(57)【要約】      （修正有）【課題】正確な温度の測定が可能なマイクロ流体デバイスを提供する。【解決手段】抵抗体の抵抗値と着目領域の温度とが対応付けられている関係式によって、着目領域２０の温度を制御するマイクロ流体デバイス１１であって、抵抗体１３は、流路１２を加熱するヒーターとしての機能と、流路１２内の温度を測定するセンサーとしての機能を兼ね備え、着目領域２０を含む流路１２の下方に着目領域よりも広い領域に亙って設けられ、抵抗体によって抵抗体１３の直上の着目領域２０を含む任意の２点以上の温度分布を測定する測定手段と、抵抗体１３の抵抗値が周囲温度の影響を受けることで見誤る温度を補正する温度補正手段とを有し、本測定前において前記関係式を求めた際に、測定手段によって測定された温度分布と、本測定において前記関係式を用いて着目領域２０の温度制御をした際に、測定手段によって測定された温度分布とを比較し見誤る温度を補正する。【選択図】図１
2015114265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抵抗体の抵抗値と温度測定領域である着目領域の温度とが対応付けられている関係式における前記抵抗体の抵抗値によって、前記着目領域の温度を制御するマイクロ流体デバイスであって、
前記抵抗体は、前記マイクロ流体デバイスを構成する基体に設けられた流路を加熱するヒーターとしての機能と、流路内の温度を測定するセンサーとしての機能を兼ね備えると共に、
前記着目領域を含む前記流路の下方に該流路の長手方向に沿って該着目領域よりも広い領域に亙って設けられた構成を備え、
前記抵抗体によって抵抗体の直上の前記着目領域を含む任意の２点以上の温度分布を測定する測定手段と、
前記抵抗体の抵抗値が周囲温度の変化による影響を受けることによって見誤る温度を補正する温度補正手段と、を有し、
前記温度補正手段は、
本測定前において前記抵抗体の抵抗値と前記着目領域の温度とが対応付けられている関係式を求めた際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、
前記本測定において前記関係式を用いて前記着目領域の温度制御をした際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、を比較し、
前記見誤る温度を補正することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記温度補正手段は、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記抵抗体の直上の全領域に対して積算し、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記温度補正手段は、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記流路内の任意の点において求め、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記温度補正手段は、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記抵抗体の直上の全領域に対して積算し、その値を用いて、予め求めた温度分布の中から最も近い温度分布を選択し、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記温度補正手段は、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記流路内の任意の点において求め、その値を用いて、予め求めた温度分布の中から最も近い温度分布を選択し、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記流路内の任意の点が、該流路内における前記抵抗体の端部に対応する位置であることを特徴とする請求項３または請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
抵抗体の抵抗値と温度測定領域である着目領域の温度とが対応付けられている関係式における前記抵抗体の抵抗値によって、前記着目領域の温度を制御するマイクロ流体デバイスにおける測定温度の補正方法であって、
前記抵抗体は、前記マイクロ流体デバイスを構成する基体に設けられた流路を加熱するヒーターとしての機能と、流路内の温度を測定するセンサーとしての機能を兼ね備えると共に、
前記着目領域を含む前記流路の下方に該流路の長手方向に沿って該着目領域よりも広い領域に亙って設けられた構成を有し、
前記抵抗体によって抵抗体の直上の前記着目領域を含む任意の２点以上の温度分布を測定する測定手段と、
前記抵抗体の抵抗値が周囲温度の変化による影響を受けることによって見誤る温度を補正する温度補正手段と、を用い
前記温度補正手段によって、
本測定前において前記抵抗体の抵抗値と前記着目領域の温度とが対応付けられている関係式を求めた際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、
前記本測定において前記関係式を用いて前記着目領域の温度制御をした際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、を比較し、
前記見誤る温度を補正することを特徴とする測定温度の補正方法。
【請求項８】
前記温度補正手段によって、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記抵抗体の直上の全領域に対して積算し、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項７に記載の測定温度の補正方法。
【請求項９】
前記温度補正手段によって、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記流路内の任意の点において求め、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項７に記載の測定温度の補正方法。
【請求項１０】
前記温度補正手段によって、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記抵抗体の直上の全領域に対して積算し、その値を用いて、予め求めた温度分布の中から最も近い温度分布を選択し、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項７に記載の測定温度の補正方法。
【請求項１１】
前記温度補正手段によって、
前記本測定前において測定された温度分布と、前記本測定において測定された温度分布とによる差分量を、前記流路内の任意の点において求め、その値を用いて、予め求めた温度分布の中から最も近い温度分布を選択し、
前記見誤る温度の補正量を算出することを特徴とする請求項７に記載の測定温度の補正方法。
【請求項１２】
前記流路内の任意の点が、該流路内における前記抵抗体の端部に対応する位置であることを特徴とする請求項９または請求項１１に記載の測定温度の補正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイス及びその測定温度の補正方法に関し、特に抵抗体が環境温度の影響を受けることによって見誤る温度を補正するマイクロ流体デバイス及びその測定温度の補正方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、１枚のチップ上で化学・生化学分析に必要な全ての要素を組み込むマイクロトータルアナリシスシステム（μ−Ｔａｓ）と呼ばれる技術についての研究開発が盛んである。
チップはマイクロ流路、温度制御機構、濃度調整機構、送液機構、反応検出機構などから構成され、一般にマイクロ流体デバイスと呼ばれている。
その中でも特に、ヒトゲノムの１塩基多型（ＳＮＰ）などの遺伝情報の検査を目的としたＤＮＡ分析デバイスに注目が集まっており、研究が盛んに行われている。
【０００３】
ＤＮＡを分析する工程は、つぎの（１）ＤＮＡを増幅する工程と（２）ＤＮＡを判定する工程の２つの工程がある。
（１）のＤＮＡを増幅する工程では、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が一般的に用いられる。これは増幅対象のＤＮＡの一部に対して相補的なプライマと酵素等とを混合し、サーマルサイクルをかけることでＤＮＡを増幅させる手法である。本工程では、正確かつ反応時間短縮のための高速な温度制御が要求される。
（２）のＤＮＡを判定する工程には様々な種類があるが、例えばＳＮＰの判定では熱融解法が用いられることがある。
熱融解法とは、ＰＣＲ後にＤＮＡ溶液の温度を徐々に上昇させることでＤＮＡの融解温度（以下、Ｔｍ）を検出する方法である。
蛍光色素がインターカレートされたＤＮＡは、温度が低い時には、２本鎖を形成しているため、蛍光シグナルが検出される。
その後、徐々に温度が上昇しＴｍに達すると、ＤＮＡが解離し１本鎖になるため、蛍光シグナルが急激に低下する。
この温度と蛍光シグナルの関係からＴｍを求め、ＳＮＰを検出する手法である。本工程では、Ｔｍを比較することによりＤＮＡ判定を行うため、正確な温度測定が求められる。
以上のように、前記ＤＮＡを分析する工程では温度制御が重要であり、特に高速性と正確性の２つが要求される。
【０００４】
特許文献１では、マイクロ流路内で高速に流路の温度変化を起こすことを目的として、微小流路と流路に沿って配置されたヒーターを有するマイクロ流体デバイスが開示されている。
マイクロ流体デバイスを用いることは、高速な温度制御の観点から大きなメリットがある。各種反応を熱容量の小さい微小流路内で行うため、高速な加熱冷却が可能となるためである。
また特許文献１では、マイクロ流体デバイスにおいて正確な温度制御、特に流路内の温度測定するために、マイクロ流路下部にヒーター兼温度センサーの抵抗体を配置し、流路内温度と抵抗体の抵抗値を対応付けることで温度制御を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１９３９８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
マイクロ流体デバイスは、デバイスを構成する要素の熱容量が小さいために伝熱を速めることができ、高速に温度制御できるという利点がある。
一方で、構成要素、特に温度センサー機能を持つ抵抗体も熱容量が小さいために、デバイス周囲の環境変化、例えば温度変化の影響を受けやすく、誤った温度（以下、見誤り温度）を示してしまうという課題を有している。
以下に、このマイクロ流体デバイスにおける課題について、説明する
図２にその具体例として、マイクロチップの模式図及びそのデバイスが有する抵抗体の長手方向の温度分布プロファイルを示す。
図２に示すマイクロチップをモデルとして、環境温度変化による抵抗体抵抗値の変化量及びその変化量から求まる見誤り温度量を、シミュレーションにより計算した。
つぎに、計算で用いたモデルについて、具体的に説明する。
マイクロチップ２８は厚さ０．５ｍｍの２枚のガラス基板（熱伝導率は２０℃で１．４Ｗ／ｍ／Ｋとした）により構成され、一方の上基板２４は１０ｍｍ×３０ｍｍ、下基板２５は１５ｍｍ×３０ｍｍとした。
上基板２４には深さ２０ｕｍ、幅１８０ｕｍ、長さ２０ｍｍのマイクロ流路２６を施し、もう一方の下基板２５には厚さ１００ｎｍ、幅３００ｕｍ、長さ１５ｍｍの抵抗体２７を配置した。
抵抗体２７の抵抗値は２０℃で１００ｏｈｍ、温度抵抗係数ＴＣＲは２５００（１０-6／Ｋ）とした。マイクロチップ２８の環境温度は２０℃と２５℃に設定し、抵抗体２７中央部の着目領域２１が７０℃となるように設定した。
その際の温度制御は、着目領域２１の温度と抵抗体２７の抵抗値との対応付けられている関係を用い、抵抗体２７に電圧を印加した際のジュール加熱による熱を制御することにより行われる。
【０００７】
環境温度２０℃での温度プロファイル２２と２５℃での温度プロファイル２３を比較すると、環境温度を上昇させた際、抵抗体２７の端部における温度分布が上昇していることがわかる。
これに伴い抵抗体２７端部の抵抗値は増加するので、結果として抵抗体２７全体の抵抗値も増加する。つまり、着目領域２１の温度は変化せず同じ温度を示していたとしても、環境温度が変化することで測定される抵抗体２７の抵抗値は変化してしまう。そのため、着目領域２１の測定温度に対する見誤りが生じる。
すなわち、前記シミュレーションにより、環境温度２０℃における抵抗体２７の抵抗値は１１２．５Ω、環境温度２５℃では１１２．５２５Ωであった。
この環境温度２０℃では、抵抗体２７の抵抗値が１１２．５Ωであり着目領域２１の温度が７０℃を示していた。
これに対して、環境温度２５℃では、抵抗体２７の抵抗値が１１２．５２５Ωに増加することから、上記したように着目領域２１の温度と抵抗体２７の抵抗値とが対応付けられていることにより、この増加した抵抗値との関係から、着目領域２１の温度が変わっていないにもかかわらずその温度が７０．１℃まで高くなったという見誤りが生じる。
以上により明らかなように、マイクロ流体デバイスの抵抗体の抵抗値が環境温度の変化による影響を受けることにより、着目領域の温度を見誤るため、着目領域の温度を正確に評価するには、これらの見誤りを補正する必要がある。
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑み、マイクロ流体デバイスを構成する抵抗体の抵抗値が環境温度の影響を受けることによって見誤る温度を補正し、正確な温度を測定することが可能となるマイクロ流体デバイス及びその測定温度の補正方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のマイクロ流体デバイスは、
抵抗体の抵抗値と温度測定領域である着目領域の温度とが対応付けられている関係式における前記抵抗体の抵抗値によって、前記着目領域の温度を制御するマイクロ流体デバイスであって、
前記抵抗体は、前記マイクロ流体デバイスを構成する基体に設けられた流路を加熱するヒーターとしての機能と、流路内の温度を測定するセンサーとしての機能を兼ね備えると共に、
前記着目領域を含む前記流路の下方に該流路の長手方向に沿って該着目領域よりも広い領域に亙って設けられた構成を備え、
前記抵抗体によって抵抗体の直上の前記着目領域を含む任意の２点以上の温度分布を測定する測定手段と、
前記抵抗体の抵抗値が周囲温度の変化による影響を受けることによって見誤る温度を補正する温度補正手段と、を有し、
前記温度補正手段は、
本測定前において前記抵抗体の抵抗値と前記着目領域の温度とが対応付けられている関係式を求めた際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、
前記本測定において前記関係式を用いて前記着目領域の温度制御をした際に、前記測定手段  によって測定された温度分布と、を比較し、
前記見誤る温度を補正することを特徴とする。
また、本発明のマイクロ流体デバイスにおける測定温度の補正方法は、
抵抗体の抵抗値と温度測定領域である着目領域の温度とが対応付けられている関係式における前記抵抗体の抵抗値によって、前記着目領域の温度を制御するマイクロ流体デバイスにおける測定温度の補正方法であって、
前記抵抗体は、前記マイクロ流体デバイスを構成する基体に設けられた流路を加熱するヒーターとしての機能と、流路内の温度を測定するセンサーとしての機能を兼ね備えると共に、
前記着目領域を含む前記流路の下方に該流路の長手方向に沿って該着目領域よりも広い領域に亙って設けられた構成を有し、
前記抵抗体によって抵抗体の直上の前記着目領域を含む任意の２点以上の温度分布を測定する測定手段と、
前記抵抗体の抵抗値が周囲温度の変化による影響を受けることによって見誤る温度を補正する温度補正手段と、を用い
前記温度補正手段によって、
本測定前において前記抵抗体の抵抗値と前記着目領域の温度とが対応付けられている関係式を求めた際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、
前記本測定において前記関係式を用いて前記着目領域の温度制御をした際に、前記測定手段  によって測定された温度分布と、を比較し、
前記見誤る温度を補正することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、マイクロ流体デバイスを構成する抵抗体の抵抗値が環境温度の影響を受けることによって見誤る温度を補正し、正確な温度を測定することが可能となるマイクロ流体デバイス及びその測定温度の補正方法を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態におけるマイクロ流体デバイスの構成例を説明する概念図。
【図２】マイクロチップの模式図及びそのデバイスが有する抵抗体の長手方向の温度分布プロファイルを示す図。
【図３】本発明の実施形態におけるマイクロ流体デバイスの着目領域における測定温度を補正する測定温度の補正方法のプロセスを示す図。
【図４】本発明の実施形態における測定温度の補正方法のプロセスでの抵抗体直上の任意の２点に対し、温度分布を測定した例を示す概念図。
【図５】本発明の実施形態における測定温度の補正方法のプロセスでの抵抗体直上の全領域に対し、温度分布を測定した例を示す概念図。
【図６】本発明の実施例で作製したマイクロチップの構成を示す模式図。
【図７】本発明の実施例１〜４で設定した着目領域を示す模式図。
【図８】本発明の実施例１による抵抗体直上全域の流路内温度分布を求めるための微小領域の配置を示す模式図。
【図９】本発明の実施例２による抵抗体直上の任意の２点の流路内温度分布を求めるための微小領域の配置を示す模式図。
【図１０】本発明の実施例３による予め求めておいた積算値と温度見誤り補正量テーブルの概念図。
【図１１】本発明の実施例４による予め求めておいた積算値と温度見誤り補正量テーブルの概念図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
つぎに、本発明の実施形態におけるマイクロ流体デバイス及びその測定温度の補正方法について説明する。
抵抗体の抵抗値と温度測定領域である着目領域の温度とが対応付けられている関係式における前記抵抗体の抵抗値によって、前記着目領域の温度を制御するマイクロ流体デバイスは、つぎのように構成される。
前記抵抗体は、前記マイクロ流体デバイスを構成する基体に設けられた流路を加熱するヒーターとしての機能と、流路内の温度を測定するセンサーとしての機能を兼ね備えると共に、
前記着目領域を含む前記流路の下方に該流路の長手方向に沿って該着目領域よりも広い領域に亙って設けられている。
そして、前記抵抗体によって抵抗体の直上の前記着目領域を含む任意の２点以上の温度分布を測定する測定手段と、
前記抵抗体の抵抗値が周囲温度の変化による影響を受けることによって見誤る温度を補正する温度補正手段と、が構成されている。
この温度補正手段は、
本測定前において前記抵抗体の抵抗値と前記着目領域の温度とが対応付けられている関係式を求めた際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、
前記本測定において前記関係式を用いて前記着目領域の温度制御をした際に、前記測定手段によって測定された温度分布と、を比較し、前記見誤る温度を補正するように構成されている。
その際、温度補正手段として、温度と抵抗体抵抗値の関係を求めた際の温度分布と、実測定時の温度分布との差分量を流路内の抵抗体全域に対して積算し、その値を用いて補正量を求めてもよい。
また、温度補正手段として、温度分布の差分量を流路内の任意の点、例えば抵抗体端部において求め、その値を用いて補正量を求めてもよい。
また、温度補正手段として、温度分布の差分量を流路内の抵抗体全域に対して積算し、その値を用いて、あらかじめ求めた温度分布の中から最も近い温度分布を選択し、補正量を求めてもよい。
また、温度補正手段として、温度分布の差分量を流路内の任意の点、例えば抵抗体端部において求め、その値を用いて、あらかじめ求めた温度分布の中から最も近い温度分布を選択し、補正量を求めてもよい。
【００１３】
以下、図１を用いて、本実施形態のマイクロ流体デバイスの構成例について具体的に説明する。
図１において、１１はマイクロチップであり、マイクロ流路１２を有しており、ポート１４を通じて試薬を流入、流出させるように構成されている。
マイクロチップ１１の材質は、流路内の試薬を蛍光観察するために、石英のような透明なガラス材料が望ましい。
マイクロ流路１２の着目領域２０における温度昇降および温度測定は、ヒーター機能と温度センサー機能を兼ねた抵抗体１３により行う。
着目領域２０における温度均一性を保つために抵抗体１３は流路内の着目領域２０よりも広いパターンのものが配置される。
抵抗体１３の材料には、白金や銅といった測温抵抗体材料や、サーミスタが用いられる。流路内に導入した試薬の蛍光輝度を測定するために、光源１７の光をフィルタ１５を通して流路内の試薬に照射し、蛍光色素を励起、発光させる。
この時得られた蛍光シグナルはフィルタ１６を通してカメラ１９で受光し、ＰＣ（パソコン）１８において画像データを収録する。
ＰＣ（パソコン）１８は、マイクロ流体デバイス全体の制御を司る。上記した測定手段により測定された、本測定前の前測定における基準となる環境温度での温度分布と前記本測定における環境温度での温度分布とを比較し、前記本測定で測定された前記着目領域の温度の補正や、抵抗体への電圧を印加する際の制御等がここで司られる。
【００１４】
次に、図３に示す着目領域における測定温度を補正するためのプロセスを用いて、本実施形態の温度分布測定および着目領域温度の補正方法について説明する。
まず、工程３１のキャリブレーションを行う。
キャリブレーションは、工程３１（ａ）と工程３１（ｂ）の２つの工程で構成される。
工程３１（ａ）は、次工程である本測定において着目領域温度を制御するために必要となる、流路内着目領域の温度と抵抗体抵抗値の関係式を求める工程であり、工程３１（ｂ）は温度分布を求める工程である。この２つの工程は同時に行われる。
例えば、抵抗体として、温度と抵抗値の関係が線形な材料を用いた場合、以下の関係式（１）が用いられる。
Ｔ = ｋ1 × Ｒ + ｋ0            （１）
Ｔは着目領域の温度、Ｒは抵抗体抵抗値である。ｋ0とｋ1は未知の係数である。係数を求めることで着目領域の温度と抵抗体抵抗値が対応付けられる。
前記関係式（１）は、Ｔｍが既知のＤＮＡ試薬を流路に導入し、熱融解時の抵抗値と対応付けることで求めてもよい。また、試薬の蛍光輝度の温度応答性を利用して対応付けてもよい。
工程３１（ｂ）の温度分布を求める工程では、抵抗体直上における蛍光シグナルの画像データを収録しておき、抵抗体直上かつ流路に沿った方向の流路内着目領域を含む２点以上の温度分布を測定する手段を用いて流路内温度の算出を行う。
図４と図５に温度分布の測定位置の例を示す。
温度分布は、図４に示すように着目領域を含む抵抗体直上の任意の２点について温度分布を測定してもよい。
この時、温度分布を測定する点は、工程３１（ａ）で求めた着目領域に加えて流路内における抵抗体４１の端部に対応する位置が好ましい。それは、着目領域のような抵抗体中央部に比べ端部ほど温度が低く、環境変化に敏感に反応するため補正精度が向上するからである。
また図５に示すように、抵抗体５１直上の全領域について温度分布を測定してもよい。
【００１５】
次に、工程３２に示す本測定を行う。
本測定も２つの工程で構成される。工程３２（ａ）は、キャリブレーションで求めた関係式を用いて着目領域にてＤＮＡの増幅および分析を行う工程である。
例えばＳＮＰ判定として熱融解法を行うのであれば、検査検体のＴｍを求めることである。
工程３２（ｂ）は工程３２（ａ）の分析と併せて抵抗体直上における蛍光シグナルの画像データを収録し、キャリブレーションで温度分布を測定した位置と同一位置について温度分布を測定する工程である。
【００１６】
最後に工程３３に示す補正を行う。
ここで、補正とは、キャリブレーションと本測定で求めた２つの温度分布を比較し補正量を求め、本測定で測定した温度を補正する工程である。
温度分布の比較、補正量の算出は、キャリブレーション及び本測定において求めた抵抗体直上の全領域の差分値を積算して計算してもよい。
温度分布の比較、補正量の算出は、キャリブレーション及び本測定において求めた同一位置における温度分布の差分値をとり、その差分値を代表として補正量を計算し、補正してもよい。代表とした差分値と補正量の関係は、実際のデータから求めてもよいし、シミュレーションから求めてもよい。
温度分布の比較、補正量の算出は、キャリブレーション及び本測定において求めた同一位置における温度分布の差分値を取り、その差分値を代表として、あらかじめ求めておいた温度分布の中で最も近い温度分布を選択し、対応する補正量を用いて補正してもよい。
温度分布の比較、補正量の算出は、キャリブレーション及び本測定において求めた抵抗体直上の全領域の差分を積算し、その積算量から、あらかじめ求めておいた温度分布の中で最も近い温度分布を選択し、対応する補正量を用いて補正してもよい。
あらかじめ求めておく温度分布は、実際のデータから求めてもよいし、シミュレーションから求めてもよい。
【実施例】
【００１７】
以下に、本発明の実施例について説明する。本発明は以上で説明した本発明の実施形態や、以下に説明する実施例によって、何ら限定されるものではない。
ここで、まず実施例で用いたマイクロ流体デバイスについて説明する。
図６に、実施例で作製したマイクロチップを示す。
マイクロ流体デバイスの構成は、図１を用いて説明する。
マイクロチップ６１は厚さ０．５ｍｍの２枚のガラス基板を貼り合わせることで作製され、一方の上基板６２は１０ｍｍ×３０ｍｍ、下基板６３は１５ｍｍ×３０ｍｍとした。
上基板６２には、深さ２０ｕｍ、幅１８０ｕｍ、長さ２０ｍｍのマイクロ流路６４をドライエッチングにより施した。試薬導入口は、ドリルにより貫通させることで設けた。
下基板６３には、抵抗体６５として厚さ１００ｎｍ程度の白金をスパッタ成膜し、フォトリソグラフィーにより幅３００ｕｍ、長さ１５ｍｍのパターンを形成した。続いて、抵抗体６５の電極配線６６として、厚さ３００ｎｍのチタン−金−チタンを連続スパッタにより成膜し、フォトリソグラフィーによりパターンを形成した。抵抗体６５及び電極６６をパターニングした後、マイクロ流路６４との絶縁を取るために下基板６３に酸化シリコンを１ｕｍ程度ＣＶＤにより成膜した。
最後に、上基板６２と下基板６３をプラズマ照射により表面を改質した後、接着すること
でマイクロチップ６１を作製した。
【００１８】
次に、図１を用いてマイクロ流体デバイスの構成について説明する。
流路内に導入した試薬の蛍光輝度を測定するために、光源１７としてＬＥＤを用い、ＬＥＤからの光をフィルタ１５を通して流路内の試薬に照射し、蛍光色素を励起、発光させる。この時得られた蛍光シグナルはフィルタ１６を通してカメラ１９で受光し、ＰＣ１８により画像データを収録した。
以下、前記マイクロ流体デバイスを用い、流路内の着目領域における測定温度を温度分布により補正する方法について詳細に説明する。
実施例では、図３に示した着目領域における測定温度の補正プロセスに則って補正を行った。その際、キャリブレーション時の環境温度を２０℃、本測定時の環境温度を５℃増加させ２５℃とすることで温度見誤りを生じさせ、補正による効果を確認した。
【００１９】
以下では、まず比較例を用いて、本発明の補正を行わなかった場合のＴｍを求め、環境温度の増加により着目領域の測定温度が見誤っていることについて説明する。
この説明に続いて、実施例１〜４において、本発明を適用することで測定温度補正プロセスにより測定温度の見誤りを改善できたことについて説明する。
この実施例１〜４では、温度分布の比較方法について詳細に説明する。
図７に実施例１〜４で設定した着目領域を示す。
以下に示す比較例及び実施例１〜４では、キャリブレーションおよび本測定時における流路内の着目領域７２を抵抗体７１中央直上の幅１００ｕｍ×長さ１ｍｍと設定した。
また、キャリブレーションおよび本測定時における着目領域７２の温度測定及び温度分布は、Ｔｍが既知のＤＮＡ増幅産物溶液を用い、その溶液を熱融解法によりＴｍを測定することで求めた。
【００２０】
［比較例］
比較例では、まずキャリブレーションを行うために、流路内にＴｍを７０℃と９０℃に設計した２種類のＤＮＡの増幅産物溶液を流路内に導入した。
キャリブレーション時のマイクロ流体デバイス内の温度は２０℃に設定した。
そして、ＰＣを通じて抵抗体に電圧を印加し、流路内でＤＮＡの熱融解反応を行い、熱融解時の抵抗値を測定した。
Ｔｍ７０℃での抵抗体抵抗値は１１２．５Ω、９０℃では１１７．５Ωであった。この結果から、k0は−３８０、k1は４と求められた。
【００２１】
次に、本測定を行った。
今回は、流路内にＴｍを７０℃に設計したＤＮＡの増幅産物溶液を流路内に導入した。本測定時のマイクロ流体デバイス内の温度は２５℃に設定した。
そして、前記キャリブレーションで求めた関係式を用いて電圧を制御し、着目領域において熱融解法を行ったところ、１１２．５２５Ωで熱融解が起こった。以上より、前記関係式を用いて測定温度は７０．１℃と求まる。
本比較例では、本発明の補正を行わなかった場合、環境温度の増加により温度見誤りが生じることを示した。着目領域の温度見誤り量は、環境温度が５℃増加すると、０．１℃であった。
【００２２】
［実施例１］
実施例１では、キャリブレーション及び本測定において、抵抗体直上の全領域について温度分布の比較を行い、全領域のキャリブレーション及び本測定時の温度分布の各点での差分値を積算し補正量を算出、補正を行った。
まず、比較例と同様の方法でキャリブレーションを行い、比較例と同じ係数の関係式を得た。キャリブレーション時のマイクロ流体デバイス内の温度は２０℃に設定した。この
時、抵抗体直上全域の流路内温度分布を求めるために、抵抗体直上の流路全域についても蛍光シグナルを撮像した。なお、ここまでのプロセスは以下の実施例においても同様のため、以下の実施例では説明を省く。
【００２３】
図８に抵抗体直上全域の流路内温度分布を求めるための微小領域の配置を示す。抵抗体８１直上の流路内温度分布を測定する際、収録した画像の流路内中央の長手方向を図８に示すような微小な領域で分割した。
微小な領域は、得られる蛍光輝度を揃えるために中央の着目領域８２と同じ、幅１００ｕｍ×長さ１ｍｍと設定した。
そして、各微小領域に対し熱融解時の抵抗値を求めることで、抵抗体８１直上の全領域における抵抗値分布を求めた。
なお、補正時の都合上、抵抗値を単位長さあたりの抵抗値に変換し、流路内における単位長さあたりの抵抗値の分布を求めた。その際、前記抵抗値分布は、流路内の温度が低い位置ほど大きい抵抗値を示すため、符号を反転させ、流路内温度分布との対応を取った。
【００２４】
次に、本測定を行った。比較例と同様に流路内にＴｍを７０℃に設計したＤＮＡの増幅産物溶液を流路内に導入した。本測定時のマイクロ流体デバイス内の温度は２５℃に設定し、熱融解法によりＴｍを求めた。着目領域でのＴｍは７０．１℃であった。同時に、前記キャリブレーションにおいて行った抵抗値分布導出方法と同様の方法により、本測定における単位長さあたりの抵抗値の分布を求めた。
最後に補正を行った。前記単位長さあたりの抵抗値分布の全領域においてキャリブレーション時と本測定時の温度分布の差分値を取り、その総和を計算し、キャリブレーションにおいて求めた関係式から温度見誤り量を計算した。総和は０．０２５Ωであり、キャリブレーションで求めた関係式から、補正量は０．１℃と計算された。この値を用いて本測定時の着目領域のＴｍを補正することができた
【００２５】
［実施例２］
実施例２では、キャリブレーション及び本測定において、抵抗体直上の任意の２点として、着目領域と抵抗体端部の２点を選択し、それぞれ温度分布の差分値を取り、この差分値を代表として補正量を計算し、補正を行った。
図９に抵抗体端部直上の流路内温度分布を求めるための微小領域の配置を示す。
抵抗体直上の流路内分布を測定する際、収録した画像の流路内中央の長手方向に沿った任意の２点を選び、微小領域を設定した。
微小な領域は、得られる蛍光輝度を揃えるために着目領域と同じ、幅１００ｕｍ×長さ１ｍｍと設定した。
本実施例では、着目領域と、抵抗体端部の２点を選択し、微小領域を設定した。そして、それらの微小領域においてＴｍを求めることで流路内のＴｍ分布を求めた。前記Ｔｍ分布は、流路内の温度が低い位置ほど大きいＴｍを示すため、符号を反転させ、流路内温度分布との対応を取った。
【００２６】
次に、本測定を行った。比較例と同様に流路内にＴｍを７０℃に設計したＤＮＡの増幅産物溶液を流路内に導入した。本測定時のマイクロ流体デバイス内の温度は２５℃に設定し、熱融解法によりＴｍを求めた。Ｔｍは７０．１℃であった。同時に、前記キャリブレーションと同様の流路内温度分布（Ｔｍ分布）導出方法により、本測定における流路内温度分布を求めた。
【００２７】
最後に補正を行った。キャリブレーションおよび本測定時の抵抗体端部における温度分布の差分値を取り、シミュレーションにより求めた差分値と温度見誤り補正量との関係から、温度見誤り補正量を算出した。その結果、補正量は０．１℃と計算され、この値を用いて本測定時の着目領域のＴｍを補正することができた。
【００２８】
［実施例３］
実施例３では、キャリブレーション及び本測定において、抵抗体直上の全領域について温度分布の比較を行い、キャリブレーション時と本測定時の温度分布の差分値を抵抗体直上の全領域について積算した。この積算量から、あらかじめ求めておいた温度分布の中で最も近い温度分布を選択し、補正量を求め、補正を行った。
実施例１と同様、図８に示すような微小な領域で分割し、各微小領域に対しＴｍを求め、Ｔｍ分布として温度分布を求めた。実施例１で述べたように、前記Ｔｍ分布は、流路内の温度が低い位置ほど大きいＴｍを示すため、符号を反転させ、流路内温度分布との対応を取った。
【００２９】
次に、本測定を行った。比較例と同様に流路内にＴｍを７０℃に設計したＤＮＡの増幅産物溶液を流路内に導入した。本測定時のマイクロ流体デバイス内の温度は２５℃に設定し、熱融解法によりＴｍを求めた。Ｔｍは７０．１℃であった。同時に、前記キャリブレーションと同様の流路内温度分布（Ｔｍ分布）導出方法により、本測定における流路内温度分布を求めた。
最後に補正を行った。キャリブレーションおよび本測定時の抵抗体直上の全領域における温度分布の差分値およびその積算値を計算した。図１０にあらかじめ求めておいた積算値と温度見誤り補正量テーブルの概念図を示す。図１０に示すようなテーブルをあらかじめシミュレーションにより求めた。そして、本工程において算出した積算値と対応付けられる補正量を選択した。その結果、選択された補正量は０．１℃と計算され、この値を用いて本測定時の着目領域のＴｍを補正することができた。
【００３０】
［実施例４］
実施例４では、キャリブレーション及び本測定において、抵抗体直上の任意の２点として、着目領域と抵抗体端部の２点を選択し、それぞれの温度分布の差分値を取った。この差分値を代表として、あらかじめ求めておいた温度分布の中で最も近い温度分布を選択し、補正量を得た。
実施例２と同様、図９に示すように、着目領域と、抵抗体端部の２点を選択し、微小領域を設定した。その微小領域においてＴｍを求めることで流路内のＴｍ分布を求めた。前記Ｔｍ分布は、流路内の温度が低い位置ほど大きいＴｍを示すため、符号を反転させ、流路内温度分布との対応を取った。
【００３１】
次に、本測定を行った。比較例と同様に流路内にＴｍを７０℃に設計したＤＮＡの増幅産物溶液を流路内に導入した。本測定時のマイクロ流体デバイス内の温度は２５℃に設定し、熱融解法によりＴｍを求めた。Ｔｍは７０．１℃であった。同時に、前記キャリブレーションと同様の流路内温度分布（Ｔｍ分布）導出方法により、本測定における流路内温度分布を求めた。
最後に補正を行った。図１１にあらかじめ求めておいた差分値と温度見誤り補正量テーブルの概念図を示す。キャリブレーションおよび本測定時の抵抗体端部における温度分布の差分値を取り、図１１に示すようなテーブルをあらかじめシミュレーションにより求めた。そして、本工程において算出した差分値と対応付けられる補正量を選択した。その結果、選択された補正量は０．１℃と計算され、この値を用いて本測定時の着目領域のＴｍを補正することができた。
【符号の説明】
【００３２】
１１：マイクロチップ
１２：マイクロ流路
１３：抵抗体
１４：ポート
１５：フィルタ
１６：フィルタ
１７：光源
１８：ＰＣ（パソコン）
１９：カメラ
２０：着目領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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