(57)【要約】【課題】化学物質を高感度かつリアルタイムな検出を小型で簡単な構成で実現する。【解決手段】化学物質受容体１０２と、Ｇタンパク質１０３と、アデニル酸シクラーゼ１０４と、微小間隙１０７とを備え、化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合することにより産生されるｃＡＭＰが微小間隙１０７に送られ、前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するときに、微小間隙１０７を流れるトンネル電流が変化する。前記トンネル電流を検出することにより、化学物質１０５を高感度に検出することが可能となる。【選択図】図２
2015014531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質を検知または定量する方法であって、
脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小間隙を有しており、
前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、
前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰを有しており、
前記方法は、
検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、
前記微小間隙に前記ｃＡＭＰを輸送する工程、
前記微小間隙に前記ｃＡＭＰが通過するときに前記微小間隙で計測されるトンネル電流の大きさによって、前記ｃＡＭＰを検出する工程、および
前記ｃＡＭＰの濃度変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程
を有する、化学物質検出方法。
【請求項２】
前記化学物質受容体が、Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項１に記載の化学物質検出方法。
【請求項３】
前記化学物質受容体が、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体である、請求項２に記載の化学物質検出方法。
【請求項４】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質である、請求項１に記載の化学物質検出方法。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質のαサブユニットである、請求項４に記載の化学物質検出方法。
【請求項６】
前記微小間隙が、ナノサイズの間隙を有するナノギャップである、請求項１に記載の化学物質検出方法。
【請求項７】
前記微小間隙が、ナノポアである、請求項６に記載の化学物質検出方法。
【請求項８】
化学物質を検知または定量する方法であって、
脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小間隙を有しており、
前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、
前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰを有しており、
前記方法は、
検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、
前記微小間隙に前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰを輸送する工程、
前記微小間隙に前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰが通過するときに前記微小間隙で計測されるトンネル電流の大きさによって、前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰとを区別して検出する工程、および
前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰの濃度変化に基づいて、前記化学物質を検知または定量する工程
を有する、化学物質検出方法。
【請求項９】
前記化学物質受容体が、Ｇタンパク質を活性化するＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項８に記載の化学物質検出方法。
【請求項１０】
前記化学物質受容体が、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体である、請求項９に記載の化学物質検出方法。
【請求項１１】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質である、請求項８に記載の化学物質検出方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｓタンパク質のαサブユニットである、請求項１１に記載の化学物質検出方法。
【請求項１３】
前記微小間隙が、ナノサイズの間隙を有するナノギャップである、請求項８に記載の化学物質検出方法。
【請求項１４】
前記微小間隙が、ナノポアである、請求項１３に記載の化学物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高感度かつリアルタイムで化学物質検出する簡便な方法を提供することに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高感度でかつ特異性の高い化学物質センサを作成するためには、生体に存在する化学物質受容体を利用するのが効率的な方法である。生体由来の受容体を利用した化学物質検出方法としては、目的の受容体と関連して動作する膜タンパク質を分子生物学的手法によって細胞に発現させ、受容体と膜タンパク質との間に発生する内因性シグナルパスウエーを利用して、化学物質を検出するというものがあった（たとえば、非特許文献１）。
【０００３】
図１に示すように、生体の細胞膜２０１には、（１）化学物質受容体（レセプター）１０２、細胞内側（図１では脂質二重膜１０１の下側）に（２）Ｇタンパク質１０３、（３）アデニル酸シクラーゼ１０４が存在する。例えば、神経伝達物質などの化学物質１０５が、化学物質受容体１０２の細胞外側（図１では細胞膜２０１の上側）に結合すると、化学物質受容体１０２の近傍にあるＧタンパク質１０３が活性化する。Ｇタンパク質１０３が活性化すると、その近傍に存在するアデニル酸シクラーゼ１０４を活性化させる。アデニル酸シクラーゼが活性化すると、細胞内に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を脱リン酸化し、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を産生する。
【０００４】
非特許文献１では、ｃＡＭＰと特異的に結合し、ホタル由来の発光するタンパク質であるルシフェラーゼを改変して作成されたｃＡＭＰ結合型発光タンパク質２０２を予め細胞内に発現させておき、さらに基質であるルシフェリン２０３を与えておくと、化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合したことによって産生されるｃＡＭＰが、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質２０２の形状変化を引き起こし、ルシフェリン２０３と結合して発光する。この現象を利用すれば、化学物質受容体１０２に結合する前記化学物質１０５の結合量を、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質２０２の光量変化として検出可能であることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２２８１８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆａｎ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｏｖｅｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ３，  ３４６−５１  （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に開示されている化学物質検出方法は、ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質から発生される微弱な光量を高感度に検出する必要があり、冷却ＣＣＤなど大型の超高感度検出計が必要となる。また、Ｓ／Ｎを向上させるためには迷光の除去などが必要となり、装置が大型かつ複雑になってしまうという課題を有していた。
【０００８】
本発明は、従来の課題を解決するもので、高感度で小型かつ簡単な構成で検出することができる化学物質検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明の化学物質検出方法は、化学物質を検知または定量する方法であって、脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小間隙を有しており、前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰを有しており、前記方法は、検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、前記微小間隙に前記ｃＡＭＰを輸送する工程、前記微小間隙に前記ｃＡＭＰが通過するときに前記微小間隙で計測されるトンネル電流の大きさによって、前記ｃＡＭＰを検出する工程、前記ｃＡＭＰの濃度変化にづいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する。
【００１０】
前記化学物質受容体は、Ｇタンパク質を活性化させるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であることが好ましく、さらには、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体であることがより好ましい。
【００１１】
前記Ｇタンパク質は、Ｇｓタンパク質であることが好ましく、さらにはＧｓタンパク質のαサブユニットであることがより好ましい。
【００１２】
前記微小間隙は、ナノサイズの間隙を有するナノギャップであることが好ましく、さらにはナノポアであることがより好ましい。
【００１３】
また、本発明は、化学物質を検知または定量する方法であって、脂質二重膜と前記脂質二重膜の裏側に微小間隙を有しており、前記脂質二重膜には、化学物質受容体と、Ｇタンパク質と、アデニル酸シクラーゼとを具備しており、前記脂質二重膜は、裏側にＡＴＰを有しており、前記方法は、検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体が前記Ｇタンパク質と前記アデニル酸シクラーゼを活性化させ、前記ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰに変化する工程、前記微小間隙に前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰを輸送する工程、前記微小間隙に前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰが通過するときに前記微小間隙で計測されるトンネル電流の大きさによって、前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰとを区別して測定する工程、前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰの濃度変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程を有する。
【００１４】
前記化学物質受容体は、Ｇタンパク質を活性化させるＧタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）であることが好ましく、さらには、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、味覚受容体、嗅覚受容体またはフェロモン受容体であることがより好ましい。
【００１５】
前記Ｇタンパク質は、Ｇｓタンパク質であることが好ましく、さらにはＧｓタンパク質のαサブユニットであることがより好ましい。
【００１６】
前記微小間隙は、ナノサイズの間隙を有するナノギャップであることが好ましく、さらにはナノポアであることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の化学物質検出方法によれば、目的の化学物質を高感度、かつ、高精度に検出するだけでなく、小型で簡便な構成で実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】従来の化学物質検出方法の概念図。
【図２】本発明の実施の形態１における化学物質検出方法の構成図。
【図３】（ａ）および（ｂ）は、本発明の実施の形態１における化学物質検出デバイスの構成図。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施の形態１における、化学物質の存在における微小間隙で検出されるトンネル電流の変化を示すグラフとその解析結果を示す図。
【図５】本発明の実施の形態２における化学物質検出方法の構成図。
【図６】（ａ）〜（ｄ）本発明の実施の形態２における、化学物質の存在における微小間隙で検出されるトンネル電流の変化を示すグラフとその解析結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２０】
（実施の形態１）
図２は、本発明の実施の形態１における化学物質検出方法の構成図である。図２において、図１と同じ構成要素については同じ符号を用い、説明を省略する。
【００２１】
図２において、脂質二重膜１０１は人工的に脂質から構成されたものが脂質保持層１０６に保持されている。化学物質受容体１０２、Ｇタンパク質１０３、および、アデニル酸シクラーゼ１０４が発現している細胞の細胞膜２０１を、脂質二重膜１０１へ融合させることによって、化学物質受容体１０２、Ｇタンパク質１０３、および、アデニル酸シクラーゼ１０４が脂質二重膜１０１に保持されている。脂質保持層１０６に保持されている脂質二重膜１０１の下側に微小間隙１０７が設置されており、脂質二重膜１０１と微小間隙１０７の間には電解液が満たされている。微小間隙１０７は、ｃＡＭＰが通過できる程度の大きさを持っており、前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するように電界が印加されている。微小間隙１０７を横断する方向（図２に示す微小間隙の左右方向）に流れるトンネル電流を測定するために、計測器が接続されている（実施の形態１の構成）。
【００２２】
かかる構成によれば、化学物質１０５が前記化学物質受容体１０１に結合することによって産生されたＡＭＰが、微小間隙１０７近傍に送られ、微小間隙１０７を通過する。そのとき、微小間隙１０７を横断する方向に流れるトンネル電流の大きさが変化する。その結果、前記ｃＡＭＰの変化量が測定されることとなり、簡単な構成で化学物質１０５を検出することができる。
【００２３】
なお、本実施の形態において、脂質二重膜１０１として人工的に脂質より構成したが、生体の細胞膜の一部を切り取って脂質保持層１０６に取り付けても良い。
【００２４】
なお、本実施の形態において、化学物質受容体１０２、Ｇタンパク質１０３、および、アデニル酸シクラーゼ１０４はそれらが発現している細胞の細胞膜２０１を脂質二重膜１０１に融合させたが、人工的に合成して脂質二重膜１０１に保持させても良い。
【００２５】
なお、本実施の形態において、前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するように電界を印加したが、圧力や重力、磁力になどによって、前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するようにしても良い。
【００２６】
（実施の形態２）
図５は、本発明の実施の形態２の化学物質検出方法の構成図である。図２との相違点は、微小間隙１０７によって検出する物質が前記ｃＡＭＰだけでなくＡＴＰも対象とし、前記ｃＡＭＰと前記ＡＴＰが微小間隙１０７を通過するときに、微小間隙１０７を横断する方向に流れている電流の変化を区別して検出するところである。
【００２７】
図５において、脂質二重膜１０１と微小間隙１０７の間には電解液が満たされており、その中にＡＴＰも混入されている。化学物質１０５が化学物質受容体１０２に結合すると、図２で説明したと同様のシグナルパスウエーが活性化され、前記ＡＴＰの脱リン酸化によって前記ｃＡＭＰが産生される。前記ＡＴＰおよび前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するように電界が印加されており、微小間隙１０７を横断する方向（図２に示す微小間隙の左右方向）に流れるトンネル電流を測定するために、計測器が接続されている（実施の形態２の構成）。
【００２８】
かかる構成によれば、微小間隙１０７近傍に送られた前記ＡＴＰと前記ｃＡＴＰが微小間隙１０７を通過するとき、微小間隙１０７を横断する方向に流れるトンネル電流が検出される。このとき、前記ＡＴＰと前記ｃＡＭＰの間で検出されるトンネル電流の大きさが異なるため、それぞれを区別して測定される。その結果、前記ｃＡＭＰと前記ＡＴＰの変化量が測定されることとなり、簡単な構成で化学物質１０５を検出することができる。
【００２９】
なお、本実施の形態において、前記ＡＴＰおよび前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するように電界を印加したが、圧力や重力、磁力になどによって、前記ＡＴＰおよび前記ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過するようにしても良い。
【実施例１】
【００３０】
次に、本発明の実施の形態１について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３１】
（化学物質受容体発現細胞の作製とプロテオリポソームの作製）
化学物質受容体、Ｇタンパク質を株化細胞の細胞膜表面（脂質二重膜）に共発現させる方法については、特許文献１などに詳細に開示されている。ここでは、特許文献１と同様に化学物質受容体としてβ１アドレナリン受容体を、Ｇタンパク質としてＧｓαタンパク質を発現させた。
【００３２】
それぞれの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅し、それをクローニングする。そして、それぞれの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを調製した。次に、２種類の発現プラスミドをベクターとして株化細胞（ＨＥＫ２９３）内へ導入することにより、株化細胞表面の脂質二重膜に、２種類の膜タンパク質を共発現させた。
【００３３】
株化細胞の１つであるＨＥＫ２９３細胞に、発現プラスミド２種類を導入し、化学物質受容体、およびＧタンパク質を共発現させた。また、アデニル酸シクラーゼはＨＥＫ２９３細胞が初めから保有しているため、必要な膜タンパク質群はＨＥＫ２９３細胞の細胞膜上に上記の方法で用意される。
【００３４】
人工的に作製した脂質二重膜へＨＥＫ２９３細胞の細胞膜の一部を融合することによって、膜タンパク質群を脂質二重膜上に移植する。そのために、ＨＥＫ２９３細胞よりプロテオリポソームを作製した。膜タンパク質を発現させたＨＥＫ２９３細胞を、超音波破砕装置によって破砕した。５秒破砕、５秒休止の繰り返しを１０分間氷上で行ったところ、直径５０〜１５０ｎｍの大きさのプロテオリポソームが得られた。このプロテオリポソームは、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜の一部から構成されるリポソームで、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜に存在していた膜タンパク質を有するリポソームである。
【００３５】
（化学物質検出デバイスの作製）
図３（ａ）に本発明の実施の形態である化学物質検出デバイスの構成図を示す。化学物質検出デバイスは３つのチャンバーから構成されており、第一のチャンバー１１１と第二のチャンバー１１２の間に脂質保持層１０６が設置されている。また、第二のチャンバー１１２と第三のチャンバー１１３の間に微小間隙１０７が設置されている。第一のチャンバー１１１と、第二のチャンバー１１２、および、第三のチャンバー１１３には電解液１１４が満たされている。
【００３６】
脂質保持層１０６は、厚さ０．１ｍｍのテフロン（登録商標）の板を用い、人工の脂質二重膜を形成するために中央に直径０．１ｍｍの孔があけられている。脂質二重膜１０１は、脂質溶液を用いて直径０．１ｍｍの孔にハケ塗り法により形成した。脂質溶液は、デカンを溶媒とし、ホスファチジルセリンとホスファチジルコリンが１：１になるように混合させ、脂質濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるように作製したものを用いた。
【００３７】
ＨＥＫ２９３細胞を破砕して作製されたプロテオリポソームを、脂質保持層１０６に作製した脂質二重膜１０１近傍に近づけて接触させると、前記プロテオリポソームと脂質二重膜１０１とが融合する。このような融合を繰り返し行うことによって、化学物質受容体、Ｇタンパク質、そして、アデニル酸シクラーゼといった膜タンパク質群が保持された脂質二重膜１０１が形成される。
【００３８】
微小間隙１０７の上下に設置されている第二のチャンバー１１２と第三のチャンバー１１３には、電気泳動回路１２１が備え付けられており、微小間隙１０７を上下に通過するように電界を与えることができる。この電界によって、脂質二重膜１０１で産生されたｃＡＭＰを微小間隙１０７に輸送することができる。微小間隙１０７を横断する方向に流れるトンネル電流は、計測部１２２によって計測することができる。よって、ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過すると、トンネル電流の大きさの変化として検出することが可能である。
【００３９】
微小間隙１０７は、図３（ｂ）に示すような構造を有する基板の一部分に存在する。シリコン基板１１５の両端から一対対の電極１１６がパターニングしてあり、その中央部にはナノサイズの間隙であるナノギャップが形成されている。そのナノギャップの部分が微小間隙１０７である。なお、電極１１６の上部あるいは下部には絶縁層が形成されており、微小間隙１０７を横断する方向しか電流を計測することができない構造になっている。一対の電極１１６の両端には計測部１２２が接続されており、微小間隙１０７を流れるトンネル電流を計測することができる。
【００４０】
（化学物質の検出）
図４（ａ）にｃＡＭＰが微小間隙を通過したときに検出されるトンネル電流の波形を示す。ここでは、ｃＡＭＰを混入した電解液をナノギャップ電極に流して得られたトンネル電流の波形を示している。ｃＡＭＰがナノギャップを通過すると、パルス状の波形が出現した。
【００４１】
化学物質が投与されると、脂質二重膜に存在する膜タンパク質群でｃＡＭＰが産生される。そのｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過すると、パルス状の電流波形が検出される。微小間隙１０７はｃＡＭＰとほぼ同じ大きさで設計されているため、ｃＡＭＰが１分子ずつしか通過できない。そのため、ｃＡＭＰが１分子ずつ微小間隙１０７を通過したときに、１つのパルス状の電流波形が発生すると考えられる。よって、パルス状の電流波形の頻度を検出することによって、産生されたｃＡＭＰを検知また定量することができる。
【００４２】
図４（ｂ）には、化学物質（イソプロテレノール）が投与される前のトンネル電流に見られるパルス波形の頻度を示している。縦軸に頻度、横軸にパルス波形の大きさを示している。図４（ｃ）には、化学物質（イソプロテレノール）が投与された後のトンネル電流に見られるパルス波形の頻度を示している。化学物質が投与された結果、ｃＡＭＰが多く産生され、その結果、ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過したときに発生するパルス状の波形の頻度が増加する。トンネル電流に現れるパルス状の波形の頻度について、化学物質投与前（図４（ｂ））と投与後（図４（ｃ））を比較することにより、投与された化学物質の検出と定量が可能である。
【００４３】
以上のように、化学物質が化学物質受容体に結合すると、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼが活性し、ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰが産生される。産生されたｃＡＭＰは微小間隙へ輸送され、微小間隙を通過する。このとき、微小間隙で計測されていたトンネル電流に、パルス状の波形変化が発生する。パルス状の波形の頻度を算出することによって、化学物質の検出と定量が可能となる。
【実施例２】
【００４４】
次に、本発明の実施の形態２について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、化学物質受容体発現細胞の作製、プロテオリポソームの作製、および、化学物質検出デバイスの作製については実施例１と同じ要領で作製した。
【００４５】
（化学物質の検出）
図６（ａ）および（ｂ）に、ＡＴＰおよびｃＡＭＰが微小間隙を通過したときに検出されるトンネル電流の波形を示す。図６（ａ）では、ＡＴＰだけを混入した電解液をナノギャップ電極に流して得られたトンネル電流の波形を示している。一方、図６（ｂ）では、ｃＡＭＰだけを混入した電解液を名のギャップ電極に流して得られたトンネル電流の波形を示している。いずれの場合も、パルス状の波形を観察することができた。図６（ａ）と図６（ｂ）で観察されたパルス状の波形の大きさを比較すると、ＡＴＰ由来の波形の方が、ｃＡＭＰ由来の波形よりも大きくなることがわかる。このことから、トンネル電流に見られるパルス状の波形の大きさによって、ＡＴＰ由来の波形か、ｃＡＭＰ由来の波形かを区別できる。
【００４６】
化学物質が投与されると、脂質二重膜に存在する膜タンパク質群でＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰが産生される。もともと存在するＡＴＰと産生されたｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過すると、パルス状の電流波形が検出される。図６（ａ）および（ｂ）で示したとおり、ＡＴＰおよびｃＡＭＰが通過したときに発生するパルス状の電流波形の大きさは、通過する物体の大きさと微小間隙との大きさの関係と関連があるため、ＡＴＰの通過とｃＡＭＰの通過を区別してその頻度を検出することが可能である。
【００４７】
図６（ｃ）には、化学物質が投与される前のトンネル電流に見られるパルス波形の頻度を示している。縦軸に頻度、横軸にパルス波形の大きさを示す。図４（ｄ）には、化学物質が投与された後のトンネル電流に見られるパルス波形の頻度を示している。化学物質が投与された結果、ｃＡＭＰが産生され、その結果、ｃＡＭＰが微小間隙１０７を通過したときに発生するパルス状の波形の頻度が増加する。一方、ＡＴＰは脱リン酸化されるため、ＡＴＰが微小間隙１０７を通過したときに発生するパルス状の波形の頻度は多少減少するが、十分量のＡＴＰが存在することからさほど変化が見られない。よって、トンネル電流に現れるｃＡＭＰ由来およびＡＴＰ由来のパルス状の波形の頻度を区別して検出することによって、より正確に化学物質投与前（図４（ｂ））と投与後（図４（ｃ））のｃＡＭＰの変化検出することが可能となり、投与された化学物質のより正確な検出と定量ができる。
【００４８】
以上のように、化学物質が化学物質受容体に結合すると、Ｇタンパク質およびアデニル酸シクラーゼが活性し、ＡＴＰが脱リン酸化してｃＡＭＰが産生される。ＡＴＰとｃＡＭＰは微小間隙へ輸送され、微小間隙を通過する。このとき、微小間隙で計測されていたトンネル電流で発生するパルス状の波形を大きさで区別することによって、正確にｃＡＭＰの変化を検出でき、化学物質の検出と定量が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明にかかる化学物質検出方法は、簡便な構成で高感度な検出能力を有し、環境ホルモンなどの化学物質センサ等として有用である。また薬品スクリーニング等の用途にも応用できる。
【符号の説明】
【００５０】
１０１  脂質二重膜
１０２  化学物質受容体
１０３  Ｇタンパク質
１０４  アデニル酸シクラーゼ
１０６  脂質膜保持層
１０７  微小間隙
２０１  細胞膜
２０２  ｃＡＭＰ結合型発光タンパク質
２０３  ルシフェリン
【図１】
2015014531.tif 000003
【図２】
2015014531.tif 000004
【図３】
2015014531.tif 000005
【図４】
2015014531.tif 000006
【図５】
2015014531.tif 000007
【図６】
2015014531.tif 000008