(57)【要約】      （修正有）【課題】冷凍品が解凍された回数を判別するための核酸及び該核酸を用いた冷凍品が解凍された回数を判別する方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列を含む核酸、該核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、該核酸の塩基配列中において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を含む核酸、若しくは該核酸の塩基配列と８０％以上の同一性を有する核酸、のいずれかである冷凍品の解凍の回数の判別用核酸。前記判別用核酸は解凍する度に高速液体クロマトグラフィーによるピーク面積が減少することを利用する冷凍品が解凍された回数を判別する方法。【選択図】図１
2015159803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷凍品が解凍された回数を判別するための核酸。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかである、請求項１記載の核酸。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列を含む核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列中において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する核酸
【請求項３】
核酸の長さが５０ｍｅｒ以上である請求項１又は２記載の核酸。
【請求項４】
核酸の長さが１５０ｍｅｒ以下である請求項１から３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
以下の工程を行うことにより、冷凍品が解凍された回数を判別する方法。
（１）一度も冷凍されていない請求項１から４のいずれかに記載の核酸並びに予め１回以上冷凍及び解凍を繰り返した当該核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、当該核酸由来のピーク面積比を用いた検量線を作成する工程
（２）一度も冷凍されていない請求項１から４のいずれかに記載の核酸を冷凍の対象となる物と共に冷凍する工程
（３）（２）工程で冷凍された当該核酸を解凍する工程
（４）（３）工程で解凍された当該核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、当該核酸由来のピーク面積比を求める工程
（５）（１）工程で作成した検量線を用いて、（４）工程で求めたピーク面積比から当該核酸が解凍された回数を求め、冷凍品が解凍された回数として判別する工程
【請求項６】
一度も冷凍されていない核酸の代りに、冷凍及び解凍された回数が判明している核酸を用いる請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷凍品が解凍された回数を判別するための核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの冷凍品は、解凍温度以上に曝されると解凍し、品質を損なうことがある。しかし、冷凍品が解凍した後、再冷凍された場合、物性上の著しい変化がない限り、再冷凍品か否か判別できない。さらには、冷凍品が食品や医薬品であった場合、内容物の変質や雑菌の繁殖等の発生を誘発し、健康上の被害を受けるケースが考えられる。
【０００３】
これまでに、冷凍温度の管理が正常に行われたか否かを確認できる発明が開示されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、密封容器に収納され、氷点下で凝固した乳化液が、氷点より高い温度領域まで昇温した際に相分離する現象を利用することにより冷凍温度での管理が正常に行われたかを確認する方法が開示されている。また、特許文献２には、互いに接触させた場合に変色を呈する材料が、マイクロカプセル壁により分離されたものが記載され、冷凍によりマイクロカプセルが膨張して崩壊し、その後の解凍時に、分離されていた材料が接触して変色を呈することを利用した温度履歴を識別する方法について開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１２１４７７号公報
【特許文献２】特表２００３−５１９４６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述した従来の方法では、冷凍温度での管理が正常に行われたか否か確認できても、解凍された回数について判別することはできなかった。
【０００７】
そこで、本発明は、冷凍品の解凍の有無だけでなく、冷凍品が解凍された回数を判別することを可能とする核酸を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、特定の核酸を使用することにより冷凍品が解凍された回数を判別できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（Ｉ）冷凍品が解凍された回数を判別するための核酸。
（ＩＩ）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかである、（Ｉ）の核酸。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列を含む核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列中において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有する核酸
（ＩＩＩ）核酸の長さが５０ｍｅｒ以上である（Ｉ）又は（ＩＩ）の核酸。
（ＩＶ）核酸の長さが１５０ｍｅｒ以下である（Ｉ）から（ＩＩＩ）のいずれかの核酸。
（Ｖ）以下の工程を行うことにより、冷凍品が解凍された回数を判別する方法。
（１）一度も冷凍されていない（Ｉ）から（ＩＶ）のいずれかの核酸並びに予め１回以上冷凍及び解凍を繰り返した当該核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、当該核酸由来のピーク面積比を用いた検量線を作成する工程
（２）一度も冷凍されていない（Ｉ）から（ＩＶ）のいずれかの判別用核酸を冷凍の対象となる物と共に冷凍する工程
（３）（２）工程で冷凍された当該核酸を解凍する工程
（４）（３）工程で解凍された当該核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、当該核酸由来のピーク面積比を求める工程
（５）（１）工程で作成した検量線を用いて、（４）工程で求めたピーク面積比から当該核酸が解凍された回数を求め、冷凍品が解凍された回数として判別する工程
（ＶＩ）一度も冷凍されていない核酸の代りに、冷凍及び解凍された回数が判明している核酸を用いる（Ｖ）の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、冷凍品の解凍の有無だけではなく、冷凍品が解凍された回数を判別することが可能となる。これまで判別できなかった再冷凍が繰り返された冷凍品を判別することができ、冷凍品の冷凍温度の管理を正確にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例２の結果をグラフに表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。
【００１２】
本明細書において、冷凍品の解凍とは、冷凍された物を、４℃以上の状態に１時間以上又はそれと同等の条件に曝すことを意味する。解凍時の雰囲気は、大気中又は水中のいずれであっても良い。
【００１３】
本明細書において、冷凍とは、冷凍しようとする物を、氷点以下の状態に１５分間以上又はそれと同等の条件に曝すことを意味する。
【００１４】
冷凍条件は、冷凍品の種類や大きさ等によって適宜変更可能である。
【００１５】
冷凍温度は、冷凍可能な温度であれば特に限定されず、−１５℃以下が好ましい。特に好ましくは、−２０℃以下が好ましい。この条件であると判別用核酸を含む液体を完全に冷凍することが可能となる。
【００１６】
冷凍時間は、冷凍可能な温度下であれば特に限定されず、１５分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、1時間以上が特に好ましい。この条件であると判別用核酸を含む液体を完全に冷凍することが可能となる。
【００１７】
本明細書において、解凍された回数を判別する対象となる冷凍品は、どのようなものでも良いが、例えば、食品、医薬品、各種薬品や生物由来の試料（ＤＮＡやＲＮＡ等）等が挙げられる。特に、解凍によって、内容物の変質や雑菌の繁殖等の発生を誘発するため冷凍温度での管理が求められるものが好ましい。
【００１８】
本発明の核酸（以下、適宜「判別用核酸」という）を含む液体は、特に限定されず、冷凍条件・解凍条件から適宜選択することが可能である。
【００１９】
汎用的な温度条件の利用しやすさから、水が好ましい。
【００２０】
本発明の冷凍品が解凍する回数を判別するための核酸は、配列番号１に示される塩基配列を含む。
GCAGGGGCAATGGAGACCCTGGAGGCGGAGATGGGGGCAAGACGGAGAAAGACAGTCAAGAATGG（配列番号１）
本発明の判別用核酸は上記配列に限定されるものではなく、配列番号１記載の塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸も、それが判別に利用可能な限り、本発明の核酸に含まれる。
【００２１】
また、配列番号１に記載の塩基配列を含む核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も、これが判別に利用可能な限り、本発明の核酸に含まれる。
【００２２】
さらに、配列番号１記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基に欠失、置換又は付加等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明の判別として利用可能な限り、本発明の核酸に含まれる。
【００２３】
本明細書において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列とは、配列番号１の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を意図する。ここで、上記数個とは、３０個以下であり、好ましくは１０個以下であり、より好ましくは５個以下であり、さらに好ましくは４個以下であり、特に好ましくは３個以下であり、さらに特に好ましくは２個以下である。なぜならば、上記１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列は、配列番号１の塩基配列に対して塩基の欠失、置換又は付加が少ないほど、配列番号１の塩基配列に近い性質を有していることになるからである。
【００２４】
本発明の判別用核酸は、配列番号１に示される塩基配列を有するものに限定されるものではなく、核酸の長さは任意に設定できる。本発明においては、５０ｍｅｒ以上が好ましく、６０ｍｅｒ以上がさらに好ましい。また、１５０ｍｅｒ以下が好ましく、１００ｍｅｒ以下がより好ましい。特に好ましくは６５〜７５ｍｅｒである。この範囲内であるとコスト、純度、品質、収量等の点から好ましい。
【００２５】
本明細書において、核酸とは、ＤＮＡ塩基、ＲＮＡ塩基またはそれらの等価物から構成されているものを含む。この等価物とは、例えばＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、または核酸アナログを含む。核酸は、ＤＮＡ合成機で合成するかマニュアルで合成することにより行う方法と、遺伝子工学的手法、すなわち、大腸菌等の微生物にプラスミドを導入して作製する方法とがある。この方法では、目的の判別用に用いられるＤＮＡを含むプラスミドを作製し、微生物へ導入し、微生物を培養することによって、目的のプラスミドを増幅し、適当な制限酵素等で目的のＤＮＡを切出すことによるものである。目的の核酸がＲＮＡの場合は、まず、上述の通りＤＮＡを作製し、そのＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡに転写することにより得られる。
【００２６】
塩基配列とは、核酸を構成する塩基の配列である。また、一般的に塩基配列は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）によって表すことができる。例えば、代表的なデータベースであるＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅにおいて、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖の塩基配列を表すときに、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔが用いられている。例えば、配列番号１記載の塩基配列を含む核酸とは、塩基の略語を用いて示される配列番号１の各Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴを含む核酸を意図する。また、相補的な塩基配列とは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）に、チミン（Ｔ）はアデニン（Ａ）に、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）に、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）によって置き換えられた塩基配列を意図する。
【００２７】
本明細書において、ハイブリダイズとはデオキシリボヌクレオチドの塩基間の水素結合等によって、デオキシリボヌクレオチド間の対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソン・クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、または任意の他の配列特異的な形で生じうる。塩基対は二本鎖構造を形成する二本鎖、複数本鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００２８】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、一般に知られたものを用いることができる。例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ）  第２版〔ザンブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕に記載されている短鎖のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する条件等を参照して設定することができる。かかるストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５質量％ＳＤＳと５×デンハルトと５０質量％ホルムアミドとを含む溶液中、４２℃で一晩保温し、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣを用いるイオン強度条件下に、４２℃以上、よりストリンジェントな条件として、５０℃以上、より一層ストリンジェントな条件として６０℃以上の温度の条件下での洗浄を行なう条件等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、核酸の長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存し、洗浄温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００２９】
本発明の判別用核酸は、解凍の回数の判別の対象となる物又は既に冷凍されている冷凍品に、貼付又はそれらを収納するケースに同封して使用することが好ましい。使用時には、判別用核酸は、容器に封入されていることが好ましい。用いる容器は、特に限定はされないが、例えば、エッペンドルフチューブやガラス瓶等の開閉可能な容器を用いることができる。
【００３０】
次に、本発明の冷凍品が解凍された回数を判別する方法について説明する。
【００３１】
以下の工程を行うことにより、冷凍品が解凍された回数を判別する方法である。
（１）一度も冷凍されていない判別用核酸並びに予め１回以上冷凍及び解凍を繰り返した当該核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、当該核酸由来のピーク面積比を用いた検量線を作成する工程
（２）一度も冷凍されていない判別用核酸を冷凍の対象となる物と共に冷凍する工程
（３）（２）工程で冷凍された当該核酸を解凍する工程
（４）（３）工程で解凍された当該核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、当該核酸由来のピーク面積比を求める工程
（５）（１）工程で作成した検量線を用いて、（４）工程で求めたピーク面積比から当該核酸が解凍された回数を求め、冷凍品が解凍された回数として判別する工程
判別用核酸を予め１回以上、冷凍及び解凍を繰り返し、解凍する毎に判別用核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析し、当該核酸由来のピーク面積比を求める。横軸に冷凍及び解凍の回数をとり、縦軸にピーク面積比をとることにより検量線を作成する。
【００３２】
さらには、一度も冷凍されていない判別用核酸のピーク面積比も測定しておくことが特に好ましい。なお、一度も冷凍されていない核酸の代りに、冷凍及び解凍された回数が判明している核酸を用いることもできる。
【００３３】
冷凍品が解凍された回数を判別するために、冷凍の対象となる物と共に、一度も冷凍されていない判別用核酸を同じ条件下で冷凍することが好ましい。
【００３４】
その後、解凍の回数の判別の対象となる物（冷凍品）の解凍回数を判別するために、冷凍した当該判別用核酸を解凍条件下で解凍する。この時、冷凍品は、解凍せずに冷凍を維持しておいても良いし、解凍しても良い。
【００３５】
解凍した判別用核酸を高速液体クロマトグラフィーで分析して、核酸由来のピーク面積比を求める。
【００３６】
最後に、検量線を用いて、求めたピーク面積比からまず判別用核酸が解凍された回数を出して、冷凍品が解凍された回数を判別する。
【００３７】
分析に用いる高速液体クロマトグラフィーの分析条件は、核酸由来のピーク面積比を測定できる条件であれば特に限定されない。
【００３８】
分析に必要な判別用核酸の量は、特に限定されず、判別に用いるのに必要な分析の回数に応じて１回分以上の分析量があることが好ましい。
【００３９】
例えば、２０ｐｍｏｌ／μLの濃度に調製した判別用核酸を容器に９μL封入したものを1回分として使用する。
【００４０】
ここで封入とは、容器に本発明の判別用核酸を入れることを意味し、容器内に充填した核酸が漏出しないよう、容器の蓋又は他の手段で核酸を封止することである。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明における核酸についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、下記の分析方法により測定した。
＜核酸由来のピーク面積比の分析＞
試料調製方法：  試料（２０ｐｍｏｌ／μL） 9μLを水100μLに溶解
装置：    Ｇｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ      
カラムオーブン          なし              
ＵＶ                    Gilson UV/VIS-151              
ポンプ                  Gilson Model305              
インテグレーター        Gilson 712 system controller software  
カラム：        Wakosil-DNA 4.6mm×150mm(w)
キャリヤー：    (A)0.1M TEAA,pH7.0 (B)100% Acetonitrile
カラム温度：    室温
流速：          １ｍＬ／ｍｉｎ
波長：          254nm
検出限界値：    0.001-2.0 AU(Sensitivity Range)
＜調整例１：オリゴＤＮＡの合成＞
ＤＮＡ合成業者（株式会社ベックス）に依頼し、配列番号１〜８記載の１本鎖核酸を各々合成した。ＤＮＡ合成後、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行った。
【００４２】
精製は、高速液体クロマトグラフィーを用いた。合成から精製までの一連の工程は、全てＤＮＡ合成業者で行った。
GCAGGGGCAATGGAGACCCTGGAGGCGGAGATGGGGGCAAGACGGAGAAAGACAGTCAAGAATGG（配列番号１）
AAGAAGAGAGCAGAGCGGGAACTGAGATCGAAATTGAAACCAGGTGGAAAGAGAGAGATAGGGTA（配列番号２）
TATGGCTCAGGAGGAAGAAGAGGAAGATCAAGGAAGAACTAGGAAACGGAAACAGAGTGGTCAGT（配列番号３）
TGCATTTTCACCCCACCCTTCCCCTCCTTCTCCCTTTTTATATCCCATTTTTATATCGATCTCTT（配列番号４）
CCCACTTCTCTTCATTATTCACTTCTTATTTTTGCCCACTCCCCACTCCTGCTTCCTGAGCTGAC（配列番号５）
GCCTTTTCTCTTCATATCTGCGGCCTATCTTTTCCCCTGACATACGTCTTTGTCCTTCTTTCCCA（配列番号６）
ATTACAACATCCAGAAGGAGTCAACCCTGCACCTGGTCCTTCGCCTGAGAGGTGGCATGCAGATC（配列番号７）
TAGCTGTTCACCTTGAAGACAGGCCTTAGTGTCACGCAGGTTTATTACAGTGGCATGATGGTGAC（配列番号８）
＜実施例１＞：冷凍品が解凍された有無
配列番号１〜８記載の１本鎖核酸を各々高速液体クロマトグラフィーで分析して、核酸由来のピーク面積比を求めた。その後、当該核酸を各々冷凍（−２０℃、２０時間）した。冷凍した当該核酸を各々解凍温度４℃、４時間で解凍した後、高速液体クロマトグラフィーで分析して、核酸由来のピーク面積比を各々求めた。各配列番号の核酸由来のピーク面積比の結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2015159803.tif 000003
【００４４】
配列番号１に示される塩基配列を有する核酸は、冷凍前と解凍後で核酸由来のピーク面積比に違いがあることが分かった。
＜実施例２＞：冷凍品が解凍された回数の判別
配列番号１〜８記載の１本鎖核酸を各々高速液体クロマトグラフィーで分析して、核酸由来のピーク面積比を求めた。この各核酸を冷凍（−２０℃、２０時間）後、解凍（４℃、４時間）することを７回、１４回、２１回、２８回繰り返した後、高速液体クロマトグラフィーで分析した。各核酸由来のピーク面積比の結果を表２及び図１に示す。
【００４５】
【表２】
2015159803.tif 000004
【００４６】
配列番号１に示される塩基配列を有する核酸は、解凍回数に応じて核酸由来のピーク面積比が減少することが示された。本発明の判別用核酸は、解凍回数の判別が可能であることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
【図１】
2015159803.tif 000005
【配列表】
2015159803000001.app