(57)【要約】【課題】  細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞に対して、従来のガラス化法における急速凍結による不都合を回避し、細胞生存率の高い、新しい凍結保存方法を提供すること。【解決手段】  細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程、培地がガラス化溶液によって置換された培養細胞を、気体雰囲気中で冷却する工程、を含む、培養細胞を緩慢ガラス化する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程、
培地がガラス化溶液によって置換された培養細胞を、気体雰囲気中で冷却する工程、
を含む、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞を、緩慢ガラス化する方法。
【請求項２】
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程が、
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、Ｃ２〜Ｃ４のポリオールを含む平衡液に置換する工程、
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞において、培地と置換された平衡液を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程、
を含む工程によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の方法によって、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態の緩慢ガラス化された培養細胞を、製造する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって得られた緩慢ガラス化した培養細胞を、液体窒素中又は液体窒素から気化した低温気体窒素中で保存する工程、
を含む、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞を凍結保存する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法によって凍結保存された培養細胞を、解凍する工程、
を含む、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である、生存した培養細胞を製造する方法。
【請求項６】
凍結保存された培養細胞を、解凍する工程が、
凍結保存された培養細胞に、糖又は糖アルコールを含む融解液を添加して解凍する工程、
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
０．０７〜１．００℃／ｓｅｃの範囲の降温速度で冷却する工程である、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
培養細胞を、断熱容器中において、液体窒素の液面の上方に設置して、液体窒素の液面からの高さを変化させることによって培養細胞の降温速度を調整して、液体窒素から気化した低温気体窒素によって冷却する工程である、
請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
平衡液が、１０〜３０質量％のＣ２〜Ｃ４のポリオールを含む培地である、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ２〜Ｃ４のポリオールが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、及びグリセリンからなる群から選択された１種以上である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ガラス化溶液が、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを５〜１５質量％の濃度で含む培地である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
融解液を添加して解凍する工程が、２０〜３８℃の範囲の温度に加温された融解液を、２０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加して、解凍する工程である、請求項６〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
融解液が、０．５〜１．２Ｍの糖又は糖アルコールを含む培地である、請求項６〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
糖又は糖アルコールが、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、マルトース、フルクトース、イヌリン、フルクタンからなる群から選択された糖又は糖アルコールである、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含む、細胞シート又は三次元細胞培養体用緩慢ガラス化剤。
【請求項１６】
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンにおいて、アミノ基に対するカルボキシル基の比率（カルボキシル基／アミノ基）が０．８〜１９の範囲にある、請求項１５に記載の緩慢ガラス化剤。
【請求項１７】
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンが、
ε−ポリ−Ｌ−リジンのアミノ基と、無水ジカルボン酸との反応生成物によって、アミノ基の位置にカルボキシル基が導入されてなる、請求項１５〜１６のいずれかに記載の緩慢ガラス化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞シート及び三次元細胞培養体の凍結保存のための緩慢ガラス化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が凍結される際には、水が結晶化することによって、細胞が損傷を受けるとされている。そのために、水の結晶化を防いで、水がいわゆるガラス状態のままで固体となることが、細胞凍結技術の目標とされている。従来から、細胞の凍結保存のためには、細胞をガラス化剤（ガラス化液）に懸濁し、素早く液体窒素中にバイアルごと浸漬し、水の結晶化が成長する時間を与えないように、急速凍結することによって、水をガラス化しようと試みられてきた。
【０００３】
従来から知られているガラス化液として、ＤＡＰ２１３がある。これはマウスの受精卵のガラス化用に開発されたものであり、数マイクロリットルという微量の場合にのみが想定されている。しかし、そのために、例えば２００マイクロリットル程度に液量が増えると、ガラス化状態が不安定となり、融解時の再結晶化が問題となる。また、含有されるＤＭＳＯには分化への悪影響が懸念されており、アセトアミドには発がん性が懸念されている。また、ガラス化を防ぐために必然的に、高濃度で使用され、結果として高浸透圧で使用されることから、毒性が高いという問題がある。さらに、例えばマウス受精卵においては、６０〜１０００℃／ｓｅｃの凍結速度が要求されている。
【０００４】
このＤＡＰ２１３を含めて、従来のガラス化剤（ガラス化液）は、いずれも、素早い凍結操作が必要となり、熟練の技能が必要となるという不都合があった。また、高濃度高浸透圧での使用による毒性が懸念されていた。また、凍結保存後の融解時にも、再結晶化を防ぐ為に、急速な解凍が必要とされるという不都合があった。
【０００５】
このような急速凍結と急速解凍は、ガラス化のために当然のことであるとされながらも、液体窒素の突沸によって細胞やディッシュが物理的に損傷するなどのダメージが、伴うものであった。
【０００６】
動物幹細胞を分散懸濁して急速凍結して保存するための保存液の成分として、カルボキシル化したε−ポリ−Ｌ−リジンが報告されている（特許文献１）。しかし、このカルボキシル化したε−ポリ−Ｌ−リジンを使用して、三次元細胞培養体となった細胞を緩慢ガラス化できることは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−３０５５７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔ．  Ｆｕｊｉｏｋａ，  Ｋ．  Ｙａｓｕｃｈｉｋａ，  Ｙ．  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｎ．  Ｎａｋａｔｓｕｊｉ，  Ｈ．  Ｓｕｅｍｏｒｉ，  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ４８  （２００４）  １１４９-１１５４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、従来のガラス化方法は、ガラス化剤を使用して急速凍結することによって行われるものであった。しかし、従来のガラス化剤の使用と急速凍結は、細胞への毒性や分化への影響が懸念されること、技能の熟練が要求されること、急速凍結や急速解凍に伴う物理的なダメージがあることなどの不都合があった。そして、細胞シート及び三次元細胞培養体への物理的ダメージは、従来のガラス化法では、ほとんど不可避のものであった。
したがって、本発明の目的は、これらの不都合を回避しつつ、細胞生存率の高い、細胞シート及び三次元細胞培養体を破損することなくガラス化可能な、新しい凍結保存方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究の結果、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンをガラス化剤として使用して、細胞シート及び三次元細胞培養体を急速凍結することなく、気体雰囲気中で緩慢ガラス化を行うことによって、従来のガラス化法における急速凍結に伴う物理的なダメージを回避しつつ、高い生存率を達成することができることを見いだして、本発明に到達した。また、この操作は、急速凍結を伴わないことから、高度な熟練が要求されないものとなっていた。
【００１１】
したがって、本発明は、次の（１）〜にある。
（１）
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程、
培地がガラス化溶液によって置換された培養細胞を、気体雰囲気中で冷却する工程、
を含む、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞を、緩慢ガラス化する方法。
（２）
（１）に記載の方法によって、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である緩慢ガラス化された培養細胞を、製造する方法。
（３）
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
０．０７〜１．００℃／ｓｅｃの範囲の降温速度で冷却する工程である、
（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
０．０８〜１．００℃／ｓｅｃの範囲の降温速度で冷却する工程である、
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
培養細胞を、液体窒素から気化した低温気体窒素によって冷却する工程である、
（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
培養細胞を、断熱容器中において、液体窒素の液面の上方に設置して、液体窒素から気化した低温気体窒素によって冷却する工程である、
（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、
培養細胞を、断熱容器中において、液体窒素の液面の上方に設置して、液体窒素の液面からの高さを変化させることによって培養細胞の降温速度を調整して、液体窒素から気化した低温気体窒素によって冷却する工程である、
（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって緩慢ガラス化した培養細胞を、液体窒素中又は液体窒素から気化した低温気体窒素中で保存する工程、
を含む、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞を凍結保存する方法。
【００１２】
さらに、本発明は、次の（１１）〜にもある。
（１１）
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程が、
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、Ｃ２〜Ｃ４のポリオールを含む平衡液に置換する工程、
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞において、培地と置換された平衡液を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程、
を含む工程によって行われる、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１２）
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、平衡液に置換する工程が、
２０〜３０℃の範囲の温度の平衡液を、２０〜３０℃の範囲の周囲温度で置換することによって行われる、（１１）に記載の方法。
（１３）
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、平衡液に置換する工程が、
５分〜６０分の範囲の時間で行われる、（１１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）
平衡液が、１０〜３０質量％のＣ２〜Ｃ４のポリオールを含む培地である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）
Ｃ２〜Ｃ４のポリオールが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、及びグリセリンからなる群から選択された１種以上である、（１１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）
平衡液が、３００〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞において、培地と置換された平衡液を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程が、
０℃〜１０℃の範囲の温度のガラス化溶液を、０℃〜１０℃の範囲の周囲温度で置換することによって行われる、（１１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）
細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞において、培地と置換された平衡液を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液と、置換する工程が、
１分〜３０分の範囲の時間で行われる、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）
ガラス化溶液が、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを５〜１５質量％の濃度で含む培地である、（１１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
【００１３】
さらに、本発明は、次の（２１）〜にもある。
（２１）
（１）〜（７）及び（１１）〜（１７）のいずれかに記載の方法によってガラス化された細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞を、凍結保存する工程、
凍結保存された培養細胞を、解凍する工程、
を含む、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である、生存した培養細胞を製造する方法。
（２２）
凍結保存された培養細胞を、解凍する工程が、
凍結保存された培養細胞に、糖又は糖アルコールを含む融解液を添加して解凍する工程、
を含む、（２１）に記載の方法。
（２３）
融解液を添加して解凍する工程が、２０〜３８℃の範囲の温度に加温された融解液を、２０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加して、解凍する工程である、（２２）に記載の方法。
（２４）
融解液が、０．５〜１．２Ｍの糖又は糖アルコールを含む培地である、（２２）〜（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５）
糖又は糖アルコールが、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、マルトース、フルクトース、イヌリン、フルクタンからなる群から選択された糖又は糖アルコールである、（２２）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）
融解液が、３００〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する、（２２）〜（２５）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
さらに、本発明は、次の（３１）〜にもある。
（３１）
凍結保存された培養細胞を、解凍する工程の後に、
糖又は糖アルコールを含む融解液を添加して解凍された培養細胞に、糖又は糖アルコールを融解液の濃度の０．３倍〜０．６倍の濃度で含み且つ融解液と同じ組成の培地を含む希釈液を添加する工程、
を含む、（２１）〜（２６）に記載の方法。
（３２）
希釈液を添加する工程が、２０〜３８℃の範囲の温度に加温された希釈液を、２０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加する工程である、（３１）に記載の方法。
（３３）
希釈液が、２５０〜５００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する、（３１）〜（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）
希釈液を添加する工程の後に、
希釈液を廃棄した後に、培養細胞に、培地からなる洗浄液を添加する工程、
を含む、（３１）〜（３３）のいずれかに記載の方法。
（３５）
洗浄液を添加する工程が、２０〜３８℃の範囲の温度に加温された希釈液を、２０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加する工程である、（３４）に記載の方法。
（３６）
培養細胞に、培地からなる洗浄液を添加する工程の後に、
培地を含む洗浄液を廃棄した後に、培養細胞に、新たに、培地からなる洗浄液を添加する工程、
を含む、（３１）〜（３５）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
さらに、本発明は、次の（４１）〜にもある。
（４１）
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含む、細胞シート又は三次元細胞培養体用緩慢ガラス化剤。
（４２）
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンにおいて、アミノ基に対するカルボキシル基の比率（カルボキシル基／アミノ基）が０．８〜１９の範囲にある、（４１）に記載の細胞シート又は三次元細胞培養体用緩慢ガラス化剤。
（４３）
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンが、
ε−ポリ−Ｌ−リジンのアミノ基と、無水ジカルボン酸との反応生成物によって、アミノ基の位置にカルボキシル基が導入されてなる、（４１）〜（４２）のいずれかに記載のの細胞シート又は三次元細胞培養体用緩慢ガラス化剤。
（４４）
無水ジカルボン酸が、Ｃ４〜Ｃ８の無水ジカルボン酸である、（４３）に記載の細胞シート又は三次元細胞培養体用緩慢ガラス化剤。
（４５）
（４１）〜（４４）のいずれかに記載の培養細胞用緩慢ガラス化剤を、５〜１５質量％の濃度で含む培地である、細胞シート又は三次元細胞培養体用緩慢ガラス化剤。
（４６）
（４１）〜（４５）のいずれかに記載の緩慢ガラス化剤の、細胞シート又は三次元細胞培養体形態の培養細胞を緩慢ガラス化するための使用（ｕｓｅ）。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、従来のガラス化法では、急速凍結による物理的ダメージの大きさから凍結保存が難しかった、細胞シート及び三次元細胞培養体などの形態の培養細胞に対して凍結保存の手段を提供することができる。また、本発明は、急速凍結を伴わないことから、高度な熟練が要求されないものとなっており、高度な研究施設にとどまることなく、一般的な医療現場においても、広く普及可能な技術となっている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、緩慢ガラス化装置の断面を示した説明図である。
【図２ａ】図２ａは、ガラス化液１０分後未凍結のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図２ｂ】図２ｂは、ガラス化液１０分後未凍結のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図２ｃ】図２ｃは、ガラス化液１０分後未凍結のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図３ａ】図３ａは、０．１ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図３ｂ】図３ｂは、０．１ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図３ｃ】図３ｃは、０．１ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図４ａ】図４ａは、０．５ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図４ｂ】図４ｂは、０．５ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図４ｃ】図４ｃは、０．５ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図５ａ】図５ａは、１．０ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図５ｂ】図５ｂは、１．０ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図５ｃ】図５ｃは、１．０ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図６ａ】図６ａは、６．０ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図６ｂ】図６ｂは、６．０ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図６ｃ】図６ｃは、６．０ｃｍガラス化解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図７ａ】図７ａは、−８０℃フリーザー凍結解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図７ｂ】図７ｂは、−８０℃フリーザー凍結解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図７ｃ】図７ｃは、−８０℃フリーザー凍結解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙの結果を示す蛍光写真である。
【図８】図８は、降温速度と解凍直後の生存率の関係を示すグラフである。
【図９】図９は、降温速度と解凍後１日培養後の生存率の関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ガラス化保存後の幹細胞の分化を示す光学顕微鏡による染色写真である。
【図１１】図１１は、３Ｄ培養用ポリスチレンの構造を説明する概念図である。
【図１２】図１２は、ヒト培養皮膚組織のガラス化実験でのＭＴＴアッセイの結果のグラフである。
【図１３】図１３は、未凍結のヒト培養皮膚組織の断面の光学顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、緩慢ガラス化したヒト培養皮膚組織の断面の光学顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、ガラス化と解凍のプロトコルをまとめた説明図（Ｓｃｈｅｍｅ２）である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施他の形態に限定されるものではない。
【００１９】
［緩慢ガラス化］
本発明による培養細胞の緩慢ガラス化は、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞の培地を、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含むガラス化溶液（ガラス化液）と、置換する工程、培地がガラス化溶液によって置換された培養細胞を、気体雰囲気中で冷却する工程、を含む方法によって、行うことができる。この方法によれば、急速凍結に伴う物理的なダメージを回避しつつ、高い生存率を達成することができ、急速凍結では凍結保存が難しかった、細胞シート及び三次元細胞培養体の形態の細胞に対して、有効なガラス化を行うことができる。
【００２０】
［緩慢ガラス化装置］
本発明の好適な実施の態様において、使用可能な緩慢ガラス化装置の断面の説明図を、図１に示す。断熱性の容器１の中には、液体窒素３が入れられている。液体窒素３の液面から高さｈの位置に、トレイ５が位置している。トレイ５は、昇降軸７を介して昇降装置９から吊り下げられている。昇降軸７に平行して記載された両矢印が示すように、昇降装置９によってトレイ５は上下することができて、トレイ５の底面は液面からの高さｈを変化させることができる。トレイ５には、細胞培養用のディッシュ１１を載置することができる。ディッシュ１１には、図示されないガラス化液（ガラス化溶液）や細胞シート又は三次元細胞培養体を、細胞培養に適した状態で入れることができる。ディッシュ１１の中のガラス化液や細胞シート又は三次元細胞培養体の温度は、液面からの高さｈを変化させることによって、調節することができる。図示されないガラス化液や細胞シート又は三次元細胞培養体には、温度測定のための熱電対を設置することができ、この熱電対を通じて、ディッシュ１１に入ったガラス化液や細胞シート又は三次元細胞培養体の温度を測定することができる。この装置は、簡便な構造でありながら、緩慢ガラス化に必要な温度調節を確実に行うことができ、ディッシュ１１の中の培養細胞がガラス化した後に、トレイ５をそのまま液体窒素中に浸漬して、保存を行うことができる。
【００２１】
昇降軸７は、棒状の軸であってもよく、ワイヤ状の軸であってもよく、また、複数を設けることもできる。また、昇降軸７は、トレイ５を昇降させて液面からの高さを変化させることができればよいので、軸の形状に代えて、カゴ状、板状、壁状、円筒状などの形状で、トレイ５を囲んで固定するものであってもよい。トレイ５は、ディッシュ１１を載置あるいは固定することができるものであればよく、トレイ状であってもよいし、その他の形状の固定器具であってもよい。また、トレイ５は、培養細胞の温度調節が適切に行える範囲であれば、多段にして設けてもよい。図示されない熱電対は、温度測定の手段であるから、適切に温度測定できるセンサーであれば、熱電対に限られず、使用することができる。また、適切に温度測定できる手段であれば、直接接触することがない手段でも使用することができる。昇降装置９は、昇降軸７を介してトレイ５を必要に応じて昇降させることができる装置であれば使用することができ、緩慢ガラス化の操作を終えた後に、取り外し可能なものであってもよい。ディッシュ１１は、培地がガラス化溶液に置換された培養細胞を収納する容器であって、トレイ５に載置又は固定して、降温調整が適切に行えるものであれば、ディッシュ状の形状に限られずに、使用することができる。
【００２２】
なお、本発明に使用可能な緩慢ガラス化装置は、培養細胞を気体雰囲気中で冷却する工程が、降温速度を制御しつつ行うことができるものであればよく、図１に示した装置に限られるものではない。例えば、温度制御された冷却用気体を、培養細胞のディッシュ等に導入接触することができるものあればよい。
【００２３】
［培養細胞］
本発明によれば、急速凍結による物理的ダメージを回避できるために、浮遊細胞の形態の培養細胞よりもガラス化が困難である、細胞シート、三次元細胞培養体などの形態の培養細胞に対して、好適に実施することができる。細胞シートについては、多層を形成して厚みがあるもの、細胞が包埋されているマトリクスに厚みがあるものについても、好適にガラス化することができ、例えば、０．０１ｍｍ以上、０．０５ｍｍ以上、０．１ｍｍ以上の厚みであって、例えば、５ｍｍ以下、２．５ｍｍ以下、１ｍｍ以下の厚みを有するシート形状の培養細胞を、ガラス化することができる。例えば、０．０１〜５ｍｍ、０．０５〜５ｍｍ、０．０５〜２．５ｍｍ、０．０５〜１ｍｍ、０．１〜２．５ｍｍ、０．１〜１ｍｍの厚みのシート形状の培養細胞をガラス化することができる。このようなシート形状の培養細胞は、細胞シートということもできるが、その厚みは、単層の細胞層の厚みを遥かに超える範囲に細胞が配置されているのであるから、これを三次元細胞培養体ということもできる。また、細胞培養体としては、シート形状のものの他に、例えば、三次元メッシュ構造の構造体に細胞を播種して培養している形態のものを挙げることができる。このような三次元メッシュ構造体は、この構造体のまま生体に埋め込んで、組織再生の足場とすることができる点で、特に有用なものである。このような三次元メッシュ構造は、例えば、繊維径５０μｍ〜３００μｍの繊維が、孔径５０μｍ〜５００μｍのメッシュ構造となるように、立体的に編み合わされてなる。この構造体の全体形状は、包埋する組織の形状にあわせて、適宜選択することができるが、例えば、略球形、略円柱形、略円盤型などとすることができ、外形の高さ又は厚みを、例えば、０．１ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、例えば、１０ｍｍ以下、５ｍｍ以下、２．５ｍｍ以下、１ｍｍ以下とすることができる。例えば、三次元構造体の高さ又は厚みを、例えば、０．１〜５ｍｍ、０．５〜５ｍｍ、０．５〜２．５ｍｍ、０．５〜１ｍｍ、１〜２．５ｍｍとすることができる。
【００２４】
［培地の置換］
培養細胞は、ガラス化に先だって、培地を、培養細胞用緩慢ガラス化溶液に置換される。好適な実施の態様において、培地の置換は、培地を、いったん平衡液に置換し、次に、ガラス化溶液に置換する手順をとることができる。
【００２５】
［平衡液］
好適な実施の態様において、平衡液は、Ｃ２〜Ｃ４のポリオールを含む培地である。Ｃ２〜Ｃ４のポリオールとしては、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、及びグリセリンからなる群から選択された１種以上を挙げることができ、特に、エチレングリコールを挙げることができる。平衡液中に含まれるＣ２〜Ｃ４のポリオールの含有量は、平衡液全体に対して、例えば１０質量％〜３０質量％の範囲、好ましくは１５質量％〜２５質量％の範囲とすることができる。好適な実施の態様において、平衡液は、３００〜２０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲、好ましくは３００〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌ、さらに好ましくは５００〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する。通常、平衡液としては、培養細胞に使用される培地の成分を含み、かつＣ２〜Ｃ４のポリオールを含む溶液が使用される。培地に使用される培地の成分としては、培養細胞に対して使用される通常の培地の成分を使用することができる。
【００２６】
［平衡液への置換］
好適な実施の態様において、平衡液への置換は、培養細胞の培地をいったん廃棄した後に、平衡液を添加することによって行うことができ、例えば２０〜３０℃の範囲の温度の平衡液へと２０〜３０℃の範囲の周囲温度で置換することができ、例えば５〜６０分の範囲の時間をかけて浸透させて置換することができる。
【００２７】
［ガラス化溶液］
ガラス化溶液（ガラス化液）は、ガラス化剤として、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを含んでいる。ガラス化溶液中に含まれるガラス化剤の含有量は、ガラス化溶液全体に対して、例えば、１．０質量％〜２０質量％の範囲、好ましくは５．０質量％〜１５質量％の範囲、さらに好ましくは５．０質量％〜１０質量％の範囲とすることができる。通常、ガラス化溶液としては、培養細胞に使用される培地の成分を含み、かつガラス化剤を含む溶液が使用される。培地に使用される培地の成分としては、培養細胞に対して使用される通常の培地の成分を使用することができる。
【００２８】
［ガラス化溶液への置換］
好適な実施の態様において、ガラス化溶液への置換は、培養細胞の培地をいったん平衡液に置換した後に平衡液を廃棄して、その後、ガラス化溶液を添加することによって行うことができ、例えば０℃〜１０℃の範囲の温度のガラス化溶液へと０℃〜５℃の範囲の周囲温度で置換することができ、例えば１分〜３０分の範囲の時間をかけて浸透させて置換することができる。
【００２９】
［培地］
上記平衡液及びガラス化溶液に使用される培地の成分としては、培養細胞に対して使用される通常の培地の成分を使用することができ、これは対象とする培養細胞に応じて、当業者が適宜選択することができるが、例えば、ＤＭＥＭ培地、ＥＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１２培地、ＴＣ１９９培地、ＧＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地を挙げることができる。
【００３０】
［ガラス化剤］
培養細胞用緩慢ガラス化剤として、カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンが使用される。カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンにおいて、アミノ基に対するカルボキシル基の比率（カルボキシル基／アミノ基）が、例えば０．８〜１９の範囲、好ましくは１．０〜１８の範囲、さらに好ましくは１．５〜１５の範囲とすることができる。
【００３１】
［降温速度］
緩慢ガラス化は、急速冷却することなく、緩慢に冷却することによって、行われる。このような緩慢な冷却における降温速度は、好ましくは、例えば２℃／ｓｅｃ以下、１℃／ｓｅｃ以下、０．６℃／ｓｅｃ以下、例えば０．０７℃／ｓｅｃ以上、０．０８℃／ｓｅｃ以上、例えば０．０７℃／ｓｅｃ〜２℃／ｓｅｃの範囲、０．０８℃／ｓｅｃ〜２℃／ｓｅｃの範囲、０．０８℃／ｓｅｃ〜１℃／ｓｅｃの範囲、０．０８℃／ｓｅｃ〜０．６℃／ｓｅｃの範囲の降温速度とすることができる。例えば、急速な冷却を試みるためにディッシュを直接に液体窒素に浸漬すると、６５℃／ｓｅｃの降温速度などを実現することができるが、本発明の降温速度は、このような降温速度から著しく遅い降温速度である。このような降温温度の範囲とする降温方法としては、例えば上述した緩慢ガラス化装置を使用する方法があるが、これに限られるものではない。
【００３２】
［凍結保存］
緩慢ガラス化された培養細胞は、ガラス化状態のまま、例えば液体窒素中あるいは液体窒素から気化した低温気体窒素中などで、凍結保存することができる。
【００３３】
［解凍］
本発明により緩慢ガラス化されて凍結保存されていた培養細胞は、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態であるにもかかわらず、破損することなく、高い生存率で解凍することができる。解凍の手段としては、公知の手段を使用することができるが、好適な実施の態様において、凍結した培養細胞へ融解液を添加して、解凍することができる。
【００３４】
［融解液］
凍結した培養細胞へ添加する融解液は、糖又は糖アルコールを含む融解液を使用することができる。好適な実施の態様において、融解液は、糖又は糖アルコールを含む培地である。糖又は糖アルコールとしては、例えば、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、マルトース、フルクトース、イヌリン、フルクタンからなる群から選択された糖又は糖アルコールを使用することができる。糖又は糖アルコールの濃度は、例えば０．５〜１．２Ｍ、好ましくは０．８〜１．２Ｍ、さらに好ましくは０．９〜１．１Ｍの範囲の濃度を使用することができる。好適な実施の態様において、融解液は、３００〜２０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲、好ましくは３００〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌ、さらに好ましくは５００〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する。通常、融解液としては、培養細胞に使用される培地の成分を含み、かつ糖又は糖アルコールを含む溶液が使用される。培地に使用される培地の成分としては、培養細胞に対して使用される通常の培地の成分を使用することができ、これらは平衡液及びガラス化溶液について、上述した通りである。
【００３５】
［融解液の添加］
融解液は、凍結した培養細胞に直接に添加することができる。好適な実施の態様において、例えば２０〜３８℃の範囲、好ましくは３０〜３８℃の範囲の温度に加温された融解液を、例えば２０〜３８℃の範囲、好ましくは３０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加して、解凍することができる。
【００３６】
［融解液の希釈］
好適な実施の態様において、融解液を添加して解凍された培養細胞に対して、さらに、融解液を廃棄した後に、希釈液を添加することができる。好適な実施の態様において、希釈液は、糖又は糖アルコールを融解液の濃度の０．３倍〜０．６倍の濃度で含み且つ融解液と同じ組成の培地を含む。希釈液に含まれる糖又は糖アルコールは、好ましくは融解液に含まれる糖又は糖アルコールである。希釈液は、２００〜１０００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲、好ましくは３００〜６００ｍＯｓｍ／Ｌの範囲の浸透圧を有する。好適な実施の態様において、例えば２０〜３８℃の範囲、好ましくは３０〜３８℃の範囲の温度に加温された希釈液を、例えば２０〜３８℃の範囲、好ましくは３０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加することができる。
【００３７】
［洗浄］
好適な実施の態様において、希釈液を添加された培養細胞に対して、さらに、希釈液を廃棄した後に、培地からなる洗浄液を添加することができる。好適な実施の態様において、例えば２０〜３８℃の範囲、好ましくは３０〜３８℃の範囲の温度に加温された洗浄液を、例えば２０〜３８℃の範囲、好ましくは３０〜３８℃の範囲の周囲温度で添加することができる。洗浄液に使用される培地としては、培養細胞に対して使用される通常の培地の成分を使用することができ、これらは平衡液及びガラス化溶液について、上述した通りである。
【００３８】
［好適な実施の一態様］
好適な実施の一態様において、上述の解凍、希釈、洗浄の操作として、例えば、凍結されていた培養細胞を、３７℃で融解液を添加して１分保持した後に取り除き、次に室温で希釈液を添加して３分保持した後に取り除き、次に室温で洗浄液を添加して５分保持した後に取り除く作業を２回（５分×２回）行うことができる。融解液としては、例えば使用している培地に１Ｍスクロースを含有させた溶液を、希釈液としては、例えば使用している培地に０．５Ｍスクロースを含有させた溶液を、洗浄液としては、例えば使用している培地と同じ溶液を、それぞれ使用することができる。
【００３９】
［カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンの合成］
カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジンから出発して、例えば、次のスキーム１にしたがって、合成することができる。
【００４０】
【化１】
2015149905.tif 000002
【００４１】
上記のスキーム１では、ε−ポリ−Ｌ−リジンのアミノ基と、無水ジカルボン酸との反応によって、ε−ポリ−Ｌ−リジンにカルボキシル基が導入されている。例えば、Ｃ４〜Ｃ８の無水ジカルボン酸を使用することができ、好ましくは無水コハク酸を使用することができる。ε−ポリ−Ｌ−リジンのアミノ基のうち、カルボキシル基に置換された割合（百分率）が、６５％であるとき、このカルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンを、ＰＬＬ（０．６５）と記載することがある。ＰＬＬ（０．６５）であれば、アミノ基に対するカルボキシル基の比率（カルボキシル基／アミノ基）は、約１．８６となる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
【００４３】
［１．カルボキシル化ポリリジンの合成］
ε−ポリ−Ｌ−リジン（チッソ、分子量４０００）２５％水溶液を５ｍＬとり、無水コハク酸（和光純薬）を０．５−０．９ｇ添加し、５０℃で１時間反応させ、カルボキシル化ポリリジンを作成した。カルボキシル基の導入量は、アミノ基定量である、ＴＮＢＳ法を用い、アミノ基の減少量より計算し求めた。以下では、カルボキシル基導入前のアミノ基のモル数（１００％）に対して、６５％のモル数のカルボキシル基を導入したものをＰＬＬ（０．６５）と表記する。
【００４４】
［２．ヒト脂肪由来間葉系幹細胞のシート培養］
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ、Ｌｏｎｚａ製）１×１０5を個３．５ｃｍ培養用ディッシュに播種し、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて２週間培養し、コンフルエント状態のシートを作成した。培地は２日に一回交換し、培地交換時にｂＦＧＦを２ｎｇ／ｍＬ添加した。
【００４５】
［３．平衡液、ガラス化液、融解液、希釈液、洗浄液の作成］
平衡液は２０％エチレングリコール／ＤＭＥＭを用いた。
ガラス化液は、以下の三種類を用いた。
・ＤＡＰ２１３（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２Ｍ、アセトアミド１Ｍ、プロピレングリコール３Ｍ／ＤＭＥＭ）：  ＤＡＰ
・エチレングリコール６．５Ｍ・スクロース０．５Ｍ／ＤＭＥＭ溶液：  ０％ＰＬＬ  ６．５Ｍ  ＥＧ  ０．５Ｍ  Ｓｕ
・エチレングリコール６．５Ｍ・スクロース０．５Ｍ・ＰＬＬ（０．６５）１０ｗ／ｗ％  ／ＤＭＥＭ溶液：  １０％ＰＬＬ  ６．５Ｍ  ＥＧ  ０．５Ｍ  Ｓｕ
融解液は１Ｍスクロース／ＤＭＥＭ、希釈液は０．５Ｍスクロース／ＤＭＥＭ、洗浄液はＤＭＥＭを用いた。
【００４６】
［４．ガラス化プロトコルと生存率評価］
ＭＳＣを培養した３．５ｃｍディッシュに平衡液を２ｍＬ添加し、室温で２５分平衡化した。その後、平衡液を除去したのち氷上でガラス化液（３種、各二枚ずつ）０．２ｍＬに置換し、１０分間放置し、細胞内の水を脱水し、ガラス化液中の浸透成分を細胞内に浸透させた。
【００４７】
その後、ＭＳＣを培養したディッシュを緩慢ガラス化装置（図１）に乗せ、底面と液体窒素液面の距離を１ｍｍから６０ｍｍまでコントロールし、その雰囲気の液体窒素蒸気によりガラス化させた。液温は熱電対により測定し、温度が−１００℃まで達した後ディッシュを液体窒素に浸漬して１日液体窒素中で保存した。
【００４８】
図１は、このガラス化に使用した緩慢ガラス化装置の断面を示した説明図である。断熱性の容器１の中には、液体窒素３が入れられている。液体窒素３の液面から高さｈの位置に、トレイ５が位置している。トレイ５は、昇降軸７を介して昇降装置９から吊り下げられている。昇降軸７に平行して記載された両矢印が示すように、昇降装置９によってトレイ５は上下することができて、トレイ５の底面は液面からの高さｈを変化させることができる。トレイ５には、細胞培養用のディッシュ１１を載置することができる。ディッシュ１１には、図示されないガラス化液や細胞シートを、細胞培養に適した状態で入れることができる。ディッシュ１１の中のガラス化液や細胞シートの温度は、液面からの高さｈを変化させることによって、調節することができる。図示されないガラス化液や細胞シートには、温度測定のための熱電対を設置することができ、この熱電対を通じて、ディッシュ１１に入ったガラス化液や細胞シートの温度を測定することができる。
【００４９】
解凍は、以下の要領で行った。あらかじめ暖めた３７℃の融解液を２ｍＬ添加し、１分後、溶解した液を捨てた。続いて希釈液を２ｍＬ加え、３分後、上清を除去し、次に洗浄液を２ｍＬ添加して洗浄した。洗浄操作は２回行った。
その後、１枚はトリプシン溶液を用いてすべて細胞をはく離し、生存率を評価した。もう一枚の方は解凍後翌日（２４時間培養後）にＬｉｖｅ−ｄｅａｄアッセイキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により細胞の生死判定を行った。
【００５０】
これらのガラス化と解凍のプロトコルをスキーム２としてまとめて、図１５に示す。
【００５１】
［５．ガラス化実験と結果］
［５．１：降温速度］
液体窒素液面からの距離ｈ（ｃｍ）とその場の蒸気温度、およびその場でのディッシュ中のガラス化液の降温速度を次の表１に示した。降温速度は、１０℃から−４０℃までの傾きから計算した。
【００５２】
【表１】
2015149905.tif 000003
（Ｄｉｒｅｃｔにディッシュを液体窒素に浸漬した時は６５℃／ｓｅｃ）
【００５３】
液面からの距離が離れるに従って降温速度は小さくなっていることが確認された。６．０ｃｍでは、−８０℃のフリーザーに放置したときと近い値であった。液面から１ｍｍの蒸気での降温速度は０．５７５℃／ｓｅｃであり、ディッシュを液体窒素に直接浸漬した場合の６５℃／ｓｅｃに比べると１００倍程度遅い事がわかった。また、ディッシュがさらされていた窒素蒸気温度は液面から１、５、１０、６０ｍｍの点でそれぞれ−１５８±１．４、−１５２±２．１、−１４５±１．７、−７５±２．８℃であった。
【００５４】
［５．２：Live/Deadアッセイ］
図２は各ガラス化液に１０分間の浸漬後、凍結せずに洗浄した時のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの結果を示す写真である。図２は、カラー写真においては、緑と赤の二重の蛍光染色の写真となっており、緑の蛍光は生存している細胞を示し、赤の蛍光は生存していない細胞を示している。生存率はこれらを計数することによって算出した。この結果から、ＤＡＰは毒性が高く、凍結に供しない場合でも細胞にダメージを与えることがわかる。エチレングリコール系のガラス化液はほとんど細胞にダメージは見られなかったが、ＰＬＬ添加系の方がより生細胞が多かった。
液体窒素液面からの距離０．１ｃｍ、０．５ｃｍ、１．０ｃｍ、６．０ｃｍでガラス化した後、解凍後１日後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの写真を図３、図４、図５、図６にそれぞれ示す。液面から０．１、０．５、１．０ｃｍではＤＡＰのみ生存細胞数が低くなり、エチレングリコール系で高い効果を示すことがわかった。一方、６．０ｃｍ（０．０８３℃／ｓｅｃ）ではカルボキシル化ポリリジン添加系のみで細胞の生存が確認され、カルボキシル化ポリリジンの有用性が示された。一方、−８０℃のフリーザーに放置した場合、（０．０７８℃／ｓｅｃ）はすべての系で細胞のダメージが高かった（図７）。０．０８℃／ｓｅｃあたりがガラス化の安定化の限界であると考えられる。
【００５５】
［５．３：生存率および接着細胞数の評価］
図８に、解凍直後の生存率と降温速度の関係を示した。ＤＡＰおよびＰＬＬ無しの系は降温速度０．０７８および０．０８３℃／ｓｅｃではそれ以上の降温速度に比べて明らかに低い生存率を示した。一方、ＰＬＬ系では０．０８３においても高い生存率であった。このデータは解凍直後の細胞の生存率であるが、場合によってはダメージの大きかった細胞は培養中に接着出来ずに死んでしまうことがある。そこで、図９に解凍後１日培養した後の細胞の生存率を示した。この結果はＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイの結果と一致しており、０．０８３℃／ｓｅｃ以上でＰＬＬ系が高い生存率を示すことがわかり、ＰＬＬの優位性が示された。
【００５６】
［５．４：分化能の維持］
分化誘導をかけることにより骨細胞、脂肪細胞への分化能を評価したところ、図１０に示すように未凍結系、ＤＭＳＯ系とほぼ同様に、多分化能を維持していることが以下のように確認された。骨分化能は、カルシウムの沈着をアリザリンレッドＳ染色により評価した。その結果、いずれの場合も同じく赤く染色されたことによって、骨分化能の維持が確認された。脂肪分化能は、細胞中の脂肪滴をオイルレッドＯを用いて染色して評価した。その結果、いずれの保存液で凍結した場合でも、未凍結系と同じく赤く染色された脂肪滴が確認され、脂肪分化能の維持が確認された。
【００５７】
［６．三次元構造体へ細胞培養した場合のガラス化実験］
［６．１：細胞培養とガラス化実験］
三次元細胞培養用メッシュ（３Ｄ  Ｉｎｓｅｒｔ−ＰＳ、直径５ｍｍ、繊維径１５０μｍ、孔径２００μｍ、ポリスチレン製、３ＤＢｉｏｔｅｋ社、図１１参照）にＡＤＳＣを播種し、３週間培養することで十分に増殖させ、三次元メッシュ状にコンフルエントになった状態を凍結実験に用いた。凍結および解凍は上記細胞シートと同様の条件で行った。液体窒素液面１ｍｍでガラス化凍結を行った。平衡液、ガラス化液、融解液、希釈液、洗浄液は同じものを使用した。
【００５８】
［６．２：結果］
結果は、解凍後、翌日に細胞をすべてトリプシン溶液ではく離し、回収した細胞数と回収した細胞を培養した際の増殖能で評価した。
その結果、次の表２に示すように、ＰＬＬ（０．６５）を１０％添加したガラス化液で未凍結コントロールの７２．３％の回収率を得られた。一方で、ＤＡＰではわずかに０．５％、ＰＬＬ（０．６５）無しのガラス化液では１２％の回収率であった。
【００５９】
【表２】
2015149905.tif 000004
【００６０】
［７．ヒト培養皮膚組織のガラス化実験］
［７．１：ヒト培養皮膚組織のガラス化と解凍］
ヒト培養皮膚組織を使用して、同様に緩慢ガラス化、凍結保存、解凍の実験を行った。
ヒト培養皮膚組織は、約４℃で低温保存されたヒト正常表皮細胞を重層培養したヒト３次元培養表皮モデル（製品名：Ｌａｂｃｙｔｅ  ｅｐｉｍｏｄｅｌ、株式会社ジャパンティッシュエンジニアリング製）（円盤状、直径約６．４ｍｍ、厚さ約１５０μｍ）を入手して、以下の実験に使用した。このヒト培養皮膚組織は、後述の写真で示すように、正常ヒト皮膚の構造に極めて近い多層構造を備えたものである。
ヒト培養皮膚組織のガラス化は、直径５ｍｍのメッシュ上で培養したままでメッシュごと取り外してディッシュに入れて、細胞シートと同様の条件で行った。液体窒素中で１日間、凍結保存した後に、細胞シートと同様の条件で解凍した。解凍後に、ＭＴＴアッセイにより生存率を求めた。
【００６１】
［ＭＴＴアッセイ］
ＭＴＴアッセイの手順は、以下である。
ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を培地に０．５ｍｇ／ｍＬで溶解し、解凍後のｗｅｌｌ（ＰＢＳで洗浄後）に１００ｍＬ添加、３７℃で３時間放置した。皮膚組織を切り出し、２００ｍＬの２−プロパノールに浸漬して２時間抽出を行った。９６ｗｅｌｌマルチプレートリーダーを用いて５４０ｎｍの吸光度から活性を測定し、未凍結の皮膚との比で生存率を算出した。この結果を、図１２に示す。
【００６２】
［ＭＴＴアッセイの結果］
図１２は、ヒト培養皮膚組織のガラス化実験でのＭＴＴアッセイの結果である。ＤＡＰ、０％ＰＬＬ、１０％ＰＬＬの３種類のガラス化液で、液体窒素表面からの高さを１ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍと変化させた条件で凍結したヒト培養皮膚組織に対して、ＭＴＴ法で細胞の生存率を測定した。縦軸は生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を表し、未凍結のコントロールの値を１００％とした。各ガラス化液において、左端のバーは１ｍｍ、中央のバーは５ｍｍ、右端のバーは、１０ｍｍの生存率を示す。１ｍｍではすべてのガラス化液で９０％を超える生存率を示したが、５ｍｍ、１０ｍｍではＤＡＰ＜０％ＰＬＬ＜１０％ＰＬＬとなった。１０％ＣＯＯＨ−ＰＬＬ含有ガラス化液の場合、１０ｍｍでも９０％程度の生存率を示した。
【００６３】
［ヒト培養皮膚組織の凍結の影響］
ヒト培養皮膚組織が、ガラス化によって受けた影響を確認するために、凍結した状態の断面を、HE染色した後に光学顕微鏡によって観察した。図１３は、コントロールとして使用した未凍結のヒト培養皮膚組織の断面の光学顕微鏡写真である。図１４は、ＰＬＬ（０．６５）／ＥＧ／Ｓｕｃのガラス化液（１０％ＰＬＬ）を使用して、液体窒素表面から１ｍｍの高さで冷却し、緩慢ガラス化したヒト培養皮膚組織の断面の光学顕微鏡写真である。このように、本発明による緩慢ガラス化によれば、ヒト培養皮膚組織は、基底層、細胞、顆粒層、有棘層、角質層すべて未凍結とほぼ同様に保たれたものとなっていた。
【００６４】
［８．大きな３次元培養足場に培養した間葉系幹細胞のガラス化実験］
［８．１  ガラス化実験］
上記の「６．三次元構造体へ細胞培養した場合のガラス化実験」で使用したものよりもさらに大きな３次元培養足場に培養した間葉系幹細胞を使用して、同様にガラス化凍結の実験を行った。
使用した３次元培養足場（３ＤＢｉｏｔｅｋ社製、商品名：３ＤＩｎｓｅｒｔ−ＰＳ）は、次のようなサイズである。
厚み１．５ｍｍ、直径２１ｍｍ、ファイバー径３００ｍｍ、孔径３００ｍｍ  
使用した３次元培養足場のモデル構造を図１１に示す。
【００６５】
上記の「６．三次元構造体へ細胞培養した場合のガラス化実験」で使用した直径５ｍｍのサイズの足場材料と同じ材質で出来た上記のサイズの足場材料に、細胞を播種し、２週間培養後、同様の方法でガラス化を行い、解凍した。解凍後播種し、翌日の生存細胞数を数えた。
【００６６】
［８．２  結果］
上記のガラス化実験の結果を、次の表３に示す。
【００６７】
【表３】
2015149905.tif 000005
【００６８】
１０％ＰＬＬ系で、未凍結に非常に近い細胞数がガラス化後も生存していることが確認された。本発明によれば、大きなサイズの三次元培養体であっても、高い生存率で細胞をガラス化可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、高い生存率を達成しつつ、細胞シート又は三次元細胞培養体の形態である培養細胞を緩慢ガラス化することができ、これらに有効な凍結保存の手段を提供することができる。本発明は産業上有用な発明である。
【図１】
2015149905.tif 000006
【図２ａ】
2015149905.tif 000007
【図２ｂ】
2015149905.tif 000008
【図２ｃ】
2015149905.tif 000009
【図３ａ】
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【図３ｂ】
2015149905.tif 000011
【図３ｃ】
2015149905.tif 000012
【図４ａ】
2015149905.tif 000013
【図４ｂ】
2015149905.tif 000014
【図４ｃ】
2015149905.tif 000015
【図５ａ】
2015149905.tif 000016
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
2015149905.tif 000019
【図６ｂ】
2015149905.tif 000020
【図６ｃ】
2015149905.tif 000021
【図７ａ】
2015149905.tif 000022
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
2015149905.tif 000024
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015149905.tif 000028
【図１２】
2015149905.tif 000029
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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