(57)【要約】【課題】現在までに、プライマーダイマーを含む非特異増幅を低減する方法が開発されているが、試薬調製が容易であり、かつ非特異増幅を防ぐ効率的な方法は未だ見出されていない。そこで、本発明が解決しようとする課題は、ＰＣＲのための試薬調製が容易であり、かつ非特異増幅を防ぐ効率的な方法を提供することである。【解決手段】ＰＣＲ反応液に界面活性剤を全く含まない、あるいは界面活性剤濃度を０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満の低濃度にすることで、非特異増幅を低減することができる。そのため、試薬調製が容易であり、界面活性剤を含有しないポリメラーゼと界面活性剤を含まないＰＣＲバッファーを使用するだけで、特異性が高いＰＣＲ反応液を調製することが可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）における非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を０％（ｖ／ｖ）以上０．００００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度で含むＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を０％（ｖ／ｖ）以上０．０００００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度で含むＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を含まないＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法。
【請求項４】
非特異増幅がプライマーのミスマッチアニーリング、プライマーダイマー、もしくはプライマー自身の二次構造に由来するものである、請求項１−３のいずれかに記載の非特異増幅を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、核酸増幅における非特異増幅を低減させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００３】
核酸増幅法は現在までに様々な方法が開発されており、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭ Ｐ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。
【０００４】
中でも、ＤＮＡの特異的配列の増幅に用いられるＰＣＲ法は、研究分野から応用分野に至るまで極めて幅広く普及している技術である。現在、ＰＣＲ法は更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ法や、蛍光色素を用いて、ＰＣＲの増幅産物をリアルタイムで検出するリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。これらの技術も、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【０００５】
ＰＣＲ法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、少なくとも一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを２０〜５０サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である（特許文献１）。
【０００６】
ＰＣＲ法には、一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を増幅することで、目的とする遺伝子配列を増幅できる特徴がある反面、プライマーが目的としない誤った配列にハイブリダイズしてしまった場合（プライマーのミスマッチアニーリング）においても、目的としない配列の増幅が起こり、非特異増幅が生じるという欠点がある。また、ＰＣＲ中にプライマー同士が会合することで、プライマーダイマーが生じ、これが鋳型ＤＮＡとして働いて、非特異増幅産物が作られてしまうという欠点がある。そのため、ＰＣＲにおける課題は、非特異増幅がなく目的産物のみを増幅させることにある。
【０００７】
非特異増幅を低減させる方法は、数多く報告されている。例えば、増幅条件（アニール温度を高める、サイクル数の減少、酵素量の減量、酵素の種類変更、ｄＮＴＰ濃度の減少、Ｍｇ濃度の減少、鋳型ＤＮＡ濃度の減少など）の至適化、プライマーのデザイン変更、抗体やアプタマーを利用したホット・スタート法の利用、特異性が高まるとされる修飾オリゴヌクレオチド（ＰＮＡやＬＮＡなど）の利用などが知られている。
【０００８】
しかしながら、かかる方法は、非特異増幅の抑制に有効な場合があるものの、効果が十分でなかったり、特異的な増幅までも抑制してしまったりすることが多い。さらに、増幅条件の検討や、プライマー設計の検討などが必要なため、手間がかかる場合や、試薬調製が煩雑な場合も多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−３２８７０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在までに、プライマーダイマーを含む非特異増幅を低減する方法が開発されているが、試薬調製が容易であり、かつ非特異増幅を防ぐ効率的な方法は未だ見出されていない。そこで、本発明が解決しようとする課題は、ＰＣＲのための試薬調製が容易であり、かつ非特異増幅を防ぐ効率的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、ＰＣＲ反応液に界面活性剤を全く含まない、あるいは界面活性剤濃度を０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満の低濃度にすることで、非特異増幅を低減することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を０％（ｖ／ｖ）以上０．００００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度で含むＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法。
［２］［１］に記載の非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を０％（ｖ／ｖ）以上０．０００００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度で含むＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法。
［３］［２］に記載の非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を含まないＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法。
［４］非特異増幅がプライマーのミスマッチアニーリング、プライマーダイマー、もしくはプライマー自身の二次構造に由来するものである、［１］−［３］のいずれかに記載の非特異増幅を低減する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＰＣＲ反応液に界面活性剤を全く含まない、あるいは界面活性剤濃度を０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満の低濃度にすることで、非特異増幅を低減することができる。そのため、試薬調製が容易であり、界面活性剤を含有しないポリメラーゼと界面活性剤を含まないＰＣＲバッファーを使用するだけで、特異性が高いＰＣＲ反応液を調製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】界面活性剤を全く含まない組成における特異性と、界面活性剤を含む組成における特異性を比較した図である。
【図２】界面活性剤を全く含まない組成における特異性と、界面活性剤を含む組成におけるプライマーダイマーを比較した図である
【図３】図３は、界面活性剤添加量と特異性との関係を調べた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一態様は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における非特異増幅を低減する方法であって、界面活性剤を０％（ｖ／ｖ）以上０．００００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度で含むＰＣＲ反応液を用いることを特徴とする、非特異増幅を低減する方法である。
【００１６】
本発明において、「非特異増幅」とは特に限定されず、増幅すべき対象を正常に増幅する形態以外の増幅形態を指す。例えば、プライマーのミスマッチアニーリングによるもの、プライマーダイマーの形成によるもの、または、プライマー自身の二次構造に由来するものが挙げられる。
【００１７】
本明細書においては、非特異増幅が低減されているかどうかの判断は、ＰＣＲ反応後反応液の融解曲線解析を行い、目的の増幅産物以外の増幅産物に由来するピークが存在する場合、その増減により定性的または定量的に行うことができる。なお、前記融解曲線解析において、非特異反応の原因は問わない。
【００１８】
本発明の非特異増幅を低減させる方法は、ＰＣＲ反応液中に界面活性剤を全く含まない、あるいは界面活性剤濃度を０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満の低濃度にすることを特徴とする。
【００１９】
本発明の方法に使用する界面活性剤は、特に限定されない。カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれでもよく、従来公知の界面活性剤が使用できる。
非イオン系界面活性剤は、エーテル型、エーテルエステル型、エステル型、および含窒素型に分類される。これらの非イオン型界面活性剤の中では、エーテルエステル型の非イオン系界面活性剤が好ましい。より具体的には、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンエステルのポリオキシエチレンエーテル、およびソルビトールエステルのポリオキシエチレンエーテルをエーテルエステル型の非イオン系界面活性剤として示すことができる。エーテルエステル型の非イオン系界面活性剤には、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ヒマシ油、ポリキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド硫酸塩などが含まれる。本発明において、特に好ましいエーテルエステル型の非イオン系界面活性剤は、ポリキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。
本発明の方法に利用することができる市販の非イオン系界面活性剤としては、たとえばＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート）Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｔｗｅｅｎ８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ポリ（オキシエチレン）＝オクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（ポリオキシエチレン(１０)オクチルフェニルエーテル）、Ｂｒｉｇ３５（ポリオキシエチレン(２３)ラウリルエーテル）、ＢＬ−９ＥＸ（ポリオキシエチレン(９)ラウリルエーテル）などが挙げられる。
【００２０】
本発明の方法に使用する界面活性剤の濃度は、ＰＣＲ反応液中において０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満であれば特に限定されない。好ましくは０．０００００１％（ｖ／ｖ）未満である。
【００２１】
さらには、本発明の方法には、界面活性剤を含まないＰＣＲ反応液を用いることが好ましい。
【００２２】
本発明の方法におけるＰＣＲ反応液のその他の構成は特に限定されないが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型となる核酸、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
【００２３】
本発明の方法に使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体的には、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。その中でも、入手可能な界面活性剤を全く含まないＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ｅｘｏ  （−）<Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｆｒｅｅ>（ＴＯＹＯＢＯ）が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２４】
本発明の方法において、鋳型となる核酸は特に限定されない。合成ＤＮＡ、生体試料等から精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写反応により得たｃＤＮＡなどが挙げられる。また、精製されている必要性はなく、鋳型となる核酸を含む生体試料の粗精製サンプルや、生体試料そのものを使用することもできる。
【００２５】
本発明において使用する１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーとは、増幅されるべき核酸の各核酸鎖に相補的なオリゴヌクレオチドであり、２種またはそれ以上のプライマーを使用することが好ましい。該プライマーは、２本鎖核酸の配列の異なる各鎖と実質的に相補的であって、一方のプライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、その伸長生成物が他方のプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型として機能することができるように選択される。
【００２６】
１種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体は、ＰＣＲ反応において基質として使用される。この基質として、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの混合物）溶液などを含んでいてもよい。
【００２７】
ＰＣＲ反応液にはさらに緩衝剤を含むことが好ましい。前記緩衝剤として、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。濃度としては、１０〜２００ｍＭ程度が好ましく、２０〜１００ｍＭ程度がより好ましい。ｐＨとしては、７．０〜９．５程度の範囲が好ましく、７．５〜９．０程度の範囲がより好ましい。
また、前記緩衝液中には、１〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
【００２８】
さらに、ＰＣＲ反応液中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
【００２９】
本発明の方法におけるＰＣＲ反応液には、増幅産物の検出、モニタリングのためにＰＣＲ反応液中にＤＮＡ検出剤を含んでいてもよい。ＤＮＡ検出剤は、特に限定されない。ＤＮＡ表面のリン酸基に結合する色素や塩基間にインターカレートする色素（インターカレーター）などが挙げられるが、インターカレーターを用いることが好ましい。
インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。
【００３０】
多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）  ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン  Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）  ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９，  ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００３１】
本発明では、増幅産物の検出、モニタリングのためにＰＣＲ反応液中にプローブを含んでいてもよい。プローブとしては、ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ、Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ、Ｑ  Ｐｒｏｂｅなどが挙げられ、任意のプローブを選択することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３３】
実施例１：界面活性剤の有無が反応特異性に与える影響の確認
本実施例においては、界面活性剤が与える影響を調べるために、界面活性剤が全く含まない酵素として、ＫＯＤ  ｅｘｏ  （−）<Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｆｒｅｅ>（ＴＯＹＯＢＯ）、界面活性剤を含む酵素として、ＫＯＤ  ｅｘｏ  （−）（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。ＫＯＤ  ｅｘｏ  （−）を酵素として使用した場合、ＰＣＲ反応液中に、０．０００７５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．０００７５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有することになる。
反応バッファーとしては、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ）に添付のものを使用した。
【００３４】
本実施例では、ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＯＭＩＣ  ＤＮＡを鋳型とし、Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ  Ｇｌｏｂｉｎ（Ｈｂｇ５８２とＨｂｇ４６８の２種）の検出を表１に示す２セットのプライマー、プライマー＃１（配列番号１）とプライマー＃２（配列番号２）、プライマー＃３（配列番号３）とプライマー＃４（配列番号４）を用いて行った。具体的には、表２に示すＰＣＲ反応液組成、表３に示すサイクル条件にてＰＣＲを実施し、融解曲線解析により増幅産物を検出した。解析には、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を使用した。
【００３５】
【表１】
2015050980.tif 000002
【００３６】
【表２】
2015050980.tif 000003
【００３７】
【表３】
2015050980.tif 000004
【００３８】
これらの結果を図１に示す。図１は、界面活性剤を全く含まない組成における特異性と、界面活性剤を含む組成における特異性を比較した結果である。界面活性剤を全く含まない組成にすることで特異性が大幅に改善にされ、非特異増幅を低減させることができることが示された。
【００３９】
実施例２：界面活性剤の有無がプライマーダイマー生成に与える影響の確認
本実施例では、プライマーダイマーが生じやすいターゲットとしてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦｂ２９１）を用い、界面活性剤の有無がプライマーダイマーに与える影響を検証した。方法は、実施例１に示す通りであり、プライマー設計のみ、図４に示すプライマー＃５（配列番号５）とプライマー＃６（配列番号６）とした。
【００４０】
【表４】
2015050980.tif 000005
【００４１】
これらの結果を図２に示す。図２は、界面活性剤を全く含まない組成における特異性と、界面活性剤を含む組成におけるプライマーダイマーを比較した結果である。界面活性剤を全く含まない組成にすることで、界面活性剤を含む組成においてプライマーダイマーが生じやすいターゲットにおいても、プライマーダイマーの発生を抑制できることが示された。
【００４２】
実施例３：界面活性剤量と反応特異性との関係
実施例１、２では、界面活性剤を全く含まないＰＣＲ反応液組成における特異性改善効果を示した。続いて、界面活性剤量をどの程度低減させることで、特異性改善効果が認められるか、検証した。
【００４３】
本実施例においては、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  ｅｘｏ  （−）<Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｆｒｅｅ>（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、ＰＣＲ反応液として、界面活性剤の添加量が、０％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０.０１％となるように、Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加し、特異性の確認を実施した。プライマーは、表１に示すＨｂｇ５８２を使用し、その他の条件は、実施例１、２と同様とした。テンプレートは、３０ｎｇのＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを添加し、Ｎ＝２で実施した。
【００４４】
これらの結果を図３に示す。図３は、界面活性剤添加量と特異性との関係を調べた結果のである。その結果、界面活性剤を添加するほど、特異性が低下することが判明した。特に、界面活性剤の添加量を０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満にすることで、高い特異性が得られることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、ＰＣＲ反応液に界面活性剤を全く含まない、あるいは界面活性剤濃度を０．００００１％（Ｖ／Ｖ）未満の低濃度にすることで、非特異増幅を低減することができる。そのため、試薬調製が容易であり、界面活性剤を含有しないポリメラーゼと界面活性剤を含まないＰＣＲバッファーを使用するだけで、特異性が高いＰＣＲ反応液を調製することが可能である。
この特異性が高いＰＣＲ反応液を利用することで、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査、診断用途等において、目的産物のみの増幅を容易に確認できるようになる。
【図１】
2015050980.tif 000006
【図２】
2015050980.tif 000007
【図３】
2015050980.tif 000008
【配列表】
2015050980000001.app