(57)【要約】【課題】本発明は、アグリカン量とＩＩ型コラーゲン量をバランスよく含有する軟骨様シートの作成方法を提供する。【解決手段】移植等の再生治療を目的とした生体由来の細胞の体外培養に関するものであり、水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法である。さらには、培養液の浸透圧を調整することにより、アグリカン量とＩＩ型コラーゲン量をバランスよく含有する軟骨様シートの作成方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法
【請求項２】
使用する培養液に分化誘導因子と血清を含み、使用する間葉系幹細胞がヒト骨髄由来であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨様シートの作成方法
【請求項３】
平坦な多孔性膜の面積が０．３ｃｍ２以上であることを特徴とする請求項１乃至２に記載の軟骨様シートの作成方法
【請求項４】
使用する培養液の浸透圧が２８５ｍＯｓｍ／Ｌから３２０ｍＯｓｍ／Ｌまでの範囲内であることを特徴とする請求項１乃至３に記載の軟骨様シートの作成方法
【請求項５】
使用する培養液の浸透圧が２９５ｍＯｓｍ／Ｌから３１０ｍＯｓｍ／Ｌまでの範囲内であることを特徴とする請求項１乃至３に記載の軟骨様シートの作成方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、軟骨様シートの作成に係わる。
【背景技術】
【０００２】近年ヒト細胞などの動物細胞を用いた組織再生に関する基礎的知見が多々発見されその臨床応用に期待が寄せられている。作成する組織の種類に応じて様々な形状の組織を作成する必要があり、軟骨、皮膚、網膜ではシート状組織の作成が必要となる。これまでシート状組織を作成する方法としては、皮膚細胞のような特殊な例を除けば、温度応答性ポリマーのコーティング面に細胞を接着培養し細胞増殖後に温度を低下させポリマーを分解して細胞シートを回収する方法（ＷＯ０１／０６８７９９）、あるいは、不織布やコラーゲンゲルなどのスキャフォールドをシート状に成型しその内部で細胞を培養する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９８（６），４７７−４８１，２００４）などがあった。【０００３】しかし、これらの方法では温度応答性ポリマーやコラーゲンなどの薬剤が作成した組織に混入し、組織を人体に移植した後も残留し影響する懸念があった。また、これらの薬剤の使用は組織の製造コストを上げる要因になるばかりでなく、薬剤の操作のために組織作成プロセスが複雑となり、これらの組織を用いた移植治療の実用化の障害となることが懸念されている。【０００４】そのため、特殊な薬剤や担体を使用しない“スキャフォールドフリー”な培養方法による立体組織の構築方法の開発が求められている。これに対して、軟骨細胞を用いた古典的な培養方法であるペレット培養法（細胞培養技術、東京化学同人、ｐ．１８９、１９９０）や旋回凝集培養法（再生医療（日本再生医療学会雑誌），Ｖｏｌ．７  Ｓｕｐｐｌ，ｐ．１２４−１２５，２００８）がある。しかし、ペレット培養法や旋回凝集培養法で作成できる細胞凝集塊はシート状ではなく球状でその大きさや正確な形状をコントロールできない。【０００５】軟骨組織の例についてより詳しく説明する。軟骨は骨と共に骨格系を形成する結合組織の一部であり、身体や器官の支持作用にあずかる非常に重要な組織である。関節軟骨は硝子軟骨で構成されており、硝子軟骨の特徴的な物理学的特性は、構成する細胞外マトリックス（ＥＣＭ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）の生化学的特性により規定される。ＥＣＭの主成分はＩＩ型コラーゲン、アグリカン（プロテオグリカンの一種）、ヒアルロン酸、その他のマトリックスタンパクからなる。軟骨の内部ではＩＩ型コラーゲン細繊維はＩＸ、ＸＩ型コラーゲンと共に網目構造を形成し、その間隙には高度に水和したアグリカンとヒアルロン酸、リンクタンパクからなる巨大会合体が含まれている。このような三次元構造が形成されているため、硝子軟骨は高い含水率と粘弾性（抗圧縮性）を持ち、体重の数倍もの荷重に耐えることができる。また、滑膜や軟骨細胞から分泌される潤滑物質であるヒアルロン酸によって軟骨表面の摩擦係数は低く関節の円滑な運動が可能となり、さらに軟骨そのものの磨耗も抑えられている。しかし、これらの豊富なＥＣＭのために周囲の組織からの細胞の浸潤が困難である上に、血管、神経、リンパ管を欠き栄養分の供給も遅いため、軟骨は自己修復能力の非常に乏しい組織である。例えば、損傷が関節軟骨層内に留まる程度の浅いものの場合、欠損周辺部の細胞が増殖してＥＣＭ産生を促すが、欠損を埋めるだけの反応を励起しない。また、軟骨下骨に達する深い損傷の場合は、骨髄からの出血を生じ、軟骨前駆細胞及び各種サイトカインが供給されるために、軟骨様組織で修復される。しかし、この修復された組織は組織学的、生化学的及び生体力学的にみて、本来の硝子軟骨とは異なるため、長期的には変性を生じて変形関節症へと進行することが多い。そこで、以上のような軟骨組織の損傷あるいは疾患に対する治療手段として、人工関節による外科的置換術が提案され、実用化されている。しかし、繰り返し応力などによる人工関節の破損のため、耐用年数が限られ、再手術によって人工関節を交換しなければならないが、患者への負担が大きいため、人工関節の適用は高齢者のみとなっているのが現状である。また、感染症の危険性や可動域が限られるなどの欠点もある。（骨と軟骨のバイオロジー  基礎から臨床への展開、金原出版株式会社、８７−１１２  （２００２）、再生医学  ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで、ＮＴＳ、２２５−２８３、６９１−７０１  （２００２）、関節マーカー  病態診断の分子生物学的アプローチ、メディカルレビュー社、９６  （１９９７）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｍ、４３  （９）、１９１６−１９２６  （２０００）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２１、４３１−４４０  （２００２））【０００６】これらの問題を解決するため、細胞を用いて組織を再生させることが有効であると考えられ、関節軟骨組織、あるいは分離した軟骨細胞の移植が試みられている。例えば、患者本人の重量負荷の少ない複数の部位から少量の軟骨片を採取し、それらを欠損部に移植するモザイク移植法（Ｍｏｓａｉｃｐｌａｓｔｙ）が臨床的に行われている。しかし、移植できる軟骨には量的な限界があるため大きな欠損には適用できないという問題があり、さらに、移植後の機能は短期的には改善されるものの、長期的には繊維化などの不具合が生じてくる。（Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ、４０１、１７０−１８４  （２００２））【０００７】また、別法として、軟骨小片から酵素処理にて分離した軟骨細胞を単層培養で増殖させてから移植する自家培養軟骨細胞移植法（ＣａｒｔｉｃｅｌＴＭ）があるが、細胞は単層培養の過程で繊維芽細胞様に脱分化し、移植後も癒着、繊維化、肥大化が生じるなどの問題がある。（Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、８８、５０３−５０７  （２００６）、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、８６、２８６−２９５  （２００４））従って、軟骨細胞移植により欠損部の再生を成功させるためには、脱分化していない正常な軟骨細胞を大量に確保できる技術の開発が必要である。【０００８】ところで、１９９９年に骨髄中に、骨、軟骨、脂肪、腱などの間葉系組織への多分化能を示す細胞の存在が報告され、間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）と名付けられた。（Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、（２７６）、７１−７４  （１９９７））ＭＳＣ独自の表面抗原はまだ完全には同定されていないがＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ４４などが陽性で、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５などが陰性であるものをＭＳＣと呼ぶことが現在一般的である。（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、２６５、１３４−１３９  （１９９９））また、ＭＳＣは骨芽細胞への分化能を保ったまま３８  ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｕｂｌｉｎｇ  Ｌｅｖｅｌ）まで増殖でき（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４、２７８−２９４  （１９９７））、軟骨細胞への分化能は２２  ＰＤＬまでは有していることが報告されている。（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２８、７０７−７１５  （２００２））すなわち、ＭＳＣを増殖させた後で軟骨細胞へ分化させることにより、上述の量的な問題を解決できるとともに、患者本人の細胞を用いるため拒絶反応を回避した治療が可能となる。また、ＭＳＣからの軟骨再生の他の利点として、骨髄液採取に関する患者の負担が軽いこと、骨髄液からのＭＳＣの分離が容易なことなども挙げられる。このように、ＭＳＣからの軟骨再生は非常に有望視されているが、この再生プロセスには、ＭＳＣの分離、増殖、分化、三次元化の一連の工程の開発が必要となる。【０００９】細胞を三次元的に培養する方法として、様々な足場材料を用いた培養法が考案されている。（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、１３  （７）、１５８３−１５９２  （２００７）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｅｓ、５０、１３８−１４３  （２０００）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  （２００５））例えば、天然高分子であるコラーゲンや合成高分子であるポリ乳酸（ＰＬＡ：Ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ：Ｐｏｌｙ  ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：Ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）などの生体吸収性ポリマーを主成分としたスポンジやメッシュ材料を用いた方法がある。軟骨には抗圧縮性が求められるため、機械的強度の点に関してスポンジやメッシュは優れた足場材料となりうるが、細胞を担体内に均一に播種することが難しく、均質な組織の作成は困難と考えられる。さらにＰＬＡやＰＧＡにおいては移植後に分解生成物（ＰＬＡでは乳酸、ＰＧＡではグリコール酸）が炎症反応を引き起こすという問題がある。一方、コラーゲンやフィブリン、アガロース、アルギン酸などのゲル材料を用いたゲル包埋培養法がある。この方法は機械的強度は低いものの、担体内に細胞を均一に播種できる利点がある。しかし、これらの担体を用いる三次元培養には生体内に異物を移植するということで拒絶反応の可能性がある。【００１０】これらの担体の問題を解決するために、担体を使用しない培養方法が有用であることが考えられる。この代表例として軟骨細胞のペレット培養がある。（セルプロセッシング工学−抗体医薬から再生医療まで−、コロナ社、１１１−１１２  （２００７））この培養法は細胞懸濁液を遠心分離することによって球状細胞凝集体を作成し、培養するというものである。ＭＳＣもペレット培養により軟骨細胞へ分化できることが確認されており（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４（４）、４１５−４２８  （１９９８））、ペレット中では細胞密度が高く、パラクリン���ジャクスタクリンを含めた細胞間相互作用が強いため、効率良くＭＳＣから軟骨細胞へ分化させることができると考えられている。よって、ＭＳＣから担体を使用しないで三次元軟骨組織を作成できることが考えられたが、この方法では１本の遠心管で１つのペレットしか作成できず、直径も約０．０３ｍｍと臨床研究に用いるには小さすぎるという欠点がある。（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１４（１２）、２０４１−２０４９  （２００８））【００１１】これに対して我々は、スキャフォールドフリーで、形状や大きさを制御できるシート状組織の作成方法を検討し、遠心回転半径方向に垂直な平坦な内面を含む容器に動物細胞懸濁液を入れて遠心分離し、シート状動物細胞塊を形成させたまま該当容器内で培養開始して得られることを特徴とするシート状動物細胞塊培養組成物を発明した。（特願２００８−２４４９０３）また、水平方向に平坦な内面の底面を含む容器に動物細胞懸濁液を入れ、自然沈降した細胞を培養しても、シートの形状に偏りが生じるもののシート状動物細胞塊を作成できることも見出している。（再生医療学会にて発表。２０１０年３月１８、１９日。広島国際会議場）しかし、これらのシート状動物細胞塊は作成途中に収縮して球場に近い凝集塊になってしまうことが多かった。これに対して我々は、水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と、血清を含む培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養することを特徴とする、シート状動物細胞塊の収縮の無い軟骨様シートの作成方法を見出した。（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１６（６），７３４−７３９（２０１３））この軟骨様シートは、直径約５ｍｍ、厚さ約１ｍｍであり、臨床研究に用いるにも十分な大きさである。【００１２】ところで、軟骨組織に特徴的な物理学的特性は、構成する細胞外マトリックス（ＥＣＭ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）の生化学的特性により規定される。したがって、ＥＣＭの主成分であるアグリカン（プロテオグリカンの一種）とＩＩ型コラーゲンの、軟骨様シートにおける十分な量の蓄積が軟骨様シートの良好な移植成績に重要となる。一般にヒトの正常な関節軟骨において、アグリカン含有量、ＩＩ型コラーゲン含有量はそれぞれ約８０ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌであるのに対して（細胞外マトリックス、羊土社、ｐ．６７−７４（１９９５））、上記の収縮なく作成した軟骨様シート中の各含有量は、それぞれ約７ｍｇ／ｍｌ、約０．０１ｍｇ／ｍｌと明らかに少ない（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１６（６），７３４−７３９（２０１３））。シート中の蓄積量は絶対量が少ないことの他に、正常軟骨に比べてアグリカンは約９％の蓄積量があるが、ＩＩ型コラーゲンは約０．０１％しかない。正常軟骨ではＩＩ型コラーゲンはアグリカンの約２倍量の蓄積があるが、軟骨様シートでは０．１％しかなく（ＩＩ型コラーゲン：約１０ｎｇ／ｍｇシート湿重量、アグリカン：約７μｇ／ｍｇシート湿重量）、アグリカン量に対するＩＩ型コラーゲン量のバランスがよくない。（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１６（６），７３４−７３９（２０１３））したがって、ア��リカン量とＩＩ型コラーゲン量を増大させることだけでなく、アグリカン量に対するＩＩ型コラーゲン量のバランスを保つことも今後の課題である。【００１３】ところで、培養液は溶質濃度に応じた浸透圧を有する。浸透圧の単位は［ｍＯｓｍ／Ｌ］であるが、グルコースの様に水溶液中でほとんど解離しない溶質の場合は、１ｍｍｏｌ／Ｌがほぼ１ｍＯｓｍ／Ｌに等しいが、ＮａＣｌのようにほぼ完全に解離する溶質の場合は、１ｍｍｏｌ／Ｌがほぼ２ｍＯｓｍ／Ｌとなる。生理的浸透圧は約２８０ｍＯｓｍ／Ｌといわれているが（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．７０３−７０９（１９７３））、培養液の浸透圧がそれより高くなると、細胞増殖速度が低下するだけでなく、アミノ酸やＲＮＡなどの細胞内含量が増大することが知られている（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，４３，７７−８９（１９９４））。また、細胞１個当たりのグルコース消費速度、エネルギー獲得速度やタンパク質生産速度は、ある浸透圧までは浸透圧上昇に応じて増大することも報告されている（Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８７（２），２５５−２５７（１９９９）．）。したがって、培養液単位体積当たりのタンパク質生産速度は、生理的浸透圧より高い浸透圧で最大になることが多い。（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３７，２９２−２９５（１９９１），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（３），１７１−１７９（２０００）．）さらに、これらの知見を応用し、培養中に、培養液の浸透圧を段階的に増大させたり（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９（１），２７−３３（１９９９）．）、浸透圧を周期的に増減させる（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１（５），５０９−５１４（２００１）．）ことによってタンパク質の生産性を改善した例も報告されている。【００１４】ここで、アグリカンのコア部分やＩＩ型コラーゲンはタンパク質であるので、細胞によるこれらの生産量が浸透圧により影響を受ける可能性はあるが、これまで調べられた例はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】本発明は、アグリカン量とＩＩ型コラーゲン量をバランスよく含有する軟骨様シートの作成方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は少なくとも、水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法に関する。【００１７】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の多孔性膜の材質としては、ポリエチレンテレフタレートやポリカーボネートを例として挙げることができる。【００１８】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の多孔性膜の細孔径としては、０．１μｍ〜１２μｍを例として挙げることができるが、０．４μｍ〜３μｍが望ましい。【００１９】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の多孔性膜の細孔密度は細孔径にもよるが、２×１０５個／ｃｍ２〜１×１０８個／ｃｍ２を例として挙げることができる。【００２０】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の底面の形状としては、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、正五角形、ドーナツ型などを例として挙げることができる。【００２１】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の底面の面積としては、０．１５〜１０００ｃｍ２のいずれでもよいが、０．３〜１０ｃｍ２が好ましい。【００２２】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜（面積が０．３ｃｍ２以上）の底面を含む容器」の深さとしては、３〜１００ｍｍのいずれでもよいが、５〜５０ｍｍが好ましい。【００２３】本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜（面積が０．３ｃｍ２以上）の底面を含む容器」の材質は、その成分が培養液に溶出し細胞に悪影響を与えるものでなくてはならないが、例としてポリスチレン、ポリプロピレン、ステンレス、ガラスなどを挙げることができる。特に、動物細胞の接着に適した材質とは、動物細胞が接着しやすいように親水化処理を施されたり、接着タンパク質をコーティングされた材質などであり、接着培養用にプラズマ放電処理を施され「細胞培養用」として市販されているポリスチレン製培養器などを例として挙げることができる。【００２４】本発明で用いる間葉系幹細胞の由来としては、ヒト骨髄由来、ヒト羊膜由来、ヒト関節滑膜由来、ヒト臍帯血由来を例として挙げることができる。【００２５】本発明で用いる間葉系幹細胞懸濁液に含まれる間葉系幹細胞の数としては、多孔性膜の底面積１ｃｍ２あたり１×１０５個〜１×１０８個を例として挙げることができるが０．２×１０７個〜１×１０７個が望ましい。【００２６】本発明で用いる培養液用の培地としては、細胞の増殖及び維持を支援すべく使用される成長因子及び栄養素を含む標準培地や標準培地に種々の添加物を加えた培地を例として挙げることができる。用いる標準培地は通常動物細胞の培養で用いられるダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ培地などを用いうる。細胞の増殖及び維持に有効であることが知られている因子、たとえば血清アルブミン、トランスフェリン、脂質及び脂肪酸、コレステロール、ピルビン酸塩、増殖因子、並びに細胞外マトリックス細胞（例えばコラーゲン、フィブ���ネクチン及びラミニン）等を添加してもよい。【００２７】本発明で用いる培養液用の分化誘導因子としては、ＴＧＦベータ、ＩＧＦ、デキサメタゾンなどを例として挙げることができる。【００２８】本発明で用いる培養液用の血清としては、ウシ胎児血清、ヒト血清などを例として挙げることができる。ヒト血清としては、間葉系幹細胞の由来するドナーの血清、プール血清などを例として挙げることができる。ここで分化誘導因子や血清は培養開始時に加えてもよいし、培養開始後の培養中に加えてもよい。【００２９】本発明の「水平方向に平坦な多孔性膜（面積が０．３ｃｍ２以上）の底面を含む容器内における細胞の自然沈降」の「自然沈降」とは、「特に重力加速度以上に加速度を加える必要がない」という意味であり、遠心力などにより沈降の加速度を付加しても構わない。【００３０】本発明における培養の期間として、３日〜６週間を例として挙げることができるが、１〜４週間が望ましい。【００３１】本発明において培養液の浸透圧を調製する方法としては、培養液の水などによる希釈でもよいし、溶質の追加添加でもよい。追加添加する溶質としては、細胞の増殖や分化を顕著に阻害しないものであればよく、食塩（ＮａＣｌ）、ＫＣｌ、グルコース、グルタミン、シュークロースなどを例として挙げることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３２】以下に実施形態例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】ＮａＣｌおよび水の添加により浸透圧を調整したウシ胎児血清（５％）含有軟骨分化培地（ＴＧＦβ３、ＩＧＦ−１、デキサメタゾン含有）を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ、６．２×１０５ｃｅｌｌｓ）を、２４穴マルチウェル中にセットした隔膜培養器（セルカルチャーインサート、ＣＣＩ）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日ごとに培地を全量交換し、３週間静置培養した。培養終了後、シートサイズ、シート湿重量、アグリカン（ｓＧＡＧ）蓄積密度（ＤＭＭＢ法）、ＣＯＬ（ＩＩ）蓄積密度（ＥＬＩＳＡ法）を各々定量した。【００３４】その結果を、３００ｍＯｓｍ／Ｌでの測定値を１として、相対値で図１に示した。高浸透圧（３７５−４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｌ）条件下において培養した結果、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌの培養と比べてシートの直径にはほとんど変化がなかったが、シートの厚さ、湿重量、アグリカンおよびＣＯＬ（ＩＩ）蓄積量は高浸透圧ほど減少した。また、３２５−３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｌ条件下においては、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌの培養と比べてシートサイズ、湿重量、ＣＯＬ（ＩＩ）蓄積量に変化はなかったが、高浸透圧ほどアグリカン蓄積量が減少した。一方、低浸透圧（２６０−２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｌ）条件下において培養した結果、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌの培養と比べてシートサイズ、アグリカン蓄積量にはほとんど変化がなかったが、ＣＯＬ（ＩＩ）蓄積量は低浸透圧ほど減少した。したがって、アグリカン蓄積量は３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌに比して高浸透圧で、ＣＯＬ（ＩＩ）蓄積量は３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌに比して高浸透圧でも低浸透圧でも有意に減少し、両者とも３００ｍＯｓｍｏｌ／ｌ付近が最適と考えられた。
【発明の効果】
【００３５】以上示したように、本発明によれば、少なくとも、水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養する軟骨様シートにおいて、培養液の浸透圧を３００ｍＯｓｍ／Ｌ付近に調節することによって、アグリカン、ＩＩ型コラーゲンの両方の蓄積量を現状の最大にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】種々の浸透圧の培養液で培養した場合の軟骨様シートの性状
【図１】
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