の一部又は全部が正しく配置されたドメインを意味する。シクラーゼ触媒ドメインの保存アミノ酸は、図２に示すように１０個存在する。シクラーゼ触媒ドメインは、好ましくは７個、８個、９個又は１０個の保存アミノ酸が正しく配置されており、最も好ましくは１０個の保存アミノ酸が正しく配置される。
【００１９】
ＰＡＣの具体例として、ベギアトアのＰＡＣについて説明する。ベギアトアのＰＡＣ（ｂＰＡＣ又はＢｓＰＡＣとも呼称）は、３５０アミノ酸からなり、１つのＢＬＵＦドメイン及び１つのシクラーゼ触媒ドメインを有している。ｂＰＡＣのアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１の２〜９５番目のアミノ酸がｂＰＡＣのＢＬＵＦドメインであり、配列番号１の１５１〜２８１番目のアミノ酸がｂＰＡＣのシクラーゼ触媒ドメインである。配列番号１の５、７、９、３１、３８、４０、４７、４９、５２、５３、６５、６８、７０、７１及び８６番目のアミノ酸がＢＬＵＦドメイン中で保存されている保存アミノ酸である。配列番号１の１９２、１９３、１９７、２０５、２１５、２３０、２４７、２５１、２５９及び２７０番目のアミノ酸がシクラーゼ触媒ドメイン中で保存されている保存アミノ酸である。
【００２０】
ＰＡＣの別の具体例として、ミドリムシのＰＡＣについて説明する。ミドリムシのＰＡＣは２つのαサブユニットと２つのβサブユニットからなるヘテロ４量体である。αサブユニット（ＰＡＣａ）は１０１９アミノ酸からなり、βサブユニット（ＰＡＣｂ）は８５９アミノ酸からなる。ＰＡＣａ及びＰＡＣｂのアミノ酸配列を配列番号２及び３にそれぞれ示す。αサブユニット及びβサブユニットは、２つのＢＬＵＦドメインＦ１及びＦ２と、２つのシクラーゼ触媒ドメインＣ１及びＣ２と、を有している。
【００２１】
配列番号２の５５〜１４８番目のアミノ酸がＰＡＣａのＦ１ドメインであり、配列番号２の４６７〜５５９番目のアミノ酸がＰＡＣａのＦ２ドメインである。また、配列番号２の２０４〜３３２番目のアミノ酸がＰＡＣａのＣ１ドメインであり、配列番号２の６１５〜７４４番目のアミノ酸がＰＡＣａのＣ２ドメインである。配列番号２の５８、６０、６２、８６、９３、９５、１０２、１０４、１０７、１０８、１２０、１２３、１２５、１２６及び１４０番目のアミノ酸がＦ１ドメイン中で保存されている主要アミノ酸であり、配列番号２の４７０、４７２、４７４、４９６、５０３、５０５、５１２、５１４、５１７、５１８、５３０、５３３、５３５、５３６及び５５０番目のアミノ酸がＦ２ドメイン中で保存されている主要アミノ酸である。配列番号２の２４５、２４６、２５０、２５８、２６８、２８３、３００、３０４、３１２及び３２３番目のアミノ酸がＣ１ドメイン中で保存されている保存アミノ酸であり、配列番号２の６５５、６５６，６６０，６６８，６７８，６９３，７１１，７１５，７２３及び７３４番目のアミノ酸がＣ２ドメイン中で保存されている保存アミノ酸である。
【００２２】
配列番号３の５６〜１４９番目のアミノ酸がＰＡＣｂのＦ１ドメインであり、配列番号３の４７１〜５６３番目のアミノ酸がＰＡＣｂのＦ２ドメインである。また、配列番号３の２０５〜３３３番目のアミノ酸がＰＡＣｂのＣ１ドメインであり、配列番号２の６１９〜７４８番目のアミノ酸がＰＡＣｂのＣ２ドメインである。配列番号３の５９、６１、６３、８７、９４、９６、１０３、１０５、１０８、１０９、１２１、１２４、１２６、１２７及び１４１番目のアミノ酸がＦ１ドメイン中の保存アミノ酸であり、配列番号３の４７４、４７６、４７８、５００、５０７、５０９、５１６、５１８、５２１、５２２、５３４、５３７、５３９、５４０及び５５４番目のアミノ酸がＦ２ドメイン中の保存アミノ酸である。配列番号３の２４６、２４７、２５１、２５９、２６９、２８４、３０１、３０５、３１３及び３２４番目のアミノ酸がＣ１ドメイン中の保存アミノ酸であり、配列番号３の６５９、６６０、６６４、６７２、６８２、６９７、７１５、７１９、７２７及び７３８番目のアミノ酸がＣ２ドメイン中の保存アミノ酸である。
【００２３】
ミドリムシのＰＡＣ遺伝子を細胞に導入する場合、ヘテロ４量体、αサブユニット及びβサブユニットのいずれをコードする遺伝子であってよい。
【００２４】
また導入する細胞の種類に応じて、コドンの最適化を行ってもよい。例えば、導入する細胞が哺乳類由来の細胞である場合、哺乳類に最適化したコドンとなるよう遺伝子配列を改変することが好ましい。コドンの最適化方法は当業者にとって周知であり、種々のソフトウェアを利用することが可能である。
【００２５】
（改変ルシフェラーゼ遺伝子）
改変ルシフェラーゼはルシフェラーゼのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインの間にｃＡＭＰ結合ドメインが挿入されている。ｃＡＭＰの非存在下では、ルシフェリンとルシフェラーゼが反応しない構造となっている。ｃＡＭＰがｃＡＭＰ結合ドメインへ結合することにより、改変ルシフェラーゼのタンパク質構造が変化し、ルシフェリンとルシフェラーゼが反応可能となり、ルシフェラーゼの発光量が増大する。このような改変ルシフェラーゼは、例えば、特表２０１１−５２０４６６号公報に記載されている。
【００２６】
ルシフェラーゼの由来は特に限定されず、例えば、甲虫、コメツキムシ、ホタル、ウミシイタケ及びバクテリアのいずれであってもよい。ｃＡＭＰ結合ドメインの由来は特に限定されず、例えば、ＡキナーゼのｃＡＭＰ結合ドメインであるＲＩ−α、ＲＩ−β、ＲＩＩ−α及びＲＩＩβＢ、並びにグアニンヌクレオチド交換因子であるＥｐａｃ１及びＥｐａｃ２を用いることができる。
【００２７】
ｃＡＭＰ結合ドメインとルシフェラーゼのＮ末端ドメイン及び／又はＣ末端ドメインとは、適切なペプチドリンカーで結合されていてもよい。
【００２８】
このような改変ルシフェラーゼ遺伝子は、例えば、特表２０１１−５２０４６６号公報の記載に基づいて作製することができ、また、市販されている製品ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ２２Ｆ  ｃＡＭＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ又はｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ２０Ｆ  ｃＡＭＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ（いずれもプロメガ社）を利用することも可能である。これらのプラスミドのＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、それぞれ、ＧＵ１７４４３４及びＥＵ７７０６１５である。
【００２９】
ｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ２２Ｆ  ｃＡＭＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ及びｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ２０Ｆ  ｃＡＭＰ  Ｐｌａｓｍｉｄに由来する改変ルシフェラーゼのアミノ酸配列を配列番号４及び５にそれぞれ示す。
【００３０】
改変ルシフェラーゼを導入する場合、配列番号４又は５のアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ存在下でルシフェラーゼの発光が増大する性質を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用することが好ましい。
【００３１】
別の改変ルシフェラーゼとして、Saito et al., "Luminescentproteins for high-speed single-cell and whole-body imaging", NatureCommunications, Vol. 3, pp.1262 (2012)に記載のＮａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）を利用することもできる。Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）は、黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ及びウミシイタケ  ルシフェラーゼの融合タンパク質であり、ｃＡＭＰ結合ドメインがルシフェラーゼ中に挿入されている。ｃＡＭＰがｃＡＭＰ結合ドメインへ結合することにより、Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）のルシフェラーゼのタンパク質構造が変化し、ルシフェリンとルシフェラーゼが反応可能となる。活性化したルシフェラーゼとＶｅｎｕｓの間でＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）が生じ、Ｖｅｎｕｓの発光量が増大する。
【００３２】
Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）は、Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ−０．４）、Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ−１．６）及びＮａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ−３．３）の３種類が存在し、ＧｅｎＢｎａｋ登録番号は、それぞれ、ＪＮ８５９４９９．１、ＪＮ８５９５００．１及びＪＮ８５９５０１．１である。Ｎａｎｏ−ｌａｎｔｅｒｎ（ｃＡＭＰ）のアミノ酸配列を、配列番号６、７及び８にそれぞれ示す。
【００３３】
改変ルシフェラーゼを導入する場合、配列番号６、７又は８のアミノ酸配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ｃＡＭＰ存在下でＶｅｎｕｓの発光が増大する性質を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用することが好ましい。
【００３４】
（ＰＡＣ遺伝子及び改変ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞）
上記遺伝子の細胞への導入は、公知の方法で行うことができる。遺伝子導入の技術として、直接注入法、粒子衝撃法、エレクトロポレーション、レーザー照射法、ソノポレーション及びマグネトフェクション等の物理的方法、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム及びカチオン性脂質等を利用した化学的方法並びにウイルスを利用した生物学的方法が挙げられる。
【００３５】
遺伝子を導入する細胞は特に限定されず、ヒトを含む哺乳類の細胞等の興味のある細胞であってよい。
【００３６】
遺伝子導入は、安定的発現及び／又は一過性発現を目的としたものであってよい。また、安定的発現は、宿主細胞のゲノムへ上記遺伝子を組み込むものであってもよく、宿主細胞のゲノムへ上記遺伝子を組み込まず、宿主細胞中にプラスミドとして存在するが、宿主細胞の細胞分裂後に娘細胞に分配されるものを用いてもよい。後者の例として、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）由来の複製起点ＯｒｉＰとＥＢＶ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １（ＥＢＮＡ１）遺伝子の働きを利用したエピソーマル型ベクターが挙げられ、ｐＥＢＭｕｌｔｉベクター（和光純薬）等の市販の製品を利用することが可能である。
【００３７】
（細胞内ｃＡＭＰ濃度の制御に用いる装置）
細胞内ｃＡＭＰ濃度の制御方法に使用する装置は、細胞を観察するための顕微鏡、細胞に光を照射する光源及びルシフェラーゼの発光を検出する検出器から構成される。光源は、ＰＡＣを活性化できる波長を含む光を照射できるものであれば特に限定されない。ＰＡＣは青色光で活性化されｃＡＭＰ産生が促進されるため、例えば４００〜５００ｎｍの領域の波長を含む光を照射できる光源であればよく、具体的には青色発光ダイオード等が挙げられる。また、細胞内ｃＡＭＰ濃度を適切に制御するために、光源は光強度を変更できることが好ましい。ルシフェラーゼの発光を検出する検出器は、ルシフェラーゼの発光の波長領域に感度があるものであれば特に限定されない。例えば、ホタルルシフェラーゼの極大発光波長は５５０〜５６０ｎｍ付近であるため、これらの領域に感度を有する検出器を利用可能である。細胞内ｃＡＭＰ濃度を高感度に検出し、それによって細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御し易くするために、検出器として、イメージインテンシファイア及びインテリジェントビジョンセンサーカメラを組み合わせたフォトンカウンティングシステム又はＥＭ−ＣＣＤ（電子増倍型ＣＣＤ）カメラを用いたフォトンカウンティングシステムを使用することが好ましい。
【００３８】
（細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する方法）
細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件の決定は、以下の手順で行う。
【００３９】
１．細胞の培地に発光基質であるルシフェリンを添加し、３０分から３時間程度室温で静置する。
【００４０】
２．上記装置に細胞をセットする。
【００４１】
３．細胞に光を照射する。光照射により光活性化アデニル酸シクラーゼはｃＡＭＰを産生し、産生されたｃＡＭＰ濃度に応じて改変ルシフェラーゼは発光する。光の照射条件は、細胞の種類及び遺伝子の導入効率等によって異なるが、例えば、０．２〜２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強度の光を０．１〜６０秒間、細胞に照射することで、改変ルシフェラーゼの発光が観測できる程度のｃＡＭＰを産生させることが可能である。
【００４２】
４．改変ルシフェラーゼの発光量を検出器で測定する。改変ルシフェラーゼの発光量は光活性化アデニル酸シクラーゼが産生したｃＡＭＰ量に応じて変化する。光の照射条件によって異なるが、光照射の直後から改変ルシフェラーゼの発光量すなわちｃＡＭＰ濃度は上昇を開始し、２〜５分後に改変ルシフェラーゼの発光量は最大となり、５〜１５分後には改変ルシフェラーゼの発光量はほぼ観測されなくなる。
【００４３】
５．改変ルシフェラーゼの発光量に基づいて産生されたｃＡＭＰ濃度変化を計測し、光照射条件と当該光照射条件下における細胞内ｃＡＭＰ濃度変化とを関連付けることにより、細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する。ｃＡＭＰ濃度の算出は相対値でも絶対値でもよい。相対値である場合、改変ルシフェラーゼの発光量をそのまま利用できる。絶対値を算出する場合、既知濃度のｃＡＭＰを用いた検量線を利用することができる。光照射及び改変ルシフェラーゼの発光量の測定を複数回繰り返すことで、所望の細胞内ｃＡＭＰ濃度に制御するための光の照射条件を決定することがより容易となる。光の照射条件は、光強度、照射時間及び照射間隔を変更することが可能であり、例えば、光強度は０．２〜２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓの範囲で、照射時間は０．１〜６０秒間の範囲で、照射間隔は１〜１５分間の範囲で変更することが可能である。
【００４４】
（細胞内ｃＡＭＰ濃度の制御方法）
細胞内ｃＡＭＰ濃度の制御は、以下の手順で行う。
【００４５】
１．細胞の培地に発光基質であるルシフェリン又はセレンテラジンを添加し、２時間程度室温で静置する。
【００４６】
２．上記装置に細胞をセットする。
【００４７】
３．上記の細胞内ｃＡＭＰ濃度を制御するための光照射条件を決定する方法により決定された光照射条件で、細胞に光を照射する。
【００４８】
上記細胞内ｃＡＭＰ濃度の制御方法は、単一細胞において繰り返しｃＡＭＰ濃度の増加及び減少を行うことが可能である。また、光の照射条件をうまく設定することで、一定範囲のｃＡＭＰ濃度を維持することも可能である。
【実施例】
【００４９】
材料及び方法
【００５０】
（１）ｃＡＭＰ発光プローブ安定発現細胞株の樹立
細胞内ｃＡＭＰの定量にはｃＡＭＰ感受性発光プローブＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（プロメガ社）を利用した。これはホタルルシフェラーゼの改変タンパク質である。本実験ではｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  ２２Ｆ  ｃＡＭＰ  ＰｌａｓｍｉｄよりＧｌｏｓｅｎｓｏｒ遺伝子のＯＲＦを切り出し、これを安定発現ベクター（ｐＥＢｍｕｌｔｉ；和光純薬）にクローニングし、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３に導入し、Ｇｌｏｓｅｎｓｏｒ遺伝子を安定発現する細胞株を作製した。
【００５１】
（２）光活性化アデニル酸シクラーゼ発現ベクターの作成
ミドリムシ由来の光活性化アデニル酸シクラーゼのαサブユニット遺伝子（ＰＡＣａ）及びベギアトア由来の光活性化アデニル酸シクラーゼ遺伝子（ｂＰＡＣ）に基づき、コドンを哺乳類に最適化した遺伝子を合成した。これらの遺伝子を、ＥＦ１ａプロモータを持つ哺乳類細胞用発現ベクター（ｐＢＡｐｏ−ＥＦ１ａ；タカラバイオ）に組み込んでＰＡＣ発現ベクター（ｐＢＡｐｏ−ＥＦ１ａ−ｍＰＡＣａ及びｐＢＡｐｏ−ＥＦ１ａ−ｍｂＰＡＣ）を作製した。
【００５２】
（３）ｃＡＭＰ発光プローブ及びＰＡＣ発現細胞の調製
光照射実験の２日前にガラスボトムディシュに播種したＧｌｏｓｅｎｓｏｒ安定発現ＨＥＫ２９３（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、上記のＰＡＣ発現ベクター導入し、ＰＡＣを一過性に発現させた。光照射実験の当日、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（発光計測のための基質：ルシフェリン）を細胞培地添加し、室温にて２時間程度静置し、細胞をｃＡＭＰの発光計測の可能な状態に整えた。
【００５３】
（４）計測機器構成及び条件
倒立顕微鏡（ＴＥ３００；Ｎｉｋｏｎ）のサイドポートにＧａＡｓ光電面イメージインテンシファイア（Ｉ．Ｉ．）ユニット２７４１−５２ＣＨ及びリレーレンズＡ４５３９（浜松ホトニクス）を介してインテリジェントビジョンセンサー（ＩＶＳ）カメラＨ３２７（フレームレート２５０ｆｐｓ、アレイサイズ５１２×５１２、ＡＤコンバータ１６ｂｉｔ；浜松ホトニクス）を用い、フォトンカウンティングシステムを構築した。対物レンズＣＦＩ  Ｓ  Ｆｌｕｏｒ  ２０×／ＮＡ０．７５を通して得られた像はＩ．Ｉ．光電面に対物レンズ倍率にて映され、さらに蛍光面の像は、１：１のリレーレンズを介してＣＭＯＳセンサーにて撮像される。
【００５４】
撮像条件は、Ｉ．Ｉ．コントローラのゲイン８、またＩＶＳカメラのゲイン７、オフセット１８０に設定。細胞内のｃＡＭＰ発光プローブ（Ｇｌｏｓｅｎｓｏｒ）が発する微弱な光を１０秒ごとに積算しながら長時間にわたり観測・記録した。
【００５５】
さらにＰＡＣの光照射用に当該顕微鏡の光路内に青色ＬＥＤ（４６０ｎｍ）を装着し、コンデンサレンズを介してこの青色照射光を細胞に照射するシステムを作成した。ＬＥＤのオン／オフ制御（ＰＡＣの光活性化操作）はＩＶＳカメラの制御用ＰＣのＲＳ−２３２ｃ通信ポートを介して実施した。光照射とフォトンカウンティングの制御と１台のＰＣに集約し、光照射と計測との間の時間差を最小に留めた。照射光の強度はコンデンサレンズ先端に挿入したＮＤフィルター（透過率５０％，２５％，１２．５％，６．２５％，３％）により実施した。
【００５６】
また、Ｉ．Ｉ．及びＩＶＳカメラに代えて、ＥＭ−ＣＣＤカメラＩｍａｇＥＭ（Ｃ９１００−１３、水冷−８０℃、有効画素数５１２×５１２ピクセル、暗電流０．００１エレクロトン／ピクセル／秒；浜松ホトニクス）を用いたフォトンカウンティングシステムを構築した。実施例１〜５は、Ｉ．Ｉ．＋ＩＶＳカメラを用いたフォトンカウンティングシステムで計測を行い、実施例６は、ＥＭ−ＣＣＤカメラを用いたフォトンカウンティングシステムで計測を行った。
【００５７】
（５）ｃＡＭＰ発光プローブ及びＰＡＣ発現細胞の光照射実験
ｃＡＭＰ発光計測の準備か整ったｃＡＭＰ発光プローブ及びＰＡＣ発現細胞が成育するガラスボトムディッシュを暗室内の顕微鏡にセットし、赤色の安全光（＞６４０ｎｍ）を用いて目視で焦点を合わせた。光路をカメラ側に切り替え、青色ＬＥＤにて細胞を光照射した後、すぐさまフォトンカウンティングを開始し細胞内ｃＡＭＰの濃度をモニターした。フォトンカウンティングの継続時間は個々の実験目的に合わせて調節した。光照射・計測の繰り返し回数も実験目的に合わせて調節した。
【００５８】
（６）細胞内ｃＡＭＰ濃度の数値解析
フォトンカウンティングで取得した細胞の微弱発光画像は、ＩｍａｇｅＪ（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）の専用マクロプログラムによって細胞単位で自動的に数値化され解析された。
【００５９】
実施例１
細胞を光照射（５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間）し、その直後から細胞内ｃＡＭＰ濃度の増減をフォトンカウンティング撮影し、発光画像から単一細胞に由来する細胞内ｃＡＭＰ濃度の経時変化を定量した。その結果を図３に示す。縦軸は発光量すなわちｃＡＭＰ濃度を表し、横軸は光照射後の時間（分）を表す。図３から明らかなように、照射直後からｃＡＭＰ濃度が上昇し、約３分後にｃＡＭＰ濃度が最大となり、その後ｃＡＭＰ濃度は減少し、約７分後にｃＡＭＰ濃度は光照射前と同じレベルとなった。数分の間に細胞内ｃＡＭＰ濃度を増減させた事例は今までになく、非常に驚くべき結果が得られた。
【００６０】
なお、図３は、ｂＰＡＣ遺伝子を導入した細胞の結果を示したが、ＰＡＣａ遺伝子を導入した細胞でも同様の結果が得られた。以下の実施例では、ｂＰＡＣ遺伝子を導入した細胞を用いた。
【００６１】
実施例２
同一の細胞に対して複数回の光照射を行い、単一細胞内のｃＡＭＰ濃度をモニターした。光照射（２μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間）を１０分間隔で３回繰り返したときの細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を図４に示す。図４から明らかなように、同一の細胞に光照射を複数回繰り返してもｃＡＭＰ濃度の増減を制御することができ、しかも光照射のたびに同一のｃＡＭＰ濃度変化のパターンを示した。
【００６２】
実施例３
同一の細胞に対して複数回の光照射を行い、単一細胞内のｃＡＭＰ濃度をモニターした。ただし、照射光の強度を変化させ、０．２，０．４，０．９，１．９及び５．０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの強度の光を３０秒間、順に１０分間隔で照射を行った。その結果を図５に示す。図５から明らかなように、照射する光の強度が強いほど、ｃＡＭＰ濃度の最大値も大きくなった。
【００６３】
別の同一細胞を用いて同様の実験を複数回行ったところ、同様の結果が得られた。ｃＡＭＰ濃度の最大値は、照射光の強度の対数に対して直線的に増加することが分かった。
【００６４】
実施例４
同一の細胞に対して複数回の光照射を行い、単一細胞内のｃＡＭＰ濃度を一定範囲に保持することを試みた。光照射（５μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間）を４分間隔で繰り返したときの細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を図６に示す。図６から明らかなように、細胞内ｃＡＭＰ濃度は小さな周期的変動を繰り返しながら、一定範囲で持続的に保持できることが確認された。
【００６５】
実施例５
照射光の強度及び照射間隔を制御することによって、種々の濃度範囲において、細胞内ｃＡＭＰ濃度を保持することを試みた。同一の細胞に対して、０．２μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間の光照射を１分間隔で行い、次に０．９μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間の光照射を２分間隔で行い、最後に５．０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ，３０秒間の光照射を４分間隔で行った。各照射条件のｃＡＭＰ濃度の変化を図７に示す。
【００６６】
実施例６
同一の細胞に対して、光強度を固定し照射時間を変化させて光照射を行い、単一細胞内のｃＡＭＰ濃度をモニターした。光強度を２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓとし、照射時間を１、２、４、８、１６又は３２秒間としたときの、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を図８に示す。図８から明らかなように、照射時間が長いほど、ｃＡＭＰ濃度の最大値も大きくなった。また、照射時間８秒間の光刺激を３回繰り返したが、ｃＡＭＰ濃度の変化パターンは一致した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015000021.tif 000008
【図８】
2015000021.tif 000009
【配列表】
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