(57)【要約】【課題】  所望の観察領域を探すときなど、観察領域を移動しながら観察する際に、領域移動に追従性よく迅速に解析結果を表示することが可能となる分光顕微鏡装置を提供する。【解決手段】  出力波長が制御可能な光源と、光源から出力された光が照射される観察領域を有する顕微鏡部と、観察領域からの光を分光データとして検出する信号検出部と、を備える分光検出手段と、  観察領域を移動させる移動手段と、を有する分光顕微鏡装置であって、  分光検出手段と移動手段とを連動可能に制御する制御部を備え、  移動手段により観察領域を移動させて計測する該観察領域の移動時と、観察領域を固定して計測する該観察領域の移動停止時とで、  計測点の数による計測条件が異なる計測条件に切り替えられるように制御され、分光データを検出するように構成されている。【選択図】  図１
2015007620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
出力波長が制御可能な光源と、前記光源から出力された光が照射される観察領域を有する顕微鏡部と、前記観察領域からの光を分光データとして検出する信号検出部と、を備える分光検出手段と、
前記観察領域を移動させる移動手段と、
を有する分光顕微鏡装置であって、
前記分光検出手段と前記移動手段とを連動可能に制御する制御部を備え、
前記移動手段により前記観察領域を移動させて計測する該観察領域の移動時と、前記観察領域を固定して計測する該観察領域の移動停止時とで、
計測点の数による計測条件が異なる計測条件に切り替えられるように制御されることを特徴とする分光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記観察領域の移動停止時における前記計測点の数は、前記観察領域の移動時よりも多い数に設定されていることを特徴とする請求項１に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記分光検出手段によって検出された分光データを解析し、該解析した結果を分光画像として出力する解析手段を備えていることを特徴とする請求項１に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項４】
前記制御部により出力される分光画像は、前記光源から出力された光の少なくとも２つの波数による分光データを解析して得られた分光画像であることを特徴とする請求項３に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項５】
前記制御部により出力される分光画像を表示する表示手段を有することを特徴とする請求項３または請求項４に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項６】
前記分光検出手段は、非線形光学現象による信号を検出することが可能に構成されていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項７】
前記光源は、２つの異なる波長を出力する２つの光源からなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項８】
前記分光検出手段は、非線形ラマン散乱信号を検出することが可能に構成されていることを特徴とする請求項７に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項９】
前記観察領域は、１次元乃至３次元の観察領域のうちのいずれかの観察領域であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記観察領域の移動時と、前記観察領域を固定して計測する該観察領域の移動停止時とで、計測点の数による計測条件が異なる計測条件に切り替えられると共に、
同じ計測波数に対して複数回の計測を行って出力信号を積算したときの積算回数による計測条件が異なる計測条件に切り替えられることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１１】
前記観察領域の移動停止時における前記計測点の数は、前記観察領域の移動時よりも多い数に設定されると共に、
前記観察領域の移動停止時における積算回数は、前記観察領域の移動時よりも多い積算回数に設定されていることを特徴とする請求項１０に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記制御部は、前記解析手段と前記移動手段と連動可能に制御する構成を備え、
前記観察領域の移動停止時と前記観察領域の移動時とで、解析条件が切り替えられるように制御されることを特徴とする請求項２乃至１１のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記解析条件の切り替えにおいて、少なくとも前記観察領域の移動停止時には多変量解析が行われることを特徴とする請求項１２に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記切り替えられる解析条件は同種或いは異種の多変量解析手法から選択され、観察領域の移動時の解析結果を観察領域の固定時の解析に利用することを特徴とする請求項１２に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１５】
前記観察領域の移動時の計測結果に基いて前記観察領域の固定時の計測条件が設定されることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１６】
前記観察領域の移動時は、狭領域を順次移動しながら計測を行い、それらの領域の観察結果を試料上の観察位置関係を保持するように並べた広領域の画像としてプレビュー表示し、そのプレビュー表示した領域の中から、前記観察位置を固定して計測する対象の領域を選択することを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の分光顕微鏡装置。
【請求項１７】
前記制御手段、或いは、前記解析手段は、ＦＰＧＡまたはＡＳＩＣを用いた処理により行われるように構成されていることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の分光顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物の分光スペクトル画像を計測する分光顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、非線形光学現象を利用した分光顕微鏡が開発されており、生体内の物質分布を観察する手段としての応用が期待されている。これらの顕微鏡には、和収差発生、多光子吸収など様々な非線形光学現象が利用される。
【０００３】
また、分子の振動情報を取得する非線形ラマン分光顕微鏡が開発されている。
【０００４】
非線形ラマン散乱では、二波長のレーザー光を合焦して、レーザー光の周波数差が試料の分子振動の周波数と一致するとき、集光点において特異的に散乱が生じる現象を利用する。
【０００５】
これらの顕微鏡は、いずれもレーザー光等の極めて強い光を試料上に集光し、試料上の計測点を移動させながら散乱光を検出する、走査型光学顕微鏡である。
【０００６】
また、光の波長を変化させることにより分光スペクトルの空間分布を得る、分光顕微鏡とすることができる。
【０００７】
非線形ラマン分光顕微鏡として、コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡が知られているが、他の例として、非特許文献１には、高速に波長掃引しながら、ラマン散乱スペクトルの空間分布を高速に取得できる誘導ラマン分光顕微鏡が開示されている。
【０００８】
これら技術によれば、自発ラマン散乱技術を用いる場合に比べて格段に強い信号が得られるので、高速分光画像取得に有効である。
【０００９】
更に、非特許文献１では、ラマン散乱スペクトルに対して主成分分析等の多変量解析を行い、構成成分を区別する手法が示されている。これらの技術を用いれば、例えば無染色の生体組織に対して、構成する物質或いは細胞組織毎の情報を分離して表示することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−１９６８５３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ６，８４５−８５１，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記した従来の分光顕微鏡においては、つぎのような課題を有している。
【００１３】
すなわち、詳細なスペクトル分布を取得するためには、空間上の多数の計測点について、データを取得する必要があり、計測に多大な時間を要する。
【００１４】
そのため、所望の観察領域を探すときなど、観察領域を移動しながら観察する際に、領域移動に追従性よく迅速に解析結果を表示することが困難であるという課題があった。
【００１５】
本発明は、上記課題に鑑み、所望の観察領域を探すときなど、観察領域を移動しながら観察する際に、領域移動に追従性よく迅速に解析結果を表示することが可能となる分光顕微鏡装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の分光顕微鏡装置は、出力波長が制御可能な光源と、前記光源から出力された光が照射される観察領域を有する顕微鏡部と、前記観察領域からの光を分光データとして検出する信号検出部と、を備える分光検出手段と、
前記観察領域を移動させる移動手段と、
を有する分光顕微鏡装置であって、
前記分光検出手段と前記移動手段とを連動可能に制御する制御部を備え、
前記移動手段により前記観察領域を移動させて計測する該観察領域の移動時と、前記観察領域を固定して計測する該観察領域の移動停止時とで、
計測点の数による計測条件が異なる計測条件に切り替えられるように制御されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、所望の観察領域を探すときなど、観察領域を移動しながら観察する際に、領域移動に追従性よく迅速に解析結果を表示することが可能となる分光顕微鏡装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１の実施形態における分光顕微鏡装置の構成例を説明する模式図。
【図２】本発明の第１の実施形態における観察領域の移動時と停止時における計測条件の切り替えの関係を表す模式図。
【図３】本発明の第２の実施形態における誘導ラマン分光顕微鏡の構成例について説明する図であり、（ａ）は本発明の第２の実施形態に係る機能の概要を示すための模式図、（ｂ）は顕微鏡部をより詳細に示す模式図。
【図４】本発明の第４の実施形態における観察領域の３次元空間状の移動状態と計測点数の変更の関係を表す模式図。
【図５】本発明の第５の実施形態における観察領域の移動時と停止時における計測点数の変更の関係を表す模式図。
【図６】本発明の第９の実施形態のおける観察領域の移動及びプレビュー表示と固定観察領域の指定における計測測条件切り替えの関係を表わす模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
つぎに、本発明の分光顕微鏡装置におけるいくつかの実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態の構成によって何ら限定されるものではない。
【００２０】
（第１の実施形態）
第１の実施の形態として、本発明を適用した分光顕微鏡装置の構成例を、図１を用いて説明する。
【００２１】
本実施形態の分光顕微鏡装置は、図１に示すように、分光検出手段１、移動制御部（移動手段）２、制御ＰＣ６、出力表示部７、観察領域指示機構８を備える。分光検出手段１は、更に光源３と、顕微鏡部４、信号検出部５から構成される。また、光源３は、レーザー光源等であって、これらの光源には波長可変或いは波長選択が可能に構成された光源〔出力波長が制御可能な光源〕、等が含まれる。光源の種類は特に限定されず、ミリ波領域からＸ線領域の光源から選択することができる。
【００２２】
制御ＰＣ６は、計測波数情報と、試料上の計測位置情報を出力する。
【００２３】
光源は予め選択された波長の光を出力する。
【００２４】
また、顕微鏡部４に接続された移動制御部２は、制御ＰＣ６からの計測位置情報を受けて、顕微鏡部４内に設置された試料位置を移動させる。
【００２５】
光源３から顕微鏡部４内に導入された光は、試料上を走査して照射される。試料から出射した光は、信号検出部５で検出される。
【００２６】
制御ＰＣ６は、位置情報、波長情報、及び信号検出部５からの信号を統合したデータを生成し、記憶する。
【００２７】
更に、光源の波長を変化させて計測すれば、分光スペクトルの空間分布を取得することもできる。
【００２８】
制御ＰＣ６は、スペクトルデータ（分光データ）を解析し、解析結果を出力表示部７に出力する。この時、表示される解析結果は、ある波数についての信号強度分布を空間的にマッピングした分光画像である。
【００２９】
或いは、例えば測定試料を構成する成分毎に色分け表示しても良い。スペクトルの解析手法としては、一般的なピーク検出等を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
また、計測・解析の高速化を図るために、データ解析を含めて、処理の一部をＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｇａｔｅ  Ａｒｒａｙ）、或いは、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）等により、制御ＰＣ６上で行われるようにしても良い。
【００３１】
上記した分光顕微鏡を操作する際、作業者は観察領域指示機構８を作動させて、移動制御部２を駆動して、試料上の観察領域を移動させる。
【００３２】
ここで、観察領域とは、光が照射されるエリアであって、試料表面に概ね水平方向に指定された領域を指す。
【００３３】
観察領域指示機構８としては、マウス、キーボード等の入力デバイスを流用することができるが、ジョイスティックやトラックボール等を備えた専用デバイスであっても良い。
【００３４】
観察領域では、光を試料表面上でスキャンさせるなどして、二次元的に分光信号を取得する。
【００３５】
観察領域の移動は、ステージ移動、光走査領域の移動、或いはこれらを組合せた方式を適宜用いることが出来るが、移動手段は特に限定されるものではない。
【００３６】
全観察エリアは、主に観察領域を移動させるための機構の可働範囲で規定される。
【００３７】
本実施形態における分光顕微鏡装置は、制御ＰＣ６によって前記分光検出手段と前記移動手段とが連動可能に制御されるように構成されている。
【００３８】
すなわち、観察エリアの移動時と停止時で、移動制御部２と連動して、分光計測の計測条件を切り替え可能に構成されている。図２は、観察領域の移動時と停止時における計測条件の切り替えの関係を表す模式図である。
【００３９】
すなわち、観察領域の移動時は計測条件１で計測を行い、観察領域の固定時には計測条件２に切り替える。或いは、観察領域の移動と固定の状態を検知し、計測条件を自動的に切り替える機能を有することもできる。
【００４０】
切り替える計測条件が、計測点数である場合の動作を、図２を用いて説明する。図中、計測領域の中の格子の交点は計測点を代表する。
【００４１】
［１］観察領域の移動時：計測点の設定数は観察領域の固定時の設定数よりも少ない値に設定される（図２）。なお、設定した観察条件での測定が完了するまでの間は、移動ステージ等による領域移動は停止する。即ち、ステップ的な移動動作を繰り返す。また、解析結果を成分分布として、色分けなどして識別表示しても良い。
【００４２】
［２］観察領域の固定時（あるいは移動停止時）：計測点の設定数は移動時の設定数よりも大きい値に設定される（図２）。計測点の数を多く設定することで、より高い空間分解能で詳細なスペクトルが得られる。
【００４３】
また、計測・解析にかかる時間は増大するものの、観察領域が固定されているので、移動に対する追従性が問題になることは無い。
【００４４】
観察領域の移動時及び固定時における計測点の設定数は予め設定するが、観察領域の移動時の計測結果あるいは解析結果に基いて観察領域の固定時の計測点の設定数を決定するようにしても良い。
【００４５】
ところで、分光スペクトルは、しばしば波数に対する信号値で表わされる。波数の定義は計測法によって多少異なるが、光源が１つである分光法では計測波長の逆数であり、非線形ラマン散乱分光等、二種類の光源を用いる場合は、計測波数は２つの光源の波長の逆数の差であらわされる。
【００４６】
後者の場合、１つの波数に対して、２つの光源の波長の組み合わせは複数取り得るが、計測波数を変化させる場合、光源の波長を適宜変化或いは選択することになる。
【００４７】
但し、一方の光源の波長を固定したときは、波数の変化は、もう一方の光源の波長の変化のみに対応する。
【００４８】
計測する波数の選択数、及び波数値は、観察領域の移動時、或いは固定時について予め設定しておく。
【００４９】
このとき、計測可能な全波数範囲を指定しておき、その範囲内で設定された計測波数の選択数によって等間隔で割り振るようにしても良い。あるいは、特定の波数を定めて、不等間隔に波数を設定しても良い。この場合、既知の物質のスペクトル情報を用いて波数を選択しても良い。
【００５０】
計測点数が少ないと空間分解能が低下するが、異種の物質の存在を粗く区別することは可能である。
【００５１】
従って、観察領域を移動しながら詳細観察領域を探す場合などの用途には必要な情報が得られる。
【００５２】
少数の計測点であれば計測時間は小さく、移動に追従してほぼリアルタイム表示も可能である。
【００５３】
従って、詳細観察を行うべき領域を探索するための表示遅延のないプレビュー画像として利用することができる。
【００５４】
一方、計測波数を増やした場合は、計測・解析時間が増大するため、移動に対する結果表示の追従性は低下するものの、より詳細な識別表示が可能である。計測点の数は、計測波数の数によっても影響を受ける計測・解析時間を考慮して適宜設定される。
【００５５】
観察領域の固定時では、例えば、観察領域を移動した後に、移動を停止して測定する場面が考えられる。
【００５６】
このとき、計測点数が多ければ、計測・解析に時間を要するものの、領域が固定されているため、観察領域に対する追従性が問題になることは無い。
【００５７】
信号の弱い場合は、Ｓ／Ｎを向上させるために、同じ計測点に対して複数回の計測を行い、出力信号を積算することが有効である。
【００５８】
そこで、計測点の位置あるいは数を固定し、積算回数を変化させても良い。また、計測点の位置あるいは数と、積算回数をそれぞれ変化させるようにしても良い。
【００５９】
観察領域の移動時及び固定時における積算数は予め設定しておいても良く、観察領域の移動時の計測結果あるいは解析結果に基いて観察領域の固定時の積算数を決定するようにしても良い。
【００６０】
領域移動時のプレビュー画面では、移動に対する追従性が求められるため、積算回数は多くできないが、領域固定時には、追従性は問題とならないので、物質の同定精度の向上を優先させるために積算回数を多く設定することができる。
【００６１】
以上、本実施形態によると、観察領域を移動させながら、領域の移動への追従性良く迅速に計測結果を画像表示することができるので、所望の詳細観察するためのエリアを探索することが容易になる。
【００６２】
なお、光源の数、光源の波長、検出光の波長を適宜選択すれば、多光子吸収信号、和周波発生信号、誘導ラマン散乱信号、コヒーレント反ストークスラマン散乱信号、など多様な非線形光学現象による信号を選択して検出することが可能である。
【００６３】
１つの光源を用いる場合として、多光子吸収や２次高調波発生、などが挙げられる。
【００６４】
また、波長の異なる２つの光源を用いる場合として、和周波発生、差周波発生、二波長型の多光子吸収、誘導ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン散乱、などが挙げられる。
【００６５】
（第２の実施形態）
第２の実施形態として、本発明を適用して誘導ラマン分光顕微鏡を構成した構成例について、図３を用いて説明する。
【００６６】
図３（ａ）は本実施形態に係る機能の概要を示すための模式図である。また、図３（ｂ）は顕微鏡部をより詳細に示す模式図である。
【００６７】
なお、本発明の分光顕微鏡は、上記誘導ラマン分光顕微鏡が構成できるだけでなく、光学フィルターを入射光が除外できるものに変更すれば、コヒーレント反ストークスラマン分光顕微鏡も容易に構成することができる。更に、光学フィルターを適宜に選択すれば、多光子吸収分光顕微鏡や、和周波発生分光顕微鏡など様々なタイプの顕微鏡とすることも可能である。
【００６８】
光源３は、第一の光源３１と第二の光源３２の二種類の光源からなり、信号検出部５は、光検出器５１、検波器５２から構成される。
【００６９】
第一の光源３１、及び第二の光源３２は、それぞれ出力波長の異なるレーザー光源であり、出力された光はパルス列を形成している。
【００７０】
これらの光パルス列は、パルス幅が典型的にはピコ秒からフェムト秒オーダーの超短パルスである。第二の光源の光強度は一定であるのに対して、第一の光源の光強度は周波数ｆで変調されている。制御ＰＣ６は、計測波数を変化させるため、第一の光源３１、及び第二の光源３２の出力波長を制御する。
【００７１】
第一の光源３１としては、例えば、中心波長１０００ｎｍ程度のファイバーレーザー等の広帯域光源を用いる。第二の光源３２としては、例えば、光強度の安定性に優れた、中心波長８００ｎｍ程度のチタンサファイアレーザーを用いる。光源３は出力周波数の可変機構を内蔵する。或いは、複数の中心波長の異なる光源を切り替えて用いれば、容易に計測波数域の拡大が行える。
【００７２】
顕微鏡部４の詳細を、図３（ｂ）の模式図を用いて説明する。
【００７３】
光照射用の第一の対物レンズ４２と、集光用の第二の対物レンズ４３が対向して設置される。これらの対物レンズには近赤外光透過仕様のものを用いる。
【００７４】
これら対向する対物レンズの間に試料台４１が設置される。試料は、プレパラート等に載置され、試料台４１に固定される。
【００７５】
試料台４１は移動ステージ２１に固定される。移動ステージ２１は、試料台４１を対物レンズ４２、４３の間で光軸方向に移動させるＺ移動機能と、Ｚ方向と垂直な方向、即ち試料表面の面内方向に試料を移動させるＸＹ移動機能を有し、観察エリアの移動に用いる。これらの２つの光源からの光は同軸上に合波されて顕微鏡本体の光学系に導入される。
【００７６】
第一の光源３１、及び第二の光源３２からの光は、ミラー４５及びハーフミラー４４等によって同一光軸上で合波されて、光スキャナー２２に導かれる。
【００７７】
光スキャナー２２は、ＰＣで制御され、光の軌道をＸＹ走査させるために用い、例えば、ガルバノスキャナー、ポリゴンミラー、光ＭＥＭＳミラー等を用いることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００７８】
光スキャナー２２を出た光は、第一の対物レンズ４２によって試料上に集光される。制御ＰＣ６は、位置指定情報を移動制御部２に出力し、移動制御部２は移動ステージ２１、及び光スキャナー２２を制御して、試料上の任意の位置にレーザー光を照射させる。
【００７９】
観察領域の移動は、ステージ移動、レーザーの走査領域の移動、或いはこれらを組合せた方式を適宜用いることが出来るが、移動手段は特に限定されるものではない。
【００８０】
移動用のステージとしては、ネジ送り式やラック＆ピニオン式のものを用いても良いが、精密移動制御を行う上ではステッピングモータ、超音波モータ、ピエゾ素子等のアクチュエータを備えたものが好ましく用いられる。
【００８１】
また、レーザーの照射位置の移動のみによって観察領域内での走査と観察領域の移動の両方を行ってもよい。例えば、光スキャナーの駆動信号として、領域内観察用の変位量の小さい走査用信号と、領域移動のための信号とを重畳した信号を入力する。或いは、光スキャナーと対物レンズの間に挿入したミラーの角度を変化させることで、レーザー照射位置を移動させて、観察領域の移動を行っても良い。
【００８２】
更に、１ｍｍ程度或いはそれ以上の広いレーザー走査範囲に対応する近赤外透過仕様の対物レンズを含めた光学系を用いれば、より広い領域の移動をレーザー走査のみで行うことが可能である。
【００８３】
焦点部において、誘導ラマン散乱現象を生じ、散乱の程度に応じてレーザー光が強度変調を受ける。
【００８４】
なお、誘導ラマン散乱現象は、２つの光源からの光の周波数の差が、試料内の分子振動の周波数と一致するときに発生する。
【００８５】
試料を透過したレーザー光は、光学フィルター４６によって一方の波長のレーザー光のみ分離され、フォトダイオード等で構成される光検出器５１で検出され、光強度が電圧に変換されて出力される。
【００８６】
光検出器５１からの信号は、検波器５２に送られ、第一の光源３１の変調信号（周波数ｆ）を参照信号として同期検波することによって、変調成分がラマン信号（非線形ラマン散乱信号）として出力される。
【００８７】
出力されたラマン信号は、制御ＰＣ６の入力ポートに入力される。制御ＰＣ６は、位置情報、光波長情報、及び、信号検出部からの入力信号を統合したデータを生成し、記憶する。位置、及び、波数をスキャンさせてラマン信号を得ることによって、ラマンスペクトルの空間分布を取得する。
【００８８】
光スキャナー２２に、高速に光走査ができるレゾナントガルバノスキャナーを用いれば、高速計測が可能となる。
【００８９】
共振周波数が８ｋＨｚ程度のスキャナーをＸライン走査に用いれば、画像１フレーム当りの走査線数を５００ライン程度としたとき、３０フレーム／秒に相当する高速計測が可能である。また、例えば、フレーム毎に波数を変化させて計測を行えば、スペクトルの空間分布が取得できる。
【００９０】
本実施形態における誘導ラマン分光顕微鏡装置は、観察領域の移動時と停止時で、移動制御部２と連動して、分光計測の計測条件を切り替える機能を有する。この機能に関しては、第１の実施の形態と同様の動作を行うものであり、説明は省略する。
【００９１】
以上、本実施形態によると、誘導ラマン分光顕微鏡等をはじめとする、２つの光源を用いる非線形光学現象を利用した顕微鏡においても、観察領域を移動させながら、観察領域の移動への追従性良く迅速に計測結果を画像表示することができるようになる。従って、所望の詳細観察するための領域を探索することが容易になる。
【００９２】
（第３の実施形態）
第３の実施形態として、スペクトル解析に多変量解析を用いた場合の構成例について説明する。
【００９３】
本実施形態においては、上記実施形態において得られた多次元の成分から成る分光スペクトルデータの解析には、主成分分析、独立成分分析、重回帰分析、或いは、判別分析などの多変量解析などを用いることができる。
【００９４】
多変量解析を用いれば、スペクトルが複数の信号源に由来する複雑な多重スペクトルであっても、信号源を分離して抽出することが可能である。
【００９５】
主成分分析は、多変量のデータから新たな分類指標を得る手法であり、独立成分分析は、信号を独立にするような変換を求めることによって、観測信号のみを用いて独立な信号源を復元する手法である。また、重回帰分析は、スペクトル成分と信号源との関係を求め、信号源を推定する手法であり、判別分析は、スペクトルデータ等の対象の特性から、その対象がどの群に属するかを判別する手法である。
【００９６】
主成分分析を例にとると、データの次元ｎと同じ数だけ直交基底ベクトルを求め、それらを分散の大きなものから順に第一主成分から第ｎ主成分を定義する。対象の特性をよく表すものとして、上位の主成分を用いられる。
【００９７】
主成分分析等では、得られた信号の次元と同数の基底ベクトルを求める必要があり、信号データの次元、即ち測定した波数の数の増大に伴って演算量が増大する。主成分分析では、計測点数の増大の演算時間への影響は相対的に小さい。
【００９８】
一方、独立成分分析等のように収束計算が含まれる手法では、計測点数に対して演算時間が非線形で増大する。
【００９９】
そこで、観察領域の移動に対する追従性を良くするためには、計測点の数を少なく設定することが有効である。同時に、計測波数の設定数を少なくすることも有効である。少なくとも２つの波数で得た情報があれば、主成分分析や独立成分分析の実行は可能である。
【０１００】
一方、計測点の数や計測波数の設定数を増やしていくと、計測・解析時間が増大していくので、移動に対する結果表示の追従性は低下するが、より詳細なスペクトル分布の表示が可能である。計測波数の設定数は、計測点の設定数との兼ね合いで設定される。第２の実施形態の装置を用い、計測点を５００×５００に設定した場合、計測波数の数が３以下であれば０．１秒以内に計測・解析結果を表示できる。
【０１０１】
これに対して、例えば、解析時間が計測回数に比例すると仮定した場合、計測時間を０．１秒以内に限定しても、計測点を５００×１００に減らせば、計測波数の数は１５に増やすことができる。
【０１０２】
上記説明では、観察領域の移動時に計測波数を少なく設定する例を示したが、計測を行った波数のうち一部の波数のみ解析に利用すれば、解析にかかる時間を短縮することで更に処理時間を短縮することもできる。
【０１０３】
このとき、解析に用いる波数の選択数及び波数値は、予め、等間隔で波数を選択しても良く、不等間隔に特定の波数を設定しても良い。後者の場合、既知の物質のスペクトル情報を用いて選択する波数を決めても良い。
【０１０４】
以上、本実施形態によると、観察領域を移動するときに、領域移動に対して追従性良く迅速に行いつつ、構成成分の空間分布を色分け表示などにより画像表示が行えるので、詳細観察するための所望の領域を探索することが更に容易になる。
【０１０５】
（第４の実施形態）
第４の実施形態として、観察領域を３次元空間で移動させる構成例について説明する。以上の実施形態では、観察領域を２次元平面（ＸＹ方向）で移動させる構成例について説明したが、観察領域の移動はＺ方向にも拡張し、３次元空間にも適用することができる。このとき、位置制御用デバイスは、観察領域をＸＹ方向に移動させるだけではなく、Ｚ方向の移動を指示する機能を備えればよい。
【０１０６】
図４は、３次元空間への適用を示す模式図である。
【０１０７】
図中、格子の交点が計測点に対応する。上記の誘導ラマン分光顕微鏡の実施形態では、光スキャナーにレゾナントガルバノスキャナー（共振周波数が８ｋＨｚ程度）を用いれば、画像１フレーム当りの走査線数を５００ライン程度としたとき、約３０フレーム／秒のビデオレート計測が可能である。
【０１０８】
従って、Ｚ方向に３０フレームを設定すれば、約１秒で３次元画像を取得することができる。走査線数を数分の１程度に減らせば、ほぼリアルタイムでの３次元表示も可能である。
【０１０９】
本実施形態では、計測点数を、３次元空間上の観察領域の移動の状態によって自動的に切り替えるようにする。すなわち、以下のような動作を行う。
【０１１０】
［１］観察領域の移動時：計測点数を観察領域の固定時よりも少ない値に設定する。なお、設定した観察条件での測定が完了するまでの間は、移動ステージの移動は停止する。
すなわち、観察領域毎にステップ的に移動動作を繰り返すことが好ましい。
【０１１１】
［２］観察領域の固定時（あるいは移動停止時）：計測点数を移動時の設定数よりも大きい値に設定する。このとき、計測波数を観察領域の移動時よりも多く設定することで、より詳細なスペクトル分布が得られる。
なお、観察領域を１次元、即ちライン状とした場合にも同様に適用できる。
【０１１２】
以上で説明したように、本発明は、１次元乃至３次元の観察領域のうちのいずれかの観察領域で適用可能である。
【０１１３】
（第５の実施形態）
第５の実施形態として、観察条件を２次元平面（ＸＹ方向）で多段階で自動的に切り替える構成例について、図５を用いて説明する。
【０１１４】
上記において説明した各実施形態の顕微鏡装置では、観察領域の移動時と固定時で計測条件を切り替えるように構成されていたが、本実施形態における顕微鏡装置は、前記移動制御部２からの移動の指示速度に応じて、多段階で自動的に計測条件を切り替えるように構成される。
【０１１５】
図５に、移動速度に応じた計測点数の切り替えの様子を模式的に示す。
【０１１６】
すなわち、移動速度に応じて、計測点数による計測条件を下記の通り条件１〜３の間で切り替える。
【０１１７】
高速移動指示時は、計測点数を少なく設定し（計測条件１）、低速移動指示時は計測点数を増大させ（計測条件３）、停止時は計測点数を更に多く設定する（計測条件２）。
【０１１８】
以上では３段階で説明したが、より細かく多段階に、或いは、無段階に測定点条件を設定しても良い。以下に、無段階に自動的に測定点を設定する機能について説明する。
【０１１９】
ここでは、ＸＹ方向の平面上の観察領域の移動とし、Ｘ，Ｙ方向の計測点数をそれぞれＰｘ，Ｐｙとする。
【０１２０】
また、Ｘ方向の走査にレゾナントスキャナなど一定の周期で光走査方向を変化させる機構を使用した場合に適用する。この場合、Ｘ走査時間は共振周波数で規定されるため、Ｐｘの設定値に関わらずＸ走査時間が規定される。
【０１２１】
なお、Ｐｘは任意の固定値とする。Ｘ方向の１ライン当たりの計測時間をＴｘとすると、１画面を計測するフレームレートＦ−Ｒａｔｅ［ｆｌａｍｅ／ｓｅｃ］は、次の通り表わされる。
「Ｆ−Ｒａｔｅ＝１／（Ｔｘ・Ｐｙ）」
観察領域の移動量（移動ステップ量、或いは、表示ずらし量をフレーム単位で示す）をＤ［ｆｒａｍｅ］、一波数当りの積算数をＭ、計測波数の数Ｎとする。
【０１２２】
なお、構成成分の色分け表示を行う場合はＮ≧２に設定される。作業者が移動領域指示機構で指示する移動速度をＳ［ｆｒａｍｅ／ｓｅｃ］とすると、Ｐｙは以下の式に従って規定される。
「Ｐｙ＝Ｄ／（Ｎ・Ｓ・Ｍ・Ｔｘ）」
【０１２３】
即ち、観察結果の表示が追従するように、移動速度Ｓに応じて測定点数Ｐｙは自動的に変化する。
【０１２４】
例えば、移動領域指示機構としてマウスを利用した場合、ドラッグ操作で移動が指示された場合には、ドラッグする速度に比例するように観察エリアの移動速度Ｓが設定されるようにする。移動速度Ｓを増大した場合、Ｐｙは移動速度Ｓに反比例して減少する。
【０１２５】
同様に、観察領域の移動をＸＹＺ方向の３次元空間上とした場合、Ｚ方向の計測点数をＰｚとすると、Ｐｚは以下のように規定される。
「Ｐｙ・Ｐｚ＝Ｄ／（Ｎ・Ｓ・Ｍ・Ｔｘ）」
Ｐｙ、Ｐｚの値の割り振りは、事前に設定しておく。例えば、平面分解能を重視する場合は、Ｐｙの割合を多くしておくと良い。
【０１２６】
以上のように、移動指示速度に応じて、計測点数を自動的に変えることによって、観察領域の移動に対する追従性を損なうことなく、２次元領域でのスペクトル計測を行うことが可能となる。
【０１２７】
（第６の実施形態）
第６の実施形態として、生物などの動く測定対象の追跡を可能とする観察領域の指定方法の構成例について説明する。
【０１２８】
モニター画面上には、初期の観察領域についての観察結果が表示されているものとする。観察領域は、例えば四角形で囲まれた領域である。
【０１２９】
観察領域表示の中央部には観察領域の位置情報を代表するものとしてカーソルが表示される。
【０１３０】
作業者は、観察領域指示機構を操作して、カーソルの表示位置を動かす。カーソルを止めた位置が、新たに観察領域の中心位置に設定される。例えば、観察対象が移動したとき、移動後の観察対象が観察領域に含まれるようにカーソルを移動する。
【０１３１】
観察エリアの指定方法の他の一例を説明する。
【０１３２】
モニター画面上には、初期の観察領域についての観察結果が表示されているものとする。作業者は、位置制御デバイスを操作して、カーソルの表示位置を動かす。カーソル位置は、予め設定した時間間隔（例えば０．２秒）で、位置を確定して位置設定する。
【０１３３】
該設定位置情報は移動ステージに送られて、ステージ移動させて、新たな設定位置を中心とする観察領域においてスペクトル計測が行われる。
【０１３４】
なお、観察領域内の一連のスペクトル計測、及び、データ解析が完了してから、次の観察エリアに移動する必要があるため、位置を確定するための時間間隔は、これら計測・解析に必要な時間よりも長い時間に設定される。
【０１３５】
本実施形態によれば、例えば、生物など動く対象を追跡しながら、刻々と計測することができる。
【０１３６】
制御ＰＣ６に、一般的な画像認識技術を実行可能な画像処理部を備えれば、細胞輪郭形状、細胞核形状などを認識して、これらの形状を基準点として自動的に観察対象を追跡する構成とすることも可能である。
【０１３７】
（第７の実施形態）
第７の実施形態として、観察領域の移動時と固定時で、解析方法（解析条件）を切り替える構成例について説明する。
【０１３８】
例えば、観察領域の移動時には、異なった複数の波数で信号計測して信号強度解析を行い、各波数における信号の強度を比較する、或いは、複数の計測波数間における信号の強度比を比較する等の単純な解析を行い、構成成分を簡便に分離する。
【０１３９】
この方法によれば、多変量解析等を行う場合に比べて、解析時間が短いという利点があり、移動時に解析結果を迅速に表示するのには好適である。
【０１４０】
一方、観察領域の固定時には、より精細なスペクトル解析を行うために、多変量解析を適用する。
【０１４１】
多変量解析としては、主成分分析、独立成分分析、重回帰分析、因子分析、クラスター分析、或いはい判別分析など種々の解析法を選択することができる。
【０１４２】
これらの解析結果を、構成成分の違いとして色分け表示する。多変量解析は、特に計測波数が多いと解析に時間を要する場合があるが、観察領域の固定時には追従性の点で問題にはならない。
【０１４３】
また、観察領域の移動時と固定時で、多変量解析の手法を切り変える構成としても良い。一例として、観察領域の移動時には比較的計算の少ない主成分分析を行い、観察領域の固定時には独立成分分析を行う構成とすることができる。
【０１４４】
また、観察領域の移動時、或いは固定時において、複数の多変量解析手法を組み合わせて解析を行っても良い。特に、固定時には、例えば、主成分分析と独立成分分析を組合せた分析を行うことで、より物質の同定能を高めることが期待できる。
【０１４５】
また、観察領域の移動時に取得したデータ、或いは、そのデータの解析結果を、観察領域の固定時の解析に利用しても良い。特に多変量解析等を行う場合には、固定時の解析に要する時間の短縮に有効である。
【０１４６】
また、観察領域の移動時に粗い計測波数で取得したデータを順次集積して多数の計測波数のデータとしてまとめて解析しても良い。更に、その集積データに対する解析結果を用いて、新たに移動時に取得した観察領域を解析すれば、解析にかかる時間の増大を抑制しつつ、試料を構成する成分の分離精度を高めることができる。
【０１４７】
例えば主成分分析や独立成分分析を行う場合、新たな観察領域で取得したデータに対して、それ以前に取得された集積データの解析で得られた基底ベクトルを用いてスコア値を求めれば、解析にかかる時間を短縮することができる。その際、基底ベクトルの導出は、データの取得と平行して行うと効率的である。
【０１４８】
なお、観察領域の移動時と固定時のそれぞれで採用し得る解析手法は、多数の選択肢が可能であり、適宜同種或いは異種の多変量解析手法から選択できる。そして、上記に限定されるものではない。
【０１４９】
（第８の実施形態）
本実施形態として、狭領域を移動させながら観察して広域のプレビュー表示を行えるようにした構成について図６を用いて説明する。
【０１５０】
対物レンズを固定した場合、観察可能な最大エリアは制限される。通常、効率良く非線形光学効果を発生させるために、高い集光性を有する高ＮＡの対物レンズを使用するが、高い空間分解能が得られる半面、計測領域は狭い。市販の倍率×６０、ＮＡ１．２の水浸対物レンズを用いた場合の有効な計測エリアは約１００μｍ□程度に制限される。数ｍｍ□に渡る程度の広領域をプレビューするためには、多数の狭領域の結合画像を形成する必要がある。
【０１５１】
そこで、観察者にとてってストレスのないプレビュー表示と詳細観察を両立させるために以下の測定を行う機能を設ける。
【０１５２】
（１）プレビュー計測時：  隣り合った狭領域を順次移動しながら観察し、多数の観察領域について、それらの試料上の位置に対応するように配置した、すなわち試料上の観察位置関係を保持するように並べた広領域の結合画像を形成する。当該狭領域は、二次元、或いは三次元領域である。
【０１５３】
このとき、計測点の数を少なく設定することで、広領域を短時間で計測を行うことができる。なお、領域の移動はステージ駆動によって行う。
【０１５４】
観察エリアは、予め設定しても良いが、観察者がマウス等の操作でなぞった軌跡に沿って狭領域を次々に指定するようにしても良い。
【０１５５】
観察結果の表示は、狭領域の観察毎に順次並べて画像表示しても良いが、広領域の観察が完了してから結合画像を一度に表示するようにしても良い。
【０１５６】
解析については、狭領域の測定毎に行って結果を画像表示しても良く、広域の測定を終えてから広領域のデータをまとめて解析してから結果を画像表示しても良い。解析には多変量解析等を用いて、大雑把に物質分布を区別して色分け等の表示をしても良い。
【０１５７】
（２）本計測時：  広領域のプレビュー画像から一つの狭領域を観察位置として選択するか、或いは広い領域上のプレビュー画像上の固定領域を新たに設定して、当該狭領域について詳細計測を行う。本計測時は、計測点の数をプレビュー計測時よりも多く設定して、詳細なスペクトル分布計測を行う。このとき、多変量解析等を用いて詳細なスペクトル解析を行えば、詳細に物質分布を区別して色分等の表示を行うことができる。
【０１５８】
本実施形態によれば、所望の観察領域を探すときなど、迅速に広域をプレビュー表示することが可能となる分光顕微鏡装置を実現することができる。
【符号の説明】
【０１５９】
１  分光検出手段
２  移動制御部
３  光源
４  顕微鏡部
５  信号検出部
６  制御ＰＣ
７  出力表示部
８  観察領域指示機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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