(57)【要約】【課題】分離対象の物質を含む移動相を固定相に通過させることで移動相から当該物質を分離する際に、大容量の移動相であっても低コスト且つ一定の精度に分離対象の物質を分離する。【解決手段】分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量の固定相を備える分離カラムを備え、当該分離カラムが交換可能であり、1バッチ分の処理で上記固定相の使用回数が寿命回数となることを特徴とする分離装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量の固定相を備える分離カラムを備え、当該分離カラムが交換可能であり、
1バッチ分の処理で上記固定相の使用回数が寿命回数となることを特徴とする分離装置。
【請求項２】
上記分離カラムは、上記固定相を備える複数のカラムからなり、当該複数のカラムに充填された固定相の総量が、上記分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量であることを特徴とする請求項１記載の分離装置。
【請求項３】
上記複数のカラムのそれぞれに対して連結された複数の配管と、当該複数の配管上にそれぞれ配設された複数のスイッチバルブと、当該複数のスイッチバルブによる各配管の連通を制御する制御装置とを更に備える請求項２記載の分離装置。
【請求項４】
上記複数のカラムのカラムベッド高さの合計は、上記容量の固定相を単一のカラムとしたときのカラムベッド高さであることを特徴とする請求項２記載の分離装置。
【請求項５】
上記固定相の容量は、移動相に含まれる分離対象の物質の総量、及び当該固定相の最大吸着容量に基づいて規定されることを特徴とする請求項１記載の分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離対象の物質を含む移動相を固定相に通過させることで移動相から当該物質を分離する分離装置及び分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分離対象の物質を含む移動相を固定相に通過させることで移動相から当該物質を分離する分離装置は、例えば、細胞培養により生産した有用物質を分離する際に利用される。例えば、有用物質である抗体医薬は、抗体産生能を有する動物細胞を培養し、培養液に分泌された抗体を分離・精製することにより得ることができる。すなわち、抗体医薬等の有用物質は、培養液から細胞を除去した後、クロマトグラフィーを用いて分離・精製される。一方、微生物を用いて所定の有用物質を製造する場合、当該有用物質は細胞内に蓄積される場合が多い。この場合、有用物質は、細胞を破砕した後、溶液から固形物を除去し、その後、クロマトグラフィーを用いて分離・精製される。
【０００３】
一般的に抗体医薬は、清澄化工程、回収工程、中間精製工程及び最終精製工程を経て製造される。この製造方法において、目的とする抗体の種類によって各工程で異なる分離装置、すなわちクロマトグラフィー手法が用いられる。ただし、段階的に抗体の純度を高め、目的の抗体の選択性を高めていく点ではいずれも共通している。
【０００４】
清澄化工程は、培養液から抗体以外のタンパク質や固形物をできるだけ除去する。抗体の種類ごとに血清や腹水、ハイブリドーマ細胞培養液など培養液成分が異なり、含有物も異なるため、塩析やフィルターによるろ過、遠心分離などを用いて清澄化を行う。
【０００５】
また、回収工程では、通常アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。目的とする抗体がIgGの場合にはProtein AやProtein Gをリガンドとした非常に特異性の高いアフィニティークロマトグラフィーが用いられ、ワンステップで純度90％以上の精製が可能である。一方、Protein AやGとの親和性が低い抗体、例えばIgMやIgYを目的とする場合には、Thiophilic interactionを利用したアフィニティークロマトグラフィーが用いられる。また、IgA、IgD及びIgEを目的とする場合は、血中濃度が低いことや、親和性の高いアフィニティリガンドがないことから、その抗体を認識する二次抗体を固定したアフィニティークロマトグラフィーが用いられる。この回収工程においては、処理スピードと処理容量が重要であり、目的とする抗体を細胞抽出液などのクルードな状態から速やかに分離・濃縮することが求められる。以降の工程を容易とするためである。
【０００６】
次に、中間精製工程では、回収工程で目的の抗体とともに回収された夾雑物を除去する。この工程では、処理溶液量が多いので、処理量が大きいイオン交換クロマトグラフィーが一般的に用いられている。なお、処理溶液量が少ない場合は、回収工程と中間精製工程とをワンステップで行うことも可能である。
【０００７】
最後の最終精製工程は、わずかに残存する夾雑物を高性能カラムを用いて分離し、最終的な精製抗体とするための工程である。抗体を目的とする最終精製工程では、高分離能なカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーが一般的に用いられている。ゲルろ過クロマトグラフィーを用いることで、構造解析を阻害するレベルの低分子物質の除去とあわせて、バッファーの交換も行うことが可能である。
【０００８】
また、バイオ医薬品製造においては、一般に容量が約10m3の培養槽を複数設置し、それら培養槽内で動物細胞を培養した後、バイオ医薬品（例えば、抗体）を含む大量の培養液（１バッチ10m3以上）を処理する。このような大量の培養液処理で特に問題となるのは、アフィニティークロマトグラフィーを用いた回収工程が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーで使用する、バイオ医薬品と特異的に結合するタンパク（例えば、Protein Aなど）は非常に高価である。したがって、当該タンパク質を用いたカラムは、培養バッチ毎に繰返し再利用される。しかし、カラムの再利用は、前回処理における各種成分が残存する可能性があり、また、カラム劣化の可能性もある。これらに起因して、培養バッチ間において、バイオ医薬品の精製品質が相違する可能性がある。
【０００９】
また、一般に、バイオ医薬品製造用の精製アフィニティーカラムは、直径約１ｍ、ベッド高数十cm程度と非常に大きく、設備としても場所を要する。一方、処理すべき培養液は10m3以上と大量であるため、上記大型精製カラムを使用したとしても、１バッチの培養液を処理するには回収工程を何度も繰り返す必要がある。回収工程には、(I)カラムの平衡化、(II)目的物質の吸着、(III)洗浄、(IV)目的物質の溶出、(V)カラムの再生の工程があるが、培養液を処理する工程は(II)目的物質の吸着の工程であり、(I)及び(III)〜(V)の工程は、培養液を処理するための待ち時間の状態となる。大量の培養液を処理するために、上記(I)〜(V)の回収工程を数多く繰り返さなくてはならず、待ち時間の状態が多くなる結果、回収工程における処理時間が増大することとなる。例えば、特許文献１には、待ち時間を解消するため、複数のカラムを設置し、各カラムでの回収工程をずらすことにより、培養液を処理する（II）目的物質の吸着工程を連続的に処理する方法が検討されている。しかしながら、この手法には、カラムを複数設置することから設備スペースをより広範に確保する必要があり、またカラム充填剤の費用が増大するといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−２１４８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のように、従来、分離対象の物質を含む移動相を固定相に通過させることで移動相から当該物質を分離する際に、大容量の移動相であっても低コスト且つ一定の精度に分離対象の物質を分離することができる分離装置及び分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した目的を達成するため本発明者等が鋭意検討した結果、所定容量の移動相を処理するのに必要な容量の固定相を備えることで、固定相を交換することでバッチ毎に一定の精度で目的物質を分離することができ、また複数バッチを処理する際の処理時間を短縮することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は以下を包含する。
（１）分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量の固定相を備える分離カラムを備え、当該分離カラムが交換可能であり、1バッチ分の処理で上記固定相の使用回数が寿命回数となることを特徴とする分離装置。
（２）上記分離カラムは、上記固定相を備える複数のカラムからなり、当該複数のカラムに充填された固定相の総量が、上記分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量であることを特徴とする（１）記載の分離装置。
（３）上記複数のカラムのそれぞれに対して連結された複数の配管と、当該複数の配管上にそれぞれ配設された複数のスイッチバルブと、当該複数のスイッチバルブによる各配管の連通を制御する制御装置とを更に備える（２）記載の分離装置。
（４）上記複数のカラムのカラムベッド高さの合計は、上記容量の固定相を単一のカラムとしたときのカラムベッド高さであることを特徴とする（２）記載の分離装置。
（５）上記固定相の容量は、移動相に含まれる分離対象の物質の総量、及び当該固定相の最大吸着容量に基づいて規定されることを特徴とする（１）記載の分離装置。
（６）分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量の固定相を備える分離カラムであって、当該分離カラムが交換可能であり、1バッチ分の処理で上記固定相の使用回数が寿命回数となる当該分離カラムに上記移動相を供給する工程と、
上記移動相の全量を処理した後に上記固定相から上記分離対象の物質を回収する工程とを備え、
上記回収工程の後に使用済みの分離カラムを交換することを特徴とする分離方法。
（７）上記分離カラムは、上記固定相を備える複数のカラムからなり、当該複数のカラムに充填された固定相の総量が、上記分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量であり、
上記複数のカラムに対して上記移動相を順次供給することを特徴とする（６）記載の分離方法。
（８）上記複数のカラムのそれぞれに対して複数の配管が連結され、当該複数の配管上にそれぞれ複数のスイッチバルブが配設され、当該複数のスイッチバルブによる各配管の連通を制御装置が制御することを特徴とする（７）記載の分離方法。
（９）上記複数のカラムのカラムベッド高さの合計は、上記容量の固定相を単一のカラムとしたときのカラムベッド高さであることを特徴とする（７）記載の分離方法。
（１０）上記固定相の容量は、移動相に含まれる分離対象の物質の総量、及び当該固定相の最大吸着容量に基づいて規定されることを特徴とする（６）記載の分離方法。
（１１）分離対象の物質を含む移動相を溜めた槽と、
上記槽に連結され、上記槽に溜められた上記移動相の全量を処理可能な容量の固定相を備える分離カラムを備え、当該分離カラムが交換可能であり、1バッチ分の処理で上記固定相の使用回数が寿命回数となることを特徴とする物質の製造装置。
（１２）上記分離カラムは、上記固定相を備える複数のカラムからなり、当該複数のカラムに充填された固定相の総量が、上記分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量であることを特徴とする（１１）記載の物質の製造装置。
（１３）上記複数のカラムのそれぞれに対して連結された複数の配管と、当該複数の配管上にそれぞれ配設された複数のスイッチバルブと、当該複数のスイッチバルブによる各配管の連通を制御する制御装置とを更に備える（１２）記載の物質の製造装置。
（１４）上記複数のカラムのカラムベッド高さの合計は、上記容量の固定相を単一のカラムとしたときのカラムベッド高さであることを特徴とする（１２）記載の物質の製造装置
（１５）上記固定相の容量は、移動相に含まれる分離対象の物質の総量、及び当該固定相の最大吸着容量に基づいて規定されることを特徴とする（１１）記載の物質の製造装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る分離装置及び分離方法によれば、処理対象の移動相バッチ毎に一定の精度で目的物質を分離することができる。したがって、本発明に係る分離装置を利用することで、品質にばらつきの少ない高品質の目的物質を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明を適用した分離装置の一例を示す概略構成図である。
【図２−１】連続アフィニティー精製装置（３カラム）の構成図の例である。
【図２−２】連続アフィニティー精製装置（３カラム）の構成図の他の例である。
【図３（ａ）】連続アフィニティー精製装置（２カラム）の構成図の例である。
【図３（ｂ）】連続アフィニティー精製装置（３カラム）の構成図の他の例である。
【図４】連続アフィニティー精製装置の処理工程の例を示す図である。
【図５】カラムベッド高と線速度との関係を示す図である。
【図６】動的結合容量の求め方を示す図である。
【図７】カラムの分割例を示す図である。
【図８】バイオ医薬品製造プラントへ適用した精製システムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明を適用した分離装置は、図１に示すように、内部に固定相を充填した分離カラムＣを備えるものである。槽Ａ内に溜められた溶液Ｂ（移動相）が分離カラムＣに供給されると、溶液内に含まれる分離対象の物質が分離カラムＣ内の固定相に捕捉される。その後、分離カラムＣに溶離液を供給すると、固定相に捕捉された物質が分離カラムＣから回収される。分離カラムＣに充填された固定相は、処理対象の溶液（移動相）の全量を処理可能な容量、すなわち１バッチ分の処理により寿命回数に達する容量である。したがって、本発明を適用した分離装置、処理対象の溶液Ｂのバッチ毎に分離カラムＣを交換することで、複数バッチを処理する際の処理時間を短縮することができ、また、分離カラムＣにおける固定相の劣化等に起因する分離精度のばらつきを抑えることができる。分離カラムと分離制御装置部分はカラム連結ジョイント部分で分けてあるため、分離カラムＣの交換はカラム連結ジョイントを外すだけで容易に行うことができる。
【００１７】
ここで、1バッチ分の処理とは、例えば、細胞培養により目的物質を製造する場合、１回の回分培養により得られるような所定量の溶液を意味する。但し、1バッチ分の処理とは、１回の回分培養により得られた溶液の全量に限定されず、１回の回分培養により得られた溶液の半量としても良いし、１回の流加培養により得られた溶液、あるいは１回の流加培養により得られた溶液の半量としても良い。
【００１８】
ここで、固定相の寿命回数とは、当該固定相による目的物質の回収量が所定の割合まで低下する回数を意味し、例えば、目的物質の回収量が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％或いは９５％まで低下する回数とすることができる。特に、目的物質の回収量が９５％まで低下する回数を寿命回数とすることが好ましく、目的物質の回収量が９０％まで低下する回数を寿命回数とすることがより好ましく、目的物質の回収量が８０％まで低下する回数を寿命回数とすることが最も好ましい。
【００１９】
以下、本発明を適用した分離装置の一例をより具体的に説明する。なお、分離装置とは、上述のように、移動相を固定相に通過させて移動相内の特定の物質を固定相に捕捉することで、移動相内の他の物質から当該特定の物質を分離する装置を意味する。分離装置は、精製装置と呼称される場合もあり、また、所謂クロマトグラフィー装置と同義である。分離装置としては、いわゆる分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分子排斥クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーのいずれであっても良い。以下の例では、医薬等に利用される抗体を含むタンパク質を細胞培養液から分離する系を説明する。しかし、本発明に係る分離装置は、本例に限定されず、分離対象の物質としては如何なる物質であっても良い。
【００２０】
＜分離装置＞
本発明に係る分離装置の好ましい実施形態を図２−１及び図２−２に示す。図２−１及び図２−２に示す分離装置は、分離対象の物質を含む溶液（移動相、サンプル溶液）を連続的に処理する３つのアフィニティー充填カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ（分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃとも称す）と、分離処理に使用される各種溶液と、送液のためのポンプ等から構成されている。なお、分離装置において、充填カラムの数は３つに限定されず、図３に示すように必要に応じて２つ以上充填カラムがあれば構わない。ここでは、充填カラムが３つの場合（図２−１及び図２−２）の装置構成について詳細に述べる。
【００２１】
図２-１に示す分離装置は、３本の直列に連結された分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ、５台の送液用ポンプ３及び４、５つの溶液リザーバー５、６、７、８及び９、スイッチバルブ１５（流路切り替え部位装置）、及びそれらをつなぐ配管より構成される。直列に連結されたカラムは、上流と下流が配管により連結されており、循環できるような構造である。各カラムの上流は、各種溶液リザーバーとスイッチバルブ１５を通して通液できる。また、各カラムの下流には、スイッチバルブ４１〜４３を通してスイッチバルブ３８に通液できる構造であり、スイッチバルブ３８から廃液用配管もしくは精製溶液用配管へつながる構造をしている。
【００２２】
リザーバー５、６、７、８及び９に入った各種溶液は送液用ポンプ３及び４を駆動することによりスイッチバルブ１５まで送液される。スイッチバルブ１５では、詳細を後述する図４に示す工程に従い、各種溶液が適切な分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに送液されるように流路の切り替えを行う。すべての分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを同時に処理するため、各種溶液と各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃへの流路接続の１対１の組み合わせがすべて実行できるようにスイッチバルブ１５は構成されている。ただし、各カラムに対して工程として送液されない溶液がある場合、送液しない（送液ポンプ３もしくは４を作動させない）溶液も存在する。
【００２３】
各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃから出てきた溶液は、溶出液により分離された目的物質の場合は、精製溶液として回収用配管を通して回収され、それ以外は廃液として、廃液用配管から回収される。各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃと各配管（精製用及び廃液用配管）は、スイッチバルブ３８によって、図４に示す工程に従って選択される。各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃと各配管はすべての組み合わせの流路を実現するようにスイッチバルブ１５及び３８が構成されている。図４に示す工程に従って、ポンプ３及び４、スイッチバルブ１５及び３８等を制御するには、コンピュータ３９に予め制御プログラムを格納し、当該制御プログラムに従って制御装置４０により実行することができる。これにより、本分離装置を用いることによって、サンプル溶液を連続的に処理し、目的物質のみを連続的に回収することができる。目的物質が適切に回収されているかを確認するため、UV装置による吸光度で検出することもできる。
【００２４】
本装置では、疑似移動床式プロセスを行うことができ、具体的な工程を以下に述べる。工程１：少なくとも1つの標的化合物を含む供給液（リザーバー５）を、分離カラム１Ａを横断して通過させ、そして流出物を分離カラム１Ａから分離カラム１Ｂへと移動させる。工程２：供給液（リザーバー５）が分離カラム１Ｂへと送液されるようにスイッチバルブ１５を制御し、そして洗浄液（リザーバー６）を標的化合物が結合した分離カラム１Ａを横断して通過させる。工程３：洗浄液流出物（分離カラム１Ａ下流）を分離カラム１Ｃへと移動させ、そしてその後分離カラム１Ｂからの流出物を分離カラム１Ｃへと移動させる。工程４：分離カラム１Ａを再生させる。工程５：供給液（リザーバー５）を分離カラム１Ｃへと振り向け、そして洗浄液（リザーバー６）を標的化合物が結合した分離カラム１Ｂを横断して通過させる。工程６：洗浄液流出物（分離カラム１Ｂ下流）を分離カラム１Ａへと移動させ、そしてその後分離カラム１Ｃからの流出物を分離カラム１Ａへと移動させる。工程７：分離カラム１Ｂを再生させる。工程８：供給液（リザーバー６）を分離カラム１Ａへと振り向け、そして洗浄液（リザーバー６）を標的化合物が結合した分離カラム１Ｃを横断して通過させる。工程９：洗浄液流出物（分離カラム１Ｃ下流）を分離カラム１Ｂへと移動させ、そしてその後分離カラム１Ａからの流出物を分離カラム１Ｂへと移動させる。工程１０：分離カラム１Ｃを再生させる。そして、図４に示す工程に従って、工程２から工程１０を繰り返す。ここで、少なくとも1つの分離対象の物質を工程４、工程７及び/又は工程１０において回収する。
【００２５】
一方、図２-２に示すような分離装置であってもよい。３本の並列に連結された分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃ（直列に繋がれているカラムは１つのカラムとみなす）、５台の送液用ポンプ３及び４、５つの溶液リザーバー５、６、７、８及び９、スイッチバルブ１５（流路切り替え部位装置）、及びそれらをつなぐ配管より構成される。リザーバー５、６、７、８及び９に入った各種溶液は送液用ポンプ３及び４を駆動することによりスイッチバルブ１５まで送液される。スイッチバルブ１５では、詳細を後述する図４に示す工程に従い、各種溶液が適切な分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに送液されるように流路の切り替えを行う。すべての分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを同時に処理するため、各種溶液と各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃへの流路接続の１対１の組み合わせがすべて実行できるようにスイッチバルブ１５は構成されている。ただし、各カラムに対して工程として送液されない溶液がある場合、送液しない（送液ポンプ３もしくは４を作動させない）溶液も存在する。
【００２６】
各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃから出てきた溶液は、溶出液により分離された目的物質の場合は、精製溶液として回収用配管を通して回収され、それ以外は廃液として、廃液用配管から回収される。各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃと各配管（精製用及び廃液用配管）は、スイッチバルブ３８によって、図４に示す工程に従って選択される。各分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃと各配管はすべての組み合わせの流路を実現するようにスイッチバルブ１５及び３８が構成されている。図４に示す工程に従って、ポンプ３及び４、スイッチバルブ１５及び３８等を制御するには、コンピュータ３９に予め制御プログラムを格納し、当該制御プログラムに従って制御装置４０により実行することができる。これにより、本分離装置を用いることによって、サンプル溶液を連続的に処理し、目的物質のみを連続的に回収することができる。目的物質が適切に回収されているかを確認するため、UV装置による吸光度で検出することもできる。
【００２７】
図３（a）には、２つの分離カラム１Ａ及び１Ｂを有する分離装置を示しており、また図３（b）には、３つの分離カラム１Ａ、１Ｂ及び１Ｃを有する分離装置であって３つの送液ポンプ３、４及び３４を有する分離装置を例示している。
【００２８】
図３（a）に示す分離装置は、２本の分離カラム（カラム１Ａおよびカラム１Ｂ）、２台の送液用ポンプ（ポンプ３およびポンプ４）、溶液リザーバー（リザーバー５、リザーバー６、リザーバー７、リザーバー８、リザーバー９）、流路切り替え部位装置（スイッチバルブ１０、スイッチバルブ１１、スイッチバルブ１２、スイッチバルブ１３、選択バルブ１４、選択バルブ１５）、及びそれらをつなぐ配管より構成される。
【００２９】
リザーバー５内に溜められた溶液は、ポンプ３により送液され、選択バルブ１５の制御で、スイッチバルブ２１の配管かスイッチバルブ２２側の配管に送液することができる。リザーバー６、リザーバー７、リザーバー８、リザーバー９に溜められた溶液は、ポンプ４で送液することができ、選択バルブ１４の制御で、ポンプ４につながる配管へ送液する溶液を選択することができる。ポンプ４へ送液された溶液は、選択バルブ１５の制御により、スイッチバルブ２３側の配管に送液するか又はスイッチバルブ２４側の配管に送液するかを制御できる。選択バルブ１５の選択において、ポンプ３側からの配管がスイッチバルブ２１側に選択された場合は、ポンプ４側の配管がスイッチバルブ２４側に同時に選択される、もしくは、ポンプ３側からの配管がスイッチバルブ２２側に選択された場合は、ポンプ４側の配管がスイッチバルブ２３側に同時に選択される。
【００３０】
また、スイッチバルブ１０においては、カラム１Ａ側の配管もしくは廃液側の配管のいずれかが選択され、スイッチバルブ１１においては、カラム１Ｂ側の配管もしくは廃液側の配管のいずれかが選択される。カラム１Ａは、スイッチバルブ１０と反対側に配管を介してスイッチバルブ１２と連結される。また、カラム１Ｂは、スイッチバルブ１１反対側に配管を介してスイッチバルブ１３と連結される。スイッチバルブ１２及び１３においては、回収容器２５側の配管もしくは廃液側の配管のいずれかが選択される。
【００３１】
上述した分離装置においては、すべてのポンプ及び流路切り替え装置（スイッチバルブ）が、あらかじめ送液タイミング、送液速度及び送液時間等の送液条件をプログラムした制御装置により制御される。すなわち、制御装置によりポンプ及び流路切り替え装置を所定の順番に従って作動することで、分離動作を自動的かつ連続的に行わせることができる。また、選択バルブ１４により、ポンプ４につなげられるリザーバーの種類としては、図３（a）の例では４種類としたが、これより多くても少なくても良い。
【００３２】
図３（a）において、カラム１Ａ及び１Ｂのすぐ上流側に配設されたスイッチバルブ１０と１１は、それぞれカラム１Ａ及び１Ｂに通液する溶液をあらかじめ廃液側に流し、カラム１Ａ及び１Ｂに通じる溶液の切り替えの際、前後の溶液の混合を最小にすることができる。カラム１Ａ及び１Ｂのすぐ下流側に配設されたスイッチバルブ１２と１３は、それぞれカラム１Ａ及び１Ｂから出てくる溶液を廃液リザーバー用容器に通液するか、回収用容器２５に通液するかを切り替えることができる。リザーバー５，リザーバー６，リザーバー７，リザーバー８，リザーバー９は各種溶液リザーバーで、リザーバー５には分離対象の物質を含む溶液（移動相）が入っており、送液ポンプ３を介して選択バルブ１５に供給される。リザーバー６にはカラムの平衡化用溶液が、リザーバー７には洗浄用溶液が入っており、リザーバー８には溶出用溶液が、リザーバー９には再生用溶液が入っている。選択バルブ１４は、リザーバー６，リザーバー７，リザーバー８，リザーバー９のいずれかを連通させるように切り替えて、送液ポンプ４を介して選択バルブ１５に各種溶液を供給することができる。
【００３３】
選択バルブ１５は、ポンプ３側から流される溶液とポンプ４側から流される溶液を、カラム１Ａもしくはカラム１Ｂに、互いに同時に同じカラムを選択しないように、流路を選択しながら切り替えるためのバルブである。例えば、ポンプ３側からの流れが、カラム１Ａ側に流れるようにした場合は、ポンプ４側からの流れをカラム１Ｂ側に流れるように、スイッチバルブ２１〜２４を制御する。また、ポンプ３側からの流れが、カラム１Ｂ側に流れるようにした場合は、ポンプ４側からの流れをカラム１Ａ側に流れるように、スイッチバルブ２１〜２４を制御する。カラム１Ａもしくは１Ｂにより分離された精製タンパク質は、スイッチバルブ１２，スイッチバルブ１３で、回収したいときだけ回収用容器２５に送ることにより、間歇的に回収することができる。なお、回収が正常に行われているかをモニターするために、回収ラインの途中に紫外線モニター２６（ＵＶモニター）を付けることにより、クロマトグラフィーのモニタリングを行うことができる。
【００３４】
なお、リザーバー６、リザーバー７，リザーバー８，リザーバー９の４種類を使用する場合について図示したが、４種類以上の溶液を用いて、クロマトグラフィーを行うことも可能である。本例においては、吸着クロマトグラフィーにおいて必要とされる溶液としては、平衡化溶液、洗浄用溶液、溶出用溶液及び再生用溶液が必要であることから、最小単位の構成について記述している。４種類以上の溶液を使用する場合には、図３（a）に示す構成に準じて、使用する溶液の数に応じたリザーバー及びスイッチバルブを使用すればよい。この場合でも、ポンプのオン/オフ制御、流速やバルブの切り替えなどは、あらかじめコンピュータ等の制御装置にて制御できる。従って、本装置を用いることにより、サンプルの送液を開始した後は、サンプルが尽きるまで、連続的に作動し、完全自動化により、タンパク質の精製を行うことができる。
【００３５】
また、図３（b）に示す分離装置では、図３（a）に示す分離装置と異なり、選択バルブ１４及びポンプ４をリザーバー６及び７に充填された溶液を送液するものとしている。また、図３（b）に示す分離装置は、リザーバー８及び９に充填された溶液を送液する選択バルブ３３及びポンプ３４と、分離カラム１Ｂへの送液に用いる選択バルブ３５と、分離カラム１Ｃへの送液に用いる選択バルブ３６と、分離カラム１Ｃへの送液を制御するためのスイッチバルブ３７と、スイッチバルブ３７と反対側に配管を介して分離カラム１Ｂと連結されたスイッチバルブ３２とを備える以外は、図３（a）に示す分離装置と同様な構成となっている。
【００３６】
＜連続処理に向けたカラム設計および制御方法＞
例えば、アフィニティーカラムを用いた物質の分離・精製では、通常、(I)カラムの平衡化、(II)目的物質の吸着、(III)洗浄、(IV)目的物質の溶出、(V)カラムの再生の工程からなる。サンプル溶液は(II)目的物質の吸着で処理される。言い換えると、他の(I)、(III)、(IV)、(V)の工程はサンプル溶液を処理する工程ではない。本分離装置では、図４に示すように複数の充填カラムで、処理工程をずらすことにより、連続的にサンプル溶液を処理することができる。これにより、大量のサンプル溶液を短時間で効率よく処理することができ、目的とする物質の分離・精製を効率良く行うことができる。
また、本分離装置では、同一の分離カラムを使用回数限度まで繰り返し使用することができる。
【００３７】
さらに、分離カラムは、カラムベッド高さ（サンプル溶液の線流速方向）で複数に分割することで、各カラムにかかる圧力損失が低減し、カラムにかかる圧力負荷を低減させることができる。ここで、複数のカラムのカラムベッド高さの合計を、分離対象の物質を含む移動相の全量を処理可能な容量の固定相を単一のカラムとしたときのカラムベッド高さとする。これにより、大量のサンプル溶液を短時間で効率よく処理することができ、目的とする物質の分離・精製を効率良く行うことができる。
【００３８】
本分離装置において、２つ以上の分割カラムを用いる場合、各分離カラムは、処理するサンプル溶液の量や(I)から(V)の各工程の必要時間に依存し、これらを考慮して設計することが好ましい。具体的な設計方法を以下に述べる。
【００３９】
１．カラム数の決定方法
培養液に含まれる物質を分離する処理（上記(I)〜(V)）を連続的に処理するためには、２つ以上のカラムを用いて、時間をずらして、(II)目的物質の吸着工程を行う必要がある（図４参照）。ここで、カラムの数：N、T1：カラムの平衡化の時間、T2：目的物質の吸着時間、T3:洗浄時間、T4：目的物質の溶出時間、T5:カラムの再生の時間とした場合、一般的に、式（１）を満たすようにカラム数を設けることで、培養液を連続的に処理することが可能となる。
【００４０】
［数１］
N×T2≧（T1+T2＋T3+T4＋T5）      式（１）
【００４１】
一方、各(I)〜(V)の時間は以下のようにして決定することができる。ただし、以下の方法は一例であり、他の基準で決定しても構わない。
【００４２】
カラムの平衡化の時間T1の決定方法
カラムの平衡化の時間は、カラム平衡化において、溶出液の吸光度をモニタリングし、ベースラインが安定するまでに要する時間と定めることができる。一方、溶媒置換時の送液量が、カラム体積の10倍量となるまでに要する時間としても構わない。
【００４３】
目的物質の吸着時間T2の決定方法
カラムへ送液する線速度が決定すれば、目的物質の吸着に要する時間を以下の式２で決定することができる。
（吸着時間）＝（カラムのベッド高）/（線速度）
【００４４】
線速度は以下のようにして決定することができる。カラムベッド高と線速度は図５に示す関係があり、カラムの許容圧力以下の範囲（図中の曲線P以下）の条件を満たす必要がある。この範囲内で、カラムベッド高と線速度を様々に変えた条件で、抗体の回収率を実験により測定し、回収率が一定値（例えば95％）を維持するカラムベッド高、線速度で決定することができる。上記、回収率の測定の代わりに、以下に示す動的結合容量を計測しても構わない。
【００４５】
線速度測定の実験例を以下に示す。プロテインAカラムを用いて適切な線速度を検討した。様々な線速度の条件でIgGサンプルを添加後、300mM塩化ナトリウム溶液を含むリン酸ナトリウム（pH7.0）、1.88カラム容量（CV）で洗浄後、300mM塩化ナトリウム溶液を含む20mMリン酸ナトリウム（pH2.8）、6.31CVを用いてステップワイズ溶出を行った。各線速度におけるIgG回収量を定量し、添加IgGサンプル量との比をとることで、回収率を導出した。本実施例では回収率が90%以上を維持する線速度を適正線速度とした。
【００４６】
担体の結合容量には、最大結合容量と動的結合容量の2種類ある。前者は担体が目的分子を回収できる上限の量をあらわし、後者は精製するサンプルが流れている状態で、どのくらい効率よく回収できるかをあらわす数値である。動的結合容量が高い担体は高流速でたくさんの目的分子を回収できるため、短時間で効率よく目的の分子を精製できる。一方、最大結合容量は、標準タンパク質溶液をカラムに添加し、溶出液の吸光度をモニターする。溶出液の吸光度が添加サンプルと同じになるまで送液を続け、「溶出したタンパク質量」から結合量を求めることができる。最大結合容量は添加流速の影響は受けない。
【００４７】
動的結合容量測定の実験例を以下に示す。動的結合容量を以下の手順に従って測定した。PBSで希釈した10mg/mL濃度のIgGをシリンジポンプにて、500cm/hの線流速度で10mL送液した。流路の出口から溶液の吸光度を測定した。結果を図６に示す。動的結合容量は一般に、添加したサンプルの吸光度もしくはタンパク量の5 % の漏出が見られた時点の添加タンパク質量とされることが多いため、図６に示すように21.5mg/mLが動的結合容量であることがわかる。
【００４８】
なお、参考のため線流速（cm/h）の求め方を以下に示す。
線流速（cm/h）=[流速（ml/min）]×60/[カラムの断面積(cm2)]=[Z×60×4]/[π×d2]
（Z=流速、d = カラム内径（cm））
【００４９】
洗浄時間T3の決定方法
洗浄の効果は洗浄前後の圧力を測定することで確認することが可能である。例えば、溶出バッファーから洗浄液に置き換える前や洗浄液での洗浄後に、超純水に一度置換して超純水を流したときの圧力を比較し、圧力が下がるまでの時間を洗浄時間として決めることができる。別の方法としては、洗浄工程で溶出液の吸光度を測定し、ベースラインが安定するまでの時間を洗浄時間と定めることもできる。あるいは、カラム体積の一定倍数（例えば10倍）量の洗浄液が流れるまでに要する時間を洗浄時間として決めることもできる。
【００５０】
カラムの洗浄は、製品の完全性/安全性、精製用担体の寿命を考慮して検討する必要がある。カラム洗浄を目的として、以下の洗浄剤が利用できる。ただし、これらの洗浄剤に限定されず、他の洗浄剤を用いることも可能である。すなわち、洗浄剤としては塩酸グアニジンを使用できる。塩酸グアニジンは疎水性相互作用を破壊し、沈殿・変性したタンパクを溶解する特徴がある。また、洗浄剤としては有機溶媒（イソプロパノールなど）を使用できる。有機溶剤は、脂質や疎水性の不純物を除去、沈殿した原料は除去困難といった特徴がある。さらに、洗浄剤としては水酸化ナトリウムを使用することができる。水酸化ナトリムは、沈殿タンパクを可溶化し、アルカリ加水分解により脂質を可溶化し、担体から核酸を除去し、殺菌作用があり、タンパクリガンドを劣化させるといった特徴がある。上記洗浄剤の中でも特に水酸化ナトリウムは洗浄、殺菌、パイロジェン不活化、ウイルス不活化に効果的であるため好ましい。
【００５１】
目的物質の溶出時間T4
カラムに抗体を吸着させておき、溶出液を流し始めてから、抗体溶出による吸光度が減少し、ベースラインに戻るまでの時間を溶出時間として定めることができる。
【００５２】
カラムの再生の時間T5
一例として、10カラム体積（CV）の20mMリン酸バッファー、0.5MのNaCl溶液、50mMのEDTA溶液（pH7.4）を送液して金属イオンを除去した後、15CVの超純水を送液するのに要する時間をカラムの再生時間とすることができる。カラムの汚れがひどい場合は、さらに5CVの1MのNaOH溶液をゆっくりと送液して洗浄し、15CV以上の中性バッファーを送液してカラムを中性に戻すのに要する時間とすることができる。
【００５３】
酸やアルカリ溶液で洗浄した後に超純水を流しただけではカラム内に酸やアルカリが残存し担体へダメージを与えることがあるため、酸やアルカリによる洗浄後にNaClでの洗浄ステップを入れることで担体へのダメージを低減することができる。
【００５４】
２．カラム容積の決定方法
培養液中の目的物質濃度：Ct、１バッチあたりの培養液の容積：Vｂ、単位容量当りのカラムの目的物質動的吸着量：Am、１カラム当りの容量：Vｃ、カラムの数：N、カラムの再利用回数：Rとすると、式（２）の関係が成り立つ。
【００５５】
［数２］
Ct・Vｂ≦Am・Vc・R・N      式（２）
【００５６】
カラム数Nを大きくすることで、式（１）（２）を満たすことができるが、カラム数Nが多くなるにつれ、精製装置の制御系が複雑になるため、式（１）（２）を満たし、カラム数Nが最小数となることが望ましい。カラム中の固定相は通常、繰り返し利用するが、再生工程でのNaOHなどのアルカリ処理で徐々に固定相でのプロテインAなどが劣化（脱離もしくは変性）し、徐々に目的物質の回収量が低下し、目的の回収量を得られなくなるまでの再利用回数を寿命（寿命回数）とする。固定相ごとに寿命が異なる場合は、使用毎に回収量をモニタリングしておき、ユーザーが決定する所定の回収量を得られなくなるまでを寿命とすることもできるし、メーカーが保障する再利用回数を寿命としてもよい。Rはカラムの再利用回数（寿命）であるため、カラム容量は通常のカラムの（１／R）となる。
【００５７】
３．カラムの分割
必要カラム容積は、１カラム当りの容量Vcとカラムの数Nの積である。Vc・Nの容積のカラムをN個に分割するが、カラムベッド高さを同じにして、カラム断面積を1/Nに分割したカラムは、圧損が分割前のカラムより大きくなる。そのため、カラムベッド高さ方向に少なくとも２分割以上にすることが望ましい。圧力損失が設計の上限値より小さくなるようにカラムベッド高さ、断面積を分割すればよい（図７参照）。図７(a)は、断面積は同じで、高さ方向に分割している。図７(b)は高さおよび断面積を分割しており、分割されたカラムが市販カラムの規格と一致した場合である。
【００５８】
４．カラム材質（充填剤およびカラムホルダー）
上述のように、分離カラムは、処理対象の移動相の全量を処理できる量の固定相を充填している。よって、所定のバッチについて分離カラムを使用した後、当該分離カラム自体を交換して新たな分離カラムを用いて次のバッチを処理することができる。特に、上述のように、複数の分離カラムを使用する場合には、処理対象の移動相が大容量であっても、カラムにかかる圧力を低減することができる。よって、この場合、他分野でディスポーザブル素材として使用されているアクリルアミド、ポリプロピレン、高密度ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート等をカラムホルダーの材料とすることができる。なお、分離カラムとしては、従来使用されていたガラスやステンレスをカラムホルダーの材質としたものを使用することもできる。
【００５９】
また、固定相の母体としては、従来使用されている如何なる材料を使用することができる。例えば、アガロース、シリカゲルのいずれかもしくはその組み合わせを使用することができる。また、分離対象の物質を特異的に捕捉できるリガンドとしても特に限定されず、例えばProtein AやG、Thiophilic interactionを利用することができる。
【００６０】
＜バイオ医薬品精製工程への適用例＞
本発明に係る分離装置をバイオ医薬品精製工程への適用したシステムを図８に示す。図８に示すシステムは、バイオ医薬品である例えば抗体を分泌生産する細胞を培養した培養液を充填した培地受けタンク１０１と、分離対象の抗体を特異的に捕捉する固定相を有するアフィニティーカラム１０２と、固定相に捕捉された抗体を溶出する溶離液が充填された溶離液タンク１０６とを備えている。また、図８に示すシステムにおいて、アフィニティーカラム１０２の下流に、画分タンク１０９、ＵＦ濾過装置１０５、除菌フィルター１０８、受けタンク１１０、陰イオン交換カラム１０３、画分タンク１０９、陽イオン交換カラム１０４、画分タンク１０９が順に設置されている。また図８に示すシステムにおいて、アフィニティーカラム１０２の上流に冷却装置１０７が配設されている。
【００６１】
先ず、抗体等のバイオ医薬品を含む培養液は、遠心処理等により細胞等の成分が取り除かれ清澄化される。その後、図８に示すシステムを利用して目的とする抗体等のバイオ医薬品を回収する。この回収工程において、アフィニティーカラム１０２は、図４に示すような工程表に従い、培養液を連続的に処理する。この間、アフィニティーカラム１０２の充填剤は図４に示すような工程表に従い再利用することができる。アフィニティーカラム１０２に充填された固定相は、培養液の全量を処理可能な容量であり、好ましくは培養液の全量が利用上限量となる。ここで利用上限量とは、固定相の分離性能を維持できる、移動相の最大通過量である。
【００６２】
そして、回収工程を経た培養サンプル液は、中間精製、最終精製を経て、バイアルに充填される。培養液について１バッチが終了した後、アフィニティーカラム１０２を取り外し、そのまま焼却処分を行うことができる。次の培養液については、新しいアフィニティーカラム１０２をラインにつなげることで、容易に次の準備を行うことができる。このように、本発明を適用することによって、カラムの劣化が生じた場合に充填剤の交換を行う必要がなく処理時間を短縮することができる。また、本発明を適用することによって、大量の充填剤を大型のカラムに充填するための特別な装置や手技を必要とせず、極めて容易に多くの培養液を処理することができる。
【符号の説明】
【００６３】
１…カラム、２…カラム、３…送液用ポンプ、４…送液用ポンプ、５〜９…リザーバー、１０〜１３…スイッチバルブ、１４〜１５…選択バルブ、２１〜２４…スイッチバルブ、３１…カラム、３２…スイッチバルブ、３３…選択バルブ、３４…送液用ポンプ、３５〜３６…選択バルブ、３７…スイッチバルブ、３８…スイッチバルブ、３９…コンピュータ、４０…制御装置、４１〜４３…スイッチバルブ、４４〜４６…UV検出器、制御装置、１０１…培地受けタンク、１０２…アフィニティーカラム、１０３…陰イオン交換カラム、１０４…陽イオン交換カラム、１０５…ＵＦ濾過装置、１０６…溶離液タンク、１０７…冷却装置、１０８…除菌フィルター、１０９…画分タンク、１１０…受けタンク
【図１】
2015014539.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４】
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【図５】
2015014539.tif 000009
【図６】
2015014539.tif 000010
【図７】
2015014539.tif 000011
【図８】
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