(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素を発現する組み換え微生物を培養することによるγ-アミノ酪酸（GABA）の新たな発酵生産法の提供。【解決手段】Corynebacterium glutamicum等のグルタミン酸生産微生物にグルタミン脱炭酸酵素活性を有する酵素を発現する組み換え体を培養する。トマトとジャガイモに由来するキメラグルタミン脱炭酸酵素、コードする遺伝子、組み換え宿主、組み換えベクター、発現カセット及びそのような宿主の作製に適した核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え微生物の培養を含む、γ-アミノ酪酸（GABA）の発酵生産方法であって、該微生物が、グルタミン酸を生産する能力に加え、グルタミン酸をGABAに変換するように異種グルタミン酸脱炭酸酵素（E.C. 4.1.1.15）を発現する能力を有する親微生物に由来する、前記方法。
【請求項２】
前記微生物がグルタミン酸生産細菌である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記グルタミン酸生産細菌がコリネフォルム細菌である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細菌がCorynebacteriumである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
細菌がCorynebacterium glutamicumである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が原核又は真核生物由来である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が植物のグルタミン酸脱炭酸酵素、又は植物のグルタミン酸脱炭酸酵素に由来するアミノ酸配列部分を含むキメラのグルタミン酸脱炭酸酵素である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum属の植物、特にSolanum tuberosum由来の脱炭酸酵素である、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosum由来であり、配列番号2のThr94からLeu336までのアミノ酸配列又はそれに少なくとも80％の同一性を有する配列を含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosum由来のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び／又はC末端に補完される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosumと異なる第二の植物のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び／又はC末端に補完される、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二の植物がSolanum lycopersicumである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルタミン酸脱炭酸酵素が配列番号2のアミノ酸配列又はそれに少なくとも80％の同一性を有する配列を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素がEscherichia属の細菌、特にE. coli由来である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記E. coliグルタミン酸脱炭酸酵素が配列番号6のGad A、配列番号8のGad B及び配列番号9のGad Cを含むGad BC複合体並びにGad A若しくはGad BCに少なくとも80％の同一性を有する配列から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素が、グルタミン酸を生産する能力を有する前記親微生物のコドン使用頻度に適合した核酸配列にコードされる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素が、
a) 配列番号1の第472〜1200位、又は配列番号1の第193〜1605位；
b) 配列番号5；
c) 配列番号7；
d) 或いは請求項6〜17のいずれか1項に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする任意のコード配列
から選択されるコード配列を含む核酸配列にコードされる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項8〜13のいずれか1項に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素。
【請求項２０】
請求項19に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素のコード配列を含む核酸配列。
【請求項２１】
配列が少なくとも1つの制御核酸配列に機能的に連結される、請求項20に記載の少なくとも1つの核酸配列を含む、発現カセット。
【請求項２２】
請求項21に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む、組み換えベクター。
【請求項２３】
請求項22に記載の少なくとも1つのベクターでトランスフォームされた、原核又は真核宿主。
【請求項２４】
組み換えコリネフォルム細菌、特に組み換えCorynebacteriumから選択される、請求項23に記載の宿主。
【請求項２５】
組み換えCorynebacterium glutamicumである、請求項24に記載の宿主。
【請求項２６】
生産されたGABAが発酵ブロスから単離される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
a) 請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法によってGABAを生産するステップ；
b) GABAを単離するステップ；並びに
c) （場合により、アミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つのさらなる適切な多価のコモノマーの存在下で）前記GABAを重合するステップ
を含む、ポリアミドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素を発現する組み換え微生物を培養することによるγ-アミノ酪酸（GABA）の新たな発酵生産法に関する。本発明はまた、対応する組み換え宿主、組み換えベクター、発現カセット及びそのような宿主の作製に適した核酸、並びに発酵生産で得られたGABAを利用したポリアミドの製造法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
GABA（CAS番号56-12-2）は、原核及び真核生物の両方において、重要で広範に存在する非タンパク性アミノ酸である。それは、例えば交感神経系における代表的な抑うつ性神経伝達物質として、様々な生物学的機能を示し、並びに実験動物及び人の血圧を低下させるのに有効である。該化合物は、グルタミン酸からグルタミン酸脱炭酸酵素（GAD；EC 4.1.1.15）によって合成される。
【０００３】
GABAは様々な技術分野で使用される。例えば、GABAを強化した食品は栄養補助食品及び栄養補給食品として使用することができ、不眠、抑うつ及び自律神経障害、慢性アルコール関連症状の治療を補助し、並びに免疫細胞を刺激する。該化合物は、ポリアミド及びピロリドンの製造用原料物質としても使用することができる。
【０００４】
前記商業的に興味深い化合物の発酵生産に適した方法は、未だに記述されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明の目的は、GABA又はその対応する塩の発酵生産に適した方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の問題は、組み換えグルタミン酸生産微生物中に形成されたグルタミン酸をGABAへ変換するGAD酵素を発現する該微生物を培養することによるGABA又はその塩の発酵生産を教示する本発明によって解決された。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図1はジャガイモEST由来のコンティグと植物由来のGADホモログの比較を図示する。
【図２】図2は本発明のキメラGAD遺伝子の模式図を図示する。
【図３】図3はpClik5aMCSクローニングベクターのプラスミドマップを図示する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
1. 好ましい実施形態
本発明はγ-アミノ酪酸（GABA）の発酵生産方法に関し、該方法は組み換え微生物の培養を含み、該微生物はグルタミン酸を生産する能力を有する親微生物に由来することが好ましく、該組み換え微生物は質的又は量的に前記親微生物の前記能力を保持し、グルタミン酸をGABAへ変換するように異種グルタミン酸脱炭酸酵素（E.C. 4.1.1.15）を発現する能力をさらに有し；並びに場合により、発酵ブロスからGABAを単離することに関する。前記改変微生物はまた、グルタミン酸を生産する能力を保持してもよいし、又はしなくてもよい。
【０００９】
特に、前記微生物はグルタミン酸生産細菌、特にコリネフォルム細菌、例えばCorynebacterium属の細菌、例えばCorynebacterium glutamicumである。
【００１０】
前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素は原核又は真核生物由来である。
【００１１】
特定の一実施態様において、前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素は、植物のグルタミン酸脱炭酸酵素又は植物のグルタミン酸脱炭酸酵素に由来する少なくとも1つのアミノ酸配列部分を含むキメラのグルタミン酸脱炭酸酵素である。前記「植物のグルタミン酸脱炭酸酵素に由来する少なくとも1つのアミノ酸配列部分」は、前記植物酵素の少なくとも10個の連続したアミノ酸残基を含む。全体で、1〜10、特に1〜5、好ましくは1又は2個の前記植物配列に由来するアミノ酸配列部分があってよい。前記部分はそれぞれ、10〜500、10〜450、10〜400、20〜350、40〜300、50〜250、60〜200、70〜150又は80〜100個の長さの前記植物酵素の連続するアミノ酸残基を有してよい。
【００１２】
特に、前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素はSolanum属の植物、特にSolanum tuberosum、すなわちジャガイモ由来の脱炭酸酵素である。例えば、前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素はSolanum tuberosumに由来し、配列番号2のThr94からLeu336までのアミノ酸配列又はそれに80%〜100%未満、例えば85%、90%、91%、92%、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列を含む。
【００１３】
さらに、前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素は、Solanum tuberosum由来のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び／又はC末端に補完され得るか、或いはSolanum tuberosumと異なる第二の植物のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び／又はC末端に補完され得る。例えば、前記第二の植物はSolanum lycopersicum、すなわちトマトである。
【００１４】
特定の実施形態において、前記グルタミン酸脱炭酸酵素は、配列番号2のアミノ酸配列、又はそれに80%〜100%未満、例えば85%、90%、91%、92%、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する配列を含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態によると、前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素は、細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素、例えばEscherichia属の細菌、特にE. coli由来である。
【００１６】
前記E. coliのグルタミン酸脱炭酸酵素は配列番号6のGadA、配列番号8のGadB配列及び配列番号9のGadC配列を含むGadBC複合体、並びにそれぞれGadA若しくはGadBCに80%〜100%未満の同一性を有する配列から選択されてよい。適切な配列は、例えば、85%、90%、91%、92%、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有してよい。
【００１７】
別の実施形態において、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素は、グルタミン酸を生産する能力を有する前記親微生物のコドン使用頻度に適合した核酸配列にコードされる。
【００１８】
特に、グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素は
a) 配列番号1の第472〜1200位、又は配列番号1の第193〜1605位；
b) 配列番号5；
c) 配列番号7；
d) 或いは上記に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする任意のコード配列
から選択されるコード配列を含む核酸配列によってコードされてよい。
【００１９】
本発明はまた、上記に定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素；並びにそのようなグルタミン酸脱炭酸酵素のコード配列を含む核酸配列にも関する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、上記に定義される少なくとも1つの核酸配列であって、少なくとも1つの核酸制御配列に動作可能なように連結されている核酸配列を含む発現カセット；及び少なくとも1つの発現カセットを含むそのような組み換えベクターを提供する。
【００２１】
本発明はまた、上記に定義される少なくとも1つのベクターでトランスフォームされた原核又は真核宿主；特に組み換えコリネフォルム細菌から選択される宿主、特に組み換えCorynebacterium、例えば組み換えCorynebacterium glutamicumにも関する。
【００２２】
最後に、本発明はポリマー、特にポリアミドを製造する方法に関し、該方法は
a) 上記に記述される方法によってGABAを生産するステップ；
b) GABAを単離するステップ；並びに
c) （場合により、例えばアミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つのさらなる適切な多価の共重合できるコモノマーの存在下で）前記GABAを重合するステップ
を含む。
【００２３】
2. 特定の用語の説明
特に明記しない限り、「γ-アミノ酪酸」及び「GABA」という表現は同義的に考えられる。本発明によって得られるGABA生成物は、遊離酸の形態、前記酸及び塩基官能基の部分的若しくは完全な塩の形態、又は非荷電の酸とその塩若しくは混合物との混合物の形態であってよい。
【００２４】
GABA「塩」は、例えば金属塩、例えば一ナトリウム、二ナトリウム、一カリウム、及び二カリウム塩のようなGABAのモノ-又はジ-アルカリ金属塩、並びに、例えばカルシウム若しくはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩又はGABAのプロトン化した形態を含む。
【００２５】
「脱制御」は最も広義に理解されるべきであり、当技術分野において周知な様々な手段による酵素（標的酵素）活性の完全なスイッチオフの増加又は減少を含む。適切な方法は、例えば、生物における遺伝子のコピー数及び／又は酵素分子の増加又は減少を含むか、或いは、その酵素活性に影響する酵素の別の特徴の改変を含み、その後問題の代謝経路、特に、グルタミン酸生合成経路又はそれに共役したいずれかの経路若しくは酵素反応に所望の影響をもたらす。適切な遺伝子操作はまた、（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーター又は多重プロモーターを除去することによって）特定の遺伝子の発現に伴う制御配列又は部位を変更又は改変すること、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の特定の遺伝子に隣接する核酸配列を変更すること、特定の遺伝子のコピー数を減少させること、特定の遺伝子の転写及び／又は特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質を修飾すること（例えば制御タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子等）、或いは当技術分野で日常的な、特定の遺伝子の発現を脱制御する他の従来の手段（アンチセンス核酸分子の使用、又は標的タンパク質の発現をノックアウトするか若しくは阻害する他の方法を含むがそれに限られない）も含み得るが、それらに限られない。
【００２６】
「異種」又は「外因性」という用語は、本明細書に定義されるように遺伝子操作される微生物に導入されるか、又は該微生物によって生産（転写若しくは翻訳）される本明細書に記載のタンパク質、核酸及び対応する配列を指し、該微生物は前記操作前に前記配列を含まず、又は生産しない。特に、前記操作前の前記微生物は、前記異種酵素活性を含み得ないか若しくは発現し得ず、又は、異なるコード配列によって若しくは異なるアミノ酸配列の酵素によってコードされ、前記外因性酵素と同じ基質を変換し得る同等の活性若しくは特異性の内在性酵素を含み得るか若しくは発現し得る。
【００２７】
本発明の「親」微生物は、グルタミン酸を生産する能力を有するあらゆる微生物である。
【００２８】
「親微生物に由来する」微生物は、化学的、生化学的又は微生物的、特に遺伝子工学的技術から選択されるいずれかの種類の操作によって改変された微生物を指す。前記操作は、前記親微生物の生物学的特徴の少なくとも1つの変化をもたらす。例として、異種酵素のコード配列が前記生物に導入されうる。前記変化によって、前記親微生物に少なくとも1つの特徴が付加、交換、又は削除されてよい。前記変化は、例えば、前記微生物の代謝特性の変化をもたらしてよく、そのため例えば前記微生物が発現する酵素の基質（前記親微生物によって全く利用されなかったか、又は異なる効率で利用されていた）が特徴的な方法（例えば、親微生物と比較して異なる量、割合又は異なる効率）で代謝され、及び／又は代謝の最終若しくは中間生成物が前記改変型微生物によって特徴的な方法（例えば、親微生物と比較して異なる量、割合又は異なる効率）で形成される。
【００２９】
「中間生成物」は、必ずしも分析上直接検出できる濃度でなく、化学的又は生化学的過程中、一過的又は連続的に形成される生成物と理解される。前記「中間生成物」は、第二の化学的又は生化学的反応によって、特に本明細書で定義される「グルタミン酸脱炭酸酵素」により触媒される反応によって、前記生化学的過程から除去されてもよい。
【００３０】
「グルタミン酸脱炭酸酵素」という用語は、グルタミン酸をGABAに変換する能力を有する任意の由来のあらゆる酵素を指す。そのような酵素はEC. 4.1.1.15として分類される。
【００３１】
「組み換え宿主」は、クローニングベクター又は発現ベクターを含むあらゆる原核又は真核細胞であり得る。この用語は、宿主細胞の染色体又はゲノム中にクローン化された遺伝子を含むように遺伝子操作された原核又は真核細胞を含むことも意図されている。適切な宿主の例として、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照。
【００３２】
「組み換え微生物」という用語は、その由来となった天然の微生物又は「親」微生物と比較して、変更した、改変した又は異なる遺伝子型及び／又は表現型（例えば遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響する場合）を示すように、遺伝子変更、改変又は操作された（例えば遺伝子工学的に操作された）微生物（例えば細菌、酵母、真菌等）又は微生物菌株を含む。
【００３３】
本明細書で使用される「実質的に純粋な」タンパク質又は酵素は、ポリアクリルアミド-ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（SDS-PAGE）後の単一のバンドによって示されるように、所望の精製タンパク質が基本的に細胞成分の夾雑を含まないことを意味する。「実質的に純粋な」という用語は、当業者によって使用される1種以上の純度又は均一性の特性によって均一な分子を記述することがさらに意図されている。例えば、実質的に純粋なグルタミン酸脱炭酸酵素は、以下のようなパラメーターについて、標準的な実験上のずれの範囲内で、一定で再現できる特徴を示す：分子量、クロマトグラフィーの移動、アミノ酸組成、アミノ酸配列、ブロックされているか又はブロックされていないN末端、HPLC溶出特性、生物学的活性、及び他のそのようなパラメーター。しかし、その用語は、グルタミン酸脱炭酸酵素と他の化合物の人工的又は合成混合物を除外することが意図されていない。さらに、その用語は、場合により組み換え宿主から単離された、グルタミン酸脱炭酸酵素融合タンパク質を除外することが意図されていない。
【００３４】
3. 本発明の他の実施形態
3.1 さらなる遺伝子の脱制御
グルタミン酸脱炭酸酵素を発現する組み換えCorynebacteriumグルタミン酸生産菌によるGABAの発酵生産は、以下に記載の少なくとも1つのさらなる遺伝子の脱制御と組み合わせると、さらに改善され得る。
【表１】
2015119707.tif 000002
【００３５】
「増幅」の好ましい方法は、例えば強力な発現シグナルを用いた遺伝子増幅及び／又は酵素活性を増強する点変異によって、遺伝子活性を増加させる「上方」変異である。
【００３６】
「減衰」の好ましい方法は、例えば弱い発現シグナル及び／又は酵素活性を破壊若しくは低下させる点変異を用いた遺伝子欠失若しくは破壊によって、遺伝子活性を低下させる「下方」変異である。
【００３７】
3.2 本発明のタンパク質
本発明は具体的に言及されるタンパク質に限定されず、その機能的等価物にも及ぶ。
【００３８】
具体的に開示される酵素の「機能的等価物」又は「類似体」又は「機能的変異体」は、本発明の範囲内で、所望の生物学的機能又は活性、例えば酵素活性をさらに有する、それらの様々なポリペプチドである。
【００３９】
例えば、「機能的等価物」は、酵素活性のために用いられる試験において、本明細書で定義される酵素の少なくとも1〜10%、又は少なくとも20%、又は少なくとも50%、又は少なくとも75%、又は少なくとも90%高いか又は低い活性を示す酵素を意味する。
【００４０】
本発明の「機能的等価物」は、特に、上記のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置において、具体的に記載されたものと異なるアミノ酸を有するがそれでもなお前述の生物学的活性の1つを有する変異体も意味する。従って「機能的等価物」は、本発明の特性プロファイルを持つ変異体を生じるならば、いずれかの配列位置において起こり得る、1つ以上のアミノ酸付加、置換、欠失及び／又は反転により得られる変異体を含む。機能的等価性は特に、反応性パターンが変異体及び未変化のポリペプチドの間で質的に一致する場合、すなわち例えば同じ基質が異なる速度で変換される場合にももたらされる。適切なアミノ酸置換の例は以下の表に示される：
【表２】
2015119707.tif 000003
【００４１】
上記の意味での「機能的等価物」は、記述されたポリペプチドの「前駆体」、並びにポリペプチドの「機能的誘導体」及び「塩」でもある。
【００４２】
「前駆体」はその場合、所望の生物学的活性を有するか又は有しないポリペプチドの天然又は合成前駆体である。
【００４３】
「塩」という表現は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩、並びにアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は周知の方法で生成することができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛塩、並びに有機塩基、例えばトリエタノールアミン等のアミン類、アルギニン、リジン、ピペリジン等との塩を含む。酸付加塩、例えば塩酸又は硫酸等の無機酸との塩、並びに酢酸及びシュウ酸等の有機酸との塩も本発明に含まれる。
【００４４】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は、周知の技術を用いて、機能的アミノ酸側基上にも、又はそのN末端若しくはC末端にも生成することができる。そのような誘導体は、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニア又は一級若しくは二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって生成される遊離アミノ基のN-アシル誘導体；或いはアシル基との反応によって生成される遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体を含む。
【００４５】
「機能的等価物」は、他の生物から得ることができるポリペプチド、及び天然のバリアントも当然に含む。例えば、相同配列領域のエリアは配列比較によって確立することができ、等価な酵素は本発明の具体的なパラメーターに基づいて決定することができる。
【００４６】
「機能的等価物」は、例えば所望の生物学的機能を示す本発明のポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメイン又は配列モチーフも含む。
【００４７】
「機能的等価物」はさらに、上記に記載されるポリペプチド配列若しくはそれに由来する機能的等価物の1つ、並びに機能的なN末端若しくはC末端結合で（すなわち融合タンパク質部分において実質的な相互の機能的損傷なく）少なくとも1つのさらなる、機能的に異なる異種配列を有する融合タンパク質である。これらの異種配列の非限定的な例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカー又は酵素である。
【００４８】
さらに含まれる本発明の「機能的等価物」は、具体的に開示されるタンパク質のホモログである。これらは上記に記載される同一性の値を有する。前記値は、具体的に開示されるアミノ酸配列との同一性を指し、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムに従って計算され得る。同一性%値はBLASTアラインメント、アルゴリズムblastp（タンパク質−タンパク質BLAST）からも、又は以下のClustal設定を適用することによっても計算され得る。
【００４９】
本発明の相同なポリペプチドの同一性パーセンテージは特に、本明細書に具体的に記述されるアミノ酸配列の1つの全長に対するアミノ酸残基の同一性パーセンテージを意味する。
【００５０】
可能性のあるタンパク質グリコシル化の場合、本発明の「機能的等価物」は、脱グリコシル化若しくはグリコシル化型、並びにグリコシル化パターンを変更することによって得ることができる修飾型における、上記に指定された種類のタンパク質を含む。
【００５１】
本発明のタンパク質又はポリペプチドのそのような機能的等価物又はホモログは、突然変異生成によって、例えば点変異、タンパク質の伸長又は短縮によって作製することができる。
【００５２】
本発明のタンパク質のそのような機能的等価物又はホモログは、変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、タンパク質バリアントの多様なデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異生成によって、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結によって作製することができる。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのデータベースを作製するために使用することができる多くの方法がある。縮重した遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成装置で実行することができ、その後合成遺伝子は適切な発現ベクターに連結することができる。縮重したゲノムの使用は、潜在的なタンパク質配列の所望のセットをコードするあらゆる配列を混合物中に供給することを可能にする。縮重したオリゴヌクレオチドの合成法は当業者に周知である（例えばNarang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら、(1984) Science 198:1056; Ikeら (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
【００５３】
先行技術において、いくつかの技術が、点変異又は短縮によって作製されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物のスクリーニングで、並びに選択された特性を持つ遺伝子産物のためのcDNAライブラリーのスクリーニングで知られている。これらの技術は、本発明のホモログのコンビナトリアル突然変異生成によって作製された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適応することができる。ハイスループット解析に基づく巨大な遺伝子バンクのスクリーニングに最も頻繁に使用される技術は、複製することができる発現ベクター中の遺伝子バンクのクローニング、結果として生じたベクターデータベースを用いた適切な細胞のトランスフォーメーション、並びに所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する状況における、コンビナトリアル遺伝子の発現を含む。再帰的アンサンブル突然変異生成（Recursive Ensemble Mutagenesis (REM)）、データベース中で機能的変異体の頻度を増加させる技術を、ホモログを同定するために、スクリーニング試験と組み合わせて使用することができる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgraveら (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００５４】
3.3 コード核酸配列
本発明は、本明細書に定義される酵素をコードする核酸配列にも関する。
【００５５】
本発明は、本明細書に具体的に開示される配列にある程度の「同一性」を有する核酸にも関する。2つの核酸間の「同一性」は、それぞれの場合に核酸の全長に渡るヌクレオチドの同一性を意味する。
【００５６】
例えば同一性は、以下の設定のClustal法（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1）を用いたInformax社（米国）のVector NTI Suite 7.1プログラムによって計算され得る：
マルチプルアラインメントパラメーター：
ギャップオープニングペナルティー  10
ギャップ伸長ペナルティー  10
ギャップ分離ペナルティー範囲  8
ギャップ分離ペナルティー  オフ
アラインメント遅延に対する同一性%  40
残基特異的ギャップ  オフ
親水性残基ギャップ  オフ
トランジション秤量  0
ペアワイズアラインメントパラメーター：
FASTアルゴリズム  オン
K-タプルサイズ  1
ギャップペナルティー  3
ウィンドウサイズ  5
ベストダイアゴナル数  5。
【００５７】
或いは同一性はChenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13): 3497-500、ウェブページ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#及び以下の設定に従って決定され得る
DNAギャップオープンペナルティー  15.0
DNAギャップ伸長ペナルティー  6.66
DNAマトリックス  同一性
タンパク質ギャップオープンペナルティー  10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティー  0.2
タンパク質マトリックス  Gonnet
タンパク質／DNA ENDGAP  -1
タンパク質／DNA GAPDIST  4。
【００５８】
本明細書で言及される全ての核酸配列（一本鎖及び二本鎖DNA及びRNA配列、例えばcDNA及びmRNA）は、ヌクレオチド構成要素からの化学合成による周知の方法で、例えば二重らせんの個々の重複する相補的な核酸構成要素のフラグメント縮合によって作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えばホスホアミダイト法（Voet, Voet, 第2版, Wiley Press, New York, pages 896-897）による周知の方法で行うことができる。DNAポリメラーゼのクレノウフラグメント及び連結反応及び一般的なクローニング技術による合成オリゴヌクレオチドの蓄積及びギャップ充填はSambrookら（1989）に記述される。
【００５９】
本発明はまた、例えば人工ヌクレオチド類似体を用いて得ることができる、上記ポリペプチド及びその機能的等価物の1つをコードする核酸配列（一本鎖及び二本鎖DNA及びRNA配列、例えばcDNA及びmRNA）にも関する。
【００６０】
本発明は、本発明のポリペプチド若しくはタンパク質又は生物学的活性があるそのセグメントをコードする単離された核酸分子、並びに、例えば本発明のコード核酸を同定若しくは増幅するためのハイブリダイゼイションプローブ若しくはプライマーとして使用することができる核酸フラグメントの両者に関する。
【００６１】
本発明の核酸分子は、コード遺伝子領域の3'及び／又は5'末端に由来する非翻訳配列をさらに含み得る。
【００６２】
本発明はさらに、具体的に記述されたヌクレオチド配列又はそのセグメントに相補的な核酸分子に関する。
【００６３】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞種及び生物において相同な配列の同定及び／又はクローニングに使用することができるプローブ及びプライマーの作製を可能にする。そのようなプローブ又はプライマーは一般に、「ストリンジェントな」条件下（以下参照）で、本発明の核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、例えば約40、50又は75の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００６４】
「単離された」核酸分子は、該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離され、組み換え技術によって作製されている場合は、さらに他の細胞物質若しくは培養培地を実質的に含み得ず、又は化学的に合成されている場合は、化学的前駆体若しくは他の化学物質を含み得ない。
【００６５】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準的技術及び本発明によって提供される配列情報によって単離することができる。例えばcDNAは、具体的に開示された完全な配列又はそのセグメントの1つをハイブリダイゼイションプローブとして用い、標準的ハイブリダイゼイション技術を用いて、適切なcDNAライブラリーから単離することができる（例えばSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記述される）。さらに、開示された配列又はそのセグメントの1つを含む核酸分子は、この配列を基に構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。こうして増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化され、DNAシークエンシングによって特性付けることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法、例えば自動DNA合成装置を用いて作製することもできる。
【００６６】
本発明の核酸配列若しくはその誘導体、ホモログ又はこれらの配列の部分は、例えば通常のハイブリダイゼイション技術又はPCR技術によって、他の細菌から、例えばゲノム又はcDNAライブラリーを介して単離することができる。これらのDNA配列は、標準的な条件で本発明の配列とハイブリダイズする。
【００６７】
「ハイブリダイズ」は、標準的な条件でポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドがほぼ相補的な配列に結合する能力を意味し、これらの条件では非相補的パートナー間で非特異的な結合が生じない。このため、配列は90〜100%相補的であり得る。互いに特異的に結合することができる相補的な配列の特性は、例えばノーザンブロッティング又はサザンブロッティング又はPCR若しくはRT-PCRにおけるプライマー結合において利用される。
【００６８】
保存された領域の短いオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼイションに有利に使用される。しかし、本発明の核酸のより長いフラグメント又は完全な配列をハイブリダイゼイションのために使用することもできる。これらの標準的な条件は、使用する核酸（オリゴヌクレオチド、より長いフラグメント若しくは完全な配列）に応じて、又はどの種類の核酸−DNA若しくはRNA−がハイブリダイゼイションに使用されるかに応じて変化する。例えば、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA:RNAハイブリッドの融解温度よりおよそ10℃低い。
【００６９】
例えば特定の核酸に応じて、標準的な条件は、濃度0.1〜5 x SSC（1 X SSC = 0.15 M NaCl、15 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2）の水性緩衝溶液中の温度42〜58℃、又はさらに50% ホルムアミドの存在下、例えば5 x SSC、50% ホルムアミド中の42℃を意味する。有利には、DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼイション条件は、0.1 x SSC及び温度約20℃〜45℃であり、好ましくは約30℃〜45℃である。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼイション条件は、有利には、0.1 x SSC及び温度約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃である。これらの記載されたハイブリダイゼイションのための温度は、ホルムアミド不在下で、およそ100ヌクレオチド長及び50%のG + C含量を有する核酸のために計算された融解温度の値の例である。DNAハイブリダイゼイションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrookら、1989に記述され、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの種類又はG + C含量に応じて、当業者に周知な式を用いて計算することができる。当業者はハイブリダイゼイションについてのさらなる情報を以下の教科書から得ることができる：Ausubelら (編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (編), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００７０】
「ハイブリダイゼイション」は特に、ストリンジェントな条件下で実施することができる。そのようなハイブリダイゼイション条件は例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57に、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記述される。
【００７１】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼイション条件は特に以下を意味する：50% ホルムアミド、5 x SSC（750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム）、50 mM リン酸ナトリウム（pH 7.6）、5 x デンハルト溶液、10% 硫酸デキストラン及び20 g/ml 変性し、せん断したサケ精子DNAからなる溶液中42℃で一晩のインキュベーション、続く65℃で0.1 x SSCを用いたフィルターの洗浄。
【００７２】
本発明はまた、具体的に開示される又は導き出せる核酸配列の誘導体にも関する。
【００７３】
従って、本発明のさらなる核酸配列は、本明細書に具体的に開示される配列に由来することができ、単一の又はいくつかのヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によって異なることができ、さらに所望の特性プロファイルを持つポリペプチドをコードすることができる。
【００７４】
本発明は、いわゆるサイレント変異を含む核酸配列、又は具体的に記載された配列と比べて、特定の元の生物若しくは宿主生物のコドン使用頻度に従って変更された核酸配列、並びに自然発生したバリアント、例えばそれらのスプライシングバリアント若しくは対立遺伝子多型も含む。
【００７５】
本発明はまた、保存的ヌクレオチド置換（すなわち問題のアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性及び／又は溶解度のアミノ酸によって置換される）によって得ることができる配列にも関する。
【００７６】
本発明はまた、配列多型により、具体的に開示される核酸に由来する分子にも関する。これらの遺伝的多型は自然変異によって集団内の個体間に存在し得る。これらの自然変異は通常、遺伝子のヌクレオチド配列中に1〜5%の変動を生じる。
【００７７】
本発明の核酸配列の誘導体は、例えば全配列範囲に渡り由来するアミノ酸レベルで少なくとも60%の相同性、好ましくは少なくとも80%の相同性、特に好ましくは少なくとも90%の相同性を有する対立遺伝子多型を意味する（アミノ酸レベルでの相同性に関し、ポリペプチドについての上記詳細について言及されるべきである）。有利には、相同性は配列の部分的な領域について、より高くあり得る。
【００７８】
さらに、誘導体はまた、本発明の核酸配列のホモログ、例えば動物、植物、真菌又は細菌のホモログ、短縮配列、翻訳領域及び非翻訳領域のDNA配列の一本鎖DNA又はRNAであるとも理解されるべきである。例えばホモログは、本明細書で具体的に開示される配列に与えられる全DNA領域に渡り、DNAレベルで少なくとも40%、好ましくは少なくとも60%、特に好ましくは少なくとも70%、非常に特に好ましくは少なくとも80%の相同性を有する。
【００７９】
さらに、誘導体は、例えばプロモーターとの融合であると理解されるべきである。記載されたヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、プロモーターの機能性又は効率を損なわずに、少なくとも1つのヌクレオチド交換、少なくとも1つの挿入、反転、及び／又は欠失によって改変することができる。さらに、プロモーターの効率はその配列を変更することによって増加させることができ、又は異なる属の生物のより効率のよいプロモーターとさえ完全に交換することができる。
【００８０】
3.4 本発明の構築物
本発明はまた、制御核酸配列の遺伝的制御下で、本発明のポリペプチド又は融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物；並びに少なくとも1つのこれらの発現構築物を含むベクターにも関する。
【００８１】
本発明の「発現単位」は、本明細書に定義されるプロモーターを含み、且つ、発現されるべき核酸又は遺伝子と機能的に連結した後、この核酸又はこの遺伝子の発現、すなわち転写及び翻訳を制御する、発現活性を有する核酸を意味する。従ってこの文脈において、それは「制御核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加え、他の調節要素、例えばエンハンサーが存在してよい。
【００８２】
本発明の「発現カセット」又は「発現構築物」は、発現されるべき核酸又は発現されるべき遺伝子と機能的に連結した発現単位を意味する。従って発現単位と異なり、発現カセットは、転写及び翻訳を制御する核酸配列だけでなく、転写及び翻訳の結果としてタンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。
【００８３】
「発現」又は「過剰発現」という用語は、本発明の文脈において、微生物中で、対応するDNAにコードされる1種以上の酵素の細胞内活性を生成するか、又は増加させることを記述する。このため、例えば生物に遺伝子を挿入し、既存の遺伝子を別の遺伝子で置換し、その遺伝子のコピー数を増加させ、強力なプロモーターを使用し、又は高い活性を持つ対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができ、そして場合によりこれらの手段を組み合わせることができる。
【００８４】
本発明のそのような構築物は、各コード配列から5'-上流のプロモーター、及び3'-下流のターミネーター配列、及び場合によりさらなる通常の調節要素を、各場合にコード配列と機能的に連結して含むことが好ましい。
【００８５】
本発明の「プロモーター」、「プロモーター活性を持つ核酸」又は「プロモーター配列」は、転写されるべき核酸と機能的に連結して、この核酸の転写を制御する核酸を意味する。
【００８６】
「機能的な」又は「動作可能な」連結は、この文脈において、例えばプロモーター活性を持つ核酸の1つ、及び転写されるべき核酸配列の1つ、及び場合によりさらなる調節要素、例えば核酸の転写を可能にする核酸配列、及び例えばターミネーターの、各調節要素が核酸配列の転写においてその機能を果たし得るような方法での連続的な配置を意味する。このことは、必ずしも化学的な意味での直接的な連結を必要としない。エンハンサー配列等の遺伝的制御配列は、より遠い位置から、又は他のDNA分子からさえ、標的配列に機能を発揮することもできる。二つの配列が互いに共有結合されるように、転写されるべき核酸配列がプロモーター配列の後ろに（すなわち3'末端に）位置する配置が好ましい。プロモーター配列及び遺伝子導入で発現されるべき核酸配列の距離は、200 bp（塩基対）未満又は100 bp未満又は50 bp未満であり得る。
【００８７】
プロモーター及びターミネーターの他に、言及され得る他の調節要素の例は、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点等である。適切な制御配列は、例えばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記述される。
【００８８】
本発明の核酸構築物は特に、本明細書に具体的に言及される配列又はその誘導体及びホモログから選択される配列、並びに遺伝子発現を調節する、例えば増加させる1つ以上の制御シグナルと動作可能なように若しくは機能的に有利に連結した、本明細書に具体的に言及されるアミノ酸配列に由来し得る核酸配列を含む。
【００８９】
これらの制御配列に加えて、これらの配列の天然の制御は、実際の構造遺伝子の前に依然として存在することができ、天然の制御がスイッチオフされて遺伝子発現が増加するように、場合により遺伝的に変更することができる。核酸構築物はより単純な設計、すなわちコード配列の前に付加的な制御シグナルが挿入されておらず、その制御をする天然プロモーターを除去せずにいることもできる。その代わり、制御がもはや起こらず、遺伝子発現が増加するように、天然の制御配列はサイレンスされる。
【００９０】
好ましい核酸構築物は有利に、プロモーターと機能的に連結され核酸配列の発現増加を許容する1つ以上の前述のエンハンサー配列も含む。他の調節要素又はターミネーター等のさらなる有利な配列をDNA配列の3'末端に挿入することもできる。本発明の核酸の1つ以上のコピーを構築物に含むことができる。構築物は、抗生物質耐性又は栄養要求性相補遺伝子等の、場合により構築物の選抜のための他のマーカーも含むことができる。
【００９１】
適切な制御配列の例は、グラム陰性菌で有利に用途を見出す、cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、 T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP (rhaPBAD)SP6-、ラムダ-PR-又はラムダ-PLプロモーター等のプロモーターに含まれる。他の有利な制御配列は、例えばグラム陽性プロモーターace、amy及びSPO2、酵母又は真菌のプロモーターADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHに含まれる。人工プロモーターも制御のために使用することができる。
【００９２】
発現のために、核酸構築物は、宿主中で遺伝子の最適な発現を許容するベクター、例えばプラスミド又はファージ中で有利に宿主生物に挿入される。プラスミド及びファージに加え、ベクターは当業者に周知なあらゆる他のベクター、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス及びアデノウイルス等のウイルス、トランスポゾン、IS要素、ファスミド、コスミド並びに直鎖若しくは環状DNAも意味すると理解されるべきである。これらのベクターは宿主生物中で自律的に複製することができ、染色体で複製することができる。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態を表す。
【００９３】
適切なプラスミドは、例えばE. coliではpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11若しくはpBdCI；nocardioform actinomycetesではpJAM；StreptomycesではpIJ101、pIJ364、pIJ702若しくはpIJ361；桿菌ではpUB110、pC194若しくはpBD214；CorynebacteriumではpSA77若しくはpAJ667；真菌ではpALS1、pIL2若しくはpBB116；酵母では2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13若しくはpEMBLYe23、又は植物ではpLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004若しくはpDH51である。前述のプラスミドは可能性のあるプラスミドの少数の選択を表す。他のプラスミドは当業者に周知であり、例えば単行本、Cloning Vectors（Pouwels P.H.ら編 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018）に見出される。
【００９４】
ベクターのさらなる実施形態において、本発明の核酸構築物を含むベクター又は本発明の核酸は、微生物中に直鎖DNAの形で有利に挿入することができ、非相同又は相同組み換えを介して宿主生物のゲノムに組み込むことができる。この直鎖DNAはプラスミド又は単なる核酸構築物又は本発明の核酸等の直鎖化されたベクターを含み得る。
【００９５】
生物における異種遺伝子の最適な発現のために、その生物で使用される固有のコドン使用頻度に従って核酸配列を変更することは有利である。コドン使用頻度は、問題の生物の他の既知遺伝子のコンピューター評価に基づいて容易に決定することができる。
【００９６】
本発明の発現カセットの作製は、適切なプロモーターと、適切なコードヌクレオチド配列及びターミネーターシグナル若しくはポリアデニル化シグナルの融合に基づく。例えばT. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)及びT.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)及びAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記述されるように、このために一般的な組み換え及びクローニング技術が使用される。
【００９７】
組み換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、適切な宿主生物中の発現のための宿主特異的ベクターに有利に挿入され、宿主中で最適な遺伝子発現を許容する。ベクターは当業者に周知で、例えば「Cloning Vectors」（Pouwels P.H.ら、Publ. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985）に見出される。
【００９８】
3.5 本発明で使用することができる宿主
文脈に応じて、「微生物」という用語は出発微生物（野生型）若しくは本発明の遺伝子改変微生物、又は両者を意味する。
【００９９】
本発明の「野生型」という用語は対応する出発微生物を意味し、必ずしも天然の生物と一致することを必要としない。
【０１００】
本発明のベクターによって、例えば少なくとも1つの本発明のベクターでトランスフォームされた組み換え微生物を作製することができ、本発明の発酵生産のために使用することができる。
【０１０１】
有利には、上記に記述された本発明の組み換え構築物は、適切な宿主システムに挿入され発現される。各発現システムにおいて記載された核酸の発現を確保するために、当業者によく知られている一般的なクローニング及びトランスフェクション法、例えば共沈降、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等を使用することが好ましい。適切なシステムは、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubelら、Publ. Wiley Interscience, New York 1997、又はSambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記述される。
【０１０２】
親微生物は典型的には、リジン、特にL-リジンをグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロース若しくはグリセロール、脂肪酸、植物油又はエタノールから生産する能力を有する微生物である。それらはコリネフォルム細菌、特にコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属であることが好ましい。特に、Corynebacterium glutamicum種について言及される。
【０１０３】
Corynebacterium属の適切な株の非限定的な例及びCorynebacterium glutamicum (C. glutamicum)種は
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806、
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539、
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
並びにBrevibacterium属の適切な株の非限定的な例は
Brevibacterium flavum ATCC 14067 
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869及び
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
或いはそこから由来する株、例えば
Corynebacterium glutamicum KFCC10065  
Corynebacterium glutamicum ATCC21608
である。
【０１０４】
KFCCはKorean Federation of Culture Collectionを意味し、ATCCはAmerican type strain culture collectionを意味し、FERM BPは生命工学工業技術研究所、工業技術院、日本の収集を意味する。
【０１０５】
本発明の宿主生物又は宿主生物群は、上記定義に従う酵素活性をコードする、本発明に記述される少なくとも1つの核酸配列、核酸構築物又はベクターを含むことが好ましい。
【０１０６】
3.5 GABAの発酵生産
本発明はGABAの発酵生産法にも関する。
【０１０７】
本発明で使用される組み換え微生物は、連続的又は不連続的に、回分培養又は流加培養若しくは連続流加培養で培養することができる。周知な培養法の概要は、Chmielによる教科書（Bioprocesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）又はStorhasによる教科書（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)）に見出される。
【０１０８】
使用されるべき培養培地は、適切な方法で特定の菌株の要求を満たさなければならない。様々な微生物のための培養培地の記述は、American Society for Bacteriologyのハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」（Washington D. C., USA, 1981）に与えられる。
【０１０９】
本発明で使用することができるこれらの培地は一般に1種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び／又は微量元素を含む。
【０１１０】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類、又は多糖類等の糖類である。非常に良い炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、ショ糖、ラフィノース、デンプン又はセルロースである。糖類は、糖蜜、又は精糖による他の副産物等の複合化合物を介して培地に添加することもできる。様々な炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油等の油脂、パルミチン酸、ステアリン酸若しくはリノール酸等の脂肪酸、グリセロール、メタノール若しくはエタノール等のアルコール並びに酢酸若しくは乳酸等の有機酸である。
【０１１１】
窒素源は通常、有機若しくは無機窒素化合物又はこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例は、アンモニアガス、又は硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム若しくは硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、或いはコーンスティープリカー（corn-steep liquor）、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキス等の複合窒素源を含む。窒素源は分離して又は混合物として使用することができる。
【０１１２】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物塩、リン酸塩又は硫酸塩を含む。
【０１１３】
無機含硫化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物だけでなく、メルカプタン及びチオール等の有機硫黄化合物も硫黄源として使用することができる。
【０１１４】
リン酸、リン酸二水素カリウム若しくはリン酸水素二カリウム又は対応する含ナトリウム塩をリン源として使用することができる。
【０１１５】
金属イオンを溶液中に保持するために、キレート剤を培地に添加することができる。特に適したキレート剤は、カテコール又はプロトカテキュ酸等のジヒドロキシフェノール類、又はクエン酸等の有機酸を含む。
【０１１６】
本発明で使用される発酵培地は、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩及びピリドキシンを含む、ビタミン類又は増殖促進物質等の他の増殖因子も含み得る。増殖因子及び塩はしばしば、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー等の、培地の複合体成分に由来する。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加することができる。培地中の化合物の正確な組成は、特定の実験に強く依存し、それぞれの特殊な場合に個々に決定されなければならない。培地の最適化についての情報は教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」（Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）に見出すことができる。増殖培地は、Standard 1（Merck）又はBHI（Brain heart infusion, DIFCO）等として商用供給業者からも得ることができる。
【０１１７】
培地の全成分は、加熱（1.5 bar及び121℃で20分）又は滅菌ろ過のいずれかによって滅菌される。成分は一緒に、又は必要ならば別々に滅菌することができる。培地の全成分は増殖の開始時に存在することができ、又は場合により連続的に若しくは流加（batch feed）によって添加することができる。
【０１１８】
培養温度は通常、15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃であり、実験中一定に保たれ得るか、又は変化し得る。培地のpH値は5〜8.5の範囲、好ましくは約7.0であるべきである。増殖のためのpH値は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくはアンモニア水等の塩基化合物、又はリン酸若しくは硫酸等の酸化合物を添加することによって、増殖中に調整することができる。消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステル類は、泡立ちを制御するために使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的作用を持つ適切な物質、例えば抗生物質を培地に添加することができる。好気状態を維持するために、酸素又は含酸素気体混合物、例えば外気を培養中に供給することができる。培養温度は通常20℃〜45℃である。培養は、所望の生成物の最大量が形成されるまで続けられる。これは通常10時間〜160時間以内に達成される。
【０１１９】
細胞は場合により、高周波数超音波によって、高圧によって、例えばフレンチプレス細胞破砕機で、浸透圧分解（osmolysis）によって、界面活性剤、溶菌酵素若しくは有機溶剤の作用によって、ホモジナイザーによって、又は挙げられたいくつかの方法の組み合わせによって破壊することができる。
【０１２０】
3.6 GABAの単離
本発明の方法は、GABAを回収するステップをさらに含み得る。「回収する」という用語は、培養培地から化合物を抽出、収穫、単離又は精製することを含む。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば陰イオン若しくは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等）を用いた処理、従来の吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）を用いた処理、pHの変化、（例えばアルコール、酢酸エチル、ヘキサン等の従来の溶媒を用いた）溶媒抽出法、蒸留、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥等を含むがそれらに限られない、当技術分野で周知な従来の単離又は精製法に従って実施することができる。例えばGABAは、まず微生物を除去することによって培養培地から回収することができる。次いで、残った培養液は陽イオン交換樹脂を通過させ、不要な陽イオンを除去し、その後陰イオン交換樹脂を通過させ、不要な無機陰イオン及び有機酸を除去する。
【０１２１】
3.7 ポリアミドポリマー及びピロリドン
別の形態において、本発明は、GABAの生産について上記に述べたステップを含む、ポリマー、特にポリアミドの製造方法を提供する。GABAは、周知の方法でそれ自体と、又は標準的なポリマー合成法を適用することによってアミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つの異なるコモノマーと反応する。適切なコモノマーは、例えば、少なくとも1つの反応性水酸基又はアミノ基を持つC2〜C31、好ましくはC4〜C10直鎖又は分枝鎖モノカルボン酸に由来する。
【０１２２】
そのような水酸基-又はアミノ-置換の、共重合可能な「カルボン酸」は、直鎖又は分枝鎖、飽和又はモノ-若しくはポリ-不飽和C2〜C30モノカルボン酸に由来する。特に前記酸は、直鎖モノ-若しくはポリ-不飽和ヒドロカルビル残基又は平均長1〜30、好ましくは3〜9の炭素原子を有するそのような残基の混合物を有する。特に好ましい残基は：
-  CH3-, C2H5 - ; C3H7 - ; C4H9 - ; C5H11 - ; C6H13 - ; C7H15 - , C8H17 - ; C9H19 - ; C10H21 - ; C11H23 - ; C12H25 - ; C13H27 - ; C14H29 - ; C15H31 - ; C16H33 - ; C17H35 - ; C18H37 - ; C19H39 - ; C20H41 -; C21H43 - ; C23H47 - ; C24H49 ; -C25H51 - ; C29H59 - ; C30H61のような飽和直鎖残基
-  iso-C3H7 - ; iso-C4H9 - ; iso-C18H37 -のような飽和分枝鎖残基
-  C2H3 - ; C3H5 - ; C15H29 - ; C17H33 - ; C21H41 -のようなモノ-不飽和直鎖残基
-  C5H7 - ; C17H31 -のような二不飽和直鎖
これらの残基は修飾され、水酸基及びアミノ基から選択される、共重合に必要な少なくとも1つの機能性置換基を持つ。
【０１２３】
別の形態において、発酵生産されたGABAは、有機合成の標準的な技術を適用することによってピロリドンを製造するために利用され得る。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例は本発明を説明する役割を果たすだけである。当業者に自明な多くの可能な変形も本発明の範囲内に入る。
【０１２５】
実験部分
特に明記しない限り、以下の実験は、遺伝子工学、微生物の培養による化合物の発酵生産、並びに生成物の分析及び単離において使用される標準的な装置、方法、化学物質、及び生化学物質を適用することによって実施された。本明細書において上記に引用されるSambrookら及びChmielらも参照。
【実施例１】
【０１２６】
E. coliグルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）遺伝子のクローニング
PCRプライマー、WKJ95/WKJ96及びWKJ99/WKJ100を、鋳型としてのE. coli染色体DNAと共に使用し、それぞれgadBC及びgadA遺伝子を含むDNAフラグメントを増幅した。増幅したDNAフラグメントを精製し、制限酵素、gadBCについてはXhoI/XbaI及びgadAについてはXhoI/SpeIで消化し、同じ制限酵素で消化したpClik5aMCS（配列番号14；図3）ベクターに連結させ、それぞれpClik5aMCS gadBC及びpClik5aMCS gadAが得られた。
【０１２７】
使用したオリゴヌクレオチドプライマー：
WKJ95    ccgctcgagcggcccaagcttcggtaaatacttataccggag (配列番号10)
WKJ96    ctagtctagactagcccaagcttgtcgatcatcgcctgttg (配列番号11)
WKJ99    ccgctcgagcggcccaagcttcgtgataaattgcgtcagaaag (配列番号12)
WKJ100   ctagactagtctagcccaagcttctcgaatttggcttgcatcc (配列番号13)
【実施例２】
【０１２８】
Solanum tuberosum（ジャガイモ）におけるGAD遺伝子の探索
ジャガイモにおいてGADをコードする未知の遺伝子を見つけるために、最初のステップは近縁生物からGADを同定することであった。配列データベースGenbank、Refseq及びUniprotにおいて「Solanum」属で「グルタミン酸脱炭酸酵素」についてのクエリーによって、以前特性づけられたSolanum lycopersicum（トマト）のGAD、Swissprot受入番号P54767が明らかとなった。この配列を鋳型として用い、Genbankのサブセクション植物のEST及びGSSにおけるtblastnサーチを実行した。最もよい100ヒット（期待値<10-118）の中で、16配列がSolanum tuberosum（ジャガイモ）から抽出された。全16配列は発現配列タグ（EST）であり、すなわち発現しスプライスされたmRNAのフラグメントを表す。VectorNTI Contig Express（設定：オーバーラップ=20、同一性=0.8、カットオフスコア=40）を用いたアセンブリーによって、15配列からなるコンティグ及び1配列（BG594946）からなる第二のコンティグが明らかとなった。
【０１２９】
アセンブリーの質を確認し、どちらのコンティグを選ぶか決定するため、両アセンブリーのコンセンサス配列を作成し、当初のblastサーチ由来の全100ヒットと比較した。アラインメント（図1にガイドツリーとして示す）によって、コンティグ1が外れ値であることがわかった。受入番号BG594946のESTのみからなるコンティグ2はトマトGADに非常によく合致するため、ジャガイモGADを表す最もよい候補として選択した。
【０１３０】
BG594946はGAD遺伝子のコアのみをカバーするので、隣接する5'及び3'領域を対応するトマト遺伝子から取得し、その結果図2に示すキメラGAD遺伝子となった。
【実施例３】
【０１３１】
合成キメラGAD遺伝子のクローニング
植物由来のキメラGAD遺伝子のコドン使用頻度はC. glutamicum遺伝子のものとかなり異なるため、キメラGAD遺伝子の発現はC. glutamicum株において効率的でないだろう。C. glutamicumにおける遺伝子発現を高めるため、C. glutamicumコドン使用頻度に適合した配列を持つ合成GAD遺伝子を、カルモジュリン結合配列を持たないキメラGAD遺伝子を基に作出した。さらに、合成GAD遺伝子はC. glutamicumのsodAプロモーター（Psod）及びgroELターミネーターを有していた。合成GAD遺伝子を制限酵素SpeIで消化し、同じ制限酵素で消化したpClik5aMCSベクターに挿入し、pClik5aMCS Psod SL_gadが得られた。
【実施例４】
【０１３２】
振とうフラスコ培養におけるGABA生産
GABA生産株を構築するため、GAD遺伝子を含む組み換えプラスミドでグルタミン酸生産細菌C. glutamicum ATCC13032をトランスフォームした。
【０１３３】
GABA生産を調べるため、振とうフラスコ実験を組み換え株について実施した。菌株をCMプレート（10 g/l グルコース、2.5 g/l NaCl、2 g/l 尿素、10 g/l バクトペプトン、10 g/l 酵母エキス、22 g/l 寒天）上で30℃で一晩前培養した。培養した細胞を1.5 mlの0.9% NaClを含むマイクロチューブに回収し、ボルテックス後、610 nmでの吸収によって細胞密度を測定した。主培養のため、オートクレーブした100 mlのエルレンマイヤーフラスコに入れた10 mlの生産培地（60 g/l グルコース、30 g/l (NH4)2SO4、2 g/l 酵母エキス、1 g/l KH2PO4、1 g/l MgSO4×7H2O、10 mg/l FeSO4×7H2O、10 mg/l MnSO4・H2O、0.2 mg/l チアミンHCl、2 mg/l ビオチン、52 g/l ACES、pH 6.5）に懸濁した細胞を初期ODが1.5に達するように植菌した。主培養はロータリーシェーカー（Infors AJ118, Bottmingen, Switzerland）で200 rpm、30℃で48時間行った。GABA濃度の測定は、Gemini C18カラム（Phenomenex）及び蛍光検出器（Agilent）を用いたHPLC（Agilent 1100 Series）によって行った。オルト-フタルアルデヒドを用いたプレカラム誘導体化はGABAの定量を許容する。細胞増殖は分光光度計によって610 nmでモニターした。
【０１３４】
GABAの蓄積はGAD遺伝子を含む全ての組み換え株で観察された。pClik5aMCS Psod SL_gadプラスミドを持つ組み換え株は最も高いGABA生産性を示した。結果は以下の表にまとめて示す：
【表３】
2015119707.tif 000004
【０１３５】
本明細書で引用された全ての文献は参照により援用される。
【図１】
2015119707.tif 000005
【図２】
2015119707.tif 000006
【図３】
2015119707.tif 000007
【配列表】
2015119707000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月4日(2015.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2のアミノ酸配列又はそれに少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、グルタミン酸脱炭酸酵素。
【請求項２】
請求項1に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素のコード配列を含む核酸。
【請求項３】
配列が少なくとも1つの制御核酸配列に機能的に連結される、請求項2に記載の少なくとも1つの核酸配列を含む、発現カセット。
【請求項４】
請求項3に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む、組み換えベクター。
【請求項５】
請求項4に記載の少なくとも1つのベクターでトランスフォームされた、原核又は真核宿主。
【請求項６】
組み換えCorynebacteriumから選択される、請求項5に記載の宿主。
【請求項７】
組み換えCorynebacterium glutamicumである、請求項6に記載の宿主。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
別の形態において、発酵生産されたGABAは、有機合成の標準的な技術を適用することによってピロリドンを製造するために利用され得る。
本発明の様々な態様を以下にまとめて示す。
１．組み換え微生物の培養を含む、γ-アミノ酪酸（GABA）の発酵生産方法であって、該微生物が、グルタミン酸を生産する能力に加え、グルタミン酸をGABAに変換するように異種グルタミン酸脱炭酸酵素（E.C. 4.1.1.15）を発現する能力を有する親微生物に由来する、前記方法。
２．前記微生物がグルタミン酸生産細菌である、上記1に記載の方法。
３．前記グルタミン酸生産細菌がコリネフォルム細菌である、上記2に記載の方法。
４．細菌がCorynebacteriumである、上記3に記載の方法。
５．細菌がCorynebacterium glutamicumである、上記4に記載の方法。
６．前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が原核又は真核生物由来である、上記1〜5のいずれかに記載の方法。
７．前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が植物のグルタミン酸脱炭酸酵素、又は植物のグルタミン酸脱炭酸酵素に由来するアミノ酸配列部分を含むキメラのグルタミン酸脱炭酸酵素である、上記6に記載の方法。
８．前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum属の植物、特にSolanum tuberosum由来の脱炭酸酵素である、上記6又は7に記載の方法。
９．異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosum由来であり、配列番号2のThr94からLeu336までのアミノ酸配列又はそれに少なくとも80％の同一性を有する配列を含む、上記6〜8のいずれかに記載の方法。
１０．異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosum由来のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び／又はC末端に補完される、上記9に記載の方法。
１１．異種グルタミン酸脱炭酸酵素がSolanum tuberosumと異なる第二の植物のグルタミン酸脱炭酸酵素の対応する末端アミノ酸配列によってN末端及び／又はC末端に補完される、上記9に記載の方法。
１２．前記第二の植物がSolanum lycopersicumである、上記11に記載の方法。
１３．前記グルタミン酸脱炭酸酵素が配列番号2のアミノ酸配列又はそれに少なくとも80％の同一性を有する配列を含む、上記12に記載の方法。
１４．前記異種グルタミン酸脱炭酸酵素が細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素である、上記1〜6のいずれかに記載の方法。
１５．前記細菌のグルタミン酸脱炭酸酵素がEscherichia属の細菌、特にE. coli由来である、上記14に記載の方法。
１６．前記E. coliグルタミン酸脱炭酸酵素が配列番号6のGad A、配列番号8のGad B及び配列番号9のGad Cを含むGad BC複合体並びにGad A若しくはGad BCに少なくとも80％の同一性を有する配列から選択される、上記15に記載の方法。
１７．グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素が、グルタミン酸を生産する能力を有する前記親微生物のコドン使用頻度に適合した核酸配列にコードされる、上記1〜16のいずれかに記載の方法。
１８．グルタミン酸脱炭酸酵素活性を有する酵素が、
a) 配列番号1の第472〜1200位、又は配列番号1の第193〜1605位；
b) 配列番号5；
c) 配列番号7；
d) 或いは上記6〜17のいずれかに定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素をコードする任意のコード配列
から選択されるコード配列を含む核酸配列にコードされる、上記1〜17のいずれかに記載の方法。
１９．上記8〜13のいずれかに定義されるグルタミン酸脱炭酸酵素。
２０．上記19に記載のグルタミン酸脱炭酸酵素のコード配列を含む核酸配列。
２１．配列が少なくとも1つの制御核酸配列に機能的に連結される、上記20に記載の少なくとも1つの核酸配列を含む、発現カセット。
２２．上記21に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む、組み換えベクター。
２３．上記22に記載の少なくとも1つのベクターでトランスフォームされた、原核又は真核宿主。
２４．組み換えコリネフォルム細菌、特に組み換えCorynebacteriumから選択される、上記23に記載の宿主。
２５．組み換えCorynebacterium glutamicumである、上記24に記載の宿主。
２６．生産されたGABAが発酵ブロスから単離される、上記1〜18のいずれかに記載の方法。
２７．a) 上記1〜18のいずれかに記載の方法によってGABAを生産するステップ；
b) GABAを単離するステップ；並びに
c) （場合により、アミノカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸から選択される少なくとも1つのさらなる適切な多価のコモノマーの存在下で）前記GABAを重合するステップ
を含む、ポリアミドの製造方法。
【外国語明細書】
2015119707000001.pdf