(57)【要約】【課題】ヒトの日常生活の中で肺高血圧症の発症要因である可能性が高い処置を用いた動物モデルの提供を目的とする。【解決手段】げっ歯類にインターロイキン３３（ＩＬ−３３）を投与することで得られるヒト肺高血圧症に類似した病態を示すモデル動物である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
げっ歯類にインターロイキン３３（ＩＬ−３３）を投与することで得られるヒト肺高血圧症に類似した病態を示すモデル動物。
【請求項２】
インターロイキン３３をげっ歯類に投与することを特徴とする肺高血圧症の動物モデルの作製方法。
【請求項３】
げっ歯類がマウスである請求項２に記載の肺高血圧症の動物モデルの作製方法。
【請求項４】
請求項１に記載の肺高血圧症のモデル動物を用いることを特徴とする肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肺高血圧症の病態モデル動物及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト肺（動脈）高血圧症は肺動脈圧の上昇を認める病態の総称であり、肺の血管に異常が生じるため、心臓への多大な負担と全身への酸素供給が障害される。
その発症には肺の血管障害に加え、遺伝的背景、肺動脈の物理的閉塞など、様々な要因があるが原因は特定されていない。
難治性であり、国の指定する特定疾患である。
治療としては、抗凝固薬投与、利尿薬投与、酸素療法などが行われる。
ヒトにおいて病理的解析が行われているが、その検体は肺高血圧症の末期の状態であるため、病態の初期段階の検体の入手は難しく、病態進行の過程を検討することは極めて困難である。
また、ほとんどの検体はすでに治療を受けた状態であるため、治療薬の影響を排除できない。
これらの問題点が肺高血圧症の発症メカニズムの解明を妨げている。
したがって、ヒト肺高血圧症に類似した動物モデルの構築は、発症メカニズムの解明に加えて治療の観点からも切望されている。
【０００３】
現在、ヒト肺高血圧症の動物モデルとして主に以下の３つのモデルが報告されている。
・モノクロタリン誘発性肺高血圧症モデル（非特許文献１）
ラットにモノクロタリンを６０ｍｇ／ｋｇを１回皮下投与し、３週間後に肺高血圧症を発症させるモデルである。
・低酸素誘発性肺高血圧症モデル（非特許文献２）
マウスやラットを２〜３週間１０％程度の低酸素状態で飼育し、肺高血圧症を発症させるモデルである。
・低酸素とVascular Endothelial Growth Factor（ＶＥＧＦ）受容体拮抗薬による肺高血圧症モデル（非特許文献３）
ラットに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体拮抗薬を一回皮下注射し、１０％の低濃度チャンバーで三週間飼育、次いで、常酸素に戻し１０週間飼育し、肺高血圧症を発症させるモデルである。
一方、肺高血圧症が原因である肺性心のモデル動物として、インターロイキン６を投与することで、肺に類線維素形成及び血栓形成を起こし右心室肥大を引き起こし、肺性心を発症するラットが知られている（特許文献１）
【０００４】
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）は、宿主防御や免疫調節、神経性の損傷や炎症において重要な役割を担っているＩＬ−１ファミリーに属し、炎症誘発性のサイトカインと転写制御機能を有する核内因子の両方の機能を有するタンパク質である。
そして、肺高血圧症の患者の末梢血液の研究からＩＬ−３３の関与が指摘されている（非特許文献４）ものの、ＩＬ−３３が肺高血圧症の原因となっているかは不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ９５／３３４８３号国際公開公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Gomez-Arroyo, J. G., et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 302, L363-L369, 2012.
【非特許文献２】Stenmark, K. R., et al. Circ Res, 99, 675-691, 2006.
【非特許文献３】Abe, K., et al. Circulation, 121, 2747-2757, 2010
【非特許文献４】Carlomagno G., et al. Int J Cardiol 2013.（Available online 3
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１及び２のモデルでは、軽度〜中程度の肺高血圧の症状が観察されるが、いずれのモデルにおいてもヒトの末期の肺高血圧症の病態を呈していない。
また、非特許文献１のモデルは多臓器障害を引き起こし、適切なモデルではないとされる。
非特許文献３のモデルは非特許文献１及び２のモデルに比べて、ヒトの末期の肺高血圧症の病態に類似したモデルである。
このモデルに用いられるＶＥＧＦ受容体拮抗薬は本来血管新生を阻害する働きがあるが、低酸素状態では逆に特定の血管内皮細胞を増殖させ、その結果、肺高血圧症の病態が誘導されるものである。
しかしながら、ヒトの肺高血圧症の発症メカニズムがこのような作用機序によって誘導されているかは検討が必要である。
特許文献１におけるインターロイキン６（ＩＬ−６）を利用したラットにおいて動脈血栓の形成が観察されたことが記載されているものの、組織学的には軽度の症状であり、最終的に症状が緩和・改善するモデルであるため、ヒトの肺高血圧症の動物モデルとしては不十分である。
例えば、ヒトＩＬ−６がラットＩＬ−６レセプターに結合した上で、正常なシグナルが伝達されているか定かでない。
また、抗ＩＬ−６ＩｇＧ抗体が検出されていることから、ラットにとって異物であるヒトＩＬ−６に対する免疫応答が起きているが、この反応が肺高血圧症の発症とどの程度関係しているか不明である。
【０００８】
ヒト肺高血圧症の発症要因は様々であり、上記の動物モデルの解析だけでは治療法の開発には不十分である。
また、ヒトの日常生活の中で肺高血圧症の発症要因である可能性が高い処置を用いた動物モデルが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）をマウスに比較的長期間投与することによって、中膜肥厚、血管閉塞を伴う血管内膜の顕著な肥厚、血管周囲への炎症細胞の集積など、ヒトの肺高血圧症の中期〜後期の段階の再現が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明に係るモデル動物は、げっ歯類にインターロイキン３３（ＩＬ−３３）を投与することで得られるヒト肺高血圧症に類似した病態を示す。
本発明に使用されるＩＬ−３３は、特に限定されることはなく、天然物由来であってもよいが、遺伝子組換法によって作製されたもの（リコンビナントＩＬ−３３）であってもよい。好ましくは、リコンビナントＩＬ−３３が挙げられる。
遺伝子組換法による作製方法は、自体公知の方法によることができる。
【００１１】
本発明に使用されるげっ歯類としてはマウスが好ましい。
【００１２】
ＩＬ−３３をげっ歯類に投与する方法として、静脈投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与などが挙げられるが、好ましいものとして腹腔内投与が挙げられる。
【００１３】
ＩＬ−３３をげっ歯類に投与する量としては、１回につき体重１ｇ当たり０．００５〜０．１μg、好ましくは、０．０１〜０．０５μｇの範囲で選ばれる。
前記の投与量は、実験条件によっても異なり、これらの値に限定されるものでない。
投与回数としては１週１回ないし２回、好ましくは１週１回であるが、これに限定されるものではない。
通常、上記投与を１〜４週間続けることにより、ヒト肺高血圧症に類似した病態を発症させることができる。
肺高血圧症の確認は、最終投与の一週間後に肺組織を採取し、中膜肥厚、血管閉塞を伴う血管内膜の顕著な肥厚、血管周囲への炎症細胞の集積などを組織学的に解析すればよい。
このようなモデル動物を使用すると、肺高血圧症の治療薬のスクリーニングに有用である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、これまでの動物モデルと比べて以下の点で優れている。
（１）ヒトの肺高血圧症の引き金となっている可能性の高い処置を施すことにより、実際の病態進行に近いモデルである。
（２）ヒトの肺高血圧症の末期の状態に近い病態（Heath-Edwards分類法のGrade3）も再現している。
（３）投与方法に特に制限がないものの腹腔内投与等の直接投与のみでも実施することができ、動物飼育用の低酸素チャンバーなどの専用機器が不要ある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＢＳ（コントロール）投与したものとリコンビナントマウスＩＬ−３３を投与したものの肺組織（Ｈ＆Ｅ染色）写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
マウス成獣（Ｃ５７ＢＬ／６系統、７〜１０週令）に４００ｎｇのリコンビナントマウスＩＬ−３３（ｒｍＩＬ−３３），［Ｒ＆Ｄ社より購入、４μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解］を、１週間に１回、１週間，３週間，５週間，７週間、腹腔内投与した。
最終投与の１週間後に肺組織を採取し、組織学的に解析した。
野生型マウスにｒｍＩＬ−３３もしくはＰＢＳを投与後、パラフィン包埋し作成した肺組織切片をＨ＆Ｅ染色で解析した結果を図１に示す。
血管病態の重症度はＨｅａｔｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ分類法（Heath D, Edwards JE., Circulation 1958;18:533-547）に従った。
ｒｍＩＬ−３３投与後１週間ではＰＢＳ投与に比べ、ごく稀にＧｒａｄｅ１の症状が観察されはしたが、ほとんど影響は認められなかった。
３週間の投与では、Ｇｒａｄｅ３の求心性の内膜肥大が観察された。
５週間の投与では、３週間と比べ顕著な変化はなかったが、７週間では管腔内の内膜が肥大した箇所に毛細血管が確認され始め、Ｇｒａｄｅ４に近い病態が観察された。
この結果から本発明に係る動物モデルは、中膜肥厚，血管閉塞を伴う血管内膜の顕著な肥厚，血管周囲への炎症細胞の集積が認められ、ヒトの肺高血圧症の中期〜後期の段階に類似する病態が再現されていることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
近年、炎症が肺高血圧症の引き金であることを示唆する事例が多々報告されており、ＩＬ−３３も炎症を惹起する因子である。
ＩＬ−３３はアレルギー性の炎症を誘導することが知られており、比較的研究が盛んに行われている分子である。
特に気管支に異物が侵入すると分泌される分子であり、肺高血圧症の原因の一つである可能性が極めて高い。
その生産細胞や標的細胞も明らかとなっており、病態の解析がスムーズに行える。
【図１】
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