(57)【要約】      （修正有）【課題】迅速な核酸ハイブリダイゼーション用の組成物及び方法、特に次世代シーケンシングにおける標的核酸の濃縮及び選択のためのハイブリダイゼーション組成物及び方法の提供。【解決手段】二価カチオンの塩と緩衝剤とを約１００〜約６００ｍＭの範囲の濃度で含み、前記塩及び前記緩衝剤が約２．５：１〜約６０：１のモル比で存在する核酸ハイブリダイゼーション用の組成物、並びに標的核酸及びベイト核酸と前記組成物とを接触させて、ハイブリダイゼーション混合物を形成するステップと、前記ハイブリダイゼーション混合物を第１の温度で第１の期間変性させるステップと、前記混合物を第２の温度で第２の期間ブロッキングするステップと、前記混合物をインキュベートするステップを１回又は複数回繰り返すステップとを含む、標的核酸とベイト核酸とを核酸ハイブリダイゼーションする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ハイブリダイゼーション用の組成物であって、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭの範囲の濃度を有する二価カチオンの塩と緩衝剤とを含み、前記塩及び前記緩衝剤が約２．５：１〜約６０：１のモル比で存在する組成物。
【請求項２】
約０．００２重量％〜約１５重量％の範囲の濃度を有する体積排除／増粘剤を更に含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記緩衝剤が、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲の濃度を有する請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、及びカドミウムからなる群から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記体積排除／増粘剤が、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチセルロース、及びヒドロキシルメチルセルロースからなる群から選択される請求項２〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記体積排除／増粘剤が、デキストラン及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＴＥＳ、ＥＰＰＳ、及びＭＯＰＳからなる群から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション溶液を調製するための濃縮緩衝液であって、２倍〜２０倍の範囲の希釈により、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物がもたらされる濃縮緩衝液。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物又は濃縮緩衝液と、そのための包装材とを含む核酸ハイブリダイゼーション用のキット。
【請求項１０】
標的核酸及びベイト核酸と、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物とを接触させて、ハイブリダイゼーション混合物を形成するステップと、
前記ハイブリダイゼーション混合物を第１の温度で第１の期間変性させるステップと、
前記混合物を第２の温度で第２の期間ブロッキングするステップと、
前記混合物を、（ｉ）第３の温度で第３の期間、及び次いで、（ｉｉ）第４の温度で第４の期間、インキュベートするステップと、
前記インキュベートするステップを１回又は複数回繰り返すステップと
を含む、標的核酸とベイト核酸とを核酸ハイブリダイゼーションする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速な核酸ハイブリダイゼーション用の組成物及び方法に関する。特に、本発明は、次世代シーケンシングにおける標的核酸の濃縮及び選択のためのハイブリダイゼーション組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸シーケンシングは、分子生物学において最も広く使用されているツールの一つである。自動ＤＮＡシーケンサを用いる迅速かつ高感度なシーケンシング方法の開発は、現代の分子生物学を改革してきた。特に、植物、ウイルス、細菌、真菌、及び動物の全ゲノムの解析が、次世代シーケンシング技術によって今では可能である。
【０００３】
次世代シーケンシング技術は、高レベルの効率をゲノムシーケンシングのプロセスにもたらしてきた。しかし、技術の進歩にもかかわらず、関連するワークフローは遂行するのに複雑であり、時間及び費用がかかる傾向があるため、全ゲノムシーケンシングには依然として莫大な費用及び作業量が伴う。さらに、正確なサンプル調製、増幅及びシーケンシングには様々な技術的問題が存在する。結果として、短期間でのゲノムの迅速なシーケンシングという目標はいまだ可能ではない。
【０００４】
或る特定のタイプのゲノムＤＮＡ配列（例えば、エクソン）の標的濃縮に関連して行われる次世代シーケンシングにより、これらの標的に集中することが可能となる。この標的化次世代シーケンシングバリエーションにより、目的のゲノム領域のみが配列決定され、費用を削減し、かつ一回の研究あたりより多くのサンプルを解析することを可能にするプロセス効率が得られる。調べるＤＮＡの量を減らすことにより、研究者らがより統計的に関連性のある数のサンプルを用いた実験を遂行することが可能となる。
【０００５】
標的化濃縮のための様々なアプローチが当該技術分野において利用可能である。最も一般的に利用されている技術は、ハイブリッド・キャプチャー、ＰＣＲ、及び分子反転プローブ（molecular inversion probes）に基づくものである。大きな標的領域については、ハイブリッド・キャプチャーが最も効率的である。このアプローチの主な利点は、マイクロアレイ上ではなく溶液中での濃縮であり、これにより、取扱いがより容易になり、かつ必要なＤＮＡが少なくてすむことになる。溶液中キャプチャー、例えば、Agilent Technologies, Inc.によるＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）は、ＤＮＡ鋳型オリゴライブラリから転写されるビオチン化ＲＮＡベイト（bait）分子をしばしば適用し、ビオチン化ＲＮＡベイト分子は、主要な成分であるとともに、主な費用源である。特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３を参照されたい。
【０００６】
しかし、標的化次世代シーケンシング技術は非常に時間がかかる。迅速かつ対費用効果の高い様式での、標的化次世代シーケンシング技術の実行の成功のための主な障壁及び律速ステップは、ゲノム、ミトコンドリア及びその他の形態のＤＮＡにわたって散在している標的化エクソン又はイントロン領域を選択的に捕捉及び濃縮するための初期段階のステップにある。実際、現在の選択的ハイブリッド・キャプチャーの手順は、しばしば、１６時間から７０時間を超える範囲に及ぶ。例えば、特許文献１及びAgilent Technologies, Inc.によるＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）を参照されたい。結果として、すぐに配列決定できるサンプルを作製するためには通常２日間〜４日間もかかり、全体のシーケンシングプロセスを完了するためには更に長い時間がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０００２９４９８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mertes et al., Brief Funct Genomics 10:374-386
【非特許文献２】Gnirke et al., Nat. Biotechnol. 27:182-189
【非特許文献３】Albert et al., Nat. Methods 4:903-905
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、次世代シーケンシングのための核酸の迅速な標的濃縮又は選択の組成物及び方法に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーション用の新規な組成物、関連するキット、及び関連する方法に関する。このような組成物及び方法により、従来の手順よりもはるかに速く所望のゲノムＤＮＡ配列の標的濃縮を完了することが可能となる。
【００１１】
一態様において、本発明は、核酸ハイブリダイゼーション用の組成物（即ち、ハイブリダイゼーション組成物）を特徴とする。組成物は、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭの範囲（例えば、約１５０ｍＭ〜５００ｍＭ、２００ｍＭ〜４００ｍＭ、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、及び６００ｍＭ）の濃度を有する二価カチオンの塩と緩衝剤とを含有する。塩及び緩衝剤は、組成物において、約２．５：１〜約６０：１の範囲（例えば、２．５：１〜３０：１、２．５：１〜２０：１、２．５：１〜１５：１、１０：１〜２０：１、２．５：１〜５：１、２．５：１、５：１、８：１、１０：１、１２：１、１５：１、及び２０：１）のモル比で存在する。組成物において、緩衝剤は、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲（例えば、１５ｍＭ〜３５ｍＭ、２０ｍＭ〜３０ｍＭ、２０ｍＭ〜４０ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、及び４０ｍＭ）の濃度を有し得る。
【００１２】
二価カチオンは、マグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、及びカドミウムからなる群から選択され得る。一つの実施の形態において、二価カチオンはマグネシウムである。
【００１３】
緩衝剤は、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＴＥＳ、ＥＰＰＳ、及びＭＯＰＳからなる群から選択され得る。組成物のｐＨ値は、約７．０〜１１．０、例えば、７．５〜１０．０、７．０〜９．０、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、及び１１．０であり得る。
【００１４】
好ましい実施の形態において、組成物は、体積排除／増粘剤を更に含む。この体積排除／増粘剤は、約０．００２重量％〜約１５重量％の範囲の濃度を有し得る。体積排除／増粘剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチセルロース（methycellulose）、及びヒドロキシルメチルセルロースからなる群から選択することができる。この場合、体積排除／増粘剤は、約０．００２重量％〜約０．１重量％の範囲（例えば、約０．００２％〜約０．０５０％、０．００４％〜０．０２０％、約０．００６％〜０．０１２％、並びに約０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１０％、０．０１２％、０．０１５％、及び０．０２０％）の濃度を有し得る。体積排除／増粘剤はまた、デキストラン及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択することもできる。そしてこの場合において、体積排除／増粘剤は、約１重量％〜約１５重量％の範囲の濃度を有し得る。
【００１５】
ハイブリダイゼーション組成物は、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ブロッキング剤、ベイト核酸、及び標的核酸からなる群から選択される１又は複数の更なる作用剤を更に含んでいてもよい。いくつかの実施の形態において、標的核酸は、３０μｌの反応中に約２５０ｎｇ〜３０００ｎｇ（例えば、５００ｎｇ〜２０００ｎｇ、及び７５０ｎｇ〜１５００ｎｇ）、即ち、８．３ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ（例えば、１６．７ｎｇ／μｌ〜６６．７ｎｇ／μｌ及び２５ｎｇ／μｌ〜５０ｎｇ／μｌ）の濃度で存在し得る。好ましくは、体積排除／増粘剤及び核酸は、約０．２〜１２０（例えば、０．２〜１００、０．２〜５０、０．５〜１０、及び０．８〜８．０）の比で存在する。
【００１６】
ハイブリダイゼーション組成物の一つの実施の形態において、塩はＭｇＣｌ２であり、体積排除／増粘剤はＨＰＭＣであり、緩衝剤は、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）である。好ましくは、塩は、約３０８ｍＭの濃度を有し、ＨＰＭＣは、約０．００８３４％の濃度を有し、緩衝剤は、約２０ｍＭの濃度を有する。塩及び緩衝剤は、組成物において、約１５．４：１のモル比で存在する。組成物は、一価カチオン又はその塩を含有しないものであってもよい。
【００１７】
上記の緩衝液組成物は、標的、プローブ、ベイト、ブロッキング剤、湿潤剤、及びハイブリダイゼーション促進因子を含むその他の試薬の添加に適応するために、核酸ハイブリダイゼーション反応の分野において常識であるように、濃縮ストック溶液から調製することができる。したがって、本発明はまた、上記のハイブリダイゼーション組成物を調製するための濃縮緩衝液を提供する。濃縮緩衝液は、２倍〜２０倍（例えば、３倍〜１５倍、４倍〜１０倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、及び２０倍）の範囲の希釈により上記のハイブリダイゼーション組成物が得られるように、２×〜２０×（例えば、３×〜１５×、４×〜１０×、２×、３×、４×、５×、１０×、１５×、及び２０×）のストックであり得る。好ましい実施の形態において、濃縮緩衝液は、５×ストックであり、５倍希釈によって上記のハイブリダイゼーション組成物が得られる。
【００１８】
上記の濃縮緩衝液又はハイブリダイゼーション組成物とそのための好適な包装材とを含むキットもまた提供される。
【００１９】
本明細書中に開示されるように、ハイブリダイゼーション組成物は、標的核酸とベイト核酸との核酸ハイブリダイゼーションに使用することができる。したがって、本発明は、標的核酸とベイト核酸とを核酸ハイブリダイゼーションする方法を提供する。例えば、この方法は、以下のステップ：標的核酸及びベイト核酸と、上記の組成物とを接触させて、ハイブリダイゼーション混合物を形成するステップ；前記ハイブリダイゼーション混合物を第１の温度で第１の期間（例えば、９５℃で２分間〜３０分間、例えば、２分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間）変性させるステップ；前記混合物を第２の温度で第２の期間（例えば、６５℃で５分間〜３０分間、例えば、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間）ブロッキングするステップ；前記混合物を、（ｉ）第３の温度で第３の期間、及び次いで（ｉｉ）第４の温度で第４の期間、インキュベートするステップ、並びに前記インキュベートするステップを１回又は複数回繰り返すステップを含む。一つの実施の形態において、方法は、前記繰り返すステップの後に、前記混合物を第５の温度（例えば、６５℃）で保持するステップを更に含む。
【００２０】
ベイト核酸は、ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を有し得る。標的核酸は、目的のゲノムＤＮＡ核酸を有し得る。一つの実施の形態において、標的核酸及びベイト核酸は、担体に結合又は付着していない。即ち、対応するハイブリダイゼーションは、溶液中ハイブリダイゼーションである。
【００２１】
この方法において、インキュベートするステップは、使用者のアッセイ設計、タイムテーブル、及び目的に応じて任意のサイクル数行うことができる。サイクル数の好適な例としては、２０回〜１００回、３０回〜８０回、４０回〜７０回、及び５０回〜６０回が挙げられる。
【００２２】
インキュベートするステップにおいて、第３の温度及び第４の温度は異なっていても同一であってもよい。２つの温度が異なっている場合（例えば、６５℃及び３７℃）、それら２つの温度での持続時間は、それぞれ、例えば、１分間及び３秒間であり得る。サイクル数に応じて、インキュベートするステップ及び繰り返すステップは、２５分間〜３時間以下の範囲（例えば、２５分間、２６分間、３０分間、１時間、１．５時間、２時間、及び２．５時間）であり得る。第３の温度及び第４の温度が同一である場合、インキュベートするステップ及び繰り返すステップの持続時間はより長くするべきであり、例えば、約１時間〜４時間である。
【００２３】
本発明の一つ以上の実施形態の詳細を以下の本明細書に示す。本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】２４時間及び１時間の一定温度でのインキュベーションによる、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液のＤＮＡ捕捉性能を示すバイオアナライザエレクトロフェログラムである。
【図２】１時間のサイクリング温度でのインキュベーション及び２４時間の一定温度でのインキュベーションによる、本発明の高速ハイブリダイゼーション緩衝液及び従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液のＤＮＡ捕捉性能を示すバイオアナライザエレクトロフェログラムである。
【図３】１時間のサイクリング温度でのインキュベーション又は１時間の一定温度でのインキュベーションによる、本発明の高速ハイブリダイゼーション緩衝液及び従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液のＤＮＡ捕捉性能を示すバイオアナライザエレクトロフェログラムである。
【図４】ナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液とマグネシウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液との比較を示すバイオアナライザエレクトロフェログラムである。
【図５】高速のマグネシウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液及び２温度サイクリングインキュベーションにより捕捉されたゲノムＤＮＡと、従来のアプローチにより捕捉されたゲノムＤＮＡとを用いた次世代シーケンシングの性能パラメータを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、非常に高濃度の二価カチオン塩を有する緩衝液により、従来のハイブリダイゼーション緩衝液よりもはるかに迅速に、断片化したゲノムＤＮＡを溶液中ハイブリダイゼーションにより捕捉及び濃縮することが可能となるという予期せぬ知見に少なくとも部分的に基づくものである。本発明はまた、ハイブリダイゼーション混合物を２つの異なる温度に繰り返して供することによってハイブリダイゼーションを行うことにより、１つの一定温度で行われる従来のハイブリダイゼーション反応よりはるかに迅速に、断片化したゲノムＤＮＡを捕捉及び濃縮することが可能となるという予期せぬ知見に基づくものである。
【００２６】
１．  組成物
一態様において、本発明は、核酸ハイブリダイゼーション用の組成物又は緩衝液を提供する。ハイブリダイゼーション組成物又は緩衝液は、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭの範囲（例えば、約１５０ｍＭ〜５００ｍＭ、２００ｍＭ〜４００ｍＭ、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、及び６００ｍＭ）の濃度を有する二価カチオンの塩と、体積排除／増粘剤と、緩衝剤とを含有する。様々な二価カチオン塩、体積排除／増粘剤、及び緩衝剤を用いることができる。塩及び緩衝剤は、約２．５：１〜約６０：１の範囲（例えば、２．５：１〜３０：１、２．５：１〜１５：１、２．５：１〜５：１、２．５：１、５：１、８：１、１０：１、１２：１、１５：１、及び２０：１）のモル比で存在する。
【００２７】
＜塩＞
本発明による緩衝液組成物は、従来の核酸ハイブリダイゼーションのための濃度よりも高濃度の二価カチオンの塩を含有する。従来のハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーションのためのプロセスは、引用することによって本明細書の一部をなすものとする、J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2nd Ed., 1989, vol. 1-3に記載されている。一般に、従来のハイブリダイゼーションのための条件には、（１）高イオン強度の溶液、（２）制御された温度、並びに（３）キャリアＤＮＡ及び界面活性剤及び二価カチオンのキレート剤の存在下、が含まれる。
【００２８】
一般に、従来の核酸ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液及び生理食塩水−リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）緩衝液）は、ナトリウムベースであり、通常、二価カチオン、例えば、マグネシウムを含有しない。いくつかの緩衝液、例えば、ＳＳＰＥは、二価カチオンが、いくらか溶液中に残っている場合でも、低減した反応性しか示さないように、試験サンプル又はその他の源に由来する二価カチオンを捕捉するためにキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含有するものですらある。いくつかの文献には、マグネシウムはハイブリダイゼーション中の核酸二本鎖の安定化において有効であり得ると示されているが、マグネシウムは、ハイブリダイゼーション反応に用いられる場合、非特異的ハイブリダイゼーション反応を減らすために通常１５ｍＭ以下で使用される。例えば、Springer et al., Nucleic Acids Res. 2010 Nov;38(20):7343-51を参照されたい。
【００２９】
実際、マグネシウムは、オリゴヌクレオチドの鋳型ＤＮＡへのアニーリングに対して、それらの相互作用を安定化することによって影響し、それゆえ非特異的アニーリングを増加させ、望ましくない生成物を生成させるということが当該技術分野において既知であった。非特異的増幅が起こると、通常、Ｍｇ２＋を低下させる必要があるか、又はＥＤＴＡを添加してＭｇ２＋をキレート化することにより、増幅の正確性及び特異性を上昇させることができる。例えば、米国特許第７９３９６４５号を参照されたい。本明細書中に開示されるように、高濃度の二価カチオンの塩を用いることにより、特異性を犠牲にすることなく、核酸ハイブリダイゼーションを介して断片化したゲノムＤＮＡを捕捉及び濃縮することに成功することができるということは予期せぬことであった。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「塩」は、生成物が中性となるようにカチオン及びアニオンから構成されるイオン性化合物のことをいう。本発明において有用な二価カチオン塩としては、これらに限定されないが、マグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、及びカドミウムの塩が挙げられる。塩はまた、当業者に既知の、二価カチオンの、炭酸水素塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、臭化物、クエン酸塩、酢酸塩、シアン化物、酸化物又はリン酸塩も含み得る。より好ましくは、塩は、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、又は硝酸マグネシウム（Ｍｇ（ＮＯ３）２）である。さらに、本発明において有用な塩には、無機塩の混合物又はブレンドが含まれ得る。本発明において用いることができる無機塩のブレンドとしては、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、及びＭｇ（ＮＯ３）２のあらゆる組合せが挙げられる。塩は、約１０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲、好ましくは１５ｍＭ〜２５ｍＭの範囲、例えば、２０ｍＭの濃度で、本発明に従って使用することができる。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」又は「結合」という用語は、相補的（部分相補的を含む）なポリヌクレオチド鎖の対形成のことをいう。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（例えば、ポリヌクレオチド鎖の間の会合の強度）は、ポリヌクレオチドの間の相補性の程度、塩濃度等の条件によって影響を受ける関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、その他の成分の存在、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、及びポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量を含む、当該技術分野において既知の多数の因子により影響を受ける。或るポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」と言われる場合、それは、それらの２つのポリヌクレオチドの間にある程度の相補性があること、又はそれら２つのポリヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成することを意味する。或るポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドとハイブリダイズしないと言われる場合、それは、それらの２つのポリヌクレオチドの間に配列相補性がないこと、又はそれらの２つのポリヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件でハイブリッドを形成しないことを意味する。
【００３２】
本明細書において用いる場合、「相補的」という用語は、２つのポリヌクレオチド鎖の領域の間又は同じポリヌクレオチド鎖の２つの領域の間の配列相補性の概念のことをいう。第１のポリヌクレオチド領域のアデニン塩基は、第１の領域と逆平行の第２のポリヌクレオチド領域の塩基と、その塩基がチミン又はウラシルである場合、特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることが既知である。同様に、第１のポリヌクレオチド鎖のシトシン塩基は、第１の鎖と逆平行の第２のポリヌクレオチド鎖の塩基と、その塩基がグアニンである場合、塩基対形成することができることが既知である。ポリヌクレオチドの第１の領域は、同じ又は異なるポリヌクレオチドの第２の領域と、それら２つの領域を逆平行の様式で配置した際に、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチドが第２の領域の塩基と塩基対形成することができる場合、相補的である。それゆえ、２つの相補的なポリヌクレオチドは、すべてのヌクレオチド位置で塩基対を形成する必要はない。「相補的」は、第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドと１００％又は「完全に」相補的であり、それゆえ、すべてのヌクレオチド位置で塩基対を形成することをいう。「相補的」はまた、１００％相補的ではない（例えば、９０％、又は８０％又は７０％相補的な）第１のポリヌクレオチドが、１又は複数のヌクレオチド位置でミスマッチしたヌクレオチドを含むこともいう。一つの実施形態において、２つの相補的なポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができる。例えば、膜ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）については、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、放射標識プローブとの、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、１％ＳＤＳ中での６５℃でのインキュベーションとして規定される。膜ハイブリダイゼーションについてのストリンジェントな洗浄は、以下のように行われる。膜を、室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、及び６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、洗浄１回あたり１０分間洗浄し、そしてフィルムに露出する。
【００３３】
実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは、少なくともハイブリダイゼーション実験のタイプ及び複雑性に応じて、完了するのに約１時間未満（例えば、約２５分間）から８時間かかり得る。「完了する」とは、標的核酸物質の所望の量のハイブリダイゼーションが達成されることを意味し、それは使用者及び標的物質の両方に依存する。以下の実施例において示すように、本発明の方法及び組成物は、従来のハイブリダイゼーションパラメータでは成功しない場合でも、例えば、約１時間のハイブリダイゼーション時間で良好に実施できる。本発明の方法及び組成物は、完了するのに少なくとも２５分間（例えば、１時間〜３時間）かかるハイブリダイゼーションを特に良好に実施でき、より具体的には、約１時間〜２時間かかるハイブリダイゼーションを良好に実施できる。
【００３４】
＜体積排除／増粘剤＞
本発明による緩衝液組成物は、体積排除／増粘剤を含有する。本明細書において用いる場合、「体積排除／増粘剤」は、周囲の環境から水分子を誘引及び保持する良好な能力を有する、不活性な粘弾性剤のことをいう。この水誘引−保持能力のために、体積排除／増粘剤は、ハイブリダイゼーション溶液中の利用可能な核酸及びプローブ／ベイトの濃度を人為的に上昇させ、非特異的結合部位を飽和させることによりハイブリダイゼーション効率を上昇させることができる。
【００３５】
好ましくは、体積排除／増粘剤は、水溶液中に可溶性であり、かつ、熱ゲル化特性を示す、粘弾性の高分子量ポリマーである。即ち、溶液が特定の臨界温度まで熱くなると、溶液は凝結して、非流動性であるが半柔軟な塊となる。典型的には、この特定の凝結温度は、かかる体積排除／増粘剤の溶液濃度と逆相関する。これらの特徴により、体積排除／増粘剤は２つの異なる温度で２つの異なる粘弾性状態を示す。したがって、体積排除／増粘剤をハイブリダイゼーション溶液に含め、かつ、２温度（例えば、６５℃及び３７℃）サイクリングインキュベーションハイブリダイゼーションに用いると、体積排除／増粘剤は、２つの異なるハイブリダイゼーション環境を標的核酸及び捕捉プローブ／ベイトに提供する。
【００３６】
これらの２つの粘弾性状態は、ハイブリダイゼーション温度の繰り返される変化によりもたらされる対流運動と相まって、捕捉プローブ／ベイトがその特異的な標的核酸と遭遇する機会及び確率を大幅に上昇させ、それにより特異的なハイブリダイゼーションを上昇させ、かつ、特異的な標的−プローブ／ベイト二本鎖を形成させる。さらに、体積排除／増粘剤の「体積排除」効果は、ハイブリダイゼーション溶液中で利用可能な核酸及びプローブ／ベイトの濃度を人為的に上昇させることにより、効率を更に高める。高濃度二価カチオンもまたこの効率に寄与し、これは、特異的な標的−プローブ／ベイト二本鎖を安定化する。
【００３７】
医薬製品において用いられている様々な賦形剤及び錠剤化成分がこれらの特徴を有する。これらはそれゆえ本発明による緩衝液組成物における体積排除／増粘剤として使用することができる。体積排除／増粘剤の例としては、メチルセルロース及びその誘導体、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチセルロース（methycellulose）、及びヒドロキシルメチルセルロースが挙げられる。
【００３８】
＜緩衝剤＞
本発明の緩衝液組成物は、緩衝剤を含有する。本発明の組成物のｐＨは、約６．０〜約１１．０の範囲内、例えば、約７〜約９、約７．５〜約８．５、又は約８．０に制御することができる。緩衝剤は、約６．０〜約１１．０の少なくとも１つのｐＫａ値及び／又はｐＫｂ値を有する、あらゆる有機又は無機、酸又は塩基、及びそれらのアルカリ金属塩を含んでいてもよい。緩衝剤は、２つ以上のｐＫａ値及び／又はｐＫｂ値を有していてもよい。緩衝剤は、示された範囲内のそのｐＫａ値及び／又はｐＫｂ値の少なくとも１つを有することができる。
【００３９】
様々な緩衝剤が当該技術分野において既知である。当業者であれば本明細書の開示を鑑みて、好適な緩衝剤を選択することができ、かつ、自身のアッセイの目的に合わせた本発明の緩衝液組成物を設計することができるであろう。いくつかの実施例において、緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｔｒｉｓ又はＴＨＡＭ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ又はＥＰＰＳ）、及びいわゆるグッドバッファー（“Good’s” buffers）のその他の緩衝液であり得る。例えば、Good et al., 1966, Biochemistry5 (2): 467-477、Good et al., 1972, Methods Enzymol. 24: 53-68、及び Ferguson et al., 1980, Anal. Biochem. 104: 300-310を参照のこと。更なる例としては、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ジメチルアルシン酸（カコジル酸塩）、コハク酸、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＮａＯＨ、及びＫＯＨが挙げられる。
【００４０】
他の好適な緩衝剤は、例えば、アクリジン、フェニルアラニン、アロスレオニン、ｎ−アミルアミン、アニリン、ｎ−アリルアニリン、４−ブロモアニリン、４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ｍ−クロロアニリン、ｐ−クロロアニリン、３−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、３，５−ジブロモアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−エチルアニリン、４−フルオロアニリン、Ｎ−メチルアニリン、４−メチルチオアニリン、アニリン−３−スルホン酸（3-sulfonic acid aniline）、アニリン−４−スルホン酸（4-sulfonic acid aniline）、ｐ−アニシジン、アルギニン、アスパラギン、グリシルアスパラギン、ＤＬ−アスパラギン酸、アジリジン、２−アミノエチルベンゼン、ベンジジン、ベンズイミダゾール、２−エチルベンズイミダゾール、２−メチルベンズイミダゾール、２−フェニルベンズイミダゾール、２−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、ベンジルアミン、２−アミノビフェニル、ブルシン、１，４−ジアミノブタン、ｔ−ブチルアミン、４−アミノ酪酸、グリシル−２−アミノ−ｎ−酪酸、カコジル酸、β−クロルトリエチルアンモニウム−ｎ−酪酸（β-chlortriethylammonium-n-butyric acid）、コデイン、シクロヘキシルアミン、シスチン、ｎ−デシルアミン、ジエチルアミン、ｎ−ドデカンアミン、１−エフェドリン、１−アミノ−３−メトキシエタン、１，２−ビスメチルアミノエタン、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、１−グルタミン酸、α−モノエチルグルタミン酸、１−グルタミン、１−グルタチオン、グリシン、ｎ−アセチルグリシン、ジメチルグリシン、グリシルグリシルグリシン、ロイシルグリシン、メチルグリシン、フェニルグリシン、Ｎ−ｎ−プロピルグリシン、テトラグリシルグリシン、グリシルセリン、デクサデカンアミン（dexadecaneamine）、１−アミノヘプタン、２−アミノヘプタン、２−アミノヘキサン酸、ＤＬ−ヒスチジン、β−アラニルヒスチジン、イミダゾール、１−アミノインダン、２−アミノイソ酪酸、イソキノリン、１−アミノイソキノリン、７−ヒドロキシイソキノリン、１−ロイシン、グリシルロイシン、メチオニン、メチルアミン、モルヒネ、モルホリン、１−アミノ−６−ヒドロキシナフタレン、ジメチルアミノナフタレン、α−ナフチルアミン、β−ナフチルアミン、ｎ−メチル−α−ナフチルアミン、ｃｉｓ−ネオボルニルアミン（neobornylamine）、ニコチン、ｎ−ノニルアミン、オクタデカンアミン、オクチルアミン、オルニチン、パパベリン、３−アミノペンタン、吉草酸、ペルミジン（permidine）、フェナントリジン、１，１０−フェナントロリン、２−エトキシアニリン、３−エトキシアニリン、４−エトキシアニリン、α−ピコリン、β−ピコリン、γ−ピコリン、ピロカルピン、ピペラジン、ｔｒａｎｓ−２，５−ジメチルピペラジン、１−ｎ−ブチルピペリジン、１，２−ジメチルピペリジン、１−エチルピペリジン、１−メチルピペリジン、プロリン、ヒドロキシプロリン、１−アミノ−２，２−ジメチルプロパン、１，２−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン、１，２，３−トリアミノプロパン、３−アミノプロパン酸、プテリジン、２−アミノ−４，６−ジヒドロキシプテリジン、２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン、６−クロロプテリジン、６−ヒドロキシ−４−メチルプテリジン、プリン、６−アミノプリン、２−ジメチルアミノプリン、８−ヒドロキシプリン、２−メチルピラジン、２−アミノ−４，６−ジメチルピリミジン、ピリジン、２−アルドキシムピリジン、２−アミノピリジン、４−アミノピリジン、２−ベンジルピリジン、２，５−ジアミノピリジン、２，３−ジメチルピリジン、２，４−ジメチルピリジン、３，５−ジメチルピリジン、２−エチルピリジン、メトキシピリジン、４−メチルアミノピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、１，２−ジメチルピロリジン、ｎ−メチルピロリジン、５−ヒドロキシキナゾリン、キニーネ、３−キノリノール、８−キノリノール、８−ヒドロキシ−５−スルホキノリン、６−メトキシキノリン、２−メチルキノリン、４−メチルキノリン、５−メチルキノリン、セリン、ストリキニーネ、タウリン、ミリスチルアミン、２−アミノチアゾール、スレオニン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジン、２，４，６−トリアミノ−１，２，３−トリアジン、トリデカンアミン、トリメチルアミン、トリプトファン、チロシン、チロシンアミド、バリン、これらの塩、及びこれらの混合物であり得る。好適な緩衝剤の更なる例は、例えば、それらの内容を引用することによって本明細書の一部をなすものとする、米国特許出願公開第２００８０２０７９６０号及び米国特許出願公開第２００６０２１０９９７号において見出すことができる。これらの緩衝液又は化合物は、典型的かつ有利には、生物学的に不活性であり、かつ、生化学反応に干渉しない。
【００４１】
＜更なる成分＞
本発明による緩衝液組成物は、様々な核酸ハイブリダイゼーション反応プロトコルに使用することができる。例としては、溶液中ハイブリダイゼーション、担体に基づくハイブリダイゼーション、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、並びに膜、マイクロアレイ及び細胞／組織スライド上でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。したがって、そのようなプロトコルのための、反応時間及び温度、サーマルサイクリングプロファイル、ハイブリダイゼーションプローブ／ベイトの配列及び濃度、検出剤（例えば、色素、酵素、放射性同位元素、及びフルオロフォア）は、一般に、変更することなく本発明の緩衝液組成物とともに使用することができる。よって、本発明の緩衝液組成物又は以下に記載する関連する濃縮形態はプロトコルに好適な１又は複数の更なる成分を含んでいてもよい。
【００４２】
そのような更なる成分の例としては、ヌクレオチド、核酸ポリメラーゼ、プライマー、核酸鋳型、色素、ハイブリダイゼーションベイト／プローブ、ハイブリダイゼーション促進因子、ブロッキング剤／ブロッカー（例えば、キャリア核酸又はタンパク質）、洗浄剤（例えば、ＮＰ４０）、界面活性剤、湿潤剤、及びヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）が挙げられる。
【００４３】
２．  濃縮緩衝液
本発明の緩衝液組成物は、核酸ハイブリダイゼーション反応の分野において常識であるように、標的、プローブ、ベイト、ブロッキング剤、湿潤剤、及びハイブリダイゼーション促進因子を含むその他の試薬の添加に適応するために、濃縮ストック溶液として調製してもよい。緩衝液組成物は、すべての成分が、所望の終濃度よりも２倍〜２０倍高い濃度、例えば、５倍高い、又は１０倍高い濃度で存在する濃縮液として調製することができる。
【００４４】
本発明の濃縮緩衝液の例としては、１５４０ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０４１７％ＨＰＭＣ、及び１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含む５×ストック溶液が挙げられる。別の例は、６１６ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６６８％ＨＰＭＣ、及び４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含む２×ストック溶液である。更に別の例は、１２３２ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０３３３６％ＨＰＭＣ、及び８０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含む４×ストック溶液である。
【００４５】
３．  ハイブリダイゼーション方法
本開示の別の態様において、核酸プローブ又はベイトのセットと標的核酸の集団とをハイブリダイズさせる方法が提供される。ハイブリダイズさせる方法は、核酸と本発明のハイブリダイゼーション緩衝液組成物とを接触させるか又は混合するステップと、結果として生じた混合物を、異なっていても同一であってもよい２つのハイブリダイゼーション温度でインキュベートするステップとを含む。
【００４６】
異なっている場合、２つの温度の間の差は、混合物中の成分、例えば、プローブ／ベイト及び標的核酸の対流運動をもたらすのに十分に大きくするべきである（例えば、５℃〜４０℃、２０℃〜３５℃、２０℃、２５℃、３０℃、及び３５℃）。その場合、高いほうの温度は、約５５℃〜約７５℃の範囲（例えば、６０℃〜７０℃及び６５℃）であってよく、低いほうの温度は、約３０℃〜約５０℃（例えば、３５℃〜４５℃及び３７℃）であってよい。
【００４７】
上記のように、インキュベーション／ハイブリダイズさせる期間は、例えば、約２５分間から８時間超に及び得る。この方法は、速度及び時間節約が重要である場合に特に有用である。好ましくは、緩衝剤は、上記のものの１又は複数から選択すればよく、例えば、ｐＨ６〜１１のｐＨ範囲内で緩衝能を有するＴｒｉｓが挙げられる。カチオンは、塩、好ましくは、上記で開示されるものの１又は複数、及びそれらの混合物から選択される塩によって提供することができる。より好ましくは、ハイブリダイゼーション緩衝液組成物は、１又は複数の更なる作用剤、例えば、体積排除／増粘剤、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ブロッキング剤、及び界面活性剤を更に含んでいてもよい。
【００４８】
本発明のハイブリダイゼーション方法は、様々な型式の核酸ハイブリダイゼーション、例えば、溶液中ハイブリダイゼーション、及び、例えば、固体担体上でのハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、並びに、膜、マイクロアレイ及び細胞／組織スライド上でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）において用いることができる。特に、この方法は、標的化次世代シーケンシングにおいて使用される或る特定のタイプのゲノムＤＮＡ配列（例えば、エクソン）の標的濃縮のための溶液中ハイブリッド・キャプチャーに好適である。上記のように、標的化核酸の選択的な捕捉及び濃縮は、主な障壁及び律速ステップであり、従来のハイブリダイゼーション方法では、満足な迅速なアプローチを提供することができなかった。標的化次世代シーケンシングにおける使用のために、本発明のハイブリダイゼーション方法は、Agilent Technologies, Inc.、Illumina, Inc.、454 Life Sciences、Life Technologies Corporation、Affymetrix, Inc.、及びその他によって提供されるシステム及びプラットフォームに関連して用いることができる。
【００４９】
変性及びブロッキングするステップは、標準的な、当該技術分野において既知の、従来の方法で行うことができるが、サーマルサイクリングハイブリダイゼーションインキュベーションステップは独自のものである。本発明のハイブリダイゼーション緩衝液とともに用いる場合、ハイブリダイゼーション時間は約２５分間までも減らすことができる。
【００５０】
本発明の方法及び組成物により、例えば、ハイブリダイゼーションプロセスを短縮し、それにより、標的化核酸の選択的捕捉及び濃縮を迅速化することによって、当該技術分野における問題を克服することが可能となる。本明細書中に開示されるように、本開示の方法及び組成物は、偏りが少なく、かつ、次世代シーケンシング適用に良好な、特異性、読み取り分布、配列適用範囲、及び再現性を示す。この方法の１つの例は、以下のステップを含む。
【００５１】
ステップ１：本発明の高速ハイブリダイゼーション緩衝液を室温で解凍するまで予熱し、使用準備ができるまで室温で維持する。
【００５２】
ステップ２：ブロッキング反応を室温に設定する。５μＬのブロッカー混合物を各１２μＬの調製されたＤＮＡサンプル（７５０ｎｇ〜１５００ｎｇの全ＤＮＡ）に添加する。混合物をピペット操作で上下させる。短時間遠心沈殿させる。１２μＬのサンプルが１５００ｎｇのＤＮＡを上回る場合、より小さい体積を使用し、水をブロッキング反応液に添加して全体積を１７μＬとする。
【００５３】
ステップ３：ＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒ８８００サーマルサイクラーを以下の表に示すようにプログラムする。プログラムを開始させ、直ちに一時停止ボタンを押す。これにより蓋を加熱し、一方、ブロッカー混合物を、予め調製したゲノムＤＮＡ断片のライブラリに添加する。
【００５４】
ステップ４：プレイボタンを押してプログラムを再開することによりサーマルプログラムをＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒ８８００で遂行する。
【００５５】
サイクリングプロファイル：ブロッキング及び高速ハイブリダイゼーションインキュベーション
【表１】
2015180193.tif 000002
【００５６】
ステップ５：ＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒでサンプルをインキュベートしている間に、捕捉ベイト混合物を氷上で調製する。
【００５７】
ステップ６：ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋを捕捉のために希釈する。１０μＬのＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（Agilent Technologies, Inc.）を３０μＬの水と混合する（ＲＮａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ１部：水３部）。
【００５８】
ステップ７：希釈したＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＲＮａｓｅ  ｂｌｏｃｋ及びＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  Ｖ５ベイト（Agilent Technologies, Inc）を室温の高速ハイブリダイゼーション緩衝液に以下の表にしたがって添加することにより、ハイブリダイゼーション混合物を調製する。
【００５９】
【表２】
2015180193.tif 000003
【００６０】
ステップ８：サーマルサイクルが６５℃の第１のハイブリダイゼーションサイクルに達したら、一時停止ボタンを押す。サーマルサイクラーをすぐに６５℃に維持する。サーマルサイクラーの蓋を開け、そして１３μＬのハイブリダイゼーション混合物をそれぞれの対応するブロッキング反応液にピペットで入れる。ゆっくりとピペット操作により８回〜１０回上下させることによりよく混合する。ハイブリダイゼーション反応液はここで３０μＬである。
【００６１】
ステップ９：ウェルをキャップで密封し、蓋を閉じ、プレイボタンを押してプログラムを再開させ、ホットトップ（hot top）を稼働させて、サイクリングハイブリダイゼーションプロファイルを実行する。
【００６２】
ステップ１０：磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１、Invitrogen）を調製する。
１．  ボルテックスミキサでＤｙｎａｌ（Invitrogen）磁気ビーズを勢いよく再懸濁させる。Ｄｙｎａｌビーズは保管中に沈む。
２．  各ハイブリダイゼーションサンプルについて、５０μＬのＤｙｎａｌ磁気ビーズをストリップチューブ／９６ウェルプレートに添加する。
３．  ビーズを洗浄する。
ａ．  ２００μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液（Agilent Technologies, Inc）を添加する。
ｂ．  ピペット操作により１０回上下させることによりビーズを混合する。
ｃ．  チューブを９６ウェル磁気スタンドに入れる。
ｄ．  ５分間待機し、そして上清を取り出して捨てる。
ｅ．  ステップａからステップｄを繰り返し、合計３回洗浄する。
４．  ビーズを２００μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液に再懸濁させる。
【００６３】
ステップ１１：ハイブリダイズしたＤＮＡを、ストレプトアビジンビーズを用いて捕捉する。
１．  インキュベーションの後、サンプルをサーマルサイクラーから取り出し、そして室温で短時間遠心して液体を収集する。各サンプルについての全ハイブリダイゼーション混合物を、対応する洗浄済みの用意ができたＤｙｎａｌ  ＭｙＯｎｅＴ１ストレプトアビジンビーズ溶液に添加し、そしてストリップチューブ／プレートを３回〜５回反転させて混合する。ハイブリッド−キャプチャー／ビーズ溶液をニューテーター（Ｎｕｔａｔｏｒ）又は振盪機上で３０分間室温でインキュベートする。プレート中でサンプルが適切に混合していることを確実にする。
２．  ９６ウェルプレート中の１ウェルあたり２００μＬをアリコートとすることにより、洗浄緩衝液＃２を６５℃で予熱する（３回の洗浄のために１つのハイブリダイゼーション反応あたり３ウェル）。ウェルにキャップをし、そしてサーマルサイクラーを用いて６５℃でインキュベートしつつ、ハイブリダイゼーションサンプルをニューテーター又は振盪機上で３０分間置く。
３．  ハイブリッド−キャプチャー／ビーズ溶液を３０分後に短時間遠心沈殿させる。
４．  ビーズ及び緩衝液を磁気分離器で分離し、そして上清を取り出す。
５．  ピペット操作により８回〜１０回上下させることによりビーズを２００μＬの洗浄緩衝液＃１に再懸濁させ、次いでボルテックスミキサ上で８秒間高速で混合する。
６．  ビーズを洗浄する。
ａ．  ビーズ及び緩衝液を９６ウェル磁気スタンドで１分間かけて分離させ、そして上清を取り出す。
ｂ．  ２００μＬの予熱した洗浄緩衝液＃２を添加する。ゆっくりとピペット操作により１０回上下させ、ビーズを再懸濁させる。ピペット操作により洗浄緩衝液を上下させて緩衝液を直接ペレット化したビーズに分注すると、それらはより高速に再懸濁される。
ｃ．  ウェルにキャップをする。ホットトップを使用してサーマルサイクラー上で１０分間６５℃でサンプルをインキュベートする。
ｄ．  ステップａからステップｃを繰り返し、合計３回洗浄する。
ｅ．  すべての洗浄緩衝液＃２が確実に除去されるようにする。
ｆ．  ２３μＬのヌクレアーゼ非含有水を添加し、５秒間ボルテックスしてビーズを再懸濁させ、そしてＰＣＲステップへと進む。
【００６４】
ステップ１２：２５μＬのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Agilent Technologies, Inc）を、捕捉されたＤＮＡが結合しているストレプトアビジンビーズの２３μＬのサンプルのそれぞれに添加する。
【００６５】
ステップ１３：１μＬの好適なインデックス、例えば、２つのＰ５  ｉ１３又はｉ１４の１つ、及び８つのＰ７  ｉ１〜ｉ８の１つ（Agilent Technologies, Inc）のそれぞれを添加する。
【００６６】
ステップ１４：サーマルプログラムをＳｕｒｅＣｙｃｌｅｒ８８００で遂行する。
【００６７】
捕捉後のＰＣＲインデックス化サイクリングプロファイル
【表３】
2015180193.tif 000004
【００６８】
ステップ１５：ＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ精製。
１．  ストリップチューブ／プレートを磁気スタンド上で２分間置くことにより、Ｄｙｎａｌ  ＭｙＯｎｅＴ１ストレプトアビジンビーズを捕捉後の増幅反応液から除去する。次いで、５０μＬのＰＣＲ反応液を取り出し、新しいストリップチューブ／プレートに入れる。Ｄｙｎａｌ  ＭｙＯｎｅＴ１ストレプトアビジンビーズはここで捨てることができる。
２．  ６０μＬの均質なＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを捕捉後増幅反応液のそれぞれに添加する。勢いよくピペット操作により２０回上下させることによりよく混合する。ビーズが均一に混合されることを確実にするよう確認する。ビーズは均質に一色であるべきであり、液体の層が存在してはならない。
３．  チューブを５分間室温でインキュベートする。
４．  チューブを９６ウェル磁気スタンド中に置く。溶液が清澄となるよう５分間待機する。磁気スタンド中のチューブを攪乱してはならない。
５．  清澄となった溶液を慎重に捨てる。ビーズを全く取り出さないことを確実にする。
６．  チューブを磁気スタンド中に維持し続けながら、２００μＬの７０％エタノールを各サンプルウェル中に分注する。
７．  ７０％エタノールを１分間放置して、すべての攪乱されたビーズを沈ませ、次いでエタノールを除去する。合計２回の洗浄のために、ステップ６及びステップ７を１回繰り返す。エタノールを可能な限り多く除去することを確実にする。
８．  蓋を開けて３７℃で１分間〜３分間サーマルサイクラー上でサンプルを乾燥する。ビーズを過剰に乾燥させてはならない。
９．  ２５μＬのヌクレアーゼ非含有水を添加する。ボルテックスによりよく混合する。ビーズを短時間遠心沈降させ、そして２分間室温でインキュベートする。
１０．  溶液が清澄となるまで、サンプルを９６ウェル磁気スタンド上に２分間置く。２５μＬの上清を新しいＬｏＢｉｎｄチューブに取り出す。
【００６９】
この時点で、必要があれば、アッセイを停止させてもよい。その場合、プレートを密封し、そして−２０℃で保管する。
【００７０】
ステップ１６：ＤＮＡサンプルを２１００バイオアナライザＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙアッセイにより評価する。バイオアナライザエレクトロフェログラムプロファイルは図２〜図４と同様になるはずである。
【００７１】
ステップ１７：多重シーケンシングのためのサンプルをプールする。
単一のシーケンシングレーンにおいて多重とすることができるインデックス化されたライブラリの数は、研究設計に必要なシーケンシングデータの量とともに、使用するプラットフォームの出力仕様によって決定される。プラットフォームの能力及び１サンプルあたりに必要とされるシーケンシングデータの量に応じて、１レーンあたり混合することができるインデックスの数を計算する。
１．  それぞれのインデックスでタグ付けされたサンプルがプール中で等モル量で存在するようにライブラリを合わせる。各ライブラリについて、使用されるインデックス化されたサンプルの量を決定するために下記式を使用する。
インデックスの体積＝Ｖ（ｆ）×Ｃ（ｆ）／｛＃×Ｃ（ｉ）｝
（式中、Ｖ（ｆ）は、プールの所望の最終体積であり、
Ｃ（ｆ）は、プール中のすべてのＤＮＡの所望の終濃度であり、
＃は、インデックスの数であり、及びＣ（ｉ）は、各インデックス化サンプルの初濃度である。）
【００７２】
以下の表は、１０ｎＭで２０μＬの最終体積に必要とされる、（異なる濃度の）４つのインデックスでタグ付けされたサンプル及び低ＴＥの量の例を示す。
【表４】
2015180193.tif 000005
【００７３】
２．  プールしたライブラリの最終体積を所望の終濃度となるよう調整する。
【００７４】
４．  用途
上記のように、標的化次世代シーケンシング技術のための主な障壁及び律速ステップは、迅速かつ対費用効果の高い様式で、ゲノム、ミトコンドリア及びその他の形態のＤＮＡにわたって散在している標的化エクソン領域又は標的化イントロン領域を選択的に捕捉及び濃縮する初期段階のステップであった。上記で開示される緩衝液により、核酸ハイブリダイゼーションをはるかにより速く完了することが可能となり、それにより、標的化次世代シーケンシング全体を高速化するために用いることができる。
【００７５】
一般に、標的化ゲノムＤＮＡ断片の捕捉及び増幅のためのプロセスは以下の通りである。（１）ＤＮＡを、核酸を含む生物学的サンプルから抽出する、（２）抽出したＤＮＡを、機械的、超音波的又は酵素的なアプローチを含む様々な手段により断片化する、（３）標的化ＤＮＡ断片を、ＤＮＡ断片と相補的なＤＮＡ及び／又はＲＮＡプローブ又はベイトとをハイブリダイズさせることにより選択的に捕捉する、（４）ハイブリダイゼーションプローブに結合しなかったＤＮＡ断片をまず洗い流し、一方、ハイブリダイゼーションプローブに結合したＤＮＡ断片を次のステップで適切な条件下で溶離する、（５）捕捉したＤＮＡを下流の用途に用いる。
【００７６】
より多量の捕捉したＤＮＡが必要な場合、一対のユニバーサルプライマーを使用することによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、捕捉したＤＮＡ断片を増幅する。ステップ（２）又はステップ（４）のいずれかの後に、特異的に設計した配列のユニバーサルＤＮＡプライマー（アダプター又はインデックス化アダプターとしても知られる）をすべてのＤＮＡ断片の５’末端及び３’末端に連結する。或いは、抽出したＤＮＡをアダプター付加（loaded）トランスポサーゼ酵素により断片化する場合、ステップ（２）の最中にアダプターを結合してもよい。詳細な手順は、例えば、Agilent Technologies, Inc.により市販されている、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）及び特許文献１においてみることができる。従来のハイブリッド・キャプチャーの手順によると、一般に、ステップ（１）〜（４）を完了するために少なくとも２日間かかる。実際、ハイブリダイゼーションステップ（即ち、上記ステップ（３））は、それ自体で通常、１６時間〜７０時間を超える範囲の期間を消費する。前掲を参照されたい。
【００７７】
ＤＮＡ断片を捕捉するために、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡベイト／プローブのハイブリダイゼーションは、固体担体物質上又は液体溶液中で行う。この捕捉ステップ（上記のプロセスにおけるステップ３）は、プロセス全体のために非常に重要である。捕捉の特異性は、ハイブリダイゼーションベイト／プローブのＤＮＡ又はＲＮＡ配列によって決定される。任意の生物種からのゲノムＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡの任意の所望の領域の選択的捕捉は、ハイブリダイゼーションステップを実施するための、対費用効果が高く、かつ、柔軟な方法を必要とする。これらのＤＮＡ及び／又はＲＮＡベイト／プローブは、目的の生物種のゲノムＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡ中の目的の領域に対して正確に相補的な配列を有さなければならない。捕捉の能力は、ハイブリダイゼーションにおける使用のために利用可能な異なるプローブの数及び長さの組み合わせによって決定される。プローブの長さがより長ければ、捕捉のための同じＤＮＡ領域をカバーするために必要なプローブの数は少なくてよい。捕捉の柔軟性は、プローブが作製され、固体担体物質上に置かれるか、液体溶液中に混合される方法によって決定される。これらのハイブリダイゼーションＤＮＡ及び／又はＲＮＡベイトは、すべてのエクソン、又は任意のエクソンのサブセット、又は任意の生物種からのゲノム、ミトコンドリア及びその他の形態のＤＮＡの任意のその他の所望の領域を、選択的に捕捉する総合的な能力及び柔軟性を有さなければならない。市場で競争することを可能とするためには、特異性、能力、柔軟性、及び適時性が、対費用効果の高い様式で達成されなければならない。
【００７８】
本明細書中に開示されるように、核酸ハイブリダイゼーション選択的捕捉ステップは、約１時間もの短い期間内で完了することができ、結果として、標的化ゲノムＤＮＡ断片の捕捉及び増幅のためのプロセス全体は、従来のアプローチを用いた場合２日間以上かかるのに対して、８時間以内で完了することができる。
【００７９】
５．  キット
本発明の更に別の態様において、上記のハイブリダイゼーション組成物又はその濃縮緩衝液と、本明細書に記載する組成物及び方法を用いてハイブリダイゼーションアッセイを行うための説明書とを含むキットが提供される。説明書は、本開示の方法、組成物、又はそれらの両方を含む。一つの実施形態において、キットは、上記で開示される１又は複数の更なる作用剤を有するハイブリダイゼーション組成物を更に含み、好ましくは、ｐＨは、例えば、ｐＨ６．０〜１１．０に維持され、ｐＨは好ましくは、そのｐＨ範囲にて有用な緩衝能を有する緩衝液を用いて維持される。
【００８０】
組成物は、ビン、特に、計量用クロージャを含むビンに入れることができる。計量用クロージャは、適量の組成物を分注するために、特に、濃縮組成物を分注してより希釈された溶液又は混合物とする場合に、便利な方法を提供する。ビンはまた、好ましくは、より容易にかつ浪費又は溢流が少なくなるよう組成物を分注することを可能とする流し戻し口（drain-back spout）を含む。好適なビンの非限定的な例は、米国特許第４，６６６，０６５号、米国特許第４，６９６，４１６号、及び米国特許第４，９８１，２３９号に詳細に記載されている。
【００８１】
標的化次世代シーケンシングにおける使用のために、キットは、プライマー、アダプター、並びにAgilent Technologies, Inc.、Illumina, Inc.、454 Life Sciences、Life Technologies Corporation、Affymetrix, Inc及びその他によって提供されるシステム及びプラットフォームにおいて用いられる、又はそれらと適合性のその他の試薬を更に含んでいてもよい。その目的のために、本明細書に開示される方法及び次世代シーケンシングのための１又は複数の反応成分を、キットの形態で供給することができる。このようなキットにおいて、適量の１又は複数の反応成分は、１又は複数の容器中に提供されるか、又は基体上に（例えば、静電相互作用又は共有結合によって）保持される。
【００８２】
本明細書に記載する方法を行うための試薬を含むキットは、１又は複数の上記の成分を含んでいてもよい。成分は、種々の形態で提供することができる。例えば、成分は、水溶液中に懸濁されていてもよいし、又はフリーズドライ若しくは凍結乾燥した粉末、ペレット、若しくはビーズであってよい。後者の場合、成分は、再構成されると、アッセイにおける使用のための、成分の完全な混合物を形成する。
【００８３】
キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な量の、本明細書に記載する成分の任意の組み合わせを含んでいてよく、実体のある形態で記録された、成分の使用のための説明書を更に含んでいてもよい。いくつかの適用において、１又は複数の反応成分は、個別の、典型的には使い捨ての、チューブ又は相当する容器中に、予め計量された単回使用量で提供してもよい。このような用意により、標的核酸の存在について濃縮されるべきサンプルを個別のチューブに添加することができ、かつ増幅が直接行われる。キットにおいて供給される成分の量は、任意の適量とすることができ、製品が向けられる標的市場に依存し得る。適量を決定するための一般的な指針は、例えば、Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001及びFrederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003にみることができる。
【００８４】
本発明のキットは、本発明の方法を実施するために有用な任意の数の更なる試薬又は物質を含んでいてもよい。そのような物質としては、これらに限定されないが、細胞の溶解のための試薬（緩衝液を含む）又は望ましくないヌクレアーゼを阻害するその他の作用剤、反応の成分が適切に機能することを確実にするために使用されるコントロールＤＮＡ、ＤＮＡ断片化試薬（緩衝液を含む）、増幅反応試薬（緩衝液、ポリメラーゼ、及びヌクレオチドを含む）及び洗浄溶液が挙げられる。本発明のキットは、あらゆる温度で提供することができる。例えば、タンパク質成分又はその複合体を液体中で含有するキットの保管のためには、それらを０℃より低温、好ましくは−２０℃以下、又は別の方法で凍結状態で、提供し、かつ維持するのが好ましい。
【００８５】
成分が供給される容器（複数の場合もあり）は、供給された形態を保持することができる任意の従来の容器であってもよく、例えば、マイクロチューブ、アンプル、ビン、又は一体式試験装置、例えば、流体素子、カートリッジ、側方流動、若しくはその他の同様の装置が挙げられる。キットは、標的核酸の濃縮又は検出における使用のための標識化又は非標識化核酸プローブ／ベイトを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載するいずれかの方法において成分を使用するための説明書を更に含んでいてもよい。そのようなキット及びシステムのための典型的な包装材としては、反応成分又はプローブを、種々の配置（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイ中等）のいずれかで保持する固体マトリックス（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微小粒子等）が挙げられる。
【００８６】
６．  更なる定義
「核酸」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、又はＤＮＡ類似体若しくはＲＮＡ類似体のことをいう。ＤＮＡ類似体又はＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであるのが好ましい。
【００８７】
本明細書において用いる場合、「ベイト」又は「プローブ」配列とは、目的の標的核酸と相補的な、長い合成オリゴヌクレオチド又は長い合成オリゴヌクレオチドに由来する（例えば、長い合成オリゴヌクレオチドを用いて生成した）オリゴヌクレオチドをいう。或る特定の実施形態において、ベイト配列のセットは、マイクロアレイにおいて合成され、マイクロアレイから切断及び溶離されたオリゴヌクレオチドに由来する。別の実施形態において、ベイト配列は、例えば、ヒトＤＮＡ又はプールされたヒトＤＮＡサンプルを鋳型として用いる核酸増幅方法によって生成される。
【００８８】
ベイト配列は、好ましくは、約７０ヌクレオチド長〜１０００ヌクレオチド長、より好ましくは、約１００ヌクレオチド長〜３００ヌクレオチド長、より好ましくは、約１３０ヌクレオチド長〜２３０ヌクレオチド長及び更により好ましくは、約１５０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。エクソン及びその他の短い標的の選択のために、好ましいベイト配列の長さは、約４０ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチド、例えば、１００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、より好ましくは、約１３０ヌクレオチド〜約２３０ヌクレオチド、及び更により好ましくは、約１５０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。捕捉ベイトの長さと比較して長い標的、例えば、ゲノム領域の選択のためには、好ましいベイト配列の長さは、典型的には、上記の短い標的のためのベイトと同じサイズ範囲にあるが、ただし、隣接する配列の標的化を最小化する目的のみのためなら、ベイト配列の最大サイズを限定する必要はない。ベイト配列のためのより長いオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当該技術分野において既知である。
【００８９】
本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、３００ヌクレオチド長以下（例えば、５ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長の範囲、好ましくは、１０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長の範囲、より好ましくは、１５ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長の範囲）の短いポリヌクレオチドのことをいう。しかし、本明細書において用いる場合、この用語はまた、より長いポリヌクレオチド鎖又はより短いポリヌクレオチド鎖を包含する意図でもある。「オリゴヌクレオチド」はその他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、それゆえ、ポリヌクレオチドの検出のためのプローブ、又はポリヌクレオチド鎖伸張のためのプライマーとして作用することができるものである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ベイト配列のセットにおけるベイト配列は、ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖はＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖よりも安定であるため、好ましくは、ベイト配列として使用され、それゆえ潜在的により良好な核酸の捕捉を提供する。ＲＮＡベイト配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を含む当該技術分野において既知の任意の方法を用いて合成することができる。ＲＮＡをビオチン化ＵＴＰを用いて合成すると、一本鎖のビオチンで標識されたＲＮＡベイト分子が生成する。好ましい実施形態において、ＲＮＡベイトは、二本鎖ＤＮＡ標的の一方の鎖のみに対応する。当業者であれば認識するであろうように、そのようなＲＮＡベイトは自己相補的ではなく、それため、ハイブリダイゼーションドライバとしてより有効である。或る特定の実施形態において、ＲＮａｓｅに耐性のＲＮＡ分子が合成される。そのような分子及びそれらの合成は、当該技術分野において既知である。
【００９１】
本明細書において用いる場合、「標的核酸」又は「標的」という用語は、同定すべき標的核酸配列を含有する核酸のことをいう。標的核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、しばしば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの誘導体、又はそれらの組み合わせである。「標的核酸配列」、「標的配列」又は「標的領域」とは、一本鎖核酸の配列の全部又は一部を含む具体的な配列を意味する。標的配列は核酸鋳型内にあってもよく、核酸鋳型は、一本鎖核酸又は二本鎖核酸のいずれの形態であってもよい。鋳型は、精製若しくは単離された核酸であってもよいし、又は非精製若しくは非単離であってもよい。
【００９２】
通常、ポリヌクレオチドの一部又は全部のなかに存在する標的又は標的核酸は、通常、ポリヌクレオチド分析物である。標的ヌクレオチド配列の同一性は一般に、その標的物質とハイブリダイズできる様々なプローブ／ベイト配列の調製を可能とするために十分な程度に知られている。標的物質は、通常、約３０〜５０００以上のヌクレオチド、好ましくは、５０〜１０００のヌクレオチド、及びより好ましくは、２００〜５００のヌクレオチドを含有する。標的物質は、一般に、より大きな分子の断片であるか、又は、標的物質は、分子、例えば、上記のポリヌクレオチドの実質的に全体であってもよい。標的物質におけるヌクレオチドの最小数は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在が、サンプル中のポリヌクレオチドの存在の特異的指標となることを保証するように選択する。標的物質におけるヌクレオチドの最大数は、通常、いくつかの因子、すなわち、標的物質が由来するポリヌクレオチドの長さ、そのようなポリヌクレオチドが単離の際の剪断又はその他のプロセスによって分解される傾向、解析のためのサンプルを調製するために必要な任意の手順、例えばＤＮＡ鋳型のＲＮＡへの転写、及び、適当な場合、標的ヌクレオチド配列の検出効率、増幅効率、又はそれら両方の効率に支配される。
【００９３】
本明細書中に開示されるように、多くの値の範囲が提供される。文脈により明らかに逆のことが示されない限り、その範囲の上限及び下限の間にある各値もまた、下限の単位の１０分の１まで、具体的に開示されているということを理解すべきである。任意の記載された値又は記載された範囲内にある値と記載された又はその記載された範囲内にある任意のその他の値との間のより小さい各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、この範囲中に含まれるか又は除外される場合があり、上限及び下限の一方若しくは両方がそのより小さい範囲に含まれるか、両方が含まれないような各範囲はまた、記載された範囲における具体的に除外された限界値に従って、本発明に包含される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含められた限界値の一方又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００９４】
「約」という用語は、一般に、示された数の±１０％のことをいう。例えば、「約２０」は、１８〜２２の範囲を示すことができ、「約１」は、０．９〜１．１を意味することができる。「約」のその他の意味は文脈から明らかにすることができ、例えば、四捨五入を意味する場合、例えば、「約１」はまた、０．５〜１．４を意味することもできる。
【００９５】
本明細書において用いる場合、「接触させる」という用語及びその変形は、任意の成分のセットに関連して用いられる場合、接触されるべき成分が混合されて同一の混合物となる（例えば、同じ区画又は溶液へと添加される）あらゆるプロセスを含み、言及された成分の間の実際の物理的な接触を必ずしも必要としない。言及された成分は、いずれの順序で接触されてもよく、又はいずれの組合せ（若しくは部分的組合せ）であってもよく、言及された成分の１つ又はいくつかが、場合によりその他の言及された成分の添加の前に、引き続いて混合物から取り出されるような状況をも含むことができる。例えば、「Ａと、Ｂ及びＣとを接触させる」には、以下の状況のいずれもすべて含まれる。（ｉ）ＡがＣと混合され、次いでＢが混合物に添加される；（ｉｉ）ＡとＢとが混合されて混合物となり；Ｂが混合物から取り出され、次いでＣが混合物に添加される、並びに（ｉｉｉ）ＡがＢとＣとの混合物に添加される。「鋳型と反応混合物とを接触させる」には、以下の状況のいずれもすべて含まれる。（ｉ）鋳型が反応混合物の第１の成分と接触して混合物が生成し、次いで反応混合物のその他の成分が任意の順序又は組合せで混合物に添加される、及び（ｉｉ）反応混合物が鋳型との混合の前に完全に形成される。
【実施例】
【００９６】
７．  実施例
本実施例において、上記のハイブリダイゼーション緩衝液及び方法を使用して、標的化次世代シーケンシングの解析のためにヒトゲノムＤＮＡからの標的化エクソン領域を選択的に捕捉及び濃縮した。
【００９７】
簡潔に説明すると、ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）サンプルを、当該技術分野において既知の方法を用いて、断片化及び末端修飾した。次いで、ハイブリダイゼーション及び増幅を介する標的濃縮を、断片化及び末端修飾したｇＤＮＡを用いて行った。この目的のために、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液並びに２つのマグネシウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液である、緩衝液（Ａ）及び緩衝液（Ｂ）を使用し、そして比較した。ナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液は、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含有していた。緩衝液（Ａ）は、３０８ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ及び２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含んでいた。緩衝液（Ｂ）は、０．００８３４％ＨＰＭＣも含む点を除いて緩衝液（Ａ）と同じであった。各緩衝液を、適量の濃縮液と、ＤＮＡ及びＲＮＡベイトとを混合することにより、５×ハイブリダイゼーション濃縮緩衝液から調製した。緩衝液（Ｂ）のための５×濃縮緩衝液は、１５４０ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０４１７％ＨＰＭＣ、及び１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含有していた。
【００９８】
ハイブリダイゼーションは、２４時間又は１時間の従来の一定温度（６５℃）のインキュベーションを用いるか、又は１時間の２温度（６５℃及び３７℃）サイクリングインキュベーションを用いて行った。この２温度サイクリングインキュベーションのプロファイルを以下の表に示す。
【００９９】
サイクリングプロファイル：ブロッキング及び高速ハイブリダイゼーション
【表５】
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【０１００】
次いで、ハイブリダイゼーションからの捕捉したＤＮＡのサンプルを、製造業者の指示に従って１μｌの各サンプルを２１００バイオアナライザでＤＮＡ１０００アッセイ（Agilent Technologies, Inc.）を用いて泳動することによって、解析した。バイオアナライザエレクトロフェログラムプロファイルを図１〜図４に示す。
【０１０１】
図１に示すように、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液及び一定温度インキュベーションを用いた場合、１時間インキュベーション後と比較して、２４時間インキュベーションの後にはるかに大量のｇＤＮＡが捕捉された。これらの結果は、満足なＤＮＡサンプルを得るためにはより長いインキュベーション時間（例えば、２４時間）が必要であること、及びより短い期間は、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液を用いる場合には望ましくないということを示す。
【０１０２】
一方、高速のマグネシウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液（Ａ）及び２温度サイクリングインキュベーションを用いた場合、１時間のハイブリダイゼーションは、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液を用いて２４時間インキュベーションした後に得られる量に匹敵する量又はより大量の捕捉されたｇＤＮＡをもたらした。図２を参照されたい。これらの結果は、緩衝液（Ａ）及びサイクリングインキュベーション手順がより効率的であることを示す。
【０１０３】
実際、１時間ハイブリダイズさせた場合、緩衝液（Ａ）は、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液と比べてはるかにより多くのｇＤＮＡの捕捉をもたらした。そして、２温度サイクリングインキュベーションは、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液との組み合わせに関連して使用した場合にも捕捉されたｇＤＮＡ量を上昇させたが、高速のマグネシウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液により到達された程度には及ばなかった。図３を参照されたい。
【０１０４】
より驚くべきことに、ＨＰＭＣをハイブリダイゼーションに含めた場合、更により多くのｇＤＮＡが捕捉された。図４に示すように、ＨＰＭＣを含有する緩衝液（Ｂ）による１時間の２温度サイクリングインキュベーションの結果、従来のナトリウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液での２４時間インキュベーションの後に得られた量と比較してほぼ３倍の量のｇＤＮＡが捕捉された。図２及び図４を比較されたい。これらの結果は、ＨＰＭＣが捕捉効率を更に上昇させたことを示す。
【０１０５】
上記のハイブリダイゼーション緩衝液及びインキュベーションプロファイルを用いて捕捉及び濃縮されたゲノムＤＮＡを次世代シーケンシング解析に用いた。結果として得られた性能パラメータ（正確率（On Target rate）、重複率、及び適用範囲）を図５に示す表に提示する。高速のマグネシウムベースのハイブリダイゼーション緩衝液（Ｂ）及び２温度サイクリングインキュベーションを用いて捕捉されたｇＤＮＡについての性能パラメータは、従来のアプローチにより捕捉されたものに匹敵するか又はそれより優れているものであることが判明した。
【０１０６】
好ましい実施形態の上記の実施例及び記載は、特許請求の範囲により規定される本発明を限定するものではなく、例示するものと解釈すべきである。容易に認識されるように、上記の特徴の多数の改変及び組合せが、特許請求の範囲に示す本発明から逸脱することなく実施することができる。そのような改変は本発明の範囲から逸脱するものとみなされるものではなく、すべてのそのような改変は以下の特許請求の範囲内に含まれる意図である。本明細書において引用したすべての文献は、それらの全体が引用することによって本明細書の一部をなすものとする。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
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