(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、十分な比活性を有したＮＡＤ（Ｈ）やＮＡＤＰ（Ｈ）に依存しないで電子の授受を行う可溶型Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの提供、および前記Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの発現システムを提供することである。【解決手段】  本発明は、ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌、および、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現システムおよび該発現システムにより製造された可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼなどに関する。さらに前記可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼを利用した光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼおよび、その光駆動ギ酸生成システムに関する。【選択図】  図３
2015130855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌、および、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現システム。
【請求項２】
ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号１に記載の塩基配列を有し、膜貫通ドメインをコードする部分が、該塩基配列の３９６４位〜４１２８位の部分である、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
ベクターが、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’（配列番号６）である、請求項１または２に記載の発現システム。
【請求項４】
ギ酸デヒドロゲナーゼが、Ｍｏ型またはＷ型ギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項５】
ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’（配列番号６）である可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の発現システムを用いた、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項７】
ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌に、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを挿入し、該ベクターが挿入された前記大腸菌を培養することを含む、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項８】
大腸菌を、容器高の７割〜８割まで培養液を入れた培養フラスコで、８０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍで、穏やかに振盪培養することを含む、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
培養が、２日間培養した場合に、培養液のＯＤ６００の値が１．８〜３．１を示す条件で行われる、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
大腸菌由来の、膜貫通ドメインおよび膜サブユニットを欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１１】
Ｍｏ型またはＷ型ギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項１０に記載の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１２】
（１）配列番号７および８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（２）該アミノ酸配列において、１〜３０個のアミノ酸が、欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼに直接またはリンカーを介して光合成反応中心蛋白質複合体（Photosystem I,ＰＳＩ）のＰｓａＥサブユニットが連結されてなる、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１４】
リンカーを有する、請求項１３に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１５】
リンカーが、親水性アミノ酸を含むリンカーである、請求項１４に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１６】
リンカーが、グリシン、セリン、プロリンから選択される１種または２種以上の親水性アミノ酸を含む、請求項１５に記載の光駆動型デヒドロゲナーゼ。
【請求項１７】
リンカーが、６個〜１６個のアミノ酸からなる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１８】
可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼが、配列番号８に記載のポリペプチドにおいて、１１１位、１１４位、１３４位、１３８位、１４１位、１５０位および２３１位のアミノ酸の少なくとも１つが、親水性アミノ酸に置換されてなる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項１９】
アミノ酸の置換が、Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｅ、Ｉ１３４Ｑ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１Ｓ、Ｌ１５０ＥおよびＬ１５０Ｑからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１８に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２０】
アミノ酸の置換が、（１）Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｅ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１ＳおよびＬ１５０Ｅ、（２）Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｅ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１ＳおよびＬ１５０Ｑ、または、（３）Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｑ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１ＳおよびＬ１５０Ｅである、請求項１９に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２１】
さらにタグを有する、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２２】
タグが、Ｈｉｓタグである、請求項２１に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項２３】
請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼとＰｓａＥサブユニットの欠損したＰＳＩとを含む、光駆動ギ酸生産システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載の光駆動ギ酸生産システムを用いた、ギ酸の生産方法。
【請求項２５】
ギ酸の生産に用いる、ＰｓａＥサブユニットの欠損したＰＳＩ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼおよびその発現システムに関し、特に、大腸菌（Escherichia coli）において大量発現可能であって、活性を有する可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼおよびその発現システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ギ酸が次世代エネルギーキャリアとして期待されていることから、ギ酸生成・分解にかかわるギ酸デヒドロゲナーゼは、大きな注目を集めいている。さらにギ酸デヒドロゲナーゼは、二酸化炭素の還元を効率よく触媒し、副生成物を出さないことから、人工光合成や化学工業の分野からも大きな注目を集めている。例えば、遺伝子操作によりギ酸デヒドロゲナーゼおよびヒドロゲナーゼの酵素群を高発現させた微生物を用いて水素を供給する燃料電池などが検討されている（特許文献１：特許第３７６４８６２号公報）。
【０００３】
ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）は、ギ酸の二酸化炭素への酸化反応（ＨＣＯＯ−→ＣＯ２＋Ｈ＋＋２ｅ−）と、二酸化炭素のギ酸への還元反応（ＣＯ２＋Ｈ＋＋２ｅ−→ＨＣＯＯ−）を触媒する酵素である。また、ギ酸デヒドロゲナーゼは、大きく２つのグループに分類できる（非特許文献１：Ferry G J(1990)）。１つ目のグループは、ＮＡＤ（Ｈ）のほかに、触媒活性に金属イオンなどの補酵素を持たないＮＡＤＨ依存的ギ酸デヒドロゲナーゼである（非特許文献２：Popov V Oら(1994)）。２つ目のグループは、モリブデンもしくはタングステンを活性中心に持つギ酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨという）に分類できる。Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨにおける活性サブユニットは、プテリンと呼ばれる補酵素を２分子有し、その２分子にモリブデンもしくはタングステンが配位されている。モリブデンもしくはタングステンには、さらに、セレノシステインが配位している（非特許文献３：Richard A. Rotheryら(2008)、非特許文献４：Moura J Jら(2004)）。
【０００４】
Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨは、活性サブユニットの他にさらにいくつかのサブユニットが会合することで、生体内において様々な役割を担っており、電子授受の方法やサブユニット構造に基づいて、さらに３つのグループに分けることができる。
【０００５】
第１のグループは、電子の授受をＮＡＤ（Ｈ）もしくはＮＡＤＰ（Ｈ）に依存する可溶性蛋白質のグループである。このグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨでは、モリブデンもしくはタングステンでギ酸から抜き取られた電子で、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋を還元する。または、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨから電子を抜き取り、二酸化炭素還元のためにモリブデンもしくはタングステンに電子が送られる。両者の電子伝達を触媒するために、フラビンを含むジアフォラーゼサブユニットなどを有する(非特許文献５：Laukel Mら(2003)、非特許文献６：Hartmann Tら(2013)、非特許文献７：Yamamoto Iら(1983))。
【０００６】
第２のグループは、ＮＡＤ（Ｈ）やＮＡＤＰ（Ｈ）に依存しないで電子の授受を行う膜結合性蛋白質のグループである。このグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨにおける電子授受は、ヘムなどの補酵素を含んだ膜サブユニットとの間の電子移動によって行われる。そのために、活性サブユニットと膜サブユニットの間に、鉄硫黄クラスターを有する電子伝達サブユニットが存在し、３つのサブユニットからなる構造を基本としている。代表例として、大腸菌由来のＦＤＨ−ＮやＦＤＨ−Ｏなどがある（非特許文献８：Jormakka Mら (2002)、非特許文献９：Benoit Sら(1998)）。
【０００７】
第３のグループは、ＮＡＤ（Ｈ）やＮＡＤＰ（Ｈ）に依存しないで電子の授受を行う可溶性蛋白質のグループである。このグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨにおける電子授受は、ヘムを有する可溶性シトクロムや鉄硫黄クラスターを有する可溶性フェレドキシンなどの電子伝達蛋白質との間の電子移動によって行われると考えられている。活性サブユニットと鉄硫黄クラスターを有する電子伝達サブユニットとの２つのサブユニットから成り、電子伝達サブユニットは可溶性電子伝達蛋白質との会合と電子移動反応の場を提供している。例として、クロストリジウム属（Clostridium pasteurianum）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ(非特許文献１０：Liu C Lら(1984))や、硫酸還元菌（Syntrophobacter fumaroxidans）由来のギ酸デヒドロゲナーゼなどがある(非特許文献１１：Torsten Rら(2008))。この第３のグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨは、電極や光触媒などとの直接電子伝達が可能であり、産業的に価値が特に高いとされている（非特許文献１１）。
【０００８】
これまでギ酸デヒドロゲナーゼを産業的に利用する試みとして、例えば、上記の特許文献１のほかにも、メタノール資化性細菌であるハイモマイクロビウム属の微生物からギ酸デヒドロゲナーゼを採取すること（特許文献２：特開２０００−７８９７０号公報）、アカカビ由来のギ酸脱水素酵素に対して特定のアミノ酸置換を導入し、大腸菌から活性を有した変異型ギ酸脱水素酵素を得ること（特許文献３：国際公開第２０１１／０１６１０２号）、マイコバクテリウムバッカエ由来のβ−ニコンチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存型ギ酸脱水素酵素活性を有する、ギ酸脱水素酵素の変異体蛋白質を構築したこと（特許文献４：国際公開第２０１２／１６９３４１号）などが報告されているが、いずれもギ酸デヒドロゲナーゼの十分な発現量や活性量を得られたとはいえないものであった。また、産業への応用が期待できるＭｏ／Ｗ−ＦＤＨについて発現系は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３７６４８６２号公報
【特許文献２】特開２０００−７８９７０号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／０１６１０２号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１６９３４１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ferry James G., “Formate dehydrogenase” FEMS Microbiology Review (1990) Volume. 87, Issues 3-4, pp.377-382.
【非特許文献２】Popov V O et al., “NAD+-dependent formate dehydrogenase” Biochemical Journal  (1994) Vol.301 pp.625-643.
【非特許文献３】Richard A. Rothery et al., “The prokaryotic complex iron-sulfur molybdoenzyme family” Biochimica et Biophysica Acta (2008) Vol.1778 pp.1897-1929.
【非特許文献４】Moura J J et al., “Mo and W bis-MGD enzymes: nitrate reductases and formate dehydrogenases”J Biol Inorg Chem (2004) Vol.9 pp.791-799.
【００１１】
【非特許文献５】Laukel M et al., “The tungsten-containing formate dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AM1: purification and properties” Eur. J. Biochem. (2003) Vol.270 pp.325-333.
【非特許文献６】Hartmann T et al., “The oxygen-tolerant and NAD+-dependent formate dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus is able to catalyze the reduction of CO2 to formate” FEBS J. (2013) Sep 13 doi:10.1111/febs. 12528.
【非特許文献７】Yamamoto I et al., “Purification and properties of NADP-dependent formate dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum, a tungsten-selenium-iron protein” J. Biol. Chem. (1983), Vol.258 pp.1826-1832.
【非特許文献８】Jormakka M et al., “Molecular basis of proton motive force generation: structure of formate dehydrogenase-N” Science (2002) Vol.295 pp.1863-1868.
【００１２】
【非特許文献９】Benoit S et al., “Topological analysis of the aerobic membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli” Journal of Bacteriology (1998) Vol.180 pp.6625-6634.
【非特許文献１０】Liu C L et al., “Formate dehydrogenase of Clostridium pasteurianum” Journal of Bacteriology (1984) Vol.159 pp.375-380.
【非特許文献１１】Torsten R et al., “Reversible interconversion of carbon dioxide and formate by an electroactive enzyme” PNAS (2008) Vol.105 pp.10654-10658.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するため、研究を重ねる中で、最も産業への応用が期待される上記第３のグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨの発現系を実用に耐え得る規模で確立することを検討したが、困難に直面した。すなわち、第３のグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨは、嫌気性菌である硫酸還元菌やクロストリジウム属細菌で見つかっていることから、これらの細菌を培養して、菌体サンプルからＭｏ／Ｗ−ＦＤＨを抽出し、多数の工程からなる精製を行う必要があった。しかし、上記の細菌は、嫌気性細菌であり培養が困難、且つ増殖が遅いという問題があった。さらに、形質転換の効率が悪く、操作が煩雑であるために、アミノ酸置換やタグの導入が困難であった。そこで本発明者らは、容易に培養操作が簡便で、形質転換も容易な大腸菌を宿主として、硫酸還元菌由来Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの組換え蛋白質の調製を試みた。しかしながら、ＦＤＨにおいて、補酵素の挿入など活性型への成熟に関連している酵素群についての知見が不十分であることなどが原因で、硫酸還元菌由来Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの大腸菌内異種発現は現状では実用化において障害が大きいとの結論に至った。
【００１４】
次に本発明者らは、大腸菌由来のＭｏ／Ｗ−ＦＤＨ（ＦＤＨ−ＯおよびＦＤＨ−Ｎ）に着目した。
そもそも、硫酸還元菌由来Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨなど、第３のグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨは、可溶性、且つ、ＮＡＤ（Ｈ）やＮＡＤＰ（Ｈ）に依存しないで直接電子の授受を行うことができることから、電極や光触媒などとの直接電子伝達が可能となり、産業的価値を高めている。
【００１５】
大腸菌には、ＦＤＨ−ＯとＦＤＨ−Ｎの２種類の第２のグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨが知られている。これらのうちＦＤＨ−Ｎは、硝酸などの窒素を誘導源とし、また嫌気的な条件により発現が誘導されやすいことから、特別な設備を必要としない好気条件での培養は好適とはいえず、実用化の上では必ずしも有利とはいえない。そこで本発明者らは、ＦＤＨ−Ｏをベースとして、膜サブユニットを削除することで、第３のグループのＭｏ／Ｗ−ＦＤＨと同様のサブユニット構造に、活性を失うことなく改変できれば、同様の機能を付与できるのではないか、さらには好気条件での大量培養が可能となり産業的価値がさらに高まるのではないかとの仮説を立てた。
【００１６】
かかる仮説に基づき、ＦＤＨ−ＯおよびＦＤＨ−Ｎを破壊した大腸菌に、ＦＤＨ−Ｏ活性サブユニット遺伝子（ｆｄｏＧ）および電子伝達サブユニット遺伝子（ｆｄｏＨ）を組み込んだプラスミドを導入したところ、可溶型ＦＤＨ−Ｏを容易に調製することができ、アミノ酸置換やタグの付与も容易に設計できるようになった。さらに、ＦＤＨ−Ｏ電子伝達サブユニットには、膜貫通ドメインが存在しており、電極や光触媒などとの直接電子伝達の立体障害となることが予想されたため、膜貫通ドメインを切断し、さらに変異を導入したところ、発現量が数倍に上がることを見出した。
【００１７】
さらに本発明者らは、これまでの本発明者らによる新しい知見に基づく発明をさらに発展的に利用できるように、ＦＤＨを光合成反応中心蛋白質複合体（Photosystem I，ＰＳＩ）に組み込んだＦＤＨ−ＰＳＩ複合体を構築することで、ＰＳＩにおける光誘起電子移動とＦＤＨの二酸化炭素還元能（ギ酸生産能）を組み合わせた光駆動ギ酸生産を目指した。自発的会合によるＦＤＨ−ＰＳＩ複合体の形成を企図し、ＦＤＨのスモールサブユニット（ｆｄｏＨ）にＰＳＩを構成するサブユニットの一つであるＰｓａＥを融合したＰｓａＥ融合Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨと、ＰｓａＥサブユニットを欠失したＰｓａＥ欠失ＰＳＩを用いることを検討したが、単にこれだけでは、実用可能な安定性が得られない場合があることが分かった。そこで、かかる安定性を得ることを新たな課題として、鋭意研究を進めたところ、もともとｆｄｏＨとｆｄｈＩの界面であった領域に存在する特定のアミノ酸に変異を加えることによって、安定性が増し、さらに変異体の構成を工夫することによって、精製の効率を著しく向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって本発明の課題は、十分な比活性を有したＮＡＤ（Ｈ）やＮＡＤＰ（Ｈ）に依存しないで電子の授受を行う可溶型Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの提供、および前記Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの発現システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］  ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌、および、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現システム。
［２］  ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が配列番号１に記載の塩基配列を有し、膜貫通ドメインをコードする部分が、該塩基配列の３９６４位〜４１２８位の部分およびである、前記［１］に記載の発現システム。
［３］  ベクターが、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’（配列番号６）である、前記［１］または［２］に記載の発現システム。
［４］  ギ酸デヒドロゲナーゼが、Ｍｏ型またはＷ型ギ酸デヒドロゲナーゼである、前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の発現システム。
【００１９】
［５］  ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’（配列番号６）である可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ発現ベクター。
［６］  前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の発現システムを用いた、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
［７］  ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌に、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを挿入し、該ベクターが挿入された前記大腸菌を培養することを含む、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
［８］  大腸菌を、容器高の７割〜８割まで培養液を入れた培養フラスコで、８０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍで、穏やかに振盪培養することを含む、前記［６］または［７］に記載の製造方法。
［９］  培養が、２日間培養した場合に、培養液のＯＤ６００の値が１．８〜３．１を示す条件で行われる、前記［８］に記載の製造方法。
【００２０】
［１０］  大腸菌由来の、膜貫通ドメインおよび膜サブユニットを欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［１１］  Ｍｏ型またはＷ型ギ酸デヒドロゲナーゼである、前記［１０］に記載の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［１２］  （１）配列番号７および８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（２）該アミノ酸配列において、１〜３０個のアミノ酸が、欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【００２１】
［１３］  前記［１０］〜［１２］のいずれか一項に記載の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼに直接またはリンカーを介して光合成反応中心蛋白質複合体（Photosystem I,ＰＳＩ）のＰｓａＥサブユニットが連結されてなる、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［１４］  リンカーを有する、前記［１３］に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［１５］  リンカーが、親水性アミノ酸を含むリンカーである、前記［１４］に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［１６］  リンカーが、グリシン、セリン、プロリンから選択される１種または２種以上の親水性アミノ酸を含む、前記［１５］に記載の光駆動型デヒドロゲナーゼ。
［１７］  リンカーが、６個〜１６個のアミノ酸からなる、前記［１４］〜［１６］のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【００２２】
［１８］  可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼが、配列番号８に記載のポリペプチドにおいて、１１１位、１１４位、１３４位、１３８位、１４１位、１５０位および２３１位のアミノ酸の少なくとも１つが、親水性アミノ酸に置換されてなる、前記［１３］〜［１７］のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［１９］  アミノ酸の置換が、Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｅ、Ｉ１３４Ｑ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１Ｓ、Ｌ１５０ＥおよびＬ１５０Ｑからなる群から選択される１種または２種以上である、前記［１８］に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［２０］  アミノ酸の置換が、（１）Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｅ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１ＳおよびＬ１５０Ｅ、（２）Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｅ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１ＳおよびＬ１５０Ｑ、または、（３）Ａ１１１Ｔ、Ａ１１４Ｓ、Ｉ１３４Ｑ、Ｙ１３８Ｓ、Ａ１４１ＳおよびＬ１５０Ｅである、前記［１９］に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
【００２３】
［２１］  さらにタグを有する、前記［１３］〜［２０］のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［２２］  タグが、Ｈｉｓタグである、前記［２１］に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼ。
［２３］  前記［１３］〜［２２］のいずれか一項に記載の光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼとＰｓａＥサブユニットの欠損したＰＳＩとを含む、光駆動ギ酸生産システム。
［２４］  前記［２３］に記載の光駆動ギ酸生産システムを用いた、ギ酸の生産方法。
［２５］  ギ酸の生産に用いる、ＰｓａＥサブユニットの欠損したＰＳＩ。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現システムによれば、十分な比活性を有する可溶型Ｍｏ/Ｗギ酸デヒドロゲナーゼを提供することができる。特に、可溶型Ｍｏ/Ｗギ酸デヒドロゲナーゼを簡易かつ短期間に、そして大量に提供することができる。
また、プラスミドサイズが比較的小さく、遺伝子操作が容易であることから、例えば、ランダムライブラリーなどの多数のアミノ酸置換体のライブラリーを構築することなどが容易にできる。かかるライブラリーなどを用いることによって、有用な可溶型Ｍｏ/Ｗギ酸デヒドロゲナーゼ変異体の探索などを迅速に行うことができる。さらに、可溶型Ｍｏ/Ｗギ酸デヒドロゲナーゼの発現を制御するプロモーターを解析することにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、大腸菌ギ酸デヒドロゲナーゼの３次元立体構造を示す図である。
【図２】図２は、大腸菌のゲノム上に存在するギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の構造を示す模式図である。ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、大サブユニット、膜貫通ドメインを含む小サブユニットおよび膜サブユニットを夫々コードする３つの領域からなる。
【図３】図３は、本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現システムの一態様を示す模式図である。かかる発現システムにおいて、大腸菌ゲノム上のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は欠失している。プラスミドにおいて、大サブユニットおよび膜貫通ドメインを欠失した小サブユニットをコードする領域を含む。
【図４】図４は、本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの発現システムの一態様を示す模式図である。かかる発現システムにおいて、大腸菌ゲノム上のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は欠失している。プラスミドにおいて、大サブユニットおよび膜貫通ドメインを欠失した小サブユニットをコードする領域を含み、大サブユニットにおいて変異が導入されている。
【図５】図５は、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性の測定結果を示す電気泳動図である。図中の記号は、夫々次の意味を有する；ＷＴ：野生型、△ｆｄｏＩ：ゲノム上のＦＤＨ-Ｏの膜サブユニットのみ破壊、△ｆｄｏ：ＦＤＨ-Ｏの活性サブユニット＋膜サブユニット破壊、△ｆｄｏ△ｆｄｎ：ＦＤＨ-ＯおよびＦＤＨ-Ｎの活性サブユニット＋膜サブユニット破壊、△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＢＲｆｄｏＧＨｍｓｔ：ＦＤＨ-Ｏの活性サブユニット＋膜サブユニットをプラスミドに乗せて導入、△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ：ＦＤＨ-Ｏの活性サブユニット（膜貫通ドメインなし）を導入、△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ’：変異を導入したＦＤＨ-Ｏの活性サブユニット（膜貫通ドメインなし）を導入。
【図６】図６は、ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨのプラスミドおよび大腸菌に発現させた、ｆｄｏＧ遺伝子、ｆｄｏＨ遺伝子、リンカー、ｐｓａＥ遺伝子を組み込みんだ、大腸菌のプラスミドと（右図）、これにより作製されたＰｓａＥ融合ギ酸デヒドロゲナーゼ蛋白質を表す（左図）。
【図７】図７は、リンカーのアミノ酸数の変化させたときのＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨのギ酸分解活性を示す電気泳動図である。各レーンにおいて、用いたリンカーは次のとおりである。レーン８：ＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１５）、レーン１０：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１６）、レーン１０ｓ：ＧＳＳＧＳＳＧＳＳＧ（配列番号１７）、レーン１０Ｐ：ＧＧＳＧＧＰＧＳＧＧ（配列番号１８）、レーン１２：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号１９）、レーン１２Ｄ：ＧＧＳＧＤＧＳＧＤＧＳＧ（配列番号２０）、レーン１２ＤＫ：ＧＧＳＧＤＧＳＧＫＧＳＧ（配列番号２１）、レーン１４：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号２２）。
【図８】図８は、リンカーのアミノ酸数の変化させたときのＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨのギ酸分解活性を示す電気泳動図である。各レーンにおいて、ａはＧＧＳＧＧ（配列番号２３）からなるリンカー、ｂはＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号１６）からなるリンカー、ｃはＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号２４）からなるリンカーをそれぞれ示す。
【図９】図９は、ＦＤＨにＰｓａＥが直接またはリンカーを介したＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨのギ酸分解活性を示す電気泳動図である。各レーンにおいて、１および２５は、ＦＤＨを、２〜２４および２６は、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（１０ｇｓ）（配列番号１６）からなるアミノ酸配列を有するＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの変異体をそれぞれ示す。
【図１０】図１０は、ＳｔｒｅｐタグとＨｉｓタグのそれぞれの異なるタグで精製されたＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨ蛋白質の活性染色図である。各レーンは、左から、細胞破砕液をそのまま用いたサンプル、蛋白質精製する前の上清サンプル、蛋白質生成する前の沈殿サンプル、精製カラムに吸着しなかったサンプル、精製カラムから分離したサンプルのフラクション１〜８をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明のギ酸デヒドロゲナーゼの発現システムは、ギ酸デヒドロゲナーゼを大腸菌によって大量発現する。発現するギ酸デヒドロゲナーゼは、Ｍｏ型またはＷ型ギ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨ）であり、少なくとも膜サブユニットがなく、好ましくは膜サブユニットおよび小サブユニットの膜貫通ドメインが欠損している。
【００２７】
本発明のギ酸デヒドロゲナーゼの発現システムは、ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌、および、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを含む。
【００２８】
本発明の発現システムに用いる大腸菌は、ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損しており、例えば、E. coli Keio Knockout Strainsより購入可能な、ＦＤＨ−Ｏ膜サブユニット（ｆｄｏＩ）破壊ＢＷ２５１１３株を用いることができる。また、公知の方法により、当業者は、適宜、ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠損した大腸菌を調製することが可能である。
【００２９】
大腸菌ギ酸デヒドロゲナーゼは、大サブユニット（活性サブユニット）、膜貫通ドメインを含む小サブユニット（電子伝達サブユニット）および膜サブユニットの３つのサブユニットから構成されている（図１、図２）。したがって、ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、上記の大サブユニット、小サブユニットおよび膜サブユニットを夫々コードする３つの領域を有する。
【００３０】
本発明の発現システムに用いるベクターは、大腸菌に形質転換可能で、目的蛋白質が発現可能であれば、特に限定されないが、好ましくは大腸菌のプラスミドに由来する。本発明の発現システムに用いるベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ｐＥＴ、ｐＧＥＭ、ｐＭＷ、ｐＡＣＹＣなどに由来し、常法により構築することができる。本発明の発現システムに用いるベクターは、大腸菌ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の大サブユニットをコードする領域および小サブユニットをコードする領域が組み込まれている。好ましくは本発明のベクターは、大サブユニットをコードする領域、および、膜貫通ドメインを除く小サブユニットをコードする領域が組み込まれている（図３）。特に好ましくは、本発明の発現システムに用いるベクターは、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’（配列番号６）である。また、プラスミド上の大サブユニットをコードする領域および／または小サブユニットをコードする領域の１個または２個以上の塩基が変異していてもよい。
【００３１】
大腸菌のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、ＦＤＨ−Ｏをコードするｆｄｏ遺伝子、ＦＤＨ−Ｎをコードするｆｄｎ遺伝子が挙げられる。例えば、ｆｄｏ遺伝子の大サブユニットをコードする領域（活性サブユニット遺伝子（ｆｄｏＧ））の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列の１６６位〜３２１６位に相当する。ｆｄｏ遺伝子の小サブユニットをコードする領域（電子伝達サブユニット遺伝子（ｆｄｏＨ））の塩基配列は、配列番号１に記載の塩基配列の３２２９位〜４１６１位に相当する。ｆｄｏ遺伝子の膜貫通ドメインをコードする領域は、配列番号１に記載の塩基配列の３９６４位〜４１２８位に相当する。
【００３２】
本発明の発現システムによって得られるギ酸デヒドロゲナーゼは、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼであり、これをコードする可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば、配列番号１の１６６位〜４１６１位に相当する塩基配列を有している。
本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼは、典型的には、配列番号７および８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、膜サブユニットを含まない。本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼは、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有していれば、前記配列番号７および８に記載のアミノ酸配列のうち、１個または複数個のアミノ酸が、欠失、置換または付加していてもよい。本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼは、前記配列番号７および８に記載のアミノ酸配列において、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、とくに好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個のアミノ酸が、欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する。
【００３３】
本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸置換体のうち、好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列の３２位のロイシンがプロリンに置換されたアミノ酸置換体、配列番号７のアミノ酸配列の５３３位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸置換体、および、配列番号７のアミノ酸配列の３２位のロイシンがプロリンに置換され、５３３位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸置換体である。特に、配列番号７のアミノ酸配列の３２位のロイシンがプロリンに、かつ、配列番号７のアミノ酸配列の５３３位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸置換体は、高い酵素活性が得られるので好ましい。
【００３４】
本発明は、一態様において、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法に関する。
本発明にかかる可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法は、ゲノム中のギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損した大腸菌に、前記ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の膜貫通ドメインおよび膜サブユニットをコードする部分を欠損させた可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有するベクターを挿入し、該ベクターが挿入された前記大腸菌を培養することを含む。
【００３５】
本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの製造方法において、大腸菌の培養は常法で行うことができるが、エアレーションに関し、激しくエアレーションを行うよりも、比較的穏やかな条件でエアレーションを行いながら培養するのが好ましい。
例えば、大腸菌を、容器高の７割〜８割まで培養液を入れた培養フラスコで、８０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍで、穏やかに振盪培養することによって、より活性の高い可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼをより多く得ることができる。例えば、１００ｍＬ三角フラスコであれば、約７０ｍＬの培養液を入れ、８０ｒｐｍ振盪する。振盪培養には、各種の形状および各種のサイズの容器を用いることができるが、好ましくは、三角フラスコを用いることができる。三角フラスコのサイズは、１０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌなど任意のものを用いることができる。大量培養する場合は、これらの三角フラスコを同比率に拡大した容器を用いることもできる。簡便に培養するためには、１００ｍＬ〜５００ｍＬ程度、好ましくは、１００ｍＬ〜３００ｍＬ程度のサイズの三角フラスコを用いることが好ましい。
さらに培養終了時の目安は、ＯＤ６００の値が、比活性および収量の観点から１．８〜３．１であるときが好ましい。
【００３６】
本発明の可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼは、直接またはリンカーを介して光合成反応中心蛋白質複合体（Photosystem I,ＰＳＩ）のサブユニットが連結されてなる、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼとして用いることができる。
ここで、光合成反応中心蛋白質複合体とは、光合成における光化学系１の反応中心となる蛋白質複合体であり、ＰｓａＡ、ＰｓａＢ、ＰｓａＣ、ＰｓａＤ、ＰｓａＥ、ＰｓａＦ、ＰｓａＧ、ＰｓａＨ、ＰｓａＩ、ＰｓａＪ、ＰｓａＫ、ＰｓａＬ、ＰｓａＭ、ＰｓａＮ、ＰｓａＯ、ＰｓａＰ、ＰｓａＸ、Ｌｈｃａ１、Ｌｈｃａ２、Ｌｈｃａ３、Ｌｈｃａ４、Ｌｈｃａ５、Ｌｈｃａ６、Ｌｈｃａ７、Ｌｈｃａ８、Ｌｈｃａ９などの各種のサブユニットから構成される（高橋裕一郎、光合成研究２１（１）、２０１１年、２７〜３４頁）。
【００３７】
本発明において、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼに連結される、光合成反応中心蛋白質複合体のサブユニットは、ＰｓａＣサブユニット、ＰｓａＤサブユニット、ＰｓａＥサブユニットが好ましく、ＰｓａＥサブユニットがより好ましい。
また、光駆動によるギ酸の生産に用いるＰＳＩは、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼに連結されるサブユニットが欠損したものが好ましく、ＰｓａＥサブユニットの欠損したＰＳＩが特に好ましい。
【００３８】
またリンカーを介する場合は、当該リンカーは、蛋白質やサブユニットなどを連結するリンカーとして用い得るものであれば特に限定されないが、好ましくはアミノ酸を含むリンカーであり、より好ましくはアミノ酸からなるリンカーである。また、リンカーにアミノ酸が含まれる場合は、少なくとも６個以上のアミノ酸を含むか、または、１６個以下のアミノ酸が好ましい。また、安定性の観点から、６〜１６個のアミノ酸が好ましく、８〜１４個のアミノ酸がより好ましい。なお、リンカーに複数のアミノ酸が含まれる場合は、アミノ酸同士が連続していてもよく、連続していなくてもよい。
【００３９】
さらに、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼと光合成反応中心蛋白質複合体のサブユニットのリンカーの位置は、後述するサブユニットの欠損したＰＳＩと会合できれば良いことから、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの活性を失わせる位置でないならば、任意の位置でよい。なお、アミノ酸をリンカーとして用いる場合は、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼのＣ末端に前記リンカーを直接連結することが好ましい。
【００４０】
アミノ酸の種類としては、親水性アミノ酸がグリシン、セリン、プロリンから選択される１種または２種以上の親水性アミノ酸を含むことが好ましく、とりわけグリシンおよび／またはセリンが含まれていることがより好ましい。さらに、グリシンおよび／またはセリンが５個以上含まれることが特に好ましい。
【００４１】
光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼとは、ギ酸デヒドロゲナーゼとＰＳＩのサブユニットとが連結し、ギ酸デヒドロゲナーゼとＰＳＩとの複合体を形成して、光駆動により、ギ酸を生成し得るギ酸デヒドロゲナーゼをいう。安定性の観点から、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼを構成するｆｄｏＨのアミノ酸に変異が存在することが好ましい。前記アミノ酸の変異は、典型的には、他のアミノ酸に置換されることであるが、例えば、アミノ酸が化学修飾された変異であってもよい。変異の存在するアミノ酸の数は、少なくとも１個以上であればよいが、５個以上が好ましく、６個以上がより好ましい。また、変異の存在するアミノ酸の数は、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性が維持されれば、とくに限定されないが、５０個以下でが好ましく、３０個以下が特に好ましい。
【００４２】
またｆｄｏＨの変異を有する領域は、ｆｄｏＨの領域内であれば、特に限定されないが、ｆｄｏＩとの境界または境界近く、すなわち配列番号８に記載のポリペプチドにおいては、７６〜１６５位または２２６〜２３６位にあることが好ましく、１０９〜１５２位、２２９位〜２３３位にあることがより好ましい。より具体的には、例えば、１１１位、１１４位、１３４位、１３８位、１４１位、１５０位、２３１位のアミノ酸の１つ若しくは２つ以上、または全部に変異があることが好ましく、さらには、１１１位、１１４位、１３４位、１３８位、１４１位、１５０位の１つ若しくは２つ以上、または全部に変異があることが特に好ましい。
【００４３】
さらに変異させる対象となるアミン酸は、疎水性アミノ酸を対象とすることが好ましく、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、チロシン（Ｙ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、システイン（Ｃ）を対象とすることがより好ましく、アラニン、ロイシン、チロシンを対象とすることがより好ましい。
【００４４】
また置換するアミノ酸としては、親水性アミノ酸へ置換させることが好ましく、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、トリプトファン（Ｗ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）のアミノ酸または修飾されたアミノ酸へ置換させることが好ましく、トレオニン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニンへの置換がより好ましい。アミノ酸の置換は、典型的には、１つのアミノ酸に対して、１つのアミノ酸を置換することで行われるが、例えば、１つのアミノ酸に対して、１〜３個程度のアミノ酸を置換してもよい。
【００４５】
とりわけ、アミノ酸の置換が、１１１位のアラニンがトレオニン、１１４位のアラニンがセリン、１３４位のイソロイシンがグルタミン酸、１３４位のイソロイシンがグルタミン、１３８位のチロシンがセリン、１４１位のアラニンがセリン、１５０位のロイシンがグルタミン酸および１５０位のロイシンがグルタミンからなる群から選択される１種または２種以上である、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼが好ましい（但し、前記の１３４位のイソロイシンからグルタミン酸への置換とイソロイシンからグルタミンへの置換や、１５０位のロイシンからグルタミン酸への置換とロイシンからグルタミンへの置換は、それぞれ同時に起こらないことは言うまでもない）。
【００４６】
さらにアミノ酸の置換が、（１）１１１位のアラニンがトレオニン（Ａ１１１Ｔ）、１１４位のアラニンがセリン（Ａ１１４Ｓ）、１３４位のイソロイシンがグルタミン酸（Ｉ１３４Ｅ）、１３８位のチロシンがセリン（Ｙ１３８Ｓ）、１４１位のアラニンがセリン（Ａ１４１Ｓ）および１５０位のロイシンがグルタミン酸（Ｌ１５０Ｅ）、（２）１１１位のアラニンがトレオニン（Ａ１１１Ｔ）、１１４位のアラニンがセリン（Ａ１１４Ｓ）、１３４位のイソロイシンがグルタミン酸（Ｉ１３４Ｅ）、１３８位のチロシンがセリン（Ｙ１３８Ｓ）、１４１位のアラニンがセリン（Ａ１４１Ｓ）および１５０位のロイシンがグルタミン（Ｌ１５０Ｑ）、または、（３）１１１位のアラニンがトレオニン（Ａ１１１Ｔ）、１１４位のアラニンがセリン（Ａ１１４Ｓ）、１３４位のイソロイシンがグルタミン酸（Ｉ１３４Ｑ）、１３８位のチロシンがセリン（Ｙ１３８Ｓ）、１４１位のアラニンがセリン（Ａ１４１Ｓ）および１５０位のロイシンがグルタミン酸（Ｌ１５０Ｅ）である、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼがより好ましい。
【００４７】
光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼは、精製などの目的でタグを有していてもよく、好ましくは、Ｈｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｔ７タグであり、精製効率および精製蛋白質の安定性の観点から、Ｈｉｓタグがより好ましく、Ｈｉｓｘ６がさらに好ましい。
【００４８】
本発明の光駆動ギ酸生産システムは、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼにＰＳＩのサブユニットを連結させた光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼと、サブユニットの欠損したＰＳＩとを含む。本発明の光駆動ギ酸生産システムに用い得るＰＳＩは、光合成に必要なＰＳＩ機能を有していれば、いずれの生物種由来のものでもよい。
【００４９】
ＰＳＩにおいて欠損したサブユニットは、当該サブユニットの欠損したＰＳＩが光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼと会合でき、光合成に必要なＰＳＩ機能を発揮できればよいことから、かかる会合と機能の発揮が担保できれば、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼに連結させたＰＳＩのサブユニットと、ＰＳＩにおいて欠損したサブユニットとは、必ずしも一致する必要はない。さらに、前記欠損は、サブユニットの全てを欠損している必要はなく、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼが、会合できる程度の一部の欠損であってもよい。
【００５０】
光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼと会合させる立体的な空間を設けるとの観点から、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼに連結させたＰＳＩのサブユニットと、ＰＳＩにおいて欠損したサブユニットとは一致していることが好ましい。かかるサブユニットとしては、ＰｓａＥサブユニットが好ましい。
【００５１】
上記システムによる、ギ酸の生産方法について、光駆動型ギ酸デヒドロゲナーゼとサブユニットの欠損したＰＳＩとを会合させるためには、混和させるだけでも十分であるが、混合促進剤、界面活性剤、蛋白質安定化剤などを入れてもよい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Triton X-100、アルブミン、スクロースなどを入れてもよい。また、ギ酸を生成させる反応環境は、通常の既知の方法で整えることができるが、蛋白質分解を防ぐという観点から、無菌的であることが好ましい。
【００５２】
以下、本発明について、さらに詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
１．プラスミドコンストラクション
ｐＢＲ３２２およびｐＵｃ１９は、タカラバイオ株式会社から購入した。ｐＢＲ３２２への大腸菌由来ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ−Ｏ）に関連する活性サブユニット遺伝子（ｆｄｏＧ）および電子伝達サブユニット遺伝子（ｆｄｏＨ）の組み込みは以下の通り行った。
まず、大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、EcoRI-Fdo-F145プライマー（配列番号９）と、EcoliFdoH-St-Rプライマー（配列番号１０）を用いたＰＣＲによって、ＤＮＡ断片１（配列番号１）を得た。この断片と、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断したｐＢＲ３２２を等モルで混合し、In-fusion kit（タカラバイオ株式会社）を用いて連結することで、ｐＢＲ ｆｄｏＧＨｍｓｔ（配列番号２）を得た。
【００５４】
ｐＵｃ１９へのｆｄｏＧおよび、膜貫通ドメインを欠失したｆｄｏＨの組み込みは以下の通り行った。
まず、ｐＢＲ ｆｄｏＧＨｍｓｔを鋳型とし、fdo145 pUcプライマー（配列番号１１）と、fdoH st rvプライマー（配列番号１２）を用いたＰＣＲによって、ＤＮＡ断片２（配列番号３）を得た。次に、pUC plac rvプライマー（配列番号１３）とpUC st forプライマー（配列番号１４）を用いて、ｐＵｃ１９を鋳型としたインバースＰＣＲによって、ＤＮＡ断片３（配列番号４）を得た。ＤＮＡ断片２および３を混合し、In-fusion kit（タカラバイオ株式会社）を用いて連結することで、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ（配列番号５）を得た。
【００５５】
また、ＤＮＡ断片２の増幅の際に、複製エラー頻度の高いＫＯＤＦＸ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いて、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔの作製と同様の操作を行うことで、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’変異体のライブラリーを得た。
【００５６】
配列番号１〜８に示す塩基配列の主な特徴について以下に示す。
［配列番号１］（ｐＢＲ ｆｄｏＧＨｍｓｔ）１位〜３７位：EcoRI-Fdo-F145プライマー／１６６位〜３２１６位：活性サブユニット／３２２９位〜４１６１位：電子伝達サブユニット／４１１４位〜４１７８位：EcoliFdoH-St-Rプライマー。
［配列番号２］２６位〜６２位：EcoRI-Fdo-F145プライマー／１９１位〜３２４１位：活性サブユニット／３２５４位〜４１８５位：電子伝達サブユニット／４１３９位〜４２０３位：EcoliFdoH-St-Rプライマー。
［配列番号３］１６２位〜３２１２位：活性サブユニット／３２２５位〜３９７４位：電子伝達サブユニット／３９６０位〜３９７４位：ストレプタグの一部。
［配列番号４］１位〜３０位：ストレプタグ／３４位〜２２５０位：ｐUｃプラスミド。
［配列番号５］（ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ）２２５２位〜５３０２位：活性サブユニット／５３１５位〜６０４９位：電子伝達サブユニット／６０５０位〜６０７９位：ストレプタグ。／２１９７位：（変異なし）ｃ／２３４６位：（変異なし）ｔ。
［配列番号６］（ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’）２２５２位〜５３０２位：活性サブユニット／５３１５位〜６０４９位：電子伝達サブユニットｐUｃ/６０５０位〜６０７９位：ストレプタグ／２１９７位：（変異あり）ｃ→ｔ／２３４６位：（変異あり）ｔ→ｃ。
［配列番号７］（活性サブユニット）１９５位：セレノシステイン。
［配列番号８］（電子伝達サブユニット）。
【００５７】
上記のプラスミドの作製などで用いた各プライマーの塩基配列は、次表のとおりである。
【表１】
2015130855.tif 000003
【００５８】
２．大腸菌Ｍｏ/Ｗ-ＦＤＨ遺伝子破壊株
大腸菌ＢＷ２５１１３株、および、ＦＤＨ−Ｏ膜サブユニット（ｆｄｏＩ）破壊ＢＷ２５１１３株は、E. coli Keio Knockout Strainsから購入した。
ＦＤＨ−ＯおよびＦＤＨ−Ｎ遺伝子破壊ＢＷ２５１１３株は、常法により作製し、単離した。
【００５９】
３．培地の調製
ＬＢ寒天培地は、ＬＢ培地（ナカライテスク株式会社）１２．５ｇ、寒天末（ナカライテスク株式会社）７．５ｇ、イオン交換水５００ｍｌを混合し、オートクレーブ後、シャーレに分注して、固化させるという操作によって調製した。
ＬＢ培地（液体）は、ＬＢ培地（ナカライテスク株式会社）２０ｇとイオン交換水１０００ｍｌを混合し、オートクレーブすることで作製した。
ＳＯＣ培地（液体）は、Bacto Tryptone ２０ｇ、Yeast Extract ５ｇ、５Ｍ ＮａＣｌ ２ｍｌ、２Ｍ ＫＣｌ １．２５ｍｌおよびイオン交換水９９０ｍｌを混合し、オートクレーブ後、さらに２Ｍ Mg solution（１Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ＋１Ｍ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を１０ｍｌおよび２Ｍグルコース溶液１０ｍｌを加えて、調製した。
【００６０】
４．形質転換体の培養
ＦＤＨ−ＯおよびＦＤＨ−Ｎ遺伝子破壊ＢＷ２５１１株へのｐＢＲ ｆｄｏＧＨｓｔおよびｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’の導入は、通常のケミカル形質転換で行った。形質転換体は、１５０ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地が入った２００ｍｌ三角フラスコに植菌し、３７℃、振盪速度９０ｒｐｍ、振盪幅２．５センチで微好気的に培養した。約５０時間後、６００ｎｍのＯＤが約２〜３に達した時点で、菌体を回収した。
【００６１】
５．ギ酸デヒドロゲナーゼ活性測定
ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）活性は、細胞破砕をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分離後、活性染色によって評価した。
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲルは、４．５ｍｌイオン交換水、３．８ｍｌ ３０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ナカライテスク株式会社）、２．８ｍｌ １．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１１ｍｌ １％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を混合し、テトラメチルエチレンジアミンと過硫酸アンモニウムで重合を開始させて作製した。泳動バッファーは、３ｇトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１４．４ｇグリシン、１ｍｌ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をイオン交換水に溶解させ、ｐＨを８．３に調節後、容量を１Ｌに合わせて、調製した。電気泳動は、ゲル一枚につき２０ｍＡの定電流で、４℃のコールドルーム内で行った。泳動後は、ゲルを活性染色液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２ｍＭベンジルビオローゲン、２ｍＭニトロブルーテトラゾリウム（NitroBlue tetrazolium）、０．２Ｍギ酸ナトリウム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に浸して、窒素ガス雰囲気下に数時間置くことで、ＦＤＨ活性によるニトロブルーテトラゾリウムの還元と色素沈着によって形成されたバンドを写真撮影した。
【００６２】
６．ギ酸デヒドロゲナーゼ活性の評価
ＢＷ２５１１株（ＷＴ）、ＦＤＨ−Ｏ膜サブユニット破壊株（△ｆｄｏＩ）、ＦＤＨ−Ｏ破壊株（△ｆｄｏ）、ＦＤＨ−Ｏ／ＦＤＨ−Ｎ破壊株（△ｆｄｏ△ｆｄｎ）、ＦＤＨ−Ｏ／ＦＤＨ−Ｎ破壊株に、ｐＢＲ ｆｄｏＧＨｍｓｔ、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ、もしくはｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ’を導入した形質転換体の活性測定の結果を図５に示す。
【００６３】
レーン１（ＷＴ）の野生型のＦＤＨでは、膜サブユニットおよび膜貫通ドメインを有するために、膜蛋白質が可溶化せずに、ＦＤＨ-ＯおよびＦＤＨ-Ｎの両者が不溶型であることが確認された。
レーン２（△ｆｄｏＩ）の大腸菌のゲノム上のＦＤＨ-Ｏの膜サブユニットのみを破壊した株では、ＦＤＨ-Ｎが可溶化せずに残存しているが、ＦＤＨ-Ｏでは膜サブユニットがないことから、活性を有する可溶型ＦＤＨ（大サブユニットおよび膜貫通ドメインを有する小サブユニット）が観察された。
【００６４】
レーン３（△ｆｄｏ）の大腸菌のゲノム上のＦＤＨ-Ｏの活性サブユニットを破壊した株では、ＦＤＨ-Ｎが観察された。ＦＤＨ-Ｏ遺伝子自体が破壊されているため、可溶型ＦＤＨは観察されないと考えられる。
レーン４（△ｆｄｏ△ｆｄｎ）の大腸菌のゲノム上のＦＤＨ-ＯおよびＦＤＨ-Ｎを破壊した株（ＦＤＨ遺伝子の大サブユニット、小サブユニット、および膜サブユニットのすべてが破壊されている）では、野生型と比べて不溶型ＦＤＨも可溶型ＦＤＨもいずれも観察されないことから、かかる遺伝子が破壊されていることがわかる。
【００６５】
レーン５（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＢＲｆｄｏＧＨｍｓｔ）の大腸菌のゲノム上のＦＤＨ-ＯおよびＦＤＨ-Ｎを破壊した株に、ＦＤＨ-Ｏの活性サブユニットを導入した場合では、膜貫通ドメインを有し、活性を有する可溶型ＦＤＨ（ＦＤＨ-Ｏ）が観察された。
レーン６（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ）の大腸菌のゲノム上のＦＤＨ-ＯおよびＦＤＨ-Ｎを破壊した株に、膜貫通ドメインを破壊したＦＤＨ-Ｏの活性サブユニットを導入した場合では、可溶型ＦＤＨは観察されなかった。
【００６６】
レーン７（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ’）の大腸菌のゲノム上のＦＤＨ-ＯおよびＦＤＨ-Ｎを破壊した株に、膜貫通ドメインを破壊したＦＤＨ-Ｏの活性サブユニットで、プロモーターに変異を導入した場合では、膜貫通ドメインをもたない活性を有する可溶型ＦＤＨが観察された。
【００６７】
レーン５（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＢＲｆｄｏＧＨｍｓｔ）とレーン６（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ）から、膜貫通ドメインを有しているＦＤＨプラスミドを導入した場合、膜貫通ドメインを有していないＦＤＨプラスミドを導入に比べて、活性が高いことがわかる。また、レーン６（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ）とレーン７（△ｆｄｏ△ｆｄｎ＋ｐＵｃｆｄｏＧＨｓｔ’）から、ＦＤＨ遺伝子プラスミドおよびそのプロモーターを導入しただけでは、可溶型ＦＤＨがほとんど発現しないことがわかる。
【００６８】
以上の結果から、膜サブユニットを破壊することで、可溶性ＦＤＨ−Ｏが生成することがわかる。また、ＦＤＨ−Ｏ／ＦＤＨ−Ｎ破壊株ではＦＤＨに由来する活性が観察されなくなったが、ｐＢＲ ｆｄｏＧＨｍｓｔを導入することで、僅かに活性が観察され、宿主ベクター系による可溶型ＦＤＨ−Ｏの調製に成功したことが明らかとなった。しかし、膜貫通ドメインをコードする配列を削除したｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔを導入することで、再び活性がほとんど見られなくなった。そこで、ｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔにランダムな変異を導入する目的で、複製エラー頻度の高いポリメラーゼでＤＮＡ断片を増幅しなおし、再びｐＵｃ１９に導入して得られた多数のプラスミドを、ＦＤＨ−Ｏ／ＦＤＨ−Ｎ破壊株に導入し、それぞれ評価を行った。その結果、活性が回復した膜貫通ドメイン欠失可溶型ＦＤＨ−Ｏの調製に成功したことが確認された。高い活性が示したプラスミドｐＵｃ ｆｄｏＧＨｓｔ’の変異個所を調べた結果、２１９７位において、ｃがｔへ、２３４６位において、ｔがｃへの変異が確認できた。
【００６９】
このことから、単に膜貫通ドメインを有していないＦＤＨプラスミドを導入しただけでは、可溶型ＦＤＨを大量に発現させることができず、ＦＤＨ遺伝子プラスミドのプロモーターに特定の変異を入れ、ＦＤＨ遺伝子プラスミドの発現を適切に調節することによって、高い活性を有する可溶型ＦＤＨを大量に発現させることができることがわかる。
【００７０】
７．ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの構築とリンカーの検討
光合成反応中心蛋白質複合体における光誘起電子移動と可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼの二酸化炭素還元能（ギ酸生産能）を組み合わせた光駆動ギ酸生産を目的とし、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）をＰＳＩに組み込んだＦＤＨ−ＰＳＩ複合体を構築するため、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼのサブユニット（ｆｄｏＨ）にＰＳＩを構成するサブユニットの一つであるＰｓａＥサブユニット組み込むことを検討した。また、可溶型ギ酸デヒドロゲナーゼと光合成反応中心蛋白質複合体のサブユニットを介するリンカーを検討した。
【００７１】
ＰｓａＥサブユニット遺伝子（ssr2831）は、Synechocystis sp. PCC 6803ゲノム（Pasteur Culture Collection（PCC）から入手可能）を鋳型にしたＰＣＲによって得ることができ、これを上記と同様にｆｄｏＨ遺伝子と組み合わせ、さらにｆｄｏＨ遺伝子とＰｓａＥ遺伝子との間にアミノ酸リンカーが挿入されるように、ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨを作製し（図６左図）、上記と同様に大腸菌にて発現させた（図６右図）。
【００７２】
アミノ酸リンカーとして、
図７の８と表示されたレーンには、［配列番号１５］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン（ＧＧＳＧＧＳＧＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly）（８アミノ酸）、
図７の１０と表示されたレーンには、［配列番号１６］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン(ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly)（１０アミノ酸）
図７の１０ｓと表示されたレーンには、［配列番号１７］グリシン−セリン−セリン−グリシン−セリン−セリン−グリシン−セリン−セリン−グリシン（ＧＳＳＧＳＳＧＳＳＧ：Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly）（１０アミノ酸）、
図７の１０Ｐと表示されたレーンには、［配列番号１８］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−プロリン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン（ＧＧＳＧＧＰＧＳＧＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly）（１０アミノ酸）、
【００７３】
図７の１２と表示されたレーンには、［配列番号１９］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly）（１２アミノ酸）、
図７の１２Ｄと表示されたレーンには、［配列番号２０］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−アスパラギン酸−グリシン−セリン−グリシン−アスパラギン酸−グリシン−セリン−グリシン（ＧＧＳＧＤＧＳＧＤＧＳＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Gly-Ser-Gly-Asp-Gly-Ser-Gly）（１２アミノ酸）、
図７の１２ＤＫと表示されたレーンには［配列番号２１］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−アスパラギン酸−グリシン−セリン−グリシン−リジン−グリシン−セリン−グリシン（ＧＧＳＧＤＧＳＧＫＧＳＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Asp-Gly-Ser-Gly-Lys-Gly-Ser-Gly）（１２アミノ酸）、
【００７４】
図７の１４と表示されたレーンには、［配列番号２２］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−グリシン（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly）（１４アミノ酸），
図８のａと表示されたレーンには、［配列番号２３］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン（ＧＧＳＧＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly）（５アミノ酸）、
図８のｂと表示されたレーンには、上記配列番号１６のアミノ酸（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly）リンカーを使用、
図８のｃと表示されたレーンには、［配列番号２４］グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−セリン−グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン−セリン（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＳ：Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser）（１５アミノ酸）をそれぞれ用いた。
【００７５】
大腸菌で発現したＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨを、上記と同様に抽出し、上記と同様にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで泳動し、ギ酸分解活性を観察した。その結果、いずれのリンカーを有するＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨも活性を有し、ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの安定性が増していることが示された。特に１０アミノ酸のリンカーを有するＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨは、他に比べて、細胞内での発現が増した（図７）。
【００７６】
８．変異体の作出および該変異体の安定性
ｆｄｏＨの領域の１１１位のアラニン（Ａ）、１１４位のアラニン（Ａ）、１３４位のイソロイシン（Ｉ）、１３８位のチロシン（Ｙ）、１４１位のアラニン（Ａ）、１５０位ロイシン（Ｌ）のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換して、それぞれの変異体を作出し、評価した。その結果、特に、１１１位のアラニンをトレオニン、１１４位のアラニンをセリン、１３４位のイソロイシンをグルタミンン酸、１３８位のチロシンをセリン、１４１位のアラニンをセリン、かつ、１５０位ロイシンをグルタミン酸に置換した変異体（Ａ１１１Ｔ／Ａ１１４Ｓ／Ｉ１３４Ｅ／Ｙ１３８Ｓ／Ａ１４１Ｓ／Ｌ１５０Ｅ）、１１１位のアラニンをトレオニン、１１４位のアラニンをセリン、１３４位のイソロイシンをグルタミン酸、１３８位のチロシンをセリン、１４１位のアラニンをセリン、かつ、１５０位ロイシンをグルタミンに置換した変異体（Ａ１１１Ｔ／Ａ１１４Ｓ／Ｉ１３４Ｅ／Ｙ１３８Ｓ／Ａ１４１Ｓ／Ｌ１５０Ｑ）、ならびに、１１１位のアラニンをトレオニン、１１４位のアラニンをセリン、１３４位のイソロイシンをグルタミン、１３８位のチロシンをセリン、１４１位のアラニンをセリン、かつ、１５０位ロイシンをグルタミ酸に置換した変異体（Ａ１１１Ｔ／Ａ１１４Ｓ／Ｉ１３４Ｑ／Ｙ１３８Ｓ／Ａ１４１Ｓ／Ｌ１５０Ｅ）の各変異体の安定性が増すことが示された（図９）。なお、図９の記号は、ＦＤＨは、配列番号７および８の蛋白質、ｓｔは、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨｉｓはＨｉｓタグ、１０ｇｓは、上記配列番号１６のアミノ酸（Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）からなるリンカー、ＰｓａＥは、ＰｓａＥサブユニットをそれぞれ表す。ＦＤＨ括弧書きは、数字がＦＤＨの置換したアミノ酸の位置、数字の前のアルファベットが置換前のアミノ酸、数字の後のアルファベットが置換後のアミノ酸をそれぞれ表す。またＭＥＤはメチオニン−グルタミン酸−アスパラギン酸を表す。
【００７７】
９．タグの検討
ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨに、Ｓｔｒｅｐタグ（商品名：Strep-TagII）とＨｉｓタグ（Ｈｉｓｘ６）との比較実験を行った。ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨを発現させた大腸菌から、上記と同様に細胞破砕液を得た。さらに遠心分離処理し、その後、ニッケルキレートカラムもしくはストレプタクチンカラムを用いて、ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨを精製し、上記と同様にギ酸分解活性を観察した。蛋白質の安定性は、１〜４日間４℃放置し、その活性を調べて評価した。さらに活性の強さおよび収量は、イメージアナライザー（Image J）を使用し、バンドの濃さを定量して評価した。
その結果、Ｓｔｒｅｐタグを有するＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨは、細胞破砕液およびその上清には存在するものの、その後沈殿し、さらにはカラムを通しても、素通りしてしまうことが示された。しかし、Ｈｉｓタグの場合は、ほとんど沈殿せず、さらにカラムに吸着することが示された。すなわち、Ｓｔｒｅｐタグに特異的なストレプタクチンを用いたＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨより、ＳｔｒｅｐタグをＨｉｓタグ（Ｈｉｓｘ６）に変えたＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの方が、沈殿が少ないことから、ＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨの安定性が増していることが示され、さらにその精製の効率が１０〜２０倍良いことが示された（図１０）。
【００７８】
１０．ギ酸の生産
ＰｓａＥ破壊株（Prof. N. Nelson （Roche Institution of Molecular Biology）から入手）から、ドデシルβＤ−マルトシドで可溶化し、ＰｓａＥサブユニットの欠損したＰＳＩ蛋白質を抽出し、上記と同様に得らえたＰｓａＥ・Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨを混合し、４２０nm以下の波長をカットしたハロゲンライトを用いて光を照射した。その結果、電気伝導度検出によるイオンクロマトによってギ酸が生成したことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の可溶型Ｍｏ／Ｗ−ＦＤＨは、ＮＡＤ（Ｈ）やＮＡＤＰ（Ｈ）に依存しないで電子の授受を行うことができ、電極や光触媒などとの直接電子伝達が可能である。また、可溶型であって、大腸菌のような培養の容易な微生物により大量生産することができ、産業的に高い価値を有する。また、アミノ酸置換を容易に行うことが可能となり、新しいＭｏ／Ｗ−ＦＤＨアミノ酸置換体など有用なギ酸デヒドロゲナーゼの創製が可能である。さらに、創製されたギ酸デヒドロゲナーゼを利用することにより、化学製造によらず、光駆動にて、ギ酸を効率よく製造することができる。
【図１】
2015130855.tif 000004
【図２】
2015130855.tif 000005
【図３】
2015130855.tif 000006
【図４】
2015130855.tif 000007
【図５】
2015130855.tif 000008
【図６】
2015130855.tif 000009
【図７】
2015130855.tif 000010
【図８】
2015130855.tif 000011
【図９】
2015130855.tif 000012
【図１０】
2015130855.tif 000013
【配列表】
2015130855000001.app