(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素反応による２’−置換型ヌクレオシドの代替的な製造方法の提供。【解決手段】ヌクレオシド生成活性を有する酵素の存在下において２’−置換型糖供与体ヌクレオシド及び糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを生成することを含む、２’−置換型ヌクレオシドの製造方法。ヌクレオシド生成活性を有する酵素としては、例えば、以下が挙げられる：タンパク質群１）（１Ａ）特定な配列のアミノ酸配列からなるタンパク質；（１Ｂ）特定な配列のアミノ酸配列を含むタンパク質；（１Ｃ）特定な配列のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；並びに（１Ｄ）特定な配列のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド生成活性を有する酵素の存在下において２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを生成することを含み、
２’−置換型糖供与体ヌクレオシドが、２’−置換型ウリジン、２’−置換型シチジン、２’−置換型プリンヌクレオシド、および２’−置換型ヒポキサンチンヌクレオシドからなる群より選ばれ、
糖受容体核酸塩基が、置換されていてもよいプリン、置換されていてもよいヒポキサンチン、置換されていてもよいウラシル、および置換されていてもよいシトシンからなる群より選ばれる、２’−置換型ヌクレオシドの製造方法。
【請求項２】
前記酵素が、ヌクレオシド生成活性として核酸塩基交換活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、ヌクレオシド生成活性として加水分解活性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
２’−置換型ヌクレオシドの生成が、前記酵素を発現する微生物を利用して行われる、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アグロサイベ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ）属、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、オーストウィッキア（Ａｕｓｔｗｉｃｋｉａ）属、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属、フラボラス（Ｆｌａｖｏｌｕｓ）属、グロエオフィラム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、レンチナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロエロスボスポリア（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏｓｂｏｓｐｏｒｉａ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａ）属、パナオラス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ホリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属、サイロサイベ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ストロファリア（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ）属、およびトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に属する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が、下記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質である、請求項１記載の方法：
タンパク質群１）
（１Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（１Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；
タンパク質群２）
（２Ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２Ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（２Ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；ならびに
タンパク質群３）
（３Ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（３Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３Ｃ）配列番号９のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（３Ｄ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質。
【請求項７】
前記酵素が、下記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項１記載の方法：
ポリヌクレオチド群１）
（１ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（１ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（１ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチド群２）
（２ａ）配列番号１６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２ｂ）配列番号１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（２ｄ）配列番号１６のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
ポリヌクレオチド群３）
（３ａ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（３ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（３ｃ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（３ｄ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記微生物が、下記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質、または下記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現するように形質転換された微生物である、請求項４記載の方法：
タンパク質群１）
（１Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（１Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；
タンパク質群２）
（２Ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２Ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（２Ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；ならびに
タンパク質群３）
（３Ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（３Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３Ｃ）配列番号９のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（３Ｄ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；ならびに
ポリヌクレオチド群１）
（１ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（１ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（１ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチド群２）
（２ａ）配列番号１６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２ｂ）配列番号１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（２ｄ）配列番号１６のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
ポリヌクレオチド群３）
（３ａ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（３ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（３ｃ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（３ｄ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
２’−置換型糖供与体ヌクレオシドが２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドであり、２’−置換型ヌクレオシドが２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドである、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドが２’−Ｏ−置換型ウリジンであり、糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいプリンである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドが、２’位の炭素原子に結合しているヒドロキシル基中の水素原子がＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されたヌクレオシドである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
下記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、ならびにタンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質：
タンパク質群１）
（１Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（１Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；ならびに
タンパク質群２）
（２Ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２Ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（２Ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質。
【請求項１３】
下記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
ポリヌクレオチド群１）
（１ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（１ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（１ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
ポリヌクレオチド群２）
（２ａ）配列番号１６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２ｂ）配列番号１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（２ｄ）配列番号１６のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または請求項１３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項１６】
微生物がエシェリヒア・コリである、請求項１５記載の微生物。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載の微生物を用いて、請求項１２記載のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２’−置換型ヌクレオシドの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシドホスホリラーゼは、反応式「ヌクレオシド＋ホスフェート＝核酸塩基＋ペントース−１−ホスフェート」（可逆反応）を触媒する酵素である。ヌクレオシドホスホリラーゼとしては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．１）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．２）、ウリジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．３）、チミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．４）が知られている。
【０００３】
置換型ヌクレオシドの製造方法としては、ホスホリラーゼを利用する２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの生物学的製造方法が知られている。例えば、特許文献１は、このような方法として、２’，３’−ジデオキシウリジンと無機リン酸もしくはその塩とアデニン、ヒポキサンチン、グアニンまたはチミンに、ヌクレオシドホスホリラーゼを発現する微生物を作用させて、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシイノシン、２’，３’−ジデオキシグアノシンまたは２’，３’−ジデオキシチミジンを生成する方法を開示している。また、非特許文献１は、ホスホリラーゼを利用するヌクレオシドアナログ（リバビリン）の生物学的製造方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１−２５７４８８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｉｄｅｙｕｋｉ  ＳＨＩＲＡＥおよびＫｅｎｚｏ  Ｙｏｋｏｚｅｋｉ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，５５（７），１８４９−１８５７，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らが知る限り、酵素反応による２’−置換型ヌクレオシドの製造方法は、これまで報告されていない。本発明の目的は、酵素反応による２’−置換型ヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを生成する能力を有する酵素が存在すること、よって、酵素反応によりこれらの材料から２’−置換型ヌクレオシドを製造できることを見出した。本発明者らはまた、後述するような新規かつ予想外の核酸塩基交換活性を有する酵素により、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを製造できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ヌクレオシド生成活性を有する酵素の存在下において２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを生成することを含み、
２’−置換型糖供与体ヌクレオシドが、２’−置換型ウリジン、２’−置換型シチジン、２’−置換型プリンヌクレオシド、および２’−置換型ヒポキサンチンヌクレオシドからなる群より選ばれ、
糖受容体核酸塩基が、置換されていてもよいプリン、置換されていてもよいヒポキサンチン、置換されていてもよいウラシル、および置換されていてもよいシトシンからなる群より選ばれる、２’−置換型ヌクレオシドの製造方法。
〔２〕前記酵素が、ヌクレオシド生成活性として核酸塩基交換活性を有する、〔１〕の方法。
〔３〕前記酵素が、ヌクレオシド生成活性として加水分解活性を有する、〔１〕の方法。
〔４〕２’−置換型ヌクレオシドの生成が、前記酵素を発現する微生物を利用して行われる、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕前記微生物が、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アグロサイベ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ）属、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、オーストウィッキア（Ａｕｓｔｗｉｃｋｉａ）属、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属、フラボラス（Ｆｌａｖｏｌｕｓ）属、グロエオフィラム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、レンチナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロエロスボスポリア（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏｓｂｏｓｐｏｒｉａ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａ）属、パナオラス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ホリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属、サイロサイベ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ストロファリア（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ）属、およびトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に属する、〔４〕の方法。
〔６〕前記酵素が、下記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質である、〔１〕の方法：
タンパク質群１）
（１Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（１Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；
タンパク質群２）
（２Ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２Ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（２Ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；ならびに
タンパク質群３）
（３Ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（３Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３Ｃ）配列番号９のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（３Ｄ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質。
〔７〕前記酵素が、下記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドによりコードされる、〔１〕の方法：
ポリヌクレオチド群１）
（１ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（１ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（１ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチド群２）
（２ａ）配列番号１６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２ｂ）配列番号１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（２ｄ）配列番号１６のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
ポリヌクレオチド群３）
（３ａ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（３ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（３ｃ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（３ｄ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
〔８〕前記微生物が、上記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質、または上記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現するように形質転換された微生物である、〔４〕の方法。
〔９〕２’−置換型糖供与体ヌクレオシドが２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドであり、２’−置換型ヌクレオシドが２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドが２’−Ｏ−置換型ウリジンであり、糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいプリンである、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドが、２’位の炭素原子に結合しているヒドロキシル基中の水素原子がＣ１〜Ｃ６アルキル基で置換されたヌクレオシドである、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１２〕上記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、ならびにタンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質。
〔１３〕上記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド。
〔１４〕〔１２〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または〔１３〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１５〕〔１４〕の発現ベクターで形質転換された微生物。
〔１６〕微生物がエシェリヒア・コリである、〔１５〕の微生物。
〔１７〕〔１５〕または〔１６〕の微生物を用いて、〔１２〕のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、酵素反応により２’−置換型ヌクレオシドを製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と各種糖受容体塩基を原料とする２’−Ｏ−メチルヌクレオシドの製造（２‘−Ｏ−メチルウリジンと各種塩基からの糖転移反応）を示す図である。
【図２】図２は、糖供与体（２’−Ｏ−メチルグアノシン）と各種糖受容体塩基を原料とする２’−Ｏ−メチルヌクレオシドの製造（２’−Ｏ−メチルグアノシンと各種塩基からの糖転移反応）を示す図である。
【図３】図３は、様々な初発添加濃度の糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体塩基（３０ｍＭ  アデニン）を原料とする２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドの製造を示す図である。低濃度アデニン（３０ｍＭ）存在下における初発２’−Ｏ−メチルウリジン添加量の影響を評価するために行った。グラフ内の数値は、２’−Ｏ−アデノシンの合成収率を示す。
【図４】図４は、様々な初発添加濃度の糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体塩基（１Ｍ  アデニン）を原料とする２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドの製造を示す図である。高濃度アデニン（１Ｍ）存在下における初発２’−Ｏ−メチルウリジン添加量の影響を評価するために行った。グラフ内の数値は、２’−Ｏ−アデノシンの合成収率を示す。
【図５】図５は、各種緩衝液存在下における糖供与体（５００ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体塩基（アデニン）を原料とする２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドの製造を示す図である。低濃度アデニン（３０ｍＭ）存在下における各種緩衝液の影響を評価するために行った。
【図６】図６は、各種緩衝液存在下における糖供与体（１．５Ｍ  ２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体塩基（アデニン）を原料とする２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドの製造を示す図である。高濃度アデニン（１Ｍ）存在下における各種緩衝液の影響を評価するために行った。
【図７】図７は、本発明の酵素による糖供与体（例、２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体（アデニン）からの２’−Ｏ−メチルアデノシン製造の各種反応の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ヌクレオシド生成活性を有する酵素の存在下において２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを生成することを含む、２’−置換型ヌクレオシドの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明では、用語「ヌクレオシド生成活性」とは、糖および核酸塩基から構成される糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基を材料として、糖供与体ヌクレオシド中の糖および糖受容体核酸塩基から構成される新たなヌクレオシドを生成する活性をいい、これらの材料から新たなヌクレオシドが生成される限り、その活性のメカニズムを問わない。したがって、ヌクレオシド生成活性は、後述する核酸塩基交換活性および加水分解活性を包含するものであり、本発明では、ヌクレオシド生成活性を有する酵素は、核酸塩基交換活性、もしくは加水分解活性のいずれか、または核酸塩基交換活性および加水分解活性の双方を有していてもよい。本発明で利用される酵素または当該酵素を産生する微生物がヌクレオシド生成活性を有することは、実施例１〜１７により支持されている。
【００１３】
本発明では、用語「核酸塩基交換活性」とは、糖受容体核酸塩基が糖供与体ヌクレオシドと反応して、糖供与体ヌクレオシドを構成する糖および糖受容体核酸塩基から構成される新たなヌクレオシドを生成する活性をいう。換言すれば、核酸塩基交換活性は、加水分解反応を介さず、かつ、リン酸を要求せずに、糖供与体ヌクレオシド中の糖を、糖供与体ヌクレオシドを構成する核酸塩基から糖受容体核酸塩基に転移する活性である。核酸塩基交換活性は、新たなヌクレオシドの生成において、加水分解反応の逆反応を介在しない点で、このような逆反応を介在する後述の加水分解活性と異なる。また、核酸塩基交換活性は、新たなヌクレオシドの生成において、リン酸を要求しない点で、リン酸を要求するヌクレオシドホスホリラーゼ活性とは異なる。
酵素が核酸塩基交換活性を有することの確認は、例えば、新たなヌクレオシドの生成において、加水分解反応の逆反応を介在しないこと、およびリン酸を要求しないことの双方を確認することにより行うことができる。
新たなヌクレオシドの生成において加水分解反応の逆反応を介在しないことの確認は、例えば、以下ｉ）〜ｉｉｉ）により行うことができる：
ｉ）酵素の存在下において糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から生成する新たなヌクレオシドの量（単位時間あたり）を測定すること；
ｉｉ）酵素の存在下において糖〔ｉ）で用いられる糖供与体ヌクレオシドを構成する糖と同じ〕および糖受容体核酸塩基から生成するヌクレオシドの量（単位時間あたり）を測定すること；ならびに
ｉｉｉ）ｉ）で生成した新たなヌクレオシドの量がｉｉ）で生成したヌクレオシドの量よりも多いことを示すこと。
新たなヌクレオシドの生成においてリン酸を要求しないことの確認は、例えば、リン酸の存在下および非存在下においてｉ）またはｉｉ）の実験を行い、生成するヌクレオシドの量（単位時間あたり）に実質的に差異がないことを確認することにより、行うことができる（例えば、図７を参照）。
本発明者らが把握する限り、このような核酸塩基交換活性を有する酵素はこれまで報告されていなかったが、本発明者らは、本発明で利用される酵素がこのような新規かつ予想外の活性を有することを見出した。本発明で利用される酵素または当該酵素を産生する微生物が核酸塩基交換活性を有することは、例えば、実施例１１−１）、実施例１１−２）により支持されている。
【００１４】
本発明では、用語「加水分解活性」とは、（１）糖供与体ヌクレオシドを加水分解して糖および核酸塩基を生成する加水分解反応、ならびに糖および核酸塩基からヌクレオシドを生成する加水分解反応の逆反応の双方を触媒する活性、あるいは（２）糖および核酸塩基からヌクレオシドを生成する、加水分解反応の逆反応を触媒する活性をいう。酵素が加水分解反応を触媒する活性を有することは、酵素の存在下における糖供与体ヌクレオシドの加水分解による糖および核酸塩基の生成を測定することにより確認できる。また、酵素が加水分解反応の逆反応を触媒する活性を有することは、酵素の存在下における糖および核酸塩基からのヌクレオシドの生成を測定することにより確認できる。本発明で利用される酵素または当該酵素を産生する微生物が加水分解活性を有することは、例えば、実施例１１−１）により支持されている。
【００１５】
本発明の製造方法では、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基が材料として用いられる。
【００１６】
本発明の製造方法で材料として用いられる２’−置換型糖供与体ヌクレオシドは、２’−置換型糖および核酸塩基から構成されるヌクレオシドである。２’−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成する２’−置換型糖は、２’位の炭素原子に結合している水素原子および／またはヒドロキシル基が異なる基（以下、必要に応じて、置換基と称する）で置換されたリボース（ＲＮＡを構成する糖成分）、または２’位の炭素原子に結合している水素原子が置換基で置換された２’−デオキシリボース（ＤＮＡを構成する糖成分）である。２’−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成する核酸塩基は、ウラシル、シトシン、プリン（例、アデニン、グアニン）、およびヒポキサンチンからなる群より選ばれる。したがって、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドは、２’−置換型ウリジン、２’−置換型シチジン、２’−置換型プリンヌクレオシド（例、２’−置換型アデノシン、２’−デオキシ−２’−置換型アデノシン、２’−置換型グアノシン、２’−デオキシ−２’−置換型グアノシン）、および２’−置換型ヒポキサンチンヌクレオシドからなる群より選ばれる。
【００１７】
本発明の製造方法で材料として用いられる２’−置換型糖供与体ヌクレオシドは、２’位で置換されている。具体的には、１）２’−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成する糖成分がリボースである場合には、リボースの２’位の炭素原子に結合している水素原子および／またはヒドロキシル基、好ましくはヒドロキシル基が置換基で置換されているか、あるいは２）２’−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成する糖成分が２’−デオキシリボースである場合には、２’−デオキシリボースの２’位の炭素原子に結合している１または２個の水素原子、好ましくは１個の水素原子が置換基で置換されている。
【００１８】
本発明の製造方法で材料として用いられる２’−置換型糖供与体ヌクレオシドについて２’位の置換基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基（ＣＸ〜ＣＹは、基を構成する炭素原子数が１〜６であることを示す。以下同様。）、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシ基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニル基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシカルボニル基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニルオキシ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシカルボニル−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、アミノ基（−ＮＨ２）、モノ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、アミノ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、モノ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、ジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基が挙げられる。
【００１９】
上述したＣ１〜Ｃ６炭化水素基（またはＣ１〜Ｃ６炭化水素）は、直鎖、分岐鎖または環状の飽和または不飽和の基であり、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基（またはＣ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基（またはＣ２〜Ｃ６アルケニル）、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基（またはＣ２〜Ｃ６アルキニル）およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基（またはＣ３〜Ｃ６シクロアルキル）が挙げられるが、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基（またはＣ１〜Ｃ６アルキル）が好ましい。
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基（またはＣ１〜Ｃ６アルキル）としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基（またはＣ２〜Ｃ６アルケニル）としては、例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニルが挙げられる。
Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基（またはＣ２〜Ｃ６アルキニル）としては、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニルが挙げられる。
Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基（またはＣ３〜Ｃ６シクロアルキル）としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
【００２０】
本発明の製造方法で材料として用いられる２’−置換型糖供与体ヌクレオシドの２’位の置換基としては、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシ基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基が好ましく、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ基がより好ましい。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明の製造方法で材料として用いられる２’−置換型糖供与体ヌクレオシドは、２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドである。２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドは、２’−Ｏ−置換型糖および核酸塩基から構成されるヌクレオシドである。２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成する２’−Ｏ−置換型糖は、２’位の炭素原子に結合しているヒドロキシル基中の水素原子が置換基で置換されたリボース（ＲＮＡを構成する糖成分）である（以下、このような置換基を、必要に応じて２’−Ｏ−置換基と称する）。２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成する核酸塩基は、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドを構成するものと同様である。したがって、２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドは、２’−Ｏ−置換型ウリジン、２’−Ｏ−置換型シチジン、２’−Ｏ−置換型プリンヌクレオシド（例、２’−Ｏ−置換型アデノシン、２’−Ｏ−置換型グアノシン）、および２’−Ｏ−置換型ヒポキサンチンヌクレオシドからなる群より選ばれる。このような２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドを材料として用いることで、２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドを製造することができる。
本発明の製造方法で材料として用いられる２’−Ｏ−置換型糖供与体ヌクレオシドについて２’−Ｏ−置換基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニル基が挙げられるが、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基が好ましく、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基がより好ましい。これらの基の詳細は、上述のとおりである。
【００２２】
本発明の製造方法で材料として用いられる糖受容体核酸塩基は、置換されていてもよいプリン（例、アデニン、グアニン）、置換されていてもよいヒポキサンチン、置換されていてもよいウラシル、および置換されていてもよいシトシンからなる群より選ばれる。表現「置換されていてもよい」核酸塩基とは、無置換の核酸塩基または置換基を有する核酸塩基をいう。糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいアデニンである場合、２位もしくは８位の炭素原子に結合している水素原子、または６位の炭素原子に結合しているアミノ基中の１または２個の水素原子が置換基で置換されていてもよい。糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいグアニンである場合、１位の窒素原子に結合している水素原子、２位の炭素原子に結合しているアミノ基中の１または２個の水素原子、または８位の炭素原子に結合している水素原子が置換基で置換されていてもよい。糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいヒポキサンチンである場合、１位の窒素原子に結合している水素原子、または２位もしくは８位の炭素原子に結合している水素原子が置換基で置換されていてもよい。糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいウラシルである場合、１位の窒素原子に結合している水素原子、または４位もしくは５位の炭素原子に結合している水素原子が置換基で置換されていてもよい。糖受容体核酸塩基が置換されていてもよいシトシンである場合、４位もしくは５位の炭素原子に結合している水素原子、または６位の炭素原子に結合しているアミノ基中の１または２個の水素原子が置換基で置換されていてもよい。置換基を有する核酸塩基について置換基の数は、１〜３個であり、好ましくは１または２個である。
【００２３】
本発明の製造方法で材料として用いられる糖受容体核酸塩基について置換基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシ基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニル基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシカルボニル基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素カルボニルオキシ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素オキシカルボニル−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、アミノ基（−ＮＨ２）、モノ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、アミノ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、モノ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基、ジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ−Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基が挙げられる。これらの基の例および好ましい例は、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドの２’位の置換基について上述したものと同じである。糖受容体核酸塩基の置換基としては、アミノ基（−ＮＨ２）、モノ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基が好ましく、アミノ基（−ＮＨ２）、モノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基がより好ましい。
【００２４】
生成される２’−置換型ヌクレオシドは、糖供与体ヌクレオシド中の糖および糖受容体核酸塩基から構成される。糖および糖受容体核酸塩基は、上述したとおりである。
【００２５】
上記活性を有する酵素が由来する微生物としては、例えば、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アグロサイベ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ）属、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、オーストウィッキア（Ａｕｓｔｗｉｃｋｉａ）属、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属、フラボラス（Ｆｌａｖｏｌｕｓ）属、グロエオフィラム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、レンチナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロエロスボスポリア（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏｓｂｏｓｐｏｒｉａ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａ）属、パナオラス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ホリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属、サイロサイベ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ストロファリア（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ）属、およびトラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。これらの微生物のうち、乳酸菌の使用もまた好ましい。乳酸菌は、上述した微生物のうち、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物である。
【００２６】
アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、例えば、アクチノマイセス・アルボシアネウス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｃｙａｎｅｕｓ）が挙げられる。アグロサイベ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ）属に属する微生物としては、例えば、アグロサイベ・プラエコックス（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ｐｒａｅｃｏｘ）が挙げられる。アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、例えば、アグロマイセス・エスピー（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）が挙げられる。オーストウィッキア（Ａｕｓｔｗｉｃｋｉａ）属に属する微生物としては、例えば、オーストウィッキア・ケロネー（Ａｕｓｔｗｉｃｋｉａ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）が挙げられる。コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コプリナス・フルイクチドスポラス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｐｈｌｙｃｔｉｄｏｓｐｏｒｕｓ）、およびコプリナス・リゾホラス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｒｈｉｚｏｐｈｏｒｕｓ）が挙げられる。コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、コリオラス・フリクチドスポラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｐｈｌｙｃｔｉｄｏｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する微生物としては、例えば、フラムリナ・バーチペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｒｔｉｐｅｓ）が挙げられる。フラボラス（Ｆｌａｖｏｌｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、フラボラス・アーキュラリウス（Ｆｌａｖｏｌｕｓ  ａｒｃｕｌａｒｉｕｓ）が挙げられる。グロエオフィラム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属に属する微生物としては、例えば、グロエオフィラム・セピアリウム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｅｐｉａｒｉｕｍ）、グロエオフィラム・ストリアタム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ）、およびグロエオフィラム・トラベウム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｔｒａｂｅｕｍ）が挙げられる。ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、ラクトバシルス・ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバシルス・カーバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバシルス・デルブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバシルス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｌｉ）、およびラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が挙げられる。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。レンチナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、レンチナス・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ）が挙げられる。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属に属する微生物としては、例えば、ロイコノストック・デクストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｄｅｘｔｒａ���ｉｃｕｍ）、およびロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）が挙げられる。ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物としては、例えば、ミクロバクテリウム・エスピー（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）が挙げられる。ミクロエロスボスポリア（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏｓｂｏｓｐｏｒｉａ）属に属する微生物としては、例えば、ミクロエロスボスポリア・ビオラセア（Ｍｉｃｒｏｅｌｌｏｓｂｏｓｐｏｒｉａ  ｖｉｏｌａｃｅａ）が挙げられる。ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａ）属に属する微生物としては、例えば、ミクロモノスポラ・チャルシー（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｈａｌｃｅａ）が挙げられる。パナオラス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、パナオラス・シフィンクチリナス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ  ｓｐｈｉｎｃｔｒｉｎｕｓ）が挙げられる。ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物としては、例えば、ペディオコッカス・アシヂラクチシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびペディオコッカス・ペントサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）が挙げられる。ホリオタ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）属に属する微生物としては、例えば、ホリオタ・アルリベラ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ａｕｒｉｖｅｌｌａ）、およびホリオタ・リモネラ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｌｉｍｏｎｅｌｌａ）が挙げられる。サイロサイベ（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ）属に属する微生物としては、例えば、サイロサイベ・アルゲンチペス（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ａｒｇｅｎｔｉｐｅｓ）が挙げられる。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属に属する微生物としては、例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が挙げられる。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物としては、例えば、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・オリヴォクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、およびストレプトマイセス・リモサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ）が挙げられる。ストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物としては、例えば、ストレプトバーチシリウム・ブラスマイセチカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｌａｓｍｙｃｅｔｉｃｕｍ）が挙げられる。ストロファリア（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ）属に属する微生物としては、例えば、ストロファリア・ルゴソアンヌラタ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ  ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ）が挙げられる。トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属に属する微生物としては、例えば、トラメテス・ビットタタ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｂｉｔｔａｔａ）、トラメテス・シンナバリナ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎａ）、およびトラメテス・サングイネア（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅａ）が挙げられる。
【００２７】
本発明に関連して、ラクトバシルス・ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）  ＬＢＫ７８株が、下記寄託機関に寄託されている。受託番号が付与された菌株は、受託番号を参照の上、所定の手続により分譲を受けることができる。
名称：ＡＪ１１１０５７
受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５８１
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
寄託機関住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
上記寄託機関に受託された日：２０１３年３月２６日
【００２８】
本発明に関連して、オーストウィッキア・ケロネー（Ａｕｓｔｗｉｃｋｉａ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）  ＮＢＲＣ１０５２００株は、下記分譲機関から所定の手続により分譲を受けることができる。
名称：ＮＢＲＣ１０５２００
分譲機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター
分譲機関住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
【００２９】
一実施形態では、上記活性を有する酵素は、下記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれる：
タンパク質群１）
（１Ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（１Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；
タンパク質群２）
（２Ａ）配列番号１７のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２Ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２Ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（２Ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；ならびに
タンパク質群３）
（３Ａ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（３Ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３Ｃ）配列番号９のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質；および
（３Ｄ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有する、タンパク質。
【００３０】
アミノ酸残基の変異に関連して、用語「１または数個」は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。用語「１又は数個」が示す数は、例えば１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、さらにより好ましくは１〜２０個、最も好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。（１Ｃ）、（２Ｃ）および（３Ｃ）のタンパク質は、所定の条件（例、５０℃、ｐＨ７．０）下で、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の約５０％以上の活性、好ましくは約８０％以上の活性、より好ましくは約９０％以上の活性、さらにより好ましくは約１００％以上の活性を保持していることが望ましい。
【００３１】
アミノ酸配列において変異を導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例、配列番号２で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。
【００３２】
アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００３３】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性％（例、同一性％、類似性％）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、またはＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性％を計算してもよい。また、相同性％としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙまたはｉｄｅｎｔｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。相同性％として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。（１Ｄ）、（２Ｄ）および（３Ｄ）のタンパク質は、所定の条件（例、５０℃、ｐＨ７．０）下で、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の約５０％以上の活性、好ましくは約８０％以上の活性、より好ましくは約９０％以上の活性、さらにより好ましくは約１００％以上の活性を保持していることが望ましい。
【００３４】
上記活性を有する酵素はまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。酵素に付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
【００３５】
別の実施形態では、上記活性を有する酵素は、下記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドによりコードされる：
ポリヌクレオチド群１）
（１ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（１ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（１ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
ポリヌクレオチド群２）
（２ａ）配列番号１６のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２ｂ）配列番号１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（２ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（２ｄ）配列番号１６のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；ならびに
ポリヌクレオチド群３）
（３ａ）配列番号８のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（３ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（３ｃ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（３ｄ）配列番号８のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ヌクレオシド生成活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、上述した微生物、好ましくは乳酸菌、より好ましくはラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、さらにより好ましくはラクトバシルス・ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）に由来し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のタンパク質をコードするものであってもよい。
【００３７】
ヌクレオチド配列の同一性は、上述した方法により決定することができる。
【００３８】
「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、高い同一性％を示す実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い同一性％を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。（１ｃ）、（２ｃ）および（３ｃ）、ならびに（１ｄ）、（２ｄ）および（３ｄ）のポリヌクレオチドによりコードされる酵素は、所定の条件（例、５０℃、ｐＨ７．０）下で、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の約５０％以上の活性、好ましくは約８０％以上の活性、より好ましくは約９０％以上の活性、さらにより好ましくは約１００％以上の活性を保持していることが望ましい。本発明のポリヌクレオチドはまた、５’末端または３’末端に、上述したような他のペプチド成分（例、タグ部分）をコードするポリヌクレオチドを有していてもよい。
【００３９】
一実施形態では、上記活性を有する酵素の存在下における２’−置換型ヌクレオシドの生成は、前記酵素を発現する微生物を利用して行われてもよい。２’−置換型ヌクレオシドの生成における微生物の利用とは、前記酵素を発現する微生物を直接的または間接的に利用して、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基から２’−置換型ヌクレオシドを生成することをいい、例えば、微生物を用いた発酵法、ならびに／あるいは微生物の培養物、培養物より分離した微生物菌体、および微生物の菌体処理物（例、菌体の破砕物、溶菌物、凍結乾燥物）の使用が挙げられる。微生物の培養は、適切な培養培地中で行われる。このような培養培地は、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素を含んでいてもよい。培養培地はまた、適切なミネラル（例、マグネシウム）、他の栄養源、緩衝液などを含んでいてもよい。培養培地としてはまた、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている培地を用いることもできる。微生物の培養中に、基質（２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基）が補充されてもよい。例えば、基質は、バッチ法またはフィード法により培養物に添加されてもよい。
【００４０】
前記酵素を発現する微生物は、天然の微生物であっても形質転換体であってもよいが、形質転換体が好ましい。天然の微生物としては、例えば、上述した微生物が挙げられる。形質転換体としては、例えば、上記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質、または上記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を発現するように形質転換された微生物（以下、必要に応じて「形質転換体」と称する）が挙げられる。形質転換体は、例えば、上記タンパク質群１）中の（１Ａ）〜（１Ｄ）、タンパク質群２）中の（２Ａ）〜（２Ｄ）、ならびにタンパク質群３）中の（３Ａ）〜（３Ｄ）からなる群より選ばれるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または上記ポリヌクレオチド群１）中の（１ａ）〜（１ｄ）、ポリヌクレオチド群２）中の（２ａ）〜（２ｄ）、ならびにポリヌクレオチド群３）中の（３ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。具体的には、形質転換された微生物は、後述する方法に準じて作製することができる。
【００４１】
別の実施形態では、上記活性を有する酵素の存在下における２’−置換型ヌクレオシドの生成は、上記活性を有する酵素（抽出酵素）を直接的に用いて行われてもよい。上記活性を有する酵素（抽出酵素）としては、例えば、未精製の酵素、粗精製酵素、および精製酵素が挙げられる。このような場合、上記活性を有する酵素、２’−置換型糖供与体ヌクレオシドおよび糖受容体核酸塩基をそれぞれ適量含む緩衝液（例、リン酸カリウム緩衝液）中で行うことができる。緩衝液のｐＨおよび温度は、適宜設定することができる（例、ｐＨ４．０〜８．０、２０〜６０℃）。反応時間は、生成されるべき２’−置換型ヌクレオシドの量に応じて適宜設定できる。基質が反応系中に補充されてもよい。
【００４２】
本発明の方法により得られた２’−置換型ヌクレオシドは、カラム処理、晶析処理、抽出処理等の既知の精製方法を駆使することによって、単離および／または精製することができる。２’−置換型ヌクレオシドは、塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩）の形態であってもなくてもよい。２’−置換型ヌクレオシドはまた、水和物であってもなくてもよい。
【００４３】
上述した酵素は、例えば、形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。
【００４４】
本発明の発現ベクターは、上述した酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。本発明の発現ベクターはまた、本発明のポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含むことができる。本発明の発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはまた、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、本発明の発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断をタンパク質発現後に可能にするため、本発明の発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。
【００４５】
上述した酵素を発現させるための宿主としては、任意の微生物を用いることができる。このような微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。宿主としては、ヌクレオシドの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子等の所定の遺伝子の欠損株を用いてもよい。このような欠損株を宿主として用いることにより、例えば、脱アミノ化産物等の副生物の生成を抑制できる。ヌクレオシドの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子としては、例えば、アデノシンの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子（例、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＡ２３４１９）、シチジンの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子（例、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿３９０４０８）が挙げられる。このような欠損株は、当該分野で公知である任意の方法により作製できる。また、ヌクレオシドの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子の欠損株としては、例えば、アデノシンの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子の欠損株（例、Ｃｈｏ−Ｙａｕ  Ｙｅｕｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（１８），１０２９９−１０３０７，１９８５を参照）、シチジンの脱アミノ化酵素をコードする遺伝子の欠損株（例、特開２００３−１８９９７を参照）などが知られているので、このような欠損株を宿主として用いて、本発明の形質転換体を作製してもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００４６】
本発明の形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。例えば、培養温度は１０℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．０〜８．０であってもよく、培養時間は１ｈ〜１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。
【００４７】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア  コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００４９】
また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
【００５１】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）〕。
【００５２】
得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、酵素を得ることができる。
【００５３】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
【００５４】
酵素を回収するには、以下の方法などがある。酵素は、本発明の形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、酵素を得ることができる。回収において、熱処理することを含んでいてもよい。また、溶剤処理（例、キシレン、トルエン、エタノール、イソプロピルアルコール）、界面活性剤処理（例、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、溶菌酵素処理（例：リゾチーム処理）等によりさらに処理することを含んでいてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
ヌクレオシド誘導体、核酸塩基の分析条件
＜ＴＬＣによる同定＞
１）ＴＬＣプレート：６０Ｆ２５４（メルク）
展開液：２−プロパノール／水／２５％アンモニア＝９／０．５／０．３（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：核酸塩基は、ＵＶ照射により検出する。
ヌクレオシド誘導体およびリボース誘導体は、ｐ−アニスアルデヒド／酢酸／硫酸＝０．５／５０／１（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を噴霧し、１２０℃で１〜５分加熱して発色させることにより検出する。
２）ＴＬＣプレート：６０Ｆ２５４（メルク）
展開液：酢酸エチル／メタノール／水＝１５／１／１／（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：核酸塩基、ヌクレオシド誘導体は、ＵＶ照射により検出する。
【００５７】
＜ＨＰＬＣによる定量＞
１）ヌクレオシド誘導体、核酸塩基の定量
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（ナカライテスク）  φ４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ
溶出液：０．１％リン酸含有の１００ｍＭ過塩素酸ナトリウム水溶液
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ  ２５４ｎｍ
【００５８】
２）酵素の相対分子量測定
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ製）  φ７．５ｍｍｘ６００ｍｍ
溶出液：１００ｍＭ硫酸ナトリウムおよび２００ｍＭ塩化ナトリウム含有の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出：ＵＶ  ２５４ｎｍ
分子量マーカー：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（分子量２９０，０００）、乳酸デヒドロゲナーゼ（分子量１４２，０００）、エノラーゼ（分子量６７，０００）、アデニル酸キナーゼ（分子量３２，０００）ならびにチトクロームｃ（分子量１２，４００）
【００５９】
実施例１：乾燥菌体を用いた糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体核酸塩基（アデニン）を原料とする２’−Ｏ−置換型プリンヌクレオシドの製造
乾燥菌体を以下のとおり調製した。乳酸菌をＭＲＳ培地１４ｍｌに植菌し、２８℃にて菌の十分な生育が認められるまで静置培養した。その前培養液をＭＲＳ培地４５０ｍｌに全量植菌し、２８℃にて菌の十分な生育が認められるまで静置培養した。この培養液を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）して得られた湿菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。洗浄菌体をシャーレ（内径８．５ｃｍ）に広げ、室温にて扇風機で一晩乾燥させた。その後、適量のシリカゲルを入ったデシケーターに移し、水分が除去されるまで乾燥させる。これを乳鉢で菌体が粉状になるまで粉砕し、これを乳酸菌乾燥菌体として用いた。
【００６０】
上述の方法で調製した乳酸菌乾燥菌体（スパーテル１杯分、約１０ｍｇ／ｍｌ）と３０ｍＭの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、１０ｍＭの糖受容体核酸塩基（アデニン）、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）含む反応液（全量５００μｌを３０℃で一晩振とう（１２０往復／分）した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）により菌体を除去し、ＴＬＣ分析およびＨＰＬＣ分析により糖転移産物である２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルアデノシン）を定量した。２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの生成量（ｍＭ）を表１に示す。
【００６１】
【表１】
2015037398.tif 000002
【００６２】
その結果、ラクトバシルス・ブクネリＬＢＫ７８、ラクトバシルス・ブクネリＬＢＫ１２４、ラクトバシルス・ブクネリＬＢＫ３１５、ラクトバシルス・プランタラムＬＢＫ３７８、ペディオコッカス・ペントサスＬＢＫ５８３の乾燥菌体を触媒として用いた場合に、０．１ｍＭ以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシド合成が認められた。
【００６３】
次いで、乳酸菌以外の微生物についても同様に乾燥菌体を調製し、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの生成量（ｍＭ）を上記と同様に測定した。乳酸菌以外の微生物の乾燥菌体による２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの生成量（ｍＭ）を表２、３に示す。
【００６４】
【表２】
2015037398.tif 000003
【００６５】
【表３】
2015037398.tif 000004
【００６６】
実施例２：放線菌湿菌体を用いた糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体核酸塩基（アデニン）を原料とする２’−Ｏ−置換型プリンヌクレオシドの製造
放線菌を０．１％  ２’−Ｏ−メチルウリジンを含むＧＰ培地〔０．１％リン酸二水素カリウム、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０１％酵母エキス,  ０．０３％硫酸マグネシウム・７水和物、０．２％ＮＨ４Ｃｌ、０．０５％グルコース、０．１５％ペプトン（ｐＨ７.０）〕２０ｍｌに植菌し、２８℃にて菌の十分な生育が認められるまで好気的に培養した。この培養液を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）して得られた湿菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、これを放線菌湿菌体として用いた。
【００６７】
上述の方法で調製した放線菌湿菌体と６０ｍＭの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、１００ｍＭの糖受容体核酸塩基（アデニン）、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）含む反応液（全量５００μｌを６０℃で一晩振とう（３００往復／分）した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）により菌体を除去し、ＴＬＣ分析およびＨＰＬＣ分析により糖転移産物である２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルアデノシン）を定量した。２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの生成量（ｍＭ）を表４に示す。
【００６８】
【表４】
2015037398.tif 000005
【００６９】
その結果、各放線菌の湿菌体を触媒として用いた場合、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシド合成が認められた。
【００７０】
実施例３：２’−Ｏ−メチルアデノシン合成能を有する乳酸菌の培養、無細胞抽出液の調製ならびにそれを用いた糖供与体ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体（アデニンまたはウラシル）を原料とする２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの製造
実施例１にて、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの合成が認められた乳酸菌（ＬＢＫ７８、ＬＢＫ１２４、ＬＢＫ３５１、ＬＢＫ３７８、およびＬＢＫ５８３）をＭＲＳ培地１４ｍｌに植菌し、２８℃で４８時間静置培した。別途、ＭＲＳ培地中に０．１％  ２’−Ｏ−メチルウリジンおよび０．１％  アデニンを含む培地中にてこれらの乳酸菌の培養を行った。この培養液を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）して得られた湿菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。その洗浄菌体に対し１ｍｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、得られた菌体懸濁液をマルチビーズショッカーＭＢ７０１ＰＵ（Ｓ）（安井器械製）にて細胞破砕し、これを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分）した。このようにして得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を半量（７５μｌ）と１５ｍＭの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、７．５ｍＭの糖受容体核酸塩基（アデニン）、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む反応液１５０μｌを３０℃で一晩攪半（１２０往復／分）した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシドを定量した。その結果、すべての試験菌の無細胞抽出液において、２’−Ｏ−メチルアデノシンの合成が認められた。
【００７１】
実施例４：リン酸基の存在下または非存在下におけるラクトバシルス・ブクネリＬＢＫ７８（以下ＬＢＫ７８と記す）の無細胞抽出液を用いた糖供与体ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体（アデニンまたはウラシル）を原料とする２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの製造
ＬＢＫ７８をＭＲＳ培地１４ｍｌに植菌し、２８℃で４８時間静置培養した。この培養液を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）して得られた湿菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。その洗浄菌体に対し１ｍｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、得られた菌体懸濁液をＰｏｗｅｒ  ｓｏｎｉｃ  ＭＡＸ（クボタ製）にて細胞破砕し、これを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分）した。このようにして得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を表５に示した各種２５ｍＭ緩衝液２Ｌに対して１２時間の透析を２回繰り返した。この各種緩衝液で平衡化された無細胞抽出液半量（７５μｌ）と１５ｍＭの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、７．５ｍＭの糖受容体核酸塩基（アデニン）、３７．５ｍＭ各種緩衝液（ｐＨ７．０）を含む反応液を３０℃で一晩攪半（１２０往復／分）した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシドを定量した。結果を表５に示す。
【００７２】
【表５】
2015037398.tif 000006
【００７３】
この結果より本糖転移反応にはリン酸基が関与しないこと、すなわち、ヌクレオシドホスホリラーゼにより本転移反応が触媒されるものではないことが示唆される。
【００７４】
実施例５：ＬＢＫ７８のヌクレオシド・ハイドロラーゼ（以下ＮＨと記す）の同定
下述の手順にてＬＢＫ７８のＮＨタンパク質の同定を行った。なお、ＮＨタンパク質の保有する活性（以下、必要に応じて単に「活性」と略称する）の検出は、上述の＜ＴＬＣによる同定＞  ２）または＜ＨＰＬＣによる定量＞  １）により行った。
【００７５】
１）ＬＢＫ７８をＭＲＳ培地１４ｍｌに植菌し、２８℃で４８時間静置培した。これを２Ｌ（ｘ１０本）のＭＲＳ培地に移し坂口フラスコにて２８℃で４８時間静置培養した。この培養液から遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）にて７９ｇの湿菌体を得た。
【００７６】
２）上述の湿菌体７９ｇを２４０ｍｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、Ｐｏｗｅｒ  ｓｏｎｉｃ  ＭＡＸ（クボタ製）にて３０分間破砕した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、その上清を無細胞抽出液（２５０ｍｌ、タンパク質量６０２５ｍｇ）とした。さらにその上清を超遠心分離（３６，０００ｒｐｍ、９０分）し、その上清を得た（２４５ｍｌ、タンパク質量５５８６ｍｇ）。
【００７７】
３）上記２）の超遠心分離上清（２４５ｍｌ）を硫酸アンモニウム塩析に供した。飽和硫酸アンモニウム２０−４０％のタンパク質沈殿中に活性が認められた。次に３Ｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１２時間の透析を２回繰り返し、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて酵素液を平衡化した。
【００７８】
４）上記３）の活性画分（６．５ｍｌ、タンパク質量１９３５ｍｇ）をＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１００陰イオン交換カラム（１．０ｘ８ｃｍ）に供した。吸着した蛋白質を０から１．０ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配にて溶出し、活性画分（２．６ｘ４→１０．４ｍｌ）を回収した。
【００７９】
５）上記４）の活性画分１０．４ｍｌを分画分子量３０，０００の限外濾過膜にて（０．２ｍｌｘ３→６００μｌ）にまで濃縮したのち、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ＨＲ１０／３０サイズ排除カラム（１．０ｘ３０ｃｍ）に供した。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーにて蛋白質を溶出し、活性画分を回収した。
【００８０】
６）上記５）の活性画分（０．６ｍｌｘ２→１．２ｍｌ）に６ｍｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、これに対して分画分子量３０，０００の限外濾過膜にて（０．０５ｍｌｘ３→０．１５ｍｌ）にまで濃縮・緩衝液交換した後、ＭｏｎｏＱ  １．６／５陰イオン交換カラム（１．６ｘ５０ｍｍ）に供した。０から１．０ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配にて蛋白質を溶出し、活性画分を回収した。次いで、各活性画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。活性の有無と検出バンドの有無の関係から３３ｋＤａ付近のバンドがＮＨのバンドである可能性が示唆できた。
【００８１】
７）上記で活性が疑われるバンドをセミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜から該当バンドを切りだした。切り出された当該バンドのアミノ末端ペプチド配列をアミノ酸分析装置ＰＰＳＱ−３１Ａ（島津製作所）により分析したところ、以下に示す配列が確認できた。
【００８２】
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ―Ａｓｎ―Ｖａｌ―Ｔｙｒ―Ｐｈｅ―Ａｓｐ―Ｈｉｓ―Ａｓｐ―Ｇｌｙ―Ａｓｎ―Ｖａｌ―Ａｓｐ−Ａｓｐ（配列番号３）
【００８３】
上記アミノ酸配列をＦＡＳＴＡ検索した結果、ラクトバチルス・ブクネリＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９のｉｎｏｓｉｎｅ／ｕｒｉｄｉｎｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＹＰ＿００４３９７４６９．１）のアミノ末端配列と９６％一致した。
【００８４】
実施例６：ＬＢＫ７８由来ＮＨ遺伝子の単離、クローニングおよび大腸菌における過剰発現
１）ゲノムＤＮＡの取得
ＬＢＫ７８をＭＲＳ培地１４ｍｌに植菌し、２８℃で４８時間静置培した。この培養液１ｍｌを遠心分離（９，０００ｒｐｍ、１０分）して湿菌体を得た。この湿菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｒ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のグラム陽性菌ゲノムＤＮＡ精製プロトコールに準じて本菌のゲノムＤＮＡを精製した。
【００８５】
２）ＮＨ遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌発現用ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とエシェリヒア・コリ  ロゼッタ２（ＤＥ３）［染色体マーカー：Ｆ−，ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ  ｐＲＡＲＥ２３（ＣａｍＲ）］からなる宿主ベクター系を用いた。ラクトバチルス・ブクネリＮＲＲＬ  Ｂ−３０９２９のｉｎｏｓｉｎｅ／ｕｒｉｄｉｎｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＹＰ＿００４３９７４６９．１）遺伝子の開始コドンＡＴＧ上流の配列に基づき設計したＮｄｅＩサイト（下線部）を持つ合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣ−３’（配列番号４））をセンスプライマーに、また、終止コドンＴＡＡ下流の配列に基づき設計したＸｈｏＩサイト（下線部）を持つ合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＣＡＧＴＡ−３’（配列番号５））をアンチセンスプライマーとしてＬＢＫ７８のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果、増幅された約９００ｂ．ｐ．の遺伝子断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクターに挿入しサブクローニングし、塩基配列を確認した。続いて、この９００ｂ．ｐ．のＮＨ遺伝子断片をｐＥＴ２１ａ（＋）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＥＴ２１ａＮＨｌｂｈを得た。クローニングされたＬＢＫ７８由来ＮＨ遺伝子のヌクレオチド配列およびＬＢＫ７８由来ＮＨ（タンパク質）のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示す。
【００８６】
３）ｐＥＴ２１ａＮＨｌｂｈをエシェリヒア・コリ・ロゼッタ２（ＤＥ３）株に形質転換し、ロゼッタ２（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａＮＨｌｂｈを得た。このロゼッタ２（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａＮＨｌｂｈを１ｍＭのＩＰＴＧと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地（１％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））中にて２０、３０、または３７℃で一晩好気的に培養した。得られた菌体を菌体重量あたり３倍量の２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて懸濁し、これを超音波処理により細胞破砕後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）にて上清を回収し、これを無細胞抽出液とした。
【００８７】
４）得られた無細胞抽出液を用いて、以下の方法により活性を測定した。活性測定用反応液は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、４８ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン、４８ｍＭアデニンおよび適当量の無細胞抽出液からなる。反応は３０℃にて行い、生成した２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドをＨＰＬＣにて定量した。その結果を表６に示す。３０℃で培養した菌体の無細胞抽出液を用いて反応を行った場合、０．３８ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成を確認した。
【００８８】
【表６】
2015037398.tif 000007
【００８９】
実施例７：ロゼッタ２（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａＮＨｌｂｈのＮＨの精製
１）実施例６にて調製したロゼッタ２（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａＮＨｌｂｈをＬＢ培地にて２０℃、２４時間培養して得られた湿菌体７．６ｇを３０ｍｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、Ｐｏｗｅｒ  ｓｏｎｉｃ  ＭＡＸ（クボタ製）にて３０分間破砕した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、その上清を無細胞抽出液（２８ｍｌ、タンパク質量６２７ｍｇ）とした。
【００９０】
２）上記１）の上清（２８ｍｌ）を硫酸アンモニウム塩析に供した。飽和硫酸アンモニウム２０−４０％のタンパク質沈殿中に活性が認められた。次に３Ｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１２時間の透析を２回繰り返し、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて酵素液を平衡化した。
【００９１】
３）上記２）の活性画分（４ｍｌ、タンパク質量１１１ｍｇ）をＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１００陰イオン交換カラム（１．０ｘ８ｃｍ）に供した。吸着した蛋白質を０から１．０ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配にて溶出し、活性画分（５ｍｌｘ３→１５ｍｌ）を回収した。
【００９２】
４）上記３）の活性画分１５ｍｌを分画分子量３０，０００の限外濾過膜により１２０μｌにまで濃縮したのち、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ＨＲ１０／３０サイズ排除カラム（１．０ｘ３０ｃｍ）に供した。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーにて蛋白質を溶出し、活性画分を回収した。
【００９３】
５）上記４）の活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果から、ＮＨが単一精製されたことが確認された。
【００９４】
実施例８：精製ＮＨの相対分子量の測定
上述（ＨＰＬＣによる定量２）に示したＨＰＬＣ条件にて精製ＮＨの相対分子量を測定した。分子量マーカーをグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（分子量２９０，０００）、乳酸デヒドロゲナーゼ（分子量１４２，０００）、エノラーゼ（分子量６７，０００）、アデニル酸キナーゼ（分子量３２，０００）ならびにチトクロームｃ（分子量１２，４００）として、精製ＮＨの相対分子量を算出した。その結果、本酵素の相対分子量は約１３０ｋＤａと推定できた。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果より、本酵素は４量体酵素であり、サブユニット分子量は約３４ｋＤａであることが確認されている。これより、本酵素は１種類のサブユニットからなるテトラマー酵素であることが示唆できる。
【００９５】
実施例９：精製ＮＨの速度論的パラメーターの測定
１）２’−Ｏ−メチルウリジン加水分解反応における２’−Ｏ−メチルウリジンに対する最大反応速度（Ｖｍａｘ）とミカエリス定数（Ｋｍ）
本酵素  ３μＭ、０．２５〜１０．０ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む反応液を５０℃で５分間反応させ、生成したウラシルを定量した。また、これと同様の反応条件に３０ｍＭアデニンを加えた反応液でも同様の解析を行った。その結果を表７に示す。
【００９６】
【表７】
2015037398.tif 000008
【００９７】
アデニン非存在下での２’−Ｏ−メチルウリジンの加水分解における２’−Ｏ−メチルウリジンに対する最大反応速度（Ｖｍａｘ）は１７．７４（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）、ミカエリス定数（Ｋｍ）は０．４ｍＭとなった。また、アデニン存在下でのＶｍａｘは６．５８（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）、Ｋｍは１．３２ｍＭとなった。
【００９８】
２）２’−Ｏ−メチルアデノシン合成反応における２’−Ｏ−メチルウリジン（またはアデニン）に対するＶｍａｘとＫｍ
本酵素  ３μＭ、０．２５〜１０．０  ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン、３０ｍＭ  アデニン、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む反応液を５０℃で５分間反応させ、生成した２’−Ｏ−メチルアデノシンを定量した。また、本酵素  ０．３μＭ、０．２５〜１０．０ｍＭ  アデニン、３０ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む反応液を５０℃で５分間反応させ、生成した２’−Ｏ−メチルアデノシンを定量した。その結果を表８に示す。
【００９９】
【表８】
2015037398.tif 000009
【０１００】
アデニン過剰下（３０ｍＭ）での２’−Ｏ−メチルアデノシン合成における２’−Ｏ−メチルウリジンに対するＶｍａｘは０．４７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、基質２’−Ｏ−メチルウリジンに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は５．２６ｍＭとなった。また、２’−Ｏ−メチルウリジン過剰下（３０ｍＭ）でのＶｍａｘは０．４７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、基質アデニンに対するＫｍは２．１５ｍＭとなった。
【０１０１】
実施例１０：精製ＮＨを用いた糖供与体（２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオシド）と糖受容体（プリン核酸塩基）を原料とする２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの製造
１）糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と各種糖受容体（アデニンまたはその誘導体）を原料とする２’−Ｏ−メチルアデノシンの製造
３０ｍＭのアデニンまたはその誘導体（アデノシンおよび２，６−ジアミノプリン）と６０ｍＭの２’−Ｏ−メチルウリジン、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１％精製ＮＨを含む反応液を５０℃で３時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ分析及びＨＰＬＣにより生成した２’−Ｏ−メチルアデノシンを定量した。結果を表９に示す。
【０１０２】
【表９】
2015037398.tif 000010
【０１０３】
糖受容体がアデニン、アデノシンである場合に２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成が認められた。また、２，６−ジアミノプリンを糖受容体とした場合、２，６−ジアミノ−２’−Ｏ−メチルアデノシンと思われる生成物ピークを検出した（２，６−ジアミノ−２’−Ｏ−メチルアデノシンの標品がないため定量せず）。
【０１０４】
２）各種糖供与体ヌクレオシドと糖受容体（アデニンまたはウラシル）を原料とする２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの製造
表１０で示される各種糖供与体ヌクレオシド６０ｍＭと３０ｍＭのアデニン（またはウラシル）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１％精製ＮＨを含む反応液を５０℃で３時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により生成した核酸塩基交換産物である２’−Ｏ−置換型ヌクレオシドを定量した。結果を表１０に示す。基質ヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、ウリジン、およびグアノシンである場合に核酸塩基交換産物ヌクレオシドの生成が認められた。
【０１０５】
【表１０】
2015037398.tif 000011
【０１０６】
３）糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジンまたは２’−Ｏ−メチルグアノシン）と各種糖受容体核酸塩基を原料とする２’−Ｏ−メチルヌクレオシドの製造
６０ｍＭの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジンまたは２’−Ｏ−メチルグアノシン）、図１、２で示される３０ｍＭの各種糖受容体核酸塩基、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１％精製ＮＨを含む反応液を５０℃で３時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシドを定量した。糖供与体ヌクレオシドを２’−Ｏ−メチルウリジンとして反応を行うと、アデニン、ヒポキサンチンを糖受容体とした場合、核酸塩基交換産物ヌクレオシドの生成が認められた（図１）。また、糖供与体ヌクレオシドを２’−Ｏ−メチルグアノシンとして反応を行うと、アデニン、ウラシル、ヒポキサンチン、シトシンを糖受容体とした場合、核酸塩基交換産物ヌクレオシドの生成が認められた（図２）。
【０１０７】
４）様々な初発添加濃度の糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体核酸塩基基（アデニン）を原料とする２’−Ｏ−アデノシンの製造
図３、４で示される初発添加濃度の糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、３０ｍＭまたは１Ｍの糖受容体（アデニン）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１％精製ＮＨを含む反応液を５０℃で４８時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルアデノシン）を定量した。結果を図３、４に示す。１Ｍアデニンの存在下、２’−Ｏ−メチルウリジンの初発添加濃度を３Ｍとした場合に、６．３ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成が認められた（図４）。また、高濃度アデニン存在下において、２‘−Ｏ−メチルアデノシンの合成収率は２’−Ｏ−メチルウリジンの初発添加量１５００ｍＭまでは一定であった（０．４％）。
【０１０８】
５）各種緩衝液存在下における糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体核酸塩基（アデニン）を原料とする２’−Ｏ−メチルアデノシンの製造
図５、６に示した２５０ｍＭの各種緩衝液存在下にて、５００ｍＭまたは１．５Ｍの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、１Ｍの糖受容体核酸塩基（アデニン）、１％精製ＮＨを含む反応液を５０℃で７２時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルアデノシン）を定量した。その結果、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタン硫酸（ＡＣＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．８）を添加した場合、反応７２時間目にて７．５ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成を確認した（図６）。
【０１０９】
実施例１１：２’−Ｏ−メチルアデノシンの製造
１）２’−Ｏ−メチルリボースとアデニンを原料とする２’−Ｏ−メチルアデノシンの製造
５００ｍＭの糖供与体ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルウリジン）と２５０ｍＭ  ＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）、１０％  Ｅ．ｃｏｌｉ  ロゼッタ２（ＤＥ）／ｐＥＴ２１ａ−ＮＨｌｂｈの無細胞抽出液を含む反応液を５０℃で３時間攪半した。なお、無細胞抽出液は実施例７で示したものと同様の培養方法で得られた湿菌体を用いて調製した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ分析により生成した２’−Ｏ−メチルリボースおよびウラシルを確認した。その反応液を限外濾過法に供し、反応系内の活性を不活化した。それぞれの反応液に精製ＮＨ（２％となるように添加）および１Ｍのアデニンを添加して引き続き５０℃にて２４時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルアデノシン）を定量した。結果を表１１に示す。精製酵素を添加した反応では０．１４ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成を確認できた。
【０１１０】
【表１１】
2015037398.tif 000012
【０１１１】
一方、対照実験として行った５００ｍＭの２’−Ｏ−メチルウリジン、１Ｍのアデニン、２５０ｍＭのＡＣＥＳ緩衝液、１％の精製ＮＨを含む反応液を上記と同じ条件で振とうした反応では、２．５６ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成が認められた（表１２）。
【０１１２】
【表１２】
2015037398.tif 000013
【０１１３】
２）２’−Ｏ−メチルリボースとアデニンを原料とする２’−Ｏ−メチルアデノシンの製造
５００ｍＭの２’−Ｏ−メチルウリジンと２５０ｍＭのＡＣＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）を含む反応液にＲｏｓｓｅｔａ２／ｐＥＴ２１ａ−ＮＨの無細胞抽出液を１０％添加し、５０℃で２４時間振とうした。上記反応液をＴＬＣ分析にかけ、ＴＬＣプレートから２’−Ｏ−メチルリボースを分離・精製した。精製した２’−Ｏ−メチルリボース５００ｍＭと１Ｍのアデニン、２５０ｍＭのＡＣＥＳ緩衝液を含む反応液を５０℃で３時間攪半した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルアデノシン）を定量した。結果を表１３に示す。２’−Ｏ−メチルリボースを基質とした場合に、０，０５ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成が認められた。
【０１１４】
【表１３】
2015037398.tif 000014
【０１１５】
一連の実施例の結果をまとめると図７に記載のとおりである。図７において、スキーム１の実験は、表１２に記載されている。スキーム２の実験は、表１１に記載されている。スキーム３の実験は、表１３に記載されている。
以上より、２’−Ｏ−メチルウリジンとアデニンからの２’−Ｏ−メチルアデノシン生成反応は、Ｈ２Ｏ由来の−ＯＨの代わりにアデニンが結合して２’−Ｏ−メチルアデノシンが生成する反応（核酸塩基交換反応）と２’−Ｏ−メチルリボース（２’−Ｏ−メチルウリジンの加水分解反応により生成）とアデニンが結合して２’−Ｏ−メチルアデノシンが生成する反応（加水分解の逆反応）が同時に起こっていることが推論できる。
また、２’−Ｏ−メチルリボースとアデニンからの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成収率よりも、２’−Ｏ−メチルウリジンとアデニンからの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成収率が５２倍高かった。したがって、２’−Ｏ−メチルリボース（２’−Ｏ−メチルウリジンの加水分解反応により生成）とアデニンが結合して２’−Ｏ−メチルアデノシンが生成する反応（加水分解の逆反応）よりも、Ｈ２Ｏ由来の−ＯＨの代わりにアデニンが結合して２’−Ｏ−メチルアデノシンが生成する反応（核酸塩基交換反応）により、優位に２’−Ｏ−メチルアデノシンが生成していると推論できる。
【０１１６】
実施例１２：リボースおよび２’−デオキシリボースと各種核酸塩基を原料とする各種ヌクレオシドの製造
３Ｍのリボースまたは２’−デオキシリボースと２５ｍＭの核酸塩基（アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはヒポキサンチン）、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１％精製ＮＨを含む反応液を５０℃で振とうした。遠心分離により沈殿物を除去し、ＨＰＬＣ分析により合成されたヌクレオシドを定量した。結果を表１４に示す。
【０１１７】
【表１４】
2015037398.tif 000015
【０１１８】
その結果、リボースおよび２’−デオキシリボースと所定の核酸塩基を原料とするヌクレオシドの製造が確認できた。
【０１１９】
実施例１３：２’−Ｏ−メチルアデノシン合成能を有する放線菌の培養、無細胞抽出液の調製ならびにそれを用いた糖供与体ヌクレオシド（２’−Ｏ−メチルウリジン）と糖受容体（アデニンまたはウラシル）を原料とする２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの製造
実施例２にて、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドの合成が認められた放線菌（オーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００）をＴＧＹ培地（０．５％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．１％グルコース、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４）２０ｍｌに植菌し、２８℃で７２時間静置培した。別途、ＴＧＹ培地中に０．１％  ２’−Ｏ−メチルウリジンおよび０．１％  アデニンを含む培地中にてこの放線菌の培養を行った。この培養液を遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）して得られた湿菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した。その洗浄菌体に対し１ｍｌの２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、得られた菌体懸濁液をマルチビーズショッカーＭＢ７０１ＰＵ（Ｓ）（安井器械製）にて細胞破砕し、これを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分）した。このようにして得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を半量（７５μｌ）と１５ｍＭの糖供与体（２’−Ｏ−メチルウリジン）、７．５ｍＭの糖受容体核酸塩基（アデニン）、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を含む反応液１５０μｌを３０℃で一晩攪半（１２０往復／分）した。遠心分離により沈殿物を除去し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析により糖転移産物ヌクレオシドを定量した。その結果、試験菌の無細胞抽出液において、２’−Ｏ−メチルアデノシンの合成が認められた。
【０１２０】
実施例１４：オーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００由来ヌクレオシド・ハイドロラーゼ（以下ＡｃＮＨと記す）遺伝子の単離、クローニングおよび大腸菌における過剰発現
１）ゲノムＤＮＡの取得
オーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００をＴＧＹ培地２０ｍｌに植菌し、２８℃で７２時間好気的に培養した。この培養液１ｍｌを遠心分離（９，０００ｒｐｍ、１０分）して湿菌体を得た。この湿菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｒ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のグラム陽性菌ゲノムＤＮＡ精製プロトコールに準じて本菌のゲノムＤＮＡを精製した。
【０１２１】
２）ＡｃＮＨ遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌発現用ベクターｐＱＥ６０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とエシェリヒア・コリ  ロゼッタ２（ＤＥ３）［染色体マーカー：Ｆ−，ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ  ｐＲＡＲＥ２３（ＣａｍＲ）］からなる宿主ベクター系を用いた。オーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００のｉｎｏｓｉｎｅ／ｕｒｉｄｉｎｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＡｃＮＨ）（ＢＡＧＺ０１００００１８．１）遺伝子の開始コドンＡＴＧ上流の配列に基づき設計したＮｃｏＩサイト（下線部）を持つ合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣ−３’（配列番号６））をセンスプライマーに、また、終止コドンＴＡＡ下流の配列に基づき設計したＨｉｎｄＩＩＩサイト（下線部）を持つ合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧ−３’（配列番号７））をアンチセンスプライマーとしてオーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果、増幅された約１０００ｂ．ｐ．の遺伝子断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクターに挿入しサブクローニングし、塩基配列を確認した。続いて、この９００ｂ．ｐ．のＡｃＮＨ遺伝子断片をｐＱＥ６０ＬのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＱＥ６０ＡｃＮＨを得た。クローニングされたオーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００由来ＡｃＮＨ遺伝子のヌクレオチド配列およびオーストウィッキア・ケロネー  ＮＢＲＣ１０５２００由来ＡｃＮＨ（タンパク質）のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８および配列番号９に示す。
【０１２２】
３）ｐＱＥ６０ＡｃＮＨをエシェリヒア・コリ・ロゼッタ２（ＤＥ３）株に形質転換し、ロゼッタ２（ＤＥ３）／ｐＱＥ６０ＡｃＮＨを得た。このロゼッタ２（ＤＥ３）／ｐＱＥ６０ＡｃＮＨを１ｍＭのＩＰＴＧと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地〔１％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）〕中にて２０℃で一晩好気的に培養した。得られた菌体を菌体重量あたり３倍量の２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて懸濁し、これを超音波処理により細胞破砕後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）にて上清を回収し、これを無細胞抽出液とした。
【０１２３】
４）得られた無細胞抽出液を用いて、以下の方法により活性を測定した。活性測定用反応液は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、６０ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン、１００ｍＭアデニンおよび適当量の無細胞抽出液からなる。反応は３０℃にて行い、生成した２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドをＨＰＬＣにて定量した。その結果を表１５に示す。２０℃で培養した菌体の無細胞抽出液を用いて反応を行った場合、０．０７ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成を確認した。
【０１２４】
【表１５】
2015037398.tif 000016
【０１２５】
実施例１５：アグロマイセス・エスピー  ｅ−１由来ヌクレオシド・ハイドロラーゼ（以下ＡｓＮＨと記す）の同定
下述の手順にてアグロマイセス・エスピー  ｅ−１のＡｓＮＨタンパク質の同定を行った。なお、ＡｓＮＨタンパク質の保有する活性（以下、必要に応じて単に「活性」と略称する）の検出は、上述の＜ＴＬＣによる同定＞  ２）または＜ＨＰＬＣによる定量＞  １）により行った。
【０１２６】
１）アグロマイセス・エスピー  ｅ−１をＧＰ培地１０ｍｌに植菌し、２８℃で４８時間静置培した。これを５００ｍＬ（ｘ２０本）のＧＰ培地に移し坂口フラスコにて２８℃で４８時間好気的に培養した。この培養液から遠心分離（９，０００ｒｐｍ、２０分）にて１０．８ｇの湿菌体を得た。
【０１２７】
２）上述の湿菌体１０．８ｇを３０ｍｌの２０ｍＭン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、Ｐｏｗｅｒ  ｓｏｎｉｃ  ＭＡＸ（クボタ製）にて３０分間破砕した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分）し、その上清を無細胞抽出液（３３ｍｌ、タンパク質量４３２ｍｇ）とした。
【０１２８】
３）上記２）の遠心分離上清（２４５ｍｌ）を硫酸アンモニウム塩析に供した。飽和硫酸アンモニウム２０−４０％のタンパク質沈殿中に活性が認められた。次に３Ｌの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１２時間の透析を２回繰り返し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて酵素液を平衡化した。
【０１２９】
４）上記３）の活性画分（１５ｍｌ、タンパク質量３０８ｍｇ）をＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１００陰イオン交換カラム（１．０ｘ８ｃｍ）に供した。吸着した蛋白質を０から１．０ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配にて溶出し、活性画分（５ｘ２→１０ｍｌ）を回収した。
【０１３０】
５）上記４）の活性画分１０ｍｌを分画分子量３０，０００の限外濾過膜にて（１００μｌ）にまで濃縮したのち、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ＨＲ１０／３０サイズ排除カラム（１．０ｘ３０ｃｍ）に供した。０．２Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーにて蛋白質を溶出し、活性画分を回収した。
【０１３１】
６）上記５）の活性画分（１ｍｌｘ２→２ｍｌ）を分画分子量３０，０００の限外濾過膜にて（０．５ｍｌ）にまで濃縮・緩衝液交換した後、ＭｏｎｏＱ  １．６／５陰イオン交換カラム（１．６ｘ５０ｍｍ）に供した。０から１．０ＭのＮａＣｌの塩濃度勾配にて蛋白質を溶出し、活性画分を回収した。次いで、各活性画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。活性の有無と検出バンドの有無の関係から３５ｋＤａ付近のバンドがＡｓＮＨのバンドである可能性が示唆できた。
【０１３２】
７）上記で活性が疑われるバンドをセミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜から該当バンドを切りだした。切り出された当該バンドのアミノ末端ペプチド配列をアミノ酸分析装置ＰＰＳＱ−３１Ａ（島津製作所）により分析したところ、以下に示す配列が確認できた。
【０１３３】
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１０）
【０１３４】
上記アミノ酸配列をＦＡＳＴＡ検索した結果、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｃ４４８のｉｎｏｓｉｎｅ／ｕｒｉｄｉｎｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＣＤＪ９８８７４）のアミノ末端配列と８６％一致した。
【０１３５】
実施例１６：ＡｓＮＨ遺伝子のクローニング
１）ゲノムＤＮＡの取得
アグロマイセス・エスピー  ｅ−１をＴＧＹ培地２０ｍｌに植菌し、２８℃で７２時間好気的に培養した。この培養液１ｍｌを遠心分離（９，０００ｒｐｍ、１０分）して湿菌体を得た。この湿菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｒ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のグラム陽性菌ゲノムＤＮＡ精製プロトコールに準じて本菌のゲノムＤＮＡを精製した。
【０１３６】
２）ＡｓＮＨ遺伝子部分断片の配列決定
ＡｓＮＨのアミノ末端ペプチド配列に基づき設計した合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＴＧＡＴＨＡＴＨＧＡＹＡＣＮＧＡ−３’（配列番号１１））をセンスプライマーに、また、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｃ４４８のｉｎｏｓｉｎｅ／ｕｒｉｄｉｎｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅの内部アミノ酸配列に基づき設計した合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＣＲＴＡＲＡＡＲＴＴＲＡＡＹＴＣ−３’（配列番号１２））をアンチセンスプライマーとしてアグロマイセス・エスピー  ｅ−１のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＲはＡまたはＧ，ＹはＣまたはＴ，ＨはＡまたはＣまたはＴ，ＮはＡまたはＣまたはＧまたはＴをそれぞれ表す。ＰＣＲの結果、増幅された約５００ｂ．ｐ．の遺伝子断片の塩基配列（配列番号１３）を自動シークエンサーによって決定した。
【０１３７】
３）Ｉｎｖｅｒｓｅ法によるＡｓＮＨをコードする遺伝子の５’及び３’末端の塩基配列解析
アグロマイセス・エスピー  ｅ−１のＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩを用いて３７℃で一晩処理し、一度ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）で精製した後、等量のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ製）と混合し、１６℃で一晩インキュベートすることで環状にした。上記２）で得られたＡｓＮＨの内部配列情報（配列番号１３）に基づき設計した合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡ−３’（配列番号１４））および（Ｐｒ：５’−ＧＴＡＣＧＣＴＣＧＣＴＧＡＣＧＡＴＣＡＴ−３’（配列番号１５））をプライマーとしてアグロマイセス・エスピー  ｅ−１の環状ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果、増幅された約１，０００ｂ．ｐ．の遺伝子断片の塩基配列を自動シークエンサーによって決定した。配列解析の結果から、遺伝子コード領域の５’及び３’末端の塩基配列を決定した。全長が決定されたアグロマイセス・エスピー  ｅ−１由来ＡｓＮＨ遺伝子のヌクレオチド配列およびアグロマイセス・エスピー  ｅ−１由来ＡｓＮＨ（タンパク質）のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１６および配列番号１７に示す。
【０１３８】
実施例１７：ＡｓＮＨ遺伝子の単離、クローニングおよび大腸菌における過剰発現
１）ＡｓＮＨ遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌発現用ベクターｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９からなる宿主ベクター系を用いた。アグロマイセス・エスピー  ｅ−１由来ＡｓＮＨ遺伝子の開始コドンＡＴＧ上流の配列に基づき設計したＳｐｈＩサイトを持つ合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＣＣＣＧＡＡＴＧＡＴＣＡＴＣＧＡ−３’（配列番号１８））をセンスプライマーに、また、終止コドンＴＡＧ下流の配列に基づき設計したＨｉｎｄＩＩＩサイトを持つ合成オリゴヌクレオチド（Ｐｒ：５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＡＡＣＧ−３’（配列番号１９））をアンチセンスプライマーとしてアグロマイセス・エスピー  ｅ−１のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲの結果、増幅された約１，０００ｂ．ｐ．の遺伝子断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔベクターに挿入しサブクローニングし、塩基配列を確認した。続いて、この１，０００ｂ．ｐ．のＡｓＮＨ遺伝子断片をｐＱＥ８０ＬのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＱＥ８０ＡｓＮＨを得た。
【０１３９】
２）ｐＱＥ８０ＡｓＮＨをエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株に形質転換し、ＪＭ１０９／ｐＱＥ８０ＡｓＮＨを得た。このＪＭ１０９／ｐＱＥ８０ＡｓＮＨを１ｍＭのＩＰＴＧと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地（１％バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））中にて２０℃で一晩好気的に培養した。得られた菌体を菌体重量あたり３倍量の２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて懸濁し、これを超音波処理により細胞破砕後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）にて上清を回収し、これを無細胞抽出液とした。
【０１４０】
３）得られた無細胞抽出液を用いて、以下の方法により活性を測定した。活性測定用反応液は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、６０ｍＭ  ２’−Ｏ−メチルウリジン、１００ｍＭアデニンおよび適当量の無細胞抽出液からなる。反応は３０℃にて行い、生成した２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオシドをＨＰＬＣにて定量した。その結果を表１６に示す。２０℃で培養した菌体の無細胞抽出液を用いて反応を行った場合、０．００６ｍＭの２’−Ｏ−メチルアデノシンの生成を確認した。
【０１４１】
【表１６】
2015037398.tif 000017
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明は、ｓｉＲＮＡ、アプタマー等の核酸医薬の材料として好適に用いることができる２’−置換型ヌクレオシドの作製などに有用である。
【図１】
2015037398.tif 000018
【図２】
2015037398.tif 000019
【図３】
2015037398.tif 000020
【図４】
2015037398.tif 000021
【図５】
2015037398.tif 000022
【図６】
2015037398.tif 000023
【図７】
2015037398.tif 000024
【配列表】
2015037398000001.app