(57)【要約】【課題】疫学的病理形質と整合性のある遺伝子診断・治療法の開発が残されている。【解決手段】被験者のがん細胞及び正常細胞からゲノム塩基配列を取得し、ゲノムデータベースと照合することにより染色体にマップした遺伝子整列化地図を作成する（ステップＳ１）。次に、当該整列化地図からデータベースに登録してある既知ＳＮＰを除外した残りのＳＮＶあるいはＭＮＶを、未知ＳＮＶとして体細胞多重変異の数量化と染色体遺伝子のランドマークにする（ステップＳ２）。このうち、がん関連遺伝子の構造・機能を転換するnon-synonymous変異を選択し、がん特異的体細胞変異の候補とする。ただし、当該ＳＮＶ、あるいはＭＮＶに塩基配列の付加、欠失がある場合には、相補塩基を体細胞多重変異の数量的指標に用いる（ステップＳ３）。【選択図】図１
2015089364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のがん細胞・組織、及び正常細胞・組織からゲノム塩基配列を取得し、ゲノムデータベースと照合することにより、染色体に整列化し、
整列化した塩基配列から一塩基多型データベース（ＳＮＰ：ＱＣ３０）に登録してある健康人の一塩基多型（既知ＳＮＰ）を除外した残りの一塩基多様性配列（ＳＮＶ）、あるいは多塩基多様性配列（ＭＮＶ）を未知ＳＮＶとして、体細胞多重変異の数量化と染色体遺伝子の変異箇所の同定を行い、
当該ＳＮＶ、およびＭＮＶの塩基配列に付加、あるいは欠失がある場合は、リファレンスの塩基配列を体細胞多重変異のパラメーターとして数量的指標に使用することを特徴とするがん診断方法。
【請求項２】
当該未知ＳＮＶから遺伝子の機能・構造の変化を誘導する疾患性ＳＮＶ を選択し、染色体遺伝子にマップする体細胞変異地図作成する、請求項１に記載のがん診断方法。
【請求項３】
変異度数を表記し、当該正常細胞の体細胞変異地図と比較し、原因遺伝子を識別する、請求項１又は２に記載のがん診断方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のがん診断方法に用いられるがん診断装置であって、別途、各腫末期がんの前記体細胞多重変異地図を作成しておき、前記被験者細胞・組織の前記体細胞多重変異地図と対比することにより、各種遺伝子の変異度数による遺伝子診断を行い、その診断結果を出力する診断結果出力手段を備えたがん診断装置。
【請求項５】
請求項１、２又は３に記載のがん診断方法において得られた診断結果に基づき、前記がんの医薬を開発するがん医薬開発方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の遺伝子の塩基配列に基づいてがんを診断する、がん診断方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の遺伝子を調べ、そのデータに基づいてがんを診断する方法が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、がん関連遺伝子を見出して、当該がん関連遺伝子の欠失、又は当該がん関連遺伝子の変異や発現量の異常を検出することにより、がんを診断する方法が開示されている。このがん診断方法は、ＧＭＤＳ遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子、ＴＥＫ遺伝子、又はＥＢＩ２遺伝子の全部又はその一部を含むＤＮＡを用いて、検体試料中の各遺伝子の欠失を検出する工程を含む、特に肺がんの診断方法である。
【０００４】
また、特許文献２には、がん関連遺伝子ｐ５３の変異の有無にかかわらず、また、ｐ５３の変異を直接検出することなくｐ５３の機能異常を検出することにより、かかる機能異常に起因するがんを診断する方法が開示されている。このがん診断方法は、被検組織又は被検細胞における、ＣＡＲＳ、ＭＯＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＬＯＣ５６９０１及びＧＥＦ−Ｈ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現量を測定する工程と、当該遺伝子の発現量と正常組織又は正常細胞における対応遺伝子の発現量とを比較する工程と、比較した結果、被検組織又は被検細胞における遺伝子の発現量が正常組織又は正常細胞における遺伝子の発現量より有意に多いか否かを判断する工程を含むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２７５０２７号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０８２８６６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】松本直道ら「エクソーム解析‐成果と将来」医学の歩み、245巻（No5）2013年 http://www.ishiyaku.co.jp/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来のがん診断方法は、がんの病理形質（phenotypes）に基づく疫学的方法でがん関連遺伝子の変異や発現量の異常を検出する帰納的方法（ボトムアップ・アプローチ）であった。このために判断が画一的、限定的であり、患者の遺伝的背景や体質、あるいは加齢や環境変化等により激動するゲノムＤＮＡの的確な診断を下すことが困難であった。
【０００８】
がん、生活習慣病等の主因は加齢あるいは生活環境等に伴う個人ゲノムの体細胞変異の結果である。近年、大量シーケンスによるヒト全ゲノム解析で、疾患別に数万人の患者の遺伝子変異を集約する国際的コホート研究（International Cancer Genome Consortium）が実施され、全ゲノムから各腫がんの原因遺伝子、あるいは関連遺伝子をカタログ化し、演繹的方法（トップダウン・アプローチ）で遺伝子診断・治療に役立たせる試みがなされている。
【０００９】
しかし、ヒトゲノム30億の中の一塩基の違いである体細胞変異を検出する方法は確立されていない。とりわけ、ゲノムの98％を占める非遺伝子（ジャンク）領域は遺伝子機能が明らかでない上に、人種間、あるいは個人間でも変形した多くの反復配列があり全ゲノム解析の技術的障害となっている。さらに同一疾患組織内の細胞間にもシーケンスの違いがあることが解り、コホート研究によるがんの全ゲノム解析は個別化解析へ移りつつある。
【００１０】
最近、個別患者の正常細胞をリファレンスに、疾患細胞から遺伝子領域（エクソーム）の塩基配列を比較することにより一塩基単位の違い（ＳＮＶ：Single Nucleotide Variations）から体細胞変異を検出し、疾患病理に連鎖する全エクソーム・リファレンス（ＥｘＲｅｆ：Exome Reference）法が提案されている。すなわち、ＤＮＡ全ゲノムの２％を占めるエクソームを特異的に増幅し、次世代シーケンサーによる大量シーケンスからＳＮＶを抽出し、体細胞変異から原因遺伝子を追求する方法である（図３）。
【００１１】
ただし、ＥｘＲｅｆ法では、数十億塩基を超す大量シーケンスの比較解析から一塩基の違いを見出す必要がある。このために全エクソームの増幅反応の「ばらつき」や次世代シーケンサーの膨大な「読取りミス」を除き、ＳＮＶを抽出し遺伝子に正確にマップする必要がある。次に、人種間、個体間のゲノムの多様性や疾患組織内の細胞間のゲノムの不均一性など細胞遺伝学的課題を解決し、当該病理に関わる遺伝子の体細胞変異を見分ける必要がある。最後に、被験者ゲノムの体細胞変異から疾患特異的遺伝子を選択し、これまでの疫学的病理診断と照合させる解析プラットフォームの開発が必要である。
【００１２】
本発明の目標は、上記障害、課題を解決し患者ごとに的確な診断を下すことができる、がん診断方法等を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これらの課題を解決する手段として、（１）同一患者の正常細胞、及び疾患細胞のＤＮＡから得た大量の塩基配列を、ヒトゲノムデータベースのエクソーム領域に整列化すること（２）当該整列化地図から一塩基多型データベース（ＳＮＰ：ＱＣ３０）に登録してある健康人の一塩基多型（以下、既知ＳＮＰと略す）を除去した残りの一塩基多様性配列（以下、未知ＳＮＶと略す）を染色体遺伝子にマップし、体細胞多重変異の数量化指標（ランドマーク）にすること（３）このうち、疾患関連遺伝子の構造・機能を転換する変異（たとえばnon-synonymous mutation）を疾患性ＳＮＶとして、前記患者正常細胞、及び疾患細胞の遺伝子変異地図を作成すること（４）別途、末期がんについて当該遺伝子変異地図をがん解析用プラットフォームに前記患者の遺伝子変異地図と対比することにより体細胞変異と病理形態との連鎖関係を明らかにすることが挙げられる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、被験者の正常細胞をリファレンスに疾患細胞から遺伝子の機能・構造を転換する疾患性ＳＮＶを抽出、体細胞多重変異の数量的指標（ランドマーカー）として新奇がん特異的遺伝子の選択と体細胞変異地図作成に供する。
【００１５】
各腫末期がんの遺伝子変異地図をがん解析用プラットフォームに、被験者の遺伝子パネルに疾患性ＳＮＶ数を記録し、がん腫の特定や症状の進行状態を診ることや、前記正常細胞と共通する疾患性ＳＮＶからがん前駆体遺伝子やがん幹細胞遺伝子のマーカーが選択され、早期遺伝子診断法を開発に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施形態におけるがん診断方法を示す流れ図である。
【図２】実施形態におけるがん診断装置を示すブロック図である。
【図３】全エクソーム法による遺伝子（エクソン）領域の構成図と体細胞変異を示す説明図である。
【図４】全エクソーム・リファレンス法（ＥｘＲｅｆ法）の全行程表である。
【図５】ＥｘＲｅｆ法による肝がんアデノーマの体細胞変異の抽出法と遺伝子解析の実施例を示す図表である。
【図６】染色体１７番短腕のエクソーム被覆率（暴走変異）を示す図表である。
【図７】non-synonymous変異度数(疾患性ＳＮＶ)を遺伝子の数量化指標とする肝がんアデノーマの正常細胞と疾患細胞の比較解析図表である。
【図８】肝がんアデノーマのＥｘＲｅｆ解析で比較の対象からはずれた各遺伝子のnon-synonymous変異度(疾患性ＳＮＶ)を示す図表である。
【図９】遺伝子機能・構造に影響の少ないsynonymous変異度数から見た肝がんアデノーマ患者の正常細胞と疾患細胞の比較解析図表である。
【図１０】体細胞変異とがんの進行速度との関係（がん細胞淘汰説）を示す説明図である。
【図１１】肝がんアデノーマ関連遺伝子の体細胞多重変異度を示す図表である。
【図１２】末期がんによるがん解析用プラットフォーム作成用フォーマットを示す図表である。
【図１３】染色体１７番遺伝子変異地図と遺伝子プロフィールを示す図表である。
【図１４】がんナビによる個別化医療診断を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、添付図面を参照しながら、本発明を実施するための形態（以下「実施形態」という。）について説明する。
【００１８】
図１は、本発明の一実施形態におけるがん診断方法を示す流れ図である。以下、この図面に基づき説明する。
【００１９】
被験者の疾患細胞、及び正常細胞から大量のゲノム塩基配列を取得し、ゲノムデータベースと照合することによりマップした遺伝子（エクソーム）整列化地図を作成する（ステップＳ１）。次に、当該整列化地図から一塩基多型データベース（ＳＮＰ：ＱＣ３０）に登録してある健康人の一塩基多型（既知ＳＮＰ）を除去した残りの一塩基多様性配列（ＳＮＶ）、あるいは多塩基多様性配列（ＭＮＶ）を未知ＳＮＶとして、体細胞多重変異の数量化と染色体遺伝子の変異箇所の特定に用いる（ステップＳ２）。このうち、当該遺伝子の構造・機能を転換する疾患性ＳＮＶ（たとえばnon-synonymous mutations）を選択し、がん特異的体細胞変異の候補とする。ただし、ＳＮＶあるいはＭＮＶが塩基配列の付加、欠失であった場合には、リファレンスの塩基をＳＮＶとして体細胞多重変異の数量的指標化に用いる（ステップＳ３）。前記被験者の疾患性ＳＮＶで遺伝子変異地図を作成し（ステップＳ４）、別途、各腫末期がんの当該遺伝子変異地図を作成しておき（ステップＳ５）、末期がんの遺伝子変異地図をがん解析用プラットームにして前記患者の遺伝子変異地図と対比することでがんの診断を行う。
【００２０】
また、前記方法にて作成した被験者の正常組織、および疾患細胞の遺伝子変異地図を対比することにより疾患原因遺伝子パネルを作成し、がん治療法および医薬の開発に用いる。換言すると、本実施形態のがん診断方法は、次世代シーケンサーによって塩基配列データを取得し、読まれた塩基配列を参照配列へ整列し、参照配列との比較によって変異部位を同定し、疾患原因か否かを判断する。
【００２１】
図２は、本発明の一実施形態におけるがん診断装置を示すブロック図である。以下、この図面に基づき説明する。
【００２２】
本実施形態のがん診断装置１０（図２）は、被験者の正常細胞及び疾患細胞の遺伝子の塩基配列ａを入力し、前記正常細胞と前記疾患細胞との塩基配列の差異からＳＮＶを抽出するＳＮＶ抽出手段１１と、前記ＳＮＶをＳＮＰデータベースで照合することにより未知ＳＮＶを同定するがん特異的ＳＮＶ同定手段１２と、前記がん特異的ＳＮＶを疾患性ＳＮＶとして前記患者の遺伝子変異地図を作成する遺伝子変異地図作成手段１３と、末期がんのがん細胞について作成した前記遺伝子変異地図と前記患者の遺伝子変異地図とを対比することにより前記患者のがん体細胞変異を診断し、その診断結果ｂを出力する診断結果出力手段１４を備えたものである。
【００２３】
がん診断装置１０の各手段は、例えばコンピュータ及びそのプログラムによって実現することができる。
【００２４】
本実施形態のがん診断方法及びがん診断装置によれば、全てのがん特異的ＳＮＶを体細胞変異として患者個人の遺伝子変異地図を作成し、これと末期がんの遺伝子変異地図とを対比することにより、詳細にがんの種類や進行状態を把握できるので、患者ごとに的確な診断を下すことができる。
【００２５】
がん、生活習慣病等、ゲノム疾患の病理及び形質発現（phenotype）の形跡は、体細胞変異として発現遺伝子（エクソーム）の塩基配列に刻み込まれている。ただし、塩基配列は人種間及び家系間によって異なる。
【００２６】
本発明者は、同一個体の肝がんアデノーマ患者の正常細胞と疾患細胞のエクソームを増幅し塩基配列を比較した結果、“当該正常細胞の体細胞変異は当該がん細胞に継承されている”こと、“当該アデノーマ特異的体細胞変異が繰返しがん関連遺伝子に刻み込まれている”ことを発見し、体細胞多重変異を数量的指標とするゲノム疾患の診断及び治療法を発明した。
【００２７】
当該発見から得られた見識は、これまで生殖細胞系列で論じられていたダーウィンの「自然淘汰説」を体細胞変異による「がん細胞淘汰説」に転用できることにある。すなわち、「進化論」の核心である“selective mutations in random drift”を がん関連遺伝子の特異的多重変異で説明できる。以下、本実施形態について更に詳しく説明する。
【００２８】
日本人ＢＡＣクローンのショットガンシークエンスを実施しＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen）を含む177,188塩基の配列を決定し（データ不掲載）、これを米国人のドラフトシークエンスと比較した。二つの配列を比較する際に、市販ソフトでは最適整列化（Maximum Alignment）ができず、288カ所7,075塩基のギャップを挿入し人為的に整列化する必要があった。このことから、人種間ゲノム塩基配列、特にゲノムの98％を占めるジャンクＤＮＡの比較は恣意的であり、機械的処理による比較は困難であると判断した。
【００２９】
ただし、全ゲノムの２％を占める転写（エクソーム）領域の60％は、たんぱく質のアミノ酸配列を決める遺伝子（エクソン）領域である。この領域は、人種間でも高いホモロジーがあり、染色体遺伝子のマッピングや相同性遺伝子の同定にも使用されている（図３）。
【００３０】
したがって、エクソンを染色体遺伝子マップの指標にすればエンハンサーやプロモーターを含む転写領域全体も整列化でき、遺伝子転写の調節部位、イントロン等、非コード領域をＳＮＶでマップできる他、疾患ゲノムのエクソンの変異（genotype）よって変性したたんぱく質又は遺伝子機能の変化を、疾患患者の病理形質（phenotype）に照合させれば、原因遺伝子との関係が解る。そこで、肝がんアデノーマ患者の正常細胞をリファレンスに疾患細胞の全エクソーム・リファレンス（ＥｘＲｅｆ）法を実施した。
【００３１】
（１）先天性疾患であれば父母子の家系解析を、がんや生活習慣病などであれば同一個体の正常細胞、および疾患細胞からゲノムＤＮＡを抽出・精製し、遺伝子解析の原材料にする。
【００３２】
（２）断片化した当該ゲノムのＤＮＡを鋳型にアジレント社のSure selectでマルチＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応を行い、全エクソームの増幅を行う。
【００３３】
（３）上記全エクソームの両端から、たとえば100塩基ずつ100回、イルミナ社のHiSec2000次世代シーケンサーで大量のシーケンスデータを得る。
【００３４】
（４）上記シーケンスデータを全ヒトゲノム公用データベース（hg19）のエクソーム領域に整列化し、マルチＰＣＲの誤反応やシーケンサーの「読取りミス」等を取除く。その結果（図５）、前記アデノーマ患者の疾患細胞と正常細胞のＤＮＡからエクソーム約23億塩基配列を決め、約2,200万塩基を整列化した（被覆率約73％）。
【００３５】
（５）ＳＮＰ公用データベース（GTAK1.4-30）を用いてＳＮＶ callingを行い、染色体別ＳＮＶデータベース（Annover）を作成し、既知ＳＮＰと未知ＳＮＶに分類した（図５）。このうち、既知ＳＮＰは前記正常細胞が22,630塩基、および前記アデノーマが18,491塩基であり、両者に共通するＳＮＰは16,260塩基であった。これらは健康人千人に共通する一塩基多型であるので疾患解析の対象からはずし、それ以外の未知ＳＮＶから以下の方法で突然変異領域を検索した。
【００３６】
前記アデノーマ疾患細胞のエクソーム整列化地図から未知ＳＮＶ 42,152塩基を、および前記正常細胞から未知ＳＮＶ 10,757塩基を染色体遺伝子上にマップした。当該未知ＳＮＶの大半はエクソーム非コード領域（non-coding Region）にあった（データ未掲載）。病理機能との関係は複雑であるために以下遺伝子のコード領域（Coding Region）に限定し未知ＳＮＶの遺伝子機能解析を行なった。
【００３７】
上記未知ＳＮＶをヒト全遺伝子22,000にマップし、non-synonymous変異（疾患性ＳＮＶ）による遺伝子機能・構造の転換を調べた。前記アデノーマの未知ＳＮＶから疾患性ＳＮＶ 718塩基を85遺伝子にマップし、前記正常細胞の未知ＳＮＶから疾患性ＳＮＶ 82塩基を68遺伝子にマップした (図５)。前記アデノーマの一遺伝子当りの疾患性ＳＮＶ数の平均値は8.5塩基であり、前記正常細胞の一遺伝子当りの疾患性ＳＮＶ数の平均値は1.2塩基、および両細胞に共通する一遺伝子当りの疾患性ＳＮＶの平均値は1.25塩基であった。また、後述する全synonymous ＳＮＶ数の一遺伝子当りの平均値は2.0塩基であった。前記アデノーマの一遺伝子当りの平均疾患性ＳＮＶ数は、未知ＳＮＶ数全体の一遺伝子当たりの平均値より高く、疾患との関連を示唆した。さらに個々の遺伝子機能と疾患性ＳＮＶとの関係を調べた。
【００３８】
がんマーカーおよびがん関連遺伝子には、現在、約550種類が知られている。いわゆるがん抑制遺伝子、遺伝子転写、細胞周期チェックポイント制御、転写制御因子、ＤＮＡ修復などの遺伝子機能、および組織臓器の構造を維持するタンパク等が関係するが、疾患性ＳＮＶ（non-synonymous変異）の存在は当該遺伝子機能の発現を転換させる。
【００３９】
前記アデノーマ患者の疾患細胞と正常細胞の個別遺伝子に対する疾患性ＳＮＶの影響を比較するために、シーケンス被覆率の高い遺伝子を各細胞単独、および両細胞に共通する遺伝子に分け疾患性ＳＮＶ数をカウントした（図７）。
【００４０】
その結果、がん関連遺伝子、及びマーカーの550種類のうち34遺伝子に、疾患性ＳＮＶ136塩基がマップされた。このうち、両細胞に共通する20種類のがん関連遺伝子に疾患性ＳＮＶ23塩基がマップされたことは、前記正常細胞の体細胞変異が前記アデノーマ遺伝子に継承されたことを示し、前記正常細胞が前がん細胞、あるいはがん幹細胞であることを示唆した。さらに、前記正常細胞の４つのヒト遺伝子にも共通の疾患性ＳＮＶ7塩基が前記アデノーマに継承され、上記両細胞の14のヒト遺伝子に共通のsynonymous ＳＮＶが15塩基マップされたことから確証された（後述）。
【００４１】
疾患性ＳＮＶ159塩基が前記アデノーマのみの31種類の遺伝子に特異的にマップされ、そのうち108塩基が11種類のがん関連遺伝子にあった。そのほとんどが１７番短腕染色体に集中していたが、がん化に重要な役割を果たすＲＡＢＥＰ１、ＴＰ５３、ＧＡＳ７、ＭＡＰ２Ｋ４、ＦＬＣＮ、ＣＹＴＳＢの６つの遺伝子は見当たらなかった。
【００４２】
精査の結果、当該１７番染色体短腕のエクソン被覆率が低く、未知ＳＮＶのカウントから除外されていた（図６）。上記６つのがんマーカー、および関連遺伝子の欠失以外に細胞骨格維持の役割を果たすＳＰＮＳ３やＭＹＨ４とその相同遺伝子に数多くの疾患性ＳＮＶがあり、しかもホモ接合体となっていた（図８）。発見者は、これをがん増殖の遺伝的優位性を持続するために、染色体単位の増幅と体細胞多重変異が進行し、エクソンの基本構造まで破壊したと解釈した。ただし、ＩＬＳ６Ｔ、ＵＳＰ３２、ＦＯＸＯ３等、がんマーカー遺伝子は各染色体に単独に多重変異が進行し、エクソン破壊以前に検知できるがんマーカーであると認知した。
【００４３】
上記正常細胞のみに見られる26遺伝子中、non-synonymous ＳＮＶは35塩基である。多重変異度は低く、ホモ接合体がなかったことから疾患性ＳＮＶとは異なる遺伝子機能があると示唆される。がん増殖と共に消滅した可能性もある。
【００４４】
ＥｘＲｅｆ法では、全エクソーム捕捉試薬や反応条件、解析法により遺伝子被覆率に「ばらつき」やランダム・シーケンスによるバイアスがあるために定量的比較解析はできない。また、がん組織細胞間のゲノムの不均一性により、体細胞変異数の正確な比較は困難である。
【００４５】
図８の斜線をいれたセルは、シーケンスによる被覆率が低いために多重化ができず、未知ＳＮＶのカウントから外された遺伝子である。ただし、被覆率が高い前記アデノーマ疾患細胞の１７番染色体短腕には、ＭＹＨ４とその相同遺伝子、ＳＰＮＳ３など多くの遺伝子に桁はずれの疾患ＳＮＶがあり、正常細胞のリファレンスがなくともがん特異的遺伝子の選択と症状の進行度測定ができることを示している。
【００４６】
なお、synonymous変異は前記正常細胞の未知ＳＮＶに見られるが、遺伝子機能・構造変化への影響は少ない。がん前駆体、あるいは前がん細胞の遺伝子マーカーとして、あるいは乗客型変異の解析に利用できる。他方、前記アデノーマ細胞のsynonymous変異は疾患性ＳＮＶの増加に連動しているために、がんの進行度測定に加えることもできる（図９）。
【００４７】
当該ＥｘＲｅｆ法による体細胞多重変異選択の精度評価とその意義は、まず、前記正常細胞のがん関連遺伝子の疾患性ＳＮＶが1、2塩基であったことと、さらに、生命維持に不可欠であるヒト恒常遺伝子（house-keeping genes）に疾患性ＳＮＶが検出されなかったことであろう（データ不掲載）。即ち、体細胞多重変異はがん細胞の自己増殖を阻止する遺伝子破壊の痕跡であり、疾患性ＳＮＶ数はがん化のパラメーターとなる。
【００４８】
図５では、上記正常細胞の未知ＳＮＶは1,553塩基に一塩基、上記がん細胞の未知ＳＮＶは471塩基に一塩基もあった。このような大量の変異は細胞複製毎におこる1/500のランダムなミスコピーから発生したと推定され、その内がん細胞にとって遺伝的優位性のある変異が繰返し特定遺伝子に蓄積し、正常細胞の増殖を凌駕したと解釈できる。これに基づき体細胞多重変異による「がん細胞淘汰説」を提唱した（図１０）。すなわち、生殖細胞系列で論じられていたダーウィンの「自然淘汰説」“selective mutations in random drift”を がん関連遺伝子の特異的多重変異に置換え、がん増殖の遺伝的優位性を保つと解釈する。
【００４９】
本説に従えば、がん、生活習慣病等は体細胞変異により誘発されるが、変異の遺伝子への取り込みと病状の進行度の関係は細胞の生活環に関係する（図１０）。すなわち、胚発生までは生殖系列を守る保守型変異であり、以後、細胞分化及び恒常性維持のために未知ＳＮＶは緩やかに働き乗客型変異としてゲノムに微量に蓄積される。しかし、初期がん突入後は、がんの遺伝的優位性を目標にした運転手型変異に切換られ、特定遺伝子の多重変異は加速される。ついには、周辺組織・臓器の秩序を破壊する暴走変異（kataegis mutations）を誘発し、進行性がんになる。これらの記録は末期がんの疾患性遺伝子に多重変異として刻みこまれているため、各末期がん腫の遺伝子変異地図はがん遺伝子解析のプラットフォームになる。
【００５０】
今日、がん等のゲノム疾患は発症の組織臓器、悪性度等の症状など様々な表現型（phenotype）で多数分類されているが、アデノーマの体細胞多重変異が関係するがん関連遺伝子は550中、わずか53に集約された（図１１）。このことから末期がん腫の遺伝子型（genotype）は限定された体細胞変異地図になり、がんゲノム解析のプラットフォームとして、がん腫識別、再発、進行度など定性・定量的指針（ナビゲーション）ができると予想できる。試料収集の解析方法、及びデータベース化とデータ項目を表１に示す。末期がんプラットフォーム作成のためのフォーマットとデータ項目を図１２に示す。
【００５１】
がんナビでデータベース化するデータ項目
各症例がん組織ＤＮＡ
↓次世代ＤＮＡシーケンサー
大量の変異データ
＋正常人塩基配列データベース
＋他のがん組織ＤＮＡの変異データ
ＤＢ−１．がん特異性変異分類ＤＢ
１ａ．症例特異的変異
１ｂ．がん腫タイプに共通する特異的変異
１ｃ．複数のタイプのがん腫に共通する変異
ＤＢ−２．各症例保有変異ＤＢ（Non-synonymous Mutations）
２ａ．ゲノム上の位置
２ｂ．所属する遺伝子、エクソン
２ｃ．変異タイプ（ミスセンス、ナンセンス、欠失等）
２ｄ．がん特異性変異分類（ＤＢ−１より）
２ｅ．タンパク質機能ドメインと変異の影響
２ｆ．他生物相同遺伝子との比較ゲノム情報
２ｇ．PolyPhen2、SIFT等による変異評価結果
ＤＢ−３．症例ＤＢ
３ａ．性別、年齢（発症時、摘出時）、家族歴
３ｂ．がん腫由来臓器・組織、原発／転移、転帰
３ｃ．組織像（ＨＥ、抗体染色等画像）、ステージ分類
３ｄ．特記事項（特徴的症状等）
【００５２】
図１２に染色体画像診断機器「がんナビ」による画面表示、図１４に臨床現場の遺伝子診断を図示した。この解析基盤（プラットフォーム）をつくるために、まず、ＥｘＲｅｆ法による各腫末期がんによる体細胞変異地図作成（図１３）とがん特異的遺伝子のスクリーニングが必要である（図１１）。
【００５３】
一旦、プラットフォームが整備されれば、正常細胞のリファレンス抜きで “定量的かつ安価ながん遺伝子診断”体制が築かれる。その結果、患者の各遺伝子の体細胞多重変異数が染色体にマップされ、画面表示された遺伝子をクリックすればプロフィールがわかり、ガン診断・治療の情報が得られる。
【００５４】
その他、各遺伝子の体細胞変異プロフィール（genotype）は、がん遺伝子代謝経路を示し、遺伝子創薬、治療やサプリメント作成等の研究基盤を提供する。また、腹水や血漿ｃｔＤＮＡに基づき、がんの再発や予防診断も行うことができる。
【００５５】
本発明の実用化により、内なる敵「がん」との闘いは疾患組織を完全に排除する外科的治療法のみでなく、遺伝子診断による日本人個別化医療への道を開く。
【００５６】
以上、本発明を上記実施形態に即して説明したが、本発明は、上記実施形態の構成や動作にのみ限定されるものではなく、本発明の範囲内で当業者であればなし得ることが可能な各種変形及び修正を含むことはもちろんである。
【００５７】
上記の実施形態の一部又は全部は以下の付記のようにも記載され得るが、本発明は以下の構成に限定されるものではない。
【００５８】
（付記１）同一個体の正常細胞とがん等疾患細胞の遺伝子（エクソーム）の塩基配列（シーケンス）からＳＮＶ（ＱＣ３０）を抽出し染色体遺伝子にマップし、体細胞変異の数量化指標とする。このうち、正常細胞の遺伝子の機能を損傷し、あるいは構造変化を誘導する疾患性ＳＮＶを体細胞多重変異（図１１）として遺伝子変異地図（図１３）を作成する方法。
【００５９】
（付記２）このうち、末期症状を示す疾患遺伝子と体細胞変異をマップした遺伝子変異地図をプラットフォームにし、患者試料の体細胞多重変異の推移から病種の識別、進行性・転移性、あるいは遺伝子代謝経路（カスケード）を推定する診断・治療に供すること。
【００６０】
（付記３）体細胞変異と疾患遺伝子のプロフィール（genotype）から遺伝子診断試薬、創薬、治療やサプリメントの設計、作製に用いること。
【００６１】
（付記４）診断・治療に資するために体細胞変異とその遺伝子プロフィールを染色体別に画像表示したコンピュータ機器を医療機器にすること。
【００６２】
（付記１１）  患者の正常細胞及びがん細胞の遺伝子の塩基配列を取得し、
前記正常細胞と前記がん細胞との塩基配列の差異から前記がん細胞のＳＮＶを抽出し、
前記ＳＮＶをＳＮＶデータベースで照合することによりがん特異的ＳＮＶを同定し、
前記がん特異的ＳＮＶを体細胞変異として前記患者の遺伝子変異地図を作成し、
別途、末期がんのがん細胞について前記遺伝子変異地図を作成しておき、
この末期がんの遺伝子変異地図と前記患者の遺伝子変異地図とを対比することにより、前記患者のがんを診断する、がん診断方法。
【００６３】
（付記１２）付記１１記載のがん診断方法において得られた診断結果に基づき、前記がんの医薬を開発する、
がん医薬開発方法。
【００６４】
（付記１３）患者の正常細胞及びがん細胞の遺伝子の塩基配列を入力し、前記正常細胞と前記がん細胞との塩基配列の差異から前記がん細胞のＳＮＶを抽出するＳＮＶ抽出手段と、
前記ＳＮＶをＳＮＶデータベースで照合することによりがん特異的ＳＮＶを同定手段と、
前記がん特異的ＳＮＶを体細胞変異として前記患者の遺伝子変異地図を作成する遺伝子変異地図作成手段と、
末期がんのがん細胞について作成した前記遺伝子変異地図と前記患者の遺伝子変異地図とを対比することにより前記患者のがんを診断し、その診断結果を出力する診断結果出力手段と、
を備えたがん診断装置。
【００６５】
本発明は次のように要約することができる。
【００６６】
がん、生活習慣病等のゲノム疾患の病理及び形質発現（phenotype）の足跡は、体細胞変異のシナリオとして遺伝子（エクソーム）に刻まれている。ただし、原シナリオは、人種間及び家系間により異なり、また、加齢や生活習慣等の環境の変化に対応し書き加えられていることを発見し、染色体遺伝子の体細胞多重変異を一塩基多様性（ＳＮＶ）で数量的指標とする診断、及び治療法を発案した。
【００６７】
すなわち、本発明者は、同一個体の肝がんアデノーマ患者の正常細胞とがん細胞のエクソームを増幅し、塩基配列を比較した結果、“当該正常細胞の体細胞変異は当該がん細胞に継承されている”こと、および“当該がん細胞では当該正常細胞にない特異的体細胞変異（疾患性ＳＮＶ）が繰返しがん関連遺伝子に刻み込まれている”ことを発見し、“がん細胞では体細胞多重変異により遺伝的優位性を確保している”と解釈し、がん細胞淘汰説に基づく診断及び治療法を開発した。
【００６８】
［課題］ただし、ヒトゲノム30億塩基中から一塩基の差を見分ける現全エクソーム法では、エクソン濃縮反応の「ばらつき」や次世代シーケンサーの膨大な「読取りミス」があり、これらを排除する技術的障害があった。さらに、人種間、個体間には疾患病理と直接関係しないゲノム多型があり、また個体内の組織・細胞内でもゲノムの不均一性など、体質や遺伝子機能・構造への影響など細胞遺伝学的課題があった。更に、当該の課題を解決した後に疫学的病理形質と整合性のある遺伝子診断・治療法の開発が残されている。
【００６９】
［解決手段］被験者のがん細胞・組織、及び正常細胞・組織から大量のゲノム塩基配列を取得し、ゲノムデータベースと照合することにより染色体にマップした遺伝子整列化地図を作成する（ステップＳ１）。次に、当該整列化地図から一塩基多型データベース（ＳＮＰ：ＱＣ３０）に登録してある健康人の一塩基多型（既知ＳＮＰ）を除外した残りの一塩基多様性配列（ＳＮＶ）、あるいは多塩基多様性配列（ＭＮＶ）を、未知ＳＮＶとして体細胞多重変異の数量化と染色体遺伝子のランドマークにする（ステップＳ２）。このうち、がん関連遺伝子の構造・機能を転換するnon-synonymous変異を選択し、がん特異的体細胞変異の候補とする。ただし、当該ＳＮＶ、あるいはＭＮＶに塩基配列の付加、欠失がある場合には、相補塩基を体細胞多重変異の数量的指標に用いる（ステップＳ３）。当該non-synonymousＳＮＶによる前記被験者の遺伝子変異地図を作成し（ステップＳ４）、別途、末期がんのがん細胞について前記遺伝子変異地図を作成しておき（ステップＳ５）、この末期がんの遺伝子変異地図と前記患者の遺伝子変異地図とを対比することにより、前記患者のがんを診断する（ステップＳ６）。
【００７０】
また、前記方法にて作成したがん患者の正常組織・細胞およびがん組織・細胞の遺伝子変異地図を対比することにより、がん原因遺伝子テストパネルを提供し、治療法および医薬の開発に貢献する。
【００７１】
換言すると、本発明（がんナビ）は、本発明者による以下５点の発見に基づいてなされたものであり、がん細胞淘汰説に進歩性が認められる。
【００７２】
１）正常細胞でおこった多くの体細胞突然変異が末期がんまで継承されていたこと。
（がん体細胞変異説＞＞がん幹細胞説）。
２）がん化に伴い特定遺伝子に体細胞変異が繰返し蓄積し，末期がんまで継続すること。
「体細胞多重変異によるがん細胞淘汰説」
３）特定遺伝子の体細胞多重変異をがん特異的ＳＮＶとして数量的指標にする。
（がん診断）
４）このために各腫末期がんが、がん解析のプラットフォームになる、
５）各遺伝子に数量化した体細胞多重変異を付記しがんナビにする。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、人間から採取したもの（例：血液、尿、皮膚、髪の毛、細胞、組織）を処理する方法、又はこれを分析するなどして各種データを収集する方法に属することから、産業上利用することができる発明である。
【符号の説明】
【００７４】
１０  がん診断装置
１１  ＳＮＶ抽出手段
１２  がん特異的ＳＮＶ同定手段
１３  遺伝子変異地図作成手段
１４  診断結果出力手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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