(57)【要約】【課題】細胞に対する賦活化および抗老化効果に優れ、長期にわたる使用に十分に耐えうる安全性を備えた賦活化剤および抗老化剤を提供し、これらを有効成分とした化粧品・医薬部外品、医薬品、飲食品を提供する。【解決手段】糖脂質型バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッドを含有することを特徴とする細胞賦活化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロビオースリピッドを含有することを特徴とする細胞賦活化剤。
【請求項２】
細胞賦活化が皮膚細胞の賦活化である、請求項１に記載の細胞賦活化剤。
【請求項３】
細胞賦活化が線維芽細胞、毛母細胞又は毛乳頭細胞の賦活化である、請求項１に記載の細胞賦活化剤。
【請求項４】
下記一般式（Ｉ）又は（II）で表される構造を有するセロビオースリピッドを含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞賦活化剤。
【化１】
2015007032.tif 000008
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１は炭素数が１２または１４を示す。また式Ｉ中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。）
【化２】
2015007032.tif 000009
（式（ＩＩ）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またｎ１は炭素数１１あるいは１２のアルキレン基を表し、ｎ２は炭素数２または４のアルキレン基を表す。）
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞賦活化剤を含む抗老化剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞賦活化剤を含む皮膚保護剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞賦活化剤を含む肌荒れ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロビオースリピッドを有効成分とする賦活化剤に関するものであり、特に、各種細胞の賦活化により細胞の代謝や再生、修復機能を改善し、老化防止や発毛・脱毛防止に有効なセロビオースリピッドを含有する化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各種の疾患などは、分裂するすべての細胞の分裂速度の低下、細胞機能の低下と深く関わっている。例えば皮膚の真皮及び表皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びこれら細胞外の皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスによって構成されている。特にコラーゲンやヒアルロン酸の合成や分解を制御しているのは主として線維芽細胞である。若い皮膚においては、これらの皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことによって柔軟性等の皮膚特性が確保され、肌は外観的にも艶、引き締め、透明感があり、しっとり状態に維持される。ところが、紫外線、乾燥、ストレスなどによって特に細胞外マトリックスや線維芽細胞の機能低下が引き起こされ、その結果、皮膚の柔軟性等の皮膚特性は低下し、肌は艶、引き締め、透明感を失い、荒れ、しわ、くすみなどの症状が発生する。皮膚特性の衰えとともに線維芽細胞の機能は衰え、コラーゲンやヒアルロン酸の代謝回転速度は低下することも知られている。 
【０００３】
細胞レベルで賦活化剤、抗老化剤の探索が行われている。例えば動物系由来の賦活化剤としては、結合組織加水分解物、胸腺・脾臓由来水溶性蛋白、牛胎盤エキスなどが知られている。植物系由来の賦活化剤としては、ゴマ、サンヤク、トウガラシ、トウキ、ドクダミ、バクモンドウ、アーモンド、セイヨウタンポポ、セイヨウニワトコ、センキュウ、センブリ、ソウハクヒ、トウニン、ニンジン、ホップ、ムクゲ、ヨクイニン、ショウガ科ウコン属、ハナヤスリ科ハナヤスリ属の抽出物などが知られている。これらの一部は賦活化剤、抗老化剤として医薬部外品や化粧品に利用されているが、非常に個人差が大きいため作用効果が十分とは言えず、満足すべき作用効果を発揮する細胞賦活化作用や抗老化作用は得られていない。
【０００４】
糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、界面活性剤としての機能を持つ。生体中には各種の両親媒物質が存在し、様々な界面で物質、エネルギー、情報の交換に関与し、生態の秩序形成に大きな役割を果たしている。
【０００５】
微生物の中にはこれらの界面活性物質を効率良く生産することが知られている。この生物由来界面活性剤（バイオサーファクタント）は、安全性が高く、生分解に優れることから合成界面活性剤に比べ環境に対する負荷が少ない。また合成では容易に作り出せないような複雑な構造をしており、優れた生理機能を持つといわれている。例えば、糖脂質系のバイオサーファクタントは、それ自体の保湿効果が高いことが知られており、化粧品等の成分として用いることが期待されている。このような特異性を持つことからバイオサーファクタントの研究は、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等各方面で進められている。
【０００６】
現在、微生物が生産する界面活性物質としては、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子化合物系の５つに分類されている。この内の糖脂質系の界面活性剤については、最もよく研究され、細菌及び酵母による多くの種類の物質が報告されている。 
【０００７】
近年糖脂質系バイオサーファクタントの一種であるセロビオースリピッド（ＣＬ）が、抗真菌活性を示すことが報告されて注目されている（非特許文献１）。セロビオースリピッドは、Ustilago maydis（ウスチラゴ メイディス）やCryptococcus humicola（クリプトコッカス フミコーラ）により生産することが知られている（非特許文献２）。また、Pseudozyma flocculosa（シュードザイマ フロキュローサ）もフロキュロシンというCLの一種を生産することが知られている（非特許文献３）。さらに、Ustilago esculenta（ウスチラゴ エスキュレンタ）はＣＬを大量に生産できることが分かっている（特許文献１）。これらの微生物が生産するＣＬは、すべて優れた抗真菌活性を示すため、抗真菌薬としての実用化が期待されている。
【０００８】
セロビオースリピッドは、洗剤、化粧品等幅広い分野で工業利用が進められており、リポソーム形成剤としての利用（特許文献２参照）、乳化剤・可溶化剤（特許文献３参照）、タンパク質分離用担体（特許文献４参照）、低分子オルガノゲル（特許文献５参照）などの報告がある。
【０００９】
セロビオースピリッドは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しいため、特に、化粧品や医薬品の素材としての実用化が期待されている。しかし今現在セロビオースピリッドの細胞に対する効果は見出されておらず、効果や効能は報告されていない。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００４−２５４５９５号公報
【特許文献２】特開２００６−０２８０６９号公報
【特許文献３】特開２００７−１８１７８９号公報
【特許文献４】特開２００６−２１９４５５号公報
【特許文献５】特開２０１２−１７６９０４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「J. Oleo Sci.」Vol.58, No.3, p133-140(2009)
【非特許文献２】「Biochim. Biophys. Acta」Vol.1558, No.2, p161-170(2002)
【非特許文献３】「Appl. Environ. Microbiol.」Vol.69, No.5, p2595-2602(2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
哺乳類、特にヒトに対して賦活化や抗老化を付与することは極めて重要な課題である。動物由来、植物由来の賦活化物質や抗老化剤は各種見つかっているが、実際には産業上利用可能な程度に十分かつ安定した効果は得られておらず、新規な賦活化剤や抗老化剤が探索されている。本発明の目的は、細胞に対する賦活化および抗老化効果に優れ、長期にわたる使用に十分に耐え得る安全性を備えた賦活化剤および抗老化剤を提供し、これらを有効成分とした化粧品・医薬部外品、医薬品、飲食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
【００１４】
１．セロビオースリピッドを含有することを特徴とする細胞賦活化剤。
２．細胞賦活化が皮膚細胞の賦活化である、１に記載の細胞賦活化剤。
３．細胞賦活化が線維芽細胞、毛母細胞又は毛乳頭細胞の賦活化である、１に記載の細胞賦活化剤。
４．下記一般式（Ｉ）又は（II）で表される構造を有するセロビオースリピッドを含有することを特徴とする、前記１〜３のいずれか一に記載の細胞賦活化剤。
【化１】
2015007032.tif 000002
（式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１は炭素数が１２または１４を示す。また式Ｉ中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。） 
【化２】
2015007032.tif 000003
（式（ＩＩ）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またｎ１は炭素数１１あるいは１２のアルキレン基を表し、ｎ２は炭素数２または４のアルキレン基を表す。）
【００１５】
５．前記１〜４のいずれか一に記載の細胞賦活化剤を含む抗老化剤。
６．前記１〜４のいずれか一に記載の細胞賦活化剤を含む皮膚保護剤。
７．前記１〜４のいずれか一に記載の細胞賦活化剤を含む肌荒れ改善剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により安全性に優れた細胞賦活作用が期待でき、セロビオースリピッドを有効成分とした化粧品・医薬部外品（皮膚外用剤、浴用剤、育毛剤など）、医薬品、飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いたＣＬの細胞賦活作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
〔賦活化剤〕
本明細書において「賦活化」とは、細胞機能や細胞活性を維持または亢進させることが意図される。その結果、細胞機能や細胞活性の恒常性の維持を助け、細胞の老化を抑制することができる。したがって、「賦活化剤」は「細胞賦活剤」と同義であり、「抗老化剤」としての有用性を持つ。
【００１９】
例えば、皮膚細胞における「賦活化、抗老化」とは、加齢や光老化による基低膜の構造変化の蓄積に伴う皮膚細胞の機能低下や代謝異常を小さくすることで、皮膚のしわ、たるみ、硬化等を防止、改善して弾力のある若々しい健康な肌の状態を維持することなどを指す。また、例えば、線維芽細胞においては、紫外線、著しい空気の乾燥、過度の皮膚洗浄、ストレス、喫煙等の外的因子の影響や加齢による線維芽細胞の増殖低下を防ぎ、皮膚の弾力性もしくはハリの低下、皮膚のシワもしくはたるみの予防あるいは改善に寄与することなどを指す。さらに、例えば、毛乳頭細胞または毛母細胞においては、加齢、ストレス、ホルモンバランスによる毛乳頭細胞または毛母細胞の機能低下を抑えることで、ヘアサイクルを維持して脱毛を抑えることなどを指す。
【００２０】
〔セロビオースリピッド〕
セロビオースリピッドは、生物により生産される界面活性能力や乳化能力を有する糖脂質型バイオサーファクタントの一種である。「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力を有する物質の総称であり、優れた界面活性や、高い生分解性を示すばかりでなく、様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動・機能を発現する可能性がある。
【００２１】
セロビオースリピッド（以下、ＣＬということがある。）は構造に様々なバリエーションがあり、これらの分子構造の違いは生産微生物の相異に基づく。式（I）中、Ｒ１は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１が１２〜１４を示す。さらに式（I）中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。これらは混合体で得られるが、精製分離操作を行い単独のＣＬ化合物を使用してもよい。また水溶性を高めるため、アルカリ処理を施しナトリウム塩として使用してもよい。また式（II）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。ｎ１が１１〜１２を表し、ｎ２が２〜４を表す。これらは混合体で得られるが、精製分離操作を行い単独のＣＬ化合物を使用しても混合体のまま用いてもよい。また水溶性を高めるため、アルカリ処理を施しナトリウム塩として使用してもよい。 
【００２２】
〔セロビオースリピッドの製法〕
セロビオースリピッドは、セロビオースリピッド生産菌の培養液を抽出、精製することにより得られる。ＣＬ生産菌としては、例えば、クリプトコッカス（Cryptococcus属）やウスチラゴ（Ustilago）属に属し、かつセロビオースリピッドを生産する能力を有する微生物が挙げられる。クリプトコッカス （Cryptococcus）属微生物は主に上記構造式（I）のセロビオースリピッドを生産し、ウスチラゴ（Ustilago）属の微生物は主に構造式（II）のセロビオースリピッドを生産する。 
【００２３】
セロビオースリピッドの製造方法は特に制限されるものはないが、公知のバイオサーファクタント生産微生物を用いた発酵方法を任意に選択して行えばよい。例えばセロビオースリピッドの培養生産は、クリプトコッカス  フミコーラ（Cryptococcus  humicola）や、ウスチラゴ  エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を常法に従って培養することにより生産することができる。セロビオースリピッド生産微生物としては、上記以外にウスチラゴ・メイディス（Ustilago maydis）、シュードザイマ フロキュローサ（Pseudozyma flocculosa）、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）、等を用いることができる。バイオサーファクタント生産微生物は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２４】
セロビオースリピッドを生産するときの発酵培地は、酵母エキス、ペプトン等のＮ源、グルコース、フルクトース等のＣ源、および硝酸ナトリウム等の無機窒素源、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム７水塩等の無機塩類からなる一般的な組成の培地を用いることができる。
【００２５】
ｐＨや温度等の発酵条件や培養時間等は任意に設定でき、発酵後の培養液をそのまま本発明のバイオサーファクタントとして使用することが可能である。また、発酵後の培養液を必要に応じて濾過、遠心分離、抽出、精製、滅菌等の任意の操作を適宜加えることも可能であり、得られたエキスを希釈、濃縮、乾燥することもできる。
【００２６】
無機窒素源としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安等が挙げられる。
【００２７】
セロビオースリピッドの回収、精製方法には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、培養液を遠心分離して油分を回収し、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出濃縮することにより回収することができる。
【００２８】
抽出溶媒としては、水、アルコール類、ケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、エステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独であるいは２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができ、また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
【００２９】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点の範囲であればよく、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすればよい。多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要であれば、その効力に影響のない範囲でさらに脱臭、脱色などの精製処理を加えてもよい。脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラムなどを用いればよく、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えばよい。必要に応じて、シリカゲルカラムを用いて精製することにより、純度の高いセロビオースリピッドを得ることができる。  
【００３０】
上述のようにして得られるセロビオースリピッドは、そのまま賦活化剤として利用することも可能であるが、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品に配合して利用することが好ましい。セロビオースリピッドを配合する濃度は、吸収程度、作用程度、製品形態、使用頻度などによって適宜選択され、特に限定されるものではないが、通常は０．００００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．０００５重量％〜０．０５重量％、より好ましくは０．０００１重量％〜０．０１重量％である。
【００３１】
賦活化剤に配合するセロビオースリピッドの使用形態は任意である。例えば、セロビオースリピッドを培養液からの抽出物のまま、あるいは精製した高純度品として使用できる。セロビオースリピッドは疎水性が高いため、非イオン性の界面活性剤や低級アルコール、多価アルコールに溶解して用いることが好ましい。または、水に溶解しやすいセロビオースリピッドのナトリウム塩を用いてもよい。
【００３２】
［皮膚保護剤］
本発明に係る賦活化剤の有効成分であるセロビオースリピッドを用いることにより線維芽細胞が活性化される。線維芽細胞の活性化により表皮細胞が正常化され皮膚のバリア機能やターンオーバーが健全化または回復し、紫外線、著しい空気の乾燥、過度の皮膚洗浄、ストレス、喫煙等の外的因子の影響や、加齢による皮膚の弾力性もしくはハリの低下に対する予防あるいは改善を行い、皮膚のシワもしくはたるみから皮膚を保護することが可能となる。
【００３３】
［肌荒れ改善剤］
本発明に係る賦活化剤の有効成分であるセロビオースリピッドを用いることにより線維芽細胞の活性化を促進することができる。線維芽細胞の活性化に伴い、天然保湿因子であるヒアルロン酸などの生産が促進され、肌荒れや乾燥肌の改善につながる。
【００３４】
本発明に係る賦活化剤は、有効成分であるセロビオースリピッドを化粧品、医薬部外品、医薬品、食品に配合して組成物の形態で実施することがより好ましい。
［本発明の使用形態］
【００３５】
化粧品、医薬部外品、医薬品の形態で実施する場合、外用剤とすることが好適である。ただし、バイオサーファクタントは経口摂取も可能であるため、外用剤に限定されず、内用剤、飲食品としてもよい。
【００３６】
剤形は限定されず、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、丸剤、錠剤、固形剤、液剤、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート、ムース、浴用剤など多様なものとすることができる。
【００３７】
化粧品、医薬部外品、医薬品としては、例えば内用・外用薬用製剤、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料などの頭髪化粧料、ファンデーション、白粉、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、眉墨、まつ毛などのメークアップ化粧料、美爪料などの仕上げ用化粧料、香水類、浴用剤、歯磨き類、口中清涼剤・含嗽剤、液臭・防臭防止剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュなどが挙げられる。
【００３８】
飲食品としては、例えば清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、種々の形態の健康・栄養補助食品、保健機能食品、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチなどが挙げられる。
【００３９】
本発明に係る賦活化剤はヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が期待できる限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【００４０】
本発明に係る賦活化剤は、有効成分であるセロビオースリピッドに加え、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品に使用される成分や添加剤を併用して配合することができる。
【００４１】
例えば、油脂類、ロウ類、鉱物油、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、金属セッケン類、ガム質および水溶性高分子化合物類、界面活性剤類、ビタミン類、アミノ酸類、美白剤、保湿剤、育毛剤、動物あるいは植物、生薬の抽出物やエキス、微生物培養代謝物、α−ヒドロキシ酸類、無機顔料、紫外線吸収剤、収斂剤、抗酸化剤、抗炎症剤、殺菌・消毒薬、頭髪用剤、香料、色素・着色剤、甘味料、栄養強化剤、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物性蛋白質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖蛋白質およびその分解物、血流促進剤、消炎剤・抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、苦味料、調味料、酵素などが挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４３】
［ 実施例１：クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）を用いたセロビオースリピッド（ＣＬ）製造］
種菌培養はCryptococcus humicolaNBRC 10251のコロニーを種培地(５０ｍＬ/５００ｍＬ坂口フラスコ)に1 Ｌｏｏｐ植菌して実施した。２７ ℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は１０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．０３ｇ／Ｌリン酸二水素ナトリウム  ０．１ｇ／Ｌ  酵母エキスとした。.培養は上記種菌 ６０ｍLを生産培地６Ｌ（１０Ｌ-ｊａｒ）に植菌し、２７ ℃、５３０ｒｐｍ（攪拌回転）、３Ｌ/ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で１０Ｌ-jarを用いて培養した。生産培地組成は、１０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．０３ｇ／Ｌリン酸二水素ナトリウム  ０．１ｇ／Ｌ  酵母エキスとした。６日間培養した培養液を遠心分離 (７５００ｒｐｍ, ２０ｍｉｎ ) を行い、菌体と上清を分離した。菌体と等量の酢酸エチル : アセトン＝４：１を加え攪拌後、ＣＬ抽出を行った。沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで乾燥させ、粉末を得た。得られた粉末からさらに脂質不純物を取り除くため、ヘキサン(３００ｇ)を加え攪拌後、ガラスフィルターろ過とエバポレーションを行いヘキサン除去した。これにより、ＣＬの混合体を得た。
【００４４】
［実施例２：ウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）を用いたセロビオースリピッド（ＣＬ）製造］
種菌培養はUstilago esculenta NBRC 9887のコロニーを種培地 (５０ｍＬ/５００ｍＬ坂口フラスコ) に1 loop植菌して実施した。２７ ℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は５０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．０２５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、８ｇ／Ｌ  酵母エキスとした。培養は上記種菌１００ｍＬを生産培地６L（１０Ｌ-ｊａｒ）に植菌し、２７ ℃、５３０ｒｐｍ（攪拌回転）、３Ｌ/ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で１０Ｌ-ｊａｒを用いて培養した。生産培地組成は、５０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ 硝酸ナトリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、０．０２５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム  ０．５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、８ｇ／Ｌ  酵母エキスであった。６日間培養した培養液を遠心分離 (７５００ｒｐｍ, ２０ｍｉｎ ) を行い、菌体と上清を分離した。菌体と等量の酢酸エチル : アセトン＝４：１を加え、十分攪拌後、ＣＬ抽出を行った。沈殿と上清に分け、上清をエバポレーターで乾燥させ、粉末を得た。得られた粉末からさらに脂質不純物を取り除くため、ヘキサン(３００ｇ)を加え、攪拌後、ガラスフィルターろ過とエバポレーションを行いヘキサン除去した。これにより、ＣＬの混合体を得た。
【００４５】
［実施例３：セロビオースリピッドのＮａ塩化］
実施例１又は２で得られたＣＬを４ｇに蒸留水２０ｍＬを添加して撹拌した。この溶液に１Ｎ ＮａＯＨを滴下し、
ｐＨ７〜８になるように調製を行った。粉末化のため、エバポレーターで水分を除去後さらにエタノールを添加、乾燥させた。
【００４６】
［実施例４：セロビオースリピッドの構造解析］
クリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）およびウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）それぞれから得られたＣＬの同定は、共鳴周波数５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲ測定（プロトン型核磁気共鳴分光測定）にて行った。測定装置はBRUKER社製 NMR装置AVANCE 500を用い、溶媒には重クロロホルム（CDCl3）および重メタノール（CD3OD）を用いた。その結果、これらの株から得られた粉末はすべてＣＬであることが判明した。化３、化４に一般式を示す。化３にクリプトコッカス・フミコーラ（Cryptococcus humicola）由来のＣＬの主な構造を示し、化４にウスチラゴ・エスキュレンタ（Ustilago esculenta）から得られたＣＬの主な構造を示す。それぞれ代表的な構造について、重クロロホルムを用いた測定ではクロロホルムのピークを７．２４ｐｐｍ、重メタノールを用いた測定ではメタノールのメチルプロトンのピークを３．３０ｐｐｍとしたときの、帰属された化学シフトをまとめて表１、表２に示す。なお、表１は式（ＩＩＩ）において、ｎ１＝１４，Ｒ1＝ＯＨであり、表２は式（ＩＶ）においてｎ１＝１２、Ｒ１＝ＯＨ，Ｒ２＝ＯＨである。
【００４７】
【化３】
2015007032.tif 000004
（式（ＩＩＩ）中、Ｒ１は、水素又はヒドロキシル基を表し、ｎ１は炭素数が１２または１４を示す。また式Ｉ中の糖１のＲ２、Ｒ３、Ｒ４はアセチル基またはヒドロキシル基であることを示す。）
【００４８】
【化４】
2015007032.tif 000005
（式（ＩＶ）中、Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ水素又はヒドロキシル基を表す。またｎ１は炭素数１１あるいは１２のアルキレン基を表し、ｎ２は炭素数２または４のアルキレン基を表す。） 
【００４９】
【表１】
2015007032.tif 000006
【００５０】
【表２】
2015007032.tif 000007
【００５１】
［実施例５：ヒト正常皮膚線維芽細胞を用いたセロビオースリピッドの細胞賦活化作用］
ヒト正常皮膚線維芽細胞を１ウェル当たり２．０×１０４個となるように４８穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地 (ＤＭＥＭ) に１０％のウシ胎児血清を添加したものを用いた。３７℃、二酸化炭素濃度５％中にて２４時間培養後、ＣＬ−Ｎａ塩を終濃度１００μｇ/ｍL〜1μｇ/ｍLとなるよう試験培地に添加し、さらに72時間培養した。
溶媒対照として、蒸留水を設けた。次いで生細胞数測定試薬ＳＦを２５μＬ添加して3時間培養し、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
【００５２】
評価結果を、蒸留水における細胞賦活作用を１００とした相対値にて図１に示した。
図１より、ＣＬ−Ｎａ塩を終濃度１００μｇ/ｍL〜1０μｇ/ｍL添加すると、ヒト正常皮膚線維芽細胞に対して、蒸留水よりも高い細胞賦活化作用を示した。特にＣＬを終濃度２５μｇ/ｍＬ添加した場合には、蒸留水よりも３０％以上の有意な細胞賦活化作用が認められた。この結果より、ＣＬが優れた細胞賦活化作用を有することが明らかとなり、ＣＬを肌に適用することにより皮膚細胞の代謝、再生能力が改善され、それに伴い加齢や紫外線暴露などにより生じる皮膚のしわ、たるみなどを効果的に改善できることが示唆された。
【００５３】
［実施例６：美容液の製造例］
以下に示す組成の美容液を常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
クエン酸                                  ０．０１
クエン酸Ｎａ                              ０．０４
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．５
１．３．ブチレングリコール                ５．０
濃グリセリン                              ２．５
１．２．ペンタンジオール                  ２．０
フェノキシエタノール                      ０．２５
精製水                                    全体で１００となる量
【００５４】
［実施例７：乳液の製造例］
以下に示す組成の乳液を常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
グリセルエーテル                          １．５
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．０１
ショ糖脂肪酸エステル                      １．５
モノステアリン酸ソルビタン                １．０
スクワラン                               ７．５
ジプロピレングリコール                    ５．０
精製水                                    全体で１００となる量
【００５５】
［実施例８：クリームの製造例］
以下に示す組成のクリームを常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
ε−アミノカプロン酸                      ０．２
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                  ０．５
フェノキシエタノール                      ０．２
1，３−ブチレングリコール                ７．５
ＭＥＬ                                    ０．１
セタノール                                ２．５
ベヘニルアルコール                        ３．０
スクワラン                                ５．０
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル  １５．０
ペンタステアリン酸ポリグリセリル−10      ０．９５
ステアロイル乳酸Na                       ０．３
精製水                                    全体で１００となる量
【００５６】
［実施例９：洗顔料の製造例］
以下に示す組成の洗顔料を常法により製造した。
(組成)                                    (重量％)
エデト酸ニナトリウム                      ０．０５
ε−アミノカプロン酸                      ０．２
濃グリセリン                              １．５
ＣＬ−Ｎａ塩                              ０．１
パラオキシ安息香酸メチル                  ０．１５
1，３−ブチレングリコール                ４．５
２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン（30%水溶液）
３．０
N-ヤシ油脂肪酸アシル-DL-アラニントリエタノールアミン液（30％水溶液）                            
３０．０
フェノキシエタノール                      ０．５
精製水                                    全体で１００となる量  
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、バイオサーファクタント由来の安全性に優れた細胞賦活作用、抗老化作用が期待でき、細胞賦活および抗老化成分を有効成分とした化粧品・医薬部外品（皮膚外用剤、浴用剤、育毛剤等）、飲食品、医薬品を提供することできることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
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