(57)【要約】【課題】一の容器で効率よく複数種類の核酸増幅反応を行うことができる新規核酸増幅方法を提供する。【解決手段】フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルを含有する一の容器に、第１の核酸を増幅するための第１の反応試薬を含有する第１の液滴を作成する工程と、前記チューブに、第２の核酸を増幅するための第２の反応試薬を含有する第２の液滴を作成する工程と、前記容器を核酸増幅反応装置に装着し、前記第１の液滴と前記第２の液滴とを独立に維持しながら、前記容器において核酸増幅反応を行う工程と、を含む方法とする。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一の容器で複数の核酸増幅反応を行う方法であって、
フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルを含有する一の容器に、第１の核酸を増幅するための第１の反応試薬を含有する第１の液滴を作成する工程と、
前記容器に、第２の核酸を増幅するための第２の反応試薬を含有する第２の液滴を作成する工程と、
前記容器を核酸増幅反応装置に装着し、前記第１の液滴と前記第２の液滴とを独立に維持しながら、前記容器において核酸増幅反応を行う工程と、
を含む方法。
【請求項２】
第１の液滴と第２の液滴が同じ種類の核酸検体を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の液滴と第２の液滴が異なる種類の核酸検体を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フルオロ変性シリコーンレジンがＸＳ６６−Ｃ１１９１（モメンティブ社）である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の液滴は第１の蛍光色素を含有し、
前記第２の液滴は前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素を含有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記フルオロ変性シリコーンレジンの添加量が、１質量％以上５０質量％以下である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
複数の核酸増幅反応を行うための容器であって、
前記フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルと、
第１の核酸を増幅するための反応試薬を含有する第１の液滴と、
第２の核酸を増幅するための反応試薬を含有する第２の液滴と、
を含む容器。
【請求項８】
前記フルオロ変性シリコーンレジンがＸＳ６６−Ｃ１１９１（モメンティブ社）である、請求項７に記載の容器。
【請求項９】
前記第１の液滴が、第１の蛍光色素を含有し、
前記第２の液滴は前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素を含有する、請求項７または８に記載の容器。
【請求項１０】
前記フルオロ変性シリコーンレジンの添加量が、１質量％以上５０質量％以下である、請求項７から９のいずれか１項に記載の容器。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれか１項に記載の容器が装着された核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などの核酸増幅方法が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする標的核酸及び試薬を含む反応液に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。
【０００４】
近年、インフルエンザウイルスＤＮＡなどで、２種類のターゲットＤＮＡを同時に増幅させる方法が有効に開発されている（非特許文献１参照）。その場合、２種類のターゲットＤＮＡを１つのチューブで増幅させるため、そのチューブに入った１つの溶液内に、２種類のターゲットＤＮＡ、及び２種類のプライマーなどのＰＣＲ用試薬を入れて反応させるのが一般的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ozdemir M, Yavru S, Baysal B."Comparison of the detection of influenza A and B viruses by different methods." J Int Med Res. 2012;40(6):2401-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、１つの容器で効率よく複数種類の核酸増幅反応を行うことができる新規核酸増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施態様は、一の容器で複数の核酸増幅反応を行う方法であって、フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルを含有する一のチューブに、第１の核酸を増幅するための第１の反応試薬を含有する第１の液滴を作成する工程と、前記容器に、第２の核酸を増幅するための第２の反応試薬を含有する第２の液滴を作成する工程と、前記容器を核酸増幅反応装置に装着し、前記第１の液滴と前記第２の液滴とを独立に維持しながら、前記容器において核酸増幅反応を行う工程と、を含む方法である。第１の液滴と第２の液滴が同じ種類の核酸検体を含有しても、異なる種類の核酸検体を含有してもよい。前記フルオロ変性シリコーンレジンがＸＳ６６−Ｃ１１９１であってもよい。また、前記第１の液滴は第１の蛍光色素を含有し、前記第２の液滴は前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素を含有してもよい。また、前記フルオロ変性シリコーンレジンの添加量が、１質量％以上５０質量％以下であってもよい。
【０００８】
本発明のさらなる一実施態様は、複数の核酸増幅反応を行うための核酸増幅反応用容器であって、前記フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルと、第１の核酸を増幅するための反応試薬を含有する第１の液滴と、第２の核酸を増幅するための反応試薬を含有する第２の液滴と、を含む容器である。前記フルオロ変性シリコーンレジンがＸＳ６６−Ｃ１１９１であってもよい。また、前記第１の液滴が、第１の蛍光色素を含有し、前記第２の液滴は前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素を含有してもよい。また、前記フルオロ変性シリコーンレジンの添加量が、１質量％以上５０質量％以下であってもよい。
【０００９】
本発明のさらなる一実施態様は、上記いずれかの容器が装着された核酸増幅装置である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、１つの容器で効率よく複数種類の核酸増幅反応を行うことができる新規核酸増幅方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置の斜視図である。（Ａ）は蓋を閉じた状態、（Ｂ）は蓋を開けた状態を示す。
【図２】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の分解斜視図である。
【図３】本発明の一実施形態に係るチューブの断面図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の、図１（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。（Ａ）は第１の配置、（Ｂ）は第２の配置を示す。
【図５】本発明の一実施例において、ＸＳ６６−Ｃ１１９１の添加量と液滴の形成の様子の関係を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、２つの液滴でマルチプレックスＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、１つの液滴でマルチプレックスＰＣＲを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
（１）核酸増幅反応を行う方法
本発明にかかる方法は、フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルを含有する一の容器に、第１の核酸を増幅するための第１の反応試薬を含有する第１の液滴を作成する工程と、前記容器に、第２の核酸を増幅するための第２の反応試薬を含有する第２の液滴を作成する工程と、前記容器を核酸増幅反応装置に装着し、前記第１の液滴と前記第２の液滴とを独立に維持しながら、前記容器において核酸増幅反応を行う工程と、を含む。この方法によると、一の容器で複数の核酸増幅反応を行うことができる。なお、この方法では、核酸を増幅させるための反応試薬を用いて核酸増幅反応を行えばよく、必ずしも反応後に核酸が増幅する必要はない。
【００１４】
フルオロ変性シリコーンレジンの濃度は特に限定されないが、１質量％以上５０質量％以下であることが好ましく、１質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、１質量％以上５質量％以下であることがさらに好ましい。フルオロ変性シリコーンレジンの種類は特に限定されないが、ＸＳ６６−Ｃ１１９１（モメンティブ社）であることが好ましい。シリコーンオイルの種類は特に限定されず、ジメチルシリコーンオイル、メチルハイドロジェンシリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、メチル水素シリコーンオイル、環状ジメチルシリコーンオイルなどが例示できる。核酸増幅方法は、特に限定されず、当業者が通常使用する方法であればよいが、昇降式ＰＣＲ装置であることが好ましい（例えば、特開２０１２−１１５２０８参照）。液滴が、各々異なる放出波長を有する蛍光色素を含有することによって、放出される蛍光を同時に測定しても、各核酸を区別することが可能になり、いわゆるマルチプレックスＰＣＲなどができるようになる。
【００１５】
ここで、各反応試薬が増幅することができる第１の核酸と第２の核酸は同じであっても異なっていてもよい。第１の核酸と第２の核酸が同じ種類の核酸であって、第１の反応試薬と第２の反応試薬が同じ反応試薬である場合、例えば、両方の液滴に当該核酸を含む検体を入れて増幅反応を行うことによって、１つの粒子で反応させた場合より多量の反応生成物を得ることができる。第１の核酸と第２の核酸が同じ種類の核酸であって、第１の反応試薬と第２の反応試薬が異なる場合、例えば、両方の液滴に当該核酸を含む検体を入れて増幅反応を行うことによって、その核酸に対し、どちらの反応試薬がより効率よく増幅することができるか等を調べることができる。これによって、例えば、同じ遺伝子に対して少し配列の異なるプライマーを作製して、どちらが効率よく機能するかを調べることができる。
【００１６】
第１の核酸と第２の核酸が異なり、第１の反応試薬と第２の反応試薬が同じ反応試薬である場合、つまり、当該反応試薬が複数の核酸を増幅させることができる場合、例えば、１つの容器で、しかも１種類の反応試薬で、２種類の核酸を同時に増やすことができる。
【００１７】
第１の核酸と第２の核酸が異なり、第１の反応試薬と第２の反応試薬がそれぞれの核酸に好適な異なる条件である場合、例えば、第１の核酸か第２の核酸かが不明である核酸を含む検体を両方の液滴に入れた場合、当該核酸が、第１の核酸か第２の核酸かを調べることができる。これによって、例えば、インフルエンザのタイプの判別などに用いることができる。あるいは、それぞれの液滴に第１の核酸を含む検体と第２の核酸を含む検体を入れることにより、１つの容器で２種類の核酸を同時に増やすことができる。
【００１８】
なお、一方の、あるいは両方の液滴で、プライマーダイマーや反応試薬に混入した核酸などによってバックグラウンドの増幅が生じるかどうか調べるため、核酸検体を入れずに反応を行ってもよい。
【００１９】
反応試薬に含まれる試薬は特に限定されず、通常の核酸増幅に用いられる試薬、例えば、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマーや、増幅反応によってはプローブなどである。そして、プライマーやプローブは、蛍光標識されていてもよい。
【００２０】
ここで用いる容器は、チューブであることが好ましく、小型遠心用チューブや、ＰＣＲ用に設計されたチューブであってもよい。
（２）核酸増幅反応用容器
本発明の一実施態様は、フルオロ変性シリコーンレジンを添加したシリコーンオイルと、第１の核酸を増幅するための反応試薬を含有する第１の液滴と、第２の核酸を増幅するための反応試薬を含有する第２の液滴と、を含む核酸増幅反応用容器である。この容器を用いることで、（１）で記載したように、一つのあるいは複数の核酸検体に対し、様々な核酸増幅反応を行うことができる。（１）と同様に、この容器は、チューブであることが好ましく、小型遠心用チューブや、ＰＣＲ用に設計されたチューブであってもよい。
（３）昇降式ＰＣＲ装置の装置構成の一例
以下、昇降式ＰＣＲ装置の一例について、詳細に述べる。
【００２１】
図１は、昇降式ＰＣＲ装置１の一例を示す。（Ａ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を閉じた状態、（Ｂ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を開けた状態であり、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を表す。図２は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の分解斜視図である。図４（Ａ）は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の、図１（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。
【００２２】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、図１（Ａ）に示すように、本体１０及び駆動機構２０を含む。図２に示すように、本体１０は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を含む。第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にはスペーサー１４が設けられている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２が底板１７の側、第２加熱部１３が蓋５０の側に配置されている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２、第２加熱部１３、及びスペーサー１４はフランジ１６、底板１７及び固定板１９に固定されている。
【００２３】
装着部１１は、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を装着する構造である。図１（Ｂ）および図２に示すように、本実施形態の装着部１１は、核酸増幅反応用チューブ１００を差し込んで装着するスロット構造であり、第１加熱部１２の第１ヒートブロック１２ｂ、スペーサー１４、及び第２加熱部１３の第２ヒートブロック１３ｂを貫通する穴に核酸増幅反応用チューブ１００を差し込む構造となっている。装着部１１の数は複数であってもよく、図１（Ｂ）の例では、２０個の装着部１１が本体１０に設けられている。
【００２４】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、核酸増幅反応用チューブ１００を第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して所定の位置に保持する構造を含む。より具体的には、図４に示すように、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１を第１加熱部１２によって、第２領域１１２を第２加熱部１３によって、加熱できる。本実施形態においては核酸増幅反応用チューブ１００の位置を定める構造は底板１７であり、図４（Ａ）に示すように、核酸増幅反応用チューブ１００を底板１７に接触する位置まで差し込むことで、第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して核酸増幅反応用チューブ１００を所定の位置に保持できる。
【００２５】
第１加熱部１２は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、後述する核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の温度に加熱する。図４（Ａ）に示す例では、第１加熱部１２は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。
【００２６】
第１加熱部１２は、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材とを含んでもよい。図２に示す例では、第１加熱部１２は第１ヒーター１２ａ及び第１ヒートブロック１２ｂを含む。本実施形態においては、第１ヒーター１２ａはカートリッジヒーターであり、導線１５によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター１２ａは第１ヒートブロック１２ｂに挿入されており、第１ヒーター１２ａが発熱することで第１ヒートブロック１２ｂが加熱される。第１ヒートブロック１２ｂは、第１ヒーター１２ａから発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材である。本実施形態においてはアルミニウム製のブロックである。
【００２７】
第２加熱部１３は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、核酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２を、第１の温度とは異なる第２の温度に加熱する。図４（Ａ）に示す例では、第２加熱部１３は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。図２に示すように、第２加熱部１３は、第２ヒーター１３ｂ及び第２ヒートブロック１３ｂを含む。第２加熱部１３は、加熱する核酸増幅反応用チューブ１００の領域及び加熱する温度が第１加熱部１２と異なる以外は、第１加熱部１２と同様である。
【００２８】
本実施形態においては、第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、図示しない温度センサー及び後述する制御部によって制御される。第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、核酸増幅反応用チューブ１００が所望の温度に加熱されるように設定されることが好ましい。本実施形態においては、第１加熱部１２を第１の温度に、第２加熱部１３を第２の温度に制御することで、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の温度に、第２領域１１２を第２の温度に加熱できる。本実施形態における温度センサーは熱電対である。
【００２９】
駆動機構２０は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３を駆動する機構である。本実施形態においては、駆動機構２０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１６とが接続されている。本実施形態における駆動軸は、装着部１１の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体１０が回転する。
【００３０】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、図示しない制御部を含む。制御部は、後述する第１の温度、第２の温度、第１の時間、第２の時間、及び熱サイクルのサイクル数のうち、少なくとも１つを制御する。制御部が第１の時間または第２の時間を制御する場合には、制御部は駆動機構２０の動作を制御することによって、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が所定の配置に保持される時間を制御する。制御部は、制御する項目ごとに異なる機構を設けても、全項目を一括して制御するものであってもよいが、本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１における制御部は電子制御であり、上記項目を全て制御する。本実施形態の制御部は図示しないＣＰＵ等のプロセッサー、及び、ＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置を含む。記憶装置には上記各項目を制御するための各種プログラム、データ等が記憶されている。また、記憶装置は各種処理の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有する。
【００３１】
本実施形態の本体１０は、図２及び図４（Ａ）の例に示すように、第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にスペーサー１４が設けられている。本実施形態のスペーサー１４は、第１加熱部１２または第２加熱部１３を保持する部材である。本実施形態においては、スペーサー１４は断熱材であり、図４（Ａ）の例においては、装着部１１はスペーサー１４を貫通している。
【００３２】
本実施形態の本体１０は、固定板１９を含む。固定板１９は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を保持する部材である。図１（Ｂ）及び図２に示す例においては、２枚の固定板１９がフランジ１６に嵌め合わされており、第１加熱部１２、第２加熱部１３及び底板１７が固定されている。
【００３３】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、蓋５０を含む。図１（Ａ）及び図４（Ａ）の例では、装着部１１は蓋５０によって覆われている。蓋５０は、固定部５１によって本体１０に固定されてもよい。本実施形態においては、固定部５１は磁石である。図１（Ｂ）及び図２の例に示すように、本体１０の蓋５０の接触する面には磁石が設けられている。図１（Ｂ）及び図２には示されていないが、蓋５０にも、本体１０の磁石が接触する位置に磁石が設けられており、蓋５０で装着部１１を覆うと、磁力によって蓋５０が本体１０に固定される。
【００３４】
なお、固定板１９、底板１７、蓋５０、フランジ１６は断熱材を用いて形成されることが好ましい。
（３）昇降式ＰＣＲ装置を用いた熱サイクル処理の一例
図３は、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００の断面図である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１の、図１（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１に核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を示す。図４（Ａ）は第１の配置、図４（Ｂ）は第２の配置を示す。図５は、実施形態における昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理の手順を表すフローチャートである。以下では、まず、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００について説明し、次に、核酸増幅反応用チューブ１００を用いた場合の、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理について説明する。
【００３５】
図３の例に示すように、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００は流路１１０及び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しないシリコーンオイル１３０とが充填され、封止部１２０によって封止されている。
【００３６】
流路１１０は、対向する内壁に近接して反応液１４０が移動するように形成されている。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域を意味する。「近接」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距離が近いことを意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する場合を含む。したがって、「対向する内壁に近接して反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０が移動する」こと、すなわち、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動することを意味する。
【００３７】
図３の例では、核酸増幅反応用チューブ１００の外形は円柱状であり、中心軸方向（図３における上下方向）に流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形の筒状である。したがって、本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、流路１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の直径を構成する流路１１０の壁面上の２点を含む領域であり、対向する内壁に沿って反応液１４０が流路１１０の長手方向に移動する。
【００３８】
核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１は、第１加熱部１２によって第１の温度に加熱される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２加熱部１３によって第２の温度に加熱される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域である。本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、第１領域１１１は、流路１１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の長手方向における他方の端部を含む領域である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、流路１１０の封止部１２０側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２であり、封止部１２０から遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１である。
【００３９】
流路１１０は、シリコーンオイル１３０と、複数の反応液の液滴１４０とを含む。シリコーンオイル１３０は、反応液とは混和しない、すなわち混ざり合わない性質であるため、図３に示すように、反応液１４０はシリコーンオイル１３０の中に液滴の状態で保持されている。反応液１４０は、シリコーンオイル１３０よりも比重が大きいため、流路１１０の重力方向における最下部の領域に位置している。反応液１４０は、反応試薬を含む液体である。反応がＰＣＲである場合には、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ（標的核酸）、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、プローブ、塩等が含まれる。
【００４０】
以下、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照しながら、実施形態に係る熱サイクル装置１を用いた熱サイクル処理を説明する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）においては、矢印ｇの方向（図における下方向）が重力の作用する方向である。本実施形態においては、熱サイクル処理の例としてシャトルＰＣＲ（２段階温度ＰＣＲ）を行う場合を説明する。なお、以下に説明する各工程は熱サイクル処理の一例を示すものである。必要に応じて工程の順序を入れ替えたり、２以上の工程を連続的にあるいは並行して行ったり、工程を追加したりしてもよい。
【００４１】
シャトルＰＣＲは、高温と低温の２段階の温度処理を繰り返し反応液に施すことにより、反応液中の核酸を増幅させる手法である。高温の処理においては２本鎖ＤＮＡの解離が、低温の処理においてはアニーリング（プライマーが１本鎖ＤＮＡに結合する反応）及び伸長反応（プライマーを始点としてＤＮＡの相補鎖が形成される反応）が起こる。
【００４２】
一般に、シャトルＰＣＲにおける高温は８０℃から１００℃の間の温度、低温は５０℃から７０℃の間の温度である。各温度における処理は所定時間行われ、高温に保持する時間は低温に保持する時間よりも短いことが一般的である。例えば、高温が１秒から１０秒程度、低温が１０秒から６０秒程度としてもよく、反応の条件によってはこれよりも長い時間であってもよい。
【００４３】
なお、使用する試薬の種類や量によって、適切な時間、温度およびサイクル数（高温と低温を繰り返す回数）は異なるので、試薬の種類や反応液１４０の量を考慮して適切なプロトコールを決定した上で反応を行うことが好ましい。
【００４４】
まず、核酸増幅反応用チューブ１００を、装着部１１に装着する（ステップＳ１０１）。本実施形態では、シリコーンオイル１３０が充填された流路１１０に反応液１４０を導入後、封止部１２０によって封止された核酸増幅反応用チューブ１００を装着部１１に装着する。反応液１４０の導入は、マイクロピペットやインクジェット方式の分注装置等を用いて行うことができる。装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した状態においては、第１加熱部１２は第１領域１１１を、第２加熱部１３は第２領域１１２を、それぞれ含む位置においてバイオチップ１００に接している。
【００４５】
ここで、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３、の配置は第１の配置である。図４（Ａ）に示すように、第１の配置は、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置させる。第１の配置においては、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に第１領域１１１が位置するので、シリコーンオイル１３０よりも比重の大きい反応液１４０は、第１領域１１１に位置する。本実施形態においては、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着したら、蓋５０によって装着部１１を覆い、昇降式ＰＣＲ装置１を作動させる。
【００４６】
次に、第１加熱部１２及び第２加熱部１３により核酸増幅反応用チューブ１００を加熱する。第１加熱部１２と第２加熱部１３とは、核酸増幅反応用チューブ１００の異なる領域を異なる温度に加熱する。すなわち、第１加熱部１２は第１領域１１１を第１の温度に加熱し、第２加熱部１３は第２領域１１２を第２の温度に加熱する。これにより、流路１１０の第１領域１１１と第２領域１１２との間には、第１の温度と第２の温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、第１領域１１１から第２領域１１２へ向けて温度が低くなる温度勾配が形成される。本実施形態の熱サイクル処理はシャトルＰＣＲであるので、第１の温度は２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度はアニーリング及び伸長反応に適した温度とする。
【００４７】
装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置は第１の配置であるので、核酸増幅反応用チューブ１００を加熱すると、反応液１４０は第１の温度に加熱される。第１の時間が経過したら、駆動機構２０によって本体１０を駆動し、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置を第１の配置から第２の配置へ切換える。第２の配置は、第２領域１１２を重力の作用する方向において流路１１０の最下部に位置させる配置である。換言すると、第２領域１１２は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が、第１の配置とは異なる所定の配置にある場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する領域である。本実施形態の熱サイクル装置１においては、制御部の制御によって駆動機構２０が本体１０を回転駆動する。駆動軸を回転の軸として、モーターによってフランジ１６を回転駆動すると、フランジ１６に固定されている装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３が回転する。駆動軸は装着部１１の長手方向に対して垂直な方向の軸であるので、モーターの動作によって駆動軸が回転すると、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が回転する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、本体１０を１８０°回転させる。これにより、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。
【００４８】
ここで、第１領域１１１と第２領域１１２との重力の作用する方向における位置関係が第１の配置とは逆になるので、反応液１４０は重力の作用によって第１領域１１１から第２領域１１２へと移動する。装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に達した場合に、駆動機構２０の動作が停止すると、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に保持される。第２の配置において、第２の時間が経過したら、再度回転し、所定の回数が来るまで、このようにして第１の位置と第２の位置を入れ替えながら回転することにより、核酸増幅反応が行われる。
（４）他の実施形態
本発明に従えば、１質量％以上１００質量％以下のＸＳ６６−Ｃ１１９１を添加したシリコーンオイルを含有する１つのチューブ内で、水溶性の液滴を独立に作成することができる。実施例のように、そのチューブに核酸増幅反応のような過激な反応をさせた後でも、液滴の独立性は保たれる。従って、核酸増幅反応以外でも、シリコーンオイル中に複数の液滴を作成し、各液滴の中で、異なるサンプルについて反応させることによって、効率よくマルチプレックス反応を起こすことができると考えられる。ここで、ＸＳ６６−Ｃ１１９１や、シリコーンオイルの条件は、上述のとおりである。
【実施例】
【００４９】
（１）ＸＳ６６−Ｃ１１９１の添加量と液滴の形成
本実施例の核酸増幅反応用チューブは外形が円柱状であり、内径２ｍｍ、長さ２５ｍｍの円筒形の流路を有する。まず、ジメチルシリコーンオイル（ＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ、信越シリコーン社製）に対し、１，５，２０，５０，８０，１００重量％の量のフルオロ変性シリコーンレジン（ＸＳ６６−Ｃ１１９１、モメンティブ社製）を添加した溶液１３０μｌを、核酸増幅反応用チューブに充填し、マイクロピペットを用いて、カラーマーカー（Loading Buffer、タカラバイオ社製）で色をつけた水を１μｌずつ３滴流路に導入した所、図５に示すように、各反応液は直径約１．５ｍｍの球形をした液滴の状態で保持され、液滴は混じり合わず、独立に存在した。
（２）２つの液滴でのＰＣＲ
次に、同じチューブを用い、ＸＳ６６−Ｃ１１９１を２０重量％含有するＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ中に、以下の組成を有する反応液を、１μｌずつ導入し、ＰＣＲを行った。なお、plasmidは、両方の液滴にInfA plasmidを添加した場合（図６上：InfA plasmidを検出）及び両方の液滴にInfB plasmidを添加した場合（図６下：InfB plasmidを検出）について増幅反応を行い、反応液１または反応液２でのみ特異的に反応を起こさせた。
反応液１：
Titanium Taq(x50)               0.4
10xbuffer                       1.0
dNTP(10mM)                      0.2
InfA forward primer (5uM)       1.0
InfA reverse primer (5uM)       0.3
InfA Qprobe (2uM)               0.25
plasmid                         1.0
DW                              up to 10.0（単位はμＬ）
反応液２：
Titanium Taq(x50)               0.4
10xbuffer                       1.0
dNTP(10mM)                      0.2
InfB forward primer (5uM)       0.3
InfB reverse primer (5uM)       1.0
InfB Qprobe (2uM)               0.25
plasmid                         1.0
DW                              up to 10.0（単位はμＬ）
対照実験として、１つの液滴で、ＰＣＲを行った。用いた反応液は、以下の組成（反応液３）を有する。なお、plasmidとして、InfA plasmidを添加した場合（図7上：InfA plasmidを検出）及びInfB plasmidを添加した場合（図7下：InfB plasmidを検出）について、増幅反応を行った。
反応液３：
Titanium Taq(x50)               0.8
10xbuffer                       1.0
dNTP(10mM)                      0.2
InfA forward primer (5uM)       1.0
InfA reverse primer (5uM)       0.3
InfA Qprobe (2uM)               0.25
InfB forward primer (5uM)       0.3
InfB reverse primer (5uM)       1.0
InfB Qprobe (2uM)               0.25
plasmid                         1.0
DW                              up to 10.0（単位はμＬ）
なお、プライマー（primer）及びプローブ（probe）の配列は、以下の通りである。
InfA forward primer:    5'- GACCRATCCTGTCACCTCTGAC -3'  （配列番号１）
InfA reverse primer:    5'- AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA -3'  （配列番号２）
InfA Qprobe:            5' Bodipy- CACAAATCCTAAAATTCCCT -3'  （配列番号３）
InfB forward primer:    5'- TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG -3'  （配列番号４）
InfB reverse primer:    5'- CGGTGCTCTTGACCAAATTGG -3'  （配列番号５）
InfB Qprobe:            5'- Atto655- CATTCAAAGCCAATTCGA -3'  （配列番号６）
熱サイクルは、９８℃  １０秒処理後、以下の条件で５０回行った。
９８℃  ５秒  −  ５２℃  ２０秒
５０回の熱サイクル後も、２つの液滴は混じり合わず、独立に存在していた。そして、反応中、蛍光測定した結果を図６（液滴２つの場合）及び図７（液滴１つの場合）に示した。
【００５０】
図６と図７の比較から明らかであるが、液滴２つで行った方が、１つで行う場合より、立ち上がりサイクル数が１サイクル程度早くなっており、輝度変化量が著しく大きかった。なお、このように、液滴を複数で行う方が、ＰＣＲの増幅効率が高い。
【符号の説明】
【００５１】
１…昇降式ＰＣＲ装置、１０…本体、１１…装着部、１２…第１加熱部、１２ａ…第１ヒーター、１２ｂ…第１ヒートブロック、１３…第２加熱部、１３ａ…第２ヒーター、１３ｂ…第２ヒートブロック、１４…スペーサー、１５…導線、１６…フランジ、１７…底板、１９…固定板、２０…駆動機構、５０…蓋、５１…固定部、１００…核酸増幅反応用チューブ、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、１２０…封止部、１３０…シリコーンオイル、１４０…反応液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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