(57)【要約】      （修正有）【課題】外用微小気泡超音波造影剤の提供。【解決手段】アルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマー、またはこれらの混合物、またはこれらの組合せから選択される微小気泡材料を、等張生理食塩水、寒天ゲル、アロエ・ゲル、局所ゲル、またはこれらの組合せから選択される媒体に分散し、複数の微小気泡を含むコーティングにより生体の体表の局所領域３０１に適用する、外用タイプの微小気泡超音波造影剤。該微小気泡の濃度が１×１０９〜２×１０９粒子／ｍｌであり、粒度が０．５〜２．５μｍである微小気泡超音波造影剤。【選択図】図１
2015007023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性の形態またはゲル形態である媒体と；
前記媒体に分散された複数の微小気泡であって、前記微小気泡の濃度が１×１０９から２×１０９粒子／ｍｌに及ぶ微小気泡と；
を含む、外用微小気泡超音波造影剤。
【請求項２】
前記微小気泡の材料が、アルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマーもしくはこれらの混合物、またはこれらの組合せから選択され、
前記媒体が、等張生理食塩水、寒天ゲル、アロエ・ゲル、局所ゲル、またはこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の微小気泡超音波造影剤。
【請求項３】
前記媒体がゲル形態の媒体であり、
前記ゲル形態の媒体の含有量が、前記微小気泡超音波造影剤の全重量の０．２重量パーセント以下である、請求項１に記載の微小気泡超音波造影剤。
【請求項４】
前記微小気泡の粒度が０．５マイクロメートルから２．５マイクロメートルの範囲にある、請求項１に記載の微小気泡超音波造影剤。
【請求項５】
化学物質または小分子をさらに含み、
前記化学物質または前記小分子が生体によって経皮的に吸収される、請求項１に記載の微小気泡超音波造影剤。
【請求項６】
生体表面の局所領域を透過する化学物質または小分子の経皮吸収を高める方法であって：
微小気泡超音波造影剤を前記生体体表面の前記局所領域に適用するステップであって、微小気泡超音波造影剤が、媒体と、前記媒体に分散された複数の微小気泡とを含み、前記媒体が、水性の形態またはゲル形態であり、前記微小気泡の材料が、アルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマーもしくはこれらの混合物、またはこれらの組合せから選択されるものであるステップと；
前記化学物質または前記小分子を前記局所領域に適用するステップと；
前記微小気泡超音波造影剤および前記化学物質または前記小分子が適用された前記局所領域に直接接触するように、機械式振動波源を適用して、前記微小気泡に作用する機械式振動エネルギー源によって発生した機械波によって、前記化学物質または前記小分子の経皮吸収を増大させるステップと；
を含む方法。
【請求項７】
前記微小気泡の濃度が、前記微小気泡超音波造影剤および前記化学物質または前記小分子の合計体積に対して２×１０６から２×１０８粒子／ｍｌの範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
希釈剤として前記化学物質または前記小分子を使用して、前記微小気泡超音波造影剤を２〜１０００倍に希釈するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微小気泡超音波造影剤を適用するステップ、および前記化学物質または前記小分子を適用するステップが、別個に行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記微小気泡の粒度が０．５マイクロメートルから２．５マイクロメートルの範囲にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記機械式振動波源が超音波源および／またはレーザ源を含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月２５日に出願された台湾特許出願第１０２１２２５８８号の優先権の利益を主張するものである。上述の特許出願の全体は、参照により本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。
【０００２】
本発明は、生物医学的薬剤に関する。詳細には、本発明は、外用超音波微小気泡造影剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
何十年もの間、超音波は、電離放射線を用いることのない、正確で安価な、かつ容易に操作されるツールであることから、医療または治療の分野で最も重要なツールの１つであった。超音波技術では、微小気泡超音波造影剤を脈管内に投与し、血管内の微小気泡超音波造影剤の小さな気泡を超音波エネルギーで励起することにより高調波共鳴を発生させ、それによって、受信した超音波画像の画質を向上させる。微小気泡超音波造影剤の適用により、高周波超音波撮像のコントラスト分解能および感度の上昇を助けることができる。しかし、従来の微小気泡超音波造影剤は血管内にまたは生体内に注入されるので、従来の微小気泡超音波造影剤を適用することの全体的なリスクはいくらか高く、このことは医療または研究の適用例において好ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、局所使用される、外用タイプの微小気泡超音波造影剤を提供する。微小気泡超音波造影剤は、注入の代わりにコーティングによって、生体の体表の局所領域に適用することができる。外用タイプの微小気泡超音波造影剤は、水性形態またはゲル形態のいずれの媒体を用いてもよく、特定の粒度および特定の濃度の微小気泡を含有していてもよい。微小気泡の材料は、アルブミン、リポソーム、ポリマー、コポリマー、または前述の材料の混合物、または上述のものの組合せであってもよい。外用タイプの微小気泡超音波造影剤は、機械的振動波の適用と併せて用いられてもよい。機械的振動波の振動エネルギーにより誘発される一連の膨潤および収縮プロセスによって、破裂したまたは破壊された微小気泡と発生したエネルギーおよび衝撃波が細胞または組織にわずかな損傷をもたらす。それが、適用された化学物質または小分子の吸収をさらに高める。機械的振動波の一般に使用されるエネルギー源は、超音波源またはレーザ源などの光学エネルギー源または音響エネルギー源であってもよい。生体の体表の局所領域に適用するのに適切な、本発明の外用タイプの微小気泡超音波造影剤は、機械的振動エネルギー源により発生させた（１つまたは複数の）機械波と併せて使用されてもよい。この機械波は、外用タイプの微小気泡超音波造影剤中の微小気泡を破裂させて、エネルギーおよび衝撃波を生成させる。微小気泡の破裂から得られたエネルギーおよび衝撃波は、皮膚表面または粘膜の接触領域にわずかな可逆的損傷を引き起こす。それによって、化学物質または小分子の経皮吸収を高める。微小気泡超音波造影剤は、術後の鎮痛剤の吸収またはビューティ・ケア成分の吸収の強化を促進するために、医療または美容の分野で広く使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、媒体と、媒体に分散された複数の微小気泡とを含む、外用タイプの微小気泡超音波造影剤を提供する。媒体は、水性の形態またはゲル形態であり、微小気泡の濃度は１×１０９から２×１０９粒子／ｍｌの範囲にある。
【０００６】
本発明の実施形態によれば、微小気泡の材料は、アルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマー、またはこれらの混合物、またはこれらの組合せから選択され、媒体は、等張生理食塩水、寒天ゲル、アロエ・ゲル、局所ゲル、またはこれらの組合せから選択される。
【０００７】
本発明の実施形態によれば、媒体はゲル形態の媒体であり、ゲル形態の媒体の含有量は、微小気泡超音波造影剤の全重量の０〜０．２重量パーセントである。
【０００８】
本発明の実施形態によれば、微小気泡の粒度は０．５マイクロメートルから２．５マイクロメートルの範囲にある。
【０００９】
本発明の実施形態によれば、微小気泡超音波造影剤は化学物質または小分子をさらに含み、化学物質または小分子は、生体に経皮的に吸収される。
【００１０】
本発明は、生体体表の局所領域を通る化学物質または小分子の経皮吸収を高めるための方法を提供する。微小気泡超音波造影剤を、生体体表の局所領域に適用する。微小気泡超音波造影剤は、媒体と、媒体に分散された複数の微小気泡とを含み、媒体は、水性の形態またはゲル形態であり、微小気泡の材料は、アルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマー、またはこれらの混合物、またはこれらの組合せから選択される。また、化学物質または小分子も局所領域に適用される。次いで機械的振動波源を、微小気泡超音波造影剤および化学物質または小分子が適用された局所領域に接触させて、この局所領域に照射する。微小気泡に作用する機械的振動エネルギー源によって発生した機械波によって、化学物質または小分子の経皮吸収が高められる。
【００１１】
本発明の実施形態によれば、微小気泡の濃度は、微小気泡超音波造影剤および化学物質または小分子の全体積に対して、２×１０６から２×１０８粒子／ｍｌの範囲にある。
【００１２】
本発明の実施形態によれば、希釈剤として化学物質または小分子を使用して、微小気泡超音波造影剤を２〜１０００倍に希釈する。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、微小気泡超音波造影剤を適用するステップ、および化学物質または小分子を適用するステップは、別個に行われ、同時には行われない。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、微小気泡の粒度は０．５マイクロメートルから２．５マイクロメートルの範囲にある。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、機械的振動波源は、超音波源および／またはレーザ源を含む。
【発明の効果】
【００１６】
上記事項に基づき、本発明は、局所領域での化学物質または小分子の吸収または透過を安全にかつ有効に高めることができ、造影剤を体内に注入することによるアレルギーリスクを回避することができる、（１種または複数の）外用タイプの超音波微小気泡造影剤を提供する。
【００１７】
この開示の前述のおよびその他の特徴および利点を理解可能にするために、図を添付したいくつかの例示的な実施形態について、以下に詳述する。
【００１８】
添付図面は、この開示のさらなる理解を助けるためのものであり、本明細書に援用されかつ本明細書の一部を構成する。図面は、この開示の実施形態を例示し、記述とともにこの開示の原理を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態による、超音波治療と併せた微小気泡超音波造影剤の適用を示す、フロー・チャートである。
【図２】本発明の一実施形態による、組織シミュレータを備えた浸透実験システムを示す概略図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による、浸透実験における寒天刺激装置の浸入深さを示す図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による、浸透実験における寒天刺激装置の浸入深さと停止時間との関係を示す、定量的な図である。
【図４Ａ】浸透実験の経皮浸入深さを示す、１００倍の倍率の図である。
【図４Ｂ】浸透実験の経皮浸入深さを示す、４００倍の倍率の図である。
【図５】内耳治療実験で、微小気泡造影剤の種々の投与アプローチを使用した、送達効率の結果を示す図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、種々の投与アプローチの下、内耳の蝸牛窓膜細胞に進入する緑色色素指示薬の送達結果を示す図である。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、動物試験後の動物の聴性脳幹応答試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の微小気泡超音波造影剤は、水性またはゲル形態のものであってもよく、特定の粒度および特定の濃度の微小気泡を含有していてもよい。内部に含有される微小気泡の材料によって、微小気泡超音波造影剤は、３つのカテゴリー：アルブミン微小気泡、リポソーム微小気泡、またはポリマー微小気泡に大別されうる。微小気泡超音波造影剤に含有される微小気泡は、安定なシェルであり、反射した超音波の散乱信号を増強するのに使用することができる。様々な超音波エネルギー強度下で、微小気泡超音波造影剤を使用することにより、適用領域での化学物質または小分子の浸入深さ（即ち、吸収効率）および／または透過した量（即ち、吸収）を高めることができる。
【００２１】
脂質微小気泡超音波造影剤を例にすると、０．０５〜０．１未満のメカニカル・インデックス（ＭＩ）の、非常に低い音場エネルギーの作用下、微小気泡超音波造影剤は線形にかつ対称的に振動する。メカニカル・インデックスが０．１〜０．３に上昇すると、微小気泡超音波造影剤は、緩和されるよりも、むしろ圧縮される。このとき、微小気泡超音波造影剤は相当なキャビテーションを持たないが、微小気泡超音波造影剤は著しい非線形応答を有し、信号スペクトルは明らかな高調波成分を有する。高調波撮像は、気泡と組織との散乱比を有効に増大させることができる。しかし高音圧（０．３〜０．６よりも大きいメカニカル・インデックス）の場合、微小気泡超音波造影剤は大きな圧縮および緩和に耐えて、微小気泡超音波造影剤中の微小気泡が細かく破裂し、次いで線形散乱およびキャビテーションが生じる可能性がある。キャビテーションにより発生した衝撃波は、膜の乱れを引き起こし、その透過率を増大させる可能性がある。研究によれば、高い音場の下、微小気泡超音波造影剤のキャビテーションは、微小血管の漏れ、炎症細胞の浸潤、溶血、または毛細血管の破裂などさえも増大させるのに使用される。
【００２２】
本発明は、外用タイプの微小気泡超音波造影剤を提供する。この微小気泡超音波造影剤は、コーティング、ペインティング、またはスプレーによって、生体の体表（即ち、外部）の局所領域に適用することができる。（１種または複数の）外用微小気泡超音波造影剤は、（１種または複数の）微小気泡超音波造影剤と混合される化学物質または小分子の、生体の局所領域での吸収力を高めることができる。生体の循環系に注入される従来の微小気泡超音波造影剤と比較すると、本発明の微小気泡超音波造影剤は、超音波プローブと作用部位（生体体表の局所領域、例えば顔、耳の穴、または関節など）との間に配置される媒体になるように設計される。即ち、微小気泡は、微小気泡超音波造影剤中に安定に存在し、微小気泡は、超音波プローブと直接接触して超音波エネルギー下でキャビテーションを誘発し、それによって、適用された化学物質または小分子の、生体表層部分への吸収および利用が促進される。さらに、本発明の微小気泡超音波造影剤と混合される化学物質または小分子は、微小気泡内に包封されないので、本発明の微小気泡超音波造影剤とは別々にまたは組み合わせて使用することができる。言い換えれば、これらの化学物質、小分子は、異なる順序で生体の外表面に適用しまたはコーティングすることができる。
【００２３】
本発明の微小気泡超音波造影剤は、微小気泡超音波造影剤の配合物を超音波プローブに接触させるのに適したものとなるように、微小気泡の濃度および／または媒体の張力を調節するよう設計されてもよい。微小気泡超音波造影剤の媒体は、水性媒体でもゲル形態でもよい。いずれの形態でも、媒体は特定の微小気泡濃度で有効な音響伝達特性を有している。微小気泡超音波造影剤中の微小気泡の材料は、アルブミン、リポソーム、ポリマー、コポリマー、または前述の（１種または複数の）材料の混合物、または上記の組合せであってもよい。
【００２４】
本発明は、これらの化学物質または小分子の吸収が高められるように、局所領域の皮膚または粘膜を通る化学物質または小分子の透過効力を促進させるために体表の局所領域に適用される、外用超音波微小気泡組成物の適用についても説明する。外用超音波微小気泡組成物は、少なくとも１種の媒体と、媒体に分散された複数の微小気泡とを含む。媒体は、水性またはコロイド懸濁液の形態であってもよく、微小気泡の材料は、アルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマーであって前述の（１種または複数の）材料の混合物、または上記の組合せから選択されてもよい。使用の際、局所超音波微小気泡組成物を、２〜１０００倍に、初期濃度１×１０９〜２×１０９粒子／ｍｌから２×１０６〜２×１０８粒子／ｍｌの濃度範囲まで、媒体を添加することによって希釈してもよい。
【００２５】
下記の実施例は、例えば（１種または複数の）アルブミン微小気泡超音波造影剤を例にするが、本発明の微小気泡超音波造影剤は、下記の実施例の内容に限定されない。
【００２６】
［実施例］
【００２７】
局所微小気泡造影剤の調製ステップ：
【００２８】
方法１：（１種または複数の）水性微小気泡超音波造影剤の調製。
【００２９】
等張生理食塩水および１．２重量％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａから購入）を均一に混合して、１０ｍｌの溶液とした。Ｃ３Ｆ８ガスを充填し、超音波細胞プロセッサを使用して２分間振動させることにより、微小気泡超音波造影剤を調製した。微小気泡超音波造影剤は、Ｃ３Ｆ８ガスをアルブミン・シェルにより封止した状態で、振動プロセスで形成された微小気泡を含有する。振動終了後、微小気泡超音波造影剤を微小遠心管内に分注し、微小遠心分離機に配置して分離を行い（速度：１２００ｒｐｍ（１２８．７ｇ）、時間：２分）、浮上分離液を抽出し、適切な量の生理食塩液を添加して、４℃の冷蔵器で貯蔵した。この実験で使用される（１種または複数の）造影剤の微小気泡の濃度は約２×１０９粒子／ｍｌであり、微小気泡の粒度分布は約０．５〜２．５μｍである。
【００３０】
成分Ａ：媒体として等張生理食塩水を使用して、様々な商用の脂質−シェル微小気泡に用いられる微小気泡（リン脂質微小気泡ＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）（Ｂｒａｃｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙから購入）またはＴａｒｇｅｓｔａｒ（Ｔａｒｇｅｓｏｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡから購入）を含む）または上述の調製されたアルブミン−シェル微小気泡超音波造影剤の濃度を、１×１０９〜２×１０９粒子／ｍｌ（微小気泡液体）の濃度に調整する。
【００３１】
成分Ｂ：成分Ａとともに使用される化学的、生物学的、および他の小分子または薬物を調製する。成分Ａとともに使用される物質は、この物質がｐＨ＝７．４でヒト細胞と等張になるように、水性、エマルジョン、またはゲルの所望の状態で配合されるべきである。例えば、化学的、生物学的、または小分子薬物は、鎮痛剤（ジクロフェナクなど）、アルブチン、ビタミンＣリン酸マグネシウム塩、白化成分（ノナペプチド−１など）、ゲンタマイシン、またはグルココルチコイド、およびその他の適用可能な成分であってもよい。
【００３２】
成分Ｃ：成分Ｂを希釈剤として、成分Ａを２〜１０００倍に希釈し、希釈後に得られた組成物を、生体表面に適用する。最も好ましくは、成分Ｂを使用して成分Ａを２〜４０倍に希釈し；より好ましくは、成分Ｂを使用して成分Ａを３０〜１５０倍に希釈する。成分Ｂは、成分Ａを１００〜１０００倍に希釈するのにも使用される。実験結果によれば、１０倍希釈は、皮膚表面に適用される最良の希釈溶液であった。その他の希釈比が有効であり、その希釈比は、適用領域に応じて調節されるべきである。一般に、局所微小気泡造影剤では、微小気泡の濃度が好ましくは約２×１０６〜２×１０８粒子／ｍｌに及ぶ。
【００３３】
一般に、生体表面に直接適用される超音波プローブは、出力０．１〜５Ｗ／ｃｍ２およびメカニカル・インデックス（ＭＩ）＜１．９の超音波を局所照射するために、成分Ｃに接触する。さらに、成分Ｃに照射される超音波エネルギーを、機械的振動エネルギーを発生させることが可能なその他の供給源に置き換えてもよく、またはその他のデバイスと組み合わせて使用してもよい。例えば治療用レーザ・ビームを、成分Ｃを有する局所領域に照射してもよい。成分Ｃと共に機能する機械的振動手段およびそれに対応する置換例は、当業者なら容易に想到することができ、本明細書の例は、照射されるエネルギー源を限定しない。
【００３４】
方法２：（１種または複数の）コロイド微小気泡超音波造影剤の調製：
【００３５】
等張生理食塩水を使用して、０．２重量％以下の寒天ゲル、アロエベラ・ゲル、またはその他の局所ゲルを調製する。
【００３６】
成分Ｄ：上述の局所ゲルを媒体として使用し、微小気泡超音波造影剤と、０．２重量％以下（例えば、０．１重量％または０．１５重量％）の寒天ゲル、アロエ（ベラ）・ゲル、またはその他の局所ゲルとを混合し、微小気泡濃度を約１×１０９〜２×１０９粒子／ｍｌ（微小気泡液体）に調整した。
【００３７】
成分Ｅ：成分Ｄとともに使用される化学的、生物学的、およびその他の小分子または薬物を調製する。成分Ｄとともに使用される物質は、この物質がｐＨ＝７．４のヒト細胞と等張になるように、水性、エマルジョン、またはゲルの所望の状態で配合すべきである。例えば、化学的、生物学的、または小分子薬物は、鎮痛剤（ジクロフェナクなど）、アルブミン、ビタミンＣリン酸マグネシウム塩、白化成分（ノナペプチド−１など）、ゲンタマイシン、またはグルココルチコイド、およびその他の適用可能な成分であってもよい。
【００３８】
成分Ｆ：成分Ｅを希釈剤として、成分Ｄを２〜１０００倍に希釈し、希釈後に得られた組成物を生体表面に適用する。最も好ましくは、成分Ｅは、成分Ｄを２〜４０倍に希釈するのに使用され；より好ましくは、成分Ｅは、成分Ｄを３０〜１５０倍に希釈するのに使用される。成分Ｅは、成分Ｄを１００〜１０００倍に希釈するのにも使用される。実験結果によれば、１０倍希釈は、皮膚表面に適用される最良の希釈溶液であった。その他の希釈比も有効であり、この希釈比は、適用領域に応じて調節されるべきである。一般に、局所微小気泡造影剤では、微小気泡の濃度が好ましくは約２×１０６〜２×１０８粒子／ｍｌに及ぶ。一般に、生体表面に直接適用される超音波プローブは、出力０．１〜５Ｗ／ｃｍ２およびメカニカル・インデックス（ＭＩ）＜１．９の超音波を局所照射するため、成分Ｆに接触する。さらに、治療用レーザ・ビームを、成分Ｆを有する局所領域に照射してもよい。本発明の原理および設計を例示するために、下記の実施形態を説明のために提示する。図１は、本発明の一実施形態による、超音波処理と併せた微小気泡超音波造影剤の適用を例示するフロー・チャートである。まず、成分Ａまたは成分Ｄ（１０１）を成分Ｂまたは成分Ｅ（１０２）と完全に混合して、成分Ｃまたは成分Ｆ（１０３）を得る。得られた成分Ｃまたは成分Ｆ（１０３）を、局所領域（３０１）の表面上に均等に広げる。次いで超音波プローブ（２０１）を、局所領域（３０１）の表面に広げた成分Ｃまたは成分Ｆ（１０３）に接触させ、上記成分または化学物質の透過および吸収を高めるために超音波を照射する（アーク線により表される）。システムはさらに、エア・ガンまたはレーザ・デバイス（２０２）を含んでいてもよい。水性またはコロイド（ゲル）微小気泡超音波造影剤（１０３）の超音波信号は、水の場合と比較するとかなり有意であり、超音波により誘発される様々な物理的作用を保持する基本周波数および高調波信号を有する。
【００３９】
経皮透過実験
【００４０】
図２は、本発明の一実施形態による組織シミュレータを備えた浸透実験システムの概略図である。まず、（１つまたは複数の）ヒトの皮膚組織をシミュレートする、０．３重量％のアガロース・ゲル（寒天ゲル）で形成された皮膚組織シミュレータ２０を、浸透実験を実施するために用意する。機械的振動波源は、超音波プローブであってもよい。超音波プローブ４０をドロッパ・ラック２２に載置し、超音波プローブ４０を、組織刺激装置２０から約５ｍｍの距離に設置する。導電性ゲル３５をプローブ４０に配置し、導電性ゲル３５を、組織刺激装置３５から約３ｍｍ離して位置付けられるようにする。図２を参照すると、潅流ゾーン３０が組織刺激装置２０の上方に配置され、導電性ゲル３５は潅流ゾーン３０の外側に位置付けられる。本発明の、ゲルをベースにした微小気泡超音波造影剤を導電性ゲル３５として使用し、小分子または化学物質を、潅流ゾーン３０内に配置してもよい。
【００４１】
超音波適用プロセス：導電性ゲルをコーティングし、超音波を１分間照射した。組織刺激装置の表面を３回濯ぐ（１０００μｌ）。対照群は、０．０１重量％のＥｖａｎｓブルー色素の生理食塩液（０．０００１ｇのＥｖａｎｓブルー色素を１ｍｌの生理食塩液に溶解したもの）を利用した。超音波照射後、組織刺激装置を潅流ゾーンに２から３０分間（例えば：５分、１０分、１５分、または２０分）配置した。潅流ゾーンに所定時間配置した後（停止時間）、組織刺激装置の色素の浸入深さ（色素進入深さ）を顕微鏡により観察し、その結果を、ＭＡＴＬＡＢプログラムにより処理して色素浸入深さを計算した。
【００４２】
下記の３つの実験では、種々のパラメータを変化させることにより、色素の浸入深さに関する最良の条件を見出した。（１）Ｅｖａｍｓブルー色素のみ（Ｅで表す）；（２）Ｅｖａｎｓブルー色素＋超音波（Ｅ＋Ｕで表す）；（３）Ｅｖａｎｓブルー色素＋超音波＋微小気泡造影剤（Ｅ＋Ｕ＋ＭＢまたはＭＢで表す）；（４）Ｅｖａｎｓブルー色素＋超音波＋１０倍希釈の微小気泡造影剤（Ｅ＋Ｕ＋１０×ＭＢまたは１０×ＭＢで表す）；Ｅは、Ｅｖａｎｓブルー色素を意味し；Ｕは、超音波を意味し；ＭＢは、微小気泡造影剤を意味し；１０×ＭＢは、１０倍希釈の微小気泡造影剤を意味する。超音波を照射し、潅流ゾーンに所定時間配置した後、色素浸入深さを顕微鏡で観察し、その結果をＭＡＴＬＡＢプログラムで処理することにより、色素浸入深さを計算した。図３Ａは、本発明の一実施形態による、浸透実験における寒天刺激装置の浸入深さを示す。図３Ｂは、本発明の一実施形態による、浸透実験における寒天刺激装置の浸入深さと停止時間との関係を示す、定量的な図である。
【００４３】
別の実験では、潅流ゾーンを厚さ２ｍｍの豚皮の上に配置して経皮透過実験を実施した。この実験システムおよび方法は、寒天刺激装置の浸透実験に類似していた。浸透実験の結果を図４Ａ〜４Ｂに示す。図４Ａは、浸透実験の経皮浸入深さを示す１００倍の倍率の図であり、一方、図４Ｂは、浸透実験の経皮浸入深さを示す４００倍の倍率の図である。
【００４４】
浸透実験の実験結果から、超音波と組み合わせて使用される本発明の微小気泡超音波造影剤は、色素の透過をより深くまたはより均一にすることができる。寒天刺激装置に関し、豚皮透過実験で実施された浸透実験は、本発明の微小気泡超音波造影剤が小分子の透過（浸み込み）を高めることを証明している。適用中、希釈剤を用いて、本発明の外用微小気泡超音波造影剤を約１：２の希釈から１：１０００の希釈の希釈比で希釈すると、より有効である。希釈剤は、媒体の割合を増加させるため、本発明の微小気泡造影剤に含有される媒体そのものであってもよく；または希釈剤は、小分子、化学または薬品成分そのものであってもよい。さらに外用微小気泡造影剤の媒体は、伝統的な液体状態の等張媒体に限定されない。微小気泡造影剤中の微小気泡は、例えばアルブミン、ポリマー、リポソーム、コポリマー、前述の材料の混合物または組合せで作製されてもよい。局所適用のための微小気泡超音波造影剤は、２×１０６〜２×１０８粒子／ｍｌの濃度範囲で微小気泡を含んでいてもよい。ゲル媒体を使用する場合、微小気泡造影剤および媒体の組成物の合計重量に対し、ゲル媒体の含量は０．２重量％以下であってもよく、音波を効率的に伝達することができる。あるいは、等張生理食塩水を媒体として使用してもよい。
【００４５】
医療での応用では、本発明の外用微小気泡造影剤は、耳の治療に使用することができる。本発明の微小気泡造影剤を、色素および／または１種もしくは複数の薬品成分と混合し、モルモットの内耳に投与する。混合物の投与は、色素または成分の送達効率を試験するために、種々の方法で実施することができる。
【００４６】
動物試験手順
【００４７】
試験に使用される動物は、（１種または複数の）聴覚が正常なＰｒｅｙｅｒ反射を有する６０匹のモルモットであり、下記の実験条件を有する３つの群に分ける：（１）２４匹のモルモットの鼓室胞に、色素指示薬を混合した微小気泡超音波造影剤を満たし、超音波を照射する；（２）９匹のモルモットの鼓室胞に、色素指示薬を満たし、超音波を照射する；（３）残り２７匹のモルモットの蝸牛窓に色素指示薬を混合した微小気泡超音波造影剤を適用し、超音波は照射せず、色素指示薬と混合した微小気泡超音波造影剤を、モルモットの蝸牛窓膜内に拡散させる。
【００４８】
本実験では、プローブ・サイズが６ｍｍであり波形が方形波であるソノポレーション遺伝子トランスフェクション・システム（ＳＴ２０００Ｖ、ＮｅｐａＧｅｎｅ、日本）を用いる。実験では超音波を、周波数１ＭＨｚ、デューティ・サイクル５０％、エネルギー３Ｗ／ｃｍ２で作動させ、１分間照射する。実験では、プローブを、５ｍｍの距離で蝸牛窓膜に対向する体表上に配置する。
【００４９】
図５は、内耳治療の実験で、微小気泡造影剤の種々の投与アプローチを適用したときの送達効率の結果を示す。ＵＳＭは、微小気泡超音波造影剤を１回与え、超音波を１回照射することを意味し；ＵＳＭ×２は、微小気泡超音波造影剤を２回与え、超音波を２回照射することを意味し；ＵＳＭ×２−１０ｍは、微小気泡超音波造影剤を２回与え、超音波を２回照射し、かつ１０分間そのままにすることを意味する。拡散作用により内耳に色素または薬物を送達する対照群に比べて、この実験結果は、微小気泡超音波造影剤とともに使用される超音波が、薬物送達効率を高めることを示す。即ち、投与アプローチＵＳＭ、ＵＳＭ×２、ＵＳＭ×２−１０ｍの送達効率は、それぞれ、対照群の場合の３．５倍、８．８倍、３７．９倍である。さらに、ゲンタマイシンを内耳に送達するために、本発明の微小気泡超音波造影剤を、超音波の照射と併せて使用する。そのようなアプローチを使用することにより、内耳蝸牛組織内に送達されるゲンタマイシンの濃度は、超音波を照射しない対照群の場合よりも著しく高くなる。したがって、微小気泡造影剤は、化学物質の送達を増強することができ、かつ薬物または小分子の吸収を促進することができることが、確認される。
【００５０】
図６Ａ〜６Ｆは、種々の投与アプローチによる、内耳の蝸牛窓膜細胞に進入する緑色色素指示薬の送達結果を示す。図６Ａ〜６Ｃは、緑色色素指示薬と混合した超音波微小気泡造影剤を使用し、超音波処理した実験群での送達結果を示す。図６Ｄ〜６Ｆは、緑色色素指示薬に混合した超音波微小気泡造影剤を使用したが、超音波処理しなかった対照群（拡散作用による）での送達結果を示す。図６Ｄ〜６Ｆの、緑色色素が蝸牛窓膜細胞内にわずかに進入または全く進入しない結果に比べて、図６Ａ〜６Ｃの結果は、さらに多くの緑色色素が蝸牛窓膜細胞内に進入していることを示す。
【００５１】
さらに、本発明の（１種または複数の）微小気泡超音波造影剤が内耳蝸牛の細胞を傷つけるかどうかを検証するために、前述の動物試験を受けたモルモットに対して聴力閾値感応性評価実験も行う。図７Ａ〜７Ｂは、動物試験後の動物の聴性脳幹応答試験の結果を示す。薬物および超音波が投与された（ＵＳＭで示される）実験群の動物と、薬物を投与して超音波を用いなかった（ＲＷＳで示される）対照群の動物とを、カチカチという音（ticking sound）（図７Ａ）および破裂音（図７Ｂ）に関して聴性脳幹応答試験に供した。結果は、２つの群の間で聴力閾値に差がないことを示し、これは、内耳蝸牛に作用する微小気泡超音波造影剤が、聴覚系の細胞を傷つけないことを示している。
【００５２】
本発明で照射可能な超音波は、好ましくは非集束タイプの低エネルギー超音波である。そのエネルギー範囲はＭＩ＝０．２〜０．４であり、ＭＩが１．９よりも低い医療用超音波またはＭＩが０．２よりも低い眼科使用のための超音波に関するＦＤＡ規定と比べて、本発明で照射可能な超音波のエネルギー範囲は非常に低い。さらに、本発明で使用される超音波のエネルギー範囲は、局所的な温度変動を引き起こさない。本発明の実験では、操作中の温度差が±０．１度しかないことがわかる。したがって、本発明で使用される超音波のエネルギー範囲は、熱作用を持たないことになる。
【００５３】
本開示の範囲または精神から逸脱することなく、様々な修正および変更を、開示される構造に行うことができることが、当業者に明らかにされよう。前述の内容に鑑み、本開示は、本開示の修正および変更が以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に包含されることを条件に、それらの修正および変更を包含するものとする。
【符号の説明】
【００５４】
２０  皮膚組織シミュレータ
２２  ドロッパ・ラック
３０  潅流ゾーン
３５  導電性ゲル
４０  超音波プローブ
１０１  成分Ａまたは成分Ｄ
１０２  成分Ｂまたは成分Ｅ
１０３  成分Ｃまたは成分Ｆ
２０１  超音波プローブ
２０２  エア・ガンまたはレーザ・デバイス
３０１  局所領域
【図１】
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【図２】
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【図５】
2015007023.tif 000005
【図７】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【外国語明細書】
2015007023000001.pdf