(57)【要約】【課題】3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸とをモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体の効率的な製造法を提供すること。【解決手段】（i）糖類の存在下に、微生物に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異遺伝子及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物由来のロイシン代謝遺伝子が導入された形質転換体を培養し、（ii）得られた培養物から、3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸とをモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）糖類の存在下に、微生物に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異遺伝子及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物由来のロイシン代謝遺伝子が導入された形質転換体を培養し、
（ii）得られた培養物から、3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸とをモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取すること
を特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法。
【請求項２】
前記クロストリジウム（Clostridium）属微生物が、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質の４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、１４９番目のアスパラギンがセリンに、及び／又は１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードするものである、請求項１又は２に記載の製造法。
【請求項４】
前記ステップ（i）において、3-ヒドロキ-4-メチル吉草酸の前駆体としてロイシンをさらに添加する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
ロイシンの濃度が、菌体量基準で、０．１ｇ／Ｌ〜１０．０ｇ／Ｌである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
前記微生物が、エシュリキア（Escherichia）属、カプリアヴィドゥス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia)属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項７】
前記微生物がエシュリキア（Escherichia）属微生物である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項８】
前記エシュリキア属微生物が、レアコドン対応ｔＲＮＡを補強するように形質転換した大腸菌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項９】
前記糖類が単糖類である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項１０】
前記単糖類がグルコースである、請求項９に記載の製造法。
【請求項１１】
糖類の濃度が、菌体量基準で、０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の製造法。
【請求項１２】
前記ステップ（i）が、嫌気性、無酸素又は微好気性条件下で行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌等を宿主としたポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法に関する。具体的には、本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子に加えてロイシン代謝遺伝子によって形質転換した大腸菌等を用いる、3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸との共重合体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、「PHA」という）は、再生可能資源から合成可能な環境低負荷かつ生分解性バイオポリエステルである（非特許文献１）。最も代表的なPHAは3-ヒドロキシブタン酸（3HB）のホモポリマーであるP(3HB)であるが、これは高い結晶化度に起因して固くて脆い性質を有するために、その用途が限られてきた。
【０００３】
P(3HB)の結晶化度を下げ、材料に柔軟性を持たせる目的で、これまでに多くの第二モノマー成分との共重合体化が報告されている。例えば、3HBと3-ヒドロキシ吉草酸（3HV）との共重合体化（非特許文献２）は、3HVが3HBとが共結晶化してしまうために、柔軟性はほとんど向上しなかった。近年、3HBと3-ヒドロキシヘキサン酸（3HHx）とからなる共重合体（以下、「P(3HB-co-3HHx)」）の製造法が確立され（特許文献１、特許文献２、非特許文献３）、P(3HB-co-3HHx)は、3HHx分率が10 mol%程度の場合に優れた柔軟性を発揮することが分かり、これにより高い柔軟性をもつPHAの製造が可能となった。
【０００４】
一方、本発明者らは、培地に、3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸（3H4MV）の前駆体として4-メチル吉草酸（4MV）又は4-メチル-2-ペンテン酸（4M2PE）を添加することにより、分岐した側鎖を持つモノマー単位である3H4MVを高組成比で含むPHAが効率よく製造できることを報告している（特許文献３）。
また、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）61-3株由来のPHA重合酵素（PhaC1Ps）遺伝子を導入した水素細菌ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）PHB-4株を、フルクトースを炭素源に培養したところ、3H4MVが導入されたPHA三元共重合体P(3HB-co-3HV-co-3H4MV)が製造されることも報告している（非特許文献４）。詳細には、培地に上記前駆体を添加することにより、最大40 mol％近い3H4MVモノマーが導入されたPHA共重合体が得られている。さらに、上記のラルストニア・ユートロファPHB-4株を、フルクトースを炭素源、ロイシンを前駆体として培養したところ、PHA三元共重合体P(3HB-co-3HV-co-3H4MV)が製造されることも報告している（非特許文献５）。
【０００５】
しかしながら、脂肪酸前駆体は、高価でありかつ菌体の増殖を阻害する。そこで、前駆体を用いることなく、一般に入手容易でかつ安価な糖類を専ら炭素源とした3H4MV共重合体の効率的な製造法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献２】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／１４７９１８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sudesh K, Abe H, Doi Y. (2000), Prog Polym Sci. 25:1503-1555
【非特許文献２】Doi Y, Tamaki A, Kunioka M, Soga K. (1988), Appl Microbiol Biotechnol. 28: 330-334
【非特許文献３】Doi Y, Kitamura S, Abe H. (1995), Macromolecules. 28:4822-4828
【非特許文献４】Tanadchangsaeng N, Kitagawa A, Yamamoto T, Abe H, Tsuge T. (2009), Biomacromolecules. 10: 2866-2874
【非特許文献５】Saika, A, Watanabe, Sudesh K, Abe H, Tsuge T. (2011), AMB Express, 1:6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸（3H4MV）の前駆体を実質的に必要としない、糖類のみを炭素源とした3H4MV共重合体の効率的な製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意検討を行った結果、アミノ酸の１つであるロイシンの炭素骨格が3H4MVと一致していることから、糖類の代謝物であるロイシンを3H4MVに効率よく変換できれば、3H4MVモノマー単位がより効率的に供給できると考え、クロストリジウム（Clostridium）属微生物由来ロイシン代謝遺伝子群、及びPHA重合酵素遺伝子群をコードするプラスミドで形質転換することにより得られた組換え大腸菌等を宿主として、ロイシンの供給源である糖類から、PHA二元共重合体「P(3HB-co-3H4MV)」が効率よく得られることを見出し、本発明を完成させた。
また、特に大腸菌を宿主としてランダム性の高いP(3HB-co-3H4MV)を得ることに初めて成功した。
【００１０】
すなわち、（１）本発明は、（i）糖類の存在下に、微生物に、ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素変異遺伝子及びクロストリジウム属微生物由来のロイシン代謝遺伝子が導入された形質転換体を培養し、（ii）得られた培養物から、3-ヒドロキシブタン酸と3-ヒドロキシ-4-メチル吉草酸とをモノマー単位として含むポリヒドロキシアルカン酸共重合体を採取することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造法を提供する。
（２）本発明はまた、前記クロストリジウム属微生物が、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）である、（１）に記載の製造法を提供する。
（３）本発明はまた、前記ポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）由来のポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質の４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、１４９番目のアスパラギンがセリンに、及び／又は１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異型ポリヒドロキシアルカン酸結合タンパク質をコードするものである、（１）又は（２）に記載の製造法を提供する。
（４）本発明はまた、前記ステップ（i）において、3-ヒドロキ-4-メチル吉草酸の前駆体としてロイシンをさらに添加する、（１）〜（３）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（５）本発明はまた、ロイシンの濃度が、菌体量基準で、０．１ｇ／Ｌ〜１０．０ｇ／Ｌである、（１）〜（４）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（６）本発明はまた、前記微生物が、エシュリキア（Escherichia）属、カプリアヴィドゥス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia)属、及びビブリオ（Vibrio）属からなる群より選ばれる、（１）〜（５）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（７）本発明はまた、前記微生物がエシュリキア（Escherichia）属微生物である、（１）〜（６）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（８）本発明はまた、前記エシュリキア属微生物が、レアコドン対応ｔＲＮＡを補強するように形質転換した大腸菌である、（１）〜（７）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（９）本発明はまた、前記糖類が単糖類である、（１）〜（８）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（１０）本発明はまた、前記単糖類がグルコースである、（９）に記載の製造法を提供する。
（１１）本発明はまた、糖類の濃度が、菌体量基準で、０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである、（１）〜（１０）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
（１２）本発明はさらに、前記ステップ（i）が、嫌気性、無酸素又は微好気性条件下で行われる、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の製造法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、糖類を唯一の炭素源として、3HBと3H4MVとをモノマー単位とするPHA共重合体であって、ランダム性が高くかつ3H4MVの組成比の高い共重合体を効率よくかつ安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、クロストリジウム・ディフィシルによる、ロイシンから4M2PE-CoAまでのロイシン代謝経路（点線で囲んだ経路）を示す。併せて、4M2PE-CoAからP(3HB-co-3H4MV)までの経路を示す。
【図２】図２は、アエロモナス・キャビエ由来のPHA重合酵素変異遺伝子を挿入したプラスミドpBBR1phaPCJAcABRe（D4N，NSDG）を示す。
【図３】図３は、クロストリジウム・ディフィシル由来のロイシン代謝酵素遺伝子を挿入したプラスミドpTTQ1dhAhadAIBCCdを示す。
【図４】図４は、各種大腸菌におけるクロストリジウム・ディフィシル由来のロイシン代謝酵素遺伝子の発現を示すSDS-PAGEである。各レーンは以下のとおりである。M: マーカー；レーン1: E.coli JM109/pTTQ19 可溶性画分；レーン2: E.coli JM109/pTTQ19 不溶性画分；レーン3: E.coli JM109/pTTQldhAhadAIBCCd 可溶性画分；レーン4: E.coli JM109/pTTQldhAhadAIBCCd 不溶性画分；レーン5: E.coli BL21 (DE3)/pTTQ19 可溶性画分；レーン6: E.coli BL21 (DE3)/pTTQ19 不溶性画分；レーン7: E.coli BL21 (DE3)/pTTQldhAhadAIBCCd 可溶性画分；レーン8: E.coli BL21 (DE3)/pTTQldhAhadAIBCCd 不溶性画分；レーン9: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQ19 可溶性画分；レーン10: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQ19 不溶性画分；レーン11: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQldhAhadAIBCCd 可溶性画分；レーン12: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQldhAhadAIBCCd 不溶性画分。
【図５】図５は、実施例２で得られたP(3HB-co-3H4MV)の13C NMRスペクトルを示す。
【図６】図６は、レアコドン対応tRNAの補強による大腸菌NS1391でのクロストリジウム・ディフィシル由来のロイシン代謝酵素遺伝子の発現を示すSDS-PAGEである。各レーンは以下のとおりである。M: マーカー；レーン1: E.coli NS1391 + tRNA/pTTQ19 可溶性画分；レーン2: E.coli NS1391 + tRNA/pTTQ19 不溶性画分；レーン3: E.coli NS1391 + tRNA/pTTQldhAhadAIBCCd 可溶性画分；レーン4: E.coli NS1391 + tRNA/pTTQldhAhadAIBCCd 不溶性画分；レーン5: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQ19 可溶性画分；レーン6: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQ19 不溶性画分；レーン7: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQldhAhadAIBCCd 可溶性画分；レーン8: E.coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQldhAhadAIBCCd 不溶性画分。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
クロストリジウム属微生物、特に偏性嫌気性グラム陽性細菌クロストリジウム・ディフィシルは、ロイシン代謝の過程で3H4MVの前駆体脂肪酸である4-メチル-2-ペンテン酸（4M2PE）の補酵素A（CoA）付加体（4M2PE-CoA）を生成する（Kim J, Darley D, Selmer T, Buckel W. (2006), Appl. Environ. Microbiol. 72: 6062-6069）（図１参照）。ロイシン代謝は、具体的には、３段階の反応、すなわち、（i）(R)-2-ヒドロキシイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ（LdhA）による、ロイシンの代謝物であるα-ケトイソカプロエートからロイシン酸への変換、（ii）2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAトランスフェラーゼ（HadA）による、ロイシン酸からロイシン酸CoAへの変換、並びに（iii）アクチベーター（HadI）及び2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ（HadBC）による、ロイシン酸CoAから4M2PE-CoAへの変換反応を経る。この4M2PE-CoAを、R体特異的エノイルCoAヒドラターゼ（PhaJ）で水和すると、3H4MV-CoAが生成する。PhaC1Ps等のPHA重合酵素でこの3H4MV-CoAと別経路で供給される3HB-CoAとを重合すると、P(3HB-co-3H4MV)：
【００１５】
【化１】
2015000033.tif 000002
【００１６】
（式中、ｎは繰り返し数であり、１〜20,000の整数を示す）
が生合成できる。
【００１７】
したがって、本発明の製造法は、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターに、PHA重合酵素遺伝子群、クロストリジウム属由来のロイシン代謝酵素遺伝子群、公知のモノマー供給遺伝子等を挿入して得られるプラスミドで、宿主を形質転換することを特徴とする。
【００１８】
本発明で使用されるPHA重合酵素遺伝子群によってコードされるPHA重合酵素は、好ましくは、アエロモナス・キャビエ由来のPHA結合タンパク質（フェイシン）に１以上のアミノ酸置換を有する変異型PHA結合タンパク質であり、より好ましくは、PhaPの４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、PhaCの１４９番目のアスパラギンがセリンに、及び／又はPhaCの１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されてなるアミノ酸配列を有する変異型PHA結合タンパク質であり、さらに好ましくは、これらの３つのアミノ酸置換すべてを含む変異型PHA結合タンパク質である。
以下、PhaPの４番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されてなる変異体を「PhaPAc D4N」、PhaCの１４９番目のアスパラギンがセリンに、及びPhaCの１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換されてなる二重変異体を「PhaCAc NSDG」と表記することがある。
PhaPAc D4Nの製造法は、例えば、特開２０１３−４２６９７号に開示され、PhaCAc NSDGの製造法は、例えば、Tsuge T, et al., FEMS Microbial Lett 277 (2007) 217-222に詳述されている。
【００１９】
ロイシン代謝酵素遺伝子は、クロストリジウム属微生物、特にクロストリジウム・ディフィシル由来のゲノムDNAであり、LdhA及びHadAIBCをコードする遺伝子である。ロイシン代謝酵素遺伝子が挿入されたプラスミドは、該ゲノムDNAを鋳型に、目的遺伝子（ldhA、hadA、hadI、hadB、hadC）をPCRにより増幅し、増幅した遺伝子を、宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターにクローニングすることによって構築できる。
【００２０】
増幅した遺伝子の上流にはプロモーター、下流にはターミネーターを連結することが好ましい。プロモーターとしては、宿主において機能するものであれば特に制限されず、例えば、ラクトースオペロンプロモーター、λファージプロモーター、アエロモナス・キャビエ由来のPHAオペロンプロモーター、C. ネクタ（necator）由来のPHAオペロンプロモーター等を使用することができる。また、ターミネーターとしては、宿主微生物において機能するものであれば特に制限されず、例えば、rrnターミネーター、アエロモナス・キャビエのPHAオペロンターミネーター、C. ネクタ由来のPHAオペロンターミネーター等を使用することができる。
【００２１】
公知のモノマー供給遺伝子としては、例えば、ラルストニア・ユートロファ由来のphbA、phbB、phaB、phbB（Peoples, O.P. and Sinskey, A.J., J. Biol. Chem. 264: 15293-15297 (1989)）、アエロモナス・キャビエ由来のphaJ（Fukui, T. and Doi, Y., J. Bacteriol. 179: 4821-4830 (1997)）等が挙げられる。
【００２２】
宿主中で目的の遺伝子を発現するための広宿主域ベクターとしては、例えば、大腸菌中で自立増殖可能なpBBR1MCS-2、pJRD215、pLA2917等が挙げられる。
【００２３】
本製造法においては、炭素源としての糖類に加えて、3H4MVの前駆体であるロイシンをさらに添加してもよい。ロイシンの添加濃度は、菌体量基準で、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌであることが好ましく、約０．１ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌがより好ましい。なお、ロイシンを過剰に添加しても、フィードバック阻害により糖類からロイシンへの生合成経路が阻害される可能性があるため、好ましくない。
【００２４】
本製造法で使用される宿主微生物は、糖類を炭素源として使用した場合の増殖性が良好で、菌株の安定性が高く、菌体と培養液との分離が比較的容易なものであれば特に制限されないが、例えば、エシュリキア（Escherichia）属、カプリアヴィドゥス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia)属、又はビブリオ（Vibrio）属の微生物が好ましい。より好ましくは、エシュリキア（Escherichia）属である。
【００２５】
しかしながら、一般に、微生物によっては、複数のコドンの間で使用する頻度に偏りが見られ、そのため、使用頻度の低いコドン（レアコドン）に対応するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の量が少なく、レアコドンを含む塩基配列によってコードされるアミノ酸を発現させる場合に、発現効率が低下することが知られている。したがって、発現遺伝子のコドン変換、レアコドンに対応するｔＲＮＡの量を増大させる等のレアコドンに対する補強により効率よくタンパク質を製造することができる。
【００２６】
本発明においてP(3HB-co-3H4MV)の生産性を上げるためには、コドンを宿主での発現に適したものに変換してもよく、あるいはレアコドンに対して補強をしてなる宿主を用いてもよい。具体的には、発現遺伝子のコドン改変を含む方法が挙げられ、PHA合成酵素のアミノ酸配列の一部又は全てを該合成酵素発現の至適のコドン状態に変換したもの、又はそれに準じる状態の宿主を用いて発現させることができる。前記至適のコドン状態又はそれに準じる状態の宿主としては、例えば、特定のコドンを認識するｔＲＮＡ量を遺伝子工学的に通常この宿主細胞中で産生する量よりも数倍以上高めた宿主が例示される。該宿主としては、大腸菌が例示され、例えばアルギニンのコドン（AGA、AGG）のｔＲＮＡを補充した大腸菌、イソロイシン（AUA）、プロリン（CCC）、ロイシン（CUA）のｔＲＮＡを補充した大腸菌等が挙げられる。このように、発現遺伝子のコドン変換、補強等によって、本来PHAを生産できない大腸菌等の宿主を利用することができる。
【００２７】
糖類としては、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、アラビノース、サッカロース、マルトース、でんぷん、でんぷん加水分解物等が挙げられる。これら中で、グルコース、フルクトース、ガクトース、キシロース、アラビノース等の単糖類が好ましく、グルコースがより好ましい。糖類の添加量は、菌体量基準で、約０．１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌであり、好ましくは約０．１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌであり、より好ましくは約０．１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌである。
【００２８】
前述のとおり、4-メチル-2-ペンテン酸（4M2PE）CoAは、α-ケトイソカプロエートから３段階の反応を経て生合成されるが、最終段階で作用する酵素HadIは、酸素感受性がきわめて強いことが報告されている（Kim J, Darley D, Buckel W. (2004), FEBS Journal. 272: 550-561）。また、実際に、本発明者らが好気条件下での培養を種々検討したところ、培養系に3H4MVの前駆体であるロイシンを適量添加しても、3H4MVをモノマー単位として含む共重合体がまったく生産されないか、あるいは、3H4MVの組成比の低いPHA共重合体しか生産されなかった。したがって、好気性条件下での培養は、導入した酸素の活性が維持されることから好ましくない。
よって、本製造法においては、嫌気性、無酸素、又は微好気性条件下で培養を行うことが好ましい。ここで、微好気性条件は、例えば、培地量２５０ｍＬに対して培養容器を９０ｒｐｍの速度で振盪して、培養容器への空気の取り込みを抑えることによって達成される。このような微好気性条件は、酸素と二酸化炭素等（と窒素）との割合に換算すると、例えば、５〜２０％Ｎ２と８０〜９５％空気、又は１００％Ｎ２、又は５〜１０％Ｏ２と９０〜９５％Ｎ２からなるものであることが好ましい。
なお、好気性条件は、例えば、培地量１００ｍＬに対して培養容器を１３０ｒｐｍの速度で振盪して、培養容器への空気の取り込みを促進することによって得られる。
【００２９】
培養温度は、宿主微生物の生育可能な温度、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜４０℃、更により好ましくは２８〜３４℃である。培養時間は、特に限定されないが、例えば、２４時間〜４８時間程度が好ましい。一方、４８時間を超えて培養を継続しても、菌体量の増殖や3H4MVの合成量の増加がほとんど認められない。
【００３０】
培養培地は、本発明の宿主が利用できるものである限り特に限定されない。炭素源に加えて、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸水素マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類などが挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質（アンピシリン、カナマイシン等）を添加してもよい。
【００３１】
本発明のPHA共重合体の菌体からの回収は、例えば、次の方法によって行うことができる。培養終了後、遠心分離器等で培養液から菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄した後、乾燥させた後、この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶媒を用いて共重合体を抽出する。次いで、この共重合体を含む有機溶媒溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノール、へキサン等の貧溶媒を加えて共重合体を沈殿させる。沈殿した共重合体から、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させ、共重合体を回収することができる。得られた共重合体の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法等により行うことができる。
【００３２】
本発明の製造法によって得られたP(3HB-co-3H4MV)は、高い柔軟性を有することが予想され、フィルム、シート等の成形体への応用が期待できる。
【実施例】
【００３３】
(1) 材料
・使用菌体
Escherichia coli BL21 codonplus (DE3)-RIL（アジレントテクノロジー）
E. coli JM109（タカラバイオ）
E. coli BL21（DE3)（タカラバイオ）
E. coli TOP10（ニッポンジーン）
E. coli NS1391（味の素より譲渡）
・ゲノムDNA
C. difficile 630株由来ゲノムDNA（ATCC寄託番号第BAA-1382D号）
・プラスミド
発現ベクターpBBR1 MCS-2（Kovach et. al, 1995,Gene, 166, 175-176）
発現ベクターpTTQ19（遺伝研）
・培地
LB培地：Bacto trypton 10 g、酵母エキス ５g、NaCl 10 gを脱イオン水１Lに溶かして、121℃で20分間オートクレーブして調製した。
M9培地：（KH2PO4 3.0 g、Na2HPO4・12H2O 17.1 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 0.5 gを脱イオン水１Lに溶かして、121℃で20分間オートクレーブした後、1M MgSO4 0.2 mL、1M CaCl2 0.01 mL、微量金属塩溶液0.5 mLを加えて調製した。
培養時には，必要に応じてクロラムフェニコール（終濃度30 μg/mL）、カナマイシン（終濃度50 μg/mL）、カルベニシリン（終濃度50 μg/mL）、及びIPTG（終濃度1 mM）を添加した。寒天培地として使用する際には，1.5 %となるように寒天を添加して使用した。
【００３４】
(2) C. difficile由来ロイシン代謝遺伝子のクローニング
C. difficile 630由来のゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ）を用い、SD配列を含む目的遺伝子（ldhA、hadA、hadI、hadB、hadC）をPCRにより増幅した。クローニングに用いたプライマー配列は以下のとおりである（下線部はオーバーラップ領域を示す）。
if_pTTQ_LA_F：5’ AAAATACTAATTTACTCTATTAGTAGCAG 3’（配列番号１）
if_pTTQ_LA_R：5’ CTCTAGAGGATCCCCTACAGGAGGGTATTGATATG 3’（配列番号２）
if_LA_HAI_F：5’ CTCTTTTTATATATTTTTCACTTC 3’（配列番号３）
if_LA_HAI_R：5’ GTAAATTAGTATTTTATTAAGGAGGAAAACGTTATG 3’（配列番号４）
if_HI_HBC_pTTQ_F：5’ TCGAGCTCGGTACCCATGAACTTACGCTAAACTCA 3’（配列番号５）
if_HI_HBC_pTTQ_R：5’ AATATATAAAAAGAGGGATGAAAATGTCTGAAA 3’（配列番号６）
PCR反応液25 μLの組成は、5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）（5 μL）、dNTP mix（各2.5 mM）、フォワードプライマー（1 μL)、リバースプライマー（1 μL）、C. difficile 630 由来ゲノムDNA（10 μL)、超純水（5.5 μL)、及びPrimeSTAR HS DNA Polymerase（0.5 μL）である。また、PCR反応は、ldhA断片については、98℃で2分を1サイクル、98℃で10秒、58℃で5秒、72℃で1分を各々30サイクル、72℃で5分を1サイクル行い、hadA-I断片については、98℃で2分を1サイクル、98℃で10秒、58℃で5秒、72℃で2.3分を各々30サイクル、72℃で5分を1サイクル行い、hadB-C断片については、98℃で2分を1サイクル、98℃で10秒、58℃で5秒、72℃で2分を各々30サイクル、72℃で5分を1サイクル行った。
【００３５】
増幅したldhA断片、hadA-I断片、及びhadB-C断片は、Gel/PCR Extraction Kit（ニッポンジーン）を用いて精製した後、GENEART Seamless Cloning and Assembly Kit（インビトロジェン）を用いて、該断片とSmaI切断pTTQ19とを混合して（PCR断片: SmaI切断pTTQ19 = モル比2:1, 5×Enzyme buffer 4 μL, オートクレーブ水 適量、18 μLの反応液を得た。この反応液に、10×Enzyme mix 2 μLを加え、軽く撹拌し、室温で30分反応させた後、反応液を氷上に移し、反応液7 μLをキット付属のE. coli oneshot Top10 コンピテントセル（ニッポンジーン）に添加した。氷上で30分静置後、42℃で30秒加温した後、氷上に戻し2分静置した。付属SOC培地を250 μL添加し、37℃で1時間振とう培養し、アンピシリン添加LB平板培地に適量を塗布し、37℃で一晩静置培養した。平板培地上で増殖したコロニーからプラスミドを抽出し、シーケンスにより確認した。構築されたプラスミドをpTTQldhAhadAIBCCdと名付けた。
【００３６】
実施例１  C. difficile由来ロイシン代謝酵素群の異種発現と酵素活性測定
(1) 粗酵素溶液の調製
pTTQldhAhadAIBCCdで形質転換した各種大腸菌（JM109、E. coli BL21 (DE3)、及びE. coli BL21 codonplus (DE3)-RIL）を、1.7 mL LB培地 + 抗生物質で37℃、2〜16時間振とう培養し、前培養液とした。得られた前培養液を、500 mL坂口フラスコに入れた抗生物質を添加したLB培地100 mLで30℃、24時間、130 rpmの振とう条件で培養した。この際、培養開始時に終濃度0.1 mMイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加した。菌体は培養後に遠心分離により回収し、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液又は50 mM KPi（pH 7.0）緩衝液で1回洗浄した後、液体を完全に取り除いた状態で-80℃にて凍結し、保存した。この凍結菌体を50 mM Tris-HCl（pH 8.0）緩衝液又は50 mM KPi（pH 7.0）緩衝液に再懸濁し、超音波破砕機（ULTRASONIC DISRUPTOR UD-201, TOMY）で破砕し、12,000 ×g、25 分、4℃で遠心して得られた上清を可溶性画分、残った沈殿を超純水に再懸濁したものを不溶性画分とした。
【００３７】
図４に、各組換え大腸菌の破砕液の可溶性及び不溶性画分のSDS-PAGEの結果を示す。レーン1から4はE. coli JM109、レーン5から8はE. coli BL21 (DE3)、レーン9から12はE. coli BL21 codonplus (DE3)-RILをそれぞれ宿主として培養した結果であるが、そのうちレーン11、12のE. coli BL21 codonplus (DE3)-RIL/pTTQldhAhadAIBCCdの可溶性および不溶性画分には、LdhA（37 kDa）、HadA（43 kDa）、HadI（30 kDa）、HadB（42 kDa）、HadC（47 kDa）に対応するバンドが見られた。C. difficileとE. coliでは、コドンの使用頻度が著しく異なっているため、レアコドン対応tRNA遺伝子（argU、ileY、leuW）がプラスミドで補強されている、E. coli BL21 codonplus (DE3)-RILでは各酵素の発現が明瞭に確認できた。この結果を受けて、本実験では、以降PHA生合成の宿主としてE. coli BL21 codonplus (DE3)-RILを用いた。本株以外の大腸菌を宿主とする際に、E. coli BL21 codonplus (DE3)-RILより抽出したレアコドン対応tRNAをコードしたプラスミドで形質転換してから使用した。
【００３８】
(2) SDS-PAGEによるタンパク質発現確認
上で得られた可溶性画分、及び不溶性画分のタンパク濃度の定量には，Quant-iT（登録商標）Protein Assay Kits（インビトロジェン）を用いた。ポリアクリルアミドゲルの組成は、以下のとおりである。分離ゲル：40 %アクリルアミド・ビス混合溶液（19:1）1485 μL, 1.5 M Tris-HCl + 0.4 % SDS溶液（pH 8.8）1500 μL, 10 % ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液 60 μL, N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン 3.6 μL, 超純水 2955 μL；濃縮ゲル：40 %アクリルアミド・ビス混合溶液（19:1）150 μL, 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8） 500 μL, 10 % ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液 20 μL, N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン 2 μL, 超純水 1330 μL。これらのゲルを用いて可溶性画分及び不溶性画分中のタンパク質を分離した。可溶性画分及び不溶性画分サンプルは、サンプルバッファー（ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 60 g, グリセロール 240 g, 1M Tris-HCl (pH 6.8) 300 mL, ブロモフェノールブルー1.5 g, 2-メルカプトエタノール 120 mL）と2: 1で混合した後、96℃、10分加熱処理し、室温に冷却した後、適当量のポリアクリルアミドゲルのウェルにそれぞれアプライした。電気泳動はPOWER PAC 300（バイオラッド）で、20 mAの一定電流の下で行った。緩衝液にはグリシン緩衝液（グリシン 7.207 g/L, Tris 1.514 g/L, SDS 0.5 g/L）を使用した。泳動後のゲルはRapid Gel染色液（関東化学）で染色した。分子量マーカーとして、Precision Plus Protein（登録商標） Standards（バイオラッド）を用いた。
【００３９】
(3) 各酵素活性測定
各酵素（LdhA、HadA、HadBC、及びHadI）の活性測定の反応系は、文献（Kim J, Darley D, Selmer T, Buckel W. (2006), Appl. Environ. Microbiol. 72: 6062-6069；Kim J, Darley D, Buckel W. (2004), FEBS Journal. 272: 550-561）に示したとおりである。いずれの反応も30℃で行い、各反応における吸光度の変化は、Pharma Spec UV-1700 UV-VIS SPECTROPHOTOMETER（島津製作所）によって測定した。
LdhAの活性は、波長340 nmにおけるNADHの減少から算出した。反応には、トータルタンパク質50 μgを含む粗酵素液を使用した。HadAの活性は、波長260 nmにおける4M2PE-CoAの増加から算出した。反応には、トータルタンパク質50 μgを含む粗酵素液を使用した。HadBC及びHadIの活性は、波長290 nmにおける4M2PE-CoAの増加から算出した。反応には、トータルタンパク質200 μgを含む粗酵素液を使用した。いずれの反応でも、1分間に1 μmolの基質を消費するのに必要な酵素量を1 Unitとした。
【００４０】
前記の好気条件で培養した組換え株で作製した粗酵素液を用いて、各反応段階で働く酵素の比活性を算出したところ、LdhAでは、空ベクターpTTQ19で形質転換した組換え株の比活性は0.07±0.02 U/mgであったのに対し、LdhAをコードしたプラスミドpTTQldhAhadAIBCCdで形質転換した組換え株の比活性は1.59±0.07 U/mgと高い値を示した。HadAでも、pTTQ19で形質転換した組換え株の比活性は0.01±0.01 U/mgであったのに対し、プラスミドpTTQldhAhadAIBCCdで形質転換した組換え株の比活性は0.20±0.01 U/mgと活性が確認された。一方、4M2PEを合成する最後の段階を触媒するHadIBCの活性については、プラスミドpTTQldhAhadAIBCCdで形質転換した組換え株においても確認できなかった。したがって、好気条件下での培養は、導入した酵素の活性が維持されることから適さないことが分かった。
【００４１】
実施例２  組換え大腸菌を用いたロイシンを前駆体としたPHA生合成
(1) PHA生合成
PHA合成宿主としてE. coli BL21 codonplus (DE3)-RILを選択し、これを井上法（Inoue et al., 1990, Gene, 96, 23-28）にてコンピテントセル化した後、pBBR1phaPCJAcABRe (D4N, NSDG)、及びpTTQldhAhadAIBCCdで形質転換した（以下、BL/PCJAB_Cd）。一方、pBBR1phaPCJAcABRe (D4N, NSDG)のみで形質転換して得られた組換え体を「BL/PCJAB」と言う。得られた組換え体を20 mL LB + 抗生物質で、37℃で、12〜16時間前培養した。この前培養液1 mL又は2.5 mLを100 mL又は250 mLのM9培地に植菌した。M9培地には炭素源として20 g/Lグルコース及び0、1、3 g/L ロイシン、終濃度0.1 mM IPTGと各種抗生物質を添加した。IPTGは培養開始時に添加した。培養は30℃、72時間行い、培地100 mLのものは130 rpm（好気培養)、培地250 mLのものは90 rpm（微好気培養）でそれぞれ振とうした。培養後の菌体は5960 ×g、4℃、10 分の遠心分離によって回収し、約20 mLの純水に再懸濁した。これを再度同条件で遠心し、得られた菌体ペレットを数mLの純水に再懸濁して-20℃で凍結した後72時間減圧乾燥して乾燥菌体を得た。また、培養上清中のロイシン濃度の定量のため、培養液を遠心して得られた上清を採取し、-20℃で凍結保存した。
【００４２】
また、ロイシン生産量の増加を目的に、好気から微好気へと培養条件を変化させる2段階培養も行った。前述の方法で得られた前培養液2.5 mLを、250 mLのM9培地に植菌した。M9培地には炭素源として20 g/L グルコースと各種抗生物質を添加した。まず30℃、130 rpmで振とう培養を行い、6又は12時間経過後に終濃度0.1 mMになるように IPTGを添加して、振とう速度を90 rpmに変更した。振とう速度を変更後72時間培養し、菌体を遠心分離して回収した。以降の操作は前述の通りである。
【００４３】
(2) 培養上清中のロイシン濃度の定量
ロイシンはそのままではUV吸収がなく、UV検出器を用いたHPLCでの分析は困難である。そのため、アミノ酸誘導体化剤フェニルイソチオシアネート（PITC，東京化成）を用い、培養上清中のアミノ酸を波長254 nmの吸収がある誘導体に変換した。
凍結保存しておいた培養上清各200 μL及び標品として1.5、1.0、0.5、0.25 g/L L-ロイシン、1.0 g/L L-バリン、1.0 g/L L-イソロイシン（いずれも関東化学）各200 μLをガラスバイアルに入れ、一晩減圧乾燥した。乾燥済みサンプルに、エタノール: 超純水: トリエチルアミン= 2: 2: 1になるように混合した溶液 40 μLを添加し、再び減圧乾燥した。続いて、このサンプルに、エタノール: 超純水: トリエチルアミン: PITCを7: 1: 1: 1になるように混合した溶液 100 μLを添加し、20分間室温で反応させた後に再び減圧乾燥した。試薬が減圧乾燥により除去されたのを確認後、後述の移動相Aを2 mL添加し、0.45 μmセルロースアセテートフィルタ（ミリポア）でろ過したものをサンプルとした。初めに標品のL-ロイシン、L-バリン、L-イソロイシンがそれぞれ分離するようなグラジエントプログラムを作成した。3種類の分岐アミノ酸の分離を確認する際には、1.0 g/Lアミノ酸溶液200 μLずつを混合したものを用いた。分離条件が定まったのち、各濃度のL-ロイシン溶液で検量線を作成した。この検量線を元に培養上清中のロイシン濃度を算出した。
＜装置＞
HPLCシステム: SCL-10Aシステム（島津製作所）；分離カラム: ShodexシリカC18M 4Eカラム 250×4.6 mm（昭和電工）；検出器: SPD-M10A。
＜測定条件＞
移動相A: 5 % CH3CN含有0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液（pH 6.5）；移動相B: 60 % CH3CN水溶液；流速: 1.0 mL/分；検出波長: 254 nm。
【００４４】
(3) 酸素移動容量係数の算出
培養フラスコの振とう速度及び培地容量と、培養系中の酸素取り込み能の関連を評価すべく、亜硫酸ソーダ法による酸素移動容量係数（kLa）の算出を行った。今回は，培地量100 mL/振とう速度 130 rpmの好気培養と、培地量250 mL/振とう速度90 rpmの微好気培養の2条件におけるkLaを算出した。
500 mL坂口フラスコに、90 mL milliQ/10 mL 2N 亜硫酸ナトリウム/100 μL 0.1 N 硫酸銅(II)（好気）、又は225 mL milliQ/25 mL 2N 亜硫酸ナトリウム/250 μL 0.1 N 硫酸銅(II)（微好気）を入れ、30℃、130 rpm（好気）又は90 rpm（微好気）で振とうした。適当な間隔で10 mLサンプリングした亜硫酸ナトリウム/硫酸銅水溶液を、25 mL 0.1 Nヨウ素ヨウ化カリウムと混合したのち、0.1 N チオ硫酸ナトリウムで滴定し、滴定に必要なチオ硫酸ナトリウムの量からサンプル中の酸素濃度を算出した。振とう時間と酸素濃度の傾きとから、各培養条件におけるkLaを算出した。
【００４５】
(4) 乾燥菌体からのポリマー抽出
乾燥菌体をガラス瓶に入れ、菌体内PHA 1 mgに対して0.5 mLのクロロホルムを加えた後、スターラーで3日間撹拌した。このクロロホルム溶液をFilter paper No. 1 (アドバンテック)でろ過し、PHA溶液と菌体残渣をろ別した。PHA溶液はロータリーエバポレーターで濃縮し、体積比20倍のメタノールに滴下してPHAを析出させた。数時間PHA/メタノール溶液を撹拌した後、Filter paper No. 5B（アドバンテック）でろ過し、乾燥させたものを精製PHAとした（1回精製）。また、この1回精製後のPHAを再度クロロホルムに溶解し、ヘキサンに滴下して析出、乾燥させたものを2回精製し、2回精製後のPHAを再びクロロホルムに溶解し、メタノールに滴下して析出、乾燥させたものを3回精製として以降の分析に使用した。
【００４６】
(5) PHA分析
(5-1) ガスクロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィー/質量分析計（GC及びGC-MS）
乾燥菌体に含まれるPHAを加水分解、及びメチルエステル化することによりサンプルとし、菌体内PHA含有率及びモノマー組成をGCにより決定した。乾燥菌体を耐圧試験管に30 mg秤量し、硫酸メタノール（硫酸/メタノール= 15 vol%/85 vol%）2 mL及びクロロホルム2 mLを加えて密栓した。これを100℃、140分間ヒートブロックにて加熱し、メチルエステル化を行った。加熱中、30分間毎に耐圧試験管を撹拌した。その後、室温になるまで自然冷却し、純水1 mLを加えて激しく撹拌した。静置後、クロロホルム層をパスツールピペットにて回収し、0.45 μm Minisart RC4フィルター（ザルトリウス）にてろ過した。ろ液500 μLに、内部標準物質（0.1 vol%オクタン酸メチル/99.9 vol%クロロホルム）500 μLを加え、混合したものをサンプルとした。GC-MS分析の際には、内部標準物質の添加は行わず、サンプルのみを分析に使用した。GC及びGC-MS分析にはサンプル1 μLを使用した。
＜装置＞
GC装置
ガスクロマトグラフ: GC14B（島津製作所）；キャピラリーカラム: NEUTRA-BOND-1（内径 0.25 mm×30 m，膜厚 0.4 μm）（GLサイエンス）；検出器: 水素炎イオン化検出器（FID）（島津製作所）
GC-MS装置
ガスクロマトグラフ: GC-2010（島津製作所）；ガスクロマトグラフ質量分析計: GCMC-QC2010（島津製作所）；カラム: Inert Cap 1（GLサイエンス）；検出器: 質量分析計（MS）；イオン化源: 電子衝撃イオン化法（EI）
＜測定条件＞
GC測定条件：ディテクター温度: 280℃；インジェクター温度: 280℃；カラム初期温度: 100℃；初期温度保持時間: 0 分；カラム最終温度: 280℃；最終温度保持時間: 5 分；昇温速度: 8℃/分
GC-MS測定条件：
GC   試料気化室: 280℃；カラム初期温度: 100℃；カラム最終温度: 280℃；カラム昇温速度: 8℃/分
MS  イオン源温度: 230℃；インターフェース温度: 150℃；溶媒溶出時間: 1.7 分
【００４７】
(5-2) ゲルろ過クロマトグラフィー（GPC）
得られたPHAの平均分子量及び分子量分布は、SCL-10A VP（島津製作所）（移動相: クロロホルム；流速: 0.8 mL/分；カラムオーブン温度: 40℃；サンプル注入量: 50 μL）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより決定した。標準物質として分子量既知のポリスチレンを用い、ポリスチレン換算で各値を算出した。用いたポリスチレンの分子量は、それぞれ1,260、3,790、13,000、52,200、219,000、723,000、2,330,000、7,450,000である。また、PHAサンプルとしては1回精製後のものを使用した。1回精製後のPHA 2 mgを量り取り、1 mLのクロロホルムに溶解して一晩放置し、PHAを溶解した。この溶液を0.45 μm Millex-FH PVDF（ミリポア）フィルターでろ過したものをサンプルとした。
(5-3) 核磁気共鳴分光法 (NMR)
得られたPHAの構造を1H NMR及び13C NMRを用いて解析した。測定には、JEOL LA500 spectrometer（日本電子株式会社）を使用した。
【００４８】
結果を表１に示す。まず、好気培養及び微好気培養における酸素移動容量係数 (kLa)は、それぞれ204 h-1及び49 h-1であった。C. difficile由来ロイシン代謝遺伝子群の導入がないBL/PCJAB株においては、好気、微好気、又はロイシン添加濃度に関わらず、蓄積したPHAから3H4MV成分が検出されることはなかった。C. difficile由来ロイシン代謝遺伝子群を導入したBL/PCJAB_Cd株の好気培養では、ロイシン添加濃度3 g/Lの際にごくわずか（0.6 mol%）の3H4MV成分が検出された以外は、該成分は検出されなかった。このことは、前項の活性測定の結果、好気培養ではHadIBCの活性が見られなかったことに対応した結果である。微好気培養では、ロイシン添加なしでも0.7 mol%の3H4MV成分が検出され、添加量を1 g/Lに増やすと3H4MV成分が12.2 mol%と飛躍的に増加した。ただし、ロイシン添加量を3 g/Lに増やしても、3H4MV分率は14.0 mol%とほぼ横ばいであり、ロイシンの添加量を1 g/Lより増やしても、3H4MV分率増加にはつながらないことが分かり、ロイシンから3H4MVの変換効率はロイシン添加1 g/Lの方が良好なことが分かった。
【００４９】
【表１】
2015000033.tif 000003
【００５０】
(6) 3H4MV共重合体合成のタイムコース
前項の結果を踏まえ、ロイシン添加1 g/Lの際の培養時間の経過に伴うロイシン消費と3H4MV生産量の相関を調べた。菌体増殖は培養開始24〜48時間で最も盛んであり、48時間以降はほぼ横ばいであった。3H4MVの合成も同様で、培養開始24〜48時間での合成量が最も多く、次いで48〜72時間の合成量が多かった。菌体増殖とは異なり、48時間以降も3H4MV合成は行われ、最終的に培養開始72時間の時点で26 mg/Lの3H4MVが合成される結果となった。培地に添加したロイシンは、培養開始時の添加量1 g/Lから徐々に減少していき、24〜48時間で最も減少幅が多かった。48〜72時間ではロイシン消費は緩やかであった。
【００５１】
(7) 3H4MV共重合体のキャラクタリゼーション
ロイシン1 g/L添加時に得られたP(3HB-co-12.2 mol% 3H4MV)を用いて、キャラクタリゼーションを行った。
初めに、1回精製後の3H4MV共重合体をGPCで分析した結果、数平均分子量（Mn）は20万、重量平均分子量（Mw）は95万であり、多分散度は4.7であることが分かった。続いて、GC-MS分析の結果は、m/z=103のクロマトグラムを示したことから、得られた共重合体は3HB及び3H4MVの2成分からなる二元共重合体であることが分かった。
3回精製後の3H4MV共重合体をNMR（JEOL LA500 spectrometer（日本電子株式会社））で分析した。1H NMR （500 MHz, CDCl3, ppm)：δ 5.30-5.20 (3HBのメチン)、5.16-5.08 (3H4MVの主鎖のメチン)、2.67-2.44 (3HB及び3H4MVのメチレン)、1.96-1.88 (3H4MVの側鎖のメチン)、1.30-1.24 (3HBのメチル)、0.92-0.88 (3H4MVのメチル)； 13C NMR（125 MHz, CDCl3, ppm）：δ 169.8 (3H4MVのカルボニル)、169.1 (3HBのカルボニル)、74.7 (3H4MVの主鎖のメチン)、67.6 (3HBのメチン)、40.8 (3HBのメチレン)、36.6 (3H4MVのメチレン)、31.3 (3H4MVの側鎖のメチン)、19.7 (3HBのメチル)、18.1-17.4 (3H4MVのメチル)。
加えて、13C NMRスペクトル（169-170 ppmまでの拡大部分を含む）13C NMRスペクトル（169-170ppmまでの拡大部分を含む）を図５に示す。各シグナルの面積比から、以下の式に基づき、共重合体のランダム性を示すD値を算出した。
【００５２】
【数１】
2015000033.tif 000004
【００５３】
その結果、D値= 1.5となり、1に近い値となったことから、本共重合体はランダム性が高いということが示唆された。
【００５４】
実施例３  組換え大腸菌を用いた糖質を炭素源としたPHA生合成
実施例１と同様にして、レアコドン対応tRNAの補強による大腸菌NS1391でのクロストリジウム・ディフィシル由来のロイシン代謝酵素遺伝子の発現を確認した（図６）。
【００５５】
次に、組換え大腸菌NS1391/pBBR1phaPCJAcABRe (D4N, NSDG)（以下、「NS/PCJAB」）、及びNS1391/pBBR1phaPCJAcABRe (D4N, NSDG) + pTTQldhAhadAIBCCd（以下、「NS/PCJAB_Cd」）を、グルコース20 g/Lで好気又は微好気性条件下で培養した。
培養は、好気条件（好気）、微好気条件（微好気）、好気で6時間培養後にIPTGを添加し微好気で72時間培養（2段階6時間）、好気で12時間培養後にIPTGを添加し微好気で72時間培養（2段階12時間）、の4種類を検討した。C. difficile由来ロイシン代謝遺伝子群の導入がないNS/PCJAB株においては、培養条件によらず3H4MV成分は検出されなかった。C. difficile由来ロイシン代謝遺伝子群を導入したNS/PCJAB_Cd株では、好気と2段階12時間では3H4MV成分は検出されなかったものの、微好気及び2段階6時間では，約3 mol%の3H4MV成分が検出された。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2015000033.tif 000005
【００５７】
以上より、大腸菌を宿主とした糖質単一培養において、3H4MV成分を含むPHA共重合体を生合成することに初めて成功した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の製造法によって、糖類を唯一の炭素源として、大腸菌等から3HBと3H4MVとをモノマー単位とするPHA共重合体であって、ランダム性が高くかつ3H4MVの組成比の高い共重合体が効率よくかつ安価に得られる。得られたPHA共重合体は、フィルム、シート等への利用が期待できる。
【図１】
2015000033.tif 000006
【図２】
2015000033.tif 000007
【図３】
2015000033.tif 000008
【図５】
2015000033.tif 000009
【図４】
2015000033.tif 000010
【図６】
2015000033.tif 000011
【配列表】
2015000033000001.app