(57)【要約】【課題】  試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、一定温度、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供すること。【解決手段】  ５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、ｐＨを上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことで、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）ｐＨを上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項２】
以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）ｐＨを上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項３】
以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）ｐＨを上昇させることで、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
【請求項４】
標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ（１）の工程の前に、ｐＨを上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする工程を行なう、請求項１から３のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項５】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、請求項１から４のいずれかに記載の増幅方法。
【請求項６】
ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、請求項１から５のいずれかに記載の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる標的核酸を特異的に増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より核酸増幅方法としてＰＣＲ法が用いられている。しかしながら、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があるため、自動化の際、反応工程の省力化や反応装置の低コスト化の点で問題があった。さらに標的核酸がＲＮＡの場合には、逆転写反応を行なう必要があり、さらに煩雑であった。
【０００３】
ＲＮＡを標的核酸とした増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法（特許文献１および２）、ＴＭＡ法（特許文献３）、ＴＲＣ法（特許文献４および非特許文献１）が知られている。これれらの増幅法は、一定温度で核酸を増幅することができるため、自動化の際、反応工程の省力化や反応装置の低コスト化が容易な点で好ましい。しかしながら、これらの増幅法は標的核酸がＤＮＡの場合、増幅が困難であった。
【０００４】
特許文献５には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する鎖置換活性を利用した、ＤＮＡを標的核酸とした、ＮＡＳＢＡ法による核酸の増幅および検出法を開示している。しかしながら、特許文献５に開示の方法は、３７℃で２時間インキュベーションして標的核酸を増幅後、一旦−２０℃で凍結し、その後ＥＬＯＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法により標的核酸を検出する方法であり、非常に煩雑な方法である。また最小検出感度も１０６コピー／テストであり、感度の面からも不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特許第３００２２５９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、試料中に含まれる標的核酸を、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、一定温度、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、ｐＨを上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことで、一定温度で、核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に増幅することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（２）ｐＨを上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第二の態様は、以下の（１）から（７）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）ｐＨを上昇させることで、前記（１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（７）（６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第三の態様は、以下の（１）から（９）の工程を含む、標的核酸の増幅方法である。
（１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（４）ｐＨを上昇させることで、前記（３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（９）（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
また本発明の第四の態様は、標的核酸が二本鎖核酸であり、かつ（１）の工程の前に、ｐＨを上昇させることで前記標的核酸を一本鎖核酸とする工程を行なう、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の増幅方法である。
【００１０】
また本発明の第五の態様は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素とが、ＡＭＶ逆転写酵素である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の増幅方法である。
【００１１】
さらに本発明の第六の態様は、ＲＮＡ転写産物の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する工程を、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の増幅方法にさらに含んでなる、標的核酸の検出方法である。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明における標的核酸とは、試料中に含まれる一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのうち、本発明の増幅方法により増幅される領域のことをいう。
【００１４】
本発明において、相補的な配列を有するとは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいい、相同的な配列を有するとは、標的核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を有することをいう。ここでいうストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール（商品名）、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが共存する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件下でハイブリダイズ可能な条件があげられる。
【００１５】
本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。なお第一または第二のプライマーに付加するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列は、本発明で用いるＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した配列を用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合の一例として、配列番号５に記載の配列からなるＴ７プロモータがあげられる。
【００１６】
本発明ではＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の他に、少なくともＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素も用いる。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよく、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体は、前述した三つの酵素活性の全てを有しているため好ましく、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が好ましい。
【００１７】
本発明の核酸増幅方法は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、ｐＨを上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことを特徴としている。ｐＨを上昇させる条件は、二本鎖核酸を解離可能なｐＨ条件とすればよく、二本鎖核酸が二本鎖ＤＮＡの場合はｐＨ約９．２以上とすればよいが、ｐＨを１２以上とするとさらによい。ｐＨを上昇させる方法に特に限定はなく、例えば塩基性薬剤を添加すればよい。塩基性薬剤の一例として、水酸化カリウム水溶液があげられる。
【００１８】
ｐＨを上昇させる操作を行なう際、さらに高温での反応や、溶媒の極性を下げる薬剤の添加などにより、二本鎖核酸の解離を促進してもよい。ここでいう高温とは、４０℃以上であればよく、４５℃以上であればさらによい。また、ここでいう溶媒の極性を下げる薬剤の例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）があげられる。なお二本鎖核酸の解離は、二本鎖核酸の長さ、二本鎖核酸のＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することで二本鎖核酸の解離を促進してもよい。二本鎖核酸が解離する条件の例として、本明細書の実施例に記載の条件があげられる。
【００１９】
ｐＨを上昇させたままの状態を維持すると、プライマーと一本鎖核酸とがアニールせず、標的核酸の増幅が進まないため、一本鎖核酸とする工程を行なった後は、プライマーと一本鎖核酸とがアニールする条件までｐＨまで下降させる。ｐＨを下降させる方法に特に限定はなく、例えば酸性薬剤を添加すればよい。酸性薬剤の一例として、塩酸があげられる。なおプライマーと一本鎖核酸とのアニールは、反応温度、溶媒の極性、プライマーの長さ、プライマーのＧＣ含量、溶媒中の塩濃度などによって影響を受けることが知られており、これらを最適化することでアニールを促進してもよい。
【００２０】
本発明の増幅方法は、鋳型核酸の形態により異なる。鋳型核酸が標的核酸の相補鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ａ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖から、標的核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（Ａ−２）ｐＨを上昇させることで、前記（Ａ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ａ−３）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ａ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ａ−５）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ａ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ａ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ａ−７）（Ａ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸が標的核酸の相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｂ−１）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸から、標的核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−２）ｐＨを上昇させることで、前記（Ｂ−１）で合成したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｂ−３）標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｂ−４）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−３）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｂ−５）第一のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｂ−４）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相同的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｂ−６）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｂ−７）（Ｂ−６）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。鋳型核酸がＲＮＡの相同鎖である場合の増幅方法の一例としては、
（Ｃ−１）標的核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的ＲＮＡから、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−３）５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−２）で得られた一本鎖ＤＮＡから、二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−４）ｐＨを上昇させることで、前記（Ｃ−３）で合成した５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（Ｃ−５）第二のプライマー、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−４）で得られた一本鎖ＤＮＡから、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（Ｃ−６）前記プロモータ配列に対応したＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−５）で得られた二本鎖ＤＮＡから、ＲＮＡ転写産物を合成する工程
（Ｃ−７）第二のプライマー、およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記（Ｃ−６）のＲＮＡ転写産物から、標的核酸に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ−８）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を用いて、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを分解する工程（一本鎖ＤＮＡの生成）
（Ｃ−９）（Ｃ−８）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型に連鎖的にＲＮＡ転写産物を合成する工程
を含む方法があげられる。
【００２１】
なお標的核酸が二本鎖核酸の場合は、前記二本鎖核酸を含む溶液のｐＨを上昇させて、一本鎖核酸とする工程を行なった後、当該一本鎖核酸の態様に応じて、前記（Ａ−１）、前記（Ｂ−１）、前記（Ｃ−１）のいずれかの工程を行なえばよい。なお前記工程は、例えば、試料からの標的核酸の抽出工程といった予備操作における最終工程で、標的核酸を高いｐＨの溶媒へ溶解させることで行なってもよい。
【００２２】
本発明の増幅方法で増幅した標的核酸（ＲＮＡ転写産物）を検出することで、試料中に含まれる標的核酸の有無を検出することができるが、増幅した標的核酸の一部と相補的二本鎖を形成すると形成前と比較し蛍光特性が変化するオリゴヌクレオチドプローブをあらかじめ本発明の増幅試薬に添加し、当該蛍光特性の変化を蛍光分光光度計で経時的に測定すると、試料中に含まれる標的核酸の増幅と検出を一段階かつ密閉容器内で行なえるため、好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の増幅方法は、５’末端側にＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列を付加した標的核酸の一部と相同的または相補的な配列を有するプライマー、およびＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、標的核酸の相補鎖または相同鎖から、標的核酸に相同的または相補的なＤＮＡを合成する工程の後、ｐＨを上昇させて、前記合成したＤＮＡを一本鎖核酸とする工程を行なうことを特徴としている。本発明により、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法であっても、標的核酸の種類（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を問わず、一定温度、かつ高特異的、高感度、迅速、簡便に標的核酸を増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）と、実施例３および実施例４で使用したプライマー／プローブの塩基配列との関係を示した図である。なお配列番号３および４は相補鎖の塩基配列である。
【図２】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。なお、本実施例で使用したプライマー／プローブの、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３７０）における位置関係を図１に示す。
【００２６】
実施例１  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ溶液の調製
ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社より購入した不活化ウイルスより、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従い抽出することで、ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を得た。抽出試料中に含まれるＨＢＶ  ＤＮＡのコピー数は、抽出効率を１００％とし、１ＩＵを約６コピーとして計算した。
【００２７】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブ（ＩＮＡＦプローブ）の作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号３に記載の配列の５’末端から５番目のＴと６番目のＡの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図２）。
【００２８】
実施例３  等温増幅法を用いたＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その１）
等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液を、注射用水を用いて１０００コピー／５μＬ、１００コピー／５μＬ、または１０コピー／５μＬとなるよう希釈した。
（２）０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に表１に示す組成からなる反応液を１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに前記ＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。なお第一のプライマー（配列番号２）は、配列番号１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端側に配列番号５に記載の配列からなるＴ７プロモータを付加したオリゴヌクレオチドである。
【００２９】
【表１】
2015130801.tif 000002
【００３０】
（３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、表２に示す組成からなる反応液４μＬを添加した。
【００３１】
【表２】
2015130801.tif 000003
【００３２】
（４）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で５分間保温後、注射用水を４μＬ添加した。
（５）５から１０回ピペッティングを行ない撹拌後、ただちに注射用水を４μＬ添加した。
（６）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で５分間保温後、あらかじめ４３℃で１分間保温した表３に記載の組成からなる反応液２μＬを添加した。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
（７）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で５分間保温後、あらかじめ４３℃で１分間保温した表４に記載の組成からなる反応液２μＬを添加した。
【００３５】
【表４】
2015130801.tif 000005
【００３６】
（８）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃の一定温度で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００３７】
表４に記載の組成からなる反応液添加時（（７）の操作を行なったとき）を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表５に示す。等温増幅法により１０００コピー／テストまでのＨＢＶ  ＤＮＡを検出することができた。
【００３８】
【表５】
2015130801.tif 000006
【００３９】
実施例４  等温増幅法を用いたＨＢＶ  ＤＮＡの検出（その２）
等温増幅法によるＨＢＶ  ＤＮＡの検出を試みた。
（１）０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー社製）に表６に示す組成からなる反応液を１７μＬ／ｔｕｂｅで分注し、これに実施例３（１）で調製したＨＢＶ  ＤＮＡ溶液５μＬを添加した。
【００４０】
【表６】
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【００４１】
（２）上記反応液を４６℃で５分間保温後、表７に示す組成からなる反応液４μＬを添加した。
【００４２】
【表７】
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【００４３】
（４）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で５分間保温後、１Ｍ水酸化カリウム水溶液を４μＬ添加した。
（５）５から１０回ピペッティングを行ない撹拌後、ただちに１Ｍ塩酸を４μＬ添加した。
（６）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で５分間保温後、あらかじめ４３℃で１分間保温した表３に記載の組成からなる反応液２μＬを添加した。
（７）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で５分間保温後、あらかじめ４３℃で１分間保温した表４に記載の組成からなる反応液２μＬを添加した。
（８）実施例３（８）に記載の方法で反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。
【００４４】
表４に記載の組成からなる反応液添加時（（７）の操作を行なったとき）を０分として、反応液の蛍光強度比が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした。結果を表８に示す。ｐＨ操作を伴う前処理により検出時間の短縮と検出感度の大幅な向上がみられ、１０コピー／テストまでのＨＢＶ  ＤＮＡを検出することができた。なお（４）で水酸化カリウム水溶液添加後のｐＨを別途測定したところ、ｐＨ１２．２であった。
【００４５】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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