(57)【要約】      （修正有）【課題】抗トレポネーマ属抗体の検出のための、ＴｐＮ１７に基づくイムノアッセイの偽陽性結果を回避し、そして特異性を増加させるための手段および方法を提供する。【解決手段】単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）のペプチド配列またはその部分配列を、干渉を減少させるため、すなわち偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法に関する。さらに、ＶｃＬｐ１５ペプチド配列およびシャペロンを含む融合ポリペプチド、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための、イムノアッセイにおける添加剤としての該融合ポリペプチドの使用、ならびにＴｐＮ１７抗原および前記ＶｃＬｐ１５−シャペロン融合ポリペプチドを含む単離試料において梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための試薬キットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離試料において、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）のＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）のペプチド配列を、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法。
【請求項２】
ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ  Ｑ９ＫＱＮ６（配列番号１）または配列番号２記載のペプチド配列、あるいは配列番号１または２の部分配列を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＶｃＬｐ１５の前記部分配列が、配列番号１または２のアミノ酸２６〜１６３を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ＶｃＬｐ１５ペプチド配列またはその部分配列がシャペロンに融合している、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
配列番号１または２記載のＶｃＬｐ１５ペプチド配列あるいは配列番号１または２の部分配列およびシャペロンを含む、融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記シャペロンがＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡおよびＳｋｐからなる群より選択される、請求項５記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３を含む請求項５または６記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするためのイムノアッセイにおける添加剤としての、請求項５〜７記載の融合ポリペプチドの使用。
【請求項９】
ＴｐＮ１７抗原および請求項５〜７記載の融合ポリペプチドを含む、イムノアッセイにより単離試料において梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための、試薬キット。
【請求項１０】
単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）体液試料を、前記試料中に存在する前記抗体が特異的に結合可能な特異的結合パートナーと混合することによって、免疫反応混合物を形成し、
ｂ）請求項５〜７のいずれか記載の融合ポリペプチドを、前記特異的結合パートナーを前記試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、前記免疫反応混合物に添加し、
ｃ）前記体液試料中に存在する抗体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し；そして
ｄ）前記免疫反応産物のいずれかの存在および／または濃度を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
２つのＴｐＮ１７抗原、
第一のＴｐＮ１７抗原であって、ＴｐＮ１７配列および第一のシャペロンを含み、固相に結合可能である、前記の第一のＴｐＮ１７抗原、
第二のＴｐＮ１７抗原であって、ＴｐＮ１７配列および第二のシャペロンを含み、検出可能標識を所持する、前記の第二のＴｐＮ１７抗原
を、単離試料中で検出しようとする抗体に関する特異的結合パートナーとして用い、
どちらのＴｐＮ１７抗原も同一であるかまたは免疫学的に交差反応性であり、したがって、これらは試料中に存在する抗体によって特異的に結合可能であり、そして
第一および第二のシャペロンが異なる
請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第一のＴｐＮ１７抗原がシャペロンとして大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＦｋｐＡを含み、そして第二のＴｐＮ１７抗原がシャペロンとして大腸菌Ｓｋｐを含む、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離試料において、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）のＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）のペプチド配列を、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法に関する。さらに、本発明は、ＶｃＬｐ１５ペプチド配列およびシャペロンを含む融合ポリペプチド、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための、イムノアッセイにおける添加剤としての該融合ポリペプチドの使用、ならびにＴｐＮ１７抗原および前記ＶｃＬｐ１５−シャペロン融合ポリペプチドを含む単離試料において、梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
梅毒（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、またＬｕｅｓとも呼ばれる）は、スピロヘータ細菌科に属する梅毒トレポネーマによって引き起こされる重症感染性疾患である。梅毒は、主に、性的接触によって伝染するが、また、妊婦である母親から妊娠中に胎児にうつる可能性もある。この疾患は、別個の臨床段階および長期間の潜伏性無症候性感染によって特徴付けられる。多くの感染個体は症状に気づかず、そしてしたがって梅毒感染に何年も気づかない。一次感染は限定され、そして通常、小さい無痛の潰瘍を引き起こす（第一段階、「梅毒Ｉ」）。ペニシリンによって治療されずに放置されると、疾患は第二段階の梅毒ＩＩに進行し（感染約８週後）、これはインフルエンザ様症状、かゆみのない皮膚発疹およびリンパ節腫脹を伴う。数年後、梅毒ＩＩＩの段階で、梅毒性結節が全身に現れる。最終段階（梅毒ＩＶ）は、中枢神経系の崩壊によって特徴付けられ、最終的に、神経学的障害および心臓障害、全身麻痺、運動失調、認知症および失明につながる。
【０００３】
２０世紀半ばにペニシリンが導入されて以来、有効な療法が利用可能になっているが、梅毒はなお、毎年、全世界で１２００万人の新規感染があると概算される、重要な世界的健康問題であり続けている。抗生物質療法を開始し、そしてしたがって梅毒のさらなる蔓延を防止するため、トレポネーマ属に感染した患者を信頼可能に同定することが必須である。そのため、梅毒トレポネーマに対する抗体の検出のため、イムノアッセイなどの信頼性がある診断ツールを提供する必要がある。さらに、血清学的適用における特異的化合物として用いるため、組換え由来タンパク質は、可溶性、安定性および抗原性などのいくつかの必要条件を満たす必要がある。
【０００４】
成熟型では１３４アミノ酸残基からなる小分子タンパク質であるＴｐＮ１７（梅毒トレポネーマ株ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）、１７ｋＤａ）は、梅毒の原因病原体である梅毒トレポネーマの免疫優性抗原である（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８），  ５０，  ２７−４４；  Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００３）４８（４），  ５４９−５５３）。ＴｐＮ１７に向けられる抗体は、トレポネーマ属に感染した個体において頻繁にそして豊富に見られ、そしてトレポネーマ属感染の高感度でそして信頼性がある検出を目的とするイムノアッセイにおいて、ＴｐＮ１７を使用することが必須である。
【０００５】
しかし、本発明者らは、ＴｐＮ１７を抗原として用いるイムノアッセイが、偽陽性結果を示す傾向があり、すなわち見かけ上、陽性のシグナルを提供するが、実際にはトレポネーマ属に対する抗体がその試料中にまったく存在しないことを観察した。これらの干渉は稀であるが、有意な現象である。これらはイムノアッセイの特異性を損ない、そしてこれらは、明らかに、梅毒イムノアッセイにおいて実質的に不可欠である梅毒トレポネーマ抗原ＴｐＮ１７を使用しているためである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８），  ５０，  ２７−４４
【非特許文献２】Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００３）４８（４），  ５４９−５５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の根底にある問題は、したがって、抗トレポネーマ属抗体の検出のための、ＴｐＮ１７に基づくイムノアッセイの偽陽性結果を回避し、そして特異性を増加させるための手段および方法を提供する際に明らかになりうる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
問題は、請求項によって特徴付けられるような本発明によって解決される。特に、本発明は、単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）のペプチド配列またはその部分配列を、干渉を減少させるため、すなわち偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法に関する。ＶｃＬｐ１５ポリペプチド配列の前記部分配列は、配列番号１のアミノ酸２６〜１６３を含むことも可能である。さらなる態様において、前記ＶｃＬｐ１５ペプチド配列またはその部分配列をシャペロンに融合させる。
【０００９】
本発明はまた、配列番号１記載のＶｃＬｐ１５ペプチド配列またはその部分配列およびシャペロンを含む、融合ポリペプチドにも関する。好ましい態様において、ＶｃＬｐ１５ペプチド配列に融合させるシャペロンを、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡ、およびＳｋｐからなる群より選択する。
【００１０】
さらなる好ましい態様において、融合ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＳｌｙＤおよびＶｃＬｐ１５の融合ポリペプチド（ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５）である配列番号３を含む。
【００１１】
本発明にやはり含まれるのは、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための、イムノアッセイにおける添加剤としての、ＶｃＬｐ１５ペプチドおよび場合によってシャペロンを含む、融合ポリペプチドの使用である。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、イムノアッセイにより、単離試料において、梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための試薬キットであって、ＴｐＮ１７抗原、ならびにＶｃＬｐ１５ペプチドおよび場合によってシャペロンを含む融合ポリペプチドを含む、前記試薬キットに関する。
【００１３】
本発明はまた、単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）体液試料を、前記試料中に存在する前記抗体が特異的に結合可能な特異的結合パートナーと混合することによって、免疫反応混合物を形成し
ｂ）ＶｃＬＰ１５ペプチドおよび場合によってシャペロンを含む融合ポリペプチドを、前記特異的結合パートナーを前記試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、前記免疫反応混合物に添加し、
ｃ）前記体液試料中に存在する抗体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し；そして
ｄ）前記免疫反応産物のいずれかの存在および／または濃度を検出する
工程を含む、前記方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明記載の融合ポリペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の近ＵＶ  ＣＤスペクトル（紫外円二色性スペクトル）を示す；より詳細には、ＣＤ分光測定によって監視した際のＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の熱誘導性アンフォールディングを記載する、実施例４を参照されたい。
【図２】図２は、近ＵＶ領域においてＣＤ分光測定によって監視するような、本発明記載の融合ポリペプチドＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の融解曲線を示す。詳細には、実施例４を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
表１は、本研究（実施例２）で用いる融合ポリペプチドのタンパク質パラメータを示す。
表２〜５は、梅毒イムノアッセイにおけるコレラ菌Ｌｐ１５の抗干渉活性に対する、実施例５にしたがって行う実験の結果を示す。
【００１６】
表２は、単量体ＶｃＬｐ１５（シャペロンとしてのＳｌｙＤと融合）を干渉減少のために添加する、トレポネーマ属特異的抗原としてのオリゴマーＴｐＮ１７に関する結果を示す。
【００１７】
表３は、単量体ＶｃＬｐ１５（シャペロンとしてのＳｌｙＤと融合）を干渉減少のために添加する、トレポネーマ属特異的抗原としての単量体ＴｐＮ１７に関する結果を示す。
表４は、オリゴマーＶｃＬｐ１５（シャペロンとしてのＳｋｐと融合）を干渉減少のために添加する、トレポネーマ属特異的抗原としてのオリゴマーＴｐＮ１７に関する結果を示す。
【００１８】
表５は、オリゴマーＶｃＬｐ１５（シャペロンとしてのＳｋｐと融合）を干渉減少のために添加する、トレポネーマ属特異的抗原としての単量体ＴｐＮ１７に関する結果を示す。
【００１９】
配列番号１は、公的データベースＵｎｉＰｒｏｔ、寄託番号Ｑ９ＫＱＮ６から回収可能であるような、コレラ菌リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）の完全アミノ酸配列（１６３残基）を示す。アミノ酸残基１〜２５は、シグナル配列を構成し；成熟ＶｃＬｐ１５はアミノ酸残基２６〜１６３（下線）を含む。
【００２０】
【化１】
2015028479.tif 000002
【００２１】
配列番号２は、異なるシャペロン・モジュールとの融合に用いられるようなＶｃＬｐ１５配列（２６〜１６３）を示す。成熟ＶｃＬｐ１５配列（アミノ酸残基２６〜１６３）はＮ末端シグナル配列（アミノ酸１〜２５）を欠き、そしてシステイン残基を欠く。再フォールディングプロセスを容易にし、そしてジスルフィド付加物形成を抑制するため、７４位および７７位［前駆体タンパク質の番号付け］のＶｃＬｐ１５の２つの真正のシステイン残基をアラニン残基によって置換した−下線−。ＶｃＬｐ１５は、精製を容易にし、そして金属カラム（Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｕ）を通じたマトリックスカップリング再フォールディングを可能にするため、Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグ（下線）を所持する。
【００２２】
【化２】
2015028479.tif 000003
【００２３】
配列番号３は、本発明記載の融合ポリペプチドであり、シャペロンとして大腸菌ＳｌｙＤの１分子および成熟ＶｃＬｐ１５配列（２６〜１６３、下線）を含む、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５を示す。
【００２４】
【化３】
2015028479.tif 000004
【００２５】
配列番号４は、本発明記載の融合ポリペプチドであり、シャペロンとして大腸菌Ｓｋｐの１分子および成熟ＶｃＬｐ１５配列（２６〜１６３、下線）を含む、ＥｃＳｋｐ−ＶｃＬｐ１５を示す。
【００２６】
【化４】
2015028479.tif 000005
【００２７】
配列番号５は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２９７２２の元にアクセス可能な公的データベースＵｎｉＰｒｏｔから回収されるような梅毒トレポネーマの完全ＴｐＮ１７配列（アミノ酸残基１〜１５６）を示す。
【００２８】
【化５】
2015028479.tif 000006
【００２９】
配列番号６は、実施例５に用いるようなＴｐＮ１７配列を示す。このイムノアッセイのため、シグナル配列（アミノ酸残基１〜２２）を欠く成熟ＴｐＮ１７タンパク質（アミノ酸残基２３〜１５６）を用いた。本発明者らは、ＴｐＮ１７の４つの真正システイン残基が、該タンパク質の抗原性に不可欠であることを見出した（データ未提示）。したがって、再フォールディングプロセスを容易にし、そしてジスルフィド付加物形成などの有害な副反応を抑制するため、２５位、２９位、４２位および５８位（前駆体タンパク質の番号付け）のシステイン残基をアラニン残基によって置換した（下線）。
【００３０】
【化６】
2015028479.tif 000007
【００３１】
配列番号７は、異なるシャペロン・モジュールとの融合に用いられるようなＴｐＮ１７配列アミノ酸残基２３〜１５６（配列番号６も参照されたい）を示す。ＴｐＮ１７は、精製を容易にし、そして金属カラム（Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｕ）を通じたマトリックスカップリング再フォールディングを可能にするため、Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグ（下線）を所持する。天然様コンホメーションにあるタンパク質の成熟（プロセシング）型を得るために、ＴｐＮ１７のＮ末端シグナル配列（アミノ酸残基１〜２２）を除いた。
【００３２】
【化７】
2015028479.tif 000008
【００３３】
配列番号８は、大腸菌ＳｌｙＤの２分子（「タンデムＳｌｙＤ」）がＮ末端に融合しているＴｐＮ１７配列（下線）を示す；この分子はまた、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ１７またはＥｃＳＳ−ＴｐＮ１７と称される。
【００３４】
【化８】
2015028479.tif 000009
【００３５】
配列番号９は、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ＳｌｙＤの２分子（「タンデムＳｌｙＤ」）がＮ末端に融合しているＴｐＮ１７配列（下線）を示す；この分子はまた、ＰｍＳｌｙＤ−ＰｍＳｌｙＤ−ＴｐＮ１７またはＰｍＳＳ−ＴｐＮ１７と称される。
【００３６】
【化９】
2015028479.tif 000010
【００３７】
配列番号１０は、大腸菌ＦｋｐＡの１分子がＮ末端に融合しているＴｐＮ１７配列（下線）を示す；この分子はまた、ＥｃＦｋｐＡ−ＴｐＮ１７と称される。
【００３８】
【化１０】
2015028479.tif 000011
【００３９】
配列番号１１は、大腸菌Ｓｋｐの１分子がＮ末端に融合しているＴｐＮ１７配列（下線）を示す；この分子はまた、ＥｃＳｋｐ−ＴｐＮ１７と称される。
【００４０】
【化１１】
2015028479.tif 000012
【００４１】
配列番号１２は、いくつかのシャペロン部分間の、柔軟で、可溶性であり、そしてプロテアーゼ耐性であるスペーサーまたはリンカーとして使用可能な、グリシンリッチスペーサー（セリンによって分離される３つのグリシン単位を含む）のアミノ酸配列を示す。
【００４２】
【化１２】
2015028479.tif 000013
【００４３】
発明の詳細な説明
梅毒トレポネーマに対する抗体の検出のためのイムノアッセイは、本発明者らによって立証可能であるように、偽陽性結果を示す傾向がある。特に、トレポネーマ属抗原ＴｐＮ１７を用いる場合、偽陽性シグナルの数は、有意に上昇する。この現象は、抗トレポネーマ属陰性であると間違いなく性質決定されているヒト血清で観察されてきている：ＴｐＮ１７抗原を用いる場合、かなりの数の偽陽性が見出された（実施例５を参照されたい）。それでも、ＴｐＮ１７は、トレポネーマ属感染における非常に重要な免疫原および梅毒血清学における最重要抗原である。その結果、ＴｐＮ１７抗原を単に除くことによって、この干渉問題を回避するのは、実行可能なオプションではない。
【００４４】
本発明者らは、したがって、抗ＴｐＮ１７抗体の信頼性があり、そして高感度である検出を可能にする、組換えＴｐＮ１７変異体の設計から始めた。より正確には、本発明者らは、ＴｐＮ１７を、グリシンおよびセリン残基が豊富で柔軟なリンカーを通じて、可溶性を与えるシャペロン（タンデムＳｌｙＤ、すなわちＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤおよびＰｍＳｌｙＤ−ＰｍＳｌｙＤ）に融合させた。融合したフォールディングヘルパーの有益な影響のため、生じる融合ポリペプチドは、血清学的目的のための（すなわちイムノアッセイにおいて使用するための）優れた抗原の、物理化学的および免疫学的必要条件すべてを満たす。
【００４５】
本発明者らが自動化梅毒イムノアッセイのために設計したシャペロン−ＴｐＮ１７融合タンパク質は、非常に可溶性でそして反応性であり、そして二重抗原サンドイッチ形式で好適に使用される。上述のように、梅毒イムノアッセイのための実行可能性研究中、ＴｐＮ１７は、実際に、驚くべき診断重要性を持つ、免疫優性トレポネーマ属抗原であることがわかった。言い換えると、望ましい感受性を保証するため、梅毒イムノアッセイにおいてＴｐＮ１７変異体を用いることが不可欠である。しかし、ＴｐＮ１７のシャペロンポリペプチド融合構築物を二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）形式で用いる場合、問題が明らかになった：ＴｐＮ１７融合構築物が非対称形式で設計されている（すなわち、ＤＡＧＳ形式の対称性を、ビオチン側およびルテニウム側で、異なる融合パートナーを使用することによって、故意に無効にした）ものの、そして抗干渉添加剤としてシャペロン・ポリマーを使用しているにもかかわらず、よく性質決定された抗トレポネーマ属陰性ヒト血清の一団において、かなりの数の陽性結果が生じ、アッセイ特異性の実質的な悪化を導いた。明らかに、いくつかの抗トレポネーマ属陰性ヒト血清は、ＴｐＮ１７抗原と特異的に相互作用することが可能な、少なくとも１つの未知の因子を含有した。
【００４６】
驚いたことに、特定の配列相同性があるにもかかわらず、梅毒トレポネーマとはまったく関連しない生物であるヒト病原体コレラ菌由来の組換え由来タンパク質Ｌｐ１５（ＶｃＬｐ１５）をイムノアッセイ混合物に添加すると、実施例５および表２〜５に見られうるように、偽陽性のシグナル上昇が、陰性血清のシグナルレベルにまで減少することがわかった。本発明者らは、ＶｃＬｐ１５が（非標識型で添加された際）、ＴｐＮ１７に対して向けられる未知の干渉因子（単数または複数）を認識し、これに結合し、そしてこれを抑えることが可能であると結論づける。実際、ＶｃＬｐ１５が、偽陽性結果を減少させ、そしてトレポネーマ属抗原ＴｐＮ１７に基づく梅毒イムノアッセイの特異性を改善するための、非常に有益なツールであることがわかった。
【００４７】
詳細には、本発明は、単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、コレラ菌リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）のペプチド配列またはその部分配列を、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法に関する。
【００４８】
抗原のコンホメーションが、試料中に存在する抗体によって認識されるために十分に天然様であるという条件で、任意のＴｐＮ１７抗原またはその変異体を使用可能である。自然宿主、梅毒トレポネーマにおいて、ＴｐＮ１７のＮ末端シグナル配列（残基１〜２２）は前駆体タンパク質から切断され、成熟ＴｐＮ１７部分が天然コンホメーションにフォールディングすることが可能になる。言い換えると、ＴｐＮ１７を原核宿主、例えば大腸菌において組換え的に産生する場合には、シグナル配列はなくてもよい。シグナル配列は、むしろ、ターゲット分子の適切なフォールディングを妨げ、そしてしたがって除かれる。好ましくは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２９７２２（配列番号５）または配列番号６記載のペプチド配列、あるいは配列番号５または６の部分配列を用いる。部分配列は、配列番号５または６の少なくとも約１００アミノ酸を含む。最も好ましいのは、配列番号５のアミノ酸残基２３〜１５６または配列番号６のアミノ酸残基１〜１３４を含むアミノ酸配列である。
【００４９】
好ましいＴｐＮ１７抗原は、配列番号７〜１１記載のポリペプチドであり、ここで、ＴｐＮ１７は、多様なシャペロンペプチド配列に融合している。精製後の再フォールディングプロセスを容易にし、そしてジスルフィド付加物形成を抑制するため、すべての予測されるＴｐＮ１７抗体中のシステイン残基を、他のアミノ酸残基、例えばアラニンまたはセリンによって置換してもよい。これらの残基は、システイン側鎖の酸化感受性チオール部分を置換するが、サイズがシステイン残基とほぼ同じである。したがって、これらは通常、全体の三次元タンパク質構造に適合し、そしてシステイン不含タンパク質変異体のフォールディングおよび安定性をひどくは損なわない。
【００５０】
本発明の方法にしたがって、コレラ菌リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）のペプチド配列またはその部分配列を、干渉を減少させるための、すなわち偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる。好ましくは、ＶｃＬｐ１５の前記部分配列は、配列番号１または２のアミノ酸残基２６〜１６３を含む。配列番号１の残基１〜２５を含むＮ末端シグナル配列はなくてもよい。本発明のさらなる様式において、配列番号１または２のアミノ酸残基２６〜１６３の前記ＶｃＬｐ１５部分配列を、Ｎ末端またはＣ末端あるいは両端で１〜５アミノ酸、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）することも可能である。別の態様において、配列番号１または２のアミノ酸残基２６〜１６３の前記ＶｃＬｐ１５部分配列は、例えば、セリン残基またはシステインによるアラニン残基の置換のように、保存的アミノ酸置換を導入可能であるような方式で、修飾可能である。これらの３つのアミノ酸のいずれも、他の２つのアミノ酸によって置換可能である。当業者に知られる保存的アミノ酸置換の他の例は、セリン／システイン／アラニン、イソロイシン／バリンまたはフェニルアラニン／チロシンである。任意のこれらの修飾のため、コレラ菌リポタンパク質１５（ＶｃＬｐ１５）の三次元構造が不変のままであることが重要である。
【００５１】
好ましくは、上述の方法において用いるＶｃＬｐ１５ペプチド配列またはその部分配列を、シャペロンに融合させて、高い発現収量を提供し、そして精製後の再フォールディングプロセスを容易にする。
【００５２】
本発明のさらなる側面は、配列番号１または２記載のＶｃＬｐ１５ペプチド配列あるいは配列番号１または２の部分配列およびシャペロンを含む融合ポリペプチドである。
困難なターゲット抗原配列にシャペロンを融合させて、該配列を可溶化し、そしてより良性にする、ポリペプチド融合タンパク質の使用が、当該技術分野に周知であり、そして国際特許出願ＷＯ  ２００３／０００８７８などに以前に非常に詳細に記載されてきている。有用な融合シャペロンの、既知であり、そしてよく文書化された例は、ＳｌｙＤ、ＦｋｐＡ、ＳｋｐおよびＳｌｐＡである。欧州特許出願ＥＰ２１２７６７８Ａ１もまた参照されたい。
【００５３】
したがって、本発明のさらなる側面は、ＶｃＬｐ１５ペプチド配列およびシャペロンを含む融合ポリペプチドである。好ましい態様において、シャペロンは、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡおよびＳｋｐからなる群より選択される。これらのシャペロンは多様な生物から生じることも可能であり、好ましくは、シャペロン配列は大腸菌由来である。
【００５４】
本発明の別の態様において、ＶｃＬｐ１５ペプチド配列を含む融合ポリペプチドは、配列番号３（ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５）を含む。
干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための、イムノアッセイにおける添加剤としての、ＶｃＬｐ１５ペプチドおよびシャペロンを含む融合ポリペプチドの使用もまた、本発明の側面である。
【００５５】
本発明の別の側面は、ＴｐＮ１７抗原、ならびに上記にさらに詳細に記載するような、ＶｃＬｐ１５ペプチド配列およびシャペロンを含む融合ポリペプチドを含む、イムノアッセイにより単離試料において梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を検出するための、試薬キットである。
【００５６】
さらに、本発明は、単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、
ａ）体液試料を、前記試料中に存在する前記抗体が特異的に結合可能な特異的結合パートナーと混合することによって、免疫反応混合物を形成し
ｂ）上に定義するようなＶｃＬｐ１５ペプチド配列を含む融合ポリペプチドを、前記特異的結合パートナーを前記試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、前記免疫反応混合物に添加し、
ｃ）前記体液試料中に存在する抗体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応して、免疫反応産物を形成することを可能にするのに十分な期間、前記免疫反応混合物を維持し；そして
ｄ）前記免疫反応産物のいずれかの存在および／または濃度を検出する
工程を含む、前記方法を含む。
【００５７】
本発明の融合ポリペプチドを、前記結合パートナーを試料に添加する前、添加すると同時、または添加した後のいずれかに、イムノアッセイ混合物（試料および試料中の分析物抗体に特異的に結合する結合パートナーを含む）に添加してもよい。好ましくは、融合ポリペプチドを、分析物抗体を含有する体液試料を特異的結合パートナーと接触させる前に、試験試薬に添加する。
【００５８】
本発明の１つの態様において、いわゆる二重抗原サンドイッチ概念（ＤＡＧＳ）にしたがって、単離試料における抗トレポネーマ属抗体を検出するためのイムノアッセイを実行する。ときに、このアッセイ概念はまた、二重抗原架橋概念とも称され、これは２つの抗原が抗体分析物によって架橋されるためである。こうしたアッセイにおいて、抗体が、２つ（ＩｇＧ、ＩｇＥ）、４つ（ＩｇＡ）または１０／１２（ＩｇＭ）のパラトープで、所定の抗原の少なくとも２つの異なる分子と結合する能力が必要であり、そしてこうした能力が用いられる。
【００５９】
より詳細には、２つの異なるＴｐＮ１７抗原、すなわち第一の（「固相」）ＴｐＮ１７抗原および第二の（「検出」）ＴｐＮ１７抗原と、抗トレポネーマ属抗体を含有する試料をインキュベーションすることによって、二重抗原架橋形式にしたがった抗トレポネーマ属抗体の決定のためのイムノアッセイを行い、ここで前記抗原は各々、前記抗トレポネーマ属抗体に特異的に結合する。第一の抗原は、固相に直接または間接的に結合するかまたは結合可能であり、そして通常、ビオチン／アビジンのようなバイオアフィン（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）結合対の一部であるエフェクター基を所持する。例えば、第一の抗原をビオチンにコンジュゲート化させた場合、固相をアビジンまたはストレプトアビジンのいずれかでコーティングする。第二の抗原は、検出可能標識を所持する。次いで、第一の抗原、試料抗体および第二の抗原を含む免疫反応混合物が形成される。前記抗原に試料を添加する前、または免疫反応混合物が形成された後のいずれかに、第一の抗原が結合可能な固相を添加する。体液試料中の前記ＴｐＮ１７抗原に対する抗トレポネーマ属抗体が、前記ＴｐＮ１７抗原と免疫反応して、免疫反応産物を形成するのに十分な期間、この免疫反応混合物を維持する。次の工程は、液相を固相から分離する分離工程である。最終的に、任意の前記免疫反応産物の存在を、固相または液相あるいは両方で検出する。
【００６０】
前記ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて、「固相抗原」および「検出抗原」の基本構造は同じである。二重抗原架橋アッセイにおいて、免疫学的に交差反応性である、類似であるが異なるＴｐＮ１７抗原を使用することもまた可能である。こうしたアッセイを実行するための本質的な必要条件は、単数または複数の適切なエピトープが両方の抗原上に存在することである。本発明にしたがって、各ＴｐＮ１７抗原に関する異なる融合部分を用いることが望ましく（例えばＥｃＦｋｐＡを固相側でＴｐＮ１７に融合させ、そしてＥｃＳｋｐを検出側でＴｐＮ１７に融合させる）、これはこうした変動が、ＤＡＧＳ形式の対称性を壊し、そしてしたがって、イムノアッセイの偽陽性結果を導くであろう融合シャペロンの抗体仲介性架橋の問題を減少させるためである。簡潔には、構造的に離れた融合パートナーをＤＡＧＳ形式の両側で使用すると、望ましくない免疫学的交差反応が減少し、そしてしたがって特異性が改善される。
【００６１】
したがって、本発明はまた、単離試料において、梅毒トレポネーマのＴｐＮ１７抗原に対する抗体を検出するための方法であって、ＶｃＬｐ１５のペプチド配列を、干渉を減少させ、そして偽陽性結果を最小限にするための試薬として用いる、前記方法にも関する。前記方法は、該アッセイが二重抗原サンドイッチ形式（ＤＡＧＳ）で実行されることでさらに特徴付けられる。さらに、前記アッセイは、２つのＴｐＮ１７抗原融合ポリペプチド−第一および第二のＴｐＮ１７抗原−を用い、ここで、どちらのＴｐＮ１７抗原も同一であるか、または少なくとも同じ抗体に対して免疫学的に交差反応性であり、したがって、試料中に存在する抗体によって、両方の抗原が架橋されることが可能である。さらに、第一および第二の抗原を、先行する段落に記載するように、異なるシャペロンに融合させる。
【００６２】
さらに、ＳｋｐおよびＦｋｐＡのような特異的シャペロン融合パートナーの使用は、かなり改善されたＩｇＭ認識および検出を容易にしうる。結合のアビディティ様式のため、ＩｇＭ分子は、中程度から高いエピトープ密度を所持するポリマー性抗原としか反応できない。ＳｋｐおよびＦｋｐＡの両方は、グラム陰性細菌の周辺質におけるフォールディングヘルパーとしての役割を果たすオリゴマーシャペロンである。驚いたことに、本発明者らは巨大ターゲット分子がシャペロンのＣ末端に融合した際、ＳｋｐおよびＦｋｐＡのクオータリー（ｑｕａｒｔｅｒｙ）構造が維持されることを見出している。その結果、ＦｋｐＡ−ＴｐＮ１７およびＳｋｐ−ＴｐＮ１７融合タンパク質は、ＩｇＭ分子を検出するのに十分な定義されるエピトープ密度を持つ天然オリゴマーを、再現可能に形成する。高感度でそして特異的なＩｇＭ検出は、初期および一次梅毒感染の信頼性がある検出を保証する、非常に重要な特徴である。本発明者らは、総免疫グロブリン検出（すなわちＩｇＧおよびＩｇＭ両方の検出）のためのイムノアッセイを発展させることを目的としているため、オリゴマー抗原モジュールＦｋｐＡ−ＴｐＮ１７およびＳｋｐ−ＴｐＮ１７は、ＤＡＧＳ形式の両側の特定因子として、好適に使用可能である（例えばＦｋｐＡ−ＴｐＮ１７−ビオチンおよびＳｋｐ−ＴｐＮ１７−ルテニウム）。ＦｋｐＡおよびＳｋｐは構造の点では非常に別個の型であるため、望ましくない免疫学的交差反応および融合パートナーを通じた架橋のリスクは非常に低い。化学的に重合させたＦｋｐＡおよびＳｋｐ抗干渉添加剤をアッセイに添加することによって、これはさらに減少する。
【００６３】
分析物を検出するためのイムノアッセイの多様なさらなる形式および原理、ならびに異なる様式の検出が、広く記載されてきており、そしてこれらは、当業者によく知られる。
本発明にしたがって、トレポネーマ属抗体が検出可能でありうる任意の生物学的単離試料が使用可能である。特に、ヒト血液、血清、血漿または唾液は、試料材料として適切である。
【００６４】
本発明はさらに、実施例セクションに例示される。
【実施例】
【００６５】
実施例１
ＴｐＮ１７およびＶｃＬｐ１５シャペロン融合ポリペプチドのクローニングおよび精製
発現カセットのクローニング
Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドに基づいて、ＴｐＮ１７およびＶｃＬｐ１５融合タンパク質をコードする発現カセットを、本質的に記載されるように得た（Ｓｃｈｏｌｚ，  Ｃ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２００５）３４５，  １２２９−１２４１）。ＴｐＮ１７およびＶｃＬｐ１５抗原の配列を、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース（それぞれ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ２９７２２およびＱ９ＫＱＮ６）から回収した。インフレームでＮ末端に融合させたグリシンリッチリンカー領域を含む、成熟ＴｐＮ１７  ａａ  ２３〜１５６（アミノ酸残基１〜２２に渡るシグナルペプチドを除いた）をコードする合成遺伝子をＭｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘ（ドイツ・マルティンスリート）から購入した。酸化または分子間ジスルフィド架橋などの望ましくない副次的影響を防止するため、２５位、２９位、４２位および５８位のＴｐＮ１７のシステイン残基を、アラニン残基に変化させた。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位は、それぞれ、ＴｐＮ１７コード領域の５’および３’端であった。グリシンリッチリンカー領域を通じて連結され、そしてＣ末端にさらなるリンカー領域部分を含む、２つのＥｃＳｌｙＤ単位（配列番号１記載の残基１〜１６５、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ寄託番号第Ｐ０Ａ９Ｋ９号）をコードするさらなる合成遺伝子を、同様に、Ｍｅｄｉｇｅｎｏｍｉｘから購入した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位は、それぞれ、このカセットの５’および３’端であった。単純な連結による、シャペロン部分ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤおよびＴｐＮ１７抗原部分のインフレーム融合を可能にするように、遺伝子および制限部位を設計した。偶発的な組換えプロセスを回避し、そして大腸菌宿主における発現カセットの遺伝的安定性を増加させるため、ＥｃＳｌｙＤ単位をコードするヌクレオチド配列を、伸長されたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列と同様に、縮重させ、すなわち、同一のアミノ酸配列をコードするように、異なるコドンの組み合わせを用いた。
【００６６】
ｐＥＴ２４ａベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてインフレームでトレポネーマ属ＴｐＮ１７  ２３〜１５６に融合させたタンデム−ＳｌｙＤを含むカセットを挿入した。パスツレラ・マルトシダＳｌｙＤ（１〜１５６、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＣＫＰ２）あるいは大腸菌Ｓｋｐ（２１〜１６１、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０ＡＥＵ７）またはＦｋｐＡ（２６〜２７０、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ４５５２３）を含む発現カセットを、それに応じて構築し、同様に、ＴｐＮ１７と異なるターゲットポリペプチド、特にコレラ菌リポタンパク質Ｌｐ１５（２６〜１６３、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ９ＫＱＮ６）を含む発現カセットを構築した。ＴｐＮ１７でのように、酸化または分子間ジスルフィド架橋などの望ましくない副次的影響を防止するため、７４位および７７位（前駆体Ｌｐ１５の番号付け）のＶｃＬｐ１５の真正システイン残基をアラニン残基に変化させた。すべての組換え融合ポリペプチド変異体は、Ｎｉ−ＮＴＡ補助精製および再フォールディングを容易にするためＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含有した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）および標準的ＰＣＲ技術を用いて、それぞれの発現カセットにおいて、点突然変異、欠失、挿入および伸長変異体または制限部位を生成した。
【００６７】
以下の図は、Ｎ末端にインフレームで融合した２つのＳｌｙＤシャペロン単位を所持するトレポネーマ属ＴｐＮ１７全長抗原２３〜１５６のスキームを示す。ＳｌｙＤ融合パートナーが大腸菌起源であることを示すため、図示する融合ポリペプチドは、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ１７（２３〜１５６）と命名されている；配列番号８も参照されたい。
【００６８】
【化１３】
2015028479.tif 000014
【００６９】
生じたプラスミドの挿入物を配列決定し、そして望ましい融合タンパク質をコードすることを見出した。ＴｐＮ１７およびＶｃＬｐ１５融合ポリペプチドの完全アミノ酸配列を配列番号２〜４（ＶｃＬｐ１５）および７〜１１（ＴｐＮ１７）に示す。リンカーＬのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００７０】
ＴｐＮ１７またはＶｃＬｐ１５を含む融合タンパク質の精製
実質的に同一のプロトコルを用いることによって、すべてのＴｐＮ１７およびＶｃＬｐ１５融合タンパク質変異体を精製した。特定のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドを宿する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地中、３７℃で１．５のＯＤ６００まで増殖させ、そして１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを添加することによって、細胞質溶解性過剰発現を誘導した。誘導３時間後、遠心分離（５０００ｇで２０分）によって細胞を採取し、凍結し、そして−２０℃で保存した。細胞溶解のため、冷却した５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ  ＧｄｍＣｌ、５ｍＭイミダゾール中に凍結ペレットを再懸濁し、そして再懸濁物を氷上で２時間攪拌して、細胞溶解を完了させた。遠心分離および濾過（０．４５μｍ／０．２μｍ）後、未精製溶解物を、５．０ｍＭ  ＴＣＥＰを含む溶解緩衝液で平衡化させたＮｉ−ＮＴＡカラム上に適用した。続く洗浄工程を、それぞれのターゲットタンパク質用に調整して、そしてこれは、５〜１５ｍＭイミダゾール（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ  ＧｄｍＣｌ、５．０ｍＭ  ＴＣＥＰ中）の範囲であった。少なくとも１０〜１５体積の洗浄緩衝液を適用した。次いで、ＧｄｍＣｌ溶液を、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５．０ｍＭ  ＴＣＥＰによって置換して、マトリックスに結合したタンパク質のコンホメーション的再フォールディングを誘導した。同時精製プロテアーゼの再活性化を回避するため、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含、Ｒｏｃｈｅ）を再フォールディング緩衝液中に含んだ。総計１５〜２０カラム体積の再フォールディング緩衝液を一晩反応で適用した。次いで、３〜５カラム体積の５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾールで洗浄することによって、ＴＣＥＰおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含阻害剤カクテルを除去した。続いて、非特異的に結合しているタンパク質混入物質を除去するため、イミダゾール濃度を、なお５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ中で、２５〜５０ｍＭ（それぞれのターゲットタンパク質に応じる）に上昇させた。次いで、同じ緩衝液中、５００ｍＭイミダゾールによって、天然タンパク質を溶出させた。Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、純度に関してタンパク質含有分画を評価し、そしてプールした。最後に、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＨｉＬｏａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供し、そしてタンパク質含有分画をプールし、そしてＡｍｉｃｏｎセル（ＹＭ１０）中、１０〜２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００７１】
カップリングした精製および再フォールディングプロトコル後、それぞれのターゲットタンパク質に応じて、およそ１０〜３０ｍｇのタンパク質収量を、１ｇの大腸菌湿細胞から得ることが可能であった。
【００７２】
実施例２
分光光度測定
Ｕｖｉｋｏｎ  ＸＬ二重光線分光光度計を用いて、タンパク質濃度測定を実行した。Ｐａｃｅ（１９９５），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ４，  ２４１１−２４２３によって記載される方法を用いることによって、モル消光係数（ε２８０）を決定した。別個の融合ポリペプチドに用いたモル消光係数（εＭ２８０）を表１に明記する。
【００７３】
表１：本研究で用いた融合ポリペプチド変異体のタンパク質パラメータ。すべてのパラメータは、それぞれのタンパク質単量体を指す。
【００７４】
【表１】
2015028479.tif 000015
【００７５】
融合ポリペプチド変異体のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３、４、８、９、１０および１１に示す。
実施例３
ＴｐＮ１７融合タンパク質へのビオチンおよびルテニウム部分のカップリング
ＴｐＮ１７融合ポリペプチドのリジンε−アミノ基を、１０〜３０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、それぞれ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識分子で修飾した。標識／タンパク質比は、それぞれの融合タンパク質に応じて、２：１〜５：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）で多様であった。反応緩衝液は、１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡであった。反応を室温で１５分間行い、そして１０ｍＭの最終濃度まで緩衝Ｌ−リジンを添加することによって、停止させた。標識の加水分解不活性化を回避するため、それぞれのストック溶液を乾燥ＤＭＳＯ（ｓｅｃｃｏｓｏｌｖ品質、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）中で調製した。反応緩衝液中の最大２５％のＤＭＳＯ濃度は、研究したすべての融合タンパク質によく許容された。カップリング反応後、未精製タンパク質コンジュゲートをゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ）上に通過させることによって、未反応未結合標識を除去した。
【００７６】
実施例４
ＣＤに検出される、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の熱誘導性アンフォールディング
サーモスタットを備えた細胞ホルダーを持つＪａｓｃｏ−７２０分光旋光計を用いて、近ＵＶ  ＣＤスペクトルを記録し、そして平均残基楕円率に変換した。緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡであった。経路長は０．２ｃｍであり、タンパク質濃度は〜７４μＭ（２．６ｍｇ／ｍｌ）であった。測定範囲は２５０〜３３０ｎｍであり、バンド幅は１．０ｎｍであり、スキャン速度は０．５ｎｍの解像度で２０ｎｍ／分であり、そして反応は１秒であった。シグナル対ノイズ比を改善するため、スペクトルを９回測定し、そして平均した。
【００７７】
円二色性分光測定（ＣＤ）は、タンパク質の二次構造および三次構造両方を評価する最適な方法である。芳香族領域（２６０〜３２０ｎｍ）における楕円率は、タンパク質内の三次接触（すなわち通常通りにフォールディングしたタンパク質の球状構造）に関して報告し、そして天然様フォールド（コンホメーション）のフィンガープリント領域と見なされる。
【００７８】
ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の近ＵＶ  ＣＤスペクトルを監視して、精製プロセスにおいて非常に重要な工程であるマトリックスカップリング再フォールディング法後に、融合タンパク質が秩序だったコンホメーションを採用するかどうかの疑問に取り組んだ。答えは非常に明快である：ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の近ＵＶ  ＣＤシグナルは、明白に、融合ポリペプチドの秩序だった三次構造を報告する。ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の芳香族残基は、明らかに、親油性タンパク質コア中に包埋されており、そしてしたがって、融合構築物内のＥｃＳｌｙＤおよびＶｃＬｐ１５両方が天然様コンホメーションであることを強く示す非対称環境を経験する（図１）。
【００７９】
ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の熱誘導性アンフォールディングが可逆性であるかどうかの疑問に取り組むため、２８１ｎｍの検出波長の近ＵＶ領域において、融解曲線を監視した。温度範囲は２０〜８０℃であり、バンド幅は１．０ｎｍであり、温度勾配は１℃／分であり、そして反応は４秒であった（図２を参照されたい）。
【００８０】
熱誘導性アンフォールディングを２８１ｎｍ（ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５に関する最大シグナル振幅の波長である）で監視した。加熱した際、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５分子の天然コンホメーションを安定化する非共有接触は、ゆるくなり、そして最終的に分解される。この熱誘導性アンフォールディングは、図２に示すようなＣＤシグナル中の増加に反映される。８０℃で、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５は、完全にアンフォールディングされる。驚くべきことに、タンパク質溶液を２０℃まで冷却すると、天然様ＣＤシグナルが再び回復する。わずかな履歴現象にもかかわらず、アンフォールディング曲線および再フォールディング曲線は、実質的に重ね合わせであり、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５が可逆的再フォールディングの振る舞いをすることが強く示唆される。アンフォールディングの協同性はかなり低く、そしてタンパク質融解曲線の典型的なシグモイド形状は、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の場合には観察されないことを認めざるを得ない。それでも、本発明者らは、タンパク質溶液を８０℃から２０℃に冷却した際、明らかに、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５が天然様コンホメーションを再採用可能であることを見出した。実際、熱誘導性アンフォールディング前および後に監視した近ＵＶ  ＣＤスペクトルは、実質的に重ね合わせである（図１を参照されたい）。結論として、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５は、ロバストなフォールディング特性を所持し、これは融合ポリペプチドに関しては傑出しており、そしてイムノアッセイにおいて抗干渉添加剤として働く分子に関しては非常に望ましい。これらの良性物理化学的特性は、傑出した可溶性（リン酸緩衝生理食塩水中、＞１３０ｍｇ／ｍｌ）および抗トレポネーマ属イムノアッセイにおいて抗干渉潜在能力を有することと組み合わせて、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５を、梅毒血清学において、高い特異性を保証する、非常に魅力的な分子としている。
【００８１】
実施例５
梅毒イムノアッセイにおけるコレラ菌Ｌｐ１５の抗干渉活性
コレラ菌Ｌｐ１５のポリペプチド融合変異体の抗干渉活性を、自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）において評価した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。二重抗原サンドイッチ形式で測定を行った。
【００８２】
Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０におけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。ビオチン・コンジュゲート（すなわち捕捉抗原）はストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズの表面上に固定される一方、検出抗原は、シグナル伝達部分として、複合体化されたルテニウム・カチオン（レドックス状態２＋および３＋の間で切り替え）を所持する。特異的免疫グロブリン分析物の存在下で、発色物質ルテニウム複合体を固相に架橋し、そして該複合体は、白金電極での励起後、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、恣意的光単位である。
【００８３】
組換え抗干渉Ｌｐ１５ポリペプチドを二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイ形式で評価した。この目的に向けて、組換えトレポネーマ属抗原ＴｐＮ１７を、それぞれ、ビオチンおよびルテニウム・コンジュゲートとして用いて、ヒト血清中の抗ＴｐＮ１７抗体を検出した。ＴｐＮ１７は、梅毒トレポネーマの免疫優性抗原の１つであり、そしてＴｐＮ１７の可溶性変異体は、本特許出願において開示するように、梅毒感染の検出のための非常に有益なツールである。抗ＴｐＮ１７  ＩｇＧ分子を検出するため、ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ−ＴｐＮ１７−ビオチンおよびＰｍＳｌｙＤ−ＰｍＳｌｙＤ−ＴｐＮ１７−ルテニウムを、それぞれ、Ｒ１（試薬緩衝液１）およびＲ２（試薬緩衝液２）中で用いた。抗ＴｐＮ１７  ＩｇＭおよびＩｇＧ分子の両方を検出するため、ＥｃＦｋｐＡ−ＴｐＮ１７−ビオチンおよびＥｃＳｋｐ−ＴｐＮ１７−ルテニウムを、それぞれ、Ｒ１（試薬緩衝液１）およびＲ２（試薬緩衝液２）中で用いた。Ｒ１およびＲ２中の抗原コンジュゲートの濃度は、それぞれ、各２００ｎｇ／ｍｌであった。
【００８４】
第一の実験において、トレポネーマ属に関して陰性であるヒト血清を、前述のＤＡＧＳイムノアッセイ・セットアップで評価した。もっぱらＴｐＮ１７部分をターゲティングする偽陽性の発生率に関するヒントを得るため、抗干渉物質として通例用いられる、ＧＤＡ架橋可溶性異種性ＳｌｙＤポリマーであるＳＳ−らせん（ＧＤＡ、Ｐ）の存在下でスクリーニングを行った。さらに、まさにＴｐＮ１７部分であるものとは異なる部分による干渉現象を排除するため、別の抗干渉モジュールであるＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤをアッセイ緩衝液に含めた。ＳＳ−らせん（ＧＤＡ、Ｐ）およびＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤを、非常に過剰な量で（１０μｇ／ｍｌ）、Ｒ１（ビオチン・コンジュゲートを含有する試薬１緩衝液）に添加した。７５μｌ  Ｒ１（試薬１緩衝液、ビオチン・コンジュゲートおよび抗干渉ポリマー）、７５μｌ  Ｒ２（試薬２緩衝液、ルテニウム・コンジュゲート）、１０μｌ試料（ヒト血清）および４０μｌビーズ懸濁物を次いで混合し、そしてインキュベーションして、ほぼ２００μｌの反応体積を生じた。
【００８５】
このアプローチによって、ＴｐＮ１７を抗原として用いた際、抗梅毒トレポネーマ抗体に関して明らかに陰性であるが、ＤＡＧＳ形式で上昇したシグナルを示す、およそ８（〜２５００陰性ヒト血清のうち）のヒト血清を見出すことが可能であった。しかし、ＴｐＮ１７の代わりにＴｐＮ１５またはＴｐＮ４７などの他のトレポネーマ属抗原を用いた場合、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）シグナルは増加しなかった。この知見は、特異的抗ＴｐＮ１７干渉因子を示す。
【００８６】
表２は、オリゴマーＴｐＮ１７アッセイ・セットアップにおける非標識単量体ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５の抗干渉効果を例示する。ＥｃＦｋｐＡ−ＴｐＮ１７−Ｂｉ（ＤＤＳ）およびＥｃＳｋｐ−ＴｐＮ１７−ＢＰＲｕ（ＳＫ（２）ＤＳＳ）をオリゴマー検出抗原として用い、そして増加する濃度で、非標識ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５をＲ１に添加した。真の陽性血清のシグナルは、Ｌｐ１５の添加に際して有意に抑えられることが明らかである。それでも、陽性シグナルは、ＶｃＬｐ１５を１μｇ／ｍｌなどの高濃度でＲ１に添加した際であっても、明らかに陽性のままである。予期されるように、トレポネーマ属感染が明らかに排除されている、よく性質決定されたヒト血清（Ｔｒｉｎａ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ  ＡＧ、スイス・ネーニコン）は、ＶｃＬｐ１５の添加とは関わりなく、システムに生得的なバックグラウンドシグナル（〜４５０カウント）に近い、非常に低いシグナルを示した。干渉血清、例えばＣ１３１８３９、Ｃ１３２６６３、Ｃ１３２７２３、Ｒ１８３５５４およびＣ１３２９７６は、ＶｃＬｐ１５抗干渉モジュールがまったく添加されない場合、有意に上昇したシグナルを示す。陰性血清の平均シグナルは、〜７７０カウントであったため、１５，１４６カウント（ヒト血清Ｃ１３２６６３に関するもの）または８，５０３カウント（ヒト血清Ｃ１３２７２３に関するもの）のシグナルレベルは、梅毒感染を疑わせる、真の陽性結果を示すであろうことが明らかである。Ｒ１中、１．０μｇ／ｍｌの濃度でＶｃＬｐ１５を添加すると、シグナル上昇が、正常のバックグラウンドシグナルレベルまで減少し、推定上の陽性結果が偽陽性であることが明らかになることは注目に値する。同じことは、非標識単量体ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５を単量体ＴｐＮ１７  ＤＡＧＳセットアップで添加した場合にも当てはまる（表３）。この場合も、ＥｃＳｌｙＤ−ＶｃＬｐ１５を１．０μｇ／ｍｌの濃度でＲ１に添加した際、ヒト血清Ｃ１３２６６３と同様に、有意に上昇したシグナルレベルが、１１，１２８カウントから６５１カウントに減少する。逆に、オリゴマーＶｃＬｐ１５（ＥｃＳｋｐ−ＶｃＬｐ１５）は、それぞれ、上昇してそして偽である陽性シグナルを、オリゴマー（表４）および単量体（表５）ＴｐＮ１７  ＤＡＧＳセットアップの両方において、陰性シグナルバックグラウンドまで効率的に抑える。
【００８７】
梅毒トレポネーマ由来のＴｐＮ１７およびコレラ菌由来のリポタンパク質１５は、９７アミノ酸残基のストレッチに渡って、３４％の配列同一性および５５％の相同性を共有する。免疫学的交差反応が起こるのは、おそらく、この共有配列（およびおそらく構造的）モチーフを通じてであり、高いシグナルを誘発し、そしてしたがってＴｐＮ１７抗原に基づくトレポネーマ属アッセイにおける陽性結果を偽する。表２〜５に示すように、アッセイ混合物にＶｃＬｐ１５抗干渉タンパク質を添加すると、上昇したシグナルが正常の陰性にまで減少する。開示するデータは、非常に強い干渉があったとしても、すなわち高い偽陽性であったとしても、単量体型またはオリゴマー型のコレラ菌リポタンパク質１５を添加することによって、効率的に排除可能であるという説得力がある証拠を提供する。表２〜５に示す結果の結論は、以下の通りである：ＤＡＧＳイムノアッセイにおいて組換えＴｐＮ１７抗原を使用したための干渉は、かなり頻繁であり（５００の陰性血清中、＞１）、そしてこれらは、梅毒トレポネーマから系統樹的にかなり遠い細菌属であるコレラ菌由来のリポタンパク質１５を添加することによって効率的に軽減可能である。簡単に言うと、本出願は、容易に入手可能な組換えタンパク質の添加が、抗トレポネーマ属抗体の検出のためのＴｐＮ１７に基づく梅毒イムノアッセイの特異性を有意に改善することを開示する。
【００８８】
表２：
オリゴマーＴｐＮ１７；単量体ＶｃＬｐ１５の添加
【００８９】
【表２】
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【００９０】
表３：
単量体ＴｐＮ１７；単量体ＶｃＬｐ１５の添加
【００９１】
【表３】
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【００９２】
表４：
オリゴマーＴｐＮ１７；オリゴマーＶｃＬｐ１５の添加
【００９３】
【表４】
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【００９４】
表５：
単量体ＴｐＮ１７；オリゴマーＶｃＬｐ１５の添加
【００９５】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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