(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的に活性のある分子を細胞、組織及び臓器に効率的に移行させることに基づく治療応用、研究応用及び診断応用に有用であり、血液循環中で安定で生物学的に活性のある分子の全身性及び局所性の送達のための化合物、組成物及び方法の提供。【解決手段】下記式で表される対称性ポリアミン誘導体及び前記化合物を含む製材。2015147927.tif 000065（ｎ１〜ｎ３は各々独立に１〜４の整数；Ｘ及びＸ’は各々独立に結合、Ｏ、又はＮ；Ｒ１及びＲ２は各々独立に１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基；Ｇはポリマー部分）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2015147927.tif 000058
の化合物であって、式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇはポリマー部分である
化合物。
【請求項２】
ｎ１、ｎ２、及びｎ３がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が結合である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２は独立して、１の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基である請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｇが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｇが、ポリオキシアルキレンである請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１の化合物と、
（ａ）リボゾームＲＮＡ；ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；アプタマー；リボザイム；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチド；又は
（ｂ）タンパク質、ペプチド、コレステロール、ホルモン、小分子医薬化合物、ビタミン及び補因子
から成る群から選択される分子とを含む製剤。
【請求項９】
製剤が、前記化合物及び前記分子を含む粒子を含む請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記粒子が、約５００ｎｍ未満の直径中央値を有する請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
式Ａの化合物及び式Ｂの化合物を含む組成物
【化２】
2015147927.tif 000059
式Ａ
【化３】
2015147927.tif 000060
式Ｂ
（式中、
式Ａ及び式Ｂ双方のｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり；
式Ａ及び式Ｂ双方のＸ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり；
式Ａ及び式Ｂ双方のＲ１及びＲ２は独立して、１〜４の二重結合又は三重結合を任意に含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり；並びに、
式Ａにおいて、Ｇは水素であり、及び
式Ｂにおいて、Ｇはポリマー部分である）。
【請求項１２】
ポリマーが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリマーが、ポリオキシアルキレンである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレンである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
式Ａの化合物がジオレオイルモノアミンであり、式Ｂの化合物がｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
式Ａ及び式Ｂ双方のｎ１、ｎ２、及びｎ３がすべて１であり、式Ａ及び式Ｂ双方のＸ及びＸ’が結合である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
式Ａ及び式Ｂ双方のＲ１及びＲ２は独立して、１の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
式Ａ及び式Ｂ双方の−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２がオレオイル基である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
製剤における式Ａの化合物と式Ｂの化合物の比が１：１から１０：１である請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１１の化合物と、
（ａ）リボゾームＲＮＡ；ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；アプタマー；リボザイム；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチド；又は
（ｂ）タンパク質、ペプチド、コレステロール、ホルモン、小分子医薬化合物、ビタミン及び補因子
から成る群から選択される分子とを含む製剤。
【請求項２１】
生物学的に活性のある分子、式Ａの化合物及び式Ｂの化合物を含む製剤であって、
【化４】
2015147927.tif 000061
式Ａ
【化５】
2015147927.tif 000062
式Ｂ
（式中、
式Ａ及び式Ｂ双方のｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり；
式Ａ及び式Ｂ双方のＸ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり；
式Ａ及び式Ｂ双方のＲ１及びＲ２は独立して、１〜４の二重結合又は三重結合を任意に含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり；並びに、
式Ａにおいて、Ｇは水素であり、及び
式Ｂにおいて、Ｇはポリマー部分である）
並びに、
該生物学的に活性のある分子が、リボゾームＲＮＡ；ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；アプタマー；リボザイム；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチド；から成る群から選択される、上記製剤。
【請求項２２】
ポリマーが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である請求項２１に記載の製剤。
【請求項２３】
ポリマーが、ポリオキシアルキレンである請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレンである請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
式Ａの化合物がジオレオイルモノアミンであり、式Ｂの化合物がｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンである、請求項２１に記載の製剤。
【請求項２６】
式Ａ及び式Ｂ双方のｎ１、ｎ２、及びｎ３がすべて１であり、式Ａ及び式Ｂ双方のＸ及びＸ’が結合である請求項２１に記載の製剤。
【請求項２７】
式Ａ及び式Ｂ双方のＲ１及びＲ２は独立して、１の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である、請求項２１に記載の製剤。
【請求項２８】
式Ａ及び式Ｂ双方の−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２がオレオイル基である請求項２７に記載の製剤。
【請求項２９】
製剤における式Ａの化合物と式Ｂの化合物の比が１：１から１０：１である請求項２１に記載の製剤。
【請求項３０】
製剤が、生物学的に活性のある分子、式Ａの化合物及び式Ｂの化合物を含む粒子を含む請求項２１に記載の製剤。
【請求項３１】
前記粒子が、約５００ｎｍ未満の直径中央値を有する請求項３０に記載の製剤。
【請求項３２】
製剤が薬学上許容可能な賦形剤を含む請求項２１に記載の製剤。
【請求項３３】
リボゾームＲＮＡ；ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；アプタマー；リボザイム；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチドの細胞への送達に使用するための請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３４】
哺乳類対象の疾患を治療又は予防するための、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３５】
疾患が対象における調節されない細胞増殖に特徴付けられる、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３６】
前記疾患が癌である請求項３５に記載の製剤。
【請求項３７】
前記疾患が肺癌である請求項３６に記載の製剤。
【請求項３８】
前記製剤が、前記哺乳類対象に経口で、局所に、非経口で、吸入によって、又は直腸に投与される、請求項３４に記載の製剤。
【請求項３９】
哺乳類対象の肺組織内の疾患を治療するための、生物学的に活性のある分子、式Ａの化合物及び式Ｂの化合物を含む製剤であって、
【化６】
2015147927.tif 000063
式Ａ
【化７】
2015147927.tif 000064
式Ｂ
（式中、
式Ａ及び式Ｂ双方のｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり；
式Ａ及び式Ｂ双方のＸ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり；
式Ａ及び式Ｂ双方のＲ１及びＲ２は独立して、１〜４の二重結合又は三重結合を任意に含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり；並びに、
式Ａにおいて、Ｇは水素であり、及び
式Ｂにおいて、Ｇはポリマー部分である）
並びに、
該生物学的に活性のある分子が、リボゾームＲＮＡ；ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；アプタマー；リボザイム；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチド；から成る群から選択される、上記製剤。
【請求項４０】
ポリマーが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である請求項３９に記載の製剤。
【請求項４１】
式Ａの化合物がジオレオイルモノアミンであり、式Ｂの化合物がｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンである、請求項３９に記載の製剤。
【請求項４２】
前記疾患が肺癌である請求項３９に記載の製剤。
【請求項４３】
製剤が、生物学的に活性のある分子、式Ａの化合物及び式Ｂの化合物を含む粒子を含む請求項３９に記載の製剤。
【請求項４４】
前記粒子が、約５００ｎｍ未満の直径中央値を有する請求項４３に記載の製剤。
【請求項４５】
前記製剤が、前記哺乳類対象に経口で、局所に、非経口で、吸入によって、又は直腸に投与される、請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対称性ポリアミン誘導体及びそのような化合物を含む製剤に関するものであり、さらに具体的には、部分的にアシル化され、任意で補助基を持つポリアミン誘導体に関する。そのような化合物は、細胞にｓｉＲＮＡを導入すること、標的配列のサイレンシング発現、ｓｉＲＮＡの生体内送達、並びに疾患及び／又は障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明の化合物、組成物及び方法は、生物学的に活性のある分子を細胞、組織及び臓器に効率的に移行させることに基づく治療応用、研究応用及び診断応用に有用である。以下に続く本発明の理解のためにのみ議論が提供される。
【０００３】
たとえば、抗菌剤や化学療法剤のような種々の治療用化合物の細胞性の送達は、普通、２つの限界によって妥協させられる。第１に、多数の治療剤の選択性は低いことが多く、その結果、正常組織に高い毒性を生じる。第２に、多数の化合物の生細胞への輸送は細胞の複雑な膜系によって高度に限定されている。特定のトランスポ−タは、栄養物又は調節性分子の選択的な侵入を可能にする一方で、たとえば、核酸及びタンパク質のようなほとんどの外因性分子を排除する。脂質キャリア、生分解性ポリマー及び種々の共役系を始めとする種々の戦略を用いて化合物の細胞への輸送を改善することができる。
【０００４】
外来の核酸の細胞への輸送を改善するために最もよく検討されているアプローチには、ウイルスベクタ−又はカチオン性脂質及び関連するサイトフェクチンの使用が含まれる。ウイルスベクタ−を用いてある種の細胞に遺伝子を効率的に移入することができるが、それらは一般に化学的に合成された分子を細胞に導入するには使用することができない。別のアプローチは、カチオン性脂質を組み入れている送達製剤を使用することであり、それは、一方の端を介した核酸及び他方の端を介した脂質又は膜系と相互作用する。プラスミドと同様に合成核酸は、サイトフェクチンを用いて送達することができるが、そのような化合物の有用性は、細胞種の特異性、形質移入の間の低血清の要件、及び毒性によって限定されることが多い。
【０００５】
生物学的に活性のある分子を送達する別のアプローチには、抱合体の使用が含まれる。抱合体は、たとえば、受容体が介在するエンドサイトーシスを介して特定に細胞に選択的に輸送される特定の分子の能力に基づいて選択されることが多い。細胞膜を横切って能動的に輸送される分子に当該化合物を連結することによって、その化合物の細胞への又は特定の細胞小器官への効果的な輸送を実現することができる。或いは、能動輸送の機構なしで細胞膜を貫通することができる分子、たとえば、種々の親油性分子を用いて当該化合物を送達することができる。抱合体として利用することができる分子の例には、ペプチド、ホルモン、脂肪酸、ビタミン、フラボノイド、糖、リポーター分子、リポーター酵素、キレーター、ポルフィリン、干渉物質、及び能動輸送又は受動輸送のいずれかによって細胞膜を貫通することが可能であるそのほかの分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００６】
特定の細胞種、たとえば、癌細胞又は特定の組織及び臓器に特異的な細胞への化合物の送達は、特定の細胞種に会合する受容体を利用して達成することができる。高親和性の葉酸受容体を含む特定の受容体は特定の癌性細胞において過剰発現している。たとえば、高親和性の葉酸受容体は、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、鼻咽腔癌を含む種々の腫瘍組織で過剰発現する腫瘍マーカーであるが、正常組織では非常に限定された程度に発現する。細胞膜を横切って外因性の化合物を輸送するのに葉酸を基にした抱合体を使用することは、疾患の治療及び診断に標的化送達アプローチを提供することができ、治療用化合物の必要とされる用量を低減することができる。さらに、葉酸生体抱合体を含む生体抱合体の使用を介して、治療上の生体利用効率、薬物動態及び薬物動力学的パラメ−タを調節することができる。生物学的に活性のあるプテロイルオリゴ−Ｌ−グルタミン酸の合成が報告されている。特定のオリゴヌクレオチド−葉酸の抱合体の固相合成の方法が記載されていると共に、特定の抱合基によってオリゴヌクレオチドが修飾される。特定のオリゴヌクレオチドを含む外因性分子の膜貫通輸送を向上させることへのビオチンと葉酸の抱合体の使用が報告されている。抱合体の核酸成分に連結されたホスホルアミダイト部分を持つ特定の核酸葉酸抱合体を含む特定の葉酸抱合体、及びこれらの葉酸抱合体の合成方法が記載されている。特定の種類の葉酸−ヌクレオシド抱合体の合成に有用な中間体、α−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］葉酸の合成が報告されている。
【０００７】
特定の種類の細胞、たとえば、肝細胞に会合する受容体を利用することによって、そのほかの細胞種への化合物の送達を達成することができる。たとえば、受容体が介在するエンドサイトーシスを利用した薬剤送達系を用いて薬剤取り込みの向上と共に薬剤のタ−ゲティングを達成している。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）は、肝細胞に独特であり、たとえば、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）のような分枝鎖のガラクトース末端の糖タンパク質に結合する。そのような糖タンパク質又は合成の糖抱合体の受容体への結合は、オリゴ糖鎖の分枝の程度に強く左右される親和性と共に生じ、たとえば、３分枝アンテナ構造は、２分枝アンテナ鎖又は１分枝アンテナ鎖よりも高い親和性で結合する（ガラクトースに比べて受容体への高い親和性を有する、糖質部分としてのＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの使用を介したこの高い特異性の例）。この「クラスタリング効果」は、マンノシル末端の糖タンパク質又は糖抱合体の結合及び取り込みについても記載されている。細胞膜を横切って外因性の化合物を輸送するのにガラクトース及びガラクトサミンに基づいた抱合体を使用することは、ＨＢＶ及びＨＣＶの感染又は肝細胞癌のような肝臓疾患の治療に標的化した送達アプローチを提供することができる。生体抱合体の使用は、治療に必要とされる治療用化合物の必要とされる用量の低減も提供することができる。さらに、生体抱合体の使用を介して、治療上の生体利用効率、薬物動態及び薬物動力学的パラメ−タを調節することができる。
【０００８】
幾つかの研究グル−プによって多数のペプチドに基づいた細胞性のトランスポ−タが開発されている。これらのペプチドは高い効率にて、試験管内で及び生体内で細胞膜を横断することが可能である。そのような融合性ペプチドの例には、ショウジョウバエの転写因子であるＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡのホメオドメインの１６アミノ酸断片；ＮＬＳドメインの存在下又は非存在下でのカポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の疎水性領域を現す１７量体；Ｃａｉｍａｎ  ｃｒｏｃｏｄｙｌｕｓのＩｇ（５）軽鎖の１７量体シグナルペプチド配列；ＨＩＶのエンベロ−プ糖タンパク質ｇｐ４１１４の１７アミノ酸融合配列；ＨＩＶ−１Ｔａｔ４９−５７断片；トランスポ−タンＡ−神経ペプチドガラニンのＮ末端断片及び膜と相互作用するスズメバチ毒ペプチドマストパランから成る隣接２７量体；及びインフルエンザウイルス凝集素エンベロ−プの糖タンパク質に由来する２４量体が挙げられる。これらのペプチドは、脂質なしでの細胞培養形質移入に、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド−ペプチド抱合体の一部として上手く利用される。多数の場合で、そのような抱合体は、脂質送達を用いて形質移入された親オリゴヌクレオチドよりも良好な細胞培養の有効性を示した。加えて、ファ−ジディスプレイ法は、生体内で幾つかの臓器タ−ゲティング及び腫瘍タ−ゲティングのペプチドを特定している。腫瘍タ−ゲティングのペプチドのドキソルビシンへの抱合は、毒性特性を有意に改善することが示され、マウスの生体内癌モデル、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌におけるドキソルビシンの高い有効性を示した。
【０００９】
生物学的に活性のある分子の細胞内送達への別のアプローチには、カチオン性ポリマーの使用が含まれる（たとえば、細胞膜を横切る種々の分子の輸送を高めるための高分子量リジンポリマーの使用が記載されている）。薬剤又は高分子が、その少なくとも５０％がグアニジン側鎖又はアミジン側鎖を含有する６〜２５のサブユニットから成る輸送ポリマーに共有結合される薬剤及び高分子を輸送するための特定の方法及び組成物が開示されている。輸送ポリマーは好ましくは、Ｄ−アルギニン及びＬ−アルギニンのすべてＤ型、すべてＬ型又は混合物で構成されるポリアルギニンペプチドである。皮膚、消化管、肺上皮及び脳血管関門を含む上皮組織を横切る薬剤及びそのほかの剤の送達のための特定のポリリジンとポリアルギニンの化合物も記載されている。薬剤の眼内送達のための特定のポリアルギニン化合物及び特定のポリリジンとポリアルギニンの化合物も開示されている。架橋されたカチオン性のポリマー成分と特定の脂質の基づいた製剤を含む特定のシクロデキストランポリマー組成物が開示されている。
【００１０】
生物学的に活性のある分子の細胞内送達への別のアプローチには、リポソーム又はそのほかの粒子形成組成物の使用が含まれる。１９６５年のリポソームの最初の記載以来、薬学上活性のある化合物の送達のための脂質に基づいたキャリア系を開発する領域では持続する関心と尽力が存在し続けた。リポソームは、生体分子を分解から保護する一方で細胞の取り込みを改善するので魅力的な薬剤キャリアである。ポリアニオン（たとえば、ＤＮＡ）を送達するリポソーム製剤の最も一般に使用される部類の１つは、カチオン性脂質を含有するものである。カチオン性脂質のみを用いて又はそのほかの脂質と、たとえば、ホスファチジルエタノールアミンのような両親媒性物質を含めて高分子と共に脂質凝集体を形成することができる。脂質製剤の組成物及びその調製方法の双方が、得られるアニオン性高分子／カチオン性脂質の凝集体の構造と大きさに影響を有することは当該技術で周知である。これらの因子を調節して試験管内及び生体内で特定の細胞種へのポリアニオンの送達を最適化することができる。生物学的に活性のある分子の細胞性の送達にカチオン性脂質を使用することは幾つかの利点を有する。カチオン性脂質を用いたアニオン性化合物の被包は、静電相互作用のために原則的に定量的である。加えて、カチオン性脂質は、細胞膜輸送を開始する負に荷電した細胞膜と相互作用すると考えられている。
【００１１】
実験によって、プラスミドＤＮＡは、二重層脂質小胞の中に被包された単一プラスミドから成る小さな粒子に被包することができることが示された。これらの粒子は通常、融合性の脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベルのカチオン性脂質を含有し、ポリ（エチレングリコ−ル）（ＰＥＧ）のコ−ティングの存在によって水性媒体中で安定化することができる。これらの粒子は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長い血液循環寿命を示すので全身性の適用を有し、そのような領域での高い血管透過性のために種々の組織及び臓器又は腫瘍で優先的に蓄積することができ、エンドソーム膜の崩壊によるエンドサイトーシスのリソソーム経路を免れるように設計することができる。これらの粒子は、実験的応用及び治療応用のために、種々の細胞種に生物学的に活性のある分子を送達するのに有用であり得る。たとえば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス、リボザイム、デコイ、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２−５Ａオリゴヌクレオチド、及びアプタマーのような核酸技法の試験管内及び生体内での効果的な使用は、細胞膜を横切るこれら化合物の効率的な送達から恩恵を受けてもよい。ｓｉＲＮＡと、特定の両親媒性化合物と、特定のポリカチオンから成る特定の組成物が開示されている。特定の脂質に基づいた製剤、特定の脂質を被包した干渉ＲＮＡ製剤、及びポリヌクレオチドの細胞性送達のための特定のポリカチオン性組成物が記載されている。短鎖干渉核酸分子（ｓｉＲＮＡ）及びｓｉＲＮＡ分子の送達のための種々の技法及びそのほかのポリヌクレオチドも記載されている。
【００１２】
加えて、カチオン性脂質粒子を含む最近の研究は、核酸（又はそのほかのポリアニオン性化合物）とカチオン性脂質を含む２つの構造的に異なった複合体の形成を明らかにした。一方の構造は、カチオン性脂質の二重層に挟まれた核酸の単層を持つ多重積層を含む（「積層構造」）。第２の構造は、二次元の六角形柱状相構造を含み（「逆六角形構造」）、その中で核酸分子は、六角形構造の形成においてカチオン性脂質によって濃縮される。著者らはまた、逆六角形構造の方が、積層構造よりも哺乳類細胞に効率的に形質移入することを実証した。さらに、光学顕微鏡による検討によって、積層構造を含む複合体は小胞に融合することなくアニオン性小胞に安定して結合するが、逆六角形構造を含む複合体は、不安定であり、アニオン性小胞に迅速に融合し、融合の際、核酸を放出することが示された。
【００１３】
積層相から逆六角形相の複合体への構造的変換は、逆六角形構造の適合で助力する好適な手助け脂質を組み入れることによって、又はたとえば、ヘキサノ−ルのような補助界面活性剤を使用することによって達成される。しかしながら、これらの変換条件のいずれもが生体系での送達に好適ではない。さらに、逆六角形複合体がさらに大きな形質移入効率を示す一方で、積層複合体に比べて、それは非常に乏しい血清安定性しか有さない。従って、血清安定性である送達剤を設計するニ−ズが依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、生物学的に活性のある分子の全身性送達及び局所性送達の効率を改善する化合物、組成物及び方法を提供する。とりわけ、本発明は、血液循環で安定であり、生物学的に活性のある分子の送達の効率を高める適切な生理的条件下（たとえば、ｐＨ）で構造的変化を受ける送達剤を作製し、使用するための化合物、組成物及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
広い態様では、本発明は、以下に示される式Ｉ〜ＶＩの化合物を包含する。
【００１６】
従って、本発明の態様の１つは、式Ｉ
【化１】
2015147927.tif 000002
の化合物を提供する。
【００１７】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である。
【００１８】
本発明の第２の態様は、式ＩＩ
【化２】
2015147927.tif 000003
の化合物を提供する。
【００１９】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、水素又はポリマー部分である。
【００２０】
本発明の第３の態様は、式（ＩＩＩ）
【化３】
2015147927.tif 000004
の化合物を提供する。
【００２１】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔ１及びＴ２は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、水素又はポリマー部分であり、
Ｔ１及びＴ２の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである。
【００２２】
本発明の第４の態様は、式（ＩＶ）
【化４】
2015147927.tif 000005
の化合物を提供する。
【００２３】
式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇは水素又はポリマー部分である。
【００２４】
本発明の第５の態様は、式（Ｖ）
【化５】
2015147927.tif 000006
の化合物を提供する。
【００２５】
式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔはタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇは結合又はポリマー部分である。
【００２６】
本発明の別の態様は、式（ＶＩ）
【化６】
2015147927.tif 000007
の化合物を提供する。
【００２７】
式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
ＲＮは、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５又はＮ＋Ｒ４Ｒ５Ｒ６を表し、その際、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はＣ１〜Ｃ６アルキル基を表す。
【００２８】
本発明はまた、式Ｉ〜ＶＩの化合物を作製するのに有用である合成中間体も提供する。
【００２９】
本発明の態様の１つは、式Ｉ〜ＶＩの化合物を含む製剤を提供する。本発明の製剤は、式Ｉ〜ＶＩの化合物によって形成されるリポプレックス又はリポソームを含有する。
【００３０】
本発明の態様の１つは、式Ｉ〜ＶＩの化合物と、生物学的に活性のある分子であり得る別の分子を含む製剤を提供する。生物学的に活性のある分子は、（ａ）リボソームＲＮＡ；ＲＮＡ若しくはＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコ−ドするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチドから成る群から選択されてもよく、又は（ｂ）タンパク質、ペプチド、コレステロ−ル、ホルモン、たとえば、抗菌剤、化学療法剤、ビタミン及び補因子のような小分子であってもよい。
【００３１】
関連する態様では、本発明は、式Ｉ〜ＶＩの化合物とアプタマーを含む製剤を提供する。これらの製剤では、アプタマーは化合物に共有結合しない。従って、化合物がタ−ゲティングリガンドＴを含有する場合、得られる製剤は、共有結合したタ−ゲティングリガンドと共有結合しないアプタマーを含んでもよい。これらの製剤では、アプタマー及びタ−ゲティングリガンドは同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３２】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＶＩの化合物によって形成される粒子と、生物学的に活性のある分子であり得る別の分子を含む製剤を提供する。この態様では、本発明は、たとえば、１以上のｓｉＲＮＡ分子を被包するのに有用である安定な粒子を提供する。
【００３３】
本発明の態様の１つは、本発明の製剤に細胞を接触させることを含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法を提供する。
【００３４】
本発明の態様の１つは、標的配列の発現を調節する方法を提供するが、前記方法は、治療上有効な量の本発明の製剤を哺乳類対象に投与することを含む。
【００３５】
本発明の別の態様は、生体内でｓｉＲＮＡを送達する方法を提供するが、前記方法は、治療上有効な量の本発明の製剤を哺乳類対象に投与することを含む。
【００３６】
本発明の別の態様は、生体内でプラスミドＤＮＡを送達する方法を提供するが、前記方法は、治療上有効な量の本発明の製剤を哺乳類対象に投与することを含む。
【００３７】
本発明のさらに別の態様は、哺乳類対象における疾患を治療する又は予防する方法を提供するが、前記方法は、治療上有効な量の本発明の製剤を哺乳類対象に投与することを含む。
【００３８】
驚くべきことに、本発明の化合物、たとえば、ジオレオイルモノアミンを用いて作製される製剤及び送達系は、双方共、転写物に特異的なノックダウンに有効であり、相対的に非毒性であることが発見された。
【００３９】
驚くべきことに、本発明の製剤及び送達系の使用は、肝臓のようなほかの組織に比べて、肺組織による薬剤の優先的な取り込みを生じ、肺における優先的な転写物ノックダウンももたらすことも発見された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】マウスの扁平上皮癌ＶＩＩ（ＳＣＣＶＩＩ）細胞を用いた試験管内の形質移入の後の細胞培養培地におけるＶＥＧＦのタンパク質発現レベルを示すグラフである。ジオレオイルモノアミンにより製剤化されたｓｉＲＮＡによって細胞に形質移入した。
【図２】マウスの扁平上皮癌ＶＩＩ（ＳＣＣＶＩＩ）細胞を用いた試験管内の形質移入の後の細胞培養培地におけるＶＥＧＦのタンパク質発現レベルを示すグラフである。ジオレオイルモノアミン又はメチル−ジオレオイルモノアミンにより製剤化されたｓｉＲＮＡによって細胞に形質移入した。
【図３】ジオレオイルモノアミンによって製剤化されたｓｉＲＮＡの単回ｉｖ注射の後、マウスの肺及び肝臓におけるｓｉＲＮＡ特異的な転写物ノックダウン（カベオリン−１）を示すグラフである。
【図４Ａ】ジオレオイルモノアミンによって製剤化されたＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡのＩＴ注射後のＳＣＣＶＩＩ腫瘍におけるｍＶＥＧＦ転写物のレベルを示すグラフ（図４Ａ）であり、製剤化されたＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡの腫瘍内投与後のマウスにおける腫瘍増殖の阻害を示すグラフ（図４Ｂ）である。
【図４Ｂ】ジオレオイルモノアミンによって製剤化されたＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡのＩＴ注射後のＳＣＣＶＩＩ腫瘍におけるｍＶＥＧＦ転写物のレベルを示すグラフ（図４Ａ）であり、製剤化されたＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡの腫瘍内投与後のマウスにおける腫瘍増殖の阻害を示すグラフ（図４Ｂ）である。
【図５Ａ】マウスの扁平上皮癌ＶＩＩ（ＳＣＣＶＩＩ）細胞を用いた試験管内の形質移入の後の細胞培養培地におけるカベオリン−１（Ｃａｖ−１）の相対的な転写物レベルを示すグラフである。ｓｉＲＮＡとジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの複合体（図５Ａ）又はジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンにより被包されたｓｉＲＮＡ（図５Ｂ）によって細胞に形質移入した。
【図５Ｂ】マウスの扁平上皮癌ＶＩＩ（ＳＣＣＶＩＩ）細胞を用いた試験管内の形質移入の後の細胞培養培地におけるカベオリン−１（Ｃａｖ−１）の相対的な転写物レベルを示すグラフである。ｓｉＲＮＡとジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの複合体（図５Ａ）又はジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンにより被包されたｓｉＲＮＡ（図５Ｂ）によって細胞に形質移入した。
【図６】ジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンにより複合体化されたｓｉＲＮＡの単回ｉｖ注射の後、マウスの肺における用量依存性（１０μｇ〜１００μｇ）のｓｉＲＮＡ特異的な転写物ノックダウンを示すグラフである。
【図７】ＨｅｐＧ２細胞を用いて試験管内の形質移入の後、細胞培養培地におけるβ−アクチンのタンパク質発現レベルを示すグラフである。ジオレオイルモノアミン／ラクトビオニル−ジオレオイルモノアミンにより製剤化されたｓｉＲＮＡによって細胞に形質移入した。
【図８】ＥＤＴＡの存在下及び非存在下におけるジオレオイルモノアミンで複合体化されたＣａｖ−１／ｓｉＲＮＡのアルギン酸ゲルからの制御放出を示すグラフである。
【図９】ジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン、又はＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１）、又はＢＰＥＩによって複合体化されたｓｉＲＮＡの単回ｉｖ注射の後、マウスの肺及び肝臓におけるｓｉＲＮＡ特異的な転写物ノックダウン（Ｃａｖ−１）を示すグラフである。
【図１０】ジオレオイルクロスアミン／前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）タ−ゲティングアプタマーによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の態様の１つは、式Ｉ
【化７】
2015147927.tif 000008
の化合物及び薬学上許容可能なその塩を提供する。
【００４２】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が結合である式Ｉの化合物を提供する。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００４９】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す式Ｉの化合物を提供する。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｉの化合物を提供する。
【００５２】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式Ｉの化合物を提供する。
【００５３】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜２、好ましくは１の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式Ｉの化合物を提供する。
【００５４】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜２、好ましくは１の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式Ｉの化合物を提供する。
【００５５】
本発明の別の態様は、式ＩＩ
【化８】
2015147927.tif 000009
の化合物を提供する。
【００５６】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、水素又はポリマー部分である。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合である式ＩＩの化合物を提供する。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００５９】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６０】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６１】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６３】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す式ＩＩの化合物を提供する。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、Ｇ１及びＧ２の一方がポリマー部分であり、他方が水素である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、Ｇ１及びＧ２の一方が、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である式ＩＩの化合物を提供する。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、ポリマーがポリマー単位間の少なくとも１つのリンカー基を含む式ＩＩの化合物を提供する。
【００６８】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリマー部分がポリオキシアルキレンである式ＩＩの化合物を提供する。
【００６９】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである式ＩＩの化合物を提供する。好ましいポリマーは約１，０００〜５，０００Ｄａに及ぶ分子量を有する。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含む式ＩＩの化合物を提供するが、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化９】
2015147927.tif 000010
である。
【００７１】
式中
2015147927.tif 000011
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、ポリマーがポリオキシエチレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００７３】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシブチレンである式ＩＩの化合物を提供する。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである式ＩＩの化合物を提供する。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩの化合物を提供する。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＩの化合物を提供する。
【００７７】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて同一であり、１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＩの化合物を提供する。
【００７８】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて同一であり、１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式ＩＩの化合物を提供する。
【００７９】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて同一であり、１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式ＩＩの化合物を提供する。
【００８０】
本発明の別の態様は、式ＩＩＩ
【化１０】
2015147927.tif 000012
の化合物を提供する。
【００８１】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔ１及びＴ２は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、水素又はポリマー部分であり、
Ｔ１及びＴ２の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８３】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８５】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８６】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８７】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００８９】
一実施形態では、本発明は、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９０】
一実施形態では、本発明は、Ｇ１及びＧ２の一方がポリマー部分であり、他方が水素である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９１】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｇ１及びＧ２の一方が、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、ポリマーがポリマー単位間の少なくとも１つのリンカー基を含む式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９３】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリマー部分がポリオキシアルキレンである式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９４】
一実施形態では、本発明は、ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである式ＩＩＩの化合物を提供する。好ましいポリマーは約１，０００〜５，０００Ｄａに及ぶ分子量を有する。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含む式ＩＩの化合物を提供するが、式中、Ｒ３は上記で定義されたとおり、及び
【化１１】
2015147927.tif 000013
である。
【００９６】
式中
2015147927.tif 000014
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、ポリマーがポリオキシエチレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９８】
別の実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシブチレンである式ＩＩＩの化合物を提供する。
【００９９】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが薬学上活性のある小分子、エンドソーム溶解剤、融合性ペプチド、細胞膜透過剤、電荷遮蔽剤、核酸、又は細胞受容体リガンドである式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１００】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが、増殖抑制活性を有するが薬学上活性のある小分子である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが増殖抑制活性を有するが薬学上活性のある小分子である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０２】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが葉酸基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０３】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが葉酸基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０４】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが融合性ペプチドである式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０５】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが融合性ペプチドである式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが、ビオチン、ガラクトース、アセチルサリチル酸、ナプロキセン、及び細胞受容体リガンドから成る群から選択される式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０７】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが、ビオチン、ガラクトース、アセチルサリチル酸、ナプロキセン、及び細胞受容体リガンドから成る群から選択される式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’の双方が結合であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’の双方が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が１であり、Ｘ及びＸ’の双方が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が１であり、Ｘ及びＸ’の双方が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式ＩＩＩの化合物を提供する。
【０１１３】
本発明の態様の１つは、式ＩＶ
【化１２】
2015147927.tif 000015
の化合物及び薬学上許容可能なその塩を提供し、式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇは水素又はポリマー部分である。
【０１１４】
一実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が結合である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１１７】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１１９】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明は、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２２】
一実施形態では、本発明は、Ｘが酸素である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２３】
一実施形態では、本発明は、Ｘが窒素である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、Ｇが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明は、ポリマーがポリマー単位間の少なくとも１つのリンカー基を含む式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリマー部分がポリオキシアルキレンである式ＩＶの化合物を提供する。
【０１２７】
さらに別の実施形態では、ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである式ＩＶの化合物を提供する。好ましいポリマーは約１，０００〜５，０００Ｄａに及ぶ分子量を有する。
【０１２８】
一実施形態では、本発明は、ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含む式ＩＶの化合物を提供するが、式中、Ｒ３は上記で定義されたとおり、及び
【化１３】
2015147927.tif 000016
である。
【０１２９】
式中
2015147927.tif 000017
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【０１３０】
一実施形態では、本発明は、ポリマーがポリオキシエチレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシブチレンである式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３２】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３７】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式ＩＶの化合物を提供する。
【０１３８】
本発明の別の態様は、式Ｖ
【化１４】
2015147927.tif 000018
の化合物を提供する。
【０１３９】
式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔはタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇは結合又はポリマー部分である。
【０１４０】
一実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３がすべて１であり、Ｘ及びＸ’の双方が結合である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４１】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４３】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４４】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４５】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４７】
一実施形態では、本発明は、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す式Ｖの化合物を提供する。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明は、Ｇがポリマー部分である式Ｖの化合物を提供する。
【０１４９】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｇが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である式Ｖの化合物を提供する。
【０１５０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリマーがポリマー単位間の少なくとも１つのリンカー基を含む式Ｖの化合物を提供する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明は、本発明は、ポリマー部分がポリオキシアルキレンである式Ｖの化合物を提供する。
【０１５２】
別の実施形態では、ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである式ＩＶの化合物を提供する。ポリマーの好ましい分子量は約１，０００〜５，０００Ｄａである。
【０１５３】
一実施形態では、本発明は、ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含む式Ｖの化合物を提供するが、式中、Ｒ３は上記で定義されたとおり、及び
【化１５】
2015147927.tif 000019
である。
【０１５４】
式中
2015147927.tif 000020
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明は、ポリマーがポリオキシエチレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１５６】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖若しくは分枝鎖のポリオキシブチレンである式Ｖの化合物を提供する。
【０１５７】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが薬学上活性のある小分子、エンドソーム溶解剤、融合性ペプチド、細胞膜透過剤、電荷遮蔽剤、又は核酸である式Ｖの化合物を提供する。
【０１５８】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが、増殖抑制活性を有するが薬学上活性のある小分子である式Ｖの化合物を提供する。
【０１５９】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが増殖抑制活性を有するが薬学上活性のある小分子である式Ｖの化合物を提供する。
【０１６０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが葉酸基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１６１】
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが葉酸基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが融合性ペプチドである式Ｖの化合物を提供する。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが融合性ペプチドである式Ｖの化合物を提供する。
【０１６４】
一実施形態では、本発明は、ターゲティングリガンドが、ビオチン、ガラクトース、アセチルサリチル酸、及びナプロキセンから成る群から選択される式Ｖの化合物を提供する。
【０１６５】
一実施形態では、本発明は、ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが、ビオチン、ガラクトース、アセチルサリチル酸、及びナプロキセンから成る群から選択される式Ｖの化合物を提供する。
【０１６６】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１６７】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式Ｖの化合物を提供する。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式Ｖの化合物を提供する。
【０１６９】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式Ｖの化合物を提供する。
【０１７０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式Ｖの化合物を提供する。
【０１７１】
本発明の別の態様は、式ＶＩ
【化１６】
2015147927.tif 000021
の化合物を提供する。
【０１７２】
式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
ＲＮは、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５又はＮ＋Ｒ４Ｒ５Ｒ６を表し、その際、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は独立してＣ１〜Ｃ６アルキル基を表す。
【０１７３】
一実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３がすべて１であり、Ｘ及びＸ’の双方が結合である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１７４】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１７６】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１７７】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１７８】
一実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する
【０１７９】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｒ１及びＲ２が独立して、二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８０】
一実施形態では、本発明は、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮがＮＨＲ４を表し、Ｒ４がＣ１〜Ｃ２アルキル基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８２】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮがＮＲ４Ｒ５を表し、Ｒ４及びＲ５が独立してＣ１〜Ｃ２アルキル基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８３】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮがＮ＋Ｒ４Ｒ５Ｒ６を表し、Ｒ４Ｒ５及びＲ６が独立してＣ１〜Ｃ２アルキル基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８４】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８５】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２の双方が、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８６】
別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８７】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が同一であり、１又は２であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、１又は２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８８】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１８９】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表し、ＲＮがＮ＋Ｒ４Ｒ５Ｒ６を表し、Ｒ４Ｒ５及びＲ６が独立してＣ１〜Ｃ６アルキル基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１９０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｎ１、ｎ２、及びｎ３が１であり、Ｘ及びＸ’が結合であり、Ｒ１及びＲ２が同一であり、二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基を表し、ＲＮがＮ＋Ｒ４Ｒ５Ｒ６を表し、Ｒ４，Ｒ５及びＲ６が独立してＣ１〜Ｃ２アルキル基を表す式ＶＩの化合物を提供する。
【０１９１】
Ｘ及びＸ’の双方が結合を表す式Ｉ〜ＶＩの化合物の別の実施形態では、好適なＣ（Ｏ）ＸＲ１及びＣ（Ｏ）Ｘ’Ｒ２の部分には、１０〜２２の炭素原子、好ましくは１２〜２０の炭素原子、さらに好ましくは１４〜１８の炭素原子を有する飽和、一飽和及び多飽和の脂肪酸に由来する基が挙げられる。代表的なＣ（Ｏ）ＸＲ１及びＣ（Ｏ）Ｘ’Ｒ２の部分には、たとえば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、イソステアリン酸、エライジン酸、ペトロセリン酸、エレオステアリン酸、又はラウロレイン酸に由来するようなものが挙げられる。
【０１９２】
Ｘ及びＸ’の双方が窒素又は酸素を表す式Ｉ〜ＶＩの化合物の別の実施形態では、好適なＲ１及びＲ２の部分には、１０〜２２の炭素原子、好ましくは１２〜２０の炭素原子、さらに好ましくは１４〜１８の炭素原子を有する飽和、一飽和及び多飽和の脂肪酸に由来する基が挙げられる。代表的なＲ１及びＲ２の部分には、たとえば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸、イソステアリン酸、エライジン酸、ペトロセリン酸、エレオステアリン酸、又はラウロレイン酸に由来するようなものが挙げられる。
【０１９３】
本発明の態様の１つは、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物を含む製剤を提供する。
【０１９４】
本発明の態様の１つは、式Ｉ〜ＶＩの化合物と、生物学的に活性のある分子であり得る別の分子を含む製剤を提供するが、該分子は、リボソームＲＮＡ；ＲＮＡ若しくはＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコ−ドするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチドから成る群から選択される。
【０１９５】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物と生物学的に活性のある分子によって形成される粒子を含む製剤を提供する。
【０１９６】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物と生物学的に活性のある分子を含む製剤を提供し、生物学的に活性のある分子と化合物はリポプレックスを形成する。
【０１９７】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物と生物学的に活性のある分子を含む製剤を提供し、生物学的に活性のある分子は少なくとも部分的に、化合物によって形成されるリポソームの中にある。
【０１９８】
本発明の別の態様は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物と生物学的に活性のある分子を含む製剤を提供し、生物学的に活性のある分子はリポソームの中に被包される。
【０１９９】
一実施形態では、本発明は、粒子が約５００ｎｍ未満の直径中央値を有する製剤を提供する。
【０２００】
本発明の態様の１つは、本発明の製剤を細胞に接触させることを含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法を提供し、製剤は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物とｓｉＲＮＡを含む。
【０２０１】
本発明の別の態様は、本発明の製剤を細胞に接触させることを含む、合成ｓｈＲＮＡを細胞に導入する方法を提供し、製剤は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物とｓｈＲＮＡを含む。
【０２０２】
本発明のさらに別の態様は、本発明の製剤を細胞に接触させることを含む、ｍｉＲＮＡを細胞に導入する方法を提供し、製剤は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物とｍｉＲＮＡを含む。
【０２０３】
本発明の別の態様は、本発明の製剤を細胞に接触させることを含む、アンチセンス核酸を細胞に導入する方法を提供し、製剤は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物とアンチセンス核酸を含む。
【０２０４】
本発明の態様の１つは、標的配列の発現を調節する方法を提供し、前記方法は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物と生物学的に活性のある分子を含む、治療上有効な量の製剤を哺乳類対象に投与することを含む。
【０２０５】
本発明の別の態様は、ｓｉＲＮＡを生体内で送達する方法を提供し、前記方法は、治療上有効な量の本発明の製剤を哺乳類対象に投与することを含む。
【０２０６】
本発明の別の態様は、哺乳類対象における疾患を治療する又は予防する方法を提供し、前記方法は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物と生物学的に活性のある分子を含む、治療上有効な量の製剤を前記対象に投与することを含む。
【０２０７】
本発明の別の態様は、遺伝子の発現を阻害することが可能である生物学的に活性のある分子と式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物を含む製剤に細胞を接触させることを含む、遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。一実施形態では、細胞は哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。さらに、これらの方法は、生体内又は試験管内で実施されてもよい。一実施形態では、生物学的に活性のある分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボゾームＲＮＡ、ＲＮＡ若しくはＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドから成る群から選択される。そのような製剤はまた、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、又は抗体のようなタンパク質も含んでもよい。
【０２０８】
本発明の別の態様では、遺伝子発現の阻害に関与するもの以外に治療で使用するために、遺伝子発現を阻害しない生物学的に活性のある分子、たとえば、種々の小分子の医薬化合物を本発明の化合物と共に製剤に含有することができる。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）式Ｉ〜ＶＩのいずれかの１以上の化合物と（ｉｉ）１以上の生物学的に活性のある分子の製剤を含有する埋め込み可能な又は注入可能な用具を提供する。これらの用具では、製剤は、用具の中に捕捉される又は被包され、製剤に加えて用具は、生分解性及び／又は生体適合性の薬剤放出物質を含む。用具は、対象、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒト対象の体内に注入する又は埋め込むのに好適な大きさ及び形状である。
【０２１０】
上記で言及したように、本発明の特定の化合物は、ポリマー部分、Ｇ、Ｇ１又はＧ２を含む。これらのポリマー基は、約２００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａに及ぶ分子量を有する。
【０２１１】
ポリマー部分は、好ましくはポリオキシアルキレンであり、又は２以上のポリオキシアルキレンの基若しくは単位を含む。ポリオキシアルキレン基は、酸化アルキレンモノマーを重合し、所望の大きさと重量のポリマー部分を提供することによって形成される。ポリマー部分が２以上のポリオキシアルキレン基を含む場合、個々のポリオキシアルキレン基はリンカー基によって互いに連結される。好適なリンカーの例は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−であり、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化１７】
2015147927.tif 000022
である。
【０２１２】
式中
2015147927.tif 000023
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【０２１３】
好ましいリンカー基は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−であり、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【０２１４】
たとえば、アミド基によって連結された独立した単位からＧ、Ｇ１又はＧ２が形成される場合、単位はさらに短い鎖のポリマーから選択されてもよく、又は広い範囲の大きさと分子量を有する単位であってもよい。上記で言及したように、ポリマーＧ、Ｇ１及びＧ２は約２００〜１０，０００Ｄａの分子量を有してもよく；これらのポリマーのいずれかが幾つかのさらに短い独立した大きさの単位から形成されてもよい。単位は、独立して約５０（すなわち、ポリエチレングリコールの１反復単位）、２００、又は５００Ｄａ、約３０００、４０００又は５０００Ｄａに及ぶ分子量を有してもよい。
【０２１５】
従って、化合物が、約３０００Ｄａの分子量を有するポリマー部分Ｇ、Ｇ１又はＧ２を含む場合、ポリマーは、たとえば、
（ａ）約３０００Ｄａの分子量を有するポリオキシエチレン基であってもよく；
（ｂ）３つのアミドリンカー（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）によって互いに共有結合した４つのポリオキシエチレンから成ってもよく、各ポリオキシエチレン基はポリマー部分が約３０００Ｄａの分子量を有するように約７５０Ｄａの分子量を有する；又は
（ｃ）４つのアミドリンカー（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）によって互いに共有結合した５つのポリオキシエチレンから成ってもよく、５つのポリオキシエチレン基は、それぞれ、約５００、１０００、２５０、１０００、及び２５０Ｄａの分子量を有する。
【０２１６】
これらのポリマー部分は例としてのみ含められ；当業者は、本発明の化合物で好適に用いることができるほかのポリマー部分を認識するであろう。
【０２１７】
本発明のポリマー部分を作製するのに有用な試薬の非限定例には以下が挙げられる。
【表１】
2015147927.tif 000024
式中、ｐｐ及びアルキレンは本明細書で定義されるとおりであり、Ｒｂｂは好ましくは、アルキル及び置換アルキルから成る群から選択される。
【０２１８】
そのような試薬の具体例には、以下が挙げられる：
【化１８】
2015147927.tif 000025
【０２１９】
一部の実施形態では、粒子は、第１のリザーバに水溶液を、第２のリザーバに有機液溶液（すなわち、本発明の化合物の水溶液）を提供し、リポソームの被包、たとえば、干渉ＲＮＡを実質的に即時に生成するように水溶液と有機液溶液を混合することによって作製される。一部の実施形態では、粒子は、界面活性剤系の方式又は有機溶媒系の方式のいずれかで疎水性の中間体複合体を形成し、その後、界面活性剤又は有機溶媒を取り除くことによって作製される。好ましい実施形態は、電荷中和型である。
【０２２０】
一実施形態では、干渉ＲＮＡはプラスミドから転写され、プラスミドは、界面活性剤溶液におけるカチオン性脂質と組み合わせて被覆された核酸−脂質の複合体を提供する。次いで複合体は、非カチオン性脂質と接触して、界面活性剤と、核酸−脂質複合体と非カチオン性脂質の溶液を提供し、その後界面活性剤が取り除かれて血清安定性の核酸−脂質粒子の溶液を提供し、その際、干渉ＲＮＡ鋳型を含むプラスミドは脂質二重層に被包される。こうして形成された粒子は約５０〜５００ｎｍの大きさを有する。
【０２２１】
別の実施形態では、安定な脂質粒子は、有機溶媒にてカチオン性脂質と非カチオン性脂質の混合物を調製し；たとえば、干渉ＲＮＡを含む核酸の水溶液をカチオン性脂質と非カチオン性脂質の混合物に接触させて透明な単一相を提供し；有機溶媒を取り除いて核酸−脂質の粒子の懸濁液を提供することによって形成され、その際、核酸は脂質二重層に被包され、粒子は血清中で安定であり、約５０〜５００ｎｍの大きさを有する。
【０２２２】
本発明の粒子と複合体、たとえば、所望の大きさ及び／又は電荷を有するｓｉＲＮＡとの式Ｉ〜ＶＩのいずれかの化合物の複合体は、上記で調製した混合物を好適なフィルターに通すことによって得ることができる。以下の実施例３２及び３３を参照のこと。
【０２２３】
本発明の脂質粒子は、ｓｉＲＮＡ配列を含む核酸の治療用送達に有用である。特に、標的核酸配列の翻訳を下方調節する又はサイレンシングすることによる哺乳類における疾患を治療する試験管内及び生体内の方法を提供することが本発明の目的である。これらの方法では、ｓｉＲＮＡ分子が核酸−脂質の粒子に製剤化され、粒子は、そのような治療を必要とする患者（たとえば、標的核酸配列を含む遺伝子の発現又は過剰発現に関連する疾患又は障害と診断された患者）に投与される。或いは、細胞が患者から取り出され、試験管内でｓｉＲＮＡが送達され、細胞が患者に再注入される。一実施形態では、本発明は、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、凝集を阻害する抱合された脂質と、ｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質の粒子に細胞を接触させることによってｓｉＲＮＡ分子を細胞に導入する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、カチオン性脂質と、凝集を阻害する抱合された脂質と、ｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質の粒子に細胞を接触させることによってｓｉＲＮＡ分子を細胞に導入する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、カチオン性脂質とｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質の粒子に細胞を接触させることによってｓｉＲＮＡ分子を細胞に導入する方法を提供する。
【０２２４】
脂質粒子をたとえば、静脈内に又は腹腔内に投与してもよい。一実施形態では、注射後約１、６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４又は９６時間の血漿に、核酸−脂質の粒子の総投与量の少なくとも約１０％が存在する。ほかの実施形態では、注射後約１、６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４又は９６時間の血漿に、核酸−脂質の粒子の総注射量の２０％、３０％、４０％を超える、及び６０％、７０％又は８０％ほどが存在する。一実施形態では、標的組織（すなわち、肺、肝臓、腫瘍、血管内皮、又は炎症部位）の細胞におけるｓｉＲＮＡの存在は、投与後２４、４８、７２及び９６時間に検出可能である。一実施形態では、標的配列の発現の下方調節は、投与後２４、４８、７２及び９６時間に検出可能である。一実施形態では、標的配列の発現の下方調節は、腫瘍細胞又は炎症部位の細胞又は病気の組織で優先的に生じる。一実施形態では、投与部位から離れた細胞におけるｓｉＲＮＡの存在は、核酸−脂質の粒子の静脈内注射後、少なくとも４日で検出可能である。別の実施形態では、標的組織（すなわち、肺、肝臓、腫瘍、血管内皮、又は炎症部位）の細胞におけるｓｉＲＮＡの存在は、核酸−脂質の粒子の注射後、少なくとも４日で検出可能である。
【０２２５】
粒子は、血液循環にて安定であり、血管外部位及び標的細胞集団にアクセスする薬物動態挙動に必要とされる大きさなので、静脈内の核酸の移行に使用するのに好適である。本発明はまた、脂質粒子を含む薬学上許容可能な組成物も提供する。
【０２２６】
粒子は、血液循環にて安定であり、血管外部位及び標的細胞集団にアクセスする薬物動態挙動に必要とされる大きさなので、静脈内の核酸の移行に使用するのに好適である。
【０２２７】
本明細書で記載される安定な核酸−脂質の粒子は通常、核酸（たとえば、ｓｉＲＮＡ配列又はｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列）と、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、たとえば、脂質粒子の凝集を抑制する抱合脂質のような二重層の安定化成分を含む。本発明の脂質粒子は、約５００ｎｍ未満の平均直径を有し、実質的に非毒性である。さらに、本発明の脂質粒子に被包される核酸は水溶液においてヌクレアーゼによる分解に耐性である。
【０２２８】
核酸−脂質の粒子の核酸成分は通常、たとえば、１以上の単離された小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二本鎖、さらに長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はＤＮＡプラスミドにおける転写カセットから転写されるｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡとして含む幾つかの形態にて提供され得る干渉ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）を含む。
【０２２９】
ＲＮＡ集団を用いて長い前駆体ＲＮＡを提供することができ、又は選択された標的配列に実質的な又は完全な同一性を有する長い前駆体ＲＮＡを用いてｓｉＲＮＡを作製することができる。当業者に周知の方法に従って、ＲＮＡを細胞又は組織から単離し、合成し、及び／又はクローニングすることができる。ＲＮＡは、混合集団（細胞又は組織から得られる、ｃＤＮＡから転写される、差し引きされる、選択される、など）であることができ、又は単一の標的配列を提示することができる。ＲＮＡは、天然に存在することができ、たとえば、細胞試料から単離することができ、たとえば、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼ及びＰＣＲ産物又はクローニングされたｃＤＮＡを用いて試験管内で合成することができ、又は化学的に合成することができる。
【０２３０】
合成ＲＮＡのために長鎖ｄｓＲＮＡを形成するには、試験管内で相補体を転写し、ハイブリッド形成してｄｓＲＮＡを形成する。天然に存在するＲＮＡ集団を使用するのであれば、ＲＮＡ集団に相当するｃＤＮＡを転写することによって、又はＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡ相補体も提供される（たとえば、大腸菌のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ又はダイサーによる消化のためにｄｓＲＮＡを形成すること）。次いで前駆体ＲＮＡをハイブリッド形成させて消化のための二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡを核酸−脂質の粒子で直接被包することができ、又は被包に先立って試験管内で消化することができる。
【０２３１】
或いは、１以上のｓｉＲＮＡ鋳型をコードする１以上のＤＮＡプラスミドを核酸−脂質の粒子に被包する。ｓｉＲＮＡは、たとえば、小型核ＲＮＡＵ６又はヒトＲＮＡ分解酵素ＰＲＮＡＨ１のための天然に存在する転写単位に基づいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写単位を有するプラスミドにおいてＤＮＡ鋳型からヘアピンループを持つ二本鎖に自動的に折り畳む配列として転写され得る（Brummelkamp, et al., Science 296:550 (2002); Donze, et al., Nucleic Acids Res. 30:e46 (2002); Paddison, et al., Genes Dev. 16:948 (2002); Yu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:6047 (2002); Lee, et al., Nat. Biotech. 20:500 (2002); Miyagishi, et al., Nat. Biotech. 20:497 (2002); Paul, et al., Nat. Biotech. 20:505 (2002); and Sui, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:5515 (2002)）。通常、転写単位又は転写カセットは、所望のｓｉＲＮＡ配列と、２〜３のウリジン残基及びポリチミジン（Ｔ５）配列（ポリアデニル化シグナル）で構成される停止配列の転写のための鋳型に操作可能に連結された、たとえば、Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモータのようなＲＮＡ転写物プロモータ配列を含有する（Brummelkamp, Science,上記）。選択されたプロモータは、保存的な又は誘導可能な転写を提供する。ＲＮＡ干渉分子のＤＮＡ指向転写のための組成物及び方法は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，５７３，０９９号に詳細に記載されている。好ましくは、合成された又は転写されたｓｉＲＮＡは、約１〜４のヌクレオチド、好ましくは約２〜３のヌクレオチドの３’オーバーハングと５’リン酸末端を有する（Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001); Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001)）。転写単位は、それから干渉ＲＮＡが転写されるプラスミド又はＤＮＡベクターに組み入れられる。治療目的での遺伝物質の生体内送達に好適なプラスミドは、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，９６２，４２８号及び同第５，９１０，４８８号に詳細に記載されている。選択されたプラスミドは、標的細胞の一時的な又は安定な送達を提供する。所望の遺伝子配列を発現するように設計されたプラスミドは、ｓｉＲＮＡの転写のための転写単位カセットを含有するように修飾され得ることは当業者に明らかであろう。
【０２３２】
ＲＮＡを単離する、ＲＮＡを合成する、核酸をハイブリッド形成させる、ｃＤＮＡライブラリを作製してスクリーニングする、及びＰＣＲを行う方法は、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)を参照）のように、当該技術で周知である（たとえば、Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al.,上記を参照）。発現ライブラリも当業者に周知である。本発明における使用の一般的方法を開示している追加の基礎的テキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４））が挙げられる。
【０２３３】
一般に、核酸−脂質の粒子を送達して当該遺伝子産物の転写（すなわち、発現）を下方調節する又はサイレンシングすることが望ましい。遺伝子産物の好適な部類には、ウイルス感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性の疾患及び障害（たとえば、肝臓が標的である疾患、及び肝臓の疾患及び障害）に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞の形質転換に関連する遺伝子、血管形成遺伝子、たとえば、炎症及び自己免疫応答に関連するもののような免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、及び神経変性障害に関連する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
ウイルス感染及び生存に関連する遺伝子には、細胞において結合する、侵入する及び複製するためにウイルスによって発現されるものが挙げられる。特に関心があるのは慢性のウイルス性疾患に関連するウイルス配列である。特に関心があるウイルス配列には、肝炎ウイルスの配列（Hamasaki, et al., FEBS Lett. 543:51 (2003); Yokota, et al., EMBO Rep. 4:602 (2003); Schlomai, et al., Hepatology 37:764 (2003); Wilson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2783 (2003); Kapadia, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2014 (2003); and FIELDS VIROLOGY (Knipe et al. eds. 2001)）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Banerjea, et al., Mol. Ther. 8:62 (2003); Song, et al., J. Virol. 77:7174 (2003); Stephenson JAMA 289:1494 (2003); Qin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:183 (2003)）、ヘルペスウイルス（Jia, et al., J. Virol. 77:3301 (2003))及びヒトのパピローマウイルス（ＨＰＶ） (Hall, et al., J. Virol. 77:6066 (2003); Jiang, et al., Oncogene 21:6041 (2002)）が挙げられる。サイレンシングされ得る、例となる肝炎ウイルスの核酸配列には、転写及び翻訳に関与する核酸配列（たとえば、Ｅｎ１、Ｅｎ２、Ｘ、Ｐ）、構造タンパク質をコードする核酸配列（たとえば、Ｃタンパク質及びＣ関連タンパク質を含むコアタンパク質；Ｓ、Ｍ、Ｌタンパク質又はその断片を含むカプシド及びエンベロープタンパク質）（FIELDS VIROLOGY, 2001,上記参照）が挙げられるが、これらに限定されない。サイレンシングされ得る、例となるＣ型肝炎ウイルスの核酸配列には、セリンプロテアーゼ（たとえば、ＮＳ３／ＮＳ４）、ヘリカーゼ（たとえば、ＮＳ３）、ポリメラーゼ（たとえば、ＮＳ５Ｂ）、及びエンベロープタンパク質（たとえば、Ｅ１、Ｅ２及びｐ７）が挙げられるが、これらに限定されない。Ａ型肝炎ウイルスの核酸配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４８９で言及され、Ｂ型肝炎ウイルスの核酸配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００３９７７で言及され、Ｃ型肝炎ウイルスの核酸配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００４１０２で言及され、Ｄ型肝炎ウイルスの核酸配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１６５３で言及され、Ｅ型肝炎ウイルスの核酸配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４３４で言及され、Ｇ型肝炎ウイルスの核酸配列は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１７１０で言及されている。ウイルス感染及び生存に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングを、従来の剤と併用して好都合に使用してウイルスの状態を治療することができる。
【０２３５】
代謝性の疾患及び障害（たとえば、肝臓が標的である疾患、及び肝臓の疾患及び障害）に関連する遺伝子には、たとえば、脂質異常症（たとえば、肝臓Ｘ受容体（たとえば、ＬＸＲα及びＬＸＲβ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００７１２１）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００５１２３）、ステロール調節要素結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、Ｓｉｔｅ−１プロテアーゼ（ＳＩＰ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素（ＨＭＧ−補酵素Ａ還元酵素）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＢ）、及びアポリポタンパク質（ＡｐｏＥ、及び糖尿病（たとえば、グルコース−６−リン酸）において発現される遺伝子が挙げられる（たとえば、Forman et al., Cell 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol. 9:72 (1995), Zavacki et al., PNAS USA 94:7909 (1997); Sakai, et al., Cell 85:1037-1046 (1996); Duncan, et al., J. Biol. Chem. 272:12778-12785 (1997); Willy, et al., Genes Dev. 9(9):1033-45 (1995); Lehmann, et al., J. Biol. Chem. 272(6):3137-3140 (1997); Janowski, et al., Nature 383:728-731 (1996); Peet, et al., Cell 93:693-704 (1998)を参照）。当業者は、代謝性の疾患及び障害（たとえば、肝臓が標的である疾患、及び肝臓の疾患及び障害）に関連する遺伝子には、肝臓自体で発現される遺伝子と共にそのほかの臓器及び組織で発現される遺伝子が含まれることを十分に理解するであろう。代謝性の疾患及び障害に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングを、従来の剤の投与と併用して好都合に使用して疾患又は障害を治療することができる。
【０２３６】
腫瘍形成及び細胞の形質転換に関連する遺伝子配列の例には、ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ−ＡＢＬのような転座配列（Wilda, et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr, et al., Blood 101: 1566）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、ＢＣＬ−２、ＡＭＬ１−ＥＴＯ及びＡＭＬ１−ＭＴＧ８（Heidenreich, et al., Blood 101:3157 (2003)）、多剤耐性遺伝子のような過剰発現配列（Nieth, et al., FEBS Lett. 545:144 (2003); Wu, et al, Cancer Res. 63:1515 (2003))、サイクリン(Li, et al., Cancer Res. 63:3593 (2003); Zou, et al., Genes Dev. 16:2923 (2002))、β−カテニン(Verma, et al., Clin Cancer Res. 9:1291 (2003)）、テロメラーゼ遺伝子（Kosciolek, et al., Mol Cancer Ther. 2:209 (2003)）、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＢＣＬ−２、ＥＲＢＢ１及びＥＲＢＢ２（Nagy, et al. Exp. Cell Res. 285:39 (2003)）、並びにＲＡＳのような変異配列（Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)にて概説）が挙げられる。ＤＮＡ修復酵素をコードする配列のサイレンシングによって、化学療法剤の投与との併用での使用が見つかる（Collis, et al., Cancer Res. 63:1550 (2003)）。腫瘍の移動に関連するタンパク質をコードする遺伝子も、当該標的配列であり、たとえば、インテグリン、セレクチン及びメタロプロテイナーゼである。前述の例は、排他的ではない。腫瘍形成又は細胞の形質転換、腫瘍増殖又は腫瘍の移動を助長する又は促進する遺伝子配列の全部又は一部が鋳型配列として含まれ得る。
【０２３７】
血管形成遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。特に関心があるのは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である（Reich, et al., Mol. Vis. 9:210 (2003)）。
【０２３８】
免疫調節遺伝子は、１以上の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例には、増殖因子のようなサイトカイン（たとえば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦなど）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２（Hill, et al., J. Immunol. 171:691 (2003)）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０など）、インターフェロン（たとえば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなど）及びＴＮＦが挙げられる。Ｆａｓ及びＦａｓリガンドも関心のある免疫調節剤標的配列である（Song, et al., Nat. Med. 9:347 (2003)）。造血系及びリンパ系の細胞における二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子も本発明に含まれ、たとえば、ＢｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼのようなＴｅｃファミリーキナーゼである（Heinonen, et al., FEBS Lett. 527:274 (2002)）。
【０２３９】
本発明の細胞の受容体リガンドは、タンパク質分子又はステロイド分子である。細胞の受容体リガンドには、細胞表面の受容体（たとえば、インスリン受容体、ＥＰＯ受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ活性を持つ受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体など）に結合して受容体が関与する生理的経路を調節する（たとえば、阻害する、活性化するなど）（たとえば、グルコースレベルの調節、血球の発生、有糸分裂誘発など）ことができるリガンドが挙げられる。細胞表面受容体のリガンドの例には、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリン、グルカゴン、Ｇ−タンパク質共役受容体リガンドなどが挙げられる。トリヌクレオチド反復（たとえば、ＣＡＧ反復）の拡大をコードする鋳型によって、球脊髄性筋萎縮症及びハンチントン病のようなトリヌクレオチド反復の拡大が原因で起きる神経変性障害におけるサイレンシング病理配列での使用が見つかる（Caplen, et al., Hum. Mol. Genet. 11:175 (2002)）。細胞受容体のリガンドには、細胞表面の受容体ではなく細胞内の受容体（たとえば、核におけるステロイド受容体、小胞体に局在する細胞質のイノシトールリン酸受容体）に結合するリガンドも含まれる。細胞内受容体のリガンドの例には、親油性ホルモン様ステロイドホルモン、イノシトール三リン酸、及びイントラクリンペプチドホルモンが挙げられる。
定義
【０２４０】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、１〜１０の炭素原子を含有するアルキル基を含む。アルキル基は直鎖であっても分枝鎖であってもよい。「アルキル」の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ−、ｓｅｃ−及びｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、３−メチルヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、３−エチルブチルなどが挙げられる。好ましいアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。本発明のアルキル基は、本明細書で提供されるような種々の基によって任意で置換されてもよい。従って、置換に利用できる任意の炭素原子は、種々の置換基、たとえば、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル，Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ９へテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、Ｃ１〜Ｃ８アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、オキソ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、モノ及びジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ１〜Ｃ８アシルオキシ、Ｃ１〜Ｃ８スルホニル、Ｃ１〜Ｃ８チオ、Ｃ１〜Ｃ８スルホンアミド及びＣ１〜Ｃ８アミノスルホニルにさらに結合してもよい。
【０２４１】
用語「アルキレン」は、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の炭素原子を有し、直鎖又は分枝鎖のいずれかである二価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、たとえば、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピレン（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−）などによって例示される。
【０２４２】
用語「アルキレンオキシ」は、酸素に結合した二価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指し、脂肪族ヒドロカルビル基は好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の炭素原子を有し、直鎖又は分枝鎖のいずれかである。
【０２４３】
用語「アリール」は、少なくとも１つの芳香族環を含有する芳香族炭化水素環系を指す。芳香族環はそのほかの芳香族炭化水素環又は非芳香族炭化水素環に任意で縮合されてもよく、さもなければ、連結されてもよい。アリール基の例には、たとえば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、インデニル、２，３−ジヒドロインデニル及びビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例には、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、及び２，３−ジヒドロインデニルが挙げられる。さらに好ましいアリール基は、フェニル及びナフチルである。本発明のアリール基は本明細書で提供されるような種々の基によって任意で置換されてもよい。従って、アリール環系の中に存在し、置換に利用できる任意の炭素原子は、種々の環置換基、たとえば、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル，Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ９へテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、Ｃ１〜Ｃ８アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、オキソ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、モノ及びジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ１〜Ｃ８アシルオキシ、Ｃ１〜Ｃ８スルホニル、Ｃ１〜Ｃ８チオ、Ｃ１〜Ｃ８スルホンアミド及びＣ１〜Ｃ８アミノスルホニルにさらに結合してもよい。
【０２４４】
用語「シクロアルキル」は、Ｃ３〜Ｃ８環状炭化水素を指す。シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられる。さらに好ましいのはＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基である。本発明のシクロアルキル基は、本明細書で提供されるような種々の基によって任意で置換されてもよい。従って、シクロアルキル環系の中に存在し、置換に利用できる任意の炭素原子は、種々の環置換基、たとえば、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル，Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ９へテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、Ｃ１〜Ｃ８アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、オキソ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、モノ及びジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルにさらに結合してもよい。
【０２４５】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、窒素、酸素及びイオウから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する環又は環系を指し、その際、前記へテロ原子は、非芳香族環にあり、環系は非芳香族環の環員（の１つ）によって親基に連結される。ヘテロシクロアルキル環は任意で、ほかのヘテロシクロアルキル環及び／又は非芳香族環及び／又はフェニル環に縮合される。従って、本発明に好適なヘテロシクロアルキル基は少なくとも３つの環員を有し、２０までの環員を有してもよい。好ましいヘテロシクロアルキル基は３〜１０の環員を有する。特定のさらに好ましいヘテロシクロアルキル基は８〜１０の環員を有する。そのほかのさらに好ましいヘテロシクロアルキル基は５又は６の環員を有する。ヘテロシクロアルキル基の例には、たとえば、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、１，２−ジヒドロキノリニル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニル、ベンゾ［１，４］オキサジニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］オキサジニル、インドリニル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル、２Ｈ−クロメニル、ピペラジニル、モルフォリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、ピリジノニル、アゼチジニル、及びピラゾリジニルが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基には、ピペリジニル、ピペラジニル、モルフォリニル、ピロリジニル、ピリジノニル、ジヒドロピロリジニル、アゼチジニル、アジリジニル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］オキサジニル、インドリニル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル及びピロリジノニルが挙げられる。さらに好ましいヘテロシクロアルキル基は、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼチジニル、アジリジニル、ピペラジニル、モルフォリニル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］オキサジニル、インドリニル、及びベンゾ［１，３］ジオキソリルである。本発明のヘテロシクロアルキル基は、本明細書で提供されるような種々の基によって任意で置換されてもよい。従って、ヘテロシクロアルキル環の中に存在し、置換に利用できる任意の炭素原子は、種々の環置換基、たとえば、たとえば、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル，Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ９へテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、Ｃ１〜Ｃ８アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、オキソ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、モノ及びジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルにさらに結合してもよい。
【０２４６】
用語「ヘテロアリール」は、窒素、酸素及びイオウから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する芳香族環系を指し、環系は芳香族環の環員（の１つ）によって親基に連結される。ヘテロアリール環は、１以上のヘテロアリール環、芳香族又は非芳香族の炭化水素環又はヘテロシクロアルキル環に縮合されてもよい。従って、本発明に好適なヘテロアリール基は、少なくとも５つの環員を有し、２０までの環員を有してもよい。ヘテロアリールの例には、たとえば、ピリジン、フラン、チエニル、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリニル、及びピリミジニルが挙げられる。好ましいヘテロアリール基には、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリニル、ピラゾリル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、インドリル、５，６−ジヒドロキナゾリニル、４，５，６，７−テトラヒドロインドリル、４，５−ジヒドロ−２Ｈ−インダゾリル、５，６−ジヒドロキノリニル、ピラゾリル及びベンゾピラゾリルが挙げられる。さらに好ましいヘテロアリール基は、ベンゾチアゾリル、ピリジル、ピラゾリル及びキノリニルである。本発明のヘテロアリール基は、本明細書で提供されるような種々の基によって任意で置換されてもよい。従って、ヘテロアリール環系の中に存在し、置換に利用できる任意の炭素原子は、種々の環置換基、たとえば、たとえば、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ８アルキル，Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ９へテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルケニル、Ｃ１〜Ｃ８アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ、オキソ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、モノ及びジ（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）アミノ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルにさらに結合してもよい。
【０２４７】
本明細書で使用されるとき、「増殖抑制活性」によって、たとえば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のような白血病、カポジ肉腫のようなＡＩＤＳ関連の癌；乳癌；骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、アダマンチノーマ及び脊索腫のような骨癌；髄膜腫、膠芽細胞腫、低レベル星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、下垂体腫瘍、シュワン細胞症及び転移性脳腫瘍のような脳腫瘍；外套細胞リンパ腫のような種々のリンパ腫を含む頭頚部の癌、非ホジキンリンパ腫、腺腫、扁平上皮癌、咽頭癌、胆嚢及び胆管の癌、網膜芽腫のような網膜の癌、食道の癌、胃癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、至急癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、黒色腫、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、肺癌（非小細胞肺癌を含む）、膵臓癌、肉腫、ウイルムス腫瘍、子宮頚癌、頭頚部の癌、皮膚癌、鼻咽腔癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性癌；並びに、たとえば、腫瘍血管形成に関連する血管新生、黄斑変性症（たとえば、湿性／乾性ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、近視性変性のような増殖性の疾患及び障害、並びに、たとえば、再狭窄及び多発性嚢胞腎疾患のようなそのほかの増殖性の疾患及び障害、並びにそのほかの癌、又は、細胞若しくは組織における遺伝子発現に関係する疾患の調節のみに応答し得る、又はほかの治療法との併用で応答し得る増殖性の疾患、症状、形質、遺伝子型若しくは表現型を含む、当該技術で既知であるような調節されない細胞の増殖又は複製を特徴とする疾患、症状、形質、遺伝子型又は表現型に対する生物活性を意味する。
【０２４８】
用語「アプタマー」は、別の分子に結合する核酸を意味する。この結合相互作用は、ワトソン／クリックの塩基対形成（たとえば、ＡはＵ又はＴと結合し、ＧはＣと結合する）によって例示される標準の核酸／核酸の水素結合の形成を包含しないが、そのほかの非共有結合（又は一部では共有結合）のすべてを包含する。非共有結合の非限定例には、水素結合形成、静電相互作用、ファン・デル・ワールス力及び疎水性相互作用が挙げられる。アプタマーは、これらの種類の相互作用のいずれか若しくはすべてによって、又は場合によっては共有結合によって別の分子に結合してもよい。別の分子へのアプタマーの共有結合は、アプタマー又は標的分子が化学的に反応性の部分又は光反応性の部分を含有する場合に生じ得る。用語「アプタマー」は、意図された標的物質との複合体を形成することが可能である核酸を指す。「標的特異的」は、アプタマーが、混入する物質に結合するよりもはるかに高い親和性で標的検体に結合することを意味する。
【０２４９】
用語「生物学的に活性のある分子」は、本明細書で使用されるとき、系において生物学的応答を誘発できる又は修飾できる化合物又は分子を指す。生物学的に活性のある分子の非限定例には、抗体（たとえば、モノクローナル、キメラ、ヒト化など）、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸（たとえば、リボザイムなど）、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｄｓＲＮＡ（たとえば、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、など）、アロザイム、アプタマー、デコイ、リボゾームＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの組み合わせのアンチセンスポリヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び治療上有用なタンパク質及びその類似体をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドが挙げられる。本発明の生物学的に活性のある分子には、生物学的に活性のある分子の薬物動力学及び／又は薬物動態を調節することが可能な分子、たとえば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及びそのほかのポリエーテルのような脂質及びポリマーも含まれる。特定の実施形態では、用語、生物学的に活性のある分子は、本明細書における用語「分子」又は「当該分子」と相互交換可能に使用される。
【０２５０】
本明細書で使用されるとき、「カチオン性脂質」によって、たとえば、式Ｉ〜ＶＩのいずれかを有する化合物のような、ほぼ生理的ｐＨで正味の正の電荷を有する親油性の化合物を意味する。
【０２５１】
本明細書で使用されるとき、「中性脂質」によって、ほぼ生理的ｐＨで正味の電荷を持たない本明細書で定義されるようなカチオン性脂質以外の親油性化合物を意味する。ほぼ生理的ｐＨで正味の電荷を持たない好適な化合物には、両性イオンが挙げられる。
【０２５２】
本明細書で使用されるとき、「細胞」は、普通の生物学的な意味で使用され、多細胞生物全体を指すものではなく、たとえば、ヒトを指すものではない。細胞は、生物、たとえば、鳥類、植物、及び、たとえば、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ及びネコのような哺乳類に存在し得る。細胞は、原核細胞（たとえば、細菌細胞）又は真核細胞（たとえば、哺乳類又は植物の細胞）であり得る。細胞は、体細胞又は生殖細胞の起源であることができ、全能性又は多能性であることができ、分裂性又は非分裂性であることができる。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来することができ、又はそれを含むことができる。
【０２５３】
本明細書で使用されるとき、用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉が可能である二本鎖ＲＮＡ分子を指す。
【０２５４】
「遺伝子」によって、ＲＮＡをコードする核酸、たとえば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むが、これらに限定されない核酸配列を意味する。遺伝子又は標的遺伝子はまた、機能性ＲＮＡ（ＦＲＮＡ）、又は小型一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小型核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小型核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びそれらの前駆体ＲＮＡのような非コーディングＲＮＡをコードすることができる。
【０２５５】
「阻害する」又は「阻害」によって、１以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、ＲＮＡ分子若しくは同等のＲＮＡ分子のレベル、又は１以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子及び分子の非存在下で認められるものより低く低減されることを意味する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡによる阻害は、不活性分子又は減衰分子の存在下で認められるレベルよりも下である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡによる阻害は、たとえば、スクランブル配列又はミスマッチを伴ったｓｉＲＮＡの存在下で認められるレベルよりも下である。別の実施形態では、本発明の核酸分子による遺伝子発現の阻害は、核酸分子の存在下で、その非存在下よりも大きい。一実施形態では、遺伝子発現の阻害は、転写後サイレンシング、たとえば、標的核酸分子（たとえば、ＲＮＡ）のＲＮＡｉが介在する切断又は翻訳の阻害に関連する。一実施形態では、阻害は、転写前サイレンシングに関連する。
【０２５６】
用語「リンカー」及び「リンカー基」は、１以上の分子を互いに接続する多価の、好ましくは二価の部分を指す。例は、ポリマー部分Ｇの一部を一緒に接続する又はターゲティングリガンドＴをポリマー部分Ｇに接続する部分である。リンカーは生分解性又は生体安定性であることができる。生分解性リンカーは、特定の組織又は細胞型への送達のような特定の目的で安定性を調節できるように設計される。好適なリンカー基の例には、以下の基：−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−が挙げられ、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化１９】
2015147927.tif 000026
である。
【０２５７】
式中
2015147927.tif 000027
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである。
【０２５８】
用語「ターゲティングリガンド」は、たとえば、受容体のような別の化合物に直接又は間接的に相互作用することが可能である、たとえば、薬剤、ペプチド、ホルモン又は神経伝達物質のような化合物又は分子を指す。リガンドと相互作用する受容体は、細胞の表面に存在することができ、又は或いは細胞間受容体であることができる。リガンドの受容体との相互作用は、生化学的反応を生じることができ、又は単に物理的相互作用若しくは会合であることができる。リガンドの非限定例には、薬学上活性のある小分子、エンドソーム溶解剤、融合性ペプチド、細胞膜貫通剤、電荷遮蔽剤、及び核酸が挙げられる。リガンドのそのほかの非限定例には、ガラクトース、がラクトサミン及びＮ−アセチルがラクトサミンのような糖及び炭水化物；エストロゲン、テストステロン、プロゲステロン、グルココルチゾン、アドレナリン、インスリン、グルカゴン、コルチゾール、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、レチノイン酸及び成長ホルモンのようなホルモン；ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ及びＰＤＧＦのような増殖因子；コレステロール；胆汁酸；ＧＡＢＡ、グルタミン酸塩、アセチルコリンのような神経伝達物質；ＮＯＧＯ；イノシトール三リン酸；ジアシルグリセロール；エピネフリン；ノルエピネフリン；ペプチド；葉酸塩、ピリドキシン及びビオチンのようなビタミン類、アセチルサリチル酸及びナプロキセンのような薬剤、抗体、並びに生体内又は試験管内で受容体と相互作用することができるそのほかの分子が挙げられる。リンカー分子、たとえば、アミド、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド、シラン、ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、リン酸エステル、ホスホルアミデート、トリホスフェート、アルキルホスフェート、又は光解離性のリンカーを用いてリガンドを本発明の化合物に連結することができる。一実施形態では、リンカーは生分解性リンカーである。切断に好適な条件には、ｐＨ、ＵＶ照射、酵素活性、温度、加水分解、排除、及び置換反応、及び結合の熱動態特性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５９】
本明細書で使用されるとき、用語「脂質」は、親油性化合物を指す。脂質化合物の非限定例には、直鎖、分枝鎖、飽和及び不飽和の脂肪酸を含む脂肪酸及びその誘導体、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、及びコレステロール及びその誘導体又は類似体を含むステロイドが挙げられる。
【０２６０】
用語「脂質粒子」又は「脂質粒子組成物」は、独立して、又はカチオン性脂質、中性脂質、及び／又はポリエチレングリコール／ジアシルグリセロール抱合体（すなわち、ポリエチレングリコール／ジアシルグリセロール（ＰＥＧ／ＤＡＧ）、ＰＥＧ／コレステロール又はＰＥＧ／ＤＭＢ）との併用で、１以上の生物学的に活性のある分子を含む組成物を指す。製剤化された分子組成物はさらにコレステロール又はコレステロール誘導体を含むことができる。本発明のカチオン性脂質は、式Ｉ〜ＶＩのいずれかを有する化合物、塩化Ｎ，Ｎ−ジオレオイルＮ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、臭化Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、塩化Ｎ−（１−（２、３−ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、塩化Ｎ−（１−（２、３−ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジオレオイルカルバミル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス、シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−１−（シス、シス−９’，１２’−オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレオイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）及び／又はこれらの混合物を含むことができる。中性脂肪は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及び／又はこれらの混合物を含むことができる。ＰＥＧ抱合体は、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド（Ｃ１２），ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド（Ｃ１８）、ＰＥＧ−コレステロール又はＰＥＧ−ＤＭＢを含むことができる。カチオン性脂質成分は、製剤に存在する総脂質の約２％〜約６０％、約５％〜約４５％、約５％〜約１５％、又は約４０％〜約５０％を構成することができる。中性脂質成分は、製剤に存在する総脂質の約５％〜約９０％、又は約２０％〜約８５％を構成することができる。ＰＥＧ−ＤＡＧ抱合体（たとえば、ポリエチレングリコール／ジアシルグリセロール（ＰＥＧ／ＤＡＧ）、ＰＥＧ／コレステロール又はＰＥＧ／ＤＭＢ）は、製剤に存在する総脂質の約１％〜約２０％、又は約４％〜約１５％を構成することができる。コレステロール成分は、製剤に存在する総脂質の約１０％〜約６０％、又は約２０％〜約４５％を構成することができる。一実施形態では、本発明の製剤化された分子組成物は、製剤に存在する総脂質の約７。５％を構成するカチオン性脂質成分と、製剤に存在する総脂質の約８２．５％を構成する中性脂質と、製剤に存在する総脂質の約１０％を構成するＰＥＧ抱合体を含む。一実施形態では、本発明の製剤化された分子組成物は、生物学的に活性のある分子と、ＤＯＤＭＡと、ＤＳＰＣと、ＰＥＧ／ＤＡＧ抱合体を含む。一実施形態では、ＰＥＧ／ＤＡＧ抱合体は、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステリルグリセロール（Ｃ１８）である。別の実施形態では、製剤化された分子組成物はまた、コレステロール又はコレステロール誘導体も含む。
【０２６１】
「ナノ粒子」によって、その大きさがナノメートルで測定される顕微鏡的粒子を意味する。本発明のナノ粒子は通常、直径が約１〜約９９９ｎｍに及び、被包された又は内包された生物学的に活性のある分子を含むことができる。
【０２６２】
「ＰＥＧ」によって、ポリエチレングリコール又はそのほかのポリアルキレンエーテル又は同等のポリマーを意味する。
【０２６３】
本明細書で使用されるとき、用語「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、及び「短鎖干渉核酸分子」は、配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングが介在することによって遺伝子の発現又はウイルスの複製を阻害する又は下方調節することが可能である核酸分子を指す。たとえば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的なセンス及びアンチセンスの領域を含む二本鎖の核酸分子であることができ、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＲＮＡは２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、一方の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、その際、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である（すなわち、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的である鎖を含み；たとえば、アンチセンス鎖とセンス鎖が、二重鎖構造又は二本鎖構造を形成する場合、たとえば、二本鎖領域は、約１５〜約３０、たとえば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は３０の塩基対であり；アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を含む（たとえば、ｓｉＲＮＡ分子の約１５〜約２５以上のヌクレオチドが標的核酸又はその一部に相補的である）。或いは、ｓｉＲＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ｓｉＲＮＡの自己相補的なセンス及びアンチセンスの領域は核酸に基づいた又は核酸に基づかないリンカーによって連結される。ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス及びアンチセンスの領域を有する、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピン、又は非対称のヘアピン二次構造を持つポリヌクレオチドであることができ、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２以上のループ構造と、自己相補的なセンス及びアンチセンスの領域を含む幹を有する環状の単鎖ポリヌクレオチドであることができ、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは生体内又は試験管内のいずれかで処理されてＲＮＡｉに介在することが可能である活性のあるｓｉＮＡ分子を生成することができる。ｓｉＮＡもまた、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含むことができ（たとえば、そのようなｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子の中での存在を必要としない）、単鎖ポリヌクレオチドはさらに、たとえば、５−リン酸（たとえば、Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574 and Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568を参照）又は５’，３’−二リン酸のような末端リン酸基を含むことができる。特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンス及びアンチセンスの配列又は領域を含み、センス及びアンチセンスの領域は、当該技術で既知のように、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドのリンカーによって共有結合し、又は代わりに、イオン相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用及び／又はスタッキング相互作用によって非共有結合する。特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こす方式で標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書で使用されるとき、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はないが、さらに、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含する。特定の実施形態では、本発明の短鎖干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有のヌクレオチドを欠く。出願者は、特定の実施形態で、ＲＮＡｉに介在するのに２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短鎖干渉核酸を記載し、本発明の短鎖干渉核酸分子は、リボヌクレオチド（たとえば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を任意で含まない。しかしながら、ＲＮＡｉを支援するのにｓｉＮＡ分子の中でリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を持つ１以上のヌクレオチドを含有する、連結されたリンカー（単数）又はリンカー（複数）又はそのほかの連結された又は関連する基、部分又は鎖を有する。任意で、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチドの位置の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％でリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾された短鎖干渉核酸分子はまた、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチドと呼ぶこともできる。本明細書で使用されるとき、用語、ｓｉＮＡは、配列特異的なＲＮＡｉに介在することが可能である核酸分子を記載するのに使用されるそのほかの用語、たとえば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、及びそのほかに同等であることを意味する。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定例は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、２００５年９月２３日に出願されたＵＳＳＮ１１／２３４，７３０に示されている。そのようなｓｉＮＡ分子は、遺伝子発現の阻害に介在する当該技術で既知のそのほかの核酸技法、たとえば、リボザイム、アンチセンス、三本鎖形成、アプタマー、２，５−Ａキメラ又はデコイオリゴヌクレオチドからは識別可能である。
【０２６４】
本明細書で使用されるとき、「標的」によって、標的遺伝子によってコードされる任意の標的タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを意味する。用語「標的」はまた、たとえば、標的ＲＮＡによってコードされる標的活性を有する標的タンパク質、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列も指す。用語「標的」はまた、そのほかの標的をコードする配列、たとえば、そのほかの標的アイソフォーム、変異標的遺伝子、標的遺伝子のスプライシング変異体、及び標的遺伝子の多型も含むことにする。
医薬組成物
【０２６５】
本発明の化合物は、従来の非毒性の薬学上許容可能なキャリア、アジュバント及びビヒクルを含有する投与単位製剤にて、経口で、局所に、非経口で、吸入又は噴霧によって、又は直腸に投与されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語、非経口には、経皮、皮下、血管内（たとえば、静脈内）、筋肉内、又はクモ膜下の注射又は注入の技法などが含まれる。さらに、本発明の化合物と薬学上許容可能なキャリアを含む医薬製剤が提供される。本発明の１以上の化合物が、１以上の非毒性の薬学上許容可能なキャリア及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント、及び所望であれば、そのほかの有効成分と共に存在してもよい。本発明の化合物を含有する医薬組成物は、たとえば、錠剤、トローチ、甘味錠剤、水性懸濁液又は油性懸濁液、分散可能な粉剤又は顆粒剤、エマルション、硬質又は軟質のカプセル、又はシロップ又はエリキシルとして経口使用の好適な形態であってもよい。
【０２６６】
経口使用を意図される組成物は、医薬組成物製造の技術で既知の方法に従って調製されてもよく、そのような組成物は、薬学上洗練され、口に合う製剤を提供するために甘味剤、風味剤、着色剤及び保存剤から成る群から選択される１以上の剤を含有してもよい。錠剤は、錠剤の製造に好適である薬学上許容可能な賦形剤と混合して有効成分を含有する。それらの賦形剤は、たとえば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；たとえば、コーンスターチ、又はアルギン酸のような造粒剤及び崩壊剤；たとえば、デンプン、ゼラチン又はアカシアのような結合剤；及びたとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクのような潤滑剤であってもよい。錠剤は、非被覆であってもよく、又は既知の技法で被覆されてもよい。場合によっては、既知の技法によってそのようなコーティングを調製して消化管における崩壊及び吸収を遅らせ、それによってさらに長い期間持続する作用を提供してもよい。たとえば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのような遅延用物質を採用してもよい。
【０２６７】
経口使用のための製剤は、硬質ゼラチンカプセルとしても提示されてもよく、その際、有効成分は、たとえば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンのような不活性固体希釈剤と混合してもよく、又は軟質ゼラチンカプセルとして提示されてもよく、その際、有効成分は、水、又はたとえば、ピーナッツ油、流動パラフィン又はオリーブ油と混合される。
【０２６８】
経口使用のための製剤はまた、甘味錠剤として提示されてもよい。
【０２６９】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合で有効物質を含有する。そのような賦形剤は、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ゴムトラガカント及びアラビアゴムのような懸濁剤であり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、たとえば、レシチン、又は脂肪酸による酸化アルキレンの縮合生成物、たとえば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又は長鎖脂肪族アルコールによる酸化エチレンの縮合生成物、たとえば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又は脂肪酸に由来する部分エステルとモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールのようなヘキシトールによる酸化エチレンの縮合生成物、又は脂肪酸に由来する部分エステルと無水ヘキシトールによる酸化エチレンの縮合生成物、たとえば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであってもよい。水性懸濁液は、１以上の保存剤、たとえば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はｎ−プロピル、１以上の着色剤、１以上の風味剤、及び１以上の甘味剤、たとえば、スクロース又はサッカリンも含有してもよい。
【０２７０】
油性懸濁液は、植物油、たとえば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、ココナッツ油、又は流動パラフィンのような鉱物油に有効成分を懸濁することによって製剤化されてもよい。油性懸濁液は、たとえば、蜜蝋、硬質パラフィン又はセチルアルコールのような増粘剤を含有してもよい。甘味剤及び風味剤を加えて口に合う経口製剤を提供してもよい。これらの組成物は、たとえば、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存されてもよい。
【０２７１】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散可能な粉剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１以上の保存剤との混合で有効成分を提供する。好適な分散剤又は湿潤剤、又は懸濁剤は、すでに上述されたものによって例示される。追加の賦形剤、たとえば、甘味剤、風味剤及び着色剤も存在してもよい。
【０２７２】
本発明の医薬組成物はまた、水中油エマルションの形態であってもよい。油相は、植物油又は鉱物油又はこれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム、たとえば、アラビアゴム又はゴムトラガカント、天然に存在するホスファチド、たとえば、大豆、レシチン、及び脂肪酸に由来するエステル又は部分エステル、及びヘキシトール、無水物、たとえば、モノオレイン酸ソルビタン、及び酸化エチレンによる前記部分エステルの縮合生成物、たとえば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであってもよい。エマルションは甘味剤及び風味剤も含有してもよい。
【０２７３】
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はスクロースと共に製剤化されてもよい。そのような製剤はまた緩和薬、保存剤及び風味剤及び着色剤を含有してもよい。医薬組成物は、無菌の注射用の水性懸濁液又は油質の懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記で言及された好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて当該技術に従って製剤化されてもよい。無菌の注射用製剤はまた、非毒性の非経口で許容可能な希釈剤又は溶媒における無菌の注射用の溶液又は懸濁液、たとえば、１，３−ブタンジオールの溶液であってもよい。採用されてもよい許容可能なビヒクル及び溶液には、水、リンガー溶液及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の不揮発性油は溶媒又は懸濁媒体として好都合に採用される。この目的で、合成のモノ又はジ−グリセリドを含むどのような銘柄の不揮発性油が採用されてもよい。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射用製剤で使用される。
【０２７４】
本発明の化合物は、たとえば、薬物の直腸投与のための座薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、常温では固体であるが、直腸温では液体であるので直腸で溶解して薬剤を放出する好適な非刺激性の賦形剤と薬剤を混合することによって調製することができる。そのような物質には、カカオバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２７５】
本発明の化合物は無菌の媒体中で非経口にて投与されてもよい。薬剤は、使用されるビヒクル及び濃度によってビヒクルに懸濁することができ、又は溶解することができる。有利なことに、局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤のようなアジュバントをビヒクルに溶解することができる。
【０２７６】
眼又は、たとえば、口及び皮膚のようなそのほかの外側組織の障害については、たとえば、総量で０．０７５〜３０％ｗ／ｗ、好ましくは０．２〜２０％ｗ／ｗ及び最も好ましくは０．４〜１５％ｗ／ｗにて有効成分を含有する局所ジェル、スプレー、軟膏又はクリーム又は座薬として製剤を好ましく適用することができる。軟膏に製剤化される場合、パラフィン基剤又は水混和性の軟膏基剤と共に有効成分を用いてもよい。
【０２７７】
或いは、有効成分は、水中油のクリーム基剤にてクリームに製剤化されてもよい。所望であれば、クリーム基剤の水性相は、たとえば、少なくとも３０％の、たとえば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコール及びそれらの混合物のような多価のアルコールを含んでもよい。局所製剤は望ましくは、皮膚又はそのほかの冒された領域を介した有効成分の吸収又は貫通を高める化合物を含んでもよい。そのような皮膚貫通増強剤には、ジメチルスルホキシド及び関連する類似体が挙げられる。本発明の化合物はまた、経皮用具によって投与されてもよい。好ましくは、リザーバ及び多孔性膜のタイプ又は固体マトリクス変異体のいずれかの貼付剤を用いて局所投与が達成される。いずれかの場合において、膜を介してリザーバ又は微小カプセルから、受入者の皮膚又は粘膜に接触する活性剤透過粘着剤に活性剤が連続的に送達される。活性剤が皮膚を介して吸収されるのであれば、制御された又は所定の流量の活性剤が受入者に投与される。微小カプセルの場合、被包剤が膜として機能してもよい。経皮貼付剤には、たとえば、アクリル系エマルション及びポリエステル貼付剤のような粘着剤系を伴った好適な溶媒系にて化合物が含まれてもよい。本発明のエマルションの油性相は、既知の方法で既知の成分から構成されてもよい。相が単に乳化剤を含んでもよい一方で、相は、少なくとも１つの乳化剤の脂肪又は油又は脂肪と油の双方との混合物を含んでもよい。好ましくは、親水性の乳化剤が、安定剤として作用する親油性の乳化剤と一緒に含まれる。油と脂肪の双方を含むことも好ましい。一緒に、安定剤の存在下又は非存在下の乳化剤がいわゆる乳化ワックスを構成し、ワックスは油及び脂肪と一緒に、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を構成する。本発明の製剤での使用に好適な乳化剤及び乳化安定剤には、とりわけ、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。医薬エマルション製剤で使用されそうなほとんどの油における活性化合物の溶解性が非常に低いので、製剤に好適な油又は脂肪の選択は、所望の化粧品特性を達成することに基づく。従って、クリームは好ましくは、チューブ又はそのほかの容器からの漏出を回避する好適な一貫性を持つベタベタしない、着色性ではない、洗い落としできる製品であるべきである。直鎖の又は分枝鎖のモノ−又はジ−塩基アルキルエステル、たとえば、ジ−イソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナッツ脂肪酸のプロピレングリコールエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、又は分枝鎖エステルの混合物を使用してもよい。これらは、必要とされる特性によって、単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。或いは、たとえば、白色軟質パラフィン及び／又は流動パラフィン又はそのほかの鉱物油のような低融点脂質を使用することができる。
【０２７８】
眼への局所投与に好適な製剤には、有効成分に好適なキャリア、特に水性溶媒に有効成分が溶解される又は懸濁される点眼剤も挙げられる。そのような製剤には、０．５〜２０％、有利には０．５〜１０％、及び特に約１．５％ｗ／ｗの濃度で抗炎症性の有効成分が好ましく存在する。治療目的で、本発明の活性化合物は、投与の指示された経路に適当な１以上のアジュバントと通常組み合わせられる。経口で投与されるのであれば、化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び／又はポリビニルアルコールと共に混合され、次いで好都合な投与のために錠剤化又はカプセル化されてもよい。そのようなカプセル又は錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースにおける活性化合物の分散物で提供されてもよいように、制御放出製剤を含有してもよい。非経口投与のための製剤は、水性の又は非水性の等張で無菌の注射用の溶液又は懸濁液の形態であってもよい。これらの溶液又は懸濁液は、経口投与用の製剤での使用で言及された１以上のキャリア又は希釈剤を有する無菌の粉体又は顆粒から調製されてもよい。化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及び／又は種々の緩衝液に溶解されてもよい。そのほかのアジュバント及び投与方式は、医薬技術で周知であり、広く知られている。
【０２７９】
体重のキログラム当たり、１日当たり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇの常態の投与量レベルが上記で指示された状態の治療に有用である（１日当たり患者当たり約０．５ｍｇ〜約７ｍｇ）。キャリア物質と組み合わせて単回投与形態を生じる有効成分の量は、治療される宿主及び特定の投与方式によって変化する。投与単位形態は一般に約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間の有効成分を含有する。１日の用量を１日当たり１〜４回の投与で投与することができる。皮膚症状の場合、本発明の化合物の局所用製剤を１日２〜４回冒された領域に塗布することが好ましくてもよい。
【０２８０】
しかしながら、特定の患者に対する特定の用量レベルは、採用される特定の化合物、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与時間、投与経路及び排泄率、薬剤の併用、及び治療を受ける特定の疾患の重症度を含む種々の因子によって左右されることが理解されるであろう。
一般的な手順
【０２８１】
本発明の化合物の調製のための代表的な合成手順を以下のスキームにて以下で概略する。当業者は、出発物質及び反応条件が変化してもよく、反応の順序が変わってもよく、追加の工程を採用して所望の化合物を生成してもよいことを認識するであろう。場合によっては、上記形質転換の一部を達成するのに特定の反応性官能性の保護が必要であってもよい。一般に、そのような保護基の必要性は、そのような基を結合し、取り外すのに必要とされる条件と共に、有機合成の当業者には明らかであろう。
【０２８２】
特に指示されない限り、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｘ’、Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、Ｔ、Ｔ１、Ｔ２、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は、式Ｉ〜ＶＩと関連して上記で言及された定義を持つ。ＬＧは、ハロゲン、トルエンスルホニル、メタンスルホニル、トリフルオロメタンスルホニル、２，２，２−トリフルオロエトキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルなどを含むが、これらに限定されない脱離基を表す。
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【０２８３】
実施例
本発明の化合物の調製を以下の実施例によってさらに説明するが、それは、そこで記載される特定の手順及び化合物に、範囲又は精神において本発明を限定するとは解釈されるべきではない。本発明の化合物を合成する代表的な方法を以下に提示する。所望の標的化合物に必要とされる置換基の性質が合成の好ましい方法を決定することが理解される。
【０２８４】
実施例１
Ｎ．Ｎ’−ジオレオイルテトラキス（アミノメチル）メタン（「ジオレオイルクロスアミン」）の合成
【化２０】
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既知の手順（Adil, K. et al., Solid State Sciences, 6 (2004), 1229-1235）によってテトラキス（アミノメチル）メタンを調製する。５０ｍＬのフラスコに還流コンデンサと磁気撹拌器を装備する。四塩化テトラキス（アミノメチル）メタン（８００ｍｇ、２．８８ミリモル）とメタノール（１０ｍＬ）とＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ溶液（５．４５７Ｍを２．１０ｇ、１１．５０ミリモル）をフラスコに充填する。混合物を撹拌し、４時間還流し、次いで冷却する。無機塩からメタノール溶液を静かに捨て、塩を無水エタノールに再懸濁する。懸濁液を遠心し、合わせた有機物を真空で濃縮する。残留物を塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解し、残りの無機塩からシリンジ（０．４５ミクロンのフィルター）を用いて濾過する。濾液の濃縮によって白色の半固形物質として定量的収率にて遊離のテトラキス（アミノメチル）メタンを得る（残りのアルコールはＮＭＲによって概算する）。ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ２．９（ｓ、ＣＨ２）。
【０２８５】
得られたテトラキス（アミノメチル）メタン（４２０ｍｇ、純度９０％、２．８６ミリモル）を無水エタノール（１５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（４００ｍｇ、３．５０ミリモル）を加え、その後、２，２，２−トリフルオロエチルオレエート（２．０８ｇ、５．７２ミリモル）［下記参照、実施例３］を加える。均質な混合物を室温にて７２時間反応させ、真空で濃縮する。残留物をＭｅＯＨ／水（１０％）／トリフルオロ酢酸（０．１％）（４０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸でｐＨを約ｐＨ２に調整する。ＭｅＯＨ／水（１０％）／トリフルオロ酢酸（０．１％）を溶離液として用いてＣ−８改変シリカでのクロマトグラフィによって残留物を精製する。ビストリフルオロ酢酸塩（０．９ｇ）としてＮ，Ｎ’−ジオレオイルテトラキス（アミノメチル）メタン（「ジオレオイルクロスアミン」）を単離する。ＭＳ（ＴＦＡ塩）６６１［Ｍ＋１］；ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８．５（ｂｒ．６Ｈ），８．０５（ｂｒ，２Ｈ），５．３７（ｍ，４Ｈ），３．０７及び２．９５（解像力弱く、各４Ｈ）；２．１５（ｔ，４Ｈ），２．０１（ｍ，８Ｈ），１．３５（ｍ，４８Ｈ），０．９（ｔ，６Ｈ）。
【０２８６】
反応を高いｐＨ（たとえば、トリフルオロ酢酸の非存在下、又はＮａＯＭｅの存在下）のもとで行うと、副産物量の２、３、及び４が生成されるが、それらは容易に取り除くことができる（たとえば、クロマトグラフィ）。
【化２１】
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【０２８７】
実施例２
２．１．葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨ
【化２２】
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１７０ｍｇのＨ２Ｎ−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨ（Ｌａｙｓａｎにより製造された）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）と無水クロロホルム（２ｍＬ）に溶解する。ヒューニッヒの塩基（１５μＬ）を加え、その後葉酸−ＮＨＳエステル（６０ｍｇ、既知の手順、Lee, R. J.; Low, P. S.; “Methods in Molecular Medicine”, 25, 69-76, April 2000によって調製された）を加えた。さらなる８０ｍｇの葉酸−ＮＨＳをＤＭＳＯの溶液（２．５ｍＬ）として加える。撹拌した混合物を室温で２４時間保持し；真空でクロロホルムを取り除き、残留物を脱イオン水（６０ｍＬ）で希釈する。３５００Ｄカットオフ膜を用いて、数滴のＴＦＡでｐＨ２〜３にした脱イオン水に対して、得られた均質な黄色の溶液を透析する。透析槽を６回交換した後、黄色の溶液を回収し、真空で濃縮して葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨを得る。
【０２８８】
２．２．「葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミン」（５）を得るための葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨとのカップリング
【化２３】
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１５０ｍｇの葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨを無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解し、ＮＨＳ（９ｍｇ）を加え、次いでＤＣＣ（１６ｍｇ）を加える。混合物を暗所にて２０時間反応させ、葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＮＨＳを得る。この溶液に、無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中３０ｍｇのＮ，Ｎ’−ジオレオイルテトラキス（アミノメチル）メタンを加える。反応混合物を２４時間反応させた後、脱イオン水（６０ｍＬ）でそれを希釈する。３５００Ｄのカットオフバッグを用いて脱イオン水に対して、得られた均質の黄色の溶液を透析することによって、未反応の葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨとの約５０％の混合物として葉酸ペグ化Ｎ，Ｎ’−ジオレオイルテトラキス（アミノメチル）メタン（「葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミン」）を得る。
【０２８９】
実施例３
Ｎ，Ｎ’−ジオレオイルトリス（アミノエチル）アミン（「ジオレオイルモノアミン」）（６）の合成
【化２４】
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塩化オレオイル（７５ｇ、２５０ミリモル）を、２，２，２−トリフルオロエタノール（６０ｇ、６００ミリモル）と共に還流にて１６時間加熱した。ＨＣｌの放出が止まった後、真空で過剰のトリフルオロエタノールを除く。残留物の真空蒸留によって、無色の液体として８７．６ｇのオレイン酸２，２，２−トリフルオロエチル、沸点１５０℃／０．３を得る。
【０２９０】
トリス（２−アミノエチル）アミン（１．４５ｇ、１０ミリモル）を２０ｍＬのエタノールに溶解する。この溶液にオレイン酸２，２，２−トリフルオロエチル（５．６ｇ）を加え、反応混合物を２４時間還流する。真空で混合物を濃縮し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によってｐＨ２〜３に酸性化する。Ｃ８シリカにおけるこの溶液の逆相クロマトグラフィ（溶離液：８９．９％アセト二トリル／１０％水／０．１％ＴＦＡ）によってそのトリフルオロ酢酸塩として１．８ｇのＮ，Ｎ’−ジオレオイルトリス（アミノエチル）アミン（「ジオレオイルモノアミン」）を得る。ＭＳ（ＴＦＡ塩）６７５［Ｍ＋１］；ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４（ｂｒ，２Ｈ），５．３７（ｍ，４Ｈ），３．５５，３．３７及び３．０５（解像度弱く、すべて１２Ｈ），２．１５（ｔ，４Ｈ），２．０１（ｍ，８Ｈ），１．３５（ｍ，４８Ｈ），０．９（ｔ，６Ｈ）。
【０２９１】
実施例３Ａ
メチル−ジオレオイルモノアミン（６．１）の調製
【化２５】
2015147927.tif 000037
過剰のヨードメタンによるＮ，Ｎ’−ジオレオイルトリス（アミノエチル）アミン（「ジオレオイルモノアミン」）のメチル化によって表題の化合物を調製する。
【０２９２】
実施例４
Ｎ，Ｎ’−ジオレオイルＮ”−アセチルサリチロイルトリス（アミノエチル）アミン（７）の合成
【化２６】
2015147927.tif 000038
トリフルオロ酢酸Ｎ，Ｎ’−ジオレオイルトリス（アミノエチル）アミン（８０ｍｇ、１００マイクロモル）を５ｍＬのクロロホルムに溶解し、３ｍＬの１０％Ｋ２ＣＯ３水溶液で処理する。有機相を分離し、乾燥させ、真空にて濃縮して遊離の塩基としてＮ，Ｎ’−ジオレオイルトリス（アミノエチル）アミンを得る。この物質を３ｍＬの無水クロロホルムに溶解し、溶液を塩化アセチルサリチロイル（２０ｍｇ、１００マイクロモル）で処理することによって表題の化合物を得る。
【０２９３】
実施例５
「葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン」（８）を得るための葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨとのカップリング
【化２７】
2015147927.tif 000039
実施例２に記載されたように、葉酸−ＰＥＧ３４００−ＣＯＯＨとジオレオイルモノアミンから葉酸−ジオレオイルモノアミンが原則的に得られる。
【０２９４】
実施例６
ｓｉＲＮＡとのジオレオイルクロスアミンの複合体；ナノ粒子の形成
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質はジオレオイルクロスアミンである。ｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルクロスアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、ｓｉＲＮＡについては０．３ｍｇ／ｍＬに、ジオレオイルクロスアミンについては１．５ｍｇ／ｍＬに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてｓｉＲＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルクロスアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０２９５】
実施例７
ＤＮＡとのジオレオイルクロスアミンの複合体；ナノ粒子の形成
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡである。使用するカチオン性脂質はジオレオイルクロスアミンである。プラスミドＤＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルクロスアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、プラスミドＤＮＡについては０．３ｍｇ／ｍＬに、ジオレオイルクロスアミンについては１．５ｍｇ／ｍＬに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてプラスミドＤＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルクロスアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０２９６】
実施例８
ｓｉＲＮＡとの葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンの複合体
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、様々なモル比（１：１）、（２：１）、（４：１）又は（１０：１）にて、葉酸リガンドに抱合させた又は葉酸化ジオレオイルクロスアミンと同時製剤化したジオレオイルクロスアミンである。補助製剤化剤をジオレオイルクロスアミンのクロロホルム溶液に加え、実施例９に記載されるようにリポソームの調製を行う。ｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）と葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、ｓｉＲＮＡについては０．３ｍｇ／ｍＬに、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンについては１．９ｍｇ／ｍＬに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてｓｉＲＮＡのデキストロース溶液を葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０２９７】
実施例９
ｓｉＲＮＡとのジオレオイルモノアミンの複合体；ナノ粒子の形成
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質はジオレオイルモノアミンである。ｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、ｓｉＲＮＡについては０．３ｍｇ／ｍＬに、ジオレオイルモノアミンについては１．５ｍｇ／ｍＬに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてｓｉＲＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０２９８】
実施例１０
ＤＮＡとのジオレオイルモノアミンの複合体；ナノ粒子の形成
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡであり、使用するカチオン性脂質はジオレオイルモノアミンである。プラスミドＤＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、プラスミドＤＮＡについては０．３ｍｇ／ｍＬに、ジオレオイルモノアミンについては１．５ｍｇ／ｍＬに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてプラスミドＤＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０２９９】
実施例１１
ジオレオイルクロスアミンによって被包したｓｉＲＮＡの調製
この実施例は、ジオレオイルクロスアミンを用いたｓｉＲＮＡのリポソームへの被包を説明する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質はジオレオイルクロスアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。
【０３００】
実施例１２
葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンによって被包したｓｉＲＮＡの調製
この実施例は、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンを用いたｓｉＲＮＡのリポソームへの被包を説明する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。
【０３０１】
実施例１３
補助製剤化剤を伴ったジオレオイルモノアミンによるｓｉＲＮＡ形質移入複合体の調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。ジオレオイルモノアミンは、（４：１）のモル比でほかの脂質と共に製剤化する。使用する脂質は、１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］、１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル、及びコレステロールである。補助製剤化剤をクロロホルム中のジオレオイルモノアミンに加える。実施例９に以前記載したようにリポソームを調製する。ｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡと、１．９ｍｇ／ｍＬのジオレオイルモノアミンに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてｓｉＲＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０３０２】
実施例１４
ジオレオイルモノアミンによるＤＮＡ形質移入複合体の調製
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡであり、ジオレオイルモノアミンが脂質である。プラスミドＤＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、プラスミドＤＮＡについては０．３ｍｇ／ｍＬに、ジオレオイルモノアミンについては１．９ｍｇ／ｍＬに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてプラスミドＤＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０３０３】
実施例１５
補助製剤化剤を伴ったジオレオイルモノアミンによるＤＮＡ形質移入複合体の調製
使用する核酸は、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡであり、使用するカチオン性脂質はジオレオイルモノアミンである。この実施例で使用されるカチオン性脂質は、（４：１）のモル比でほかの脂質と製剤化されたジオレオイルモノアミンである。使用する脂質は、１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］、１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ラクトシル、及びコレステロールである。補助製剤化剤をクロロホルム中のジオレオイルモノアミンに加える。実施例９に以前記載したようにリポソームを調製する。ＤＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン補助製剤化剤（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、０．３ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと、１．９ｍｇ／ｍＬのジオレオイルモノアミンに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてＤＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０３０４】
実施例１６
葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって同時製剤化されたジオレオイルモノアミンによるｓｉＲＮＡ形質移入複合体の調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、様々なモル比（１：１）、（２：１）、（４：１）又は（１０：１）にて、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンと同時製剤化したジオレオイルモノアミンである。補助製剤化剤をジオレオイルモノアミンのクロロホルム溶液に加える。実施例９に以前記載されたようにリポソームの調製を行う。ｓｉＲＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン／葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製し、その後、０．３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡと、１．９ｍｇ／ｍＬのジオレオイルモノアミンに５％デキストロースで希釈する。マイクロピペットを用いてｓｉＲＮＡのデキストロース溶液をジオレオイルモノアミンのデキストロース溶液に加え、５：１（正：負）の電荷比とする。製剤を室温にて１５分間インキュベートして複合体を形成させる。
【０３０５】
実施例１７
ジオレオイルモノアミンのリポソームによって被包したｓｉＲＮＡの調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。
【０３０６】
実施例１８
葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンのリポソームによって被包したｓｉＲＮＡの調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンである。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。
【０３０７】
実施例１９
ｓｉＲＮＡとジオレオイルクロスアミンの複合体の形質移入活性
ｓｉＲＮＡとジオレオイルクロスアミンの複合体の形質移入活性を以下のように試験管内で測定する。ｍＶＥＧＦ又はルシフェラーゼのｓｉＲＮＡ構築物を含有する形質移入複合体を実施例９に記載された方法によって調製する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル；マウス扁平上皮癌）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）にて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬのダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にてＦＢＳの非存在下又は存在下において０．５μｇのｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。その培地にＦＢＳを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。その形質移入培地にＦＢＳを伴った細胞には、１０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、細胞培養培地（タンパク質）又は細胞溶解物（転写物）においてｍＶＥＧＦのタンパク質及び転写物のノックダウンを評価する。ｍＶＥＧＦのタンパク質レベルの測定については、ｍＶＥＧＦのＥＬＩＳＡアッセイによって細胞培養培地を直接分析する。ｍＶＥＧＦの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてｍＶＥＧＦ転写物のレベルを定量する。
【０３０８】
実施例２０
ジオレオイルクロスアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性
この実施例は、ジオレオイルモノアミン、ジオレオイルクロスアミン、又は両方のカチオン剤の混合物を用いたｓｉＲＮＡのリポソーム被包を説明する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン（実施例３）、ジオレオイルクロスアミン（実施例１）、又は両方の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにてＦＢＳの非存在下又は存在下において０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。その培地にＦＢＳを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。その形質移入培地にＦＢＳを伴った細胞には、１０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、細胞培養培地（タンパク質）又は細胞溶解物（転写物）においてｍＶＥＧＦのタンパク質及び転写物のノックダウンを評価する。ｍＶＥＧＦのタンパク質レベルの測定については、ｍＶＥＧＦのＥＬＩＳＡアッセイによって細胞培養培地を直接分析する。ｍＶＥＧＦの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてｍＶＥＧＦ転写物のレベルを定量する。
【０３０９】
実施例２１
葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性
この実施例は、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミン、又は両方のカチオン剤の混合物を用いたｓｉＲＮＡのリポソーム被包を説明する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（実施例５）、葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミン（実施例２）、又は両方の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの側面上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにてＦＢＳの非存在下又は存在下において０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。その培地にＦＢＳを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。その形質移入培地にＦＢＳを伴った細胞には、１０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、細胞培養培地（タンパク質）又は細胞溶解物（転写物）においてｍＶＥＧＦのタンパク質及び転写物のノックダウンを評価する。ｍＶＥＧＦのタンパク質レベルの測定については、ｍＶＥＧＦのＥＬＩＳＡアッセイによって細胞培養培地を直接分析する。ｍＶＥＧＦの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてｍＶＥＧＦ転写物のレベルを定量する。
【０３１０】
実施例２２
ジオレオイルモノアミン複合体化ｓｉＲＮＡの膣内投与に続く子宮ＶＥＧＦタンパク質のノックダウン
ｓｉＲＮＡ投与の２日前に、プロゲステロン（ゴマ油に溶解した０．５ｍｇ）を皮下投与で２日間、メスＩＣＲマウス（１７〜２２グラム）に与えて動物における発情周期を正常化した。次いでＶＥＧＦ転写物を標的とする製剤化ｓｉＲＮＡ又は非標的型の対照ｓｉＲＮＡをマウスに膣内投与する。ｓｉＲＮＡは、５：１のＮ：Ｐ電荷比にてジオレオイルモノアミンと複合体化する。最終容量３０μＬにて総量９μｇのｓｉＲＮＡ（０．３ｍｇ／ｍＬ）を投与する。投与後４８時間で動物を安楽死させ、膣／頚部と子宮（子宮角を含む）を回収し、ほかの組織から切り離し、液体Ｎ２に保存する。プロゲステロン処理に一致する肉眼所見を持った動物の組織のみを解析に使用する。溶解緩衝液で組織をホモジネートし、ＥＬＩＳＡによってＶＥＧＦタンパク質の判定を行う。
【０３１１】
実施例２３
クロスアミンｓｉＲＮＡの投与後の、腹腔に播種された悪性腫瘍を持つ動物における腹水と腹腔内腫瘍結節での増殖因子のタンパク質及び転写物のノックダウン
疾患の進行に関係しているＶＥＧＦのレベルを低下させる尽力において、播種された卵巣癌を持つ動物にｓｉＲＮＡとジオレオイルクロスアミンを含有する製剤を投与する。播種性卵巣癌を誘導するために、２．５×１０６個のＩＤ８（マウス卵巣癌）細胞をＩＰでメスＣ５７ＢＬ／６マウスに埋め込む。腫瘍の埋め込み後所定の日に、５：１のＮ：Ｐの比でジオレオイルクロスアミンと共に製剤化されたｓｉＶＥＧＦを２００μｇマウスに注射する。処理後２４時間で開始して、動物を安楽死させ、腹腔から腫瘍と腹水を回収し、ＶＥＧＦのタンパク質と転写物のレベルについて解析する。腹水転写物の解析については、試料を先ず、赤血球溶解プロトコールに供し、ＲＮＡ単離の前に有核細胞について濃縮する。
【０３１２】
実施例２４
葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンを用いた腫瘍標的化ｓｉＲＮＡ
ＳＣＣＶＩＩ腫瘍の担癌マウスに葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルクロスアミンによって製剤化したＶＥＧＦのｓｉＲＮＡを静脈内で又は腹腔内で送達する。投与後、特定の時間に腫瘍を回収し、転写物及び標的転写物のタンパク質レベルを判定する。
【０３１３】
実施例２５
ペプチド改変のジオレオイルクロスアミンを用いたｓｉＲＮＡの全身性の取り込みの向上
保存されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有するペプチドの付加によって標的インテグリン受容体に機能的に改変をもたらしたジオレオイルクロスアミンによってｓｉＲＮＡを製剤化する。担癌マウスに複合体を静脈内で又は腹腔内で送達する。投与後、特定の時間に、種々の組織を回収し、標的とされた転写物／タンパク質の転写物及びタンパク質の定量を行う。
【０３１４】
実施例２６
ジオレオイルモノアミン送達剤によって複合体化されたｓｉＲＮＡの試験管内形質移入に続くタンパク質のノックダウン
ｓｉＲＮＡとジオレオイルモノアミン送達剤との共役複合体の形質移入活性を試験管内で測定する。実施例９に以前記載された方法によって、ｓｉｍＶＥＧＦのｓｉＲＮＡの構築物を含有する形質移入複合体を調製する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにて０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、上清のｍＶＥＧＦのタンパク質の定量を行う。結果は、ＶＥＧＦタンパク質の有意な（約９５％）ノックダウンを示す（図１）。
【０３１５】
実施例２７
ジオレオイルモノアミンとメチル−ジオレオイルモノアミンの送達剤によって複合体化されたｓｉＲＮＡの試験管内形質移入に続くタンパク質のノックダウン
ジオレオイルモノアミン（実施例３）とメチル−ジオレオイルモノアミン（実施例３Ａ）の送達剤とのｓｉＲＮＡの複合体の形質移入活性を試験管内で測定する。実施例９に以前記載された方法によって、ｓｉｍＶＥＧＦのｓｉＲＮＡの構築物を含有する形質移入複合体を調製する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにて０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、上清のｍＶＥＧＦのタンパク質の定量を上述のように行う。結果は、ＶＥＧＦタンパク質の有意な（約９５％）ノックダウンを示す（図２）。
【０３１６】
実施例２８
葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたｓｉＲＮＡの試験管内形質移入に続くタンパク質及び転写物のノックダウン
ｓｉＲＮＡと葉酸−ＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの共役複合体の形質移入活性を試験管内で測定する。以前記載された方法によって、ｓｉｍＶＥＧＦのｓｉＲＮＡの構築物を含有する形質移入複合体を調製する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにて種々の濃度での葉酸基質の非存在下又は存在下で、０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、ｍＶＥＧＦタンパク質及びｍＶＥＧＦ転写物をそれぞれ、細胞培養培地及び細胞溶解物から測定する。ｍＶＥＧＦのタンパク質レベルの測定については、ｍＶＥＧＦのＥＬＩＳＡアッセイによって細胞培養培地を直接測定する。ｍＶＥＧＦの転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてｍＶＥＧＦ転写物のレベルを定量する。非サイレンシング対照のｓｉＲＮＡで形質移入した細胞に比べて生じるＶＥＧＦタンパク質及び転写物のノックダウンの比率を計算する。
【０３１７】
実施例２９
ジオレオイルモノアミン送達剤によって複合体化されたｓｉＲＮＡの投与に続く肺及び肝臓におけるカベオリン−１転写物のノックダウン
カベオリン−１（Ｃａｖ−１）転写物を標的とする製剤化ｓｉＲＮＡ又は非標的性のｓｉＲＮＡ対照をメスＩＣＲマウス（１７〜２２グラム）に静脈内注射する。ｓｉＲＮＡは、１０：１の比でジオレオイルモノアミン送達剤と複合体化させる。合計１００μｇのｓｉＲＮＡを最終容量２００μＬ（０．５ｍｇ／ｍＬ）で注射する。注射後４８時間で動物を安楽死させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いたＣａｖ−１転写物の解析のために肺及び肝臓を回収する。内部対照としてのβ−アクチンに対して転写物レベルを標準化する。結果（図３）は、肺（７６％ノックダウン）及び肝臓（６２%ノックダウン）の双方で標的特異的なＣａｖ−１転写物レベルで有意な低下を示す。各群についてｎ＝５。
【０３１８】
実施例３０
マウスにおける皮下腫瘍に注射されたジオレオイルモノアミン製剤化ｓｉＲＮＡに続く腫瘍阻害を生じるＶＥＧＦ転写物のノックダウン
この実施例では、５×１０５個の扁平上皮癌細胞を注射することによりＣ３Ｈマウスの後脇腹に腫瘍を埋め込んだ。腫瘍は、それが約４０ｍｍ３に達するまで増殖することができた。次いで、５：１のＮ：Ｐ比にてジオレオイルモノアミンによって製剤化された市販のＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡ又は同様に製剤化された非サイレンシング対照のｓｉＲＮＡを腫瘍に注入した。ｓｉＲＮＡの最終濃度は０．３ｍｇ／ｍＬだった。合計３０μＬの製剤化されたｓｉＲＮＡ溶液を腫瘍に注入し、注入は３〜４日ごとに合計６回繰り返した。２回目の製剤化ｓｉＲＮＡの注入後４８時間に転写物の解析のために一部の動物から腫瘍を回収した。この試験の結果（図４）は、ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡの投与が非サイレンシング対照群に比べてＶＥＧＦの転写で３２％の低下を生じたことを示している。最後の腫瘍注入の１週間後では、非サイレンシングｓｉＲＮＡに比べてＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ群における腫瘍容積で３１％の低下があり、無処理の対照動物に比べて５７％の低下があった。ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ処理はさらに、非サイレンシング対照（ｓｉＮＯＮ）群又は無処理群に比べて動物の生存率中央値で１３％の改善を生じた。
【０３１９】
実施例３１
濾過により濃縮された、ジオレオイルモノアミンとのｓｉＲＮＡ形質移入複合体の調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。カチオン性脂質のリポソームは実施例９で以前記載されたように調製する。ｓｉＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルモノアミン（６．４ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製する。２５μＬのｓｉＲＮＡを５００μＬのジオレオイルモノアミン溶液と混合する。その後、５％デキストロースで複合体を０．０３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡに希釈する。希釈した複合体を２５〜５０ｋＤａの遠心フィルターユニットに移し、数分間遠心して残余分で所望のｓｉＲＮＡ濃度に達する。
【０３２０】
実施例３２
濾過により濃縮された、ジオレオイルクロスアミンとのｓｉＲＮＡ形質移入複合体の調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。カチオン性脂質のリポソームは実施例９で以前記載されたように調製する。ｓｉＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）とジオレオイルクロスアミン（５ｍｇ／ｍＬ）の溶液を注射用水にて別々に調製する。５μＬのｓｉＲＮＡを５００μＬのジオレオイルクロスアミン溶液と混合する。その後、５％デキストロースで複合体を０．０３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡに希釈する。希釈した複合体を２５〜５０ｋＤａの遠心フィルターユニットに移し、数分間遠心して残余分で所望のｓｉＲＮＡ濃度に達する。
【０３２１】
実施例３３
ナノ粒子の粒度及びゼータ電位の測定
実施例６及び９のように、ジオレオイルクロスアミン／ｓｉＲＮＡ及びジオレオイルモノアミン／ｓｉＲＮＡを製剤化し、５０ｍＭのＮａＣｌで適当な濃度に希釈する。次いで試料をポリスチレン製のキュベットに加え、９０プラス／ＢＩ−ＭＡＳ粒子サイザーを用いて粒度及びゼータ電位について測定する。観察された粒度は８０〜４００ｎｍの間であり、観察されたゼータ電位は＋１０〜＋４０ｍＶの間である。
【０３２２】
実施例３４
ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−［（メトキシドデカエチレングリコールカルボニルアミノ）エチル］アミン「ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン」（９）の調製
【化２８】
2015147927.tif 000040
メトキシ（ドデカエチレングリコール）（ＭＷ５５０、ポリ分散、約１２のエチレングリコール単位を含有する、７２０ｍｇ、１．３０ミリモル）を８ｍＬの無水トルエンに溶解する。これに、ホスゲンのトルエン溶液（２Ｍ溶液を４ｍＬ、８ミリモル）を加える。反応混合物を室温にて３時間撹拌し、次いで室温にて真空で濃縮して、８１０ｍｇ（１．３１ミリモル）の粗精製のクロロギ酸メトキシ（ドデカエチレングリコール）を得る。
【０３２３】
上記クロロギ酸メトキシ（ドデカエチレングリコール）（８１０ｍｇ、１．３１ミリモル）を６．３１３ｇの塩化メチレンに溶解する。炭酸カリウムによる処理によってジオレオイルモノアミンを遊離の塩基に変換し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥させ、無水油性物質（７００ｍｇ、１．０４ミリモル）を生じ、それを６ｍＬの無水塩化メチレンに再溶解する。撹拌しながら、ジオレオイルモノアミン遊離塩基溶液に、５．６６ｇのクロロギ酸メトキシ（ドデカエチレングリコール）（ｍＰＥＧクロロギ酸の１．０４ミリモル）を加える。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで濃縮し、シリカゲル（塩化メチレンにおける３〜１５％のメタノールの勾配溶出）を用いたクロマトグラフィで精製する。精製によってＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（８３０ｍｇ、０．６６４ミリモル）を得る。
【０３２４】
実施例３５
蛍光タガントを持つモノアミンの調製
塩化スルホローダミンＢアシル（Ｆｌｕｋａ、１１５ｍｇ、０．２ミリモル）を４ｍＬの無水クロロホルムに溶解する。５ｍＬの無水クロロホルム中のジオレオイルモノアミン遊離塩基［１４０ｍｇ、約０．２ミリモル、そのＴＦＡ塩のクロロホルム溶液を炭酸カリウムで処理することによって上記のように調製された］のよく撹拌された溶液に、この溶液を加える。混合物を室温にて３時間撹拌し、次いで濃縮し、２０００ミクロンの厚層シリカゲル分取プレートを用いた［その後、塩化メチレンにおける３〜１５％のメタノールで溶出］クロマトグラフィで精製する。精製によって［ローダミンＢスルホニル］ジオレオイルモノアミン（１２０ｍｇ、０．１ミリモルが得られる。
実施例３６
【０３２５】
α−ラクトビオニルアミド−ω−プロピオン酸ウンデカエチレングリコール−ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］（２−アミノエチル）アミン、「ラクトビオニル−ジオレオイルモノアミン」（１０）の合成
【化２９】
2015147927.tif 000041
Ｆｍｏｃアミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコールリンカー（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ１１−ＣＯＯＨ）（１００ｍｇ、０．１１９ミリモル）とｐ−ニトロフェノール（１８ｍｇ、０．１２９ミリモル）を１ｍＬの塩化メチレンに溶解する。ＤＣＣ（２７ｍｇ、０．１３１モリモル）を１ｍＬの塩化メチレンに溶解し、撹拌しているＰＥＧ／ｐ−ニトロフェノール溶液に加える。室温にて反応を３時間進め、その後、０．４５μｍのシリンジフィルターを用いてＤＣＵを取り除く。炭酸カリウム処理によってジオレオイルモノアミンを遊離の塩基に変換し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥させて７５ｍｇ（０．１１１ミリモル）の乾燥物質を得、それを０．５ｍＬの塩化メチレンに再溶解する。この溶液をｐ−ニトロフェノール活性化α−Ｆｍｏｃアミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコール酸溶液に加える。室温にて反応を１８時間進める。粗精製物質を乾燥させ、１．８ｍＬのジメチルホルムアミドに再溶解し、それに２００μＬのピペリジンを加える。Ｆｍｏｃ切断を１５分間進め、その後、高真空下でジメチルホルムアミドとピペリジンを取り除く。メタノール中８０％の塩化メチレン、その後７５％の塩化メチレンを含有するシリカゲルカラムでの分離によってα−アミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコール−ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］（２−アミノエチル）アミンを単離する。適当な分画を乾燥させ、７５ｍｇ（０．５９ミリモル）の茶色の油性物質を得る。
【０３２６】
一滴のトリフルオロ酢酸を含有するメタノール中で５０℃にて脱水することによって先ず、ラクトビオン酸を相当するラクトンに変換する。１５μＬのジイソプロピルエチルアミンを含有する１．５ｍＬのメタノールにα−アミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコール−ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］（２−アミノエチル）アミン（５０ｍｇ、０．０３９ミリモル）を溶解する。この撹拌している溶液に、無水ラクトビオノラクトン（１５ｍｇ、０．０４４ミリモル）を加える。フラスコを密封し、反応物を６０℃にて２０時間撹拌する。シリンジ濾過によって少量の沈殿物を取り除き、高真空下でα−ラクトビオニルアミノ−ω−プロピオン酸−ウンデカエチレングリコール−ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］（２−アミノエチル）アミンを乾燥させて５７ｍｇ（０．０３５ミリモル）の純粋な物質を得る。
【０３２７】
実施例３７
ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−［ω−プロピオニル−ＬＨＲＨ−オクタエチレングリコールアミノ）エチル］アミン、「ＬＨＲＨ−ジオレオイルモノアミン」（１１）の合成
【化３０】
2015147927.tif 000042
オクタエチレングリコールジプロピオン酸（３４７ｍｇ、０．６７５ミリモル）を８ｍＬの無水塩化メチレンに溶解する。これに、ｐ−ニトロフェノール（２１０ｍｇ、１．５ミリモル）を加え、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（３１３ｍｇ、１．５２ミリモル）を加える。翌日、反応混合物を沈殿したジシクロヘキシルウレアから濾別し、濾液を濃縮し、シリカにおけるクロマトグラフィ（先ずエーテルによる溶出で未反応のｐ−ニトロフェノールを除き、次いで４％メタノール／塩化メチレン）によって溶出する）によって表題の化合物を精製する。
【０３２８】
上記のオクタエチレングリコールジプロピオン酸−ジ−ｐ−ニトロフェノールエステル（５１０ｍｇ、０．６８ミリモル）を６ｍＬの無水塩化メチレンに溶解する。炭酸カリウム処理によってジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］（２−アミノエチル）アミンを遊離の塩基に変換し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥させて乾燥した油性物質（３９０ｍｇ、０．５８ミリモル）を得、それを３ｍＬの塩化メチレンに再溶解する。混合物を一晩撹拌し、次いで前述のジ−ｐ−ニトロフェノールエステルと同様の手順を用いてクロマトグラフィで精製する。未反応のジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］（２−アミノエチル）アミンを分画した後、ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオン酸オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミンｐ−ニトロフェノレート（２６８ｍｇ、０．２０７ミリモル）を回収する。
【０３２９】
市販のＬＨＲＨペプチド（配列：Ａｃ−ＱＨＷＳＹＫＬＲＰ−Ａｍ、ＴＦＡ塩を９８ｍｇ、０．０７８ミリモル）を２ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解し、高真空下で溶液を蒸発させてペプチドを乾燥させる。残留物を１ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解し；上記ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオン酸オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミンｐ−ニトロフェノレート（１３５ｍｇ、０．１０４ミリモル）の１ｍＬジメチルホルムアミド溶液を加え、その後、トリエチルアミン（０．０２８ｍＬ、０．２０１ミリモル）を加える。撹拌した反応混合物を室温にて１７時間保持し、次いで真空で濃縮する。Ｃ８カラムとアセトニトリル／水の勾配溶出（１５分間かけて３０％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）から９０％）を用いた逆相分取用クロマトグラフィによって標的物質の精製を達成し、９７ｍｇのジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオニル−ＬＨＲＨオクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミンを得る。
【０３３０】
実施例３８
ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオニル−ＲＧＤ−オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミン、「ＲＧＤ−ジオレオイルモノアミン」（１２）の合成
【化３１】
2015147927.tif 000043
オクタエチレングリコールジプロピオン酸（３４７ｍｇ、０．６７５ミリモル）を８ｍＬの無水塩化メチレンに溶解する。これに、ｐ−ニトロフェノール（２１０ｍｇ、１．５ミリモル）を加え、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（３１３ｍｇ、１．５２ミリモル）を加える。翌日、反応混合物を沈殿したジシクロヘキシルウレアから濾別し、濾液を濃縮し、シリカにおけるクロマトグラフィ（先ずエーテルによる溶出で未反応のｐ−ニトロフェノールを除き、次いで４％メタノール／塩化メチレン）によって溶出する）によって表題の化合物を精製する。
【０３３１】
上記オクタエチレングリコールジプロピオン酸ジ−ｐ−ニトロフェノールエステル（５１０ｍｇ、０．６８ミリモル）を６ｍＬの無水塩化メチレンに溶解する。炭酸カリウム処理によってジオレオイルモノアミンを遊離の塩基に変換し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥させて乾燥した油性物質（３９０ｍｇ、０．５８ミリモル）を得、それを３ｍＬの塩化メチレンに再溶解する。混合物を一晩撹拌し、次いで上述のジ−ｐ−ニトロフェノールエステルと同様の手順を用いたクロマトグラフィで精製する。未反応のジオレオイルモノアミンを分画した後、ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオン酸オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミンｐ−ニトロフェノレート（２６８ｍｇ、０．２０７ミリモル）を回収する。
【０３３２】
市販のＲＧＤペプチド（配列：Ａ＊ＣＲＧＤＭＦＧ＊ＣＡ（２−９ジスルフィド結合）、ＴＦＡ塩で１１７ｍｇ、０．１００ミリモル）を３ｍＬの無水ジメチルホルムアミドに溶解し、高真空下で溶液を蒸発させてペプチドを乾燥させる。残留物を３ｍＬの無水メタノールに溶解し；上記ジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオン酸オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミンｐ−ニトロフェノレート（１３５ｍｇ、０．１０４ミリモル）の３ｍＬ塩化メチレン溶液を加え、その後、ヒューニッヒの塩基（０．０６５ｍＬ、０．３７０ミリモル）を加える。反応混合物を室温で７２時間撹拌し、次いで真空で濃縮する。Ｃ８カラムとアセトニトリル／水の勾配溶出を用いた逆相分取用クロマトグラフィによって標的物質の精製を達成し、４３ｍｇ（０．０２０ミリモル）のジ−［２−（オレオイルアミノ）エチル］［２−（ω−プロピオニル−ＲＧＤ−オクタエチレングリコールプロピオニルアミノ）エチル］アミンを得る。
【０３３３】
実施例３９
ジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたｓｉＲＮＡの調製
使用するｓｉＲＮＡは、内因性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の転写物及びタンパク質のレベルでのノックダウンを生じることを意図したヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン（実施例３）とｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（実施例３４）の混合物である。リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を所望の濃度にて蒸留水で再水和し、数分間激しく撹拌する。溶液を超音波処理槽に１時間入れ、次いで２００ｎｍのシリンジフィルターを介して濾過し、最終的なリポソーム溶液を得る。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム溶液に加える。
【０３３４】
実施例４０
ジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの調製
この実施例は、ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンを用いたｓｉＲＮＡのリポソーム被包を説明する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性の標的転写物及びタンパク質のレベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン（実施例３）とｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（実施例３４）の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。
【０３３５】
実施例４１
ｓｉＲＮＡとジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの複合体の形質移入活性
ｓｉＲＮＡとジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの複合体の形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性カベオリン−１（Ｃａｖ−１）の転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン（実施例３）とｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（実施例３４）の混合物である。リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を所望の濃度にて蒸留水で再水和し、数分間激しく撹拌する。溶液を超音波処理槽に１時間入れ、次いで２００ｎｍのシリンジフィルターを介して濾過し、最終的なリポソーム溶液を得る。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム溶液に加える。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにてＦＢＳの非存在下又は存在下において０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。その培地にＦＢＳを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。その形質移入培地にＦＢＳを伴った細胞には、１０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、Ｃａｖ−１転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。Ｃａｖ−１転写物の解析を行うには、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、ｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてＣａｖ−１転写物のレベルについて定量する。非サイレンシング対照に比べて、Ｃａｖ−１の転写物は９０％まで阻害される。
【０３３６】
実施例４２
ジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性
ジオレオイルモノアミン／ｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するｓｉＲＮＡは、内因性カベオリン−１（Ｃａｖ−１）の転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン（実施例３）とｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミン（実施例３４）の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。ＳＣＣＶＩＩ細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにてＦＢＳの非存在下又は存在下において０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。その培地にＦＢＳを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。その形質移入培地にＦＢＳを伴った細胞には、１０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、Ｃａｖ−１転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。Ｃａｖ−１転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてＣａｖ−１転写物のレベルについて定量する。非サイレンシング対照に比べて、Ｃａｖ−１の転写物は４５％まで阻害される（図５Ｂを参照）。
【０３３７】
実施例４３
ジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたｓｉＲＮＡの投与に続く肺におけるカベオリン−１転写物のノックダウン
カベオリン−１（Ｃａｖ−１）転写物を標的とする以前製剤化されたｓｉＲＮＡをメスＩＣＲマウス（１７〜２２グラム）に静脈内（ＩＶ）注射する。ｓｉＲＮＡ複合体は、１００、６０、４０、２０又は１０μｇのｓｉＲＮＡと共にジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの１０：０混合物を含有する（Ｎ：Ｐ比、２０：１）（実施例９を参照）。注射後４８時間で動物を安楽死させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いた標的Ｃａｖ−１転写物の解析及びｓｉＲＮＡの定量のために肺を回収する。Ｃａｖ−１転写物のレベル（内部対照としてのβ−アクチンに対して転写物レベルを標準化される）は、未処理の対照動物と比べた発現比率として表される。結果は、１００μｇのｓｉＲＮＡを投与された動物での＞６０％から１０μｇのｓｉＲＮＡを投与された動物での約１３％までに及ぶ動物の肺におけるＣａｖ−１転写物レベルの用量依存性の低下を示す。注射したｓｉＲＮＡの定量は、肺に分布するｓｉＲＮＡの絶対量において用量依存性の増加を示す（図６）。最低用量にて、注射されたｓｉＲＮＡの約５％が肺に分布する。最高用量では、注射されたｓｉＲＮＡの約５０％が肺に分布する。動物の数（「ｎ」）は各群６匹である。
【０３３８】
実施例４４
ジオレオイルモノアミン／ラクトビオニル−ジオレオイルモノアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性
オレオイルモノアミン／ラクトビオニル−ジオレオイルモノアミンによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するｓｉＲＮＡは、β−アクチンの転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルモノアミン（実施例３）とラクトビオニル−ジオレオイルモノアミン（実施例３５）の混合物である。被包リポソームを調製するには、脂質をクロロホルムに溶解し、混合して脂質の均質な混合物を確保する。回転蒸発によって有機溶媒を除き、丸底フラスコの壁上で脂質の薄膜を得る。丸底フラスコを一晩真空ポンプに入れることによってクロロホルムをさらに蒸発させる。得られた脂質膜を先ず１００％エタノールに溶解し、次いで５０％にする。水に溶解したｓｉＲＮＡをリポソーム／エタノールの溶液に加える。回転蒸発方式によってリポソーム／ｓｉＲＮＡの混合物からエタノールを蒸発させる。等量の１０％デキストロースを被包ｓｉＲＮＡ粒子に加えることによって、得られたナノ粒子を５％デキストロースに懸濁する。Ｈｅｐａ１６細胞（０．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積２５０μＬＤＭＥＭにてＦＢＳの非存在下又は存在下において０．５μｇの複合体化ｓｉＲＮＡと共に各ウェルを６時間インキュベートする。その培地にＦＢＳを欠く細胞についてインキュベート時間が終了すると、２０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。その形質移入培地にＦＢＳを伴った細胞には、１０％のＦＢＳを補完した２５０μＬのＤＭＥＭを形質移入した細胞に加え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、β−アクチン転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。β−アクチン転写物の解析については、トリス試薬を用いて細胞を溶解し、次いでｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてβ−アクチン転写物のレベルについて定量する。非サイレンシング対照に比べて、β−アクチンの転写物は９０％まで阻害されるが、ＬＢＡリガンドを欠く同一の粒子を含有する試料は、非サイレンシング対照に比べて５７％の阻害しか示さなかった（図７）。
【０３３９】
実施例４５
ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたｓｉＲＮＡの架橋ゲルからの制御された放出
【０３４０】
実施例３９で記載されたように、５０μｇのＣａｖ−１のｓｉＲＮＡと１．４μｇのジオレオイルモノアミンを５０μＬの容積に含有させて、ジオレオイルモノアミンによって複合体化されたｓｉＲＮＡを製剤化する。アルギン酸ナトリウム（Ａ型）を水に溶解して２％溶液を得る。アルギン酸溶液（１００μＬ）を９６穴プレートの単一のウェルに加え、次いで５０μＬのジオレオイルモノアミン／Ｃａｖ−１のｓｉＲＮＡの溶液を加える。十分に混合した後、５０μＬの０．６８ＭのＣａＣｌ２を前の混合物に加え、ゲルを架橋する。次いで、１００μＬの水又は０．１ＭのＥＤＴＡ（Ｃａ２＋イオンを錯体化することによってゲルを壊すのに役立つ）を加えて水溶液中でのゲルの完全な浸漬を保証する。記載された時点で、上清を取り出し（２００μＬ）、新しい２００μＬの水又は０．１ＭのＥＤＴＡに置き換える。８４時間後、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、回収した試料すべてをＣａｖ−１のｓｉＲＮＡについて解析する。時間をかけて放出された量を判定するために、各時点で回収されたｓｉＲＮＡの量を合計する。ＥＤＴＡの添加を有する試料では、負荷されたジオレオイルモノアミン複合体化ｓｉＲＮＡの１００％が８４時間後放出される。ＥＤＴＡを含有しない試料では、８４時間までに放出される負荷された合計ｓｉＲＮＡの＜２０％で有意に遅い放出動態が認められた（図８）。
【０３４１】
実施例４６
ほかの市販のカチオン性脂質とカチオン性ポリマー系で複合体化したｓｉＲＮＡと比べたジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンで複合体化したｓｉＲＮＡの投与に続く肺におけるカベオリン−１転写物のノックダウン
カベオリン−１（Ｃａｖ−１）転写物を標的とする以前製剤化されたｓｉＲＮＡをメスＩＣＲマウス（１７〜２２グラム）に静脈内（ＩＶ）注射する。ｓｉＲＮＡ複合体は、４０μｇのｓｉＲＮＡと共にジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンの１０：０混合物を含有する（Ｎ：Ｐ比、２０：１）（実施例９を参照）。さらに、２０：１のＮ：Ｐ比でのＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ（１：１）又は２５ｋＤａの分枝鎖ＰＥＩ（１０：１）のいずれかと共にｓｉＲＮＡを製剤化する。ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥと共に製剤化した合計４０μｇのｓｉＲＮＡ）（２００μＬにて）をマウスにＩＶ注射する、又は分枝鎖ＰＥＩと共に製剤化した合計２０μｇのｓｉＲＮＡ）（１００μＬにて）をＩＶ注射する。この製剤に関連する既知の毒性を試み、緩和するために、低い用量で分枝鎖ＰＥＩを用いる。注射の４８時間後に動物を安楽死させ、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いた標的Ｃａｖ−１転写物の解析及びｓｉＲＮＡの定量のために肺及び肝臓を回収する。Ｃａｖ−１転写物のレベル（内部対照としてのβ−アクチンに対して転写物レベルを標準化される）は、未処理の対照動物と比べた発現比率として表される。動物の数（「ｎ」）は各群５匹である。結果は、肺におけるＣａｖ−１発現にて有意な転写物のノックダウン（約６０％）及び肝臓における約３３％の転写物ノックダウンを示す。ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥで製剤化したｓｉＲＮＡについて有意な転写物ノックダウンは言及されない。分枝鎖ＰＥＩで製剤化したｓｉＲＮＡについては、組織を回収する前に製剤に関連する毒性のために動物が死亡したので、解析できなかった；ジオレオイルモノアミンとｍＰＥＧ−ジオレオイルモノアミンで製剤化したｓｉＲＮＡ及びＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥで製剤化したｓｉＲＮＡは、毒性がほとんどなく投与された。
【０３４２】
実施例４７
ジオレオイルクロスアミン／ＰＳＭＡターゲティングアプタマーによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性
ジオレオイルクロスアミン／ＰＳＭＡターゲティングアプタマーによって被包されたｓｉＲＮＡの形質移入活性を試験管内で以下のように測定する。使用するｓｉＲＮＡは、Ｃａｖ−１の転写物レベルのノックダウンを生じるように意図されたヌクレオチドの二本鎖配列である。使用するカチオン性脂質は、ジオレオイルクロスアミン（実施例１）である。ＲＮＡアプタマーは前立腺特異的膜抗原を標的とし、３’末端にｓｓＲＮＡウリジンテイルを含む（ＰＳＭＡアプタマーの配列：５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＡＵＧＵＵＵＡＣＧＵＣＡＣＵＣＣＵＡＡＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ−３’）。非結合性の変異アプタマーを陰性対照として含める（変異ＰＳＭＡアプタマーの配列：５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＡＵＣＣＵＵＡＣＧＵＣＡＣＵＣＣＵＡＡＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ−３’）。被包したリポソームは実施例４５で記載されたように調製する。ＲＮＡアプタマーを被包リポソームに加え、室温で３０分間インキュベートすることによって標的化されたリポソームを調製する。ＬＮＣａｐ細胞（２．５×１０５個の細胞／ウェル）を１０％ＦＢＳにて２４穴組織培養プレートに播く。総容積５００μＬのＲＰＭＩ１６４０にてＦＢＳの非存在下において０．１μｇの標的化リポソーム又は非標的化対照リポソームと共に各ウェルを５時間インキュベートする。インキュベート時間が終了すると、１０％のＦＢＳを補完した５００μＬのＲＰＭＩ１６４０で培地を置き換え、さらに４０時間インキュベートする。インキュベート時間の終了時、Ｃａｖ−１転写物のノックダウンを細胞溶解物で測定する。転写物の解析については、細胞を溶解し、ＱｉａｇｅｎのＲＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎの製品番号：７４１０６）を用いて全ＲＮＡを精製する。ｑＲＴ−ＰＣＲ検出キットを用いてＣａｖ−１とＧＡＰＤＨ（内部対照）の転写物レベルを定量する。非サイレンシング対照に比べて、Ｃａｖ−１転写物レベルは、ＰＳＭＡターゲティングリポソームで処理された細胞では７０％枯渇する。これは、非ターゲティング変異ＰＳＭＡアプタマーで処理した細胞とは対照的であり、それは、非サイレンシング対照と比べてＣａｖ−１転写物の枯渇を示さない。前立腺特異的膜抗原を欠く細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）の処理は、ターゲティングアプタマーの同一性とは無関係に、非サイレンシング対照と比べてＣａｖ−１枯渇の類似したレベル（約３５％）を示す（図１０）。
【０３４３】
本発明及びそれを作製する及び使用する方法及び工程を、当業者が同様に作製し、使用できるように完全な、明瞭な、簡明な及び正確な用語で記載している。前述は本発明の好ましい実施形態を記載し、特許請求の範囲で言及されるような本発明の精神又は範囲を逸脱することなく、そこで改変が為されてもよいことが理解されるべきである。本発明とみなされる主題を特に指摘し、はっきりと主張するために、以下の特許請求の範囲が、本明細書を結論付ける。
本発明の好ましい態様には以下が含まれる。
（１）
式
【化３２】
2015147927.tif 000044
の化合物であって、式中
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である
化合物。
（２）
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が結合である（１）に記載の化合物。
（３）
少なくともＲ１及びＲ２の一方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１）に記載の化合物。
（４）
Ｒ１及びＲ２の双方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１）に記載の化合物。
（５）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１）に記載の化合物。
（６）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１）に記載の化合物。
（７）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（１）に記載の化合物。
（８）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（１）に記載の化合物。
（９）
−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す（８）に記載の化合物。
（１０）
式
【化３３】
2015147927.tif 000045
の化合物であって、式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、水素又はポリマー部分である
化合物。
（１１）
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合である（１０）に記載の化合物。
（１２）
少なくともＲ１及びＲ２の一方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である１０に記載の化合物。
（１３）
Ｒ１及びＲ２の双方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１０）に記載の化合物。
（１４）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１０）に記載の化合物。
（１５）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（１０）に記載の化合物。
（１６）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（１０）に記載の化合物。
（１７）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（１０）に記載の化合物。
（１８）
−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す（１７）に記載の化合物。
（１９）
Ｇ１及びＧ２の一方がポリマー部分であり、他方が水素である（１０）に記載の化合物。
（２０）
Ｇ１及びＧ２の一方が、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である（１９）に記載の化合物。
（２１）
ポリマーが、ポリマー単位間での少なくとも１つのリンカー基を含む（２０）に記載の化合物。
（２２）
ポリマー部分が、ポリオキシアルキレンである（１９）に記載の化合物。
（２３）
ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである（１９）に記載の化合物。
（２４）
ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含み、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化３４】
2015147927.tif 000046
であり、
式中
2015147927.tif 000047
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである２１に記載の化合物。
（２５）
ポリマーが、ポリオキシアルキレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である（２１）に記載の化合物。
（２６）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖又は分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖又は分枝鎖のポリオキシブチレンである（２５）に記載の化合物。
（２７）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレンである（２５）に記載の化合物。
（２８）
式
【化３５】
2015147927.tif 000048
の化合物であって、式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔ１及びＴ２は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、水素又はポリマー部分であり、
Ｔ１及びＴ２の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである
化合物。
（２９）
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合である２８に記載の化合物。
（３０）
少なくともＲ１及びＲ２の一方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（２８）に記載の化合物。
（３１）
Ｒ１及びＲ２の双方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（２８）に記載の化合物。
（３２）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（２８）に記載の化合物。
（３３）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（２８）に記載の化合物。
（３４）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（２８）に記載の化合物。
（３５）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（２８）に記載の化合物。
（３６）
−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す（３５）に記載の化合物。
（３７）
Ｇ１及びＧ２の一方がポリマー部分であり、他方が水素である（２８）に記載の化合物。
（３８）
Ｇ１及びＧ２の一方が、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である（３６）に記載の化合物。
（３９）
ポリマーが、ポリマー単位間での少なくとも１つのリンカー基を含む（３８）に記載の化合物。
（４０）
ポリマー部分が、ポリオキシアルキレンである（３７）に記載の化合物。
（４１）
ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである（３７）に記載の化合物。
（４２）
ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含み、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化３６】
2015147927.tif 000049
であり、
式中
2015147927.tif 000050
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ，−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである（３９）に記載の化合物。
（４３）
ポリマーが、ポリオキシアルキレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である（３９）に記載の化合物。
（４４）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖又は分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖又は分枝鎖のポリオキシブチレンである（４３）に記載の化合物。
（４５）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが葉酸基である（４３）に記載の化合物。
（４６）
ターゲティングリガンドが、薬学上活性のある小分子、融合性ペプチド、エンドソーム溶解剤、融合性ペプチド、細胞膜透過剤、電荷遮蔽剤、又は核酸である（２８）〜（４５）のいずれかに記載の化合物。
（４７）
薬学上活性のある小分子が、ビオチン、ガラクトース、アセチルサリチル酸、及びナプロキセンである（４６）に記載の化合物。
（４８）
式
【化３７】
2015147927.tif 000051
の化合物であって、式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｇは水素又はポリマー部分である
化合物。
（４９）
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が結合である（４８）に記載の化合物。
（５０）
少なくともＲ１及びＲ２の一方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である４８に記載の化合物。
（５１）
Ｒ１及びＲ２の双方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（４８）に記載の化合物。
（５２）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（４８）に記載の化合物。
（５３）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（４８）に記載の化合物。
（５４）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（４８）に記載の化合物。
（５５）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（４８）に記載の化合物。
（５６）
−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基を表す（５５）に記載の化合物。
（５７）
Ｘが酸素である（４８）に記載の化合物。
（５８）
Ｘが窒素である（４８）に記載の化合物。
（５９）
Ｇが、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である（４８）に記載の化合物。
（６０）
ポリマーが、ポリマー単位間での少なくとも１つのリンカー基を含む（５９）に記載の化合物。
（６１）
ポリマー部分が、ポリオキシアルキレンである（５９）に記載の化合物。
（６２）
ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである（５９）に記載の化合物。
（６３）
ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含み、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化３８】
2015147927.tif 000052
であり、
式中
2015147927.tif 000053
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである（６０）に記載の化合物。
（６４）
ポリマーが、ポリオキシアルキレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である（６０）に記載の化合物。
（６５）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖又は分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖又は分枝鎖のポリオキシブチレンである（６４）に記載の化合物。
（６６）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレンである（６４）に記載の化合物。
（６７）
式
【化３９】
2015147927.tif 000054
の化合物であって、式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔはタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇは結合又はポリマー部分である
化合物。
（６８）
ｎ１、ｎ２、及びｎ３がすべて１であり、Ｘ及びＸ’が双方共結合である（６７）に記載の化合物。
（６９）
少なくともＲ１及びＲ２の一方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（６７）に記載の化合物。
（７０）
Ｒ１及びＲ２の双方が１〜４の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（６７）に記載の化合物。
（７１）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（６７）に記載の化合物。
（７２）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基である（６７）に記載の化合物。
（７３）
Ｒ１及びＲ２が独立して１〜２の二重結合を含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（６７）に記載の化合物。
（７４）
Ｒ１及びＲ２が独立して二重結合を１つ含有するＣ１４〜Ｃ２０炭化水素基である（６７）に記載の化合物。
（７５）
Ｘ及びＸ’が独立して結合であり、−Ｃ（Ｏ）Ｘ−Ｒ１及び−Ｃ（Ｏ）Ｘ’−Ｒ２の双方がオレオイル基である（７４）に記載の化合物。
（７６）
Ｇの一方が、ポリオキシアルキレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコ−ル、デキストラン、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、スチレン無水マレイン酸、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、又はポリジビニルエ−テル無水マレイン酸である（６７）に記載の化合物。
（７７）
ポリマーが、ポリマー単位間での少なくとも１つのリンカー基を含む（７６）に記載の化合物。
（７８）
ポリマー部分が、ポリオキシアルキレンである（７６）に記載の化合物。
（７９）
ポリマーの分子量が約２００〜１０，０００Ｄａである（７６）に記載の化合物。
（８０）
ポリマー部分が、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−及び−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−から選択される少なくとも１つのリンカーを含み、式中、Ｒ３は水素、又は任意で置換されるアルキル、及び
【化４０】
2015147927.tif 000055
であり、
式中
2015147927.tif 000056
は、
アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、複素環及び置換複素環から成る群から選択され、Ｄ及びＥは、独立して、結合、−Ｏ−、ＣＯ、−ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−、−アルキレン−ＮＲ３−、−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−、アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−ＮＲ３−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ、−ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−Ｏ−アルキレンオキシ−、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレンオキシ−、−アルキレンオキシ−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレンオキシ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３−アルキレン−、アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アルキレン−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）−アルキレン−及び−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３−アルキレン−から成る群から選択され、Ｒ３は上記で定義されたとおりである（７７）に記載の化合物。
（８１）
ポリマーが、ポリオキシアルキレンであり、オキシアルキレン基が独立して、その反復単位に２〜５の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖のポリオキシアルキレン基である（７７）に記載の化合物。
（８２）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレン、直鎖又は分枝鎖のポリオキシプロピレン、又は直鎖又は分枝鎖のポリオキシブチレンである（８１）に記載の化合物。
（８３）
ポリオキシアルキレンが、ポリオキシエチレンであり、ターゲティングリガンドが葉酸基である（８１）に記載の化合物。
（８４）
１〜８３又は１０４のいずれかの化合物と、
（ａ）リボゾームＲＮＡ；ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド；アプタマー；リボザイム；ｓｉＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；及び治療上有用なタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのポリヌクレオチド；
（ｂ）アプタマー；又は
（ｃ）タンパク質、ペプチド、コレステロール、ホルモン、小分子医薬化合物、ビタミン及び補因子
から成る群から選択される分子とを含む製剤。
（８５）
製剤が、前記化合物及び前記分子によって形成される粒子を含む（８４）に記載の製剤。
（８６）
粒子が、約５００ｎｍ未満の直径中央値を有する（８５）に記載の製剤。
（８７）
（８４）の製剤に細胞を接触させることを含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法。
（８８）
標的配列の発現を調節する方法であって、治療上有効な量の（８４）の製剤を哺乳類対象に投与することを含む方法。
（８９）
ｓｉＲＮＡの生体内での送達方法であって、治療上有効な量の（８４）の製剤を哺乳類対象に投与することを含む方法。
（９０）
哺乳類対象において疾患を治療する又は予防する方法であって、治療上有効な量の（８４）の製剤を前記対象に投与することを含む方法。
（９１）
分子と化合物がリポプレックスを形成する８４に記載の製剤。
（９２）
化合物によって形成されるリポソームの中に分子が少なくとも部分的に存在する８４に記載の製剤。
（９３）
分子がリポソームの中に被包される（９２）に記載の製剤。
（９４）
細胞における遺伝子の発現を阻害する方法であって、（８４）の製剤に細胞を接触させることを含む方法。
（９５）
試験管内で細胞が接触させられる（９４）に記載の方法。
（９６）
生体内で細胞が接触させられる（９４）に記載の方法。
（９７）
細胞が哺乳類細胞である（９５）に記載の方法。
（９８）
哺乳類細胞がヒト細胞である（９７）に記載の方法。
（９９）
プラスミドＤＮＡの生体内での送達方法であって、治療上有効な量の８４の製剤を哺乳類対象に投与することを含む方法。
（１００）
用具内に捕捉された又は被包された（８４）の製剤を含有する埋め込み型用具であって、前記用具が製剤に加えて、生分解性及び／又は生体適合性の薬剤放出物質を含む用具。
（１０１）
用具が対象の体内への埋め込みに好適な大きさと形状を有する（１００）に記載の用具。
（１０２）
用具内に捕捉された又は被包された（８４）の製剤を含有する注入型用具であって、前記用具が製剤に加えて、生分解性及び／又は生体適合性の薬剤放出物質を含む用具。
（１０３）
用具が対象の体内への注入に好適な大きさと形状を有する（１００）に記載の用具。
（１０４）
式
【化４１】
2015147927.tif 000057
の化合物であって、式中、
ｎ１、ｎ２、及びｎ３は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
ＲＮは、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５又はＮ＋Ｒ４Ｒ５Ｒ６を表し、その際、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はＣ１〜Ｃ６アルキルを表す
化合物。
【図１】
2015147927.tif 000066
【図２】
2015147927.tif 000067
【図３】
2015147927.tif 000068
【図４Ａ】
2015147927.tif 000069
【図４Ｂ】
2015147927.tif 000070
【図５Ａ】
2015147927.tif 000071
【図５Ｂ】
2015147927.tif 000072
【図６】
2015147927.tif 000073
【図７】
2015147927.tif 000074
【図８】
2015147927.tif 000075
【図９】
2015147927.tif 000076
【図１０】
2015147927.tif 000077
【配列表】
2015147927000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月3日(2015.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔ１及びＴ２は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、結合又はポリマー部分であり、
Ｔ１及びＴ２の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
式中、
ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は独立して１、２、３又は４であり、
Ｘ及びＸ’は独立して結合、酸素、又は窒素であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、任意で１〜４の二重結合又は三重結合を含有するＣ８〜Ｃ２５炭化水素基であり、
Ｔ１及びＴ２は独立して、水素又はタ−ゲティングリガンドであり、
Ｇ１及びＧ２は独立して、結合又はポリマー部分であり、
Ｔ１及びＴ２の少なくとも一方はタ−ゲティングリガンドである。