(57)【要約】【課題】磁性粒子を効率よく除去できる、標的物質の精製装置及び精製方法を提供すること。【解決手段】長手方向を有し、オイルからなるプラグ、オイルと相分離し、標的物質を着脱可能に保持する磁性体から前記標的物質を溶出する溶出液からなるプラグ、オイルからなるプラグ、を、順に内部に備えているキャピラリーと、前記キャピラリーに磁力を印加して前記磁性体を保持し、前記磁性体のキャピラリー長手方向の移動を制御する磁力印加機構と、前記磁力印加機構が前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限している間に、前記溶出液を前記キャピラリー長手方向に移動させる送液機構と、を有する、標的物質の精製装置とする。【選択図】図６
2015177770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長手方向を有し、
オイルからなるプラグ、
オイルと相分離し、標的物質を着脱可能に保持する磁性体から前記標的物質を溶出する溶出液からなるプラグ、
オイルからなるプラグ、
を、順に内部に備えているキャピラリーと、
前記キャピラリーに磁力を印加して前記磁性体を保持し、前記磁性体のキャピラリー長手方向の移動を制御する磁力印加機構と、
前記磁力印加機構が前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限している間に、前記溶出液を前記キャピラリー長手方向に移動させる送液機構と、
を有する、標的物質の精製装置。
【請求項２】
前記キャピラリーを装着可能な装着部を有する、請求項１に記載の標的物質の精製装置。
【請求項３】
前記磁力印加機構は永久磁石を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標的物質の精製装置。
【請求項４】
前記送液機構が加圧手段を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の標的物質の精製装置。
【請求項５】
前記加圧手段がプランジャーである、請求項５に記載の標的物質の精製装置。
【請求項６】
長手方向を有し、
オイルからなるオイルプラグ、
洗浄液からなる洗浄液プラグ
オイルからなるオイルプラグ
オイルと相分離し、核酸を着脱可能に保持する磁性体から前記核酸を溶出する溶出液からなる溶出液プラグ、
オイルからなるオイルプラグ、
を、順に内部に備えているキャピラリーと、
前記キャピラリーに磁力を印加して前記磁性体を保持し、前記磁性体のキャピラリー長手方向の移動を制御する磁力印加機構と、
前記磁力印加機構が前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限している間に、前記溶出液プラグを前記キャピラリー長手方向に移動させる送液機構と、
を有する、核酸精製装置。
【請求項７】
前記磁力印加機構は、前記キャピラリーの長手方向と交わる面内で前記磁性体を移動させる、請求項６に記載の核酸精製装置。
【請求項８】
前記キャピラリー内部と連通した核酸増幅用容器を備える、請求項６または７に記載の核酸精製装置。
【請求項９】
前記核酸増幅用容器が、凍結乾燥された核酸増幅用試薬を含む、請求項８に記載の精製装置。
【請求項１０】
標的物質の精製方法であって、
長手方向を有し、オイルからなるプラグ、オイルと相分離し前記標的物質を着脱可能に保持する磁性体から前記標的物質を溶出する溶出液からなる溶出液プラグ、オイルからなるプラグを、順に内部に備えているキャピラリー内に、前記標的物質を保持した磁性体を導入する工程と、
前記キャピラリーの外から磁力を加えて、前記溶出液プラグ内に、前記磁性体を移動し、保持する工程と、
前記液体内で前記標的物質を前記磁性体から溶出させる工程と、
前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限しながら、前記標的物質が溶出した前記液体を前記キャピラリー長手方向に移動させ、前記キャピラリーから外に出す工程と、
を含む方法。
【請求項１１】
前記キャピラリーの長手方向と交わる面内で、前記磁性体を移動させる工程を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記キャピラリー内を加圧することによって、前記標的物質が溶出した前記液体を、前記キャピラリー長手方向に移動させる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キャピラリー内をプランジャーによって加圧する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的物質が核酸であり、請求項１０〜１３のいずれか１項の方法によって得られた核酸を増幅させる核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の精製装置、核酸精製装置、標的物質の生成方法、及び核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomらの方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程からなる（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１-１４６７８３号公開公報
【特許文献２】特開２００９−２０７４５９号公開公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、担体として使用する磁性粒子は一つ一つが非常に小さな微粒子であり、さらにその表面は親水性であるため、外部からの磁力による操作が不十分だと水溶液である溶出液内に一部残留することがある、という課題がある。磁性粒子が溶出液に残留すると、その後の増幅反応の際、検出用の励起光を遮り、反応を検出することを阻害することがある。
【０００６】
そこで、本発明は、磁性体を効率よく除去できる、標的物質の精製装置、核酸精製装置、標的物質の生成方法、及び核酸増幅を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施態様は、長手方向を有し、オイルからなるプラグ、オイルと相分離し、標的物質を着脱可能に保持する磁性体から前記標的物質を溶出する溶出液からなるプラグ、オイルからなるプラグ、を、順に内部に備えているキャピラリーと、前記キャピラリーに磁力を印加して前記磁性体を保持し、前記磁性体のキャピラリー長手方向の移動を制御する磁力印加機構と、前記磁力印加機構が前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限している間に、前記溶出液を前記キャピラリー長手方向に移動させる送液機構と、を有する、標的物質の精製装置である。前記精製装置は、前記キャピラリーを装着可能な装着部を有してもよい。前記磁力印加機構は永久磁石を有してもよく、前記送液機構が加圧手段を有してもよく、前記加圧手段がプランジャーであってもよい。
【０００８】
本発明の他の一実施態様は、長手方向を有し、オイルからなるオイルプラグ、洗浄液からなる洗浄液プラグ、オイルからなるオイルプラグオイルと相分離し、核酸を着脱可能に保持する磁性体から前記核酸を溶出する溶出液からなる溶出液プラグ、オイルからなるオイルプラグ、を、順に内部に備えているキャピラリーと、前記キャピラリーに磁力を印加して前記磁性体を保持し、前記磁性体のキャピラリー長手方向の移動を制御する磁力印加機構と、前記磁力印加機構が前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限している間に、前記溶出液プラグを前記キャピラリー長手方向に移動させる送液機構と、を有する、核酸精製装置である。前記磁力印加機構は、前記キャピラリーの長手方向と交わる面内で前記磁性体を移動させてもよい。前記キャピラリー内部と連通した核酸増幅用容器を備えてもよい。前記核酸増幅用容器が、凍結乾燥された核酸増幅用試薬を含んでもよい。
【０００９】
本発明のさらなる一実施態様は、標的物質の精製方法であって、長手方向を有し、オイルからなるプラグ、オイルと相分離し前記標的物質を着脱可能に保持する磁性体から前記標的物質を溶出する溶出液からなる溶出液プラグ、オイルからなるプラグを、順に内部に備えているキャピラリー内に、前記標的物質を保持した磁性体を導入する工程と、前記キャピラリーの外から磁力を加えて、前記溶出液プラグ内に、前記磁性体を移動し、保持する工程と、前記液体内で前記標的物質を前記磁性体から溶出させる工程と、前記磁性体の前記キャピラリー長手方向の移動を制限しながら、前記標的物質が溶出した前記液体を前記キャピラリー長手方向に移動させ、前記キャピラリーから外に出す工程と、
を含む方法である。前記精製方法は、前記キャピラリーの長手方向と交わる面内で、前記磁性体を移動させる工程を有してもよい。前記キャピラリー内を加圧することによって、前記標的物質が溶出した前記液体を、前記キャピラリー長手方向に移動させてもよい。前記キャピラリー内をプランジャーによって加圧してもよい。
【００１０】
本発明のさらなる一実施態様は、前記標的物質が核酸であり、上記いずれか１項の方法によって得られた核酸を増幅させる核酸増幅方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、磁性体を効率よく除去できる、標的物質の精製装置、核酸精製装置、標的物質の生成方法、及び核酸増幅を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係る、核酸の精製装置の模式図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る、キャピラリー内のプラグ近傍の拡大図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る、反応容器と物質抽出用装置を有する核酸の精製装置の模式図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る、核酸の精製装置の使用方法を示す模式図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る、核酸の精製装置の使用方法について、具体的手順を示す模式図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る、 核酸の精製装置の模式図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る核酸の精製方法において、 核酸の精製装置に、検体の溶解液を入れる模式図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る核酸の精製方法において、磁気粒子を揺動させながら、溶出液まで移動させる模式図である。
【図９】本発明の一実施形態に係る核酸の精製方法において、溶出液をキャピラリーから押し出す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝標的物質の精製装置＝＝
【００１４】
図１左図に示すように、本発明の標的物質の精製装置８０の一実施形態は、プラグ状の液体１０を有するキャピラリー１２と、キャピラリー１２内で、標的物質を着脱可能に保持する磁性体Ｍと、キャピラリー１２に磁力を印加し、磁性体Ｍを保持し、磁性体Ｍのキャピラリー１２長手方向の移動を制御する磁力印加機構２０と、磁力印加機構２０が磁性体Ｍの移動を制限している間に、液体をキャピラリー１２長手方向に移動させる送液機構１８と、を有する。
【００１５】
プラグ状の液体１０は、水溶液であることが好ましく、塩溶液、特にバッファーであることが好ましい。キャピラリー１２は、複数のプラグを有していても良いが、その場合、プラグ状の液体とプラグ状の液体を独立に存在させるため、プラグの間に、プラグ状のワックスまたはオイルを設けることが好ましい。
【００１６】
キャピラリー１２は、内部に空洞を有し、当該空洞内に液体を長手方向に流通させることのできるチューブ状の部分（チューブ部とも呼ぶ）を有する。チューブ部は、長手方向を有するが、屈曲してもよい。チューブ部の内部の空洞は、液体がチューブ部内でプラグ形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ部の内部の空洞の大きさや長手方向に垂直な断面の形状は、チューブ部の長手方向に沿って変化してもよい。液体がチューブ部内でプラグ形状を維持できるかどうかについては、チューブ部の材質、液体の種類等の条件に依存するので、チューブ部の長手方向に垂直な断面の形状は、液体がチューブ部内でプラグ形状を維持できる範囲内で適宜に設計される。チューブ部の外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブ部の肉厚も特に限定されない。チューブ部の内部の空洞の長手方向に垂直な断面が円形である場合、チューブ部の内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブ部の内径がこの範囲であると、チューブ部の材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすいので好ましい。チューブ部の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、高分子、金属などとすることができる。チューブ部の材質にガラスや高分子などの可視光において透明性を有する材質を選択すると、チューブ部の外部から内部（空洞内）を観察することができるのでより好ましい。また、チューブ部の材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブ部に磁性体Ｍを通過させる場合などに、チューブ部の外から磁力を与えることによってこれを行うことが容易化されるため好ましい。
【００１７】
標的物質は限定されず、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）やタンパク質などの高分子であっても、化合物などの低分子であっても良い。磁性体Ｍの形状は特に限定されないが、粒子状であることが好ましい。標的物質を着脱可能に保持するため、磁性体Ｍは、標的物質に着脱可能に結合するか、または標的物質に着脱可能に結合する標的物質結合物質を有する。例えば、標的物質が核酸の場合、磁性体Ｍはシリカ、ガラス、珪藻土などの核酸結合分子を有しても良く、標的物質が抗体の場合、磁性体ＭはProteinAなどの抗体結合分子を有しても良い。
【００１８】
本発明の精製装置８０は、磁力印加機構２０を備える。キャピラリー１２の外からキャピラリー１２に磁力を印加し、キャピラリー１２内の磁性体Ｍを保持可能で、その磁性体Ｍの移動を制御する磁力印加機構２０は、当業者によって容易に設計されうる。例えば、磁力印加機構２０は、印加体支持部１６によって支持される永久磁石などの磁力印加体１４を有し、磁力印加体１４の磁力によって磁性体Ｍを保持可能である。磁力印加機構２０は、また、磁性体Ｍのキャピラリー１２長手方向の移動を制御し、任意に停止させることができる。これは、例えば、磁力印加体１４を移動させ、好ましい位置で停止させることのできる機構を設けることで実現可能となる。また、この磁力印加機構２０は、キャピラリー１２の長手方向と交わる面内、特に直交する面内で、磁性体Ｍを移動させる移動機構を有すること、すなわち磁性体Ｍを揺動させることができるほうが好ましい。例えば、磁性体Ｍは、距離の近い磁力印加体１４の方に引き寄せられるため、移動機構として二つの磁力印加体１４を設け、一方の磁力印加体１４がキャピラリーに近接していると、その磁力印加体１４の側に磁性体Ｍが引き寄せられる。その後、その磁力印加体１４がキャピラリー１２から離れ、逆側の磁力印加体１４がキャピラリー１２に近接すると、今度は逆側の磁力印加体１４に磁性体Ｍが引き寄せられる。これにより、磁性体Ｍを前後方向に移動させることができる。一対の磁力印加体１４を前後方向に揺動させると、磁性体Ｍが前後方向に往復移動することになる。このように、磁性体Ｍをプラグ状の液体１０中で移動させると、磁性体Ｍに液体が接しやすくなり、液体の洗浄効果や溶出効果が高まる。
【００１９】
この精製装置８０の有する送液機構１８は、プラグ状の液体１０をキャピラリー１２長手方向に移動させ、キャピラリー端部２４から、液体を吐出することができる機構であって、例えば、キャピラリー１２内部の液体に圧力を加え、その圧力によって液体を移動させる加圧手段であってもよく、キャピラリー１２内部を吸引し、内部を陰圧にすることで液体を移動させる吸引手段であってもよい、加圧手段の例として図１に例示したピストンやプランジャーなどでもよく、吸引手段の例として真空ポンプなどでもよい。ピストンやプランジャーは、キャピラリー１２の内径と同じ直径を有し、直接キャピラリー１２に嵌めて用いるものが好ましく、図１右図に示したように、ピストンやプランジャーをキャピラリー１２内に押し込むことによって、プラグ状の液体をキャピラリー１２長手方向に移動させることができる。また、真空ポンプの場合は、例えば、枝付きフラスコの口にキャピラリー１２を通したゴム栓を嵌め、枝にはアスピレーターなどの真空ポンプを接続してフラスコ内を減圧することにより、プラグ状の液体をキャピラリー１２長手方向に移動させることができる。その他、キャピラリー１２が両端に、キャップなどの着脱可能な封止手段を有し、キャピラリー１２を垂直に保持し、封止手段を開閉することによって、標的物質が溶出した液体を、重力によってキャピラリー１２長手方向に移動させ、吐出させて回収しても良い。あるいは、キャピラリー１２の一方の端に、揮発性が高く、瞬間的にオイルと混和しない液体からなるプラグを設け、その側の端を封止し、そのプラグを加熱することによって、揮発性の高い液体は気化し、標的物質が溶出した液体をキャピラリー１２長手方向の、揮発性の高い液体のプラグと逆の端の方向に移動させることができる。
【００２０】
＝＝標的物質の精製方法＝＝
以上のような構成を有する精製装置８０を用い、標的物質を精製することができる。例えば、まず、細胞やウイルスなど、そこから標的物質を精製したいサンプルを溶解液などで溶解したり、抽出液などで抽出したりする。そして、標的物質を着脱可能に保持することのできる磁性体Ｍを加え、標的物質を結合させる。この標的物質着脱可能に保持する磁性体Ｍは、遠心チューブなどを用い、緩衝液などで洗浄することができる。その後、プラグ状の液体１０を有するキャピラリー１２内に、標的物質を着脱可能に保持する磁性体Ｍを導入する。導入方法は特に限定されないが、同じ種類の液体に懸濁した磁性体Ｍをキャピラリー１２の端部２４よりキャピラリー１２内に導入し、プラグ状の液体１０に合一させればよい。
【００２１】
平行して、キャピラリー１２の外から磁力を加えて、液体内に磁性体Ｍを保持する。例えば、図２に示すように、右側の磁力印加体１４をプラグ状の液体１０のすぐ外側に設置することにより、磁性体Ｍを液体内に保持することが可能になる、また、磁力印加機構２０により、磁力印加体１４をキャピラリー１２長手方向に移動させたり、任意に停止させたりすることによって、キャピラリー１２内で磁性体Ｍを任意に移動させたり、キャピラリー１２長手方向の特定の位置に保持することが可能である（図４Ａ）。
【００２２】
そして、液体内に磁性体Ｍを保持したまま、液体内で標的物質を磁性体Ｍから溶出させる。この溶出方法は特に限定されず、標的物質と磁性体Ｍが有する標的物質結合物質との結合様式によって、適宜決定することができる。例えば、核酸とシリカの場合、液体をキャピラリーごと加熱してもよく、抗体と抗原の場合、液体に酸を加え、ｐＨを酸性にすることによって抗体と抗原を分離することができる。なお、この際、上述したように、キャピラリー１２の長手方向と交わる面内、特に直交する面内で、磁性体Ｍを揺動させることにより、磁性体Ｍに対する液体の効果を向上させることができる。
【００２３】
その後、図１右図に示すように、磁性体Ｍのキャピラリー１２長手方向の移動を停止させながら、標的物質が溶出した液体をキャピラリー１２長手方向に移動させ、キャピラリー１２の端２４から吐出し、この液体を回収することによって、磁性体に結合させた標的物質を回収することが可能になる。
【００２４】
液体状のプラグを複数にし、一方を、標的物質を着脱可能に保持する磁性体Ｍを洗浄するための洗浄液とし、もう一方を、磁性体Ｍから標的物質を溶出させる溶出液とすることもできる。すなわち、キャピラリー１２が、オイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、標的物質を着脱可能に保持する磁性体を洗浄する洗浄液からなる第２プラグ、オイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、標的物質を着脱可能に保持する磁性体Ｍから標的物質を溶出する溶出液からなる第４プラグ、オイルからなる第５プラグ、を、順にその内部に備えている。プラグが１つの時と同様にして、標的物質を着脱可能に保持する磁性体Ｍを洗浄液に導入する。磁力印加機構２０によって、磁性体Ｍを溶出液まで移動させる。そして、上述したように、溶出液中で標的物質を溶出させ、溶出液をキャピラリーの端から吐出させ、回収する。この際、洗浄液を有するプラグをさらに複数にすることで、洗浄効果を高めることも可能になる。
【００２５】
＝＝核酸を精製する場合の実施例＝＝
図３に示すように、本実施例の核酸の精製装置は、反応容器１００と物質抽出用装置３００を有する。反応容器１００は、長手方向を有するキャピラリー１２と、キャピラリー１２の一端に設けられた開口部１２０側に接続するプランジャー１３０を有する。また、キャピラリー１２は開口部１２０とは反対側の端部に開口部１４０を有し、キャピラリー１２内部には開口部１４０側から開口部１２０側へ、オイルからなる第１プラグ２００、洗浄液からなる第２プラグ２１０、オイルからなる第３プラグ２２０、溶出液からなる第４プラグ２３０、オイルからなる第５プラグ２４０が充填されている。ここで、洗浄液および溶出液はオイルとは混和しない水溶液である。また、物質抽出用装置３００は、反応容器１００を装着するための装着部３１０、反応容器１００のキャピラリー１２側面から磁力を印加する永久磁石３２０Ａ，Ｂと、プランジャー１３０を押し、反応容器１００内の液体を送液するための送液機構３３０、およびキャピラリー１２の一部を加熱するための加熱部３４０を有する。なお、本実施例では、オイルとして、シリコーンオイルを用いた。また、洗浄液には７６質量％のグアニジン塩酸塩の水溶液を用いた。さらに溶出液として滅菌水を用いた。
【００２６】
ここで、「プラグ」とは、キャピラリー１２内において、特定の液体が一区画を占める場合の液体をいい、図５では、柱状に保持されている液体を「プラグ」と呼ぶ。なお、オイルは、水溶液と混ぜると相分離し、従って、オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを防止する機能を有する。プラグの中やプラグの間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、後述の磁性粒子Ｍがプラグを通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在しても良い。
【００２７】
以下、この核酸の精製装置を用いてヒト血液からの核酸抽出を行う方法を詳述する。
【００２８】
まず、図４に示すように、容量３ｍＬのポリエチレン型容器（吸着容器１５０）に、３７５μＬの吸着液、及び１μＬの磁性粒子（磁性粒子Ｍ〉分散液を収容した。吸着液の組成は、７６質量％のグアニジン塩酸塩、１．７質量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウムニ水和物、及び１０質量％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの水溶液（東洋紡製、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−、ＮＰＫ−１）である。また、磁性粒子分散液としては、５０体積％の磁性シリカ粒子及び２０質量％の塩化リチウムを含有したものを用いた。
【００２９】
ヒトから採取した血液を、ピペットを用いて吸着容器１５０の口から５０μＬ入れ、吸着容器１５０に蓋をして手で３０秒間振って撹絆し、血液に含まれる核酸を磁性粒子Ｍに吸着させた（図４（イ）参照）。その後、吸着容器１５０の蓋を外し，反応容器１００の第１プラグ側の開口部１３０を吸着容器１５０に挿入し、プランジャー１３０を開口部１２０側にスライドさせる。その結果、吸着容器１５０内の磁性粒子Ｍは吸着液と共に反応容器１００のチューブ部１１０内に充填される（図４（ロ）参照）。そして、プランジャー１３０が接続したキャピラリー１２を物質抽出用装置３００に備えられた装着部３１０に装着する。このときチューブの開口部１２０側が開口部１４０に対し鉛直上向きになるように設置する。また、反応容器１００は、開口部１２０が永久磁石３２０Ａ，Ｂを通過し、さらに永久磁石３２０Ａ，Ｂがキャピラリー１２の第１プラグの位置にくるように装着される。その結果、磁性粒子Ｍは永久磁石３２０Ａ，Ｂからの磁力によって、キャピラリー１２内の第１プラグが配置される位置まで移動する（図５（イ）参照）。永久磁石３２０Ａと永久磁石３２０Ｂは一定の間隔が設けられ、キャピラリー１２を挟み込むように向かい合っている。また、永久磁石３２０Ａおよび３２０Ｂは、それぞれのキャピラリー１２との距離が変化するように、チューブ長手方向に直交する軸上を往復運動する。
【００３０】
永久磁石３２０Ａ，Ｂをチューブ長手方向と直交する軸上を往復運動させながら、プランジャー１３０を開口部１４０側に押すことで、チューブ内の液体を移動させる。プランジャー１３０によってチューブ内を加圧することで、洗浄液からなる第２プラグ２１０は永久磁石３２０Ａ，Ｂが往復している軸上にくる。その結果、磁性粒子Ｍはオイルからなる第１プラグから第３プラグへ相対的に移動する。引き続きプランジャー１３０による送液を行いながら、永久磁石３２０Ａ，Ｂの往復移動をすることで、磁性粒子Ｍは洗浄液によって洗浄され、磁性粒子Ｍの周囲にある夾雑物が除去される（図５（口）および（ハ）参照）。さらに、プランジャー１３０による送液を行うことで第２プラグは開口部１４０側に移動し、永久磁石３２０Ａ，Ｂが往復する軸上の位置にはオイルからなる第３プラグ２２０が位置するようになる。また、磁性粒子を第２プラグ２１０と策３プラグ２２０の界面が通過するときは、永久磁石３２０Ａ，Ｂの往復運動を停止し、一方の永久磁石３２０Ａあるいは３２０Ｂがチューブ側面に接近した状態でいることが望ましい、その結果、第２プラグを構成する洗浄液が磁性粒子Ｍの周囲に多く残った状態で、磁性粒子Ｍが第３プラグに入ることを避けられる（図５（ロ）および（ニ）参照）。引き続きプランジャー１３０による送液を行うことで第３プラグは開口部１４０に移動し、永久磁石３２０Ａ，Ｂが往復運動する軸上の位置には溶出液からなる第５プラグ２３０が位置するようになる。磁性粒子Ｍが第５プラグのチューブ長手方向の中間近くにくる位置まで送液された後、送液を一旦停止し、加熱部３４０によって溶出液をチューブ側面から加熱しながら、永久磁石３２０Ａ，Ｂを往復運動させることで、磁性粒子Ｍに吸着した核酸を溶出液２３０中に溶出させる（図５（ホ）参照）。以上の工程によって、増幅反応を行う核酸の、溶出液中への溶出が可能となる。溶出した核酸を含む溶出液２３０はプランジャー１３０を開口部１４０側に押すことで、開口部１４０から吐出され（図５（へ）参照）増幅反応用容器に第３プラグ２２０および第５プラグ２４０を構成するオイルの一部あるいは全部とともに充填することで、増幅反応容器に自動で抽出物を含む溶出液を導入することが可能になる。
【００３１】
＝＝一体型核酸増幅装置の実施例＝＝
図６に示すように、本実施例の核酸の精製装置は、反応容器１００と物質抽出用装置３００を有する。反応容器１００は、長手方向を有するキャピラリー１２と、キャピラリー１２の上端に設けられた開口部１２０側に接続するプランジャー１３０を有する。また、キャピラリー１２は開口部１２０とは反対側の下端部に開口部１４０を有し、反応容器１００は、内部が開口部１４０に連通する核酸増幅用容器４３０を有する。キャピラリー１２内部には開口部１２０側から開口部１４０側へ、オイルからなる第１プラグ２００、洗浄液からなる第２プラグ２１０、オイルからなる第３プラグ２２０、溶出液からなる第４プラグ２３０、オイルからなる第５プラグ２４０が充填されている。ここで、洗浄液および溶出液はオイルとは混和しない水溶液である。また、物質抽出用装置３００は、反応容器１００を装着するための装着部３１０、反応容器１００の外から磁力を印加する磁力印加機構３２０と、反応容器１００のキャピラリー１２側面から磁力を印加する永久磁石３２０Ａ，Ｂと、プランジャー１３０を押し、反応容器１００内の液体を送液するための送液機構３３０、およびキャピラリー１２の一部を加熱するための加熱部３４０を有する。
【００３２】
オイルの種類は、特に限定されず、ミネラルオイル、シリコーンオイル（２ＣＳシリコーンオイルなど）、植物油などを用いることができるが、より高粘度なオイルにすることによって、上側のプラグとの界面で、核酸結合性固相担体を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、上側のプラグから、オイルからなるプラグに核酸結合性固相担体を移動させた場合に、核酸結合性固相担体に付着した水溶性の成分をオイル内に、より持ち込まれにくくすることができる。
【００３３】
第２プラグに充填されている洗浄液は、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１０ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。特に、８Ｍグアニジン塩酸塩、０．７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いるのが好ましい。さらに、この洗浄液は、アルコールを、核酸の担体への吸着、逆転写反応、ＰＣＲ反応などを阻害しない量だけ含むことが好ましい。アルコール濃度は、特に限定されないが、７０％以下であってもよく、６０％以下であってもよく、５０％以下であってもよく、４０％以下であってもよく、３０％以下であってもよく、２０％以下であってもよく、１０％以下であってもよいが、５％以下または２％以下であることが好ましく、１％以下または０．５％以下であることがさらに好ましく、０．２％以下または０．１％以下であることが最も好ましい。なお、洗浄液にカオトロピック剤を含有させてもよい。例えば、洗浄液にグアニジン塩酸塩を含有させると、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗浄することができる。グアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。
【００３４】
第４プラグの溶出液中には、逆転写酵素を含む逆転写用試薬が含まれていても良い。逆転写酵素も特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる逆転写酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ2+を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ-を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。逆転写プライマー用オリゴヌクレオチドは、０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。
核酸増幅用容器４３０にはオイルで満たされており、凍結乾燥された核酸増幅反応試薬がオイル中に保持されている。凍結乾燥された核酸増幅反応試薬はオイルに溶解しないことが好ましい。
【００３５】
凍結乾燥された核酸増幅反応試薬は、少なくともＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰを含むが、核酸増幅反応用プライマー及び／又は核酸増幅反応用プローブを含んでいることが好ましい。また、第４プラグの溶出液中に逆転写用試薬を添加していない場合、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬は、逆転写酵素を含む逆転写用試薬を含んでいてもよい。その場合、逆転写用プライマーは、核酸増幅反応用プライマーと別に含んでいてもよく、核酸増幅反応用プライマーと共用してもよい。
【００３６】
ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ2+を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ-を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。
核酸増幅反応試薬の凍結乾燥は、通常行われる方法で行えばよく、例えば、核酸増幅反応用容器４３０のための容器に、核酸増幅反応用バッファーの中に１反応分の核酸増幅反応試薬を入れ、急速凍結させ、低圧にして、所定時間放置する。核酸増幅反応用バッファーの量は特に限定されないが、５μＬでもよく、２．５μＬが好ましく、１．６μＬがより好ましく、バッファーの量が少ないほど，核酸増幅反応試薬が容器の底に小さく硬く固着するようになる。急速凍結の際の温度は特に限定されず、-１０℃から-１６０℃が好ましいが、約-８０℃であることが最も好ましい。凍結乾燥した核酸増幅反応試薬はスポンジ状もしくはケーキ状で、中に気泡がたまっている微細孔（気孔）が沢山ある多孔質であることが好ましく、それによって、溶解性が良くなる。そして、急速に凍結させた方が、微細孔がさらに小さくなり、保存性がさらに良くなる。孔の平均空隙径（例えば、断面の孔の径を顕微鏡下で一定回数計測し、その平均値をとったもの）が２０μｍ以下であることが好ましい。低圧時の圧力は特に限定されず、１００ｍｍＨｇ以下であることが好ましいが、２０ｍｍＨｇ以下であることが最も好ましい。低圧に保つ時間も特に限定されず、２-２４時間であることが好ましいが、８時間程度であることが最も好ましい。なお、核酸増幅反応試薬を凍結乾燥させるための核酸増幅反応試薬溶液の量は、核酸増幅反応試薬を溶解させる水溶液の量より少ないことが好ましい。
【００３７】
このようにして核酸増幅反応用容器４３０に用いる容器中で核酸増幅反応試薬を凍結乾燥することにより、核酸増幅反応試薬を容器の底に固着させる。その後でオイルを添加するが、容器を満たすように添加するのが好ましい。凍結乾燥した核酸増幅反応試薬は水分に弱く、水分がある状態では、長期間安定して保存できないので、オイルは予めシリカゲルなどで脱水しておくことが好ましく、オイルの添加はグローブボックス内などで行うことが好ましい。また、オイルを加えた後、容器を軽く遠心して、気泡を除去しておくのが好ましい。
【００３８】
凍結乾燥した核酸増幅反応試薬にオイルを加える前に、溶解したワックスを加え、ワックスが固形化した後でオイルを加えることによって、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬がオイル中で拡散するのを防ぐことができる。ここで、ワックスとは、室温で固体であって、加熱すると液体となる有機物のことであるが、本発明に使用できるワックスは、３１℃以上、好ましくは３６℃以上、より好ましくは４１℃以上、さらに好ましくは４６℃以上であって、かつ１００℃以下、好ましくは９０℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは７０℃以下の融点を有し、中性脂肪、高級脂肪酸、炭化水素などからなることが好ましい。ワックスとしては、特に限定されず、例えば、パラフィン、マイクロクリスタリンなどの石油由来のワックス、蜜蝋、ウールワックス、鯨蝋などの動物由来のワックス、カルナバ、ロジン、キャンデリラワックス、木蝋などの植物由来のワックスのほか、エルクリスタ（登録商標、出光興産）、ニッサンエレクトール（登録商標、日油株式会社）、ポエム（登録商標、理研ビタミン）、リケマール（登録商標、理研ビタミン）、ネオワックス（登録商標、ヤスハラケミカ（株））、ハイワックス（登録商標、三井化学）、シリコンワックス（登録商標、東レ・ダウコーニング）などを用いることができる。
【００３９】
以下、この核酸の精製装置を用いて綿棒を用いて採取した検体からの核酸増幅を行う方法を詳述する。
【００４０】
まず、物質抽出用装置３００に対し、反応容器１００を、チューブの開口部１２０側が開口部１４０に対し鉛直上向きになるように設置する。そして、永久磁石３２０Ａ，Ｂがプランジャー１３０の側面の位置にくるようにする。永久磁石３２０Ａと永久磁石３２０Ｂは一定の間隔が設けられ、キャピラリー１２を挟み込むように向かい合っている。また、永久磁石３２０Ａおよび３２０Ｂは、それぞれのキャピラリー１２との距離が変化するように、チューブ長手方向に直交する軸上を往復運動することができる。初期設定として、永久磁石３２０Ａをキャピラリー１２に近づけておく。
【００４１】
次に、図７に示すように、容量３ｍＬのポリエチレン型容器（吸着容器１５０）に、３７５μＬの吸着液２６０を入れ、１μＬの磁性粒子（磁性粒子Ｍ〉分散液を添加する。吸着液２６０の組成は、７６質量％のグアニジン塩酸塩、１．７質量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウムニ水和物、及び１０質量％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの水溶液（東洋紡製、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−、ＮＰＫ−１）である。また、磁性粒子分散液としては、５０体積％の磁性シリカ粒子及び２０質量％の塩化リチウムを含有したものを用いる。
【００４２】
ヒトからの検体が付着した綿棒１６０を、吸着液２６０に浸し、吸着容器１５０に蓋１７０をして手で３０秒間振って撹絆し、検体に含まれる核酸を磁性粒子Ｍに吸着させる（図７（ロ）参照）。その後、吸着容器１５０の蓋１７０を外し，反応容器１００の第１プラグ側の開口部１３０を吸着容器１５０に挿入し、物質抽出用装置３００に設置した反応容器１００のプランジャー１３０内に添加する（図７（ハ）参照）。
【００４３】
その結果、図８（イ）に示すように、吸着容器１５０内の磁性粒子Ｍは吸着液と共にプランジャー１３０内に導入され、磁性粒子Ｍは永久磁石３２０Ａからの磁力によって、プランジャー１３０の側面に付着する。プランジャー１３０に蓋１８０をして、永久磁石３２０Ａを、まっすぐ鉛直下方に移動させることによって、磁性粒子Ｍは、キャピラリー１２内を鉛直下方に移動し、オイルからなる第１プラグ２００を通り抜け、洗浄液からなる第２プラグ２１０に入る。そこで、永久磁石３２０Ａ，Ｂを揺動させながら、さらに鉛直下方に移動させる。すなわち、磁気粒子Ｍは、永久磁石３２０Ａ，Ｂの磁力がほぼ同じ場合、距離の近い永久磁石の方に引き寄せられるため、一方の永久磁石３２０Ａがキャピラリー１２に近接していると、その永久磁石３２０Ａの側に磁気粒子Ｍが引き寄せられる。その後、永久磁石３２０Ａがチューブ２０から離れ、逆側の永久磁石３２０Ｂがキャピラリー１２に近接すると、今度は逆側の永久磁石３２０Ｂに磁気粒子Ｍが引き寄せられる。従って、一対の永久磁石３２０Ａ，Ｂをキャピラリー１２側面に対し、遠近方向に交互に揺動させると、それに伴って、磁気粒子Ｍもキャピラリー１２内で揺動する。このように、磁気粒子Ｍを揺動させながら、鉛直下方に移動させることができる（図８（ロ）参照）。この往復運動を各プラグ当たり少なくとも２度行うことが好ましい。なお、永久磁石３２０Ａ，Ｂの磁力が異なる場合、磁気粒子Ｍは、それにかかる磁力の大きい側の永久磁石に近づくため、磁力の大小を考慮すれば、同様にして揺動させることができる。
【００４４】
磁性粒子Ｍがオイルからなる第３プラグ２２０に入ると、永久磁石３２０Ａ，Ｂの揺動を停止させ、まっすぐ鉛直下方に移動させる。それに従い、磁気粒子Ｍもキャピラリー１２壁面にそって、鉛直下方に移動する（図８（ハ）参照）。
【００４５】
磁性粒子Ｍが溶出液からなる第４プラグ２３０に入ると、再度永久磁石３２０Ａ，Ｂを揺動させながら、鉛直下方に移動させる（図８（ニ）参照）。この間に、磁性粒子Ｍに結合している核酸が溶出する。この際、磁性粒子Ｍを第４プラグ２３０の長手方向に往復運動させることが好ましく、それによって、溶出が効率よく行われる。また、加熱部３４０によって加熱することで、核酸の溶出を加速することができる。抽出された核酸がＲＮＡであって、第４プラグ２３０の溶出液に逆転写用試薬が含まれている場合、この段階で、加熱部３４０によって第４プラグ２３０を加熱し、逆転写反応を行う。温度や時間の反応条件は、逆転写酵素に適したものを選択すればよい。
【００４６】
その後、図９（イ）に示すように、永久磁石３２０Ａをチューブに近づけた状態で静止させ、図９（ロ）に示すように、プランジャー１３０を開口部１４０側に押すことで、チューブ内の液体を移動させる。プランジャー１３０によってチューブ内を加圧することで、永久磁石３２０Ａをその場所に残したまま、各プラグは下方へ移動し、図９（ハ）に示すように、引き続きプランジャー１３０による送液を行うことで、第４プラグ２３０は開口部１４０側に移動し、核酸増幅用容器４３０内に押し出される。押し出された第４プラグ２３０の溶出液は、核酸増幅用容器４３０内のオイル中で液滴状になる。液滴状の溶出液は、核酸増幅用容器４３０内で凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を溶解し、核酸増幅反応液となる。
【００４７】
抽出された核酸がＲＮＡであって、第４プラグ２３０の溶出液に逆転写用試薬が含まれている場合、逆転写されて生成したｃＤＮＡが溶出液に含まれ、逆転写用試薬が含まれていない場合、ＲＮＡが溶出液に含まれる。その場合、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬中に逆転写用試薬を含有させることによって、核酸増幅用容器４３０内でＲＮＡを逆転写させてｃＤＮＡを合成することができる。また、抽出された核酸がＤＮＡであれば、溶出液にはＤＮＡが含まれる。これらのＤＮＡを鋳型にすることによって、凍結乾燥した核酸増幅反応試薬を用い、核酸増幅反応を行わせることができる。
【００４８】
この核酸増幅反応試薬とオイルとを有する核酸増幅反応用容器４３０がＰＣＲ装置などの核酸増幅装置にそのままセットして使用できる場合、核酸増幅反応試薬が溶出液に溶解後、核酸増幅反応用容器４３０を取り外し、そのまま核酸増幅反応に用いることができる。あるいは、反応容器１００をそのまま用いることができる核酸増幅装置であれば、核酸増幅反応試薬が溶出液に溶解後、反応容器１００をそのまま核酸増幅反応に用いることができる。
【符号の説明】
【００４９】
１０…プラグ状の液体、１２…キャピラリー、１４…磁力印加体、１６…印加体支持部、１８…送液機構、２０…磁力印加機構、２４…キャピラリー端部、８０…精製装置、１００…反応容器、１１０…チューブ、１２０…開口部、１３０…プランジャー、１４０…開口部、１５０…吸着容器、１６０…綿棒、１７０…蓋、１８０…蓋、２００…第１プラグ、２１０…第２プラグ、２２０…第３プラグ、２３０…第４プラグ、２４０…第５プラグ、２６０…溶解液、３００…物質抽出用装置、３１０…装着部、３２０…磁力印加機構、３２０Ａ、３２０Ｂ…永久磁石、３３０…送液機構、３４０…加熱部、４３０…核酸増幅用容器、４５０…オイル、Ｍ…磁石粒子（磁性体）
【図１】
2015177770.tif 000003
【図２】
2015177770.tif 000004
【図３】
2015177770.tif 000005
【図４】
2015177770.tif 000006
【図５】
2015177770.tif 000007
【図６】
2015177770.tif 000008
【図７】
2015177770.tif 000009
【図８】
2015177770.tif 000010
【図９】
2015177770.tif 000011