(57)【要約】      （修正有）【課題】患者によって提供された尿サンプルから高リスク形態のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を分別検出するための組成物及び方法の提供。【解決手段】ＨＰＶのＥ１遺伝子内の配列を特異的に認識及び結合するプライマー並びにプローブ。高リスク形態のＨＰＶの検出によって、子宮頸癌腫の発生の危険性がある、又は初期の病期にある個体が同定する方法。また、ＨＰＶに対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。【選択図】図１
2015130863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる配列を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
【請求項２】
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７の相補的配列を含む組成物。
【請求項３】
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５によってコードされる配列を含む、高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
【請求項４】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５による配列によってコードされるオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項５】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の相補的配列を含む組成物。
【請求項６】
ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して相同な配列を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
【請求項７】
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子のヌクレオチド９８７〜１１３５を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記配列が配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％同一である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％相同である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１１】
患者におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を診断する方法であって、
（ａ）該患者から尿サンプルを入手する工程；および
（ｂ）該尿サンプルにおいてＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出する工程；
を含み、ＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出することが、少なくとも１つのヒトパピローマウイルスの存在を示し、それによって患者におけるＨＰＶ感染を診断する、方法。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡが経腎臓性ＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出工程が、ハイブリダイゼーション；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ネステッドプライマーＰＣＲ；リアルタイムＰＣＲ；ＮＡハイブリダイゼーション；サイクリックプローブ反応；一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）；鎖置換増幅（ＳＴＡ）；および制限断片長多型（ＲＦＬＰ）からなる群から選択される技術を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出工程が、ＨＰＶのＥ１遺伝子中の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出工程が、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４１および４２のプライマーの対を使用する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４７と５８、４８と３３、４９と３４、５０と３６、５１と５９、５２と３８、５３と３９、または５４と４０によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３４、３５、３６、５９、３８、３９、および４０からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４８と３３、５０と３６、５１と５９、および５２と３８によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３５、３６、５９、３８、および３９からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記尿サンプルにおける核酸分解を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸分解を減少させることが、上昇させたｐＨ、増大させた塩濃度、熱不活性化によって、または前記尿サンプルを、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンＨＣＩ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で処理することによって、ヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）が、前記尿サンプル中の前記核酸を実質的に単離する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離が、沈降によるまたは固形吸着物質を用いることによるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
夾雑物を除去するために前記尿サンプルを濾過する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記濾過によって、約１０００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記濾過によって、約３００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸を定量化する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年１０月３１日に出願された米国仮出願第６１／１９７，８５０号に対する優先権およびその利益を主張する。この出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、医学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、最も一般的な高リスクＨＰＶ遺伝子型を低リスクの対応物に対して検出することによる鑑別診断のための特異的マーカーとしてのパピローマウイルスゲノムのＥ１遺伝子フラグメントの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
最新の世界的な概算によると、女性の間では毎年新たに４９３，０００人の子宮頸癌の患者が生じ、年に２７４，０００人の女性が当該疾患で死亡している（Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｆｅｒｌａｙら、２００２，ＧＬＯＢＯＣＡＮ）。当該疾患は長年にわたって進行するため、全世界で推定１４０万人の女性が子宮頸癌を抱えて生活しており、また２〜５倍、すなわち全世界で最大７００万人の女性が同定および処置される必要のある前癌症状を有している可能性がある（Ｆｅｒｌａｙら、２００２，ＧＬＯＢＯＣＡＮ；非特許文献１）。
有効なスクリーニングおよび処置ストラテジーの欠如が、先進国と比較して発展途上国において子宮頸癌率が有意に高いことの主要な原因である。
【０００４】
スクリーニングの取り組みは、異常な子宮頸部細胞を検出するために１９４０年代に開発された臨床検査である子宮頸部細胞診に大きく依存している。当該検査は、定期的な質の高いスクリーニングを提供する先進工業国において驚異的な成功を収めている。しかしながら、子宮頸部細胞診プログラムは複雑でかつ実行するのに費用がかかり、保健システムおよびインフラが脆弱である発展途上国では、かなりの割合の女性に到達していない。重要なことには、ある国では女性が文化的制限のために子宮頸部細胞診の手法を実施または承諾しない。さらに、子宮頸部細胞診検査にともなう分析の問題がある。子宮頸部細胞診は、すべての症例の子宮頸部異形成または前悪性腫瘍を検出するわけではない。医師が医学的な勧告をするのを導く検査の偽陰性に対して、現在の許容され得る割合はおよそ５〜１０％であるが、最近の調査では子宮頸部細胞診の実際の割合ははるかに高い可能性があることが示唆されている（非特許文献２；非特許文献３）。子宮頸部細胞診は、およそ７〜８％の症例を意義不明な異型扁平上皮（ＡＳＣＵＳ）として定義する。さらなる２０〜３０％の症例では、子宮頸部細胞診は、炎症細胞の存在のために解釈には不十分であり得る。現在、子宮頸部細胞診検査にともなう欠点を克服するために、女性における頸部前悪性腫瘍症状を早期発見するための、分析上より信頼性のある新しいアッセイを開発するより多くの研究が進行中である。そのアプローチの一つは、子宮頸部の一致したＨＰＶ感染と浸潤性子宮頸癌の発生との間の広く受け入れられている関連性に基づき、当該ウイルスの検出に向けられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｏｓｃｈら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．（２００２）５５：    ２４４−２６５
【非特許文献２】Ｎａｎｄａ  Ｋ．ら、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．（２０００    ）１３２：８１０−８１９
【非特許文献３】Ｋｕｌａｓｉｎｇａｍ  Ｓ．ら、ＪＡＭＡ．（２００２）２８８：    １７４９−１７５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、高リスク型ＨＰＶを分別検出するための組成物および方法を提供する。具体的には、新規に同定されたＨＰＶゲノムのフラグメントを、この高リスク型ウイルスを分別検出するためのマーカーとして用いる。このマーカーフラグメントを標的とするオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ組成物を用いて、尿などの臨床サンプル中の高リスクＨＰＶを検出する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
具体的には、本発明は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物を提供する。あるいは、または加えて、本発明は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７の相補的配列を含む組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５によってコードされる配列を含有する高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５による配列によってコードされるオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。あるいは、または加えて、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の相補的配列を含む組成物を提供する。
【０００９】
さらに本発明は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して相同な配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物を提供する。一態様において、当該配列はＨＰＶのＥ１遺伝子のヌクレオチド９８７〜１１３５を含む。別の態様において、当該配列は配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる。本発明は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％同一である、またはその間の任意のパーセンテージポイントである配列を包含する。好ましい実施形態において、当該配列はＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％同一である。本発明は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％相同である、またはその間の任意のパーセンテージポイントである配列を包含する。好ましい実施形態において、当該配列はＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％相同である。
【００１０】
本発明は、患者におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を診断する方法であって、（ａ）前記患者から尿サンプルを入手する工程；および（ｂ）前記尿サンプルにおいてＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出する工程；を含めており、ＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出することが、少なくとも１つのヒトパピローマウイルスの存在を示し、それによって患者におけるＨＰＶ感染を診断する方法を提供する。この方法によれば、当該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。この方法の好ましい実施形態において、当該ＤＮＡは経腎臓性（ｔｒａｎｓｒｅｎａｌ）ＤＮＡである。この方法は、経腎臓性ＤＮＡを含むＨＰＶ  ＤＮＡを検出する。あるいはこの方法は、経腎臓性ＤＮＡだけを検出する。
【００１１】
この方法のある実施形態において、当該検出工程は、ハイブリダイゼーション；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ネステッドプライマーＰＣＲ；リアルタイムＰＣＲ；ＮＡハイブリダイゼーション；サイクリックプローブ反応（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）；一本鎖高次構造多型（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＴＡ）；および制限断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＲＦＬＰ）からなる群から選択される技術を含む。
【００１２】
当該検出工程は、ＨＰＶのＥ１遺伝子中の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む。さらに、当該検出工程は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む。あるいは、または加えて、当該検出工程は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５によってコードされる配列、あるいはその相補的な配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む。本明細書に記載される方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を用いてＨＰＶを検出する場合、当該ポリメラーゼ連鎖反応は配列番号：４１および４２のプライマーの対を使用する。配列番号：４１および４２のプライマーの対は、高リスク形態のＨＰＶを分別して検出する。あるいは、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４７と５８、４８と３３、４９と３４、５０と３６、５１と５９、５２と３８、５３と３９、または５４と４０によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する。ある実施形態において、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３４、３５、３６、５９、３８、３９、および４０からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する。当該ポリメラーゼ連鎖反応は、さらに、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４８と３３、５０と３６、５１と５９、および５２と３８によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する。ある態様において、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３５、３６、５９、３８、および３９からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する。
【００１３】
本発明のある実施形態において、１本のチューブに含有されるＰＣＲ反応液に複数のプライマーの対を添加する。集団ＰＣＲ反応には、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５対、またはその間の任意の数のプライマーが含まれる。集団ＰＣＲ反応を用いて、生物学的または臨床の尿サンプル中に存在する可能なすべての形態のＨＰＶを同定する。例えば、表３、表４、または表５において一覧にしたプライマーを、単一ＰＣＲ反応の下で任意の所与のサンプルに適用する。
【００１４】
この方法のある態様に従って、前記尿サンプルにおける核酸分解を減少させる。核酸分解を減少させることには、上昇させたｐＨ、増大させた塩濃度、熱不活性化によって、または前記尿サンプルを、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンＨＣＩ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で処理することによって、ヌクレアーゼ活性を阻害することが含まれる。
【００１５】
この方法の検出工程は、前記尿サンプル中の前記核酸を実質的に単離することをさらに含めている。単離は、沈降によってまたは固形吸着物質を用いることによって行われる。
【００１６】
この方法は、夾雑物を除去するために当該尿サンプルを濾過することをさらに含む。一態様において、濾過によって、約１０００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される。別の態様において、濾過によって、約３００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される。
【００１７】
またこの方法は、前記核酸を定量化する工程をさらに含めている。定量化は、当該技術分野において既知の方法によって達成される。
【００１８】
特に定義されていない限り、本明細書において使用したすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載したものと類似のまたは同等の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。すべての刊行物、特許出願、特許、および本明細書において言及した他の参考文献は、参照することによりそれらの全体として組み込まれているものとする。対立した場合、定義を含む本明細書が制御するであろう。さらに、当該材料、方法、および実施例は一例にすぎず、制限することを意図するものではない。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＨＰＶ１６のゲノムにおけるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の概略図または地図である。
【図２】図２は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に位置するプライマーを用いて増幅された、個    々のＨＰＶ遺伝子型のＰＣＲ産物を図示しているゲル電気泳動分析の写真である。
【図３】図３は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に位置する配列番号：４１および配列番号：４２の単一のプライマーの対を用いて増幅された、個々のＨＰＶ遺伝子型のＰＣＲ産物を図示しているゲル電気泳動分析の写真である。
【図４】図４は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に位置する配列番号：４１および配列番号：４２の単一のプライマーの対を用いて増幅された、子宮頸癌を有する患者から回収された尿ＤＮＡについて行われたＨＰＶ  ＰＣＲ検査のＰＣＲ産物を図示しているゲル電気泳動分析の写真である。
【図５】図５は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に位置するすべての高リスク特異的プライマー（表４を参照されたい）を用いて増幅された、個々のＨＰＶ遺伝子型のＰＣＲ産物を図示しているゲル電気泳動分析の写真である。
【図６】図６は、単一チューブのＰＣＲ反応においてすべての高リスク特異的プライマーの混合物を用いて増幅された、子宮頸癌を有する患者から回収された尿ＤＮＡについて行われたＨＰＶ  ＰＣＲ検査のＰＣＲ産物を図示しているゲル電気泳動分析の写真である。当該プライマーはＨＰＶのＥ１遺伝子に位置するものであった。
【図７】図７は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に位置する高リスク特異的プライマーの一部（表５を参照されたい）を用いることによる、個々のＨＰＶ遺伝子型のＰＣＲ産物を図示しているゲル電気泳動分析の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、皮膚および粘膜上皮の良性および悪性病変に関連する上皮親和性ウイルスである（当該ウイルスの遺伝子地図についての図１）。ＨＰＶ感染とそれに続く子宮頸癌の発生との間には、十分に立証された因果関係が存在する。また、ＨＰＶ感染と頭頸部、呼吸器組織、および乳房の癌とを関連づける観察結果も存在する（Ｂｒａａｋｈｕｉｓら、２００４，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９６（１３）：９９８−１００６；Ｄａｈｌｓｔｒａｎｄら、２００４，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４（３ｂ）：１８２９−３５；Ｄａｌｉｎｇら、２００４，Ｃａｎｃｅｒ  １０１（２）：２７０−８０；Ｈａら、２００４，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１５（４）：１８８−９６；Ｈａｆｋａｍｐら、Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１２４（４）：５２０−６；Ｈａｒｗｏｏｄら、２００４，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５０（５）：９４９−５７；Ｒｅｅｓら、２００４，Ｃｌｉｎ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２９（４）：３０１−６；Ｗｉｄｓｃｈｗｅｎｄｔｅｒら、２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．３１（４）：２９２−７）。
【００２２】
１００種を超える異なる型のＨＰＶがこれまでに同定されており（Ａｎｔｏｎｓｓｏｎ，Ａ．ら、２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１６３６−１１６４１；Ｃｈａｎ，Ｓ．  Ｙ．ら、１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３０７４−３０８３；ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．ら、２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２４：１７−２７）、そのうちの４０種は肛門性器系感染で報告されている（ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ  Ｅ−Ｍ．２００１，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐ．１２：５７−６３；Ｖｉｌｌｉｅｒｓ  ＥＭら、２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｊｕｎ  ２０；３２４（１）：１７−２７）。ＨＰＶの疫学的分類に基づき、１５種の高リスクおよび５種の低リスクのウイルス遺伝子型が存在する（Ｍｕｎｏｚ  Ｎら、２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，３４８，５１８−５２７）。１００％近くの浸潤性子宮頸癌および高悪性度の前癌性上皮内新生物は、高リスクのＨＰＶ感染による感染と関連していることが認められている。このことが、女性のスクリーニングおよびそれに続く子宮頸癌の発生の危険性がある個体の同定のために、高リスクＨＰＶの検出を使用する論理的根拠である。
【００２３】
ＨＰＶをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することはできず、また血清学的アッセイがまだ無効であるため、ＨＰＶ感染の診断は分子ツールの使用に基づいている。直接的なドット・スポット検出およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイが記載されているが（Ｍｅｌｃｈｅｒｓ  ＷＪら、１９８８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  ２５：１１−１６；  Ｍｅｌｃｈｅｒｓ  ＷＪ，１９８９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２７：１０６−１１０）、これらの方法は冗長であり、また感度および特異性を欠いているように思われる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等のＤＮＡ増幅法は、ウイルスＤＮＡのより高感度な検出を可能にする。個々のＨＰＶ遺伝子型に対する型特異的なＰＣＲプライマーに加えて（Ｂａａｙ  ＭＦら、１９９６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３４：７４５−７４７；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｌｅ  ＡＪら、１９８９，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ，２９：２０−２７）、ＭＹ１１／ＭＹ０９（Ｍａｎｏｓ  ＭＭら、１９８９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，７：２０９−２１４）、ＯＢＩ／ＩＩ（Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ａら、１９９１，ＡＰＭＩＳ，９９：６６７−６７３）、ＣＰＩ／ＣＰＩＩＧ（Ｔｉｅｂｅｎ  ＬＭら、１９９３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，４２：２６５−２７９）、ＧＰ５＋／６＋（ｄｅ  Ｒｏｄａ  Ｈｕｓｍａｎ  ＡＭら、１９９５，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７６：１０５７−１０６２）、ＳＰＦプライマー（Ｋｌｅｔｅｒ  Ｂら、１９９８，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｄｅｃ；１５３（６）：１７３１−９）、およびＳＰＦプライマー由来のＨＰプライマー（Ｐａｙａｎ  Ｃら、２００７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５（３）：８９７−９０１）を含めた、いくつかのユニバーサルＰＣＲプライマーセットが開発されている。これらすべてのプライマーは、特異的プローブを用いて、低リスク型から高リスク型というその後の分化を有するＨＰＶサブタイプすべての検出を目的としたものであった。同様に、臨床試料中のＨＰＶを検出するためのプライマーおよびプローブを開示している交付済み特許が多数存在する（６，５８３，２７８，２００３年６月，Ｃａｒｔｅｒ；Ｎ．Ｍ．（Ｅ６およびＥ７）；６，５０３，７０４，２００３年１月，Ｍａｈｏｎｙら（Ｌ１）；６，３５５，４２４，２００２年３月，Ｌｏｒｉｎｃｚら；６，２２８，５７７，２００１年５月，Ｍａｈｏｎｙら；６，２１８，１０４，２００１年４月，Ｍｏｒｒｉｓら；６，０４５，９９３，２０００年４月，Ｍａｈｏｎｙら；５，８８８，７２４，１９９９年３月，Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎら；５，７８３，４１２，１９９８年７月，Ｍｏｒｒｉｓら；５，７０５，６２７，１９９８年１月，Ｍａｎｏｓら；５，６３９，８７１，１９９７年６月，Ｂａｕｅｒら；５，５２７，８９８，１９９６年６月，Ｂａｕｅｒら；５，４４７，８３９，１９９５年９月，Ｍａｎｏｓら；５，２８３，１７１，１９９４年２月，Ｍａｎｏｓら；５，１８２，３７７，１９９３年１月，Ｍａｎｏｓら；５，５０１，９４７，１９９６年３月，Ｅｍｅｒｙら）。
【００２４】
本発明は、あらゆる様式：（ｉ）核酸（ＮＡ）増幅または他の分析方法のみを用いることによる最も高頻度な高リスク型の直接的検出；（ｉｉ）２段階プロセス（ハイブリダイゼーションによる産物のその後の分析をともなうＮＡ増幅）を用いることによる最も高頻度な高リスク型の直接的検出；ならびに（ｉｉｉ）単一反応での高リスクおよび低リスクのＨＰＶ型の増幅および分析；でＨＰＶを検出するプライマーおよびプローブを提供する。本発明はさらに、ＨＰＶのＥ１遺伝子領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計および使用するための方法を提供する。重要なことには、本発明の組成物および方法は、ＨＰＶ感染にともなう疾患の検出、スクリーニングおよびモニタリングの長年にわたる必要性に対処する。
【００２５】
ＨＰＶスクリーニングに対する現在利用可能な検査の欠点の一つは、ＤＮＡの供給源、つまり子宮頸部細胞である。患者由来の子宮頸部細胞の回収は、診療所への訪問および少なくとも熟練技術者、しかしよりふさわしくは試料回収を行う資格を持つ医師を必要とする。さらに、当該手法は患者にとって侵襲的かつ不快なものである。子宮頸部細胞の回収に先行する障害は、アメリカ合衆国における女性の約３０％が定期的に子宮頸部細胞診の診察を受けないという理由であり得ると示唆されている（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ  ＳＰら、１９９２，ＭＭＷＲ  ＣＤＣ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌ  Ｓｕｍｍ，４１：１７−２５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＬＭ，Ｍａｙ  ＤＳ．１９９５，Ａｍ  Ｊ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，８５：８４０−２）。さらに、子宮頸部の試料採取および一般的な膣内診のための産婦人科への女性の訪問を制限する宗教的および他の文化的な理由が存在する。
【００２６】
本発明は、前述の子宮頸部細胞の回収に対する障害に対処するための解決法を提供する。本発明の方法は、異なるＨＰＶ  ＤＮＡの供給源を使用し、子宮頸部の掻爬を必要としない。むしろ、本発明の組成物および方法は、患者から入手した尿サンプル中のＨＰＶ  ＤＮＡを検出する。ＨＰＶ  ＤＮＡを、遠心分離した尿の細胞ペレット（Ｐａｙａｎ  Ｃら、２００７，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５（３）：８９７−９０１；Ｆｏｒｓｌｕｎｄ  Ｏら、１９９３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１（８）：１９７５−９；Ｓｏｎｇ  ＥＳら、２００７，Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．，２２（１）：９９−１０４）または尿全体（５０，５１，５２  Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＪＡら、２００２，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０（９）：３１５５−６１；Ｓｅｌｌｏｒｓ  ＪＷら、２０００，ＣＭＡＪ．１６３（５）：５１３−８；Ｓｍｉｔｓ  ＰＨら、２００５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５，４３（１２）：５９３６−９）において検出する。しかしながら、先行する公開された検査はＰＣＲに基づくものである。これらの報告における臨床的感度は、１００〜５００塩基対（ｂｐ）に及ぶアンプライマーのサイズのために十分ではない。
【００２７】
現在、（ｉ）尿生殖路から尿中に流れた細胞であって、そのＮＡは通常高分子量である細胞；および（ｉｉ）血流から腎臓の障壁を越えて尿中に入る経腎臓性ＮＡ（Ｔｒ−ＤＮＡ）であって、通常低分子量フラグメントであるもの：という２つの供給源由来の尿中にＮＡが現れることが当該技術分野において認められている。低分子量の経腎臓性ＮＡのサイズは、約２０〜１５０ｂｐに及ぶ（Ｃｈａｎ  ＫＣら、２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４（１５）：４８０９−１３；Ｓｕ  ＹＨら、２００４，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，１０２２：８１−９；Ｕｍａｎｓｋｙ  ＳＲ，Ｔｏｍｅｉ  ＬＤ．２００６，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．，６（２）：１５３−６３）。アンプリコンサイズの縮小により、検査の感度が１０倍増大する（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ  ＨＳら、２００８，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１３７：７３−８１）。
したがって、本発明は、非常に短い（約３０〜５０ｂｐ）アンプリコンを標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを設計および使用するための方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、尿中のＴｒ−ＤＮＡとともに、流れた細胞から放出されたＨＰＶ  ＤＮＡの両方を効果的に検出する。
【００２８】
重要なことには、本発明のオリゴヌクレオチドプライマー組成物は、ＨＰＶのＥ１遺伝子中の新規に同定された非常に特異的な遺伝子マーカーを標的とする（表１）。Ｅ１遺伝子内のこのマーカーを標的とすることによって、臨床または生物学的サンプルにおける高リスクＨＰＶ遺伝子型を特異的に検出するためのＰＣＲプライマーおよびプローブの設計が可能となる。本発明はまた、尿のＴｒ−ＤＮＡ画分に存在するＨＰＶゲノムフラグメントを検出するために非常に短いＤＮＡフラグメントを増幅する、Ｅ１遺伝子の領域に位置する高リスクＨＰＶ特異的プライマーを提供する。
【００２９】
表１に特定されているＨＰＶのＥ１遺伝子の領域から選択されるオリゴヌクレオチドまたは相補的配列を、生物学的または臨床サンプル中のＨＰＶ検出に用いる。さらに、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％相同または同一である、あるいはその間の任意のパーセンテージポイントであるオリゴヌクレオチドまたは相補的配列を、生物学的または臨床サンプル中のＨＰＶ検出に用いる。ＨＰＶを、以下の例示的技術：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびこの方法のすべての変形型；リアルタイムＰＣＲ；ＮＡハイブリダイゼーション；サイクリックプローブ反応；一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）；鎖置換増幅（ＳＴＡ）；制限断片長多型（ＲＦＬＰ）；およびナノテクノロジーが関与するＮＡ分析の技術が含まれるが、これに制限されない技術を用いることによって生物学的または臨床サンプルから検出する。プライマーは、標的配列上で互いに直接隣接しているまたはわずかに重複している（プライマー結合部位の間に介在する配列がない）結合部位にハイブリダイズし得る。
【００３０】
さらに、ＨＰＶのＥ１遺伝子の領域（表１に提示されている）から選択されるオリゴヌクレオチドは、逆転写ＰＣＲ反応によってＥ１遺伝子の特異的ＲＮＡ転写産物を検出する。本発明の生物学的および臨床サンプルには、血液、尿、唾液、痰、涙、精液、母乳、または膣分泌物を含めた身体中の任意の流体が含まれるが、これに制限されない。本発明の好ましい実施形態において、当該生物学的または臨床サンプルは尿である。
【００３１】
さらに、尿由来の長さ２０〜５００ヌクレオチドのＤＮＡの単離を容易にする試薬；ポリメラーゼ連鎖反応による長さ２０〜５００ヌクレオチドのＤＮＡの増幅を容易にする試薬；熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；およびＨＰＶのＥ１遺伝子にのみ存在するマーカー配列に特異的なオリゴヌクレオチドを含む、ＨＰＶを検出するための診断キットが本発明に包含される。
【００３２】
【表１】
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本発明の実施に有用な核酸操作のための技術には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）、ならびに定期的に更新したものが含まれるが、これに制限されない様々な参考文献に記載されている。特定の記載は、本発明の範囲を制限することを意図するものではないが、本発明のある態様を実施する際に指針を提供する。
【００３３】
ＤＮＡは、尿などの体液中に存在するＤＮａｓｅによって分解を受ける。尿中では以下に記載するような既知のＤＮＡ検出方法によって、検出のために十分に大きな配列が利用可能であるが、本発明は、ＤＮＡの分解を阻止するまたは減少させるためのいくつかの方法を包含する。一実施形態においては尿が膀胱内に留まって１２時間未満である場合に、特定の実施形態においては尿が膀胱内に留まって５時間未満、より好ましくは２時間未満である場合に、尿のサンプルを採取する。尿サンプルが長時間膀胱内に留まる前に、尿サンプルを回収および分析することによって、尿中に存在する任意のＤＮａｓｅへのＤＮＡの暴露を減少させる。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、回収後、ＤＮａｓｅ活性を阻害する１つ以上の方法を用いて尿サンプルを処理する。ＤＮａｓｅ活性を阻害する方法には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グアニジンＨＣｌ、ＧＩＴＣ（グアニジンイソチオシアネート）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の使用、高塩濃度、およびＤＮａｓｅの熱不活性化が含まれるが、これに制限されない。
【００３５】
さらに別の実施形態において、回収後、ＤＮＡを捕捉する吸着剤で尿サンプルを処理し、その後、吸着剤をサンプルから除去し、リンスし、そして検出および分析のために捕捉されたＤＮＡを放出するための処理をする。この方法は、尿サンプルからＤＮＡを単離するだけでなく、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を含むが、これに制限されないいくつかの吸着剤を用いた場合には、ＤＮａｓｅ活性による分解からＤＮＡを保護する。
【００３６】
ある場合には、尿サンプル中のＤＮＡの量は限られている。したがって、ある程度の応用のために、本発明は、１つ以上の以下の方法を含むが、これに制限されない当該技術分野において既知の任意の方法によって、検出の感度を増大させる実施形態を包含する。
【００３７】
ＤＮＡが尿中に微量に存在する場合には、より大量の尿サンプルを回収し、その後、サンプル中に存在するＤＮＡの検出に影響を及ぼさない任意の手段によって濃縮することができる。ある実施例は、本発明の広さを制限することなく、ブタノール濃縮またはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）を用いた濃縮によって、サンブル中に存在する液体を減少させることを含む。
【００３８】
ネステッドＰＣＲを用いて、桁違いに感度を高めることができる。ＤＮＡの混入が原因によるネステッドＰＣＲの不正確な結果に対する脆弱性のために、本発明の一実施形態において、サンプルのＤＮＡ混入を回避するために予防策を講じる。例えば、本発明を制限することなく、ＰＣＲ試薬を検査用ＤＮＡサンプルに添加する前に、標的配列内を切断する制限エンドヌクレアーゼでＰＣＲ試薬を処理することができる。
【００３９】
一実施形態において、本発明は、検出の前にサンプルから核酸を実質的に精製または単離することを包含する。当該技術分野において周知である多くの手法のいずれかを用いることによって、尿から核酸分子を単離することができる。標的核酸の検出を容易にする単離のための任意の方法が許容され得る。例えば、Ｉｓｈｉｚａｗａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，５９７２（１９９１）によって記載されているような沈降によって、ＤＮＡを単離することができる。尿のように、大量のサンプルが低濃度のＤＮＡを含有する場合、ＤＮＡを単離する好ましい方法が包含される。この方法では、ＤＮＡを濃縮するように作用する吸着剤でサンプルを処理する。例えば、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｎ．Ｊ．）、ＤＮＡフィルター、および／またはガラスミルク等であるが、これに制限されないＤＮＡを吸着する固形物質でサンプルを処理することができる。他の組成物質を洗い流した後、サンプルＤＮＡを吸着剤から溶出する。
【００４０】
ＰＣＲ等の様々な核酸分析技術の感度を考慮して、本発明はまた、尿サンプル中の混入核酸の存在を減少させる方法も包含する。腎臓の障壁を越えない核酸配列による尿サンブルの汚染は、尿路内膜から剥がれ落ちる細胞によって、性交によって、または対象のＤＮＡ配列を検出する前に尿サンプルを処理する間に取り込まれ得る。本発明を任意のメカニズムに制限することを意図するものではなく、腎臓の障壁を通過し、また尿中に現れるＤＮＡは、血中および尿中のＤＮａｓｅの作用と組み合わさった、身体におけるアポトーシス細胞および壊死細胞で生じる断片化のために、汚染源から取り込まれたＤＮＡより平均して短い長さを有する可能性が高いと考えられる。
【００４１】
より短い配列のＤＮＡを選択することによって、濾過を用いて、検出前に尿サンプル中の混入ＤＮＡの量を減少させることができる。本発明の一実施形態において、変性させた場合に約１０００超の塩基対、すなわち１０００超のヌクレオチドを含有する核酸を、検出前にサンプルから除去する。本発明の特定の実施形態において、ＰＣＲによる増幅前に、変性させた場合に３００より大きい塩基対、すなわち３００より大きいヌクレオチドを含む実質的にすべてのＤＮＡを除去するために、尿サンプルを濾過する。本発明を特定のメカニズムに制限することなく、そのような濾過によって、尿道／膀胱壁から剥がれ落ちた、または性交の間に尿道内に取り込まれた細胞由来の混入ＤＮＡが除去されることが提案される。そのような汚染源由来のＤＮＡの大部分は、当該ＤＮＡはほとんどがアポトーシス細胞死の結果としての核酸の断片化の産物ではないため、３００ｂｐ超のヌクレオチドを含む可能性が高い。核酸分子をゲル電気泳動によって単離することもでき、それによって核酸のフラグメントが分子量に応じて分離される。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の技術を電気泳動による分離の方法に適用し、その後に、特定の遺伝子配列の２つ以上のアレル由来のフラグメントの分子量による比較を可能にする核酸の検出が続く。
【００４２】
前述の精製の方法は、本発明における使用に適した方法を記載することを意味するものであって、制限するものではない。核酸を単離する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本明細書に詳細に記載されない。
【００４３】
本発明はさらに、一実施形態において、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンＨＣｌ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムを含む群から選択される化合物を用いた処理を包含する、前記尿サンプル中のＤＮＡ分解を減少させる工程を有する方法を包含する。膀胱内に留まって１２時間未満である尿サンプルを採取することによって、ＤＮＡ分解をさらに減少させることができる。一実施形態において、ＨＰＶ核酸配列の存在について尿をアッセイする前に、腎臓の障壁を越える前記核酸配列を実質的に単離することが有益である。代替の実施形態において、沈降によってまたは固形吸着物質を用いた処理によって、核酸配列を実質的に単離する。別の実施形態において、汚染物質を除去するために尿サンプルを濾過し、また特定の実施形態において、濾過によって約１０００超のヌクレオチドを含むＤＮＡが除去される。好ましくは、濾過によって約３００超のヌクレオチドを含むＤＮＡが除去される。
【００４４】
核酸配列との関連での「検出する」および「分析する」という用語は、サンプル中の標的核酸配列の存在、あるいはサンプル中のその標的核酸配列の絶対量または相対量を示すシグナルを観察、確認、または定量化する任意の方法を使用することを表す。方法を、例えば：蛍光、放射能、比色定量、重量測定、Ｘ線回折またはＸ線吸収、磁性、酵素活性等によってシグナルを出す核酸標識法と組み合わせることができる。次いで、対象の特定ＤＮＡ配列の有無を決定するために、シグナルの種類に適した方法によってシグナルを検出および／または定量化することができる。
【００４５】
核酸配列との関連で「定量化する」こととは、核酸配列のコピー数を測定するための、または核酸配列の経時的なコピー量の変化を測定するための、または別の配列と比較した場合の配列の相対的濃度を測定するための方法を含むが、これに制限されない特定の核酸配列の量を調べるための任意の方法を使用することを表す。
【００４６】
検出および分析を補助するために、サイクリングプローブ反応（Ｂｅｋｋａｏｕｉ，Ｆ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，２４０−２４８（１９９６））、ポリメラーゼポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｆ．Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１８９−９３（１９９１））、クローニング、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｇ．Ｋ．Ｔｅｒｒａｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２６７０−７７（１９９４））、およびアレル特異的増幅（ＡＳＡ）等の変形型を含むが、これに制限されない多くの方法で特定ＤＮＡ配列を「増幅する」ことができる。
【００４７】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００４８】
「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ配列の転写に必要な制御およびコード配列を含むＤＮＡ配列を表す。「ゲノム」という用語は、真核生物における染色体の１セットに含有される生物の完全な遺伝子相補体を表す。
【００４９】
「野生型」の遺伝子または遺伝子配列は、集団において最も高頻度に観察されるものであり、ゆえに任意に当該遺伝子の「正常な」または「野生型」の形態を意図するものである。対照的に、「改変された」、「変異体」、「異常」、または「変化した」という用語は、野生型の遺伝子、配列、または遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性の改変（すなわち変化した特徴）を示す遺伝子、配列、または遺伝子産物を表す。天然に存在する変異体を単離することができ、それらは野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実によってそれらが同定されるということに留意されたい。本発明を任意の特定の型の異常の検出に制限することなく、変異は、付加、付加−欠失、欠失、フレームシフト、ミスセンス、点、リーディングフレームシフト、復帰、転移、および転換の変異、ならびにマイクロサテライト変化を含めた多くの形態をとり得る。
【００５０】
「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」および「ポリマー」核酸という用語は代替可能であり、２つ以上、好ましくは３個超、通常１０個超のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成された分子として定義される。正確なサイズは多くの要素によって決まり、結果として、当該オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用によって決まる。オリゴヌクレオチドを、化学合成、ＤＮＡの複製、逆転写、またはその組み合わせを含めた任意の方法で作製することができる。
【００５１】
モノヌクレオチドは、１個のモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸が一方向にあるその近隣の３’酸素にホスホジエステル結合を介して接着するような方法で反応してオリゴヌクレオチドを作るため、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素に連結していない場合には「５’末端」、その３’酸素がそれに続くモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸に連結していない場合には「３’末端」と呼ばれる。本明細書において使用する場合、核酸配列は、たとえより大きなオリゴヌクレオチドに対する内部にあるものであっても、５’および３’末端を有するともいえる。
【００５２】
２つの異なる重複しないオリゴヌクレオチドが、同一の線状の相補的核酸配列の異なる領域にアニールし、また一方のオリゴヌクレオチドの３’末端がもう一方のものの５’末端の方向に向いている場合、前者を「上流」のオリゴヌクレオチド、後者を「下流」のオリゴヌクレオチドと称することができる。
【００５３】
「プライマー」という用語は、プライマーの伸長が開始される条件下に置かれた場合に、合成の開始地点として作用し得るオリゴヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製した制限酵素消化物中に見られるように天然に存在し得、または合成によって作製することもできる。
【００５４】
テンプレートの特定の配列の鎖に「実質的に」相補的であるように、プライマーを選択する。プライマーは、プライマーの延長が生じるために、テンプレート鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマー配列の残りが当該鎖に実質的に相補的であれば、相補的でないヌクレオチドフラグメントは当該プライマーの５’末端に接着することができる。プライマー配列が、ハイブリダイズし、またそれによってプライマーの伸長産物の合成のためのテンプレート・プライマー複合体を形成するのに十分なテンプレートの配列との相補性を有するならば、相補的でない塩基またはより長い配列を当該プライマーに組み入れることができる。
【００５５】
「標的」核酸は、ハイブリダイゼーション、増幅、または分析方法の組み合わせを含めた核酸配列を分析する他の任意の手段によって評価され得る核酸配列である。
【００５６】
「ハイブリダイゼーション」法は、標的核酸（分析される配列）に相補的な配列のアニーリングをともなう。相補的配列を含有する核酸の２つのポリマーが互いを見つけ、また塩基対合の相互作用を介してアニールする能力は、周知の現象である。ＭａｒｍｕｒおよびＬａｎｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４６：４５３（１９６０）、ならびにＤｏｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４６：４６１（１９６０）による「ハイブリダイゼーション」手法の最初の観察に続いて、この手法の近代生物学の不可欠なツールへの改良が行われている。ハイブリダイゼーションは、スロット、ドット、およびブロットハイブリダイゼーション技術を包含するが、これに制限されない。
【００５７】
ある診断的適用にとって、ハイブリダイゼーションが完全または部分的な相補性を示すかどうかを決定することが重要である。例えば、病原体ＤＮＡ（ウイルス、細菌、菌類、マイコプラズマ、原生動物等）の有無を単に検出することが所望される場合には、関連配列が存在し、部分的に相補的なプローブおよび完全に相補的なプローブの両方がハイブリダイズする条件を選択することができる場合に、ハイブリダイゼーション法によってハイブリダイゼーションを確実にすることのみが重要である。しかしながら、他の診断的適用では、ハイブリダイゼーション法によって部分的および完全な相補性を区別することが必要とされ得る。遺伝的多型を検出することは興味深いかもしれない。
【００５８】
部分的および完全な相補性の両方の場合で同レベルのハイブリダイゼーションを可能にする方法は、プローブが正常および変異型の標的配列の両方にハイブリダイズするような適用には典型的には不適である。本発明は、ある診断目的のために、ハイブリダイゼーションを他の技術（制限酵素分析等）と組み合わせることを検討する。用いる方法にかかわらず、ハイブリダイゼーションは、分析される配列（標的配列）と検査を行うために用いられるＤＮＡのフラグメント（プローブ）との間にある程度の相補性を必要とする。（もちろん、相補性なしで結合を得ることができるが、この結合は非特異的であり、回避されるべきである。）
本明細書において使用する場合、核酸配列の相補体とは、一方の配列の５’末端がもう一方のものの３’末端と対合するように核酸配列と整列させた場合に、「逆平行な関係」の状態にあるオリゴヌクレオチドを表す。天然の核酸に一般に見られない特定の塩基を本発明の核酸中に含めることができ、例えば、イノシンおよび７−デアザグアニンを含めることができる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖はミスマッチ塩基対または不適合塩基を含有し得る。核酸技術の分野における当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成およびオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の出現率を含めた多くの変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を判断することができる。
【００５９】
本明細書において使用する場合、「Ｔｍ」という用語は、「融解温度」に関連して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が半分だけ一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを算出するための方程式は、当該技術分野において周知である。標準的参考文献に示されているように、Ｔｍ値の簡単な概算は、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌで水溶液の状態にある場合、方程式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）によって算出することができる（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ（１９８５）を参照されたい）。他の参考文献には、Ｔｍの算出のために構造的および配列の特性を考慮に入れる、より洗練された計算が含まれる。
【００６０】
本明細書において使用する場合、「プローブ」という用語は、精製した制限酵素消化物中に見られるように天然に存在する、または合成によって作製されたにかかわらず、プローブ中の少なくとも１つの配列ともう一方の核酸中の配列の相補性または他の再現可能な引力相互作用の手段によって、もう一方の核酸中の配列と二本鎖構造または他の複合体を形成するオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を表す。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、および単離に有用である。本発明で用いる任意のプローブを任意の「レポーター分子」で標識し、それによって、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡおよび酵素に基づく組織化学的アッセイ）、蛍光、放射性、および発光システムを含むが、これに制限されない任意の検出システムでそれが検出可能になることが検討される。対象の（すなわち、検出されるべき）オリゴヌクレオチドをレポーター分子で標識することがさらに検討される。プローブおよび対象のオリゴヌクレオチドの両方を標識することも検討される。それは、本発明が任意の特定の検出システムまたは標識に制限されることを意図するものではない。
【００６１】
本明細書において使用する場合、「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）シグナルを提供するために用いることができ、また核酸またはタンパク質に接着できる任意の原子または分子を表す。標識は、蛍光、放射能、比色定量、重量測定、Ｘ線回折またはＸ線吸収、磁性、および酵素活性を含むが、これに制限されないあらゆる方法によって検出可能なシグナルを提供する。
【００６２】
核酸標的に関連して用いられる場合、「実質的に一本鎖の」という用語は、鎖間塩基対合の相互作用によって結びついている二本鎖の核酸として存在する二本鎖標的とは対照的に、標的分子が主に一本鎖の核酸として存在することを意味する。
【００６３】
本明細書において使用する場合、「配列変異」という用語は、２つの核酸テンプレートの間の核酸配列の相違を表す。例えば、野生型の構造遺伝子およびこの野生型の構造遺伝子の変異型の形態は、一塩基置換および／または１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入の存在によって配列が異なり得る。当該構造遺伝子のこれら２つの形態を、互いに配列が異なるという。当該構造遺伝子の第二の変異型の形態が存在し得る。この第二の変異型の形態を、当該野生型遺伝子および当該遺伝子の第一の変異型の形態の両方と配列が異なるという。
【００６４】
「構造プローブ特徴」、「ハイブリダイゼーション特徴」、および「ハイブリダイゼーションプロファイル」という用語は、標的核酸およびプローブまたはプローブセットの間での複合体形成の測定レベルを示すために、本明細書において代替可能に用いられるものであって、かかる測定レベルは、参照標的またはプローブをともなう複合体形成のレベルと比較した場合に当該標的核酸に特有である。
【００６５】
「遺伝子配列に適合しているまたは相補的なオリゴヌクレオチドプライマー」とは、一本鎖または二本鎖の核酸のテンプレート依存的合成を容易にし得るオリゴヌクレオチドプライマーを表す。遺伝子配列に適合しているまたは相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等に用いることができる。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは一部、ならびに一本鎖または二本鎖であり得、またセンスまたはアンチセンス鎖に相当し得るゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを表す。
【００６７】
「欠失」とは、それぞれ１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が欠けている、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化として定義される。
【００６８】
「挿入」または「付加」とは、天然に存在する配列と比較して、それぞれ１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をもたらす、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化のことである。
【００６９】
「置換」は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸をそれぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸で交換することによって生じる。
【００７０】
核酸配列における「改変」とは、欠失、付加、付加−欠失、置換、挿入、復帰、転換、点変異、マイクロサテライト変化、メチル化、またはヌクレオチド付加物形成を含むが、これに制限されない核酸配列に対する任意の変化を表す。
【００７１】
本明細書において使用する場合、「精製された」、「汚染除去された」、および「滅菌された」という用語は、サンプルからの夾雑物の除去を表す。
【００７２】
本明細書において使用する場合、「実質的に精製された」および「実質的に単離された」という用語は、天然の環境から取り出され、単離または分離され、またそれらが天然に関わる他の成分が好ましくは６０％存在しない、より好ましくは７５％存在しない、また最も好ましくは９０％存在しない核酸配列を表す。したがって、「単離されたポリヌクレオチド」とは、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。本発明の方法を実施するために、ポリヌクレオチドを実質的に精製し得るが、必ずしもそうする必要はないことが検討される。精製されていない形態の核酸配列を検出するための様々な方法が、当該技術分野において既知である。
【００７３】
「増幅」とは、核酸配列のさらなるコピーの生成として定義され、通常、ポリメラーゼ連鎖反応または当該技術分野において周知の他の技術（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．［１９９５］）を用いて行われる。本明細書において使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、参照することにより本明細書に組み込まれている）の方法を表すものであって、それらは、クローニングまたは精製なしで、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列の断片の濃度を増加させる方法を記載している。標的配列を増幅するためのこの手法は、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に大過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを入れ、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な順序の熱サイクルが続く工程からなる。当該２種のプライマーは、二本鎖の標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を引き起こすために、混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内のそれらの相補的な配列にアニールさせる。アニーリングの後、新しい相補鎖の対を形成するためにプライマーをポリメラーゼで伸長させる。高濃度の所望の標的配列の増幅断片を得るために、変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼによる伸長の工程を何度も繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリング、および伸長が１回の「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が起こり得る）。所望の標的配列の増幅断片の長さはプライマーの互いの相対的位置によって決定し、それゆえ、この長さは制御可能なパラメーターである。当該プロセスの繰り返す様相に基づいて、当該方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅断片は混合物中で優勢な配列（濃度の観点から）となるため、それらは「ＰＣＲ増幅された」といわれる。
【００７４】
本明細書において使用する場合、「ポリメラーゼ」という用語は、対象の核酸の増幅における使用に適した任意の酵素を表す。他のポリメラーゼもまた熱安定性でも熱不安定性でもこの定義に包含されるが、この用語は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼを包含することを意図する。ＰＣＲに関して、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法論（例えば、染色；標識したプローブを用いたハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込みの後にアビジン−酵素の接合体による検出；増幅断片内へのｄＣＴＰまたはｄＡＴＰ等の３２Ｐ標識したデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）によって検出され得るレベルまで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列を適切なプライマー分子のセットで増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセス自体によって作られた増幅断片は、それら自体がそれに続くＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートである。増幅された標的配列を用いて、組換えベクター内への挿入用のＤＮＡの断片（例えば、遺伝子）を得ることができる。
【００７５】
本明細書において使用する場合、「ＰＣＲ産物」および「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング、および伸長という２サイクル以上のＰＣＲ工程が完了した後に、結果として生じた化合物の混合物を表す。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上の断片の増幅が生じている状況を包含する。
【００７６】
本明細書において使用する場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、それぞれが特定のヌクレオチド配列の位置または付近で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を表す。
【００７７】
本明細書において使用する場合、「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則によって結びついたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば「Ａ−Ｇ−Ｔ」という配列は、「Ｔ−Ｃ−Ａ」という配列に相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って適合している「部分的」であり得る。あるいは、核酸間には「完全な」または「全くの」相補性が存在し得る。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強さに重要な影響をもたらす。このことは、増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
【００７８】
「相同性」という用語は、相補性の程度を表す。部分的相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があり得る。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害し、「実質的に相同な」という機能的用語を用いることをいうものである。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェントな条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いることによって検証することができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェントな条件下で、完全に相同なものの標的への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）を競合および阻害するであろう。このことは、低ストリンジェントな条件とは非特異的結合が許容され、低ストリンジェントな条件には２つの配列の互いへの結合が特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることが必要とされるというわけではない。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえ欠いている第二の標的を使用することによって確かめることができ、非特異的結合がない場合には、プローブは当該第二の相補的でない標的にハイブリダイズしないであろう。
【００７９】
多くの同等な条件を利用して、低ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件を構成することができ、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するまたは固定化されている等）ならびに塩の濃度および他の成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）等の要素を考慮し、上記の条件とは異なるがそれと同等な低ストリンジェントまたは高ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を生み出すために、ハイブリダイゼーション溶液を変えることができる。本明細書において使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、「塩基対合を介して核酸の鎖が相補鎖と合体する任意のプロセス」を含む（Ｃｏｏｍｂｓ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．［１９９４］）。
【００８０】
「ストリンジェンシー」は、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下回る）からＴｍより約２０℃〜２５℃下回る範囲で生じる。当業者に理解されるであろうとおり、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを用いて、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出、あるいは類似または関連したポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【００８１】
本明細書において使用する場合、「ハイブリダイゼーション複合体」という用語は、相補的なＧとＣの塩基間、および相補的なＡとＴの塩基間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列の間で形成される複合体を表し、この水素結合は塩基のスタッキング相互作用によってさらに安定化され得る。２つの相補的な核酸配列の水素結合は逆平行の配置にある。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）、または溶液中に存在する一方の核酸配列と、固形担体（例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングで利用されるようなナイロンメンブレンまたはニトロセルロースフィルター、あるいはＦＩＳＨ［蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション］を含めたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで利用されるようなスライドガラス）に固定化されたもう一方の核酸配列との間で形成され得る。
【００８２】
本明細書において使用する場合、「アンチセンス」という用語は、特定のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ配列に相補的であるＲＮＡ配列に関して用いられる。アンチ-センスＲＮＡは、対象の遺伝子をコード鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに対して逆方向に接合することによる合成を含めた任意の方法によって生成され得る。一度細胞内に導入されると、この転写鎖は当該細胞によって生成される天然のｍＲＮＡと組み合わさり、二本鎖を形成する。次いで、これら二本鎖はｍＲＮＡのさらなる転写またはその翻訳をブロックする。このようにして、突然変異表現型を作り出すことができる。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して用いられる。（−）という記号（すなわち、「マイナス」）がアンチセンス鎖に関して時々用いられ、（＋）という記号がセンス（すなわち、「プラス」）鎖に関して時々用いられる。
【００８３】
本明細書において使用する場合、「サンプル」という用語は、その最も広い意味において用いられる。核酸を含有していると推測される生物学的サンプルには、ゲノムＤＮＡ（溶液中にある、またはサザンブロット分析用等の固形担体に結合している）、ｃＤＮＡ（溶液中にある、または固形担体に結合している）等が含まれ得るが、これに制限されない。
【００８４】
本明細書において使用する場合、「尿路」という用語は、身体からの尿の分泌および排泄に関与する器官および管を表す。
【００８５】
本明細書において使用する場合、「経腎臓性ＤＮＡ」および「経腎臓性核酸」という用語は、腎臓の障壁を越える核酸を表す。本明細書において使用する経腎臓性ＤＮＡは、ｍｉＲＮＡとは異なる。具体的には、経腎臓性ＤＮＡは、ｍｉＲＮＡには存在しない３’および５’末端におけるランダム性を含む。
【００８６】
以下の実施例によって、本発明を以下にさらに記載する。また実施例によって、本発明を実施するための有用な方法論も説明する。これらの実施例は、特許請求される発明を制限するものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１：全尿核酸の精製
尿の調製
尿試料を、少なくとも１００ｍｌの容量を入れることが可能な容器中に回収した。
【００８８】
排尿の前に、回収カップに容器が満たされた場合に５０ｍＭの最終濃度に達するのに十分なＥＤＴＡをあらかじめ注いだ（例えば、尿で１００ｍｌまで希釈された場合、１０ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ＝５０ｍＭ）。尿試料を−８０℃で保存した。凍結した尿を室温で解凍した。
【００８９】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程
１０ｍｌの尿（希釈前）の標準的なバッチサイズに、１．０ｍｌのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅスラリー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅストック：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の２５ｍｌサイズ；２５０μＬ樹脂）を用いた。
【００９０】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへの尿ＮＡの結合を、回転させながら５０ｍＬチューブ中で室温（２０〜２５℃）にて３０分間行った。室温での遠心（５分間の８００〜１０００×ｇ）によって樹脂を回収し、空の使い捨てカラムに移した。樹脂を、少なくとも１ｍＬの０
．３Ｍ  ＬｉＣｌ／１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５）で２回洗浄した。ＮＡを、７５０μ
Ｌの２Ｍ  ＬｉＣｌ／１０ｍＭ  ＮａＯＡｃで溶出した。
【００９１】
シリカ精製
７５０μｌバッファー中のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＮＡから溶出したＤＮＡに２．２５ｍＬの９５％  ＥｔＯＨを補充し、シリカカラム（Ｑｉａｇｅｎまたは同等物）に適用した。カラムエクステンションを用いた場合には、１回のロードで全混合液が取り込まれ、そうでない場合には、数回のロードを行った。卓上微小遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中でカラムを１分間遠心分離した。あるいは、吸引マニホールドを用いた。
【００９２】
シリカカラムを、７０％  ＥｔＯＨ中２Ｍ  ＬｉＣｌを５００μＬ用いて、５０００ｒｐｍにて１分間遠心分離することによって洗浄した。続いて、７５ｍＭ  ＫＯＡｃ  ｐＨ５．０，８０％  ＥｔＯＨで２回の洗浄を行った。ＮＡを、１００μＬの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．０２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で溶出した。
【００９３】
２５μｌのＰＣＲ反応に対して、規定どおりに５μｌを用いた。
【００９４】
実施例２：ＨＰＶの個別の遺伝子型を増幅するための、Ｅ１遺伝子に位置する特異的ＰＣＲプライマーの使用
単一の型の高リスクＨＰＶに特異的であり、また開示されたＥ１遺伝子のフラグメント中に位置するように設計したプライマーを検査した。これらのプライマーを表３に一覧にする。当該ＰＣＲにおいて、それぞれの正方向プライマーは５００ｎＭの濃度で対応する逆方向プライマーと対合した。ＰＣＲごとに、ＭｇＣｌ２の最終濃度は２ｍＭであり、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は１．２５Ｕ／反応であった。高リスクＨＰＶ型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、１反応につき１０００コピーでテンプレートとして用いた（表２を参照されたい）。ＰＣＲ産物の予想されるサイズは４７塩基対（ｂｐ）であった。
【００９５】
以下のプログラムに従って、増幅を行った。
１サイクル
９４℃−２分間（酵素活性化）
５サイクル
９４℃−３０秒間
６５℃−２分間
５サイクル
９４℃−３０秒間
６０℃−１分間
３５サイクル
９４℃−３０秒間
５５℃−１分間
１サイクル
７２℃−５分間
４℃−永久  。
【００９６】
当該反応の産物を図２に提示するものであって、レーン数１〜１３は以下の高リスクＨＰＶ遺伝子型：１６；１８；３１；３３；３５；３９；４５；５１；５２；５６；５８；５９；６８にそれぞれ対応する。分子量マーカー（「Ｍ」）は２５ｂｐラダーである。
【００９７】
【表２】
2015130863.tif 000004
【００９８】
【表３】
2015130863.tif 000005
実施例３：１３種すべての高リスクＨＰＶ遺伝子型を検出するための、単一のＰＣＲプライマーの対の使用
この実験の目的は、１３種の高リスクＨＰＶ株のすべてまたは大部分を特異的に検出するために、低リスクの対応物とは反応しない、ＨＰＶのＥ１遺伝子の対象のフラグメント中に位置する単一のプライマーの対を使用することであった。配列番号４１：５’−ＣＡＧＧＣＡＧＡＡＴＴＡＧＡＧＲＣＡＧＣ−３’を正方向プライマーとして用い、配列番号４２：５’−ｔｃｃａｃｃａｃａＷＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡ−３’を逆方向プライマーとして用いた。逆方向プライマー中の小文字のヌクレオチドは、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を調節するためにランダムに選択されたテイルである。
【００９９】
特異的産物の期待されるサイズは９７ｂｐであった。当該ＰＣＲにおいて、正方向プライマーは８００ｎＭの濃度で逆方向プライマーと対合した。この反応では、ＭｇＣｌ２の最終濃度は３ｍＭであり、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は１．２５Ｕ／反応であった。高リスクおよび低リスクのＨＰＶ型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、１反応につき１０００コピーでテンプレートとして用いた（表２を参照されたい）。
【０１００】
以下のプログラムに従って、増幅を行った。
１サイクル
９４℃−２分間（酵素活性化）
４０サイクル
９４℃−３０秒間
５０℃−３０秒間
７２℃−３０秒間
１サイクル
７２℃−５分間
４℃−永久  。
【０１０１】
当該反応の産物を図３に提示するものであって、レーン数１〜１３は以下の高リスクＨＰＶ遺伝子型：１６；１８；３１；３３；３５；３９；４５；５１；５２；５６；５８；５９；６８にそれぞれ対応し、レーン１４および１５は低リスク遺伝子型６および１１にそれぞれ対応する。分子量マーカー（「Ｍ」）は２５ｂｐラダーである。
【０１０２】
実施例４：子宮頸癌を有する患者由来の尿サンプルを分析するための、単一のＰＣＲプライマーの対の使用
ＨＰＶのＥ１遺伝子の対象のフラグメント中に位置する単一のプライマーの対を、高リスクＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡを特異的に検出するために用いた。具体的には、配列番号４１：５’−ＣＡＧＧＣＡＧＡＡＴＴＡＧＡＧＲＣＡＧＣ−３’を正方向プライマーとして用い、配列番号４２：５’−ｔｃｃａｃｃａｃａＷＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡ−３’を逆方向プライマーとして用いた。逆方向プライマー中の小文字のヌクレオチドは、プライマーのＴｍを調節するために用いられたランダムに選択されたテイルである。当該ＰＣＲにおいて、正方向プライマーは８００ｎＭの濃度で逆方向プライマーと対合した。この反応では、ＭｇＣｌ２の最終濃度は３ｍＭであり、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は１．２５Ｕ／反応であった。
【０１０３】
尿サンプル由来のＤＮＡを、実施例１に記載されたプロトコールに従って抽出した。患者に、２種の尿サンブル：朝に自己回収した第一のサンプル、および同日の後で（２４時間以内に）診療所において回収した第二のサンプルを提供するように求めた。子宮頸部サンプルをＤｉｇｅｎｅ検査のために採取した。１０ｍｌの尿由来のＤＮＡを、１００μｌの溶出バッファー中に抽出し、そのうちの５μｌをＰＣＲに用いた。
【０１０４】
以下のプログラムに従って、増幅を行った。
１サイクル
９４℃−２分間（酵素活性化）
４０サイクル
９４℃−３０秒間
５０℃−３０秒間
７２℃−３０秒間
１サイクル
７２℃−５分間
４℃−永久  。
【０１０５】
当該反応の産物を図４に提示するものであって、レーン数１〜１８は子宮頸部の癌を有する患者の尿サンプルを示す。奇数のレーン数は自己回収した朝の尿サンプルを示し、一方で偶数のレーン数は同日の後で診療所において当該患者によって提供された尿サンプルを示す。具体的には、レーン１９は健常ボランティア由来の尿サンプルを含有していた。レーン２０は尿ＤＮＡの精製に対するコントロールとしての水を含有していた。レーン２１は陽性コントロールとしてのＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡを含有していた。レーン２２はヒトゲノムＤＮＡ（２０，０００ゲノム相当）を含有していた。レーン２３は低リスクＨＰＶ６および１１テンプレートの不明瞭な混合物を含有していた。また、レーン２４はオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡテンプレートを含有していない反応コントロールであった。
【０１０６】
実施例５：ウイルスを検出するための、単一チューブのＰＣＲにおけるすべての高リスクＨＰＶ特異的ＰＣＲプライマーの対の使用
高リスク遺伝子型を示すオリゴヌクレオチドテンプレート（表２を参照されたい）を、すべての高リスク特異的プライマーの対の混合物を有するＰＣＲによって増幅した。それぞれの反応には、計２５のＰＣＲプライマーが含まれていた（表４を参照されたい）。当該ＰＣＲにおいて、それぞれ２００ｎＭの濃度で用いられた正方向プライマーは、それぞれ３００ｎＭの濃度で用いられた逆方向プライマーとそれぞれ組み合わさった。この反応では、ＭｇＣｌ２の最終濃度は２ｍＭであり、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は１．２５Ｕ／反応であった。高リスクおよび低リスクのＨＰＶ型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、１反応につき１０００コピーでテンプレートとして用いた（表３を参照されたい）。
【０１０７】
以下のプログラムに従って、増幅を行った。
１サイクル
９４℃−１０分間（酵素活性化）
４０サイクル
９４℃−３０秒間
６０℃−３０秒間
７２℃−３０秒間
１サイクル
７２℃−２分間
４℃−永久  。
【０１０８】
産物の期待されるサイズは６２ｂｐであった。標的の痕跡は５１ｂｐであった。結果を図５に図示するものであって、レーン数１〜１３は以下の高リスクＨＰＶ遺伝子型：１６；１８；３１；３３；３５；３９；４５；５１；５２；５６；５８；５９；６８にそれぞれ対応し、レーン１５および１６は低リスク遺伝子型６および１１にそれぞれ対応する。分子量マーカー（「Ｍ」）は２５ｂｐラダーである。
【０１０９】
【表４】
2015130863.tif 000006
実施例６：ウイルスを検出するための、単一チューブのＰＣＲにおけるすべての高リスクＨＰＶ特異的ＰＣＲプライマーの対の使用
子宮頸癌を有する患者由来の尿サンプルを、すべての高リスク特異的プライマーの対の混合物を用いることによって検査した。したがって、当該ＰＣＲはそれぞれの反応に計２５のＰＣＲプライマーを含有していた（表４を参照されたい）。当該ＰＣＲにおいて、それぞれ２００ｎＭの濃度で用いられた正方向プライマーは、それぞれ３００ｎＭの濃度で用いられた逆方向プライマーと組み合わさった。この反応では、ＭｇＣｌ２の最終濃度は２ｍＭであり、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は１．２５Ｕ／反応であった。尿サンプル由来のＤＮＡを、実施例１に記載されたプロトコールに従って抽出した。診療所への訪問時に回収された尿サンプルを用いた（実施例５を参照されたい）。１０ｍｌの尿由来のＤＮＡを、１００μｌの溶出バッファー中に抽出し、そのうちの５μｌをＰＣＲに用いた。
【０１１０】
以下のプログラムに従って、増幅を行った。
１サイクル
９４℃−１０分間（酵素活性化）
４０サイクル
９４℃−３０秒間
６０℃−３０秒間
７２℃−３０秒間
１サイクル
７２℃−２分間
４℃−永久。
【０１１１】
産物の期待されるサイズは６２ｂｐであった。結果を図６に図示するものであって、レーン数１〜１０は子宮頸部の癌を有する患者の尿を示す。具体的には、レーン１１はヒトゲノムＤＮＡ（２０，０００ゲノム相当）を含有していた。レーン１２は陽性コントロールとしてのＨＰＶ１８ゲノムＤＮＡを含有していた。レーン１３はオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡテンプレートを含有していない反応コントロールを示した。
【０１１２】
実施例７：ウイルスを検出するための、単一チューブのＰＣＲにおける高リスクＨＰＶ特異的プライマーの一部の使用
高リスクＨＰＶ遺伝子型を示すオリゴヌクレオチド（表３）を、高リスクＨＰの一部を用いたＰＣＲによって増幅し、それぞれ２００ｎＭの濃度で用いられた正方向プライマーは、３００ｎＭの濃度で用いられた逆方向プライマーとそれぞれ組み合わさった。この反応では、計２０のプライマーを用いた（表５）。この反応では、ＭｇＣｌ２の最終濃度は２ｍＭであり、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度は１．２５Ｕ／反応であった。高リスクおよび低リスクのＨＰＶ型に対応する個々のオリゴヌクレオチドを、１反応につき１０００コピーで用いた（表２）。
【０１１３】
以下のプログラムに従って、増幅を行った。
１サイクル
９４℃−１０分間（酵素活性化）
４０サイクル
９４℃−３０秒間
６２℃−３０秒間
１サイクル
７２℃−２分間
４℃−永久  。
【０１１４】
産物の期待されるサイズは６２ｂｐであった。標的の痕跡は５１ｂｐであった。結果を図７に図示するものであって、レーン数１〜１３は以下の高リスクＨＰＶ遺伝子型：１６；１８；３１；３３；３５；３９；４５；５１；５２；５６；５８；５９；６８にそれぞれ対応し、レーン１５および１６は低リスク遺伝子型６および１１にそれぞれ対応する。分子量マーカー（「Ｍ」）は２５ｂｐラダーである。
【０１１５】
【表５】
2015130863.tif 000007
実施例８：インドにおける高リスクおよび低リスクの集団の尿において高リスクＨＰＶを検出するための、改良された分子スクリーニング検査
Ｘｅｎｏｍｉｃｓの経腎臓性ＤＮＡ（Ｔｒ−ＤＮＡ）技術は、身体全体にわたる死にかけている細胞由来のＤＮＡフラグメントに基づいている。このＤＮＡは血流中に現れ、尿中に排出される。尿サンプルの分析を、男性胎児を有する女性由来のＹ染色体特異的ＤＮＡ配列、結腸直腸癌患者における変異型Ｋ−ｒａｓ、および肺結核を有する患者におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出に適用した。
【０１１６】
この調査で用いたＨＰＶ  ＤＮＡ検査は、子宮頸癌に関連している高リスクＨＰＶ型の存在を検出するために、尿由来のＤＮＡの単離およびＨＰＶ  Ｅ１領域の特異的増幅をともなう。これらの高リスク型には、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８が含まれる。ＦＡＭ標識した正方向プライマーおよび標識していない逆方向プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＤＮＡを増幅する。これらのプライマーにより、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定される９３〜９６塩基対（ｂｐ）のアンプリコンが生成される。低リスクＨＰＶ型６および１１との交差反応は観察されなかった。得られたデータにより、この検査の感度および特異性は、子宮頸部の掻爬に基づく臨床用途の現在のアッセイのものと同等またはより優れていることが証明された。
【０１１７】
方法
サンプル回収
Ｓｉｍｂｉｏｓｙｓ  Ｂｉｏｗａｒｅｓ社およびＭｅｔｒｏｐｏｌｉｓ社によって病期分類された癌患者由来のものを含む、インドにおける高リスクおよび低リスクの集団からサンプルを回収した。高リスクの被験者を、病院のＳＴＤ外来またはインド東部にある西ベンガルの売春街から募集した。具体的には、この集団由来の事前スクリーニングした２７０のサンプルをこの調査に用い、当該２７０のうちの５１サンプル（１８．９％）がＱＩＡＧＥＮ  ｈｃ２検査によって陰性であることが分かった。既知の疾病素因を有さない５０人の低リスクの被験者を、ムンバイにあるヘルスキャンプから募集した。５０の尿サンプルを、インドの一般集団からの妊娠女性から入手した。インド医学研究評議会を含めた独立倫理委員会によって審査されたプロトコールに従い、また当該被験者のインフォームド・コンセントを得て、細胞診試料および尿サンプルを入手した。市販の回収カップ中に尿を回収した。尿サンプルを少なくとも５０ｍＭのＥＤＴＡの状態にし、ドライアイス上で運搬し、さらなる使用まで−８０℃で保存した。
【０１１８】
子宮頸部細胞診およびｈｃ２検査
子宮頸部細胞診およびｈｃ２検査を、Ｓｉｍｂｉｏｓｙｓ  Ｂｉｏｗａｒｅｓ社およびＭｅｔｒｏｐｏｌｉｓ社によって行った。回収した子宮頸部サンプルの一部を用いて、直ちに細胞診検査のための塗抹標本を作製し、残りをＱＩＡＧＥＮ  ｈｃ２によるＨＰＶ検査のためのバッファー溶液に移した。ＨＲ  ＨＰＶプローブカクテルを用いて、ｈｃ２検査をメーカーの使用説明書どおりに行い、分析した。１ｐｇ／ｍｌの推奨される陽性閾値をカットオフとして用い、１．００以上の相対発光量／コントロール（ＲＬＵ／ＣＯ）の比率を有するすべてのサンプルを陽性とみなした。
【０１１９】
ＤＮＡの単離
−８０℃で保存した尿サンプルを解凍し、穏やかに反転させることによって混合した。以前に記載されているプロトコールどおりにＤＮＡの単離を実施した（Ｓｈｅｋｈｔｍａｎ  Ｅ．Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００９；５５：７２３−７２９）。簡潔には、１：１の尿：水のサンプルをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂のスラリー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）とインキュベーションした。樹脂を沈殿させ、上清を捨てた。沈殿させた樹脂を再懸濁し、スピンカラムに移した。再懸濁バッファーを除去し、樹脂を洗浄した。２Ｍ  ＬｉＣｌによって、ＤＮＡを樹脂から溶出した。溶出液を７０％エタノールの状態にし、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用した。カラムを、２Ｍ  ＬｉＣｌ／７０％  ＥｔＯＨで、続いて７５ｍＭ  ＫＯＡｃ（ｐＨ５．０）／８０％  ＥｔＯＨで洗浄した。ＤＮＡをＥＢバッファー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で溶出し、−２０℃で保存した。単離したＤＮＡサンプルをＰｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって定量化した。
【０１２０】
ＰＣＲおよび検出
ＸＥＮ−ＨＰＶ−ＦＡＭ−ＦおよびＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｒのプライマー（表６）をＰＣＲアッセイに用いた。ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分間処理した後、２５μＬ中に６００ｎＭの各プライマー、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ；および４００μＭ  ｄＵＴＰを用いて、４０サイクルで増幅を実施した。各サイクルは、９５℃で１５秒間（ｓ）および５０℃で６０ｓであった。反応産物をＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）によるキャピラリー電気泳動にかけた。
【０１２１】
ＤＮＡシークエンシング
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および様々な濃度のＭｇＣｌ２（ＭＹ０９／ＭＹ１１およびＧＰ５＋／ＧＰ６＋に対しては２ｍＭ、ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒに対しては３ｍＭ）とともに、種々のプライマーセット（表６）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。反応混合物をそれぞれのプライマーの対に対して様々なサイクル工程：９５℃３０秒間，５５℃４５秒間，７２℃２０秒間で３７サイクルの増幅（ＭＹ０９／ＭＹ１１）；９５℃１５秒間，４０℃３０秒間，７２℃１０秒間で５０サイクルの増幅（ＧＰ５＋／ＧＰ６＋）；９５℃１５秒間，５０℃６０秒間で４５サイクルの増幅（ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒ）にかけた。ＰＣＲ産物を、１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上での電気泳動によって分析した。ゲル切片を切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キット使用説明書（ＱＩＡＧＥＮ）に従って精製し、ＰＣＲ増幅に用いたプライマーの一つを用いて配列決定した。ＤＮＡシークエンシングをＧＥＮＥＷＩＺ社（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）によって行った。生のＰＣＲ産物の配列を、特定のヒトパピローマウイルス株と適合させるために、ＮＣＢＩのＢｌａｓｔｎアルゴリズムによって分析した。
【０１２２】
統計分析
標準的な分割表の方法（Ｅｘｃｅｌ  ２００３，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）を用いてデータを分析した。本発明者らの方法の有用性を特徴付けするために、本発明者らは、ｈｃ２検査ならびに／あるいはシークエンシングならびに診断の感度、特異性、ならびに陽性および陰性適中率（ＰＰＶおよびＮＰＶ）とのその一致率を算出した（Ａｌｔｍａｎ，Ｄ．Ｇ．およびＢｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．ＢＭＪ  １９９４；３０９：１０２）。上記パラメーターのそれぞれに対して、Ｊａｖａ（登録商標）Ｓｔａｔによって９５％の信頼区間を算出した。比較される分析方法間の周辺同等性を、ＭｃＮｅｍａｒ検定によって評価した（Ｘ２）。＜０．０５のＰ値を統計的に有意であるとみなした。検査間の一致度を、Ｃｏｈｅｎのκ統計量を用いて評価した（Ｋ）。０．４〜０．６間のＫ値を中程度の一致度を有するとみなし、０．６１〜０．８の値をかなりの一致度を有するとみなした（Ｌａｎｄｉｓ，ＪＲ；Ｋｏｃｈ，ＧＧ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ．１９７７；３３：１５９−１７４．ｄｏｉ：１０．２３０７／２５２９３１０）。
【０１２３】
【表６】
2015130863.tif 000008
結果
計３２０の尿サンプルを、対応する子宮頸部試料のｈｃ２アッセイおよび細胞診検査の結果と比較するために、ＸｅｎｏｍｉｃｓのＣＥアッセイによって分析した。ｈｃ２に関する比較の結果を表７に示す。一致率は２４８／３２０（７７．５％）であった。３２０の尿サンプルのうち、７２は適合させた子宮頸部試料のｈｃ２アッセイと不一致の結果を出し、ＤＮＡシークエンシングによってさらに検証された。
【０１２４】
不一致物（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）のＤＮＡシークエンシング
まず、約４５０ｂｐの産物を生成するプライマーＭＹ０９／ＭＹ１１を用いることによって、代替的な増幅およびシークエンシングを試みた。高リスクのＨＰＶ産物が得られないまたは配列決定されない場合、次いで、約１５０ｂｐのフラグメントを作り出すＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いることによってシークエンシングを試みた。これらプライマーの対の両方は、ＣＥアッセイによるＨＰＶ検出に用いられたものから独立した部位であるＨＰＶ  Ｌ１領域を検証する。ＭＹ０９／ＭＹ１１および／またはＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーが低リスクＨＰＶの配列のみを作り出す、あるいは特定の産物を作り出さない場合には、ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを用いて、サンプル中にわずかでも存
在していれば高リスクＨＰＶ  ＤＮＡ配列の証拠を提供し得る、Ｅ１遺伝子の８８ｂｐの
痕跡を増幅した。
【０１２５】
ＣＥによって反応性であり、またｈｃ２によって非反応性である３８の不一致サンプル
のうち、１８サンプル（４７．４％）において、高リスクＨＰＶ型がＬ１領域のＤＮＡシ
ークエンシング（ＭＹ０９／ＭＹ１１および／またはＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー）に
よって証明された。さらには、ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを用いることによっ
て、さらなる１３サンプルが高リスクＨＰＶを有することが示され、計３１／３８（８１
．６％）が高リスクＨＰＶを含有することになった（表８）。
【０１２６】
ｈｃ２によって反応性であるがＣＥによって非反応性である３４の不一致サンプルのうち、４サンプルにおいて、高リスクＨＰＶ型がＬ１領域のＤＮＡシークエンシング（ＭＹ０９／ＭＹ１１および／またはＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー）によって証明された。ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを用いることによって、さらなる６サンプルが高リスクＨＰＶ型を有することが示された。この後者のプライマーは、おそらくＨＰＶの低力価のために、ＣＥによってサンプルを検出できなかったが、シークエンシングに対しては産物を増幅した。これは、ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを用いたＰＣＲが、シークエンシングには４５サイクルに対して、検出には４０サイクルで実施されたからかもしれない。後者の６サンプルを、ＭＹ０９／１１および／またはＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーの対を用いて増幅した場合、ＨＰＶ産物が生じないまたは低リスク型が生じた。合計で、ｈｃ２によって反応性であるがＣＥによってはそうでない３４サンプルのうちの１０（２９．４％）が、高リスクＨＰＶを含有することが示された（表８）。
【０１２７】
シークエンシングとともにＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを使用した結果により、ｈｃ２アッセイはＣＥ検査よりも多くの偽陽性および偽陰性の結果をもたらすことが示されている（表８）。このグループの患者に対する、Ｘｅｎｏｍｉｃｓおよびｈｃ２検査とシークエンシング結果との一致率は、それぞれ５５／７２（７６．４％）および１７／７２（２３．６％）である。ＣＥアッセイは、ＨＰＶ１６を有する５サンプル、１つのＨＰＶ１８、１つのＨＰＶ３３、１つのＨＰＶ３５、１つのＨＰＶ５１、および複数の高リスクＨＰＶ型（１６＋３３）を含有する１つを検出しなかった（表９）。しかしながら、それはＨＰＶ５１を除くそれぞれの型を有する他のサンプルを検出したため、これらの偽陰性は低力価による可能性がある（表１０）。本発明者らは、本発明者らの患者のサンプルセットにおいて、ＨＰＶ５１についての他の例を見出していないが、ＨＰＶ５１はＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを用いることによってのみ増幅され、また配列決定されたことに留意すべきである。
【０１２８】
それに対し、ｈｃ２アッセイは、ＨＰＶ１６を有する１３サンプル、６つのＨＰＶ１８、１つのＨＰＶ３１、１つのＨＰＶ３５、２つのＨＰＶ４５、１つのＨＰＶ５２、１つのＨＰＶ５８、および２つのＨＰＶ５９、および複数の高リスクＨＰＶ型（１６＋４５、１６＋３３、１６＋５６および１８＋３１）を含有する４つを検出しなかった（表１０）。ｈｃ２検査によって非反応性である３８サンプルのうちの３１（８１．６％）は、高リスクＨＰＶを含有していた。表１１は、高リスク型を明らかにするのにＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーを用いることを必要とした３１サンプルのうちの１３を一覧にしている。Ｌ１領域のプライマー（ＭＹ０９／ＭＹ１１および／またはＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー）を用いた第二のシークエンシングでは、ＨＰＶが検出されないまたは低リスク型を生じた。
【０１２９】
低リスクのサンプル
ＣＥアッセイは、ＡＳＣＵＳおよび正常として記された多くを含めた高リスクＨＰＶ陽性の女性をｈｃ２アッセイよりも多く検出した（表１０）。Ｓｉｍｂｉｏｓｙｓによって提供されたサンプルの中には、正常な細胞診の結果を有するがｈｃ２の結果を入手できないコントロールとして分類されたものがあった。他のものは、子宮頸部細胞診によって正常として記され、またｈｃ２によって非反応性であった。これらのグループ由来のサンプルは、ＳＴＤ外来および売春宿を含めた高リスク集団から入手したものであった。本発明者らは、正常または悪性でないという臨床診断を受けた、Ｍｅｔｒｏｐｏｌｉｓによって低リスクとして指定された５０サンプルを検査した。５０のうちの３つ（６．０％）はｈｃ２によって反応性であり、６つ（１２．０％）はＣＥによって反応性であった。この後者の６サンプルのうち、４つはシークエンシングによって高リスクＨＰＶ（型：１６、１８、および３１）を含有しており、２つはＨＰＶ  ＤＮＡの証拠を含有していなかった。
【０１３０】
低リスクと推定される集団におけるＨＰＶ感染の有病率をさらに検証するために、本発明者らは、インドにおける一般集団から入手した妊娠女性由来の５０の尿サンプルをアッセイした。細胞診およびｈｃ２の結果は、これらの患者から入手できなかった。５０のうち、１つはＸｅｎｏｍｉｃｓ  ＣＥアッセイによって反応性であった。ＤＮＡシークエンシングによって、このサンプルが高リスクＨＰＶ４５を含有していることを確認した。
【０１３１】
【表７】
2015130863.tif 000009
【０１３２】
【表８】
2015130863.tif 000010
【０１３３】
【表９】
2015130863.tif 000011
【０１３４】
【表１０】
2015130863.tif 000012
【０１３５】
【表１１】
2015130863.tif 000013
高リスクＨＰＶを検出するためのサンプルマトリックスとして尿を用いることの実現可能性を検証した。その結果、Ｘｅｎｏｍｉｃｓ  ＨＰＶ検査を定性的スクリーニング検査として提案することができ、それによって細胞診検査またはスクリーニングのための他の分子検査の必要性を排除し得る。
【０１３６】
Ｘｅｎｏｍｉｃｓ  ＨＰＶ検査をｈｃ２検査と比較した場合の一致率は７７．５％（２４８／３２０，Ｋ＝０．５；ｐ＝０．７）であり、全体的な感度および特異性はそれぞれ７５．０％（１０２／１３６）および７９．３％（１４６／１８４）であった（表７）。０．５というκ係数は、２つの検査間の中程度の一致度を示す。分析した３２０の尿サンプルのうち、７２が子宮頸部試料に基づくｈｃ２アッセイと不一致の結果を出し、解決のためにＤＮＡシークエンシングによってさらに検証された。ＤＮＡシークエンシングを究極の判断基準として用いると、ＣＥ検査は、証明された偽陰性率および偽陽性率がそれぞれ１０／１８０（５．６％）および７／１４０（５．０％）で、より高感度かつ特異性が高かった。それに対してｈｃ２アッセイは、それぞれ３１／１８４（１６．８％）および２４／１３６（１７．６％）の偽陰性率および偽陽性率を有した（表７および８）。
【０１３７】
ｈｃ２検査によって非反応性であり、またＸｅｎｏｍｉｃｓ検査によって反応性であるサンプルの大部分は、細胞診検査によってＡＳＣＵＳまたは正常な細胞学的所見であった。サンプルの１６／３８（４２％）、７／３８（１８．４％）および４／３８（１０．５％）を占めるＨＰＶ型１６、１８および４５は失敗した。インドの集団における正常な細胞学的所見を有する女性の間での高リスクのヒトパピローマウイルス型１６／１８感染の有病率は以前に報告されている（Ｇｕｐｔａ  Ｓ．ら、Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００８；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２３０３．２００８．００６１１）。その調査における細胞学的に正常な女性の間での全ＨＰＶ有病率は１６．６％であった。ＨＰＶ１６は１０．１％で検出され、一方でＨＰＶ１８は女性の１％で検出された。ＱＩＡＧＥＮ  ｈｃ２検査は、他のＰＣＲに基づく検査と比較した場合、正常またはＣＩＮ１細胞学的所見を有する３０歳を超えた女性において高リスクＨＰＶをより低く検出するという知見も以前に報告された（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｍ．Ｐ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００７；４５：２１３０−２１３７）。本発明者らのサンプル集団の８０％超も３０歳を超えていた。
【０１３８】
細胞診検査によって正常であり、またｈｃ２検査によって非反応性であるがＸｅｎｏｍｉｃｓ検査によって反応性であるサンプルの中には、高リスクおよび低リスクのＨＰＶ型での混合感染を有するものがあった。このことは、本発明者らのＨＰＶのＥ１領域を標的とするプライマーが、現在使用されている標準的な検査では不可能な条件下で、高リスクＨＰＶを検出し得るという見解を強めるものである。Ｌ１領域を標的とするプライマーが、ある高リスクＨＰＶ型（ＨＰＶ４８、５１、５２、６８）を検出できないことは以前に報告されている（Ｄｅｐｕｙｄｔ  Ｃ．Ｅ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００７；１１：８８１−８９１）。このことは、これらのサンプルにおけるＬ１領域の欠失によって説明できる。あるいは、ＭＹ０９／ＭＹ１１およびＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーの対は非特異的であり、それゆえ、低リスクＨＰＶ型の有無により、任意の潜在する高リスクＨＰＶを配列決定する試みが混乱する可能性がある。
【０１３９】
Ｘｅｎｏｍｉｃｓ  ＨＰＶ検査は、ＤＮＡシークエンシングによって確認されたｈｃ２反応性の１０サンプルにおいて高リスクＨＰＶ型を検出することができなかった（表９）。当該１０サンプルのうちの６つは、ＣＩＮ２およびそれ以上に病期分類されていた。考えられる説明は、ＨＰＶ  Ｅ１領域の欠失である（Ａｒｉａｓ−Ｐｕｌｉｄｏ  Ｈ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００６；４４：１７５５−１７６２）。当該６サンプルのうちの３つにおいて、ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーのみが、シークエンシングすると高リスクＨＰＶを含有するＰＣＲ産物をもたらした。第４のサンプルにおいて、ＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーにより高リスクＨＰＶ３３の存在が確認された。このことは、ゆえにＥ１領域が欠失していなかったことを示している。検出とは対照的に、ＪｕｍｐＳｔａｒｔＤＮＡポリメラーゼおよびサイクル数を含めたシークエンシングに用いられたＰＣＲ条件は、より高感度の増幅システムを提供し得る。ＨＰＶ  ＤＮＡ  ＣＥアッセイは、いくつかの低力価のＨＰＶサンプルが検出され得ないように、感度および特異性のバランスを保つ。当該結果は、市販のアッセイと比較して、より低い偽陽性および偽陰性の結果を有するアッセイである。
【０１４０】
表１２は、不一致サンプルを解決するために、ｈｃ２の結果を文献プライマー（ＭＹ０９／ＭＹ１１および／またはＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー）およびＸＥＮ−ＨＰＶ−Ｆ／−Ｒプライマーの両方を用いたＤＮＡシークエンシングと組み合わせた場合のアッセイ比較を考察するものである。この場合には、一致率は９４．７％（３０３／３２０，Ｋ＝０．８９，ｐ＝０．６）である。アッセイの感度は９３．０％（１３３／１４３）であり、特異性は９６．０％（１７０／１７７）である。陽性および陰性適中率は、それぞれ９５．０％（１３３／１４０）および９４．４％（１７０／１８０）である。０．８９というκ値は、２つの方法間の優れた一致度を示す。それゆえ、ＨＰＶゲノムのＬ１およびＥ１領域の両方を標的とするプライマーを用いたシークエンシング結果と組み合わせたＱＩＡＧＥＮ  ｈｃ２検査は、本発明者らのＣＥアッセイと同等であると考えられる（ｐ＝０．６）。
【０１４１】
したがって、尿に基づくＨＰＶ検査の感度は、現在用いられている子宮頸部細胞の分析に基づいたｈｃ２検査と同様またはより優れている。他の尿ＤＮＡに基づく調査と比較して、ＣＥ検査のより高い感度は、いくつかの要素によって説明できる。第一に、本発明者らの実験において、ＤＮＡは細胞画分ではなく尿全体から単離された。このことは、ＨＰＶ  ＤＮＡの全回収に重要である。死にかけている子宮頸部細胞由来のクロマチンフラグメントを交差するだけでなく、ＨＰＶ  ＤＮＡ配列は経腎臓性ＤＮＡ（Ｔｒ−ＤＮＡ）によっても寄与され得る（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ  Ｈ．Ｓ．ら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００８；１１３７：７３−８１）。この意見は、シークエンシング実験において、より短いアンプリコン（８８ｂｐ）を増幅するように設計された本発明者らのプライマーが、より大きい４５０ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計されたＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーよりも高リスクＨＰＶを検出したという事実によって裏付けられている。これらの結果はまた、より短いＤＮＡ標的をＰＣＲに用いることが、尿サンプルにおけるＨＰＶ検出の感度を増大させることを証明している。第二に、尿ＤＮＡのためのＱ樹脂に基づく技術は、シリカに基づく方法よりも、短いＤＮＡフラグメントの単離により効果的である。
【０１４２】
いくらかの高リスクＨＰＶの検出の差は、尿および子宮頸部細胞のサンプリングの比較から生じ得る。残念なことには、この調査において子宮頸部細胞を直接比較に利用できなかった。ＣＥアッセイによって非反応性であるいくつかのサンプルは、病院の患者に適用される種々の衛生上のルールの結果であり得ると仮定する人もいるかもしれない。
【０１４３】
ｈｃ２アッセイを他の分子アッセイと比較する多くの報告が発表されているが、しかしながら、これらのアッセイのすべては患者由来の子宮頸部細胞に基づいている。これは、ＨＰＶゲノムのＥ１領域を標的とするプライマーを用いることによって尿由来のＨＰＶ  ＤＮＡを検出する最初の報告である。この報告はまた、インドおよび他の発展途上国の女性における高リスクＨＰＶのスクリーニングに細胞診およびｈｃ２検査を用いることについて疑問を提起するものである。これらの国々では、主にスクリーニングプログラムの欠如または無効性のために、子宮頸癌の発生率と死亡率はほとんど抑制できないままである。サンプル回収の非侵襲性および簡潔性はスクリーニング検査の受け入れに重要であるため、子宮頸部細胞の掻爬の代わりに簡潔な尿回収を用いることは、先進国および発展途上国の両方において、子宮頸癌のためのＨＰＶスクリーニング検査の実行を促進し得る。
【０１４４】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年2月26日(2015.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列5′-CAGGCAGAATTAGAGRCAGC (SEQ ID NO:41または 99)を有するオリゴヌクレオチドであって、
ここで、RはAまたはGであり、そして、該オリゴヌクレオチドは任意にラベルされていてもよい、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは蛍光標識されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、XEN-HPV-FAM-F (SEQ ID NO:98) である請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマーと配列5′-TCCACCACAWACTTTCGTTTTA (SEQ ID NO:42 または 100)を有するリバースプライマーとを含む対をなすオリゴヌクレオチドプライマーであって、
ここで、ＷはＴまたはＡである、
オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
前記フォワードプライマーが蛍光標識されている、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
前記フォワードプライマーがXEN-HPV-FAM-F (SEQ ID NO:98)であり、そして、リバースプライマーがXEN-HPV-R (SEQ ID NO:100)である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項８】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項９】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１０】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット。
【請求項１１】
請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット。
【請求項１２】
請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット。
【請求項１３】
配列5′-TCCACCACAWACTTTCGTTTTA (SEQ ID NO:42 または 100)を有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、
ここで、ＷはＴまたはＡである、
オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１４】
患者におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を検出する方法であって、
患者から採取した尿サンプルにおいて、ＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出する工程を含み、ここで、前記検出は、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドへの１以上の配列のハイブリダイゼーションを含み、そして、ＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出することが、該患者における少なくとも１つのヒトパピローマウイルスの存在を示す、方法。
【請求項１５】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ネステッドプライマーＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＮＡハイブリダイゼーション、サイクリックプローブ反応、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、鎖置換増幅（ＳＴＡ）、および制限断片長多型（ＲＦＬＰ）からなる群から選択される技術を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出が、（ａ）前記オリゴヌクレオチドを増幅されたＥ１遺伝子配列を生成するためのフォワードプライマーとして、前記患者から採取した尿サンプル由来の核酸を増幅する工程、及び（ｂ）該増幅されたＥ１遺伝子配列を検出する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅が、さらに、配列5′-TCCACCACAWACTTTCGTTTTA (SEQ ID NO:42 または100)を有するオリゴヌクレオチドであって、ここで、ＷはＴまたはＡであるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅が、XEN-HPV-FAM-F (SEQ ID NO:98) 及びXEN-HPV-R (SEQ ID NO:100)をプライマーとして含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、トランスレナル（transrenal）ＤＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記尿サンプルにおける核酸分解を減少させる工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分解を減少させる工程が、上昇させたｐＨ、増大させた塩濃度、熱不活性化によって、または前記尿サンプルを、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンＨＣＩ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で処理することによって、ヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、前記増幅の前に、前記尿サンプル由来の前記核酸を実質的に単離する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離が、沈降によるまたは固形吸着物質を用いることによるものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、前記増幅されたＥ１遺伝子配列を定量化する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出が、さらに、ハイブリダイゼーション後の前記オリゴヌクレオチドの拡張（extension）を含む、請求項１４に記載の方法。
【外国語明細書】
2015130863000001.pdf