(57)【要約】【課題】  特別な装置を使用せずに短時間で沈降でき、かつタンパク質を吸着可能な粒子、およびその粒子を安価に製造する方法を提供すること。【解決手段】  平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化アルミニウム粒子、および平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に平均粒子径が１から４０μｍの酸化アルミニウム粒子を分散させる第一の工程と、当該反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて酸化アルミニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程を含む、前記酸化アルミニウム粒子の製造方法によって、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化アルミニウム粒子であって、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの平均分子量が４００００以下である、前記酸化アルミニウム粒子。
【請求項２】
酸化アルミニウム粒子の平均粒子径が１から４０μｍである、請求項１に記載の酸化アルミニウム粒子。
【請求項３】
平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化アルミニウム粒子を分散させる第一の工程と、
前記反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化アルミニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程と、
を含む、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化アルミニウム粒子の製造方法。
【請求項４】
平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端に
カルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化アルミニウム粒子を分散
させる第一の工程と、
前記反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化アルミニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程と、
を含む方法で製造される、請求項１または２に記載の酸化アルミニウム粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を粒子表面に吸着可能な、ポリスチレン類で表面が被覆された酸化アルミニウム粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子に低分子化合物、核酸、タンパク質、糖鎖または細胞等の物質を結合させ、それら粒子上の物質と、核酸、蛋白質、抗原または糖鎖等の標的物質とを、結合、吸着または反応させることによって診断、分析、抽出、精製または反応を行なうシステムが種々提案されている。
【０００３】
例えば市販のマイクロビーズへタンパク質を固定化し、当該マイクロビーズをカップやマイクロタイタープレートに入れた後、抗体抗原反応を利用して測定を行なう手法が提案されており、一例として、抗原と抗体との反応を利用した免疫測定装置が開示されている（特許文献１）。抗体抗原反応を利用した測定では、まず定量したい物質（以下、「抗原」という）に対する抗体を吸着または化学結合により担体に固定化して得られる抗体固定化担体と、前記抗体とは異なる抗原のエピトープを認識する抗体をラジオアイソトープや酵素等により標識して得られる標識抗体を準備する。
【０００４】
次に抗体固定化担体および標識抗体を含む溶液に、被検液を加え、当該被検液に含まれる抗原と標識抗体との複合体を抗体固定化担体に捕捉させる。ここで前記複合体の量は、被検液中に含まれる抗原の濃度に比例するため、抗体固定化担体に補捉されなかった標識抗体を分離し、固定化された標識抗体を標識方法に応じた分析手法で分析することにより、目的とする抗原の濃度を測定することができる。
【０００５】
抗体固定化担体と当該抗体固定化担体に補捉されなかった標識抗体との分離は、例えば、抗体固定化担体を時間をかけて遠心装置にかけたり、抗体固定化担体として磁性体を含むマイクロビーズを用いた場合は磁場をかけたり、抗体固定化担体として酸化ジルコニウム粒子といった密度の高い粒子を用いた場合は密度を利用して自然沈降（特許文献２）させたりした後、抗体固定化担体に補捉されなかった標識抗体を含む上澄み液を除去することで行なわれる。
【０００６】
タンパク質を固定化するためのマイクロビーズとして酸化アルミニウム粒子を用いる際、あらかじめ酸化アルミニウム粒子をポリマーにより被覆する。酸化アルミニウム粒子のポリマーによる被覆は、特許文献２のように間接的に被覆する方法が開示されている。また特許文献３のように硫酸バリウム粒子へ直接ポリスチレンを被覆した樹脂粒子の製造方法が開示されている。しかしながら分子量４００００以下のポリスチレン類を直接、酸化アルミニウム粒子へ被覆した例は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１−１７２７５５号公報
【特許文献２】国際公開２００７／１２６１５１号パンフレット
【特許文献３】特開平４−００５２１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
標識抗体が結合した抗体固定化担体の分離には、抗体固定化担体を沈降させ分離洗浄する方法が利用されている。しかしながら、抗体を固定化するための担体として通常用いられるマイクロビーズ（担体）は樹脂基材やシリカ等の比重の軽い材質から成るものが多く、沈降に時間を要すため、遠心装置にかける工程を追加して強制的に沈降させる必要があった。またこれらの欠点を補う目的で磁性体を含むマイクロビーズ（担体）を用いる方法もあるが、粒子の沈降には磁場をかける装置や工程を必要とした。また比重の重い酸化アルミニウム粒子を用いる方法は、酸化アルミニウム粒子をポリマーで被覆させる際、高価
なシランカップリング剤を用いるため、製造原価が高く、工程数も多いという問題があった。さらに酸化アルミニウム粒子に被覆させるポリマーも、適切なポリマーを選択しなければ樹脂粒子同士の凝集がおこり、本発明の目的である測定、分析、抽出、精製または反応の再現性、感度、効率の点で適用できなくなる。
【０００９】
そこで本発明の課題は、特別な装置を使用せずに短時間で沈降でき、かつタンパク質を吸着可能な粒子、およびその粒子を安価に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明の第一の態様は、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化アルミニウム粒子であって、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの平均分子量が４００００以下である、前記酸化アルミニウム粒子である。
【００１２】
また本発明の第二の態様は、酸化アルミニウム粒子の平均粒子径が１から４０μｍである、前記第一の態様に記載の酸化アルミニウム粒子である。
【００１３】
さらに本発明の第三の態様は、
平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化アルミニウム粒子を分散させる第一の工程と、
前記反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化アルミニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程と、
を含む、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化アルミニウム粒子の製造方法である。
【００１４】
さらに本発明の第四の態様は、
平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端に
カルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化アルミニウム粒子を分散
させる第一の工程と、
前記反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化アルミニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程と、
を含む方法で製造される、前記第一または第二の態様に記載の酸化アルミニウム粒子である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明において被覆に用いられるポリスチレン、ポリスチレンコポリマーまたは末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを、以下、ポリスチレン類とする。ポリスチレンコポリマーとしては、ポリ（スチレン−メタクリル酸）コポリマー、ポリ（スチレン−アクリル酸）コポリマー、ポリ（スチレン−スチレンスルホン酸）コポリマー、ポリ（スチレン−ビニル安息香酸）コポリマーが例示できる。また末端にカルボキシル基を有するポリスチレンとしては、ポリスチレンの片末端にカルボキシル基を有するポリスチレン及び両末端にカルボキシル基を有するポリスチレンが例示できる。前述のポリスチレン類の中では、ポリスチレンが好ましい。なお、末端にカルボキシル基を有するポリスチレンやポリスチレンコポリマーは、自身が持つ負荷電により、酸化アルミニウム粒子への付着性が向上し、酸化アルミニウム粒子へ均一に被覆しやすくなる。
【００１７】
本発明における被覆させるポリスチレン類の平均分子量は４００００以下である。本発明において、平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ）で求めた値である。本発明において、平均分子量は、好ましくは１０００から４００００であり、さらに好ましくは１０００から３８０００であり、とりわけ１００００から３８０００が好ましい。最も好ましくは３５０００から３８０００である。ポリマー鎖が長くなると樹脂粒子同士の凝集が起こり目的の診断、分析、抽出、精製または反応などの処理に適した酸化アルミニウム粒子には不向きとなるからである。本発明の粒子は粒子同士の凝集が全く無い方が好ましいが、わずかに凝集していても、本発明の目的には適応しうるものである。
【００１８】
本発明におけるポリスチレン類被覆酸化アルミニウム粒子は、酸化アルミニウム粒子を被覆するポリスチレン類で完全に被覆されていても、部分的に被覆されていても本発明の目的には適応しうるものである。
【００１９】
本発明に用いられる酸化アルミニウム粒子は、アルミナの焼結体粒子が好ましい。未焼結の酸化アルミニウム粒子は崩れやすいため、ポリスチレン類を被覆するとき、またはタンパク質を固定化する際に攪拌すると粒子自体が崩れるおそれがあるためである。
【００２０】
また、本発明に用いられる酸化アルミニウム粒子の平均粒子径は、１μｍから４０μｍが好ましい。より好ましくは１μｍから２０μｍである。さらに好ましくは１μｍから１０μｍである。これ以上粒子のサイズが小さくなると自然沈降の速度が低下する。逆に粒子の大きさが大きくなると体積あたりの表面積が小さくなり診断または分析のシグナル・感度の低下、抽出、精製、または反応効率の低下をもたらす。
【００２１】
さらに本発明に用いられる酸化アルミニウム粒子の形状は特に制限はないが、好ましくは無定形の粒子である。それは単位体積あたりの表面積が大きくなり、診断または分析のシグナル・感度の向上、抽出、精製、または反応の効率の向上の点で好ましいからである。
【００２２】
本発明のポリスチレン類被覆酸化アルミニウム粒子は、平均分子量４００００以下のポリスチレン類を溶解した反応液に酸化アルミニウム粒子を分散させる第一の工程と、前記反応液に当該ポリスチレン類の貧溶媒を加えて、酸化アルミニウム粒子表面に当該ポリスチレン類を析出させる第二の工程の二つの工程を含む方法によって製造することができる。
【００２３】
第一の工程は、平均分子量４００００以下のポリスチレン類を溶解した反応液に酸化アルミニウム粒子を分散させる工程である。この工程で使用する溶媒はポリスチレン類を溶解できる溶媒であれば種類を問わないが、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、アセトン、トルエン、キシレン、ベンゼン、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトニトリル、イソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルケトンが例示でき、中でもＴＨＦが好ましい。また分散させる方法は超音波分散、ホモジナイズ、攪拌が例示できる。
【００２４】
本発明の第一の工程で用いられる、ポリスチレン類／酸化アルミニウム粒子の比率は、１／１０（ｇ／ｇ）以下が好ましい。ポリスチレン類の量が多くなるとポリスチレン類で被覆された粒子同士の凝集が起こりやすくなり、目的の診断、分析、抽出、精製または反応などの処理に適したアルミナ粒子には不向きとなるからである。またポリスチレン類で被覆された酸化アルミニウム粒子の比重が軽くなり自然沈降の速度が低下する。
【００２５】
第二の工程は、当該ポリスチレン類の貧溶媒を加えて、酸化アルミニウム粒子表面に当該ポリスチレン類を析出させる工程である。この工程で使用する貧溶媒としてはポリスチレン類を析出させることができる溶媒であれば種類を問わないが、水、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、ヘキサンが例示できる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によって、特別な装置を使用せずに短時間で沈降でき、かつタンパク質を吸着しうるポリスチレン類被覆酸化アルミニウム粒子を提供することができる。また本発明の粒子は、ポリスチレン類を溶解した反応液に酸化アルミニウム粒子を分散させる工程と、前記反応液に当該ポリスチレン類の貧溶媒を加えて酸化アルミニウム粒子表面に当該ポリスチレン類を析出させる工程を含む方法で製造できるため、安価かつ簡便に製造できる。
【００２７】
したがって本発明の粒子に低分子化合物、核酸、タンパク質、糖鎖または細胞等の物質を結合させ、それら粒子上の物質と、核酸、蛋白質、抗原または糖鎖等の標的物質とを、結合、吸着または反応させることによって診断、分析、抽出、精製するシステムへ利用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例  酸化アルミニウム粒子のポリスチレン被覆
第一の工程として、ＴＨＦ１０ｍＬにポリスチレン（Ｍｗ＝３５０００、シグマアルドリッチ製、７１ｍｇ）を加え、６０分間撹拌溶解した。これに酸化アルミニウム粒子（住友化学工業製アドバンスドアルミナ  スミコランダムＡＡ１０、φ１０μｍ、１ｇ）を加え、３０分間撹拌した。第二の工程として撹拌しながらヘキサン３０ｍＬを加え、デカンテーションにより上澄み液を取り除いた。さらにヘキサン２０ｍＬを加え撹拌したのち、懸濁液をガラスフィルターでろ過した。残渣をヘキサンでよく洗浄したのち乾燥し、凝集していないポリスチレン被覆酸化アルミニウム粒子８８０ｍｇを得た。
【００３０】
本実施例から明らかなように、本発明の製造方法によって、平均分子量が４００００以下のポリスチレン類を被覆させることにより、本発明の目的に合ったポリスチレン類被覆酸化アルミニウム粒子を得ることができる。