(57)【要約】【課題】本発明は、移植片対宿主病などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物を提供することを目的とする。【解決手段】ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２】
造血幹細胞移植におけるドナー側の白血球に対して細胞障害性を示し、レシピエント側の細胞に対しては細胞障害性を示さない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
造血幹細胞移植におけるレシピエント側の白血球に対して細胞障害性を示し、ドナー側の白血球に対しては細胞障害性を示さない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡアリルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩのＨＬＡアリルから選択される１以上のアリルである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＨＬＡの特定のアリルが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２のアリルである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
機能断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞障害作用を増強させたアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
同種移植拒絶に伴う疾患の処置のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
微小残存病変の処置のための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片が、１〜２５ｍｇ／（ｋｇ体重・日）の投与量で投与されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
【請求項１５】
ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡアリルである、請求項１４記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
【請求項１６】
ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩのＨＬＡアリルから選択される１以上のアリルである、請求項１５に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
【請求項１７】
ＨＬＡの特定のアリルが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２のアリルである、請求項１６に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
【請求項１８】
抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
【請求項１９】
断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の断片。
【請求項２０】
細胞障害作用を増強させた、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか一項に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、ＨＬＡアリル特異的な細胞傷害剤。
【請求項２２】
特定アリルのＨＬＡを有するヒトＰＢＭＣを移植した、ＧＶＨＤ動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植や輸血の際に、しばしば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症することが知られている。ＧＶＨＤは、主にドナーとレシピエントのＨＬＡ型の不一致である場合に、ドナー由来の白血球がレシピエントの組織を攻撃することにより発症する疾患であると考えられている。ＧＶＨＤは、治療により治癒することもあるが、重症例ではほぼ全例が死亡することが知られている。
【０００３】
治療法としては、免疫抑制剤（抗胸腺細胞グロブリンなど）やステロイドの投与などの対処療法が試みられているが、多くのＧＶＨＤでは症状が長期に持続するため、根本的な治療とはなっていない。また、治療効果が表われたとしても、免疫抑制剤やステロイドの投与の副作用等の結果、長期生存者のＱＯＬは低い傾向にある。
【０００４】
ところで、造血幹細胞移植では、本来、レシピエントの造血幹細胞をドナーのものに置き換えるべきところ、レシピエント側の白血球が残存してしまうことによる微小残存病変が発症することがある。微小残存病変の治療のゴールは、レシピエント側の白血球を減少させることであり、治療効果を確認することを目的としてレシピエント側の白血球の数量をモニターするためのＨＬＡアリル特異的抗体が開発されている（非特許文献１）。しかし、このような抗体で細胞傷害性を有するものは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Yamazaki et. al., “A rapid and efficient strategy to generate allele-specific anti-HLA monoclonal antibodies”, Journal of Immunological Methods (2009), 343: 56-60.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、移植片対宿主病などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、抗ＨＬＡ抗体がＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すこと、そして、このような抗ＨＬＡ抗体がＧＶＨＤの治療に有効であることを見出した。本発明は、このような知見に基づいてなされた発明である。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、医薬組成物。
（２）造血幹細胞移植におけるドナー側の白血球に対して特異的に細胞障害性を示し、レシピエント側の細胞に対しては細胞障害性を示さない、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）造血幹細胞移植におけるレシピエント側の白血球に対して特異的に細胞障害性を示し、ドナー側の白血球に対しては細胞障害性を示さない、上記（１）に記載の医薬組成物。
（４）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡアリルである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩのＨＬＡアリルから選択される１以上のアリルである、上記（４）に記載の医薬組成物。
（６）ＨＬＡの特定のアリルが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２のアリルである、上記（５）に記載の医薬組成物。
（７）抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）機能断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）細胞障害作用を増強させたアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）同種移植拒絶に伴う疾患の処置のための、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１１）移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のための、上記（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）微小残存病変の処置のための、上記（１０）に記載の医薬組成物。
（１３）アリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片が、１〜２５ｍｇ／（ｋｇ体重・日）の投与量で投与されることを特徴とする、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１４）ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１５）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡアリルである、上記（１４）に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１６）ＨＬＡの特定のアリルが、クラスＩのＨＬＡアリルから選択される１以上のアリルである、上記（１５）に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１７）ＨＬＡの特定のアリルが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２のアリルである、上記（１６）に記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１８）抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（１９）断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ＦｖまたはｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２である、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の断片。
（２０）細胞障害作用を増強させた、上記（１４）〜（１９）のいずれかに記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片。
（２１）上記（１４）〜（２０）のいずれかに記載のアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなる、ＨＬＡアリル特異的な細胞傷害剤。
（２２）特定アリルのＨＬＡを有するヒトＰＢＭＣを移植した、ＧＶＨＤ動物モデル。
【０００９】
本発明の抗体若しくはその機能断片は、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示し、特定のアリルのＨＬＡを発現する細胞を特異的に傷害する細胞傷害剤として用いられる。従って、本発明の抗体やその機能断片は、微小残存病変やＧＶＨＤなどの造血幹細胞移植に伴う疾患の処置にも有利に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例４で得られた抗体が、ＨＬＡアリル特異的に細胞傷害性を示すことを示す図である。縦軸は、死細胞の割合を示す。
【図２】図２は、ＨＬＡアリル特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ−Ａ２抗体が、１０μｇで十分な細胞傷害性を示すことを示す図である。
【図３】図３は、ＦｌｏｗＰＲＡを用いて抗体がアリル特異的認識能力を有することを示した図である。
【図４】図４は、ＨＬＡアリル特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１抗体を静脈注射したときに、抗体が、移植したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性（＋）または陰性（−）の臍帯血の生着割合に及ぼす影響を示す図である。
【図５】図５は、ＨＬＡアリル特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１抗体を腹腔内投与したときに、抗体が、移植したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性（＋）または陰性（−）の臍帯血の生着割合に及ぼす影響を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本発明の抗体若しくはその機能断片は、ＨＬＡの特定のアリルから産出されるＨＬＡをアリル特異的に認識し、該ＨＬＡを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片であり、好ましくは、該ＨＬＡを発現する細胞に対してのみ細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片である。本発明の抗体若しくはその機能断片は、特にクラスＩまたはクラスＩＩのＨＬＡ、好ましくはクラスＩのＨＬＡをアリル特異的に認識し、該ＨＬＡを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す。
【００１２】
ＨＬＡクラスＩ分子には３つの遺伝子座ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃが存在し、それぞれには抗原型が数多く存在する。本発明の抗体若しくはその機能断片は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、好ましくはＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ、より好ましくはＨＬＡ−Ａの抗原型のアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す。
【００１３】
ＨＬＡクラスＩ分子のＨＬＡ−Ａの抗原型としては、例えば、ＨＬＡ−Ａ１〜ＨＬＡ−Ａ８０が知られている（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）。この中で日本人によく見られる抗原型は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ９（ＨＬＡ−Ａ２４としても知られる）、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２６およびＨＬＡ−Ａ３３である。これらの抗原型のそれぞれには更にアリルが存在する。例えば、ＨＬＡ−Ａ２には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１〜ＨＬＡ−Ａ＊０２：１２６のアリルが存在し、日本人では、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１０およびＨＬＡ−Ａ＊０２：１８などのアリルがよく見られる。なお、本明細書では、ＨＬＡ−Ａ９は、慣例に従い、抗原型を示す場合にはＨＬＡ−Ａ９と表現するが、特定のアリルを示す場合には、ＨＬＡ−Ａ２４にアリル番号を付して、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２と表現する。
【００１４】
ＨＬＡクラスＩ分子のＨＬＡ−Ｂの抗原型としては、例えば、ＨＬＡ−Ｂ１〜ＨＬＡ−Ｂ８２（http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）が知られている。この中で日本人によく見られる抗原型は、例えば、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ２２、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４６、ＨＬＡ−Ｂ４８、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６１（ＨＬＡ−Ｂ４０としても知られる。）、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７１およびＨＬＡ−Ｂ７５である。ＨＬＡ−Ａ同様に、これらの抗原型のそれぞれには更にアリルが存在する。なお、本明細書では、ＨＬＡ−Ｂ６１は、抗原型を示す場合にはＨＬＡ−Ｂ６１と表現するが、特定のアリルを示す場合には、ＨＬＡ−Ｂ４０にアリル番号を付して、例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２と表現する。
【００１５】
本発明の抗体またはその機能断片は、特に限定されないが、例えば、ＨＬＡ−Ａ２のアリル、ＨＬＡ−Ａ３のアリル、ＨＬＡ−Ａ９のアリル、ＨＬＡ−Ａ２３のアリル、ＨＬＡ−Ｂ３５のアリル、またはＨＬＡ−Ｂ６１のアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞障害性を示す。より具体的な態様では、本発明の抗体またはその機能断片は、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、またはＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２を発現する細胞に対して特異的に細胞障害性を示す。
【００１６】
ＨＬＡクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰの３つが知られる。この３つの遺伝子座それぞれにも、抗原型が数多く存在し、それぞれの抗原型に対してアリルが存在する。本発明の抗体若しくはその機能断片は、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲのβ１鎖の抗原のアリルをアリル特異的に認識し、該ＨＬＡを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す。
【００１７】
このように、本発明の抗体またはその機能断片は、特定のＨＬＡアリルを有する細胞（すなわち、ＨＬＡクラスＩであれば赤血球を除く有核細胞、ＨＬＡクラスＩＩであればマクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞）に対してＨＬＡアリル特異的な細胞障害性を示す。従って、本発明によれば、本発明の抗体またはその機能断片を含んでなるＨＬＡアリル特異的な細胞傷害剤が提供される。
【００１８】
本明細書では、「ＨＬＡアリル特異的に認識する」とは、ＨＬＡの特定のアリルを認識し、それ以外のアリルは認識しないことを意味する。本明細書では、「アリル特異的に認識する」には、複数のＨＬＡのアリルを認識することが含まれ、本発明のアリル特異的な抗ＨＬＡ抗体は、２つ以上のＨＬＡのアリルを認識し得るものであってもよい。本明細書では、ＨＬＡをアリル特異的に認識する抗体は、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体（または「ＡＳＨｍＡｂ」）と呼ぶ。
【００１９】
本明細書では、「ＨＬＡアリル特異的な細胞障害性を示す」または「ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す」とは、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示し、ＨＬＡの特定のアリルを発現しない細胞に対しては細胞障害性を示さないことを意味する。本明細書では、「アリル特異的な細胞障害性を示す」または「ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示す」には、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体が複数のＨＬＡのアリルを認識し得る場合が含まれ、そのような場合には、それぞれのＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すことがある。本明細書では、「ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対してのみ細胞傷害性を示す」とは、該特定のアリルを発現する細胞以外に対しては細胞傷害性を示さないことを意味する。
【００２０】
本明細書では、「機能断片」とは、アリル特異的な細胞障害性を示す本発明の抗体の断片をいう。本明細書では、「断片」としては、特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ’）２が挙げられ、これらの断片は当業者に周知の方法により作製することができる。
【００２１】
本明細書では、「キメラ抗体」とは、抗原特異性を有する元の抗体由来の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、他の生物種の軽鎖定常領域および重鎖定常領域と結合させた抗体を意味する。
【００２２】
本明細書では、「ヒト化抗体」とは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト以外の抗体由来であり、ＣＤＲ以外の全部または一部がヒト由来である抗体を意味する。ＣＤＲがグラフトされる抗体は、好ましくは、元の抗体のフレームワーク領域との相同性により選択することができる。また、ヒト化抗体を作製する際には、抗体のフレームワークをサポートするアミノ酸を改変して抗体の抗原への特異性や親和性を改善してもよい。このようなヒト化抗体の作製法は、当業者に周知である。
【００２３】
本明細書では、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子から産生されるヒト抗体である。ヒト抗体は、特に限定されないが、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したヒト抗体産生動物、例えば、マウス、ウシ若しくはブタ等の非ヒト動物を用いた方法、ＥＢウイルスを感染させて増殖させたヒトＢリンパ球を用いた方法、または、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法などの当業者に周知の方法を用いて作製できる。
【００２４】
本発明の抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００２５】
本発明の抗体またはその機能断片はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体としてヒトに投与することで、医薬としての有効性や安全性を高めることができる。
【００２６】
本発明の抗体またはその機能断片は、細胞障害作用を有する化合物が共有結合または非共有結合にて連結していてもよい。細胞障害作用を有する化合物は、本発明の抗体またはその機能断片に連結させることにより、特定のＨＬＡアリルを発現する細胞に効率的かつ選択的に送達され得、抗体またはその機能断片の細胞障害作用を増強させることができる。本発明の抗体またはその機能断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体として、あるいは、ＩｇＭとしてヒトに投与することによっても、抗体が有する細胞障害作用を増強させることができる。
【００２７】
本発明によれば、特定のＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、以下のように作製する。
【００２８】
まず、抗体を作製したいアリルとは異なるＨＬＡのアリルを発現する非ヒトトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、ニワトリ、マウス、ラットなどの齧歯類や哺乳類）を作製する。
【００２９】
トランスジェニック動物に発現させるＨＬＡアリルは、特に限られないが、抗体を作製したいアリルと同じ動物種のＨＬＡであることが好ましく、また、同じ動物種の同じクラスのＨＬＡであることがより好ましい。すなわち、ＨＬＡクラスＩのＡＳＨｍＡｂを得る場合には、得たいアリルとは異なるクラスＩのアリルを発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）、例えば、既に作製済みのＨＬＡ−Ｂ５１：０１を発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる（非特許文献１）。このＨＬＡ−Ｂ５１：０１トランスジェニック動物（例えば、マウス）からは、ＨＬＡ−ＡおよびＢに属する抗原型のアリル（ＨＬＡ−Ｂ５１：０１を除く）を発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す抗体が得られる。同様に、ＨＬＡクラスＩＩのＡＳＨｍＡｂを得る場合には、得たいアリルとは異なるクラスＩＩのアリルを発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。
【００３０】
得られたトランスジェニック動物は、常法により、抗体を作製したいアリルのＨＬＡをアジュバントと共に注射して免疫する（初回免疫）ことができる。免疫に用いるＨＬＡは、テトラマーを形成させることによりその免疫原性を高める等の工夫を行ってもよい。また、初回免疫の後は、１回以上の追加免疫を行ってもよい。免疫後は、マウスの脾臓および／またはリンパ節からＢ細胞を取得して、常法によりハイブリドーマ細胞を得ることができる。抗ＨＬＡ抗体は、ハイブリドーマ細胞の培養液から回収することができる。
【００３１】
アリル特異的な細胞傷害性を示す抗体を得るために、得られた抗体は、細胞傷害性試験に供することができる。具体的には、得られた抗体を補体と共に、抗体を作製したいアリルのＨＬＡを発現する細胞、および、該アリルのＨＬＡを発現しない細胞の培地にそれぞれ添加して、例えば、１０％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートすることができる。その結果、抗体を作製したいアリルのＨＬＡを発現する細胞のみに対して細胞障害性を示したモノクローナル抗体は、ＨＬＡのアリル特異的に細胞障害性を示す抗体である。細胞障害性試験には、例えば、単離した健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いることができる。細胞障害性は、特に限定されないが、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）染色およびクロミウム５１放出試験などにより評価することができる。
【００３２】
アリル特異的な細胞傷害性を示すヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したヒト抗体産生動物、例えば、マウス、ウシ若しくはブタ等の非ヒト動物を用いた方法、ＥＢウイルスを感染させて増殖させたヒトＢリンパ球を用いた方法、または、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法などの当業者に周知の方法を用いて作製することができる。アリル特異的に細胞傷害性を示す抗体を効率良く得る観点では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したヒト抗体産生動物は、さらに抗体を作製したいアリルとは別のアリルのＨＬＡを発現するように遺伝子改変がなされていることが好ましい。
【００３３】
本発明の抗体またはその機能断片は、微小残存病変やＧＶＨＤなどの造血幹細胞移植に伴う疾患の処置に有利に用いられる。
【００３４】
造血幹細胞移植の際には、特にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３つのＨＬＡをアリルのレベルで完全に合致させることが理想的であるとされる。しかしながら、実際の移植では、ドナーとレシピエントとのＨＬＡのアリルが完全には合致しない場合がある。ＨＬＡのアリルが完全に合致しない細胞は、非自己と見なされてＣＤ８陽性Ｔ細胞により傷害を受けることがある。造血幹細胞移植の場合には、ＨＬＡのアリルが完全に合致しないレシピエントの細胞が非自己とみなされて、ドナー由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞により傷害を受ける（移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））。このＧＶＨＤは、輸血の際にも見られることがあり、ドナーとレシピエントのＨＬＡのアリルが完全に合致しないことにより生ずる疾患であると考えられている。
【００３５】
ＧＶＨＤの治療は、現在、免疫抑制剤やステロイドの投与により、免疫機能を一時的に抑制することにより行われている。確かに、免疫機能の抑制は、ＧＶＨＤにより生じる炎症を鎮めることに役立っているが、上記のＨＬＡアリルの適合性を改善するものではなく、十分な治療効果を有するものではない。また、ＧＶＨＤに関して他の有効な治療手段は知られていない。
【００３６】
しかしながら、本発明者らは、本発明の抗体がＧＶＨＤの治療に有効であることを見出した。すなわち、本発明者らは、ドナーのみが有するＨＬＡクラスＩのアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞障害性を示す抗体を作製し、得られた抗体をＧＶＨＤモデル動物に対して投与することにより、ＧＶＨＤモデル動物のＧＶＨＤを有効に治療することに成功した。
【００３７】
本発明の抗体またはその機能断片は、微小残存病変の処置に用いることもできる。微小残存病変は、レシピエント由来の白血球がレシピエントの体内に残存してしまうことによる疾患であり、レシピエント由来の白血球の数を低減させることが治療上有効であるとされている。本発明によれば、レシピエントのみに細胞障害性を示す抗体またはその機能断片を得ることができるが、ＨＬＡは白血球で特に高く発現するため、本発明の抗体またはその機能断片は白血球を優先的に傷害し得る。そのため、本発明の抗体またはその機能断片を用いれば、体内に残存したレシピエント由来の白血球を殺傷して微小残存病変を処置することができる。
【００３８】
このように、本発明の抗体またはその機能断片は、ＧＶＨＤや微小残存病変などの同種移植拒絶に伴う疾患の処置に有効である。従って、本発明によれば、本発明の抗体またはその機能断片を含んでなる医薬組成物、特にＧＶＨＤや微小残存病変などの同種移植拒絶に伴う疾患の処置のための医薬組成物が提供される。
【００３９】
本発明の医薬組成物の好ましい態様によれば、造血幹細胞移植におけるドナーのみが有するＨＬＡクラスＩまたはＩＩのアリルを発現する細胞（好ましくは、白血球）に対して特異的に細胞障害性を示す抗体およびその機能断片を含んでなる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、ドナー側の細胞（好ましくは、白血球）に対しては細胞傷害性を示すが、レシピエント側の細胞に対しては細胞障害性を示さず、例えば、ＧＶＨＤの処置に用いることができる。
【００４０】
また、本発明の医薬組成物の好ましい態様によれば、造血幹細胞移植におけるレシピエントの細胞（好ましくは、白血球）のみが有するＨＬＡクラスＩまたはＩＩのアリルを発現する細胞に対して特異的に細胞傷害性を示す抗体およびその機能断片を含んでなる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、レシピエント側の細胞、好ましくは、白血球に対しては細胞傷害性を示すが、ドナー側の白血球に対しては細胞障害性を示さず、例えば、微小残存病変の処置に用いることができる。
【００４１】
このように、本発明の医薬組成物は、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞傷害性を示すアリル特異的抗ＨＬＡ抗体またはその機能断片を含んでなり、例えば、ＧＶＨＤや微小残存病変などの同種移植拒絶に伴う疾患の処置に用いることができる。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与することができ、より好ましくは、静脈内投与することができる。
【００４３】
経口投与および非経口投与のための剤形およびその製造方法は当業者に周知であり、本発明による抗体またはその機能断片を、薬学的に許容される坦体等と混合等することにより、常法に従って製造することができる。
【００４４】
また、本発明の医薬組成物は、例えば、免疫抑制剤などの他の薬剤をさらに含んでいてもよい。
【００４５】
非経口投与のための剤型は、注射用製剤（例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）が挙げられる。
【００４６】
例えば、注射用製剤は、通常、本発明による抗体またはその機能断片を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、治療上有効量の本発明の抗体またはその機能断片を含んでなる。本明細書では、「治療上有効量」とは、かかる量を投与されていない対象と比較して、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減をもたらす量を意味する。
【００４８】
本発明の抗体またはその機能断片の治療上有効量は、治療対象の年齢、体重、治療する疾患若しくは障害の重症度、投与経路、および／または、これらに限定されない種々の要因によって定まり、主治医の裁量により決定され得る。例えば、本発明の抗体またはその機能断片を静脈注射により注射する場合には、例えば、１日当り１．０ｍｇ／ｋｇ体重〜２５．０ｍｇ／ｋｇ体重、２．０ｍｇ／ｋｇ体重〜１０．０ｍｇ／ｋｇ体重、２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜３．７５ｍｇ／ｋｇ体重である。この量は、単位用量として投与することもできるし、いくつかのサブ用量で数回に分けて与えてもよい。投与日数も、主治医の裁量により決定され得るが、本発明の抗体またはその機能断片は、例えば３日間〜１０日間、例えば５日間投与することができる。
【００４９】
本発明によれば、治療上の有効量の本発明の抗体またはその機能断片をヒトを含むほ乳類に投与することを含んでなる、同種移植拒絶に伴う疾患（例えば、ＧＶＨＤまたは微小残存病変）を処置する方法が提供される。
【００５０】
本発明のある態様では、ＧＶＨＤを処置する方法であって、
（i）ドナーのＨＬＡアリルとレシピエントのＨＬＡアリルに基づいて、ドナーに特有のアリル（すなわち、ドナーの白血球は発現するが、レシピエントの細胞は発現しないアリル）を特定する工程と、
（ii）ドナーに特有のＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すが、レシピエントの細胞に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体の治療上有効量を、レシピエントに投与する工程と
を含んでなる方法が提供される。
【００５１】
工程（ii）では抗ＨＬＡ抗体のレシピエントへの投与に先立って、ドナーに特有のＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すが、レシピエントの細胞に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体を選択し、得る工程を実施してもよい。
【００５２】
本発明のＧＶＨＤを処置する方法では、レシピエントに投与する本発明の抗体またはその機能断片は、レシピエントの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、他のＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示すものであっても許容される。ＧＶＨＤの処置では、ドナーに特有のＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、レシピエントの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、ＨＬＡのアリルに対する特異性の高さは要求されないことは、当業者であれば十分理解できるであろう。
【００５３】
本発明の別の態様では、微小残存病変を処置する方法であって、
（i）ドナーの白血球に発現するＨＬＡのアリルとレシピエントの白血球に発現するＨＬＡのアリルに基づいて、レシピエントの白血球に特有のアリル（すなわち、レシピエントの白血球は発現するが、ドナーの白血球は発現しないアリル）を特定する工程と、
（ii）レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示すが、ドナーの白血球に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体の治療上有効量を、レシピエントに投与する工程と
を含んでなる方法が提供される。
【００５４】
工程（ii）では抗ＨＬＡ抗体のレシピエントへの投与に先だって、レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示すが、ドナーの白血球に対しては細胞障害性を示さない抗ＨＬＡ抗体を選択し、得る工程を実施してもよい。
【００５５】
本発明の微小残存病変を処置する方法では、レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、ドナーの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、他のＨＬＡのアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示し得るものであっても許容される。微小残存病変の処置では、レシピエントの白血球に対して細胞障害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、ドナーの細胞に対して細胞障害性を示さない限り、ＨＬＡのアリルに対する特異性の高さが要求されないことは、当業者であれば十分理解できるであろう。また、白血球では白血球以外の細胞と比べてＨＬＡの発現が高いことから、ＨＬＡクラスＩに対するＡＳＨｍＡｂであっても、白血球に対して優先的に細胞障害性を示すことも十分に理解できることである。
【００５６】
このようにして、本発明では、ドナーとレシピエントで発現するＨＬＡのアリルの違いを利用して、いずれかでのみ発現するＨＬＡアリルに対して特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体を利用することにより、ドナーまたはレシピエントの細胞のみを殺すことができる。従って、本発明では、この原理を用いて、様々な同種移植拒絶に伴う疾患を処置することができる。
【００５７】
本発明の同種移植拒絶に伴う疾患の処置は、同種移植拒絶に伴う疾患の処置は、治療上有効量の本発明の抗体若しくはその機能断片またはこれらを含んでなる医薬組成物をその処置を必要とする患者に投与することにより行ってもよい。
【００５８】
本発明によれば、さらに、ＧＶＨＤモデル動物が提供される。本発明のＧＶＨＤモデル動物としては、特に限定されないが、齧歯類および霊長類などの哺乳類の非ヒト動物、好ましくはマウスを用いることができる。本発明のＧＶＨＤモデル動物は、例えば、免疫不全動物（Blood (2002), Nov 1, 100(9): 3175-82）に、ヒトＰＢＭＣを移植して作製することができる（Transplantation (2009), 87: 1654-1658）。ヒトＰＢＭＣは、好ましくは、当業者に周知のＨＬＡ遺伝子型タイピングの方法を用いてＨＬＡアリルを特定した後に、免疫不全とした動物に移植することができる。
【００５９】
本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ヒトＰＭＢＣ移植後、約１０日間〜約１５日間でＧＶＨＤ様の症状を発症し、移植後約２週間〜約３週間で死亡する。従って、本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ＧＶＨＤ発症後であって死亡する前に、例えば、作成後約１０日〜約１４日の間に実験に使用することができる。本発明のＧＶＨＤモデル動物は、ＨＬＡアリルに対して特異的に細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体を投与してＧＶＨＤの治療効果を確かめることにより、抗体の医薬としての安全性や有効性の試験に用いることができる。
【実施例】
【００６０】
実施例１：アリル特異的抗体（ＡＳＨｍＡｂ）の産生ハイブリドーマの取得
本実施例では、まず、アリル特異的抗体を作製した。
【００６１】
アリル特異的抗体の作製は以下の通り行った。すなわち、アリル特異的抗体は、ヒトＨＬＡ−Ｂ５１を有するトランスジェニックマウスに対して、抗原として所望のアリルのＨＬＡをアジュバントと共に免疫し、免疫したマウスからアリル特異的抗体産生Ｂ細胞を取得し、ハイブリドーマを得ることにより、モノクローナル抗体として得た。
【００６２】
ヒトＨＬＡ−Ｂ５１を有するトランスジェニックマウスとしては、ＨＬＡ−Ｂ５１（Ｂ＊５１０１）トランスジェニックマウス（Karaki, S., Kariyone, A., Kato, N., Kano, K., Iwakura, Y., Takiguchi, M., 1993. HLA-B51 transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA-A, B-specific antibodies. Immunogenetics 37, 139）を用いた。
【００６３】
抗原としては、ＨＣＭＶｐｐ６５由来のペプチドであるＮＬＶＰＭＶＡＴＶを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ａ２テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳ−００１０−１）、ＱＹＤＰＶＡＡＬＦを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ａ９テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳ−００２０−１）、ＨＣＭＶｐｐ６５由来のペプチドであるＩＰＳＩＮＶＨＨＹを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ｂ３５テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳ−００２７−１）およびＨＥＲＮＧＦＴＶＬを提示するフィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートＨＬＡ−Ｂ６１テトラマー（株式会社医学生物学研究所製、製品番号：ＴＳＣＭ−１）を用いた。アジュバントとしては、完全アジュバント（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｆ５８８１−１０ＭＬ）および不完全アジュバント（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｆ５５０６−１０ＭＬ）を用いて、これらに対する抗体を新たに取得した。
【００６４】
初回免疫は、２００μｇの上記ＨＬＡ−Ａ２テトラマー、ＨＬＡ−Ａ９テトラマー、ＨＬＡ−Ｂ３５テトラマーまたはＨＬＡ−Ｂ６１テトラマーを完全アジュバントと共に足蹠内に注射することにより行った。２回目の免疫（追加抗原注射）は、初回免疫から１０日後に抗原を１００μｇずつ皮下注射することにより行い、アジュバントとしては、不完全アジュバントを用いた。
【００６５】
初回免疫から１３日後に、トランスジェニックマウスからリンパ節由来のＢ細胞を得て、ＰＥＧ法によりミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と細胞融合させた。具体的には、リンパ節由来のＢ細胞とミエローマ細胞（ＳＰ２／０）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｄ５７９６）で洗浄し、ペレットにした後、ＰＥＧ溶液（Stem Cell Technology社製、製品番号：０３８０６）を滴下により加えて細胞を再懸濁した。その後、ＤＭＥＭ（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ｄ５７９６）４ｍＬを滴下により加えた。さらに１０ｍＬのＤＭＥＭを添加した後、細胞懸濁液を１０％ＣＯ２雰囲気下３７℃で５分間インキュベートした。融合した細胞は、ＤＭＥＭで１回洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁した後に、一晩培養した。翌日、細胞は、メチルセルロースベースのヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地（Medium D）（Stem Cell Technology社製、製品番号：０３８０４）に懸濁して１０ｃｍディッシュに播種した。１０日後、ハイブリドーマ細胞コロニーをピックアップして、ＤＭＥＭを満たした９６ウェルディッシュに継代した。継代後、ハイブリドーマは、添加物として１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製、製品番号：１００９９−１４１）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社製、製品番号：１０３７８）、１０％  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（Stem Cell Technology社製、製品番号：０３８０５）を加えたＤＭＥＭを用いて培養した。
【００６６】
実施例２：ＡＳＨｍＡｂ産生ハイブリドーマ細胞の選択
本実施例では、実施例１で得られたハイブリドーマ細胞からアリル特異的な抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマを選択した。
【００６７】
まず、抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマを選択するため、Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ９６ウェルプレート（ヌンク社製、製品番号：１５０２８８）を５０μＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）に希釈した１ｍｇ／ｍＬのＨＬＡを用いてコーティングした。コーティングは、３７℃で３時間行い、次いで、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、５％乾燥ミルクおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ギブコ社製、製品番号：１４２００）を用いてプレートをブロッキングした。抗ビオチン、抗ストレプトアビジンおよび抗ＰＥ抗体の検出のため、ビオチン、ストレプトアビジンおよびＰＥの各１ｍｇ／ｍＬの混合物を用いてプレートをコーティングした。ハイブリドーマ細胞の培養上清をこれらのプレートに添加して３７℃で１時間インキュベートし、プレート表面のＨＬＡとハイブリドーマ細胞が産生する抗体を反応させた。ハイブリドーマ細胞が産生するＩｇＧ抗体は、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート  ｓｈｅｅｐ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ抗体（ＧＥヘルスケアー社製、製品番号：ＮＸＡ９３１−１ＭＬ）および２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（シグマアルドリッチ社製、製品番号：４５−０５３−１５００１）を用いてＥＬＩＳＡにより検出した。吸光は、λ＝４９０ｎｍにて測定した。
【００６８】
その結果、各ＨＬＡアリルのテトラマーで免疫して得られたハイブリドーマクローン数は、表１の通りであった。
【００６９】
【表１】
2015180607.tif 000002
【００７０】
表１に示されるように、いずれのＨＬＡアリルに対しても抗ＨＬＡ抗体を産生するハイブリドーマを得ることができた。
【００７１】
実施例３：ＡＳＨｍＡｂの取得
本実施例では、実施例２で取得した抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマ細胞から、ＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験により、アリル特異的抗ＨＬＡ抗体産生ハイブリドーマ細胞を取得した。
【００７２】
ＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験（One Lambda社製、製品番号：Ｇｒｏｕｐ１：ＦＬ１ＨＤ０１、Ｇｒｏｕｐ２：ＦＬ１ＨＤ０２、Ｇｒｏｕｐ３：ＦＬ１ＨＤ０３）は、製造者マニュアルに従って行った。まず、精製ＨＬＡクラスＩ抗原でコーティングした３２種の異なるマイクロビーズ（すべての共通ＨＬＡ抗原をカバーする）のプールを用いて、アリル特異的抗ＨＬＡモノクローナル抗体（ＡＳＨｍＡｂ）をフローサイトメトリーにより検出した。すなわち、９μＬのハイブリドーマ培養上清を０．５μＬのＦｌｏｗＰＲＡクラスＩビーズとインキュベートし、次いで、ビーズを洗浄し、予め滴定したフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート  ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ社製、製品番号：Ａ−２１２３５）により染色した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシズ社製、製品番号：３４２９７５）を用いて測定した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製、Version 9.5.2）を用いて解析した。
【００７３】
得られたＡＳＨｍＡｂのアイソタイプは、ｍＡｂ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、製品番号：ＭＭＴ１）を用いて決定した。
【００７４】
ヘパリン処理済みの血液１０ｍＬを２人の健常者から得た。これらの健常者のＨＬＡの血清学的タイピングは、ＨＬＡ−ＤＮＡ  ＭｉｃｒｏＳＳＰ（商標）タイピングキット（One Lambda社製、製品番号：ＳＳＰ１ＡＢ）を用いて製造者マニュアルに従って行った。２人の健常者のうち、１人は、各ＨＬＡアリルのいずれかを発現することが示された健常者であった。サンプルは、リンホセパールＩ（免疫生物研究所社製、製品番号：２３０１０）を用いて遠心分離し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。各ＨＬＡアリルを発現するＰＢＭＣは、得られたＡＳＨｍＡｂ、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５７８３２）、６−２Ｈ６（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）またはアイソタイプ対照抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５７２７３）を用いて染色した。蛍光強度は、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンシズ社製）を用いて測定した。フローサイトメトリーのデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。
【００７５】
その結果、得られた各ＨＬＡアリルに対する特異的抗体（ＡＳＨｍＡｂ）ハイブリドーマクローン数は、表２の通りであった。
【００７６】
【表２】
2015180607.tif 000003
【００７７】
得られたハイブリドーマ細胞は、常法により一部を凍結保存した。
【００７８】
実施例４：細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの取得
本発明で使用する細胞傷害作用を持つアリル特異的抗ＨＬＡモノクローナル抗体（以下、「細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ」ということがある）を同定するため、実施例３によりえられたハイブリドーマすべてをストックから起こし、実施例１に記載の培地で培養した。２回継代後、細胞が対数増殖期にあると判断された時点で抗体を含む培養上清の一部（１０ｍｌ）をそれぞれ回収した。２４穴プレートの各ウェルには、回収した培養上清３５０μＬと、ＨＬＡが判明している各１×１０６個の健常人末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（(i)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性かつＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陰性のＰＢＭＣ、(ii)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性かつＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陽性のＰＭＢＣ、(iii)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性かつＨＬＡ−Ａ＊２４：０２陰性のＰＭＢＣ）とを加え、さらに補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製  Ｓｔｅｒｉｌｅ  ｂａｂｙ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）３０％（１５０μｌ）を加えた。３７℃、１０％ＣＯ２の条件で２４時間培養後、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）により細胞染色を行い、フローサイトメーターを用いて有核細胞における死細胞の割合を求めた。この結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＡＳＨｍＡｂの中に細胞傷害作用を持つ抗体３種類とＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＡＳＨｍＡｂの中に細胞傷害性を持つ抗体３種類（図２）が同定された。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＡＳＨｍＡｂを用いた細胞傷害試験の結果は図１Ａに示し、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＡＳＨｍＡｂを用いた細胞傷害試験の結果は図１Ｂに示す。いずれの抗体も、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１を発現する細胞またはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２を発現する細胞のどちらかに対してのみ細胞傷害性を示したことから（図１ＡおよびＢ）、細胞傷害性ＡＳＨｍＡｂであることが明らかとなった。なお、本実施例では、ＰＢＭＣはリンホセパールＩ（免疫生物研究所製、製品番号：２３０１０）を用いて健常人末梢血より分離したものを用いた。
【００７９】
次に、実施例３に記載のＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験により、得られた３種類のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＡＳＨｍＡｂのうち２種類についてアリル特異性の高さを再検証したところ、１種類は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のみと特異的に反応したが（図３右上）、もう１種類はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に加えＨＬＡ−Ａ＊０３：０１とも特異的に反応した（図３右下）。また、実施例３に記載のＦｌｏｗＰＲＡスクリーング試験により、得られた３種類のＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に対するＡＳＨｍＡｂについてアリル特異性を検証したところ、２種類は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２とのみ特異的に反応したが、もう１種類は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に加えＨＬＡ−Ａ＊２３：０１とも特異的に反応した（データ示さず）。さらに、いずれの抗体も、上記以外の他のＨＬＡアリルとは反応しなかったことから、高いＨＬＡアリル特異性を有することが示された。従って、この結果からも、これらの抗体は、ＨＬＡの特定のアリルを発現する細胞に対して細胞障害性を示す抗体であることが明らかとなった。
【００８０】
さらに、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のみと特異的に反応する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを酸性するハイブリドーマクローンをマウスに移植して、その後抗体を精製した。具体的には、ハイブリドーマクローンを、予めプリスタン５００μＬ（フナコシ社製、製品番号：９８０−６０５４２）を投与したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹腔内に１×１０７個接種し、約１０日後に腹水を回収した。回収した腹水をプロテインＧセファロースカラム（ＧＥヘルスケア社製、製品番号：１７−０６１８−０２）に通し、抗体の精製を行った。精製した抗体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた結果、抗体のＨ鎖およびＬ鎖に由来する２本のバンド以外には、バンドは検出されず、抗体が十分な精製度を有することが確認された。さらに得られた抗体をＭｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＡｂＤ  ｓｅｒｏｔｅｃ社製、製品番号：ＭＭＴ１）を用いて調べたところ、抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ａ型であることが判明した。
【００８１】
実施例５：細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの細胞障害作用の評価
本実施例では、実施例４で精製したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１のみに特異性を有する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを用いて、まず、細胞染色能力を確認し、その後、細胞障害作用を評価した。
【００８２】
まず、実施例４で精製した抗体を用いて、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性の健常人由来のＰＢＭＣの細胞染色を行った。細胞染色では、負の対照としては、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５７２７３）を用い、正の対照としては、Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＬＡ  Ａ２（ＦＩＴＣ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５１２８５）を用いた。実施例４で精製した細胞障害性ＡＳＨｍＡｂは、１μｇ、３μｇおよび５μｇの３段階の用量で用いた。実施例４で得られた細胞障害性ＡＳＨｍＡｂおよび負の対照で使用した抗体は、それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（インビトロジェン社製、製品番号：Ａ−１１００１）を２次抗体として蛍光標識し、細胞を染色した。この細胞障害性ＡＳＨｍＡｂはいずれの量においても正の対照と比較して、十分な細胞染色能力を有することが明らかとなった。
【００８３】
次に、ハイブリドーマ培養上清を実施例４で精製した抗体に変更する以外は、実施例４で記載された方法と同様の方法により、得られた抗体の細胞障害性を確認した。具体的には、まず、２４穴プレートの各ウェルに、実施例４で精製した１０μｇ、３０μｇまたは５０μｇの抗体と、ＨＬＡが判明している各１×１０６個の健常人末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（(i)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性のＰＢＭＣ、(ii)ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性のＰＢＭＣ）とを含む１ｍＬの培地を加え、さらに補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製  Ｓｔｅｒｉｌｅ  ｂａｂｙ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）３０％を加えた。次に、３７℃、１０％ＣＯ２の条件で２４時間培養後、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）により細胞染色を行い、フローサイトメーターを用いて、有核細胞中の死細胞の割合を求めた。この結果、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂは、１０μｇでも十分に殺細胞作用を有することを確認した（図２）。
【００８４】
実施例６：インビボにおける細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの有効性および安全性の検証
本実施例では、まず、ＨＬＡが判明しているヒトＰＢＭＣを免疫不全マウスに移植して、ヒトマウス骨髄キメラマウスを作製し、得られたＧＶＨＤモデルマウスにヒトＰＢＣＭに対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを投与することにより、生体内における細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの有効性および安全性を検証した。
【００８５】
まず、以下の方法により、ヒトマウス骨髄キメラマウスを作製した。すなわち、東京都赤十字センター研究用臍帯血バンクから提供された臍帯血からＰＢＭＣを分離し、フローサイトメーターを用いて、ＨＬＡのタイピングを行った。ＨＬＡタイピングは、ａｎｔｉ  ＨＬＡ−Ａ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＦＩＴＣ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、製品番号：５５１２８５）を用いた細胞染色により、ＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性（＋）細胞または陰性（−）細胞の２種類に分けることにより行った。ＨＬＡタイピング後、ＣＤ３４  ｍｉｃｒｏ  ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、製品番号：１３０−０４６−７０３）を用いてＰＢＭＣ中のＣＤ３４陽性細胞を分離し、２Ｇｙの放射線照射後、１×１０５個を免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）に移植することにより、ヒトマウス骨髄キメラマウスを作製した。
【００８６】
移植後８週間が経過した時点で、ヒトマウス骨髄キメラマウス中でヒト由来の細胞が生着していることを確認するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（ＰＥ）、ＣＤ４５（ＡＦ４０５）、ＰＩで細胞染色後、フローサイトメーターを用いて血液検査を行った。負の対照としては、Ｉｎｔａｃｔ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅのＰＢＭＣを用い、正の対照としては、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性のＰＢＭＣを用いて、ヒトＰＢＭＣの生着を確認した。本実施例では、これらの対照に加えて、さらに正の対照と負の対照の混合物を用いて、ヒトＰＢＭＣの生着を確認する実験も行った。ヒトＰＢＭＣの生着が確認されたマウスには、すぐに実施例４で精製した細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ  ０．５ｍｇを静脈注射し、投与１日後および投与７日後にヒトＰＢＭＣの生着の確認を行った。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性細胞を移植した群では、細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ投与後も細胞の生着には特に変化が見られなかったが、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞を移植した群においては、細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの投与２４時間後には生着細胞の大幅な減少が見られた（図４）。なお、抗体投与による外見上の副作用は特になく、抗体投与を受けたマウスは、その後も長期に生存した。また、同量の抗体を同じ条件で腹腔内に投与した場合にも、同様の結果が得られた（図５）。このことから、生体内における細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの有効性および安全性が確認された。
【００８７】
これらの結果から、ＨＬＡアリル特異的な細胞傷害性を示す抗ＨＬＡ抗体は、ＧＶＨＤの処置に用いることができることが示された。また、本実施例のヒトマウス骨髄キメラマウスはＧＶＨＤモデル動物として利用できることが示された。
【００８８】
実施例７：造血幹細胞移植後のＧＶＨＤの治療実験
本実施例では、実施例６で得られたＧＶＨＤモデルマウスに細胞障害性ＡＳＨｍＡｂを投与して、ＧＶＨＤの症状、例えば、体重減少、皮膚の掻痒（pruritus）、紅斑（erythema）、浮腫（Edema/papulation）、擦創（excoriation）、および、ふけ／乾燥（scaling/dryness）に対する治療効果を確認する。
【００８９】
ＧＶＨＤモデルマウスが示すＧＶＨＤの症状の改善は、以下の評点（クリニカルスコア）に基づいて評価する。
【００９０】
体重減少
３点：体重減少が激しい 
２点：体重減少が中程度である
１点：体重減少がほとんど見られない
皮膚の掻痒
３点：掻痒が激しい
２点：掻痒が中程度である
１点：掻痒がほとんど見られない
皮膚の紅斑
３点：全体的に赤みがかっている
２点：部分的に赤みがかっている
１点：薄いピンク色である
皮膚の浮腫
３点：浮腫が全体的であり、激しい
２点：浮腫が全体的であり、中程度である
１点：浮腫が部分的である
皮膚の擦創
３点：擦創が激しい
２点：擦創が中程度である（一目して擦創が発見される）
１点：擦創がほとんど見られない（見つけにくい）
ふけ・乾燥
３点： 程度が激しい
２点：中程度である
１点：ほとんど見られない
【００９１】
前記ＧＶＨＤモデルマウスに対して、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂ  ０．５μｇを含むＰＢＳ溶液を静脈注射する。その後、上記クリニカルスコアに基づいてＧＶＨＤの症状に対する細胞障害性ＡＳＨｍＡｂの効果を検証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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