(57)【要約】【課題】癒着防止効果が高く、ハンドリング性に優れた癒着防止剤を提供することを目的とする。【解決手段】人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤であって、（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ（２）、ＶＰＧＶＧ（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中に含まれる下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１〜２０個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である癒着防止剤。アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤であって、
（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ（２）、ＶＰＧＶＧ（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
（Ａ）中に含まれる下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１〜２０個であり、
（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である癒着防止剤。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。
【請求項２】
人工タンパク質（Ａ）が、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１に記載の癒着防止剤。
【請求項３】
人工タンパク質（Ａ）１分子中の、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数とアミノ酸配列（Ｘ）及び下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（７）：アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の合計）が、１：２〜１：２０である請求項１又は２に記載の癒着防止剤。
【請求項４】
人工タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜３のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項５】
人工タンパク質（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）であるアミノ酸配列（Ｘ）と、ＧＶＧＶＰ配列（１）中のアミノ酸がリシンで置換されたアミノ酸配列（Ｘ’１）とを有する人工タンパク質（Ａ１）である請求項１〜４のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項６】
人工タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）とを有する人工タンパク質（Ａ１１）である請求項１〜５のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項７】
人工タンパク質（Ａ）の下記細胞接着率が０〜２０％である請求項１〜６のいずれかに記載の癒着防止剤。
細胞接着率：１ｃｍ２当たり２．５μｇの人工タンパク質（Ａ）を有する基材を作成し、基材にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種したとき、基材に接着するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の割合。
【請求項８】
癒着防止剤が、癒着防止剤中の人工タンパク質（Ａ）の含有量が５〜３０重量％であり、水の含有量が７０〜９５重量％である請求項１〜７のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項９】
３７℃で５００分以内にゲル化する請求項１〜８のいずれかに記載の癒着防止剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の癒着防止剤と、添加物質とを含む癒着防止剤組成物。
【請求項１１】
添加物質が、増粘物質、架橋剤及び／又は抗炎症剤である請求項１０に記載の癒着防止剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癒着防止剤及び癒着防止剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癒着防止膜として、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース及び酸化再生セルロールからなる群から選ばれる少なくとも１種のポリアニオン性多糖類からなるフィルム（特許文献１）が用いられており、科研製薬（株）製のセプラフィルム（登録商標）が市販されている。
【０００３】
癒着防止膜は手術後に腹腔内の臓器に貼り付けられ、臓器同士の癒着を防止する目的で使用される。癒着を引き起こした場合、各臓器の根本的な機能に障害を起こし、生命の危機にさらされるなどの予後の不良を引き起こす原因となる。
【０００４】
しかしながら、セプラフィルムを癒着防止膜として使用した場合、癒着防止効果が５０％前後と十分ではない。また、癒着防止膜が使用される腹腔内は凹凸のある構造を有しており、フィルムが貼り付け時に破れるなどハンドリング性が悪く、使用に際しては熟練を要する欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２７７５７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、癒着防止効果が高く、ハンドリング性に優れた癒着防止剤及び癒着防止剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤であって、（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ（２）、ＶＰＧＶＧ（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中に含まれる下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１〜２０個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である癒着防止剤である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の癒着防止剤は、癒着防止効果が高く、ハンドリング性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１〜５で得た人工タンパク質（Ａ１）〜（Ａ４）及び（Ａ１）組成物のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に対する細胞接着率とプレート表面のコーティング量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤であって、（Ａ）が、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）ＧＶＰＧＶ配列（４）、ＶＧＶＰＧ配列（５）、ＧＰＰ配列、ＧＡＰ配列及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（６）のうちいずれか１種のアミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）並びに／又は下記ペプチド鎖（Ｙ’）を有し、（Ａ）中に含まれる下記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数が１〜２０個であり、（Ａ）の疎水性度が０．２〜１．２である癒着防止剤である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖（Ｙ’）：アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖。
【００１１】
「癒着防止剤」とは、手術により損傷を受けた臓器が、他の臓器と癒着することを防止するために、損傷を受けた臓器に塗布又は貼り付けされる医療機器を意味する。
【００１２】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、動物由来成分を排除するために、人工的に製造されるものである。製造方法としては、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等が挙げられる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。
有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質（Ａ）を製造できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点及び分子量の大きいタンパク質を生産する場合における生産性の観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００１３】
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ）として、具体的には（ＧＶＧＶＰ）ａ配列（Ｙ１）、（ＰＧＶＧＶ）ｂ配列（Ｙ２）、（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列（Ｙ４）、（ＶＧＶＰＧ）ｅ配列（Ｙ５）、（ＧＰＰ）ｆ配列（Ｙ６）、（ＧＡＰ）ｇ配列（Ｙ７）及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｈ配列（Ｙ８）で表されるポリペプチド鎖等が挙げられる。（なお、ａ〜ｈはそれぞれアミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である。）
人工タンパク質（Ａ）１分子中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖を１種有してもよく、２種以上有してもよい。
また、人工タンパク質（Ａ）中にアミノ酸配列（Ｘ）が同種類のポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記ａ〜ｈが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ａ〜ｈが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもいい。
【００１４】
ポリペプチド鎖（Ｙ）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞との親和性及び細胞非接着性の観点から、ＧＶＧＶＰ配列（１）、ＰＧＶＧＶ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）、ＧＶＰＧＶ配列（４）及びＶＧＶＰＧ配列（５）が好ましく、さらに好ましくはＧＶＧＶＰ配列（１）及びＶＰＧＶＧ配列（３）である。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、癒着防止性、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点の観点から、（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列（Ｙ１）、（ＰＧＶＧＶ）ｂ配列（Ｙ２）、（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）、（ＧＶＰＧＶ）ｄ配列（Ｙ４）及び（ＶＧＶＰＧ）ｅ配列（Ｙ５）が好ましく、さらに好ましくは（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列（Ｙ１）及び（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列（Ｙ３）である。
【００１５】
本発明において、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、アミノ酸（Ｘ）と下記アミノ酸配列（Ｘ’）とが合計２〜２００個結合したポリペプチド鎖である。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の全アミノ酸の個数のうち２０〜４０％がそれぞれＫ又はＲで置換されたアミノ酸配列。
【００１６】
アミノ酸配列（Ｘ’）としては、ＧＶＧＶＰ配列（１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’１）｛ＧＫＧＶＰ配列（８）、ＧＶＧＫＰ配列（９）及びＧＫＧＫＰ配列（１０）等｝、ＶＰＧＶＧ配列（３）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたアミノ酸配列（Ｘ’２）｛ＫＰＧＶＧ配列（１１）、ＶＰＧＫＧ配列（１２）及びＫＰＧＫＧ配列（１３）等｝等が挙げられる。
【００１７】
また、アミノ酸配列（Ｘ’）としては、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、ＧＫＧＶＰ配列（８）、ＧＶＧＫＰ配列（９）、ＧＫＧＫＰ配列（１０）、ＫＰＧＶＧ配列（１１）、ＶＰＧＫＧ配列（１２）及びＫＰＧＫＧ配列（１３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（８）及びＫＰＧＶＧ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００１８】
人工タンパク質（Ａ）はポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することにより、体温付近でゲル化することが可能となる。したがって、本発明の人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤を、臓器等に塗布することにより、癒着防止膜を形成し、臓器同士の癒着を防止することができる。また、貼付時に液状であるので、破れることがない。
【００１９】
人工タンパク質（Ａ）１分子中に含まれる上記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数は、１〜２０個であり、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、好ましくは３〜１８個である。
【００２０】
人工タンパク質（Ａ）において、（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、５０〜２００個が好ましく、特に好ましくは９０〜１５０個である。
【００２１】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）の疎水性度は０．２〜１．２であるが、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点から、０．５〜１．２が好ましく、さらに好ましくは０．５〜０．８であり、次にさらに好ましくは０．５５〜０．７５であり、特に好ましくは０．６〜０．７２である。
（Ａ）の疎水性度は、（Ａ）分子の疎水性の度合いを示すものであり、（Ａ）分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数（Ｍα）、それぞれのアミノ酸の疎水性度（Ｎα）及び（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献（アルバート・Ｌ．レーニンジャー、デビット・Ｌ.ネルソン、レ−ニンジャ−の新生化学  上、廣川書店、２０１０年９月、ｐ．３４６−３４７）に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度＝Σ（Ｍα×Ｎα）／（ＭＴ）
Ｍα：（Ａ）１分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Ｎα：各アミノ酸の疎水性度
ＭＴ：（Ａ）１分子中のアミノ酸の総数
Ａ（アラニン）：１．８
Ｒ（アルギニン）：−４．５
Ｎ（アスパラギン）：−３．５
Ｄ（アスパラギン酸）：−３．５
Ｃ（システイン）：２．５
Ｑ（グルタミン）：−３．５
Ｅ（グルタミン酸）：−３．５
Ｇ（グリシン）：−０．４
Ｈ（ヒスチジン）：−３．２
Ｉ（イソロイシン）：４．５
Ｌ（ロイシン）：３．８
Ｋ（リシン）：−３．９
Ｍ（メチオニン）：１．９
Ｆ（フェニルアラニン）：２．８
Ｐ（プロリン）：−１．６
Ｓ（セリン）：−０．８
Ｔ（トレオニン）：−０．７
Ｗ（トリプトファン）：−０．９
Ｙ（チロシン）：−１．３
Ｖ（バリン）：４．２
例えば、（Ａ）が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）である場合、（Ａ）の疎水性度＝｛１６（Ｇの数）×（−０．４）＋１５（Ｖの数）×４．２＋８（Ｐの数）×（−１．６）＋１（Ｋの数）×（−３．９）｝／４０（アミノ酸の総数）＝１．００である。
【００２２】
本発明においては、上記ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、且つ（Ａ）の疎水性度が上記範囲内であることにより、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間の観点が向上する。
（Ａ）は配列（Ｘ）を有する場合、細胞との親和性および細胞非接着性は高いが、疎水性度が上記範囲外となり、溶解性（特に水への溶解性）の低下及びゲル化時間が増加する場合がある。その場合、アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸の一部をＫ又はＲで置換することにより、疎水性度を小さくすることができ、溶解性（特に水への溶解性）の向上及びゲル化時間を短縮でき、癒着防止膜として有用になる。
【００２３】
本発明において、人工タンパク質（Ａ）は、ゲル化時間の観点から、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有することが好ましい。（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有している場合、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２〜１０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｓ）を有していることが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が連続する数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、２〜１０個が好ましく、さらに好ましくは２〜８個であり、次にさらに好ましくは２〜６個であり、特に好ましくは２〜４個である。
（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｓ）を有する際、（Ａ）１分子中に（Ｓ）を１つ以上有すればよいが、ゲル化時間の観点から、２〜２０個が好ましく、さらに好ましくは５〜１８個である。
【００２４】
人工タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点のから、１〜１０個が好ましく、さらに好ましくは１〜５個であり、特に好ましくは１〜３個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１４）、ＧＡＡＧＹ配列（１５）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
【００２５】
人工タンパク質（Ａ）中の両末端の各ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）及びポリペプチド鎖（Ｓ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもいい。（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、（Ｙ）、（Ｙ’）又は（Ｓ）では無いペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは５〜４０個であり、特に好ましくは１０〜３５個である。
（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１６）等が挙げられる。
【００２６】
人工タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製または検出を容易にするために、（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ、ＫＴ３タグ、マルトース結合タンパク質、ＨＱタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２７】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）の合計含有量（重量％）は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、（Ａ）の分子量を基準として、４０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜７０重量％である。
【００２８】
人工タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量は、アミノ酸配列決定によって求めることができる。具体的には、下記の測定法によって求めることができる。
＜ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量の測定法＞
津製作所社製ペプチドシーケンサー（プロテインシーケンサ）ＰＰＳＱ−３３Ａを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式（１）によりポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含量を求める。
ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）の合計含有量＝Σ（γ×β）／Σ（α×β）×１００  （１）
α：人工タンパク質（Ａ）中の各アミノ酸の数
β：各アミノ酸の分子量
γ：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）中の各アミノ酸の個数
【００２９】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（重量％）は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、（Ａ）の分子量を基準として４０〜８０重量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜７０重量％である。
【００３０】
人工タンパク質（Ａ）１分子中のＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数とポリペプチド鎖（Ｙ）及びポリペプチド鎖（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比率（ＧＡＧＡＧＳ配列（７）の個数：ポリペプチド鎖（Ｙ）及び（Ｙ’）を構成するアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数）は、（Ａ）の溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１：２〜１：２０が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：１０である。
【００３１】
本発明において、（Ａ）がＧＡＧＡＧＳ配列（７）を有していると、ゲル化時間がさらに良好になる。特に、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）とアミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）との比が上記範囲であることで、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間のバランスがとれる。
【００３２】
人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、溶解性（特に水への溶解性）及びゲル化時間観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは６０〜８０ｋＤａである。この範囲であると、（Ａ）が分解されるまでの時間が適度である。
なお、人工タンパク質（Ａ）の分子質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
【００３３】
好ましい人工タンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（１）の人工タンパク質（Ａ１−１）
アミノ酸配列（Ｘ）としてＧＶＧＶＰ配列（１）を有し、アミノ酸配列（Ｘ’）としてＧＫＧＶＰ配列（８）を有する人工タンパク質（Ａ１）であり、さらに好ましくは、（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）であるポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を有する人工タンパク質（Ａ１−１）、ポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）及び（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）であるポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１−２）、並びにポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）、ポリペプチド鎖（Ｓ１−１）及びポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を有する人工タンパク質（Ａ１−３）である。具体的には、下記人工タンパク質が挙げられる。
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）（Ｙ’１−１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約７０ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ、疎水性度０．６１８）
（ｉｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）のポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約７７ｋＤａの配列（２２）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ、疎水性度０．７１８）
（ｉｉｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を１６個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を８個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−２）｝８の順で化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（２３）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ、疎水性度０．６９３）
（ｉｖ）ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を６個、ＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を６個、及びＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を６個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−１）｝６の順で化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ、疎水性度０．６０７）
【００３４】
人工タンパク質（Ａ）は、細胞非接着性の観点から、下記細胞接着率が０〜２０％であることが好ましく、さらに好ましくは５〜２０％であり、次にさらに好ましくは１０〜２０％である。
細胞接着率：１ｃｍ２当たり２．５μｇの人工タンパク質（Ａ）を有する基材を作製し、基材にＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種したとき、基材に接着するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の割合。
細胞接着率は、疎水性度を高くすることによって高くすることができる。また、人工タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列中に細胞接着性のアミノ酸配列｛ＲＧＤ配列等｝を組み込む等により、高くすることができる。
なお、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性のアミノ酸配列としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【００３５】
細胞接着率は、具体的には、下記測定法により測定される。
＜細胞接着率の測定方法＞
（１）細胞接着率測定用プレートの作成
人工タンパク質（Ａ）１ｍｇを０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する：以下、ＰＢＳと記載）１ｍＬに溶解し、さらに、ＰＢＳで希釈して、溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）｛溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）中の人工タンパク質（Ａ）の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ｄ１）：０．０１、（Ｄ２）：１、（Ｄ３）：１０、（Ｄ４）：１００｝を作製する。この溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳで１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）を作成する。
【００３６】
（２）コーティング量の測定
次に、細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の表面のポリペプチドによるコーティング量を測定する。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得る。細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置する。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量（μｇ／ｃｍ２）を得る。
【００３７】
（３）細胞の接着及び細胞接着率の測定
血清を含まないＤＭＥＭ培地を５０μＬ／穴でプレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存する。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去する。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置する。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、それぞれ８穴分の平均データとする。
人工タンパク質（Ａ）の代わりにフィブロネクチンを用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行う。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量（Ｘ０）を測定する。（Ｘ０）が細胞接着率１００％であるとして、（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の細胞接着率を算出する。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロットし、近似直線を描き、コーティング量が２．５（μｇ／ｃｍ２）のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とする。
【００３８】
本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質（Ａ）及び水を含む癒着防止剤である。
水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
【００３９】
水は、緩衝成分を含んだ緩衝液としてもいい。
緩衝成分としては、リン酸等有機酸やグッドバッファー等が挙げられる。
【００４０】
本発明の癒着防止剤中の人工タンパク質（Ａ）の含有量は、溶解性及びゲル化時間の観点から、５〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜２０重量％である。
癒着防止剤中の水の含有量は、ゲル化時間の観点から、７０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは８０〜９０重量％である。
癒着防止剤中の緩衝成分の含有量は、ゲル化時間の観点から、０〜５０ｍＭが好ましく、さらに好ましくは０〜１０ｍＭである。
【００４１】
本発明において、癒着防止剤中にはさらに塩（例えばナトリウム塩等）を含んでいても良い。
ゲル化の観点から、塩の濃度は、０〜０．８重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜０．６重量％である。
【００４２】
本発明の癒着防止剤の３７℃でのゲル化時間は、ハンドリング性の観点から、５００分以内が好ましく、さらに好ましくは５〜５００分であり、特に好ましくは１５〜２００分である。
ゲル化時間は、癒着防止剤中の人工タンパク質（Ａ）の濃度を高くしたり、人工タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（７）の比率を大きくすることにより短くすることができる。
【００４３】
ゲル化時間は、具体的には、下記測定法により測定される。
＜ゲル化時間の測定＞
癒着防止剤１００μＬをマイクロチュブ（２ｍＬ）に量りとり、３７℃のインキュベーターに放置する。５分おきに、マイクロチューブを１８０度傾けて、癒着防止剤が垂れるかを確認する。癒着防止剤が垂れなくなった時間をゲル化時間とする。
【００４４】
本発明の癒着防止剤組成物は、癒着防止剤のほかに、添加物質を含んでいても良い。
添加物質としては、ゲル化時間を調整する観点や癒着防止性向上の観点から、増粘物質、架橋剤及び／又は抗炎症剤が好ましい。
【００４５】
増粘物質として、アルギン酸、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース及びこれらのアルカリ金属塩などが挙げられる。これらのうち、癒着防止剤組成物のゲル化時間の調整及び安全性の観点から、アルギン酸、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース及びこれらのアルカリ金属塩が好ましい。
【００４６】
増粘物質の粘度としては、癒着防止剤組成物のゲル化時間を調整する観点から、１５０〜８００cpのものが好ましく、さらに好ましくは３００〜４００cpである。
【００４７】
本発明の癒着防止剤組成物において、増粘物質の含有量としては、フィルム形成の観点及びゲル化時間を調整する観点から、癒着防止剤の重量に基づいて、好ましくは０．２５〜４重量％であり、さらに好ましくは０．５〜１重量％である。
【００４８】
架橋剤として、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル及びカルボジイミドなどが挙げられる。これらのうち、癒着防止剤組成物のゲル化時間の調整及び安全性の観点から、グルタルアルデヒドが好ましい。
【００４９】
抗炎症剤として、ステロイド系抗炎症剤、酸性抗炎症剤又は塩基性抗炎症剤などが挙げられる。
癒着防止剤のゲル化時間は、下記測定法によって測定する。
【００５０】
本発明の癒着防止剤組成物の製造方法としては、室温で癒着防止剤溶液と添加物質溶液とを混合するなどが挙げられる。
【００５１】
本発明の癒着防止剤及び癒着防止剤組成物は、外科的手術後に臓器同士、器官同士又は臓器若しくは器官と医療用器具との癒着を防止するために使用される。特に、複雑な臓器や器官の外科的手術や内視鏡手術などに好適に用いることができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１＞
○人工タンパク質（Ａ１）含有癒着防止剤（１）の作製
特表平３−５０２９３５号公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製し、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を１２個及びＧＶＧＶＰ配列（１）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１−１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）（Ｙ’１−１）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）１個が化学結合した構造を有する分子質量が約７０ｋＤａの配列（２１）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）（Ａ１）を得た。
人工タンパク質（Ａ１）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（１−１、１−２、１−３）を作製した。
【００５４】
＜実施例２＞
○人工タンパク質（Ａ２）含有癒着防止剤（２）の作製
実施例１と同様にして、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（１９）のポリペプチド鎖（Ｙ’１−１）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約７７ｋＤａの配列（２２）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）（Ａ２）を作製した。
人工タンパク質（Ａ２）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（２−１、２−２、２−３）を作製した。
【００５５】
＜実施例３＞
○人工タンパク質（Ａ３）含有癒着防止剤（３）の作製
実施例１と同様にして、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を１６個、及びＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を８個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−２）｝８の順で化学結合してなる分子質量が約７１ｋＤａの配列（２３）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ４１５Ｋ）（Ａ３）を作製した。
人工タンパク質（Ａ３）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（３−１、３−２、３−３）を作製した。
【００５６】
＜実施例４＞
○人工タンパク質（Ａ４）含有癒着防止剤（４）の作製
実施例１と同様にして、ＧＡＧＡＧＳ配列（７）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１８）のポリペプチド鎖（Ｓ１−２）を６個、ＧＶＧＶＰ配列（１）が１６個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）中のＶ（バリン）のうち１個がＫ（リシン）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）１１配列（２０）（Ｙ’１−２）を６個、及びＧＡＧＡＧＳ配列（７）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｓ１−１）を６個有し、これらが｛（Ｓ１−２）（Ｙ’１−２）（Ｓ１−１）｝６の順で化学結合してなる分子質量が約６５ｋＤａの配列（２４）の人工タンパク質（ＳＥＬＰ８１５Ｋ）（Ａ４）を作製した。
人工タンパク質（Ａ４）を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ５、２０、３０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、それぞれ癒着防止剤（４−１、４−２、４−３）を作製した。
【００５７】
＜実施例５＞
○人工タンパク質（Ａ１）含有癒着防止剤組成物（５）の作製
実施例１と同様にして得られた人工タンパク質（Ａ１）を癒着防止剤の重量に基づいて２０重量％の濃度となるようにＰＢＳ：脱イオン水＝７：３に溶解し、次いで、この溶液に粘度３００〜４００ｃｐのアルギン酸ナトリウムを癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ０．２５、１、４重量％の濃度となるように溶解し、癒着防止剤組成物（５−１、５−２、５−３）を作製した。
【００５８】
＜比較例１＞
セプラフィルム（科研薬社製）を比較用の癒着防止剤として用いた。
【００５９】
＜評価：癒着防止能の測定＞
ラットを開腹し、盲腸を取り出した。ラット盲腸先端部位９点（直径約１ｍｍ）をハンダゴテで焼灼した。癒着防止剤（１）〜（４）及び癒着防止剤組成物（５）１００μｌを焼灼部位に塗布した。また、ラット盲腸末端部も同様に焼灼し、セプラフィルムを貼り付けた。その後、閉腹した。なお、癒着防止剤１種に対して３つの試験体を作成した。
７日間後、再び開腹し、癒着度合いを評価した。癒着の評価は以下の基準で評価し、３つの試験体のそれぞれの評価結果及び３つの平均を表１に示す。
グレード１：癒着なし
グレード２：容易に剥離可能な軽度の癒着
グレード３：軽度の牽引に耐えうる程度の癒着
グレード４：重度の癒着で剥離により一部の損傷を伴う（強い脂肪の癒着）
グレード５：強い臓器の癒着
【００６０】
＜細胞接着率の測定＞
（１）細胞接着率測定用プレートの作成
実施例１〜４で得た人工タンパク質（Ａ１）〜（Ａ４）について、それぞれ１ｍｇを０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する：以下、ＰＢＳと記載）１ｍＬに溶解し、さらに、ＰＢＳで希釈して、それぞれ溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）｛溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）中の人工タンパク質（Ａ）の濃度（μｇ／ｍＬ）；（Ｄ１）：０．０１、（Ｄ２）：１、（Ｄ３）：１０、（Ｄ４）：１００｝を作製した。この溶液（Ｄ１）〜（Ｄ４）を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）中の８穴ずつにそれぞれ５０μＬ／穴で投入し、室温（約２５℃）で２時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、ＰＢＳで１００μＬ／穴で２回洗浄し、さらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、アスピレーターを用いて脱イオン水を除去して、基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ４）を作成した。また、（Ａ１）を実施例５で得た人工タンパク質（Ａ１）組成物に置き換えた以外は前記基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレートと同様にして（Ｐ５）を作成した。
【００６１】
（２）コーティング量の測定
次に、細胞接着率測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の表面のポリペプチドによるコーティング量を測定した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ溶液：Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃ溶液＝２５：２４：１の混合液（Ｃ）を得た。細胞接着測定用プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の各ウェルに混合液（Ｃ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）とＣｕ＋とからなるキレートの生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量（μｇ／ｃｍ２）を得た。
【００６２】
（３）細胞の接着及び細胞接着率の測定
血清を含まないＤＭＥＭ培地を５０μＬ／穴でプレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）にそれぞれ添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存する。１時間後、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）を１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／穴で添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて２時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量（Ｘ）を、４５０ｎｍ（参照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、それぞれ８穴分の平均データとした。
人工タンパク質（Ａ）の代わりにフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、品名「フィブロネクチン溶液」）を用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行った。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量（Ｘ０）を測定した。（Ｘ０）が細胞接着率１００％であるとして、（Ｘ）及び（Ｘ０）を下記式に当てはめ、プレート（Ｐ１）〜（Ｐ５）の細胞接着率を算出した。
細胞接着率（％）＝（Ｘ）／（Ｘ０）×１００
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロット（図１）し、近似直線を描き、コーティング量が２．５（μｇ／ｃｍ２）のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とした。結果を表２に示す。
【００６３】
＜ゲル化時間の測定＞
実施例１〜５で得た癒着防止剤（１）〜（４）及び癒着防止剤組成物（５）をそれぞれ１００μＬ、マイクロチュブ（２ｍＬ）に量りとり、３７℃のインキュベーターに入れた。５分おきに、マイクロチューブを１８０度傾けて、癒着防止剤が垂れるかを確認した。癒着防止剤が垂れなくなった時間をゲル化時間とした。１つの癒着防止剤について、３つのサンプルを作成し、実験を行った。３つのサンプルのゲル化時間及び平均値を表３に示す。
【００６４】
【表１】
2015177968.tif 000003
【００６５】
【表２】
2015177968.tif 000004
【００６６】
【表３】
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【００６７】
表１の結果から、本発明の癒着防止剤は、比較例のセプラフィルムと比較して、癒着防止効果が高いことが分かる。特に、ゲル化時間が５００分以内の実施例１、２及び４の癒着防止剤は、癒着グレードが１．３３３以下と極めて癒着防止効果が高いことが分かる。また、本発明の癒着防止剤は、作製直後は溶液状であり、時間経過によりゲル化するものであるので、患部に塗布しやすく、ハンドリング性に優れる。実施例５の癒着防止剤組成物は、添加剤を０．２５〜４重量％加えることにより、簡単にゲル化時間を調整することができ、０．２重量％以下ではゲル化時間に変化はないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の癒着防止膜は、癒着防止効果が高く、ハンドリング性が高いので、外科的手術後に臓器同士、器官同士又は臓器若しくは器官と医療用器具との癒着を防止するために使用することができる。特に、複雑な臓器や器官の外科的手術や内視鏡手術などに好適に用いることができる。
【図１】
2015177968.tif 000006
【配列表】
2015177968000001.app