(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトを含む哺乳動物における血管新生及び／又は心臓血管形成の促進又は阻害するための組成物及び方法の提供。【解決手段】特定のヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子、及び該核酸配列を含むベクター並びに宿主細胞、又は特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドと製造方法、更には該ポリペプチドを含むキメラポリペプチド分子又は該ポリペプチドに結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号：280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372)及びFig 374 (配列番号：374)中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項２】
Fig 1 (配列番号：1), Fig 3 (配列番号：3), Fig 5 (配列番号：5), Fig 7 (配列番号：7), Fig 9 (配列番号：9), Fig 11 (配列番号：11), Fig 13 (配列番号：13), Fig 15 (配列番号：15), Fig 17 (配列番号：17), Fig 19 (配列番号：19), Fig 21 (配列番号：21), Fig 23 (配列番号：23), Fig 25 (配列番号：25), Fig 27 (配列番号：27), Fig 29 (配列番号：29), Fig 31 (配列番号：31), Fig 33 (配列番号：33), Fig 35 (配列番号：35), Fig 37 (配列番号：37), Fig 39 (配列番号：39), Fig 41 (配列番号：41), Fig 43 (配列番号：43), Fig 45 (配列番号：45), Fig 47 (配列番号：47), Fig 49 (配列番号：49), Fig 51 (配列番号：51), Fig 53 (配列番号：53), Fig 55 (配列番号：55), Fig 57 (配列番号：57), Fig 59 (配列番号：59), Fig 61 (配列番号：61), Fig 63 (配列番号：63), Fig 65 (配列番号：65), Fig 67 (配列番号：67), Fig 69 (配列番号：69), Fig 71 (配列番号：71), Fig 73 (配列番号：73), Figs 75A-75B (配列番号：75), Fig 77 (配列番号：77), Fig 79 (配列番号：79),  Fig 81 (配列番号：81), Fig 83 (配列番号：83), Fig 85 (配列番号：85), Fig 87 (配列番号：87), Fig 89 (配列番号：89), Fig 91 (配列番号：91), Fig 93 (配列番号：93), Fig 95 (配列番号：95), Fig 97 (配列番号：97), Fig 99 (配列番号：99), Fig 101 (配列番号：101), Fig 103 (配列番号：103), Fig 105 (配列番号：105), Fig 107 (配列番号：107), Fig 109 (配列番号：109), Fig 111 (配列番号：111), Fig 113 (配列番号：113), Fig 115 (配列番号：115), Fig 117 (配列番号：117), Fig 119 (配列番号：119), Fig 121 (配列番号：121), Fig 123 (配列番号：123), Fig 125 (配列番号：125), Fig 127 (配列番号：127), Fig 129 (配列番号：129), Fig 131 (配列番号：131), Fig 133 (配列番号：133), Fig 135 (配列番号：135), Fig 137 (配列番号：137), Fig 139 (配列番号：139), Fig 141 (配列番号：141), Fig 143 (配列番号：143), Fig 145 (配列番号：145), Fig 147 (配列番号：147), Fig 149 (配列番号：149), Fig 151 (配列番号：151), Fig 153 (配列番号：153), Fig 155 (配列番号：155), Fig 157 (配列番号：157), Fig 159 (配列番号：159), Fig 161 (配列番号：161), Fig 163 (配列番号：163), Fig 165 (配列番号：165), Fig 167 (配列番号：167), Fig 169 (配列番号：169), Fig 171 (配列番号：171), Fig 173 (配列番号：173), Fig 175 (配列番号：175), Fig 177 (配列番号：177), Fig 179 (配列番号：179),  Fig 181 (配列番号：181), Fig 183 (配列番号：183), Fig 185 (配列番号：185), Fig 187 (配列番号：187), Fig 189 (配列番号：189), Fig 191 (配列番号：191), Fig 193 (配列番号：193), Fig 195 (配列番号：195), Fig 197 (配列番号：197), Fig 199 (配列番号：199), Fig 201 (配列番号：201), Fig 203 (配列番号：203), Fig 205 (配列番号：205), Fig 207 (配列番号：207), Fig 209 (配列番号：209), Fig 211 (配列番号：211), Fig 213 (配列番号：213), Fig 215 (配列番号：215), Fig 217 (配列番号：217), Fig 219 (配列番号：219), Fig 221 (配列番号：221), Fig 223 (配列番号：223), Fig 225 (配列番号：225), Fig 227 (配列番号：227), Fig 229 (配列番号：229), Fig 231 (配列番号：231), Fig 233 (配列番号：233), Fig 235 (配列番号：235), Fig 237 (配列番号：237), Fig 239 (配列番号：239), Fig 241 (配列番号：241), Fig 243 (配列番号：243), Fig 245 (配列番号：245), Fig 247 (配列番号：247), Fig 249 (配列番号：249), Fig 251 (配列番号：251), Fig 253 (配列番号：253), Fig 255 (配列番号：255), Fig 257 (配列番号：257), Fig 259 (配列番号：259), Fig 261 (配列番号：261), Fig 263 (配列番号：263), Fig 265 (配列番号：265), Fig 267 (配列番号：267), Fig 269 (配列番号：269), Fig 271 (配列番号：271), Fig 273 (配列番号：273), Fig 275 (配列番号：275), Fig 277 (配列番号：277), Fig 279 (配列番号：279),  Fig 281 (配列番号：281), Fig 283 (配列番号：283), Fig 285 (配列番号：285), Fig 287 (配列番号：287), Figs 289A-289B (配列番号：289), Fig 291 (配列番号：291), Fig 293 (配列番号：293), Fig 295 (配列番号：295), Fig 297 (配列番号：297), Fig 299 (配列番号：299), Fig 301 (配列番号：301), Fig 303 (配列番号：303), Fig 305 (配列番号：305), Fig 307 (配列番号：307), Fig 309 (配列番号：309), Figs 311A-311B (配列番号：311), Fig 313 (配列番号：313), Fig 315 (配列番号：315), Fig 317 (配列番号：317), Fig 319 (配列番号：319), Fig 321 (配列番号：321), Fig 323 (配列番号：323), Fig 325 (配列番号：325), Fig 327 (配列番号：327), Fig 329 (配列番号：329), Fig 331 (配列番号：331), Fig 333 (配列番号：333), Fig 335 (配列番号：335), Fig 337 (配列番号：337), Fig 339 (配列番号：339), Fig 341 (配列番号：341), Fig 343 (配列番号：343), Fig 345 (配列番号：345), Fig 347 (配列番号：347), Fig 349 (配列番号：349), Figs 351A-351B (配列番号：351), Fig 353 (配列番号：353), Fig 355 (配列番号：355), Fig 357 (配列番号：357), Fig 359 (配列番号：359), Fig 361 (配列番号：361), Fig 363 (配列番号：363), Fig 365 (配列番号：365), Fig 367 (配列番号：367), Fig 369 (配列番号：369), Fig 371 (配列番号：371)及びFig 373 (配列番号：373)中に示されるヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項３】
Fig 1 (配列番号：1), Fig 3 (配列番号：3), Fig 5 (配列番号：5), Fig 7 (配列番号：7), Fig 9 (配列番号：9), Fig 11 (配列番号：11), Fig 13 (配列番号：13), Fig 15 (配列番号：15), Fig 17 (配列番号：17), Fig 19 (配列番号：19), Fig 21 (配列番号：21), Fig 23 (配列番号：23), Fig 25 (配列番号：25), Fig 27 (配列番号：27), Fig 29 (配列番号：29), Fig 31 (配列番号：31), Fig 33 (配列番号：33), Fig 35 (配列番号：35), Fig 37 (配列番号：37), Fig 39 (配列番号：39), Fig 41 (配列番号：41), Fig 43 (配列番号：43), Fig 45 (配列番号：45), Fig 47 (配列番号：47), Fig 49 (配列番号：49), Fig 51 (配列番号：51), Fig 53 (配列番号：53), Fig 55 (配列番号：55), Fig 57 (配列番号：57), Fig 59 (配列番号：59), Fig 61 (配列番号：61), Fig 63 (配列番号：63), Fig 65 (配列番号：65), Fig 67 (配列番号：67), Fig 69 (配列番号：69), Fig 71 (配列番号：71), Fig 73 (配列番号：73), Figs 75A-75B (配列番号：75), Fig 77 (配列番号：77), Fig 79 (配列番号：79),  Fig 81 (配列番号：81), Fig 83 (配列番号：83), Fig 85 (配列番号：85), Fig 87 (配列番号：87), Fig 89 (配列番号：89), Fig 91 (配列番号：91), Fig 93 (配列番号：93), Fig 95 (配列番号：95), Fig 97 (配列番号：97), Fig 99 (配列番号：99), Fig 101 (配列番号：101), Fig 103 (配列番号：103), Fig 105 (配列番号：105), Fig 107 (配列番号：107), Fig 109 (配列番号：109), Fig 111 (配列番号：111), Fig 113 (配列番号：113), Fig 115 (配列番号：115), Fig 117 (配列番号：117), Fig 119 (配列番号：119), Fig 121 (配列番号：121), Fig 123 (配列番号：123), Fig 125 (配列番号：125), Fig 127 (配列番号：127), Fig 129 (配列番号：129), Fig 131 (配列番号：131), Fig 133 (配列番号：133), Fig 135 (配列番号：135), Fig 137 (配列番号：137), Fig 139 (配列番号：139), Fig 141 (配列番号：141), Fig 143 (配列番号：143), Fig 145 (配列番号：145), Fig 147 (配列番号：147), Fig 149 (配列番号：149), Fig 151 (配列番号：151), Fig 153 (配列番号：153), Fig 155 (配列番号：155), Fig 157 (配列番号：157), Fig 159 (配列番号：159), Fig 161 (配列番号：161), Fig 163 (配列番号：163), Fig 165 (配列番号：165), Fig 167 (配列番号：167), Fig 169 (配列番号：169), Fig 171 (配列番号：171), Fig 173 (配列番号：173), Fig 175 (配列番号：175), Fig 177 (配列番号：177), Fig 179 (配列番号：179),  Fig 181 (配列番号：181), Fig 183 (配列番号：183), Fig 185 (配列番号：185), Fig 187 (配列番号：187), Fig 189 (配列番号：189), Fig 191 (配列番号：191), Fig 193 (配列番号：193), Fig 195 (配列番号：195), Fig 197 (配列番号：197), Fig 199 (配列番号：199), Fig 201 (配列番号：201), Fig 203 (配列番号：203), Fig 205 (配列番号：205), Fig 207 (配列番号：207), Fig 209 (配列番号：209), Fig 211 (配列番号：211), Fig 213 (配列番号：213), Fig 215 (配列番号：215), Fig 217 (配列番号：217), Fig 219 (配列番号：219), Fig 221 (配列番号：221), Fig 223 (配列番号：223), Fig 225 (配列番号：225), Fig 227 (配列番号：227), Fig 229 (配列番号：229), Fig 231 (配列番号：231), Fig 233 (配列番号：233), Fig 235 (配列番号：235), Fig 237 (配列番号：237), Fig 239 (配列番号：239), Fig 241 (配列番号：241), Fig 243 (配列番号：243), Fig 245 (配列番号：245), Fig 247 (配列番号：247), Fig 249 (配列番号：249), Fig 251 (配列番号：251), Fig 253 (配列番号：253), Fig 255 (配列番号：255), Fig 257 (配列番号：257), Fig 259 (配列番号：259), Fig 261 (配列番号：261), Fig 263 (配列番号：263), Fig 265 (配列番号：265), Fig 267 (配列番号：267), Fig 269 (配列番号：269), Fig 271 (配列番号：271), Fig 273 (配列番号：273), Fig 275 (配列番号：275), Fig 277 (配列番号：277), Fig 279 (配列番号：279),  Fig 281 (配列番号：281), Fig 283 (配列番号：283), Fig 285 (配列番号：285), Fig 287 (配列番号：287), Figs 289A-289B (配列番号：289), Fig 291 (配列番号：291), Fig 293 (配列番号：293), Fig 295 (配列番号：295), Fig 297 (配列番号：297), Fig 299 (配列番号：299), Fig 301 (配列番号：301), Fig 303 (配列番号：303), Fig 305 (配列番号：305), Fig 307 (配列番号：307), Fig 309 (配列番号：309), Figs 311A-311B (配列番号：311), Fig 313 (配列番号：313), Fig 315 (配列番号：315), Fig 317 (配列番号：317), Fig 319 (配列番号：319), Fig 321 (配列番号：321), Fig 323 (配列番号：323), Fig 325 (配列番号：325), Fig 327 (配列番号：327), Fig 329 (配列番号：329), Fig 331 (配列番号：331), Fig 333 (配列番号：333), Fig 335 (配列番号：335), Fig 337 (配列番号：337), Fig 339 (配列番号：339), Fig 341 (配列番号：341), Fig 343 (配列番号：343), Fig 345 (配列番号：345), Fig 347 (配列番号：347), Fig 349 (配列番号：349), Figs 351A-351B (配列番号：351), Fig 353 (配列番号：353), Fig 355 (配列番号：355), Fig 357 (配列番号：357), Fig 359 (配列番号：359), Fig 361 (配列番号：361), Fig 363 (配列番号：363), Fig 365 (配列番号：365), Fig 367 (配列番号：367), Fig 369 (配列番号：369), Fig 371 (配列番号：371)及びFig 373 (配列番号：373)中に示されるヌクレオチド配列の全長コード化配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項４】
表７に示されるいずれかのATCCアクセッション番号の下、寄託されたDNAの全長コード化配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞がCHO細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が大腸菌である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が酵母細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記PROポリペプチドの発現に適する条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、前記PROポリペプチドを細胞培養物から回収することを含むPROポリペプチドを生産する方法。
【請求項１１】
Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号：280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 及びFig 374 (配列番号：374)中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
表７に示されるいずれかのATCCアクセッション番号の下、寄託されたDNAの全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
異種性のアミノ酸配列と融合された請求項１１に記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項１４】
前記異種性のアミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１３に記載のキメラ分子。
【請求項１５】
前記異種性のアミノ酸配列がイムノグロブリンのFc領域である請求項１３に記載のキメラ分子。
【請求項１６】
請求項１１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
（a）Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号���280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドであって、その付随するシグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（b）Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号���280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示さるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを持つものをコードするヌクレオチド配列；又は
（c）Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号���280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列：
と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【請求項１９】
（a）Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号���280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドであって、その付随するシグナルペプチドを欠くポリペプチドのアミノ酸配列；
（b）Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号���280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを持つもののアミノ酸配列；又は
（c）Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号���280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを欠くもののアミノ酸配列：
と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号：280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患を治療する方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトが心筋梗塞を患っている請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトが心肥大、外傷、癌又は加齢黄斑変性症を患っている請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
心肥大がPGF２αの上昇したレベルでの存在により特徴づけられる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドが心臓血管性、内皮性又は血管形成の薬剤と共に投与される請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが一次血管形成術に従い投与される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患が癌である請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが化学治療剤、成長抑制剤又は細胞障害性薬剤と組合わせて投与される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記アンタゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号：280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372) 又はFig 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患を治療する方法。
【請求項３２】
前記アゴニストが前記ポリペプチドの抗体である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アンタゴニストが前記ポリペプチドの抗体である請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物がヒトである請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
核酸分子がエクスヴィボ遺伝子治療によって投与される請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
PRO229, PRO238, PRO247, PRO444, PRO720, PRO827, PRO1007, PRO1029, PRO1075, PRO1184, PRO1190, PRO1195, PRO1274, PRO1279, PRO1419, PRO1474, PRO1477, PRO1488, PRO1782, PRO1890, PPRO4302, PRO4405, PRO5725, PRO5776, PRO6006, PRO7436, PRO9771, PRO10008, PRO21384 又は PRO28631ポリペプチド又はそのアゴニストを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における内皮性細胞の増殖を阻害する方法であって、前記哺乳動物における内皮性細胞の増殖が阻害される方法。
【請求項３７】
哺乳動物にPRO21, PRO181, PRO205, PRO214, PRO221, PRO231, PRO238, PRO241, PRO247, PRO256, PRO258, PRO263, PRO265, PRO295, PRO321, PRO322, PRO337, PRO363, PRO365, PRO533, PRO697, PRO725, PRO771, PRO788, PRO791, PRO819, PRO828, PRO836, PRO846, PRO865, PRO1005, PRO1006, PRO1025, PRO1054, PRO1071, PRO1079, PRO1080, PRO1114, PRO1131, PRO1155, PRO1160, PRO1186, PRO1192, PRO1244, PRO1272, PRO1273, PRO1279, PRO1283, PRO1286, PRO1306, PRO1309, PRO1325, PRO1329, PRO1347, PRO1356, PRO1376, PRO1382, PRO1411, PRO1412, PRO1508, PRO1550, PRO1556, PRO1760, PRO1787, PRO1801, PRO1868, PRO1887, PRO3438, PRO3444, PRO4324, PRO4333, PRO4341, PRO4342, PRO4353, PRO4354, PRO4356, PRO4371, PRO4408, PRO4422, PRO4425, PRO4499, PRO5723, PRO5737, PRO6029, PRO6071, PRO9821, PRO9873, PRO10008, PRO10096, PRO19670, PRO20040, PRO20044, PRO21055 又は PRO21384ポリペプチド、又はそのアゴニストを投与することを含む哺乳動物におけるに内皮性細胞の増殖を刺激する方法であって、前記哺乳動物における内皮性細胞の増殖が刺激される方法。
【請求項３８】
哺乳動物にPRO21ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む哺乳動物における心肥大を誘導する方法であって、前記哺乳動物における心肥大が誘導される方法。
【請求項３９】
哺乳動物においてPRO1376又はPRO1449によって誘導される血管形成を刺激する方法であって、前記ポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含み、前記血管形成が刺激される方法。
【請求項４０】
内皮性細胞にPRO4302ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む内皮性細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、前記内皮性細胞におけるアポトーシスが誘導される方法。
【請求項４１】
平滑筋細胞にPRO162, PRO182, PRO204, PRO221, PRO230, PRO256, PRO258, PRO533, PRO697, PRO725, PRO738, PRO826, PRO836, PRO840, PRO846, PRO865, PRO982, PRO1025, PRO1029, PRO1071, PRO1083, PRO1134, PRO1160, PRO1182, PRO1184, PRO1186, PRO1192, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1306, PRO1308, PRO1325, PRO1337, PRO1338, PRO1343, PRO1376, PRO1387, PRO1411, PRO1412, PRO1415, PRO1434, PRO1474, PRO1550, PRO1556, PRO1567, PRO1600, PRO1754, PRO1758, PRO1760, PRO1787, PRO1865, PRO1868, PRO1917, PRO1928, PRO3438, PRO3562, PRO4333, PRO4345, PRO4353, PRO4354, PRO4408, PRO4430, PRO4503, PRO6714, PRO9771, PRO9820, PRO9940, PRO10096, PRO21055, PRO21184 又は PRO21366ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む平滑筋細胞の増殖を刺激する方法であって、前記平滑筋細胞における平滑筋細胞の増殖が刺激される方法。
【請求項４２】
平滑筋細胞における平滑筋細胞増殖が促進される、平滑筋細胞にPRO181, PRO195, PRO1080, PRO1265, PRO1309, PRO1488, PRO4302, PRO4405 又は PRO5725ポリペプチド、又はそのアゴニストを投与することを含む平滑筋細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項４３】
PRO178, PRO195, PRO228, PRO301, PRO302, PRO532, PRO724, PRO730, PRO734, PRO793, PRO871, PRO938, PRO1012, PRO1120, PRO1139, PRO1198, PRO1287, PRO1361, PRO1864, PRO1873, PRO2010, PRO3579, PRO4313, PRO4527, PRO4538, PRO4553, PRO4995, PRO5730, PRO6008, PRO7223, PRO7248又はPRO7261ポリペプチド又はそのアゴニストを内皮性細胞に投与することを含む内皮性細胞管形成を誘導する方法であって、前記内皮性細胞における管形成が誘導される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、かかる生物学的効果を必要とする哺乳動物において血管形成及び／又は心臓血管新生の調節（例えば、促進又は阻害）に有用な組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、血管形成に関与する疾患（例えば、心臓血管並びに腫瘍学的疾患）の診断及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１．血管形成
血管形成誘導は、既存の血管から新しい血管の増殖又は出芽（sprouting）として定義され、胚発育期間に主として生じる複雑な過程である。成人の正常な生理学的状態下では、血管形成は、髪の毛の成長及び創傷治癒などの非常に限定された状況下においてのみ生じる（Auerbach, W.及びAuerbach, R., 1994, Pharmacol Ther 63(3):265-3 11；Ribatti等, 1991, Haematologica 76(4):3 11-20；Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1-4）。制御されない血管形成が、限定はしないが、心臓血管疾患、癌、関節リウマチ、乾癬及び糖尿病網膜症を含む広い範囲の疾患の原因であることが徐々に認識されてきた（Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31；Isner, 1999, Circulation 99(13):1653-5；Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62；Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 38(2):103-12；Ware及びSimons, 1997, Nat Med 3(2):158-64）。
２．２．心疾患及び要因
約500万人のアメリカ人が心不全にかかり、毎年約400,000人が心不全の新しい患者となる。アメリカ合衆国における65歳以上の人々の入院の単独では最多の原因である。急性心筋梗塞を含む急性心不全に対する対応の最近の進歩の結果、慢性の心不全が発症した患者数が拡大している。1979年から1995年まで、鬱血性心不全(CHF)の患者は377,000人から872,000人(130パーセント増)に昇り、CHFによる死亡は116パーセント増えた。
CHFは、左心室の機能不全、運動耐性(exercise tolerance)の低下、生命水準の悪化、顕著な寿命の低下により特徴付けられる症候群である。心不全の必須条件は、心臓が体組織の代謝必要量を満たすのに十分な速度で血液を押し出すことが不可能であることである(換言すれば、心拍出量の不足である)。
末梢血管収縮、心拍数の増加、心収縮性の増加、血漿容量の増加を含む、少なくとも４種の主要な補償メカニズムが心不全の場合に活性化される。これらの効果は、交感神経系とレニン-アンジオテンシン系により主に媒介される。Eichhorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169(1998)参照。交感神経系からの出力が増えると脈拍、心拍数、及び収縮性が上昇する。アンジオテンシIIは、１)血管平滑筋収縮を直接刺激し、２)アルドステロンと抗利尿ホルモン分泌を刺激することにより血漿容量の拡大を促進させ、３)交感神経媒介血管緊張を刺激し、４)血管拡張とナトリウム利尿活性を有するブラジキニンの変性を触媒することにより、血圧を上昇させる。Brown and Vaughan, Circulation, 97: 1411-1420(1998)による検討を参照。以下に記載するように、アンジオテンシンIIはまた、ミオサイト壊死(心臓収縮機能の悪化)及び心臓線維症(心臓拡張及び場合によっては収縮機能の悪化)を促進することで直接的に有害な影響を有する。Weber, Circulation, 96: 4065-4082(1998)参照。
【０００３】
鬱血性心不全(CHF)の共通した特徴は心臓肥大であり、心臓の拡大は力学的及びホルモン的刺激の両方により活性化され、心臓が心拍出量の増加の要求に適合できるようにする。Morgan and Baker, Circulation, 83: 13-25 (1991)。この肥大反応は、多くの場合、高血圧、大動脈弁狭窄症、心筋梗塞、心筋症、弁膜逆流、及び心内短絡のような様々な特徴的な病状に関わり、その全てが慢性的な血行動態過負荷となる。
肥大は通常、腫瘍形成を含まず、自然成長に関与しない器官又は構造の大きさの増大として定義される。心臓の肥大は、個々の細胞(ミオサイト)の質量の増加、又は組織を形成する細胞数の増加(過形成)のどちらか又は両方により起こる。胎児心臓の拡大は主にミオサイト数の増加(出生直後まで続く)に依存するが、出生後の心臓ミオサイトは増殖能力を失う。更なる発達は個々の細胞の肥大を通して起こる。
成人のミオサイトの拡大は最初に個々の筋繊維の負担を少なくすることを可能にすることにより、障害性心機能に対しては短時間の応答として最初は有益である。しかしながら、過酷で長時間の過負荷を受けると、肥大細胞は劣化し始め、死亡する。Katz, "Heart Failure", in: Katz A.M. ed., Physiology of the Heart(New York: Raven Press, 1992)pp. 638-668。心臓肥大は、心不全の臨床経過での死亡率及び罹患率にとって重大な危険因子である。Katz, Trends Cardiovasc. Med.,5: 37-44 (1995)。心臓肥大の原因及び症状の更なる詳細については、例えばHeart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1988),Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure"。
細胞レベルでは、心臓はミオサイト及び包括的に非ミオサイトと呼ばれる周囲の支持細胞で構成される。非ミオサイトは最初線維芽細胞／間葉細胞であり、またそれらは内皮及び平滑筋細胞を含む。実際、ミオサイトは成人心筋質量の大部分を形成しているが、心臓に存在する全細胞数の約３０％にしか相当しない。ホルモン的、生理的、血行力学的、及び病理学的な刺激に対する反応では、成人心室筋細胞は、肥大化プロセスの活性化を通して負担が増えるのに適合することができる。この反応は、細胞の分裂及び心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の遺伝子を含む胎児遺伝子の活性化の付随なしに起こる、個々の心筋細胞の収縮性タンパク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。Chien等, FASEB J., 5: 3037-3046(1991); Chien等, Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95(1993)。細胞外マトリックス内及び心筋内冠動脈の周りにある間質性コラーゲンの蓄積と関連したミオサイトの大きさの増大の結果として起こる心筋質量の増加は、ヒトにおいて圧負荷に引き続いて起こる左心室肥大において記述されている。Caspari等, Cardiovasc．Res．, 11：554-558(1977); Schwarz等, Am. J. Cardiol., 42: 895-903(1978); Hess等, Circulation, 63: 360-371(1981); Pearlman等, Lab. Invest., 46 158-164(1982)。
【０００４】
また非ミオサイト支持細胞によって産生されたパラ分泌因子はさらに心臓肥大の発達に関わり得ることが示唆され、さらに様々な非ミオサイト由来肥大因子、例えば白血球抑制因子(LIF)及びエンドセリン等が同定されている。Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173(1992); Kurzrock等, Endocrinne Reviews, 12: 208-217(1991); Inoue等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867(1989); Yanagisawa and Masaki, Treds Pharm. Sci., 10: 374-378(1989); 米国特許第5573762(1996年11月12日公開)。心臓肥大の潜在的な介在物質とされる更なる例示的な因子は、カルジオトロフィン-１(CT-1)(Pennica等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146(1995))、カテコールアミン類、副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、及びプロスタグランジン類を含む。
現在のところ、心肥大の治療は潜在的な心臓疾患に依存して異なる。カテコールアミン類、副腎皮質ステロイド類、アンジオテンシン、プロスタグランジン類、LIF、エンドセリン、(エンドセリン-1、-2、及び-3及び大(big)エンドセリンを含む)及びCT-1は、肥大の潜在的な介在物質とされる因子にはいる。例えば、β-アドレナリン受容体遮断薬(β-遮断薬、例えばプロプラノロール、チモロール、タートアルオロール(tertalolol)、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、カルベジロール、等)及びベラパミルは、肥大型心筋症の治療に広く用いられている。症状(例えば胸痛)及び運動負荷でのβ-遮断薬の有益な効果は、主に心拍数を減らすことに依存し、その結果弛緩期を延長し、受動的に心室充満を増大する。Thompson等, Br. Heart J., 44: 488-98(1980); Harrison等, Circulation, 29: 84-98 (1964)。ベラパミルは心室充満を向上させ、恐らく心筋虚血を減少させるということが記載されている。Bonow 等, Circulation, 72: 853-64(1985)。
またニフェジピン及びジルチアゼムは時に肥大型心筋症の治療に利用される。Lorell等, Circulation, 65:499-507(1982); Betocchi等, Am. J.Cardiol.,78:451-457(1996)。しかしながら、強力な血管拡張特性のために、特に流出障害をもつ患者には、ニフェジピンは害になりうる。ジソピラミドはその負の筋収縮特性によって症状を和らげるのに使用される。Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999(1982)。しかしながら、多くの患者において、最初の効果は徐々に減ってくる。Wigle等,Circulation, 92: 1680-1692(1995)。抗高血圧薬治療は、血圧の上昇に関連する心臓肥大に有益な効果を有することが報告されている。抗高血圧治療に使用される、単独で又は組み合わせて使用される薬の例としては、カルシウムアンタゴニスト、例えばニトレンジピン；アドレナリン受容体阻害薬、例えば上に挙げたもの；例えばキナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、ホシノプリル、リシノプリルのようなアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害薬；利尿薬、例えばクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド(methylchlothiazide)、ベンズチアジド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、及びインダパミド；及びカルシウムチャネル阻害剤、例えばジルチアゼン、ニフェジピン、ベラパミル、及びニカルジピンがある。
例えば、ジルチアゼン及びカプトリルを用いた高血圧の治療は、左心室筋質量の減少を示すが、心臓拡張機能のドップラー指数は正常にならなかった。Szlachcic等, Am. J. Cardiol.,63: 198-201(1989); Shahi等, Lancet, 336: 458-461(1990)。これらの発見は、過剰量となった間質性コラーゲンが左心室肥大の退化後に残りうることを表すと解釈される。Rossi等, Am. Heart J., 124: 700-709(1992)。上掲のRossi等は、実験用ラットにおいて、圧負担心臓肥大での間質性線維症及び心筋細胞肥大の抑制及び退化でのカプトプリルの影響を研究した。
【０００５】
心筋収縮能を直接増加する薬剤(変力剤)は、初め、心不全を持つ患者に、短期間において心拍出量を改善するために有用であると思われていた。しかしながら、ジゴキシゲニンを除いた全ての陽性変力剤は、短期的に心臓の性能を改善するにしても、長期的には死亡率を高める。Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217(1997); Reddy等, Curr. Opin. Cardiol., 12:233-241(1997)。最近、β-アドレナリン受容体阻害剤は心不全での利用が提唱されている。臨床試験から明らかになったことは、心臓機能の改善が死亡率を増加させずに達成されうることが示唆されるが、患者の生存率が向上することは未だ実証されていない。また、CHF治療のカルジオトロピン-１又はそのアンタゴニスト、又は成長ホルモン及び／又はインシュリン様成長因子-Ｉに関する米国特許第5935924号、5624806号；5661122号；及び5610134号及び国際公開第95/28173号参照。他の治療様式は心臓移植であるが、これはドナー心臓の入手可能性により制限がある。
エンドセリンは２１アミノ酸を含んでなる血管収縮ペプチドであり、ブタ動脈内皮培養上清から単離され、構造的に決定される。Yanagisawa等, Nature, 332: 411-415 (1998)。エンドセリンは後に様々な作用が発見され、エンドセリンアンタゴニストのようなエンドセリン抗体は心筋梗塞、腎不全、及び他の病気の治療に有効であることが証明されている。エンドセリンは生体内に存在し、血管収縮活性を示すため、それは循環系の調節に関する内生要因であることが予想され、さらに高血圧、心筋梗塞のような心疾患、急性腎不全のような腎臓病に関与しうる。エンドセリンアンタゴニストは、例えば米国特許第5773414号；日本特許公開3130299/1991号、欧州特許457195号、欧州特許460679号；及び欧州特許552489号に記載されている。エンドセリン受容体アンタゴニストを同定するための新規のエンドセリンＢ受容体は米国特許番号5773223号に記載されている。
心疾患の現在の治療は主に、カプトプリル、及び利尿薬のようなアンジオテンシン転換酵素(ACE)抑制剤の使用に向けられている。これらの薬剤は、血流力学的側面、及び運動負荷を改善し、CHFを持つ患者の死亡率及び発病率を減少させる。Kramer等, Circulation, 67(4): 807-816(1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763(1983); The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435(1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302(1991)。さらにそれらは高血圧、左心室機能障害、アテローム硬化性血管疾患、及び糖尿病性ネフロパシーに利用される。上掲のBrown及びVaughan。しかしながら、効果が証明されたにも関わらず、ACE抑制剤の反応は限度がある。例えば、心不全の状況で延命したとき、ACE抑制剤は末期心不全への進行を遅らせるようだが、ACE抑制剤に関し大多数の患者が機能的クラスIIIの心不全を有する。
さらに、機能的許容能力の改善及び運動時間はほんのわずかで、死亡率は減少はするが、依然として高い。The CONSESUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453(1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302(1991); Cohn等, N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310(1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4): 539-544(1988)。従って、ACE抑制剤は心不全患者の60％以上において症状を緩和することができず、約15-20％まで心不全の死亡率を減少させるにすぎないようである。さらに副作用については、上掲のBroun及びVaughan参照。
【０００６】
ACE抑制剤の代替物は、特定のAT1受容体アンタゴニストによって表される。臨床研究では、心臓血管及び腎臓の疾患の治療において、これら２つの様態の効果の比較が計画されている。しかしながら、動物モデルのデータはACE/AngII経路が、心臓肥大に明確に関係しているが、唯一のものではないか、この役割での活性な主要経路ではないことを示唆する。マウス遺伝子「ノックアウト」モデルは経路の個々の成分を試験するために作成されている。あるそのようなモデルで、AngIIに対する主要な心臓病受容体、ATsub1Aが遺伝学的に欠失された；これらのマウスは、AngIIが実験的に与えられたとき 、肥大が発達しなかった(AngIIの二次的な肥大除去におけるモデルでの基本的な成功を確認)。しかしながら、大動脈がこれらの動物(高血圧心臓ストレスモデル)で収縮されたとき、心臓はなおも肥大性になる。このことは、このレセプター(ATsub1A)に無関係な別のシグナル伝達経路が高血圧において活性化されていることを示唆している。ACE抑制剤は恐らくこれらの経路を抑制することはできないであろう。Harada等, Circulation, 97: 1952-1959(1998)参照。また、心臓肥大の過程及び機構に関連する謎に関してはHomcy, Circulation, 97: 1890-1892(1998)参照。
毎年約750,000人の患者が急性心筋梗塞(AMI)に懸かり、アメリカ合衆国での全死亡のおよそ４分の１がAMIによるものである。近年、血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、及び特に組織プラスミノゲン活性剤(t-PA)は、心筋梗塞に罹患した患者の生存率を大きく向上させた。１．５から４時間の連続静脈注射として投与したとき、t-PAは治療を施した患者の69％から90％が90分で冠血管解放を引き起こす。Topol等, Am. J. Cardiol., 61: 723-728(1988); Neuhaus等, J. Am. Coll. Cardiol.,12: 581-587(1988); Neuhaus等, J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569(1989)。最も高い開放率は、高い投与量又は急速な投与療法において報告されている。Topol, J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924(1990)。またt-PAは一回のボーラスとして投与され得るし、それに関連する短い半減期に依存しているが、注入療法に適している。Tebbe等, Am. J. Cardiol., 64: 448-453(1989)。t-PA変異体は、特に長い半減期及び高いフィブリン特異性を有するように作成されているが、TNKt-PA(aT103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAAt-PA変異体、Keyt等, PROc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674(1994))は特にボーラス投与に適している。しかしながら、これら全ての発達にもかかわらず、患者の生存の長期予後は、心臓肥大の監視及び治療を含む患者の注入後の監視及び治療にかなり依存する。
【０００７】
２．３．成長因子
報告によると、様々な自然発生ポリペプチドが内皮細胞の増殖を誘導する。これらのポリペプチドは、塩基性の及び酸性の線維芽細胞増殖因子(FGF)(Burgess及びMaciag, Annual Rev. Biochem., 58:575(1989))、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)(Ishikawa等, Nature, 338: 557(1989))、及び血管内皮成長因子(VEGF)である。Leung等, Science, 246: 1306(1989); Ferrara及びHenzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851(1989);Tischer等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198(1989); 1996年7月31日に特許付与された欧州特許第471754B号。
ヒトVEGF(hVEGF)ｃDNAで核酸移入した細胞による条件培地は毛細血管内皮細胞の増殖を促進するのに対し、コントロールではそうではなかった。Leung等, Science 246: 1306(1989)。いくつかの付加ｃDNAはhVEGFの121-、189-、及び206-アミノ酸アイソフォーム(また集合的にhVEGF関連タンパク質と呼ばれる)をコードするヒトｃDNAライブラリで同定された。121-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116及び159の間の44アミノ酸が欠失している特徴によってhVEGFと異なる。189-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116で24アミノ酸が挿入している特徴によってhVEGFと異なり、明らかにヒト血管透過性因子(hVPF)と同一である。206-アミノ酸タンパク質は、hVEGFの残基116で41アミノ酸が挿入している特徴によってhVEGFと異なる。Houck等, Mol. Endocrin., 5: 1806(1991); Ferrara等, J. Cell. Biochem., 47:211(1991);Endocrine Reviews, 13:18(1992); Keck等, Science, 246: 1309(1989); Connolly等, J. Biol. Chem., 264: 20017(1989); 1990年5月30日に公開された欧州特許第370989号。
現在、前から存在する内皮からの新しい血管の形成を含む脈管形成は、様々な疾患の病因と関連しているということがかなり証明されている。これらは、固形腫瘍及び転移、アテローム性動脈硬化症、水晶体後線維増殖症、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症(例えば糖尿病性網膜症)のような眼内新生血管症候群、加齢性黄斑変性(AMD)、血管新生緑内障、移植された角膜細胞及び他の細胞の免疫反応、リウマチ様関節炎、及び乾癬を含む。Folkman等, J. Biol. Chem., 267: 10931-10934(1992); Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239(1991); 及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition(Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
腫瘍成長の場合には、脈管形成は過形成から腫瘍形成への変化、固形腫瘍の成長用の滋養物の提供に非常に重要であると思われる。Folkman等, Nature, 339: 58(1989)。新血管新生は、正常な細胞に比べて腫瘍細胞の成長を有利にし、増殖自立性を与える。通常、腫瘍は、利用可能な毛細血管床からの距離に依存した、たかだか数立方ミリメートルの大きさにのみ増殖可能な異常な単一細胞として発症し、長期間、更なる増殖及び汎発を伴わない「休眠状態」で留まることができる。その後、特定の腫瘍は、内皮細胞を活性化する血管原性表現型にスイッチし、新規の毛細血管中へと成長し、成熟を行う。これら新規形成された血管は、原発腫瘍の成長の継続を可能ならしめるだけでなく、転移性腫瘍細胞の汎発及び再コロニー化も可能にする。従って、腫瘍部分の微細血管密度と乳癌並びにいくつかの他の腫瘍での患者生存率の間には相関関係が見られる。Weidner等, N. Engl. J. Med, 324: 1-6(1991); Horak等, Lancet, 340: 1120-1124(1992); Macchiarini等, Lancet, 340: 145-146(1992)。血管形成スイッチをコントロールする正確なメカニズムはよく理解されていない、しかし、腫瘍塊の新血管形成の結果、多くの血管形成の刺激因子及び阻害因子の正味のバランスが保たれることになる（Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31）。
脈管形成の正の制御因子を探求することで、aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-α、アンジオテンシン、IL-8、等を含む多くの候補が与えられた。上掲のFolkman等, J. B. C.、及び上掲のKlagsbrun等。これまでに定義された負の制御因子はトロンボスポンジン(Good等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628(1990))、プロラクチンの16-キロダルトンN-末端断片(Clapp等, Endocrinology, 133: 1292-1299(1993))、アンジオスタチン(O'Reilly等, Cell, 79: 315-328(1994))、及びエンドスタチン。O'Reilly等, Cell, 88: 277-285(1996)。
【０００８】
ここ数年の研究で、血管内皮細胞の増殖を刺激するだけでなく、血管浸透及び脈管形成を誘発することのVEGFの重要な役割が明らかになっている。Ferrara等, Endocr. Rev., 18: 4-25(1997)。一つのVEGF対立遺伝子さえ喪失すると胎児死亡に至るという知見は、血管系の発達と分化におけるこの因子が担っている代替のない役割を示している。さらに、VEGFは腫瘍及び眼内疾患に関連した新血管新生の重要な媒介物であることが示されている。Ferrara等, Endocr. Rev., 上掲。VEGFmRNAは検査した多くのヒト腫瘍で過剰発現している。Berkman等, J. Clin. Invest., 91：153-159(1993)；Brown等, Human Pathol., 26：89-91(1995)；Brown等, Cancer Res., 53：4727-4735(1993)；Mattern等, Brit. J. Cancer, 73：931-934(1996)；Dvorak等, Am. J. Pathol., 146：1029-1039(1995)。
また、眼の流体中のVEGFの濃度レベルは、糖尿病及び他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在性と高い相関関係がある。Aiello等, N. Engl. J. Med., 331：1480-1487(1994)。さらに、近年の研究により、AMDの影響を受けている患者の脈絡膜新生血管膜にVEGFが局在化していることが示されている。Lopez等, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37：855-868(1996)。
抗-VEGF中和抗体は、ヌードマウスにおいて、様々なヒト腫瘍株化細胞の成長を抑制し(Kim等, Nature, 362：841-844(1993)；Warren等, J. Clin. Invest., 95：1789-1797(1995)；Borgstrom等, Cancer Res., 56：4032-4039(1996)；Melnyk等, Cancer Res., 56：921-924(1996))、また虚血性網膜疾患における眼内血管形成を阻害する。Adamis等, Arch. Ophthalmol., 114：66-71(1996)。よって、抗-VEGFモノクローナル抗体又はVEGF作用に対する他のインヒビターは、固形腫瘍及び種々の眼内新血管疾患の治療用の候補薬とされている。このような抗体は、例えば1998年1月14日に公開されたEP817,648及び1998年10月15日に共に公開された国際公開第98/45331号及び国際公開第98/45332号に記載されている。
【０００９】
ある種の細胞により発現する遺伝子の複合体を素早く誘導することができる、トランスフォーミング発ガン遺伝子を含む、いくつかの他の成長因子及び分裂促進因子が存在する。Lau及びNathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6：165-202(1991)。前初期遺伝子又は初期反応遺伝子と命名されているこれらの遺伝子は、新規タンパク質合成と無関係に、成長因子又は分裂促進因子と接触後数分間で転写的に活性化される。これらの前初期遺伝子のグループは、分化及び増殖、再生、及び傷治療等の複雑な生物学的プロセスを調整するのに必要な、分泌性の細胞外タンパク質をコードする。Ryseck等, Cell Growth Differ., 2：235-233(1991)。
このグループに属する高度に関連したタンパク質には、cef10(Simmons等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1178-1182(1989))、血清-又は血小板誘導成長因子(PDGF)により素早く活性化されるcyr61(O'Brien等, Mol. Cell. Biol., 10：3569-3577(1990))、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)による活性化後に高レベルでヒト血管内皮細胞により分泌され、ＰＤＧＦ様の生物学的及び免疫学的活性を示し、特定の細胞表面レセプターに対してPDGFと競合するヒト結合組織成長因子(CTGF)(Bradham等, J. Cell. Biol., 114：1285-1294(1991))、ｆｉｓｐ-１２(Ryseck等, Cell Growth Differ., 2：235-233(1991))、ヒト血管ＩＢＰ-様成長因子(VIGF)(WO96/17931)、及び通常は成人腎臓細胞に静止され、骨髄芽球-関連-ウイルスＩ型誘発腎芽細胞腫において過剰発現することが見出されているnovが含まれる。Joloit等, Mol. Cell. Biol., 12：10-21(1992)。
これらの前初期遺伝子の発現は、成長因子により誘発される事象のカスケードにおける「第３のメッセンジャー」として作用する。また、それらは複雑な生物学的プロセス、例えば分化及び細胞増殖が通常の事象である傷治療を統合及び調整するのに必要であると考えられている。
付加的な分裂促進因子として、インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBPs)が、インシュリン様成長因子(IGF)との複合体において、線維芽細胞及び平滑筋細胞表面レセプターへのIGFの結合性を増加させるように刺激することが示されている。Clemmonsら., J. Clin. Invest., 77: 1548(1986)。様々なインビトロでのＩＧＦ作用に対するIGFBPの阻害効果は、脂肪細胞によるグルコース輸送の刺激、軟骨細胞によるサルフェートの取り込み、及び線維芽細胞中へのチミジンの取り込みを含む。Zapf等, J. Clin. Invest., 63：1077(1979)。さらに、正常な細胞での、成長因子媒介性分裂促進因子活性におけるＩＧＦＢＰの阻害効果が示されている。
【００１０】
２．４．さらなる治療の必要性
多くの病気及び疾患における血管内皮細胞の成長及び血管形成の役割に鑑みると、これらのプロセスに起因する一又は複数の生物学的影響を低減又は抑制する手段を有していることが好ましい。また、正常及び病気の状態、特にガンにおいて病原性ポリペプチドの存在を検査する手段を有していることも望ましい。さらに、特定の側面では、心臓肥大の治療には一般的に適用できる治療法がないので、心臓ミオサイト肥大を防止又は低減可能な因子を同定することは、病態生理学的な心臓成長を阻害するための新規な治療方策の開発において非常に重要である。様々な心臓血管及び発癌遺伝子疾患のためのいくつかの治療様式が存在するが、さらなる治療的アプローチがなお必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
３．発明の概要
本発明は、哺乳類における血管形成及び／又は心臓血管新生を調節（例えば、促進又は阻害）するための組成物及び方法に関する。本発明は、ある種の生物学的活性の調節（例えば、促進又は阻害）をテストする種々の心臓血管アッセイにおいて陽性であることをテストする化合物（即ち、タンパク質）の同定に基づく。従って、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞成長の阻害又は刺激、血管内皮細胞の成長又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長の阻害、血管形成依存性組織成長の刺激、心臓肥大の阻害及び心臓肥大の刺激、例えば鬱血性心不全の治療等の効果が望まれているところでは、当該化合物は、ある効果、例えば、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞増殖の阻害又は刺激、血管内皮細胞の生育又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長、例えばうっ血性心不全の治療の心肥大の阻害及び心肥大の刺激などが望まれる、疾患の診断及び／又は治療(予防及び寛解を含む)に有用な薬剤及び／又は薬物成分であると考えられる。さらに、本発明の組成物及び方法は、血管形成関連疾患の治療のため、臨床試験における効果をモニタリングするため、及びそのような血管形成関連疾患になり易い患者を同定するための臨床的評価を受ける患者の診断上のモニタリングを提供する。
一実施態様において、本発明は薬剤的に許容される担体と混合されたPROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を含んでなる組成物を提供する。一態様では、組成物は治療的有効量のポリペプチドを含有する。他の態様では、組成物はさらなる活性成分、すなわち、心臓血管、内皮又は血管形成薬又はアンジオスタチック(angiostatic)薬、好ましくは血管形成又はアンジオスタティック薬を含有する。好ましくは組成物は無菌である。PROポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体は、液状の製薬調製物の形態で投与することができ、これは、貯蔵安定性が延びるように保存できる。保存された液状の製薬調製物は複数回投与用のPROポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体を含有していてもよく、よって繰り返し使用に適している。好ましい実施態様において、組成物は抗体を含み、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明は薬剤的に許容される担体と、治療的有効量のPROポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体との混合物を含有する、心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調製方法を提供する。
またさらなる態様において、本発明は：
(ａ)PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する物質の組成物；
(ｂ)該組成物を収容する容器；及び
(ｃ)心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療における該PROポリペプチドの使用を記した、該容器に添付されるラベル又は当該容器に収納される包装挿入物を具備する製造品を提供し、前記アゴニスト又はアンタゴニストはPROポリペプチドに結合する抗体であってよい。該組成物は、治療的有効量のPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてよい。
他の実施態様において、本発明は、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
他の実施態様において、本発明は、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、当該細胞増殖の刺激が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
【００１３】
他の実施態様では、本発明はPROポリペプチドの活性を阻害する化合物の同定方法を提供し、それは、試験化合物をPROポリペプチドと、試験化合物とポリペプチドとが相互作用するのに十分な条件及び時間で接触させ、PROポリペプチドの活性が阻害されるか否かを測定することを含む。特に好ましい態様では、試験化合物又はPROポリペプチドのいずれかが固体支持体に固定化される。他の好ましい態様では、非固定化成分は検出可能な標識を担持する。好ましい態様では、この方法は：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドの存在下で、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の好ましい態様においては、この方法は：
（ａ）細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドの存在下で、PROポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の実施態様では、本発明は、通常はPROポリペプチドを発現する細胞における当該細胞の発現を阻害する化合物の同定方法を提供し、当該方法は、細胞と試験化合物とを接触させ、PROポリペプチドの発現が阻害されるか否かを測定することを含む。好ましい態様では、この方法は：
(ａ)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とをPROポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ；そして
(ｂ)前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する工程を含む。
またさらなる実施態様では、本発明は、前掲の方法により同定された化合物等の、PROポリペプチドの発現を阻害する化合物を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様は、前掲の方法により同定されてもよいPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに向けられる。
PROポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を阻害するPROポリペプチドのアンタゴニストの一種は抗体である。よって、他の態様では、本発明はPROポリペプチドに結合する単離された抗体を提供する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又はヒト化抗体である。好ましくは、抗体はポリペプチドに特異的に結合する。
またさらなる態様において、本発明はPROポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関連した疾患又は疾患に対する感受性を診断する方法であって、PROポリペプチドコード化核酸配列中の前記変異の存在又は非存在を決定することを含んでなり、前記変異の存在または非存在が前記疾患又は前記疾患に対する感受性の存在を示す方法を提供する。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、（ａ）前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料、及び（ｂ）同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料におけるPROポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを分析することを含んでなり、対照試料に比較した場合の試験試料中の発現レベルの高低が、前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。PROポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、場合によっては、対照試料と比較した際の試験試料中のｍＲＮＡ又はポリペプチドのレベルの測定によってなされてもよい。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料におけるポリペプチドの有無を検出することを含んでなり、前記試験試料における前記ポリペプチドの有無が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。
【００１５】
またさらなる態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、（ａ）前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料を抗-PRO抗体と接触させ、そして（ｂ）試験試料中での前記抗体とPROポリペプチドとの複合体形成を検出することを含んでなり、前記複合体の形成が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の公知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成のモニタリングと比較して実施してもよい。試験試料における複合体形成量の多少が、試験組織細胞を得た当該哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成不全の存在を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を担持している。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で知られた他の技術によってモニターできる。試験試料は通常、心臓血管、内皮又は血管形成疾患を持つと推定される個体から得る。
他の実施態様では、本発明は、試料中のPROポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、それは、PROポリペプチドを含有すると推測される試料を抗-PRO抗体と接触させ、前記抗体の前記試料の成分への結合を測定することを含んでなる。特別な態様では、当該試料はPROポリペプチドを含むと推定される細胞を含み、抗体は細胞に結合する。抗体は、好ましくは検出可能に標識され及び／又は固体支持体に固定化される。
さらなる態様において、本発明は、抗-PRO抗体と担体とを適切な包装内に具備してなる心臓血管、内皮又は血管形成疾患の診断キットを提供する。好ましくは、そのようなキットは、前記抗体をPROポリペプチド存在検出に使用するための指示書をさらに具備する。好ましくは、担体は例えばバッファーである。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌である。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療する方法を提供し、それは、PROポリペプチドの有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、疾患は心臓肥大、創傷又は火傷などの外傷、又は癌の一型である。さらなる態様では、心臓血管、内皮又は血管形成疾患が癌の一型であるならば、哺乳動物は、血管形成術、又は心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療するための薬剤、例えばACEインヒビター、又は化学治療薬にさらに曝露される。好ましくは哺乳動物はヒト、好ましくは心臓肥大を起こす危険性のあるヒト、より好ましくは心筋梗塞を罹患しているヒトである。
他の好ましい態様において、心臓肥大は、PEG2αレベルの上昇が存在することにより特徴付けられる。あるいは、心臓肥大は心筋梗塞により誘発され、ここで、好ましくはPROポリペプチドの投与は、心筋梗塞に続いて48時間、好ましくは24時間以内に開始される。
【００１６】
他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、前記PROポリペプチドは心臓血管、内皮又は血管形成薬と共に投与される。この目的のために好ましい心臓血管、内皮又は血管形成薬は、抗高血圧薬、ACEインヒビター、エンドセリンレセプターアンタゴニスト及び血栓溶解剤からなるグループから選択される。血栓溶解剤が投与される場合、好ましくは、PROポリペプチドはこのような薬剤の投与後に投与される。より好ましくは、血栓溶解剤は組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である。
他の好ましい態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、PROポリペプチドは急性心筋梗塞の治療のための一次血管形成術に続いて投与され、ここで好ましくは、当該哺乳動物は血管形成術又は心臓血管、内皮又は血管形成薬にさらに曝露される。
他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌であり、PROポリペプチドは化学治療薬、成長阻害薬又は細胞毒性薬と組合せて投与される。
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、それは、PROポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体の有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大、外傷、癌、又は加齢性黄斑変性である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又はアンジオスタチック薬はアゴニスト、アンタゴニスト又は抗体と共に投与される。
【００１７】
またさらなる実施態様において、本発明は、心臓血管、内皮又は血管形成疾患を患っている哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法を提供し、それは、(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストのいずれかをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましい実施態様において哺乳動物はヒトである。他の好ましい実施態様において、遺伝子は、エキソビボの遺伝子治療を介して投与される。さらなる好ましい実施態様において、遺伝子はベクター、より好ましくはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、又はレトロウイルスベクター内に包含される。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターを含有する組換えレトロウイルス粒子を提供し、ここでレトロウイルスベクターはレトロウイルス構造タンパク質を付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然PROポリペプチドからのものである。
また、さらなる実施態様において、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構造体を含有し、プロモータ、(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターをさらに含有するエキソビボ産生細胞(Producer cell)を提供し、ここで当該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させる構造タンパク質を付随するレトロウイルスベクターを包含する。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を阻害する方法を提供し、それは(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長は阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、内皮細胞の成長は腫瘍又は網膜疾患に関連している。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を刺激する方法を提供し、それは(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を阻害する方法を提供し、それは(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、心臓肥大は心筋梗塞によって誘発されたものである。
【００１８】
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を刺激する方法を提供し、それは(ａ)PROポリペプチド、(ｂ)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(ｃ)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてPROポリペプチドにより誘発される血管形成を阻害する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量の抗-PRO抗体を投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてPROポリペプチドにより誘発される血管形成を刺激する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量のPROポリペプチドを投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは血管形成は組織再生又は外傷治癒を促進する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO21, PRO181, PRO205, PRO214, PRO221, PRO229, PRO231, PRO238, PRO241, PRO247, PRO256, PRO258, PRO263, PRO265, PRO295, PRO321, PRO322, PRO337, PRO363, PRO365, PRO444, PRO533, PRO697, PRO720, PRO725, PRO771, PRO788, PRO791, PRO819, PRO827, PRO828, PRO836, PRO846, PRO865, PRO1005, PRO1006, PRO1007, PRO1025, PRO1029, PRO1054, PRO1071, PRO1075, PRO1079, PRO1080, PRO1114, PRO1131, PRO1155, PRO1160, PRO1184, PRO1186, PRO1190, PRO1192, PRO1195, PRO1244, PRO1272, PRO1273, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1286, PRO1306, PRO1309, PRO1325, PRO1329, PRO1347, PRO1356, PRO1376, PRO1382, PRO1411, PRO1412, PRO1419, PRO1474, PRO1477, PRO1488, PRO1508, PRO1550, PRO1556, PRO1760, PRO1782, PRO1787, PRO1801, PRO1868, PRO1887, PRO1890, PRO3438, PRO3444, PRO4302, PRO4324, PRO4333, PRO4341, PRO4342, PRO4353, PRO4354, PRO4356, PRO4371, PRO4405, PRO4408, PRO4422, PRO4425, PRO4499, PRO5723, PRO5725, PRO5737, PRO5776, PRO6006, PRO6029, PRO6071, PRO7436, PRO9771, PRO9821, PRO9873, PRO10008, PRO10096, PRO19670, PRO20040, PRO20044, PRO21055, PRO21384又はPRO28631ポリペプチド、そのアゴニスト又はそのアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における内皮細胞の増殖を調節（例えば、阻害又は刺激）する方法であって、前記哺乳動物において内皮細胞の増殖が調節される方法を提供する。
【００１９】
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO162, PRO181, PRO182, PRO195, PRO204, PRO221, PRO230, PRO256, PRO258, PRO533, PRO697, PRO725, PRO738, PRO826, PRO836, PRO840, PRO846, PRO865, PRO982, PRO1025, PRO1029, PRO1071, PRO1080, PRO1083, PRO1134, PRO1160, PRO1182, PRO1184, PRO1186, PRO1192, PRO1265, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1306, PRO1308, PRO1309, PRO1325, PRO1337, PRO1338, PRO1343, PRO1376, PRO1387, PRO1411, PRO1412, PRO1415, PRO1434, PRO1474, PRO1488, PRO1550, PRO1556, PRO1567, PRO1600, PRO1754, PRO1758, PRO1760, PRO1787, PRO1865, PRO1868, PRO1917, PRO1928, PRO3438, PRO3562, PRO4302, PRO4333, PRO4345, PRO4353, PRO4354, PRO4405, PRO4408, PRO4430, PRO4503, PRO5725, PRO6714, PRO9771, PRO9820, PRO9940, PRO10096, PRO21055, PRO21184又はPRO21366ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における平滑筋細胞の増殖を調節（例えば、阻害又は刺激）する方法であって、前記哺乳動物において平滑筋細胞の増殖が調節される方法を提供する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO21ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における心肥大を調節（例えば、誘導又は減少）する方法であって、前記哺乳動物において心肥大が刺激される方法を提供する。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO4302ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの投与を含んでなる哺乳動物における内皮細胞のアポトーシスを調節（例えば、誘導又は減少）する方法であって、前記哺乳動物において心肥大が調節される方法を提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物へのPRO1376又はPRO1449ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を投与することを含んでなる哺乳動物における血管形成を調節（例えば、阻害又は刺激）する方法であって、前記血管形成が調節される方法を提供する。
さらに他の実施態様において、本発明は、PRO178, PRO195, PRO228, PRO301, PRO302, PRO532, PRO724, PRO730, PRO734, PRO793, PRO871, PRO938, PRO1012, PRO1120, PRO1139, PRO1198, PRO1287, PRO1361, PRO1864, PRO1873, PRO2010, PRO3579, PRO4313, PRO4527, PRO4538, PRO4553, PRO4995, PRO5730, PRO6008, PRO7223, PRO7248 or PRO7261ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物における内皮細胞管形成を調節（例えば、誘導又は減退）することにより血管形成を調節（例えば、誘導又は減退）する方法であって、前記哺乳動物における内皮細胞管形成が調節される方法を提供する。
本発明の他の実施態様において、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列を提供する。
【００２０】
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は（ｂ）（ａ）のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長PROポリペプチドｃDNAコード化配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード化配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片のコード化配列を持つDNA分子、又は（ｂ）（ａ）のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらなる態様では、本発明は（ａ）ここに開示するATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は（ｂ）（ａ）のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80％の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失しているか又は膜貫通ドメインが不活性化されているPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペプチドの膜貫通ドメインはここに開示される。従って、ここに記載されるPROポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【００２１】
他の実施態様はPROポリペプチドコード化配列の断片、又はその相補鎖に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗-PRO抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPROポリペプチドのコード化断片のハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700又は800ヌクレオチド長であり、あるいは、少なくとも約1000ヌクレオチド長であって、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス10%のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの周知の配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、定法で同定してもよいことを付言しておく。このようなPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は全てここで考慮される。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗-PRO抗体に対する結合部位を含むPROポリペプチド断片によってコードされるPROポリペプチド断片も考慮される。
【００２２】
他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。
ある態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドに対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドを提供する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示するATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものにコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドを提供する。
特別な実施態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たず、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からPROポリペプチドを回収することを含む。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した又は膜貫通ドメインが不活性化された、単離されたPROポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からPROポリペプチドを回収することを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニタリングすることを含む。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
【００２３】
またさらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチド、又はここに記載するPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は薬剤的に許容される担体である。
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-PRO抗体に起因する状態の治療において有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域に融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、天然配列PRO181 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：1）を示し、配列番号：1は、ここで「DNA23330-1390」と命名されるクローンである。
【図２】図2は、図1に示した配列番号：1のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：2）を示す。
【図３】図3は、天然配列PRO178 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：3）を示し、配列番号：3は、ここで「DNA23339-1130」と命名されるクローンである。
【図４】図4は、図3に示した配列番号：3のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：4）を示す。
【図５】図5は、天然配列PRO444 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：5）を示し、配列番号：5は、ここで「DNA26846-1397」と命名されるクローンである。
【図６】図6は、図5に示した配列番号：5のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：6）を示す。
【図７】図7は、天然配列PRO195 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：7）を示し、配列番号：7は、ここで「DNA26847-1395」と命名されるクローンである。
【図８】図8は、図7に示した配列番号：7のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：8）を示す。
【図９】図9は、天然配列PRO182 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：9）を示し、配列番号：9は、ここで「DNA27865-1091」と命名されるクローンである。
【図１０】図10は、図9に示した配列番号：9のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：10）を示す。
【図１１】図11は、天然配列PRO205 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：11）を示し、配列番号：11は、ここで「DNA30868-1156」と命名されるクローンである。
【図１２】図12は、図11に示した配列番号：11のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：12）を示す。
【図１３】図13は、天然配列PRO204 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：13）を示し、配列番号：13は、ここで「DNA30871-1157」と命名されるクローンである。
【図１４】図14は、図13に示した配列番号：13のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：14）を示す。
【図１５】図15は、天然配列PRO1873 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：15）を示し、配列番号：15は、ここで「DNA30880」と命名されるクローンである。
【図１６】図16は、図15に示した配列番号：15のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：16）を示す。
【図１７】図17は、天然配列PRO214 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：17）を示し、配列番号：17は、ここで「DNA32286-1191」と命名されるクローンである。
【図１８】図18は、図17に示した配列番号：17のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：18）を示す。
【図１９】図19は、天然配列PRO221 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：19）を示し、配列番号：19は、ここで「DNA33089-1132」と命名されるクローンである。
【図２０】図20は、図19に示した配列番号：19のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：20）を示す。
【図２１】図21は、天然配列PRO228 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：21）を示し、配列番号：21は、ここで「DNA33092-1202」と命名されるクローンである。
【図２２】図22は、図21に示した配列番号：21のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：22）を示す。
【図２３】図23は、天然配列PRO229 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：23）を示し、配列番号：23は、ここで「DNA33100-1159」と命名されるクローンである。
【図２４】図24は、図23に示した配列番号：23のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：24）を示す。
【図２５】図25は、天然配列PRO230 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：25）を示し、配列番号：25は、ここで「DNA33223-1136」と命名されるクローンである。
【図２６】図26は、図25に示した配列番号：25のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：26）を示す。
【図２７】図27は、天然配列PRO7223 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：27）を示し、配列番号：27は、ここで「DNA34385」と命名されるクローンである。
【図２８】図28は、図27に示した配列番号：27のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：28）を示す。
【図２９】図29は、天然配列PRO241 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：29）を示し、配列番号：29は、ここで「DNA34392-1170」と命名されるクローンである。
【図３０】図30は、図29に示した配列番号：29のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：30）を示す。
【図３１】図31は、天然配列PRO263 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：31）を示し、配列番号：31は、ここで「DNA34431-1177」と命名されるクローンである。
【図３２】図32は、図31に示した配列番号：31のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：32）を示す。
【図３３】図33は、天然配列PRO321 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：33）を示し、配列番号：33は、ここで「DNA34433-1308」と命名されるクローンである。
【図３４】図34は、図33に示した配列番号：33のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：34）を示す。
【図３５】図35は、天然配列PRO231 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：35）を示し、配列番号：35は、ここで「DNA34434-1139」と命名されるクローンである。
【図３６】図36は、図35に示した配列番号：35のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：36）を示す。
【図３７】図37は、天然配列PRO238 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：37）を示し、配列番号：37は、ここで「DNA35600-1162」と命名されるクローンである。
【図３８】図38は、図37に示した配列番号：37のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：38）を示す。
【図３９】図39は、天然配列PRO247 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：39）を示し、配列番号：39は、ここで「DNA35673-1201」と命名されるクローンである。
【図４０】図40は、図39に示した配列番号：39のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：40）を示す。
【図４１】図41は、天然配列PRO256 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：41）を示し、配列番号：41は、ここで「DNA35880-1160」と命名されるクローンである。
【図４２】図42は、図41に示した配列番号：41のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：42）を示す。
【図４３】図43は、天然配列PRO258 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：43）を示し、配列番号：43は、ここで「DNA35918-1174」と命名されるクローンである。
【図４４】図44は、図43に示した配列番号：43のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：44）を示す。
【図４５】図45は、天然配列PRO265 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：45）を示し、配列番号：45は、ここで「DNA36350-1158」と命名されるクローンである。
【図４６】図46は、図45に示した配列番号：45のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：46）を示す。
【図４７】図47は、天然配列PRO21 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：47）を示し、配列番号：47は、ここで「DNA36638-1056」と命名されるクローンである。
【図４８】図48は、図47に示した配列番号：47のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：48）を示す。
【図４９】図49は、天然配列PRO295 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：49）を示し、配列番号：49は、ここで「DNA38268-1188」と命名されるクローンである。
【図５０】図50は、図49に示した配列番号：49のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：50）を示す。
【図５１】図51は、天然配列PRO302 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：51）を示し、配列番号：51は、ここで「DNA40370-1217」と命名されるクローンである。
【図５２】図52は、図51に示した配列番号：51のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：52）を示す。
【図５３】図53は、天然配列PRO301 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：53）を示し、配列番号：53は、ここで「DNA40628-1216」と命名されるクローンである。
【図５４】図54は、図53に示した配列番号：53のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：54）を示す。
【図５５】図55は、天然配列PRO337 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：55）を示し、配列番号：55は、ここで「DNA43316-1237」と命名されるクローンである。
【図５６】図56は、図55に示した配列番号：55のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：56）を示す。
【図５７】図57は、天然配列PRO7248 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：57）を示し、配列番号：57は、ここで「DNA44195」と命名されるクローンである。
【図５８】図58は、図57に示した配列番号：57のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：58）を示す。
【図５９】図59は、天然配列PRO846 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：59）を示し、配列番号：59は、ここで「DNA44196-1353」と命名されるクローンである。
【図６０】図60は、図59に示した配列番号：59のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：60）を示す。
【図６１】図61は、天然配列PRO1864 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：61）を示し、配列番号：61は、ここで「DNA45409-2511」と命名されるクローンである。
【図６２】図62は、図61に示した配列番号：61のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：62）を示す。
【図６３】図63は、天然配列PRO363 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：63）を示し、配列番号：63は、ここで「DNA45419-1252」と命名されるクローンである。
【図６４】図64は、図63に示した配列番号：63のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：64）を示す。
【図６５】図65は、天然配列PRO730 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：65）を示し、配列番号：65は、ここで「DNA45624-1400」と命名されるクローンである。
【図６６】図66は、図65に示した配列番号：65のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：66）を示す。
【図６７】図67は、天然配列PRO365 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：67）を示し、配列番号：67は、ここで「DNA46777-1253」と命名されるクローンである。
【図６８】図68は、図67に示した配列番号：67のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：68）を示す。
【図６９】図69は、天然配列PRO532 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：69）を示し、配列番号：69は、ここで「DNA48335」と命名されるクローンである。
【図７０】図70は、図69に示した配列番号：69のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：70）を示す。
【図７１】図71は、天然配列PRO322 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：71）を示し、配列番号：71は、ここで「DNA48336-1309」と命名されるクローンである。
【図７２】図72は、図71に示した配列番号：71のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：72）を示す。
【図７３】図73は、天然配列PRO1120 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：73）を示し、配列番号：73は、ここで「DNA48606-1479」と命名されるクローンである。
【図７４】図74は、図73に示した配列番号：73のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：74）を示す。
【図７５】図75は、天然配列PRO7261 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：75）を示し、配列番号：75は、ここで「DNA49149」と命名されるクローンである。
【図７６】図76は、図75に示した配列番号：75のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：76）を示す。
【図７７】図77は、天然配列PRO533 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：77）を示し、配列番号：77は、ここで「DNA49435-1219」と命名されるクローンである。
【図７８】図78は、図77に示した配列番号：77のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：78）を示す。
【図７９】図79は、天然配列PRO724 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：79）を示し、配列番号：79は、ここで「DNA49631-1328」と命名されるクローンである。
【図８０】図80は、図79に示した配列番号：79のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：80）を示す。
【図８１】図81は、天然配列PRO734 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：81）を示し、配列番号：81は、ここで「DNA49817」と命名されるクローンである。
【図８２−１】図82は、図81に示した配列番号：81のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：82）を示す。
【図８２−２】図82は、図81に示した配列番号：81のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：82）を示す。
【図８３】図83は、天然配列PRO771 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：83）を示し、配列番号：83は、ここで「DNA49829-1346」と命名されるクローンである。
【図８４】図84は、図83に示した配列番号：83のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：84）を示す。
【図８５】図85は、天然配列PRO2010 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：85）を示し、配列番号：85は、ここで「DNA50792」と命名されるクローンである。
【図８６】図86は、図85に示した配列番号：85のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：86）を示す。
【図８７】図87は、天然配列PRO871 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：87）を示し、配列番号：87は、ここで「DNA50919-1361」と命名されるクローンである。
【図８８】図88は、図87に示した配列番号：87のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：88）を示す。
【図８９】図89は、天然配列PRO697 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：89）を示し、配列番号：89は、ここで「DNA50920-1325」と命名されるクローンである。
【図９０】図90は、図89に示した配列番号：89のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：90）を示す。
【図９１】図91は、天然配列PRO1083 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：91）を示し、配列番号：91は、ここで「DNA50921-1458」と命名されるクローンである。
【図９２】図92は、図91に示した配列番号：91のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：22）を示す。
【図９３】図93は、天然配列PRO725 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：93）を示し、配列番号：93は、ここで「DNA52758-1399」と命名されるクローンである。
【図９４】図94は、図93に示した配列番号：93のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：94）を示す。
【図９５】図95は、天然配列PRO720 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：95）を示し、配列番号：95は、ここで「DNA53517-1366-1」と命名されるクローンである。
【図９６】図96は、図95に示した配列番号：95のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：96）を示す。
【図９７】図97は、天然配列PRO738 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：97）を示し、配列番号：97は、ここで「DNA53915-1258」と命名されるクローンである。
【図９８】図98は、図97に示した配列番号：97のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：98）を示す。
【図９９】図99は、天然配列PRO865 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：99）を示し、配列番号：99は、ここで「DNA53974-1401」と命名されるクローンである。
【図１００】図100は、図99に示した配列番号：99のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：100）を示す。
【図１０１】図101は、天然配列PRO840 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：101）を示し、配列番号：101は、ここで「DNA53987-1438」と命名されるクローンである。
【図１０２】図102は、図101に示した配列番号：101のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：102）を示す。
【図１０３】図103は、天然配列PRO1080 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：103）を示し、配列番号：103は、ここで「DNA56047-1456」と命名されるクローンである。
【図１０４】図104は、図103に示した配列番号：103のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：104）を示す。
【図１０５】図105は、天然配列PRO1079 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：105）を示し、配列番号：105は、ここで「DNA56050-1455」と命名されるクローンである。
【図１０６】図106は、図105に示した配列番号：105のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：106）を示す。
【図１０７】図107は、天然配列PRO793 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：107）を示し、配列番号：107は、ここで「DNA56110-1437」と命名されるクローンである。
【図１０８】図108は、図107に示した配列番号：107のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：108）を示す。
【図１０９】図109は、天然配列PRO788 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：109）を示し、配列番号：109は、ここで「DNA56405-1357」と命名されるクローンである。
【図１１０】図110は、図109に示した配列番号：109のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：110）を示す。
【図１１１】図111は、天然配列PRO938 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：111）を示し、配列番号：111は、ここで「DNA56433-1406」と命名されるクローンである。
【図１１２】図112は、図111に示した配列番号：111のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：112）を示す。
【図１１３】図113は、天然配列PRO1012 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：113）を示し、配列番号：113は、ここで「DNA56439-1376」と命名されるクローンである。
【図１１４】図114は、図113に示した配列番号：113のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：114）を示す。
【図１１５】図115は、天然配列PRO1477 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：115）を示し、配列番号：115は、ここで「DNA56529-1647」と命名されるクローンである。
【図１１６】図116は、図115に示した配列番号：115のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：116）を示す。
【図１１７】図117は、天然配列PRO1134 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：117）を示し、配列番号：117は、ここで「DNA56865-1491」と命名されるクローンである。
【図１１８】図118は、図117に示した配列番号：117のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：118）を示す。
【図１１９】図119は、天然配列PRO162 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：119）を示し、配列番号：119は、ここで「DNA56965-1356」と命名されるクローンである。
【図１２０】図120は、図119に示した配列番号：119のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：120）を示す。
【図１２１】図121は、天然配列PRO1114 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：121）を示し、配列番号：121は、ここで「DNA57033-1430-1」と命名されるクローンである。
【図１２２】図122は、図121に示した配列番号：121のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：122）を示す。
【図１２３】図123は、天然配列PRO828 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：123）を示し、配列番号：123は、ここで「DNA57037-1444」と命名されるクローンである。
【図１２４】図124は、図123に示した配列番号：123のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：124）を示す。
【図１２５】図125は、天然配列PRO827 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：125）を示し、配列番号：125は、ここで「DNA57039-1402」と命名されるクローンである。
【図１２６】図126は、図125に示した配列番号：125のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：126）を示す。
【図１２７】図127は、天然配列PRO1075 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：127）を示し、配列番号：127は、ここで「DNA57689-1385」と命名されるクローンである。
【図１２８】図128は、図127に示した配列番号：127のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：128）を示す。
【図１２９】図129は、天然配列PRO1007 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：129）を示し、配列番号：129は、ここで「DNA57690-1374」と命名されるクローンである。
【図１３０】図130は、図129に示した配列番号：129のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：130）を示す。
【図１３１】図131は、天然配列PRO826 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：131）を示し、配列番号：131は、ここで「DNA57694-1341」と命名されるクローンである。
【図１３２】図132は、図131に示した配列番号：131のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：132）を示す。
【図１３３】図133は、天然配列PRO819 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：133）を示し、配列番号：132は、ここで「DNA57695-1340」と命名されるクローンである。
【図１３４】図134は、図133に示した配列番号：133のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：134）を示す。
【図１３５】図135は、天然配列PRO1006 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：135）を示し、配列番号：135は、ここで「DNA57699-1412」と命名されるクローンである。
【図１３６】図136は、図135に示した配列番号：135のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：136）を示す。
【図１３７】図137は、天然配列PRO982 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：137）を示し、配列番号：137は、ここで「DNA57700-1408」と命名されるクローンである。
【図１３８】図138は、図137に示した配列番号：137のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：138）を示す。
【図１３９】図139は、天然配列PRO1005 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：139）を示し、配列番号：139は、ここで「DNA57708-1411」と命名されるクローンである。
【図１４０】図140は、図139に示した配列番号：139のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：140）を示す。
【図１４１】図141は、天然配列PRO791 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：141）を示し、配列番号：141は、ここで「DNA57838-1337」と命名されるクローンである。
【図１４２】図142は、図141に示した配列番号：141のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：142）を示す。
【図１４３】図143は、天然配列PRO1071 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：143）を示し、配列番号：143は、ここで「DNA58847-1383」と命名されるクローンである。
【図１４４】図144は、図143に示した配列番号：143のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：144）を示す。
【図１４５】図145は、天然配列PRO1415 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：145）を示し、配列番号：145は、ここで「DNA58852-1637」と命名されるクローンである。
【図１４６】図146は、図145に示した配列番号：145のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：146）を示す。
【図１４７】図147は、天然配列PRO1054 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：147）を示し、配列番号：147は、ここで「DNA58853-1423」と命名されるクローンである。
【図１４８】図148は、図147に示した配列番号：147のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：148）を示す。
【図１４９】図149は、天然配列PRO1411 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：149）を示し、配列番号：149は、ここで「DNA59212-1627」と命名されるクローンである。
【図１５０】図150は、図149に示した配列番号：149のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：150）を示す。
【図１５１】図151は、天然配列PRO1184 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：151）を示し、配列番号：151は、ここで「DNA59220-1514」と命名されるクローンである。
【図１５２】図152は、図151に示した配列番号：151のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：152）を示す。
【図１５３】図153は、天然配列PRO1029 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：153）を示し、配列番号：153は、ここで「DNA59493-1420」と命名されるクローンである。
【図１５４】図154は、図153に示した配列番号：153のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：154）を示す。
【図１５５】図155は、天然配列PRO1139 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：155）を示し、配列番号：155は、ここで「DNA59497-1496」と命名されるクローンである。
【図１５６】図156は、図155に示した配列番号：155のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：156）を示す。
【図１５７】図157は、天然配列PRO1190 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：157）を示し、配列番号：157は、ここで「DNA59586-1520」と命名されるクローンである。
【図１５８】図158は、図157に示した配列番号：157のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：158）を示す。
【図１５９】図159は、天然配列PRO1309 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：159）を示し、配列番号：159は、ここで「DNA59588-1571」と命名されるクローンである。
【図１６０】図160は、図159に示した配列番号：159のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：160）を示す。
【図１６１】図161は、天然配列PRO836 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：161）を示し、配列番号：161は、ここで「DNA59620-1463」と命名されるクローンである。
【図１６２】図162は、図161に示した配列番号：161のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：162）を示す。
【図１６３】図163は、天然配列PRO1025 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：163）を示し、配列番号：163は、ここで「DNA59622-1334」と命名されるクローンである。
【図１６４】図164は、図163に示した配列番号：163のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：164）を示す。
【図１６５】図165は、天然配列PRO1131 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：165）を示し、配列番号：165は、ここで「DNA59777-1480」と命名されるクローンである。
【図１６６】図166は、図165に示した配列番号：165のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：166）を示す。
【図１６７】図167は、天然配列PRO1182 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：167）を示し、配列番号：167は、ここで「DNA59848-1512」と命名されるクローンである。
【図１６８】図168は、図167に示した配列番号：167のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：168）を示す。
【図１６９】図169は、天然配列PRO1155 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：169）を示し、配列番号：169は、ここで「DNA59849-1504」と命名されるクローンである。
【図１７０】図170は、図169に示した配列番号：169のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：170）を示す。
【図１７１】図171は、天然配列PRO1186 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：171）を示し、配列番号：171は、ここで「DNA60621-1516」と命名されるクローンである。
【図１７２】図172は、図171に示した配列番号：171のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：172）を示す。
【図１７３】図173は、天然配列PRO1198 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：173）を示し、配列番号：173は、ここで「DNA60622-1525」と命名されるクローンである。
【図１７４】図174は、図173に示した配列番号：173のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：174）を示す。
【図１７５】図175は、天然配列PRO1265 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：175）を示し、配列番号：175は、ここで「DNA60764-1533」と命名されるクローンである。
【図１７６】図176は、図175に示した配列番号：175のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：176）を示す。
【図１７７】図177は、天然配列PRO1361 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：177）を示し、配列番号：177は、ここで「DNA60783-1611」と命名されるクローンである。
【図１７８】図178は、図177に示した配列番号：177のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：178）を示す。
【図１７９】図179は、天然配列PRO1287 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：179）を示し、配列番号：179は、ここで「DNA61755-1554」と命名されるクローンである。
【図１８０】図180は、図179に示した配列番号：179のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：180）を示す。
【図１８１】図181は、天然配列PRO1308 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：181）を示し、配列番号：181は、ここで「DNA62306-1570」と命名されるクローンである。
【図１８２】図182は、図181に示した配列番号：181のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：182）を示す。
【図１８３】図183は、天然配列PRO4313 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：183）を示し、配列番号：183は、ここで「DNA62312-2558」と命名されるクローンである。
【図１８４】図184は、図183に示した配列番号：183のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：184）を示す。
【図１８５】図185は、天然配列PRO1192 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：185）を示し、配列番号：185は、ここで「DNA62814-1521」と命名されるクローンである。
【図１８６】図186は、図185に示した配列番号：185のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：186）を示す。
【図１８７】図187は、天然配列PRO1160 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：187）を示し、配列番号：187は、ここで「DNA62872-1509」と命名されるクローンである。
【図１８８】図188は、図187に示した配列番号：187のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：188）を示す。
【図１８９】図189は、天然配列PRO1244 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：189）を示し、配列番号：189は、ここで「DNA64883-1526」と命名されるクローンである。
【図１９０】図190は、図189に示した配列番号：189のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：190）を示す。
【図１９１】図191は、天然配列PRO1356 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：191）を示し、配列番号：191は、ここで「DNA64886-1601」と命名されるクローンである。
【図１９２】図192は、図191に示した配列番号：191のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：192）を示す。
【図１９３】図193は、天然配列PRO1274 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：193）を示し、配列番号：193は、ここで「DNA64889-1541」と命名されるクローンである。
【図１９４】図194は、図193に示した配列番号：193のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：194）を示す。
【図１９５】図195は、天然配列PRO1272 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：195）を示し、配列番号：195は、ここで「DNA64896-1539」と命名されるクローンである。
【図１９６】図196は、図195に示した配列番号：195のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：196）を示す。
【図１９７】図197は、天然配列PRO1412 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：197）を示し、配列番号：197は、ここで「DNA64897-1628」と命名されるクローンである。
【図１９８】図198は、図197に示した配列番号：197のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：198）を示す。
【図１９９】図199は、天然配列PRO1286 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：199）を示し、配列番号：199は、ここで「DNA64903-1553」と命名されるクローンである。
【図２００】図200は、図199に示した配列番号：199のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：200）を示す。
【図２０１】図201は、天然配列PRO1347 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：201）を示し、配列番号：201は、ここで「DNA64950-1590」と命名されるクローンである。
【図２０２】図202は、図201に示した配列番号：201のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：202）を示す。
【図２０３】図203は、天然配列PRO1273 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：203）を示し、配列番号：203は、ここで「DNA65402-1540」と命名されるクローンである。
【図２０４】図204は、図203に示した配列番号：203のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：204）を示す。
【図２０５】図205は、天然配列PRO1283 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：205）を示し、配列番号：205は、ここで「DNA65404-1551」と命名されるクローンである。
【図２０６】図206は、図205に示した配列番号：205のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：206）を示す。
【図２０７】図207は、天然配列PRO1279 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：207）を示し、配列番号：207は、ここで「DNA65405-1547」と命名されるクローンである。
【図２０８】図208は、図207に示した配列番号：207のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：208）を示す。
【図２０９】図209は、天然配列PRO1306 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：209）を示し、配列番号：209は、ここで「DNA65410-1569」と命名されるクローンである。
【図２１０】図210は、図209に示した配列番号：209のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：210）を示す。
【図２１１】図211は、天然配列PRO1195 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：211）を示し、配列番号：211は、ここで「DNA65412-1523」と命名されるクローンである。
【図２１２】図212は、図211に示した配列番号：211のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：212）を示す。
【図２１３】図213は、天然配列PRO4995 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：213）を示し、配列番号：213は、ここで「DNA66307-2661」と命名されるクローンである。
【図２１４】図214は、図213に示した配列番号：213のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：214）を示す。
【図２１５】図215は、天然配列PRO1382 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：215）を示し、配列番号：215は、ここで「DNA66526-1616」と命名されるクローンである。
【図２１６】図216は、図215に示した配列番号：215のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：216）を示す。
【図２１７】図217は、天然配列PRO1325 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：217）を示し、配列番号：217は、ここで「DNA66659-1593」と命名されるクローンである。
【図２１８】図218は、図217に示した配列番号：217のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：218）を示す。
【図２１９】図219は、天然配列PRO1329 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：219）を示し、配列番号：219は、ここで「DNA66660-1585」と命名されるクローンである。
【図２２０】図220は、図219に示した配列番号：219のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：220）を示す。
【図２２１】図221は、天然配列PRO1338 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：221）を示し、配列番号：221は、ここで「DNA66667-1596」と命名されるクローンである。
【図２２２】図222は、図221に示した配列番号：221のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：222）を示す。
【図２２３】図223は、天然配列PR1337 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：223）を示し、配列番号：223は、ここで「DNA66672-1586」と命名されるクローンである。
【図２２４】図224は、図223に示した配列番号：223のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：224）を示す。
【図２２５】図225は、天然配列PRO1343 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：225）を示し、配列番号：225は、ここで「DNA66675-1587」と命名されるクローンである。
【図２２６】図226は、図225に示した配列番号：225のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：226）を示す。
【図２２７】図227は、天然配列PRO1376 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：27）を示し、配列番号：27は、ここで「DNA67300-1605」と命名されるクローンである。
【図２２８】図228は、図227に示した配列番号：227のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：228）を示す。
【図２２９】図229は、天然配列PRO1434 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：229）を示し、配列番号：229は、ここで「DNA68818-2536」と命名されるクローンである。
【図２３０】図230は、図229に示した配列番号：229のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：230）を示す。
【図２３１】図231は、天然配列PRO3579 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：231）を示し、配列番号：231は、ここで「DNA68862-2546」と命名されるクローンである。
【図２３２】図232は、図231に示した配列番号：231のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：232）を示す。
【図２３３】図233は、天然配列PRO1387 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：233）を示し、配列番号：233は、ここで「DNA68872-1620」と命名されるクローンである。
【図２３４】図234は、図233に示した配列番号：233のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：234）を示す。
【図２３５】図235は、天然配列PRO1419 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：235）を示し、配列番号：235は、ここで「DNA71290-1630」と命名されるクローンである。
【図２３６】図236は、図235に示した配列番号：235のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：236）を示す。
【図２３７】図237は、天然配列PRO1488 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：237）を示し、配列番号：237は、ここで「DNA73736-1657」と命名されるクローンである。
【図２３８】図238は、図237に示した配列番号：237のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：238）を示す。
【図２３９】図239は、天然配列PRO1474 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：239）を示し、配列番号：239は、ここで「DNA73739-1645」と命名されるクローンである。
【図２４０】図240は、図239に示した配列番号：239のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：240）を示す。
【図２４１】図241は、天然配列PRO1508 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：241）を示し、配列番号：241は、ここで「DNA73742-1662」と命名されるクローンである。
【図２４２】図242は、図241に示した配列番号：241のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：242）を示す。
【図２４３】図243は、天然配列PRO1754 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：243）を示し、配列番号：243は、ここで「DNA76385-1692」と命名されるクローンである。
【図２４４】図244は、図243に示した配列番号：243のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：244）を示す。
【図２４５】図245は、天然配列PRO1550 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：245）を示し、配列番号：245は、ここで「DNA76393-1664」と命名されるクローンである。
【図２４６】図246は、図245に示した配列番号：245のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：246）を示す。
【図２４７】図247は、天然配列PRO1758 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：247）を示し、配列番号：247は、ここで「DNA76399-1700」と命名されるクローンである。
【図２４８】図248は、図247に示した配列番号：247のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：248）を示す。
【図２４９】図249は、天然配列PRO1917 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：249）を示し、配列番号：249は、ここで「DNA76400-2528」と命名されるクローンである。
【図２５０】図250は、図249に示した配列番号：249のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：250）を示す。
【図２５１】図251は、天然配列PRO1787 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：251）を示し、配列番号：251は、ここで「DNA76510-2504」と命名されるクローンである。
【図２５２】図252は、図251に示した配列番号：251のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：252）を示す。
【図２５３】図253は、天然配列PRO1556 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：253）を示し、配列番号：253は、ここで「DNA76529-1666」と命名されるクローンである。
【図２５４】図254は、図253に示した配列番号：253のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：254）を示す。
【図２５５】図255は、天然配列PRO1760 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：255）を示し、配列番号：255は、ここで「DNA76532-1702」と命名されるクローンである。
【図２５６】図256は、図255に示した配列番号：255のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：256）を示す。
【図２５７】図257は、天然配列PRO1567 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：257）を示し、配列番号：257は、ここで「DNA76541-1675」と命名されるクローンである。
【図２５８】図258は、図257に示した配列番号：257のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：258）を示す。
【図２５９】図259は、天然配列PRO1600 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：259）を示し、配列番号：259は、ここで「DNA77503-1686」と命名されるクローンである。
【図２６０】図260は、図259に示した配列番号：259のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：260）を示す。
【図２６１】図261は、天然配列PRO1868 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：261）を示し、配列番号：261は、ここで「DNA77624-2515」と命名されるクローンである。
【図２６２】図262は、図261に示した配列番号：261のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：262）を示す。
【図２６３】図263は、天然配列PRO1890 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：263）を示し、配列番号：263は、ここで「DNA79230-2525」と命名されるクローンである。
【図２６４】図264は、図263に示した配列番号：263のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：264）を示す。
【図２６５】図265は、天然配列PRO1887 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：265）を示し、配列番号：265は、ここで「DNA79862-2522」と命名されるクローンである。
【図２６６】図266は、図265に示した配列番号：265のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：266）を示す。
【図２６７】図267は、天然配列PRO4353 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：267）を示し、配列番号：267は、ここで「DNA80145-2594」と命名されるクローンである。
【図２６８】図268は、図267に示した配列番号：267のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：268）を示す。
【図２６９】図269は、天然配列PRO1782 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：269）を示し、配列番号：269は、ここで「DNA80899-2501」と命名されるクローンである。
【図２７０】図270は、図269に示した配列番号：269のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：270）を示す。
【図２７１】図271は、天然配列PRO1928 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：271）を示し、配列番号：271は、ここで「DNA81754-2532」と命名されるクローンである。
【図２７２】図272は、図271に示した配列番号：271のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：272）を示す。
【図２７３】図273は、天然配列PRO1865 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：273）を示し、配列番号：273は、ここで「DNA81757-2512」と命名されるクローンである。
【図２７４】図274は、図273に示した配列番号：273のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：274）を示す。
【図２７５】図275は、天然配列PRO4341 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：275）を示し、配列番号：275は、ここで「DNA81761-2583」と命名されるクローンである。
【図２７６】図276は、図275に示した配列番号：275のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：276）を示す。
【図２７７】図277は、天然配列PRO6714 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：277）を示し、配列番号：277は、ここで「DNA82358-2738」と命名されるクローンである。
【図２７８】図278は、図277に示した配列番号：277のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：278）を示す。
【図２７９】図279は、天然配列PRO5723 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：279）を示し、配列番号：279は、ここで「DNA82361」と命名されるクローンである。
【図２８０】図280は、図279に示した配列番号：279のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：280）を示す。
【図２８１】図281は、天然配列PRO3438 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：281）を示し、配列番号：281は、ここで「DNA82364-2538」と命名されるクローンである。
【図２８２】図282は、図281に示した配列番号：281のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：282）を示す。
【図２８３】図283は、天然配列PRO6071 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：283）を示し、配列番号：283は、ここで「DNA82403-2959」と命名されるクローンである。
【図２８４】図284は、図283に示した配列番号：283のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：284）を示す。
【図２８５】図285は、天然配列PRO1801 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：285）を示し、配列番号：285は、ここで「DNA83500-2506」と命名されるクローンである。
【図２８６】図286は、図285に示した配列番号：285のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：286）を示す。
【図２８７】図287は、天然配列PRO4324 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：287）を示し、配列番号：287は、ここで「DNA83560-2569」と命名されるクローンである。
【図２８８】図288は、図287に示した配列番号：287のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：288）を示す。
【図２８９】図289は、天然配列PRO4333 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：289）を示し、配列番号：289は、ここで「DNA84210-2576」と命名されるクローンである。
【図２９０】図290は、図289に示した配列番号：289のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：290）を示す。
【図２９１】図291は、天然配列PRO4405 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：291）を示し、配列番号：291は、ここで「DNA84920-2614」と命名されるクローンである。
【図２９２】図292は、図291に示した配列番号：291のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：292）を示す。
【図２９３】図293は、天然配列PRO4356 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：293）を示し、配列番号：293は、ここで「DNA86576-2595」と命名されるクローンである。
【図２９４】図294は、図293に示した配列番号：293のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：294）を示す。
【図２９５】図295は、天然配列PRO3444 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：295）を示し、配列番号：295は、ここで「DNA87997」と命名されるクローンである。
【図２９６】図296は、図295に示した配列番号：295のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：296）を示す。
【図２９７】図297は、天然配列PRO4302 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：297）を示し、配列番号：297は、ここで「DNA92218-2554」と命名されるクローンである。
【図２９８】図298は、図297に示した配列番号：297のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：298）を示す。
【図２９９】図299は、天然配列PRO4371 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：299）を示し、配列番号：299は、ここで「DNA92233-2599」と命名されるクローンである。
【図３００】図300は、図299に示した配列番号：299のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：300）を示す。
【図３０１】図301は、天然配列PRO4354 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：301）を示し、配列番号：301は、ここで「DNA92256-2596」と命名されるクローンである。
【図３０２】図302は、図301に示した配列番号：301のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：302）を示す。
【図３０３】図303は、天然配列PRO5725 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：303）を示し、配列番号：303は、ここで「DNA92265-2669」と命名されるクローンである。
【図３０４】図304は、図303に示した配列番号：303のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：304）を示す。
【図３０５】図305は、天然配列PRO4408 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：305）を示し、配列番号：305は、ここで「DNA92274-2617」と命名されるクローンである。
【図３０６】図306は、図305に示した配列番号：305のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：306）を示す。
【図３０７】図307は、天然配列PRO9940 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：307）を示し、配列番号：307は、ここで「DNA92282」と命名されるクローンである。
【図３０８】図308は、図307に示した配列番号：307のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：308）を示す。
【図３０９】図309は、天然配列PRO5737 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：309）を示し、配列番号：309は、ここで「DNA92929-2534-1」と命名されるクローンである。
【図３１０】図310は、図309に示した配列番号：309のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：310）を示す。
【図３１１】図311は、天然配列PRO4425 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：311）を示し、配列番号：311は、ここで「DNA93011-2637」と命名されるクローンである。
【図３１２】図312は、図311に示した配列番号：311のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：312）を示す。
【図３１３】図313は、天然配列PRO4345 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：313）を示し、配列番号：313は、ここで「DNA94854-2586」と命名されるクローンである。
【図３１４】図314は、図313に示した配列番号：313のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：314）を示す。
【図３１５】図315は、天然配列PRO4342 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：315）を示し、配列番号：315は、ここで「DNA96787-2534-1」と命名されるクローンである。
【図３１６】図316は、図315に示した配列番号：315のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：316）を示す。
【図３１７】図317は、天然配列PRO3562 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：317）を示し、配列番号：317は、ここで「DNA96791」と命名されるクローンである。
【図３１８】図318は、図317に示した配列番号：317のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：318）を示す。
【図３１９】図319は、天然配列PRO4422 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：319）を示し、配列番号：319は、ここで「DNA96867-2620」と命名されるクローンである。
【図３２０】図320は、図319に示した配列番号：319のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：320）を示す。
【図３２１】図321は、天然配列PRO5776 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：321）を示し、配列番号：321は、ここで「DNA96872-2674」と命名されるクローンである。
【図３２２】図322は、図321に示した配列番号：321のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：322）を示す。
【図３２３】図323は、天然配列PRO4430 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：323）を示し、配列番号：323は、ここで「DNA96878-2626」と命名されるクローンである。
【図３２４】図324は、図323に示した配列番号：323のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：324）を示す。
【図３２５】図325は、天然配列PRO4499 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：325）を示し、配列番号：325は、ここで「DNA96889-2641」と命名されるクローンである。
【図３２６】図326は、図325に示した配列番号：325のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：326）を示す。
【図３２７】図327は、天然配列PRO4503 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：327）を示し、配列番号：327は、ここで「DNA100312-2645」と命名されるクローンである。
【図３２８】図328は、図327に示した配列番号：327のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：328）を示す。
【図３２９】図329は、天然配列PRO10008 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：329）を示し、配列番号：329は、ここで「DNA101921」と命名されるクローンである。
【図３３０】図330は、図329に示した配列番号：329のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：330）を示す。
【図３３１】図331は、天然配列PRO5730 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：331）を示し、配列番号：331は、ここで「DNA101926」と命名されるクローンである。
【図３３２】図332は、図331に示した配列番号：331のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：332）を示す。
【図３３３】図333は、天然配列PRO6008 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：333）を示し、配列番号：333は、ここで「DNA102844」と命名されるクローンである。
【図３３４】図334は、図333に示した配列番号：333のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：334）を示す。
【図３３５】図335は、天然配列PRO4527 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：335）を示し、配列番号：335は、ここで「DNA103197」と命名されるクローンである。
【図３３６】図336は、図335に示した配列番号：335のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：336）を示す。
【図３３７】図337は、天然配列PRO4538 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：337）を示し、配列番号：337は、ここで「DNA103208」と命名されるクローンである。
【図３３８】図338は、図337に示した配列番号：337のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：338）を示す。
【図３３９】図339は、天然配列PRO4553 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：339）を示し、配列番号：339は、ここで「DNA103223」と命名されるクローンである。
【図３４０】図340は、図339に示した配列番号：339のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：340）を示す。
【図３４１】図341は、天然配列PRO6006 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：341）を示し、配列番号：341は、ここで「DNA105782-2693」と命名されるクローンである。
【図３４２】図342は、図341に示した配列番号：341のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：342）を示す。
【図３４３】図343は、天然配列PRO6029 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：343）を示し、配列番号：343は、ここで「DNA105849-2704」と命名されるクローンである。
【図３４４】図344は、図343に示した配列番号：343のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：344）を示す。
【図３４５】図345は、天然配列PRO9821 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：345）を示し、配列番号：345は、ここで「DNA108725-2766」と命名されるクローンである。
【図３４６】図346は、図345に示した配列番号：345のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：346）を示す。
【図３４７】図347は、天然配列PRO9820 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：347）を示し、配列番号：347は、ここで「DNA108769-2765」と命名されるクローンである。
【図３４８】図348は、図347に示した配列番号：347のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：348）を示す。
【図３４９】図349は、天然配列PRO9771 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：349）を示し、配列番号：349は、ここで「DNA119498-2965」と命名されるクローンである。
【図３５０】図350は、図349に示した配列番号：349のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：350）を示す。
【図３５１】図351は、天然配列PRO7436 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：351）を示し、配列番号：351は、ここで「DNA119535-2756」と命名されるクローンである。
【図３５２】図352は、図351に示した配列番号：351のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：352）を示す。
【図３５３】図353は、天然配列PRO10096 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：353）を示し、配列番号：353は、ここで「DNA125185-2806」と命名されるクローンである。
【図３５４】図354は、図353に示した配列番号：353のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：354）を示す。
【図３５５】図355は、天然配列PRO19670 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：355）を示し、配列番号：355は、ここで「DNA131639-2874」と命名されるクローンである。
【図３５６】図356は、図355に示した配列番号：355のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：356）を示す。
【図３５７】図357は、天然配列PRO20044 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：357）を示し、配列番号：357は、ここで「DNA139623-2893」と命名されるクローンである。
【図３５８】図358は、図357に示した配列番号：357のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：358）を示す。
【図３５９】図359は、天然配列PRO9873 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：359）を示し、配列番号：359は、ここで「DNA143076-2787」と命名されるクローンである。
【図３６０】図360は、図359に示した配列番号：359のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：360）を示す。
【図３６１】図361は、天然配列PRO21366 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：361）を示し、配列番号：361は、ここで「DNA143276-2975」と命名されるクローンである。
【図３６２】図362は、図361に示した配列番号：361のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：362）を示す。
【図３６３】図363は、天然配列PRO20040 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：363）を示し、配列番号：363は、ここで「DNA164625-2890」と命名されるクローンである。
【図３６４】図364は、図363に示した配列番号：363のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：364）を示す。
【図３６５】図365は、天然配列PRO21184 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：365）を示し、配列番号：365は、ここで「DNA167678-2963」と命名されるクローンである。
【図３６６】図366は、図365に示した配列番号：365のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：366）を示す。
【図３６７】図367は、天然配列PRO21055 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：367）を示し、配列番号：367は、ここで「DNA170021-2923」と命名されるクローンである。
【図３６８】図368は、図367に示した配列番号：367のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：368）を示す。
【図３６９】図369は、天然配列PRO28631 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：369）を示し、配列番号：369は、ここで「DNA170212-3000」と命名されるクローンである。
【図３７０】図370は、図369に示した配列番号：369のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：370）を示す。
【図３７１】図371は、天然配列PRO21384 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：371）を示し、配列番号：371は、ここで「DNA177313-2982」と命名されるクローンである。
【図３７２】図372は、図371に示した配列番号：371のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：372）を示す。
【図３７３】図373は、天然配列PRO1449 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号：373）を示し、配列番号：373は、ここで「DNA64908-1163-1」と命名されるクローンである。
【図３７４】図374は、図373に示した配列番号：373のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：374）を示す。
【図３７５】図375は、PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を有するPRO1449のマウスオルソログを用いた、マウス胎児におけるインサイツハイブリダイゼーションのホールマウントによる結果を示す。結果から、PRO1449オルソログは発生中の脈管構造中で発現されることが示される。さらに、切片は、内皮細胞及び内皮細胞の前駆細胞中での発現を示す。
【図３７６】図376は、PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を持つPRO1449のオルソログが、多くの炎症化及び疾患性の組織の脈管構造中で発現されており、正常な成体の血管中では非常に低いか、又は欠損していることを示す。
【図３７７】図377は、PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を持つPRO1449のオルソログが、ニワトリ胎児の眼中における異所性の血管を誘導することを示す。
【００２５】
５．発明の詳細な説明
５．１．定義
「心臓血管、内皮及び血管形成疾患」、「心臓血管、内皮及び血管形成機能不全」、「心臓血管、内皮又は血管形成疾患」及び「心臓血管、内皮又は血管形成機能不全」という用語は相互交換可能に使用され、並びに血管、例えば動脈、毛細管、静脈、及び／又はリンパ管それ自体の病気の、糖尿病などの血管に影響を与える全身疾患の一部を称する。これには、血管形成及び／又は心臓血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び／又は心臓血管新生を阻害する徴候が含まれている。このような疾患には、例えば動脈の病気、例えばアテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄；静脈及びリンパ管の疾患、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎、及びリンパ浮腫；及び他の血管疾患、例えば末梢血管病、癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫、及びリンパ管肉腫、腫瘍血管形成、外傷、例えば傷、火傷、及び他に損傷を被った組織、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、腎臓病、例えば急性腎不全、及び骨粗鬆症が含まれる。また、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大、及び心不全、例えばCHFも含まれる。
ここで使用される場合の「肥大」とは、腫瘍形成に関与しない正常な成長とは無関係に組織又は構造体の大きさが増加することとして定義される。器官又は組織の肥大は個々の細胞の大きさの増加(真性肥大)、又は組織を形成する細胞数の増加(過形成)、又はその両方のいずれかによる。ある種の器官、例えば心臓は誕生後、短い期間で分割能力を失う。従って、「心臓肥大」は心臓の大きさが増加するものとして定義され、成人においては、細胞分割が付随することのない、収縮性タンパク質の含有量とミオサイトの細胞サイズの増加により特徴付けられる。肥大を刺激する原因となるストレスの特徴(例えば、プレロードの増加、アフターロードの増加、心筋梗塞の場合と同様のミオサイトの損失、収縮性の一次低下)が、反応の性質の決定において重要な役割を担っていることは明らかである。心臓肥大の初期段階は、通常、ミオフィブリルとミトコンドリアのサイズの増加、並びにミトコンドリアと核の拡大により形態学的に特徴付けられる。この段階において、筋細胞は正常なものよりもより大きくなり、細胞組織はかなり保存される。心臓肥大の段階がさらに進行すると、特定のオルガネラ、例えばミトコンドリアの数及びサイズが優先的に増加し、新規の収縮エレメントは不規則な方法で、細胞の局在領域に添加される。長年にわたって肥大を被っている細胞は、隣接するミオフィブリルを置換し、正常なＺ膜レジストレーションの破壊を引き起こす、高度に分葉された膜を有する、かなり拡大した核を含む、細胞組織体におけるより明らかな分裂を示す。「心臓肥大」という用語は、根底にある心疾患に関係なく、心筋の種々の度合いの構造的ダメージにより特徴付けられる病状の進行における全ての段階を含むように使用される。この故に、その用語は、心臓肥大の進行における生理学的病状、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄、又は心筋梗塞も含まれる。
【００２６】
「心不全」は、心臓が代謝中の組織の要求が必要とする速さで血液を送らない心機能の異常を指す。心不全は虚血、先天的、リュウマチ性又は特発的形態を含む、種々の因子が原因となり得る。
「うっ血性心不全」(CHF)は、末梢組織まで酸素化された血液を送達させるために、十分な心拍出量(経時的に心臓により押し出される血液量)を供給することのできない心臓の進行性の病状である。 CHFが進行すると、構造的及び血行力学的ダメージが生じる。これらのダメージは色々と現れ、一つの特徴的徴候は心室肥大である。CHFは多くの心疾患の共通した終末結果である。
「心筋梗塞」は、しばしば多重冠動脈血栓症を伴う、冠動脈のアテローム性動脈硬化の結果であると一般的にされている。それは、心室壁の全厚みにわたって心筋壊死がある壁内梗塞、及び心室壁を通って心外膜に至る全ての経路に伸長することなく、壊死が内皮下層、心筋壁内、又はその両方にある副心内膜(非壁内)梗塞２つのタイプに分けることができる。心筋梗塞は、血行力学的影響の変化と心臓のダメージを受けた構造及び健康なゾーンにおける変化の両方に原因があることが知られている。よって、例えば心筋梗塞により心臓の最大流出量及び心臓鼓動容量が低減する。また、心筋梗塞に関連して、間隙に生じるDNA合成が刺激され、影響を受けていない心臓領域におけるコラーゲンの形成が増加する。
長期間にわたる高血圧において、心臓のストレス及び圧力が増加する結果、例えば全末梢耐性が増加して、心臓肥大は長期間「高血圧」を付随するようになる。慢性的に圧力が加わる結果、肥大した心室の特徴は、心拡張の実行が損なわれることである。Fouad等,  J. Am. Coll. Cardiol., 4：1500-1506(1984)；Smith等,  J. Am. Coll. Cardiol., 5：869-874(1985)。長期間にわたる左心室の弛緩が、心収縮機能が正常又は通常であるにかかわらず、早期に本質的な高血圧にみられた。Hartford等,Hypertension, 6: 329-338(1984)。しかし、血圧レベルと心臓肥大との間には近い並行性はない。ヒトにおいて、抗高血圧治療に応じて左心室機能の改善が報告されているが、利尿薬(ヒドロクロロチアジド)、β-ブロッカー(プレパノロール)、又はカルシウムチャンネルブロッカー(ジルチアゼム)で治療している患者は、心拡張機能が改善されることなく左心室肥大への逆戻りがみられる。Inouye等, Am. J. Cardiol., 53：1583-7(1984)。
【００２７】
心臓肥大に関連した他の複合的心疾患は「肥大性心筋症」である。この病状は形態学的、機能的及び臨床的特性が非常に多様であること(Maron等, N. Engl. J. Med., 316：780-789(1987)；Spirito等,  N. Engl. J. Med., 320：749-755(1989)；Louie及びEdwards, PROg. Cardiovasc. Dis., 36：275-308(1994)；Wigle等, Circulation, 92：1680-1692(1995))により特徴付けられる、その異種性は全年齢の患者を悩ますという点で強調される。Spirito等, N. Engl. J. Med., 336：775-785(1997)。また、肥大心筋症の原因となる要因は多様であり、ほとんど理解されていない。一般的に、サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における変異が肥大性心筋症に関与している。近年のデータでは、β-ミオシン重鎖変異が、家族性肥大性心筋症の原因の約30から40パーセントであると計測されていることを示唆している。Watkins等, N. Engl. J. Med., 326：1108-1114(1992)；Schwartz等, Circulation, 91：532-540(1995)；Marian及びRoberts,  Circulation, 92：1336-1347(1995)；Thierfelder等, Cell, 77：701-712(1994)；Watkins等, Nat. Gen., 11：434-437(1995)。β-ミオシン重鎖の他にも、他の位置の遺伝子変異に、心臓トロポニンＴ、アルファトポミオシン、心臓ミオシン結合プロテインＣ、必須ミオシン軽鎖、及び調節性ミオシン軽鎖が含まれる。Malik及びWatkins, Curr. Opin. Cardiol., 12：295-302(1997)を参照されたい。
上弁「大動脈狭窄」は、上行大動脈が狭くなることにより特徴付けられる遺伝性血管疾患であるが、肺動脈を含む他の動脈もさらに影響をうけるおそれがある。未治療の大動脈狭窄では、心内圧力が増加し、結果として心臓肥大が生じ、最終的には心不全及び死に至る。この疾患の病因は十分には理解されていないが、中間平滑筋の過形及び肥大がことによってはこの疾患の顕著な特徴である。エラスチン遺伝子の分子変異体が大動脈狭窄の進行の病因に関与していることが、1997年7月22日公開の米国特許第5,650,282号に報告されている。
「心臓弁逆流」は心臓弁の疾患の結果による心臓病の結果として生じる。リュウマチ熱のような種々の病気は、弁オリフィスの収縮又は引っ張りを引き起こすものであるが、他の病気は、心内膜炎、心内膜又は心房オリフィスの内側の膜の炎症、及び心臓の動きに関する。欠損、例えば弁狭窄又は弁の欠損近接により、心臓腔における血液の蓄積、又は弁を通過しての血液の逆流が生じる。弁狭窄又は不全を長期間治癒しないと、心臓肥大や心筋に関連したダメージを被る結果となり、最終的には弁の交換が必要となる。
これら全て、及び心臓肥大が付随するしないに関わらず他の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療が本発明に含まれる。
【００２８】
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、例えば肝癌(hepatic carcinoma)及び肝細胞腫(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。ここでの治療に好適な癌は乳癌、大腸癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌及び上述に記した血管腫瘍に係るものである。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、131I、125I、90Y及び186Re）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗物質、抗生物質、ピリミジン類似物、５-フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類が含まれる。特定の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ara-C」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第4,675,187号参照）、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
【００２９】
「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、例えばＷｎｔ-過剰発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害薬は、Ｓ期における悪性細胞のパーセンテージをかなり低減させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻止する薬剤、例えば、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポII阻害剤、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル及びAra-Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael,編集, Chapter 1, Murakamiらによる表題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」（WB Saunders: Philadelphia, 1995）、特に13頁に見出される。さらなる例には、腫瘍壊死因子(TNF)、酸性又は塩基性FGF又は肝実質細胞成長因子(HGF)の血管形成活性を阻害又は中和可能な抗体、組織因子の凝固活性を阻害又は中和可能な抗体、プロテインＣ又はプロテインＳ(1991年2月21日に公開されたWO91/01753を参照されたい)、又はHER2レセプターに結合可能な抗体(WO89/06692)、例えば4D5抗体(及びそれらの機能的等価物)(例えばWO92/22653)が含まれる。
「治療」とは、心臓血管、内皮及び血管形成疾患の病的状態の進行の防止又は改変を意図して行われる。治療の概念は最も広い意味に使用され、任意の段階の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の防止(予防)、緩和、低減、及び治癒を特に含む。従って、「治療」は治癒的処置、及び予防的又は防止的手段の両方を称し、目的は肥大のような心臓血管、内皮及び血管形成疾患を防止し又は遅延させ（低減させ）又は改善することにある。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。疾患は、特発症、心栄養性（cardiotrophic）、又は筋栄養性の原因、又は虚血又は虚血発作、例えば心筋梗塞を含む、任意の原因の結果によるものである。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果、例えば抗肥大効果を長時間に渡って維持することを称する。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００３０】
「心臓血管、内皮及び血管形成薬」なる用語は、一般的に、心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に作用する任意の薬剤を称する。心臓血管剤の例は、血圧、心拍数、心収縮、及び内皮及び平滑筋の生物学を調節する血管ホメオスタシスを促進するもので、全因子は心臓血管病における役割を有している。これらの特定の例には、アンジオテンシン-ＩＩレセプターアンタゴニスト；エンドセリンレセプターアンタゴニスト、例えばBOSENTANＴＭ及びMOXONODINＴＭ；インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)；デス-アスパラタート-アンジオテンシンＩ；血栓溶解剤、例えばストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、t-PA、及び半減期がより長く、非常に高いフィブリン特異性を有するように設計されたｔ-ＰＡ変異体、TNK-t-PA(T103N、N117Q、KHRR(296-299)AAAAt-PA変異体, Keyt等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：3670-3674(1994))：強心薬又は昇圧薬、例えばジゴキシゲニン、及びβ-アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、及びカーベジルロール；アンジオテンシン転換酵素(ＡＣＥ)インヒビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル及びリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、及びインダパミド；及びカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル及びニカルジピンが含まれる。この種の好ましい一カテゴリーは、心臓肥大、又は心臓肥大の進行における生理学的状態、例えば血圧の上昇、大動脈狭窄又は心筋梗塞の治療に使用される治療薬である。
「血管形成薬」及び「内皮薬」は、血管形成及び／又は内皮細胞の成長、又は適切であるならば血管形成を促進する活性剤である。これには、傷の治癒を促進する因子、例えば成長ホルモン、インシュリン様成長因子-I(IGF-I)、VEGF、VIGF、PDGF、表皮成長因子(EGF)、CTGF及びそのファミリーのメンバー、EGF、及びTGF-α及びTGF-βが含まれる。
「アンジオスタチック薬」は血管形成又は管形成を阻害、又は癌細胞の成長を阻害又は防止する活性剤である。例には、上述した血管形成剤の抗体又は他のアンタゴニスト、例えばVEGFに対する抗体が含まれる。さらに、細胞治療薬、例えば細胞毒性薬、化学治療薬、成長阻害薬、アポトーシス薬、及び癌を治療する他の薬剤、例えば抗-HER-2、抗-CD20、及び生物活性及び有機化学薬が含まれる。
本発明における薬理学的意味で、活性剤、例えばPROポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の「治療的有効量」とは、哺乳動物の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有効な量を称するものであり、経験的に決定することができる。
ここで使用される場合、活性剤、例えばPROポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の「有効量」とは記載した目的の実行に有効な量を称するものであり、このような量は、所望する効果に応じて経験的に決定することができる。
ここで用いられる用語「PROポリペプチド」及び「PRO」は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、PRO／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」という用語がここで使用される実際の数値符号として与えられる「PRO／数字ポリペプチド」及び「PRO／数字」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここに記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
【００３１】
「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示される天然配列PROポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字及び下線で示した。しかし、添付の図面に開示したPROポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置１としてここに標記されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をPROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPROポリペプチドの形態を意味する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを1％未満、好ましくはそのようなドメインを0.5％未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されたように膜貫通ドメイン及び／又は細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５を越えないアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わないにかかわらず、それらのポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
ここに開示する種々のPROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び／又は添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に同定されたシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsen等, PROt. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここで同定されたシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００３２】
「PROポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、ここに開示されたような、シグナルペプチドを持つか持たないPROポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPROポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、ここに開示されたようなシグナルペプチドを持つか持たないPROポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の特に明確にされた断片と、少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%又は98%のアミノ酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150又は200アミノ酸長であり、或いは少なくとも約300アミノ酸長であり、又はそれより長い。
【００３３】
ここに定義されるPROポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PRO配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれと対照しての％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂに対して、それと、又はそれと対照して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの100倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２-３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の、「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００３４】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードでき、また他の手段ではNational Institute of Health, Bethesda, MDから得られる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝10、最小低複合長＝15/5、マルチパスｅ-値＝0.01、マルチパスの定数＝25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝25、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62である。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれに対照しての％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの100倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、ワード閾値（Ｔ）＝11、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするPROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３５】
「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」は、以下に定義するような活性なPROポリペプチドをコードする核酸分子を意味し、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のPROポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列に対して少なくとも約80％の核酸配列同一性を有する。通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無のPROポリペプチド細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の他の断片をコードする核酸配列と少なくとも約80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 又は98%の核酸配列同一性、そして、或いは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。
通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450又は600ヌクレオチド長であり、或いは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれより長い。
【００３６】
ここに同定されたPROポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PROポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また図２Ａ-Ｐに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標）V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの又はそれに対照しての％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの100倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、表４-５は、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO-DNA」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、あるいはその他、国立医療研究所, Bethesda, MDから得られる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝10、最小低複合長＝15/5、マルチパスｅ-値＝0.01、マルチパスの定数＝25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝25、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62である。
【００３７】
配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの、又はそれに対照しての％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄに対しての、それとの又はそれに対照しての或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの100倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、ワード閾値（Ｔ）＝11、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象とする比較核酸分子（即ち、対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするPROポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
他の実施態様では、PRO変異体ポリヌクレオチドは、活性なPROポリペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここでの明細書及び添付の図中に示される全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成できる。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００３８】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、自然に結合する全ての成分と結合していない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
PROポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、PRO-コード化核酸の天然源、又は抗-PRO-コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離されたPRO-コード化核酸分子又は単離された抗-PRO-コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するPRO-コード化核酸分子又は抗-PRO-コード化核酸分子とは区別される。しかし、PROポリペプチドをコードする単離された核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPROポリペプチド又は抗-PRO抗体を通常は発現する細胞に含まれるPRO-核酸分子、又は抗-PRO-核酸分子を含む。
【００３９】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのPROポリペプチドのDNAに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的ストランドがその融点より低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50％（v/v）ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％のポリビニルピロリドン／50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）42℃における50％ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA（50μg/ml）、0.1％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び55℃での50％ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハード液、10％デキストラン硫酸、及び20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37-50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００４０】
「エピトープタグ」なる修飾詞は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するのに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合するポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０から約２０のアミノ酸残基)を有する。
PRO変異体における「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するPROタンパク質の形態を称する。
ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能なPROポリペプチドに拮抗する分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、ここで同定されたPROポリペプチドに結合又は複合体化、又は他の細胞タンパク質とPROポリペプチドとの相互作用を干渉、又はPROポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する分子の能力を称するときに使用される。特に好ましい生物学的活性には、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病、並びに動脈、毛細管、静脈及び／又はリンパ管の病気、及び癌に作用する心臓肥大活性が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの一又は複数の生物学的活性、例えば適切であるならば、その分裂促進又は血管形成活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。PROポリペプチドのアンタゴニストは、PROポリペプチドの細胞レセプターへの結合に干渉する、PROポリペプチドにより活性化される細胞を無力化又は死亡させる、又はPROポリペプチドが細胞レセプターに結合した後に血管内皮細胞の活性化に干渉することにより作用する。PROポリペプチドアンタゴニストによる仲介のこのような点の全ては、この発明の目的と等しいと考えられる。アンタゴニストは、分裂促進、血管形成、又はPROポリペプチドの他の生物学的活性を阻害し、よって、腫瘍、特に固形悪性腫瘍、慢性関節リュウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化、糖尿病、他の網膜症、水晶体後繊維増殖症、年齢関連性斑変性、新血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成(グレイブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、及び慢性炎症を含む、所望しない過度の新血管新生により特徴付けられる病気又は疾患の治療に有用である。また、アンタゴニストは、所望しない過度の血管浸透性により特徴付けられる病気又は疾患、例えば脳腫瘍に関連した浮腫、悪性腫瘍に関連した腹水症、メーグス症候群、肺炎、ネフローゼ症候群、心外膜液(例えば心膜炎に関連したもの)、胸膜滲出の治療に有用である。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。
「小分子」とは、ここでは約５００ダルトン以下の分子量を有するものと定義する。
ここで使用される場合の「PROポリペプチドレセプター」なる用語は、PROポリペプチドの細胞性レセプター、通常は血管内皮細胞に見出される細胞表面レセプター、並びにPROポリペプチドに結合する能力を保持しているそれらの変異体を称する。
【００４１】
「抗体」(ABs)と「免疫グロブリン」(Igs）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域(CDR)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのCDRにより連結されたβシート配置を主にとる４つのFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRにより近接して結合せしめられ、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁[1991]を参照のこと。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００４２】
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062[1995])；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るF(ab')2断片が得られる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００４３】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントのCDRの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ領域残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するプリマタイズしたPRIMATIZEDTM抗体を含む。
【００４４】
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、sFvが抗原結合に対する所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間に更に含んでいる。sFvのレビューには、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編(Springer-Verlag, New York, 1994)pp.269-315を参照されたい。
「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を同じポリペプチド鎖(VH-VL)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号；国際公開93/11161号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」、又は「特異的である」抗体は、他の如何なるポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合することなく特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合するものである。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に複合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。検出可能な標識として提供できる放射性核種は、例えば、I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、At-211、Cu-67、Bi-212、及びPd-109を含む。また、標識は毒素などの検出できない物質であってもよい。
【００４５】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（PROポリペプチド又はここに開示されているそれらの抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA（IgA-1及びIgA-2を含む）、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
以下に示すように、表１はALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの安全なソースコードを与える。このソースコードは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを与える。
さらに、表２−５は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた％アミノ酸配列同一性（表２−３）及び％核酸配列同一性（表４−５）を決定するために下記の方法を使用した仮説的例示を示す図であり、「PRO」は対象とする仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「PRO」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「PRO-ＤＮＡ」は対象とするPRO-コード化核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「PRO-ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
５．２．本発明の組成物及び方法
５．２．１．PRO変異体
ここに記載した全長天然配列PROに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PROポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列PRO又はここに記載したPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROポリペプチドと比較した場合にPROポリペプチドのアミノ酸配列が変化するPROポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のPROポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟型天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
【００５１】
特別の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換を示し又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
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【００５２】
PROポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, PRO; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００５３】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該技術において公知の技術を使用して作成することができる。部位指向性突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他の周知の技術が、PRO変異体DNAを製造するために、クローン化されたDNAに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244：1081-1085(1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５４】
５．２．２．PROポリペプチドの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROポリペプチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-PRO抗体の精製方法及びその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００５５】
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PROポリペプチドに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列PROポリペプチドに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この成句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PROポリペプチド（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【００５６】
PROポリペプチド上に糖鎖の数を増加させる他の方法は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
PROポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
PROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、PROポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【００５７】
また、本発明のPROは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、種々の組織への送達、及び、より特別には、例えば、ヒト免疫欠損ウィルスのTATタンパク質のタンパク質伝達ドメインを用いて、脳−血管関門を通過、のためにPROポリペプチドを標的とするタンパク質伝達ドメインとPROポリペプチドとの融合を含む（Schwarze等, 1999, Science 285:1659-72）。
他の実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-His）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-His-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；KT3エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPROポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてPROポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００５８】
５．２．３．PROポリペプチドの調製
本発明は、本出願においてPROポリペプチドと称される、新規に同定及び単離されたヌクレオチド配列コード化ポリペプチドを提供するものである。特に、PROポリペプチドをコードするｃDNAは、以下の実施例にさらなる詳細が開示されているようにして、同定され単離される。分離発現環状部に生産されるタンパク質は、異なるPRO番号が付与されるが、ＵＮＱ番号は任意の付与されるDNA及びコード化タンパク質で唯一であり、変わることはないであろう。しかしながら、簡単にする目的で、本出願においては、PRO DNAにコードされるタンパク質、さらなる天然相同体、及びPROポリペプチドの先の定義に含まれる変異体は、由来又は調製方法に無関係に、それぞれ「PRO」と称される。
以下の説明は、主として、PROポリペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、PROポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい。Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis,(W.H. Freeman Co., San Francisco, CA 1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROポリペプチドを生産してもよい。
【００５９】
５．２．３．１．PROポリペプチドをコードするDNAの単離
PROポリペプチドをコードするDNAは、PROポリペプチドをコードするmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPROポリペプチドをコードするDNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPROポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, 上掲に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のPROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである。Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
下記の実施例には、cDNAライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリスクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長配列に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、相同性を測定する種々のアルゴリズムを使用する、コンピュータソフトウエアプログラム、例えばALIGN、DNAstar及びINHERITにより決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００６０】
５．２．３．２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPROポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、CaPO4処理及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願公開公報第WO89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336: 348-352 (1988)を参照のこと。
【００６１】
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞を含む。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294（ATCC31,446）；大腸菌X1776（ATCC31,537）；大腸菌株W3110（ATCC27,325）及びK5772（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス41P）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP omp Tkanrを有する大腸菌W3110株27C7（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvGkanrを有する大腸菌W3110株37D6；非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces Pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
グリコシル化PROポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００６３】
５．２．３．３．複製可能なベクターの選択及び使用
PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、配列が分泌されるならば、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPROをコードするDNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６４】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PROポリペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である。Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ATCC番号４４０７６あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。
発現及びクローニングベクターは、通常、PROポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたPROをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ(Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980))又は他の糖分解酵素(Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987))、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【００６５】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからPRO核酸の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROポリペプチドをコードする配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００６６】
５．２．３．４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びDNA−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPROポリペプチドをコードするDNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
５．２．３．５．PROポリペプチドの精製
PROポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-XTM100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (Springer-Verlag, New York 1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
【００６７】
５．２．４．PROポリペプチドの用途
５．２．４．１．心臓血管、内皮及び血管形成活性のアッセイ
種々のアッセイがここで記載されたポリペプチドの心臓血管、内皮及び血管形成活性をテストするために使用可能である。これらのアッセイは、以下の実施例中にて提供されるものも含む。
米国特許第5,773,414号に開示されているエンドセリンアンタゴニスト活性をテストするアッセイには、レセプターアッセイにおけるポリペプチドのヨード化エンドセリン-Ｉ結合を阻害する能力をテストするラット心室結合アッセイ、ウサギ腎動脈平滑筋細胞を使用し、放射能標識されたエンドセリン-Ｉの無傷細胞結合性をテストするエンドセリンレセプタ結合アッセイ、機能活性が第２のメッセッンジャーの細胞内レベルを測定することにより、Rat-I細胞内で測定されるイノシトールホスファート蓄積アッセイ、雄のニュージーランドウサギの内皮を使用するインビトロ(単離された血管)の研究、及びＳＤラットを使用するインビボの研究において、添加化合物の、培養血管平滑筋内に放出されるエンドセリン刺激アラキドン酸を低減させる能力を測定するアラキドン酸放出アッセイが含まれる。
組織生成活性のアッセイには、限定するものではないが、WO95/16035(骨、軟骨、腱)、；WO95/05846(神経、ニューロン)、及びWO91/07491(皮膚、内皮)に記載されているものが含まれる。
傷治癒活性のアッセイには、例えば、Eaglstein及びMertz,  J. Invest. Dermatol., 71：382-384(1978)の論文で改変されている、Winter, Epidermal Wound  Healing, Maibach, HI及びRovee, DT,編(Year Book Medical Publishers. Inc., Chicago),pp71-112に記載されているものが含まれる。
エンドセリンB1(ETB1)レセプターポリペプチドに結合し、シグナル変換活性を調節するPROポリペプチドに関連したテスト用分子のスクリーニングアッセイは、米国特許第5,773,223号に記載されたようにして、エンドセリンB1レセプターポリペプチドをコードするDNAで形質転換した宿主細胞を提供し、テスト用候補薬に細胞を曝露し、エンドセリンB1レセプターシグナル変換活性を測定する。
心肥大アッセイにはいくつかある。インビトロアッセイには、成体ラット心臓ミオサイトの拡散の誘導が含まれる。このアッセイにおいて、心室ミオサイトは、Piperら,「Adult ventricular rat heart muscle cells」,  Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. H.M. Piper. ed(Berlin：Springer-Verlag,1990),pp.36-60により詳細に記載されている手順を改変したものに本質的に従って、単一の(雄のＳＤ)ラットから単離される。この手順により、成長心室ミオサイトの単離、及び桿体フェノタイプ細胞の長期間にわたる培養が可能になる。フェニレフリンとプロスタグランジンF2α(PGF2α)は、これら成長細胞の転移反応を誘発することが示されている。種々の心肥大の潜在的インヒビターによる、PGF2α又はPGF2α類似体(例えばフルプロステノール)及びフェニレフリンにより誘発されるミオサイト転移阻害が次にテストされる。
【００６８】
インビボアッセイの一例は、インビボにおけるフルプロステノールにより誘発される心肥大の阻害をテストすることである。この薬理学的モデルは、フルプロステノール(PGF2αのアゴニスト類似体)の皮下注射によりラット(例えば、雄のWistar又はＳＤ)に誘発された心肥大を阻害するPROポリペプチドの能力をテストするものである。心筋梗塞に誘発される病的な心肥大のあるラットにおいて、心筋内のPGF2αが検出可能なレベルまで慢性的に上昇していることが知られている。Laiら,  Am. J. Physiol.(Heart Circ. Physiol.),  271：H2197-H2208(1996)。従って、インビボでの心筋成長におけるフルプロステノールの影響を阻害可能な因子は、心肥大の治療に有用である可能性がある。心肥大におけるPROポリペプチドの効力は、PROポリペプチドを受容しないフルプロステノール処理されたラットに対する、心臓、心室及び左心室(体重により正規化)の重量を測定することにより決定される。
インビボアッセイの他の例は、圧力負荷心肥大アッセイである。インビボテストにおいて、テスト用動物の腹部大動脈の収縮による圧力負荷心肥大を誘発することは共通している。典型的なプロトコルにおいて、ラット(例えば雄のWistar又はＳＤ)は麻酔処理され、各ラットの腹部大動脈を横隔膜の真下まで狭窄する。Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33：985-94(1955)。 大動脈を外科的切開により曝露し、短い太針を管の隣におく。大動脈を針周囲に絹糸で結紮して収縮させ、すぐに除去し、針の直径まで大動脈の管腔を低減させる。このアプローチは、例えばRossiら, Am. Heart J., 124：700-709(1992)及びO'Rourke及びReibel,  P.S.E.M.B., 200：95-100(1992)に記載されている。
また他のインビボアッセイにおいて、心肥大、続いて実験的に誘発された心筋梗塞(ＭＩ)における効果を測定する。ラットにおいて、急性ＭＩを左冠動脈結紮にて誘発し、さらにこれを心電図試験で確認する。また動物の擬似操作グループを対照動物として用意する。初期のデータには、心肥大はＭＩを有するグループに存在することが示され、体重に対し心臓重量は18％増加していることが明らかとなった。上掲のLai等。心肥大の候補ブロッカー、例えばPROポリペプチドでこれらの動物を治療し、テストした候補薬の治療可能性についての貴重な情報を提供する。ＳＤラットを使用する、心肥大の誘発におけるさらなるアッセイテストは米国特許第5,773,415号に開示されている。
【００６９】
癌において、腫瘍の病原及び進行におけるここで同定された遺伝子の役割をさらに理解し、天然PROポリペプチドの抗体及び他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む治療用候補薬の効力をテストするために、種々のよく知られた動物モデルを使用することができる。このようなモデルのインビボの性質は、ヒト患者に前兆となる反応を特に起こさせるものである。腫瘍及び癌(乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌等)の動物モデルには、非組換え及び組換え(トランスジェニク)動物が含まれる。非組換え動物モデルには、例えば齧歯動物、例えばネズミモデルが含まれる。このようなモデルは標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜移植、腎嚢下移植、又はオルソピン(orthopin)移植、例えば結腸組織に移植された結腸癌細胞を使用し、同系のマウスに腫瘍細胞を移入することにより作成することができる。例えば、1997年9月18日に公開されたPCT公開番号WO97/33551を参照されたい。おそらくは癌遺伝子の研究に最も頻繁に使用される動物種は、免疫欠損マウス、特にヌードマウスである。胸腺刺激／形成不全を有するヌードマウスがヒト腫瘍異種移植片用の宿主として成功裡に作用するという知見はこの目的への広範な使用に導いた。常染色体劣性nu遺伝子は、例えばASW、A/He、AKR、BALB/c、B10.LP、C17、C3H、C57BL、C57、CBA、DBA、DDD、I/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、NZW、P、RIII及びSJLを含む、非常に多数の明確に同族のヌードマウスに導入される。さらに、ヌードマウス以外に免疫学的欠損を受け継いだ広範囲の他の動物を育て、腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用する。さらなる詳細は、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven及びB. Winograd. eds.(CRC Press, Inc., 1991)を参照されたい。
このような動物に導入された細胞は周知の腫瘍／癌細胞、例えば上述にて列挙した任意の腫瘍細胞系、例えばB104-1細胞系(neu原腫瘍遺伝子で形質移入された安定NIH-3T3細胞系)；Caco-2(ATCC HTB-37)；又は中程度に分化したグレードIIヒト結腸腺癌細胞系、HT-29(ATCC HTB-38)、又は腫瘍及び癌からのものを誘導可能である。腫瘍又は癌細胞のサンプルは凍結及び液体窒素での保管等を含む標準的な状態で使用され、外科手術により患者から得ることができる。Karmaliら, Br. J. Cancer. 48：689-696(1983)。
【００７０】
腫瘍細胞は種々の手順によりヌードマウス等の動物に導入することができる。腫瘍の移植には、マウスの皮下(s.c.)空間が非常に適している。腫瘍は、固体ブロックとして、例えばトロカールの使用による針バイオプシー、又は細胞懸濁液を移植することもできる。固体ブロック又はトロカール移植用に適した大きさの腫瘍組織フラグメントが皮下空間に導入される。細胞懸濁液は一次腫瘍又は安定腫瘍細胞系から新鮮に調製され、皮下注射される。また、腫瘍細胞は皮下移植として注射することもできる。この位置において、移植片は真皮結合組織の下部と皮下組織との間に付与される。
乳癌の動物モデルは、Drebinら,  Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83：9129-9133(1986)に記載されたようにして、例えばラット神経芽細胞(当初単離されたneu癌遺伝子からのもの)、又はneu-形質転換NIH-3T3細胞を、ヌードマウスに移植することにより作成することができる。
同様に、結腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに結腸癌細胞を通過させ、これらの動物に腫瘍を出現せしめることにより作成することができる。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所移植モデルは、例えばWangら, Cancer Research, 54：4726-4728(1994)及びTooら, Cancer Research, 55：681-684(1995)により記載されている。このモデルはAntiCancer,Inc.,(San Diego, California)から販売されている、いわゆる「METAMOUSEＴＭ」に基づく。
動物内で生じた腫瘍は除去され、インビトロで培養することができる。ついで、インビトロ培養からの細胞を動物に継代させる。このような腫瘍はさらなるテスト又は薬剤スクリーニングの目的で役立ちうる。あるいは、継代により得られた腫瘍は単離可能で、継代前細胞及び一又は複数の継代段階の後に単離された細胞のＲＮＡは、関心のある遺伝子の差次的発現用に分析される。このような継代技術は、任意の周知の腫瘍又は癌細胞系で行うことができる。
例えば、Meth A、CMS4、CMS5、CMS21及びWEHI-164はBALB/c雌マウス(DeLeoら, J. Exp. Med., 146：720(1977))の繊維肉腫を化学的に誘発し、種々の薬剤の抗腫瘍活性を研究する高度に制御されたモデル系を提供する。Palladinoら, J. Immunol., 138：4023-4032(1987)。簡単に言えば、腫瘍細胞は細胞培養におけるインビトロで増殖される。動物に注射をする前に細胞系を洗浄し、10x106から10x107細胞／mlの細胞密度でバッファーに懸濁させる。ついで、動物に１０から１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射すると、１から３週間で腫瘍が出現する。
さらに、最も詳細に研究されている試験用腫瘍の一つであるマウスのルイス肺(3LL)癌腫を研究用腫瘍モデルとして使用することができる。この腫瘍モデルの効力は、肺の小細胞癌腫(SCCL)と診断されたヒト患者における好ましい効果と相関している。この腫瘍は、病気になったマウス、又は培養されている細胞からの腫瘍フラグメントを注射することで、正常なマウスに導入することができる。Zupiら, Br. J. Cancer, 41：suppl. 4. 30(1980)。腫瘍が単一細胞の注射から出発して、感染した細胞がかなりの高割合で生存しているという証拠が示された。この腫瘍モデルについてのさらなる情報は、Zacharski, Haemostasis, 16：300-320(1986)を参照されたい。
【００７１】
移植腫瘍を有する動物モデルにおける試験化合物の効力を評価する方法の一つは、治療前又は後の腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植腫瘍の大きさは２又は３次元のスライドカリパスで測定される。２次元に限定する測定は腫瘍の大きさを正確に反映せず；よって通常は数学的公式を使用し、対応する量に転換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。候補薬の治療効果は治療誘発性の成長が遅れ、特定の成長が遅れた場合に、より良好であると記載することができる。腫瘍成長の記載における他の重要な変数は腫瘍量が２倍になる時間である。また、腫瘍成長の算出及び記載のためのコンピュータプログラム、例えばRygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals. Wu及びSheng. eds.(Basel. 1989), p.301により報告されているプログラムを入手することができる。しかし、治療後の壊死及び炎症反応は、実際には少なくとも当初には腫瘍サイズの増加の結果となり得ることに留意されるべきである。よって、これらの変化は形態計測とフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。
さらに、組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定されたPRO遺伝子のコード化部位を、関心のある動物のゲノムに導入し、トランスジェニック動物を作成するための標準的な技術を使用して加工することができる。トランスジェニック操作の標的として提供可能な動物には、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが含まれる。このような動物に導入遺伝子を導入するための、当該技術における周知の技術には、前核のミクロ注射(米国特許第4,873,191号)；胚へのレトロウイルス媒介性遺伝子移動(例えば、Van der Puttenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82：6148-615(1985))；胚幹細胞における遺伝子を標的化(Thompsonら, Cell, 56：313-321(1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cell. Biol., 3：1803-1814(1983))；及び精子媒介性遺伝子移動が含まれる。Lavitranoら, Cell, 57：717-73(1989)。レビューには、例えば米国特許第4,736,866号を参照されたい。
本発明の目的において、トランスジェニック動物にはそれらの細胞の一部のみに導入遺伝子を担持するもの(「モザイク動物」)が含まれる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又は鎖状体で組み込むことができ、例えば、ヘッド対ヘッド又はヘッド対テイルのタンデムで組み込むことができる。また特定の細胞系への導入遺伝子の選択的導入は、例えばLaskoら,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：6232-636(1992)の技術に続いて可能である。トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は通常の技術により監視可能である。例えば、サザンブロット分析又はPCR増幅を導入遺伝子の統合を証明するために使用することができる。ついで、mRNAの発現レベルはインシトゥーハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、PCR又は免疫細胞化学等の技術を使用して分析することができる。動物は腫瘍又は癌進行の徴候のためにさらに試験される。
【００７２】
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたPROポリペプチドをコードする変更ゲノムDNAと、PROポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ここで同定されるPROポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を構築することができる。例えば、特定のPROポリペプチドをコードするｃDNAは、確立された技術に従い、該ポリペプチドをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。特定のPROポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む。例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞が選択される。例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する。例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、PROポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
ここで同定されたPROポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の効果は、自発的動物腫瘍の治療においてさらに試験することができる。この研究のための適切な標的はネコ口部扁平上皮細胞癌腫(SCC)である。ネコ口部SCCは侵入性が高く、この悪性腫瘍はネコにおいて最も一般的な口部悪性腫瘍とされ、口部腫瘍の60％以上がこの種において繰り返されると計測されている。それは遠くの部位にはめったに転移しないが、転移の発生率が低いのは、この腫瘍を有するネコの生存期間が短いことに反映されている。これらの腫瘍は、主としてネコの口腔の解剖学的構造により、通常外科手術により処理することができない。現在では、この腫瘍に対する効果的な治療はない。この研究に入る前に、各々のネコを完全な臨床実験用のバイオプシーとし、コンピュータＸ線断層撮影(CT)によりスキャンする。舌下口部扁平上皮細胞腫瘍であると診断されたネコはこの研究から除外する。舌はこのような腫瘍の結果として麻痺し、治療により腫瘍が死亡しても、動物は自分自身で食餌することができない。各々のネコを長期間繰り返し治療する。治療期間中、腫瘍の写真を毎日取り、続いて再チェックする。治療後、各ネコを他のCTスキャンにかける。CTスキャンと胸部放射線写真を、その後８週間毎に評価する。データは、対照グループに対し、生存率、反応性及び毒性において異なっていると評価した。ポジティブ反応は、好ましくは生存の質の改善及び／又はライフスパンの増加を伴う腫瘍退行の証拠を必要とする。
さらに、イヌ、ネコ及びヒヒ他の自発的動物腫瘍、例えば線維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫、又は平滑筋肉腫もテストすることができる。もちろん、イヌ及びネコの乳房腺癌は好ましいモデルであり、その外観及び性質はヒトのものと非常に似ている。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの種の腫瘍の発生率により制限される。
また、当該技術で周知の他のインビトロ及びインビボ心臓血管、内皮及び血管形成試験もここで適切である。
【００７３】
５．２．４．２．組織分布
さらなる研究、例えば種々のヒト組織におけるmRNA発現を測定することにより、ここで心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの結果を証明することができる。
上述したように、種々の組織における遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。
あるいは、種々の組織における遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRODNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外来性配列に対して調製され得る。抗体生産のための一般的な技術、及びインサイツ-ハイブリッド形成のための特定のプロトコルは以下に提供する。
【００７４】
５．２．４．３．抗体結合性の研究
心臓血管、内皮及び血管形成アッセイに使用される内皮細胞又は他の細胞におけるPROポリペプチドの効果を阻害する抗-PRO抗体の能力を試験する、心臓血管、内皮及び血管形成研究の結果は、抗体結合性を研究することで証明することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれ、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は任意の周知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で行われうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987)pp. 147-158 。
競合結合アッセイは、有限量の抗体との結合における、試験用サンプルに対して競合する標識された標準体の能力による。試験用サンプル中の標的タンパク質の量は、抗体が結合する標準体の量に対して逆比例する。結合する標準体の量の測定を容易にするため、好ましくは抗体は競合の前後に不溶化され、抗体に結合する分析物及び標準体は、便宜上、結合しないで残存する標準体及び分析物から分離する。
サンドイッチアッセイでは、検出される互いに異なる免疫原部分、又はエピトープ、又はタンパク質に結合可能な２つの抗体が使用される。サンドイッチアッセイにおいて、分析されるテスト用サンプルは、固体支持体に固定化された第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部位複合体が形成される。例えば、米国特許第4,376,110号を参照されたい。第２の抗体は検出可能な部分で、それ自身がラベルされてもよく（直接サンドイッチアッセイ）、又は検出可能な部分でラベルされた抗免疫グロブリン抗体を使用して測定してもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、一方の種類のサンドイッチアッセイはELISAアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものであるか凍結されていてもよく、パラフィンに包埋されていてもよく、防腐剤、例えばホルマリンで固定されていてもよい。
【００７５】
５．２．４．４．細胞ベースの腫瘍アッセイ
心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍のための細胞ベースのアッセイ及び動物モデルは、ここで心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの発見を立証し、さらに、ここで同定された遺伝子と所望しない心臓血管、内皮及び血管形成細胞成長の進行及び病因との関係を理解するために使用可能である。所望しない心臓血管、内皮及び血管形成細胞成長、例えば腫瘍の進行及び病因におけるここで同定された遺伝子産物の役割は、PROポリペプチドにより刺激又は阻害されると同定された細胞又は細胞系を使用して試験することができる。このような細胞には、例えば以下の実施例に示すものが含まれる。
異なるアプローチにおいて、特定の心臓血管、内皮及び血管形成疾患に係る周知の細胞種の細胞を、cDNAを用いて形質移入し、これらのcDNAが過度の成長を誘発するか、又は成長を阻害する能力を分析する。心臓血管、内皮及び血管形成疾患が癌である場合、適切な腫瘍細胞には、例えば安定腫瘍細胞系、例えばB104-1-1細胞系(neu原腫瘍遺伝子で形質移入された安定NIH-3T3細胞系)及びｒａｓ-形質移入NIH-3T3細胞が含まれ、これらは所望する遺伝子を形質移入することができ、腫瘍形成成長を監視することができる。ついで、このような形質移入細胞系を使用し、ポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物が、形質移入細胞の成長における細胞増殖抑制又は細胞毒性活性を働かせることによる、又は抗体-依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を媒介することによる腫瘍形成細胞成長を阻害する能力をテストする。さらに、ここで同定された遺伝子のコード化配列で形質移入された細胞を、心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば癌の治療用の候補薬を同定するのに使用することができる。
さらに、トランスジェニック動物の腫瘍から得られた初代培養(上述に記載)を細胞ベースのアッセイに使用することができるが、安定細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から一定の細胞系を誘導するための技術は当該技術においてよく知られている。例えばSmall等, Mol. Cell. Biol., 5：642-648(1985)を参照されたい。
【００７６】
５．２．４．５．遺伝子治療
以下の記載は、それによって疾患の症状が寛解され得る方法及び組成物に関してのものである。ある種の疾患は、少なくとも一部において、過剰レベルの遺伝子産物、又は異常な又は過剰な活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらされる。従って、そのような遺伝子産物のレベル及び／又は活性の低下がそのような疾患の症状の寛解を引き起こす。
あるいは、ある種の他の疾患は、少なくとも一部において、遺伝子発現のレベルの欠如又は低下、又は遺伝子産物活性レベルの低下によってもたらされる。従って、そのような遺伝子産物の遺伝子発現レベル及び／又は活性のレベルは、そのような疾患の症状の寛解をもたらす。
場合によっては、疾患状態における遺伝子の上方制御は、疾患状況に応答する遺伝子産物に関する防御的役割を反映する。そのような標的遺伝子の発現又は標的遺伝子産物の活性の促進は、それが発揮する防御的効果を補強することになろう。ある種の疾患状態は、そのような防御的遺伝子の異常に低いレベルの活性に起因する。また、このような場合、そのような遺伝子産物の遺伝子発現レベル及び／又は活性の増加は、そのような疾患症状の寛解をもたらすであろう。
ここに記載されるPROポリペプチド及びポリペプチジルアゴニスト及びアンタゴニストは、それらのペプチドを、しばしば遺伝子治療と呼ばれるインビボでの発現により本発明に従って用いてもよい。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はPROポリペプチドが必要とされている部位、すなわちPROポリペプチドの合成部位、もし知られているならばPROポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位(例えば傷)に、患者に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入は、複製欠陥、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸の細胞への導入を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【００７７】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPE、及びDC-Cholである；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）での形質移入を含む。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルス、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子、あるいは選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出、又はメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段により遺伝子発現を制御する他の因子を含む。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、PROポリペプチドをコードする遺伝子の存在下で転写されたとき、それに作用可能に結合し、翻訳開始配列として機能する核酸分子を含む。このようなベクター作成物はまた、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（LTR）又はその一部、及びポジティブ及びネガティブストランドプライマー結合部位を含む（これらがウイルスベクターに既に存在しない場合）。さらに、これらのベクターは、典型的には、それらが配置される宿主細胞からPROポリペプチドを分泌させるシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は哺乳動物シグナル配列、最も好ましくはPROポリペプチドのための天然シグナル配列である。場合によっては、ベクター作成物は、ポリアデニル化並びに一又は複数の制限部位を指向するシグナル及び翻訳終結配列も含む。例として、このようなベクターは典型的には5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖DNA合成の開始点、及び3'LTR又はその一部を含む。非ウイルスの他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリシン、及びデンドリマーを用いることもできる。
幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞にターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第5,681,746号に見出される。
【００７８】
５．２．４．６．診断法としての遺伝子の用途
また本発明は、診断法としてのPROポリペプチドをコードする遺伝子の用途に関する。PROポリペプチド中の変異体は腫瘍の原因であるため、変異した形態のPROポリペプチドの検出は、心臓血管、内皮及び血管形成疾患、又は心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍への感受性の診断を可能にする。
ヒトPROポリペプチドをコードする遺伝子に変異体を担持する個人は、種々の技術でDNAレベルが検出される。診断用の核酸は患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシー、及び検屍物質から得ることができる。ゲノムDNAは、分析の前にPCRを使用して酵素的に増幅させる(Saikiら, Nature, 324：163-166(1986))か、又は直接検出に使用することができる。ＲＮＡ又はcDNAは同じ目的のために使用することができる。例として、PROポリペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーを、PROポリペプチド変異体の同定及び分析に使用することができる。例えば、欠失及び挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により検出することができる。点変異(point mutations)は、PROポリペプチドをコードする放射能標識されたRNA、又はPROポリペプチドをコードする放射能標識されたアンチセンスDNA配列に対し、増幅DNAをハイブリッド形成させることにより同定することができる。完全な適合配列はRNアーゼA消化又は溶解温度の相違により非適合二重鎖と区別することができる。
DNA配列の相違に基づく遺伝子テストは、変性剤を用いるか用いないで、ゲル中のDNAフラグメントの電気泳動移動性の変化を検出することにより達成される。小配列の欠失及び挿入は高解像度のゲル電気泳動により可視化することができる。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミジン勾配ゲルにおいて区別され、異なるDNAフラグメントの移動は、特定の溶解又は部分的な溶解温度により、ゲルの異なる位置で阻害される。例えば、Myersら, Science, 230：1242(1985)。
また、特定の位置における配列変化はヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼ及びＳＩ保護、又は化学的切断方法、例えばCottonら,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：4397-4401(1985)により明らかになる。
よって、特定のDNA配列の欠失はハイブリッド形成、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直接DNA配列化、又は制限酵素、例えば制限フラグメント長のポリモルフィズム(RFLP)の使用、及びゲノムDNAのサザンブロット等の方法により達成することができる。
【００７９】
５．２．４．７．PROポリペプチドレベル検出のための用途
より便宜的なゲル電気泳動及びDNA配列化に加えて、変異はインサイツ分析で検出することもできる。
PROポリペプチドをコードする核酸の発現は、腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生に連動している。PROポリペプチドがシグナル配列を有している場合は、ｍＲＮＡは平滑筋細胞では少ないのに対して内皮細胞では高度に発現しており、このことはPROポリペプチドが血清中に存在していることを示している。従って、このPROポリペプチドのレベルの変化が腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生であることを示しているために、抗-PROポリペプチド抗体は、このような疾患の診断に使用することができる。
PROポリペプチドに特異的な抗体を固体支持体上に取り付け、標識されたPROポリペプチド及び宿主から誘導されたサンプルを固体支持体に通過させる競合アッセイを使用することもでき、固体支持体に取り付けた検出されるレベルの量はサンプル中のPROポリペプチドの量と相関関係がある。
【００８０】
５．２．４．８．染色体マッピング
また、本発明の配列は染色体同定において重要である。配列は特異的に標的とされ、個人のヒト染色体の特定の位置にハイブリッド形成させることができる。さらに、染色体の特定の部位を同定するために、現在必要である。実際の配列データ(反復多形性)に基づいたいくつかの染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置のマーキングのために入手可能である。本発明の染色体のDNAマッピングは、病気に関連した遺伝子を有する配列を相関させるために、重要な第１段階である。
簡単に言えば、配列はcDNAからＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５塩基対)を調製することにより、染色体にマッピングすることができる。３'-非翻訳領域のコンピュータ分析を使用すると、ゲノムDNAの一エクソン以上のスパンではないプライマーが素早く選択され、よって増幅プロセスがより複雑になる。これらのプライマーを、次に、個々のヒト染色体を遺伝子を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅断片を作成するであろう。
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための急速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを本発明で使用すると、サブ局部限定を、類似した方法で、大きなゲノムクローンのプール又は特定の染色体からの断片のパネルで達成することができる。同様に、その染色体へのマッピングに使用可能な他のマッピング方法には、インサイツハイブリッド形成、標識されたフローソート染色体を用いたプレスクリーニング、及び染色体特異性cDNAライブラリを組み立てるためのハイブリッド形成によるプレ選択が含まれる。
中期染色体展開へのcDNAクローンの蛍光インサイツハイブリッド形成(ＦＩＳＨ)を、正確な染色体位置を一工程で提供するために使用することができる。この技術は５００又は６００塩基と短いｃDNAで使用することができるが；２０００塩基対を越える長さのクローンは、単純な検出に対して十分なシグナル強さを有する独特の染色体位置に結合する見込みが高い。FISHには、PROポリペプチドをコードする遺伝子を誘導するクローンの使用が必要であり、長くなればなる程良好になる。例えば、２０００塩基対で良好であり、４０００塩基対でより好ましく、４０００を越えても、時間の合理的なパーセンテージの良好な結果を得るのには、おそらく必要ではない。この技術のレビューについては、Verma等, Human Chromosomes；a Manual of Basic  Techniques(Pergamon Press, New York. 1988)を参照されたい。
一度、配列を厳密な染色体位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置は遺伝子地図データと相関可能である。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Welch Medical Library)に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と病気の関係を連鎖アッセイにより同定する(物理的に隣接する遺伝子の共同相続)。
次に、病気に罹患した又は病気に罹患しなかった個体間のcDNA又はゲノム配列における差異を測定する必要がある。変異が病気に罹患し個体の数人又は全員に見出され、正常な個体では見出されない場合、変異は病気の原因であると思われる。
物理的マッピング及び遺伝子マッピング技術の現在の解像度によれば、病気に関連した染色体領域に厳密に位置するcDNAは、５０と５００潜在的原因遺伝子の間の一つである(このことは、１メガベースのマッピング解像度で、２０ｋｂ当たり１遺伝子であると仮定している)。
【００８１】
５．２．４．９．候補薬のスクリーニングアッセイ
本発明は、PROポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はPROポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPROポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるPROポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をPROポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるPROポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【００８２】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のPROポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)に開示されているようにして、(Fields及び共同研究者等［Fields及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991))に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌GAL4などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1-lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定されたPROポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【００８３】
PROポリペプチドが同時有糸分裂促進物質ConAの存在下で内皮細胞の増殖を刺激する能力を有している場合、スクリーニング方法の一例では、この能力の利点が利用される。特に、増殖アッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞を得、９６-ウェル平底培養皿(Costar, Cambridge, MA)で培養し、細胞の増殖を容易にするのに適切な反応混合物を補い、該混合物はCon-A(Calbiochem, La Jolla, CA)を含有している。Con-A及びスクリーニングされる化合物を添加し、３７℃でインキュベートした後、培養物を３−Ｈチミジンで標識し、ガラス繊維フィルター上に収集する(phD;Cambridge  Technology, Watertown, MA)。３組の培養の平均３−Ｈチミジン取り込み(cpm)を、液体シンチレーション計測器を使用して測定する(Beckman Instruments. Irvine. CA)。有意な３−(Ｈ)チミジン混入率が内皮細胞の刺激において示された。
アンタゴニストを検定するために、上述したアッセイを行うが、このアッセイにおいて、PROポリペプチドはスクリーニングされる化合物とともに添加してよく、PROポリペプチド存在下での3-(H)チミジン導入を阻害する化合物の能力が、化合物がPROポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、PROポリペプチド及び膜結合PROポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。PROポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したPROポリペプチド分子の数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがPROポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃDNAライブラリがプールに分配され、COS細胞又はPROポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したPROポリペプチドに曝露する。PROポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【００８４】
これに代わるレセプター同定のアプローチとして、標識したPROポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はPAGEに溶解させ、Ｘ線フィルムに曝露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcDNAライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PROポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有用な組成物には、限定するものではないが、標的遺伝子産物の活性及び／又は発現を阻害する抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、トリプルへリックス分子が含まれる。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPROポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが影響せず、それによりPROポリペプチドの作用を競合的に阻害するPROポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なPROポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスRNA又はDNA作成物であり、例えば、アンチセンスRNA又はDNA分子は、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスDNA又はRNAを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟PROポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの設計に使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりPROポリペプチドの転写及び生成を防止する。ここで述べるように、RNAの一部と「相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズ可能な相補性を持ち、安定な二重鎖を形成することを意味し；従って、二重鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖DNAの一本鎖がテストされ、三重鎖へリックス形成がアッセイされる。ハイブリダイズする能力は相補度とアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長い程、より多くのRNAとの塩基ミスマッチを包含することとなり、さらに安定二重鎖（又は場合によっては三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解温度を決定するための標準的な手法の使用により、可能な温度を評価することができる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリッド形成してmRNA分子のPROポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)）。
【００８５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はRNA又はそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された種類、一本鎖又は二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において、例えば、分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を改善するために修飾してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボにおいて、宿主細胞のレセプターを標的化するための）、又は細胞膜（例えば、Letsinger等, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86:6553-6556；Lemaitre等, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652；PCT公報、WO88/09810, 1988年12月15日発行を参照のこと）又は血管−脳関門（例えば、PCT公報、WO89/10134, 1988年4月25日発行を参照のこと）輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション−トリガー切断剤（例えば、Krol等, 1988, BioTechniques 6:958-976を参照のこと）又はインターカレーティング剤（Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549）などの付加的な他の集団を含んでもよい。このために、オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション−トリガー架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション−トリガー切断剤、などと結合してもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−D−ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、N6−アデニン、7−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−D−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−N６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（V）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（V）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−N−２−カルボキシプロピル）ウラシル、(acp3)w、及び２，６−ジアミノプリンを含む集団から選択される少なくとも一つの修飾された塩基部分を含んでもよい。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む集団から選択される少なくとも一つの修飾された糖部分を含んでもよい。
さらに他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はその類似体から成る集団から選択される少なくとも一つの修飾されたリン酸骨格を含む。
さらに他の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは_-アノメリックオリゴヌクレオチドである。_-アノメリックオリゴヌクレオチドは、相補的なRNAと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成するが、通常の_-ユニットとは反対に、鎖は互いに平行に並ぶ（Gautier等, 1987, Nucl. Acids. Res. 15:6625-6641）。オリゴヌクレオチドは2'-O-メチルリボヌクレオチド（Inoue等, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）、又はキメラRNA-DNA類似体である（Inoue等, 1987, Febs Lett. 215:327-330）。
本発明のオリゴヌクレオチドは当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、自動DNA合成機（Biosearch, Applied Biosystems, などから購入できるような）の使用により合成してもよい。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein等の方法（1988, Nucl. Acids Res. 16:3209）によって合成されてもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、調整された孔のガラスポリマー支持体などを用いて調製することができる（Sarin 等, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85:7448-7451）。
上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はDNAをインビボで発現させて、PROポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００８６】
アンチセンスＲＮＡ又はDNA分子は、一般的に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
潜在的アンタゴニストは、PROポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPROポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
更なる潜在的アンタゴニストはリボザイムであるが、これはRNAの特異的な切断を触媒することができる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照されたい。
特異的な認識部位でmRNAを切断するリボザイムは標的遺伝子mRNAを破壊するために使用可能であるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置でmRNAを切断する。唯一の条件は、標的mRNAは以下の２塩基配列：5'-UG-3'を持つことである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び生産は当該技術分野においてよく知られており、その全体としてここに文献により取り込まれているMyers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, （特に、833ページの図４を参照のこと）中、Haseloff及びGerlach, 1988, Nature, 334:585-591中により詳細に記載されている。
好ましくはリボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子mRNAの5'末端近くに位置するように、即ち、効率を増大し、非機能的なmRNA転写の細胞内蓄積を最小にするために加工される。
また、本発明のリボザイムは、テトラヒメナ  サーモフィラ（IVS、又はL-19 IVSRNAとして知られる）中で天然に産生され、Thomas Cech及び共同研究者（Zaug等, 1984, Science, 224:574-578；Zaug及びCech, 1986, Science, 231:470-475；Zaug等, 1986, Nature, 324:429-433；University Patents Inc.による、公開された国際特許出願番号WO88/04300；Been及びCech, 1986, Cell, 47:207-216）により広範に記述されてきたRNAエンドリボヌクレアーゼ（「Cech-タイプリボザイム」と後述される）も含む。Cech-タイプリボザイムは、標的RNA配列とハイブリダイズした後、標的RNAの切断が生じる８塩基対の活性部位を持つ。本発明は標的遺伝子中に存在する８塩基対の活性配列を標的とするこれらCech-タイプリボザイムを包含する。
アンチセンスのアプローチにおいて、リボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、改善された安定、標的化などのために）で構成され、インビボで標的遺伝子を発現する細胞へ送達される。送達の好ましい方法は、形質移入された細胞が、内在性の標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生産するように、強力で構成的なpol III又はpol IIプロモーターのコントロール下において、リボザイムをコードするDNAコンストラクトを用いることを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは酵素的であるため、低い細胞内濃度が効率化のために要求される。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のPCT公報、番号WO 97/33551を参照されたい。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【００８７】
５．２．４．１０．治療される心臓血管、内皮及び血管形成疾患のタイプ
ここで記載された心臓血管、内皮及び血管形成アッセイにおいて活性を有し、及び／又はそれらの遺伝子産物が心臓血管系に位置することが見出されているPROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病を含む種々の心臓血管、内皮及び血管形成疾患において治療用途を有していると思われる。それらの治療有効性は、動脈、毛細管、静脈、及び／又はリンパ管の病気を含みうる。以下治療例には、筋肉消耗病治療、骨粗鬆症治療、移植周囲の細胞成長を刺激するための移植固定補助、よってその意図する部位への結合を容易にするもの、組織又は血清中のＩＧＦ安定性の増加、適切であるならば、IGFレセプターへの結合性の増加(IGFがヒト骨髄赤血球及び顆粒球原種細胞の成長を高めることが、インビトロで示されているため)が含まれる。
また、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、赤血球生成又は顆粒球生成を刺激し、傷の治癒及び組織の再生を刺激し、組織、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺又は腎臓の再成長に関連した治療に関連し、内皮細胞の移動を刺激又は阻害し、及び血管性平滑筋の増殖及び内皮細胞の生産を増やすために使用することができる。PROポリペプチド又はアンタゴニストにより媒介される血管形成の増加は、虚血組織、心臓の側枝冠動脈、続いて冠動脈狭窄に有益である。アンタゴニストは、このようなポリペプチドの作用を阻害し、例えば、PROポリペプチドがそのような生成を促進する場合、傷の治癒又は胚線維症の間に、過度の結合組織の生成を制限するために使用される。これには急性心筋梗塞及び心不全が含まれる。
さらに、本発明は原因にかかわらず、治療的有効量のPROポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストを投与することによる、心臓肥大の治療に関する。目的がヒト患者の治療である場合、PROポリペプチドは、好ましくは組換えヒトPROポリペプチド(rhPROポリペプチド)である。心臓肥大の治療は、心筋梗塞、高血圧、肥大性心筋症、及び心臓弁逆流を含む、多種多様な病状の結果における、その種々の段階の任意において行うことができる。治療は、根本にある心疾患にかかわらず、心筋の構造的ダメージを有するか又は有さない、心臓肥大の進行の全ての段階に広げることができる。
分子のアンタゴニストに対抗する場合、特定の指示に対し、分子それ自身又はそのアゴニストを使用するか否かの決定は、主として、分子が新血管新生、内皮細胞の発生、又は血管形成を促進する、又はこれらの病状を阻害するか否かに依存する。例えば、分子が血管形成を促進する場合は、そのアンタゴニストは血管形成の制限又は防止が所望されている疾患の治療に有用である。このような疾病の例には、血管腫瘍、例えば血管腫、腫瘍血管形成、網膜の新血管新生、糖尿病性網膜症又は時期尚早の幼児性網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体網膜症に関連した脈絡膜、慢性関節リュウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜症、気球血管形成が続く再狭窄、瘢痕組織過剰生成、例えば外科手術の後に形成されるケロイドのようなもの、心筋梗塞の後の線維症、又は胚線維症に関連した線維症障害が含まれる。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、上述した病状の治療に直接使用されることが予期される。
【００８８】
他方、分子が血管形成を刺激する場合、指示に対し、それ自体を所望する血管形成、例えば末梢血管病、高血圧、血管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄、血栓静脈炎、リンパ管炎、リンパ浮腫、創傷治癒及び組織の修復、虚血再潅流傷害、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、慢性心疾患、心不全、例えば鬱血性心不全、及び骨粗鬆症等に使用される。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、そのアゴニスト又はアンタゴニストは血管形成が所望される病状の治療に使用される。
特定の型の病気は以下に記載され、ここでのPROポリペプチド又はそのアンタゴニストは疾患の予防、又は治療のための治療標的として、又は標的とする血管放出剤に有用なものとして提供される。アテローム性動脈硬化は、体液の蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内の繊維組織の形成により、動脈内の厚みが増した脈管内膜にプラークが蓄積することにより特徴付けられる病気である。病気は、任意の器官において大、中及び小動脈を襲う。内皮及び血管平滑筋細胞機能の変化は、これらのプラークの蓄積及び緩和を調節する、重要な役割を担っていることが知られている。
高血圧は全身性動脈、肺動脈、又は門脈系において血圧が上昇することにより特徴付けられる。上昇した血圧は、欠陥のある内皮機能及び／又は血管病に帰着するか、又はこれらに起因する。
血管炎には、巨大細胞動脈炎、タカヤス動脈炎、多発性動脈nodosa(細小血管障害形態を含む)、カワサキ病、微小多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、種々の感染症関連の血管疾患(Henoch-Schonlein prupuraを含む)が含まれる。変更内皮細胞機能はこれらの病気において重要であることが示されている。
レーノー病及びレーノー現象は、冷気にさらされた手足を通って、循環の間欠性異常欠陥により特徴付けられるものである。変更内皮細胞機能がこれらの病気において重要であることが示されている。
動脈瘤は、変更内皮細胞及び／又は血管平滑筋細胞に関連した動脈又は静脈樹状分の嚢状又は紡錘状拡張症である。
動脈再狭窄(動脈壁再狭窄)は、内皮及び血管平滑筋細胞の増殖及び機能の変更の結果によるもので、続いて血管形成を生じる。
血栓静脈炎及びリンパ管炎は静脈及びリンパ管の炎症性疾患であり、それぞれ内皮細胞機能の変更に帰着するか、及び／又は起因する。同様に、リンパ浮腫は内皮細胞機能からのリンパ管の欠陥に関連した病状である。
良性及び悪性血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞エレメントの異常な増殖及び成長により特徴付けられる。例えば、リンパ管腫は、先天的で、しばしば膀胱のリンパ系の良性腫瘍、通常新生児に生じるリンパの奇形である。膀胱腫瘍は隣接した組織内で成長する傾向にある。膀胱腫瘍は、通常、子宮頸部及び腋か領域に生じる。また、それらは四肢の軟組織でも生じる。主たる徴候は膨張であり、時折、網状に構造化されたリンパ及びリンパ球(lymphocyst)は結合組織に囲まれている。リンパ管腫は、胎性リンパ管又はそれらの欠失に不適当に結合することに起因すると仮定されている。結果は局所的にリンパドレナージを害している。Griener等, Lymphology, 4: 140-144 (1971)。
【００８９】
ここでのPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの他の用途は、成長及び／又は転移可能な腫瘍の血管新生に関与する腫瘍血管形成にある。このプロセスは新しい血管の成長に依存する。新生物及び腫瘍血管形成に係る関連した病状の例には、乳癌腫、肺癌腫、胃癌腫、食道癌腫、結腸直腸癌腫、肝臓癌腫、卵巣癌腫、テコーマ、男性胚腫、子宮頸部癌腫、子宮内膜癌腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、繊維肉腫、絨毛癌、頭部及び首部の癌、鼻咽腔癌腫、喉頭癌腫、肝臓芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌腫、血管腫、海面性血管腫、血管芽腫、膵臓癌腫、網膜癌腫、星状細胞腫、膠芽腫、シュワン細胞腫、乏突起膠細胞腫、髄芽腫、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路肉腫、甲状腺癌腫、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、phakomatosesに関連した異常な血管増殖、浮腫(例えば脳腫瘍に関連したもの)、及びMeigs症候群が含まれる。
加齢性黄斑変性(AMD)は年輩者の集団における、ひどい視覚損失に至る原因である。ＡＭＤの滲出形態は脈絡膜新血管新生及び網膜色素内皮細胞剥離により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の動的低下に関連しているため、PROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、重度のAMDを低減させるのに有用であることが予期される。
また、外傷の治癒、例えば傷の治癒及び組織の修復は、ここでのPROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが目的とする用途である。新しい血管の形成及び緩和は、本質的に組織の治癒及び修復である。この範疇には、骨、軟骨、腱、靱帯、及び／又は神経組織の成長又は再生、並びに傷の治癒及び組織の再生及び交換、及び火傷、切断、及び潰瘍の治療が含まれる。骨が正常に形成されない環境で軟骨及び／又は骨の成長を誘発するPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、骨折及び軟骨のダメージ、又はヒト及び他の動物の欠損の治療に適用される。PROポリペプチドまたはそのアゴニスト又はアンタゴニストを使用するこのような調製物は、骨折の低減及び人工関節の固定の改善において予防的に使用される。骨形成剤により誘発される新たな骨の形成は、先天的、外傷誘発性、又は腫瘍学的、切除誘発性頭蓋欠損の修復に寄与し、また美容形成外科においても有用である。
さらに、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、限定するものではないが、圧迫潰瘍、血管不全に関連した潰瘍、外科的又は外傷的な傷等を含む治癒していない傷を、より良好により早く閉塞させることを促進させるのに有用である。
またさらに、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、他の組織、例えば器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚又は内皮を含む)、筋肉(平滑筋、骨格筋又は心筋)、及び血管(血管内皮を含む)組織の生成又は再生、又はこのような組織を含む細胞成長の促進活性を示し得る。所望の効果の一部は、線維性瘢痕化を阻害又は調節して、正常な組織を再生することである。
【００９０】
またここでのPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、全身的サイトカインダメージからの病状、及び種々の組織における傷の再灌流、肺又は肝臓線維症の治療、及び再生又は保護に有用である。また、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、先駆組織又は細胞からの上述した組織の分化を促進又は阻害、又は上述した組織の成長を阻害するのに有用である。
さらに、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは歯周病の治療及び他の歯修復プロセスに使用することができる。このような薬剤は骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形成細胞の原種の分化を誘発する環境で提供される。ここでのPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、血管が、骨の回転及び成長の調節において重要な役割を担っているため、骨粗鬆症又は骨関節症の、例えば骨及び／又は軟骨修復を刺激、又は炎症プロセスにより媒介される組織破壊(コラゲナーセ活性、破骨細胞等)のプロセス又は炎症をブロックすることによる治療に有用である。
ここでPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストにあるとされる組織再生活性の他の範疇は、腱／靱帯形成である。組織が通常形成されない環境での腱／靱帯様組織又は他の組織形成を誘発するタンパク質は、ヒト及び他の動物の腱又は靱帯の裂け目、奇形、及びの腱又は靱帯の欠損の治癒に適用される。このような調製物は、腱又は靱帯組織へのダメージの予防、並びに腱又は靱帯の骨又は他の組織への固定の改善、及び腱又は靱帯組織の欠損の修復において予防的に使用される。ここでのPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの組成物により誘発される新しい腱／靱帯様組織形成は、先天的、外傷誘発性、又は他の由来による腱又は靱帯の他の欠損の修復に寄与し、また腱又は靱帯の取り付け又は修復のための美容形成外科においても有用である。ここでの組成物は、腱-又は靱帯-形成細胞を誘引、腱-又は靱帯-形成細胞の成長を刺激、腱-又は靱帯-形成細胞原種の分化を誘発、又はイクスビボでの回復インビボでの組織修復効果における腱／靱帯細胞又は原種の成長を誘発する環境で提供される。また、ここでの組成物は、腱炎、手根管症候群、及び他の腱又は靱帯欠損にも有用である。さらに組成物は、当該技術でよく知られている担体と同じ適切なマトリクス及び／又は金属イオン封鎖剤を含む。
【００９１】
PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは神経細胞の増殖、及び神経及び脳組織の再生、すなわち神経細胞又は神経組織の変性、死亡又は外傷に関与する中枢及び末梢神経系の病気及び神経障害、並びに機械的又は外傷的疾患の治療に有用である。特に、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、末梢神経系の病気、例えば末梢神経損傷、末梢神経障害及び局所的神経障害、及び中枢神経系の病気、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン病、筋萎縮性側索硬化症、及びシャイ・ドレーガー症候群の治療に使用される。本発明で治療されるさらなる病状には、機械的又は外傷的疾患、例えば脊髄疾患、頭部外傷及び脳血管疾患、例えば脳卒中が含まれる。また、化学療法又は他の医学的療法の結果による末梢神経障害も、PROポリペプチド又はそれに対するアゴニスト又はアンタゴニストを使用しての治療が可能である。
虚血-再潅流傷害は他の徴候である。内皮細胞機能不全は虚血-再潅流傷害が続いて生じる事象の後遺症の開始及び調節の両方において重要である。
慢性関節リュウマチはさらなる徴候である。血管成長及び脈管構造を通過する炎症細胞の標的は、関節炎のリュウマチ様及び血清ネガティブの形態の病因の重要な要因である。
また、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、病状の進行の防止、無症候性の患者の死を含む急死の回避のために、心臓肥大を有する患者に予防的に投与される。このような予防的治療は大きな左心室心臓肥大(成人においては最大壁厚が３５ｍｍ又はそれ以上、又は子供においてはそれに匹敵する値)のケース、又は心臓における血管腫の負荷が特に強くなった場合の例において、特に正当である。
さらにPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、肥大性心筋症と診断された患者のかなりの部分に発現する、心房細動の治療に有用である。
さらなる徴候には、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、及び心不全、例えば鬱血性心不全が含まれる。さらなる、非新生物病状には乾癬、糖尿病、及び時期尚早の網膜症、水晶体後方繊維増殖症、新血管緑内障を含む他の増殖性網膜症、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、慢性的炎症、肺炎、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水症、心膜滲出(例えば心膜炎に関連するもの)、及び胸膜滲出が含まれる。
上述した観点から、内皮細胞機能、増殖及び／又は形態を変更又はこれに衝撃を与えると示されている、ここで記載されたPROポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述した多くの又は全ての疾患の原因及び病因において重要な役割を担っており、これらの疾患を標的とする血管関連剤、又はこれらのプロセスを増大又は阻害するための治療標的として提供可能であると思われる。
【００９２】
５．２．４．１１．投与プロトコール、スケジュール、用量及び製剤
ここに記載された分子及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストは、上述した種々の疾患及び病気の予防及び治療薬として薬剤的に有用である。
PROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの治療用組成物は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編, (1980)）と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール（PEG）等の非イオン性界面活性剤を含む。
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びポリエチレングリコールである。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下状錠剤、及び徐放性製剤を含む。PROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは、典型的にはそのような媒体中に約0.1mg/mlから100mg/mlの濃度で処方される。
【００９３】
他の調製物は、形成された製品中に、PROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストを導入して含有される。このような製品は内皮細胞の成長及び血管形成の調節に使用することができる。加えて、腫瘍侵入及び転移をこれらの製品で調節してよい。
インビボ投与に用いられるPROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。PROポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、PROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。PROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の１回投与バイアルに充填されている。繰り返し使用に適切な防腐製薬組成物は、例えばポリペプチドの種類及び指示に主として依存し、
ａ）PROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト；
ｂ）溶液中のポリペプチド又は他の分子の安定性を最大にする範囲内のｐＨ、好ましくは約４-８のｐＨを維持可能なバッファー；
ｃ）主として、撹拌誘発性集合体に対しポリペプチド又は分子を安定化させる洗浄剤／界面活性剤；
ｄ）等張剤；
ｅ）フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物の群から選択される防腐剤；及び
ｆ）水；
を含有し得る。
使用される洗浄剤が非イオン性であるならば、それは、例えばポリソルベート(例えば、POLYSORBATEＴＭ(TWEENＴＭ)20、80等)、ポロキサマー(例えば、POLOXAMERＴＭ188等)であってよい。非イオン性界面活性剤を使用することにより、ポリペプチドの変性を引き起こすことなく、表面応力の剪断に調製物をさらすことができる。さらに、このような界面活性剤含有調製物は、エアゾール装置、例えば静脈投与、及びニードレスジェット注入ガンに使用されるものにおいて、使用され得る(例えば、EP257,956を参照されたい)。
等張剤は、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの液体組成物を確実に等浸透圧とするために存在し、多価糖アルコール、好ましくは３価又は高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。これらの糖アルコールは、単独で、又は組合せて使用することもできる。また、塩化ナトリウム又は他の適切な塩を、溶液を等張にするために使用してもよい。
バッファーは、所望するｐＨに応じて、アセタート、シトラート、スクシナート又はホスファートバッファーであってよい。本発明の液状調製物の一種類のｐＨは、約４から８、好ましくはほぼ生理学的ｐＨの範囲に緩衝される。
防腐剤、フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物は、使用可能な周知の抗菌薬である。
【００９４】
治療用PROポリペプチド組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。製剤は、好ましくは静脈内（i.v.）、皮下（s.c.）、又は筋肉内（i.m.）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えばEP 257,956参照）。
また、PROポリペプチドは持続放出製剤の形態で投与することもできる。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)に記載されたようなポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及びガンマエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Langer等, 上掲）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。
エチレン−酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸等の重合体は１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、37℃で水分に曝されることで、変性又は凝集し、生理活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。かかる機構によって安定性を得るための合理的な処置が考えられる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間S-S結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を変更し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリクス化合物を開発することで安定性を保証することができる。
PROポリペプチドの持続放出組成物は、リポソーム的に包括されたPROポリペプチドを含む。PROポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、DE 3,218,121、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号、及びEP 102,324等による方法によって調製する。通常、リポソームは、脂質含有量が約30モル％以上コレステロールであり、選択される割合が最適な治療法に対して調整された微小（約２００-８００オングストローム）な単ラメラ状のものである。
【００９５】
PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量は、当然のことながら、治療（予防を含む）すべき病理学的状態、投与方法、治療に用いられる化合物の型、包含される任意の同時治療、患者の年齢、体重、一般的な医学的状態、医学的履歴などの要因によって変化し、それは担当する医師の技量の範囲内で良好に決定される。従って、治療者は、最大の治療効果が得られるように、投与量を滴定し投与経路を修正する必要がある。PROポリペプチドが狭い範囲の宿主を有しているならば、ヒトの患者の治療には、ヒトPROポリペプチド、より好ましくは天然配列ヒトPROポリペプチドを含有する調製物であることが好ましい。臨床医は投与量が当該病状の治療において所望する効果が得られるまで、PROポリペプチドを投与するであろう。例えば、目的がCHFの治療である場合、この病状に関連した進行性心臓肥大を阻害する量とされる。この治療及び進行状況は、エコーカルジオグラフィーにより容易にモニターされる。同様に、肥大性心筋症の患者には、経験に基づいてPROポリペプチドを投与することができる。
上記の指針では、有効投与量は、一般的に約0.001から約1.0mg/kg、好ましくは約0.01-1.0mg/kg、最も好ましくは約0.01-0.1mg/kgの範囲内である。
成人の高血圧の治療における非経口用途では、注射の形態で、体重１ｋｇ当たり約０．０１から50mg、好ましくは約0.05から20ｍｇ、最も好ましくは１から20ｍｇのPROポリペプチドを、静脈内注射により１日に１から３回投与するのが有利である。経口投与では、PROポリペプチドをベースとする分子を、好ましくは体重1ｋｇ当たり約5ｍｇから１ｇ、好ましくは約10から100ｍｇ、１日に１から３回投与する。内毒素汚染物質、安全レベルの最小量、例えば0.5ng/mgタンパク質未満に保持すべきである。さらにヒト投与では、調製物は好ましくは滅菌され、発熱性であり、一般的に安全で、FDA Office and Biologics standardsで要求されるようにして精製される。
組織再生に使用されるPROポリペプチドを含有する製薬組成物の用量計画は、ポリペプチドの作用を変える種々の要因、例えば、形成が望まれる組織(例えば骨)の重量、傷害部位、傷害を受けた組織の状態、創傷の大きさ、傷害を受けた組織のタイプ（例えば、骨）、患者の年齢、性別、食餌、感染症の重傷度、投与時間、及び他の臨床的要因を考慮して、担当する医師により決定されるであろう。用量は、再構成に使用されるマトリクスの種類、製薬組成物の他のタンパク質含有物により変わり得る。例えば、他の周知の成長因子、例えばIGF-Iを最終組成物に添加すると、さらに用量に影響を与える。進行状況は組織／骨の成長及び／又は修復を、例えばＸ線、組織形態測定(histomorphometric determinations)及びテトラサイクリン標識化により、定期的に評価することにより監視可能である。
【００９６】
PROポリペプチド又はアンタゴニスト又はアゴニスト投与の経路は周知の方法に従い、例えば静脈内、筋肉内、脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼内、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所又は吸入経路による注射又は注入、あるいは以下に記載する持続放出系による。またPROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与され、局所的並びに全身に治療効果を発揮する。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療に特に有用であることが予期されている。
ペプチド又は小分子がアンタゴニスト又はアゴニストとして使用される場合、好ましくは、液体又は固体の形態で経口的又は非経口的に哺乳動物に投与される。
塩を形成し下記において有用な分子の薬理学的に許容可能な塩類の例には、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えばカルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えばピリジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば塩酸、硫酸塩、硝酸塩)及び有機酸塩(例えば酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩)が含まれる。
ここで記載され、骨、軟骨、腱、又は靱帯再生に有用な組成物における治療方法には、移植又は装置としての、局所的(topically)、全身的又は局部的(locally)な組成物の投与が含まれる。投与した場合、有用な治療用組成物は、発熱物質を含有しない生理学的に許容可能な形態である。さらに組成物は、骨、軟骨又は組織のダメージ部位に送達される粘性のある形態で注射されるかカプセル化されることが望ましい。局所的投与は傷の治癒及び組織の修復に適している。好ましくは、骨及び／又は軟骨の形成のためには、組成物は、骨及び／又は軟骨のダメージ部位にタンパク質含有組成物を送達せしめ、好ましくは体内に再吸収可能な骨及び軟骨を発育する構造体を提供することのできるマトリクスを含む。このようなマトリクスは他の移植医療用途に使用される材料で作成される。
【００９７】
マトリクス材料の選択は、生物学的融和性、生物分解性能、機械的特性、美容的外観、及び界面活性に基づく。組成物の特定の用途は、適切な処方により定義される。組成物の潜在的マトリクスは生物分解性であり、化学的に定義される硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリ無水物であってよい。他の潜在的マトリクスは生物分解性で生物学的に明確に定義された、例えば骨又は真皮コラーゲンである。さらなるマトリクスは純粋タンパク質又は細胞外マトリクス成分からなる。他の潜在的マトリクスは、非生物分解性であり、化学的に定義された、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミナート、又は他のセラミックスである。マトリクスは上述した任意の種類の材料、例えばポリ乳酸とヒドロキシアパタイト又はコラーゲンとリン酸三カルシウムの組合せからなるものであってもよい。生物セラミックは組成において、例えばカルシウム-アルミナート-ホスファートに変えてもよく、孔サイズ、粒子サイズ及び生物分解性能を変更するためのプロセスが施されていてもよい。
特定の一実施態様では、乳酸とグリコール酸が５０：５０(モル重量)のコポリマーであり、１５０から８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態である。いくつかの用途において、金属イオン封鎖剤、例えばカルボキシメチルセルロース、又は自己移植血塊を利用し、マトリクスからの分離から組成物を保護するのに有用である。
一好適なファミリーの金属イオン封鎖剤は、セルロース材料、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース(ヒドロキシアルキルセルロースを含む)であり、好ましくはカルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ)のカチオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギニン酸ナトリウム、ポリ(エチレングリコール)、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、及びポリ(ビニルアルコール)が含まれる。ここで有用な金属イオン封鎖剤の量は、調製物の全量に基づき、0.5-20重量％、好ましくは1-10重量％であり、ポリマーマトリクスからのポリペプチド(又はそのアンタゴニスト)の脱着を防止し、組成物に適切な操作性を付与し、さらに原細胞のマトリクスへの浸透を防止し、よって、ポリペプチド（又はそのアンタゴニスト）に原細胞の骨形成活性を助長する機会を付与するのに必要な量である。
【００９８】
５．２．４．１２．組合せ治療
当問題となる疾患の防止又は治療におけるPROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニストの効力は、同じ組成物又は別個の組成物において、これらの目的のために有効な他の薬剤と組合せるか、又は活性剤を連続して投与することにより改善される。
例えば、心肥大の治療のためには、PROポリペプチド治療は、周知の心筋ミオサイト肥大因子のインヒビター、例えばフェニレフリン等のα-アドレナリンアゴニストのインヒビター；エンドセリン-1インヒビター、例えばBOSENTANTM及びMOXONODINTM；CT-1に対するインヒビター(米国特許第5,679,545号)；LIFに対するインヒビター；ACEインヒビター；デス-アスパラタート-アンジオテンシンIインヒビター(米国特許第5,773,415号)及びアンジオテンシンIIインヒビターの投与を組合せることができる。
高血圧に関連した心臓肥大の治療のためには、PROポリペプチドを、β-アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジロール；ACEインヒビター、例えばクイナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリル；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニカルジピンと組合せて投与することができる。一般名によりここで同定された治療薬を含む遺伝子製薬用組成物は市販されており、用量、投与方法、副作用、禁忌等の製造者の使用説明書に従い投与される。例えば、Physicians'Desk Reference(Medical Economics Data Production Co.：Montvale, N.J., 1997), 51版を参照されたい。
【００９９】
心臓肥大の治療における組合せ治療用の好ましい候補薬は、β-アドレナリン様レセプターブロック剤(プロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジロール）、ベラパミル、ジフェジピン、又はジルチアゼムである。高血圧を伴う肥大の治療には、カルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニカルジピン；β-アドレナリン様レセプターブロック剤；ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド；及び／又はACEインヒビター、例えばクイナプリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリルを使用する、抗高血圧治療薬の使用が必要である。
他の徴候のために、ＰＲＯポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、当該問題における骨及び／又は軟骨欠損、傷又は組織の治療に有用な他の薬剤と組合せてもよい。このような薬剤には、種々の成長因子、例えばEGF、PDGF、TGF-α又はTGF-β、IGF、FGF、及びCTGFが含まれる。
加えて、癌の治療に使用されるPROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述にて同定したような細胞毒性薬、化学治療薬又は成長阻害薬と組合せられる。また癌の治療のために、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。
PROポリペプチド又はそのアゴニストと組合せて投与される治療薬の有効量は、医師又は獣医の裁量による。投与量とその調節は処理される病状に最大の治療効果が達成されるようになされる。例えば、高血圧の治療においては、これらの量は、理想的にはジウレティクス又はデジタルの使用、及び高血圧又は低血圧、腎損傷等を考慮に入れる。用量は、治療される特定の患者及び使用される治療薬の種類等の因子に依存する。典型的には、使用される量は、治療薬をPROポリペプチドと共に投与しない場合と同じ用量である。
【０１００】
５．２．４．１３．製造品
上述した疾患の診断又は治療に有用なPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含むキットのような製造品は、少なくとも１つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤はPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。容器上又は添付されるラベルには、組成物が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、薬剤的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【０１０１】
５．２．５．抗体
本発明の多くの有用な候補薬のいくつかは、ここで同定された遺伝子の生成、又は遺伝子生成物を阻害、及び／又は遺伝子生成物の活性を低減する抗体及び抗体フラグメントである。
５．２．５．１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０１０２】
５．２．５．２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,(New York；Academic Press, 1986) pp. 59-103。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) pp. 51-63。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０３】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる。Goding, 上掲。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲)、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントの生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０４】
５．２．５．３．ヒト及びヒト化抗体
抗-PRO抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそのフラグメント(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はCDRの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリを含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) 。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-813 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０１０５】
５．２．５．４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースの場合において、結合特異性の一方はPROポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-36569(1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１０６】
５．２．５．５．ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために（WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
５．２．５．６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ADCC）を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０１０７】
５．２．５．７．免疫抱合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はそのフラグメント）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫抱合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
抗体及び細胞毒性薬の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
５．２．５．８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズの孔のフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab'フラグメントは、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１０８】
５．２．５．９．抗体の薬剤的組成物
ここで同定されるPROポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、薬剤的組成物の形態で投与することができる。
PROポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体フラグメントを細胞に導入するのに使用できる。抗体フラグメントが用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン、化学療法剤又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１０９】
５．２．５．１０．抗体を使用する治療方法
PROポリペプチドに対する抗体を上述した種々の心臓血管、内皮及び血管形成病の治療に使用できることが予期されている。
抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
他の治療的養生法を例えば上述の本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、抗体で癌の治療をする場合は、このような抗体で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, (Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)にも記載されている。化学治療薬は、抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェン又はEVISTAＴＭ等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
また、抗体を癌の治療に使用する場合、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えば一又は複数のErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、又はVEGFレセプターに結合する抗体を投与することも好ましい。また、上述した薬剤も含む。抗体は適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。あるいは、又はそれに加えて、ここで開示されており、同じか、又は二又はそれ以上の異なる抗原に対して結合する二又はそれ以上の抗体を、患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
【０１１０】
一実施態様において、腫瘍の血管新生は、組合せ治療において攻撃される。抗-PROポリペプチド抗体及び他の抗体(例えば抗-VEGF)は、例えば腫瘍又は転移病巣の壊死がみられるように決定された治療的有効量で、腫瘍を有する患者に投与される。この治療は、好ましい効果が観察されるか、又は腫瘍又は任意の転移病巣の痕跡がなくなるまで続けられる。ついで、TNFを、補助剤、例えばアルファ-、ベータ-又はガンマ-インターフェロン、抗-ＨＥＲ２抗体、ヘレグリン(heregulin)、抗ヘレグリン抗体、Ｄ-因子、インターロイキン-１(IL-1)、インターロイキン-２(IL-2)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、又は腫瘍中の微細血管凝固促進剤、例えば抗-プロテインC抗体、抗-プロテインＳ抗体、又はC4b結合プロテイン(1991年2月21日公開のWO91/01753)、又は熱又は放射線と組合わせて投与される。
補助剤はその有効性に応じて変わり、便宜的な方式でスクリーニングされるマトリクスにより、腫瘍における影響力と比較することが望ましい。抗-PROポリペプチド抗体及びTNFの投与は、所望する臨床効果が達成されるまで繰り返される。また、抗-PROポリペプチド抗体は、ＴＮＦ、場合によっては補助剤と共に投与される。固形腫瘍が、四肢又は一般的な循環器からの単離が可能な他の位置で見出される例では、ここに記載される治療薬は単離された腫瘍又は器官に投与される。他の実施態様において、FGF又はPDGFアンタゴニスト、例えば抗-FGF又は抗-PDGF中和剤は、抗-PROポリペプチド抗体と共に患者に投与される。抗-PROポリペプチド抗体を用いた治療は、好ましくは傷の治癒又は所望する新血管新生の期間中は中止する。
心臓血管、内皮及び血管形成疾患の予防又は治療のための、ここでの抗体の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び抗体に対する反応、及び主治医の裁量による。抗体は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約1μｇ／ｋｇから50ｍｇ／ｋｇ（例えば、0.1-20ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日又は週毎の用量は、上記の要因に応じて、約1μｇ／ｋｇから100ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイ、例えばＸ線腫瘍イメージングによって容易に監視される。
【０１１１】
５．２．５．１１．抗体の製造品
また、抗体を収容する容器とラベルを含む製造品を提供する。このような製造品は上述しており、ここで活性剤は抗-PRO抗体である。
５．２．５．１２．抗体を使用する腫瘍の診断及び予知
抗体が使用される徴候が癌である場合、或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍（例えば、癌）治療の優れた標的であるが、PROポリペプチドと同じタンパク質は腫瘍の診断及び予知におけるさらなる用途が見出されている。例えば、PROポリペプチドに対して向けられる抗体は腫瘍の診断及び予知に使用することができる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、PROポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。このような結合アッセイは、実質的に上述のように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【０１１２】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の開示の全体を、出典明示によりここに取り込む。
６．実施例
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えDNA技術の標準的な手法を用いた：上掲のSambrook等; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989）; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Academic Press, Inc.; N.Y., 1990); Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis（IRL Press, Oxford, 1984）; Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【０１１３】
６．１．実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃDNAを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ECD）配列（もしあれば、分泌シグナル配列を含む）を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）及び企業のデータベース（例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ECDタンパク質配列のEST配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば（常にではない）BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及びPROポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100-1000 bp長のPCR産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に40-55bp長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1-1.5kbpより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current PROtocols in Molecular Biology, のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（pRKB又はpRKD等；pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【０１１４】
６．２．実施例２：アミラーゼスクリーニングによるcDNAクローンの単離
６．２．１．オリゴｄＴプライムcDNAライブラリの調製
ｍＲＮＡを対象とするヒト組織から、Invitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Fast Track 2）。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターpRK5DにおけるオリゴdTプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAは1000bpを越えるサイズ分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dを、sp6転写開始部位、それに続くSfiI制限酵素部位、さらにXhoI/NotI cDNAクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
６．２．２．ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの５’末端を好ましく表現するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを（上記の）一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST-AMY.0におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いてランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500-1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST-AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【０１１５】
６．２．３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌（Life Technologies、20ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、SOC培地（Life Technologies、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（37℃）。ポジティブコロニーをプレートから拾い、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCsCl-勾配を用いてDNAを単離した。精製DNAは、次いで以下の酵母プロトコールで用いた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／cDNA結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのDNAの精製。
用いた酵母菌株はHD56-5A（ATCC-90785）であった。この株は以下の遺伝子型：MATアルファ、ura3-52、leu2-3、leu2-112、his3-11、his3-15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p又はSSA1p-4p）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からYEPD複合培地ブロス（100ml）に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なYEPDブロス（500ｍｌ）中におよそ2x106細胞／ml（約ＯＤ６００＝0.1）に希釈し、1x107細胞／ml（約ＯＤ６００＝0.4-0.5）まで再成長させた。
【０１１６】
次いで細胞を回収し、5,000rpmで5分間のSorval GS3 ローターのGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして50ｍｌのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE（10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA  pH7.5, 100mMのLi2OOCCH3）で続けて洗浄し、LiAc/TE（2.5ml）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（100μl）を新鮮な変性一本鎖サケ精子DNA（Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD）及び形質転換DNA（1μg. vol.＜10μl）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE（600μl, 40%のポリエチレングリコール-４０００, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi２OOCCH３, pH 7.5）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE（1ml）中に希釈し、アリコート（200μl）を150mm成長プレート（VWR）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（SCD-Ura）であった。形質転換体は30℃で2-3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Red-120, Sigma）に結合させた。結合したデンプンをSCD-Ura寒天プレートに最終濃度0.15%（w/v）で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した（最終濃度50-100mM）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（150mmプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD-Ura寒天への赤色デンプンの直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【０１１７】
６．２．４．PCR増幅によるDNAの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（30μl）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（5μl）を、0.5μlのKlentaq（Clontech, Palo Alto, CA）; 4.0μlの10mM dNTP（Perkin Elmer-Cetus）; 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
（配列番号：３８２）であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
（配列番号：３８３）であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ．                  変性           92℃、 5分間
ｂ．次の３サイクル：  変性           92℃、30秒間
アニール       59℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｃ．次の３サイクル：  変性           92℃、30秒間
アニール       57℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｄ．次の２５サイクル：変性           92℃、30秒間
アニール       55℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｅ．                  保持           4℃
下線を施した領域は、各々ADHプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターpSST-AMY.0からの307bp領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の18ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのPCR反応の全生成物は343bpであった。しかしながら、シグナル配列融合cDNAは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
PCRに続いて、反応のアリコート（5μl）を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ボレート-EDTA(TBE)緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動により試験した。400bpより大きな単一で強いPCR産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム（Qiagen Inc., Chatsworth, CA）での精製の後にDNA配列によりさらに分析した。
【０１１８】
６．３．実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃDNAクローンの単離
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのESTs並びに集団化及び構築されたEST断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ATG）を取り囲むDNAヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のATGに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のATGが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ATGコドンを取り囲むDNA及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
【０１１９】
６．４．実施例４：ヒトPROポリペプチドをコードするｃDNAクローンの単離
上述の実施例１から３に記載された技術を用いて、多数の全長cDNAクローンがここで開示されたPROポリペプチドをコードするものとして同定された。そして、これらのｃＤＮＡは、下記の表７に示してあるように、ブダペスト条約の条項に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア  20110-2209米国(ATCC)へ寄託した。
【０１２０】
2015037408.tif 000021
2015037408.tif 000022
2015037408.tif 000023
2015037408.tif 000024
2015037408.tif 000025
2015037408.tif 000026
【０１２１】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０１２２】
６．５．実施例５：PRO1873, PRO7223, PRO7248, PRO730, PRO532, PRO7261, PRO734, PRO771, PRO2010, PRO5723, PRO3444, PRO9940, PRO3562, PRO10008, PRO5730, PRO6008, PRO4527, PRO4538及びPRO4553
添付の図中に示されるPRO1873, PRO7223, PRO7248, PRO730, PRO532, PRO7261, PRO734, PRO771, PRO2010, PRO5723, PRO3444, PRO9940, PRO3562, PRO10008, PRO5730, PRO6008, PRO4527, PRO4538及びPRO4553ポリペプチドをコードするDNA分子はGenBankを通じて入手した。
【０１２３】
６．６．実施例６：PROのハイブリッド形成プローブとしての使用
以下の方法は、PROをコードするヌクレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。全長又は成熟PRO（添付の図中に示される）又はその断片のコード化配列を含むDNAは、ヒト組織ｃDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの相同なDNA（PROの天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリDNAを含むフィルターの洗浄は、以下の高緊縮性条件下で実施される。PROポリペプチドをコードしている遺伝子から誘導された放射標識プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5x ＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施した。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳ水溶液中で、４２℃で実施した。
全長天然配列をコードするDNAと所望の同一性を持つDNAは、次いでこの分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
【０１２４】
６．７．実施例７：大腸菌におけるPROの発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるPROの非グリコシル化型の調製を例証する。
ＤＮＡ配列コード化は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来；Bolivarら, Gene, 2:95 (1977)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターにライゲーションする。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリHisリーダー（最初の６つのSTIIコドン、ポリHis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、PROコード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をLBプレート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、それを制限分析及びDNA配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したPROタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０１２５】
以下の手法を用いて、ポリ−Hisタグ形態でPROを大腸菌で発現させてもよい。PROをコードするＤＮＡを、選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、PCR増幅されたポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら3-5のO.D.600に達するまで成長させた。ついで培養液をCRAP培地（3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500ｍＬ水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110ｍＭのMPOS、pH7.3、0.55％（w/v）のグルコース及び7ｍMのMgSO4の混合で調製）中にて50-100倍希釈し、30℃で振盪によって約20-30時間成長させた。SDS-PAGEにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させた。
0.5から1Lの発酵（6-10gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、20ｍＭのトリス、pH8バッファー中で10容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の3-5容量で希釈し、透明にするために0.22ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni2+-NTA金属キレートカラムに負荷した。カラムを50mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
【０１２６】
試料を20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを採取濃度0.4％（約3のpH）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10％で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1％TFAの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したPROポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。
ここで開示された多くのPROポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。
【０１２７】
６．８．実施例８：哺乳動物細胞におけるPROの発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現による潜在的にグリコシル化形態のPROの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、PRODNAを選択した制限酵素でpRK5に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたような結合方法を用いてPRO DNAの挿入を行う。得られたベクターは、pRK5-PROと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、子ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのpRK5-PROを約1μgのVA RNA遺伝子をコードするDNA［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの1mMトリス-HCl、0.1mMのEDTA、0.227MのCaCl2に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMのHEPES（pH7.35）、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/mlの35S-システイン及び200μCi/mlの35S-メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに曝露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１２８】
これに換わる技術では、PROを、Somparyrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入してもよい。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5-PRO DNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。DNA−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μｇ/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたPROをコードする発現された遺伝子を含む試料を濃縮し、透析又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって濃縮及び精製した。
他の実施態様では、PROをCHO細胞で発現させることができる。pRK5-PROは、CaPO4又はDEAE-デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PROポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPROポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法によって精製することができる。
また、エピトープタグ化PROを、宿主CHO細胞において発現させてもよい。PROはpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物はPCRを行ってバキュロウイルス発現ベクター中にポリ-Hisタグ等の選択されたエピトープタグとインフレームで融合できる。ポリ-HisタグPRO挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-HisタグPROを含む培地を次いで濃縮し、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
また、PROはCHO細胞及び／又はCOS細胞中で一過的手法か、又はCHO細胞中では他の安定発現の手法によって発現させてもよい。
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、そのタンパク質の可溶化形態（例えば、細胞外ドメイン）のコード化配列がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメイン及び／又はポリ-Hisタグ形態を含む定常領域配列に融合したIgG作成物（イムノアドヘシン）として発現された。
PCR増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの５’及び３’に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）の発現の制御にSV40初期プロモーター／エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Qiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）を使用して約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3ｘ10７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【０１２９】
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地（0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分けた。1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートした。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3ｘ105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行の米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ106細胞/mLで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の30mLとした。生産を通して、ｐＨは7.2近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。
ポリ-Hisタグ作成物について、タンパク質はNi2+-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi2+-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Fc含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりＮ-末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示されるPROポリペプチドの多くが上述のごとく成功裏に発現された。
【０１３０】
６．９．実施例９：酵母菌でのPROの発現
以下の方法は、酵母菌中でのPROの組換え発現を記載する。
第１に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。PROをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーター、天然PROシグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチドをコードするDNA、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）PROの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10％トリクロロ酢酸での沈降及びSDS-PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PROを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示されるPROポリペプチド多くが上述のごとく成功裏に発現された。
【０１３１】
６．１０．実施例１０：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載する。
PROをコードする配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Hisタグ及び免疫グロブリンタグ（IgGのFc領域など）を含む。pVL1393（Novagen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PRO又はPROのコード化配列の所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、又は該タンパク質が細胞外のものならば成熟タンパク質をコードする配列など）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldTMウイルスDNA（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Sf9」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
次いで、発現されたポリ-HisタグPROは、例えば、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mlのHepes、pH7.9；12.5mMのMgCl2；0.1mMのEDTA；10%のグリセロール；0.1%のNP-40；0.4MのKCl）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMNaCl、10%のグリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μｍフィルターで濾過した。Ni2+-NTAアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mlの総容積で調製し、25mlの水で洗浄し、25mlの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mlでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMのリン酸塩；300mMのNaCl、10%のグリセロール、pH6.0）で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMのイミダゾール勾配で展開した。1mlの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したNi2+-NTAでのウェスタンブロットで分析した。溶離したHis10−タグPROを含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。
【０１３２】
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
PCR増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター（IgG融合物に対するpb.PH.IgG及びポリ-Hisタグに対するpb.PH.His.c）にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイルスDNA（Pharmingen）を105スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（「Sf9」）細胞（ATCC CRL 1711）にリポフェクチン（Gibco BRL）を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びpb.PH.Hisは、市販のバキュロウイルス発現ベクターpVL1393（Pharmingen）の修飾物であり、His又はFcタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%のFBS（Hyclone）を添加したHinkのTNM-FH培地で成長させた。細胞は、28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%FBSを添加したHinkのTNM-FH培地におけるSf9細胞感染による約10の感染効率（MOI）での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi2+-NTAビーズ（QIAGEN）又はIgGタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS-PAGE分析により測定した。
第１の増幅ウイルス上清をESF-921培地（Expression Systems LLC）で成長させたSf9細胞のスピナー培地（500ml）の約0.1のMOIでの感染に使用した。細胞は28℃で３日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びSDS-PAGEを、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈｉｓタグ作成物については、配列を含むタンパク質をNi2+-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi２＋-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。  
【０１３３】
タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。タンパク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（PEG）電気泳動及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定により評価できる。
あるいは、修飾バキュロウイルス法をhigh5細胞取り込みに使用してもよい。この方法では、所望の配列をコードするDNAは、Pfu（Stratagene）等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流（5'-）に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ポリ-Ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（IgGのFc領域等）を含む。種々のプラスミドを用いることができ、pIE1-1（Novagen）等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む。pIE1-1及びpIE1-2ベクターは、安定に形質転換された昆虫細胞（1）におけるバキュロウイルスie1プロモーターからの組換えタンパク質の構成的発現のために設計される。このプラスミドは複数のクローニング部位の方向においてのみ相違し、未感染昆虫細胞におけるie1媒介遺伝子発現に重要であることが知られた全てのプロモーター配列並びにhr5エンハンサー成分を含む。pIE1-1及びpIE1-2は翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の製造に使用できる。簡単には、所望の配列又は配列の所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）を、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅する。５'プライマーは隣接する（選択された）制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥｌ-１の誘導体はヒトIgG（pb.PH.IgG）のFc領域又は８ヒスチジン（pb.PH.His）タグ下流（3'-）を含むことができる。好ましくは、ベクター作成物は確認のために配列決定される。
【０１３４】
High-5細胞は、27℃、CO2無し、pen/strep無しの条件下で50%の集密度まで成長させた。150mmプレート各々について、配列を含む30μgのpIEベースベクターを1mlのＥｘ-細胞培地（媒質：Ex-細胞401＋1/100のL-Ｇｌｕ JRH Biosciences #14401-78P（注：この媒質は光感受性））と混合し、別の管において、100μlのセルフェクチン（CellFECTIN(Gibco BRL #10362-010)(ボルテックスで混合)）を1mlのEx-細胞培地と混合した。２つの溶液を混合し、室温で１５分間インキュベーションした。8mlのＥｘ-細胞培地を2mlのDNA／セルフェクチン混合物に添加し、Ex-細胞培地で１回洗浄したhigh-５細胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温で１時間インキュベートした。次いでDNA／セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をEx-細胞で１回洗浄して過剰のセルフェクチンを除去した。30mlの新鮮なEx-細胞培地を添加し、細胞を28℃で３日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス発現ベクターでの配列の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi2+-NTAビーズ（QIAGEN）又はIgGタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS-PAGE分析により測定した。
形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Hisタグ作成物については、タンパク質作成物をNi2+-NTAカラム（Qiagen）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi2+-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４８℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）カラムを用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン（Fc含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。配列の均一性はSDSポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
ここに開示のPROポリペプチドの多くが、上記の方法により成功裏に発現された。
【０１３５】
６．１１．実施例１１：PROに結合する抗体の調製
この実施例は、他の何れかのポリペプチド又はポリペプチドエピトープと実質的に結合することなく、PROポリペプチド又はPROポリペプチド上のエピトープに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製PRO、PROを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPROをコードする遺伝子を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したPRO免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL-TDMアジュバント（Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-PRO抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１３６】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、PROの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を（35％ポリエチレングリコールを用いて）、ATCCから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、PROに対する反応性についてELISAでスクリーニングされる。所望のPROに対するモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗-PROモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１３７】
６．１２．実施例１２：特異的抗体を用いたPROポリペプチドの精製
天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-PROポリペプチド、成熟PROポリペプチド、又はプレ-PROポリペプチドは、対象とするPROポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース（商品名）（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPROポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPROポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PROポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化PROポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPROポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／PROポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、PROポリペプチドが回収される。
【０１３８】
６．１３．実施例１３：薬物スクリーニング
本発明は、PROポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPROポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該技術分野に周知の方法により、その試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、PROポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なPROポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する又はPROポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１３９】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。PROポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPROポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPROポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したPROポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PROポリペプチドに結合可能な中和抗体がPROポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、PROポリペプチドで、１つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１４０】
６．１４．実施例１４：合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（即ち、PROポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、PROポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPROポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
【０１４１】
１つの方法において、PROポリペプチド、又はPROポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、X線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PROポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PROポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似PROポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１４２】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のPROポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したPROポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０１４３】
６．１５．実施例１５：内皮細胞増殖の刺激（アッセイ８）
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが副腎皮質毛細管内皮細胞（ＡＣＥ）成長を刺激する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される（これらPROポリペプチドのアゴニストがそうであるように）。このアッセイにおいて陽性と試験されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であると期待される。
ウシ副腎皮質毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（初代培養からのもの、最大１２−１４継代）を96ウェルのプレートにおいて100マイクロリットル当たり500細胞／ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースDMEM、10％子ウシ血清、2mMグルタミン、及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む：（１)ACE細胞無添加；（２）ACE細胞のみ；（３）ACE細胞＋VEGF(5 ng/ml)；及び（４）ACE細胞＋FGF(5ng/ml)。次いで、対照及び試験試料（100マイクロリットル容量）をウェルに添加した（各々、1％、0.1％及び0.01％希釈）。細胞培地を37℃/５％CO2で6-7日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をＰＢＳで1x洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物（100マイクロリットル、0.1Ｍ酢酸ナトリウム, ｐＨ5.5，0.1％  トリトンX-100、10mMのリン酸ｐ-ニトロフェニル）を各ウェルに添加した。３７℃で2時間のインキュベーション後に、１０マイクロリットルの１ＮのNaOHの添加により反応を停止させた。光学密度（OD）を405nmでマイクロプレートリーダーで測定した。
PROポリペプチドの活性は、（１）細胞のみのバックグラウンドに対する、及び（２）ＶＥＧＦによる最大刺激に対する（酸ホスファターゼ活性、OD405nmで測定した）増殖増加の倍数として計算した。最大刺激についての活性参照としてＶＥＧＦ（3−10ng/ml）及びFGF（1-5ng/ml）を使用した。アッセイの結果は、観察された刺激がバックグラウンドを越えて≧50%である場合に「陽性」と考えた。VEGF（5 ng/ml）対照は１％希釈において1.24倍の刺激を与え；FGF（5ng/ml）対照は１％希釈において1.46倍の刺激を与えた。
試験されたPRO21がこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１４４】
６．１６．実施例１６：血管内皮成長因子（VEGF）の刺激による内皮細胞成長の阻害(アッセイ９）
VEGFに刺激された内皮細胞の増殖を阻害する種々のPROポリペプチドの能力を試験した。このアッセイにおいてポリペプチド試験がポジティブであると哺乳類の内皮細胞の成長の阻害に有用であり、このような効果は、例えば腫瘍成長の阻害等に有利である。
特に、ウシ副腎皮質性毛細管内皮（ACE）細胞（一次培地から、最大12-14継代）を９６-ウェルのプレート100マイクロリットルあたり500細胞/ウェルで蒔いた。アッセイ用培地は、低グルコースDMEM、10%のウシ血清、2mMのグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン/フンギゾンを含有する。対照ウェルは次のものを含む：(１)ACE細胞を添加しないもの；(２)ACE細胞単独；(３)ACE細胞プラス5ng/mlのFGF；(４)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGF；(５)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGFプラス1ng/mlのＴＧＦ-ベータ；及び(６)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGFプラス5ng/mlのLIF。ついで、試験用試料であるポリ-hisタグPROポリペプチド(100マイクロリットル容量中)をウェル(それぞれ１％、０．１％及び０．０１％に希釈)に添加した。細胞を37℃／5％のCO2で６−７日インキュベートした。インキュベート後、ウェルの培地を吸引し、細胞を1x PBSで洗浄した。酸ホスファターゼ反応混合物（100マイクロリットル、0.1Mの酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%のトリトンX-100、10mMのｐ-ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに添加した。37℃で２時間インキュベートした後、１０マイクロリットルの1NのNaOHの添加で反応を停止した。光学密度(OD)をマイクロプレートリーダーで405nmにおいて測定した。
PROポリペプチドの活性を、刺激無しの細胞に対するVEGF（３ng/ml）刺激増殖のパーセント阻害(OD405nmにおける酸ホスファターゼ活性を測定することにより決定)として算出した。TGF-βはVEGF刺激ＡＣＥ細胞増殖を70-90%阻止するので、1ng/mlで活性参照として使用した。結果は、PROポリペプチドの癌治療、特に腫瘍新脈管形成の阻害における有用性を示している。数値(相対阻害度)は刺激なし細胞に対するPROポリペプチドによるVEGF刺激増殖のパーセント阻害を算出し、ついで1ng/ml濃度でのTGF-βが、VEGF刺激細胞増殖を70-90％阻止することが知られていることで得られたパーセント阻害をパーセンテージに除することで決定される。結果は、PROポリペプチドが内皮細胞成長のＶＥＧＦ刺激を30％又はそれ以上(相対阻害度30％又はそれ以上)を阻害したときにポジティブと考える。
試験されたPRO247, PRO720及びPRO4302がこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１４５】
６．１７．実施例１７：LIF+ET-1によって誘導される心臓新生児肥大の刺激（アッセイ７５）
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドがLIF及びエンドセリン-1（ET-1）によって誘導される新生児心臓肥大を刺激する能力を示すかどうか決定するためにデザインされる。本アッセイにおいてポジティブな反応を与える試験化合物は、心筋肥大の望ましくないレベルに特徴付けられ又は関連する心不全の疾病又は疾患の治療上の処置に対して有用である。
生後１日のSDラット由来の心筋細胞（7.5 x 104/mlで180μl、血清＜0.1, 新しく単離されたもの）は、一日目にDMEM/F12+4% FCSで予めコートした96ウェルプレートへ移される。その後、試験PROポリペプチドサンプル又は成長培地のみ（ネガティブコントロール）が、２日目に20μl用量でウェル中に直接添加される。その後、３日目にLIF+ET-1がウェルに添加される。細胞はさらに培養２日後に染色され、その後、翌日に可視的にスコア化される。PROポリペプチド処理筋細胞がゼロより大きなスコアを得た場合、アッセイにおいてポジティブとなる。ゼロのスコアは非応答細胞を示し、1又は2のスコアは増強（即ち、それらは、視覚的に非処理の筋細胞より概して大きく、又より数が多い）を示す。
PRO21ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった。
６．１８．実施例１８：内皮細胞アポトーシスの検出（FACS）（アッセイ９６）
本発明のPROポリペプチドの内皮細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、ゼラチン化されたT-175フラスコ中、１０継代に満たないHUVEC細胞を用いて、ヒト静脈性臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）中にて試験された。本アッセイにおいてポジティブの試験PROポリペプチドは、内皮細胞のアポトーシスが有益である状態を治療的に処置するために有用であると予想され、例えば、腫瘍の治療上の処置を含む。
１日目、細胞は継代し[ゼラチン化した6 cmディッシュあたり420,000細胞-（11 x 103細胞/cm2 Falcon, Primaria）]、血清を含む培地(CS-C, Cell System)中で一晩又は16時間から24時間成長させた。
２日目、細胞を5 mlのPBSで一回洗浄した；0 %血清培地3 mlをVEGFと共に添加した（100 ng/ml）；及びPROの30μl試験化合物（最終希釈1%）又は0%血清培地（ネガティブコントロール）が添加された。混合物は収集するまで48時間インキュベートした。
その後、FACS分析のために細胞を収集した。培地は吸引し、細胞は一回PBSで洗浄した。1 x トリプシン、5 mlをT-175フラスコ中の細胞に添加し、細胞がプレートから剥がれるまで（約5-10分間）細胞を静置した。トリプシン処理は5 mlの成長培地を添加することにより停止した。細胞は、4℃にて、5分間、1000 rpmで遠心した。培地を吸引し、10%血清を補充した培地（Cell System）の10 ml中に細胞を懸濁し、アネキシン-FITC（Bio Vison）5μlを添加され冷却されたチューブをFACSにかけた。ポジティブな結果は、PROポリペプチド処理サンプル中でネガティブコントロールと比較して増強されたアポトーシスとして決定された。
PRO4302ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１４６】
６．１９．実施例１９：HUVEC細胞におけるc-fosの誘導（アッセイ１２３）
本アッセイは、PROポリペプチドがHUVEC細胞においてc-fosを誘導する能力を示すかどうかを決定するためにデザインされる。ポジティブとして試験されるPROポリペプチドは、血管形成が有益である状態又は疾患の治療的処置にとって有用であり、例えば、創傷治癒など（PROポリペプチドのアゴニストがそうであるように）が含まれる。このアッセイでポジティブと試験されるPROポリペプチドのアンタゴニストは癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であることが期待される。
成長培地中（50% Ham's F12w/o GHT：低グルコース、及び50% DMEM グリシン無し：NaHCO3, 1% グルタミン, 10 mM HEPES, 10%FBS, 10ng/ml bFGF）のヒト静脈性臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）は、細胞密度5 x 103細胞/ウェルで96-ウェルマイクロタイタープレート上にプレートした。プレートの翌日（２日目）、細胞は、成長培地を除去し、無血清培地を置換することにより、24時間飢餓状態にした。３日目、細胞を100μl/ウェルの試験サンプルとコントロールで処理した（ポジティブコントロール＝成長培地；ネガティブコントロール＝Protein 32バッファー＝10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 4%(w/v)マンニトール, pH6.8）。細胞の一プレートを37℃、5%ＣＯ２下にて30分間インキュベートした。他の細胞のプレートは、37℃、5%ＣＯ２下にて60分間インキュベートした。サンプルを除去し、RNeasy 96 kit（Qiagen）を用いてRNAを収集した。次いで、該RNAをc-fos, egr-1及びGAPDHの誘導に関しTaqmanを用いてアッセイした。
ネガティブコントロール（上述のProtein 32/HEPES バッファー）値に対する増加倍率の活性の測定値は、ネガティブコントロールと比較した試験サンプル中のGAPDHに対するc-fosの増加倍率を計算することにより得られた。PROポリペプチドが少なくともネガティブバッファーコントロールに対して2倍値を示す場合、結果はポジティブとした。
PRO1376ポリペプチドはこのアッセイにおいてポジティブであった。
６．２０．実施例２０：正常ヒト腸骨動脈内皮細胞の増殖（アッセイ１３８）
本アッセイは、本発明のPROポリペプチドが、培養下においてヒト腸骨動脈内皮細胞の増殖を誘導する能力を示し、その結果、有用な成長又は阻害因子として機能するかどうかを決定するためにデザインされる。
０日目、ヒト腸骨動脈内皮細胞（最大12-14継代の細胞株由来）を96-ウェルプレート中に100マイクロリットルあたり1000細胞/ウェルでプレートし、完全培地中で一晩インキュベートした[上皮細胞成長培地（EGM, Clonetics）、＋サプリメント：ヒト上皮成長因子（hEGF）、ウシ脳抽出液（BBE）、ヒドロコルチゾン、GA-1000、及びウシ胎児血清（FBS, Clonetics）]。１日目、完全培地は、基礎培地[EGM＋1% FBS]と1%, 0.1%, 0.01%でPROポリペプチドの添加により置換された。７日目、細胞増殖の評価は、Crystal VioletによるAlamar Blueアッセイによって実施された。結果はコントロールバッファー中で観察された細胞増殖の%で表される。
以下のPROポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を促進した：PRO214, PRO256, PRO363, PRO365, PRO791, PRO836, PRO1025, PRO1186, PRO1192, PRO1272, PRO1306, PRO1325, PRO1329, PRO1376, PRO1411, PRO1508, PRO1787, PRO1868, PRO4324, PRO4333, PRO4408, PRO4499, PRO9821, PRO9873, PRO10008, PRO10096, PRO19670, PRO20040, PRO20044 及び PRO21384。
以下のPROポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を阻害した：PRO238, PRO1029, PRO1274, PRO1279, PRO1419, PRO1890, PRO6006 及び PRO28631。
【０１４７】
６．２１．実施例２１：プールされたヒト臍静脈内皮細胞の増殖（アッセイ１３９）
本アッセイは、本発明のPROポリペプチドが、培養下においてプールされたヒト臍静脈内皮細胞の増殖を誘導する能力を示し、その結果、有用な成長又は阻害因子として機能するかどうかを決定するためにデザインされる。
０日目、プールされたヒト臍静脈内皮細胞（最大12-14継代の細胞株由来）を96-ウェルプレート中に100マイクロリットルあたり1000細胞/ウェルでプレートし、完全培地中で一晩インキュベートした[上皮細胞成長培地（EGM, Clonetics）、＋サプリメント：ヒト上皮成長因子（hEGF）、ウシ脳抽出液（BBE）、ヒドロコルチゾン、GA-1000、及びウシ胎児血清（FBS, Clonetics）]。１日目、完全培地は、基礎培地[EGM＋1% FBS]と1%, 0.1%, 0.01%でPROポリペプチドの添加により置換された。７日目、細胞増殖の評価は、Crystal VioletによるAlamar Blueアッセイによって実施された。結果はコントロールバッファー中で観察された細胞成長の%で表される。
以下のPROポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を促進した：PRO181, PRO205, PRO221, PRO231, PRO238, PRO241, PRO247, PRO256, PRO258, PRO263, PRO265, PRO295, PRO321, PRO322, PRO337, PRO363, PRO533, PRO697, PRO725, PRO771, PRO788, PRO819, PRO828, PRO846, PRO865, PRO1005, PRO1006, PRO1025, PRO1054, PRO1071, PRO1079, PRO1080, PRO1114, PRO1131, PRO1155, PRO1160, PRO1192, PRO1244, PRO1272, PRO1273, PRO1279, PRO1283, PRO1286, PRO1306, PRO1309, PRO1325, PRO1329, PRO1347, PRO1356, PRO1376, PRO1382, PRO1412, PRO1550, PRO1556, PRO1760, PRO1787, PRO1801, PRO1868, PRO1887, PRO3438, PRO3444, PRO4324, PRO4341, PRO4342, PRO4353, PRO4354, PRO4356, PRO4371, PRO4422, PRO4425, PRO5723, PRO5737, PRO6029, PRO6071, PRO10096 及び PRO21055。
以下のPROポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を阻害した：PRO229, PRO444, PRO827, PRO1007, PRO1075, PRO1184, PRO1190, PRO1195, PRO1419, PRO1474, PRO1477, PRO1488, PRO1782, PRO4302, PRO4405, PRO5725, PRO5776, PRO7436, PRO9771, PRO10008 及び PRO21384。
【０１４８】
６．２２．実施例２２：ヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖（アッセイ１４０）
本アッセイは、本発明のPROポリペプチドが、培養下においてヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖を誘導する能力を示し、その結果、有用な成長又は阻害因子として機能するかどうかを決定するためにデザインされる。
０日目、ヒト冠動脈平滑筋細胞（最大12-14継代の細胞株由来）を96-ウェルプレート中に100マイクロリットルあたり1000細胞/ウェルでプレートし、完全培地中で一晩インキュベートした[平滑筋成長培地（SmGM, Clonetics）、＋サプリメント：インスリン、ヒト上皮成長因子（hEGF）、ヒト線維芽細胞成長因子（hFGF）、及びウシ胎児血清（FBS, Clonetics）]。１日目、完全培地は、基礎培地[SmGM＋1% FBS]と1%, 0.1%, 0.01%でPROポリペプチドの添加により置換された。７日目、細胞増殖の評価は、Crystal VioletによるAlamar Blueアッセイによって実施された。結果はコントロールバッファー中で観察された細胞増殖の%で表される。
以下のPROポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を促進した：PRO162, PRO182, PRO204, PRO221, PRO230, PRO256, PRO258, PRO533, PRO697, PRO725, PRO738, PRO826, PRO836, PRO840, PRO846, PRO865, PRO982, PRO1025, PRO1029, PRO1071, PRO1083, PRO1134, PRO1160, PRO1182, PRO1184, PRO1186, PRO1192, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1306, PRO1308, PRO1325, PRO1337, PRO1338, PRO1343, PRO1376, PRO1387, PRO1411, PRO1412, PRO1415, PRO1434, PRO1474, PRO1550, PRO1556, PRO1567, PRO1600, PRO1754, PRO1758, PRO1760, PRO1787, PRO1865, PRO1868, PRO1917, PRO1928, PRO3438, PRO3562, PRO4333, PRO4345, PRO4353, PRO4354, PRO4408, PRO4430, PRO4503, PRO6714, PRO9771, PRO9820, PRO9940, PRO10096, PRO21055, PRO21184 及び PRO21366。
以下のPROポリペプチドがこのアッセイにおいて増殖を阻害した：PRO181, PRO195, PRO1080, PRO1265, PRO1309, PRO1488, PRO4302, PRO4405 及び PRO5725。
【０１４９】
６．２３．実施例２３：成長因子で処理されたHUVEC細胞におけるPROポリペプチドの過剰発現を検出するためのマイクロアレイ解析
本アッセイは、本発明のPROポリペプチドがHUVEC細胞中での内皮細胞管形成を刺激することにより血管形成を誘導する能力を示すかどうか決定するためにデザインされる。
しばしば、数千もの遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、様々な刺激（例えば、成長因子）に曝された組織中において、その正常組織、つまり刺激に曝されない組織と比較した場合、差次的に発現している遺伝子を同定するために有用である。核酸マイクロアレイを使用する場合、試験及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールmRNA試料が逆転写され、cDNAプローブを生成するために標識される。次いで、このcDNAプローブは、固体支持体上に固定化された多くの核酸とハイブリダイズされる。このアレイは、アレイの各メンバーの配列と位置がわかるように構成されている。標識プローブとある特定のアレイのメンバーとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現していることを示す。試験（刺激に曝された組織）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール（正常組織、曝されていない組織）試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルより大きい場合は、刺激に曝された組織において過剰発現している遺伝子又は複数遺伝子が同定される。この結果の意味するところは、刺激に曝された組織で過剰発現しているタンパク質が、刺激に曝された組織内における機能的変化（例えば、管形成など）に関与するということである。
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法論は、当業者には良く知られている。本実施例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライドのための核酸の特別な調製、並びにハイブリダイゼーションの条件は、２０００年３月３１日に出願された米国仮出願一連番号 60/193,767にすべて詳述されており、ここにおいて文献として取り入れられている。
【０１５０】
本実施例において、コラーゲンゲル又はフィブリンゲルのどちらかにおいて成長するHUVEC細胞が、種々の成長因子の添加により管を形成するために誘導された。特に、コラーゲンゲルはすでに、Yang等, American J. Pathology, 1999, 155(3):887-895及びXin等, American J. Pathology, 2001, 158(3):1111-1120中の記載に従い調製された。HUVEC細胞のゲル化の後、M199を含み1 % FBSが添加された1 X 基礎培地、1 X ITS、2 mM L-グルタミン、50μg/mlアスコルビン酸、26.5 mM NaHCO3、100U/ml ペニシリン及び100U/mlストレプトマイシンが添加された。管形成は、ホルボルミリスチン酸アセテート（50 nM）、血管内皮細胞成長因子（40 ng/ml）及び塩基性線維芽細胞成長因子（40 ng/ml）（"PMA成長因子混合物"）、又は肝細胞成長因子（40 ng/ml）及び血管内皮細胞成長因子（40 ng/ml）（HGF/VEGF混合物）のいずれかを指示された期間に含有させることにより誘導された。フィブリンゲルはHuvec（4 x 105細胞/ml）を1%ウシ胎児血清（Hyclone）及びヒトフィブリノーゲン（2.5 mg/ml）を含むM199中に懸濁することにより調製された。その後、トロンビン（50U/ml）は１パートトロンビン溶液：３０パートフィブリノーゲン懸濁液の割合でフィブリノーゲン懸濁液に添加された。その後、溶液は10 cmの組織培養プレート上に重層され（総体積：15 ml/プレート）、次に37℃で20分間凝固させた。その後、組織培養液（PMA(50 nM), bFGF(40 ng/ml)及びVEGF(40 ng/ml)を含む10 mlのBM）が添加され、細胞は、37℃、5%CO2の空気中にて指示された期間培養した。
全RNAは、0, 4, 8, 24, 40及び50時間インキュベートしたHUVEC細胞から、異なるマトリックス及び培地の組合わせ中で、TRIzol抽出の後、RNAeasy Mini Kit（Qiagen）を用いた第二の抽出を使用して抽出された。全RNAは後にマイクロアレイにハイブリダイズされたcRNAを調製するために使用された。
本実験では、ここに記載のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列から誘導された核酸プローブをマイクロアレイの作製に用い、上記のHUVEC細胞由来のＲＮＡをそれとのハイブリダイゼーションに用いた。二組による比較は、ベースラインとしてタイム０のチップを用いて行われた。３つの複製サンプルが各実験条件及び時間に対して分析された。それ故、各処理に対して３つのタイム０サンプル及び各継時点に３つの複製が存在した。従って、各タイム０に対する３対３の比較が各時点において行われた。これにより、各時点において９つの比較が行われた。３つのタイム０のどれと比較しても、各異なるマトリックス及び培地の組合わせにおける３つのタイム０ではない全ての複製物中で発現が増大した遺伝子のみがポジティブとされた。このストリンジェントなデータ分析方法は擬似ネガティブを許容しうるが、擬似ポジティブを最小にする。
PRO178, PRO195, PRO228, PRO301, PRO302, PRO532, PRO724, PRO730, PRO734, PRO793, PRO871, PRO938, PRO1012, PRO1120, PRO1139, PRO1198, PRO1287, PRO1361, PRO1864, PRO1873, PRO2010, PRO3579, PRO4313, PRO4527, PRO4538, PRO4553, PRO4995, PRO5730, PRO6008, PRO7223, PRO7248 及び PRO7261ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった。
【０１５１】
６．２４．実施例２４：インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、PCR生成33P-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。(33-P)UTP-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、55℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2ＴＭ核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
６．２４．１．33P-リボプローブ合成
6.0μl（125mCi）の33P-UTP（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：
2.0μlの5ｘ転写バッファー
1.0μlのDTT（100mM）
2.0μlのNTP混合物（2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH2O）
1.0μlのUTP（50μM）
1.0μlのRNAsin
1.0μlのDNAテンプレート（1μg）
1.0μlのＨ２Ｏ
1.0μlのＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS, T7=S,通常）
チューブを37℃で１時間インキュベートした。1.0μlのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μlのTE（10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0）を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMICROCON-50ＴＭ限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた（6分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（3分間）。最終回収スピンの後、100μlのＴＥを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR IITMで数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で泳動した。1-3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間泳動した。ゲルをプラスチックラップ（SARANTM商標）でラップし、-70℃冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１５２】
６．２４．２．33P-ハイブリッド形成
６．２４．２．１．凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で10分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において氷上4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5ｘSSCで５分間室温で洗浄した（25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O）。0.5μg/mlのプロテイナーゼＫ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（250mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl）、切片を0.5ｘSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、及び100%エタノール中、各2分間脱水した。
６．２４．２．２．パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2ｘSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼＫ（250ｍｌのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μｌ；37℃、15分間）−ヒト胚組織又は8ｘプロテイナーゼＫ（250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5ｘSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
６．２４．２．３．プレハイブリッド化
スライドをBoxバッファー（4 x SSC、50%ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッファー（3.75gデキストラン硫酸＋6mlSQ H2O）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75ｍｌの20ｘSSC及び9mlのSQ H2Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1-4時間インキュベートした。
６．２４．２．４．ハイブリッド形成
スライド当たり1.0ｘ10６cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA（50mg/mlストック）を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
６．２４．２．５．洗浄
洗浄は、2ｘ10分間、2ｘSSC、EDTAで室温で実施し（400mlの20ｘSSC＋16mlの0.25M EDTA、Vf=4L）、次いでRNAseA処理を37℃で30分間行った（250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μｌ＝20μg/ml）。スライドを2ｘ10分間、2ｘSSC、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、0.1ｘSSC、EDTA（20mlの20ｘSSC＋16mlのEDTA、Vf=4L）。
【０１５３】
６．２４．２．６．オリゴヌクレオチド
ここに開示したDNA配列の３つについてインサイツ分析を実施した。プローブを作成するのに使用したプライマー及び／又はこれらの分析に対して用いたプローブは次の通りである：
DNA33100-p1：5'GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CGG GTG GAG GTG GAA CAG AAA 3'（配列番号：３７５）
DNA33100-p2：5'CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CAC AGA CAG AGC CCC ATA CGC 3'（配列番号：３７６）
DNA34431-p1：5'GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAG GGA AAT CCG GAT GTC TC 3'（配列番号：３７７）
DNA34431-p2：5'CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTA AGG GGA TGC CAC CGA GTA 3'（配列番号：３７８）
DNA38268-p1：5'GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAG CTA CCC GCA GGA GGA GG 3'（配列番号：３７９）
DNA38268-p2：5'CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCC CAG GTG ATG AGG TCC AGA 3'（配列番号：３８０）
DNA64908                                                 probe:
5'CCATCTCGGAGACCTTTGTGCAGCGTGTATACCAGCCTTACCTCACCACTTGCGACGGACACAGAGCCTGCAGCACCTACCGAACCATCTACCGGACTGCCTATCGCCGTAGCCCTGGGGTGACTCCCGCAAGCCTCGCTATGCTTGCTGCCCTGGTTGGAAGAGGACCAGTGGGCTCCCTGGGGCTTGTGGAGCAGCAATATGCCAGCCTCCATGTGGGAATGGAGGGAGTTGCATCCGCCCAGGACACTGCCGCTGCCCTGTGGGATGGCAGGGAGATACTTGCCAGACAGATGTTGATGAATGCAGTACAGGAGAGGCCAGTTGTCCCCAGCGCTGTGTCAATACTGTGGGAAGTTACTGGTGCCAGGGATGGGAGGGACAAAGCCCATCTGCAGATGGGACGCGCTGCCTGTCTAAGGAGGGGCCCTCCCGGTGGCCCCAACCCCACAGCAGGAGTGGACAGCA3'（配列番号：３８１）
【０１５４】
６．２４．２．７．結果
インサイツ分析が実施され、これらの解析結果が以下に示される：
６．２４．２．７．１．DNA33100-1159(PRO229)（スカベンジャー-R／CD6ホモログTNFモチーフ）
特異的なポジティブシグナルがヒト胎児及び成人の単核貪食細胞（マクロファージ）、脾臓、肝臓、リンパ節及び胸腺中に観察された。他の全ての細胞はネガティブであった。
６．２４．２．７．２．DNA34431-1177(PRO263)（CD44）
特異的なポジティブシグナルがヒト胎児組織及び胎盤の単核細胞中に、強い発現を伴って副腎皮質の上皮細胞中に観察された。全ての成人組織はネガティブであった。
６．２４．２．７．３．DNA38268-1188(PRO295)（インテグリン）
特異的なポジティブシグナルがヒト胎児神経節細胞、胎児神経細胞、成人副腎髄質、及び成人神経細胞中に観察された。他の全ての組織はネガティブであった。
６．２４．２．７．４．DNA64908-1163-1(PRO1449)
特異的なポジティブシグナルが発生中の脈管構造（E7からE11）、内皮細胞及び内皮細胞前駆体中に、ホールマウントのマウス胎児インサイツハイブリダイゼーションにおいて観察された（図375）。また、特異的な発現がE12以後の血管及び表皮のサブセット中にも観察された。PRO1449と約78%のアミノ酸同一性を持つPRO1449のマウスオルソログがプローブとして使用された。
正常な成人組織中において、発現は低いレベルから全く確認されないものまであった。存在する場合、発現は血管に限定された（図376）。さらに、図376は、成人組織における最も高い発現は、脳の白質内の血管中に局部的に観察されたことを示す。また、限定はしないが、腫瘍の脈管構造を含む多くの炎症化及び疾患性組織の脈管構造中においても、上昇した発現が観察された。続くマウスPRO1449のオルソログのニワトリ胎児の眼中の脈絡膜層へのエレクトロポレーションの結果、新規血管形成がエレクトロポレーションされた眼（右上）中に観察されたが、同じ胎児由来のコントロール側（左上）、または、コントロールのcDNAでエレクトロポレーションが行われた胎児（右下）においては観察されなかった（図377）。
【０１５５】
６．２５．実施例２５：内皮細胞成長の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）刺激性増殖の阻害
内皮細胞のｂＦＧＦ刺激性増殖を阻害する様々なＰＲＯポリペプチドの能力を試験した。このアッセイでポジティブと試験されるポリペプチドは、このような効果が有益である哺乳動物での内皮細胞成長を阻害するために、例えば腫瘍成長を阻害するために有用である。
具体的には、内皮細胞成長培地（EGM, Clonetics）のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）を細胞密度5x103細胞/ウェル、体積100μl/ウェルで96穴マイクロタイタープレートに蒔いた。播種の翌日（２日目）に、成長培地を取り除き、飢餓培地（1%のFBS、2mMのL-グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100U/mlのストレプトマイシンを補足したM199）と交換して24時間細胞を飢餓させた。５日目、細胞を：（１）10%のFBSを含有するM199；（２）1%のFBSを含有するM199；（３）1%のFBS及び20ng/mlのbFGFを含有するM199；（４）1%のFBS及び20ng/mlのbFGF及びＰＲＯポリペプチド（500nM）を含有するM199；（５）1%のFBS及び20ng/mlのbFGF及びＰＲＯポリペプチド（50nM）を含有するM199；又は（６）1%のFBS及び20ng/mlのbFGF及びＰＲＯポリペプチド（5nM）を含有するM199の何れかで処理した。８日目、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖の評価を行った。マイクロプレートリーダーを使って励起530及び発光590nmで吸光度（ＯＤ）を測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性を、刺激なしの細胞に対するｂＦＧＦ刺激性増殖の阻害パーセントとして計測した。結果は癌治療、特に腫瘍血管形成の阻害でのＰＲＯポリペプチドの有用性を示すものである。数値（相対的な阻害）は、刺激のない細胞に対するＰＲＯポリペプチドによるｂＦＧＦ刺激性増殖の阻害パーセントを計算することにより決定した。結果は、ＰＲＯポリペプチドが３０％又はそれより高い内皮細胞成長のｂＦＥＧＦ刺激の阻害を示す場合にポジティブとみなす。
このアッセイにおいてPRO5725がポジティブと試験された。
【０１５６】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【０１５７】
実施態様
１．   図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番��：280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372)及び図 374 (配列番号：374)中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
２．  図 1 (配列番号：1), 図 3 (配列番号：3), 図 5 (配列番号：5), 図 7 (配列番号：7), 図 9 (配列番号：9), 図 11 (配列番号：11), 図 13 (配列番号：13), 図 15 (配列番号：15), 図 17 (配列番号：17), 図 19 (配列番号：19), 図 21 (配列番号：21), 図 23 (配列番号：23), 図 25 (配列番号：25), 図 27 (配列番号：27), 図 29 (配列番号：29), 図 31 (配列番号：31), 図 33 (配列番号：33), 図 35 (配列番号：35), 図 37 (配列番号：37), 図 39 (配列番号：39), 図 41 (配列番号：41), 図 43 (配列番号：43), 図 45 (配列番号：45), 図 47 (配列番号：47), 図 49 (配列番号：49), 図 51 (配列番号：51), 図 53 (配列番号：53), 図 55 (配列番号：55), 図 57 (配列番号：57), 図 59 (配列番号：59), 図 61 (配列番号：61), 図 63 (配列番号：63), 図 65 (配列番号：65), 図 67 (配列番号：67), 図 69 (配列番号：69), 図 71 (配列番号：71), 図 73 (配列番号：73), 図s 75A-75B (配列番号：75), 図 77 (配列番号：77), 図 79 (配列番号：79),  図 81 (配列番号：81), 図 83 (配列番号：83), 図 85 (配列番号：85), 図 87 (配列番号：87), 図 89 (配列番号：89), 図 91 (配列番号：91), 図 93 (配列番号：93), 図 95 (配列番号：95), 図 97 (配列番号：97), 図 99 (配列番号：99), 図 101 (配列番号：101), 図 103 (配列番号：103), 図 105 (配列番号：105), 図 107 (配列番号：107), 図 109 (配列番号：109), 図 111 (配列番号：111), 図 113 (配列番号：113), 図 115 (配列番号：115), 図 117 (配列番号：117), 図 119 (配列番号：119), 図 121 (配列番号：121), 図 123 (配列番号：123), 図 125 (配列番号：125), 図 127 (配列番号：127), 図 129 (配列番号：129), 図 131 (配列番号：131), 図 133 (配列番号：133), 図 135 (配列番号：135), 図 137 (配列番号：137), 図 139 (配列番号：139), 図 141 (配列番号：141), 図 143 (配列番号：143), 図 145 (配列番号：145), 図 147 (配列番号：147), 図 149 (配列番号：149), 図 151 (配列番号：151), 図 153 (配列番号：153), 図 155 (配列番号：155), 図 157 (配列番号：157), 図 159 (配列番号：159), 図 161 (配列番号：161), 図 163 (配列番号：163), 図 165 (配列番号：165), 図 167 (配列番号：167), 図 169 (配列番号：169), 図 171 (配列番号：171), 図 173 (配列番号：173), 図 175 (配列番号：175), 図 177 (配列番号：177), 図 179 (配列番号：179),  図 181 (配列番号：181), 図 183 (配列番号：183), 図 185 (配列番号：185), 図 187 (配列番号：187), 図 189 (配列番号：189), 図 191 (配列番号：191), 図 193 (配列番号：193), 図 195 (配列番号：195), 図 197 (配列番号：197), 図 199 (配列番号：199), 図 201 (配列番号：201), 図 203 (配列番号：203), 図 205 (配列番号：205), 図 207 (配列番号：207), 図 209 (配列番号：209), 図 211 (配列番号：211), 図 213 (配列番号：213), 図 215 (配列番号：215), 図 217 (配列番号：217), 図 219 (配列番号：219), 図 221 (配列番号：221), 図 223 (配列番号：223), 図 225 (配列番号：225), 図 227 (配列番号：227), 図 229 (配列番号：229), 図 231 (配列番号：231), 図 233 (配列番号：233), 図 235 (配列番号：235), 図 237 (配列番号：237), 図 239 (配列番号：239), 図 241 (配列番号：241), 図 243 (配列番号：243), 図 245 (配列番号：245), 図 247 (配列番号：247), 図 249 (配列番号：249), 図 251 (配列番号：251), 図 253 (配列番号：253), 図 255 (配列番号：255), 図 257 (配列番号：257), 図 259 (配列番号：259), 図 261 (配列番号：261), 図 263 (配列番号：263), 図 265 (配列番号：265), 図 267 (配列番号：267), 図 269 (配列番号：269), 図 271 (配列番号：271), 図 273 (配列番号：273), 図 275 (配列番号：275), 図 277 (配列番号：277), 図 279 (配列番���：279),  図 281 (配列番号：281), 図 283 (配列番号：283), 図 285 (配列番号：285), 図 287 (配列番号：287), 図s 289A-289B (配列番号：289), 図 291 (配列番号：291), 図 293 (配列番号：293), 図 295 (配列番号：295), 図 297 (配列番号：297), 図 299 (配列番号：299), 図 301 (配列番号：301), 図 303 (配列番号：303), 図 305 (配列番号：305), 図 307 (配列番号：307), 図 309 (配列番号：309), 図s 311A-311B (配列番号：311), 図 313 (配列番号：313), 図 315 (配列番号：315), 図 317 (配列番号：317), 図 319 (配列番号：319), 図 321 (配列番号：321), 図 323 (配列番号：323), 図 325 (配列番号：325), 図 327 (配列番号：327), 図 329 (配列番号：329), 図 331 (配列番号：331), 図 333 (配列番号：333), 図 335 (配列番号：335), 図 337 (配列番号：337), 図 339 (配列番号：339), 図 341 (配列番号：341), 図 343 (配列番号：343), 図 345 (配列番号：345), 図 347 (配列番号：347), 図 349 (配列番号：349), 図s 351A-351B (配列番号：351), 図 353 (配列番号：353), 図 355 (配列番号：355), 図 357 (配列番号：357), 図 359 (配列番号：359), 図 361 (配列番号：361), 図 363 (配列番号：363), 図 365 (配列番号：365), 図 367 (配列番号：367), 図 369 (配列番号：369), 図 371 (配列番号：371)及び図 373 (配列番号：373)中に示されるヌクレオチド配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
３．  図 1 (配列番号：1), 図 3 (配列番号：3), 図 5 (配列番号：5), 図 7 (配列番号：7), 図 9 (配列番号：9), 図 11 (配列番号：11), 図 13 (配列番号：13), 図 15 (配列番号：15), 図 17 (配列番号：17), 図 19 (配列番号：19), 図 21 (配列番号：21), 図 23 (配列番号：23), 図 25 (配列番号：25), 図 27 (配列番号：27), 図 29 (配列番号：29), 図 31 (配列番号：31), 図 33 (配列番号：33), 図 35 (配列番号：35), 図 37 (配列番号：37), 図 39 (配列番号：39), 図 41 (配列番号：41), 図 43 (配列番号：43), 図 45 (配列番号：45), 図 47 (配列番号：47), 図 49 (配列番号：49), 図 51 (配列番号：51), 図 53 (配列番号：53), 図 55 (配列番号：55), 図 57 (配列番号：57), 図 59 (配列番号：59), 図 61 (配列番号：61), 図 63 (配列番号：63), 図 65 (配列番号：65), 図 67 (配列番号：67), 図 69 (配列番号：69), 図 71 (配列番号：71), 図 73 (配列番号：73), 図s 75A-75B (配列番号：75), 図 77 (配列番号：77), 図 79 (配列番号：79),  図 81 (配列番号：81), 図 83 (配列番号：83), 図 85 (配列番号：85), 図 87 (配列番号：87), 図 89 (配列番号：89), 図 91 (配列番号：91), 図 93 (配列番号：93), 図 95 (配列番号：95), 図 97 (配列番号：97), 図 99 (配列番号：99), 図 101 (配列番号：101), 図 103 (配列番号：103), 図 105 (配列番号：105), 図 107 (配列番号：107), 図 109 (配列番号：109), 図 111 (配列番号：111), 図 113 (配列番号：113), 図 115 (配列番号：115), 図 117 (配列番号：117), 図 119 (配列番号：119), 図 121 (配列番号：121), 図 123 (配列番号：123), 図 125 (配列番号：125), 図 127 (配列番号：127), 図 129 (配列番号：129), 図 131 (配列番号：131), 図 133 (配列番号：133), 図 135 (配列番号：135), 図 137 (配列番号：137), 図 139 (配列番号：139), 図 141 (配列番号：141), 図 143 (配列番号：143), 図 145 (配列番号：145), 図 147 (配列番号：147), 図 149 (配列番号：149), 図 151 (配列番号：151), 図 153 (配列番号：153), 図 155 (配列番号：155), 図 157 (配列番号：157), 図 159 (配列番号：159), 図 161 (配列番号：161), 図 163 (配列番号：163), 図 165 (配列番号：165), 図 167 (配列番号：167), 図 169 (配列番号：169), 図 171 (配列番号：171), 図 173 (配列番号：173), 図 175 (配列番号：175), 図 177 (配列番号：177), 図 179 (配列番号：179),  図 181 (配列番号：181), 図 183 (配列番号：183), 図 185 (配列番号：185), 図 187 (配列番号：187), 図 189 (配列番号：189), 図 191 (配列番号：191), 図 193 (配列番号：193), 図 195 (配列番号：195), 図 197 (配列番号：197), 図 199 (配列番号：199), 図 201 (配列番号：201), 図 203 (配列番号：203), 図 205 (配列番号：205), 図 207 (配列番号：207), 図 209 (配列番号：209), 図 211 (配列番号：211), 図 213 (配列番号：213), 図 215 (配列番号：215), 図 217 (配列番号：217), 図 219 (配列番号：219), 図 221 (配列番号：221), 図 223 (配列番号：223), 図 225 (配列番号：225), 図 227 (配列番号：227), 図 229 (配列番号：229), 図 231 (配列番号：231), 図 233 (配列番号：233), 図 235 (配列番号：235), 図 237 (配列番号：237), 図 239 (配列番号：239), 図 241 (配列番号：241), 図 243 (配列番号：243), 図 245 (配列番号：245), 図 247 (配列番号：247), 図 249 (配列番号：249), 図 251 (配列番号：251), 図 253 (配列番号：253), 図 255 (配列番号：255), 図 257 (配列番号：257), 図 259 (配列番号：259), 図 261 (配列番号：261), 図 263 (配列番号：263), 図 265 (配列番号：265), 図 267 (配列番号：267), 図 269 (配列番号：269), 図 271 (配列番号：271), 図 273 (配列番号：273), 図 275 (配列番号：275), 図 277 (配列番号：277), 図 279 (配列番���：279),  図 281 (配列番号：281), 図 283 (配列番号：283), 図 285 (配列番号：285), 図 287 (配列番号：287), 図s 289A-289B (配列番号：289), 図 291 (配列番号：291), 図 293 (配列番号：293), 図 295 (配列番号：295), 図 297 (配列番号：297), 図 299 (配列番号：299), 図 301 (配列番号：301), 図 303 (配列番号：303), 図 305 (配列番号：305), 図 307 (配列番号：307), 図 309 (配列番号：309), 図s 311A-311B (配列番号：311), 図 313 (配列番号：313), 図 315 (配列番号：315), 図 317 (配列番号：317), 図 319 (配列番号：319), 図 321 (配列番号：321), 図 323 (配列番号：323), 図 325 (配列番号：325), 図 327 (配列番号：327), 図 329 (配列番号：329), 図 331 (配列番号：331), 図 333 (配列番号：333), 図 335 (配列番号：335), 図 337 (配列番号：337), 図 339 (配列番号：339), 図 341 (配列番号：341), 図 343 (配列番号：343), 図 345 (配列番号：345), 図 347 (配列番号：347), 図 349 (配列番号：349), 図s 351A-351B (配列番号：351), 図 353 (配列番号：353), 図 355 (配列番号：355), 図 357 (配列番号：357), 図 359 (配列番号：359), 図 361 (配列番号：361), 図 363 (配列番号：363), 図 365 (配列番号：365), 図 367 (配列番号：367), 図 369 (配列番号：369), 図 371 (配列番号：371)及び図 373 (配列番号：373)中に示されるヌクレオチド配列の全長コード化配列からなるグループから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
４．  表７に示されるいずれかのATCCアクセッション番号の下、寄託されたDNAの全長コード化配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
５．  請求項１に記載の核酸を含むベクター。
６．  請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
７．  前記細胞がCHO細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
８．  前記細胞が大腸菌である請求項６に記載の宿主細胞。
９．  前記細胞が酵母細胞である請求項６に記載の宿主細胞。
１０．  前記PROポリペプチドの発現に適する条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、前記PROポリペプチドを細胞培養物から回収することを含むPROポリペプチドを生産する方法。
１１．  図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号：280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 及び図 374 (配列番号：374)中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
１２．  表７に示されるいずれかのATCCアクセッション番号の下、寄託されたDNAの全長コード化配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
１３．  異種性のアミノ酸配列と融合された請求項１１に記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
１４．  前記異種性のアミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１３に記載のキメラ分子。
１５．  前記異種性のアミノ酸配列がイムノグロブリンのFc領域である請求項１３に記載のキメラ分子。
１６．  請求項１１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
１７．  前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項１６に記載の抗体。
１８．  （a）図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (��列番号：280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドであって、その付随するシグナルペプチドを欠くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（b）図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号���280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示さるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを持つものをコードするヌクレオチド配列；又は
（c）図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号���280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列：
と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
１９．  （a）図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (��列番号：280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドであって、その付随するシグナルペプチドを欠くポリペプチドのアミノ酸配列；
（b）図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号���280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを持つもののアミノ酸配列；又は
（c）図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号���280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの細胞外ドメインであって、その付随するシグナルペプチドを欠くもののアミノ酸配列：
と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
２０．  図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号：280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患を治療する方法。
２１．  哺乳動物がヒトである請求項２０に記載の方法。
２２．  前記ヒトが心筋梗塞を患っている請求項２１に記載の方法。
２３．  ヒトが心肥大、外傷、癌又は加齢黄斑変性症を患っている請求項２１に記載の方法。
２４．  心肥大がPGF２αの上昇したレベルでの存在により特徴づけられる請求項２３に記載の方法。
２５．  ポリペプチドが心臓血管性、内皮性又は血管形成の薬剤と共に投与される請求項２０に記載の方法。
２６．  ポリペプチドが一次血管形成術に従い投与される請求項２３に記載の方法。
２７．  心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患が癌である請求項２０に記載の方法。
２８．  ポリペプチドが化学治療剤、成長抑制剤又は細胞障害性薬剤と組合わせて投与される請求項２７に記載の方法。
２９．  前記アゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である請求項２０に記載の方法。
３０．  前記アンタゴニストが前記ポリペプチドに対する抗体である請求項２０に記載の方法。
３１．  図 2 (配列番号：2), 図 4 (配列番号：4), 図 6 (配列番号：6), 図 8 (配列番号：8), 図 10 (配列番号：10), 図 12 (配列番号：12), 図 14 (配列番号：14), 図 16 (配列番号：16), 図 18 (配列番号：18), 図 20 (配列番号：20), 図 22 (配列番号：22), 図 24 (配列番号：24), 図 26 (配列番号：26), 図 28 (配列番号：28), 図 30 (配列番号：30), 図 32 (配列番号：32), 図 34 (配列番号：34), 図 36 (配列番号：36), 図 38 (配列番号：38), 図 40 (配列番号：40), 図 42 (配列番号：42), 図 44 (配列番号：44), 図 46 (配列番号：46), 図 48 (配列番号：48), 図 50 (配列番号：50), 図 52 (配列番号：52), 図 54 (配列番号：54), 図 56 (配列番号：56), 図 58 (配列番号：58), 図 60 (配列番号：60), 図 62 (配列番号：62), 図 64 (配列番号：64), 図 66 (配列番号：66), 図 68 (配列番号：68), 図 70 (配列番号：70), 図 72 (配列番号：72), 図 74 (配列番号：74), 図 76 (配列番号：76), 図 78 (配列番号：78), 図 80 (配列番号：80),  図 82 (配列番号：82), 図 84 (配列番号：84), 図 86 (配列番号：86), 図 88 (配列番号：88), 図 90 (配列番号：90), 図 92 (配列番号：92), 図 94 (配列番号：94), 図 96 (配列番号：96), 図 98 (配列番号：98), 図 100 (配列番号：100), 図 102 (配列番号：102), 図 104 (配列番号：104), 図 106 (配列番号：106), 図 108 (配列番号：108), 図 110 (配列番号：110), 図 112 (配列番号：112), 図 114 (配列番号：114), 図 116 (配列番号：116), 図 118 (配列番号：118), 図 120 (配列番号：120), 図 122 (配列番号：122), 図 124 (配列番号：124), 図 126 (配列番号：126), 図 128 (配列番号：128), 図 130 (配列番号：130), 図 132 (配列番号：132), 図 134 (配列番号：134), 図 136 (配列番号：136), 図 138 (配列番号：138), 図 140 (配列番号：140), 図 142 (配列番号：142), 図 144 (配列番号：144), 図 146 (配列番号：146), 図 148 (配列番号：148), 図 150 (配列番号：150), 図 152 (配列番号：152), 図 154 (配列番号：154), 図 156 (配列番号：156), 図 158 (配列番号：158), 図 160 (配列番号：160), 図 162 (配列番号：162), 図 164 (配列番号：164), 図 166 (配列番号：166), 図 168 (配列番号：168), 図 170 (配列番号：170), 図 172 (配列番号：172), 図 174 (配列番号：174), 図 176 (配列番号：176), 図 178 (配列番号：178), 図 180 (配列番号：180),  図 182 (配列番号：182), 図 184 (配列番号：184), 図 186 (配列番号：186), 図 188 (配列番号：188), 図 190 (配列番号：190), 図 192 (配列番号：192), 図 194 (配列番号：194), 図 196 (配列番号：196), 図 198 (配列番号：198), 図 200 (配列番号：200), 図 202 (配列番号：202), 図 204 (配列番号：204), 図 206 (配列番号：206), 図 208 (配列番号：208), 図 210 (配列番号：210), 図 212 (配列番号：212), 図 214 (配列番号：214), 図 216 (配列番号：216), 図 218 (配列番号：218), 図 220 (配列番号：220), 図 222 (配列番号：222), 図 224 (配列番号：224), 図 226 (配列番号：226), 図 228 (配列番号：228), 図 230 (配列番号：230), 図 232 (配列番号：232), 図 234 (配列番号：234), 図 236 (配列番号：236), 図 238 (配列番号：238), 図 240 (配列番号：240), 図 242 (配列番号：242), 図 244 (配列番号：244), 図 246 (配列番号：246), 図 248 (配列番号：248), 図 250 (配列番号：250), 図 252 (配列番号：252), 図 254 (配列番号：254), 図 256 (配列番号：256), 図 258 (配列番号：258), 図 260 (配列番号：260), 図 262 (配列番号：262), 図 264 (配列番号：264), 図 266 (配列番号：266), 図 268 (配列番号：268), 図 270 (配列番号：270), 図 272 (配列番号：272), 図 274 (配列番号：274), 図 276 (配列番号：276), 図 278 (配列番号：278), 図 280 (配列番号：280),  図 282 (配列番号：282), 図 284 (配列番号：284), 図 286 (配列番号：286), 図 288 (配列番号：288), 図 290 (配列番号：290), 図 292 (配列番号：292), 図 294 (配列番号：294), 図 296 (配列番号：296), 図 298 (配列番号：298), 図 300 (配列番号：300), 図 302 (配列番号：302), 図 304 (配列番号：304), 図 306 (配列番号：306), 図 308 (配列番号：308), 図 310 (配列番号：310), 図 312 (配列番号：312), 図 314 (配列番号：314), 図 316 (配列番号：316), 図 318 (配列番号：318), 図 320 (配列番号：320), 図 322 (配列番号：322), 図 324 (配列番号：324), 図 326 (配列番号：326), 図 328 (配列番号：328), 図 330 (配列番号：330), 図 332 (配列番号：332), 図 334 (配列番号：334), 図 336 (配列番号：336), 図 338 (配列番号：338), 図 340 (配列番号：340), 図 342 (配列番号：342), 図 344 (配列番号：344), 図 346 (配列番号：346), 図 348 (配列番号：348), 図 350 (配列番号：350), 図 352 (配列番号：352), 図 354 (配列番号：354), 図 356 (配列番号：356), 図 358 (配列番号：358), 図 360 (配列番号：360), 図 362 (配列番号：362), 図 364 (配列番号：364), 図 366 (配列番号：366), 図 368 (配列番号：368), 図 370 (配列番号：370), 図 372 (配列番号：372) 又は図 374 (配列番号：374)中に示されるポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストをコードする核酸分子を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における心臓血管性、内皮性又は血管形成疾患を治療する方法。
３２．  前記アゴニストが前記ポリペプチドの抗体である請求項３１に記載の方法。
３３．  前記アンタゴニストが前記ポリペプチドの抗体である請求項３１に記載の方法。
３４．  哺乳動物がヒトである請求項３１に記載の方法。
３５．  核酸分子がエクスヴィボ遺伝子治療によって投与される請求項３１に記載の方法。
３６．  PRO229, PRO238, PRO247, PRO444, PRO720, PRO827, PRO1007, PRO1029, PRO1075, PRO1184, PRO1190, PRO1195, PRO1274, PRO1279, PRO1419, PRO1474, PRO1477, PRO1488, PRO1782, PRO1890, PPRO4302, PRO4405, PRO5725, PRO5776, PRO6006, PRO7436, PRO9771, PRO10008, PRO21384 又は PRO28631ポリペプチド又はそのアゴニストを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における内皮性細胞の増殖を阻害する方法であって、前記哺乳動物における内皮性細胞の増殖が阻害される方法。
３７．  哺乳動物にPRO21, PRO181, PRO205, PRO214, PRO221, PRO231, PRO238, PRO241, PRO247, PRO256, PRO258, PRO263, PRO265, PRO295, PRO321, PRO322, PRO337, PRO363, PRO365, PRO533, PRO697, PRO725, PRO771, PRO788, PRO791, PRO819, PRO828, PRO836, PRO846, PRO865, PRO1005, PRO1006, PRO1025, PRO1054, PRO1071, PRO1079, PRO1080, PRO1114, PRO1131, PRO1155, PRO1160, PRO1186, PRO1192, PRO1244, PRO1272, PRO1273, PRO1279, PRO1283, PRO1286, PRO1306, PRO1309, PRO1325, PRO1329, PRO1347, PRO1356, PRO1376, PRO1382, PRO1411, PRO1412, PRO1508, PRO1550, PRO1556, PRO1760, PRO1787, PRO1801, PRO1868, PRO1887, PRO3438, PRO3444, PRO4324, PRO4333, PRO4341, PRO4342, PRO4353, PRO4354, PRO4356, PRO4371, PRO4408, PRO4422, PRO4425, PRO4499, PRO5723, PRO5737, PRO6029, PRO6071, PRO9821, PRO9873, PRO10008, PRO10096, PRO19670, PRO20040, PRO20044, PRO21055 又は PRO21384ポリペプチド、又はそのアゴニストを投与することを含む哺乳動物におけるに内皮性細胞の増殖を刺激する方法であって、前記哺乳動物における内皮性細胞の増殖が刺激される方法。
３８．  哺乳動物にPRO21ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む哺乳動物における心肥大を誘導する方法であって、前記哺乳動物における心肥大が誘導される方法。
３９．  哺乳動物においてPRO1376又はPRO1449によって誘導される血管形成を刺激する方法であって、前記ポリペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含み、前記血管形成が刺激される方法。
４０．  内皮性細胞にPRO4302ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む内皮性細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、前記内皮性細胞におけるアポトーシスが誘導される方法。
４１．  平滑筋細胞にPRO162, PRO182, PRO204, PRO221, PRO230, PRO256, PRO258, PRO533, PRO697, PRO725, PRO738, PRO826, PRO836, PRO840, PRO846, PRO865, PRO982, PRO1025, PRO1029, PRO1071, PRO1083, PRO1134, PRO1160, PRO1182, PRO1184, PRO1186, PRO1192, PRO1274, PRO1279, PRO1283, PRO1306, PRO1308, PRO1325, PRO1337, PRO1338, PRO1343, PRO1376, PRO1387, PRO1411, PRO1412, PRO1415, PRO1434, PRO1474, PRO1550, PRO1556, PRO1567, PRO1600, PRO1754, PRO1758, PRO1760, PRO1787, PRO1865, PRO1868, PRO1917, PRO1928, PRO3438, PRO3562, PRO4333, PRO4345, PRO4353, PRO4354, PRO4408, PRO4430, PRO4503, PRO6714, PRO9771, PRO9820, PRO9940, PRO10096, PRO21055, PRO21184 又は PRO21366ポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含む平滑筋細胞の増殖を刺激する方法であって、前記平滑筋細胞における平滑筋細胞の増殖が刺激される方法。
４２．  平滑筋細胞における平滑筋細胞増殖が促進される、平滑筋細胞にPRO181, PRO195, PRO1080, PRO1265, PRO1309, PRO1488, PRO4302, PRO4405 又は PRO5725ポリペプチド、又はそのアゴニストを投与することを含む平滑筋細胞の増殖を阻害する方法。
４３．  PRO178, PRO195, PRO228, PRO301, PRO302, PRO532, PRO724, PRO730, PRO734, PRO793, PRO871, PRO938, PRO1012, PRO1120, PRO1139, PRO1198, PRO1287, PRO1361, PRO1864, PRO1873, PRO2010, PRO3579, PRO4313, PRO4527, PRO4538, PRO4553, PRO4995, PRO5730, PRO6008, PRO7223, PRO7248又はPRO7261ポリペプチド又はそのアゴニストを内皮性細胞に投与することを含む内皮性細胞管形成を誘導する方法であって、前記内皮性細胞における管形成が誘導される方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２−１】
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【図８２−２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４２】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５３】
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【図１６０】
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【図１６６】
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【図１７０】
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【図１８０】
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【図１８１】
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【図１８２】
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【図１８３】
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【図１８４】
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【図１８５】
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【図１８６】
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【図１８７】
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【図１８８】
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【図１９１】
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【図１９２】
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【図２００】
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【図２０１】
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【図２０３】
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【図２０５】
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【図２１２】
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【図２１３】
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【図３２７】
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【図３２９】
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【図３３０】
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【図３３１】
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【図３４３】
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【図３４８】
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【図３５０】
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【図３５１】
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【図３５２】
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【図３５３】
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【図３５６】
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【図３５７】
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【図３５８】
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【図３５９】
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【図３６０】
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【図３６１】
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【図３６２】
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【図３６３】
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【図３６４】
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【図３６５】
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【図３６６】
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【図３６７】
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【図３６８】
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【図３６９】
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【図３７０】
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【図３７１】
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【図３７２】
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【図３７３】
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【図３７４】
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【図３７５】
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【図３７６】
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【図３７７】
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【配列表】
2015037408000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月14日(2014.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fig 2 (配列番号：2), Fig 4 (配列番号：4), Fig 6 (配列番号：6), Fig 8 (配列番号：8), Fig 10 (配列番号：10), Fig 12 (配列番号：12), Fig 14 (配列番号：14), Fig 16 (配列番号：16), Fig 18 (配列番号：18), Fig 20 (配列番号：20), Fig 22 (配列番号：22), Fig 24 (配列番号：24), Fig 26 (配列番号：26), Fig 28 (配列番号：28), Fig 30 (配列番号：30), Fig 32 (配列番号：32), Fig 34 (配列番号：34), Fig 36 (配列番号：36), Fig 38 (配列番号：38), Fig 40 (配列番号：40), Fig 42 (配列番号：42), Fig 44 (配列番号：44), Fig 46 (配列番号：46), Fig 48 (配列番号：48), Fig 50 (配列番号：50), Fig 52 (配列番号：52), Fig 54 (配列番号：54), Fig 56 (配列番号：56), Fig 58 (配列番号：58), Fig 60 (配列番号：60), Fig 62 (配列番号：62), Fig 64 (配列番号：64), Fig 66 (配列番号：66), Fig 68 (配列番号：68), Fig 70 (配列番号：70), Fig 72 (配列番号：72), Fig 74 (配列番号：74), Fig 76 (配列番号：76), Fig 78 (配列番号：78), Fig 80 (配列番号：80),  Fig 82 (配列番号：82), Fig 84 (配列番号：84), Fig 86 (配列番号：86), Fig 88 (配列番号：88), Fig 90 (配列番号：90), Fig 92 (配列番号：92), Fig 94 (配列番号：94), Fig 96 (配列番号：96), Fig 98 (配列番号：98), Fig 100 (配列番号：100), Fig 102 (配列番号：102), Fig 104 (配列番号：104), Fig 106 (配列番号：106), Fig 108 (配列番号：108), Fig 110 (配列番号：110), Fig 112 (配列番号：112), Fig 114 (配列番号：114), Fig 116 (配列番号：116), Fig 118 (配列番号：118), Fig 120 (配列番号：120), Fig 122 (配列番号：122), Fig 124 (配列番号：124), Fig 126 (配列番号：126), Fig 128 (配列番号：128), Fig 130 (配列番号：130), Fig 132 (配列番号：132), Fig 134 (配列番号：134), Fig 136 (配列番号：136), Fig 138 (配列番号：138), Fig 140 (配列番号：140), Fig 142 (配列番号：142), Fig 144 (配列番号：144), Fig 146 (配列番号：146), Fig 148 (配列番号：148), Fig 150 (配列番号：150), Fig 152 (配列番号：152), Fig 154 (配列番号：154), Fig 156 (配列番号：156), Fig 158 (配列番号：158), Fig 160 (配列番号：160), Fig 162 (配列番号：162), Fig 164 (配列番号：164), Fig 166 (配列番号：166), Fig 168 (配列番号：168), Fig 170 (配列番号：170), Fig 172 (配列番号：172), Fig 174 (配列番号：174), Fig 176 (配列番号：176), Fig 178 (配列番号：178), Fig 180 (配列番号：180),  Fig 182 (配列番号：182), Fig 184 (配列番号：184), Fig 186 (配列番号：186), Fig 188 (配列番号：188), Fig 190 (配列番号：190), Fig 192 (配列番号：192), Fig 194 (配列番号：194), Fig 196 (配列番号：196), Fig 198 (配列番号：198), Fig 200 (配列番号：200), Fig 202 (配列番号：202), Fig 204 (配列番号：204), Fig 206 (配列番号：206), Fig 208 (配列番号：208), Fig 210 (配列番号：210), Fig 212 (配列番号：212), Fig 214 (配列番号：214), Fig 216 (配列番号：216), Fig 218 (配列番号：218), Fig 220 (配列番号：220), Fig 222 (配列番号：222), Fig 224 (配列番号：224), Fig 226 (配列番号：226), Fig 228 (配列番号：228), Fig 230 (配列番号：230), Fig 232 (配列番号：232), Fig 234 (配列番号：234), Fig 236 (配列番号：236), Fig 238 (配列番号：238), Fig 240 (配列番号：240), Fig 242 (配列番号：242), Fig 244 (配列番号：244), Fig 246 (配列番号：246), Fig 248 (配列番号：248), Fig 250 (配列番号：250), Fig 252 (配列番号：252), Fig 254 (配列番号：254), Fig 256 (配列番号：256), Fig 258 (配列番号：258), Fig 260 (配列番号：260), Fig 262 (配列番号：262), Fig 264 (配列番号：264), Fig 266 (配列番号：266), Fig 268 (配列番号：268), Fig 270 (配列番号：270), Fig 272 (配列番号：272), Fig 274 (配列番号：274), Fig 276 (配列番号：276), Fig 278 (配列番号：278), Fig 280 (配列番号：280),  Fig 282 (配列番号：282), Fig 284 (配列番号：284), Fig 286 (配列番号：286), Fig 288 (配列番号：288), Fig 290 (配列番号：290), Fig 292 (配列番号：292), Fig 294 (配列番号：294), Fig 296 (配列番号：296), Fig 298 (配列番号：298), Fig 300 (配列番号：300), Fig 302 (配列番号：302), Fig 304 (配列番号：304), Fig 306 (配列番号：306), Fig 308 (配列番号：308), Fig 310 (配列番号：310), Fig 312 (配列番号：312), Fig 314 (配列番号：314), Fig 316 (配列番号：316), Fig 318 (配列番号：318), Fig 320 (配列番号：320), Fig 322 (配列番号：322), Fig 324 (配列番号：324), Fig 326 (配列番号：326), Fig 328 (配列番号：328), Fig 330 (配列番号：330), Fig 332 (配列番号：332), Fig 334 (配列番号：334), Fig 336 (配列番号：336), Fig 338 (配列番号：338), Fig 340 (配列番号：340), Fig 342 (配列番号：342), Fig 344 (配列番号：344), Fig 346 (配列番号：346), Fig 348 (配列番号：348), Fig 350 (配列番号：350), Fig 352 (配列番号：352), Fig 354 (配列番号：354), Fig 356 (配列番号：356), Fig 358 (配列番号：358), Fig 360 (配列番号：360), Fig 362 (配列番号：362), Fig 364 (配列番号：364), Fig 366 (配列番号：366), Fig 368 (配列番号：368), Fig 370 (配列番号：370), Fig 372 (配列番号：372)及びFig 374 (配列番号：374)中に示されるアミノ酸配列からなるグループから選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸分子。
【外国語明細書】
2015037408000001.pdf
2015037408000002.pdf
2015037408000003.pdf
2015037408000004.pdf