(57)【要約】【課題】短時間で目的ヌクレオシド化合物を精製でき且つ量産可能なヌクレオシド化合物の製造方法の提供。【解決手段】置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いて、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物を得る、ヌクレオシド化合物の製造方法であって、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程を含むことを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いて、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物を得る、ヌクレオシド化合物の製造方法であって、
前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃを含むことを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ｃの後に、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｄを含む請求項１に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項３】
前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物を得る工程Ａを含む請求項１又は２に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項４】
前記工程Ａの後に、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｂを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項５】
前記原材料ヌクレオシド化合物の塩基、及び、前記目的ヌクレオシド化合物の前記目的塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである請求項１〜４のいずれか一項に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項６】
前記工程Ａ又は工程Ｃにおいて用いられる前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼである請求項１〜５のいずれか一項に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項７】
前記工程Ｃにおいて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と反応する前記目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である請求項１〜６のいずれか一項に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項８】
目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物と、
置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより担体との親和性が改変された担体親和性改変ヌクレオシド化合物、前記担体親和性改変塩基、前記目的塩基、及びヌクレオシドホスホリラーゼからなる群から選ばれる一種以上と、を含有し、
前記目的塩基は、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有することを特徴とする組成物。
【請求項９】
組成物中のヌクレオシド化合物、塩基、リン酸化糖、及びそれらの誘導体の総量に対して、前記目的ヌクレオシド化合物の含有率が９５ｍｏｌ％以上である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、
前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基と、を
含有することを特徴とする組成物。
【請求項１２】
前記目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヌクレオシド化合物の製造方法およびヌクレオシド化合物含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２’−デオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドは、リン酸と結合して、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡの核酸となり得る重要な構成成分であり、医薬品開発分野等においても需要の高い化合物である。しかし、ヌクレオシドの化学的な合成は非常に効率が悪いため、これらの分子を工業的に得ようとした場合、一般的に、サケなどの卵巣からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、これを分解、精製してヌクレオシドを得ていた。
この方法では、天然のＤＮＡおよびＲＮＡに含まれる各種ヌクレオシドの全てを含む混合物が必要不必要によらず得られ、例えば２’−デオキシリボヌクレオシド由来の場合は、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノジン（ｄＧ）、デオキシシチジン（ｄＣ）およびチミジン（ｄＴ）が、リボヌクレオシド由来の場合は、アデノシン（Ａ）、グアノジン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）およびウリジン（Ｕ）が含まれる混合物が得られる。しかしながら、その誘導体が抗がん剤、抗ＨＩＶ剤に用いられるウリジンのように、特定のヌクレオシド化合物のみが選択的に又は高い割合で得られる方法の開発も求められていた。
従来、ヌクレオシド化合物を合成する方法として、イノシン又はデオキシイノシン（原料ヌクレオシド化合物）と、ピリミジン塩基又はプリン塩基とを、リン酸若しくはリン酸塩存在下の水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによって塩基交換反応させる方法が開示されていた（特許文献１）。また、ピリミジンヌクレオシド化合物（原料ヌクレオシド化合物）と、プリン塩基とを、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いて交換反応させるプリンヌクレオシド化合物の製造方法も開発されていた（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−１９７１９３号公報
【特許文献２】特開平１１−４６７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ホスホリラーゼの反応は可逆的であり、ホスホリラーゼを用いた製造方法で得られるのは、出発材料である原材料ヌクレオシド化合物と目的物のヌクレオシドである目的ヌクレオシド化合物の混合物である。これは上記のヌクレオシド化合物の製造方法においても同様であり、特許文献１および２では原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離については何ら検討されていない。
また、目的ヌクレオシド化合物の取得のために、目的ヌクレオシド化合物以外のヌクレオシドを各種デヒドロゲナーゼにより分解した場合にも、分解によって生産された塩基等の副生成物が生じるので、やはり副生成物と目的ヌクレオシド化合物との分離が課題となる。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いれば、目的ヌクレオシド化合物の分離が可能ではあるが、分取には長い時間を要し、また得られる量も微量であるため、目的ヌクレオシドの量産化には不適である。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、短時間で目的ヌクレオシド化合物を精製でき且つ量産可能なヌクレオシド化合物の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、目的ヌクレオシド化合物が備えた目的塩基と担体親和性の異なるよう改変された担体親和性改変塩基を備えた担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用い、塩基交換反応によって目的ヌクレオシド化合物を製造することで、当該反応系から目的ヌクレオシド化合物を短時間で且つ大量に精製可能となることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】
（１）置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いて、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物を得る、ヌクレオシド化合物の製造方法であって、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃを含むことを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
（２）前記工程Ｃの後に、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｄを含む前記（１）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（３）前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物を得る工程Ａを含む前記（１）又は（２）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（４）前記工程Ａの後に、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｂを含む前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（５）前記原材料ヌクレオシド化合物の塩基、及び、前記目的ヌクレオシド化合物の前記目的塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（６）前記工程Ａ又は工程Ｃにおいて用いられる前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼである前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（７）前記工程Ｃにおいて、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と反応する前記目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（８）目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物と、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより担体との親和性が改変された担体親和性改変ヌクレオシド化合物、前記担体親和性改変塩基、前記目的塩基、及びヌクレオシドホスホリラーゼからなる群から選ばれる一種以上と、を含有し、前記目的塩基は、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有することを特徴とする組成物。
（９）組成物中のヌクレオシド化合物、塩基、リン酸化糖、及びそれらの誘導体の総量に対して、前記目的ヌクレオシド化合物の含有率が９５ｍｏｌ％以上である前記（８）に記載の組成物。
（１０）前記目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である前記（８）又は（９）に記載の組成物。
（１１）置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基と、を含有することを特徴とする組成物。
（１２）前記目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基である前記（１１）に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法によれば、目的ヌクレオシド化合物を短時間で精製でき、且つ目的ヌクレオシド化合物を量産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】工程Ｃおよび工程Ｄの反応の概要を模式的に示した図である。
【図２】工程Ｄの反応の概要を模式的に示した図である。
【図３】工程Ａおよび工程Ｂの反応の概要を模式的に示した図である。
【図４】工程Ｂの反応の概要を模式的に示した図である。
【図５】１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図６】１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図７】１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図８】１５Ｎ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
《ヌクレオシド化合物の製造方法》
【００１１】
本発明における「ヌクレオシド化合物」とはヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得る化合物であれば特に制限されず、ＤＮＡ、又はＲＮＡ等の天然核酸の構成要素であるリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドの他、人工核酸の構成要素、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の人工的に合成される人工核酸類似化合物の構成要素を挙げることができる。
具体的なリボヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、５−メチルウリジン、イノシン、５−フルオロウリジン、などが挙げられ、デオキシリボヌクレオシドとしては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、５’ −デオキシウリジン、アジドチミジンなどが挙げられる。
【００１２】
前記ヌクレオシド化合物の塩基は、ヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得る範囲において、−Ｆ、−Ｃｌ等のハロゲノ基、メチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、アルケン、アルキン等の長鎖置換基で修飾されていてもよく、具体的には、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−エチニルウラシル、５−ビニルウラシル、５−ヘキサ−５−エン−ウラシル等の塩基であってもよい。
【００１３】
本発明においてヌクレオシドホスホリラーゼとは、ヌクレオシドのリン酸加水分解を触媒する酵素を指す。具体的なヌクレオシドホスホリラーゼとしては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ピリミジントランスフェラーゼなどを挙げることができる。以下では、ヌクレオシドホスホリラーゼを例に挙げて説明する。
【００１４】
ヌクレオシドホスホリラーゼによるリボヌクレオシドのリン酸加水分解の反応は、例えば以下のように表される。
【００１５】
【化１】
2015159772.tif 000002
【００１６】
上記の反応は可逆的であるので、
【００１７】
【化２】
2015159772.tif 000003
【００１８】
の反応も同時に起こる。したがって、「塩基交換反応」では、リン酸加水分解によって生成した塩基が、再度リボース−１−リン酸とともにリボヌクレオシドを形成する反応において、反応系に二種以上の塩基が存在するとき、反応前とは異なる種類の塩基がリボース−１−リン酸塩基と反応し塩基が交換され得る。
【００１９】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いて、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物を得る、ヌクレオシド化合物の製造方法であって、
前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記目的塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃを含む。
【００２０】
上記の反応１および反応２を、目的ヌクレオシド化合物を得る工程Ｃに当てはめると、以下のように表される。
【００２１】
【化３】
2015159772.tif 000004
【００２２】
反応１−２〜反応２−２までをまとめると、以下のように表すことができる。
【化４】
2015159772.tif 000005
【００２３】
工程Ｃの反応の概要を、図１において模式的に示して説明する。図１には、後述の工程Ｄも併せて示してある。
図１中の工程Ｃでは、置換基１３を有する担体親和性改変塩基２１と糖部分１２とを備えた担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０と目的塩基３１とをヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的塩基３１と糖部分１２とを備えた目的ヌクレオシド化合物３０を得る工程を示している。
【００２４】
ここで、本発明における担体親和性の対象となる「担体」とは、ヌクレオシド化合物と直接的又は間接的に結合し得るものであれば特に制限されず、好ましくは、結合後にそれらの塩基及びヌクレオシド化合物を再び分離（溶離）させ得る物である。そのようなより好ましい担体として、担体が有する官能基との反応を介して当該化合物と結合し得る、イオン交換性樹脂、キレート樹脂、アフィニティー樹脂を挙げることができる。
【００２５】
「担体親和性改変」とは、所望のヌクレオシド又は所望の塩基と、反応系に存在する所望のヌクレオシド以外又は所望の塩基以外の化合物との間で、担体に対する親和性が本来は差別可能でなかった又は差別が容易ではなかったところ、差別可能又は差別が容易なようにヌクレオシド化合物又は塩基の担体親和性が改変されることを云う。
上記のヌクレオシドホスホリラーゼによる塩基交換反応を、工程Ｃにおける反応を例にすると、上記反応は可逆的であるため、反応系には、上記反応１−２の出発物質の担体親和性ヌクレオシド化合物と、上記反応２−２で生成された目的ヌクレオシド化合物とが混在している。したがって、前記工程Ｃにおける担体親和性改変は、工程Ｃにおける所望のヌクレオシド化合物である目的ヌクレオシド化合物が有する目的塩基と、目的ヌクレオシド化合物以外のヌクレオシド化合物の塩基との間で差別可能となるように改変されることが好ましい。
担体親和性が改変された「担体親和性改変塩基」を有するヌクレオシドは、同様に担体親和性が改変されるため、「担体親和性改変ヌクレオシド」となる。
改変としては、所望のヌクレオシド化合物は担体に結合するが、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は担体に結合しないよう改変される場合が挙げられ、逆の場合としては、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は担体に結合するが、所望のヌクレオシドは担体に結合しないよう改変される場合が挙げられる。さらに別の態様としては、担体に対しての結合においては差別可能ではないが、担体からの溶離（分離）に際し差別可能であってもよい。
【００２６】
このように、上記反応系には、反応１−２の出発物質のヌクレオシド化合物と反応２−２で生成された目的ヌクレオシド化合物とが混在しているが、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、反応１−２の出発物質に担体親和性改変ヌクレオシド化合物を用いるので、担体への結合を利用して、反応２−２で生成された目的ヌクレオシド化合物と出発物質の担体親和性改変ヌクレオシド化合物とを容易に分離がすることが可能となる。
【００２７】
したがって、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記目的ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｄを含んでいても良い。
【００２８】
工程Ｄの反応の概要を、図２において模式的に示して説明する。
工程Ｃで得られた組成物中には、目的ヌクレオシド化合物３０の他、塩基交換反応により生成された副生成物の担体親和性改変塩基２１も含まれている。さらには、該組成物中には未反応の目的塩基３１及び未反応の担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０が含まれている。未反応の担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０は担体親和性改変塩基２１を備えたことにより、目的ヌクレオシド化合物３０と担体親和性が異なる。図２は、工程Ｄにおける担体とヌクレオシド化合物の結合を模式的に示したものである。図２（ａ）に示すように、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を担体に結合させることによって、工程Ｃで得られた組成物中から担体との親和性の低い目的ヌクレオシド化合物３０を分離させ、目的ヌクレオシド化合物を得てもよい。担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０が分離された後の水溶液には、目的ヌクレオシド化合物３０以外に、担体親和性改変塩基２１及び目的塩基３１が含まれるが、これらは互いに担体親和性が異なっているため、目的ヌクレオシド化合物３０を容易に精製することが可能である。又は、図２（ｂ）に示すように、目的ヌクレオシド化合物３０を担体に結合させることによって、工程Ｃで得られた組成物中から、担体との親和性の高い目的ヌクレオシド化合物３０を分離（精製）させてもよい。担体親和性改変の手段としては、ヌクレオシドの塩基部分に官能基を付加（置換）し、置換基１３を有する塩基とすることで、担体親和性改変塩基とする方法が好ましい。
【００２９】
前記置換基は、該置換基が付加されたことによって、ヌクレオシドホスホリラーゼによる反応が阻害されることのない官能基であれば特に制限されず、親和性の差別が可能となるよう種々のものを選択することができる。
【００３０】
担体としてイオン交換樹脂を用いる場合、担体親和性の改変により親和性の差異を与える置換基としては、種々の極性基を例示できる。極性基が付加されたことによる親和性（イオン性）の改変の結果に応じて、分離に適したイオン交換樹脂を選択すればよい。
担体親和性改変ヌクレオシド化合物がイオン交換樹脂に結合するようにイオン性を改変させる場合を例に挙げると、担体親和性改変ヌクレオシド化合物が分離に適した条件下で陽イオン性となる場合、イオン交換樹脂として、公知の強酸性陽イオン交換樹脂又は弱酸性陽イオン交換樹脂を担体として用いればよい。またそれとは逆に、担体親和性改変ヌクレオシド化合物が分離に適した条件下で陰イオン性となる場合、公知の強塩基性陰イオン交換樹脂または弱塩基性陰イオン交換樹脂を担体として用いればよい。
【００３１】
このように、ヌクレオシド化合物を陽イオン性へと改変し得る極性基としては、アミノ基（‐ＮＨ２、並びにメチルアミン又はジメチルアミンから１個の水素原子を除去した官能基）、ピリジン基等の官能基を挙げることができる。同様に、ヌクレオシド化合物を陰イオン性へと改変し得る極性基としては、カルボキシル基、スルホン酸基等の官能基を挙げることができる。
【００３２】
担体としてキレート樹脂を用いる場合、キレート樹脂の有するキレート形成基と結合する、担体親和性改変によって担体への親和性の結合の差異となる置換基としては、イミノジ酢酸、イミノジプロピオン酸等の有機酸から１個の水素原子を除いた基、ポリアミンから１個の水素原子を除いた基、グルカミン基等を付加することが挙げられる。
【００３３】
担体親和性を改変されるヌクレオシドの種類としては特に制限されないが、例えば、担体親和性を改変されるヌクレオシドとしてウリジンを用いる場合、ウラシルのピリミジン環の５位又は６位の水素原子を前記極性基で置換することが挙げられる。具体的な極性基としては、上記のとおり、アミノ基、ピリジン基、カルボキシル基、スルホン酸基、イミノジ酢酸、イミノジプロピオン酸等の有機酸から１個の水素原子を除いた基、ポリアミンから１個の水素原子を除いた基、グルカミン基等を選択することができ、より具体的な態様としてアミノ基の場合を例示すると、ウラシルのピリミジン環の５位又は６位の水素原子をアミノ基に置換し、５−アミノウラシル又は、６−アミノウラシルとすることができる。この場合、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は、ｄＵ−５−ＮＨ２又はｄＵ−６−ＮＨ２である。
【００３４】
また、担体親和性を改変されるヌクレオシドとしてチミジンを用いる場合、チミンのピリミジン環の６位の水素原子を前記官能基で置換することが挙げられる。具体的な官能基としては、上記のとおり、アミノ基、ピリジン基、カルボキシル基、スルホン酸基、イミノジ酢酸、イミノジプロピオン酸等の有機酸から１個の水素原子を除いた基、ポリアミンから１個の水素原子を除いた基、グルカミン基等を選択することができ、より具体的な態様としてアミノ基の場合を例示すると、チミジンのピリミジン環の６位の水素原子をアミノ基に置換し、６−アミノチミンとすることができる。この場合、担体親和性改変ヌクレオシド化合物は、ｄＴ−６ＮＨ２である。
【００３５】
前記イオン交換樹脂、キレート樹脂等の樹脂からの溶離液は、用いる樹脂と結合する官能基の種類に応じて一般的に用いられている各種溶離液を用いることができ、溶離液の種類、濃度等を適宜選択することが可能であり、好ましい溶離液として、酢酸、ギ酸、アンモニア水、希塩酸などが挙げられる。
【００３６】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法が含む、目的ヌクレオシド化合物を得る反応工程Ｃを、上述したように、担体親和性を改変されるヌクレオシドとしてウリジンを用い、ウラシルのピリミジン環の５位又をアミノ基に置換し、５−アミノウラシルとし、目的ヌクレオシド化合物をチミジンとした場合、反応工程Ｃは以下のように表される。
【００３７】
【化５】
2015159772.tif 000006
【００３８】
上記反応系には、目的ヌクレオシド化合物であるチミジンの他に、ｄＵ−５−ＮＨ２、５−アミノウラシルといった目的物以外のヌクレオシド及び塩基が含まれることとなるが、ｄＵ−５−ＮＨ２及び５−アミノウラシルはチミジンと比較して陽イオン交換樹脂に対する親和性が高められており、チミジンが陽イオン交換樹脂に結合しない条件で、ｄＵ−５−ＮＨ２及び５−アミノウラシルが陽イオン交換樹脂に結合するため、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、容易に目的ヌクレオシドであるチミジンと目的物以外のヌクレオシド及び塩基を分離可能である。なお、ヌクレオシドと塩基では担体親和性、例えば水に対する溶解性が異なり、水で溶離を行う場合、先に析出される塩基をろ過することで、塩基とヌクレオシドとの分離も容易である。
【００３９】
このように担体を用いてのヌクレオシド化合物又は塩基の精製は、担体へ結合又は溶離の有無で精製することが可能であるので、精製量を容易に増加させることができ、短時間で大量の目的ヌクレオシドを精製できる。
【００４０】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、担体親和性改変塩基の置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を得る工程Ａを工程Ｃの前に含んでいてもよい。
担体親和性改変ヌクレオシド化合物も、目的ヌクレオシドの場合と同様に、塩基交換反応によって得ることができる。
【００４１】
【化６】
2015159772.tif 000007
【００４２】
ここで、工程Ａにおける「担体親和性改変」ヌクレオシド化合物は、反応１−１の出発物質の原材料ヌクレオシド化合物との間で、担体に対する親和性が差別可能なように担体親和性が改変されていることが好ましい。親和性が差別可能であることにより、反応２−１における生成物である担体親和性改変ヌクレオシド化合物を精製して取得することがより容易となる。原材料ヌクレオシド化合物は、担体親和性改変塩基の置換基とは異なる側鎖を有する塩基を備えているため、担体親和性改変ヌクレオシド化合物との、担体に対する親和性が差別可能である。
【００４３】
工程Ａの反応の概要を、図３において模式的に示して説明する。図３には、後述の工程Ｂも併せて示してある。
図３中の工程Ａでは、担体親和性改変塩基２１の置換基１３とは異なる側鎖を有する塩基１１と糖部分１２とを備え、原材料として用いられる、原材料ヌクレオシド化合物１０と、前記担体親和性改変塩基２１とをヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、担体親和性改変塩基２１と糖部分１２とを備えた担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を得る工程を示している。
【００４４】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、前記担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を担体に結合させて該担体親和性改変ヌクレオシド化合物又は前記原材料ヌクレオシド化合物を前記水溶液中から分離させる工程Ｂを含んでいてもよい。
【００４５】
工程Ｂの反応の概要を、図４において模式的に示して説明する。
工程Ａで得られた組成物中には、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０の他、塩基交換反応により生成された副生成物の塩基１１も含まれている。さらには、該組成物中には未反応の担体親和性改変塩基２１及び未反応の原材料ヌクレオシド化合物１０が含まれている。担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０は担体親和性改変塩基２１を備えたことにより、原材料ヌクレオシド化合物１０と担体親和性が異なる。図４は工程Ｄにおける担体とヌクレオシド化合物の結合を模式的に示したものである。図４（ａ）に示すように、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を担体に結合させることによって、工程Ａで得られた組成物中から担体との親和性の低い原材料ヌクレオシド化合物１０を分離させ、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を精製させてもよい。又は、図４（ｂ）に示すように、原材料ヌクレオシド化合物１０を担体に結合させることによって、工程Ａで得られた組成物中から担体との親和性の高い原材料ヌクレオシド化合物１０を分離させてもよい。原材料ヌクレオシド化合物１０が分離された後の水溶液には、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０以外に、担体親和性改変塩基２１及び塩基１１が含まれるが、これらは互いに担体親和性が異なっているため、担体親和性改変ヌクレオシド化合物２０を容易に精製することが可能である。
【００４６】
反応１−１〜反応２−２までをまとめると、以下のように表すことができる。
【００４７】
【化７】
2015159772.tif 000008
【００４８】
原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基と目的ヌクレオシド化合物が有する目的塩基との間で、担体に対する親和性が本来は差別可能ではないとき、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離（精製）は大変困難であった。例えば、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基及び目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、ウラシル及びチミンとの間では、イオン交換樹脂に対する親和性が少なく、差別が困難であるため、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離（精製）が特に困難であった。しかし、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法では、担体親和性ヌクレオシド化合物を介して目的ヌクレオシド化合物を製造するので、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を反応系から分離させることで、目的ヌクレオシド化合物の精製を大変容易に行うことが可能である。
【００４９】
また、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基、担体親和性改変ヌクレオシド化合物が有する塩基又は目的ヌクレオシド化合物の塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、用いる前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼとすることができる。チミジンホスホリラーゼは、チミジンの他にウリジンに対しても基質として認識可能であるため、チミジンホスホリラーゼによって反応を行うことが可能である。特に、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基、担体親和性改塩基及び目的塩基の全ての塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、チミジンホスホリラーゼのみで反応を行うことが可能である。
【００５０】
また、原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基と目的ヌクレオシド化合物の塩基との間で、担体に対する親和性が本来は差別可能ではない別の場合として、当該両塩基が同種の塩基である場合がある。この場合も、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の分離（精製）は大変困難であった。
当該両塩基が同じ種類の塩基である場合としては、例えば、目的ヌクレオシド化合物の目的塩基が同位体標識された塩基であって、さらに原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基と同じ種類の塩基である場合が挙げられる。ここで、同位体標識とは、安定同位体標識又は放射性同位体標識の両方を指す。このように、原材料ヌクレオシド化合物を安定同位体標識又は放射性同位体標識する場合に、担体親和性ヌクレオシド化合物を介して目的物である安定同位体標識又は放射性同位体標識されたヌクレオシド化合物を製造することにより、担体親和性改変ヌクレオシド化合物を反応系から分離させることで、安定同位体標識又は放射性同位体標識されたヌクレオシドのみを容易に得ることが可能となる。前記安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏを挙げることができる。放射性同位体標識としては、一例として、３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓを挙げることができる。
【００５１】
反応工程におけるヌクレオシドホスホリラーゼの反応条件は、酵素の性質や塩基およびヌクレオシドに合わせて適切な条件を適宜選択すればよい。好ましい反応条件としては、反応液中の塩基およびヌクレオシドの濃度は１〜１００ｍＭが好ましく、ヌクレオシドは２０〜５０ｍＭがより好ましく、塩基は５〜５０ｍＭがさらに好ましい。反応液中のリン酸濃度は１〜１０００ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましい。反応開始時のヌクレオシドに対する塩基のモル比は、目的のヌクレオシドに応じて適宜設定すればよく、例えば0.1〜1倍とすることができる。特に塩基が安定同位体標識された塩基の場合、当該標識塩基が高価であり塩基収率を高める必要があるため、塩基のモル比を０．１〜０．２倍とすることが好ましい。反応液中のヌクレオシド量及び塩基量に対するリン酸のモル比は０．０１〜２５倍が好ましく、０．０１〜５倍がより好ましく、０．０２〜０．０３倍がさらに好ましい。ヌクレオシドホスホリラーゼの使用量は、反応液量に対して０．１〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍＬを用いることが例示できる。
【００５２】
反応液の温度は使用するホスホリラーゼの反応温度に合わせて定めればよいが、１０〜１００℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましく、３７℃がさらに好ましい。反応液のｐＨはｐＨ６〜９の範囲が好ましく、ｐＨ６．５〜７．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．８〜７．２の範囲で行うことがより好ましい。反応時間についても、使用する材料（酵素の量、基質の量など）に合わせて適切な反応時間を適宜定めればよいが、０．５〜４８時間が好ましく、１〜１２時間がより好ましい。
【００５３】
≪組成物≫
［第一実施形態］
本発明の第一実施形態の組成物は、目的塩基を備えた目的ヌクレオシド化合物と、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより担体との親和性が改変された担体親和性改変ヌクレオシド化合物、前記担体親和性改変塩基、前記目的塩基、及びヌクレオシドホスホリラーゼからなる群から選ばれる一種以上と、を含有し、前記目的塩基は、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有するものである。
ここで、目的塩基、目的ヌクレオシド化合物、担体親和性改変塩基、担体親和性改変ヌクレオシド化合物、又はクレオシドホスホリラーゼについては、上記≪ヌクレオシド化合物の製造方法≫において説明したものである。本発明の第一実施形態の組成物は、一例として、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法により取得することが可能である。
【００５４】
例えば、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法を用いて取得された当該組成物には、下記に挙げたような高純度で目的ヌクレオシド化合物を含む組成物を得ることができる。本発明の第一の実施形態の組成物は、一例として、組成物中のヌクレオシド化合物、塩基、リン酸化糖、及びそれらの誘導体の総量に対して、前記目的ヌクレオシド化合物の含有率が９５ｍｏｌ％以上、９７ｍｏｌ％以上、又は９９ｍｏｌ％以上とすることができる。
【００５５】
また、本発明の第一の実施形態の組成物は、前記目的塩基が、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基であることが好ましい。
【００５６】
［第二実施形態］
本発明の第二実施形態の組成物は、置換基を有する塩基である担体親和性改変塩基を備えたことにより、担体との親和性が改変された、担体親和性改変ヌクレオシド化合物と、前記担体親和性改変塩基の前記置換基とは異なる側鎖を有する目的塩基と、を含有することを特徴とするものである。当該組成物は、先に記載した本発明のヌクレオシド化合物の製造方法に好適に用いられる。
また、本発明の第二実施形態の組成物は、前記目的塩基が安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基であることが好ましい。
【実施例】
【００５７】
以下に共通の測定条件であるＨＰＬＣの測定条件を記載する。
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
使用カラム：ＯＤＳ−３、（ＧＬサイエンス社製）
カラムサイズ：φ４．６×Ｌ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：８０％メタノール
検出波長：２６５ｎｍ
【００５８】
＜反応工程Ａ：担体親和性改変ヌクレオシド化合物の製造＞
１．５ｍＬチューブ中に、リン酸緩衝液５０μＬ（ｐＨ６．８、リン酸濃度は表１参照）、原材料ヌクレオシド化合物５０ｍＭ（各Ｓｉｇｍａ社製）、担体親和性改変塩基（５-アミノウラシル、Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ、ヌクレオシドホスホリラーゼ（チミジンホスホリラーゼ、Ｓｉｇｍａ社製）１Ｕの混合液を得た。この混合液を、温水浴中３７℃で２４時間反応させた後、反応後の混合液の少量を取り分けてＨＰＬＣで測定し、担体親和性改変ヌクレオシド化合物の生成量を確認した。
表１に、反応に用いた化合物、リン酸濃度条件、および原材料ヌクレオシド化合物に対する担体親和性改変ヌクレオシド化合物の生成量（モル％）を示す。
【００５９】
【表１】
2015159772.tif 000009
【００６０】
ＨＰＬＣの測定結果から、ｄＵ−５−ＮＨ２又はＵ−５−ＮＨ２を高収率および高収量で短時間に得られたことが確認できた。
【００６１】
＜精製工程Ｂ：担体親和性改変ヌクレオシド化合物の精製＞
上記の反応工程Ａで得た反応後の混合液を、陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ８、ダウ・ケミカル社製）が充填された１０ｍＬガラスカラムに流し、次いで、純水を流してカラムを洗浄した。この洗浄後の純水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、未反応の原材料ヌクレオシド化合物（ｄＴ、ｄＵ、Ｔ、Ｕ）及び副生成物塩基（チミン、ウラシル）が検出された。さらに十分に純水を流してカラムを洗浄した後、２％アンモニア水を流し、担体親和性改変塩基および担体親和性改変ヌクレオシド化合物を溶離させた。この溶離に用いたアンモニア水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、未反応の担体親和性改変塩基（５−アミノウラシル）および担体親和性改変ヌクレオシド化合物（ｄＵ−５−ＮＨ２、Ｕ−５−ＮＨ２）が検出された。前記アンモニア水の分画をエバポレーターで濃縮したところ、白色固体を得た。１Ｈ−ＮＭＲで分析した。
その結果、Ｕ−５−ＮＨ２については図５に示す結果が得られた。1H-NMR(Deuterium oxide, 400 MHz): d ppm = 7.131-7.924 (1H, s, 5-CH), 6.120 (1H, t, J = 6.8 Hz, 1’-CH), 4.305-4.269 (1H, m, 3’-CH), 3.861-3.830 (1H, m, 4’-CH), 3.687-3.566 (2H, m, 5’-CH2), 2.189-2.160 (2H, m, 2’-CH2)。
ｄＵ−５−ＮＨ２については図６に示す結果が得られた。1H-NMR(Deuterium oxide, 400 MHz): d ppm = 7.157 (1H, s, 5-CH), 5.190-5.778 (1H, m, 1’-CH), 4.162 (2H, t, J = 5.2 Hz, 2’-CH), 4.062 (1H, t, J = 4.8 Hz, 3’-CH), 3.960-3.930 (1H, Q, 4’-CH), 3.747-3.614 (2H, m, 5’-CH2)。
これらの結果から、得られた白色固体は、Ｕ−５−ＮＨ２、ｄＵ−５−ＮＨ２であることがそれぞれ確認された。ＮＭＲの解析結果では、Ｕ−５−ＮＨ２またはｄＵ−５−ＮＨ２の担体親和性改変ヌクレオシド化合物以外のシグナルがほぼ検出されなかったことから、当該白色固体中およそ９９％以上の高純度で担体親和性改変ヌクレオシド化合物が得られたことが確認できた。
【００６２】
＜反応工程Ｃ：目的ヌクレオシド化合物の製造＞
１．５ｍＬチューブ中に、リン酸緩衝液５０μＬ（ｐＨ６．８、リン酸濃度は表２参照）、上記の生成工程Ｂで得られたｄＵ−５−ＮＨ２５０ｍＭ、目的ヌクレオシド化合物の目的塩基（表２参照、各Ｓｉｇｍａ社製）５０ｍＭ、ヌクレオシドホスホリラーゼ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）又はチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ））、各酵素の添加量は表２参照、Ｓｉｇｍａ社製）の混合液を得た。この混合液を、３７℃の温水浴中で２４時間反応させた後、反応後の混合液の少量を取り分けてＨＰＬＣで分析し、目的ヌクレオシド化合物の生成量を確認した。実施例１３では、３７℃で２時間反応させた。
表２に反応に用いた化合物、リン酸濃度条件、ヌクレオシドホスホリラーゼ、担体親和性改変ヌクレオシド化合物に対する目的ヌクレオシド化合物の生成量（モル％）を示す。なお、目的ヌクレオシド化合物の目的塩基がプリン塩基の場合、ＰＮＰとＴＰの両方のヌクレオシドホスホリラーゼを前記混合液に添加した。
【００６３】
【表２】
2015159772.tif 000010
【００６４】
例として、実施例１３で用いたｄＵ−５−ＮＨ２、及び実施例１３で得られたデオキシウラシル−１，３−１５Ｎ２の合成を以下に示す。
【００６５】
【化８】
2015159772.tif 000011
【００６６】
ＨＰＬＣ分析の結果から、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＵ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ及びデオキシウラシル−１，３−１５Ｎ２を高収率および高収量で短時間に得られたことが確認できた。
【００６７】
＜精製工程Ｄ：目的ヌクレオシド化合物の精製＞
上記の反応工程Ｃで得た反応後の混合液を、陽イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ５０ＷＸ８、ダウ・ケミカル社製）が充填された１０ｍＬガラスカラムに流し、次いで、純水を流してカラムを洗浄した。この洗浄後の純水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、目的ヌクレオシド化合物（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＵ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｕ）及び未反応の目的ヌクレオシド化合物の目的塩基（アデニン、チミン、グアニン、ウラシル）が検出された。さらに十分に純水を流してカラムを洗浄した後、２％アンモニア水を流し、担体親和性改変塩基および担体親和性改変ヌクレオシド化合物を溶離させた。この溶離に用いたアンモニア水の分画を、ＨＰＬＣを用いて分析したところ、担体親和性改変塩基（５−アミノウラシル）および担体親和性改変ヌクレオシド化合物（ｄＵ−５−ＮＨ２）が検出された。前記純水の分画をエバポレーターで濃縮したところ、白色固体を得た。実施例１３で得られた白色固体について１Ｈ−ＮＭＲで分析したところ、図７に示す結果が得られた。1H-NMR(Metahnol-D4, 400 MHz): d ppm = 7.99-7.97 (1H, m, 5-CH), 6.27 (1H, t, J = 6.4 Hz, 1’-CH), 5.70-5.69 (1H, m, 6-CH), 4.39-4.38 (1H, m, 3’-CH), 3.86-3.83 (1H, m, 4’-CH), 3.77-3.72 (2H, m, 5’-CH2), 2.27-2.2 (2H, m, 2’-CH2)。また、実施例１３で得られた白色固体について１５Ｎ−ＮＭＲで分析したところ、図８に示す結果が得られた。15N-NMR（Methanol-D4, 400 MHz）；δppm=143,896, 143.829 (2N, s, 1,3-N)。15N-NMRスペクトルから、１，３位のＮに帰属されるシグナルが２本観測され、２か所１５Ｎ標識されていることが確認できた。
以上の結果から、実施例１３で得られた白色固体はｄＵ−１，３−１５Ｎ２であることが確認された。ＮＭＲの解析結果では、ｄＵ−１，３−１５Ｎ２以外のシグナルがほぼ検出されなかったことから、当該白色固体中およそ９９％以上の高純度で目的ヌクレオシド化合物が得られたことが確認できた。
【００６８】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、所望のヌクレオシド化合物を短時間で、高純度で製造可能であるため、化学あるいは医学等の分野におけるヌクレオシド化合物の製造に有用である。本発明の組成物は、ヌクレオシド化合物の製造に用いられるほか、それ自体を試薬として、又は医薬品原材料として使用できる。
【符号の説明】
【００７０】
１０・・・原材料ヌクレオシド化合物、２０・・・担体親和性改変ヌクレオシド化合物、３０・・・目的ヌクレオシド化合物、１１・・・原材料ヌクレオシド化合物の塩基、２１・・・担体親和性改変塩基、３１・・・目的塩基、１２・・・糖部分、１３・・・置換基、１４・・・担体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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