(57)【要約】【課題】生体内におけるグルタチオン量を増強させることができるため、酸化ストレスが原因となる様々な疾病の治療や予防が期待できる内因性グルタチオン増強剤及びその製造方法を提供する。【解決手段】米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有する内因性グルタチオン増強剤である。また、アルカリ溶液を用いて米から抽出した米糠又は米由来のタンパク質を、アスペルギルス  オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解する前記内因性グルタチオン増強剤の製造方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有する内因性グルタチオン増強剤。
【請求項２】
ＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性剤である請求項１記載の内因性グルタチオン増強剤。
【請求項３】
概日リズム改善剤である請求項２記載の内因性グルタチオン増強剤。
【請求項４】
アルカリ溶液を用いて米から抽出した米糠又は米由来のタンパク質を、アスペルギルス  オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の内因性グルタチオン増強剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性グルタチオン増強剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、生体内で産生される抗酸化物質であり、酸化ストレスに対する防御をはじめ、細胞内における酸化還元状態の制御、毒物や薬物の解毒などの様々な生理作用を有することが知られている。
【０００３】
特許文献１には、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを有効成分として含有するジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤について記載されており、長期に連続して使用しても安全であり、小腸からの吸収性に優れ、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用が強く、しかも血中での安定性に優れているとされている。しかしながら、特許文献１には、グルタチオン増強剤として用いることについての記載はなかった。
【０００４】
特許文献２には、ホエーを有効成分として含む内因性メラトニン分泌リズムの位相調整又は振幅増強剤について記載されており、食経験のあるホエーを有効成分とするので、日常的に連用可能で、安全性に優れ、これらリズムの異常に起因すると考えられる非２４時間睡眠・覚醒症候群、時差症候群、後退勤務症候群、睡眠時無呼吸症候群、中高年期睡眠障害等の睡眠障害や入眠潜時障害等の予防又は改善が期待できるとされている。しかしながら、特許文献２には、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物についての記載もなく、グルタチオン増強剤についての記載もなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−４０１１１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０９４８４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、生体内におけるグルタチオン量を増強させることができるため、酸化ストレスが原因となる様々な疾病の治療や予防が期待できる内因性グルタチオン増強剤及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有する内因性グルタチオン増強剤を提供することによって解決される。
【０００８】
このとき、前記内因性グルタチオン増強剤が、ＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性剤であることが本発明の好適な実施態様である。また、前記内因性グルタチオン増強剤が、概日リズム改善剤であることも本発明の好適な実施態様である。
【０００９】
また、このとき、アルカリ溶液を用いて米から抽出した米糠又は米由来のタンパク質を、アスペルギルス  オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解することを特徴とする内因性グルタチオン増強剤の製造方法を提供することも本発明の好適な実施態様である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、内因性グルタチオン増強剤及びその製造方法を提供することができる。本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有するものであり、生体内におけるグルタチオン量を増強させることができる。したがって、酸化ストレスが原因となる様々な疾病の治療や予防が期待できる。また、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠タンパク又は米タンパクをタンパク質分解酵素で分解して製造されるので、効率よく大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果を示す図である。
【図２】実施例２において、ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果を示す図である。
【図３】実施例３において、ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果を示す図である。
【図４】実施例４において、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果を示す図である。
【図５】実施例４において、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果を示す図である。
【図６】実施例５において、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いたＮＡＴ活性増強効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有するものである。米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有することにより、生体内におけるグルタチオン量を増強させることができる。したがって、酸化ストレスが原因となる様々な疾病の治療や予防が期待できる。ここで、本発明者らは、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物がペプチドであることを確認している。したがって、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来のタンパク質を加水分解物してなるペプチドを有効成分として含有するものである。
【００１３】
本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米から抽出した米糠又は米由来のタンパク質を原料とするが、米としては、品種、種類、精米方法に限定されず、ジャポニカ米、インディカ米など種々の米を用いることができる。米糠は、通常大量に廃棄されるものであるので、グルタチオン増強作用に優れることに加え、原料ソースの点でも好ましい。原料として米糠を用いる場合は脂質成分を除去することが好ましい。
【００１４】
脱脂の方法としては特に制限されるものではなく、機械搾油、溶剤による抽出方法などを用いることができる。食品に用いられるためには、残留してはならないヘキサンなどの溶剤を用いることは避けるべきであり、かかる観点からは、機械搾油やエタノールを用いた抽出により脂質を除去することが好ましい。
【００１５】
本発明の内因性グルタチオン増強剤に使用される米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を製造するには、まず、米糠又は米から、米糠タンパク又は米タンパクをアルカリ溶液で溶出させる。アルカリ溶液としては、ｐＨを１２．５近辺に調整したＮａＯＨ水溶液を用い、この溶液に米糠又は米などを添加し、４０〜６０℃の温度で撹拌しながら２〜５時間程度抽出する。次いで、遠心分離機などの分離手段でろ液とろ過物とに分離し、１〜２Ｎの希塩酸でろ液のｐＨを４に調整し、タンパク質を沈殿させ、減圧乾燥などで乾燥させて米糠タンパク又は米タンパクを得ることができる。タンパク質を得る方法はこれに限定されるものではなく、酵素により糖質、セルロース等を水溶化して得ても良い。
【００１６】
得られた米糠タンパク又は米タンパクを蒸留水に懸濁し、５ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨを７．０〜８．０に調整した後、タンパク質分解酵素を加え、４０〜５０℃で１２〜２４時間反応を行う。次いで、酵素を失活させ、液体窒素で凍結乾燥して米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を得ることができる。すなわち、本発明において、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物は、タンパク質分解酵素により加水分解されることで得られるものである。
【００１７】
タンパク質分解酵素としては、ペプシン、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢなど市販のタンパク質分解酵素を使用することができるが、具体的には、ビオプラーゼＳＰ、デナチームＡＰ、プロテアーゼＰ、ペプチターゼＲ、ウマミザイムＧなどを挙げることができる。なかでも、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のタンパク質分解酵素を用いることにより、得られる米糠又は米由来のタンパク質加水分解物によるグルタチオン増強効果が高くなる利点を有するため好ましい。
【００１８】
アスペルギルス  オリゼ由来のタンパク質分解酵素としては、ペプチターゼ及びプロテアーゼを有する上述の市販のウマミザイムＧ（至適ｐＨ８．０、中性付近で有効に作用し、至適温度４５℃）、及びアスペルギルス  オリゼが生産するプロテアーゼを製剤化したデナチームＡＰ（至適ｐＨ７．０、至適温度５０℃）を挙げることができる。これらの酵素を用いることにより、グルタチオン増強効果が高い本発明の内因性グルタチオン増強剤を得ることができる。また、これらの酵素を用いると、タンパク質加水分解物の収率が５０％以上を示す点でも好ましい。したがって、アルカリ溶液を用いて米から抽出した米糠又は米由来のタンパク質を、アスペルギルス  オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解する内因性グルタチオン増強剤の製造方法が本発明の好適な実施態様である。
【００１９】
本発明において、内因性グルタチオン増強剤に含まれる米糠又は米由来のタンパク質加水分解物の含有量としては特に限定されないが、終濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍＬとなるように添加されることが好ましい。終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ未満の場合、グルタチオン増強効果が得られないおそれがあり、０．５ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以上であることが更に好ましく、３ｍｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。一方、終濃度が１００ｍｇ／ｍＬを超える場合、不溶になるおそれがあり、５０ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であることが更に好ましい。
【００２０】
本発明の内因性グルタチオン増強剤は、例えば経口的に投与して、生体内におけるグルタチオン量を増強させることができる。経口投与に用いる本発明の内因性グルタチオン増強剤の剤形は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、タブレット剤、トローチ剤、舌下剤、液剤などが可能である。また、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、各種食品、各種飲料に添加して用いることもできるし、サプリメントとして用いてもよい。
【００２１】
本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分として含有する。前記タンパク質加水分解物は、生体内におけるグルタチオン量を増強させることができ、安全性が高く、数々の医薬品、特定用保健食品、機能性食品等への利用が期待できる。本発明の内因性グルタチオン増強剤は、安価に入手することができるという利点があり、実用上極めて利用価値が高い。また、後述する実施例で示されているように、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、ＮＡＴ活性を増強させることができる。したがって、ＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性剤であることが本発明の好適な実施態様であり、概日リズム改善剤であることが本発明のより好適な実施態様である。このように、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、ＮＡＴ活性剤や概日リズム改善剤として用いられることにより、睡眠障害や入眠潜時障害等の各種症状を予防又は改善することが可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を用いて本発明の内因性グルタチオン増強剤を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明において、用いた方法を以下に記載した。
【００２３】
（グルタチオンの定量方法１）
Analytica Chimica Acta, 205 (1988) 29-41に記載された方法に準じてグルタチオンの定量を以下のようにして行った。下記細胞内グルタチオンの抽出における方法に従って得られた細胞抽出液５０μＬに、０．２％ＡＢＤ−Ｆ（4-fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan）溶液（５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）に溶解）を２５０μＬ加え、６０℃、５分間反応させた。冷却後、酢酸エチル５００μＬ加え攪拌し１５，０００ｒｐｍ、４℃、１分間遠心後、酢酸エチル層を取り除いた。この操作を３回行い、未反応のＡＢＤ−Ｆを除去した。水層に２％ＳＢＤ−Ｆ（4-fluoro-7-sulfobenzofurazan, ammonium salt）溶液（５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）に溶解）、１０％ＴＢＰ(tri-n-butylphosphine)溶液（２−プロパノール／アセトニトリル（２:９８）で希釈）をそれぞれ２５μＬずつ加え、６０℃、２０分間反応させた。冷却後、４Ｍ  ＨＣｌを５０μＬ加え反応を停止させた。これをＨＰＬＣの試料とした。ＨＰＬＣによる分析には、ＯＤＳカラムを使用し、移動層は７５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）、アセトニトリルを用いた。移動層中のアセトニトリル濃度を１％から１５％まで段階的に上昇させ、蛍光誘導体化したグルタチオンを分離した。検出には、蛍光検出器（励起波長：３８０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）を用いた。
【００２４】
（グルタチオン上昇活性の測定）
ヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２を１．５×１０５ｃｅｌｌ/ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培地交換後、被験物質を終濃度２．５、５、１０ｍｇ/ｍＬになるように添加し、２４時間共培養した。培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳで二回洗浄後、細胞をセルスクレーパーで回収した。
【００２５】
（細胞内グルタチオンの抽出）
回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ  ＢＡＰＳ／０．１Ｍ  ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。
【００２６】
（グルタチオンの定量方法２）
細胞内グルタチオンの定量はＤＴＮＢ法を用いて行った。１５ｍＬの１２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５、６．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）、５ｍＬの６ｍＭ  ＤＴＮＢ、１０μＬの１０００ｕ／ｍＬグルタチオンレダクターゼを混合し反応液とした。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに、８０μＬのグルタチオン標準液または細胞抽出液と、８０μＬの反応液とを添加した。さらに、４０μＬの１．０５ｍＭ  ＮＡＤＰＨを添加して反応を開始し、プレートリーダーのカイネティックモード（吸光度４０５ｎｍ）で１分３０秒測定した。その反応速度からグルタチオン量を計算した。
【００２７】
（脱脂米糠の製造）
精米工場からの生糠を７０〜１００℃に加熱することにより、生糠に残留するリパーゼを失活させ、油が絞りやすい状態にしてレイノルズ社（ドイツ）製の搾油機ＡＰ１４／２２を用いて搾油した。圧搾された油と（半）脱脂米糠を分離し、半脱脂米糠には３〜５倍量のエタノールを入れ、３０〜６０℃で０．５〜４時間撹拌し、その後５Ａの濾紙にてろ過した。この撹拌とろ過を再度繰り返し、半脱脂米糠を７０℃以下の通風乾燥機で半脱脂米糠の水分が５％以下になるように乾燥し、脱脂米糠を得た。
【００２８】
（米糠タンパクの調製）
２５０ｍｌの水に１．０ｇのＮａＯＨを溶解し、ｐＨを１２．５付近に調整したアルカリ溶液に上記のようにして得た脱脂米糠２５ｇを加え、４５℃の温度で攪拌しながら２時間抽出した。遠心分離機により、ろ液とろ過物に分け、ろ過物にさらに上記アルカリ溶液を２５０ｍｌ加え、同様に抽出した。得られたろ液を併せて１〜２規定の希塩酸でｐＨ４に調整することにより、タンパク質を溶液中に沈殿させた。これを再度、遠心分離機でろ液とろ過物に分けた後、ろ過物を４０℃で減圧乾燥して米糠タンパクとして回収した。得られた米糠タンパクのタンパク含量はデュマ法で７７．３％であった。
【００２９】
（ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞の作成）
動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ライフテクノロジーズ社製）に、ヒト由来セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）遺伝子を、Ｃ末端にｍｙｃタグが付加するように組み込んだものを作成した。このベクターを、Journal of Biological Chemistry, 276(26), 24097-24107(2001)に記載された方法と同様にして、アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞にリポフェクトアミン２０００試薬（ライフテクノロジーズ社製）を用いて形質転換し、ＮＡＴ発現細胞（ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞）を得た。
【００３０】
（ＮＡＴ活性の測定方法）
Journal of Biological Chemistry, 277(46), 44229-44235(2002)に記載された方法に準じてＮＡＴ活性の測定を以下のようにして行った。ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を、１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培地交換後、被験物質を終濃度５ｍｇ／ｍＬになるように添加し、２４時間共培養した。その後培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳで一回洗浄後、細胞を回収した。回収したＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を、終濃度１．５ｍＭアセチルＣｏ−Ａを含む０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍＬ加えホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清７５μＬに対し、６ｍＭアセチルＣｏ−Ａおよび８ｍＭトリプタミンを含む０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２５μＬ加え、３７℃、１５分間反応させた。その後、氷冷したトルエン／イソアミルアルコール／１Ｎ塩酸混液（９９：０．６６：０．３３）を１ｍＬ加えることによって、反応を停止させた。反応混合液を、３０秒間激しく振とう後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。遠心後、有機溶媒相を７５０μＬ回収し、溶媒を遠心エバポレーターで留去した。得られた乾燥物を、０．１ｍＬのＨＰＬＣ用移動相（５０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ４．３，３５％メタノール）に溶解し、生成したＮ−アセチルトリプタミンをＨＰＬＣにより定量することにより、ＮＡＴ活性を測定した。ＨＰＬＣの分析には、カラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を、ＨＰＬＣ用移動相に５０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ４．３，３５％メタノール（流速１ｍＬ／分）を用いた。検出には、蛍光検出器（励起波長：２８５ｎｍ、蛍光波長：３６０ｎｍ）を用いた。
【００３１】
実施例１
（ウマミザイムＧによる米糠由来タンパク質加水分解物の調製）
上記で得た米糠タンパク２ｇをプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍＬに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。ウマミザイムＧ（アマノエンザイム社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４５℃に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、ウマミザイムＧによる米糠由来タンパク質加水分解物１．２ｇ（収率７２．７％）を得た。
【００３２】
（ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果の評価）
得られた米糠タンパクのウマミザイムＧによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物と、比較対象として、大豆タンパク（不二製油社製、フジプロＥ）を同様にウマミザイムＧにより消化して得たタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度に対する影響を検討した。１．５×１０５／２ｍＬ／３５ｍｍ  ｄｉｓｈで、ＨｅｐＧ２細胞を４８時間培養した後、各サンプルを、終濃度５ｍｇ／ｍＬになるように培地に加え、２４時間培養し、細胞を回収した。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ  ＢＡＰＳ／０．１Ｍ  ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。グルタチオンの定量は、上記定量方法１に従って行った。得られた結果を図１に示す。
【００３３】
実施例２
（ウマミザイムＧによる米由来タンパク質加水分解物の調製）
米タンパク２ｇ（オリザ油化社販売、オリザプロテイン−Ｐ７０）をプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍｌに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。ウマミザイムＧ（アマノエンザイム社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４５℃に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、ウマミザイムＧによる米由来タンパク質加水分解物１．０ｇ（収率７２．５％）を得た。
【００３４】
（ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果の評価）
得られた米タンパクのウマミザイムＧによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、実施例１と同様にして、ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度に対する影響を検討した。１．５×１０５／２ｍＬ／３５ｍｍ  ｄｉｓｈで、ＨｅｐＧ２細胞を４８時間培養した後、サンプルをそれぞれ終濃度０、２．５、５、７．５、１０ｍｇ／ｍＬとなるように培地に加え、２４時間培養し、細胞を回収した。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ  ＢＡＰＳ／０．１Ｍ  ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。グルタチオンの定量は、上記定量方法１に従って行った。得られた結果を図２に示す。
【００３５】
実施例３
（デナチームＡＰによる米由来タンパク質加水分解物の調製）
米タンパク２ｇ（オリザ油化社販売、オリザプロテイン−Ｐ７０）をプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍＬに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。デナチームＡＰ（ナガセケムテックス社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４０℃に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、デナチームＡＰによる米由来タンパク質加水分解物０．２３ｇ（収率５６．９％）を得た。
【００３６】
（プロテアーゼＰによる米由来タンパク質加水分解物の調製）
米タンパク２ｇ（オリザ油化社販売、オリザプロテイン−Ｐ７０）をプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍＬに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。プロテアーゼＰ（アマノエンザイム社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４０℃に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、プロテアーゼＰによる米由来タンパク質加水分解物０．２４ｇ（収率４７．５％）を得た。
【００３７】
（ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果の評価）
実施例２で得られた米タンパクのウマミザイムＧによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物および、米タンパクのデナチームＡＰあるいはプロテアーゼＰによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、実施例１と同様にして、ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度に対する影響を検討した。ヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２を１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培地交換後、被験物質を終濃度２．５、５、１０ｍｇ／ｍＬになるように添加し、２４時間共培養した。培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳで二回洗浄後、細胞をセルスクレーパーで回収した。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ  ＢＡＰＳ／０．１Ｍ  ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。細胞内グルタチオンの定量は、上記定量方法２に従って行った。得られた結果を図３に示す。
【００３８】
実施例４
（ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果の評価）
実施例２で得られた米タンパクのウマミザイムＧによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物および、実施例３で得られた米タンパクのデナチームＡＰによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、実施例３における評価方法と同様にして、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞内のグルタチオン濃度に対する影響を検討した。ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培地交換後、被験物質を終濃度２．５、５、１０ｍｇ／ｍＬになるように添加し、２４時間共培養した。培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳで二回洗浄後、細胞をセルスクレーパーで回収した。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ  ＢＡＰＳ／０．１Ｍ  ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。細胞内グルタチオンの定量は、上記定量方法２に従って行った。得られた結果を図４及び図５に示す。
【００３９】
実施例５
（ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いたＮＡＴ活性増強効果の評価）
実施例１で得られた米糠タンパクのウマミザイムＧによるタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物および、比較対象として、大豆タンパク（不二製油社製、フジプロＥ）を同様にウマミザイムＧにより消化して得たタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞内のＮＡＴ活性に対する影響を検討した。前述したＮＡＴ活性の測定方法に従って、ＮＡＴ活性の測定を行った。得られた結果を図６に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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