(57)【要約】【課題】細胞内への送達能に優れた高分子担体を提供する。【解決手段】細胞内送達用高分子担体は、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる。共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有するか、セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有するか、又はミセル形成能を有するのが好ましい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる、細胞内送達用高分子担体。
【請求項２】
前記共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有する請求項１記載の細胞内送達用高分子担体。
【請求項３】
前記共重合体は、前記セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有する請求項１記載の細胞内送達用高分子担体。
【請求項４】
前記共重合体は、ミセル形成能を有する請求項１記載の細胞内送達用高分子担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内送達用高分子担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高分子を担体として用いた、核酸、無機微粒子、薬剤等の細胞内への送達が注目されており、多数の高分子担体が開発されている。
【０００３】
例えば、核酸を細胞内に送達するための高分子担体として、特許文献１には、所定のカチオン性ポリマーと核酸とを含む、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体からなる細胞内送達用高分子担体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５２７７４４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞内への送達能に優れた高分子担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、ランダム共重合したセグメントを有する共重合体が、細胞内に取り込まれやすいことを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００７】
（１）カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる、細胞内送達用高分子担体。
【０００８】
（２）前記共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有する（１）記載の細胞内送達用高分子担体。
【０００９】
（３）前記共重合体は、前記セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有する（１）記載の細胞内送達用高分子担体。
【００１０】
（４）前記共重合体は、ミセル形成能を有する（１）記載の細胞内送達用高分子担体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞内への送達能に優れた高分子担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施例に係る金ナノロッドのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体による、金ナノロッドの細胞内への送達量を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体とラクトースとを用いることによる、金ナノロッドの細胞への取込み量を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体を用いて金ナノロッドを細胞内に送達した後に、送達した細胞にレーザー照射を行った前後の細胞量を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例に係る金コロイドのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示すグラフである。
【図６】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体による、金コロイドの細胞内への送達量を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体により修飾された金コロイドにおける、ｐＨとゼータ電位との関係を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体による、金コロイドの細胞内への送達量と、送達する細胞の培地のｐＨとの関係を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体を用いて金ナノロッドを送達する細胞の培地のｐＨが５．５である場合における、細胞内への金ナノロッドの送達後に、細胞にレーザー照射を行った前後の細胞量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものでない。
【００１４】
本発明の細胞内送達用高分子担体は、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる。
【００１５】
本発明の細胞内送達用高分子担体が、細胞内への送達能に優れる理由は以下のように推定される。セグメント（Ａ）がカチオン性モノマーのランダム共重合体であるため、セグメント（Ａ）のカチオン性モノマーが重合した部分は正の電荷を有する。細胞表面は、負の電荷を帯びているので、本発明の細胞内送達用高分子担体は、この正電荷によって細胞表面に集積する。更に、セグメント（Ａ）は、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーをランダム共重合したものであるため、セグメント（Ａ）はカチオン性モノマーが重合した部分の近傍に上記リガンドを有するモノマーが重合した部分を有することになる。これにより、セグメント（Ａ）は、その正電荷により細胞表面に集積し、リガンドを介して細胞表面に対して結合できるので、細胞内に取り込まれやすくなる。
【００１６】
本発明のカチオン性モノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマー等と重合することができる。
【００１７】
カチオン性モノマー特に限定されないが、例えば、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【００１８】
【化１】
2015168653.tif 000003
【００１９】
上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ２はＯ、ＮＨ、又はＮＲ３であり、Ｒ３は１〜４の炭素数を有するアルキル基であり、Ｘは、下記一般式（ＩＩ）で表される基を表す。
【００２０】
【化２】
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【００２１】
上記一般式（ＩＩ）中、Ｘ０及びＸ１は炭素数２〜６のアルキレン基又はヒドロキシアルキレン基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は互いに独立に炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｚ−は対イオンである。対イオンは、特に限定されないが、例えば、ハロゲン化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。
【００２２】
カチオン性モノマーは、具体的には、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジエチルアミノメチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノブチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノネオペンチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノネオペンチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらのうち、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートが好ましい。
【００２３】
本発明の細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、カチオン性モノマー等と重合することができる。
【００２４】
本発明の共重合体では、モノマー（Ｂ）が下記一般式（ＩＩＩ）で表されるものであることが好ましい。
【化３】
2015168653.tif 000005
【００２５】
上記一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ１０は、Ｏ又はＮＨである。また、Ｘは、スペーサーであり、Ｚ２は、リガンドである。
【００２６】
上記リガンドを有するモノマーでは、スペーサーは、上述のリガンドを導入することができれば特に限定されないが、例えば、繰り返し単位数１〜２００のアルキレンオキシ基、アルキレン基等が挙げられ、好ましくは繰り返し単位数１〜５０のエチレンオキシ基又はアルキレン基である。アルキレン基は、直鎖状でも分枝状でもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、好ましくは１〜８である。繰り返し単位数１〜５０のエチレンオキシ基や炭素数１〜８のアルキレン基であれば、本発明の高分子担体の細胞への送達能が良好となるので好ましい。なお、本発明のセグメント（Ａ）では、このスペーサーを介して上述のリガンドが結合している。
【００２７】
細胞表面に対する結合能を有するリガンドとしては、例えば、糖鎖、タンパク質、抗原等の細胞表面の特定の対象物質に対して特異的相互作用を示す分子認識素子が挙げられ、より具体的には、糖鎖（ラクトース、ガラクトース等）、抗体等が挙げられる。
【００２８】
本発明のセグメント（Ａ）には、カチオン性モノマーと上記リガンドを有するモノマー以外のその他のモノマーが含まれてもよい。その他のモノマーとしては、例えば、メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、ブトキシメトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、無水イタコン酸、シトラコン酸、無水シトラコン酸、クロトン酸、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−フェノキシ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピルフタレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらのモノマーを、単独で有していても、２種以上を組み合わせて有していてもよい。
【００２９】
セグメント（Ａ）における、カチオン性モノマーのユニット数は、特に限定されないが、１〜１００が好ましく、２〜８０がより好ましく、５〜６０が更に好ましく、１５〜４０が最も好ましい。
【００３０】
セグメント（Ａ）における、カチオン性モノマーに由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは５ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは２０ｍｏｌ％以上であり、最も好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。カチオン性モノマーに由来する構成単位の占める割合が高いほど、セグメント（Ａ）の正の電荷が高くなって細胞表面に集積しやすくなり、細胞内への送達能に優れる。
【００３１】
セグメント（Ａ）における、上記リガンドを有するモノマーのユニット数は、特に限定されないが、１〜１００が好ましく、５〜８０がより好ましく、１５〜５０が更に好ましい。
【００３２】
セグメント（Ａ）における、上記リガンドを有するモノマーに由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは１０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは２０ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは４０ｍｏｌ％以上であり、最も好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。上記リガンドを有するモノマーに由来する構成単位の占める割合が高いほど、リガンドの分子認識作用が向上し、細胞内への送達能に優れる。
【００３３】
セグメント（Ａ）のランダム共重合方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法が好ましい。リビングラジカル重合法によれば、合成する両親媒性高分子の分子量や分子量分布を制御することができる。
【００３４】
ＲＡＦＴに用いられる連鎖移動剤は、特に限定されず、例えば、ブチルベンジルトリチオカルボナート、クミルジチオベンゾエート（ＣＤＢ）、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、酢酸ジチオベンゾエート、ブタン酸ジチオベンゾエート、４−トルイル酸ジチオベンゾエート等が挙げられる。
【００３５】
重合開始剤は、特に限定されず、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、ジイソプロピルペルオキシカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ベンゾイル、ラウロイルパーオキサイド、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等を用いることができる。重合開始剤の好適な使用量は、モノマーに対して、０．００１〜１質量％、連鎖移動剤に対して、１〜３３質量％である。
【００３６】
ＡＴＲＰに用いられるハロゲン化アルキル開始剤は、特に限定されず、例えば、２−ブロモイソブチリルブロミド、２−クロロイソブチリルクロリド、ブロモアセチルブロミド、ブロモアセチクロリド、ベンジルブロミド等が挙げられる。
【００３７】
触媒としては、例えば、１価の銅、２価のルテニウム等の遷移金属錯体を用いることができる。
【００３８】
なお、重合反応に用いる溶媒は、特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、これらの混合液等が挙げられる。
【００３９】
本発明の細胞内送達用高分子担体を構成する共重合体は、細胞内に送達する対象となる物質に応じて、セグメント（Ａ）以外のセグメントを有してもよい。
【００４０】
例えば、本発明の共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有することができる。
【００４１】
無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）は、例えば、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーによって構成することができる。
【００４２】
本発明の無機微粒子に吸着可能なモノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、例えば、セグメント（Ａ）に付加することができる。
【００４３】
無機微粒子に吸着可能なモノマーは、特に限定されないが、例えば、金属を細胞内に送達させる場合は、無機微粒子に吸着して分散可能な基を有するモノマーが挙げられる。該基としては、チオール基や、ピリジル基が挙げられる。ピリジル基を有するモノマーとしては、特に限定されないが、以下の一般式（ＩＶ）で表される化合物であるものが好ましい。
【００４４】
【化４】
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【００４５】
Ｒ１１は、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ１２は、炭素数１〜７のアルキレン基であり、炭素数２〜７のアルキレン基であることが好ましく、炭素数３〜５のアルキレン基であることが更に好ましい。
【００４６】
無機微粒子は、特に限定されないが、例えば、シリカ、金属酸化物（アルミナ等）、金属（金、銀、鉄、銅等）等の微粒子が挙げられる。細胞に金属ナノ粒子を送達する場合、金属ナノ粒子として、金属ナノロッド（棒状）を用いると、送達する細胞を光温熱により細胞死させることができる。また、無機微粒子としてメソポーラスシリカを用いることで、薬剤を細胞内に送達させることもできる。
【００４７】
セグメント（Ｂ）における、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーのユニット数は、特に限定されないが、１〜１００が好ましく、１０〜８０が好ましく、２０〜５０が更に好ましい。
【００４８】
セグメント（Ｂ）における、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーに由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは５０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは７０ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは８０ｍｏｌ％以上であり、最も好ましくは９０ｍｏｌ％以上である。セグメント（Ｂ）における、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーに由来する構成単位の占める割合が高いほど、細胞内に送達可能な無機微粒子が多くなり、より効率的に細胞内への送達が可能となる。
【００４９】
本発明のセグメント（Ｂ）には、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマー以外の上述のその他のモノマーが含まれてもよい。その他のモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、ブトキシメトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、無水イタコン酸、シトラコン酸、無水シトラコン酸、クロトン酸、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−フェノキシ−２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピルフタレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらのモノマーを、単独で有していても、２種以上を組み合わせて有していてもよい。
【００５０】
セグメント（Ａ）とセグメント（Ｂ）とを有する共重合体の製造方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、セグメント（Ａ）を製造した後に、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーを用いて、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法により製造することができる。
【００５１】
本発明の細胞内送達用高分子担体を構成する共重合体は、セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有することができる。これにより、細胞内に核酸を送達したい場合、本発明の共重合体のセグメント（Ｃ）が、核酸とポリプレックス（複合体）を形成するので、核酸を細胞内に送達することができる。
【００５２】
セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）は、特に限定されず、セグメント（Ａ）の正電荷を勘案して適宜設定することができ、例えば、カチオン性モノマーに由来する構成単位を有するものを用いることができる。
【００５３】
本発明のセグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、例えば、セグメント（Ａ）に付加することができる。
【００５４】
セグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーは、特に限定されないが、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン等のカチオン性のペプチドを有するモノマーや、エチレンイミン等が挙げられる。また、セグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーは、セグメント（Ａ）を構成するカチオン性モノマーと同種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよく、セグメント（Ｃ）が、セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するように構成されればよい。
【００５５】
カチオン性のペプチドを有するモノマーの製造方法は、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、ポリリジンを有するモノマーの製造方法は、α−アミノ酸Ｎ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）のリジン誘導体（ε−カルボベンゾキシＬ−リジンＮＣＡ）について、α−アミノ基とカルボン酸以外の官能基を保護した後、ホスゲンを反応させることにより製造することができる。
【００５６】
セグメント（Ａ）とセグメント（Ｃ）とを有する共重合体の製造方法は従来公知の方法を用いることができるが、例えば、セグメント（Ａ）を製造した後に、セグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーを用いて、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法により製造することができる。
【００５７】
本発明の細胞内送達用高分子担体を構成する共重合体を、ミセル形成能を有するように構成することができる。ミセル形成能を有するように構成する場合、細胞への送達能を向上させるために、上記セグメント（Ａ）を親水性とすることが好ましい。セグメント（Ａ）が、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーのみによって構成される場合において、セグメント（Ａ）が疎水性となるときは、これら以外の親水性モノマーを更に共重合させることによって、セグメント（Ａ）を親水性にすることができる。該親水性モノマーとしては、具体的には、（メタ）アクリル酸、アミノスチレン、ヒドロキシスチレン、酢酸ビニル、（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（アルキル）アミノアルキル（メタ）アクリレート、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリアルキレンオキシド変性（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン等のＮ−ビニルラクタム類、Ｎ−ビニルホルムアミド等のＮ−ビニルアミド類、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル等のポリエチレングリコールモノアルキルエーテル等が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５８】
上記セグメント（Ａ）が親水性である場合、本発明の共重合体がミセル形成能を有するようにするためには、セグメント（Ｂ）やセグメント（Ｃ）が疎水性であってもよい。また、セグメント（Ｂ）やセグメント（Ｃ）が親水性であった場合、本発明の共重合体に更に疎水性モノマーを重合してもよい。これにより、高分子ミセル担体として、対象となる物質を細胞内に送達することができる。
【００５９】
本発明の共重合体の質量平均分子量（ポリスチレンを標準物質としたＧＰＣによる測定）は、２０００〜１０００００であることが好ましく、２０００〜３００００であることがより好ましい。上記範囲とすることで、対象物質の細胞への送達能に優れる。
【００６０】
本発明の細胞内送達用高分子担体の、細胞への送達する方法は、従来の公知の方法によりすることができ、例えば、人体の細胞内に送達する場合、静脈注射により送達することができ、単離された細胞に送達する場合、細胞培地に混合することで、送達することができる。
【実施例】
【００６１】
＜細胞内送達用高分子担体の合成＞
［ピリジンモノマーの合成］
常温、Ａｒ雰囲気下で、ＤＣＣ（１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）８．２７ｇ（４０ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ２（ジクロロメタン）２００ｍＬで溶解した。その後、メタクリル酸を３．４ｍＬ（４０ｍｍｏｌ）加え、１０分撹拌した。更に、４−ピリジンプロパノールを５ｇ（３６．４ｍｍｏｌ）加えた。最後に、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）４４５．３ｍｇ（３．６４ｍｍｏｌ）を加え、１日撹拌した。撹拌後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で反応が進んでいることを確認し、ろ過、濃縮した。酢酸エチルに溶解させ、ＮａＨＣＯ３、Ｂｒｉｎｅ（食塩水）で洗浄後、有機層を回収した。回収した有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、濃縮を行なった。濃縮によって得られたクルードをカラム（展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝４／１）によって精製分離し、濃縮、真空乾燥を行った（３．９ｇ，収率５２．１％）。得られた化合物が式（１）で表されるピリジンモノマーであることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
【００６２】
【化５】
2015168653.tif 000007
【００６３】
［ＲＡＦＴ重合剤ＣＤＢ（クミルジチオベンゾエート）の合成］
マグネシウム１．１３ｇ（４６．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ）（テトラヒドロフラン（超脱水））６０ｍＬに溶解し、Ａｒ雰囲気下、６０℃で還流しながらブロモベンゼン５．０ｍＬ（４６．５ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、マグネシウムが溶解するまで撹拌した。氷浴下で二硫化炭素４．０ｍＬ（５１．１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、２時間撹拌後、更に室温で３０分撹拌した。反応終了後、氷水７００ｍＬを反応溶液に加え、ｐＨが酸性になるまで１ＮＨＣｌを加えた。反応溶液をジエチルエーテルで３回抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、溶液を濃縮した後に真空乾燥を行い、式（２）で表される化合物を得た。式（２）で表される化合物５．２ｇ（３３．７ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４１００ｍＬに溶解し、ＴｓＯＨ（トルエンスルホン酸）・Ｈ２Ｏ１３０ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）を加え、Ａｒ雰囲気下、９０℃で還流しながらα−メチルスチレン６．４ｍＬ（５０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、一晩撹拌した。反応溶液を濃縮し、ＣＨＣｌ３で希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液とｂｒｉｎｅ（食塩水）とで洗浄した後に、ｄｒｙＭｇＳＯ４（無水硫酸マグネシウム）で脱水した。その後、濃縮・真空乾燥を行い、カラム精製（展開溶媒：ヘキサン）を行い、式（３）で表されるＲＡＦＴ重合剤ＣＤＢ（クミルジチオベンゾエート）を得た（４．０ｇ，収率４５．５％）。得られた化合物が式（３）で表されるＣＤＢであることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
【００６４】
【化６】
2015168653.tif 000008
【００６５】
［Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧの合成］
式（１）で表される化合物（ピリジンモノマー）６００ｍｇ（２．９ｍｍｏｌ）、式（４）で表される化合物（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＡ）１．８ｇ（０．８７ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（アゾイソブチロニトリル）０．７２ｍｇ（４．０μｍｏｌ）、式（３）で表される化合物（ＣＤＢ）５．２ｍｇ（２０μｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）が２０．６ｍｌになるようにこれに溶かした。その後、凍結脱気を３回し、再びＡｒ置換して、７０℃オイルバスで３日間撹拌した。撹拌後、再沈殿（再沈殿溶媒：ジエチルエーテル／ＩＰＡ＝１８／２）、ろ過、濃縮の操作を二回行った。その後、ベンゼンによる凍結乾燥を行い、式（５）で表される化合物（Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧ）を得た（１．０３７ｇ，収率４２．７％）。仕込み比（モル比）は、式（１）で表される化合物：式（４）で表される化合物：ＡＩＢＮ：式（３）で表される化合物＝１３３：４０：０．２：１とした。得られた化合物が式（５）で表される化合物であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
【００６６】
【化７】
2015168653.tif 000009
【００６７】
［Ｇｌｙｃｏｍｏｎｏｍｅｒの合成］
ピリジン溶液１４１．７０ｍＬ（１．６１３ｍｏｌ）にＤ−ラクトースを２５．０５ｇ（０．０７３ｍｏｌ）、無水酢酸を１６４．６２ｍｌ（１．６１３ｍｏｌ）、ＤＭＡＰ０．０９２ｇ（０．７３００ｍｍｏｌ）を加え、９６時間撹拌した。白濁していた溶液が透明に変化したところで、ＴＬＣにより反応の終了を確認し、濃縮、真空引きをした。その後、少量のＣＨＣｌ３で溶解し、ジエチルエーテルを用いて再結晶二回行って精製し、式（６）で表される化合物を得た（３０．８１ｇ，収率６２．２０％）。得られた化合物が式（６）で表される化合物（オクタアセチルラクトース）であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。
【００６８】
Ａｒ雰囲気下において、式（６）で表される化合物（オクタアセチルラクトース）１５ｇ（２２．１ｍｍｏｌ）と、ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）３．２ｇ（２６．５２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２溶液１００ｍＬに溶解させ、氷冷で３０分、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。Ｈ２ＯとＮａＨＣＯ３、Ｂｒｉｎｅ（食塩水）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水、濃縮した。その後、少量のクロロホルムに溶解し、水に対して滴下して精製を行った。デカンテーションとＭｇＳＯ４により水を除き、ベンゼンによる凍結乾燥を行い、式（７）で表される化合物を得た（１３．８ｇ，収率８３．２％）。得られた化合物が式（７）で表される化合物（Ｇｌｙｃｏｍｏｎｏｍｅｒ）であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。１反応スキームを以下に示す。
【００６９】
【化８】
2015168653.tif 000010
【００７０】
［ＡｃＬａｃ−ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒの合成］
式（７）で表される化合物を２ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）、式（３）で表される化合物（ＣＤＢ）２１．７ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ４．３８ｍｇ（０．０２７ｍｏｌ）をＤＭＦ１２ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製を行い、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（８）で表さられる化合物（ＡｃＬａｃ−ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を得た（９５２ｍｇ，収率４７．６％）。得られた化合物が式（８）で表される化合物（ＡｃＬａｃ−ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
【００７１】
【化９】
2015168653.tif 000011
【００７２】
［ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥの合成］
式（７）で表される化合物を２ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＥＭＡ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）４２ｍｇ（０．２６７ｍｍｏｌ）、式（３）で表される化合物（ＣＤＢ）２１．６ｍｇ（０．０７９２ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ４．４２ｍｇ（０．０２７ｍｏｌ）をＤＭＦ１３．３５ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製を行い、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（９）で表される化合物を得た（１．１２７ｇ，収率５５．２％）。得られた化合物が式（９）で表される化合物（ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２％）であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。また、式（９）で表される化合物と、仕込み比（モル比）を変えて、式（１０）で表される化合物（ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）、（１１）で表される化合物（ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ５２％）を合成した。反応スキームを以下に示す。
【００７３】
【化１０】
2015168653.tif 000012
【００７４】
式（８）−（１１）で表される化合物のそれぞれの仕込み比（モル比）を表１に示す。上記「ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２％」、「ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％」、ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ５２％」中のそれぞれの数値は、合成後の、Ｌａｃのユニット数とＤＭＡＥのユニット数との合計ユニット数に対する、ＤＭＡＥのユニット数の割合を示す。
【００７５】
【表１】
2015168653.tif 000013
【００７６】
なお、１Ｈ−ＮＭＲ測定より、式（８）−（１１）で表される化合物について算出した理論数平均分子量、各モノマーのユニット数の詳細な結果を以下の表２に示す。なお、表２中の「Ｌａｃのユニット数」とは、Ｇｌｙｃｏｍｏｎｏｍｅｒのユニット数を指し、ＤＭＡＥのユニット数とは、ＤＭＡＥＭＡのユニット数を指す。
【００７７】
【表２】
2015168653.tif 000014
【００７８】
［Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃの合成］
式（８）で表される化合物を１．３ｇ（０．０７９ｍｍｏｌ）、式（１）で表される化合物（ピリジンモノマー）を６４８．６ｍｇ（３．１６ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ４．２６ｍｇ（０．０２６ｍｏｌ）をＤＭＦ１４．３ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。仕込み比は［ＡｃＬａｃ  ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ］：［ピリジンモノマー］：［ＡＩＢＮ］：＝１：４０：０．３３である。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製し、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（１２）で表される化合物を得た（１．８４ｇ，収率９４．２％）。得られた化合物が式（１２）で表される化合物であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。
【００７９】
ナスフラスコに式（１２）で表される化合物を１．８ｇ（０．０７２ｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）５０ｍＬ、Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ５ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加えて一晩撹拌した。その後、濃縮し、透析（分画分子量３５００）による精製を行なった。精製後、凍結乾燥により回収し、式（１３）で表される化合物を得た（１．１ｇ，収率８５．６％）。得られた化合物が式（１３）で表される化合物（Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ）であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
【００８０】
【化１１】
2015168653.tif 000015
【００８１】
［Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）の合成］
式（９）で表される化合物を１ｇ（０．０５６ｍｍｏｌ）、式（１）で表される化合物（ピリジンモノマー）を４６３ｍｇ（２．２６ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ３．００ｍｇ（０．０１８４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０．５ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。仕込み比は［ＡｃＬａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ］：［ピリジンモノマー］：［ＡＩＢＮ］：＝１：４０：０．３３とした。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製し、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（１４）で表される化合物を得た（１．３６８ｇ，収率９３．５％）。得られた化合物が式（１４）で表される化合物であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。
【００８２】
ナスフラスコに式（１４）で表される化合物を１．３６８ｇ（０．０７７ｍｏｌ）、ＤＭＳＯ２０ｍＬ、Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ３．８ｍＬ（７７ｍｍｏｌ）を加えて一晩撹拌した。その後、濃縮し、透析（分画分子量３５００）による精製を行なった。精製後、凍結乾燥により回収し、式（１７）で表される化合物を得た（８７１ｇ，収率８９．７％）。得られた化合物が式（１７）で表される化合物（Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２％））であることを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析により確認した。また、式（１７）で表される化合物の合成とは、各モノマーのユニット数を変更して、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）（式（１８）で表される化合物）とＰｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ５２％）（式（１９）で表される化合物）を合成した。反応スキームを以下に示す。
【００８３】
【化１２】
2015168653.tif 000016
【００８４】
化合物（１３）及び式（１７）−（１９）で表される化合物についての各モノマーのユニット数と、理論数的平均分子量を表３に示す。表３中の「Ｐｙのユニット数」とは、ピリジンモノマーのユニット数を示す。
【００８５】
【表３】
2015168653.tif 000017
【００８６】
＜ポリマー保護金ナノロッドの調製＞
［ＣＴＡＢ−金ナノロッドの調製］
０．１ＭのＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）溶液に１ｍＭの塩化金酸水溶液を２．５ｍｌずつ加えて、更に２０ｍＭのＮａＢＨ４水溶液を６００μｌ加えて５分撹拌し、金シードを調製した。
【００８７】
［金ナノロッドの調製］
０．１ＭのＣＴＡＢ溶液５０ｍｌに、１ｍＭ硝酸銀を５ｍｌ加えて３時間撹拌した。３時間後、０．５ｍＭの塩化金酸水溶液を５０ｍｌ加え、３０分撹拌した。その後、０．１Ｍのアスコルビン酸を２５０μｌ加え、更に上記金シードを２５０μｌ加え、１日撹拌してナノロッドを成長させた。
【００８８】
［ポリマー保護金ナノロッドの調製］
調製したＣＴＡＢ−金ナノロッドを遠心分離（２１０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。その後、上澄みを取り除き、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加えて、もう一度遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。その後、上澄みを取り除いた。これにより、余分なＣＴＡＢを取り除いた。その後、０．５ｍｇ／ｍｌのポリマー水溶液（キトサン、Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧ、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ及びＰｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２−５２％）のそれぞれの水溶液）を加えて２日間振とうした。振とう後、３日間の透析（ＭＷＣＯ：３５００）によりＣＴＡＢを除き、遠心分離（２００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で更に過剰のポリマーを除去した。調製後の金ナノロッドのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを図１に示す。
【００８９】
＜ポリマー修飾金ナノロッドの細胞取り込みの評価＞
［細胞準備］
ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、キトサン、Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧ、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２−５２％）のそれぞれに保護された金ナノロッドを、それぞれ金の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬとなるように加え４８時間インキュベートした。
【００９０】
［細胞回収］
４時間後、培地を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
【００９１】
［サンプル調製］
細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、サンプルとした。
【００９２】
［細胞内への送達量の定量（ＩＣＰ−ＡＥＳ測定）］
金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定した。測定結果から、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。その結果を表４、図２に示す。なお、図２中、ＰＬとは、「Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ」を意味し、ＰＬＤ−１２とは、「Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２％）」を示し、ＰＬＤ−２３とは、「Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）」を示し、ＰＬＤ−５２とは、「Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ５２％）」を示す。
【００９３】
【表４】
2015168653.tif 000018
【００９４】
表４及び図２に示すとおり、金ナノロッドの細胞取り込みは、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）修飾金ナノロッドが、大きな細胞取り込み量を示した。これは、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）修飾金ナノロッドが、まずＤＭＡＥの正電荷により、細胞表面に濃縮され、更にラクトースにより細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに認識された結果、高い細胞集積効果を示したためであると推定される。
【００９５】
［ポリマー修飾金ナノロッドの細胞取り込み阻害評価］
ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２％）のそれぞれに保護された金ナノロッドを、それぞれ、金の最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、また、ラクトースを最終濃度が５０ｍＭになるように加えて４８時間インキュベートした。
【００９６】
［細胞回収］
４時間後、培地を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
【００９７】
［サンプル調製］
細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、各サンプルとした。
【００９８】
［細胞内への送達量の定量（ＩＣＰ−ＡＥＳ測定）］
金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定し、その結果に基づいて、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。その結果を表５、図３に示す。
【００９９】
【表５】
2015168653.tif 000019
【０１００】
図２と図３との比較により、ラクトースを添加することで、細胞取り込みが減少したことが確認された。これは、細胞表面のレセプターがフリーのラクトースにキャップされたことに起因すると考えられる。このことから、この粒子の細胞取り込みがＬａｃ−細胞間の特異的なものであるということが確認され、更に、この取り込みは、ＤＭＡＥの正電荷による細胞表面への濃縮効果と、ラクトースによる糖鎖認識効果が共同的に作用することによって、達成されることが示唆された。
【０１０１】
＜細胞への光温熱治療効果＞
［細胞準備］
ＨｅｐＧ２細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３．２×１０４（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。この時の培地量は１００μＬとした。２４時間後、キトサン、Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧ、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ１２−５２％）のそれぞれに保護された金ナノロッド粒子をそれぞれ含有する培地を１００μＬ（濃度は１０μｇ／ｍＬ）添加し、４８時間インキュベートした。
【０１０２】
［レーザー照射］
粒子添加から４８時間後、培地を除去しＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去し、培地を１００μＬ添加して、レーザーを照射した。レーザー条件は、波長８００ｎｍ、照射時間１０分／ｗｅｌｌ、強度２．７Ｗ／ｃｍ２、ビーム直径０．６ｃｍとした。
【０１０３】
［ＭＴＴアッセイ］
レーザー照射後、２４時間後にＭＴＴアッセイを行った。まず、培地を除去し、ＭＴＴ試薬濃度が０．５ｍｇ／ｍＬの培地を１００μＬ添加し、４時間３７℃でインキュベートした。その後培地を除去し、ＩＰＡ／ＨＣｌを１００μＬ加え一晩静置し、プレートリーダーにより吸光度を測定した。ＭＴＴアッセイの結果を図４に示す。
【０１０４】
図４に示すとおり、ＰＬＤ−５２においては、レーザー照射により、細胞活性が低下しており、細胞死が確認できた。これは、ＰＬＤ−５２修飾ナノロッドは他の粒子に比べ、より多くの粒子が細胞内に取り込まれたため、より発熱し、大きな細胞死が誘導できたためであると考えられる。この結果は、ＩＣＰ−ＡＥＳの結果とも相関しており、粒子の細胞取り込みは、光温熱治療における重要なファクターであると示唆された。
【０１０５】
＜ポリマー保護金コロイドの調製＞
［クエン酸還元金コロイドの合成］
テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、２４．２８ｍＭ塩化金酸水溶液を調製した。また、クエン酸をＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、１００ｍＭクエン酸水溶液を調製した。２４．２８ｍＭ塩化金酸水溶液０．２４８ｍＬをＭｉｌｌｉ−Ｑ水２９．１５２ｍＬに添加し、１０分間激しく撹拌しながら１１０℃で還流した。１０分後、１００ｍＭクエン酸水溶液０．６ｍＬをゆっくり滴下し、３０分撹拌した。撹拌後、氷冷することで、０．２ｍＭ金コロイド溶液を得た。
【０１０６】
調製したクエン酸還元金コロイドに０．５ｍｇ／ｍｌとなるようポリマー水溶液（キトサン、Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧ、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ及びＰｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）のそれぞれの水溶液）を加えて１日間振とうした。振とう後、２日間透析（ＭＷＣＯ：３５００）によりクエン酸を除き、遠心分離（２００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で更に過剰のポリマーを除去した。調製後の金コロイドのＵＶ−ｖｉｓスペクトルを図５に示す。
【０１０７】
＜ポリマー修飾金コロイドの細胞取り込み評価＞
［細胞準備］
ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、キトサン、Ｐｙ−ｃｏ−ＰＥＧ、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ及びＰｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）に保護されたそれぞれの金コロイドを、それぞれ金の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬとなるように加え４８時間インキュベートした。
【０１０８】
［細胞回収］
４時間後、培地を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収し、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
【０１０９】
［サンプル調製］
細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、サンプルとした。
【０１１０】
［細胞内への送達量の定量（ＩＣＰ−ＡＥＳ測定）］
金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルと測定サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定し、その結果に基づいて、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。各サンプルの金濃度を表６、図６に示す。
【０１１１】
【表６】
2015168653.tif 000020
【０１１２】
表６、図６より、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）修飾金コロイドは、金ナノロッドと同様に、高い細胞取り込み量を示すことが確認された。これは、上述のＰｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）修飾金ナノロッドと同様に、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）修飾金コロイドは、まずＤＭＡＥの正電荷により細胞表面に濃縮され、更にＬａｃにより細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに認識された結果、高い細胞集積効果を示したためであると推定される。
【０１１３】
金コロイドのゼータ電位を測定した結果を図７に示す。図７中（ａ）は、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ修飾金コロイドを示し、（ｂ）は、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）修飾金コロイドを示す。図７に示すとおり、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）修飾金コロイドにおいては、細胞培養培地のｐＨ（ｐＨ７．４）で正の値を示していることが確認された。このことからも、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ）修飾金コロイドは、まずＤＭＡＥの正電荷により細胞表面に濃縮され、更にラクトースにより細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに認識された結果、高い細胞集積効果を示すことが示された。
【０１１４】
＜酸性条件での金コロイドの細胞取り込み＞
［細胞準備］
ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、Ｐｙ−ｂ−Ｌａｃ、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）にそれぞれ保護された金コロイドを、それぞれ金の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬとなるように加え４８時間インキュベートした。また、このとき、ｐＨが５．５、６．５又は７．４の３種類の培地について準備した。
【０１１５】
［細胞回収］
４８時間後、それぞれの培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収し、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
【０１１６】
［サンプル調製］
細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、サンプルとした。
【０１１７】
［ＩＣＰ−ＡＥＳ測定］
金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定した。測定結果に基づいて、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。全細胞に取り込まれた金の重量を、表７、図８に示す。
【０１１８】
【表７】
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【０１１９】
Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ２３％）においては、ｐＨが低くなるほど、金の取り込み量が大きくなった。これは、ｐＨが低くなることにより、よりアミンがカチオニックになったためであると推定される。
【０１２０】
＜細胞への光温熱治療効果（ｐＨ５．５）＞
［細胞準備］
ＨｅｐＧ２細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３．２×１０４（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。この時の培地量は１００μＬとした。２４時間後、キトサン、Ｐｙ−ｂ−（Ｌａｃ−ｃｏ−ＤＭＡＥ５２％）にそれぞれ保護された金ナノロッド粒子含有培地を１００μＬ（濃度は１０μｇ／ｍＬ）添加し、４８時間インキュベートした。このとき培地のｐＨをｐＨ５．５とした。
【０１２１】
［レーザー照射］
粒子添加から４８時間後、培地を除去しＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去し培地を１００μＬ添加して、レーザーを照射した。レーザー条件は、波長：８００ｎｍ、照射時間：１０分／ｗｅｌｌ、強度：２．７Ｗ／ｃｍ２、ビーム直径：０．６ｃｍとした。
【０１２２】
［ＭＴＴアッセイ］
レーザー照射後、６時間後にＭＴＴアッセイを行った。まず、培地を除去し、ＭＴＴ試薬濃度が０．５ｍｇ／ｍＬの培地を１００μＬ添加し、４時間３７℃でインキュベートした。その後培地を除去し、ＩＰＡ／ＨＣｌを１００μＬ加え一晩静置し、プレートリーダーにより吸光度を測定した。ＭＴＴアッセイの結果を図９に示す。
【０１２３】
キトサン、ＰＬＤ−５２共に、レーザー照射により細胞死が誘導されたことが確認された。また、キトサンにおいては、レーザー未照射にもかかわらず、ＰＬＤ−５２より細胞活性が低下していることが確認できた。上記の図２から、キトサンは、ＰＬＤ一５２より、細胞への金ナノロッドの取り込み量が少ないことが確認される。それにもかかわらず、キトサンの方が、細胞死が多かったことから、キトサンの方が、ＰＬＤ−５２より、細胞毒性が強いことが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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