(57)【要約】【課題】経口免疫寛容増強物質の新たなスクリーニング方法及び経口免疫寛容増強物質を含む組成物の提供を課題とする。【解決手段】経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法であって、免疫抑制に関わるＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を誘導する被験物質を経口免疫寛容増強物質と評価する工程を含むスクリーニング方法、及び乳酸菌による豆乳発酵物中の成分を有効成分として含む経口免疫寛容増強組成物を提供する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法であって、免疫抑制に関わるＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を誘導する被験物質を経口免疫寛容増強物質と評価する工程を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記評価工程の前に、乳酸菌体、菌体成分又は乳酸菌による豆乳発酵物を被験物質として選定する工程を含む、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記乳酸菌がペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌である、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記評価工程の前に、マウス由来脾臓細胞又はＮａｉｖｅＴ細胞と前記被験物質とを接触させ、当該細胞におけるＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞への分化促進活性を測定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
乳酸菌体、菌体成分又は乳酸菌による豆乳発酵物中の成分を有効成分として含む、経口免疫寛容増強組成物。
【請求項６】
前記乳酸菌がペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌である、請求項５に記載の経口免疫寛容増強組成物。
【請求項７】
前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス又はペディオコッカス・ペントサセウスである、請求項６に記載の経口免疫寛容増強組成物。
【請求項８】
前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株である、請求項７に記載の経口免疫寛容増強組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口免疫寛容を増強する物質・乳酸菌のスクリーニング方法とその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーとは、「食物によって引き起こされる抗原特異的な免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状が惹起される現象」をいう（例えば、非特許文献１参照）。
食物中のタンパク質が十分に消化されタンパク質が分解されてしまえば、吸収されても免疫反応は起こらない。消化酵素の働きによるタンパク質の分解、粘膜面の粘液による物理的なバリア、タンパク質と結合するＩｇＡ抗体の分泌など、経口的に摂取された食物を体内に吸収する過程で、腸管においては様々なバリアが存在する。腸管においてはこれらのバリアにより未消化な食物の体内への侵入を防いでいるものの、実際には未消化なタンパク質も日常的に吸収されている。
【０００３】
しかし、そのような外来のタンパク質に対して免疫反応が起こらない仕組みである経口免疫寛容が働くことで、食物アレルギーが起こらないように制御されている（例えば、非特許文献２参照）。つまり、食物アレルギーとは特定の食物に対する免疫寛容がうまく働かなくなっている状態と考えられる。
【０００４】
現在、特定の食物アレルゲン除去による食物アレルギー発症の防止が行われているものの、その原因アレルゲンに対する経口免疫寛容が生体に誘導されない限り、根本的な治療にはならない。加えて、重症患者は食器などに付着した微量なアレルゲンに対してアナフィラキシーショックを起こすこともあり、除去食には限界がある。
現在は、病院で経口負荷試験により決定した範囲内で原因アレルゲンを摂取する、「正しい診断に基づいた必要最低限の原因食物の除去」が指導されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
しかし、この方法についても除去食同様、食物アレルギーの根本的な治療とはならない。根本的な治療を目指す治療法として、原因アレルゲンを含む食品を少量ずつ摂取することで原因アレルゲンに対する耐性の獲得を誘導する経口免疫療法が臨床研究されている。治療経過中にアナフィラキシーショックを起こすことも多く、かつ、重篤な副反応も起こりうるため現段階では、本治療法は、一般診療として推奨されていない（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
そこで、経口免疫寛容を効率的に誘導することが可能となれば、食物アレルギーの根本的な治療を安全に行え、さらには、まだ食物アレルギーを発症していない人々にとっても食物アレルギーの発症を未然に防ぐことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「食物アレルギーの診療の手引き２０１１」２０１１年、ｐ２
【非特許文献２】「食物アレルギー診療ガイドライン２０１２」２０１２年、ｐ２０−２５
【非特許文献３】「食物アレルギーの栄養指導の手引き２０１１」２０１１年、ｐ４
【非特許文献４】「食物アレルギー診療ガイドライン２０１２」２０１２年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、経口免疫寛容増強物質の新たなスクリーニング方法及び経口免疫寛容増強物質を含む組成物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、異なるメカニズムにより経口免疫寛容を増強する二つの因子を誘導することで経口免疫寛容を増強する組成物を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法であって、免疫抑制に関わるＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を誘導する被験物質を経口免疫寛容増強物質と評価する工程を含む、スクリーニング方法。
（２）前記評価工程の前に、乳酸菌体、菌体成分又は乳酸菌による豆乳発酵物を被験物質として選定する工程を含む、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）前記乳酸菌がペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌である、上記（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）前記評価工程の前に、マウス由来脾臓細胞又はＮａｉｖｅＴ細胞と前記被験物質とを接触させ、当該細胞におけるＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び／又はＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞への分化促進活性を測定する工程を含む、上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
（５）乳酸菌体、菌体成分又は乳酸菌による豆乳発酵物中の成分を有効成分として含む、経口免疫寛容増強組成物。
（６）前記乳酸菌がペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌である、上記（５）に記載の経口免疫寛容増強組成物。
（７）前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス又はペディオコッカス・ペントサセウスである、上記（６）に記載の経口免疫寛容増強組成物。
（８）前記乳酸菌がラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株である、上記（７）に記載の経口免疫寛容増強組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法によれば、ＮａｉｖｅＴ細胞のＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞への分化促進作用の有無を指標として候補物質が選定されるため、候補物質をヒトや動物に直接投与することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで簡便にスクリーニングすることが可能になる。得られた経口免疫寛容増強組成物は、抗ＩＶ型アレルギー剤、食物アレルギーの治療剤、経口免疫療法の治療補助剤、又は食物アレルギーの予防剤として好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各乳酸菌体とマウス由来脾臓細胞を共培養した際の、各種乳酸菌のＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞誘導試験の結果を示す図である。
【図２】フラボノイド系化合物とＮａｉｖｅＴ細胞を共培養した際のＴｒｅｇ分化誘導の結果を示す図である。
【図３】リン酸バッファー（コントロール）、若しくはラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株を用いて作製した豆乳発酵物の上清（ホエー）とＮａｉｖｅＴ細胞を共培養した際のＴｒｅｇ分化誘導の結果を示す図である。
【図４】生理食塩水、豆乳、又はラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株を用いて作製した豆乳発酵物を投与した際の、小腸粘膜固有層中におけるＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞分化誘導の結果を示す図である。
【図５】ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株で発酵した豆乳発酵物の経口免疫寛容増強効果を調べたときの遅延型過敏反応の結果を示す図である。
【図６】ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株で発酵した豆乳発酵物の経口免疫寛容増強効果を調べたときのＯＶＡ特異的抗体価の結果を示す図である。
【図７】食物アレルギーモデルでＫ４７８豆乳発酵物の経口免疫寛容増強効果を調べた際の下痢の発症率を示す図である。
【図８】食物アレルギーモデルでＫ４７８豆乳発酵物の経口免疫寛容増強効果を調べた際の小腸粘膜固有層中のマスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを調べた結果を示す図である。
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）経口免疫寛容増強物質のスクリーニング方法
経口免疫寛容の誘導メカニズムや、どのような成分が経口免疫寛容を誘導するかは、未解明な部分が多い。経口免疫寛容に影響する因子として、Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が知られている。Ｔｒｅｇは、抗原特異的に他のＴ細胞の働きを抑制する。ヒト腸内においては常在細菌がＴｒｅｇを誘導し免疫恒常性を保っている。また、抑制性サイトカイン産生能を持つＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞も免疫抑制に関わっていることが知られている。
本発明のスクリーニング方法においては、経口免疫寛容増強作用を決定する指標の一つとして、候補物質がＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の分化促進作用を有するか否かについて、その両者の協調について評価される。
ここで、「経口免疫寛容」とは、本明細書で使用する場合、経口的に摂取された抗原に対し免疫応答が抑制される状態（すなわち免疫寛容状態）が誘導されることを意味する。免疫寛容状態は、当業者にとって公知の方法、例えば、免疫寛容において重要な役割を果たすＴ細胞の反応性等の測定により評価することができる。
【００１４】
経口免疫寛容増強効果は、免疫したマウスに対して抗原を足蹠に投与した際の足の腫れを測定することにより、又は経口摂取させた際の下痢症状を観察することにより評価する。
「経口免疫寛容増強」とは、足の腫れ又は下痢を発症したマウス数が対象物質との比較で被験物質より有意に、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、若しくは５０％以上抑制又は減少されていることを意味する。
経口免疫寛容増強作用について評価される被験物質は、特定の化学物質又はその混合物に限定されず、細菌、例えば、乳酸菌の培養物、菌体又は菌体成分であってもよい。食品への応用性、安全性の観点から、被験物質としての細菌は乳酸菌であることが好ましく、特にペディオコッカス属（例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシ、ペディオコッカス・ペントサセウス）、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌であることがより好ましい。
【００１５】
選定された被験物質は、ＮａｉｖｅＴ細胞と接触してＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の分化促進活性が測定される。被験物質のＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞の分化促進活性は常用の方法により評価することができる。限定することを意図するものではないが、マウス由来脾臓細胞や脾臓細胞より単離したＮａｉｖｅＴ細胞と被験物質とを共培養し、その後細胞内又は細胞外標識によってＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを測定してもよい。
【００１６】
各細胞群のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎは、ＮａｉｖｅＴ細胞を対象物質又は被験物質存在下で培養し、分化誘導されたＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）やＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより検出することにより測定する。各細胞群のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが対照物質との比較で有意に、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、又は５０％以上増大する場合、被験物質を経口免疫寛容増強物質と評価することができる。
Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞への分化は、当業者にとって公知の方法、例えば、抗ＩＬ−１０抗体による抗原抗体反応を利用する方法（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等）を介して測定してもよい。
【００１７】
（２）経口免疫寛容増強組成物
ＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞分化促進組成物は、上記スクリーニング方法により得られたＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞分化促進組成物、例えば、乳酸菌体、菌体成分又は乳酸菌を用いた豆乳発酵物中の成分を有効成分とする。乳酸菌とは、例えば、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属の乳酸菌である。ラクトコッカス属の乳酸菌が好ましく、ラクトコッカス・ラクティスがより好ましく、例えば、ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株（ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株は、Ｋ４７８として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１４年１月９日に受領され、受領番号ＮＩＴＥ−ＡＰ０１７８６が付与されている。）が挙げられる。
Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）分化促進組成物は、例えば、フラボノイドを有効成分とすることができる。フラボノイドとは、例えば、豆乳中に豊富に含まれるイソフラボン、好ましくは豆乳中に豊富に含まれるゲニステイン又はゲニスチンを挙げることができる。
【００１８】
本発明の経口免疫寛容増強組成物は、上記スクリーニング方法により得られたＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞分化促進組成物とＦｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）分化促進組成物とを組み合わせた経口免疫寛容増強物質であり、例えば、乳酸菌とイソフラボンの組み合わせ、乳酸菌と豆乳の組み合わせ、又は乳酸菌を用いて豆乳を発酵させた豆乳発酵物を経口免疫寛容増強組成物とすることができる。
経口免疫寛容増強作用を示す限り、有効成分である乳酸菌体、菌体成分又は乳酸菌を用いた豆乳発酵物中の成分は、どのような方法で調製されたものでもよい。
【００１９】
食物アレルギーの発症予防、若しくは経口免疫療法の治療補助を目的として本発明の経口免疫寛容増強組成物を摂取する場合、その摂取量は、摂取者の症状や体格に合わせて適宜設定すればよい。ラクトコッカス属に属する乳酸菌の菌体を有効成分とする場合、その菌体摂取量は、例えば、１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。ゲニステインを有効成分とする場合、その摂取量は、例えば、１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。
【００２０】
有効成分である乳酸菌の菌体又は菌体成分、豆乳発酵物中の成分は単独で使用してもよいし、他の成分と組み合わせて、例えば、飲食品、医薬品に添加して使用することもできる。
【００２１】
（３）経口免疫寛容増強組成物の製造法
本発明の経口免疫寛容増強組成物は、乳酸菌を用いて豆乳を発酵し、発酵物を採取することにより得られる。有効成分である経口免疫寛容増強活性を示す成分が得られる限り、発酵条件や、有効成分である培養物、菌体又は菌体成分の採取方法は特に限定されない。
【００２２】
以下に、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を有効成分とする経口免疫寛容増強組成物の製造法を例示する。
【００２３】
まず、例えば、無調整豆乳にラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株を植菌し、２５〜３７℃で７２時間培養することで、豆乳発酵物が得られる。豆乳発酵物は、培養後に１〜６０分程度、好ましくは１０分程度の煮沸処理を行ってもよい。
【００２４】
上記のようにして得られた豆乳発酵物は、本発明の経口免疫寛容増強組成物として使用可能である。
【実施例１】
【００２５】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
〔マウス脾臓由来免疫細胞を用いた各種乳酸菌のＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞誘導促進試験〕
抑制性サイトカイン産生能を持つＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞も免疫抑制に関わっていることが知られており、経口免疫寛容の作用メカニズムにも本細胞群が関わっていると考えられる。そこで、以下に示す乳酸菌を用いて、ＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞誘導促進試験を実施した。
ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｋ１０９０株、Ｋ１１７４株、Ｋ１９株）、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｋ５９株、Ｋ３３５株、Ｋ１３３株）、ラクトコッカス・ラクティス(Ｋ４７８株、Ｋ５５０株、Ｋ４２２株)、ラクトコッカス・ブレビス（Ｋ２７株、Ｋ１９５株、Ｋ１０２２株）、ペディオコッカス・エタノリデュランス（Ｋ３０３株、Ｋ１２５株、Ｋ１１６株）。
【００２７】
１．乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌を１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で２４〜４８時間静置培養した後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。非加熱処理菌体に関しては生理食塩水にて菌体を洗浄後、凍結乾燥を行った。加熱処理菌体サンプルに関しては９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行い、凍結乾燥を行った。
【００２８】
２．ＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞誘導促進試験
（１）脾臓由来細胞懸濁液の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８−１２週齢、雌、日本クレア社生産）をイソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して安楽死させた後、脾臓を取り出し、氷冷した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、非動化したもの）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）１ｍＬ中でカットし、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（８ｍＬ）と４００ユニット／ｍｌ  コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）（１ｍＬ）を加え３７℃で１時間撹拌した。得られた細胞懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ、ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した後、４４０×ｇで５分間遠心分離した。
【００２９】
溶血バッファー（５ｍＬ、０．１５５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を加え２分間氷上に置いた後、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１１６４０（５ｍＬ）を加えて遠心分離し、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０でさらに２回洗浄した。基本培地に懸濁し、脾臓由来細胞懸濁液とした。その後、細胞液をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、血球計算板を用いて細胞数を計測した。
【００３０】
（２）ＩＮＦ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞誘導試験
上記のようにして得た細胞と乳酸菌を用い、共培養を行った。９６ウェル平底プレート（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ社製）に脾臓由来細胞を１×１０６／ウェル、乳酸菌を３μｇ／ウェルとなるように添加した。３日間培養後に４４０×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去することで細胞を回収した。リン酸バッファーで各ウェルを洗浄後、Ｆｃブロック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、５μｇ／ｍL）を１０μＬ各ウェルに添加した。
５℃で５分間静置後、ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファー（１０％  ＦＣＳ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌ  ポリミキシンＢ（シグマ社製）、１００，０００ Ｕ／Ｌペニシリン・１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ社製）、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製））で洗浄した。
細胞とＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＧＫ１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）とを反応させ、細胞表面標識を行った。
ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ＣｏｍｃｅｍｔｒａｔｅとＤｉｌｕｅｎｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化した。
Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて洗浄し、ＰＥ標識抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）、ＡＰＣ標識抗ＩＬ−１０抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＪＥＳ５−１６Ｅ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）と反応させ細胞内標識を行った。
ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、同バッファー２００μＬに懸濁後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて解析した。結果を図１に示す。
【００３１】
図１に示すように、今回用いた乳酸菌の中でもペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトコッカス・ラクティスがＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を強く誘導することが確認された。
【実施例２】
【００３２】
〔マウス脾臓由来ＮａｉｖｅＴ細胞を用いた、食品素材のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導試験〕
ＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞に加え、Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）もまた経口免疫寛容に影響する因子として知られている。Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を誘導する食品素材を選択するため、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を誘導する可能性のあるフラボノイド系化合物（ナリンゲニン、プロシアニン、ＥＣＧ、ケルセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、グリシチン、ゲニスチン、ダイジン、グリシチン）のＴｒｅｇ誘導活性を評価した。また、芳香環は持つがフラボノイド骨格は持たないグルタミルチロシンも同時に評価した。
【００３３】
１．フラボノイド及びグルタミルチロシンの調製
各々を１０ｍＭになるように、ジメチルスルホキシド（ＷＡＫＯ社製）に懸濁した。次いで、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０を用いて１００倍に希釈した。これらを終濃度１０μＭになるよう細胞培養液に添加した。
【００３４】
２．Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導促進試験
（１）脾臓由来Ｎａｉｖｅ Ｔ細胞懸濁液の調製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８−１２週齢、雌、日本クレア社生産）をイソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して安楽死させた後、脾臓を取り出し、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬ中でカットし、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（８ｍＬ）と４００ユニット／ｍｌ  コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）（１ｍＬ）を加え３７℃で１時間撹拌した。得られた細胞懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ、ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した後、４４０×ｇで５分間遠心分離した。
【００３５】
溶血バッファー（５ｍＬ、０．１５５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を加え２分間氷上に置いた後、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（５ｍＬ）を加えて遠心分離し、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０でさらに２回洗浄した。ＭＡＣＳ  ｒｕｎｎｉｎｇバッファーにて１回洗浄した後、ＣＤ４＋ＴＣｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｃｋｔａｉｌと、次いで、Ａｎｔｉ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄｓと反応させ、自動磁気分離システム（Ａｕｔｏ  ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてネガティブフラクションを分離した。
ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇバッファーにて１回洗浄した後、Ｆｃブロックと反応させた。ＭＡＣＳｒｕｎｎｉｎｇバッファーにて洗浄後、抗ＣＤ６２Ｌ-ＦＩＴＣ抗体と反応させた。
ＭＡＣＳｒｕｎｎｉｎｇバッファーにて洗浄後、Ａｎｔｉ  ＦＩＴＣ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）と反応させ自動磁気分離システム（Ａｕｔｏ  ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてポジティブフラクションを分離した。
分離した細胞をＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し、細胞液をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、血球計算板を用いて細胞数を計測した。
【００３６】
（２）Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導促進試験
上記のようにして得た細胞にイソフラボン・アグリコン又は配糖体を添加し、培養した。９６ウェル平底プレート（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ社製）に抗ＣＤ３ｅ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、５μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェル入れ、３７℃で２時間温置した。その後、ＰＢＳで２回ウェルを洗浄し、脾臓由来ＮａｉｖｅＴ細胞５×１０６／ウェルに対し、ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）を２０ｎｇ／ｍＬ、ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）を２ｎｇ／ｍＬ、イソフラボン・アグリコン又は配糖体を５、１０、２０μＭ／ウェルとなるように添加し、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培養液中で２日以上３日未満培養した。
次いで、ＰＭＡ（シグマ、０．２５ｍｇ／ｍＬ）２μＬ、イオノマイシン（シグマ社製、１．２５ｍｇ／ｍＬ）４μＬ、Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）１０μＬを各ウェルに添加し、４時間培養した。
リン酸バッファーで洗浄後、Ｆｃブロックと反応させた。ＦＡＣＳ Ｗａｓｈバッファーで洗浄後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ＣｏｍｃｅｍｔｒａｔｅとＤｉｌｕｅｎｔを用いて固定化した。Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファーを用いて洗浄し、ＰＥ標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＮＲＲＦ−３０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）、ＦＩＴＣ標識抗ＩＬ−１７Ａ抗体（Ｃｌｏｎｅ  ｅＢｉｏ１７８７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）と反応させ細胞内標識を行った。
ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、同バッファー２００μＬに懸濁後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて解析した。結果を図２に示す。
【００３７】
フラボノイド骨格を持たないグルタミルチロシンは、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導活性を示さなかった。また、フラボノイド骨格を持つプロシアニンにも活性は見られなかった。ナリンゲニン、ＥＣＧは、マイルドな活性を示し、ケルセチン、ゲニステインには顕著な活性が見られた。
【実施例３】
【００３８】
〔マウス脾臓由来ＮａｉｖｅＴ細胞を用いた、Ｋ４７８豆乳発酵物上清のＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導試験〕
実施例１において、ペディオコッカス・ペントサセウス及びラクトコッカス・ラクティスがＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞を強く誘導することが明らかとなった。また、実施例２において、フラボノイド骨格を持つ化合物の中でも、ケルセチン、ゲニステインがＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を強く誘導することが明らかになった。
経口免疫寛容のメカニズムに関わるこれら二つのＴ細胞の両方を誘導することができれば、経口免疫寛容を効率的に増強することができる。つまり、ケルセチン又はゲニステインが含まれる食品を、実施例１で選抜した乳酸菌で発酵させれば、両者の機能を掛け合わせた機能性食品が生産できる可能性がある。そこで、乳酸菌が生育でき、かつ、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導するゲニステインを含む食品として豆乳を、また、実施例１で選抜した二つの菌種のうち豆乳の風味を損なわないと考えられるラクトコッカス・ラクティスをそれぞれ選択した。
発酵により機能性が損なわれないかを検証するため、ラクトコッカス・ラクティスのうちＫ４７８株を用いて発酵した豆乳発酵物の上清がＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導するかを検証した。
【００３９】
１．豆乳発酵物上清の調整
ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株グリセロールストック（１ｘ１０９  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を無調整豆乳に対し０．５％植菌した。７２時間培養後、１０分間煮沸することにより滅菌し、８，０００×ｇで１５分間遠心して上澄みを採取した。次いで、上澄みを凍結乾燥し、リン酸バッファーを用いて２０ｍｇ／ｍLに調整した。
【００４０】
２．Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導促進試験
（１）脾臓由来ＮａｉｖｅＴ細胞懸濁液の調製
実施例２に示した方法により脾臓由来Ｎａｉｖｅ Ｔ細胞懸濁液を調製した。
【００４１】
（２）Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞誘導促進試験
得られた細胞に豆乳発酵物上清懸濁液を終濃度２ｍｇ／ｍＬで添加し、培養した。培養や細胞の固定化、抗体による標識は、実施例２で述べた方法で行った。結果を図３に示す。
【００４２】
図３より、ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株により発酵した豆乳発酵物の上清は、Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞を誘導することが明らかとなった。
【実施例４】
【００４３】
〔ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株を用いた豆乳発酵物による、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＩＮＦ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞とＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導試験〕
【００４４】
５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、日本クレア社生産）に対して乳酸菌ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株を用いて発酵させた豆乳発酵物の連続強制経口投与を行い、マウスの腸管内でＩＮＦ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞とＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が誘導されるかを調べた。
【００４５】
１．豆乳、豆乳発酵物の投与
豆乳は、１０分間煮沸したものを用いた。豆乳発酵物は、豆乳に対し乳酸菌Ｋ４７８株グリセロールストックを０．５％植菌し７２時間発酵した。その後、１０分間煮沸を行った。
コントロール群には生理食塩水０．２ｍｌ／日を、豆乳摂取群、豆乳発酵物摂取群にはそれぞれ豆乳、豆乳発酵物０．２ｍｌ／日を試験開始０日目から５日目まで６日間、又は８日目まで９日間摂取させた。
【００４６】
２．小腸粘膜固有層中のＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞とＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の解析
頸椎脱臼して安楽死させた後、小腸を取り出し脂肪、パイエル板を除き、管を開くように切って、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に入れた。リン酸バッファーで小腸を洗浄した後、１ｃｍにカットし、ＬＰ  ＦＡＣＳバッファー（組成）を用いて３７℃１時間撹拌することで上皮細胞を除去した。リン酸バッファーで４、５回洗浄し、ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地内でさらに細かくカットした。
それらを４００ユニット／ｍｌ  コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）、５０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ、１０％  ＦＣＳ含有の１００，０００Ｕ／Ｌペニシリン・１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（シグマ社製）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）で処理した。パーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）による密度勾配処理により小腸粘膜固有層中の免疫細胞を得た。
細胞とＦｃブロックを反応させ洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体とを反応させ、細胞表面標識を行った。ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ＣｏｍｃｅｍｔｒａｔｅとＤｉｌｕｅｎｔを用いて固定化した。
Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎバッファーを用いて洗浄し、ＰＥ標識抗ＩＦＮ−γ抗体、ＡＰＣ標識抗ＩＬ−１０抗体と反応させ細胞内標識を行った。ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、同バッファー２００μＬに懸濁後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて解析した。
結果を図４に示す。
【００４７】
豆乳発酵物投与の６日間又は９日間の連続投与により、小腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３陽性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はＩＦＮ−γ産生ＩＬ−１０産生Ｔ細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎの増大が見られた。
【実施例５】
【００４８】
〔Ｋ４７８株による豆乳発酵物の経口免疫寛容増強試験〕
５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、日本クレア社生産）に対して、ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株によって発酵した豆乳発酵物の連続強制経口投与を行い、経口免疫寛容増強効果を調べた。オボアルブミン（ＯＶＡ、シグマ社製）感作を行い、アレルギーを誘導することで、豆乳発酵物摂取が遅延型過敏反応、血清中ＯＶＡ特異的抗体価、脾臓細胞の抗原特異的サイトカイン産生に及ぼす影響を調べた。
試験は、下記の方法に従い行った。
【００４９】
１．豆乳発酵物の投与
豆乳は、１０分間煮沸したものを用いた。豆乳発酵物は、豆乳に対し乳酸菌ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株グリセロールストックを０．５％植菌し、７２時間発酵した。その後１０分間煮沸を行った。加えて、選抜菌であるラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株以外に、ラクトバチルス・プランタラムＫ１６２株を用いて、ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株と同様に豆乳発酵物を作製した。
コントロール群には生理食塩水０．２ｍｌ／日を、豆乳摂取群、豆乳発酵物摂取群にはそれぞれ豆乳、豆乳発酵物０．２ｍｌ／日を試験開始０日目から２２日目まで２１日間摂取させた。
【００５０】
２．経口免疫寛容の誘導
経口免疫寛容誘導群、豆乳投与群、ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株による豆乳発酵物投与群（Ｋ４７８豆乳発酵物投与群）、ラクトバチルス・プランタラムＫ１６２株による豆乳発酵物投与群（Ｋ１６２豆乳発酵物投与群）には、１４日目にＯＶＡ２０ｍｇ／０．２ｍｌ生理食塩水を投与し、経口免疫寛容を誘導した。未処理対照群、アレルギー誘導対照群には生理食塩水を０．２ｍｌ投与した。
【００５１】
３．アレルギー誘導
試験開始２８日目にアレルギーを誘導するためにＯＶＡ（シグマ社製）３００μｇ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  １００μｌを背面皮下に投与した。
【００５２】
４．遅延型過敏反応の測定
背面皮下免疫から１４日後（試験開始４２日目）にＯＶＡ５０μｇを足の裏の背面皮下に投与し、２４時間後に腫れの大きさを測定することで、遅延型過敏反応を調べた。
この結果を図５に示す。なお、有意差検定は、ｔ検定により行った。
【００５３】
図５に示すように、経口免疫寛容の誘導により遅延型過敏反応は抑制されたが、Ｋ４７８豆乳発酵物を摂取することでその抑制作用が増強していることが確認された。豆乳や選抜株ではないＫ１６２豆乳発酵物を投与した群では、抑制が見られなかった。
【００５４】
５．血清中のＯＶＡ特異的抗体価の測定
遅延型過敏反応の測定後、イソフルラン麻酔下で採血を行った。１,５００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、血清を得た。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ量、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量をエンザイムイムノアッセイにより測定した。詳しくは、抗マウスＩｇＧ抗体、抗マウスＩｇＥ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）に５００倍希釈で添加し、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルでコーティングした。その後、血清サンプルを２倍−５０，０００倍希釈し、プレート上に５０μｌずつ分注し、１時間インキュベートした。
洗浄後、ビオチン標識ＯＶＡを１％ＢＳＡ添加０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌとなるように溶解し、プレート上に５０μｌずつ分注した。ビオチン標識ＯＶＡは、シグマ社製のＯＶＡと、同仁化学研究所製のビオチン化キットを用いて作製した。１時間インキュベートした後に洗浄を行い、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。
発色は、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１ウェルあたり５０μＬ加え、室温で２０分間反応させることで行った。反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）で、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、生理食塩水摂取群に対する相対値でＯＶＡ特異的ＩｇＧ、ＩｇＥ量を定量化した。
この結果を、図６に示す。なお、有意差検定は、ｔ検定により行った。
【００５５】
図６に示すように、豆乳発酵物投与マウスでは、ＯＶＡ特異的ＩｇＧが経口免疫寛容増強により抑制されていた。
【実施例６】
【００５６】
〔ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株による豆乳発酵物を用いた、食物アレルギーマウス試験〕
経口免疫寛容の増強により食物アレルギーの発症が強く抑制されることを、食物アレルギーモデルで確認した。
【００５７】
１．豆乳発酵物の投与
ラクトコッカス・ラクティスＫ４７８株により発酵した豆乳発酵物を実施例５と同様に作製した。試験開始０日目から２０日目まで豆乳発酵物を０．２ｍｌ投与した。未処理（アレルギー非誘導）対照群、アレルギー誘導／非発症群、アレルギー誘導／発症群、アレルギー誘導／経口免疫寛容誘導／発症群、アレルギー誘導／Ｋ４７８豆乳発酵物投与＋経口免疫寛容誘導／発症群で試験を実施し、Ｋ４７８豆乳発酵物投与群以外は、生理食塩水を０．２ｍｌ投与した。
【００５８】
２．経口免疫寛容の誘導
経口免疫寛容の誘導は、試験開始１４日目にアレルギー誘導／経口免疫寛容誘導／発症群、アレルギー誘導／Ｋ４７８豆乳発酵物投与＋経口免疫寛容誘導／発症群に対し、ＯＶＡ１０ｍｇ／０．２ｍｌ生理食塩水を投与することで行った。その他の群には、０．２ｍｌの生理食塩水を投与した。
【００５９】
３．アレルギー誘導
試験開始２２日目と３６日目にＯＶＡ（シグマ社製）１０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水、水酸化アルミニウムゲル（和光純薬工業社製）０．１ｍｌを混合し、腹腔内に０．２ｍｌを投与した。
【００６０】
４．発症
試験開始５０日目、５２日目、５４日目、５６日目、５８日目、６０日目、に１回あたりＯＶＡ５０ｍｇ／２５０μL生理食塩水を経口投与し、発症を行った。６３日目にイソフルラン麻酔下で頸椎脱臼後、小腸粘膜固有層中のマスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ解析を行った。
【００６１】
５．下痢の観察
試験開始６０日目のＯＶＡ経口投与の１時間後に下痢の観察を行った。結果を図７に示す。
経口免疫寛容の誘導により下痢の発症が抑制していたが、Ｋ４７８豆乳発酵物投与群で最も下痢の発症が抑制されていることが確認された。
【００６２】
６．小腸粘膜固有層中のマスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
試験開始から６３日目のマウスの小腸を採取し、小腸免疫固有層中の細胞を調整した。方法は、実施例４で述べた手法で行った。得られた細胞懸濁液をリン酸バッファーで洗浄後、Ｆｃブロックと反応させた。ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄後、抗ＰＥ標識抗ＣＤ１１７（ｃｋｉｔ）抗体（Ｃｌｏｎｅ  ２８８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）抗ＦＩＴＣ標識抗ＦｃεＲ抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＭＡＲ−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、２０μｇ／ｍＬ）と反応させ細胞表面標識を行った。
ＦＡＣＳ  Ｗａｓｈバッファーで洗浄し、同バッファー２００μＬに懸濁後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて解析した。
結果を図８に示す。なお、有意差検定は、ｔ検定により行った。
【００６３】
図８に示すように、アレルギー誘導／経口免疫寛容群と比較し、豆乳発酵物を投与した群においてマスト細胞のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが低下していることが明らかになった。
【図１】
2015130842.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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