(57)【要約】【課題】  ＰＣＳＫ９の生体内の振る舞いについての検討を行い、その本質に迫り、診断・医学分野の進歩に貢献する途を提供すること。【解決手段】  血中に非ヘテロダイマー形態で、かつ、６０ｋＤａのＰＣＳＫ９セグメント（６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー））が存在することを突き止め、「ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーをプロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に分解する被験薬剤の試験系において、当該薬剤の使用前と使用後の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率を求めることを特徴とするＰＣＳＫ９の測定方法」を提供し、例えば血中のＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを非ヘテロダイマー化することで血中ＬＤＬコレステロールを低下させる薬剤のスクリーニングを可能とした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーをプロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に分解する被験薬剤の試験系において、当該薬剤の使用前と使用後の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率を求めることを特徴とする、ＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項２】
６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率を求める際に行う６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の定量は、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａＰＣＳＫ９には交差反応しない抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載のＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項３】
６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異的な抗体として、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａＰＣＳＫ９には交差反応しない抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項２に記載のＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項４】
試験系として血液検体を用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項５】
試験系はＰＣＳＫ９ヘテロダイマーが添加された溶媒系であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項６】
被験薬剤を有効とする判定は、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率の当該薬剤の使用後における上昇、に伴うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項７】
ＰＣＳＫ９は、ヒトＰＣＳＫ９であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９の測定方法。
【請求項８】
６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａＰＣＳＫ９には交差反応しないモノクローナル抗体を含有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法を行うための測定キット。
【請求項９】
ＰＣＳＫ９は、ヒトＰＣＳＫ９であることを特徴とする、請求項８に記載の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな薬剤のスクリーニング、薬剤の効果確認等において有用な特定生理活性物質の測定方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
日本人における死因の第一位は悪性新生物（３０．３％）、第二位は心疾患（１５．８％）、第三位は脳血管障害（１１．５％）である。心疾患及び脳血管障害は、脂質異常症や糖尿病などの生活習慣病を基盤とする動脈硬化症が主要な原因となっている。脂質異常症の管理は動脈硬化の最も有効な予防と治療手段の一つと考えられている。したがって、脂質異常症を早期に診断し、適切な治療を施すことは心疾患及び脳血管障害を予防する方法と考えられる。
【０００３】
そのような背景の中、ＰＣＳＫ９（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9：プロ蛋白転換酵素サブチリシン/ケキシン9型）が着目されている。ＰＣＳＫ９は、ＮＡＲＣ−１（Neural apoptosis-regulated convertase 1：神経アポトーシス調節転換酵素1型）とも呼ばれ、サブチリシン様セリンプロテアーゼのケキシンに属するプロ蛋白転換酵素ファミリーの９番目の酵素である。ヒトＰＣＳＫ９は主に肝臓、腎臓、及び小腸で発現している６９２アミノ酸からなる分泌蛋白質である（非特許文献１：Seidah NG,et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003;100:928-933.）。
【０００４】
肝細胞膜表面上のＬＤＬ受容体はリガンドであるＬＤＬを結合した後、細胞内に取り込まれる（エンドサイトーシス）。エンドサイトーシス後、ＬＤＬ受容体はＬＤＬを細胞内に供給後、再び細胞膜表面上に局在する（リサイクリング）。この工程を繰り返して血中のコレステロール量を調節している。しかしながら、ＰＣＳＫ９が結合したＬＤＬ受容体は、エンドサイトーシス後、リソソームへ移行した後分解され、ＬＤＬ受容体のリサイクリング機構が働らなくなる。その結果、肝細胞膜上に発現するＬＤＬ受容体の量的異常がおこり、延いては血中ＬＤＬの取り込みが減少し、血中ＬＤＬコレステロールが上昇する。すなわち、ＰＣＳＫ９はＬＤＬ受容体の分解を促してＬＤＬコレステロール代謝に関与することが明らかにされている（非特許文献２：Lagace TA, et al. J Clin Invest, 2006;116:2995-3005、非特許文献３：Qian YW, et al., J Lipid Res, 2007;48:1488-1498、非特許文献４：Li J, et al. Biochem J, 2007;406:203-207、非特許文献５：Grefhorst A, et al. J Lipid Res, 2008;49:1303-1311）。
【０００５】
ヒトＰＣＳＫ９は全長６９２アミノ酸から成り、アミノ酸１−３０がｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（シグナルペプチド）、３１−１５２がｐｒｏ  ｄｏｍａｉｎ（プロドメイン）、１５３−４５２がｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ（プロテアーゼ触媒ドメイン）、４５３−６９２がＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ（Ｃ末端ドメイン）を形成している。
【０００６】
ヒトＰＣＳＫ９は、上記のシグナルペプチドが外れた約７４ｋＤａのｐｒｏＰＣＳＫ９（ＰＣＳＫ９前駆体）として、小胞体内にてＰＣＳＫ９自身のセリンプロテアーゼ活性によりアミノ酸配列１５２番目のグルタミンと１５３番目のセリンの間で自己分解を引き起こし、Ｎ末端側約１４ｋＤａのｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔ（プロセグメント）とＣ末端側約６０ｋＤａでプロテアーゼ触媒ドメインを含むｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ（成熟セグメント）に変換される。これら２種の断片はプロセグメントが成熟セグメントの活性中心を塞ぐように複合体（ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー）を形成した後、当該複合体としてゴルジ体へ移行し、細胞外へ分泌される（非特許文献１：Seidah NG, et al. Proc Natl AcadSci U S A, 2003;100:928-933、非特許文献６：Naureckiene S, et al. Arch Biochem Biophys, 2003;420:55-67、非特許文献７：Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2004;279:48865-48875）。
【０００７】
血中に分泌されたヘテロダイマーＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａに結合し上述のごとく当該受容体を分解へと誘導する。ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解促進はＰＣＳＫ９自身のプロテアーゼ活性（セリンプロテアーゼ活性）とは独立した現象であり、ＰＣＳＫ９の分子シャペロン的作用によりＬＤＬ受容体のリサイクリングを阻害する、すなわちリソソームへの誘導とも考えられているが、未だ結論に至っていない（非特許文献８：McNutt MC, et al. J Biol Chem, 2007;282:20799-20803）。
【０００８】
また、ＰＣＳＫ９はゴルジ体から細胞外へ分泌される過程において一部のＰＣＳＫ９が更に分解を受けることが報告されている。例えばヒトＰＣＳＫ９においては、プロ蛋白転換酵素Ｆｕｒｉｎ等の作用によりアミノ酸配列２１８番目のアルギニンと２１９番目のグルタミンの間におけるＰＣＳＫ９の切断が認められる。この作用によりＰＣＳＫ９ヘテロダイマーの成熟セグメントドメインは、Ｎ末端側約７ｋＤａのセグメント（７ｋＤａセグメント）とＣ末端側約５３ｋＤａのΔＮ２１８セグメント（５３ｋＤａセグメント）とに分解され、プロセグメントと成熟セグメントとのヘテロダイマー構造は崩壊する。分解後の断片（７ｋＤａセグメントと５３ｋＤａセグメント）も細胞外へ分泌される。Ｆｕｒｉｎによる分解を受けていないヘテロダイマーＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体に結合して上記のリサイクリングを阻害して、ＬＤＬ受容体を分解に導く働きがあるのに対し、Ｆｕｒｉｎによる分解を受けた非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９には、そのような働きがない（非特許文献９：Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2006;281:30561-30572）。
【０００９】
２００３年Abifadelらにより、ＰＣＳＫ９遺伝子が常染色体優性家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の第３の原因遺伝子であることが見出された(非特許文献１０：Abifadel M, et al. Nat Genet, 2003;34:154-156)。
【００１０】
ＰＣＳＫ９遺伝子の異常は、これまでに１００以上の変異が報告されており（http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/）、遺伝子異常によりＰＣＳＫ９の機能が亢進する、すなわちＬＤＬ受容体を分解促進する機能増強型変異（gain-of-function）と機能が喪失する、すなわちＬＤＬ受容体を分解を促進することができない機能喪失型変異（loss-of-function）の２通りが見つかっており、それぞれ高コレステロール血症と低コレステロール血症を呈することが明らかになっている。
【００１１】
ＰＣＳＫ９は、コレステロールや中性脂肪生合成に関わる遺伝子の発現を調節している転写因子ＳＲＥＢＰｓ（Sterol Regulatory Element-Binding Proteins：ステロール調節エレメント結合性タンパク質）の活性化により転写促進されることが報告されている（非特許文献１１：Maxwell KN, et al. J Lipid Res, 2003;44:2109-2019）。
【００１２】
すなわち、高コレステロール血症治療薬であるスタチン系薬剤はＳＲＥＢＰｓの活性化を介してＬＤＬ受容体の発現を誘導するが、同様の経路でＰＣＳＫ９も発現誘導される。このことから、ＰＣＳＫ９はスタチンのコレステロール低下作用に対して拮抗的に働くと考えられる（非特許文献１２：Dubuc G, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004;24:1454-1459）。すなわち、ＰＣＳＫ９はＦＨの病因となっているばかりでなく、高コレステロール血症治療における薬剤効果を減弱する作用がある。また、ＰＣＳＫ９の作用を阻害することによる高コレステロール血症治療薬のターゲット分子として阻害薬の開発も行われている（特許文献１〜５）。
【００１３】
このような背景のもと、本出願人は血液検体中のＰＣＳＫ９を当該成分に対する抗体を用いて定量し、当該定量値に基づいて高コレステロール血症を検出する、高コレステロール血症の検出方法、についての特許出願を行った（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２０１０−５３６３８４号公報
【特許文献２】特表２０１０−５２３１３５号公報
【特許文献３】特表２０１０−５０８８１７号公報
【特許文献４】特表２０１０−５０１９５２号公報
【特許文献５】米国公開２０１０／１６６７６８号公報
【特許文献６】特開２０１２−２３７７５２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Seidah NG,et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003;100:928-933
【非特許文献２】Lagace TA, et al. J Clin Invest, 2006;116:2995-3005
【非特許文献３】Qian YW, et al.,J Lipid Res, 2007;48:1488-1498
【非特許文献４】Li J, et al. Biochem J, 2007;406:203-207
【非特許文献５】Grefhorst A, et al. J Lipid Res, 2008;49:1303-1311
【非特許文献６】Naureckiene S, et al. Arch Biochem Biophys, 2003;420:55-67
【非特許文献７】Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2004;279:48865-48875
【非特許文献８】McNutt MC,et al. J Biol Chem,2007;282;20799-20803
【非特許文献９】Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2006;281:30561-30572
【非特許文献１０】Abifadel M, et al. Nat Genet, 2003;34:154-156
【非特許文献１１】Maxwell KN, et al. J Lipid Res, 2003;44:2109-2019
【非特許文献１２】Dubuc G, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004;24:1454-1459
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
図１は、特許文献６においても開示したＰＣＳＫ９（ヒト）の模式図であり、従来のＰＣＳＫ９についての認識を端的に表している。上記と重複するが、重要な前提であるので再び説明を行う。なお、図１の説明において同じ符合で「ドメイン」と「セグメント」の２種類の用語を用いることがあるが、「ドメイン」はＰＣＳＫ９において潜在的に認められる存在状態を重要視した表現であり、「セグメント」は現実に当該部分が他のＰＣＳＫ９の分子から分離された状態を重要視した表現である。
【００１７】
ヒトＰＣＳＫ９は全長６９２アミノ酸から成るペプチド（１）であり、アミノ酸１−３０がシグナルペプチド（１１）、３１−１５２がプロドメイン（１２）、１５３−４５２がプロテアーゼ触媒ドメイン（１３）、４５３−６９２がＣ末端ドメイン（１４）を形成している。図１（ａ）は、このペプチド（１）を示しており、ペプチド（１）はＰＣＳＫ９の生体内での最初の形態である「preproＰＣＳＫ９」（プレＰＣＳＫ９前駆体）である。プレＰＣＳＫ９前駆体は、その遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列（preproPCSK9、アミノ酸１−６９２）は公知である（NCBI リファレンス配列：NM_174936及びNP_777596：配列番号１及び２）。
【００１８】
次いで図１（ｂ）は、プレＰＣＳＫ９前駆体（１）の細胞外への分泌に働く、シグナルペプチド（１１）が外れた約７４ｋＤａのＰＣＳＫ９前駆体（２）の形成を示している。
【００１９】
このような形で生体内合成されＰＣＳＫ９前駆体（２）は、小胞体内にてＰＣＳＫ９自身のセリンプロテアーゼ活性によりアミノ酸配列１５２番目のグルタミンと１５３番目のセリンの間で自己分解を引き起こし、Ｎ末端側約１４ｋＤａのプロセグメント（１２）と、Ｃ末端側約６０ｋＤａでプロテアーゼ触媒ドメイン（１３）を含む成熟セグメント（１３・１４）に変換される。そして、これらの２種の領域［（１２）と（１３・１４）］は、プロセグメント（１２）が、成熟セグメント（１３・１４）の活性中心を塞ぐように非共有結合したヘテロダイマー構造のＰＣＳＫ９ヘテロダイマー（３）を形成した後、当該ヘテロダイマー（３）としてゴルジ体へ移行し、細胞外へ分泌される。図１（ｃ）は、このＰＣＳＫ９ヘテロダイマー（３）の形成を示している。ＰＣＳＫ９のプロドメインはプロテアーゼ活性の阻害因子としての働きがあり、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー（３）は蛋白質分解酵素（セリンプロテアーゼ）としては不活性型であるにもかかわらず、ＬＤＬ分解活性が認められる。血中に分泌されたこのＰＣＳＫ９ヘテロダイマー（３）は、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａに結合し当該受容体を分解へと誘導するのである。このようにＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解促進はＰＣＳＫ９自身のプロテアーゼ活性（セリンプロテアーゼ活性）とは独立した現象である。そしてこの現象が血中ＬＤＬコレステロール値の上昇を引き起こす要因となっている。
【００２０】
その一方でＰＣＳＫ９は、ゴルジ体から細胞外へ分泌される過程において、一部のＰＣＳＫ９が更に分解を受けることが報告されている。すなわち、プロ蛋白転換酵素Ｆｕｒｉｎ等の作用によりアミノ酸配列２１８番目のアルギニンと２１９番目のグルタミンの間で切断されるのである。この作用により成熟セグメント（１３・１４）が、Ｎ末端側約７ｋＤａの７ｋＤａセグメント（１５）とＣ末端側約５３ｋＤａの５３ｋＤａセグメント（ΔＮ２１８セグメント）（４）とに分解され、プロセグメント（１２）と成熟セグメント（１３・１４）とのヘテロダイマー構造が崩壊し、分解後の断片（７ｋＤａセグメント（１５）と５３ｋＤａセグメント（４））も細胞外へ分泌される。図１（ｄ）は、この最後の段階を図示したものである。５３ｋＤａセグメント（４）には、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーのようなＬＤＬ分解活性は認められない。
【００２１】
このように生体内で現実に血液中に存在するＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体の分解促進活性を有する図１（ｃ）のＰＣＳＫ９ヘテロダイマー（３）、又は、同分解促進活性が失われた当該ヘテロダイマーの分解後の５３ｋＤａセグメント（４）、７ｋＤａセグメント（１５）、及び、プロセグメント（１２）のみであると認識されていた。すなわち、図１（ｃ）のＰＣＳＫ９ヘテロダイマーからプロドメイン（１２）のみが外れた「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」は、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー（３）の酸処理等により実験室のin vitro系の中でのみ存在するだけで、少なくともヒト血中には存在しないものと認識されていた。
【００２２】
ＰＣＳＫ９の生体内の振る舞いについてのさらなる検討を行い、その本質に迫り、診断・医学分野の進歩に貢献する途を提供することが、本発明に想到するきっかけとなる初発の課題であったが、その時点では後述する本発明の内容については全く予想することができなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、特許文献６において開示された３種類のＰＣＳＫ９の検出系、すなわち、「全ＰＣＳＫ９検出系」、「ヘテロダイマー特異的検出系」、及び、「非ヘテロダイマー特異的検出系」にて血清検体を測定したところ、一部に「ヘテロダイマー低値かつ非ヘテロダイマー高値」の検体が見出された。当時の技術常識に従い、当該非ヘテロダイマー成分は、上記の５３ｋＤａセグメント（４）であろうと考えられた。それを確認するため、非ヘテロダイマー特異抗体［Ｂ１Ｇ：５３ｋＤａセグメント（４）、及び、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の双方に反応する］を用い、上記の血清検体に対して免疫沈降を行い、非ヘテロダイマー成分の分子量を確認したところ、技術常識に基づく予想とは全く異なり、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）であることが確認された。上述したように、ＰＣＳＫ９はヒトの脂質代謝において重要な役割を有することが知られており、この「血中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」の存在もまたヒトの脂質代謝において重要な意義を有するものと考えられる。
【００２４】
この驚くべき結果から、新たに認識された「血中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」の脂質代謝において予想される重大な役割を鑑みて、本発明者は「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａＰＣＳＫ９には交差反応しない新規の抗体（以下、本発明の抗体ともいう）」を作出した。これの詳細に関しては後述する。
【００２５】
そして、このモノクローナル抗体を用いてヒトの血液検体における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の存在をより直接的に検討したところ、ヒト血中において確かに「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」が存在することが見出された。
【００２６】
これも後述するように、「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」は「Ｆｕｒｉｎによる分解を受けたＰＣＳＫ９（５３ｋ）」と同様に、ＬＤＬ受容体を分解する働きは減弱していることが、本発明者により確認された。よって、この血中の「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」の値が高く、ヘテロダイマー型のＰＣＳＫ９が少なければ、ＬＤＬの分解処理がなされる最初のステップにかかわるＬＤＬ受容体は分解され難くなっており、その結果としてＬＤＬ血中コレステロール値は低下することが予想される。また上述のように、ヘテロダイマー型のＰＣＳＫ９は高コレステロール血症治療剤であるスタチン系薬剤の投与に伴って増加する傾向が認められ、これが当該治療剤治療の抵抗となっている。これに対してヘテロダイマー型のＰＣＳＫ９からプロセグメントを解離させることが可能な薬剤が提供されれば、それ自体が高コレステロール血症治療剤となるばかりか、スタチン系薬剤の増強薬としても用いることが可能であることが予想される。
【００２７】
本発明は、上記のようなプロセグメントを解離させる治療薬の開発過程において、当該解離作用を有する候補物質を選別することを可能とする、ＰＣＳＫ９の測定方法を提供する。また、そのような治療剤の効果を臨床の場においてモニタリングすることを可能とする、ＰＣＳＫ９の測定方法を提供する。
【００２８】
具体的には本発明は、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーをプロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に分解する被験薬剤の試験系において、当該薬剤の使用前と使用後の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率を求めることを特徴とする、ＰＣＳＫ９の測定方法（以下、本発明の測定方法ともいう）を提供する発明である。
【００２９】
この本発明の測定方法は、後述するように新規の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異的な抗体を用いて行うことが可能であり、当該抗体はモノクローナル抗体であることが好適である。
【００３０】
本発明の測定方法は、臨床の場、又は、in vivo試験の場で用いる場合、すなわち、「ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを、プロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に分解する働きを行ったか否か」について検証を行う場合には、血液検体を用いて行うことが好適である。血液検体としては、全血、血清、血漿等があるが、血清又は血漿を用いることが好ましく、さらに血清が特に好ましい。さらに創薬の基礎実験において、薬剤のスクリーニングを行う場合、すなわち、「ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを、プロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に分解する働きを有するか否か」について検証を行う場合には、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーが添加された溶媒系を用いることができる。
【００３１】
６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の上記したような存在意義に基づけば、被験薬剤を有効とする判定は、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率の当該薬剤の使用後における上昇に伴ってなされるものである。
【００３２】
ＰＣＳＫ９は、ヒト以外にもカニクイザル(Frank-Kamenetsky M,et al.,Proc.Natl.Acad Sci U.S.A,2008;105;11915-11920)、マウス（非特許文献２）、ラット(Persson L,et al.,Endocrinology,2009;150:1140-1146)等の哺乳動物においてヒトと同様の生理活性を有することが報告されている（ただし、種間のアミノ酸配列は異なることが原則である。例えば、ヒト／マウス間のＰＣＳＫ９のアミノ酸配列のホモロジーは７６％である）。上述した本発明における「ＰＣＳＫ９」とは、これらの哺乳動物全般に認められるＰＣＳＫ９を網羅するものであるが、ヒトＰＣＳＫ９が主要な本発明の対象である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーをプロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に分解する作用を有する薬剤を開発段階において選別する際に、又は、当該作用薬の臨床における効果をモニタリングする際に用いられる、ＰＣＳＫ９の測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＰＣＳＫ９についての従来からの認識内容を示す概略図である。
【図２】ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９のＦｕｒｉｎ処理による切断の内容を検討した結果を示す電気泳動図面である。
【図３】ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の精製の結果を示す電気泳動図面である。
【図４】精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動による純度の確認の結果を示す図面である。
【図５】ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を検討した結果を示す電気泳動図面である。
【図６】免疫沈降法による、取得された各モノクローナル抗体のＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を検討した結果を示す電気泳動図面である。
【図７】６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異的なモノクローナル抗体（８Ｈ９）の反応性を示す、ウェスタンブロット法による電気泳動図面である。
【図８】６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異的なモノクローナル抗体（８Ｈ９）について、Ｆｕｒｉｎ処理による特異性の確認を行った結果を示すウェスタンブロット法による電気泳動図面である。
【図９】６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異的なモノクローナル抗体（８Ｈ９）について、免疫沈降法による特異性の確認を行った結果を示す電気泳動図面である。
【図１０】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系（Ａ系、Ｂ系、Ｃ系）の説明図である。
【図１１】実施例において用いた血清サンプル（１〜１１）におけるＰＣＳＫ９についての免疫沈降を行った結果を示す電気泳動図面である。
【図１２】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系（Ａ系、Ｂ系、Ｃ系）における検量線を示した図面である。
【図１３】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系（Ａ系、Ｂ系、Ｃ系）による血清サンプルに対する希釈直線性を示した図面である。
【図１４】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系（Ｄ系）における検量線を示した図面である。
【図１５】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系（Ｄ系）による血清サンプルに対する希釈直線性を示した図面である。
【図１６】ヒト血清における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の存在を示す、モノクローナル抗体８Ｈ９を用いた免疫沈降法に基づく電気泳動図面である。
【図１７】ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ受容体の分解活性を、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）において比較検討した結果を示す図面である。
【図１８】ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを分解する薬剤のスクリーニングに本発明の測定方法を用いる場合の有用性を検討した結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１．本発明の抗体
本発明の測定方法では、試験系中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を定量することが必要となる。この場合、ＰＣＳＫ９の中でも６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に対して特異的な抗体を用いることによる、直接的な測定が効率的である。具体的には、「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａセグメントには交差反応しない抗体」（本発明の抗体）である。また、本発明の抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であるが、モノクローナル抗体であることが好適であり、かつ、現実的である。モノクローナル抗体は特定の抗原決定基のみであり、所望の性質を有する抗体の抗原決定基が限定されたものだからである。
【００３６】
本発明の抗体の製造方法は、常法に従って行うことが可能であるが、抗原としてのＰＣＳＫ９の全部又は一部が必要である。ＰＣＳＫ９の入手法は、生体材料からの天然蛋白質や細胞株が自然発現している蛋白質を用いることも可能であるが、実質的には蛋白工学的手法を用いてＰＣＳＫ９の組み換え（リコンビナント）蛋白質を製造することにより入手する。当該組み換え蛋白質は、上述したＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列を参考にして、遺伝子増幅用プライマーを調製し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、ＰＣＳＫ９遺伝子を遺伝子増幅産物として得ることができる。そして、これを組み込んだ発現ベクターを細胞等に導入することにより得た強制発現細胞より産生されるＰＣＳＫ９組み換え蛋白質を、通常公知の精製法により精製することにより、ＰＣＳＫ９に対する抗体を製造するための抗原として用いることが可能な、ＰＣＳＫ９組み換え蛋白質とすることができる。また、上記のＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列を一部改変した、ＰＣＳＫ９一部改変遺伝子がコードする改変組み換え蛋白質も、ＰＣＳＫ９に対する抗原としての性質を失わない限り可能である。ここで使用される抗原としてのＰＣＳＫ９は、必ずしもＰＣＳＫ９の全部である必要はなく、その一部の断片ペプチドであってもよい。特に所望の性質を有する抗体の抗原決定基は、図１（ｄ）のＮ末端側約７ｋＤａセグメント（１５）（アミノ酸配列番号１５３〜２１８番）の中にあるため、少なくとも当該約７ｋＤａセグメントを免疫原として選択することが合理的である。このような予め絞り込まれた免疫原を用いることにより、本発明の抗体の製造をより効率的に行うことが可能となる。ＰＣＳＫ９の一部の断片ペプチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子の一部断片を発現させたＰＣＳＫ９断片や、ＰＣＳＫ９のプロテアーゼ処理物、ホスファイト−トリエステル法(Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984)) 等を用いた固相法や液相法による化学合成ペプチド等を抗原として用いることができる。
【００３７】
このようにして得られるＰＣＳＫ９において、特に、免疫抗原として用いるＰＣＳＫ９が小分子の一部ペプチドである場合には、抗原の免疫原性を向上させるために、ハプテンを結合させることができる。ハプテンとしては、通常はハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、傘貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
【００３８】
免疫は一般的方法により、例えば、上記免疫抗原を、免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
【００３９】
ポリクローナル抗体は、ＰＣＳＫ９分子のうち上記７ｋＤａセグメントの全部又は一部を免疫抗原として、免疫した動物に由来する免疫血清から製造することができる。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体は、ＰＣＳＫ９分子の全部又は一部により免疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これにより所望の性質を有する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより製造することができる。
【００４１】
上述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、公知技術、例えば、Nature 1992 Mar12;356, p152-154やJ.Immunol Methods Mar 1;249, p147-154を参考に、遺伝子免疫によっても調製が可能である。具体的にはＰＣＳＫ９分子の全部又は一部をコードする遺伝子を発現するベクターを直接動物に免疫する事によって製造することができる。
【００４２】
また、免疫される動物も特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等を広く用いることができるが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００４３】
より具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に７〜２１日毎を目安に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞や腹水を得ることができる。
【００４４】
モノクローナル抗体を作製する場合、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、安藤民衛、千葉  丈、共著、「単クローン抗体実験操作入門」講談社（１９９１年）や、EdHarlow and David Lane,“Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に従い作製することができる。
【００４５】
本発明の抗体に備わるべき「所望の性質」とは、上記したように「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａセグメントには交差反応しない」ことであるが、抗原決定基が上記の７ｋＤａセグメントに存在することにより、５３ｋＤａセグメントには抗原決定基は存在しないゆえに交差反応はせず、５３ｋＤａセグメントのＮ末端側に上記の７ｋＤａセグメントが結合した６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）には反応する。これに加えて、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーはアミノ酸配列１８６番目（７ｋＤａセグメント領域内）のアスパラギン酸、２２６番目のヒスチジン、及び、３８６番目のセリンにより構成されるセリンプロテアーゼ活性中心をプロセグメントが塞ぐように形成されているため、７ｋＤａセグメント領域内とプロセグメントにより立体構造的に被覆される部分に抗原決定基を持つ抗体は、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに結合することは困難となる。
【００４６】
上述した操作により、モノクローナル抗体を産生するクローンが得られた後、これらから所望の性質を有するモノクローナル抗体を産生するクローンをスクリーニングすることが必要である。この抗体のスクリーニングは常法、すなわち免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。これらの方法はいずれも蛋白工学的な手法により製造したＰＣＳＫ９の種々の形態と、各々のクローンから得られたモノクローナル抗体との反応性を検討して、当該モノクローナル抗体が所望の性質を有するか否かの判断をするための方法である。具体的には、下記（１）〜（３）の性質を有するモノクローナル抗体の産生クローンを、本発明のモノクローナル抗体の産生クローンとして選択することができる。加えて、下記（１）〜（３）の性質を有するポリクローナル抗体は、本発明の抗体として用いることができる。
（１）７ｋＤａセグメントとは結合するが、これが分離した５３ｋＤａセグメントとは結合しない。
（２）プロセグメントが結合したＰＣＳＫ９ヘテロダイマーには結合しない。
（３）プロセグメント非結合の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）には結合する。
【００４７】
このようにして選択されたクローンから産生されるモノクローナル抗体、ないし、ポリクローナル抗体は、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異反応性を有する本発明の抗体として用いることができる。
【００４８】
さらに、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に特異反応性を有する本発明の抗体に、必要に応じて標識処理、すなわち、酵素標識処理、蛍光標識処理、アイソトープ標識処理等を、常法に従い行うことができる。
【００４９】
後述するように、試験系中における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を捕捉し得る抗体は、固相に固定化された固定化抗体として用いられるのが、好適な態様の一つである。
【００５０】
固相としては、例えば、マイクロプレートやビーズ（アガロースゲルやセファロースゲル、ラテックス粒子、磁性粒子等）、等が挙げられる。
【００５１】
固定化方法は、固相の種類に応じた抗体の固定化方法における常法に従い行うことができる。
【００５２】
例えば、マイクロプレートに対しては、常法に従った物理的な非特異的吸着法を行うことにより、抗体の固定化を行うことができる。また、ビーズに対しても、常法に従って固定化を行うことができる。例えば、化学的な架橋剤を用いた固定化や、ビオチン−アビジンのような他の物質間の親和性を利用して、予め化合物で抗体を標識し、その化合物に親和性のある固定化された蛋白質等を用いた固定化法、固定化された抗イムノグロブリン抗体やプロテインＡ等の抗体に親和性のある蛋白質を用いた固定化法等を行うことにより、抗体の固定化を行うことができる。
【００５３】
２．本発明の測定方法
本発明の測定方法は、上述したように試験系における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を測定することを要旨とする方法であるが、大きく分けて２種類の目的がある。
【００５４】
本発明の測定方法の第一の目的は、創薬における薬剤のスクリーニングである。この場合、予め人工的なＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを蛋白工学的手法により調製し、これを適切な溶媒系に添加して、被験薬剤の添加前のＰＣＳＫ９ヘテロダイマーと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の比率を測定する。次いで、当該試験系に被験薬剤を添加してインキュベーション後の当該比率を測定する。当該比率において被験薬剤添加後の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の比率が有意に増加していれば、被験薬剤はＰＣＳＫ９ヘテロダイマーからプロセグメントを解離させる作用を有しており、所望する脂質代謝改善剤の候補として挙げることが可能となる。
【００５５】
この溶媒を用いる形態で本発明の測定方法により薬剤スクリーニングを行う場合には、溶媒環境として、（１）「ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーと候補薬剤の反応を行う」第１溶媒環境、及び、（２）「候補薬剤との反応後における定量を行うための反応（抗原抗体反応等）」第２溶媒環境、が用いられる。第１溶媒環境においては、候補薬剤無しでＰＣＳＫ９ヘテロダイマーが解離又は変性する溶媒環境は好ましくない。第２溶媒環境においては、抗原抗体反応等の定量シグナルの基となる反応を阻害する溶媒環境は好ましくない。また、可能な限り第１溶媒環境と第２溶媒環境は類似する環境であることが好適である。第１溶媒環境と第２溶媒環境が異なる場合には、例えば第１溶媒環境におけるＰＣＳＫ９ヘテロダイマーの濃度を高めに設定し、これを第２溶媒環境において希釈することにより行うことが可能となる。この希釈倍率は、１０〜１００倍程度であることが好適である。
【００５６】
第１溶媒環境と第２溶媒環境を通じて、用いられる溶媒や緩衝液は、この条件を満たす限り特に限定されない。具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Tris-HCl、HEPES等が挙げられる。
【００５７】
溶媒環境のｐＨは５以上であることが必要である。これは第１溶媒環境の「ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーが解離しないための条件」である。スクリーニングの対象薬剤は医薬であるから、生理的条件に近いｐＨ６．５〜７．５程度が好適である。さらに溶媒環境の温度は、凍結しない４℃以上、上限はＰＣＳＫ９ヘテロダイマーが熱変性しない範囲又は候補薬剤が失活しない範囲であるが、生理的条件に近い３０〜４０℃程度が好適である。
【００５８】
第１溶媒環境におけるＰＣＳＫ９ヘテロダイマーの濃度は、用いる定量方法で検出可能な濃度である。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡであれば、１ｎｇ／ｍＬ程度が下限である。ただし、第２溶媒環境における希釈を考慮すると、この１０倍程度の濃度は必要となる。好適な濃度はヒト血清中のＰＣＳＫ９の濃度である１００〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。
【００５９】
本発明の測定方法の第二の目的は、投与した薬剤の有効性のチェックである。この場合、上記のスクリーニング等より開発されたＰＣＳＫ９ヘテロダイマーからプロセグメントを解離させる作用を有する脂質代謝改善剤の投与前後の、被験者の血液検体における上記のＰＣＳＫ９ヘテロダイマーと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の比率を測定する。当該薬剤投与前よりも投与後の当該比率における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の比率の方が有意に高い場合に、当該薬剤が有効であることを示す指標となる。
【００６０】
このように、溶媒系中又は血中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を測定することが可能な本発明の測定方法は、非常に重要な意義を有している。
【００６１】
６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の測定は、上述した本発明の抗体を用いて、それと試験系における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）との抗原抗体反応を利用する検出手段を用いて行うことが好適である。具体的には、例えば、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、免疫クロマトグラフィー法、ラテックス凝集比濁法、免疫沈降法等を利用した解析法等を例示することができる。これらの検出手段の中でも、その定量性と検出感度、安全性、簡便性、さらには、正確性ゆえに、ＥＬＩＳＡ法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を選択することが好適である。また、蛍光や化学発光等を検出に利用した免疫測定（ＦＥＩＡ，ＣＬＩＡ，ＣＬＥＩＡ，ＥＣＬＩＡ）法等も好適である。
【００６２】
検出手段がＥＬＩＳＡ法である場合には、例えば、マイクロプレートに固定化した本発明の抗体に、血液検体又は被験溶媒（以下、試験系溶媒と総称することもある）を接触させて、試験系溶媒中の可溶性６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を固定化抗体に結合させ、この固相に結合した可溶性６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を、酵素標識した別のＰＣＳＫ９に対する抗体等を用いて検出することにより、本発明の測定方法を構成する、試験系中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の定量を行うことができる。また、固定化抗体と試験系溶媒及び酵素標識抗体を同時に反応させて検出することも可能である。
【００６３】
また、検出手段として、免疫沈降法を利用する場合には、例えば、ビーズに固定化した本発明の抗体に、試験系溶媒を接触させて６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を固定化抗体に結合させ、この固相に結合した６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を分離して、この分離物から６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を検出することにより、試験系溶媒における６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の定量を行うことができる。この６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の免疫沈降法による検出手段は、例えば、前記の分離物に対して電気泳動を行って、この電気泳動パターンの転写物に、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に対する標識抗体を作用させて、可溶性６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）のバンドを検出する、ウェスタンブロット法を挙げることができる。
【００６４】
定量手段として、ラテックス凝集比濁法を用いることも可能である。例えば、ラテックス粒子に結合させた６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に対する抗体に、試験系溶媒を接触させて、液相中で抗原抗体反応による免疫複合体の凝集塊を形成させ、その濁度の変化を測定することにより、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の定量を行うことができる。
【００６５】
またＰＣＳＫ９ヘテロダイマーの定量は、本発明の抗体に代えて、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに対して特異的な抗体、すなわち、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに対しては反応するが、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）及び５３ｋＤａセグメントには交差反応しない抗体を用いることにより行うことができる。
【００６６】
上述した通りに本発明の測定方法におけるＰＣＳＫ９の定量は、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の定量ステップ（１）、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーの定量ステップ（２）、の定量ステップにより行われる。これらの定量ステップ（１）（２）は、共通の検体又は溶媒系において行われるが、各々の定量ステップ自体は別個に行われることが好適である。例えば、薬剤のスクリーニングを行う場合のこれらの定量ステップ（１）（２）は、共通の上述した第１溶媒環境における候補薬剤との接触後、好適には同条件の第２溶媒環境において別個に行われることが好適である。
【００６７】
本発明の測定方法を行う場合の好適な定量手段の一つであるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いる場合、前記の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の定量ステップ（１）は、上述したように固相抗体として本発明の抗体を用い、検出抗体として６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とも５３ｋＤａセグメントとも結合する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、逆に固相抗体として６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とも５３ｋＤａセグメントとも結合する抗体を用い、検出抗体として本発明の抗体を用いることもできる。また、同定量ステップ（２）は、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに対して結合するが、非ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体を固相抗体として用い、検出抗体として６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とも５３ｋＤａセグメントとも結合する抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、逆に固相抗体として６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とも５３ｋＤａセグメントとも結合する抗体を用い、検出抗体としてＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに対して結合するが、非ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことも可能である。
【００６８】
このようにして、試験系溶媒中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー又は全ＰＣＳＫ９に対する比率を測定することにより、当該測定値を指標として、（１）上記した被験薬剤のスクリーニング、及び、（２）ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）化する薬剤の有効性の判断、を行うことができる。
【００６９】
本発明は、本発明の測定方法を行うためのキットを提供する。すなわち、本発明は、上記の検出を行うための要素を含むキット（以下、本発明のキットともいう）を提供する発明でもある。
【００７０】
本検出用キットには、最低限、本発明の抗体が要素として含まれる。
【００７１】
例えば、定量手段が、ＥＬＩＳＡ法の場合には、固相に固定化された又は固定化するための本発明の抗体を用いる第１抗体、及び／又は、この固定化第１抗体が認識するエピトープとは別の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）分子内エピトープを認識する検出用の第２抗体が、ＥＬＩＳＡ法の本発明のキットに要素として含まれることが好適である。また、この第１抗体と第２抗体を入れ替えて用いることもできる。そして、これに加えてＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを特異的に定量するための、固相に固定化された又は固定化するためのＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに対して特異的な第１抗体、及び／又は、この固定化第１抗体が認識するエピトープとは別のＰＣＳＫ９ヘテロダイマー分子内エピトープを認識する検出用の第２抗体が、当該本発明のキットに要素として含まれることも好適である。また、この第１抗体と第２抗体を入れ替えて用いることもできる。さらに、第２抗体を検出するための検出試薬、ブロッキング液、希釈液、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）標準品等を、ＥＬＩＳＡ法の本発明のキットの要素として含めることも好適である。
【００７２】
定量手段が、ラテックス凝集反応を利用した解析法では、ラテックス粒子に結合させた本発明の抗体が、本発明のキットに要素として含まれることが好適である。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例により、具体的に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲は限定されない。なお、後述する５種類のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマについては、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおいて寄託を行っている。すなわち、モノクローナル抗体「１ＦＢ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-1FBは受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０９として、モノクローナル抗体「Ｂ１Ｇ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-B1Gは受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１１０として、モノクローナル抗体「Ｂ１２Ｅ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-B12E」は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１１１として、モノクローナル抗体「Ｇ１２Ｄ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-G12D」は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１１２として、及び、モノクローナル抗体「８Ｈ９」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-8H9」は受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１５８２として、上記寄託機関において受領されている。
【００７４】
なお、本実施例の記載において「ＰＣＳＫ９」と記載されたものは、特に断りのない限りは「ヒトＰＣＳＫ９」を意味するものとする。
【００７５】
１．リコンビナントＰＣＳＫ９の作製
（１）リコンビナントヒト全長ＰＣＳＫ９の調製
ＨｅｐＧ２細胞由来の全ＲＮＡより、ヒトＰＣＳＫ９全長（アミノ酸番号１−６９２）に相当する相補鎖ＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、pEF321ベクター (Kim DW, Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)に組み込み、発現ベクターpEF/PCSK9を作製した。なお、上記ＰＣＲは、金属アフィニティー精製のために蛋白質のC末端にヒスチジン6残基が融合する形で発現するようプライマー配列を設定した（下記）。当該ＰＣＲの熱サイクルは、95℃ 5分の変性処理を行った後、「94℃ 1分 → 65℃ 2分 → 72℃ 5分 → 65℃ 1分」を35サイクル行い、最後に65℃ 7分の反応を行った。
【００７６】
増幅用プライマーとしては、
「gacgaattccagcgacgtcgaggcgctcatggttg」（フォワードプライマー：配列番号３）、
「gacgaattctcagtgatggtgatggtgatgctggagctcctgggaggcctgcgcc」（リバースプライマー：配列番号４）
を用いた。
【００７７】
発現ベクターｐＥＦ／ＰＣＳＫ９、及びネオマイシン耐性遺伝子発現ベクターｐＳＶ２Ｎｅｏ（クローンテック社製）を哺乳類動物細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（理研）に共導入し、ゲネティシン（シグマ社製）による選別を繰り返し行い、安定的にリコンビナントヒトＰＣＳＫ９（ｒｈＰＣＳＫ９）を発現するクローンＣＨＯ−Ｋ１／ＰＣＳＫ９細胞を作製した。
【００７８】
このＣＨＯ−Ｋ１／ＰＣＳＫ９細胞を無血清・低蛋白質培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（インビトロジェン社製）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、培養上清を回収した。さらに、培養上清５００ｍＬはＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ（クローンテック社製）６ｍＬと混合し、４℃で一晩反応させた。ＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎをカラムに充填し、５０ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、続いて１０ｍＬの２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で洗浄し、２０ｍＬの２００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。次いで、この溶出液を予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（０．６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）カラムにアプライし、５ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、次いで１．５ｍＬの１００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、３ｍＬの２００ｍＭ  塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。この溶出画分を精製ｒｈＰＣＳＫ９とした。
【００７９】
後述の「２（６）モノクローナル抗体のＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性」において言及するように、プロセグメントに対する抗体（Ｇ１２Ｄ）を用いた免疫沈降を行うと、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９では成熟セグメント（６０ｋＤａ）が免疫沈降するのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９では成熟セグメント（５３ｋＤａ）は免疫沈降しない。このことからＦｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９、すなわち上記の精製ｒｈＰＣＳＫ９は、ヘテロダイマーを形成していることが明らかとなっている。
【００８０】
なお、特許文献６に開示された実施例（特許文献６段落［００６７］）において、上記精製ｒｈＰＣＳＫ９に対してＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ったところプロセグメントは外れた形で存在する旨が開示されているが、これはＳＤＳが強力は蛋白変性剤であるためにプロセグメントと６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）を結合させている非共有結合が外れた結果であると考えられる。
【００８１】
（２）リコンビナントヒトΔＮ２１８ＰＣＳＫ９（５３ｋＤａセグメント）の調製
ΔＮ２１８ＰＣＳＫ９（アミノ酸番号２１９−６９２）に相当する相補鎖ＤＮＡをｐＥＦ／ＰＣＳＫ９を鋳型としたＰＣＲによって増幅し、ｐＥＦ３２１ベクター(Kim DW, Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)に組み込み、発現ベクターｐＥＦ／ΔＮ２１８ＰＣＳＫ９を作製した。当該ＰＣＲの熱サイクルは、９４℃・３０秒の変性処理を行った後、「９８℃・１０秒  →６０℃・５秒  →７２℃・１．５分」を２３サイクル行い、最後に７２℃・２分の反応を行った。
【００８２】
増幅用プライマーとしては、
「agtcaagcttcaggccagcaagtgtgacagtcat」（フォワードプライマー：配列番号５）、
「agtagtcgacctggagctcctgggaggcctg」（リバースプライマー：配列番号６）
を用いた。
【００８３】
発現ベクターｐＥＦ／ΔＮ２１８ＰＣＳＫ９を上述と同様に、哺乳類動物細胞株ＣＨＯ−Ｋ１に導入し、リコンビナントΔＮ２１８ＰＣＳＫ９を安定的に発現するクローンＣＨＯ−Ｋ１／ΔＮ２１８ＰＣＳＫ９細胞を作製した。
【００８４】
この細胞は１５ｃｍφディッシュで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）処理にて細胞を回収し、遠心操作によりＰＢＳにて洗浄した。洗浄後、細胞は１×Complete mini EDTA-free（ロシュ社製）及び１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０含有トリス緩衝液（ＴＢＳ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に懸濁し、氷中で３０分冷却した。次いで、細胞懸濁液を遠心（１５０００rpm、４℃、２０分）し、上清を回収した。この上清画分をリコンビナントΔＮ２１８ＰＣＳＫ９（ｒｈΔＮ２１８ＰＣＳＫ９）含有細胞ライセートとした。
【００８５】
（３）リコンビナントヒトΔＮ１５２  ＰＣＳＫ９の調製
後述するモノクローナル抗体８Ｈ９の特異性を免疫沈降によって確認するために、ヒトＰＣＳＫ９のアミノ酸配列番号（１５３−６９２）の部分によりなるセグメントを調製した。
【００８６】
具体的には、ΔＮ１５２ＰＣＳＫ９（アミノ酸配列番号１５３−６９２）に相当する相補鎖ＤＮＡを、全長ＰＣＳＫ９の相補鎖ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって増幅し、ｐＥＦ３２１ベクター(Kim DW, Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)に組み込み、発現ベクターｐＥＦ／ΔＮ１５２ＰＣＳＫ９を作製した。当該ＰＣＲの熱サイクルは、９４℃・３０秒の変性処理を行った後、「９８℃・１０秒  →６０℃・５秒  →７２℃・１．５分」を２３サイクル行い、最後に７２℃・２分の反応を行った。
【００８７】
増幅用プライマーとしては、
「agtcaagcttagcatcccgtggaacctggagcgga」（フォワードプライマー：配列番号７） 
「agtagtcgacctggagctcctgggaggcctg」（リバースプライマー：配列番号６）を用いた。
【００８８】
発現ベクターｐＥＦ／ΔＮ１５２ＰＣＳＫ９を上述と同様に、哺乳類動物細胞株ＣＨＯ−Ｋ１に導入し、リコンビナントΔＮ１５２ＰＣＳＫ９を安定的に発現するクローンＣＨＯ−Ｋ１／ΔＮ１５２ＰＣＳＫ９細胞を作製した。
【００８９】
この細胞は１５ｃｍφディッシュで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）処理にて細胞を回収し、遠心操作によりＰＢＳにて洗浄した。洗浄後、細胞は１×Complete mini EDTA-free（ロシュ社製）及び１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０含有トリス緩衝液（ＴＢＳ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に懸濁し、氷中で３０分冷却した。次いで、細胞懸濁液を遠心（１５０００rpm、４℃、２０分）し、上清を回収した。この上清画分をリコンビナントΔＮ１５２ＰＣＳＫ９（ｒｈΔＮ１５２ＰＣＳＫ９）含有細胞ライセートとした。
【００９０】
（４）Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９（実質上は５３ｋＤａセグメントに相当する）の調製
２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）液中で、上述の精製ｒｈＰＣＳＫ９  １μｇとリコンビナントヒトＦｕｒｉｎ（Ｒ＆Ｄ社）を混合し、３７℃で６時間反応させた。その後、１μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加え、反応を停止した。この反応液をＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９溶液とした。
【００９１】
Ｆｕｒｉｎ処理によるｒｈＰＣＳＫ９の切断は、以下のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法により確認した。Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９及びＦｕｒｉｎ処理ｒｈＰＣＳＫ９(２０ｎｇ）をそれぞれ還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１%  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬペルオキシダーゼ標識抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（Ｒ＆Ｄ社製）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した(図２)。
【００９２】
その結果、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９は分子量約６０ｋＤａのバンド（６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に相当する）が検出されるのに対し、Ｆｕｒｉｎ処理ｒｈＰＣＳＫ９はそのほとんどが分子量約５３ｋＤａのバンド（５３ｋＤａセグメントに相当する）が検出された。詳細には、５３ｋＤａセグメント、７ｋＤａセグメント、プロセグメント、及び、残存ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーの混合物であるが、９０％以上が５３ｋＤａセグメントである。
【００９３】
よって上記のＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９溶液を、５３ｋＤａセグメント含有溶液とした。
【００９４】
（５）ｒｈＰＣＳＫ９非ヘテロダイマー６０ｋＤａの調製
（５）−１  プロセグメントに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて、本発明の標準物質を生産する方法
＜ｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー含有培養上清の調製＞
上述したＣＨＯ−Ｋ１／ＰＣＳＫ９細胞を無血清・低蛋白質培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ II（インビトロジェン社製）にて３７℃で５％ＣＯ２で培養し、ｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー含有培養上清を回収した。
【００９５】
＜抗プロセグメント抗体Ｇ１２Ｄ結合セファロース（Ｇ１２Ｄ−seph）の作製＞
ＮＨＳ−activated Sepharose（ＧＥヘルスケア社製）０．５ｍＬをカラムに充填し、１ｍＭ  ＨＣｌ  １０ｍＬで洗浄した。次いで、５００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したＧ１２Ｄ溶液６ｍＬと混合し、室温で２時間反応させた。反応後のセファロースをカラムに充填し、５ｍＭの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）で洗浄した。次いで５ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄後、１ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、４℃で一晩反応させた。反応後のセファロースをカラムに充填し、１．５ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄後、１．５ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した。この２種類の緩衝液による洗浄を６回繰り返した後、５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、Ｇ１２Ｄ−sephとした。
【００９６】
＜ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の精製＞
上記培養上清３００ｍＬに１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１８ｍＬ添加し、培養上清のｐＨを４．０に調整後、室温下で１時間放置し、ヘテロダイマーを解離させた。２M  Ｔｒｉｓを２７ｍＬ添加し、培養上清をｐＨ８．０に調整後、ＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ（クローンテック社）７ｍＬと混合し、４℃で一晩反応させた。このＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎをカラムに充填し、３５ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、続いて１０ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、２０ｍＬの２００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。次いでこの溶出液を予め２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Sepharose ＣＬ−６Ｂ  ０．６ｍＬ（ＧＥヘルスケア社せ）を充填したカラムにアプライし、５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、次いで２ｍＬの１００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２ｍＬの１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。次いで、この溶出液を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＧ１２Ｄ−seph  ０．１ｍＬを充填したカラムにアプライし、通過画分を精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とした。
【００９７】
精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、ゲルを銀染色によりバンドを検出し、精製純度を確認した（図３）。
【００９８】
（５）−２  ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて、本発明の標準物質の本質成分を生産する方法
＜抗６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）抗体８Ｈ９結合セファロース（８Ｈ９−seph）の作製＞
ＮＨＳ−activated Sepharose（ＧＥヘルスケア社製）０．５ｍＬをカラムに充填し、１ｍＭ  ＨＣｌ  １０ｍＬで洗浄した。次いで、５００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した８Ｈ９溶液６ｍＬと混合し、室温で２時間反応させた。反応後のセファロースをカラムに充填し、５ｍＭの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）で洗浄した。次いで５ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄後、１ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、４℃で一晩反応させた。反応後のセファロースをカラムに充填し、１．５ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄後、１．５ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した。この２種類の緩衝液による洗浄を６回繰り返した後、５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、８Ｈ９−sephとした。
【００９９】
＜ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の精製＞
上記培養上清３００ｍＬに１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１８ｍＬ添加し、培養上清のｐＨを４．０に調整後、室温下で１時間放置し、ヘテロダイマーを解離させた。２M  Ｔｒｉｓを２７ｍＬ添加し、培養上清をｐＨ８．０に調整後、ＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ（クローンテック社）７ｍＬと混合し、４℃で一晩反応させた。このＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎをカラムに充填し、３５ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウム含有２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、続いて１０ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、２０ｍＬの２００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。
【０１００】
この溶出液に８Ｈ９−seph  ０．５ｍＬを混合し、室温で１時間緩やかに転倒混和した。次いで８Ｈ９−sephをカラムに充填し、２ｍＬのＰＢＳで洗浄後、２．７ｍＬの１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。次いで、溶出液に０．３ｍＬの２Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を加え中和した。この段階では、モノクローナル抗体８Ｈ９の特異性を活かしてｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の濃縮精製を行っているが、高分子凝集体が混在している。
【０１０１】
この溶出液を予め２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社）２本において、カラム１本当たり１．５ｍＬをアプライし、さらに１ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、カラム２本分の溶出液を１本にまとめて、次のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに供するためのバッファー交換を行った。
【０１０２】
この溶出液を予め２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ  ０．６ｍＬ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラムにアプライし、５ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、２ｍＬの１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。これにより、高分子凝集体を除去した。この溶出液を精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とした。
【０１０３】
精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）は、精製過程の各画分についてＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色によりバンドを検出し、それぞれの純度を確認した（図４）。図４において、レーン１はクエン酸緩衝液添加前の培養上清、２はＴｒｉｓ溶液添加後の培養上清、３はＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ非吸着画分、４はＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ洗浄画分、５はＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ溶出画分、６は８Ｈ９−ｓｅｐｈ非結合画分、７は８Ｈ９−ｓｅｐｈ洗浄画分、８は８Ｈ９−ｓｅｐｈ溶出画分、９はＮＡＰ−２５溶出画分、１０はＤＥＡＥ非吸着画分、１１はＤＥＡＥ洗浄画分、及び、１２はＤＥＡＥ溶出画分である。精製段階が進むほど、６０ｋａＤａのバンドが特異的に顕れていることが分かる。
【０１０４】
２．抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の作製（１）（参考例）
（１）抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
精製ｒｈＰＣＳＫ９を抗原とした蛋白免疫あるいは発現ベクターpEF/PCSK9を免疫源とした遺伝子免疫にてマウスを免疫した。
【０１０５】
蛋白免疫は、１回あたり精製ｒｈＰＣＳＫ９  ３μgをアジュバントAbisco-100（ＩＳＣＯＮＯＶＡ社）１２μgと混合し、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）の背部皮下に投与した（初回免疫）。追加免疫は２週間ごとに合計３回初回免疫同様の操作を行った。
【０１０６】
遺伝子免疫は、１回あたりＰＢＳに溶解した発現ベクターpEF/PCSK9  ５０μgをＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）尾部皮下に投与した（初回免疫）。追加免疫は２週間ごとに合計４回初回免疫同様の操作を行った。
【０１０７】
蛋白免疫、遺伝子免疫ともに最終投与から２週間後に、２０μgの精製ｒｈＰＣＳＫ９をマウス腹腔内に投与した。腹腔内投与から３日後にマウス脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。脾細胞はポリエチレングリコール１５００溶液（ベーリンガーマンハイム社製）にてマウス骨髄腫細胞(SP2/0-Ag14)と融合させた。融合した細胞（ハイブリドーマ）は３％ハイブリドーマクローニングファクター（ＨＣＦ、エアブラウン社製）、１×ＨＡＴ（シグマ社製）および１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ニチレイ社製）含有ＲＰＭＩ培地で選択した。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の産生細胞は、精製ｒｈＰＣＳＫ９を固相したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって選別した。すなわち、各ウェル当たり２５ｎｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９を固相化（４℃、一晩）し、各ウェルを１％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、シグマ社製）含有ＰＢＳでブロッキングした。各ウェルを洗浄後、１００μＬの各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間反応した。反応後、各ウェルを洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を加えて、室温下で１時間反応した。反応後、洗浄液にてウェルを５回洗浄し、１００μＬの発色溶液［０．０１２％過酸化水素、０．４ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ(o-phenulenediamine dihydrochloride、シグマアルドリッチ社製）含有クエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０］を添加し、室温下で３０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸を添加し、反応を停止し、波長４９２nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ハイブリドーマ培養上清の吸光度が１．０以上を示すウェルを陽性として選別した。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマはさらに限界希釈法によりクローニングし、細胞株を樹立した。
【０１０８】
さらに、陽性ハイブリドーマ細胞の選別は、ハイブリドーマ細胞培養上清を用いてウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性、あるいは免疫沈降法によるヒト血清ＰＣＳＫ９に対する反応性をそれぞれ確認し、両方法にて特異性が認められたクローンを最終的に選別した。
【０１０９】
ウェスタンブロット法は、ゲル１枚あたり１μｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９を非還元にてＳＤＳ−ＰＡＧＥし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄後、各ハイブリドーマ培養上清を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【０１１０】
免疫沈降法は、１．０×１０７個のDynabeads M-280 抗マウスＩｇＧ（ベリタス社製）に各ハイブリドーマ培養上清を２００μＬ加え、室温2時間、転倒混和しながら抗体をビーズに結合させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳでビーズを３回洗浄した後、ヒト血清１００μＬを添加し転倒混和しながら４℃、１６時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してSDS-PAGEし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄後、０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＰＣＳＫ９抗体MAB38881（Ｒ＆Ｄ社製）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【０１１１】
最終的に、精製ｒｈＰＣＳＫ９固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法による精製ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性、免疫沈降法によるヒト血清ＰＣＳＫ９に対する反応性により選別し、ヒトＰＣＳＫ９に対して反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２５クローンを作製した。
【０１１２】
（２）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体調製
プリステン（０．５ｍＬ/匹、シグマ社製）を予め腹腔内に投与したＢａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雄）に一匹あたりハイブリドーマ細胞１０６〜１０７個／０．５ｍＬを腹腔内に注入した。注入１０日後、マウスを開腹し、腹水を採取した。得られた腹水は、遠心にて細胞成分を取り除き、上清に等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し２時間放置した。次いで、１００００×ｇで１０分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液（３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン溶液、ｐＨ８．９）に溶解し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロース（ＧＥヘルスケア社製）と混和し、４℃で一晩転倒混和した。結合させたProtein Ａセファロースをカラムに充填し、６倍量の結合溶液にて洗浄後、溶出溶液（０．１Ｍクエン酸溶液、ｐＨ４．０）で１ｍＬずつ溶出した。溶出された画分は、０．１ｍＬの２Ｍトリス溶液（ｐＨ１０．０）で中和した。各溶出画分の吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収した。回収したモノクローナル画分はＰＢＳにて透析（４℃、一晩）し、精製モノクローナル抗体を得た。
【０１１３】
得られたモノクローナル抗体のアイソタイプは、マウスモノクロナール抗体アイソタイプ決定用キット（べーリンガー社製）を用い、キット添付の操作手順に準じて測定した。ヒトＰＣＳＫ９に対するモノクローナルは、ＩｇＧ１（１７クローン）、ＩｇＧ２ａ（２クローン）、ＩｇＧ２ｂ（６クローン）であった。これらのうち、ハイブリドーマ１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｇ１２Ｄ、Ｂ１Ｇに由来するモノクローナル抗体［抗体１ＦＢ（ＩｇＧ１）、Ｂ１２Ｅ（ＩｇＧ１）、Ｇ１２Ｄ（ＩｇＧ１）、Ｂ１Ｇ（ＩｇＧ１）］について、下記のように抗体の特異性を確認した。
【０１１４】
（３）モノクローナル抗体特異性の確認
モノクローナル抗体の特異性は、ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性、免疫沈降法によるＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を検討し、確認した。
【０１１５】
（４）ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の作製
抗体１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｇ１２Ｄ、Ｂ１Ｇ、及び市販抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（R&D社）、抗ヒスチジンタグ抗体（Tetra-His Antibody、キアゲン社）はPeroxidase Labeling Kit-SH（同仁化学研究所）を用いて各抗体のペルオキシダーゼ標識抗体を作製した。抗体の標識はキット説明書に従い行った。
【０１１６】
（５）ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する抗体の特異性検討
ゲル１枚あたり１μｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９を非還元及び還元条件下にてSDS-PAGEし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、各ペルオキシダーゼ標識抗体１０ｎｇ／ｍＬを室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した（図５）。
【０１１７】
ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性の結果より、抗体１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｂ１Ｇは約６０ｋＤａの成熟セグメントに反応し、この反応性は抗原の還元処理により失われることが明らかとなった。抗体Ｇ１２Ｄはプロセグメントのみに反応し、この反応性は抗原の還元処理に影響されないことが明らかとなった。
【０１１８】
（６）モノクローナル抗体のＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性
抗ＰＣＳＫ９抗体１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｂ１Ｇ、Ｇ１２Ｄ、及び、コントロール抗体１６Ｇ５について、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５)で洗浄したDynabeads M-280 Tosyl-activated（ベリタス社製）を３Ｍ硫酸アンモニウム含有０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５)に懸濁し、１．０×１０８個のビーズあたり抗体を１０μｇ加え、４℃で２０時間、転倒混和しながらビーズに各抗体を結合させた。反応後上清液を捨て、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、緩やかに攪拌しながら、室温で２時間反応させビーズを不活化した後、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗体結合ビーズを作製した。抗体結合ビーズ１．０×１０７個に対しｒｈＰＣＳＫ９  ２０μｇ、もしくはＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９  ２０μｇを添加し、転倒混和しながら４℃で１６時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧＥし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルク含有ＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（Ｒ＆Ｄ社）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した（図６）。
【０１１９】
前記のようにウェスタンブロット法によりプロセグメントに対する抗体であることが確認されたＧ１２Ｄは、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９では成熟セグメント（６０ｋＤａ）が免疫沈降するのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９では成熟セグメント（５３ｋＤａ）が免疫沈降しない。このことから、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９はヘテロダイマーを形成しているのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９はヘテロダイマーを形成していない（非ヘテロダイマー）ことが確認された。
【０１２０】
成熟セグメントに対する抗体１ＦＢ、Ｂ１２ＥはＦｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９（ヘテロダイマー）及びＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９（非ヘテロダイマー：５３ｋＤａセグメント）の両者を免疫沈降することから、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー、及び、５３ｋＤａセグメントのいずれにも反応することが確認された。抗体Ｂ１ＧはＦｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９（ヘテロダイマー）を免疫沈降しないのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９（非ヘテロダイマー：５３ｋＤａセグメント）を免疫沈降することから、非ヘテロダイマーの成熟セグメント（５３ｋＤａセグメント）特異的に反応することが確認された。
【０１２１】
３．抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の作製（２）（実施例）
本発明のモノクローナル抗体、すなわち、「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に反応し、かつ、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー及び５３ｋＤａＰＣＳＫ９には交差反応しないモノクローナル抗体」の調製を試みた。これは、後述する家族性高コレステロール血症（ＦＨ）血清における結果を受けて、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の検出を念頭に置いての実施例である。
【０１２２】
（１）抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
精製ｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを抗原としてマウスを免疫した。
【０１２３】
具体的には、１回当たり精製ｒｈＰＣＳＫ９  ３μｇをアジュバンドAbisio-100（ＩＳＣＯＮＯＶＡ社）２５μｇと混合し、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）の背部皮下に投与した（初回免疫）。追加免疫は２週間毎に合計３回初回免疫と同様の操作にて行った。
【０１２４】
最終投与から２週間後に、２０μｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９をマウス腹腔内に投与した。腹腔内投与から３日後にマウスの脾臓を取り出し、脾細胞を回収した。脾細胞はポリエチレングリコール１５００溶液（ベーリンガーマンハイム社製）にてマウス骨髄腫細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）と融合させた。融合した細胞（ハイブリドーマ）は、１０％ハイブリドーマクローニングファクター（ＨＣＦ、エアブラウン社製）を添加したＨＡＴ培地（シグマ社製）で選択した。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の産生細胞は、精製ｒｈＰＣＳＫ９を固相化したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって選別した。すなわち、各ウェル当たり２５ｎｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９を固相化（４℃、一晩）し、洗浄後、各ウェルを５％スキムミルク含有ＰＢＳでブロッキングした。各ウェルを洗浄後、１００μＬの各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間の反応を行った。反応後、各ウェルを洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄し、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（BioSource社）を加えて、室温下で１時間反応を行った。反応後、洗浄液にてウェルを５回洗浄し、１００μＬの発色溶液［０．０１２％過酸化水素、０．４ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ（o-phenulenediamine dihydrochloride、シグマある度リッチ社製）含有クエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ５．０］を添加し、室温下で３０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸を添加して反応を停止し、波長４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ハイブリドーマ培養上清の吸光度が１．０以上を示すウェル陽性として選別した。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマはさらに限界希釈法によりクローニングし、細胞株を樹立した。
【０１２５】
（２）ハイブリドーマ８Ｈ９の選別
ハイブリドーマ８Ｈ９は、ハイブリドーマ培養上清を用いたウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を基準として、上記の陽性ハイブリドーマ株から選別された。
【０１２６】
ウェスタンブロット法は、ゲル１枚あたり１μｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９を非還元にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルク含有ＰＢＳにて４℃下で一晩静置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）により２回洗浄後、各ハイブリドーマの培養上清を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液で５回洗浄した後、１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（BioSource社）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した（図７）。
【０１２７】
ｒｈＰＣＳＫ９にはＣ末端にＨｉｓ×６ｔａｇが付加されている。Ｈｉｓ×６ｔａｇを認識する抗ヒスチジンタグ抗体では、６０ｋＤａ付近のバンドに加え、微量の約５０ｋＤａのバンドが検出される。抗ヒスチジンタグ抗体が成熟セグメントのＣ末端を認識するころから、この約５０ｋＤのバンドは成熟セグメントのＮ末端側が分解することにより生じた分子であり、これは５３ｋＤａセグメントと考えられる。一方モノクローナル抗体８Ｈ９では、６０ｋＤａセグメントは検出されるものの前記約５０ｋＤａのバンドは検出されず、代わりにanti His-tag抗体では検出されない１９．８ｋＤａ未満のバンドが検出された。このことから、ハイブリドーマ８Ｈ９は成熟セグメントのＮ末端を認識するモノクローナル抗体を産生する特徴的なクローンと考えられ、腹水からのモノクローナル抗体調製に値するクローンとして選別された。
【０１２８】
（３）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体調製
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌）に一匹当たりハイブリドーマ細胞を１０６〜１０７個／０．５ｍＬを腹腔内に注入した。注入１０日後、マウスを開腹し、腹水を採取した。得られた腹水は、遠心を用いて細胞成分を取り除き、上清に等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し、２時間放置した。次いで、１００００×ｇで１０分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液（３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン溶液、ｐＨ８．９）に溶解しＰｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロース（ＧＥヘルスケア社製）と混和し、４℃で一晩転倒混和した。結合させたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースをカラムに充填し、６倍量の結合溶液にて洗浄後、溶出溶液（０．１Ｍクエン酸溶液、ｐＨ４．０）で１ｍＬずつ溶出した。溶出された画分は、０．１ｍＬの２Ｍトリス溶液（ｐＨ１０．０）で中和した。各溶出画分の吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収した。回収したモノクローナル画分はＰＢＳにて４℃で一晩透析し、精製モノクローナル抗体を得た。
【０１２９】
得られたモノクローナル抗体のアイソタイプは、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット（ベーリンガー社製）を用い、キット添付の操作手順に準じて測定した。その結果、モノクローナル抗体８Ｈ９のアイソタイプはＩｇＧ１であった。
【０１３０】
（４）モノクローナル抗体８Ｈ９の特異性の確認
＜Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対するウェスタンブロット＞
Ｆｕｒｉｎによる切断前と切断後のｒｈＰＣＳＫ９を、それぞれ２０ｎｇを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃で一晩静置した。洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（Ｒ＆Ｄ社：抗ヒトＰＣＳＫ９ヘテロダイマー抗体）又はペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体８Ｈ９を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社）に感光させ、特異バンドを検出した（図８）。
【０１３１】
Ｆｕｒｉｎ切断前ではいずれの抗体も６０ｋＤａの成熟セグメントを検出した。Ｆｕｒｉｎ切断後では残存している６０ｋＤａの成熟セグメントに加え、MAB38881が５３ｋＤａのＣ末端側分子を検出したのに対し、モノクローナル抗体８Ｈ９は７ｋＤａのＮ末端側分子を検出した。以上のことから、モノクローナル抗体８Ｈ９は、ＰＣＳＫ９成熟セグメントのＮ末端側７ＫＤａの領域にエピトープを持つモノクローナル抗体であることが明らかになった。
【０１３２】
＜免疫沈降＞
免疫沈降サンプルとしてｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー、５３ｋＤａセグメント、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）、免疫沈降抗体として８Ｈ９及びＢ１２Ｅ、検出抗体としてペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅを用い免疫沈降を行った。
【０１３３】
各免疫沈降抗体について、０．１Ｍホウ酸緩衝液で洗浄したDynabeads M-280 抗マウスＩｇＧ（ベリタス社製）を、３Ｍ硫酸アンモニウム含有０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に懸濁し、１．０×１０８個のビーズ当たり抗体を１０μｇ加え、４℃下で２０時間、転倒混和しながらビーズに抗体を結合させた。反応後上清液を捨て、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、緩やかに攪拌しながら、室温で２時間反応させてビーズを不活化した後、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗体結合ビーズを調製した。抗体結合ビーズ１．０×１０７個に対し血清検体１００μＬを添加し、転倒混和しながら４℃下で１６時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃で一晩静置した。洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、０．１μｇ／ｍＬの検出抗体を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した（図９）。
【０１３４】
Ｂ１２Ｅが全てのＰＣＳＫ９を免疫沈降したのに対し、８Ｈ９は６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）のみ免疫沈降した。このことから、モノクローナル抗体８Ｈ９は６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）に対して特異的な抗体であることが明らかになった。
【０１３５】
４．サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系（参考例）
上述のごとく作製したモノクローナル抗体（８Ｈ９を除く）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡが可能な抗体の組合せを検討し、最終的に、固相抗体１ＦＢと検出抗体ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅの組合せによる「全ＰＣＳＫ９測定系」（Ａ系）、固相抗体Ｂ１２Ｅと検出抗体ペルオキシダーゼ標識Ｇ１２Ｄの組合せによる「ヘテロダイマーＰＣＳＫ９測定系」（Ｂ系）、固相抗体Ｂ１Ｇと検出抗体ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅの組合せによる「非ヘテロダイマーＰＣＳＫ９測定系」（Ｃ系）をそれぞれ構築した（図１０）。
【０１３６】
これらの測定系（Ａ系、Ｂ系、及び、Ｃ系）のサンドイッチＥＬＩＳＡ系は、特許文献６にて示した通りである。Ｂ系値≫Ｃ系値であれば非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が小さいことを示し、逆にＢ系値≪Ｃ系値であれば非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が大きいことを意味する。
【０１３７】
健常者１０８名及び家族性高コレステロール血症（ＦＨ）患者１９４名の血清におけるＰＣＳＫ９濃度を、これらの測定系を用いて測定し、（ａ）Ｂ系値≫Ｃ系値の非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が小さい血清サンプル（サンプル番号１〜４）と、（ｂ）Ｂ系値≪Ｃ系値の非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が大きい血清サンプル（サンプル番号５〜１１）をピックアップした。これらのサンプル１〜１１のＡ系値、Ｂ系値、及び、Ｃ系値を表１に示す。
【０１３８】
【表１】
2015007622.tif 000002
【０１３９】
５．血清サンプル中の６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の免疫沈降による検出
次いで上記の血清サンプル１〜１１を、非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９特異的な抗ＰＣＳＫ９抗体Ｂ１Ｇを用いて血清ＰＣＳＫ９分子を免疫沈降により検討した。この免疫沈降において行った各抗体のペルオキシダーゼ標識は、Peroxidase Labeling Kit-SH（同仁化学研究所製）を用いて行った。標識方法は、キット添付の説明書に従って行った。
【０１４０】
免疫沈降法は、抗ＰＣＳＫ９抗体Ｂ１Ｇについて、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）で洗浄したDynabeads M-280 抗マウスＩｇＧ（ベリタス社製）を、３Ｍ硫酸アンモニウム含有０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に懸濁し、１．０×１０８個のビーズ当たり抗体を１０μｇ加え、４℃下で２０時間、転倒混和しながらビーズに抗体を結合させた。反応後上清液を捨て、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、緩やかに攪拌しながら、室温で２時間反応させてビーズを不活化した後、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗体結合ビーズを調製した。抗体結合ビーズ１．０×１０７個に対し血清検体１００μＬを添加し、転倒混和しながら４℃下で１６時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識抗ＰＣＳＫ９抗体MAB38881（Ｒ＆Ｄ社製）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【０１４１】
結果を図１１に示す。
【０１４２】
その結果、非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が小さい血清サンプル（サンプル番号１〜４）においては、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９と同様に５３ｋＤａのバンドが検出され、バンドシグナルの濃さは非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が高い血清サンプル（サンプル番号５〜１１）において濃い、すなわち濃度が高い傾向が認められた。
【０１４３】
そして非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９値が高い血清サンプル（サンプル番号５〜１１）においては、薄めの５３ｋＤａのバンドに加え、意外なことに６０ｋＤａのバンドが濃く検出された。この６０ｋＤａのバンドの分子量は、６０ｋＤａ成熟ドメインに相当するサイズであり、これは６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）であると認められた。これまでに、ヒト血清中での成熟ドメインは、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーと５３ｋＤａセグメントの存在が報告されているのみであり（Piper DE et al.,Structure,2007:15;545-552、Dubuc G et al.,J Lipid Res,2010:51;140-149）、ヒト血清中に６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）が存在することが、今般初めて見出された。
【０１４４】
６．サンドイッチＥＬＩＳＡの構築
イムノプレート（Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで希釈した各固相抗体（Ａ系：１ＦＢ  １μｇ／ｍＬ、Ｂ系：Ｂ１２Ｅ  ０．３μｇ／ｍＬ、Ｃ系：Ｂ１Ｇ  １μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／wellで添加し、４℃で一晩静置した。
【０１４５】
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で２回洗浄後、１％ＢＳＡ及び１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ含有ＰＢＳを２００μＬ／wellで添加し、室温２時間ブロッキングした。各ウェルの液を除去後、０．３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈したスタンダード溶液（Ａ系及びＢ系はｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー、Ｃ系はｒｈΔＮ２１８  ＰＣＳＫ９（５３ｋＤａセグメント））、あるいはヒト血清を１００μＬ／wellで添加し、室温で２時間静置した（表２）。
【０１４６】
【表２】
2015007622.tif 000003
【０１４７】
反応後洗浄液で４回洗浄し、１０% StabilZyme（SurModics社）、０．３% ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈した各検出抗体（Ａ系：ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅ  １０ｎｇ／ｍＬ、Ｂ系：ペルオキシダーゼ標識Ｇ１２Ｄ  ２５ｎｇ／ｍＬ、Ｃ系：ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅ  ３５ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ／wellで添加し、室温１時間静置した。反応後洗浄液で４回洗浄し、酵素基質液ＴＭＢ＋（Dako社）を１００μＬ／well添加し、室温３０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸１００μＬ／wellを添加して酵素反応を停止し、Multiskan Ascent (Thermo Labsystems社製)にて各ウェルの吸光度を波長４５０nm（バックグラウンド５６０nm）で測定した。
【０１４８】
各ＥＬＩＳＡ測定系における検量線は図１２のとおりである。Ａ系及びＢ系は、０〜２０ｎｇ／ｍＬ、Ｃ系は０〜４ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な検量線を示した。
【０１４９】
図１３は、血清サンプルの希釈直線性試験の結果を示している。いずれの系、サンプルについても直線性が示されており、各ＥＬＩＳＡ系の正確度が確認された。
【０１５０】
７．サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９非ヘテロダイマー６０ｋＤａ特異的蛋白質量測定系の構築（実施例）
６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）特異的抗体８Ｈ９及び抗ＰＣＳＫ９成熟セグメント抗体Ｂ１２Ｅを組み合わせ、ＰＣＳＫ９非ヘテロダイマー６０ｋＤａ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ系（Ｄ系）を構築した。固相抗体として８Ｈ９、検出抗体としてペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅを使用した。スタンダードには、前述の「８Ｈ９−seph」を用いて調製した「精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」を使用した。
【０１５１】
イムノプレート（Nunc社）に、ＰＢＳで希釈した８Ｈ９  ５μｇ／ｍＬを１００μＬ／wellで添加し、４℃で一晩静置した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で２回洗浄後、１％ＢＳＡ及び１０％Sucrose含有ＰＢＳを２００μＬ／wellで添加し、室温で２時間ブロッキングを行った。各ウェルの液を除去後、０．３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈したスタンダード溶液（ｒｈΔＮ１５２ＰＣＳＫ９）、あるいは測定サンプルを１００μＬ／wellで添加し、室温で２時間静置した。反応後、洗浄液で４回洗浄し、１０％stabiliZyme（SurModics社）、０．３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈したペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅ  ５０ng／ｍＬを１００μＬ／wellで添加し、室温で１時間静置した。反応後洗浄液で４回洗浄し、酵素基質液ＴＭＢ＋（Dako社）を１００μＬ／wellで添加し、室温で３０分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸を１００μＬ／well添加して酵素反応を停止し、Multiskan Ascent（Thermo Labsystems社製）にて各ウェルの吸光度を波長４５０ｎｍ（バックグラウンド５６０ｎｍ）で測定した。
【０１５２】
本ＥＬＩＳＡ測定系（Ｄ系）における検量線は図１４に示す通りである。本ＥＬＩＳＡ系は０〜４ｎｇ／ｍＬの範囲で良好であった。
【０１５３】
さらに、本ＥＬＩＳＡ測定系（Ｄ系）における血清サンプルの希釈直線性試験の結果は図１５に示す通りである。いずれのサンプルについても直線性が示され、本ＥＬＩＳＡ系の正確度が確認された。
【０１５４】
８．モノクローナル抗体８Ｈ９のヒト血清サンプルに対する反応性の確認
（１）サンドイッチＥＬＩＳＡによる測定
家族性高コレステロール血症患者の血清サンプルＳ１，Ｓ２，Ｓ３について、Ａ系、Ｂ系、Ｃ系及びＤ系のサンドイッチＥＬＩＳＡ系にて、各ＰＣＳＫ９分子形態濃度を測定した。これらのサンプルのＡ系値、Ｂ系値、Ｃ系値及びＤ系値を表３に示す。
【０１５５】
【表３】
2015007622.tif 000004
【０１５６】
（２）免疫沈降による確認
上記の血清サンプルＳ１，Ｓ２，Ｓ３について、免疫沈降抗体として８Ｈ９及びＢ１２Ｅを、検出抗体としてペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅ及び同標識Ｇ１２Ｄを用い、下記のように免疫沈降を行った。
【０１５７】
各免疫沈降抗体について、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）で洗浄したDynabeads M-280 Tosyl-activated（ベリタス社）を３Ｍ硫酸アンモニウム含有０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に懸濁し、１．０×１０８個のビーズあたり抗体を１０μｇ加え、４℃で２０時間、転倒混和しながらビーズに抗体を結合させた。反応後上清液を捨て、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、緩やかに攪拌しながら、室温で２時間反応させてビーズを不活化した後、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗体結合ビーズを作製した。抗体結合ビーズ１．０×１０７個に対し、各血清サンプル１００μＬを添加し、転倒混和しながら４℃で１６時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルク含有ＰＢＳにて４℃で一晩の反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社）に感光させ、特異バンドを検出した（図１６）。
【０１５８】
図１６に示すように、モノクローナル抗体Ｂ１２Ｅが６０ｋＤａセグメント、５３ｋＤａセグメント（Ａ系値相当）、及び、プロセグメント（Ｂ系値相当）を免疫沈降したのに対し、モノクローナル抗体８Ｈ９は６０ｋＤａセグメント（Ｄ系値相当）のみを免疫沈降した。このことから、ヒト血清中には確かに６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）が存在することが確認された。
【０１５９】
９．ｒｈＰＣＳＫ９非ヘテロダイマー６０ｋＤａのＬＤＬ受容体分解活性の検討
（１）ＨｅｐＧ２細胞の培養
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ）を２４ウェル細胞培養プレート（ＢＭ機器社）に１ウェルあたり１×１０５個の細胞数で撒き、１０％ＦＢＳ（ニチレイ社）含有ＤＭＥＭ（ライフテクノロジー社）を１ウェルあたり０．５ｍＬ添加し、３７℃・５％ＣＯ２下で２４時間培養した。次いで培地を５％ＬＰＤＳ(Lipoprotein Deficient Serum：Havel RJ et al.,J Clin Invest,1955:34;1345-1353に従い調製した)含有ＤＭＥＭ、１ウェルあたり０．３ｍＬに変更し、３７℃・５％ＣＯ２下で２４時間培養した。次いで、培地を濃度０μｇ／ｍＬ、１．１μｇ／ｍＬ、３．３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの精製ｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー若しくは精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）含有ＤＭＥＭ，１ウェルあたり０．２５ｍＬに変更し、３７℃・５％ＣＯ２下で４時間培養した。培養後の細胞をＰＢＳで１回洗浄後、１ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳを１ウェルあたり０．２ｍＬ添加し、３７℃で１０分間静置し、培養プレートから遊離させた。遊離した細胞をマイクロチューブ（ＢＭ機器）に回収後、４００ｇ・４℃にて３分間遠心し上清を除いた後、３０μＬの０．３％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（緩衝液Ａ）に懸濁し、氷上に静置した。
【０１６０】
（２）ＨｅｐＧ２細胞表面上ＬＤＬ受容体の染色
３０μＬのＨｅｐＧ２細胞懸濁液に２０μＬの５μｇ／ｍＬ抗ヒトＬＤＬ受容体マウスモノクローナル抗体含有緩衝液Ａを添加し、氷上にて４０分間反応させた。反応後、細胞を氷冷した緩衝液Ａにて２回洗浄後、２０μＬの２５０倍希釈のフィコエリスリン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ロックランド社）含有緩衝液Ａに懸濁し氷上にて３０分間反応させ、細胞表面上のＬＤＬ受容体を蛍光標識した。反応後、細胞を氷冷した緩衝液Ａにて２回洗浄後、０．１７ｍＬの氷冷したＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳＣalibur（ベクトン・ディッキンソン社）にて蛍光強度を測定し、細胞表面上のＬＤＬ受容体発現量を評価した。なお、上記抗ヒトＬＤＬ受容体マウスモノクローナル抗体は、Kosaka S et al.,Circulation, 2001:103;1142-1147、及び、Takahashi M et al.,Clin Genet,2001:59;290-292に従って調製したものを用いた。
【０１６１】
ｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー添加、前述の「Ｇ１２Ｄ−seph」を用いて調製した「精製ｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）」添加のいずれにおいてもＨｅｐＧ２細胞表面上のＬＤＬ受容体発現量低下が認められたが、いずれの添加濃度においてもｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに比べｒｈ６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）の方が低下量が有意に少なかった（ｎ＝３、Student's t-testにて有意差検定）（図１７）。
【０１６２】
このことから、６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）のＬＤＬ受容体分解促進活性は、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーに比べ明らかに減弱していることが明らかになった。
【０１６３】
１０．薬剤スクリーニング系構築
ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーは、ｐＨ４．０処理により６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）とプロセグメントが解離することが知られている。これをモデル現象として、本発明の測定方法を行うためのアッセイ系を構築した。
【０１６４】
上述したｒｈＰＣＳＫ９ヘテロダイマー含有培養上清３０ｍＬに対し、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）１．８ｍＬと２Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液２．７ｍＬの混合液４．５ｍＬを添加し、室温にて１時間静置する処理（ｐＨ４．０処理無し）、又は、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１．８ｍＬ添加し培養上清のｐＨを４．０に調整後、室温にて１時間静置し、その後２Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を２．７ｍＬ添加し、培養上清のｐＨを８．０にする処理（ｐＨ４．０処理有り）を行った。両サンプルを、（ａ）上述の「６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）測定系」、及び、（ｂ）「ＰＣＳＫ９ヘテロダイマー特異的測定系（Ｂ系）」にて測定したところ、ｐＨ４．０処理有りのサンプルにおいて６０ｋＤａセグメント（非ヘテロダイマー）が増加し、ＰＣＳＫ９ヘテロダイマーが減少していることを明確に検出することができた（図１８）。
【０１６５】
この結果より、本発明のＰＣＳＫ９ヘテロダイマーを解離させる物質のスクリーニングにおける有用性が明らかになった。
【図１】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１６】
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【配列表】
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