(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中の補体固定抗体の高感受性かつ特異的検出のための方法を提供する。【解決手段】生体試料を用いて、目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質を、生体試料及び補体因子Ｃ１ｑと接触させることであって、該接触は、該試料内の抗ＡｇＩ補体固定抗体を該ＡｇＩに結合させ、該補体因子Ｃ１ｑを前記抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間接触することと、該固体基質を、該ＡｇＩに結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合した該補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある少なくとも１つの検出可能に標識されたリガンドでインキュベートすることと、該生体試料内で、該ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体の存在または不在を決定するために、該補体因子Ｃ１ｑに結合した該検出可能に標識されたリガンドの存在または不在を検出することにより、生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法。【選択図】図１８
2015007651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法であって、
目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質を、対象からの生体試料および補体因子Ｃ１ｑと接触させることであって、前記接触は、前記試料中の抗ＡｇＩ補体固定抗体を前記ＡｇＩに結合させ、補体因子Ｃ１ｑを前記抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われ、
前記固体基質を、前記ＡｇＩに結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合した前記補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある少なくとも１つの検出可能に標識されたリガンドでインキュベートすることと、
前記生体試料内で、前記ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体の存在または不在を決定するために、前記補体因子Ｃ１ｑに結合した前記検出可能に標識されたリガンドの存在または不在を検出することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
補体系は、抗体および他の因子と協力し、免疫、アレルギー、免疫化学的、および免疫病理学的反応の媒介物として重要な役割を果たす、血液中のタンパク質の複合群である。補体系の活性化は、オプソニン化、様々な種類の細胞、細菌、および原虫の溶菌、ウイルスの不活性化、および炎症過程の直接媒介等の広範の反応をもたらし得る。その成分の幾つかのホルモン様活性を介して、補体系は、他の液性および細胞エフェクター系を動員し、その関与を得ることができる。これらは順に、白血球の方向性移動を誘導し、マスト細胞からのヒスタミン放出を誘発し、食細胞からのリソソーム構成物質の放出を刺激することができる。
【０００２】
補体系は、相互に、抗体と、および細胞膜と相互作用する能力がある少なくとも２０個の特徴的な血漿タンパク質から成る。活性化された場合、これらのタンパク質の多くが、他のタンパク質と混合して酵素を形成し、系内のさらなる他のタンパク質を切断、かつ活性化させる。補体カスケードとして周知である、これらタンパク質の連続的な活性化は、２つの主要な経路、古典的経路および副経路に進む。双方の経路は、Ｃ３で収束し、細胞溶菌、細菌オプソニン化および溶菌、またはウイルス不活性化を導く共通の最終経路を使用する。
【０００３】
古典的経路は、抗原抗体複合、凝集した免疫グロブリン、およびＤＮＡおよびトリプシン様酵素等の非免疫物質により活性化され得る。古典的活性化経路は、連続的に、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、およびＣ３と命名された４つの成分を含む。これらの成分は、２つの機能ユニット、Ｃ１または認識ユニット、ならびにＣ４、Ｃ２、およびＣ３、または活性化ユニットに分類できる。Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９と指定された５つの追加の成分は、細胞溶菌に導く双方の経路に共通している最終経路を形成する膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を定義する。代替経路は、因子Ｂを利用し、Ｃ１−Ｃ４−Ｃ２段階を迂回し、Ｃ３で活性する。
【０００４】
古典的経路は、Ｃ１ｑの１個の分子ならびにＣ１ｒおよびＣ１ｓの双方の２個の分子から成るＣ１複合体から始まる。Ｃ１複合体の活性化は、クラスＭおよびＧからの抗体へのＣ１ｑの結合、抗原との複合、または病原体の表面へのＣ１ｑの結合により誘発される。Ｃ１ｒおよびＣ１ｓは共にセリンプロテアーゼである。Ｃ１ｑの結合は、Ｃ１ｑ分子中の立体構造の変化を導き、順に２個のＣ１ｒ分子の活性化、続いてＣ１ｓ分子の活性化を導く。このカスケードの自発的活性化を防ぐために、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓは、セリンプロテアーゼ阻害剤であるＣ１阻害剤により阻害される。一旦活性化されると、Ｃ１複合体は、Ｃ２およびＣ４と結合し、切断し、Ｃ２ａおよびＣ４ｂを産生する。Ｃ２ａおよびＣ４ｂは、次いでＣ３転換酵素として周知のＣ４ｂ２ａ複合体を形成するため結合する。Ｃ３転換酵素の産生は、Ｃ３のＣ３ａおよびＣ３ｂへの切断へと導き、後者は、Ｃ２ａおよびＣ４ｂ（Ｃ３転換酵素）と結合し、ＭＡＣの初期成分であるＣ５転換酵素を形成する。
【０００５】
補体経路の活性化の研究および決定は、可能性のある多くの生物学的障害の兆候を提供することができる。補体経路は、広範囲のヒト疾患および病態の病変形成または兆候に関わっている。かかる疾患には、免疫複合疾患の幾つかのタイプ、自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデス、ならびにグラム陰性菌、ウイルス、寄生虫、真菌による感染に関与することが発見されているもの等の感染性疾患、ならびに様々な皮膚科学的、腎性、および血液学的な疾患が含まれる。ある障害は、患者における不十分な補体のためであり得る。
【０００６】
患者の試料中の補体固定抗体を、特に特定の抗原から正確かつ確実に識別する能力に関して、迅速、高感度、かつ特異的な様式で検出するための方法が必要とされている。
【０００７】
本発明は、これらの必要性に対処する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，５１４，７１４号
【特許文献２】米国特許第６，１５０，１２２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗａｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２７５（１−２）：１４９−６０（２００３）
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７（１２）：２８０９−１５（２００７）
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、生体試料中に存在する自己補体因子Ｃ１ｑおよび自己補体因子Ｃ１ｑに結合する検出可能に標識された抗体、外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑおよび外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑに結合する検出可能に標識された抗体、検出可能に標識された外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑ、または自己補体因子Ｃ１ｑおよび外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑの組み合わせを含む、補体因子Ｃ１ｑを使用し、生体試料中の補体固定抗体の高感受性かつ特異的検出のための方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキット、システム、およびデバイスも特徴とする。
【００１１】
一態様において、本発明は、対象および補体因子Ｃ１ｑからの生体試料を用いて、目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質を、対象からの生体試料および補体因子Ｃ１ｑと接触させることであって、該接触は、該試料内の抗ＡｇＩ補体固定抗体を該ＡｇＩに結合させ、該補体因子Ｃ１ｑを前記抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われる、接触することと、該固体基質を、該ＡｇＩに結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合した該補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある少なくとも１つの検出可能に標識されたリガンドでインキュベートすることと、該生体試料内で、該ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体の存在または不在を決定するために、該補体因子Ｃ１ｑに結合した該検出可能に標識されたリガンドの存在または不在を検出することにより、目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法を提供する。
【００１２】
幾つかの実施形態において、補体因子Ｃ１ｑは自己補体因子Ｃ１ｑである。他の実施形態において、補体因子Ｃ１ｑは外因性補体因子Ｃ１ｑである。さらに他の実施形態において、該補体因子Ｃ１ｑは、自己補体因子Ｃ１ｑおよび外因性補体因子Ｃ１ｑの組み合わせである。
【００１３】
幾つかの実施形態において、固体基質はマルチウェルプレートである。他の実施形態において、固体基質は膜である。さらに他の実施形態において、固体基質は、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、または磁気ビーズ等の微粒子である。幾つかの実施形態において、固体基質は細胞である。他の実施形態において、固体基質は細胞膜である。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である。幾つかの実施形態において、検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、対象および直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑからの生体試料を用いて、目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質を、対象からの生体試料および直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑと接触させることであって、該接触は、該試料内の抗ＡｇＩ補体固定抗体を該ＡｇＩに結合させ、該直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑを該抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われる、接触することと、該ＡｇＩに特異的に結合する該生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するために、該抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合した該直接標識された外因性Ｃ１ｑの存在または不在を検出することと、により、目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法を提供する。
【００１５】
幾つかの実施形態において、固体基質はマルチウェルプレートである。他の実施形態において、固体基質は膜である。さらに他の実施形態において、固体基質は、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、または磁気ビーズ等の微粒子である。幾つかの実施形態において、固体基質は細胞である。他の実施形態において、固体基質は細胞膜である。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、対象からの生体試料を異なるサブタイプの一群の微粒子および補体因子Ｃ１ｑでインキュベートすることであって、各微粒子は、異なる精製されたＨＬＡサブタイプでコーティングされ、同一ＨＬＡを提示する細胞集団に由来し、該インキュベートは、該生体試料中の抗ＨＬＡ補体固定抗体を該ＨＬＡに結合させ、該補体因子Ｃ１ｑを該生体試料中の該抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われる、インキュベートすることと、該微粒子を、該ＨＬＡに結合した該抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合した該補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある少なくとも１つの検出可能に標識されたリガンドでインキュベートすることと、補体固定抗体の存在または不在を決定するために、該補体因子Ｃ１ｑに結合した該検出可能に標識されたリガンドの存在または不在を検出することと、により、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法を提供する。
【００１７】
幾つかの実施形態において、補体因子Ｃ１ｑは自己補体因子Ｃ１ｑである。他の実施形態において、補体因子Ｃ１ｑは外因性補体因子Ｃ１ｑである。さらに他の実施形態において、該補体因子Ｃ１ｑは、自己補体因子Ｃ１ｑおよび外因性補体因子Ｃ１ｑの組み合わせである。
【００１８】
幾つかの実施形態において、微粒子はアガロースビーズである。他の実施形態において、微粒子はラテックスビーズである。他の実施形態において、微粒子は磁気ビーズである。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である。幾つかの実施形態において、検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である。幾つかの実施形態において、検出はフローサイトメトリーによる。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、対象からの生体試料を異なるサブタイプの一群の微粒子および直接標識された補体因子Ｃ１ｑでインキュベートすることであって、各微粒子は、異なる精製されたＨＬＡサブタイプでコーティングされ、同一ＨＬＡを提示する細胞集団に由来し、該インキュベートは、該生体試料中の抗ＨＬＡ補体固定抗体を該ＨＬＡに結合させ、該補体因子Ｃ１ｑを該生体試料中の該抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われる、インキュベートすることと、ＨＬＡに特異的に結合する該生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するために、該抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合した該直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑの存在または不在を検出することと、により、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法を提供する。
【００２０】
幾つかの実施形態において、微粒子はアガロースビーズである。他の実施形態において、微粒子はラテックスビーズである。他の実施形態において、微粒子は磁気ビーズである。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される。幾つかの実施形態において、検出はフローサイトメトリーによる。
【００２１】
別の態様において、本発明は、目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質と、補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある検出可能に標識されたリガンドと、該目的の抗原に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットを提供する。
【００２２】
幾つかの実施形態において、固体基質はマルチウェルプレートである。他の実施形態において、固体基質は膜である。さらに他の実施形態において、固体基質は、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、または磁気ビーズ等の微粒子である。幾つかの実施形態において、固体基質は細胞である。他の実施形態において、固体基質は細胞膜である。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である。幾つかの実施形態において、検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質と、補体固定抗体に結合する能力がある直接標識された外因性Ｃ１ｑと、該目的の抗原に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットを提供する。
【００２４】
幾つかの実施形態において、固体基質はマルチウェルプレートである。他の実施形態において、固体基質は膜または細胞である。さらに他の実施形態において、固体基質は、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、または磁気ビーズ等の微粒子である。他の実施形態において、固体基質は細胞膜である。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、一群の微粒子サブタイプであって、各微粒子サブタイプは、前記群が正常ヒト集団におけるＨＬＡの分布をシミュレートするように、単一細胞株または複数の細胞株の前記ＨＬＡ抗原集団を表すために、異なる精製されたＨＬＡでコーティングされる、微粒子サブタイプと、補体因子Ｃ１ｑと特異的に結合する能力がある検出可能に標識されたリガンドと、ＨＬＡに対抗する対象からの試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットを提供する。
【００２６】
幾つかの実施形態において、微粒子は、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズである。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である。幾つかの実施形態において、検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である。
【００２７】
別の態様において、本発明は、一群の微粒子サブタイプであって、各微粒子サブタイプは、前記群が正常ヒト集団におけるＨＬＡの分布をシミュレートするように、単一細胞株または複数の細胞株の前記ＨＬＡ抗原集団を表すために、異なる精製されたＨＬＡでコーティングされる、微粒子サブタイプと、補体固定抗体に結合する能力がある直接標識された外因性Ｃ１ｑと、ＨＬＡに対抗する対象からの試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットを提供する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、微粒子は、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズである。幾つかの実施形態において、生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である。幾つかの実施形態において、直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される。
【００２９】
本発明のこれらのおよび他の目的、利点、および特徴は、さらに下記に記載される本発明の詳細を読む場合、当業者にとって明白となるであろう。
【００３０】
本発明は、付随の図面に併せて以下の詳述を読む場合から最も理解される。一般的な実践において、図面の様々な特徴は、原寸に比例しないことが強調される。一方、様々な特徴の次元は、明確にするために、任意に拡大または縮小される。図面に含まれるのは、以下の図である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本開示の一実施形態の概略図を提供する。目的の抗原または個々に識別可能な抗原（ＡｇＩ）が表面に固定化された固体基質は、抗ＡｇＩ補体固定抗体（ＣＦＡｂ）を含有していることが疑われる生体試料に接触される。図に示されるように、試料はまた、非補体固定抗体（非ＣＦＡｂ）ならびに同一試料中の補体固定抗体に特異的に結合する自己および／または外因性Ｃ１ｑを含み得るであろう。インキュベートに続いて、存在する場合、抗ＡｇＩ補体固定抗体は、固定化したＡｇＩに特異的に結合し、Ｃ１ｑは、結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体に特異的に結合する。固体基質は、特異的にヒトＣ１ｑに結合する検出可能に標識された抗ヒトＣ１ｑ（抗ｈＣ１ｑ）抗体に接触される。検出可能な標識の存在は、次いで当技術分野では既知の方法を使用しアッセイされる。
【図２】本開示の別の実施形態の概略図を提供する。この実施形態において、検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ（抗ｈＣ１ｑ）抗体は、固体基質が試料に接触される前に、直接生体試料に添加される。あるいは、抗ｈＣ１ｑ抗体および生体試料を、同時に固体基質に導入することができる。
【図３】本開示の別の実施形態の概略図を提供する。この実施形態において、検出可能に標識された外因性Ｃ１ｑは、固体基質を試料に接触させる前に、生体試料に直接添加される。あるいは、検出可能に標識された外因性Ｃ１ｑおよび生体試料を固体基質に同時に導入することができ、あるいは生体試料が基質に導入された後、検出可能に標識された外因性Ｃ１ｑを固体基質に導入することができる。この実施形態においては、他の実施形態と同様に、検出可能に標識された外因性Ｃ１ｑの存在は、当技術分野では既知の方法を使用しアッセイされる。
【図４】本開示の別の実施形態の概略図を提供する。この実施形態は、図１に説明される実施形態と同様であり、同様の様式で機能する。この実施形態においては、しかしながら、目的の抗原または個々に識別可能な抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質は、ビーズ、ミクロビーズ、ミクロスフィア、微粒子、細胞、または膜である。
【図５】本開示の別の実施形態の略図を提供する。この実施形態は、図２に説明される実施形態と同様であり、同様の様式で機能する。この実施形態においては、しかしながら、目的の抗原または個々に識別可能な抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質は、ビーズ、ミクロビーズ、ミクロスフィア、微粒子、細胞、または膜である。
【図６】本開示の別の実施形態の略図を提供する。この実施形態は、図３に説明される実施形態と同様であり、同様の様式で機能する。この実施形態においては、しかしながら、目的の抗原または個々に識別可能な抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質は、ビーズ、ミクロビーズ、ミクロスフィア、微粒子、細胞、または膜である。
【図７】期待される抗体を定義するための１段階対２段階Ｃ１ｑ手順の能力の比較を示す。
【図８】通常のＬＭＸ−ＩｇＧアッセイを使用した静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）スパイクの結果が機能しないことを示す。図は、ＩＶＩＧインビトロ阻害アッセイに対して行われたように、かつ抗ＩｇＧ標識された第２段階（現存の市販のアッセイ）を使用して、緩衝液中で希釈される陰性標準血清対ＩＶＩＧ中で希釈される陰性標準血清の試験を表す。
【図９】患者血清がスパイクされたことを除き図８と同一である。結果は、ＩＶＩＧが血清に添加され、抗ＩｇＧで検出された場合、患者の抗体の阻害（緩衝液中で希釈された試料において可視）を検出することが不可能であり得ることを示す。
【図１０】ＩＶＩＧによる阻害の決定のための補体依存性傷害（ＣＤＣ）アッセイおよびＣ１ｑアッセイの比較を示す。ＣＤＣアッセイは、この測定に関して、以前利用可能な唯一のアッセイである。
【図１１】大人の心臓病患者の血清の実際のＩＶＩＧインビトロ阻害Ｃ１ｑアッセイを示し、患者が処置されれば、Ａ２４のみがＩＶＩＧにより阻害することができることを示唆している。
【図１２Ａ】各次の処置に伴い、大人の心臓病患者の血清のＡ２４抗体中の変化の監視におけるＬＭＸ−Ｃ１ｑ（図１２Ａ）およびＬＭＸ−ＩｇＧ（図１２Ｂ）アッセイの比較を示す（図１１と同一患者）。
【図１２Ｂ】各次の処置に伴い、大人の心臓病患者の血清のＡ２４抗体中の変化の監視におけるＬＭＸ−Ｃ１ｑ（図１２Ａ）およびＬＭＸ−ＩｇＧ（図１２Ｂ）アッセイの比較を示す（図１１と同一患者）。
【図１３Ａ】後のＩＶＩＧ処置に伴う、ＬＭＸ−Ｃ１ｑ（図１２Ａ）およびＬＭＸ−ＩｇＧ（図１２Ｂ）アッセイにおける、全ての患者の抗体の監視を示す。ＬＭＸ−ＩｇＧアッセイを使用して、抗体の抑制／消失を見ることが困難であることに留意されたい。
【図１３Ｂ】後のＩＶＩＧ処置に伴う、ＬＭＸ−Ｃ１ｑ（図１２Ａ）およびＬＭＸ−ＩｇＧ（図１２Ｂ）アッセイにおける、全ての患者の抗体の監視を示す。ＬＭＸ−ＩｇＧアッセイを使用して、抗体の抑制／消失を見ることが困難であることに留意されたい。
【図１４】図１１と同様であるインビトロＩＶＩＧ阻害Ｃ１ｑアッセイの結果を示すが、結果は、小児腎臓病患者に対するものであり、Ｂ５７、Ｂ５８抗体がＩＶＩＧにより効果的に抑制されるとこを示唆している。
【図１５】インビトロおよびインビボ結果の対照比較を表す。左のパネル（図１４と同一）はインビトロＩＶＩＧ阻害を示し、右のパネルは、同じ血清日の患者にＩＶＩＧ注入前後を示す。
【図１６Ａ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｂ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｃ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｄ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｅ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｆ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｇ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｈ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｉ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｊ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｋ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｌ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｍ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１６Ｎ】Ｃ１Ｑ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ａ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｂ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｃ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｄ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｅ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｆ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｇ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｈ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｉ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１７Ｊ】Ｃ１Ｑ−ＩＶＩＧ検証実験の結果を示す表である。
【図１８】直接標識されたＣ１ｑアッセイの概略図を提供する。
【図１９Ａ】ＬＭＸ−Ｃ１ｑアッセイを使用するＣ１ｑの直接および間接標識の比較を提供する。
【図１９Ｂ】ＬＭＸ−Ｃ１ｑアッセイを使用するＣ１ｑの直接および間接標識の比較を提供する。
【図２０Ａ】インビトロＬＭＸ−Ｃ１ｑ  ＩＶＩＧ阻害アッセイ中のＣ１ｑの間接標識（図２０Ａ）およびインビトロＬＭＸ−Ｃ１ｑ  ＩＶＩＧ阻害アッセイ中のＣ１ｑの直接標識（図２０Ｂ）の比較を提供する。
【図２０Ｂ】インビトロＬＭＸ−Ｃ１ｑ  ＩＶＩＧ阻害アッセイ中のＣ１ｑの間接標識（図２０Ａ）およびインビトロＬＭＸ−Ｃ１ｑ  ＩＶＩＧ阻害アッセイ中のＣ１ｑの直接標識（図２０Ｂ）の比較を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
「補体固定抗体」という用語は、病原体上の抗原に特異的に結合し、生物から前記抗原を有する標的（例えば、細胞）または病原体の排除を提供する免疫系の補体カスケードを開始する抗体を指す。概して、補体固定抗体は、補体因子Ｃ１ｑに認識される、かつ特異的に結合されるＩｇＭまたはＩｇＧ抗体である。
【００３３】
Ｃ１ｑ補体因子は、血清補体系を活性化するＣ１酵素複合体のサブユニットである。それは、Ｎ末端非らせん領域、三重（コラーゲン性）領域、およびＣ末端球状頭部から成る共通構造を共有する鎖Ａ、Ｂ、およびＣの９個のジスルフィド結合二量体から構成される（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９９４．  ３０１：２４９−２５６）。Ｃ１ｑは、宿主防御、炎症、アポトーシス、自己免疫、細胞分化、器官形成、冬眠、およびインスリン抵抗性肥満に含まれる。５つの厳重に保存された残渣は、Ｃ１ｑファミリーにおいて同定された（Ｋｉｓｈｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００４．  ２５（１０）：５５１−５６１）。各Ｃ１ｑドメインは、各逆平行鎖から作成される、２つの５本鎖βシート（Ａ’、Ａ、Ｈ、Ｃ、Ｆ）および（Ｂ’、Ｂ、Ｇ、Ｄ、Ｅ）から成るゼリーロール（ｚｅｌｌｙ−ｒｏｌｌ）トポロジーを伴い１０本鎖サンドウィッチ倍を示す。概して、Ｃ１ｑ補体因子は、動物の血清中に存在し、補体固定抗体に対する結合特異性および結合親和性の双方を有し、これらもまた動物の血清中に存在する。Ｃ１ｑ補体因子の補体固定抗体への結合は、免疫系の補体カスケードを活性化する。
【００３４】
「自己」とは、別の要素と同じ患者の試料に由来することを意味する。例えば、自己Ｃ１ｑに関しては、補体固定抗体と同じ対象試料中でＣ１ｑが発生することを意味する。
【００３５】
「外因性」とは、特定の動物に本質的には由来しない要素を意味する。例えば、外因性Ｃ１ｑに関しては、Ｃ１ｑが、補体固定抗体を有する対照試料とは異なる動物または系に由来することを意味する。
【００３６】
主題発明の「親和性試薬」は、標的分析物に対する高い結合親和性を有する分析物結合ドメイン、部分、または成分を有する。高い結合親和性とは、少なくとも約１０−４Ｍ、通常少なくとも約１０−６Ｍ以上、例えば、１０−９Ｍ以上の結合親和性を意味する。親和性試薬は、標識された親和性リガンドとして存在する場合、標的タンパク質に対する必要結合親和性を示す限り、様々な異なるタイプの分子のいずれでもあり得る。
【００３７】
したがって、親和性試薬は、小分子または大分子リガンドであり得る。小分子リガンドとは、リガンドのサイズが約５０〜約１０，０００ダルトン、通常約５０〜約５，０００ダルトン、およびより通常では約１００〜約１０００ダルトンの範囲であることを意味する。大分子とは、リガンドのサイズが、分子重量において約１０，０００ダルトン以上であることを意味する。
【００３８】
大分子親和性リガンドとして特に目的とされるのは、抗体、ならびに結合断片およびその模倣薬である。抗体が親和性リガンドである場合、特異性によって異なる抗体の不均一集団は、同じ標識核酸またはモノクローナル組成物でそれぞれ標識されるポリクローナル組成物に由来し得、標的タンパク質に対し同じ特異性を有する同一抗体の均質集団は、それぞれ同じ標識（例えば、フルオロフォア）で標識される。したがって、親和性リガンドはモノクローナル、オリゴクローナル、および／またはポリクローナル抗体であり得る。さらに他の実施形態において、親和性リガンドは抗体結合断片または模倣薬であり、これらの断片および模倣薬は、標的タンパク質に対する必要結合親和性を有する。例えば、Ｆｖ、（Ｆａｂ’）２、およびＦａｂ等の抗体断片は、無傷タンパク質の切断、例えば、プロテアーゼまたは化学的切断により調製する。また、目的とされるのは、単鎖抗体またはｓｃＦｖｓ等の組換え産生された抗体断片であり、かかる組換え産生された抗体断片は、上記抗体の結合特性を保持する。かかる組換え産生された抗体断片は、対照抗体の結合特性を保持するように、概して対照抗体の少なくともＶＨおよびＶＬドメインを含む。これらの組換え産生された主題発明抗体断片または模倣薬は、米国特許第５，８５１，８２９号および５，９６５，３７１号に記載の方法等のいずれの有用な方法を使用しても直ちに調製することができ、これらの開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００３９】
上述の抗体、その断片および模倣薬は、商業的供給源から得ることができ、および／またはいずれの有用な技術を使用しても調製することができる、その組換え誘導体を含む、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片および模倣薬の産生の方法は、当業者には周知である。
【００４０】
「エピトープ」とは、特定のＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原上の部位を意味する。該用語はまた、「抗原決定因子」または「抗原決定因子部位」と互換的に使用される。エピトープは、３個以上のアミノ酸等の１個以上のアミノ酸を、エピトープに特有の立体構造中に含むことができる。概して、エピトープは、少なくとも５個のかかるアミノ酸を含み、より通常は、少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸から成る。アミノ酸の立体構造を決定する方法は当技術分野では既知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴を含む。さらに、所与のタンパク質中のエピトープの同定は、当技術分野では周知の技術を使用し直ちに達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８４）  ８１：３９９８−４００２（所与の抗原中の免疫原性エピトープの場所を検出するためのペプチドを迅速に合成する一般方法）、米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定、かつ化学的に合成するための手順）、およびＧｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９８６）  ２３：７０９−７１５（所与の抗体に対する高い親和性でペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合を遮断する１個の抗体の能力を示すイムノアッセイで同定することができる。
【００４１】
「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」とは、特異的抗原への抗体の高い結合活性および／または高い親和性結合を意味する。特異的抗原上でそのエピトープに結合する抗体は、特に分子中に存在し得る目的の抗原に関連する異なるエピトープ、または目的の抗原と同一試料中の異なるエピトープへの、同じ抗体の結合より大きな結合活性および／または親和性を伴う。しかしながら、補体固定抗体は、目標の異なる抗原上の様々なエピトープに対する、同じあるいは同様の結合活性および／または親和性を有することができる。したがって、「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」は、１個以上の目的の抗原への結合からの所与の補体固定抗体を妨げることを意味しない。目標のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが、検出可能なレベル（例えば、目標のポリペプチドに示される１０％以下の結合）で、他のポリペプチドに結合する能力があり得る。かかる弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば、適切な対照の使用により直ちに目標のポリペプチドに結合している特異的抗体から識別可能である。
【００４２】
「検出可能に標識されたリガンド」または「検出可能に標識された第２リガンド」は、検出可能な標識を付着されたリガンドを意味し、該リガンドは、別の化合物に特異的に結合する能力がある。リガンドの例は、結合特異性を保持する抗体または抗体断片を含むが、それらに制限されない。検出可能な標識は化学的接合により付着され得るが、標識がポリペプチドである場合、遺伝子工学技術によって交互に付着させることが可能である。検出可能に標識されたタンパク質の産生のための方法は、当技術分野においては周知である。検出可能な標識は、当技術分野では既知の様々なかかる標識から選択することができるが、通常は、放射性同位元素、発色団、フルオロフォア、蛍光色素、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、リンカー分子、または他の部分もしくは標識をその基質に暴露後、検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）もしくは検出可能なシグナルを放出する化合物であり得る。様々な検出可能な標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および抗原を検出するため標識された第２抗体を使用するための方法は、当技術分野において周知である。［注記：例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．  （Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。］
【００４３】
「直接標識されたＣ１ｑ」とは、付着した検出可能な標識を有する外因性Ｃ１ｑ分子を意味する。検出可能な標識は化学的接合により付着され得るが、標識がポリペプチドである場合、遺伝子工学技術によって交互に付着させることが可能である。検出可能に標識されたタンパク質の産生のための方法は、当技術分野においては周知である。検出可能な標識は、当技術分野では既知の様々なかかる標識から選択することができるが、通常は、放射性同位元素、発色団、フルオロフォア、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、リンカー分子、または他の部分もしくは標識をその基質に暴露後、検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）もしくは検出可能なシグナルを放出する化合物であり得る。様々な検出可能な標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および抗原を検出するため標識された第２抗体を使用するための方法は、当技術分野において周知である。［注記：例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．  （Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。］
【００４４】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、単離された化合物の文脈中で使用される場合、該化合物が自然に発生する環境とは異なる環境に目的の化合物があることを指す。「単離された」とは、目的の化合物に対して実質的に濃縮されている、および／または目的の化合物が部分的、もしくは実質的に精製されている試料中の化合物を含むことを意味する。「単離された」という用語は、化合物が、その自然状態と通常関係のあるものと共に、少なくともある材料に付随されない例を包含する。例えば、ポリペプチドに関して「単離された」という用語は、概してアミノ酸分子が、本質としてそれと通常関係した配列、または本質として存在するが、異種配列をそれと関係して有する配列の全体として、または部分として欠くことを指す。
【００４５】
本明細書で使用される「精製された」は、記載の材料が、少なくとも約８０％を伴うことが好まれる、少なくとも約９０％が特に好まれる、少なくとも総タンパク質の約７５重量％を含むことを意味する。本明細書で使用される「実質的に純粋」という用語は、その自然環境から除去された化合物、および少なくとも６０％、好ましくは７５％、および最も好ましくは９０％が自然に関係している他の成分から遊離していることを指す。
【００４６】
本明細書で使用される「生体試料」という用語は、対象から単離された組織または液体を指し、本発明の文脈中、概して抗ＡｇＩ補体固定抗体を含有することが疑われる試料を指し、任意の処理後、試料は、インビトロアッセイで分析することができる。目的の典型的な試料は、血液、血漿、血清、血液細胞、尿、唾液、および粘液を含むが、必ずしもそれらに限定されない。試料はまた、培地中の細胞および組織の増殖、例えば、組換え細胞および細胞成分による馴化培地を含むが、それらに限定されないインビトロ細胞培養構成物の試料を含む。
【００４７】
本明細書で使用される「ヒト白血球抗原系」または「ＨＬＡ」という用語は、染色体６の短腕に約３．５百万塩基対またがる主要組織適合性複合体を指す。それは、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩ遺伝子を含有する３つの分離した領域に分割可能である。ヒトにおいて、ＨＬＡクラスＩ複合体は、長さ約２０００ｋｂであり、かつ約２０遺伝子を含有する。クラスＩ領域内には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃと指定される明確に特徴付けられたＭＨＣクラスＩ分子をコード化する遺伝子が存在する。加えて、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−ＪおよびＨＬＡ−Ｘ、ならびにＭＩＣとして既知の新規のファミリーを含む非古典的クラスＩ遺伝子が存在する。クラスＩＩ領域は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ座位として既知の３個の遺伝子を含有する。これらの遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、およびＤＱと指定される古典的ＭＨＣクラスＩＩ分子のαおよびβ鎖をコード化する。ヒトにおいて、ＤＭ、ＤＮ、およびＤＯと指定される非古典的遺伝子はまた、クラスＩＩ内において同定される。クラスＩＩＩ領域は、３６個越の遺伝子の不均一な一群を含有する。
【００４８】
本明細書で使用される「精製されたＨＬＡサブタイプ」は、下記の表で説明されるようにＨＬＡサブタイプの実質的に精製された抗原を指す。「異なるＨＬＡサブタイプ」でコーティングされたミクロビーズが参照のため使用される場合、ミクロビーズの各集団が、異なるＨＬＡ抗原サブタイプでコーティングされることを意味する。
【００４９】
本明細書で使用される「ＨＬＡ抗原集団」は、特異的細胞または組織タイプ等の自然に発生できる、または自然に発生できないいずれか１つの群に見出される、ＨＬＡ抗原の特異的集団を指す。
【００５０】
本明細書で使用される「正常ヒト集団におけるＨＬＡの分布」は、特異的細胞または組織タイプ、もしくは個体等の正常ヒト集団に見出されるＨＬＡ抗原の特異的集団を指す。
【００５１】
「査定」という用語は、測定のいずれの形態も含み、かつ要素が存在する、またはしないことを決定することも含む。「決定」、「測定」、「評価」、「査定」、および「アッセイ」という用語は、互換的に使用され、量的および質的決定を含む。査定は、相対的または絶対的であり得る。「の存在を査定」は、存在する何かの量を決定すること、および／またはそれが存在するか、または不在であるかを決定することを含む。本明細書に使用される「決定」、「測定」、「査定」、「アッセイ」という用語は、互換的に使用され、量的および質的決定の双方を含む。
【００５２】
「固体基質」という用語は、抗原および／または抗体を上に固定化させた固体の支持体を指す。例示的固体基質は、マルチウェルプレート、ニトロセルロース膜およびポリエチレン膜、細胞および細胞膜、ビーズ、微粒子、ミクロスフィア、およびミクロビーズを含む膜を含む。本発明の方法は、例えば、シリカ、金、ラテックス、ポリマー（ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエチレン、またはヒドロゲル等）のいずれの材料の微粒子、ミクロスフィア、ミクロビーズ、またはビーズを用いて行われる。加えて、微粒子、ミクロスフィア、ビーズ、またはミクロビーズは、磁性であり得る。
【００５３】
特許請求の範囲は、いずれの任意の要素も排除するように作成され得ることをさらに留意されたい。したがって、この記載は、請求項要素の記載に関連した「ただ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等の排他的用語の使用、または「負」の制限の使用に対する先の記載としての役割を果たすことを意図する。
【００５４】
本発明は、生体試料中に存在する自己補体因子Ｃ１ｑおよび自己補体因子Ｃ１ｑに結合する検出可能に標識された抗体、外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑおよび外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑに結合する検出可能に標識された抗体、検出可能に標識された外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑ、または自己補体因子Ｃ１ｑおよび外因性ヒト補体因子Ｃ１ｑの’組み合わせを含む、補体因子Ｃ１ｑを使用し、生体試料中の補体固定抗体の高感受性かつ特異的検出のための方法を提供する。また、本発明は、本発明の方法における使用のためのキット、システム、およびデバイスも特徴とする。
【００５５】
本発明が記載される前に、本発明が記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら変化することを理解されたい。本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのみの目的のためであり、限定することを意図しないこともまた理解されたい。
【００５６】
値の範囲が提供される場合、文脈によって明確に決定されない限り、その範囲の上および下限間の各介在値（下限の単位の１０分の１）がまた、具体的に開示されることを理解されたい。記載の範囲におけるいずれの記載の値または介在値およびその記載の範囲におけるいずれの他の記載の、もしくは介在値間の各小さい範囲も、本発明の範囲内に包含される。これらの小さい範囲の上限および下限は範囲内で独立して含まれる、または排除されることができる、かつ小さい範囲にどちらかが含まれる、いずれも含まれない、または双方含まれる各範囲もまた、本発明の範囲内に包含され、記載の範囲においていずれの特異的に排除される限界も対象である。記載の範囲が１つまたは双方の限界も含む場合、それらの含まれた限界のどちらか、または双方が排除される範囲はまた、本発明内に含まれる。
【００５７】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野に精通する者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等であるいずれの方法および材料も本発明の実践または試験において使用できるが、ある潜在的および好ましい方法および材料が記載される。本明細書で言及される全ての文献は、参照することにより本明細書に組み込まれ、記載の文献に関連した方法および／または材料を開示する、かつ説明する。本開示は、矛盾が存在する範囲において、組み込まれた文献のいかなる開示にも優先することを理解されたい。
【００５８】
本明細書および添付の請求項で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって明確に決定されない限り、複数形を含むことを留意されたい。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、かかる細胞の負空数を含み、「化合物（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、１つ以上の化合物、および当業者には既知のその同等物等を含む。
【００５９】
本明細書で考察されている文献は、本出願日前に先立ち、それらの開示のためのみに提供される。本明細書中のいずれも、本発明が、先の発明の特徴により、かかる文献に先行する権利がるものではない自白として見なされるべきではない。さらに、提供される公開日は、独立して確認される必要があるであろう実際の公開日とは、異なり得る。
【００６０】
検出方法
上述のように、主題発明は、生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法を提供する。主題発明の方法は、補体因子Ｃ１ｑ（例えば、自己または外因性）を、目的の抗原に特異的に結合する同一生体試料中の補体固定抗体の存在を同定するために利用する。
【００６１】
方法は、概して目的の抗原に特異的に結合する補体固定抗体を含有することが疑われる生体試料を、上に固定化させた目的の抗原（ＡｇＩ）を有する固相支持体に接触させることを有する。存在する場合、補体固定抗体は、固相支持体上に固定された抗原に特異的に結合し、かつＣ１ｑは、補体固定抗体に結合するであろう。Ｃ１ｑ結合は、次いで固相支持体を、結合したＣ１ｑに特異的に結合する検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体を接触させることにより、アッセイすることができる。あるいは、直接標識されたＣ１ｑを、このアッセイに使用することができ、検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体の使用無しで、この直接標識されたＣ１ｑの結合を直接測定することができる。
【００６２】
生体試料は、概して非補体固定抗体ならびに補体固定抗体を含むであろう。本発明の一利点は、同一試料中に存在するＣ１ｑを使用するか、または外因性Ｃ１ｑを使用するかにより、それが２つの異なる抗体間で区別できることである。同一試料中に存在するＣ１ｑを使用することにより、アッセイは、ウサギ血清に由来するもの等の異種Ｃ１ｑが使用された場合は発生しないであろう、関連する補体固定抗体の高感受性および特異的検出を提供する。
【００６３】
直ちに明確になるであろうが、本明細書に記載のアッセイの設計は、多くの変化の影響下にあり、多くのフォーマットが当技術分野において周知である。以下の記述は、単にガイダンスとして提供されており、当業者は、記載の手順を、当技術分野においては周知の技術を使用し、容易に変更することができる。
【００６４】
目的の抗原（ＡｇＩ）
抗体を誘発する能力がある抗原または抗原決定因子は、本発明における使用に対して好適である。かかる抗原または抗原決定因子は、例えば、正常ヒト［例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）］、細菌、ウイルス、寄生虫、または真菌供給源、もしくは腫瘍抗原等の異常組織に由来するものであり得る。抗原は、概して抗体が産生され得るいずれの分子でもあり得、アジュバンドの存在を必要とする、または別の分子に接合し、抗体形成を誘導することを必要とする分子を含む。抗原は、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、核酸、もしくは脂質であり得る。また、「抗原」という用語は、例えば、機能的ドメインまたは生物学上関連のあるモチーフを含有するタンパク質のサブユニット、またはタンパク質の断片等を含む自然に発生する分子の部分を含む。好適な抗原は、細胞周期、組織特異的タンパク質、腫瘍マーカー、サイトカイン、主要組織適合性複合タンパク質、ヒートショックタンパク質、および病原体関連タンパク質（病原体は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、多寄生虫、またはプリオンであり得る）に関連するタンパク質、ならびに輸血抗原および組織適合試験、リポ多糖、スフィンゴ脂質等に関連する炭水化物残渣を含むが、それらに制限されない。例示的抗原は、動物を疾患から保護する免疫応答を誘発するものである。かかる抗原の例は、原虫寄生虫抗原、蠕虫寄生虫抗原、エクト寄生虫抗原、真菌抗原、細菌性抗原、およびウイルス性抗原を含むが、それらに制限されない。
【００６５】
ウイルス性抗原の例は、肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザＡウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルスウイルス（ＲＳＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、および麻疹ウイルス等のウイルスに由来する抗原を含む。細菌性抗原の例は、アクチノミセス、桿菌、バクテロイド、ボルデテラ、バルトネラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、キャプノサイトファーガ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、コクシエラ、デルマトフィルス、腸球菌、エーリキア、エシェリキア、フランシセラ、フソバクテリウム、ヘモバルトネラ、ヘリコバクター、クレブシエラ、Ｌ型細菌、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリア、マイコプラズマ、ネオリケッチア、ノカルジア、パスツレラ、ペプトコッカス、ペプトストレプトコッカス、プロテウス、シュードモナス、リケッチア、ロシャリメア、サルモネラ、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、およびエルシニアからの抗原を含むが、それらに制限されない。真菌抗原の例は、アブシディア、アクレモニウム属、アルテルナリア属、コウジカビ、バシジオボラス属、ビポラリス属（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）、ブラストミセス、カンジダ、クラミジア、コクシジオイデス、コニディオボラス、クリプトコッカス、クルブラリア、表皮菌（エピデルモフィトン属）、エクソフィアラ属、ゲオトリクム属、ヒストプラズマ、マヅレラ属、マラセチア属、小胞子菌、モニエラ属（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）、モルチエレラ、ケカビ属、ペシロマイセス属、アオカビ属、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）、フィアロフォラ属、プロトテカ属、シュードアレシェリア属、Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ、フハイカビ属、リノスポリジウム属、リゾプス属、スコレバシジウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロトリクス属、ステムフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、白癬菌属、トリコスポロン属、およびキシロヒファ属からの抗原を含むが、それらに制限されない。原虫および蠕虫寄生虫抗原の例は、バベシア、バランチジウム属、ベスノイティア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）、クリプトスポリジウム、エイメリア、エンセファリトゾーン属、エントアメーバ属、ジアルジア属、ハモンジア属、ヘパトゾーン属（Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ）、イソスポーラ属、リーシュマニア属、微胞子虫、ネオスポラ属、ノゼマ属、腸トリコモナス、プラスモジウム属、ニューモシスチス属、肉胞子虫属、住血吸虫属、タイレリア属、トキソプラズマ、およびトリパノソーマ属、アカントケイロネマ属、アエルロシトロンギルス属（Ａｅｌｕｒｏ円虫属）、鉤虫属、住血線虫属、回虫属、ブルギア属、ブノストムム属（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、毛細線虫属、大口腸線虫属、クーペリア属、クレノソーマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）、ディクチオカウルス属、ジンチュウ属、ディペタロネマ属、裂頭条虫属、ジプリジウム属（Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍ）、イヌ糸状虫属、ドラクンクルス属、エンテロビウス属、フィラロイデス属、ヘモンクス属、ラゴキルアスカリス属、ロア糸状虫属、マンソネラ属、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）、アメリカ鉤虫属、ネマトジルス属、腸結節虫属、オンコセルカ属、肝吸虫属、オステルタギア属、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）、肺吸虫属、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）、フィサロプテラ属、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏ円虫属）、セタリア属、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）、スピロメトラ属、ステファノフィラリア属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ）、糞線虫属、円虫属、テラジア属、トキサスカリス属、トキソカラ属、旋毛虫属、毛様線虫属、鞭虫属、ウンシナリア属、およびウケレリア属からの抗原を含むが、それらに制限されない。エクト寄生虫抗原の例は、ノミからの抗原（保護抗原ならびにアレルゲンを含む）；カタダニおよびヒメダニを含むマダニ；小昆虫、蚊、スバエ、ブユ、ウマバエ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ症原因バエ、およびヌカカ（ｂｉｔｉｎｇ  ｇｎａｔ）等のハエ；アリ；クモ、シラミ；ダニ；トコジラミおよびサシガメ（ｋｉｓｓｉｎｇ  ｂｕｇ）等の半翅類の昆虫を含むが、それらに制限されない。
【００６６】
例示的抗原は、カルシウイルス抗原、コロナウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、免疫不全ウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、汎白血球減少ウイルス抗原、小細胞性ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、バルトネラ抗原、エルシニア抗原、エルシニアイヌフィラリア属抗原、トキソプラズマ抗原、腫瘍抗原、ノミ抗原、ノミアレルゲン、小昆虫抗原、小昆虫アレルゲン、ダニ抗原、およびダニアレルゲンを含むが、それらに制限されない。特に好まれる抗原は、狂犬病ウイルスグリコタンパク質Ｇ抗原；フィラリアＰＬＡ２、Ｐ３９、Ｐ４、Ｐ２２Ｕ、Ｇｐ２９、アスタシン、システインプロテアーゼ、マクロファージ移動阻害剤因子、毒液アレルゲン、ＴＰＸ−１、ＴＰＸ−２、トランスグルタミナーゼ、アンキリン、およびアスパラギナーゼ抗原；ノミセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、セルピン、カルボキシエステラーゼ、幼若ホルモンエステラーゼ、およびエポキシドヒドロラーゼ抗原；ノミ唾液抗原；エルシニアＦ１ならびにＶ抗原；およびキソプラズマ原虫抗原を含む。
【００６７】
本発明で使用される抗原は、遺伝子組換え方法または遺伝子組換えにより測定された遺伝子配列またはペプチド配列の基礎上で化学的に合成されることによって、産生されるものであり得る。したがって、それは、すでに既知のゲノム配列またはＤＮＡ配列が天然ウイルスからの分子クローニングにより得られるといったような様式により調製される組換え抗原であり、または遺伝子組換え技術の利用による細胞は、酵素等で処理され、あるいは化学合成の処理を受ける、かつ得られたＤＮＡ配列または修飾ＤＮＡ配列は、微生物、動物、植物、昆虫等で発現され、組換え抗原を得る、あるいはそれは、ペプチドまたは液相方法として既知のペプチド化学合成の方法、または上記の情報を利用する固相方法により調製される修飾ペプチドである。ペプチドに対する固相合成方法は、自動ペプチド合成装置により、有利な様式で通常行うことができる。
【００６８】
予吸収
幾つかの実施形態において、生体試料を、最初に任意で交差反応性抗原に接触させる。概して、生体試料を交差反応性抗原に接触させることは、生体試料中の交差反応性抗体の欠乏をもたらすが、抗ＡｇＩ（目的の抗原）特異的補体固定抗体は欠乏させず、存在する場合には、（例えば、本明細書に記載されるように特異的抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体を検出するアッセイの使用による）検出可能なレベルで試料中に残存する。したがって、生体試料に接触するため使用される交差反応性抗原は、概して、予吸収された生体試料中の抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の存在または不在を検出するために使用されるＡｇＩを含まない。
【００６９】
接触は、例えば、本明細書に記載されるように、生体試料に１つ以上の交差反応性抗原を接触させることにより達成できる。生体試料を交差反応性抗原に接触させ、次いで連続的に特異的固体の支持体を固定化させたＡｇＩに接触させることができる。幾つかの実施形態において、試料中の特異的抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の検出前に、試料から非特異的抗体を「予吸収」する本発明に従い、生体試料を交差反応性抗原に接触させる。具体的に別途表示されない限り、本明細書で使用される「予吸収」は、生体試料を、最初に交差反応性抗原に接触させ、続いて試料をＡｇＩに接触させることを必ずしも示唆してはおらず、むしろ試料が交差反応性抗原に暴露される後まで、特異的抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体が検出されないことを意味している。
【００７０】
試料調製
主題方法を実践するにおいて、対象からの試料は、抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の存在に対してアッセイされる。幾つかの実施形態において、アッセイされる試料は、ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体を含有する最初の供給源である試料であるか、それに由来する試料である。他の実施形態において、試料は、不十分な補体を含有する最初の供給源であるか、あるいはそれから得られる。かかる試料は、補体またはＣ１ｑが熱失活により破壊されたもの、および外因的にＣ１ｑが供給されたものを含む。故に、好適な試料供給源は、ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体が放出された液体に由来するであろう。目的の試料供給源は、多くの異なる体液、特に血液または血液産物、例えば、血清、血漿、および全血、血液細胞、および尿を含むが、それらに制限されない。試料の量は、特異的アッセイフォーマットに適合する任意の量であり得る。幾つかの実施形態において、ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体の存在または不在に対するアッセイの前に、試料は、好適な溶液に希釈されるであろう。概して、生体試料を希釈するのに好適な溶液は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を含み、かつ例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の非特異的遮断薬、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００等の洗浄剤等の添加物を含んでもよい。
【００７１】
アッセイの適切な対照試料は、抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体を有さないヒト対象から収集された血液、血清、全血、または尿（すなわち、陰性対照）、あるいは、既知の所定量の抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体を含有する試料（すなわち、陽性対照）を含むが、それらに制限されない。
【００７２】
多くの実施形態において、ヒト試料に対して好適な最初の供給源は、血液試料である。したがって、主題アッセイで用いられる試料は、概して血液由来試料である。血液由来試料は、全血またはその留分、例えば、血清、血漿等に由来し得、幾つかの実施形態において、試料は、凝固させた血液およびアッセイに使用するために分離かつ収集された血清に由来する。
【００７３】
試料が血漿、血清、または血清由来試料である幾つかの実施形態において、試料は、概して液体試料である。液体血清試料を産生するためのいずれの有用な方法も用いられ得る。多くの実施形態において、方法は、皮膚穿刺（例えば、指穿刺、静脈穿刺）により静脈血を血餅または血清分離管に採血し、血液を凝固させ、血液凝固から血清を遠心する。血清は、アッセイされるまで、次いで収集かつ貯蔵される。同様に、血漿試料は、血液細胞が管底に収集されるように、静脈血を管に採血する、かつ血液を遠心することにより、患者から収集することができる。血液血漿である試料の液状部分は、次いで収集され、アッセイまで貯蔵される。一度患者由来試料が得られると、試料は、抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の存在を決定するためにアッセイされる。
【００７４】
主題試料は、抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の存在の検出を向上させるように、様々な手段で処理することができる。例えば、試料が血液である場合、アッセイ前に赤血球は試料から除去され得る（例えば、遠心分離により）。また、検抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の存在の検出は、当技術分野では周知の手順（例えば、酸沈殿（ａｃｉｄ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、アルコール沈殿（ａｌｃｏｈｏｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、塩沈殿（ｓａｌｔ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、疎水性沈殿（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、濾過（３０ｋＤより大きい分子を保持する能力があるフィルターを使用、例えば、Ｃｅｎｔｒｉｍ３０（商標））、親和性精製）を使用し、試料を濃縮することにより、向上することができる。
【００７５】
アッセイフォーマット
ＡｇＩを固定化させた固体の支持体は、生体試料中の反応性抗ＡｇＩ特異的補体固定抗体の存在または不在を検出するための診断として、本明細書で使用される。典型的には、アッセイは、概して抗原補体固定抗体複合体が結合される、固相支持体からの液相中の非結合抗体の分離を含む。アッセイは、概して実質的に平らな固体の支持体（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態）に関して図１、図２、および図３に記載され、かつミクロビーズ固体支持体に関して図４、図５、および図６に記載される。本発明の実践において使用できる固体支持体は、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態で）等の基質；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレン；ラテックス（例えば、ビーズ、ミクロビーズ、微粒子、微小球、またはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ紙；ナイロン膜；ポリエチレン膜、活性化ビーズ、磁気応答性ビーズ、細胞、および細胞膜等を含む。
【００７６】
幾つかの実施形態において、生体試料は、アッセイ前に、好適な溶液に希釈されるであろう。概して、生体試料を希釈するのに好適な溶液は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を含むであろう、かつ例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の非特異的遮断薬、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００等の洗浄剤等の添加物を含み得る。
【００７７】
概して、固体の支持体は、成分が支持体に十分に固定化するように、好適結合条件下で、第１に液相成分（例えば、１つ以上の目的の特異的抗原（ＡｇＩ））で反応させる。任意で、支持体への抗原の固定化は、最初にＡｇＩをより優れた結合特性を有するタンパク質にカップリングさせることにより向上できる。好適カップリングタンパク質は、当業者には周知のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵白アルブミン、および他のタンパク質を含む血清アルブミン等のマクロ分子を含むが、それらに制限されない。抗原を支持体に結合させるために使用できる他の分子は、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体等を含む。これらの分子をＡｇＩにカップリングするためのかかる分子および方法は、当業者には周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，  Ｍ．Ａ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  （１９９２）  ３：２−１３，  Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９８４）  ６：５６−６３、およびＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｏｓ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  （１９８７）  ３０：１１７−１２４を参照されたい。
【００７８】
固体の支持体をＡｇＩに接触させた後、非固定化されていないＡｇＩは、洗浄により支持体から除去される。次いで支持体結合ＡｇＩを、好適結合条件下で、抗ＡｇＩ補体固定抗体を含有することが疑われる生体試料と接触させる。存在する場合、補体固定抗体は、固定化させたＡｇＩに特異的に結合するであろう。試料中に存在するＣ１ｑ（例えば、自己または外因性）は、固相支持体上に固定化させたＡｇＩに結合している補体固定抗体に結合するであろう。試料中に存在するＣ１ｑは、生体試料自体からの自己Ｃ１ｑであり得るか、あるいは外因性Ｃ１ｑであってもよい。幾つかの実施形態において、結合Ｃ１ｑは、次いで固相支持体を、Ｃ１ｑに特異的に結合する検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体と接触させることにより、アッセイされる。次いで検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体の存在は、当技術分野では周知の技術を使用して検出できる。
【００７９】
幾つかの実施形態において、アッセイは連続的な様式で行われ、第１に、固相支持体を抗ＡｇＩ補体固定抗体およびＣ１ｑを含有する生体試料に接触させ、次いで固相支持体を検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体に接触させる。このアプローチは、図１に記載されている。他の実施形態において、固相支持体を、生体試料および検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体の双方を同時に接触させる。このアプローチは、図２に記載されている。
【００８０】
幾つかの実施形態において、検出可能に標識された外因性Ｃ１ｑがアッセイに使用される。かかる実施形態において、固相支持体を、目的の試料および検出可能に標識された外因性Ｃ１ｑの双方に同時に接触させる。結合Ｃ１ｑは、次いで当技術分野では周知の技術を使用し、検出される。このアプローチは、図３に記載されている。
【００８１】
より具体的には、幾つかの実施形態において、ＥＬＩＳＡ方法を使用することができ、マイクロタイタープレートのウェルは、特異的ＡｇＩでコーティングされる（例えば、特異的ＡｇＩが表面上に固定される）。抗ＡｇＩ補体固定抗体およびＣ１ｑ（例えば、自己または外因性）を含有している、あるいは含有することが疑われる試料は、次いでコーティングされたウェルに添加される。任意に、対照として、既知の濃縮の抗ＡｇＩ補体固定抗体を含有している一連の標準物質を、試料またはその一定分量と並行してアッセイできる。概して、希釈された、あるいはそうでない約０．００１〜１ｍｌの試料が十分であり、通常は約０．０１ｍｌで十分である。さらに、ある実施形態において、各試料および標準物質は、それぞれの平均値が得られるように、複数のウェルに添加されるであろう。試験および対照試料は、抗原に対する抗体の結合を発生させるのに十分な時間、固体の支持体とそれぞれインキュベートされる。概して、約０．１〜３時間が十分であり、通常１時間で十分である。
【００８２】
固定化させたＡｇＩに対して抗体を結合させ、かつ固定化させたＡｇＩに結合した補体固定抗体に対して試料中に存在するＣ１ｑを結合させるのに十分な時間インキュベーションさせた後、プレートを任意に洗浄して結合していない抗体を除去することができる。概して、適切なｐＨ、概して７〜８で希釈非イオン性洗浄剤媒が、洗浄媒として使用できる。リン酸塩緩衝生理食塩水等の等張緩衝液を、洗浄段階で用いることができる。ある実施形態においては、アッセイ中に洗浄は実行されない。
【００８３】
別の実施形態において、抗ＡｇＩ補体固定抗体を含有している、あるいは含有していることが疑われる生体試料を、溶液中の交差反応性抗原に接触させて、予吸収した混合物を得る。抗体が交差反応性抗原に結合するのに十分なインキュベーションの期間後、「残留」抗体を含有する予吸収された混合物は、次いで特異的ＡｇＩでコートされたマイクロタイタープレートのウェルに添加される。予吸収した混合物からの「残留」抗ＡｇＩ補体固定抗体を固定化したＡｇＩに対して結合させ、かつ固定化したＡｇＩに結合している補体固定抗体に対して試料中に存在するＣ１ｑ（例えば、自己または外因性）を結合させるのに十分な時間インキュベーションした後、プレートを任意に洗浄して、結合していない抗体を除去できる。ある実施形態では、洗浄は実行されない。検出可能に標識された第２の結合分子が添加され、補体固定抗体に結合しているＣ１ｑに結合する。第２の結合分子は、抗ＡｇＩ補体固定抗体（例えば、表面に固定化させた特異的ＡｇＩ抗原に結合している補体固定抗体）に結合しているいずれのＣ１ｑ（例えば、自己または外因性）と反応可能であり、プレートは、任意で洗浄され、第２の結合分子の存在が当技術分野では周知の方法を使用して検出される。
【００８４】
したがって、一特定の実施形態において、生体試料からの結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体および自己Ｃ１ｑの存在は、自己Ｃ１ｑに対する抗体を含む第２の結合剤を使用することで容易に検出できる。別の実施形態において、生体試料からの結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在は、直接標識された外因性Ｃ１ｑを含む第２の結合剤を使用することで、容易に検出できる。多くの抗ヒトＣ１ｑ分子が当該技術分野において知られており（例えば、市販のヤギ抗ヒトＣ１ｑ、ヒツジ抗ヒトＣ１ｑ等）、これらは自己または外因性のＣ１ｑの直接的または間接的検出を容易にする検出可能な標識に容易に結合可能である。免疫複合体の直接測定を可能とする標識の例は、３Ｈまたは１２５Ｉ、フルオロフォア、色素、ビーズ、化学発光、コロイド粒子等の放射性標識を含む。結合の間接測定を可能とする標識の例は、基質が有色または蛍光生成物を提供する酵素を含む。標識は、直接的に（例えば、放射性同位元素）、あるいは１個以上の追加の分子（例えば、標識化抗体に結合するエピトープ）に結合することによって、検出される。本発明に従い使用され得る蛍光化合物の非限定的例は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）もしくはＡｌｅｘａ４８８、Ｃｙ３、またはＣｙ５および緑色の蛍光タンパク質、ならびにフィコエリトン（ＰＥ）ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、ＥＣＤ等の蛍光色素を含む。幾つかの実施形態において、抗体は、好適基質の添加後、検出可能な生成物シグナルを提供する能力がある共有結合的に結合した酵素で標識される。複合体で使用されるのに好適な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素等を含む。市販でない場合、かかる抗体−酵素複合体は、当業者には既知の技術により容易に産生される。
【００８５】
かかるアッセイにおいて、検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体または直接標識されたＣ１ｑの濃度は、概して約１５０μｇ／ｍｌ等の約０．１〜５００μｇ／ｍｌであろう。検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体を含有する溶液は、概して約ｐＨ６．５〜９．５の範囲で緩衝化される。インキュベーションの時間は、検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体が、利用可能である自己または外因性Ｃ１ｑに結合するのに十分であるべきである。概して、約０．１〜３時間で十分であり、通常４０分で十分である。非特異的結合材料が除去された後、結合した検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体により産生されたシグナルが、従来の方法により検出される。例えば、検出可能な標識が蛍光化合物である場合、標識の存在は、フローサイトメトリーまたはＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭａｐ  ｓｙｓｔｅｍ等の他の同様の技術を使用して検出することができる。酵素抱合体が使用される場合、検出可能な生成物が形成されるように適切な酵素基質が提供される。さらに具体的には、ペルオキシダーゼが選択された酵素抱合体である場合、好ましい基質の組み合わせは、適切な反応条件下で有色生成物をもたらすＨ２Ｏ２およびＯ−フェニレンジアミンである。上記で開示されたもの等の他の酵素抱合体に対して適切な基質は、当業者には既知である。また、様々な有益な抱合体またはそれらの生成物を検出するための好適な反応条件ならびに方法は、当業者には既知である。例えば、基質Ｏ−フェニレンジアミンの生成物に関しては、４９０〜４９５ｎｍの吸光度が都合良く分光光度計により測定される。．
【００８６】
また、アッセイは、生体試料中に存在するＡｇＩおよび抗体が沈殿条件下で複合体を形成するように、溶液中で実施できる。一特定の実施形態において、特異的ＡｇＩを、直接化学的または間接的カップリングによる等の当技術分野では既知のカップリング技術を使用して、固相粒子（例えば、アガロースビーズ、ラテックスビーズ等）に固定化できる。ＡｇＩコーティングされた粒子および遊離型交差反応性抗原（例えば、固相粒子に固定化されていない）を、次いで好適な結合条件下で抗ＡｇＩ補体固定抗体を含有していることが疑われる生体試料に接触させる。結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体およびＣ１ｑ（例えば、自己または外因性）間の架橋結合は、粒子−抗原−抗体複合凝集体の形成を引き起こし、洗浄および／または遠心分離を使用して沈殿かつ、試料から分離できる。反応混合物を、検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体を含む上述のそれらの免疫診断方法等の多くの標準手段のいずれかを使用して、抗体抗原複合体の存在または不在を決定するために分析できる。
【００８７】
さらなる実施形態において、特異的ＡｇＩを第１の固相粒子（例えば、アガロースビーズ等）に固定化でき、交差反応性抗原を第２の固相粒子（例えば、磁気ビーズ）に固定化でき、ここで第１の固相粒子および第２の固相粒子は異なる。かかる実施形態において、交差反応性抗原でコーティングされた粒子および特異的ＡｇＩでコーティングされた粒子を、次いで好適結合条件下において抗ＡｇＩ補体固定抗体が含有されることが疑われる生体試料に接触させる。粒子−交差反応性抗原−抗体複合体は、次いで試料から分離される。例えば、交差反応性抗原が磁気ビーズ等の第１の粒子に結合する場合、粒子−交差反応性抗原−抗体複合体は、多くの標準手段のいずれかを使用して溶液から分離され得る。次いで、反応混合物を、上述の方法を使用して、補体固定抗体−特異的ＡｇＩ抗原複合体の存在または不在を決定するため分析することができる。
【００８８】
さらなる別の実施形態において、本発明を使用する感染（例えば、細菌性またはウイルス性）を診断するための方法は、特異的ＡｇＩに交差反応できるいずれの抗体も除去するため、第１に任意で試料を交差反応性抗原に接触させること、次いで試料中の抗ＡｇＩ補体固定抗体を結合するために、試料を特異的ＡｇＩに接触させることにより、試料中の抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在または不在を検出するためのアッセイデバイスの使用を含む。かかる実施形態において、アッセイデバイスは、少なくとも試料適用領域、予吸収ゾーン、および検出ゾーンを含み、ニトロセルロース膜ストリップ等の液体流動を行う能力がある膜から構成されるであろう。任意で、膜は、ポリエチレンストリップ等の剛性または半剛性の支持面上に提供され得る。代表的実施形態において、予吸収ゾーンは、試料適用領域および検出ゾーン間に挿入されるであろう。ゾーンの場所は、液体の膜に沿った側方流動が、試料の全ての成分を、第１に予吸収ゾーンに接触させ、次いで検出ゾーンに接触させることを引き起こすような場所であろう。したがって、試料適用領域からの膜に沿った液体流動は予吸収ゾーンの方向に向かい、次いで検出ゾーンは、膜を介した毛管現象により促進される。側方流動アッセイデバイスを使用する例示的側方流動アッセイデバイスおよび検出方法は、例えば、米国特許第６，１４６，５８９号に提供されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
代表的実施形態において、交差反応性抗原は、予吸収ゾーン中に固定化され、特異的ＡｇＩは、検出ゾーン中に固定化される。抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在または不在の検出は、第１に試料を試料適用領域に添加すること、膜ストリップを通る毛管現象により試料を移動させることにより行われる。試料が膜ストリップを越えて移動するため、試料が第１に予吸収ゾーン中に固定化された交差反応性抗原と接触し、予吸収された試料が得られる。予吸収された試料は、次いで検出ゾーンに移動し、固定化された特異的ＡｇＩに接触する。存在する場合、抗ＡｇＩ補体固定抗体は、固定化されたＡｇＩに特異的に結合し、Ｃ１ｑ（例えば、自己または外因性）は、次いで抗ＡｇＩ補体固定抗体に特異的に結合する。検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体は、次いで検出ゾーンと接触し、Ｃ１ｑおよび抗ＡｇＩ補体固定抗体複合体の存在を上述のように検出する。検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体分子は、捕捉された試料Ｃ１ｑにも反応し、この第２の結合分子の存在は、上述の方法および当技術分野では周知の方法を使用して検出される。
【００９０】
上述の実施形態のいずれにおいても、非特異的に結合したタンパク質または他の分子の存在を完全に洗い流されるのに十分な量で、１〜６回の洗浄が用いられ得る。
【００９１】
キット
上述のように主題方法を実践するにあたって使用を見出されるキットがまた提供される。主題方法を実践するためのキットは、抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在または不在についてヒト対象に由来する試料をアッセイするための試薬を少なくとも含み、かかるキットは、特異的ＡｇＩ、および／または特異的ＡｇＩ、検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体、直接標識された外因性Ｃ１ｑ、ならびに酵素基質等のシグナル産生系のメンバーを含む免疫アッセイデバイス、主題検出アッセイを行うにあたっての使用のための様々な緩衝液、試料中の抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在または不在を決定するための参照等を含む。
【００９２】
幾つかの実施形態において、組成物は、生体試料を希釈するのに好適な溶液中で提供されるであろう。概して、生体試料を希釈するのに好適な溶液は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を含むであろう、かつ例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の非特異的遮断薬、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００等の洗浄剤等の追加の物品を含み得る。
【００９３】
キットはさらに、ヘパリン、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ、溶解緩衝液、プロテアーゼ阻害剤等の、患者由来試料の調製において使用され得る、１つ以上の試薬を含む。加えて、主題キットは、例えば、ポリアクリルアミドゲルの乾燥前駆物質、１つ以上の緩衝媒体またはその成分等の電気泳動媒体またはその前駆物質等の試料の分画で用いられる、１つ以上の成分をさらに含み得る。
【００９４】
ある実施形態において、キットはさらに、少なくとも情報ストレージおよび提示媒体を含み、媒体は、アッセイ結果が感染を診断するために比較され得る参照データ、例えば、上述のように、細菌性またはウイルス性供給源に由来する目的の抗原に特異的に結合する抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在と、正または負に相関する参照データを含有する。情報ストレージおよび提示媒体は、添付文書上に印刷された情報、電子貯蔵媒体上に存在する電子ファイル、例えば、磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ等の任意の有用な形態であり得る。さらに他の実施形態において、キットは、参照データを得るための代替の方法を含み得る、例えば、参照データ「オンライン」を得るためのウェブサイトである。
【００９５】
キットは、患者試料を得るための手段、例えばシリンジをさらに含んでもよい。主題キットは、主題方法を行うための説明書をさらに典型的には含み、これらの説明書は、添付文書および／またはキットの梱包上で存在し得る。最後に、キットは、抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在を検出するのに使用される、追加の生化学的アッセイからの１つ以上の試薬をさらに含み得る。
【００９６】
キットの成分は別々の容器に存在し得るか、あるいは１つ以上の成分は同一容器に存在し得、容器は、貯蔵容器および／またはキットが設計されているアッセイのための容器であり得る。
【００９７】
デバイス
上述のように、主題方法を実践するにあたって使用が見出されるデバイスが提供される。主題方法を実践するためのデバイスは、抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在または不在に対する、ヒト対象に由来する試料のアッセイのための試薬を少なくとも含み、かかるデバイスは、特異的ＡｇＩおよびアガロースまたはラテックスビーズ等のマイクロタイタープレートまたはミクロビーズ等の固体支持体の表面上に任意で固定化された交差反応性抗原を含む。
【００９８】
ある実施形態において、マイクロタイタープレートは、プレートの各ウェルの表面に固定化された唯一のＡｇＩと共に提供されるであろう。他の実施形態において、マイクロタイタープレートは、プレートの各ウェルの表面上に固定化された同一ＡｇＩと共に提供されるであろう。ある実施形態において、ミクロビーズの集団は、ミクロビーズの集団の表面に固定化されたＡｇＩと共に提供されるであろう。ある実施形態において、ミクロビーズの集団は、ミクロビーズの各サブ集団の表面に固定化された唯一のＡｇＩと共に提供されるであろう。例えば、ミクロビーズの集団は、各サブ集団が唯一の固定化されたＡｇＩを含む１０個のサブ集団を含むように提供されるであろう。例えば、ＨＬＡクラスＩ抗原（表１および表３）の３０個およびＨＬＡクラスＩＩ抗原（表２および表４）の３０個は、単一抗原形態（表１および２）か、あるいは１個のＨＬＡサブタイプに特異的に結合する補体固定抗体を同定するにあたっての使用のためのサブ集団（表３および４）中で、ラテックスビーズ等のミクロビーズの表面上に固定化され得る。
【００９９】
【表１】
2015007651.tif 000003
【０１００】
【表２】
2015007651.tif 000004
【０１０１】
【表３】
2015007651.tif 000005
【０１０２】
【表４】
2015007651.tif 000006
【０１０３】
多数のかかるデバイスは、当技術分野において周知である。非限定的実施例において、デバイスは、直接化学的または間接的カップリング等により、当技術分野において既知のカップリング技術を使用して固相粒子（例えば、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ等）に固定化されたＡｇＩを含む。粒子−ＡｇＩ複合体は、次いで上述のアッセイで使用できる。幾つかの実施形態において、ＡｇＩは、例えば、ポリペプチド等の結合部分により、固相粒子に固定化される。
【０１０４】
該デバイスと共に実践される方法において必要とされるまたは所望される追加の物品が、存在し得、該追加の物品は、患者試料を得るための方法、例えば、シリンジ；ヘパリン、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ、溶解緩衝液、プロテアーゼ阻害剤等の患者由来試料の調製のために必要不可欠である１つ以上の試薬；題デバイスを使用して主題方法を行うための説明書；抗ＡｇＩ補体固定抗体の存在または不在を検出するのに使用される、追加の生化学的アッセイからの１つ以上の試薬を含むが、それらに制限されない。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、デバイスはまた、生体試料を希釈するために好適な溶液と共に提供される。概して、生体試料を希釈するために好適な溶液は、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を含むであろう、かつ例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の非特異的遮断薬、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００等の洗浄剤等の追加の物品を含み得る。
【０１０６】
別の非限定的実施例において、装置は、少なくとも３つの領域（液体輸送領域、試料領域、および測定領域）を有するニトロセルロース膜等の好適なフィルターまたは膜の持続的流動経路を、概して用いるであろう。試料を受取する前に、試料領域は、液体伝達が流動経路の他の部分に接触するのを防がれる。試料領域が試料を受取した後、それは、液体輸送領域（例えば、試料領域は液体輸送領域と流体車通である）と、液体伝達関係をもたらされる。液体伝達領域は、交差反応性抗体を結合するために、固定化された交差反応性抗原を任意で有し得る。液体輸送領域の試料受取後、それは、測定領域と、液体伝達関係をもたらされる（例えば、液体輸送領域は測定領域と流体連結である）。測定領域には、特異的ＡｇＩが固定化されており、次いで検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体がアッセイされた試料と組み合わされ、上記のようにアッセイが実行される。
【０１０７】
さらなる別の非限定的実施例において、デバイスは尿試験紙であり、その表面の異なる領域に、（１）特異的ＡｇＩ、および任意で（２）交差反応性抗原、親和性試薬が結合している。かかる例示的デバイスにおいて、特異的ＡｇＩへの抗ＡｇＩ補体固定抗体の結合およびその後の結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体に対するＣ１ｑ（例えば、自己または外因性）の結合を可能とするのに好適な条件下で、尿試験紙を、ヒト対象に由来する試験試料（例えば、血液、血清、または尿）に直接挿入する。尿試験紙は、次いで試料から取り出され、必要であれば、非特異的結合物質を除去するために洗浄される。尿試験紙は次に、ヒトＣ１ｑに特異的に結合する検出可能に標識された抗Ｃ１ｑ抗体、または断片、またはその模倣薬を含有する容器に挿入される。ヒトＣ１ｑおよび抗ＡｇＩ補体固定抗体−ＡｇＩ複合体への抗Ｃ１ｑ抗体の結合に対して十分な時間のインキュベーション後、尿試験紙は、洗浄され得、抗Ｃ１ｑ抗体の結合が標準手段により検出される。第２の抗体の検出が必要である場合、尿試験紙は、第２の抗体上の検出可能な標識を活性化する試薬を含有する第２の容器に挿入され得る。あるいは、同様の実施形態は、抗Ｃ１ｑ抗体に代わり直接標識された外因性Ｃ１ｑを使用できる。かかる実施形態において、尿試験紙が試料から取り出された後、尿試験紙は洗浄され得、直接標識された外因性Ｃ１ｑの結合は標準的な方法により検出され得る。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、本発明を作製および使用するための完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、発明者が彼らの発明の範囲であると見なす範囲を限定することを意図しておらず、以下の実験が全てまたは実施された実験のみであるとして表すことも意図しない。使用された温度（例えば、量、温度等）に関しては正確性を保証する努力が成されてはいるが、幾つかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別途表示されない限り、部分は重量による部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気気圧で、または大気気圧付近でのものである。
【０１０９】
実施例１
Ｃ１ｑ  ＨＬＡ抗体アッセイ
方法および材料
以下の方法および材料を、以下の実施例において使用した。
【０１１０】
材料
ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ  Ｓｉｎｇｌｅ抗原およびＰＲＡキットをＯｎｅ  Ｌａｍｂｄａ（Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）より購入した。ヒツジ抗ヒトＣ１ｑのＰＥ抱合体を、Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．  （Ｓａｃｏ，  Ｍａｉｎｅ  ０４０７２）より購入した。ＩＶＩＧ（Ｇａｍｉｍｍｕｎｅ−Ｎ）、０．２Ｍのグリシン中１０％、ｐＨ４．４が、Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供された。
【０１１１】
方法
１．    細胞傷害性依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
１０−Ｓ−１５０  細胞傷害性交差適合−Ｔ細胞。
１０−Ｓ−１５１  細胞傷害性交差適合−Ｂ細胞。
２．    ＣＤＣインビトロ静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）阻害
１０−Ｓ−１５０  細胞傷害性交差適合−Ｔ細胞。
１０−Ｓ−１５１  細胞傷害性交差適合−Ｂ細胞。
３．    Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩｇＧ（シングル抗原ビーズおよびＰＲＡビーズ）：
１０−Ｓ−１２７  ＬＵＭＩＮＥＸ  ＩｇＧシングル抗原ビーズアッセイ。
４．    Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃ１ｑ（シングル抗原ビーズおよびＰＲＡビーズ）実験手順
以下の手順を、シングル抗原ビーズおよびＰＲＡビーズのＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃ１ｑ実験手順に対して使用した、
４．１． ２０ｕｌの血清を、２．５ｕｌのＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ−Ａｇでコーティングされたビーズ（シングル抗原／混合抗原ビーズ）と２０分室温でトレーシェイカーにおいてインキュベートした、
４．２． 洗浄無しで、１０ｕｌのＰＥ抱合された抗ヒトＣ１ｑを添加し、さらに２０分レーシェイカーにおいて継続してインキュベートする、
４．３． ビーズを２００ｕｌのＬｕｍｉｎｅｘ洗浄緩衝液で２回洗浄し、６０ｕｌのＰＢＳで再懸濁する。
４．４． 試料を得、Ｌｕｍｉｎｅｘ機器上でデータを収集する、
４．５． ＬＡＢＳｃｒｅｅｎソフトウェアを使用してデータ分析を進める。
【０１１２】
カットオフ設定
陽性ＨＬＡ−Ａｂ特異性は、以下の２つの判断基準の双方を充たさなければならない、
ａ．  スコアは、Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａに提供される式に基づき＞４であるべきである、かつ
ｂ．  ＰＥの未加工の蛍光シグナルは、＞１００であるべきである。
【０１１３】
５．    ＩＶＩＧインビトロ阻害Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃ１ｑ試験のための試料調製
以下の３つの試料を、インビトロＩＶＩＧ阻害試験において使用した、
ａ．  未希釈血清（既知の抗ＨＬＡ特異性）、
ｂ．  ［１０％ヒトアルブミン、０．２Ｍグリシン／ＰＢＳ］緩衝液中１：２で希釈された血清；ｐＨ７．４
ｃ．  １０％のＩＶＩＧ（担体として０．２Ｍのグリシン緩衝液中の）中１：２で希釈された血清；ｐＨ〜４．４。
【０１１４】
ＩＶＩＧ阻害アッセイ対照としての役割を果たすために、上記のように調製されたＡＢ陰性非感作男性血清
【０１１５】
６．    インビトロ阻害ＣＤＣ試験のための試料調製
希釈液として使用された０．２Ｍのグリシン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を除き、試料を、上記のＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃ１ｑ試料調製と同一様式で調製した。上述の手順は１段階手順である。以下の手順は使用しても良い多段階手順である、
ａ）．  余分のヒトＣ１ｑの添加有りおよび無しの２段階洗浄
ｂ）．  余分のヒトＣ１ｑの添加有りおよび無しでアッセイを実施する前のＤＴＴ処理血清。
ｃ）．  第２の抗体としてＰＥ抗Ｃ３を使用。
ｄ）．  １段階手順を伴うＬｕｍｉｎｅｘ  ＰＲＡビーズ。
ｅ）．  Ｃ１ｑ添加有りおよび無しの血清の熱失活。
【０１１６】
７．    検証実験設計
全ての検証実験を「盲験」原則に基づき実施した。全ての形式的検証試料を、ＡＨＧ−ＣＤＣ、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩｇＧ、およびＬｕｍｉｎｅｘ  Ｃ１ｑアッセイにより同時に試験した。
【０１１７】
８．    アッセイ間／アッセイ内アッセイＱＣ試料
以下の事前に定義されたＱＣ試料を、ＱＣ監視方法のために使用した：
アッセイ間アッセイＱＣのための陽性対照：
ＰＰＳ、３％のＨＢＳＡ（Ｄｒ．  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｒａｙの厚意により提供された）中１：１０で希釈された広範に特異的ＨＬＡ抗体。
アッセイ内アッセイＱＣのための陽性対照：
Ｈａｒｂｕｒｙ；未希釈；既知のＨＬＡ抗体特異性（組織内分類血清）を有する。
アッセイ間アッセイＱＣのための陰性対照：
輸血または移植の既往が無いシングルＡＢ陰性男性ドナー。
【０１１８】
全てのＱＣ試料を、事前に試験し、小さい一定分量で凍結した。各一定分量を、シングルバッチアッセイのためにのみ使用した。アッセイ内アッセイＱＣの場合、Ｈａｒｂｕｒｙ血清の１０個の複写物を、同一バッチアッセイで試験し、ＰＰＳおよびシングルＡＢ  ＱＣ血清を、アッセイ間アッセイＱＣのためのアッセイの各バッチ中で試験した。３つの異なる蛍光強度のレベル（相対的数値として表した）中の３つの群のデータを、変動係数（ＣＶ％）算出のために使用した。各郡は、５つの蛍光強度の数値を含有した。
【０１１９】
９．    試料供給源
合計９１個の盲試料を、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ検証研究で使用し、ＣＤＣおよび／またはＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧ結果と比較した。全ての検証試料を以下の供給源より得た：
１．  事前に定義されたＨＬＡタイピング血清（Ｎ＝１６）、
２．  ランダム組織内臨床血清（Ｎ＝４２）、
３．  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（Ｎ＝１１）からのランダム臨床血清、および
４．  ランダム男性ＡＢ血清（Ｎ＝２２）。
【０１２０】
３０個の試料（インビトロ試料）にＩＶＩＧインビトロ阻害試験を行い、１１個のＩＶＩＧ前およびＩＶＩＧ後血清（インビボ）を収集し、ＣＤＣ、ＬＭＸ−Ｃ１Ｑ、およびＬＭＸ−ＩｇＧ方法により試験した。
【０１２１】
結果
（Ａｂ−Ａｇ）複合体の形成および補体Ｃ１ｑの固定化は、古典的経路カスケードおよびＣＤＣの初期イベントである。Ｃ１ｑ固定化の量は、細胞死、古典的経路カスケードおよびＣＤＣの終端段階と直接相関している。顕微鏡下で細胞死のパーセントを視覚的に見積もる代わりに、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑが、高処理能力Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用してＨＬＡ−（Ａｂ−Ａｇ）複合体によりＣ１ｑ固定化を検出するために設計された。
【０１２２】
反応において、シングルＨＬＡ抗原で個々にコーティングされたＬｕｍｉｎｅｘビーズを血清とインキュベートし、ＨＬＡ−Ａｂ（存在する場合）を、対応するＡｇビーズに結合させ、血清からの補体Ｃ１ｑを固定させ、続いて蛍光標識された抗ヒトＣ１ｑ（ＰＥ抗Ｃ１ｑ）を添加した。追加のインキュベーション後、ビーズを洗浄し、各ビーズ表面上のＰＥ蛍光の強度を、Ｌｕｍｉｎｅｘ機器により測定した。
【０１２３】
各ＨＬＡシングル抗原ビーズ上のＰＥの強度は、対応するＨＬＡ（Ａｂ−Ａｇ）複合体の補体固定化能力を表し、ＣＤＣ効果と比例して相関する。
【０１２４】
Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１方法の設計および最適化
２段階対１段階手順
追加のヒトＣ１ｑの添加有り／無しの１段階および２段階手順を評価した。データは、１段階手順がバックグラウンドノイズ、検出の感受性、および方法の単純性に関して２段階手順よりも優れていることを示した（図７）。
【０１２５】
試料希釈液の効果
５つの異なる希釈液を１段階Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑで評価した、
ａ．３％のＨＢＳＡ、
ｂ．０．２Ｍのグリシン緩衝液；ｐＨ４．４、
ｃ．ＰＢＳ中の０．２Ｍのグリシン；ｐＨ７．２、
ｄ．グリシン緩衝液中の１０％のヒトアルブミン；ｐＨ４．４、および
ｅ．０．２Ｍのグリシン緩衝液／ＰＢＳ中の１０％のヒトアルブミン；ｐＨ７．２。
【０１２６】
興味深いことに、上記の希釈液のそれぞれで血清を１：２に希釈した場合、グリシンを用いる希釈液のみが、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑアッセイにおいて、事前に定義された陽性血清でＣ１ｑ固定を劇的に上昇させた（未希釈血清結果と比較して２〜８倍上昇）。グリシン緩衝液によるＣ１ｑ固定化の上昇は、（ａ）Ｃ１ｑ固定の直接的向上、および／または（ｂ）ＣＦＡｂ結合を間接的に向上させ、それによってＣ１ｑ固定を上昇させることによって生じえる。また、ＩｇＧ結合に及ぼすグリシン、３％のＨＢＳＡ、およびＰＢＳの効果をＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧアッセイで評価した。ＩｇＧ結合の上昇に代わり、全ての希釈液は、ＩｇＧ結合を比例して減少させた。したがって、グリシン緩衝液は、未知のメカニズムを介してＣ１ｑ固定化を直接向上する。
【０１２７】
検出の感受性および方法の安定性の双方の結果および考慮に基づき、０．２Ｍのグリシン緩衝液／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１０％のヒトアルブミンを、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ  ＩＶＩＧ阻害アッセイに対して使用するのに最良の希釈液として最終的に選択した。
【０１２８】
Ｃ３固定化
ＨＬＡ−Ａｂ（Ａｂ−Ａｇ）複合体への補体Ｃ３の固定化をまた、１段階および２段階手順の双方で、ＰＥ抱合された抗ヒトＣ３Ａｂを使用して評価した。Ｃ３固定化は、アッセイで検出可能ではなかった。ＰＥ抗Ｃ３が最適化されていない、あるいは抗体自体が不十分な親和性を有することが考えられる。必要であれば、さらなるＣ３抗体が試験可能である。
【０１２９】
ＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑの相関関係
合計７８つの血清を、ＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑの双方により試験し、得られた結果は相互間で高く相関した（Ｎ＝７６、９７％、添付の「ＬＭＸ−Ｃ１ｑ検証試料−通常試料（図１６Ａ〜Ｎ）およびＬＭＸ−Ｃ１ｑ検証−ＩＶＩＧ試料（図１７Ａ〜Ｊ）」を参照されたい）。血清中に存在する全ての結合するＡｂをＬＭＸ−ＩｇＧ使用し測定した場合、ＬＭＸ−Ｃ１Ｑが、ＣＦ  ＡｂをＣＤＣより優れて同定した２２の血清が存在した（Ｎ＝２２、２８％）。また、全ての試験された試料において、ＣＤＣにより選別されたＨＬＡ、ＩｇＧ特異性はＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑでも陽性であった。Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑアッセイは、ＣＤＣでは見られなかった、限定的一連のさらなるＣＦ  ＨＬＡ−Ａｂ特異性をしばしば選別する。Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより検出された全ての「追加の（ｅｘｔｒａ）」特異性はまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＩｇＧアッセイでも検出され、ＬＭＸ−Ｃ１Ｑアッセイの高い感受性を裏付けている。広いＨＬＡ−Ａｂ特異性を伴う血清の場合、ＣＤＣは、いずれの特異性も判定できないが、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは、それらの特異性を明確に同定することができる（＃２、＃２１、＃３６、＃３７、＃４０、＃４２、＃６４、Ｎ＝７、９％）。
【０１３０】
別の５つの血清（＃６、＃９、＃１８、＃６７、＃７０、６．４％）は、ＣＤＣで「不明確または定義されていないＨＬＡ−Ａｂ特異性」と判定されたが、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑおよびＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧにより、明確な特異性が判定された。試料＃７、＃１０、＃１１、＃２７、および＃２８（Ｎ＝５、６．４％）中で、ＣＤＣにより誤同定された特異性が判定されたが、それらは、どちらのＬｕｍｉｎｅｘ  アッセイ（Ｃ１ｑまたはＩｇＧ）においても見出されなかった。
【０１３１】
４つの血清（試料＃２、＃３、＃７、および＃１０、Ｎ＝４、５．１％）は、ＣＤＣでは幾つかの特異性を同定したが、これらはＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑでは陰性であった。次いで、ＣＤＣにより盲試料を再試験したところ、繰り返し陰性であり、ＣＤＣによる誤った判定を裏付けている。Ｒｅｔｕｘａｎ処置を受けている患者血清が１つ存在し、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは、クラスＩおよびＩＩ双方の特異性を同定することができたが、全てのＢ細胞が血清中の細胞傷害性Ｒｉｔｕｘａｎにより死滅されるため、ＣＤＣでは特異性を測定することができなかった。
【０１３２】
ＣＤＣにより試験されたＤＴＴ処理された血清中で検出されたいずれのＩｇＭ特異性（図１６Ａ〜Ｎの＃３８、＃４１、＃６４、＃６７、および＃７６および図１７Ａ〜Ｊの＃７）はまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧ（＃３８、＃４１、＃６４、および＃６７のみＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより選別された）において検出された対応するＩｇＧを有することが観察された。これは、同一Ａｇ特異性に対するＩｇＭおよびＩｇＧの同種抗体の双方の共存がインビボで一般的な現象であり得ることを示唆する。
【０１３３】
ＣＤＣにより検出されたＩｇＭ特異性は、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑアッセイで陰性あった（図１６Ａ〜Ｎの＃７６および図１７Ａ〜Ｊの＃７）。［その後の研究がこの観察を裏付けている］。Ｃ１ｑは、ＩｇＭ（Ａｂ−Ａｇ）複合体に結合し得ない、または抗Ｃ１ｑ抗体は、立体障害により複合体中でＣ１ｑに接近し得ない。
【０１３４】
別の２つの明らかに無相関試料（Ｎ＝２、２．６％）が、検証中に見出された。試料＃１３は、ＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧの双方では検出可能であるがＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑでは検出可能ではないＡ２３、Ｂ５７、およびＢ５８を有し、試料＃２４は、ＣＤＣおよびＬＭＸ−ＩｇＧで検出可能であるがＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ検出可能ではないＢ５４、５５、５６、６１、８１を有した。（Ｂ６１＝ＣＤＣにより誤って判定されていることを留意されたい）。これらの２つの疑わしい試料を、外因性ヒトＣ１Ｑを用いて「スパイク(spiking)」により繰り返したところ、完全なる一致が観察された。全体から見て、ＣＤＣにより試験された２７％（Ｎ＝２１）の試料が、広くまたは誤って判定され、かつ／または定義されていない特異性を有した。全てが、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより明確な特異性を有した。
【０１３５】
ＣＤＣと比較した場合、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは追加の特異性を検出するが（ＬＭＸ−ＩｇＧにおいても観察された）、その包含関係（ＬＭＸ−Ｃ１ｑがＣＤＣにより検出された全ての特異性を含む）が１００％（７８／７８）であった。
【０１３６】
Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧおよびＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ間の相関関係
検証された試料からの結果は、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより判定された全てのＨＬＡ−Ａｂ特異性がまたＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧによっても見出されたことを示している。我々が試験した全ての試料において、Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧは、ＣＤＣおよび／またはＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより検出されるより特異性を常に定義した。これは、それぞれＣＤＣおよびＬＭＸ−Ｃ１Ｑでは検出不可能な、非ＣＦ  ＡｂおよびＩｇＭの検出を欠くためである。Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧは、試料＃１、＃５、＃２９、＃３０、＃３８、＃６５、＃７１、および＃７７（Ｎ＝８、１０％）中で非ＣＦＡｂを選別するようである。ＬＭＸ−ＩｇＧはまた、正常な非感作ＡＢ陰性男性ドナー血清（＃２７、＃２８、および＃８８）中で特異性を検出したが、理論上それらは、アッセイにおいて陰性であるべきである。
【０１３７】
ＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは、同一原則、すなわち補体固定抗体の検出に基づいており、免疫応答において臨床的に意義のあるものとして長いこと評価されてきた。しかしながら、Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧは、その結合の下流効果を考慮せずに、ＩｇＧ−結合の原則のみに基づいている。したがって、方法感受性の比較は情報的に有益ではあるが、試験が原理的に異なるため、試験検証の基盤ではない。より優れたアッセイ系を判断するための基準は、最高のドナー−レシピエントのマッチング、急性拒絶反応の予測および移植後の監視に対する信頼できる情報を提供する、それらの臨床的に関連する同種抗体を明確に同定することである。ＣＤＣは、その臨床的有意性において実証されているため、我々のＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ検証研究において、我々は主にＣＤＣとの比較に焦点を絞った。また、Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧを参照に使用し、結果をさらに裏付けた。
【０１３８】
インビトロＩＶＩＧ阻害試験およびインビボＩＶＩＧ処理された患者試験
合計１１人の患者血清試料を、ＩＶＩＧ阻害研究で使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ、ＣＤＣおよび／またはＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧの並列実験を、同時に実施した。ＩＶＩＧ阻害試験をＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより実施したが、Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧでは実施しなかった。後者がこの目的に対して適切なアッセイではないためである（ＩＶＩＧスパイク結果、図８〜９を参照されたい）。
Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑインビトロＩＶＩＧ阻害試験の全ての結果は、ＩＶＩＧ後試料中に見られるインビボＩＶＩＧ効果と完璧にマッチし、それらの試料中においてさえ、ＩＶＩＧは、特定の特異性の差別的な阻害をもたらし、他についてそのような阻害を生じなかった（図１０）。ＩＶＩＧ前および後の血清のフォローアップ試料を、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより、ＩＶＩＧにより複数回処置された一患者において試験した。インビトロＩＶＩＧ阻害試験は、差別的な阻害パターンを示し、Ａ２４は阻害され、Ａ２、６８、６９は阻害されなかった。患者がＩＶＩＧ処理を受けた後、フォローアップＩＶＩＧ後試料を、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑアッセイのために採取し、同一阻害パターンを確認した（図１１〜１３Ｂ）。大抵の場合において、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ  ＩＶＩＧ阻害結果はまた、ＣＤＣ  ＩＶＩＧ阻害試験の結果と相関するか、あるいはその結果よりも優れていた。
ＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧと比較して、ＩＶＩＧ研究グループから得られた検証データは、明確にＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑの利点を示した（図１６Ａ〜Ｎおよび図１７Ａ〜Ｊ）。
【０１３９】
考察
移植片レシピエント（潜在的）の血清中に存在している臨床的に関連のある／有害なＨＬＡ同種抗体の正確な同定は、移植前の重要な段階である。移植分野では、細胞傷害性同種抗体（ＣＦＡｂ）が超急性拒絶反応を引き起こすことが概して認められている。
【０１４０】
補体固定特性に基づき、レシピエント血清中に存在し得るＨＬＡ抗体（ＨＬＡ−Ａｂ）の２つの主要なカテゴリー、例えば、ＣＦＡｂおよび非ＣＦＡｂが存在する。ＣＦＡｂのみが有害であり、かつ臨床的に関連することが既知であるが、非ＣＦＡｂの本来の免疫学的機能は明確ではない。フロー交差適合研究は、一部の結合抗体が無関係であり、一部は有害であることを示唆している。フロー中において、補体に結合する能力に関しての区別は従来されていない。事実上、幾つかの非ＣＦＡｂは有益な抗体であり得、かつ正常な免疫恒常性を維持するのに重要な役割を果たす。我々の未発表のＩＶＩＧ研究データは、幾つかのＩｇＧが、ＨＬＡ−Ａｇに特異的に結合する正常ヒト血清中に自然に存在することを示唆する。細胞を死滅するためのＣＤＣカスケードの活性化の代わりに、それらは保護作用を発揮し、細胞傷害性ＨＬＡ同種抗体より得られるＣＤＣ効果を阻害する。そのメカニズムは、現在も調査中である。移植の実践において、抗体の２つのタイプを区別することが非常に重要である。
【０１４１】
補体Ｃ１ｑは古典的補体経路の鍵となる成分であり、抗体−抗原複合体と相互作用する第１の認識分子として作用し、補体カスケードを活性化する。抗体へのＣ１の結合はＣ１ｑを介し、それが固く固定される前に、Ｃ１ｑは、少なくとも２個の抗体分子と架橋結合しなければならない。３個の特徴的なタンパク質Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓを含む補体１（Ｃ１）複合体は、補体の古典的経路の鍵となる初期活性化段階であり、炎症過程の開始において重要な役割を果たす。補体Ｃ１ｑは、高い血清濃度（１５０ｕｇ／ｍｌ）の非常に安定なタンパク質分子である。我々の研究において、試験された最も古い血清は１９７６年に凍結され、それは、未だに優れたＣ１ｑ結合活性を有した。理論的に、ＨＬＡ同種抗体によるＣ１ｑ固定化の検出は、古典的経路カスケードにおいて、他の遅発の下流補体要素の使用よりも優れている。本方法によって、スクリーンドナーが特定の抗体−抗原複合体に補体を固定可能であることを知ることができ、これは移植後のカスケードの連続的段階を活性化させるためのリスクの推定を提供する。我々の提示したＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ方法の開発および検証データは、このアッセイ設計の理論的根拠のための強力な証拠を提供する。
【０１４２】
Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑ方法の開発および最適化の際、１段階、２段階（追加のヒトＣ１ｑ有りおよび無し）、ＤＴＴ血清処理、ならびに異なる希釈液を含む、手順に対する数個の異なる実験的設計を評価した。方法感受性、安定性、正確性、および単純性に基づき、最終最適化された１段階手順を調べ、検証研究において使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃ１ｑインビトロＩＶＩＧ阻害アッセイのために、０．２Ｍのグリシン／ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ：７．４）中の１０％のヒトアルブミンを試料希釈液対照として使用し、希釈効果を調節した。
【０１４３】
この新しく開発されたＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは、ＣＤＣおよびＬｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧの双方の特徴を完璧に混合し、同時に、それら２つのアッセイ中に存在する主要な欠点を除外する。一方で、ＬＭＸ−ＩｇＧとは異なるがＣＤＣのように、それは直接ＣＦＡｂを検出し、無細胞、固相結合系を介してＣＤＣより優れた機能的試験結果を与える。追加的に高い感受性を有するため、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは、ＣＤＣではもれた低いレベルの細胞傷害性抗体を選別できる。もう一方で、ＣＤＣとは異なるがＬＭＸ−ＩｇＧと同様に、Ｌｕｍｉｎｅｘの高い処理量マルチプレックス検出系の使用のため、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは、一回の反応で１００近くまでの異なるＨＬＡ−Ａｂを、容易かつ同時に同定できる。
【０１４４】
ＬＭＸ−Ｃ１ｑは、実際にＬｕｍｉｎｘ−ＩｇＧによりしばしば判定される非細胞傷害性Ａｂによる偽の陽性結果を排除できる。Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑアッセイはＣＦＡｂのみ検出し、かつＩＶＩＧ（すなわち、ＩＶＩＧ処理された患者からの血清中に存在する非ＣＦ  ＩｇＧ）からの干渉を有さないため、ＬＭＸ−Ｃ１ｑは、インビトロＩＶＩＧ阻害試験に対して、確実に使用できる。Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑアッセイは、ＩＶＩＧインビボ効果の予測および監視においてその信頼性を提供する（図１７Ａ〜Ｊおよび図１０〜１５）。全ての３つの方法の結果を分析かつ比較することにより、以下のパターンが見出され、各試験系の理論的原則と一致する：
１．ＣＤＣにより判定されるいずれの特異性（ＩｇＭのため１つを除く）もＬｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑに含まれ、含まれない場合には、ＣＤＣが不正確に解釈されたか、かつ／または非ＨＬＡ抗体によるものである、
２．Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑにより判定されるいずれの特異性も、Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧにより検出された特異性中に含まれるが、必ずしもＣＤＣにより検出されたものには含まれない、
３．Ｌｕｍｉｎｅｘ−ＩｇＧが陰性である場合、Ｌｕｍｉｎｅｘ−Ｃ１ｑは陰性であり、ＣＤＣにおけるＤＴＴ処理された血清もまた陰性であろう。
【０１４５】
実施例２
直接標識されたＣ１ｑ  ＨＬＡアッセイ
以下は、ヒト血清スクリーニングの例示的方法を提供し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックス／シングル抗原ビーズ技術を使用し、ＨＬＡ補体固定抗体（ＨＬＡ−ＣＦＡｂ）を同定する。しかしながら、これらの方法を、いずれのフローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡ系を使用しても行うことができ、いずれの種類の補体固定抗体が、いずれのマルチプレックスまたはシングル抗原系を用いても同定できる。
【０１４６】
試験されるための血清を、ＬＡＢｓｃｒｅｅｎクラスＩおよびＬＡＢｓｃｒｅｅｎクラスＩＩシングル抗原ビーズミックス（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ、Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）、ならびにビオチン標識されたＣ１ｑ等のＬｕｍｉｎｅｘ（ＬＭＸ）ビーズでコーティングしたＨＬＡシングル抗原を用いてインキュベートした。補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および間接的Ｃ１ｑ（抗Ｃ１ｑ）アッセイの双方により、血清Ａが補体固定能力を有することは既知だ。それは限定的一連のＨＬＡ抗体特異性を有する。血清Ｂは陽性対照血清であり、ＣＤＣおよび間接的Ｃ１ｑ（抗Ｃ１ｑ）アッセイにより補体固定能力を有することが既知である。それは非常に広域である一連のＨＬＡ抗体特異性を有する。陰性対照は非輸血された男性ＡＢ陰性（ＡＢＯ／Ｒｈ血液群タイプ）血清であり、いずれのアッセイにおいて固定補体を結合しないことが既知である。全ての血清を熱失活し、試験前にそれらを「脱補体」した。
【０１４７】
図１８において例示されるように、試験血清中のＨＬＡ抗体は（１）対応するビーズ上でＨＬＡ抗原に結合し、（２）結合ＨＬＡ−ＣＦＡｂ固定化されたビオチン標識されたＣ１ｑ（Ｂｉｏ−Ｃ１ｑ）は（３）ＨＬＡ−ＣＦＡｂ／Ａｇ／Ｂｉｏ−ｈＣ１ｑの複合体を形成する。反応物中に存在するＲ−フィコエリトリン抱合ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）は、次いでＢｉｏ−ｈＣ１ｑの複合体に結合する。ＬＡＢｓｃｒｅｅｎ洗浄緩衝液で洗浄した後、ビーズをＬｕｍｉｎｅｘ機器上で得た。各ＨＬＡシングル抗原ビーズ上でＰＥ強度は、対応するＨＬＡ−Ａｂ／Ａｇ複合体の補体固定化能力を表し、比例して抗体の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）効果と相関した。
【０１４８】
次いで、試験血清の反応パターンを、アッセイで使用した抗原ビーズミックスに関連した抗原アレイワークシートと比較し、付随の分析プログラムは、パネル反応性抗体（ＣＰＲＡ）の算出および抗ＨＬＡ補体固定抗体特異性の定義のためのデータを提供した。
【０１４９】
先の実施例で説明したように、ＬＭＸ−Ｃ１ｑアッセイにおいて直接標識されたＣ１ｑを使用するＨＬＡの特異性の検出を、直接標識されたＣ１ｑ（抗Ｃ１ｑ抗体）を使用するＬＭＸ−Ｃ１ｑアッセイの実施の特異性と比較した。図１９Ａで表されるように、直接標識されたＣ１ｑを用いる検出が、真陽性の数の上昇をもたらした。図１９Ｂは、標識されたＣ１ｑにより検出された陽性抗体のみを含む血清Ｂのサブセットを表示し、このサブセットは、直接標識されたＣ１ｑ反応の強さにより配置される。各ケースにおけるＸ軸は、シングル抗原ビーズ（すなわち、各バーが、他の全てのバーとは異なる唯一のシングル抗原である）の特異性を表す。Ｙ軸はＭＦＩ（平均蛍光強度）を表し、反応の強さの兆候である。
【０１５０】
また、インビトロＩＶＩＧ阻害アッセイをこの方法で行い、該相関関係、および抗Ｃ１ｑ抗体（図２０Ａ）および直接標識されたＣ１ｑ（図２０Ｂ）を用いるアッセイの実行の再現性を明示した。ＩＶＩＧアッセイを上述のように行った。図２０Ｂに表されるように、直接標識されたＣ１ｑは、ＩＶＩＧ阻害アッセイにおいて抗Ｃ１ｑ抗体と同様に効果的であった。しかしながら、直接標識されたＣ１ｑも用いて行われたアッセイは、抗Ｃ１ｑ方法を用いて行われたアッセイよりもより感受的であった。
【０１５１】
上記の結果は、この新しく開発されたアッセイが、簡便であり、信頼性があり、感受的であり、多覚的であり、特異的である高処理能力マルチプレックスＨＬＡ同種抗体試験であることをうまく明示している。それは、古典的ＣＤＣアッセイの代用となるであろう。このアッセイの原則は、いずれの細胞傷害性抗体検出に対しても使用される世界的技術のプラットフォームであり得る。
【０１５２】
前述されるものは、単に本発明の原則を解説するにすぎない。本明細書に明白に説明もしくは表されてはいないが、当業者は、本発明の原則を具体化し、その精神と範囲内に含まれるものである様々な構造を考案し得ることが理解されるであろう。さらに、本明細書に記載される全ての実施例および条件言語は、主に、読者が、本発明の原則、ならびに本発明者らによって貢献された当技術分野を推進するための概念を理解することを補助することを意図しており、かかる具体的に記載される実施例および条件に限定されることはない解釈されたい。さらに、原則、態様、および本発明の実施形態、ならびにその特異的実施例を記載する本明細書の全ての陳述は、その構造的および機能的同等物の双方を包含することを意図している。加えて、かかる同等物が、現在既知の同等物および将来的に開発される同等物の双方を含むことを意図している、すなわち、開発されるいずれの、構造にかかわることなく同一機能を実施する要素をもである。したがって、本発明の範囲は、本明細書で表され、説明される例示的実施形態に限定されることを意図していない。正確には、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【０１５３】
例示的な実施形態
１．  目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法であって、
目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質を、対象からの生体試料および補体因子Ｃ１ｑと接触させることであって、前記接触は、前記試料中の抗ＡｇＩ補体固定抗体を前記ＡｇＩに結合させ、補体因子Ｃ１ｑを前記抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われ、
前記固体基質を、前記ＡｇＩに結合した抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合した前記補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある少なくとも１つの検出可能に標識されたリガンドでインキュベートすることと、
前記生体試料内で、前記ＡｇＩに特異的に結合する補体固定抗体の存在または不在を決定するために、前記補体因子Ｃ１ｑに結合した前記検出可能に標識されたリガンドの存在または不在を検出することと、を含む、方法。
２．  前記補体因子Ｃ１ｑは自己補体因子Ｃ１ｑである、実施形態１に記載の方法。
３．  前記補体因子Ｃ１ｑは外因性補体因子Ｃ１ｑである、実施形態１に記載の方法。
４．  前記補体因子Ｃ１ｑは、自己補体因子Ｃ１ｑおよび外因性補体因子Ｃ１ｑの組み合わせである、実施形態１に記載の方法。
５．  前記固体基質はマルチウェルプレートである、実施形態１に記載の方法。
６．  前記固体基質は膜である、実施形態１に記載の方法。
７．  前記固体基質は微粒子である、実施形態１に記載の方法。
８．  前記微粒子はポリスチレンビーズである、実施形態７に記載の方法。
９．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態７に記載の方法。
１０．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態７に記載の方法。
１１．  前記固体基質は細胞である、実施形態１に記載の方法。
１２．  前記固体基質は細胞膜である、実施形態１に記載の方法。
１３．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態１に記載の方法。
１４．  前記検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である、実施形態１に記載の方法。
１５．  前記検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である、実施形態１に記載の方法。
１６．  目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法であって、
目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質を、対象からの生体試料および直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑと接触させることであって、前記接触は、前記試料内の抗ＡｇＩ補体固定抗体を前記ＡｇＩに結合させ、前記直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑを前記抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われ、
前記ＡｇＩに特異的に結合する前記生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するために、前記抗ＡｇＩ補体固定抗体に結合した前記直接標識された外因性Ｃ１ｑの存在または不在を検出することと、を含む、方法。
１７．  前記固体基質はマルチウェルプレートである、実施形態１６に記載の方法。
１８．  前記固体基質は膜である、実施形態１６に記載の方法。
１９．  前記固体基質は微粒子である、実施形態１６に記載の方法。
２０．  前記微粒子はポリスチレンビーズである、実施形態１９に記載の方法。
２１．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態１９に記載の方法。
２２．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態１９に記載の方法。
２３．  前記固体基質は細胞である、実施形態１６に記載の方法。
２４．  前記固体基質は細胞膜である、実施形態１６に記載の方法。
２５．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態１６に記載の方法。
２６．  前記直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される、実施形態１６に記載の方法。
２７．  ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法であって、
対象からの生体試料を異なるサブタイプの一群の微粒子および補体因子Ｃ１ｑとインキュベートすることであって、各微粒子は、異なる精製されたＨＬＡサブタイプでコーティングされ、同一ＨＬＡを提示する細胞集団に由来し、前記インキュベートは、前記生体試料中の抗ＨＬＡ補体固定抗体を前記ＨＬＡに結合させ、前記補体因子Ｃ１ｑを前記生体試料中の前記抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われ、
前記微粒子を、前記ＨＬＡに結合した前記抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合した前記補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある少なくとも１つの検出可能に標識されたリガンドとインキュベートすることと、
補体固定抗体の存在または不在を決定するために、前記補体因子Ｃ１ｑに結合した前記検出可能に標識されたリガンドの存在または不在を検出することと、を含む、方法。
２８．  前記補体因子Ｃ１ｑは自己補体因子Ｃ１ｑである、実施形態２７に記載の方法。
２９．  前記補体因子Ｃ１ｑは外因性補体因子Ｃ１ｑである、実施形態２７に記載の方法。
３０．  前記補体因子Ｃ１ｑは、自己補体因子Ｃ１ｑおよび外因性補体因子Ｃ１ｑの組み合わせである、実施形態２７に記載の方法。
３１．  前記微粒子はアガロースビーズである、実施形態２７に記載の方法。
３２．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態２７に記載の方法。
３３．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態２７に記載の方法。
３４．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態２７に記載の方法。
３５．  前記検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である、実施形態２７に記載の方法。
３６．  前記検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である、実施形態２７に記載の方法。
３７．  前記検出はフローサイトメトリーによる、実施形態２７に記載の方法。
３８．  ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための方法であって、
対象からの生体試料を異なるサブタイプの一群の微粒子および直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑでインキュベートすることであって、各微粒子は、異なる精製されたＨＬＡサブタイプでコーティングされ、同一ＨＬＡを提示する細胞集団に由来し、前記インキュベートは、前記生体試料中の抗ＨＬＡ補体固定抗体を前記ＨＬＡに結合させ、前記補体因子Ｃ１ｑを前記生体試料中の前記抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合させるのに十分な時間行われ、
ＨＬＡに特異的に結合する前記生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するために、前記抗ＨＬＡ補体固定抗体に結合した前記直接標識された外因性補体因子Ｃ１ｑの存在または不在を検出することと、を含む、方法。
３９．  前記微粒子はアガロースビーズである、実施形態３８に記載の方法。
４０．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態３８に記載の方法。
４１．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態３８に記載の方法。
４２．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態３８に記載の方法。
４３．  前記直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される、実施形態３８に記載の方法。
４４．  前記検出はフローサイトメトリーによる、実施形態３８に記載の方法。
４５．  目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットであって、
目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質と、
補体因子Ｃ１ｑに特異的に結合する能力がある検出可能に標識されたリガンドと、
前記目的の抗原に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、キット。
４６．  前記固体基質はマルチウェルプレートである、実施形態４５に記載のキット。
４７．  前記固体基質は膜である、実施形態４５に記載のキット。
４８．  前記固体基質は微粒子である、実施形態４５に記載のキット。
４９．  前記微粒子はアガロースビーズである、実施形態４８に記載のキット。
５０．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態４８に記載のキット。
５１．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態４８に記載のキット。
５２．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態４５に記載のキット。
５３．  前記検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である、実施形態４５に記載のキット。
５４．  前記検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である、実施形態４５に記載のキット。
５５．  目的の抗原に特異的に結合する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットであって、
目的の抗原（ＡｇＩ）を上に固定化させた固体基質と、
補体固定抗体に結合する能力がある直接標識された外因性Ｃ１ｑと、
前記目的の抗原に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、キット。
５６．  前記固体基質はマルチウェルプレートである、実施形態５５に記載のキット。
５７．  前記固体基質は膜である、実施形態５５に記載のキット。
５８．  前記固体基質は細胞である、実施形態５５に記載のキット。
５９．  前記固体基質は微粒子である、実施形態５５に記載のキット。
６０．  前記微粒子はアガロースビーズである、実施形態５９に記載のキット。
６１．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態５９に記載のキット。
６２．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態５９に記載のキット。
６３．  前記微粒子はポリスチレンビーズである、実施形態５８に記載のキット。
６４．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態５５に記載のキット。
６５．  前記直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される、実施形態５５に記載のキット。
６６．  ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットであって、
一群の微粒子サブタイプであって、各微粒子サブタイプは、前記群が正常ヒト集団におけるＨＬＡの分布をシミュレートするように、単一細胞株または複数の細胞株の前記ＨＬＡ抗原集団を表すために、異なる精製されたＨＬＡでコーティングされる、微粒子サブタイプと、
補体因子Ｃ１ｑと特異的に結合する能力がある検出可能に標識されたリガンドと、
ＨＬＡに対抗する対象からの試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含む、キット。
６７．  前記微粒子はアガロースビーズである、実施形態６６に記載のキット。
６８．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態６６に記載のキット。
６９．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態６６に記載のキット。
７０．  前記微粒子はポリスチレンビーズである、実施形態６６に記載のキット。
７１．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態６６に記載のキット。
７２．  前記検出可能に標識されたリガンドは、検出可能に標識された抗体またはその結合断片である、実施形態６６に記載のキット。
７３．  前記検出可能な標識は、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種である、実施形態６６に記載のキット。
７４．  ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対抗する対象からの生体試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するためのキットであって、
一群の微粒子サブタイプであって、各微粒子サブタイプは、前記群が正常ヒト集団におけるＨＬＡの分布をシミュレートするように、単一細胞株または複数の細胞株の前記ＨＬＡ抗原集団を表すために、異なる精製されたＨＬＡでコーティングされる、微粒子サブタイプと、
補体固定抗体に結合する能力がある直接標識された外因性Ｃ１ｑと、
ＨＬＡに対抗する対象からの試料中の補体固定抗体の存在または不在を決定するための説明書と、を含むキット。
７５．  前記微粒子はアガロースビーズである、実施形態７４に記載のキット。
７６．  前記微粒子はラテックスビーズである、実施形態７４に記載のキット。
７７．  前記微粒子は磁気ビーズである、実施形態７４に記載のキット。
７８．  前記微粒子はポリスチレンビーズである、実施形態７４に記載のキット。
７９．  前記生体試料は、血清、血液、唾液、血漿、または尿である、実施形態７４に記載のキット。
８０．  前記直接標識された外因性Ｃ１ｑは、蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種で標識される、実施形態７４に記載のキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１６Ｌ】
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【図１６Ｍ】
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【図１６Ｎ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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