(57)【要約】【課題】  ＨＳＰ９０阻害剤による治療効果のある患者の判定に有用なバイオマーカーが確立されていなかった。【解決手段】  患者の腫瘍組織中のＡｋｔのリン酸化レベルまたはＥＲＫのリン酸化レベルを測定することにより、ＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍の感受性を判定する方法。【選択図】図１７
2015114312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍の感受性を判定する方法であって、患者由来の腫瘍組織の、
（１）Ａｋｔのリン酸化レベルを検出する工程、または
（２）ＥＲＫのリン酸化レベルを検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
患者由来の腫瘍組織の
（１）Ａｋｔのリン酸化レベルがコントロールレベルに比較して亢進していること、または
（２）ＥＲＫのリン酸化レベルがコントロールレベルに比較して亢進していること、
に基づいて、ＨＳＰ９０阻害剤による治療が有効である患者を選択する方法。
【請求項３】
ＨＳＰ９０阻害剤が、トリアゾール環を有する化合物である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
トリアゾール環を有する化合物がＧａｎｅｔｅｓｐｉｂである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
トリアゾール環を有する化合物が下記一般式（１）
【化１】
2015114312.tif 000009
［式中、Ｘは直鎖状または分岐状の炭素数１〜８のアルキル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、またはハロゲン原子を示し、Ｙは硫黄原子または酸素原子を示し、ｍは０〜４の整数を示し、Ａは置換基を有するアミノ基を示す］で表されるトリアゾール化合物（Ａ）である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記一般式（１）において、Ｘがエチル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、２−プロピニル基、２−ブチニル基、ハロゲン原子である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一般式（１）において、ｍが０または１であり、Ａがモルホリノ基、４−メチルピペラジン−１−イル基、ピペリジン−１−イル基、ピロリジン−１−イル基である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
Ａｋｔのリン酸化および／またはＥＲＫのリン酸化が免疫組織学的解析（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ解析または質量分析のいずれか１以上の手段によって検出される請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
患者由来の腫瘍中のリン酸化Ａｋｔ陽性細胞数の全腫瘍細胞数に対する割合が１．０％以上である請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
患者由来の腫瘍中のリン酸化ＥＲＫ陽性細胞数の全腫瘍細胞数に対する割合が１．０％以上である請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
がんが卵巣がん、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、胃がん、食道がん、腎細胞がん、前立腺がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍および肉腫から選択される請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
がんが卵巣がん、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんである請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
がんが卵巣がんである請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＨＳＰ９０阻害活性を有する抗腫瘍剤によるがんの治療が有効であることが予測される癌患者を選択するための、生物マーカー、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍疾患の治療のため、新たな抗腫瘍化学療法の開発が求められている。近年では、細胞増殖に関与するシグナル伝達に関わる増殖因子や増殖因子受容体、並びにシグナル伝達経路に関わるタンパク質等の各種機能性分子が認知されてきている。そこで、これらの機能性分子を標的とした分子標的抗腫瘍剤が開発されている。
このような分子標的抗腫瘍剤には治療効果の期待できる患者群と治療効果の期待できない患者群が存在する。たとえばＢＣＲ−ＡＢＬ／ＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ−Ａ阻害剤イマチニブは、ＢＣＲ／ＡＢＬ転座を有する慢性骨髄性白血病患者において非常に高い治療効果を発揮する（非特許文献１）。またＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブおよびエルロチニブはＥＧＦＲ遺伝子変異肺がん患者において高い治療効果を発揮する（非特許文献２、３）。抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブやＨＥＲ２／ＥＧＦＲ阻害剤であるラパチニブはＨＥＲ２過剰発現が認められる乳癌患者において高い治療効果を発揮する（非特許文献４、５）。ＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブはＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子変異肺がん患者において非常に高い治療効果を有する（非特許文献６）。したがって、新規の分子標的抗腫瘍剤の開発を成功させるため、ひいては該抗腫瘍剤が有効な患者に新たな治療選択肢を提供するには、臨床試験の開始前に治療に関連するバイオマーカーを発見しておくことが非常に重要といえる。
【０００３】
バイオマーカーはしばしば化合物と１対１で対応していない。例えば、エルロチニブとゲフィチニブは異なる化合物であるにも関わらず、バイオマーカーはいずれもＥＧＦＲ変異である。さらには抗体であるトラスツズマブと低分子化合物であるラパチニブもバイオマーカーは同一である。すなわち、分子標的抗腫瘍剤のバイオマーカーは分子標的抗腫瘍剤の構造ではなく、その作用機序に依存する。
【０００４】
分子標的抗腫瘍剤の標的の一つとして熱ショックタンパク（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＳＰ）がある。ＨＳＰは細胞内に存在する分子シャペロンであり、その分子量によってＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、ｓｍａｌｌ  ＨＳＰｓなど、幾つかのファミリーに分類される機能性分子である。分子シャペロンとは、タンパク質の機能的高次構造の形成を促進するため、標的タンパク質と一時的に複合体を形成するタンパク質の総称である。すなわち、分子シャペロンは、タンパク質の折り畳み（フォールディング）や会合を助け、凝集を抑止する。
中でもＨＳＰ９０は、１００種類以上のタンパク質の正確なフォールディング、凝集阻害、細胞内輸送、準活性化状態への維持など、多くの生体内高次機能に関わっている。ＨＳＰ９０の作用機作は、ＨＳＰ９０が不安定な折り畳み状態にあるタンパク質を特異的に認識して、これと結合して複合体を形成するというものである。特に、癌関連のシグナル伝達に関わる多様な標的タンパク質（ステロイドレセプター、Ｒａｆセリンキナーゼ、チロシンキナーゼ類）は、ＨＳＰ９０にその構造構築を依存し、ＨＳＰ９０は細胞周期の制御、細胞の癌化・増殖・生存シグナルに深く関与している。
【０００５】
ヒト腫瘍では多くのシグナル分子の調節機能が失われているが、この機能を維持するためにＨＳＰ９０が必要である（非特許文献７）。ＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０とその標的タンパク質を含むシャペロン複合体の構成を変化させ、該複合体から離脱した標的タンパク質を主にユビキチン・プロテアソーム系で分解させる。これにより、ＨＳＰ９０の標的タンパク質量が減少し、それに伴う下流へのシグナル伝達を遮断し、癌細胞の増殖を抑制することにより抗腫瘍効果をもたらす。
特に、癌化する過程では複数の遺伝子異常が蓄積されており、タンパク質の変異が生じている。癌細胞では、生成した変異タンパク質が多く、正常タンパク質からなる正常細胞と比較して、より多くのシャペロン活性を必要とする。このため、多くの癌細胞ではＨＳＰ９０の発現量が増加している。癌細胞は、異常なタンパク質発現が認められる事に加え、低酸素状態、栄養飢餓状態に置かれており、一種のストレス状態下にあるため、ＨＳＰ９０によるシャペロン活性への依存度合いが高いと考えられる。したがって癌細胞は、ＨＳＰ９０阻害剤に対する感受性が、正常細胞と比較して高いことが期待される。そこでＨＳＰ９０を標的分子とするＨＳＰ９０阻害剤の探索的研究、並びにその抗腫瘍効果の検証がなされている。
【０００６】
ＨＳＰ９０阻害剤として、特許文献１には、５−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−［１，２，４］トリアゾール−３−オン誘導体が記載されている。該化合物は動物実験においても優れた抗腫瘍効果を示し、抗腫瘍剤として有望であることが報告されている。また、特許文献２および特許文献３でも、ＨＳＰ９０阻害活性を有するトリアゾール化合物を報告している。
【０００７】
前記のようにＨＳＰ９０は有望な抗腫瘍剤の標的タンパク質であるが、ＨＳＰ９０阻害剤による治療に関連したバイオマーカーは未だ確立されていない。特許文献４はＨＳＰ９０のバイオマーカーとしてＫＲＡＳ、ＥＧＦＲおよびＢＲＡＦ遺伝子の内、少なくとも１つの活性化型突然変異を報告している。また特許文献５はＨＳＰ９０阻害剤のバイオマーカーとしてＡＬＫ、ＭＡＰＫ経路またはＥＧＦＲ遺伝子の変異を報告しているが、詳細な実施例はＡＬＫ、ＫＲＡＳまたはＥＧＦＲ遺伝子の変異とＨＳＰ９０阻害剤の治療効果に限定されており、さらにはＫＲＡＳおよびＥＧＦＲ遺伝子変異とＨＳＰ９０阻害剤の効果における相関性は高くなかった。特許文献５ではＡＬＫ遺伝子変異とＨＳＰ９０阻害剤の効果に相関性は見られたものの、肺がんにおけるＡＬＫ遺伝子変異を持つ患者は全体の５％に満たない。
【０００８】
特許文献５はＨＳＰ９０阻害剤のバイオマーカーとしてＡｋｔ遺伝子とＥＲＫ遺伝子の変異についても言及している。しかしながら前述したように特許文献５にはＡｋｔおよびＥＲＫの変異とＨＳＰ９０阻害剤の治療効果を予期させる実施例は皆無であり、ＡｋｔおよびＥＲＫ遺伝子またはタンパク質の、具体的にどのような変異がＨＳＰ９０阻害剤の治療効果と相関するかについての選択基準についても言及していない。
【０００９】
Ａｋｔは増殖因子の下流で働くセリン／スレオニンキナーゼであり、細胞の増殖・生存・分化・糖代謝に関わるシグナルを伝達する。Ａｋｔは細胞膜上で上流のキナーゼであるＰＤＫ１／２によってリン酸化を受けることによって活性化される（非特許文献８）。Ａｋｔは一部の癌種において遺伝子増幅や活性化変異が報告されていることや、Ａｋｔを負に調節するＰＴＥＮの欠損が多くの癌種で認められていることから、抗腫瘍剤の標的タンパクとして薬剤が開発されている。
【００１０】
ＥＲＫは最初に発見されたＭＡＰキナーゼであり、細胞骨格や細胞運動、細胞周期、分化に関わるシグナルを伝達する。ＥＲＫは様々な増殖因子や細胞特異的な刺激によりリン酸化を受け活性化する。ＥＲＫの活性化はがん細胞の増殖・運動・生存において重要な役割を果たしており、実際に多くの癌種でＥＲＫの活性亢進が認められている（非特許文献９）。
【００１１】
ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化は細胞の生存・増殖に重要な役割を担うシグナルであるが、これらのリン酸化がＨＳＰ９０によって直接制御されているという知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開２００６／０９５７８３
【特許文献２】国際公開２００９／０２３２１１
【特許文献３】国際公開２００７／１３４６７８
【特許文献４】特表２０１２−５０００１３
【特許文献５】国際公開２０１１／０６０３２８
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔ  ｃｒｉｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１，３４４：１０３８−４２．
【非特許文献２】Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００４，３５０：２１２９−３９．
【非特許文献３】Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｓ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＥＧＦＲ  ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａａｎｃｅｒ（ＯＰＴＩＭＡＬ，ＣＴＯＮＧ−０８０２）：ａｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，  ｐｈａｓｅ  ３  ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１１，１２：７３５−４２．
【非特許文献４】Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｌｕｓ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＥＲ２  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＥＲ２．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１，３４４：７８３−９２．
【非特許文献５】Ｌａｐａｔｉｎｉｂ  ｐｌｕｓ  ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ  ｆｏｒ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００６，３５５：２７３３−４３．
【非特許文献６】Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１０，３６３：１６９３−７０３．
【非特許文献７】Ｈｓｐ９０ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００２，８：４（Ｓｕｐｐｌ．），Ｓ５５−６１．
【非特許文献８】Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ  ａｎｄ  ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ．Ａｇｉｎｇ．２０１１，３：１９２−２２２．
【非特許文献９】Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００７，２６：３２９１−３１０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的はＨＳＰ９０阻害剤が有効な患者群を同定する方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、腫瘍内のリン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）またはリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）の発現レベルが、ＨＳＰ９０阻害剤の抗腫瘍効果と相関することを見出した。すなわち、特定の腫瘍のｐＡｋｔまたはｐＥＲＫの発現量がコントロールレベルに比較して上回っている判定されたとき、該腫瘍はＨＳＰ９０阻害剤に対し高い感受性を持つと判定できることを見出した。すなわち、本発明は、以下の構成を要旨とする。
【００１６】
ＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍の感受性を判定する方法であって、患者由来の該腫瘍組織のｐＡｋｔを検出する工程、または該腫瘍組織のｐＥＲＫを検出する工程を含む方法に関する。
さらには、腫瘍のＡｋｔのリン酸化レベルがコントロールレベルに比較して亢進していること、または腫瘍のＥＲＫのリン酸化レベルがコントロールレベルに比較して亢進していることに基づき、ＨＳＰ９０阻害剤による治療が有効である患者を選択する方法に関する。
さらには、ＨＳＰ９０阻害剤に対する腫瘍の感受性を判定する方法であって、患者由来の該腫瘍組織のｐＡｋｔを検出する工程及び該腫瘍組織のｐＥＲＫを検出する工程を含む方法。
【００１７】
さらには、ある患者由来の腫瘍のｐＡｋｔ陽性細胞数の全腫瘍細胞数に対する割合が１．０％程度またはそれ以上であった場合、該患者にはＨＳＰ９０阻害剤による治療が有効であると判定する工程を含む方法、またはある患者由来の腫瘍のｐＥＲＫ陽性細胞の該腫瘍の全腫瘍細胞数に対する割合が１．０％程度またはそれ以上であった場合、該患者にはＨＳＰ９０阻害剤による治療が有効であると判定する工程を含む方法に関する。
【００１８】
さらには、Ａｋｔのリン酸化および／またはＥＲＫのリン酸化が免疫組織学的解析（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ解析または質量分析のいずれか１以上の手段によって検出される方法である。
【００１９】
さらには、ＨＳＰ９０阻害剤は下記一般式（１）
【００２０】
【化１】
2015114312.tif 000003
［式中、Ｘは直鎖状または分岐状の炭素数１〜８のアルキル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、またはハロゲン原子を示し、Ｙは硫黄原子または酸素原子を示し、ｍは０〜４の整数を示し、Ａは置換基を有するアミノ基を示す］で表されるトリアゾール化合物（Ａ）である上記方法に関する。
さらには、ＨＳＰ９０阻害剤はＧａｎｅｔｅｓｐｉｂである上記方法に関する。
さらには、腫瘍が卵巣がん、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、胃がん、食道がん、腎細胞がん、前立腺がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍および肉腫から選択される上記方法に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＨＳＰ９０阻害剤による治療が有効な癌患者を確実、且つ、簡便に選択できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図２】ヒト卵巣癌細胞ＴＯＶ−２１Ｇの皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図３】ヒト卵巣癌細胞ＯＶ−９０の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図４】ヒト卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ−３の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図５】ヒト卵巣癌細胞ＯＣ−１１−ＪＣＫの皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図６】ヒト卵巣癌細胞ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＣＤＤＰの皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図７】ヒト卵巣癌細胞ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＰＴＸの皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）およびＧａｎｅｔｅｓｐｉｂの抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図８】ヒト卵巣癌細胞ＴＯＧＹ−１８の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）およびＧａｎｅｔｅｓｐｉｂの抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図９】ヒト卵巣癌細胞２００８の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図１０】ヒト卵巣癌細胞ＳＨＩＮ−３の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図１１】ヒト乳癌細胞ＭＣ−１９−ＪＣＫの皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）およびＧａｎｅｔｅｓｐｉｂの抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図１２】ヒト乳癌細ＪＩＭＴ−１の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）およびＧａｎｅｔｅｓｐｉｂの抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図１３】ヒト肺がん細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５の皮下移植マウスをもちいた、トリアゾール化合物（Ａ−１）およびＧａｎｅｔｅｓｐｉｂの抗腫瘍効果を示す図である。（実施例１）
【図１４】マウス皮下に移植したヒト卵巣癌細胞ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＣＤＤＰ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＰＴＸ、ＥＳ−２、ＳＨＩＮ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３、ＴＯＶ−２１Ｇ、ＯＶ−９０，ＴＯＧＹ−１８、ＯＣ−１０−ＪＣＫおよび２００８腫瘍内のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ｍｅｔ，ＩＧＦ−１Ｒ、Ｒａｆ−１、Ｓｔａｔ３、リン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、ＥＲＫ，ｍＴＯＲ、ＭＥＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０およびＡｃｔｉｎタンパクの免疫ブロット解析を表す図である。（実施例１）
【図１５】ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３皮下移植マウスにトリアゾール化合物（Ａ−１）を投与し、投与前・投与後４時間および２４時間後に採取したＳＫ−ＯＶ−３腫瘍内のＨＳＰ９０関連タンパク免疫ブロット解析を示す図である。（実施例２）
【図１６】ヒト卵巣癌細胞ＴＯＶ−２１Ｇ皮下移植マウスにトリアゾール化合物（Ａ−１）を投与し、投与前・投与後４時間および２４時間後に採取したＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍内のＨＳＰ９０関連タンパク免疫ブロット解析を示す図である。（実施例２）
【図１７】マウス皮下に移植したヒト卵巣癌細胞２００８、ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＳＫ−ＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍に対し、抗ｐＡｋｔ抗体を用いた免疫組織染色を施した際のｐＡｋｔ陽性細胞数の割合を示す図である。（実施例３）
【図１８】マウス皮下に移植したヒト卵巣癌細胞ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＳＫ―ＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍に対し、抗ｐＥＲＫ抗体を用いた免疫組織染色を施した際のｐＥＲＫ陽性細胞数の割合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書においてＡｋｔとは、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３のいずれか、又は全てである。またＡｋｔのリン酸化（リン酸化Ａｋｔ：ｐＡｋｔ）とはＡｋｔのいずれかのアミノ酸残基にリン酸基が付与されること、またはリン酸基が付与されたアミノ酸残基を持つＡｋｔを指す。リン酸基が付与されるアミノ酸残基はそれだけに限定されないが、特にＳｅｒ３０８またはＳｅｒ４７３（Ａｋｔ１）、Ｓｅｒ３０９またはＳｅｒ４７４（Ａｋｔ２）、Ｓｅｒ３０５またはＳｅｒ４７２（Ａｋｔ３）が挙げられる。
本明細書においてＥＲＫとは、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２のいずれか、又は全てである。またＥＲＫのリン酸化（リン酸化：ｐＥＲＫ）とはＥＲＫのいずれかのアミノ酸残基にリン酸基が付与されること、またはリン酸基が付与されたアミノ酸残基を持つＥＲＫを指す。リン酸基が付与されるアミノ酸残基はそれだけに限定されないが、特にＴｈｒ１６０、Ｔｈｒ１７７、Ｔｈｒ２０２またはＴｙｒ２０４が挙げられる。
本明細書においてリン酸化レベルとは細胞内のあるタンパク質におけるアミノ酸残基中のリン酸基が付与されたタンパクの量または割合を指す。例えばＡｋｔのリン酸化レベルはｐＡｋｔの量または総Ａｋｔ量（ｐＡｋｔ量＋非リン酸化Ａｋｔ量）に対するｐＡｋｔの割合となる。ＡｋｔとＥＲＫを含む細胞内のシグナル伝達を担うタンパク質は主にリン酸化を受けることにより機能が活性化される。したがってリン酸化レベルの高いシグナル伝達タンパクはその機能が活性化されており、リン酸化レベルが低いシグナル伝達タンパクはその機能が活性化されていないと推測することができる。
本明細書においてＡｋｔのリン酸化レベルまたはＥＲＫのリン酸化レベルを検出する工程とは上述したＡｋｔのリン酸化レベルまたはＥＲＫのリン酸化レベルを検出する作業のすべてを指す。検出法として例えばウエスタンブロット解析やＥＬＩＳＡ解析、免疫染色法、免疫組織学的解析（ＩＨＣ）に代表されるような、抗リン酸化Ａｋｔ抗体または抗リン酸化ＥＲＫ抗体を用いた免疫学的な検出法、質量分析によるｐＡｋｔまたはｐＥＲＫの検出、リン酸基に対し特異的な相互作用を有する機能性分子を用いた検出、ｐＡｋｔまたはｐＥＲＫに対し特異的に相互作用する機能性分子、タンパク質、ＲＮＡ等を用いた検出法などが挙げられる。
本明細書において免疫組織学的解析（ＩＨＣ）とは検体より作製した凍結標本またはパラフィン包埋標本について、特定のタンパク質の発現を確認する一般的な手技である。
本明細書においてウエスタンブロット解析とは電気泳動で分離したタンパク質を膜に転写した後、抗体を利用して目的のタンパク質のみを検出する一般的な手技である。
本明細書においてＥＬＩＳＡ解析とは目的のタンパク質またはリン酸残基に特異的な抗体と酵素反応による検出を組み合わせた手法であり、複数の成分が存在する検体中から抗体により認識される特定の物質の量のみを測定することが可能である。
本明細書において質量分析とは分子やイオンの質量電荷比を求めるために使用される手法である。高電圧をかけた真空中で試料をイオン化し、電気的・磁気的に試料を分離する。その際の分離は質量電荷比に依存して起こり、これは由来する物質について固有であるため、目的物質の検出が可能となる。本明細書では特に限定しないがイオン源としてタンパク質を安定にイオン化できるMALDIが挙げられる。
本明細書においてＨＳＰ９０阻害剤とは、ＨＳＰ９０の阻害作用を有するものすべてをいう。例えば抗ＨＳＰ９０抗体、トリアゾール環を有する化合物、１７−ＡＡＧ、Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ、Ｒａｄｉｃｉｃｏｌ、ＰＵ３又はそれらの誘導体、または薬理学的に許容される塩であってＨＳＰ９０の阻害作用を有するものである。トリアゾール環を有する化合物としては、Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂ、または、下記一般式（１）
【００２４】
【化２】
2015114312.tif 000004
2015114312.tif 000005
で表されるトリアゾール化合物（Ａ）またはその薬理学的に許容される塩もＨＳＰ９０阻害剤の１例である。また、Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂおよびトリアゾール化合物（Ａ）の互換異性体も含まれる。
【００２５】
前記一般式（１）において、Ｘは炭素数が１〜２０の鎖状、分岐状、環状のアルキル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、またはハロゲン原子である。Ｘがアルキル基の場合、好ましくは直鎖状または分岐状の炭素数１〜８のアルキル基であって、さらに好ましくはエチル基、イソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、２，２−ジメチルプロピル基である。Ｘがアルキニル基の場合、好ましくは炭素数２〜６のアルキニル基であって、さらに好ましくは２−プロピニル基、２−ブチニル基である。Ｘがハロゲン原子の場合、好ましくは臭素原子または塩素原子である。
【００２６】
前記一般式（１）において、Ｙは硫黄原子または酸素原子のいずれかである。
【００２７】
前記一般式（１）において、ｍは０〜４の整数であり、好ましくは０または1である。
【００２８】
前記一般式（１）において、Ａは置換基を有するアミノ基であれば限定はないが、好ましくはモルホリノ基、４−メチルピペラジン−１−イル基、ピペリジン−１−イル基、又はピロリジン−１−イル基のいずれかである。
【００２９】
Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂおよび前記一般式（１）において、互換異性体とはそれぞれの異性体が速やかに相互変換可能で、トリアゾール環が下記一般式（２−１）と（２−２）に示すような関係であり、同一の化合物である。
【００３０】
【化３】
2015114312.tif 000006
【実施例】
【００３１】
本実施例は、本発明の特定の実施形態、およびその様々な使用を例証するものである。これらは説明の目的で述べるものであり、本発明を限定するものではない。
本実施例で用いられたマウス（いずれも雌性）は以下のとおりである。
ヌードマウス
系統名：BALB/cA-nu/nu（移植時６−１３週令）
購入会社：日本クレア株式会社、またはチャールズリバー
スキッドマウス
系統名：CB-17/scid（移植時５−７週令）
購入会社：チャールズリバー
NOD/スキッド
系統名：NOD-scid（移植時８週令）
購入会社：チャールズリバー
【００３２】
合成例１  ＨＳＰ９０阻害剤化合物の合成
本発明の一般式（１）で表されるトリアゾール化合物（Ａ）として、５−（２，４−ジヒドロキシ−５−イソプロピル−フェニル）−４−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イルメチル）−フェニル］−２，４−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾール−３−オン；（Ａ−１）を用いた。当該（Ａ−１）は、国際公開２００６／０９５７８３の実施例２−５に開示される製造方法に従い合成した。Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂは、国際公開２００７／１３９９５２の実施例４に開示される製造方法に従い合成した。
【００３３】
試験例１    腫瘍皮下移植マウスによる抗腫瘍試験
＜細胞と移植腫瘍＞
ヒト卵巣がん株であるＯＣ−１０−ＪＣＫ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＴＯＧＹ−１８およびヒト乳がん株であるＭＣ−１９−ＪＣＫは公益財団法人実験動物中央研究所から入手した。凍結保存していた腫瘍片を融解し、ＯＣ−１０−ＪＣＫとＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＭＣ−１９−ＪＣＫはスキッドマウス皮下に移植した。ＴＯＧＹ−１８はヌードマウス皮下に移植した。腫瘍が増殖したのち、腫瘍を取り出して腫瘍片を作成し、スキッドマウス皮下またはヌードマウス皮下へ套管針を用いて移植した。同様の操作で移植を繰り返し、腫瘍を維持させ、移植腫瘍を調製した。ヒト卵巣がん細胞株であるＥＳ−２、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶ−９０、ＴＯＶ−２１Ｇおよびヒト肺がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ１９７５はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＳＫ−ＯＶ−３およびＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞は推奨されている培地中で増殖させた後、１×１０７個程度をＨＢＳＳにて懸濁し、スキッドマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、腫瘍を取り出して腫瘍片を作成し、スキッドマウス皮下へ套管針を用いて移植した。同様の操作で移植を繰り返し、腫瘍を維持させ、移植腫瘍を調製した。ＯＶ−９０細胞は推奨培地で増殖させた後、１×１０６個程度をＨＢＳＳにて懸濁し、スキッドマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、抗腫瘍試験に供した。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞は推奨培地で増殖させた後、１×１０７個程度をＨＢＳＳにて懸濁し、スキッドマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、抗腫瘍試験に供した。ＥＳ−２細胞は推奨されている培地中で増殖させた後、ＨＢＳＳに懸濁し、ヌードマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、腫瘍を取り出して腫瘍片を作成し、ヌードマウス皮下へ套管針を用いて移植した。同様の操作で移植を繰り返し、腫瘍を維持させ、移植腫瘍を調製した。ヒト卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ−３はＣｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＲＣＢＲ）から入手した。１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた後、１×１０７個程度をＨＢＳＳにて懸濁し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、抗腫瘍試験に供した。ヒト乳がん細胞株ＪＩＭＴ−１はＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から入手した。推奨されている培地中で増殖させた後、ＨＢＳＳに懸濁し、スキッドマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、腫瘍を取り出して腫瘍片を作成し、スキッドマウス皮下へ套管針を用いて移植した。同様の操作で移植を繰り返し、腫瘍を維持させ、移植腫瘍を調製した。ヒト卵巣がん細胞株２００８は１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた後、１×１０７個程度をＨＢＳＳにて懸濁し、スキッドマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、腫瘍を取り出して腫瘍片を作成し、スキッドマウス皮下へ套管針を用いて移植した。同様の操作で移植を繰り返し、腫瘍を維持させ、移植腫瘍を調製した。ヒト卵巣がん細胞株ＳＨＩＮ−３は１５％ＦＢＳを添加したＥ���ＭＥＭ培地で増殖させた後、１×１０６個程度をＨＢＳＳにて懸濁し、スキッドマウスの皮下に注射した。細胞が腫瘍を形成したのち、抗腫瘍試験に供した。ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＰＴＸおよびＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＣＤＤＰは日本化薬株式会社医薬研究所で樹立したものを使用した。公益財団法人実験動物中央研究所から入手したＯＣ−１１−ＪＣＫをスキッドマウスまたはヌードマウスに移植し、パクリタキセル（ＰＴＸ）またはシスプラチン（ＣＤＤＰ）を継続的に投与することでそれぞれの薬剤について薬剤抵抗性を獲得した株をそれぞれＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＰＴＸ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＣＤＤＰと名付けた。
【００３４】
＜腫瘍皮下移植マウスによる抗腫瘍試験＞
スキッドマウスまたはヌードマウスで継代維持した上述のＯＣ−１０−ＪＣＫ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＣＤＤＰ、ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＰＴＸ、ＭＣ−１９−ＪＣＫ、ＴＯＧＹ−１８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＥＳ−２、２００８、ＮＣＩ−Ｈ１９７５およびＪＩＭＴ−１腫瘍を、各スキッドマウス、ＮＯＤスキッドマウス（ＯＶＣＡＲ−３のみ）またはヌードマウスの背側部皮下に套管針を用いて移植した。ＯＶ−９０、ＴＯＶ−２１Ｇ、ＯＶＣＡＲ−３およびＳＨＩＮ−３細胞は上述の方法でマウス皮下に移植した。平均腫瘍体積が概ね１００〜２００ｍｍ３に達したときに、供試薬剤の投与を開始した。投与各薬剤の量及び用法は、ＨＳＰ９０阻害剤化合物として合成例１で合成したトリアゾール（Ａ−１）を日本薬局方ブドウ糖注射液に溶解して４０ｍｇ／ｋｇの用量を４日間隔で３回、尾静脈内に投与した。ＭＣ−１９−ＪＣＫについては４０ｍｇ／ｋｇを単回投与、ＮＣＩ−Ｈ１９７５およびＪＩＭＴ−１については４０ｍｇ／ｋｇを７日間隔で３回投与した。Ｇａｎｅｔｅｓｐｉｂは、ジメチルスルフォキシドに溶解し、クレモフォール（登録商標）ＲＨ４０を２０％含有させた日本薬局方ブドウ糖注射液で１０倍希釈して１２５ｍｇ／ｋｇの用量を７日間隔で３回、尾静脈内に投与した。ＭＣ−１９−ＪＣＫについては１２５ｍｇ／ｋｇを単回投与、ＮＣＩ−Ｈ１９７５については１５０ｍｇ／ｋｇの用量を７日間隔で３回、尾静脈内に投与した。腫瘍の計測は，投与開始日から観察期間終了まで週２回行い、腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｗ）を、ノギスを用いて測定した。計測した腫瘍の長径と短径を用いて，腫瘍体積を式（Ｌ×Ｗ２×１／２）から算出した。各薬剤投与群に無投与群（コントロール群）を加えて、各群３〜５匹にて抗腫瘍試験を行なった。投与開始から２１日目までについて、無投与群の相対腫瘍体積を１００とした薬剤投与群相対腫瘍体積（Ｔ／Ｃ（％））を抗腫瘍効果の指標として以下の式で算出した。式（投与群相対腫瘍体積／無投与群相対腫瘍体積×１００）。それぞれの腫瘍について投与開始から２１日目までのＴ／Ｃ（％）の中で最も低い値を表１に示した。
また、投与開始日の腫瘍体積を１とした相対腫瘍体積を算出した経時的腫瘍増殖曲線を図１（ＳＫ−ＯＶ−３）、図２（ＴＯＶ−２１Ｇ）、図３（ＯＶ−９０）、図４（ＯＶＣＡＲ−３）、図５（ＯＣ−１１−ＪＣＫ）、図６（ＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＣＤＤＰ）、図７（ＯＣ−１１／ＰＴＸ、図８（ＴＯＧＹ−１８）、図９（２００８）、図１０（ＳＨＩＮ−３）、図１１（ＭＣ−１９−ＪＣＫ）、図１２（ＪＩＭＴ−１）および図１３（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）に示した。
【００３５】
＜腫瘍タンパク質の抽出＞
各腫瘍のタンパク質抽出液は以下のように採取した。スキッドマウスまたはヌードマウスで継代維持したヒト卵巣がん腫瘍を、各スキッドマウスまたはヌードマウスの背側部皮下に套管針を用いて移植した。腫瘍体積が概ね３００ｍｍ３に達したときに腫瘍を取り出した。採材した腫瘍を速やかに細断し、湿重量を測定した後、液体窒素によって急速冷凍した。冷凍した腫瘍はビーズショッカーを用いて完全にホモジェナイズし、ここにプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液を４μＬ／ｍｇで加え軽く撹拌した後、氷上で１５分間静置した。この細胞懸濁液を遠心して上清をタンパク質抽出液とした。タンパク質抽出液中の総タンパク量はＢｉｏＲａｄプロテインアッセイを用いて定量した。
【００３６】
＜タンパク質の発現量＞
腫瘍におけるＨＳＰ９０の標的タンパク質（クライアントタンパク質）や細胞の生存および増殖に関連するタンパク質の発現量を免疫ブロット法で確認した。
３０μｇの総タンパク質を８％アクリルアミドゲルで電気泳動した。次いで４℃下で１００Ｖ、６０分間電圧をかけてタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写の終えたＰＶＤＦ膜は５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）を用いて常温で６０分間ブロッキングした後、以下に示す一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。
【００３７】
一次抗体（入手先、製品番号、希釈比率、露光時間）
ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−００３，１：５００，１分）
ＨＥＲ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２８４，１：２０００，５秒）
ＨＥＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２８５，１：４００，１分）
Ｍｅｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１６１，１：５００，５分）
ＩＧＦ−１Ｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３０２７，１：５００，１５秒）
Ｒａｆ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１３３，１：３００，５分）
Ｓｔａｔ３（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，６１０１８９，１：５００，１５秒）
ｐＡｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃４０５８Ｓ，１：５００，１分）
Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃４６９１Ｓ，１：２０００，１５秒）
ｐＥＲＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１６９８２−Ｒ，１：５００，１分）
ＥＲＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，４４−６５４Ｇ，１：１０００，１５秒）
ｍＴＯＲ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃２９８３Ｓ，１：５００，１５秒）
ＭＥＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１２２Ｓ，１：５００，１分）
ＨＳＰ９０（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＳＰＡ−８３０，１：５００，１５秒）
ＨＳＰ７０（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＳＰＡ−８１０，１：２０００，１５秒）
Ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−８４３２／ＨＲＰ，１：３００，５分）
【００３８】
インキュベート後、ブロット膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）を用いて常温で１０分間洗浄×３回行い、余剰の一次抗体を除去した後、適切な二次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ又はａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と常温で６０分間インキュベートした。余剰な二次抗体をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）を用いて常温で１０分間×３回の洗浄で除去し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）と２分間インキュベートした後、Ｘ線フィルムに露光することで目的タンパク質のシグナルを検出した。
クライアントタンパク質としてＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ｍｅｔ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｒａｆ−１、Ｓｔａｔ−３、Ａｋｔ、ｍＴＯＲおよびＭＥＫの発現量を調べた。細胞の生存および増殖を制御するタンパク質としてｐＡｋｔ、ｐＥＲＫおよびＥＲＫの発現量を調べた。ＨＳＰ９０関連タンパク質としてＨＳＰ９０およびＨＳＰ７０の発現量を確認した。内部標準タンパク質としてＡｃｔｉｎを採用した。１つの腫瘍株につき最低２個体からタンパク質抽出液を採取し評価した。結果を図１４に示した。また一部のタンパク質発現レベルの強弱を表１に示した。発現レベルは以下の基準により決定した。
＋＋＋：上述した条件でウエスタンブロットした際、目的の分子量の位置に非常に濃く明確なバンドが確認された。
＋＋：上述した条件でウエスタンブロットを行った際、目的の分子量の位置に明確なバンドが確認された。
＋：上述した条件でウエスタンブロットを行った際、目的の分子量の位置に薄いまたはやや不明確なバンドが得られた。
−：上述した条件でウエスタンブロットを行った際、目的の分子量の位置にバンドが見られない、または極薄いバンド、不明瞭なバンドしか得られない。
【００３９】
【表１】
2015114312.tif 000007
【００４０】
表１から分かるように、トリアゾール化合物（Ａ−１）には他の分子標的薬と同様に薬剤が高い効果を示す株（例えばＳＫ−ＯＶ−３やＴＯＶ−２１Ｇ）と効果をほとんど示さない株（例えばＯＣ−１１−ＪＣＫ／ＰＴＸやＳＨＩＮ−３）が存在することが分かった。
【００４１】
図１４または表１から分かるように、トリアゾール化合物（Ａ−１）の効果が比較的高い腫瘍であるＳＫ−ＯＶ−３、ＴＯＶ−２１Ｇ、ＥＳ−２，ＯＶ−９０およびＯＶＣＡＲ−３においてはｐＡｋｔの発現量またはｐＥＲＫの発現量が他の腫瘍株に比べ高い傾向にあり、トリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果が低い腫瘍（例えば２００８、ＯＣ−１１／ＰＴＸまたはＳＨＩＮ−３）においてはｐＡｋｔとｐＥＲＫの発現レベルは両者とも低い傾向にあった。一方で他のＨＳＰ９０クライアントタンパク質やＨＳＰ９０関連タンパク質の発現量とトリアゾール化合物（Ａ−１）の効果との間には相関性が見られなかった。
以上の結果はｐＡｋｔまたはｐＥＲＫの発現量が亢進している腫瘍はトリアゾール化合物（Ａ−１）に対して高い感受性を持っていることを示している。
【００４２】
また、表１から分かるようにトリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果とＧａｎｅｔｅｓｐｉｂの抗腫瘍効果が相関していることが確認された。このことは少なくともトリアゾール環を有するＨＳＰ９０阻害剤であれば、抗腫瘍効果の発現パターンおよび効果の判別につながるバイオマーカーが共通であることによる。分子標的抗腫瘍剤のバイオマーカーは分子標的抗腫瘍剤の構造ではなく、その作用機序に依存するため、ＨＳＰ９０阻害剤全般においても、ｐＡｋｔまたはｐＥＲＫの発現量が亢進している腫瘍はＨＳＰ９０阻害剤に対して高い感受性を持っていることを示唆している。
【００４３】
実施例２
＜細胞と移植腫瘍＞
実施例１と同様にして、ヒト卵巣がん細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇの移植腫瘍を調製した。
【００４４】
＜腫瘍タンパク質の抽出＞
各腫瘍のタンパク質抽出液は以下のように採取した。スキッドマウスで継代維持した該ヒト卵巣がん腫瘍を、スキッドマウスの背側部皮下に套管針を用いて移植した。腫瘍体積が概ね３００ｍｍ３に達したときに、ＨＳＰ９０阻害剤として合成例１で合成したトリアゾール（Ａ−１）を実施例１と同様に４０ｍｇ／ｋｇの用量でマウス尾静脈に投与した。投与前および投与後４、２４時間に腫瘍を取り出した。各時点においてＳＫ−ＯＶ−３腫瘍については３匹ずつ、ＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍については２匹ずつのマウスから腫瘍を取り出した。実施例１と同様にしてタンパク質抽出液を得、タンパク質抽出液中の総タンパク質量を実施例１と同様にして定量した。
【００４５】
＜タンパク質の発現量の変化＞
トリアゾール化合物（Ａ−１）を投与した後のＳＫ−ＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍内におけるクライアントタンパク質およびＨＳＰ９０関連タンパク質の発現量の変化を実施例１と同様に免疫ブロット法により調べた。用いた一次抗体及び二次抗体の種類、希釈比率は実施例１と同一である。
ＳＫ−ＯＶ−３腫瘍の免疫ブロット結果を図１５に、ＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍の免疫ブロット結果を図１６に示した。
【００４６】
図１５から分かるようにトリアゾール化合物（Ａ−１）投与後４時間のＳＫ−ＯＶ−３腫瘍ではクライアントタンパク質であるＥＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒ、ＭｅｔおよびｍＴＯＲなどの発現レベルが顕著に減少しており、それに伴って細胞の増殖・生存シグナルを制御するｐＡｋｔおよびｐＥＲＫの発現レベルも顕著に減少した。一方で総Ａｋｔおよび総ＥＲＫ発現量に変化は見られなかった。また図１６から分かるようにＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍についてもクライアントタンパク質であるＥＧＦＲ，ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＭｅｔおよびｍＴＯＲなどの発現レベルが減少しており、それに伴ってｐＡｋｔの発現レベルも減少した。しかし総Ａｋｔおよび総ＥＲＫの発現量に変化は見られなかった。以上の結果はＨＳＰ９０阻害剤であるトリアゾール化合物（Ａ−１）はがん細胞の増殖に寄与するクライアントタンパク質の発現量を減少させることでＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化を阻害し、抗腫瘍効果を発現することを示している。
【００４７】
実施例３
＜細胞と移植腫瘍＞
ヒト卵巣がん細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３、ＴＯＶ−２１Ｇ、２００８およびＯＣ−１１−ＪＣＫを実施例１と同様にして移植腫瘍を調製した。
【００４８】
＜組織標本の作製＞
各腫瘍の組織標本は以下のように作製した。スキッドマウスで継代維持した上述のヒト卵巣がん腫瘍を、スキッドマウスの背側部皮下に套管針を用いて移植した。腫瘍体積が概ね３００ｍｍ３に達したときに腫瘍を取り出した。採材した腫瘍は割を入れたのち、速やかに１０％中性緩衝ホルマリンで一晩固定した。固定した腫瘍をエタノールで段階的に脱水し、キシレンに透徹後、パラフィンに包埋した。作製したパラフィンブロックを３μｍで薄切しスライドガラスに固定することで切片を得た。作製した切片はキシレンを用いてパラフィンを除去し、エタノールで段階的に親水化した。クエン酸ナトリウムバッファー中でのマイクロウェーブ処理により抗原を賦活化した後（ｐＡｋｔ染色のみこの作業を行った。）、０．２％ブタ血清溶液を用いて常温で３０分間ブロッキングした。次いで以下に示す一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ｐＡｋｔ（シグマ，ＳＡＢ４３００２５９，１：５００）、ｐＥＲＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１６９８２−Ｒ，１：５００）ＴＢＳ緩衝液を用いて常温で５分間洗浄×３回行い、余剰の一次抗体を除去した後、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅと３７℃で３０分間インキュベートした。余剰な二次抗体を、ＴＢＳを用いて常温、５分間×３回の洗浄で除去し、ＤＡＢで目的タンパク質のシグナルを染色した。各腫瘍の染色切片について顕微鏡観察を行い、細胞の増殖が盛んで壊死層の少ない腫瘍辺縁部において３視野の写真を撮影した。がん細胞の内、陽性細胞と陰性細胞の数を計測して、陽性細胞の割合を以下の式で算出した。陽性細胞％＝１００×陽性細胞数／（陽性細胞数＋非陰性細胞数）。
【００４９】
２００８、ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＳＫ−ＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍におけるｐＡｋｔ陽性細胞の割合を図１７に示した。ＯＣ−１１−ＪＣＫ、ＳＫ−ＯＶ−３およびＴＯＶ−２１Ｇ腫瘍におけるｐＥＲＫ陽性細胞の割合を図１８に示した。またそれぞれの陽性細胞割合の値と実施例１で得られたトリアゾール化合物（Ａ−１）のＴ／Ｃ（％）を表２に示した。
【００５０】
【表２】
2015114312.tif 000008
【００５１】
図１７、１８および表２から、免疫組織学的検討においてもｐＡｋｔ陽性細胞またはｐＥＲＫ陽性細胞の割合とトリアゾール化合物（Ａ−１）の抗腫瘍効果は相関していることが確認できた。またこれらの結果からｐＡｋｔおよびｐＥＲＫの陽性細胞の割合が両者とも１％未満の腫瘍に対してはトリアゾール化合物（Ａ−１）の高い効果は望めないことが示唆された。分子標的抗腫瘍剤のバイオマーカーは分子標的抗腫瘍剤の構造ではなく、その作用機序に依存するため、その他のＨＳＰ９０阻害剤全般においても、ｐＡｋｔまたはｐＥＲＫの発現量が亢進している腫瘍はＨＳＰ９０阻害剤に対して高い感受性を持っていることを示唆している。
【図１】
2015114312.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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