(57)【要約】      （修正有）【課題】関節リウマチのような関節炎の病態および関節炎の病態に関係する疾患を治療する組成物の提供。【解決手段】関節関連の抗原（例えば、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、およびＨＳＰのうちから選択される関節関連の抗原）に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する組成物であって、前記関節関連の抗原がＨＳＰ、ケラチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、トポイソメラーゼＩ、カルジオリピン、またはＩV型コラーゲンではないことを条件とする組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する組成物であって、前記関節関連の抗原がＨＳＰ、ケラチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、トポイソメラーゼＩ、カルジオリピン、またはＩV型コラーゲンではないことを条件とする、組成物。
【請求項２】
前記ヒトＴｒ１細胞集団がヒトＴｒ１クローン集団である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記関節関連の抗原が、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９(ＨＣｇｐ３９)ペプチド、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ビメンチン、フィブリノゲン、Ｉ、ＩＩＩおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、アルドラーゼ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物を含む群から選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記関節関連の抗原が、II型コラーゲン、並びにその断片、変異体、および混合物である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記関節関連の抗原が、ＨＣｇｐ３９、並びにその断片、変異体、および混合物である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
関節関連の抗原に向けられる、少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する薬剤。
【請求項７】
１つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わせられる、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する医薬組成物。
【請求項８】
前記ヒトＴｒ１細胞集団が、ヒトＴｒ１クローン集団である、請求項６に記載の薬剤または請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ヒトＴｒ１細胞集団が、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９(ＨＣｇｐ３９)ペプチド、ＨＳＰ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、カルジオリピン、Ｉ、ＩＩＩ、ＩVおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物のうちから選択される関節関連の抗原に向けられる、請求項８に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１０】
前記ヒトＴｒ１細胞集団が、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、およびＨＳＰのうちから選択される関節関連の抗原に向けられる、請求項８に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１１】
関節炎の病態を治療するための、請求項６乃至請求項１０のいずれか一項に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１２】
前記関節炎の病態が関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、または乾癬性関節炎である、請求項１１に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１３】
その必要がある対象に投与する薬剤または医薬組成物が、前記対象の細胞に自己由来するヒトＴｒ１細胞を含有する、請求項１１または１２に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１４】
その必要がある対象に、１０４／ｋｇ〜１０９／ｋｇのＴｒ１細胞を投与する、請求項１１乃至請求項１３のいずれか一項に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１５】
有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することが、関節炎の病態を治療するために使用される１つ以上の治療薬と組み合わせられている、請求項１１乃至請求項１４のいずれか一項に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１６】
有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することが、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害剤、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群から選択される１つ以上の治療薬と組み合わせられている、請求項１５に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１７】
前記対象が、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害剤、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群における１つ以上の治療薬に十分に反応しないか、または十分に反応しないと見込まれる請求項１１乃至請求項１４のいずれか一項に記載の薬剤または医薬組成物。
【請求項１８】
その必要がある対象における関節炎の病態を治療するための工程であって、
―選択された関節関連の抗原に向けられるＴｒ１細胞を取得するステップであって、前記Ｔｒ１細胞を前記対象の血液試料から取得する前記ステップと、
―選択された関節関連の抗原に向けられる前記Ｔｒ１細胞をクローニングするステップと、
―先のステップで取得したＴｒ１クローンをさらに拡大するステップと、
―そうして取得したＴｒ１クローンを、好ましくは静脈内経路により前記対象に注射するステップと、を含む工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎の病態（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の治療分野に関する。本発明は特に、関節関連の抗原に向けられる（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ）ヒトＴｒ１細胞を含有する薬剤を使用した、関節炎の病態および関節炎の病態に関係する疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
およそ４６００万人のアメリカ人および１億人のヨーロッパ人が関節炎に侵されており、その数は年々増加すると予想されている。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１(ＩＬ-１)の過剰産生と、抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１０、ＩＬ−１１の不足とを引き起こす免疫システムのアンバランスさに特徴付けられる。ＲＡは、軟骨組織の破壊、骨びらん、それに続く関節の変形を進行させる滑膜炎に特徴付けられる。ＲＡの初期症状は、関節の炎症、腫脹、移動困難、および痛みである。炎症過程においては、多形核細胞、マクロファージ、およびリンパ球が関与する。マクロファージがプロスタグランジンおよび細胞毒素の放出を刺激する一方、活性化されたＴリンパ球は細胞毒素および炎症性サイトカインを産生する。血管作用性物質（ヒスタミン、キニン、およびプロスタグランジン）が炎症部位に放出され、炎症した関節に伴って浮腫、温感、紅斑、および痛みを引き起こす。ＲＡの末期では、炎症細胞により産生された酵素が骨および軟骨組織を消化させ得る。長期間におよぶ損傷は、結果として慢性疼痛、機能損失、変形、関節の能力障害を生じさせ、平均余命の短縮さえ生じさせる。世界中のＲＡの羅患率は、常に総人口の１．０％である。
【０００４】
若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）として以前から知られている若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)は、小児における持続性関節炎の最も一般的な種類である。ＪＩＡは時に若年性慢性関節炎（ＪＣＡ）と呼ばれることもあるが、この用語はＪＩＡとしては的確ではなく、慢性の小児期の関節炎の全ての種類を包含しているわけではない。ＪＩＡは、１６歳未満の子供に６週間以上にわたり関節の炎症および硬直を引き起こす関節炎である。ＪＩＡの３つの主な種類は、少関節型ＪＩＡ、多関節型ＪＩＡ、および全身型ＪＩＡである。少関節型（または小関節型）ＪＩＡは、疾患の最初の６ヶ月間に５以下の関節を侵す。多関節型ＪＩＡは、疾患の最初の６ヶ月間に５以上の関節を侵す。この亜型は、首および下顎の侵襲を含み得るとともに、小関節が大抵侵される。全身型ＪＩＡ(スチル病)は、関節炎、発熱、およびサーモンピンクの発疹に特徴付けられる。全身型ＪＩＡは、発熱および発疹が現れたり消えたりするため、診断が困難であり得る。全身型ＪＩＡは、内臓器官の合併症があるかもしれず、漿膜炎（例えば心膜炎）に至るかもしれない。
【０００５】
強直性脊椎炎(ＡＳ；ベヒテレフ病／ベヒテレフ症候群／マリー・シュトリュンペル病／マリー・シュトリュンペル病／脊椎関節炎としても知られる)は、まず脊椎および仙腸関節を侵し、最終的に脊椎の融着を引き起こす慢性、有痛性、変性、炎症性の関節炎であり、遺伝的素因の可能性がある自己免疫性脊椎関節症の群の一員である。完全に融着すると、竹様脊柱として知られる脊椎の完全な強直の状態に至る。
【０００６】
乾癬性関節炎(関節性乾癬または乾癬性関節症でもある)は炎症性関節炎の一種であり、およそ５〜７％の人々が侵されて慢性的に皮膚病態の乾癬を被る。乾癬性関節炎の治療は、関節リウマチの治療と類似する。乾癬性関節炎を伴った患者のうち８０％を上回る患者は、爪の凹窩に特徴付けられる乾癬性の爪病変、または、より極端には爪それ自体の損失(爪甲剥離症)を有する。
【０００７】
関節炎の病態の最近の治療のほとんどは、滑膜の細胞増殖および軟骨びらんを促進すると想定される免疫異常の修正を目的とする。関節炎の現在の治療は、例えばアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として分類される、痛みおよび炎症の制御のための第一選択薬を含む。第二の治療はコルチコステロイド、並びに疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、例えばペニシリナミン、シクロホスファミド、金塩、アザチオプリン、レバミソール、メトトレキサート、レフルノミド、シクロスポリン、エタネルセプト、およびスルファサラジンなどを含む。
【０００８】
痛みの制御は、関節炎を治療するのに重要な部分である。鎮痛薬は、一時的な鎮痛を提供するにすぎない。それらは、炎症の低減も疾患の進行遅延もしない。アセトアミノフェン(タイレノール)が最も一般的に使用される鎮痛薬である。より激痛用には、麻薬性鎮痛薬も処方され得る。
【０００９】
コルチコステロイドは、副腎皮質で産生されるホルモンであるコルチゾールと密接に関係する。コルチコステロイドを用いた関節リウマチの治療は、利益／不利益の得失評価の点で問題となる。コルチコステロイドは、腫脹および炎症を迅速に低減するその能力ゆえに、非常に強力な薬としてみなされている。しかし、コルチコステロイドは、潜在的に深刻で持続性の副作用を引き起こし得ることがよく知られている。それゆえ、それらは、時間とともに徐々に用量を減らすか、または漸減させながら、常に可能な限り短い期間にわたり、可能な限り最小有効量で、軽減のために全身的または特定の関節内に局所的に、特定の状況下においてのみ使用される。
【００１０】
ＮＳＡＩＤは、コルチコステロイドと区別される。ＮＳＡＩＤは低用量では痛みを低減させ、高用量では炎症を軽減させる。ほとんどのＮＳＡＩＤは、酵素シクロオキシゲナーゼの阻害剤であり、非選択的にシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の両方を阻害する。シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸由来のプロスタグランジンおよびトロンボキサンの形成を触媒する律速酵素である。とりわけ、プロスタグランジンは、炎症過程においてメッセンジャー分子として機能する。ＣＯＸ−１は、多くの正常な生理的過程を調節する「ハウスキーピング」の役割を伴って恒常的に発現する酵素である。ＮＳＡＩＤの有害作用は主に、プロスタグランジンが保護的役割を果たす腎臓および消化管におけるそれらのＣＯＸ−１阻害に関連する。ＣＯＸ−２は、ほとんどの組織で発現率が低いか、または発現が検出できない酵素であるが、サイトカイン、増殖因子、腫瘍プロモータによる細胞活性化に反応して直ちに誘発され得る。ＮＳＡＩＤの治療効果は、ＣＯＸ−２の阻害に起因する。選択的なＣＯＸ−２阻害薬であるコキシブ（セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ）は、胃保護のプロスタグランジンを乱すことなく抗炎症作用を有すると考えられたが、臨床適用において心血管リスクの増加が認められ、その結果いくつかのコキシブ（ロフェコキシブおよびバルデコキシブ）が世界中で使用中止となった。
【００１１】
ＮＳＡＩＤが日常的な炎症を減少させる一方で、より強力な医薬であるＤＭＡＲＤは、通常、炎症性関節炎に起因する複数の関節における持続性の炎症を伴う患者に、６週間以上にわたって必要とされる。ＤＭＡＲＤは、持続性の炎症を助ける原動力である生物学的過程を減速させる。ＤＭＡＲＤは、遅効性の抗リウマチ薬である。最速効性のＤＭＡＲＤはメトトレキサートであり、これは利益が認められるまでに通常は４〜６週間かかる。残りのＤＭＡＲＤは、効果が得られるまでに３〜６ヶ月、または一層長い期間でさえかかり得る。ＤＭＡＲＤは免疫システムを抑制するので、長期間の使用によって重篤な有害作用が生じ得る。単一薬剤として、または他のＤＭＡＲＤと組み合わせるかのいずれかとして、メトトレキサートがＲＡのための有効な治療法として登場した。メトトレキサートの毒性プロファイルは十分に確立されており、重篤かつ時には致死的である、肝臓病、間質性肺炎、および血球減少を含む。
【００１２】
近年のＲＡ治療における最も興奮する進歩は、生物学的ＤＭＡＲＤの開発である。ＲＡの病理発生におけるＴＮＦ−αの鍵的な役割の解明により、このサイトカインの活性を遮蔽する標的治療法の開発に至った。抗ＴＮＦ治療に加え、特に免疫関連疾患の過程に関与する分子（ＩＬ−１）または細胞（Ｂ細胞およびＴ細胞）に対する、他のいくつもの生物学的ＤＭＡＲＤが開発されてきた。従来のＤＭＡＲＤを上回る生物学的ＤＭＡＲＤの潜在的な利点は、病理発生に非常に関与する標的分子の高度に特異的な遮蔽、臨床行為の即時開始、最小化された非特異的毒性、長い投与間隔（毎週皮下に投与するか、または毎月静脈内に投与する）、長期にわたる免疫調節効果の可能性、および改善された生活の質を含む。関節炎に使用される生物学的ＤＭＡＲＤは、炎症性サイトカインを遮蔽し、Ｂ細胞を特異的に枯渇させ、Ｔ細胞の活性化を選択的に阻害するものを含む。 
【００１３】
広範な薬剤が利用可能であるが、炎症性関節炎のための成功する治療法は、未だに大きなアンメット・メディカル・ニーズである。生物学的ＤＭＡＲＤは、この疾患を減速させるか、または止めさえする最も有望なルートを提供するものの、患者の一部に対してしか機能しない。最も有効な抗ＴＮＦ治療でさえ、ＲＡ患者の少なくとも３分の１が反応しない。
【００１４】
本発明では、出願人は、関節関連の抗原に向けられるＴｒ１細胞の使用に基づいた関節炎のための、代替的治療法の提供を目的とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６７４６６７０号
【特許文献２】国際公開第０２／０９２７９３号
【特許文献３】国際公開第２００７／０１０４０６号
【特許文献４】国際公開第２００５／０００３４４号
【特許文献５】国際公開第２００６／１０８８８２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する組成物に関し、前記関節関連の抗原が、ＨＳＰ、ケラチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、トポイソメラーゼI、カルジオリピン、またはＩV型コラーゲンではないことを条件とする。
【００１７】
好ましい実施形態では、前記ヒトＴｒ１細胞集団は、ヒトＴｒ１クローン集団である。
【００１８】
本発明の実施形態では、前記関節関連の抗原は、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ビメンチン、フィブリノゲン、I、ＩＩＩおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、アルドラーゼ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物を含む群から選択される。
【００１９】
好ましい実施形態では、前記関節関連の抗原はII型コラーゲン、並びにその断片、変異体、および混合物である。別の好ましい実施形態では、前記関節関連の抗原はＨＣｇｐ３９、並びにその断片、変異体、および混合物である。
【００２０】
本発明の別の目的は、関節関連の抗原に向けられる、少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する薬剤である。
【００２１】
本発明の別の目的は、１つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わせられる、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する医薬組成物である。
【００２２】
好ましい実施形態では、前記ヒトＴｒ１細胞集団は、ヒトＴｒ１クローン集団である。
【００２３】
本明細書の実施形態では、前記薬剤または医薬組成物は、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、カルジオリピン、Ｉ、ＩＩＩ、ＩVおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(ＰＤＨ)、アルドラーゼ、トポイソメラーゼI、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物、のうちから選択される関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞を含有する。
【００２４】
好ましい実施形態では、前記ヒトＴｒ１細胞は、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、およびＨＳＰから選択される、関節関連の抗原に向けられる。 
【００２５】
本発明は、関節炎の病態を治療するために、薬剤または医薬組成物の調製に、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する組成物を使用することに関する。
【００２６】
本発明の一実施形態では、前記関節関連の抗原は、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、カルジオリピン、Ｉ、ＩＩＩ、ＩVおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(ＰＤＨ)、アルドラーゼ、トポイソメラーゼI、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物を含む群から選択される。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団は、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、およびＨＳＰから選択される、関節関連の抗原に向けられる。
【００２８】
好ましい実施形態では、前記関節炎の病態は関節リウマチである。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、前記関節炎の病態は、強直性脊椎炎である。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、前記関節炎の病態は、若年性特発性関節炎である。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、前記関節炎の病態は、乾癬性関節炎である。
【００３２】
本発明の一実施形態では、その必要がある対象に投与する薬剤または医薬組成物は、前記対象の細胞に自己由来するヒトＴｒ１細胞を含む。
【００３３】
好ましい実施形態では、１０４／ｋｇ〜１０９／ｋｇのＴｒ１細胞を、その必要がある対象に投与する。
【００３４】
本発明の一実施形態では、有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することは、関節炎の病態を治療するために使用される１つ以上の治療薬と組み合わせられている。
【００３５】
好ましい実施形態では、前記１つ以上の治療薬は、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害薬、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群から選択される。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、本発明の薬剤または医薬組成物は、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害薬、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群における１つ以上の治療薬に、十分に反応しないか、または十分に反応しないと見込まれる対象に投与する。
【００３７】
本発明の別の目的は、その必要がある対象における関節炎の病態を治療するための工程であり、前記工程は：
―選択された関節関連の抗原に向けられるＴｒ１細胞を取得するステップであって、前記Ｔｒ１細胞を前記対象の血液試料から取得する前記ステップと、
―選択された関節関連の抗原に向けられる前記Ｔｒ１細胞をクローニングするステップと、
―先のステップで取得したＴｒ１クローンをさらに拡大（ｅｘｐａｎｄ）するステップと、
―そうして取得したＴｒ１クローンを前記対象に、好ましくは静脈内経路により再注入するステップと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】II型コラーゲンを用いた特異的活性化後におけるＴｒ１クローンのＩＬ−１０産生を示す図である。  図１は、特異的抗原であるII型コラーゲンの存在下におけるＴ細胞クローンによるＩＬ−１０産生の特異的増加を表す。照射した自己抗原提示細胞の存在下において、II型コラーゲンの有る場合と無い場合でクローンを活性化させた。４８時間後、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１０産生を測定した。
【図２】II型コラーゲンＴｒ１クローンのサイトカイン分泌プロファイルを示す図である。  抗ＣＤ３+抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で活性化させた細胞の４８時間後の上清において、II型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞クローンのＩＬ−１０、ＩＬ−４、およびＩＦＮγの分泌を測定した。
【図３】II型コラーゲンＴｒ１クローンのｉｎ  vｉｔｒｏでの抑制活性を示す図である。  自己由来ＣＤ４＋Ｔリンパ球を用いた共培養実験において、II型コラーゲンＴｒ１クローンの抑制活性を調べた。抗ＣＤ３+抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用して、細胞集団を３日にわたり共培養した。次に、段階付けた量のＴｒ１細胞の非存在下または存在下において、自己由来ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞増殖を評価した。結果は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球へのＴｒ１細胞の添加がＴ細胞増殖を大幅に阻害することを示している。
【図４】関節リウマチの患者から単離したII型コラーゲンＴｒ１クローンの細胞分泌プロファイルを示す図である。
【図５】関節リウマチの患者から単離したII型コラーゲンＴｒ１クローンのｉｎ  vｉｔｒｏでの抑制活性を示す図である。
【図６】II型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞は、コラーゲンで誘発した関節炎のマウスモデルにおいて、深刻な関節炎の進行を阻害することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本明細書で使用される「Ｔｒ１細胞」という用語は、静止状態（ａｔ  ｒｅｓｔ）でＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−の表現型を有し、活性化されると高レベルのＩＬ−１０および有意なレベルのＴＧＦ−βを分泌できる細胞を言う。Ｔｒ１細胞は、独特なサイトカインプロファイルにより一部特徴付けられる。これらは、高レベルのＩＬ−１０、有意なレベルのＴＧＦ−β、および中間レベルのＩＦＮ−γを産生するが、ＩＬ−４またはＩＬ−２はほとんど、もしくは全く産生しない。サイトカイン産生は典型的に、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体またはインターロイキン２、ＰＭＡ＋イオノマイシンのような、Ｔリンパ球のポリクローナル活性化因子を用いて活性化した後の細胞の培養物において評価される。代替的に、サイトカイン産生は、抗原提示細胞により提示される特異的Ｔ細胞抗原を用いて活性化した後の細胞の培養物において評価される。高レベルのＩＬ−１０とは、少なくとも約５００ｐｇ／ｍｌ、典型的には約１０００、２０００、４０００、６０００、８０００、１万、１万２０００、１万４０００、１万６０００、１万８０００、もしくは２万ｐｇ／ｍｌ、またはそれを上回る量に相当する。有意なレベルのＴＧＦ−βとは、少なくとも約１００ｐｇ／ｍｌ、典型的には約２００、３００、４００、６００、８００、もしくは１０００ｐｇ／ｍｌ、またはそれを上回る量に相当する。中間レベルのＩＦＮ−γとは、０ｐｇ／ｍｌ〜少なくとも４００ｐｇ／ｍｌの間、典型的には約６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、もしくは２０００ｐｇ／ｍｌまたはそれを上回る量を含む濃度に相当する。ＩＬ−４またはＩＬ−２がほとんど、もしくは全くないとは、約５００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２５０、１００、７５、もしくは５０ｐｇ／ｍｌまたはそれより少ない量に相当する。
【００４０】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、本発明の細胞が調節するように使用されるため、または本発明の任意の方法の使用のためのタンパク質またはペプチドを言う。一実施形態では、「抗原」という用語は、目的の抗原と配列相同性、もしくは目的の抗原と構造的相同性、またはそれらの組み合わせを共有する、合成由来の分子または天然由来の分子を言い得る。一実施形態では、抗原はミメトープであり得る。抗原の「断片」とは、より短いペプチドのような、抗原の任意のサブセットを言う。抗原の「変異体」とは、抗原全体またはその断片のどちらかに実質的に類似する分子を言う。変異体の抗原は、当技術分野で周知の方法を使用して、変異体のペプチドを直接化学合成することにより、便利に調製され得る。
【００４１】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトを言う。
【００４２】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、有益な、または所望の臨床結果（例えば、臨床的病態の改善）を生じさせるに十分な量を言う。
【００４３】
本明細書で使用される「クローン」または「クローン集団」という用語は、唯一の分化細胞に由来する分化細胞の集団を言う。
【００４４】
本明細書で使用される「治療」または「治療する」という用語は、通常、治療される個体の自然経過を変えようとする臨床的介入を言い、臨床病理の過程中に行われ得る。望ましい効果とは、症状を軽減させ、いかなる直接的もしくは間接的な疾患の病理学的事象も抑制、減少、または阻害し、疾患進行率を低下させ、疾患の状態を改善もしくは緩和させ、寛解もしくは改善された予後を生じさせることを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の内容においては、炎症性関節炎の臨床症状の任意の改善とともに患者の健康の任意の改善、特に以下の少なくとも１つにより表される改善を言う：関節の低減した腫脹および圧痛、関節における痛みの減少、改善した運動性、関節および周辺組織の悪化の緩徐化、疾患の急性発作間の寛解期間の増加、急性発作の時間の長さの短縮、重篤な疾患発生の防止、など。
【００４５】
本明細書で使用される「関節炎」という用語は、腱、靭帯、および筋肉とともに、身体における他の器官のような関節周囲の組織における慢性炎症（関節に発症するが、主に自己免疫過程に起因することは問わない）を言う。好ましくは、治療される炎症性関節炎は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および化膿性関節炎である。好ましい治療標的は関節リウマチである。
【００４６】
本発明
本発明は、その必要がある対象における関節炎の病態を治療する方法に関し、関節関連の抗原に向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する組成物を前記対象に投与することを含む。
【００４７】
本発明によれば、「ヒトＴｒ１細胞集団」とは、本明細書の定義において先に説明したＴｒ１細胞に相当し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞もしくはＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（天然または従来のＴｒｅｇ）、ＴＧＦ−β分泌Ｔｈ３細胞、または制御性ＮＫＴ細胞を含まない。
【００４８】
本発明によれば、「関節関連の抗原」という用語は、関節に存在する免疫原性ペプチドを言う。
【００４９】
本発明の一実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、安静時の関節に存在し得る。
【００５０】
別の実施形態では、前記免疫原性ペプチドは、炎症関節に存在し得る。
【００５１】
関節関連の抗原の例は、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、およびＨＳＰ９０、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、Ｉ、ＩＩＩ、ＩVおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性カルジオリピン、ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカンを含むがこれらに限定されるものではない。
【００５２】
好ましい実施形態では、前記ヒトＴｒ１細胞は、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、ＨＳＰタンパク質から選択される関節関連の抗原に向けられる。
【００５３】
より好ましい実施形態では、前記組成物は、II型コラーゲンに向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する。II型コラーゲンに向けられるヒトＴｒ１細胞は、II型コラーゲンの２４５〜２７３断片（ＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴ、配列番号１) に存在するエピトープに向けられていてもよく、ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４のどちらかの対象に関連してもよい。
【００５４】
別のより好ましい実施形態では、前記組成物は、ＨＣｇｐ３９に向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する。ＨＣｇｐ３９に向けられるヒトＴｒ１細胞は、以下のＨＣｇｐ３９のエピトープに向けられる：ＰＴＦＧＲＳＦＴＬＡＳＳＥ(配列番号２)、ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧVＧ(配列番号３)、VＧＹＤＤＱＥＳVＫＳＫV(配列番号４)、ＳＱＲＦＳＫＩＡＳＮＴＱＳＲ(配列番５)、ＦＧＲＳＦＴＬＡＳ(配列番号６)、ＦＴＬＡＳＳＥＴＧ(配列番号７)、ＹＤＤＱＥＳVＫＳ(配列番号８)、およびＦＳＫＩＡＳＮＴＱ(配列番号９)。
【００５５】
別のより好ましい実施形態では、前記組成物は、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、およびＨＳＰ９０のようなＨＳＰタンパク質に向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する。
【００５６】
理論に拘束されることを望むものではないが、出願人は、関節関連の抗原に向けられる注入されたＴｒ１細胞集団が、関節に存在する抗原によりｉｎ  vｉvｏで活性化され、関節炎の病態を制御できるであろうと想定する。それ故、Ｔｒ１細胞を刺激するため、Ｔｒ１細胞が向けられる抗原を注入する必要がない。
【００５７】
本発明は、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する組成物に関し、前記ヒトＴｒ１細胞集団はＨＳＰ、ＩV型コラーゲン、ケラチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、トポイソメラーゼＩ、およびカルジオリピンに向けられる細胞ではないことを条件とする。
【００５８】
好ましい実施形態では、前記組成物は、II型コラーゲンおよびＨＣｇｐ３９から選択される、関節関連の抗原に向けられるヒトＴｒ１細胞集団を含有する。
【００５９】
より好ましい実施形態では、前記組成物は、II型コラーゲンに向けられるヒトＴｒ１細胞集団を含有する。
【００６０】
別のより好ましい実施形態では、前記組成物はＨＣｇｐ３９に向けられるヒトＴｒ１細胞集団を含有する。
【００６１】
本発明の一実施形態では、ヒトＴｒ１細胞は：
ａ）対象から前駆細胞集団を単離するステップと、
ｂ）ＩＬ−１０の存在下で、前記前駆細胞を培養することにより樹状細胞集団を取得するステップと、
ｃ）関節関連の抗原の存在下で、ステップｂ）の細胞を、前記対象から単離したＣＤ４＋Ｔリンパ球集団と接触させ、前記抗原に向けられるＣＤ４＋Ｔ細胞の分化によりＴｒ１細胞集団にするステップと、
ｄ）ステップｃ)のＴｒ１細胞集団を回収するステップと、により取得され得る。
ステップｂ）では、ＩＬ−１０は、培地中に５０〜２５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは１００Ｕ／ｍｌ存在する。Ｔｒ１細胞を取得するための前記方法は、Ｗａｋｋａｃｈら（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００３  Ｍａｙ；１８（５）：６０５−１７）に説明されている。
【００６２】
前記方法はまた、デキサメタゾンおよびビタミンＤ３、またはステップｂ）のＤＣの代わりに、寛容化もしくは未熟ＤＣを使用して実行してもよい。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、ヒトＴｒ１細胞は：
ａ）対象から単離した関節関連の抗原に向けられるＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、適切な量のＩＦＮ−αを用いた培地で培養するステップと、
ｂ）Ｔｒ１細胞集団を回収するステップと、により取得され得る。
【００６４】
ＩＦＮ−αは、好ましくは５ｎｇ／ｍｌで培地に存在する。ステップａ）では、培地は適切な量のＩＬ−１０、好ましくは１００Ｕ／ｍｌをさらに含有し得る。
【００６５】
ステップｂ）では、Ｔｒ１細胞集団は、増殖できるようにＩＬ−１５を含有する培地で培養され、ＩＬ−１５は培地中、好ましくは５ｎｇ／ｍｌである。Ｔｒ１細胞を取得するための前記方法は、米国特許第６７４６６７０号に説明されている。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態では、ヒトＴｒ１細胞は、
ａ）人工抗原提示細胞により提示された関節関連の抗原の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団をｉｎ  vｉｔｒｏで活性化させるステップと、
ｂ）少なくとも１０％のＴｒ１細胞を含有する活性化させたＣＤ４＋Ｔ細胞を回収するステップと、により取得され得る。
【００６７】
好ましくは、人工抗原提示細胞は、ＨＬＡ  ＩＩ系分子およびヒトＬＦＡ−３分子を発現し、共刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ４０、ＣＤ２３、およびＩＣＡＭ−１を発現しない。
【００６８】
Ｔｒ１細胞を取得するための前記工程は、国際公開第０２／０９２７９３号に説明されている。
【００６９】
本発明のさらに別の実施形態では、ヒトＴｒ１細胞は、
ａ）関節関連の抗原および適切な量のＩＬ−１０の存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団をｉｎ  vｉｔｒｏで活性化させるステップと、
ｂ）Ｔｒ１細胞集団を回収するステップと、により取得され得る。
【００７０】
好ましくは、ＩＬ−１０は培地中、１００Ｕ／ｍｌで存在する。前記方法は、Ｇｒｏｕｘら（Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８９（６６５２）：７３７−４２）に説明されている。
【００７１】
本発明のさらに別の実施形態では、ヒトＴｒ１細胞は、
ａ）関節関連の抗原を用いて、白血球集団または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団を刺激するステップと、
ｂ）刺激した集団から、関節関連の抗原−特異的Ｔｒ１細胞集団を回収するステップと、
ｃ）前記関節関連の抗原−特異的Ｔｒ１細胞集団を随意に拡大するステップと、により取得され得る。
【００７２】
白血球は、その重要性、その分布、その数、その寿命、およびその可能性により特徴付けられる数種類の細胞を包含する。これらの種類は以下の通りである：多核白血球または顆粒白血球であり、その中には好酸球性、好中球性、および好塩基球性の白血球、並びに単核細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が見出され、これは巨大な白血球であり、免疫システム（リンパ球および単球）の主要な細胞型にある。白血球またはＰＢＭＣは、当技術分野で公知の、任意の方法により末梢血液から分離することができる。有利には、ＰＢＭＣの分離には遠心分離、好ましくは密度勾配遠心分離、好ましくは非連続的な密度勾配遠心分離が使用され得る。代替手段は特異的モノクローナル抗体の使用である。ある実施形態では、ＰＢＭＣは典型的に、標準的な手順を使用して、フィコール・ハイパックの手段により全血産物から単離される。別の実施形態では、ＰＢＭＣは、白血球除去の手段により回収される。
【００７３】
前記方法は、国際公開第２００７／０１０４０６号に説明されている。
【００７４】
さらに別の実施形態では、ヒトＴｒ１細胞は、
ａ）白血球集団または末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）集団を、関節関連の抗原の存在下で間葉系幹細胞を用いて培養するステップと、
ｂ）Ｔｒ１細胞集団を回収するステップと、により取得し得る。
【００７５】
前記方法はまた、ＰＢＭＣまたは白血球の代わりに、ナイーブＴ細胞またはメモリーＴ細胞を用いて実行することもできる。
【００７６】
そうして取得したＴｒ１細胞集団は、インターロイキン−２およびインターロイキン−４のようなサイトカインの存在下で、培養によりさらに拡大し得る。代替的に、インターロイキン−１５およびインターロイキン−１３もまた、Ｔｒ１細胞拡大培養に使用し得る。
【００７７】
先に説明した方法では、ヒトＴｒ１細胞は、国際公開第２００５／０００３４４号に説明される同定方法により特徴付けられ得る。Ｔｒ１細胞の前記同定方法は、ＣＤ４分子、並びにＣＤ１８および／またはＣＤ１１ａ、およびＣＤ４９ｂを含有する群の分子をコードする遺伝子の発現産物の、同時存在性を検出することに基づく。Ｔｒ１細胞は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または前記マーカーに対する抗体を用いた免疫親和性の方法により、同定および／または精製できる。
【００７８】
Ｔｒ１細胞はまた、フローサイトメトリーまたは電磁ビーズを使用して、ポジティブ選択またはネガティブ選択により濃縮することができる。そのような方法はまた、国際公開第２００５／０００３４４号に説明されている。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、関節関連の抗原に向けられるＴｒ１細胞は、国際公開第２００６／１０８８８２号に説明されている、ｉｎ  vｉｔｒｏにおける方法により拡大され得る。前記方法は：
ａ）３５℃より下の温度Ｔ１、培地Ｍｆにおいて、昆虫フィーダー細胞のようなフィーダー細胞を培養するステップであって、前記温度Ｔ１によりフィーダー細胞の増殖が可能となり、前記フィーダー細胞が次の細胞表面タンパク質：
―ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、
―ＣＤ２８タンパク質、
―ＩＬ−２受容体、
―ＣＤ２タンパク質、および
―ＩＬ−４受容体
と相互作用する因子を発現するステップと、
ｂ）ステップａ）で取得した、その培地Ｍｆから除去した、またはその培地Ｍｆ以外のフィーダー細胞を、培地Ｍｐに包含されたＴｒ１細胞集団と接触させるステップであって、前記培地Ｍｐが、Ｔｒ１細胞集団、フィーダー細胞、および培地Ｍｐを包含する混合物を取得するために、ステップａ）で記載した因子を最初から包含していない前記ステップと、
ｃ）ステップｂ）で取得した混合物を、少なくとも３５℃の温度Ｔ２で培養するステップであって、Ｔｒ１細胞集団が増殖し、フィーダー細胞が増殖しないように前記温度を選択する前記ステップと、
ｄ）そのように拡大したＴｒ１細胞集団を回収するステップと、を含む。
【００８０】
先に言及した細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例は：
―修飾された抗ＣＤ３抗体であって、ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインが膜貫通ドメインと置換された、前記修飾された抗ＣＤ３抗体と、
―ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質と、
―フィーダー細胞から分泌されたＩＬ−２と、
―ＣＤ５８タンパク質と、
―ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含有する群から選択されるインターロイキンと、を含む。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態では、関節関連の抗原に向けられる前記Ｔｒ１細胞は、Ｔ細胞をクローニングするために、従来の方法を使用してクローニングしてよい。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態では、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団、または関節関連の抗原に向けられるヒトＴｒ１細胞の少なくとも１つのクローンを含有する組成物は、保存のために凍結されてよい。
【００８３】
本発明好ましい実施形態では、前記関節関連の抗原は、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ビメンチン、フィブリノゲン、Ｉ、ＩＩＩ、およびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、アルドラーゼ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリン、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物を含む群から選択される。
【００８４】
好ましくは、前記関節関連の抗原は、組み換え抗原または合成抗原である。
【００８５】
好ましくは、前記関節関連の抗原は、II型コラーゲン、並びにその断片、変異体、および混合物である。
【００８６】
好ましくは、前記関節関連の抗原は、ＨＣｇｐ３９、並びにその断片、変異体、および混合物である。
【００８７】
本明細書における関節関連の抗原の「変異体」という用語は、天然の抗原とほぼ同一であり、同様の生物学的活性を共有する抗原を言う。天然の抗原とその変異体との極めて小さな違いは、例えば、アミノ酸置換、欠失、および／または付加にあり得る。そのような変異体は、例えば、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基と置換される、保存的な（ｃｏｎｓｅｒvａｔｉvｅ）アミノ酸置換を包含する。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、およびヒスチジン）酸性側鎖（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００８８】
本発明の別の目的は、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する薬剤を提供することである。
【００８９】
本発明はまた、１つ以上の薬学的に許容される担体と組み合わせて、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する薬剤を提供することを目的とする。
【００９０】
好ましい実施形態によれば、前記ヒトＴｒ１細胞集団はヒトＴｒ１クローン集団である。
【００９１】
好ましい実施形態によれば、前記関節関連の抗原は、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、カルジオリピン、Ｉ、ＩＩＩ、ＩVおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物から選択される。
【００９２】
より好ましい実施形態によれば、本発明の薬剤または医薬組成物は、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、およびＨＳＰから選択される、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団またはクローンを含有する。
【００９３】
好ましくは、前記組成物は、II型コラーゲンに向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する。II型コラーゲンに向けられるヒトＴｒ１細胞は、II型コラーゲンの２４５〜２７３断片（ＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴ、配列番号１）に存在するエピトープに向けられていてもよく、ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４のどちらかの対象に関連してもよい。
【００９４】
別のより好ましい実施形態では、前記組成物は、ＨＣｇｐ３９に向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する。ＨＣｇｐ３９に向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する前記組成物は、以下のＨＣｇｐ３９のエピトープに向けられ得る：ＰＴＦＧＲＳＦＴＬＡＳＳＥ(配列番号２)、ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧVＧ(配列番号３)、VＧＹＤＤＱＥＳVＫＳＫV(配列番号４)、ＳＱＲＦＳＫＩＡＳＮＴＱＳＲ(配列番５)、ＦＧＲＳＦＴＬＡＳ(配列番号６)、ＦＴＬＡＳＳＥＴＧ(配列番号７)、ＹＤＤＱＥＳVＫＳ(配列番号８)、およびＦＳＫＩＡＳＮＴＱ(配列番号９)。
【００９５】
別のより好ましい実施形態では、前記組成物は、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０のようなＨＳＰタンパク質に向けられるヒトＴｒ１細胞を含有する。
【００９６】
本明細書における薬学的に許容される有用な担体は、従来の担体である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）では、本発明の組成物の医薬品送達のための適した組成物および製剤を説明している。一般的に、担体の特質は、用いられる投与方法によって決まる。例えば、非経口的な製剤は、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性ブドウ糖、ゴマ油、グリセリン、エタノール、それらの組み合わせなどのような、薬学的および生理学的に許容される液体を含んだ注射液を通常は含む。担体および組成物は無菌にすることができ、製剤は投与方法に適合する。生物学的に中性の担体に加え、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラートのような無毒性の補助物質を少量包含することができる。組成物は溶液、懸濁液、および乳剤にできる。
【００９７】
本発明は、関節炎の病態を治療する薬剤または医薬組成物の調製に、関節関連の抗原に向けられる少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団を含有する組成物を使用することに関する。
【００９８】
本発明の目的は、関節炎の病態を治療するためか、または関節炎の病態を治療において使用するための、本明細書で先に説明した薬剤または医薬組成物である。
【００９９】
前記関節炎の病態は、関節リウマチ、多発性軟骨炎、化膿性関節炎、脊椎関節症または強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎(ＪＩＡ)、乾癬性関節炎、並びに全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症、線維筋痛症、サルコイドーシス、および血管炎のような関節炎に関連する疾患を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
好ましい実施形態によれば、前記ヒトＴｒ１細胞集団は、ヒトＴｒ１クローン集団である。
【０１０１】
好ましい実施形態によれば、前記１つのヒトＴｒ１細胞集団またはクローンは、シトルリンに置換した環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、II型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９(ＨＣｇｐ３９)ペプチド、ＨＳＰ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質(ｈｎＲＮＰ)Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ  Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、カルジオリピン、Ｉ、ＩＩＩ、ＩVおよびV型コラーゲンのペプチド、アネキシンV、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチル−カルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｃｌ−１００、陰イオン性ホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリン、アグリカン、並びにそれらの断片、変異体、および混合物から選択される関節関連の抗原に向けられる。
【０１０２】
より好ましい実施形態によれば、前記少なくとも１つのヒトＴｒ１細胞集団またはクローンは、II型コラーゲン、ＨＣｇｐ３９、およびＨＳＰから選択される関節関連の抗原に向けられる。
【０１０３】
好ましくは、ヒトＴｒ１細胞またはクローンは、II型コラーゲンに向けられる。II型コラーゲンに向けられるヒトＴｒ１細胞またはクローンは、II型コラーゲンの２４５〜２７３断片（ＩＡＧＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧＡＴＧＰＬＧＰＫＧＱＴ、配列番号１）に存在するエピトープに向けられていてもよく、ＨＬＡ−ＤＲ１またはＨＬＡ−ＤＲ４のどちらかの対象に関連してもよい。
【０１０４】
別のより好ましい実施形態では、ヒトＴｒ１細胞またはクローンは、ＨＣｇｐ３９に向けられる。ＨＣｇｐ３９に向けられるヒトＴｒ１細胞またはクローンは、以下のＨＣｇｐ３９のエピトープに向けられ得る：ＰＴＦＧＲＳＦＴＬＡＳＳＥ(配列番号２)、ＲＳＦＴＬＡＳＳＥＴＧVＧ(配列番号３)、VＧＹＤＤＱＥＳVＫＳＫV(配列番号４)、ＳＱＲＦＳＫＩＡＳＮＴＱＳＲ(配列番５)、ＦＧＲＳＦＴＬＡＳ(配列番号６)、ＦＴＬＡＳＳＥＴＧ(配列番号７)、ＹＤＤＱＥＳVＫＳ(配列番号８)、およびＦＳＫＩＡＳＮＴＱ(配列番号９)。
【０１０５】
別のより好ましい実施形態では、ヒトＴｒ１細胞またはクローンは、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０のようなＨＳＰタンパク質に向けられる。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明は、関節リウマチを治療する薬剤または医薬組成物の調製に、本明細書で先に記載した組成物を使用することに関する。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、乾癬性関節炎を治療する薬剤または医薬組成物の調製に、本明細書で先に記載した組成物を使用することに関する。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、強直性脊椎炎を治療する薬剤または医薬組成物の調製に、本明細書で先に記載した組成物を使用することに関する。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、若年性特発性関節炎を治療する薬剤または医薬組成物の調製に、本明細書で先に記載した組成物を使用することに関する。
【０１１０】
本発明の目的はまた、その必要がある対象における関節炎の病態、好ましくは関節リウマチ、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎を治療するための方法であり、本明細書で先に説明した有効量の薬剤、または本明細書で先に説明した有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【０１１１】
組成物は、非経口的な、筋肉内、静脈内、腹腔内への注射、鼻腔内吸入、肺吸入、皮内、関節内、くも膜下内への注入用に製剤され得る。本発明の一実施形態では、本発明の薬剤または医薬組成物は、治療される関節内に注射され得る。
【０１１２】
好ましくは、本発明の薬剤または医薬組成物は、関節内、腹腔内、または静脈内への注射か、患者のリンパ節への直接注射、好ましくは静脈内注射により投与され得る。
【０１１３】
関節炎の病態の治療において有効な、関節関連の抗原に向けられるＴｒ１細胞の量は炎症の特性によって決まり、標準の臨床技術によって決定することができる。製剤に用いられる的確な量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度によって決まるであろうし、医師の判断および各個人の環境に応じて決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ  vｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから導かれる用量反応曲線から推定することができる。
【０１１４】
本発明の一実施形態では、１０４／ｋｇ〜１０９／ｋｇの細胞を対象に投与する。好ましくは、１０５／ｋｇ〜１０７／ｋｇの細胞、より好ましくは、約１０６／ｋｇの細胞を対象に投与する。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、対象は、対象の臨床状態における低下によりフレアーアップが起こったとき、または、例えばＸ線撮影または磁気共鳴断層撮影により炎症性病変が可視化されたとき、薬剤を投与される。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、対象は、本発明の薬剤または医薬組成物を１回投与される。
【０１１７】
本発明の第二実施形態では、対象は、本発明の薬剤または医薬組成物を月に１回投与される。
【０１１８】
本発明の第三実施形態では、対象は、本発明の薬剤または医薬組成物を３ヶ月に１回投与される。
【０１１９】
本発明の第四実施形態では、対象は、本発明の薬剤または医薬組成物を一年に１回から２回投与される。
【０１２０】
本発明の別の実施形態では、その必要がある対象に投与する薬剤または医薬組成物は、前記対象の細胞が自己由来であるヒトＴｒ１細胞を含む。
【０１２１】
これは、Ｔｒ１細胞がその由来する対象に投与されるか、またはＴｒ１細胞の産生のために使用する前駆体がＴｒ１細胞を投与する対象に由来することを意味する。
【０１２２】
本発明はまた、その必要がある対象の関節炎の病態を治療するための工程に関し、前記工程は：
―前記対象の血液試料を採取するステップと、
―関節関連の抗原に向けられるＴｒ１細胞を取得するステップと、
―関節関連の抗原に向けられる前記Ｔｒ１細胞をクローニングするステップと、
―先のステップで取得したＴｒ１クローンをさらに拡大するステップと、
―そうして取得したＴｒ１クローンを前記対象に、好ましくは静脈内注射により注射するステップと、を含む。
【０１２３】
好ましくは、関節関連の抗原に向けられるＴｒ１クローンのクローニングおよび拡大は、以下の方法：
ａ）３５℃より下の温度Ｔ１、培地Ｍｆで、昆虫フィーダー細胞のようなフィーダー細胞を培養するステップであって、前記温度Ｔ１によりフィーダー細胞の増殖が可能となり、前記フィーダー細胞が次の細胞表面タンパク質：
―ＣＤ３／ＴＣＲ複合体、
―ＣＤ２８タンパク質、
―ＩＬ−２受容体、
―ＣＤ２タンパク質、
―ＩＬ−４受容体
と相互作用する因子を発現するステップと、
ｂ）ステップａ）で取得した、その培地Ｍｆから除去した、またはその培地Ｍｆ以外のフィーダー細胞を、培地Ｍｐに包含されたＴｒ１細胞集団と接触させるステップであって、前記培地Ｍｐが、Ｔｒ１細胞集団、フィーダー細胞、および培地Ｍｐを包含する混合物を取得するために、ステップａ）で記載した因子を最初から包含していない前記ステップと、
ｃ）ステップｂ）で取得した混合物を、少なくとも３５℃の温度Ｔ２で培養するステップであって、Ｔｒ１細胞集団が増殖し、フィーダー細胞が増殖しないように前記温度を選択する前記ステップと、
ｄ）そのように拡大されたＴｒ１細胞集団を回収するステップと、を用いて実行される。
【０１２４】
先に言及した細胞表面タンパク質と相互作用する因子の例は：
―修飾された抗ＣＤ３抗体であって、ＣＤ３重鎖の抗ＣＤ３細胞質内ドメインが膜貫通ドメインと置換された、前記修飾された抗ＣＤ３抗体と、
―ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質と、
―フィーダー細胞から分泌されたＩＬ−２と、
―ＣＤ５８タンパク質と、
―ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含有する群から選択されるインターロイキンと、を含む。
【０１２５】
本発明の別の実施形態では、その必要がある対象における関節炎の病態を治療するための方法は、関節炎の病態を治療するために使用される１つ以上の治療薬と組み合わせて、有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【０１２６】
本発明は、本発明の医薬組成物または薬物を使用することに関し、有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することは、関節炎の病態を治療するために使用される１つ以上の治療薬と組み合わせられている。
【０１２７】
関節炎の病態を治療するために一般に使用される治療薬の例は以下が挙げられる：
―コルチコイド（プレドニゾン）、
―インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプトのような抗ＴＮＦ；
―アナキンラ、ＡＭＧ１０８、イグラチモド、アクテムラのような抗インターロイキン
―リツキシマブ、エピラツズマブのような抗Ｂリンパ球；
―アバタセプト、ベリムマブのような抗−共刺激分子；
―ＬＪＰ３９４またはＴV−４７１０のような免疫寛容薬（Ｂリンパ球表面のＤＮＡ受容体に向けられる合成分子）；
―エクリズマブのような抗補体タンパク質；
―ＣＰ６９０５５０のようなＴ細胞シグナル伝達分子の阻害薬
―ケモカイン受容体の拮抗薬（マラビロク、ＩＮＣＢ３２８４）のような、細胞遊走の阻害薬、
―レフルノミド、
―スルファサラジン、
―ヒドロキシクロロキン、
―アザチオプリン、
―メトトレキサート、
―シクロスポリン、
―ミノサイクリン、
―Ｄ―ペニシラミン、
―メトトレキサート＋スルファサラジン、メトトレキサート＋ヒドロキシクロロキン、メトトレキサート＋アザチオプリン、メトトレキサート＋インフリキシマブ、メトトレキサート＋レフルノミド、メトトレキサート＋エタネルセプト、シクロスポリン＋ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン＋メトトレキサート、メトトレキサート＋スルファサラジン＋ヒドロキシクロロキン、のようなそれらの併用療法。
【０１２８】
本発明の好ましい実施形態では、その必要がある対象における関節炎の病態を治療するための方法は、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害薬、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群において選択される、１つ以上の治療薬と組み合わせて、有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することを含む。
【０１２９】
本発明は、その必要がある対象における関節炎の病態を治療するために本発明の医薬組成物または薬物の使用することに関し、有効量の本発明の薬剤または医薬組成物を前記対象に投与することは、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害剤、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群から選択される、１つ以上の治療薬と組み合わせられている。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明はまた、関節炎の病態の治療の方法に関し、本発明の薬剤または医薬組成物をその必要がある対象に投与し、前記対象とは、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害剤、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群における１つ以上の治療薬に、十分に反応しないか、または十分に反応しないと見込まれる対象である。
【０１３１】
本発明は、本発明の医薬組成物または薬物を使用することに関し、前記対象とは、コルチコイド、抗ＴＮＦ、抗インターロイキン、抗Ｂリンパ球、抗−共刺激分子、免疫寛容薬、抗補体タンパク質、Ｔ細胞シグナル伝達分子の阻害剤、細胞遊走の阻害薬、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、ミノサイクリン、Ｄ―ペニシラミンの群における１つ以上の治療薬に、十分に反応しないか、または十分に反応しないと見込まれる対象である。
【０１３２】
「不十分な反応」、「十分に反応しない」、または「十分に反応しないと見込まれる」とは、対象が関わる限りにおいて、治療薬が無効であり、毒性があり、耐容性に乏しかった、またはそのように見込まれることを指す、対象の実際の反応または可能性のある反応を言う。
【０１３３】
実施例
以下の説明では、詳細なプロトコルが与えられていない全ての実験は、標準的なプロトコルに従って行っている。
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態を実証するために以下の実施例が含まれる。当業者には、発明者により見出された技術を示している実施例で開示される技術が、本発明の実施において十分に機能し、従ってその実施のための好ましい様式を構築していると考え得ることが理解されるべきである。しかし、本開示を踏まえると、当業者は、開示される特定の実施形態において多くの変更を成すことができ、また、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様の結果または類似の結果をさらに得られることを理解すべきである。
【０１３５】
実験手順
Ｔｒ１細胞の単離
健常な患者または深刻な関節リウマチの患者から血液試料を採取し、密度勾配遠心分離法により白血球を分離した。次いで、この抗原に向けられるＴｒ１細胞の特異的増殖を誘発するために、II型コラーゲンの存在下で細胞を培養した。培養の１３日後、限界希釈法により細胞集団をクローニングした。次いで、II型コラーゲンに対するその特異性、および特徴的なＴｒ１サイトカイン産生プロファイルについてクローンを評価した。
【０１３６】
サイトカイン分析
抗原特異性の判定のため、抗原提示細胞（４．１０５）の存在下、および特異的抗原（II型コラーゲン）の存在下または非存在下で刺激した、Ｔｒ１細胞クローンの４８時間後の上清についてサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。サイトカイン産生プロファイルの決定のため、II型コラーゲンＴｒ１細胞クローンを抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激し、４８時間後に上清を収集した。抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、抗ＩＬ−１０（２Ａ５）、抗ＩＦＮγ（ＸＧＭ１．２）、ビオチン抗ＩＬ−４（２４Ｇ２）、抗ＩＬ−１０（ＳＸＣ１）、抗ＩＦＮγ（Ｒ４−６Ａ２）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＥＬＩＳＡを行った。
【０１３７】
抑制研究
抑制研究のため、段階付けた量のII型コラーゲン特異的Ｔｒ１クローンを、自己由来ＣＤ４陽性Ｔリンパ球を用いて共培養した。共培養物を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を用いて刺激した。別の手段として、II型コラーゲン特異的クローンの上清を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で刺激した、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球に添加した。３日後、ＲｏｃｈｅのＷＳＴ−１増殖キットを使用して細胞増殖の総計を評価した。
【０１３８】
結果
図１は、抗原の存在または非存在下で、II型コラーゲンに特異的な２つの別々のＴｒ１細胞集団のＩＬ−１０産生を示す。結果は、II型コラーゲンの刺激がＩＬ−１０の産生の増加を誘発することを示す。これらの結果は、II型コラーゲンに対する細胞集団の特異性を実証している。
【０１３９】
II型コラーゲンに特異的なこれらのＴｒ１細胞集団のサイトカイン分泌プロファイルをさらに決定するため、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下で細胞を刺激した。ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮγの産生を測定するため、４８時間後の上清についてＥＬＩＳＡを行った。図２は、後者のII型コラーゲン特異的集団について観測したサイトカイン分泌プロファイルが、Ｔｒ１サイトカイン分泌プロファイル、すなわちＩＬ−１０の高い産生、ＩＦＮγの低い産生、およびＩＬ−４の無産生と一致することを示す。
【０１４０】
次いで、これらII型コラーゲンＴｒ１集団の抑制活性を評価した。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の存在下で、自己由来ＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、Ｔｒ１細胞を共培養した。刺激の３日後、細胞増殖を測定した。図３は、２つのＴｒ１集団の結果を示し、これらの細胞の抑制活性を裏付ける。
【０１４１】
図４は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８抗体を用いてｉｎ  vｉｔｒｏで刺激したII型コラーゲン特異的クローンのサイトカイン産生プロファイルを示す。
【０１４２】
このクローンは、抗ＴＮＦ−α抗体を含む、従来の関節リウマチ治療では治りにくい関節リウマチ患者の末梢血液から作り出された。
【０１４３】
ＩＬ−４非存在下でのＩＬ−１０の高い産生およびＩＦＮγの産生は、Ｔｒ１細胞の独自性を特徴付けている。
【０１４４】
この活性化したクローンの上清は、ｉｎ  vｉｔｒｏにおいてＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖を抑制することができる（図５）。この実験において、ＩＬ−１０およびＴＧＦβ両方の同時遮断により増殖が回復し、Ｔｒ１クローンの抑制活性が、これら２つのサイトカインに媒介されることを示している。
【０１４５】
従って、この実験により、II型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞は、従来の関節リウマチ治療では治りにくい患者から単離することができ、これらのＴｒ１細胞が、ＩＬ−１およびＴＧＦβを介してＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を抑制できることが確認される。
【０１４６】
次に、II型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞の効果を、コラーゲンで誘発した関節炎のマウスモデルでｉｎ  vｉvｏで評価した。
【０１４７】
ウシのII型コラーゲン（５μｇ／ｍｌ）を用いて、７日間にわたり、ＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、トランスジェニックＴＢＣマウス（II型コラーゲンに特異的なＴ細胞受容体を発現する）に由来するマウスの脾細胞を活性化させた。
【０１４８】
０日目に、完全フロイントアジュバントに含めたII型コラーゲン（１００μｇ）の皮下投与により、ＤＢＡ−１マウスに関節炎を誘発させ、次に、２１日目に、不完全フロイントアジュバントに含めたII型コラーゲン（１００μｇ）を注射して第２免疫を行った。 
【０１４９】
関節の腫脹および炎症の数を測定することにより、疾患の重症度を評価した。II型コラーゲンに特異的な同系のＴｒ１細胞（１５０万）を、１９日目に、静脈内に注射した。
【０１５０】
図６は、コラーゲンで誘発した関節炎のマウスモデルにおいて、II型コラーゲン特異的Ｔｒ１細胞の静脈内投与により、重篤な関節炎の進行が阻害されることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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