(57)【要約】      （修正有）【課題】インスリン抵抗性、糖代謝の異常の簡便な検出方法を提供する。【解決手段】空腹時における血液サンプル中の下記の（１）並びに（２）〜（４）；（１）インスリン、（２）L/A及び｛（10ZE＋12ZE）／LA｝、（３）L/A、（４）アディポネクチン及び血糖値のいずれか１つを測定又は算出する工程を含み、下記の(i)〜(iii)；(i)インスリン、L/A及び｛（10ZE＋12ZE）／LA｝からなる３つの説明変数の組み合わせ、(ii)インスリン及びL/Aからなる２つの説明変数の組み合わせ、(iii)インスリン、アディポネクチン及び空腹時血糖値からなる３つの説明変数の組み合わせ、のいずれかの説明変数の組み合わせに基づき、重回帰モデルもしくは非線形モデルによるMatsuda Indexの予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
空腹時における血液サンプル中の下記の（１）並びに（２）〜（４）
（１）インスリン
（２）L/A及び｛（10ZE＋12ZE）／LA｝
（３）L/A
（４）アディポネクチン及び血糖値
(但し、L/Aはレプチン／アディポネクチン比を示し、10ZEは10ZE-HODEを示し、12ZEは12ZE -HODEを示し、HODEはヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを示し、LAはリノール酸を示す)
のいずれか１つを測定又は算出する工程を含み、下記の(i)〜(iii)
(i) インスリン、L/A及び｛（10ZE＋12ZE）／LA｝からなる３つの説明変数の組み合わせ
(ii) インスリン及びL/Aからなる２つの説明変数の組み合わせ
(iii) インスリン、アディポネクチン及び空腹時血糖値からなる３つの説明変数の組み合わせ
のいずれかの説明変数の組み合わせに基づき重回帰モデルもしくは非線形モデルによりMatsuda Indexを予測することを特徴とする、Matsuda Indexの予測方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によりMatsuda Indexを予測し、Matsuda Indexの予測値と空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性の正常と異常を判別することを特徴とする、インスリン抵抗性の検出方法。：
【請求項３】
Matsuda Index 3 pointsの予測値と空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性の正常と異常を判別することを特徴とする、請求項２に記載のインスリン抵抗性の検出方法：
【請求項４】
インスリン、レプチン／アディポネクチン比（L/A）及び｛（10ZE-HODE＋12ZE-HODE）／リノール酸｝比の３つの項目を測定又は算出することを特徴とする、請求項２又は３に記載の検出方法。
【請求項５】
インスリン、レプチン／アディポネクチン比（L/A）の２つの項目を測定又は算出することを特徴とする、請求項２又は３に記載の検出方法。
【請求項６】
インスリン、アディポネクチン及び空腹時血糖値の３つの項目を測定又は算出することを特徴とする、請求項２又は３に記載の検出方法。
【請求項７】
インスリン抵抗性の異常が境界型を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によりMatsuda Indexを予測する工程、Matsuda Indexの予測値と空腹時血糖値を用いて耐糖能とインスリン抵抗性の正常と異常を判別することを特徴とする、糖代謝異常の検出方法
【請求項９】
血液サンプルが血漿又は血清である、請求項２〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
血液サンプル中の下記の（１）並びに（２‘）、（３’）、（４）
（１）インスリン
（２‘）レプチン、アディポネクチン、10ZE-HODE、12ZE-HODE及びリノール酸
（３‘）レプチン及びアディポネクチン
（４）アディポネクチン及び血糖値
(但し、HODEはヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを示す。)
のいずれか１つを測定可能なバイオマーカー測定部、上記（２‘）の場合にレプチン／アディポネクチン比(L/A比)、（10ZE＋12ZE）／LA比を算出し、これらの測定値及び計算値に基づき重回帰モデルもしくは非線形モデルによりMatsuda Indexを予測する演算部、前記演算部により予測されたMatsuda Indexと空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性及び／又は耐糖能の異常を検出する検出部を有する、インスリン抵抗性及び／又は耐糖能の異常を検出するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン抵抗性、糖代謝の異常を検出のための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病及び糖尿病予備群などの糖代謝異常の検査、とりわけ、境界型（IGT） 若しくはインスリン作用の検査は、糖尿病及び生活習慣病の予防の観点から非常に重要である。
【０００３】
健康診断では空腹時血糖値が測定され、血糖値110〜125 mg/dlの被験者ではグルコース負荷試験(OGTT)を行い、血糖値109 mg/dl以下は正常型と見なされる。正常型であってもインスリン作用の低下がみられる被験者の場合、境界型（IGT）や糖尿病型に移行する頻度が高いため、そのことを被験者に注意喚起していれば、糖尿病患者又はその予備群の数を減らすことができる。一方、空腹時血糖値やHbA1cで正常型の被験者全部にグルコース負荷試験を行うことは現実的ではない。
【０００４】
特許文献１は、サンプル中のミオイノシトールをミオイノシトールに作用する酵素で処理してミオイノシトールを定量し、糖尿病予備群あるいは糖尿病と判定する検査方法を提案している。このような酵素を用いた測定は煩雑であるので、より簡便な検査方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2001-190299
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、インスリン抵抗性、糖代謝の異常の簡便な検出方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題に鑑み検討を重ねた結果、少ない検査項目で簡便に糖代謝異常が検出できることを見出した。
【０００８】
本発明は、以下の方法及び装置を提供するものである。
項１．  空腹時における血液サンプル中の下記の（１）並びに（２）〜（４）
（１）インスリン
（２）L/A及び｛（10ZE＋12ZE）／LA｝
（３）L/A
（４）アディポネクチン及び血糖値
(但し、L/Aはレプチン／アディポネクチン比を示し、10ZEは10ZE-HODEを示し、12ZEは12ZE -HODEを示し、HODEはヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを示し、LAはリノール酸を示す)
のいずれか１つを測定又は算出する工程を含み、下記の(i)〜(iii)
(i) インスリン、L/A及び｛（10ZE＋12ZE）／LA｝からなる３つの説明変数の組み合わせ
(ii) インスリン及びL/Aからなる２つの説明変数の組み合わせ
(iii) インスリン、アディポネクチン及び空腹時血糖値からなる３つの説明変数の組み合わせ
のいずれかの説明変数の組み合わせに基づき重回帰モデルもしくは非線形モデルによりMatsuda Indexを予測することを特徴とする、Matsuda Indexの予測方法：
項２．  項１に記載の方法によりMatsuda Indexを予測し、Matsuda Indexの予測値と空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性の正常と異常を判別することを特徴とする、インスリン抵抗性の検出方法。：
項３．  Matsuda Index 3 pointsの予測値と空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性の正常と異常を判別することを特徴とする、項２に記載のインスリン抵抗性の検出方法：
項４．  インスリン、レプチン／アディポネクチン比（L/A）及び｛（10ZE-HODE＋12ZE-HODE）／リノール酸｝比の３つの項目を測定又は算出することを特徴とする、項２又は３に記載の検出方法。
項５．  インスリン、レプチン／アディポネクチン比（L/A）の２つの項目を測定又は算出することを特徴とする、項２又は３に記載の検出方法。
項６．  インスリン、アディポネクチン及び空腹時血糖値の３つの項目を測定又は算出することを特徴とする、項２又は３に記載の検出方法。
項７．  インスリン抵抗性の異常が境界型を含む、項２〜６のいずれか１項に記載の検出方法。
項８．  項１に記載の方法によりMatsuda Indexを予測する工程、Matsuda Indexの予測値と空腹時血糖値を用いて耐糖能とインスリン抵抗性の正常と異常を判別することを特徴とする、糖代謝異常の検出方法
項９．  血液サンプルが血漿又は血清である、項２〜８のいずれかに記載の検出方法。
項１０．  血液サンプル中の下記の（１）並びに（２‘）、（３’）、（４）
（１）インスリン
（２‘）レプチン、アディポネクチン、10ZE-HODE、12ZE-HODE及びリノール酸
（３‘）レプチン及びアディポネクチン
（４）アディポネクチン及び血糖値
(但し、HODEはヒドロキシオクタデカジエノイックアシッドを示す。)
のいずれか１つを測定可能なバイオマーカー測定部、上記（２‘）の場合にレプチン／アディポネクチン比(L/A比)、（10ZE＋12ZE）／LA比を算出し、これらの測定値及び計算値に基づき重回帰モデルもしくは非線形モデルによりMatsuda Indexを予測する演算部、前記演算部により予測されたMatsuda Indexと空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性及び／又は耐糖能の異常を検出する検出部を有する、インスリン抵抗性及び／又は耐糖能の異常を検出するための装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、インスリンに加えて空腹時血糖値、アディポネクチンの測定（モデル３）、Ｌ／Ａと(10ZE+12ZE)/LAの測定／算出(モデル１)、或いはＬ／Ａ の測定／算出(モデル２)により、インスリン抵抗性を検出することができる。
【００１０】
耐糖能異常は、空腹時血糖値(血糖値０分)により評価することができる。
【００１１】
インスリン抵抗性は、モデル１，２又は３において２種又は３種の説明変数を用いてMatsuda Indexを予測し、それにより正常と異常を検出、評価または判別することができる。
【００１２】
インスリン抵抗性は、従来グルコース負荷試験(OGTT)を行い、空腹時血糖値と空腹時インスリン濃度とグルコース摂取の６０分後及び１２０分後の血糖値とインスリン濃度（Matsuda Index 3 points）、或いは空腹時血糖値と空腹時インスリン濃度とグルコース摂取の３０分後、６０分後、９０分後及び１２０分後の血糖値とインスリン濃度（Matsuda Index 5 points）により評価されていた。
【００１３】
本発明ではグルコース負荷試験(OGTT)を行うことなくインスリン抵抗性及び糖代謝異常の検出／評価／判別を行うことができるので、採血の回数及び拘束時間を大きく減らすことができ、医療現場及び被験者の負担を大幅に軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】耐糖能とインスリン抵抗性で表されるリスクの判別（モデル１）
【図２】耐糖能とインスリン抵抗性で表されるリスクの判別（モデル２）
【図３】耐糖能とインスリン抵抗性で表されるリスクの判別（モデル３）
【図４】本発明の装置の概略を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「測定」とは、インスリン、レプチン（Ｌ）、アディポネクチン（Ａ）、空腹時血糖値、リノール酸（ＬＡ）、12ZE-HODE、10ZE-HODEなどの血液サンプル中の各種バイオマーカーの濃度を測定することを意味し、「算出」とはレプチンとアディポネクチンの比（L/A）、12ZE-HODEと10ZE-HODEの合計量とリノール酸の比｛（10ZE＋12ZE）／LA｝を算出することを意味する。
【００１６】
「L/A」の測定又は算出は、レプチン(L)とアディポネクチン(A)の2つの測定値をMatsuda Indexの予測に用いてもよく、レプチン(L)とアディポネクチン(A)の比をMatsuda Indexの予測に用いてもよいことを意味する。換言するとL/Aは、L+Aでもよく、L÷Aでもよく、A÷Lでもよい。
【００１７】
同様に、「｛（10ZE＋12ZE）／LA｝」の測定又は算出は、10ZE-HODE、12ZE-HODE、リノール酸(LA)の3つの測定値をMatsuda Indexの予測に用いてもよく、（10ZE＋12ZE）÷LA比或いはLA÷（10ZE＋12ZE）比をMatsuda Indexの予測に用いてもよいことを意味する。
【００１８】
本発明は哺乳類(ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタなど)由来の血液サンプルを使用し、好ましくはヒト由来の血液サンプルを使用する。
【００１９】
血液サンプルとしては、血漿、血清、血球（赤血球、白血球）が挙げられ、好ましくは血漿または血清が例示される。
【００２０】
本発明者は、糖尿病患者、境界型または正常型の被験者の血液サンプルについて、インスリン、hs-CRP、RBP4、プロインスリン、GA、L/A、(12ZE+10ZE)/LA、BMI、HbA1c、空腹時血糖値の10個のバイオマーカーを説明変数の初期候補として選択し、ステップワイズ変数選択を行った結果、選択された変数(インスリン、L/A、(12ZE+10ZE)/LAの3変数)を説明変数としたMatsuda Indexの重回帰予測モデルをモデル１(MODEL#=1)とした。
【００２１】
次に、モデル１から測定に時間とコストのかかる(12ZE+10ZE)/LAを除いた2変数のみを説明変数として重回帰モデル２(MODEL#=2)を得た。モデル２はステップワイズ変数選択により得られたものではないが、表2に示されるインスリン抵抗性判別の感度と特異度をいずれも100％にすることができ、赤池情報量規準（AIC）値、重相関係数、ｐ値がいずれも許容される数値になっており、Matsuda Indexの予測モデルとして十分に有用であることを確認した。
【００２２】
さらに、時間及びコスト面で有利な予測モデルを得るために、上記10個のバイオマーカーから｛（10ZE＋12ZE）／LA｝を除外し、さらにL/Aを割らずにレプチン(L)とアディポネクチン(A)として独立させて、インスリン、hs-CRP、RBP4、プロインスリン、GA、レプチン(L)、アディポネクチン(A)、BMI、HbA1c、空腹時血糖値の10個のバイオマーカーを説明変数の初期候補として選択し、同様にステップワイズ変数選択を行った結果、選択された変数を説明変数(インスリン、A、空腹時血糖値の3変数)としたものをMatsuda Indexの重回帰予測モデルであるモデル３(MODEL#=3)とした。
【００２３】
モデル３を得るための統計解析において(12ZE+10ZE)/LAを説明変数から除いたのは、12ZE、10ZE、LAの測定にコストと時間がかかるため、これを除いてもインスリン抵抗性異常の十分な予測が成立するのかを検証するためである。
【００２４】
モデル１，２，３の説明変数を表1に示し（「○」が使用された説明変数である）、各モデルの重相関係数、AIC値、耐糖能判別とインスリン抵抗性判別の特異度と感度、説明変数を表2に示す。表2において、耐糖能の判別は、空腹時血糖値の測定値に基づく。
【００２５】
【表１】
2015180865.tif 000002
【００２６】
モデル1，2，3では重回帰モデルでMatsuda Indexを予測しているが、非線形モデルで予測することもできる。
【００２７】
【表２】
2015180865.tif 000003
【００２８】
重相関係数：Ma tsuda-Index 3 points の実測値と数理モデルを用いた推定値との間の相関係数
赤池情報量規準（ＡＩＣ）値：  ― 数理モデルを用いた推定値の真値との当てはまりの良さ＋説明変数の数によるペナルティ（AIC値が低いほど良いモデル）
感度：  非正常群の被験者のうち，モデルが正しく非正常と判定する割合
特異度：  正常群の被験者のうち，モデルが正しく正常と判定する割合
本明細書において、Matsuda IndexはMatsuda Index 3 pointsとMatsuda Index 5 pointsの両方を含む。本明細書ではMatsuda Index 3 pointsの予測モデルを用いた例を示すが、Matsuda Index 5 pointsの予測モデルを用いることもできる。
【００２９】
Matsuda Indexと各説明変数の関係式を以下に示す。
【００３０】
【数１】
2015180865.tif 000004
【００３１】
この重回帰式において１０個の説明変数（インスリン、hs-CRP、RBP4、プロインスリン、GA、L/A、(12ZE+10ZE)/LA、BMI、HbA1c、空腹時血糖値）を初期説明変数候補として、AIC値が最も低くなる説明変数の組み合わせをステップワイズ変数選択によりもとめて、Matsuda Index 3 pointsを予測する重回帰モデル１を得た。
【００３２】
本明細書において、「Matsuda Index 3 points」は、空腹時血糖値、空腹時インスリン濃度、グルコース負荷試験でのグルコース摂取の６０分後と１２０分後の血糖値から計算される。
【００３３】
本明細書において、「Matsuda Index 5 points」は、空腹時血糖値(血糖値０分)、空腹時インスリン濃度、グルコース負荷試験でのグルコース摂取の３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後の血糖値とインスリン濃度から計算される。
【００３４】
糖代謝異常とは、インスリン作用不足によって説明される、糖の産生と消費のアンバランスに基づいた糖が十分に代謝されていない状態を意味する。糖代謝異常が亢進すると、十分に代謝処理されないで残った糖が血中に余り、結果として血糖値が高くなる。この状態が続くと境界型、ひいては糖尿病に至る。従って、糖代謝異常は糖尿病と境界型を含み、さらに糖尿病および境界型には該当しないが糖代謝の低下により血糖値が徐々に上昇していく過程の糖尿病予備群の前段階の健常者を含む。
【００３５】
本明細書で、「評価する」とは、正常であるか異常であるかを評価もしくは決定するという意味であり、具体的な数値を予測することを意味しない。
【００３６】
本発明では、説明変数として(12ZE+10ZE)/LAを使用することができ、10ZE-HODE及び12ZE-HODEが有効である。従来、糖尿病との関連性は9-HODE、13-HODEが注目されていたが、インスリン抵抗性、糖代謝の評価には10ZE-HODE、12ZE-HODEが特に有効であるという意外な結果が得られた。
【００３７】
リノール酸由来成分は、リノール酸自体、及び、リノール酸の酸化物が含まれる。リノール酸（２つの二重結合がZ, Z(シス型)）が酸化されると、ZEないしEZ、或いはEEのHODE類に異性化する。また、酸化により導入されるOH基の位置により9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODEなどが生じる。
【００３８】
本発明によるMatsuda Indexの予測は、インスリン抵抗性の評価に有用であり、糖尿病及びその予備群の糖代謝異常を有効に検出することができる。
【００３９】
本発明の装置は、
(I)  Matsuda Indexの予測に必要な血液中のバイオマーカー成分（インスリン、レプチン、アディポネクチン、10ZE-HODE、12ZE-HODE、リノール酸、グルコース）を測定可能な測定部、
(II)  測定されたバイオマーカーに基づきMatsuda Indexを予測する演算部、必要な場合にレプチン／アディポネクチン比(L/A比)、（10ZE＋12ZE）／LA比を算出し、これらの測定値及び計算値に基づき重回帰モデルもしくは非線形モデルによりMatsuda Indexを予測する演算部、
(III)  前記演算部により予測されたMatsuda Indexと空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性及び／又は耐糖能の異常を検出する検出部を有するものである。
【００４０】
バイオマーカー測定部としては、図４に示すような各バイオマーカー成分を検出可能なマルチアッセイ用免疫測定チップを使用するのが好ましい。このチップは、抗原抗体反応によりバイオマーカーを測定可能な測定ユニットを円盤状チップに多数配置したチップが挙げられ、チップを回転させることにより反応液、洗浄液などが測定ユニットの反応部に送られるようになっている。反応部には抗体を付着させたプッシュイン部材を嵌め込むようになっており、測定対象のバイオマーカーに応じて適切な抗体を備えたプッシュイン部材を使用することができる。抗原抗体反応によるバイオマーカーの検出は、蛍光などの化学発光(CL)の検出器により行ってもよく、(超高感度)表面プラズモン励起増強蛍光(SPF)検出器により行ってもよく、これらを組み合わせてもよい。
【００４１】
バイオマーカー測定部で測定された各成分のデータ(例えば蛍光強度、SPFシグナルなど)は、電気信号として演算部に送り、重回帰モデルもしくは非線形モデルにより演算部(例えばCPU)で演算することにより、Matsuda Indexを高精度で予測することができる。
【００４２】
さらに、前記演算部により予測されたMatsuda Indexと空腹時血糖値に基づきインスリン抵抗性及び／又は耐糖能の異常を検出部で検出することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
【００４４】
実施例１
健康診断において特に異常な結果がなく、健常者とみなされる被験者56名にブドウ糖負荷試験を実施した。ブドウ糖負荷試験は10時間以上の絶食後、採血、その後75ｇブドウ糖液を飲用することによって行った。30分おきに採血し、即座に血漿部と血球部を遠心によって分離した。同時に一部の血液から血清を採取した。得られた血漿、血清を用いて、下記の(1)〜(10)の各種バイオマーカーの測定を行った。
(1) インスリン、
(2) hs-CRP、
(3) RBP4、
(4) プロインスリン、
(5) GA、
(6) L/A、
(7) (12ZE+10ZE)/LA、
(8) BMI、
(9) HbA1c、
(10) 空腹時血糖値
【００４５】
上記バイオマーカーを初期説明変数候補として，Matsuda Index 3 pointsを予測する重回帰モデルのAIC値を最も低くする説明変数の組み合わせを探索する統計手法（AIC値基準によるステップワイズ変数選択）を適用した．
【００４６】
その結果、重回帰モデル１を得た(表1，表2、図1)。
【００４７】
次に、モデル１から測定に時間とコストのかかる(12ZE+10ZE)/LAを除いた2変数のみを説明変数として重回帰モデル２(MODEL#=2)を得た(表1，表2，図2)。
【００４８】
さらに、時間及びコスト面で有利な予測モデルを得るために、上記10個のバイオマーカーから｛（10ZE＋12ZE）／LA｝を除外し、さらにL/Aを割らずにレプチン(L)とアディポネクチン(A)として独立させて、インスリン、hs-CRP、RBP4、プロインスリン、GA、レプチン(L)、アディポネクチン(A)、BMI、HbA1c、空腹時血糖値の10個のバイオマーカーを説明変数の初期候補として選択し、同様にステップワイズ変数選択を行った結果、選択された変数を説明変数(インスリン、A、空腹時血糖値の3変数)としたものをMatsuda Indexの重回帰予測モデルであるモデル３(MODEL#=3)とした(表1，表2，図3)。
【００４９】
表2において、耐糖能判別は、空腹時血糖値により行った。
【００５０】
モデル１，２，３は、いずれもAIC値、重相関係数、ｐ値が優れており、感度はいずれも100％であって、特異度は90％以上あり、Matsuda Indexの予測モデルとして優れている。
【００５１】
図１〜３は、Matsuda Index 3 pointsの推定値(予測値)を縦軸、空腹時血糖値の実測値を横軸に取り、耐糖能とインスリン抵抗性の評価を行っているが、Matsuda Index 3 pointsの推定値(予測値)だけでもインスリン抵抗性の評価は十分に行うことができる。
【図１】
2015180865.tif 000005
【図２】
2015180865.tif 000006
【図３】
2015180865.tif 000007
【図４】
2015180865.tif 000008