(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルの励起波長が変化する状況下においても、コントラストの高い画像を、簡便な方法で得ることが可能な画像取得装置及び画像取得方法を提供する。【解決手段】レーザー光を出射し、当該レーザー光の波長を制御可能に構成された光源２と、レーザー光によりサンプルＳを走査し、当該レーザー光を受けてサンプルＳからの測定対象光の強度を測定する測定部５３と、測定された測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルＳの画像を生成する制御部６ａと、を備え、制御部６ａは、測定された測定対象光の強度分布に基づき、レーザー光の波長を制御する。【選択図】図２８
2015114420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光を出射し、当該レーザー光の波長を制御可能に構成された光源と、
前記レーザー光によりサンプルを走査し、当該レーザー光を受けて前記サンプルからの測定対象光の強度を測定する測定部と、
測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルの画像を生成する制御部と、
を備え、
前記制御部は、測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、前記レーザー光の波長を制御する、画像取得装置。
【請求項２】
前記光源は、第１の波長のレーザー光と、前記第１の波長とは異なる第２の波長のレーザー光とを切り替えて出射し、
前記測定部は、前記第１の波長及び前記第２の波長のレーザー光それぞれで、前記サンプルを走査し、前記第１の波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の第１の強度と、前記第２の波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の第２の強度とを測定し、
前記制御部は、
前記第１の波長及び前記第２の波長のうち、少なくともいずれか一方の波長を、前記第１の強度の強度分布と前記第２の強度の強度分布とに基づき制御する、
請求項１に記載の画像取得装置。
【請求項３】
前記サンプルに含まれる、互いに異なる第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の、前記第１の波長に対する蛍光相対効率をそれぞれＥ（λ１，Ｆ１）、Ｅ（λ１，Ｆ２）とし、
前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素の、前記第２の波長に対する蛍光相対効率をそれぞれＥ（λ２，Ｆ１）、Ｅ（λ２，Ｆ２）としたとき、
前記制御部は、制御前の前記第１の波長及び前記第２の波長を、以下に示す式１２で示された式が最大となるように決定する、請求項２に記載の画像取得装置。
2015114420.tif 000018
【請求項４】
前記測定部は、前記一方の波長よりも高い波長と、当該一方の波長よりも低い波長のそれぞれについて、当該波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の強度を測定し、
前記制御部は、前記高い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布と、前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布とのそれぞれのコントラストを算出して比較し、当該比較結果に基づき、前記一方の波長を、前記高い波長及び前記低い波長のうち、算出した前記コントラストが高い強度分布に対応した波長側に制御する、請求項２に記載の画像取得装置。
【請求項５】
前記制御部は、前記一方の波長の制御と、当該制御後の前記一方の波長を基準とした前記高い波長及び前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布のコントラストの比較とを繰り返すことで、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記一方の波長を制御する、請求項４に記載の画像取得装置。
【請求項６】
前記制御部は、
前記第１の波長及び前記第２の波長のうち他方の波長を固定して、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記一方の波長を制御し、
次いで、制御後の前記一方の波長を固定し、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記他方の波長を制御する、
請求項５に記載の画像取得装置。
【請求項７】
前記測定部は、前記第１の波長及び前記第２の波長それぞれを、所定の波長ずつ変更して、変更前及び変更後のそれぞれについて、前記第１の波長及び前記第２の波長それぞれのレーザー光に基づく前記測定対象光の強度を測定し、
前記制御部は、前記第１の波長及び前記第２の波長それぞれについて、変更前の前記測定対象光の強度分布と、変更後の前記測定対象光の強度分布とのそれぞれのコントラストを算出して比較し、当該比較結果に基づき、前記第１の波長及び前記第２の波長のうち、当該変更前と当該変更後との間で算出された前記コントラストの差が大きい波長を前記一方の波長とする、請求項２に記載の画像取得装置。
【請求項８】
前記第１の波長のレーザー光に基づき測定された前記測定対象光の強度分布に基づく第１の画像中において輝度が最も高い画素を示す第１の座標を（ｘ１，ｙ１）とし、
前記第２の波長のレーザー光に基づき測定された前記測定対象光の強度分布に基づく第２の画像中において輝度が最も高い画素を示す第２の座標を（ｘ２，ｙ２）とし、
前記第１の画像中における、第１の座標の輝度をＬ（λ１，ｘ１，ｙ１）、第２の座標の輝度をＬ（λ１，ｘ２，ｙ２）とし、
前記第２の画像中における、第１の座標の輝度をＬ（λ２，ｘ１，ｙ１）、第２の座標の輝度をＬ（λ２，ｘ２，ｙ２）としたとき、
前記制御部は、前記コントラストＣ（λ１，λ２）を、以下に示す式１３に基づき決定する、請求項４に記載の画像取得装置。
2015114420.tif 000019
【請求項９】
前記測定部は、出射可能な前記レーザー光の波長のうち、一の波長を基準波長として、前記基準波長よりも高い波長と、当該基準波長よりも低い波長とのそれぞれについて、当該波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の強度を測定し、
前記制御部は、前記高い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布と、前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布とのそれぞれのコントラストを算出して比較し、当該比較結果に基づき、前記レーザー光の波長を、前記基準波長から、前記高い波長及び前記低い波長のうち、算出した前記コントラストが高い強度分布に対応した波長側に制御する、請求項１に記載の画像取得装置。
【請求項１０】
前記制御部は、前記レーザー光の波長の制御と、当該制御後の波長を前記基準波長とした前記高い波長及び前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布のコントラストの比較とを繰り返すことで、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記レーザー光の波長を制御する、請求項９に記載の画像取得装置。
【請求項１１】
前記光源は、所定の周波数のポンプ光を出力するレーザー部と、光パラメトリック発振器とを備え、前記光パラメトリック発振器の発振条件を制御することで、前記レーザー光の波長を制御可能に構成されている、請求項１に記載の画像取得装置。
【請求項１２】
前記光源と、前記測定部とは、同一筐体内に設けられている、請求項１に記載の画像取得装置。
【請求項１３】
前記測定部は、前記光源から出射されたレーザー光の強度を測定し、
前記制御部は、測定された当該レーザー光の強度に基づき、前記光源から出射されるレーザー光の強度の制御と、測定された前記測定対象光の強度分布の補正との、少なくともいずれかを実行する、請求項１に記載の画像取得装置。
【請求項１４】
レーザー光の波長を制御可能に構成された光源から出射された前記レーザー光によりサンプルを走査し、当該レーザー光を受けて前記サンプルから生じる測定対象光の強度を測定することと、
測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルの画像を生成することと、
測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、前記レーザー光の波長を制御すること、
を含む画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、画像取得装置及び画像取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物やバイオテクノロジー等の分野において、生きた細胞の生理反応や形態を観察するために、各種の顕微鏡が使用される。例えば、このような各種の顕微鏡の中には、生体または非生体の測定資料（以降では、「サンプル」と呼ぶ場合がある）からの蛍光・燐光現象を観察することによって、対象を観察する顕微鏡である。例えば、特許文献１には、蛍光顕微鏡の一例が開示されている。
【０００３】
また、近年では、光源として使用されるレーザーの短波長化が可能となってきており、このような蛍光顕微鏡として、物質励起に２光子吸収過程を利用した２光子（多光子）励起顕微鏡も使われるようになってきている。
【０００４】
このような蛍光顕微鏡は、例えば、レーザー光源から出力される励起光によりサンプルを走査し、当該サンプルからの蛍光の強度分布を作成することで、当該強度分布に基づきサンプルの画像を生成する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−８２６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に説明したような蛍光顕微鏡のような光源を要する画像取得装置は、例えば、使用する蛍光色素に依ってあらかじめ決められた励起波長を投光可能な固定波長のレーザー光源を用いている場合が少なくない。
【０００７】
しかしながら、サンプル中の蛍光基体が時間の経過とともに退色する場合があり、このような場合には、励起波長が変化するため、レーザー光源から出力される励起光の波長も変える必要がある。このような状況に対して、固定波長のレーザー光源を用いる構成により対応する場合に、複数種類のレーザー光源を設ける必要があり、装置が大型化するため使用者の利便性を著しく阻害し、また、装置自体も高価になる傾向にある。
【０００８】
また、サンプル中の蛍光基体の励起波長は、退色の度合いに応じて変化するため、固定波長のレーザー光源を複数設ける構成では、操作者は使用するレーザー光源を適宜切り替えて当該蛍光基体が励起するレーザー光源を特定する必要があり、利便性が低下する場合がある。また、複数種類のレーザー光源を切り替えて用いる構成の場合には、退色が進んだサンプルから蛍光を励起できたとしても、必ずしもコントラストの高い画像を得られるとは限らない。
【０００９】
そこで、本開示では、サンプルの励起波長が変化する状況下においても、コントラストの高い画像を、より簡便な方法で得ることが可能な、新規かつ改良された画像取得装置及び画像取得方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示によれば、レーザー光を出射し、当該レーザー光の波長を制御可能に構成された光源と、前記レーザー光によりサンプルを走査し、当該レーザー光を受けて前記サンプルからの測定対象光の強度を測定する測定部と、測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルの画像を生成する制御部と、を備え、前記制御部は、測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、前記レーザー光の波長を制御する、画像取得装置が提供される。
【００１１】
また、本開示によれば、レーザー光の波長を制御可能に構成された光源から出射された前記レーザー光によりサンプルを走査し、当該レーザー光を受けて前記サンプルから生じる測定対象光の強度を測定することと、測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルの画像を生成することと、測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、前記レーザー光の波長を制御すること、を含む画像取得方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
以上説明したように本開示によれば、サンプルの励起波長が変化する状況下においても、コントラストの高い画像を、より簡便な方法で得ることが可能な画像取得装置及び画像取得方法が提供される。
【００１３】
なお、上記の効果は必ずしも限定的なものではなく、上記の効果とともに、または上記の効果に代えて、本明細書に示されたいずれかの効果、または本明細書から把握され得る他の効果が奏されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本開示の第１の実施形態に係る画像取得装置の概略的な構成の一例を示した説明図である。
【図２】蛍光について説明するための説明図である。
【図３】共焦点顕微鏡の原理について説明するための説明図である。
【図４】共焦点顕微鏡の原理について説明するための説明図である。
【図５】１光子励起による蛍光と２光子励起による蛍光との違いについて説明するための説明図である。
【図６】生体の光吸収特性について説明するためのグラフ図である。
【図７】２光子励起蛍光顕微鏡について説明するための説明図である。
【図８】顕微鏡のサンプル走査方式について説明するための説明図である。
【図９】比較例に係る画像取得装置の概略的なシステム構成の一例を示したシステム図である。
【図１０】比較例に係る画像取得装置の光学系の構成の一例を示した説明図である。
【図１１】顕微鏡ユニットの構成の一例について説明するための説明図である。
【図１２】比較例に係る画像取得装置の機能構成の一例について説明するための説明図である。
【図１３Ａ】同実施形態に係る光源の構成を詳細に示す模式図である。
【図１３Ｂ】間欠発光によりレーザーのピークパワーを高くした状態を示す特性図である。
【図１４】本開示の第１の実施形態に係る画像取得装置の光学系の構成の一例を示した説明図である。
【図１５】同実施形態に係る画像取得装置の機能構成の一例について説明するための説明図である。
【図１６】同実施形態に係る分布情報生成部及びシステム制御部の詳細な機能構成について説明するための説明図である。
【図１７】同実施形態に係る二次元化処理部の動作の一例について説明するための説明図である。
【図１８】同実施形態に係る補正処理の概要について説明するための説明図である。
【図１９】同実施形態に係るＲＡＷファイルのファイルフォーマットの一例を示した図である。
【図２０】強度分布の補正の原理について説明するための説明図である。
【図２１】強度分布の補正に係る処理の流れについて説明するためのフローチャートである。
【図２２】光源からの出射光の強度制御の原理について説明するための説明図である。
【図２３】光源からの出射光の強度制御に係る処理の流れについて説明するためのフローチャートである。
【図２４】ウォームアップ時における光源からの出射光の強度制御の原理について説明するための説明図である。
【図２５】同実施形態に係る情報処理装置の画像表示に係る一連の処理の流れを示したフローチャートである。
【図２６】同実施形態に係る情報処理装置のノイズ補正に関する処理の一例を示したフローチャートである。
【図２７】本開示の第２の実施形態に係る画像取得装置の光学系の構成の一例を示した説明図である。
【図２８】同実施形態に係る画像取得装置の機能構成の一例について説明するための説明図である。
【図２９】同実施形態に係る分布情報生成部及びシステム制御部の詳細な機能構成について説明するための説明図である。
【図３０】観測対象の指定方法の一例について説明するための図である。
【図３１】同実施形態に係るＲＡＷファイルのファイルフォーマットの一例を示した図である。
【図３２】同実施形態に係る画像取得装置の一連の動作についてその流れの一例を示したフローチャートである。
【図３３】光源から出射されるレーザー光の波長制御の原理について説明するための説明図である。
【図３４】光源から出射されるレーザー光の波長制御の原理について説明するための説明図である。
【図３５】光源から出射されるレーザー光の波長制御の原理について説明するための説明図である。
【図３６】光源から出射されるレーザー光の波長制御に係る処理の流れについて説明するためのフローチャートである。
【図３７】本開示の第３の実施形態に係る画像取得装置の機能構成の一例について説明するための説明図である。
【図３８】同実施形態に係る分布情報生成部及びシステム制御部の詳細な機能構成について説明するための説明図である。
【図３９】本開示の第４の実施形態に係る画像取得装置の概要について説明するための説明図である。
【図４０】同実施形態に係る補正処理の原理について説明するための説明図である。
【図４１】同実施形態に係る分布情報生成部及びシステム制御部の詳細な機能構成について説明するための説明図である。
【図４２】同実施形態に係るＲＡＷファイルのファイルフォーマットの一例を示した図である。
【図４３】画像取得装置のハードウェア構成の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に添付図面を参照しながら、本開示の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００１６】
なお、説明は以下の順序で行うものとする。
１．第１の実施の形態
１．１．画像取得装置の概要
１．２．顕微鏡について
１．２．１．顕微鏡の種類について：共焦点顕微鏡
１．２．２．顕微鏡の種類について：２光子励起顕微鏡
１．３．比較例に係る画像取得装置
１．３．１．光学系の構成
１．３．２．顕微鏡ユニットの構成
１．３．３．画像取得装置の機能構成
１．４．比較例に係る画像取得装置の課題
１．５．画像取得装置の構成
１．５．１．概要
１．５．２．光源の構成
１．５．３．光学系の構成
１．５．４．画像取得装置の機能構成
１．６．ＲＡＷファイルのファイルフォーマット
１．７．補正処理の詳細
１．７．１．補正の原理
１．７．２．補正に係る動作の流れ
１．８．レーザー光の強度制御の詳細
１．８．１．強度制御の原理
１．８．２．強度制御に係る動作の流れ
１．９．ウォームアップ時におけるレーザー光の強度制御
１．１０．情報処理装置の動作
１．１１．まとめ
２．第２の実施の形態
２．１．画像取得装置の概要
２．２．画像取得装置の構成
２．２．１．光学系の構成
２．２．２．画像取得装置の機能構成
２．３．ＲＡＷファイルのファイルフォーマット
２．４．画像取得装置の動作の流れ
２．５．波長制御の詳細
２．５．１．波長制御の原理：複数の観測波長により試料を観測する場合
２．５．２．波長制御の一態様：単一の観測波長により試料を観測する場合
２．６．まとめ
３．第３の実施の形態
３．１．画像取得装置の概要
３．２．画像取得装置の構成
３．２．１．光学系の構成
３．２．２．画像取得装置の機能構成
３．３．まとめ
４．第４の実施の形態
４．１．画像取得装置の概要
４．２．画像取得装置の構成
４．３．ＲＡＷファイルのファイルフォーマット
４．４．まとめ
５．ハードウェア構成
６．まとめ
【００１７】
＜１．第１の実施形態＞
［１．１．画像取得装置の概要］
まず、図１を参照しながら、本開示の第１の実施形態に係る画像取得装置の概要について説明する。図１は、本開示の第１の実施形態に係る画像取得装置の概略的な構成の一例を示した説明図である。
【００１８】
図１に示すように、本実施形態に係る画像取得装置１は、光源２と、測定部３と、制御部６と、Ｉ／Ｆ（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）７とを含む。
【００１９】
本実施形態に係る画像取得装置１は、サンプルＳを光源２から出射された光で走査し、サンプルＳから放出される蛍光を測定部３で測定することで、測定された蛍光に基づき当該サンプルＳの画像を取得する。なお、この場合の蛍光のように、サンプルＳから得られる光が「測定対象光」の一例に相当する。
【００２０】
特に、本実施形態に係る画像取得装置１は、少なくとも、光源２と測定部３とが、画像取得装置１内（即ち、同一筐体内）に設けられている。例えば、図１に示す例では、光源２と、測定部３と、制御部６と、Ｉ／Ｆ７とが、画像取得装置１内に設けられている。
【００２１】
測定部３は、後述する顕微鏡の役割を果たす顕微鏡ユニット４と、サンプルＳの走査及び当該サンプルＳから放出される蛍光の検出を担う走査系（検出系）５とを含む。
【００２２】
また、制御部６は、光源２及び測定部３の動作を制御し、測定部３で測定（検出）された光を画像に変換する。また、制御部６は、測定部３で測定（検出）された光に基づき光源２の動作を制御することで、光源２を安定的に動作させる。
【００２３】
Ｉ／Ｆ７は、画像取得装置１が、ユーザや他の装置と情報を送受信するためのインタフェースである。画像取得装置１は、例えば、当該Ｉ／Ｆ７（例えば、通信用インタフェース）を介して外部ネットワークに接続し、当該外部ネットワークを介して接続された情報処理装置８００に、制御部６で生成された画像を出力してもよい。
【００２４】
本実施形態に係る画像取得装置１の光源２、測定部３、制御部６、及びＩ／Ｆ７の詳細については、「１．５．画像取得装置の構成」として別途後述する。
【００２５】
なお、本実施形態に係る画像取得装置１は、少なくとも光源２と測定部３とが同一筐体内に設けられていれば、その他の構成（例えば、制御部６やＩ／Ｆ７）については、必ずしも画像取得装置１内に設けられていなくてもよい。例えば、光源２と測定部３とを内蔵した画像取得装置１との間で情報を送受信可能な情報処理装置を別途設け、当該情報処理装置に、制御部６と、Ｉ／Ｆ７とを設けてもよい。もちろん、情報処理装置８００側に、制御部６と、Ｉ／Ｆ７とを設けてもよいことは言うまでもない。
【００２６】
［１．２．顕微鏡について］
ここで、本実施形態に係る画像取得装置１の詳細についての説明に先立ち、本実施形態に係る画像取得装置１において、測定部３の顕微鏡ユニット４として用いられる顕微鏡について、図２〜図８を参照しながら、詳細に説明する。
【００２７】
本実施形態で着目するサンプルＳに生じている現象の一つとして、サンプルＳから放出される蛍光を挙げることができる。以下では、まず、図２を参照しながら、蛍光について簡単に説明する。図２は、蛍光について説明するための説明図である。
【００２８】
測定サンプルを構成する（又は、測定サンプルに付着する）ある分子に対して所定波長の光が照射されると、照射された光が有するエネルギーを利用して、分子中の電子が基底状態に対応するエネルギー準位から励起状態に対応するエネルギー準位に移動することがある。この際に照射された光のことを、励起光と呼ぶ。基底状態にある分子が励起されて一重項励起状態が生じると、励起された電子は、一重項励起状態に対応するエネルギー準位のいずれかへ移動することとなるが、この励起された電子は、内部転換によりエネルギーを放出しながらより低位のエネルギー準位へと移動していく。励起状態にある電子が基底状態へと戻る際にエネルギーが光として放出されることがあるが、この際に放出される光が、本実施形態で着目する蛍光である。
【００２９】
＜＜１．２．１．顕微鏡の種類について：共焦点顕微鏡＞＞
このような蛍光を観測するために利用される光学顕微鏡の一つとして、図３及び図４に示したような共焦点顕微鏡がある。以下、図３及び図４を参照しながら、共焦点顕微鏡の原理について簡単に説明する。図３及び図４は、共焦点顕微鏡の原理について説明するための説明図である。
【００３０】
図３に示した共焦点蛍光顕微鏡は、励起光としてレーザー光線を用いて、このレーザー光線を測定サンプル（蛍光標本）まで導光し、測定サンプルの焦点面で発生した蛍光を、検出器まで導光するような構成となっている。ここで、励起光として用いられるレーザー光線は、ピンホールＡを通過することによって点光源とみなすことができ、レーザー光線は、ダイクロイックミラー及び対物レンズを透過して、蛍光標本に投影される。蛍光標本では、投影されたレーザー光線の有するエネルギーにより蛍光が生じ、射出された蛍光が対物レンズにより集光され、ダイクロイックミラーにより検出器の方向へと導光される。検出器の直前にはピンホールＢが設置されており、ピンホールＢを通過した蛍光が、光電子増倍管（PhotoMultiplier  Tube：ＰＭＴ）等の検出器で検出されることとなる。
【００３１】
ここで、励起光として用いるレーザー光線の波長は、例えば測定サンプルを染色するために用いた蛍光色素の種別等に応じて、適宜選択することが可能であり、特定の波長に限定されるものではない。
【００３２】
このような共焦点蛍光顕微鏡において、ピンホールＡの設置位置と、点光源の投影位置（測定サンプルの焦点面）と、ピンホールＢの設置位置とは、光学的に互いに共役な関係となっており、この３点の共役関係を共焦点関係にあるという。
【００３３】
このとき、図４に示したように、対物レンズの焦点面（ピントのあった面）から射出された蛍光は、対物レンズによって集光されて共焦点ピンホール（図３のピンホールＢ）を通過することができるが、焦点の合っていない部分からの蛍光は、共焦点ピンホールを通過することができない。結果として、共焦点蛍光顕微鏡では、焦点の合った測定サンプルの部分のみの輝度情報を得ることができる。従って、測定サンプルの平面（試料面）を縦方向及び横方向に走査することで、焦点の合った部分のみの２次元像（光学断層像）を構築することができる。また、このような試料面の走査を、焦点位置を変えながら繰り返して異なる奥行き位置（深さ位置）にある測定サンプルからの蛍光を集積することで、奥行き位置毎の光学断層像の集合（３次元拡大画像群）を得ることができる。
【００３４】
＜＜１．２．２．顕微鏡の種類について：２光子励起顕微鏡＞＞
３次元画像を得ることが可能な他の手法として、２光子励起顕微鏡がある。図５は、２光子励起の原理を説明するための説明図である。図５の左側の図は、先だって説明した通常の蛍光の原理を示した説明図であり、ある波長の励起光（図では、波長３５０ｎｍの励起光）によって分子が励起されることで、励起光よりも長波長の蛍光（図では、波長５００ｎｍの蛍光）が射出される。このような蛍光発生の仕組みは、いわば１つの光子と分子との相互作用により分子が励起状態となることで蛍光が発生する仕組みであるため、１光子励起による蛍光発生と呼ばれている。
【００３５】
一方、図５の右側の図に示したように、１つの光子により分子が仮想準位に励起されている間に、もうひとつの光子によって更に分子が励起されることにより、分子がある励起状態へと励起され、励起状態にある分子が基底状態へと遷移することにより蛍光が発生することがある。このような蛍光発生の仕組みは、２つの光子と分子との相互作用により分子が励起状態となることで蛍光が発生する仕組みであるため、２光子励起による蛍光発生と呼ばれている。２光子励起による蛍光発生を利用することで、励起光よりも短い波長の蛍光を発生させることが可能となる（図５の例では、波長７００ｎｍの赤外光を励起光として、波長５００ｎｍの蛍光が発生している。）。
【００３６】
２光子励起が成立するためには、１つめの光子と衝突した分子が仮想準位に励起している１．０×１０−１６秒程度の極めて短い時間内に、もう１つの光子と衝突して一重項励起状態まで遷移することが求められるため、高い光子密度が必要になり、高いピーク・パワーを出力可能なレーザー光源を用いることとなる。また、１光子励起過程と比べると放出される蛍光信号が極めて微弱であるため、損失の少ない光学系や感度の良い検出器を利用することが求められる。
【００３７】
このような点にも関わらず２光子励起蛍光顕微鏡が希求される大きな理由は、２光子励起で用いられる７００ｎｍ〜１０００ｎｍ程度の赤外帯域の蛍光波長が、図６に示したように、水やヘモグロビンの吸収を受けることなく生体を透過しやすい「生体の窓」と呼ばれる波長域となっているためである。このような励起光の高い透過性のために、共焦点蛍光顕微鏡では１００μｍ程度の深さまでしか観察できないのに対して、２光子励起蛍光顕微鏡では１０００μｍ（１ｍｍ）の深さまで観察可能であると言われている。
【００３８】
また、図７に示したように、１光子励起蛍光顕微鏡では、焦点面以外にも試料の厚み方向全体にわたって分子が励起され、厚み方向全体から蛍光が射出されるのに対し、２光子励起蛍光顕微鏡では、焦点面近傍のみが励起される。このため、試料のより深い部分を明るく観察することが可能となるとともに、異なった焦点面で縦方向及び横方向の走査を繰り返し実施した場合であっても、蛍光の消退や光によるダメージを最小限に抑えることができる。また、同様の理由により光毒性を最小限に抑えることができるため、サンプルの深い位置に存在する生きた細胞を長時間に渡って観察することが可能になる。
【００３９】
また、２光子励起蛍光顕微鏡では、励起により射出された蛍光は試料内の微小領域に由来するため、その光シグナルを全て検出すれば蛍光画像を得ることができる。これにより、２光子励起蛍光顕微鏡では、顕微鏡における検出光学系を簡易化できる。すなわち、２光子励起過程では、焦点位置近傍の試料のみから蛍光が射出されるため、共焦点蛍光顕微鏡のようにピンホールを用いて余計な信号をカットする必要は無く、サンプルの近傍に検出器を配置して、全方位に拡散する蛍光信号をできるだけ多く拾うようにすればよい。
【００４０】
＜＜１．２．３．顕微鏡の走査方式について＞＞
以上説明したようなレーザー走査型の顕微鏡では、多くの場合、２種類のガルバノミラーを用いて測定サンプルのＸ方向及びＹ方向（縦方向及び横方向）の走査を行うことで、２次元画像（光学断層像）を取得している。図８では、２種類のガルバノミラーを用いた共焦点蛍光顕微鏡の構成例を示している。
【００４１】
レーザー光源から射出された励起光は、レンズ等の光学系及び共役位置に設けられたピンホールを透過した後に、励起光を透過させるとともに蛍光を反射させるダイクロイックミラーを透過する。ダイクロイックミラーを透過した励起光は、レンズ等の光学系を透過し、測定サンプルのＸ方向の走査を制御するＸ方向ガルバノミラーによりＸ座標が制御された後に、Ｙ方向の走査を制御するＹ方向ガルバノミラーによりＹ座標が制御され、対物レンズにより測定サンプル上の所望のＸＹ座標に集光される。
【００４２】
測定サンプルから射出された蛍光は、Ｙ方向ガルバノミラー及びＸ方向ガルバノミラーによって反射されて励起光と同じ経路をたどり、ダイクロイックミラーによって反射される。ダイクロイックミラーにより反射された蛍光は、共役位置に設けられたピンホールを透過した後、光電子増倍管等の検出器へと導光される。
【００４３】
ここで、測定サンプル上の集光位置を制御するために用いられる２つのガルバノミラーは、図８に模式的に示したように、ミラーに回転軸が接続されたものである。ガルバノミラーは、入力された電圧の大きさによって回転軸の回転量が制御され、ミラー面が向いている角度を高速かつ高精度に変更することができる。
【００４４】
［１．３．比較例に係る画像取得装置］
次いで、本実施形態に係る画像取得装置１の詳細について説明するにあたり、従来の画像取得装置の構成を比較例として説明することで、本実施形態に係る画像取得装置１の課題について整理する。例えば、図９は、比較例に係る画像取得装置の概略的な構成の一例を示した説明図である。図９に示すように、比較例に係る画像取得装置１ｗは、光源２ｗを画像取得装置１ｗの外部に設けている。
【００４５】
＜＜１．３．１．光学系の構成＞＞
ここで、図１０を参照しながら、比較例に係る画像取得装置１ｗの光学系の構成について、主に、サンプルＳに光源２ｗからの光を照射し、当該光により励起されることでサンプルＳから発生した蛍光を検出する部分に着目して説明する。
【００４６】
図１０に示すように、比較例に係る画像取得装置１ｗの光学系は、光源２と、ビーム整形用レンズ５１１と、ガルバノミラー５１と、レンズ５１３及び５１５と、ミラー５１７と、ダイクロイックミラー５２と、対物レンズ４２と、結像レンズ５２１と、エミッションフィルタ５２３と、光検出器５３とを含む。なお、図１０に示す例では、光検出器５３として、ＰＭＴを用いている。以降では、光検出器５３としてＰＭＴが用いられるものとし、「ＰＭＴ５３」と記載した場合には、「光検出器５３」を示すものとする。
【００４７】
光源２から出射された励起光（レーザー光）は、ビーム整形用レンズ５１１により平行光のままビーム径が拡大されてガルバノミラー５１に到達する。ガルバノミラー５１に到達した励起光は、当該ガルバノミラー５１により反射された後、レンズ５１３、ミラー５１７、及びレンズ５１５を介してダイクロイックミラー５２に導かれる。レンズ５１３、ミラー５１７、及びレンズ５１５は、ガルバノミラー５１により反射された励起光を、ダイクロックミラー５２に導くための光学系である。
【００４８】
ダイクロイックミラー５２は、到達した励起光を透過させて対物レンズ４２へ導く。対物レンズ４２は、当該励起光をサンプルＳへ集光する。そして対物レンズ４２及び結像レンズ５２１は、サンプルＳの像を所定の倍率に拡大し、当該拡大像をＰＭＴ５３の検出面に結像させる。
【００４９】
サンプルＳに励起光が照射されると、サンプルＳのある分子が、当該励起光により励起されて蛍光を発する。この蛍光は、対物レンズ４２を介してダイクロイックミラー５２により反射されて結像レンズ５２１へ到達し、結像レンズ５２１により集光されてエミッションフィルタ５２３を介してＰＭＴ５３の検出面に結像する。エミッションフィルタ５２３は、例えば、上記対物レンズ４２によって拡大された発色光以外の光（外光）を吸収することで、当該発行色のみを透過させる。当該外光が喪失された発色光の像は、ＰＭＴ５３上に結像される。
【００５０】
＜＜１．３．２．顕微鏡ユニットの構成＞＞
次に、図１１を参照しながら、顕微鏡ユニット４の構成の一例について説明する。図１１は、顕微鏡ユニット４の構成の一例について説明するための説明図である。図１４に示すように、顕微鏡ユニット４は、非偏光ビームスプリッタ４１及び４４と、対物レンズ４２と、フィルタ４３と、カメラ４５と、アイピース４６とを含む。なお、図１１に示す例において、走査系（検出系）５ｗの各構成は、図１０に示した光学系において同様の符号が付された構成に対応している。また、図１１に示す例では、図１０に示した構成のうち一部を省略している。
【００５１】
光源２ｗから出射された励起光（レーザー光）は、走査系（検出系）５ｗを介して顕微鏡ユニット４内の非偏光ビームスプリッタ４１に導光される。非偏光ビームスプリッタ４１は、走査系（検出系）５ｗを介して導光された励起光を、対物レンズ４２に向けて反射させる。対物レンズ４２は、図１０に示した光学系における対物レンズ４２に相当する。
【００５２】
対物レンズ４２は、当該励起光をサンプルＳへ集光する。これにより、サンプルＳのある分子が、当該励起光により励起されて蛍光を発する。サンプルＳから発生した励起光は、対物レンズ４２を介して非偏光ビームスプリッタ４１に導光される。非偏光ビームスプリッタ４１は、対物レンズ４２を介して導光された蛍光を、走査系（検出系）５ｗとフィルタ４３との双方に向けて分岐させる。
【００５３】
フィルタ４３は、対物レンズ４２及び非偏光ビームスプリッタ４１を介して導光された発光色を選択的に透過させる。具体的な一例として、フィルタ４３として、エミッションフィルタを適用することも可能である。この場合には、当該フィルタ４３は、発色光以外の光（外光）を吸収し、発光色のみを透過させる。当該外光が喪失された発色光の像は、非偏光ビームスプリッタ４４に導光される。非偏光ビームスプリッタ４４は、フィルタ４３を介して導光された発色光の像を、カメラ４５及びアイピース４６の双方に向けて分岐させる。このような構成により、ユーザは、アイピース４６を介して導光されたサンプルの像を観測したり、当該サンプルの像をカメラ４５により撮影することが可能となる。
【００５４】
また、走査系（検出系）５ｗに向けて導光された蛍光は、ダイクロイックミラー５２に反射されてＰＭＴ５３に導光され、ＰＭＴ５３で検出される。なお、ＰＭＴ５３で検出された蛍光に基づく処理については、制御部６ｗの動作として後述する。
【００５５】
＜＜１．３．３．画像取得装置の機能構成＞＞
次に、図１２を参照しながら、比較例に係る画像取得装置１ｗの機能構成について、特に、制御部６ｗと、Ｉ／Ｆ７との構成に着目して説明する。
【００５６】
図１２に示すように、比較例に係る画像取得装置１ｗは、装置の外部に光源２を接続し、光源２から出射される励起光を、走査系（検出系）５ｗと顕微鏡ユニット４とを介してサンプルＳに照射する。このとき、後述するシステム制御部６１により、ガルバノミラー５１の動作が制御されることで、励起光によりサンプルＳ上が走査される。
【００５７】
そして、照射された励起光によりサンプルＳから生じた蛍光は、顕微鏡ユニット４を介して走査系（検出系）５ｗに導かれ、走査系（検出系）５ｗのＰＭＴ５３で検出される。ＰＭＴ５３は、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、検出された蛍光を光電効果により電気信号に変換し、当該蛍光の強度を示すデータとして制御部６ｗに出力する。
【００５８】
制御部６ｗは、システム制御部６１ｗと、二次元化処理部６２ｗと、補正処理部６３ｗと、画像処理部６４と、ＲＡＷ画像生成部６５と、記憶部６６と、表示制御部６７と、通信制御部６８とを含む。また、Ｉ／Ｆ７は、条件指定部７１と、表示部７２と、通信部７３とを含む。
【００５９】
システム制御部６１ｗは、条件指定部７１を介してユーザから指定された測定条件に基づき、光源２及びガルバノミラー５１の動作を制御する。条件指定部７１は、測定および画像取得に係る条件（以降では、総じて「測定条件」と呼ぶ場合がある）をユーザが指定するための入力Ｉ／Ｆである。例えば、ユーザは、測定条件として、光源２の出力、及びサンプルＳ上の走査に係る走査条件（例えば、走査される範囲や、生成される画像の解像度）を、条件指定部７１を介して指定することが可能である。
【００６０】
システム制御部６１ｗは、ユーザから測定条件として指定された走査条件に基づきガルバノミラー５１の動作を制御し、当該制御の内容を示す制御情報を後述する二次元化処理部６２ｗに出力する。
【００６１】
二次元化処理部６２ｗは、ＰＭＴ５３で検出された（測定された）蛍光の強度を示すデータを、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、当該ＰＭＴ５３から逐次取得する。また、二次元化処理部６２ｗは、ガルバノミラー５１の制御内容を示す制御情報をシステム制御部６１ｗから逐次取得する。これにより、二次元化処理部６２ｗは、ＰＭＴ５３から取得した蛍光の強度を示すデータが、システム制御部６１ｗから取得した制御情報に基づき、サンプルＳ上のどの位置のデータに相当するかを認識することが可能となる。即ち、二次元化処理部６２ｗは、ＰＭＴ５３から逐次取得した蛍光の強度を示すデータを、システム制御部６１ｗから取得した制御情報に基づき並べて二次元化することで、検出された蛍光の強度分布を生成する。
【００６２】
二次元化処理部６２ｗにより生成された蛍光の強度分布は、例えば、補正処理部６３ｗによりノイズ除去等の補正処理が施されて画像処理部６４に出力される。画像処理部６４は、補正処理施された強度分布に対して、圧縮処理等の画像処理を施すことで画像データを生成する。
【００６３】
画像処理部６４は、生成した画像データを、例えば、表示制御部６７に出力する。また、画像処理部６４は、生成した画像データを、通信制御部６８に出力してもよい。また、画像処理部６４は、生成した画像データを、記憶部６６に記憶させてもよい。
【００６４】
ＲＡＷ画像生成部６５は、二次元化処理部６２ｗから蛍光の強度分布を取得し、当該蛍光の強度分布を画像データ（ＲＡＷ画像）として、所定のファイルフォーマットに整形することでＲＡＷファイルを生成する。このとき、ＲＡＷ画像生成部６５は、蛍光の強度分布の取得条件（例えば、撮影時のパラメタのような撮影条件や走査条件）のように、当該蛍光の強度分布に関連する情報をシステム制御部６１ｗから取得し、取得した情報を関連情報として、生成したＲＡＷファイルに関連付けてもよい。なお、関連情報は、ＲＡＷファイルの付帯情報としてＲＡＷファイル内に記録されてもよいし、ＲＡＷファイルとは別ファイルとして関連付けられていてもよい。なお、以降では、これらの態様を総じて、単に「関連付ける」と記載する場合がある。
【００６５】
ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルを、例えば、通信制御部６８に出力する。また、ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルを、記憶部６６に記憶させてもよい。
【００６６】
記憶部６６は、画像取得装置１ｗ内で使用される各種制御データや、画像取得装置１ｗ内で生成されたデータ（例えば、画像データやＲＡＷファイル）を記憶するための記憶部である。記憶部６６は、例えば、データベースとして構成されていてもよい。また、記憶部６６は、例えば画像処理のような各種処理を実行するために一時的に作成されるデータを記憶するための記憶領域として使用されてもよい。
【００６７】
表示制御部６７は、画像処理部６４から画像データを取得し、取得した画像データを表示部７２に表示させる。表示部７２は、例えば、ディスプレイのような情報を表示するための出力Ｉ／Ｆである。これにより、ユーザは、サンプルＳの画像を、表示部７２を介して確認することが可能となる。
【００６８】
また、表示制御部６７は、画像取得装置１ｗを操作するためのＵ／Ｉ（Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｆａｃｅ）を表示部７２に表示させてもよい。なお、表示制御部６７がＵ／Ｉを生成するための制御データは、例えば、記憶部６６にあらかじめ記憶させておけばよい。
【００６９】
通信制御部６８は、画像取得装置１ｗが、情報処理装置８００のような外部装置とネットワークを介してデータを送受信するために、当該外部装置との間で通信を行う通信部７３の動作を制御する。通信制御部６８は、例えば、画像取得装置１ｗ内で生成された画像データやＲＡＷファイルを取得し、取得した当該データを、通信部７３を制御することで、ネットワークを介して情報処理装置８００に送信する。これにより、例えば、生成された画像データやＲＡＷファイルを、画像取得装置１ｗよりも画像処理能力の高い情報処理装置８００で処理することが可能となる。
【００７０】
［１．４．比較例に係る画像取得装置の課題］
以上説明したように、比較例に係る画像取得装置１ｗは、光源２ｗを画像取得装置１ｗの外部に設けており（即ち、外付けしている）、光源２ｗと画像取得装置１ｗとを含む一連のシステムが大型化する傾向にある。これに対して、本実施形態に係る画像取得装置１は、光源２（即ち、レーザーモジュール）を筐体内に内蔵することにより小型化を図っている。
【００７１】
一方で、光源２を測定部３や制御部６と同一筐体内に設けた場合には、光源２が、当該測定部３や制御部６と近接して設けられることとなる。そのため、測定部３や制御部６の発熱により、光源２の動作が不安定となり、例えば、光源２から出力されるレーザー光の強度が変化し、当該強度の変化が、生成した画像中にノイズとして顕在化する場合がある。
【００７２】
特に、本実施形態に係る画像取得装置１のように、顕微鏡ユニット４（例えば、二光子励起顕微鏡）の観測結果を画像化する場合には、サンプルＳを走査することで画像を生成するため、撮影速度が、走査に用いるガルバノミラー５１の制御速度や、ＰＭＴ５３の検波速度に依存する。このような構成のため、所謂カメラのような撮像素子を用いて画像を生成する機器に比べて撮影速度が遅い場合が多く、画像サイズの増大に比例して撮影速度が遅くなる傾向にある。そのため、光源２から出射される励起光をサンプルＳに照射し、当該サンプルＳからの蛍光を基に画像を生成する構成の場合には、光源２から出射されるレーザー光の強度の熱変動が、画像上にノイズとして顕在化する場合が少なくない。
【００７３】
［１．５．画像取得装置の構成］
＜＜１．５．１．概要＞＞
本実施形態に係る画像取得装置１は、上記課題を鑑みて、光源２を装置内（同一筐体内）に内蔵することで小型化を図り、かつ、光源２から出射されるレーザー光の熱変動に伴うノイズを低減し、より鮮明な画像を取得可能とするためになされたものである。
【００７４】
具体的には、本実施形態に係る画像取得装置１は、光源２から出射されるレーザー光の強度を測定し、測定されたレーザー光の強度分布に基づき、光源２から出射されるレーザー光の強度の制御と、生成された画像の補正との少なくともいずれかを実行する。
【００７５】
例えば、本実施形態に係る画像取得装置１は、生成された画像を、測定されたレーザー光の強度分布に基づき補正することで、当該画像上に顕在化したレーザー光の熱変動に伴うノイズを低減することが可能となる。
【００７６】
また、本実施形態に係る画像取得装置１は、測定されたレーザー光の強度分布に基づき、当該レーザー光の強度を制御することで、熱変動により不安定になったレーザー光を安定させることが可能となる。
【００７７】
以降では、本実施形態に係る画像取得装置１について、まず、光源２の構成の一例について説明し、次いで、本実施形態に係る画像取得装置１の光学系及び機能構成について説明する。なお、顕微鏡ユニット４の構成は、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗと同様のため、詳細な説明は省略する。
【００７８】
＜＜１．５．２．光源の構成＞＞
まず、本実施形態に係る画像取得装置１で使用される光源２の構成の一例について説明する。本実施形態に係る画像取得装置１では、光源２として、例えば、光パラメトリック発振器のような発振部を備え、当該発振部の発振条件を変更することで、出射するレーザー光の波長を変更可能に構成された光源を用いる。以下に、図１３Ａを参照しながら、光源２の構成の一例について説明する。図１３Ａは、光源２の構成の一例について詳細に示した模式図である。
【００７９】
光源２は、モードロック発振型レーザーと光アンプを組み合わせたＭＯＰＡ２１０と、波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０とから構成されている。ＭＯＰＡ２１０は、モードロックレーザー部(Mode  Locked  Laser  Diode)２２０と、光アイソレータ部２３０と、光増幅器部（ＳＯＡ部）２４０とを有している。
【００８０】
また、図２の下段には、モードロックレーザー部２２０、光増幅器部２４０、波長変換モジュール２５０から出力されるそれぞれのレーザー光のパルス波形Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３と、後述する間欠駆動のためのパルス波形Ｐ１をそれぞれ示している。
【００８１】
モードロックレーザー部２２０は、半導体レーザー２２２と、半導体レーザー２２２から出射したレーザー光を通過させるレンズ２２４、バンドパスフィルタ２２６、ミラー２２８の各素子とを含んで構成されている。バンドパスフィルタ２２６は、ある波長範囲の光を透過させて、範囲外の光は通さないという機能を有する。そして、半導体レーザー２２２の後方端面のミラーと、ミラー２２８との間に、外部共振器（空間共振器）が構成され、この外部共振器の行路長により、モードロックレーザー部２２０から出射されるレーザー光の周波数が決まる。これにより、強制的に特定の周波数にロックさせることができ、レーザー光のモードをロックすることができる。
【００８２】
モードロックレーザー部２２０は、外部共振器を構成することにより、通常の半導体レーザーよりも長い周期（例えば、１ＧＨｚ程度）で短いパルスを同期させることができる。このため、モードロックレーザー部２２０から出力されるレーザー光Ｌ１は、平均パワーが低く、ピークが高いものとなり、生体に対するダメージが少なく、光子効率が高いものとなる。
【００８３】
光アイソレータ部２３０は、モードロックレーザー部２２０の後段に配置されている。光アイソレータ部２３０は、光アイソレータ２３２とミラー２３４とを含んで構成される。光アイソレータ部２３０は、後段の光学部品等において反射した光が、半導体レーザー２２２に入射することを防ぐ機能を有している。
【００８４】
光増幅器部（ＳＯＡ部）２４０は、半導体レーザー２２２から出射されたレーザー光を増幅変調する光変調部として機能し、光アイソレータ部２３０の後段に配置されている。モードロックレーザー部２２０から出力されるレーザーは、そのパワーが比較的小さいため、光増幅器部２４０によって増幅される。この光増幅器部２４０は、ＳＯＡ（Semiconductor  Optical  Amp）、即ち、半導体光増幅器２４２と、半導体光増幅器２４２を制御するＳＯＡドライバ２４４とから構成されている。半導体光増幅器２４２は、小型かつ低コストの光増幅器であり、また、光をオン・オフする光ゲート、光スイッチとして用いることができる。本実施の形態においては、この半導体光増幅器２４２のオン・オフによって、半導体レーザー２２２から出射したレーザー光を変調する。
【００８５】
光増幅器部（ＳＯＡ部）２４０では、制御電流（直流）の大きさに応じてレーザー光が増幅される。更に、光増幅器部２４０は、増幅の際に図２に示すパルス波形Ｐ１の制御電流で間欠駆動を行うことにより、パルス波形Ｌ１のレーザー光を所定の周期Ｔでオン・オフし、間欠的なレーザー光（パルス波形Ｌ２）を出力する。このように所望のタイミングと周期のパルス波形を生成する事により、システムが有する制御信号と同期させることができる。このように、例えばＭＯＰＡ型の光源の場合は、前段の発振部のパルスを増幅する後段部の半導体光増幅器２４２（Semiconductor  Optical  Amplifier略してＳＯＡと記す）において間欠駆動する事により、間欠駆動を実現する事が出来る。ＭＯＰＡ型の光源の場合、光増幅器部２４０（半導体光増幅器２４２）は、間欠発光部として機能する。
【００８６】
本実施形態ではＭＬＬＤを用いているため、半導体レーザー２２２から出力されるレーザー光の周波数は、一例として５００ＭＨｚ〜１ＧＨｚであり、パルス幅は０．５〜１．０［ｐｓ］程度である。後述するように、発振同期信号注入部３１６から発信同期信号を注入することにより、ＳＯＡ部による間欠駆動の同期に加えて半導体レーザー２２２から出力される発振パルスについてもシステムが有する制御信号と同期させることが可能である。なお、ＴｉＳａを用いる場合、レーザー光の発振周波数は４０ＭＨｚ〜８０ＭＨｚ程度、パルス幅は０．１〜０．２［ｐｓ］程度であるのに対して、ＭＬＬＤを用いることでより高い発振周波数のレーザー光を出力することが可能である。
【００８７】
本実施形態において、光増幅器部２４０から出力されるレーザー光の波長は、一例として４０５ｎｍである。４０５ｎｍの波長は比較的吸収が多い波長であるため、生体の奥に到達して高い密度で二光子の効果を生じさせる波長（９００ｎｍ〜１３００ｎｍ程度）に変換する。このため、光増幅器部２４０から出力されたレーザー光は、後段の波長変換モジュール２５０に入力され、波長変換モジュール２５０のＬＢＯ２５２によって波長変換される。
【００８８】
波長変換モジュール２５０のＬＢＯ２５２は、一例として、入力されたレーザー光（パルス波形Ｌ２）を２つの波長に変換する。なお、変換した２つの波長のレーザー光のうち、一方がシグナル光に相当し、他方がアイドラー光に相当する。本実施形態に係る光源２では、シグナル光及びアイドラー光のうち、一方のレーザー光を、波長変換モジュール２５０から外部に出力し、対象物（サンプルＳ）に照射する。
【００８９】
なお、図１３Ａに示す例では、変換した２つの波長のレーザー光のうち、長波長のレーザー光（パルス波形Ｌ３）が、シグナル光として波長変換モジュール２５０から出力され、対象物（サンプルＳ）に照射される。この場合には、変換した２つの波長のレーザー光のうち、短波長のレーザー光が、アイドラー光に相当となる。
【００９０】
ところで、生体のレーザー顕微鏡観察においては、対象物のダメージを少なくするために、レーザーの平均パワーを低くして、ピークパワーを高くすることが有効である。また、半導体レーザーを用いたＭＯＰＡ型光源を構成するレーザーチップは、小型であるが故に、高電力の負荷による発熱によって動作限界が定まることが考えられる。
【００９１】
本実施形態の光源２においては、間欠的なレーザー光（パルス波形Ｌ２）を出力して間欠運転を行うため、間欠運転を行わない場合と比較すると、平均電力は同じであるにも関わらず、発光している際のピークを高めることができる。また、間欠運転を行うことにより、高電力の負荷による発熱も抑えることができる。
【００９２】
本実施形態では、二光子励起の光源２として用いており、光源２は２つの光子で蛍光体を励起する。特に二光子励起の光源を用いる顕微鏡においては、性能指数(Figure  of  Merit)としてＦＯＭ（＝（ピークパワー）２×パルス幅×周波数＝ピークパワー×平均パワー）が知られている。この性能指数によれば、ピークパワーと平均パワーの積に比例して、出力を増加させることができる。従って、生体のレーザー顕微鏡観察において、対象物のダメージを最小限に抑えて出力を高めるためには、平均パワーを低くしてピークパワーを高くすることが有効である。このため、本実施形態では、間欠運転を行うことでデューティ（ＤＵＴＹ＝パルス幅×周波数）比を低くして、ピークパワーを高くしている。
【００９３】
図１３Ｂは、間欠発光によりレーザーのピークパワーを高くした状態を示す特性図である。図１３Ｂの上段では一光子励起の場合の特性を示しており、上段の左側の特性は連続発光のピークパワーを、右側の特性はＤＵＴＹ比を５０％とした場合の間欠発光のピークパワーを示している。このように、間欠発光のＤＵＴＹ比を５０％とした場合、連続発光の信号強度（Ｉ０）に対して、間欠発光の場合は２倍の信号強度（２×Ｉ０）を出力することができる。
【００９４】
また、図１３Ｂの中段は二光子励起の場合の特性を示しており、左側の特性は連続発光のピークパワーを、右側の特性はＤＵＴＹ比を５０％とした場合の間欠発光のピークパワーを示している。性能指数ＦＯＭによれば、二光子励起の場合はピークパワーの２乗で性能指数が高くなる。従って、間欠発光の場合、二光子励起の信号強度（＝４×Ｉ０２）は連続発光の信号強度（＝Ｉ０２）に対して４倍となる。また、パルス発光ポイントとパルス非発光ポイントの平均の信号強度においても、二光子励起の平均信号強度（＝２×Ｉ０２）は、連続発光の信号強度（＝Ｉ０２）に対して２倍となる。従って、本実施形態によれば、二光子励起の光源２において間欠駆動を行うことにより、ピークパワーおよび平均信号強度を高めることが可能である。
【００９５】
図１３Ｂの下段の特性は、中段の特性を帯域制限のローパスフィルタに通過させた信号を示している。帯域制限のローパスフィルタによる処理をＡ／Ｄ変換前に入れるため、オン／オフのデューティ比が５０％（１／２）の場合、Ａ／Ｄ変換前の信号振幅は１／２となり、結果として、二光子励起の間欠発光では２倍の信号振幅を得ることができる。また、オン／オフのデューティ比が１／ｎの場合、ピークパワーがｎ倍になるのであれば、二光子励起で得られる信号振幅はｎ倍になるのでデューティは小さい方が望ましいが、実際には光源２から得られるピークパワーには上限があるので、デューティ比は１以下の適切な値が選ぶことが好適である。
【００９６】
＜＜１．５．３．光学系の構成＞＞
次に、図１４を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１の光学系の構成について、特に、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗの光学系の構成（図１０参照）と異なる部分に着目して説明する。
【００９７】
前述したように、本実施形態に係る画像取得装置１では、光源２は、波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０を備え、入力されたレーザー光（ポンプ光）を２つの波長のレーザー光（即ち、シグナル光及びアイドラー光）に変換して出力する。本実施形態に係る画像取得装置１では、光源２から出力されるシグナル光及びアイドラー光のうち、いずれか一方を励起光としてサンプルＳに向けて照射する。図１４に示す例では、シグナル光を励起光としてサンプルＳに向けて照射する構成としている。
【００９８】
なお、励起光をサンプルＳに向けて照射する構成については、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗの光学系（図１０参照）と同様である。即ち、光源２から出射された励起光は、ビーム整形用レンズ５１１、ガルバノミラー５１、レンズ５１３、ミラー５１７、レンズ５１５及びダイクロイックミラー５２を介して対物レンズ４２に導光され、当該対物レンズ４２によりサンプルＳに向けて集光される。
【００９９】
また、サンプルＳに励起光が照射されると、サンプルＳのある分子が、当該励起光により励起されて蛍光を発し、当該蛍光が、対物レンズ４２、ダイクロイックミラー５２、結像レンズ５２１、及びエミッションフィルタ５２３を介してＰＭＴ５３の検出面に結像する。このとき、エミッションフィルタ５２３により、上記対物レンズ４２によって拡大された、発色光以外の光（外光）が吸収され（即ち、発光色のみが透過し）、当該外光が喪失された発色光の像が、ＰＭＴ５３上に結像される。
【０１００】
また、本実施形態に係る画像取得装置１では、ＰＤ（Photo  Detector）５４を設け、シグナル光及びアイドラー光のうち、励起光として使用した一方とは異なる他方の強度を検出する。図１４に示す例では、ＰＤ５４は、光源２から出射されるアイドラー光の強度を測定している。
【０１０１】
＜＜１．５．４．画像取得装置の機能構成＞＞
次に、図１５を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１の機能構成の一例について、特に、制御部６の構成に着目して説明する。なお、図１５に示す例において、走査系（検出系）５の各構成は、図１４に示した光学系において同様の符号が付された構成に対応している。また、図１５に示す例では、図１４に示した構成のうち一部を省略している。
【０１０２】
図１５に示すように、本実施形態に係る画像取得装置１は、装置内部（筐体内部）に光源２を備え、光源２から出射される励起光を走査系（検出系）５と顕微鏡ユニット４とを介してサンプルＳに照射する。このとき、システム制御部６１により、ガルバノミラー５１の動作が制御されることで、励起光によりサンプルＳ上が走査される。なお、以降では、説明をわかりやすくするために、光源２から出射されるシグナル光及びアイドラー光のうち、シグナル光を励起光として使用するものとして説明する。
【０１０３】
照射された励起光によりサンプルＳから生じた蛍光は、顕微鏡ユニット４を介して走査系（検出系）５に導かれ、走査系（検出系）５のＰＭＴ５３で検出される。ＰＭＴ５３は、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、検出された蛍光を光電効果により電気信号に変換し、当該蛍光の強度を示すデータとして制御部６に出力する。
【０１０４】
また、本実施形態に係る画像取得装置１の走査系（検出系）５は、ＰＤ５４を備え、当該ＰＤ５４により、アイドラー光の強度を、あらかじめ設定されたサンプリングレートで測定する。ＰＤ５４は、測定したアイドラー光の強度を電気信号に変換し、当該アイドラー光の強度を示すデータとして制御部６に出力する。
【０１０５】
なお、ＰＤ５４に替えて、励起光（シグナル光）の強度を測定するＰＤ５６を設けてもよい。この場合には、サンプルＳに向けて照射される励起光（シグナル光）の光路上にビームスプリッタ５５を設け、サンプルＳに向けて導光される励起光（シグナル光）の一部を、ＰＤ５６に向けて分岐させればよい。なお、以降では、走査系（検出系）５には、アイドラー光の強度を測定するＰＤ５４が設けられているものとして説明する。
【０１０６】
制御部６は、システム制御部６１と、分布情報生成部６２と、補正処理部６３と、画像処理部６４と、ＲＡＷ画像生成部６５と、記憶部６６と、表示制御部６７と、通信制御部６８とを含む。また、Ｉ／Ｆ７は、条件指定部７１と、表示部７２と、通信部７３とを含む。なお、記憶部６６、表示制御部６７、通信制御部６８、条件指定部７１、表示部７２、及び通信部７３の動作は、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗと同様のため、詳細な説明は省略する。
【０１０７】
システム制御部６１は、条件指定部７１を介してユーザから指定された測定条件に基づき、光源２及びガルバノミラー５１の動作を制御する。条件指定部７１は、測定および画像取得に係る測定条件をユーザが指定するための入力Ｉ／Ｆである。例えば、ユーザは、測定条件として、光源２の出力、及びサンプルＳ上の走査に係る走査条件（例えば、走査される範囲や、生成される画像の解像度）を、条件指定部７１を介して指定することが可能である。
【０１０８】
システム制御部６１は、ユーザから測定条件として指定された走査条件に基づきガルバノミラー５１の動作を制御し、当該制御の内容を示す制御情報を後述する二次元化処理部６２１及び６２５に出力する。ここまでの動作は、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗ（図１２参照）と同様である。
【０１０９】
なお、システム制御部６１は、あらかじめ決定された測定条件を示す制御情報に基づき、光源２やガルバノミラー５１の動作を制御してもよい。例えば、サンプルＳが既知の場合には、当該サンプルＳに対応してあらかじめ作成された制御情報に基づき、光源２から出力されるレーザー光の波長や出力を制御してもよい。なお、これらの制御情報は、例えば、記憶部６６にあらかじめ記憶させておいてもよい。
【０１１０】
また、本実施形態に係るシステム制御部６１は、アイドラー光の強度に基づく強度分布を示すデータを、後述する分布情報生成部６２から取得し、取得したデータに基づき、光源２の動作を制御する。
【０１１１】
ここで、図１６を参照しながら、システム制御部６１の更に詳細な構成について説明する。図１６は、本実施形態に係る分布情報生成部６２及びシステム制御部６１の詳細な機能構成について説明するための説明図である。図１６に示すように、システム制御部６１は、強度制御量決定部６１１を含む。
【０１１２】
強度制御量決定部６１１は、後述する分布情報生成部６２の二次元化処理部６２１から、ＰＤ５４で測定されたアイドラー光の強度に基づく強度分布を示すデータを取得する。また、強度制御量決定部６１１は、後述する分布情報生成部６２の強度補正分布決定部６２３から補正量の最大幅の通知を受ける。強度制御量決定部６１１は、取得したアイドラー光の強度分布を示すデータと補正量の最大幅とに基づき、光源２の状態（特に、励起光の強度の変化）を監視する。
【０１１３】
また、強度制御量決定部６１１は、監視結果に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度を制御するための制御情報を生成する。システム制御部６１は、強度制御量決定部６１１が生成した制御情報に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度を制御する。
【０１１４】
このような構成により、例えば、システム制御部６１は、光源２の動作が不安定となった場合（例えば、出射されるレーザー光の強度に揺らぎが生じた場合）に、光源２が安定的に動作するように、当該光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度を制御することが可能となる。なお、システム制御部６１による、光源２の制御、即ち、光源２から出射されるレーザー光の強度制御の詳細については、「１．８．レーザー光の強度制御の詳細」として別途後述する。
【０１１５】
次に、図１５及び図１６を参照しながら、分布情報生成部６２の詳細について説明する。図１６に示すように、分布情報生成部６２は、二次元化処理部６２１と、強度補正分布決定部６２３と、二次元化処理部６２５とを含む。
【０１１６】
二次元化処理部６２１は、ＰＤ５４で検出された（測定された）アイドラー光の強度を示すデータを、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、当該ＰＤ５４から逐次取得する。また、二次元化処理部６２１は、ガルバノミラー５１の制御内容を示す制御情報をシステム制御部６１から逐次取得する。これにより、二次元化処理部６２１は、ＰＤ５４から取得したアイドラー光の強度を示すデータがサンプルＳ上のどの位置のデータに相当するかを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき認識することが可能となる。即ち、二次元化処理部６２１は、ＰＤ５４から逐次取得したアイドラー光の強度を示すデータを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき並べて二次元化することで、検出されたアイドラー光の強度分布を生成する。
【０１１７】
ここで、図１７を参照する。図１７は、二次元化処理部６２１の動作の一例について説明するための説明図である。図１７において、参照符号Ｃ１１は、ガルバノミラー５１の制御内容、即ち、励起光によるサンプルＳ上の走査の内容を模式的に示している。二次元化処理部６２１は、ＰＤ５４から逐次取得したアイドラー光の強度を示すデータを、制御情報が示す走査の内容に基づき並べることで二次元化して、強度分布Ｄ２１を生成する。
【０１１８】
なお、前述の通り、光源２から出力されるレーザー光（ポンプ光）の強度は、画像取得装置１内の各機器（例えば、測定部３や制御部６）の発熱の影響を受けて変化する場合がある。このとき、ポンプ光の強度の変化に伴い、当該ポンプ光と同様に、シグナル光及びアイドラー光の強度も変化する。そのため、アイドラー光の強度の変化が、例えば、ＰＤ５４で変換された電気信号の強弱として表れることとなる。
【０１１９】
なお、生成された強度分布Ｄ２１のうち、走査方向が切り替わる端部の領域Ｄ２１１ａ及びＤ２１１ｂを不要分として削除し、それ以外の領域Ｄ２１０を有効部分としてもよい。不要部分Ｄ２１１ａ及びＤ２１１ｂの削除は、例えば、二次元化処理部６２１が行ってもよいし、後述する補正処理部６３が行ってもよい。また、後述する二次元化処理部６２５が、ＰＭＴ５３で検出された蛍光の強度に基づく強度分布を生成する場合の動作についても、図１７を参照しながら説明した二次元化処理部６２１の動作と同様である。
【０１２０】
二次元化処理部６２１は、生成したアイドラー光の強度分布を示すデータ（以降では、単に「アイドラー光の強度分布」と呼ぶ場合がある）を、強度補正分布決定部６２３及び強度制御量決定部６１１に出力する。
【０１２１】
強度補正分布決定部６２３は、二次元化処理部６２１からアイドラー光の強度分布を取得する。強度補正分布決定部６２３は、取得したアイドラー光の強度分布を基に、後述する補正処理部６３が、蛍光の強度分布を補正するための補正データを生成する。
【０１２２】
また、強度補正分布決定部６２３は、ウォームアップ期間中にアイドラー光の強度分布をあらかじめ取得しておき、当該ウォームアップ期間中のアイドラー光の強度分布に基づき、補正量の最大幅を算出してもよい。なお、このようにして算出された補正量の最大幅は、光源２から出射されるレーザーの強度の変動による光子数の時間変動に基づく、蛍光の強度分布の補正量及び光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度の制御量の最大幅（マージン）を示している。そのため、強度補正分布決定部６２３は、算出した補正量の最大幅を、強度制御量決定部６１１に通知してもよい。
【０１２３】
強度補正分布決定部６２３は、アイドラー光の強度分布をＲＡＷ画像生成部６５に出力し、当該アイドラー光の強度分布に基づき生成した補正データを、補正処理部６３に出力する。
【０１２４】
二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３で検出された（測定された）蛍光の強度を示すデータを、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、当該ＰＭＴ５３から逐次取得する。また、二次元化処理部６２５は、ガルバノミラー５１の制御内容を示す制御情報をシステム制御部６１から逐次取得する。これにより、二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３から取得した蛍光の強度を示すデータがサンプルＳ上のどの位置のデータに相当するかを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき認識することが可能となる。即ち、二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３から逐次取得した蛍光の強度を示すデータを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき並べて二次元化することで、検出された蛍光の強度分布を生成する。
【０１２５】
二次元化処理部６２５は、生成した蛍光の強度分布を示すデータ（以降では、単に「蛍光の強度分布」と呼ぶ場合がある）を補正処理部６３及びＲＡＷ画像生成部６５に出力する。
【０１２６】
補正処理部６３は、二次元化処理部６２５から蛍光の強度分布を取得する。また、補正処理部６３は、強度補正分布決定部６２３からアイドラー光の強度分布に基づき生成された補正データを取得する。
【０１２７】
補正処理部６３は、蛍光の強度分布を補正データに基づき補正する。ここで、補正処理部６３による補正の概要について図１８を参照しながら説明する。本実施形態に係る補正処理の概要について説明するための説明図である。図１８において、参照符号Ｄ１１は、二次元化処理部６２５で生成された蛍光の強度分布を模式的に示している。また、参照符号Ｄ２１は、二次元化処理部６２１で生成されたアイドラー光の強度分布を模式的に示している。また、参照符号Ｄ１０は、補正処理後の蛍光の強度分布（即ち、ＲＡＷ画像）を示している。
【０１２８】
なお、前述の通り、光源２から出力されるレーザー光（ポンプ光）の強度は、画像取得装置１内の各機器の発熱の影響を受けて変化する場合があり、当該ポンプ光と同様に、シグナル光及びアイドラー光の強度も変化する。そのため、シグナル光の強度変化が、蛍光の強度分布にノイズとして顕在化し、同様に、アイドラー光の強度変化が、アイドラー光の強度分布にノイズとして顕在化することとなる。一方で、シグナル光及びアイドラー光は、波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０によりポンプ光が変換されて出力される。そのため、シグナル光の強度変化とアイドラー光の強度変化とは常に同調している。即ち、シグナル光の強度とアイドラー光の強度とは常に比例関係にある。
【０１２９】
そのため、本実施形態に係る補正処理部６３では、このような性質を利用して、シグナル光の強度変化に基づき蛍光の強度分布に顕在化したノイズを、アイドラー光の強度分布に基づき生成された補正データにより補正する。補正処理部６３は、補正データにより補正された蛍光の強度分布を画像処理部６４に出力する。
【０１３０】
なお、上述した強度補正分布決定部６２３による補正データの生成と、補正処理部６３による当該補正データに基づく蛍光の強度分布の補正に係る動作の詳細については、「１．７．補正処理の詳細」として別途後述する。
【０１３１】
画像処理部６４は、補正データにより補正された蛍光の強度分布を取得する。画像処理部６４は、補正後の蛍光の強度分布に対して、圧縮処理等の画像処理を施すことで画像データを生成する。
【０１３２】
画像処理部６４は、生成した画像データを、例えば、表示制御部６７に出力する。また、画像処理部６４は、生成した画像データを、通信制御部６８に出力してもよい。また、画像処理部６４は、生成した画像データを、記憶部６６に記憶させてもよい。
【０１３３】
また、上記に示した補正データＤ２１に基づく蛍光の強度分布Ｄ１１に対する補正処理は、例えば、情報処理装置８００のような外部装置で行ってもよい。そのため、本実施形態に係るＲＡＷ画像生成部６５は、蛍光の強度分布Ｄ１１を画像データ（ＲＡＷ画像）として生成したＲＡＷファイルＤ１に対して、アイドラー光の強度分布Ｄ２１を関連付けてもよい。
【０１３４】
このように、ＲＡＷファイルＤ１にアイドラー光の強度分布Ｄ２１を関連付けておくことで、当該ＲＡＷファイルＤ１を読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、補正処理部６３と同様に、レーザー強度の変動に伴うノイズを補正することが可能となる。
【０１３５】
ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルを、例えば、通信制御部６８に出力する。また、ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルを、記憶部６６に記憶させてもよい。
【０１３６】
以上、図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１４〜図１８を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１の構成について説明した。次に、本実施形態に係る画像取得装置１の各構成の更に詳細な内容について説明する。
【０１３７】
［１．６．ＲＡＷファイルのファイルフォーマット］
まず、図１９を参照しながら、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１のファイルフォーマットの一例について説明する。図１９は、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１のファイルフォーマットの一例を示した図である。
【０１３８】
図１９に示すように、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１は、例えば、データ領域ｄ１０と、基本制御情報領域ｄ３０と、拡張領域ｄ２０とを含む。
【０１３９】
データ領域ｄ１０は、画像データ（実データ）を格納するための領域である。図１９に示すように、例えば、データ領域ｄ１０は、ＲＡＷ本画像ｄ１１と、子画像用ＩＦＤ（Ｉｍａｇｅ  Ｆｉｌｅ  ｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ）ｄ１２と、子画像ｄ１２１とを含む。ＲＡＷ本画像ｄ１１は、ＲＡＷ画像を示している。本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１では、ＲＡＷ本画像ｄ１１として、蛍光の強度分布Ｄ１１が格納される。なお、ＲＡＷ本画像ｄ１１として格納される蛍光の強度分布Ｄ１１は、１枚（１スライス）とは限らない。例えば、ＸＹ方向（平面方向）に走査されて作成された蛍光の強度分布Ｄ１１が、Ｚ方向（深さ方向）に沿って複数枚取得された場合には、当該複数枚の蛍光の強度分布Ｄ１１が、ＲＡＷ本画像ｄ１１としてＲＡＷファイルＤ１に格納されてもよい。
【０１４０】
また、データ領域ｄ１０には、画像処理が施された画像データや、拡大・縮小画像のデータのような画像処理が施された画像を、子画像として別途格納できるようにしてもよい。この場合には、例えば、子画像を格納するための子画像用ＩＦＤｄ１２を設け、当該子画像用ＩＦＤｄ１２内に子画像ｄ１２１を格納すればよい。なお、子画像用ＩＦＤｄ１２が、ＲＡＷファイルＤ１中における子画像ｄ１２１の位置（アドレス）を示す役割も果たす。
【０１４１】
また、基本制御情報領域ｄ３０には、あらかじめ決められた種別の情報が制御情報として記録される。例えば、基本制御情報領域ｄ３０は、メイン画像及び撮影情報ＩＦＤｄ３１と、セット再生用ＪＰＥＧｄ３２と、平文部メーカーノートＩＦＤｄ３３とを含む。メイン画像及び撮影情報ＩＦＤｄ３１は、例えば、再生用に使用する画像データや、撮影情報（例えば、ＥＸＩＦ（Exchangeable  image  file  format）のようなメタ情報）を格納するためのＩＦＤである
【０１４２】
メイン画像及び撮影情報ＩＦＤｄ３１には、例えば、画像の再生に用いられる画像データ（例えば、圧縮処理が施されたデータ）がセット再生用ＪＰＥＧｄ３２として格納されている。
【０１４３】
また、平文部メーカーノートＩＦＤｄ３３は、画像取得装置１の機種情報や、暗号化などのフォーマットを示す情報が制御情報として記憶される。なお、これらの制御情報については、例えば、記憶部６６にあらかじめ記憶させておき、ＲＡＷ画像生成部６５が当該制御情報を記憶部６６から読み出して、ＲＡＷファイルＤ１に埋め込めばよい。
【０１４４】
拡張領域ｄ２０は、メーカーノートＩＦＤｄ２１を含む。メーカーノートＩＦＤｄ２１は、カメラ制御モードなどのＥＸＩＦに規定されていない情報を格納するためのＩＦＤであり、画像取得装置１に固有の撮影情報や制御情報も格納される。
【０１４５】
本実施形態に係るメーカーノートＩＦＤｄ２１は、例えば、撮影条件ｄ２１１と、アイドラー光強度画像ｄ２１２と、サーボ信号画像ｄ２１３と、ウォームアップ時の撮影画像ｄ２１４と、改竄防止信号ｄ２１５と、自動トラッキング調整時の被写体画像ｄ２１６と、撮影間同期信号ｄ２１７とを含む。
【０１４６】
撮影条件ｄ２１１は、ＲＡＷ画像（即ち、蛍光の強度分布）の取得時の撮影条件のうち、ＥＸＩＦに規定されていない条件を示す制御情報である。撮影条件ｄ２１１には、各条件を示す制御情報が、例えば、パラメタテーブルの形式で格納されている。
【０１４７】
アイドラー光強度画像ｄ２１２は、アイドラー光の強度分布Ｄ２１を示している。なお、ＲＡＷ本画像ｄ１１として蛍光の強度分布Ｄ１１が複数枚記録されている場合には、当該複数枚の蛍光の強度分布Ｄ１１それぞれに対応したアイドラー光の強度分布Ｄ２１が、アイドラー光強度画像ｄ２１２として記録される。また、アイドラー光強度画像ｄ２１２として、アイドラー光の強度分布Ｄ２１に替えて、当該アイドラー光の強度分布Ｄ２１に基づき算出された補正データを用いてもよい。
【０１４８】
このように、ＲＡＷファイルＤ１にアイドラー光強度画像ｄ２１２を格納しておくことで、当該ＲＡＷファイルＤ１を読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、前述した補正処理部６３と同様に、ＲＡＷ本画像ｄ１１を補正することが可能となる。
【０１４９】
サーボ信号画像ｄ２１３は、システム制御部６１による光源２から出射されるレーザー光の強度制御のためのサーボ信号を、走査条件に基づき二次元化したデータである。このようなサーボ信号画像ｄ２１３を、ＲＡＷファイルＤ１内に格納しておくことで、当該ＲＡＷファイルＤ１を読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、蛍光の強度分布（即ち、ＲＡＷ画像）の取得時に、光源２に対してどのような制御が行われていたかを認識することが可能となる。そのため、例えば、外部装置は、ＲＡＷファイルＤ１内のサーボ信号画像ｄ２１３に基づき認識した制御内容に応じて、蛍光の強度分布（即ち、ＲＡＷ画像）のに対して施される画像処理の内容（制御パラメタ）を適宜変更することも可能となる。
【０１５０】
ウォームアップ時の撮影画像ｄ２１４は、ウォームアップ時に取得したアイドラー光の強度分布や蛍光の強度分布を二次元化した画像である。このように、ＲＡＷファイルＤ１に、ウォームアップ時の撮影画像ｄ２１４を記録しておくことで、例えば、当該ＲＡＷファイルＤ１を読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、ウォームアップ期間中のレーザー光の強度の変化を推定することが可能となる。なお。ウォームアップ時の撮影画像ｄ２１４は、少なくともウォームアップ期間中に撮影を開始した場合にＲＡＷファイルＤ１に記録されればよく、それ以外の場合については含まなくてもよい。また、ウォームアップ期間中に撮影を行う場合の動作の詳細については、「１．９．ウォームアップ時におけるレーザー光の強度制御」として別途後述する。
【０１５１】
改竄防止信号ｄ２１５は、ＲＡＷファイルＤ１中の少なくとも一部のデータが改竄された場合に、当該改竄を検出するための信号（データ）である。改竄防止信号ｄ２１５の具体的な一例として、スティッキービット（Sticky  bit）等が挙げられる。
【０１５２】
自動トラッキング調整時の被写体画像ｄ２１６は、例えば、トラッキングや拡大／縮小を行った場合に、当該トラッキングや拡大／縮小の結果として取得された画像を示している。なお、自動トラッキング調整時の被写体画像ｄ２１６に替えて、トラッキングや拡大／縮小に係る制御の内容を示す情報を記録してもよい。
【０１５３】
撮影間同期信号ｄ２１７は、複数枚の蛍光の強度分布Ｄ１１が、ＲＡＷ本画像ｄ１１としてＲＡＷファイルＤ１に格納されている場合に、各蛍光の強度分布Ｄ１１の取得に係る各撮影のタイミングを示す信号である。
【０１５４】
以上、図１９を参照しながら、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１のファイルフォーマットについて説明した。なお、上記に示すＲＡＷファイルＤ１のファイルフォーマットはあくまで一例であり、必ずしも全ての情報を含まなくてもよいことは言うまでもない。また、アイドラー光強度画像ｄ２１２、サーボ信号画像ｄ２１３、及びウォームアップ時の撮影画像ｄ２１４のような画像データは、当該画像データを再現するために必要な情報が記録されれば、必ずしも二次元化されたデータとして記録する必要はない。例えば、画像データの各画素に相当するデータの羅列を、走査条件を示す制御情報（即ち、データの羅列を二次元化するための情報）とあわせて記録してもよいことは言うまでもない。
【０１５５】
［１．７．補正処理の詳細］
次に、図２０及び図２１を参照しながら、本実施形態に係る制御部６による、アイドラー光の強度分布に基づく補正データの生成と、当該補正データに基づく蛍光の強度分布の補正に係る動作の詳細について説明する。
【０１５６】
＜＜１．７．１．補正の原理＞＞
まず、図２０を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１における蛍光の強度分布の補正の原理について説明する。図２０は、強度分布の補正の原理について説明するための説明図である。図２０に示すように、光源２を構成するＯＰＯレーザーモジュールのうち、ＭＯＰＡ光源（固定波長）から出力されるポンプ光の周波数をνｐ、シグナル光の周波数をνｓ、アイドラー光の周波数をνｉとする。
【０１５７】
ここで、周波数νの光の光子１つあたりのエネルギーＥは、プランク乗数ｈ、光の速度ｃ、及び光の波長λとした場合に、以下に示す式１で表される。
【０１５８】
【数１】
2015114420.tif 000003
【０１５９】
ここで、レーザー強度の変動による光子数の時間変動をｎ（ｔ）とした場合には、ポンプ光の周波数νｐ、シグナル光の周波数νｓ、及びアイドラー光の周波数νｉは、以下に式２で表される条件を満たす。
【０１６０】
【数２】
2015114420.tif 000004
【０１６１】
このとき、ｈ＊νｓ＊ｎ（ｔ）のエネルギーを有するシグナル光で励起した場合に、サンプルＳ上の座標（ｘ，ｙ，ｚ）で発生する蛍光の空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、以下に示す式３で表される。
【数３】
2015114420.tif 000005
【０１６２】
なお、上記に示した式３において、Ｓ（ｃ／νｓ）は、吸収発光効率を示しており、Ｑ（ｘ，ｙ，ｚ）は、観測対象（即ち、サンプルＳ）の空間蛍光濃度分布を示している。
【０１６３】
式３に示すように、一般的には、空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）には、レーザー強度の変動に伴う光子数の時間変動ｎ（ｔ）が残存することとなる。
【０１６４】
これに対して、本実施形態に係る制御部６は、ＰＤ５４で検出されたアイドラー光の強度分布に基づき、レーザー強度の変動に伴う光子数の時間変動ｎ（ｔ）を推定する。
【０１６５】
具体的には、サンプルＳ上の座標（ｘ，ｙ，ｚ）を走査しているときのアイドラー光の強度ＰＤｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、ポンプ光の強度の変動に伴い、シグナル光と同様に変動するため、以下に示す式４で表される。
【０１６６】
【数４】
2015114420.tif 000006
【０１６７】
制御部６は、上記に示した式４に基づき、時間変動ｎ（ｔ）を算出し、算出した時間変動ｎ（ｔ）に基づき、式３で示した空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）を補正する。なお、補正後の空間蛍光強度をＰＭＴｉｎ’（ｘ，ｙ，ｚ）とした場合には、当該空間蛍光強度をＰＭＴｉｎ’（ｘ，ｙ，ｚ）は、以下に示す式５で表される。
【０１６８】
【数５】
2015114420.tif 000007
…（式５）
【０１６９】
なお、上記に示した式５において、（ｈ＊νｉ）／ＰＤｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）が補正データに相当する。即ち、強度補正分布決定部６２３は、取得したアイドラー光の強度分布が示す座標（ｘ，ｙ，ｚ）ごとの強度ＰＤｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）に基づき当該補正データを算出することとなる。
【０１７０】
＜＜１．７．２．補正に係る動作の流れ＞＞
次に、図２１を参照しながら、アイドラー光の強度分布に基づく補正データの生成と、当該補正データに基づく蛍光の強度分布の補正に係る動作の流れについて説明する。図２１は、強度分布の補正に係る処理の流れについて説明するためのフローチャートである。なお、本説明ではウォームアップが終了しサンプルＳの観測時における処理に注目して説明することとし、サンプルＳの観測の前段階として、ウォームアップ期間中にアイドラー光の強度分布をあらかじめ取得しておくものとして説明する。
【０１７１】
（ステップＳ１０１）
分布情報生成部６２の二次元化処理部６２１は、ＰＤ５４で検出された（測定された）アイドラー光の強度を示すデータを、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、当該ＰＤ５４から逐次取得する。また、二次元化処理部６２１は、ガルバノミラー５１の制御内容を示す制御情報をシステム制御部６１から逐次取得する。二次元化処理部６２１は、ＰＤ５４から逐次取得したアイドラー光の強度を示すデータを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき並べて二次元化することで、検出されたアイドラー光の強度分布を生成する。なお、このとき二次元化処理部６２１は、アイドラー光の強度分布のうち、不要部分を破棄し、有効部分のみをアイドラー光の強度分布としてもよい。二次元化処理部６２１は、生成したアイドラー光の強度分布を、強度補正分布決定部６２３及び強度制御量決定部６１１に出力する。
【０１７２】
また、分布情報生成部６２の二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３で検出された（測定された）蛍光の強度を示すデータを、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、当該ＰＭＴ５３から逐次取得する。また、二次元化処理部６２５は、ガルバノミラー５１の制御内容を示す制御情報をシステム制御部６１から逐次取得する。二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３から逐次取得した蛍光の強度を示すデータを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき並べて二次元化することで、検出された蛍光の強度分布を生成する。なお、このとき二次元化処理部６２５は、蛍光の強度分布のうち、不要部分を破棄し、有効部分のみを蛍光の強度分布としてもよい。二次元化処理部６２５は、生成した蛍光の強度分布を補正処理部６３及びＲＡＷ画像生成部６５に出力する。
【０１７３】
（ステップＳ１０３）
なお、二次元化処理部６２１及び二次元化処理部６２５より生成された、アイドラー光の強度分布及び蛍光の強度分布それぞれに対して、分布情報生成部６２によりノイズ除去処理が施されてもよい。アイドラー光の強度分布及び蛍光の強度分布それぞれに対してノイズ除去処理を施す態様については、「第４の実施形態」として別途後述する。
【０１７４】
（ステップＳ１０５）
強度補正分布決定部６２３は、あらかじめ取得したウォームアップ期間中のアイドラー光の強度分布に基づき、当該アイドラー光の強度の最大値及び平均値を取得し、最大値／平均値に基づき補正量の最大幅を算出する。強度補正分布決定部６２３は、算出した補正量の最大幅を、強度制御量決定部６１１に通知する。これにより、強度制御量決定部６１１は、光源２から出射されるレーザーの強度の変動による光子数の時間変動を推定し、レーザー光（ポンプ光）の強度の制御量の最大幅（マージン）を決定することが可能となる。なお、レーザー光（ポンプ光）の強度制御の詳細については、「１．８．レーザー光の強度制御の詳細」として別途後述する。
【０１７５】
（ステップＳ１０７）
また、強度補正分布決定部６２３は、サンプルＳの観測時に二次元化処理部６２１から取得したアイドラー光の強度分布に基づき、蛍光の強度分布を補正するための補正データを生成する。具体的には、強度補正分布決定部６２３は、サンプルＳ上の座標（ｘ，ｙ，ｚ）におけるアイドラー光の強度をＰＤｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）とした場合に、（ｈ＊νｉ）／ＰＤｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）に基づき、補正データを生成する。なお、ｈはプランク定数を示し、νｉはアイドラー光の周波数を示している。強度補正分布決定部６２３は、アイドラー光の強度分布をＲＡＷ画像生成部６５に出力し、当該アイドラー光の強度分布に基づき生成した補正データを、補正処理部６３に出力する。
【０１７６】
（ステップＳ１０９）
ＲＡＷ画像生成部６５は、二次元化処理部６２５から取得した蛍光の強度分布を画像データ（ＲＡＷ画像）として、所定のファイルフォーマットに整形することでＲＡＷファイルを生成する。このとき、ＲＡＷ画像生成部６５は、Ｚ方向（深さ方向）に沿って複数枚取得された一連の蛍光の強度分布を、画像データとしてＲＡＷファイルを生成してもよい。
【０１７７】
（ステップＳ１１１）
また、ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルに対して、強度補正分布決定部６２３から取得したアイドラー光の強度分布を関連付ける。なお、ＲＡＷ画像生成部６５は、Ｚ方向（深さ方向）に沿って複数枚取得された一連の蛍光の強度分布がＲＡＷファイルに画像データとして記録されている場合には、当該一連の蛍光の強度分布それぞれに対応するアイドラー光の強度分布をあわせて関連付ける。
【０１７８】
このように、ＲＡＷファイルにアイドラー光の強度分布を関連付けておくことで、当該ＲＡＷファイルＤ１を読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、蛍光の強度分布に顕在化したレーザー強度の変動に伴うノイズを補正することが可能となる。
【０１７９】
ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルを、例えば、通信制御部６８に出力する。また、ＲＡＷ画像生成部６５は、生成したＲＡＷファイルを、記憶部６６に記憶させてもよい。
【０１８０】
（ステップＳ１１３）
補正処理部６３は、二次元化処理部６２５から蛍光の強度分布を取得する。また、補正処理部６３は、強度補正分布決定部６２３からアイドラー光の強度分布に基づき生成された補正データを取得する。補正処理部６３は、前述した式５に基づき、補正データにより蛍光の強度分布を補正する。
【０１８１】
このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１は、シグナル光の強度変化に基づき蛍光の強度分布に顕在化したノイズを、アイドラー光の強度分布に基づき生成された補正データにより補正することが可能となる。
【０１８２】
［１．８．レーザー光の強度制御の詳細］
＜＜１．８．１．強度制御の原理＞＞
次に、図２２及び図２３を参照しながら、本実施形態に係る制御部６による、光源２から出力されるレーザー光（ポンプ光）の強度の制御に係る処理の詳細について説明する。
【０１８３】
まず、図２２を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１におけるレーザー光の強度制御の原理について説明する。図２２は、光源２からの出射光の強度制御の原理について説明するための説明図である。図２２に示すように、光源２を構成するＯＰＯレーザーモジュールのうち、ＭＯＰＡ光源（固定波長）から出力されるポンプ光の周波数をνｐ、シグナル光の周波数をνｓ、アイドラー光の周波数をνｉとする。
【０１８４】
例えば、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗのように、光源２ｗを画像取得装置１ｗの外部に設ける構成の場合には、光源２ｗに対して細かい制御を行うことが困難な場合が少なくない。このような場合には、例えば、出力されるレーザー光の強度の変動に伴う光子数の時間変動ｎ（ｔ）を見越して、空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）が、下記に示す式６で表される最大空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ＿ｍａｘ（ｘ，ｙ，ｚ）となるように設計する。
【０１８５】
【数６】
2015114420.tif 000008
【０１８６】
なお、上記に示した式６において、ｎ＿ｍａｘ（ｔ）は、光子数の時間変動ｎ（ｔ）の最大値を示しており、Ｑ＿ｍａｘ（ｘ，ｙ，ｚ）は、観測対象（即ち、サンプルＳ）の空間蛍光濃度分布の最大値を示している。
【０１８７】
即ち、比較例に係る画像取得装置１ｗのように、光源２ｗに対して細かい制御を行うことが困難な場合には、時間変動ｎ（ｔ）の最大値を見越して設計を行うため、空間蛍光濃度分布Ｑ（ｘ，ｙ，ｚ）に対して、ダイナミックレンジ全体を使うことが困難であった。
【０１８８】
これに対して、本実施形態に係る制御部６は、ＰＤ５４で検出されたアイドラー光の強度分布に基づき、レーザー強度の変動を監視し、レーザー強度の変動に追随して当該レーザー強度の制御を行う。
【０１８９】
具体的には、レーザー強度の変動のうち、撮影時間に対して十分に大きい緩やかな変化分をｎｌ（ｔ）、撮影時間内の変化をｎｈ（ｔ）とした場合には、制御部６は、ｎ（ｔ）＝ｎｌ（ｔ）＋ｎｈ（ｔ）の関係にあるように分離する。そのうえで、制御部６は、ｎｌ（ｔ）に対して、アイドラー光の強度に比例した負帰還をかけることにより、撮影時間に対して十分短いレイテンシｔｌを持つ強度制御をかける。この時の空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、以下に示す式７で表される。
【０１９０】
【数７】
2015114420.tif 000009
【０１９１】
上記に示した式７において、ｎｌの変動に対してｔｌが十分に短い場合には、上記式７は、以下に示す式８に近似できる。
【０１９２】
【数８】
2015114420.tif 000010
【０１９３】
また、前述した補正処理を併用した場合には、上記に示した式８において、ｎｈ＜＜ｎｌとみなせるため、上記式８は、以下に示す式９に近似できる。
【０１９４】
【数９】
2015114420.tif 000011
【０１９５】
即ち、空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）が、下記に示す式１０で表されることとなるため、レーザー光の強度の変動に伴う光子数の時間変動ｎ（ｔ）を考慮する必要がなくなり、ダイナミックレンジのほぼ全体を使用することが可能となる。
【０１９６】
【数１０】
2015114420.tif 000012
【０１９７】
＜＜１．８．２．強度制御に係る動作の流れ＞＞
次に、図２３を参照しながら、光源２から出力されるレーザー光（ポンプ光）の強度の制御に係る動作の流れについて説明する。図２３は、光源からの出射光の強度制御に係る処理の流れについて説明するためのフローチャートである。
【０１９８】
（ステップＳ２０１）
まず、測定の開始前に光源２に用いられているレーザー光源（例えば、モードロックレーザー部２２０の半導体レーザー２２２）の個体差については、当該レーザー光源の制御パラメタに基づきあらかじめ決められた基準状態に調整しておく。なお、本調整は、レーザー光源の個体差に基づく調整であり、熱変動に伴うレーザー強度の調整とは異なる。
【０１９９】
次いで、システム制御部６１の強度制御量決定部６１１は、分布情報生成部６２の強度補正分布決定部６２３から、ウォームアップ期間中のアイドラー光の強度分布に基づく補正量の最大幅（即ち、ウォームアップ期間中のアイドラー光の強度の最大値／平均値）を取得する。強度制御量決定部６１１は、取得した補正量の最大幅に基づき、レーザー光（ポンプ光）の強度制御目標の最大値ｎ＿ｍａｘを決定する。具体的な一例として、取得した補正量の最大幅が２の場合には、強度制御量決定部６１１は、レーザー光（ポンプ光）の強度のダイナミックレンジのうち、当該補正量の最大幅の逆数、即ち１／２の範囲を使用するように、強度制御目標の最大値ｎ＿ｍａｘを決定する。
【０２００】
（ステップＳ２０３）
強度制御量決定部６１１は、決定した強度制御目標の最大値ｎ＿ｍａｘに基づき、アイドラー光の強度の制御目標最大値ＰＤｉｎ＿ｍａｘを、下記に示す式１１に基づき算出する。なお、下記に示す式１１において、ｈはプランク定数を示しており、νｉはアイドラー光の周波数を示している。
【０２０１】
【数１１】
2015114420.tif 000013
【０２０２】
（ステップＳ２０５）
また、強度制御量決定部６１１は、分布情報生成部６２の二次元化処理部６２１からアイドラー光の強度分布のうち、直近（例えば、直前の１撮影）に取得された１撮影分の強度分布に基づき、アイドラー光の強度の平均ＰＤｉｎ＿ａｖｅを算出する。
【０２０３】
（ステップＳ２０７）
次いで、強度制御量決定部６１１は、アイドラー光の強度分布を直近で取得された複数枚（例えば、２撮影分）にわたってパターンマッチングによりレーザー光の安定性を評価し、重み付け係数Ｗを０＜Ｗ≦１の範囲で決定する。なお、Ｗ＝１は、レーザー光が安定している場合に対応しており、係数Ｗが低くなるほどレーザー光がより不安定な状態に対応していることとなる。
【０２０４】
具体的な一例として、強度制御量決定部６１１は、パターンマッチングによりアイドラー光の強度分布を複数枚比較してその差を数値化し、当該差を所定の閾値と比較することでレーザー光の安定性を評価してもよい。この場合には、強度制御量決定部６１１は、算出した差が閾値以下の場合には、レーザー光が安定している状態と判断しＷ＝１を設定する。また、強度制御量決定部６１１は、算出した差が閾値を超える場合には、レーザー光が不安定な状態と判断し、係数Ｗを、０＜Ｗ＜１の範囲であらかじめ決められた値に設定する。
【０２０５】
また、他の一例として、強度制御量決定部６１１は、アイドラー光の強度分布間の比較に応じて算出した差に基づき、係数Ｗを０＜Ｗ≦１の範囲で動的に決定してもよい。具体的には、強度制御量決定部６１１は、算出した差が大きい場合（即ち、不安定な場合）には、Ｗをより０に近い値に設定し、算出した差が小さい場合（即ち、比較的安定している場合）には、Ｗをより１に近い値に設定すればよい。
【０２０６】
（ステップＳ２０９）
係数Ｗを決定したら、強度制御量決定部６１１は、光源２から出射されるレーザー光の制御後の強度を、制御後の強度＝制御前の強度＊（ＰＤｉｎ＿ｍａｘ＋１）／（ＰＤｉｎ＿ａｖｅ＋１）＊Ｗの条件式に基づき算出する。
【０２０７】
（ステップＳ２１１）
システム制御部６１は、強度制御量決定部６１１が算出した、制御後の強度に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度が制御されるように、光源２を制御する。このとき、システム制御部６１が、１撮影単位（即ち、蛍光の強度分布１枚分の撮影内）以内に、レーザー光の強度が制御されるようにフィードバック制御を行うことが望ましい。
【０２０８】
（ステップＳ２１３）
システム制御部６１がレーザー光の強度を制御したら、強度制御量決定部６１１は、レーザー光（ポンプ光）の強度が制御された後に光源２から出射されるアイドラー光の強度分布に基づきレーザー光が安定しているか否かを判定する。
【０２０９】
以上のようにして、システム制御部６１は、レーザー光が安定しているか否かを逐次判定し、当該判定結果に基づき重み付け係数Ｗを決定して、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度の制御を実行する。
【０２１０】
なお、システム制御部６１は上述した一連の動作を、光源２がレーザー光を出射している期間中は継続的に実行してもよいし、所定のタイミングごとに定期的（間欠的）に実行してもよい。
【０２１１】
上述した一連の動作を所定のタイミングごとに定期的に実行する場合には、システム制御部６１は、ステップＳ２１３において、一連の動作を停止するか否かの判断を行えばよい。具体的には、システム制御部６１は、ステップＳ２０７〜Ｓ２１１に係る一連の動作（即ち、レーザー光の監視と、監視結果に基づくフィードバック処理）をレーザー光が安定するまで繰り返し実行する（ステップＳ２１３、Ｎｏ）。そして、レーザー光が安定したら（ステップＳ２１３、Ｙｅｓ）、システム制御部６１は、レーザー光（ポンプ光）の強度の制御に係る一連の動作を停止すればよい。
【０２１２】
このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１は、内蔵される機器（例えば、測定部３や制御部６）の発熱により光源２の動作が不安定になった場合においても、光源２から出射されるレーザー光の強度を制御することで、光源２を安定的に動作させることが可能となる。
【０２１３】
［１．９．ウォームアップ時におけるレーザー光の強度制御］
次に、フォームアップ時におけるレーザー光の強度制御について説明する。レーザーモジュールから出力されるレーザー光の強度は、前述の通り、温度に依存する場合が少なくない。そのため、光源２としてレーザーモジュールを利用する場合には、多くの場合、出力されるレーザー光の強度を安定化させるためにウォームアップを行ってから使用する。
【０２１４】
一方で、レーザーモジュールのウォームアップには、長い時間を要する場合が少なくはなく、このウォームアップの時間が、サンプルＳの観測に係る作業の時間を圧迫する場合がある。そこで、本実施形態に係る画像取得装置１では、レーザー光の強度を制御することで、ウォームアップ中のようにレーザー光の強度が不安定な状態下においても、当該レーザー光を安定化させて、サンプルＳの観測を可能とする。
【０２１５】
以下に、本実施形態に係る画像取得装置１の、ウォームアップ時におけるレーザー光の強度制御の例について、図２４を参照しながら説明する。図２４は、ウォームアップ時における光源２からの出射光の強度制御の原理について説明するための説明図である。図２４に示す例では、本実施形態に係る制御部６による、ウォームアップ時におけるフィードバック制御を、ラプラス変換により時間応答に変換して示した図である。
【０２１６】
図２２に基づき前述した構成の場合には、所謂、比例成分Ｋ１と積分成分Ｋ２／ｓとに基づくフィードバック制御、即ち、ＰＩ制御となる。しかしながら、ウォームアップ期間中のようにレーザー光の強度が不安定な場合には、比例成分Ｋ１と積分成分Ｋ２／ｓとに基づくフィードバック制御のみ（即ち、ＰＩ制御）では即応性に欠ける場合がある。
【０２１７】
特に、ウォームアップ期間中は、前述した式７として示した空間蛍光強度ＰＭＴｉｎ（ｘ，ｙ，ｚ）の条件式において、撮影時間に対して十分に大きい緩やかな変化分ｎｌ（ｔ）に対して、レイテンシｔｌが十分に短いとはみなせなくなる。そのため、例えば、光源２から出射されるレーザー光の強度の変化に、周期性を持った変化分が顕在化する場合がある。
【０２１８】
そこで、本実施形態に係る画像取得装置１は、フィードバック制御に対して微分成分Ｋ３ｓに基づく制御を追加することでＰＩＤ制御とし、即応性の改善を行う。
【０２１９】
具体的には、画像取得装置１の制御部６は、ウォームアップ期間における波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０の伝達関数Ｇ（ｓ）を演算して蓄積することで、蓄積された伝達関数Ｇ（ｓ）に基づく予測演算により、微分成分Ｋ３ｓを算出する。なお、制御部６は、例えば、光源２から出射されるレーザー光の強度を制御するための制御情報に基づき波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０への入力を演算し、検出されたアイドラー光の強度を出力として伝達関数Ｇ（ｓ）を算出すればよい。そして、画像取得装置１は、算出した微分成分Ｋ３ｓに基づき、光源２から出射されるレーザー光の強度を制御することで、周期性を持った変化分の顕在化を抑制する。
【０２２０】
具体的な一例として、画像取得装置１は、蓄積されたＯＰＯの伝達関数Ｇ（ｓ）に基づき、レーザー光の強度の変化の周期性を予測し、予測した周期と逆異相のフィードバック制御をかけることで、周期性を持った変化を抑制してもよい。
【０２２１】
このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１は、ウォームアップ期間中のように、光源２から出射されるレーザー光の強度が不安定な状態においても、当該光源２から出射されるレーザー光の強度制御に係る即応性を改善することが可能となる。そのため、画像取得装置１に依れば、例えば、ウォームアップ期間が完了していない状態（出射されるレーザー光の強度が不安定な状態）においても、サンプルＳの観測を開始することが可能となる。
【０２２２】
なお、ウォームアップ期間の完了前に観測を開始した場合には、微分成分Ｋ３ｓに基づく制御量が、出射されるレーザー光の周期的変化の変化量よりも大きく、当該微分成分Ｋ３ｓによる制御の影響がノイズとして残存する場合もある。そのため、画像取得装置１は、ウォームアップ期間の完了前に観測を開始する場合には、当該観測の開始前に蛍光ビーズのような既知のサンプルを用いて、蛍光の強度分布とアイドラー光の強度分布とを取得しておいてもよい。この場合には、画像取得装置１は、サンプルＳの観測結果に基づき作成されたＲＡＷファイルに、観測前にあらかじめ取得した蛍光の強度分布とアイドラー光の強度分布とを、当該ＲＡＷファイルにウォームアップ時の撮影画像として関連付けてもよい（図１９参照）。
【０２２３】
このような構成により、例えば、ＲＡＷファイルを取得した外部装置（例えば、情報処理装置８００）は、当該ＲＡＷファイルに関連付けられたウォームアップ時の撮影画像に基づき、レーザー光の強度の変化を推測することが可能となる。そのため、ＲＡＷファイル中の観測結果（即ち、蛍光の強度分布）に、微分成分Ｋ３ｓによる制御の影響がノイズとして残存した場合においても、当該外部装置は、レーザー光の強度の変化を推測して当該ノイズを補正することが可能となる。
【０２２４】
以上説明したように、本実施形態に係る画像取得装置１に依れば、ウォームアップ期間が完了していない状態（出射されるレーザー光の強度が不安定な状態）においても、サンプルＳの観測を開始することが可能となる。そのため、本実施形態に係る画像取得装置１に依れば、ウォームアップにより観測が不可能な期間が短縮されるため、結果として、サンプルＳの観測時間を短縮することが可能となる。
【０２２５】
［１．１０．情報処理装置の動作］
次に、情報処理装置８００が、画像取得装置１から取得したＲＡＷファイルＤ１に基づき、サンプルＳの画像を生成し、生成した画像に対して画像処理を施してユーザに提示する処理の一例について、図２５及び図２６を参照しながら説明する。図２５は、本実施形態に係る情報処理装置８００の画像表示に係る一連の処理の流れを示したフローチャートである。また、図２６は、本実施形態に係る情報処理装置８００のノイズ補正に関する処理の一例を示したフローチャートである。まず、図２５を参照する。
【０２２６】
（ステップＳ３０１）
まず、情報処理装置８００は、画像の補正及び表示の対象となるＲＡＷファイルＤ１の指定や、指定されたＲＡＷファイルＤ１に対する画像処理の内容や当該処理のパラメタを指定するためＵ／Ｉ（以降では、「画像調整用Ｕ／Ｉ」と記載する）を、例えば、表示デバイスを介してユーザに提示する。
【０２２７】
（ステップＳ３０３）
また、情報処理装置８００は、提示した画像調整用Ｕ／Ｉを介してユーザが指定した情報、例えば、処理対象のＲＡＷファイルＤ１、画像処理の内容、及び処理パラメタを、ユーザの操作内容（例えば、操作デバイスを用いた操作内容）に基づき特定する。
【０２２８】
（ステップＳ３０５）
情報処理装置８００は、ユーザの指定に基づき処理対象となるＲＡＷファイルＤ１を取得する。なお、当該ＲＡＷファイルＤ１は、あらかじめ画像取得装置１から取得して記憶デバイス等に記憶しておいてもよいし、画像取得装置１との間で通信を確立し、当該画像取得装置１から取得してもよい。
【０２２９】
（ステップＳ３０７）
情報処理装置８００は、取得したＲＡＷファイルＤ１を、当該ＲＡＷファイルＤ１のファイルフォーマットに基づき解析し、ＲＡＷファイルＤ１内に記録された各情報を抽出する。これにより、情報処理装置８００は、例えば、ＲＡＷファイルＤ１内に記録されたＲＡＷ本画像Ｓ３０９と、当該ＲＡＷ本画像Ｓ３０９の撮影時の条件を示す撮影情報Ｓ３１１及びＳ３２１とを抽出する。このようにして抽出された撮影情報Ｓ３１１及びＳ３２１の中には、例えば、前述したアイドラー光の強度分布が含まれている。なお、情報処理装置８００は、対象となるＲＡＷファイルＤ１が既に解析済みの場合には、当該ＲＡＷファイルＤ１の解析に係る処理を改めて実行しなくてもよいことは言うまでもない。
【０２３０】
情報処理装置８００は、ＲＡＷファイルＤ１から抽出したＲＡＷ本画像Ｓ３０９と撮影情報Ｓ３１１及びＳ３２１とに基づきサンプルＳの画像を生成し、生成した画像に対して画像処理を施してユーザに提示する。なお、画像処理の例としては、各種ノイズ補正に係る処理が挙げられる。そこで、以降では、ステップＳ３１３〜Ｓ３１５として、前述したレーザー光の強度の変動に伴うノイズの補正に係る処理について説明し、ステップＳ３２３〜Ｓ３２５として、レーザー光の強度の変動に伴うノイズとは異なる他のノイズの補正に係る処理について説明する。
【０２３１】
（ステップＳ３１３）
まず、レーザー光の強度の変動に伴うノイズの補正に係る処理の内容について説明する。この場合には、まず情報処理装置８００は、抽出したＲＡＷ本画像Ｓ３０９から、処理対象となる領域の画像を切り出し、切り出した当該領域に対応する部分画像を処理対象とする。
【０２３２】
なお、処理対象となる領域は、例えば、情報処理装置８００自身が、ユーザ入力に基づき取得してもよい。
【０２３３】
また、他の一例として、画像取得装置１が、ＲＡＷ本画像Ｓ３０９の撮影時に、観測対象となる領域の指定をユーザ入力として受けて、当該領域を示す制御情報を、ＲＡＷファイルＤ１に撮影情報Ｓ３１１として記録しておいてもよい。この場合には、情報処理装置８００は、ＲＡＷファイルＤ１から撮影情報Ｓ３１１として記録された制御情報に基づき、処理対象となる領域を認識すればよい。
【０２３４】
もちろん、切り出し処理を行わずに、ＲＡＷ本画像Ｓ３０９を処理対象としてもよいことは言うまでもない。なお、以降の処理については、切り出された部分画像とＲＡＷ本画像Ｓ３０９自体とを特に区別せずに、単に「ＲＡＷ本画像Ｓ３０９」として説明するものとする。
【０２３５】
（ステップＳ３１５）
情報処理装置８００は、撮影情報Ｓ３１１として抽出されたアイドラー光の強度分布により、ＲＡＷ本画像Ｓ３０９上に顕在化したレーザー光の強度の変動に伴うノイズを補正する。本補正処理の内容は、前述した画像取得装置１が、アイドラー光の強度分布に基づき補正データを算出し、当該補正データに基づき蛍光の強度分布を補正する処理の内容と同様である。
【０２３６】
なお、情報処理装置８００は、ユーザ入力として指定された補正処理のパラメタに基づき、補正処理の内容を調整できるように構成してもよい。具体的な一例として、情報処理装置８００は、ユーザ入力に基づき、ＲＡＷ本画像Ｓ３０９に対して、アイドラー光の強度分布に基づく補正処理の適用量を調整できるようにしてもよい。
【０２３７】
以上のようにして、情報処理装置８００は、ＲＡＷ本画像Ｓ３０９上に顕在化したレーザー光の強度の変動に伴うノイズを補正することで、調整後画像Ｓ３１７を生成する。
【０２３８】
（ステップＳ３２３）
次に、レーザー光の強度の変動に伴うノイズとは異なる他のノイズの補正に係る処理について、εフィルタに基づくノイズ補正を行う場合を例に説明する。まず、情報処理装置８００は、抽出したＲＡＷ本画像Ｓ３０９から、処理対象となる領域の画像を切り出し、切り出した当該領域に対応する部分画像を処理対象とする。本処理については、前述したステップＳ３１３に係る処理と同様である。
【０２３９】
（ステップＳ３２３）
次いで、情報処理装置８００は、抽出された撮影情報Ｓ３２１に基づきＲＡＷ本画像Ｓ３０９を補正する。
【０２４０】
ここで、当該補正に係る処理の内容について、図２６を参照しながら説明する。図２６は、本実施形態に係る情報処理装置８００のノイズ補正に関する処理の一例を示したフローチャートである。
【０２４１】
（ステップＳ４０１）
まず、情報処理装置８００は、ＲＡＷ本画像Ｓ３０９から処理の基準となる画素を特定し、当該画素のレベル（画素値）を基準レベルとして算出する。
【０２４２】
（ステップＳ４０３）
次に、情報処理装置８００は、処理対象となる画素ごとに重み付けための閾値を計算する。このとき、情報処理装置８００は、撮影情報Ｓ３１１として抽出されたアイドラー光の強度分布により、アイドラー光の強度が周囲の画素と比べて極端に変動している画素については、他の画素に比べて閾値を高く設定する。
【０２４３】
（ステップＳ４０５）
処理対象となる画素ごとに閾値を算出したら、情報処理装置８００は、算出した基準レベルと、処理対象の画素ごとに算出した閾値とに基づき、当該処理対象の画素ごとにレベルに関する重み付けを行う。
【０２４４】
（ステップＳ４０７）
また、情報処理装置８００は、処理対象となる画素ごとに、基準となる画素からの距離を算出する。
【０２４５】
（ステップＳ４０９）
情報処理装置８００は、処理対象となる画素ごとに算出した距離に基づき、当該処理対象の画素ごとに距離に関する重み付けを行う。
【０２４６】
（ステップＳ４１１）
情報処理装置８００は、処理対象となる画素ごとに算出した、レベルに関する重み付けと、距離に関する重み付けとに基づき、εフィルタを適用して平均化処理を行う。
【０２４７】
（ステップＳ４１３）
以上のようにして、情報処理装置８００は、一連の画素を処理対象としてノイズ補正処理を施されるまで（ステップＳ４１３、ＮＯ）、前述した一連の動作を実行する。そして、情報処理装置８００は、一連の画素についてノイズ補正処理を施すことで（ステップＳ４１３、ＹＥＳ）、調整後画像Ｓ３２７を生成する。
【０２４８】
（ステップＳ３３１）
ここで、再度図２５を参照する。情報処理装置８００は、調整後画像Ｓ３１７及びＳ３２７の少なくともいずれかを生成すると、生成した調整後画像を画像調整用Ｕ／Ｉ上の所定の領域に提示し、画像調整用Ｕ／Ｉの表示を更新する。これにより、ユーザは、生成された調整後画像を、画像調整用Ｕ／Ｉを介して確認することが可能となる。このとき、情報処理装置８００は、生成した調整後画像を所定の記憶部（例えば、ハードディスク等のストレージ）に記憶させてもよい。
【０２４９】
（ステップＳ３３３）
情報処理装置８００は、上述した画像の調整及び調整後の画像の提示に係る一連の処理を、ユーザが画像調整の終了を指示するまで継続する（ステップＳ３３３、ＮＯ）。このとき、情報処理装置８００は、生成した調整後画像に対して、ユーザからの指示に基づき、更に画像の調整に係る処理を実行できるようにしてもよい。
【０２５０】
ユーザが画像調整の終了を指示した場合には（ステップＳ３３３、ＹＥＳ）、情報処理装置８００は、上述した画像の調整及び調整後の画像の提示に係る一連の処理を終了する。
【０２５１】
以上、図２５及び図２６を参照しながら、本実施形態に係る情報処理装置８００のノイズ補正に関する処理の一例について説明した。以上のように、ＲＡＷファイルＤ１に対して、アイドラー光の強度分布のような関連情報を関連付けておくことで、情報処理装置８００のような外部装置においても、画像取得装置１と同様に、レーザー強度の変動に基づくノイズを補正することが可能となる。
【０２５２】
［１．１１．まとめ］
以上、説明したように、本実施形態に係る画像取得装置１は、シグナル光を励起光とした場合に、当該励起光に基づく蛍光の強度分布を、アイドラー光の強度分布に基づき補正する。このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１は、例えば、レーザー光の強度が変動するような状況下においても、当該レーザー光の強度の変動に伴うノイズを補正して鮮明な画像を得ることが可能となる。
【０２５３】
また、本実施形態に係る画像取得装置１は、アイドラー光の強度分布に基づき光源２から出射される励起光の強度を監視し、監視結果に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度を制御する。このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１は、例えば、レーザー光の強度が変動するような状況下においても、当該レーザー光の強度が安定するように制御することが可能となる。
【０２５４】
以上のような特徴により、本実施形態に係る画像取得装置１は、光源２を同一筐体内に内蔵できるため、画像取得装置１自体を小型化することが可能となる。
【０２５５】
また、比較例に係る画像取得装置１ｗのように光源を外部に設ける構成の場合には、当該光源として用いられるレーザーモジュールが、例えば、ＯＥＭ（Original  equipment  manufacturer）等により提供され、その内部構造がブラックボックス化されており、詳細な制御が困難な場合も少なくない。そのため、比較例に係る画像取得装置１ｗは、レーザーモジュールを安定的に動作させるために低い出力で使用される場合が少なくはなく、当該レーザーモジュールの性能を十分に活かしきれない場合もあった。
【０２５６】
これに対して、本実施形態に係る画像取得装置１は、上記に示したように、レーザー光の強度を制御するとともに、当該レーザー光の強度の変動に伴うノイズを補正する。そのため、本実施形態に係る画像取得装置１は、レーザーモジュールの出力を上げて使用したとしても鮮明な画像を得られるため、当該レーザーモジュールの性能を活かして使用することが可能である。
【０２５７】
＜２．第２の実施形態＞
［２．１．画像取得装置の概要］
次に、第２の実施形態に係る画像取得装置について説明する。まず、本実施形態に係る画像取得装置の課題について整理する。
【０２５８】
蛍光顕微鏡のような光源を要する画像取得装置は、例えば、使用する蛍光色素に依ってあらかじめ決められた励起波長を投光可能な固定波長のレーザー光源を用いている場合が少なくない。
【０２５９】
しかしながら、サンプル中の蛍光基体が時間の経過とともに退色する場合があり、このような場合には、励起波長が変化するため、レーザー光源から出力される励起光の波長も変える必要がある。このような状況に対して、固定波長のレーザー光源を用いる構成により対応する場合には、複数種類のレーザー光源を設ける必要があるため、装置が大型化して使用者の利便性を著しく阻害し、装置自体も高価になる傾向にある。
【０２６０】
また、サンプル中の蛍光基体の励起波長は、退色の度合いに応じて変化するため、固定波長のレーザー光源を複数設ける構成では、ユーザは使用するレーザー光源を適宜切り替えて当該蛍光基体が励起するレーザー光源を特定する必要があり、利便性が低下する場合がある。また、複数種類のレーザー光源を切り替えて用いる構成の場合には、退色が進んだサンプルから蛍光を励起できたとしても、必ずしもコントラストの高い画像を得られるとは限らない。
【０２６１】
そこで、本開示では、サンプルの励起波長が変化する状況下においても、コントラストの高い画像を、より簡便な方法で得ることが可能な、新規かつ改良された画像取得装置及び画像取得方法を提案する。
【０２６２】
具体的には、本実施形態に係る画像取得装置は、光源として、出力されるレーザー光（励起光）の波長を変更可能なレーザーモジュールを使用し、観測された蛍光の強度分布に基づき当該レーザー光の波長を制御する。これにより、本実施形態に係る画像取得装置は、例えば、観測者（ユーザ）が、観測結果を確認しながら光源２の動作を制御したり、光源２自体を切り替えるといった煩雑な作業を要することなく、コントラストの高い画像の取得を可能とする。
【０２６３】
以降では、本実施形態に係る画像取得装置について、まず、光学系の構成について説明し、次いで、画像取得装置の機能構成について説明する。なお、本実施形態に係る画像取得装置を、第１の実施形態に係る画像取得装置１と区別するために、以降では「画像取得装置１ａ」と記載する場合がある。
【０２６４】
［２．２．画像取得装置の構成］
＜＜２．２．１．光学系の構成＞＞
まず、図２７を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ａの光学系の構成について、特に、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１の光学系の構成（図１４参照）と異なる部分に着目して説明する。なお、本説明では、前述した第１の実施形態と同様に、シグナル光を励起光としてサンプルＳに向けて照射するものとして説明する。
【０２６５】
本実施形態に係る画像取得装置１ａは、ＰＭＴ５３で検出される蛍光（発色光）の強度に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の波長を制御する。そのため、必ずしも、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１のように、アイドラー光の強度を検出するためのＰＤ５４を設ける必要はない。
【０２６６】
なお、励起光をサンプルＳに向けて照射する構成については、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗの光学系（図１０参照）や第１の実施形態に係る画像取得装置１の光学系（図１４参照）と同様である。即ち、光源２から出射された励起光は、ビーム整形用レンズ５１１、ガルバノミラー５１、レンズ５１３、ミラー５１７、レンズ５１５及びダイクロイックミラー５２を介して対物レンズ４２に導光され、当該対物レンズ４２によりサンプルＳに向けて集光される。
【０２６７】
また、サンプルＳに励起光が照射されると、サンプルＳのある分子が、当該励起光により励起されて蛍光を発し、当該蛍光が、対物レンズ４２、ダイクロイックミラー５２、結像レンズ５２１、及びエミッションフィルタ５２３を介してＰＭＴ５３の検出面に結像する。このとき、エミッションフィルタ５２３により、上記対物レンズ４２によって拡大された、発色光以外の光（外光）が吸収され（即ち、発光色のみが透過し）、当該外光が喪失された発色光の像が、ＰＭＴ５３上に結像される。
【０２６８】
＜＜２．２．２．画像取得装置の機能構成＞＞
次に、図２８を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ａの機能構成の一例について説明する。図２８に示すように、本実施形態に係る画像取得装置１ａは、光源２と、測定部３と、制御部６ａと、Ｉ／Ｆ７とを含む。また、測定部３は、顕微鏡ユニット４と、走査系（検出系）５ａとを含む。なお、光源２、顕微鏡ユニット４、及びＩ／Ｆ７の構成は、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１と同様である。そのため、以降では、特に、第１の実施形態に係る画像取得装置１と異なる、走査系（検出系）５ａ及び制御部６ａの構成に着目して説明する。なお、図２８に示す例において、走査系（検出系）５ａの各構成は、図２７に示した光学系において同様の符号が付された構成に対応している。また、図２８に示す例では、図２７に示した構成のうち一部を省略している。
【０２６９】
図２８に示すように、本実施形態に係る走査系（検出系）５ａは、アイドラー光を測定するためのＰＤ５４を、必ずしも含む必要がない点で、前述した第１の実施形態に係る走査系（検出系）５（図１５参照）と異なる。なお、その他の構成については、前述した第１の実施形態に係る走査系（検出系）５と同様である。
【０２７０】
即ち、光源２から出射された励起光は、走査系（検出系）５ａと顕微鏡ユニット４とを介してサンプルＳに照射される。また、照射された励起光によりサンプルＳから生じた蛍光は、顕微鏡ユニット４を介して走査系（検出系）５ａに導かれ、走査系（検出系）５ａのＰＭＴ５３で検出される。ＰＭＴ５３は、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、検出された蛍光を光電効果により電気信号に変換し、当該蛍光の強度を示すデータとして制御部６ａに出力する。
【０２７１】
制御部６ａは、システム制御部６１ａと、分布情報生成部６２ａと、補正処理部６３と、画像処理部６４と、ＲＡＷ画像生成部６５と、記憶部６６と、表示制御部６７と、通信制御部６８とを含む。なお、本実施形態に係る制御部６ａは、特に、システム制御部６１ａ及び分布情報生成部６２ａの構成が、前述した第１の実施形態に係る制御部６（図１５及び図１６参照）と異なる。
【０２７２】
ここで、図２９を参照しながら、システム制御部６１ａ及び分布情報生成部６２ａの詳細な構成について説明する。図２９に示すように、分布情報生成部６２ａは、二次元化処理部６２５を含む。また、システム制御部６１ａは、波長制御量決定部６１３を含む。
【０２７３】
二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３で検出された（測定された）蛍光の強度を示すデータを、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、当該ＰＭＴ５３から逐次取得する。また、二次元化処理部６２５は、ガルバノミラー５１の制御内容を示す制御情報をシステム制御部６１から逐次取得する。そして、二次元化処理部６２５は、ＰＭＴ５３から逐次取得した蛍光の強度を示すデータを、システム制御部６１から取得した制御情報に基づき並べて二次元化することで、検出された蛍光の強度分布を生成する。
【０２７４】
二次元化処理部６２５は、生成した蛍光の強度分布を、波長制御量決定部６１３、補正処理部６３及びＲＡＷ画像生成部６５に出力する。
【０２７５】
なお、二次元化処理部６２５から出力された蛍光の強度分布は、補正処理部６３によりノイズ除去等の補正処理が施されて画像処理部６４に出力される。画像処理部６４は、補正処理施された強度分布に対して、圧縮処理等の画像処理を施すことで画像データを生成する。生成された画像データは、例えば、表示制御部６７に出力され、当該表示制御部６７により、表示部７２に表示される。これにより、ユーザは、表示部７２を介してサンプルＳの画像を確認することが可能となる。
【０２７６】
波長制御量決定部６１３は、二次元化処理部６２５から、生成された蛍光の強度分布を取得し、当該蛍光の強度分布のコントラストを向上させるように、光源２から出射されるレーザー光（励起光）の波長（周波数）の制御量を決定する。波長制御量決定部６１３によりレーザー光の波長の制御量が決定されると、当該制御量に基づき、システム制御部６１が、当該光源２から出射されるレーザー光の波長を制御する。
【０２７７】
光源２から出射されるレーザー光の波長が制御されると、二次元化処理部６２５により、当該制御後のレーザー光に基づく蛍光の強度分布が取得され、取得された蛍光の強度分布が波長制御量決定部６１３に出力される。波長制御量決定部６１３は、改めて取得した蛍光の強度分布を評価し、当該蛍光の強度分布のコントラストを向上させるように、レーザー光の波長の制御量を算出する。
【０２７８】
以上の動作を繰り返すことで、システム制御部６１及び波長制御量決定部６１３により、例えば、蛍光の強度分布のコントラストが最大となるように、光源２から出射されるレーザー光の波長が制御される。
【０２７９】
なお、波長制御量決定部６１３は、取得した蛍光の強度分布中において、ユーザに観測対象として指定された領域を対象にコントラストを評価して、レーザー光の波長の制御量を決定してもよい。
【０２８０】
この場合には、表示制御部６７は、蛍光の強度分布に基づき作成された画像データとともに、当該画像データ中の領域を指定するためのＵ／Ｉを表示部７２に表示するとよい。これにより、ユーザは、表示部７２に表示された画像に対して、観測対象となる領域を、条件指定部７１を介して指定することが可能となる。
【０２８１】
例えば、図３０は、観測対象の指定方法の一例について説明するための図である。図３０において、参照符号Ｖ２０は、表示部７２に表示された画像を示しており、参照符号Ｖ２１は、ユーザにより観測対象として指定された領域を模式的に示している。なお、領域Ｖ２１の形状は、画像Ｖ２０中の少なくとも一部の領域を指定できれば、必ずしも図３０に示すような円形形状には限定されない。例えば、領域Ｖ２１の形状は、矩形形状であってもよいし、ユーザにより指定された任意の形状であってもよい。
【０２８２】
波長制御量決定部６１３は、表示部７２に表示されたサンプルＳの画像Ｖ２０に対して、ユーザが条件指定部７１を介して指定した画像中の領域Ｖ２１を示す情報を、条件指定部７１から取得する。なお、画像Ｖ２０の座標系と、蛍光の強度分布の座標系とは対応している。そのため、波長制御量決定部６１３は、条件指定部７１から取得した領域Ｖ２１を示す情報に基づき、ユーザが画像Ｖ２０に対して指定した領域Ｖ２１に対応する、蛍光の強度分布上の領域を認識する。
【０２８３】
なお、ユーザにより観測対象として指定された領域Ｖ２１を示す情報を取得した場合には、波長制御量決定部６１３は、蛍光の強度分布上における当該領域Ｖ２１を対象として、コントラストを向上させるように、レーザー光の波長の制御量を決定すればよい。
【０２８４】
また、システム制御部６１は、ユーザからの指定に基づきレーザー光の波長を制御（調整）できるようにしてもよい。具体的な一例として、システム制御部６１は、波長制御後の蛍光の強度分布に基づき作成された画像に対して、さらに調整が必要か否かをユーザに指定させることで、当該指定に基づきレーザー光の波長を更に制御するか否かを判断できるようにしてもよい。
【０２８５】
この場合には、例えば、表示制御部６７が、波長制御後の蛍光の強度分布に基づき作成された画像データを、表示部７２を介してユーザに提示し、システム制御部６１は、さらに調整が必要か否かを示すユーザの指定を条件指定部７１から取得する。
【０２８６】
システム制御部６１は、ユーザにより、さらに調整が必要である旨の指定を受けた場合には、波長制御量決定部６１３に、改めてレーザー光の波長の制御量を算出させてもよい。また、このとき、システム制御部６１は、レーザー光の波長の制御量の算出に係る条件（例えば、コントラストの判定に係る閾値等のパラメタ）を制御するように、波長制御量決定部６１３を制御してもよい。
【０２８７】
また、他の一例として、レーザー光の波長をユーザが直接的または間接的に指定できるように、システム制御部６１を動作させてもよい。具体的な一例として、システム制御部６１は、ユーザからコントラストの調整に係る指定（例えば、コントラストを上げ下げや調整量の指定）を受けて、指定されたコントラストの調整内容に基づき、レーザー光の波長を制御してもよい。
【０２８８】
このようにシステム制御部６１は、蛍光の強度分布のコントラストを向上させるように自動でレーザー光の波長を制御することが可能であり、また、ユーザからの指示に基づき当該レーザー光の波長を制御することも可能である。このような構成により、例えば、システム制御部６１を、蛍光の強度分布のコントラストが最大となるように自動でレーザー光の波長を制御した後、ユーザからの指示に基づき、当該レーザー光の波長を微調整するように動作させることも可能である。
【０２８９】
なお、レーザー光の波長の制御量の決定と、当該制御量に基づくレーザー光の波長制御との詳細な内容については、「２．５．波長制御の詳細」として別途後述する。
【０２９０】
ＲＡＷ画像生成部６５は、二次元化処理部６２５から蛍光の強度分布を取得し、当該蛍光の強度分布を画像データ（ＲＡＷ画像）として、所定のファイルフォーマットに整形することでＲＡＷファイルを生成してもよい。このとき、ＲＡＷ画像生成部６５は、蛍光の強度分布の取得条件（例えば、撮影時のパラメタのような撮影条件や走査条件）のように、当該蛍光の強度分布に関連する情報をシステム制御部６１から取得し、取得した情報を関連情報として、生成したＲＡＷファイルに関連付けてもよい。
【０２９１】
特に、本実施形態に係るＲＡＷ画像生成部６５は、例えば、図３０に示すように、画像Ｖ２０中にユーザが指定した領域Ｖ２１を示す情報や、当該領域Ｖ２１中の画像を、関連情報としてＲＡＷファイルに関連付けてもよい。
【０２９２】
また、ＲＡＷ画像生成部６５は、波長制御量決定部６１３が決定したレーザー光（励起光）の波長（周波数）の制御量を示す制御情報を、関連情報としてＲＡＷファイルに関連付けてもよい。このようにレーザー光の波長の制御量を示す制御情報を関連情報としてＲＡＷファイルに関連付けることで、例えば、情報処理装置８００の外部装置が、当該制御量に基づきサンプルの退色の度合いを認識することが可能である。
【０２９３】
なお、ＲＡＷ画像生成部６５は、システム制御部６１による自動調整に基づき決定された制御情報と、ユーザの指示に基づき変更された制御情報とを別々に関連情報としてＲＡＷファイルに関連付けてもよい。また、ＲＡＷ画像生成部６５は、各条件に基づき取得された蛍光の強度分布に基づく画像（例えば、圧縮等の画像処理が施された画像）を、制御情報とあわせてＲＡＷファイルに関連付けてもよい。このように、ＲＡＷ画像生成部６５は、レーザー光の波長の制御量を示す制御情報や、当該制御量に応じて制御されたレーザー光に基づき取得された画像を、複数の条件にわたって当該条件ごとにＲＡＷファイルに関連付けてもよい。
【０２９４】
以上、図２７〜図３０を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ａの構成について説明した。次に、本実施形態に係る画像取得装置１ａの各構成の更に詳細な内容について説明する。
【０２９５】
［２．３．ＲＡＷファイルのファイルフォーマット］
まず、図３１を参照しながら、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ａのファイルフォーマットの一例について説明する。図３１は、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ａのファイルフォーマットの一例を示した図である。
【０２９６】
図３１に示すように、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１は、例えば、データ領域ｄ１０と、基本制御情報領域ｄ３０と、拡張領域ｄ２０ａとを含む。なお、データ領域ｄ１０及び基本制御情報領域ｄ３０の構成については、前述した第１の実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１（図１９参照）と同様のため、詳細な説明は省略する。
【０２９７】
図３１に示すように、拡張領域ｄ２０は、メーカーノートＩＦＤｄ２１を含む。メーカーノートＩＦＤｄ２１は、カメラ制御モードなどのＥＸＩＦに規定されていない情報を格納するためのＩＦＤであり、画像取得装置１に固有の撮影情報や制御情報も格納される。
【０２９８】
本実施形態に係るメーカーノートＩＦＤｄ２１は、例えば、撮影条件ｄ２１１と、初期撮影画像ｄ２２１と、ユーザが指定したターゲット画像ｄ２２２と、ユーザの指定した可変範囲ｄ２２３と、自動調整に基づくパラメタｄ２２４と、観察者の指定したパラメタｄ２２５と、自動調整後画像ｄ２２６とを含む。なお、撮影条件ｄ２１１は、前述した第１の実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１と同様である。
【０２９９】
初期撮影画像ｄ２２１は、波長制御量決定部６１３が決定した制御量に基づき、システム制御部６１が波長を制御する前に取得された蛍光の強度分布に基づく画像である。換言すると、初期撮影画像ｄ２２１は、観測対象となるサンプルＳに応じてあらかじめ決められた波長（即ち、初期設定）のレーザー光を励起光として取得された蛍光の強度分布に基づく画像を示している。
【０３００】
ユーザが指定したターゲット画像ｄ２２２は、撮像された画像のうち、ユーザが観測対象として指定した領域に相当する部分を切り出した画像を示している。例えば、図３１に示す例の場合には、ユーザが指定したターゲット画像ｄ２２２は、画像Ｖ２０から領域Ｖ２１で示された部分を切り出した画像に相当する。
【０３０１】
また、ユーザの指定した可変範囲ｄ２２３は、撮像された画像中において、ユーザにより観測対象として指定された領域を示す情報である。例えば、図３１に示す例の場合には、ユーザの指定した可変範囲ｄ２２３は、領域Ｖ２１を示す制御情報に相当する。なお、領域を示す制御情報は、例えば、撮像された画像中の座標やベクトルにより表現することが可能である。
【０３０２】
自動調整に基づくパラメタｄ２２４は、システム制御部６１による自動調整により決定された光源２から出射されるレーザー光の波長のように、当該自動調整時にシステム制御部６１が決定したパラメタを示している。具体的な一例として、自動調整に基づくパラメタＤ２２４は、撮像された画像のコントラストが最大となるように調整が行われた場合の、各パラメタ（例えば、レーザー光の波長）を示している。なお、自動調整に基づくパラメタＤ２２４は、システム制御部６１による自動調整により決定された当該パラメタに基づく光源２の制御に応じて取得された蛍光の強度分布に基づく画像（例えば、圧縮等の画像処理が施された画像）を含んでもよい。
【０３０３】
観察者の指定したパラメタｄ２２５は、ユーザからの指定に基づきシステム制御部６１が決定したパラメタを示している。観察者の指定したパラメタｄ２２５は、ユーザからの指定により決定された当該パラメタに基づく光源２の制御に応じて取得された蛍光の強度分布に基づく画像（例えば、圧縮等の画像処理が施された画像）を含んでもよい。
【０３０４】
このように、ＲＡＷファイルＤ１ａにレーザー光（励起光）の波長（周波数）の制御量を示す関連情報（即ち、自動調整に基づくパラメタｄ２２４や観察者の指定したパラメタｄ２２５）を記録しておくことで、例えば、情報処理装置８００の外部装置は、当該関連情報に基づき、サンプルの退色の度合いを認識することが可能となる。また、当該パラメタに基づく光源２の制御に応じて取得された蛍光の強度分布に基づく画像を記録しておくことで、情報処理装置８００の外部装置は、各条件に応じた画像を、当該画像の取得条件（即ち、パラメタ）とあわせてユーザに提示することが可能となる。
【０３０５】
自動調整後画像ｄ２２６は、最終的に決定されたパラメタに基づく光源２の制御に応じて取得された蛍光の強度分布に基づく画像を示している。なお、自動調整後画像ｄ２２６は、ユーザの指定した可変範囲ｄ２２３に基づき、切り出された画像であってもよい。
【０３０６】
以上、図３１を参照しながら、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ａのファイルフォーマットについて説明した。なお、上記に示すＲＡＷファイルＤ１ａのファイルフォーマットはあくまで一例であり、必ずしも全ての情報を含まなくてもよいことは言うまでもない。
【０３０７】
［２．４．画像取得装置の動作の流れ］
次に、図３２を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ａの一連の動作の流れについて説明する。図３２は、本同実施形態に係る画像取得装置１ａの一連の動作についてその流れの一例を示したフローチャートである。
【０３０８】
（ステップＳ５０１）
まず、画像取得装置１ａの制御部６ａは、測定対象となるサンプルＳに応じて光源２から出射される励起光の波長を制御する（即ち、初期設定に基づき制御する）。制御部６ａの制御に基づき光源２から出射された励起光は、測定部３（即ち、走査系（検出系）５ａ及び顕微鏡ユニット４）によりサンプルＳに向けて導光される。そして、測定部３は、光源２から出射される励起光によりサンプルＳ上を走査し、当該サンプルＳから出射された蛍光を検出する。測定部３は、蛍光の検出結果を制御部６ａに出力する。
【０３０９】
制御部６ａは、測定部３から取得した蛍光の検出結果に基づき蛍光の強度分布を生成し、当該蛍光の強度分布に所定の画像処理（例えば、ノイズ除去処理や圧縮処理）を施して画像データを生成する。そして、制御部６ａは、生成した画像データとともに、該画像データ中の領域を指定するためのＵ／Ｉを表示部７２に表示するとよい。これにより、ユーザは、表示部７２に表示された画像に対して、観測対象となる領域を、条件指定部７１を介して指定することが可能となる。
【０３１０】
（ステップＳ５０３）
制御部６ａは、条件指定部７１を介して、ユーザ入力に基づく、画像データ中における観測対象となる領域の指定を受ける。なお、このユーザにより指定された領域が可変範囲に相当し、当該領域中の対象物（サンプルＳの一部）がターゲットとなる。
【０３１１】
（ステップＳ５１）
制御部６ａは、ユーザ入力に基づき指定された領域内の画像を対象として、当該画像中の対象物が鮮明に表示されるように（例えば、当該領域中のコントラストが最大となるように）、光源２から出射される励起光の波長を制御する。なお、詳細については、「２．５．波長制御の詳細」として別途後述する。
【０３１２】
（ステップＳ５０５）
制御部６ａは、光源２から出射される励起光の波長を制御したら、波長制御後の励起光に基づく蛍光の強度分布を取得し、取得した蛍光の強度分布に基づき画像データを生成する。そして、制御部６ａは、生成した画像データを表示部７２に表示させる。これにより、ユーザは、光源２から出射される励起光の波長の制御に基づき、調整が施された画像を確認することが可能となる。
【０３１３】
（ステップＳ５０７）
なお、本実施形態に係る画像取得装置１ａは、調整が施された画像に対して更に調整が必要か否かについて、ユーザからの指示を受け付けてもよい。この場合には、例えば、画像取得装置１ａは、ユーザから更に調整が必要と指示された場合には（ステップＳ５０７、ＮＯ）、条件（例えば、コントラストの判定に係る閾値等のパラメタ）を変更して、再度励起光の波長を制御する。
【０３１４】
（ステップＳ５０９）
調整後の画像に対してユーザからさらなる調整が不要と指示された場合には（ステップＳ５０７、ＹＥＳ）、本実施形態に係る画像取得装置１ａは、その時点での励起光に基づき取得された蛍光の強度分布を基にＲＡＷファイルＤ１を生成する。
【０３１５】
以上、図３２を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ａの一連の動作の流れについて説明した。なお、上記に示した画像取得装置１ａの一連の動作は、あくまで一例であり、必ずしも上記に示した動作の流れには限定されない。具体的な一例として、励起光の波長をユーザが直接的または間接的に指定できるように、画像取得装置１ａを動作させてもよい。
【０３１６】
［２．５．波長制御の詳細］
＜＜２．５．１．波長制御の原理：複数の観測波長により試料を観測する場合＞＞
次に、図３３〜図３６を参照しながら、本実施形態に係る制御部６ａによる、光源２から出射されるレーザー光の波長の制御に係る動作の詳細について説明する。なお、本説明では、図３３〜図３５を参照しながら、実施形態に係る画像取得装置１ａにおける波長制御の原理について、複数（例えば、２つ）の観測波長で試料の組成を識別する場合を例に説明する。また、単一の観測波長で試料の組成を測定する場合については、「２．３．３．波長制御の一態様：単一の観測波長により試料を観測する場合」として別途後述する。
【０３１７】
まず、図３３を参照する。図３３は、光源２から出射されるレーザー光の波長制御の原理について説明するための説明図光源２から出力されるレーザー光の波長と、サンプルＳ中に含まれる蛍光色素の励起スペクトル及び蛍光スペクトルとの関係の一例を示している。なお、以降では、サンプルＳ中の互いに異なる２種類の蛍光色素Ｆ１及びＦ２を観測対象とし、当該蛍光色素Ｆ１及びＦ２を発光させるための励起光の波長（以降では「発光波長」と呼ぶ場合がある）をそれぞれλ１及びλ２とするものとして説明する。
【０３１８】
図３３において、横軸は波長［ｎｍ］を示し、縦軸は相対効率［％］を示している。また、参照符号ｇ１１は、蛍光色素Ｆ１の励起スペクトルを示しており、参照符号ｇ１２は、蛍光色素Ｆ１の蛍光スペクトルを示している。また、参照符号ｇ２１は、蛍光色素Ｆ２の励起スペクトルを示しており、参照符号ｇ２２は、蛍光色素Ｆ２の蛍光スペクトルを示している。
【０３１９】
また、蛍光波長分布（即ち、蛍光スペクトル）ｇ１２により求まる、発光波長λ１における蛍光色素Ｆ１及びＦ２の蛍光相対効率をＥ１１＝Ｅ（λ１，Ｆ１）及びＥ１２＝Ｅ（λ１，Ｆ２）とする。また、蛍光波長分布（即ち、蛍光スペクトル）ｇ２２により求まる、発光波長λ２における蛍光色素Ｆ１及びＦ２の蛍光相対効率をＥ２１＝Ｅ（λ２，Ｆ１）及びＥ２２＝Ｅ（λ２，Ｆ２）とする。
【０３２０】
また、光源２は、出力されるレーザー光の波長を、波長λＨ〜λＬの間で定義される帯域Ｗ１内において、波長λｓごとに波長を制御可能に構成されているものとする。
【０３２１】
本実施形態に係る画像取得装置１ａの制御部６ａは、発光波長λ１及びλ２それぞれについて取得された蛍光の強度分布を合成することで２色の識別画像を生成する。例えば、図３４は、光源から出射されるレーザー光の波長制御の原理について説明するための説明図であり、発光波長λ１及びλ２それぞれについて取得された蛍光の強度分布を合成することで生成された２色の識別画像の一例を示している。
【０３２２】
図３４において、参照符号Ｖ１１ａは、発光波長λ１の場合の蛍光の強度分布を示しており、参照符号Ｖ１２ａは、発光波長λ２の場合の蛍光の強度分布を示している。また、参照符号Ｖ１３ａは、蛍光の強度分布Ｖ１１ａ及びＶ１２ａを合成することで得られる２色の識別画像の一例を示している。
【０３２３】
図３４に示すように、発光波長λ１及びλ２それぞれについて取得された蛍光の強度分布Ｖ１１ａ及びＶ１２ａを合成した場合に、得られる識別画像Ｖ１３ａは、必ずしもコントラストが高くなるとは限らない。
【０３２４】
そこで、本実施形態に係る画像取得装置１ａの制御部６ａ（具体的には、システム制御部６１ａ）は、例えば、識別画像Ｖ１３ａのコントラストが最大となるように、発光波長λ１及びλ２を制御して、発光波長λ１及びλ２それぞれに基づき得られる蛍光の強度の割合を調整する。
【０３２５】
以下に、システム制御部６１ａが、発光波長λ１及びλ２それぞれに基づき得られる蛍光の強度分布を合成することで生成された２色の識別画像のコントラストの算出する処理の一例について、図３５を参照しながら説明する。図３５は、光源２から出射されるレーザー光の波長制御の原理について説明するための説明図であり、複数の観測波長により試料を観測する場合におけるコントラストの算出方法の一例について説明するための図である。
【０３２６】
図３５において、参照符号Ｖ１１は、発光波長λ１の場合の蛍光の強度分布を示しており、参照符号Ｖ１２は、発光波長λ２の場合の蛍光の強度分布を示している。また、参照符号Ｖ１３は、蛍光の強度分布Ｖ１１及びＶ１２を合成することで得られる２色の識別画像の一例を示している。
【０３２７】
まず、システム制御部６１ａは、蛍光相対効率Ｅ１１＝Ｅ（λ１，Ｆ１）、Ｅ１２＝Ｅ（λ１，Ｆ２）、Ｅ２１＝Ｅ（λ２，Ｆ１）、及びＥ２２＝Ｅ（λ２，Ｆ２）に基に、以下に示す式１２が最大となるように、発光波長λ１及びλ２の初期値を算出する。
【０３２８】
【数１２】
2015114420.tif 000014
【０３２９】
なお、蛍光色素Ｆ１及びＦ２それぞれの励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示すデータは、例えば、記憶部６６をデータベースとして構成し、当該データベース上にあらかじめ記憶させておけばよい。これにより、システム制御部６１ａは、記憶部６６（データベース）に記憶された蛍光色素Ｆ１及びＦ２それぞれの励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示すデータに基づき、蛍光相対効率Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ２１、及びＥ２２を算出すれことが可能となる。
【０３３０】
以上のようにして、発光波長λ１及びλ２の初期値を決定したら、システム制御部６１ａは、決定した発光波長λ１及びλ２のレーザー光が出力されるように光源２を制御し、発光波長λ１及びλ２それぞれに基づく蛍光の強度分布を取得する。これにより、発光波長λ１及びλ２の初期値に基づく蛍光の強度分布Ｖ１１及びＶ１２が取得される。
【０３３１】
次に、システム制御部６１ａは、取得した蛍光の強度分布Ｖ１１から、輝度の高い（例えば、輝度が最大の）座標Ｖ１１１＝（ｘ１，ｙ１）を特定する。同様に、システム制御部６１ａは、取得した蛍光の強度分布Ｖ１２から、輝度の高い座標Ｖ１２１＝（ｘ２，ｙ２）を特定する。
【０３３２】
座標Ｖ１１１及びＶ１２１を特定したら、システム制御部６１ａは、蛍光の強度分布Ｖ１１中における座標Ｖ１１１及びＶ１２１の輝度Ｌ（λ１，ｘ１，ｙ１）及びＬ（λ１，ｘ２，ｙ２）を算出する。同様に、システム制御部６１ａは、蛍光の強度分布Ｖ１２中における座標Ｖ１１１及びＶ１２１の輝度Ｌ（λ２，ｘ１，ｙ１）及びＬ（λ２，ｘ２，ｙ２）を算出する。
【０３３３】
システム制御部６１ａは、算出した輝度Ｌ（λ１，ｘ１，ｙ１）、Ｌ（λ１，ｘ２，ｙ２）、Ｌ（λ２，ｘ１，ｙ１）、及びＬ（λ２，ｘ２，ｙ２）と、以下に示す式１３とに基づき、コントラストＣ（λ１，λ２）を算出する。
【０３３４】
【数１３】
2015114420.tif 000015
【０３３５】
以上のようにして、発光波長λ１及びλ２それぞれに基づき得られる蛍光の強度分布Ｖ１１及びＶ１３を合成することで生成された２色の識別画像Ｖ１３のコントラストＣ（λ１，λ２）が算出される。
【０３３６】
なお、システム制御部６１ａは、発光波長λ１及びλ２の制御と、制御後の発光波長λ１及びλ２に基づくコントラストＣ（λ１，λ２）の算出及び評価とを繰り返すことで、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となるように発光波長λ１及びλ２を調整すればよい。
【０３３７】
次に、図３６を参照しながら、複数の観測波長により試料を観測する場合における、システム制御部６１ａによる発光波長λ１及びλ２の制御の流れについて説明する。図３６は、光源２から出射されるレーザー光の波長制御に係る処理の流れについて説明するためのフローチャートであり、複数の観測波長により試料を観測する場合の一例について示している。
【０３３８】
（ステップＳ５１１）
まず、システム制御部６１ａは、蛍光相対効率Ｅ１１＝Ｅ（λ１，Ｆ１）、Ｅ１２＝Ｅ（λ１，Ｆ２）、Ｅ２１＝Ｅ（λ２，Ｆ１）、及びＥ２２＝Ｅ（λ２，Ｆ２）に基に発光波長λ１及びλ２の初期値を算出する。なお、発光波長λ１及びλ２の初期値は、前述した式１２が最大となるように算出すればよい。
【０３３９】
（ステップＳ５１３）
次いで、システム制御部６１ａは、光源２から出射される励起光の波長が、算出した発光波長λ１となるように制御する。これにより、測定部３ａから、当該制御後の励起光に基づく蛍光の検出結果が分布情報生成部６２ａに出力される。そして、分布情報生成部６２ａは、取得した蛍光の検出結果に基づき、発光波長λ１に基づく蛍光の強度分布Ｖ１１を生成する。分布情報生成部６２ａは、生成した蛍光の強度分布Ｖ１１をシステム制御部６１ａに出力する。以上のようにして、システム制御部６１ａは、当該制御後の励起光に基づく蛍光の強度分布Ｖ１１を、当該分布情報生成部６２ａから取得する。
【０３４０】
（ステップＳ５１５）
また、システム制御部６１ａは、光源２から出射される励起光の波長が、算出した発光波長λ２となるように制御する。これにより、測定部３ａから、当該制御後の励起光に基づく蛍光の検出結果が分布情報生成部６２ａに出力される。そして、分布情報生成部６２ａは、取得した蛍光の検出結果に基づき、発光波長λ２に基づく蛍光の強度分布Ｖ１２を生成する。分布情報生成部６２ａは、生成した蛍光の強度分布Ｖ１２をシステム制御部６１ａに出力する。以上のようにして、システム制御部６１ａは、当該制御後の励起光に基づく蛍光の強度分布Ｖ１２を、当該分布情報生成部６２ａから取得する。
【０３４１】
（ステップＳ５１７）
システム制御部６１ａは、生成した発光波長λ１及びλ２それぞれに基づく蛍光の強度分布Ｖ１１及びＶ１２を基に、コントラストＣ（λ１，λ２）を算出する。
【０３４２】
（ステップＳ５２１）
システム制御部６１ａは、以上の処理を、発光波長λ１及びλ２を調整しながら、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となるまで継続し（ステップＳ５１９、ＮＯ）、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となったら一連の処理を終了する（ステップＳ５１９、ＹＥＳ）。
【０３４３】
次に、システム制御部６１ａが、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となる発光波長λ１及びλ２を特定する方法の一例について説明する。
【０３４４】
まず、システム制御部６１ａは、発光波長λ１及びλ２がともに初期値の場合を基準状態として、当該基準状態から発光波長λ１をプラス方向にλｓ変化させた場合と、マイナス方向にλｓ変化させた場合とについて蛍光の強度分布Ｖ１１を取得する。そして、システム制御部６１ａは、取得した蛍光の強度分布Ｖ１１それぞれに基づきコントラストＣ（λ１，λ２）を算出し、コントラストＣ（λ１，λ２）が増加する発光波長λ１の変化方向を特定する。
【０３４５】
同様に、システム制御部６１ａは、基準状態から発光波長λ２をプラス方向にλｓ変化させた場合と、マイナス方向にλｓ変化させた場合とについて蛍光の強度分布Ｖ１２を取得する。そして、システム制御部６１ａは、取得した蛍光の強度分布Ｖ１２の分布それぞれに基づきコントラストＣ（λ１，λ２）を算出し、コントラストＣ（λ１，λ２）が増加する発光波長λ２の変化方向を特定する。
【０３４６】
次いで、システム制御部６１ａは、基準状態から、発光波長λ１及びλ２それぞれについて、特定した方向にλｓずつ複数回（例えば、２回）変化させて、当該変化ごとにコントラストＣ（λ１，λ２）を算出する。そして、システム制御部６１ａは、コントラストＣ（λ１，λ２）の算出結果に基づき、発光波長λ１及びλ２のうち、コントラストＣ（λ１，λ２）の変化量が大きい発光波長（即ち、制御前後においてコントラストＣ（λ１，λ２）の差が大きい発光波長）を特定する。なお、以降では、発光波長λ１を変化させた方が、発光波長λ２を変化させた場合に比べてコントラストＣ（λ１，λ２）の変化量が大きいものとして説明する。
【０３４７】
システム制御部６１ａは、発光波長λ２側を固定し、発光波長λ１を特定した方向にλｓずつ変化させながらコントラストＣ（λ１，λ２）を算出することで、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となる発光波長λ１を特定する。
【０３４８】
次いで、システム制御部６１ａは、発光波長λ１側を固定し、発光波長λ２を特定した方向にλｓずつ変化させながらコントラストＣ（λ１，λ２）を算出することで、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となる発光波長λ２を特定する。
【０３４９】
以上のようにして、システム制御部６１ａは、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となる発光波長λ１及びλ２を特定する。なお、上記に示す例はあくまで一例であり、コントラストＣ（λ１，λ２）が最大となる発光波長λ１及びλ２を特定できれば、その方法は特に限定されないことは言うまでもない。
【０３５０】
以上、図３３〜図３６を参照しながら、本実施形態に係る制御部６ａによる、光源２から出射されるレーザー光の波長の制御に係る動作の詳細について、複数の観測波長で試料の組成を識別する場合を例に説明した。
【０３５１】
＜＜２．５．２．波長制御の一態様：単一の観測波長により資料を観測する場合＞＞
次に、本実施形態に係るシステム制御部６１ａによる、光源２から出射されるレーザー光の波長の制御に係る動作の一態様として、単一の観測波長により資料を観測する場合について説明する。なお、本説明では、システム制御部６１ａは、サンプルＳ中の蛍光色素Ｆ１を対象とし、発光波長λ１を制御するものとして説明する。
【０３５２】
この場合には、まず、システム制御部６１ａは、蛍光相対効率Ｅ１１＝Ｅ（λ１，Ｆ１）が最大となるように、発光波長λ１の初期値を決定する。なお、システム制御部６１ａは、蛍光相対効率Ｅ１１が最大となる発光波長λ１を、蛍光色素Ｆ１の励起スペクトルのピーク値に基づき算出すればよい。
【０３５３】
次いで、システム制御部６１ａは、発光波長λ１が初期値の場合を基準状態として、当該基準状態から発光波長λ１をプラス方向にλｓ変化させた場合と、マイナス方向にλｓ変化させた場合とについて蛍光の強度分布Ｖ１１を取得する。そして、システム制御部６１ａは、取得した蛍光の強度分布Ｖ１１のコントラストを算出し、コントラストが増加する発光波長λ１の変化方向を特定する。なお、蛍光の強度分布Ｖ１１のコントラストの算出方法としては、例えば、当該強度分布Ｖ１１中の画素値の最大値及び最小値に基づくコントラストの算出方法のように、所謂、一般的なコントラストの算出方法適用することが可能である。
【０３５４】
コントラストが増加する発光波長λ１の変化方向を特定したら、システム制御部６１ａは、発光波長λ１を当該変化方向にλｓずつ変化させながらコントラストを算出し、当該コントラストが最大となる発光波長λ１を特定する。
【０３５５】
以上のようにして、システム制御部６１ａは、コントラストが最大となる発光波長λ１を特定する。なお、上記に示す例はあくまで一例であり、コントラストが最大となる発光波長λ１を特定できれば、その方法は特に限定されないことは言うまでもない。
【０３５６】
［２．６．まとめ］
以上説明したように、本実施形態に係る画像取得装置１ａは、出力されるレーザー光（励起光）の波長を制御可能なレーザーモジュールを光源２として使用し、観測された蛍光の強度分布に基づき当該レーザー光の波長を制御する。このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１ａは、例えば、観測者（ユーザ）が、観測結果を確認しながら光源２の動作を制御したり、光源２自体を切り替えるといった煩雑な作業を要することなく、コントラストの高い画像の取得を可能とする。
【０３５７】
また、本実施形態に係る画像取得装置１ａは、温度の上昇に伴いレーザー光の波長が変化するような状況下においても、取得される蛍光の強度分布のコントラストが最大となるようにレーザー光の波長を制御することが可能である。そのため、本実施形態に係る画像取得装置１は、例えば、光源２を同一筐体内に内蔵したとしても、レーザー光の波長を安定させることが可能なため、画像取得装置１ａ自体を小型化することが可能となる。
【０３５８】
＜３．第３の実施形態＞
［３．１．画像取得装置の概要］
次に、第３の実施形態に係る画像取得装置について説明する。前述した第１の実施形態では、光源２からの出射光の強度制御及び補正について説明し、第２の実施形態では、光源２からの出射光の波長制御について説明したが、これらを組み合わせて実行してもよいことは言うまでもない。そこで、第３の実施形態では、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１と、第２の実施形態に係る画像取得装置１ａとを組み合わせた構成について説明する。なお、以降では、本実施形態に係る画像取得装置を、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１及び第２の実施形態に係る画像取得装置１ａのそれぞれと区別するために、「画像取得装置１ｂ」と記載する場合がある。
【０３５９】
［３．２．画像取得装置の構成］
＜＜３．２．１．光学系の構成＞＞
まず、本実施形態に係る画像取得装置１ｂの光学系の構成について説明する。本実施形態に係る画像取得装置１ｂの光学系の構成は、図１４に示した第１の実施形態に係る画像取得装置１の光学系と同様である。
【０３６０】
即ち、本実施形態に係る画像取得装置１ｂでは、光源２は、波長変換モジュール（ＯＰＯ）２５０を備え、入力されたレーザー光（ポンプ光）を２つの波長のレーザー光（即ち、シグナル光及びアイドラー光）に変換して出力する。本実施形態に係る画像取得装置１ｂでは、光源２から出力されるシグナル光及びアイドラー光のうち、いずれか一方を励起光としてサンプルＳに向けて照射する。なお、以降では、シグナル光を励起光としてサンプルＳに向けて照射するものとして説明する。
【０３６１】
また、励起光をサンプルＳに向けて照射する構成については、前述した比較例に係る画像取得装置１ｗの光学系（図１０参照）や各実施形態に係る画像取得装置の光学系（図１４、図２７参照）と同様である。即ち、光源２から出射された励起光は、ビーム整形用レンズ５１１、ガルバノミラー５１、レンズ５１３、ミラー５１７、レンズ５１５及びダイクロイックミラー５２を介して対物レンズ４２に導光され、当該対物レンズ４２によりサンプルＳに向けて集光される。
【０３６２】
また、サンプルＳに励起光が照射されると、サンプルＳのある分子が、当該励起光により励起されて蛍光を発し、当該蛍光が、対物レンズ４２、ダイクロイックミラー５２、結像レンズ５２１、及びエミッションフィルタ５２３を介してＰＭＴ５３の検出面に結像する。このとき、エミッションフィルタ５２３により、上記対物レンズ４２によって拡大された、発色光以外の光（外光）が吸収され（即ち、発光色のみが透過し）、当該外光が喪失された発色光の像が、ＰＭＴ５３上に結像される。
【０３６３】
＜＜３．２．２．画像取得装置の機能構成＞＞
次に、図３７を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ｂの機能構成の一例について説明する。図３７に示すように、本実施形態に係る画像取得装置１ｂは、光源２と、測定部３と、制御部６ｂと、Ｉ／Ｆ７とを含む。また、測定部３は、顕微鏡ユニット４と、走査系（検出系）５とを含む。なお、光源２、顕微鏡ユニット４、走査系（検出系）５、及びＩ／Ｆ７の構成は、述した第１の実施形態に係る画像取得装置１と同様である。そのため、以降では、以降では、特に、第１の実施形態に係る画像取得装置１と異なる、制御部６ｂの構成に着目して説明する。なお、図３７に示す例において、走査系（検出系）５の各構成は、図１４に示した光学系において同様の符号が付された構成に対応している。また、図３７に示す例では、図１４に示した構成のうち一部を省略している。
【０３６４】
図３７に示すように、照射された励起光によりサンプルＳから生じた蛍光は、顕微鏡ユニット４を介して走査系（検出系）５に導かれ、走査系（検出系）５のＰＭＴ５３で検出される。ＰＭＴ５３は、あらかじめ設定されたサンプリングレートで、検出された蛍光を光電効果により電気信号に変換し、当該蛍光の強度を示すデータとして制御部６ｂに出力する。
【０３６５】
また、ＰＤ５４は、アイドラー光の強度を、あらかじめ設定されたサンプリングレートで測定する。ＰＤ５４は、測定したアイドラー光の強度を電気信号に変換し、当該アイドラー光の強度を示すデータとして制御部６に出力する。なお、ＰＤ５４に替えて、励起光（シグナル光）の強度を測定するＰＤ５６を設けてもよい。このように、ＰＭＴ５３、ＰＤ５４、及びＰＤ５６の構成は、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１と同様である。
【０３６６】
また、図３７に示すように、制御部６ｂは、システム制御部６１ｂと、分布情報生成部６２ｂと、補正処理部６３と、画像処理部６４と、ＲＡＷ画像生成部６５と、記憶部６６と、表示制御部６７と、通信制御部６８とを含む。なお、本実施形態に係る制御部６ｂは、特に、システム制御部６１ｂ及び分布情報生成部６２ｂの構成が、前述した第１の実施形態に係る制御部６（図１５及び図１６参照）や、第２の実施形態に係る制御部６ａ（図２８及び図２９参照）と異なる。
【０３６７】
ここで、図３８を参照しながら、システム制御部６１ｂ及び分布情報生成部６２ｂの詳細な構成について説明する。図３８に示すように、分布情報生成部６２ｂは、二次元化処理部６２１、強度補正分布決定部６２３、及び二次元化処理部６２５を含む。また、システム制御部６１ａは、強度制御量決定部６１１と、波長制御量決定部６１３とを含む。
【０３６８】
なお、二次元化処理部６２１、強度補正分布決定部６２３、及び強度制御量決定部６１１の動作と、当該強度制御量決定部６１１の動作に基づくシステム制御部６１ｂの動作とは、前述した第１の実施形態に係る画像取得装置１（図１６参照）と同様である。
【０３６９】
即ち、強度制御量決定部６１１は、二次元化処理部６２１からアイドラー光の強度分布を取得し、強度補正分布決定部６２３から補正量の最大幅の通知を受けて、取得したアイドラー光の強度分布と補正量の最大幅とに基づき、光源２の状態（特に、励起光の強度の変化）を監視する。また、強度制御量決定部６１１は、監視結果に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度を制御するための制御情報を生成する。そして、システム制御部６１ｂは、強度制御量決定部６１１が生成した制御情報に基づき、光源２から出射されるレーザー光（ポンプ光）の強度を制御すればよい。
【０３７０】
また、二次元化処理部６２５及び波長制御量決定部６１３と、当該波長制御量決定部６１３の動作に基づくシステム制御部６１ｂの動作とは、前述した第２の実施形態に係る画像取得装置１ａ（図２９参照）と同様である。
【０３７１】
即ち、波長制御量決定部６１３は、二次元化処理部６２５から、生成された蛍光の強度分布を取得し、当該蛍光の強度分布のコントラストを向上させるように、光源２から出射されるレーザー光（励起光）の波長（周波数）の制御量を決定する。波長制御量決定部６１３によりレーザー光の波長の制御量が決定されると、当該制御量に基づき、システム制御部６１ｂが、光源２を制御することで、当該光源２から出射されるレーザー光の波長を制御する。
【０３７２】
光源２から出射されるレーザー光の波長が制御されると、二次元化処理部６２５により、当該制御後のレーザー光に基づく蛍光の強度分布が取得され、取得された蛍光の強度分布が波長制御量決定部６１３に出力される。波長制御量決定部６１３は、改めて取得した蛍光の強度分布を評価し、当該蛍光の強度分布のコントラストを向上させるように、レーザー光の波長の制御量を算出する。
【０３７３】
以上の動作を繰り返すことで、システム制御部６１ｂ及び波長制御量決定部６１３により、光源２から出射されるレーザー光の波長が、蛍光の強度分布のコントラストが最大となるように制御される。
【０３７４】
また、本実施形態に係るＲＡＷ画像生成部６５の動作は、前述した第１及び第２の実施形態に係るＲＡＷ画像生成部６５と同様である。即ち、ＲＡＷ画像生成部６５は、二次元化処理部６２５から蛍光の強度分布を取得し、当該蛍光の強度分布を画像データ（ＲＡＷ画像）として、所定のファイルフォーマットに整形することでＲＡＷファイルを生成する。また、ＲＡＷ画像生成部６５は、当該蛍光の強度分布に関連する情報をシステム制御部６１から取得し、取得した情報を関連情報として、生成したＲＡＷファイルに関連付けてもよい。なお、ＲＡＷファイルに関連付けられる関連情報には、例えば、第１の実施形態で示した関連情報（図１９参照）や、第２の実施形態で示した関連情報（図３１参照）を含み得ることは言うまでもない。
【０３７５】
以上、図３７及び図３８を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ｂの構成について説明した。
【０３７６】
［３．３．まとめ］
以上説明したように、第１の実施形態に係る画像取得装置１と、第２の実施形態に係る画像取得装置１ａとを組み合わせることで、本実施形態に係る画像取得装置１ｂとして動作させることも可能である。なお、本実施形態に係る画像取得装置１ｂが、第１の実施形態に係る画像取得装置１と、第２の実施形態に係る画像取得装置１ａとの双方の作用効果を同様に奏することは言うまでもない。
【０３７７】
＜４．第４の実施形態＞
［４．１．画像取得装置の概要］
次に、第４の実施形態に係る画像取得装置について説明する。まず、図３９及び図４０を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置の課題について整理する。図３９は、本実施形態に係る画像取得装置の概要について説明するための図である。また、図４０は、本実施形態に係る補正処理の原理について説明するための説明図である。なお、以降では、本実施形態に係る画像処理装置を、他の実施形態に係る画像取得装置と区別するために、「画像取得装置１ｃ」と記載する場合がある。
【０３７８】
前述の第１の実施形態に係る画像取得装置１や、第３の実施形態に係る画像取得装置１ｂは、アイドラー光の強度分布に基づき補正データを生成し、生成した補正データに基づき、蛍光の強度分布上に顕在化した、レーザー光の強度変動に伴うノイズを補正する。
【０３７９】
一方で、蛍光及びアイドラー光の強度は、それぞれ別々に検出されるため、生成される蛍光の強度分布と、アイドラー光の強度分布とには、レーザー光の強度変動には依存しないノイズが、それぞれ別々に発生する場合がある。例えば、図３９は、生成された蛍光の強度分布Ｄ１１と、アイドラー光の強度分布Ｄ２１とに、それぞれ異なるノイズが発生している状態を模式的に示している。
【０３８０】
図３９に示す例の場合には、アイドラー光の強度分布Ｄ２１に基づき、蛍光の強度分布Ｄ１１を補正した場合には、補正処理後の蛍光の強度分布Ｄ１０には、補正前の蛍光の強度分布Ｄ１１に発生したノイズに加えて、アイドラー光の強度分布Ｄ２１に発生したノイズも重畳することとなる。即ち、図３９に示す例の場合には、補正処理によりレーザー光の強度の変動に伴うノイズを補正されるが、一方で、蛍光の強度分布Ｄ１１及び補正データＤ２１それぞれに発生したノイズが低減されることなく、補正処理後の蛍光の強度分布Ｄ１０に顕在化する。
【０３８１】
そこで、本実施形態に係る画像取得装置１ｃでは、図４０に示すように、生成された蛍光の強度分布Ｄ１１とアイドラー光の強度分布Ｄ２１とのそれぞれにノイズ補正処理を施す。これにより、画像取得装置１ｃは、蛍光の強度分布Ｄ１１及びアイドラー光の強度分布Ｄ２１に顕在化した、レーザー光の強度変動には依存しないノイズを補正してノイズ補正後の蛍光の強度分布Ｄ１１ａ及びアイドラー光の強度分布Ｄ２１ａを生成する。
【０３８２】
そして、本実施形態に係る画像取得装置１ｃは、蛍光の強度分布Ｄ１１ａを、アイドラー光の強度分布Ｄ２１ａで補正することで、蛍光の強度分布Ｄ１１ａに顕在化したレーザー光の強度変動に伴うノイズを補正して、補正処理後の蛍光の強度分布Ｄ１０を生成する。このような構成により、画像取得装置１ｃは、蛍光の強度分布Ｄ１１とアイドラー光の強度分布Ｄ２１とのそれぞれに発生した、レーザー光の強度変動には依存しないノイズの顕在化を抑制することが可能となる。
【０３８３】
また、本実施形態に係る画像取得装置１ｃは、ノイズ補正後の蛍光の強度分布Ｄ１１ａ及びアイドラー光の強度分布Ｄ２１ａに基づき、ＲＡＷファイルＤ１を生成する。これにより、情報処理装置８００のような外部装置において、同様に補正処理後の蛍光の強度分布Ｄ１０を生成したとしても、レーザー光の強度変動には依存しないノイズの顕在化を抑制することが可能となる。以下に、本実施形態に係る画像取得装置１ｃの詳細について説明する。
【０３８４】
［４．２．画像取得装置の構成］
本実施形態に係る画像取得装置は、前述した第３の実施形態に係る画像取得装置１ｂにおける分布情報生成部６２ｂに対応する分布情報生成部６２ｃの構成が、画像取得装置１ｂと異なり、その他の構成については、基本的には当該画像取得装置１ｂと同様である。そのため、以降では、図４１を参照しながら、本実施形態に係る分布情報生成部６２ｃの構成に着目して説明する。図４１は、本実施形態に係る分布情報生成部６２ｃ及びシステム制御部６１ｃの詳細な機能構成について説明するための説明図である。
【０３８５】
図４１に示すように、本実施形態に係る分布情報生成部６２ｃは、補正処理部６２７と、補正処理部６２９とを含む点で、前述した第３の実施形態に係る分布情報生成部６２ｂ（図３８参照）と異なる。
【０３８６】
本実施形態に係る分布情報生成部６２ｃでは、二次元化処理部６２１は、生成したアイドラー光の強度分布を補正処理部６２７に出力する。
【０３８７】
補正処理部６２７は、二次元化処理部６２１からアイドラー光の強度分布を取得し、取得したアイドラー光の強度分布に対して、レーザー光の強度変動には依存しないノイズに対する補正処理を施す。このとき、補正処理部６２７は、取得したアイドラー光の強度分布に対して画素単位のフィルタを適用する。
【０３８８】
画素単位のフィルタの一例としては、例えば、メディアンフィルタが挙げられる。この場合には、補正処理部６２７は、例えば、アイドラー光の強度分布中の画素それぞれを基準画素とし、当該基準画素の画素値を閾値として、周囲の他の画素（例えば、周囲８画素）に対して閾値処理を施す。そして、補正処理部６２７は、当該基準画素と周囲の他の画素との間で画素値を平滑化する。
【０３８９】
なお、補正処理部６２７は、基準画素と周囲の他の画素との間で画素値を平滑化する場合には、単純平均を用いてもよいし、所定の統計に従い各画素値を平滑化してもよい。
【０３９０】
また、補正処理部６２７は、周囲の他の画素に対する閾値処理や、基準画素と周囲の他の画素との間で画素値の平滑化に係る処理に対して異方性を持たせてもよい。具体的な一例として、補正処理部６２７は、横方向に対して縦方向よりも、より強いノイズ除去処理が施されるように、当該ノイズ除去処理のパラメタ（例えば、閾値）を制御してもよい。
【０３９１】
補正処理部６２７は、ノイズ除去処理が施されたアイドラー光の強度分布を、強度補正分布決定部６２３及び強度制御量決定部６１１に出力する。なお、以降の処理、即ち、強度補正分布決定部６２３及び強度制御量決定部６１１の動作については、ノイズ除去処理後のアイドラー光の強度分布を対象としている点を除けば、前述した第１及び第３の実施形態に係る画像取得装置と同様である。
【０３９２】
また、本実施形態に係る分布情報生成部６２ｃでは、二次元化処理部６２５は、生成した蛍光の強度分布を補正処理部６２９に出力する。
【０３９３】
補正処理部６２９は、二次元化処理部６２５からアイドラー光の強度分布を取得し、取得した蛍光の強度分布に対して、レーザー光の強度変動には依存しないノイズに対する補正処理を施す。このとき、補正処理部６２９は、取得した蛍光の強度分布に対して周波数単位のフィルタ（即ち、周波数フィルタ）を適用する。
【０３９４】
具体的には、補正処理部６２９は、所定の周波数を閾値として、当該閾値よりも高い周波数の信号をノイズと見做して除去する（即ち、高周波成分を除去する）。このように、補正処理部６２７と、補正処理部６２９とは、それぞれが取得した強度分布に対して、互いに方式の異なるノイズ除去処理を施す。
【０３９５】
補正処理部６２９は、ノイズ除去処理が施された蛍光の強度分布を、波長制御量決定部６１３、補正処理部６３、及びＲＡＷ画像生成部６５に出力する。なお、以降の処理、即ち、波長制御量決定部６１３、補正処理部６３、及びＲＡＷ画像生成部６５の動作については、ノイズ除去処理後の蛍光の強度分布を対象としている点を除けば、前述した第２及び第３の実施形態に係る画像取得装置と同様である。
【０３９６】
また、本実施形態に係るＲＡＷ画像生成部６５は、ノイズ除去後の蛍光の強度分布を画像データとしてＲＡＷファイルを生成し、当該ＲＡＷファイルに対して、ノイズ除去後のアイドラー光の強度分布を関連情報として関連付けることは言うまでもない。
【０３９７】
以上、図４１を参照しながら、本実施形態に係る画像取得装置１ｃの構成について、特に、分布情報生成部６２ｃの動作に着目して説明した。なお、補正処理部６２７及び６２９は、必ずしも双方を設ける必要はなく、いずれかのみが設けられていてもよい。
【０３９８】
［４．３．ＲＡＷファイルのファイルフォーマット］
次に、図４２を参照しながら、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ｃのファイルフォーマットの一例について説明する。図４２は、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ｃのファイルフォーマットの一例を示した図である。
【０３９９】
図４２に示すように、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ｃは、例えば、データ領域ｄ１０と、基本制御情報領域ｄ３０と、拡張領域ｄ２０ｃとを含む。なお、データ領域ｄ１０及び基本制御情報領域ｄ３０の構成については、前述した第１の実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１（図１９参照）と同様のため、詳細な説明は省略する。
【０４００】
図４２に示すように、拡張領域ｄ２０ｃは、メーカーノートＩＦＤｄ２１を含む。メーカーノートＩＦＤｄ２１は、カメラ制御モードなどのＥＸＩＦに規定されていない情報を格納するためのＩＦＤであり、画像取得装置１に固有の撮影情報や制御情報も格納される。
【０４０１】
また、本実施形態に係るメーカーノートＩＦＤｄ２１は、例えば、撮影条件ｄ２１１と、初期撮影画像ｄ２２１と、ユーザが指定したターゲット画像ｄ２２２と、ユーザの指定した可変範囲ｄ２２３と、ノイズ分離に用いたデータｄ２３１と、ノイズ分離に適用したパラメタｄ２３２と、ノイズ補正後のアイドラー光の強度画像とを含む。なお、撮影条件ｄ２１１、初期撮影画像ｄ２２１、ユーザが指定したターゲット画像ｄ２２２、及びユーザの指定した可変範囲ｄ２２３は、前述した第２の実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ａ（図３１参照）と同様である。
【０４０２】
ノイズ補正後のアイドラー光の強度画像ｄ２３３は、補正処理部６２７によりノイズ除去処理が施されたアイドラー光の強度分布Ｄ２１ａを示している。なお、アイドラー光の強度分布Ｄ２１ａに替えて、当該アイドラー光の強度分布Ｄ２１ａに基づき算出された補正データを、ノイズ補正後のアイドラー光の強度画像ｄ２３３としてＲＡＷファイルＤ１ｃに記録してもよい。
【０４０３】
ノイズ分離に用いたデータｄ２３１は、蛍光の強度分布Ｄ１１に対してノイズ除去のために適用した周波数フィルタのデータを示している。なお、蛍光の強度分布Ｄ１１に対して施されたノイズ除去処理の内容が特定できれば、ノイズ分離に用いたデータｄ２３１の形式は特に限定されない。具体的な一例として、ノイズ分離に用いたデータｄ２３１は、周波数フィルタの特性（周波数特性）を示すヒストグラムであってもよい。
【０４０４】
このように、ＲＡＷファイルＤ１ｃにノイズ分離に用いたデータｄ２３１を記録しておくことで、当該ＲＡＷファイルＤ１ｃを読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、ＲＡＷ本画像ｄ１１上のノイズを、本実施形態に係る画像取得装置１ｃと同様に補正することが可能となる。
【０４０５】
ノイズ分離に適用したパラメタｄ２３２は、アイドラー光の強度分布に基づく補正データＤ２１に対して施したノイズ除去処理の種別やその内容を示すパラメタ（例えば、適用したフィルタを示す情報やそのパラメタ）である。なお、補正データＤ２１に対して施されたノイズ除去処理の種別やその内容が特定できれば、ノイズ分離に適用したパラメタｄ２３２の形式は特に限定されない。
【０４０６】
このように、ＲＡＷファイルＤ１ｃにノイズ分離に適用したパラメタｄ２３２を記録しておくことで、当該ＲＡＷファイルＤ１ｃを読み出した外部装置（例えば、情報処理装置８００）が、ノイズ補正後のアイドラー光の強度画像に対して施されたノイズ除去処理の内容を特定することが可能となる。
【０４０７】
以上、図４２を参照しながら、本実施形態に係るＲＡＷファイルＤ１ｃのファイルフォーマットについて説明した。なお、上記に示すＲＡＷファイルＤ１ｃのファイルフォーマットはあくまで一例であり、必ずしも全ての情報を含まなくてもよいことは言うまでもない。
【０４０８】
［４．４．まとめ］
以上説明したように、本実施形態に係る画像取得装置１ｃは、蛍光の強度分布Ｄ１１とアイドラー光の強度分布Ｄ２１とのそれぞれに対してノイズ補正処理を施して、ノイズ補正後の蛍光の強度分布Ｄ１１ａ及びアイドラー光の強度分布Ｄ２１ａを生成する。そして、画像取得装置１ｃは、蛍光の強度分布Ｄ１１ａを、アイドラー光の強度分布Ｄ２１ａで補正することで、蛍光の強度分布Ｄ１１ａに顕在化したレーザー光の強度変動に伴うノイズを補正して、補正処理後の蛍光の強度分布Ｄ１０を生成する。このような構成により、本実施形態に係る画像取得装置１ｃは、蛍光の強度分布Ｄ１１とアイドラー光の強度分布Ｄ２１とのそれぞれに発生した、レーザー光の強度変動には依存しないノイズの顕在化を抑制することが可能となる。
【０４０９】
また、本実施形態に係る画像取得装置１ｃは、ノイズ補正後の蛍光の強度分布Ｄ１１ａ及びアイドラー光の強度分布Ｄ２１ａに基づき、ＲＡＷファイルＤ１ｃを生成する。これにより、情報処理装置８００のような外部装置において、同様に補正処理後の蛍光の強度分布Ｄ１０を生成したとしても、レーザー光の強度変動には依存しないノイズの顕在化を抑制することが可能となる。
【０４１０】
＜５．ハードウェア構成＞
次に、図４３を参照して、本実施形態に係る画像取得装置１のハードウェア構成の一例について説明する。図４３は、本実施形態に係る画像取得装置１のハードウェア構成の一例を示した図である。
【０４１１】
図４３に示すように、本実施形態に係る画像取得装置１は、プロセッサ９０１と、メモリ９０３と、ストレージ９０５と、光源ユニット９０７と、測定ユニット９０９と、操作デバイス９１１と、表示デバイス９１３と、通信デバイス９１５と、バス９１７とを含む。
【０４１２】
プロセッサ９０１は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）、ＤＳＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）又はＳｏＣ（Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｎ  Ｃｈｉｐ）であってよく、画像取得装置１の様々な処理を実行する。プロセッサ９０１は、例えば、各種演算処理を実行するための電子回路により構成することが可能である。なお、前述した制御部６に含まれる各構成は、プロセッサ９０１により構成され得る。
【０４１３】
メモリ９０３は、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）及びＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）を含み、プロセッサ９０１により実行されるプログラム及びデータを記憶する。ストレージ９０５は、半導体メモリ又はハードディスクなどの記憶媒体を含み得る。なお、前述した記憶部６６は、例えば、メモリ９０３やストレージ９０５により構成され得る。
【０４１４】
光源ユニット９０７は、サンプルＳに対して励起光を照射するためのユニットであり、前述した光源２に対応している。光源ユニット９０７は、出射される励起光の強度及び波長が、プロセッサ９０１により制御する。
【０４１５】
測定ユニット９０９は、光源ユニット９０７から出射された励起光をサンプルＳに向けて導光させるとともに、サンプルＳからの蛍光を検出するユニットであり、前述した測定部３に対応している。測定ユニット９０９は、プロセッサ９０１の制御に従い、光源ユニット９０７から出射された光の光路を制御し、当該光によりサンプルＳ上を走査する。
【０４１６】
操作デバイス９１１は、ユーザが所望の操作を行うための入力信号を生成する機能を有する。操作デバイス９１１は、例えばボタン及びスイッチなどユーザが情報を入力するための入力部と、ユーザによる入力に基づいて入力信号を生成し、プロセッサ９０１に供給する入力制御回路などから構成されてよい。なお、前述した条件指定部７１は、操作デバイス９１１により構成され得る。
【０４１７】
表示デバイス９１３は、出力装置の一例であり、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ：Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ）装置、有機ＥＬ（ＯＬＥＤ：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ）ディスプレイ装置などの表示装置であってよい。表示デバイス９１３は、ユーザに対して画面を表示することにより情報を提供することができる。なお、前述した表示部７２は、表示デバイス９１３により構成され得る。
【０４１８】
通信デバイス９１５は、画像取得装置１が備える通信手段であり、ネットワークを介して情報処理装置８００のような外部装置と通信する。通信デバイス９１５は、無線通信用のインタフェースであり、通信アンテナ、ＲＦ（Ｒａｄｉｏ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）回路、ベースバンドプロセッサなどを含んでもよい。
【０４１９】
通信デバイス９１５は、外部装置から受信した信号に各種の信号処理を行う機能を有し、受信したアナログ信号から生成したデジタル信号をプロセッサ９０１に供給することが可能である。なお、前述した通信部７３は、通信デバイス９１５により構成され得る。
【０４２０】
バス９１７は、プロセッサ９０１、メモリ９０３、ストレージ９０５、光源ユニット９０７、測定ユニット９０９、操作デバイス９１１、表示デバイス９１３、及び通信デバイス９１５を相互に接続する。バス９１７は、複数の種類のバスを含んでもよい。
【０４２１】
また、コンピュータに内蔵されるＣＰＵ、ＲＯＭ及びＲＡＭなどのハードウェアを、上記した画像取得装置１が有する構成と同等の機能を発揮させるためのプログラムも作成可能である。また、当該プログラムを記録した、コンピュータに読み取り可能な記憶媒体も提供され得る。
【０４２２】
＜６．まとめ＞
以上、添付図面を参照しながら本開示の好適な実施形態について詳細に説明したが、本開示の技術的範囲はかかる例に限定されない。本開示の技術分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の制御例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本開示の技術的範囲に属するものと了解される。
【０４２３】
また、本明細書に記載された効果は、あくまで説明的または例示的なものであって限定的ではない。つまり、本開示に係る技術は、上記の効果とともに、または上記の効果に代えて、本明細書の記載から当業者には明らかな他の効果を奏しうる。
【０４２４】
なお、以下のような構成も本開示の技術的範囲に属する。
（１）
レーザー光を出射し、当該レーザー光の波長を制御可能に構成された光源と、
前記レーザー光によりサンプルを走査し、当該レーザー光を受けて前記サンプルからの測定対象光の強度を測定する測定部と、
測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルの画像を生成する制御部と、
を備え、
前記制御部は、測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、前記レーザー光の波長を制御する、画像取得装置。
（２）
前記光源は、第１の波長のレーザー光と、前記第１の波長とは異なる第２の波長のレーザー光とを切り替えて出射し、
前記測定部は、前記第１の波長及び前記第２の波長のレーザー光それぞれで、前記サンプルを走査し、前記第１の波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の第１の強度と、前記第２の波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の第２の強度とを測定し、
前記制御部は、
前記第１の波長及び前記第２の波長のうち、少なくともいずれか一方の波長を、前記第１の強度の強度分布と前記第２の強度の強度分布とに基づき制御する、
前記（１）に記載の画像取得装置。
（３）
前記サンプルに含まれる、互いに異なる第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の、前記第１の波長に対する蛍光相対効率をそれぞれＥ（λ１，Ｆ１）、Ｅ（λ１，Ｆ２）とし、
前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素の、前記第２の波長に対する蛍光相対効率をそれぞれＥ（λ２，Ｆ１）、Ｅ（λ２，Ｆ２）としたとき、
前記制御部は、制御前の前記第１の波長及び前記第２の波長を、以下に示す式１２で示された式が最大となるように決定する、前記（２）に記載の画像取得装置。
2015114420.tif 000016
（４）
前記測定部は、前記一方の波長よりも高い波長と、当該一方の波長よりも低い波長のそれぞれについて、当該波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の強度を測定し、
前記制御部は、前記高い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布と、前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布とのそれぞれのコントラストを算出して比較し、当該比較結果に基づき、前記一方の波長を、前記高い波長及び前記低い波長のうち、算出した前記コントラストが高い強度分布に対応した波長側に制御する、前記（２）または（３）に記載の画像取得装置。
（５）
前記制御部は、前記一方の波長の制御と、当該制御後の前記一方の波長を基準とした前記高い波長及び前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布のコントラストの比較とを繰り返すことで、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記一方の波長を制御する、前記（４）に記載の画像取得装置。
（６）
前記制御部は、
前記第１の波長及び前記第２の波長のうち他方の波長を固定して、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記一方の波長を制御し、
次いで、制御後の前記一方の波長を固定し、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記他方の波長を制御する、
前記（５）に記載の画像取得装置。
（７）
前記測定部は、前記第１の波長及び前記第２の波長それぞれを、所定の波長ずつ変更して、変更前及び変更後のそれぞれについて、前記第１の波長及び前記第２の波長それぞれのレーザー光に基づく前記測定対象光の強度を測定し、
前記制御部は、前記第１の波長及び前記第２の波長それぞれについて、変更前の前記測定対象光の強度分布と、変更後の前記測定対象光の強度分布とのそれぞれのコントラストを算出して比較し、当該比較結果に基づき、前記第１の波長及び前記第２の波長のうち、当該変更前と当該変更後との間で算出された前記コントラストの差が大きい波長を前記一方の波長とする、前記（２）〜（６）のいずれか一項に記載の画像取得装置。
（８）
前記第１の波長のレーザー光に基づき測定された前記測定対象光の強度分布に基づく第１の画像中において輝度が最も高い画素を示す第１の座標を（ｘ１，ｙ１）とし、
前記第２の波長のレーザー光に基づき測定された前記測定対象光の強度分布に基づく第２の画像中において輝度が最も高い画素を示す第２の座標を（ｘ２，ｙ２）とし、
前記第１の画像中における、第１の座標の輝度をＬ（λ１，ｘ１，ｙ１）、第２の座標の輝度をＬ（λ１，ｘ２，ｙ２）とし、
前記第２の画像中における、第１の座標の輝度をＬ（λ２，ｘ１，ｙ１）、第２の座標の輝度をＬ（λ２，ｘ２，ｙ２）としたとき、
前記制御部は、前記コントラストＣ（λ１，λ２）を、以下に示す式１３に基づき決定する、前記（４）〜（７）のいずれか一項に記載の画像取得装置。
2015114420.tif 000017
（９）
前記測定部は、出射可能な前記レーザー光の波長のうち、一の波長を基準波長として、前記基準波長よりも高い波長と、当該基準波長よりも低い波長とのそれぞれについて、当該波長のレーザー光に基づく前記測定対象光の強度を測定し、
前記制御部は、前記高い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布と、前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布とのそれぞれのコントラストを算出して比較し、当該比較結果に基づき、前記レーザー光の波長を、前記基準波長から、前記高い波長及び前記低い波長のうち、算出した前記コントラストが高い強度分布に対応した波長側に制御する、前記（１）に記載の画像取得装置。
（１０）
前記制御部は、前記レーザー光の波長の制御と、当該制御後の波長を前記基準波長とした前記高い波長及び前記低い波長の前記レーザー光に基づく前記測定対象光の強度分布のコントラストの比較とを繰り返すことで、前記測定対象光の強度分布のコントラストが最大となるように前記レーザー光の波長を制御する、前記（９）に記載の画像取得装置。
（１１）
前記光源は、所定の周波数のポンプ光を出力するレーザー部と、光パラメトリック発振器とを備え、前記光パラメトリック発振器の発振条件を制御することで、前記レーザー光の波長を制御可能に構成されている、前記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の画像取得装置。
（１２）
前記光源と、前記測定部とは、同一筐体内に設けられている、前記（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の画像取得装置。
（１３）
前記測定部は、前記光源から出射されたレーザー光の強度を測定し、
前記制御部は、測定された当該レーザー光の強度に基づき、前記光源から出射されるレーザー光の強度の制御と、測定された前記測定対象光の強度分布の補正との、少なくともいずれかを実行する、前記（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の画像取得装置。
（１４）
レーザー光の波長を制御可能に構成された光源から出射された前記レーザー光によりサンプルを走査し、当該レーザー光を受けて前記サンプルから生じる測定対象光の強度を測定することと、
測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、当該サンプルの画像を生成することと、
測定された前記測定対象光の強度分布に基づき、前記レーザー光の波長を制御すること、
を含む画像取得方法。
【符号の説明】
【０４２５】
１、１ａ、１ｂ、１ｃ    画像取得装置
２    光源
３、３ａ  測定部
４    顕微鏡ユニット
４１    非偏光ビームスプリッタ
４２    対物レンズ
４３    フィルタ
４４    非偏光ビームスプリッタ
４５    カメラ
４６    アイピース
５、５ａ  走査系（検出系）
５１    ガルバノミラー
５２    ダイクロイックミラー
５３    ＰＭＴ
５４    ＰＤ
５５    ビームスプリッタ
６、６ａ、６ｂ  制御部
６１、６１ａ、６１ｂ、６１ｃ    システム制御部
６１１  強度制御量決定部
６１３  波長制御量決定部
６２、６２ａ、６２ｂ、６２ｃ    分布情報生成部
６２１  二次元化処理部
６２３  強度補正分布決定部
６２５  二次元化処理部
６２７  補正処理部
６２９  補正処理部
６３    補正処理部
６４    画像処理部
６５    ＲＡＷ画像生成部
６６    記憶部
６７    表示制御部
６８    通信制御部
７    Ｉ／Ｆ
７１    条件指定部
７２    表示部
７３    通信部
８００  情報処理装置
【図１】
2015114420.tif 000020
【図２】
2015114420.tif 000021
【図３】
2015114420.tif 000022
【図４】
2015114420.tif 000023
【図５】
2015114420.tif 000024
【図６】
2015114420.tif 000025
【図７】
2015114420.tif 000026
【図８】
2015114420.tif 000027
【図９】
2015114420.tif 000028
【図１０】
2015114420.tif 000029
【図１１】
2015114420.tif 000030
【図１２】
2015114420.tif 000031
【図１３Ａ】
2015114420.tif 000032
【図１３Ｂ】
2015114420.tif 000033
【図１４】
2015114420.tif 000034
【図１５】
2015114420.tif 000035
【図１６】
2015114420.tif 000036
【図１７】
2015114420.tif 000037
【図１８】
2015114420.tif 000038
【図１９】
2015114420.tif 000039
【図２０】
2015114420.tif 000040
【図２１】
2015114420.tif 000041
【図２２】
2015114420.tif 000042
【図２３】
2015114420.tif 000043
【図２４】
2015114420.tif 000044
【図２５】
2015114420.tif 000045
【図２６】
2015114420.tif 000046
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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