(57)【要約】【課題】物質結合用固相担体を分散させるための作業を省いて、より短時間で物質を物質結合用固相担体に結合するための容器を提供する。【解決手段】物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体であって、  物質結合用固相担体が添加剤とともに凍結乾燥されたことを特徴とする凍結乾燥体、物質結合用固相担体が添加剤とともに凍結乾燥された凍結乾燥体を容器内に備えることを特徴とする、物質含有液中の物質を物質結合用固相担体と結合させるための容器、および、物質結合用固相担体を添加剤とともに凍結乾燥することを特徴とする、物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体であって、
物質結合用固相担体が添加剤とともに凍結乾燥されたことを特徴とする、凍結乾燥体。
【請求項２】
前記物質結合用固相担体が磁気粒子である、請求項１に記載の凍結乾燥体。
【請求項３】
前記添加剤が、トレハロース、スクロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、デキストラン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又はマルトデキストリンである、請求項１又は２に記載の凍結乾燥体。
【請求項４】
物質含有液中の物質を物質結合用固相担体に結合させるための容器であって、
前記物質結合用固相担体が添加剤とともに凍結乾燥された凍結乾燥体を容器内に備えることを特徴とする、容器。
【請求項５】
前記物質含有液を投入するための開口部と、
前記開口部から投入された前記物質含有液を濾過するためのフィルター部と、
前記フィルター部を通過した前記物質含有液と前記凍結乾燥体とを接触させるための接触部と、
前記接触部において前記凍結乾燥体に接触した前記物質含有液を前記容器の外へ流出させるための流出部と、を有する、請求項４に記載の容器。
【請求項６】
物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体の製造方法であって、
前記物質結合用固相担体を添加剤とともに凍結乾燥することを特徴とする製造方法。
【請求項７】
前記物質結合用固相担体が磁気粒子である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記添加剤が、トレハロース、スクロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、デキストラン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又はマルトデキストリンである、請求項６又は７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質結合用固相担体の凍結乾燥体、物質含有液中の物質を物質結合用固相担体と結合させるための容器、および、物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている。また農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲは生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。ＰＣＲは、増幅の対象とする核酸（標的核酸）及び試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。ＰＣＲの熱サイクルとしては、２段階又は３段階の温度で熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００３】
一方、医療の現場におけるインフルエンザに代表される感染症の診断は、現状ではイムノクロマト等の簡易検査キットを用いることが主流である。しかしこのような簡易検査では、精度が不十分となる場合があり、より高い検査精度を期待できるＰＣＲを感染症の診断に適用することが望まれている。また、医療機関における一般外来等では、診察の時間が制限される関係から、検査に費やすことのできる時間は短時間に制限される。そのため、例えばインフルエンザの検査は、検査の精度を犠牲にして、簡易的なイムノクロマト等の検査により短時間化して行われているのが現状である。このような事情から、医療の現場で、より高い精度を期待できるＰＣＲによる検査を実現するためには反応に要する時間を短縮する必要があった。
【０００４】
特許文献１には、ＰＣＲの反応前に行う核酸の抽出作業を短時間で行う方法として、磁性を有するマイクロビーズに核酸を接着させて、磁石を用いて操作する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０７４５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
磁気粒子などの核酸結合用固相担体は通常、静置しておけばその磁性等により凝集する。このため、ＰＣＲなどに使用する直前に、核酸結合用固相担体を液内で分散させる必要がある。
【０００７】
本発明は、核酸結合用固相担体を分散させるための作業を省いて、より短時間で核酸を核酸結合用固相担体に結合させるための容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一実施形態に係る物質結合用固相担体の凍結乾燥体は、物質結合用固相担体が添加剤とともに凍結乾燥されたことを特徴とする。前記物質結合用固相担体が磁気粒子であることが好ましい。前記添加剤が、トレハロース、スクロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、デキストラン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又はマルトデキストリンであってもよい。
【０００９】
本発明の他の実施形態に係る、物質含有液中の物質を物質結合用固相担体に結合させるための容器は、物質結合用固相担体が添加剤とともに凍結乾燥された凍結乾燥体を容器内に備えることを特徴とする。前記物質含有液を投入する開口部と、前記開口部から投入された前記物質含有液を濾過するためのフィルター部と、前記フィルター部を通過した前記物質含有液と前記凍結乾燥体とを接触させるための接触部と、前記接触部において前記凍結乾燥体に接触した前記物質含有液を前記容器外へ流出させるための流出部と、を有してもよい。
【００１０】
本発明の他の実施形態に係る、物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体の製造方法は、物質結合用固相担体を添加剤とともに凍結乾燥することを特徴とする。前記物質結合用固相担体が磁気粒子であることが好ましい。前記添加剤が、トレハロース、スクロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、デキストラン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又はマルトデキストリンであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態に係る容器の模式断面図である。
【図２】実施形態に係る容器の、図１のＡにおける断面を模式的に示す断面図である。
【図３】実施形態に係る容器の、図１のＢにおける断面を模式的に示す断面図である。
【図４】図４Ａ〜Ｅは、実施形態に係る容器を用いた核酸抽出方法を示す模式図である。
【図５】図５Ａ〜Ｅは、実施形態に係る容器を用いたタンパク質の精製方法を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の例を説明するものである。本発明は以下の実施形態になんら限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形形態も含む。なお以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要素であるとは限らない。
【００１３】
図１は、本実施形態の物質含有液中の物質を物質結合用固相担体と接触させるための容器の模式断面図である。なお、本明細書において「物質」とは、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、タンパク質等を意味する。
【００１４】
本発明にかかる容器１００は、フィルター設置部１１２と、凍結乾燥体１１４と、凹部１１８と、流出口１１０とを有する。フィルター設置部１１２は、例えば、直径数ｍｍあるいは一辺数ｍｍの穴の開いたプラスティック板である。好ましくは、フィルター設置部１１２には、細目フィルターと粗目フィルターの２層のフィルターが設置される。
【００１５】
細目フィルターは粗目フィルターの後段に設置されている。細目フィルターおよび粗目フィルターは、物質が通過することのできる大きさの孔を有すればよい。例えば、粗目フィルターの孔は５０〜２００μｍとすることができ、細目フィルターの孔は１０〜３０μｍとすることができる。粗目フィルターおよび細目フィルターの材質は特に限定されないが、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ニトロセルロース、ガラス繊維を使用して作製することができる。なお、本実施形態では、目詰まりを抑制するためにフィルターを粗目フィルター及び細目フィルターの２層設けているが、１層のみ設けてもよい。また、物質含有液中の混入物の量によってはフィルターを設けなくてもよい。
【００１６】
物質含有液を開口部１０６から容器１００内に投入すると、物質含有液は２層のフィルターで  濾過され、細胞やウイルス等の残渣が物質含有液から除去される。フィルターの孔を通過した物質含有液は、凍結乾燥体１１４と接触し、凍結乾燥体を溶解する。そして、凍結乾燥体１１４中の物質結合用固相担体に物質含有液中の物質が結合する。これにより得られた、物質の結合した担体から、例えば、後述するような物質抽出方法に従って物質を単離することができる。容器１００の材質は、特に限定されず、高分子からなるプラスティックや、金属等とすることができる。図２は、図１のＡにおける容器の断面を模式的に示す。図２に示すように、フィルター設置部１１２の穴１１６は、面の一部に設けて、穴１１６を通過した物質含有液が物質結合用固相担体１１４に流れるようにすることが好ましいが、フィルター設置部１１２の穴は全体に設け、一部だけ穴１１６の開いたプラスティックシートなどを、フィルター設置部１１２とフィルターの間に挟むことによって、物質含有液が物質結合用固相担体１１４に流れるようにしてもよい。
【００１７】
凍結乾燥体１１４は、添加剤と物質結合用固相担体とを凍結乾燥させたものである。添加剤を加えた液体中に物質結合用固相担体を分散させ、その分散した状態のまま凍結乾燥させて作製する。この凍結乾燥体１１４中では物質結合用固相担体が分散した状態で存在している。物質結合用固相担体とともに凍結乾燥させる添加剤としては、凍結乾燥後に物質結合用固相担体の分散状態を保てるものであって、水に接触させた場合に溶解容易な物質であればよく、例えば、トレハロース、スクロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、デキストラン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又はマルトデキストリンなどを使用することができる。物質結合用固相担体とともに凍結乾燥させる添加剤の液体中への添加量は、凍結乾燥後に物質結合用固相担体の分散状態を保てる量であればよく、例えば、１０μｌの液体中には２００〜２０００μｇのトレハロースを添加することが好ましい。物質結合用固相担体は、物質を表面に結合できるものであればよく、例えばシリカ粒子、ポリマー粒子、磁気粒子等の従来公知の物質を挙げることができるが、磁気粒子を使用することが好ましい。
【００１８】
図３は、実施形態に係る容器の、図１のＢにおける断面を模式的に示す断面図である。凹部１１８は、物質含有液を凍結乾燥体１１４と接触させる部分である。凹部１１８は、容器１００の底面１１９で窪地状となった部位である。凹部１１８には、凍結乾燥体１１４が接着されており、また、流出口１１０が形成されている。フィルターを通過した物質含有液は、底面１１９において、凹部１１８に沿って流れ、流出口１１０を通じて容器外へ流出する。
【００１９】
（核酸の抽出方法）
次に、図４を参照しながら、本実施形態にかかる容器１００を用いた核酸の抽出方法を説明する。図４は、実施形態に係る容器を用いた核酸抽出方法を示す模式図である。
【００２０】
まず、核酸抽出方法に使用する容器１００、ボトル２００、及び、核酸抽出用デバイス４００について説明する。
【００２１】
ボトル２００の上部は、開口部２２０を有している。本実施形態では、ボトル２００の開口部が、容器１００の開口部１０６と嵌合できる態様となっており、これらを嵌合させることによりボトル２００内と容器１００内とを連通させることができる。
【００２２】
ボトル２００の内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。ボトル２００の材質は、特に限定されず、プラスティック、金属等とすることができる。
【００２３】
ボトル２００内には液を入れる。液は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。液は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。
【００２４】
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の微粒子への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。
【００２５】
この液は、アルコール、又はアセトニトリルを含むことが好ましい。この場合、アルコール等の濃度は、特に限定されないが、下限については、１０％以上であってもよく、２０％以上であってもよく、３０％以上であってもよいが、４０％以上であることが最も好ましい。上限については、８０％以下であってもよく、７０％以下であってもよく、６０％以下であってもよいが、５０％以下であることが最も好ましい。アルコールの種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノールなどが例示できる。吸着液にアルコール等を添加することにより、粒子等に核酸を吸着する効果を高め、核酸抽出用デバイスとしてみた場合には核酸の抽出効率を高めることが可能になる。
【００２６】
液は、標的となる核酸を含む試料を投入して、核酸を含有する核酸含有液２１０とする。以下、標的となる核酸を単に標的核酸ということがある。標的核酸は、本実施形態の核酸抽出方法によって試料から抽出され、溶出液に溶出された後、例えば核酸がｍＲＮＡであれば、ｃＤＮＡに逆転写され、ＰＣＲの鋳型として利用され、核酸がｃＤＮＡやゲノムＤＮＡであれば、そのままＰＣＲの鋳型として利用される。試料としては、血液、鼻腔粘液、口腔粘膜、各種の生体試料のほか、一部精製された核酸溶液などでもかまわない。
【００２７】
核酸抽出用デバイス４００は、チューブ部４４０と、チューブ部４４０の一端と接続したカップ部４２０と、チューブ部４４０の他端を封止する脱着可能な栓４６０と、を有する。
【００２８】
チューブ部４４０は、内部に空洞を有し、当該空洞内に液体を長手方向に流通させることのできる筒状の部分である。チューブ部４４０は、屈曲してもよい。チューブ部４４０の内部の空洞は、内部に収容される液体がチューブ部４４０内でプラグ形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ部４４０の内部の空洞の大きさや長手方向に垂直な断面の形状は、チューブ部４４０の長手方向に沿って変化してもよい。液体がチューブ部４４０内でプラグ形状を維持できるかどうかについては、チューブ部４４０の材質、液体の種類等の条件に依存するので、チューブ部４４０の長手方向に垂直な断面の形状は、液体がチューブ部４４０内でプラグ形状を維持できる範囲内で適宜に設計される。  チューブ部４４０の外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブ部４４０の肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されない。チューブ部４４０の内部の空洞の長手方向に垂直な断面が円形である場合、チューブ部４４０の内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブ部４４０の内径がこの範囲であると、チューブ部４４０の材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすいので好ましい。
【００２９】
チューブ部４４０の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、高分子、金属などとすることができる。なお、チューブ部４４０の材質にガラスや高分子などの可視光において透明性を有する材質を選択すると、チューブ部４４０の外部から内部（空洞内）を観察することができるので好ましい。また、チューブ部４４０の材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブ部４４０に磁気粒子を通過させる場合などに、チューブ部４４０の外部から磁力を与えることによってこれを行うことが容易化されるためより好ましい。
【００３０】
本実施形態の核酸抽出方法では、カップ部４２０及びチューブ４４０に磁力を透過する材質を選び、カップ部４２０及びチューブ４４０の外部から磁力を印加することによって磁気粒子１１４ａをカップ部４２０及びチューブ４４０の内部で移動させる。
【００３１】
チューブ部４４０の内部には、第１のオイルからなる第１プラグ４４１、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した微粒子を洗浄する洗浄液からなる第２プラグ４４２、洗浄液と混和しない第２のオイルからなる第３プラグ４４３、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した微粒子から核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ４４４、及び溶出液と混和しない第３のオイルからなる第５プラグ４４５を、この順で内部に備える。
【００３２】
第１プラグ４４１、第３プラグ４４３、及び第５プラグ４４５は、いずれもオイルからなる。第１プラグ４４１、第３プラグ４４３、及び第５プラグ４４５のオイルは、互いに異なる種類のオイルであってもよいし、同じ種類のオイルであってもよい。オイルとしては、例えば、ジメチルシリコーンオイル等のシリコーン系オイル、パラフィン系オイル及びミネラルオイル並びにそれらの混合物から選択される一種を挙げることができる。また、第１プラグ４４１、第２プラグ４４２、第３プラグ、４４３第４プラグ４４４、及び第５プラグ４４５の隣り合うプラグを形成する液体は、互いに混和しないように選択される。
【００３３】
第１プラグ４４１と第３プラグ４４３の間には、第２プラグ４４２が配置される。第１プラグ４４１の第２プラグ４４２と反対側の領域には、他の液体のプラグが配置されてもよい。第１プラグ４４１の中には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第１プラグ４４１を通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。また、第１プラグ４４１と第２プラグ４４２の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第１プラグ４４１から第２プラグ４４２へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。同様に、第２プラグ４４２と第３プラグ４４３の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第２プラグ４４２から第３プラグ４４３へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。
【００３４】
第３プラグ４４３と第５プラグ４４５の間には、第４プラグ４４４が配置される。第５プラグ４４５の第４プラグ４４４と反対側の領域には、他の液体のプラグが配置されてもよい。第３プラグ４４３の中には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第３プラグ４４３を通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。また、第３プラグ４４３と第４プラグ４４４の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第３プラグ４４３から第４プラグ４４４へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。同様に、第４プラグ４４４と第５プラグ４４５の間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸を吸着させた粒子等が第４プラグ４４４から第５プラグ４４５へと通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。さらに、第５プラグ４４５の中には、気泡や他の液体がないことが好ましい。
【００３５】
第１プラグ４４１、第３プラグ４４３、及び第５プラグ４４５のチューブ部４４０の長手方向における長さは、プラグが形成可能な範囲であれば、いずれも特に限定されない。第１プラグ４４１、第３プラグ４４３、及び第５プラグ４４５のチューブ部４４０の長手方向における具体的な長さとしては、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であり、粒子等の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。これらのうち第３プラグ３０のチューブ部１００の長手方向における長さを長くすると、第４プラグ４０をチューブ部４４０の第５プラグ４４５側の端から吐出する態様を採る場合に、第２プラグ４４２を吐出しにくくすることができる。この場合、第３プラグ４４３の具体的な長さとしては、１０ｍｍ以上５０ｍｍ以下とすることができる。
【００３６】
第１プラグ４４１及び第５プラグ４４５は、チューブ部４４１の少なくとも一方の端が開放されたとしても、洗浄液（第２プラグ４４２）及び溶出液（第４プラグ４４４）の、蒸発等の外気との物質交換や、外部からの汚染を防ぐ機能を有している。そのため、チューブ部４４０の少なくとも一方の端が外気に開放されたとしても、洗浄液や溶出液の体積を一定に保つことができ、各液体の濃度の変動や汚染を抑制することができる。これにより、核酸抽出における核酸や各種の薬剤の濃度の精度を高めることができる。
【００３７】
また、第３プラグ４４３は、洗浄液（第２プラグ４４２）及び溶出液（第４プラグ４４４）が互いに混合することを抑制する機能を有する。また第３プラグ４４３は、より高粘度のオイルとすることにより、第１洗浄液（第２プラグ４４２）との界面で、粒子等を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、第２プラグ４４２の洗浄液のプラグから、オイルの第３プラグ４４３に粒子等を移動させた場合に、粒子等に付着した水溶性の成分を第３プラグ４４３（オイル）に、より持ち込まれにくくすることができる。
【００３８】
第２プラグ４４２は、チューブ部４４０内の第１プラグ４４１と第３プラグ４４３との間の位置に配置される。第２プラグ４４２は、核酸が結合した微粒子を洗浄する洗浄液からなる。第１プラグ４４１を構成するオイル及び第３プラグ４４３を構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。
【００３９】
洗浄液は、酸性溶液である。特に酸性水溶液であることが好ましく、含有する酸は特に限定されないが、クエン酸、酢酸、グリシン塩酸塩などの水溶液が好ましい。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）や、界面活性剤（Triton、Tween、SDSなど）等を含有してもよいが、カオトロピック物質を事実上含まない溶液であるほうが好ましい。ｐＨは、酸性であれば特に限定されないが、下限については、１以上であることが好ましく、２以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましく、４以上であることが最も好ましく、上限については、６以下であることが好ましく、５以下であることがさらに好ましく、４以下であることが最も好ましい。このような第１洗浄液を採用することにより、第１プラグの上流側で、核酸や核酸が吸着した粒子がアルコールを含む溶液と接しても、すなわち後述するアルコールを含む吸着液で核酸を抽出する場合や、アルコールを含む洗浄液で核酸が吸着した粒子を洗浄する場合であっても、第１洗浄液により核酸が吸着した粒子等を効率よく洗浄することができ、かつ下流へのアルコールの持ち込み、いわゆるアルコールのキャリーオーバーを防ぐことができる。
【００４０】
第２プラグ４４２の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量等を指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第２プラグ４４２の体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０μＬ以上５０μＬ以下とすることが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさらに好ましい。第２プラグ４４２の体積が、この範囲であれば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合に粒子等の洗浄を十分に行うことができる。なお、粒子等の洗浄には、第２プラグ４４２の体積は、より大きいことが好ましいが、チューブ部４４０の長さや太さ、これに依存する第２プラグ４４２のチューブ部４４０の長手方向における長さ等を考慮して、適宜に設定することができる。
【００４１】
第４プラグ４４４は、チューブ部４４０内の第３プラグ４４３と第５プラグ４４５との間の位置に配置される。第４プラグ４４４は、核酸が結合した微粒子から核酸を溶出する溶出液からなる。
【００４２】
溶出液としては、例えば、滅菌水、蒸留水、イオン交換水等の精製された水、又はバッファーを用いることができる。溶出液を水又は水溶液とすれば、核酸が吸着した粒子等が溶出液に浸漬されることで、粒子等に吸着した核酸を溶出することができる。溶出液は、第３プラグ４４３を構成するオイル及び第５プラグ４４５を構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。
【００４３】
溶出液プラグ４４４の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、溶出液プラグ４４４の体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。溶出液プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、微粒子の体積を０．５μＬにしても、微粒子から核酸を十分溶出することができる。
【００４４】
栓４６０は、チューブ部４４０の他端を脱着可能に封止することのできる材質であればよく、例えば、ゴムやエラストマー、高分子等によりなる。封止時、栓４６０は、第５プラグ４４５と接してもよいし、第５プラグ４４５と栓４６０との間に空気等の気体が配置されてもよい。また、栓４６０は脱着自在であるが、その機構は特に限定されない。
【００４５】
カップ部４２０は、容器１００の流出口１１０から吐出した液をカップ部４２０内部に注ぐことができる形状である。カップ部４２０の材質は、ゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものである。前述したように、蓋４７０によりカップ部４２０の開口部を塞いでカップ部４２０を変形させることにより、核酸抽出用デバイス４００のチューブ部４４０の内部を加圧することができる。このようにすれば、溶出液４４４をチューブ部４４０の端から吐出させるために、チューブ部４４０の容器１００の接続側から圧力を印加することが容易である。これにより、例えばＰＣＲのための反応容器等に溶出液を分注することができる。
【００４６】
次に、核酸抽出方法の各工程を説明する。
【００４７】
まず、ボトル２００に試料を導入し、核酸含有液２１０を作製する（図４Ａ）。綿棒３００に試料を付着させ、ボトル２００の開口２２０から、当該綿棒３００を差し入れ、ボトル２００内の液にこれを浸漬して行うことができる。また、試料は、ピペット等によってボトル２００の開口２２０から導入してもよい。また試料がペースト状や固体状であれば、例えば、ボトル２００の開口２２０から匙やピンセット等によりボトル２００の内壁に付着させたり投入してもよい。
【００４８】
次に、本発明にかかる容器１００の開口部１０６をボトル２００の開口部２２０と嵌合させて、容器１００とボトル２００を一体とする（図４Ｂ）。
【００４９】
次に、液２１０中の核酸を磁気粒子に結合させる（図４Ｃ）。容器１００およびボトル２００の一体型を上下逆にすることにより、核酸含有液２１０をボトル２００内から容器１００内へ送る。容器１００内では、粗目フィルターを通過した核酸含有液が細目フィルターを通過する。細目フィルターを通過した核酸含有液は容器１００の底部に位置する凍結乾燥体と接触する。このとき、凍結乾燥体内の磁気粒子が核酸含有液中に混入する。標的核酸は、カオトロピック剤の作用により、磁気粒子の表面に吸着されて結合する。ここでは、磁気粒子の表面に、標的核酸以外の核酸やフィルターを通過してしまったタンパク質が吸着してもよい。
【００５０】
このように、磁気粒子の表面に標的核酸を結合させるために、ボルテックスシェイカーなどの装置を用いて容器を揺動させたり、作業者の手で振り混ぜたりする必要がない。このため、本発明によれば、核酸結合用固相担体を分散させるための作業を省いて、より短時間で核酸を核酸結合用固相担体に結合することができる。
【００５１】
次に、磁気ビーズに結合した核酸をチューブ部４４０内の溶出液内に溶出させる（図４Ｄ）。核酸が吸着した磁気粒子をチューブ部４４０に導く手法としては、重力や遠心力を利用する方法を用いてもよく、特に制限されないが、本実施形態ではカップ部４２０及びチューブ部４４０の外部から永久磁石４８０を用いて磁力を印加して行う。磁力は、永久磁石の他、例えば、電磁石等により印加することができるが、発熱等を生じない点で、永久磁石を用いて印加することがより好ましい。また、永久磁石を用いる場合には、作業者の手で磁石を動かして行ってもよいし、機械装置等を利用して行ってもよい。磁気粒子は、磁力によって引き寄せられる性質を有しているため、この性質を利用して、カップ部４２０及びチューブ部４４０と、永久磁石の相対的な配置を変化させて、カップ部４２０内からチューブ部４４０に移動させる。本実施形態では、永久磁石４８０を図４Ｄ中の矢印方向に移動させることにより行う。これにより、第１プラグ４４１から順に、各プラグを通って、第４プラグ４４４まで磁気粒子が移動される。磁気粒子が各プラグを通過するときの各プラグにおける滞在時間は特に限定されないし、同一プラグ内でチューブ部４４０の長手方向に沿って往復するようにして移動させてもよい。
【００５２】
磁気粒子が第４プラグ４４４に到達すると、溶出液の作用により、磁気粒子に吸着された核酸が、第４プラグ４４４の溶出液に溶出する。本工程を経ると、試料から溶出液に対して核酸が溶出し、試料から核酸が抽出された状態となる。
【００５３】
次に、第４プラグの溶出液４４４をチューブ部４４０から吐出させる（図４Ｅ）。本実施形態では、カップ部４２０に蓋４７０をはめ、核酸抽出用デバイス４００のチューブ部４４０から栓４６０を外し、チューブ部４４０の第５プラグ４４５側の端を開放する。そしてカップ部４２０に図４Ｅ中の矢印方向に外力を加えて、チューブ部４４０の内圧を高めるように変形させると、圧力によりチューブ部４４０の第１プラグ４４１側から第５プラグ４４５側へと各プラグが移動する。これにより、チューブ２００の第５プラグ４４５側の端から、第５プラグ４４５及び第４プラグ４４４の順に吐出される。
【００５４】
以上のように、本実施形態の容器１００によれば、ＰＣＲ等に使用する核酸を調製するための前処理において、従来核酸結合用担体を分散するのに要していた時間と手間を削減することができる。
【００５５】
（タンパク質の精製方法）
次に、図５を参照しながら、本実施形態にかかる容器１００を用いた細胞からのタンパク質の精製方法を説明する。図５は、実施形態に係る容器を用いたタンパク質精製方法を示す模式図である。
【００５６】
タンパク質精製方法に使用する容器１００及びボトル２００は、核酸抽出方法に使用したものと同様に、ボトル２００の上部は、開口部２２０を有している。本実施形態では、ボトル２００の開口部が、容器１００の開口部１０６と嵌合できる態様となっており、これらを嵌合させることによりボトル２００内と容器１００内とを連通させることができる。容器１００の凍結乾燥体１１４中には、精製の標的とする細胞内のタンパク質（以下、標的タンパク質という）に対して親和性を有する物質、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、アビジン、グルタチオン、レクチンおよび抗体が表面修飾されている磁気粒子が含まれている。その磁気粒子に結合した物質は、その物質に対して特異的に吸着する作用を有するタンパク質と特異的に結合することが可能である。
【００５７】
細胞からタンパク質を精製するには、まず、ボトル２００内に溶解バッファ５１０を入れる（図５Ａ）。溶解バッファ５１０は、標的タンパク質を変性させることなく、細胞を溶解することのできる液であればよい。例えば、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＳＤＳ、デオキシコール酸塩、及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ又はＮＰ４０等を含む液を、標的タンパク質を取得するのに最適なｐＨに調整して使用することができる。そして、ボトル２００内の溶解バッファ５１０に細胞５００を導入し、タンパク質含有液５１０を作製する。
【００５８】
次に、本発明にかかる容器１００の開口部１０６をボトル２００の開口部２２０と嵌合させて、容器１００とボトル２００を一体とする（図５Ｂ）。
【００５９】
次に、溶解バッファ５１０中のタンパク質を磁気粒子表面のタンパク質に親和性を有する物質に結合させる（図５Ｃ）。容器１００およびボトル２００の一体型を上下逆にすることにより、タンパク質含有液５１０をボトル２００内から容器１００内へ送る。容器１００内では、粗目フィルターを通過したタンパク質含有液が細目フィルターを通過する。細目フィルターを通過したタンパク質含有液は容器１００の底部に位置する凍結乾燥体１１４と接触する。このとき、凍結乾燥体内の磁気粒子がタンパク質含有液中に混入する。標的タンパク質は、磁気粒子表面のタンパク質に親和性を有する物質と結合する。ここでは、磁気粒子の表面に、標的タンパク質以外のタンパク質やフィルターを通過してしまったタンパク質が吸着してもよい。容器１００の流出口１１０から流出したタンパク質含有液は容器６００に流入させる。
【００６０】
このように、磁気粒子の表面に標的タンパク質を結合させるために、ボルテックスシェイカーなどの装置を用いて容器を揺動させたり、作業者の手で振り混ぜたりする必要がない。このため、本発明によれば、タンパク質結合用固相担体を分散させるための作業を省いて、より短時間でタンパク質をタンパク質結合用固相担体に結合することができる。
【００６１】
次に、容器６００の外部に永久磁石６８０を接近させて、その磁力によって磁気粒子を容器６００の側壁に保持しつつ、液体を容器６００外へ除去する（図５Ｄ）。
【００６２】
次に、容器６００内に適当な溶出液６４４を加えることによって、タンパク質を磁気粒子から溶出させる（図５Ｅ）。そして、溶出後、容器６００の側壁に永久磁石６８０を外側から近づけて磁気粒子をチューブの側壁近傍に保持しつつ、容器６００から上澄み部分となる液体を採取することによって、磁気粒子に結合していたタンパク質を回収することができる。タンパク質を溶出させる溶出液としては、タンパク質とリガンドとの親和性を低下させる効果がある液体が好ましい。当該液体としては、例えば、塩酸、イミダゾール、グルタチオンおよびビオチンを含むバッファが挙げられる。バッファとしては、例えば、リン酸カリウムバッファ、リン酸ナトリウムバッファ、トリス塩酸塩バッファ、ＰＩＰＥＳバッファ、ホウ酸バッファおよびグリシン塩酸バッファが挙げられる。
【００６３】
磁気粒子からタンパク質を溶出させる前に磁気粒子を洗浄し、夾雑物を除去してもよい。具体的な洗浄方法としては、例えば、０．５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸ナトリウムバッファ中にタンパク質の結合した磁気粒子を加え、再分散を繰り返すことで磁性微粒子に吸着していた夾雑物を取り除く方法が挙げられる。  以上のように、本実施形態の容器１００によれば、タンパク質を調製するための前処理において、従来タンパク質結合用担体を分散するのに要していた時間と手間を削減することができる。
【００６４】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【００６５】
１００…容器
１０２…側壁
１０４…フィルター支持部
１０６…開口部
１１０…流出口
１１２…フィルター設置部
１１４…凍結乾燥体
１１４ａ…磁気粒子
１１６…穴
１１８…凹部
１１９…底面
２００…ボトル
２１０…核酸含有液
２２０…開口部
３００…綿棒
４００…核酸抽出用デバイス
４２０…カップ部
４４０…チューブ部
４４１…第１プラグ
４４２…第２プラグ（洗浄液）
４４３…第３プラグ
４４４…第４プラグ（溶出液）
４４５…第５プラグ
４６０…栓
４７０…蓋
４８０…永久磁石
５００…細胞
５１０…タンパク質含有液（溶解バッファ）
６００…容器
６４４…溶出液
６８０…永久磁石
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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