(57)【要約】      （修正有）【課題】抗酸化活性や抗癌活性等の多様な生理活性をピセアタンノールである、ヒドロキシスチルベンの新規な製造方法の提供。【解決手段】一般式（Ｉ）で示される化合物に、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる方法。2015130819.tif 000032（Ｒ１〜Ｒ３は−Ｈ、−ＯＨ又は−ＯＲ；ＲはＣ１〜６のアルキル基又はグリコシル基から独立に選択される基）【選択図】図１
2015130819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物に、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる、製造方法。
2015130819.tif 000021
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000022
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項２】
一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる、製造方法。
2015130819.tif 000023
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000024
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2015130819.tif 000025
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【請求項３】
Ｒ３は、−Ｈである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＨＰＡＨが、組換えタンパク質または天然タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
基質となる化合物に、精製ＨＰＡＨ組換えタンパク質、精製ＨＰＡＨ天然タンパク質、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌の抽出物、または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物の抽出物を作用させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
基質となる化合物に、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物を作用させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記内在性ＨＰＡＨを発現する細菌がPseudomonas aeruginosaである、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
前記化合物を界面活性剤の存在下で内在性ＨＰＡＨを発現する細菌または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物を作用させる、請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１１】
一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素活性の測定方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含み、
前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢまたはＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質を有する、測定方法。
2015130819.tif 000026
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000027
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項１２】
一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素のスクリーニング方法であって、
複数の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程と、
一般式（ＩＩ）で示される化合物が検出されたＨＰＡＨ類似体を選択する工程を含み、
前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢまたはＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質である、スクリーニング方法。
2015130819.tif 000028
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000029
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【請求項１３】
一般式（Ｉ）で示される化合物またはその配糖体を基質として、一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素活性の測定方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を前記一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、前記一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含む、測定方法。
2015130819.tif 000030
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000031
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシスチルベン製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レスベラトロールの３’位が水酸化された構造を有するピセアタンノール（3’,4’,3,5-テトラヒドロキシ-trans-スチルベンまたは3,3’,4’,5-テトラヒドロキシ-trans-スチルベン）は、抗酸化活性や抗癌活性等の多様な生理活性を示すことが明らかにされつつある注目すべき化合物である（非特許文献１参照）。このようなピセアタンノールの多様な生理活性に着目し、本化合物を含有するパッションフルーツ種子からの抽出物について、健康、医療への応用を目的として種々の研究開発が進められている（特許文献１〜３参照）。
【０００３】
しかし、ピセアタンノールはパッションフルーツやブドウ等の植物に含まれているものの、含量が少ないために、植物からの抽出は効率的な製造法とは言い難い（特許文献４参照）。また、有機合成法によっても得られるが多数の複雑な反応ステップを要する。
【０００４】
最近、大腸菌由来の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ；ＥＣ  １．１４．１３．３）（別名：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−モノオキシゲナーゼ、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ、４−ＨＰＡ  ３−ヒドロキシラーゼ）がレスベラトロールからピセアタンノールへ変換できることが開示された（非特許文献２参照）が、その収率はいまだに問題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０３０９１１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１５１４５７号公報
【特許文献３】特開２０１３−１５１４５８号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１０−１１３３１５国際公開公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mutat Res-Fund Mol M vol.750, p.60-82 (2012).
【非特許文献２】Curr Opin Biotech vol.26 p.71-78 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒドロキシスチルベンの新規な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ；ＥＣ  １．１４．１３．３）（別名：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−モノオキシゲナーゼ、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸ヒドロキシラーゼ、４−ＨＰＡ  ３−ヒドロキシラーゼ）は、二成分型ＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼの一種であり、フラビンを補酵素として、モノフェノール化合物から、オルソ−ジフェノール化合物を合成することが知られている。
【０００９】
本発明者らは、ピセアタンノールの効率的な製造方法を探索する中で、ＨＰＡＨが効率よくレスベラトロールをピセアタンノールに変換することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明の一実施態様は、一般式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物に、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を作用させる、製造方法である。
【００１１】
2015130819.tif 000003
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
本発明のさらなる実施態様は、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物の製造方法であって、一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又は一般式（ＩＩ）で示される化合物に、ＨＰＡＨを作用させる、製造方法である。
【００１２】
2015130819.tif 000005
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000006
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
2015130819.tif 000007
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
上記いずれの製造方法においても、一般式（ＩＩ）で示される化合物がピセアタンノールであってもよい。前記ＨＰＡＨが、組換えタンパク質または天然タンパク質であってもよい。
【００１３】
また、上記いずれの製造方法においても、基質となる化合物に、精製ＨＰＡＨ組換えタンパク質、精製ＨＰＡＨ天然タンパク質、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌またはその抽出物、または外来性ＨＰＡＨを発現する微生物またはその抽出物を作用させてもよい。この内在性ＨＰＡＨを発現する細菌がPseudomonas aeruginosaであってもよい。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素活性の測定方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程を含み、前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢまたはＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質を有する、測定方法である。
【００１５】
2015130819.tif 000008
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
本発明のさらなる実施態様は、一般式（Ｉ）で示される化合物を一般式（ＩＩ）で示される化合物に変換する酵素のスクリーニング方法であって、複数の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を一般式（Ｉ）で示される化合物に作用させ、一般式（ＩＩ）で示される化合物を検出する工程と、一般式（ＩＩ）で示される化合物が検出されたＨＰＡＨ類似体を選択する工程を含み、前記類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢまたはＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上の相同性を有するタンパク質である、スクリーニング方法である。
【００１６】
2015130819.tif 000010
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
本発明のさらなる実施態様は、ヒドロキシフェニル化合物を基質として、ジヒドロキシフェニル化合物に変換する酵素活性の測定方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を前記ヒドロキシフェニル化合物に作用させ、前記ジヒドロキシフェニル化合物を検出する工程を含み、前記ヒドロキシフェニル化合物は、一般式（Ｉ）で示される化合物である、測定方法である。
【００１７】
2015130819.tif 000012
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
本発明のさらなる実施態様は、ヒドロキシフェニル化合物を基質として、ジヒドロキシフェニル化合物に変換する、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）の基質のスクリーニング方法であって、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）を前記ヒドロキシフェニル化合物に作用させ、前記ジヒドロキシフェニル化合物を検出する工程と、前記ジヒドロキシフェニル化合物が検出されたＨＰＡＨの基質を選択する工程を含み、前記ヒドロキシフェニル化合物は、一般式（Ｉ）で示される化合物である、スクリーニング方法である。
【００１８】
2015130819.tif 000013
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、ヒドロキシスチルベンの新規な製造方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＨＰＡＨによる化合物の変換メカニズム（Ａ）及び菌体反応系での変換メカニズム（Ｂ）を模式的に記載した図である。
【図２】Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のHpaBCのアミノ酸配列を示した図である。
【図３】本発明の一実施例における、HpaBC発現組換え大腸菌によるレスベラトロール変換のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例における、HpaBC発現組換え大腸菌による、フラスコスケールでのピセアタンノール合成の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２３】
＝＝化合物の変換方法＝＝
本発明の一実施態様によると、一般式（Ｉ）で示される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記す）に、酵素ＨＰＡＨを作用させて、一般式（ＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩ）と記す）を合成することができる。また、この反応により、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換するＨＰＡＨ酵素活性を測定することができる。
【００２４】
2015130819.tif 000014
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
2015130819.tif 000015
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であり、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
ここで、Ｒ３が−Ｈであることが好ましい。さらに、Ｒ１とＲ２が両方とも−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基であることが好ましい。なお、Ｒ１とＲ２が両方とも−ＯＨであることが最も好ましく、この場合、化合物（Ｉ）がレスベラトロールであって、化合物（ＩＩ）がピセアンタノールとなる。その変換における酵素の変換活性のメカニズムを図１に示す。
【００２５】
2015130819.tif 000016
2015130819.tif 000017
（式中、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである。）
さらに、長時間作用させることによって、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）から、一般式（ＩＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と記す）を合成することができる。
【００２６】
2015130819.tif 000018
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＲであって、ＲはＣ１〜６のアルキル基またはグリコシル基から独立に選択される基である。）
ここで作用させる二成分型フラビン依存性酸化酵素ＨＰＡＨは、モノキシゲナーゼのサブユニットであるＨｐａＢと、オキシドリダクターゼのサブユニットであるＨｐａＣとから成る。ＨｐａＢ及びＨｐａＣの由来は特に限定されず、Pseudomonas、Escherichia、Enterobacter、Krebsiella、Salmonella、Serratia、Shigella、Yersinia、Rhizobium、Bradyrhizobium、Mesorhizobium、Sinorhizobium、Bacillus、Geobacillus、Saccharothrix、Streptomyces、Rhodococcus、Gordonia、Mycobacterium、Thermus、Acinetbacter、Halomonas、Micrococcusなどの属に分類される細菌が例示できるが、Pseudomonas putida、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas ovalisなどの緑膿菌が好ましく、特にPseudomonas aeruginosaまたはEscherichia coliが好ましい。Pseudomonas aeruginosaの場合、PAO1株であることがより好ましく、Escherichia coliの場合、W株およびB株系列であることが好ましい。本明細書では、酵素を生物種で特定しない限り、ＨｐａＢ及びＨｐａＣは、相互作用して二成分型フラビン依存性酸化酵素として機能することができる全てのホモログまたは変異体を含むものとし、そのホモログまたは変異体は、天然の配列を有していても人工の配列を有していてもかまわない。また、ＨｐａＢ及びＨｐａＣは、同じ生物種由来であっても、異なる生物種由来であってもかまわないし、少なくとも一方が、人工の配列を有していてもかまわない。ここで、ホモログまたは変異体は、Pseudomonas aeruginosaのＨｐａＢまたはＨｐａＣに対し、７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、８０％以上の相同性を有するものが好ましく、９０％以上の相同性を有するものがより好ましく、９５％以上の相同性を有するものがさらに好ましい。なお、相同性の測定方法は特に限定されず、BLAST、FASTA、PSI-BLASTなどが例示できる。
【００２７】
ＨｐａＢ及びＨｐａＣの形態は、特に限定されず、それぞれ独立に、組換えタンパク質であっても天然タンパク質であってもよい。
【００２８】
ＨＰＡＨが組換えタンパク質の場合、一例として、ＨＰＡＨを構成するＨｐａＢをコードするｈｐａＢ遺伝子とＨｐａＣをコードするｈｐａＣ遺伝子の両方を同じ宿主微生物内に導入して発現させると、組換え微生物内でＨＰＡＨが再構成される。化合物（Ｉ）は細胞膜を透過するので、組換え微生物を培養した培地に化合物（Ｉ）を添加すると、細胞内で化合物（ＩＩ）及び／又は化合物（ＩＩＩ）が合成される。従って、化合物の変換に組換え微生物をそのまま用いてもよい。ここで、宿主微生物は、細菌、酵母などが例示され、特に限定されないが、大腸菌であることが好ましい。酵素が天然タンパク質の場合、上述したような組換え微生物を用いる代わりに、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌を用いればよい。このような菌体反応系における酵素の変換活性のメカニズムを図１（Ｂ）に示す。
【００２９】
化合物の変換に微生物を用いる場合、培地に界面活性剤を添加することで、化合物の変換効率が上昇する。用いる界面活性剤の種類は特に限定されず、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ８０などを例示できる。界面活性剤の濃度も特に限定されず、当業者が適切な濃度を容易に選択できるが、約０．１％以上約１０％以下が好ましく、約０．５％以上約２％以下がより好ましく、約１％が最も好ましい。
【００３０】
また、化合物の変換に、微生物を用いる代わりに、内在性ＨＰＡＨを発現する細菌や組換え微生物の抽出物、あるいは内在性ＨＰＡＨを発現する細菌や組換え微生物から精製したＨＰＡＨを用いてもよい。精製工程は特に限定されず、粗精製でも高純度精製でもかまわない。抽出物や精製ＨＰＡＨを用いた場合、ＦＡＤ、ＮＡＤなどを添加した再構成系（Biochemistry vol.49, p.372-385 (2010)など）を作ることによって、in vitroでも化合物を変換することができる。
【００３１】
＝＝化合物変換活性の測定方法＝＝
本発明の一実施形態において、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する酵素活性は、４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を化合物（Ｉ）に作用させ、化合物（ＩＩ）を検出することによって、測定できる。ここで、ＨＰＡＨ類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢ（配列番号１）またはＨｐａＣ（配列番号２）のホモログであって、アミノ酸レベルで５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または８０％以上、または９０％以上の相同性を有するタンパク質を有する。これによって、ＨＰＡＨ類似体が、化合物変換活性を有するかどうか、判別できる。なお、相同性の測定方法は特に限定されず、BLAST、FASTA、PSI-BLASTなどが例示できる。
【００３２】
＝＝化合物変換活性を有する酵素のスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施形態において、複数の４−ヒドロキシフェニル酢酸  ３−ヒドロキシラーゼ（ＨＰＡＨ）類似体を化合物（Ｉ）に作用させ化合物（ＩＩ）を検出し、検出可能であったＨＰＡＨ類似体を選択することによって、化合物（Ｉ）を化合物（ＩＩ）に変換する酵素のスクリーニングを行うことができる。ここで、ＨＰＡＨ類似体は、Pseudomonas aeruginosa PAO1株由来のＨｐａＢまたはＨｐａＣと、アミノ酸レベルで５０％以上、または６０％以上、または７０％以上、または８０％以上、または９０％以上の相同性を有するタンパク質を有する。これによって、ＨＰＡＨ類似体が、化合物変換活性を有するかどうか、判別できる。なお、相同性の測定方法は特に限定されず、BLAST、FASTA、PSI-BLASTなどが例示できる。
【実施例】
【００３３】
（１）二成分型フラビン依存性酸化酵素HpaBCを発現する組換え大腸菌の作製
まず、二成分型フラビン依存性酸化酵素HpaBC（図２にアミノ酸配列を示す）をコードする遺伝子をpETDuet-1ベクター（Novagen社製）に挿入して、Escherichia coli BL21 Star (DE3)株（Invitrogen社製）に導入した。
【００３４】
具体的には、モノオキシゲナーゼコンポーネントをコードするhpaB遺伝子（ORF no. PA4091）とオキシドレダクターゼコンポーネントをコードするhpaC遺伝子（ORF no. PA4092）を、Pseudomonas aeruginosa PAO1株のゲノム（ATCC 47085D-5、GenBank Accession no. NC_002516）を鋳型としてPCRにより増幅した。hpaB遺伝子の増幅に使用したセンスプライマー（hpaB-s）およびアンチセンスプライマー（hpaB-as）、hpaC遺伝子の増幅に使用したセンスプライマー（hpaC-s）およびアンチセンスプライマー（hpaC-as）を以下に示す。
【００３５】
hpaB-s: TTCTCATGAAACCCGAAGATTTCCGTGCCT  （配列番号３）
hpaB-as: CGCGGATCCTCATTGGCGGATGCGATCGAG  （配列番号４）
hpaC-s: TTCCATATGTCCCAGCTCGAACCCAGGCAG  （配列番号５）
hpaC-as: TTCGGTACCTCAGGCCGCCCGCCGGGGGCA  （配列番号６）
PCRにより増幅後、hpaB遺伝子に関しては両端を制限酵素BspHIおよびBamHIで、hpaC遺伝子に関してはNdeIおよびKpnIで消化し、pETDuet-1のマルチクローニングサイト1、2にそれぞれ挿入した。そして、構築したプラスミド（pETDhpaBC）をエレクトロポレーション法によりE. coli BL21 Star (DE3)株に導入した。
【００３６】
（２）HpaBC発現組換え大腸菌によるレスベラトロール変換産物の同定
作製した組換え大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、イーストエクストラクト０．５％、ＮａＣｌ１％、ｐＨ７．０）に植菌し、２５℃で培養した。１２時間後にイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド１ｍＭを添加して、さらに１２時間培養し、hpaBC遺伝子の発現を誘導した。集菌後、グリセロール１０％（ｖ／ｖ）含有リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）で洗菌し、同緩衝液に懸濁してレスベラトロールとの反応に用いた。具体的には、HpaBC発現組換え大腸菌の菌体８ｇ／ｌ（乾燥重量換算）、レスベラトロール１０ｍＭ、ジメチルスルホキシド４％（ｖ／ｖ）、グリセロール１０％（ｖ／ｖ）、リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）を組成とする反応液１００μｌを調製後、３０℃で２４時間振とうした。
【００３７】
反応後、５Ｎ  ＨＣｌ１０μｌ、Ｈ２Ｏ４００μｌ、メタノール５００μｌを添加し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析はアジレント社製の装置（１１００シリーズ）とウォーターズ社製のカラム（ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８  ＩＳ、カラム長４．６x２０ｍｍ、粒子径３．５μｍ）を用いて行なった。展開溶媒はアセトニトリル／メタノール／リン酸カリウム緩衝液１０ｍＭ（ｐＨ２．７）＝２．５／２．５／９５（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎで０分から３分までＢ液０％で流した後、３分から１２分にかけてＢ液を直線勾配により７０％まで上昇させてサンプルを溶出させた。
【００３８】
その結果、レスベラトロールのピーク（６．３分）に加えて新規ピーク（５．９分）が検出された（図３）。本ピークの保持時間は標品のピセアタンノールと一致し、ＰＤＡスペクトルも一致した。
【００３９】
さらに、ＮＭＲ分析とＬＣ-ＭＳ分析を行ったところ、新規ピークに相当する化合物のＮＭＲスペクトルおよび質量数はピセアタンノールと一致した。これより、レスベラトロール変換産物はピセアタンノールと同定された。ＮＭＲ分析とＬＣ-ＭＳ分析の結果を以下に示す。
【００４０】
1H NMR (600 MHz, [D6]DMSO): δ=6.13 (dd, J=1.8, 1.8 Hz, 1H), 6.39 (d, J=1.8 Hz, 2H), 6.73 (d, J=17.6 Hz, 1H), 6.73 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.84 (dd, J=7.8, 1.8 Hz, 1H), 6.86 (d, J=17.6 Hz, 1H), 6.98 (d, J=1.8 Hz, 1H); 13C NMR (600 MHz, [D6]DMSO): δ=102.2, 104.8, 113,7, 116,2, 119.0, 126.0, 128.7, 129.1, 139.7, 145.8, 145.9, 158.9; MS (ESI) (m/z): calculated for C14H11O4 [M-H]-, 243.1; found, 243.2.
このように、レスベラトロールに、HpaBC発現組換え大腸菌を作用させることにより、ピセアタンノールに変換することができる。
【００４１】
また、長時間反応後には、ＨＰＬＣ分析においてピセアタンノールのピークに加えて新規ピーク（５．４分）が検出された。ＬＣ-ＭＳ分析を行ったところ、本ピークに相当する化合物の［Ｍ-Ｈ］-は２５９．２であり、レスベラトロールに酸素が２つ結合した化合物と同定され、ピセアタンノールから以下の化合物に変換されたことを示した。
【００４２】
2015130819.tif 000019
（３）レスベラトロール変換反応条件の検討
基質濃度、菌体濃度、界面活性剤濃度のレスベラトロール変換活性に対する影響について検討した（表１）。まず、（２）と同じ条件で、１０ｍＭの基質に、乾燥重量換算で８ｇ／ｌの菌体を作用させたところ、２４時間で４．３ｍＭのピセアタンノールが生成した（Entry 1）。基質濃度と菌体濃度を検討したところ（Entry 2〜5）、ピセアタンノールの生成量は８．８ｍＭにまで向上した（Entry 5）。さらに、反応液中に界面活性剤を添加したところ（Entry 6〜9）、１％（ｖ／ｖ）の濃度で生産量が飛躍的に向上した。とくに１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０存在下では、３０ｍＭのレスベラトロールからモル変換収率８３％で２５ｍＭ（６．１ｇ／ｌ）のピセアタンノールが生成した（Entry 7）。これは、大腸菌由来のＨｐａＢＣを用いた場合の６倍以上の収量である (Curr Opin Biotech vol.26 p.71-78 (2014))。
【００４３】
2015130819.tif 000020
（４）フラスコスケールでのピセアタンノール合成
（３）で得られた最適反応条件で、フラスコスケールでのピセアタンノール合成を行った。具体的には、ＨｐａＢＣ発現組換え大腸菌の菌体３２ｇ／ｌ（乾燥重量換算）、レスベラトロール３０ｍＭ、ジメチルスルホキシド４％（ｖ／ｖ）、グリセロール１０％（ｖ／ｖ）、リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ７．５）を組成とする反応液２０ｍｌを調製後、３０℃で振とうした。その結果、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を添加しない条件下では１２時間で１３ｍＭ（２．９ｇ／ｌ）のピセアタンノールが生成したのに対して、１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０存在下では２３ｍＭ（５．２ｇ／ｌ）のピセアタンノールが生成した（図４）。このように、フラスコスケールでも効率的にピセアタンノールを合成可能であった。
【図２】
2015130819.tif 000033
【図３】
2015130819.tif 000034
【図４】
2015130819.tif 000035
【図１】
2015130819.tif 000036
【配列表】
2015130819000001.app