(57)【要約】      （修正有）【課題】サブチリシンとその安定化剤としてのペプチド化合物とを含む、安定性の向上した液体組成物の提供。【解決手段】Ｃ末端残基としてＯＨ置換フェニルアラニンアルデヒドを有するペプチド化合物をはじめとする、ペプチドアルデヒド又はケトン誘導体により、液体洗剤組成物中のサブチリシン型プロテダーゼを安定化する。具体的には、サブチリシンと式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物とを含んでなる液体組成物であって、Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり、Ｂ1は単一アミノ酸残基であり、Ｂ０がパラ位及び／又はメタ位にＯＨ置換基を有するフェニルアラニン残基で、Ｂ２は１又は複数のアミノ酸残基であって良く、随意にＮ末端保護基を含んでよい液体組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブチリシンと式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物とを含んでなる液体組成物であって、ここで
Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；
Ｂ0はパラ位及び／又はメタ位にＯＨ置換基を有するフェニルアラニン残基であり；
Ｂ1は単一アミノ酸残基であり；そして
Ｂ2は随意にＮ末端保護基を含んで成る１又は複数個のアミノ酸残基から成る
ことを特徴とする液体組成物。
【請求項２】
Ｂ2がＮ末端保護基を含んで成る１又は２個のアミノ酸残基から成る、請求項１記載の液体組成物。
【請求項３】
サブチリシンと式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物とを含んでなる液体組成物であって、ここで
Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；
Ｂ0は単一アミノ酸残基であり；
Ｂ1は単一アミノ酸残基であり；そして
Ｂ2はＮ末端保護基が結合しているGly，Arg又はLeu残基である
ことを特徴とする液体組成物。
【請求項４】
Ｂ0がチロシン残基である、請求項１〜３のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項５】
Ｂ1がAla, Cys, Gly, Pro, Ser, Thr, Val, Nva又はNle残基である、請求項１〜４のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項６】
Ｂ2がホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、フルオロメトキシカルボニル、メトキシスクシニル、芳香族及び脂肪族ウレタン保護基、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭＯＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）又はｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）から選択されたＮ末端保護基を含んで成る、請求項１〜５のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項７】
前記ペプチド化合物が、ペプチドアルデヒドＺ−ＲＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＬ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＦ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＶ−Ｈ，Ｚ−ＲＶＹ−Ｈ，Ｚ−ＬＶＹ−Ｈ，Ａｃ−ＬＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＹＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＶＹ−Ｈ又はＡｃ−ＷＬＶＹ−Ｈ（ここでＺはベンジルオキシカルボニルでありそしてＡｃはアセチルである）である、請求項１〜６のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項８】
界面活性剤を更に含んで成る液体洗剤組成物である、請求項１〜７のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項９】
式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物であって、ここで
Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；
Ｂ0はパラ位及び／又はメタ位にＯＨ置換基を有するフェニルアラニン残基であり；
Ｂ1は単一アミノ酸残基であり；そして
Ｂ2はＮ末端保護基としてベンジルオキシカルボニルを有する１又は複数個のアミノ酸残基から成る
ことを特徴とするペプチド化合物。
【請求項１０】
式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物であって、ここで
Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；
Ｂ0はパラ位及び／又はメタ位にＯＨ置換基を有するフェニルアラニン残基であり；
Ｂ1は単一アミノ酸残基であり；そして
Ｂ2はＮ末端保護基が結合しているGly, Arg又はLeu残基である
ことを特徴とするペプチド化合物。
【請求項１１】
Ｂ2がホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、フルオロメトキシカルボニル、メトキシスクシニル、芳香族及び脂肪族ウレタン保護基、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭＯＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）又はｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）から選択されたＮ末端保護基を含んで成る、請求項９又は１０記載のペプチド化合物。
【請求項１２】
式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物であって、ここで
Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；
Ｂ0は単一アミノ酸残基であり；
Ｂ1は小型のアミノ酸残基であり；そして
Ｂ2は芳香族Ｎ末端保護基が結合しているGly, Arg又はLeu残基である
ことを特徴とするペプチド化合物。
【請求項１３】
Ｂ0がTyr, Phe, Leu又はVal残基である、請求項１２記載のペプチド化合物。
【請求項１４】
前記芳香族Ｎ末端保護基がベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭＯＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）又はｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）である、請求項１２又は１３記載のペプチド化合物。
【請求項１５】
ペプチドアルデヒドＺ−ＲＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＬ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＦ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＶ−Ｈ，Ｚ−ＲＶＹ−Ｈ，Ｚ−ＬＶＹ−Ｈ，Ａｃ−ＬＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＹＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＶＹ−Ｈ又はＡｃ−ＷＬＶＹ−Ｈ（ここでＺはベンジルオキシカルボニルでありそしてＡｃはアセチルである）である、請求項９〜１４のいずれか一項記載のペプチド化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブチリシンと該サブチリシン用の安定化剤としてのペプチド化合物とを含んで成る液体組成物に関する。本発明はまた、サブチリシン用の安定化剤として有用なペプチド化合物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
サブチリシン型プロテアーゼは液体水性洗剤において周知であり、特に洗濯の際の使用が知られている。そのような液体洗剤の場合に一般に遭遇する問題は、組成物中の別の酵素のサブチリシンによる分解とサブチリシンそれ自体の分解である。結果として、液体洗剤中のサブチリシンと別の酵素の安定性が低下し、洗浄力の低下した液体洗剤となる。
【０００３】
従来技術は、例えば様々なサブチリシン阻害剤又は安定化剤を添加することにより、液体洗剤中の酵素の貯蔵安定性を改善することを広く扱っている。ホウ酸とボロン酸がタンパク質分解酵素を可逆的に阻害することが知られている。
【０００４】
液体洗剤中の或る種のプロテアーゼを安定化するためのペプチドアルデヒドの使用はWO 94/04651, WO 98/13458, WO 98/13459, WO 98/13460及びWO 98/13462に開示されている。より詳しくは、WO 94/04651は、サブチリシン型プロテアーゼを安定化するためのペプチドアルヒデドPhe-Gly-Ala-PheH及びPhe-Gly-Ala-LeuHの使用を開示している。WO 94/04651もキモトリプシン型プロテアーゼを安定化するための好適なペプチドアルデヒドとしてのLeu-Leu-TyrHを開示している。更に、WO 94/04651は、ペプチドアルデヒドのＮ末端保護基としてメチルカルバメート又はメチル尿素を提案している。WO 98/13460は、ペプチドアルデヒド又はトリフルオロメチルケトンであって、ペプチド鎖が２〜５個のアミノ酸を含み、且つ該アルデヒド／トリフルオロメチルケトンがアミノ酸アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルグリシン、フェニルアラニン又はホモフェニルアラニンから誘導され、そしてＮ末端保護基が好ましくはスルホンアミド又はアミドホスフェートである、ペプチドアルデヒド又はトリフルオロメチルケトンのいずれかのペプチド阻害剤の使用を提案している。
【０００５】
WO 2007/141736, WO 2007/145963及びWO 2007/145964は、液体洗剤組成物を安定化するための可逆性ペプチドプロテアーゼ阻害剤の使用を開示している。US 2003/157088は、阻害剤で安定化された酵素を含有する組成物を開示している。
【０００６】
WO 96/41638及びWO 2005/105826は、ペプチドアルデヒド及びケトンを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｃ末端残基としてOH置換フェニルアラニンを有するペプチド化合物をはじめとする、或る種のペプチドアルデヒド又はケトン誘導体が、液体洗剤のような水性組成物中のサブチリシン型プロテアーゼを安定化するのに特に効果的であることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、サブチリシンと式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物とを含んでなる液体組成物であって、ここで
・Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；そして
・Ｂ1は単一アミノ酸残基である
ことを特徴とする液体組成物を提供する。
【０００９】
Ｂ0はパラ位及び／又はメタ位にＯＨ置換基を有するフェニルアラニン残基であってよく；そしてＢ2は１又は複数のアミノ酸残基から成ることができ、Ｂ2は随意にＮ末端保護基を含んで成ることができる。あるいは、Ｂ0は単一アミノ酸残基であってよく；そしてＢ2はＮ末端保護基が結合したGly，Arg又はLeu残基である。
【００１０】
本発明は更に、式Ｂ2−Ｂ1−Ｂ0−Ｒのペプチド化合物であって、式中
・Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；そして
・Ｂ1は単一アミノ酸残基である
ことを特徴とするペプチド化合物を提供する。
【００１１】
Ｂ0はパラ位及び／又はメタ位にＯＨ置換基を有するフェニルアラニン残基であってよく；そしてＢ2はＮ末端保護基としてベンジルオキシカルボニルを有する１又は複数のアミノ酸残基から成ることができ、又はＢ2はＮ末端保護基が結合したGly，Arg又はLeu残基であってよい。あるいは、Ｂ0は単一アミノ酸残基であってよく；Ｂ1は小型のアミノ酸残基であってよく；そしてＢ2は芳香族Ｎ末端保護基が結合したGly，Arg又はLeuの残基である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
「アミノ酸残基」は、Ｎ末端が左側に書かれ、Ｃ末端が右側に書かれた−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−のような構造を有する基を示す。
【００１３】
アミノ酸残基は次のような略号を含む、標準的な１文字又は３文字記号を使って省略される：アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）。略号「Ｙ−Ｈ」はチロシナールを表し、即ち、チロシン残基のＣ末端がカルボン酸基からアルデヒド基に変換されていることを意味する。チロシナールは既知の方法により調製することができる。
【００１４】
アミノ酸
Ｂ1及びＢ2基中の各アミノ酸残基は、構造−ＮＨ−(ＣＨ(Ｒ))n−Ｃ(＝Ｏ)−〔ここでｎ＝１〜２（好ましくは１）であり、そしてＲは次の基：Ｃ1〜Ｃ6アルキル；フェニル；Ｃ7〜Ｃ9アルキルアリール；Ｃ4〜Ｃ8シクロアルキルから選択された、直鎖状又は分枝状及び／又は環状、置換又は非置換構造から選択される〕を含む天然型の又は非天然型のα−もしくはβ−アミノ酸であることができる。Ｌ型とＤ型の両方が含まれる。
【００１５】
アミノ酸はα−アミノ酸、例えば任意の天然型アミノ酸、ノルバリン（Nva）、ノルロイシン（Nle）、ホモフェニルアラニン（Hph）又はフェニルグリシン（Pgl）であってよい。α−アミノ炭素原子はＤ配置又はＬ配置のいずれであってもよい。
【００１６】
ペプチド化合物
チロシンのようなＯＨ置換フェニルアラニンは比較的親水性のアミノ酸であり、ペプチド中にそれが存在すると、一般に、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、システイン、イソロイシン、メチオニン及びバリンのようなより疎水性のアミノ酸〔これらは全てチロシンの負のハイドロパシー指標（hydropathy index）に比較して正のハイドロパシー指標を有する〕に比較して、ペプチドの溶解性が増加するだろう（Kyte & Doolittle (1982), J. Mol. Biol. 157 (1), pp 105-132）（ハイドロパシー指標が大きければ大きいほどより疎水性のアミノ酸になる）。
【００１７】
ペプチド化合物は式
【化１】
2015180736.tif 000002
【００１８】
〔式中、Ｒは水素、ＣＨ3、ＣＸ3、ＣＨＸ2又はＣＨ2Ｘ（Ｘはハロゲン原子である）であり；Ｘ’はＯＨ又はＨであり、少なくとも１つのＸ’基がＯＨであり；Ｂ1は単一アミノ酸残基であり；そしてＢ2は１又は複数のアミノ酸残基であり、Ｂ2は随意にＮ末端保護基を含んで成る〕。
を有することができる。
【００１９】
よって、Ｂ0（Ｃ末端のアミノ酸残基）は、チロシン残基（パラ（p）−チロシン）、メタ(m)−チロシン又は３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンであってよい。チロシン残基の場合、ペプチド化合物は次の式を有する：
【００２０】
【化２】
2015180736.tif 000003
【００２１】
本発明の特定の一態様では、ペプチド化合物は、Ｃ末端残基を包含する３個のみのアミノ酸残基を含んで成る。本発明のこの観点では、合成はよりコストが効果的であり、化合物はより高度に効果的な酵素活性阻害剤であると証明された。好ましくは、わずか３個のアミノ酸残基を有するペプチド化合物は、Ｎ末端保護基により保護される。従って、この観点では、本発明は、Ｂ2がＮ末端保護基を含んで成る単一アミノ酸残基である化合物に関する。
【００２２】
本発明の好ましい観点では、ペプチド化合物は３個のみのアミノ酸残基を含んで成り、Ｂ2がＮ末端保護基を含有するアルギニン、グリシン及びロイシンの中から選択されるというアルデヒド化合物である。ペプチド化合物がわずか３個のアミノ酸残基を含んで成るアルデヒドである場合、Ｂ2は好ましくはＮ末端保護基を含有するアルギニンとグリシンの中から選択される。
【００２３】
本発明の別の観点では、ペプチド化合物は少なくとも４個のアミノ酸残基を含んで成る。好ましくは、少なくとも４個のアミノ酸残基を有するペプチド化合物がＮ末端保護基により保護される。従って、この観点では、本発明は、Ｂ2がＮ末端保護基を含んで成る少なくとも２個のアミノ酸残基である化合物に関する。
【００２４】
好ましい観点では、ペプチド化合物が少なくとも４個のアミノ酸残基を含んで成る場合、Ｂ2は無極性の側鎖を有するＮ末端アミノ酸残基を含んで成る。より具体的な態様では、Ｂ1への結合箇所から数えてＢ2の２番目のアミノ酸残基は無極性の側鎖を有する。更により具体的な態様では、ペプチド化合物は４個のアミノ酸残基を含んで成り、ここで無極性の側鎖を有するＮ末端アミノ酸残基はグリシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの中から選択される。好ましくは、該Ｎ末端アミノ酸残基が更にＮ末端保護基を含んで成る。
【００２５】
Ｂ1は小型のアミノ酸残基であるのが好ましい。より好ましくは、Ｂ1はアラニン又はバリンである。この点では、次のものが小型アミノ酸であるとみなされる：アラニン、システイン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニン、バリン、ノルバリン、ノルロイシン。
【００２６】
ペプチド化合物は、Ｒが水素であり、Ｂ1が好ましくはバリンやアラニンのような小型アミノ酸の中から選択された単一アミノ酸であり、Ｂ2が少なくとも２個のアミノ酸残基を含んで成り、そして前記２個のアミノ酸残基のうちの少なくとも１個がフェニルアラニン、グリシン及びロイシンの中から選択され、そしてＢ2の２番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン、グリシン、ロイシン、チロシン及びトリプトファンの中から選択された無極性の側鎖を有するというアルデヒドである。好ましくは、Ｂ2はアセチル（Ａｃ）Ｎ末端保護基を含んで成り、特に、ペプチドアルデヒド化合物Ａｃ−ＦＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＬＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＹＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＶＹ−Ｈ及びＡｃ−ＷＬＶＹ−Ｈを提供する。好ましくは、本発明のこの観点に従う化合物は、10個未満の残基、例えば９，８，７，６，５個又は最も好ましくは４個のアミノ酸残基を含んで成る。
【００２７】
別の観点では、ペプチド化合物はトリペプチドアルデヒドであり、Ｒが水素であり、Ｂ1が小型アミノ酸、例えばバリン及びアラニンの中から選択された単一アミノ酸であり、Ｂ2がアルギニン、グリシン及びロイシンの中から選択されたアミノ酸残基を含んで成る。好ましくは、Ｂ2がベンジルオキシカルボニル（Ｚ）及びアセチル（Ａｃ）の中から選択されたＮ末端保護基を含んで成り、特に、ペプチドアルデヒド化合物Ｚ−ＲＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＬ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＦ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＶ−Ｈ，Ｚ−ＲＶＹ−Ｈ，Ｚ−ＬＶＹ−Ｈ及びＡｃ−ＧＡＹ−Ｈを提供する。最も好ましくは、この観点によれば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）Ｎ末端保護基を含んで成る。
【００２８】
好ましい観点では、ペプチド化合物が少なくとも４個のアミノ酸残基を含んで成る場合、Ｂ2は無極性の側鎖を有するＮ末端アミノ酸残基を含んで成る。本発明の範囲内では、「無極性の側鎖を有するアミノ酸」とは、次の群：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、プロリン、グリシン、ノルバリン又はノルロイシンから選択された１又は複数のアミノ酸残基を意味する。
【００２９】
特に好ましい本発明のペプチドアルデヒドとしては、Ｚ−ＲＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＹ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＬ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＦ−Ｈ，Ｚ−ＧＡＶ−Ｈ，Ｚ−ＲＶＹ−Ｈ，Ｚ−ＬＶＹ−Ｈ，Ａｃ−ＬＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＹＧＡＹ−Ｈ，Ａｃ−ＦＧＶＹ−Ｈ又はＡｃ−ＷＬＶＹ−Ｈが挙げられ、ここでＺはベンジルオキシカルボニルでありそしてＡｃはアセチルである。
【００３０】
Ｎ末端保護基
Ｎ末端保護基は、ペプチド合成に使用することができる任意のアミノ末端保護基であってよい。Gross & Meinhoffer編、The Peptides, 第３巻；3-88 (1981), Academic Press, New York, 1981は、多数の適当なアミン保護基を開示しており、その目的のため参考として本明細書に組み込まれる。
【００３１】
好適な基の例としては、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、フルオロメトキシカルボニル、メトキシスクシニル、芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル；及び脂肪族ウレタン保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル又はアダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭＯＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）又はｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）が挙げられる。
【００３２】
好ましくは、本発明のＮ末端保護基はホルミル、アセチル、ベンゾイル、芳香族又は脂肪族ウレタンの中から、より好ましくはアセチル又はベンジルオキシカルボニルから選択される。ペプチド化合物が３個のアミノ酸を含む場合、Ｎ末端保護基は、好ましくは芳香族もしくは脂肪族ウレタン又は芳香族Ｎ末端保護基、特にベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭＯＺ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）又はｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、更に好ましくはベンジルオキシカルボニルである。ペプチド化合物が４個以上のアミノ酸を含む場合、Ｎ末端保護基はホルミル、アセチル又はベンゾイルが好ましく、より好ましくはアセチルである。
【００３３】
液体組成物
好ましい態様では、本発明のペプチド化合物は液体組成物中のサブチリシンを安定化するため又は阻害するために使用され、該液体組成物は界面活性剤と別の酵素とを更に含んでもよい。
【００３４】
一観点では更に、本発明は、サブチリシン型プロテアーゼをはじめとする酵素を安定化するためそして／又は阻害するための上記に定義したような化合物の使用に関する。好ましい観点では、液体洗剤において酵素が安定化されそして／又は阻害される。液体洗剤への該ペプチド化合物の添加が洗浄力を増加してもよい。
【００３５】
液体組成物は、サブチリシンと随意に第二の酵素とを含んで成る酵素組成物であってよい。第二の酵素はどんな市販の酵素であってもよく、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ及びそれらの混合物から成る群より選択された酵素であってよい。同一クラスからの酵素（例えばプロテアーゼ）の混合物も含まれる。酵素組成物は別の安定化剤、例えばポリオール、例えばグリセロール又はプロピレングリコールを、例えば25〜75重量％の量で含んでもよい。
【００３６】
液体組成物に使用される酵素の量は、酵素（１又は複数）の型や組成物の種類に従って異なる。液体洗剤のような組成物では、各酵素の量は、純粋な酵素タンパク質として計算すると、典型的には0.04〜80マイクロM（μM）、特に0.2〜30マイクロM、特に0.4〜20マイクロM（通常１〜2000 mg/l、特に５〜750 mg/l、特に10〜500 mg/l）であろう。酵素濃縮液のような組成物では、各酵素の量は、純粋な酵素タンパク質として計算すると、典型的には0.01〜20 mM、特に0.04〜10 mM、特に0.1〜5 mM（通常0.3〜500 g/l、特に１〜300 g/l、特に３〜150 g/l）であろう。
【００３７】
酵素は一般に、当業者に既知であろう洗濯効果を提供するのに十分なレベルで洗剤組成物に含められる。通常これは0.0001％(w/w)〜５％(w/w)の範囲内であろう。典型的な量は、液体洗剤組成物の重量で0.01％〜１％の範囲内である。プロテアーゼに対する本発明に係る酵素安定化剤または阻害剤のモル比は、少なくとも１：１又は1.5：１であり、それは1000：１未満、より好ましくは500：１未満であり、更により好ましくは100：１〜２：１、又は20：１〜２：１、最も好ましくは該モル比が10：１〜３：１である。
【００３８】
特定の一観点では、本発明は、１〜95重量％の洗剤界面活性剤（１又は複数）と、0.0001〜５重量％のサブチリシンと、0.00001〜１重量％の上記で定義したペプチド阻害剤とを含んで成る組成物に関する。より特定の態様では、本発明は、２〜60重量％の洗剤界面活性剤（１又は複数）と、0.0005〜１重量％のサブチリシンと、0.00005〜0.2重量％の上記で定義したペプチド阻害剤とを含んで成る組成物に関する。更により特定の態様では、本発明は、３〜50重量％の洗剤界面活性剤（１又は複数）と、0.001〜0.5重量％のサブチリシンと、0.0001〜0.1重量％の上記で定義したペプチド阻害剤とを含んで成る組成物に関する。
【００３９】
サブチリシン
サブチリシンは動物、植物又は微生物起源のものであってよく、化学的に又は遺伝学的に修飾された変異体を包含する。それはセリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性細菌プロテアーゼであってよい。その例は、Siezen他（Protein Engineering, 1991, 第４巻,第７号，719-737頁）により定義されたＩ−Ｓ群からのサブチリシン型プロテアーゼである。サブチリシンの例は、バチルス由来のもの、例えばサブチリシンノボ（Novo）、サブチリシンカールスバーグ（Carlsberg）、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、サブチリシン１６８である（WO 89/06279に記載）。例はWO 1998/020115, WO 01/44452, WO 01/58275, WO 01/58276, WO 2003/006602及びWO 2004/099401中に記載されている。
【００４０】
市販のプロテアーゼ（ペプチダーゼ）の例としては、カンナーゼ（Kannase）（登録商標）、エバーラーゼ（Everlase）（登録商標）、エスペラーゼ（Eaperase）（登録商標）、アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）、ノイトラーゼ（Neutrase）（登録商標）、デュラザイム（Durazym）（登録商標）、サビナーゼ（登録商標）、オボザイム（Ovozyme）（登録商標）、リカナーゼ（Liquanase）（登録商標）、ポーラーザイム（Polarzyme）（登録商標）、ピラーゼ（Pyraze）（登録商標）、膵トリプシンNOVO (PTN)、バイオ−フィード（Bio-Feed）（登録商標）Pro、及びクリアーレンズ（Clear-Lens）（登録商標）Pro（これら全てNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkより入手可能）が挙げられる。別の市販のプロテアーゼとしては、ロノザイム（Ronozyme）（登録商標）Pro、マキサターゼ（Maxatase）（登録商標）、マキサカル（Maxacal）（登録商標）、マキサペム（Maxapem）（登録商標）、オプチクリーン（Opticlean）（登録商標）、プロペラーゼ（Properase）（登録商標）、ピュラフェクト（Purafect）（登録商標）、ピュラフェクトOx（Purafect Ox）（登録商標）、及びピュラフェクト・プライム（Purafect Prime）（これら全てGenencor International Inc., Gist-Brocades, BASFから又はDSM Nutritional Productsから入手可能）が挙げられる。
【００４１】
第二の酵素
サブチリシンに加えて、液体組成物はアミラーゼ類、リパーゼ類、セルラーゼ類、マンナナーゼ類、オキシドレダクターゼ類及びリアーゼ類から成る群から選択された第二の酵素を含んで成ることができ；特に好ましいのは第二の酵素がリパーゼである液体組成物である。
【００４２】
好適なアミラーゼ（α及び／又はβ）類としては、細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼ類としては例えば、GB 1,296,839に記載されたＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のα−アミラーゼが挙げられる。市販のアミラーゼはデュラミル（Duramyl）（登録商標）、ターマミル（Termamyl）、ステインザイム（Stainzyme）（登録商標）、ステインザイム・プラス（Stainzyme Plus）（登録商標）、ターマミル・ウルトラ（Termamyl Ultra）（登録商標）、ファンガミル（Fungamyl）（登録商標）及びBAN（登録商標）（Novozymes A/Sより入手可能）及びラピダーゼ（Rapidase）（登録商標）、マキサミルP（Maxamyl P）（登録商標）、ピューラスター（Purastar）及びピューラスターOxAm (Gist-Brocades 及びGenencor Inc.より入手可能)である。
【００４３】
好適なセルラーゼ類は細菌又は真菌起源のものであることができる。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。それはフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）由来（US 4,435,307）又はトリコデルマ（Trichoderma）、例えばＴ．リーセイ（T. reesei）又はＴ．ビリデ（T. viride）由来の真菌セルラーゼであってよい。セルラーゼ類の例はEP 0 495 257中に記載されている。市販のセルラーゼ類としては、ケアザイム（Carezyme）（登録商標）、セルザイム（Celluzyme）（登録商標）、セルクリーン（Celluclean）（登録商標）、セルクラスト（Celluclast）（登録商標）及びエンドラーゼ（Endolase）（登録商標）（Novozymesより入手可能）、ピュラダックス（Puradax）、ピュラダックスHA及びピュラダックスEG（Genencorより入手可能）が挙げられる。
【００４４】
好適なオキシドレダクターゼ類としてはペルオキシダーゼ又はオキシダーゼ、例えばラッカーゼが挙げられる。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。ペルオキシダーゼは植物、細菌又は真菌起源のものであってよい。例はコプリヌス（Coprinus）の株、例えばＣ．シネリウス（C. cinerius）又はＣ．マクロリズス（C. macrorhizus）由来、又はバチルス（Bacillus）の株、例えばＢ．ピュミルス（B. pumilus）由来のペルオキシダーゼ、特にWO 91/05858に記載のペルオキシダーゼである。ここで好適なラッカーゼ類としては細菌又は真菌起源のものが挙げられる。その例としてはトラメテス（Trametes）の株、例えばＴ．ビロサ（T. villosa）又はＴ．ベルシコロール（T. versicolor）由来、又はコプリヌス（Coprinus）の株、例えばＣ．シネレウス（C. cinereus）由来、又はミセリオフトラ（Myceliophthora）の株、例えばＭ．サーモフィラ（M. thermophila）由来のラッカーゼである。
【００４５】
好適な脂質分解酵素としては、細菌又は真菌起源のリパーゼ又はクチナーゼが挙げられる。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる、例としては、EP 258 068とEP 305 216に記載されたサーモマイセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）（フミコラ・ラヌギノーザ(Humicola lanuginosa）)由来のリパーゼ、例えばEP 238 023に記載されたリゾムコル・ミーヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、カンジダ（Candida）リパーゼ、Ｃ．カンタークチカ（Cantarctica）リパーゼ、例えばEP 214 761に記載されたＣ．アンタークチカ（C.antarctica）リパーゼＡ又はＢ、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）リパーゼ（WO 98/26057）、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えばＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）及びＰ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）リパーセ、例えばEP 218 272に記載のもの、Ｐ．セパシア（P. cepacia）リパーゼ、例えばEP 331 376に記載のもの、Ｐ．スツゼリ（P. stutzeri）リパーゼ、例えばBP 1,372,034に開示されたもの、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ、例えばＢ．サチリス（B. subtilis）リパーゼ（Dartois他（1993）Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）リパーゼ（JP 64/744992）、Ｂ．ピュミルス（B. pumilus）リパーゼ（WO 91/16422）、ペニシリウム・カメンベルティ（Penicillius camenbertii）リパーゼ（Yamaguchi他(1991), Gene 103, 61-67）、ゲオトリカム・カンジダム（Geotrichum candidum）リパーゼ（Shimada, Y.他(1989), J. Biochem. 106, 383-388）及び様々なリゾプス（Rhizopus）リパーゼ類、例えばＲ．デレマール（R. delemar）リパーゼ（Hass, M.J.他(1991), Gene 109, 117-113）、Ｒ．ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Kugimiya他 (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716-719）及びＲ．オリゼ（R. oryzae）リパーゼが挙げられる。追加の例はシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（WO 88/09367）、フザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（WO 90/09446）及びフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のクチナーゼ（WO 2001/092502）である。脂質分解酵素はリパーゼ変異体、例えばWO 2000/060063に記載のものであってよい。
【００４６】
市販のリパーゼ類の例としては、ライペックス（Lipex）（登録商標）、リポプライム（Lipoprime）（登録商標）、リポパン（Lipopan）（登録商標）、リポパンＦ（登録商標）、リポパンXtra（登録商標）、リポラーゼ（Lipolase）（登録商標）、リポラーゼUltra（登録商標）、リポザイム（Lipozyme）（登録商標）、パラターゼ（Palatase）（登録商標）、レシナーゼ（Resinase）（登録商標）、ノボザイム（Novozyme）（登録商標）435及びレシターゼ（Lecitase）（登録商標）（これら全てNovozymes A/Sより入手可能）が挙げられる。別の市販のリパーゼ類としては、ルマファースト（Lumafast）（登録商標）〔Genencor International Inc.からのシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）リパーゼ〕；リポマックス（Lipomax）（登録商標）〔Gist-Brocadews/Genencor Int. Inc.からのＰｓ．シュードアルカリゲネス（Ps. pseudoalcaligenes）リパーゼ〕；及びSolvay enzymesからのバチルス（Bacillus）種リパーゼが挙げられる。更なるリパーゼ類は別の供給業者、例えばリパーゼＰ“アマノ(Amano)”（Amano Pharmaceutical Co. Ltd.）から入手可能である。
【００４７】
好適なマンナナーゼ類としては細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。市販のマンナナーゼ類の例としてマンナウェイ（Mannaway）（登録商標）（Novozymesの製品）とマンナスター（MannaStar）（Genencorの製品）が挙げられる。
【００４８】
好適なリアーゼ類としては細菌又は真菌起源のものが挙げられる。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リアーゼ類の例としてはペクテートリアーゼとペクチンリアーゼが挙げられる。市販のリアーゼ類の例はペクタウオッシュ（Pectawash）（登録商標）及びペクタウェイ（Pectaway）（登録商標）（ともにNovozymesの製品）が挙げられる。
【００４９】
本発明を下記の実施例により更に説明するが、この実施例は本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。
【実施例】
【００５０】
実施例１
様々なペプチドアルデヒドが一般のペプチド合成会社により、全て＞80％の純度で製造された。ペプチドアルデヒドを使用前に10 mg/mlの濃度になるようにDMSO中に溶かした。
【００５１】
様々な安定化剤を試験するためにモデル液体洗剤を調製した：
【００５２】
洗剤基剤：
【表１】
2015180736.tif 000004
【００５３】
酵素を含む参照洗剤を調製した：
洗剤Ａ：
【００５４】
【表２】
2015180736.tif 000005
【００５５】
更に本発明の安定化剤を含む下記の洗剤を調製した。これら全ての試料を100ｇの洗剤に標準化した：
【００５６】
【表３】
2015180736.tif 000006
【００５７】
洗剤を35℃と40℃の密閉ガラス中に維持した。リパーゼとプロテアーゼの残留活性を、標準酵素分析法を使って様々な時点で測定した（−18℃で貯蔵した参照に対する比較により）（プロテアーゼは40℃，pH 8.3でのＮ，Ｎ−ジメチルカゼインの加水分解により測定し、そしてリパーゼは40℃，pH 7.7での吉草酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解により測定した）。下表において、３×はプロテアーゼ等に比較した阻害剤の３モル超過分を表す。
【００５８】
【表４】
2015180736.tif 000007
【００５９】
上記結果は、チロシナールペプチドアルデヒドが非常に有効なプロテアーゼ安定化剤であることを証明する。
【００６０】
実施例２
次の酵素を含有する参照洗剤を調製した：
洗剤Ｌ：
【００６１】
【表５】
2015180736.tif 000008
【００６２】
本発明に係る安定化剤を含有する下記の洗剤を調製し、100ｇの洗剤に標準化した。
【００６３】
【表６】
2015180736.tif 000009
【００６４】
洗剤を25℃と35℃の密閉ガラス中に維持した。リパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼの残留活性を、様々な時点で(ｗ＝週間)、標準酵素分析法を使って測定した（−18℃で保存した参照に対する比較により）（プロテアーゼは40℃，pH 8.3でのＮ，Ｎ−ジメチルカゼインの加水分解により測定し、リパーゼは40℃，pH 7.7での吉草酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解により測定し、そしてアミラーゼは37℃，pH 7.35での４，６−エチリデン−（Ｇ7）ｐ−ニトロフェニル−（Ｇ1）−α，Ｄ−マルトヘプタソイドの加水分解により測定した）。
【００６５】
【表７】
2015180736.tif 000010
【００６６】
チロシナルペプチドアルデヒドが液体洗剤中のプロテアーゼ、リパーゼ及びアミラーゼの貯蔵安定性を有意に改善することがわかった。
【００６７】
実施例３
ペプチドアルデヒドＺ−ＧＡＦ−Ｈ、Ｚ−ＧＡＬ−Ｈ及びＺ−ＧＡＹ−Ｈを全て純度＞80％で、ペプチド合成により製造した。該ペプチドアルデヒドを使用前に10 mg/mlの濃度になるようDMSO中に溶解した。
酵素を含む次の洗剤Ｎを調製した：
【００６８】
【表８】
2015180736.tif 000011
【００６９】
本発明の安定化剤を用いて次の洗剤を調製し、そして100ｇの洗剤に標準化した：
【００７０】
【表９】
2015180736.tif 000012
【００７１】
洗剤を40℃の密閉ガラス中に置いた。１週間後、標準酵素分析法を使ってプロテアーゼの残留活性（−18℃で保存した参照への比較により）を測定した（プロテアーゼは40℃、pH 8.3でのＮ，Ｎ−ジメチルカゼインの加水分解により測定した）。
40℃で１週間後の％残留プロテアーゼ活性：
【００７２】
【表１０】
2015180736.tif 000013
【００７３】
結果は３つのペプチドアルデヒド全てがプロテアーゼを有効に安定化することを証明する。チロシナールペプチドアルデヒドＺ−ＧＡＹ−Ｈは、その他のペプチドアルデヒドと同じ残留活性に到達するのに、プロテアーゼに対する阻害剤のモル超過分がほぼ半分しか必要でないため、最も有効であることがわかった。
【外国語明細書】
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