(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡ複製において、従来より増幅増強活性に優れた汎用性の高いＤＮＡ複製促進因子であるＰＣＮＡ（増殖核抗原）変異体を得ること。【解決手段】ＰＣＮＡの多量体形成にかかわる特定のアミノ酸配列において、８２、８４、１０９、１３９、１４３および１４７番目のアミノ酸残基群のうち、１４７番目に相当するアミノ酸残基のみが中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列からなるポリペプチドで示されるＰＣＮＡ単量体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体。
（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列における、下記（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち、１４７番目に相当するアミノ酸残基のみが中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、（ａ）および（ｂ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
【請求項７】
請求項６に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
【請求項８】
ＰＣＲ用の試薬を備えた、請求項７に記載のＤＮＡ複製用キット。
【請求項９】
請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、請求項９に記載のＤＮＡの複製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ複製因子に関し、より詳しくは、ＤＮＡ複製を補助する機能に優れたＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（増殖核抗原）（本明細書では、ＰＣＮＡとも記載する。）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ複製は、ＤＮＡヘリカーゼで複製起点の二本鎖構造が解かれることにより開始される。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化され、さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｃ（本明細書では、ＲＦＣとも記載する。）がプライマーを認識して結合し、ＰＣＮＡをＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をし、ＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。
【０００３】
ＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のもの（以下、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡとも表記する）、および、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ−１株由来のもの（以下、ＫＯＤ−ＰＣＮＡとも表記する）が知られている。ＤＮＡ合成系へのＰｆｕ−ＰＣＮＡまたはＫＯＤ−ＰＣＮＡの添加は、ポリメラーゼのＤＮＡ伸長活性（プライマー伸長活性）および増幅増強活性を促進することが知られている。
【０００４】
特許文献１によれば、ＤＮＡの複製反応に関与する因子の一つであるＰＣＮＡの多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し形成される。真核細胞および古細菌において、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。野生型Ｐｆｕ−ＰＣＮＡでは、配列番号２に記載のアミノ酸配列における、１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８４番目、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、接合し、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられている。
【０００５】
また、特許文献１では、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの変異体についても検討されている。野生型のＰｆｕ−ＰＣＮＡにおいては、多量体形成に寄与する界面領域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に、電荷的に引き合うようなアミノ酸残基で構成されている。これに対し、変異体では分子間相互作用を形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構成されており、単量体のまま又は多量体を形成して、野生型より優れた増幅増強活性を備えているとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／００４６５４（国際公開、再公表）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＮＡ複製において、さらに増幅増強活性に優れたＰＣＮＡ変異体を得ること。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうち、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列における、第１４７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸残基に改変した変異型ＰＣＮＡを作製することにより、ＤＮＡ複製において、従来より優れた増幅増強活性を示すという知見を得、本発明を完成した。代表的な本発明は、以下の通りである。
【０００９】
［項１］
以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体。
（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列における、下記（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち、１４７番目に相当するアミノ酸残基のみが中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、（ａ）および（ｂ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
［項２］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
［項３］
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項４］
項３に記載のベクターを含む形質転換体。
［項５］
項４に記載の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
［項６］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
［項７］
項６に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
［項８］
ＰＣＲ用の試薬を備えた、項７に記載のＤＮＡ複製用キット。
［項９］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法。
［項１０］
前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、項９に記載のＤＮＡの複製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＤＮＡ複製における増幅増強活性に優れた汎用性の高いＤＮＡ複製促進因子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰＣＮＡの増幅増強活性の比較
【図２】ＰＣＮＡ添加によるｄＵＴＰ存在下での増幅
【図３】変異型ＰＣＮＡを用いた長鎖ターゲットの増幅評価
【図４】ＰＣＮＡ添加による合成速度の比較
【図５】バイサルファイト処理済みＤＮＡの増幅評価
【図６】ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
【図７】市販（古細菌由来）酵素とＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
【図８】ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
【図９】市販（古細菌由来）酵素とＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
【図１０】ＰＣＮＡ添加による糞便からの増幅
【図１１】ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
【図１２】ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
【図１３】ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
【図１４】変異型ＰＣＮＡを用いた血液からの増幅評価
【図１５】糞便からの増幅
【図１６】ＰＣＮＡの多量体形成に関するアミノ酸領域を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
【００１３】
なお、「配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１４７番目に『相当する』アミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＰＣＮＡにおいて、配列番号１の１４７番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。
【００１４】
本願明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。
配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
【００１５】
（１）本発明のＰＣＮＡ
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体である。
（１）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列における、下記（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち、１４７番目に相当するアミノ酸残基のみが中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ａ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、（ａ）および（ｂ）で示される群以外の部位において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
【００１６】
（１．１）アミノ酸配列
配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株（以下、単にＫＯＤとも記載する。）由来のＰＣＮＡのアミノ酸配列である。また、配列番号２は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（以下、単にＰｆｕとも記載する。）由来のＰＣＮＡのアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号１および２に記載のアミノ酸配列のそれぞれにおいて、１４７番目に相当するアミノ酸残基はＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうちの１つである。ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基は、各単量体のＮ末端側領域とＣ末端側領域とに存在する。ＰＣＮＡ多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合することにより形成される。真核細胞および古細菌においては、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。配列番号１および２で示されるアミノ酸配列においては、Ｎ末端領域が上記の（ａ）で示される群の位置に該当し、Ｃ末端領域が下記の（ｂ）で示される群の位置に該当する。
【００１８】
上記および下記において、配列番号１または配列番号２を例にして説明したことは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図１６で示したように配列番号１および２に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号１の１４７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のことを示す。
【００１９】
本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡとしては、由来は特に限定されないが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。
パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。
【００２０】
上記（２）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡ単量体をコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡ単量体を得ることができる。バリアントＰＣＮＡ単量体には、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
【００２１】
上記（３）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡ単量体が有するアミノ酸配列と配列番号１または２に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
【００２２】
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
【００２３】
上記の（２）または（３）に記載したようなＰＣＮＡとして、好ましくは、ＰＣＮＡの発現量を増やすため配列番号１または２における７３番目に相当するメチオニンをロイシンに改変したもの（Ｍ７３Ｌ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２４】
（１．２）中性アミノ酸残基
本発明のＰＣＮＡ単量体においては、配列番号１における１４７番目に相当するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基に置換されるが、置換する中性アミノ酸の種類は特に限定されない。中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。
【００２５】
（１．３）増幅増強活性
増幅増強活性はＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのものと増幅量を比較することで、増幅増強活性を確認することができる。好ましくは、増幅量が少ないＰＣＲ反応系でＰＣＮＡの増幅増強活性は評価しやすく、さらに好ましくは、ｄＵＴＰを含む反応系や伸長時間が短い反応条件などでＰＣＮＡの増幅増強活性を評価することが望ましい。
【００２６】
（１．３．１）増幅増強活性の測定方法
ＰＣＮＡの増幅増強活性を評価しやすくするため、増幅量が少なくなるｄＵＴＰを含んだ反応系で減少した塩基類似体検出活性を持つ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いて増幅を行う。
減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とする古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
本明細書においては、増幅増強活性は以下の方法で評価する。
（ｉ）ｄＵＴＰ存在下でのＰＣＲ
ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されている。）を用い、
１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含んだ０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂの増幅には配列番号５及び６、２．８ｋｂの増幅には配列番号７及び８、３．６ｋｂの増幅には配列番号９及び１０）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、０．８μｇの抗体を混合した１Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ  Ｖ９３Ｋ変異体を含む
５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、
９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１ｍｉｎ／ｋｂ（１．３ｋｂの増幅には１分３０秒、２．８ｋｂの増幅には３分、３．６ｋｂの増幅には４分を３５サイクル繰り返すスケジュール）でＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することで増幅増強活性を評価することができる。増幅増強活性の高いＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。
【００２７】
（１．４）
ＰＣＲにおいては、プライマーと鋳型ＤＮＡを用いてＤＮＡ複製を繰り返し、幾何級数的にＤＮＡを増幅させる。そのため、ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼに対するクランプとしての機能を果たすと共に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上で安定した後または所定領域の増幅後には鋳型から速やかに外れることが望ましい。
本発明のＰＣＮＡ変異体が従来のＰＣＮＡ変異体よりＤＮＡの複製反応を促進し得る作用・機序は必ずしも明確ではないが、多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有することにより、ＤＮＡの複製反応の繰り返しが円滑に行われ、その結果、ＤＮＡ複製反応をより促進するということが推測される。
【００２８】
（１．５）
本発明のＰＣＮＡ単量体は、単離されたもの又は精製されたものであることが好ましい。また、本発明のＰＣＮＡ単量体は、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＰＣＮＡ単量体に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたＰＣＮＡ単量体は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＰＣＮＡ単量体は、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。また、一部または全部が三量体などの多量体を形成していてもよい。
【００２９】
（２）本発明のＰＣＮＡの製造方法等
（２．１）本発明のＰＣＮＡをコードするＤＮＡ
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列における、下記の（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち、１４７番目に相当するアミノ酸残基のみが中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（ａ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
（Ｂ）配列番号３または４に記載の塩基配列において、下記の（ｃ）および（ｄ）で示される群の位置に存在するヌクレオチドのうち、第４３９〜４４１番目のみが中性アミノ酸残基をコードするトリプレットに対応するヌクレオチドで置き換えられたＤＮＡ
（ｃ）２４４〜２４６、２５０〜２５２、３２５〜３２７番目のヌクレオチド群
（ｄ）４１５〜４１７、４２７〜４２９、４３９〜４４１番目のヌクレオチド群
（Ｃ）前記（Ｂ）に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、下記の（ｃ）および（ｄ）で示される群の位置に存在するヌクレオチドのうち、第４３９〜４４１番目のみが中性アミノ酸残基をコードするトリプレットに対応するヌクレオチドで置き換えられ、かつ、増幅増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）２４４〜２４６、２５０〜２５２、３２５〜３２７番目のヌクレオチド群
（ｄ）４１５〜４１７、４２７〜４２９、４３９〜４４１番目のヌクレオチド群
（Ｄ）配列番号３または４のポリヌクレオチドの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、
下記の（ａ）および（ｂ）で示される群の位置に存在するアミノ酸残基のうち、１４７番目に相当するアミノ酸残基のみが中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、増幅増強活性を有するＰＣＮＡをコードするポリヌクレオチド
（ａ）８２、８４、１０９番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸残基群
【００３０】
本明細書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
【００３１】
本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、増幅増強活性を備える限り、配列番号３または４に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。
【００３２】
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出する。
【００３３】
本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質が増幅増強活性を有する限り、配列番号３または４に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。
【００３４】
「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
本明細書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。
ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ  ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。
【００３５】
（２．２）ベクター
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターである。
【００３６】
本発明のベクターは、上記（２．１）で説明する本発明の変異型ＰＣＮＡをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。
ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００３７】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢＲ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００３８】
発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １．８４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００３９】
（２．３）形質転換体
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む形質転換体である。
ＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記（２．２）で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現して変異型ＰＣＮＡを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
【００４０】
宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｃ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。
【００４１】
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、キャンデイダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）などが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。
【００４２】
宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、コレトトリカム・ヒエマリス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）等を例示することができる。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００４３】
本発明の形質転換体は、好ましくは、上記（２．２）に示される発現ベクターを用いたトランスフェクションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。
【００４４】
形質転換体に生成させた本発明のＰＣＮＡは、必要に応じて、タンパク質精製の定法により、精製、単離することができる。
【００４５】
（２．４）ＰＣＮＡの製造方法
本発明の実施形態の一つは、前記の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、変異型ＰＣＮＡの製造方法である。
【００４６】
上記改変ＰＣＮＡ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパクを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパクの発現を確認することができる。
【００４７】
上記方法により選抜された菌株から精製ＰＣＮＡを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＰＣＮＡ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロースカラムクロマトグラフィーにに供することで、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
【００４８】
組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得る場合は、好ましくは、ＰＣＮＡの発現量を増やすため、配列番号１または２における７３番目に相当するメチオニンをロイシンに改変（Ｍ７３Ｌ）することが好ましい。
特許文献１には、天然型のＰｆｕ−ＰＣＮＡを、大腸菌を宿主とした組み替えタンパク質として調製した場合、本来の開始Ｍｅｔからの翻訳タンパク質以外に、Ｎ末端が７３残基目からスタートする約２０ｋＤａのタンパク質が副産物として生成されるが、Ｍ７３Ｌではこの約２０ｋＤａのタンパク質の生成が抑えられること、このように作製されたＰｆｕ−ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ）は野生型ＰＣＮＡとかわらない性質を有していることなどから、Ｍ７３Ｌを準野生型として扱っている。また、特許文献１の実施例ではＫＯＤ−ＰＣＮＡについてもＭ７３Ｌを準野生型として扱っている。これらのことから、本明細書でも配列番号１または２に記載のアミノ酸配列のＭ７３Ｌ変異を野生型に相当するものとみなして扱う。
【００４９】
組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本ＰＣＮＡをコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本ＰＣＮＡを得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出・精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００５０】
なお、ＰＣＮＡの単量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し多量体を形成する。その接合は可逆的であるため、ＰＣＮＡ単量体として発現させたものの少なくとも一部が多量体を形成することがある。
【００５１】
（３）本発明の変異型ＰＣＮＡの利用法等
（３．１）ＤＮＡの複製方法
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明のＰＣＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法である。前記方法において、ＰＣＮＡは単量体であっても前記単量体で構成された多量体のいずれであってもかまわないし、その両方の形態が混在していても良い。
【００５２】
ＤＮＡの複製方法は特に限定されない。ＰＣＲ、プライマーエクステンション、ニックトランスレーション、逆転写酵素によるＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成、などが挙げられるが、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が好適な形態として挙げられる。
【００５３】
ＤＮＡの複製方法の条件も特に限定されない。たとえばＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示す。
増幅対象ＤＮＡに、本発明のＰＣＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼのほか、プライマー、ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））およびＭｇイオンを含むバッファー溶液を混合し、ＰＣＲ装置にセットして前記ＰＣＲ装置を以下の（Ｉ）から（ＩＶ）で示されるサイクルに設定して反応を行う。
（Ｉ）反応液を９４°Ｃ程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分かれさせる。
（ＩＩ）６０°Ｃ程度（プライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、その１本鎖ＤＮＡとプライマーをアニーリングさせる。
（ＩＩＩ）プライマーの分離がおきずＤＮＡポリメラーゼの活性に至適な温度帯まで、再び加熱する。実験目的により、その温度は６０−７２℃程度に設定される。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常１分から２分、この温度を保つ。
（ＩＶ）ここまでが１つのサイクルで、以後、（Ｉ）から（ＩＩＩ）までの手順を繰り返していく事で特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
【００５４】
本発明のＰＣＮＡは、様々なＤＮＡポリメラーゼと相性がよく、汎用性が高い。ＤＮＡポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があるのが一般的である。しかし、本発明のＰＣＮＡと組み合わせることにより、忠実性を低下させずに、伸長性を向上し得るため、ＤＮＡポリメラーゼの短所を補強しつつＤＮＡ複製活性が増強され得る。
本発明のＰＣＮＡは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れるが、伸長性に劣るタイプのα型ポリメラーゼとの組み合わせにおいて特に有用である。典型的なα型ポリメラーゼとしては、ファミリーＢに属するものが挙げられる。なかでもＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓやＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓなど古細菌に由来するものが好ましい。
例えば、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、およびＰｗｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）など、現在主要に用いられているＤＮＡポリメラーゼのほとんどに適用し得る。
【００５５】
上記のα型ポリメラーゼは、さらに、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体であっても良い。
このような変異体としては、具体的には、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１２）の１〜４０番目、および７８〜１３０番目によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。
【００５６】
ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１２）においては、上述の通り、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号１３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号１４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号１５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号１６）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号１７）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号１８）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号１９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号２０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号２１）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。
【００５７】
（１．２．２）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、配列番号１２または配列番号１３で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、すなわち、
（ａ１）配列番号１２または配列番号１３で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である。
【００５８】
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ２）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１２との同一性またはそのアミノ酸配列と配列番号１３との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
【００５９】
上記の古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ３）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。
【００６０】
ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。
【００６１】
なお、「配列番号１２に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１２の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。
【００６２】
本願明細書において、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１２上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１２の当該位置と対応する位置とする。
【００６３】
なお、特許文献１または２には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。
【００６４】
（１．２．３）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号１２または配列番号１３で示されるアミノ酸配列の７、３６、または９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００６５】
前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が１か所である場合、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換が例示される。別の例としては、３６番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換が例示される。別の例としては、９３番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＶ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換が例示される。
【００６６】
より好ましくは、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれるいずれかである。
【００６７】
前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が２か所である場合、好ましい変異体として、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられる。好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
３‘−５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１２）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１３）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１４）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１５）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１６）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１７）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１８）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１９）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２０）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２１）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸である。
本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１２〜２１に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１２の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。
【００６９】
なお、「配列番号１２に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１２の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。
【００７０】
上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１２における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。
【００７１】
本発明のＤＮＡ複製方法においては，本発明のＰＣＮＡがＲＦＣを必要としないことから、反応系にＲＦＣを添加しなくてよい。ＲＦＣ標品は一般には市販されておらず、その調製は手間を要する。ＲＦＣ標品が利用できるとしても、添加して使用する場合には、ＲＦＣ以外のＤＮＡ複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であるが、本発明においてはこれらを考慮しなくてよいというメリットがある。また、特にＰＣＲでの使用の場合には、本発明のＰＣＮＡはＲＦＣを併用しなくとも、野生型ＰＣＮＡとＲＦＣの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。
【００７２】
また、ＰＣＲの具体的な条件に関しては、既に多くの解説書が発行されており、本発明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。ＰＣＲの条件としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの添加量、ＰＣＲの反応時間、反応溶液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液のｐＨ、投入する鋳型ポリヌクレオチドの量などの種々の条件が調整される。
【００７３】
（３．２）ＤＮＡ複製用試薬、ＤＮＡ複製用キット
本発明の試薬キットは、上記本発明のＰＣＮＡおよび必要に応じその他の試薬類を含むＤＮＡ複製用の試薬キットである。本発明のＰＣＮＡは、単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含む形態で、ＤＮＡ複製用試薬の一成分として好適に用い得る。本発明の試薬キットは、本発明のＰＣＮＡがＰＣＲにおいて特に好適に用い得るため、ＰＣＲ用の試薬キットとして特に好適である。
【００７４】
本発明の試薬キットに備えられるＰＣＮＡはどのような形態であってもよく、精製タンパク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド、あるいはこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説明したとおりである。また、本発明のＰＣＮＡと他のＰＣＮＡを組み合わせてもよい。また、本発明のＰＣＮＡが、組換えＤＮＡまたは形質転換体の形態で提供される場合には、本発明のＰＣＮＡを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、本発明のＰＣＮＡを含む試薬には、必要に応じてバイオテクノロジー試薬として一般に用いられる他の成分や媒体を配合してもよい。
【００７５】
（４）
（４．１）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ  塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ  塩化マグネシウム１５
ｍＭ  ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ  活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ  ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％  トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
【００７６】
（４．２）ＤＮＡポリメラーゼ合成速度測定法
本発明において、核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼの合成速度は以下のように測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２．５μｌ、Ｂ液２．５μｌ、Ｃ液１．５μｌ、Ｄ液４．８μｌ、およびＥ液４μｌを混合し、９５℃にて１０分、３７℃にて１０分置き、基質を作成する。
（２）、７５℃にて３０秒、インキュベートさせた基質に０．６４ｎｇ／μｌ酵素溶液５μｌを加えて７５℃にて３０秒、６０秒、１２０秒反応する。その後氷冷し、Ｆ液３５μｌを加えて、よく攪拌する。
（３）この液を１０μｌ、１％のアルカリアガロースゲルに供し、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ２−Ｌｏｇ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  （０．１−１０  ｋｂ）（ＮＥＢ製）をマーカーとし電気泳動する。
（４）Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋へブロッテリングし、ＮＥＢのＰｈｏｔｏｔｏｐｅ−Ｓｔａｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔの取説に従い、ビオチンを検出する。１秒当たりに伸長した鎖の長さを合成速度とする。
Ａ：１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ   −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）
Ｂ：２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴＯＹＯＢＯ製）
Ｃ：２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４
Ｄ：２００ｎｇ／μｌ  Ｍ１３  ｓｓＤＮＡ（ＴａＫａＲａ製）
Ｅ：１００μＭ  Ｂｉｏｔｉｎ化Ｐ７プライマー（配列：Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）
Ｆ：５９ｍＭ  ＮａＯＨ、５９ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＢＰＢ  ３０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
【実施例】
【００７７】
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００７８】
（実施例１）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号３）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
【００７９】
（実施例２）
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体の作製
パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来のＰＣＮＡ（配列番号４）（ｐＰｆｕＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例１および実施例２で作製したプラスミドを表１に示す。
【００８０】
【表１】
2015050995.tif 000002
【００８１】
（実施例３）
改変型耐熱性ＰＣＮＡの作製
実施例１および２で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。
【００８２】
（実施例４）
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、サーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス  ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１１）（ｐＫＯＤ）を用いた。
変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例５）
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例におけるＰＣＮＡの評価に用いるために、パイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１２）（ｐＰｆｕ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例４および実施例５で作製したプラスミドは表２および、表３に示す。
【００８３】
【表２】
2015050995.tif 000003
【００８４】
【表３】
2015050995.tif 000004
【００８５】
（実施例６）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例４および５で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。
上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は（４．１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法に従い行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
【００８６】
（実施例７）
ＰＣＮＡの評価
ＰＣＮＡの増幅増強活性を比較するため、ＫＯＤ−ＰＣＮＡの変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）を用いてｄＵＴＰ存在下ＰＣＲでの増幅量の違いを、上記（１．３．１）で示した増幅増強活性の測定方法に従い、ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＨｕｍａｎ  β−グロビンの１．３ｋｂ、２．８ｋｂ、３．６ｋｂを増幅することで比較した。ＤＮＡポリメラーゼには、実施例４および６で作製したＫＯＤ  Ｖ９３Ｋ変異体を用いた。なお、上述のとおり、Ｍ７３Ｌ変異を野生型に相当するものとみなす。
【００８７】
図１は、ＰＣＲ増強因子として３種類のＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）を用いて、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を終濃度０．２ｍＭで含む反応系で、長さの異なるＨｕｍａｎ  β−グロビンＤＮＡに対して、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  Ｖ９３Ｋ変異体を用いてＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果である。図１において、
１．３ｋｂｐがレーン１
２．８ｋｂｐがレーン２
３．６ｋｂｐがレーン３
である。
対照としてＰＣＮＡ変異体を含まない場合についても同様の試験を行った。
【００８８】
結果を図１に示す。今回用いたＫＯＤ  Ｖ９３Ｋ変異体ではＰＣＮＡ添加なしで増幅が出来なかったが、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）の添加で１．３ｋｂ、３．６ｋｂの増幅が可能になった。中でも、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものがもっとも増幅量が多い結果となり２．８ｋｂの増幅も確認することができた。これはＭ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの変異体が、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒの変異体より増幅増強活性が高いため、より増幅量が向上したと考えられる。
ＰＣＮＡは多量体を形成し反応を促進するが、多量体形成が強すぎるとＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｄ１４７Ａの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡが単独でＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる。
【００８９】
ＰｆｕのＰＣＮＡについてもＭ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの変異体を上記の反応に添加し、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの方がＭ７３Ｌ／Ｄ１４３Ｒより増幅量が向上することが確認された。
【００９０】
（実施例８）
ＰＣＮＡ添加によるｄＵＴＰ存在下での増幅
実施例７と同様に、上記で得られたＫＯＤ  Ｖ９３Ｋを用いてｄＵＴＰ存在下でＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）添加による効果を比較した。
ＰＣＲにはＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含んだ０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号５及び６に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕ  ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ  Ｖ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【００９１】
図２は、種々のＰＣＮＡ変異体を２５０ｎｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの計３種である。
【００９２】
今回用いたＫＯＤ Ｖ９３Ｋ変異体はｄＵＴＰの阻害を受けて増幅量が少ない。ＰＣＮＡ添加なしやＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ａ変異体ではほとんどバンドが確認されなかったが、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａでしっかりとしたバンドが確認された。ＰＣＮＡは多量体を形成し核酸の合成反応を促進するが、通常、ＲＦＣの働きなしではＤＮＡにロードできず反応が進まない。Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの改変は、多量体形成に関わる部位への改変であり、適度に多量体形成が弱まったため、ＰＣＮＡがＤＮＡにロードでき、ＰＣＲ増幅量を向上させたことが考えられる。
【００９３】
Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）でも同様の実験を行い、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４３Ａ変異体では、ほとんどバンドが確認できなかったが、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７ＡのＰｆｕ−ＰＣＮＡ変異体の添加ではしっかりとしたバンドが確認された。
【００９４】
（実施例９）
変異型ＰＣＮＡを用いた長鎖ターゲットの増幅評価
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で長鎖ターゲットの増幅（ＨＢｇ８．５ｋｂ）を実施し、変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）ありなしで評価した。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体を用い、ＨＢｇの８．５ｋｂのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭまたは２．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号１３および１４）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には５０ｎｇのヒトゲノム（Ｒｏｃｈｅ製）を用いた。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、９分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
【００９５】
図３は、ｄＵＴＰを含む反応液８．５ｋｂの長鎖ターゲットを変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）あり／なしで増幅し、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の１，２レーン目はＰＣＮＡなし、３，４レーン目はＰＣＮＡを添加したこと示す。１、３レーン目は１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２、４レーン目は２ｍＭ  ＭｇＳＯ４の増幅を示す。
結果、変異型ＰＣＮＡなし、ＫＯＤ  Ｎ２１０Ｄ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨではＭｇＳＯ４が１．５ｍＭでも２．０ｍＭでも増幅は見られなかったものの、変異型ＰＣＮＡを添加することで、８．５ｋｂのしっかりしたバンドを増幅することができた（図３）。
【００９６】
（実施例１０）
ＰＣＮＡ添加による合成速度の比較
ＫＯＤ  Ｖ９３Ｋ変異体に様々なＰＣＮＡ変異体を添加し、合成速度を測定した。ＫＯＤ  Ｖ９３Ｋは、保存緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，５０％  グリセリン）で希釈し用いた。また、ＰＣＮＡ変異体は各反応系に２５０ｎｇ添加し、合成速度を測定した。
試薬・方法は、（４．１）に記載のＤＮＡポリメラーゼ合成速度測定法に従い実施した。
【００９７】
結果を図４に示す。図４は、Ｖ９３Ｋ変異体に様々なＰＣＮＡ変異体を添加してＰＣＲ反応を３０秒、６０秒、１２０秒行い、それぞれで得られた産物を電気泳動した結果である。ＰＣＮＡ変異体としては、ＫＯＤ由来のＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ、Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ）を用いた。図４において、３０とあるのは反応時間を３０秒行ったことを示す。６０、１２０についても同様である。図４では、増幅産物が電気泳動写真の上部で検出されるほど、長い増幅産物が取れ合成速度が速いことが示される。写真の左側には、７０００ｂｐ、３０００ｂｐの増幅産物がそれぞれの矢印のところで検出されることを示す。写真の下部に示されている数字は、その結果に基づいて計算された各ＤＮＡポリメラーゼの合成速度である。
【００９８】
結果、ＰＣＮＡを添加すると、合成速度が大幅に増加することが確認できた。これはＰＣＮＡがクランプの働きを行い、ＤＮＡとポリメラーゼをしっかり結合させたことによると考えられる。また、よりＤＮＡにロードしやすい変異体、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの方がＭ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体より合成速度が増加することも確認できた。
【００９９】
（実施例１１）
バイサルファイト処理済みＤＮＡの増幅評価
バイサルファイト処理後、ウラシルが含まれるＤＮＡからの増幅ができるかを検討した。メチル化の影響をなくすため、バイサルファイトに供するＤＮＡは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用い、配列番号１５および１６のプライマーで増幅した１７．５ｋｂのＰＣＲ産物を用いた。バイサルファイトはＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ  Ｘｃｅｅｄ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、ＰＣＲ、バイサルファイト処理はそれぞれ添付の取扱い説明書に準じて行った。増幅の検討はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（５７４ｂｐの増幅は配列番号１７および１８、５１９ｂｐの増幅は配列番号１９および２０、１００４ｂｐの増幅は配列番号１９および２１、１５６１ｂｐの増幅は配列番号２２および２３、１９９３ｂｐの増幅は配列番号２２および２４）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を含む５０μｌの反応液中に、上記バイサルファイト処理済みのＤＮＡ２０ｎｇを添加し、ＰＣＲ増強因子であるＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体の添加無しと２５０ｎｇ添加したものを比較した。ＰＣＲは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、１分／ｋｂ（５７４ｂｐ、５１９ｂｐ、１００４ｂｐの増幅は１分、１５６１ｂｐ、１９９３ｂｐの増幅は２分）を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１００】
図５は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを鋳型として様々な長さのターゲットを増幅し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）の添加ありなしで増幅量を比較した結果を示す。各写真の左側がＫＯＤ−ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加せずに反応した場合、右側がＫＯＤ−ＰＣＮＡ（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加して反応した場合である。１レーンは５７４ｂｐ、２レーンは５１９ｂｐ、３レーンは１００４ｂｐ、４レーンは１５６１ｂｐ、５レーンは１９９３ｂｐのターゲットを増幅した結果を示す。
結果、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加していない反応では５７４ｂｐなど増幅できないターゲットがあるところ、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加したものでは全てのターゲットでしっかりとした増幅が確認された。また増幅量もＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を添加したものの方が多い結果となった（図５）。
【０１０１】
（実施例１２）
ＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
様々なＰＣＮＡ変異体の添加でクルード（血液）耐性を評価した。比較には、ＰＣＮＡの添加なしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ変異体（Ｍ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を用い、ＨＢｇの３．６ｋｂの増幅量の違いを比較した。
【０１０２】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ４、酵素液（ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号９および１０）、１ＵのＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して８％になるように加え、ＰＣＮＡなしと様々な濃度のＰＣＮＡ変異体（０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ）を添加したものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、４分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１０３】
図６は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を８％になるよう反応液を調製して、種々のＰＣＮＡ変異体を０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いたＰＣＮＡ変異体はＭ７３Ｌ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの計２種である。各写真の０．５、１、２、４は添加されたＰＣＮＡの量（μｇ）を示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なし、Ｍ７３Ｌの変異体では４μｇ添加しても血液から直接増幅が確認されないところ、Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの変異体は０．５μｇ添加すれば血液が８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図６）。多量体形成に関わる部位に変異を入れ単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、ＰＣＲ反応系に添加すればクルード耐性が上がることが示される。
【０１０４】
（実施例１３）
市販（古細菌由来）酵素とＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ以外の古細菌由来の酵素にもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（Ｔｏｙｏｂｏ社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（タカラバイオ製）、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（タカラバイオ製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（タカラバイオ製）のポリメラーゼを用い、血液、反応液に対して１６％存在下でＨＢｇの３．６ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１０５】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号９および１０）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、４分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１０６】
図７は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬの計４種である。各写真の１はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、２はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ、３はＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、４はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬの結果を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ではＰＣＮＡ添加なしで血液１６％から直接増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加することでしっかりとしたバンドが確認された。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬではＰＣＮＡ添加なしで血液１６％から直接増幅がみられたが、ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加することで増幅量が大幅に向上することが確認された（図７）。ＰＣＮＡ変異体を添加すればクルード（血液）耐性が上がり、増幅できなかったものが増幅できた。また、増幅量が血液の阻害によって抑えられていたものが、ＰＣＮＡ変異体の添加によって改善され増幅量が増えたことが示された。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬは古細菌由来のポリメラーゼで調製されている。ＰＣＮＡ変異体はＫＯＤポリメラーゼだけでなく、様々な古細菌ポリメラーゼに効果があることが示された。
【０１０７】
（実施例１４）
ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体にＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ  １．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡはＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１０８】
鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＫＯＤ変異体のＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２５および２６）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃  ３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。 
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１０９】
図８は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２、４、８、１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ変異体、 ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼの計４種である。
各写真の１、２、８、１６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ  Ｈ１４７Ｅ、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは植物ライセートを８％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図８）。同様にＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋでも、ＰＣＮＡなしでは４％の植物ライセートで阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが４％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された。ＰＣＮＡ変異体はＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体にも効果があることが示された。
一方、古細菌由来のポリメラーゼではないＴａｑポリメラーゼではＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性の変化は見られなかった。ＴａｑポリメラーゼにはＰＣＮＡ変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。
【０１１０】
（実施例１５）
市販（古細菌由来）酵素とＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
市販されている様々な古細菌由来の酵素にもＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬを用い、ｒｂｃＬ  １．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１１１】
鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＰＣＲは、それぞれ添付のＢｕｆｆｅｒを用い、推奨の反応液中に１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２５および２６） と、植物ライセートを反応液に対して１％、２％、４％、６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１１２】
図９は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を１、２、４、６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、ｐｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬの計３種である。
各写真の１、２、４、６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−では植物ライセートを１％以上で、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬでは２％以上で阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが４％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図９）。
【０１１３】
（実施例１６）
ＰＣＮＡ添加による糞便からの増幅
ＰＣＮＡの添加でクルード（糞便）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用い、ＨＢｇの３．６ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１１４】
阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＳＯ４、酵素（ＫＯＤ  −ＰＬＵＳ−）を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号９および１０）、５ｎｇ ヒトゲノム、１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０．２％、０．４％、０．８％、１．６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ  ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、４分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１１５】
図１０は、ヒトゲノムからＨＢｇ３．６ｋを増幅する反応液に阻害物質である糞便を０％、０．２％、０．４％、０．８％、１．６％の割合になるよう添加し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７ＡありなしでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−である。
各写真の０、０．２、０．４、０．８、１．６は添加された糞便の割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−では糞便を０．２％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは糞便が０．４％含まれていてもバンドが確認された（図１０）。ＰＣＮＡ変異体は糞便の阻害にも耐性能を向上させる効果があることが示された。
【０１１６】
（実施例１７）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１１７】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２７および２８）、２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１１８】
図１１は、試料として血液を用い、ｄＵＴＰを含む反応液に血液を０．００２％、０．０２％、０．２％、２％、５％、１０％ の割合になるよう添加して、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの添加ありなしでＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋでは血液を１０％添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図１１）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。
【０１１９】
（実施例１８）
ｄＵＴＰを含む反応液を用いたＰＣＮＡ添加による血液からの増幅
図１１と同様、ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（血液）耐性が向上するかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄを用い、ＨＢｇの１．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＰｆｕ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１２０】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号５および６）、２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、血液を反応液に対して０．０２％、 ０．２％、 ０．５％、２％、５％、１０％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＰｆｕ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１２１】
図１２は、試料として血液を用い、反応液に占める血液の割合を０．０２％、０．２％、０．５％、２％、５％、１０％ になるよう反応液を調製して、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体および、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＰｆｕ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしでは阻害がかかり血液から増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは血液が１０％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図１２）。図１１と同様、ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰ存在下のＰＣＲでも効果があることが示された。
【０１２２】
（実施例１９）
ＰＣＮＡ添加による植物ライセートからの増幅
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系でもＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性が向上するかを評価した。
比較には、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、ｒｂｃＬ  １．３ｋｂの増幅量の違いを比較した。ＰＣＮＡにはＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを用いた。
【０１２３】
鋳型にはイネの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。
ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号２５および２６）、 ２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、ＫＯＤ抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃  ３０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて行った。
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、 ２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、植物ライセートを反応液に対して２％、４％、８％、１６％になるように加え、ＰＣＮＡなしとＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを２５０ｎｇ加えたものを比較した。反応は９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１、５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。 
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１２４】
図１３は、試料として植物ライセートを用い、反応液に占めるライセートの割合を２、４、８、１６％になるよう反応液を調製して、種々の酵素にＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加しＰＣＲ反応を行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。用いた酵素はＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼの計２種である。
各写真の１、２、８、１６は添加された植物ライセートの割合（％）を示し、−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。
結果、ＰＣＮＡ添加なしのＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは植物ライセートを４％以上添加すると阻害がかかり増幅が確認されないところ、ＰＣＮＡの変異体を添加したものは植物ライセートが８％含まれていてもしっかりしたバンドが確認された（図１３）。ＰＣＮＡ変異体はｄＵＴＰを含む反応液でも効果があることが示された。
一方、古細菌由来のポリメラーゼではないＴａｑポリメラーゼではＰＣＮＡの添加でクルード（植物）耐性の変化は見られなかった。ＴａｑポリメラーゼにはＰＣＮＡ変異体を添加してもクルード耐性は変わらないことが示される。
【０１２５】
（実施例２０）
変異型ＰＣＮＡを用いた血液からの増幅評価
ｄＵＴＰを含むＰＣＲ反応系で血液から様々な長さのターゲットの増幅を実施し、変異型ＰＣＮＡありなしで評価した。
酵素には１Ｕあたり０．８μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体とＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、抗体を混合したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ−Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用い、ＨＢｇの４８２ｂｐ、１．３ｋｂ、２．８ｋｂ、３．６ｋｂ、５．７ｋｂのＰＣＲを行い増幅の違いを比較した。
上記と同様、ＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ４を用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１５ｐｍｏｌのプライマー（４８２ｂｐの増幅は配列番号２５および２６、１．３ｂｐの増幅は配列番号５および６、２．８ｋｂの増幅は配列番号７および８、３．６ｋｂの増幅は配列番号９および１０、５．７ｋｂの増幅は配列番号２９および３０）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）または、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液１μｌを用いた。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｄ１４７Ａ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１分／ｋｂ（４８２ｂｐの増幅は１分、１．３ｂｐの増幅は１．５分、２．８ｋｂの増幅は３分、３．６ｋｂの増幅は４分、５．７ｋｂの増幅は６分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）または、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用い、鋳型には血液１μｌを用いた。また、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｅ１４３Ｒ変異体を２５０ｎｇ添加したものも実施した。９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分／ｋｂ（上記と同様）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
【０１２６】
図１４は、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰを含む反応液で様々な長さのターゲットを変異型ＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）ありなしで増幅し、得られた産物を電気泳動した結果を示す。各写真の−はＰＣＮＡなし、＋はＰＣＮＡを添加したこと示す。１レーン目は４８２ｂｐ、２レーン目は１．３ｋｂ、３レーン目は２．８ｋｂ、４レーン目は３．６ｋｂ、５レーン目は５．７ｋｂの増幅を示す。
結果、ｄＴＴＰとｄＵＴＰで増幅量を比べると、ｄＵＴＰで大きく阻害が見られることがわかる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは、ｄＴＴＰでは４８２ｂｐが増幅しているところ、ｄＵＴＰでは４８２ｂｐの増幅は確認できなかった。ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体では、ｄＴＴＰではすべてのターゲットで良好な増幅が見られているが、ｄＵＴＰでは４８２ｂｐ以上のターゲットでほとんど増幅が見られなかった。そこに変異型ＰＣＮＡを添加した結果は、Ｔａｑでは大差はないものの、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体では、変異型ＰＣＮＡを添加することで、増幅できなかった２．８ｋｂ以上のターゲットを増幅することができた（図１４）。ＰＣＮＡ変異体の添加でｄＵＴＰ存在下、ｄＴＴＰと同等の増幅ができることが示された。また、ＰＣＮＡの添加でクルードサンプルから直接ＰＣＲも可能であることが示された。
【０１２７】
（実施例２１）
糞便からの増幅
ｄＵＴＰ、糞便存在下でリアルタイムＰＣＲでの遺伝子増幅ができるかを評価した。
酵素には、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、Ｔａｑポリメラーゼを用い、サルモネラのｉｎｖＡ遺伝子約７００ｂｐの増幅の違いをＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲ、および融解曲線で比較した。ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にはＰＣＲ増強因子としてＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものも実施した。
【０１２８】
阻害物質には１０％糞便懸濁液を９５℃で１０分熱処理したものを用いた。
ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤのＰＣＲは、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３１および３２）、 ２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ） 、１／３００００  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、ＫＯＤ抗体と混合した０．４Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃  １０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。ＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａは上記反応系に１００ｎｇ加え、ＰＣＮＡなしのものと比較した。
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×Ｔａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ別添タイプ）、５０コピーのサルモネラゲノム、４ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、 ２ｍＭ  ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１／３００００  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む２０μｌの反応液中に、糞便を反応液に対して０、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５％になるように加え、９５℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃  １０秒→６８℃、３０秒を５０サイクル繰り返すスケジュールでＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて行った。
それぞれ、反応終了後、融解曲線解析にて、８０℃後半に出現する目的ピークを確認した。
【０１２９】
実施例２１のＣｑ値を表４に示す。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
表４はｄＵＴＰ、糞便存在下で行ったリアルタイムＰＣＲのＣｑ値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０のデフォルト設定）を示す。Ｎ．Ｄ．は増幅が見られず、Ｃｑ値が求められなかったことを示す。
結果、Ｔａｑポリメラーゼでは０．５％の糞便を添加すると増幅が見られなくなるところ、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄでは２．５％の糞便を添加しても増幅が確認された。また、ＰＣＮＡありなしを比較すると、ＰＣＮＡを添加したものの方が、Ｃｑ値が小さく、優れたＰＣＲ効率を示していることがわかった。
【０１３２】
図１５は、ｄＵＴＰ、糞便存在下でＰＣＲを用い、得られた増幅産物の融解曲線解析の結果を示す。用いたポリメラーゼはＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体にＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したもの、Ｔａｑポリメラーゼの計３種である。
１はＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄの結果を、２はＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤにＫＯＤ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａを添加したものの結果を、３はＴａｑポリメラーゼの結果を示す。
結果、ＫＯＤ  Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０ＤではｄＵＴＰ、糞便存在下からでも増幅が確認され、糞便の添加でピークは低くなるものの、２．５％を添加しても、目的ピークを確認することができた。ＰＣＮＡを添加したものでも同様に、２．５％の添加でも目的ピークを確認することができた。しかし、Ｔａｑポリメラーゼでは０．２５％の添加で目的ピークが消失しており、糞便の影響で阻害を受けたことが示唆された（図１５）。
【０１３３】
ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼの他の変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｈ１４７Ｅ、Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｎ２１０Ｄ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ／Ｎ２１０Ｄ、Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｋ／Ｉ１４２Ｒ、Ｖ９３Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｉ１４２Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｉ１４２Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）でも同様に２．５％糞便が含まれる反応系で増幅を確認し、ｄＵＴＰ存在下でもしっかりとしたバンドが確認できた。
【０１３４】
またＰｆｕ−ＰＣＮＡ  Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａの変異体でも、同様の反応を行い、ＰＣＮＡ添加なしに比べＰＣＲ効率の向上が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特にＤＮＡ合成に関わる技術関連において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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