(57)【要約】【課題】高分子量エラスチン様ポリペプチドなどのアミド化合物を、高収率かつ高純度で簡便に合成する方法、および該方法で得られるアミド化合物を提供すること。【解決手段】カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、前記反応を、水系媒体中、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩を用いて行うことを特徴とする、アミド化合物の合成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、
前記反応を、水系媒体中、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩を用いて行うことを特徴とする、
アミド化合物の合成方法。
【請求項２】
前記硫酸塩が、アルカリ金属の硫酸塩である、
請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
前記カルボキシ基を少なくとも有する化合物と前記アミノ基を少なくとも有する化合物が、ともに、アミノ酸またはペプチドである、
請求項１または２に記載の合成方法。
【請求項４】
前記カルボキシ基を少なくとも有する化合物と前記アミノ基を少なくとも有する化合物が、ともに、下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成方法。
ＧＸ1ＧＸ2Ｐ・・・（１）
Ｘ1ＧＸ2ＰＧ・・・（２）
ＧＸ2ＰＧＸ1・・・（３）
Ｘ2ＰＧＸ1Ｇ・・・（４）
ＰＧＸ1ＧＸ2・・・（５）
〔式（１）〜（５）中、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示す。〕
【請求項５】
前記アミド化合物が、エラスチン様ポリペプチドである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の合成方法。
【請求項６】
前記反応を、マイクロ波照射下で行う、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の合成方法。
【請求項７】
カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、
前記反応を、マイクロ波照射下で行うことを特徴とする、
アミド化合物の合成方法。
【請求項８】
前記カルボキシ基を少なくとも有する化合物と前記アミノ基を少なくとも有する化合物が、ともに、アミノ酸またはペプチドである、
請求項７に記載の合成方法。
【請求項９】
前記カルボキシ基を少なくとも有する化合物と前記アミノ基を少なくとも有する化合物が、ともに、下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、
請求項７または８に記載の合成方法。
ＧＸ1ＧＸ2Ｐ・・・（１）
Ｘ1ＧＸ2ＰＧ・・・（２）
ＧＸ2ＰＧＸ1・・・（３）
Ｘ2ＰＧＸ1Ｇ・・・（４）
ＰＧＸ1ＧＸ2・・・（５）
〔式（１）〜（５）中、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示す。〕
【請求項１０】
式（１）〜（５）中のＸ1及びＸ2がＶである、
請求項９に記載の合成方法。
【請求項１１】
前記反応を、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる１種以上を用いて行う、
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の合成方法。
【請求項１２】
前記アミド化合物が、エラスチン様ポリペプチドである、
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の合成方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の合成方法で得られるアミド化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミド化合物の合成方法、および該方法で得られるアミド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏの繰り返し配列を主要ペプチド配列とする弾性繊維状のタンパク質であり、水等に溶解させ約４０℃付近まで加熱すると相分離して白濁する温度感受性を示す。
また、エラスチンなどのポリペプチドは、化粧品テクスチャーの改善や保湿作用の向上を目的として化粧料に配合するなどされており、細胞培養、ドラッグデリバリーシステム、生体適合性材料等の種々の分野での応用も期待されている。
また、エラスチンは、豚や牛の大動脈血管、魚皮等に存在する。従来、エラスチンは、豚の大動脈血管等の抽出物を精製して得ていたが、このような精製によってポリペプチドを高純度及び高収率で得るのは容易ではなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そのため、ポリペプチドなどのアミド化合物の化学的合成法の開発が望まれているが、例えば、Ｇｌｙ−Ｘ1−Ｇｌｙ−Ｘ2−Ｐｒｏ（Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示す）を含むペンタポリペプチドを重縮合させた場合、反応が途中で止まってしまい、高分子量かつ高収率で目的物を得ることができず、従って、エラスチンと同様の温度感受性を示す高分子量エラスチン様ポリペプチドの合成には至らないなどという問題があった。
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、高分子量エラスチン様ポリペプチドなどのアミド化合物を、高収率かつ高純度で簡便に合成する方法、および該方法で得られるアミド化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは、カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを、水系媒体中、特定の硫酸塩を用いて反応させることによって、アミド化合物を簡便に合成できることを見出した。
また、本発明者らは、カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを、マイクロ波照射下で反応させることによって、アミド化合物を簡便に合成できることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、＜１＞カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、上記反応を、水系媒体中、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩を用いて行うことを特徴とする、アミド化合物の合成方法（以下、この合成方法を第１の合成方法とも称する）を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、＜２＞カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、上記反応を、マイクロ波照射下で行うことを特徴とする、アミド化合物の合成方法（以下、この合成方法を第２の合成方法とも称し、また、該第２の合成方法と上記第１の合成方法とをあわせて、本発明の合成方法と総称する）を提供するものである。
【０００８】
更に、本発明は、＜３＞上記＜１＞または＜２＞の合成方法で得られるアミド化合物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の合成方法によれば、高分子量エラスチン様ポリペプチドなどのアミド化合物を、高収率かつ高純度で簡便に合成できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について説明する。なお、本明細書において、ａ〜ｂ等は、ａ以上、ｂ以下を意味し、ａ、ｂをその範囲内に含む。
本発明の合成方法は、カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させるものであるが、この合成方法は、カルボン酸とアミンとを反応させるアミド化合物の合成方法、ジカルボン酸とジアミンを反応させるポリアミドの合成方法、アミノ酸またはペプチドを重縮合させるポリアミノ酸またはポリペプチドの合成方法などを包含する概念である。
【００１１】
本発明の合成方法の原料化合物であるカルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物は、反応してアミド化合物を生成させるものであれば特に限定されないが、ポリアミノ酸またはポリペプチドを得る観点からは、両者がともにアミノ酸またはペプチドであるのが好ましい。特に、カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物の両者として、下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いた場合、エラスチン様ポリペプチドが得られる。なお、本明細書において、エラスチン様ポリペプチドとは、Ｇｌｙ−Ｘ1−Ｇｌｙ−Ｘ2−Ｐｒｏの繰り返し配列を主要ペプチド配列とする温度感受性をもつポリペプチドをいう。好ましくは、水等に溶解させ約４〜７０℃、より好ましくは約３０〜４０℃付近まで加熱すると相分離するポリペプチドのことをいう。
【００１２】
ＧＸ1ＧＸ2Ｐ・・・（１）
Ｘ1ＧＸ2ＰＧ・・・（２）
ＧＸ2ＰＧＸ1・・・（３）
Ｘ2ＰＧＸ1Ｇ・・・（４）
ＰＧＸ1ＧＸ2・・・（５）
〔式（１）〜（５）中、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、プロリン以外のアミノ酸残基を示す。〕
【００１３】
上記式（１）〜（５）中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載している。ここで、Ｇはグリシンを、Ｐはプロリンをそれぞれ示す。
【００１４】
また、上記Ｘ1及びＸ2はプロリン以外のアミノ酸残基を示す。エラスチンは、ＧＶＧＶＰの繰り返し配列を主要ペプチド配列とするタンパク質であり、上記ＧＶＧＶＰ中の２つのＶがプロリン以外のアミノ酸残基であればその特性等は保存され、有意な影響や変化はない。
【００１５】
Ｘ1及びＸ2としては、脂肪族アミノ酸の残基が挙げられ、中性アミノ酸（モノアミノモノカルボン酸）の残基が好ましい。
具体的には、Ｖ（バリン）、Ｇ、Ａ（アラニン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｃ（システイン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｋ（リジン）、Ｒ（アルギニン）が挙げられ、これらの中でも、Ｖ、Ｌ、Ｉが好ましく、Ｖが特に好ましい。
【００１６】
また、上記ポリペプチド（１）〜（５）は、以下の式に示すように、いずれも重縮合反応が進行した場合にＧＸ1ＧＸ2Ｐの繰り返しを主要とする配列を誘導する。
【００１７】
【化１】
2015007034.tif 000002
【００１８】
また、本発明の合成方法で得られるアミド化合物がポリマーである場合、得られるポリマーの重量平均分子量としては、１，０００〜２，０００，０００が好ましく、１０，０００〜５００，０００がより好ましく、１５，０００〜５０，０００が更に好ましい。また、分散度としては、好ましくは２以上、より好ましくは３５以上であり、また、好ましくは２００以下である。なお、これらはＧＰＣやＴｏｆ−ＭＳなどにより測定可能である。
【００１９】
以下、本発明の第１の合成方法と第２の合成方法についてより具体的に説明する。
（第１の合成方法）
本発明の第１の合成方法は、上記カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、上記反応を、水系媒体中、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩を用いて行うことを特徴とするものである。
本発明の第１の合成方法は、水系媒体中で反応を行うため、脱水反応により生じる水以外にも水分子が反応系中に存在するものであるが、これら水分子の存在によって平衡反応の均衡が崩れて反応効率が低下するということがみられない。斯かる作用や機構は必ずしも明らかではないが、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩が、アミド生成反応の反応場を制御するためであると、本発明者らは推察する。そして、本発明の第１の合成方法は、アミド生成反応により大量に水分子が発生しても反応効率が低下しにくく、アミド化合物の工業的な大量合成に好適に使用される。また、有機溶媒を使用しなくてもアミド化合物を合成することができ、環境負荷が少ない。
【００２０】
本発明の第１の合成方法は、アルカリ金属の硫酸塩及びアルカリ土類金属の硫酸塩から選ばれる１種以上の硫酸塩を用いるものである。
ここで、本明細書において、アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム及びフランシウムの総称を意味し、アルカリ土類金属とは、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム及びラジウムの総称を意味する。
【００２１】
本発明の第１の合成方法において、アルカリ金属の硫酸塩としては、反応効率の観点から、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムが好ましい。また、アルカリ土類金属の硫酸塩としては、反応効率の観点から、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムが好ましい。
これらの中でも、第１の合成方法で用いる硫酸塩としては、反応効率の観点から、アルカリ金属の硫酸塩が好ましく、硫酸ナトリウムが特に好ましい。
なお、第１の合成方法で用いる硫酸塩は通常、水系媒体中では、硫酸イオンとアルカリ金属またはアルカリ土類金属のイオンとにわかれるが、本発明の第１の合成方法においては、反応系中に上記硫酸塩を添加するなどすればよい。硫酸塩は、反応系中で上記のようなイオンとして存在していてもよい。
【００２２】
第１の合成方法で用いる硫酸塩の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、１〜１００モル当量であり、好ましくは５〜７５モル当量であり、より好ましくは５〜２５モル当量である。
【００２３】
また、本発明の第１の合成方法は、水系媒体中でアミド化反応を行うものである。
上記水系媒体としては、水を３０体積％以上含む水系媒体が好ましく、水を４０体積％以上含む水系媒体がより好ましく、水を５０体積％以上含む水系媒体が更に好ましく、水を８０体積％以上含む水系媒体が更に好ましく、水を９５体積％以上含む水系媒体が特に好ましい。斯様な多量の水を含む水系媒体を用いた場合であっても、本発明の第１の合成方法によればアミド化合物を効率よく得ることができる。なお、上記水系媒体に含まれる水以外の媒体としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
水系媒体としては、例えば、水、リン酸緩衝液等の各種緩衝液などが挙げられるが、反応効率の観点から、水が好ましい。
【００２４】
上記水系媒体の合計使用量は、原料化合物の合計１００質量部に対し、通常、１００〜２００００質量部であり、好ましくは５００〜１００００質量部であり、より好ましくは７５０〜７５００質量部であり、さらに好ましくは１０００〜６０００質量部であり、特に好ましくは２５００〜５０００質量部である。このような多量の水系媒体を使用した場合でも、本発明の第１の合成方法によればアミド化合物を効率よく得ることができる。
【００２５】
また、本発明の第１の合成方法においては、反応効率の観点から、縮合剤存在下で上記反応を行うのが好ましい。
縮合剤はペプチド合成に使用される縮合剤であればよいが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド誘導体；Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−[ビス−（ジメチルアミノ）メチリウミル]−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール[４，５−ｂ]ピリジン−３−オキサイドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）等のベンゾトリアゾール誘導体の他、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、カルボジイミド誘導体が好ましく、ＷＳＣがより好ましい。
上記縮合剤の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、１〜１０モル当量であり、好ましくは１〜５モル当量である。
【００２６】
また、本発明の第１の合成方法においては、上記縮合剤とともに、縮合安定剤を用いるのが好ましい。
縮合安定剤としてはヒドロキシルアミン化合物が挙げられる。具体的には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ＨＯＢｔが好ましい。
上記縮合安定剤の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、０．２５〜１０モル当量であり、好ましくは０．７５〜５モル当量である。
【００２７】
また、本発明の第１の合成方法においては、マイクロ波照射下で上記反応を行ってもよい。マイクロ波を照射することにより速やかに反応が進行し、短時間で収率よく目的とするアミド化合物を得ることができる。
上記マイクロ波の周波数は、好ましくは１〜５ＧＨｚの範囲であり、より好ましくは２〜３ＧＨｚの範囲である。
また、マイクロ波の波長は、通常、１ｍ〜１００μｍの範囲である。
また、マイクロ波の出力は、好ましくは５〜２０００Ｗの範囲であり、より好ましくは１５０〜１５００Ｗの範囲であり、更に好ましくは１７５〜１０００Ｗの範囲である。
上記のようなマイクロ波照射は、μ−ｒｅａｃｔｏｒ  ＥＸ（四国計測工業社製）等の市販のマイクロ波反応装置を用いて行うことができる。
【００２８】
また、反応時間は、マイクロ波照射を行わない場合は、通常、５分間〜２４時間程度であり、好ましくは１０分間〜１０時間であり、より好ましくは２０分間〜８時間であり、更に好ましくは３０分間〜６時間である。一方、マイクロ波照射を行う場合は、通常、１０〜１０００秒間程度であり、好ましくは１０〜３００秒間であり、より好ましくは１０〜１２０秒間である。
また、反応温度は、マイクロ波照射を行わない場合は、通常、０〜２００℃であるが、好ましくは４〜１５０℃であり、より好ましくは１０〜１００℃であり、更に好ましくは更に好ましくは２０〜５０℃であり、更に好ましくは２０〜４０℃である。マイクロ波照射を行わない場合、低温領域（４〜５０℃）での反応の後、追加で高温領域（７０〜１００℃）での多段階の加熱を施してもよい。
一方、反応温度は、マイクロ波照射を行う場合は、通常、４０〜１５０℃であるが、好ましくは４０〜１００℃であり、より好ましくは６０〜１００℃である。
【００２９】
なお、上記反応で得られた反応生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、透析、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。
【００３０】
そして、本発明の第１の合成方法によれば、水系媒体中であるにも拘わらず、アミド化合物を、高収率かつ高純度で簡便に合成できる。特に、エラスチンと同様の温度感受性を示すエラスチン様ポリペプチドの合成に有用である。
【００３１】
（第２の合成方法）
本発明の第２の合成方法は、上記カルボキシ基を少なくとも有する化合物とアミノ基を少なくとも有する化合物とを反応させる工程を含むアミド化合物の合成方法であって、上記反応を、マイクロ波照射下で行うことを特徴とするものである。
【００３２】
上記マイクロ波の周波数は、好ましくは１〜５ＧＨｚの範囲であり、より好ましくは２〜３ＧＨｚの範囲である。
また、マイクロ波の波長は、通常、１ｍ〜１００μｍの範囲である。
また、マイクロ波の出力は、好ましくは５〜２０００Ｗの範囲であり、より好ましくは１５０〜１５００Ｗの範囲であり、更に好ましくは１７５〜１０００Ｗの範囲である。
上記のようなマイクロ波照射は、μ−ｒｅａｃｔｏｒ  ＥＸ（四国計測工業社製）等の市販のマイクロ波反応装置を用いて行うことができる。
【００３３】
また、マイクロ波の照射時間は、通常、１０〜１０００秒間程度であり、好ましくは１０〜３００秒間であり、より好ましくは１０〜１２０秒間である。本発明の第２の合成方法によれば、斯様な短い時間でアミド化合物を得ることができる。
また、反応温度は、通常、４０〜１５０℃であるが、好ましくは４０〜１００℃であり、より好ましくは６０〜１００℃である。
【００３４】
また、本発明の第２の合成方法においては、反応効率の観点から、縮合剤存在下で上記反応を行うのが好ましい。
縮合剤はペプチド合成に使用される縮合剤であればよいが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド誘導体；Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）、（１−[ビス−（ジメチルアミノ）メチリウミル]−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール[４，５−ｂ]ピリジン−３−オキサイドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）等のベンゾトリアゾール誘導体の他、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、カルボジイミド誘導体が好ましく、ＷＳＣがより好ましい。
上記縮合剤の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、１〜１０モル当量であり、好ましくは１〜５モル当量である。
【００３５】
また、本発明の第２の合成方法においては、上記縮合剤とともに、縮合安定剤を用いるのが好ましい。
縮合安定剤としてはヒドロキシルアミン化合物が挙げられる。具体的には、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ＨＯＢｔが好ましい。
上記縮合安定剤の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、０．２５〜１０モル当量であり、好ましくは０．７５〜５モル当量である。
【００３６】
また、本発明の第２の合成方法においては、反応効率の観点から、塩類を用いて反応を行うのが好ましい。塩類としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記アルカリ金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩が好ましく、上記アルカリ土類金属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩が好ましい。また、斯様な塩類の中でも、反応効率の観点から、アルカリ金属塩の無機酸塩、アルカリ土類金属塩の無機酸塩が好ましい。
具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化リチウム、塩化カルシウム等が挙げられる。
これらの中でも、反応効率の観点から、アルカリ金属塩の硫酸塩、アルカリ土類金属塩の硫酸塩が好ましい。当該硫酸塩を用いた場合、水分子の存在により平衡反応の均衡が崩れることによる反応効率の低下を抑制することができる。すなわち、アミド生成反応により大量に水分子が発生しても反応効率が低下しにくく、アミド化合物の工業的な大量合成に好適に使用される。また、有機溶媒を使用しなくてもアミド化合物を合成することができ、環境負荷が少ない。
この中でも、上記硫酸塩としては、反応効率の観点から、アルカリ金属の硫酸塩が好ましく、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムがより好ましく、硫酸ナトリウムが特に好ましい。
【００３７】
なお、上記塩類を用いて溶媒中で反応を行う場合には、反応系中に上記塩類を添加するなどすればよい。反応系中で塩類は、塩として存在していてもよく、上記のようなイオンとして存在していてもよい。
【００３８】
本発明の第２の合成方法において、上記塩類の合計使用量は、原料化合物の合計１モルに対し、通常、１〜１００モル当量であり、好ましくは５〜７５モル当量であり、より好ましくは５〜２５モル当量である。
【００３９】
また、本発明の第２の合成方法は、溶媒中で反応を行うのが好ましい。該溶媒としては、水、リン酸緩衝液等の水系媒体；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【００４０】
上記水系媒体としては、水を３０体積％以上含む水系媒体が好ましく、水を４０体積％以上含む水系媒体がより好ましく、水を５０体積％以上含む水系媒体が更に好ましく、水を８０体積％以上含む水系媒体が更に好ましく、水を９５体積％以上含む水系媒体が特に好ましい。なお、上記水系媒体に含まれる水以外の媒体としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
水系媒体としては、例えば、水、リン酸緩衝液等の各種緩衝液などが挙げられるが、反応効率の観点から、水が好ましい。
本発明の第２の合成方法によれば、上記水系媒体中で反応を行った場合であっても、短時間で収率よく目的とするアミド化合物を得ることができる。
【００４１】
上記溶媒の合計使用量は、原料化合物の合計１００質量部に対し、通常、１００〜２００００質量部であり、好ましくは５００〜１００００質量部であり、より好ましくは７５０〜７５００質量部であり、さらに好ましくは１０００〜６０００質量部であり、特に好ましくは２５００〜５０００質量部である。
【００４２】
なお、上記反応で得られた反応生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、透析、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。
【００４３】
そして、本発明の第２の合成方法によれば、高収率かつ高純度で簡便に、しかも短時間で、目的とするアミド化合物を得ることができる。特に、エラスチンと同様の温度感受性を示すエラスチン様ポリペプチドの合成に有用である。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１−１
ＧＶＧＶＰ５ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）を超純水２５０ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１１ｇ（５８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１．７ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、更に、Ｎａ2ＳＯ4  ３５．５ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を室温（２５℃）で１時間、静置した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：７２質量％）。
【００４６】
実施例１−２
室温（２５℃）で１時間、静置したところを、室温（２５℃）で３０分間静置、その後、１００℃で１時間加熱に変更した以外は実施例１−１と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：７２．８質量％）。
【００４７】
実施例１−３
室温（２５℃）で１時間、静置したところを、１００℃で３０分間加熱に変更した以外は実施例１−１と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：６７．８質量％）。
【００４８】
比較例１−１
ＧＶＧＶＰ５００ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）を超純水２５ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１．１ｇ（５．８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）０．１７ｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を１００℃で２時間加熱した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：１６質量％）。
【００４９】
比較例１−２
ＧＶＧＶＰ５００ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）を超純水２５ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１．１ｇ（５．８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）０．１７ｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、更に、ＮａＣｌ  ２．５ｇを添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、上記で得られた溶液を１００℃で３０分間加熱した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：２８．４質量％）。
【００５０】
実施例１−４
ＮａＣｌをＭｇＳＯ4  ３ｇ（２５ｍｍｏｌ）に変更した以外は、比較例１−２と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：４６質量％）。
【００５１】
実施例１−５
ＮａＣｌをＫ2ＳＯ4  ３ｇ（１７ｍｍｏｌ）に変更した以外は、比較例１−２と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：７０質量％）。
【００５２】
試験例１  温度感受性試験（１）
実施例１−１〜１−５及び比較例１−１〜１−２で得られたＧＶＧＶＰの重合体１０ｍｇを常温（２５℃）で水１ｍＬに溶解させたところ、その溶液は無色透明であった。
次いで、この溶液を４０℃に加熱して重合体の温度感受性を試験したところ、実施例１−１〜１−５及び比較例１−１〜１−２で得られたＧＶＧＶＰの重合体は３０〜３５℃で白濁した。
この結果から、実施例１−１〜１−５及び比較例１−１〜１−２で得られたＧＶＧＶＰの重合体はエラスチンと同様の温度感受性（濁点）をもつことがわかった。
【００５３】
以下の表１に、実施例１−１〜１−５及び比較例１−１〜１−２の結果を示す。
【００５４】
【表１】
2015007034.tif 000003
【００５５】
実施例２−１
ＧＶＧＶＰ５ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）を超純水１５０ｍＬに溶解させ、これに、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）１１ｇ（５８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１．７ｇ（１１ｍｍｏｌ）を加え、更に、ＮａＣｌ  ８．５８ｇ（１４７ｍｍｏｌ）を添加し撹拌し十分に溶解させた。
次いで、μ−ｒｅａｃｔｏｒ  ＥＸ（四国計測工業社製）を用いて、上記で得られた溶液を２分間マイクロ波照射した後（周波数：２．４５ＧＨｚ、出力：１，０００Ｗ、反応温度：７０〜１００℃）、反応溶液を４℃まで冷却した。この反応溶液を撹拌し、分子量カットオフが１４０００のセルロース透析膜に入れ、水１５Ｌに対して透析を行った。その後、凍結乾燥して、ＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：３５質量％）。
【００５６】
実施例２−２
ＮａＣｌの使用量を２５．８ｇ（７３５ｍｍｏｌ）に変更した以外は実施例２−１と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：５７．６質量％）。
【００５７】
実施例２−３
ＧＶＧＶＰの使用量を５００ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）に、超純水を２００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ４．５）２５ｍＬに、ＷＳＣの使用量を１．１ｇ（５．８ｍｍｏｌ）に、ＨＯＢｔの使用量を０．１７ｇ（１．１ｍｍｏｌ）に、ＮａＣｌの使用量を１．４ｇ（２５ｍｍｏｌ）に、それぞれ変更した以外は実施例２−１と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：９質量％）。
【００５８】
実施例２−４
ＮａＣｌの使用量を４．３８ｇ（７５ｍｍｏｌ）に変更した以外は実施例２−３と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率２１．８質量％）。
【００５９】
実施例２−５
ＮａＣｌをＫＣｌ  １．８ｇ（２５ｍｍｏｌ）に変更し、リン酸緩衝液を超純水に変更した以外は実施例２−３と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：３８質量％）。
【００６０】
実施例２−６
ＮａＣｌをＭｇＳＯ4  ３ｇ（２５ｍｍｏｌ）に変更し、リン酸緩衝液を超純水に変更した以外は実施例２−３と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：４６質量％）。
【００６１】
実施例２−７
ＮａＣｌをＮａ2ＳＯ4  ３．５５ｇ（２５ｍｍｏｌ）に変更し、リン酸緩衝液を超純水に変更した以外は実施例２−３と同様にしてＧＶＧＶＰの重合体を得た（収率：７１質量％）。
【００６２】
比較例２−１
マイクロ波を照射しない以外は実施例２−１と同様にして操作したが、重合体の合成は確認されず、ＧＶＧＶＰの二量体または三量体が確認された。斯かる二量体および三量体は、濁点をもたないものだった。
【００６３】
試験例２  温度感受性試験（２）
実施例２−１〜２−７で得られたＧＶＧＶＰの重合体１０ｍｇを常温（２５℃）で水１ｍＬに溶解させたところ、その溶液は無色透明であった。
次いで、この溶液を４０℃に加熱して重合体の温度感受性を試験したところ、実施例２−１〜２−７で得られたＧＶＧＶＰの重合体は３０〜３５℃で白濁した。
この結果から、実施例２−１〜２−７で得られたＧＶＧＶＰの重合体はエラスチンと同様の温度感受性（濁点）をもつことがわかった。
【００６４】
以下の表２に、実施例２−１〜実施例２−７及び比較例２−１の結果を示す。
【００６５】
【表２】
2015007034.tif 000004
【配列表】
2015007034000001.app