(57)【要約】【課題】主として多能性幹細胞を非凍結状態で安定に輸送するための新規な輸送方法を提供することにある。【解決手段】本発明として、例えば、多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内で輸送することを特徴とする多能性幹細胞の輸送方法を挙げることができる。特にｉＰＳ細胞の輸送に有用である。  また、本発明として、多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内に保ちうる入れ物に収めて保存することを特徴とする多能性幹細胞の保存方法も挙げることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内で輸送することを特徴とする多能性幹細胞の輸送方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、又はエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）である請求項１記載の輸送方法。
【請求項３】
輸送手段が、徒歩（ヒト）、二輪、車両、鉄道、航空機、又は船舶である請求項１又は２記載の輸送方法。
【請求項４】
多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内に保ちうる入れ物に収めて保存することを特徴とする多能性幹細胞の保存方法。
【請求項５】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、又はエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）である請求項４記載の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の輸送方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、体を構成するすべての種類の細胞に分化することができる分化万能性と、その分化万能性を維持したまま増殖することができる自己複製能を併せ持つ細胞である。代表的な多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、及びエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞、Ｅｐｉｂｌａｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を挙げることができる。
ｉＰＳ細胞は、体細胞へ数種類の初期化因子（通常は３、４種の遺伝子）を導入することにより作製される多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、受精卵着床前の胚盤胞の内部細胞塊から作製される多能性幹細胞である。ＥｐｉＳ細胞は、受精卵着床後のエピブラストから作製される多能性幹細胞である。
ｉＰＳ細胞は、再生医療への適用の観点から見たとき、患者本人の体細胞から樹立されうることから、免疫拒絶の可能性が低く、倫理面での問題も少ない。一方、ＥＳ細胞等は、基本的に患者本人以外の他家から樹立されることから、免疫拒絶の問題を惹起し、また受精卵を壊して樹立されることから、倫理的な問題も孕んでいる。
さらに、ヒト多能性幹細胞より分化誘導した心筋や神経などの各種ヒト細胞は、医薬品候補化合物のヒトにおける有効性と安全性を評価・予測するのにも有用である。中でもｉＰＳ細胞は、対象とする疾患患者の皮膚細胞や血液細胞から比較的容易に樹立することができることから、病因の解析とそれに基づく治療薬のスクリーニングに特に有用である。
【０００３】
ところで、多能性幹細胞を別の場所に輸送して、輸送先で実験や検査・診断、治療等に直ちに供したい場合がある。そのため、輸送中は、該細胞が生きた状態ないしできる限り元のままの状態であることが望まれる。
【０００４】
安定した状態で細胞の輸送を図るためには、いくつかの要因を考えなければならない。その一つに温度管理を挙げることができる。そして、最も安定に保ちうると考えられる凍結状態で液体窒素温度下に輸送することが現に行われている。また、その簡便性から液体窒素より少し温度の高いドライアイス保冷下に輸送することも行われている。さらに、非凍結状態で輸送する場合には、細胞をできるだけ低温状態に保つのが一般的である。
しかし、細胞の中には、凍結や低温に弱いものがあり、また凍結状態では輸送先で届いた細胞を速やかに使用することができないといった問題などがある。
【０００５】
上記問題から、常温で輸送する試みや工夫が行われ（特許文献１参照）、そのための装置やシステムも開発されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。
しかしながら、細胞の種類に応じて、安定に生きた状態のまま輸送するのに適した環境温度を選択するための決まった規則があるわけではない。多能性幹細胞においては、それを非凍結状態で輸送するための温度条件が全く明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１９７８６０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】“培養細胞運搬システム  セルポーター”：、[ｏｎｌｉｎｅ]、コアフロント社、[平成２５年７月１９日検索]、インターネット（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｅｆｒｏｎｔ．ｃｏｍ／ｂｉｏ０９．ｈｔｍｌ）
【０００８】
【非特許文献２】“再生医療用細胞の定温輸送サービス”：、[ｏｎｌｉｎｅ]、日立物流社、[平成２５年７月１９日検索]、インターネット（ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｔａｃｈｉ−ｈｂ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ｐａｃｋｉｎｇ＿０１．ｈｔｍｌ）
【０００９】
【非特許文献３】幡多徳彦、外５名、「自家組織培養プロセスにおける細胞および組織輸送デバイス開発」、人工臓器、２０１２年、４１巻、１号、ｐ．５１−５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、主として多能性幹細胞を非凍結状態で安定に輸送するための新規な輸送方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ある一定の比較的狭い温度範囲から外れた環境で多能性幹細胞を輸送すると、意外にも該細胞が死滅してしまうことを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
具体的に、本発明として、多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内で輸送することを特徴とする多能性幹細胞の輸送方法を挙げることができる。
本発明に係る多能性幹細胞は、その性質を有していれば特に制限されない。具体的には、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、又はエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）を挙げることができる。
これら各多能性幹細胞は、ヒト由来であっても、マウスやラット、サル等の動物由来であってもよい。その他、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）状態であっても、プライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）状態であってもよい。また、マウスの線維芽細胞（例、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ））や、ヒト新生児若しくは成人の線維芽細胞をフィーダー細胞として培養作製されたものであっても、フィーダーレス培養により作製されたものであってもよい。
【００１３】
ｉＰＳ細胞については、上記以外に、例えば、次のものも挙げることができる。
（１）健常者由来ｉＰＳ細胞、又は筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、先天的免疫不全症、ゴーシェ病、パーキンソン病、ハンチントン病、若年性糖尿病、若しくは自立神経失調症などの疾患を有する患者由来の疾患特異的ｉＰＳ細胞
（２）皮膚細胞ないし線維芽細胞、骨髄細胞、肝細胞、胃上皮細胞、膵臓細胞、神経幹細胞、リンパ球、毛包細胞（角化細胞）、血液前駆細胞、白血球、口腔内粘膜上皮細胞などから作製されたｉＰＳ細胞
（３）４つの初期化因子（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，及びＭｙｃファミリー（ｃ−Ｍｙｃ，Ｌ−Ｍｙｃ，又はＮ−Ｍｙｃ）の遺伝子又は遺伝子産物やＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，及びＬｉｎ２８の遺伝子又は遺伝子産物）、３つの初期化因子（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，及びＫｌｆ４の遺伝子又は遺伝子産物）、２つ以下の初期化因子と低分子化合物との組合せ（例えば、Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２の２遺伝子又は遺伝子産物＋バルプロ酸ナトリウム）、又は１種以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉｒ−３０２）を用いて作製されたｉＰＳ細胞、さらには前述の初期化因子にＧｌｉｓファミリーのメンバー及びＺｓｃａｎファミリーのメンバーを加えた群から選択される様々な初期化因子の組合せ（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，Ｌ−Ｍｙｃ，Ｌｉｎ２８及びＧｌｉｓ１の遺伝子又は遺伝子産物やＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，Ｚｓｃａｎ４，及びＧｌｉｓ１の遺伝子又は遺伝子産物）を用いて作製されたｉＰＳ細胞
（４）初期化因子を体細胞へ導入するベクターとして、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、センダイウィルスベクター、プラスミドベクター、又はエピソーマルベクターを用いて作製されたｉＰＳ細胞
【００１４】
本発明は、３０℃〜３７℃の温度範囲内で輸送することを特徴とするが、３２℃〜３７℃の温度範囲内での輸送、３５℃〜３７℃の温度範囲内での輸送であってもよい。
【００１５】
輸送手段としては、徒歩（ヒト）、二輪、車両、鉄道、航空機、船舶等を挙げることができるが、特に制限されるものではない。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）を少なくとも２日間、非凍結状態で安定に生きた状態のまま輸送することができる。逆に、本発明によらなければ、多能性幹細胞を２日間、非凍結状態で安定に生きた状態のまま輸送することが困難である。
したがって、本発明によれば、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）を安定に生きたまま、ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅの非凍結状態で輸送することができるので、凍結状態で輸送する従来の方法が抱える欠点、すなわち熟練した解凍技術が要求されることや実験供試までの準備に時間を要すること等の問題を克服することができる。
ここで「安定に生きた状態のまま」とは、輸送後の多能性幹細胞が、通常の知識・技能を有する専門家による顕微鏡下での形態観察により生きていると評価できる状態ないし輸送前と変わらないと評価できる状態（死細胞がほとんど認められない状態）、若しくは輸送前に比し増殖していると認められる状態であることをいう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】顕微鏡写真を表す。上段左の写真はＣＯ２インキュベーター（３７℃）の環境下における結果を、右側の写真は３３℃〜３５℃の温度環境下における結果と２５℃の温度環境下における結果を、それぞれ示す。
【図２】顕微鏡写真を表す。上段左の写真はＣＯ２インキュベーター（３７℃）の環境下における結果を、右側の写真は３３℃〜３５℃の温度環境下における結果と２５℃の温度環境下における結果を、それぞれ示す。
【図３】顕微鏡写真を表す。上段の写真はＣＯ２存在下で３２℃〜３５℃の温度環境下に４８時間放置後の結果とそれを更に６時間培養した後の結果を、下段の写真はＣＯ２不存在下で３２℃〜３５℃の温度環境下に４８時間放置後の結果とそれを更に６時間培養した後の結果を、それぞれ示す。
【図４】顕微鏡写真を表す。上段の写真は３４℃〜３５℃の温度環境下で５０時間放置後の結果とそれを更に１４時間培養した後の結果を、中段の写真は３１℃〜３２℃の温度環境下で５０時間放置後の結果とそれを更に１４時間培養した後の結果を、下段の写真は２５℃の温度環境下で５０時間放置後の結果とそれを更に１４時間培養した後の結果を、それぞれ示す。
【図５】顕微鏡写真を表す。上段の写真はＣＯ２インキュベーター（３７℃）内、ＣＯ２存在下で４８時間放置後の結果とそれを更に１６時間培養した後の結果を、下段の写真はＣＯ２インキュベーター（３７℃）内、ＣＯ２不存在下で４８時間放置後の結果とそれを更に１６時間培養した後の結果を、それぞれ示す。
【図６】顕微鏡写真を表す。上段の写真は温度２５℃、ＣＯ２存在下で４８時間放置後の結果とそれを更に１６時間培養した後の結果を、下段の写真は温度２５℃、ＣＯ２不存在下で４８時間放置後の結果とそれを更に１６時間培養した後の結果を、それぞれ示す。
【図７】顕微鏡写真を表す。左側の写真は３０℃又は２５℃の温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図８】顕微鏡写真を表す。左側の写真は３０℃の温度環境下に放置した後、３日間継代培養した結果を、右側の写真は２５℃の温度環境下に放置した後、３日間継代培養した結果を、それぞれ示す。
【図９】顕微鏡写真を表す。左側の写真は３０℃又は２８℃の各温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図１０】顕微鏡写真を表す。上段の写真は３０℃の温度環境下に放置した後、４日間継代培養した結果を、下段の写真は２８℃の温度環境下に放置した後、４日間継代培養した結果を、それぞれ示す。
【図１１】顕微鏡写真を表す。左側の写真は２５℃又は２８℃の各温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図１２】顕微鏡写真を表す。上段左の写真は通常コロニーを示す。上段右の写真は２５℃の温度環境下に放置した後、３日間継代培養した結果を、下段の写真は２８℃の温度環境下に放置した後、３日間継代培養した結果を、それぞれ示す。
【図１３】顕微鏡写真を表す。左側の写真は２５℃又は２８℃の温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図１４】顕微鏡写真を表す。左側の写真は３０℃又は３７℃の温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図１５】顕微鏡写真を表す。各温度環境下に放置した後、５日間継代培養した結果を、それぞれ示す。
【図１６】顕微鏡写真を表す。左側の写真は２５℃、３０℃又は３３℃の各温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図１７】顕微鏡写真を表す。左側の写真は３５℃又は３７℃の温度環境下に放置する前の状態を、右側の写真は前記各温度環境下に４８時間放置した後の結果を、それぞれ示す。
【図１８】顕微鏡写真を表す。各温度環境下に放置した後、８日間継代培養した結果を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、例えば、適当な培地を有する適当な容器に接着（担持）した又は浮遊した多能性幹細胞を、３０℃〜３７℃の温度範囲内に保つことができる適当な入れ物に収めて輸送することにより実施することができる。
【００１９】
適当な培地としては、多能性幹細胞の培養に用いうるものであれば、特に制限されないが、多能性幹細胞の培養に標準的に用いられるものが適当である。例えば、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル社製）を挙げることができる。また、培養はフィーダー細胞を用いる条件（オンフィーダー培養）で行っても、フィーダー細胞を用いない条件（フィーダーレス培養）で行ってもよい。フィーダーレス培地としては、例えば、ＲｅｐｒｏＸＰ（リプロセル社製）を挙げることができる。
多能性幹細胞の形態は、コロニー（細胞塊）でもよいし、薄い膜状のいわゆる細胞シートに加工したものでもよい。
【００２０】
適当な容器としては、多能性幹細胞の培養に用いうるものであれば、特に制限されない。例えば、シャーレ、プレート、ウェルプレート、フラスコ、チューブ、バッグ、浮遊培養容器を挙げることができる。必要に応じてガス透過性フィルムなどで容器を覆うこともできる。
多能性幹細胞が入った容器は、そのまま３０℃〜３７℃の温度範囲内に保つことができる適当な入れ物に収めることができるが、別の気密容器に、多能性幹細胞が入った容器１〜数個を入れて該入れ物に収めることもできる。かかる気密容器は、５〜１０％の二酸化炭素で満たすこともできる。そのために、例えば、炭酸ガス濃度調整剤を該気密容器に封入することができる。
【００２１】
多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内に保つことができる適当な入れ物としては、例えば、保温箱（保温ボックス）、デバイス、バッグを挙げることができる。３０℃〜３７℃の温度維持は、例えば、電気で稼働する又は独立型の蓄熱剤と（真空）断熱剤とを該入れ物に入れることにより達成することができる。かかる蓄熱剤や断熱剤は、市販のものを用いることができる。また、該入れ物内を３０℃〜３７℃の温度範囲内に保ちうる、適当な温度コントローラーを用いても達成することができる。
【００２２】
前記非特許文献１に係る「セルポーター」（サービス名）や非特許文献２に係る定温輸送サービスを利用しても、本発明を実施することができる。また、３０℃〜３７℃の温度範囲内で多能性幹細胞を輸送することができるサービスであれば、本発明を実施することができる。
【００２３】
本発明によれば、培地の交換が不要な期間、通常は１日〜２日間、多能性幹細胞を安定に生きた状態のまま輸送することができる。培地の交換が可能であれば、２日以上輸送することもできる。
【００２４】
なお、多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内に保ちうる入れ物に収めれば、別の場所に輸送しなくても少なくとも２日間、多能性幹細胞を安定に生きた状態のまま保つことができる。
従って、例えば、多能性幹細胞を３０℃〜３７℃の温度範囲内に保ちうる入れ物に収めて保存することを特徴とする多能性幹細胞の保存方法も本発明として挙げることができる。
かかる本発明（保存方法）における、多能性幹細胞、３０℃〜３７℃の温度範囲、適当な培地、適当な容器、適当な入れ物などの各用語の意義は、上記輸送方法に係る本発明の各用語と同義である。
【実施例】
【００２５】
次に本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
［実施例１：３３℃〜３５℃温度環境下と２５℃温度環境下との異同］
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株（フィーダー細胞（ＳＮＬ細胞）上）、フィーダーレス培養実験を除いて以下同じ）を、温度３３℃〜３５℃、５％ＣＯ２環境の恒温輸送容器（セルポータースタンダードセット、コアフロント社製、以下同じ）内に、仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。また、同様のｉＰＳ細胞を、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内、及び温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内に、それぞれ２日間（４８時間）放置した。ＣＯ２濃度の調整は、ＣＯ２インキュベーターを用いて行う場合を除いて、ＣＯ２発生試薬（カルチャーパルＣＯ２  ０．５Ｌ、三菱ガス化学社製）と０．５Ｌ密封容器を用いることによって行った（以下同じ）。放置後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１Ｎ−２２ＴＦＬ／ＰＨ、オリンパス社製、以下同じ）で観察し、顕微鏡用カメラ（ＤＰ７２−ＳＥＴ−Ａ、オリンパス社製、以下同じ）で撮影した。その結果を図１に示す。
図１の各写真が示す通り、温度３３℃〜３５℃（恒温輸送容器内）、５％ＣＯ２環境下に放置したｉＰＳ細胞と、温度３７℃（ＣＯ２インキュベーター内）、５％ＣＯ２環境下に放置したｉＰＳ細胞は互いに区別の付かない形態を示し、いずれも２日間、安定に生きた状態のまま保持されたことが示された。一方、温度２５℃、５％ＣＯ２環境下に放置したｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ細胞コロニー中の個々の細胞が接着性を失い、モザイク状に細胞が欠失した。
続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の実地を想定し、２日間放置後の各容器の培地を交換し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で６時間、通常の培養を行った。培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図２に示す。
図２の各写真が示す通り、温度３３℃〜３５℃（恒温輸送容器内）、５％ＣＯ２環境下に２日間放置したｉＰＳ細胞と、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内に２日間放置したｉＰＳ細胞は、いずれもその後の培地交換に続く更なる６時間の通常培養の間も安定に生きた状態のまま保持された。一方、温度２５℃、５％ＣＯ２環境下に放置したｉＰＳ細胞は、その後の６時間に及ぶ通常培養の間にｉＰＳ細胞コロニーが崩壊し、残骸を残すのみであった。
【００２７】
［実施例２：５％ＣＯ２の要否］
ｉＰＳ細胞を、温度３２℃〜３５℃、５％ＣＯ２環境の恒温輸送容器内、及び同温度、０％ＣＯ２環境の恒温輸送容器内に、それぞれ仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の実地を想定し、２日間放置後の各容器の培地を交換し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で６時間、通常の培養を行った。放置後と培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図３に示す。
図３の各写真が示す通り、いずれもＣＯ２の有無による顕著な差は見られなかった。即ち、ｉＰＳ細胞は、当該温度範囲内であれば、ＣＯ２の有無に関わらず、いずれも２日間（４８時間）、また更なる６時間の通常培養後においても安定に生きた状態のまま保持された。
【００２８】
［実施例３：温度範囲の検討］
ｉＰＳ細胞を、温度３４℃〜３５℃、５％ＣＯ２環境の恒温輸送容器内、温度３１℃〜３２℃、５％ＣＯ２環境の恒温容器（乾熱滅菌器ＭＯＶ−１１２Ｓ、サンヨー社製）内、及び温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内に、それぞれ仮想輸送期間の２日間（５０時間）放置した。続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の実地を想定し、２日間放置後の各容器の培地を交換し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で１４時間、通常の培養を行った。放置後と培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図４に示す。
図４の各写真が示す通り、３１℃以上の温度環境下ではいずれも特に問題は見られなかった。即ち、ｉＰＳ細胞は、３１℃以上の温度環境下ではいずれも２日間（５０時間）、また更なる１４時間の通常培養後においても安定に生きた状態のまま保持された。一方、２５℃の温度環境下に放置したｉＰＳ細胞は、２日後にはモザイク状に細胞が欠失し、更なる１４時間の通常培養後においてはコロニーが崩壊し、残骸を残すのみであった。
【００２９】
［実施例４：３７℃温度環境下と２５℃温度環境下におけるＣＯ２の影響］
ｉＰＳ細胞を、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内、同温度、０％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内、温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内、及び同温度、０％ＣＯ２環境の室温容器内に、それぞれ仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の実地を想定し、２日間放置後の各容器の培地を交換し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で１６時間、通常の培養を行った。放置後と培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図５及び図６に示す。
図５の各写真が示す通り、３７℃の温度環境下では、ＣＯ２の有無に関わらず、いずれのｉＰＳ細胞も特に問題は見られなかった。即ち、ｉＰＳ細胞は、３７℃の温度環境下では、ＣＯ２の有無に関わらず、いずれも２日間（４８時間）、また更なる１６時間の通常培養後においても安定に生きた状態のまま保持された。一方、２５℃の温度環境下では、図６の各写真が示す通り、ＣＯ２の有無に関わらず、いずれのｉＰＳ細胞も２日後にはモザイク状に細胞が欠失し、更なる１６時間の通常培養後においてはコロニーが崩壊し、残骸を残すのみであった。
【００３０】
［実施例５：温度範囲の検討］
ｉＰＳ細胞を、温度３０℃、５％ＣＯ２環境の恒温容器（ハイブリダイゼーションインキュベーターＨＢ−８０、タイテック社製）内、及び温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内に、それぞれ仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の活用を想定し、各温度で２日間（４８時間）放置後のｉＰＳ細胞を継代培養に付し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。放置後と培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図７に示す。
図７の各写真が示す通り、３０℃の温度環境下では、４８時間の放置前後で特に差は見られなかった。即ち、ｉＰＳ細胞は、３０℃の温度環境下では、２日間（４８時間）、安定に生きた状態のまま保持された。一方、２５℃の温度環境下では、２日間（４８時間）放置後、ｉＰＳ細胞コロニーはモザイク状に細胞が欠失した。
また、２日間（４８時間）放置した後の３日間の継代培養の結果については、３０℃の温度環境下のもので、ｉＰＳ細胞コロニー数は＞２，０００個／６ｃｍ  ｄｉｓｈ、２５℃の温度環境下のもので、２３個／６ｃｍ  ｄｉｓｈであった（図８参照）。
【００３１】
［実施例６：温度範囲の検討］
ｉＰＳ細胞を、温度３０℃、５％ＣＯ２環境の恒温容器（ハイブリダイゼーションインキュベーターＨＢ−８０、タイテック社製）内、及び温度２８℃、５％ＣＯ２環境の恒温容器（ステリサイクルＣＯ２インキュベーター、サーモサイエンティフィック社製）内（ｎ＝２）に、それぞれ仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。放置後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図９に示す。
図９の各写真が示す通り、３０℃の温度環境下では、４８時間の放置前後で特に差は見られなかった。即ち、ｉＰＳ細胞は、３０℃の温度環境下では、２日間（４８時間）、安定に生きた状態のまま保持された。一方、２８℃の温度環境下では、２日間（４８時間）放置後、ｉＰＳ細胞コロニーはモザイク状に細胞が欠失した。
続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の活用を想定し、各温度で２日間（４８時間）放置後のｉＰＳ細胞を継代培養に付し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で４日間培養した。継代培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図１０に示す。
図１０の各写真が示す通り、３０℃の温度環境下では、４８時間放置後の継代培養（４日間）が可能であった。一方、２８℃の温度環境下では、４８時間放置後の継代培養（４日間）も不可能であった。
【００３２】
［参考例１：温度範囲の検討］
ｉＰＳ細胞を、温度２８℃、５％ＣＯ２環境の恒温容器（ステリサイクルＣＯ２インキュベーター、サーモサイエンティフィック社製）内（ｎ＝２）、及び温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内に、それぞれ仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。放置後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図１１に示す。
図１１の各写真が示す通り、いずれの温度環境下でも、２日間（４８時間）放置後、ｉＰＳ細胞コロニーはモザイク状に細胞が欠失した。
念のため、各温度で２日間（４８時間）放置後のｉＰＳ細胞を継代培養に付し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。継代培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図１２に示す。
図１２の各写真が示す通り、いずれの温度環境下でも、継代培養（３日間）で細胞が復活することはなかった。
【００３３】
［実施例７：フィーダーレス培養での検討］
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株（フィーダーレス培地上））を、温度２８℃、３０℃、及び３７℃で、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内に、仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。また、同様のｉＰＳ細胞を、温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内に２日間（４８時間）放置した。放置後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図１３と図１４に示す。
図１３、図１４の各写真が示す通り、温度３０℃以上に放置したｉＰＳ細胞は、温度依存的に増殖し、安定に生きた状態のまま保持された。また、継代時に行う通常の酵素処理が問題なく実施可能であった。温度２８℃では、ｉＰＳ細胞の増殖が殆ど観察されず、また基質との接着も弱くはなったが酵素処理はなお可能であった。２５℃に放置したｉＰＳ細胞では、増殖が見られず一部のコロニーには縮小すら観察された。さらに、温度２５℃では、酵素処理時の洗浄操作で殆どの細胞が脱離するほどに基質との接着が弱くなった。
続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の活用を想定し、各温度で２日間（４８時間）放置後のｉＰＳ細胞を継代培養に付し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で５日間培養した。継代培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を図１５に示す。
図１５の各写真が示す通り、温度３０℃以上に放置したｉＰＳ細胞では、問題なく継代培養が可能であった。温度２８℃に放置したｉＰＳ細胞でも、コロニー数は少ないものの、継代培養は可能であった。温度２５℃に放置した後のｉＰＳ細胞は殆どが死滅し、少数の残存細胞が増えるのみで継代培養不能であった。
【００３４】
［実施例８：フィーダーレス培養での検討］
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株（フィーダーレス培地上））を、温度３０℃、３３℃、３５℃及び３７℃で、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内に、仮想輸送期間の２日間（４８時間）放置した。また、同様のｉＰＳ細胞を、温度２５℃、５％ＣＯ２環境の室温容器内に２日間（４８時間）放置した。放置後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を表１、及び図１６、図１７に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
表１と図１６、図１７の各写真が示す通り、温度３０℃以上に放置したｉＰＳ細胞は、温度依存的に増殖し、安定に生きた状態のまま保持された。また、酵素処理が可能であった。一方、温度２５℃に放置したｉＰＳ細胞では、増殖が見られず一部のコロニーは縮小していた。また、基質との接着が弱くなり、酵素処理時の洗浄操作で殆どの細胞が脱離した。
続いて、ｉＰＳ細胞輸送後の活用を想定し、各温度で２日間（４８時間）放置後のｉＰＳ細胞を継代培養に付し、温度３７℃、５％ＣＯ２環境のＣＯ２インキュベーター内で８日間培養した。継代培養後のそれぞれの形態を倒立型リサーチ顕微鏡で観察し、顕微鏡用カメラで撮影した。その結果を表２及び図１８に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
表２と図１８の各写真が示す通り、温度３０℃以上に放置したｉＰＳ細胞では、問題なく継代培養が可能であった。温度２８℃に放置したｉＰＳ細胞でも、コロニー数は少ないものの、継代培養は可能であった。温度２５℃に放置した後のｉＰＳ細胞は殆どが死滅し、少数の残存細胞が増えるのみで継代培養不能であった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）を安定に生きた状態のまま輸送するのに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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