(57)【要約】【課題】感染症の予防又は治療剤として有用で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることのできる舌下投与可能なワクチン組成物を提供する。【解決手段】ヒト又は動物の口腔内に投与されるワクチン組成物であって、少なくとも一種類の感染症由来抗原と、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、環状ビスジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類とを含み、前記感染症由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であり、前記インフルエンザウイルス由来抗原は、ウイルス全粒子であることを特徴とするワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物の口腔内に投与されるワクチン組成物であって、
少なくとも一種類の感染症由来抗原と、
トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、
トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、
環状ビスジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩
からなる群より選択される少なくとも１種類とを含み、
前記感染症由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であり、
前記インフルエンザウイルス由来抗原は、ウイルス全粒子である
ことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストは、
リポポリサッカライド又はその塩、及び、
モノホスホリルリピッド又はその塩
からなる群より選択される少なくとも１種類を含む請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項３】
リポポリサッカライド又はその塩は、大腸菌由来、サルモネラ菌由来、パントエア菌由来、アセトバクテリア菌由来、ザイモモナス菌由来、キサントモナス菌由来又はエンテロバクテリア菌由来であり、
モノホスホリルリピッド又はその塩は、サルモネラ菌由来のモノホスホリルリピッド又は合成グルコピラノシルリピッドである
請求項２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニストは、ジアシル化リポペプチド又はその誘導体若しくは塩を含む請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ジアシル化リポペプチドは、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、ＭＡＬＰ−２、ＦＳＬ−１、又は、これらの誘導体若しくは塩を含む請求項４記載のワクチン組成物。
【請求項６】
環状ビスジヌクレオチドは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、又は、これらの誘導体若しくは塩を含む請求項１記載のワクチン組成物。
【請求項７】
リポポリサッカライド又はその塩は、パントエア菌由来である請求項３記載のワクチン組成物。
【請求項８】
粘膜免疫及び全身性免疫応答を誘導せしめるものであり、
前記粘膜免疫応答は、抗原特異的ＩｇＡ抗体産生であり、
前記全身性免疫応答は、抗原特異的ＩｇＧ抗体産生及び抗原特異的細胞性免疫産生である請求項１記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症の予防又は治療剤として有用で舌下投与可能なワクチン組成物に関する。特に本発明は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、環状ビスジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類をアジュバントとして、感染症由来抗原とともに舌下投与することで、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導せしめることが可能なワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン製剤の剤形としては、現在製品化されているものそのほとんどが注射剤である。注射型ワクチンは、血中（全身性）の免疫応答（ＩｇＧ抗体の産生）を誘導するが、粘膜での免疫応答（ＩｇＡ抗体の産生）は誘導せず、感染後による病原体の増殖を防ぐことはできるが、粘膜経路による病原体の感染自体を防御することは困難であるという問題点があった。
そこで、近年、粘膜からのワクチン接種に注目が浴びており、なかでも、インフルエンザウイルスを抗原として用いた粘膜投与（経鼻投与）型ワクチンの開発が脚光を浴びている。
【０００３】
粘膜投与型ワクチンは、全身性免疫（ＩｇＧ抗体の産生）を誘導するだけでなく、粘膜免疫（ＩｇＡ抗体の産生）を誘導することが可能である。このＩｇＡ抗体は、対象となる疾患の病原体のタイプをあまり厳格に区別しないのが特徴であり、年々変わる病原体の流行型が変化しても対応することが可能であり、パンデミック防止に効果的であると考えられている。
また、経鼻投与型ワクチンが脚光を浴びているのは、消化管粘膜への抗原の投与では胃酸の影響やタンパク分解酵素の影響を受けやすく、これらを防ぐことが困難であるのに対し、経鼻粘膜への抗原の投与ではこれらの影響がないことがその理由の１つとして挙げられる。更に、鼻腔粘膜上にはＮＡＬＴと呼ばれる抗原認識組織があり、免疫応答に効果的であることも理由の１つである。
しかしながら、鼻腔粘膜への抗原の投与は、効果は高いが急性脳症等の重篤な副作用の可能性も高く、また老人や乳児等では経鼻投与自体が煩雑で難しく、更に鼻水等の身体的要因により安定した効果が得られない問題点があった。
【０００４】
一方で、抗原を経口投与し、嚥下後、消化管粘膜（小腸）等で全身性免疫及び粘膜免疫を誘導させようとする試みも多数行われている。この際の懸念点は、胃酸による抗原の分解、タンパク分解酵素による抗原の分解をいかに防ぐかということである。これらを解決するために、胃酸を中和する制酸剤を多量に含ませたり、マイクロスフェア等の被膜技術によって抗原を守るような技術が開発されてきた。
しかし、実際に開発が成功したものは、元々胃酸での安定性が高い生弱毒化ポリオウイルスワクチンや生弱毒化ロタウイルスワクチンであった。
【０００５】
また、経口投与で、嚥下せずに口腔内粘膜（特に舌下粘膜）経路で免疫応答させる製剤として、アレルギーワクチンが挙げられる。このワクチンは、Ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ  Ｉｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（ＳＬＩＴ）と呼ばれ、舌下にアレルギーの抗原となるタンパク（アレルゲン）を含む植物由来の抽出物を継続して投与することにより、当該アレルゲンに対して免疫寛容を起こすようになり、アレルギー反応が起こらなくなる現象を利用したものである。近年ヨーロッパにおいて当該治療法が認知され、現在は多数の製品が上市されている。
この口腔粘膜経路、特に舌下粘膜経路で免疫応答させる製剤を用いた治療法は、アレルゲンを皮下に注射していた従来の治療法（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）と比較して、患者のＱＯＬ及び重篤な副作用であるアナフィラキシーショックが起こりにくいとの観点から、大変脚光を浴びている。
しかし、当該治療法は、あくまで特異的な免疫寛容を起こさせる製剤を利用するものであり、免疫を活性化させる療法ではなかった。口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられてきた。
【０００６】
口腔粘膜経路、特に舌下粘膜経路で粘膜免疫及び全身性免疫を誘導する例としては、以下の報告が成されている。
抗原としてＯＶＡを用い、免疫賦活剤（アジュバント）としてコレラトキシンを用い、舌下に投与することにより、ＯＶＡ特異的な全身性免疫応答（ＩｇＧ産生）並びに、ＯＶＡ特異的な粘膜免疫応答（ＩｇＡ産生）が認められることが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、当該提案においては、神経毒性が高いコレラトキシンを免疫賦活剤として用いており、安全性に対して問題があった。
【０００７】
また、抗原としてＯＶＡを用い、免疫賦活剤としてＴＬＲ４アゴニストである３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａを用い、舌下に投与することにより、ＯＶＡ特異的な全身性免疫応答（ＩｇＧ産生）及びＯＶＡ特異的な粘膜免疫応答（ＩｇＡ産生）が認められることも提案されている（例えば、特許文献２参照）。当該提案においては、舌下投与においてＴＬＲ４アゴニストを免疫賦活剤として用いているが、感染症由来抗原に関する実施例がなく、効果に抗原の種類に対する汎用性があるかどうかは明確ではない。更に、ＯＶＡの投与量が８０〜１６０μｇであり、３脱−О−アシル化モノホスホリル脂質Ａの投与量の２０〜４０μｇとかなり投与量が多く、安全性を考慮した場合には実用性に欠ける部分があった。
【０００８】
また、合成アジュバントであるＧｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｌｉｐｉｄの合成法に関する提案（例えば、特許文献３参照）の中にも、抗原と当該アジュバントを併用して粘膜投与することで粘膜免疫応答が誘導される旨が記載されている。また、ＴＬＲ２／６リガンドであるＭＡＬＰ−２を用い、抗原としてβ−ガラクトシダーゼを用い、マウスに経鼻投与することで、血清中のＩｇＧ及び鼻腔洗浄液中のＩｇＡが誘導されることを提案（例えば、特許文献４参照）している。しかしながら、感染症由来の抗原及び口腔粘膜への投与に関しては、実施例がなく効果に汎用性があるかどうかは不明であった。更に、環状ビスジヌクレオチドであるｃ−ｄｉ−ＧＭＰ又はｃ−ｄｉ−ＡＭＰを免疫賦活剤として用い、抗原としてβ−ガラクトシダーゼを用い、マウスに経鼻投与することで、血清中のＩｇＧが誘導されることを提案（例えば、特許文献５参照）しているが、経鼻投与でのＩｇＡ誘導に関しては言及しておらず、また、感染症由来の抗原及び口腔粘膜への投与に関しては実施例がなく、効果に汎用性があるかどうかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０１１２９７４号明細書
【特許文献２】特表２００３−５１９６６９号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２７６８１３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００８／０２８６２９６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記現状に鑑み、感染症の予防又は治療剤として有用で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることのできる舌下投与可能なワクチン組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、口腔内投与、特に舌下投与において、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、環状ビスジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類をアジュバントとして、感染症由来抗原と共に舌下投与することで、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ヒト又は動物の口腔内に投与されるワクチン組成物であって、少なくとも一種類の感染症由来抗原と、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、環状ビスジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類とを含み、前記感染症由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であり、前記インフルエンザウイルス由来抗原は、ウイルス全粒子であることを特徴とするワクチン組成物である。
【００１３】
本発明のワクチン組成物において、上記トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストは、リポポリサッカライド又はその塩、及び、モノホスホリルリピッド又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種類を含むことが好ましい。
また、上記リポポリサッカライド又はその塩は、大腸菌由来、サルモネラ菌由来、パントエア菌由来、アセトバクテリア菌由来、ザイモモナス菌由来、キサントモナス菌由来、又は、エンテロバクテリア菌由来であり、上記モノホスホリルリピッド又はその塩は、サルモネラ菌由来のモノホスホリルリピッド又は合成グルコピラノシルリピッドであることが好ましい。
また、上記トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニストは、ジアシル化リポペプチド又はその誘導体若しくは塩を含むことが好ましい。
また、上記ジアシル化リポペプチドは、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、ＭＡＬＰ−２、ＦＳＬ−１、又は、これらの誘導体若しくは塩を含むことが好ましい。
また、上記環状ビスジヌクレオチドは、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ、又は、これらの誘導体若しくは塩を含むことが好ましい。
また、本発明のワクチン組成物において、口腔内への投与は、舌下粘膜への投与であることが好ましい。
また、本発明のワクチン組成は、粘膜免疫及び全身性免疫応答を誘導せしめるものであり、上記粘膜免疫応答は、抗原特異的ＩｇＡ抗体産生であり、上記全身性免疫応答は、抗原特異的ＩｇＧ抗体産生及び抗原特異的細胞性免疫産生であることが好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明のワクチン組成物は、少なくとも一種類の感染症由来抗原を含有する。
上記感染症由来抗原とは、被験生物体によって生じる免疫応答の標的であることができるあらゆる物質を指す。また、上記感染症由来抗原は、免疫担当細胞に接触した際に、免疫応答（例えば、免疫担当細胞の成熟、サイトカイン産生、抗体産生等）の標的であってもよい。
【００１５】
本発明で使用する感染症由来抗原としては、感染性病原体及び感染性病原体由来の抗原であれば特に限定されない。
上記感染性病原体から罹る疾患としては特に限定されず、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、またはＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡若しくはワクシニア、又は、伝染性軟属腫などのオルトポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス又はエンテロウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、生殖器疣、尋常性胱贅、又は、足底疣費を引き起こすものなどの乳頭腫ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、肝炎Ｂウイルス）、フラビウイルス（例えば、肝炎Ｃウイルス又はデングウイルス）、又は、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）などのウイルス感染から罹る疾患などのウイルス疾患、エシェリキア属、エンテロバクター、サルモネラ、ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、マイコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、又は、ボルデテラなどの細菌感染から罹る疾患などの細菌疾患、クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎をはじめとするがこれに限定されるものではない真菌疾患、マラリア、ニューモシスティスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及び、トリパノソーマ感染等が挙げられる。
【００１６】
本発明において、上記感染症由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であることが好ましい。
ここで、上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質とからなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。また、上記インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものであり、このＡ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。
本発明においては、上記感染症由来抗原としては、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。
【００１７】
本発明において、インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、例えば、精製ウイルス粒子が有機溶媒／界面活性剤若しくは他の試薬で不活化されたウイルス全粒子、又は、該ウイルス全粒子の中から不純物を取り除き、ＨＡ及び／若しくはＮＡを精製して作られたウイルスサブユニット等が挙げられる。免疫原性の観点から、ＨＡサブユニット又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。また、不純物が少なく、免疫賦活剤などのアジュバントが必須となるＨＡサブユニット（スプリット）について特に有効である。
上記インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。
【００１８】
本発明のワクチン組成物において、上記感染症由来抗原は有効量含有されていればよいが、例えば、１個体に１回投与のために、本発明のワクチン組成物の全量に対して、０．００１〜１０００μｇの範囲で含有されていることが好ましい。より好ましくは０．０１〜１００μｇの範囲であり、更に好ましくは０．１μｇ〜５０μｇの範囲である。０．００１μｇ未満であると、感染症の予防又は治療剤としての機能が不充分となることがあり、１０００μｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。なお、本明細書にいう「１個体」とは、任意の哺乳動物であってよく、好ましくはヒトである。
【００１９】
本発明のワクチン組成物は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニスト、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニスト、及び、環状ビスジヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類を含有する。
これらの化合物は、本発明のワクチン組成物において免疫賦活剤として機能するものである。
【００２０】
上記トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストとしては、リポポリサッカライド又はその塩が好適に挙げられる。なお、本明細書にいうリポポリサッカライドは、リポポリサッカライドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体であってもよい。本明細書にいう塩とは、任意の有機酸又は無機酸であってよいが、好ましくは薬学的に許容される塩である。
また、上記リポポリサッカライドは、グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記グラム陰性菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ  Ｃｏｌｉ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ属、Ｖｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｏｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｅｎｏｒｔｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属等が挙げられる。
なかでも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ  Ｃｏｌｉ属由来、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属由来、Ｐａｎｔｏｅａ属由来、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属由来、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属由来又はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属由来のものであることが好ましい。これらは、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、特にＰａｎｔｏｅａ属由来は、現在健康食品として用いられており、より有効であるといえる。これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。
【００２１】
また、上記グラム陰性菌細胞壁からの抽出物又は精製したリポポリサッカライドとして用いる場合には、一般的には生体への安全性を加味する必要があり、これらを解毒化するための改変体として用いることもできる。一方、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ等）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ等）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ等）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ等）、Ｐａｎｔｏｅａ属（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ等）は、古来より多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、これらの菌由来の抽出物又は精製したリポポリサッカライドをそのまま用いることも可能である。
【００２２】
また、上記トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストとしては、上記リポポリサッカライドの誘導体、例えば、多糖部分を除去したリピドＡ又はモノホスホリルリピッドＡ、３−脱−アシル化ＭＰＬ等が挙げられ、若しくは塩であってもよい。
上記リポポリサッカライドの多糖部分を除去したリピドＡとしては、上記グラム陰性菌由来の単離物であればよく、あるいはこれらグラム陰性菌由来の単離物と同じ構造になるように合成した物を用いてもよい。
また、上記リピドＡの改変体としては、脱リン酸化を行ったモノホスホリルリピッド（ＭＰＬ）又は塩も好適に用いられる。なお、本明細書にいうモノホスホリルリピッドは、モノホスホリルリピッドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体であってもよい。特に既に医療用途で免疫賦活剤として実績がある３−脱−アシル化物モノホスホリルリピッド（３Ｄ−ＭＰＬ）、又は、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号明細書で提案されている脱アシル化されていない合成Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄが生体への安全性の観点から好ましい。
また、上記モノホスホリルリピッドとしては、安全性及び使用前例のあるサルモネラ菌由来のものも好適に用いられる。
【００２３】
上記トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニストとしては、例えば、ジアシル化リポペプチド又はその誘導体若しくは塩を含むことが好ましい。
上記ジアシル化リポペプチドとしては、安全性及び使用前例のあるＰａｍ２ＣＳＫ４、ＭＡＬＰ−２、ＦＳＬ−１又はこれの誘導体若しくは塩からなる群より選択される少なくとも１種類を含むことが好ましい。
【００２４】
また、上記トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）アゴニストとしては、マイコプラズマ細胞膜からの抽出物又はその改変体であってもよく、合成品であってもよい。
上記マイコプラズマとしては、例えば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等が挙げられる。
【００２５】
上記マイコプラズマ細胞膜からの抽出物又は精製したジアシル化リポペプチドとして用いる場合には、一般的には生体への安全性を加味する必要があり、これらを解毒化するための改変体として用いることもできる。
【００２６】
上記環状ビスジヌクレオチドとしては、環状ビスジプリンヌクレオチド又はその誘導体若しくは塩であればよく、例えば、安全性の面からｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ又はその導体若しくは塩が好ましい。
【００２７】
上記ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ２／６アゴニスト及びｃ−ｄｉ−ＧＭＰは、いずれも舌下免疫賦活剤として充分な機能を有するものであり、特にＴＬＲ４アゴニストは安価に手に入り、またヒトでも使用実績がある。例えば、上記ＴＬＲ４アゴニストの一つであるパントエア菌由来ＬＰＳは、健康食品として広く使用されており、ヒトでの適応が容易であるといった利点がある。
【００２８】
本発明のワクチン組成物において、上述した３種類の免疫賦活剤（ＴＬＲ４、ＴＬＲ２／６、環状ビスジヌクレオチド）のそれぞれの含有量としては、例えば、１個体に１回投与のために、本発明のワクチン組成物の全量に対して、０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．１μｇ未満であると、充分な感染症の予防又は治療剤としての機能が得られないことがあり、１００ｍｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記免疫賦活剤含有量のより好ましい下限は０．３μｇ、より好ましい上限は５０ｍｇである。
【００２９】
また、本発明のワクチン組成物は、上述した３種類の群より選ばれる免疫賦活剤を少なくとも１種類含めば、これらと他の従来公知の免疫賦活剤を組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
本発明のワクチン組成物は、上述した感染症由来抗原及び免疫賦活剤に必要に応じて他の成分（例えば、リン酸緩衝溶液等）を加え、公知の方法で攪拌混合することで調製することができる。
また、本発明のワクチン組成物を用いて、液剤、固形製剤、噴霧剤を調製することが可能であり、上述した材料以外に、所望により、賦形剤、結合剤、香料、矯味剤、甘味剤、着色剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、界面活性剤等を適宜使用してもよい。
これらの材料としては特に限定されず、従来公知のものが使用できる。
【００３１】
ここで、上記固形製剤には、錠剤、コーティング錠、散剤、顆粒剤、紬粒剤、口腔内崩壊錠、口腔内貼付剤、ゼリー剤、フィルム剤が含まれ、口腔粘膜、舌下粘膜に投与する固形状のものであれば特に限定されない。
【００３２】
本発明のワクチン組成物は、ヒト又は動物（哺乳類、鳥類等）の口腔内への投与されるものであるが、当該口腔内への投与は、舌下粘膜への投与であることが好ましい。上述したように、口腔粘膜は、一般的には、免疫が起こりにくく、これら免疫寛容を引き起こすことができても、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明のワクチン組成物は、少なくとも一種類の感染症由来抗原とともに、上述した特定の免疫賦活剤を併用するため、口腔粘膜への投与であっても、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。
また、舌下粘膜への投与であることで、消化管粘膜へ抗原を投与する場合のように胃酸の影響やタンパク分解酵素の影響を受けることがなく、また、鼻腔粘膜へ抗原を投与する場合のように急性脳症等の重篤な副作用の可能性がなく、老人や乳児等でも投与が容易で更に鼻水等の身体的要因による安定した効果が妨げられることもない。
【００３３】
また、本発明のワクチン組成物の投与方法としては、前述した通りである。また、その投与量としては、動物種、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、例えば、感染症由来抗原としてＨＡを用いた場合、通常０．１μｇ〜５０μｇを１回又は２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、１〜４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。上記感染症由来抗原としてウイルス全粒子を用いた場合、ＨＡ換算で投与量を設定すればよい。なお、上記ＨＡの重量は、ＳＲＤ力価若しくはＬｏｗｒｙ法により測定した値である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のワクチン組成物は、少なくとも一種類の感染症由来抗原とともに、上述した特定の免疫賦活剤を併用するため、口腔粘膜、特に舌下粘膜への投与により、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１〜６、比較例１〜９のマウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。
【図２】実施例１〜６、比較例１〜９のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。
【図３】実施例７〜９、比較例１０〜１２のマウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。
【図４】実施例７〜９、比較例１０〜１２のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。
【図５】実施例１０、比較例１３、１４のインフルエンザウイルス感染時のマウス生存率を表すグラフである。
【図６】実施例１１、比較例１、１４のマウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。
【図７】実施例１１、比較例１、１４のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。
【図８】実施例１２、１３、比較例１５、１６、１のマウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。
【図９】実施例１２、１３、比較例１５、１６、１のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例１２、１４、１５、比較例１６、１のマウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１２、１４、１５、比較例１６、１のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例１６、１７、比較例１７、１８のマウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。
【図１３】実施例１６、１７、比較例１７、１８のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）７６.３μＬ（２３６μｇ／ｍＬ）と、大腸菌由来リポポリサッカライド（ナカライテスク社製）溶液３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）とに、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて１２０μＬのワクチン組成物を調製した。
予め準備したマウス（メス７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス、日本エスエルシー社）５匹に麻酔（ソムノペンチル；共立製薬社製）をかけた後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を２０μＬ投与した。
当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を２０μＬ投与した。
２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び鼻腔洗浄液を採取し、血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。
【００３８】
（実施例２〜６）
大腸菌由来リポポリサッカライドの代わりに、実施例２ではパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）を用い、実施例３ではグルコピラノシルリピッド（ＭＰＬＡｓ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、実施例４ではＦＳＬ−１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、実施例５ではＰａｍ２ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、実施例６ではｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＢＩＯＬＯＧ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にしてワクチン組成物を調製し、表１に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００３９】
（比較例１）
予め準備したマウス（メス７週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス、日本エスエルシー社）５匹に麻酔をかけた後、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を１２０μＬ用意し、それぞれのマウスの舌下に２０μＬ投与した。以降の操作は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００４０】
（比較例２）
リン酸緩衝液の代わりに、インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）７６．３μＬ（２３６μｇ／ｍＬ）に、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。以降の操作は表１に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００４１】
（比較例３〜９）
インフルエンザＨＡ抗原（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）に加え、比較例３ではペプチドグリカン（サルモネラ菌由来ＰＧＮ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、比較例４ではＺｙｍｏｓａｎ（ナカライテスク社製）を用い、比較例５ではＰａｍ３ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、比較例６ではＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、比較例７ではｆｌａｇｅｌｌｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、比較例８ではｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、比較例９ではＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用いた以外は、比較例２と同様にしてワクチン組成物を調製し、表１に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００４２】
【表１】
2015028092.tif 000002
【００４３】
（実施例７〜９）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）１９μＬ（２３６μｇ／ｍＬ）に加え、実施例７ではグルコピラノシルリピッド（ＭＰＬＡｓ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）溶液３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）に、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて１２０μＬのワクチン組成物を調製し、麻酔下にてマウス（メス７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス、日本エスエルシー社）に２０μＬ舌下投与した。実施例７におけるグルコピラノシルリピッドの代わりに、実施例８ではＦＳＬ−１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、実施例９ではｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍ ｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＢＩＯＬＯＧ社製）を用いてワクチン組成物を調製した。投与量は表２の通りであり、調製後の操作はマウスの種類が異なる以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００４４】
（比較例１０）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）１９μＬ（２３６μｇ／ｍＬ）にリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。投与量は表２の通りであり、調製後の操作はＢＡＬＢ／ｃマウスを用いている以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００４５】
（比較例１１、１２）
インフルエンザＨＡ抗原（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）７６．３μＬ（２３６μｇ／ｍＬ）に加え、比較例１１ではペプチドグリカン（サルモネラ菌由来ＰＧＮ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）３０μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）に、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて１２０μＬのワクチン組成物を調製した。比較例１１におけるペプチドグリカンの代わりに、比較例１２ではＰａｍ３ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用いてワクチン組成物を調製した。投与量は表２の通りであり、調製後の操作はＢＡＬＢ／ｃマウスを用いている以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００４６】
【表２】
2015028092.tif 000003
【００４７】
（実施例１０）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）１５２．６μＬ（２３６μｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）６０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え２４０μＬのワクチン組成物を調製した。
予め準備したマウス（メス７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス、日本エスエルシー社製）１０匹に麻酔をかけた後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を２０μＬ投与した。
当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を２０μＬ投与した。
２度目の投与から更に１週間後に、致死量のインフルエンザウイルス（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）を感染させ、その後２週間経過観察を行い、生存率測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。
【００４８】
（比較例１３、１４)
比較例１３ではインフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）のみを含んだ溶液、比較例１４ではリン酸緩衝液を調製した。表３の通りの投与量で実施例１０と同じ手順で試験を行った。
【００４９】
【表３】
2015028092.tif 000004
【００５０】
（実施例１１）
インフルエンザＨＡ抗原含有全粒子溶液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）１０．１μＬ（１７７６μｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。
表４に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５１】
（比較例１４)
比較例１４ではインフルエンザＨＡ抗原含有全粒子溶液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１））のみを含んだ溶液を調製した。表４に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５２】
【表４】
2015028092.tif 000005
【００５３】
（実施例１２）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）３６μＬ（５００μｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。
表５に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５４】
（実施例１３）
実施例１２におけるパントエア菌由来リポポリサッカライドの代わりに、実施例１３ではｃ−ｄｉ−ＧＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＢＩＯＬＯＧ社製）を用い、実施例１２と同様にしてワクチン組成物を調製し、表５に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５５】
（比較例１５)
実施例１２におけるパントエア菌由来リポポリサッカライドの代わりに、比較例１５ではｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用い、表５に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５６】
（比較例１６)
実施例１２におけるパントエア菌由来リポポリサッカライドの代わりに、比較例１６では他に何も加えず、インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）のみを含んだ溶液を作成した。表５に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５７】
【表５】
2015028092.tif 000006
【００５８】
（実施例１４）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／Ｖｉｃｔｒｉａ／３６１／２００９（Ｈ３Ｎ２）、阪大微生物病研究会製）３３．７μＬ（５３４μｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。表６に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００５９】
（実施例１５）
インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８、阪大微生物病研究会製）４７．４μＬ（３８０μｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。表６に示した投与量で実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００６０】
【表６】
2015028092.tif 000007
【００６１】
（実施例１６）
ワクチン組成物の調製は実施例１２と同じである。すなわち、インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）３６μＬ（５００μｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。
表７に示した投与量でＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００６２】
（実施例１７)
ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、シグマ社製）１８μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）にパントエア菌由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）３０μＬ（１ｍｇ／ｍＬ）、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え１２０μＬのワクチン組成物を調製した。
表７に示した投与量でＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００６３】
（比較例１７)
実施例１６におけるパントエア菌由来リポポリサッカライドの代わりに、比較例１７では他に何も加えず、インフルエンザＨＡ抗原含有溶液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、阪大微生物病研究会製）のみを含んだ溶液を調製した。表７に示した投与量でＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００６４】
（比較例１８)
実施例１７におけるパントエア菌由来リポポリサッカライドの代わりに、比較例１８では他に何も加えず、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、シグマ社製）のみを含んだ溶液を調製した。表７に示した投与量でＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた以外は実施例１と同じ手順で試験を行った。
【００６５】
【表７】
2015028092.tif 000008
【００６６】
（試験方法）
マウス血清中のインフルエンザＨＡ若しくはＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価を測定することにより、全身性免疫応答を評価した。また、マウス鼻腔洗浄液中のインフルエンザＨＡ若しくはＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価を測定することにより、粘膜免疫応答を評価した。それぞれの評価法に関しては次に示す。また、それぞれの評価結果を図１〜１３（図５除く）に示した。
一方でマウスにインフルエンザウイルスを感染させることでワクチン効果を確認する、ウイルス感染実験を行った。評価結果を図５に示した。
【００６７】
（マウス血清中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに炭酸緩衝液にて希釈した各インフルエンザＨＡ（例えばＡ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）特異的ＩｇＧ抗体価を測定する時にはＡ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザＨＡ抗原溶液）若しくはＯＶＡ含有溶液（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ添加し、一晩放置した。
予め準備した洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を精製水で４ｇ／１００ｍＬに希釈したブロッキング溶液を２００μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。その後、洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄した。
予めマウスから採取した血清を４℃下３０００Ｇで１０分間遠心し、上清２０μＬにリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）３００μＬを加えて希釈血清溶液を調製した。
ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液を用いて、前述の希釈血清溶液を用いて２倍ずつ１６回段階希釈し、その溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。
その後、洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液でＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍に希釈し、１００μＬずつ添加し、１時間室温で放置した。
その後、洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ  ＴＭＢキット、ナカライテスク社製）を１００μＬずつ加えた。ここに１Ｍ硫酸溶液を１００μＬずつ加え、当該９６ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（１６８−１１１３５ＣＡＭ、バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。段階希釈時の吸光度を基に、マウス血清中ＩｇＧ力価をＬｏｇ２で求めた。
【００６８】
（マウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＡ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに炭酸緩衝液にて希釈した各インフルエンザＨＡ（例えばＡ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）特異的ＩｇＡ抗体価を測定する時にはＡ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザＨＡ）もしくはＯＶＡ含有溶液（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ添加し、一晩放置した。
予め準備した洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を精製水で４ｇ／１００ｍＬに希釈したブロッキング溶液を２００μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。
その後、洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液を用いて、マウスから採取した鼻腔洗浄液を２倍ずつ１２回段階希釈し、その溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。
その後、洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液でＨＲＰ標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＡ  α  ＨＲＰ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍に希釈し、１００μＬずつ添加し、１時間室温で放置した。その後、洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回ウェルを洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ  ＴＭＢキット、ナカライテスク社製）を１００μＬずつ加えた。ここに１Ｍ硫酸溶液を１００μＬずつ加え、当該９６ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（１６８−１１１３５ＣＡＭ、バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。段階希釈時の吸光度を基に、マウス鼻腔洗浄液中ＩｇＡ力価をＬｏｇ２で求めた。
【００６９】
（マウスへのＡ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルス感染実験（生存率測定））
ワクチン投与を行ったマウスについて、最終投与より一週間後、麻酔下にて希釈したＡ／ＩｖＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを１５μＬ投与した（１０×ＬＤ５０：５０％  Ｌｅｔｈａｌ  Ｄｏｓｅ）。その日を０日目とし、１４日目までマウスの経過観察を行い、生存率を測定した。
【００７０】
図１、２に示したように、実施例１〜６では、インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが高レベルで産生しているのに対し、比較例１〜９では、インフルエンザＨＡ特異的ＩｇＧに関しては産生しているものもあるが、インフルエンザ特異的ＩｇＡに関しては産生量が低かった。これらの結果から免疫賦活剤としてＴＬＲ４アゴニスト及びＴＬＲ２／６アゴニスト、環状ビスジヌクレオチドが舌下での粘膜免疫誘導に有効であることが見出された。
図３、４に示したように、実施例７〜９と比較例１０〜１２との比較により、インフルエンザＨＡ抗原の投与量を０．７５μｇに減らした系においても、充分に舌下投与で全身性免疫及び粘膜免疫を誘導する事が可能であることが見出された。
図５に示したように、実施例１０と比較例１３、１４との比較により、舌下免疫を行うことによって、致死量のインフルエンザウイルスに対して完全な感染防御を達成していることが見出された。
図６、７に示したように、実施例１１と比較例１４、１との比較により、全粒子タイプのワクチンにおいてもアジュバントを用いることによって充分に全身性免疫及び粘膜免疫を誘導することが可能であることが見出された。
図８、９に示したように、実施例１２、１３と比較例１５、１６、１との比較により、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、すなわちヒトに感染する季節性インフルエンザについても全身性免疫及び粘膜免疫を誘導することが可能であることが見出された。
図１０、１１に示したように、実施例１２、１４、１５と比較例１６、１との比較により、舌下免疫によって様々なタイプのインフルエンザウイルスに対して全身性免疫及び粘膜免疫を誘導することが可能であることが見出された。
図１２、１３に示したように、実施例１６、１７と比較例１７、１８との比較により、インフルエンザＨＡ特異的及びＯＶＡ特異的全身性免疫及び粘膜免疫が高く誘導されていることが見いだされた。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明のワクチン組成物は、少なくとも一種類の感染症由来抗原とともに、上述した特定の免疫賦活剤を併用するため、口腔粘膜への投与であっても、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。
【図１】
2015028092.tif 000009
【図２】
2015028092.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015028092.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015028092.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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