(57)【要約】【課題】コラーゲン産生促進作用に優れ、長期にわたる使用に十分に耐えうる安全性を備えた抗老化剤、肌キメ調整剤、皮膚しわ防止剤を提供し、これらを有効成分とした化粧品・医薬部外品、医薬品、飲食品を提供する。【解決手段】糖脂質型バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される構造を有するセロビオースリピッドを含有することを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
【化１】
2015007031.tif 000008
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１は炭素数が１２または１４を示す。また式Ｉ中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。） 
【化２】
2015007031.tif 000009
（式（ＩＩ）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またｎ１は炭素数１１あるいは１２のアルキレン基を表し、ｎ２は炭素数２または４のアルキレン基を表す。）
【請求項３】
請求項１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤を含む抗老化剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤を含む肌のキメ調整剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤を含む皮膚のしわ防止・抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントを有効成分とするコラーゲン産生促進剤に関するものであり、特にコラーゲン産生により抗老化、肌のキメの調整、皮膚のしわ防止・抑制に有効なバイオサーファクタントを含有する化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真皮はコラーゲンとエラスチンが絡み合い、その間を酸性ムコ多糖で埋められた構造をしており、これにより皮膚の弾力、ハリを与えられる。ところが、紫外線、乾燥、ストレスなどによる外的要因や加齢による細胞の衰えとともに、コラーゲンの代謝の恒常的なバランスが損なわれたり、変性したりすることによりシワ、たるみ、皮膚弾力性の低下が引き起こされる。
【０００３】
コラーゲンを産生促進する作用を有する物質としては、甘草葉抽出物、ハス胚芽抽出物、加水分解バレイショタンパク、柿の葉抽出物又はサンザシの果実抽出物、米糠溶媒抽出物、アヤメ科クロッカス属サフラン抽出物、ウリ科植物の種子抽出物などが知られており、これらの一部はコラーゲン産生促進剤として医薬部外品や化粧品への応用が試みられているが、作用効果が十分とは言えず、満足すべき作用効果を発揮するコラーゲン産生促進剤は得られていなかった。
【０００４】
糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、界面活性剤としての機能を持つ。生体中には各種の両親媒物質が存在し、様々な界面で物質、エネルギー、情報の交換に関与し、生態の秩序形成に大きな役割を果たしている。
【０００５】
これらの界面活性物質を効率良く生産する微生物の存在が知られている。この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、生分解に優れることから合成界面活性剤に比べ環境に対する負荷が少ない。また合成では容易に作り出せないような複雑な構造をしており、優れた生理機能を持つといわれている。例えば、糖脂質系のバイオサーファクタントは、それ自体の保湿効果が高いことが知られており、化粧品等の成分として用いることが期待されている。このような特異性を持つことからバイオサーファクタントの研究は、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等各方面で進められている。
【０００６】
現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。この内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母による多くの種類の物質が報告されている。 
【０００７】
近年糖脂質系バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドが、抗真菌活性を示すことが報告されて注目されている（非特許文献１）。セロビオースリピッドは、Ustilago maydis（ウスチラゴ メイディス）やCryptococcus humicola（クリプトコッカス フミコーラ）が生産することが知られている（非特許文献２）。また、Pseudozyma flocculosa（シュードザイマ フロキュローサ）もフロキュロシンというセロビオースリピッドの一種を生産することが知られている（非特許文献３）。さらに、ウスチラゴエスキュレンタ（Ustilago esculenta）はセロビオースリピッドを大量に生産できることが分かっている（特許文献１）。これらの微生物が生産するセロビオースリピッドは、すべて優れた抗真菌活性を示すため、抗真菌薬としての実用化が期待されている。
【０００８】
セロビオースリピッドは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、リポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献３参照）、タンパク質分離用担体（特許文献４参照）、低分子オルガノゲル（特許文献５参照）などの報告がある。
【０００９】
セロビオースリピッドは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しいため、特に、化粧品や医薬品の素材としての実用化が期待されている。しかし今現在セロビオースリピッドの生理活性機能は見出されておらず、効果や効能は報告されていない。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２５４５９５号公報
【特許文献２】特開２００６−０２８０６９号公報
【特許文献３】特開２００７−１８１７８９号公報
【特許文献４】特開２００６−２１９４５５号公報
【特許文献５】特開２０１２−１７６９０４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「J. Oleo Sci.」Vol.58, No.3, p133-140(2009)
【非特許文献２】「Biochim. Biophys. Acta」Vol.1558, No.2, p161-170(2002)
【非特許文献３】「Appl. Environ. Microbiol.」Vol.69, No.5, p2595-2602(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、細胞のコラーゲン産生促進剤として優れ、長期にわたる使用に十分に耐え得る安全性を備えた化合物を提供し、これらを有効成分とした化粧品・医薬部外品、医薬品、飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
【００１４】
１．セロビオースリピッドを含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
２．下記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される構造を有するセロビオースリピッドを含有することを特徴とする、１に記載のコラーゲン産生促進剤。
【化１】
2015007031.tif 000002
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１は炭素数が１２〜１４を示す。また式Ｉ中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。） 
【化２】
2015007031.tif 000003
（式（ＩＩ）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またｎ１は炭素数１１あるいは１２のアルキレン基を表し、ｎ２は炭素数２または４のアルキレン基を表す。）
３．１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤を含む抗老化剤。
４．１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤を含む肌のキメ調整剤。
５．１又は２に記載のコラーゲン産生促進剤を含む皮膚のしわ防止・抑制剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により安全性に優れたコラーゲン産生作用が期待でき、セロビオースリピッドを有効成分とした化粧品・医薬部外品（皮膚外用剤、浴用剤、育毛剤など）、医薬品、飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いたＣＬの細胞賦活作用を示すグラフである
【図２】正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いたＣＬのコラーゲン産生促進作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
〔コラーゲン産生促進〕
本明細書において「コラーゲン産生促進」とは、細胞により生産されるコラーゲンの生産量を増加させる効果のことである。表皮と真皮の境界部位は、コラーゲンＩＶ、ＶＩＩが表皮細胞の支持、接着などに関与する。加齢や紫外線によるダメージ、特に紫外線によってコラーゲンＩＶ、ＶＩＩが減少し、表皮、真皮支持機能が減少し、選別透過機能が弱化して有害な成分が容易に皮膚に影響を及ぼすため、シワが生成される。また真皮を構成する細胞外マトリックスは、真皮内の線維芽細胞から作られ、コラーゲン、エラスチンなどの繊維状のタンパク質とヒアルロン酸などの酸性ムコ多糖と呼ばれる多糖類で構成されており、皮膚の弾力性、代謝、生気などに直接関与している。線維芽細胞の活性が特に加齢や光老化より低下すると、コラーゲン生合成性が減少して変性されたエラスチンが増加する。さらに真皮の主成分であるコラーゲンＩ型を分解するマトリックスメタロプロテナーゼＭＭＰ−１の増加によってコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の分解が増加し、真皮内にキズが発生して、表皮−真皮の境界が破壊され、真皮の分解が加速化される。最終的には、皮膚の弾力性やみずみずしさ、生気が失われ、シワ、小ジワ、肌荒れが発生し皮膚の老化をもたらされる。このため「コラーゲン産生促進」の効果により抗老化作用が期待される。
【００１８】
〔セロビオースリピッド〕
セロビオースリピッドは、生物により生産される界面活性能力や乳化能力を有する糖脂質型バイオサーファクタントの一種である。「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力を有する物質の総称であり、優れた界面活性や、高い生分解性を示すばかりでなく、様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動・機能を発現する可能性がある。
【００１９】
セロビオースリピッド（以下、ＣＬということがある。）は構造に様々なバリエーションがあり、これらの分子構造の違いは生産微生物の相異に基づく。式（I）中、Ｒ１は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１が１２〜１４を示す。さらに式（I）中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。これらは混合体で得られるが、精製分離操作を行い単独のＣＬ化合物を使用してもよい。また水溶性を高めるため、アルカリ処理を施しナトリウム塩として使用してもよい。また式（II）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。ｎ１が１１〜１２を表し、ｎ２が２〜４を表す。これらは混合体で得られるが、精製分離操作を行い単独のＣＬ化合物を使用しても混合体のまま用いてもよい。また水溶性を高めるため、アルカリ処理を施しナトリウム塩として使用してもよい。 
【００２０】
〔セロビオースリピッドの製法〕
セロビオースリピッドは、セロビオースリピッド生産菌の培養液を抽出、精製することにより得られる。ＣＬ生産菌としては、例えば、クリプトコッカス（Cryptococcus属）やウスチラゴ（Ustilago）属に属し、かつセロビオースリピッドを生産する能力を有する微生物が挙げられる。クリプトコッカス （Cryptococcus）属微生物は主に上記構造式（I）のセロビオースリピッドを生産し、ウスチラゴ（Ustilago）属の微生物は主に構造式（II）のセロビオースリピッドを生産する。 
【００２１】
セロビオースリピッドの製造方法は特に制限されるものはないが、公知のバイオサーファクタント生産微生物を用いた発酵方法を任意に選択して行えばよい。例えばセロビオースリピッドの培養生産は、クリプトコッカス  フミコーラ（Cryptococcus  humicola）や、ウスチラゴ  エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を常法に従って培養することにより生産することができる。セロビオースリピッド生産微生物としては、上記以外にウスチラゴ・メイディス（Ustilago maydis）、シュードザイマ フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）、等を用いることができる。バイオサーファクタント生産微生物は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
セロビオースリピッドを生産するときの発酵培地は、酵母エキス、ペプトン等のＮ源、グルコース、フルクトース等のＣ源、および硝酸ナトリウム等の無機窒素源、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム７水塩等の無機塩類からなる一般的な組成の培地を用いることができる。
【００２３】
ｐＨや温度等の発酵条件や培養時間等は任意に設定でき、発酵後の培養液をそのまま本発明のバイオサーファクタントとして使用することが可能である。また、発酵後の培養液を必要に応じて濾過、遠心分離、抽出、精製、滅菌等の任意の操作を適宜加えることも可能であり、得られたエキスを希釈、濃縮、乾燥することもできる。
【００２４】
無機窒素源としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安等が挙げられる。
【００２５】
セロビオースリピッドの回収、精製方法には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、培養液を遠心分離して油分を回収し、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出濃縮することにより回収することができる。
【００２６】
抽出溶媒としては、水、アルコール類、ケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、エステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独であるいは２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができ、また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
【００２７】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点の範囲であればよく、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすればよい。多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要であれば、その効力に影響のない範囲でさらに脱臭、脱色などの精製処理を加えてもよい。脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラムなどを用いればよく、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えばよい。必要に応じて、シリカゲルカラムを用いて精製することにより、純度の高いセロビオースリピッドを得ることができる。  
【００２８】
上述のようにして得られるセロビオースリピッドは、そのままコラーゲン産生促進剤として利用することも可能であるが、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品に配合して利用することが好ましい。セロビオースリピッドを配合する濃度は、吸収程度、作用程度、製品形態、使用頻度などによって適宜選択され、特に限定されるものではないが、通常は０．０００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．０００１重量％〜０．０１重量％、より好ましくは０．００１重量％〜０．０１重量％である。
【００２９】
ここで、コラーゲン産生促進剤に配合するセロビオースリピッドの使用形態は任意である。例えば、セロビオースリピッドを培養液からの抽出物のまま、あるいは精製した高純度品できる。セロビオースリピッドは疎水性が高いため、非イオン性の界面活性剤や低級アルコール、多価アルコールに溶解して用いることが好ましい。または、水に溶解しやすいセロビオースリピッドのナトリウム塩を用いてもよい。
【００３０】
［肌のキメ調整剤］
「肌のキメ」とは表皮の表面にあるくぼみ（皮溝）と盛り上がり（皮丘）でできた凹凸のことを指す。また「肌のキメ」が整っているとは、皮溝の幅が狭く皮丘が平らでそろっている状態をいい、皮溝の幅と間隔により決まる。それらは表皮の厚さと硬さ、細胞間基質の弾力などにより構成される。加齢または光老化とともにこの構成要素が不均一になるとキメの規則性が損なわれる。細胞間基質の弾力にはコラーゲンが関与している。本発明に係るコラーゲン産生促進剤の有効成分であるセロビオースリピッドを用いることによりコラーゲン産生能が活性化され、細胞間基質の弾力が改善され、キメが正常な状態に調整される。キメが整うことで、光の散乱効果が高まり皮膚のくすみが消え肌のトーンが明るくなるといった効果が得られる。
【００３１】
［皮膚のしわ防止・抑制剤］
「皮膚のしわ防止・抑制」とは加齢や光老化に伴うしわ形成を阻止する効果を指す。本発明に係るセロビオースリピッドを用いることにより細胞のコラーゲン産生能が促進されることによりしわの防止、抑制される。しわの発生は、紫外線の照射に伴い真皮細胞がダメージを受けたり、加齢による影響で、エラスチンやコラーゲンで構成される真皮の構造が壊れたり、それらの産生が低下することに起因する。
［本発明の使用形態］
【００３２】
上述のように、本発明に係るコラーゲン産生促進剤は、有効成分であるバイオサーファクタントを化粧品、医薬部外品、医薬品、食品に配合して組成物の形態で実施することが好ましい。
【００３３】
化粧品、医薬部外品、医薬品の形態で実施する場合、外用剤とすることが好適である。ただし、バイオサーファクタントは経口摂取も可能であるため、外用剤に限定されず、内用剤、飲食品としてもよい。
【００３４】
剤形は限定されず、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、丸剤、錠剤、固形剤、液剤、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート、ムース、浴用剤など多様なものとすることができる。
【００３５】
化粧品、医薬部外品、医薬品としては、例えば内用・外用薬用製剤、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料などの頭髪化粧料、ファンデーション、白粉、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、眉墨、まつ毛などのメークアップ化粧料、美爪料などの仕上げ用化粧料、香水類、浴用剤、歯磨き類、口中清涼剤・含嗽剤、液臭・防臭防止剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュなどが挙げられる。
【００３６】
飲食品としては、例えば清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、種々の形態の健康・栄養補助食品、保健機能食品、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチなどが挙げられる。
【００３７】
本発明に係るコラーゲン産生促進剤はヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が期待できる限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００３８】
本発明に係るコラーゲン産生促進剤は、有効成分であるセロビオースリピッドに加え、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品に使用される成分や添加剤を併用して配合することができる。
【００３９】
例えば、油脂類、ロウ類、鉱物油、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、金属セッケン類、ガム質および水溶性高分子化合物類、界面活性剤類、ビタミン類、アミノ酸類、美白剤、保湿剤、育毛剤、動物あるいは植物、生薬の抽出物やエキス、微生物培養代謝物、α−ヒドロキシ酸類、無機顔料、紫外線吸収剤、収斂剤、抗酸化剤、抗炎症剤、殺菌・消毒薬、頭髪用剤、香料、色素・着色剤、甘味料、栄養強化剤、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物性蛋白質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖蛋白質およびその分解物、血流促進剤、消炎剤・抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、苦味料、調味料、酵素などが挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［ 実施例１：クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）を用いたセロビオースリピッド（ＣＬ）製造］
種菌培養はCryptococcus humicola NBRC 10251のコロニーを種培地(５０ｍＬ/５００ｍＬ坂口フラスコ)に1 Ｌｏｏｐ植菌して実施した。２７ ℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は１０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．０３ｇ／Ｌリン酸二水素ナトリウム  ０．１ｇ／Ｌ  酵母エキスとした。.培養は上記種菌 ６０ｍLを生産培地６Ｌ（１０Ｌ-ｊａｒ）に植菌し、２７ ℃、５３０ｒｐｍ（攪拌回転）、３Ｌ/ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で１０Ｌ-jarを用いて培養した。生産培地組成は、１０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．０３ｇ／Ｌリン酸二水素ナトリウム  ０．１ｇ／Ｌ  酵母エキスとした。６日間培養した培養液を遠心分離 (７５００ｒｐｍ, ２０ｍｉｎ ) を行い、菌体と上清を分離した。菌体と等量の酢酸エチル : アセトン＝４：１を加え攪拌後、ＣＬ抽出を行った。沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで乾燥させ、粉末を得た。得られた粉末からさらに脂質不純物を取り除くため、ヘキサン(３００ｇ)を加え攪拌後、ガラスフィルターろ過とエバポレーションを行いヘキサン除去した。これにより、ＣＬの混合体を得た。
【００４２】
［実施例２：ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いたセロビオースリピッド（ＣＬ）製造］
種菌培養はUstilago esculenta NBRC 9887のコロニーを種培地 (５０ｍＬ/５００ｍＬ坂口フラスコ) に1 loop植菌して実施した。２７ ℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は５０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．２５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、８ｇ／Ｌ  酵母エキスとした。培養は上記種菌１００ｍＬを生産培地６L（１０Ｌ-ｊａｒ）に植菌し、２７ ℃、５３０ｒｐｍ（攪拌回転）、３Ｌ/ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で１０Ｌ-ｊａｒを用いて培養した。生産培地組成は、５０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．２５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、８ｇ／Ｌ酵母エキスとした。６日間培養した培養液を遠心分離 (７５００ｒｐｍ, ２０ｍｉｎ ) を行い、菌体と上清を分離した。菌体と等量の酢酸エチル : アセトン＝４：１を加え、十分攪拌後、ＣＬ抽出を行った。沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで乾燥させ、粉末を得た。得られた粉末からさらに脂質不純物を取り除くため、ヘキサン(３００ｇ)を加え、攪拌後、ガラスフィルターろ過とエバポレーションを行いヘキサン除去した。これにより、ＣＬの混合体を得た。
【００４３】
［実施例３：セロビオースリピッドのＮａ塩化］
実施例１又は２で得られたＣＬを４ｇに蒸留水２０ｍＬを添加して撹拌した。この溶液に１Ｎ ＮａＯＨを滴下し、ｐＨ７〜８になるように調製を行った。粉末化のため、エバポレーターで水分を除去後さらにエタノールを添加、乾燥させた。
【００４４】
［実施例４：セロビオースリピッドの構造解析］
クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）およびウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）それぞれから得られたＣＬの同定は、共鳴周波数５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲ測定（プロトン型核磁気共鳴分光測定）にて行った。測定装置はBRUKER社製 NMR装置AVANCE 500を用い、溶媒には重クロロホルム（CDCl3）および重メタノール（CD3OD）を用いた。その結果、これらの株から得られた粉末はすべてＣＬであることが判明した。化３、化４に一般式を示す。化３にクリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）由来のＣＬの主な構造を示し、化４にウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）から得られたＣＬの主な構造を示す。それぞれ代表的な構造について、重クロロホルムを用いた測定ではクロロホルムのピークを７．２４ｐｐｍ、重メタノールを用いた測定ではメタノールのメチルプロトンのピークを３．３０ｐｐｍとしたときの、帰属された化学シフトをまとめて表１、表２に示す。なお、表１は式（ＩＩＩ）において、ｎ１＝１４，Ｒ1＝ＯＨであり、表２は式（ＩＶ）においてｎ１＝１２、Ｒ１＝ＯＨ，Ｒ２＝ＯＨである。
【００４５】
【化３】
2015007031.tif 000004
（式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は、水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１は炭素数が１２または１４を示す。また式Ｉ中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。）
【００４６】
【化４】
2015007031.tif 000005
（式（ＩＶ）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またｎ１は炭素数１１あるいは１２のアルキレン基を表し、ｎ２は炭素数２または４のアルキレン基を表す。）
【００４７】
【表１】
2015007031.tif 000006
【００４８】
【表２】
2015007031.tif 000007
【００４９】
［実施例５：ヒト正常皮膚線維芽細胞を用いたセロビオースリピッドの細胞賦活化作用］
ヒト正常皮膚線維芽細胞を１ウェル当たり２．０×１０４個となるように４８穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地 (ＤＭＥＭ) に１０％のウシ胎児血清を添加したものを用いた。３７℃、二酸化炭素濃度５％中にて２４時間培養後、ＣＬ−Ｎａ塩を終濃度１００μｇ/ｍL〜1μｇ/ｍLとなるよう試験培地に添加し、さらに72時間培養した。
溶媒対照として、蒸留水を設けた。次いで生細胞数測定試薬ＳＦを２５μＬ添加して3時間培養し、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
【００５０】
評価結果を、蒸留水における細胞賦活作用を１００とした相対値にて図１に示した。
図１より、ＣＬ−Ｎａ塩を終濃度１００μｇ/ｍL〜1０μｇ/ｍL添加すると、ヒト正常皮膚線維芽細胞に対して、蒸留水よりも高い細胞賦活化作用を示した。特にＣＬを終濃度２５μｇ/ｍＬ添加した場合には、蒸留水よりも３０％以上の有意な細胞賦活化作用が認められた。この結果より、ＣＬが優れた細胞賦活化作用を有することが明らかとなった。
【００５１】
［実施例６  ＣＬ−Ｎａ塩によるコラーゲン産生能の評価 ］
実施例３に記載されているＣＬ−Ｎａ塩の粉末を蒸留水に溶解し、それぞれＣＬ−Ｎａ塩の終濃度が１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、および１μｇ／ｍＬであるセロビオースリピッド水溶液を用意して、正常ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生量の変化を評価した。コントロールとして蒸留水のみ用い、同じく評価した。評価は、以下の手順で行った。正常ヒト皮膚線維芽細胞を１ウェル当たり１．０×１０４個となるように４８穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１％のウシ胎児血清を添加したものを用いた。３７℃、二酸化炭素濃度５ｖｏｌ％中にて２４時間培養後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、任意の濃度の試料を添加した無血清培地に交換し、さらに３日間、６日間同条件にて培養した。培養上清から、ヒト線維芽細胞が産生するＩ型プロコラーゲンＣ末端ペプチド（Procollagen typeＩcarboxyterminal propeptide：ＰＩＰ）を、Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA Kit (TaKaRa)で測定した。コラーゲン産生促進率は、標準品を上記ＥＬＩＳＡキットにて測定し、その結果から検量線を作成、その検量線から試料添加時のコラーゲン産生量及び試料無添加時のコラーゲン産生量を求めた。
【００５２】
図２より、ＣＬ−Ｎａ塩を終濃度１００μｇ/ｍL〜1０μｇ/ｍL添加すると、ヒト正常皮膚線維芽細胞に対して、蒸留水よりも高いコラーゲン産生促進作用を示した。特にＣＬを終濃度５０μｇ/ｍＬ添加した場合には、蒸留水と比べて２６０％以上の有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。この結果より、ＣＬが優れたコラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００５３】
コラーゲンは線維芽細胞により産生される。しかし図１のＣＬによる線維芽細胞の賦活化活性が１００〜１３０％であるのに対し、図-２のＣＬによるコラーゲン産生率は１６０%〜２６０％と極めて高い値を示している。したがって本結果は、ＣＬによる線維芽細胞の賦活化能に伴いコラーゲン産生能が向上しただけではなく、ＣＬがコラーゲンの代謝系のいずれかの経路に作用することによりコラーゲン産生が促進していることが示唆するものである。
【００５４】
［実施例７：美容液の製造例］
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
クエン酸                                  ０．０１
クエン酸Ｎａ                              ０．０４
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．５
１．３．ブチレングリコール                ５．０
濃グリセリン                              ２．５
１．２．ペンタンジオール                  ２．０
フェノキシエタノール                      ０．２５
精製水                                    全体で１００となる量
【００５５】
［実施例８：乳液の製造例］
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
グリセルエーテル                          １．５
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．０１
ショ糖脂肪酸エステル                      １．５
モノステアリン酸ソルビタン                １．０
スクワラン                               ７．５
ジプロピレングリコール                    ５．０
精製水                                    全体で１００となる量
【００５６】
［実施例９：クリームの製造例］
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
ε−アミノカプロン酸                      ０．２
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                  ０．５
フェノキシエタノール                      ０．２
1，３−ブチレングリコール                ７．５
ＭＥＬ                                    ０．１
セタノール                                ２．５
ベヘニルアルコール                        ３．０
スクワラン                                ５．０
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル  １５．０
ペンタステアリン酸ポリグリセリル−10      ０．９５
ステアロイル乳酸Na                       ０．３
精製水                                    全体で１００となる量
【００５７】
［実施例１０：洗顔料の製造例］
以下に示す組成の洗顔料を常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
エデト酸ニナトリウム                      ０．０５
ε−アミノカプロン酸                      ０．２
濃グリセリン                              １．５
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                  ０．１５
1，３−ブチレングリコール                ４．５
２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン （30%水溶液）
３．０
N-ヤシ油脂肪酸アシル-DL-アラニントリエタノールアミン液 （30％水溶液）                            
３０．０
フェノキシエタノール                      ０．５
精製水                                    全体で１００となる量  
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、バイオサーファクタント由来の安全性に優れたコラーゲン産生促進作用、抗老化作用が期待でき、コラーゲン産生および抗老化成分を有効成分とした化粧品・医薬部外品（皮膚外用剤、浴用剤、育毛剤等）、飲食品、医薬品を提供することできることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
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【図２】
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