(57)【要約】【課    題】安全性の点で問題のないヒアルロン酸産生促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合したヒアルロン酸産生促進用サプリメント、飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料を提供することを課題とする。【解決手段】リポカリンファミリータンパク質及び／又はリポカリンファミリータンパク質をペプシンやパンクレアチン等のタンパク質分解酵素で分解して得られるリポカリンファミリータンパク質分解物をヒアルロン酸産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進用サプリメント、飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料の有効成分とする。このリポカリンファミリータンパク質及び／又はリポカリンファミリータンパク質分解物には、ヒアルロン酸量を増加させる働きがある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物である、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、βラクトグロブリン及び／又はβラクトグロブリン分解物である、請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
前記リポカリン２分解物が、分子量３００以上、８０００以下であることを特徴とする請求項２に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項５】
前記リポカリン２分解物が、リポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項２記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項６】
前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項５記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したサプリメント。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合した飲食品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合した化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用なヒアルロン酸産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進用サプリメント、飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、光老化という、長年において肌に紫外線が照射され続けることによる、しみ、皺、たるみなどの肌の障害を防止することに関して、多くの研究がなされている。
皮膚はおおまかに皮膚表面に存在する表皮と表皮の下部に存在する真皮からなる。表皮は主に外部からの異物や病原菌、紫外線から保護するバリアー機能や、生体内からの物質の漏洩を防護する機能を有する。また真皮は表皮の約１５〜４０倍の厚さを持ち、皮膚の力学的強度を保つ役割を担っている。真皮はその乾燥重量の７０％がコラーゲンからなる繊維成分であるが、真皮の線維と皮膚線維芽細胞との間には、糖蛋白質や、プロテオグリカンといった基質が存在する。プロテオグリカンは、糖蛋白質とグリコサミノグリカンといったムコ多糖とが結合した分子量１０５〜１０６以上の巨大分子であり、真皮のグリコサミノグリカンは、主にヒアルロン酸やデルマタン硫酸からなるため、ヒアルロン酸は真皮における主要なマトリックス成分であると言える。
老化などの生理的要因や、太陽光などの紫外線、乾燥、酸化等などの外的環境の変化により皮膚の水分含量や真皮のヒアルロン酸量が低下すると、皮膚に皺が発生し、たるんだ状態を引き起こす。ヒアルロン酸は、主に皮膚の水分を保持する機能を有していることから、真皮中のヒアルロン酸含量を高めることによって、皮膚の水分含量の低下を防ぐことができると考えられ、皮膚における水分保持機能の改善剤として、ヒアルロン酸を配合した化粧料が数多く提案されている。しかしながら、これらは皮膚表面に塗布されたヒアルロン酸は、皮膚表面の保湿効果を発揮するのみであり、肌の機能低下を本質的に改善し得るものではない。
体内のヒアルロン酸を増加させる為に、ヒアルロン酸を経口摂取する方法がある。しかし、ヒアルロン酸は、高い相対分子量や低い脂溶性、生体膜障壁の通過困難性、大量の多糖分解酵素の存在といった理由から、経口投与した際の消化管からの吸収が悪い。ヒアルロン酸の吸収増進のために、特許文献１では、ヒアルロン酸とリン脂質の複合体が提案されている。しかし、ヒアルロン酸を経口摂取せずに体内のヒアルロン酸を増加させる方法はなんら開示されていない。
そこで、肌の機能低下を本質的に改善するために、真皮層のヒアルロン酸の生合成を促進させる必要があり、これによって皮膚のシワやたるみを防止できるヒアルロン酸産生促進剤が望まれていた。
ヒアルロン酸産生促進剤としてはアマチャヅル、カンラン化ボスウェリア属フランキンセンス、ビャクダン科ビャクダン属ビャクダン、バラ科バラ属ダマスクロ−ズ、シソ科マンネンロウ属ロ−ズマリ−から得られる抽出物が開示されている。（特許文献１，２）
一方、関節液中のヒアルロン酸は、関節軟骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立っている。正常人関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、例えば、関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬへと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する。また、化膿性関節炎や痛風性関節炎などでも関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（非特許文献１）。
上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制及び病的関節液の性状改善をするために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが行われている。例えば、関節リウマチ患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法を行うと、上記の改善が認められている（非特許文献２）。同様に、外傷性関節症、骨関節炎や変形性関節症においても、ヒアルロン酸の関節注入療法による改善効果が報告されている（非特許文献３）。
以上のことから、ヒアルロン酸産生の促進は、肌荒れ等の皮膚疾患、関節リウマチや外傷性関節症、骨関節炎、変形性関節症といった関節疾患の予防、治療に有効である。したがって、日常の生活の中で手軽に治療できるヒアルロン酸産生促進剤を含有するサプリメント、クリームあるいは飲食品が望まれていた。
リポカリン２（ＬＣＮ２）及びβラクトグロブリンは、８本のβ−バレル構造を有するリポカリンファミリーに属するタンパク質である。
リポカリン２（ＬＣＮ２）は、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）とも呼ばれ、９２ｋＤａのヒト好中球タイプIVコラゲナーゼに結合するタンパク質として同定されている。肝臓から分泌されるリポカリン２は、ジデロフォア−Ｆｅ３＋と選択的に結合することで、バクテリアの鉄利用を阻害し増殖を阻害するといった抗菌作用を持つ。また、血漿、血中のリポカリン２が炎症や感染のマーカーとして、尿中のリポカリン２が乳がんなどの悪性腫瘍のマーカーとして利用できるとの報告がある。リポカリン２は、牛乳中にも含まれることが知られているが、成熟乳に比べて初乳中に多く含まれるとの報告がある。しかしながら牛乳中のリポカリン２の機能についての報告はない。
βラクトグロブリンは牛乳中の主要な乳清タンパク質である。有用生理活性物質であるレチノール等の疎水性物質の結合能を有しており、優れた機能特性（乳化性、ゲル化性、起泡性）を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開  ２００７−５１０９１
【特許文献２】特開  ２０１３−２３４３７
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，第３５１巻，１９７頁，１９９８年
【非特許文献２】Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，第２２巻，４号，２００２年
【非特許文献３】Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｊｕｏｒｎａｌ，第１７２巻，８号，１０３９頁，２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１，２に開示されている発明では、植物由来の原材料を用いる為、ヒアルロン酸産生促成剤の原料の栽培が特定の地域に限られていたり、季節による供給の変動が大きいなど安定供給が出来ないという課題がある。そこで、本発明は、経口摂取可能なヒアルロン酸産生促進剤を提供すること及び、そのような物質を配合したヒアルロン酸産生促進用サプリメント、飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料を提供することを課題とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、ヒアルロン酸産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、リポカリンファミリータンパク質あるいはリポカリンファミリータンパク質を分解して得られるリポカリンファミリータンパク質分解物が、ヒアルロン酸産生量を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
（２）上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物である、（１）記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（３）上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、βラクトグロブリン及び／又はβラクトグロブリン分解物である、（１）記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（４）前記リポカリン２分解物が、分子量３００以上、８０００以下であることを特徴とする（２）に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（５）前記リポカリン２分解物が、リポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（２）記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（６）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（５）記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合したサプリメント。
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合した飲食品。
（９）（１）〜（６）のいずれかに記載のヒアルロン酸産生促進剤を配合した化粧料。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、リポカリンファミリータンパク質及び／またはリポカリンファミリータンパク質分解物を有効成分とすることで安全性を向上させたヒアルロン酸産生促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】リポカリン２によるヒアルロン酸産生促進効果を示す。
【図２】リポカリン２がヒアルロン酸合成酵素遺伝子（Ｈａｓ２）のｍＲＮＡ発現へ及ぼす影響について比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤の特徴は、リポカリン２及び／またはリポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られるリポカリン２分解物を有効成分とすることにある。本発明のリポカリン２はどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のリポカリン２はすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたリポカリン２も使用可能であり、細胞培養の培養液から回収した細胞由来のものも使用可能である。また、リポカリン２はウシ初乳中に含有されており、乳から回収したものであっても良く、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から、加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等によって取得することも可能である。
【００１０】
リポカリン２分解物は、任意の方法で精製したリポカリン２をトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物を使用することが可能である。但し、分子量の下限は３００以上であることが好ましい。
【００１１】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する。本発明のヒアルロン酸産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるリポカリン２あるいはリポカリン２分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化することが可能である。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用してもよい。結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられ、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。また、界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
さらには、これらのリポカリン２やリポカリン２分解物をそのままあるいは製剤化した後、これをサプリメント、栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。なお、リポカリン２あるいはリポカリン２分解物は、比較的熱に対して安定であるので、リポカリン２あるいはリポカリン２分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
【００１２】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明のヒアルロン酸産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、ヒアルロン酸産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。
【００１３】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果、リポカリン２及び／またはリポカリン２分解物は、ラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ以上摂取させることでヒアルロン酸産生促進作用を示すことが明らかとなった。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日１０μｇ以上のリポカリン２及び／またはリポカリン２分解物を摂取すればヒアルロン酸産生促進効果が期待できるため、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。
【００１４】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、リポカリン２及び／またはリポカリン２分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。
【実施例１】
【００１５】
以下、実施例および試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。実施例および試験例における「％」は断らない限り「重量％」を意味するものとする。
以下に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１６】
Ｓセファロース ３,０００ｇ を充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液して、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。その後、リポカリン２を含む溶出画分を再度フェニルＳセファロース疎水性カラムクロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＨＰＬＣシステムにてＣ４およびＣ８逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで順次処理し、リポカリン２４００ｍｇ（画分Ａ）を得た。なお、このようにして得られたリポカリン２は、そのままヒアルロン酸産生促進剤として使用可能である。
【実施例２】
【００１７】
実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が１％となるようにパンクレアチンを加え、３７℃で５分から６時間、酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、リポカリン２分解物２４ｍｇ（画分Ｂ、Ｃ、Ｄ）を得た。なお、このようにして得られたリポカリン２分解物の平均分子量は、Ｂが約８，０００、Ｃが約５００、Ｄが約３００であった。また、実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が０．０１％となるようにペプシンを添加し、ｐＨを２〜３に調整した後、３７℃で１２時間酵素処理を行い、さらにｐＨを８に調整した後、最終濃度が０．０１％となるようにトリプシンを添加し、３７℃で１２時間酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥し、リポカリン２分解物２４ｍｇ（画分Ｅ）を得た。画分Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、そのままヒアルロン酸産生促進剤として使用可能である。
【００１８】
［試験例１］
実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｅについて、ラットを用いた動物実験によりヒアルロン酸産生促進作用を調べた。７週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを、生理食塩水投与群（対照群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ａ−１群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ａ−２群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ｂ−１〜Ｅ−１群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ｂ−２〜Ｅ−２群）の１１試験群（ｎ＝６）に分け、それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して１０週間飼育した。皮膚のヒアルロン酸量については、試験前日に剃毛したラットを屠殺後速やかに回収した皮膚組織（各３００ｍｇ）を測定に供した。加熱によりタンパク変性させた皮膚組織をアクチナーゼによりタンパク質分解した。得られた分解物を、更にヒアルロニダーゼにてヒアルロン酸に分解した。ヒアルロン酸をＨＰＬＣ法にて測定した。
その結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2015000038.tif 000002
【００２０】
この結果、１０週間後の可溶性画分中ヒアルロン酸量は、対照群に比べ、すべての試験群で有意に高い値を示した。このことから、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物には、ヒアルロン酸産生促進作用があることが明らかとなり、ヒアルロン酸産生促進剤として有用であることが示された。また、このヒアルロン酸産生促進作用はリポカリン２及び／又はリポカリン２分解物をラット体重１ｋｇ当たり少なくとも１０．０μｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００２１】
［試験例２］
実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄについて、正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ（ＡＴＣＣＲＬ １５０６）〕を用いた実験によりヒアルロン酸産生促進作用を調べた。１０容量％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）含有変法イーグル培地（ＭＥＭ、１０‐１０１、大日本製薬社製）を用いて、正常ヒト線維芽細胞株を４×１０４個／ウエル／０．４ｍｌとなるように２４ウエルプレートに播種して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で２４時間培養した後、０．６容量％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に置換した。そして、実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄを、各ウエルに０．１容量％となるように添加（ｎ＝６）して、７２時間培養して培養液を得た。このようにして得られた培養液中の、ヒアルロン酸量（バイオテック トレーディング パートナーズ社製）を測定した。なお、対照として、リポカリン２又はリポカリン２分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
2015000038.tif 000003
【００２３】
表２の結果、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を添加した群は、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも２倍以上のヒアルロン酸産生促進能を示した。このことから、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、ヒアルロン酸産生を促進する作用があることが明らかとなり、ヒアルロン酸産生促進剤として有用であることが示された。
【００２４】
［試験例３］
市販のヒトリポカリン２リコンビナントタンパク質（ＮＧＡＬ）（ＰＲＯＳＰＥＣ社）、及び正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ（ＮＢ））を用いた細胞実験により、リポカリン２によるヒアルロン酸産生促進作用について調べた。ＮＨＤＦ（ＮＢ）細胞を１２穴プレートに０．５×１０５cells/wellになる様に播種し、ＭＥＤＩＵＭ１０６培地(ＧＩＢＣＯ社製)にて３７℃、５％ＣＯ２環境下にて３日間培養した。ＮＧＡＬが１０ｎＭなるようにＭＥＤＩＵＭ１０６培地に溶解したものを培養した細胞に添加し、２４時間培養した。このようにして得られた培養液のヒアルロン酸量をヒアルロン酸測定キットＱｎＥ    Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＨＡ）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｖｅ  ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ社製）にて測定した。その結果を図１に示す。
【００２５】
この結果、コントロールと比較し、ＮＧＡＬを添加したサンプルは、ヒアルロン酸量が有意に増加したことから、リポカリン２がヒアルロン酸産生を促進することか確認された。
【００２６】
［試験例４］
リポカリン２がヒアルロン酸合成酵素遺伝子（Ｈａｓ２）のｍＲＮＡ発現へ及ぼす影響について、リアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。具体的には、ＮＨＤＦ（ＮＢ）細胞を２４穴プレートに０．５×１０５cells/wellになる様に播種し、ＭＥＤＩＵＭ１０６培地(ＧＩＢＣＯ社製)にて３７℃、５％ＣＯ２環境下にて３日間培養した。３日間の培養期間のうち、ＮＧＡＬを１０ｎＭになるようにＭＥＤＩＵＭ１０６培地に溶解したものを、それぞれ２時間、４時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間細胞に添加・保持した後、以下の手順でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収しｃＤＮＡを合成した。
培養した細胞にＲＮＡ抽出剤であるＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン社製)を０．５ｍｌ添加し５分間静置した後、ピペッティングにて可溶化させた細胞液を１．５ｍｌ容のチューブに回収した。細胞液に０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、十分に攪拌した後、二層に分離した上層(水層)を新たな１．５ｍｌ容のチューブに回収した。回収液に０．２５ｍｌの２−プロピルアルコールを添加し、１０分間静置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃の条件にて１５分間遠心分離し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿物を得た。得られた沈殿物を、７０％エタノールにて洗浄した後、ＤＥＰＣ水に溶解しＲＮＡ液とした。１μg分のＲＮＡからＴａｋａｒａ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｉｍｅ  Ｅｘ  ＴａｑII）を使用したリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、９５℃、３０秒の初期変性後、９５℃、５秒の変性、５７℃、１５秒のアニーリング、７２℃、２０秒の伸張であり、合計４０サイクル反応させた。プライマーは表３に記載のＨａｓ２遺伝子発現確認用プライマーを使用した。結果を図２に示す。
【００２７】
【表３】
2015000038.tif 000004
【００２８】
図２により、ＮＧＡＬをＮＨＤＦ（ＮＢ）細胞に添加した時に、Ｈａｓ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、４時間で有意に亢進し、その後１２時間までゆるやかに減弱し、２４時間で対照群との差は見られなくなった。
【実施例３】
【００２９】
表４に示す配合のヒアルロン酸産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で沈殿等の問題もなかった。
【００３０】
【表４】
2015000038.tif 000005
【実施例４】
【００３１】
表５に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼してヒアルロン酸産生促進用ビスケットを製造した。
【００３２】
【表５】
2015000038.tif 000006
【実施例５】
【００３３】
表６に示す配合のヒアルロン酸産生促進剤を常法により製造した。
【００３４】
【表６】
2015000038.tif 000007
【実施例６】
【００３５】
表７に示す配合の化粧水を常法により製造した。
【００３６】
【表７】
2015000038.tif 000008
【実施例７】
【００３７】
表８に示す配合のクリームを常法により製造した。
【００３８】
【表８】
2015000038.tif 000009
【００３９】
［試験例５］
実施例６で得られた化粧水及び実施例７で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を除いた以外は実施例６及び７と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｃ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｄ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布した。結果を表９に示す。
【００４０】
【表９】
2015000038.tif 000010
【００４１】
表９の結果より、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善、肌荒れ等の改善が顕著であり、ヒアルロン酸産生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善、肌荒れに顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。
［試験例６］
変形性関節炎による軽度の痛みを有する患者２０名を対象に、実施例３の飲料を１日１回１００ｇ飲用し、１年間の臨床試験を行った。関節の疼痛および機能の評価を、疼痛に対するビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）、及び、関節炎の関節における疼痛、機能、および硬直に関するＷｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）指標にて変形性関節症の評価を行った。結果を表１０に示す。
【００４２】
【表１０】
2015000038.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用なヒアルロン酸産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進用サプリメント、飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料に関する。
【図１】
2015000038.tif 000012
【図２】
2015000038.tif 000013