(57)【要約】【課題】癌治療を開始した早期の時期に治療効果を診断可能な、癌に対する治療効果の診断剤を提供すること。【解決手段】式（１−０）で表される化合物を含む、癌に対する治療効果の診断剤。    [化１]2015078149.tif 000034（式（１−０）中、Ｒは、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−、−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−又は−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−を示し、ｎは１〜５の整数を示し、Ｑ１は、Ｆ又は−ＯＣＨ３を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１−０）で表される化合物を含む、癌に対する治療効果の診断剤。
【化１】
2015078149.tif 000032
（式（１−０）中、Ｒは、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−、−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−又は−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−を示し、ｎは１〜５の整数を示し、Ｑ１は、Ｆ又は−ＯＣＨ３を示す。）
【請求項２】
前記化合物が式（１−０’）で表される化合物である、請求項１に記載の診断剤。
【化２】
2015078149.tif 000033
【請求項３】
Ｑ１が１８Ｆ又は−Ｏ１１ＣＨ３である、請求項１又は２に記載の診断剤。
【請求項４】
陽電子放出型断層撮影法用である、請求項３に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に対する治療効果の診断剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
陽電子（ポジトロン）放出型断層撮影法（ＰＥＴ法）は、シングルフォトン断層撮影法（ＳＰＥＣＴ法）よりも、感度、解像度及び定量性に優れていることから近年特に注目されている。
【０００３】
例えば、神経精神疾患の診断は、ＰＥＴ法による神経細胞のグルコース代謝の評価によって、現在行われている。このときＰＥＴ用プローブとして、１８Ｆ−フルオロデオキシグルコース（［１８Ｆ］ＦＤＧ）が用いられている。
【０００４】
さらに、ＰＥＴ法による癌に対する治療効果の診断（判定）も試みられている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kubota  R.  et  al.,  J  Nucl  Med  33  (1992)  1972-1980.
【非特許文献２】Sugiyama  M.  et  al.,  J  Nucl  Med  45  (2004)  1754-1758.
【非特許文献３】Murayama  C.  et  al.,  J  Nucl  Med  50  (2009)  290-295.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、［１８Ｆ］ＦＤＧは、癌細胞のみならず、癌に対する治療（癌治療）によって誘導される活性化免疫細胞（マクロファージ、ミクログリア等）にも取り込まれる性質を有する。そのため、［１８Ｆ］ＦＤＧをプローブとして用いたＰＥＴ法の場合、特に癌治療を開始した早期の時期（治療開始から２〜１０日後）において、癌の治療効果の診断には不適であることが報告されている（非特許文献１〜３）。
【０００７】
一方、選択した癌治療法が、対象である患者に適した治療法であるかどうかを早期に治療効果を診断することは、より効果的でより副作用の少ない治療法の選択につながり、対象である患者の生活の質（ＱＯＬ）を向上させるために極めて重要である。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、癌治療を開始した早期の時期に治療効果を診断可能な、癌に対する治療効果の診断剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、ある特定の化合物をプローブとして使用することで、アポトーシスを起こしている癌細胞を特異的に検出できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、式（１−０）で表される化合物を含む、癌に対する治療効果の診断剤を提供する。
【化１】
2015078149.tif 000002
（式（１−０）中、Ｒは、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−、−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−又は−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−を示し、ｎは１〜５の整数を示し、Ｑ１は、Ｆ又は−ＯＣＨ３を示す。）
【００１１】
上記診断剤は、アポトーシスを起こしている癌細胞を特異的に検出できることから、癌治療を開始した早期の時期に治療効果を診断することができる。
【００１２】
上記化合物は式（１−０’）で表される化合物であってもよい。
【化２】
2015078149.tif 000003
【００１３】
上記化合物において、Ｑ１は１８Ｆ又は−Ｏ１１ＣＨ３であってもよい。このようにすることで、上記化合物はポジトロンを放出することが可能になる。上記化合物から放出されたポジトロンは、すぐに電子と結合してγ線（消滅放射線）を放出する。このγ線をＰＥＴ法に用いられる装置で測定することによって、上記化合物の体内分布を定量的かつ経時的に画像化することができる。すなわち、ＰＥＴ法によって、癌に対する治療効果の診断が可能になる。
【００１４】
Ｑ１が１８Ｆ又は−Ｏ１１ＣＨ３である化合物（１−０）を含む上記診断剤は、陽電子放出型断層撮影法に好適に利用できる。
【００１５】
本発明の他の側面は、癌に罹患している対象に癌治療を行う工程と、式（１−０）で表される化合物を上記対象に投与する工程と、上記癌における上記化合物を検出する工程と、上記癌における上記化合物の集積量を定量解析する工程、を含む、癌に対する治療効果の診断方法を提供する。
本発明の別の他の側面は、癌に対する治療効果の診断用である、式（１−０）で表される化合物を提供する。
本発明の別の他の側面は、癌に対する治療効果を診断するための、式（１−０）で表される化合物の応用を提供する。
本発明の別の他の側面は、癌に対する治療効果の診断剤の製造における、式（１−０）で表される化合物の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、癌治療を開始した早期の時期に治療効果を診断可能な、癌に対する治療効果の診断剤を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に対する結合親和性を示すグラフである。
【図２】放射線治療後における腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。
【図３】マウスの腫瘍組織における、放射線治療の効果を示すＰＥＴ画像の図である。
【図４】マウスの腫瘍組織における、ＰＥＴプローブの取り込み量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１９】
本実施形態に係る癌に対する治療効果の診断剤（以下、単に「診断剤」という場合がある。）は、式（１−０）で表される化合物（以下、「化合物（１−０）」という場合がある。）を含む。
【００２０】
【化３】
2015078149.tif 000004
【００２１】
ここで、「癌に対する治療効果の診断剤」とは、ある治療方法が癌細胞又は腫瘍組織に対してどの程度効果があるのかを診断するための薬剤のことを意味し、ＭＣ−１が関与する電子伝達系が活性化され、アポトーシスが誘導された癌細胞を検出できる薬剤を意味する。言い換えると、「癌に対する治療効果の診断剤」は、癌細胞のアポトーシス検出剤として把握することもできる。
【００２２】
次に、化合物（１−０）について説明する。Ｒは、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−、−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−又は−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−である。ｎは１〜５の整数であり、２〜４であってもよい。Ｑ１は、Ｆ又は−ＯＣＨ３であり、１８Ｆ又は−Ｏ１１ＣＨ３であってもよい。Ｑ１を−Ｏ１１ＣＨ３又は１８Ｆとすることで、化合物（１−０）は、ポジトロンを放出することが可能になる。Ｑ１が−Ｏ１１ＣＨ３である場合、半減期が２０分と短いため、１日に複数回の計測を行うことも可能になる。Ｑ１が１８Ｆである場合、半減期が１１０分と−Ｏ１１ＣＨ３よりも長いため、１回の計測時間を長くすることが可能になると同時に、あるサイクロトロンを有する製造場所から他の複数の計測場所に供給（デリバリー）することが可能になる。
【００２３】
ピリジン環における、ピリダジン環と結合している−ＯＣＨ２−の結合位置及びＲの結合位置は特に制限されないが、ピリダジン環と結合している−ＯＣＨ２−の結合位置がピリジン環の５位であり、Ｒの結合位置がピリジン環の２位であってもよい。ピリダジン環と結合している−ＯＣＨ２−の結合位置がピリジン環の５位であり、Ｒの結合位置がピリジン環の２位であるときの構造式を、式（１−０’）として以下に示す。
【００２４】
【化４】
2015078149.tif 000005
【００２５】
ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に対する結合特異性という観点から、化合物（１−０）は、式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」という場合がある。）であってもよい。
【００２６】
【化５】
2015078149.tif 000006
【００２７】
ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に対する結合親和性という観点から、化合物（１−０）は、式（１−２）で表される化合物（以下、「化合物（１−２）」という場合がある。）であってもよい。
【００２８】
【化６】
2015078149.tif 000007
【００２９】
式（２−０）で表される化合物（以下、「化合物（２−０）」という場合がある。）は、上記化合物（１−０）の前駆体である。
【００３０】
【化７】
2015078149.tif 000008
【００３１】
Ｑ２は、脱離可能な置換基（置換スルホニルオキシ基、ハロゲン原子又は水酸基等）である。
【００３２】
上記置換スルホニルオキシ基としては、例えば、トシルオキシ基（−ＯＴｓ）、メタンスルホニルオキシ基（−ＯＭｓ）、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基（−ＯＴｆ）、ニトロベンゼンスルホニルオキシ基（−ＯＮｓ）が挙げられる。上記置換スルホニルオキシ基として−ＯＴｓが用いられてもよい。
【００３３】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【００３４】
式（２−０’）で表される化合物（以下、化合物（２−０’）という場合がある）は、上記化合物（１−０’）の前駆体である。
【００３５】
【化８】
2015078149.tif 000009
【００３６】
式（２）で表される化合物（以下、化合物（２）という場合がある）は、上記化合物（１）の前駆体である。
【００３７】
【化９】
2015078149.tif 000010
【００３８】
式（２−２）で表される化合物は、上記化合物（１−２）の前駆体である。
【００３９】
【化１０】
2015078149.tif 000011
【００４０】
（前駆体の合成方法）
Ｒが−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎが２であり、Ｑ２が水酸基である化合物（２−０）は、公知の化合物から合成可能である。例えば、後述する実施例の実験２に記載の合成スキーム（工程１〜１０）を経て合成が可能である。Ｒが−ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣ２Ｈ４−でありＱ２が水酸基である化合物（２−０）は、後述する実施例の実験２に記載の合成スキーム（工程１〜１０）及び後述する合成スキーム（ｃ）を参照することで、合成が可能である。
【００４１】
Ｑ２が水酸基である化合物（２）は、公知の化合物から合成可能である。例えば、後述する実施例の実験１に記載の合成スキーム（ａ）〜（ｈ）を経て合成が可能である。
【００４２】
Ｑ２がトシルオキシ基である化合物（２）は、公知の化合物から合成可能である。例えば、上記Ｑ２が水酸基である化合物（２）から後述する実施例に記載の合成スキーム（ｉ）を経て合成が可能である。
【００４３】
化合物（２）からＱ１がＦである化合物（１）を製造する方法は、化合物（２）をフッ素化する方法によって行われる。例えば、Ｑ２が−ＯＴｓである場合、化合物（２）をフッ素化する方法は以下の合成スキーム（Ａ）で表される。Ｑ２が、他の置換スルホニルオキシ基又はハロゲン原子である場合にも同様の合成スキームで対応する化合物（１）が合成可能である。
【化１１】
2015078149.tif 000012
【００４４】
化合物（２）からＱ１が１８Ｆである化合物（１）を製造する方法は、化合物（２）を［１８Ｆ］フッ素化する方法によって行われる。例えば、Ｑ２が−ＯＴｓである場合、化合物（２）を［１８Ｆ］フッ素化する方法は以下の合成スキーム（Ｂ）で表される。Ｑ２が、他の置換スルホニルオキシ基又はハロゲン原子である場合にも同様の合成スキームで対応する化合物（１）が合成可能である。
【化１２】
2015078149.tif 000013
【００４５】
化合物（２）を［１８Ｆ］フッ素化する方法としては、化合物（２）を溶媒中、大環状配位子と［１８Ｆ］ＫＦとの複合体と反応させることで、［１８Ｆ］フッ素化することが可能である。
【００４６】
［１８Ｆ］フッ素化するときの溶媒としては、出発物質をある程度溶解できるものであれば特に限定されず、例えば、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。上記溶媒として、アセトニトリルが用いられてもよい。
【００４７】
大環状配位子としては、例えば、４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］ヘキサコサン（Ｋ［２．２．２］）、１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサオキサシクロオクタデカン（１８−クラウン−６）等が挙げられる。上記大環状配位子として、Ｋ［２．２．２］が用いられてもよい。
【００４８】
Ｑ２が水酸基である化合物（２）からＱ１が−ＯＣＨ３である化合物（１）を製造する方法は、例えば、以下の合成スキーム（Ｃ）で表される。
【００４９】
【化１３】
2015078149.tif 000014
【００５０】
Ｑ２が水酸基である化合物（２）からＱ１が−Ｏ１１ＣＨ３である化合物（１）を製造する方法は、例えば、以下の合成スキーム（Ｄ）で表される。
【化１４】
2015078149.tif 000015
【００５１】
上記合成スキーム（Ｄ）において、１１ＣＨ３ＯＴｆは、公知の方法によって合成が可能である。例えば、反応式（Ｅ）を経て合成できる。
【化１５】
2015078149.tif 000016
【００５２】
化合物（１−０）は、ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１の検出に適している。例えば、蛍光色素等を化合物（１−０）に結合させる、又はポジトロン標識を化合物（１−０）に行えば、ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１の標識化合物として使用できる。特に化合物（１−０）のＱ１が−Ｏ１１ＣＨ３又は１８Ｆである場合、化合物（１−０）はポジトロンを放出することが可能になる。上記化合物（１−０）から放出されたポジトロンは、すぐに電子と結合してγ線を放出する。このγ線をＰＥＴ法に用いられる装置で測定することによって、化合物（１−０）の体内分布を定量的かつ経時的に画像化することができる。
【００５３】
したがって、上記化合物（１−０）を含む上記診断剤は、アポトーシスを起こしている癌細胞を特異的に“陽性画像”として感度よく検出することが可能である。上記診断剤が、アポトーシスを起こしている癌細胞を特異的に検出できる理由について、これに限定されるものではないが、本発明者らは以下のように考えている。
すなわち、式（１−０）で表される化合物は、後述する実施例で明らかにされているように、ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１（ＭＣ−１）の検出に適した化合物である。癌細胞は、生存に必要なアデノシン三リン酸（ＡＰＴ）を、正常細胞が用いている電子伝達系（ＭＣ−１が関与する電子伝達系）ではなく嫌気的解糖系を使って産生している。そのため、上記化合物が癌細胞中の機能低下しているＭＣ−１に結合せず、生きている癌細胞は“陰性画像”（プローブが存在しない部分の画像）として計測される。一方、放射線治療等の癌治療によって遺伝子等が破壊されている癌細胞は代謝が大きく変化して、ＭＣ−１が関与する電子伝達系が活性化される。そのため、ＭＣ−１が関与する電子伝達系が活性化されている癌細胞は、上記化合物が癌細胞中のＭＣ−１に結合し“陽性画像”（プローブが存在する部分の画像）として計測が可能になる。ここで、ＭＣ−１が関与する電子伝達系が活性化されている癌細胞では、大量の活性酸素ラジカルが発生する。しかし、癌細胞には上記ラジカルを除去する酵素活性が正常細胞に比べて低下しているため、ＤＮＡ鎖又は細胞膜の脂質に上記ラジカルによる障害が生じる。その結果、アポトーシスが誘導されてやがて癌細胞は死んでいく。すなわち、上記化合物は、アポトーシスを起こしている癌細胞を特異的に“陽性画像”として感度よく検出することが可能である。
【００５４】
上記診断剤は、例えば、化合物（１−０）を任意の緩衝液に溶解することによって製造することができる。この場合、上記診断剤は、溶液として提供され、上記緩衝成分の他、界面活性剤、防腐剤、安定化剤等のその他の成分を含有してもよい。
【００５５】
本実施形態に係る癌に対する治療効果の診断方法は、癌に罹患している対象に癌治療を行う工程と、式（１−０）で表される化合物を上記対象に投与する工程と、上記癌における上記化合物を検出する工程と、上記癌における上記化合物の集積量を定量解析する工程、を含む。
上述したように上記診断剤は、アポトーシスを起こしている癌細胞を特異的に“陽性画像”として感度よく検出することが可能であるため、上記方法は、癌治療を開始してから早期の時期において、癌の治療効果を診断することが可能である。
【００５６】
上記癌は、特に制限されないが、例えば、肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌及び皮膚癌等が挙げられる。
【００５７】
上記対象としては、例えば、ヒト、サル、マウス及びラットが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００５８】
上記癌治療の方法は、ＭＣ−１が関与する電子伝達系が活性化されることで、目的の癌細胞のアポトーシスを誘導することが可能な方法であれば特に制限されない。上記癌治療の方法としては、例えば、放射線治療及び化学療法が挙げられる。放射線治療に用いられる放射線としては、Ｘ線、電子線、γ線等が挙げられる。化学療法に用いられる薬剤としては、例えば、ダカルバジン、シスプラチン、アドリアマイシン、ビンブラスチン、タキソール、マイトマイシン、抗体医薬等のがん分子標的薬が挙げられる。
【００５９】
上記化合物を上記対象に投与する方法は、化合物（１−０）が癌組織に到達することができればどの様な方法でもよいが、通常、静脈内投与である。
【００６０】
上記化合物を上記対象に投与する時期は、癌治療を行った後であればいつでもよいが、例えば、癌治療を行ってから２日〜１０日後の早期の時期に投与してもよい。
【００６１】
上記化合物の投与量としては、投与する対象及び上記化合物を検出する方法によって変わるが、上記化合物を生体内で検出するのに十分な投与量であれば、特に制限されない。例えば、式（１−０）におけるＱ１が１８Ｆ又は−Ｏ１１ＣＨ３である化合物（１−０）を含む上記診断剤を用いて、癌の治療効果を診断する場合、上記化合物の投与量（「投与放射能量」という場合がある。）は、１ＭＢｑ／ｋｇ体重〜１０００ＭＢｑ／ｋｇ体重であってもよい。また、上記化合物の比放射能は、１０−１０，０００ＧＢｑ／μｍｏｌであってもよい。
上記診断剤を用いて、ＰＥＴ法によって癌の治療効果を診断する場合、上記診断剤の投与放射能量は、使用するＰＥＴカメラの感度と対象個体の体積に依存するが、げっ歯類（マウス、ラット）ではおおよそ２００−５００ＭＢｑ／ｋｇ体重を０．１−０．５ｍＬの生理食塩水溶液として投与する。ヒト以外の霊長類（サル類）の場合、４０−２００ＭＢｑ／ｋｇ体重を０．５−２ｍＬの生理食塩水で投与し、ヒトの場合、２−１０ＭＢｑ／ｋｇ体重を１−５ｍＬの生理食塩水溶液として投与する。
【００６２】
上記癌における上記化合物を検出する方法としては、特に制限されず、公知の方法に準じて実施することができる。例えば、式（１−０）におけるＱ１が１８Ｆ又は−Ｏ１１ＣＨ３である化合物（１−０）を含む上記診断剤を用いる場合、ＰＥＴ法によって、上記化合物を検出することが可能である。ＰＥＴ計測の方法としては、上記診断剤の投与直後から６０分間のダイナミック計測をしてもよいし、上記診断剤を投与して３０−４０分間待って癌組織にプローブを十分集積させてから、１０−２０分間のＰＥＴ計測をしてもよい。
【００６３】
上記癌における上記化合物の集積量を定量解析する方法としては、特に制限されず、公知の方法に準じて実施することができる。例えば、以下の方法が挙げられる。まず、ＰＥＴ法によって得られた上記プローブの集積画像と、ＣＴ計測等によって得られた癌の形態画像を重ねあわせ、癌組織のＰＥＴ画像を同定する。次に上記癌組織のＰＥＴ画像上に関心領域を設定して、対象となる個体の体重と投与放射能量とで正規化した値を、癌組織への上記化合物の集積量とする。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明について、実施例を挙げて更に詳細に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６５】
なお、以下の実施例において、特に断りがない限り、シリカゲルカラムクロマトグラフィに用いたシリカゲルは、関東化学社製のＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ（フラッシュクロマトグラフィー用）４０〜５０μｍを用いた。
【００６６】
＜実験１＞
ＢＣＰＰ−ＥＦの合成
ＢＣＰＰ−ＥＦを下記工程１〜工程１０に従って合成した。以下、各工程を説明する。
工程１
合成スキーム（ａ）に従って、化合物３を合成した。
【化１６】
2015078149.tif 000017
【００６７】
ムコクロル酸１（５０ｇ、０．２９ｍｏｌ）を水（４４０ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム（１５．３ｇ、０．１４ｍｏｌ）を加えた。その溶液に０℃にて、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン塩酸塩（３６．９ｇ、０．２９ｍｏｌ）を加えた。得られた反応液を２．５時間撹拌した。析出した固体をろ過し、冷水で洗浄後、減圧下で析出した固体を乾燥し中間体２を得た。
【００６８】
中間体２に酢酸（５００ｍＬ）を加え、反応液を３０分間還流した。反応液中の酢酸を減圧下で留去した後、塩化メチレン及び炭酸水素ナトリウム水溶液にて分液した。有機層を水洗後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：クロロホルム＝７：３〜０：１０）にて精製し、淡黄色固体である化合物３（５２．９ｇ、収率８０％）を得た。
【００６９】
工程２
合成スキーム（ｂ）に従って、化合物４を合成した。
【化１７】
2015078149.tif 000018
【００７０】
化合物３（２ｇ、９ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液に、水酸化カリウム（１．５ｇ、２７ｍｍｏｌ）水溶液（１５ｍＬ）を加え、混合液を５時間還流した。得られた混合液を氷水に注ぎ、濃塩酸を加えて、析出した固体（粗体）をろ取した。粗体を水、ヘプタンの順に洗浄し、化合物４（１．６ｇ、収率９１％）を得た。
【００７１】
工程３
合成スキーム（ｃ）に従って、化合物６を合成した。
【化１８】
2015078149.tif 000019
【００７２】
ジエチレングリコール（２２．８ｍＬ、０．２４ｍｏｌ）及び３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２１．７ｍＬ、０．２４ｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）と塩化メチレン（４００ｍＬ）との混合溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（４．５７ｇ、２４ｍｍｏｌ）を−１０℃にて加え、反応液を１時間撹拌した。反応液に水を加え、エーテルにて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝５０：５０〜０：１００）にて精製し、無色液体である化合物６（１４ｇ、収率３１％）を得た。
【００７３】
工程４
合成スキーム（ｄ）に従って、化合物９を合成した。
【化１９】
2015078149.tif 000020
【００７４】
アルゴン雰囲下、０℃にて水素化ナトリウム（１．５１ｇ、３７．８ｍｍｏｌ（６０％  ｉｎ  ｏｉｌ））に、６−クロロ−３−ピリジンメタノール７（５ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）をゆっくり加えた。その後、反応液に１−クロロ−３−メチル−２−ブテン８（４．１１ｍＬ、３６．５ｍｍｏｌ）を更に加え、２５℃にて反応液を１時間撹拌した。残存している原料に対し、１−クロロ−３−メチル−２−ブテン（２．０ｍＬ、１７．７ｍｍｏｌ）を更に加え、５０℃にて反応液を１時間撹拌した。
【００７５】
残存している原料に対し、水素化ナトリウム（１．５１ｇ、３７．８ｍｍｏｌ（６０％  ｉｎ  ｏｉｌ））と１−クロロ−３−メチル−２−ブテン（８．０ｍＬ、７１．１ｍｍｏｌ）とを加え、５０℃にて反応液を３０分間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルにて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝９５：５〜８５：１５）にて精製し、無色液体である化合物９（７．０ｇ、収率９６％）を得た。
【００７６】
工程５
合成スキーム（ｅ）に従って、化合物１０を合成した。
【化２０】
2015078149.tif 000021
【００７７】
アルゴン雰囲下、０℃にて水素化ナトリウム（３２０ｍｇ、８ｍｍｏｌ（６０％  ｉｎ  ｏｉｌ））に、化合物６（１．９０ｇ、１０ｍｍｏｌ）の１，４―ジオキサン溶液（８ｍＬ）をゆっくり加え、６０℃にて反応液を３０分間撹拌した。その後、化合物９（０．８４ｇ、４ｍｍｏｌ）の１，４―ジオキサン溶液（４ｍＬ）を反応液に加え、マイクロウェーブで１７０℃にて３０分間反応液を撹拌した。反応液を冷却した後、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、クロロホルムにて分液した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝９５：５〜８５：１５）にて精製し、化合物１０（４．９ｇ、収率９６％）を得た。
【００７８】
工程６
合成スキーム（ｆ）に従って、化合物１１を合成した。
【化２１】
2015078149.tif 000022
【００７９】
アルゴン雰囲下、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１５．３ｇ、０．１３ｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１３０ｍＬ）に、化合物１０（５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、６０℃にて反応液を４０分間撹拌した。反応液を冷却した後、反応液に飽和塩化アンモニウム水溶水を加え、酢酸エチルにて分液した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝８０：２０）にて精製し、淡黄色液体である化合物１１（２．７ｇ、収率６８％）を得た。
【００８０】
工程７
合成スキーム（ｇ）に従って、化合物１２を合成した。
【化２２】
2015078149.tif 000023
【００８１】
アルゴン雰囲下、化合物４（１．４３ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）、化合物１１（２．３ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（２．７７ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（２．０９ｍＬ、１０．６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて反応液を１６時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルにて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（１回目、ヘプタン：酢酸エチル＝９０：１０〜６０：４０、２回目、クロロホルム：メタノール＝９９：１）にて精製し、化合物１２（２．７ｇ、収率８０％）を得た。
【００８２】
工程８
合成スキーム（ｈ）に従って、化合物１３を合成した。
【化２３】
2015078149.tif 000024
【００８３】
化合物１２（９６ｍｇ、７．２ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１ｍＬ）に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて反応液を１６時間撹拌した。減圧下で反応液を濃縮した後、濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝７０：３０〜２０：８０）にて精製し、無色固体である化合物１３（９６．９ｍｇ、収率９９％）を得た。
【００８４】
工程９
合成スキーム（ｉ）に従って、化合物１４を合成した。
【化２４】
2015078149.tif 000025
【００８５】
化合物１３（４５０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．５８ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（１３．８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１０ｍＬ）に、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（０．３２ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を−１０℃以下にて加え、反応液を１６時間撹拌した。反応液に水を加え、塩化メチレンにて目的化合物を２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝９０：１０〜４０：６０）にて精製し、化合物１４（６１０ｍｇ、収率９７％）を得た。
【００８６】
工程１０
合成スキーム（ｊ）に従って、化合物１５（ＢＣＰＰ−ＥＦ）を合成した。
【化２５】
2015078149.tif 000026
【００８７】
アルゴン雰囲気下、化合物１４（１１０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びテトラブチルアンモニウムフルオリド（０．６ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ（ＴＨＦ中、１．０ｍｏｌ／Ｌ））の混合溶液を２５℃にて１６時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後、濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝９０：１０〜５０：５０）にて精製し、ＢＣＰＰ−ＥＦである化合物１５（７０ｍｇ、収率８８％）を得た。
【００８８】
ＢＣＰＰ−ＥＭの合成
ＢＣＰＰ−ＥＭを上記工程１〜工程８及び下記工程１１に従って合成した。以下、工程１１について説明する。
工程１１
合成スキーム（ｋ）に従って、化合物１６を合成した。
【化２６】
2015078149.tif 000027
【００８９】
アルゴン雰囲下、０℃にて水素化ナトリウム（１２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ（６０％  ｉｎ  ｏｉｌ））に、化合物１３（８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の１，４―ジオキサン溶液（２ｍＬ）を加えた。その後反応液にヨウ化メチル（１２５μＬ、２ｍｍｏｌ）を加え、封管容器内２５℃にて反応液を１時間撹拌した。反応液を冷却した後、反応液に水を加え、酢酸エチルにて分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、減圧下で有機層を濃縮した。濃縮した残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘプタン：酢酸エチル＝７０：３０〜３０：７０）にて精製し、化合物１６（６２ｍｇ、収率７５％）を得た。
【００９０】
［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦの合成
［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦ（化合物１７）を上記工程１〜工程９及び下記合成スキーム（ｌ）に従って合成した。
【化２７】
2015078149.tif 000028
【００９１】
標識合成は［１８Ｆ］標識化合物自動合成装置（Ｆ−１１０、Ｆ−１２０、住友重機械工業、東京）を用いて行った。ターゲットから回収し、陰イオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ８（バイオラッドラボラトリーズ、ヘラクレス、米国）にトラップした［１８Ｆ］Ｆ−を４０ｍＭ  Ｋ２ＣＯ３水溶液（０．５ｍＬ、２０μｍｏｌ）で脱着した。得られた溶液に、Ｋ［２，２，２］（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（１５ｍｇ、２０μｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）溶液（２ｍＬ）を加えて、Ｈｅ気流下で反応液を共沸脱水した。残渣にＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）を加えて共沸脱水を２度繰り返し、水分が除去された［１８Ｆ］ＫＦ／Ｋ［２，２，２］を調製した。［１８Ｆ］ＫＦ／Ｋ［２，２，２］に、前駆体（化合物１４、６．２９ｍｇ、１１．３μｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（シグマアルドリッチ、セントルイス、米国）溶液（１．５ｍＬ）を加え、８０℃で１０分間フッ素化を行った。得られた反応混合物にＣＨ３ＣＮとＨ２Ｏとの混合液（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝３：７、１．５ｍＬ）を加えて反応を停止させた。その後、反応液をＨＰＬＣインジェクターに移送した。さらに反応容器をＣＨ３ＣＮとＨ２Ｏとの混合液（ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝３：７、１．５ｍＬ）で共洗いし、同様に上記混合液をＨＰＬＣインジェクターに移送した。粗生成物をＨＰＬＣ［カラム  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（５μ、１０．０ｘ２５０ｍｍ、ＧＬサイエンス、東京）、移動相ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ＝５００：５００、流速６ｍＬ／ｍｉｎ、波長２５４ｎｍ］によって精製した。保持時間１７．４分の放射能ピークを分取し、分収した溶液をエバポレータで濃縮乾固した。その後、濃縮乾固した生成物を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０／生理食塩水（５ｍＬ）に再溶解し、［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦ（２．３６ＧＢｑ）を回収した。
【００９２】
生成物の一部を採り、ＨＰＬＣ［カラム  Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８Ｓ  （５μ、４．６ｘ１５０ｍｍ、日本分光、東京）、移動相  ＣＨ３ＣＮ：３０ｍＭ  ＣＨ３ＯＮＨ４：ＣＨ３ＣＯＯＨ＝５００：５００：２、流速２ｍＬ／ｍｉｎ、波長２５４ｎｍ］によって分析した。放射化学的収率、比放射能、及び放射化学的純度はそれぞれ１６．９８％（ｄｅｃａｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）、８４．３ＧＢｑ／μｍｏｌ、１００％であった。全合成時間は照射終了時（Ｅｎｄ  ｏｆ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、ＥＯＢ）から約６３分であった。
【００９３】
［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦについて、前駆体（化合物１４）３．５４ｍｇで合成した場合は、放射化学的収率が４．０２％であった。上記前駆体を６．２９ｍｇに増やすことで放射化学的収率が１６．９８％まで向上した。得られた最終生成物の放射化学的純度は１００％、比放射能は８４．３ＧＢｑ／μｍｏｌであり、ＰＥＴ実験に十分な純度と収量を得ることができた。
【００９４】
［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭの合成
［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭを上記工程１〜工程８及び下記合成スキーム（ｍ）に従って合成した。
【化２８】
2015078149.tif 000029
【００９５】
サイクロトロン（ＨＭ−１８、住友重機械工業、東京）にて、陽子を１８ＭｅＶに加速した。一方で、純窒素ガス（Ｇグレード、ジャパンファインプロダクツ、神奈川）をおよそ１７ｋｇ／ｃｍ２の圧力で封入したターゲットガスを準備した。上記ターゲットガスに、上記陽子をおよそ２０μＡの電流値で照射して、１４Ｎ（ｐ，α）１１Ｃ核反応によって［１１Ｃ］を製造した。ターゲットガス内で、［１１Ｃ］は［１１Ｃ］ＣＯ２の化学形で存在した。上記［１１Ｃ］ＣＯ２を含むターゲットガスを自動合成装置（住友重機械工業、東京）で、冷却した０．１Ｍ  ＬｉＡｌＨ４／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（５００μＬ）（ＡＢＸアドバンストバイオケミカルズコンパウンズ、ドイツ）に導入した。このときの上記ターゲットガスの流量は、４００ｍＬ／ｍｉｎであった。上記ターゲットガスを導入した後、得られた反応溶液に窒素ガス（ガス流量、２００ｍＬ／ｍｉｎ）をバブリングし、２００℃に加熱してＴＨＦを留去した。ＴＨＦを留去した後、反応器を一旦冷却し、ヨウ化水素酸（ナカライテスク、京都、０．５ｍｌ）を反応溶液に加え１５０℃に加熱した。生成した［１１Ｃ］ヨウ化メチルを蒸留し、２００℃に加熱したＡｇＯＴｆ（シグマアルドリッチ、米国）カラムを通過させることで［１１Ｃ］メチルトリフレートとした。カラムを通過した［１１Ｃ］メチルトリフレートは、直ちに前駆体（化合物１３）の溶液に導入した。
【００９６】
前駆体（化合物１３、２ｍｇ）を２−ブタノン（和光純薬工業、東京、０．３ｍＬ）に溶解した。得られた前駆体溶液にＮａＨ（約２ｍｇ）を加えて調製した。得られた前駆体溶液に、蒸留されてきた上記［１１Ｃ］メチルトリフレートを導入し、放射能が平衡に達した時点で上記［１１Ｃ］メチルトリフレートの導入を停止した。その後、４０℃で５分間の条件で前駆体のメチル化反応を行った。
【００９７】
高速液体クロマトグラフィー（固定相  Ｍｅｇａｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−１０  ７．６×２５０ｍｍ（日本分光、東京）、移動相  アセトニトリル（和光純薬工業、大阪）：３０ｍＭ  酢酸アンモニウム水溶液（和光純薬工業、大阪）＝４５０：５５０、流速６ｍＬ／ｍｉｎ、波長２５４ｎｍ）にて、［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭの溶液を分取した。分取した溶液をエバポレーター（住友重機械工業、東京）にて溶離液を留去し、残渣に生理食塩溶液（大塚製薬、東京）を加え、最終製剤とした。
【００９８】
最終製剤の放射能を測定した（アロカ、東京）。最終製剤の一部を高速液体クロマトグラフィー（固定相  Ｆｉｎｅｐａｃｋ  Ｃ１８−Ｓ  ４．６×１５０ｍｍ（日本分光、東京）、移動相  アセトニトリル（和光純薬工業、大阪）：３０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ナカライテスク、京都）：酢酸（和光純薬工業、大阪）＝５００：５００：２、流速２ｍＬ／ｍｉｎ、波長２５４ｎｍ）にて分析した。
【００９９】
およそ６０分間、上記陽子を上記ターゲットガスに照射した場合、［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭの生産量は、０．２６−２．０１ＧＢｑ、放射化学的純度は９３．６％以上であった。
【０１００】
分離ＨＰＬＣにおける、［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭの前駆体（化合物１３）の保持時間は５．２分、［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭの保持時間は１０分であった。分析ＨＰＬＣにおける、［１１Ｃ］ＢＣＰＰ−ＥＭの保持時間は４．０分であった。
【０１０１】
＜実験２＞
ＢＭＳ−Ｐの合成
ＢＭＳ−Ｐ（化合物１５’’）を下記工程１〜工程１２に従って合成した。以下、各工程を説明する。
【化２９】
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【０１０２】
工程１
化合物５ａ（１０．００ｇ、６８．４１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１０．３８ｇ、１０２．６ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（８３６ｍｇ、６．８４１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１００ｍＬ）に、氷冷下でｐ−トルエンスルホニルクロライド（１３．６９ｇ、７１．８３ｍｍｏｌ）を分けて添加した。添加後、氷冷下で反応液を１６時間撹拌した。反応液に氷水（２００ｍＬ）を注ぎ込み、塩化メチレン（１００ｍＬ）で、目的化合物を抽出した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、有機層の溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取（シリカゲル１２０ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝５／１〜１／１）で精製し、無色液体である化合物５ｂ（１８．３８ｇ、収率８９．４％）を得た。
【０１０３】
工程２
Ａｒ雰囲気下、塩化カルシウム（２９．９２ｇ、２６９．６ｍｍｏｌ）、エタノール（３９０ｍＬ）及びＴＨＦ（３９０ｍＬ）を、反応器に仕込み、続いて氷冷下、水素化ホウ素ナトリウム（２０．４０ｇ、５３９．２ｍｍｏｌ）を分割して反応器に投入した。水素化ホウ素ナトリウムを投入した後、氷冷下で反応液を２．５時間撹拌した。反応液に氷冷下、化合物７’（３０．０９ｇ、１３４．８ｍｍｏｌ）を分割して投入し、氷冷下で反応液を３０分間攪拌した。反応液を氷水（１．５Ｌ）に注ぎ込んだ後、塩化アンモニウム（３００ｇ）を撹拌しながら反応液に加えた。目的化合物を酢酸エチル（１Ｌ×２）で抽出した。有機層を水（１Ｌ）、飽和食塩水（１Ｌ）で順次洗浄した。硫酸マグネシウムで有機層を乾燥した後、有機層の溶媒を減圧留去し、淡黄褐色固体である化合物９’（１６．１２ｇ、収率６６．０％）を得た。
【０１０４】
工程３
化合物９’（１７．０７ｇ、９４．２１ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１８．１１ｇ、９４．２１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（５００ｍＬ）に、氷冷下、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（２３．５５ｍＬ、２５９．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で反応液を１８時間攪拌した。有機層を飽和重曹水（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で順次洗浄した。硫酸マグネシウムで有機層を乾燥した後、有機層の溶媒を減圧留去することで、淡黄褐色液体である化合物１０’’’（４２．７２ｇ、粗収率１７０．９％）を得た。化合物１０’’’はクルードのまま次工程に供した。
【０１０５】
工程４
Ａｒ雰囲気下、水素化アルミニウムリチウム（７．９８８ｇ、２１０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ懸濁液（１００ｍＬ）に、クルードの化合物１０’’’（４２．７２ｇ、Ｎｅｔ＝２４．９９ｇ，９４．２１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍＬ）を氷冷下で滴下した。その後、室温で反応液を１時間攪拌した。氷冷下、反応液に水（８ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（８ｍＬ）、水（２４ｍＬ）を順次滴下して反応を停止した。得られた混合物をろ過し、スラリーを酢酸エチル（６００ｍＬ）で洗浄した。得られたろ液を飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、ろ液の溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取（シリカゲル２００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１〜酢酸エチルｏｎｌｙ）で精製し、淡黄褐色液体である化合物１６’（１４．９８ｇ、化合物９’からの収率７１．２％）を得た。
【０１０６】
工程５
Ａｒ雰囲気下、化合物１６’（１４．９８ｇ、６７．０９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（６０ｍＬ）に氷冷下、水素化ナトリウム（３．４８９ｇ、６０％換算として８７．２２ｍｍｏｌ）を分けて添加し、室温で反応液を１時間攪拌した。続いて化合物８（１０．５３ｇ、１００．７ｍｍｏｌ）を、反応液に加え、５０℃で３時間攪拌した。反応液に氷水（３００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３００ｍＬ）で目的化合物を抽出した。有機層を水（３００ｍＬ）、飽和食塩水（３００ｍＬ）で順次洗浄した。硫酸マグネシウムで有機層を乾燥した後、有機層の溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取（シリカゲル２００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１〜１／１）で精製し、淡黄褐色液体である化合物１７’（１５．４０ｇ、収率７８．８％）を得た。
【０１０７】
工程６
化合物１７’（１５．４０ｇ、５２．８５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１５４ｍＬ）に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（５０２．７ｍｇ、２．６４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で反応液を１８時間攪拌した。その後、反応液を８時間加熱還流した。反応液を濃縮し、得られた残渣を中圧分取（シリカゲル２００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１〜酢酸エチルｏｎｌｙ）で精製し、淡黄褐色液体である化合物１８’（１０．７８ｇ、収率９８．４％）を得た。
【０１０８】
工程７
Ａｒ雰囲気下、化合物１８’（１０．７６ｇ、５１．９１ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液（１００ｍＬ）に、氷冷下、水素化ナトリウム（２．４３０ｇ、６０％換算として６０．７４ｍｍｏｌ）を分けて添加し、室温で反応液を１５分攪拌した。続いて化合物５ｂ（１８．２４ｇ、６０．７４ｍｍｏｌ）のジオキサン溶液（６０ｍＬ）を加え、５０℃で反応液を２時間攪拌した。反応液に氷水（３００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ×２）で目的化合物を抽出した。有機層を飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、有機層の溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取（シリカゲル２００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝４／１〜酢酸エチルｏｎｌｙ）で精製し、淡黄褐色液体である化合物１９（１４．２１ｇ、収率８１．６％）を得た。
【０１０９】
工程８
Ａｒ雰囲気下、化合物１９（１４．２１ｇ、４３．６７ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（３７５ｍＬ）に、カリウムｔ−ブトキシド（４９．００ｇ、４３６．７ｍｍｏｌ）を添加し、６０℃で反応液を３０分間攪拌した。反応液を氷水中（１Ｌ）に注ぎ込み、酢酸エチル（５００ｍＬ×４）で目的化合物を抽出した。有機層を飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後、有機層の溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取（シリカゲル２００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝１／１〜酢酸エチルｏｎｌｙ）で精製し、淡黄色液体である化合物１１’’、（４．２０１ｇ、収率３７．１％）を得た。
【０１１０】
工程９
Ａｒ雰囲気下、化合物４（３．１８５ｇ、１５．７２ｍｍｏｌ）、化合物１１’’（４．２０１ｇ、１５．７２ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（６．１８５ｇ、２３．５８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍＬ）に、氷冷下、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、４．７６８ｇ、２３．５８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２３ｍＬ）を滴下し、室温で反応液を１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を中圧分取（シリカゲル２００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝４／１〜１／１、２回）で精製し、微黄色液体である化合物１２’’、（４３１ｍｇ、収率６．１％）を得た。
【０１１１】
工程１０
化合物１２’’（４３０ｍｇ、０．９５１５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（４．３ｍＬ）に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（９．０５ｍｇ、０．０４５７ｍｍｏｌ）を加え、室温で反応液を１８時間攪拌した。反応液を更に６０℃で４時間撹拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を中圧分取（シリカゲル６０ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１〜酢酸エチルｏｎｌｙ）で精製し、無色液体である化合物１３’’、（２４２ｍｇ、収率６９．２％）を得た。
【０１１２】
工程１１
化合物１３’’（１４０．６ｍｇ、０．３８２２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３８６．７ｍｇ、３．８２２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（４．６７ｍｇ、０．０３８２２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（３ｍＬ）に、−１０℃でｐ−トルエンスルホニルクロライド（１０９．３ｍｇ、０．５７３４ｍｍｏｌ）を添加した。ｐ−トルエンスルホニルクロライドを添加した後、−１０℃で反応液を１６時間撹拌した。反応液に氷水（２０ｍＬ）を注ぎ込み、塩化メチレン（２０ｍＬ）で目的化合物を抽出した。有機層を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、有機層の溶媒を減圧留去し、赤褐色で粘稠な液体である化合物１４’’（２０１．２ｍｇ、粗収率１００．８％）を得た。化合物１４’’は、クルードのまま直ちに次工程に供した。
【０１１３】
工程１２
クルードな化合物１４’’（１９５ｍｇ、Ｎｅｔ＝１９３．５ｍｇ，０．３７０６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、１ＭのＴＢＡＦ／ＴＨＦ（２ｍＬ）、ＴＢＡＦ・ｘＨ２Ｏ（５００ｍｇ）を加え、室温で反応液を２時間攪拌した。反応液に氷水（５０ｍＬ）を注ぎ込み、酢酸エチル（５０ｍＬ）で目的化合物を抽出した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、有機層の溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取（シリカゲル６０ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝４／１〜１／１）で精製し、化合物１３’’（５０ｍｇ）から別途調製及び精製したロットとあわせて赤褐色液体である化合物１５’’（ＢＭＳ−Ｐ）（４７．６ｍｇ、収率２５．４％）を得た。
【０１１４】
ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に対する結合親和性の評価
被験物質及び陽性物質のｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅを作成し，被験物質及び陽性物質がトレーサーとミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１（レセプター）との結合を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０値）及び絶対阻害定数（Ｋｉ）を算出した。被験物質としては、［１８Ｆ］ＢＭＳ−７４７１５８−０２（２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−クロロ−５−［４−（２−フルオロ−エトキシメチル）−ベンジルオキシ］−２Ｈ−ピリダジン−３−オン、以下、「ＢＭＳ」という場合がある。）、ＢＣＰＰ−ＥＦ、ＢＣＰＰ−ＢＦ、ＢＣＰＰ−ＰＦ、ＢＣＰＰ−ＥＭ及びＢＭＳ−Ｐを用いた。詳細を以下に示す。
【０１１５】
ミトコンドリア画分原液の調製
動物組織を秤量（湿重量）し、２倍量のホモジネート緩衝液（２５０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース、１ｍｍｏｌ／Ｌのコハク酸及び０．２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡの１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ、７．４０））を加え、氷冷下でホモジナイズした。その後、ホモジナイズした懸濁液を遠心分離した（１２００×ｇ、４°Ｃ、２０分間）。上清を採取し、遠心分離した（２６０００×ｇ、４°Ｃ、１５分間）。沈殿している残渣を採取し、１００ｍｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｑ．／ｍＬとなるようにホモジネート緩衝液を加えホモジナイズした。得られたミトコンドリア画分原液は使用時まで−８０°Ｃに保存した。ミトコンドリア画分のタンパク質濃度はＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定した。動物組織は、ラットの脳及びウシの心臓を用いた。
【０１１６】
ミトコンドリア画分溶液の調製
上記ミトコンドリア画分原液を緩衝液で希釈することによって、最終濃度の２倍濃度のミトコンドリア画分溶液を調製した（用時調製）。ミトコンドリア画分溶液の最終濃度は、４５μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬとした。
【０１１７】
被験物質溶液の調製
被験物質をＤＭＳＯで段階希釈することによって、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した各濃度の溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０倍希釈することによって最終濃度の１０倍濃度の被験物質溶液を調製した（用時調製）。
被験物質の最終濃度は、以下の濃度範囲とした：
ＢＭＳ            ；３×１０−１１〜３×１０−８ｍｏｌ／Ｌ
ＢＣＰＰ−ＥＦ    ；１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ
ＢＣＰＰ−ＢＦ    ；３×１０−１１〜３×１０−８ｍｏｌ／Ｌ
ＢＣＰＰ−ＰＦ    ；１×１０−１０〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ
ＢＣＰＰ−ＥＭ    ；３×１０−１０〜３×１０−７ｍｏｌ／Ｌ
ＢＭＳ―Ｐ        ；１×１０−７〜１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ。
【０１１８】
陽性物質溶液の調製
陽性物質を秤量し、ＤＭＳＯで溶解した。得られた溶液をＤＭＳＯで段階希釈することによって、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した各濃度の溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０倍希釈することによって、最終濃度の１０倍濃度の陽性物質溶液を調製した（用時調製）。陽性物質は、ロテノンを用いた。陽性物質の最終濃度は、３×１０−１１〜３×１０−８ｍｏｌ／Ｌとした。
【０１１９】
置換物質溶液の調製
置換物質を秤量し、ＤＭＳＯで溶解することによって、最終濃度の１００倍濃度の溶液を調製した。さらに、調製した溶液を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０倍希釈することによって最終濃度の１０倍濃度の置換物質溶液を調製した（用時調製）。置換物質は、ロテノンを用いた。置換物質の最終濃度は、１×１０−５ｍｏｌ／Ｌとした。
【０１２０】
トレーサー溶液の調製
トレーサー原液を緩衝液で希釈することによって、最終濃度の１０倍濃度のトレーサー溶液を調製した（用時調製）。トレーサーは、Ｄｉｈｙｄｒｏｒｏｔｅｎｏｎｅ  ［２−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−３Ｈ（Ｎ）］を用いた。
トレーサーの最終濃度は、１回目が４．５ｎｍｏｌ／Ｌであり、２回目が４．４ｎｍｏｌ／Ｌであり、３回目が４．５ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【０１２１】
測定手順
以下の順序に従い測定を実施した。各濃度において２例サンプルを調製し、それぞれ３回測定した。
１：非特異的結合を算出するためのチューブには、置換物質溶液を１００μＬ添加した（ＤＭＳＯの最終濃度：１％）。総結合を算出するためのチューブには、１０％ＤＭＳＯを１００μＬ添加した（ＤＭＳＯの最終濃度：１％）。被験物質又は陽性物質の阻害率を算出するためのチューブには、被験物質溶液又は陽性物質溶液を、それぞれ１００μＬ添加した（ＤＭＳＯの最終濃度：１％）。
２：各チューブに緩衝液（３００μＬ）を添加した。
３：各チューブにトレーサー溶液（１００μＬ）を添加した。
４：各チューブにミトコンドリア画分溶液（５００μＬ）を添加した。
５：各チューブ含まれる反応液を２２°Ｃで３０分間インキュベートした。
６：反応液をセルハーベスターによって濾過（ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ）し、濾過した濾紙を５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ、７．４０、３ｍＬ）で３回洗浄した。
７：測定するためのバイアルビンに、濾紙を移し、液体シンチレーター（ＰＩＣＯ−ＦＬＵＯＲＴＭ  ＰＬＵＳ、５ｍＬ）を添加し、液体シンチレーションカウンターで、放射能量を測定（測定時間、２分間）した。
【０１２２】
阻害率の算出
阻害率は、「１００−結合率」の式によって算出した。
結合率：［（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ）］×１００（％）
Ｂ    ：被験物質存在下での結合放射能量（個別値）
Ｂ０    ：被験物質非存在下での総結合放射能量（平均値）
Ｎ    ：非特異的結合放射能量（平均値）
阻害率が０％以下の場合には０％として、１００％を超えた場合には１００％として阻害率を算出した。
陽性物質に関しても被験物質と同様に阻害率を算出した。
【０１２３】
Ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅの作成（ＩＣ５０値の算出）
Ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅは、被験物質存在下での特異的結合放射能（Ｂ−Ｎ）と非存在下での総結合放射能（Ｂ０−Ｎ）との比（（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ））をｌｏｇｉｔ変換した後、被験物質の最終濃度の常用対数値に対してプロットするｌｏｇｉｔ−ｌｏｇモデルにあてはめて作成した。
Ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅの回帰は、次の回帰式を用いた。
Ｙ＝ａＸ＋ｂ
（Ｙ＝ｌｏｇｉｔ  ｙ＝ｌｎ（ｙ／（１−ｙ））、ｙ＝（Ｂ−Ｎ）／（Ｂ０−Ｎ））
（Ｘ＝ｌｏｇ  ｘ、ｘは被験物質の最終濃度を示す。）
（ａ＝定数、ｂ＝定数）
得られた回帰式から、ＩＣ５０値を算出した。回帰の際、被験物質の最終濃度における阻害率平均が５％〜９５％の範囲を超えたものについては採用せず、範囲内の連続して増加する阻害率を用いてＩＣ５０値を算出することとした。
【０１２４】
Ｋｉ値の算出
ＩＣ５０値の算出の試験に用いたトレーサー濃度（Ｌ）、得られたＩＣ５０値及び、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析の試験により求めたトレーサーのミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に対するＫｄ値を用いて、次式より被験物質及び陽性物質のＫｉ値を算出した。
【数１】
2015078149.tif 000031
【０１２５】
Ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｕｒｖｅを図１に示す。いずれの被験物質においても、濃度依存的にミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に結合することが分かった。ＢＣＰＰ−ＢＦが、最も低いＩＣ５０を示しており、ミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に対する親和性が高いことが示唆された。一方、ＢＭＳ−Ｐは、他の被験物質よりも高いＩＣ５０を示しており、弱い親和性でミトコンドリアＣｏｍｐｌｅｘ−１に結合することが示唆された。
【０１２６】
マウスを用いた癌治療の効果の判定
腫瘍体積の計測
げっ歯類の上皮細胞由来の悪性腫瘍であって、放射線感受性が高い細胞であるＳＣＣＶＩＩ細胞（１×１０５個／０．５ｍＬ）を、雌のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（８週齢）の後肢大腿部の皮下に移植した。
定期的にノギスで腫瘍を計測し、腫瘍体積（Ｔｖｏｌ）を以下の計算式によって算出した。
Ｔｖｏｌ＝πｌｗｈ／６（ｍｍ３）（ｌ＝長径（ｍｍ）、ｗ＝幅（ｍｍ）、ｈ＝高さ（ｍｍ））
腫瘍体積の計測は、後述するＸ線の照射による癌治療を施してから１４日目まで行った。その結果を図２に示す。
【０１２７】
Ｘ線の照射による癌治療
腫瘍体積がおおよそ１００ｍｍ３に達した時点で、エネルギーが２５０ｋｅＶであるＸ線を照射できる装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＭＢＲ−１５２０Ｒ−３）を使用して、マウスの腫瘍部位に１．２Ｇｙ／分の線量率でＸ線照射による癌治療を施した。Ｘ線照射の条件として、非照射（０Ｇｙ、コントロール）、６Ｇｙ、１５Ｇｙ及び３０Ｇｙの４条件を設定し、照射処理後も定期的に上述の方法に準じて腫瘍体積を計測した。
【０１２８】
ＰＥＴ計測による、癌治療の効果の判定
Ｘ線照射の２日後及び７日後に、腫瘍組織を有するマウス（担癌マウス）をイソフルレンのガスによって麻酔した。その後、動物用ＰＥＴカメラ（ＨＡＭＡＭＡＴＳＵ  ＳＨＲ−３８０００）のガントリー内に１度に４匹のマウスを固定した。吸収補正のために６８Ｇｅ−６８Ｇａの校正線源で１５分間のトランスミッション計測を実施した後、マウスの尾静脈からおおよそ５ＭＢｑ／０．２ｍＬの［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦを投与して、６０分間のダイナミックエミッション計測を実施した。マウスの腫瘍組織における、放射線治療の効果を示すＰＥＴ画像を図３に示す。
ＰＥＴ計測が終了した後、麻酔を施したまま固定台ごと小動物用Ｘ−ＣＴ（ＳＨＩＭＡＤＺ  ＣｌａｉｒｖｉｖｏＣＴ）に移動させて、１０分間のＣＴ計測を実施した。ＣＴ計測で得られた形態画像（Ｘ−ＣＴ画像）を収集し、［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦを投与してから４０〜６０分後のＰＥＴ集積画像を、Ｘ−ＣＴ画像に重ね合わせ、がん組織のＰＥＴ画像を同定した。
上記癌組織のＰＥＴ画像上に関心領域を設定して、各個体の体重と投与放射能量で正規化した値を、癌組織への［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦの集積量とした。結果を図４に示す。
【０１２９】
結果
マウスの後肢大腿部に移植したがん細胞の増殖速度は、放射線の照射線量に応じて低下したことが分かった（図２）。
放射線治療の前には［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦを投与しても腫瘍組織への集積が認められず、ＰＥＴ画像において腫瘍組織の部分が“陰性画像”であった。しかし、放射線照射の２日後において、腫瘍組織への［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦの集積が増加して“陽性画像”として治療効果が得られている腫瘍組織の部分を検出できた。放射線の照射線量が増加するに伴い［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦの集積の増加が認められた（図３及び４）。さらに、その照射線量に比例した［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦの集積の増加は、放射線照射の７日後まで継続した（図３及び４）。
以上のことから、［１８Ｆ］ＢＣＰＰ−ＥＦ等の化合物（１−０）を含む診断剤は、癌治療を開始した早期の時期に、治療効果を診断できることが示された。
【図１】
2015078149.tif 000035
【図２】
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【図４】
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【図３】
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