(57)【要約】【課題】リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節を、簡便且つ効率的に判別する方法を提供すること、リンパ節をより多く判別すること、及び判別をリンパ節の構造がより保たれた状態で行うことを目的とする。【解決手段】タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を有効成分として含む、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる当該組織片の処理剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を有効成分として含む、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる当該組織片の処理剤。
【請求項２】
有効成分がタンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素である、請求項１に記載の処理剤。
【請求項３】
前記タンパク質分解酵素がコラゲナーゼ及びトリプシンからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である、請求項１又は２に記載の処理剤。
【請求項４】
前記脂肪分解酵素がリパーゼである、請求項１〜３のいずれかに記載の処理剤。
【請求項５】
有効成分がトリプシン及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素並びにコラゲナーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の処理剤。
【請求項６】
（ａ）リンパ節郭清により得られた組織片と請求項１〜５のいずれかに記載の処理剤とを接触させる工程、及び
（ｂ）工程（ａ）後の組織片中の球形部分をリンパ節として判別する工程
を含む、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法。
【請求項７】
（ａ）リンパ節郭清により得られた組織片と請求項１〜５のいずれかに記載の処理剤とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）後の組織片中の球形部分をリンパ節として判別する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で判別されたリンパ節中のがん細胞の有無を判定する工程
を含む、リンパ節中のがん細胞の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法、及び該方法に用いられる処理剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん組織の切除手術においては、がん細胞のリンパ行性転移に対する処置として、がん組織のみならず、その周辺組織（所属リンパ節含む）ごと除去（郭清）することが行われる。そして、除去されたリンパ節について、がん細胞の転移の有無が調べられる。
【０００３】
この転移の有無や、転移しているリンパ節の数などは、切除したがん組織のステージ及びその後の化学療法戦略を決定する重要な要因となる。したがって、これらの決定をより正確に行うという観点から、リンパ節郭清により得られた組織片から、できるだけ多くのリンパ節について調べることが重要である。
【０００４】
しかしながら、リンパ節はリンパ節郭清により得られた組織片中に埋もれた状態で存在するので、リンパ節を調べるためには、まず該組織片からリンパ節を判別して取り出すことが必要となる。通常、この判別は医師の触診によって行われており、多くの労力と時間を要する。
【０００５】
このような問題を解決するために、リンパ節郭清により得られた組織片からmRNAを抽出し、遺伝子増幅反応によってがん細胞の存在の有無を判定する方法が報告されている（非特許文献1〜3）。
【０００６】
しかしながら、この方法では、組織片中のがん細胞の有無の情報しか得ることができず、極一部のリンパ節のみへの転移なのか、或いは大半のリンパ節への転移なのかといった情報を得ることができない。したがって、がん組織のステージ及びその後の化学療法戦略を決定するための情報としては不十分である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tsujimoto M et al．Clin Cancer Res 13（16）：4807-4816，2007
【非特許文献２】Tanis PJ et al．Ann Surg Oncol8：222‐226，2001
【非特許文献３】Hughes SJ et al．Ann Surg 243：389-398，2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節を、簡便且つ効率的に判別する方法を提供することを目的とする。また、リンパ節をより多く判別することも目的とする。さらに、この判別を、リンパ節の構造が保たれた状態で行うことをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は鋭意研究した結果、リンパ節郭清により得られた組織片を、タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素で処理することによって、該組織片からリンパ節や脈管以外の余分な組織の大半が除かれることを見出した。処理後の組織片からは、目視により容易にリンパ節を判別することができた。さらに、上記処理剤で処理した後でも、リンパ節の構造は破壊されずに残っていることをも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発明が完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【００１１】
項１．
タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素からなる群より選択される少なくとも１種の酵素を有効成分として含む、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる当該組織片の処理剤。
【００１２】
項２．
有効成分がタンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素である、項１に記載の処理剤。
【００１３】
項３．
前記タンパク質分解酵素がコラゲナーゼ及びトリプシンからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である、項１又は２に記載の処理剤。
【００１４】
項４．
前記脂肪分解酵素がリパーゼである、項１〜３のいずれかに記載の処理剤。
【００１５】
項５．
有効成分がトリプシン及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素並びにコラゲナーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の処理剤。
【００１６】
項６．
（ａ）リンパ節郭清により得られた組織片と項１〜５のいずれかに記載の処理剤とを接触させる工程、及び
（ｂ）工程（ａ）後の組織片中の球形部分をリンパ節として判別する工程
を含む、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法。
【００１７】
項７．
（ａ）リンパ節郭清により得られた組織片と項１〜５のいずれかに記載の処理剤とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）後の組織片中の球形部分をリンパ節として判別する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で判別されたリンパ節中のがん細胞の有無を判定する工程
を含む、リンパ節中のがん細胞の検査方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節を、簡便且つ効率的に判別することができる。また、より多くのリンパ節を判別できるので、判別されたリンパ節へのがん細胞の転移を調べることによって、切除したがん組織のステージ及びその後の化学療法戦略をより正確に決定することができる。さらに、リンパ節の構造が保たれた状態で判別できるので、病理学的診断へは影響を与えない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例1における、リンパ節郭清により得られた組織片からリンパ節を判別する方法の概要を示す。
【図２】酵素処理前の組織片の写真（左側）、及び酵素処理後の組織片の写真（右側）を示す。
【図３】実施例1における、触診により判別されたリンパ節数、及び酵素処理後、目視により判別されたリンパ節数を示す。各カラムの上端は10検体中の最大値を示し、下端は10検体中の最小値を示す。また、各カラム中の横線は10検体中の中央値を示す。
【図４】触診により判別したリンパ節の観察像（左側）、及び酵素処理後に判別したリンパ節の観察像（右側）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる当該組織片の処理剤
本発明は、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる当該組織片の処理剤（以下、単に「処理剤」と略記することもある）に関する。
【００２１】
「リンパ節郭清」とは、がん組織周囲のリンパ節への転移の有無を調べるために、これらのリンパ節を除去することである。通常、リンパ節は単独で存在しているのではなく、他の組織（リンパ管、脂肪組織等）と連結した状態或いは他の組織と付着した状態で存在している。したがって、「リンパ節郭清により得られた組織片」には、リンパ節のみならず他の組織も含まれる。
【００２２】
「リンパ節郭清により得られた組織片」は、上記のような組織片である限り特に限定されない。例えば、大腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、肝臓がん、胆嚢がん、膵臓がん、乳がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、肺がんなどのがん組織からのがん細胞の転移が疑われるリンパ節を含む組織片が挙げられる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮させるという観点からは、好ましくは大腸がん、小腸がん、胃がん、及び乳がん、より好ましくは大腸がん、小腸がん、及び胃がん、さらに好ましくは大腸がん、よりさらに好ましくは結腸直腸がんのがん組織からのがん細胞の転移が疑われるリンパ節を含む組織片が挙げられる。
【００２３】
「がん組織からのがん細胞の転移が疑われるリンパ節を含む組織」は、がんの発生した部位毎に、及びがんの進行度に従って定められている。例えば、大腸がんの場合は、大腸癌治療ガイドライン2010年版に定められている。
【００２４】
「リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる」とは、リンパ節と他の組織が混在する「リンパ節郭清により得られた組織片」の中から、リンパ節を判別する目的で用いられることを意味する。このようにして判別されたリンパ節は、がん細胞の転移の有無について調べられる。
【００２５】
本発明の処理剤は、この目的のために、「リンパ節郭清により得られた組織片」を処理するための剤であり、その限りにおいて使い方は特に限定されない。
【００２６】
本発明の処理剤は、有効成分として、タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素からなる群より選択される少なくとも1種の酵素を含む。
【００２７】
タンパク質分解酵素としては、プロテアーゼ活性を有するものであれば特に限定されない。例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシぺプチダーゼA、カルボキシぺプチダーゼB、アミノぺプチダーゼN、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、ズブチリシン等が挙げられる。これらの中でも、リンパ節判別をより簡便に行えるという観点からは、コラゲナーゼ及びトリプシンが挙げられる。タンパク質分解酵素は1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２８】
脂肪分解酵素としては、例えばリパーゼが挙げられる。リパーゼとしては、各種生物由来のものを用いることができる。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ等の哺乳類の膵臓から抽出されたリパーゼを用いることができる。脂肪分解酵素は1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２９】
有効成分は、リンパ節判別をより簡便に行えるという観点からは、好ましくはタンパク質分解酵素、又はタンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素であることができ、より好ましくはトリプシン及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素並びにコラゲナーゼであることができる。
【００３０】
本発明の処理剤において、タンパク質分解酵素の含有割合については、タンパク質分解酵素の種類に応じて適宜設定される。例えば、処理剤の総量に対して、タンパク質分解酵素が総量で0.001〜10 w/v％、好ましくは0.01〜3 w/v％、より好ましくは0.05〜1 w/v％、さらに好ましくは0.1〜0.5 w/v％であることができる。
【００３１】
本発明の処理剤において、脂肪分解酵素の含有割合については、脂肪分解酵素の種類に応じて適宜設定される。例えば、処理剤の総量に対して、脂肪分解酵素が総量で0.001〜20 w/v％、好ましくは0.01〜10 w/v％、より好ましくは0.05〜5 w/v％、さらに好ましくは0.1〜3 w/v％であることができる。
【００３２】
本発明の処理剤のpHは、有効成分であるタンパク質分解酵素や脂肪分解酵素の至適pHから大きく外れない限り特に限定されない。例えば、有効成分がトリプシン（至滴pHは通常pH 8〜9）及びコラゲナーゼ（至滴pHは通常、中性付近）である場合は、処理剤のpHはpH 6〜9、好ましくは6.5〜8程度であることができる。
【００３３】
本発明の処理剤は、有効成分以外にも、塩、緩衝剤等の他の成分を含んでいてもよい。また、有効成分である酵素の種類によっては、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の金属イオンをさらに含んでいることが好ましい。
【００３４】
塩としては、主に処理剤を細胞内液と等張にするために用いられるものである限り特に限定されず、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
【００３５】
緩衝剤は、公知の緩衝剤である限り特に限定されず、有効成分である酵素の至適pHに従って適宜選択される。例えば、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤等や、HEPES等のグッド緩衝剤等が挙げられる。
【００３６】
本発明の処理剤の剤形は、液状であることが好ましい。液状の中でも水性液状が好ましい。本発明の処理剤は、剤形に応じた公知の方法に従って製造することができる。例えば水性液状にする場合、蒸留水、常水、精製水、滅菌精製水等の水に、上記した有効成分や他の成分を溶解することにより製造することができる。また、有効成分を、予め緩衝剤や塩等を含む溶液（PBS等）に溶解することによっても製造することができる。
【００３７】
斯かる本発明に処理剤を、下記「２．リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法」のように用いることによって、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節を、簡便且つ効率的に、より多く判別することが可能となる。
【００３８】
２．リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法
本発明は、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法（以下、単に「判別方法」と略記することもある）に関する。
【００３９】
本発明の判別方法は、下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を含む。
工程（ａ）：リンパ節郭清により得られた組織片と本発明の処理剤とを接触させる工程
工程（ｂ）：工程（ａ）後の組織片中の球形部分をリンパ節として判別する工程
工程（ａ）
「リンパ節  郭清により得られた組織片」、及び「本発明の処理剤」については、上記「１．リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別に用いられる当該組織片の処理剤」の記載と同様である。
【００４０】
接触は、リンパ節郭清により得られた組織片と本発明の処理剤とが接する態様であれば特に限定されない。典型的には、該組織片を本発明の処理剤に浸すことによって行われる。また、該組織片と本発明の処理剤とが均一に混合されるように、撹拌することが好ましい。撹拌は、有効成分である酵素が失活しない程度の速度で行えばよい。撹拌によってより効率的に接触させることが出来るが、必ずしも必要ではない。
【００４１】
リンパ節郭清により得られた組織片と、本発明の処理剤との比率としては、該処理剤中の有効成分が該組織片全体に作用できる限り特に限定されない。例えば、該組織片1 g当たり、該処理剤0.1〜10 ml程度の比率が挙げられる。
【００４２】
接触中の温度は、有効成分である酵素が活性を有する限り特に限定されない。例えば15〜50℃、好ましくは20〜40℃程度であることができる。
【００４３】
接触時間は、有効成分である酵素が活性を十分に発揮できる限り特に限定されない。例えば、酵素の濃度が比較的低く、接触中の温度が比較的低温（20℃程度）である場合は、1〜8時間程度であることができる。また、酵素の濃度が比較的高く、接触中の温度が比較的高温（40℃程度）である場合は、5〜20分程度であることができる。
【００４４】
斯かる処理によって、リンパ節郭清により得られた組織片から、余分な組織（脂肪組織等）の大半を分離させることができる。処理後は、リンパ節を含む組織片、分離された余分な組織片、及び本発明の処理剤の混合物が得られるので、該混合物から、水分を除去し、さらに分離された余分な組織を取り除いておくとよい。
【００４５】
工程（ｂ）
工程（ａ）後の組織片においてはリンパ節周囲の余分な組織が除去されているので、該組織片中の球形部分を、リンパ節として判別することができる。
【００４６】
リンパ節の直径は、通常0.2〜15 mm程度である。したがって、この点も考慮に入れることにより、より正確にリンパ節を判別することができる。
【００４７】
判別は、上記のように形状や大きさに基づいて行うことができるので、通常、目視によって行われる。
【００４８】
斯かる本発明の判別方法によれば、リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節を、簡便且つ効率的に、より多く判別することが可能となる。
【００４９】
判別されたリンパ節は、がん細胞の転移の有無を調べるために、通常、工程（ａ）後の組織片から分離される。リンパ節中のがん細胞の有無は下記「３．リンパ節中のがん細胞の検査方法」に従って行うことができる。
【００５０】
３．リンパ節中のがん細胞の検査方法
本発明は、リンパ節中のがん細胞の検査方法（以下、単に「検査方法」と略記することもある）に関する。
【００５１】
本発明の検査方法は、下記工程（ａ）、工程（ｂ）、及び工程（ｃ）を含む。
工程（ａ）：リンパ節郭清により得られた組織片と本発明の処理剤とを接触させる工程
工程（ｂ）：工程（ａ）後の組織片中の球形部分をリンパ節として判別する工程
工程（ｃ）：工程（ｂ）で判別されたリンパ節中のがん細胞の有無を判定する工程
工程（ａ）及び工程（ｂ）
工程（ａ）及び工程（ｂ）については、上記「２．リンパ節郭清により得られた組織片中のリンパ節判別方法」の記載の同様である。
【００５２】
工程（ｃ）
リンパ節中のがん細胞の有無の判定は、公知の方法に従って行うことができる。一般的にはリンパ節の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、染色像を観察することによりがん細胞の有無を判定する。この判定は、例えば大腸癌取り扱い規約第8版2013年度に記載の基準に従って行うことができる。
【００５３】
斯かる本発明の検査方法によれば、リンパ節郭清により得られた組織片から、より多くのリンパ節中のがん細胞の有無を、簡便且つ効率的に検査することができる。
【実施例】
【００５４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５５】
実施例１：リンパ節郭清により得られた組織片の酵素処理、及びリンパ節の判別
図1に示す方法に従って、リンパ節郭清により得られた組織片からリンパ節を判別し、その数を測定した。具体的には次のように行った。
【００５６】
（１）組織片の調製
結腸直腸がん手術を受けた10名の被験者それぞれから、倫理規定に従った書面によるインフォームド・コンセントを受けた上で、該手術中のリンパ節郭清により得られた腸間膜組織片を取得した（計10検体）。該組織片の大半は脂肪組織から構成されており、その中にリンパ節が埋め込まれた状態で存在している。外科医が該組織片を触診することによってリンパ節を判別し、判別されたリンパ節を除去した。リンパ節が除去された組織片を2つに分割した。
【００５７】
（２）リンパ節の判別
（２−１）再度の触診によるリンパ節判別
分割された組織片の一方から、外科医による再度の触診によりリンパ節を判別した。判別されたリンパ節の数を測定した。
【００５８】
（２−２）酵素処理後、目視によるリンパ節判別
もう一方の組織片はポリ袋に入れ、そこへ組織片3 g当たり1 mlの酵素処理剤（0.25％トリプシン溶液（25200072; Life technologies, Carlsbad, CA, USA）にコラゲナーゼ（C6885; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）を1 mg/mlになるように溶解した溶液）を添加した。ポリ袋を密閉し、40℃で10分間、100 rpmの速度で回転させた。回転後、ポリ袋から組織片を取り出し、乾燥させた。酵素処理前の組織片の写真、及び酵素処理後、乾燥した組織片の写真を図2に示す。図2に示すように、酵素処理前の組織片には多量の脂肪等の組織が付着しており、目視でリンパ節を判別することはできなかった（図2左側）。一方、酵素処理後の組織片からは余分な組織が除かれており、目視で容易にリンパ節及びリンパ管を判別することができた（図2右側）。判別されたリンパ節の数を測定した。
【００５９】
（３）結果
上記「（２）リンパ節の判別」で判別されたリンパ節数を下記表1に示す。触診により判別されたリンパ節数と、酵素処理後、目視により判別されたリンパ節数の測定値を、ウィルコクソンの符号順位検定で統計解析したところ、P値は0.004であった。また、図3に、表1の結果の箱髭図を示す。図3中、ボックスから上方向に伸びた髭の上端は90パーセンタイル値を示し、ボックスから下方向に伸びた髭の下端は10％パーセンタイル値を示す。
【００６０】
【表１】
2015130836.tif 000002
【００６１】
前述したように、酵素処理の場合は、短時間（10分間）の処理により、目視で容易にリンパ節を判別することができた（図2）。また、表1及び図3に示されるように、触診により判別した場合に比べて、酵素処理後に目視により判別した場合の方が、より多くのリンパ節を判別できた。
【００６２】
実施例２：酵素処理条件の検討
表2に示す条件で、実施例1と同様に組織片の酵素処理を行った。酵素処理剤の調製は、酵素としてトリプシンを含まない場合は、DPBS（14190250; Life technologies）にコラゲナーゼ及び／又はリパーゼ（MP Bio, 100817）を溶解して作成し、酵素としてトリプシンを含む場合は0.25％トリプシン溶液コラゲナーゼ及び／又はリパーゼを溶解して作成した。酵素処理後、目視によるリンパ節の判別のし易さを3段階で評価した。評価基準は、「1」が「酵素処理前と判別し易さは変らない」という評価、「3」が「目視により容易にリンパ節を判別できる」という評価、「2」は1と3との中間の評価とした。
【００６３】
【表２】
2015130836.tif 000003
【００６４】
評価結果を表2の最右列に示す。この結果より、コラゲナーゼやトリプシンなどのタンパク質分解酵素やリパーゼ等の脂肪分解酵素を単独で用いることにより（条件1〜3）、リンパ節の判別がより容易になることが示された（評価「2」）。さらに、タンパク質分解酵素や脂肪分解酵素を2種類以上組み合わせることにより（条件4〜8）、それぞれ単独で用いるよりもより容易にリンパ節を判別できることが示された（評価「3」）。
【００６５】
実施例３：酵素処理後に判別されたリンパ節の観察
リンパ節へのがん細胞の転移を調べるためには、リンパ節が破壊されていないことが重要である。リンパ節が破壊されていると、検査中にがん細胞がリンパ節から抜け落ちる可能性があるので、正確にリンパ節転移の有無を調べることができなくなるからである。そこで、実施例1及び2で判別されたリンパ節の切片像を観察し、破壊の有無を調べた。具体的には次のように行った。
【００６６】
実施例1及び2において判別されたリンパ節から、定法に従って、パラフィン切片を得て、該切片をヘマトキシリン・エオジン染色した。染色後の切片を光学顕微鏡で観察した。触診により判別した場合のリンパ節の観察像を図4に左側に示し、実施例1において酵素処理後に判別した場合の観察像を図4の右側に示す。
【００６７】
図4に示すように、酵素処理後に判別した場合であっても、触診により判別された場合と同様に、リンパ節の構造は破壊されていなかった。このことから、酵素処理後にリンパ節を判別する方法を用いても、該リンパ節へのがん細胞の転移を正確に調べられることが示された。
【図１】
2015130836.tif 000004
【図３】
2015130836.tif 000005
【図２】
2015130836.tif 000006
【図４】
2015130836.tif 000007