(57)【要約】      （修正有）【課題】非標準的な官能基としてハロゲン原子を含有する非標準的なアミノ酸の組み込みにより安定化される一方、類似体の生物活性の少なくとも一部分を維持するインスリン類似体の提供。【解決手段】Ｂ２４位にてペンタフルオロ−フェニルアラニンが組み込まれたＢ鎖ポリペプチドを含むインスリン類似体。前記類似体は、ヒトインスリンのような哺乳動物インスリンのものであってよく、前記インスリン類似体をコードする核酸。著しい活性を保持するハロゲン化インスリン類似体。生理的有効量のインスリン類似体またはその生理的に許容される塩を患者に投与することを含む患者を治療する方法。【効果】インスリンのハロゲン置換に基づく安定化は、冷蔵のない開発途上の地域における真性糖尿病の治療を向上させ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ２４位にてペンタフルオロ−フェニルアラニンにより修飾されたインスリンＢ鎖ポリペプチドを含むインスリン類似体。
【請求項２】
Ｂ１０位にて酸性アミノ酸置換でさらに修飾された、請求項１に記載のインスリン類似体。
【請求項３】
Ｂ１０位の酸性アミノ酸がAspである、請求項２に記載のインスリン類似体。
【請求項４】
LysB28及びProB29の組により置換されてさらに修飾された、請求項１〜３のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項５】
AspB28により置換されてさらに修飾された、請求項１〜３のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項６】
配列番号４〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項７】
野生型インスリンのA８位に相当するアミノ酸がHisである、請求項１〜３のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項８】
哺乳動物インスリンの類似体である、請求項４に記載のインスリン類似体。
【請求項９】
哺乳動物インスリンの類似体である、請求項５に記載のインスリン類似体。
【請求項１０】
ハロゲン化フェニルアラニンが２位のペンタフルオロ−フェニルアラニンである、配列番号９または１０のポリペプチド。
【請求項１１】
インスリン類似体またはその生理的に許容される塩であって、Ｂ２４位にてペンタフルオロ−フェニルアラニンが組み込まれたＢ鎖ポリペプチドを含有する、薬剤として使用するインスリン類似体またはその生理的に許容される塩。
【請求項１２】
LysB28及びProB29の組による置換、AspB28による置換、Ｂ１０位にての酸性アミノ酸置換、及びA８位におけるHis置換からなる群から選ばれた１以上の置換を含む、請求項１１のインスリン類似体またはその生理的に許容される塩。
【請求項１３】
Ｂ１０位にて酸性アミノ酸置換でさらに修飾された、請求項１２に記載のインスリン類似体。
【請求項１４】
Ｂ１０位の酸性アミノ酸がAspである、請求項１３に記載のインスリン類似体。
【請求項１５】
LysB28及びProB29の組による置換である、請求項１２〜１４のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項１６】
AspB28により置換されてさらに修飾された、請求項１２〜１４のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項１７】
配列番号４〜８からなる群より選択される配列を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項１８】
野生型インスリンのA８位に相当するアミノ酸がHisである、請求項１２〜１４のいずれかに記載のインスリン類似体。
【請求項１９】
哺乳動物インスリンの類似体である、請求項１１に記載のインスリン類似体。
【請求項２０】
哺乳動物インスリンの類似体である、請求項１２に記載のインスリン類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年７月３１日に出願された米国仮出願第６１／０８５，２１２号の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府により支援された研究または開発に関する陳述
本発明は、契約番号ＤＫ４０９４９およびＤＫ０７４１７６で米国立衛生研究所により授与された協力協定の下で政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、熱分解に対して耐性のポリペプチド類似体に関する。より具体的には、本発明は、熱安定化されたインスリン類似体に関する。さらにより具体的には、本発明は、フッ素、塩素または臭素元素をインスリン類似体のアミノ酸に組み込むことにより化学的および熱的に安定化されたインスリン類似体に関する。これらの元素は、ハロゲンに分類され、それらの原子半径、電気陰性度、部分電荷の立体電子分布、および分子内の隣接する原子の立体電子特性に対する波及効果により、タンパク質の通常の構成成分とは区別される。
【背景技術】
【０００４】
治療薬およびワクチンを含む超安定タンパク質を工学的に作製することは、電気および冷蔵を常に利用できるわけではない開発途上の地域において、広い社会的な利点を有し得る。熱分解しやすい治療用タンパク質の例は、インスリンである。アフリカおよびアジアにおける真性糖尿病の流行が切迫しており、インスリンの化学的および物理的な分解が深刻な問題になっている。インスリン類似体の化学分解速度はそれらの相対的安定性と逆比例するので、超安定製剤の設計は、このような課題のある地域におけるインスリン補充療法の安全性および有効性を向上させ得る。
【０００５】
小さい有機分子内のフルオラス置換の利用は、医薬品化学において知られている。フッ素化官能基は、コレステロール生合成の阻害薬であるアトルバスタチン（Ｌｉｐｔｏｒ（商標））ならびにうつおよび他の感情障害の治療に用いられる選択的セロトニン再取り込み阻害薬であるフルオキセチン塩酸塩（Ｐｒｏｚａｃ（商標））のような広く処方されている小分子の有効性にとって重要である。フッ素の原子半径は水素と類似しているが、その大きい誘起効果はこれらの薬物の立体電子特性を改変し、よって、それらの生物活性を増進する。塩素および臭素のようなより大きいハロゲン原子を組み込むことについても、物理有機化学的に同様のことが考えられる。小分子であるモンテルカストナトリウム（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（商標））は、ロイコトリエン阻害薬であり、その薬学的特性は、塩素原子の共有的な取り込みにより増進される。
【０００６】
多フッ素化脂肪族側鎖（例えばトリフルオロ−γ−ＣＦ３−Ｖａｌ、トリフルオロ−δ−ＣＦ３−Ｖａｌ、トリフルオロ−δ−ＣＦ３−Ｉｌｅ、ヘキサフルオロ−γ１，２−ＣＦ３−Ｖａｌおよびヘキサフルオロ−δ１，２−ＣＦ３−Ｌｅｕ）を用いて、この改変に伴う疎水性の増加を最大限にすることに以前は焦点が当てられていた。その例は、αヘリックスモチーフモデルであるホモ２量体コイルドコイルの安定化である。その界面の脂肪族鎖をトリフルオロ類似体で同時に置換すると、安定性が０．３〜２．０ｋｃａｌ／モル増進されたフルオラスコアが創出される。フッ素原子あたりの安定化の程度は、０．１ｋｃａｌ／モル未満である。フッ素原子あたりのより著しい安定化は、単一の内部Ｐｈｅをペンタフルオロ−Ｐｈｅ（Ｆ５−Ｐｈｅ）１に置換することにより、無関係のαヘリックスドメインにおいて達成された（５個のフッ素原子あたりΔΔＧｕ  ０．６ｋｃａｌ／モル）。安定化は、タンパク質中の１つの特定の位置でのみ生じ、このことは、この機構が特定の空間的環境を必要とすることを示唆する。関係するＦ５−Ｐｈｅ改変ドメインの構造は、未改変のドメインのものと同一である。しかし、構造安定化は、生物活性ポリペプチドにとって要件のほんの一部分である。少なくとも活性の大部分も維持されなければならない。
【０００７】
多数の文献が、タンパク質のフッ素標識を１９Ｆ−ＮＭＲプローブとして用いることを記載している。このような標識は非撹乱性であると広くみなされているが、タンパク質工学におけるフッ素化アミノ酸の応用により、それらの変更された物理化学特性を活用しようとしている。単一Ｆ５−Ｐｈｅ置換を含有するαヘリックス折り畳み（ビリンヘッドピースサブドメイン）モデルの研究は、このような改変がタンパク質の安定性に影響するかどうかおよびその影響の程度が、詳細には構造的環境に依存することを示している。実際に、この折り畳みモデルの見かけの安定性は、コアにおいて試験した７つの部位のうち１つのみでＦ５−Ｐｈｅ置換により増進された。しかし、この安定化効果は、フッ素化部位の近くの主鎖中に硫黄原子を含有する非標準的なポリペプチド類似体において示されただけであることに注意すべきである。本発明者らの手によると、天然ポリペプチド主鎖を有するビリンヘッドピースサブドメイン内の全く同じＦ５−Ｐｈｅ置換は、その安定性に影響しない。つまり、発明者らの知るところによると、上記の非標準的なもの以外の天然のタンパク質において芳香族残基のハロゲン化によるタンパク質安定性の増進を示す真のデータは、これまでに報告されていない。これらの観察結果は、全般的に疎水性の環境それ自体が、改変により安定化することを保証するわけではないことを示唆する。タンパク質内部は、特定の距離および角度に依存する芳香族間相互作用によりしばしば安定化されるので、安定化Ｆ５−Ｐｈｅ置換のサブセットは、特に好ましいペルフルオロアリール／アリールの形状を採用し得る。このような相互作用は、これらの芳香族系における部分電荷の非対称分布から生じる。改変アミノ酸への塩素または臭素原子の部位特異的組み込みによるタンパク質の化学的、物理的および生物学的な特性の調節は、フッ素原子の組み込みによる上記の効果の他には、科学的文献においてあまり特徴付けされていない。
【０００８】
芳香族側鎖は、隣接する芳香環だけでなく正または負の静電位の他の供給源も含む、種々の弱極性の相互作用に携わり得る。例は、ペプチド結合中の主鎖のカルボニルおよびアミド基を含む。
【０００９】
インスリンの投与は、真性糖尿病の治療として長く確立されている。インスリンは、脊椎動物における代謝の中心的な役割を演じる小さい球状タンパク質である。インスリンは、２つの鎖、すなわち２１残基を含むＡ鎖と、３０残基を含むＢ鎖とを含む。このホルモンは、Ｚｎ２＋安定化６量体として膵臓β細胞内に貯蔵されているが、血流中ではＺｎ２＋を有さない単量体として機能する。インスリンは、単鎖前駆体であるプロインスリンの生成物であり、プロインスリンでは、連結領域（３５残基）がＢ鎖のＣ末端残基（残基Ｂ３０）をＡ鎖のＮ末端残基と結合している（図１Ａ）。プロインスリンの構造は決定されていないが、これがインスリン様のコアおよび不規則な連結ペプチド（図１Ｂ）からなることを示す様々な証拠がある。３つの特定のジスルフィド架橋（Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７およびＡ２０−Ｂ１９；図１Ａおよび１Ｂ）の形成は、粗面小胞体（ＥＲ）でのプロインスリンの酸化的折り畳みと連動すると考えられている。プロインスリンは、ＥＲからゴルジ装置へ輸送されたすぐ後に、集合して、可溶性Ｚｎ２＋配位６量体を形成する。エンド型タンパク質分解消化と、インスリンへの変換は、未熟分泌顆粒において起こり、その後、形態的凝縮が生じる。成熟貯蔵顆粒内の亜鉛インスリン６量体の結晶配列は、電子顕微鏡（ＥＭ）により視覚化されている。
【００１０】
インスリン中でのアミノ酸置換が、熱力学的安定性および生物活性に対する効果について研究されている。安定性と活性との間の一貫した関係は観察されていない。熱力学的安定性を増進し、インスリン受容体との結合も増進させる置換もあれば、安定性を増進し、このような結合を妨げる置換もある。いくつかの別のアミノ酸によるＴｈｒＡ８の置換の効果が、野生型ヒトインスリンにおいて研究され、Ｂ鎖におけるそれとは別の３つの置換（ＨｉｓＢ１０→Ａｓｐ、ＰｒｏＢ２８→ＬｙｓおよびＬｙｓＢ２９→Ｐｒｏ）を含む工学的に作製されたインスリン単量体の関連において報告されている。吸収の時間経過を促進または遅延させる置換の例も、当該技術分野において知られている。このような置換（例えばＮｏｖａｌｏｇ（登録商標）におけるＡｓｐＢ２８およびＨｕｍａｌｏｇ（登録商標）における［ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９］）は、より迅速な繊維形成およびより乏しい物理的安定性と関連し得、かつしばしば関連する。実際に、繊維形成しやすさについて、ＡｓｐＢ２８−インスリンおよびＡｓｐＢ１０−インスリンを含むヒトインスリンの一連の１０個の類似体が試験されている。１０個全てが、ｐＨ７．４および３７℃にてヒトインスリンよりも繊維形成しやすいことが見出された。１０個の置換は、インスリン分子の様々な部位にあり、古典的な熱力学的安定性の多様な変化と関連するようである。様々な影響が観察されたが、活性と熱力学的安定性との間に相関関係は存在しない。
【００１１】
インスリンは、化学合成および半合成を非常に行いやすい小さい球状タンパク質であり、これにより、非標準的な側鎖の取り込みが容易になる。インスリンは、３つのフェニルアラニン残基（Ｂ１位、Ｂ２４位およびＢ２５位）と、Ｂ２６位にて構造的に類似したチロシンとを含む。脊椎動物のインスリンおよびインスリン様成長因子の間で保存されているＰｈｅＢ２４の芳香環は、疎水性コア側に密集して（しかしコア内には含まれない）、Ｂ鎖の超２次構造を安定化する。ＰｈｅＢ２４は、古典的な受容体結合表面にあり、受容体結合の際の高次構造の変化を導くことが提案されている。ＰｈｅＢ２５は、インスリン単量体の表面から突き出しているが、ＴｙｒＢ２６は、コアの一端にて脂肪族側鎖（ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３およびＶａｌＢ１２）付近に密集している。Ｂ２４に関連する高次構造変化は、ＰｈｅＢ２５およびＴｙｒＢ２６がインスリン受容体の別のドメインと接触することを可能にすることが提案されている。
【００１２】
タンパク質繊維形成の現在の理論は、繊維形成の機構が、部分的に折り畳まれた中間体の状態を経て進行し、これが次いで集合して、アミロイド形成性の核を形成すると仮定する。この理論では、天然状態を安定化するアミノ酸置換が、部分的に折り畳まれた中間状態を安定化し得るまたはし得ないこと、および天然状態と中間状態との間の自由エネルギーの障壁を増加（または減少）させ得るまたはし得ないことが考えられる。よって、現在の理論は、インスリン分子中の所与のアミノ酸置換が繊維形成の危険性を増加または減少させる傾向が、非常に予測困難であることを示す。
【００１３】
糖尿病治療用のインスリンおよびインスリン類似体の製造、貯蔵および使用における重大な問題である繊維形成は、高温、低ｐＨ、撹拌、または尿素、グアニジン、エタノール共溶媒もしくは疎水性表面の存在により増進される。現在の米国薬品規則は、１パーセント以上のレベルで繊維形成が生じた場合に、インスリンを廃棄することを要求している。繊維形成は高温で増進されるので、糖尿病者は、最も有利には、使用前にインスリンを冷蔵保存しなければならない。インスリンまたはインスリン類似体の繊維形成は、少量のインスリンまたはインスリン類似体が患者の体内に一定の間隔で注入される外付けインスリンポンプを用いる糖尿病患者にとって特に問題となり得る。このような使用において、インスリンまたはインスリン類似体は、ポンプ装置内で冷蔵保存されず、インスリンの繊維形成が、インスリンまたはインスリン類似体を体内に注入するために用いられるカテーテルの閉塞をもたらすことがあり、予測困難な血糖値の変動またはさらには危険な高血糖をもたらす可能性がある。少なくとも１つの最近の報告が、リスプロインスリン（残基Ｂ２８およびＢ２９が、野生型ヒトインスリン中でのそれらの位置と比較して交換されている類似体；商品名Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））が、特に繊維形成しやすく、インスリンポンプカテーテルの閉塞をもたらし得ることを示している。
【００１４】
インスリン繊維形成は、インスリンが１〜３カ月にわたって高濃度でかつ外付けポンプのような周囲温度ではなく生理的温度（すなわち３７℃）にてインプラント内に含まれる埋め込み型インスリンポンプにおいて、さらにより大きな問題である。さらに、通常の運動により引き起こされる撹拌も、インスリンの繊維形成を促進しやすい。インスリン繊維形成の可能性の増加にもかかわらず、埋め込み型インスリンポンプは、このようなシステムの潜在的な利点のために、いまだに研究努力の対象である。これらの利点は、門脈循環系へのインスリンの腹腔内送達を含み、これは、皮下注射よりも密接にインスリンの通常の生理的送達を模倣し、このことにより、インスリンが全身循環系を介して患者に提供される。腹腔内送達は、注射部位ごとに様々な吸収および分解を提供し得る皮下注射と比較してより迅速かつ一貫したインスリンの吸収を提供する。埋め込み型ポンプによるインスリンの投与は、潜在的に、患者の利便性も増加させる。リザーバーへの界面活性剤の添加などによる繊維形成の防止のための努力がいくらかの改良をもたらしているが、これらの改良は、これまでのところは、厳密に監視された臨床試験外の糖尿病患者における埋め込み型インスリンポンプの信頼できる使用を可能にするには不十分であるとみなされている。
【００１５】
上記のように、開発途上国は、薬物およびワクチンの安全な貯蔵、送達および使用に関する問題に直面している。この問題は、電気および冷蔵を常に使用できるわけではないアフリカおよびアジア地域での温度感受性インスリン製剤の使用を困難にし、この問題は、開発途上国における糖尿病の流行が切迫することよってさらに深刻になるようである。インスリンは、２５℃を超える温度において１０℃の増加ごとに１０倍以上の分解速度の増加を示し、ガイドラインは、３０℃未満の温度および好ましくは冷蔵での貯蔵を命じている。より高温では、インスリンは化学分解（イソアスパラギン酸の形成、ジスルフィド架橋の再編成および共有結合ポリマーの形成などの共有結合構造の変化）および物理的分解（非天然凝集および繊維形成）をともに受ける。
【００１６】
タンパク質を安定化するが、インスリン受容体（ＩＲ）へのその結合とインスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）の相同受容体へのその交差結合とを、発癌の危険性を与えるように増加させるアミノ酸置換が、インスリンにおいて記載されている。当該技術分野において知られる例は、ＨｉｓＢ１０のアスパラギン酸による置換である。ＡｓｐＢ１０−インスリンは、安定性および薬物動態に関して好ましい薬学的特性を示すが、その増進された受容体結合特性は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける腫瘍形成に関連していた。ＡｓｐＢ１０−インスリンまたは関連する類似体に導入して、ＩＲおよびＩＧＦＲへのその結合を、ヒトインスリンのものと同様のレベルまで低減することができるＡまたはＢ鎖における多くの可能性のある置換が存在するが、このような置換は、通常、インスリン（またはインスリン類似体）の安定性を損ない、その化学的および物理的分解に対する感受性を増加させる。受容体結合親和性の「調整」を可能にし、同時に、安定性および繊維形成に対する耐性を増進する、インスリンおよびインスリン類似体の改変方法を見出すことが望まれている。このような応用は、その受容体結合特性が超活性な類似体の潜在的発癌性を相殺するようにＩＲおよびＩＧＦＲへの結合を様々な程度まで低減させる一連の安定化改変を必要とするだろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、非標準的な官能基としてハロゲン原子を含有する非標準的なアミノ酸の組み込みにより安定化される一方、類似体の生物活性の少なくとも一部分を維持するインスリン類似体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
よって、本発明の一態様は、アミノ酸におけるハロゲン置換により、高い安定性を与え、そのうえ、対応する非ハロゲン化インスリンまたはインスリン類似体の生物活性の少なくとも一部分を維持するインスリン類似体を提供する。
【００１９】
全般的に、本発明は、Ｂ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位にてハロゲン化フェニルアラニンが組み込まれたＢ鎖ポリペプチドを含むインスリン類似体を提供する。一実施形態において、ハロゲン化フェニルアラニンは、Ｂ２４位にある。別の実施形態において、ハロゲン化フェニルアラニンは、オルト−モノフルオロ−フェニルアラニン、オルト−モノブロモ−フェニルアラニンまたはオルト−モノクロロ−フェニルアラニンである。別の実施形態において、インスリン類似体は、ヒトインスリンの類似体などの哺乳動物インスリン類似体である。ある特定の一連の実施形態において、Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号４〜８およびその３つ以下のさらなるアミノ酸置換を有するポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
Ｂ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位にてハロゲン化フェニルアラニンが組み込まれたＢ鎖ポリペプチドを含むインスリン類似体をコードする核酸も提供される。一例において、ハロゲン化フェニルアラニンは、核酸配列ＴＡＧなどの停止コドンによりコードされる。発現ベクターは、このような核酸を含むことができ、宿主細胞は、このような発現ベクターを含有することができる。
【００２１】
本発明は、患者を治療する方法も提供する。この方法は、生理的有効量のインスリン類似体またはその生理的に許容される塩を患者に投与することを含み、該インスリン類似体またはその生理的に許容される塩が、Ｂ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位にてハロゲン化フェニルアラニンが組み込まれたＢ鎖ポリペプチドを含有する。一実施形態において、患者に投与されるインスリン類似体中のハロゲン化フェニルアラニンは、Ｂ２４位にある。別の実施形態において、ハロゲン化フェニルアラニンは、オルト−モノフルオロ−フェニルアラニン、オルト−モノブロモ−フェニルアラニンまたはオルト−モノクロロ−フェニルアラニンである。さらに別の実施形態において、インスリン類似体は、ヒトインスリンの類似体などの哺乳動物インスリン類似体である。ある特定の一連の実施形態において、Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号４〜８およびその３つ以下のさらなるアミノ酸置換を有するポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】Ａ鎖およびＢ鎖と、隣接する２塩基性切断部位（黒丸）およびＣペプチド（白丸）で示す連結領域とを含むヒトプロインスリン配列の模式図である。
【図１Ｂ】インスリン様部分および不規則な連結ペプチド（点線）からなるプロインスリンの構造モデルである。
【図１Ｃ】Ｂ鎖中の残基Ｂ２４の位置を示すヒトインスリン配列の模式図である。
【図１Ｄ】３つのジスルフィド架橋に関連してＰｈｅＢ２４の芳香族残基を示すインスリン単量体のリボンモデルである。ＬｅｕＢ１５（矢印）およびＰｈｅＢ２４の隣り合わせの側鎖を示す。Ａ鎖およびＢ鎖は、それ以外の部分については、それぞれ薄い灰色および濃い灰色で示し、システインの硫黄原子は丸で示す。
【図１Ｅ】疎水性コアの端のポケット内のＰｈｅＢ２４側鎖を示すインスリンの空間充填モデルである。
【図２Ａ】ペンタフルオロ−フェニルアラニン（Ｆ５−Ｐｈｅ）を表す図である。
【図２Ｂ】オルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（２Ｆ−Ｐｈｅ）を表す図である。
【図２Ｃ】メタ−モノフルオロ−フェニルアラニン（３Ｆ−Ｐｈｅ）を表す図である。
【図２Ｄ】パラ−モノフルオロ−フェニルアラニン（４Ｆ−Ｐｈｅ）を表す図である。
【図３】遠紫外波長についての一連の４つの円２色性（ＣＤ）スペクトルである。パネルＡ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）および２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（□）；パネルＢ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）および３Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（▲）；パネルＣ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）および４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（▼）；パネルＤ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）およびＦ５−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（●）。
【図４】ＣＤにより検出されたグアニジン変性研究についての一連の４つのグラフである。パネルＡ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）および２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（□）；パネルＢ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）および３Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（▲）；パネルＣ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）および４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（▼）；パネルＤ：ＤＫＰ−インスリン（黒の実線）およびＦ５−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（●）。
【図５】インスリン類似体の受容体結合研究の結果を示すグラフである。相対活性は、受容体結合１２５Ｉ標識ヒトインスリンが、漸増濃度のＤＫＰ−インスリン（■）またはその類似体：ペンタフルオロ−ＰｈｅＢ２４（▲）、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４（▼）、３Ｆ−ＰｈｅＢ２４（◆）および４Ｆ−ＰｈｅＢ２４（●）により置き換えられる競合的結合アッセイにより決定する。
【図６】インスリン類似体の受容体結合研究の結果を示すグラフである。相対活性は、受容体結合１２５Ｉ標識ヒトインスリンが、漸増濃度のＫＰ−インスリン（■）またはその類似体：２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（▲）、２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（▼）、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（◆）および４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（●）により置き換えられる競合的結合アッセイにより決定する。アッセイは、インスリン受容体のＢアイソフォームと、トレーサーとして１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４−ヒトインスリンを用いた。
【図７Ａ】ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（点線；「親」）、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（▲）、３Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（■）および４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（○）のモノフルオラス置換を含むＫＰ−インスリン類似体のＣＤにより検出されたグアニジン変性研究についてのグラフである。
【図７Ｂ】ヒトインスリン（実線）、ＫＰ−インスリン（点線；「親」）、２−Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（▼）および２−Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン（△）のＣＤにより検出されたグアニジン変性研究についてのグラフである。
【図８Ａ】７００ＭＨｚで３２℃およびｐＤ７．０にて記録された、ＤＫＰ−インスリンに関してＰｈｅＢ２４の２位、３位および４位でのフルオロ置換を比較するＤＫＰ−インスリン類似体についての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図８Ｂ】７００ＭＨｚで３２℃およびｐＤ７．０にて記録された、ＫＰ−インスリンに関してＰｈｅＢ２４の２位でのフルオロ、ブロモおよびクロロ置換を比較するＫＰ−インスリン類似体についてのＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、アミノ酸におけるハロゲン置換により、高い安定性を与え、そのうえ、対応する非ハロゲン化インスリンまたはインスリン類似体の生物活性の少なくとも一部分を維持するインスリン類似体を対象とする。特に、本発明は、アミノ酸における単一のハロゲンの置換により、高い安定性を与え、そのうえ、対応する非ハロゲン化インスリンまたはインスリン類似体の生物活性の少なくとも一部分を維持するインスリン類似体を提供する。一例において、本発明は、アミノ酸におけるフッ素、塩素または臭素置換により、高い安定性を与え、そのうえ、対応する非ハロゲン化インスリンまたはインスリン類似体の生物活性の少なくとも一部分を維持するインスリン類似体を提供する。１つの可能性のある応用は、インスリン類似体の生物活性の一部分を維持しながら、インスリン類似体の化学的および物理的安定性を増すことである。別の応用は、ヒトインスリンの特性を超えないようにインスリン類似体の受容体結合特性を較正することである。これらのために、本発明は、ハロゲン化フェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基を置換基としてＢ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位に含有するインスリン類似体を提供する。Ｂ２４またはＢ２５でのハロゲン化フェニルアラニンへの置換はインスリンまたはインスリン類似体の根本的なアミノ酸配列を変更しないが、インスリンのＢ２６位のハロゲン化フェニルアラニンは、インスリンの野生型配列中で見出されるチロシン（Ｔｙｒ）を置換しなければならない。
【００２４】
本発明は、しかし、ヒトインスリンおよびその類似体に限定されない。これらの置換は、限定しない例として、ブタ、ウシ、ウマおよびイヌのインスリンなどの動物インスリンにおいて行ってもよいことも構想される。
【００２５】
さらに、ヒトインスリンと動物インスリンとの間の類似性、およびヒト糖尿病患者での動物インスリンの過去の使用に鑑みて、インスリンの配列中の別の小規模な改変、特に、「保存的」と考えられる置換を導入してよいことも構想される。例えば、アミノ酸のさらなる置換を、本発明から逸脱することなく、類似の側鎖を有するアミノ酸の群の中で行ってよい。これらは、中性疎水性アミノ酸：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）およびメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）を含む。同様に、中性極性アミノ酸は、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｕまたはＱ）およびアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）の群の中で互いを置換してよい。塩基性アミノ酸は、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）を含むと考えられる。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）である。別途記載されている、または文脈から明らかな場合を除き、本明細書に記載されるアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸とみなされる。一例において、本発明のインスリン類似体は、本発明のハロゲン化Ｐｈｅ置換以外に３つ以下の保存的置換を含む。別の例において、本発明のインスリン類似体は、本発明のハロゲン化Ｐｈｅ置換以外に１つ以下の保存的置換を含む。
【００２６】
本明細書および特許請求の範囲において用いる場合、インスリンまたはインスリン類似体中の種々のアミノ酸は、問題のアミノ酸残基と、その後の、任意選択で上付きのアミノ酸の位置により記載される。問題のアミノ酸の位置は、置換があるインスリンのＡ鎖またはＢ鎖を含む。つまり、ＰｈｅＢ２４は、インスリンのＢ鎖の２４番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを表し、ＰｈｅＢ２５は、インスリンのＢ鎖の２５番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを表し、ＰｈｅＢ２６は、インスリンのＢ鎖の２６番目のアミノ酸であるチロシンについてのフェニルアラニン置換を表す。フッ素化アミノ酸は、接頭辞「Ｆ−」を用いて示すことができ、臭素化アミノ酸は、接頭辞「Ｂｒ−」を用いて示すことができ、塩素化アミノ酸は、接頭辞「Ｃｌ−」を用いて示すことができる。よって、フッ素化フェニルアラニンは「Ｆ−Ｐｈｅ」と省略でき、塩素化フェニルアラニンは「Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略でき、臭素化フェニルアラニンは「Ｂｒ−Ｐｈｅ」と省略できる。フェニルアラニンの場合、ハロゲン置換基またはフェニル側鎖上の置換基の位置は、ハロゲンが結合する炭素の番号によりさらに示すことができる。よって、オルト−モノフルオロ−フェニルアラニン（図２Ｂに示す）は「２Ｆ−Ｐｈｅ」と省略され、メタ−モノフルオロ−フェニルアラニン（図２Ｃに示す）は「３Ｆ−Ｐｈｅ」と省略され、パラ−モノフルオロ−フェニルアラニン（図２Ｄに示す）は、４Ｆ−Ｐｈｅと省略される。ペンタフルオロ−フェニルアラニン（図２Ａに示す）は「Ｆ５−Ｐｈｅ」と省略される。同様に、オルト−モノブロモ−フェニルアラニンは「２Ｂｒ−Ｐｈｅ」と省略でき、オルト−モノクロロ−フェニルアラニンは「２Ｃｌ−Ｐｈｅ」と省略できる。
【００２７】
Ｂ２４のフェニルアラニンは、機能的インスリン中の不変アミノ酸であり、芳香族側鎖を含む。インスリン中のＰｈｅＢ２４の生物学的重要性は、ヒトの真性糖尿病の原因となる臨床変異（ＳｅｒＢ２４）により示される。図１Ｄおよび１Ｅに示すように、また理論に結び付けられることを望まないが、ＰｈｅＢ２４は、古典的な受容体結合表面での疎水性コアの端に密集していると考えられる。モデルは、結晶学的プロトマーに基づく（２−Ｚｎ分子１；プロテインデータバンク識別子４ＩＮＳ）。Ｂ鎖のＣ末端β鎖内にあって（残基Ｂ２４〜Ｂ２８）、ＰｈｅＢ２４は、中央のαヘリックス（残基Ｂ９〜Ｂ１９）と接する。芳香環の一方の面と端は、ＬｅｕＢ１５とＣｙｓＢ１９により輪郭を示される浅いポケット内にある。他方の面と端は、溶媒にさらされている（図１Ｅ）。このポケットは、主鎖のカルボニルおよびアミド基により部分的に囲まれ、よって、複雑で非対称な静電環境を創出する。インスリン安定性に対する、単一のオルト−、メタ−またはパラ−フルオラス置換（それぞれ２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅまたは４Ｆ−Ｐｈｅと示す、図２Ｂ〜２Ｄ）を含む「不均衡な」類似体のものとともに、近対称置換基であるテトラフルオロ−フェニルアラニン（Ｆ５−ＰｈｅＢ２４）（全般的な疎水性の増進とフルオロアリール−アリール相互作用を有する）（図２Ａ）の効果が提供される。
【００２８】
ＰｈｅＢ２５は、インスリン単量体の表面にあると考えられ、溶液構造においては、ＰｈｅＢ２４のものよりも小さい構造秩序を有して溶媒中に突出する。その生物学的重要性は、同様に、ヒト糖尿病の原因となる臨床変異（ＬｅｕＢ２５）により示される。ＴｙｒＢ２６は、ＰｈｅＢ２４と同様に、非極性残基ＩｌｅＡ２、ＶａｌＡ３およびＶａｌＢ１２付近に密集している疎水性コアの端にある。光架橋研究は、残基Ｂ２４、Ｂ２５およびＢ２６の側鎖がそれぞれインスリン受容体と接触することを示唆する。インスリン残基の２量体および６量体において、残基Ｂ２４〜Ｂ２６および対称関係にある残基Ｂ２４’〜Ｂ２６’は、分子間逆平行βシートに関与すると考えられる。これらの位置での芳香族側鎖は、このβシート界面での単量体間の密集を安定化すると考えられる。
【００２９】
本発明の置換は、いくつかの既存のインスリン類似体のいずれにおいて作製してもよいことが構想される。例えば、本明細書で提供されるハロゲン化フェニルアラニン（Ｘ−Ｐｈｅ）置換は、ヒトインスリンに加えて、リスプロインスリン、インスリンアスパルト、他の改変インスリンもしくはインスリン類似体などのインスリン類似体において、または正規のインスリン、ＮＰＨインスリン、レンテインスリンもしくはウルトラレンテインスリンなどの種々の医薬製剤において作製してよい。アスパルトインスリンは、ＡｓｐＢ２８置換を含み、Ｎｏｖａｌｏｇ（登録商標）として販売され、リスプロインスリンは、ＬｙｓＢ２８およびＰｒｏＢ２９置換を含み、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の名称のもとで知られ、販売されている。これらの類似体は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１４９，７７７号および第５，４７４，９７８号に記載されている。これらの類似体はともに、速効型インスリンとして知られている。
【００３０】
Ｂ２４、Ｂ２５および／またはＢ２６でのハロゲン化Ｐｈｅ置換は、以下により詳細に記載されるＤＫＰインスリン、またはＢ鎖のＣ末端残基とＡ鎖のＮ末端残基との間の通常の３５アミノ酸連結領域の代わりにインスリンのＡ鎖部分とＢ鎖部分の間にジペプチドリンカー（Ａｌａ−Ｌｙｓ）を含むプロインスリン類似体であるミニプロインスリンなどの、以前に臨床的に用いられていないが、実験的にはなお有用であるヒトインスリンの類似体に導入してもよい。ＤＫＰ−インスリン（またはＡｓｐＢ１０を含むかもしくはヒトインスリンよりも高い受容体結合親和性を示す他のインスリン類似体）におけるＢ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位でのハロゲン化芳香族残基の組み込みは、それらの受容体結合親和性を、ヒトインスリンと同様またはそれ未満まで低減できるので、臨床的使用を潜在的に可能にする。このようにして、インスリン類似体の、分裂促進的ＩＧＦＲへの交差結合も低減できる。
【００３１】
ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を、比較の目的のために、配列番号１として示す。
配列番号１（プロインスリン）
【００３２】
【化１】
2015180647.tif 000002
【００３３】
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列を、配列番号２として示す。
配列番号２（Ａ鎖）
【００３４】
【化２】
2015180647.tif 000003
【００３５】
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列を、配列番号３として示す。
配列番号３（Ｂ鎖）
【００３６】
【化３】
2015180647.tif 000004
【００３７】
ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は、Ｂ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位でのハロゲン化Ｐｈｅの置換を用いて改変してよい。このような配列の例を、配列番号４（ここで、ＸａａはＴｙｒまたはＰｈｅであり得る）として示す。これらの置換のいずれかにおいて用いられるハロゲンは、例えばフッ素、塩素または臭素であり得る。
配列番号４
【００３８】
【化４】
2015180647.tif 000005
【００３９】
他の置換のさらなる組合せも、本発明の範囲内である。本発明の置換を、従来知られるインスリン類似体の置換と組み合わせてもよいことも構想される。例えば、ハロゲン化Ｐｈｅ置換の１つも導入されていてよいリスプロインスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））のＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９置換を含むヒトインスリンのＢ鎖の類似体のアミノ酸配列を、配列番号５として示す。同様に、Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換が導入されていてもよいアスパルトインスリンのＡｓｐＢ２８置換を含むヒトインスリンのＢ鎖の類似体のアミノ酸配列を、配列番号６として示す。
配列番号５
【００４０】
【化５】
2015180647.tif 000006
配列番号６
【００４１】
【化６】
2015180647.tif 000007
【００４２】
Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００３２０号および米国特許出願第１２／１６０，１８７号により詳細に記載される、残基Ａ４、Ａ８および／またはＢ１にてＨｉｓ置換を含むヒトインスリンの類似体などの他のインスリン類似体置換と組み合わせて導入してもよい。例えば、Ｆ−ＰｈｅＢ２４置換は、［ＨｉｓＡ４、ＨｉｓＡ８］および／またはＨｉｓＢ１置換とともに、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するインスリン類似体またはプロインスリン類似体中に存在してよい。
配列番号７
【００４３】
【化７】
2015180647.tif 000008
（式中、Ｒ１はＨｉｓまたはＰｈｅであり；Ｒ２はＴｙｒまたはＰｈｅであり、Ｒ３はＰｒｏ、ＬｙｓまたはＡｓｐであり；Ｒ４はＬｙｓまたはＰｒｏであり；Ｒ５はＨｉｓまたはＧｌｕであり；Ｒ６はＨｉｓまたはＴｈｒであり；Ｘａａ０−３５は０〜３５個の任意のアミノ酸またはアミノ酸鎖中の休止であり；
さらに、以下のアミノ酸置換の群から選択される少なくとも１つの置換が存在する：
Ｒ１はＨｉｓである；
Ｒ６はＨｉｓである；
Ｒ５とＲ６とはともにＨｉｓである）。
【００４４】
Ｂ２４、Ｂ２５またはＢ２６でのハロゲン化Ｐｈｅ置換は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の米国仮特許出願第６０／８２８，１５３号に開示される単鎖インスリン類似体に導入してもよい。
【００４５】
フッ素置換を、ＡｓｐＢ１０（Ｄ）、ＬｙｓＢ２８（Ｋ）およびＰｒｏＢ２９（Ｐ）の置換を含むＤＫＰ−インスリンと表される高活性の工学的に作製されたインスリン単量体に導入した。Ｂ鎖の表面上のこれらの３つの置換は、２量体および６量体の形成を妨げると考えられる。工学的に作製された単量体の使用は、安定性アッセイにおける自己集合による交絡効果を回避する。ＤＫＰ−インスリンの構造は、結晶学的プロトマーに非常によく似ている。ＤＫＰインスリンについてのＢ鎖ポリペプチドの配列を、配列番号８（ここで、ＸａａはＴｙｒまたはＰｈｅである）として示す。
配列番号８（ＤＫＰ  Ｂ鎖配列）
【００４６】
【化８】
2015180647.tif 000009
【００４７】
ＤＫＰ−インスリンの類似体を、トリプシン触媒半合成により調製し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した（Ｍｉｒｍｉｒａ，Ｒ．Ｇ．およびＴａｇｅｒ，Ｈ．Ｓ．、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６３４９〜６３５４）。このプロトコルは、（ｉ）残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（改変残基（Ｆ＊）と「ＫＰ」置換（下線）とを含む；配列番号９）と、（ｉｉ）切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−ＡｓｐＢ１０−インスリン（配列番号１６）とを用いる。オクタペプチドは、ＰｒｏＢ２８およびＬｙｓＢ２９（斜体）の交換により、野生型Ｂ２３〜Ｂ３０配列（ＧＦＦＹＴＰＫＴ；配列番号１０）とは異なるので、リジンε−アミノ基の保護は、トリプシン処理中に必要でない。簡単に述べると、デスオクタペプチド（１５ｍｇ）およびオクタペプチド（１５ｍｇ）を、１０ｍＭ酢酸カルシウムおよび１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ８）（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、０．４ｍＬ）の混合物中に溶解した。最終ｐＨを７．０に、１０μＬのＮ−メチルモルホリンを用いて調整した。溶液を１２℃まで冷却し、１．５ｍｇのＴＰＣＫ−トリプシンを加え、１２℃にて２日間インキュベートした。さらに１．５ｍｇのトリプシンを、２４時間後に加えた。反応物を、０．１％トリフルオロ酢酸を用いて酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）により精製した。マトリクス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した質量分析法は、それぞれの場合において、予期された値を示した（示さず）。固相合成の一般的なプロトコルは、記載されたとおりである（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９８２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：５０２０〜５０３１）。９−フルオレン−９−イル−メトキシカルボニル（Ｆ−ｍｏｃ）保護フェニルアラニン類似体は、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）から購入した。
【００４８】
円２色性（ＣＤ）スペクトルを、４℃および２５℃にて、Ａｖｉｖ分光旋光計を用いて得た（Ｗｅｉｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１５４２９〜１５４４０）。試料は、およそ２５μＭのＤＫＰ−インスリンまたは類似体を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）中に含んでいた。試料を、２５℃でのグアニジン誘導変性研究のために５μＭに希釈した。アンフォールディングの自由エネルギーを抽出するために、変性遷移を、非線形最小２乗法により、Ｓｏｓｎｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１７：３９３〜４０９に記載されている２相モデルにあてはめた。簡単に述べると、ＣＤデータθ（ｘ）（式中、ｘは変性剤の濃度を示す）を、
【００４９】
【数１】
2015180647.tif 000010
（式中、ｘはグアニジンの濃度であり、θＡおよびθＢは未変性のほどかれた状態におけるベースライン値である）に従って、非線形最小２乗法プログラムによりあてはめた。ベースラインは、遷移前および遷移後の直線θＡ（ｘ）＝θＡＨ２Ｏ＋ｍＡｘおよびθＢ（ｘ）＝θＢＨ２Ｏ＋ｍＢｘにより近似させた。変異型のアンフォールディング遷移のあてはめにより得られるｍの値は、野生型アンフォールディング曲線のあてはめにより得られるｍの値よりも低い。この差およびΔＧｕにおける見かけの変化が、完全にほどかれた状態からのＣＤシグナルを測定できないことに起因するかを試験するために、データを、より高濃度のグアニジンでのプラトーＣＤの値に外挿するシミュレーションを行った。ΔＧｕおよびｍの本質的に同一の推定値が得られた。
【００５０】
相対活性は、特異的に結合した１２５Ｉ−ヒトインスリンの５０パーセントを置き換えるのに必要な野生型ヒトインスリンに対する類似体の割合として定義される。インスリン受容体（ＩＲ）を含むヒト胎盤膜調製物を、当該技術分野において知られるようにして用いた。膜フラグメント（０．０２５ｍｇタンパク質／チューブ）を、１２５Ｉ標識インスリン（およそ３０，０００ｃｐｍ）と、選択された濃度の未標識類似体の存在下で１８時間、４℃にて、０．２５ｍｌの最終容量のｐＨ８の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．２５パーセント（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン中でインキュベートした。インキュベーションの後に、混合物を１ｍｌの氷冷緩衝液で希釈し、４℃にて５分間遠心分離する（１０，０００ｇ）。次いで、上清を吸引により除去し、膜ペレットを放射活性について計測する。データを、非特異的結合（１μＭヒトインスリンの存在下で結合した膜に残存する放射活性の量）について補正する。全てのアッセイにおいて、競合リガンドの非存在下で結合したトレーサーのパーセンテージは、リガンド欠乏アーチファクトを回避するために、１５％未満であった。インスリン類似体の３７℃でのインキュベーション期間中の活性の変化を監視するためのさらなるインスリン受容体結合アッセイを、当該技術分野において知られるようにして、マイクロタイタープレート抗体捕捉を用いて行った。マイクロタイターストリッププレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を、４℃にて１晩、ＡＵ５  ＩｇＧ（リン酸緩衝食塩水中の４０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ／ウェル）とインキュベートした。結合データは、２部位逐次モデルにより分析した。ＩＧＦ  Ｉ型受容体を用いる対応するマイクロタイタープレート抗体アッセイを行って、この相同受容体への交差結合を評価した。
【００５１】
一フッ素化類似体の遠紫外円２色性（ＣＤ）スペクトルは、親の類似体のものと本質的に同一である（図３）。Ｆ５−ＰｈｅＢ２４類似体のスペクトルにおいて、わずかな歪みが観察される（図３、パネルＤ）。類似体の安定性および受容体結合活性を、表１に示す。改変Ｂ２４残基を、ＤＫＰ−インスリンの関係において導入した。示される活性の値は、ヒトインスリンに対するホルモン−受容体解離定数の比率に基づく。よって、ヒトインスリンの活性は、定義によると１．０である。活性の値における標準誤差は、全般的に、２５％未満であった。２５℃におけるアンフォールディングの自由エネルギー（ΔＧｕ）を、ゼロ変性剤濃度に外挿して、２相モデルに基づいて見積もった。遅延時間は、３７℃の亜鉛非含有リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）中で穏やかな撹拌においてタンパク質繊維形成の開始に必要とされる時間（日数）を示す。
【００５２】
【表１】
2015180647.tif 000011
【００５３】
ＰｈｅＢ２４のＦ５−Ｐｈｅによる置換は、ＤＫＰ−インスリンの安定性を、２５℃にて０．８±０．１ｋｃａｌ／モル増大させる（図４、パネルＤ）。１置換類似体はそれぞれ、著しい活性を保持する：オルト（ヒトインスリンに対して３７％）、メタ（１００％）およびパラ（４３％）。このような活性はそれぞれ、通常、治療効力の予測となる１０％（１ｎＭ未満のホルモン−受容体解離定数に相当する）の閾値を超える。さらに、３Ｆ−ＰｈｅＢ２４および４Ｆ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体は、親の類似体よりも、もはや安定でない（そしておそらく安定性がわずかにより低い）（図４および表１）が、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンは、Ｆ５−Ｐｈｅ類似体と少なくとも同程度に安定である（ΔΔＧｕ０．９±０．１ｋｃａｌ／モル）。類似体の物理的安定性を、ｐＨ７．４の６０μＭリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で３７℃にて穏やかな撹拌の下でのインキュベーション中に、３連で評価した。試料を、２０日間、または沈殿もしくはガラスバイアルのフロスティングの徴候が観察されるまで観察した。Ｆ５−、２Ｆ−および３Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン類似体（しかし４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンではない）はそれぞれ、タンパク質繊維形成の開始前に、遅延時間の増加を示す（親の類似体と比較して）（表１）。よって、単一のフッ素原子の置換は、低減されているが臨床的に著しい活性を保持して、単量体インスリン類似体の安定性を増大させることができる。改変は、ｐＨ７．４および３７℃での穏やかな撹拌において、タンパク質繊維形成の前の遅延時間を延長することもできる。
【００５４】
Ｆ５−ＰｈｅＢ２４置換は高い安定性を与える。特に、位置特異的改変２Ｆ−ＰｈｅＢ２４は、同様に安定性を与えるが、インスリン受容体に対する（低減されているが）実質的な親和性を保持する。
【００５５】
フッ素置換を、リスプロインスリン（つまり、ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９置換も含むインスリン類似体（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）の名称で販売される））中のＢ２４位、Ｂ２５位およびＢ２６位にてオルト−、メタ−、パラ−およびペンタ−フッ素化フェニルアラニンが導入されたことを除いて、本質的に上記のようにして導入した。Ｂ２４位でのオルト−、メタ−、パラ−およびペンタ−フッ素化フェニルアラニン置換を含む類似体を、それぞれ２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン、３Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン、４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン、Ｆ５−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンと表す。Ｂ２５位でのオルト−、メタ−、パラ−およびペンタ−フッ素化フェニルアラニン置換を含む類似体を、それぞれ２Ｆ−ＰｈｅＢ２５−ＫＰ−インスリン、３Ｆ−ＰｈｅＢ２５−ＫＰ−インスリン、４Ｆ−ＰｈｅＢ２５−ＫＰ−インスリン、Ｆ５−ＰｈｅＢ２５−ＫＰ−インスリンと表す。Ｂ２６位でのオルト−、メタ−、パラ−およびペンタ−フッ素化フェニルアラニン置換（チロシンの置換）を含む類似体を、それぞれ２Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン、３Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン、４Ｆ−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリン、Ｆ５−ＰｈｅＢ２６−ＫＰ−インスリンと表す。さらに、オルト−ブロモおよびオルト−クロロフェニルアラニンを、リスプロインスリン中のＢ２４位に置換した。これらの類似体を、それぞれ２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンおよび２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンと表す。ＫＰ−インスリンおよびＤＫＰ−インスリンのそれぞれの類似体の表記を、表および図において、簡約のために「インスリン」を省略して、ＫＰおよびＤＫＰと省略する。
【００５６】
より具体的には、Ｂ２４でのハロゲン化フェニルアラニン置換のために、残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（「Ｆ＊」と表されるハロゲン化フェニルアラニン残基および「ＫＰ」置換（下線）；配列番号９）と、切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（Ｂ１０位において野生型、配列番号１７）とを用いた。Ｂ２５でのフッ素化フェニルアラニン置換のために、残基（Ｎ）−ＧＦＦ＊ＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（ここでもまた「Ｆ＊」と表されるフッ素化フェニルアラニンおよび「ＫＰ」置換（下線）；配列番号９）と、切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（Ｂ１０位において野生型；配列番号１７）とを用いた。Ｂ２６でのフッ素化フェニルアラニン置換のために、残基（Ｎ）−ＧＦＦＦ＊ＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（ここでもまた「Ｆ＊」と表されるフッ素化フェニルアラニンおよび「ＫＰ」置換（下線）；配列番号１８）と、切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（Ｂ１０位において野生型；配列番号１７）とを用いた。同様に、Ｂ２４でのクロロ−およびブロモ−フェニルアラニン置換（２Ｃｌおよび２Ｂｒ）のために、残基（Ｎ）−ＧＦ＊ＦＹＴＫＰＴを表す合成オクタペプチド（「Ｆ＊」と表されるハロゲン化フェニルアラニン残基および「ＫＰ」置換（下線）；配列番号９）と、切断型類似体デスオクタペプチド［Ｂ２３〜Ｂ３０］−インスリン（Ｂ１０位において野生型；配列番号１７）とを用いた。典型的には、デスオクタペプチド（１５ｍｇ）およびオクタペプチド（１５ｍｇ）を、１０ｍＭ酢酸カルシウムおよび１ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するジメチルアセトアミド／１，４−ブタンジオール／０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ８）（３５：３５：３０、ｖ／ｖ、０．４ｍＬ）の混合物中に溶解した。最終ｐＨを７．０に、１０μＬのＮ−メチルモルホリンを用いて調整した。溶液を１２℃まで冷却し、１．５ｍｇのＴＰＣＫ−トリプシンを加え、１２℃にて２日間インキュベートした。さらに１．５ｍｇのトリプシンを、２４時間後に加えた。反応物を、０．１％トリフルオロ酢酸を用いて酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）により精製した。マトリクス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した質量分析法は、それぞれの場合において、予期された値を示した。相対活性および解離定数は、上記のようにして決定した。
【００５７】
得られたデータを、インスリンのＢ２４位でのフッ素化フェニルアラニンの置換について表２に示す。比較の目的のために、野生型インスリンおよび２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンを、３７℃にて同じ条件下で試験した。３７℃での試験のデータは、以下の表３に示す。Ｂ２４位、Ｂ２５位およびＢ２６位でのフッ素化フェニルアラニンの置換、ならびにリスプロインスリン類似体バックグラウンドでのブロモおよびクロロ置換フェニルアラニンの置換についてのデータは、以下の表４に示す。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【００６１】
競合的置き換えによるリスプロインスリンの類似体についての受容体結合データは、図６にも示す。アッセイは、インスリン受容体のＢアイソフォームと、トレーサーとして１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４−ヒトインスリンを用いた。
【００６２】
Ｂ２４にてクロロまたはブロモ置換フェニルアラニンのいずれかを含むリスプロインスリン類似体（それぞれ２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンおよび２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン）を、非ハロゲン化リスプロ（ＫＰ）インスリンと比較して、糖尿病ラットにおいて血糖を低下させる能力について試験した。雄のＬｅｗｉｓラット（体重約２５０ｇ）を、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病にした。リスプロインスリン類似体である２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンおよび２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンを、ＨＰＬＣにより精製し、粉末に乾燥し、インスリン希釈剤（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｃｏｒｐ）に溶解した。ラットに、時間＝０にて、１００μｌの希釈剤中の２０μｇまたは６．７μｇのインスリン類似体を皮下注射した。血液を、時間０でおよび９０分までの１０分ごとに、切断した尾の先端から得た。血糖を、Ｈｙｐｏｇｕａｒｄ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏ−Ｄｒａｗ計を用いて測定した。血糖濃度変化（時間（ｈ）あたりデカリットル（ｄＬ）あたりのミリグラム（ｍｇ））を、表５および６に列挙する（これらの研究は、異なる組のラットを用いて行ったので、ＫＰ−インスリン（各表の最初の行）の対照注射に対するベースライン薬物動態応答において差を示す）。
【００６３】
【表５】
2015180647.tif 000015
【００６４】
【表６】
2015180647.tif 000016
【００６５】
表５および６からわかるように、ハロゲン化フェニルアラニン含有インスリン類似体は、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリン以外は、リスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））インスリンと同等またはそれより大きい効力を有した。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４インスリン類似体の効力は、ＡｓｐＢ１０置換を２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン類似体に含めることによりＫＰ−インスリンの効力まで回復できる（表６の２行目）。さらに、Ｂ２４位でのハロゲン化フェニルアラニンの存在は、繊維形成遅延時間を３倍〜４倍増加させる。つまり、上記の実験条件下でのＫＰ−インスリンは約３日間の遅延時間を示すが、ＰｈｅＢ２４を２Ｆ−ＰｈｅＢ２４、２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４または２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４のいずれかに置換することにより、遅延時間が１０〜１２日まで延長される。これらの改変は、熱力学的安定性も０．５〜１ｋｃａｌ／ｍｏｌ増加させる（グアニジン変性により調べられるように）（表４）。
【００６６】
解離定数（Ｋｄ）を、ＷｈｉｔｔａｋｅｒおよびＷｈｉｔｔａｋｅｒ（２００５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２〜２０９３６）により記載されるようにして、１２５Ｉ−ＴｙｒＡ１４−インスリン（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋにより親切にも提供された）と、精製され可溶化されたインスリン受容体（アイソフォームＢ）とを、わずかに改変したマイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにおいて用いる競合的置き換えアッセイにより決定した。形質移入受容体を、それらのＣ末端にて、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１１）の３重反復によってタグ付加し、マイクロタイタープレートを、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）により被覆した。競合リガンドの非存在下で結合したトレーサーのパーセンテージは、リガンド欠乏アーチファクトを回避するように、１５％未満であった。結合データを、異種競合モデル（Ｗａｎｇ、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０：１１１〜１１４）を用いる非線形回帰により解析して、解離定数を得た。
【００６７】
【表７】
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【００６８】
ＩＧＦ受容体への選択されたインスリン類似体の交差結合の測定を、表７にまとめる。これらの条件下でのヒトインスリンのＩＧＦＲへの結合は、ＩＧＦ−Ｉが結合するよりも２６０倍弱い。ＡｓｐＢ１０−インスリンの交差結合は２倍増加するが、広く臨床的に用いられている類似体であるＡｒｇＢ３１、ＡｒｇＢ３２、ＧｌｙＡ２１−インスリン（インスリンｇｌａｒｇｉｎｅ（商標）；Ｌａｎｔｕｓ（商標））による交差結合は３倍増加する。ＩＧＦＲ交差結合のこのような増加は望ましくない。なぜなら、ＡｓｐＢ１０−インスリンを用いるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの処理は、乳房腫瘍の発生率の増加と関連するが、最近の臨床研究は、ヒトへのＬａｎｔｕｓの使用が、多様な癌の危険性の用量依存的な増加を与える可能性を示唆するからである。（ＩＧＦ−Ｉの配列は、ＧｌｕをＢ１０位に含み、ＡｓｐＢ１０と同様に負電荷である。理論に結び付けられることを望まないが、Ｌａｎｔｕｓによる交差結合は、Ｂ鎖のＣ末端での２つの塩基性残基により増えると考えられる。ＩＧＦ−ＩもＬｙｓをＢ２８位に、そしてＰｒｏをＢ２９位に含むので、ＫＰ−インスリンが交差結合のわずかな増加を示すことも考えられるが、上記のデータは、このことを確立するために十分に正確でない。）ＤＫＰ−インスリンは、ＩＧＦＲ交差結合において６倍の増加を示す。重要なことに、この増加は、Ｂ２４位でのオルト−モノフルオロ置換により相殺される：２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンは、野生型ヒトインスリンと同じ低い交差結合レベルを示す。糖尿病ラットにおけるその血糖降下効力も、ヒトインスリンのものと同じである（表６）。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリンは、０．５ｍＭを超えるタンパク質濃度でさえも単量体であるので、よって、この類似体は、臨床使用のための超速効型超安定インスリン製剤として利用できる可能性がある。２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンおよび２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの交差結合親和性も、ヒトインスリンのものと同様の低いレベルである。これらの類似体も、糖尿病ラットにおいて十分に活性である（表５）。
【００６９】
ＣＤスペクトルを、ヒトインスリン、ＫＰ−インスリン（リスプロ）およびハロゲン化ＰｈｅＢ２４インスリン類似体について、上記のようにして決定した。ＣＤにより検出されたタンパク質変性は、図７Ａおよび７Ｂ中にグアニジン塩酸塩の濃度の関数として示す。図７Ａは、ヒトインスリン（実線）およびＫＰ−インスリン（点線；「親」）の、２位、３位または４位（それぞれ黒三角、黒四角および白丸）でのＰｈｅＢ２４のモノフルオラス置換を含むＫＰ−インスリン類似体との比較を示す。図７Ｂは、ヒトインスリン（実線）およびＫＰ−インスリン（点線；「親」）の、ＰｈｅＢ２４の２−Ｃｌまたは２−Ｂｒ改変（それぞれ黒逆三角および白三角）を含む類似体との比較を示す。推定熱力学的パラメータを、上記の表４に示す。断片的なアンフォールディングを、２２２ｎｍにて２５℃での平均残基分子楕円率により監視した。
【００７０】
ハロゲン置換がインスリンにうまく適応され、高次構造の混乱の伝達の原因にならないことを示すために、選択されたインスリン類似体のＮＭＲ構造を得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、図８Ａおよび８Ｂに示す。溶液中の単量体としての２Ｃｌ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのＮＭＲ構造は、このように、ＫＰ−インスリンのものと同様である；同様に、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＤＫＰ−インスリン（これもまた溶液中の単量体）のＮＭＲ構造は、ＤＫＰ−インスリンのものと同様である。２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンおよび２Ｂｒ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンのＮＭＲスペクトルの定性分析は、同様に、天然様の構造を示す。
【００７１】
防腐剤フェノールの存在下での亜鉛安定化６量体としての２Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンおよび４Ｆ−ＰｈｅＢ２４−ＫＰ−インスリンの結晶構造を決定した（データは示さず）。構造は、フェノールの存在下での亜鉛安定化６量体としてのＫＰ−インスリンについて以前に報告されたものと同様である。それぞれの場合において、６量体の高次構造は、２つの軸方向の亜鉛イオンと、３つの結合したフェノール分子とを含むＴ３Ｒｆ３である。ハロゲン原子の電子密度が容易に観察される。２量体および３量体形成表面の構造は、ハロゲン化類似体で保存され、このことは、ＫＰ−インスリンおよび他の速効型インスリン類似体について用いられるものと同様の医薬製剤を得ることができるであろうことを示唆する。
【００７２】
患者を治療する方法は、ハロゲン置換インスリン類似体を患者に投与することを含む。ある例において、ハロゲン置換インスリン類似体は、フルオロ、クロロまたはブロモ置換フェニルアラニンなどのハロゲン置換フェニルアラニンを含有するインスリン類似体である。１つの具体的な例において、ハロゲン置換フェニルアラニンは、２Ｆ−ＰｈｅＢ２４、２Ｆ−ＰｈｅＢ２５または２Ｆ−ＰｈｅＢ２６である。別の例において、ハロゲン置換インスリン類似体は、体内での類似体の作用の速度を変更するように設計された１つまたは複数の置換を、インスリン分子内の他の位置にさらに含有する。さらに別の例において、インスリン類似体は、外付けまたは埋め込み型インスリンポンプにより投与される。本発明のインスリン類似体は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８０４６７号により詳細に記載される、Ｂ鎖のＣ末端とＡ鎖のＮ末端との間のテザーなどの他の改変も含んでよい。
【００７３】
医薬組成物は、このようなインスリン類似体を含んでよく、これは任意選択により亜鉛を含んでよい。亜鉛イオンは、このような組成物中に、インスリン類似体の６量体あたり２．２〜３．０のモル比のレベルで含まれ得る。このような製剤において、インスリン類似体の濃度は、典型的に、約０．１〜約３ｍＭである。３ｍＭまでの濃度は、インスリンポンプのリザーバーにおいて用いてよい。食事時間のインスリン類似体の改変は、（ａ）Ｈｕｍｕｌｉｎ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｈｕｍａｌｏｇ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、Ｎｏｖａｌｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＮｏｖａｌｏｇ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）ならびにヒトへの使用が現在承認されている他の速効型インスリン製剤の「正規」製剤、（ｂ）上記のおよび他のインスリン類似体の「ＮＰＨ」製剤、ならびに（ｃ）このような製剤の混合物について記載されるようにして処方してよい。
【００７４】
賦形剤は、グリセロール、グリシン、他の緩衝剤および塩、ならびにフェノールおよびメタ−クレゾールなどの抗菌防腐剤を含んでよい。後者の防腐剤は、インスリン６量体の安定性を増進することが知られている。このような医薬組成物は、生理的有効量の組成物を患者に投与することにより、真性糖尿病または他の病状を有する患者を治療するために用いてよい。
【００７５】
Ｂ２４位、Ｂ２５位またはＢ２６位にフッ素化フェニルアラニンを有するインスリンのＢ鎖を少なくともコードする配列を含むインスリン類似体をコードするポリペプチドをコードする配列を含む核酸も構想される。これは、Ｂ２４位に停止コドン（アンバーコドンＴＡＧなど）を、サプレッサーｔＲＮＡ（アンバーコドンを用いる場合はアンバーサプレッサー）と、以前に記載された（Ｆｕｒｔｅｒ、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：４１９〜４２６；Ｘｉｅら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６：２２７〜２３８）停止コドンに応答してポリペプチド中に非標準的なアミノ酸を組み込む対応するｔＲＮＡ合成酵素とともに導入することにより達成できる。具体的な配列は、核酸配列が導入される種の好ましいコドン使用に依存し得る。核酸は、野生型インスリンの他の改変もコードしてよい。核酸配列は、ポリペプチドまたは改変プロインスリン類似体の他の位置に無関係の置換または伸長を含む改変Ａ鎖またはＢ鎖配列をコードしてよい。核酸は、発現ベクターの一部分であってもよく、このベクターは、大腸菌細胞系などの原核宿主細胞、あるいはＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）またはピスチア・パストリス（Ｐｉｓｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株もしくは細胞系などの真核細胞系などの宿主細胞に挿入してよい。
【００７６】
例えば、酵母ピシア・パストリス（Ｐｉｓｃｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）および他の微生物におけるＢ鎖ポリペプチドの発現を導くように合成遺伝子を合成してよいことが構想される。Ｂ２４位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用いるＢ鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列は、以下のいずれかまたはその変異型であってよい：
（ａ）ヒトコドン優先性を有する：
【００７７】
【化９】
2015180647.tif 000018
【００７８】
（ｂ）ピチアコドン優先性を有する：
【００７９】
【化１０】
2015180647.tif 000019
【００８０】
同様に、ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２４位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用いる全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列番号１４の配列を有してよい。
【００８１】
【化１１】
2015180647.tif 000020
【００８２】
同様に、Ｂ２４位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用い、Ｐ．パストリスが好むコドンを有する全長ヒトプロインスリンｃＤＮＡは、配列番号１５の配列を有してよい。
【００８３】
【化１２】
2015180647.tif 000021
【００８４】
同様に、Ｂ２５位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用いるＢ鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列は、以下のいずれかまたはその変異型であってよい：
（ｂ）ヒトコドン優先性を有する：
【００８５】
【化１３】
2015180647.tif 000022
【００８６】
（ｂ）ピチアコドン優先性を有する：
【化１４】
2015180647.tif 000023
【００８７】
ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２５位にてフッ素化フェニルアラニンなどのハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用いる全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列番号２１の配列を有してよい。
【００８８】
【化１５】
2015180647.tif 000024
【００８９】
同様に、Ｂ２５位にてフッ素化フェニルアラニンのようなハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用い、Ｐ．パストリスが好むコドンを有する全長ヒトプロインスリンｃＤＮＡは、配列番号２２の配列を有してよい。
【００９０】
【化１６】
2015180647.tif 000025
【００９１】
同様に、Ｂ２６位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用いるＢ鎖ポリペプチドのヌクレオチド配列は、以下のいずれかまたはその変異型であってよい：
（ｃ）ヒトコドン優先性を有する：
【００９２】
【化１７】
2015180647.tif 000026
【００９３】
（ｂ）ピチアコドン優先性を有する：
【００９４】
【化１８】
2015180647.tif 000027
【００９５】
ヒトコドン優先性を有し、Ｂ２６位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用いる全長プロインスリンｃＤＮＡは、配列番号２５の配列を有してよい。
【００９６】
【化１９】
2015180647.tif 000028
【００９７】
同様に、Ｂ２６位にてハロゲン化フェニルアラニンを組み込む目的でこの位置にて停止コドンを用い、Ｐ．パストリスにより優先されるコドンを有する全長ヒトプロインスリンｃＤＮＡは、配列番号２６の配列を有してよい。
【００９８】
【化２０】
2015180647.tif 000029
【００９９】
遺伝子コードのシノニムを考慮すれば、同じポリペプチド配列をコードするこれらの配列の他の変異型が可能である。
【０１００】
上記の開示に基づいて、ハロゲン置換インスリン類似体が上記の目的を達成することが、ここで明らかになったはずである。つまり、これらのインスリン類似体は、熱力学的安定性の増進、繊維形成への耐性、および血糖値を低減させる効力を示す。ハロゲン置換フェニルアラニン含有インスリン類似体は、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）への交差反応性も低減させる。よって、特許請求される発明の範囲内に明らかに含まれる任意の変形形態、およびしたがって特定の構成要素の選択も、本明細書に開示され記載される本発明の精神を逸脱することなく決定できることを理解されたい。
【０１０１】
以下の文献は、本明細書に記載される試験およびアッセイ方法が当業者に理解されることを示すために引用される。
Ｆｕｒｔｅｒ，Ｒ．、１９９８．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐ−ｆｌｕｏｒｏ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：４１９〜４２６。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、Ｖｉｚｉｏｌｉ，Ｌ．Ｄ．およびＢｏｍａｎ，Ｈ．Ｇ．１９８２．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ａ（１−３３）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１：５０２０〜５０３１。
Ｍｉｒｍｉｒａ，Ｒ．Ｇ．およびＴａｇｅｒ，Ｈ．Ｓ．１９８９．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ｂ２４  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６３４９〜６３５４。
Ｓｏｓｎｉｃｋ，Ｔ．Ｒ．、Ｆａｎｇ，Ｘ．およびＳｈｅｌｔｏｎ，Ｖ．Ｍ．２０００．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ＲＮＡ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１７：３９３〜４０９。
Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｘ．１９９５．Ａｎ  ｅｘａｃｔ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｂｉｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０：１１１〜１１４。
Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．Ａ．、Ｈｕａ，Ｑ．Ｘ．、Ｊｉａ，Ｗ．、Ｃｈｕ，Ｙ．Ｃ．、Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｙ．およびＫａｔｓｏｙａｎｎｉｓ，Ｐ．Ｇ．２０００．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  “ｕｎ−ｄｅｓｉｇｎ”：ｉｎｓｕｌｉｎ’ｓ  ｉｎｔｒａｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ  ｔｅｔｈｅｒｓ  ａ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  α−ｈｅｌｉｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１５４２９〜１５４４０。
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｊ．およびＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｌ．２００５．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２０９３２〜２０９３６。
Ｘｉｅ，Ｊ．およびＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．２００５．Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３６：２２７〜２３８。
【図１Ａ】
2015180647.tif 000030
【図１Ｂ】
2015180647.tif 000031
【図１Ｃ】
2015180647.tif 000032
【図１Ｄ】
2015180647.tif 000033
【図１Ｅ】
2015180647.tif 000034
【図２Ａ】
2015180647.tif 000035
【図２Ｂ】
2015180647.tif 000036
【図２Ｃ】
2015180647.tif 000037
【図２Ｄ】
2015180647.tif 000038
【図３】
2015180647.tif 000039
【図４】
2015180647.tif 000040
【図５】
2015180647.tif 000041
【図６】
2015180647.tif 000042
【図７Ａ】
2015180647.tif 000043
【図７Ｂ】
2015180647.tif 000044
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2015180647.tif 000046