(57)【要約】      （修正有）【課題】本来の生物活性を損なわずに目的とする性質を導入するために、レセプター結合機能を保持する部位特異的化学修飾を施したヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質を提供する。【解決手段】ヒトFasリガンド細胞外ドメインとヒトFasレセプタータンパク質との間のリガンド-レセプター間特異的相互作用の界面部位から離れた、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に接続した、システイン残基に、システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物による化学修飾を有する、ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体【選択図】図２
2015007025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトFasリガンド細胞外ドメインの、立体構造上、標的細胞に対するアポトーシスの誘導を含む生物活性発現の要となるヒトFasレセプターの細胞外ドメインとの特異的相互作用に直接関与しない、アミノ末端部位に接続したシステイン残基に、システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物による化学修飾を有することを特徴とする、ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項２】
ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に接続したシステイン残基が、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に接続したタグ配列中に存在することを特徴とする、請求項１に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項３】
タグ配列が、以下に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項２に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly
【請求項４】
ヒトFasリガンド細胞外ドメインが、天然型のヒトFasリガンド細胞外ドメインの全体構造(アミノ酸残基103-281)のうち103番目から138番目のアミノ酸残基が除かれ、かつ天然型のものに存在する184番目ならびに250番目のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換された変異型ヒトFasリガンド細胞外ドメインであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項５】
システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物が、他の有用な化学的性質を有する化合物を結合させるためのリンカーとして機能することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項６】
システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物が、それ自体、他の有用な化学的性質を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項７】
システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物におけるシステイン残基に特異的に結合する反応性部位が、マレイミド基、ハロゲン化酢酸基、アジリジン基、アクロイル基、ビニルスルホン基、ハロゲン化ベンゼン基、ピリジルジスルフィド基からなる群から選ばれた部位であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項８】
システイン残基に特異的に結合する反応性部位がマレイミド基であることを特徴とする、請求項７に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項９】
システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物が、N-エチルマレイミド、SUNBRIGHT ME-050MAまたはSUNBRIGHT DE-100MAである、請求項８に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
【請求項１０】
アミノ末端部位にシステイン残基を接続させたヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質を遺伝子工学的手法により生産し、当該生産物をシステイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物と反応させることにより、当該化合物を結合させることを特徴とする、ヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体の製造方法。
【請求項１１】
配列内に反応性のシステイン残基を有するタグ配列をアミノ末端部位に接続させたヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質を遺伝子工学的手法により生産し、当該生産物をマレイミド基を含有する化合物と反応させることにより、タグ配列中のシステイン残基の側鎖スルフヒドリル基をマレイミド基の炭素−炭素二重結合部位に付加させることにより当該化合物を結合させることを特徴とする、請求項１０に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体からなる、標的細胞に対する細胞死誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはタンパク質の化学修飾体、より特定的にはレセプター結合機能を保持する部位特異的化学修飾を施したヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医療への応用が可能な生物活性を有するタンパク質の中で、ヒトFasリガンドを始めとするデスリガンド型のサイトカインと呼ばれるタンパク質は、がん細胞や関節リウマチを形成する組織の細胞など、ヒトの各種の疾病の発症原因となる悪性の細胞にアポトーシスによる外因性の細胞死を誘導できる利点がある(非特許文献１１)ので、これらの疾病の治療用薬剤としての開発が進められている(非特許文献１、４、１４、１５)。
ヒトFasリガンドはヒトのデスリガンド型サイトカインの中でも主要なものの一つであり、その膜タンパク質としての全体構造のうち細胞外ドメイン部分が、標的となる細胞の表面に存在する膜タンパク質の一つである、ヒトFasレセプターと呼ばれる、細胞死誘導シグナルを細胞内部に伝達するための受容体タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合することにより、標的細胞の細胞死を誘導することができる(非特許文献１２)。
【０００３】
ヒトFasリガンド自体は上述のとおり膜タンパク質であるが、ヒトFasレセプターに対する特異的結合活性を有する、その可溶性のヒトFasリガンド細胞外ドメイン誘導体が標的細胞のアポトーシスによる細胞死誘導を始めとする各種医療応用上有用な生物活性を保持することは、種々の公知の特許文献により示されている(特許文献１〜１０)。
また、これまでに可溶性のヒトFasリガンド細胞外ドメインに関しては、大腸菌、酵母、細胞性粘菌など、いくつかの種類の宿主細胞を用いた遺伝子工学的手法による生産が試みられているが、それらの中でも特に酵母を発現用宿主とする分泌発現系の利用は効率的であることが知られている(非特許文献９)。ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ酸配列上そのアミノ末端側に13アミノ酸残基からなるNFG5タグ配列(図１)
(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)を付加させたもの、あるいはこのようなタグ配列を持たないもの(図１)について、酵母Pichia pastorisを発現用宿主とした遺伝子工学的手法による分泌生産が可能であり、当該発現生産物は高純度に精製可能であること、さらに精製された当該タンパク質試料はヒトFasレセプター細胞外ドメインに対して特異的な結合活性を有していることが、本特許申請に係る発明者らにより既に明らかにされている(非特許文献７、８、１０)。
【０００４】
しかしながら、ヒトFasレセプタータンパク質は、悪性の疾病の発症原因となる標的細胞以外の他のヒトの正常な組織(例えば、肝臓など)を構成する細胞の表面にも分布しているため、ヒトFasリガンドを天然型のままの状態で生体に投与した場合には、正常細胞を含む非特異的な細胞死が誘導される副作用に基づく有害な事象(例えば、劇症肝炎の発症など)の発生の原因となる欠点がある(非特許文献１３)。
また、可溶型のヒトFasリガンド細胞外ドメインが有するアポトーシス誘導活性は、ヒトFasレセプタータンパク質の細胞外ドメインとの相互作用に伴い細胞膜上で複数の膜型ヒトFasリガンド分子が局在化して生じる、ヒトFasリガンド分子の集合体が示すものと比較した場合、大きく低下するという欠点もあり(非特許文献５)、実用上の問題があった。
【０００５】
これらの問題点の改善策として、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端側に標的とするべき細胞の表面に特異的に存在する各種の抗原に選択的に結合する抗体タンパク質の抗原認識ドメインを遺伝子レベルで融合させたものを発現生産することにより得られる融合タンパク質を用いることにより、標的細胞に対する特異性を高める方法(非特許文献２、３、６)や、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端側にヒトACRP30のコラーゲン様ドメインを遺伝子レベルで融合させることにより、元来同一のサブユニット３個から構成される３量体型のヒトFasリガンド細胞外ドメインをさらに２つ会合させて６量体型の融合タンパク質を形成させることによって、標的細胞に対するアポトーシス誘導活性を大幅に増幅させる方法(非特許文献５)が提案されている。
しかしながら、これらの方法では、両タンパク質の融合体化により、発現生産量の低下や、ヒトFasレセプタータンパク質の細胞外ドメインに対する特異的結合のための相互作用を行う上で障害となる、新たな物理的な立体構造の発生や、化学的性質の変化によるヒトFasリガンド細胞外ドメイン本来の生物活性の発現の阻害などの悪影響が生じる可能性がある。また、目的タンパク質の精製過程における追加的操作が必要になる可能性もある。
通常、これらの融合により生じる可能性のある悪影響は事前の予測が困難であるため、所望の特性を有する融合タンパク質を得るための両タンパク質の融合箇所の設計は煩雑であり、かつ困難を伴うものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許公表２００９−５３９４１３(JP，A)
【特許文献２】特許公表２００８−５２８００６(JP，A)
【特許文献３】特許公表２００８−５２６８８９(JP，A)
【特許文献４】特許公開２００４−２９０１９６(JP，A)
【特許文献５】特許公表２００１−５０３６３５(JP，A)
【特許文献６】特許公表２０００−５００３３６(JP，A)
【特許文献７】特許公表平１０−５００５６８(JP，A)
【特許文献８】特許公表平９−５０８００９(JP，A)
【特許文献９】特許再公表ＷＯ２００１／０９０３８２(JP，A1)
【特許文献１０】特許再公表ＷＯ９５／１３２９３(JP，A1)
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ashkenazi，A. (2008) Nature Reviews Drug Discovery 7: 1001-1012.
【非特許文献２】Bremer E，Cate BT，Samplonius DF，de Leij FMH and Helfrich W. (2006) Blood 107:2863-2870.
【非特許文献３】Bremer E，Cate BT，Samplonius DF，Mueller N，Wajant H，Stel AJ，Chamuleau M，van de Loosdrecht AA，Stieglmaier J，Fey GH and Helfrich W. (2008) Cancer Research 68:597-604.
【非特許文献４】Etter AL，Bassi I，Germain S，Delaloye JF，Tschopp J，Sordat B and Dupuis M. (2007) Gynecologic Oncology 107:14-21.
【非特許文献５】Holler N，Tardivel A，Kovacsovics-Bankowski M，Hertig S，Goide O，Martinon F，Tinel A，Deperthes D，Calderata S，Schulthess T，Engel J，Schneider P and Tschopp J. (2003) Molecular Cellular Biology 23: 1428-1440.
【非特許文献６】Kassahn D，Nachbur U and Brunner T. (2007) Cell Death Differentiation 14:393-399.
【非特許文献７】Muraki M. (2006) Protein Expression Purification 50:137-146.
【非特許文献８】Muraki M. (2008) Protein Expression Purification 60:205-213.
【非特許文献９】Muraki M. (2012) Protein Peptide Letters 19:861-879.
【非特許文献１０】Muraki M and Honda S. (2010) Protein Expression Purification 73: 209-216.
【非特許文献１１】Nagata，S. (1997) Cell 88: 355-365.
【非特許文献１２】Takahashi T，Tanaka M，Inazawa J，Abe T，Suda T and Nagata S. (1994) International Immunology 6:1567-1574.
【非特許文献１３】Tanaka M，Suda T，Yatomi T，Nakamura N and Nagata S. (1997) J. Immunology 158: 2303-2309.
【非特許文献１４】TopoTarget A/S. (2012) ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00437736
【非特許文献１５】Vinay，DS and Kwon，BS. (2011) Clinical Experimental Immunology 164: 145-157.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、ヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質に、標的細胞に対する認識選択性やアポトーシス活性の増強などの各種の有用な性質を付与するにあたり、従来の、有用な性質を有する他のタンパク質とヒトFasリガンド細胞外ドメインを融合タンパク質として一体化する手法は、本来の生物活性を損なわずに目的とする性質を導入するための設計の困難さ、タンパク質改変による発現生産量の低下や精製工程の複雑化に伴う製造コストの上昇、付与可能な化学的性質の制限、等の問題を有している。
本発明は、このような問題を有さない、各種の有用な性質を具備するヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質誘導体を得るための手法を提供することを、課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質に関して、十分な生物活性を保持した形態で部位特異的な化学修飾を可能とすることで、上記課題が解決できるとの発想の下、鋭意、研究した結果、ヒトFasリガンド細胞外ドメインの立体構造上、標的細胞に対するアポトーシスの誘導を含む各種の生物活性を発現する上での要となる、ヒトFasレセプタータンパク質の細胞外ドメインとの間のリガンド-レセプター間特異的相互作用の界面部位から離れた、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に、他のタンパク質をはじめとする各種の有用な化学的性質を有する化合物と接合可能な結合部位を導入することにより、上記課題を解決した。
当該結合部位に有用な性質を有する他の化合物を直接あるいはリンカーを介して結合させることにより、ヒトFasリガンド細胞外ドメインの有する、標的細胞に対するアポトーシスの誘導を含む各種の生物活性を維持しつつ、これに更に当該他の化合物の有する有用な性質を付加することができる。
具体的には、上記結合部位として、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位にシステイン残基を導入する。システイン残基の導入は、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に、システイン残基を含むタグ配列を接続させることにより行ってもよい。
上記システイン残基に対する他の化合物の接合は、システイン残基に対し特異的に結合する反応性部位を介して行う。このような反応性部位としては、マレイミド基、ハロゲン化酢酸基、アジリジン基、アクロイル基、ビニルスルホン基、ハロゲン化ベンゼン基などの、システイン残基に対しチオエーテル結合を形成する基、ピリジルジスルフィド基などの、ジスルフィド交換型の基等が挙げられる。
このような反応性部位を各種の有用な化学的性質を有する化合物自体に直接設けることにより、当該有用な化学的性質を有する化合物を直接システイン残基に接合させてもよく、あるいは、このような官能基を有する化合物をシステイン残基に接合させ、当該化合物に各種の有用な化学的性質を有する化合物を結合させることにより、当該化合物をリンカーとして、有用な化学的性質を有する化合物を接合させてもよい。
【００１０】
例えば、配列内に反応性のシステイン残基を有するタグ配列をアミノ末端部位に接続させたヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質を遺伝子工学的手法により生産する。この生産物をマレイミド基を含有する化合物と反応させることにより、タグ配列中のシステイン残基の側鎖スルフヒドリル基をマレイミド基の炭素−炭素二重結合部位に付加させることによって当該化合物が結合した、ヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体を調製する。
このようにして得られた、ヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体は、ヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する特異的結合活性を保持しており、システイン残基と結合した上記化合物をリンカーとすることで、当該活性を保持したまま、他のタンパク質などの有用な化学的性質を有する化合物と容易に結合させることができる。また、上記化合物としてそれ自体有用な化学的性質を有する化合物を用いることで、ヒトFasリガンド細胞外ドメインに有用な特性を付加することもできる。
【００１１】
すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
〈１〉ヒトFasリガンド細胞外ドメインの、立体構造上、標的細胞に対するアポトーシスの誘導を含む生物活性発現の要となるヒトFasレセプターの細胞外ドメインとの特異的相互作用に直接関与しない、アミノ末端部位に接続したシステイン残基に、システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物による化学修飾を有することを特徴とする、ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈２〉ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に接続したシステイン残基が、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端部位に接続したタグ配列中に存在することを特徴とする、〈１〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈３〉タグ配列が、以下に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、〈２〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly
〈４〉ヒトFasリガンド細胞外ドメインが、天然型のヒトFasリガンド細胞外ドメインの全体構造(アミノ酸残基103-281)のうち103番目から138番目のアミノ酸残基が除かれ、かつ天然型のものに存在する184番目ならびに250番目のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換された変異型ヒトFasリガンド細胞外ドメインであることを特徴とする、〈１〉〜〈３〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈５〉システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物が、他の有用な化学的性質を有する化合物を結合させるためのリンカーとして機能することを特徴とする、〈１〉〜〈４〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈６〉システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物が、それ自体、他の有用な化学的性質を有することを特徴とする、〈１〉〜〈４〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈７〉システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物におけるシステイン残基に特異的に結合する反応性部位が、マレイミド基、ハロゲン化酢酸基、アジリジン基、アクロイル基、ビニルスルホン基、ハロゲン化ベンゼン基、ピリジルジスルフィド基からなる群から選ばれた部位であることを特徴とする、〈１〉〜〈６〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈８〉システイン残基に特異的に結合する反応性部位がマレイミド基であることを特徴とする、〈７〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈９〉システイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物が、N-エチルマレイミド、SUNBRIGHT ME-050MAまたはSUNBRIGHT DE-100MAである、〈８〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体。
〈１０〉アミノ末端部位にシステイン残基を接続させたヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質を遺伝子工学的手法により生産し、当該生産物をシステイン残基に特異的に結合する反応性部位を含有する化合物と反応させることにより、当該化合物を結合させることを特徴とする、ヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体の製造方法。
〈１１〉配列内に反応性のシステイン残基を有するタグ配列をアミノ末端部位に接続させたヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質を遺伝子工学的手法により生産し、当該生産物をマレイミド基を含有する化合物と反応させることにより、タグ配列中のシステイン残基の側鎖スルフヒドリル基をマレイミド基の炭素−炭素二重結合部位に付加させることによって当該化合物を結合させることを特徴とする、〈１０〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体の製造方法。
〈１２〉〈１〉〜〈９〉に記載のヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質の部位特異的化学修飾体からなる、標的細胞に対する細胞死誘導剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒトFasリガンド細胞外ドメインの立体構造上、生物活性発現の要となるヒトFasレセプターの細胞外ドメインとの特異的相互作用に関わる箇所を避けた形態で、部位特異的化学修飾を施した修飾体を調製することが可能であり、これにより、ヒトFasリガンド細胞外ドメインの有する本来の生物活性を損なうことなく、各種の有用な化学的性質を付与することができる。
本発明のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体は、当該タンパク質の立体構造上、ヒトFasレセプター細胞外ドメインとの特異的相互作用に直接関与しないアミノ末端部位に付属するタグ配列中に挿入した反応性のシステイン残基を利用する。これにより、本来の生物活性を維持した形態で、マレイミド化合物を始めとする各種のシステイン残基特異的な化学修飾剤による部位特異的化学修飾が可能となるため、遺伝子レベルでの改変の場合には到達困難な多様かつ有用な化学的性質を有する誘導体が得られるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】新規な反応性システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインの分泌生産に使用する発現用遺伝子ユニットを模式的に表したものである。
【図２】ヒトFasリガンド細胞外ドメインの部位特異的化学修飾体を得るに当たって新たに導入する反応性システイン残基の立体構造上の導入位置を示したものである。
【図３】N-エチルマレイミドおよびSUNBRIGHT ME-050MAの化学構造式を示したものである。
【図４】新規な反応性システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAによる化学修飾反応における各反応段階の試料に関するSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示したものである。
【図５】SUNBRIGHT DE-100MAの化学構造式を示したものである。
【図６】N-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAとの反応により得られたヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体を含む反応混合物の陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画パターンを示したものである。
【図７】N-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAとの反応により得られたヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体の陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製工程において得られた分画物試料のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示したものである。
【図８】SUNBRIGHT DE-100MAとの反応により得られたヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体を含む反応混合物のサイズ排除クロマトグラフィーによる分画パターンを示したものである。
【図９】SUNBRIGHT DE-100MAとの反応によるヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体のサイズ排除クロマトグラフィーを用いた精製工程において得られた各ピークの分画物試料のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示したものである。
【図１０】ヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAによる部位特異的化学修飾体に関する精製試料のヒトFasレセプター細胞外ドメインとの特異的結合をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析により示したものである。
【図１１】ヒトFasリガンド細胞外ドメインのSUNBRIGHT DE-100MAによる部位特異的化学修飾体に関する精製試料のヒトFasレセプター細胞外ドメインとの特異的結合をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析により示したものである。
【図１２】ヒトFasリガンド細胞外ドメインN-エチルマレイミド付加体処理によるヒト結腸ガンHT-29細胞の形態変化を示す顕微鏡写真である（×100倍率）。
【図１３】ヒトFasリガンド細胞外ドメインN-エチルマレイミド付加体処理によるヒト結腸ガンHT-29細胞の細胞死誘導活性の検出結果をMTTアッセイ法による６回の測定の平均値として示した図である。細胞生存率は未処理の場合を100％とした。＊はP＜0.05を、＊＊はP＜0.01を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体を得るために用いられた手法は、以下の６つの工程から構成される。
（１）ヒトFasリガンド細胞外ドメインの立体構造上の観点から、構造改変の導入によりもたらされる可能性のある潜在的な悪影響が回避しやすい部位特異的化学修飾のための新たな反応性システイン残基の適切な導入位置を設計する工程、
（２）設計した新規反応性システイン残基を含むヒトFasリガンド細胞外ドメイン誘導体の生産工程、
（３）生産したヒトFasリガンド細胞外ドメイン誘導体の部分精製ならびに当該部分精製試料の化学修飾剤との反応を行う工程、
（４）化学修飾剤との反応により得られたヒトFasリガンド細胞外ドメインの部位特異的化学修飾体の精製工程、ならびに
（５）精製した当該部位特異的化学修飾体のヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する特異的結合機能の評価を行う工程。
（６）精製した当該部位特異的化学修飾体の標的細胞に対する細胞死誘導活性の評価を行う工程。
【００１５】
第１の工程であるヒトFasリガンド細胞外ドメインの立体構造上の観点から適切な、新規な反応性システイン残基の導入位置の設計については、ヒトFasリガンド細胞外ドメイン自身の詳細な立体構造が未だ明らかとなっていないため、ヒトFasリガンドが属し、これまでにＸ線結晶構造解析によりそれぞれの細胞外ドメイン間の立体構造が互いによく類似していることが明らかになっているTNFリガンドスーパーファミリーを構成する他のタンパク質の立体構造を参照することにより設計を行った。
このようなタンパク質の例として、ヒトリンフォトキシンαが挙げられる。これまでに立体構造が明らかにされている全てのTNFリガンドスーパーファミリーを構成するデスリガンド型サイトカインの細胞外ドメインは、細胞外ドメイン部分のみが他の全体構造から切り離された状態でも、生物活性を発現する生理的な環境条件下では同一の３個のサブユニットからなるホモ３量体を形成していることが知られている。図２は、ヒトリンフォトキシンαにおいてこの３量体を構成する３個のサブユニットのうちの１個のみの部分について、ヒトリンフォトキシンαに特異的な結合活性を示すレセプターであるヒトTNFレセプターIの細胞外ドメインと複合体を形成する際の、両者の立体的な配置を示したものである。
図２に示される立体配置に基づき、本発明の実施例においては、ヒトリンフォトキシンαのアミノ末端に対応するヒトFasリガンド細胞外ドメインのアミノ末端にタグ配列を付加し、当該タグ配列中に新規システイン残基を導入した。この新規システイン残基の導入位置は、ヒトFasリガンド細胞外ドメインが標的細胞上のヒトFasレセプター細胞外ドメインとの特異的相互作用を行う際の界面部位から立体構造上離れているため、各種の化学修飾剤による部位特異的修飾が実施された後にも、本来の生物活性を保持しやすい。
【００１６】
次に、第２の工程である新規な反応性システイン残基を含むヒトFasリガンド細胞外ドメイン誘導体の生産については、遺伝子工学的なタンパク質の発現生産の手法を適用することが望ましい。
その際に用いる発現生産用の宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の各種の細胞を用いることが可能であるが、本発明において対象としているヒトFasリガンド細胞外ドメインに関しては、これまでの本発明者らによる研究結果から、他のタンパク質との融合を行なうことなく可溶性かつ生物活性を有する発現生産物を得ることが可能であるという観点において、酵母あるいは生物学的分類上より高等な宿主の細胞を用い、また精製工程の簡便さの観点から、可能であれば発現生産物を培養液中に分泌させる形態で実施することが望ましい。
【００１７】
第３の工程のうち、生産したヒトFasリガンド細胞外ドメイン誘導体の部分精製については、可溶性の発現生産物をイオン交換クロマトグラフィーに代表される各種のクロマトグラフィーの手法を用いて、できる限り簡便にかつ発現生産物の生物活性を損なわない形態で実施することが望ましい。
得られた部分精製試料と化学修飾剤との反応を行う工程においては、当該反応に用いる物理化学的条件ができるだけ穏やかかつ短時間で進行することが望ましい。また、反応生成物の化学的均一性を保証するために、本発明において新規に導入した反応性システイン残基以外に対する副反応が生じない化学修飾剤が用いられるべきである。
これらの要求を充たす可能性のある化学修飾剤の例としては、マレイミド基、ハロゲン化酢酸基、アジリジン基、アクロイル基、ビニルスルホン基、ハロゲン化ベンゼン基、ピリジルジスルフィド基などの、システイン残基に対し特異的に結合する反応性部位を有する各種の化合物が挙げられる(例えばHermanson G.T. (2008) Bioconjugate Techniques，2nd Edition，Chapter 2-2: Thiol Reactions，pp 182-192参照)。
【００１８】
第４の工程であるヒトFasリガンド細胞外ドメインの部位特異的化学修飾体の精製工程においては、第３の工程と同様に各種のカラムクロマトグラフィーの手法を用いて簡便かつ生物活性を損なわない形態で実施することが望ましい。その際、目的とする修飾体の化学的性質に応じて最適の分離原理に基づくクロマトグラフィー用カラムが用いられるべきである。
【００１９】
第５の工程である精製後の修飾体のヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する結合機能の評価工程においては、得られた各ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体が、ヒトFasレセプター細胞外ドメインに対して非修飾体の場合と同等の強度で特異的に結合することを確認できる手法を用いることが望ましい。
この要求を充たす確認手法の一例として、ヒトFasレセプター細胞外ドメインとヒトIgG1 Fcドメインからなる融合タンパク質ならびにプロテインAを担持したアガロースゲルビースを利用したレセプター介在型の共免疫沈降実験が挙げられる。当該実験を実施する際には、結合特異性を保証するために、非化学修飾体をポジティブコントロール用試料として、またタンパク質を含まない緩衝液をネガティブコントロール用試料として用いる対照実験を同時に並行して行うことが望ましい。
【００２０】
また、第６の工程である標的細胞に対する細胞死誘導活性の評価工程においては、対象とする細胞に対する細胞死の誘導が医療応用上有用であると考えられるヒトのがん組織由来の細胞を標的細胞として用いることが望ましい。細胞死誘導活性の確認手法としては、細胞死誘導処理後の標的細胞に関する細胞形態の変化を検出可能な手法ならびに当該処理を行わない場合との細胞生存量の変化を測定することによる細胞生存率を算定することができる手法を用いることが望ましい。当該実験を実施する際には、確認された細胞死誘導活性が有意なものであることを保証するために、当該ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体のみを含まない試料をネガティブコントロール用試料として用いる対照実験を同時に並行して行うことが望ましい。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインの分泌発現生産
図１は、新規な反応性システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインの酵母Pichia pastoris GS115株を宿主とする分泌生産に使用する、発現用遺伝子ユニットの構造を模式的に表したものである。
本発現用遺伝子ユニットは、図１中のTag遺伝子領域からhFasLECD(139-281，N184Q，N250Q)遺伝子領域までの部分を、インビトロジェン社から市販されているPichia pastoris酵母形質転換用発現ベクターpPICZαA中に存在する、目的とする発現用遺伝子のクローニング用制限酵素サイト(XhoI-NotI)の間に挿入することにより構築したものである。
本発明のシステイン残基導入ヒトFasリガンド細胞外ドメインの発現用遺伝子ユニットにおいて使用したTag遺伝子は、発現の際にヒトFasリガンド細胞外ドメインタンパク質のアミノ末端側にNFG1CG4タグ(図１および図２)と名付けた、システイン残基を１つ含む、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly-Cys-Gly-Gly-Gly-Glyの14残基からなるアミノ酸配列を付加するものであり、一方hFasLECD(139-281，N184Q，N250Q)遺伝子は、天然型のヒトFasリガンド細胞外ドメインの全体構造(アミノ酸残基103-281)のうち103番目から138番目のアミノ酸残基が除かれ、かつ天然型のものに存在する184番目ならびに250番目のアスパラギン残基がグルタミン残基に置換された変異型ヒトFasリガンド細胞外ドメインをコードする構造遺伝子である。当該変異型ヒトFasリガンド細胞外ドメインは、ヒトFasレセプター細胞外ドメインに対して天然型と同等の結合活性を有することが既に明らかとなっている(非特許文献８)。
また、Tag遺伝子として、上述のNFG1CG4タグにおけるCysを欠失させた、システイン残基を含まないNFG5タグ(図１)を付加する遺伝子を用いた発現用遺伝子ユニット、および、Tag遺伝子を含まない発現用遺伝子ユニットを、それぞれ、比較例として構築した。
酵母Pichia pastoris GS115株の形質転換は、上記のタグ配列が付加された遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用い、インビトロジェン社より市販されている「Pichia Easy Comp kit」を用いて行った。
形質転換体の選択は100μg/mlの抗生物質ゼオシンを含むYPDS寒天プレート上で行い、得られた互いに独立した100個以上の形質転換体のシングルコロニーを取得した。このうち5個の独立したシングルコロニーをそれぞれ100ml容量のバッフル付きフラスコに入れた10mlのBMGY培地(pH6.2-6.5)中、29.5℃で一晩、毎分300回転の回転振とう培養を行い増殖させた後、集菌したものを、500mlのバッフル付きフラスコに入れた50mlのBMMY培地(pH6.2-6.5)中に接種した。
このBMMY培養液に濃度0.5％になるようにメタノールを24時間おきに添加し、29.5℃、96時間、毎分200回転の回転振とう培養を行った。この際、24時間おきに少量の培養上清をサンプリングし、その一部を濃度10-20％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、目的物と考えられるバンドの濃さから判断して最も発現量の多いシングルコロニーを選択した。以下の実験においては、このシングルコロニーを100μg/mlの抗生物質ゼオシンを含むYPD寒天プレート上で増殖させたものを使用した。
当該シングルコロニーを3000ml容量のバッフル付きフラスコに入れた500mlのBMGY培地(pH6.2-6.5)中、29.5℃で一晩、毎分300回転の回転振とう培養を行い増殖させた後、集菌したものを5000ml容量のポリプロピレン製「カルチャーバッグ」(藤森工業社製)内に入れた2500mlのBMMY培地(pH6.2-6.5)に接種し、培養した。この際、培養中の通気はフィルター濾過(孔径0.2μm、アドバンテック社製)により滅菌した空気をポンプで送り込むことにより実施した。その他の培養時の操作に関する手順は、当該「カルチャーバッグ」の製品に添付された取扱説明書に記載の方法に従って行った。培養は29.5℃、毎分80-85回転の回転振とう培養により96時間行い、24時間おきに濃度0.5％になるようにメタノールを添加した。
本実施例中で用いた全ての培養用寒天プレートならびに液体培地はインビトロジェン社より市販されている「Easy SelectTM Pichia Expression kit」のマニュアルに記載されている方法により調製した。
【００２３】
（実施例２）新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインの部分精製
実施例１において最終的に得られた培養液を500ml容量のポリプロピレン製遠沈管に分注し、4℃で毎分5000回転の遠心分離を2分間行うことにより、菌体を沈殿させた。
次に、新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインを含む培養上清のみを別のポリプロピレン製容器に移し替えることにより、大部分の菌体を除去した。さらに、これを孔径の異なる二重の膜構造からなるフィルター(バキュキャップ80、日本ポール社製)を用いて濾過することにより、完全に菌体を除去した。
得られた培養上清を分画分子量10kDaのタンジェンシャルフロー式限外濾過デバイス(ミニメイト、日本ポール社製)２個を並列に接続したものに通過させることにより、目的物の濃縮を行うと共に50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.6)への緩衝液組成の置換を行い、最終的に約100mlの当該ヒトFasリガンド細胞外ドメインを含む濃縮液を得た。
この濃縮液を、数回に分けて、陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Hi-Trap S 5ml，GEヘルスケア社製)に添加した後、担体に結合した目的物を0.3Mの塩化ナトリウムを含有する50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.6)で溶出することにより、7mlのタンパク質濃度9.9mg/mlの新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインの部分精製試料を得た。
【００２４】
（実施例３）新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAによる化学修飾
図３は、本実施例において使用したN-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MA(平均分子量:5393ダルトン、日油社製)の化学構造式を示したものである。
実施例２において得られたタンパク質濃度9.9mg/mlの新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインの部分精製試料1.6mlに16μlの0.5Mエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩(pH8.0)を添加した後、64μlのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン中性pH溶液(サーモサイエンティフィク社製)を加え、十分に混合した後27℃で1時間静置した。1時間後、反応混合物に2mMのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む25mMリン酸緩衝液(pH6.4)を添加して全量を2.5mlとしたものを脱塩用限外濾過カラム(PD-10，GEヘルスケア社製)に添加した後、初めに3.5mlの同じリン酸緩衝液を用いて溶出し、引き続き2.5mlの同じリン酸緩衝液を追加して溶出した。
図４のａ〜ｄに、上記処理の前後における試料のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析結果を示す。
図４のａ〜ｃにおける、一番下の主要なバンドは、新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインに対応するものである。
レーンａとｂを比較すると、上記のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン中性pH溶液による還元処理により、当該処理前の試料に含まれていた、図４中のレーンａに矢印で示したそれぞれ異なるヒトFasリガンド細胞外ドメイン分子を構成する2個のサブユニット間でタグ配列中に導入したシステイン残基同士がジスルフィド結合を形成することにより現れたと考えられる生成物のバンドが、レーンｂでは消失している。このことは、上記還元処理により、上記2個のサブユニット間のジスルフィド結合が還元され、開裂したこと、そして、これにより、レーンａに矢印で示した２つのサブユニットがジスルフィド結合により連結された非反応性のヒトFasリガンド細胞外ドメイン分子の結合体は解消され、反応性のシステイン残基のみを有するヒトFasリガンド細胞外ドメイン分子が生じたことを示している。
また、レーンｃ及びｄにより、脱塩用限外濾過カラム分画の操作において、最初に溶出された3.5mlの画分にほぼ全ての新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインが含まれ、次の2.5mlの画分には含まれていないことが確認できる。
次に、この3.5mlの溶出液を２等分した各1.75mlの一方に30μlの1MのN-エチルマレイミドのエタノール溶液を、もう一方には189mgの粉末状のSUNBRIGHT ME-050MAを添加し、十分に混合した後いずれも27℃で15分間静置し、次に過剰のマレイミド基を不活性化する目的で33μlの1MのL-システイン塩酸塩水溶液を加えて、さらに27℃で15分間静置した。
これらの試料の電気泳動の結果(図４、レーンｅ及びｆ)は、レーンfにおいてのみ、生成物のバンドが高分子量の側に大きく移動しており、システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインに対し、レーンeの試料では低分子量のN-エチルマレイミドが、また、レーンfの試料では高分子量のSUNBRIGHT ME-050MAが、それぞれ結合したことを示している。
【００２５】
（実施例４）新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインのSUNBRIGHT DE-100MAによる架橋型化学修飾
図５は、本実施例において使用したSUNBRIGHT DE-100MA(平均分子量：10644ダルトン、日油社製)の化学構造式を示したものである。
実施例２において得られたタンパク質濃度9.9mg/mlの新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメイン部分精製試料1.6mlについて、まず実施例３の場合と同一の方法を用いてトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン中性pH溶液(サーモサイエンティフィク社製)による還元処理を行った。
次いで、今回は、当該還元処理後の目的物を含む全量(3.5ml)の脱塩ゲル濾過画分に対して、100μlの用時調製したSUNBRIGHT DE-100MAの2mMのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む25mMリン酸緩衝液(pH6.4)溶液(濃度16mg/ml)を加え、十分に混合した後、22℃で1時間静置し反応させた。
次に、未反応のシステイン残基を保護する目的で70μlの1M N-エチルマレイミドのエタノール溶液を加え、22℃で15分間静置した後、さらに過剰のマレイミド基を不活性化するために69μlの1M L-システイン塩酸塩水溶液を加え、22 ℃で15分間静置した。
【００２６】
（実施例５）N-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAによる部位特異的化学修飾を施したヒトFasリガンド細胞外ドメインの精製
図６は、実施例３において行った新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインとN-エチルマレイミドあるいはSUNBRIGHT ME-050MAとの反応により得た反応混合物中に含まれる部位特異的化学修飾体を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム(Resource S 1ml，GEヘルスケア社製)により分画精製した際の、クロマトグラムのパターンを示したものである。いずれの化学修飾剤を使用した場合にも主要な１つのピークからなる分画パターンが得られた。
図中に下線で示した領域の各主要ピークの溶出液を分取し、これらの溶出液の一部をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて解析した結果(図７)、それぞれの分取物の中に目的の部位特異的化学修飾体が含まれていることが明らかとなった。また、分取の結果得られた各化学修飾体の精製物の収量は、N-エチルマレイミド付加体が2.8mg、SUNBRIGHT ME-050MA付加体が1.9mgであった。
【００２７】
（実施例６）SUNBRIGHT DE-100MAによる部位特異的化学修飾を施したヒトFasリガンド細胞外ドメインの精製
図８は、実施例４において行った新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインとSUNBRIGHT DE-100MAとの反応により得られた架橋型の部位特異的化学修飾体を含む反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーカラム(Superdex 200 10/30GL、GEヘルスケア社製)により分画精製した際のクロマトグラムのパターンを示したものである。
また、図８中の大きく４つに分離したピークのそれぞれについてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析を行った結果を示したのが図９である。図９中のレーンａ，ｂ，ｃに認められる２つの矢印で示された位置のバンドが、新規システイン残基を導入したヒトFasリガンド細胞外ドメインを構成するサブユニットとSUNBRIGHT DE-100MAのみから形成された化学修飾体に対応している。
それぞれのバンドの位置から推定される分子量に基づいて、上側のバンドはヒトFasリガンド細胞外ドメインを構成する２個のサブユニットがSUNBRIGHT DE-100MAの両端に付加した部位特異的架橋体であり、下側のバンドはヒトFasリガンド細胞外ドメインを構成する１個のサブユニットがSUNBRIGHT DE-100MAの片端のみに付加した部位特異的化学修飾体であると考えられる。
本実施例においては、図９中のレーンｂおよびレーンｃに対応する図８中のピークIIおよびピークIIIの下線で示した領域の溶出液を分取した。分取の結果得られたピークIIおよびピークIIIに含まれる各SUNBRIGHT DE-100MA付加体の精製物の収量は、それぞれピークIIが1.7mg、ピークIIIが2.8mgであった。
【００２８】
（実施例７）ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体のヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する結合機能の評価
実施例５および実施例６において調製した各ヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体のヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する結合機能の評価に用いた方法は以下の通りである。
本結合機能の評価には市販のプロテインAを担持したアガロースゲルビースを用いた免疫沈降キット(Immunoprecipitation kit-Protein A、ロシュダイアグノスティクス社製)を使用した。
5.0μgの各精製試料を1mlの150mMの塩化ナトリウム、1％ノニデットP40、0.5％デオキシコーレートナトリウムおよび「コンプリートTM」プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解し、この溶液に15μgのヒトFasレセプター細胞外ドメインとヒトIgG1 Fcドメインからなる融合タンパク質ならびに50μlのプロテインA担持アガロースゲルビース懸濁液を加え、4℃で一晩、ゆるやかに振とうした。
この懸濁液を4℃、5000回転、1分間の遠心分離により沈殿させ、当該アガロースゲルビースをペレット状にした。このペレットを再度1mlの150mMの塩化ナトリウム、1％ノニデットP40、0.5％デオキシコーレートナトリウムおよび「コンプリートTM」プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に充分に懸濁させた後、4℃で1時間、ゆるやかに振とうすることにより、当該アガロースゲルビースに非特異的に結合した物質を洗浄して除いた。この洗浄操作をさらに２回繰り返した後、同様の操作により塩化ナトリウムのみを含まない上記のトリス塩酸緩衝液(pH7.5)を用いて最終的に１回洗浄した。
洗浄後のアガロースゲルビースを4℃、5000回転、1分間の遠心分離により沈殿、ペレット化させたものに75μlのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動試料添加用緩衝液(組成：125mMトリス塩酸、4.3％SDS、30％グリセロール、0.01％BPB、pH6.8)を加え、十分に懸濁させた後、95℃、12分間の加熱処理を行うことにより、ヒトFasレセプター細胞外ドメインとヒトIgG1 Fcドメインからなる融合タンパク質と共に免疫沈降したタンパク質を抽出した。
本実施例を行うに当たっては、アミノ末端側にNFG5タグ配列を含むものとタグ配列を持たないものの２種類の非化学修飾体ヒトFasリガンド細胞外ドメインをポジティブコントロール用試料として、またタンパク質を含まない緩衝液をネガティブコントロール用試料として用いた対照実験を同時に並行して行った。
図１０は、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドならびにSUNBRIGHT ME-050MAによる部位特異的化学修飾体のヒトFasレセプター細胞外ドメインとの特異的結合を、上述の共免疫沈降試験において得られたSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した結果を示している。図１０中、レーンａ,ｂは上記のポジティブコントロール用試料を用いて得られたもの、レーンｃはN-エチルマレイミド付加体精製物、レーンｄはSUNBRIGHT ME-50MA付加体精製物、レーンｅはタンパク質を含まない緩衝液のみを用いたネガティブコントロール試料を用いて得られた結果を示している。
両付加体の精製物を用いた場合にも共免疫沈降物中にポジティブコントロール試料の場合と同様に各付加体由来のバンドが確認できることから、N-エチルマレイミド付加体精製物ならびにSUNBRIGHT ME-50MA付加体精製物はヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する特異的結合活性を保持することが明らかとなった。
図１１は、図１０と同様の試験をヒトFasリガンド細胞外ドメインのSUNBRIGHT DE-100MAとの反応により生成した付加体のうち実施例６において分画精製したピークII(レーンａ)およびピークIII(レーンｂ)に含まれる部位特異的化学修飾体について行った結果を示している。レーンｃ及びレーンｄは、それぞれ矢印で示されているピークIIおよびピークIIIに含まれる部位特異的化学修飾体に由来するタンパク質のバンドの位置を明らかにする目的で、各分画精製物のみをそれぞれ0.3μgずつ分析したものである。各共免疫沈降物試料のレーンにはSUNBRIGHT DE-100MA付加体由来のバンドが確認されたことから、各精製物はいずれもヒトFasレセプター細胞外ドメインに対する特異的結合活性を保持することが明らかとなった。
【００２９】
（実施例８）ヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドによる部位特異的化学修飾体の標的細胞に対する細胞死誘導活性の評価
実施例５において調製したヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドによる部位特異的化学修飾体の精製物を用いて、以下の方法で、標的細胞に対する細胞死誘導活性の評価を行った。
本細胞死誘導活性の評価においては、被検用の標的細胞としてヒト結腸がん由来の株化細胞であるHT-29細胞（ATCC HTB-38）を使用した。HT-29細胞はATCCより購入し、10％牛胎児血清（Biowest社製）ならびに1mMのピルビン酸ナトリウムを含有するDMEM培地(Sigma社製)を用い、96ウェルのマイクロプレートを用いて、37℃、5％CO2を含む95％湿度空気の条件下で培養した。当該細胞の継代は80％コンフルエンスの時点でトリプシン-EDTA 溶液(Sigma社製)により脱着させることにより行った。活性評価試験の実施にあたっては、上記ヒトFasリガンド細胞外ドメイン修飾体による処理に先立ち、HT-29細胞を1ウェル当り2×104細胞の細胞密度で培地中に接種した後、24時間の前培養を行ったものを用いた。
検定用の当該ヒトFasリガンド細胞外ドメイン修飾体は、試験実施時の培養液中での最終濃度が0.1，1，10，100および1000ng/mlの濃度になるように、当該DMEM培地の10％容量かつ1ウェル当りの培養液の全体量が100μlになるように調整して添加し、37℃、5％CO2を含む95％湿度空気の条件下で48時間あるいは72時間の処理を行った。この際、当該Fasリガンド細胞外ドメイン誘導体のアミノ末端部位に接続されているNFG1CG4タグ配列内に存在するAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lysからなるアミノ酸配列を特異的に認識し、架橋を行う性質を有する抗FLAG M2モノクローナル抗体(Sigma社製)を2μg/mlの濃度で共存させた。本実施例を行うに当たっては、細胞死誘導活性物質が存在しない場合の細胞生存量の基準として用いる当該DMEM培地のみを添加した試料ならびにネガティブコントロールとして用いる当該細胞外ドメイン修飾体を含まない緩衝液（150mMの塩化ナトリウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.6）のみを当該DMEM培地に対し10％容量になるように加えた試料による対照実験を同時に並行して行った。いずれの対照実験においても抗FLAG M2モノクローナル抗体は同じく2μg/mlの濃度で共存させた。
細胞死誘導活性の評価は、細胞形態の顕微鏡観察ならびに3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド(MTT)を用いるMTTアッセイ法による細胞生存量の測定により行った。上記の各検定用試料による処理が終了した時点で5mg/mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水に溶解したMTT溶液を1ウェル当り10μl添加し、37℃、5％CO2を含む95％湿度空気の条件下で一晩インキュベートすることによりホルマザン色素の生成を完了させた。生成したホルマザン色素は100μlの10％ SDS溶液を添加することにより溶解させ、同じ条件でさらに24時間インキュベートした。生成したホルマザン色素溶液の吸光度をPower Scanプレートリーダー(大日本製薬製)を用いて570nmで測定し、細胞生存量を決定した。それぞれの検定条件において６回ずつの独立した試験を実施し、６回の試験における平均細胞生存率を、当該DMEM培地のみを添加した場合の細胞生存率を100％として評価した。
図１２は、一例として100ng/mlのヒトFasリガンド細胞外ドメインN-エチルマレイミド部位特異的付加体検体試料ならびに当該検体試料を含まない緩衝液のみからなる試料により72時間の処理を行った後の、HT-29細胞の顕微鏡写真を比較したものである。当該細胞外ドメイン付加体による処理を行ったものでは、緩衝液のみを含むネガティブコントロール用試料による処理の場合には認められない、アポトーシス誘導による細胞死を示唆すると考えられる、多数の、外観上の密度が濃く、縮小した形態の細胞が存在していることが明らかとなった。
図１３は、当該Fasリガンド細胞外ドメイン付加体検体試料の濃度ならびに処理時間を変化させた場合のMTTアッセイから求められた細胞生存率への影響をグラフ化したものである。当該検体試料は濃度ならびに処理時間に正に依存してHT-29細胞の生存率を低下させた。例えば100ng/mlの検体試料濃度の場合、48時間ならびに72時間の処理を行うことにより、細胞生存率の平均値ならびに標準偏差は未処理の場合のそれぞれ58.0±3.1％および49.8±1.8％に低下した。一方、緩衝液のみを含むネガティブコントロール用試料による細胞生存率の平均値は、48時間処理の場合106.7±1.7％，72時間処理の場合95.3±1.4％であった。尚、統計学的な有意差の指標として、図中にステューデントのt検定により求めた有意水準5％(*P<0.05)および1％（**P<0.01）を基準とした判定記号を示した。これらの結果から、ヒトFasリガンド細胞外ドメインのN-エチルマレイミドによる部位特異的化学修飾体がヒト結腸がん由来のHT-29細胞に有意な細胞死誘導活性を保持することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により得られるヒトFasリガンド細胞外ドメイン部位特異的化学修飾体は、当該化学修飾により付加する物質の化学的性質に応じて種々の産業上の利用可能性を有する。例えば、がん細胞を始めとする悪性の標的細胞の細胞表面に特異的に存在する抗原を選択的に認識する抗体の抗原認識ドメインを付加することにより各種の疾病の治療用薬剤として、また当該部位特異的化学修飾を介して適切な基板あるいは蛍光性や発光性の化合物またはタンパク質と結合させ、血清などの各種体液中に含まれる可溶性のヒトFasレセプターや標的細胞表面上の膜局在型のヒトFasレセプター等を検出、定量することにより各種の疾病の進行度、他の化学療法剤の効果判定、予後の予測などを行う医療用診断ツールとして利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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