(57)【要約】【課題】悪性神経膠腫Grade4患者の予後予測を行う。【解決手段】悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、当該患者から採取された試料において、以下の２５遺伝子：GPNMB, EFNB2, ASF1A, LOC283027, AMIGO2, IL13RA2, ITGA7, LDHA, C11orf71, AFTPH, TBC1D19, MED29, ACN9, SLC25A19, RPL12, ALS2CR4, C10orf88, ARHGAP39, LMAN2L, CASP8, ST6GAL2, LOXL3, ANGPTL1, MRRF, ARHGAP32 の少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、方法。【選択図】図１
2015000006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、当該患者から採取された試料において、以下の２５遺伝子：
GPNMB, EFNB2, ASF1A, LOC283027, AMIGO2, IL13RA2, ITGA7, LDHA, C11orf71, AFTPH, TBC1D19, MED29, ACN9, SLC25A19, RPL12, ALS2CR4, C10orf88, ARHGAP39, LMAN2L, CASP8, ST6GAL2, LOXL3, ANGPTL1, MRRF, ARHGAP32 
の少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記２５遺伝子全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
下記の予後予測式
［数１］
Z1 = 0.27 × GPNMB + 0.09 × EFNB2 - 0.22 × ASF1A + 0.02 × LOC283027 + 0.15 × AMIGO2 + 0.22 × IL13RA2 + 0.25 × ITGA7 + 0.15 × LDHA - 0.01 × C11orf71 + 0.15 × AFTPH + 0.15 × TBC1D19 - 0.21 × MED29 + 0.02 × ACN9 + 0.29 × SLC25A19 + 0.16 × RPL12 - 0.09 × ALS2CR4 - 0.14 × C10orf88 - 0.11 × ARHGAP39 + 0.18 × LMAN2L + 0.29 × CASP8 - 0.28 × ST6GAL2 + 0.33 × LOXL3 + 0.08 × ANGPTL1 + 0.22 × MRRF - 0.33 × ARHGAP32.
を用いてZ1を算出し、Z1の値に基づいて予後を予測する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、当該患者から採取された試料において、以下の３遺伝子：
ASF1A, ITGA7, AFTPH
の少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記３遺伝子全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
下記の予後予測式
［数２］
Z2 = - 0.63 × ASF1A + 0.62 × ITGA7 + 0.47 × AFTPH.
を用いてZ2を算出し、Z2の値に基づいて予後を予測する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、Z２の値と年齢によって予後を予測する方法。
【請求項１０】
悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測するためのキットであって、以下の２５遺伝子
GPNMB, EFNB2, ASF1A, LOC283027, AMIGO2, IL13RA2, ITGA7, LDHA, C11orf71, AFTPH, TBC1D19, MED29, ACN9, SLC25A19, RPL12, ALS2CR4, C10orf88, ARHGAP39, LMAN2L, CASP8, ST6GAL2, LOXL3, ANGPTL1, MRRF, ARHGAP32 
の少なくとも１種に対するプローブまたはプライマーを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法、ならびに前記方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠腫患者の予後は、従来病理組織学的診断を基本になされていた。組織学的診断方法として、世界保健機関（WHO）の方法が現在最も広く用いられている（非特許文献１）。しかしながら、Grade4診断区分内でさえも依然として多くの個体差が存在し、また診断者の主観要素もあり、必ずしも正確な診断と予後予測ができていなかった。病理組織学的診断だけでは、患者を予め認識できない点で不十分であることが明らかとなっている。例えば、WHO Grade 4の神経膠芽腫は平均生存期間は14ヵ月とされているが、1年以下の短期生存者から3年以上の長期生存者も含まれ、症例によってかなりの幅が存在する。それゆえ、悪性神経膠腫Grade4患者のためのさらなる予後予測マーカーが必要とされている。
【０００３】
近年、マイクロアレイ技術による、各種癌の分類（非特許文献２−４）、神経膠腫サブクラスの同定、分子マーカーの発見、疾患の予後予測など（非特許文献５−９）が可能となってきている。病理組織学的診断と異なり、分子診断は診断時の腫瘍の遺伝子発現プロファイルに基づき個人の長期的な転帰を予測することができ、臨床医が最適な臨床判断を行う助けとなる。その代表例として、乳癌におけるOncotype DX診断キットがあげられる。これは発現プロファイルによる治療方針の決定を行い、乳癌の術後５年以内の転移リスクを評価し、術後補助化学療法追加の選択に資するものであり、FDAから認可され臨床で利用されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kleihues P, Louis DN, Wiestler OD, et al  WHO grading of tumours of the central nervous system. In: Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK eds. World Health Organization Classification of Tumours of the Nervous System. Lyon, France:IARC Press;2007:10-11.
【非特許文献２】van de Vijver MJ, He YD, van't Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002;347(25):1999-2009.
【非特許文献３】Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R, et al. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 15149-15154.
【非特許文献４】Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:8418-8423.
【非特許文献５】Freije WA, Castro-Vargas FE, Fang Z, et al.  Gene expression profiling of gliomas strongly predicts survival. Cancer Res 2004; 64:6503-6510.
【非特許文献６】Petalidis LP, Oulas A, Backlund M, et al. Improved grading and survival prediction of human astrocytic brain tumors by artificial neural network analysis of gene expression microarray data. Mol Cancer Ther 2008;7:1013-1024.
【非特許文献７】Phillips HS, Kharbanda S, Chen R et al. 1371087088203_0.Pubmed_RVDocSum&ordinalpos=4 Cancer Cell 2006;9:157-173.
【非特許文献８】Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature 2008;455:1061-1068.
【非特許文献９】Roel G.W. Verhaak R.G.W., Hoadley K.A., Purdom E, et al.Integrated Genomic Analysis Identifies Clinically Relevant Subtypes of Glioblastoma Characterizedby Abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell 2010;17:98-110.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、悪性神経膠腫Grade4患者の新規な予後予測方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、表１に示す悪性神経膠腫Grade4患者32人の摘出腫瘍からmRNAを抽出し、GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)（約47,000遺伝子を含む）を用いて各mRNAの発現量を測定した。これらの発現プロファイルと、追跡調査により得た各患者の術後の生存日数との相関を統計学的に処理し、発現プロファイルと生存日数との間に強い相関を示す遺伝子を同定した。これにより本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下の悪性神経膠腫Grade4患者の新規な予後予測方法及びキットを提供するものである。
項１
悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、当該患者から採取された試料において、以下の２５遺伝子：
GPNMB, EFNB2, ASF1A, LOC283027, AMIGO2, IL13RA2, ITGA7, LDHA, C11orf71, AFTPH, TBC1D19, MED29, ACN9, SLC25A19, RPL12, ALS2CR4, C10orf88, ARHGAP39, LMAN2L, CASP8, ST6GAL2, LOXL3, ANGPTL1, MRRF, ARHGAP32 
の少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、方法。
項２
前記２５遺伝子全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項１に記載の方法。
項３
前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、項１に記載の方法。
項４
下記の予後予測式
［数１］
Z1 = 0.27 × GPNMB + 0.09 × EFNB2 - 0.22 × ASF1A + 0.02 × LOC283027 + 0.15 × AMIGO2 + 0.22 × IL13RA2 + 0.25 × ITGA7 + 0.15 × LDHA - 0.01 × C11orf71 + 0.15 × AFTPH + 0.15 × TBC1D19 - 0.21 × MED29 + 0.02 × ACN9 + 0.29 × SLC25A19 + 0.16 × RPL12 - 0.09 × ALS2CR4 - 0.14 × C10orf88 - 0.11 × ARHGAP39 + 0.18 × LMAN2L + 0.29 × CASP8 - 0.28 × ST6GAL2 + 0.33 × LOXL3 + 0.08 × ANGPTL1 + 0.22 × MRRF - 0.33 × ARHGAP32.
を用いてZ1を算出し、Z1の値に基づいて予後を予測する、項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５
悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、当該患者から採取された試料において、以下の３遺伝子：
ASF1A, ITGA7, AFTPH
の少なくとも１種の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項１に記載の方法。
項６
前記３遺伝子全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項５に記載の方法。
項７
前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、項５に記載の方法。
項８
下記の予後予測式
［数２］  
Z2 = - 0.63 × ASF1A + 0.62 × ITGA7 + 0.47 × AFTPH.
を用いてZ2を算出し、Z2の値に基づいて予後を予測する、項５〜８のいずれかに記載の方法。
項９
項８に記載の悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測する方法であって、Z２の値と年齢によって予後を予測する方法。
項１０
悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測するためのキットであって、以下の２５遺伝子
GPNMB, EFNB2, ASF1A, LOC283027, AMIGO2, IL13RA2, ITGA7, LDHA, C11orf71, AFTPH, TBC1D19, MED29, ACN9, SLC25A19, RPL12, ALS2CR4, C10orf88, ARHGAP39, LMAN2L, CASP8, ST6GAL2, LOXL3, ANGPTL1, MRRF, ARHGAP32 
の少なくとも１種に対するプローブまたはプライマーを含むキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、悪性神経膠腫Grade4患者のより正確な予後予測が可能となった。本発明は、悪性神経膠腫Grade4の予後予測に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】適用した25遺伝子Z1予測式により分類された群のKaplan-Meier曲線による比較。(A) Test set、(B) Validation set。
【図２】適用した3遺伝子Z2予測式により分類された群のKaplan-Meier曲線による比較。(A) Test set、(B) Validation set。
【図３】Z2値と年齢により分類された群のKaplan-Meier曲線による比較。(A)Test set、(B) Validation set。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、悪性神経膠腫Grade4患者の生存日数と高い相関を示す遺伝子を同定したことに基づく。すなわち、本発明の予後予測方法は、表２に示す２５遺伝子の少なくとも１種、好ましくは３遺伝子（ASF1A, ITGA7, AFTPH）の少なくとも１種の発現レベルを測定し、この発現レベルから予後予測式により予後の予測をするものである。
【００１１】
本発明の予後予測方法は、悪性神経膠腫Grade4患者の生存日数を予後予測式（Z2）と年齢を用いて行うことができる。
【００１２】
本発明において、遺伝子の発現レベルは、遺伝子のmRNA又はタンパク質の発現レベルを意味し、好ましくはmRNAの発現レベルを意味する。
【００１３】
本発明において、悪性神経膠腫Grade4とは神経膠細胞（グリア細胞）から発生する悪性脳腫瘍を意味し、これには神経膠芽腫が含まれる。
【００１４】
患者試料としては、患者から採取した腫瘍組織を使用することができる。常套的方法により、この組織から全RNAまたはmRNAを抽出し、必要に応じてcDNAを合成して、実験に使用する。腫瘍組織は、初回手術時に採取すればよい。
【００１５】
遺伝子の発現レベルは、常套的方法により測定すればよい。mRNAの発現レベルの測定方法としては、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などが挙げられるが、なかでもＤＮＡマイクロアレイ法が好適である。
【００１６】
ＤＮＡマイクロアレイ法では、測定対象とする遺伝子に対するプローブを含むマイクロアレイを使用する。かかるマイクロアレイとしては、Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)が挙げられる。あるいは、測定対象の遺伝子に対するプローブを合成し、スライドガラスなどの適当な基盤上に固定して、所望のマイクロアレイを作製してもよい。マイクロアレイの作製およびデータ解析の方法は、例えばMicroarray Technology and Cancer Gene Profiling. Simone Mocellin (ed). Landes Bioscience, Austin, Tx, 2006などに記載される。
【００１７】
ＤＮＡマイクロアレイ法による発現レベルの測定は、例えば以下のとおりである。まず、各腫瘍組織からISOGEN（ニッポンジーン）を用いて全RNAを抽出する。次いで、RNAをGene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)（約47,000遺伝子を含む）でのハイブリダイゼーション用に処理し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後のチップは、Fluidics Station 450、High-Resolution Microarray Scanner 3000、およびGCOS Workstation Version 1.3 (Affymetrix, Inc.)を用いて解析することができる。
【００１８】
ＰＣＲ法では、各遺伝子を特異的に増幅可能なプライマーを利用する。例えば、StepOne RealTime PCR system (Applied Biosystems)およびTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)などの市販のキットを用いて、定量的ＰＣＲを行えばよい。
【００１９】
各遺伝子の配列は、表２に示すGene ID 番号に基づき特定可能である。
【００２０】
患者の予後は、測定した遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数（すなわち、各時点においてそれ以降生存する確率）を算出することによって予測することができる。すなわち、本明細書において「予後」は試料の採取後の生存期間或いは一定期間以上生存する確率を意味する。選択された２５個の遺伝子発現量に対して主成分分析を行い，第1主成分スコアを抽出した．RSFにより群分けされた予後良群と悪群を用い，ROC解析を行い，主成分スコアのカットオフ値を求め，そのカットオフ値より大か小かで予後良群か悪かを判別するルールを作成した。各遺伝子発現量(具体的にはmRNAの発現量)を予測式に代入し，Z1を計算した上で，下のルールで群分けすることができる。
Z1 ＞  -1.17  →  予後不良群
Z1 ≦  -1.17  →  予後良好群
【００２１】
さらに選択された３個の遺伝子発現量に対して主成分分析を行い，第1主成分スコアを抽出した．RSFにより群分けされた予後良群と悪群を用い，ROC解析を行い，主成分スコアのカットオフ値を求め，そのカットオフ値より大か小かで予後良群か悪かを判別するルールを作成した。各遺伝子発現量(具体的にはmRNAの発現量)を予測式に代入し，Z2を計算した上で，下のルールで群分けすることができる。
Z2 ＞  -0.76  →  予後不良群
Z2 ≦  -0.76  →  予後良好群
【００２２】
さらに、本発明は、悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測するための、survival tree method (LeBlanc M. and CrowleyJ. Relative Risk Trees for Censored Survival Data. Biometrics 1992;48:411-25)を用いてZ2値と年齢を用いて以下のように予後予測を提供する。
-0.76 > Z2 又は -0.76 < Z2 及び  年齢 < 57 歳  →  予後良好
-0.76 < Z2, 及び  年齢> 57歳  →  予後不良
【００２３】
本発明のキットは、本発明の予後予測方法に用いることができるものであり、表２に示す２５遺伝子に対するプローブまたはプライマーを含む。各遺伝子に対するプローブおよびプライマーは、その遺伝子の配列情報に基づき、常套的方法により合成することができる。キットは、測定方法に応じて、その他必要な試薬を含んでいてもよい。本発明のキットは、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法などに用いられるキットである。ＤＮＡマイクロアレイ法用のキットとしては、前記プローブが適当な基盤上に固定されたマイクロアレイを含むものが挙げられる。プライマー、プローブの設計は、市販の設計ソフト（たとえば、Wisconsin GCG package Version 10.2、OligoTM(National Bioscience Inc.)、GENETYX(ソフトウェア開発（株）））を用いる等、常法により容易に行うことができる。  
【００２４】
本発明の遺伝子セットは、悪性神経膠腫Grade4患者の予後を予測するために使用されるものであり、本発明の予後予測方法に用いるＤＮＡマイクロアレイ用のプローブやＰＣＲ用プライマーなどを作製するために用いることができる。
【実施例】
【００２５】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００２６】
［実施例１］
１．材料および方法
（１）サンプル
組織は、回収後５分以内に液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。臨床ステージは、外科的病理および臨床報告から評価した。サンプルは、新潟大学の有資格の病理学者により、WHOの2007年基準に従い、後にRNAを抽出する凍結サンプルに近接または隣接するパラフィン包埋組織切片の観察によって再評価した。サンプルの適正（すなわち、非腫瘍性の要素のコンタミネーションが最小であること）を確認するため、および腫瘍の壊死および細胞充実性の程度を評価するため、各収集標本の組織病理を再評価した。新潟大学医学部ヒト研究倫理委員会のガイドライン（プロトコール#70）にしたがい、全ての患者からサンプルの使用についてインフォームドコンセントを得た。全生存率は、診断データから測定した。生存期間の最終日は、死亡日または追跡最終日とした。
【００２７】
（２）RNA抽出およびアレイハイブリダイゼーション
各腫瘍からの約100mgの組織を用いて、ISOGEN（ニッポンジーン）により製造元の説明書にしたがい全RNAを抽出した。得られたRNAの質は、Bioanalyzer System (Agilent Technologies) によりRNA Pico Chipを用いて検証した。28S/18S比＞0.7であってリボゾームピークの崩壊が見られないサンプルのみを本研究に使用した。RNA（6μg）をGene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)（約47,000遺伝子を含む）でのハイブリダイゼーション用に処理した。ハイブリダイゼーション後、Fluidics Station 450、High-Resolution Microarray Scanner 3000、およびGCOS Workstation Version 1.3 (Affymetrix, Inc.)を用いてチップを処理した。
【００２８】
（３）リアルタイム定量的PCRによる発現差異の検証
StepOne RealTime PCR system (Applied Biosystems) において、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) を用いて、製造元のプロトコールにしたがい定量的PCR（QPCR）を行った。TaqMan Gene Expression Assay Mixには、プライマーおよびTaqManプローブ（Applied BiosystemsのASF1A,Hs00204044_m1；CASP8,Hs01018151_m1;C11orf71,Hs00535489_s1;EFNB2,Hs00187950_m1;GAPDH,Hs99999905_m1;ITGA7,Hs00174397_m1;LDHA,Hs00855332_g1;LMAN2L,Hs01091681_m1;LOXL3,Hs01046945_m1;MED29,Hs00378316_m1）が含まれた。全RNA（5μg）を、SuperScript II (Invirtogen) を用いて逆転写してcDNAとした。このcDNA（1μl）をQPCRに使用した。検証は、はじめに評価した腫瘍の一部について行った。アッセイはデュプリケートで行った。QPCRの生データは、反応が対数期に到達するのに必要なサイクル数である。GAPDHの発現をQPCRデータの標準化に使用した。腫瘍群間の平均発現変化は、2-ΔΔCT法（Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 ;25:402-408）を用いて計算した。
【００２９】
（４）免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本の5ミクロンの切片を用いて免疫組織化学を行った。MGMT (抗体希釈1:50; clone MT3.1, Neomarkers Inc.,Fermont, CA, USA)を一次抗体として用いた。１０００個の腫瘍細胞の染色性を調べ、３０％以上の細胞が陽性の場合にMGMT陽性と判定した。観察者は患者番号を認識していなかった。
【００３０】
（５）IDH1遺伝子のコドン132 の変異解析
PCR system (Applied Biosystems) において、Taq DNA Polymerase (Applied Biosystems) を用いて、製造元のプロトコールにしたがいPCR（PCR）を行った。使用したプライマーはIDH1f: CGGTCTTCAGAGAAGCCATTとIDH1r: GCAAAATCACATTATTGCCAACである。129 bpのPCRサンプルをBigDyeTerminator v3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems)で反応後、IDH1f, IDH1rc: TTCATACCTTGCTTAATGGGTGTプライマーを用い、シーケンサー(ABI 3100 Genetic Analyzer,Applied Biosystems)を用いて解析をおこなった。 
【００３１】
（６）細胞起源による分類
Roelら（非特許文献９）により報告されている２４種類の遺伝子を用いて、Proneural, Neural, Classical,  Mesenchymalの４サブタイプに分類した。各サブタイプの生存期間の比較を行った。
【００３２】
（７）統計学的解析
統計学的解析は全て、Rソフトウェア（R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2011 ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org）およびBioconductor（Gentleman R, Carey V, Bates D, et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 2004, 5:R80）にて行った。  
【００３３】
生存期間の予測因子となる遺伝子を選択するため、Random Survival Forest -Variable Hunting 法(Ishwaran H, Kogalur UB, Gorodeski EZ, Minn AJ and Lauer MS High-dimensional variable selection for survival data. J. Amer. Stat. Assoc, 2010;105: 205-217)をあてはめ、小さいminimum depthを有する遺伝子のセットを選択した．Random Survival Forestパッケージ内のvarSel関数において、繰り返し数100，ステップサイズ5とし他の値についてはデフォルトセッティングを使用した。    
【００３４】
Ward's minimum variance cluster analysisにより、あてはめたRandom Survival Forest modelから評価した全ての死亡時点についての各個人のensemble cumulative hazard functionをインプットとして用いて、サンプルを２つの生存群に分けた。Kaplan-Meier method (Kaplan EL, Meier P. Nonparametric estimation from incomplete observations.J Am Statist Assoc 1958;53:457- 481) を用いて、各群について生存分布を評価した。Log-rank検定を用いて生存群間の相違を調べた。  
【００３５】
予測精度を評価するため、４つの実験（非特許文献５−８）からの独立の試験データを利用した。症例の年齢、性別、生存期間を表１のvalidation setに示す。各試験における各個人の表２の２５遺伝子あるいは３遺伝子の発現値を用いて予後予測式からZ値を計算し、Z値による予後予測が可能であるか検討した。これらは、survcomp package（Haibe-Kains B, Desmedt C, Sotiriou C, Bontempi, G. A comparative study of survival models for breast cancer prognostication based on microarray data: does a single gene beat them all? Bioinformatics 2008;24:2200-2208）内のconcordance.index functionおよびtest.hetero.test functionを用いて実施した。試験データ中に見あたらない遺伝子が幾つか存在したので、これら遺伝子は欠損値として扱い、近似法（Breiman L. Random forests. Machine Learning 2001; 45:5-32）により帰属させた。この解析について、p値＜0.05を統計学的に有意と判断した。
【００３６】
２．結果
（１）患者特性
2000年〜2005年に外科的切除を受けた患者３２人から、非処置腫瘍標本（神経膠芽腫（グレードIV））を得た。患者の平均年齢は54.5歳（18-80歳）であり、男性20人、女性12人であった。手術前のKarnofsky Performance Status (KPS)は、25人の患者で70以上であった。腫瘍の最大の外科的切除後に、患者は外照射療法（2cmの周縁の腫瘍につき標準線量60Gy）およびニムスチンによる第一選択化学療法をうけ、再発時にテモゾロマイド治療をうけた。初期治療および維持治療中の腫瘍の再発について、磁気共鳴映像法（MRI）またはコンピュータ断層撮影法（CT）により観察した。処置は、新潟大学病院の脳神経外科において行った。生存期間中央値は411日であった。
【００３７】
（２）予測遺伝子の選択
２５遺伝子が予測因子として選択された。表２は、これら遺伝子および各遺伝子のVariable Importance (VI)を示す。
【００３８】
（３）選択遺伝子を用いた生存率解析
適用した２５遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群について、Kaplan-Meier曲線を描いた（図１A）。対応するLogrank検定のためのp値は、p＜0.0001であった。さらに、３遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群について、Kaplan-Meier曲線を描いた（図２A）。対応するLogrank検定のためのp値は、p＜0.0001であった。これらの結果は、予後予測式による分類が有用であることを示す。
【００３９】
（４）独立したデータセットにおける選択遺伝子を用いた生存率解析
予測精度の結果を図1B、図2Bに示す。算出したp値は、Z1式でp =0.0016、Z2式でp=0.0028であった。これは選択された遺伝子セットが有意に予測的であることを示唆する。
【００４０】
（５）選択遺伝子と年齢を用いた生存率解析
適用した３遺伝子のセットによるZ2値と年齢によって、Kaplan-Meier曲線を描いた（図3A:test set, 図3B:validation set）。対応するLogrank検定のためのp値は各々p =0.0006、p＜0.0001であった。これらの結果は、予後予測式と年齢による分類が有用であることを示す。
【００４１】
前記の１０遺伝子について、QPCRによる検証ができた（データ非提示）。
【００４２】
患者の全生存期間(OS)を入院時の年齢（６０歳以上/未満か）、性別、KPS（７０以上/未満か）、IDH遺伝子の変異陽性/陰性、MGMT陽性/陰性、MGMT mRNA、細胞起源に基づくサブタイプ分類、Z1値が-1.17以上/未満、Z2値が-0.76以上/未満かで２群間比較した単変量解析結果が表３に示されている。年齢、KPS、細胞起源、Z1値、Z2値の各因子がOSを有意に２群に分けることができることが示される。
【００４３】
患者の全生存期間(OS)と各因子の関係の多変量解析結果が表４に示されている。Z1
値に基づくサブタイプ分類が有意であることが示される。
【００４４】
【表１】
2015000006.tif 000003
【００４５】
【表２】
2015000006.tif 000004
【００４６】
【表３】
2015000006.tif 000005
【００４７】
【表４】
2015000006.tif 000006
【図１】
2015000006.tif 000007
【図２】
2015000006.tif 000008
【図３】
2015000006.tif 000009
【配列表】
2015000006000001.app