(57)【要約】【課題】同位体標識されたヌクレオシド化合物を効率的に製造することができるヌクレオシド化合物の製造方法の提供。【解決手段】原材料ヌクレオシド化合物と、塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的ヌクレオシド化合物を得る工程を含み、前記目的ヌクレオシド化合物が安定同位体標識又は放射性同位体標識されたものであることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原材料ヌクレオシド化合物と、塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的ヌクレオシド化合物を得る工程を含み、前記目的ヌクレオシド化合物が安定同位体標識又は放射性同位体標識されたものであることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記原材料ヌクレオシド化合物の塩基及び前記目的ヌクレオシド化合物の塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体である請求項１に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【請求項３】
前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼである請求項１又は２に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は同位体標識されたヌクレオシド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２’−デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドは、リン酸と結合して、それぞれＤＮＡ及びＲＮＡの核酸となり得る重要な構成成分であり、医薬品開発分野等においても需要の高い化合物である。しかし、ヌクレオシドの化学的な合成は非常に効率が悪いため、これらの分子を工業的に得ようとした場合、一般的に、サケなどの卵巣からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、これを分解、精製してヌクレオシドを得ていた。
この方法では、天然のＤＮＡ及びＲＮＡに含まれる各種ヌクレオシドの全てを含む混合物が必要不必要によらず得られ、例えば２’−デオキシリボヌクレオシド由来の場合は、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノジン（ｄＧ）、デオキシシチジン（ｄＣ）及びチミジン（ｄＴ）が、リボヌクレオシド由来の場合は、アデノシン（Ａ）、グアノジン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）及びウリジン（Ｕ）が含まれる混合物が得られる。しかしながら、その誘導体が抗がん剤、抗ＨＩＶ剤に用いられるウリジンのように、特定のヌクレオシド化合物のみが選択的に又は高い割合で得られる方法の開発も求められていた。
従来、ヌクレオシド化合物を合成する方法として、イノシン又はデオキシイノシン（原料ヌクレオシド化合物）と、ピリミジン塩基又はプリン塩基とを、リン酸若しくはリン酸塩存在下の水溶液中において、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼによって塩基交換反応させる方法が開示されていた（特許文献１）。また、ピリミジンヌクレオシド化合物（原料ヌクレオシド化合物）と、プリン塩基とを、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いて交換反応させるプリンヌクレオシド化合物の製造方法も開発されていた（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−１９７１９３号公報
【特許文献２】特開平１１−４６７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヌクレオシド化合物を得るためには、上記のようにサケなどの生物の卵巣からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出することが一般的であり、同位体標識されたヌクレオシド化合物を得ようとする場合、抽出に用いる生物に餌として同位体標識した物質を与える方法がとられていた。しかしこの方法では、実際にＤＮＡ及びＲＮＡに取り込まれる同位体は僅かであり、同位体標識ヌクレオシドの製造法としては効率が悪い。同様の方法で、生物として菌類を用い、同位体標識したアルコール、糖類等を栄養源として菌体を培養する方法であれば高収率に同位体標識ヌクレオシドを得ることが可能だが、この方法では生産されるヌクレオシドの構成元素の大部分が必要以上に同位体に置換されてしまい、必要以上の同位体を原料として使用しなくてはならず、コスト面で不都合がある。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、同位体標識されたヌクレオシド化合物を効率的に製造することができるヌクレオシド化合物の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、同位体標識されたヌクレオシドの製造方法に従来検討されていなかった、同位体標識された原料塩基とヌクレオシドとを塩基交換反応させる工程を採用することで、同位体標識されたヌクレオシド化合物を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】
（１）原材料ヌクレオシド化合物と、塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的ヌクレオシド化合物を得る工程を含み、前記目的ヌクレオシド化合物が安定同位体標識又は放射性同位体標識されたものであることを特徴とするヌクレオシド化合物の製造方法。
（２）前記原材料ヌクレオシド化合物の塩基、及び、前記目的ヌクレオシド化合物の塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体である前記（１）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
（３）前記ヌクレオシドホスホリラーゼが、チミジンホスホリラーゼである前記（１）又は（２）に記載のヌクレオシド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法によれば、同位体標識されたヌクレオシド化合物を安価に効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】塩基交換反応の概要を模式的に示した図である。
【図２】実施例１において製造された目的ヌクレオシド化合物の１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図３】実施例１において製造された目的ヌクレオシド化合物の１３Ｃ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図４】実施例１において製造された目的ヌクレオシド化合物の１５Ｎ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図５】実施例２において製造された目的ヌクレオシド化合物の１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図６】実施例２において製造された目的ヌクレオシド化合物の１３Ｃ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図７】実施例３において製造された目的ヌクレオシド化合物の１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図８】実施例３において製造された目的ヌクレオシド化合物の１３Ｃ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【図９】実施例３において製造された目的ヌクレオシド化合物の１５Ｎ−ＮＭＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
《ヌクレオシド化合物の製造方法》
本発明における「ヌクレオシド化合物」とはヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得る化合物であれば特に制限されず、ＤＮＡ、又はＲＮＡ等の天然核酸の構成要素であるリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドの他、人工核酸の構成要素、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の人工的に合成される人工核酸類似化合物の構成要素を挙げることができる。
具体的なリボヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、５−メチルウリジン、イノシン、５−フルオロウリジン、などが挙げられ、デオキシリボヌクレオシドとしては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、５’ −デオキシウリジン、アジドチミジンなどが挙げられる。
【００１１】
前記ヌクレオシド化合物の塩基は、ヌクレオシドホスホリラーゼの基質となり得る範囲において、−Ｆ、−Ｃｌ等のハロゲノ基、メチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ３アルキル基、アルケン、アルキン等の長鎖置換基で修飾されていてもよく、具体的には、５−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−エチニルウラシル、５−ビニルウラシル、５−ヘキサ−５−エン−ウラシル等の塩基であってもよい。
【００１２】
本発明においてヌクレオシドホスホリラーゼとは、ヌクレオシドのリン酸加水分解を触媒する酵素を指す。具体的なヌクレオシドホスホリラーゼとしては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンホスホリラーゼ、ウリジンホスホリラーゼ、ピリミジントランスフェラーゼなどを挙げることができる。以下では、ヌクレオシドホスホリラーゼを例に挙げて説明する。
【００１３】
ヌクレオシドホスホリラーゼによるリボヌクレオシドのリン酸加水分解の反応は、例えば以下のように表される。
【００１４】
【化１】
2015160832.tif 000002
【００１５】
上記の反応は可逆的であるので、
【化２】
2015160832.tif 000003
【００１６】
の反応も同時に起こる。したがって、「塩基交換反応」では、リン酸加水分解によって生成した塩基が、再度リボース−１−リン酸とともにリボヌクレオシドを形成する反応において、反応系に二種以上の塩基が存在するとき、反応前とは異なる種類の塩基がリボース−１−リン酸塩基と反応し塩基が交換され得る。
【００１７】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、原材料ヌクレオシド化合物と、塩基とを、リン酸イオンを含む水溶液中において、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的ヌクレオシド化合物を得る工程を含み、前記目的ヌクレオシド化合物が安定同位体標識又は放射性同位体標識されたものである。
【００１８】
同位体標識とは、安定同位体標識又は放射性同位体標識の両方を指す。前記安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏを挙げることができる。放射性同位体標識としては、一例として、３Ｈ、１４Ｃ、13Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓを挙げることができる。
【００１９】
上記の反応１及び反応２を、前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程に当てはめると、以下のように表される。
【００２０】
【化３】
2015160832.tif 000004
【００２１】
反応１−２〜反応２−２までをまとめると、以下のように表すことができる。
【００２２】
【化４】
2015160832.tif 000005
【００２３】
前記目的ヌクレオシド化合物を得る工程の反応の概要を、図１において模式的に示して説明する。
図１中の工程では、塩基１１と糖部分１２とを備え原材料として用いられる原材料ヌクレオシド化合物１０と、目的化合物の塩基３１とを、ヌクレオシドホスホリラーゼにより塩基交換反応させて、目的ヌクレオシド化合物の塩基３１と糖部分１２とを備えた目的ヌクレオシド化合物３０を得る工程を示している。
【００２４】
このとき、例えば、目的ヌクレオシド化合物の塩基として、安定同位体標識又は放射性同位体標識された塩基を用いて当該反応を行うことが挙げられる。又は、糖部分が安定同位体標識又は放射性同位体標識された原材料ヌクレオシド化合物を用いて、当該反応を行ってもよい。
このように、本発明のヌクレオシド化合物の製造方法によれば、安定同位体標識又は放射性同位体標識されたヌクレオシドを、短時間で大量に且つ容易に得ることが可能となる。さらには、生合成では得られない特殊な同位体標識パターンのヌクレオシド化合物を製造することが可能である。
【００２５】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法において、原材料ヌクレオシド化合物と目的ヌクレオシド化合物の組合せは特に制限されないが、下記表１に記載の組合せを例示できる。
【００２６】
【表１】
2015160832.tif 000006
【００２７】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、原材料ヌクレオシド化合物の塩基、及び、前記目的ヌクレオシド化合物の前記目的ヌクレオシド化合物の塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかであることがより好ましい。
【００２８】
原材料ヌクレオシド化合物の塩基及び前記目的ヌクレオシド化合物の塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、用いる前記ヌクレオシドホスホリラーゼを、チミジンホスホリラーゼとすることができる。チミジンホスホリラーゼは、チミジンの他にウリジンに対しても基質として認識可能であるため、チミジンホスホリラーゼによって反応を行うことが可能である。原材料ヌクレオシド化合物が有する塩基及び目的ヌクレオシド化合物の塩基の全ての塩基が、ウラシル、チミン又はそれらの誘導体のいずれかである場合、チミジンホスホリラーゼのみで反応を行うことが可能である。
【００２９】
反応工程におけるヌクレオシドホスホリラーゼの反応条件は、酵素の性質や塩基及びヌクレオシドに合わせて適切な条件を適宜選択すればよい。好ましい反応条件としては、反応液中の塩基及びヌクレオシドの濃度は１〜１００ｍＭが好ましく、ヌクレオシドは２０〜５０ｍＭがより好ましく、塩基は５〜５０ｍＭがさらに好ましい。反応液中のリン酸濃度は１〜１０００ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましい。反応開始時のヌクレオシドに対する塩基のモル比は、目的のヌクレオシドに応じて適宜設定すればよく、例えば０．１〜１倍とすることができる。特に塩基が安定同位体標識された塩基の場合、当該標識塩基が高価であり塩基収率を高める必要があるため、塩基のモル比を０．１〜０．２倍とすることが好ましい。反応液中のヌクレオシド量及び塩基量に対するリン酸のモル比は０．０１〜２５倍が好ましく、０．０１〜５倍がより好ましく、０．０２〜０．０３倍がさらに好ましい。ヌクレオシドホスホリラーゼの使用量は、反応液量に対して０．０１〜１００Ｕ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍＬを用いることが例示できる。
【００３０】
反応液の温度は使用するホスホリラーゼの反応温度に合わせて定めればよいが、１０〜１００℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましく、３７℃がさらに好ましい。反応液のｐＨはｐＨ６〜９の範囲が好ましく、ｐＨ６．５〜７．５の範囲が好ましく、ｐＨ６．８〜７．２の範囲で行うことがより好ましい。反応時間についても、使用する材料（酵素の量、基質の量など）に合わせて適切な反応時間を適宜定めればよいが、０．５〜４８時間が好ましく、１〜１２時間がより好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下に共通の測定条件であるＨＰＬＣの測定条件を記載する。
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
使用カラム：ＯＤＳ−３、（ＧＬサイエンス社製）
カラムサイズ：φ４．６×Ｌ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：８０％メタノール
検出波長：２６５ｎｍ
【００３２】
（参考例１〜２８）
１．５ｍＬチューブ中に、リン酸緩衝液５０μＬ（ｐＨ６．８）、原材料ヌクレオシド化合物５０ｍＭ（各Ｓｉｇｍａ社製）、目的ヌクレオシド化合物の塩基（表２参照）５０ｍＭ、ヌクレオシドホスホリラーゼ（チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、各Ｓｉｇｍａ社製）、水９５０μＬの混合液を得た。リン酸の終濃度及び酵素量を表２に記載する。上記混合液を、温水浴中３７℃で２４時間反応させた後、反応後の混合液の少量を取り分けてＨＰＬＣで測定し、目的ヌクレオシド化合物の生成量を確認した。
表２に、反応に用いた化合物、及び原材料ヌクレオシド化合物に対する目的ヌクレオシド化合物の生成量（モル％）を示す。
【００３３】
【表２】
2015160832.tif 000007
【００３４】
（実施例１〜２）
１．５ｍＬチューブ中に、リン酸緩衝液１ｍＭ（ｐＨ６．８）、原材料ヌクレオシド化合物５０ｍＭ（各Ｓｉｇｍａ社製）、安定同位体標識された目的ヌクレオシド化合物の塩基（Ｉｓｏｔｅｃ社製）（表３参照）を５ｍＭ、ヌクレオシドホスホリラーゼ（チミジンホスホリラーゼ、Ｓｉｇｍａ社製）１Ｕ、水９５０μＬの混合液を得た。この混合液を、温水浴中３７℃で２時間反応させた後、反応後の混合液の少量を取り分けてＨＰＬＣで測定し、目的ヌクレオシド化合物の生成量を確認した。
表３に、反応に用いた化合物、及び原材料ヌクレオシド化合物に対する目的ヌクレオシド化合物の生成量（モル％）を示す。
【００３５】
【表３】
2015160832.tif 000008
【００３６】
実施例１の反応を以下に示す。
【００３７】
【化５】
2015160832.tif 000009
【００３８】
実施例２の反応を以下に示す。
【００３９】
【化６】
2015160832.tif 000010
【００４０】
実施例３の反応を以下に示す。
【００４１】
【化７】
2015160832.tif 000011
【００４２】
ＨＰＬＣの測定結果から、ｄＵ‐２‐１３Ｃ‐１，３‐１５Ｎ２、ｄＵ‐２‐１３Ｃ及びｄＵ‐１，３‐１５Ｎ２が高収量で短時間に得られたことが確認できた。
【００４３】
分取ＨＰＬＣでｄＵ‐２‐１３Ｃ‐１，３‐１５Ｎ２分画（実施例１で製造）を分取し、濃縮乾固後ＮＭＲで構造を確認したところ、図２〜図４に示す結果となり、2’-デオキシウリジン-2-13C-1,3-15N2であることを確認した。
図２（１Ｈ‐ＮＭＲ）1H-NMR(Methanol-D, 400 MHz): δppm = 7.979-7.924 (1H, m, 5-CH), 6.238 (1H, t, J = 6.8 Hz, 1’-CH), 5.678-5.663 (1H, m, 6-CH), 4.359-4.352 (1H, m, 3’-CH), 3.892 (1H, m, 4’-CH), 3.740-3.707 (2H, m, 5’-CH2), 2.260-2.160 (2H, m, 2’-CH2、
図３（１３Ｃ−ＮＭＲ）13C-NMR (Methanol-D, 400 MHz) : δppm = 150.953 (1C, t, J = 72.4 Hz, 2-13C)、
図４（１５Ｎ−ＮＭＲ）15N-NMR (Methanol-D, 400 MHz) : δppm = 152.505-152.069 (1N,  m, 3-15N), 144.122 - 143.592 (1N, m, 1-15N)。
【００４４】
分取ＨＰＬＣでｄＵ‐２‐１３Ｃ分画（実施例２で製造）を分取し、濃縮乾固後ＮＭＲで構造を確認したところ、図５〜図６に示す結果となり2’-デオキシウリジン-2-13Cであることを確認した。
図５（１Ｈ−ＮＭＲ）1H-NMR(Methanol-D, 400 MHz): δppm = 7.968-7.920 (1H, m, 5-CH), 6.238 (1H, t, J = 6.0 Hz, 1’-CH), 5.671-5.652 (1H, m, 6-CH), 4.359-4.352 (1H, m, 3’-CH), 3.892 (1H, m, 4’-CH), 3.733-3.699 (2H, m, 5’-CH2), 2.250-2.160 (2H, m, 2’-CH2)、
図６（１３Ｃ−ＮＭＲ）13C-NMR (Methanol-D, 400 MHz) : δppm = 151.143-150.819 (1C, m, 2-13C)。
【００４５】
分取ＨＰＬＣでｄＵ−１，３−１５Ｎ２分画（実施例３で製造）を分取し、濃縮乾固後ＮＭＲで構造を確認したところ、図７〜図９に示す結果となり2’-デオキシウリジン-1,3-15N2であることを確認した。
図７（１Ｈ−ＮＭＲ）1H-NMR(Methanol-D, 400 MHz): δppm = 7.992-7.967 (1H, m, 5-CH), 6.266 (1H, t, J = 6.8 Hz, 1’-CH), 5.703-5.689 (1H, m, 6-CH), 4.392-4.377 (1H, m, 3’-CH), 3.892 (1H, m, 4’-CH), 3.765-3.723 (2H, m, 5’-CH2), 2.273-2.196 (2H, m, 2’-CH2)、
図８（１３Ｃ−ＮＭＲ）13C-NMR (Methanol-D, 400 MHz) : δppm = 165.035-164.940 (1C, m, 4-C), 150.905 (1C, t, J = 72.4 Hz, 2-C), 141.228-141.104 (1C, m, 6-C), 101.335-101.278 (1C, m, 5-C), 87.624 (1C, s, 4’-C), 85.624-85.193 (1C, m, 1’-C), 70.910 (1C, s, 3’-C), 61.499 (1C, s, 5’-C), 40.008 (1C, s, 2’-C)、
図９（１５Ｎ−ＮＭＲ）15N-NMR (Methanol-D, 400 MHz) : δppm = 143.896-143.829 (2N,  m, 1, 3-15N)。
【００４６】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のヌクレオシド化合物の製造方法は、同位体標識されたヌクレオシド化合物を短時間で大量に製造可能であり、化学、医学等の分野に広く適応可能である。
【符号の説明】
【００４８】
１０・・・原材料ヌクレオシド化合物、３０・・・目的ヌクレオシド化合物、１１・・・原材料ヌクレオシド化合物の塩基、３１・・・目的ヌクレオシド化合物の塩基、１２・・・糖部分
【図１】
2015160832.tif 000012
【図２】
2015160832.tif 000013
【図３】
2015160832.tif 000014
【図４】
2015160832.tif 000015
【図５】
2015160832.tif 000016
【図６】
2015160832.tif 000017
【図７】
2015160832.tif 000018
【図８】
2015160832.tif 000019
【図９】
2015160832.tif 000020