(57)【要約】      （修正有）【課題】運動を介した運動機能や筋量の向上を評価するためのモデル動物の提供。【解決手段】ゼブラフィッシュに高強度運動を一定期間負荷することにより短期間で効率よく筋肉を増加させることができる方法は、限界持続遊泳速度を決め、この水流下で１〜８時間／日、３〜５日間遊泳させ、この状態を少なくとも５日間繰り返す。筋肉断面が積が日運動軍に比べて大きくなっている。この高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュをモデル動物として用いることが運動による筋力増加を促進する手段の開発を効率よくすることができる。【選択図】図５
2015119700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと
を含む、筋量評価のためのモデル動物の製造方法。
【請求項２】
ゼブラフィッシュが稚魚、幼魚または成魚である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の（１）〜（３）：
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと
により該ゼブラフィッシュに運動を負荷すること、
該運動負荷の前、間または後に、該ゼブラフィッシュに試験物質を投与すること、
該運動負荷されたゼブラフィッシュの筋量を測定すること、
を含む、運動による筋量増加の促進剤の探索方法。
【請求項４】
ゼブラフィッシュが稚魚、幼魚または成魚である請求項３記載の方法。
【請求項５】
筋量の測定が、尾部の脊椎垂直断面における筋断面積の測定である、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
筋量の測定が、尾部の筋体積の測定である、請求項３〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の筋量の変化を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
持久力や筋力等の運動機能の低下は、ＱＯＬ（quality of life：生活の質）に重大な悪影響をもたらす。特に、加齢に伴う筋萎縮や持久力、筋力の低下は、廃用症候群や寝たきり等の原因となる。日常生活動作を改善、維持し、健康寿命を延伸するためには、日頃から運動機能を維持または高めておくこと、また老化に伴う運動機能の低下を抑制することが重要である。運動機能を向上させるには、運動トレーニングを行うことが適切であるといえるが、忙しさのため十分な運動をする時間がとれない人や、運動してもすぐに疲労してしまい、継続して運動できない人も多いのが現状である。また、高齢者においては、モチベーションの維持の困難さや怪我の恐れもあり、運動の実践は容易ではないのが実情である。したがって、運動による持久力や筋力等の向上効果をより高めることができる方法の開発が望まれている。
【０００３】
従来、運動機能や筋肉の評価においては、ラットやマウスなどに回し車やトレッドミルなどにより運動負荷を与えるモデルが用いられていた。哺乳類モデルを用いたいくつかの報告では、運動により、体重の増加ではなく、運動に伴いよく駆動している主に脚部の筋肉において筋量増加が検出されている（非特許文献１〜４）。しかしながら、これらの運動機能や筋肉の評価モデルは、運動負荷が軽すぎると、筋肉が付きにくくなり適切な評価ができないかまたはモデルの作製に長期間を必要とし、一方、運動負荷が重すぎても、ストレスによって動物が却って痩せてしまうことなどにより、やはり適切な評価ができないという問題があった。また、モデル動物は、大型になるほど、飼育および計測評価の作業がより重労働になるという問題がある。
【０００４】
魚類は、骨格構造が単純で、筋肉の評価が比較的容易である。魚類の運動の研究は、以前より行われている（非特許文献５〜７）。これらの研究により、魚類でも運動により筋肉中のグリコーゲンやＡＴＰが減少し、筋肉中や血中の乳酸値が増加するなど、運動に伴う基本的な体内応答はヒトのそれと類似していることが分かってきた。さらに２０００年以降は、ゼブラフィッシュを用いた運動や筋肉の研究報告が増加した。これまでに、ゼブラフィッシュにおいて、哺乳動物と同じく、瞬発力に優れる白筋と持久力に優れる赤筋とを有すること（非特許文献８〜９）、マイオスタチン遺伝子発現抑制により筋肉量が増加すること（非特許文献１０）、老化により、筋萎縮、および筋肉中での酸化タンパク質やｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎの蓄積が生じること（非特許文献１１）、運動による筋肉形成関連や脂質代謝関連遺伝子発現の変化（非特許文献８）、および長期間の高強度運動負荷により、体重増加や筋肉関連遺伝子の発現変化がみられること（非特許文献１２〜１４）が報告されている。これらの報告から、ゼブラフィッシュは、筋肉の形成、運動や老化に伴う筋肉の変化に関して、哺乳類と同等の機序を持つと考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Applied Physiology, 1998, 84(6):pp.2183-2189
【非特許文献２】Journal of Applied Physiology, 2001, 90(5):pp.1900-1908
【非特許文献３】American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology, 2005, 289：pp.H455-H465
【非特許文献４】Journal of Applied Physiology,2002, 93(4):pp.1301-1309
【非特許文献５】Journal of Fisheries Research Board of Canada, 1964, 21(5)：pp.1183-1226
【非特許文献６】Comparative Biochemistry and Physiology - A Physiology, 1997, 117(1)：pp.67-75
【非特許文献７】Comparative Biochemistry and Physiology - A Physiology, 1995, 112(1)：pp.1-20
【非特許文献８】American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology, 2006, 291 (4), pp. R1040-R1048
【非特許文献９】American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology, 2006, 291 (5):pp.R1327-R1337
【非特許文献１０】Journal of Experimental Biology, 2003, 206(22):pp.4067-4079
【非特許文献１１】Experimental Gerontolog, 2002, 37(8-9):pp.1055-1068
【非特許文献１２】Journal of Physiology, 2006, 577(2):pp.739-751
【非特許文献１３】PLoS ONE, 2010, 5(12):e14483
【非特許文献１４】Journal of Comparative Physiology B: : Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology, 2010, 180(1):pp.151-160
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ゼブラフィッシュをモデル動物として用いた運動生理機能や筋肉の評価方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、飼育および計測評価が容易な下等小型脊椎動物を用いた、運動を介した運動機能や筋量の向上の評価モデルを開発するため、鋭意研究を行った。その結果、本発明者は、ゼブラフィッシュに高強度運動を一定期間負荷することにより短期間で効率よく筋量を増加させることができること、および当該高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュをモデル動物として用いることによって、運動による筋量の増加を促進することができる手段を効率よく開発することができることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下：
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと、
を含む、筋量評価のためのモデル動物の製造方法を提供する。
【０００９】
また本発明は、
以下の（１）〜（３）：
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと
により該ゼブラフィッシュに運動を負荷すること、
該運動負荷の前、間または後に、該ゼブラフィッシュに試験物質を投与すること、
該運動負荷されたゼブラフィッシュの筋量を測定すること、
を含む、運動による筋量増加の促進剤の探索方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、運動を介した運動機能や筋量の向上を評価するためのモデル動物を提供する。本発明でモデル動物として用いられるゼブラフィッシュは、小型で、飼育が容易であり、かつ高強度の運動負荷に応じて短期間で筋肉を発達させることができるので、高効率かつ高精度での筋量の計測および評価に好適である。当該運動負荷されたゼブラフィッシュをモデル動物とした本発明の筋量改善剤の評価方法によれば、運動による筋量の増加を促進することができる物質や環境等を効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュ１匹あたりにおける試験期間中の積算摂餌量。
【図２】尾部脊椎垂直断面切片の筋組織染色像。
【図３】実施例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける試験期間前後の体重変移。エラーバー：ＳＥＭ。
【図４】実施例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける全身筋体積および尾部骨格筋体積。エラーバー：ＳＥＭ、＊：ｐ＜０．０５（ｔ−ｔｅｓｔ  非運動群ｖｓ．運動群）。
【図５】実施例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける赤筋、白筋、およびそれらの合計筋断面積。エラーバー：ＳＥＭ、＊：ｐ＜０．０５（ｔ−ｔｅｓｔ  非運動群ｖｓ．運動群）。
【図６】実施例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける赤筋、白筋の筋繊維断面積および筋繊維数。エラーバー：ＳＥＭ、＊：ｐ＜０．０５（ｔ−ｔｅｓｔ  非運動群ｖｓ．運動群）。
【図７】比較例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける試験期間前後の体重変移。エラーバー：ＳＥＭ。
【図８】比較例１の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける尾部骨格筋体積。エラーバー：ＳＥＭ。
【図９】実施例２の非運動群、運動群ゼブラフィッシュ１匹あたりにおける試験期間中の積算摂餌量。
【図１０】実施例２の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける試験期間前後の体重変移。
【図１１】実施例２の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける赤筋、白筋、およびそれらの合計筋断面積。エラーバー：ＳＥＭ、＊：ｐ＜０．０５（ｔ−ｔｅｓｔ  非運動群ｖｓ．運動群）。
【図１２】実施例３の非運動群、運動群ゼブラフィッシュ１匹あたりにおける試験期間中の積算摂餌量。
【図１３】実施例３の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける試験期間前後の体重変移。エラーバー：ＳＥＭ。
【図１４】実施例３の非運動群、運動群ゼブラフィッシュにおける赤筋、白筋、およびそれらの合計筋断面積。エラーバー：ＳＥＭ、＊：ｐ＜０．０５（ｔ−ｔｅｓｔ  非運動群ｖｓ．運動群）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、筋量評価のためのモデル動物、好ましくは、運動を介した筋量の向上を評価するためのモデル動物を提供する。当該モデル動物としては、高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュ（Danio rerio）が用いられる。ゼブラフィッシュは、小型動物であるため、飼育し易く、かつ体重や筋肉の計測が容易である。また、ゼブラフィッシュは、高強度運動を負荷しても、運動を休まず持続することができ、かつそのような負荷を与えても、強負荷による摂餌量の低減などの負の作用を受けることがなく、筋肉を発達させることができるという利点を有する。さらに、ゼブラフィッシュ等の魚類においては、マウス等の哺乳動物と異なり、筋肉中で、持久力に優れた筋肉である赤筋（遅筋、魚類の場合は血合筋とも呼ばれる）と、瞬発力に優れた筋肉である白筋（速筋）とが明瞭に分かれて分布している。したがって、ゼブラフィッシュは、筋肉のタイプ別評価のためのモデル動物としても使用することができる。
【００１３】
本発明で使用されるゼブラフィッシュは、稚魚、幼魚および成魚のいずれか、またそれらの組み合わせであればよいが、好ましくは成魚である。本明細書において、「稚魚」とは、摂食を行い、形態はほぼ種の特徴を示しているが、体の各部の特徴はまだ発現初期の状態（仔魚期の特徴など）を残している発生段階（孵化約６〜２７日）をいい、「幼魚」とは、形態はほぼ種の特徴を現すが生殖能力はまだ持たない発生段階（孵化約２７日〜９０日）をいい、それ以降（孵化約９１日以降）を成魚という。
【００１４】
ゼブラフィッシュに高強度運動を負荷するには、ゼブラフィッシュを所定の速度で泳がせればよい。ゼブラフィッシュは水流に逆らって泳ぐ習性があるため、水槽中で一定方向に水流を与え続ければ、ゼブラフィッシュは流れと逆向きに泳ぎ続ける。このとき、水流の速度を制御すれば、ゼブラフィッシュの泳ぐ速度を制御することができる。水流の速度は、ゼブラフィッシュに高強度の運動負荷を与える一方で、ゼブラフィッシュの遊泳能力を超えた過度な負荷を与えないような速度にするのがよい。好ましくは、高強度の運動負荷を与えるには、ゼブラフィッシュを限界持続遊泳速度で泳ぐようにさせるとよい。本明細書において、限界持続遊泳速度とは、一定方向に水流を発生させた水槽中でゼブラフィッシュを泳がせたときに、ゼブラフィッシュが１時間以上流れに負けて後退することなく泳ぐことのできる最高速度をいう。ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度は、ゼブラフィッシュが泳ぐ水槽の水流速度を徐々に上げていき、ゼブラフィッシュが前進も後退もせずに１時間以上泳ぐことができた速度として決定すればよい。一旦ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定した後は、当該ゼブラフィッシュを観察しながら水流速度を調整すれば、長時間に亘って限界持続遊泳速度での遊泳を継続させることができる。
【００１５】
ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度は、いずれの成長段階においても、該ゼブラフィッシュの全長（total length：ＴＬ（ｍｍ）、頭の先から尾ひれの先までの長さ）を基準に見積もることができる。例えば、ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度は、多くの場合、約１０ＴＬ／秒以上である。より具体的には、成魚の場合、ＴＬが大体３５〜４５ｍｍであるので、好ましい水流速度は約４０±２．５ｃｍ／秒以上である。したがって、ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定する際は、最初に該ゼブラフィッシュに対して約１０ＴＬ／秒の水流を与え、次いで、その流れに逆らって泳ぐ該ゼブラフィッシュの様子を観察しながら、前進も後退もせずに泳ぎ続けられるように水流速度を調節すればよい。ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度が全く未知の場合、運動負荷開始の少なくとも１時間前、より好ましくは２〜３時間以上前、さらに好ましくは運動負荷開始日の前日までに、ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を予め決定しておくことが好ましい。
【００１６】
ゼブラフィッシュは、運動負荷期間中に成長することがあり、かつ運動負荷により運動能力を向上させるため、通常、限界持続遊泳速度は、運動負荷期間中に徐々に上昇する。一方で、ゼブラフィッシュの状態により、一日のうちで限界持続遊泳速度が増減することもあり得る。したがって、運動負荷期間中、ゼブラフィッシュの遊泳速度（水流の速度）は始終一定である必要はなく、ゼブラフィッシュの能力に応じて増減させてもよい。
【００１７】
上記限界持続遊泳速度での運動の負荷は、好ましくは１〜８時間／日、より好ましくは３〜７時間／日、さらに好ましくは５〜７時間／日与えられる。上記限界持続遊泳速度での運動の負荷期間は、ゼブラフィッシュの筋量や運動能力の向上に必要な期間、または後述する筋量改善剤の評価方法における試験物質の投与期間にあわせて、適宜選択することができる。当該運動負荷期間は、適宜選択することができるが、５日間以上であればよく、７日間以上が好ましく、８日間以上がより好ましい。また好ましくは、当該運動負荷期間は２０日間未満であるとよい。好ましい運動負荷期間は５日間〜１９日間、より好ましくは５日間〜１４日間、さらに好ましくは７日間〜１９日間、さらにより好ましくは７日間〜１４日間、なお好ましくは８日間〜１９日間、なお好ましくは８日間〜１４日間である。あるいは、より筋肉を発達させるため、運動負荷期間を１０日間以上、例えば、１０日間〜１９日間または１４日間〜１９日間にしてもよい。
上記運動負荷期間には、動物を連日運動させてもよいが、３〜５日毎に１〜３日間の休養期間をはさむ断続的運動を行わせてもよい。したがって、上記運動負荷期間とは、動物が連日運動した日数であってもよく、または断続的運動中の運動日の積算数であってもよい。例えば、運動負荷期間が９日間の場合、連続する９日間の運動であってもよいが、３日毎に１〜２日間の休養日を挟んでもよく、または４日間運動→１〜２日間休養→５日間運動もしくは５日間運動→１〜２日間休養→４日間運動する合計で９日間の運動であってもよい。
【００１８】
本発明における、ゼブラフィッシュに対する高強度運動負荷の好ましい手順を以下に記載する。まず、上述の手順でゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定し、その速度の水流下で１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを限界持続遊泳させる。その後、必要に応じて、該ゼブラフィッシュを１〜２日間休養させる。翌日、同じ手順で、再度該ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定し、その速度の水流下で１〜８時間／日、３〜５日間与えて該ゼブラフィッシュを限界持続遊泳させ、必要に応じて１〜２日間休養させる。このサイクルを繰り返しながら、通算で少なくとも５日間、好ましくは５日間〜１９日間、より好ましくは５日間〜１４日間、さらに好ましくは７日間〜１９日間、さらにより好ましくは７日間〜１４日間、なお好ましくは８日〜１９日間、なお好ましくは８日〜１４日間、ゼブラフィッシュを運動させる。
【００１９】
ゼブラフィッシュに上述のような高強度運動を負荷するための装置としては、上述した水流を付加することができる水槽を用いればよい。例えば、装置内の魚に水流を負荷する部位において、一様な層流を発生させることができ、且つ水温、水質を維持できる回流水槽が好ましい。
【００２０】
上記の手順で高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュは、運動負荷により摂餌量が増加し、筋肉を顕著に発達させることができる（図１、４〜６）。一方で、摂餌量が増加するにもかかわらず、当該ゼブラフィッシュが成魚の場合、体重はほとんど増加することがない（図３）。したがって、上記のような高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュは、筋量の評価のためのモデル動物、好ましくは、運動を介した運動機能や筋量の向上を評価するためのモデル動物（以下、「本発明のモデル動物」とも称する）として有用である。
【００２１】
さらに、本発明のモデル動物である高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュにおいては、筋染色像上で、赤筋および白筋を明瞭に視認することができる（図２参照）。したがって、本発明のモデル動物は、向上させたい運動機能に応じたタイプの筋肉が増強されているかどうかを観察するための、筋肉のタイプ別に筋量の向上を評価するためのモデル動物としても有用である。好ましくは、本発明のモデル動物は、赤筋の筋量の向上を評価するためのモデル動物として用いることができる。
【００２２】
一般に、げっ歯類モデルでの筋量評価には７〜８週間の運動期間が必要であり、しかも、回転ケージで運動させる場合、個体ごとに運動量がばらつくという問題がある。一方、本発明のモデル動物は、最短で５日間というげっ歯類モデルに比べて非常に短い期間で作製することができ、また、全ての個体に等しい量の運動が負荷されているという利点を有する。
【００２３】
本発明のモデル動物は、運動による筋量の増加を促進させるための物質、環境、生活習慣等の探索に有用である。例えば、上記の手順でゼブラフィッシュに高強度運動を負荷するとともに、当該ゼブラフィッシュに特定の物質を投与するか、および／または当該ゼブラフィッシュを特定の環境下で、もしくは特定の生活習慣に従って生活させる。その後、当該ゼブラフィッシュの筋量を測定し、その測定値を、高強度運動は負荷したが、当該物質や環境もしくは生活習慣を与えなかったゼブラフィッシュの値と比較することによって、当該物質や環境もしくは生活習慣が、ゼブラフィッシュにおける運動による筋量増加を促進したかどうかを評価することができる。さらに、当該評価に基づいて、運動による筋量増加を促進する物質や環境もしくは生活習慣を選択することができる。
【００２４】
したがって、本発明はまた、ゼブラフィッシュに上述の手順で高強度運動を負荷するとともに、当該運動負荷の前、間または後に当該ゼブラフィッシュに試験物質を投与することと、当該運動負荷されたゼブラフィッシュの筋量を測定することとを含む、運動による筋量増加の促進剤の探索方法を提供する。
【００２５】
さらに本発明は、ゼブラフィッシュに上述の手順で高強度運動を負荷するとともに、当該運動負荷の前、間または後に当該ゼブラフィッシュに試験物質を投与するか、および／または当該ゼブラフィッシュを試験環境もしくは試験生活習慣に付することと、当該運動負荷されたゼブラフィッシュの筋量を測定することとを含む、運動による筋量増加を促進する方法の探索方法を提供する。
【００２６】
上記本発明の探索方法において、ゼブラフィッシュの選択、およびゼブラフィッシュに対する高強度運動の負荷の手順は、上述したとおりである。また、上記探索方法において、ゼブラフィッシュに対する高強度運動の負荷と、当該ゼブラフィッシュに対する試験物質の投与、または試験環境もしくは試験生活習慣の付与は、並行して行われてもよく、あるいは当該運動負荷の前または後に、試験物質の投与や試験環境もしくは試験生活習慣の付与が行われてもよい。
【００２７】
上記試験物質としては、運動による筋量増加を促進することが所望される物質であれば、特に制限されない。当該試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的または生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。当該試験物質を投与する場合、ゼブラフィッシュの食餌に当該試験物質を添加してもよく、またはゼブラフィッシュの水槽に当該試験物質を添加してもよい。
【００２８】
上記試験環境および試験生活習慣としては、運動による筋量増加を促進することが所望されるあらゆる環境および生活習慣が挙げられる。例えば、試験環境としては、機械刺激、電気、光、温度などの物理化学的刺激への曝露などが挙げられ、試験生活習慣としては、概日リズムの変化、休息時間、食餌回数や時間、社会的ストレスへの曝露などが挙げられる。
【００２９】
上記本発明の探索方法においては、続いて、上記運動負荷、および試験物質、試験環境または試験生活習慣が与えられたゼブラフィッシュの筋量を測定する。筋量測定の前には、ゼブラフィッシュを安楽死させるか、または深麻酔することが好ましい。当該ゼブラフィッシュにおける筋量を測定する場合、好ましくは、ゼブラフィッシュの尾部における骨格筋の筋量が測定される。本明細書において、ゼブラフィッシュの尾部とは、魚体の肛門から尾鰭基底までの部位（または腹腔後端部から脊椎末端までの部位でもよい）として、解剖学的に決定される。遊泳中のゼブラフィッシュは、尾部がよく伸縮かつ駆動していることから、尾部を解析することで、体重や全身の骨格筋量を指標とするよりも、より高精度に、運動に伴う筋量増加を検出することができる。
【００３０】
筋量の測定は、動物の筋量測定法として公知の方法に従って行えばよい。例えば、ゼブラフィッシュの尾部筋量を測定する場合、ゼブラフィッシュの尾部の脊椎垂直断面における筋断面積や筋厚、または尾部の筋体積を測定すればよい。より詳細な例においては、ゼブラフィッシュ魚体尾部を脊椎に対して垂直方向に切断した切片の筋組織染色像を作製するか、またはＣＴスキャン等によりゼブラフィッシュ魚体尾部の垂直断面画像を作製し、それらの染色像やＣＴ画像から、尾部の脊椎垂直断面の一部もしくは全部における筋断面積や筋厚を計測するか、またはＣＴ画像から尾部の筋体積を計測し、得られた計測値をゼブラフィッシュの尾部筋量の測定値とすることができる。
【００３１】
筋量測定値を、試験群と対照群との間で比較することにより、試験物質、試験環境または試験生活習慣が運動による筋量増加を促進したかどうかを評価することができる。試験群は、上記高強度運動負荷、および試験物質、試験環境または試験生活習慣が与えられたゼブラフィッシュである。対照群としては、試験群と同様の運動負荷が与えられたが、試験物質、試験環境および試験生活習慣が与えられなかったゼブラフィッシュを挙げることができる。さらに、当該試験群や対照群の筋量測定値から、運動負荷を与えなかったゼブラフィッシュ（非運動群）から測定した筋量測定値を差し引くことによって、運動により増加した筋量のみを評価することができる。対照群と比較して、試験群における筋量が増加していれば、当該試験物質、試験環境または試験生活習慣を、運動による筋量増加を促進する物質や環境または生活習慣として選択することができる。対照群との筋量の比較は、好ましくは統計学的に行われる。例えば、試験群における筋量が、対照群に対して統計学的に有意に増加しており、かつ対照群に対して、好ましくは１０５％以上、より好ましくは１１０％以上、さらに好ましくは１２０％以上に増加していれば、当該試験物質、試験環境または試験生活習慣を、運動による筋量増加を促進する物質や環境または生活習慣として選択することができる。
【００３２】
上述したように、高強度運動を負荷されたゼブラフィッシュの筋染色像上では、２タイプの骨格筋、すなわち赤筋および白筋を、視覚的に区別することができる。したがって、本発明の探索方法においてゼブラフィッシュの尾部筋量を測定する場合、筋肉のタイプごとに、すなわち赤筋および白筋のそれぞれについて筋量を測定することができる。さらに、測定された各筋量から、互いの筋量の比や、測定した筋量全体に対する各筋の割合を求めることもできる。尾部における赤筋および白筋の筋量は、例えば、尾部の脊椎垂直断面の一部もしくは全部における赤筋および白筋の筋断面積または筋厚として測定され得る。より詳細には、ゼブラフィッシュ魚体尾部を脊椎に対して垂直方向に切断した切片の筋組織染色像を作製し、当該染色像に基づいて、赤筋および白筋それぞれの領域を識別する。次いで、識別された赤筋および白筋のそれぞれについて、筋断面積や筋厚を計測すればよい。
【００３３】
次いで、測定された筋肉タイプごとの筋量に基づいて、上述と同様の手順で、対照群、またはさらに非運動群と対比することにより、試験物質、試験環境または試験生活習慣が運動による筋量増加を促進したかどうかを評価し、運動による筋量増加を促進する物質や環境または生活習慣を選択することができる。当該筋肉タイプごとの筋量測定を行うことにより、試験物質、試験環境または試験生活習慣によって、向上させたい運動機能に応じたタイプの筋肉（例えば、瞬発力を向上させたい場合は白筋、一方、持久力を向上させたい場合は赤筋）が増強されたかどうかを評価することが可能になるので、増加させたい筋肉のタイプに応じた筋量増加促進剤や促進方法の探索が可能となる。より好ましくは、ゼブラフィッシュは加齢に伴い減少しやすい筋肉である白筋を多く有することから、本発明の探索方法は、加齢による筋量減少を改善することができる物質、環境または生活習慣の探索に有用である。
【００３４】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の組成物、製造方法、用途または方法を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３５】
〔１〕下記工程：
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと
を含む、筋量評価のためのモデル動物の製造方法。
【００３６】
〔２〕上記ゼブラフィッシュが、好ましくは稚魚、幼魚または成魚であり、より好ましくは成魚である、〔１〕記載の方法。
【００３７】
〔３〕上記工程（２）の遊泳時間が、好ましくは３〜７時間／日、より好ましくは５〜７時間／日である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
【００３８】
〔４〕上記工程（２）に続いて、１日〜３日間の休養期間をはさんで上記工程（３）が行われる、〔１〕〜〔３〕のいずれか１に記載の方法。
【００３９】
〔５〕上記工程（２）に続いて、休養期間なしで上記工程（３）が行われる、〔１〕〜〔３〕のいずれか１に記載の方法。
【００４０】
〔６〕上記積算運動日数が、好ましくは５日間〜１９日間、より好ましくは５日間〜１４日間、さらに好ましくは７日間〜１９日間、さらにより好ましくは７日間〜１４日間、なお好ましくは８日間〜１９日間、なお好ましくは８日間〜１４日間である、〔１〕〜〔５〕のいずれか１に記載の方法。
【００４１】
〔７〕上記モデル動物が、赤筋の筋量の向上を評価するためのモデル動物である、〔１〕〜〔６〕のいずれか１に記載の方法。
【００４２】
〔８〕下記工程：
以下の（１）〜（３）：
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと
により該ゼブラフィッシュに運動を負荷すること、
該運動負荷の前、間または後に、該ゼブラフィッシュに試験物質を投与すること、
該運動負荷されたゼブラフィッシュの筋量を測定すること、
を含む、運動による筋量増加の促進剤の探索方法。
【００４３】
〔９〕下記工程：
以下の（１）〜（３）：
（１）ゼブラフィッシュの限界持続遊泳速度を決定すること；
（２）該限界持続遊泳速度の水流下で、１〜８時間／日、３〜５日間、該ゼブラフィッシュを遊泳させること；ならびに
（３）積算運動日数が少なくとも５日間になるまで該（１）および（２）を繰り返すこと
により該ゼブラフィッシュに運動を負荷すること、
該運動負荷の前、間または後に、該ゼブラフィッシュに試験環境もしくは試験生活習慣に付すること、
該運動負荷されたゼブラフィッシュの筋量を測定すること、
を含む、運動による筋量増加の促進剤の探索方法。
【００４４】
〔１０〕好ましくは、上記運動負荷が与えられたが、上記試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣を与えられなかったゼブラフィッシュの筋量を測定することをさらに含む、〔８〕又は〔９〕記載の方法。
【００４５】
〔１１〕好ましくは、上記試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられなかったゼブラフィッシュの筋量と比較して、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられたゼブラフィッシュの筋量が増加していれば、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣を、運動による筋量増加を促進する物質や環境または生活習慣として選択することをさらに含む、〔１０〕記載の方法。
【００４６】
〔１２〕好ましくは、
上記運動負荷および上記試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられたゼブラフィッシュの筋量の測定値から、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられたが該運動負荷が与えられなかったゼブラフィッシュの筋量測定値を差し引くことによって、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられたゼブラフィッシュにおける運動により増加した筋量を測定すること、ならびに
上記運動負荷が与えられたが上記試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられなかったゼブラフィッシュの筋量の測定値から、該運動負荷、試験物質、試験環境および試験生活習慣のいずれも与えられなかったゼブラフィッシュの筋量測定値を差し引くことによって、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられなかったゼブラフィッシュにおける運動により増加した筋量を測定すること
をさらに含む、〔１０〕記載の方法。
【００４７】
〔１３〕好ましくは、上記試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられなかったゼブラフィッシュにおける運動により増加した筋量と比較して、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣が与えられたゼブラフィッシュにおける運動により増加した筋量が増加していれば、該試験物質、試験環境もしくは試験生活習慣を、運動による筋量増加を促進する物質や環境または生活習慣として選択することをさらに含む、〔１２〕記載の方法。
【００４８】
〔１４〕上記ゼブラフィッシュが、好ましくは稚魚、幼魚または成魚であり、より好ましくは成魚である、〔８〕〜〔１３〕のいずれか１に記載の方法。
【００４９】
〔１５〕工程（２）の遊泳時間が、好ましくは３〜７時間／日、より好ましくは５〜７時間／日である、〔８〕〜〔１４〕のいずれか１に記載の方法。
【００５０】
〔１６〕工程（２）に続いて、１日〜３日間の休養期間をはさんで工程（３）が行われる、〔８〕〜〔１５〕のいずれか１に記載の方法。
【００５１】
〔１７〕工程（２）に続いて、休養期間なしで工程（３）が行われる、〔８〕〜〔１５〕のいずれか１に記載の方法。
【００５２】
〔１８〕積算運動日数が、好ましくは５日間〜１９日間、より好ましくは５日間〜１４日間、さらに好ましくは７日間〜１９日間、さらにより好ましくは７日間〜１４日間、なお好ましくは８日間〜１９日間、なお好ましくは８日間〜１４日間である、〔８〕〜〔１７〕のいずれか１に記載の方法。
【００５３】
〔１９〕筋量の測定が、尾部の脊椎垂直断面における筋断面積の測定である、〔８〕〜〔１８〕のいずれか１に記載の方法。
【００５４】
〔２０〕筋量の測定が、尾部の筋体積の測定である、〔８〕〜〔１８〕のいずれか１に記載の方法。
【００５５】
〔２１〕筋量増加の促進剤が赤筋の筋量の増加促進剤である、〔８〕〜〔２０〕のいずれか１に記載の方法。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
【００５７】
実施例１
１）筋量評価モデルゼブラフィッシュの作製
ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、５箇月齢雄、約８０匹を、流水運動を負荷することができる回流水槽（以下、運動負荷装置）に移し、速度４０〜４５ｃｍ／秒の水流負荷し、負荷に耐えて１時間以上泳ぎ続けることができた個体を選抜した。これらの個体の遊泳を観察した結果、限界持続遊泳速度は４３ｃｍ／秒と決定された。さらに選抜した個体を、体重および体長（全長）が同等になるように、非運動群（１２匹）、運動群（６匹）の２群に分けた。
運動群には、運動負荷装置を用いて限界持続遊泳速度（４３ｃｍ／秒）の水流を負荷し、限界持続遊泳速度で遊泳させた。遊泳は、１日連続６時間（基本１０：００〜１６：００）、通算で１９日間（５日間運動→２日間休養を３週間、４週目は４日間運動）行われた。週に１度、限界持続遊泳速度を再決定し、動物が耐えられそうであれば水流の増速を行った。水流の増速および減速を行う場合、ともに約０．３ｃｍ／秒の変化率とした。夜間を含めた運動負荷を行わない時間帯の流速は、動物の睡眠の妨げとならない速度（４ｃｍ／秒）とした。
非運動群は、体重が等しくなるよう６匹ずつにわけ、それぞれを、運動負荷装置からバイパスした飼育水が交換される、ほぼ流水のない環境の１．７Ｌの通常飼育ケージで飼育した。
飼育環境は、運動群、非運動群いずれも、水温２７〜２８℃、照明サイクルは７：００−２１：００（１４ｈ）点灯／２１：００−７：００（１０ｈ）消灯とし、簡易型の水質浄化装置により、試験中の水質は正常値を維持した。餌は、細かく粉砕した通常飼育中の餌（おとひめＢ２；キョーリン）３に対してグルテン２を混合したものに、グルテン量の１〜１．５倍の水を加えてよく練ったものを凍結乾燥し、これを砕き、メッシュにて摂餌しやすい粒径にそろえたものを用いた。餌は、１時間以内に食べ切る最大量を、運動負荷の前後に与え、摂餌量は記録した。
【００５８】
試験期間中脱落する個体はなく、運動に耐えられなくなる個体も発生しなかった。週１回の増速の検討により、運動負荷の流速は１週目：４３ｃｍ／秒、２週目：４８ｃｍ／秒、３週目：５２ｃｍ／秒、４週目：５２ｃｍ／秒（増速なし）となった。
非運動群、運動群の１匹あたりの積算摂餌量を図１に示す。非運動群、運動群の積算摂餌量はそれぞれ２３８．１ｍｇ、３５３．６ｍｇであった。
【００５９】
２）筋量測定
最後の運動日の翌日に、朝の給餌の後、動物に運動を負荷せず、午後にトリカイン水溶液による過剰麻酔にて安楽殺し、検体を回収した。回収した検体の体重測定を行った後、開腹内臓除去し、骨格筋体積測定のためのＣＴ撮影を行った。その後、尾部を切断して１０％中性緩衝ホルマリン液に浸漬して常温保存した。
【００６０】
（骨格筋体積測定）
検体から内臓組織を外科的に除去することで、測定サンプルを、ほぼ骨格筋、体脂肪組織、骨組織のみの状態とした。実験動物用３ＤマイクロＸ線ＣＴ  Ｒ＿ｍＣＴ（リガク）および小動物用画像ファイリングソフトウェアｉ−  ＶＩＥＷ−タイプＲ（モリタ）を用いて、検体をＣＴ撮影した。撮影条件は［倍率：４倍、スライス厚：５０μｍ、電圧：９０ｋＶ、電流：１００μＡ、撮影モード（撮影時間）：１７秒］にて行った。撮影データをＣＴ  Ａｔｌａｓ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（リガク）にて解析することにより、筋体積量を測定した。解析において筋組織を指定するＨｏｕｎｓｆｉｅｌｄ  Ｕｎｉｔ（ＨＵ：空気のＣＴ値を−１０００、水のＣＴ値を０としたときのＣＴ値の単位。本試験で使用した装置では、メーカー推奨に従って、空気のＣＴ値を−１０００、アクリルのＣＴ値を２０と設定した）範囲は、−１４５〜２２４．６を使用した。この範囲は、水のＨＵが０付近であり、かつメーカー指定値情報より、脂肪組織のＨＵが−１４５以下であること、および我々の過去の観察から、骨組織のＨＵは２２４．６以上と判断されることから、体脂肪組織でも骨組織でもない範囲として選択された。フィルター処理は、３Ｄ  ｆｉｌｔｅｒ（ｓｏｆｔ）、Ｎｏｉｓｅ  ｃｕｔ  ｆｉｌｔｅｒ、Ａｉｒ  ｃｕｔ  ｆｉｌｔｅｒを使用した（メーカー推奨）。解析は、全身および尾部について行った。
【００６１】
（筋組織染色切片の作製）
１０％中性緩衝ホルマリン液に浸漬して常温保存した尾部から、尻鰭接合終端部脊椎垂直断面の切片を作製し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。切片作製および染色は、株式会社バイオ病理研究所に委託した。筋組織染色像の例を図２に示す。切片画像は、蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００  ＢＩＯＲＥＶＯ（キーエンス）にて撮影し、付属の画像解析ソフトＢＺ−ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（キーエンス）にて、筋断面積測定および筋繊維断面積解析を行った。
筋断面積測定では、背右側を領域指定し、ハイブリッドセルカウント機能を使用して、筋繊維間の空隙を自動的に除去することで正確な面積測定を行った。目視にて赤筋の領域を決定し、その面積を測定した。全筋断面積からの赤筋面積の差分を白筋面積とした。
筋繊維断面積解析では、切片背右側全領域中の白筋繊維、赤筋繊維それぞれの領域を目視にて決定し、筋繊維断面積および筋繊維数を集計した。
【００６２】
（統計的検定）
得られた値は平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、ｔ検定にて有意差検定（ｐ＊＜０．０５）を行った。
【００６３】
３）結果
試験期間前後での体重変移を図３に示す。非運動群、運動群の試験開始時の体重はそれぞれ８４６．６±１５．４ｍｇ、８４７．２±２１．８ｍｇ、また終了時の体重は８５８．８±２４．２ｍｇ、８７３．５±１６．９ｍｇであり、両群間に統計学的に有意な体重差は認められなかった。
【００６４】
全身骨格筋体積及び尾部骨格筋体積の結果を図４に示す。非運動群、運動群の全身骨格筋体積は、それぞれ５０７．０±１３．５２ｍｍ3、５１８．４２±９．０７ｍｍ3であり、両群間に統計学的な有意差は認められなかった。一方、尾部骨格筋体積は、非運動群、運動群でそれぞれ１６５．２９±４．１０ｍｍ3、１７９．６０±３．３０ｍｍ3であり、非運動群に比べて運動群では尾部骨格筋体積が統計学的に有意に増加した。
【００６５】
赤筋断面積、白筋断面積、およびこれらの合計筋断面積を図５に示す。非運動群、運動群の赤筋断面積はそれぞれ０．０９０２±０．００４０ｍｍ2、０．１３６５±０．０１００ｍｍ2、白筋断面積はそれぞれ０．９７１２±０．０３５８ｍｍ2、１．１９６８±０．０６０８ｍｍ2、合計の筋断面積は１．０６１５±０．０３７９ｍｍ2、１．３３３±０．０６８９ｍｍ2であり、赤筋断面積、白筋断面積、合計筋断面積のいずれも非運動群に対し運動群は統計学的に有意に増加していた。
【００６６】
赤筋、白筋の筋繊維断面積および筋繊維数を図６に示す。まず筋繊維断面積に関して、非運動群、運動群の赤筋繊維断面積はそれぞれ５９２．４±２１．１μｍ2、７４４．５±５４．３μｍ2であり、また白筋繊維断面積はそれぞれ１５３２．４±２８．２μｍ2、１７２７．９±２４．１μｍ2であって、いずれも非運動群に対して運動群は統計学的に有意に増加していた。筋繊維数は、非運動群、運動群の赤筋繊維はそれぞれ１５１．１±５．３、１８０．７±１９．７であり、白筋繊維はそれぞれ６０９．９±１９．１、６７７．２±３９．４であって、非運動群と運動群の間に統計学的に有意な差は認められなかった。
【００６７】
上記持久の運動を長期間負荷したゼブラフィッシュにおいては、赤筋、白筋ともに断面積が増加していたが、特に赤筋が２倍近く増加していた。また、白筋も赤筋ほどではないが増加していた。このような結果は、げっ歯類モデルでも観察されていることから、本発明の運動負荷ゼブラフィッシュが、筋量評価モデルとして利用可能であること、さらに、赤筋への効果を期待する技術、白筋への効果を期待する技術の何れの開発にも適用可能なモデルであることが示された。
【００６８】
比較例１
実施例１の１）と同様の手順で、運動群１８匹、非運動群１２匹を飼育した。但し、運動群への水流負荷は４３ｃｍ／ｓｅｃで一定とし、増速は行わなかった。次いで、実施例１の２）と同様の手順で、ゼブラフィッシュの体重と尾部骨格筋体積を測定した。
試験期間前後の体重変移を図７に、尾部骨格筋体積を図８に示す。運動群と非運動群の間で、運動開始時および終了時の体重、ならびに尾部骨格筋体積には、統計学的に有意な差は認められなかった。
【００６９】
実施例２
１）筋量評価モデルゼブラフィッシュの作製および筋量測定
実施例１の１）と同様の手順で、但し、運動群および非運動群は各１８匹とし、運動負荷期間は通算で９日間（５日間運動→２日間休養→４日間運動）とした。週の初めに限界持続遊泳速度を決定し、それを水流速度とした（１週目４３ｃｍ／ｓｅｃ、２週目４８ｃｍ／ｓｅｃ）。摂餌量は記録した。次いで、実施例１の２）と同様の手順で、ゼブラフィッシュの体重と尾部筋断面積を測定した。
【００７０】
２）結果
試験期間中の積算摂餌量を図９に、試験期間前後の体重変移を図１０に、赤筋、白筋およびそれらの合計筋断面積を図１１に示す。
非運動群、運動群の開始時の積算摂餌量は１匹あたりそれぞれ、１７３ｍｇ、２３０ｍｇで、非運動群に比べて運動群は摂餌量が多かった。
非運動群、運動群の開始時の体重はそれぞれ８１５．７±１５．０ｍｇ、８１５．７±１５．６ｍｇ、終了時の体重は８６９．６±１３．８ｍｇ、８４９．７±１７．２ｍｇであり、両群間に統計学的に有意な体重差は認められなかった。
非運動群、運動群の赤筋断面積は、それぞれ０．０９７１±０．００２２ｍｍ2、０．１２４５±０．００３６ｍｍ2、白筋断面積はそれぞれ０．９８９８±０．０２９５ｍｍ2、１．０１０６±０．０４０３ｍｍ2、合計の筋断面積は１．０８６９±０．０３０１ｍｍ2、１．１３５２±０．０４２４ｍｍ2であり、赤筋断面積は非運動群に対し運動群で統計学的に有意に増加していた。
【００７１】
実施例３
１）筋量評価モデルゼブラフィッシュの作製および筋量測定
実施例１の１）と同様の手順で、但し、運動群および非運動群は各８匹とし、遊泳は、１日連続３時間とし、運動負荷期間は通算で８日間（５日間運動→２日間休養→３日間運動）とした。週の初めに限界持続遊泳速度を決定し、それを水流速度とした（１週目４３ｃｍ／ｓｅｃ、２週目４８ｃｍ／ｓｅｃ）。摂餌量は記録した。次いで、実施例１の２）と同様の手順で、ゼブラフィッシュの体重と尾部筋断面積を測定した。
【００７２】
２）結果
試験期間中の積算摂餌量を図１２に、試験期間前後の体重変移を図１３に、赤筋、白筋およびそれらの合計筋断面積を図１４に示す。
非運動群、運動群の開始時の積算摂餌量は１匹あたりそれぞれ、１４２．５ｍｇ、１６２．５ｍｇで、非運動群に比べて運動群は摂餌量が多かった。
非運動群、運動群の開始時の体重はそれぞれ７５７．５±２１．４ｍｇ、７６０．８±２２．２ｍｇ、終了時の体重は７７２．６±２０．６ｍｇ、７６２．４±２１．７ｍｇであり、両群間に統計学的に有意な体重差は認められなかった。
非運動群、運動群の赤筋断面積は、それぞれ０．０８７６±０．００４４ｍｍ2、０．１０１０±０．００４１ｍｍ2、白筋断面積はそれぞれ０．９３６８±０．０２９１ｍｍ2、０．９１９４±０．０４４８ｍｍ2、合計の筋断面積は１．０２４４±０．０３３３ｍｍ2、１．０２０４±０．０４７１．ｍｍ2であり、赤筋断面積は非運動群に対し運動群で統計学的に有意に増加していた。
【図６】
2015119700.tif 000003
【図１３】
2015119700.tif 000004
【図１】
2015119700.tif 000005
【図２】
2015119700.tif 000006
【図３】
2015119700.tif 000007
【図４】
2015119700.tif 000008
【図５】
2015119700.tif 000009
【図７】
2015119700.tif 000010
【図８】
2015119700.tif 000011
【図９】
2015119700.tif 000012
【図１０】
2015119700.tif 000013
【図１１】
2015119700.tif 000014
【図１２】
2015119700.tif 000015
【図１４】
2015119700.tif 000016