(57)【要約】【課題】従来のシリコンナフタロシアニン含有リポソームは、光線力学療法に用いるため色素が分散した状態で内包する必要があり、色素含有率が低く光音響信号も低かった。【解決手段】７００ｎｍから８００ｎｍでの第一の吸収極大における吸収係数Ａと第二の吸収極大における吸収係数Ｂの比率Ａ／Ｂが５．０以下であってシリコンナフタロシアニン類縁体を含有した脂質粒子によれば、脂質粒子内の色素含有率を上げ、光音響信号強度を向上させることが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコンナフタロシアニン類縁体を含有する脂質粒子を有する光音響造影剤であって、前記脂質粒子の、波長領域７００ｎｍから８００ｎｍにおいて最も大きい吸収係数Ａと、２番目に大きい値であって、かつ極大値である吸収係数Ｂとが下記式（１）を満たすことを特徴とする光音響造影剤。
Ａ／Ｂ≦５．０  （１）
【請求項２】
前記吸収係数Ａは、前記シリコンナフタロシアニン類縁体のモノマーの吸収極大波長である第一の波長ａにおける吸収係数であり、前記吸収係数Ｂは、前記シリコンナフタロシアニン類縁体の凝集体の吸収極大波長である第二の波長ｂにおける吸収係数であることを特徴とする請求項１に記載の光音響造影剤。
【請求項３】
前記第一の波長ａが７５０ｎｍより大きく、８００ｎｍ以下の範囲にあることを特徴とする請求項２に記載の光音響造影剤。
【請求項４】
前記第二の波長ｂが７００ｎｍ以上７５０ｎｍ以下の範囲にあることを特徴とする請求項２または３のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【請求項５】
前記吸収係数Ａと前記吸収係数Ｂが下記式（２）を満たすことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
Ａ／Ｂ≦２．５  （２）
【請求項６】
前記脂質粒子がリン脂質を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【請求項７】
前記リン脂質が、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジミリストリルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、からなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【請求項８】
前記脂質粒子がリポソームを有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【請求項９】
前記シリコンナフタロシアニン類縁体の構造が下記の化学式（１）で示されることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【化１】
2015028001.tif 000005
（式中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３、Ｒ２０４、Ｒ２０５、Ｒ２０６、Ｒ２０７、Ｒ２０８、Ｒ２０９、Ｒ２１０、Ｒ２１１、Ｒ２１２、Ｒ２１３、Ｒ２１４、Ｒ２１５、Ｒ２１６、Ｒ２１７、Ｒ２１８、Ｒ２１９、Ｒ２２０、Ｒ２２１、Ｒ２２２、Ｒ２２３、Ｒ２２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
また、Ｒ１０１、Ｒ１０２は各々が同一でも異なっていてもよく、−ＯＨ、−ＯＲ１１、−ＯＣＯＲ１２、−ＯＳｉ（−Ｒ１３）（−Ｒ１４）（−Ｒ１５）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
ここで、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。）
【請求項１０】
前記シリコンナフタロシアニン類縁体がシリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）を有することを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【請求項１１】
前記脂質粒子がポリエチレングリコールを有することを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコールの分子量が２０００以上１０００００以下であることを特徴とする請求項１１に記載の光音響造影剤。
【請求項１３】
前記脂質粒子における前記ポリエチレングリコールの占める割合が０．１モル％以上１０モル％以下であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の光音響造影剤。
【請求項１４】
前記脂質粒子がさらにコレステロールを有することを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の光音響造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリコンナフタロシアニン類縁体を含有する脂質粒子を有する光音響造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、非侵襲的に生体内部の情報を可視化する方法として、光音響イメージング法が注目されている。
光音響イメージング法を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算して可視化することができる。
【０００３】
光吸収体には、生体内で光を吸収して音響波や蛍光を発するものを好適に用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体として、光吸収体から発せられた音響波を測定することが可能である。その他にも、近赤外波長領域の光を吸収する色素などを体内に投与し、造影剤として利用することもできる。近赤外波長領域の光は、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高いため、近赤外波長領域の光を吸収する色素は光音響イメージング法における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において色素とは、６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲に含まれる波長の光を吸収することのできる化合物と定義する。
造影剤においては、信号強度（音響波や蛍光の強度）を有効に増幅するために、色素を粒子、ミセル、ポリマーミセル、リポソーム等（総称して粒子等という）に集積することにより、色素含有率を上げて、照射エネルギーの吸収効率を上げることが望まれる。
これまでにシリコンナフタロシアニンを含有したリポソームが報告されている（非特許文献１）。一方、フタロシアニンやナフタロシアニンでは、モノマーと凝集体では吸収スペクトルが変化することが知られている（非特許文献２）。非特許文献３では、二つの吸収極大における吸収係数の比率からリポソーム内に内包したフタロシアニンの凝集度を算出している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９０），  ６２，  ９６６−９７０
【非特許文献２】Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｄａｔｉｏｎ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  １４６
【非特許文献３】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９５）  ７１，  ７２７−７３２
【非特許文献４】「リポソームの応用の新展開」  秋吉一成、辻井薫監修、ＮＴＳ出版、２００５年６月１日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１が開示するリポソームは、光線力学療法（ＰＤＴ）用である。非特許文献１のリポソームにおいては、活性酸素を発生させるためシリコンナフタロシアニンを凝集させないよう分散させた状態（モノマー）でリポソーム内に封入する必要がある。その結果、色素含有率が低く、光音響信号強度は低いという課題がある。
そこで、本発明では色素含有率の高い脂質粒子（例えばリポソーム）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、シリコンナフタロシアニン類縁体を含有した脂質粒子の吸収スペクトルが示す第一の吸収極大である波長ａにおける吸収係数Ａと第二の吸収極大である波長ｂにおける吸収係数Ｂの比が５以下と低い粒子は、光音響造影効果が高いことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明に係る光音響造影剤は、シリコンナフタロシアニン類縁体を含有する脂質粒子を有する光音響造影剤であって、前記脂質粒子の、波長領域７００ｎｍから８００ｎｍにおいて最も大きい吸収係数Ａと、２番目に大きい値であって、かつ極大値である吸収係数Ｂとが下記式（１）を満たすことを特徴とする光音響造影剤である。
０＜Ａ／Ｂ≦５．０  （１）
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る脂質粒子は、光音響信号強度が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施例１における色素含有率と吸収係数比率との関係図である。
【図２】本発明の実施例１における色素含有率と１００ｎｍ換算粒子当たりの光音響信号強度との関係図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本実施形態に係る光音響造影剤はシリコンナフタロシアニン類縁体を含有する脂質粒子を有する。そして、脂質粒子の、波長領域７００ｎｍから８００ｎｍにおいて最も大きい吸収係数Ａと、２番目に大きい値であって、かつ極大値である吸収係数Ｂとが下記式（１）を満たすことを特徴としている。
０＜Ａ／Ｂ≦５．０  （１）
ここで、シリコンナフタロシアニン類縁体は、溶媒中で、モノマーで存在する場合と凝集体で存在する場合で、波長領域７００ｎｍから８００ｎｍでの吸収スペクトルが異なる。したがって、シリコンナフタロシアニン類縁体のモノマーと凝集体の混合物は、波長領域７００ｎｍから８００ｎｍに複数の吸収極大を有することとなる。このうち、最も大きい吸収係数Ａとなるときの吸収極大波長を本明細書では波長ａと呼び、２番目に大きい値であって、かつ極大値である吸収係数Ｂとなるときの吸収極大波長を本明細書では波長ｂと呼ぶ。
ａ、ｂは、溶媒や測定条件によって異なるが、ａは７５０ｎｍより大きく、８００ｎｍ以下の範囲にあることが好ましく、ｂは７００ｎｍ以上７５０ｎｍ以下の範囲にあることが好ましい。
したがって上記式（１）は、脂質粒子におけるシリコンナフタロシアニン類縁体の凝集体とモノマーとの割合を規定するものである。上記式（１）を満たすとき、シリコンナフタロシアニン類縁体の量が多く、脂質粒子に多くのシリコンナフタロシアニン類縁体を内包することができる。その結果、本実施形態に係る光音響造影剤はモル吸光係数が大きく、光音響強度が大きくなる。
本実施形態において、吸収係数Ａと吸収係数Ｂとが、下記式（２）を満たすことが好ましい。
０＜Ａ／Ｂ≦２．５  （２）
【００１０】
（シリコンナフタロシアニン類縁体）
本実施形態に係るシリコンナフタロシアニン類縁体とは、ナフタロシアニン骨格を有し、中心にシリコン化合物を持つものであればいかなるものでもよい。ナフタロシアニン骨格は疎水性であるため、ナフタロシアニン骨格を有するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、疎水性相互作用によって複数で集まりやすい。複数集まったシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体はさらに疎水性が高くなる。そのため、本実施形態に係る脂質粒子が血清などの水溶液中におかれた場合、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、粒子外へと漏出しにくくなる。
【００１１】
シリコンナフタロシアニン類縁体は、生体透過性の優れた６００ｎｍから９００ｎｍの近赤外波長の吸収を持つ。本実施形態に係る脂質粒子はシリコンナフタロシアニン類縁体を含有しているため、生体に照射したときに安全で、かつ、生体に対して比較的高い透過性をもつ近赤外波長領域（６００ｎｍから９００ｎｍの近赤外波長領域）の波長を吸収することができる。本実施形態においてシリコンナフタロシアニン類縁体の構造は、下記の化学式（１）で示される。
【化１】
2015028001.tif 000002
（式中、Ｒ２０１、Ｒ２０２、Ｒ２０３、Ｒ２０４、Ｒ２０５、Ｒ２０６、Ｒ２０７、Ｒ２０８、Ｒ２０９、Ｒ２１０、Ｒ２１１、Ｒ２１２、Ｒ２１３、Ｒ２１４、Ｒ２１５、Ｒ２１６、Ｒ２１７、Ｒ２１８、Ｒ２１９、Ｒ２２０、Ｒ２２１、Ｒ２２２、Ｒ２２３、Ｒ２２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
また、Ｒ１０１、Ｒ１０２は各々が同一でも異なっていてもよく、−ＯＨ、−ＯＲ１１、−ＯＣＯＲ１２、−ＯＳｉ（−Ｒ１３）（−Ｒ１４）（−Ｒ１５）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基または、炭素数１〜１８のアルキル基若しくは芳香族基であってハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。
ここで、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、又は炭素数１〜１８のアルキル基から選択される一若しくは複数の官能基で置換されているか若しくは未置換のものを表す。）
【００１２】
シリコンナフタロシアニン類縁体の好ましい具体例としては、シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｂｉｓ  （ｔｒｉｈｅｘｙｌｓｉｌｙｌｏｘｉｄｅ））を挙げることができる。
【００１３】
（リン脂質）
本実施形態の光音響造影剤における脂質粒子は、リン脂質を含むことが出来る。好ましいリン脂質の例としては、合成されたジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）が挙げられるが、その他の合成されたホスファチジン酸（ＰＡ）などのアルキルあるいはアルケニル誘導体も使用でき、例えば、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）からなる群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。
【００１４】
その他リン脂質として、大豆あるいは卵黄レシチン、リゾレシチン、またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体、あるいは半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリンも挙げられる。
【００１５】
（ポリエチレングリコール）
本実施形態に係る脂質粒子は、脂質粒子の脂質膜表面にポリエチレングリコール鎖が導入されていることが好ましい。本実施形態における脂質粒子の用途の例として、腫瘍造影剤が挙げられる。腫瘍へのパッシブターゲティングの原理として提唱されているＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、腫瘍血管の透過性亢進と腫瘍内滞留）効果を生じさせるためには、高い血中滞留性を有することが造影剤には求められる。ポリエチレングリコールは補体等の血中タンパク質との相互作用を抑制することで肝臓などの細網内皮系細胞に貪食され難くなり、リポソームの血中滞留性を向上させることができるため、本実施形態における脂質粒子へのポリエチレングリコールの導入は非常に有益である。
【００１６】
ポリエチレングリコールの分子量や脂質粒子への導入率を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。その分子量が５００以上２０００００以下のポリエチレングリコールの使用が好ましく、特に２０００以上１０００００以下であることが好適である。また脂質粒子へのポリエチレングリコール導入率、すなわち脂質粒子におけるポリエチレングリコールの占める割合は、該脂質粒子を構成する脂質に対して０．００１モル％以上５０モル％以下であることが好ましい。さらに好ましくは０．０１モル％以上３０モル％以下、より好ましくは０．１モル％以上１０モル％以下である。
【００１７】
脂質粒子へのポリエチレングリコール導入方法は、公知の技術を利用することができる。好ましい例としては、脂質粒子原料のリン脂質類の中に、予めポリエチレングリコール結合リン脂質などを含めて脂質粒子を作製する方法である。ポリエチレングリコール結合リン脂質の例としては、１，  ２−  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−  ｓｎ−  ｇｌｙｃｅｒｏ−  ３−  ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−  Ｎ−  ［ｃａｒｂｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ）、Ｐｏｌｙ  （ｏｘｙ−  １，  ２−  ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ），  α−  ［７−  ｈｙｄｒｏｘｙ−  ７−  ｏｘｉｄｏ−  １３−  ｏｘｏ−  １０−  ［（１−  ｏｘｏｏｃｔａｄｅｃｙｌ）  ｏｘｙ］−  ６，  ８，  １２−  ｔｒｉｏｘａ−  ３−  ａｚａ−  ７−  ｐｈｏｓｐｈａｔｒｉａｃｏｎｔ−  １−  ｙｌ］−  ω−  ｍｅｔｈｏｘｙ−  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）、Ｎ−  （ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、３−  （Ｎ−  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、Ｎ−  （３−  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−  １−  ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−  ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＰＡ、  ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＣＮ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０５０−ＣＮ、Ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ＤＳＰＥ，  Ｍｗ１００００、Ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ＰＥＧ  ＤＳＰＥ，  Ｍｗ２００００等のポリエチレングリコール結合リン脂質を挙げることができる。これらのうちポリエチレングリコールリン脂質の好ましい例としては、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＣＮを挙げることができる。
【００１８】
（脂質粒子）
本実施形態において脂質粒子とは少なくともリン脂質などの脂質から構成される脂質粒子であり脂質小胞あるいはリポソームも含まれる。一般的にリポソームは主にリン脂質から構成される２重膜が一枚あるいは多層の膜から構成される脂質小胞を意味するが、本実施形態における脂質粒子は、そのようなリポソームに限定されず、少なくともリン脂質などの脂質から構成される脂質粒子全般を含んでおり、シリコンナフタロシアニンが脂質膜に入り込み脂質膜の秩序性が乱れていても、分散媒に分散していれば本実施形態でいう脂質粒子に含まれる。また脂質粒子は脂質、糖脂質、ステロール誘導体、脂質誘導体ならびにそれらの組み合わせを構成成分に含んでもよい。異なる脂質の混合物から構成されていてもよい。また脂質誘導体として、たとえばポリエチレングリコール結合リン脂質なども使用することができる。脂質粒子の調製方法は、従来公知のリポソームの調製方法を利用でき、望ましい物性の脂質粒子を得るために適宜、選択することができる。脂質の種類や量などは、脂質粒子の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、脂質の種類、脂質量、その比率、脂質の荷電を考慮することで、脂質粒子の粒径や表面電位を制御することができる。
【００１９】
脂質以外の構成材料として、必要に応じ他の材料を加えることもできる。例として、膜安定化剤として作用するコレステロール、エチレングリコールなどのグリコール類、電荷制御のために添加されるリン酸ジアルキルエステル類、ステアリルアミンなどの脂肪族アミンが例示される。
【００２０】
本実施形態に係る脂質粒子の調製方法は、公知のリポソーム製造方法により調製することができる。公知の技術としては、非特許文献４のｐ３３〜ｐ３７に記載がある。例えばバンガム法（単純水和法、ソニケーション法、エクストルージョン法）、ｐＨ勾配（リモートローディング）法及び対イオン濃度勾配法、凍結融解法、逆相蒸発法、メカノケミカル法、超臨界二酸化炭素法、フィルムローディング法などが挙げられ、また市販の中空リポソームを用いた方法などが挙げられ、これら公知の方法により調製されるリポソームを本実施形態における脂質粒子に供することができる。
【００２１】
（リポソームの調製方法）
本実施形態におけるシリコンナフタロシアニン含有脂質粒子の製造方法の好ましい一例は、バンガム法によるリポソーム作製方法に従うものである。すなわち、リン脂質などのリポソームの原料と高濃度のシリコンナフタロシアニンを有機溶媒に溶解、混合して、有機溶媒を減圧下で除去して脂質とシリコンナフタロシアニンを乾固させ、これを水系媒体で分散させ、超音波照射により均一化させることでリポソームを形成させるものである。
【００２２】
（脂質粒子サイズ）
本実施形態にかかる脂質粒子は、一般的なリポソームと同様に、数１０ｎｍの小型のものから数μｍの大型のものまで、さまざまな大きさのものが使用できる。実際には、脂質粒子のサイズおよびその分布は、本実施形態における脂質粒子の用途の一例である腫瘍造影剤としては非常に重要であり、血中滞留性や標的組織への送達効率と密に関連している。したがって、脂質粒子の平均粒径が２０から２００ｎｍであることが特に好ましい。粒径は電子顕微鏡観察や動的光散乱法に基づく粒径測定法により測定することができる。
【００２３】
（造影剤）
本実施形態に係る脂質粒子はシリコンナフタロシアニンを内包し、近赤外光を吸収して音響波を発するため、光音響イメージング用の造影剤として用いることができる。また、本実施形態に係る脂質粒子は深緑色に着色しているため、目視で検出するための造影剤としても使用できる。
【００２４】
ここで、本明細書において「造影剤」とは、主に、検体内にあって観察したい組織や分子とその周囲の組織や分子とのコントラスト差を生じさせ、当該観察したい組織や分子の形態情報あるいは位置情報の検出感度を向上させることができる物質と定義する。「光音響イメージング」とは、上記の組織や分子を光音響信号検出機装置などによって、イメージングすることを意味する。
【００２５】
本実施形態に係る脂質粒子を主成分とする造影剤は、薬理上許容できる添加物を有していても良い。薬理上許容できる添加物の例としてショ糖やグルコースなどの糖類あるいはグリセリンあるいはプロピレングリコールなどの多価アルコールなどの等張化剤やｐＨ調整剤、安定化剤などが挙げられる。添加物は生体内に投与する前に当該造影剤と任意の添加物を混合して使用することができる。
【００２６】
本実施形態に係る脂質粒子を主成分とする造影剤を用いたイメージング方法は、当該造影剤を被験体に投与する工程と、前記造影剤を標的組織に蓄積させる工程と、前記標的組織に存在する前記造影剤を検出する工程と、を有する。前記造影剤を検出する方法は、肉眼での直接観察法や、近赤外蛍光法や光音響法などが挙げられる。
【００２７】
本実施形態に係る光音響イメージング方法の一例は以下の通りである。すなわち、本実施形態に係る脂質粒子を主成分とする造影剤を検体に投与する。なお、検体とは、ヒトあるいはそれ以外の実験動物やペット等の哺乳類、その他、特に限定されない。当該造影剤の投与後、前記検体等に対し近赤外波長領域のレーザーパルス光を照射する。次に、当該造影剤からの光音響信号（音響波）を音響波検出器、例えば圧電トランスデューサーで検出し、電気信号に変換する。この音響波検出器より得られた電気信号に基づき、前記検体等の中の吸収体の位置や大きさ、あるいは光吸光係数などの光学特性値分布を計算することができる。本実施形態に係る脂質粒子を主成分とする造影剤の好ましい用途の一例は、腫瘍を検出することである。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例で本実施形態における脂質粒子作製の際に用いる具体的な試薬や反応条件等を挙げているが、これらの試薬や反応条件等は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００２９】
（回収方法）
遠心分離操作は、微量高速冷却遠心機（株式会社トミー精工製、ＭＸ−３００）を用いて行った。
【００３０】
（分析方法）
粒径測定は、動的光散乱解析装置（大塚電子製、ＥＬＳＺ−２）を用いて行った。
光源として半導体レーザーを用いて測定を行い、キュムラント径の値を粒径として採用した。
吸光度測定は、ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ測定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、  Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ  ４０）を用いて行った。
【００３１】
（色素含有量の算出方法）
粒子分散液の色素定量を行い、分散液中に含まれる色素量を算出した。・・・（ア）
粒子分散液を凍結乾燥することにより、分散液中に含まれる固体成分の重量を算出した。・・・（イ）
（ア）で求めた色素量を（イ）で求めた固体成分の重量で除することにより、色素含有量を算出した。
【００３２】
（吸収係数比率の算出）
波長ａにおける吸収係数Ａ’と波長ｂにおける吸収係数Ｂ’と６００ｎｍにおける吸収係数Ｃを吸光度測定より求めた。吸収係数の比率は、ベースライン補正をするため、吸収係数Ａ’から吸収係数Ｃを引いた吸収係数Ａを吸収係数Ｂ’から吸収係数Ｃを引いた吸収係数Ｂで除することにより算出した。
【００３３】
（光音響信号強度の測定方法）
光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光を超純水中に設置したサンプル容器に照射し、容器内のサンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７８０ｎｍ、エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）を用いた。測定容器は、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μＬであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ  ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。
【００３４】
（１００ｎｍ換算粒子当たりの光音響信号強度の算出）
粒子分散液を凍結乾燥することにより、分散液中に含まれる固体成分の重量濃度を算出した。・・・（ア）
各構成材料の密度を１（ｇ／ｃｍ３）と仮定し、各粒子の粒径から１粒子当たりの重量を算出した。・・・（イ）
（ア）で求めた重量濃度を（イ）で求めた１粒子当たりの重量で除算して、粒子分散液中の粒子濃度を算出した。・・・（ウ）
光音響信号測定の結果と、（ウ）の結果より、粒子当たりの光音響信号強度を算出した。その後、同一組成で１００ｎｍ粒子が存在した場合に、それぞれの値は、体積比に応じて比例すると仮定して、算出した。
【００３５】
（実施例１−１）
（シリコンナフタロシアニンを含有する脂質粒子の調製１）
ＤＳＰＣ  ６１．２ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ  ２０．４ｍｇ、コレステロール２０．４ｍｇをクロロホルム１ｍＬに溶解した。シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（以下、化合物１と略すことがある）  １３ｍｇをクロロホルム０．３１２５ｍＬに溶解した（この溶液を以下、化合物１溶液と略すことがある）。上記した、ＤＳＰＣ等を溶解したクロロホルム溶液１ｍＬと化合物１溶液全量をナス型フラスコに入れ混合し、４０℃で溶媒を減圧留去（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２０５、ビュッヒ製）した後、真空乾燥（Ｖａｃｕｕｍ  ｏｖｅｎ  ＶＯＳ−３０１ＳＤ、ＥＹＥＬＡ製）を一晩行った。得られた脂質と化合物１の乾固物に対して、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．３）（以後ＨＥＰＥＳ溶液と呼ぶ）を２．５ｍＬ添加し、６０℃で超音波照射（３周波超音波洗浄器  ＶＳ−１００III、アズワン）を３０分間行った。その後、ＨＥＰＥＳ溶液で希釈後、０．４５μｍフィルターろ過したものを室温で２００００×ｇ、１５分間遠心し、沈殿物と上清を回収した。表１に示したように化合物１量、化合物１溶液量を変えて４種類（８サンプル）の脂質粒子を作製した。各サンプル名、粒径、色素含有率、波長ａ、波長ｂ、吸収係数比率、１００ｎｍ換算粒子当たりの光音響信号も表１に示した。
【００３６】
【表１】
2015028001.tif 000003
【００３７】
（実施例１−２）
（色素含有率と吸収係数比率の関係）
実施例１で得られた脂質粒子の色素含有率と吸収係数比率の関係を図１に示した。図１に示した通り、色素含有率が高い粒子では、吸収係数比率が低い。非特許文献１に記載のリポソームの吸収係数比率は約７．３であり、実施例１で得られた脂質粒子は非特許文献１に記載のリポソームよりも色素含有率が向上していると考えられる。
【００３８】
（実施例１−３）
（色素含有率と粒子当たりの光音響信号との関係）
実施例１で得られた脂質粒子の色素含有率と粒子当たりの光音響信号の関係を図２に示した。
図２に示した通り、色素含有率が上がると粒子当たりの光音響信号が向上することが分かった。
以上より、吸収係数比率が小さい本実施例の脂質粒子内の色素含有率が高く、さらに、吸収係数が２．５以下では、色素含有率が高く、かつ、光音響信号が、いずれも１．０Ｅ＋１０以上と非常に高いことが示された。
【００３９】
（実施例２−１)
（シリコンナフタロシアニンを含有する脂質粒子の調製２）
ＤＳＰＣ  ６１．２ｍｇ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ  ２０．４ｍｇ、コレステロール１．７ｍｇをクロロホルム１ｍＬに溶解した。シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）（以下、化合物１と略すことがある）  １．３ｍｇをクロロホルム１ｍＬに溶解した（この溶液を以下、化合物１溶液と略すことがある）。上記した、ＤＳＰＣ等を溶解したクロロホルム溶液１ｍＬと化合物１溶液全量をナス型フラスコに入れ混合した。４０℃で溶媒を減圧留去（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２０５、ビュッヒ製）した後、真空乾燥（Ｖａｃｕｕｍ  ｏｖｅｎ  ＶＯＳ−３０１ＳＤ、ＥＹＥＬＡ製）を一晩行った。得られた脂質と化合物１の乾固物に対して、ＰＢＳ溶液を２．５ｍＬ添加し、６０℃で超音波照射（３周波超音波洗浄器  ＶＳ−１００III、アズワン）を３０分間行った。０．２２μｍフィルターろ過後、室温で２８８０００×ｇ、１７分間遠心し、沈殿物を回収し、脂質粒子２−１を得た。
【００４０】
（シリコンナフタロシアニンを含有する脂質粒子２−１の腫瘍集積性確認）
腫瘍集積性の確認においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。ｃｏｌｏｎ２６（マウス大腸癌細胞）を、マウスに皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２gであった。担癌させたマウスのマウス尾部に粒子分散液を、１００μＬ（色素として１３  ｎｍｏｌ）を静脈注射した。
次に粒子分散液を投与したマウスを投与２４時間後に安楽死させた後、ｃｏｌｏｎ２６腫瘍を摘出した。腫瘍組織をプラスチックチューブに移し、腫瘍組織の重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加し、ホモジネートした。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標） ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定し腫瘍組織中の色素量を定量した。
表２に脂質粒子２−１の粒径、色素含有率、波長ａ、波長ｂ、吸収係数比率、１００ｎｍ換算粒子当たりの光音響信号、腫瘍集積性を示す。
【００４１】
【表２】
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得られた粒子は、１００ｎｍ換算粒子当たりの光音響信号が高く、かつ、腫瘍集積性が高いことが示された。
【図１】
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【図２】
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