(57)【要約】【課題】心不全の重症度を低侵襲に経時的かつ簡便に可視化又は定量化できるモデル動物を提供すること、並びに、モデル動物の心不全重症度を低侵襲に経時的、正確かつ簡便に評価する方法を提供すること。【解決手段】心不全で誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、非ヒトトランスジェニック動物。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全で誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である請求項１に記載の動物。
【請求項３】
前記発現制御遺伝子領域が、配列番号１の塩基配列である請求項１又は２に記載の動物。
【請求項４】
ルシフェリンの発光により心不全重症度を可視化する請求項１〜３のいずれか１項に記載の動物。
【請求項５】
非ヒト動物が、げっ歯類である請求項１〜４のいずれか１項に記載の動物。
【請求項６】
げっ歯類が、マウス又はラットである請求項５に記載の動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定することにより心不全重症度を評価する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、循環器疾患薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
心不全で誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、in vitro細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、循環器疾患薬のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬研究等において使用する、心不全の重症度を経時的に正確に測定可能なモデル動物、並びにその心不全重症度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化が進む今日の社会では、心不全患者数は増加の一途をたどっているが、現状では有効な治療法は限られている。
【０００３】
心不全とは、一般的に、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、心筋症、高血圧症等の様々な原因により心臓の機能が低下した病態を指す。現在、このような心不全を診断するためのバイオマーカーとして、心房性利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びその前駆タンパク質ｐｒｏＢＮＰ等が知られており（非特許文献１）、これらのマーカーを測定することで、患者が心不全であるか否か、あるいはその重症度がどの程度かを知ることができる。
なお、ＡＮＰ及びＢＮＰは、心不全の際に心臓において強くその発現が誘導されるタンパク質であるが、どのような因子によって発現が誘導されるかについては、未だ解明されていない。
【０００４】
薬剤の生体内スクリーニングに最も適している系はマウスである。しかしながら、マウスの心不全の程度を評価するために、ＢＮＰ及び／又はＡＮＰを測定しようとすると、ほぼ致死量の採血をしなければならない。したがって、測定の度にマウスを殺処分することとなり、経時的な測定は不可能である。
【０００５】
マウスの心不全の状態を経時的に評価する方法としては、心エコー法による左心室壁運動評価及び心臓カテーテルによる左心室内圧測定が知られているが（非特許文献２及び３）前者にはマウスの心臓の小ささや心拍数の高さ等のために測定自体が難しいことから正確な評価が困難であるという問題、後者には手技自体が非常に難しいため実施者の技能によって結果が左右されるという問題がある。そのため、従来の方法では、マウスの心不全の程度を、低侵襲、経時的にかつ正確に評価することは実質的にできていなかった。
【０００６】
また、創薬においては、開発中の薬剤が臨床応用された段階で初めて、心不全を引き起こす等の心毒性を有していることが確認される場合もある（例えば、非特許文献４）。薬剤の心毒性を適確に評価できる技術が開発されれば、開発した薬剤による早期の心臓毒性予測が可能となりより安全性の高い創薬研究が可能となる。
【０００７】
そのため、心不全をはじめとする循環器疾患の創薬研究の発展を期すために、マウス等の小動物において、低侵襲であり経時的かつ正確で簡便に病態評価が可能となる技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】L.S. Nielsen, et al., “N-terminal pro-brain natriuretic peptide for discriminating between cardiac and non-cardiac dyspnoea” Eur J Heart Fail, 6 (2004), pp. 63-70
【非特許文献２】Gardin JM, et al., “Leinwand LA. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice.” Circ Res 1995; 76: 907-914.
【非特許文献３】Pacher P, et al., “Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.” Nat Protoc. 2008;3(9):1422-34.
【非特許文献４】Slamon DJ, et al., “Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.” N Engl J Med. 2001 Mar 15;344(11):783-92.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記状況に鑑み本発明者らは、心不全の重症度を低侵襲に経時的かつ簡便に可視化又は定量化できるモデル動物を提供すること、並びに、モデル動物の心不全重症度を低侵襲に経時的、正確かつ簡便に評価する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、心不全の際に心臓において増加するＢＮＰに関して、ＢＮＰをコードする遺伝子発現の増大に関与する遺伝子領域（発現制御遺伝子領域）の配列の同定に成功した。そして、この発現制御遺伝子領域とレポーター遺伝子とを含有する塩基配列をマウスに導入することで、外部からの測定によって心不全の重症度を可視化、定量化ができることを見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）  心不全で誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、非ヒトトランスジェニック動物。
（２）  前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である前記（１）に記載の動物。
（３）  前記発現制御遺伝子領域が、配列番号１の塩基配列である前記（１）又は（２）に記載の動物。
（４）  ルシフェリンの発光により心不全重症度を可視化する前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の動物。
（５）  非ヒト動物が、げっ歯類である前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の動物。
（６）  げっ歯類が、マウス又はラットである前記（５）に記載の動物。
（７）  前記（１）〜（６）のいずれかに記載の動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定することにより心不全重症度を評価する方法。
（８）  前記（１）〜（６）のいずれかに記載の動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、循環器疾患薬のスクリーニング方法。
（９）配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、循環器疾患薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のトランスジェニック動物を用いることで、低侵襲、経時的かつ簡便に心不全病態の重症度を定量化して評価できる。そのため、本発明によれば、循環器系創薬開発研究に重要な動物モデル、心不全の重症度の評価方法、及び循環器系創薬のスクリーニング方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、minimalＣＭＶプロモーターにＬａｃＺレポーターとルシフェラーゼレポーターが挿入されたベクターのマップを示す。
【図２】図２は、配列番号１を含むマウスゲノムＢＡＣ (clone RP23-128E8, BACPAC Resources Center)をテンプレートにして、配列番号２及び配列番号３のプライマーでＰＣＲを行い、レポーターベクターのminimal ＣＭＶプロモーターの上流にある制限酵素サイト(EcoRI, SpeI)にサブクローニングして得られたベクターのマップを示す。
【図３】図３は、実施例１及び２において受精卵又はin vitro培養細胞に導入したコンストラクトを示す。
【図４】図４は、試験例１の結果を示す。ａ）は、大動脈縮窄術（ＴＡＣ）による心不全の進行を、マウス心臓部のルシフェリン発光を撮影して比較した図である。ｂ）は、ルシフェリン発光を定量化したグラフである。
【図５】図５は、試験例２の結果を示す。ａ）は、フェニレフリンの投与による心肥大の様子を、マウス心臓部のルシフェリン発光を撮影して比較した図である。ｂ）は、ルシフェリン発光を定量化したグラフである。
【図６】図６は、実施例２で用いたｐＭｄ２．Ｇベクターのマップを示す。
【図７】図７は、実施例２で用いたｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥベクターのマップを示す。
【図８】図８は、実施例２で用いたｐＲＳＶ−Ｒｅｖベクターのマップを示す。
【図９】図９は、試験例３の結果を示す。ａ）は、実施例３で作成した細胞が、フェニレフリンの添加によって有意にルシフェラーゼ発現を増加させた結果を示す。ｂ）は、ＣＲ９（配列番号１）の塩基配列のみがフェニレフリン感受性であったことを示す。なお、＊は統計学的に有意な差があったことを示す。
【図１０】図１０は、哺乳類における進化保存領域と、全ゲノムクロマチン免疫沈降シーケンス（ＣｈＩＰ−シーケンス）で得られたネズミのＮｐｐａ及びＮｐｐｂの位置する領域の周辺のデータを示す。
【図１１】図１１は、ＣＲ９が、実際に転写が活性化しているときにはゲノムが曲がってＡＮＰ及びＢＮＰのすぐ近くまで寄ってきていることを示しており、ＡＮＰ及びＢＮＰの両方の発現を制御していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００１５】
真核生物の遺伝子発現は正確にコントロールされており、ＤＮＡ複製のようにすべての細胞で全か無かの法則で調節されるのではなく非常に選択的である。遺伝子発現は、遺伝子が転写、翻訳されてタンパク質になるまでの数多くの過程で調節されうる。
【００１６】
遺伝子の転写は、ＲＮＡポリメラーゼが転写開始領域の遺伝子に結合することで開始される。しかし、真核生物のＲＮＡポリメラーゼだけでは転写開始領域の遺伝子に結合できず、転写因子と呼ばれる様々な調節タンパク質が組み立てられて初めて転写が開始される（Lee TI, et. al., “transcription of eukaryotic protein coding genes” Annu Rev Genet. 2000; 34: pp.77-137）。前記転写因子が結合する遺伝子領域は特定の配列を有しており、「発現制御遺伝子領域」とも呼ばれる。
【００１７】
本発明において、「発現制御遺伝子領域」の「発現制御」とは、例えば、遺伝子発現の増幅又は増強に関与すること、遺伝子の転写開始に関与する又は遺伝子転写量の増大に関与することを意味する。また、「発現制御遺伝子領域」の「遺伝子領域」とは、塩基配列を意味する。
【００１８】
本発明のひとつの態様は、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を可視化及び定量する方法に関する。本態様においては、心臓において産生されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子（以降、それぞれをＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子ともいう。）の発現を制御する遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている、非ヒトトランスジェニック動物を用いる。なお、前記非ヒトトランスジェニック動物も、本発明のひとつの態様である。
【００１９】
前記ＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域は、ＡＮＰ遺伝子、ＢＮＰ遺伝子のいずれか一方、又は両方の発現を制御するものであってよい。本発明のひとつの好ましい態様において、前記発現制御遺伝子領域は、ＡＮＰ遺伝子及びＢＮＰ遺伝子の両方の発現を制御する。
【００２０】
前記ＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域は、心臓におけるＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現を制御する遺伝子領域であれば特に限定されないが、配列番号１の塩基配列であるものが好ましい。配列番号１の塩基配列の発現制御遺伝子領域は、本発明において初めて同定されたものであり、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を誘導する。なお、Sonisha Aらが２０１１年に発見したＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域（Sonisha A, et. al., “Differential Role of Nkx2-5 in Activation of the Atrial Natriuretic Favtor Gene in the Developing versus Failing Heart” MOLECULER AND CELLULAR BIOLOGY, Nov. 2011,pp.4633-4645を参照。）は、受精卵の発生初期のＡＮＰ及びＢＮＰの発現には関与するが、成マウスの心不全となった心臓において上昇するＡＮＰ及びＢＮＰの発現には関与しない。
【００２１】
本発明において、前記「レポーター遺伝子」は、導入したＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域に転写因子が結合して転写が行われることで発現する遺伝子を包含する。導入された発現制御遺伝子領域に結合する転写因子は、好ましくは、心不全の状態において心臓でＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を誘導する因子である。あるいは、前記転写因子は、心不全の状態に応じて心臓で特異的に増加する因子である。したがって、本発明の好ましい態様においては、心臓で発現するＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量と前記レポーター遺伝子の発現量は正の比例関係を示す。すなわち、本態様においては、レポーター遺伝子の発現量を測定することで、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量を評価することができる。さらには、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量から心不全の重症度を評価することができる。
【００２２】
レポーター遺伝子は、その発現が検出可能である限り、特に制限されない。レポーター遺伝子の発現は、転写物、翻訳産物、または翻訳産物の活性もしくは機能を検出することによって直接的または間接的に検出することができる。レポーター遺伝子としては、公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができ、特に限定されないが、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、β-D-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子などが挙げられる。レポーター遺伝子は、単独で又は２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２３】
本発明のひとつの好ましい態様においては、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子を用いる。ルシフェラーゼ遺伝子を用いると、例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリンアッセイ法により、生細胞、組織、器官、さらには個体における遺伝子の発現を実時間で検出することができ、遺伝子発現量の定量もできることから好ましい（例えば、G. Zhang et. al., “Bioluminescent imaging of Cdk2 inhibition in vivo” NATURE MEDICINE Vol.10, No.6, June 2004: 643-648等を参照。）。本態様においては、レポーター遺伝子として、さらに、ルシフェラーゼ遺伝子以外のレポーター遺伝子を１以上用いてもよい。
【００２４】
本発明の別のひとつの態様は、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を可視化及び定量することによって、心不全の重症度を評価する方法に関する。ＡＮＰ及びＢＮＰは心不全の状態となった際に、心臓においてその発現が強く誘導される。前記非ヒトトランスジェニック動物を用いて、発現が誘導されたＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現を可視化及び定量することによって、心不全の重症度を評価することができる。すなわち、好ましいひとつの態様において、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の際に心臓において発現されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰを測定することにより心不全の重症度を評価する。
【００２５】
より好ましい態様において、配列番号１の塩基配列、及び、レポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の重症度を評価する。レポーター遺伝子は、特に限定されず、例えば、上記したものを使用してもよい。
【００２６】
さらにより好ましい態様において、配列番号１の塩基配列、並びに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、β-D-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子及び緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子からなる群から選択される１以上のレポーター遺伝子を含有する塩基配列が導入されている非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の重症度を評価する。
【００２７】
本発明の特に好ましい態様においては、配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列が導入された非ヒトトランスジェニック動物を用いて、心不全の重症度を、ルシフェリン発光で可視化することによって評価する。
【００２８】
次に、本発明において、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合における、心不全重症度の評価方法について具体的に説明する。
【００２９】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物において、心臓におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現は、好ましくは、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現量に比例する。そのため、非ヒトトランスジェニック動物の心臓において発現するルシフェラーゼ遺伝子の発現量を定量することで、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現量を評価することができる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定する方法は、特に限定されないが、この分野において通常用いられる公知の方法を用いることができる。例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリンアッセイ法等に基づいて測定することができる。具体的には、非ヒトトランスジェニック動物に、発光基質であるルシフェリンを腹腔内あるいは静脈内に投与して、ルシフェラーゼとルシフェリンの反応によって生じる発光を測定し、ルシフェリンの発光量を定量することで、ルシフェラーゼ遺伝子を定量してもよい（ルシフェラーゼアッセイのより詳しい操作手順等については、例えば、C.E.Burd, et. Al., “Monitoring Tumorigenesis and Senescence In Vivo with a p16INK4a-Luciferase Model” Cell 152, 340-351, Jan. 17, 2013を参照のこと。）。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現量が高いほど、すなわち、ルシフェリンの発光量が多いほど、心不全の重症度が高いと評価できる。
【００３０】
ルシフェリン発光量の測定は、具体的には、例えばインビボ（in vivo）イメージングシステム (IVIS Lumina II（登録商標）、Caliper Life Sciences)を使用して、撮影することで行ってもよい。また、ルシフェリン発光量の定量は、例えば、Living Image 4.0解析ソフトを使用して、測定場所をROIで囲み、発光量をrelative light units (RLU/min)で表示することで行うことができる。
より詳しくは、後記する実施例に記載の方法により測定してもよい。
【００３１】
本発明の別のひとつの好ましい態様において、心臓部のルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、心臓部のルシフェリン発光量の測定値を、心臓部以外の部位におけるルシフェリン発光量の測定値によって補正することで評価してもよい。例えば、心臓以外の部位で特異的に発現する遺伝子の発現制御遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ遺伝子が導入されていれば、心臓以外の部位においてルシフェラーゼが発現することが期待される。そのような心臓以外の部位におけるルシフェラーゼの発現量は、心不全によって発現が誘導されるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの発現量には依存しないため、誤操作などによりルシフェリンの投与量に誤差が生じた場合であっても、補正をかけることによって、精度よく心臓部のルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することができる。
【００３２】
また、本発明のひとつの態様は、非ヒトトランスジェニック動物に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリンの発光量を測定する工程を含む、創薬スクリーニング方法に関する。本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いることで、経時的に心不全重症度を評価することができるため、例えば、心不全の重症度に応じた治療薬、改善薬、予防薬等の開発が可能となる。本発明の前記創薬スクリーニング方法を用いることで、例えば、罹患人口の多い高血圧性心肥大（拡張不全）や軽度心不全にならば使用できるという薬剤のみをスクリーニングすることができる。
スクリーニングは、例えば、施術により大動脈縮窄又は心肥大の状態にした非ヒトトランスジェニック動物に対し、薬剤、好ましくは循環器疾患薬を投与し、薬剤の投与前後の心臓部のルシフェリン発光量を測定して、その発光量を比較することで行ってもよい。例えば、薬剤の投与後にルシフェリン発光量を減少させた薬剤は、ANP/BNPの発現を低下させる。つまり心不全を改善させる薬剤として効果を示すことが期待される。また、例えば、ルシフェリン発光量を増加させた薬剤は、ANP/BNPの産生誘導剤として効果を示すことが期待される薬剤のスクリーニングは、他の評価方法を併せて実施して総合的に評価することが好ましい。前記他の評価方法としては、例えば、心エコー法による左室壁運動評価、心臓カテーテルによる左心室内圧測定、病理組織学的検査、遺伝子発現検査等が挙げられる。
【００３３】
また、本発明のトランスジェニック動物を用いることで心機能を鋭敏に測定できることから、従来困難であった生体内での薬剤の心毒性効果についての評価にも、本発明のスクリーニング方法を適用することできる。心毒性効果の評価は、例えば、評価したい薬剤の投与前後の心臓部のルシフェリン発光量を測定して、その発光量を比較することで行ってもよい。例えば、薬剤の投与後にルシフェリン発光量を増加させた薬剤は、心毒性を有する可能性が高いと考えられる。薬剤が心毒性を有するか否かの評価は、他の評価方法を併せて実施して総合的に評価することが好ましい。前記他の評価方法としては、例えば、心エコー法による左室壁運動評価、心臓カテーテルによる左心室内圧測定、病理組織学的検査、遺伝子発現検査等が挙げられる。
【００３４】
本発明によれば、心不全の重症度又は病期別に試験動物を分類することができるため、心不全という非常に幅広い病態に対して、開発薬剤の投与時期を分別して投与試験を行うことができ、また、ヒト疾患への応用、前臨床を進めるに当り、どのような心不全群に対してどのような薬剤開発を行うことが有効か、事前に判断することができる。
【００３５】
続いて、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の作成方法について、具体的に説明する。より詳細な方法については、後記の実施例に記載する。
【００３６】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、従来公知の方法（例えば、（財）東京都臨床医学総合研究所 実験動物研究部門 編「マウスラボマニュアル」シュプリンガー・フェアラーク東京（株）, 1998年12月14日, pp.225-245、Animal Biotechnology, 1, 175−84, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)）に基づいて作製することができる。具体的には、例えば、導入遺伝子を非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作成することができる。
【００３７】
遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いてもよい。また、培養細胞への遺伝子導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等の公知方法を用いてもよい。
【００３８】
例えば、マイクロインジェクション法を用いた場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶かしたベクターをマイクロピペットで受精卵に注入し、この卵をホルモン処理（ＰＧＦ２α、ｈＣＧ、エストラジオール、ＬＨ等）又は物理的刺激により擬妊娠状態にした宿主動物の子宮内に移植してもよい。この宿主動物を飼育して分娩させることによって遺伝子導入非ヒト動物が得られる。遺伝子導入非ヒト動物が得られたか否かは、体の一部（例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認することにより知ることができる。
【００３９】
本発明のトランスジェニック動物は、構築物（コンストラクト）が直接導入されている動物、並びに、その構築物を発現する能力を保持する当該動物の後代を含む。
【００４０】
本明細書において「動物」とは、ヒトを除く動物（すなわち、非ヒト動物）を意味し、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、イルカ、又はウマ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、爬虫類、又は昆虫（例えば、ショウジョウバエ）などを挙げることができる。非ヒト動物としては、技術的にはすべての動物種を対象とすることが可能であるが、実験動物として使用する観点からげっ歯類が好ましく、特に、近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウス、又はラットが好ましい。
【００４１】
本発明の別のひとつの態様は、ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞（以降、トランスジェニックin vitro細胞ともいう。）を用いる創薬スクリーニング方法に関する。本態様において、前記ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域は、上記した非ヒトトランスジェニック動物に導入したものと同じものを用いてよく、配列番号１の塩基配列であることが好ましく、前記レポーター遺伝子は、上記した非ヒトトランスジェニック動物に導入したものと同じものを用いてよく、ルシフェラーゼ遺伝子であることが好ましい。
なお、前記トランスジェニックin vitro細胞も本発明のひとつの態様である。
【００４２】
本態様の好ましい形態は、配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞に、ルシフェリンを投与する工程、ルシフェラーゼの発現量を測定する工程を含む、循環器疾患薬スクリーニング方法である。ルシフェラーゼの発現量は、ルシフェリン発光量を測定することで測定することが好ましい。より好ましくは、配列番号１の塩基配列及びルシフェラーゼ遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞に、ルシフェリンを投与し、ルシフェリン発光量を測定する工程を含む、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬のスクリーニング方法である。
遺伝子を導入する細胞は、所望のあらゆる培養細胞を用いることができ、特に限定されないが、例えば、マウスやラットの心筋細胞であってもよい。
【００４３】
前記ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬のスクリーニング方法は、例えば、遺伝子を導入したin vitro細胞に、評価したい薬剤を投与し、薬剤の投与前後のルシフェリン発光量を測定することで行ってもよい。ルシフェリンの発現量すなわちルシフェリン発光量は、細胞に導入したＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域が活性化されることで増加する。したがって、本態様のスクリーニング方法において、ルシフェリン発光量を増加させた薬剤は、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬として有効であると期待できる。
【００４４】
本発明のさらに別のひとつの態様は、前記トランスジェニックin vitro細胞を用いる薬剤の心毒性効果の評価方法に関する。心毒性を有する薬剤のひとつの特徴として、心臓におけるＡＮＰ及び／又はＢＮＰの産生を減少させるという作用があることが知られている（Y.Aihara, et. al., “Doxorubicin Represses CARP Gene Transcription Through the Generation of Oxidative Stress in Neonatal Rat Cardiac Myocytes: Possible Role of Serine/Threonine Kinase-dependent Pathways” J Mol Cell Cardiol 32, 1401-1414 (2000)）。そのため、心毒性効果の評価方法は、例えば、前記トランスジェニックin vitro細胞に、評価したい薬剤を投与し、薬剤の投与前後のルシフェリン発光量を測定し比較することで行ってもよく、薬剤の投与後にルシフェリンの発光量を低下させた薬剤は、心毒性を有している可能性があると評価できる。また、該評価方法において、評価したい薬剤の投与前に、ＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導薬を細胞に投与する工程が含まれていてもよい。
【００４５】
前記ＡＮＰ遺伝子及び／又はＢＮＰ遺伝子の発現制御遺伝子領域、並びに、レポーター遺伝子を含有する塩基配列を導入したin vitro細胞は、公知の方法（例えば、R.B.Sekar, et. al., “Lentiviral vector-mediated expression of GFP or Kir2.1 alters the
electrophysiology of neonatal rat ventricular myocytes without inducing cytotoxicity” Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H3757-H3770, 2007を参照。）を用いて作成することができる。具体的には、例えば、導入したい遺伝子を組み込んだベクターを培養細胞に感染させることで、目的の遺伝子を標的の細胞に組み込むことによって作成してもよい。より詳しくは、後記する実施例に記載の方法を用いてもよい。
【００４６】
前記トランスジェニックin vitro細胞を用いたスクリーニング方法又は心毒性効果の評価方法において、ルシフェリンの発光量測定方法は、後記する実施例に具体的に記載する。
【実施例】
【００４７】
次に、実験例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
【００４８】
本実施例におけるすべての動物実験は実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従い、大阪大学動物実験委員会の承認を得て行った。
【００４９】
フェニレフリンはSigma-Aldrich社より購入した。ChIP-seqに使用したanti-RNA ポリメラーゼ II抗体、及びanti-H3K4me3抗体は木村博士（Dr. H. Kimura）より提供を受けた。
【００５０】
＜ラット心筋培養細胞の作成方法＞
｛１｝１日齢のラットから心臓を取り出し、４℃トリプシン溶液で一晩静置。
｛２｝心臓組織を37℃コラゲナーゼ溶液でインキュベートすると、細胞がばらばらになる。
｛３｝ばらばらになった細胞10%ウシ胎仔血清を含む培地で70分培養すると、線維芽細胞はプレートの底に接着し、心筋細胞は上清に残る。
｛４｝上清に残った心筋細胞を回収し、プレートにまく。
【００５１】
＜ルシフェラーゼアッセイ法＞
（Ｉ）非ヒトトランスジェニック動物におけるルシフェリン発光測定：
ルシフェラーゼの発光は、下記の方法にて測定する。
イメージング装置：IVIS Lumina II（登録商標）
(Caliper Life Sciences)
解析ソフト：Living Image 4.0 (Caliper Life Sciences)
吸入麻酔：エスカイン吸入麻酔液（登録商標）(マイラン製薬)
発光基質：D-ルシフェリン (VivoGlo Luciferin In Vivo Grade（登録商標）, Promega)
（撮影）
マウスを吸入麻酔で鎮静し、頸部・前胸部・腹部の除毛を行う。ただし、白色の毛は発光検出に影響しないため、ICRなどの白色マウスは除毛不要。ルシフェリンを腹腔内(150 mg/kg)もしくは静脈内(75 mg/kg)に投与し、鎮静をかけたまま、イメージング装置内に仰向けに固定する。ルシフェリン腹腔内投与の場合は、投与５分後から５分間撮影する。静脈内投与の場合は投与１分後から１分間撮影する。
【００５２】
（ＩＩ）非ヒトトランスジェニック動物におけるルシフェリン発光測定：
ｉ）培養細胞に溶解液を加え、溶解させる。
ｉｉ）前記ｉ）の溶解液を、測定用の９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移す。
ｉｉｉ）ルシフェリンを添加して、ルミノメーター（ベルトールド社製：CentroXS3 LB960（製品名））で発光を測定する。
【００５３】
（ＩＩＩ）ルシフェリン発光量の解析
解析ソフトLiving Image 4.0を使用し、発光をROIで囲み、発光量(Relative light unit: RLU)を測定する。
【００５４】
＜統計学的分析＞
データはmean ± SEMを使用し、2群間の比較には2-tailed Student’s t-testを使用し、P < 0.05を有意とした。
【００５５】
＜実施例１＞トランスジェニックマウスの作成
（１）ベクターの作成
ＡＮＰ及び／又はＢＮＰをコードする遺伝子の発現制御遺伝子領域として、配列番号１の塩基配列を用いた。本実施例において、配列番号１の塩基配列を、以降「ＣＲ９」と呼ぶ。
（１−１）レポーターベクターへのＣＲ９のサブクローニング
レポーターベクターは、minimal ＣＭＶプロモーターにＬａｃＺレポーターとルシフェラーゼレポーターがついたベクターを使用した（図１）。ＣＲ９領域を含むマウスゲノムＢＡＣ (clone RP23-128E8, BACPAC Resources Center)をテンプレートにして、配列番号２及び配列番号３のプライマーでＰＣＲを行い、レポーターベクターのminimal ＣＭＶプロモーターの上流にある制限酵素サイト(EcoRI, SpeI)にサブクローニングを行った(完成ベクターは図２)。
（１−２）ＣＲ９トランスジェニックマウスの作成
上記（１−１）で作成したベクターを制限酵素(EcoR1, Sfi1)で切断し、ＣＲ９を含む約７  ｋｂの直鎖ＤＮＡを精製した(遺伝子情報：表１、配列番号４及び図３)。この直鎖DNAをマウス受精卵 (Jcl:BDF（登録商標）1凍結受精卵、日本クレア) にインジェクションすることにより、トランスジェニックマウスを作成した。ジェノタイピングは、LacZレポーターを増幅させる配列番号５及び配列番号６のプライマーを用いて行った。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
（１−３）導入遺伝子の存在確認
ＣＲ９トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子の存在は、ルシフェラーゼの発現を確認することで行うことができるが、併せて次の方法によっても確認した。
マウス組織から抽出したゲノムを用いて、（i）ジェノタイピングＰＣＲと、(ii)サザンブロットで確認。なお、（i）で使用したプライマー配列を配列番号７及び配列番号８に示した。（ii）で使用したＤＮＡプローブ作成用のプライマー配列を配列番号９及び配列番号１０に示した。
【００５８】
＜＜試験例１＞＞
大動脈縮窄術（ＴＡＣ）マウスの作成と心不全重症度の評価
【００５９】
＜実施例２＞
実施例１で得たマウスの中から、８週齢・体重20-25gのトランスジェニックマウスを使用した。胸骨左縁第二肋間から胸腔内に入り、大動脈弓部を露出後、無名動脈と左内頚動脈の間で、27ゲージ針とともに大動脈弓部を7-0縫合糸で縛った。その後、27ゲージ針を慎重に除去し、結果として大動脈の60-80%狭窄を作成した。
＜比較例１＞
実施例１で得たマウスの中から、８週齢・体重20-25gのトランスジェニックマウスを使用し、シャム手術を施した。
【００６０】
実施例２及び比較例１で得られたマウスの心不全重症度を評価するため、ルシフェラーゼアッセイを上記の方法を用いた実施した。結果を図４に示す。
心臓におけるルシフェリン発光量は、比較例１のシャム（Sham）マウスと比較し、実施例２のＴＡＣマウスの値は有意に増加した。
【００６１】
＜＜試験例２＞＞
フェニレフリン誘導心臓負荷マウスの作成と心不全重症度の評価
【００６２】
＜実施例３＞
実施例１で得たマウスの中から、８週齢・体重20-25gのトランスジェニックマウスを使用し、フェニレフリン(75 mg/kg/day)を注入した浸透性ポンプを皮下挿入することにより、心臓負荷モデルを作成した。フェニレフリンの投与は、２８日間の連続投与の後、１４日間の休薬、その後にフェニレフリンを再投与連続３日間で行った。
【００６３】
得られたマウスの心不全重症度を評価するため、ルシフェラーゼアッセイを上記の方法を用いた実施した。結果を図５に示す。
フェニレフリンの投与中は心臓の発光が強くなり、フェニレフリンの休薬中は発光が低下するという心臓負荷の状態を精度良く反映した結果となった。
【００６４】
＜実施例４＞ＣＲ９及びルシフェラーゼ遺伝子を導入したin vitro培養細胞の作成
（１）pMD2.G  （図６、配列番号１１）
（２）pMDLg/pRRE  （図７、配列番号１２）
（３）pRSV-Rev  （図８、配列番号１３）
配列番号４の塩基配列が導入されているレンチベクター（図２）を、上記の３つのベクター（１）〜（３）とともに２９３Ｔ細胞に遺伝子導入すると、レンチウイルス粒子を形成し、２９３Ｔ細胞の培養上清に分離される。この培養上清を心筋培養細胞にふりかけることで、培養細胞にレンチウイルス粒子が感染し、ベクターが細胞内に導入される。
（導入遺伝子の存在確認）
心筋培養細胞における導入遺伝子の存在は、ルシフェラーゼの発現を確認することにより確認することができる。
【００６５】
＜＜試験例３＞＞ＣＲ９及びルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞を用いた、薬剤のＡＮＰ及び／又はＢＮＰ誘導効果の評価
＜実施例５＞
実施例３に記載の方法により、ラット心筋培養細胞にレンチベクターを感染させ、培養液にフェニレフリンを加え、４８時間後にルシフェリン発光量を測定した。
＜比較例２＞
ＣＲ９とは別のＤＮＡ領域をｍＣＭＶプロモーターに繋げる以外は、実施例２に記載の方法と同様の方法でベクターを導入した心筋培養細胞を作成した。得られた培養液にフェニレフリンを加え、４８時間後にルシフェリン発光量を測定した。
【００６６】
試験例３の結果を図９に示した。実施例４のＣＲ９−ｍＣＭＶ−ルシフェラーゼベクターを導入した心筋培養細胞に、フェニレフリンを加えると、ルシフェラーゼ発現が５倍程度に増加した。一方、比較例２のＣＲ９とは別のＤＮＡ領域をｍＣＭＶプロモーターにつなげたベクターを導入した心筋培養細胞では、フェニレフリンを加えても、ルシフェラーゼ発現は変化しなかった。
【００６７】
＜参考例＞
【００６８】
１．＜比較ゲノム解析＞
UCSC Genome Browserを使用して、マウスと7種の脊椎動物間で、ANP、BNP遺伝子を含むゲノム領域のアライメントを行った。7種の脊椎動物とは、ラット、ヒト、オラウータン、イヌ、ウマ、カモノハシ、ニワトリである。アライメントによって、これらの脊椎動物間のシンテニーマップを作成し、保存性の高い領域を評価した。この保存領域の中から偽陽性を除外するために、既知の遺伝子領域、EST、mRNAは除外し、またシンテニーマップの視覚的評価からも他の偽陽性も除外した。これらの除外を経て、最終的に、少なくともマウスとヒトの間で、保存されている領域を進化的保存領域と定義した。
【００６９】
２．＜マウス心筋細胞からのChIPのシーケンス処理＞
８週齢のC57BL6マウスから心臓を摘出し、冷PBSで素早く洗浄後、液体窒素で凍結させ、組織を粉砕・ホモジナイズし、0.3%パラホルムアルデヒドでクロスリンクした。クロマチンを抽出し、ソニケーションを行い、anti-RNA polymerase II抗体とanti-H3K4me3抗体で免疫沈降した。免疫沈降したDNAとインプットをソニケーションにより分断した後、シーケンスアダプターにライゲーションさせ、増幅させ、免疫沈降DNAライブラリーを作成した。このDNAライブラリーは、Illumina Genome Analyzer IIで配列解析を行った。得られた配列をマウスゲノムにアライメントし、MACSで解析することで、RNA polymerase IIとH3K4me3が豊富な領域を同定した。
結果を図１０に示した。
【００７０】
３．＜レンチウイルスを用いた発現制御遺伝子領域の同定試験＞
11箇所の保存領域はANP、BNP遺伝子を含むマウスBACクローンをテンプレートにして、PCRで増幅させた。このPCR産物をpCR-Blunt II-TOPOにサブクローニングし、その後ホタルルシフェラーゼレポーターを含むレンチベクターに組み込んだ。このレンチベクターと３つのレンチベクターパッケージングプラスミドをLipofectamine 2000を用いて、293T細胞に同時にトランスフェクションさせることにより、レンチウイルス粒子を産生させた。産生されたレンチウイルス粒子は48時間後に回収し、0.45 μmセルロースフィルターで精製後に、沈殿濃縮させた。
ラット心筋培養細胞を96wellプレートにまき、翌日にレンチウイルスを含む無血清培地に交換し、12時間インキュベートし、感染させた。その後、48時間100mMフェニレフリンで刺激を行い、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【００７１】
４．＜ＲＮＡの抽出と定量ＲＴ−ＰＣＲ＞
ラット心筋培養細胞、ラット心臓線維芽細胞、マウス心臓組織、マウス脳組織から、RNA-Bee RNA isolation reagentも用いてTotal RNAを抽出し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いてcDNAを作成した。定量PCRは、TaqMan technologyとStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いて行い、内因性コントロールとして、GAPDH遺伝子を使用した。
【００７２】
５．＜３Ｃアッセイ＞
マウスから心臓を摘出し、冷PBSで素早く洗浄後、液体窒素で凍結させ、組織を粉砕・ホモジナイズし、1%パラホルムアルデヒドでクロスリンクした。3Cアッセイをするために、クロスリンクDNAをBamHI制限酵素で切断した。また、コントロールとして、ANP, BNPを含むBACクローンを使用した。制限酵素近辺のプローベとプライマーを用いて、TaqMan（登録商標）定量PCRで解析を行った。
３Ｃアッセイの結果、ＣＲ９がＡＮＰ遺伝子（Ｎｐｐａ）及びＢＮＰ遺伝子（Ｎｐｐｂ）のいずれも制御していることが示された。分析結果を図１１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、心不全をはじめとする循環器疾患の創薬研究において、有用な非ヒトトランスジェニック動物及びトランスジェニックin vitro細胞を提供することができる。本発明の非ヒトトランスジェニック動物、トランスジェニックin vitro細胞を用いることで、安全性及び質が高く、より効率の良い創薬研究が可能となる。
【図９】
2015084764.tif 000004
【図１】
2015084764.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015084764.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
2015084764.tif 000012
【図１０】
2015084764.tif 000013
【図１１】
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【配列表】
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