(57)【要約】【課題】セルラーゼが酵素糖化反応容器に添加した直後にリグノセルロース系バイオマスと活性部位以外の部分で非特異的に吸着することに加え、リグノセルロース系バイオマスの糖化は加水分解反応時に溶出されるバイオマス由来セルラーゼ活性阻害物質の影響によりセルラーゼを必要以上に使用するので、セルラーゼが糖化反応における最大のコストとなっているのが現状である。そこで、本発明は、より少ないセルラーゼ添加量で糖化反応を行い、より多くの糖を得ることで糖化コストを低下させるための技術を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、前記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、リグノセルロース系バイオマス酵素糖化時に、脂質分解酵素もしくは脂質分解酵素と非イオン性界面活性剤を添加することにより、リグノセルロース系バイオマスの糖化効率を向上させることに加え、脂質分解酵素と非イオン性界面活性剤存在下で同時糖化発酵を行うことにより発酵阻害も回避できることを見出し、本発明に至った。【選択図】図2
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスから酵素を用いて糖を製造する方法において、酵素糖化工程に脂質分解酵素を添加することにより糖収量を改善する前記方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、脂質分解酵素に加えて非イオン性界面活性剤も添加する方法。
【請求項３】
リグノセルロース系バイオマスから同時糖化発酵によりエタノールを製造する方法において、脂質分解酵素又は脂質分解酵素及び非イオン性界面活性剤を同時糖化発酵工程に添加することにより、エタノール収量を改善する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、リグノセルロース系バイオマスから酵素糖化による糖の製法並びにリグノセルロース系バイオマスからの同時糖化発酵によるエタノール製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本は国土のおよそ7割を森林が占めている緑豊かな国で、スギやヒノキ、松に加え稲わらや麦わらなど未利用のリグノセルロース系バイオマスが豊富に存在している。このような未利用のリグノセルロース系バイオマスは非食量資源からのバイオマスエタノールの生産のみならず、石油資源枯渇後の食料原料や化学工業、発酵原料としての糖を生産するための地球上でもっとも重要な炭素源である（非特許文献1）。
【０００３】
しかし自然界に存在しているリグノセルロース系バイオマスはセルロース、ヘミセルロース、リグニンが複雑に構成されたものであるため、バイオマスとセルラーゼを混合するだけでは糖化反応が乏しくカッターミルなどによる物理的な粉砕やアルカリ処理によるリグニンとセルロース、ヘミセルロースの構造を破壊する前処理が行われている（非特許文献2）、もしくは前述の前処理を複数組み合わせて行われている。これらの前処理が行われているにも関わらずリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化液はその後のエタノール発酵などと併せて価格面並びに発酵効率の面で実際に利用できるレベルには至っていない（非特許文献3,4）。
【０００４】
これはセルラーゼによる糖化反応が生産物であるセルロース由来のグルコース、セロビオースやヘミセルロース由来のマンノース、ガラクトース、キシロースによりβ−グルコシターゼの活性が阻害される（非特許文献5）だけでなく、キシラン、可溶性でんぷん、ペクチンなどの多糖類、キシロースやアラビノース、グルクロン酸のような炭水化物の他にフルフラールやバニリン、シリンガアルデヒド、Trans-ケイ皮酸、4-ヒドロキシ安息香酸がセルラーゼおよびβ−グルコシターゼの活性を阻害すること（非特許文献6）が判明している。上述のような物質が加水分解反応中にリグノセルロース系バイオマスから徐々に溶出し、セルラーゼの活性を阻害する他に、酵素糖化容器にセルラーゼを添加した直後にセルラーゼがバイオマスと活性部位以外の部分で非特異的に結合する（非特許文献7）ことにより高価なセルラーゼを必要以上に使用するためである。また、リグノセルロース系バイオマスには最大で約４％の油分が含まれており（非特許文献8）、この油分が前処理を行うことによりバイオマスの表面を覆うことから、セルラーゼと基質となるバイオマスが接するのを妨げるため、酵素糖化反応が十分に行われていないと予想されている。
さらに、得られた糖化液は多量の発酵阻害物質を含んでおり、このままでは実用に耐えることができず、糖化反応後に糖化液に含まれている発酵阻害物質を除去する必要があるなど問題を抱えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２４６４２２世良豊ら : セルロース系原料の同時糖化発酵法
【特許文献２】特開２０１２−２５４０７２趙雅蘋ら : リグノセルロース含有バイオマスからのエタノール製造方法
【特許文献３】特開２００４−３３７０９９奥田直之ら : エタノールの製造方法
【特許文献４】特願２０１２−２３５１０３星野保ら : 酵素阻害物質を除去する工程を経由する糖の製造方法
【特許文献５】特願２０１３−０６４７５０星野保ら : 南極産酵母による低温下でのエタノール製造方法
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Nowakら：Composite structure of wood cells in petrified wood. Materials Science and Engineering: C, 25, 119-130, 2005
【非特許文献２】Y. Yamashitaら: Effective enzyme saccharification and ethanol production from Japanese cedar using various pretreatment methods. Journal of Bioscience and Bioengineering, 110, 79-86, 2010
【非特許文献３】木本浩介 : 木質系原料からのバイオエタノール製造プロセス. 三井造船技報, 201, 24-29, 2010
【非特許文献４】朝野賢司ら : 日本におけるバイオエタノールの生産コストとCO2削減コスト分析. [online] AIST/BTRC DISCUSSION PAPER, July, 2007, インターネット<https://unit.aist.go.jp/btrc/research_result/documents/DISCUSSIONPAPER.pdf>
【非特許文献５】Z. Xiaoら: Effect of Sugar Inhibition on Cellulases and β- Glucosidase During Enzymatic Hydrolysis of Softwood Substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 113-116, 1115-1126, 2004
【非特許文献６】E. Ximenesら: Inhibitor of cellulases by phenols. Enzyme and Microbial Technology, 46, 170-176, 2010
【非特許文献７】T. Eriksson ら: Mechanism of surfactant effect in enzymatic hydrolysis of lignocellulose, Enzyme and Microbial Technology, 31, 353-364, 2002
【非特許文献８】P Gupta ら : Tissue culture of forest trees* - - Clonal propagation of mature trees of Eucalyptus citriodora Hook, by tissue culture  Plant Science Letters 20, 195-201, 1981
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の状況のもと、本発明は、（１）煩雑な工程を経ることなくリグノセルロース系バイオマスを加水分解する際のセルラーゼ使用量を削減しより多くの糖を得る、又は、（２）前記加水分解する際に発酵性微生物を加え同時糖化発酵を行うことにより多くのエタノールを得るためのリグノセルロース系バイオマスの変換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため、リグノセルロース系バイオマスの糖化反応開始時に、脂質分解酵素又は脂質分解酵素及び非イオン性界面活性剤を加え加水分解反応を行うことで糖化液を効率よく得ることができることを見出した。さらに本発明者らは、リグノセルロース系バイオマスにセルラーゼ、脂質分解酵素及び非イオン性界面活性剤を添加する際、同時に発酵性微生物を加える同時糖化発酵を行い、エタノールを効率よく生産することができること見出した。このようにして、本願発明者らは、脂質分解酵素又は脂質分解酵素及び非イオン性界面活性剤を糖化反応系又は同時糖化発酵系に添加する特徴とするバイオマスの変換方法である本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の脂質分解酵素と非イオン性界面活性剤を添加することにより得られた糖化液は従来の糖化液と比べ約2倍のグルコース濃度となった。
【００１０】
本発明によるとリグノセルロース系バイオマス加水分解反応時に脂質分解酵素もしくは脂質分解酵素と非イオン性界面活性剤を添加することにより、通常の酵素糖化反応を行うよりもセルラーゼの添加量を1/5以下にすることができる。また、同時糖化発酵時に脂質分解酵素と非イオン性界面活性剤を添加することにより、通常の同時糖化発酵と比較して約2.5倍のエタノールを生産することができる等、従来法からは予想できない、極めて優れた、効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例1の条件にて実施した酵素糖化反応を行った際のグルコース濃度(●)。
【図２】実施例2の条件にて実施した酵素糖化反応を行った際のグルコース濃度(●)。
【図３】比較例1の条件にて実施した酵素糖化反応を行った際のグルコース濃度(●)。
【図４】比較例2の条件にて実施した酵素糖化反応を行った際のグルコース濃度(●)。
【図５】実施例3の条件にて実施したMrakia blollopisによる同時糖化発酵を行った際のグルコース濃度(▲)とエタノール濃度(●)。
【図６】比較例3の条件にて実施したMrakia blollopisによる同時糖化発酵を行った際のグルコース濃度(▲)とエタノール濃度(●)。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．はじめに
本願発明者らは、上述したように、リグノセルロース系バイオマスからのセルラーゼによる酵素糖化反応に脂質分解酵素又は脂質分解酵素及び非イオン性界面活性剤を添加することで、セルラーゼの活性低下を防げることを見出した。
【００１３】
本願発明には、以下の方法が包含される。
（１）リグノセルロース系バイオマスから酵素を用いて糖を製造する方法において、酵素糖化工程に脂質分解酵素を添加することにより糖収量を改善する前記方法。
（２）（１）記載の方法において、脂質分解酵素に加えて非イオン性界面活性剤も添加する方法。
（３）リグノセルロース系バイオマスから同時糖化発酵によりエタノールを製造する方法において、脂質分解酵素又は脂質分解酵素及び非イオン性界面活性剤を同時糖化発酵工程に添加することにより、エタノール収量を改善する前記方法。
以下にその原料及び反応を説明する。
【００１４】
２．リグノセルロース系バイオマス
本発明方法の対象となるリグノセルロース系バイオマスとはセルロース、ヘミセルロースからなる多糖類がリグニンにより木化したものであり、広葉樹、針葉樹、ササ、タケ、稲ワラ、もみ殻、麦ワラ、コーンストーバー、その他農林水産物資源およびそれらの廃棄物、これらに由来する木材繊維、木材チップ、木くず、パルプ類、古紙類などリグニン含量が少ないもしくは含まれないリグノセルロース系バイオマスであってもよく、リグノセルロース系バイオマスおよびそれらの廃棄物をも含む。これらのバイオマス資源は2以上の組み合わせであってもよい。
【００１５】
好ましいリグノセルロース系バイオマスは例えば稲ワラや麦ワラ、ユーカリ木粉、スギ木粉である。
ユーカリ木粉はリグノセルロースを含む代表的な材料である。本発明はユーカリ木粉に限定されるものではなくリグノセルロース系バイオマスに代表されるバイオマス資源全般に応用できる。すなわち、本発明で対象となるリグノセルロース系バイオマス資源とはセルロースおよびヘミセルロースの構造物をリグニンにより木化した資源である。針葉樹、広葉樹、ササ、タケ、稲ワラ、もみ殻、麦ワラ、その他農林産物質資源およびそれらの廃棄物、さらにはこれらに由来する木材繊維、木材チップや単板くず、パルプ類、古紙類などである。さとうきびやテンサイなどの糖質資源、ばれいしょ、かんしょ、さといもなどのでんぷん資源などタンニン・リグニン含量が少ないバイオマス資源も含まれる。これらのバイオマス資源は2以上の組み合わせであってもよい。
【００１６】
２−１．リグノセルロース系バイオマスの前処理
リグノセルロース系バイオマスであれば、廃材等の形体で入手されるが、これを効率よく糖化するために、通常粉砕し、更に酵素法により投下する場合はリグノセルロースが酵素により分解される前処理がなされる。
【００１７】
本発明における前処理としては、バイオマスの糖化で通常なされているいずれの前処理方法を採用しても良い。前処理としては、例えば、（１）微粉砕処理、（２）蒸煮／爆砕処理または水熱処理、（３）希硫酸処理、（４）アルカリ処理、（５）オルガノソルブ処理、（６）生物学的前処理法などが知られており、これらを組み合わせることもできる。好適には、前処理として、メカノケミカル処理をすることができる。
【００１８】
３．酵素糖化
本発明は、リグノセルロース系バイオマスから酵素を用いて、酵素糖化反応により、糖を製造する方法に関する。本発明において、リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化反応には、リグノセルロース系バイオマスをセルラーゼによる糖化工程、又はセルラーゼを用いる同時糖化発酵工程を含む。
【００１９】
通常、酵素処理に用いる酵素としては、セルラーゼに加えて、必要により、へミセルラーゼを含めることができる。バイオマスのセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼによる糖化条件は、従来のバイオマスの糖化における一般的条件によることができる。
【００２０】
酵素糖化工程または同時糖化発酵工程（併行糖化発酵工程とも呼ぶ）でのセルラーゼ添加量は乾燥基質1g当たり0.1 FPU〜200FPUの範囲が好ましく、0.1〜50 FPUの範囲のセルラーゼ添加量がより好ましく、0.1〜20 FPUの範囲のセルラーゼ添加量がさらに好ましい。またヘミセルラーゼも合わせて使用する場合は、酵素糖化工程または同時糖化発酵工程（併行糖化発酵工程とも呼ぶ）へのヘミセルラーゼ添加量は乾燥基質1g当たり0.1 U〜200Uの範囲が好ましく、10〜150 Uの範囲のヘミセルラーゼ添加量がより好ましく、20〜100Uの範囲のヘミセルラーゼ添加量がさらに好ましい。
【００２１】
酵素糖化工程または同時糖化発酵工程でのｐＨは2.0〜10.0の範囲に維持することが好ましく、4.0〜7.5の範囲に維持することがより好ましい。
【００２２】
酵素糖化工程または同時糖化発酵工程の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、0〜50℃が好ましく、10〜40℃がさらに好ましい。
【００２３】
反応は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は10〜240時間、さらに好ましくは15〜168時間である。連続式の場合も、平均滞留時間が、10〜148時間、さらに好ましくは15〜120時間である。
【００２４】
本発明においてセルロース系バイオマスを加水分解するにあたり、その方法および装置に特に制限は無く、公知の方法や装置が適応できる。セルロース系バイオマスの加水分解法にはセルラーゼ及びヘミセルラーゼを用いる酵素糖化法が適用でき、酵素糖化法と酸糖化法などの組み合わせであってもよい。加水分解装置はバッチ式、固定床反応式、連続式などであってもよい。
【００２５】
また、同時糖化発酵における、アルコール発酵には、例えばSaccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicas, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Scheffersomyces stipites, Candida shehatae, Issatchenkia orientalisなど、Saccharomyces属, Schizosaccharomyces属 Kluyveromyces属、Scheffersomyces属、 Candida属, Issatchenkia属、Pichia属等の酵母、Zymomonas mobilis等 Zymomonas属、 Zymobacter palmae等Zymobacter属、Clostrium属などのアルコール発酵細菌、を用いることができる。
【００２６】
また、本件同時糖化発酵は、低温で作用する酵母を用いることもでき、具体的には担子菌門ハラタケ亜門シロキクラゲ菌網シストフィロバシディウム目シストフィロバシディウム科ムラキア属の菌類、例えばムラキア・ブロロピス  SK-4株 (Mrakia blollopis)（ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２６株）を最も好ましい菌株として挙げることができる。
【００２７】
４．セルラーゼ及びヘミセルラーゼによる糖化
４−１．セルロース
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ-1,4グルコシド結合により重合した重合体およびその誘導体をいう。セルロースにおけるグルコースの重合度は特に限定しないが好ましくは200 以上である。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体が挙げられる。また、セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでもよい。さらに、セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。さらに、セルロースはバイオマス由来のものであれば特に限定しない。植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００２８】
４−２．セルラーゼ及びヘミセルラーゼ
セルラーゼはセルロースをグルコースにまで分解する一連の酵素群を意味している。セルラーゼとしては、こうした酵素群から選択されるが、好ましくは、エンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.74)、セロビオヒドロラーゼ(EC 3.2.1.91)、及びβ−グルコシナーゼ(EC 23.2.4.1、EC 3.2.1.21) が挙げられる。
【００２９】
セルラーゼとしては、特に限定しないが、それ自体の活性が高いセルラーゼであることが好ましい。このようなセルラーゼとしては、例えばアクレモニウム属(Acremonium)菌、タラロマイセス属(Talaromyces)菌、Trichoderuma reesei, Trichoderuma virideなどのトリコデルマ属(Trichoderma)菌、フザリウム属(Fusarium)菌、ファネロケーテ属(Phanerochaete)菌、トレメテス属(Tremetes)菌、ペニシリウム属(Penicillium)菌、フミコーラ属(Humicola)菌、アスペルギルス属(Aspergillus)菌、ムラキア属(Mrakia)菌、ムラキエラ属(Mrakiella)菌等の他に、クロストリジウム属(Clostridium)菌、シュードモナス属(Pseudomonas)菌、セルロモナス属(Cellulomonas)菌、ルミノコッカス属(Ruminococcus)菌、バチルス属(Bacillus)菌等の細菌、スルフォロバス属(Sulfolobus)菌、ストレプトマイセス属(Streptomyces)菌、サーモアクチノマイセス属(Thermoactinomyces)菌等の放線菌由来のセルラーゼが挙げられる。こうした各種セルラーゼから1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。なお、こうしたセルラーゼは人工的に改変されていてもよい。改変方法としてはポイントミューテーション法や微生物に紫外線照射などをすることによる突然変異などが挙げられる。
【００３０】
ヘミセルラーゼも、従来からバイオマスの糖化に利用されているヘミセルラーゼであれば、いずれを利用しても良い。ヘミセルラーゼは、ヘミセルロースをキシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース等に加水分解する酵素反応系を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式により、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼなど種々の名称で呼ばれる酵素が存在する。ヘミセルラーゼとしては、特に限定されないが、それ自体の活性が高いヘミセルラーゼであることが好ましい。こうした各種ヘミセルラーゼから1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
なお、こうしたヘミセルラーゼも人工的に改変されていてもよい。改変方法としてはポイントミューテーション法や微生物に紫外線照射などをすることによる突然変異などが挙げられる。
【００３２】
また、当該酵素の作用温度範囲内であればよく、例えば酵素の作用温度範囲内の低温で糖化反応を行うこともできる。例えば、40℃以下の範囲を採用することができる。
【００３３】
４−３．セルラーゼ活性阻害物質
バイオマス由来セルラーゼ活性阻害物質とは、セルロース系バイオマスをセルラーゼにより酵素糖化した際に溶出されるセルラーゼの活性を阻害する物質を意味する。具体的にはタンニン酸や酢酸、没食子酸などが挙げられる。
【００３４】
５．バイオマスの同時糖化発酵法
前述のように、セルラーゼによる糖化反応が生産物であるセルロース由来のグルコース及びセロビオースが反応液中に蓄積することによりセルラーゼの活性が阻害されることが知られている。この阻害を防ぐために、糖化すると同時にエタノール発酵する、つまり、セルラーゼによる生産物を直ちにエタノール発酵することで、反応液中のセルラーゼによる生産物の濃度を低下して、生産物によりセルラーゼの活性阻害を防ぐことができる。このように酵素糖化処理とエタノール発酵を同時に行う方法は、同時糖化発酵法と呼ばれている。
【００３５】
本件発明においても、バイオマスからの糖化とエタノール発酵は同時に行うこともできる。本発明においてリグノセルロース系バイオマス等バイオマスを同時糖化発酵するにあたり、その方法および装置に特に制限は無く、公知の方法や装置が適応できる。同時糖化反応装置はバッチ式・固定床反応式・連続式などであってもよい。
【００３６】
６．脂質分解酵素
ここで脂質分解酵素とは脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素群のことを言う。特にトリグリセリドを分解し脂肪酸を遊離するトリアシルグリセリドリパーゼ(EC 3.1.1.3)のことを指す。脂質分解酵素としては特に限定しないが、それ自体の活性が高い脂質分解酵素であることが好ましい。このような脂質分解酵素としては例えばムラキア属(Mrakia)菌、カンジダ属(Candida)菌、アスペルギルス属(Aspergillus)菌、クリプトコッカス属(Cryptococcus)菌、フザリウム属(Fusarium)菌、ヤロウイア属(Yarrowia)菌、ゲオトリクム属(Geotrichum)菌、チフラ属(Typhula)菌、ムラキエラ属(Mrakiella)菌、クロストリジウム属(Clostridium)菌、シュードモナス属(Pseudomonas)菌などの菌類・細菌類由来の脂質分解酵素も挙げられる。こうした各種脂質分解酵素から1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。なお、こうした脂質分解酵素は人工的に改変されていてもよい。
改変方法としては、セルラーゼと同様に、ポイントミューテーション法や微生物に紫外線照射することによる突然変異などが挙げられる。
【００３７】
７．非イオン性界面活性剤
本願発明で使用できる非イオン性界面活性剤としてはTween 20, Tween 80, Triton X-100, Triton X-114, Brij35, Brij 58, Digitoninなどが挙げられる。
【００３８】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
【００３９】
［実施例1］
メカノミケミカル処理されたユーカリ木粉が20% (w/v)になるように20mM クエン酸緩衝液pH5.0が入っている加水分解反応容器に懸濁し、121℃で30分間加熱処理した。室温まで冷やしたあとセルラーゼT「アマノ」4 (天野エンザイム（株）社)を1.8 FPU/(g-基質)、Optimash BG (Genencor社)を20μl/ (g-基質) 添加し、さらに加水分解反応液に5 U/(g-基質)となるように脂質分解酵素リパーゼAS「アマノ」を添加し、37℃、120rpmで120時間撹拌を行った。加水分解反応開始直後から24時間ごとに回収した加水分解物を3分間煮沸処理し完全に酵素を失活させ15000rpm 10分間遠心分離させることにより水可溶部を回収した。回収した水可溶部はその後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、グルコース濃度の定量を行った。図1に本実施例１の加水分解試験のグルコース濃度を示した。同図からグルコース濃度が約42.8 g/lの糖化液を得ることができた。
【００４０】
［実施例2］
メカノミケミカル処理されたユーカリ木粉が20% (w/v)になるように20mM クエン酸緩衝液pH5.0が入っている加水分解反応容器に懸濁し、121℃で30分間加熱処理した。室温まで冷やしたあとセルラーゼT「アマノ」4 (天野エンザイム（株）社)を1.8 FPU/(g-基質)、Optimash BG(Genencor社)を20μl/ (g-基質)添加し、さらに加水分解反応液の1% (v/v)となるように非イオン性界面活性剤Tween 80と5 U/(g-基質)の脂質分解酵素リパーゼAS「アマノ」を添加し、37℃、120rpmで120時間撹拌を行った。加水分解反応開始直後から24時間ごとに回収した加水分解物を3分間煮沸処理し完全に酵素を失活させ15000rpm 10分間遠心分離させることにより水可溶部を回収した。回収した水可溶部はその後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、グルコース濃度の定量を行った。図2に本実施例２の加水分解試験のグルコース濃度を示した。同図からグルコース濃度が約47.5g/lの糖化液を得ることができた。
【００４１】
［比較例1］
メカノミケミカル処理されたユーカリ木粉に20mM クエン酸緩衝液pH5.0を加水分解反応容器に加え121℃で30分間加熱処理した。室温まで冷やしたあとセルラーゼT「アマノ」4 (天野エンザイム（株）社)を9 FPU/(g-基質)、Optimash BG (Genencor社)を20μl/ (g-基質) 添加し、37℃、120rpmで120時間撹拌を行った。加水分解反応開始直後から24時間ごとに回収した加水分解物を3分間煮沸処理し完全に酵素を失活させ15000rpm 10分間遠心分離させることにより水可溶部を回収した。回収した水可溶部はその後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、グルコース濃度の定量を行った。図3に本比較例１の加水分解試験のグルコース濃度を示した。同図からグルコース濃度が約33.6 g/lの糖化液を得ることができた。
【００４２】
［比較例2］
メカノミケミカル処理されたユーカリ木粉が20% (w/v)になるように20mM クエン酸緩衝液pH5.0が入っている加水分解反応容器に懸濁し、121℃で30分間加熱処理した。室温まで冷やしたあとセルラーゼT「アマノ」4 (天野エンザイム（株）社)を1.8FPU/(g-基質)、Optimash BG (Genencor社)を20μl/ (g-基質) 添加し、37℃、120rpmで120時間撹拌を行った。加水分解反応開始直後から24時間ごとに回収した加水分解物を3分間煮沸処理し完全に酵素を失活させ15000rpm 10分間遠心分離させることにより水可溶部を回収した。回収した水可溶部はその後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、グルコース濃度の定量を行った。図4に本比較例２の加水分解試験のグルコース濃度を示した。同図からグルコース濃度が約23.3 g/lの糖化液を得ることができた。
【００４３】
［実施例3］
YPD 液体培地(10 g/l yeast extract, 20 g/l peptone, 20 g/l glucose)で96時間10℃、 120 rpmの条件で前培養していたムラキア・ブロロピス(ＦＥＲＭ Ｐ−２２１２６株)8 mlを3000 × g 4℃ 10分間遠心分離し、菌体を回収した。滅菌蒸留水で2回洗浄し再び遠心分離して回収した菌体を滅菌蒸留水1 mlに懸濁したものをムラキア・ブロロピスの接種源として調整した。
【００４４】
20 mM クエン酸緩衝液(pH 5.0)にメカノケミカル処理したユーカリ木粉を100 g/l, 5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2O, 同時糖化発酵反応溶液の1% (v/v)となるように非イオン性界面活性剤Tween80を、基質1g当たり5Uとなるように脂質分解酵素リパーゼAS「アマノ」加え、上記したムラキア・ブロロピスの接種源を植菌し、セルラーゼT「アマノ」4 (天野エンザイム（株）社) を9 FPU/g, Genencor社製 Optimash BGを20μl/ g添加し、10℃，180rpmで120時間撹拌しながら同時糖化反応をおこなった。同時糖化発酵試験開始直後から同時糖化発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、5分間遠心分離し、上清を回収した。
【００４５】
回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにてグルコース濃度とエタノール濃度を測定した。グルコースの定量条件は検出器：日本分光RI-2031、カラム：Aminex HPX87P、移動相：イオン交換水、流速: 0.6 mL / min、カラム温度：80℃で行った。エタノールの定量条件は検出器：日本分光RI-2031、カラム：Aminex HPX87H、移動相：5mM H2SO4、流速: 0.6 mL / min、カラム温度：65℃で行った。結果を図5に示す。同時糖化発酵試験開始24時間後に約10.3 g/lのグルコースが生産されその後、グルコース濃度はほぼ一定に推移した。最終的に2.8 g/lのグルコースが残存し、最大で17.3 g/lのエタノールを得ることができた。
【００４６】
［比較例3］
20 mM クエン酸緩衝液(pH 5.0)にメカノケミカル処理したユーカリ木粉を200 g/l, 5 g/l yeast extract, 5 g/l Bacto peptone, 2 g/l NH4Cl, 1 g/l KH2PO4, 0.3 g/l MgSO4・7H2Oを加え、実施例3の条件で培養を行った接種源を植菌した後、セルラーゼT「アマノ」4 (天野エンザイム（株）社) 9 FPU/(g-基質), Genencor社製 Optimash BGを20μl/(g-基質)添加し、10℃，180rpmで120時間撹拌しながら同時糖化反応をおこなった。同時糖化発酵試験開始直後から同時糖化発酵試験溶液の一部を採取し、12100 × g 4℃、5分間遠心分離し、上清を回収した。
【００４７】
回収した上清はその後、高速クロマトグラフィーにて実施例1の条件でグルコース濃度とエタノール濃度の測定を行った。結果を図6に示す。同時糖化発酵試験開始24時間後に約11.9 g/lのグルコースが生産されその後、グルコース濃度はほぼ一定に推移した。最終的に14.2 g/lのグルコースが残存し、最大で7.1 g/lのエタノールを得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、例えば、メカノケミカル処理されたリグノセルロース系バイオマスを含む加水分解容器に脂質分解酵素又は非イオン性界面活性剤及び脂質分解酵素を添加することで、酵素糖化反応に使用する脂質分解酵素の添加量を1/5以下にすることが可能になり、最終的に非イオン性界面活性剤や脂質分解酵素を添加していない従来の酵素糖化反応と比べて約2倍のグルコースを得ることができる。また、同時糖化発酵の反応容器に非イオン性界面活性剤及び脂質分解酵素を加えることにより、エタノール生産量を従来の同時糖化発酵と比較して約2.5倍にすることができる。リグノセルロース系バイオマスの糖化反応コスト及び糖化同時発酵コストを低下することが期待できるだけでなく、得られた糖は乳酸やバイオエタノール、バイオディーゼル製造などに使用される発酵原料として利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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