(57)【要約】      （修正有）【課題】グアノシン-（G-）及び／又はグアノシン-シトシン-リッチ（GC-rich）核酸の発現を調節するための方法及び医薬組成物を提供する。【解決手段】該方法は、サリドマイドと核酸のG-及び／又はGC-リッチ領域との相互作用のステップを含み、該医薬組成物は、サリドマイドと薬学的キャリヤーを含む。【選択図】図９
2015028059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）の発現を調節する方法であって、サリドマイドと前記bFGFのG-及び／又はGC-リッチ領域との相互作用のステップを含むことを特徴とする、bFGFの発現を調節する方法。
【請求項２】
前記サリドマイドの濃度が、１００μｇ  ／ｍｌから０．０１μｇ  ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記サリドマイドの濃度が、１０μｇ  ／ｍｌから０．１μｇ  ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記G-及び／又はGC-リッチ領域が、該領域内に50％よりも多いGC含量を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記サリドマイドが、薬剤送達技術により徐放的に放出されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記サリドマイドが、ビヒクルによってカプセル化されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項７】
サリドマイドと薬学的キャリヤーを含むことを特徴とする、bFGFのG-及び／又はGC-リッチ領域によってbFGFの発現を調節する医薬組成物。
【請求項８】
サリドマイドとbFGFのG-及び／又はGC-リッチ領域との相互作用のステップを含むことを特徴とする、bFGFの発現と関連した疾患を治療する方法。
【請求項９】
前記疾患が、bFGFの過剰発現と関連した疾患であることを特徴とする請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記bFGFの過剰発現と関連した疾患が、ガン、免疫学的疾患、血管形成関連疾患、及び睡眠障害からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガンが、脳腫瘍、前立腺ガン、膵臓ガン、乳ガン、肺ガン、頭頚部ガン、腎細胞ガン、大腸直腸ガン、肝細胞ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、膀胱ガン、プロラクチノーマ、メラノーマ、カポシ肉腫、軟組織肉腫、多発性ミエローマ、骨髄発育不全症候群、ノンホジキンリンパ腫及び白血病からなる群より選ばれるガンであることを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫学的疾患が、リウマチ性関節炎、骨関節炎、ベーチェット症候群、全身系硬化症、結節性多動脈炎、乾癬、喘息、角膜ケラト結膜炎、及びクローン病からなる群より選ばれる免疫学的疾患であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記血管形成関連疾患が、肺動脈高血圧、リウマチ性関節炎、喘息、乾癬、増殖性糖尿病性網膜症、及び老人性黄斑変性からなる群より選ばれる血管形成関連疾患であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
サリドマイドと薬学的キャリヤーを含むことを特徴とする、bFGFのG-及び／又はGC-リッチ領域によってbFGF関連疾患を治療する医薬組成物。
【請求項１５】
濃度が１００μｇ  ／ｍｌから０．０１μｇ  ／ｍｌの範囲であるサリドマイドとG-及び／又はGC-リッチ領域との相互作用のステップを含むことを特徴とする、G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現を調節する方法。
【請求項１６】
前記Ｇ−及び／又はＧＣ−リッチ領域を有するＤＮＡ及び／又はＲＮＡが、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＨＩＦ−１α、Ｂｃｌ−２、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ−Ｋｉｔ、Ｒｂ、Ｒｅｔ、ｃ−ＭＹＣ、ＫＲＡＳ、第二型ＴＮＦレセプター、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１レセプター、インテグリン、テトラスパイン及びｈＴＥＲＴからなる群より選ばれるDNA及び／又はRNAであることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記サリドマイドが、薬剤伝達技術によって徐放的に放出されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記サリドマイドが、カプセル化されることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
１００μｇ  ／ｍｌから０．０１μｇ  ／ｍｌの範囲であるサリドマイドを含むことを特徴とする、G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現を調節する医薬組成物。
【請求項２０】
濃度が１０μｇ  ／ｍｌから０．１μｇ  ／ｍｌの範囲内であるサリドマイドとG-及び／又はGC-リッチ領域との相互作用のステップを含むことを特徴とする、G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現と関連した疾患を治療する方法。
【請求項２１】
前記疾患が、ガン、免疫学的疾患、血管形成関連疾患、及び睡眠障害からなる群より選ばれる疾患であることを特徴とする請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
濃度が１００μｇ  ／ｍｌから０．０１μｇ  ／ｍｌの範囲であるサリドマイドを含むことを特徴とする、G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現と関連した疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２３】
徐放性技術によりサリドマイドの濃度を保持するステップを含むことを特徴とする、bFGFに対するサリドマイドの生物学的利用能を増大する方法。
【請求項２４】
前記サリドマイドの濃度が、１０μｇ  ／ｍｌから０．１μｇ  ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
徐放性ビヒクル中にサリドマイドを含むことを特徴とする、bFGFに対するサリドマイドの生物学的利用能を増大する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本願は、２００７年１１月２２日に出願された仮出願第60/989,831号の優先権を主張する。その全体は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
特許、特許出願及び様々な文献を含み得るいくらかの参考文献は、本発明の説明中で引用され、論じられる。そのような参考文献の引用及び／又は論議は、本発明の説明を単に明瞭化するためにのみ提供され、そのような参考文献は本明細書に記載の発明に対する「先行技術」であるということを何ら認めるものではない。本明細書中で引用され、論じられる全ての参考文献は、その全体を参照することにより本明細書中に組み込まれ、かつそれぞれの参考文献が個別に参照により組み込まれるのと同じ程度にまで本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、核酸の発現を調節する方法とその医薬組成物に関し、特に、グアノシン-(G)-及び／又はグアノシン-シトシン-リッチ(GC-rich)核酸の発現を調節するための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
サリドマイド（thalidomide）は、ラセミ化合物であり、その化学名は2-(2,6-ジオキソ-3-ピペリジニル)-1H-イソインドール-1.,3(2H)-ジオンである。サリドマイドは非常に高い催奇形性(teratogenicity)の危険性があるのにも関わらず、癌と炎症を処理する医薬品として再起している(Franks ら、2004を参照)。更に、その抗血管形成（anti-angiogenic）と免疫調節(immunomodulatory)活性により、サリドマイドは、難治性多発性骨髄腫(refractory multiple myeloma)を治療するのに有効な医薬品として脚光を浴びている(Singhalら、1999を参照)。事実上、サリドマイドは上記のミエローマの外、多くの異なるタイプの癌の試験的治療に広く使用されている。例えば、大腸直腸癌（Franksら、2004を参照）、骨髄発育不良症候群（myelodysplastic syndrome）、ワルデンストロームマクログロブリン血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、ミエロイドメタプラシアを伴うミエロフィブロシス（myelofibrosis with myeloid metaplasia）、脳腫瘍（brain tumor）(Eleutherakis-Papaiakovouら、2004を参照)、急性ミエロイド白血病（acute myeloid leukemia）、ノンホジキンリンパ腫(Non-Hodgkin's lymphoma)、肺癌（lung cancer）、乳癌（breast cancer）、神経内分泌腫瘍（neuroendocrine tumors）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）(Kumarら、2004を参照)、マントル細胞リンパ腫（mantle cell lymphoma）、膵臓癌（pancreatic cancer）(Teoら、2005を参照)、腎細胞癌（renal cell carcinoma）、前立腺癌（prostate cancer）、カポシ肉腫（Kaposi s sarcoma）、メラノーマ（melanoma）(Richardsonら、2002を参照)及びプロラクチノーマ(prolactinoma) (Mukdsi ら、2006を参照)などが挙げられる。又、若干の免疫疾患の臨床学的研究により、更にサリドマイドの免疫調節性が知られている。例えば、リウマチ性関節炎（rheumatoid arthritis）、結節性紅斑らい(erythema nodosum leprosum)、ベーチェット症候群（Behcet's syndrome）、サルコイドーシス(Sarcoidosis)、クローン病（Crohn's disease）(Franksら、2004を参照)、口腔潰瘍（aphthous ulcers）(Teoら、2005を参照)、アフタ性口内炎（aphthous stomatitis）、紅斑性狼瘡（lupus erythematosus）、結節性痒疹(Prurigo nodularis)(Wuら、2005を参照)、強直性背椎関節炎(ankylosing spondylitis) (Scalapinoら、2003を参照)、慢性心臓衰弱（chronic heart failure）(Gullestadら、2005を参照) 及び異体骨髄と腎臓移植後に発生する移植症VS宿主疾患(graft-versus-host disease，GVHDと略称)(Richardsonら、2002; Matthewsら2005を参照)などが挙げられる。サリドマイドの抗血管形成活性は、血管形成に係わる糖尿病（angiogenesis-associated diabetic diseases）、例えば、糖尿病性網膜症（diabetes retinopathy）(Boscoら、2003を参照)においても確認されている。これらのデータにより上記の疾患及び／又は失調の治療上、サリドマイドは有効であることが示されているが、その作用のメカニズムはまだ十分に明らかではない。一部の研究報告によると、サリドマイドは、血漿中の塩基性繊維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor，bFGFと略称）含量を減少し、グリオーム（glioma）と多発性ミエローマ（multiple myeloma）の治療に効果がある（Fineら、2000；Nebenら、2001；Satoら、2002などを参照）。治療ステップにおいて、血清及び／又は血漿中のbFGF含量に変化があることは、bFGFがサリドマイドの作用標的である可能性を意味する。
【０００５】
bFGFは繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor、FGFと略称)遺伝子ファミリーの一員であり、且つ、普遍的に発現される強力なオートクリン及／又はパラクリンミトゲンである。bFGFは、多くの生物活性、例えば、中胚葉(mesoderm)の形成を刺激すること、血管形成、平滑筋細胞の増生、神経系統と目の発育の調節などに関わっていることが知られている(Bikfalviら、1997を参照)。今日、異なる腫瘍疾患においてbFGFが過度に発現されることが知られている。例えば、脳腫瘍、前立腺癌(Eleutherakis-Papaiakovouら、2004を参照)、プロラクチノーマ (prolactinoma) (Mukdsiら、2006を参照)、乳癌（breast cancer）(Fuhrmann-Benzakeinら、2000を参照)、頭頸部癌（head and neck cancer）、軟組織肉腫（soft tissue sarcoma）、腎細胞癌（renal cell carcinoma）、大腸直腸癌（colorectal carcinoma）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）、卵巣癌（ovarian carcinoma）、子宮内膜癌（endometrial carcinoma）(Poonら、2001を参照)、メラノーマ（melanoma）(Ugurelら、2001を参照)、肺癌（lung cancer）(Uenoら、2001; Iwasakiら、2004を参照)、カポシ肉腫（Kaposi s sarcoma）(Samaniegoら、1998を参照)、膵臓癌（pancreatic cancer）(Yamanakaら、1993を参照)。多発性ミエローマ（multiple myeloma）(Sezerら、2001を参照)、骨髄発育不良症候群（myelodysplastic syndrome）、白血病（leukemia）(Aguayoら、2000を参照)、ノンホジキンリンパ腫(non-Hodgkin's lymphoma)(Gilesら、2004を参照)、膀胱癌（bladder cancer）(Nguyenら、1994を参照)等の報告が挙げられる。この外、bFGFは睡眠失調（sleep disorder）(Okumuraら、1996を参照)、免疫学的疾患（immunological disorder）及び血管形成等の疾患と関連付けることが知られている。例えば、リウマチ性関節炎、（rheumatoid arthritis）、骨関節炎（osteoarthritis）(Nakashimaら、1994を参照)。クローン病(Crohn's disease)(Di Sabatinoら、2004を参照)。ベーチェット症候群（Behcet's disease）(Erdemら、2005を参照)、全身系硬化症（systemic sclerosis）(Lawrenceら、2006を参照)、結節性多動脈炎（polyarteritis nodosa）(Kikuchiら、2005を参照)、角膜ケラト結膜炎（vernal keratoconjunctivitis）(Leonardiら、2000を参照)、乾癬（psoriasis）(Andrysら、2007を参照)、増殖性糖尿病性網膜症（proliferative diabetic retinopathy）(Boultonら、1997を参照)、老年性黄斑変性(age-related macular degeneration)(Frank、1997を参照)、喘息(asthma)(Hoshino ら、2001を参照)及び肺動脈高血圧（pulmonary arterial hypertension）(Benistら、2004を参照)などが挙げられる。又、血管形成異常（neoangiogenesis）は、すでに慢性炎性疾患（chronic inflammatory diseases），例えば、リウマチス関節炎（rheumatoid arthritis）、乾癬（psoriasis）及び網膜症（retinopathy）(Andrysら、2007を参照)等の免疫病原性反応（immunopathogenesis）において不可欠であることが報告されている。
【０００６】
bFGFの分泌は、従来の小胞体-ゴルジ（endoplasmic reticulum(ERと略称) -Golgi）を経由して分泌するものとは異なる(Mignattiら、1992を参照)。この分泌形式の外、bFGFは更に4種類の核標的形式（nuclear-target-forms）が存在し、この4種類の形式は、上流インフレーム中の異なるシトシン-ウラシル-グアニンコドン（cytosine-uracil- guanine codon，CUG コドンと略称）の内部リボソームエントリー部位（internal ribosome entry site 、IRESと略称）に関わる依存性メカニズムにより選択的に翻訳される。このIRESの構造は、bFGF転写物のグアニン-リッチ N-末端により形成される(Florkiewiczら、1989；Vagnerら、1995を参照)。低分子量のbFGF（low molecular weightbFGF 、LMW bFGFと略称）は、bFGF転写物の第一のアデニン-ウラシル-グアニンコドン（adenine-uracil-guanine codon，AUG コドンと略称）を使用して翻訳され、高分子量のbFGF（high molecular weight bFGF、HMW bFGFと略称）は、上流CUGコドン（CUG codons）を使用して翻訳される。LMWとHMWのbFGFSのC-末端部分は同様であるが、細胞内における分布が異なることと、HMW  bFGFSのN -末端エクステンションとにより、両者の機能は相互に異なるものと考えられている(Quartoら、2005を参照)。今日、細胞核内におけるbFGFSの蓄積、又はLMW bFGFに対するHMW bFGFSの比率の増加は、腫瘍発達（tumor progression）の指標として知られている(Fukuiら、2003を参照)。癌細胞におけるbFGFの過剰発現と、腫瘍の後期（advanced tumor stage）とは相関性があり、又、膵臓癌の予後の良くないこととも関連がある(Yamanakaら、1993を参照)。
【０００７】
bFGF転写物の発現は、グアニン-リッチプロモーターのコントロール下にあり、このグアニン-リッチプロモーターは、2次構造、例えば、グアニン-四重体（guanine-quadruplexes、G-quadruplexesと略称）を形成し、このグアニン-四重体は、デオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid、DNAと略称)結合薬と作用し、次にプロモーターの活性を変えるという(Hurleyら、2000を参照)。現在、既に多くの遺伝子が、G-及び／又はGC-リッチ領域（G- and/or GC-rich region）を有することが知られている。例えば、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor、VEGFと略称)遺伝子、血小板由来増殖因子A（platelet-derived growth factor-A、PDGF-Aと略称）遺伝子、低酸素誘導因子−１α（ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１α、ＨＩＦ−１αと略称）遺伝子、B-細胞リンパ腫/白血板-2 (B-cell CLL/lymphoma 2、Bcl-2と略称)遺伝子、鳥類骨髄芽球症 ウイルス性癌遺伝子相同体（avian myeloblastosis viral oncogene homolog (v-myb)、c-Mybと略称）、ハーディズッカーマン4ネコ肉腫ウイルス性癌遺伝子相同体（Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog (v-kit)、c-Kitと略称）、網膜芽細胞腫 (retinoblastoma、Rbと略称)遺伝子、retプロト癌（ret proto-oncogene、Retと略称）遺伝子、鳥類骨髄球腫症ウイルス性癌遺伝子相同体（avian myelocytomatosis viral oncogene homolog、c-MYCと略称）、キルステンネズミ肉腫-2ウイルス性癌遺伝子相同体（Kirsten rat sarcoma-2 viral (v-Ki-ras 2) oncogene homolog、KRASと略称）(Qinら、2008を参照)、又、第二型腫瘍壊死因子レセプター（type II tumor necrosis factor (TNFと略称) receptor）遺伝子(Betheaら、1997を参照)、第一型インスリン様成長因子（insulin-like growth factor-1、IGF-1と略称）遺伝子、第一型インスリン成長因子レセプター（IGF-1 receptorと略称）遺伝子、インテグリン（integrin）遺伝子、テトラスパイン（tetraspanins）遺伝子、及びヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase、hTERTと略称）遺伝子(Druckerら、2003を参照)が挙げられる。G-リッチプロモーターによる転写性調節の外、bFGF転写のN-末端エクステンション(N-terminal extension)もまたG-リッチであり、異なるbFGFのイソ型（isoform）の翻訳を調節する機能を有するする。リボ核酸（RNA）転写物（transcript）のG-リッチ領域は、DNA結合薬の標的として用いられ、次に、イソ型の発現を調節する。
【０００８】
サリドマイドの催奇形性の活性は、経口投与であれ又は非経口投与であれ、胎児のDNAとRNAとに結合しておこり、サリドマイドのグルタルイミド部分とDNAとの結合によりDNAの2次構造が変化すると推測される。 (Bakayら、1968; Huangら、1990; Huangら、1999; Nichollsら、1966を参照)。Druckerらの報告によると、サリドマイドは１２．５  μｇ／ｍｌ以上の相対的に高い濃度下において、GC-リッチプロモーターにより転写物量をダウンレギュレートする(Druckerら、2003を参照)。
【０００９】
更に、米国特許によりサリドマイドは、免疫性疾患と、癌の治療や、血管形成の抑制などに使用されることが、例えば、米国特許第6,124,322号公報、同第 6,235,756号公報、同第6,617,354号公報、同第 6,914,067号公報、同第 7,230,012号公報、及び同第 7,435,726号公報などに開示されている。
【００１０】
米国特許第 6,124,322号公報は、「サリドマイドの注射方式による免疫性疾患の治療」と題し、非経口投与方式に適用する水性サリドマイド溶液に関し、更に詳しくは、サリドマイドの静脈注射形式に関わるものである。米国特許第6,235,756号公報は、「サリドマイドによる血管形成の抑制方法とその医薬組成物」と題し、サリドマイドとその関連化合物を服用することより、過度の血管形成を防止する方法に関し、特に、血管形成又は血管形成に関わる疾患において、サリドマイドとその関連化合物を服用し、過度の血管形成の防止方法に関する。又、米国特許第6,423,321号公報は、「サイトカイン拮抗薬による知覚神経性聴力損失の治療処理」と題し、TNF拮抗薬及び／又はIL-1拮抗薬を人に投与することによりその聴覚器官に影響する炎症反応を減少し、又は、治療に有効な量のTNF拮抗薬及び／又はIL-1拮抗薬を投与することで、その聴覚器官に影響する免疫反応を調節して、上記の聴力損失を治療する方法に関する。又、米国特許第6,617,354号公報は、「抗血管形成物質の安定化と作用を増強する方法」と題し、癌とその他の調節できない血管形成活性を含む細胞増殖失調の治療に使用される抗血管形成試薬に関する。更に、米国特許第6,914,067号公報は、「大腸直腸癌の治療に使用される医薬組成物と方法」と称し、サリドマイドとイリノテカン（irinotecan）を含有する医薬組成物、大腸直腸癌の治療方法、イリノテカンの副作用を防止、又は低減する方法に関する。又、米国特許第7,230,012号公報の標題は、「サリドマイドの医薬組成と剤形」と題し、サリドマイドと薬学的に許容されるプロドラッグ、塩類、溶媒和化合物、水和物とそのクラスレイト（clathrates）を含有する医薬組成物と剤形に関する。又、米国特許第7,435,726号公報は、「癌を治療する医薬組成物と方法」と題し、サリドマイドと抗癌剤、特にトポイソメラーゼ阻害剤（topoisomerase inhibitor）を含有する医薬組成物、癌の治療方法、抗癌剤(例えば、トポイソメラーゼ阻害剤)の副作用を防止、又は低減する癌の治療方法に関する。
【００１１】
上記より、サリドマイドは、既に癌と免疫疾患の治療及び血管形成の阻害に使用されているのにも関わらず、その作用と関連付けるメカニズムは十分に明らかにされていない。
サリドマイドの作用メカニズムを明らかにすることは、癌、免疫疾患、及び血管形成にかかわる疾患に使用される医薬組成及び／又は方法にとっても非常に有益である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第一の態様においては、
bFGFの発現を調節する方法に関し、特に、サリドマイドとbGFのG-及び／又はGC-リッチ領域との相互作用のステップを含む方法に関する。
【００１３】
好ましくは、該サリドマイドの濃度は１００μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ範囲内で使用される。
好ましくは、該サリドマイドの濃度は１０μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌ範囲内で使用される。
好ましくは、該G-及び／又はGC-リッチ領域は50%よりも多いGC含量を有する。
好ましくは、該サリドマイドは、薬剤送達技術（drug delivery technology）により徐放的に（sustainedly）放出される。
好ましくは、該サリドマイドはカプセルに詰められている。
【００１４】
本発明の他の態様においては、
bFGFの発現を調節するために使用される医薬組成物に関する。該医薬組成物はサリドマイドを含む。
【００１５】
本発明の更に他の態様においては、
bFGFの発現と関連した疾患を治療する方法に関する。該方法はサリドマイドとbFGFのG-及び／又はGC-リッチ領域を相互作用させるステップを含む。
【００１６】
好ましくは、該疾患は、bFGF 過剰発現と関連した疾患である。
好ましくは、該bFGFの過剰発現と関連した疾患は、癌、免疫学的疾患、血管形成と関連した疾患と睡眠障害よりなる群から選出された疾患である。
【００１７】
好ましくは、該癌は脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、大腸直腸癌、肝細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、プロラクチノーマ、メラノーマ、カポシ肉腫、軟組織肉腫、多発性ミエローマ、骨髄発育不良症候群、ノンホジキンリンパ腫と白血病などよりなる群から選出された癌である。
【００１８】
好ましくは、該免疫学的疾患は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、ベーチェット症候群、全身系硬化症、結節性多動脈炎、乾癬、喘息、角膜ケラト結膜炎とクローン病よりなる群から選出された疾患である。
【００１９】
好ましくは、該血管形成と関連した疾患は、肺動脈高血圧、リウマチ性関節炎、喘息、乾癬、増殖性糖尿病性網膜症と老人性黄斑変性よりなる群から選出された疾患である。
【００２０】
本発明の更に他の態様においては、
G-及び／又はGC-リッチ領域を有するbFGFの発現と関連した疾患を治療するために使用される医薬組成物に関する。該医薬組成物はサリドマイドを含む。
【００２１】
本発明の更に他の態様においては、
G-及びGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現を調節する方法に関し、特に該方法は、bFGFのG-及び／又はGC-リッチ領域と、濃度が１００μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ範囲内にあるサリドマイドとの相互作用のステップを含む方法である。
【００２２】
好ましくは、該G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAは、bFGF、VEGF、PDGF-A、ＨＩＦ−１α、Bcl-2、cMyb、c-kit、Rb、Ret、c-MYC、KRAS、第2型TNFレセプター、IGF-1、IGF-1レセプター、インテグリン、テトラスパインとhTERTよりなる群から選出されたものである。
【００２３】
好ましくは、そのサリドマイドは、薬剤送達技術により徐放的に放出される。
好ましくは、該サリドマイドはカプセルに詰められて徐放される。
本発明の更に他の様態においては、
G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現を調節する医薬組成物に関する。該医薬組成物は１００μｇ／ｍｌ〜０．０１  μｇ／ｍｌのサリドマイドを含む。
【００２４】
本発明の更に他の態様においては、
G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現と関連した疾患を治療する方法に関する。該方法はG-及び／又はGC-リッチ領域と１０μｇ／ｍｌ〜０．１  μｇ／ｍｌの濃度を有するサリドマイドとの相互作用のステップを含む。
好ましくは、該疾患は癌、免疫学的疾患、血管形成と関連した疾患と睡眠障害よりなる群から選出されたものである。
【００２５】
本発明の更に他の様態においては、
G-及び／又はGC-リッチ領域を有するDNA及び／又はRNAの発現と関連した疾患の治療に用いる医薬組成物に関する。該医薬組成物には、１００μｇ／ｍｌ〜０．０１  μｇ／ｍｌ範囲内の濃度のサリドマイドが含まれる。
【００２６】
本発明の又一つ別な態様においては、
bFGFに対するサリドマイドの生物学的利用能(bioavailability)を増加させる方法に関する。該方法は、徐放性（slow-release）技術によりサリドマイドの濃度を保持するステップを含む。
好ましくは、上記サリドマイドの濃度は１０μｇ／ｍｌ〜０．１  μｇ／ｍｌ範囲内に保持される。
【００２７】
本発明の更に他の態様においては、
bFGFに対するサリドマイドの生物学的利用能を増加する医薬組成物に関する。該医薬組成物は、徐放性伝達体（slow-release vehicle）中に存在するサリドマイドを有するものである。
【００２８】
本発明の上記又はその他の態様に関しては、下記に示す好ましい実施例と図面の説明により、更に明らかにされる。当業者は、本発明が開示する新規な概念の主旨と範囲を逸脱することなく修正及び変更を施すことができる。
下記図面は、本発明の一つ又は多くの実施例について説明したものであり、図面と関連付ける説明内容とともに本発明の原理を明らかにするものである。図面内に使用される参照符は実施例に使用されたものとできる限り同様なものが用いられている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】U-87MG 細胞中のbFGF転写物量に対するサリドマイドの効果を示す。サリドマイド（０〜１０  μｇ／ｍｌ）を、３時間の処理のために細胞に添加する前に、貯蔵液（ｓｔｏｋｅ  ｓａｌｕｔｉｏｎ）より新たに調製した。
【図１Ｂ】Ｕ−８７  ＭＧ細胞中のｂＦＧＦ転写物含量に対するサリドマイドの効果を示す。サリドマイド（０〜１０  μｇ／ｍｌ）を、12時間の処理のために細胞に添加する前に、貯蔵液より新たに調製された。
【図１Ｃ】U-87 MG細胞中のbFGF転写物量に対する、培地のみにおけるサリドマイドのプレ培養（pre-incubation）の効果を示す。サリドマイド（０〜１０  μｇ／ｍｌ）を、3時間の処理のために細胞に添加する前に、培地と単独で9時間培養した。
【図１Ｄ】、U-87 MG細胞中のbFGF転写物量に対するサリドマイドの効果を示す。リポソーマルサリドマイド（０〜１０  μｇ／ｍｌ）を、12時間又は24時間の処理のために細胞に添加した。
【図２Ａ】は、U-87 MG細胞中のbFGF蛋白の発現量に対するサリドマイドの効果を示す。リポソーマルサリドマイド（０〜１０  μｇ／ｍｌ）を細胞に添加し、12時間の処理を行い、FACS分析法によりbFGF蛋白の発現量を測定した。
【図２Ｂ】bFGF蛋白の細胞内分布に対するサリドマイドの効果を示す。遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0.1〜10  μｇ／ｍｌ)をU-87 MG細胞に添加し、12時間の処理を行い、bFGF蛋白の分布を蛍光顕微鏡法により測定した。DNAを、核のマーカーとしてHoechstヘッシスト33258染料によって着色した。拡大倍数は400倍であった。
【図２Ｃ】bFGF蛋白の多種のイソ型の発現に対するサリドマイドの効果を示す。遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0.1〜10  μｇ／ｍｌ)をU-87 MG細胞に添加し、12時間の処理を行い、細胞のbFGF含量を、ウェスタンブロッティング法により測定した。
【図３Ａ】細胞の増生に対するサリドマイドの効果を示す。遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0〜100  μｇ／ｍｌ)をU-87MG細胞に添加し、72時間の処理を行い、レサズリン（resazurin）分析法により相対的な細胞成長を測定した。
【図３Ｂ】サリドマイドによるU-87 MG細胞の足場非依存性増殖(anchorage-independent growth)に対する阻害を示す。細胞を遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0〜10μｇ／ml)を含む軟寒天中で培養した。関連試験のスタート後14日目にコロニーを撮影した。
【図３Ｃ】サリドマイドによるU-87 MG細胞の足場非依存性増殖に対する阻害を示す。細胞を遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0〜10μｇ／ml)を含む軟寒天中で培養した。関連試験のスタート後14日目にコロニーの計数を行った。
【図３Ｄ】サリドマイドによるスフェロイド（spheroids）の解凝集（disaggregation）とbFGFによるサリドマイドの解凝集作用の反転効果を示す。細胞を0〜10μｇ／mlのサリドマイドを含み、且つ、外来のbFGF の共存又は非共存下の培養培地中に懸濁した。位相差顕微鏡によりスフェロイドの撮影を行った。その拡大倍数は100倍であった。
【図３Ｅ】サリドマイドによるU-87 MG細胞における三次元成長の阻害を示す。細胞を0〜10μｇ／mlのサリドマイドを含む培養培地中に懸濁した。凝集比率の分析を行った。
【図４Ａ】U-87 MG細胞中におけるサリドマイドによるbFGFプロモーターで調節されたEGFPリポーター遺伝子の発現にかかわる阻害を示す。該細胞はプラスミドpbFGF-EGFPで安定的にトランスフェクトされた。サリドマイド(0〜10μｇ／ml)を用いて3時間処理した後、流動サイトメトリーによりEGFP転写物の発現量を測定した。
【図４Ｂ】U-87 MG細胞中におけるサリドマイドによるbFGFプロモーターで調節されたEGFPリポーター遺伝子の発現にかかわる阻害を示す。該細胞はプラスミドpbFGF-EGFPで安定的にトランスフェクトされた。サリドマイド(0〜10μｇ／ml)を用いて3時間処理した後、リアルタイムPCR分析によりEGFP転写物の発現量を測定した。
【図５Ａ】プラスミドpLMW-IRESとpHMW-IRESの図解を示す。
【図５Ｂ】U-87 MG細胞中におけるサリドマイドによるLMW-IRES-依存性翻訳の阻害を示す。細胞は図5Aに示すバイシストロニックベクター(bicistronic vector) pLMW-IRESにより安定的にトランスフェクトされ、サリドマイド(0〜10μｇ／ml)により12時間処理された。IRES活性をLucR/LucF率を計算することにより測定した。
【図５Ｃ】U-87 MG細胞中におけるサリドマイドによるHMW-IRES -依存性翻訳の阻害を示す。細胞は図5Aに示すバイシストロニックベクターpHMW-IRESにより安定的にトランスフェクトされ、サリドマイド(0〜10μｇ／ml)により12時間処理された。IRES活性をLucR/LucF率を計算することにより測定した。
【図６Ａ】bFGFcDNAの部分配列を示す。G-リッチフラグメントは実線の長方形で示され、ノン- G-リッチの対照DNAフラグメントは点線の長方形で示される。
【図６Ｂ】G-リッチbFGF DNAフラグメントと一緒に培養した後のサリドマイドのUV-VIS吸収スペクトルを示す。
【図６Ｃ】ノン- G-リッチbFGF対照DNAフラグメントと一緒に培養した後のサリドマイドのUV-VIS吸収スペクトルを示す。
【図７Ａ】bFGFノックダウンクローンと対照クローンのウエスタンブロッティングを示し、内部対照のGAPDHに比べ、bFGF蛋白の発現量は顕著に減少した。クローンNO.1〜3は、それぞれBfgf shRNA NO.1〜3を発現するU-87MG細胞から由来した。
【図７Ｂ】bFGFノックダウンクローンと対照クローンの細胞増生能力を示す。
【図７Ｃ】bFGFノックダウンクローンのサリドマイドによる足場非依存性増殖の阻害と外来のbFGF処理による回復を示す。細胞を遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0〜10μｇ／ml)を含み、且つ、外来のbFGFが存在又は存在しない軟寒天中で培養した。14日後にコロニーを撮影した。
【図７Ｄ】bFGFノックダウンクローンのサリドマイドによる足場非依存性増殖の阻害と外来のbFGF処理による回復を示す。細胞を遊離型又はリポソーマルサリドマイド(0〜10μｇ／ml)を含み、且つ、外来のbFGFが存在又は存在しない軟寒天中で培養した。14日後にコロニーを計数した。
【図８Ａ】bFGFノックダウンクローンと対照クローン由来のスフェロイドの形態を示す。スフェロイドを位相差顕微鏡により撮影した。
【図８Ｂ】bFGFノックダウンクローンと対照クローン由来のスフェロイドの直径を示す。
【図８Ｃ】bFGFノックダウンクローンと対照クローン由来のスフェロイド中の細胞数を示す。
【図９】サリドマイドにより少なくとも2レベル調節されたbFGFの発現を示す図解である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
定義
本発明の説明書内に使用されている専門用語には、通常、その専門分野での一般的な意味がある。本発明を記述するためのある専門用語については、下記、又は明細書のどこかで討論して追加的に本発明の説明を述べる場合もある。便宜上、ある専門用語は、例えば、斜体及び／又は括弧などの記号により特に強調して示される。しかし、その専門用語の範囲と意味は特に強調することによって何ら変わらない。注意すべきは、同様の事例に一つ以上の方法で説明する場合がある。そこで、本発明において討論される任意の一つ又は一つ以上の専門用語は、代替の言語と同意語が使用され、その専門用語が明細書内で念入りに説明又は討論されたかどうか重要ではない。いくつかの専門用語には同意語を用いている。一つ又は一つ以上の同意語を使用することは、その他の同意語の使用を妨げるものではない。本発明において、実施例(専門用語について討論する事例を含め)の用途は、本発明を説明するにすぎないものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００３１】
特に定義が与えられた場合を除き、本発明において使用される全ての技術用語と科学用語は、本発明の技術分野において通常理解されているのと同様な意味を有する。不一致のある場合は、定義を含め、本発明の明細書に準ずる。
【００３２】
本文中に用いられる“あたり”“約”“およそ”は、通常、その指定する数値又は範囲の20%以内であり、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内を意味する。その取り扱う
数値が接近値の場合、明確な表示ができない場合に、“あたり”“約”“およそ”が使用される。
【００３３】
本発明の概観
本発明の好ましい具体例において、従来の臨床治療に使用する血清濃度の1.8〜10μｇ／ml（Eleutherakis-Papaiakovou ら、2004を参照）よりも相対的に低い濃度の0.1μｇ／mlのサリドマイドを用い、U-87 MGヒトグリオーマ細胞中のG-及び／又はGC-リッチプロモーターを標的にして作用することで、bFGF RNA転写物の発現を下向調節(down regulated)したことを示している。本発明の好ましい具体例においても、サリドマイドは、異なるbFGFのイソ型の発現に対しても用量依存性の態様(0.1,1,10  μｇ／ｍｌ)の下向調節を示し、G-及び／又はGC-リッチIRES活性の変化からその結果が示される。サリドマイドは、溶液中で非常に容易く水解することが知られている(Erikssonら、1998を参照)。そこで、本発明は、リポソームによるカプセル化などの徐放性技術により、0.1〜10μｇ／mlの濃度のサリドマイドの生物学的利用能を高める方法を提供する。
【００３４】
本発明の好ましい具体例において、bFGF のG-及び／又はGC-リッチプロモーター及び／又はG-及び／又はGC-リッチコーディング配列は、サリドマイドの主要な標的であることが包含されている。サリドマイドを研究のツールとして応用した場合、bFGFが癌形成の特徴である癌の非固定依存成長において非常に重大な役割を果たしていることが判る。本発明の好ましい具体例における、サリドマイドの分子メカニズムによって、ガン、血管形成関連疾患、免疫学的疾患と睡眠障害などを、相対的に低い用量で、例えばリポソーム、N−トリメチルキトサン、及びｐＨ依存性徐放手段などの薬剤伝達技術を利用して阻止する新しい方法を提供する。特に、ランダム性の臨床試験に替り、高いbFGF発現量に関連した疾患の治療に有効な指標を提供する。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の具体例に使用された例示的な装置、機器、方法および関連する結果について説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。注意すべきは、実施例に使用されたタイトル又はサブタイトルは、読者が読み易いよう便宜上用いたものであり、本発明の範囲を制限するものではない。さらに、いつくかの理論が提示されているが、それが正確であるか否かを問わず、本発明がそれらの理論なしでも実施できる場合、本発明はこれらの理論や説明に制限されるものではない。
【００３６】
実施例１
U-87 MG細胞中におけるbFGF RNA含量に対するサリドマイドの下向調節（down-regulate）サリドマイドの抗ガン効果がbFGFの発現の下向調節によって得られることを調べるため、高い基本的含量を有する悪性の高いヒトグリオーマU-87 MG細胞系を使用した（Keら、2000を参照）。該U-87 MG細胞は、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection， Rockville，MD ，ATCCと略称）より購入し、10％の熱不活性化した牛胎児血清（fetal bovine serum，FBSと略称；Gibco社）と抗生物質（例えば、ペニシリンG（Sigma-Aldrich社）とストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEMと略称）に保持し、37℃下で加湿した培養器中、5％の炭酸ガスと95％の空気中において培養した。先に、サリドマイド（TTY, Biopharm社、台湾）をジメチルスルホキシド（DMSO；Sigma-Aldrich社）に溶解させて50 mg／ml濃度の貯蔵液を調製し、使用時に培地で希釈し所望する濃度に調整した。培地中に含まれるDMSOの最終的な最高濃度は0.02％である。
【００３７】
U-87 MG細胞中のbFGFのRNA量を、リアルタイムRT-PCR分析により測定した。U-87 MG細胞を指定する濃度（0, 0.1, 1及び10μｇ/ml）のサリドマイドで3時間と12時間それぞれ処理した後、氷冷したリン酸塩緩衝食塩水（phosphate buffered saline，PBSと略称）を用いて2回洗浄し、RNA-BeeTM RNA 分離用溶剤（Tel-test社）によりRNAを抽出した。AMV逆転写酵素（Promega社）を用い、全RNA(5μｇ)よりcDNAを調製した。逆転写したcDNAの試料は、ABIプリズム7700配列検定系（Applied Biosystems社）とSyBLグリーンマスターミックスキット（Applied Biosystems社）を用いたリアルタイムPCRにより分析を行った。リアルタイムPCRのプライマーは、プライマー発現ソフトウェア（Applied Biosystems社）により設計し、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDHと略称）プライマー（配列番号1 と配列番号2）、bFGFプライマー（配列番号3と配列番号4）を標的とした。これらプライマーの配列を表1に示す。
【００３８】
該PCRの条件を下記に示す：95℃で10分間変性した後、95℃で15秒、55度で20秒、及び72度で40秒、40サイクルを行い、ヒトGAPDHの発現量を内部参照とした。相対遺伝子発現量は2-ΔΔＣＴに従い計算され、U-87 MG細胞中のbFGF  RNA量は、0.1〜10μｇ/ml範囲の濃度のサリドマイドで3時間処理した後、顕著な減少を示した（図1Aを参照）。従来報告され
ている治療用量（3〜6μｇ /ml、Vaccaら、2005を参照）より低い濃度でも有効であることが明らかにされた。しかし、サリドマイドで細胞を長時間（12時間）処理した場合、bFGF発現の阻害効果は消失した（図1Bを参照）。
【００３９】
表1
【表１】
2015028059.tif 000003
【００４０】
培養培地中におけるサリドマイド単独の安定性を調べるため、新鮮な培養培地を用いてサリドマイド貯蔵液を0.1〜10μm/ml範囲内の濃度に希釈し、37℃に加湿した培養器中、5％の炭酸ガスと95％の空気中で9時間培養した後、U-87 MG細胞に加え、3時間処理した。図1Cに示す通り、サリドマイドは短い（9時間）時間培養培地で培養するだけで完全にその活性を失った。水溶液中におけるサリドマイドの安定性を増強するため、例えば、リポソームとN-トリメチルキトサンなどのビヒクル(vehicle)又は薬学的に許容されるキャリヤー(carrier)によりサリドマイドをカプセル化することができる。サリドマイドはリポソームによりカプセル化されてリポソーマルサリドマイドを形成した。その方法は前記の通りである（Fangら、2005を参照）が、改良を経たものである。簡単に述べると、卵ホスファチジルコリン（120mg、Fluka社）とコレステロール（30mg、Sigma社）とを重量比4:1及びサリドマイド12mgとを共に混合し、5mlのクロロホルム．メタノール溶液（2:1、v/v）中に溶解し、次に、ロータリエバポレータを用い40℃で溶剤を除去した。残余の溶剤は脂質フィルムを真空下に一夜保持することにより除去した。該フィルムは、先に10mlの蒸留水を用いてバスタイプソニケーターにより、4℃下で1時間処理した。リポソームの水性分散液は、さらに、プローブタイプソニケーターで均一化して、サイズの細かいリポソームを調製し、その後、74、53、30及び10μmの一系列の細孔サイズのナイロンメッシュで濾過し、26,000×ｇで遠心分離し、リポソームペレットを収集した。リポソーマルサリドマイドの濃度は、リポソーマルサリドマイドをメタノールに溶解し、ＵＶ吸収を波長230nｍで測定することにより得た。興味深いことは、リポソーマルサリドマイドのU-87 MG細胞中におけるbFGF転写物に対する顕著な阻害効果は、24時間処理後でも確認された（図1Dを参照）。しかし、先に見られた用量依存性（図1Aを参照）は消失した。
【００４１】
実施例２
Ｎ−トリメチルキトサンカプセル化によりサリドマイドを徐放する
前記の方法でＮ−トリメチルキトサン（ＴＭＣと略称）を合成した（Thanouら、2000を参照）。簡単に言うと、300μmの細孔サイズのナイロンメッシュでキトサン（2g, Sigma- Aldrich社）、を篩過し、これを沃化ナトリウム（4.8g, Sigma-Aldrich社）15％（w/v）の水酸化ナトリウム溶液（11ml,  Sigma-Aldrich社）、沃化メタン（11.5ml, Sigma-Aldrich社）及び1-メチル-2-ピロリジノン（80ml, Sigma-Aldrich社）と共に、60℃で75分間混合した。その生成物を4容量の95％（v/v）エタノールで沈殿させ、1670×ｇの遠心分離により分離し、エーテルで洗浄してエタノールを完全に除去した。その後、上記で得た生成物を1-メチル-2-ピリロリジノン(1-methyl-2-pyrrolidinone)（80ml, Sigma-Aldrich社）に溶解し、60℃下でエーテルを除去した後、沃化ナトリウム（4.8g, Sigma-Aldrich社）と共に15％（w/v）の水酸化ナトリウム溶液（11ml, Sigma-Aldrich社）と沃化メタン（11.5ml, Sigma-Aldrich社）と共に、60℃で混合して、還元メチレーションの第2ステップを行った。その生成物に4容量の95％（v/v）エタノールを加え、沈殿させ、1670×ｇの遠心分離で分離し、エーテルで十分に洗浄した。その純化ステップは、生成物を10％（w/v）の塩化ナトリウム（20ml,  J. T. Baker社）に溶解し、沃素を塩素に変え、4容量の95％（v/v）エタノールで沈殿させ、1670×ｇの遠心分離で分離し、エーテルで十分洗浄し、脱イオン水により一夜透析することにより行われた。TMCを真空下で乾燥し、500-MHzスペクロメーター（Bruker Avance 500 MHz NMR）により重水（D2O）中でその特性評価を解析した。TMCによりカプセル化したサリドマイドのナノ粒子は、前記の如く室温下でマグネチックスターラーの攪拌下イオン-ゲル化法により調製する（Miら、2008を参照）。約言すれば、水性ポリ（γ−グルタミン酸）（18.26mg/1.97mlの脱イオン水、Vedan社,台湾）をサリドマイド（18.16mg/31.91ml（脱イオン水／エタノール＝2/3,v/v））と予備混合した。続いて、この混合液に硫酸マグネシウム（36.54mg／4.12mlの脱イオン水, Sigma-Aldrich社）を混合し、1時間十分に攪拌する。この混合液に水性TMC（114.6mg／20mlの脱イオン水）を加え、室温下でマグネチックスターラーで1時間攪拌する。ローディング収容力（loading content）とローディング効率（loading efficiency）を決定するため、TMCによりカプセル化したサリドマイドのナノ粒子を遠心分離機（Beckman 55.2 Ti ローター（Beckman Coulter社））を用い、45,000rpm（２２７．４８０×ｇ）で収集し、液相クロマトグラフ質量分析計（LC/MS/MS, Bruker社）で解析した。前記の急速に水解するサリドマイド（Erikssonら,1998を参照）と比べるとTMCによりカプセル化したサリドマイドは徐放的に放出されることが判る。
【００４２】
実施例3
bFGF蛋白量のサリドマイドによる下向調節とその核内分布
U-87 MG細胞を一定濃度（0, 0.1, 1及び10μｇ /ml）の遊離型のサリドマイドとリポソーマルサリドマイドで処理し、PBS内の4％（w/v）のパラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich社）中に15分間固定し、室温下で30分間PBS中で0.01％（v/v）のトリトンX-100（Sigma- Aldrich社）又は0.5％（v/v）のサポニン（Sigma- Aldrich社）により透過処理した。
次に、室温下で30分間0.5μｇのポリクローナルウサギ抗ヒトbFGF抗体（ab16828, Abcam社）を用いて処理し、洗浄した後、FITC−複合ヤギ抗ウサギIgG（Jackson ImmunoResearch社）の1：200に希釈したもので染色した。核マーカーとしてHoechst  33258（Sigma-Aldrich社）を用いた。その後、細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡（オリンパス光学社,東京,日本）で観察、又はBD FACSCaliburTM流量細胞計（BD Biosciences社）を用いて分析した。細胞性bFGFの相対的発現量は、空のリポソームで処理した対照により、各処理組の平均的蛍光値を標準化して計算した。免疫蛍光光染色により、bGFG蛋白の全量だけでなく（図2Aを参照）、その核量（図2Bを参照）も、サリドマイドによる下向調節を示した。HMW bFGFSは核内に存在する主要なイソ型であるため（Renkoら,1990を参照）、この分画内におけるそのシグナル強度の低減は、HMW bFGFSの発現の低減を反映するものである。
【００４３】
GAPDH量はサリドマイドに影響されないため、内部対照として用いられ、免疫ブロット法（又は、ウェスタンブロット法）により異なるbFGFのイソ型の分析が行われた。U-87 MG細胞は、一定した濃度（0,0.1,1及び10μｇ/ml）の遊離型サリドマイドとリポソーマルサリドマイドにより処理された後、50mMトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（トリス、USB社）、1％（v/v）トリトンX-100（Sigma-Aldrich社）150mM塩化ナトリウム（J.T.Baker社）,1mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTAと略称, Sigma-Aldrich社）,1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSFと略称, Sigma-Aldrich社）を含む溶解緩衝液（Lysis buffer）を用いて溶解液（cell lysate）を調製した。蛋白質を含む細胞溶解液（2μｇ）は、15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した後、ポリビニリデンフルオリド（PVDFと略称）膜（PerkinElmer社）に転移した。該膜は1：200に希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトbFGF抗体（ab16828，Abcam社）、又は1：10000に希釈した抗GAPDH抗体（ab9842，Abcam社）を内部対照として使用して培養し、続いて1：5000で希釈されたワサビダイコンペルオキシダーゼ複合抗IgG 2次抗体（Jackson ImmunoResearch社）を用いて培養した。ブロッティング分析には、強化化学発光（ECLと略称、PerkinElmer社）検定方法（Amersham社）が使用された。サリドマイドで処理されなかったU-87MG細胞は、すべてのbFGFのイソ型の発現を示したが、24キロダルトン（kDa）にあたる一つのイソ型は、他のイソ型に比べ低い発現を示した（図2Cを参照）。HMWとLMWのbFGFは同様な転写から翻訳されているのにもかかわらず、サリドマイドにより引き起されたHMW bFGFの低減はLMW bFGFに比べて劇的な低減を示した(1と10μｇ／ml)。同時に、リポソーマルサリドマイドはHMW bFGF量だけでなく、LMF bFGF量においても用量依存性の下向調節を示すことが明らかになった（図2Cを参照）。
【００４４】
実施例4
細胞の増生（cell proliferation）と足場非依存性増殖に対するサリドマイドの効果
サリドマイドは、U-87 MG細胞内のbFGF発現に対して下向調節を示し、グリオーマ(glioma)細胞中のその成長因子の過剰発現は、オートクリン的態様でその増生を刺激すること、さらに、bFGFアンチセンスオリゴヌクレチドをこれらの細胞に導入すると、その成長と軟寒天中でコロニーを形成することを遮断することが報告されているため（Murphyら，1992を参照）、次に、その成長に対するサリドマイドの効果を評価することにした。細胞の増生能力を分析するためにレサズリン分析法を使用し（Nociariら，1998を参照）、レサズリン染料をレドックス指示薬として細胞の死亡ではなく、細胞の成長を調べた。レサズリンナトリウム(Sigma-Aldrich社)の貯蔵液（5ｍM PBS中）を調製し、使用する前に、FBS抜きのDMEM（Gibco社）を用いて貯蔵液を希釈し、50μM濃度の操作用溶液を調製した。96-ウェルプレート（Costar, Corning社）にU-87 MG細胞を約3000個播種し、37℃、加湿下の培養器中、5％の炭酸ガスと95％の空気中で16時間培養し、一定した濃度（0, 0.1, 1, 10と100μｇ/ml）の遊離型サリドマイドとリポソーマルサリドマイドで72時間処理した。
レサズリン分析の際、培養液を除去し、新たに希釈したレサズリン操作用溶液（100μl）をそれぞれのウェル中に加え、続いて37℃下、加湿した培養器中、炭酸ガス5％と空気95％中において2時間培養し、生きている細胞の活性によりレサズリン染料が還元され、還元型のレサズリンが形成された。それをVictor 21420マルチラベル計数計（Wallac，PerkinElmer社）で波長530nmにある蛍光励起と、波長590nmにある放射を測定した。図3Aに示される通り、濃度の高い（100μｇ/ml）リポソーマルサリドマイドだけが、U-87 MG細胞の増生を僅かに低減させることが明らかになった。
【００４５】
bFGFが細胞の形質転換（transformation）を促進することが知られているため（Vagnerら，1996を参照）、軟寒天にコロニー形成分析法（Murphyら，1992を参照）と懸滴培養方法(hanging drop method, Kelmら，2003を参照)とを用い、サリドマイドによるU-87 MG細胞の足場非依存性増殖と三次元成長能(three-dimensional growth ability)についてそれぞれ評価した。コロニー形成分析法は、2層寒天技術（Murphyら,1992を参照）に従って行われた。10％FBSと0.5％（w/v）寒天（Amresco社）と0.3mlのDMEMにより底層を構成した。10％FBS, 0.3％（w/v）の低融点の寒天（Amresco社）と一定した濃度（0, 0.1, 1及び10μｇ/ml）の遊離型サリドマイドを含む同様の培地に、U-87 MG細胞約1000個を加え、24-ウェルプレート（Costar, Corning社）の基層上にプレートした。37℃下、加湿した培養器中、5％炭酸ガスと95％空気中で2週間培養した後、細胞を3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリゥムブロミド（MTTと略称, Sigma-Aldrich社）染料溶液で染色し、プレートを撮影し、コロニー数を計数し、コロニー形成能（サイズ＞0.1mm）を測定した。図3Bと図3Cに示す通り、遊離型のサリドマイドとリポソーマルサリドマイドは、低濃度（0.1μｇ/ml）において、明らかな用量依存性反応の効果を示した。
【００４６】
懸滴培養分析法としては、20μlの細胞懸滴液当りU-87 MG細胞約1000個を含む培養培地（10％FBSを含むDMEM）と、一定した濃度（0, 0.1, 1及び10μｇ/ml）の遊離型のサリドマイドを6-cm径の培養皿のカバー（Falcon社）上にスポットする。該カバーをその頂上の位置に戻し、細胞懸滴液を培養皿の底に向けている。培養中、湿度を保持するため培養皿の底に5mlのDMEMを含ませる。37℃下、加湿した培養器中、5％炭酸ガスと95％空気中で48時間培養した後、スフェロイドが形成される。位相差顕微鏡を用いて各スフェロイドを撮影する。異なるそれぞれの分析条件下の20個のスフェロイドより凝集能力を計算して凝集率を得る。スフェロイド培養中の細胞凝集形成は、用量依存的に遊離型サリドマイドにより破壊される（図3Dと図3Eを参照）。
【００４７】
実施例5
サリドマイドはG−及び／又はGC−リッチプロモーターの調節によりbFGF転写を下向調節（down regulate）する
bFGFプロモーターをによってドライブされる転写に対するサリドマイドの効果を評価するため、強化グリーン蛍光蛋白（EGFPと略称）の発現をドライブするbFGFプロモーターを含むpbFGF−EGFPプラスミドをU-87 MG細胞中に安定的にトランスフェクトさせてU-87-bFGF-EGFP細胞を得た。約言すると、U-87 MG細胞よりゲノムDNAを純化する。約500ngのゲノムDNAを鋳型（template）として、Tagポリメラーゼ（GENET,  Bio社）を用いて、ABI 2700型サーモサイクラー（Applied Biosystems社）によりPCRフラグメントを増幅した。増幅bFGFプロモーターに用いられるプライマー（配列ID No.5と配列ID No.6）は表1に示した。PCR条件を下記に示す：先に96℃で10分間、次に95℃で40秒、58℃で40秒、及び72℃で1分間により35回循環を繰り返し、最後に72℃で7分間処理した後、4℃下に保持した。bFGFプロモーターフラグメント（配列ID No.７）をPGEMT−イージィベクター（Promega社）中にクローニングし、pEGFP−N２ベクター（BD Biosciences Clontech社）中にサブクローニングして、プラスミドpbFGF−EGFPを生成した。約2×105個U−87 MG細胞を6−ウェルプレート（Falcon社）にプレートし、24時間後にトランスフェクションを行った。リポフェクトアミン2000（Invitrogen Corp.社）のメーカーの説明書に従い、FBS抜きのDMEM中に3μlのリポフェクトアミン2000と3μｇの全DNA（プラスミドpbFGF-EGFP）を加えたものにさらした。37℃下、加湿した培養器内、5％炭酸ガスと95％空気中で48時間培養し、その細胞をトリプシン処理し、10％FBSを含むDMEM（20倍希釈）中で継代させた。ジネチシン（geneticin, 800μｇ/ml；Merck Biosciences社）を用い、1ヶ月かけて安定したトランスフェクタント（U-87-bFGF-EGFP細胞）を選択した。
【００４８】
U-87-bFGF-EGFP細胞を一定した濃度（0, 0.1 , 1及び10μｇ/ml）の遊離型サリドマイドで3時間処理した。EGFPの蛍光を流動サイトメトリー（FACS Calibur, BD Biosciences社）により測定し、その相対的な蛍光指数を測定して、bFGFプロモーターによりコントロールされたEGFPの発現に対するサリドマイドの効果を評価した。EGFPのRNA量は、GAPDHを内部対照としたリアルタイムRT-PCRを用いて分析した。表１にEGFPプライマー（配列番号8及び配列番号9）を示す。サリドマイドは3時間の処理を経てEGFP転写物と蛍光の用量依存態様を弱める結果を示した（図4Aと図4Bを参照）。
【００４９】
実施例６
サリドマイドはIRES活性を調節することによりbFGF翻訳を下向調節する
bFGF転写物のN-末端エクステンションのIRES中にあるG-及び／又はGC−リッチ領域がサリドマイドにより調節されるか否かを調べるため、前記の通りバイシストロニックベクターを用いて（Creancierら,2000）プラスミドpHMW-IRESとpLMW−IRESを設計した（図5Aを参照）。これにより二つのルシフェラーゼ（luciferase）遺伝子、レニラルシフェラーゼ（Renilla luciferase，LucRと略称）とホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase，LucFと略称）がサイトメガロウイルス（cytomegalovirus ，CMV と略称）プロモーターにより調節され、LMW-IRESフラグメント（配列番号12）とHMW-IRESフラグメント（配列番号15）により隔離され、それらは、それぞれプラスミドpLMW-IRES又はpHMW-IRES中にある（図5Aを参照）。LMW-IRESフラグメント（配列番号12）とHMW-IRESフラグメント（配列番号15）は、表1に示すプライマー（配列番号10, 配列番号11, 配列番号13及び配列番号14）とPCRによりU-87 MGゲノムDNAから増幅された後、pGEMT−イーズィベクター系（Promega社）にクローナルされ、バイシストロニックベクター系（Promega社）にサブクローナルされ、それぞれプラスミドpLMW−IRESとpHMW−IRESを生成した。約2×105個のU-87 MG細胞をトランスフェクションの24時間前に6ウェルのプレート（Falcon社）にプレートし、をメーカーの説明書に従い、FBS抜きのDMEMに、3μｇの全DNA（プラスミド pLMW-IRES又はpHMW-IRES）と3μlのリポフェクトアミン2000（Lipofectamine 2000,米国）と加えたものにさらした。37℃下、加湿した培養器中、5％炭酸ガスと95％空気中で48時間培養した後、細胞をトリプシン処理し、10％FBS（20倍希釈）を含むDMEMで継代させた。ジネチシン（800μｇ/ml, Merck Biosciences社）を用い1ヶ月かけて安定したトランスフェクタント（U87-HMW-IRESとU87-LMW-IRES細胞）を選出した。
【００５０】
U87-LMW-IRESとU87-HMW-IRES細胞を一定濃度（0, 0.1 ,1及び10μｇ/ml）のリポソーマルサリドマイドで12時間処理し、それぞれの細胞抽取物中における二つのルシフェラーゼ活性をVictor 2  1420  マルチラベル計数計（Wallac，PerkinElmer社）によりシンチレーションカウンターで測定した。IRES活性は、無処理の対照により標準化し、LucR ／LucF比率（ホタルルシフェラーゼ活性に対するレニラルシフェラーゼ活性の比率）を計算して求めた。サリドマイドは、LMW−IRESとHMW−IRES双方のIRES活性を用量依存的態様で変化させた（図5B及び図5Cを参照）。
【００５１】
実施例７
サリドマイドのUV-VIS吸収は、G-リッチDNAフラグメントにより、より効果的に消光される
ラージゲノムDNA（＞100キロベース）のGC量は30％〜65％範囲内にあり、その平均値は約40％であり（Venterら、2001；Landerら、 2001を参照）、核酸のGC量は50％よりも多ければG-及び／又はGC−リッチである。ｂＦＧＦのプロモーター領域より、91％GC含量のG−リッチフラグメントと、44％GC含量のノン−G−リッチ対照フラグメントが設計された（図6Aを参照）。サリドマイドがbFGFのG−及び／又はGC−リッチ領域と優先的に相互作用するか否かを調べるため、サリドマイドのUV−VIS吸収を日立U2000分光光度計を用い、330〜190nm範囲の波長を走査した。サリドマイドの吸収は、DNAの2次構造との緊密な結合により減じる（Ushaら、2005を参照）。図6Bと図6Cに示される如く、ノン−G−リッチ対象フラグメントと共に培養した場合と比べて、G−リッチフラグメントと共に培養した方が、サリドマイドの波長230nmにおける吸収が、より強く消光されることが検出され、この結果は、サリドマイドが優先的に高いGC量を有する核酸と結合することを示唆するものである。
【００５２】
実施例８
U87 MG細胞の足場非依存性増殖はそのbFGF発現のノッキングダウンにより抑制される
サリドマイドは、U-87 ＭＧ細胞中のbFGF発現を下向調節するだけでなく、軟寒天内におけるそのコロニー形成をも阻害することが明示されたので、次にこれら細胞における腫瘍形成は、そのbFGF発現をノッキングダウンすることにより低減できるか否かを調べた。
【００５３】
台湾の国立RNAiコア施設（台湾．中央研究院遺伝研究センター分子生物学研究所。国家科学委員会のゲノムメディシン国家研究プログラムの援助による）の提供による指導書に従い、リン酸カルシウム方法を用いてヒト胚腎臓細胞系293T細胞（ATCC，Rockville，MDより入手）の一時性トランスフェクションにより、組換レンチウイルス（recombinant lentivirus）を製造した。簡単に述べると、293T細胞を、ノン−標的対照sｈRNA（shGEP対照、表2に示す、配列番号19）或いはbFGF shRNA（bFGF shRNA No.1, No.2又はNo.3, 表2を参照）（配列番号16,  配列番号17と配列番号18）を発現する20μｇのpLKO.1−puro レンチウイルス性ベクター（国立RNAiコア施設，台湾．中央研究院，台北）と、6μｇのエンベローププラスミドpMD.G（国立RNAiコア施設，台湾．中央研究院，台北）及び15μｇのパッケージングプラスミドｐＣＭＶΔＲ８．９１（国立ＲＮＡｉコア施設，台湾．中央研究院，台北）とで同時トランスフェクトさせた。トランスフェクションの6時間後に新しい培地（10％FBSを含むDMEM）に置き換えた。ポスト−トランフェクションの40時間と64時間目に感染性レンチウイルスを収集し、0.45μmの低蛋白結合フィルター（Millipore社）で濾過した。ウルトラ遠心分離機（Beckman SW28 スウィングルバケツ型，4℃，26,000rpmで2時間）によりウイルス粒子を落とした。遠心分離後、上澄液を廃棄し、200μlのFBSフリーのDMEMにウイルスペレットを懸濁し、−70℃下で保存した。
【００５４】
ｂＦＧＦノックダウン細胞を用意するため、10％のFBSを含む5mlのDMEM中に約106個のU-87 MG細胞が含まれたものを6-cm径の培養皿（Falcon社）にプレートし、37℃下、加湿した培養器中、5％炭酸ガスと95％空気中で16時間培養し、細胞の付着を行った。その後、細胞をレンチウイルス懸濁液（100ml）で24時間感染させた。組換レンチウイルスは、耐ピューロマイシン遺伝子（puromycin resistant gene）を有するため、ノックダウン細胞を選出するために使用する1μｇ／mlのピューロマイシン（Sigama-Aldrich社）を含む新鮮な培地（10％のFBSを含むDMEM）を、3日ごとに置き換え、2週間続けた。これにより、各自のshRNAから3つのbFGFノックダウンクローンが選出され、それぞれクローン#1，クローン#2，クローン#3と命名した。
【００５５】
表2
【表２】
2015028059.tif 000004
【００５６】
ウェスタンブロットの結果、この3種のノックダウンクローンは、内生bFGFの発現にかかわる下向調節に異なる効果を示した（図7Aを参照）、クローン#3を除き、その他のクローンは、細胞増生活性において、その対照と著しい差はみられなかった（図7Bを参照）。
しかし、これらのbFGF下向調節細胞の足場非依存性増殖は、著しく阻害され、特に、クローン＃3ではその阻害は大きい（図7Cを参照）。U-87 MG細胞の足場非依存性増殖に対するLMWとHMW bFGFの貢献の違いを調べるため、前述のクローンを軟寒天中、コロニーが形成される前に、組換LMW bFGF(0, 10, 50 と250ng／ml)と共に培養した後、計算した。LMW bFGFの補足作用により、bFGF下向調節細胞から形成されるコロニー数は著しく増加したにもかかわらず、この処理により足場非依存性増殖の活性は、僅かに一部分だけ回復した（図7Dと表3を参照）。このような結果は、核内bFGF（HMW部分）が細胞の形質転換において重要な役割を果すことを示すものである。
【００５７】
表3
【表３】
2015028059.tif 000005
結果は平均値±標準誤差（各群n＝6）で示される。*p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001対0 ng／ml bFGF対照細胞（student検定法）。
【００５８】
実施例9
U-87 MGの三次元成長（three-dimensional growth）は細胞内bFGF量のノックダウン後に減少する
懸滴培養方法（hanging drop method）を用いて、ガン細胞を成長させスフェロイドを形成するように仕向けた。日付けは示されていないが、凝集に必要とする時間は、対照に比べてbFGFノックダウンクローンの方が長く、スフェロイドのサイズは著しく小さくなった（図8Aと図8Bを参照）。さらに、分析を行うため、各ウェルにFBS抜きの100μlのDMEMを含む96−ウェルプレート（Costar, Corning社）の各ウェル中にスフェロイドを転移し、37℃下、加湿した培養器中、5％炭酸ガスと95％空気中、12時間付着させた後、培地を除き、メチレンブルー（5g／l濃度のメタノール溶液、Sigama-Aldrich社）200μlを使用してスフェロイドを30分間染色し、各ウェルを5回水洗して過剰の染料を除去した後、プレートを25℃下一夜放置して乾燥した。25℃下、2％（w/v）SDS（200μl／ウェル；J．T．Baker社）により24時間かけて染色されたスフェロイドを溶解し、Power WaveTM HT 340 (BioTek社)を用いて、スフェロイド溶菌液のメチレンブルー吸収％を測定し（波長650nm）、スフェロイド中の生存細胞として示した。その結果、細胞数はbFGFの細胞量と相関性を示し（図8Cを参照）、外因性のbFGFは細胞増生活性を促進し、用量依存性態様によりスフェロイドのサイズを回復することが示された（表4を参照）。このことは、U-87 MG細胞が立体的なスフェロイドに生成する活性が、bFGFの内分泌機構に依存することを示すものである。
【００５９】
表4
【表４】
2015028059.tif 000006
結果は、無処理対照の相対的指数±標準誤差（各群n＝8）で示される。*p＜0.05，** p＜0.01対0 ng／ml bFGF対照細胞（student検定法）。
【００６０】
サリドマイドは、研究や使用が始められてから、50年を超えているが、その作用機構は十分に明らかにされていない。その多くの臨床試験は、その抗血管形成と免疫調節活性について行われている（Eleutherakis-Papaiakovouら，2004を参照）。面白いことに、サリドマイドに対して正の反応を示すガン患者において、サリドマイドは、例えば、VEGF、bFGFとHGFなどの血管形成因子の血清濃度の変化に対して相関関係を示すことである（Fineら，2000；Nebenら，2001；Vaccaら，2005；Kakimotoら，2002を参照）。本発明において、低濃度のサリドマイドが、U-87 MG細胞内のbFGFに対し、用量依存性の下向調節に効果的であり、そのサリドマイドの生物学的利用能は、徐放性技術、例えば、リポソーム，N−トリメチルキトサンによるカプセル化により、pH−依存性の安定した釈放をすることにより増大することが発見された。加えるに、本発明で明らかにされた発現（図4A及び図4B）とDNA結合分析結果（図6B）は、サリドマイドによるbFGF転写物量の下向調節が、その遺伝子のG-リッチプロモーターと直接相互作用を介しておこることを示唆するものである。本発明におけるサリドマイドの有効濃度（0.1及び1μｇ／ml）は、従来の文献においてG−リッチhTERT プロモーターの抑圧に使用されている濃度（12.5及び25μｇ／ml）に比べて非常に低いものである（Druckerら，2003を参照）。又、同時に、サリドマイドの処理により、その細胞内でbFGF蛋白量が低減することが発見されており、それが高分子量（HMW）bFGFの核内分布量の変化とも関連する（図2Bを参照）。
【００６１】
HMWとLMWの双方の転写物に存在するIRES活性（Bonnalら，2003を参照）は、サリドマイドにより用量依存性に下向調節することが示されている（図5B及び図5Cを参照）。これは細胞内のIRESsが、正常条件下における低量の発現を支持することに進展する可能性を示唆する。又、異なる刺激に反応して発現が誘導可能であることは、人類のいくつかの病気の状態、例えば、糖尿病、心臓血管疾患、ガンの展開と進行などの発展に貢献する（Komarら，2005を参照）。bFGF  IRESは、特に、内因性bFGFの発現の増大と関連して、ストレプトゾトシン（streptozotocin）に誘発された糖尿病のネズミの大動脈壁内で活性化されるが、これは、糖尿病関連性のアテローム性動脈硬化症の悪化のかぎの一つになる（Gonzalez-Herreraら、2006を参照）。アンギオテンシンII（angiotensin II）は、高血圧の病因学上中心的な役割を演じているだけでなく、心臓肥大、心臓機能不全、血管肥厚、アテローム性動脈硬化症、糸状体硬化症などヒトの疾患においても、病理生理学上同様に重大な任務を果たしている。アンギオテンシンIIの生物学的反応は、アンギオテンシンIIの第1型レセプター（AT1Rと略称）との相互作用を介して行われ、このAT1Rは心臓血管疾患の発病と密切な関係を有する。AT1RはIRESを携帯し、又、AT1Rの活性化は病原性ステップにおいて非常に重要な役割を果たしている（Martinら、2003を参照）。
【００６２】
充実性腫瘍（solid tumor）は、生体内で多細胞の集団として成長し、その内、一部分の細胞は基底膜（basement membrane）と正常に接触することがなく、アノイキス耐性（anoikis-resistant）であることは良く知られている。この充実性腫瘍から引き出した細胞系は、軟寒天又は懸濁培養により足場非依存性にコロニーとして成長する能力を有する（Freedmanら、1974を参照）。この足場非依存性の習得がガン細胞の重要な特徴であり、ガンの成長と転移の臨界要因の一つと考えられている。ガン細胞の足場非依存性増殖のためのインテグリンエクストラセルラーマトリックス媒介の信号機能の需要を取消す某信号径路が提議されているが、その正確な分子メカニズムは十分に明らかではない（Grossmann、2002及びWang、2004を参照）。U-87 MG細胞の増生の引き立たない抑制に対比して（図3Aを参照）、サリドマイドは低濃度でこれら細胞の凝集と足場非依存性増殖を能率的に阻害する（図3B〜図3Eを参照）。これは、サリドマイドの新しいガン抑制のメカニズムを明らかに示すものである。bFGF発現量とヒト繊維芽細胞（fibroblast）、前立腺上皮細胞（prostatic epithelial cell）とメラニン細胞（melanocyte）の足場非依存性増殖との正の相関については、すでに多くの報告がある（Bikfalviら、1995を、Quartoら、1991を、Nesbitら、1999を、Ropiquetら、1997を参照）。今後、サリドマイドによるU-87 MG細胞の軟寒天中におけるコロニー形成の下向調節は、その誘発するbFGF発現の低減に貢献する。この推測は、shRNAが媒介するbFGFノックダウンの研究に支持され、これは明らかに細胞のbFGF量とこれら細胞の軟寒天中におけるコロニー形成能力との正相関関係を示すものである（図7A、図7C、図7Dを参照）。他方、組換ヒトbFGFの添加は、ただ一部分のU-87 MG細胞の軟寒天中のコロニー形成能率の損失を回復するだけにとどまり（表3を参照）、細胞の形質転換に対してこの成長因子のイントラクリンシグナリング（intracrine signaling）が貢献するものと仮定される。
【００６３】
U-87 MG細胞内における核bFGFの確かな役割は不明でも、低い血清中の繊維芽細胞の成長に対する核bFGFの刺激はすでに報告されている（Areseら、1999を参照）。その上、ヒト星状細胞腫（astrocytic tumors）中のbFGFの核の蓄積もすでに患者の生存を予測する有用な指標として示されている（Fukuiら、2003を参照）。最近の報告によると、細胞と細胞の粘着は足場非依存性増殖にとっては重要であるが、又、足場非依存性増殖を阻害する可能性も存在する（Hokariら、2007を参照）。反面、bFGFは、いくつかの粘着分子の発現を調節する。例えば、内皮細胞（endothelial cell）におけるインテグリン（Kleinら、1993を参照）と、神経膠腫（glioma periphery）におけるインテグリンが挙げられるが（Belloら、2001を参照）、これにはG-リッチプロモーター領域が含まれ、胚発育中組織の足場非依存性増殖（Stephensら、2000を参照）及びガン細胞の足場非依存性増殖（Bikfalviら、1995を参照）に関わる可能性がある。本発明によると、従来の足場依存性に替り、足場非依存性のメカニズムによるサリドマイドを用いる新規な抗ガン剤を開発するための新しい戦略に対する革命的な視野を提供し、かつ、生長と転移を含むガン形成を抑制することを効果的に実現できる。
【００６４】
サリドマイドが0.3μｇ /mlの低い濃度で、LPSにより誘発されたモノサイドによるＴＮＦ−α分泌を潜在的に抑制することができるため、サリドマイドの免疫調節活性に焦点をおいて多くの研究が行われ（Sampaioら、1991を参照）、該濃度は本発明に使用される有効濃度に非常に近いものである。サリドマイドは、すでにＮＦ−κＢの活性を下向調節できると言われ、それは、例えば、免疫反応と粘着分子発現など（Liら、2002を参照）の大量の下流径路を、ＩκＢキナーゼ活性を抑制することによりコントロールする（Keiferら、2002を参照）。それでも、bFGFは、FGFR2と結合することによりＩκＢキナーゼの活性を調節し、下流のシグナル径路を活性化させる（Tangら、2007を参照）。この外、bFGFはモノサイト（monocyte）と好中球（neutrophil）とを炎症の場所に吸引することを高めることが証明されている。その結果、免疫学的なシグナルが増幅される可能性もある（Zittermannら、2006を参照）。そこで、本発明は、bFGF発現とシグナルの下向調節によるサリドマイドの統一された分子メカニズムを強調し、次に、免疫調節活性により下流免疫反応を調節する。
【００６５】
前記の通り、本発明はbFGFの転写物とプロモーター内に含まれるG-及び／又はGC-リッチ配列がサリドマイドの相互作用の標的であり、細胞のbFGF発現量の下向調節の原因であることを示している。bFGFの低減は、足場非依存性増殖を介して、U-87 MG腫瘍発生の下向調節を導き、RNAiによるbFGF量の下向調節で確定する。臨床上、サリドマイドの日投与量は、多発性ミエローマ（multiple myeloma）で、約200〜800mg、グリオーマ（glioma）と腎臓ガン（renal cancer）で、最高量の1200 mgが与えられ、患者の血清濃度としては、約1.8〜10μｇ /mlが投与される（Eleutherakis-Papaiakovouら、2004を参照）。本発明によると、U-87 MG細胞内の足場非依存性増殖を抑制するサリドマイドの有効濃度は、該U-87 MG細胞が一種の高bFGF基礎量を有する腫瘍であるため、その必要とする用量より低量でよい。それ故、より高いbFGF血清量の患者は、現在使用されているよりも非常に低い用量が投与されるので、その副作用が軽減される。この外、例えば、リポソームでサリドマイドの生物学的活性を強化するなどの薬剤伝達システムを使用することにより、事実上、その副作用をも軽減できる。bFGFは、内皮細胞の有力なプロ血管形成因子の一種であるだけでなく、血管形成の発足を調節する上流調整剤（upstream regulator）として作用する（Tsunodaら、2007を、Seghezziら、1998を参照）。このように、ガン患者におけるサリドマイドの活性は、高い予処理のbFGF発現量の腫瘍細胞に対して下向調節をするだけではなく、同時にbFGFが調整する血管形成をも抑制する。
【００６６】
前記の発見をまとめると、bFGFはＮＦ−  κＢシグナルを調節し、モノサイトと好中球の補足を強化することによる炎症反応を増幅する機能を果たす。サリドマイドが如何に血管形成、ガン成長と免疫反応を調節するかを図9に示すが、それは、bFGFのG-及び／又はGC-リッチプロモーターと、G-及び／又はGC-リッチコーディング配列（coding sequence）の一次効果に基づくサリドマイドの合理的な分子メカニズムを提供するものである。第一段階としては、bFGF遺伝子のG-及び／又はGC-リッチプロモーター領域にかかわる。例えば、サリドマイドのような医薬品が、bFGF遺伝子のG-及び／又はGC-リッチプロモーター領域に結合し、これにより、プロモーターの活性を下向調節することである。第二段階としては、Bfgf mRNAのIRESにかかわり、サリドマイドのような医薬品がIRESに結合し、bFGF転写物の翻訳を下向調節する。bFGF蛋白量の低減は、腫瘍発生を低下させ、bFGFにより誘発された血管形成を下向調節する。これに加え、bFGF蛋白量の低減は、FGFR2が介在するシグナル径路を減少させて、核ＮＦ−κＢの部位活性にネガティブな影響を与え、その結果、細胞の免疫反応を低減させる。
【００６７】
本発明の実施例によると、相対的に低濃度のサリドマイドにより、bFGF RNA転写物のG-及び／又はGC-リッチプロモーターを標的にして、bFGF RNA転写物の発現を下向調節することが明らかにされた。好ましい実施例において、サリドマイドは、G-及び／又はGC-リッチIRES活性を変化させることにより、用量依存性の態様で異なるイソ型のbFGFの発現を下向調節することが示される。サリドマイドは、すでに溶液中で水解作用に対して非常に受容性があることが報告されている（Erikssonら、1998を参照）が、本発明においては、例えば、リポソームとTMCによるカプセル化などの徐放性技術によりサリドマイドの生物学的利用能を増大する方法が提供される。本発明の実施例から分るように、本発明の相対的な徐放性技術によれば、サリドマイドの生物学的利用能が増大し、本発明と文献に開示された関連技術（例えば、Gomez-Orellana I. 2005、Lambkin I.ら 2002、Lamprecht A 2004、Li C.L.  2005、Mustata G.ら 2006、Ranade VV.  1991、Rogers JA.ら 1998、Taira MC.ら 2004、Tiwari SB.ら 2008、Zheng AP.ら 2006などの文献）に基づくそれらの応用はすべて本発明の主旨の範囲内に含まれる。
【００６８】
本発明において引用されたすべての文献を参考のため下記に示す。
上述の本発明の実施例は、本発明を説明し例証するためのものにすぎず、本発明について余すところなく述べ尽くすものではなく、又、本発明の正確な開示を限定するものでもない。上述の教示に基づいて、本発明に対して様々な修正と変更ができることは言うまでもない。
【００６９】
本発明の具体的内容と実施例は、本発明の原理との実用化を説明するために選出し、記述されたものであり、それ故、本発明の分野を熟知し、本発明と異なる具体的内容を利用するものは、本発明に対し、その期待する特殊な用途に合わせて様々な修正を行うことが可能である。本発明の主旨を逸出しない範囲において、本発明の分野の技術を熟知するものにが、代替となる具体化を行うことは明らかに実現可能である。従って、本発明の範囲は下記の特許請求の範囲において定義され、前記の記述と具体的実施例により限定されるものではない。
【００７０】
参考文献のリスト
Aguayo A. et al. 2000. Blood. 96:2240-2245.
Andrys C. et al. 2007. Archives of Dermatological Research. 298:479-483.
Arese M et al. 1999. Mol. Biol. Cell 10:1429-1444.
Bakay B et al. 1968. J. Pharmacol. Exp. Ther. 161:348-360.
Bello L et al. 2001. Neurosurgery 49:380-389.
Benisty JI et al. 2004. Chest. 126:1255-1261.
Bethea JR et al. 1997. J Immunol. 158:5815-5823.
Bikfalvi A et al. 1995. J Cell Biol. 129:233-243.
Bikfalvi A et al. 1997. Endocr. Rev. 18:26-45.
Bonnal S et al. 2003. J Biol. Chem. 278:39330-39336.
Bosco AA et al. 2003. Diabetologia. 46:1669-1675.
Boulton M et al. 1997. Br J Ophthalmol. 81:228-33.
Creancier L et al. 2000. J. Cell Biol. 150:275-281.
Di Sabatino A et al. 2004. Inflamm Bowel Dis. 10:573-577.
Drucker L et al. 2003. Mol. Pharmacol. 64:415-420.
Eleutherakis-Papaiakovou V et al. 2004. Annals of Oncology. 15:11511160
Erdem F et al. 2005. Rheumatology International. 25:599-603.
Eriksson T et al. 1998. Chirality 10:223-228.
Fang JY et al. 2005. J. Drug Target 13:19-27.
Fine HA et al. 2000. J. Clin. Oncol. 18:708-715.
Florkiewicz RZ et al. 1989. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A 86:3978-3981.
Frank RN. 1997. Ophthalmic Res. 29:341-353.
Franks ME et al. 2004. Lancet 363:1802-1811.
Freedman VH et al. 1974. Cell 3:355-359.
Fuhrmann-Benzakein E et al. 2000. Int. J. Cancer. 85:4045.
Fukui S et al. 2003. Cancer 97:3061-3067.
Giles FJ et al. 2004. Leukemia Research. 28:595604.
Gomez-Orellana I. 2005. Expert Opinion on Drug Delivery.  2:419-33
Gonzalez-Herrera IG et al. 2006. Biochem. Soc. Trans. 34:17-21.
Grossmann J. 2002. Apoptosis. 7:247-260.
Gullestad L et al. 2005. Circulation. 112:3408-3414.
Hokari M et al. 2007. Life Sci. 81:336-345.
Hoshino M et al. 2001. J Allergy Clin Immunol. 107:295-301.
Huang PH et al. 1990. Teratog. Carcinog. Mutagen. 10:281-294.
Huang PH et al. 1999. Pharmacol. Toxicol. 85:103-104.
Hurley LH et al. 2000. Pharmacol. Ther. 85:141-158.
Iwasaki A et al. 2004. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 25:443448.
Kakimoto T et al. 2002. Jpn. J. Cancer Res. 93:1029-1036.
Ke LD et al. 2000. Clin. Cancer Res. 6:2562-2572.
Keifer JA et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:22382-22387.
Kelm JM et al. 2003. Biotechnol. Bioeng. 83:173-180.
Kikuchi K et al. 2005. J Am Acad Dermatol. 53:57-61.
Klein S et al. 1993. Mol. Biol. Cell 4:973-982.
Komar AA et al. 2005. J. Biol. Chem. 280:23425-23428.
Kumar S et al. 2004. J Clin. Oncol. 22:2477-2488.
Lambkin I. et a. 2002l. Expert Opinion on Biological Therapy.  2:67-73.
Lamprecht A et al. 2004. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics.  58:37-43.
Lander ES, et al. 2001. Nature. 409:860-921.
Lawrence A et al. 2006. Dermatol Online J. 12:2.
Leonardi A et al. 2000. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41:4175-4181.
Li C.L. 2005. Journal of Pharmacy & Pharmacology.  57:533-46.
Li X, Stark GR. 2002. Exp. Hematol. 30:285-296.
Martin MM et al. 2003. Mol. Cell Endocrinol. 212:51-61.
Matthews SJ et al. 2005. Clin. Ther. 25:342-395.
Mi FL et al. 2008. Bioconjug Chem. 19:1248-1255.
Mignatti P et al. 1992. J. Cell Physiol 151:81-93.
Mukdsi JH et al. 2006. Acta Neuropathol. (Berl) 112:491-501.
Murphy PR et al. 1992. Mol. Endocrinol. 6:877-884.
Mustata G. et al. 2006. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems.  23:111-35
Nakashima M et al. 1994. Annals of the Rheumatic Diseases. 53:45-50.
Neben K et al. 2001. Clin. Cancer Res. 7:2675-2681.
Nesbit M et al. 1999. Oncogene 18:6469-6476.
Nguyen M et al. 1994. J Natl Cancer Inst 86:356361.
Nicholls PJ. 1966. J. Pharm. Pharmacol. 18:46-48.
Nociari MM et al. 1998. J. Immunol. Methods 213:157-167.
Okumura M et al. 1996. Arzneimittel forschung. 46:727-39.
Poon RT et al. 2001. J Clin Oncol. 19:12071225.
Qin Y et al.. 2008. Biochimie. 90:1149-1171.
Quarto N et al. 1991. Cell Regul. 2:699-708.
Quarto N et al. 2005. Gene 356:49-68.
Ranade VV. 1991. Journal of Clinical Pharmacology.  31:98-115.
Renko M et al.. 1990. J Cell Physiol 144:108-114.
Richardson P et al. 2002. Annu. Rev. Med. 53:629-657.
Rogers JA. et al. 1998. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems.  15:421-80.
Ropiquet F et al. 1997. Int. J. Cancer 72:543-547.
Samaniego F et al. 1998. Am J Patbol. 152:1433-1443.
Sampaio EP et al. 1991. J. Exp. Med. 173:699-703.
Sato N et al. 2002. Jpn. J. Cancer Res. 93:459-466.
Scalapino KJ et al.2003. Clin Exp Med. 2:159-165.
Seghezzi G et al.. 1998. J. Cell Biol. 141:1659-1673.
Sezer O et al. 2001. Eur J Haematol. 66:83-88.
Singhal S et al. 1999. N. Engl. J. Med. 341:1565-1571.
Stephens TD et al. 2000. Biochem. Pharmacol. 59:1489-1499.
Taira MC. et al. 2004. Drug Delivery.  11:123-8.
Tang CH et al. 2007. J. Cell Physiol 211:45-55.
Teo SK et al. 2005. Drug Discovery Today. 10:107-114.
Thanou MM et al. 2000. J Control Release. 64:15-25.
Tiwari SB. et al. 2008. Methods in Molecular Biology.  437:217-43.
Tsunoda S et al. 2007. Cancer Sci. 98:541-548.
Ueno K et al. 2001. Lung Cancer. 31:213219.
Ugurel S et al. 2001. J Clin Oncol. 19:577-583.
Usha S et al. 2005. J. Biochem. Mol. Biol. 38:198-205.
Vacca A et al. 2005. J. Clin. Oncol. 23:5334-5346.
Vagner S et al. 1995. Mol. Cell Biol. 15:35-44.
Vagner S et al. 1996. J Cell Biol. 135:1391-1402.
Venter JC, et al. 2001. Science 291, 1304.
Wang LH. 2004. Mt. Sinai J. Med. 71:361-367.
Wu JJ et al. 2005. British Journal of Dermatology. 153:254273.
Yamanaka Y et al. 1993. Cancer Res. 53:5289-5296.
Zheng AP. et al. 2006. Journal of Nanoscience & Nanotechnology.  6:2936-44.
Zittermann SI et al. 2006. Am. J. Pathol. 168:835-846.
【図１Ａ】
2015028059.tif 000007
【図１Ｂ】
2015028059.tif 000008
【図１Ｃ】
2015028059.tif 000009
【図１Ｄ】
2015028059.tif 000010
【図２Ａ】
2015028059.tif 000011
【図２Ｂ】
2015028059.tif 000012
【図２Ｃ】
2015028059.tif 000013
【図３Ａ】
2015028059.tif 000014
【図３Ｂ】
2015028059.tif 000015
【図３Ｃ】
2015028059.tif 000016
【図３Ｄ】
2015028059.tif 000017
【図３Ｅ】
2015028059.tif 000018
【図４Ａ】
2015028059.tif 000019
【図４Ｂ】
2015028059.tif 000020
【図５Ａ】
2015028059.tif 000021
【図５Ｂ】
2015028059.tif 000022
【図５Ｃ】
2015028059.tif 000023
【図６Ａ】
2015028059.tif 000024
【図６Ｂ】
2015028059.tif 000025
【図６Ｃ】
2015028059.tif 000026
【図７Ａ】
2015028059.tif 000027
【図７Ｂ】
2015028059.tif 000028
【図７Ｃ】
2015028059.tif 000029
【図７Ｄ】
2015028059.tif 000030
【図８Ａ】
2015028059.tif 000031
【図８Ｂ】
2015028059.tif 000032
【図８Ｃ】
2015028059.tif 000033
【図９】
2015028059.tif 000034
【配列表】
2015028059000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月15日(2014.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン細胞の足場非依存性増殖および凝集の阻害を通して、免疫学的疾患、血管形成関連疾患、及び睡眠障害からなる群より選ばれる塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）の過剰発現と関連した疾患を治療するための医薬の製造におけるサリドマイドの使用であって、
bFGFのRNA転写物の発現を、そのG-及び／又はGC-リッチプロモーターを標的することにより下向調節するのに有効な量にてサリドマイドを放出する徐放性医薬組成物として前記サリドマイドを製剤化することを特徴とする、サリドマイドの使用。
【請求項２】
前記免疫学的疾患が、リウマチ性関節炎、骨関節炎、ベーチェット症候群、全身系硬化症、結節性多動脈炎、乾癬、喘息、角膜ケラト結膜炎、及びクローン病からなる群より選ばれる免疫学的疾患であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記血管形成関連疾患が、肺動脈高血圧、リウマチ性関節炎、喘息、乾癬、増殖性糖尿病性網膜症、及び老人性黄斑変性からなる群より選ばれる血管形成関連疾患であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
サリドマイドと、前記サリドマイドの徐放のための薬学的キャリヤーとを含む、ガン細胞の足場非依存性増殖および凝集の阻害を通して、免疫学的疾患、血管形成関連疾患、及び睡眠障害からなる群より選ばれるbFGFの過剰発現と関連した疾患を治療する医薬組成物であって、
bFGFのRNA転写物の発現を、そのG-及び／又はGC-リッチプロモーターを標的することにより下向調節するのに有効な量にてサリドマイドを放出する、医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫学的疾患が、リウマチ性関節炎、骨関節炎、ベーチェット症候群、全身系硬化症、結節性多動脈炎、乾癬、喘息、角膜ケラト結膜炎、及びクローン病からなる群より選ばれる免疫学的疾患であることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記血管形成関連疾患が、肺動脈高血圧、リウマチ性関節炎、喘息、乾癬、増殖性糖尿病性網膜症、及び老人性黄斑変性からなる群より選ばれる血管形成関連疾患であることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2015028059.tif 000035
2015028059.tif 000036
2015028059.tif 000037
2015028059.tif 000038
2015028059.tif 000039
2015028059.tif 000040
2015028059.tif 000041
2015028059.tif 000042
2015028059.tif 000043
2015028059.tif 000044
2015028059.tif 000045
2015028059.tif 000046
2015028059.tif 000047
2015028059.tif 000048
2015028059.tif 000049
2015028059.tif 000050
2015028059.tif 000051
2015028059.tif 000052
2015028059.tif 000053
2015028059.tif 000054
2015028059.tif 000055
2015028059.tif 000056
2015028059.tif 000057
2015028059.tif 000058
2015028059.tif 000059
2015028059.tif 000060
2015028059.tif 000061
2015028059.tif 000062
2015028059.tif 000063
2015028059.tif 000064
2015028059.tif 000065
2015028059.tif 000066
2015028059.tif 000067
2015028059.tif 000068
2015028059.tif 000069
2015028059.tif 000070
2015028059.tif 000071
2015028059.tif 000072
2015028059.tif 000073
2015028059.tif 000074
2015028059.tif 000075
2015028059.tif 000076
2015028059.tif 000077
2015028059.tif 000078
2015028059.tif 000079
2015028059.tif 000080
2015028059.tif 000081
2015028059.tif 000082
2015028059.tif 000083
2015028059.tif 000084
2015028059.tif 000085
2015028059.tif 000086
2015028059.tif 000087