(57)【要約】      （修正有）【課題】受精卵などの細胞の培養における、マイクロウェルの状態や正しい向きを直感的に判断することができる培養容器の提供。【解決手段】底部と側壁とを有し、マイクロウェルを底部に備えた培養容器であって、底部は、培養する細胞を入れるマイクロウェルを有する細胞培養領域と、細胞培養領域外の領域に画定されており、細胞培養領域外の領域に、マイクロウェルの数、配置、形状、大きさ、向きおよび表面加工から選択されるマイクロウェル情報の表示が、使用者が直接視覚または触覚により認識可能な形態で付されている培養容器。【選択図】図３
2015053876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
底部と側壁とを有し、培養する細胞を入れるマイクロウェルを前記底部に備えた培養容器であって、前記底部は、マイクロウェルを有する細胞培養領域と、前記細胞培養領域外の領域とに画定されており、前記細胞培養領域外の領域にマイクロウェルの数、配置、形状、大きさ、向きおよび表面加工から選択されるマイクロウェル情報の表示が、使用者が直接視覚または触覚により認識可能な形態で付されている、前記培養容器。
【請求項２】
前記マイクロウェル情報の表示が、前記細胞培養領域内のマイクロウェルを相似拡大したマイクロウェルの模型の形態である、請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記マイクロウェル情報の表示が培養容器の製造時に一体成型されたものである、請求項１または２に記載の培養容器。
【請求項４】
向きの情報である前記マイクロウェル情報の表示が、使用者が直接触れることで認識可能な形状で側壁に設けられている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロウェルを備えた培養容器に関する。より詳細には、マイクロウェルの構造に対応する情報表示を視覚または触覚により認識可能に設けた培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス分野の研究開発において、複数のマイクロウェルを備えた培養容器内で培養した細胞を顕微鏡で観察し画像を取得することが行われている。そのような培養容器を用いて培養する細胞の一例としては、体外受精または顕微授精における受精卵が挙げられる。卵子の大きさは、哺乳類の種類にもよるが約０．１ｍｍと非常に小さく、従ってそれを培養するマイクロウェルも非常に小さいため、肉眼でマイクロウェルの配列や形状などの構造を確認するのは非常に困難である。
【０００３】
特許文献１には、被培養物を生きたまま顕微鏡観察するのに用いる培養容器が記載されており、被培養物を付着させるための板状ガラス部に、その被培養物の所定部位の位置の特定を可能にするため複数本の緯線と経線とからなるグリッド座標を設けることが記載されている。しかし、そのようなグリッド座標は微細であり、その状態を肉眼で確認するのは困難である。また、グリッド上に被培養物が乗るため、場合によってはグリッドが被培養物に隠されて読み取れないことが考えられる。
【０００４】
特許文献２には、細胞培養用ディッシュであって、基部とカバーとからなり、基部の壁部分には数字からなる第１標識が付され、一方カバー上には第２標識が付され、それら標識により円形座標を形成し、培養用ディッシュ上の位置の特定を可能としたものが記載されている。しかしそのような標識は単に培養用ディッシュにおいて培養部位を区別するためのグリッド情報を与えるものであり、肉眼で確認するのが困難な微細構造の情報を提供するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献２】特開２００９−１８３２８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
受精卵などの細胞の培養では、目的によって異なる配置、あるいは異なる形状や性状を有するマイクロウェルを備えた培養容器を使い分ける場合があるが、マイクロウェルのような微細な構造は肉眼では確認できず、培養容器の選択に手間がかかる。また、培養容器は従来機器との適合性を考慮して円形である場合が多いため、マイクロウェルの構造が確認しにくいことも関係して、使用時に意図されている正しい方向が即座には判別しにくい。マイクロウェルの状態や正しい向きを直感的に判断することができる培養容器を提供することができれば、利用者の利便性が向上すると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マイクロウェルが設けられている培養容器の底部において、マイクロウェルを有する細胞培養領域は全体に対して小さいのに対し、培養容器の取り扱い性向上を目的として培養容器を一定以上の大きさとすることにより必然的に生じるそれ以外の領域が全体に対して大きな割合を占めることに着目し、そこを利用してマイクロウェルの情報を直感的に理解することができる表示を付すことに想到した。本発明の要旨は以下のとおりである。
【０００８】
（１）底部と側壁とを有し、培養する細胞を入れるマイクロウェルを前記底部に備えた培養容器であって、前記底部は、マイクロウェルを有する細胞培養領域と、前記細胞培養領域外の領域とに画定されており、前記細胞培養領域外の領域にマイクロウェルの数、配置、形状、大きさ、向きおよび表面加工から選択されるマイクロウェル情報の表示が、使用者が直接視覚または触覚により認識可能な形態で付されている、前記培養容器。
（２）前記マイクロウェル情報の表示が、前記細胞培養領域内のマイクロウェルを相似拡大したマイクロウェルの模型の形態である、（１）に記載の培養容器。
（３）前記マイクロウェル情報の表示が培養容器の製造時に一体成型されたものである、（１）または（２）に記載の培養容器。
（４）向きの情報である前記マイクロウェル情報の表示が、使用者が直接触れることで認識可能な形状で側壁に設けられている、（１）〜（３）のいずれかに記載の培養容器。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の培養容器は、マイクロウェルの数、配置、形状、大きさ、向きおよび表面加工から選択されるマイクロウェル情報の表示が、使用者が直感的に把握できるような態様で表示されているため、多数の培養容器の中から目的のものをすぐに選び出すことができ、利便性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マイクロウェル情報の表示を付していない状態の従来の培養容器の構成例を示す上面図である。
【図２】マイクロウェル情報の表示を付していない状態の従来の培養容器の構成例を示す垂直断面図である。
【図３】本発明の培養容器の一実施態様を示す上面図である。
【図４】本発明の培養容器の他の実施態様を示す上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図１および２は、マイクロウェル情報の表示を付していない状態の従来の培養容器の構成例を示す図である。培養容器１は、底部２と側壁３とを有し、底部２に細胞を収容するための複数のマイクロウェル４が配置されている。マイクロウェル４が配置されている細胞培養領域は、内壁５により、底部２のその他の領域から画定されている。図２に示したように、内壁５は一定の高さを有し、細胞培養領域に液体を貯留することができるようになっている。なお、本明細書において「マイクロウェル」とは、開口部の開口幅（開口部の外縁が円形である場合はその直径）が、０．０５〜１．０ｍｍであり、好ましくは０．１５ｍｍ以上、より好ましくは０．２５ｍｍ以上、さらに好ましくは０．２８ｍｍ以上であり、好ましくは０．５ｍｍ未満、さらに好ましくは０．３４ｍｍ未満であるウェルを意味する。培養容器の上面視における各マイクロウェルの開口部の面積は、０．１９７ｍｍ２以下、さらに好ましくは０．０９１ｍｍ２以下であり、好ましくは０．０１７ｍｍ２以上、より好ましくは０．０４９ｍｍ２以上、さらに好ましくは０．０６１ｍｍ２以上である。このようなサイズのマイクロウェルは、特に受精卵などの細胞である被観察物を個別に収容するのに適している。マイクロウェルのサイズは微小であり、肉眼ではその状態を把握するのが難しい。
【００１２】
図３は、本発明の培養容器の一実施態様を示す図である。図１に示した従来の培養容器と比べると、マイクロウェル模型３１、向き表示３２、および側壁凹部３３を有する点で相違する。また、図４は本発明の培養容器の他の実施態様を示す図である。図１に示した従来の培養容器と比べると、マイクロウェル模型４１、向き表示４２、およびマイクロウェルサイズ表示４３を有する点で相違する。
【００１３】
本発明の培養容器は、底部の細胞培養領域外に、マイクロウェルの数、配置、形状、大きさ、向きおよび表面加工から選択されるマイクロウェルの情報が、使用者が直接視覚または触覚により認識可能な形態、すなわち使用者が拡大鏡などを用いずに肉眼で認識できるか、または使用者が手で触れて認識できる形態で付されていることを特徴とする。そのようなマイクロウェル情報の表示の態様としては、マイクロウェルの数、配置、形状、大きさ、向きおよび表面加工から選択されるいずれか一つを示す、文字もしくは図形、または培養容器の底部や側壁などに設けた凹部または凸部、あるいはマイクロウェルの形態をそのまま拡大したマイクロウェルの模型が挙げられる。最も好ましい態様としては、マイクロウェルの模型の形態、特に実際のマイクロウェルをそのまま相似拡大したマイクロウェル模型の形態が挙げられる。
【００１４】
マイクロウェルの模型は、使用者が肉眼で容易に視認可能であるよう、実際のマイクロウェルの３倍以上、特に５倍以上、とりわけ１０倍以上の大きさに拡大したサイズを有することが好ましい。より具体的には、実際のマイクロウェル１個に対応するマイクロウェルの模型の大きさは、開口部の開口幅（開口部の外縁が円形である場合はその直径）が、好ましくは０．４５ｍｍ以上、より好ましくは１ｍｍ以上、さらに好ましくは２．５ｍｍ以上であり、培養容器の上面視におけるマイクロウェルの模型の開口部の面積は、０．１６ｍｍ２以上、より好ましくは０．８ｍｍ２以上、さらに好ましくは５ｍｍ２以上である。
【００１５】
図３の実施態様の場合、マイクロウェル模型３１は、内壁１５により画定される細胞培養領域の図３における上部であって該領域の外に設けられている。８個のマイクロウェルの配列の中央には、マイクロウェルではない記号（図中ハート型で表されるもの）が付されているが、マイクロウェル模型３１ではその記号も含めて模型化している。このように、マイクロウェル模型は、マイクロウェルの近傍に付された個々のマイクロウェルを識別したりマイクロウェル配列の向きを判別したりするための図形や標識なども含めて、実際のマイクロウェルを相似拡大したものであることが好ましい。ただし「相似拡大」の概念には、完全に実際のマイクロウェルの構造を再現したもののみならず、実際のマイクロウェルの構造と実質的に同一であると判断可能な範囲であれば、一部構成（表面加工など）を省略したり変更したりしたものも含まれる。すなわち、ここでいう「相似拡大」は、実際のマイクロウェルと同様に凹部で形成した態様のみならず、培養容器を上面視した際に輪郭形状が相似拡大図形となっているが必ずしも凹部は形成されていない態様も含む概念である。
【００１６】
図４の実施態様の場合、マイクロウェル模型４１は、内壁１５により画定される細胞培養領域の図４における右部であって該領域の外に設けられている。この実施態様では、８個のマイクロウェルのうち４個については、マイクロウェル１４の表面が微細凹凸を有するように加工されており、マイクロウェル模型４１においても、個々のマイクロウェルに対応する模型においてその加工の有無が目視により確認可能となっている。このように、マイクロウェルに表面加工が施されている場合には、マイクロウェルの模型にもその表面加工の存在が認識できるように表示が付されていることが好ましい。マイクロウェルの模型における表面加工の有無の表示は、実際のマイクロウェルと全く同じ加工を施すことにより行ってもよく、あるいは表面加工が施されていることが判別できるよう、他とは異なる色を付したり、凹凸を付けたり、文字や図形による表示を付したりしてもよい。
【００１７】
マイクロウェル情報の表示は、文字または図形によって付されていてもよい。その具体的態様としては、マイクロウェルの配列の上下方向を示す矢印（図３の３２）、マイクロウェルの配列の下側を意味する線（図４の４２）、マイクロウェルのサイズを示す文字（図４の４３）などが挙げられる。この他にも、マイクロウェルの個数や配列の列数を数字や図形で表してもよい。
【００１８】
また、マイクロウェル情報の表示は、とりわけ向きの情報の場合、図３の３３で示されるように、培養容器の側壁に設けられた凹部または凸部など使用者が直接触れることで認識可能な側壁の形状で示すこともできる。培養容器の側壁は使用者が容器を持つ際に触れる場所であるため、向きを凹部または凸部などで示すことにより、より直感的に正しい向きを判別することが可能となる。
【００１９】
マイクロウェル情報の表示は、印刷やレーザーマーキングなどにより付してもよいが、培養容器の作製と同時に、培養容器と一体成型することが好ましい。マイクロウェルの模型であるマイクロウェル情報の表示を培養容器と一体成型とする場合、該マイクロウェルの模型は、実際のマイクロウェルと同様に凹部を形成するように設けることができる。そのようにして付された情報表示は、培養容器と同じ材質からなる。培養容器の作製と同時に情報表示も付されるようにすることで、製造コストの低減が図れる。また、そのようにして付された情報表示は、容易には消失せず、長期の細胞培養時の頻回な培養操作や消毒用エタノールでの清拭の際にも耐えることができる。
【００２０】
マイクロウェルは、壁面と開口部を有する凹部を形成し、培養容器の底部に直接窪みとして設けられた凹部でもよいし、底部から突出した部材により形成される凹部でもよい。したがって、上面視における各マイクロウェルの開口部の面積は、換言すれば、マイクロウェルの開口部の外縁が形成する図形の面積である。マイクロウェルの開口部の外縁が形成する図形は特に制限されず、三角形および四角形等の多角形の形状でもよく、円（円形、略円形、楕円形および略楕円形を含む）の形状でもよいが、好ましくは円形である。
【００２１】
本発明の培養容器の底部には、マイクロウェルが、好ましくは４個以上、さらに好ましくは８個以上、例えば１０個以上で、好ましくは５０個以下、より好ましくは３０個以下の個数で配置されている。本発明の培養容器は受精卵等の細胞を各マイクロウェルに１個ずつ配置して、複数の細胞を同時に培養する用途に適している。受精卵等の細胞を同一系内に複数近接して配置した状態で培養することにより、良好なパラクライン効果やオートクライン効果を期待することができる。
【００２２】
本発明の培養容器は、底部と側壁とを有し、底部と側壁とから形成される空間に液体を収容可能である。底部の形状は特に制限されず、三角形および四角形等の多角形の形状でもよく、円（円形、略円形、楕円形および略楕円形を含む）の形状でもよく、側壁は底部の外縁を囲うように形成される。本発明の培養容器において、通常、底部と反対側は開口しており、開口部の形状は好ましくは底部の形状と同一である。好ましくは、開口部が円形で、開口幅が、好ましくは３０〜６０ｍｍ、特に３５ｍｍのものが用いられる。これは従来の細胞培養に用いられているシャーレと同等のサイズであり、汎用のシャーレと同様に簡便に作製できること、および既存の培養装置等に適合しやすいことから、上記のようなサイズのものが好ましい。なお、本発明の培養容器は、通常のシャーレと同様に蓋を有していてもよい。
【００２３】
本発明の培養容器の材質は、特に制限されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。本発明の培養容器は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。
【００２４】
本発明の培養容器は、培養細胞の非特異的接着を防止し、また培養液のドロップが表面張力によって偏ることを防止する観点から、プラズマ処理などの表面親水化処理することが好ましい。製造後の容器に付着している菌数（バイオバーデン数）が１００ｃｆｕ／容器以下であることが好ましい。また、さらにγ線滅菌などの滅菌処理を施されていることがより好ましい。
【００２５】
本発明の培養容器は、受精卵の発育を促進するような表面処理または表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞をあらかじめ培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。
【００２６】
培養対象となる細胞は、特に制限されないが、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）およびｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚および８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞および脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性または全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本発明において細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。
【００２７】
本発明の培養容器は、好ましくは哺乳動物および鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。本発明の培養容器は、ヒトの受精卵の培養に特に好適である。
【００２８】
例えば受精卵を培養する場合には、通常、培養後に、子宮への移植に適した良質な受精卵であるか否かが判別される。判別は画像解析装置により自動で行ってもよいし、顕微鏡等により目視により手動で行ってもよい。培養細胞の自動判別においては、顕微鏡により取得された培養容器内の細胞の画像をＣＣＤカメラ等の検出装置によって撮像し、得られた画像を輪郭抽出処理に付し、画像中の細胞に該当する部分を抽出し、抽出された細胞の画像を画像解析装置で解析することによりその質を判別することができる。画像の輪郭抽出処理については、例えば、特開２００６−３３７１１０号に記載された処理を利用できる。
【符号の説明】
【００２９】
１：培養容器
２：底部
３：側壁
４：マイクロウェル
５：内壁
１１：培養容器
１２：底部
１３：側壁
１４：マイクロウェル
１５：内壁
３１：マイクロウェル模型
３２：向き表示
３３：側壁凹部
４１：マイクロウェル模型
４２：向き表示
４３：マイクロウェルのサイズ表示
【図１】
2015053876.tif 000003
【図２】
2015053876.tif 000004
【図３】
2015053876.tif 000005
【図４】
2015053876.tif 000006