(57)【要約】【課題】遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の第７０番目のアミノ酸がアルギニンである野生型と、グルタミン又はヒスチジンに変異した変異型Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法であって、従来法よりも高感度に精度良く前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスを検出できる方法を提供すること。 【解決手段】この検出方法は、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子中の、前記アミノ酸をコードするコドンを含む領域をリアルタイム検出ＰＣＲ法により増幅して増幅産物を検出することを含む。リアルタイム検出ＰＣＲ法に用いるプローブとして、特定の塩基配列をそれぞれ持つ、第１の野生型プローブと、第２の野生型プローブと、第１の変異型プローブと、第２の変異型プローブとの混合物であるプローブセットを用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の第７０番目のアミノ酸がアルギニンである野生型と、グルタミン又はヒスチジンに変異した変異型のＣ型肝炎ウイルスの検出方法であって、前記Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子中の、前記アミノ酸をコードするコドンを含む領域をリアルタイム検出ＰＣＲ法により増幅して増幅産物を検出することを含み、該リアルタイム検出ＰＣＲ法に用いるプローブとして、
(1)  塩基配列が配列番号１で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号１中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第１の野生型プローブと、
(2)  塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号２中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第２の野生型プローブと、
(3)  塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号３中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第１の変異型プローブと、
(4)  塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号４中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第２の変異型プローブと
の混合物であるプローブセットを用いるか、又は
上記(1)〜(4)のプローブの各相補鎖の混合物であるプローブセットを用いる、検出方法。
【請求項２】
上記(1)〜(4)のプローブの混合物であるプローブセットを用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１の野生型プローブが、配列番号１中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチドであり、前記第２の野生型プローブが、配列番号２中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチドであり、前記第１の変異型プローブが、配列番号３中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチドであり、前記第２の変異型プローブが、配列番号４中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチドである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１の野生型プローブが、配列番号１中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチドであり、前記第２の野生型プローブが、配列番号２中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチドであり、前記第１の変異型プローブが、配列番号３中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチドであり、前記第２の変異型プローブが、配列番号４中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチドである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１の野生型プローブが、配列番号１中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドであり、前記第２の野生型プローブが、配列番号２中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドであり、前記第１の変異型プローブが、配列番号３中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドであり、前記第２の変異型プローブが、配列番号４中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記４種類の各プローブが、ヌクレオチドとして少なくとも１個のロックド核酸を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リアルタイム検出ＰＣＲ法が、デジタルリアルタイム検出ＰＣＲ法である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記デジタルリアルタイム検出ＰＣＲ法が、ドロップレットデジタルリアルタイム検出ＰＣＲ法である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記第１及び第２の野生型プローブが、第１の蛍光色素で標識され、前記第１及び第２の変異型プローブが、前記第１の蛍光色素とは発光波長が異なる第２の蛍光色素で標識されている請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型をそれぞれ定量し、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を測定する方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法により、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を、IFN/RBV併用療法の前後において測定することを含み、前記併用療法後に変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合が増大していることが、予後不良の可能性が高く、減少していることが、Ｃ型肝炎ウイルスの一過性消失である可能性が高いことを示す、IFN/RBV併用療法の予後の予測方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法により、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染しているC型慢性肝炎患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を測定することを含み、前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合が高いほど肝臓がん発症の可能性が高いことを示す、Ｃ型慢性肝炎患者の肝臓がんの発症の可能性の予測方法。
【請求項１３】
IL28B近傍のSNP rs8099917がTT型かGG/GT型かを検査することをさらに含み、該SNPがGG/GT型の場合にTT型よりも肝臓がん発症の可能性が高いことを示す、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の第７０番目のアミノ酸がアルギニンである野生型と、グルタミン又はヒスチジンに変異した変異型Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の日本のHCV感染者数は約200万人、世界では1億7千万人（世界人口の3%近く）がキャリアであると見られ、その一部が肝臓がんを発症する。日本ではインターフェロン治療が効きにくい遺伝子型（ジェノタイプ）1bが70〜85%を占める。2a型が10〜15%、2b型が約5%で、他の遺伝子型はまれである。ウイルス粒子はエンベロープを持つ、直径35〜65nmの球状粒子であり、ゲノムとして9.5kbのプラス一本鎖RNAを持ち、ヒトを固有宿主とする。近年、Ｃ 型肝炎ウイルス（HCV）に対するペグインターフェロン（PEG-IFN）・リバビリン（RBV）併用療法により、ジェノタイプ1 型高ウイルス量症例に対しても50％程度の著効率が得られるようになった。しかし20％程度の無効例が存在することから、PEG-IFN・RBV併用療法の治療効果にはウイルス因子（ウイルス量、NS5A変異、HCVのコアタンパク質の第７０番目のアミノ酸(core70アミノ酸)の変異）、宿主因子（年齢、性別、肝線維化進展度）、薬剤投与量が関係すると考えられている。さらに2009年9月に宿主因子としてIL28B遺伝子周辺の遺伝子多型がPEG-IFN・RBV併用療法の治療効果と関係することが報告されている。特にジェノタイプ1bでHCV core 70アミノ酸変異型（変異型グルタミン又はヒスチジン）の場合において肝臓がん（非特許文献１〜４）やIFN/RBV治療（特許文献１、非特許文献５、６）との関係が報告されており、その測定は臨床的に重要と考えられるが、不明瞭な点も多い。
【０００３】
HCV core 70アミノ酸変異の既存の簡便な測定法としては、ダイレクトシーケンス法、インベーダー法、ARMS法などが報告されている（非特許文献７、８）が、実際の複数のＣ型肝炎患者血清を用いて変異に対する十分な検討がされているものではなく、これらの従来法では、感度及び精度の点で臨床的に満足できるものではない。さらに、次世代シークエンサー等を用いて測定することも可能であるが、コストや工数がかかりルーチン検査としては十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４７９４９４４号掲載公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】El-Shamy A et al., Hepatology. 2012 Dec 24. doi: 10.1002/hep.26205. [Epub ahead of print]
【非特許文献２】Takeyasu M et al., J Med Virol. 2012 Aug;84(8):1199-207. doi: 10.1002/jmv.23288.
【非特許文献３】Miura M et al., Hepatol Int. 2011 Aug 17. [Epub ahead of print]
【非特許文献４】Akuta N et al., J Med Virol. 2011 Jun;83(6):1016-22. doi: 10.1002/jmv.22094.
【非特許文献５】Akuta N et al., Intervirology. 2012;55(3):231-41. doi: 10.1159/000328327. Epub 2011 JμL 5.
【非特許文献６】Funaoka Y et al., J Virol. 2011 Jun;85(12):5986-94. doi: 10.1128/JVI.02583-10. Epub 2011 Apr 13.
【非特許文献７】Tadokoro K et al., J Virol Methods. 2013 Apr;189(1):221-7. doi: 10.1016/j.jviromet.2012.10.011. Epub 2012 Nov 2.
【非特許文献８】Akuta N et al., J Med Virol. 2006 Jan;78(1):83-90.
【非特許文献９】Chayama K et al., J Gastroenterol Hepatol 1993; 8: 150-156)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の第７０番目のアミノ酸がアルギニンである野生型と、グルタミン又はヒスチジンに変異した変異型Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法であって、従来法よりも高感度に精度良く前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスを検出できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、４４５例の日本人Ｃ型肝炎患者血清中に含まれるHCVのcore70アミノ酸のコード領域近辺の遺伝子配列を決定し、パターン化と度数調査を行った。さらに鋭意研究の結果、ウイルス遺伝子の増幅及び検出方法としてドロップレットデジタルＰＣＲ法を採用すると共に、この方法に用いられるプローブとして、特定の塩基配列を持つプローブの混合物であるプローブセットを用いることにより、日本人のＣ型肝炎患者が持つ遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスの大部分について、従来法よりも高感度に精度良くHCV core70アミノ酸の野生型と変異型を同時に検出可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の第７０番目のアミノ酸がアルギニンである野生型と、グルタミン又はヒスチジンに変異した変異型Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法であって、前記Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子中の、前記アミノ酸をコードするコドンを含む領域をリアルタイム検出ＰＣＲ法により増幅して増幅産物を検出することを含み、該リアルタイム検出ＰＣＲ法に用いるプローブとして、
(1)  塩基配列が配列番号１で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号１中の少なくとも8nt〜14nt（「nt」は、5'末端から数えて何番目の塩基かを示す。従って、「8nt」は5'末端から数えて８番目の塩基を示す。以下同じ）の領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第１の野生型プローブと、
(2)  塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号２中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第２の野生型プローブと、
(3)  塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号３中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第１の変異型プローブと、
(4)  塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号４中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチドから成る第２の変異型プローブと
の混合物であるプローブセットを用いる、検出方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、上記本発明の方法により、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスをそれぞれ定量し、その相対割合を測定する方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染しているＣ型慢性肝炎患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を測定することを含み、前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合が高いほど肝臓がん発症の可能性が高いことを示す、Ｃ型慢性肝炎患者の肝臓がんの発症の可能性の予測方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、日本人のＣ型肝炎患者が感染している遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスの約９１％について、前記変異型ウイルスの割合（該変異型と野生型の合計に対する該変異型の割合）が１％（好ましい実施形態では0.005%）であっても、該変異型ウイルスを検出することができ、かつ、その相対割合も測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】下記実施例において得られた、人工的に調製した、変異型％が0%、10％、30％、50％、70％、100％の血清について本発明の方法により変異型％を測定した結果と調製時の変異型％との相関関係を示す図である。
【図２】下記実施例において得られた、人工的に調製した、変異型％が0.005%〜10％の血清について本発明の方法により変異型％を測定した結果と調製時の変異型％との相関関係を示す図である。
【図３】下記実施例において得られた、公知のCobas TaqMan（商品名） HCV法による測定結果と本発明の方法による測定結果との相関関係を示す図である。
【図４】下記実施例において得られた、His変異を持つ検体を包含する検体の、公知のCobas TaqMan（商品名） HCV法による測定結果と本発明の方法による測定結果との相関関係を示す図である。
【図５】下記実施例において得られた、TaqMan（商品名）法により測定した検量線を示す。
【図６】肝硬変を伴わない慢性Ｃ肝炎患者（CH)と肝硬変を伴う肝臓がん（HCC）患者で、ddPCRを用いて、変異型％の測定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法が適用される患者は、遺伝子型（ジェノタイプ）１ｂのHCVに感染した患者である。Ｃ型慢性肝炎を引き起こすHCVには、遺伝子型１ｂと遺伝子型２があることが知られており、遺伝子型１ｂの方が多く、かつ、難治性の割合も高い。遺伝子型１ｂと遺伝子型２の識別方法は周知であり（非特許文献９）、HCV RNAのNS5領域の塩基配列に基づいて容易に識別することができる。
【００１３】
本発明の方法に供される検体は、HCVに感染した患者から採取されたものであり、HCVを含むものであれば、何ら限定されず、血液のような体液や、肝生検検体等であってよい。これらのうち、採取が容易で感度も良好な血液（全血の他に、血清、血漿のような血液成分も包含する）検体が好ましい。
【００１４】
本発明の方法では、リアルタイム検出ＰＣＲ法(RTD-PCR)によりウイルスの検出を行う。リアルタイム検出ＰＣＲ法自体は周知であり、TaqMan（商品名）法に代表される。周知のTaqMan（商品名）法を簡単に説明すると、通常のＰＣＲと同様にして、フォワードプライマーとリバースプライマーに挟まれる鋳型核酸の領域を増幅し、かつ、この増幅をTaqMan（商品名）プローブの存在下で行う。TaqMan（商品名）は、一方の末端にレポーター蛍光色素、他方の末端にクエンチャーが結合されている。レポーター蛍光色素の蛍光は、クエンチャーにより消沈されるので、プローブが存在する間は蛍光が検出されない。ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーが伸長し、プローブの位置まで伸長してくるとＤＮＡポリメラーゼが持っているエキソヌクレアーゼ活性により、プローブが分解される。プローブの分解により、レポーター蛍光色素がクエンチャーから遠く離れるので、レポーター蛍光色素の蛍光が測定されるようになる。この蛍光強度は、検体中に存在する鋳型核酸（被検核酸）の量が多いほど大きくなるので、この蛍光強度を測定することにより、検体中の被検核酸を定量することができる。
【００１５】
本発明で用いるリアルタイム検出ＰＣＲ法は、上記TaqMan（商品名）法に限定されるものではなく、その改良法として知られるデジタルＰＣＲ(dPCR)法や、特にその中でもドロップレットデジタルＰＣＲ法(ddPCR)も好ましく採用することができる。デジタルＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応液を多数（市販品では２万個から10万個）のウェルに分割し、各ウェルで上記TaqMan（商品名）法が行われる。反応液を多数の画分に分割するので、被検核酸が存在する画分も存在しない画分も生成する。各画分について、増幅反応が起きたか否かを調べ（起きたか否かなので、デジタル化（二値化）である）、増幅反応が起きた画分の数に基づき検体中の被検核酸を定量するものである。デジタルＰＣＲ法を行うシステムも既に商品化されており、例えば、Applied Biosystems社のQuantStudio 3D デジタル PCRシステム（商品名）やFluidigm社のBioMark HD（商品名）を用いることにより容易に行うことができる。また、請求範囲の配列を基にインベーダー法なども容易に行うことができる。
【００１６】
さらに、デジタルＰＣＲ法の１つの変法として、ドロップレットデジタルＰＣＲ法(ddPCR)も知られており、商品化されている。ddPCRは、基本的には、通常のリアルタイム検出PCR(TaqMan（商品名）プローブを用いる)を、多数の微小液滴（ドロップレット）中で行い、PCR後、それぞれのドロップレットの蛍光を測定して各ドロップレットで増幅が起きたか否かを判定し（デジタル化）、増幅が起きた（ポジティブ）ドロップレットの数と起きなかった（ネガティブ）ドロップレットの数に基づき検体中に含まれる被検核酸を定量する方法である。ddPCRは既に実用化されており、そのための装置が市販されている(Bio Rad社製のQX100（商品名）及びRainDance Technologies社のRainDrop Digital PCR System（商品名）)。QX100（商品名）では、２０μLの検体を２万個のドロップレットに分割してPCRを行う。そのほかRainDance Technologies社のRainDrop（商品名）Digital PCR Systemを用いることもできる。
【００１７】
上記デジタルＰＣＲ法において、後述する本発明の方法の場合のように、発光波長の異なる２種類の蛍光色素で標識したプローブの混合物を用いる場合には、各画分（ドロップレット）について、どちらの波長の蛍光が検出されるか又は蛍光が検出されないかが判定される。
【００１８】
なお、デジタルＰＣＲを包含するリアルタイム検出ＰＣＲは、検体中の被検核酸を定量する方法であるが、定量を目的とすることなく検出のみを目的とする場合にも利用可能である。定量すれば、必然的に検出が行われるので、本発明における「検出」という語は、定量をも包含する。
【００１９】
本発明の方法では、検体中に含まれるHCVの遺伝子（RNA）中の、コアタンパク質の第７０番目のアミノ酸をコードするコドン（以下、「core70コドン」）を含む領域（後述）を増幅し増幅産物を検出する。HCVのコアタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、GenBank Accession No. D90208には、HCVゲノムの原型（プロトタイプ）配列(HCVJ)が記載されている。配列表の配列番号５に、HCVJのコア領域の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す（ただし、PCR増副産物であるDNAの塩基配列として表記）。配列番号６には、このアミノ酸配列のみを示す。
【００２０】
本発明の方法は、原理的には、リアルタイム検出ＰＣＲ法によりHCVの遺伝子中のcore70コドンを含む領域を増幅し、増幅産物中のcore70コドンが野生型であるアルギニンをコードするものか、変異型であるグルタミン又はヒスチジンをコードするものかを識別するものである。この識別はプローブにより行われるものであり、本発明の方法は、使用するプローブに特徴がある。下記実施例に具体的に記載するように、このプローブの開発にあたり、本願発明者らは先ず、日本人のＣ型肝炎患者における各core70コドン周辺遺伝子配列の存在比率を調べた。core70コドン自体は、野生型も変異型も公知であるが、周辺遺伝子をパターン化し、かつ日本人のＣ型肝炎患者における存在比率を調べた例はこれまで知られていない。下記実施例に具体的に記載するとおり、本願発明者らは、４４５例の日本人Ｃ型肝炎患者の血清検体中に含まれるcore70コドン近傍の塩基配列をダイレクトシーケンシングにより決定した。その結果、３０種類のパターンが見つかり、そのうちの４パターンで約８３％、この４パターンに包含される２種類のパターンの混合型である５つのパターンを加えると約９１％を占めることが明らかになった。本発明の方法に用いられるプローブは、この約９１％のパターンのいずれかを持つ場合に、野生型か変異型かを識別して検出可能になるように設定した。さらに、上記のとおり、検体中における変異型の存在割合が１％と微量な場合であっても検出可能となるように、プローブの配列を鋭意検討した。その結果、
(1)  塩基配列が配列番号１で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号１中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチド、好ましくは、配列番号１中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、配列番号１中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチド、最も好ましくは、配列番号１中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドから成る第１の野生型プローブと、
(2)  塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号２中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチド、好ましくは、配列番号２中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、配列番号２中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチド、最も好ましくは、配列番号２中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドから成る第２の野生型プローブと、
(3)  塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号３中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチド、好ましくは、配列番号３中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、配列番号３中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチド、最も好ましくは、配列番号３中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドから成る第１の変異型プローブと、
(4)  塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド又はその断片であって配列番号４中の少なくとも8nt〜14ntの領域を含む断片であるオリゴヌクレオチド、好ましくは、配列番号４中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから15merのオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、配列番号４中の少なくとも6nt〜16ntの領域を含む11merから13merのオリゴヌクレオチド、最も好ましくは、配列番号４中の5nt〜17ntの領域から成るオリゴヌクレオチドから成る第２の変異型プローブとの混合物とすることにより、約９１％を占める上記した９パターンの全てについて検出が可能であり、かつ、変異型の存在割合が１％（好ましい実施形態では0.005%）と微量な場合であっても変異型を検出可能であることを見出した。さらに、下記実施例において具体的に記載するように、驚くべきことに、この混合プローブを用いると、プローブがハイブリダイズする領域であってcore70コドン以外の部位に変異がある場合であっても、良好に検出が可能である。なお、プローブは、オリゴヌクレオチドから成り、好ましくはDNAから成る。もっとも、下記実施例に具体的に示されるように、ロックド核酸(locked nucleic acid)のような人工ヌクレオチドを含むものであってもよい。なお、ロックド核酸は、EXIQON社（デンマーク）から「LNA」の商品名で市販されているので、市販品を用いて容易にロックド核酸含有オリゴヌクレオチドを合成することができる。
【００２１】
なお、上記(1)〜(4)のプローブの各相補鎖の混合物であるプローブセットを用いても、プローブがハイブリダイズするＤＮＡが、上記(1)〜(4)のプローブがハイブリダイズするＤＮＡの相補鎖となるだけであるので、上記(1)〜(4)のプローブを用いた場合と同様に検出を行うことができる。また、上記(1)〜(4)の各プローブとして、それぞれ好ましい配列が記載されているが、それらの好ましい各プローブの相補鎖のセットも同様に好ましいプローブセットとして用いることができる。
【００２２】
PCR反応液中の各プローブの濃度は、通常、50〜500nM程度であり、この範囲内であれば、各プローブの濃度が異なっていてもよいが、通常、上記４種類のプローブは等量混合される。
【００２３】
各プローブは、TaqMan（商品名）プローブであるので、レポーター蛍光色素と、クエンチャーが結合されている。第１及び第２の野生型プローブを、第１の蛍光色素で標識し、前記第１及び第２の変異型プローブを、前記第１の蛍光色素とは発光波長が異なる第２の蛍光色素で標識することにより、野生型と変異型を識別して定量することが可能である。レポーター蛍光色素としては、種々のものが市販されており、これらの市販の蛍光色素のうち、適宜発光波長の異なるものを選択すればよい。下記実施例では、VIC（商品名）とFAM（商品名）を用いているが、これらに限定されるものではない。また、クエンチャーも種々のものが市販されており、各レポーター蛍光色素からの蛍光をクエンチできる市販品を選択して用いることができる。クエンチャーには蛍光色素と非蛍光色素があり、どちらでもよいが、検出の精度の観点から、非蛍光色素が好ましい。下記実施例では、クエンチャーとしてTAMRA（商品名）及びNFQ（Non Flurescent Quencher）を用いている。さらに、プローブにMGB（Minor Groove Binding)構造を結合することにより、ハイブリダイズした核酸の融解温度を上げることができ、より短いサイズのプローブであっても、十分な特異性でハイブリダイズすることができるようになるので好ましい。MGB構造は、市販されているので市販品を利用することができる。レポーター蛍光色素、クエンチャー及びMGB構造は、通常、プローブを構成するオリゴヌクレオチドの末端にそれぞれ結合される。
【００２４】
PCRに用いるプライマーセットは、型に拘わらずHCVのcore70コドンを含む領域を増幅できるものであればよく、公知のコンセンサス配列にハイブリダイズするものを用いることができる。プライマーセットは、各型のcore70コドンを含む領域を増幅できればよく、本発明の効果は、上記した混合プローブにより達成されるものである。実際、下記実施例において、種々のプライマーセットを用いて実験を行ったが、いずれの場合でも良好に検出可能であった。
【００２５】
本発明の方法は、検体から常法によりRNAを抽出し、このRNAを鋳型として逆転写PCR(RT-PCR)を行い、この逆転写PCRを、上記混合プローブの存在下で、ddPCRにより行うことにより実施することができる。上記混合プローブを用いる点以外は、各操作は公知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００２６】
本発明の方法によれば、下記実施例に具体的に記載するように、日本人のＣ型肝炎患者が感染しているＣ型肝炎ウイルスのほとんどについて、野生型及び変異型を検出することができる。特に、本発明の方法により、検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を測定することが可能であり、下記実施例では、変異型の相対割合（以下、「変異型％」ということがある）が0.005%と非常に微量な場合でも測定可能であった。
【００２７】
さらに、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染している患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を本発明の方法によりIFN/RBV併用療法の前後において測定することにより、IFN/RBV併用療法の予後を予測することができる。この場合、併用療法後に変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合が増大していることが予後不良の可能性が高いことを示し、減少していることがTR（HCV-RNAの一過性消失）である可能性が高いことを示す（下記実施例１２参照）。表９の結果から、IFN/RBV併用療法の前後において変異型の相対割合が減少した場合、とりわけ２％以上減少した場合はTR（HCV-RNAの一過性消失）にとなった。一方、IL28B遺伝子周辺の遺伝子多型が治療効果と関係することが報告されている（文献：Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C. Nat Genet.41; 1105-9, 2009）。すなわち、上記方法に加え、さらにIL28BのSNPがTT型かGG/GT型かを検査することにより、予後を予測することができる。一般的にIL28B遺伝子のrs8099917がTTの場合はIFN著効（CR）と言われているが、本願発明者らはIL28B遺伝子のrs8099917がTTの場合であってもIFN/RBV併用療法の前後において変異型の相対割合が増大している場合、とりわけ３％以上増大している場合には、予後不良の可能性が高くなることを見出した。具体的には、変異型の相対割合が２％以上減少した例（10/24）は全てTRとなった。今回検討した症例では、HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合が、３％以上増大している場合に、予後不良となったIL28BのSNP rs8099917 TT例が１例あった。つまり、IL28BのSNPがメジャーアレル（たとえばrs8099917 TT）であっても、IFN/RBV投与後に、HCV-コアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合が増大するほど、好ましくは３％以上増大した場合は、予後不良（Non Responder, NR）と予測できる。よって、これらをまとめると、以下のように予後予測が可能となる。
IFN/RBV併用療法の予後予測方法：
１）HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合がIFN/RBV治療後で減少、とりわけ２％以上減少した場合は、NRとならない可能性が高いと予測できる。
２）HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合がIFN/RBV治療後で減少、とりわけ２％以上減少しなかった場合は、NRとなる可能性が高いと予測できる。
３）さらにIL28B  SNPがメジャーアレル（たとえばrs8099917 TT）の場合は、HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合がIFN/RBV治療中後で増大、とりわけ３%以上増大した場合は、NRとなる可能性が高いと予測できる。４）IL28B  SNPがマイナーアレル（たとえばrs8099917 GT/GG）の場合は、 HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合が減少、とりわけ２％以上減少しなかった場合は、NRとなる可能性が高いと予測できる。
【００２８】
さらに、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染しているＣ型慢性肝炎患者から採取された検体中に含まれるＣ型肝炎ウイルスの、野生型と前記変異型の合計に対する前記変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合を本発明の方法により測定することにより、肝臓がん発症の可能性を予測することができる。変異型Ｃ型肝炎ウイルスの相対割合が高いほど肝臓がん発症の可能性が高い。特に、変異型の割合が0.5〜2%以上、特には１．７５％(ROC解析結果)以上増大している場合に、肝臓がん発症の可能性が高くなる。なお、IL28B遺伝子及びSNPは周知であり、第１９染色体上にあり（NC_000019.9 (39734272bpから39735916bp, complement)、そのSNPは、rs8099917（NCBI Reference Sequence: NT_011109.16）中の12011383番目の塩基（SNPはk(t又はg、t>g)にある。この変異の近傍（前後500bp）の塩基配列を配列番号７に示す。
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３０】
参考例
日本人のＣ型肝炎患者におけるcore70コドン近傍の配列パターンの調査
実際の日本人Ｃ型肝炎患者血清からcore70コドン近傍の配列パターンを決定した。Ｃ型慢性患者445例血清から常法によりRNA抽出し、core70コドンを含む領域(-12〜343bp)をRT-PCRし、さらにダイレクトシーケンスを実施し塩基配列を決定した(方法は、 Ohno O, Mizokami M, Wu RR, Saleh MG, Ohba K, Orito E, Mukaide M, Williams R, Lau JY. New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, and 6a.  J. Clin. Microbiol. 1997, 35,20.)。
【００３１】
結果を下記表１に示す。表１に示すとおり、１４のパターンが存在した。そのうち検出度数の高かった上位４パターンで全体の８３％以上、上記した６パターン含めて約９１％を占めることがわかった。
【００３２】
【表１】
2015084704.tif 000003
【００３３】
実施例１
ddPCR法
Ｃ型肝炎患者の血清から常法によりＲＮＡを抽出し、常法により逆転写酵素でｃＤＮＡを生成させ、リアルタイム検出ＰＣＲをddPCRにより行った。具体的には次のようにして行った。血清検体は、0.5ｍL血清から核酸抽出をRoche社MagNA Pure LC 2.0 Systemを用いて行った。精製した核酸をsuperscriptIII(ライフテクノロジー社)でｃDNA合成した。その5μLを用いddPCRを行った。反応組成は、ddPCR Supermix for probes (BioRad社製QX100（商品名）に付属) 11μL、 各100μMプライマー0.18μL、プローブ混合物 (各10μMプローブを等量ずつ混合した溶液)2μL、 精製水3.14μL、cDNA 5μLを混合しそのうち20μLを70μL Droplet Readerオイル(BioRad社製QX100（商品名）に付属)、QX100 Droplet Generatorシステム(BioRad社製QX100（商品名）)、そしてDG8カートリッジ & ガスケットセットを用いてドロップレットを作製した。PCRは95℃、10分、そして94℃、30秒-56℃、2分−72℃、1分の45サイクル(ランプレーと50%)、さらに、98℃、10分、4℃∞で、サーマルサーキュラーVeriti（ライフテクノロジー社）で行った。検出は、BioRad社製QX100 Droplet Readerシステム（商品名）により行い、データ処理はBioRad社製QuantaSoft Version:1.2.10.0（商品名）により行った。
【００３４】
ここで、用いたプライマーは次の通りであった。
フォワードプライマー(coreF1)   5' cgtggaaggcgRcaacctat 3'
リバースプライマー(Rmix)   5' cRcggggKgacaggagcca 3'
R: aとgの等量混合物
K: gとtの等量混合物
また、用いたプローブは、以下の４つのプローブの等量混合物(probe set 1)であった。
VIC-ctcgccggcccga-MGB （野生型検出用）
VIC-ctcgccgacccga-MGB （野生型検出用）
FAM-ctcgccagcccga-MGB（変異型検出用）
FAM-ctcgccaacccga-MGB（変異型検出用）
【００３５】
実施例２
測定精度の検討（その１）
実施例１において、野生型100.00%と判定された血清及び変異型100.00%と判定された血清並びにこれらの血清を所定の割合で混合した混合血清を調製し、人工的に、変異型％が0%、10％、30％、50％、70％、100％の血清を調製した。これらの血清について、実施例１と同じ方法により変異型％を測定し、調製時の変異型％との相関関係を調べた。なお、各測定は、同時に５回ずつ行った。結果を図１に示す。
【００３６】
図１に示すとおり、両者は非常によく一致しており、再現性も良好であった。
【００３７】
実施例３
測定精度の検討（その２）
実施例２と同様な方法により変異型％が0.005%〜10%である血清を人工的に調製し、実施例２と同様に調製時の変異型％との相関関係を調べた。なお、各測定は、同時に５回ずつ行った。結果を図２に示す。
【００３８】
図２に示すとおり、両者は非常によく一致しており、再現性も良好であった。この結果から、本発明の方法により、変異型％が0.005%と極めて少ない場合であっても変異型を検出可能であることが明らかになった。
【００３９】
実施例４
血清を用いたddPCR法でのダイナミックレンジの測定
53例のＣ型慢性肝炎患者のHCV-RNA定量値を測定した。Cobas TaqMan HCV法（The COBAS TaqManHCV Test,ｖ2.0（商品名））と、実施例１と同様なddPCR法で測定した。ddPCR法は、血清0.5ｍLを用い測定し、測定値core70 変異体のコピー数と野生型のコピー数を合計し血清ｍLあたりに換算した。それぞれの測定値は、図３に示すようによく相関した(R2=0.96)。ダイナミックレンジは、血清検体を用いた場合、約2から8  Logコピー/mLであった。
【００４０】
実施例５
ダイレクトシーケンスとの相関
177例のＣ型慢性肝炎患者について、実施例１と同様にしてddPCRを行い、変異型％を測定した。一方、同じ検体の一部を用いてダイレクトシーケンスを行い、野生型、変異型、混合型の判定を行った。結果を下記表２に示す。
【００４１】
【表２】
2015084704.tif 000004
【００４２】
実施例６
種々のプライマーを用いた測定（その１）
フォワードプライマーとして、以下の４種類のいずれかを用い、リバースプライマーとして以下の３種類のいずれかを用いた。HCVのcore領域の遺伝子配列、wild(野生型5' ctcgccggcccga3’配列を持つ )とMutant（変異型5'ctcgccagcccga3'配列を持つ）をクローニングしたプラスミド（HCV core 70アミノ酸の野生型と変異型をそれぞれ含む領域（-12〜343bp）をpCR 4-TOPO TA vector（商品名）を用いてTAクローニングしたプラスミド）をOD260nmから算出したコピー数から希釈してcore70Mutant（変異型）％を0.000％、0.005％、0.05％、0.498％に調整した。ddPCR自体は実施例１と同様にして行った。
【００４３】
フォワードプライマー
F1: 5' agaccgtgcaYcatgagcac 3'
F2: 5' aagcggtcRcaacctcg 3'
F3: 5' tgcgacaacctatccccaag 3'
coreF1: 5' cgtggaaggcgRcaacctat 3'（前掲）
リバースプライマー
R1: 5' tccgggctgagcccagg 3'
R2: 5' aaggagccatcctgccca 3'
Rmix: 5' cRcggggKgacaggagcca 3'（前掲）
Y: cとtの等量混合物
【００４４】
プライマーの組み合わせ及び測定結果を下記表３に示す。
【００４５】
【表３】
2015084704.tif 000005
【００４６】
表３に示されるように、ddPCRを用いた変異型％の測定の結果、理論値（サンプル調整した値）とddPCR測定値は一致し、プライマーを変更しても結果は、変わらなかった。
【００４７】
実施例７
種々のプライマーを用いた測定（その２）
実際の血清検体（サンプル）について、実施例６と同様に行った。結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
2015084704.tif 000006
【００４９】
表４の結果から、どのプライマーセットを用いた場合でも、測定結果はほとんど同じであることが明らかになった。
【００５０】
実施例８
種々のプライマーを用いた測定（その３）
HCVのcore領域の遺伝子配列、wild(野生型5’ ctcgccggcccga3’配列を持つ )とMutant（変異型5’ ctcgccagcccga3’配列を持つ）をクローニングしたプラスミドをOD260nmから算出したコピー数から希釈してcore70Mutant（変異型）％を0.000％(plasmid wild 2500)、0.005％(plasmid mix1)に調整した。ddPCRを用いた70mutant％の測定の結果、理論値（サンプル調整した値）とddPCR測定値は一致し、プライマーを変更しても結果は、ほとんど変わらなかった。
【００５１】
【表５】
2015084704.tif 000007
【００５２】
実施例９
His変異の検出
His変異は、塩基で“cat”でプローブ配列の真ん中でctcgccatcccgaとなり、各プローブと１〜2塩基一致していないが、正確にプローブセット１だけを用いて検出定量できていることを示した。すなわち、実施例１と同様なddPCR法により、Ｃ型慢性肝炎患者のHCV-RNA定量値を測定した。total 量として、他のサンプルと同時に測定しtotal HCV-RNA定量法であるCobasTaqMan(ロシュ)（実施例１参照）の同一サンプル測定結果と比較した。結果を下記表６及び図４に示す。なお、表６中、サンプル10026がHis変異を持つサンプルである。
【００５３】
【表６】
2015084704.tif 000008
【００５４】
図４に示されるとおり、変異のないサンプルとそん色なく相関直線に乗っているので、His変異についても正確に定量できることが示された。
実施例１０
デジタルＰＣＲ法
Applied Biosystems社のQuantStudio 3D デジタル PCR システム（商品名）を用い、基本的に実施例６と同様な実験を行った。用いたプライマーは、上記F2と上記Rmixであり、プローブは、上記プローブセット１であった。ＰＣＲ反応液の組成は次のとおりであった。
QuantStudio 3D（商品名）  Master Mix 15uL
5μM  プローブセット１  2μL
50μM プライマー混合物 (F2+Rmix) 0.2μL
精製水  7.8μL
合計 30μL
この３０μＬ中の１５μＬをQuantStudio 3D デジタル PCR システム（商品名）に供し、FAM及びVICからの蛍光強度をそれぞれ測定した。結果を下記表７に示す。
【００５５】
【表７】
2015084704.tif 000009
【００５６】
それぞれの配列１００％で、定量できるため、マイナー％  （最低でも1/3000程度）測定可能と考えられた。
【００５７】
実施例１０
TaqMan（商品名）法
プローブセット１を用い、変異型プラスミドの割合を0.01％、0.05％、0.1％、1.0％、10％、50％に調整し、TaqMan（商品名）を行った。反応組成は、FastStart TaqMan（商品名） Probe Master (Roshe) 11μＬ、各100μMプライマー0.18μL、プローブセット１(10μMプローブを等量ずつ混合した溶液)2μL、精製水3.14μL、DNA 5μLを混合しLightcycler 480IIシステム(商品名、ロシュ)で測定した。 PCRは95℃、10分、そして94℃、30秒-56℃,2min- 72℃、1分の70サイクルで行った。core70Mutant（変異型）％を0.01％、0.05％、0.1％、1.0％、10％、50％に調整し同時に測定し検量線を作成した。結果を図５に示す。
【００５８】
図５に示されるように、core70Mutant（変異型）％が１％以上であれば定量可能であることが示された。
【００５９】
実施例１１
ロックド核酸含有プローブを用いたddPCR
下記の４種類のプローブを含むプローブセットを用いた。各塩基配列中、大文字で記載されているヌクレオチドをLNA（商品名）とした。なお、変異型検出用は、5'末端の蛍光色素がFAMに代えてAlex532であるものも作製し、試験した。
VIC-tcGccGGcccg-MGB（第１の野生型）
VIC-tcGccGAcccg-MGB（第２の野生型）
FAM-tcGccAGcccg-BHQ1（第１の変異型）
FAM-tcGccAAcccg-BHQ1（第２の変異型）
ddPCRは、実施例１と同様に行った。結果を下記表８に示す。
【００６０】
【表８】
2015084704.tif 000010
【００６１】
実施例１２
IFN/RBV併用療法の予後予測への応用（その１）
治療前後で、変異型％上昇例では、治療抵抗性を示すHCVと予測できる。シーケンス法で野生型でも再治療でも予後不良の可能性がある。
【００６２】
IFN/RBV併用療法（４８週間+２４週間経過観察）の前後において、実施例１と同様な方法により変異型％を測定した。結果を表９に示す。
【００６３】
表９に示すように、IFN/RBV併用療法の前後において変異型の相対割合が２％以上減少した場合はTR（HCV-RNAの一過性消失）となった。またIL28B遺伝子のrs8099917がTTの場合で、IFN/RBV併用療法の前後において変異型の相対割合が３％以上増大している場合には、予後不良の可能性が高くなる。具体的には、変異型の相対割合が２％以上減少した例は全てTRとなった。今回検討した症例では、HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合が、３％以上増大している場合に、予後不良となったIL28BのSNP rs8099917,TT例が１例あった。つまり、IL28BのSNPがメジャーアレル（たとえばrs8099917,TT）であっても、IFN/RBV投与後に、HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合が３％以上増大した場合は、予後不良（Non Responder）と予測できる。よって、これらをまとめると、以下のように予後予測が可能となる。
１）HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合がIFN/RBV治療後で２％以上減少した場合は、NRとならない可能性が高いと予測できる。
２）HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合がIFN/RBV治療後で２％以上減少しないかった場合は、NRとなる可能性が高いと予測できる。
３）さらにIL28B  SNP  がメジャーアレル（たとえばrs8099917 TT）の場合は、HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合がIFN/RBV治療後で３%以上増大した場合は、NRとなる可能性が高いと予測できる。  
４）IL28B  SNP  がマイナーアレル（たとえばrs8099917 GT/GG）の場合は、 HCVコアタンパク質の第70アミノ酸の変異型の相対割合が２％以上減少しなかった場合は、NRとなる可能性が高いと予測できる。
【００６４】
【表９】
2015084704.tif 000011
48週、PEGIFN/RBV  24週  フォローアップ
Corea.a.70 アミノ酸変異％が、TR群は治療中、HCV-RNA消失し、治療後平均３４．０６％減少。NR群では、１６．５３％上昇していた。投与前後では、2％以上減少ではすべてTR(100%). rs8099917 TTでは、３％以上上昇では、１００％NR。
【００６５】
実施例１３
IFN/RBV併用療法の予後予測への応用（その２）
実施例９と同様にして、IFN/RBV併用療法の変異型％を測定し、その結果とIL28B遺伝子の変異との組み合わせにより、IFN/RBV併用療法の著効例(SVR)、再燃例(RR)及び無効例(NVR)の治療効果予測を行った。結果を表１０−１及び表１０−２に示す。
【００６６】
【表１０−１】
2015084704.tif 000012
【００６７】
【表１０−２】
2015084704.tif 000013
【００６８】
以上から、次のことがわかった。
1群  IL28B TT  ISDR変異数 0または1個では、変異型％が0.7％未満でSVRが高く、0.7％以上、20％未満では、RR、20％以上では、NVR率が高くなる。
2群  IL28B TT  ISDR変異数  2個以上では、SVR,RR率が高く、変異型％が１％未満では、SVRとなる確率が高い。
3群  IL28B GG/GTは、NVR率が高く、特に変異型％が25%以上では、SVR率が低い。
【００６９】
実施例１４
HCCでの関係
肝硬変を伴わない慢性Ｃ肝炎患者（CH)と肝硬変を伴う肝臓がん（HCC）患者で、ddPCRを用いて、変異型％の測定を行った。測定自体は実施例１と同様にして行った。IL28B（rs8099917）のSNPを同時に測定した。IL28B  TT型と GG/GT型に分け、また、Ｃ型慢性肝炎では、年齢を76歳以上と以下に分けた。
【００７０】
測定結果を図６に示す。76歳以上のＣ型慢性肝炎患者でIL28B  SNPがTT型である患者が最も変異型％が低く、Ｃ型慢性肝炎患者でIL28B  SNPがGG/GT型である患者より有意に低かった。また、肝臓がんにおいては、より変異型％が高くなった。さらに、肝臓がん（HCC）のIL28B遺伝子SNPがTT型よりGG/GT型のほうが変異型％が高く、平均でもこれらの群ではもっとも高かった。変異型％平均では、1群<3,4群<2群<5群となった。高齢（76歳以上）になってもHCCを発症せず、LC（肝硬変）を伴わない、経過良好のＣ型慢性肝炎症例でかつIFN治療成績が良好といわれるIL28BSNP TTの１群がもっとも変異型％が低く、IFN治療不良であるIL28B  GG/GTの５群が変異型％が最も高いことから、IL28B SNP型と本発明の方法を組み合わせて、Ｃ型慢性肝炎患者の肝臓がん発症の予測を行える。
【００７１】
また、ＲＯＣ解析の結果を表１１に示す。0.5〜２％をカットオフとし、特に1.75%(ROC解析)をカットオフとし、それ以上は肝臓がんになり易い。
【００７２】
【表１１】
2015084704.tif 000014
【図１】
2015084704.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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