(57)【要約】【課題】生体に対する安全性が高く、分子イメージングによって炎症病変の位置を検出することのできる関節リウマチの診断薬を提供する。【解決手段】サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマー、及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチ診断薬。前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位は２〜３００個であり、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である。前記標識剤は、好ましくは蛍光色素である。【選択図】図２
2015078150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチ診断薬。
【請求項２】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位は２〜３００個である、請求項１に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項３】
前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である、請求項１又は２に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項４】
前記標識剤は、蛍光色素Ｂである、請求項１〜３のいずれかに記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項５】
前記蛍光色素Ｂは、５個以上の乳酸単位と、蛍光基とを少なくとも有する蛍光標識ポリマーＢ１であり、且つ、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１とともに自己集合することによりナノ粒子を形成している、請求項４に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項６】
前記蛍光標識ポリマーＢ１における蛍光基が、下記式（I）：
【化１】
2015078150.tif 000029
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるものである、請求項５に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項７】
前記蛍光標識ポリマーＢ１における蛍光基は、インドシアニングリーンに由来する基である、請求項５又は６に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項８】
前記蛍光色素Ｂは、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１の自己集合により形成されたナノ粒子に内包された蛍光分子Ｂ２である、請求項４に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項９】
前記近赤外蛍光分子Ｂ２が、下記式（I’）：
【化２】
2015078150.tif 000030
（式中、Ｒ１及びＲ２’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘはハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるシアニン化合物である、請求項８に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項１０】
前記蛍光分子Ｂ２は、インドシアニングリーン分子である、請求項８又は９に記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項１１】
前記ナノ粒子は、１０個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーＡ２をさらに含むものである、請求項１〜１０のいずれかに記載の関節リウマチ診断薬。
【請求項１２】
前記ナノ粒子は、１０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の関節リウマチ診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ診断薬に関する。より詳しくは、本発明は、両親媒性ブロックポリマー及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチ診断薬に関する。さらに詳しくは、本発明は、両親媒性ブロックポリマー及び標識剤を含むナノ粒子を含有し、前記標識剤に基づいた分子イメージングによって炎症病変の位置を検出することのできる関節リウマチ診断薬に関する。
【０００２】
前記ナノ粒子において、前記標識剤を関節リウマチ治療作用のある薬剤に代えると、関節リウマチ治療薬となる。また、前記ナノ粒子において、前記標識剤が関節リウマチ治療作用を有していると、あるいは前記標識剤及び関節リウマチ治療作用のある薬剤の双方を包含させると、関節リウマチ治療診断薬となる。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチ（Rheumatoid arthritis:ＲＡ）は、進行にともない全身の関節が破壊される自己免疫疾患であり、日本には約７０万人の患者がいるとされる。進行すると痛みや関節変形により、日常生活に著しい制限を受ける場合がある。関節リウマチにおける関節炎は、関節内腔を覆う滑膜の炎症と増殖によるものである。治療においては、一般に消炎鎮痛剤や抗リウマチ薬(メトトレキサート)が使用されるが、症状によっては充分な効果が得られない場合もある。
【０００４】
関節リウマチの診断は、例えば、アメリカリウマチ学会（American College of Rheumatology:ＡＣＲ）の関節リウマチ分類基準に応じて行われるが、早期の関節リウマチでは、ＡＣＲ基準の診断感度は５０％程度と見られる。
【０００５】
関節リウマチの診断には、臨床所見、血液検査による血清リウマトイド因子（変性IgG に対する自己抗体；ＲＦ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、画像検査（単純レントゲン写真、ＣＴ、ＭＲＩ）などが用いられている。
【０００６】
関節リウマチにおける関節炎及び他のリウマチ性疾患を診断することは、多くの症状は様々な疾患の間で類似しているので、しばしば困難である。従って、より的確な診断法が求められる。
【０００７】
関節リウマチ診断の改良については、例えば、特開２００３−５７２４２号公報、特開２００５−３１５７７２号公報、特開２００６−３０４７２１号公報、特開２０１３−２１９３２号公報、特開２０１３−３２３５８号公報等に報告がある。これらは、いずれも免疫化学的な診断手法に関している。
【０００８】
特開２０１３−５１５０９９号公報には、ホスホリルコリンなどの双性イオンと機能性剤（薬剤、検出剤、イメージング剤、標識化剤、診断剤など）とを有するランダム共重合体が開示され、前記ランダム共重合体は、診断及びイメージングの目的に有効であることが開示されている（［００２４］）。同号公報には、前記ランダム共重合体は、ホスホリルコリンなどの双性イオンを含む単量体に連結することができる単量体を用い、ラジカル重合によって製造されること（［００２５］）、前記ランダム共重合体は、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタアクリルアミド、スチレン、ビニル−ピリジン及びビニル−ビロリドンを含む単量体から製造されること（［００２７］）が開示されている。双性イオン成分とは、陽電荷及び陰電荷の双方を有する化合物である（［００２８］）。機能性剤はナノ粒子を含んでいてもよく、ナノ粒子に診断剤及び／又は治療剤を詰めることができることが開示されている（［０１９１］）。また、前記ランダム共重合体を近赤外光線やＭＲＩによるイメージングに用いることが開示され（［０２５８］〜［０２６０］）、慢性関節リウマチの治療に言及されている（［０２５５］）。上記の各単量体は生体適合性が十分ではない。同号公報には、両親媒性ブロックポリマーからなるナノ粒子は開示されていない。
【０００９】
一方、より生体適合性が高いペプチド性のナノ粒子も知られている。例えば、特開２００８−２４８１６号公報及び米国特許出願公開ＵＳ２００８／００１９９０８には、疎水性ブロックとしてポリグルタミン酸メチルエステルを有する両親媒性ブロックポリマーを用いた、ペプチドタイプのナノ粒子が開示されている。この公報には、両親媒性ブロックポリマーの鎖長を変化させることにより、ナノ粒子の粒子径を制御できることが記載されている。また、当該ナノ粒子ががん組織へ集積することを観察したことが示されている。
【００１０】
また、Chemistry Letters, vol.36, no.10, 2007, p.1220-1221には、ポリ乳酸鎖とポリサルコシン鎖から構成される両親媒性ブロックポリマーを合成し、当該両親媒性ブロックポリマーの自己集合によって、ＤＤＳにおけるナノキャリアとしての利用可能性を有する粒径２０〜２００ｎｍの分子集合体を調製したことが示されている。
【００１１】
国際公開第２００９／１４８１２１号公報（米国特許出願公開ＵＳ２０１１／０１０４０５６）及びバイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０に、疎水性ブロックがポリ乳酸鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。ラクトソームの粒子径については、国際公開第２００９／１４８１２１号公報の段落［０１２７］に１０ｎｍ〜５００ｎｍが開示されているが、実際には、段落［０２５１］に３０ｎｍ〜１３０ｎｍが開示されているのみである。ラクトソームは、高い血中滞留性を有するほか、それまでに既に開発されていた高分子ミセルと比べて肝臓への集積量が著しく減少することが分かっている。このラクトソームは、血中に滞留している粒子径が数十〜数百ｎｍのナノ粒子が癌疾に溜まりやすいという性質［Enhanced Permeation and Retention effect（ＥＰＲ効果）］を利用することによって、癌疾部位を標的とした分子イメージング又は薬剤搬送用のナノキャリアとして適用可能である。
【００１２】
がん組織は正常組織よりも細胞の増殖が速く、細胞の増殖に必要な酸素やエネルギーを獲得するために、がん組織中に新生血管を誘導する。この新生血管はもろいため、ある程度大きな分子も当該血管外に漏れ出すことが知られている。さらに、がん組織では物質の排泄機構が未発達であるため、当該血管から漏れ出た分子がある程度がん組織中に滞留する。この現象がＥＰＲ効果として知られているものである。
【００１３】
国際公開第２０１２／１７６８８５号公報には、サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸を有する疎水性ブロックとを有する分岐型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、粒径が１０〜５０ｎｍの高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。
【００１４】
国際公開第２０１２／０２６３１６号公報（米国特許出願公開ＵＳ２０１３／０１４９２５２）、及び国際公開第２０１２／１１８１３６号公報には、蛍光色素を内包させたラクトソームナノ粒子からなるスイッチング型蛍光ナノ粒子プローブ及びそれを用いた蛍光分子イメージング法が開示されている。
【００１５】
国際公開第２０１２／１２８３２６号公報には、疎水性ブロックがポリ乳酸鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーからなり、レーザー照射により細胞毒性を生じさせる近赤外蛍光色素を含むナノ粒子（ラクトソーム）を光線力学治療に用いることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００３−５７２４２号公報
【特許文献２】特開２００５−３１５７７２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７２１号公報
【特許文献４】特開２０１３−２１９３２号公報
【特許文献５】特開２０１３−３２３５８号公報
【特許文献６】特開２０１３−５１５０９９号公報
【特許文献７】特開２００８−２４８１６号公報
【特許文献８】米国特許出願公開ＵＳ２００８／００１９９０８
【特許文献９】ＷＯ２００９／１４８１２１号公報
【特許文献１０】米国特許出願公開ＵＳ２０１１／０１０４０５６
【特許文献１１】ＷＯ２０１２／１７６８８５号公報
【特許文献１２】ＷＯ２０１２／０２６３１６号公報
【特許文献１３】米国特許出願公開ＵＳ２０１３／０１４９２５２
【特許文献１４】ＷＯ２０１２／１１８１３６号公報
【特許文献１５】ＷＯ２０１２／１２８３２６号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ケミストリ・レターズ (Chemistry Letters)、２００７年、第３６巻、第１０号、ｐ．１２２０−１２２１
【非特許文献２】バイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上述したように、関節リウマチの診断法は未だ確立されていないのが現状である。特に、早期の関節リウマチを診断することはさらに困難である。そのため、関節リウマチの的確な診断法が求められる。特に、早期の関節リウマチをも検出し得る的確な診断法が求められる。
【００１９】
本発明の目的は、生体に対する安全性が高く、分子イメージングによって炎症病変の位置を検出することのできる関節リウマチの診断薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、標識剤を内包させたラクトソームナノ粒子は、関節リウマチの炎症部位に集積し、分子イメージングによって関節リウマチの炎症病変の位置を検出することのできる関節リウマチ診断試薬として用い得ることを見出した。
【００２１】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチ診断薬。
【００２２】
前記「ナノ粒子」は、基本的に、両親媒性ブロックポリマー分子の凝集により、或いは自己集合的な配向会合により成り立つ「分子集合体」である。乳酸単位を基本単位として有する疎水性ブロック鎖を含む両親媒性ブロックポリマーＡ１を含んで構成される分子集合体を、「ラクトソーム（lactosome）」と記載することがある。「サルコシン」とは、Ｎ−メチルグリシンである。
【００２３】
前記ナノ粒子は、分子集合体（ラクトソーム；lactosome）をキャリア剤とし、且つ標識剤を有するものである。キャリア剤を有する態様として、下記（５）及び（８）がある。本明細書においては、便宜上、下記（５）及び（８）の態様のいずれについても、分子集合体に標識剤が「内包される」と表現する場合がある。
【００２４】
両親媒性ブロックポリマーＡ１の親水性ブロック鎖が有する「親水性」とは、当該親水性ブロック鎖が、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖に対して、相対的に親水性が強い性質をいう。疎水性ブロック鎖が有する「疎水性」とは、当該疎水性ブロック鎖が、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖に対して、相対的に疎水性が強い性質をいう。
【００２５】
標識剤は、検出によりイメージングを可能にする特性を有するものである。例えば、標識剤として、蛍光基を有する物質（蛍光色素）、放射性元素含有基を有する物質、磁性基を有する物質などが挙げられる。
【００２６】
（２）  前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位は２〜３００個である、上記（１）に記載の関節リウマチ診断薬。本明細書において、構成単位の数すなわち重合度は平均重合度である。
【００２７】
（３）  前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は５〜４００個である、上記（１）又は（２）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００２８】
（４）  前記標識剤は、蛍光色素Ｂである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の関節リウマチ診断薬。
【００２９】
（５）  前記蛍光色素Ｂは、５個以上の乳酸単位と、蛍光基とを少なくとも有する蛍光標識ポリマーＢ１であり、且つ、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１とともに自己集合することによりナノ粒子を形成している、上記（４）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００３０】
（６）  前記蛍光標識ポリマーＢ１における蛍光基が、下記式（I）：
【化１】
2015078150.tif 000003
（式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘは水素又はハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、それぞれ同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるものである、上記（５）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００３１】
（７）  前記蛍光標識ポリマーＢ１における蛍光基は、インドシアニングリーンに由来する基である、上記（５）又は（６）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００３２】
（８）  前記蛍光色素Ｂは、前記両親媒性ブロックポリマーＡ１の自己集合により形成されたナノ粒子に内包された蛍光分子Ｂ２である、上記（４）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００３３】
（９）  前記近赤外蛍光分子Ｂ２が、下記式（I’）：
【化２】
2015078150.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基であり；Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものであり；Ｘはハロゲンであり；Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１であり；環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。）で示されるシアニン化合物である、上記（８）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００３４】
（１０）  前記蛍光分子Ｂ２は、インドシアニングリーン分子である、上記（８）又は（９）に記載の関節リウマチ診断薬。
【００３５】
（１１）  前記ナノ粒子は、１０個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーＡ２をさらに含むものである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の関節リウマチ診断薬。
【００３６】
（１２）  前記ナノ粒子は、１０〜２００ｎｍの粒子径を有する、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の関節リウマチ診断薬。「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒子径、すなわち中心粒子径を意味する。
【００３７】
・  サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチの炎症性滑膜の診断薬。
【００３８】
・  サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチの炎症性滑膜の範囲の診断薬。
【００３９】
・  サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び標識剤を含むナノ粒子を含有する関節リウマチの炎症性滑膜の切除範囲の診断薬。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によると、内包された標識剤に基づいた分子イメージングによって炎症病変の位置を検出することのできる関節リウマチ診断薬が提供される。すなわち、本発明において、上記ナノ粒子は、関節リウマチの炎症部位にＥＰＲ効果により特異的に集積するので、集積したナノ粒子を分子メージング装置によって検出することにより、関節リウマチの正確な診断、特に滑膜炎症部位の範囲の正確な診断を行うことができる。これは、免疫化学的な診断手法に対して大きな利点である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実験例２において、ラクトソーム投与直後、３、６時間での蛍光検出画像である。関節炎群は上段、コントロール群は下段に示されている。
【図２】実験例２において、ラクトソーム投与１２、２４、４８時間での蛍光検出画像である。関節炎群は上段、コントロール群は下段に示されている。
【図３】実験例２において、関節炎群及びコントロール群の両群について、ラクトソーム投与２４時間経過後での実写真と蛍光イメージングの同時撮影の結果を示す。図３（ａ）は実写真であり、下段の写真は足関節部分の拡大である。図３（ｂ）は蛍光イメージングの画像である。
【図４】実験例２において、関節炎群及びコントロール群の各群について、ラクトソーム投与からの経過時間に対する蛍光強度比を示す。
【図５】実験例２において、関節炎群について、ラクトソーム投与からの経過時間に対する蛍光強度比を示す。
【図６】実験例２において、各組織における蛍光強度を示す。図６（ａ）は足関節の皮膚を切除した実写真であり、図６（ｂ）は（ａ）に対応する蛍光イメージングの画像である。図６（ｃ）は皮膚切除した後、足関節の筋を切除した実写真であり、図６（ｄ）は（ｃ）に対応する蛍光イメージングの画像である。
【図７】実験例２において、各組織における蛍光強度を示す。図７（ａ）は筋切除した後、足関節の関節包・滑膜を切除した実写真であり、図７（ｂ）は（ａ）の部分拡大であり、図７（ｃ）は（ａ）に対応する蛍光イメージングの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の関節リウマチ診断薬は、サルコシン単位を有する親水性ブロックと乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーＡ１、及び標識剤を含むナノ粒子を含有するものである。前記ナノ粒子は、両親媒性ブロックポリマー分子の凝集により、或いは自己集合的な配向会合により成り立つ分子集合体（ラクトソーム）であり、分子集合体に前記標識剤が内包されている。以下に説明する。
【００４３】
［１．両親媒性ブロックポリマーＡ１］
両親媒性ブロックポリマーＡ１は、サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する。
【００４４】
［１−１．親水性ブロック］
本発明において、親水性ブロック鎖が有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロック鎖の全体が、後述の乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖に対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロック鎖が疎水性ブロック鎖とコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、特に粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。
【００４５】
本発明において、両親媒性ブロックポリマーは、親水性ブロックにおいて直鎖構造を有していてもよいし、分岐した構造を有していてもよい。分岐構造の場合には、親水性ブロックの分岐それぞれにサルコシンが含まれる。
【００４６】
親水性ブロックにおいて、構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。例えば、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計は２〜３００個である。具体的には、直鎖型の場合、サルコシン単位の合計は、例えば、１０〜３００、２０〜２００、又は２０〜１００程度でありうる。構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４７】
分岐型の場合、分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、２〜２００、２〜１００、又は２〜１０個でありうる。あるいは、複数の親水性ブロック全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、３０〜２００、又は５０〜１００個でありうる。１つの分岐当たりのサルコシン単位数の平均は、例えば、１〜６０、１〜３０、１〜１０、又は１〜６でありうる。すなわち、親水性ブロックそれぞれは、サルコシン又はポリサルコシン鎖を含んで構成されることができる。構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４８】
分岐型の場合、親水性ブロックにおける分岐は２以上であればよいが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、好ましくは３以上である。親水性ブロックにおける分岐の数の上限は特に限定されるものではないが、例えば２７である。特に、本発明においては、分岐型の場合、親水性ブロックの分岐の数が３であることが好ましい。分岐構造は、当業者が適宜設計できる。
【００４９】
サルコシン（すなわちＮ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃα炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このような構造を構成ブロックとして用いることは、当該ブロックに高い親水性の基本特性、又は、高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つ基本特性が備わる点で非常に有用である。
【００５０】
さらに、親水性ブロックは、末端（すなわちリンカー部と反対側の末端）に親水性基（例えば水酸基に代表される）を有していることが好ましい。
【００５１】
なお、ポリサルコシン鎖においては、全てのサルコシン単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、当該ポリペプチド鎖全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００５２】
親水性ブロック鎖がサルコシン単位以外の他の構成単位を有する場合、そのような構成単位としては特に限定されないが、アミノ酸（親水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）とすることができる。なお、本明細書において「アミノ酸」は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの修飾及び／又は化学的変更による誘導体を含む概念で用いる。さらに、本明細書において、アミノ酸は、α−、β−、γ−アミノ酸を含む。好ましくは、αアミノ酸である。例えば、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５３】
また、両親媒性ブロックポリマーＡ１は糖鎖やポリエーテルなどのさらなる基を有してよい。この場合は、両親媒性ブロックポリマーＡ１の親水性ブロックが糖鎖やポリエーテルなどを有するように分子設計されることが好ましい。
【００５４】
［１−２．疎水性ブロック］
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
【００５５】
１本の両親媒性ブロックポリマー中に存在する疎水性ブロックは分岐していなくともよいし、分岐していてもよい。しかしながら、疎水性ブロックは分岐していない方が、疎水性コア部に対して、親水性分岐型シェル部の稠密度が増すので、より小さい粒径の安定したコア／シェル型分子集合体を形成し易いと考えられる。
【００５６】
本発明において、疎水性ブロックは乳酸単位を含むものである。疎水性ブロックにおいて構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。例えば、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数は５〜４００個である。具体的には、例えば疎水性ブロックが分岐していない場合、乳酸単位の数は、例えば５〜１００、１５〜６０個、又は２５〜４５個でありうる。疎水性ブロックが分岐している場合は、分岐全てに含まれる乳酸単位の数の合計が、例えば１０〜４００、好ましくは２０〜２００個でありうる。この場合、１つの分岐当たりの乳酸単位数の平均は、例えば、５〜１００、好ましくは１０〜１００個である。
【００５７】
構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００５８】
疎水性ブロックが分岐する場合、分岐の数は特に限定されないが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、例えば、親水性ブロックにおける分岐数以下とすることができる。
【００５９】
ポリ乳酸は、以下の基本特性を有する。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
【００６０】
なお、疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）においては、全ての乳酸単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、疎水性ブロック全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００６１】
疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（ＰＬＡ）は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（ＰＬＬＡ）か、又は、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（ＰＤＬＡ）のいずれであってもよい。また、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位との両者から構成されていてもよい。この場合において、Ｌ−乳酸単位とＤ−乳酸単位とは、交互配列、ブロック配列、又はランダム配列のいずれであってもよい。
【００６２】
疎水性ブロック鎖が乳酸単位以外の他の構成単位を有する場合、そのような構成単位の種類・比率は、ブロック鎖全体が上述したような疎水性であることを満たせば特に限定されるものではないが、所望の諸特性を有するように分子設計されたものであることが好ましい。
【００６３】
疎水性ブロック鎖において、乳酸単位以外の構成単位を有する場合、そのような構成単位は、乳酸以外のヒドロキシ酸及びアミノ酸（疎水性アミノ酸及びその他のアミノ酸を含む）からなる群から選択することができる。ヒドロキシ酸としては、特に限定されないが、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸などが挙げられる。疎水性アミノ酸は、その多くが、脂肪族側鎖、芳香族側鎖などを有する。天然アミノ酸では、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、及びトリプトファンなどが挙げられる。非天然アミノ酸では、特に限定されないが、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステルなどのアミノ酸誘導体が挙げられる。
【００６４】
［１−３．両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成］
本発明において、両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成法としては、特に限定されるものではなく、公知のペプチド合成法、ポリエステル合成法、及び/又はデプシペプチド合成法を用いることができる。
【００６５】
ペプチド合成は、例えば、アミンなどの塩基を開始剤として、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物(アミノ酸ＮＣＡ)を開環重合することなどによって行うことができる。
【００６６】
ポリエステル合成は、例えば、アミンなどの塩基や金属錯体などを開始剤として、ラクチドを開環重合することなどによって行うことができる。ラクチドとしては、ブロック鎖の所望の光学純度を考慮して、当業者が適宜決定することができる。例えば、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、ＤＬ−ラクチド及びメソラクチドから適宜選択し、ブロック鎖の所望の光学純度に応じて当業者が適宜使用量を決定することができる。
【００６７】
デプシペプチド合成は、例えば、疎水性ブロックとしてポリ乳酸を先に合成し、その後、親水性ブロックとなるポリペプチド鎖を伸張する方法と、親水性ブロックとなるポリペプチド鎖を先に合成し、その後、疎水性ブロックとなるポリ乳酸を伸張する方法とが挙げられる。
【００６８】
分子集合体において、ポリ乳酸の鎖長を調整することができる。両親媒性ブロックポリマーＡ１の合成の際には、ポリ乳酸の鎖長をより自由に制御するという観点から、疎水性ブロックであるポリ乳酸を先に合成し、その後、親水性ブロック鎖となるポリペプチド鎖を伸張する方法を行う方が好ましい。また、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖としてのポリ乳酸は、親水性ブロック鎖としてのポリサルコシンに比べ重合度の制御をより容易に且つ正確に行うことができる。
【００６９】
両親媒性ブロックポリマーＡ１の構造及び合成については、ＷＯ２００９／１４８１２１号公報（直鎖型）、及びＷＯ２０１２／１７６８８５号公報（分岐型）を参照することができる。
【００７０】
［２．標識剤］
標識剤は、検出によりイメージングを可能にする特性を有するものであればよい。例えば、標識剤として、蛍光基を有する物質（蛍光色素）、放射性元素含有基を有する物質、磁性基を有する物質などが挙げられる。これら標識剤を検出する手段は、当業者によって適宜選択されるものである。標識剤は、キャリア剤としてのラクトソームナノ粒子に内包される。
【００７１】
［２−１．標識基］
蛍光基としては、特に限定されないが、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素、量子ドットなどに由来する基が挙げられる。本発明においては、近赤外蛍光基（例えばシアニン系色素、量子ドットなどに由来する基）を用いてもよい。
【００７２】
近赤外領域（７００〜１３００ｎｍ）では、水素結合を有する各置換基の吸収が存在するものの、その吸収は比較的小さい。このため、近赤外光は生体組織を透過しやすい特性を有する。このような近赤外光の特性を利用すれば、身体に無用の負荷を与えることなくラクトソームナノ粒子が集積した部位の情報を正確に得ることができる。
【００７３】
近赤外蛍光基のより具体的な例としては、ＩＣＧ（インドシアニングリーン）などのインドシアニン系色素、Ｃｙ７、ＤＹ７７６、ＤＹ７５０、Ａｌｅｘａ７９０、Ａｌｅｘａ７５０などに由来する基が挙げられる。
【００７４】
放射性元素含有基としては、特に限定されないが、18Ｆなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などに由来する基が挙げられる。放射性元素含有基の導入方法の具体例の一つとしては、モノFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) エチレンジアミンを用いてラクチドの重合を行う工程、末端OHをシリル保護基で保護する工程、ピペリジン処理でFmocを脱離する工程、サルコシン−Ｎ−カルボキシ無水物（SarNCA）の重合を行い、重合物末端をターミネーションする工程、シリル保護基を外し、スルホン酸エステル（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸エステル、パラトルエンスルホン酸エステルなど）に変換する工程、及び放射性元素含有基を導入する工程により行う方法が挙げられる。さらに、当該具体例は当業者によって適宜変更されて良い。
【００７５】
磁性基としては、特に限定されないが、フェリクロームなどの磁性体を有するものや、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などに見られるものが挙げられる。
【００７６】
［２−２．蛍光色素Ｂ］
本発明において、前記標識剤は蛍光色素であることが好ましい。蛍光色素Ｂについて、さらに説明する。
【００７７】
蛍光色素Ｂは、キャリア剤に内包される要素である。具体的には、ポリマーに近赤外蛍光基が結合した態様を有するもの（近赤外蛍光標識ポリマーＢ１）及び近赤外蛍光分子そのもの（近赤外蛍光分子Ｂ２）から選ばれる。
【００７８】
［２−２−１．近赤外蛍光標識ポリマーＢ１］
近赤外蛍光標識ポリマーＢ１は、以下の標識基及びポリマー部を少なくとも有する。近赤外蛍光標識ポリマーＢ１は、上記両親媒性ブロックポリマーＡ１とともに自己集合により分子集合体を形成することができる要素である。近赤外蛍光標識ポリマーＢ１は、下記の１種又は複数種を組み合わせて使用することができる。
【００７９】
［２−２−１−１．標識基］
標識基は、近赤外蛍光色素Ｂに上述の特性を付与する部分であり、具体的には、近赤外蛍光分子に由来する基（近赤外蛍光基）である。例えば、シアニン系蛍光分子や量子ドットなどに由来する基が用いられる。シアニン系色素に由来する基の一例は、以下の一般式（I）で表される。
【００８０】
【化３】
2015078150.tif 000005
【００８１】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基であり、Ｒ２は、置換されていてもよい２価の炭化水素基である。
Ｒ１における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキル基でありうる。
Ｒ２における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキレン基でありうる。
Ｒ１及びＲ２における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。
【００８２】
Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものである。Ｒ３及びＲ３’は互いに連結して環状構造をとることにより、蛍光色素の分子構造をリジッド化しうる。
【００８３】
Ｘは水素又はハロゲンである。ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩでありうる。Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１である。ｍが０の場合、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方がアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。ｍが１の場合、Ａ−は、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲンイオン、ＣＩＯ４−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＳＣＮ−等でありうる。
【００８４】
環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。たとえば、含窒素二環式や三環式芳香族複素環でありうる。好ましくは、環Ｂ及び環Ｄは、同一である。
環Ｂの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
【００８５】
【化４】
2015078150.tif 000006
【００８６】
環Ｄの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
【００８７】
【化５】
2015078150.tif 000007
【００８８】
上記式において、Ｒ４及びＲ５は、いずれも水素でありうる。又は、Ｒ４及びＲ５は、それらが互いに連結してアリール環を形成しうる。前記アリール環は、置換されてよいベンゼン環でありうる。
【００８９】
本発明において好ましい蛍光基は、下記構造式（II）で示される、インドシアニン化合物由来の基である。
【００９０】
【化６】
2015078150.tif 000008
【００９１】
本発明における蛍光基の具体例として、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣＧ基（III）、ＩＣ７−１基（IV）及びＩＲ８２０基（V）、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３基（VI）及びＩＲ８０６基（VII）、及び、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７−２基（VIII）が挙げられる。これら基の構造式を以下に示す。
【００９２】
【化７】
2015078150.tif 000009
【００９３】
上記式（III）で表されるＩＣＧ基は、８１０ｎｍ付近の近赤外光レーザーの照射を受けると励起され、定常状態に戻る際に活性酸素やフリーラジカルを放出し、さらに細胞毒性を有する分解物を生じる。
【００９４】
【化８】
2015078150.tif 000010
【００９５】
【化９】
2015078150.tif 000011
【００９６】
【化１０】
2015078150.tif 000012
【００９７】
【化１１】
2015078150.tif 000013
【００９８】
【化１２】
2015078150.tif 000014
【００９９】
［２−２−１−２．ポリマー部］
ポリマー部は、５個以上の乳酸単位を有する。例えば、乳酸単位を主たる構成成分とするもの（すなわちポリ乳酸基）であってもよいし、乳酸単位を疎水性ブロックとし、さらにそれに対する親水性ブロックを有するもの（すなわち両親媒性ブロックポリマー基）であってもよい。本発明における分子集合体は、生体適合性、安定性及び生分解性に優れ、構成ポリマーが低沸点溶媒への溶解性に優れるという諸特性を有するものであることが好ましい。従って、ポリマー部の構成は、これらの優れた諸特性を有するように分子設計されることが好ましい。
【０１００】
ポリ乳酸基は、例えば５〜５０、１０〜５０、好ましくは１５〜３５の乳酸単位を主たる構成成分とする。乳酸単位のすべてが連続していてもよいし、非連続であってもかまわない。上記範囲内で、標識ポリマーＢ１全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の長さを超えないように分子設計される。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの２倍の長さを超えないように分子設計される。
【０１０１】
その他、標識ポリマーＢ１のポリマー部の構成単位や鎖長に関しては、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、標識ポリマーＢ１と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖との親和性に優れるという効果も得られる。
【０１０２】
標識ポリマーＢ１において、近赤外蛍光基は、ポリマー部の末端構成単位に結合しうる。また、標識ポリマーＢ１は、分子設計上化学的又は生化学的に許容される近赤外蛍光基及びポリマー基以外の構成要素のいかなるものも有しうる。この場合、他の構成要素は、標識ポリマーＢ１が全体として上記定義された「疎水性」の範疇を越える影響を与えない程度で含まれる。
【０１０３】
以下に、この態様における標識ポリマーＢ１の具体例を示す。下記式において、ｎは、５〜５０の整数である。下記の化合物は、近赤外蛍光基としてＩＣＧ基を有するものである。
【０１０４】
【化１３】
2015078150.tif 000015
【０１０５】
標識ポリマーＢ１が標識両親媒性ブロックポリマーである場合、「疎水性」及び「親水性」の物性の具体的な程度は、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の分子設計における場合と同様である。また、この場合における標識ポリマーＢ１のポリマー部（すなわち両親媒性ブロックポリマー部）の構成単位や鎖長に関しても、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、標識ポリマーＢ１と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖との親和性に優れるという効果も得られる。
【０１０６】
［２−２−２．近赤外蛍光分子Ｂ２］
近赤外蛍光分子Ｂ２は、上記両親媒性ブロックポリマーＡ１を基礎的要素とする分子集合体に内包されることができる要素である。近赤外蛍光分子Ｂ２は、下記の１種又は複数種を組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
近赤外蛍光分子Ｂ２は、例えば、シアニン系蛍光分子や量子ドットなどが用いられる。シアニン系蛍光分子の一例は、以下の一般式（I’）で表される。
【０１０８】
【化１４】
2015078150.tif 000016
【０１０９】
上記式（Ｉ’）に示す構造は、上記式（Ｉ）に示す構造における２価のＲ２が１価のＲ２’に置き換わったことを除き、上記式（Ｉ）と同様である。
上記式（Ｉ’）中、Ｒ１及びＲ２’は、それぞれ、同一又は異なっていてもよく、置換されていてもよい炭化水素基である。
Ｒ１及びＲ２’における炭化水素基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数２〜５のアルキル基でありうる。Ｒ１及びＲ２’における置換基は、アニオン性であってもよい置換基であり、カルボキシル基、カルボキシレート基、金属カルボキシレート基、スルホニル基、スルホネート基、金属スルホネート基、又は水酸基でありうる。前記金属は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属でありうる。
【０１１０】
Ｒ３及びＲ３’は、水素であるか、又はそれらが互いに連結して環状構造を形成するものである。Ｒ３及びＲ３’は互いに連結して環状構造をとることにより、蛍光色素の分子構造をリジッド化しうる。
【０１１１】
Ｘは水素又はハロゲンである。ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩでありうる。Ａ−は陰イオンであり、ｍは０又は１である。ｍが０の場合、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方がアニオン性基であり、分子全体としてベタイン構造をとる。ｍが１の場合、Ａ−は、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−等のハロゲンイオン、ＣＩＯ４−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＳＣＮ−等でありうる。
【０１１２】
環Ｂ及び環Ｄは、同一又は異なっていてもよい含窒素縮合芳香族複素環である。たとえば、含窒素二環式や三環式芳香族複素環でありうる。好ましくは、環Ｂ及び環Ｄは、同一である。
環Ｂの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
【０１１３】
【化１５】
2015078150.tif 000017
【０１１４】
環Ｄの好ましい態様としては、以下に示す構造が挙げられる。
【０１１５】
【化１６】
2015078150.tif 000018
【０１１６】
上記式において、Ｒ４及びＲ５は、いずれも水素でありうる。又は、Ｒ４及びＲ５は、それらが互いに連結してアリール環を形成しうる。前記アリール環は、置換されてよいベンゼン環でありうる。
【０１１７】
本発明においてより好ましい蛍光色素は、下記構造式（II’）で示されるインドシアニン化合物である。
【０１１８】
【化１７】
2015078150.tif 000019
【０１１９】
本発明における蛍光色素の具体例として、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素三環式芳香族複素環であるＩＣＧ（III’）、ＩＣ７−１（IV’）及びＩＲ８２０（V’）、環Ｂ及び環Ｄがいずれも含窒素二環式芳香族複素環であるＩＲ７８３（VI’）及びＩＲ８０６（VII’）、及び、環Ｂが含窒素三環式芳香族複素環、環Ｃが含窒素二環式芳香族複素環であるＩＣ７−２（VIII’）の構造式を以下に示す。
【０１２０】
【化１８】
2015078150.tif 000020
【０１２１】
上記式（III’）で表されるＩＣＧ（インドシアニングリーン）分子は、８１０ｎｍ付近の近赤外光レーザーの照射を受けると励起され、定常状態に戻る際に活性酸素やフリーラジカルを放出し、さらに細胞毒性を有する分解物を生じる。
【０１２２】
【化１９】
2015078150.tif 000021
【０１２３】
【化２０】
2015078150.tif 000022
【０１２４】
【化２１】
2015078150.tif 000023
【０１２５】
【化２２】
2015078150.tif 000024
【０１２６】
【化２３】
2015078150.tif 000025
【０１２７】
［２−２−３．近赤外蛍光色素Ｂの濃度］
近赤外蛍光色素Ｂの濃度は、ナノ粒子を構成するポリマー及び前記近赤外蛍光色素Ｂの合計に対し、例えば、０．１〜５０ｍｏｌ％、又は０．５〜２０ｍｏｌ％でありうる。また、上記範囲の下限は、１ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％又は１０ｍｏｌ％であってもよい。上記範囲の上限は、下限値よりも大きいことを条件として、１０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％又は１ｍｏｌ％であってもよい。また、他の標識剤の濃度も適宜選択するとよい。
【０１２８】
［３．疎水性ポリマーＡ２］
本発明において、ナノ粒子はさらに有する疎水性ポリマーＡ２を含むことができる。疎水性ポリマーＡ２は、１０個以上の乳酸単位を少なくとも有する疎水性ポリマーであり、好ましくは、１５個以上の乳酸単位を少なくとも有する。ここで、疎水性ポリマーＡ２が有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては特に限定されるものではないが、少なくとも、上記の両親媒性ポリマーＡ１の親水性ブロックに対して、相対的に疎水性が強い。
【０１２９】
疎水性ポリマーＡ２においては、１０個以上の乳酸単位が主たる構成成分であることが好ましい。しかしながら一方で、乳酸単位以外の他の構成単位を有することも許容する。当該乳酸単位はそのすべてが連続していてもよいし、非連続であってもよい。
疎水性ポリマーＡ２の構成単位や鎖長は、基本的に、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロック鎖や、近赤外蛍光標識ポリマーＢ１におけるポリマー部の分子設計における場合と同様の観点で決定することができる。このようにすることによって、分子集合体において、疎水性ポリマーＡ２と、両親媒性ブロックポリマーＡ１の疎水性ブロック鎖及び／又は近赤外蛍光標識ポリマーＢ１におけるポリマー部との親和性に優れるという効果も得られる。
【０１３０】
疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、上述の両親媒性ブロックポリマーＡ１の長さを超えないものであれば特に限定されないが、好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの２倍の長さを超えないものとする。従って、疎水性ポリマーＡ２の構成単位数の上限としては、例えば疎水性ブロックが分岐していない場合、２００程度とすることができる。本発明においては、しばしば、１０〜１６０、好ましくは２０〜１００程度の構成単位数を有する疎水性ポリマーＡ２が合成されうる。構成単位数が２００程度を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が１０を下回ると、疎水性ポリマーＡ２を混合することによる後述の効果（疎水コア体積増大効果及び粒子径制御効果）が小さくなる。
【０１３１】
疎水性ポリマーＡ２の配合量は、例えば、両親媒性ブロックポリマーＡ１と疎水性ポリマーＡ２との使用割合が、モル基準で１０：１〜１：１０となる量でありうる。上記範囲よりも疎水性ポリマーＡ２の割合が上回ると、分子集合体自体がその形状を保ちにくくなる傾向にある。また、上記範囲よりも疎水性ポリマーＡ２の割合が下回ると、疎水性ポリマーＡ２を混合することによる後述の効果（疎水コア体積増大効果及び粒子径制御効果）が得られにくくなる傾向にある。
【０１３２】
［４．ナノ粒子の大きさ］
本発明において、ナノ粒子の大きさは、例えば粒子径１０〜５００ｎｍ、又は１０〜２００ｎｍ、好ましくは２０〜２００ｎｍである。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。粒子径が１０ｎｍより小さいものは作成が難しく、５００ｎｍより大きいものは、特に生体内へ注射により投与する場合に、注射剤として好ましくない場合がある。また、本発明において、関節リウマチの炎症部位において血管透過性が亢進し、ＥＰＲ効果により、血管外間質腔にナノ粒子が漏出・滞留するために、ナノ粒子の大きさは、例えば粒子径は２０〜２００ｎｍであり、より好ましくは２０〜１００ｎｍ、２０〜５０ｎｍである。このような粒子径にすると、関節リウマチの滑膜炎症部位にナノ粒子が集積しやすく、分子イメージングによって関節リウマチの炎症病変の位置を検出することができる。
【０１３３】
本発明において、ナノ粒子の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）による観察法や、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法などが挙げられる。ＤＬＳ法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。
【０１３４】
ナノ粒子の大きさを制御する手段の例として、両親媒性ブロックポリマーＡ１の鎖長を制御することが挙げられる。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡ１における疎水性ブロックの重合度を調整することができる。
他の例においては、近赤外蛍光色素Ｂとしての近赤外蛍光標識ポリマーＢ１のポリマー部や、疎水性ポリマーＡ２の重合度を調整することができる。
さらなる他の例においては、疎水性ポリマーＡ２の配合量を制御することができる。疎水性ポリマーＡ２は、分子集合体の疎水性コアを増大させる効果がある。しかも、その配合量を調整することにより、分子集合体の大きさの連続的制御を可能にする。従って、この手段は、ラクトソームの微妙な大きさの調整ができる点で好ましい。
【０１３５】
［５．ナノ粒子の形成］
ナノ粒子（ラクトソーム）の作成法は特に限定されず、所望するナノ粒子の大きさ、特性、担持させる標識物質（蛍光色素Ｂなど）の種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のようにナノ粒子を形成した後に、得られたナノ粒子に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
【０１３６】
［５−１．フィルム法］
本発明における両親媒性ブロックポリマーＡ１及び疎水性ポリマーＡ２は低沸点溶媒への溶解性を有するため、この方法を用いたナノ粒子の調製が可能である。
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えばガラス容器）中に、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２等分子集合体を構成するポリマーと標識物質（蛍光色素Ｂなど）とを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁にポリマーと標識物質とを含むフィルムを得る工程；及び、前記容器中に水又は水溶液を加え、必要に応じて超音波処理を行い、前記フィルム状物質を、標識物質を内包する粒子状の分子集合体に変換してナノ粒子の分散液を得る工程、を含む。さらに、フィルム法は、前記のナノ粒子の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
【０１３７】
分子集合体を構成するポリマーと標識物質（蛍光色素Ｂなど）とを有機溶媒中に含む溶液は、分子集合体を構成するポリマーをあらかじめフィルムの状態でストックしておき、ナノ粒子調製時に、標識物質（蛍光色素Ｂなど）を含む溶液を加えてフィルムを溶解することによって調製してもよい。
【０１３８】
フィルム法に用いる有機溶媒としては、低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、２−プロパノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサンなどが挙げられる。
分子集合体を構成するポリマー及び近赤外蛍光色素Ｂの溶解にこのような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
【０１３９】
有機溶媒が除去された後は、容器内壁に分子集合体を構成するポリマーと標識物質（蛍光色素Ｂなど）とを含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１４０】
水又は水溶液が加えられた後、加温処理を行う。加温によりフィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体を形成する。加温処理は、例えば２０〜１００℃、又は７０〜９０℃、１〜６０分、又は５〜６０分の条件下で行うことができる。加温処理終了時には、標識物質（蛍光色素Ｂなど）が内包された分子集合体（ナノ粒子）が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。
【０１４１】
得られた分散液は、直接生体に投与されることが可能である。すなわち、無溶媒のナノ粒子そのものの状態で保存されなくてもよい。
一方、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られたナノ粒子の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、ナノ粒子の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、ナノ粒子を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、ナノ粒子の分散液を得ることによって、ナノ粒子を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１４２】
ここで、凍結乾燥処理前の分散液中には、分子集合体を構成するポリマーと標識物質（蛍光色素Ｂなど）とから形成されたナノ粒子以外にも、そのようなナノ粒子の形成に寄与しなかったポリマー及び／又は標識物質（蛍光色素Ｂなど）が各々それ自体として残存しうる。このような分散液を凍結乾燥処理に供すると、溶媒が濃縮される過程で、ナノ粒子を形成せず残存していたポリマーと標識物質（蛍光色素Ｂなど）とから、さらにナノ粒子を形成することが可能になる。従って、ナノ粒子の調製を効率的に行うことが可能になる。
【０１４３】
［５−２．インジェクション法］
インジェクション法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えば試験管など）中に、両親媒性ブロックポリマーＡ１、疎水性ポリマーＡ２等分子集合体を構成するポリマーと標識物質（蛍光色素Ｂなど）とを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；前記の溶液を水又は水溶液に分散させる工程；及び有機溶媒を除去する工程を含む。さらに、インジェクション法においては、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。
【０１４４】
インジェクション法に用いる有機溶媒としては、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、２−プロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。
水又は水溶液としては、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが用いられる。
精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行うことができる。
【０１４５】
このようにして得られた分子集合体を生体内へ投与する場合であって、有機溶媒に生体に有害なものを用いた場合は、この有機溶媒の除去を厳密に行う必要がある。
【０１４６】
分子集合体をベシクルとして調製する場合において、内包型のものを調製する場合は、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などの水系溶媒に、内包すべき物質を溶解又は懸濁させ、このようにして得られた水溶液又は懸濁液に、両親媒性ブロックポリマーＡ１と疎水性ポリマーＡ２及び／又は必要に応じて機能性物質とを上記有機溶媒に溶解させて得られた溶液を分散させるとよい。
【０１４７】
［６．ナノ粒子の投与］
以上のようにして、両親媒性ブロックポリマーＡ１及び標識剤を含むナノ粒子が製造される。ナノ粒子を関節リウマチ診断薬として用いる。
【０１４８】
ナノ粒子を投与される生体としては特に限定されず、ヒト及び非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
【０１４９】
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。投与液中におけるナノ粒子の濃度は、例えば内包物がICG-PLLA30でありキャリアがPSar70-PLLA30の分子集合体であるラクトソームの場合の量に換算して０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．８〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌでありうる。
【０１５０】
関節リウマチの炎症部位において血管透過性が亢進している。ＥＰＲ (enhanced permeability and retention) 効果により、血管外間質腔に上記ナノ粒子が漏出・滞留する。関節リウマチの滑膜炎症部位にナノ粒子が集積する。内包された標識剤（蛍光色素など）をイメージングによって検出する。これにより、関節リウマチの炎症病変の位置を検出することができる。
【０１５１】
ナノ粒子投与から検出開始までの時間は、投与されるナノ粒子が有する近赤外蛍光色素Ｂなどの標識剤の種類、及び投与ターゲットの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、投与後３〜４８時間、或いは１〜２４時間とすることができる。上記範囲を下回ると、シグナルが強すぎ、投与ターゲットと他の部位（バックグラウンド）とを明確に分けることができない場合がある。また、上記範囲を上回ると、蛍光プローブが投与ターゲットから排泄されてしまう場合がある。
【０１５２】
ナノ粒子の検出には、標識剤が蛍光色素の場合には、蛍光イメージング装置を用いる。蛍光イメージング装置は、滑膜炎症部位の位置を示す画像データを取得するための装置である。蛍光イメージング装置は、人体などの被写体に投与されたナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素に由来する近赤外光を検出し、ナノ粒子が存在する組織の位置や大きさを観測することができるものであればよい。従って、当業者であれば、ナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素に由来する近赤外光を可視化することができる装置を適宜選択することができる。
【０１５３】
好ましい態様において、滑膜炎症部位の位置を示す画像データを取得するための装置は、被写体に投与されたナノ粒子に含まれる近赤外蛍光色素に由来する近赤外蛍光を検出し、その可視化像と周辺組織可視光像とを同時に抽出するものである。これにより、本発明のナノ粒子を蛍光造影剤として投与した人体などの被写体において、ナノ粒子が集積した滑膜炎症部位における可視光像と、集積したナノ粒子からの赤外光像との合成画像を取得することができる。具体的には、以下のように光源、光学フィルタ、固体撮像素子、及び信号処理回路を含む撮像装置が用いられうる。このような手段を有する蛍光イメージング装置の具体例として、HyperEye Medical System（瑞穂医科工業株式会社製）が挙げられる。
【０１５４】
光源は、被写体に対し、可視光と、近赤外蛍光色素の励起光とを照射するものである。具体的には、可視光を発する可視光発光部と、励起光を発する励起光発光部とを有しうる。可視光発光部としては、例えばキセノンランプや白色ＬＥＤであり、励起光発光部としては、ナノ粒子に包含される近赤外蛍光色素Ｂの励起波長（具体的にはＩＣＧの場合は７８０ｎｍにピーク波長）を有する、ＬＥＤ等の半導体発光デバイスでありうる。被写体からの光は、レンズ等の光学系を介して撮像装置内に取り込まれ、光学フィルタを介して固体撮影素子に入射する。
【０１５５】
光学フィルタは、被写体からの可視光成分と赤外蛍光成分とを分離することなく固体撮像素子に入射させるものである。光学フィルタは、可視光、励起光、及び近赤外光の透過性を独立して制御する。具体的には、被写体からの光のうち、可視光及び赤外蛍光を透過し、励起光の透過を阻止する。さらに、光学フィルタは、可視光発光部及び励起光発光部それぞれの発光強度を個別に制御可能でありうる。このような光学フィルタにおいては、可視光に対する透過率は蛍光に対する透過率より低く設定されることにより、微弱な蛍光による赤外光像を可視光像上にて明瞭に表示することができる。光学フィルタとしては、例えば真空蒸着法により金属や誘電体を積層して成膜された薄膜が用いられる。
【０１５６】
固体撮像素子は、上記光学フィルタの透過光に基づいて可視光像と近赤外光像とを撮影するものである。これにより、可視光と近赤外光との同時撮影が可能になる。具体的には、半導体基板上に、受光画素を構成するモザイク状のカラーフィルタが配置されて構成される。カラーフィルタは、着色した有機材料で構成されている。各カラーフィルタの透過特性に応じて、各受光画素が感度を有する光成分が定まる。各受光画素には、入射光のうち各画素に配置されたカラーフィルタの色に対応する可視光成分に応じた信号電荷と、赤外光成分に応じた信号電荷とが合成されて蓄積される。蓄積された信号電荷は、信号処理回路に出力される。
【０１５７】
信号処理回路は、固体撮像素子から出力された信号を処理するものである。具体的には、上記撮像素子の各受光画素から読み出された信号から、可視光像と近赤外光像とに基づく合成画像を表す画像信号を生成する。生成された合成信号は、表示デバイスに入力及び表示される。具体的には、手術部位の可視光像と、ナノ粒子が集積された位置が、内包される蛍光色素の濃度に応じた色調で構成された赤外光像とが合成された合成画像がモニターに表示される。
【０１５８】
本発明において、上記ナノ粒子は、関節リウマチの炎症部位にＥＰＲ効果により特異的に集積するので、上述の蛍光メージング装置によって検出することにより、関節リウマチの正確な診断、特に滑膜炎症部位の範囲の正確な診断を行うことができる。
【０１５９】
蛍光色素以外の他の標識剤に対しては、ポジトロン放出断層撮影装置（Positron Emission Tomography;ＰＥＴ）、単一光子放射断層装置(Single Photon Emission Computed Tomography;ＳＰＥＣＴ)、核磁気共鳴イメージング装置（ＭＲＩ）などを用いることができる。
【実施例】
【０１６０】
以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【０１６１】
［実験例１：ＩＣＧラクトソームの調製］
以下のように、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30）とポリ乳酸結合蛍光化合物（ICG-PLLA30）とから構成される蛍光色素内包ナノ粒子（ＩＣＧラクトソームと記載する）を調製した。
【０１６２】
（アミノ化ポリL-乳酸の合成）
まず、Ｌ−ラクチドとＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩とを用いて、アミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）（平均重合度３０）を合成した（スキーム１）。
【０１６３】
【化２４】
2015078150.tif 000026
【０１６４】
重合開始剤であるＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（310 mg, 1.60 mmol）に、オクタン酸スズ（6.91 mg）をトルエン（1.0 ｍL）に拡散させたものを加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ−ラクチド（3.45 g, 24mmol）を加え、Ar雰囲気下、120 ℃にて重合反応を行った。12時間後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を少量のクロロホルム（10 mL程度）に溶解させた。クロロホルムを冷メタノール（100 mL）に滴下することにより白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。
【０１６５】
得られた白色沈殿（500 mg）のジクロロメタン(1 ml)溶液に25v/v%臭化水素／酢酸（2.0 mL）を加え、遮光、乾燥空気下にて2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を冷メタノール（100 mL）に滴下し、析出してきた沈殿を遠心分離にて回収した。得られた白色沈殿はクロロホルムに溶解させた後、飽和NaHCO3水溶液にて洗浄し、無水MgSO4にて脱水操作を行った。セライト(R)濾過によりMgSO4を除去した後、真空乾燥することにより、白色のアモルファス状粉末のa-PLA（440 mg）を得た。
【０１６６】
（ポリ乳酸結合蛍光化合物（ICG-PLLA30）の合成）
次に、アミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）にICG標識を行い、ポリ乳酸結合蛍光化合物（ICG-PLLA30）を得た（スキーム２）。
【０１６７】
【化２５】
2015078150.tif 000027
【０１６８】
a-PLAを1.9 mg (1.0 eq)含むDMF溶液に、インドシアニングリーン誘導体（ICG-sulfo-OSu）1mg (1.3 eq)を溶かしたDMF溶液を加え、室温で約20時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、LH20カラムにて精製を行い、化合物ICG-PLLA30を得た。
【０１６９】
（ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30）の合成）
サルコシン−NCA（Sar-NCA）とアミノ化ポリL-乳酸（a-PLA）とから、ポリサルコシン−ポリ乳酸両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30）を合成した（スキーム３）。
【化２６】
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【０１７０】
a-PLA（383 mg, 0.17 mmol）とサルコシン−NCA (Sar-NCA) (3.21 g, 27.9 mmol) に、Ar雰囲気下、ジメチルホルムアミド（DMF）（140 mL）を加え、室温にて12時間攪拌した。反応溶液を0 ℃に冷却した後、グリコール酸（72 mg, 0.95 mmol）、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）（357 mg, 0.94 mmol）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（245 μL, 1.4 mmol）を加え、室温にて18時間反応させた。
【０１７１】
ロータリーエバポレーターによりDMFを減圧溜去した後、LH20カラムにて精製を行った。UV270 nmにてピークが検出されたフラクションを回収・濃縮した。得られた濃縮溶液を0 ℃にてジエチルエーテル中に滴下し、再沈澱することにより、目的物であるPSar70-PLLA30（1.7 g）を得た。
【０１７２】
（蛍光色素内包ナノ粒子の作成）
キャリア剤であるポリ乳酸−ポリサルコシン両親媒性ブロックポリマー（PSar70-PLLA30 ・26H2O, MW=7767）及び蛍光色素ICG-PLLA30それぞれのクロロホルム溶液（0.2 mM）を調製した。蛍光色素ICG-PLLA30については、蛍光色素のモル濃度が20 mol%となるように、ガラス容器内で両溶液の混合液を調製した。その後、フィルム法に従ってラクトソームを作製した。なお、フィルム法は以下の通り行った。混合液から溶媒を減圧留去しガラス容器の壁面にキャリア剤及び蛍光色素を含むフィルムを形成させた。さらに、フィルムを形成したガラス容器内に、水または緩衝液を加え、温度８２℃で２０分間湯せんした後、室温で３０分間放置し、０．２ｍｍのフィルターでろ過し凍結乾燥した。このようにして、インドシアニングリーン内包ナノ粒子（ＩＣＧラクトソーム）を調製した。動的光散乱測定装置（Malvern Instruments 社製、Zetasizer Nano）を用いて、粒子径を測定したところ、約３０ｎｍであった。
【０１７３】
［実験例２：関節リウマチモデルマウスにおけるＩＣＧラクトソームを用いた蛍光イメージング］
次のようにして、関節リウマチモデルマウスにおける上記インドシアニングリーン内包ナノ粒子（ＩＣＧラクトソーム）を用いた近赤外蛍光イメージングを行った。
【０１７４】
（実験方法）
ヒト関節リウマチと免疫病理学的に酷似した自己免疫性関節炎を自然発症するSKG/Jclマウス（日本クレア株式会社）を用いた。関節炎（Ａ）群（ｎ＝４）とコントロール（Ｃ）群（ｎ＝４）に分けた。SKG/JclマウスはＳＰＦ環境下において関節炎を自然発症しにくいため、関節炎群では、８週齢でマンナン２０ｍｇ（シグマアルドリッチ社Ｍ−７５０４）を腹腔内投与して６週間飼育（１４週齢）し、関節炎を発症させた。１４週齢の時点で関節炎群及びコントロール群の両群に、ＩＣＧラクトソーム２．０ｍｇ／匹を尾静脈から投与した。
【０１７５】
（関節炎スコア評価）
１４週齢の時点（ＩＣＧラクトソーム投与前）で関節炎群及びコントロール群の両群について、外観観察により、関節炎スコアの評価を行った。関節炎スコアの評価は、手指、手関節、足趾、足関節の腫脹について行い、それら各部位の合計スコアを求めた。関節炎スコアは、関節炎群の平均４．７３及びコントロール群の平均０であった。
【０１７６】
（病理学的評価）
関節炎群及びコントロール群の両群について、病理学的評価（サフラニンO、トルイジンブルー、ＨＥ染色）の評価を行った。関節炎群では、コントロール群と比較し、１０週齢の時点より、関節軟骨の破壊（軟骨プロテオグリカン減少、軟骨細胞減少）、滑膜の増生（滑膜細胞の増加）を認めた。
【０１７７】
このように、関節炎スコア評価及び病理学的評価により、関節炎群では自己免疫性関節炎を発症していることを確認した。
【０１７８】
（蛍光イメージング）
関節炎群及びコントロール群の両群について、蛍光in vivoイメージング装置（IVIS Spectrum Xenogen社：励起波長：７４５ｎｍ，蛍光波長：８４０ｎｍ）を用いて、ＩＣＧラクトソーム投与直後、３、６、１２、２４、４８時間での画像評価を行った。図１に直後、３、６時間での画像、図２に１２、２４、４８時間での画像を示す。図１、２いずれにおいても、関節炎群は上段、コントロール群は下段に示されている。関節炎群では、コントロール群と比較し、手関節、足関節での蛍光強度の増加が認められた。
【０１７９】
さらに、関節炎群及びコントロール群の両群について、ラクトソーム投与２４時間経過後において、実写真と蛍光イメージングの同時撮影を行った。図３（ａ）は実写真であり、下段の写真は足関節部分の拡大である。図３（ｂ）は蛍光イメージングの画像である。実写真（ａ）から、関節炎群では、コントロール群と比較し、手関節、足関節の腫脹が認められ、それに対応して、図３（ｂ）において、関節炎群では、コントロール群と比較し、手関節、足関節での蛍光強度の増加が認められた。
【０１８０】
（蛍光強度比）
上記画像評価の結果から、次のようにして、関心領域ＲＯＩ（Region of Interest）の蛍光強度比を求めた。
【０１８１】
コントロール群の足関節の（画像における）最大幅は３．５ｍｍ程度であった。直径φ：３．５ｍｍの円で蛍光前と蛍光後の各ＲＯＩ値［(p/sec)／ (μW/cm2 )］を求め、
蛍光強度比＝蛍光後ＲＯＩ値／蛍光前ＲＯＩ値
とした。
【０１８２】
図４に、関節炎群及びコントロール群の各群について、ラクトソーム投与からの経過時間に対する蛍光強度比を示す。横軸：ラクトソーム投与からの経過時間（時間）、縦軸：蛍光強度比。各時間において、関節炎（Ａ）群は右側の棒で、コントロール（Ｃ）群は左側の棒でそれぞれ示されている。関節炎群とコントロール群とは、Mann-Whitney’s testにより有意差があった。図４より、コントロール群では、ラクトソーム投与からの経過時間によらず蛍光強度比はいずれも小さいものであった。これに対して、関節炎群では、ラクトソーム投与からの経過時間に従い蛍光強度比が増加し、２４時間で最も大きくなった。
【０１８３】
図５に、関節炎群について、ラクトソーム投与からの経過時間に対する蛍光強度比を示す。横軸：ラクトソーム投与からの経過時間（時間）、縦軸：蛍光強度比。図４に示したものと同じ蛍光強度比が示されている。ラクトソーム投与からの経過時間２４時間と、その他の経過時間とは、Wilcoxon符号付順位和検定により有意差があった。
【０１８４】
（各組織における蛍光強度）
関節炎群のＩＣＧラクトソーム投与２４時間のものについて、足関節の皮膚、筋、関節包・滑膜を順次切除し、それらについて蛍光強度を観察した。
まず、足関節の皮膚を切除して（図６（ａ））、蛍光強度を観察すると（図６（ｂ））、切除していない場合と同等であった。すなわち、ＩＣＧラクトソームは、皮膚には集積していないことを確認した。
次に、皮膚切除した後、足関節の筋を切除して（図６（ｃ））、蛍光強度を観察すると（図６（ｄ））、何も切除していない場合と同等であった。すなわち、ＩＣＧラクトソームは、皮膚にも筋肉にも集積していないことを確認した。
次に、筋切除した後、足関節の関節包・滑膜を切除して（図７（ａ））、蛍光強度を観察すると（図７（ｃ））、蛍光はほとんど観察されなかった。すなわち、ＩＣＧラクトソームは、関節包・滑膜に集積していたことを確認した。
【０１８５】
図６、図７に上記の観察結果を示す。すなわち、図６（ａ）は足関節の皮膚を切除した実写真であり、図６（ｂ）は（ａ）に対応する蛍光イメージングの画像である。
図６（ｃ）は皮膚切除した後、足関節の筋を切除した実写真であり、図６（ｄ）は（ｃ）に対応する蛍光イメージングの画像である。
図７（ａ）は筋切除した後、足関節の関節包・滑膜を切除した実写真であり、図７（ｂ）は（ａ）の部分拡大であり、図７（ｃ）は（ａ）に対応する蛍光イメージングの画像である。
【０１８６】
以上の結果から、ＩＣＧラクトソームは、関節リウマチの滑膜炎症部位に特異的に集積し、蛍光イメージングによって検出することができる。これにより、関節リウマチの正確な診断を行うことができる。正確な診断により投薬治療する際の副作用を軽減できる。特に滑膜炎症部位の範囲の正確な診断を行うことができるので、滑膜切除の範囲の特定に非常に有効となる。
【図１】
2015078150.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015078150.tif 000035
【図６】
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【図７】
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