(57)【要約】【課題】樹状細胞を効率的に培養するのに有用であり且つ培養用容器から樹状細胞を回収する際に樹状細胞の損傷を十分に抑制可能な樹状細胞の調製方法を提供する。【解決手段】本発明に係る樹状細胞の調製方法は、（Ａ）培養によって樹状細胞へと育つ単球と、単球よりも容器の底面に対する付着力が弱いリンパ球とを、単球とリンパ球とが混ざった状態で容器内に供給する工程と、（Ｂ）容器を振動させることによって底面からリンパ球を剥離させた後、リンパ球を含む液を容器内から排出する工程と、（Ｃ）培地が収容された容器内の底面に付着している単球を樹状細胞へと分化させる工程と、（Ｄ）容器を振動させることによって、培養された樹状細胞の一部を底面から剥離させる工程と、（Ｅ）（Ｄ）工程後、底面上に残存している樹状細胞をスクレーパによって掻き取る工程とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）培養によって樹状細胞へと育つ単球と、単球よりも容器の底面に対する付着力が弱いリンパ球とを、単球とリンパ球とが混ざった状態で前記容器内に供給する工程と、
（Ｂ）前記容器を振動させることによって前記底面からリンパ球を剥離させた後、リンパ球を含む液を前記容器内から排出する工程と、
（Ｃ）培地が収容された前記容器内の底面に付着している単球を樹状細胞へと分化させる工程と、
（Ｄ）前記容器を振動させることによって、培養された樹状細胞の一部を前記底面から剥離させる工程と、
（Ｅ）（Ｄ）工程後、前記底面上に残存している樹状細胞をスクレーパによって掻き取る工程と、
を備える、樹状細胞の調製方法。
【請求項２】
少なくとも（Ｂ）工程から（Ｄ）工程まで閉鎖系で実施する、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
（Ｅ）工程において、磁力によって前記容器の外側から前記スクレーパを遠隔操作する、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
少なくとも（Ｂ）工程から（Ｅ）工程まで閉鎖系で実施する、請求項３に記載の調製方法。
【請求項５】
複数の前記容器を準備し、当該複数の容器を上下方向に並ぶように配置した状態で、少なくとも（Ｂ）工程と（Ｄ）工程とを実施する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項６】
複数の前記容器を準備し、当該複数の容器を上下方向に並ぶように配置した状態で、少なくとも（Ｂ）工程と（Ｄ）工程と（Ｅ）工程とを実施する、請求項３又は４に記載の調製方法。
【請求項７】
複数の前記容器を準備するとともに、（Ｃ）工程を実施するためのインキュベータをその他の工程を実施するための装置から独立させ、前記インキュベータにおける培養が終了した前記容器を順次、（Ｄ）工程を実施するための装置に移送する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シャーレ等の容器で細胞を培養し、培養後の細胞を容器から剥離させて回収する培養方法が広く用いられている。従来、培養後の細胞の剥離は手作業で行われていた。この作業の効率を高めるため、当該作業の自動化が提案されている。特許文献１は、細胞を剥離させるためのブレードを備えた装置を開示する。当該装置は、容器内に挿入されるブレードと、ブレードを容器の底面に押し当てるホルダと、ホルダとともにブレードを回転させる回転手段とを備える。
【０００３】
近年、がんの治療法の一つとして、樹状細胞ワクチン療法が知られている。この治療法は、患者から採取した単球を培養することによって樹状細胞へと分化させ、樹状細胞から作製したワクチンをその患者に投与するという、いわばオーダーメイドの治療法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３２５５１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の樹状細胞ワクチン療法において、樹状細胞を効率的に培養することは当該治療法のより一層の普及に向けた重要な要素技術の一つである。本発明者らによる検討の結果、ブレードを採用した従来の剥離装置を樹状細胞の調製に適用するには未だ改善の余地があることが判明した。すなわち、ブレードを使って細胞を掻き取る手法では、細胞が破壊されたり損傷を受けたりする可能性がある。容器から培養した細胞を取り出す際、細胞の破壊又は損傷を抑制できれば樹状細胞の回収率を更に高めることが可能である。
【０００６】
本発明は、樹状細胞を効率的に培養するのに有用であり且つ培養用容器から樹状細胞を回収する際に樹状細胞の損傷を十分に抑制可能な樹状細胞の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る樹状細胞の調製方法は以下の工程を備える。
（Ａ）工程：培養によって樹状細胞へと育つ単球と、単球よりも容器の底面に対する付着力が弱いリンパ球とを、単球とリンパ球とが混ざった状態で容器内に供給する工程。
（Ｂ）工程：容器を振動させることによって底面からリンパ球を剥離させた後、リンパ球を含む液を容器内から排出する工程。
（Ｃ）工程：培地が収容された容器内の底面に付着している単球を樹状細胞へと分化させる工程。
（Ｄ）工程：容器を振動させることによって、培養された樹状細胞の一部を底面から剥離させる工程。
（Ｅ）工程：（Ｄ）工程後、底面上に残存している樹状細胞をスクレーパによって掻き取る工程。
【０００８】
上記（Ｂ）工程において、培養対象の単球についてはなるべく容器の底面に付着した状態を維持し、他方、培養対象ではないリンパ球については振動によって容器の底面から選択的に剥離させ、容器外に排出する。これは、単球とリンパ球の容器底面に対する付着力の違いを利用したものであり、振動条件（周波数、振幅など）を調節することによって実現可能である。この工程を実施することで、事前に単球とリンパ球とを分離する工程を省略できる。また容器内に導入されたリンパ球を培養前に容器から排出することで、（Ｃ）工程において単球を効率的に培養でき樹状細胞へと分化させることができる。
【０００９】
上記（Ｄ）工程において、再び容器を振動させることによって、培養後の樹状細胞を剥離させる。（Ｅ）工程におけるスクレーパによる機械的な剥離処理に先立って振動による剥離処理を実施することで、少なくとも一部の樹状細胞については機械的な剥離処理を経ることなく、つまり当該処理に起因する損傷を受けることなく、回収することができる。一方、（Ｄ）工程後に容器の底面に残存している樹状細胞についても、振動を与えない場合と比較して底面に対する付着力が十分に低下しているため、スクレーパによって比較的容易に剥離する。このため、当該処理による損傷を十分に抑制できる。（Ｄ）工程も（Ｂ）工程と同様、振動条件を調節することによって実現可能である。なお、振動装置の性能によっては（Ｂ）工程及び（Ｄ）工程における両方の振動処理を同じ装置で実施することも可能である。
【００１０】
本発明は閉鎖系において樹状細胞を調製するのに有用である。すなわち少なくとも（Ｂ）工程から（Ｄ）工程まで閉鎖系で実施してもよい。あるいは、（Ｅ）工程において、磁力によって容器の外側からスクレーパを遠隔操作してもよく、この場合、少なくとも（Ｂ）工程から（Ｅ）工程まで閉鎖系で実施してもよい。
【００１１】
樹状細胞をより一層効率的に培養する観点から、複数の容器を準備し、当該複数の容器を上下方向に並ぶように配置した状態で、少なくとも（Ｂ）工程と（Ｄ）工程とを実施してもよい。上述のように、遠隔操作可能なスクレーパを内部にそれぞれ備える容器を採用した場合、複数の容器を上下方向に並ぶように配置した状態で、更に（Ｅ）工程も実施してもよい。
【００１２】
樹状細胞の調製プロセスにおいて、律速となりやすい培養工程（（Ｃ）工程）を複数の容器で並行して実施することによって調製効率を高めてもよい。すなわち、（Ｃ）工程を実施するためのインキュベータをその他の工程を実施するための装置から独立させ、インキュベータにおける培養が終了した容器を順次、（Ｄ）工程を実施するための装置に搬送してもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、樹状細胞を効率的に培養でき且つ培養用容器から樹状細胞を回収する際に樹状細胞の損傷を十分に抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る調製方法の実施に使用する調製システムの一例を示す模式図である。
【図２】培養器の一例を示す斜視図である。
【図３】図２に示す培養器の断面図である。
【図４】剥離の原理を説明するための模式図である。
【図５】図１に示す調製システムであってスクレーパが回転している状態を示す模式図である。
【図６】本発明に係る調製方法の手順の一例を示すフローチャートである。
【図７】保持台を傾けることによって培養器から液体を排出している様子を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を参照しつつ詳細に説明する。まず、樹状細胞調製システムの実施形態について説明し、その後これを用いて樹状細胞を調製する方法について説明する。説明において、同一又は同一機能を有する要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１６】
＜樹状細胞調製システム＞
図１に示す調製システム１００は、培養器１内で単球を培養することによって樹状細胞へと分化させるとともに、得られた樹状細胞を培養器１から回収するための設備である。調製システム１００は、複数の培養器１と、複数の培養器１を収容する保持台１０と、保持台１０に対して振動を与えることによって培養器１を振動させる振動装置２０と、それぞれの培養器１内に収容されたスクレーパ５を磁力によって駆動するスクレーパ駆動装置３０と、培養器１への送液又は培養器１からの排液を行う輸液装置４０と、これらを制御するシステム制御部８０とを備える。調製システム１００は、複数の培養器１を収容し、適した温度条件下において細胞を培養するインキュベータ５０を更に備える。インキュベータ５０は、その他の装置（保持台１０、振動装置２０など）と独立して設けられている。以下、各構成について説明する。
【００１７】
（培養器）
培養器１は、図２，３に示すように、容器２と、容器２内に収容されたスクレーパ５とを有する。容器２は例えば透明な樹脂材料により構成されており、細胞を培養する培地も収容できるようになっている。容器２は円形の底板２ａと、底板２ａの周縁に沿って設けられた側壁２ｂとを有する。容器２は、その内面がリンパ球よりも単球が高い付着力で付着する材質で構成されていればよく、かかる材質を内面にコーティングしたものであってもよい。
【００１８】
底板２ａの内面側の中心には、スクレーパ５を取り付けるための凸部２ｃが形成されている。容器２の上部は、蓋材としての透明なフィルムＦによって塞がれている（図３参照）。フィルムＦの周縁部は、例えば溶着により、側壁２ｂの上端部に接合されている。これにより、容器２内に閉鎖空間Ｓ１が構成される。
【００１９】
側壁２ｂは、送液ポート２ｅと通気ポート２ｆとを有する。送液ポート２ｅは、培地及び細胞を流入又は流出させるためのポートであり、閉鎖空間Ｓ１に連通している。送液ポート２ｅは、側壁２ｂに一体的に形成されており、底板２ａの近傍から斜め上方に突出した筒形状を呈している。送液ポート２ｅには、送液管Ｌ１が着脱自在に接続される（図１参照）。通気ポート２ｆは、培地及び細胞の流入及び流出に伴って閉鎖空間Ｓ１内の気体を流入又は流出させるためのポートであり、異物の混入防止用のフィルタ（不図示）を介して閉鎖空間Ｓ１に連通している。通気ポート２ｆは、側壁２ｂに一体的に形成されており、側方に突出した筒形状を呈している。
【００２０】
スクレーパ５は、閉鎖空間Ｓ１内に収容されており、軸線ＣＬを中心に回転することによって容器２の底面２ｄ上の樹状細胞を掻き取る。図２，３に示すように、スクレーパ５は、培養器１の凸部２ｃに対して回転自在に設けられた円筒部５ａと、円筒部５ａの周面から互いに逆側に延出した二本のアーム５ｂと、二本のブレード５ｃと、二個の磁石５ｄとを有する。各アーム５ｂの下側に一本のブレード５ｃが設けられ、上側に一個の磁石５ｄが設けられている。
【００２１】
なお、図３には二本のアーム５ｂの長さが互いに異なる態様のスクレーパを図示したが、模式図である図１に示したように、二本のアーム５ｂの長さは同じであってもよい。また、必要であれば、容器２内においてスクレーパ５が浮上する機能を採用してもよい。すなわち、容器２の凸部２ｃをスクレーパ５が上下方向に移動するガイドとして利用し且つスクレーパ５の二つの磁石５ｄを、スクレーパ５を底面２ｄから浮上させるのに利用してもよい。例えば培養器１の上方に他の磁石や鉄板を配置すれば磁石５ｄとの間に引力が生じてスクレーパ５が浮上する。細胞の培養中にスクレーパ５を液面よりも上に浮上させておけば、スクレーパ５に細胞が付着することを防止でき、底面２ｄの全面に細胞を付着させることができる。
【００２２】
（保持台）
保持台１０は、複数の培養器１を上下方向に並べた状態で保持するためのものである。ここで例示する保持台１０は、四段の棚部１１と、底板１２とを有する。棚部１１同士の間には柱状のスペーサ１３が介在している（図７参照）。棚部１１とスペーサ１３とは、ボルト締結等により固定されていてもよいし、溶接等により一体化されていてもよい。底板１２は、最下段の棚部１１の下方に配置されている。棚部１１と底板１２との間には柱状のスペーサ１４が介在している。棚部１１及び底板１２とスペーサ１４とは、ボルト締結等により固定されていてもよいし、溶接等により一体化されていてもよい。なお、棚部１１の数は必ずしも四段でなくてもよく、これよりも少なくても多くてもよい。ただし、効率的に多量の細胞を培養するとともに、保持台１０に設置された培養器１に十分な振動を与える観点から、棚部１１の段数は好ましくは２〜７であり、より好ましくは３〜５である。
【００２３】
各棚部１１は培養器１を支持する支持面Ｍ１に吸着部Ｒ１が設けられている。吸着部Ｒ１は負圧により培養器１を棚部１１の上面側に吸着する。吸着部Ｒ１は排気管（不図示）を介して真空ポンプ（不図示）に接続されている。なお、棚部１１に対する培養器１の固定は必ずしも負圧によるものに限定されず、例えば把持機構又はロック機構等であってもよい。
【００２４】
（振動装置）
振動装置２０は、例えば電磁式の振動発生装置であり、防振部材２１を介して設置台２５の上に設置されている。防振部材２１は、例えば防振ゴムであり、振動装置２０から設置台２５への振動の伝わりを軽減する。振動装置２０は、上方に突出する振動体２２を有する。振動体２２は、連結部２３を介して保持台１０を支持する。
【００２５】
連結部２３は、底板１２を負圧により吸着する吸着部Ｒ２を有し、振動体２２に固定されている（図７参照）。連結部２３が底板１２を吸着することにより、保持台１０が振動装置２０上に固定される。吸着部Ｒ２は排気管（不図示）を介して真空ポンプ（不図示）に接続されている。なお、連結部２３に対する底板１２の固定は必ずしも負圧によるものに限定されず、例えば把持機構又はロック機構等であってもよい。
【００２６】
振動装置２０は、振動体２２を鉛直方向に沿って振動させる。これに伴い、保持台１０も鉛直方向に沿って振動し、保持台１０に設置された培養器１も鉛直方向に沿って振動する。本実施形態において、振動装置２０は支持面Ｍ１に直交する方向において、培養器１全体が同じ側に同時に動くように保持台１０を振動させることが好ましい。このように培養器１を振動させることが好ましい理由について、本発明者らは次のように推定する。培養器１全体が同じ側に同時に動くような振動が生じると、図４に示すように、培養器１内の液面にはファラデー波ＷＦが生じる。ファラデー波ＷＦが生じた状態において、液中には、支持面Ｍ１に沿って並ぶ多数の旋回流ＲＦが生じる。各旋回流ＲＦは、支持面Ｍ１に交差する面に沿って旋回し、培養器１の底面２ｄに沿う流れＨＦを発生させる。この流れＨＦにより、培養器１の内面の付着物を効率よく剥離できる。なお、本発明者らの検討によると、振幅を一定とした場合、周波数を大きくするにしたがって剥離性が向上し、他方、周波数を一定とした場合、振幅を大きくするにしたがって剥離性が向上する。
【００２７】
（スクレーパ駆動装置）
スクレーパ駆動装置３０は、保持台１０の周囲に設置され、保持台１０側に延出する四本の支持アーム３１を有する。四本の支持アーム３１は、四段の棚部１１にそれぞれ対応するように上下に並んでいる。各支持アーム３１先端部の上には、駆動回転体３２が取り付けられている。駆動回転体３２は、上下方向に沿う軸を中心に回転自在となっており、その回転軸から互いに逆側に延在した一対の回転アーム３２ｂを有する。一対の回転アーム３２ｂの上部には、一対の磁石３２ａがそれぞれ設けられている。
【００２８】
スクレーパ駆動装置３０は、支持アーム３１を伸縮させるアクチュエータを内蔵しており、支持アーム３１を伸縮させることで棚部１１の下の駆動位置（図５参照）と棚部１１の周囲の待機位置との間で駆動回転体３２を移送する。また、スクレーパ駆動装置３０は、棚部１１の下に配置された駆動回転体３２を回転させるアクチュエータを内蔵している。
【００２９】
駆動回転体３２が駆動位置にあるときに、磁石３２ａは、磁石５ｄと協働して磁力を発生する。この磁力により、駆動回転体３２からスクレーパ５に動力が伝わる。このため、駆動回転体３２が回転すると、それに伴ってスクレーパ５も回転する。すなわち、スクレーパ駆動装置３０は、培養器１の外側から磁力によりスクレーパ５を遠隔操作する。磁石５ｄと磁石３２ａとの間の磁力が弱められないように、棚部１１は、例えばアルミニウム系の金属のような非磁性材料により構成されることが好ましい。
【００３０】
なお、スクレーパ５及び駆動回転体３２の両方に磁石が配置されていなくてもよく、スクレーパ５及び駆動回転体３２の一方には磁石の代わりに鉄等の軟磁性体が配置されていてもよい。
【００３１】
（輸液装置）
輸液装置４０は、供給容器４１Ａ，４１Ｂと、回収容器４２と、送液管Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５とを有し、培養器１内に液体を供給し又は培養器１内から液体を排出する。供給容器４１Ａは、培養器１への供給用の培養液を収容する。培養液は、培養対象の栄養となる成分を含む液体である。供給容器４１Ｂは、培養器１への供給用の洗浄液を収容する。洗浄液は例えばｐＨ緩衝液である。回収容器４２は、培養器１から排出された液体を収容する。
【００３２】
送液管Ｌ１は、培養器１の送液ポート２ｅに接続される。四個の培養器１からそれぞれ延出する四本の送液管Ｌ１は、１本の送液管Ｌ２に合流する。送液管Ｌ２は三本の送液管Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５に分岐し、送液管Ｌ３は供給容器４１Ａに接続され、送液管Ｌ４は供給容器４１Ｂに接続され、送液管Ｌ５は回収容器４２に接続される。
【００３３】
送液管Ｌ１，Ｌ３，Ｌ４，Ｌ５には送液弁Ｖ１，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５がそれぞれ設けられている。送液弁Ｖ１，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５は例えば電磁弁である。送液管Ｌ２にはポンプＰ１が設けられている。培養器１への液体供給に際して、ポンプＰ１は供給容器４１Ａ，４１Ｂ側から培養器１側に液体を圧送する。培養器１からの液体排出に際して、ポンプＰ１は培養器１側から回収容器４２側に液体を圧送する。
【００３４】
（インキュベータ）
インキュベータ５０は、上下方向に並ぶ複数のセルＣ１を有する恒温装置であり、振動装置２０等に対して独立して設けられている。各セルＣ１は、培養器１を収容する。インキュベータ５０は、セルＣ１内を培養に適した温度に保つことにより、培養器１内における培養を促進する。
【００３５】
（システム制御部）
システム制御部８０は、例えばコンピュータにより構成され、振動装置２０、スクレーパ駆動装置３０及び輸液装置４０を制御することで培養手順の一部を自動的に実行する。
【００３６】
＜樹状細胞調製方法＞
以下、調製システム１００を用いて樹状細胞を培養する手順を説明する。本実施形態に係る調製方法は以下の工程を備える。
（Ａ）工程：単球と、単球よりも培養器１の底面２ｄに対する付着力が弱いリンパ球とを、単球とリンパ球とが混ざった状態で培養器１内に供給する工程。
（Ｂ）工程：培養器１を振動させることによって底面２ｄからリンパ球を剥離させた後、リンパ球を含む液を培養器１内から排出する工程。
（Ｃ）工程：培地が収容された培養器１内の底面に付着している単球を樹状細胞へと育てる工程。
（Ｄ）工程：培養器１を振動させることによって、培養された樹状細胞の一部を底面２ｄから剥離させる工程。
（Ｅ）工程：（Ｄ）工程後、底面２ｄ上に残存している樹状細胞をスクレーパ５によって掻き取る工程。
【００３７】
図６は上記調製方法の工程のより具体的な手順を示すフローチャートである。まず、ユーザーは、複数の培養器１を準備し、これらを保持台１０の四段の棚部１１上に設置し（Ｓ０１）、各培養器１の送液ポート２ｅに送液管Ｌ４を接続する（Ｓ０２）。培養器１内には、培養対象である単球と、リンパ球と、スクレーパ５とが封入されている。培養器１内への単球及びリンパ球の供給は、培養器１を保持台１０に設置する前に行ってもよいし、設置した後に行ってもよい（（Ａ）工程）。
【００３８】
次に、システム制御部８０は、培養器１を開放することなく、培養器１に対し洗浄液を供給するように輸液装置４０を制御する（Ｓ０３）。具体的には、輸液装置４０を制御することで、送液弁Ｖ１，Ｖ４を開き、送液弁Ｖ３，Ｖ５を閉じた状態で、ポンプＰ１により供給容器４１Ｂから培養器１に洗浄液を圧送する。
【００３９】
次に、システム制御部８０は、振動体２２を振動させるように振動装置２０を制御する第１振動制御を実行する（Ｓ０４）。このとき、振動の周波数及び振幅は、単球に比べ多くのリンパ球を培養器１の内面から剥離可能となるように設定される。すなわち、システム制御部８０は、培養器１を開放することなく培養器１の内面のリンパ球を選択的に剥離可能な条件で、保持台１０を振動させるように振動装置２０を制御する。システム制御部８０は、単球に比べ多くのリンパ球を培養器１の内面から剥離可能な条件で、保持台１０を振動させるように振動装置２０を制御する。
【００４０】
ステップＳ０４における周波数は、例えば２０〜１００Ｈｚであることが好ましく、３０〜７０Ｈｚであることがより好ましく、５０〜６０Ｈｚであることが特に好ましい。周波数が２０Ｈｚ以上であれば十分にリンパ球を底面２ｄから剥離させることができる。一方、周波数が１００Ｈｚ以下であれば培養対象である単球の剥離を十分に抑制できる。
【００４１】
支持面Ｍ１に直交する方向における振幅は、例えば０ｍｍ超５ｍｍ以下であることが好ましく、１〜４ｍｍであることがより好ましく、１〜２ｍｍであることが特に好ましい。振幅が５ｍｍ以下であれば培養対象である単球の剥離を十分に抑制できる。なお、振幅は、振動の中心位置を基準とした一方側への変位量を意味する。
【００４２】
次に、システム制御部８０は、剥離したリンパ球を含む懸濁液を培養器１から排出するように輸液装置４０を制御する（Ｓ０５）。具体的には、送液弁Ｖ１，Ｖ５を開き、送液弁Ｖ３，Ｖ４を閉じた状態で、ポンプＰ１により培養器１から回収容器４２に懸濁液を圧送するように輸液装置４０を制御する。なお、本実施形態においてはステップＳ０４及びステップＳ０５が（Ｂ）工程に相当する。
【００４３】
洗浄液の排出において保持台１０を振動装置２０から分離し、洗浄液の排出後に保持台１０と振動装置２０とを再度連結してもよい。これにより、培養器１から洗浄液を排出するときに、各培養器１の送液ポート２ｅが下側になるように保持台１０全体を傾けてもよい（図７参照）。保持台１０を傾ける処理は、ユーザーの手作業により実行してもよいし、専用の装置により自動的に実行してもよい。
【００４４】
次に、システム制御部８０は、培養器１を開放することなく、培養器１に対し培養液を供給するように輸液装置４０を制御する（Ｓ０６）。具体的には、送液弁Ｖ１，Ｖ３を開き、送液弁Ｖ４，Ｖ５を閉じた状態で、ポンプＰ１により供給容器４１Ａから培養器１に培養液を圧送するように、輸液装置４０を制御する。
【００４５】
次に、システム制御部８０は、培養器１の保持を解除するように保持台１０を制御する。ユーザーは、培養器１の送液ポート２ｅから送液管Ｌ１を取り外し、培養器１をインキュベータ５０に移送し（Ｓ０７）、インキュベータ５０のセルＣ１内に収容する。インキュベータ５０により、セルＣ１内の温度は単球の培養に適した温度に保たれ、単球の培養が促進される。これにより、単球由来の樹状細胞（単球の分化物）が培養される（Ｓ０８、（Ｃ）工程）。
【００４６】
次に、ユーザーは、培養完了後の培養器１を保持台１０に移送し、四段の棚部１１上に培養器１を再設置し（Ｓ０９）、各培養器１の送液ポート２ｅに送液管Ｌ１を接続する（Ｓ１０）。
【００４７】
次に、システム制御部８０は、振動体２２を振動させるように振動装置２０を制御する第２振動制御を実行する（Ｓ１１、（Ｄ）工程）。このとき、振動の周波数及び振幅は、樹状細胞を培養器１の内面から剥離可能となるように設定される。すなわち、システム制御部８０は、インキュベータ５０における培養後に、単球の分化物を培養器１の内面から剥離可能な条件で保持台１０を振動させるように、振動装置２０を更に制御する。
【００４８】
ステップＳ１１における周波数は、例えば２０〜１００Ｈｚであることが好ましく、３０〜７０Ｈｚであることがより好ましく、５０〜６０Ｈｚであることが特に好ましい。周波数が２０Ｈｚ以上であれば十分に樹状細胞を底面２ｄから剥離させることができる。一方、周波数が１００Ｈｚであれば振動による樹状細胞の損傷を十分に抑制できる。
【００４９】
支持面Ｍ１に直交する方向における振幅は、例えば０．５〜５ｍｍであることが好ましく、０．５〜４ｍｍであることがより好ましく、０．５〜２ｍｍであることが特に好ましい。振幅が０．５ｍｍ以上であれば十分に樹状細胞を底面２ｄから剥離させることができる。一方、振幅が５ｍｍ以下であれば振動による樹状細胞の損傷を十分に抑制できる。
【００５０】
次に、システム制御部８０は、剥離した樹状細胞を含む懸濁液を培養器１内から排出するように輸液装置４０を制御する（Ｓ１２）。具体的には、送液弁Ｖ１，Ｖ５を開き、送液弁Ｖ３，Ｖ４を閉じた状態で、ポンプＰ１により培養器１から回収容器４２に懸濁液を圧送するように輸液装置４０を制御する。これにより、培養器１の内面から剥離した樹状細胞が回収容器４２に回収される。
【００５１】
懸濁液の排出において保持台１０を振動装置２０から分離し、懸濁液の排出後に保持台１０と振動装置２０とを再度連結してもよい。これにより、培養器１から懸濁液を排出するときに、各培養器１の送液ポート２ｅが下側になるように保持台１０全体を傾けることができる（図７参照）。保持台１０を傾ける処理は、ユーザーの手作業により実行してもよいし、専用の装置により自動的に実行してもよい。
【００５２】
次に、システム制御部８０は、培養器１を開放することなく、培養器１に対し洗浄液を供給するように輸液装置４０を制御する（Ｓ１３）。具体的には、送液弁Ｖ１，Ｖ４を開き、送液弁Ｖ３，Ｖ５を閉じた状態で、ポンプＰ１により供給容器４１Ｂから培養器１に洗浄液を圧送するように、輸液装置４０を制御する。
【００５３】
次に、システム制御部８０は、培養器１を開放することなく、駆動回転体３２を駆動位置に移送して回転させるようにスクレーパ駆動装置３０を制御する（Ｓ１４、（Ｅ）工程）。スクレーパ５は、ブレード５ｃが磁力によって底面２ｄに押し付けられた状態で、図５に示すように回転する。これによりスクレーパ５のブレード５ｃが培養器１の底面２ｄ上に残存する樹状細胞を掻き取る。
【００５４】
次に、システム制御部８０は、掻き取られた樹状細胞を含む懸濁液を培養器１内から排出するように輸液装置４０を制御する（Ｓ１５）。具体的には、送液弁Ｖ１，Ｖ５を開き、送液弁Ｖ３，Ｖ４を閉じた状態で、ポンプＰ１により培養器１から回収容器４２に懸濁液を圧送するように輸液装置４０を制御する。これにより、培養器１の内面から掻き取られた樹状細胞が回収容器４２に回収される。
【００５５】
以上に説明した本実施形態によれば、ステップＳ０４及びステップＳ０５を実施することで、単球についてはなるべく培養器１の底面２ｄに付着した状態を維持し、他方、リンパ球については振動によって培養器１の底面２ｄから選択的に剥離させ、培養器１外に排出することができる。これらのステップを実施することで、事前に単球とリンパ球とを分離する工程を省略できる。また培養器１内に導入されたリンパ球を培養前に培養器１から排出することで、ステップＳ０８において単球を効率的に培養でき樹状細胞へと分化させることができる。
【００５６】
上記実施形態によれば、ステップＳ１１において、再び培養器１を振動させることによって、培養後の樹状細胞を底面２ｄから剥離させることができる。ステップＳ１４におけるスクレーパ５による機械的な剥離処理に先立って振動による剥離処理を実施することで、少なくとも一部の樹状細胞については機械的な剥離処理に起因する損傷を受けることなく、回収することができる。一方、ステップＳ１１の後に培養器１の底面２ｄに残存している樹状細胞については、ステップＳ１１における振動によって底面２ｄに対する付着力が低下しているため、スクレーパ５によって比較的容易に掻き取ることができる。このため、当該処理による損傷も十分に抑制できる。
【００５７】
スクレーパ５は培養器１内に収容され、スクレーパ駆動装置３０は培養器１の外側から磁力によりスクレーパ５を駆動する。このため、培養器１を開放することなく、すなわち培養器１を覆うフィルムＦを剥がさずに閉鎖系において底面２ｄ上の樹状細胞を最終的に掻き取る作業をも実施できる。
【００５８】
本実施形態は、樹状細胞の調製プロセスにおいて律速となりやすい樹状細胞の培養を、複数の培養器１で並行して実施するとともに、他の装置と独立して設けられたインキュベータ５０において実施する。これにより、インキュベータ５０における培養が終了した培養器１を順次、振動装置２０及びスクレーパ５による処理に供することができる。また、複数の培養器１を上下方向に並ぶように保持台１０に配置した状態で、単球とリンパ球の分離処理及び樹状細胞の剥離処理を実施できるため、多量の樹状細胞を効率的に培養できる。
【００５９】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能である。例えば、上記実施形態においては好ましい態様として閉鎖系で樹状細胞の調製を行う場合を例示したが、必ずしも閉鎖系で実施しなくてもよい。また、培養器１の振動方向は、必ずしも鉛直方向に沿っていなくてもよい。例えば培養器１は、鉛直方向において変位し且つ水平方向において変位してよい。つまり、振動装置２０は、鉛直方向に対して傾斜した方向に沿って振動体２２を振動させてもよい。また、支持面Ｍ１に直交する方向において、培養器１の各部の変位方向は一致していることがファラデー波ＷＦの発生の点から好ましいが、その変位量は部分ごとに異なっていてもよい。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例及び比較例について説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６１】
図１に示す調製システムと同様の構成のシステムを構築し、このシステムを用いて樹状細胞を調製し、その回収率の評価を行った。
【００６２】
（実施例１）
単球及びリンパ球を収容した四個の培養器を準備した（（Ａ）工程）。各培養器を保持台の棚部に設置し、各培養器内に洗浄液を供給した。そして、培養器が鉛直方向に沿って振動するように保持台を振動させた。振動の周波数を約５５Ｈｚとし、振幅を約１．５ｍｍとした。保持台の振動を停止させた後、剥離したリンパ球を含む懸濁液を培養器から排出した（（Ｂ）工程）。
【００６３】
リンパ球の排出後、輸液装置を使用して培養器に培養液（培地）を供給した。その後、保持台から培養器を回収してインキュベータに移送した。インキュベータ内の温度３７℃に設定し、６日間にわたって単球を培養し、樹状細胞へと分化させた（（Ｃ）工程）。
【００６４】
樹状細胞の培養終了後、インキュベータから各培養器を保持台の棚部に移設し、各培養器内に洗浄液を供給した。そして、培養器が鉛直方向に沿って振動するように保持台を振動させ、樹状細胞の剥離処理を行った（（Ｄ）工程）。振動の周波数を約５５Ｈｚとし、振幅を約２ｍｍとした。保持台の振動を停止させた後、剥離した樹状細胞を含む懸濁液を培養器から回収した。各培養器内に再び洗浄液を供給した後、スクレーパ駆動装置を起動し、培養器の底面上に残存している樹状細胞をスクレーパで掻き取った（（Ｅ）工程）。スクレーパの駆動を停止させた後、剥離した樹状細胞を含む懸濁液を培養器から回収した。
【００６５】
回収した樹状細胞の生存率を次のようにして評価した。すなわち、回収した樹状細胞をトリパンブルー染色液と混合し、血球計算版にて生細胞と死細胞をカウントした。回収後に生きていた細胞数を回収した全細胞数で除すことによって樹状細胞の生存率を算出した。実施例１における樹状細胞の生存率は７２％であった。
【００６６】
（比較例１）
（Ｄ）工程を実施しなかったこと、すなわち振動による樹状細胞の剥離処理を実施せず、スクレーパによる剥離処理のみを実施したことの他は実施例１と同様にして樹状細胞の調製を行った。比較例１における樹状細胞の生存率は４４％であった。
【符号の説明】
【００６７】
１…培養器、２…容器、２ａ…容器の底板、５…スクレーパ、１０…保持台、２０…振動装置、３０…スクレーパ駆動装置、４０…輸液装置、５０…インキュベータ、８０…システム制御部、Ｓ１…閉鎖空間。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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