(57)【要約】      （修正有）【課題】治療薬（特に抗腫瘍薬）の有効な送達が可能で、機能性両親媒性の分子を基とする、該治療薬を封入したナノ粒子の提供。【解決手段】下記式に代表される機能性両親媒性分子及び治療薬とを混合し、加熱及び凍結の繰り返しサイクルを適用することによって得られる、該治療薬を含有するナノ粒子。2015044815.tif 000038【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬を封入する方法であって、
ａ）少なくとも１種の一般式（Ｉ）の機能性両親媒性化合物：
【化１】
2015044815.tif 000030
（式中、
−  Ｘは、酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表し；
−  Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基、例えばウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン、又はその誘導体であるか、各環が４〜７員であり、任意により置換されていてもよい、非天然の単環又は二環の複素環塩基であり；
−  Ｌ1とＬ2は、同一でも異なっていてもよく、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバミン酸−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カーボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホン酸基、又は１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、飽和又は不飽和で直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30炭化水素鎖で置換され、或いは
Ｌ1及びＬ2が共に一般式：
【化２】
2015044815.tif 000031
のセタール基を形成するか、
Ｌ1及びＬ2の一方が水素を表し、他方がヒドロキシ基又は１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル鎖で置換され；
−  Ｒ1及びＲ2は、同一でも異なっていてもよく、
−  直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30の炭化水素鎖、好ましくはＣ6〜Ｃ25、特に好ましくはＣ8〜Ｃ25であって、飽和又は一部不飽和であり、任意により一部又は全部がフッ素化され、無置換であるか、鎖末端の炭素が、フッ素原子、エステル、ベンジルエーテル、ナフチルエーテルの何れかで置換されているものを表し、或いは
−  各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル鎖を表し、或いは
−  ジアシルグリセロール基、スフィンゴシン基又はセラミド基を表し、
−  Ｌ1とＬ2の一方が水素を表し、他方がヒドロキシ基か、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表す場合には、Ｒ1及びＲ2は存在せず；
−  Ｒ3は、
−  ヒドロキシ基、アミノ基、リン酸基、ホスホン酸基、ホスファチジルコリン基、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン基、三リン酸基、ホスホニウム基、ＮＨ2−Ｒ4基、ＮＨＲ4Ｒ5基、又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基を表し、但しＲ4、Ｒ5及びＲ6は同一でも異なっていてもよく、水素原子、直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5アルキル鎖、又は、直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5ヒドロキシアルキル鎖を表し、或いは、
−  任意によりヒドロキシ基で置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル鎖を表し、或いは、
−  シクロデキストリン残基を表し、或いは
−  残基：
【化３】
2015044815.tif 000032
（但し、Ｖは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−の何れかの結合基を表し、Ｒ7はＨ又はＣＨ3を表し、ｎ＝１〜５００である）を表し、或いは
−  基−（ＣＨ2）n−Ｖ−Ｒ8（但し、Ｒ8はＣ2〜Ｃ30アルキルを表し、ｎ＝１〜５００である）を表し、或いは
−  １〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、Ｃ2〜Ｃ30アルキル又は基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０であり、Ｒ9は５〜７個の炭素原子を含む環式セタール基であって、無置換であるか、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル又はステロール残基で置換されたものを表す）で置換され、或いは、
−  Ｒ3は、同一又は異なる他の一般式（Ｉ）の化合物の、同一又は異なる他の置換基Ｒ3と、共有結合されて一般式（Ｉ）の化合物の二量体を形成する）
と、治療薬、好ましくは抗腫瘍薬、との混合物を用意する段階；
ｂ）前記混合物に加熱及び凍結の繰り返しサイクルを適用し、前記治療薬を含有するナノ粒子を取得する段階；及び
ｃ）前記手順により得られた前記治療薬を含有するナノ粒子を回収する段階を含んでなる方法。
【請求項２】
一般式（Ｉ）においてＸが酸素を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一般式（Ｉ）においてＢがチミン又はアデニンを表す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、
−  Ｘ及びＢが請求項１〜３の何れか１項に定義した通りであり；
−  Ｌ1がリン酸基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1がＣ2〜Ｃ30アルキル基、又は各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基であり；或いは
−  Ｌ1及びＬ2が酸素原子を表し、Ｒ1及びＲ2が水素を表し、Ｒ3が、Ｃ2〜Ｃ30アルキル基で置換されたトリアゾール基、テトラゾール基、ピラゾール基、又はイミダゾール基を表し；或いは
−  Ｌ1が、トリアゾール基、テトラゾール基、ピラゾール基、又はイミダゾール基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1がＣ2〜Ｃ30アルキル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基を表し；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、任意によりヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ2〜Ｃ30アルキル鎖で置換されたトリアゾール基であるか、或いはＲ3が基−（ＣＨ2）n−Ｖ−Ｒ8（但し、Ｖは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ8はＣ2〜Ｃ30アルキルを表す）であり；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０であり、Ｒ9は５〜７個の炭素原子を含む環式セタール基であって、無置換であるか、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル又は１つのステロール残基で置換されたものを表す）で置換されたトリアゾール基であり；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０である）で置換されたトリアゾール基であり、前記基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9が、他の同一の一般式（Ｉ）の化合物の同一の置換基Ｒ3に共有結合されて一般式（Ｉ）の化合物の二量体を形成し；或いは
−  Ｌ1がリン酸基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1が、各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基である、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、
−  Ｘ、Ｂ、Ｌ2、Ｒ1、及びＲ2が一般式（Ｉ）で定義したものであり、
−  置換基Ｌ1又は置換基Ｒ3が、無置換又は置換のトリアゾール基からなるか、或いは無置換又は置換のトリアゾール基を含んでなる、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
一般式（Ｉ）の化合物を有機溶媒に溶解させ、脂質混合物とする段階、
前記混合物を蒸発させて膜を形成する段階、
所望の量の治療薬、好ましくは抗腫瘍薬を蒸留水に溶解させる段階、
治療薬、好ましくは抗腫瘍薬の前記溶液中、前記脂質膜を再び水和させる段階、及び
前記手順により得られた混合物に対して加熱及び冷却のサイクルを１〜１０回実施する段階を含んでなる、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
補助脂質の存在下で一般式（Ｉ）の化合物を有機溶媒に溶解させる、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記補助脂質が、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）及びジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療薬が、白金錯体、白金錯体に結合し得るルテニウム、或いは、ルテニウムII又はIII、チタン、ガリウム、コバルト、鉄、又は金を主成分とする白金未含有の無機錯体から選択される、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療薬が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、及びロバスタチンから選択される、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法によって得られるナノ粒子。
【請求項１２】
治療薬、好ましくは抗腫瘍薬に富むコアが、補助脂質の共存又は不在下で、一般式（Ｉ）の化合物：
【化４】
2015044815.tif 000033
（但し一般式（Ｉ）において、
−  Ｘは、酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表し；
−  Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基、例えばウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン、又はその誘導体、或いは、各環が４〜７員であり、任意により置換されていてもよい、非天然の単環又は二環の複素環塩基を表し；
−  Ｌ1及びＬ2は、同一でも異なっていてもよく、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバミン酸−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カーボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホン酸基、又は１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、飽和又は不飽和で直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30炭化水素鎖で置換され、或いは
Ｌ1及びＬ2が共に一般式：
【化５】
2015044815.tif 000034
のセタール基を形成するか、或いは
Ｌ1とＬ2の一方が水素を表し、他方がヒドロキシ基又は１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル鎖で置換され；
−  Ｒ1とＲ2は、同一でも異なっていてもよく、
−  直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30、好ましくはＣ6〜Ｃ25、特に好ましくはＣ8〜Ｃ25の炭化水素鎖であって、飽和又は一部不飽和であり、任意により一部又は全部がフッ素化され、無置換であるか、鎖末端の炭素が、フッ素原子、エステル、ベンジルエーテル、ナフチルエーテルの何れかで置換されたものを表すか、或いは、
−  各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル鎖を表すか、
−  ジアシルグリセロール基、スフィンゴシン基、又はセラミド基を表し、
−  Ｌ1及びＬ2の一方が水素を表し、他方がヒドロキシ基か、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表す場合には、Ｒ1とＲ2は存在せず；
−  Ｒ3は、
−  ヒドロキシ基、アミノ基、リン酸基、ホスホン酸基、ホスファチジルコリン基、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン基、三リン酸基、ホスホニウム基、ＮＨ2−Ｒ4基、ＮＨＲ4Ｒ5基、又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基（但しＲ4、Ｒ5、Ｒ6は同一でも異なっていてもよく、水素原子を表すか、直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5アルキル鎖を表すか、直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5ヒドロキシアルキル鎖を表す）を表すか、
−  任意によりヒドロキシ基で置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル鎖を表すか、
−  シクロデキストリン残基を表すか、
−  残基：
【化６】
2015044815.tif 000035
（但し、Ｖは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−の何れかの結合基を表し、Ｒ7はＨ又はＣＨ3を表し、ｎ＝１〜５００である）を表すか、
−  基−（ＣＨ2）n−Ｖ−Ｒ8（但し、Ｒ8はＣ2〜Ｃ30アルキルを表し、ｎ＝１〜５００である）を表すか、
−  １〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基であって、無置換であるか、Ｃ2〜Ｃ30アルキル又は基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０であり、Ｒ9は５〜７個の炭素原子を含む環式セタール基であって、無置換であるか、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル又はステロール残基で置換されたものを表す）で置換されたものを表すか、或いは、
−  Ｒ3は、同一又は異なる他の一般式（Ｉ）の化合物の同一又は異なる他の置換基Ｒ3に共有結合されて一般式（Ｉ）の化合物の二量体を形成する）
からなる１又は２以上の脂質層によって包囲された構成を有する固体ナノ粒子。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）の化合物：
【化７】
2015044815.tif 000036
（但し、
−  Ｘは酸素原子又はイオウ原子を表し、
−  Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基、例えばウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン、又はその誘導体であるか、各環が４〜７員であり、任意により置換されていてもよい、非天然の単環又は二環の複素環塩基であり；
Ｌ1、Ｌ2、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、以下の定義の何れかから選択され：
−  Ｌ1がリン酸基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1がＣ2〜Ｃ30アルキル基、又は各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基であり；或いは
−  Ｌ1及びＬ2が酸素原子を表し、Ｒ1及びＲ2が水素を表し、Ｒ3が、Ｃ2〜Ｃ30アルキル基で置換されたトリアゾール基、テトラゾール基、ピラゾール基、又はイミダゾール基を表し；或いは
−  Ｌ1が、トリアゾール基、テトラゾール基、ピラゾール基、又はイミダゾール基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1がＣ2〜Ｃ30アルキル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基を表し；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、任意によりヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ2〜Ｃ30アルキル鎖で置換されたトリアゾール基であるか、Ｒ3が基−（ＣＨ2）n−Ｖ−Ｒ8（但しＶは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ8はＣ2〜Ｃ30アルキルを表す）を表し；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０であり、Ｒ9は５〜７個の炭素原子を含む環式セタール基であって、無置換であるか、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル又は１つのステロール残基で置換されたものを表す）で置換されたトリアゾール基であり；或いは
Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０である）で置換されたトリアゾール基であり、他の同一の一般式（Ｉ）の化合物の同一の置換基Ｒ3に共有結合されて一般式（Ｉ）の化合物の二量体を形成し；或いは
−  Ｌ1がリン酸基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1が各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基である）。
【請求項１４】
一般式（Ｉ）の化合物：
【化８】
2015044815.tif 000037
（但し、
−  Ｘ、Ｂ、Ｌ2、Ｒ1、Ｒ2は、請求項１の定義と同様であり；
−  Ｌ1又はＲ3は、無置換又は置換のトリアゾール基からなるか、無置換又は置換のトリアゾール基を含む）。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の一般式（Ｉ）の化合物と、治療薬とを含むナノ粒子。
【請求項１６】
前記治療薬が抗腫瘍薬である、請求項１５に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記治療薬が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ロバスタチンから選択される、請求項１１、１２、１５、１６の何れか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
請求項１１、１２、１５、１６、１７の何れか１項に記載のナノ粒子を用いて、治療薬、特に抗腫瘍薬を輸送又はベクター化する方法。
【請求項１９】
請求項１１、１２、１５、１６、１７の何れか１項に記載のナノ粒子を用いて、治療薬、特に抗腫瘍薬を細胞内に送達する方法。
【請求項２０】
抗腫瘍薬の調製における請求項１１、１２、１５、１６、１７の何れか１項に記載のナノ粒子の使用。
【請求項２１】
腫瘍性疾患の治療用である請求項１１、１２、１５、１６、１７の何れか１項に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性両親媒性の分子又は巨大分子を基とするナノ粒子の調製方法と、治療薬、特に抗腫瘍薬の輸送又はベクター化における前記ナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍薬の中でもシスプラチンは、特に固形腫瘍の治療に広く利用されている抗腫瘍薬である。しかし、毒性及び獲得耐性の出現ゆえに、その利用は限られる。
【０００３】
斯かる欠点を克服するべく、様々な製剤が従来提案されている。例えば米国特許第５，１７８，８７６号には、リポソーム内封入を企図した疎水性錯体形態の白金誘導体が記載されている。
【０００４】
米国特許第６，００１，８１７号には、シスプラチンと、少なくとも１つのヌクレオシド又はデオキシヌクレオシドを含有するベクターとを含む組成物が記載されている。
【０００５】
米国特許第７，９０８，１６０号は、リガンドに結合したシスプラチン誘導体に関する。本誘導体の活性は、リガンドへの結合関数に応じて可逆的である。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ０１／３２１３９には、負に帯電した天然脂質（特にジオレイルホスファチジルセリン）を主成分とし、加熱及び凍結のサイクルを繰り返して得られる、シスプラチンが親油性ナノ粒子に封入された組成物が記載されている。本出願では、シスプラチンが水中で正に帯電した凝集体を形成し、非帯電種と比べて大きな溶解度を示す結果、負に帯電した脂質膜との相互作用、及び、シスプラチン凝集体周囲での脂質膜の再組織化が可能になることが示唆されている。
【０００７】
しかし、治療薬、特に抗腫瘍薬のベクター化に伴う課題を解決することが、依然として求められている。
【０００８】
特に、腫瘍細胞の内部に治療薬（特にシスプラチン及び／又はその誘導体）を、高い薬理活性で迅速に輸送可能とすると同時に、正常な細胞の保護、すなわち神経、腎臓、聴覚、消化器等への毒性を減らすと同時にこの治療薬に対する耐性の出現を制限することが可能な手段が求められている。
【０００９】
また、治療薬の早過ぎる放出を防止するとともに、生物環境中における遊離治療薬の存在に伴う課題、特に活性喪失及び毒性を防止するべく、十分な経時安定性を有するベクターを提供することも求められている。
【００１０】
今回、機能性両親媒性の分子又は巨大分子を基に形成されたナノ粒子を利用することにより、治療薬を細胞内に有効且つ迅速に送達できるとともに、特に３７℃での安定性を改善でき、惹いては前記治療薬を長期に亘り持続的にベクター化することが可能となることが見出された。
【００１１】
「治療薬」とは、例えば、特に動物（ヒトを含む）又は単離細胞において、インビトロ又はインビボで、病気の予防又は治療、生物学的機能の回復に用いられる、天然又は合成分子を意味する。但し核酸又はそのフラグメントは除く。
【００１２】
斯かる分子は、例えば医薬活性成分、特に抗腫瘍薬から選択することができる。斯かる薬の例としては以下が挙げられる。
−  白金錯体、特に例としてはシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン等、
−  白金錯体に結合し得るルテニウム、
−  ルテニウムII及び／又はIIIを基とする白金不含有の無機錯体、チタンを基とする白金不含有の無機錯体、例えば二塩化チタノセン、ガリウムを基とする白金不含有の無機錯体、例えば硝酸ガリウム、塩化ガリウム、ＫＰ４６等のガリウム塩、
−  鉄の誘導体、例えばフェロセニウム塩、鉄含有ヌクレオシド類似体、ピリジル五座配位子含有鉄（II）錯体、
−  コバルトの誘導体、例えばヘキサカルボニルの二コバルト錯体、アルキンのコバルト錯体、ナイトロジェン・マスタード・リガンド含有Ｃｏ（III）錯体、
−  金の誘導体、例えばオーラノフィン、金（Ｉ）、（II）、（III）の錯体、オーロチオグルコース等。
【００１３】
一般式（Ｉ）の機能性両親媒性の分子又は巨大分子を基に形成したナノ粒子を用いて、前記の化合物を封入して細胞内に送達することにより、これらの化合物に対する耐性の発生を抑制することができる。
【００１４】
本発明の目的によれば、治療薬としては白金錯体、特にシスプラチンが好ましい。
【００１５】
ルテニウムII及び／又はIIIを基とする無機錯体としては、例えばＮＡＭＩ−Ａ、ＲＡＰＴＡ−Ｃ、ＫＰ１０１９と呼ばれる錯体が挙げられる。斯かる非白金錯体は、Ott I.及びGust R., Arch. Pharm. Chem. Life Sci., 2007年、第340巻、117〜126ページ；Reedijk J., Curr. Opin. Chem. Biol.、1999年、第3巻、236〜240ページ；Haimei Chen他、J. Am. Chem. Soc.、2003年、第125巻、173〜186ページに記載されている。
【００１６】
鉄含有ヌクレオシド類似体は、Schlawe D.他、Angew. Chem. Int. Ed.、2004年、第43巻、1731〜1734ページに記載されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
即ち、本発明の第１の側面は、治療薬、好ましくは抗腫瘍薬を封入する方法であって、
ａ）少なくとも１種の一般式（Ｉ）の機能性両親媒性化合物：
【化１】
2015044815.tif 000002
（式中、
−  Ｘは、酸素原子、イオウ原子又はメチレン基を表し；
−  Ｂは、プリン塩基又はピリミジン塩基、例えばウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン、又はその誘導体であるか、各環が４〜７員であり、任意により置換されていてもよい、非天然の単環又は二環の複素環塩基であり；
−  Ｌ1とＬ2は、同一でも異なっていてもよく、水素、オキシカルボニル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−基、チオカルバミン酸−Ｏ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−基、カーボネート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−基、カルバメート−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−基、酸素原子、リン酸基、ホスホン酸基、又は１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、飽和又は不飽和で直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30炭化水素鎖で置換され、或いは
Ｌ1及びＬ2が共に一般式：
【化２】
2015044815.tif 000003
のセタール基を形成するか、
Ｌ1及びＬ2の一方が水素を表し、他方がヒドロキシ基又は１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル鎖で置換され；
−  Ｒ1及びＲ2は、同一でも異なっていてもよく、
−  直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30の炭化水素鎖、好ましくはＣ6〜Ｃ25、特に好ましくはＣ8〜Ｃ25であって、飽和又は一部不飽和であり、任意により一部又は全部がフッ素化され、無置換であるか、鎖末端の炭素が、フッ素原子、エステル、ベンジルエーテル、ナフチルエーテルの何れかで置換されているものを表し、或いは
−  各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル鎖を表し、或いは
−  ジアシルグリセロール基、スフィンゴシン基又はセラミド基を表し、
−  Ｌ1とＬ2の一方が水素を表し、他方がヒドロキシ基か、１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表す場合には、Ｒ1及びＲ2は存在せず；
−  Ｒ3は、
−  ヒドロキシ基、アミノ基、リン酸基、ホスホン酸基、ホスファチジルコリン基、Ｏ−アルキルホスファチジルコリン基、三リン酸基、ホスホニウム基、ＮＨ2−Ｒ4基、ＮＨＲ4Ｒ5基、又はＮＲ4Ｒ5Ｒ6基を表し、但しＲ4、Ｒ5及びＲ6は同一でも異なっていてもよく、水素原子、直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5アルキル鎖、又は、直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5ヒドロキシアルキル鎖を表し、或いは、
−  任意によりヒドロキシ基で置換されていてもよい直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル鎖を表し、或いは、
−  シクロデキストリン残基を表し、或いは
−  残基：
【化３】
2015044815.tif 000004
（但し、Ｖは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−の何れかの結合基を表し、Ｒ7はＨ又はＣＨ3を表し、ｎ＝１〜５００である）を表し、或いは
−  基−（ＣＨ2）n−Ｖ−Ｒ8（但し、Ｒ8はＣ2〜Ｃ30アルキルを表し、ｎ＝１〜５００である）を表し、或いは
−  １〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基を表し、前記ヘテロアリール基は無置換であるか、Ｃ2〜Ｃ30アルキル又は基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０であり、Ｒ9は５〜７個の炭素原子を含む環式セタール基であって、無置換であるか、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル又はステロール残基で置換されたものを表す）で置換され、或いは、
−  Ｒ3は、同一又は異なる他の一般式（Ｉ）の化合物の、同一又は異なる他の置換基Ｒ3と、共有結合されて一般式（Ｉ）の化合物の二量体を形成する）
と、治療薬、好ましくは抗腫瘍薬、との混合物を用意する段階；
ｂ）前記混合物に加熱及び凍結の繰り返しサイクルを適用し、前記治療薬を含有するナノ粒子を取得する段階；及び
ｃ）前記手順により得られた前記治療薬を含有するナノ粒子を回収する段階を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、シスプラチンの放出曲線をインキュベーション時間の関数として示すグラフである。
【図２】図２は、経時的な細胞溶解により遊離したシスプラチンの濃度を示すグラフである。
【図３】図３Ａ、Ｂは、５０％の細胞を死滅させるのに必要な濃度（ＩＣ50）を、遊離シスプラチン（カラムＡ）又はシスプラチン含有ナノ粒子（カラムＢ）について示すグラフである。図３ＡはＩＧＲＯＶ１細胞系に関し、図３ＢはＳＫＯＶ３細胞系に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
望ましいことに、一般式（Ｉ）の化合物を構成する分子及び／又は巨大分子構造は、置換基Ｂで表される治療薬の少なくとも１つのリガンド（核酸塩基、ヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、複素環等）を含むとともに、少なくとも１つの親水部（リン酸塩、カルボン酸塩等）と少なくとも１つの疎水部（単鎖又は二鎖の疎水性区画や、生物起源のシントンに由来する極性部等）の存在による両親媒性を示すため、治療薬を用いた安定なナノ粒子の形成に利用できることが見出された。
【００２０】
一般式（Ｉ）の化合物の両親媒性、これらの化合物中における治療薬（有効成分）のリガンドの存在、並びに、治療薬とこれらの化合物との間における何らかの静電相互作用が相俟って、前記手順により得られたナノ粒子は、封入された有効成分、特に抗腫瘍薬を、細胞内に効率的且つ迅速に送達できる構造を有することになる。
【００２１】
理論に束縛されるものではないが、一般式（Ｉ）の化合物の分子間相互作用によってナノ粒子表面の凝集力が増大する結果、使用条件下での経時安定性が向上するものと推測される。
【００２２】
望ましいことに、前記のナノ粒子は、治療薬のベクターとしての用途に適した寿命を有する。
【００２３】
前記一般式（Ｉ）において、ｎは１〜５００であることが望ましく、１〜１００であることがより好ましく、特に１〜５０であることが好ましく、１〜１０であることがさらに好ましい。
【００２４】
「直鎖又は分岐鎖のＣ1〜Ｃ5アルキル」とは、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基を意味し、メチル基又はエチル基が好ましい。
【００２５】
また、前記の一般式（Ｉ）では、プリン塩基又はピリミジン塩基又は非天然複素環塩基は、少なくとも１個の置換基で置換されていてもよい。置換基は、例えばハロゲン、アミノ基、カルボキシ基、カルボニル基、カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、アジド基、シアノ基、アルキル基、シクロアルキル基、ペルフルオロアルキル基、アルキルオキシ基（例えばメトキシ基）、オキシカルボニル基、ビニル基、エチニル基、プロピニル基、アシル基等から選択される。
【００２６】
「非天然複素環塩基」は、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン以外の塩基で、天然に存在しないものを意味する。
【００２７】
「１〜４個の窒素原子を含むヘテロアリール基」は、単環又は二環の炭素環基であって、芳香族であるか一部不飽和であり、５〜１２個の原子を含み、１〜４個の窒素原子が介在するものを意味する。例として、特にピラゾール基、トリアゾール基、テトラゾール基、イミダゾール基が挙げられる。
【００２８】
一般式（Ｉ）の化合物の調製法については、例えば国際特許出願ＷＯ２００５／１１６０４３を参照すればよい。本文献には、斯かる種類の化合物を入手するための種々の方法が記載されている（特に８〜１７ページ及び実施例を参照）。
【００２９】
本発明の方法は、以下の一般条件下で実施される段階を含んでいてもよい。
−  一般式（Ｉ）の化合物を有機溶媒に溶解させて脂質混合物を形成し、次いで除去後、蒸発させて膜を形成する。
−  並行して、所望の量の治療薬、好ましくは抗腫瘍薬を、蒸留水に溶解させる。
−  治療薬、好ましくは抗腫瘍薬の溶液中で脂質膜を再び水和する。超音波処理及び加熱によって透明な溶液を得る。
−  この溶液を、例えば液体窒素浸漬により、急速冷却する。この加熱／冷却のサイクルを好ましくは１〜１０回、特に５〜１０回、特に１０回繰り返す。
【００３０】
得られた溶液を遠心分離する。上清を分離する。複数回の遠心分離後、ペレットを乾燥させる。
【００３１】
有機溶媒は、例えば本分野における一般的な有機溶媒から選択でき、例えばクロロホルム、アルコール（メタノール、エタノール等）が挙げられる。
【００３２】
加熱は２０℃〜８０℃程度の温度、冷却は約−１９０℃（液体窒素）〜０℃（氷）程度の温度で行うことが好ましい。適切な加熱／冷却のサイクルとしては、例えば４５℃の加熱と−７８℃の冷却が挙げられる。
【００３３】
治療薬は、白金錯体（シスプラチン、カルボプラチン等）、特に好ましくはシスプラチン、白金錯体に結合し得るルテニウム、ルテニウムII又はIII、チタン、ガリウム、コバルト、鉄、又は金を基にする前記の白金不含有の無機錯体から選択することが好ましい。
【００３４】
一般式（Ｉ）の化合物／治療薬のモル比Ｒは、例えば０．０１〜５０、特にＲ＝０．２である。
【００３５】
得られたナノ粒子は、任意により、例えば孔径が約１００〜２００ｎｍのポリカーボネート・フィルタで押し出し成形してもよい。
【００３６】
以上の手順により、治療薬（活性物質）が豊富なコアが、補助脂質の共存下又は不在下、一般式（Ｉ）の機能性両親媒性化合物からなる１又は２以上の脂質層で包囲された構成の固体ナノ粒子が得られる。
【００３７】
治療薬（抗腫瘍薬、特に白金錯体が好ましい）が豊富なコアが、補助脂質の共存下又は不在下、一般式（Ｉ）の機能性両親媒性化合物からなる１又は２以上の脂質層で包囲された構成の固体ナノ粒子は、以降における本発明の主題の１つとなる。
【００３８】
多層包囲の場合は、全ての脂質層が同じ脂質（補助脂質の共存又は不在下の一般式（Ｉ）の化合物）で構成される。
【００３９】
本発明の一側面によれば、脂質混合物に、一般式（Ｉ）の化合物に加えて少なくとも１種の補助脂質を用いる。
【００４０】
「補助脂質」とは、一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせで使用され、ナノ粒子の１又は２以上の脂質層の構造の形成に関与する化合物を意味する。
両性イオン性の補助脂質を用いることが好ましい。
【００４１】
前記補助脂質は、例えばジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）又はジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン（ＤＯＵＰＣ）から選択され、一般式（Ｉ）の化合物との組み合わせでナノ粒子の脂質層を形成する。
【００４２】
これらの化合物は、一般式（Ｉ）の化合物との混合物として使用すると、補助脂質の役割を果たし得る。或いは、これらの化合物は、例えばジオレイルホスファチジルウリジンホスファチジルコリン（ＤＯＵＰＣ）のように、一般式（Ｉ）に含まれる場合がある。その場合、これらの化合物は、一般式（Ｉ）の化合物の役割を果たすか、或いは一般式（Ｉ）の他の化合物との組み合わせで、補助脂質の役割を果たすことになる。
【００４３】
この方法の好ましい一側面によれば、脂質混合物は、少なくとも１種の一般式（Ｉ）の化合物のみを含有し、補助脂質を含有しない。
【００４４】
治療薬は、細胞内への有効成分の送達が十分となるよう、水相中０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ程度の濃度で利用することが好ましい。
【００４５】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物は、Ｘが酸素である化合物である。
一般式（Ｉ）においてＢがチミン又はアデニンである化合物も好ましい。
【００４６】
一般式（Ｉ）の化合物のうち、本発明の目的にとって特に好ましいのは、一般式（Ｉ）において、
−  ＸとＢが上に定義した通りであり；
−  Ｌ1がリン酸基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1がＣ2〜Ｃ30アルキル基、又は各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基であり；或いは
−  Ｌ1及びＬ2が酸素原子を表し、Ｒ1とＲ2が水素を表し、Ｒ3が、Ｃ2〜Ｃ30アルキル基で置換されたトリアゾール基、テトラゾール基、ピラゾール基、イミダゾール基の何れかを表し；
−  Ｌ1が、トリアゾール基、テトラゾール基、ピラゾール基、イミダゾール基の何れかを表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1がＣ2〜Ｃ30アルキル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基であり；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、任意によりヒドロキシ基で置換されていてもよいＣ2〜Ｃ30アルキル鎖で置換されたトリアゾール基であるか、Ｒ3が基−（ＣＨ2）n−Ｖ−Ｒ8（但しＶは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｒ8はＣ2〜Ｃ30アルキルを表す）であり；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０であり、Ｒ9は５〜７個の炭素原子を含む環式セタール基であって、無置換であるか、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖のＣ2〜Ｃ30アルキル又は１つのステロール残基で置換されたものを表す）で置換されたトリアゾール基であり；或いは
−  Ｌ1がヒドロキシ基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ3が、基（ＣＨ2）m−Ｏ−（ＣＨ2）p−Ｒ9（但しｍ＝１〜６であり、ｐ＝０〜１０である）で置換されたトリアゾール基であり、他の同一の一般式（Ｉ）の化合物の同一の置換基Ｒ3に共有結合されて一般式（Ｉ）の化合物の二量体を形成し；
−  Ｌ1がリン酸基を表し、Ｌ2が水素を表し、Ｒ1が各アシル鎖がＣ2〜Ｃ30であるジアシル基を表し、Ｒ3がヒドロキシ基である化合物である。これらは新規な化合物である。
【００４７】
一般式（Ｉ）において、置換基Ｌ1又は置換基Ｒ3が、無置換又は置換のトリアゾール基からなるか、無置換又は置換のトリアゾール基を含む化合物も、本発明の方法の目的を達成するのに好ましい新規な化合物である。
【００４８】
前記の化合物は本発明の一主題をなす新規な化合物である。また、これらの化合物と、治療薬、特に抗腫瘍薬、特に白金錯体（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン等）、白金錯体に結合し得るルテニウム、又は、前記のルテニウム、チタン、ガリウム、コバルト、鉄、又は金に基づく白金不含有の無機錯体とを含むナノ粒子も同様である。シスプラチンは本発明の目的にとって好ましい抗腫瘍薬である。
【００４９】
一般式（Ｉ）の化合物は、抗新生物活性を有するプリン塩基又はピリミジン塩基の誘導体を含み得る。そのような誘導体としては、例えばアラシトシン（ＡｒａＣ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、５−クロロ−６−アジド−５，６−ジヒドロ−２’−デオキシウリジンが挙げられる。
【００５０】
本発明の別の主題は、上に説明した方法によって得られるナノ粒子の、治療薬、特に抗腫瘍薬の輸送又はベクター化における使用に存する。
【００５１】
特に、本発明は、前記の方法によって得られるナノ粒子の、治療薬、特に抗腫瘍薬の細胞内送達における使用に関する。
【００５２】
本発明は、前記の方法によって得られるナノ粒子の、抗腫瘍薬の調製における使用にも関する。
【００５３】
本発明は、前記の方法によって得られるナノ粒子であって、腫瘍性疾患、特にがん、例えば卵巣がん、精巣がん、大腸がん、子宮頸がん、肺がん、腺肉腫等の治療用であるナノ粒子にも関する。
【実施例】
【００５４】
本発明を以下の非限定的な実施例に即して説明する。
【００５５】
出発物質は全て、化学試薬メーカー（オールドリッチ社、アルファ・イーザー社、アヴァンティ・ポラー・リピド社）から入手し、更に精製することなく使用する。溶媒は更に蒸溜することなく使用した。合成した化合物は、標準的な分光分析法である３００．１３ＭＨｚでの1Ｈ ＮＭＲ、７５．４６ＭＨｚでの13Ｃ ＮＭＲ、１２１．４９ＭＨｚでの31Ｐ ＮＭＲ、質量分析により特性化した（諸特性）。ＮＭＲにおける化学シフト（δ）は、ＴＭＳに対するｐｐｍで表す。1Ｈ ＮＭＲの結合定数ＪはＨｚで表す。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にはメルク社のプレートRP-18 F254を用いた。定量クロマトグラフィーによる精製はシリカSEPHADEX LH-20（２５〜１００μｍ）を用いた。
【００５６】
「調製物」と称する以下の例では、一般式（Ｉ）の化合物の調製に用いられる合成中間体の調製について説明する。続いて「実施例」と称する合成例において、一般式（Ｉ）の化合物の調製について説明する。
【００５７】
調製物１
５’−パラトルエンスルホニルチミジン
【化４】
2015044815.tif 000005
【００５８】
無水窒素雰囲気下にある二首フラスコの中に、２ｇのチミジン（８．２６ミリモル）を無水ピリジンに溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。この溶液を０℃まで冷却し、３．９３５ｇのパラトルエンスルホン酸塩化物（２．５当量、２０．６ミリモル）を少量ずつ添加する。この反応媒体を放置して周囲温度まで戻した後、１０時間に亘って撹拌する。その後１０ｍｌのメタノールを添加して反応を停止させ、３０分間に亘って撹拌を続ける。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加した後、２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3溶液、２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液、２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3溶液で順番に洗浄する。溶媒を減圧下で除去する。メタノールの中で再結晶させることにより、予想される化合物が純粋な状態で得られる。
【００５９】
ＲＦ：０．４７（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）
収率：７５％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ6）：δ１．７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ２．１１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ２．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ３．５２（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ４．１８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、δ４．２５（ｍ，３Ｈ，ＣＨ，ＣＨ2）、δ５．４２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、δ６．１５（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，Ｈ，ＣＨ）、δ７．３８（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．４６（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．４９（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．７８（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．８１（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ１１．２８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５．４７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ6）：δ１２．５（ＣＨ3）、δ２１．６（ＣＨ3）、δ３８．９（ＣＨ2）、δ７０．４（ＣＨ2）、δ７０．６（ＣＨ）、δ８３．７（ＣＨ）、δ８４．５（ＣＨ）、δ１１０．３（Ｃ）、δ１２８．１（ＣＨ ａｒ）、δ１３０．６（２ＣＨ ａｒ）、δ１３２．６（ＣＨ ａｒ）、δ１３６．４（ＣＨ ａｒ）、δ１４５．６（Ｃ）、δ１５０．８（Ｃ＝Ｏ）、δ１６４．１（Ｃ＝Ｏ）。
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：３９７．１
【００６０】
調製物２
２’−デオキシ−５’−トルエンスルホニルアデノシン
【化５】
2015044815.tif 000006
【００６１】
無水窒素雰囲気下にある二首フラスコの中に、２ｇの２’−デオキシアデノシン（８ミリモル）を無水ピリジンに溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。この溶液を０℃まで冷却し、３．７９３ｇのパラトルエンスルホン酸塩化物（２．５当量、２０ミリモル）を少量ずつ添加する。この反応媒体を放置して周囲温度まで戻した後、１０時間に亘って撹拌する。その後１０ｍｌのメタノールを添加して反応を停止させ、３０分間に亘って撹拌を続ける。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加した後、２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3溶液、２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液、２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ3溶液で順番に洗浄する。溶媒を減圧下で除去する。メタノールの中で再結晶させることにより、予想される化合物が純粋な状態で得られる。このようにして白い生成物が２．１ｇ分離される。
【００６２】
ＲＦ：０．３７（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）
収率：６３％
【００６３】
調製物３
５’−アジド−５’−デオキシチミジン
【化６】
2015044815.tif 000007
【００６４】
冷却器を取り付けた無水窒素雰囲気下にある二首フラスコの中に、調製物１に記載した５’−パラトルエンスルホニルチミジン２ｇ（５ミリモル）をＤＭＦに溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。１．３ｇのアジ化ナトリウム（４当量、２０ミリモル）を添加する。次いでこの溶液を１１０℃に加熱しながら１０時間に亘って撹拌する。前記混合物を周囲温度まで冷却する。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加し、次いで１５ｍｌの水で２回洗浄した後、１５ｍｌの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去する。メタノールの中で再結晶させることにより、予想される化合物が純粋な状態で得られる。このようにして白い固形物が０．８ｇ得られる。
【００６５】
ＲＦ：０．４７（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）
収率：６０％
ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：２６８．１
【００６６】
調製物４
５’−アジド−５’，２’−ジデオキシアデノシン
【化７】
2015044815.tif 000008
【００６７】
冷却器を取り付けた無水窒素雰囲気下にある二首フラスコの中に、調製物２に記載した２’−デオキシ−５’−パラトルエンスルホニルアデノシン２ｇ（５ミリモル）をＤＭＦに溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。１．３ｇのアジ化ナトリウム（４当量、２０ミリモル）を添加する。次いでこの溶液を１１０℃に加熱しながら１０時間に亘って撹拌する。前記混合物を周囲温度まで冷却する。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加し、次いで１５ｍｌの水で２回洗浄した後、１５ｍｌの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去する。メタノールの中で再結晶させることにより、予想される化合物が純粋な状態で得られる。このようにして白い固形物が０．８ｇ得られる。
【００６８】
ＲＦ：０．３７（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）
収率：６０％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：：質量の計算値：２７７．１１６１、質量の測定値：２７７．１１５７。
【００６９】
調製物５
１−プロパルギルオキシオクタデカン
【化８】
2015044815.tif 000009
【００７０】
無水窒素雰囲気下にある清潔かつ乾燥したフラスコの中に、６７３ｍｇのプロパルギルアルコール（１２ミリモル）をＤＭＦに溶かした０．５Ｍ溶液を導入する。この溶液を０℃に冷却し、１８０ｍｇの水素化ナトリウム（０．６２５当量、７．５ミリモル）を少量ずつ添加する。この反応媒体を放置して周囲温度に戻す。２ｇの１−ブロモオクタデカン（０．５当量、６ミリモル）を添加する。５時間に亘って撹拌を続ける。その後１０ｍｌのメタノールを添加して反応を停止させ、３０分間に亘って撹拌を続ける。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加した後、２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄する。その後、有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、次いで溶媒を減圧下で除去する。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン）で分離すると、予想される化合物が純粋な状態で得られる。このようにして白い生成物が１．２ｇ分離される。
【００７１】
ＲＦ：０．８２（ヘキサン）
収率：６５％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．９０（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ１．２８（ｓ，３０Ｈ，ＣＨ2）、δ１．６１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ２．４３（ｔ，ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、δ３．５３（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ４．１５（ｄ，ｊ＝３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５．４７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１４．２（ＣＨ2）、δ２２．７（ＣＨ2）、δ２６．１（ＣＨ2）、δ２９．４（ＣＨ2）、δ２９．５（ＣＨ2）、δ２９．６（ＣＨ2）、δ３２．０（ＣＨ2）、δ５８．０（ＣＨ2）、δ７０．４（ＣＨ2）、δ７４．１（ＣＨ）、δ８０．１（Ｃ）。
【００７２】
調製物６
１，１２−プロパルギルオキシドデカン
１２−プロパルギルオキシドデカン−１−オール
【００７３】
無水窒素雰囲気下にある清潔かつ乾燥したフラスコの中に、１ｇのドデカン−１，１２−ジオール（５ミリモル）をＤＭＦに溶かした０．５Ｍ溶液を導入する。この溶液を０℃に冷却し、３６０ｍｇの水素化ナトリウム（３当量、１５ミリモル）を少量ずつ添加する。この反応媒体を放置して周囲温度に戻す。１．４９ｇの臭化プロパルギル（２．５当量、１２．５ミリモル）を添加する。５時間に亘って撹拌を続ける。その後１０ｍｌのメタノールを添加して反応を停止させ、３０分間に亘って撹拌を続ける。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加した後、２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄する。その後、有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、次いで溶媒を減圧下で除去する。その後、得られた生成物をカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃｔＥｔｈ ９／１）で分離する。２種の生成物が分離される。すなわち、１，１２−プロパルギルオキシドデカンに対応する３７０ｍｇの褐色の油と、１２−プロパルギルオキシドデカン−１−オールに対応する４３０ｍｇの褐色の固形物である。
【００７４】
１，１２−プロパルギルオキシドデカン
【化９】
2015044815.tif 000010
【００７５】
ＲＦ：０．５３（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ ９／１）
収率：２７％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．３１（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ2）、δ１．６１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ２．４３（ｔ，ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、δ３．５２（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ４．１５（ｄ，ｊ＝３Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５．４７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ２６．１（ＣＨ2）、δ２９．４（ＣＨ2）、δ２９．５（ＣＨ2）、δ２９．６（ＣＨ2）、δ５８．０（ＣＨ2）、δ７０．３（ＣＨ2）、δ７４．１（ＣＨ）、δ８０．１（Ｃ）。
【００７６】
１２−プロパルギルオキシドデカン−１−オール
【化１０】
2015044815.tif 000011
【００７７】
ＲＦ：０．１０（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ ９／１）
収率：３６％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１．３２（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ2）、δ１．５９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ２．４３（ｔ，ｊ＝３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ）、δ３．５２（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ３．６５（ｄ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ４．１５（ｄ，ｊ＝３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５．４７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ２５．８（ＣＨ2）、δ２６．０（ＣＨ2）、δ２９．４（２ＣＨ2）、δ２９．５（２ＣＨ2）、δ２９．６（ＣＨ2）、δ３２．７（ＣＨ2）、δ５７．９（ＣＨ2）、δ６２．７（ＣＨ2）、δ７０．２（ＣＨ2）、δ７４．２（ＣＨ）、δ７９．９（Ｃ）。
【００７８】
調製物７
ｏ−プロパルギルコレステロール
【化１１】
2015044815.tif 000012
【００７９】
無水窒素雰囲気下にある清潔かつ乾燥したフラスコの中に、５００ｍｇのコレステロール（１．３ミリモル）をＤＭＦに溶かした０．５Ｍ溶液を導入する。この溶液を０℃に冷却し、４７ｍｇの水素化ナトリウム（１．５当量、２ミリモル）を少量ずつ添加する。この反応媒体を放置して周囲温度に戻す。２３８ｍｇの臭化プロパルギル（１．５当量、２ミリモル）を添加する。５時間に亘って撹拌を続ける。その後１０ｍｌのメタノールを添加して反応を停止させ、３０分間に亘って撹拌を続ける。前記混合物に５０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2を添加した後、２０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄する。その後、有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、次いで溶媒を減圧下で除去する。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ ８／２）で分離すると、予想される化合物が純粋な状態で得られる。このようにして白い生成物が２１５ｍｇ分離される。
【００８０】
ＲＦ：０．８３（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ ８／２）
収率：３９％
【００８１】
［実施例１］
３’−（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）チミジン（ｄｉ  ｃ１４ｄＴ）
【化１２】
2015044815.tif 000013
【００８２】
窒素雰囲気下で、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジンと、３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（０．５００ｇ、１当量、０．６７ミリモル）と、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール（０．４４７ｇ、１．３当量、０．８７ミリモル）と、テトラゾールをアセトニトリル（２ｍｌ、１．３当量、０．８７ミリモル）に溶かした０．４５Ｍ溶液とを、４ｍｌの無水アセトニトリルに溶かす。この反応媒体を周囲温度にて２４時間に亘って磁気的に撹拌する。次に、ジヨードをＴＨＦ／Ｐｙｒ／Ｈ2Ｏに溶かした０．０２Ｍ溶液を４３ｍｌ添加することによって前記混合物を酸化する。１２時間に亘って周囲温度にした後、溶媒を真空下で蒸発させる。残留物を８ｍのジクロロメタンに溶かす。次に０．２ｍｌの１，５−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデス−７−エン（ＤＢＵ）（１．３当量、０．８７ミリモル）を５時間かけて反応媒体に添加する。この反応媒体を０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、次いで飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ7溶液で洗浄する。有機相を真空下で濃縮する。溶離液の勾配（ＭｅＯＨ／ＤＣＭが９：１から１：１へ）を利用したフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製すると、化合物が得られる（３８１ｍｇ）。
【００８３】
収率：６９％
ＲＦ：０．３４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９：１）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（単位はｐｐｍ）０．８４（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ，２＊ＣＨ3）、１．２１（ｍ，４０Ｈ，２０＊ＣＨ2）、１．４２（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ１＝８．４５Ｈｚ，Ｊ２＝１５．６８Ｈｚ，２＊ＣＨ2）、１．８９（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ）、２．３０（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ１＝７．４３Ｈｚ，Ｊ２＝１５．９２Ｈｚ，２＊ＣＨ2）、２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８４Ｈｚ，Ｈ２’）、３．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’）、４．０９〜４．３５（ｍ，７Ｈ，２＊ＣＨ2（グリセロール），Ｈ４’，Ｈ５’）、５．２７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ（グリセロール））、６．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．８１Ｈｚ，Ｈ１’）、７．６１（ｓ，１Ｈ，Ｈ塩基）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（単位はｐｐｍ）１９．２９（ＣＨ3）、２３．７１（ＣＨ2）、２６．５７（ＣＨ2）、２８．７３（ＣＨ2）、３２．７６（ＣＨ2）、３７．８５（ＣＨ2）、４８．９０（ＣＨ2）、１６６．１５（Ｃ＝Ｏ）。
31Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（単位はｐｐｍ）０．６１。
高分解の質量ＦＡＢの理論値ｍ／ｚ＝８１５．４８２３、観測値ｍ／ｚ＝８１５．４７９４。
【００８４】
［実施例２］
３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）チミジン（ｄｅ  ｃ１６ｄＴ）
【化１３】
2015044815.tif 000014
【００８５】
窒素雰囲気下で、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシチミジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイト（０．５０００ｇ、１当量、０．６７ミリモル）と、１，２−ペルミトイル−ｓｎ−グリセロール（０．４９６ｇ、１．３当量、０．８７ミリモル／３ｍｌのＴＨＦに溶かす）と、テトラゾールをアセトニトリル（２ｍｌ、１．３当量、０．８７ミリモル）に溶かした０．４５Ｍ溶液とを、３ｍｌの無水アセトニトリルに溶かす。この反応媒体を周囲温度にて窒素雰囲気下で２４時間に亘って撹拌する。次に、ジヨードをＴＨＦ／Ｐｙｒ／Ｈ2Ｏに溶かした０．０２Ｍ溶液を４３ｍｌ添加することによって前記混合物を酸化する。１２時間に亘って周囲温度にした後、溶媒を真空下で蒸発させ、Ｐ2Ｏ5下で一晩に亘ってポンピングして乾燥させる。残留物を８ｍのジクロロメタンに溶かす。次に０．２ｍｌの１，５−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデス−７−エン（ＤＢＵ）（１．３当量、０．８７ミリモル）を５時間かけて反応媒体に添加する。この反応媒体を０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、次いで飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液で洗浄する。有機相を真空下で濃縮する。溶離液の勾配（ＭｅＯＨ／ＤＣＭが９８：２から１：１へ）を利用したフラッシュ・クロマトグラフィーによって精製すると、化合物が得られる（１８０ｍｇ）。
【００８６】
収率：２４％
ＲＦ：０．３（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ８：２）
1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（単位はｐｐｍ）０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２＊ＣＨ3）、１．２５（ｍ，４８Ｈ，２４＊ＣＨ2）、１．４２（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ１＝８．４Ｈｚ，Ｊ２＝１５．６Ｈｚ，２＊ＣＨ2）、１．９０（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ）、２．３３（ｍ，４Ｈ，２＊ＣＨ2）、２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ２’）、３．８４（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’）、４．０９〜４．３５（ｍ，７Ｈ，２＊ＣＨ2（グリセロール），Ｈ４’，Ｈ５’）、５．２７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ（グリセロール））、６．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ１’）、７．５４（ｓ，１Ｈ，Ｈ  （塩基））。
13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（単位はｐｐｍ）１２．４（ＣＨ3塩基）、１４．１（ＣＨ3鎖）、１９．６（ＣＨ2）、１９．７（ＣＨ2）、２２．６（ＣＨ2）、２４．８（ＣＨ2）、２９．１〜２９．６（ＣＨ2）、３１．９（ＣＨ2）、３３．９（ＣＨ2）、３４．１（ＣＨ2）、６１．５（ＣＨ2）、６１．７（ＣＨ2）、６２．５（ＣＨ2）、６２．６（ＣＨ2）、６６．１（ＣＨ2）、６６．２（ＣＨ2）、６９．１（ＣＨ）、７８．８（ＣＨ）、８５．５（ＣＨ）、８６．１（ＣＨ）、１１１．３（Ｃ塩基）、１３６．８（ＣＨ塩基）、１５０．５（Ｃ＝Ｏ塩基）、１６４．１（Ｃ＝Ｏ塩基）、１７３．０（Ｃ＝Ｏ鎖）、１７３．５（Ｃ＝Ｏ鎖）。
31Ｐ ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ（単位はｐｐｍ）２．１。
質量ＥＳＩ-：理論値ｍ／ｚ＝８７２．５、観測値ｍ／ｚ＝８７１．３。
【００８７】
［実施例３］
５’−（４−ヘキサデシルオキシメチル−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化１４】
2015044815.tif 000015
【００８８】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２００ｍｇ（０．７５ミリモル）と調製物５に記載した１−プロパルギルオキシオクタデカン２３１ｍｇ（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１２ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。シリカ上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって白色の固形物が１８０ｍｇ得られる。
【００８９】
ＲＦ：０．７２（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）
収率：４２％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：５７６．４１２５、質量の測定値：５７６．４１２０
【００９０】
［実施例４］
５’−（４−ヘキサデシルオキシメチル−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシアデノシン
【化１５】
2015044815.tif 000016
【００９１】
フラスコの中に、調製物４に記載した５’−アジド−５’，２’−デオキシアデノシン２００ｍｇ（０．７２ミリモル）と調製物５に記載した１−プロパルギルオキシオクタデカン２２３ｍｇ（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１２ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。シリカ上のカラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって白色の固形物が１５０ｍｇ得られる。
【００９２】
ＲＦ：０．６５（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）
収率：３５％
【００９３】
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．８９（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ１．２６（ｍ，３０Ｈ，ＣＨ2）、δ１．５５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ２．５４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2）、δ３．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ2）、δ３．４５（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ４．５０（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2，ＣＨ）、δ４．８９（ｍ，？？？）、δ５．８８（ｓ，２Ｈ，ＮＨ2）、δ６．４０（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．４２（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．８１（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ８．３５（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）。
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：５８５．４２４１、質量の測定値：５８５．４２５４
【００９４】
［実施例５］
５’−（４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化１６】
2015044815.tif 000017
【００９５】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２１５ｍｇ（０．８ミリモル）とオクト−１−イル−３−オールのラセミ混合物１０１ｍｇ（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３１．５ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１３ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８５／１５）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が２５５ｍｇ得られる。
【００９６】
ＲＦ：０．４８（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８５／１５）
収率：７８％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ6）：δ０．８３（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ１．２４（ｍ，６Ｈ，ＣＨ2）、δ１．６８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ１．８１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ４．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、δ４．２７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、δ４．６２（ｍ，３Ｈ，ＣＨ2，ＣＨ）、δ５．２（ｄ，ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ）、δ５．５（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、δ６．１７（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．３７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．８９（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５．４７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ6）：δ１２．５（ＣＨ3）、δ１４．４（ＣＨ3）、δ２２．６（ＣＨ2）、δ２５．１、δ３１．７（ＣＨ2）、δ３８．４（ＣＨ2）、δ５１．６（ＣＨ2−Ｎ）、δ６６．０（ＣＨ−Ｏ）、δ７１．３（Ｃ）、δ８４．４、δ８４．５、δ１１０．３（＝Ｃ−Ｎ）、δ１２２．８、δ１３６．４、δ１５０．９、δ１５２．４、δ１６４．１。
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｎａ］+：質量の計算値：４１６．１９１０、質量の測定値：４１６．１８９７
【００９７】
［実施例６］
５’−（４−（ヘキシル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化１７】
2015044815.tif 000018
【００９８】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２００ｍｇ（０．７５ミリモル）と８２．６５ｍｇのノン−１−イン（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１２ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が１３０ｍｇ得られる。
【００９９】
ＲＦ：０．６２（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）
収率：４６％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：５７６．４１２５、質量の測定値：５７６．４１２０
【０１００】
［実施例７］
５’−（４−（ヘプチル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化１８】
2015044815.tif 000019
【０１０１】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２００ｍｇ（０．７５ミリモル）と９３ｍｇのノン−１−イン（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１２ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８５／１５）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が１２０ｍｇ得られる。
【０１０２】
ＲＦ：（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８５／１５）
収率：４１％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ０．８３（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ１．２５（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2）、δ１．５５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ１．７９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）、δ２．１０（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ２．６１（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ４．０６（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ４．２７（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ４．５９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ５．５（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）、δ６．１６（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．２９（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ７．８２（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、δ１１．３１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
13Ｃ ＮＭＲ（７５．４７ＭＨｚ，ＤＭＳＯ ｄ6）：δ１２．６（ＣＨ3）、δ１４．４（ＣＨ3）、δ２２．５（ＣＨ2）、δ２５．４（ＣＨ2）、δ２８．９（ＣＨ2）、δ２９．０（ＣＨ2）、δ２９．４（ＣＨ2）、δ３１．７（ＣＨ2）、δ３８．４（ＣＨ2）、δ５１．５（ＣＨ2）、δ７１．１（ＣＨ）、δ８４．４（ＣＨ）、δ１１０（Ｃ）、δ１２３．１（ＣＨ）、δ１３６．５（ＣＨ）、δ１４７．４（Ｃ）、δ１５０．９（Ｃ＝Ｏ）、δ１６４．１（Ｃ＝Ｏ）。
【０１０３】
［実施例８］
５’−（４−（２，２−ジトリデシル−［１，３］ジオキソラン−４−イルメトキシメチル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化１９】
2015044815.tif 000020
【０１０４】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２６４ｍｇ（１ミリモル）と５００ｍｇの４−プロプ−２−イニルオキシメチル−２，２−ジトリデシル−［１，３］ジオキソラン（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３９．５ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．２ミリモル）と１６ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．１ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が５５０ｍｇ得られる。
【０１０５】
収率：７２％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：７７４．５７４５、質量の測定値：７７４．５７３９
【０１０６】
［実施例９］
５’−（４−（２，２−ジトリデシル−［１，３］ジオキソラン−４−イルブトキシメチル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化２０】
2015044815.tif 000021
【０１０７】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン１９５ｍｇ（０．７３ミリモル）と４００ｍｇの４−（４−プロプ−２−イニルオキシ−ブチル）−２，２−ジトリデシル−［１，３］ジオキソラン（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１２ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７３ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が１８０ｍｇ得られる。
【０１０８】
ＲＦ：０．４３（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）
収率：３０％
【０１０９】
［実施例１０］
５’−（４−（（Ｏ−コレステリル）−メチル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化２１】
2015044815.tif 000022
【０１１０】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン１７０ｍｇ（０．６３ミリモル）と調製物７に記載したｏ−プロパルギルコレステロール２７０ｍｇ（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、２０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１３ミリモル）と１０ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０６３ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が２６０ｍｇ得られる。
【０１１１】
ＲＦ：０．５７（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）
収率：５９％
ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：６９２．３
【０１１２】
［実施例１１］
１，１２−ビス−［５’−（４−（メチル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン］−オキシドデカン
【化２２】
2015044815.tif 000023
【０１１３】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン１００ｍｇ（０．３７５ミリモル）と調製物６に記載した化合物を基に調製した１，１２−ジプロパルギルオキシドデカン５２ｍｇ（０．５当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、１５ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．０７５ミリモル）と６ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０３７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物９０ｍｇが得られる。
【０１１４】
収率：５９％
1Ｈ ＮＭＲ（３００．１３ＭＨｚ，ＭｅＯＨ ｄ4）：δ１．２８（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ2）、δ０．８３（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ１．８９（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3）、δ２．１７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2）、δ２．２５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ３．５１（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ４．１８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ）、δ４．４２（ｍ，２Ｈ，ＯＨ）、δ４．５８（ｓ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ４．７６（ｑｄ，ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ，ＣＨ2）、δ６．２１（ｔ，ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ）、δ７．２３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ）、δ７．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ）。
【０１１５】
［実施例１２］
５’−（４−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−ヘキシル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化２３】
2015044815.tif 000024
【０１１６】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２１５ｍｇ（０．８ミリモル）と１０１．５ｍｇの（Ｒ）オクト−１−イン−３−オール（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３１．５ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１３ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が２４０ｍｇ得られる。
【０１１７】
ＲＦ：０．４８（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ９／１）
収率：７６％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：５７６．４１２５、質量の測定値：５７６．４１２０
【０１１８】
［実施例１３］
５’−（４−（１（Ｓ）−ヒドロキシ−ヘキシル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジン
【化２４】
2015044815.tif 000025
【０１１９】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２１５ｍｇ（０．８ミリモル）と１０１．５ｍｇの（Ｓ）オクト−１−イン−３−オール（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３１．５ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１３ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８５／１５）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が２５５ｍｇ得られる。
【０１２０】
ＲＦ：０．４８（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８５／１５）
収率：７８％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：５７６．４１２５、質量の測定値：５７６．４１２０
【０１２１】
［実施例１４］
５’−（４−（１−ヒドロキシ−ヘキシル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシアデノシン
【化２５】
2015044815.tif 000026
【０１２２】
フラスコの中に、調製物３に記載した５’−アジド−５’−デオキシチミジン２００ｍｇ（０．７５ミリモル）とオクト−１−イン−３−オールのラセミ混合物９５ｍｇ（１当量）をＴＨＦと水の混合物（１／１）に溶かした０．１Ｍ溶液を導入する。次に、３０ｍｇのアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量、０．１５ミリモル）と１２ｍｇの硫酸銅（０．１当量、０．０７５ミリモル）を順番に添加する。この反応媒体を６０℃に加熱して５時間に亘って撹拌する。次に前記混合物を周囲温度まで冷却する。この反応媒体を直ちにシリカに吸着させ、溶媒を蒸発させて除去する。カラムクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）によって純粋な化合物が得られる。白色の固形物が２４０ｍｇ得られる。
【０１２３】
ＲＦ：０．４７（ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ ８／２）
収率：８０％
高分解能ＳＭ［Ｍ＋Ｈ］+：質量の計算値：５７６．４１２５、質量の測定値：５７６．４１２０
【０１２４】
［実施例１５］
ナノ粒子の調製
一般式（Ｉ）の化合物として、実施例２で調製した３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）チミジン（ｄｉＣ１６ｄＴ）を、補助脂質としてジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を用いる。
【０１２５】
１）貯蔵溶液の調製
ａ）シスプラチン溶液の調製
１５ｍｇのシスプラチンを１０ｍｌのミリＱ水に溶かす（５ｍＭ）。この懸濁液を１分間に亘って撹拌し（ボルテックス）、次いで３７℃にて２４時間に亘ってインキュベートする。
【０１２６】
ｂ）脂質溶液の調製
溶液Ａ：２０ｍｇのｄｉＣ１６ｄＴを２ｍｌのクロロホルムに溶解させる（１０ｍｇ／ｍｌ）。溶液は−２０℃で保管する。
溶液Ｂ：ＤＯＰＣ：クロロホルム中２０ｍｇ／ｍｌ溶液、−２０℃保管。
【０１２７】
２）脂質製剤の調製
２ｍｌのエッペンドルフ（登録商標）管内で、５２．３μｌの溶液Ａを２３．６μｌの溶液Ｂと混合する。両者の体積はモル比１／１に対応する。
窒素雰囲気下でクロロホルムを蒸発させると、一様な脂質膜が得られる。
【０１２８】
３）ナノ粒子の調製
あらかじめ３７℃でインキュベートした１．２ｍｌのシスプラチン溶液を用い、あらかじめ調製した脂質膜を再び水和させる。前記混合物を３０分間に亘って３７℃でインキュベートする。加熱（４５℃の熱浴）と凍結（ドライアイス／メタノール−７８℃）のサイクルを１０回実施する。
【０１２９】
４）ナノ粒子の洗浄と回収
１０サイクルの終了後、エッペンドルフ管を４℃にて５分間に亘って２１００ｒｐｍで遠心分離する。上清を除去した後、沈殿物を１ｍｌのミリＱ水の中に再び懸濁させる。２回目の遠心分離（４℃にて５分間に亘って２１００ｒｐｍ）を実施した後、上清を除去し、沈殿物を乾燥させる。
【０１３０】
１ｍｌのミリＱ水の中に再び懸濁させた沈殿物の濃度（ＩＣＰ／光学分析）は、シスプラチンが２．８４４ｍＭに等しい（８５２．２ｍｇ／ｌ）。この濃度は、最初に使用したシスプラチンの４７．４％に相当する。
【０１３１】
［実施例１６］
ナノカプセルの調製
一般式（Ｉ）の化合物として、実施例２で調製した３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）チミジン（ｄｉＣ１６ｄＴ）を、補助脂質としてジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を用いる。
【０１３２】
１）貯蔵溶液の調製
ａ）シスプラチン溶液の調製
１５ｍｇのシスプラチンを１０ｍｌのミリＱ水に溶かす（５ｍＭ）。この懸濁液を１分間に亘って撹拌し（ボルテックス）、次いでときどき撹拌しながら３７℃にて２４時間に亘ってインキュベートする。
【０１３３】
ｂ）脂質溶液の調製
溶液Ａ：２０ｍｇのｄｉＣ１６ｄＴを２ｍｌのジクロロメタンに溶解させる（１０ｍｇ／ｍｌ）。溶液は−２０℃で保管する。
溶液Ｂ：ＤＯＰＣ：ジクロロメタン中２０ｍｇ／ｍｌ溶液、−２０℃保管。
【０１３４】
２）脂質製剤の調製
２ｍｌのエッペンドルフ（登録商標）管内で、５２．３μｌの溶液Ａを４７．２μｌの溶液Ｂと混合する。両者の体積はモル比１／２に対応する。
圧縮窒素を用いてジクロロメタンを蒸発させると、一様な脂質膜が得られる。
【０１３５】
３）ナノ粒子の調製
１．２ｍｌのシスプラチン溶液（５ｍＭ）を、あらかじめ調製した脂質膜とともに、撹拌することなく周囲温度にて一晩インキュベートする。加熱（４５℃の熱浴）と凍結（ドライアイス／メタノール−７８℃）のサイクルを１０回実施する。
【０１３６】
４）ナノ粒子の洗浄と回収
１０サイクルの終了後、得られた懸濁液を撹拌し、ガラス製溶血管の中に入れ、次いで５分間に亘って超音波処理する。超音波処理の後、ペレット中に見出される大きなカプセルを除去するため、この懸濁液を１０００ｒｐｍ／２．５分間／２０℃で遠心分離し、ペレットを除去する。上清を新たに１０，０００ｐｐｍ／５分間／２０℃で遠心分離する。ナノ粒子はペレット中にある。沈殿物を１ｍｌのミリＱ水に再び懸濁させ、２回目の遠心分離を行なう。沈殿物を１ｍｌの中に懸濁させ、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）光学分析によって定量する。
【０１３７】
［実施例１７］
安定性の試験
実施例１６のプロトコルに従って調製したナノ粒子をＩＣＰ光学分析によって定量する（測定値は全濃度に対応する）。ナノ粒子の懸濁液を５本のエッペンドルフ（登録商標）管（１５０μｌ）に分ける。これらエッペンドルフ管を撹拌しながら３７℃にて種々の時間（０、２．５、５、１０、２４時間）に亘ってインキュベートする。
【０１３８】
所定の時間（ｘ）が経過した後にエッペンドルフ管を１４，０００ｒｐｍ／１０分間／２０℃で遠心分離し、（沈殿物が再び懸濁状態に戻らないよう静かに回収した）５０μｌの上清を定量分析する。
【０１３９】
比較のため、補助脂質として１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）用い、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＤＯＰＳ）を基とするナノ粒子を同じプロトコルに従って調製する。
【０１４０】
シスプラチンの放出率を以下の式に従って計算する：
放出されたシスプラチンの％＝（Ｃｘ−Ｃ０）／（Ｃｔ−Ｃ０）
Ｃｘ：所定時間（ｘ）経過時の濃度
Ｃ０：インキュベーション前の上清における濃度
Ｃｔ：インキュベーションなし、遠心分離なしの全濃度
【０１４１】
シスプラチンの放出曲線をインキュベーション時間の関数として示したグラフを図１に示す。実施例１６のナノ粒子は記号−○−で示し、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＳを基とするナノ粒子は黒三角で示す。
【０１４２】
この結果から、本発明のナノ粒子では半減期（５０％のシスプラチンが放出されるのに必要なインキュベーション時間）が２４時間を超えるのに対し、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＳを基とするナノ粒子では約６．５時間であることが分かる。
【０１４３】
［実施例１８］
ナノ粒子のサイズ測定
実施例１６のプロトコルに従って調製したナノ粒子をマルバーン社のゼータサイザで分析した。
【０１４４】
ナノ粒子を２ｍｌのミリＱ水（サイズの測定に必要な体積）に懸濁させる。濃度は約０．５ｍＭである（光を散乱させるためこの懸濁液は濁っていなければならない）。測定には使い捨ての容器（１ｃｍ／１ｃｍ）を用いる。
結果から、９５％を超えるナノ粒子が１００〜２５０ｎｍのサイズであり、多分散度が０．２２８であることが分かる。
【０１４５】
［実施例１９］
細胞内へのシスプラチンの投与
プロトコル
遊離したシスプラチンか、実施例１６のナノ粒子の中に封入したシスプラチンを１００μＭ用い、集密度が８０％の細胞ＩＧＲＯＶ１（卵巣腺癌系）（直径１０ｃｍの箱）を２時間、４時間、６時間何れかの時間に亘って処理する。この処理が終了したとき、ＰＢＳで２回洗浄する。細胞をトリプシンで処理し、ＰＢＳの中に再び懸濁させる。この細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄する（遠心分離を１０００ｒｐｍ／１分間）。細胞を１ｍｌのＰＢＳの中に再び懸濁させ、カウントする。
【０１４６】
ＩＣＰ光学分析による定量
１０6個の細胞を５００μｌの細胞溶解溶液を用いて溶解させる（シグマ社の溶解緩衝液）。１％のＨＮＯ3酸を含むミリＱ水を加えて体積を５ｍｌにする。
【０１４７】
結果
結果を図２に示す。この図は、経時的な細胞溶解により遊離したシスプラチンの濃度を示す。この濃度は、処理細胞内に取り込まれたシスプラチン濃度に相当する。
各時間について、斜線を施した列（左側）は遊離したシスプラチンに対応し、点の列（右側）はシスプラチン含有ナノ粒子に対応する。
【０１４８】
この結果から、シスプラチンの内部化は、ナノ粒子の存在下で断然有効性が大きいことが分かる。例えば同じ条件（１０6個の細胞、１００μｌ、２時間）において、遊離シスプラチンの場合には０．５ナノモルのシスプラチンが内部化されるのに対し、ナノ粒子の場合には内部化は４．５倍多い（２．３ナノモル）。
【０１４９】
［実施例２０］
本発明に従って調製したナノ粒子の細胞毒性効果の研究
ナノ粒子を実施例１５に記載した方法に従って調製した。一般式（Ｉ）の化合物として、Nathalie Campins他、New J. Chem.、2007年、第31巻、1928〜1934ページに記載の化合物Ｃ２０ｄＴ：
【化２６】
2015044815.tif 000027
（但しｎ＝１８である）を使用した。
【０１５０】
プロトコル
実施する試験では、白金誘導体に対する固有の耐性を持つことが知られるヒトがん細胞系ＨＣＴ８（結腸直腸腺癌）を用いる。
【０１５１】
プロトコルは次の通りである：
３日前、９６ウエルのプレートに、細胞を、ウエル１つにつき細胞が５０，０００個の密度となるように播種する。
０日目、細胞を試験製剤で処理する。生理的血清中の短時間曝露（３０分間）、又は培地中の長時間曝露（７２時間）を行う。実施した濃度は、０〜０．４〜０．８〜１．５〜３〜６．２５〜１２．５〜２５〜５０〜１００ｍｇ／ｌの点を含む。負の対照（処理しない細胞）と正の対照（シスプラチン）を同時に実施した。
３日目、培地を交換し、７２時間の処理を停止する。
６日目、プロトコルを終了し、ウエルの底に残った細胞をクリスタル・バイオレットで着色する。
【０１５２】
結果の表現
細胞の生存を調べ、様々な濃度の試験製剤により得られた全死亡率（又は細胞毒性）を、負の対照（未処理細胞）により得られた死亡率と比較した。細胞毒性の結果は、阻害濃度５０（ＩＣ50）（すなわち５０％の細胞の死が観察される濃度）で特徴付けられる効果用量曲線の形で示した。
【０１５３】
３０分の時点における予備的な結果（ＩＣ50）
結果を以下の表１に示す。
【０１５４】
【表１】
2015044815.tif 000028
【０１５５】
結果から、一般式（Ｉ）の化合物Ｃ２０ｄＴを含む本発明のナノ粒子は、この試験において、ある用量におけるＩＣ50によって表される３０分後の細胞毒性が、シスプラチンだけを用いた場合よりも有意に小さいことが分かる。
【０１５６】
［実施例２１］
本発明に従って調製したナノ粒子の細胞毒性効果の研究
一般式（Ｉ）の化合物として、
−  実施例２のｄｉＣ１６ｄＴ（３’−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸）チミジン）と補助脂質（ＤＯＰＣ）、又は、
−  補助脂質未添加の実施例１２の５’−（４−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−ヘキシル）−［１，２，３］トリアゾル−１−イル）−５’，２’−ジデオキシチミジンを用いた。
【０１５７】
ナノ粒子を実施例１５に記載した方法に従って調製したが、実施例１２の化合物に対する加熱／冷却のサイクルは１回だけとした。
【０１５８】
プロトコル
１０００〜５０００個のＩＧＲＯＶ１細胞を、ウエル１つにつき血清を含む１００μｌの培地の中でインキュベートする（９６ウエルのプレート）。２４時間後、培地を除去し、細胞を１〜３日間に亘って（望む濃度の）本発明の製剤及び／又は遊離シスプラチンで処理する。血清を含む２００μｌの培地の中で細胞を３７℃にてインキュベートする。処理終了後、細胞の生存率をＭＴＳ試験による比色分析で調べる。
【０１５９】
結果の表現
細胞の生存を調べ、種々の濃度の製剤で得られた全死亡率（又は細胞毒性）を、負の対照（未処理細胞）により得られた結果と比較した。細胞毒性の結果は、阻害濃度５０（ＩＣ50）（すなわち５０％の細胞の死が観察される濃度）で特徴付けられる効果用量曲線の形態で示した。
【０１６０】
結果を以下の表２に示す。この表では、ＩＣ50を、μＭ、又はシスプラチン１Ｌ当たりｍｇの単位で示す（インキュベーション時間：２４時間）。
【０１６１】
【表２】
2015044815.tif 000029
【０１６２】
この結果から、補助脂質の存在下又は不在下で調製した一般式（Ｉ）の化合物を含む本発明のナノ粒子は、この試験において、ある用量におけるＩＣ50によって表される２４時間後の細胞毒性が、シスプラチンのみを用いた場合よりも有意に小さいことが分かる。
【０１６３】
［実施例２２］
本発明に従って調製したナノ粒子の細胞傷害効果の研究
プロトコル
ａ／細胞の調製と処理
９６ウエルのプレートの中で、ウエル１つにつき２５００個の細胞（卵巣腺癌系であるＩＧＲＯＶ１とＳＫＯＶ３）を、血清を含む１００μｌの培地の中でインキュベートする。２４時間後、培地を吸引し、血清なしの１００μｌの培地中で、遊離シスプラチン、又は実施例１６のナノ粒子の中に封入したシスプラチンをさまざまな濃度（５００、１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１μＭ）にして細胞を処理する。２４時間処理した後、培地を取り出し、細胞を１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した後、血清を含む１００μｌの培地とともにインキュベートする。
【０１６４】
ｂ／毒性の出現
その２回の洗浄から４８時間後、２０μｌのＭＴＳを添加して細胞の生存率を調べる。３７℃にて２〜４時間インキュベートした後に４９０ｎｍでの吸光度を測定する。吸光度は、細胞の生存率に比例する。
【０１６５】
ｃ／結果
結果を図３に示す。図３Ａ、Ｂは、５０％の細胞を死滅させるのに必要な濃度（ＩＣ50）を、遊離シスプラチン（カラムＡ）又はシスプラチン含有ナノ粒子（カラムＢ）について示すグラフである。図３ＡはＩＧＲＯＶ１細胞系に関し、図３ＢはＳＫＯＶ３細胞系に関する。
【０１６６】
結果から、シスプラチンを含む実施例１６のナノ粒子は、ＩＧＲＯＶ１（シスプラチンに敏感）とＳＫＯＶ３（シスプラチンに抵抗）という２つの細胞系において、遊離シスプラチンよりも有効であることが分かる。
【０１６７】
ＩＧＲＯＶ１細胞系では、シスプラチン含有ナノ粒子を０．２７μＭ用いると細胞が５０％死ぬのに対し、遊離シスプラチンではこの結果を得るのに２．４１μＭ用いる必要がある。ＳＫＯＶ３細胞系では、シスプラチン含有ナノ粒子を０．５４μＭ用いると細胞が５０％死ぬのに対し、遊離シスプラチンでは４．３μＭである。
【０１６８】
シスプラチン含有ナノ粒子は、ＩＧＲＯＶ１細胞系とＳＫＯＶ３細胞系に関して遊離シスプラチンよりもそれぞれ９倍と８倍効果が大きい。
【図１】
2015044815.tif 000039
【図２】
2015044815.tif 000040
【図３】
2015044815.tif 000041
【外国語明細書】
2015044815000001.pdf