(57)【要約】      （修正有）【課題】分子間ジスルフィド結合の形成方法に関し、この方法で用いられる（ポリ）ペプチド／タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、及びバクテリオファージ。バクテリオファージ粒子の表面への（ポリ）ペプチド／タンパク質の向上されたディスプレイのための方法の提供。【解決手段】第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの構成要素であり、第２（ポリ）ペプチド／タンパク質が、免疫グロブリン又はその機能的断片を含み、両者のシステイン残基の間でジスルフィド結合を形成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１のシステイン残基と第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合形成方法であって、当該方法が：
（ａ）ｐＩが８を超すアミノ酸を前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質又は前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に人工的に導入するステップであって、前記アミノ酸が前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるステップと；
（ｂ）前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質を、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質への付着を生じさせ、あるいは前記付着を可能にするステップと；
を具え、前記付着が前記第１のシステイン残基と前記第２の第２システイン残基との間のジスルフィド結合の形成により生じ、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、ステップ（ａ）において前記第１又は第２（ポリ）ペプチド／タンパク質に人工的に導入され、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、前記バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの構成要素であり、前記第２（ポリ）ペプチド／タンパク質が、免疫グロブリン又はその機能的断片を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ｐＩが８を超すアミノ酸が、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記ｐＩが８を超すアミノ酸が、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれることを特徴とする方法。    
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法において、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、バクテリオファージ粒子の表面上に提示されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法において、前記ジスルフィド結合が、宿主細胞のペリプラズム空間で形成されることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法において、前記ｐＩが８を超すアミノ酸が、リジン及びアルギニンから選択されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法において、前記タンパク質コートの構成要素が、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の短縮変異体又は修飾変異体であり、前記短縮変異体が前記バクテリオファージ粒子の前記タンパク質コートに組み込み可能であることを特徴とする方法。
【請求項８】
バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体をコードする配列を有する核酸であって、前記修飾変異体が：
（ａ）前記バクテリオファージの野生型コートタンパク質の１以上の部分であって、当該部分の１つが前記コートタンパク質をファージコートへの組み込みを生じさせ、あるいは前記組み込みを可能にする部分を少なくとも含む、前記バクテリオファージの野生型コートタンパク質の１又はそれ以上の部分と；
（ｂ）Ｎ末端又はＣ末端のシステイン残基と、
（ｃ）当該Ｎ末端又はＣ末端のシステイン残基に隣接する５アミノ酸内に位置し、前記Ｎ末端又はＣ末端のシステイン残基の反応性に好影響を与える、ｐＩが８を超すアミノ酸と；
を含むことを特徴とする核酸。
【請求項９】
修飾免疫グロブリン又はその機能的断片をコードする配列を有する核酸であって、前記修飾免疫グロブリン又はその機能的断片が：
（ａ）免疫グロブリン又はその機能的断片と、
（ｂ）Ｎ末端又はＣ末端のシステイン残基と、
（ｃ）当該Ｎ末端又はＣ末端のシステイン残基に隣接する５アミノ酸内に位置し、前記Ｎ末端又はＣ末端のシステイン残基の反応性に好影響を与える、ｐＩが８を超すアミノ酸と；
を具えることを特徴とする核酸。
【請求項１０】
請求項８又は９のいずれか１項に記載の核酸を具えることを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項８又は９のいずれか１項に記載の核酸又は請求項１０に記載のベクターを具えることを特徴とする宿主細胞。
【請求項１２】
請求項４に記載の方法で得られるバクテリオファージ粒子の多様なコレクションであって、前記バクテリオファージ粒子の各々が第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクション中の第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示することを特徴とするバクテリオファージ粒子の多様なコレクション。
【請求項１３】
（ａ）第１のシステイン残基を含む第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質と；
（ｂ）第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質と；
を含む複合体であって、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の１つが前記システイン残基の少なくとも１つに隣接する５アミノ酸内に位置し、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８を超すアミノ酸を更に含み、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質がバクテリオファージ粒子のタンパク質コートの構成要素であり、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が免疫グロブリン又はその機能的断片を含み、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が前記システイン残基を介してジスルフィド結合を形成することを特徴とする複合体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の複合体であって、前記第２（ポリ）ペプチド／タンパク質が複数のバクテリオファージ粒子の多様なコレクションに提示される第２（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションの構成要素であることを特徴とする複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書を通して複数の文書を引用する。それら文書の開示内容の全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
１９８５年、Ｓｍｉｔｈは、繊維状ファージが、このファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）に挿入された外来タンパク質断片に対して寛容であることを最初に実証し、タンパク質断片がファージ表面に提示されることを示すことに成功した（非特許文献１）。Ｌａｄｎｅｒは、この概念を、ファージ粒子の表面に提示される（ポリ）ペプチド及び／又はタンパク質のレパートリーのスクリーニングにまで拡大した（特許文献１及び２）。以後、ファージディスプレイは劇的な進展を遂げ、大きな成果を収めた。
【０００３】
（ポリ）ペプチド／タンパク質のファージディスプレイライブラリーを構築及びスクリーニングするための種々の形態が開発され、多くの概説記事及びモノグラフでそれらの発展が取り上げられており、要約されている（例えば非特許文献２〜４）。最も多く用いられてきたのは繊維状ファージを用いたシステムである。
【０００４】
当初は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片のディスプレイ（提示）として提案された（特許文献１；特許文献３も参照）方法が、その他の（ポリ）ペプチド／タンパク質のディスプレイに急速に拡大し、そのような（ポリ）ペプチド／タンパク質としては、例えばウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）（特許文献２）、ペプチドライブラリー（特許文献４）、ヒト成長ホルモン（特許文献５）、その他種々のタンパク質が含まれ、Ｆａｂ断片を初めとする多量体タンパク質の提示も含まれる（特許文献６及び３）。
【０００５】
（ポリ）ペプチド／タンパク質を繊維状バクテリオファージ表面に固定するためには、ファージコートタンパク質との主に遺伝的な融合が用いられる。遺伝子ＩＩＩタンパク質（非特許文献５）又はその断片（非特許文献６）との融合及び遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（非特許文献７）との融合が好ましい。遺伝子ＶＩが使用されたこともあり（非特許文献８）、Ｆｖ断片のディスプレイのために遺伝子ＶＩＩ及び遺伝子ＩＸが組み合わされて使用されたこともある（非特許文献９）。
【０００６】
更に、ファージディスプレイはラムダファージでも成功している。その場合には、遺伝子Ｖタンパク質（非特許文献１０）、遺伝子Ｊタンパク質、及び遺伝子Ｄタンパク質（非特許文献１１及び１２）が使用された。
【０００７】
遺伝的融合を用いる他には、会合ドメインを介して外来のペプチド又はタンパク質をファージ表面に付着させることが行われている。特許文献７は、非共有結合性のディスプレイを実現するために、ファージ上に提示されるタグと提示する（ポリ）ペプチド／タンパク質を融合させたタグ結合リガンドとを用いることを示唆している。
【０００８】
同様な概念によるｃＤＮＡライブラリーのディスプレイも探求されており（非特許文献１３）、ｃＤＮＡ断片のディスプレイを仲介するためにｊｕｎ／ｆｏｓ相互作用が用いられた。そのコンストラクトでは、ｊｕｎ及びｆｏｓの両端に付加されたシステイン残基のフランキングが２つのジスルフィド結合を形成することで、相互作用が更に安定化されている。
【０００９】
所望の標的に結合したファージを回収する最良の方法が１つの問題であった。通常、これは、ｐＨ勾配若しくは塩勾配を利用した適切な緩衝剤による溶出又は可溶性の標的を用いた特異的溶出により達成される。しかし、この方法では、標的に高いアフィニティーで結合する最も興味深いバインダーが失われかねない。この問題の克服を試みる複数の代替方法が記載されており、そのような方法は、提示される（ポリ）ペプチド／タンパク質とその融合相手との間又は目的の標的とその標的を固体表面に固定するためのその担体との間に切断シグナルを設けるものである。更に、上述した手法の多くは、少なくともファージコートタンパク質の一部と外来（ポリ）ペプチド／タンパク質とを含む融合タンパク質の使用を必要とする。
【００１０】
特許文献８には全く異なるシステムが記載されており、融合タンパク質を必要としないので、これらの問題の多くを解決した。特許文献８に記載されている、いわゆる「ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ」システムは、バクテリオファージコートタンパク質と免疫グロブリン又はその機能的断片との間のジスルフィド共有結合の形成に基づくものである。免疫グロブリン又はその機能的断片は、バクテリオファージ粒子の表面に提示される。同様な技術がその後特許文献９に開示された。特許文献９が特許文献８と異なる点は、ファージミドではなく修飾されたヘルパーファージを介してシスタグを付けたｐＩＩＩポリペプチドが提供される点である。更に、特許文献９はまた、バクテリオファージ粒子上に（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示するために使用され得る、ホモ多量体タンパク質（ＰＤＧＦ、Ｍａｘ、ＲｅｌＡ、ニューロトロフィン）及びヘテロ多量体タンパク質（タンパク質キナーゼ複合体、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質、ａ−Ｐａｌ／Ｍａｘ、Ｈｏｘ／Ｐｂｘ）等のその他のアダプターに言及している。
【００１１】
ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙシステムは十分に機能するが、バクテリオファージ粒子上により多くの（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示するシステムが特定の状況では有利となり得る。例えば、提示率を高めた、特に機能的提示率を高めたそのような改良されたシステムは確実に有益であり、利便性、信頼性、及び特異的のより高い、バインダーの単離、特にその標的と高いアフィニティーで結合するバインダーの単離を可能にする。
【００１２】
非特許文献１４は、２−ニトロ安息香酸で処理することで、天然タンパク質のペプチドの反応性システイン残基の局所的環境を研究し、正に帯電したアミノ酸に囲まれたシステイン残基がより高い反応性を示すことを観察した。追跡実験で、非特許文献１５はジスルフィド形成のカイネティクスを調べ、本質的に同じ結論に達した。非特許文献１６は、１６個のモデルペプチドのカイネティクスを、それらが種々の非タンパク質分子とジスルフィド結合を形成する能力について調べ、ペプチド上及び非タンパク質試薬上の正味の電荷の存在が反応性に影響を与えることを観察した。非特許文献１７は、チューブリン中の細胞内ジスルフィド結合の静電環境を調べ、最も反応性の高いシステイン残基は正に帯電した残基から６．５オングストローム内にあり、このことがチオールが解離してチオラートアニオンになるのを促進しているであろうことを見出した。非特許文献１８は、操作したＹＦＰの細胞内ジスルフィド結合を調べ、反応性システインの近傍に正に帯電したアミノ酸が存在すると反応性が増大することを見出した。非特許文献１９は、システイン残基を介してＰＧＥに付着させた単一特異性の多価Ｆａｂの作製を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第８８／０６６３０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９０／０２８０９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９２／０１０４７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９１／１９８１８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９２／０９６９０号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９１／１７２７１号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９１／１７２７１号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０１／０５９０９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０３／０６００６５号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．（１９８５）．Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１３１５−１３１７．
【非特許文献２】Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．＆  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．，ｅｄｓ．（１９９６）．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．
【非特許文献３】Ｄｕｎｎ，Ｉ．Ｓ．１９９６．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：５４７−５５３．
【非特許文献４】ＭｃＧｒｅｇｏｒ，Ｄ．（１９９６）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１５５−１６２．
【非特許文献５】Ｐａｒｍｌｅｙ  Ｓ．Ｆ．＆  Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｄ  ｐｈａｇｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｅ  ７３，３０５−３１８．
【非特許文献６】Ｂａｓｓ，Ｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｒ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．（１９９０）Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｈａｇｅ：ａｎ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８，３０９−３１４．
【非特許文献７】Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｊ．，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｅ．＆  Ｐｅｒｈａｍ  Ｒ．Ｎ．（１９９１）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ａ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０，８２１−８２７．
【非特許文献８】Ｊｅｓｐｅｒｓ  Ｌ．Ｓ．，Ｍｅｓｓｅｎｓ  Ｊ．Ｈ．，Ｄｅ  Ｋｅｙｓｅｒ  Ａ．，Ｅｅｃｋｈｏｕｔ  Ｄ．，Ｖａｎ  ｄ．Ｂ．，Ｉ，Ｇａｎｓｅｍａｎｓ  Ｙ．Ｇ．，Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  Ｍ．Ｊ．，Ｖｌａｓｕｋ  Ｇ．Ｐ．＆  Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ  Ｐ．Ｅ．（１９９５）．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｇｅｎｅ  Ｖｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１３，３７８−３８２．
【非特許文献９】Ｇａｏ，Ｃ，Ｍａｏ，Ｓ．，Ｌｏ，Ｃ−Ｈ．Ｌ．，Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｐ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，＆  Ｊａｎｄａ，Ｋ．Ｄ．（１９９９）．Ｍａｋｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｆｏｒｍａｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ａｒｒａｙｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，６０２５−６０３０．
【非特許文献１０】Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｉ．Ｎ．，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｈ．Ｉ．＆  Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｓ．（１９９４）Ｌａｍｂｄａ  ｆｏｏ：ａ  ｌａｍｂｄａ  ｐｈａｇｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，８２７３−８２７７．
【非特許文献１１】Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｎ．＆  Ｈｏｅｓｓ  Ｒ．Ｈ．（１９９５）．Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，１６０９−１６１３．
【非特許文献１２】Ｍｉｋａｗａ  Ｙ．Ｇ．，Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｉ．Ｎ．＆  Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｓ．（１９９６）．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ｈｅａｄｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，２１−３０．
【非特許文献１３】Ｃｒａｍｅｒｉ，Ｒ．，＆  Ｓｕｔｅｒ，Ｍ．（１９９３）．Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅｓ：ａ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  １３７，６９−７５．
【非特許文献１４】Ｓｎｙｄｅｒ，Ｇ．Ｈ．，Ｃｅｎｎｅｒａｚｚｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｋａｒａｌｉｓ，Ａ．Ｊ．＆  Ｆｉｌｅｄ，Ｄ．（１９８１）．Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０，６５０９−６５１９．
【非特許文献１５】Ｓｎｙｄｅｒ，Ｇ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｃｅｎｎｅｒａｚｚｏ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｆｉｌｅｄ，Ｄ．（１９８３）．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｓｉｒｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ７４９，２１９−２２６．
【非特許文献１６】Ｂｕｌｊａ，Ｇ．，Ｋｏｒｔｅｍｍｅ，Ｔ．＆  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｐ．（１９９８）Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｆｏｒ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｔｈｉｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，８９６５−８９７２．
【非特許文献１７】Ｂｒｉｔｔｏ，Ｐ．Ｊ．，Ｋｎｉｐｌｉｎｇ，Ｌ．＆  Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．（２００２）Ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｔｕｂｕｌｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２９０１８−２９０２７．
【非特許文献１８】Ｈａｎｓｅｎ，Ｒ．Ｅ：，Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｈ．＆  Ｗｉｎｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．（２００５）Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｄｉｔｈｉｏｌ−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｐａｉｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｍｉｌｉｅｕ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４４，５８９９−５９０６−
【非特許文献１９】Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｈ．，ＤｅＮａｒｄｏ，Ｇ．Ｌ．＆  ＤｅＮａｒｄｏ，Ｓ．Ｊ．（２００６）Ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｓｃＦｖ−ＳＨ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｒ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｒｅｅ  ＳＨ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１０，１００−１１６．
【発明の概要】
【００１５】
しかし、上記の研究はいずれも、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質と第２の異なる（ポリ）ペプチド／タンパク質との間に分子間ジスルフィド結合が形成されるシステムは記載していない。特にこれらの実験のいずれにおいても、そのようなジスルフィド結合が宿主細胞のペリプラズム空間で形成されているものはない。更に、引用した実験のいずれにおいても、（ポリ）ペプチド／タンパク質はバクテリオファージ粒子の表面に提示されていない。
【００１６】
そこで、本発明は、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１のシステイン残基と好ましくは異なる（ポリ）ペプチド／タンパク質である第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間にジスルフィド結合を形成するための改良された方法を提供する。前記改良は好ましくは前記システイン残基の反応性をより高くし、それによって提示率、特に機能的提示率を上昇させる。
【００１７】
この技術的問題は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することで解決される。根底にある問題を解決する、本発明の基礎を形成する技術的解決法、すなわち正に帯電したアミノ酸を反応性システイン残基に空間的に関連させて導入することは、先行技術中に提供も示唆もされていない。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明は、ファージコートタンパク質との融合タンパク質を使用する必要のない、バクテリオファージ粒子の表面に（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示するための改良されたシステムを提供する。それにより、前記システイン残基のより高い反応性が、より高い提示率、特により高い機能的提示率をもたらす。
【００１９】
したがって、本発明はとりわけ、バクテリオファージ粒子の表面に提示された（ポリ）ペプチド／タンパク質の巨大なライブラリーをスクリーニングするための改良された方法を提供する。
【００２０】
ある実施形態では、本発明は、ジスルフィド結合形成方法であって、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質を第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に付着させる工程を含み、前記付着が、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１のシステイン残基と前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合の形成により起こり、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の一方が、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を含んでいる、方法を提供する。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質又は前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質中に含まれ得る。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記野生型（ポリ）ペプチド／タンパク質中の対応するアミノ酸位置に存在しないものであってもよい。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、人工的に導入されていてもよい。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、同じ（ポリ）ペプチド／タンパク質上のシステイン残基に隣接する１０アミノ酸、好ましくは同じ（ポリ）ペプチド／タンパク質上のシステイン残基に隣接する５アミノ酸以内に含まれ得る。前記第１のシステイン残基は、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又はその近傍に存在してよい。前記第１のシステイン残基はまた、Ｎ末端システイン残基又はＣ末端システイン残基であってもよい。前記第２のシステイン残基は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮ末端若しくはＣ末端又はその近傍に存在してよい。前記第２のシステイン残基はまた、Ｎ末端システイン残基又はＣ末端システイン残基であってもよい。前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、バクテリオファージ粒子の表面に提示され得る。前記第１及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、適切な宿主細胞内で発現及び構築されてよい。前記ジスルフィド結合は、宿主細胞のペリプラズム空間で形成され得る。前記ジスルフィド結合は分子間ジスルフィド結合であってもよい。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、リジン及びアルギニンから選択され得るが、好ましくはリジンであってよい。前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は異なっていてもよい。前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーであってもよい。前記タンパク質コートのメンバーは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の短縮変異体であってもよく、ここで前記短縮変異体は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートに前記コートタンパク質を組み込まさせる前記野生型コートタンパク質の部分を少なくとも含む。前記タンパク質コートのメンバーは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体であってもよく、ここで前記修飾変異体は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートに組込み可能である。前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質中の対応するアミノ酸位置に存在するものであってよい。前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質中の対応するアミノ酸位置に存在しないものであってもよい。前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質に人工的に導入されていてもよい。前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の短縮変異体に人工的に導入されていてもよい。前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体に人工的に導入されていてもよい。前記バクテリオファージ粒子は、繊維状バクテリオファージのバクテリオファージ粒子であってもよい。バクテリオファージ粒子の前記タンパク質コートのメンバーは、野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであってもよく、又はそれに由来してもよい。バクテリオファージ粒子の前記タンパク質コートのメンバーは、野生型コートタンパク質ｐＩＸであってもよく、又はそれに由来してもよい。前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる前記第２のシステイン残基は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型中の対応するアミノ酸位置に存在しないものであってもよい。前記第２のシステイン残基は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に人工的に導入されていてもよい。前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片を含んでもよい。前記機能的断片はｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片であってよい。
【００２１】
ある実施形態では、本発明は、バクテリオファージ粒子の表面に第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示する方法であって、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現後にタンパク質コートのメンバーに付着させる工程を含み、前記付着が、前記タンパク質コートのメンバーに含まれる第１のシステイン残基と前記（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合の形成により起こり、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質又は前記タンパク質コートのメンバーが、前記第１又は前記第２のシステイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を含んでいる、方法を提供する。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体をコードする核酸配列であって、前記修飾変異体が、
（ａ）バクテリオファージの前記野生型コートタンパク質の１又は複数部分であって、前記部分の１つが、ファージコートへの前記コートタンパク質の組込みを起こす又は可能にする部分を少なくとも含む、１又は複数部分、
（ｂ）第１のシステイン残基、及び
（ｃ）前記第１のシステイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸
を含む、核酸配列を提供する。
【００２３】
ある実施形態では、本発明は、
（ａ）免疫グロブリン又はその機能的断片、
（ｂ）システイン残基、及び
前記システイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸
を含む修飾された免疫グロブリン又はその機能的断片をコードする核酸配列を提供する。修飾免疫グロブリンの前記機能的断片は、ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片であってよい。
【００２４】
上記の核酸配列はいずれも、精製及び／又は検出のための１又は複数のペプチド配列を更にコードしていてもよい。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は、上記の核酸配列のいずれかを含むベクターを提供する。前記ベクターは、第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする１又は複数の核酸配列を更に含んでもよい。
【００２６】
ある実施形態では、本発明は、上記の核酸配列又はベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする１又は複数の核酸配列を含む第２のベクターを含んでもよい。
【００２７】
ある実施形態では、本発明は、上記核酸配列のいずれかによりコードされる（ポリ）ペプチド／タンパク質、上記ベクターのいずれかによりコードされる（ポリ）ペプチド／タンパク質、又は上記宿主細胞のいずれかにより産生される（ポリ）ペプチド／タンパク質を提供する。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法によって得られる、表面に（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示しているバクテリオファージ粒子を提供する。前記バクテリオファージ粒子上に提示される前記（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片であってよい。
【００２９】
ある実施形態では、本発明は、前述したバクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供し、前記バクテリオファージ粒子はそれぞれが、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションの中から第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示する。
【００３０】
ある実施形態では、本発明は、
（ａ）前述のバクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供する工程、及び
（ｂ）所望の特性を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示している少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るための、前記多様なコレクションのスクリーニング及び／又はセレクション工程
を含む、所望の特性を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法を提供する。前記方法の工程（ｂ）は更に、
（ｂａ）前記バクテリオファージ粒子の多様なコレクションを目的の標的と接触させる工程、
（ｂｂ）目的の標的に結合していないバクテリオファージ粒子を溶出する工程、及び
（ｂｃ）工程（ｂａ）で形成された目的の標的と目的の標的に結合しているバクテリオファージとの複合体を還元条件下で処理することで目的の標的に結合しているバクテリオファージ粒子を溶出する工程
を含んでもよい。前記所望の特性は、目的の標的への結合、目的の標的の抑制、目的の標的のブロッキング、標的が媒介する反応の活性化又は酵素活性であり得る。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、
第１のシステイン残基を含む第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質及び
第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質
を含む複合体を提供し、ここで前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の一方は、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を更に含み、前記第１及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、前記システイン残基を介してジスルフィド結合を形成する。前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、複数のバクテリオファージ粒子の多様なコレクションに提示される第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションのメンバーであってよい。前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、ファージコートタンパク質であってよい。前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片を含んでもよい。前記機能的断片は、ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片であってよい。
【００３２】
ある実施形態では、本発明は、上記の複合体のいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【００３３】
ある実施形態では、本発明は、ジスルフィド結合形成方法であって、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質を第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に付着させる工程を含み、前記付着が、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１のシステイン残基と前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合の形成により起こり、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の１つが、ｐＩが８超のアミノ酸を含んでいる、方法を提供する。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与え得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】典型的なＣｙｓＤｉｓｐｌａｙベクターを示す図である。Ｆａｂ断片の重鎖及び軽鎖がｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下にある。第１の発現カセットが、シグナル配列ｏｍｐＡ並びに軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）を含み、第２の発現カセットが、シグナル配列ｐｈｏＡ並びに重鎖の可変領域（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ１）を含む。重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合で連結されていない。遺伝子ＩＩＩも同じベクター上のコードされている（ｇＩＩＩ）。ジスルフィド結合を形成するシステインは、ｐＩＩＩのＮ末端及び重鎖Ｆｄ断片のＣ末端（「Ｃ」で表す）に位置する。ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩは、ディスプレイベクターの作製又は修飾に便利に利用可能な制限部位を表す。
【図２】Ｎｉ−ＮＴＡプレートへの結合を示す図である。「ｐＭ２５」は、元の「ｐＭＯＲＰＨ２５」コンストラクトを表し、「ｐＭ２５＿Ａ」〜「ｐＭ２５＿Ｅ」は、それぞれコンストラクト「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡ」〜「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥ」を表す。「ｐＭ２５  ｗ／ｏ  ＨＩＳタグ」は、ヒスチジンタグを除去したコンストラクトを表す。吸収は３７０ｎｍで測定した。
【図３】ｐＭＯＲＰＨバージョンＡ、Ｂ、及びＣの機能的提示率を示す図である。「ｐＭ２５」は元の「ｐＭＯＲＰＨ２５」コンストラクトを表し、「ｐＭ２５＿Ａ」〜「ｐＭ２５＿Ｃ」は、それぞれコンストラクト「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡ」〜「「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＣ」を表す。各コンストラクトについて、棒グラフは左から順に以下の通りである：５．０ｅ＋１０バクテリオファージ粒子毎ウェル、５．０ｅ＋９バクテリオファージ粒子毎ウェル、５．０ｅ＋８バクテリオファージ粒子毎ウェル、５．０ｅ＋７バクテリオファージ粒子毎ウェル、５．０ｅ＋１０バクテリオファージ粒子毎ウェル＋２５ｍＭ  ＤＴＴ、及びＢＳＡコーティングされたプレート中のウェルで５．０ｅ＋１０バクテリオファージ粒子毎ウェル。
【図４】ｐＭＯＲＰＨバージョンＥの機能的提示率を示す図である。「ｐＭ２５」は元の「ｐＭＯＲＰＨ２５」コンストラクトを表し、「ｐＭ２５＿Ｅ」は「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥ」を表す。各コンストラクトについて、棒グラフは左から順に以下の通りである：１．０ｅ＋１０バクテリオファージ粒子毎ウェル、１．０ｅ＋９バクテリオファージ粒子毎ウェル、５．０ｅ＋８バクテリオファージ粒子毎ウェル、２．５ｅ＋８バクテリオファージ粒子毎ウェル、１．２５ｅ＋８バクテリオファージ粒子毎ウェル、６．２５ｅ＋７バクテリオファージ粒子毎ウェル、ＢＳＡコーティングされたプレート中のウェルで１．０ｅ＋１０バクテリオファージ粒子毎ウェル、及び１．０ｅ＋１０バクテリオファージ粒子毎ウェル＋２５ｍＭ  ＤＴＴ。矢印は、ｐＭＯＲＰＨ２５標準バージョンとｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥの差が最も顕著である測定値を表す。
【図５】エストラジオール−ＢＳＡ特異的ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂ断片を含むｐＭＯＲＰＨ２３派生体の配列を示す図である。
【図６】エストラジオール−ＢＳＡ特異的ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂ断片を含むｐＭＯＲＰＨ２３派生体のベクターマップを示す図である。
【図７】エストラジオール−ＢＳＡ特異的ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂ断片を含むｐＭＯＲＰＨ２５派生体の配列を示す図である。
【図８】エストロジオール−ＢＳＡ特異的ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂ断片を含むｐＭＯＲＰＨ２５派生体のベクターマップを示す図である。
【図９】従来のコンストラクトのライブラリーと比較した本発明に基づくＦａｂ断片ライブラリーの相対的提示率を示す図である。各コンストラクトについて、従来のコンストラクト（ｐＭＯＲＰＨ２３）の提示率を１（すなわち１００％）とした。ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥで例示する改良されたコンストラクトの相対的提示率をｐＭＯＲＰＨ２３コンストラクトの提示率との関連で示す。試験に用いた異なるフレームワークをｘ軸に示す。白い棒グラフはラムダ鎖断片、黒い棒グラフはカッパ鎖断片を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
「ジスルフィド結合」は、２個のチオール基の反応により形成される共有結合である。ジスルフィド結合は（ポリ）ペプチド及びタンパク質のフォールディング及び安定性に重要な役割を果たす。ジスルフィド結合を有する多くのタンパク質は分泌型である。多くの細胞内コンパートメントは還元性環境であり、ジスルフィド結合は一般的に細胞質ゾル中では不安定である。（ポリ）ペプチド及びタンパク質中のジスルフィド結合は通常、システイン残基のチオール基間で形成され、２つのシステイン残基が酸化されると共有結合性のジスルフィド結合が形成される。ジスルフィド結合は、分子内結合と分子間結合が可能である。原核生物では、ジスルフィド結合は、ペリプラズムの酸化性環境で好ましく形成される。真核細胞では、ジスルフィド結合は通常、小胞体の酸化性環境では形成されるが、細胞質ゾルの還元性環境では形成されない（例外は、酸化センサーとして機能するシステイン残基を有するいくつかの細胞質ゾルタンパク質）。ジスルフィド結合は主に分泌タンパク質、リソソームタンパク質、及び膜タンパク質の細胞質外ドメインに見られる。ジスルフィド結合は、ゴムの加硫においても重量な役割を果たす。
【００３６】
「ｐＩ］又は「等電点」とは、分子又は表面が正味の電荷を有しないｐＨである。明確な等電点を有するためには、分子（又は表面）は両性、すなわち酸性官能基と塩基性官能基の両方を有しなければならない。タンパク質及びアミノ酸はこの要件を満たす分子である。２０個の天然アミノ酸のｐＩを表１に示す。しかし、本発明の方法の実施には非天然アミノ酸を使用してもよい。
【００３７】
2015037419.tif 000002
【００３８】
１個のアミノ基及び１個のカルボキシル基だけを有するアミノ酸のｐＩは、その分子のｐＫａから計算することができる。リジン等のイオン化可能な基を２つ以上有するアミノ酸は、それら２つのｐＫａを、天然型のアミノ酸から電荷が１つ増加又は減少したｐＩの計算に用いる。各計算方法は当業者に公知であり、あらゆる生化学の教科書に見出すことができる（例えば、ネルソンＤＬ（Ｎｅｌｓｏｎ  ＤＬ）、コックスＭＭ（Ｃｏｘ  ＭＭ）著、「レーニンジャーの新生化学（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第４版、２００４年、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）刊）。
【００３９】
タンパク質は、そのｐＩに従って等電点電気泳動で分離することができる。ｐＩより低いｐＨでは、タンパク質は正味で正の電荷を有する。ｐＩより高いｐＨでは、タンパク質は正味で負の電荷を有する。電気泳動ゲルのｐＨは、そのゲルに使用する緩衝剤によって決まる。緩衝剤のｐＨが泳動にかけるタンパク質のｐＩより高いと、タンパク質は正極に移動する（負電荷が正極に引き寄せられる）。緩衝液のｐＨが泳動にかけるタンパク質のｐＩより低いと、タンパク質はゲルの負極に移動する（正電荷が負極に引き寄せられる）。ｐＩと等しい緩衝剤ｐＨでタンパク質を泳動すると、タンパク質は全く移動しない。これは個々のアミノ酸についても同様である。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の第１及び／又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、ｐＩが８超のアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、前記第１及び／又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、ｐＩが９超、１０超、又は１１超であるアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、前記ｐＩが８超、９超、１０超、又は１１超のアミノ酸は、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質中に存在する。別の好ましい実施形態では、ｐＩが８超、９超、１０超、又は１１超のアミノ酸は、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質中に存在する。別の好ましい実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、リジン及びアルギニンから選択される。ある実施形態では、前記アミノ酸はリジンである。別の好ましい実施形態では、前記アミノ酸はアルギニンである。
【００４１】
ある好ましい実施形態では、本発明の第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を２個以上含む。別の好ましい実施形態では、本発明の第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を２個以上含む。いくつかの実施形態では、前記第１及び／又は前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、又は少なくとも５個含む。
【００４２】
更に別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸に直接隣接するアミノ酸残基はヒスチジン残基である。ある実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸のすぐＮ末端側のアミノ酸残基はヒスチジン残基である。別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸のすぐＣ末端側のアミノ酸残基はヒスチジン残基である。更に別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸のすぐＮ末端側のアミノ酸残基及び前記ｐＩが８超のアミノ酸のすぐＣ末端側のアミノ酸残基の両方がヒスチジン残基である。前記ｐＩが８超のアミノ酸に直接隣接する更に好ましい一続き（ｓｔｒｅｔｃｈ）のポリペプチドは、ｐＩが８超のアミノ酸（好ましくはリジン）で少なくとも１個のヒスチジン残基が置換されている長さが３、４、５、６、７、又は８のヒスチジン残基のポリペプチドである。前記ｐＩが８超のアミノ酸に直接隣接する非常に好ましい一続きのポリペプチド部分は、ｐＩが８超のアミノ酸（好ましくはリジン）で１、２、又は３個のヒスチジン残基が置換されている長さが６のヒスチジン残基のポリペプチドである。特に好ましいのは、前記ｐＩが８超のアミノ酸に直接隣接する以下のポリペプチドである：ＨＨＨＨＨＨ、ＨＨＨＫＨＨ、ＨＨＨＨＨＫ、ＨＫＨＫＨＫ（全てのアミノ酸を１文字表記で表す。すなわちＨ＝ヒスチジン、Ｋ＝リジン）。ある実施形態では、前記第１及び／又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１及び／又は第２のシステイン残基は、ｐＩが８超のアミノ酸（好ましくはリジン）で少なくとも１つのヒスチジン残基が置換されているそのような一続きのヒスチジン残基のすぐＣ末端側にある。
【００４３】
別の実施形態では、前記第１及び／又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１及び／又は第２のシステイン残基は、３、４、５、６、７、又は８個の一続きのヒスチジン残基のすぐＣ末端側及びｐＩが８超のアミノ酸、好ましくはリジンのすぐＮ末端側にある。場合によっては、前記第１及び／又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１及び／又は第２のシステイン残基のすぐＮ末端側にあるヒスチジン残基の１個は、ｐＩが８超のアミノ酸、好ましくはリジンで更に置換される。
【００４４】
本発明で、「反応性に好影響を与える」とは、２個のチオール基が反応してジスルフィド結合を形成する反応の平衡が生成物側にシフトする状況、すなわち、例えば国際公開第０１／０５９０９号に記載されている「ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ」システム等の公知のシステムと比較してより多くのジスルフィド結合が形成される状況を指す。各チオール基の反応性は、国際公開第０１／０５９０９号及び本発明に記載されているように容易に検出及び測定することができる。後述する相対的提示率又は機能的提示率が適切な試験系であり得る。本発明によれば、そのような平衡のシフトは、反応物の１つ、すなわち第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に存在するｐＩが８超のアミノ酸によって達成される。前記ｐＩが８超のアミノ酸は、そのような平衡のシフトをもたらすことができるように、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１のシステイン残基又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基の近傍に空間的に位置する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第１又は前記第２のシステイン残基に直接隣接する１０アミノ酸以内、好ましくは８アミノ酸以内、より好ましくは６アミノ酸以内、最も好ましくは５アミノ酸以内に位置する。ある実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第１又は前記第２のシステイン残基のＮ末端側に存在する。別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第１又は前記第２のシステイン残基のＣ末端側に存在する。
【００４６】
別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸の位置は、前記第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１又は第２のシステイン残基から１１アミノ酸以上離れているが、前記第１又は前記第２のシステイン残基に前記ｐＩが８超のアミノ酸が空間的に近接するような３次元構造を前記第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が有する。ｐＩが８超のアミノ酸及び前記アミノ酸の影響を受けるシステイン残基は、同じ（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれてもよく、例えば同じ（ポリ）ペプチド／タンパク質の異なるドメインに含まれてもよい。あるいは、ｐＩが８超のアミノ酸及び前記アミノ酸の影響を受けるシステイン残基は、異なる（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれてもよく、例えばｐＩが８超のアミノ酸が第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれ、前記アミノ酸の影響を受けるシステイン残基が第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれてもよく、その逆であってもよい。この場合、一方の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれるｐＩが８超のアミノ酸が、他方の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基の反応性に好影響を与える。当業者であれば、システイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸の導入に、所与の（ポリ）ペプチド／タンパク質内のどの位置のアミノ酸を選択し得るか知ることができる。（ポリ）ペプチド／タンパク質の３次元構造を決定するための種々の技術が公知であり、例えばＸ線結晶学又はＮＭＲ技術がある。更に、多くの（ポリ）ペプチド／タンパク質の３次元構造が既に利用可能であり、適切なアミノ酸位置の選択を容易にしている。詳細には、種々の免疫グロブリン又はｓｃＦｖ断片やＦａｂ断片等の機能的断片の３次元構造が、ＰＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）又はＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）等の種々のデータベースから公的に入手可能である。
【００４７】
本発明において、「バクテリオファージ」とは、ファージの複製に必要な核酸を含むタンパク質コートからなるパッケージを形成する細菌ウイルスに関する。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、２本鎖又は一本鎖であってよく、線上又は環状であってよい。ラムダファージ又は繊維状ファージ（Ｍ１３、ｆｄ、又はｆ１等）等のバクテリオファージは当業者に周知である。ある実施形態では繊維状ファージが好ましい。本発明において、「バクテリオファージ粒子」とは、本発明に係る粒子、すなわちジスルフィド結合を介して（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示する粒子を指す。ある実施形態では繊維状ファージのバクテリオファージ粒子が好ましい。
【００４８】
バクテリオファージの構築中、パッケージングシグナルが含まれていれば、異なる核酸配列がコートタンパク質にパッケージされてもよい。本発明において、バクテリオファージ又はバクテリオファージ粒子に含まれる「核酸配列」とは、バクテリオファージ又はバクテリオファージ粒子の構築中にバクテリオファージコートタンパク質にパッケージされ得る核酸配列又はベクターに関する。好ましくは、前記核酸配列又はベクターは、バクテリオファージの天然ゲノムに由来し、例えば、繊維状ファージの場合であれば、ファージ及びファージミドを含む。後者は、プラスミドの構成に加えてパッケージングシグナル及びファージ複製オリジンを含むプラスミドである。
【００４９】
ある実施形態では、バクテリオファージ粒子の表面に前記第１又は前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が提示される。好ましい実施形態では、バクテリオファージ粒子の表面に第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が提示される。別の実施形態では、バクテリオファージ粒子の表面に第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質が提示される。繊維状バクテリオファージ粒子が好ましい。
【００５０】
ある実施形態では、前記第１又は前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーである。好ましい実施形態では、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーである。別の実施形態では、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーである。好ましい実施形態では、前記バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーは、野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか又はそれに由来するものである。別の実施形態では、前記バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーは、野生型コートタンパク質ｐＩＸであるか又はそれに由来するものである。
【００５１】
本発明において、「由来する」とは修飾を意味し、この修飾されたタンパク質は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コート中に組み込むことが可能である。好ましくは、修飾タンパク質中の、野生型タンパク質に対応する部分は、対応する野生型の配列と比較して約５０％、約６０％、約７０％、好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０％を超えるアミノ酸同一性を有する。
【００５２】
更に別の好ましい実施形態では、本発明は、前記タンパク質コートのメンバーがバクテリオファージの野生型コートタンパク質である、方法に関する。
【００５３】
「野生型コートタンパク質」とは、天然のバクテリオファージのファージコートを形成するタンパク質を指す。繊維状バクテリオファージの場合、前記野生型タンパク質は、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタンパク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質（ｐＶＩＩＩ）、及び遺伝子ＩＸタンパク質（ｐｌＸ）である。ｆ１、ｆｄ、及びＭ１３等の繊維状バクテリオファージの密接に関連するメンバー間の差を含むこれらの配列は当業者に周知である（例えばＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、前記タンパク質コートのメンバーは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体であって、前記修飾変異体はバクテリオファージ粒子のタンパク質コートに組み込むことができる。
【００５５】
「修飾変異体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、前述した野生型タンパク質に由来する、野生型の配列と比較して修飾されているタンパク質を指す。そのような修飾には、野生型の配列と比較した任意のアミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、又は更なるアミノ酸の付加が含まれ得る。「修飾変異体」には、以下に定義する「短縮変異体」も含まれる。
【００５６】
本発明に係る野生型タンパク質を修飾するための方法は当業者に周知であり、標準的なクローニング及び／又は突然変異誘発技術が含まれる。本発明に係る方法で使用される野生型タンパク質の修飾変異体をコードする核酸分子の構築方法、ファージベクター及び／又はファージミドベクターの構築を初めとする前記核酸分子を含むベクターの構築方法、適切に選択された宿主細胞に前記ベクターを導入する方法、前記修飾タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。本発明に係る修飾変異体を同定するために、検出タグを変異体に融合させてもよく、変異体存在下で形成されたバクテリオファージ粒子のファージコート中に変異体が組込み可能であるか調べるためのアッセイを設計してもよい。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、前記タンパク質コートのメンバーは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の短縮変異体であり、前記短縮変異体は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートに前記コートタンパク質を組み込ませる前記野生型コートタンパク質の部分を少なくとも含む。
【００５８】
「短縮変異体」という語は、前述した野生型タンパク質に由来する、野生型配列の少なくとも一部の欠失によって修飾されているタンパク質を指す。これには、バクテリオファージ突然変異体で発見された（Ｃｒｉｓｓｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，１９８４）又は標準的なファージディスプレイ法の途上で作製された（例えばＢａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋｒｅｂｂｅｒ，１９９６）短縮遺伝子ＩＩＩタンパク質変異体等の変異体が含まれる。例えば、前記短縮変異体は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインからなってもよく、又はこれを含んでいてもよい。本発明に係る短縮変異体を同定するために、検出タグを変異体に融合させてもよく、変異体存在下で形成されたバクテリオファージ粒子のファージコート中に変異体が組み込まれているか調べるためのアッセイを設計してもよい。
【００５９】
野生型タンパク質の一部を欠失させて野生型タンパク質を短縮することで、野生型タンパク質中においては欠失部分に含まれていた第２のシステインとジスルフィド結合を形成していたシステイン残基が、利用可能になり得る。
【００６０】
「（ポリ）ペプチド」という語は、ペプチド結合で連結された複数すなわち２個以上のアミノ酸の鎖を１又は複数含む分子を指す。
【００６１】
「タンパク質」という語は、（ポリ）ペプチドの少なくとも一部が、その（ポリ）ペプチド鎖内及び／又は（ポリ）ペプチド鎖間で２次、３次、又は４次構造を形成することで、規定された３次元配置を有する又はとることができる（ポリ）ペプチドを指す。この定義には、天然タンパク質又は一部人工的なタンパク質が含まれ、また、タンパク質全体の断片又はドメインも、これらの断片又はドメインが上述のように規定された３次元配置をとることができる限り、含まれる。
【００６２】
１つの鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例としては、単鎖Ｆｖ抗体断片を挙げることができ、それより多くの鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例としてはＦａｂ抗体断片を挙げることができる。
【００６３】
第１のシステイン残基が第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質のＣ末端に位置する場合、提示形態は、ファージコートタンパク質のメンバーにＣ末端が遺伝子的に融合された従来の提示構成に対応する。しかし、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質のＮ末端を用いることで、前述したＣｒａｍｅｒｉ  ＆  ＳｕｔｅｒのｐＪｕＦＯシステム（Ｃｒａｍｅｒｉ  ＆  Ｓｕｔｅｒ，１９９３）におけるのと同じように提示形態を逆転することができる。
【００６４】
「バクテリオファージ粒子の表面」とは、バクテリオファージ粒子を含んでいる溶媒に接触している、接近可能なバクテリオファージ粒子の部分を指す。この表面は、適切な宿主細胞内でのファージ産生中に構築されるファージコートの一部であるタンパク質（粒子のタンパク質コートのメンバー）によって決まる。
【００６５】
「発現後」とは、バクテリオファージコートタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸が発現される手法に対して、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が前記コートに付着する前の、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸が宿主細胞内で発現される状況を指す。前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸の発現及び付着工程は、別々の工程及び／又は環境で行ってもよい。しかし、発現及び付着工程は適切な宿主細胞内で続けて行われることが好ましい。
【００６６】
「前記付着がジスルフィド結合の形成によって起こる」とは、例えばｐＪｕＦｏシステム（Ｃｒａｍｅｒｉ  ＆  Ｓｕｔｅｒ，１９９３）の場合のように、付着がジスルフィド結合によるものであり、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質中に存在する第２のドメインと相互作用するための相互作用ドメインが前記タンパク質メンバーに組換え融合されていない状況を指す。
【００６７】
好ましい実施形態では、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示するバクテリオファージ粒子は、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００６８】
本発明に係る（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子の構築方法、前記核酸分子を含むベクターの構築方法、適切に選択された宿主細胞への前記ベクターの導入方法、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５参照）。更に、適切な宿主細胞内におけるバクテリオファージ又はバクテリオファージ粒子の子孫の作製に必要な遺伝材料の導入方法及び前記バクテリオファージ又はバクテリオファージ粒子の子孫の作製方法も周知である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。
【００６９】
ある実施形態では、本発明は、前記第１のシステイン残基が、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中の対応するアミノ酸位置に存在するものである、方法に関する。より好ましくは、前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質中の対応するアミノ酸位置に存在するものである。
【００７０】
より好ましい実施形態では、前記第１のシステイン残基は、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中の対応するアミノ酸位置には存在しないものである。更により好ましくは、前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置には存在しないものである。
【００７１】
本発明において、（ポリ）ペプチド／タンパク質の「野生型バージョン」とは、自然のアミノ酸配列を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を指す。
【００７２】
更により好ましい実施形態では、前記第１のシステイン残基は、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に人工的に導入されている。より好ましい実施形態では、前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質に人工的に導入されている。別の実施形態では、前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体に人工的に導入されている。更に別の実施形態では、前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の短縮変異体に人工的に導入されている。
【００７３】
ある実施形態では、本発明は、前記第２のシステイン残基が、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中の対応するアミノ酸位置に存在するものである、方法に関する。より好ましくは、前記第２のシステイン残基は、免疫グロブリン又はその機能的断片中の対応するアミノ酸位置に存在するものである。
【００７４】
より好ましい実施形態では、前記第２のシステイン残基は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中の対応するアミノ酸位置には存在しないものである。更により好ましくは、前記第２のシステイン残基は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質中の対応するアミノ酸位置には存在しないものである。
【００７５】
更により好ましい実施形態では、前記第２のシステイン残基は、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に人工的に導入されている。より好ましい実施形態では、前記第２のシステイン残基は、免疫グロブリン又はその機能的断片に人工的に導入されている。好ましくは、前記機能的断片は、ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片である。
【００７６】
ある実施形態では、本発明は、前記ｐＩが８超のアミノ酸が、第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中の対応するアミノ酸位置に存在するものである、方法に関する。より好ましくは、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質又は免疫グロブリン若しくはその機能的断片、好ましくはｓｃＦｖ断片若しくはＦａｂ断片中の対応するアミノ酸位置に存在するものである。
【００７７】
より好ましい実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中の対応するアミノ酸位置には存在しないものである。別の好ましい実施形態では、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は野生型（ポリ）ペプチド／タンパク質ではなく、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中には存在しないものである。別の好ましい実施形態では、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は野生型（ポリ）ペプチド／タンパク質ではなく、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョン中には存在しないものである。更により好ましくは、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質又は免疫グロブリン若しくはその機能的断片、好ましくはｓｃＦｖ断片若しくはＦａｂ断片中の対応するアミノ酸位置には存在しないものである。
【００７８】
更により好ましい実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の野生型バージョンに人工的に導入されている。より好ましい実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質又は免疫グロブリン若しくはその機能的断片、好ましくはｓｃＦｖ断片若しくはＦａｂ断片に、人工的に導入されている。
【００７９】
本発明において、「人工的に導入されている」とは、（ポリ）ペプチド／タンパク質が、例えば組換え手段によって、修飾されている状況を指す。本発明では、種々の（ポリ）ペプチド／タンパク質が修飾され得る。例えば、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子を標準的な手法で操作してシステインコドンを導入してよく、それにより、修飾された第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列が作製される。ここで、システイン残基の人工的導入は、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質中への前記システイン残基の挿入若しくは付加、又は前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質若しくは修飾タンパク質に含まれるアミノ酸残基の前記システイン残基による置換、又は前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質と前記第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質との融合、又は前記挿入、付加、置換、若しくは融合の任意の組合せにより行われる。最も好ましくは、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質又はその修飾変異体若しくは短縮変異体である。
【００８０】
同様に、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸も、第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質について記載したのと同じように、標準的な手法で操作してシステインコドンを導入してよい。好ましい前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片を含む。ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片が特に好ましい。
【００８１】
同様に、第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸を標準的な手法で操作して、ｐＩが８超のアミノ酸をコードするアミノ酸コドンを導入してよい。
【００８２】
第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質がバクテリオファージの野生型コートタンパク質である場合、そのような組換えによって導入されたシステインコドンを含む核酸が発現することで、システイン残基を含む野生型コートタンパク質の変異体が形成される。
【００８３】
別の非常に好ましい実施形態では、前記第１のシステインは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の短縮変異体に人工的に導入されている。
【００８４】
更に別の好ましい実施形態では、前記第１のシステインは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体に人工的に導入されている。
【００８５】
本発明に係る人工的導入を達成するための方法は当業者に周知であり、標準的なクローニング及び／又は突然変異誘発技術が含まれる。本発明に係る方法で使用される野生型タンパク質の修飾変異体をコードする核酸分子の構築方法、前記核酸分子を含むベクターの構築方法、適切に選択された宿主細胞への前記ベクターの導入方法、前記融合タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９参照）。
【００８６】
別の実施形態では、本発明は、前記第１のシステイン残基が前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質のメンバーのＣ末端若しくはＮ末端又はその近傍に存在する、方法に関する。好ましい実施形態では、前記第１のシステイン残基は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーのＣ末端若しくはＮ末端又はその近傍に存在する。ある実施形態では、前記第１のシステイン残基はＮ末端システイン残基である。別の実施形態では、 前記第１のシステイン残基はＣ末端システイン残基である。
【００８７】
別の実施形態では、本発明は、前記第２のシステイン残基が前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質のメンバーのＣ末端若しくはＮ末端又はその近傍に存在する、方法に関する。好ましい実施形態では、前記第２のシステイン残基は、免疫グロブリン又はその機能的断片、好ましくはｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片の、Ｃ末端若しくはＮ末端又はその近傍に存在する。ある実施形態では、前記第２のシステイン残基はＮ末端システイン残基である。別の実施形態では、前記第２のシステイン残基はＣ末端システイン残基である。
【００８８】
「の近傍」とは、前記第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質のどちらの場合もＮ末端又はＣ末端から数えて１５個まで、より好ましくは１０個まで、更により好ましくは５個までの一続きのアミノ酸を指す。
【００８９】
好ましい実施形態では、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバー、好ましくはｐＩＩＩを含む。
【００９０】
好ましい実施形態では、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片、好ましくはｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片を含む。
【００９１】
この文脈において、「免疫グロブリン」は「抗体」の類義語として使用している。「機能的断片」とは、免疫グロブリンの抗原結合部分を保持している免疫グロブリン断片を指す。本発明に係る機能的免疫グロブリン断片は、Ｆｖ断片（Ｓｋｅｒｒａ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９８８）、ｓｃＦｖ断片（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ジスルフィド連結されたＦｖ断片（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、又は当業者に周知のその他の断片であってよく、これらは、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の可変領域を含む。ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片が特に好ましい。
【００９２】
ある実施形態では、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は異なる。この文脈において「異なる」とは、２個の（ポリ）ペプチド／タンパク質が完全に同一ではないことを意味する。好ましい実施形態では、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の修飾変異体又は短縮変異体ではない。非常に好ましい実施形態では、第１及び第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、異なる機能的（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードし、例えば一方の（ポリ）ペプチド／タンパク質はバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体をコードし、他方の（ポリ）ペプチドは免疫グロブリン又はその機能的断片をコードする。別の好ましい実施形態では、第１及び第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、異なる種に由来する（例えば一方の（ポリ）ペプチド／タンパク質はバクテリオファージに由来し、他方の（ポリ）ペプチドはヒトに由来する）。
【００９３】
好ましい実施形態では、本発明は、バクテリオファージ粒子の表面に第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示する方法であって、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現後にタンパク質コートのメンバーに付着させる工程を含み、前記付着が、前記タンパク質コートのメンバーに含まれる第１のシステイン残基と前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合の形成により起こり、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、前記第１のシステイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を含んでいる、方法を提供する。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、前記第１及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、適切な宿主細胞内で発現及び構築される。
【００９５】
更に別の実施形態では、本発明は、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）第１のシステイン残基を含む第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の核酸配列及び第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２の核酸配列を有する宿主細胞を提供する工程であって、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の一方が前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を含んでいる、工程、
（ｂ）前記第１及び前記第２の核酸配列を発現させる工程、及び
（ｃ）前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる前記第１のシステイン残基を、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる前記第２のシステイン残基に付着させる工程。
【００９６】
工程（ｂ）及び（ｃ）は順に続けて行われてもよく、同時に行われてもよい。
【００９７】
本発明において、「発現させる（ｃａｕｓｉｎｇ  ｏｒ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、核酸配列が発現されるような条件下で宿主細胞を培養することを意味する。
【００９８】
本発明に係る第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子の構築方法、前記核酸分子を含むベクターの構築方法、適切に選択された宿主細胞への前記ベクターの導入方法、（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野で周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９参照）。更に、適切な宿主細胞内でバクテリオファージ又はバクテリオファージ粒子の子孫を作製するために必要な遺伝材料の導入方法、前記バクテリオファージ又はバクテリオファージ粒子の子孫の作製方法も周知である（例えばＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）。バクテリオファージ粒子を産生する工程では、例えばファージミドを利用する場合、適切なヘルパーファージの使用が必要なこともある。
【００９９】
好ましい実施形態では、本発明は、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体をコードする核酸配列に関し、前記修飾変異体は、
（ａ）バクテリオファージの前記野生型コートタンパク質の１又は複数部分であって、前記部分の１つが、前記コートタンパク質をファージコート中に組み込ませる部分を少なくとも含む、１又は複数部分；
（ｂ）第１のシステイン残基；及び
（ｃ）前記第１のシステイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸
を含む又はからなる。別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基の反応性に好影響を与える。好ましい実施形態では、前記核酸配列は単離された核酸配列である。別の実施形態では、前記核酸配列は、精製及び／又は検出のための１又は複数のペプチド配列を更にコードする。
【０１００】
別の好ましい実施形態では、本発明は、修飾免疫グロブリン又はその機能的断片をコードする核酸配列に関し、前記修飾免疫グロブリン又はその機能的断片は、
（ａ）免疫グロブリン又はその機能的断片、
（ｂ）システイン残基、及び
（ｃ）前記システイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸
からなる。本明細書で使用されているように、免疫グロブリン又はその機能的断片は、本発明の用語法による第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質と同じである。別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、別の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる別のシステイン残基の反応性に良い影響を与える。この別のポリ（ペプチド）／タンパク質は、本発明の用語法による第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質と同じである。好ましい実施形態では、修飾免疫グロブリンの前記機能的断片は、ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片である。好ましい実施形態では、前記核酸配列は単離された核酸配列である。別の実施形態では、 前記核酸配列は、精製及び／又は検出のための１又は複数のペプチド配列を更にコードする。
【０１０１】
本発明において、野生型コートタンパク質配列中のアミノ酸を前記システイン残基で置換することで得られる修飾変異体は、付加的なシステイン残基によって連結された前記野生型タンパク質の２つの部分からなる変異体とみなせる。同様に、野生型配列と比較して複数の変異を含む野生型コートタンパク質の変異体は、その変異残基で個々の部分が連結された複数の野生型部分からなっているとみなせる。しかし、前記変異体はまた、システイン残基を含む最大６個の残基が野生型コートタンパク質のＣ末端又はＮ末端に付加されたものであってもよい。
【０１０２】
同様に、野生型すなわち親免疫グロブリンタンパク質配列又はその機能的断片中のアミノ酸残基を置換することで得られる免疫グロブリン又はその機能的断片の修飾変異体は、付加的システイン残基で連結された免疫グロブリン又はその機能的断片の２つの部分からなる変異体とみなせる。同様に、野生型コートタンパク質の修飾変異体又は免疫グロブリン若しくはその機能的断片の修飾変異体は、前記システイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超の付加的アミノ酸によって連結された２つの部分からなる変異体とみなせる。野生型コートタンパク質の修飾変異体又は免疫グロブリン若しくはその機能的断片の修飾変異体中にシステイン残基及びｐＩが８超のアミノ酸の両方が導入される場合、前記タンパク質は、３つの部分からなる変異体とみなせ、あるいは前記タンパク質が更により多くの変異を含むのであれば、更により多くの部分からなる変異体とみなせる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸配列は、精製及び／又は検出のための１又は複数のペプチド配列を更にコードする。本発明のある実施形態では、本発明の核酸配列は宿主細胞に含まれる。
【０１０４】
少なくとも５個のヒスチジン残基を含むペプチドが特に好ましく（Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、これは金属イオンに結合できるので、融合させたタンパク質の精製に用いることができる（Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。一般的に使用されているｃ−ｍｙｃ及びＦＬＡＧタグ（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｋｎａｐｐｉｋ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ．１９９４）、ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｓｋｅｒｒａ，１９９４；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、又はＥ−タグ（ＧＥヘルスケア社製）等の付加的部分を本発明で使用してもよい。
【０１０５】
本発明の第１及び第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の修飾変異体は、クローニング、発現、又はタンパク質輸送のために必要なアミノ酸残基を更に含んでもよい。クローニングに必要なアミノ酸残基としては、核酸配列を適切なベクター内にクローニングすることを可能にするために組み込まれる制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含む核酸配列によってコードされるアミノ酸残基が含まれ得る。発現に必要なアミノ酸残基としては、（ポリ）ペプチド／タンパク質の溶解性又は安定性を増大させる残基が含まれ得る。タンパク質輸送に必要なアミノ酸残基としては、大腸菌のペリプラズムへの修飾変異体の輸送を担うシグナル配列及び／又は前記シグナル配列の効率的切断を容易にするアミノ酸残基が含まれ得る。上述のクローニング、発現、タンパク質輸送、精製及び／又は検出に必要な更なるアミノ酸残基には、当業者に周知の多数の部分がある。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明は、本発明に係る核酸配列を含むベクターに関する。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ベクターは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体をコードする１又は複数の核酸配列を含み又はからなり、前記修飾変異体は、
（ａ）バクテリオファージの前記野生型コートタンパク質の１又は複数部分であって、前記部分の１つが、ファージコートへの前記コートタンパク質の組込みを起こす又は可能にする部分を少なくとも含む、１又は複数部分；
（ｂ）第１のシステイン残基、及び
（ｃ）前記第１のシステイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸
を含む又はからなる。別の実施形態では、前記ベクターは、修飾された免疫グロブリン又はその機能的断片をコードする核酸配列を更に含み、ここで前記修飾免疫グロブリン又はその機能的断片は、（ａ）免疫グロブリン又はその機能的断片及び（ｂ）第２のシステイン残基からなる。
【０１０８】
好ましい実施形態では、ベクターは、修飾免疫グロブリン又はその機能的断片をコードする１又は複数の核酸配列を含み又はからなり、ここで前記修飾免疫グロブリン又は機能的断片は、
（ａ）免疫グロブリン又はその機能的断片、
（ｂ）システイン残基、及び
（ｃ）前記システイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸
を含む又はからなる。別の実施形態では、前記ベクターは、バクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾変異体をコードする核酸配列を更に含み、前記修飾変異体は、
（ａ）バクテリオファージの前記野生型コートタンパク質の１又は複数部分であって、前記部分の１つが、ファージコートへの前記コートタンパク質の組込みを起こす又は可能にする部分を少なくとも含む、１又は複数部分；及び
（ｂ）別のシステイン残基
を含む又はからなる。
【０１０９】
本発明のある実施形態では、本発明のベクターは宿主細胞に含まれている。
【０１１０】
非常に好ましい実施形態では、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片を含む。
【０１１１】
前述した単鎖Ｆｖ抗体断片の場合、ベクターは、（ポリ）ペプチドリンカーによって連結されたＶＨ領域及びＶＬ領域をコードする１つの核酸配列を含み、Ｆａｂ抗体断片の場合、ベクターは、ＶＨ−ＣＨ鎖及びＶＬ−ＣＬ鎖をコードする２つの核酸配列を含む。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、本発明に係る核酸配列又は本発明に係るベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、本発明の第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸と同じベクターに含まれる核酸配列にコードされてもよい。そのような場合、宿主細胞は、両方の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む１つのベクターを含み得る。あるいは、本発明の第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、本発明の第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸とは異なるベクターに含まれる核酸配列によってコードされてもよい。その場合、宿主細胞は、異なる２つのベクター、すなわち第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター及び第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを含み得る。
【０１１３】
本発明において、「宿主細胞」とは、異種性タンパク質の産生において一般的に使用されている複数の細胞のいずれであってもよく、大腸菌（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）等の細菌、又は枯草菌（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、酵母（Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；  Ｒｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、糸状菌（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）等の真菌、植物細胞（Ｈｉａｔｔ  ＆  Ｍａ，１９９３；  Ｗｈｉｔｅｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、昆虫細胞（Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、又は哺乳動物細胞（Ｔｒｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、宿主細胞は真核宿主細胞、より好ましくはグラム陰性宿主細胞、最も好ましくは大腸菌である。
【０１１４】
更に別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明に係る核酸配列にコードされるか、本発明に係るベクターにコードされるか、又は本発明に係る宿主細胞によって産生される、野生型バクテリオファージコートタンパク質の修飾変異体に関する。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明は、表面に（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示しているバクテリオファージ粒子に関し、このバクテリオファージ粒子は、
前記（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現後にタンパク質コートのメンバーに付着させる工程を含み、前記付着が、前記タンパク質コートのメンバーに含まれる第１のシステイン残基と前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合の形成によって起こり、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質又は前記タンパク質コートのメンバーが、前記第１又は前記第２のシステイン残基の反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を含んでいる、方法によって得ることができる。ある実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質内に含まれる。別の実施形態では、前記ｐＩが８超のアミノ酸は、前記タンパク質のメンバー内に含まれる。好ましい実施形態では、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片である。更に別の実施形態では、ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質、好ましくはタンパク質コートのメンバーに含まれ、ｐＩが８超のアミノ酸は、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質、好ましくは免疫グロブリン又はその機能的断片に含まれる。
【０１１６】
本発明の特に好ましい実施形態では、バクテリオファージ粒子は本発明に係るベクターを含み、前記ベクターは、第１のシステイン残基を含む第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の核酸配列及び第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２の核酸配列を含み、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の一方は、前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を含む。最も好ましくは、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、少なくとも免疫グロブリンの機能的領域を含む。
【０１１７】
前述した本発明の方法の好ましい実施形態は、必要な変更を加えて、本発明のバクテリオファージに適用される。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明に係るバクテリオファージ粒子の多様なコレクションに関し、前記バクテリオファージ粒子のそれぞれが、（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションから第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示する。
【０１１９】
「バクテリオファージ粒子の多様なコレクション」は、「ライブラリー」又は「複数のバクテリオファージ粒子」ともいう。そのようなライブラリーの各メンバーは、別個の（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）ライブラリーのメンバーを提示する。
【０１２０】
本発明において、「多様なコレクション」とは、その組成、特性、及び／又は配列の少なくとも一部が異なる少なくとも２つの粒子又は分子のコレクションを意味する。例えば、（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションは、その配列の少なくとも１個のアミノ酸位置で異なる（ポリ）ペプチド／タンパク質の集合である。そのような（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションは種々の方法で得ることができ、例えば、誤りの多いＰＣＲを用いて出発点となる（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を増幅するか又は本発明に係る方法においてミューテーター株を宿主細胞として用いることにより、出発点となる（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも１つのコドンにランダム突然変異を誘発することで得られる。（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションを作製するためのこれらの方法及び更なる方法又は代替的方法は当業者に周知である。「バクテリオファージ粒子の多様なコレクション」は、ライブラリー又は複数のバクテリオファージ粒子ともいう。そのようなライブラリーの各メンバーは別個のライブラリーのメンバーを提示する。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）本発明に係るバクテリオファージ粒子の多様なコレクションを提供する工程；及び
（ｂ）所望の特性を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を提示している少なくとも１つのバクテリオファージ粒子を得るための、前記多様なコレクションのスクリーニング及び／又はセレクション工程
を含む、所望の特性を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法に関する。
【０１２２】
本発明において、「所望の特性」とは、（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクション中の（ポリ）ペプチド／タンパク質の１つが有するべき所定の特性であって、多様なコレクションのスクリーニング及び／又はセレクションの基礎を形成するものである。そのような所望の特性としては、標的への結合、標的のブロッキング、標的が介する反応の活性化、酵素活性等の特性、及び当業者に公知の更なる特性が含まれる。所望の特性の種類に応じて、当業者はスクリーニング及び／又はセレクションを実施するための形態及び必要な工程を決定することができる。前記所望の特性が、目的の標的への結合である方法が非常に好ましい。
【０１２３】
前記目的の標的は、当業者に周知の種々の方法で、前記バクテリオファージ粒子の多様なコレクションに呈することができ、例えば固相バイオパニング用に表面にコーティングされるか、溶液中でのバイオパニング用に磁気ビーズ等の粒子に連結されるか、又は全細胞のバイオパニング若しくは組織切片上でのバイオパニング用に細胞の表面上に提示される。前記標的に結合したバクテリオファージ粒子は、当業者に周知の種々の方法、例えば、ｐＨ勾配若しくは塩勾配を利用した適切な緩衝剤による溶出又は可溶性標的を用いた特異的な溶出によって回収することができる。
【０１２４】
好ましい実施形態では、（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法は、
（ｂａ）前記バクテリオファージ粒子の多様なコレクションを目的の標的と接触させる工程、
（ｂｂ）目的の標的に結合していないバクテリオファージ粒子を溶出する工程、
（ｂｃ）工程（ｂａ）で形成された目的の標的と目的の標的に結合しているバクテリオファージ粒子との複合体を還元条件下で処理することで、目的の標的に結合しているバクテリオファージ粒子を溶出する工程、
を更に含む。
【０１２５】
ＤＴＴとのインキュベート等の還元条件下ではジスルフィド結合が開裂するので、前記標的に特異的に結合した（ポリ）ペプチド／タンパク質の更なるバイオパニング及び／又は同定のために、特異的バクテリオファージ粒子を回収することができる。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明は、システインディスプレイシステムの改良方法に関し、第１又は第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質にｐＩが８超のアミノ酸を導入することにより、そのようなｐＩが８超のアミノ酸が導入されていない同等なシステインディスプレイシステムと比べて、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第１のシステイン残基が第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第２のシステイン残基とより好ましくジスルフィド結合を形成する。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）第１のシステイン残基を含む第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質
（ｂ）第２のシステイン残基を含む第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質
を含む複合体であって、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の一方が前記システイン残基の少なくとも１つの反応性に好影響を与えるｐＩが８超のアミノ酸を更に含み、前記第１及び前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質が、前記システイン残基を介してジスルフィド結合を形成している、複合体に関する。好ましい実施形態では、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、複数のバクテリオファージ粒子の多様なコレクション上に提示される第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質の多様なコレクションのメンバーである。ある好ましい実施形態では、前記第１の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、ファージコートタンパク質である。別の好ましい実施形態では、前記第２の（ポリ）ペプチド／タンパク質は、免疫グロブリン又はその機能的断片、より好ましくはｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片を含む。別の実施形態では、本発明は、上記の複合体のいずれかを含む宿主細胞を提供する。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：新規ベクターの構築
ベクターは、国際公開第０１／０５９０９号に記載されている公知の発現ベクターに基づいている。ｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下で、ジシストロニックなファージミドからＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖を発現させた。第１の発現カセットはシグナル配列ｏｍｐＡ並びに軽鎖の可変領域及び定常領域を含む。第２の発現カセットは、シグナル配列ｐｈｏＡ並びに重鎖の可変領域及び定常領域を含む。重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合で連結されていない。同じベクター上に遺伝子ＩＩＩもコードされている。ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ｐＩＩＩのＮ末端及び重鎖Ｆｄ断片のＣ末端に位置する。典型的なＣｙｓＤｉｓｐｌａｙベクターの主な構成を図１に示す。
【０１２９】
ｐＭＯＲＰＨ２３（国際公開第０４／０１３２７６号に記載）から派生したｐＭＯＲＰＨ２５ベクターに基づいて、新規のディスプレイベクター変異体（ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＥ）を構築した。エストラジオール−ＢＳＡ特異的ＨｕＣＡＬ  Ｆａｂ断片を含むｐＭＯＲＰＨ２３及びｐＭＯＲＰＨ２５の配列及びベクターマップを図５、６、７、及び８に示す。ｐＭＯＲＰＨ２３及びｐＭＯＲＰＨ２５のシステインタグ配列は同一である。
【０１３０】
修飾されたシステインタグを有するベクター変異体を構築するために、ｐＭＯＲＰＨ２５をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｃ末端の野生型配列を除去した（ｐＭＯＲＰＨ２５＿ＷＴタグ）。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されたディスプレイベクターｐＭＯＲＰＨ２５と適合する突出部を有するアニーリングされた２本鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチドをライゲーションすることで、バージョンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＥの新規のＣ末端タグを挿入した。
【０１３１】
各オリゴヌクレオチドの配列を表２にまとめた。２本鎖オリゴヌクレオチドは以下の手順に従ってアニーリングさせた。それぞれのオリゴヌクレオチドの組合せ（例えばｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡについては配列番号１及び配列番号２）各２００ｎｇを９９℃で２０分間インキュベートした後、室温に冷却し、相補的配列をアニーリングさせた。標準的なＤＮＡ技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；  Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）を用いて、アニーリングされたｄｓＤＮＡを消化済のｐＭＯＲＰＨ２５中にライゲーションし、電気的形質転換に受容性（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）のＴｏｐ１０Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に形質転換した。
【０１３２】
2015037419.tif 000003
【０１３３】
対照コンストラクトｐＭＯＲＰＨ２５の重鎖断片のＣ末端のアミノ酸配列を表３に示す。表３では、そのような４つの派生体を「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡ」、「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＢ」、「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＣ」、及び「ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥ」と名付けた。１つの変異体はＣ末端に余分にリジン残基を有する（変異体Ａ）。変異体Ｂ及びＣは、反応性システイン残基のＮ末端側それぞれ３個目及び１個目のアミノ酸をリジン残基に交換した。変異体Ｅは、反応性システインのすぐＮ末端側の５個のヒスチジン残基のうち３個をリジン残基に交換した。
【０１３４】
2015037419.tif 000004
【０１３５】
実施例２：Ｎｉ−ＮＴＡプレートへのファージの結合
ｐＭＯＲＰＨ２５の反応性システイン残基のすぐＮ末端側の６ヒスチジン残基は、Ｎｉ−ＮＴＡプレートへの結合能をバクテリオファージ粒子に付与する。バージョンＡでは、反応性システイン残基のＣ末端側にリジン残基を導入した。ｐＭＯＲＰＨ２５のバージョンＢ、Ｃ、及びＥでは、この一続きの６ヒスチジン残基を、前記一続きのヘキサヒスチジンのそれぞれに少なくとも１個のリジン残基を導入することで破壊した。これにより、Ｆａｂ断片を提示するバクテリオファージ粒子がＮｉ−ＮＴＡプレートに結合する能力は消失すると考えられる。
【０１３６】
Ｆａｂ断片を提示するバクテリオファージ粒子を標準的な技術（例えばＫａｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６及び国際公開第０１／０５９０９号の実施例２．２参照）で作製した。Ｎｉ−ＮＴＡプレートへのバクテリオファージ粒子の結合を以下に概説するように調べた。ファージ粒子（８×１０８／ウェル）をブロッキング溶液（ＴＢＳで希釈したケミブロック（Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）と共に２時間プレインキュベートし、予めブロッキングされたＨＩＳ−ｓｅｌｅｃｔ  ｉＬＡＰ  ＨＣニッケルコーティングされた９６ウェルプレート（シグマ−アルドリッチ社製）に添加した。ＰＢＳＴ及びＰＢＳで洗浄した後、抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（アマシャムファルマシアバイオテク社製）及び可溶性ＢＭブルー（ＢＭ  ｂｌｕｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ；ベーリンガーマンハイム社製）を用いて残ったファージを可視化した。結果を図２に示す。
【０１３７】
図２に示すように、ｐＭＯＲＰＨ２５のバージョンＢ及びＥのヒスチジンタグ破壊は効果的であった。本来のコンストラクトはまだＮｉ−ＮＴＡに結合していた。依然としてヘキサヒスチジンタグを有しているバージョンＡ、及び依然としてペンタヒスチジンタグを有しているバージョンＣも同様であり、バクテリオファージ粒子をＮｉ−ＮＴＡプレートに結合可能にするのにはペンタヒスチジンタグでも十分なようである。
【０１３８】
実施例３：相対的提示率
種々のベクターコンストラクト（バージョンＡ〜Ｅ、実施例１に概説）のファージ粒子の相対的提示率を以下に記載したようにして決定した。
【０１３９】
標準的な手法（例えばＫａｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６及び国際公開第０１／０５９０９号の実施例２．２参照）でファージ粒子を作製した。未知ファージ粒子溶液のファージ粒子の数及びファージ提示率を、独立した２回のＥＬＩＳＡ実験で決定した。抗ｐＩＩＩ捕獲ＥＬＩＳＡによりファージ標品のファージ粒子タイターを決定し、抗Ｆｄ捕獲ＥＬＩＳＡによりファージ標品の抗体提示率を決定した。相対的提示率は、抗Ｆｄシグナルを抗ｐＩＩＩ捕獲ＥＬＩＳＡシグナルで割ったものと定義される。
【０１４０】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃイムノマイクロタイタープレートを、２．５μｇ／ｍｌの抗ｐＩＩＩ捕獲抗体溶液（ドイツ、ゲッティンゲンのモビテック社（ＭｏＢｉＴｅｃｈ）製）１００μｌでコーティングし、第２のプレートを、０．５μｇ／ｍｌの抗Ｆｄ捕獲抗体溶液１００μｌで１２時間、４℃でコーティングして、ケミブロック溶液（ケミコン・インターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｈｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製）をＴＰＢＳで１：２に希釈して用いて室温で２時間ブロッキングした。ファージ粒子の段階希釈物をプレートに２時間添加した。ＴＢＳＴで５回洗浄した後、捕獲されたファージ粒子の検出を、抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（抗ｇ８ｐ特異的、アマシャム社製）、その後蛍光検出（ＱｕａｎｔａＢｌｕｅ、ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）製）を用いて行った。
【０１４１】
ファージ粒子タイターは、既知の粒子濃度の参照用ファージ溶液の較正曲線から計算することができる。抗体断片提示率が既知の規定の参照用ファージ粒子標品から、提示率を計算した。この参照用ファージ標品の提示率は、Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）に従って求めた。
【０１４２】
相対的提示率を表４にまとめる。元のｐＭＯＲＰＨ２５コンストラクトの提示率を１００パーセントとした。
【０１４３】
2015037419.tif 000005
【０１４４】
見て分かるように、ｐＭＯＲＰＨ２５の４つの派生体は全て、ｐＭＯＲＰＨ２５自体と比べて高い相対的提示率を示した。最も高い提示率を示したのはｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥであり、元のコンストラクトｐＭＯＲＰＨ２５よりも２．５７倍高い提示率を示した。
【０１４５】
本実験は、正に帯電したアミノ酸リジンを導入することでヘキサヒスチジンタグを破壊するとバクテリオファージ粒子上での提示率が上昇するという驚くべき結果を示している。
【０１４６】
実施例４：機能的提示率
本研究で用いる特定のバインダーに特異的な抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイによって、機能的提示率を測定した。
【０１４７】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃイムノマイクロタイタープレート上に１μｇの組換えタンパク質を４℃で１２時間コーティングし、５％脱脂粉乳（Ｊ．Ｍ．ガブラー・サリター・ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ社（Ｊ．Ｍ．Ｇａｂｌｅｒ  Ｓａｌｉｔｅｒ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ  ＫＧ）製）を含むＰＢＳを用いて室温で２時間ブロッキングした。種々のタグコンストラクト由来のファージ標品を、２０ｍＭのＤＴＴ存在下又は非存在下において、ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中でプレインキュベートした。予めブロッキングしたバクテリオファージ粒子の段階希釈物を、コーティングされたＭａｘｉｓｏｒｐウェルに添加し、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ及びＰＢＳで洗浄した後、抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（アマシャムファルマシアバイオテク社製）及び可溶性ＢＭブルー（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて残ったファージを可視化した。
【０１４８】
第１の対照実験群では、ウェルに２５ｍＭのＤＴＴを更に添加した。第２の対照実験群では、プレートをＢＳＡのみでコーティングした。ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡ、Ｂ、及びＣの結果を図３に、ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥの結果を図４に示す。
【０１４９】
試験に用いた全てのコンストラクトで機能的バクテリオファージ粒子を同定した。ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＡは、ｐＭＯＲＰＨ２５標準バージョンよりもわずかに良く、ｐＭＯＲＰＨ２５のバージョンＢ及びＣは、ｐＭＯＲＰＨ２５標準バージョンより明らかに良好である。個々のウェルに少なくとも５ｅ＋０８／ウェルのバクテリオファージ粒子を蒔いた時の差が最も顕著である。ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥの機能的提示率は、ｐＭＯＲＰＨ２５標準バージョンの約４倍も高い（図４に矢印で示す）。全ての対照の測定、すなわち２５ｍＭのＤＴＴを更に添加したウェル及びＢＳＡでコーティングされたプレート中のウェルの測定で、バックグラウンド以上のシグナルは生じなかった。
【０１５０】
本実験は、正に帯電したアミノ酸リジンを導入してヘキサヒスチジンタグを破壊すると、バクテリオファージ粒子の提示率が上昇するだけでなく、上昇した提示率がバクテリオファージ粒子の機能的結合とも連携しているという、驚くべき結果を示している。事実、機能的提示率の上昇は、前述の実験で測定した相対的提示率の上昇よりも更に高い。
【０１５１】
実施例５：多様なライブラリーの提示
本実施例では、修飾されたタグバージョンによる提示率の向上（表４参照）が、特異的Ｆａｂ断片に限定されず、多様なＦａｂ断片ライブラリーに一般的に適用可能であることを示す。ｐＭＯＲＰＨ２５バージョンＥ（Ｃ末端：−ＨＫＨＫＨＫＣ）の重鎖断片を含むＦａｂライブラリーの相対的提示率を元のｐＭＯＲＰＨ２３ベクター（Ｃ末端：−ＨＨＨＨＨＨＣ）の重鎖断片を含むＦａｂライブラリーと比較した。比較については表３を参照されたい（ｐＭＯＲＰＨ２３及びｐＭＯＲＰＨ２５のシステインタグ配列は同一である）。実験の設定は、実施例３と同一にした。結果を図９に示す。
【０１５２】
見て分かるように、本発明に係るポリペプチドを含むほぼ全てのフレームワークで、従来のベクター（これを１とする）と比べて明らかに提示率が向上している。更に、上昇した相対的提示率は、ラムダ鎖断片及びカッパ鎖断片の両方で観察される。
【０１５３】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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