(57)【要約】【課題】低級脂肪酸に高い特異性を有するエステラーゼ酵素、該酵素をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターによる形質転換体、ならびに該形質転換体により生産された酵素およびその製造方法を提供すること。【解決手段】Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有する、低級カルボン酸エステル特異的エステラーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有する、低級カルボン酸エステル特異的エステラーゼ。
【請求項２】
低級カルボン酸のエステルに特異的な活性を示すエステラーゼであって、
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ４のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ３およびＣ６のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性よりも強く、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ３およびＣ６のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性よりも弱く、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のカルボン酸のエステルに対してはエステラーゼ活性がＣ２を１００％とした場合に０．５％未満である、エステラーゼ。
【請求項３】
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大の活性を有するエステラーゼであって、
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５；
（２）至適反応温度：３５℃〜４５℃；
（３）熱安定性：熱不活性温度として、５０℃；
（４）硫酸銅または塩化鉄（III）により活性が阻害される；および
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で３８ｋＤａ
の性質を有する、エステラーゼ。
【請求項４】
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大の活性を有するエステラーゼであって、
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５；
（２）至適反応温度：５５℃〜６５℃； 
（３）熱安定性：熱不活性温度として、７０℃；
（４）硫酸銅または塩化鉄（III）により活性が阻害される；および
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で５２ｋＤａ
の性質を有する、エステラーゼ。
【請求項５】
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対する活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有する、請求項３または４に記載のエステラーゼ。
【請求項６】
以下の（１）または（２）のいずれかのポリペプチド：
（１）配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
（２）配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチドの部分ペプチド。
【請求項８】
請求項６または７のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号３または配列番号４で表される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９のいずれかに記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大の活性を有するエステラーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１または請求項２に記載のエステラーゼをコードする、請求項８から１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する、組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換体を培養し、精製することにより製造される、エステラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボン酸エステルを分解するエステラーゼに関する。より詳しくは、本発明は、低級カルボン酸エステルを分解するエステラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼあるいはエステラーゼを乳脂肪に作用させると、その脂肪酸を遊離し、これを乳製品に利用できることが知られている。特に、良好な乳フレーバーを生成する酵素として子牛前胃由来カルボキシルエステラーゼが報告されている。これは、この酵素の低級脂肪酸エステルに対する高い特異性によるものである。
【０００３】
一方、微生物由来のリパーゼあるいはエステラーゼは多く報告されているが、低級脂肪酸エステルに対する高い特異性を持つ酵素は少ない。低級脂肪酸エステルに対する高い特異性を持つ酵素であっても、炭素数１２〜１８の脂肪酸エステルを分解する活性も有しており（例えば、特許文献１）低級脂肪酸エステルに対してのみ選択的に作用するものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１６５６７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、低級脂肪酸エステルに高い特異性を有するエステラーゼ酵素、該酵素をコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、該ベクターによる形質転換体、ならびに該形質転換体により生産された酵素およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有する、低級カルボン酸エステル特異的エステラーゼを提供する。
【０００７】
本発明はまた、低級カルボン酸のエステルに特異的な活性を示すエステラーゼであって、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ４のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ３およびＣ６のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性よりも強く、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ３およびＣ６のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性よりも弱く、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ２を１００％とした場合に０．５％未満である、エステラーゼを提供する。
【０００８】
本発明はまた、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大の活性を有するエステラーゼであって、
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５；
（２）至適反応温度：３５℃〜４５℃； 
（３）熱安定性：熱不活性温度として、５０℃；
（４）硫酸銅または塩化鉄（III）により活性が阻害される；および
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で３８ｋＤａ
の性質を有する、エステラーゼを提供する。
【０００９】
本発明はまた、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大の活性を有するエステラーゼであって、
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５；
（２）至適反応温度：５５℃〜６５℃； 
（３）熱安定性：熱不活性温度として、７０℃；
（４）硫酸銅または塩化鉄（III）により活性が阻害される；および
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で５２ｋＤａ；
の性質を有する、エステラーゼを提供する。
【００１０】
１つの実施形態では、上記Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大の活性を有するエステラーゼは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対する活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有するエステラーゼである。
【００１１】
本発明はまた、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はまた、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明はまた、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明はまた、上記のいずれかに記載のポリペプチドの部分ペプチドを提供する。
【００１５】
本発明はまた、上記のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
１つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００１７】
本発明はまた、配列番号３または配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
１つの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。
【００１９】
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに最大の活性を有するエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明はまた、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対する活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有するエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを提供する。
【００２２】
本発明はまた、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２３】
本発明はまた、上記形質転換体を培養し、精製することにより製造される、エステラーゼを提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、低級脂肪酸を特異的に分解できるため、食品に新たなフレーバーを付与することができる。また、生理活性物質等からの脂肪酸基の脱離による物質変換をしたり、逆にアルコールと脂肪酸とをエステル合成させて、香料成分を製造したりして、食品や化粧品に有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による酵素ＡおよびＢの分子量測定を表す図である。
【図２】各ｐＨにおける酵素ＡおよびＢの相対活性を表す図である。
【図３】各温度における酵素ＡおよびＢの相対活性を表す図である。
【図４】各温度にて９０分間処理した場合の酵素ＡおよびＢの相対活性を表す図である。
【図５】各ｐＨで３７℃、９０分間処理したあとの酵素ＡおよびＢの残存活性を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、低級カルボン酸のエステルに高い特異性を有するエステラーゼを提供する。本発明のエステラーゼは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を示し、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対しては、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対する活性の１０％以下のエステラーゼ活性を有する。本発明のエステラーゼはまた、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８のうち、Ｃ２のカルボン酸のエステルに対して最大のエステラーゼ活性を有し、Ｃ４のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ３およびＣ６のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性よりも強く、Ｃ８のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ３およびＣ６のカルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性よりも弱く、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６およびＣ１８カルボン酸のエステルに対するエステラーゼ活性がＣ２を１００％とした場合に０．５％未満であることが好ましい。
【００２７】
本明細書において、ＣＸのカルボン酸とは、炭素数Ｘのカルボン酸を意味する。例えば、Ｃ２のカルボン酸のエステルとは、酢酸のエステルを意味する。また、カルボン酸には脂肪酸が含まれ、カルボン酸エステルには脂肪酸エステルが含まれる。例えば、Ｃ２のカルボン酸とは、炭素数２のカルボン酸をいい、例えば酢酸である。
【００２８】
本明細書において、エステラーゼ活性は、以下の方法により測定される。３ｍＭのｐ−ニトロフェニル酢酸、１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（和光純薬製）、０．１％（ｗ／ｖ）アラビアガム（ナカライテスク製）を含む水溶液を基質溶液とし、基質溶液０．７５ｍＬ、０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）０．２ｍＬ、酵素液０．０５ｍＬを混合し、３７℃、１０分間保温する。５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸水溶液０．０５ｍＬを添加して反応を停止したのち、１０％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを含む０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を１．４ｍＬ添加し、よく混合したのち、波長４００ｎｍの吸光度を測定する。本エステラーゼは、上記の条件において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットとする。
【００２９】
本発明のエステラーゼは、上で説明した活性を満たし、好ましくは下記の理化学的性質：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５；
（２）至適反応温度：３５℃〜４５℃；
（３）熱安定性：熱不活性温度として、５０℃；
（４）硫酸銅または塩化鉄（III）により活性が阻害される；および
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で３８ｋＤａ；
または下記の理化学的性質を有する：
（１）至適反応ｐＨ：ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５；
（２）至適反応温度：５５℃〜６５℃； 
（３）熱安定性：熱不活性温度として、７０℃；
（４）硫酸銅または塩化鉄（III）により活性が阻害される；および
（５）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で５２ｋＤａ。
ここで、熱安定性は、熱不活性温度にて表し、この熱不活性温度とは、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中で９０分処理することで活性が検出できなくなる温度を意味する。上記理化学的性質を有するエステラーゼは、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）由来酵素である。
【００３０】
本発明のエステラーゼは、例えば、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有する。本酵素は、上で説明した活性を満たす限り、天然型酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列）に対して１または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であってもよく、置換、欠失、挿入、および／または付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。これらの置換、欠失、挿入、および／または付加を導入する方法としては、ペプチド合成により、直接導入することもできる。または、当業者が通常用いる部位特異的変異導入法などを用いて、エステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列に適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質のアミノ酸配列を改変することができる。本発明において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドについては、通常１１４以下、例えば７６以下、あるいは３８以下、好ましくは１９以下、より好ましく３以下、さらに好ましくは１〜３アミノ酸残基であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドについては、通常１４９以下、例えば９９以下、あるいは４９以下、好ましくは２４以下、より好ましく４以下、さらに好ましくは１〜３アミノ酸残基である。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあるので、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も、上で説明した活性を満たす限り、本発明において用いられ得る。
【００３１】
本発明のアミノ酸が変異した酵素は、好ましくは、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上述のエステラーゼ活性を有するタンパク質であり得る。
【００３２】
タンパク質の同一性または相同性検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした推定アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷなどの相同性検索プログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて、あるいはローカルホストを用いて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記手順を利用して行い得る。
【００３３】
当業者であれば、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入法などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができるが、この場合、相同アミノ酸、活性中心等の技術常識を考慮して活性に悪影響を与えない変異を導入することが好ましい。
【００３４】
一般的に相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下のＡ群〜Ｆ群に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； Ｃ群：アスパラギン、グルタミン； Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン； Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。これらの置換は酵素活性に影響を与えない場合が多いが、酵素活性に影響を与える場合もありうるので、置換した後、酵素を精製して酵素活性を測定することが好ましい。
【００３５】
また、本発明は、上記ポリペプチドの部分ペプチドを提供する。この部分ペプチドは、上記ポリペプチドの一部を含み、上記エステラーゼ活性を有することが好ましい。部分ペプチドには、上記エステラーゼ活性を有しないが、活性中心、保存領域等、酵素活性に必須または重要な働きをする領域で、保存領域を増幅するプライマーデザインに使用できる部分ペプチド等も含まれる。
【００３６】
また、本発明は、上記エステラーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、１つの実施形態では、ＤＮＡである。エステラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３または４で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３７】
ストレプトマイセス・シンナモネウス由来エステラーゼは、天然型としては、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列を有し、配列番号３または４に記載の塩基配列を有する遺伝子によりコードされる。該塩基配列は、配列番号３または４に記載の塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加変異された塩基配列からなる遺伝子であってもよい。配列番号３について置換、欠失、挿入、および／または付加することができる塩基数は、３４５個以下、より好ましくは２３０個以下、さらに好ましくは１１５個以下、さらに好ましくは５７個以下、さらに好ましくは１１個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは１〜数個、よりさらに好ましくは１〜３個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加変異された塩基配列である。配列番号４について置換、欠失、挿入、および／または付加することができる塩基数は、４４８個以下、より好ましくは２９８個以下、さらに好ましくは１４９個以下、さらに好ましくは７４個以下、さらに好ましくは１４個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは１〜数個、よりさらに好ましくは１〜３個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加変異された塩基配列である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３または４に記載の塩基配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％の相同性を有し、上記エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
【００３９】
当業者であれば、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入法などを用いて、ポリヌクレオチドの塩基を適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、対応するタンパク質の構造を改変することができる。この場合、相同アミノ酸、活性中心等の技術常識を考慮して活性に悪影響を与えない変異を導入することが好ましい。
【００４０】
さらに、これらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記エステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００４１】
ここでストリンジェントな条件とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０であり、５×デンハルト溶液は、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌ（登録商標）  ４００、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４２】
本発明のエステラーゼは、上述の性質を満たす限り、起源は問わない。酵素の起源は特に限定されないが、典型的には微生物由来の酵素が用いられる。微生物としては、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌などで、例えば放線菌が好まれる。放線菌としては、コリネバクテリウム属菌、マイコバクテリウム属菌、ノカルディア属菌、ゴルドニア属菌、フランキア属菌、ミクロコッカス属菌、ブレビバクテリウム属菌、セルロモナス属菌、ミクロモノスポラ属菌、アクチノプラネス属菌、シュードカルディア属菌、ストレプトマイセス属菌、キタサトスポラ属菌、ノカルディオプシス属菌、サーモビフィダ属菌、ビフィドバクテリウム属菌などが用いられ、好ましくはストレプトマイセス属菌が用いられる。ストレプトマイセス属菌としては、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプトマイセス・ビオラセオルバー、ストレプトマイセス・エバーメチリス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・シンナモネウス、ストレプトマイセイス・サーモビオラセウスなどが用いられるが、これらに限られない。
【００４３】
本発明のエステラーゼは、上述の性質を満たす限り、調製方法は問わない。本発明のエステラーゼは、例えば、当該酵素を生産する菌からの抽出、遺伝子組換え、またはFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）等のペプチド合成法によって製造することができる。ペプチド合成にはペプチド合成機を使用してもよく、例えば、島津製作所、CEM社のペプチド合成機等が好適に用いられる。
【００４４】
本発明のエステラーゼを遺伝子組換えにより製造する場合、エステラーゼをコードする遺伝子を用いて、遺伝子発現カセットを構築してもよい。遺伝子発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するプロモーター、ターミネーター、オペレーター、エンハンサーなどのいわゆる調節因子を含み得る。調節因子は、発現させる遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものであってもよく、当業者によって適宜選択され得る。各種塩基配列を含むＤＮＡの合成および連結は、当業者が通常用い得る手法で行われ得る。遺伝子または該遺伝子を含む発現カセットは、組換えベクターに挿入され得る。
【００４５】
このような組換えベクターは、宿主菌への導入に適した任意のベクターであり得、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すればよい。例えば、プラスミドベクター、ファージベクターなどが挙げられる。放線菌と大腸菌との両方で増幅可能なベクターは、大腸菌−放線菌シャトルベクターとして利用することができる。
【００４６】
本発明のエステラーゼをコードする遺伝子または遺伝子発現カセットを有する組換えベクターの作製、ならびに当該遺伝子またはベクターを用いる適切な宿主菌への導入および形質転換体の作製は、当業者が通常用いる手順に従って行われ得る。
【００４７】
本発明に用いられる宿主菌としては、放線菌、大腸菌、バシラス属菌、シュードモナス属菌、サーマス属菌、アグロバクテリウム属菌などが挙げられる。中でも、本発明においては、放線菌が好適に用いられる。以下、特に放線菌を宿主とする場合の遺伝子組換えについて説明する。
【００４８】
遺伝子発現カセットまたはベクターに用いられ得るプロモーターとしては、特に放線菌を宿主とする場合、例えば、ストレプトマイセス・シンナモネウス由来のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子のプロモーター、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｐｔａｔｕｓ）由来メタロエンドペプチダーゼ（ＳＳＭＰ）遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターは、宿主菌中で活性を発揮し得るものであればいずれの遺伝子に由来するターミネーターを用いてもよい。ターミネーターは、通常、発現させるタンパク質の翻訳を停止するためのパリンドローム配列を有する。特に放線菌を宿主とする場合、ターミネーターとしては、例えば、ＴＨ−３  ｃｏｌｌターミネーター、ＰＬＤターミネーター、ｆｄファージのターミネーター（ｆｄ−ｔｅｒ）、Ｔ４ターミネーター（Ｔ４−ｔｅｒ）などが挙げられる。
【００４９】
放線菌に適したベクターは、放線菌で増幅するための複製起点（ｏｒｉ）を含み得る。放線菌に適したベクターは、必要に応じて、大腸菌で増幅するための複製起点をさらに有していてもよい。放線菌で増幅するための複製起点（ｏｒｉ）は、低コピー型であっても多コピー型であってもよい。低コピープラスミドとは、放線菌内で１から１０コピー程度のプラスミド増幅をもたらすプラスミドをいい、多コピープラスミドとはそれ以上、具体的には４０コピーから４００コピー程度またはそれ以上のコピー数をもたらすプラスミドをいう。低コピーのｏｒｉを例示すれば、例えば ＳＣＰ２＊ ｏｒｉ（Gene、35巻3号、223-235頁、1985年）が挙げられる。高コピーのｏｒｉとしては、例えば ｐＩＪ１０１ ｏｒｉ（J. Gen. Microbiol.、129巻、2703-2714頁、1983年）が挙げられる。
【００５０】
放線菌に適したベクターとしては、例えば、ｐＴＯＮＡ４（特開２００９−１５３５１６号公報）、ｐＩＪ４８６（Mol. Gen. Genet.、203巻、468-478頁、1986年）、ｐＫＣ１０６４（Gene、103巻、97-99頁、1991年）、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Gene、165巻、149-150頁、1995年）、ｐＩＪ７０２（J. Gen. Microbiol.、129巻、2703-2714頁、1983年）、およびｐＩＪ８６００（Microbiology、145巻、2221-2227頁、1999年）が挙げられる。
【００５１】
このようなベクターは、ゲノム組み込み型ベクターであってもよい。ゲノム組み込み型ベクターとは、例えば、放線菌に導入されたときに、放線菌ゲノムに組み込まれて、ゲノムから組み込んだ遺伝子を発現できるベクターである。このベクターは、放線菌に導入する前に、プラスミドの形態で調製することもできる。ゲノム組み込み型ベクターの作成においては、放線菌ファージが有する、宿主ゲノムへのファージＤＮＡの組み込みに必要な組換え配列を利用することができる。具体的には、例えば、φ３１ファージのｉｎｔ遺伝子とａｔｔＰとをベクターに挿入すればよい（Gene、116巻、43-49頁、1992年）。プラスミドを宿主菌体内で保持させ続けるには、通常、プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤により選択し続ける必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組換え宿主菌を得ると、薬剤選択の必要がない点で優れている。
【００５２】
また、ベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適切な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などの選択用マーカー遺伝子を含むことが好ましい。このような選択用マーカー遺伝子は、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子などが含まれ、これらはいずれも当業者には周知である。
【００５３】
ベクターは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を有してもよい。ＭＣＳは、複数種類の制限酵素部位を有するＤＮＡ断片であり、発現の目的遺伝子をＭＣＳに連結してベクターに挿入するために使用される。例えば、ＭＣＳは、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩなどの制限酵素部位（少なくとも１個）を有する。
【００５４】
ベクターの調製に用いられる菌としては、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌が挙げられ、具体的には、例えば、放線菌、大腸菌などが挙げられる。より具体的には、放線菌としては、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ−２３など、そして大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９などが挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、安全性などの観点から、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９が望ましい。
【００５５】
本明細書で遺伝子の「導入」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入するだけでなく、発現させることも意味する。「形質転換」は、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入して発現させることにより宿主の遺伝的形質を変えること、またはその操作をいう。遺伝子またはＤＮＡの導入、または形質転換のための方法は、形質転換を行う宿主微生物に応じて適宜選択され、当業者が通常用いる手法が用いられ得る。放線菌に関しては、プロトプラスト融合法、接合伝達法などが用いられ得る。
【００５６】
放線菌とは、放線菌目（ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する菌をいう。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり、主に土壌などに生息する。原核生物であるが、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｕａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａｃｅａｅ）、およびノカジア科（Ｎｏｃａｕｄｉａｃｅａｅ）が含まれる。本発明において放線菌とは、好ましくは、ストレプトマイセス科、より好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌である。ストレプトマイセス属に属する菌としては、例えば、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓ．ｓｅｐｔｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ）、およびストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられる。本発明においては、宿主菌体として、特にストレプトマイセス・リビダンスが好適に用いられる。このようなストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、種々のカタログに記載されており、当業者であれば容易に入手可能である。
【００５７】
宿主にエステラーゼをコードする遺伝子が導入され、形質転換されたかどうかは、選択マーカーによる選択に加え、例えば、上記エステラーゼ活性の測定によって調べることによって確認することができる。
【００５８】
酵素生産菌（元来生産能を有する菌および形質転換体のいずれをも包含する）を当該菌の生育に適した培地中および培養条件下で培養することによって、エステラーゼを製造し得る。
【００５９】
培地としては、酵素生産菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、天然培地および合成培地のいずれであってもよい。液体培地または固体培地のいずれでもよいが、生産物の回収が容易なため、液体培地が好ましい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸などを含んでいてもよい。その他に、無機塩として、微量のカリウム、ナトリウム、鉄などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩などを含んでいてもよい。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００６０】
培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、酵素生産菌が増殖し、エステラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。放線菌の場合、通常、液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、例えば、１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜３５℃で、特に好ましくは２８℃で、例えば、１２〜１２０時間行われる。ｐＨは、４から１０、好ましくは６から８に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
【００６１】
本発明のエステラーゼを酵素反応に使用する場合、菌体から抽出および精製された酵素が用いられるが、菌体そのものを酵素反応に用いてもよい。酵素は、溶液中で遊離の状態で反応させてもよく、固定化して用いてもよい。本明細書において、精製とは、出発材料よりも容積あたりの比活性が上昇することをいい、菌体を濃縮することも含まれる。
【００６２】
菌体からの酵素の抽出および精製は、例えば、以下のように行われ得る。培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を回収し、得られた菌体を超音波処理などによって破砕した後、遠心分離などによって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。エステラーゼが細胞外に分泌される場合には、培養上清から同様に精製することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００６４】
（実施例１：遺伝子クローニング）
＜染色体DNAの分離＞
ストレプトマイセス・シンナモネウスＮＢＲＣ  １２８５２２株をトリプチックソイ培地（ベクトン・ディンキンソン社製）５ｍＬを用いて２８℃で４日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および８ｍｇ／ｍＬ  リゾチームからなる溶液０．８ｍＬに懸濁し、３７℃で４５分間処理した後、さらに−８０℃で１０分間処理した。次に、これに１％（ｗ/ｖ）ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、および０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）からなる溶液６ｍＬを添加し、６０℃で２０分間処理した後、氷冷した。この溶液４．５ｍＬにフェノール／クロロホルム混合液４ｍＬを加えて撹拌し、遠心分離により水相を３ｍＬ分取した。この水相に６ｍＬのエタノールを添加混合してＤＮＡを回収し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および1ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液０．９ｍＬに溶解した。これにＲＮａｓｅＡを２０μｇ/ｍＬとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、フェノール／クロロホルム混合液０．９ｍＬを加えて撹拌し、遠心分離により、水相を０．６ｍＬ分取した。この水相に３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．０６ｍＬおよびエタノール１．２ｍＬを添加混合し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％（ｖ/ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液０．６ｍＬに溶解した。
【００６５】
＜遺伝子クローニング、発現プラスミド作製、形質転換＞
酵素A：構造遺伝子上流域配列にＮｄｅＩ部位を付加したセンスプライマー（配列番号５：GGAATTCCATATGATCATGATCAGCTCGAT）、構造遺伝子下流域配列にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加したアンチセンスプライマー（配列番号６：CCCAAGCTTTCACTTCATGAAGGTGACCTC）を設計した。
酵素B：構造遺伝子上流域配列にNdeI部位を付加したセンスプライマー（配列番号7：GGAATTCCATATGGAGATACGTACCGCTCA）、構造遺伝子下流域配列にHindIII部位を付加したアンチセンスプライマー（配列番号8：CCCAAGCTTTCAGACGAGGTCGAAGGGTTC）を設計した。
上記で得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液組成は次のとおりである。１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ５μＬ、プライマー各  ３００ｎＭ、ｄＮＴＰ混合物各０．２ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １ｍＭ、ＤＭＳＯ  ５％、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １．０ユニットに、蒸留水を全量５０μＬとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。ステップ１；９８℃、２分；ステップ２；９８℃、１５秒；ステップ３；６０℃、３０秒；ステップ４；６８℃、２分。ステップ２からステップ４を３０回繰り返した。このＰＣＲにより１．２Ｋｂｐ、１．５Ｋｂｐの特異な増幅産物が得られた。この増幅された断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。接合型放線菌プラスミドｐＴＯＮＡ４（特開２００９−１５３５１６号公報）もＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた２つの断片を互いにライゲーションしたのち、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株に導入し、形質転換体を作製した。導入した構造遺伝子はＤＮＡシーケンサーで分析し、塩基配列を決定した。
【００６６】
（実施例２：培養方法・酵素調製方法）
５００ｍＬバッフルフラスコにトリプチックソイ培地（ベクトン・ディンキンソン社製）５０ｍＬ、２８℃、３日間培養した。得られた培養液からはＨＩＴＡＣＨＩ微量高速遠心機（ＣＦ１５ＲＸＩＩ型；日立工機株式会社）を用いた遠心分離（７０００ｒｐｍ，１０分）にて上清を回収した。菌体は５０ｍＬの蒸留水に分散したのち、ＱＳＯＮＩＡ  Ｑ７００を用いて、出力３０％、２０秒間２回超音波処理を行った。７０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を回収した。６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で１６時間放置し、遠心分離（７０００ｒｐｍ，１０分）にて沈殿物を回収した。沈殿物を蒸留水に溶解し、酵素Ａおよび酵素Ｂの溶液を得た。
【００６７】
＜分子量測定＞
酵素Ａおよび酵素Ｂについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に従って、バイオラッド製ポリアクリルアミドゲル（商品名Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ａｎｙ  ｋＤ  プレキャストゲル）を用いて、２００Ｖ固定電圧下電気泳動を行い、ゲル撮影装置（商品名Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＲＺ  Ｉｍａｇｅｒ，バイオラッド製Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅシステム）にて泳動像を撮影した。この電気泳動写真を図１に示す。酵素Ａおよび酵素Ｂの分子量について、本ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果によって、それぞれ約３８ｋＤａおよび約５２ｋＤａと推定した。
【００６８】
（実施例３：酵素活性測定）
３ｍＭのｐ−ニトロフェニル酢酸、１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）、０．１％（ｗ／ｖ）アラビアガム（ナカライテスク株式会社製）を含む水溶液を基質溶液とした。基質溶液０．７５ｍＬ、０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）０．２ｍＬ、酵素液０．０５ｍＬを混合し、３７℃、１０分間保温した。５％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸水溶液０．０５ｍＬを添加して反応を停止したのち、１０％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルを含む０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１．４ｍＬ添加し、よく混合したのち、波長４００ｎｍの吸光度を測定した。本エステラーゼは、上記の条件において１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１ユニットとした。
【００６９】
基質特異性：各種ｐ−ニトロフェニル化合物を用いて、上記条件にて測定した。その結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
2015159802.tif 000002
【００７１】
表１に示されるように、酵素Ａ、Ｂとも、Ｃ２を１００とした場合、Ｃ８に対する活性は、Ｃ２に対する活性の３％、８％であった。なお、表１において、Ｃ１２，Ｃ１４，Ｃ１６，Ｃ１８では、相対活性が０％となっているが、これは活性が完全に０という意味ではなく、酢酸に対するエステラーゼ活性を１００％とした場合に相対活性が０．５％未満であることを意味する。
【００７２】
（実施例４：各種金属塩およびＥＤＴＡの影響）
酵素とｐ−ニトロフェニル酢酸との反応の際に、各種金属塩またはＥＤＴＡを終濃度が１ｍＭになるように添加した。その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
2015159802.tif 000003
【００７４】
（実施例５：作用ｐＨ、作用温度）
作用ｐＨ：緩衝液として、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３〜４）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜６）およびトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜１０）を用いた。その結果を図２に示す。
【００７５】
作用温度：反応温度を変化させた。その結果を図３に示す。
【００７６】
温度安定性：酵素を０．０２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、種々の温度で９０分間処理したあとの残存活性を測定した。その結果を図４に示す。
【００７７】
ｐＨ安定性：酵素をグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３〜４）、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５〜６）およびトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜１０）中で、３７℃にて９０分間処理したあとの残存活性を測定した。その結果を図５に示す。
【００７８】
（実施例６：遺伝子解析）
酵素Ａおよび酵素Ｂの遺伝子サイズおよび推定アミノ酸配列について、株式会社ゼネティックス社製の遺伝子情報処理ソフトフェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」を用いて解析した。その結果、酵素Ａについては、１１５２塩基対、３８３アミノ酸、分子量３８０００で、シグナルペプチド予測では、菌体外酵素と推定された。シグナルペプチド予測は、von Heijneのシグナルペプチド予測アルゴリズムを用いた方法（von Heijne, G:Nuc.Acids Res.,14,4683-4690(1986)）により行った。酵素Ｂについては、１４９４塩基対、４９７アミノ酸および分子量５２０００であり、菌体内酵素と推定された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、例えば炭素数２〜８のような低級脂肪酸基を有するエステルに特異的に作用するエステラーゼを提供することができる。本発明のエステラーゼは、医薬品分野、食品分野等種々の産業分野において有効である。
【図１】
2015159802.tif 000004
【図２】
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【図３】
2015159802.tif 000006
【図４】
2015159802.tif 000007
【図５】
2015159802.tif 000008
【配列表】
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