(57)【要約】      （修正有）【課題】酵母を用いて製造された飲食品を、簡便且つ正確に識別する方法を提供する。【解決手段】飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある５種の特定の塩基配列と一致するか否かを判定し、一致した場合は、前記飲食品が５種の特定の塩基配列のアルギナーゼ遺伝子を有する飲食品製造用酵母を用いて製造されたものであると識別する飲食品の識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対比する酵母が同一か否かを判別するために用いるアルギナーゼ遺伝子であって、酵母が有するアルギナーゼ遺伝子を配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列を有するように変異させたことを特徴とするアルギナーゼ遺伝子。
【請求項２】
請求項１記載のアルギナーゼ遺伝子において、前記塩基配列は、所定の制限酵素で識別可能な塩基配列であることを特徴とするアルギナーゼ遺伝子。
【請求項３】
請求項１，２いずれか１項に記載のアルギナーゼ遺伝子において、前記塩基配列は、所定の制限酵素により変異前に存在した塩基配列の一部が切断するものであることを特徴とするアルギナーゼ遺伝子。
【請求項４】
対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別するために用いる飲食品製造用酵母であって、飲食品製造用酵母が有するアルギナーゼ遺伝子を配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列を有するように変異させたことを特徴とする飲食品製造用酵母。
【請求項５】
請求項４記載の飲食品製造用酵母において、前記塩基配列は、所定の制限酵素で識別可能な塩基配列であることを特徴とする飲食品製造用酵母。
【請求項６】
請求項４，５いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母において、前記塩基配列は、所定の制限酵素により変異前に存在した塩基配列の一部が切断するものであることを特徴とする飲食品製造用酵母。
【請求項７】
請求項４〜６いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母において、前記アルギナーゼ遺伝子は、飲食品製造において発現させる必要のないものであることを特徴とする飲食品製造用酵母。
【請求項８】
請求項４〜７いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母において、醸造特性を向上させる変異遺伝子を有することを特徴とする飲食品製造用酵母。
【請求項９】
請求項８記載の飲食品製造用酵母において、前記変異遺伝子は、脂肪酸合成酵素遺伝子ＦＡＳ２の３７４８位の塩基Ｇが塩基Ａに変異したヘテロ接合型の変異遺伝子であることを特徴とする飲食品製造用酵母。
【請求項１０】
飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品であって、請求項４〜９いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母を用いて製造されたものであることを特徴とする飲食品。
【請求項１１】
飲食品の製造に用いられた対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別する方法であって、前記飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列と一致しているか否かを判定して、この対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別することを特徴とする飲食品製造用酵母の同一性判別方法。
【請求項１２】
飲食品の製造に用いられた対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別する方法であって、前記飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を所定の制限酵素で処理し、この制限酵素で処理した前記飲食品製造用酵母若しくは前記飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列と比較して該塩基配列の一部が切断されているか否かを判定し、この対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別することを特徴とする飲食品製造用酵母の同一性判別方法。
【請求項１３】
飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品の識別方法であって、前記飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列と一致しているか否かを判定し、一致した場合は、前記飲食品が配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列のアルギナーゼ遺伝子を有する飲食品製造用酵母を用いて製造されたものであると識別することを特徴とする飲食品の識別方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の飲食品の識別方法において、前記配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列を、産地、原材料、製造者若しくは製造時期等の生産情報と対応させたことを特徴とする飲食品の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギナーゼ遺伝子、飲食品製造用酵母及び飲食品並びに飲食品製造用酵母の同一性判別方法及び飲食品の識別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、酒類におけるラベル不正表示、食品原料の産地偽装、飲食品の賞味期限・消費期限偽装等の相次ぐ不祥事により、消費者は食の安全性に対して不安を抱くと共に、飲食品メーカーに対して不信感を高めている。
【０００３】
このような状況の中、飲食品業界では、上述のような不祥事の再発防止を目的とて、飲食品の生産履歴やラベル表示の正確性、安全性を担保する技術が求められており、例えば特許文献１〜９、非特許文献１〜４に示すような、核酸解析技術を用いて簡便且つ正確に飲食品の産地や原材料を識別する種々の方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２１０２２２号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５６３６号公報
【特許文献３】特開２００８−１９３９０４号公報
【特許文献４】特開２００７−１８１４３８号公報
【特許文献５】特開２００７−０８２４３１号公報
【特許文献６】特開２００６−３４０６７１号公報
【特許文献７】特開２００５−０２７５２７号公報
【特許文献８】特開２００４−３２９０８６号公報
【特許文献９】特開２００３−２４５０７７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Akada R.et al. : J.Biosci.Bioeng.,Vol.92,p.189-192,(2001).
【非特許文献２】岸綾華 : PCR-DGGE法による清酒もろみ中の清酒酵母の判別，第62                  回日本生物工学会大会  講演要旨集（平成22年度）, p.43
【非特許文献３】Kawahata M.et al. : Biosci.Biotechnol.Biochem.,Vol.71,p1616-                  1620,(2007).
【非特許文献４】Ogihara F.et al. : Yeast,Vol.25,p419-432,(2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１のAkadaらの方法は、セレルニン耐性付与による酵母のFAS2遺伝子の変異部位を利用した判別法であるが、酵母にFAS2変異を導入すると、この酵母はカプロン酸エチル高生産性になるため、酵母の形質が大きく変化し、この酵母を用いた酵母発酵物の特徴（例えば香味など）も、変異前の酵母とは大きく異なってしまうという問題があり、更に、セルレニン耐性株のFAS2変異部位は、一定の箇所が明らかになっているのみであり、識別マーカーとしての多様性に限界があった。
【０００７】
また、上述した特許文献及び非特許文献に示される識別方法は、いずれも限定された酵母間の特定部位の塩基配列の多様性を利用したものであり、識別可能な酵母や検出系が限定されるため、識別の信頼性が低いという問題があった。
【０００８】
本発明は、特定の酵母の核酸を標識し、製造や流通の過程において、その履歴を管理・追跡する手法がまだ未確立である点に鑑み、特定のアルギナーゼ欠損酵母によって製造された飲食品及びその加工品から得られる核酸試料のアルギナーゼ遺伝子（CAR1）を核酸増幅法により増幅し、更に制限酵素による切断処理を行うことによって、その増幅産物のパターンに基づき、特定のアルギナーゼ欠損酵母由来のアルギナーゼ遺伝子の有無を検出でき、従って、この特定のアルギナーゼ欠損酵母を用いて製造された飲食品であるかどうかを簡便且つ正確に判別することで飲食品の産地や原材料等を識別し得る技術を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１０】
対比する酵母が同一か否かを判別するために用いるアルギナーゼ遺伝子であって、酵母が有するアルギナーゼ遺伝子を配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列を有するように変異させたことを特徴とするアルギナーゼ遺伝子に係るものである。
【００１１】
また、請求項１記載のアルギナーゼ遺伝子において、前記塩基配列は、所定の制限酵素で識別可能な塩基配列であることを特徴とするアルギナーゼ遺伝子に係るものである。
【００１２】
また、請求項１，２いずれか１項に記載のアルギナーゼ遺伝子において、前記塩基配列は、所定の制限酵素により変異前に存在した塩基配列の一部が切断するものであることを特徴とするアルギナーゼ遺伝子に係るものである。
【００１３】
また、対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別するために用いる飲食品製造用酵母であって、飲食品製造用酵母が有するアルギナーゼ遺伝子を配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列を有するように変異させたことを特徴とする飲食品製造用酵母に係るものである。
【００１４】
また、請求項４記載の飲食品製造用酵母において、前記塩基配列は、所定の制限酵素で識別可能な塩基配列であることを特徴とする飲食品製造用酵母に係るものである。
【００１５】
また、請求項４，５いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母において、前記塩基配列は、所定の制限酵素により変異前に存在した塩基配列の一部が切断するものであることを特徴とする飲食品製造用酵母に係るものである。
【００１６】
また、請求項４〜６いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母において、前記アルギナーゼ遺伝子は、飲食品製造において発現させる必要のないものであることを特徴とする飲食品製造用酵母に係るものである。
【００１７】
また、請求項４〜７いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母において、醸造特性を向上させる変異遺伝子を有することを特徴とする飲食品製造用酵母に係るものである。
【００１８】
また、請求項８記載の飲食品製造用酵母において、前記変異遺伝子は、脂肪酸合成酵素遺伝子ＦＡＳ２の３７４８位の塩基Ｇが塩基Ａに変異したヘテロ接合型の変異遺伝子であることを特徴とする飲食品製造用酵母に係るものである。
【００１９】
また、飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品であって、請求項４〜９いずれか１項に記載の飲食品製造用酵母を用いて製造されたものであることを特徴とする飲食品に係るものである。
【００２０】
また、飲食品の製造に用いられた対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別する方法であって、前記飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列と一致しているか否かを判定して、この対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別することを特徴とする飲食品製造用酵母の同一性判別方法に係るものである。
【００２１】
また、飲食品の製造に用いられた対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別する方法であって、前記飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を所定の制限酵素で処理し、この制限酵素で処理した前記飲食品製造用酵母若しくは前記飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列と比較して該塩基配列の一部が切断されているか否かを判定し、この対比する飲食品製造用酵母が同一か否かを判別することを特徴とする飲食品製造用酵母の同一性判別方法に係るものである。
【００２２】
また、飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品の識別方法であって、前記飲食品から飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸を取得し、この取得した飲食品製造用酵母若しくは飲食品製造用酵母核酸のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を確知し、この確知した塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列と一致しているか否かを判定し、一致した場合は、前記飲食品が配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列のアルギナーゼ遺伝子を有する飲食品製造用酵母を用いて製造されたものであると識別することを特徴とする飲食品の識別方法に係るものである。
【００２３】
また、請求項１３記載の飲食品の識別方法において、前記配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列を、産地、原材料、製造者若しくは製造時期等の生産情報と対応させたことを特徴とする飲食品の識別方法に係るものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は上述のように構成したから、飲食品製造用酵母の塩基配列を確認し、この塩基配列が、変異させて予め確知してある配列番号１〜５いずれかに示される特有の塩基配列と一致するか否かを判定することで、飲食品製造用酵母の同一性を容易に且つ正確に判別できることになる。
【００２５】
また、この配列番号１〜５の塩基配列を夫々固有の識別情報（生産情報）、例えば産地や製造時期（製造期間）等とすれば、たとえ同一銘柄の酒類でも、この配列番号１〜５いずれかに示される特有の塩基配列のアルギナーゼ遺伝子を有する飲食品製造用酵母を用いて製造した飲食品か否かを識別できるから、産地や製造時期などの生産情報（生産履歴）を正確に識別することが可能となり、よって、飲食品のラベル不正表示、産地偽装、賞味期限・消費期限の偽装等の不正行為を抑制できると共に、このような不正行為の早期発見にも寄与し得ることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１に係る各種酵母のアルギナーゼ遺伝子（１位〜５３６位）の塩基配列パターンである。
【図２】実施例１に係る各種酵母のアルギナーゼ遺伝子（５３７位〜１００２位）の塩基配列パターンである。
【図３】実施例１に係る各種飲食品製造用酵母のFAS2遺伝子の変異部位の塩基配列パターン図である。
【図４】実施例１に係る飲食品製造用酵母（G9CRarg11）の塩基配列解析の説明図である。
【図５】実施例１に係る飲食品製造用酵母（G9CRarg22）の塩基配列解析の説明図である。
【図６】実施例１に係る飲食品製造用酵母（G9CRarg26）の塩基配列解析の説明図である。
【図７】実施例１に係る飲食品製造用酵母（G9CRarg11）を判別する電気泳動パターンである。
【図８】実施例１に係る飲食品製造用酵母（G9CRarg22）を判別する電気泳動パターンである。
【図９】実施例１に係る飲食品製造用酵母（G9CRarg26）を判別する電気泳動パターンである。
【図１０】実施例２に係る各種酵母のアルギナーゼ遺伝子（１位〜８９７位）の塩基配列パターンである。
【図１１】実施例２に係る各種酵母のアルギナーゼ遺伝子（８９８位〜１００２位）の塩基配列パターンである。
【図１２】実施例２に係る飲食品製造用酵母（G9arg32）の塩基配列解析の説明図である。
【図１３】実施例３に係る各種酵母のアルギナーゼ遺伝子（１位〜８９７位）の塩基配列パターンである。
【図１４】実施例３に係る各種酵母のアルギナーゼ遺伝子（８９８位〜１００２位）の塩基配列パターンである。
【図１５】実施例３に係る飲食品製造用酵母（G74NFarg1）の塩基配列解析の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好適と考える本発明の実施形態を、図面に基づいて本発明の作用を示して簡単に説明する。
【００２８】
本発明のアルギナーゼ遺伝子は、塩基配列が配列番号１〜５いずれかに示される塩基配列に変異させたものである。
【００２９】
具体的には、配列番号１の塩基配列を有するアルギナーゼ遺伝子は、変異により、変異前の塩基配列の７３１位〜７３８位のＡＡＡＣＡＡＡＣからＡＡＡＣが欠失したものである。
【００３０】
また、配列番号２の塩基配列を有するアルギナーゼ遺伝子は、変異により、変異前の塩基配列の７６８位の塩基Ｃが塩基Ａに置換したものである。
【００３１】
また、配列番号３の塩基配列を有するアルギナーゼ遺伝子は、変異により、変異前の塩基配列の７８１位の塩基Ｇが塩基Ａに置換したものである。
【００３２】
また、配列番号４の塩基配列を有するアルギナーゼ遺伝子は、変異により、変異前の塩基配列の８３４位〜８３９位のＧＡＧＡＧＡからＧＡが欠失したものである。
【００３３】
また、配列番号５の塩基配列を有するアルギナーゼ遺伝子は、変異により、変異前の塩基配列の８１７位〜８２０位のＡＧＡＧからＡＧが欠失したものである。
【００３４】
このように、本発明のアルギナーゼ遺伝子は、変異により、夫々特有の塩基配列のアルギナーゼ遺伝子となっているから、この特有の塩基配列を識別情報とすれば、このアルギナーゼ遺伝子の塩基配列の有無を確知することで酵母の同一性判別を容易に且つ正確に行うことができる。
【００３５】
この配列番号１〜５いずれかの塩基配列を示す変異させたアルギナーゼ遺伝子は、酵母、具体的には、飲食品製造用酵母の変異により取得し得る。即ち、本発明の変異させたアルギナーゼ遺伝子は、飲食品製造用酵母を変異させてアルギナーゼ欠損酵母（アルギナーゼ遺伝子内の一塩基以上の塩基の挿入、欠失、置換が一個所以上ある酵母）から得られるものである。
【００３６】
本発明においては、飲食品製造用酵母として、例えば清酒酵母（日本醸造協会きょうかい７号酵母、きょうかい９号酵母、きょうかい１０号酵母、高エステル生成酵母１７０１号、高エステル生成酵母１８０１号など）、ワイン酵母（日本醸造協会ブドウ酒１号酵母、同ブドウ酒３号酵母、同ブドウ酒４号酵母など）、ビール酵母、パン酵母などのアルコール飲料や食品の製造に常用される、主にサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する飲食品製造用酵母を用いてアルギナーゼ欠損酵母を得る。
【００３７】
具体的には、例えばオルニチン培地とアルギニン培地を用いた検定方法（北本ら, J. Brew. Soc. Japan, Vol.87, p.598-601，1992）や、酵母菌体内のアルギナーゼ活性の測定法（Kitamoto K. et al, J. Ferment. Bioeng., Vol.75, p.359-363, 1993）等によって、アルギナーゼ欠損を確認し、このアルギナーゼ欠損が確認されたアルギナーゼ欠損酵母を、化学分解法（Maxam & Gilbert法）及びチェーンターミネータ法（Sangerジデオキシ法）などの常法により、アルギナーゼ遺伝子の塩基配列解析を行って、アルギナーゼ欠損酵母のアルギナーゼ遺伝子が有する塩基配列を得、変異のないアルギナーゼ遺伝子の塩基配列と比較する。
【００３８】
詳細には、例えば欠損前のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列や、ROBERTAらの報告（Roberta A. et al.,J. Bacteriol.,Vol.103,1079-1087,1984）や遺伝子データベース（清酒酵母ゲノムの場合、Sake Yeast Genome Database (http://nribf1.nrib.go.jp/SYGD/)のSYGD ID:e8011600201(Systematic Name:K7_YPL111W) ）に登録されている塩基配列と比較する。
【００３９】
この変異のないアルギナーゼ遺伝子の塩基配列との比較により変異個所を判定し、アルギナーゼ遺伝子内の一塩基以上の塩基の挿入、欠失、置換が一個所以上ある酵母を選んで、これをアルギナーゼ遺伝子に変異が生じて欠損したアルギナーゼ欠損酵母としている。
【００４０】
尚、アルギナーゼ欠損をアルギナーゼ遺伝子の塩基配列のみから判定して特定のアルギナーゼ欠損酵母としても良い。
【００４１】
また、本発明は、このようなアルギナーゼ欠損酵母のアルギナーゼ遺伝子の変異部位を利用し、このアルギナーゼ欠損酵母（飲食品製造用酵母）を使用した飲食品、例えば酒類や食品やその加工品等を識別することが可能となる。
【００４２】
具体的には、例えばこれら飲食品の産地（県、市町村或いは製造工場など）の識別が可能となる。
【００４３】
このアルギナーゼ欠損酵母（飲食品製造用酵母）を使用した飲食品の識別に際しては、この飲食品から核酸試料を取得し、核酸増幅法によりアルギナーゼ遺伝子を増幅し、増幅産物のパターンに基づき、特定のアルギナーゼ欠損酵母由来のアルギナーゼ遺伝子の有無を判別することによって、この飲食品の識別が可能となる。
【００４４】
また、この飲食品を製造する際に用いるアルギナーゼ欠損酵母は、一株だけ使用しても良いし複数株混合しても良く、更に通常の飲食品製造用酵母、即ち、アルギナーゼが欠損していない飲食品製造用酵母と混合して使用しても良い。
【００４５】
また、本発明における核酸試料は、DNA及びRNAである。尚、核酸増幅法を用いることのできる核酸試料であれば、これらに限らず適宜採用可能である。
【００４６】
本発明においては、この核酸試料を飲食品や飲食品製造用酵母から抽出する方法として、例えば特開２００７−３３０２３０号に示される中村らの方法やHotzelらの方法（Hotzel H.et al.:Eur.Food Res.Technol.Vol.209,192-196,1999)等の公知の方法や、DNeasy mericon Food kit(QIAGEN社製）等の市販の核酸抽出キットを用いている。
【００４７】
また、必要に応じて、例えばナノセップ30Kやナノセップ100K（共に日本ポール社製）を用いた限外ろ過法や、凍結乾燥法等によって試料中の核酸を濃縮してから上記の方法を用いて核酸試料の抽出を行っても良い。
【００４８】
また、更に飲食品をそのまま核酸増幅法の核酸試料として用いても良い。
【００４９】
また、本発明においては、飲食品製造用酵母を変異させてアルギナーゼ欠損酵母を取得する方法として、自然変異、突然変異による取得方法を用いている。
【００５０】
具体的は、例えばカナバニン、アルギニン、オルチニンを含むCAO培地を選択培地として用いる方法（特公平６−９７９９３号）や、大内らによるレプリカ法（大内弘造ら：発酵工学，Vol.61,p.349-352,1983）等を用いることが好ましく、特に、ポジティブセレクション法であるCAO培地を用いる方法による取得が好ましい。
【００５１】
より具体的には、自然変異によってアルギナーゼ欠損酵母を取得する場合は、例えば飲食品製造用酵母を前述のCAO培地（カナバニン，アルギニン及びオルニチンを含む培地）で自然変異させれば良く、また、突然変異によってアルギナーゼ欠損酵母を取得する場合は、物理的方法と科学的方法とがあり、物理的方法としては、例えば紫外線照射や放射線照射などがあり、また、化学的方法としては、例えばエチルメタンスルホン酸（EMS）や、Ｎ-メチルＮ'-ニトロ-Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁する方法があり、これらの方法を単独又は組み合わせて適宜実施することで、アルギナーゼ欠損酵母を取得することができる。
【００５２】
更に、既知のアルギナーゼ遺伝子の情報を利用して、例えば変異前のアルギナーゼ遺伝子には存在しない制限酵素の認識配列が付与されるように、遺伝子組換え技術を利用してアルギナーゼ遺伝子に変異を導入することもできる。
【００５３】
例えば、所定の制限酵素（BslI）を用いた場合、所定の塩基配列の一部が切断する配列番号１の塩基配列を有するアルギナーゼ遺伝子を変異により得ておけば、被検酵母を前記所定の制限酵素で処理し、この処理により塩基配列の一部が切断したか否かで当該変異アルギナーゼ遺伝子が含まれているか否かを簡易に判定できることになる。
【００５４】
尚、飲食品製造用酵母を対象とした場合には、上述の選択培地によりアルギナーゼ遺伝子変異の生じた酵母株をスクリーニングし、その中からアルギナーゼ遺伝子内の制限酵素の認識配列が新たに生じた酵母株、または消失した酵母株を選抜することによって、識別可能な飲食品製造用酵母を取得することが好ましい。
【００５５】
また、本発明では、取得したアルギナーゼ欠損酵母のアルギナーゼ遺伝子の一部若しくは全部の核酸増幅を行っており、この核酸増幅にはプライマーを用いている。
【００５６】
これは、核酸増幅反応の際にアルギナーゼ遺伝子配列内の所定の位置に特異的にアニーリングするように、そのアルギナーゼ遺伝子配列の部分配列若しくはその変異配列又はこれらの相補配列を含むように作成したオリゴヌクレオチドプライマーを少なくとも一つ（好ましくはフォワードプライマーとリバースプライマーの二つ）を含むプライマーの組み合わせを意味する。
【００５７】
尚、本発明に用いるアルギナーゼ遺伝子配列は、例えば前述したSake Yeast Genome Databaseや、A.ROBERTAらの報告に示されるもの、或いはDDBJ/GenBank/EMBLデータベース・アクセッション番号M10110の配列等である。
【００５８】
このような本発明のプライマーは、具体的には、アルギナーゼ遺伝子の変異部位を含む配列を増幅させるプライマーであり、例えば変異部位がDNA増幅断片として得られるように各プライマーの配列に変異部位を採用した場合は、アレルPCR法やリアルタイムPCR法等により、その変異部位を確認することができる。
【００５９】
また、このプライマーを用いた核酸増幅は、公知の核酸増幅法、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、SDA（Strand Displacement Amplification）法を用いて行うことができる。
【００６０】
尚、核酸増幅を行う反応液組成やサイクリング条件は、使用する核酸増幅法、プライマーのＴｍ値、サーマルサイクラーの仕様などによって適宜決定するものとする。
【００６１】
本発明の飲食品製造用酵母の同一性判別方法は、このような核酸増幅の結果として得られる増幅産物のパターンに基づいて行われる。
【００６２】
本発明における増幅産物のパターンとは、核酸増幅反応を終了した後の反応液中に含まれる各核酸断片の分子量サイズ若しくは塩基長、塩基配列、又は存在量（相対量若しくは絶対量）を意味するものであり、例えば核酸増幅反応を終了した後の反応液を直接、若しくは制限酵素等で処理したものを、電気泳動して得たバンドパターン及びそのバンドの相対的な濃さである。
【００６３】
尚、電気泳動としては、例えばSpreadexゲル（Elchrom Scientific社製）を用いた１ｂｐの欠失や挿入の検出や、GMAゲル（Elchrom Scientific社製）を用いたSSCP（一本鎖高次構造多型）法といった塩基置換の検出、また、PCR産物を制限酵素で処理する方法等を用いれば良く、また、更に、定量的PCR法やリアルタイムPCR法も含まれる。
【００６４】
この増幅産物のパターンは、アルギナーゼが欠損していない通常の飲食品製造用酵母では、多くの菌株間で共通した結果が得られるが、本発明のような特定のアルギナーゼ欠損酵母においては、明らかな部分的相違が示され、本発明は、この相違を認知することによって飲食品製造用酵母の同一性判別を可能としている。
【００６５】
また、本発明の飲食品は、この同一性判別が可能な飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品であり、この飲食品製造用酵母の同一性を判別することで識別が可能となると共に、例えば本発明に係る塩基配列を産地及び原材料に対応させておけば、被検飲食品の産地や製造時期（製造期間）等の生産情報（生産履歴）を知り得ることも可能となる画期的な飲食品となる。
【００６６】
本発明の飲食品は、飲食品製造用酵母を用いて製造され、その製造工程及び製品に、酵母由来の核酸が残存する飲食品であれば適宜採用し得るものであり、例えば清酒，果実酒，その他の醸造酒，連続式蒸留しょうちゅう，単式蒸留しょうちゅう，ウイスキー，ブランデー，原料用アルコール，スピリッツ，ビール，発泡酒，その他の発泡性酒類，合成清酒，みりん，甘味果実酒，リキュール，粉末酒，雑酒、若しくは、これらを混和した酒などの酒類、又は、パン，酒粕，漬け物などの食品、酵母エキスなどの調味料、酵母を含有した健康食品若しくはサプリメント、又は、味噌，醤油，酢などの発酵調味料、又は、ケーキ，クッキー，酒饅頭，中華饅頭などの菓子、又は、サイダ，ジュース，ビールテイスト飲料などの清涼飲料でも良い。
【００６７】
例えば清酒を例に挙げると、清酒は、蒸米に酒母と米麹とを加え発酵させて醪を製造し、この醪を上槽して製造するが、この酒米に加える酒母の仕込み時、若しくは酒母及び醪の発酵時に所定のアルギナーゼ遺伝子が変異した飲食品製造用酵母、即ち、配列番号１〜５いずれかの塩基配列のアルギナーゼ遺伝子を有する飲食品製造用酵母（アルギナーゼ欠損酵母）を添加して清酒を製造することで、この清酒は、識別が可能となると共に、例えば産地や製造時期（製造期間）等の生産情報（生産履歴）を知り得ることも可能となる。
【実施例１】
【００６８】
本発明の具体的な実施例１について図面に基づいて説明する。
【００６９】
本実施例は、同一性判別が可能な飲食品製造用酵母及びこの同一性判別が可能な飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品に係るものである。
【００７０】
具体的には、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母は、アルギナーゼ遺伝子を変異させて配列番号１〜３いずれかに示される塩基配列としたアルギナーゼ遺伝子を有する同一性判別が可能なアルギナーゼ欠損酵母である（以下、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母をアルギナーゼ欠損酵母と称する。）。
【００７１】
また、本実施例の前記塩基配列は、所定の制限酵素で認識可能な塩基配列、具体的には、所定の制限酵素により、変異前に存在した塩基配列の一部が切断するものである。
【００７２】
即ち、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、制限酵素処理によって認識でき、且つ、変異により作り出された塩基配列を有するものである。
【００７３】
また、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、飲食品製造において発現させる必要のないアルギナーゼ遺伝子を変異させたものである。
【００７４】
また更に、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、醸造特性を向上させる変異遺伝子を有するものである。
【００７５】
本実施例における醸造特性を向上させるとは、例えば、清酒製造の効率化や、発酵力の強化、清酒の香味の向上である。
【００７６】
また、それらに関与する具体的な遺伝子としては、清酒酵母の泡なし化に関わるAWA1遺伝子や、吟醸香である酢酸イソアミルの生成に関与するATF1遺伝子、EST2遺伝子、LEU4遺伝子、カプロン酸エチルの生成に関与するFAS2遺伝子等が挙げられ、本実施例ではカプロン酸エチルの生成に関与するFAS2遺伝子に変異を導入し、吟醸香の高い清酒酵母を育種した。
【００７７】
以下に本実施例のアルギナーゼ欠損酵母の取得方法について詳述する。
【００７８】
本実施例では、先ず、親株となる清酒酵母から吟醸香の主成分であるカプロン酸エチルの生産性が高い、カプロン酸エチル高生産性清酒酵母を取得した。
【００７９】
このカプロン酸エチル高生産性清酒酵母の取得は、市川らの方法（特許第２６３２６５４号）を用いており、具体的には、この方法により脂肪酸合成酵素遺伝子FAS2を変異させることで、カプロン酸エチル高生産性清酒酵母を取得した。
【００８０】
より具体的に説明すると、本実施例では、親株となる清酒酵母として、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母G9株（以下、G9株と称する。）を用い、このG9株を、YPD液体培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）５ｍｌに植菌し、３０℃で３日間、静置培養させた後、変異処理をせず直接セルレニンYPD培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、０．５μｇ／ｍＬセルレニン（シグマ社製）、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーを釣菌し、NEFA-Cテストワコー（和光純薬社製）を用いたスクリーニング法（栗林ら：特開２０１２−２３１７５１号）を用いて、カプロン酸エチル高生産性清酒酵母を分離し、このG9株より単離されたカプロン酸エチル高生産性清酒酵母（以下、G9CR株と称する。）を取得した。
【００８１】
次いで、このG9CR株を用いてアルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【００８２】
このアルギナーゼ欠損酵母の取得は、ポジティブセレクション法であるCAO培地を用いる方法、具体的には、特公平６−９７９９３号に開示される、カナバニン、アルギニン、オルチニンを含むCAO培地を選択培地として用いる方法を用いた。
【００８３】
詳細には、G9CR株を、YPD液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で３日間、静置培養させた後、変異処理をせず直接CAO平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、２０ｐｐｍカナバニン、１ｍＭアルギニン塩酸塩、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーを釣菌し、アルギニン平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、５ｍＭアルギニン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）とオルニチン平板培地（０．１７％Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に夫々塗布し、アルギニン平板培地に生育できず、オルニチン平板培地に生育できるものをアルギナーゼ欠損株として選抜し（本実施例では異なる三株を選抜）、この選抜したアルギナーゼ欠損株を、再度CAO平板培地を用いて、シングルコロニー単離を行い、アルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【００８４】
本実施例では、上記方法により、G9CRarg11株，G9CRarg22株，G9CRarg株26の異なる三株のアルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【００８５】
次に、この取得した各アルギナーゼ欠損酵母のアルギナーゼ遺伝子及びFAS2遺伝子の塩基配列解析を行った。尚、本実施例では、G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株の他に、比較のため、G9株、G9CR株の塩基配列解析も合わせて行った。
【００８６】
塩基配列解析は、先ず、各酵母のゲノムDNAの抽出を行った。
【００８７】
ゲノムDNAの抽出は、G9株、G9CR株、G9CRarg11株，G9CRarg22株，G9CRarg26株の夫々をYPD液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で２日間、静置培地した後、培養液を遠心分離して得られた菌体から、「Ｇｅｎとるくん酵母用」（タカラバイオ社製）を用いて行った。尚、抽出したゲノムDNAは、３ｎｇ／μｌの濃度になるようにTE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）に溶解し、−２０℃で保存した。
【００８８】
次いで、この抽出したゲノムDNAのアルギナーゼ遺伝子の増幅及びFAS2変異遺伝子の増幅を行った。
【００８９】
このアルギナーゼ遺伝子の増幅及びFAS2変異遺伝子の増幅は、PCR法を用い、本実施例では、具体的には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を用いた。
【００９０】
このPCR法に使用したプライマーセットを下表１に示す。
【００９１】
【表１】
2015037394.tif 000002
【００９２】
本実施例では、この表１に示した、CAR1-4F（配列番号６），CAR1-12R（配列番号７）のプライマーセットと、CAR1-14F（配列番号８），CAR1-3R（配列番号９）のプライマーセットを使用してアルギナーゼ遺伝子を増幅した。
【００９３】
また、G9CR株、G9CRarg11株，G9CRarg22株，G9CRarg26株においては、同じく表１に示したSCFAS2-1250F（配列番号１０），SCFAS2-1250R（配列番号１１）のプライマーセットを用いて、FAS2遺伝子変異部位を増幅した。
【００９４】
また、PCR反応液は、下表２〜４に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５５℃で３０秒間・７２℃で１分間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【００９５】
【表２】
2015037394.tif 000003
【００９６】
【表３】
2015037394.tif 000004
【００９７】
【表４】
2015037394.tif 000005
【００９８】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物を、２％アガロースゲル（SeaKem GTG Agarose,Lonza社製）上で１００Ｖ、４０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を含むアガロースゲルを切り出し、また、得られたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてPCR産物を抽出した後、BigDye Terminator Ver.3.1（Applied Biosystems社製）を用いてDNAシーケンス反応に供し、Applied Biosystems 3730xl ジェネティックアナライザ（Applied Biosystems社製）によって塩基配列を決定した。
【００９９】
このシーケンスにより得られた各酵母株（G9株、G9CR株、G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株）のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を、Sake Yeast Genome Database (http://nribf1.nrib.go.jp/SYGD/)で公開されている、きょうかい７号（K7株）のアルギナーゼ遺伝子（SYGD ID:e8011600201, Systematic Name:K7_YPL111W）のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列と比較した結果を図１，２に示す。
【０１００】
各酵母のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を比較した結果、K7株、G9株、G9CR株は同一の塩基配列であった。
【０１０１】
一方、G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株は、K7株、G9株及びG9CR株と比較して、差が見られた。
【０１０２】
具体的には、G9CRarg11株は、アルギナーゼ遺伝子の塩基配列の７３１位〜７３８位の塩基配列ＡＡＡＣＡＡＡＣからＡＡＡＣが欠失したことが確認され、新たにＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧという、K7株、G9株及びG9CR株には存在しない制限酵素BslI認識配列が生じた。
【０１０３】
また、G9CRarg22株は、アルギナーゼ遺伝子の塩基配列の７６８位の塩基Ｃが塩基Ａに置換したことが確認された。
【０１０４】
また、このG9CRarg22株は、変異前のアルギナーゼ遺伝子では、BsaHI、HpyCH4IV、ZraI、SetI、AatII、Hpy99Iの制限酵素の認識配列が存在したが、変異後は、この制限酵素配列が消失した。
【０１０５】
また、G9CRarg26株は、アルギナーゼ遺伝子の塩基配列の７８１位の塩基Ｇが塩基Ａに置換したことが確認された。
【０１０６】
また、このG9CRarg26株は、変異前のアルギナーゼ遺伝子では、AccIの制限酵素の認識配列が存在したが、変異後は、この制限酵素配列が消失した。
【０１０７】
また、FAS2変異部位解析の結果、G9株はFAS2遺伝子に変異は認められなかったが、G9CR株、G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株は、図３に示すように、FAS2遺伝子の３７４８位の塩基ＧがＡ変異したヘテロ接合型を有することが確認された。
【０１０８】
このように、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母（G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株）は、夫々特有の塩基配列を有するものとなり、この特有の塩基配列によって同一性判別が可能な飲食品製造用酵母となる。
【０１０９】
以下、本実施例のG9株、G9CR株、G9CRarg11株を用いた飲食品製造用酵母の同一性判別の実験を行ったので、その実験方法と結果について詳述する。
【０１１０】
本実施例の飲食品製造用酵母の同一性判別を、先ず、各酵母からゲノムDNAを抽出して行った。尚、このゲノムDNAの抽出は、前述した塩基配列解析を行う際と同じ方法を用いた。
【０１１１】
次いで、調製した酵母ゲノムDNA試料を鋳型として用いて、PCR法による飲食品製造用酵母のアルギナーゼ遺伝子由来のDNAの増幅を行った。
【０１１２】
PCR法には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を使用した。
【０１１３】
また、アルギナーゼ遺伝子の増幅は、表１に示した、P1（配列番号１２），P2（配列番号１３）のプライマーセットを使用した。
【０１１４】
また、PCR反応液は、下表５に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５８℃で３０秒間・７２℃で３０秒間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【０１１５】
【表５】
2015037394.tif 000006
【０１１６】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）によって精製し、精製後の試料量が４０μｌになるように、TE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）でスピンカラムによりPCR産物を溶出した。
【０１１７】
この精製したPCR産物を下表６〜８に示す反応液条件によって制限酵素処理を行った後、再度、上記QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）で精製した。尚、各制限酵素は全てNew England Biolab社製を使用した。
【０１１８】
【表６】
2015037394.tif 000007
【０１１９】
【表７】
2015037394.tif 000008
【０１２０】
【表８】
2015037394.tif 000009
【０１２１】
この得られた精製試料を４％アガロースゲル（Agalose XP,ニッポンジーン社製）上で１００Ｖ、３０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を検出した。
【０１２２】
この検出した各酵母のDNA断片の判別結果を図４〜６に示す。
【０１２３】
この図４〜６に示すように、本実施例のG9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株は、アルギナーゼ遺伝子の変異によって、各制限酵素により得られるDNA断片パターンが、G9CR株と異なる結果が得られた。尚、G9CRarg22株においては、制限酵素にZraIを用いた場合の結果である。
【０１２４】
このように、本実施例は、上記プライマーを用いて制限酵素処理を施し、電気泳動により現れるDNA断片パターンを認識することによって、飲食品製造用酵母の同一性判別、即ち、本実施例の各G9CRarg株であるかどうかの判別を、容易に且つ正確に行うことが可能となる。
【０１２５】
尚、図４〜６に示した制限酵素処理によるDNA断片の塩基数は、Saccharomyces Genome DatabaseのYeast Genome Restriction Analysis（http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/PATMATCH/RestrictionMapper）による解析結果Sorted Fragment Size(bp)の値を記載した。
【０１２６】
次に、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母を用いて製造された飲食品について説明する。尚、本実施例は、上記飲食品として清酒を採用した場合である。
【０１２７】
本実施例の清酒は、下表９に示す仕込配合により一段階仕込で製造したものである。
【０１２８】
【表９】
2015037394.tif 000010
【０１２９】
また、本実施例では、同一性判別が可能な飲食品製造用酵母としてG9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株の各飲食品製造用酵母を用い、また、これらと比較するためG9株、G9CR株を用いて、五種類の清酒を製造した。
【０１３０】
本実施例の清酒について、詳述すると、原料米は五百万石（精米歩合６０％）を使用し、製麹は０℃にて貯蔵したものを使用した。
【０１３１】
また、本実施例では、上記の各飲食品製造用酵母を、ボーメ６の麹汁培地３００ｍＬに１白金耳の菌体を植菌し、２５℃で７日間静置培養したものを夫々の仕込みに使用した。
【０１３２】
また、醪を品温１５℃で一定になるように温度管理し、炭酸ガスによる醪重量の減量が仕込総米の３０％に達した時点で遠心分離により上槽して製成酒を得た。
【０１３３】
尚、本実施例における製成酒とは、上槽直後の未調整の清酒のことを意味する。
【０１３４】
上記方法により得た製成酒の成分分析結果（一般成分、尿素濃度）を下表１０に示す。
【０１３５】
【表１０】
2015037394.tif 000011
【０１３６】
この表１０に示すように、本実施例のアルギナーゼ遺伝子を変異させた飲食品製造用酵母を使用した清酒、即ち、G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株を使用して製造した清酒からは尿素が検出されず、これらG9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株は、全て尿素非生産性酵母であることが確認された。
【０１３７】
尚、この表１０中の一般成分の成分分析は、国税庁所定分析法（国税庁所定分析法，３清酒，国税庁訓令第６号別冊，平成１９年６月２２日，http://www.nta.go.jp/shiraberu/zeiho-kaishaku/tsutatsu/kobetsu/sonota/070622/01.htm）により測定した。
【０１３８】
また、本実施例の清酒は、上記の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母（G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株）を用いて製造したことにより識別可能な清酒となる。
【０１３９】
以下に、本実施例の清酒の識別方法を示す。
【０１４０】
本実施例では、先ず、各製成酒から核酸試料の抽出を行った。
【０１４１】
本実施例における核酸試料の抽出は、Hotzelらの方法（Hotzel H.et al.:Eur.Food Res.Technol.Vol.209,192-196,1999)を参考にして行い、各製成酒２００μｌからInvisorb Genomeic DNA kitIII（STRATEC Molecular社製）で核酸を抽出し、付属のマニュアルに従い、核酸抽出液１００μｌを得た。
【０１４２】
次に、上記のように調製した核酸試料を鋳型として用いて、製成酒の識別を行った。
【０１４３】
本実施例における清酒の識別は、具体的には、飲食品製造用酵母の同一性を判別することにより成される。
【０１４４】
本実施例の飲食品製造用酵母の同一性判別方法は、前述した本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母における同一性判別方法と同様の方法を用いた。
【０１４５】
具体的には、PCR法には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を使用した。
【０１４６】
また、本実施例では、アルギナーゼ遺伝子の増幅に、表１に示した、P1（配列番号１２），P2（配列番号１３）のプライマーセットを使用した。
【０１４７】
また、PCR反応液は、下表１１に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５８℃で３０秒間・７２℃で３０秒間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【０１４８】
【表１１】
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【０１４９】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）によって精製し、精製後の試料量が４０μｌになるように、TE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）でスピンカラムによりPCR産物を溶出した。
【０１５０】
この精製したPCR産物を表６〜８に示す条件で、制限酵素処理を行った後、再度、上記QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）で精製した。尚、各制限酵素は全てNew England Biolab社製を使用した。
【０１５１】
この得られた精製試料を４％アガロースゲル（Agalose XP,ニッポンジーン社製）上で１００Ｖ、３０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を検出した。
【０１５２】
この検出した各酵母のDNA断片の判別結果（電気泳動パターン）を図７〜９に示す。
【０１５３】
この図７〜９に示すように、本実施例のG9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株を用いて製造した製成酒からは、G9CRarg株由来のDNA断片パターンが検出されG9株、G9CR株を用いて製造した製成酒のDNA断片パターンとは異なるパターンのDNA断片パターンが検出された。
【０１５４】
即ち、本実施例のように、特定の飲食品製造用酵母（G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株）を用いて清酒を製造すれば、上記のように、G9CRarg株由来のDNA断片パターンを検出することで、例えば、真偽の識別が容易に可能となり、また、G9CRarg11株、G9CRarg22株、G9CRarg26株の夫々の特有のDNA断片パターンを産地や製造期間などの識別情報として認識すれば、このDNA断片パターンを確知することによって、産地、製造工場、製造期間等の製造履歴を認知することもできる。
【０１５５】
また、本実施例では、制限酵素処理前のPCR産物を常法によってゲル電気泳動で精製し、BigDye Terminator Ver.3.1（Applied Biosystems社製）を用いてDNAシーケンス反応に供し、Applied Biosystems 3730xl ジェネティックアナライザ（Applied Biosystems社製）によって塩基配列を決定し、PCR増幅産物が清酒酵母アルギナーゼ遺伝子由来であることも確認した。
【０１５６】
また更に、本実施例では、表１０に示すように、G9CRarg株は、G9株に比べて清酒の好ましい香りの吟醸香の成分であるカプロン酸エチル濃度が高く、カプロン酸エチル高生産性飲食品製造用酵母であることを確認した。
【０１５７】
即ち、G9CRarg株は、識別が容易な変異させたアルギナーゼ遺伝子を有し、且つ吟醸香を高生産することが可能な飲食品製造用酵母であることを確認した。
【０１５８】
また、前述したように、本実施例のG9CRarg株は、尿素非生産性の飲食品製造用酵母であるから、清酒中の尿素を除去するためのウレアーゼ処理、処理後のオリ下げ（清酒中からウレアーゼを除去する工程）が不要となり、製造工程の効率化が図れると共に、オリ下げ処理等による品質（例えば香気成分）の低下を避けることもできる。
【０１５９】
尚、本実施例では、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母G9株を親株としたが、例えば、きょうかい７号やきょうかい９号等の一般的な飲食品製造用酵母を親株として用いても、同様の結果を得ることができる。
【実施例２】
【０１６０】
本発明の具体的な実施例２について図面に基づいて説明する。
【０１６１】
本実施例は、実施例１における同一性判別が可能な飲食品製造用酵母において、醸造特性を向上させる変異遺伝子、具体的には、吟醸香特性を向上させる変異遺伝子が無い飲食品製造用酵母（以下、アルギナーゼ欠損酵母と称す。）とした場合である。
【０１６２】
具体的には、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母は、アルギナーゼ遺伝子を変異させて配列番号４に示される塩基配列としたアルギナーゼ遺伝子を有する同一性判別が可能なアルギナーゼ欠損酵母である（以下、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母をアルギナーゼ欠損酵母と称する。）。
【０１６３】
即ち、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、制限酵素処理によって認識でき、且つ、変異により作り出された塩基配列を有するものである。
【０１６４】
また、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、飲食品製造において発現させる必要のないアルギナーゼ遺伝子を変異させたものである。
【０１６５】
以下に本実施例のアルギナーゼ欠損酵母の取得方法について詳述する。
【０１６６】
本実施例では、実施例１同様、親株となる清酒酵母として、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母G9株（以下、G9株と称する。）を用いてアルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【０１６７】
このアルギナーゼ欠損酵母の取得は、ポジティブセレクション法であるCAO培地を用いる方法、具体的には、特公平６−９７９９３号に開示される、カナバニン、アルギニン、オルチニンを含むCAO培地を選択培地として用いる方法を用いた。
【０１６８】
詳細には、G9株を、YPD液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で３日間、静置培地させた後、変異処理をせず直接CAO平板培地（０．１７％Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、２０ｐｐｍカナバニン、１ｍＭアルギニン塩酸塩、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーを釣菌し、アルギニン平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、５ｍＭアルギニン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）とオルニチン平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に夫々塗布し、アルギニン平板培地に生育できず、オルニチン平板培地に生育できるものをアルギナーゼ欠損株として選抜し、この選抜したアルギナーゼ欠損株を、再度CAO平板培地を用いて、シングルコロニー単離を行い、アルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【０１６９】
本実施例では、上記方法により取得したアルギナーゼ欠損酵母をG9arg32株とした。
【０１７０】
次に、この取得したアルギナーゼ欠損酵母、即ちG9arg32株のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列解析を行った。尚、本実施例では、比較のため、G9株の塩基配列解析も合わせて行った。
【０１７１】
塩基配列解析は、先ず、各酵母のゲノムDNAの抽出を行った。
【０１７２】
ゲノムDNAの抽出は、G9株、G9arg32株をYPD液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で２日間、静置培地した後、培養液を遠心分離して得られた菌体から、「Ｇｅｎとるくん酵母用」（タカラバイオ社製）を用いて行った。尚、抽出したゲノムDNAは、３ｎｇ／μｌの濃度になるようにTE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）に溶解し、−２０℃で保存した。
【０１７３】
次いで、この抽出したゲノムDNAのアルギナーゼ遺伝子の増幅を行った。
【０１７４】
このアルギナーゼ遺伝子の増幅は、PCR法を用い、本実施例では、具体的には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を用いた。
【０１７５】
このPCR法に使用したプライマーセットは、実施例１記載の表１に示した、CAR1-4F（配列番号６），CAR1-12R（配列番号７）のプライマーセットと、CAR1-14F（配列番号８），CAR1-3R（配列番号９）のプライマーセットを使用してアルギナーゼ遺伝子を増幅した。
【０１７６】
また、PCR反応液は、実施例１記載の表３，４に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５５℃で３０秒間・７２℃で１分間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【０１７７】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物を、２％アガロースゲル（SeaKem GTG Agarose,Lonza社製）上で１００Ｖ、４０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を含むアガロースゲルを切り出し、また、得られたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてPCR産物を抽出した後、BigDye Terminator Ver.3.1（Applied Biosystems社製）を用いてDNAシーケンス反応に供し、Applied Biosystems 3730xl ジェネティックアナライザ（Applied Biosystems社製）によって塩基配列を決定した。
【０１７８】
このシーケンスにより得られたG9株及びG9arg32株のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を、Sake Yeast Genome Database (http://nribf1.nrib.go.jp/SYGD/)で公開されている、きょうかい７号（K7株）のアルギナーゼ遺伝子（SYGD ID:e8011600201, Systematic Name:K7_YPL111W）のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列と比較した結果を図１０，１１に示す。
【０１７９】
各酵母のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を比較した結果、K7株、G9株は同一の塩基配列であった。
【０１８０】
一方、G9arg32株は、K7株及びG9株と比較して、差が見られた。
【０１８１】
具体的には、G9arg32株は、アルギナーゼ遺伝子の塩基配列の８３４位〜８３９位のＧＡＧＡＧＡからＧＡが欠失したことが確認され、新たにＣＣＴＮＮＮＮＮＡＧＧという、K7株、G9株には存在しない制限酵素EcoNI認識配列が生じた。
【０１８２】
このように、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母（G9arg32株）は、特有の塩基配列を有するものとなり、この特有の塩基配列によって同一性判別が可能な飲食品製造用酵母となる。
【０１８３】
以下、本実施例のG9株、G9arg32株を用いた飲食品製造用酵母の同一性判別の実験を行ったので、その実験方法と結果について詳述する。
【０１８４】
本実施例の飲食品製造用酵母の同一性判別を、先ず、各酵母からゲノムDNAを抽出して行った。尚、このゲノムDNAの抽出は、前述した塩基配列解析を行う際と同じ方法を用いた。
【０１８５】
次いで、調製した酵母ゲノムDNA試料を鋳型として用いて、PCR法による飲食品製造用酵母のアルギナーゼ遺伝子由来のDNAの増幅を行った。
【０１８６】
PCR法には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を使用した。
【０１８７】
また、アルギナーゼ遺伝子の増幅は、実施例１記載の表１に示した、P3（配列番号１４），P4（配列番号１５）のプライマーセットを使用した。
【０１８８】
また、PCR反応液は、下表１２に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５８℃で３０秒間・７２℃で３０秒間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【０１８９】
【表１２】
2015037394.tif 000013
【０１９０】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）によって精製し、精製後の試料量が４０μｌになるように、TE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）でスピンカラムによりPCR産物を溶出した。
【０１９１】
この精製したPCR産物を下表１３に示す反応液条件によって制限酵素処理を行った後、再度、上記QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）で精製した。尚、制限酵素はNew England Biolab社製を使用した。
【０１９２】
【表１３】
2015037394.tif 000014
【０１９３】
この得られた精製試料を４％アガロースゲル（Agalose XP,ニッポンジーン社製）上で１００Ｖ、３０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を検出した。
【０１９４】
この検出した各酵母のDNA断片の判別結果を図１２に示す。
【０１９５】
この図１２に示すように、本実施例のG9arg32株は、アルギナーゼ遺伝子の変異によって、制限酵素により得られるDNA断片パターンが、G9株と異なる結果が得られた。
【０１９６】
このように、本実施例は、上記プライマーを用いて制限酵素処理を施し、電気泳動により現れるDNA断片パターンを認識することによって、飲食品製造用酵母の同一性判別、即ち、本実施例のG9arg32株であるかどうかの判別を、容易に且つ正確に行うことが可能となる。
【実施例３】
【０１９７】
本発明の具体的な実施例３について図面に基づいて説明する。
【０１９８】
本実施例は、実施例２における同一性判別が可能な飲食品製造用酵母において、親株が異なる場合である。
【０１９９】
具体的には、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母は、アルギナーゼ遺伝子を変異させて配列番号５に示される塩基配列としたアルギナーゼ遺伝子を有する同一性判別が可能なアルギナーゼ欠損酵母である（以下、本実施例の同一性判別が可能な飲食品製造用酵母をアルギナーゼ欠損酵母と称する。）。
【０２００】
即ち、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、制限酵素処理によって認識でき、且つ、変異により作り出された塩基配列を有するものである。
【０２０１】
また、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母は、飲食品製造において発現させる必要のないアルギナーゼ遺伝子を変異させたものである。
【０２０２】
以下に本実施例のアルギナーゼ欠損酵母の取得方法について詳述する。
【０２０３】
本実施例では、親株となる清酒酵母として、新潟県醸造試験場が保有する新潟清酒酵母G74NF株（以下、G74NF株と称する。）を用いてアルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【０２０４】
このアルギナーゼ欠損酵母の取得は、ポジティブセレクション法であるCAO培地を用いる方法、具体的には、特公平６−９７９９３号に開示される、カナバニン、アルギニン、オルチニンを含むCAO培地を選択培地として用いる方法を用いた。
【０２０５】
詳細には、G74NF株を、YPD液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で３日間、静置培養させた後、変異処理をせず直接CAO平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、２０ｐｐｍカナバニン、１ｍＭアルギニン塩酸塩、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に塗布し、３０℃で培養し、出現したコロニーを釣菌し、アルギニン平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、５ｍＭアルギニン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）とオルニチン平板培地（０．１７％ Difco社製イーストニトロゲンベース w/o amino acid and ammonium sulfate、５ｍＭオルニチン塩酸塩、２％グルコース、２％寒天）に夫々塗布し、アルギニン平板培地に生育できず、オルニチン平板培地に生育できるものをアルギナーゼ欠損株として選抜し、この選抜したアルギナーゼ欠損株を、再度CAO平板培地を用いて、シングルコロニー単離を行い、アルギナーゼ欠損酵母を取得した。
【０２０６】
本実施例では、上記方法により取得したアルギナーゼ欠損酵母をG74NFarg1株とした。
【０２０７】
次に、この取得したアルギナーゼ欠損酵母、即ちG74NFarg1のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列解析を行った。尚、本実施例では、比較のため、G74NF株の塩基配列解析も合わせて行った。
【０２０８】
塩基配列解析を、先ず、各酵母のゲノムDNAの抽出し行った。
【０２０９】
ゲノムDNAの抽出は、G74NF株、G74NFarg1株をYPD液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃で２日間、静置培養した後、培養液を遠心分離して得られた菌体から、「Ｇｅｎとるくん酵母用」（タカラバイオ社製）を用いて行った。尚、抽出したゲノムDNAは、３ｎｇ／μｌの濃度になるようにTE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）に溶解し、−２０℃で保存した。
【０２１０】
次いで、この抽出したゲノムDNAのアルギナーゼ遺伝子の増幅を行った。
【０２１１】
このアルギナーゼ遺伝子の増幅は、PCR法を用い、本実施例では、具体的には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を用いた。
【０２１２】
このPCR法に使用したプライマーセットは、実施例１記載の表１に示した、CAR1-4F（配列番号６），CAR1-12R（配列番号７）のプライマーセットと、CAR1-14F（配列番号８），CAR1-3R（配列番号９）のプライマーセットを使用してアルギナーゼ遺伝子を増幅した。
【０２１３】
また、PCR反応液は、実施例１記載の表３，４に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５５℃で３０秒間・７２℃で１分間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【０２１４】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物を、２％アガロースゲル（SeaKem GTG Agarose,Lonza社製）上で１００Ｖ、４０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を含むアガロースゲルを切り出し、また、得られたゲルからQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてPCR産物を抽出した後、BigDye Terminator Ver.3.1（Applied Biosystems社製）を用いてDNAシーケンス反応に供し、Applied Biosystems 3730xl ジェネティックアナライザ（Applied Biosystems社製）によって塩基配列を決定した。
【０２１５】
このシーケンスにより得られたG74NF株及びG74NFarg1株のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を、Sake Yeast Genome Database (http://nribf1.nrib.go.jp/SYGD/)で公開されている、きょうかい７号（K7株）のアルギナーゼ遺伝子（SYGD ID:e8011600201, Systematic Name:K7_YPL111W）のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列と比較した結果を図１３，１４に示す。
【０２１６】
各酵母のアルギナーゼ遺伝子の塩基配列を比較した結果、K7株、G74NF株は同一の塩基配列であった。
【０２１７】
一方、G74NFarg1株は、K7株及びG74NF株と比較して、差が見られた。
【０２１８】
具体的には、G74NFarg1株は、アルギナーゼ遺伝子の塩基配列の８１７位〜８２０位のＡＧＡＧからＡＧが欠失したことが確認され、新たにＣＣＡＮＮＮＮＮＮＴＧＧという、K7株、G74NF株には存在しない制限酵素BstXI認識配列が生じた。
【０２１９】
このように、本実施例のアルギナーゼ欠損酵母（G74NFarg1株）は、特有の塩基配列を有するものとなり、この特有の塩基配列によって同一性判別が可能な飲食品製造用酵母となる。
【０２２０】
以下、本実施例のG74NF株、G74NFarg1株を用いた飲食品製造用酵母の同一性判別の実験を行ったので、その実験方法と結果について詳述する。
【０２２１】
本実施例の飲食品製造用酵母の同一性判別を、先ず、各酵母からゲノムDNAを抽出し行った。尚、このゲノムDNAの抽出は、前述した塩基配列解析を行う際と同じ方法を用いた。
【０２２２】
次いで、調製した酵母ゲノムDNA試料を鋳型として用いて、PCR法による飲食品製造用酵母のアルギナーゼ遺伝子由来のDNAの増幅を行った。
【０２２３】
PCR法には、EmeraldAmp PCR（タカラバイオ社製）を使用した。
【０２２４】
また、アルギナーゼ遺伝子の増幅は、実施例１記載の表１に示した、P1（配列番号１２），P2（配列番号１３）のプライマーセットを使用した。
【０２２５】
また、PCR反応液は、実施例１記載の表５に示した組成に調製し、サーマルサイクラー（TAKARA PCR Thermal cycler MP,タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１分間熱変性させた後、９８℃で１０秒間・５８℃で３０秒間・７２℃で３０秒間を１サイクルの温度プロファイルとして３０サイクルのサイクリング条件でPCR反応を行った。
【０２２６】
本実施例では、このようにして得られたPCR産物をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）によって精製し、精製後の試料量が４０μｌになるように、TE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0,ニッポンジーン社製）でスピンカラムによりPCR産物を溶出した。
【０２２７】
この精製したPCR産物を下表１４に示す反応液条件によって制限酵素処理を行った後、再度、上記QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）で精製した。尚、制限酵素はNew England Biolab社製を使用した。
【０２２８】
【表１４】
2015037394.tif 000015
【０２２９】
この得られた精製試料を４％アガロースゲル（Agalose XP,ニッポンジーン社製）上で１００Ｖ、３０分間電気泳動し、ゲルレッド（Biotium社製）で染色した後、紫外線の照射下でDNA断片を検出した。
【０２３０】
この検出した各酵母のDNA断片の判別結果を図１５に示す。
【０２３１】
この図１５に示すように、本実施例のG74NFarg1株は、アルギナーゼ遺伝子の変異によって、制限酵素により得られるDNA断片パターンが、G74NF株と異なる結果が得られた。
【０２３２】
このように、本実施例は、上記プライマーを用いて制限酵素処理を施し、電気泳動により現れるDNA断片パターンを認識することによって、飲食品製造用酵母の同一性判別、即ち、本実施例のG74NFarg1株であるかどうかの判別を、容易に且つ正確に行うことが可能となる。
【０２３３】
尚、本発明は、実施例１〜３に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。
【図１】
2015037394.tif 000016
【図２】
2015037394.tif 000017
【図３】
2015037394.tif 000018
【図４】
2015037394.tif 000019
【図５】
2015037394.tif 000020
【図６】
2015037394.tif 000021
【図７】
2015037394.tif 000022
【図８】
2015037394.tif 000023
【図９】
2015037394.tif 000024
【図１０】
2015037394.tif 000025
【図１１】
2015037394.tif 000026
【図１２】
2015037394.tif 000027
【図１３】
2015037394.tif 000028
【図１４】
2015037394.tif 000029
【図１５】
2015037394.tif 000030
【配列表】
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