(57)【要約】【課題】本発明の目的は、microRNAを利用して大腸癌を治療でき、且つ癌転移等を抑制して予後を良好にできる大腸癌治療技術を確立することである。【解決手段】microRNAを炭酸アパタイトと共に複合化した複合粒子を投与することにより、in vivoで大腸癌細胞の増殖を抑制でき、効果的に抗腫瘍効果を発揮できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とする、大腸癌の治療剤。
【請求項２】
炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が50nm以下である、請求項１に記載の大腸癌の治療剤。
【請求項３】
骨髄中遊離癌細胞が認められ、且つ当該骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340が低発現している大腸癌患者に対して投与される、請求項１又は２に記載の大腸癌の治療剤。
【請求項４】
miR-340の発現量が低下している大腸癌細胞を有する大腸癌患者に対して、大腸癌の切除後に投与される、請求項１又は２に記載の大腸癌の治療剤。
【請求項５】
miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とする、大腸癌患者における癌転移の予防剤。
【請求項６】
miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とする、大腸癌の切除後の患者における予後の改善剤。
【請求項７】
大腸癌患者の骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340の発現量を検出することを特徴とする、大腸癌患者における肝への癌転移の検査方法。
【請求項８】
大腸癌患者の大腸癌細胞におけるmiR-340の発現量を検出することを特徴とする、大腸癌患者の予後の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、miR-340を用いた大腸癌の治療剤に関する。より詳細には、本発明は、大腸癌を治療でき、しかも癌転移等を抑制して予後を良好にできる大腸癌の治療剤に関する。更に、本発明は、miR-340をマーカーとして使用した、腸癌患者における肝への癌転移の検査方法、及び大腸癌患者の予後の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌転移機構において骨髄を介した転移機構が注目されており、様々な癌種において、骨髄中の癌細胞の有無が予後や再発と関連しているという報告が多数なされている。推測される骨髄を介した転移メカニズムとしては、原発巣の癌細胞が骨髄にホーミング（homing）し、そこで休眠状態（dormant）となって薬剤耐性を獲得するという説や、ホーミングした骨髄中で転移能を獲得し肝臓等の他臓器に転移するという説が考えられている。しかしながら、詳細な癌転移機構、骨髄中の癌細胞の性質変化、担癌状態における宿主骨髄細胞自体の性質変化等については、未だ研究段階にあり、報告は殆ど認められない。一方、大腸癌は、かつて欧米において多く認められる癌であったが、生活の習慣の欧米化に伴って、我が国においても、癌患者の中で３番目に罹患者数が多い癌疾患になっている。また、大腸癌では、肝や肺等への癌転移を生じさせ易く、制御不能になった転移巣が死亡原因になる割合が高いため、大腸癌の治療には、転移抑制等の予後を視野に入れた治療方策を確立することが重要になっている。
【０００３】
一方、microRNAは、体内に存在している22塩基程度の短鎖RNAであり、遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしており、遺伝子発現の異常が一因となっている種々の疾患の治療薬や予後マーカーとしての利用が期待されている。特に、担癌状態で発現低下するmicroRNAを補充する癌治療法は、元来非担癌状態で体内に存在していたmicroRNAを投与することになり、副作用が少ないことは動物実験でも報告されており（例えば、非特許文献１参照）、ヒトへの応用が強く期待されている。
【０００４】
これまでに、大腸癌との関連性を示すmicroRNAについては種々検討されている。例えば、miR-340は、in vitroにおいて大腸癌細胞の増殖を抑制できること（非特許文献２参照）、大腸癌の診断マーカーとして使用し得ること（特許文献１参照）等が報告されている。このように、miR-340を含めて複数のmicroRNAについて大腸癌との関連性を示すことが報告されている。しかしながら、大腸癌患者の骨髄中遊離癌細胞の遺伝子発現や、大腸癌患者の予後と遺伝子発現との関係については解析されておらず、大腸癌の転移等の予後に重要な役割を担うmicroRNAについては同定されていない。そのため、大腸癌との関連性を示すmicroRNAの候補の中で、どのようなmicroRNAを選択すれば、大腸癌を治療でき且つ転移抑制等の予後が良好になる大腸癌治療を確立できるかについては明らかにされていない。
【０００５】
また、microRNAを用いた癌治療の実用化において最も成否を握るのが生体へのドラックデリバリーシステム(DDS)である。microRNAは、22塩基程度の短鎖RNA分子であるため、生体内でRNase等の作用によって分解され易く、しかも腫瘍細胞に対する特異的な認識能を備えていないため、単にmicroRNAを生体内に投与するだけでは、生体内で当該microRNAが腫瘍細胞に集積できず、当該microRNAの作用を有効に発揮できない。そのため、microRNAを用いた癌治療には、投与されたmicroRNAを腫瘍細胞に集積させるDDS技術の確立が不可欠となっている。本発明者等は、ポリヌクレオチドを腫瘍細胞に特異的に集積・導入させるDDSとして、腫瘍細胞内に導入させるポリヌクレオチドを炭酸アパタイトと共に複合化した複合体粒子が有効であることを報告している（非特許文献３参照）。しかしながら、当該DDS技術を、大腸癌の治療に適用させる技術については未だ検討されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Research 14, 70(1): 5923-5930, 2010
【非特許文献２】Oncol. Rep., 28(4): 1346-1352, 2012
【非特許文献３】Plos One 5, 376(1): 87-94, 2013
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第2008/096084号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、microRNAを利用して大腸癌を治療でき、且つ癌転移等を抑制して予後を良好にできる大腸癌治療技術を確立することである。また、本発明の他の目的は、腸癌患者における肝への癌転移の検査方法、及び大腸癌患者の予後の予測方法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決すべく、先ず、大腸癌肝転移患者及び大腸癌非肝転移患者において、骨髄中遊離癌細胞のmicroRNA発現を網羅的に比較検討したところ、miR-340は大腸癌肝転移患者の骨髄中遊離癌細胞において発現が低下していることを見出した。即ち、miR-340の発現低下が、大腸癌の転移に関与している可能性が高いことを突き止めた。また、本発明者は、miR-340について大腸癌患者からの切除組織における発現を確認したところ、miR-340低発現の症例群では、miR-340高発現の症例群に比べて予後が悪いことを見出した。即ち、miR-340の発現が低下している大腸癌細胞を有する大腸癌患者は、大腸癌の外科的治療後の予後が悪くなることを突き止めた。これらの知見に基づき、大腸癌の転移を抑制したり、大腸癌の術後の予後を良好にしたりするには、miR-340の補充療法が有効になることを見出した。
【００１０】
更に、本発明者は、microRNAを炭酸アパタイトと共に複合化した複合粒子を投与することにより、in vivoで大腸癌細胞の増殖を抑制でき、効果的に抗腫瘍効果を発揮できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とする、大腸癌の治療剤。
項２．  炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が50nm以下である、項１に記載の大腸癌の治療剤。
項３．  骨髄中遊離癌細胞が認められ、且つ当該骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340が低発現している大腸癌患者に対して投与される、項１又は２に記載の大腸癌の治療剤。
項４．  miR-340の発現量が低下している大腸癌細胞を有する大腸癌患者に対して、大腸癌の切除後に投与される、項１又は２に記載の大腸癌の治療剤。
項５．  miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とする、大腸癌患者における癌転移の予防剤。
項６．  miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とする、大腸癌の切除後の患者における予後の改善剤。
項７．  大腸癌患者の骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340の発現量を検出することを特徴とする、大腸癌患者における肝への癌転移の検査方法。
項８．  大腸癌患者の大腸癌細胞におけるmiR-340の発現量を検出することを特徴とする、大腸癌患者の予後の予測方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の大腸癌の治療剤によれば、miR-340を使用することにより、大腸癌細胞の増殖を抑制しつつ、大腸癌の転移も抑制できるので、予後が良好な大腸癌の治療を行うことが可能になる。更に、本発明の大腸癌の治療剤は、miR-340を炭酸アパタイトに複合化した複合粒子を使用することにより、生体内に投与されたmiR-340を大腸癌細胞に集積させて当該細胞内に効率的に移行させることができるので、大腸癌治療を実用化する上で求められるDDS技術も備えており、臨床上の有用性が極めて高い。
【００１３】
また、本発明の癌転移の検査方法によれば、骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340発現量を指標とすることにより、大腸癌患者において、肝への癌転移が生じているか、又は肝への癌転移リスクが高いかを推測することができるので、肝への癌転移のリスクが高い大腸癌患者を早期に特定して、適切な処置を施すことが可能になる。
【００１４】
更に、本発明の大腸癌患者の予後の予測方法によれば、大腸癌細胞おけるmiR-340発現量を指標とすることにより、大腸癌の外科的手術後に、予後が悪化し易いか否かを推測することができるので、予後の悪化のリスクが高い術後大腸癌患者に対して、早期に適切な処置を施すことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】試験例１において、全骨髄細胞（BM1）からCD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）を得た細胞選別フローを示す図である。
【図２】試験例１において、CD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）におけるE-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CEA及びMYCのmRNA量を測定した結果を示す図である。図２中、CD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）における各mRNA量の発現量は、BM2（単球系（毛球形）細胞）における各mRNA量の発現量に対する相対的発現比率として示している。
【図３】試験例１において、CD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）について、EpCAM、DAPI、及びcytokeratinの免疫染色を行った結果を示す図である。
【図４】試験例２において、In vitroでの大腸癌細胞株HCT116株及びSW480株に対して、pre-miR-340で処理した条件（図中、「pre-miR-340」と表記）、Pre-miR negative controlで処理した条件（図中、「Pre-miR negative control」と表記）、及び未処理の条件（図中、「Parent」と表記）で、細胞増殖を測定した結果を示す図である。
【図５】試験例３において、大腸癌細胞と正常粘膜細胞におけるmiR-340の発現量を比較した結果を示す図である。図５中、miR-340発現量は、RNU6Bの発現量に対する相対的発現比率として示している。
【図６】試験例４において、miR-340高発現群とmiR-340低発現群に分けて、５年無病生存率と５年総生存率をまとめた結果を示す図である。
【図７】試験例５において、pre-miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を含む製剤で処理した条件（図中、「pre-miR-340」と表記）、Pre-miR negative controlと炭酸アパタイト粒子を含む製剤で処理した条件（図中、「Pre-miR negative control」と表記）、及び未処理の条件（図中、「Parent」と表記）で、in vivoでの大腸癌の治療効果を評価した結果である。Ａは、腫瘍の容量の経時的変化を示しており、Ａ中の矢印は、各製剤を投与した時点を示している。Ｂは、HCT116細胞の投与から３６日後のヌードマウスの背部を撮影した写真を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．大腸癌の治療剤
本発明の大腸癌の治療剤は、miR-340が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の大腸癌の治療剤について詳述
する。
【００１７】
miR-340
本発明で使用されるmiR-340は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、大腸癌細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、本発明で使用されるmiR-340は、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、大腸癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。
【００１８】
本発明で使用されるmiR-340の由来については、適用対象となる動物の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、ヒトの大腸癌の治療に使用する場合であれば、ヒト由来のmiR-340を使用すればよい。本発明で使用されるヒト由来のmiR-340としては、具体的には、以下に示す成熟型has-miR-340が挙げられる。
成熟型has-miR-340（sense）; 5′-UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU-3（配列番号１）
成熟型has-miR-340（antisense）；5′- AAUCAGUCUCAUUGCUUUAUAA-3′（配列番号２）
【００１９】
炭酸アパタイト粒子
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）の水酸基の一部をCO3で置換した構造を有し、一般式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYnで表される化合物である。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換し得る元素であり、例えば、Sr、Mn、希土類元素等が挙げられる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる基又は元素であり、OH、F、Cl等が挙げられる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
【００２０】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径については、生体内に投与されて、大腸癌細胞内へ移行できる程度の大きさである限り、特に制限されないが、生体内で大腸癌細胞に集積させて大腸癌細胞内への移行を効率的に行うという観点から、通常50nm以下、好ましくは1〜40nm、更に好ましくは1〜20nm、より好ましくは5〜10nmが挙げられる。
【００２１】
なお、前記の炭酸アパタイトの平均粒子径は、走査型プローブ顕微鏡を用いて観察することにより測定される値である。走査型プローブ顕微鏡による粒子径の測定に際して、測定部位をＣＣＤカメラで確認し、明らかに走査型プローブ顕微鏡を用いた測定に適さない巨大な粒子（例えば、粒径5μｍ以上）が存在する場合は、それらは測定対象範囲から除去される。また、本明細書において、粒径とは、走査型プローブ顕微鏡で測定した際に、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を意味する。よって、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。
【００２２】
炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることができる。例えば、水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを共存させることによって調製することにより得ることができる。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
【００２３】
水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００２４】
水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００２５】
水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常1.0〜10000mM、好ましくは5〜1000mM、更に好ましくは10〜100mMが挙げられる。
【００２６】
カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源としては、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの水溶性塩が挙げられる。具体的には、カルシウムイオン源としてＣａＣｌ2を用いることができ、リン酸イオン源としてＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを用いることができ、炭酸イオン源としてＮａＨＣＯ3を用いることができる。
【００２７】
炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるＣａまたはＣＯ3を部分的に置換してもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎの添加量は、形成される複合体粒子のｐＨ溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、基剤として水を使用すればよいが、細胞培養用の各種培地やバッファー等を使用してもよい。
【００２８】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の調製において、水溶液中への各イオン供給源及び他の物質の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び他の物質を含有する第１の溶液を調製すると共に、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液を調製し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して水溶液を調製することができる。
【００２９】
炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のｐＨを6.0〜9.0の範囲に調整し、一定時間放置（インキュベート）することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨとしては、例えば7.0〜8.5、好ましくは７．１〜8.5、更に好ましくは7.2〜8.5、より更に好ましくは7.3〜8.5、特に好ましくは7.4〜8.5、最も好ましくは7.5〜8.0が挙げられる。
【００３０】
炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常10℃以上であり、好ましくは25〜80℃、更に好ましくは37〜70℃以上が挙げられる。
【００３１】
炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液のインキュベート時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常1分〜24時間、好ましくは10分〜1時間が挙げられる。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
【００３２】
また、炭酸アパタイト粒子の平均粒径を50nm以下に制御する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記の水溶液中で形成した炭酸アパタイト粒子を超音波振動処理する方法が挙げられる。ここで、超音波振動処理とは、いわゆる菌体破砕等に用いられる超音波破砕機やホモジナイザー等の超音波振動子を直接試料に接触させて超音波をかける処理ではなく、一般に精密機器や試験管等の洗浄に用いられる超音波振動子と洗浄槽とが一体となった超音波洗浄器を用いた処理である。超音波洗浄器の洗浄槽（水槽）に液体（例えば、水）を入れ、そこに炭酸アパタイト粒子を収容した容器（例えば、プラスチック製のチューブ）を浮かべ、精密機器を洗浄する要領で液体を介して炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に超音波をかける処理を意味する。これによって、簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子の粒径を50nm以下に微細化することができる。
【００３３】
超音波振動処理に使用可能な装置は、上記超音波洗浄器のように、水などの溶媒を介して間接的に炭酸アパタイト粒子を収容した容器に超音波振動を与えることが可能であるものであれば特に制限されない。汎用性及び取り扱い性の良さという観点から、超音波振動子及び恒温槽を備えた超音波洗浄器を用いることが好ましい。
【００３４】
上記の超音波振動処理の条件は、粒子径を所定範囲に制御可能である限り特に制限されない。例えば、水槽の温度としては、5〜45℃の温度から適宜選択することができ、好ましくは10〜35℃、更に好ましくは20〜30℃が挙げられる。超音波振動処理の高周波出力としては、例えば、10〜500Ｗの範囲で適宜設定することができ、好ましくは20〜400Ｗ、更に好ましくは30〜300Ｗであり、より好ましくは40〜100Ｗが挙げられる。発振周波数としては、通常10〜60Ｈｚ、好ましくは20〜50Ｈｚ、更に好ましくは30〜40Ｈｚである。また、超音波振動処理時間としては、例えば、30秒〜30分、好ましくは1〜20分、更に好ましくは3〜10分が挙げられる。
【００３５】
超音波振動処理を行う際に用いる、炭酸アパタイト粒子を包含する容器の種類は、粒子を所定の粒子径範囲に微細化することが可能である限り制限されず、水溶液の容量や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、1〜1000ml容量のプラスチック製チューブを用いることができる。
【００３６】
また、超音波振動処理は、アルブミンの存在下（即ち、アルブミンを炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に添加した状態）で行うことが好ましい。これは、アルブミンと炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。炭酸アパタイト粒子を含む水溶液中でのアルブミンの濃度としては、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、0.1〜500mg/ml、好ましくは1〜100mg/ml、更に好ましくは1〜10mg/ml程度添加することができる。
【００３７】
miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子
本発明の大腸癌の治療剤では、前記miR-340と炭酸アパタイト粒子が複合化した複合粒子を使用する。このようにmiR-340を炭酸アパタイト粒子に複合化させることによって、炭酸アパタイトの作用によって生体内でmiR-340を大腸癌細胞に効率的に集積させて、大腸癌細胞内にmiR-340を導入させることが可能になる。また、細胞内に導入された後に、細胞内でmiR-340が炭酸アパタイト粒子から遊離できるので、miR-340に所望の活性を発揮させることも可能になる。
【００３８】
本発明において、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子とは、miR-340が炭酸アパタイト粒子に対してイオン結合、水素結合等によって吸着して担持された状態を指す。miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成方法については、特に制限されないが、例えば、miR-340と炭酸アパタイト粒子を水溶液中で共存させることにより形成する方法；炭酸アパタイト粒子を調製する水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンと共に、miR-340を共存させることにより、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-340と炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う方法等が挙げられる。
【００３９】
miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成を、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-340と炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う場合、炭酸アパタイトの調製に使用される水溶液中にmiR-340を、例えば0.1〜1000nM、好ましくは0.5〜500nM、更に好ましくは1〜200nMとなるように添加すればよい。
【００４０】
miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子において、miR-340と炭酸アパタイト粒子の比率については特に制限されず、miR-340の投与量等に応じて適宜設定すればよい。例えば、2mgのmiR-340を炭酸アパタイト粒子に複合化させる場合、前述する炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液1Lに、5mgのmiR-340を添加して、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-340と炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行えばよい。
【００４１】
また、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子には、本発明の効果を損なわないことを限度として、他の抗癌剤等の薬剤を担持させていてもよい。このような抗癌剤としては、特に制限されないが、例えば、シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤；ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンD、ブレオマシイン塩酸塩、プペロマシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセル等の微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤、プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド、サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド、プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブ等が挙げられる。これらの抗癌剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
また、本発明の大腸癌の治療剤は、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を生体への投与に適した溶媒中に分散した状態で使用される。前述するように、炭酸アパタイト粒子は、各種のイオン供給源となる物質を水、培地、又はバッファー等の溶媒に溶解させることによって得られるが、そのようにして得られる炭酸アパタイト粒子分散溶液は、浸透圧、緩衝能、無菌性等の観点から必ずしも生体への投与（血管内投与）に適していない。よって、炭酸アパタイト粒子が分散した溶媒を生体への投与に適した溶媒（例えば、生理食塩水等）に置換するためには、通常、遠沈によって炭酸アパタイト粒子を溶媒から分離し、回収して溶媒を置き換える操作が必要である。しかしながら、このような操作を行うと炭酸アパタイト粒子同士が凝集し、粒子が巨大化するため、却って生体への投与には適さない状態へと変化してしまう。そこで、凝集した炭酸アパタイト粒子を生体への投与に適した溶媒に添加した上で、前述する超音波振動処理を行うことにより、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子が、生体への投与に適した溶媒中で適度な粒子径（好ましくは平均粒径が50nm以下）で分散させることができる。
【００４３】
適用対象疾患、用量、用法等
本発明の大腸癌の治療剤は、大腸癌の治療を目的として大腸癌患者に適用される。また、本発明の大腸癌の治療剤は、大腸癌患者における癌転移の予防剤（特に、肝への転移予防剤）として使用してもよい。更に、本発明の大腸癌の治療剤は、大腸癌患者から大腸癌を摘出した後に、再発や転移を予防する目的で投与してもよく、大腸癌の切除後の患者における予後の改善剤又は癌の転移予防剤（特に、肝への転移予防剤）としても使用することができる。
【００４４】
また、後述する試験例１に示すように、本発明者によって、骨髄中遊離癌細胞が認められ、且つ当該骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340が低発現している大腸癌患者は、肝への癌転移が生じ易いことが解明されている。従って、本発明の大腸癌の治療剤は、骨髄中遊離癌細胞が認められ、且つ当該骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340が低発現している大腸癌患者に対して投与することにより、miR-340の補充療法によって大腸癌患の治療及び肝への移転抑制を効果的に行うことが可能になる。
【００４５】
骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340が低発現になっているか否かは、肝非転移大腸癌患者から得られた骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340（以下、「肝非転移骨髄中遊離癌細miR-340」と表記することもある）の発現量を予め測定しておき、大腸癌患者から得られた骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340量と、肝非転移骨髄中遊離癌細胞miR-340量を比較することにより行われる。大腸癌患者から得られた骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340量が、肝非転移骨髄中遊離癌細胞miR-340量に比べて低い場合、特に１／２程度以下、１／４程度以下、又は１／７．５程度以下になっている場合、当該大腸癌患者は、肝への転移が生じているか、生じやすい状態になっていると推測され、本発明の大腸癌の治療剤の投与によるmiR-340の補充療法が有効になる。
【００４６】
骨髄中遊離癌細胞のmiR-34量の測定は、従来公知の方法に従って行うことができる。例えば、大腸癌患者の骨髄から骨髄中遊離癌細胞を公知の手法に従って分離し、当該骨髄中遊離癌細胞からグアニジン−塩化セシウム超遠心法、酸性グアニジン−フェノール−クロロホルム（AGPC）法等によってＲＮＡ試料を得て、miR-34量の測定を行えばよい。miR-34量の測定方法についえは、特に制限されないが、例えばマイクロアレイ法、RT-PCＲ法、リアルタイムRT-PCR法、ノーザンブロット法等が挙げられる。
【００４７】
また、後述する試験例４に示すように、本発明者によって、miR-340の発現量が低下している大腸癌細胞を有する大腸癌患者は、大腸癌の切除後に予後が悪化し易い傾向があることが解明されている。従って、本発明の大腸癌の治療剤は、iR-340の発現量が低下している大腸癌細胞を有する大腸癌患者に対して、大腸癌の切除後に投与することにより、miR-340の補充療法によって予後の悪化を効果的に抑制することもできる。
【００４８】
大腸癌細胞においてmiR-340が低発現になっているか否かは、予後が良好であった大腸癌患者由来の大腸癌細胞におけるmiR-340の発現量の平均値（以下、「予後良好群miR-340量平均値」と表記することもある）を予め測定しておき、大腸癌患者から摘出された大腸癌組織の大腸癌細胞におけるmiR-340量と、大腸癌細胞miR-340量平均値を比較することにより行われる。大腸癌患者から得られた大腸癌細胞におけるmiR-340量が、予後良好群miR-340量平均値に比べて低い場合、特に、１／１．２程度以下、１／２程度以下、又は１／３程度以下になっている場合、当該大腸癌患者は、術後の予後が悪化し易いと推測され、本発明の大腸癌の治療剤の投与によるmiR-340の補充療法が有効になる。
【００４９】
大腸癌細胞におけるmiR-34量の測定は、従来公知の方法に従って行うことができる。例えば、切除した大腸癌組織から大腸癌細胞を公知の手法に従って分離し、当該大腸癌細胞から、骨髄中遊離癌細胞の場合と同様の方法でＲＮＡ試料の作製、miR-34量の測定を行えばよい。
【００５０】
本発明の大腸癌の治療剤の投与方法としては、本発明の大腸癌の治療剤を生体内で大腸癌にデリバリーできることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００５１】
本発明の大腸癌の治療剤の投与量は、患者の症状の程度、患者の性別、年齢等に応じて適宜設定されるため、一律に規定することはできないが、例えば、miR-340の重量換算で１日当たり１５〜７０ｍｇ／ｍ2（体表面積）程度が挙げられる。
【００５２】
また、前述するように、本発明で使用される炭酸アパタイト粒子は、平均粒径が50nm以下である場合に、生体内で大腸癌細胞に集積させて大腸癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、本発明の大腸癌の治療剤の投与は、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を超音波振動処理によって微小な粒子の状態で分散させた後に、当該粒子が凝集する前に速やかに行うことが望ましい。例えば、超音波振動処理後１分以内、好ましくは３０秒以内の投与が好適である。但し、前述するように、アルブミンを添加することによって炭酸アパタイト粒子の凝集を抑制する場合は、超音波振動処理後、数分〜数十分経過後に投与することも可能である。
【００５３】
２．大腸癌患者における肝への癌転移の検査方法
後述する試験例１に示すように、骨髄中遊離癌細胞が認められ、且つ当該骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340が低発現している大腸癌患者は、肝への癌転移が生じ易いことが明らかにされている。従って、本発明は、更に、大腸癌患者の骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340の発現量を検出することを特徴とする、大腸癌患者における肝への癌転移の検査方法を提供する。当該検査方法においてmiR-340の発現量が低下していれば、肝への癌転移が生じているか、肝への癌転移リスクが高いと予測される。
【００５４】
骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340の発現量が低下しているか否かは、肝非転移大腸癌患者から得られた骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340（以下、「肝非転移骨髄中遊離癌細miR-340」と表記することもある）の発現量を予め測定しておき、大腸癌患者から得られた骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340量と、肝非転移骨髄中遊離癌細胞miR-340量を比較することにより行われる。大腸癌患者から得られた骨髄中遊離癌細胞におけるmiR-340量が、肝非転移骨髄中遊離癌細胞miR-340量に比べて低い場合、特に１／２程度以下、１／４程度以下、又は１／７．５程度以下になっている場合、当該大腸癌患者は、肝への癌転移が生じているか、肝への癌転移リスクが高いと予測される。
【００５５】
当該検査方法において、骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340量を測定する方法については、前記「大腸癌の治療剤」の欄に記載の通りである。
【００５６】
３．大腸癌患者の予後の予測方法
後述する試験例４に示すように、miR-340の発現量が低下している大腸癌細胞を有する大腸癌患者は、大腸癌の切除後に予後が悪化し易い傾向があることが明らかにされている。従って、本発明は、更に、大腸癌患者の大腸癌細胞におけるmiR-340の発現量を検出することを特徴とする、大腸癌患者の予後の予測方法を提供する。当該予測方法においてmiR-340の発現量が低下していれば、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと予測される。
【００５７】
大腸癌細胞においてmiR-340の発現量が低下しているか否かは、予後良好群miR-340量平均値を予め測定しておき、大腸癌患者から摘出された大腸癌組織の大腸癌細胞におけるmiR-340量と、大腸癌細胞miR-340量平均値を比較することにより行われる。大腸癌患者から得られた大腸癌細胞におけるmiR-340量が、予後良好群miR-340量平均値に比べて低い場合、特に１／１．２程度以下、１／２程度以下、又は１／３程度以下になっている場合、当該大腸癌患者は、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪化し易いと推測される。
【００５８】
当該予測方法において、大腸癌細胞及び正常大腸粘膜細胞においてmiR-340量を測定する方法については、前記「大腸癌の治療剤」の欄に記載の通りである。
【実施例】
【００５９】
以下、試験例、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下の試験において、サンプル提供を受けた全ての患者には、各機関によって承認されたガイドラインに従って、インフォームドコンセントを行った。また、この試験は、大阪大学病院の倫理委員会の監督の下で行なった。
【００６０】
試験例１：大腸癌患者由来の骨髄中遊離癌細胞におけるmicroRNA発現の網羅的検討
１．大腸癌患者由来の骨髄中遊離癌細胞の回収
大腸癌肝転移患者7名と大腸癌非肝転移患者12名から、以下の方法で骨髄中遊離癌細胞を単離した。大腸癌患者の手術前に麻酔を投与し、左右の腸骨稜前部から各々20mLの骨髄液（全量40mL）を採取し、標準Ficoll-Hypaqueグラジエント法によって単核細胞（全骨髄細胞、BM1）を回収した。次いで、抗CD14免疫ビーズ(Milteny Biotec)を用いたMACSTM pro (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)によって、磁気ビーズ細胞選別を行い、BM1からCD14+細胞（BM2）を除去し、CD14-細胞を回収した。次に、抗CD45免疫ビーズ(Milteny Biotec)を用いた磁気ビーズ細胞選別により、CD14-細胞からCD14-CD45+細胞（BM3）を除去し、CD14-CD45-細胞を回収した。得られたCD14-CD45-細胞をFcRブロッキング試薬（Milteny Biotec）と共にインキュベートした後に、抗EpCAM免疫ビーズ(Milteny Biotec)を用いた磁気ビーズ細胞選別により、CD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）を回収した。全骨髄細胞（BM1）からCD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）を得た細胞選別フローを図１に示す。
【００６１】
次いで、CD14-CD45-EpCAM+細胞（BM4）について、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、CEA及びMYCのmRNA量を測定した。結果を図２に示す。図２から明らかなように、BM4では、BM2（単球系（毛球形）細胞）に比べて、上皮マーカーであるE-cadherinのmRNA量が9.25倍、間葉マーカーであるVimentinのmRNA量が0.48倍、N-cadherinのmRNA量は同程度となっていた。また、BM4では、BM2（単球系（毛球形）細胞）に比べて、腫瘍マーカーであるCEAのmRNA量、及び癌遺伝子であるMYCのmRNA量が、それぞれ１９．５倍及び２．２６倍になっていた。このBM4の遺伝子発現の結果は、癌細胞の遺伝子発現と一致しており、BM4として癌細胞が回収されたことが確認された。更に、BM4についてEpCAM、DAPI、及びcytokeratinに対する抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図３に示す。この免疫染色の結果からも、BM4として癌細胞が回収されていることが確認できた。
【００６２】
２．骨髄中遊離癌細胞のmicroRNA発現特性の解析
上記で得られた骨髄中遊離癌細胞から、miRNeasy kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)を用いて、その添付マニュアルに従って全RNAを単離した。全RNA濃度及び純度を分光光度計で分析し、RNA integrityをAgilent2100バイオアナライザ(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)を用いて確認した。全RNA(100ng)について、正確でしかも0.2 amolから2 fmolまでのmicroRNAを線形ダイナミックレンジで精密に測定できるAgilentプロトコールを用いて、分画や増幅することなく、シアニン３−CTPで直接標識した。各100ngの全RNAを、８８６個のmicroRNA (version 12.0 of the Sanger miRNA database; http://www. mirbase.org/)を有するmicroRNAアレイ(Agilent Microarray Kit; G4470C)に競争的にハイブリダイズさせた。各ハイブリダイゼーションのシグナル強度は、Extraction Software Version A.7.5.1 (Agilent Technologies)を用いて測定した。Ｐ値はペアｔ検定を用いて算出した。
【００６３】
その結果、大腸癌肝転移患者と大腸癌非肝転移患者の間で1.5倍以上の発現量に差があるmicroRNAとして、表１に示す10種のmicroRNAが検出された。表１から分かるように、大腸癌肝転移患者由来の骨髄中遊離癌細胞では、大腸癌非肝転移患者の場合に比べて、miR-340の発現量が著しく低くなっていた。この結果から、骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340の発現量が低くなっている大腸癌患者は、肝への癌転移が生じる又は生じやすくなっていることが明らかとなった。また、骨髄中遊離癌細胞においてmiR-340の発現量が低くなっている大腸癌患者には、肝への癌転移を抑制するために、miR-340の補充療法が有効になることも明らかとなった。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
試験例２：In vitroでの大腸癌細胞株に対するmiR-340の増殖抑制効果
ヒト大腸癌細胞として、HCT116株及びSW480株（いずれもATCCから購入）を用いて、以下の試験を行った。
【００６６】
ヒト大腸癌細胞を、10％FBS（fetal bovine serum）及び1％抗生物質溶液（antibiotic/antimycotic solution (Sigma, St. Louis, MO)）を含むDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)で、37℃、5% CO2雰囲気で培養した。次いで、Lipofectamine iMax (Invitrogen, Darmstadt, Germany)を用い、製造者プロトコールに従って、12穴ディッシュ中でhas-miR-340の前駆体であるpre-miR-340(MC12670, Applied Biosystems；前記配列番号１及び２からなるmature hsa-miR-340の前駆体)30 nmol/Lをヒト大腸癌細胞にトランスフェクトした。なお、コントロールとして、Pre-miR negative control (Applied Biosystems；センス5′- UAAAUGUACUGCGCGUGGAGAGGAA-3′（配列番号３）、アンチセンス5′- UUCCUCUCCACGCGCAGUACAUUUA-3′（配列番号４）)を使用した。
【００６７】
トランスフェクトした大腸癌細胞を2穴ディッシュ中に3〜4×104 cells/wellとなるように播種し、72時間培養を行った。培養後、NucleoCounter kit (Chemometec, Gydevang 43, DK-3450 Alleroed, Denmark)を用いて、細胞数を測定した。
【００６８】
得られた結果を図４に示す。図４から明らかなように、HCT116株及びSW480株のいずれもで、pre-miR-340で処理した場合には、未処理の場合に比して、細胞増殖が有意に阻害されていた(P < 0.001)。即ち、この結果から、miR-340には、大腸癌細胞の増殖を抑制する作用があることが確認された。
【００６９】
試験例３：大腸癌細胞と正常粘膜細胞におけるmiR-340発現の比較
大腸癌細胞と正常粘膜細胞（大腸癌患者の正常大腸粘膜及び粘膜下層由来）についてmiR-340発現量を前記試験例１と同様の方法で測定した。
【００７０】
得られた結果を図５に示す。この結果から、大腸癌細胞におけるmiR-340発現は、正常大腸粘膜細胞に比べて有意に低下していることが明らかとなった（P=0.010）。即ち、この結果からも、大腸癌の治療にはmiR-340の補充療法が有効になることが確認された。
【００７１】
試験例４：大腸癌細胞におけるmiR-340の発現量と、臨床病理学所見及び予後の相関解析
1999年から2010年の間に大阪大学病院と２つの関連病院で外科治療を受けた大腸癌患者から１３６例の原発性大腸癌細胞のサンプルを収集した。各サンプルは、RNA抽出を行うまで、RNAlater（商標）にて-80℃で保存した。また、１３６例の大腸癌患者の内、ステージ０が4例、ステージIが15例、ステージIIが38例、ステージIIIA/Bが52例、ステージIIICが27例であった。
【００７２】
各大腸癌細胞におけるmiR-340発現量を前記試験例１と同様の方法で測定し、miR-340発現量の平均値を求めた。次いで、miR-340発現量が平均値より低い群（miR-340低発現群、n=73）と、miR-340発現量が平均値より高い群（miR-340高発現群、n=63）に分けた。miR-340低発現群とmiR-340高発現群間に分けて臨床病理学所見をまとめた結果を表２に示し、miR-340低発現群とmiR-340高発現群間に分けて５年無病生存率（5-years Disease Free Survival）と5年総生存率（5-years Overall Survival）をまとめた結果を図６に示す。
【００７３】
表２から明らかなように、腫瘍サイズについては、miR-340低発現群は、miR-340高発現群に比べて大きかったが(P < 0.001)、他の因子については、miR-340低発現群とmiR-340高発現群の間で差は認められなかった。また、図６から明らかなように、５年無病生存率及び5年総生存率の双方とも、miR-340低発現群はmiR-340高発現群に比べて低くなっていた。即ち、miR-340が低発現の大腸癌細胞を有する大腸癌患者は、術後の再発や転移のリスクが高く、予後が悪くなる傾向があることが明らかとなった。また、この結果から、miR-340が低発現の大腸癌細胞を有する大腸癌患者には、miR-340の補充療法によって、予後の悪化を抑制し得ることも明らかとなった。
【００７４】
また、５年無病生存に関連する因子を単変量解析と多変量解析を行った。統計的解析は、JMP9プログラム(SAS Institute, Cary, NC)を用いて行った。大腸癌から腫瘍再発の推測は、Kaplan-Meier法及びCoxハザードモデルを用いて行い、統計的有意差は、log-rankテスト及びCoxハザード比を用いて求めた。離散変数間の関連性は、chi-squareテストを用いて分析した。平均値は、Student's t-テストを用いて比較した。In vitro分析に使用した連続変数については、データは平均± SEとして表示し、Wilcoxon's rankテストで分析した。Ｐ値が< 0.05である場合に、統計的有意差があるとした。
【００７５】
結果を表３に示す。単変量解析の結果から、リンパ節転移（P=0.003）、漿膜層表面浸潤（P=0.001）、及びmiR-340低発現（P=0.020）は、５年無病生存に有意に関連していることが分かった。また、多変量解析の結果から、miR-340低発現は、漿膜層表面浸潤(RR, 3.053; 95% CI, 1.311-7.041; P = 0.011)及びリンパ節転移(RR, 2.918; 95% CI, 1.081-10.16; P = 0.033)のように、独立した５年無病生存の予測因子であることも明らかとなった。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
【表３】
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【００７８】
試験例５：In vivoにおけるmiR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子による大腸癌の治療効果
マトリゲル(BD Biosciences, San Jose, CA)と培地を容量比1:1で含む培地／マトリゲル溶液100μL当たりHCT116細胞を1×106 cellsとなるように混合し、その100μLをメスヌードマウス(NIHON CLEA, Tokyo, Japan)の左右両側の背部の下側部分に皮下注入した。当該ヌードマウスを飼育し、背部の腫瘍容量が75〜80mm3に達した時点で、下記で得られたPre-miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を含む製剤を、１回投与当たり当該複合粒子が30μgとなるように尾静脈に注入した。前記製剤の投与を1日１回、3日間繰り返した。また、コントロールとして、Pre-miR-340の代わりに、Pre-miR negative control（配列番号３及び配列番号４）を用いて作製した複合粒子を含む製剤を使用して、同様に試験を行った。
【００７９】
（Pre-miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を含む製剤の調製法）
１００ｍｌの蒸留水に、0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O（1M）、及び180μlのCaCl2（1M）をこの順に添加して溶解させ、1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。得られたバッファー1ml当たりに2μgのPre-miR-340、４μｌのCaCl2（1M）を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。その後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを生理食塩水に分散させ、miR340を炭酸アパタイト粒子に内包させた複合粒子の分散液を得て、これを10分間超音波振動処理にかけることにより、miR340を包含した炭酸アパタイトナノ粒子からなる複合体を含む製剤を得た。なお、超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容した前記分散液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。斯して得られた製剤は、直ちに、前記試験に使用した。また、斯して得られた製剤は、iR340を包含した炭酸アパタイトナノ粒子からなる複合体の平均粒径が50nm以下であることが、走査型プローブ顕微鏡を用いた測定において確認されている。
【００８０】
培地／マトリゲル溶液の投与した時点から、マウス背部の腫瘍サイズ（長径×短径×短径×1/2）を経時的に測定した。得られた結果を図７に示す。図７から明らかなように、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を尾静脈投与した場合には、コントロールに比べて、腫瘍の増殖が有意に抑えられていた（P<0.05）。この結果から、miR-340と炭酸アパタイト粒子の複合粒子を静脈投与すると、miR-340の大腸癌細胞への送達及び大腸癌細胞への移行が効率的に行われ、腸癌細胞に対してmiR-340による抗腫瘍作用を効果的に発揮できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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