(57)【要約】【課題】新規なバイオフィルム形成抑制作用を有する物質の提供。【解決手段】豆類抽出物を含有するバイオフィルム形成抑制のための口腔用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆類抽出物を含有するバイオフィルム形成抑制のための口腔用組成物。
【請求項２】
前記豆類抽出物が豆類７Ｓグロブリンである、請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制のための口腔用組成物。
【請求項３】
前記豆類７Ｓグロブリンの分子量が、５０ｋＤａ、７０ｋＤａ、又は７５ｋＤａである請求項１又は２に記載のバイオフィルム形成抑制のための口腔用組成物。
【請求項４】
前記豆類が、アズキ、ダイズ、またはインゲンマメである請求項１乃至３の何れか一項に記載のバイオフィルム形成抑制のための口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、新規なバイオフィルム形成抑制素材を含有する口腔用組成物に関する。
すなわち、本願発明は、豆類の貯蔵蛋白質である７Ｓグロブリンが、バイオフィルム形成抑制作用を有することを見出したことに基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
物体の表面に付着した微生物は単独で存在しているのではなく、特徴ある構造の中で他の微生物とともにバイオフィルムを形成している。このバイオフィルムは、固定化微生物の利用に見られるように人間にとって有益に働くかと思えば、逆にう蝕や食品汚染を引き起こす原因となることが明らかとなり、近年盛んに研究がなされている。
【０００３】
特に、口腔バイオフィルムは、７００種類以上の細菌で構成され１ｍｇ中に１０８個以上の菌が存在している。口腔バイオフィルムがう蝕や歯周病の原因になることが分かっており、これらの病気が微生物感染症として捉えられている。その中で多数（２０％〜４０％）を占めるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉは、口腔表面で細菌間コミュニケーションのもとに、ダイナミックに細菌間活性物質を介してバイオフィルムを形成している。なかでもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）は、粘着性のある菌体外多糖を産生し、病原性のあるバイオフィルム形成の中心的な役割を演じている。
【０００４】
従来のう蝕予防では、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを殺菌しう蝕を抑制するという考えに基づき抗菌物質を使用することが主流であったが、実際のう蝕病巣にはバイオフィルムが存在し抗菌物質の浸透を妨げていることから、思ったようなう蝕予防効果が得られないことが多いうえ、耐性菌出現の危険性と常に隣り合わせであった。
【０００５】
また、バイオフィルムの抑制方法ではブラッシングやスケーリングなどの機械的除去がもっとも効果的と言われているが、要介護高齢者などそのような機械的な口腔バイオフィルムのコントロールが困難な人々に対しては、現状の方法で的確な口腔ケアを実践することは難しく、今までとは異なる切り口でのバイオフィルム除去、虫歯予防方法の開発が望まれている。
【０００６】
また、口腔バイオフィルムのコントロールにおいては、日常習慣的に継続して実施することが望ましく、ガムなどの食品および歯磨剤等の口腔用組成物を利用することが効果的である。
【０００７】
近年、情報伝達系の分子メカニズムであるクオラムセンシング（ＱＳ：細菌密度依存的遺伝子発現制御系）がＳ．ｍｕｔａｎｓのバイオフィルムの病原性発現に働いていることや、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのＱＳは、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＳＰ）によりコントロールされていることが明らかになった。現在では、このＱＳをターゲットとした病原性の発現制御研究が、口腔疾患のみならず、他の微生物感染症の予防方法開発に繋がると期待され、様々な研究が試みられているが、実用化にはまだ至っていない。
【０００８】
本願出願人はこれまでの研究で、豆類にＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム抑制活性を有することを見出してきた（特許文献１）。
【０００９】
さらに、アズキ渋切り排水中の縮合性タンニンの抗う蝕活性（特許文献２）、植物抽出物からなる口腔組成物の虫歯予防（特許文献３）等、種々の虫歯予防方法の開発が進められている。しかしながら実用化にはまだ至っていない。
【００１０】
本出願では、アズキ中のＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム抑制成分の特定を行いＳ．ｍｕｔａｎｓのバイオフィルム形成を阻害する、より高い効果を発揮する新規う蝕抑制素材としての開発を試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１２−６７０１８号公報
【特許文献２】特開平０８−８１３８４号公報
【特許文献３】特開２００２−２１２０４２号公報
【特許文献４】特開２００７−１１０９０１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０（２００６）ｐ２６２０−２６２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来用いられてきた抗菌剤による虫歯予防方法は、口腔内細菌叢を乱し、菌交代症を引き起こすことが危惧されている。また、耐性菌が出現する危険性が高く、好ましくない。従って、抗菌作用を示さずに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓにより形成される虫歯バイオフィルムを制御することが、より安全で効果の高い虫歯予防方法であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者等が鋭意研究を進めた結果、豆類の貯蔵タンパク質である７Ｓグロブリン（アズキ：約５０ｋＤａのタンパク質の３量体、ダイズ：約７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａのタンパク質の３量体、インゲンマメ：約５０ｋＤａのタンパク質の３量体）に虫歯原因菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓのバイオフィルム形成阻害効果を有することを見出した。なお、豆類の７Ｓグロブリンは  Ｓ．ｍｕｔａｎｓの増殖には影響を及ぼさなかったため、作用機序は抗菌作用とは異なると考えられた。
そこで、豆類の７Ｓグロブリンによるバイオフィルム抑制メカニズムを、バクテリオシン産生試験にて検討したところ、アズキ７Ｓグロブリンが、ＣＳＰの働きを阻害していることが明らかになった。この結果から、７ＳグロブリンがＣＳＰの働きを阻害することで、S. mutans によるバイオフィルム形成を抑制していることが示唆された。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、虫歯菌によるバイオフィルム形成を抑制することにより虫歯を予防するものであり、そのバイオフィルム抑制剤を豆類の７Ｓグロブリンに見出した。従来の虫歯菌の抗菌剤と異なり、虫歯菌の住処であるバイオフィルムの形成を抑制するものであり、効果的で、安全であると考えられ、新規口腔用組成物として、チューインガムやキャンディに応用展開が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アズキ熱水抽出物の硫安分画物のバイオフィルム抑制活性を示すグラフである。
【図２】リン酸ナトリウムバッファーを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質溶出ピークのバイオフィルム抑制率を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質溶出曲線を示すグラフである。（ｂ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンによるグループ分けを示す図である。（ｃ）は、各グループのバイオフィルム抑制活性を示すグラフである。
【図４】（ａ）は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である。（ｂ）は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥメジャーバンドのバイオフィルム抑制活性を示すグラフである。（ｃ）は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥメジャーバンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である。
【図５】（ａ）は、アズキ７Ｓグロブリン画分のバイオフィルム抑制活性を示すグラフである（室温抽出）。（ｂ）は、アズキ７Ｓグロブリン画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である（室温抽出）。（ｃ）は、アズキ７Ｓグロブリン画分のバイオフィルム抑制活性を示すグラフである（７０℃抽出）。（ｄ）は、アズキ７Ｓグロブリン画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である（７０℃抽出）
【図６】（ａ）は、ダイズ７Ｓグロブリン画分のバイオフィルム抑制活性を示すグラフである（室温抽出）。（ｂ）は、ダイズ７Ｓグロブリン画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である（室温抽出）。（ｃ）は、ダイズ７Ｓグロブリン画分のバイオフィルム抑制活性を示すグラフである（７０℃抽出）。（ｄ）は、ダイズ７Ｓグロブリン画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である（７０℃抽出）。
【図７】（ａ）は、インゲンマメ７Ｓグロブリン画分のバイオフィルム抑制活性を示すグラフである。（ｂ）は、インゲンマメ７Ｓグロブリン画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願発明者等は鋭意研究の結果、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのクオラムセンシングが日常的に安全に摂取できる特定の物質により制御されうることを発見し、もってクオラムセンシングを制御することによるう蝕バイオフィルムの形成阻害を実現した。
すなわち、本発明は、豆類抽出物、特にアズキ抽出物、ダイズ抽出物またはインゲンマメ抽出物を含む口腔用組成物によりクオラムセンシングに関連する虫歯バイオフィルム形成を阻害することを特徴とする。
さらに、７ＳグロブリンがＣＳＰの働きを阻害することで、S. mutans によるバイオフィルム形成を抑制していることが示唆された。
【００１８】
本発明に係る口腔用組成物によれば、ＣＳＰ依存性のＳ．ｍｕｔａｎｓのバイオフィルム形成が阻害されるため、病原性細菌は口腔内に付着することができない。そのため、ブラッシングやスケーリングなどの機械的な方法によらずにバイオフィルムの抑制が可能となる。
【００１９】
また、口腔バイオフィルムが存在する場合、口腔バイオフィルムの菌体外多糖により抗菌剤、酵素阻害剤又は抗生物質等の浸透が妨げられ、う蝕抑制効果を出すことが困難であるという問題がある。
【００２０】
さらに、抗菌剤、酵素阻害剤、抗生物質等を使用せずにう蝕を抑制することができるため、抗菌物質や抗生物質に対する耐性菌が出現する可能性を抑えることができる。
【００２１】
本発明で使用する豆類の種類は特に限定されないが、ササゲ、アズキ、紫花豆、白花豆、クロインゲンマメ、インゲンマメ、キントキマメ、ダイズから選ばれる少なくとも１種類以上の豆類から抽出した抽出物を使用することが好ましく、アズキ、ダイズ、インゲンマメから抽出した抽出物を使用することがより好ましい。
【００２２】
本発明の有効成分である豆類の７Ｓグロブリンを得る方法については特に限定されないが、上記豆類の種子又は果実（豆）を適当な粉砕手段で粉砕し、溶媒抽出等の方法により抽出物を調製する。抽出溶媒としては、水及び緩衝液、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール並びにｎ−ブタノール等の低級アルコール、エーテル、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、グリセリン、プロピレングリコール等の有機溶媒の１種または２種以上を混合して使用するが、好ましくは水または熱水または緩衝液または親水性の有機溶媒を使用する。また、本発明の抽出物は、飲食品として用いられることが多いことを考慮すると、抽出溶媒としては安全性の面から水とエタノールとの組み合わせ又は緩衝液を用いるのが好ましい。好ましくは９０％以下のエタノールで抽出し、さらに好ましくは６０％以下のエタノールで抽出し、さらに好ましくは３０％以下のエタノールで抽出し、さらに好ましくは水または熱水で抽出し、最も好ましくはｐＨ７．０〜８．５に調整しながら水または緩衝液で抽出する。
【００２３】
抽出条件としては、高温、室温、低温のいずれかの温度で抽出することが可能であり１〜５時間程度抽出するのが好ましい。
【００２４】
豆類の抽出物としては７Ｓグロブリンが好ましい。７Ｓグロブリンの調製方法としては、さらに、ダイズのように主要貯蔵タンパク質として７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンを豊富に含む豆類は、抽出物のｐＨを６．０に調整し、遠心したその上清を回収する。その上清のｐＨを４．５に調整し、遠心することでその沈殿物を回収する（特許文献４）。アズキやインゲンマメのように主要貯蔵タンパク質として７Ｓグロブリンが豊富に含まれる豆類は、抽出物のｐＨを４．５に調整し、遠心することでその沈殿物を回収する（非特許文献１）。それぞれ回収した沈殿物を水に懸濁した後、ｐＨ７．０に調整しながら溶解し、その上清を７Ｓグロブリンとして回収する。
【００２５】
また、本発明の口腔用組成物は、安全性が高いことから、例えば、含そう剤、練り歯磨き、消臭スプレー等の口腔用組成物、或いはチューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、スナック等の菓子、アイスクリーム、シャーベット、氷菓等の冷菓、飲料、パン、ホットケーキ、乳製品、ハム、ソーセージ等の畜肉製品類、カマボコ、チクワ等の魚肉製品、惣菜類、プリン、スープ並びにジャム等の飲食品に配合し、日常的に利用することが可能である。
【００２６】
その配合量としては、種々の製造条件によって変わり得るが、口腔用組成物に対して、豆類抽出物を０．０１重量％以上２．０重量％以下、さらに好ましくは０．０１重量％以上１．０重量％以下配合させることが好適である。
【００２７】
本発明は従来より食用とされているものの抽出物を使用しているため、口腔内や体内に摂取してもその安全性については問題ない。また、チューインガム等の食品や歯磨剤等に含有させて手軽に摂取することが可能であり、遺伝子の発現調節のような複雑な手順を必要としないため、日常的に継続してバイオフィルムのコントロールをすることが可能となる。
【００２８】
（実施例）
（実施例１）バイオフィルム形成抑制試験
１−１  ＣＳＰ添加バイオフィルム形成試験
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９株を５ｍｌのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）液体培地にてＯ．Ｄ．６６０ｎｍ  ＝  ０．５まで３７℃・嫌気条件下にて前培養した。培養液を回収後、１，１００×ｇで１０分間遠心して菌を回収し、ＰＢＳにて１，１００×ｇで１０分間遠心洗浄を２回行い、供試菌液とした。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅに０．１％スクロース配合  ２×  ＴＨＢ  培地１００μｌ、サンプル５０μｌ、１０μＭ  ＣＳＰ  ２０μｌ、ＰＢＳ  １０μｌを添加し、３７℃で５％ＣＯ２条件下にて１６時間培養した。
培養液を捨て、２００μｌの蒸留水（ＤＷ）にて洗浄後、１００μｌサフラニンを添加し１５分間静置しバイオフィルムを染色した。サフラニンを捨て、２００μｌ  ＤＷ  にて２回洗浄後、１００μｌの７０％エタノールを添加し、３０分間振とうすることでサフラニンを溶出し、マイクロプレートリーダーにて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００２９】
（実施例２）アズキ熱水抽出物の分画と活性評価
２−１  アズキ熱水抽出物の調製
粉砕機にて細かく粉砕した乾燥アズキ１ｇに対して蒸留水１００ｍｌを加え、７０℃で２時間抽出を行い、遠心および吸引濾過により上清を回収した。回収した上清を凍結乾燥により乾燥させ、アズキ熱水抽出物を調製した。
【００３０】
２−２  アズキ熱水抽出物の硫安分画
２−１に従い調製したアズキ熱水抽出物を硫酸アンモニウムによる塩析により分画した。蒸留水にアズキ熱水抽出物を溶解し、硫酸アンモニウムを徐々に添加し、沈殿物を２０，０００×ｇで１０分間の遠心により回収し、透析後に凍結乾燥にて硫安分画物を調製した。
【００３１】
２−３  アズキ熱水抽出物の硫安分画物のイオン交換クロマトグラフィー
２−２に従い調製した硫安分画物をＤＥＡＥ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにて分画を行った。５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）にアズキ熱水抽出物の硫安分画物を溶解し、カラムに充填した担体に吸着させ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）により洗浄後、０．５Ｍ  ＮａＣｌによるリニアグラジエントにて溶出した。さらに、バイオフィルム抑制活性を有していた画分は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、再びカラムに充填した担体に吸着させ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて洗浄後、０．５Ｍ  ＮａＣｌによるリニアグラジエントにて溶出した。タンパク質の溶出パターンは波長２８０ｎｍの吸光度にて測定した。
なお、全ての操作は流速１ｍｌ／分にて行った。
【００３２】
２−４  イオン交換クロマトグラフィー活性画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、バイオフィルム抑制活性評価
２−４−１  Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ
２−３に従い分画した活性画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色にてバンドを検出した。ゲルからバンドを抽出して活性評価する場合は、リバース染色にてバンドを検出した。
２−４−２  バイオフィルム抑制活性
２−４−１にて分離したバンドを切り出し、ホモジナイザーペッスル（アズワン）を用いてゲルからタンパク質を抽出し、１−１に従いバイオフィルム抑制活性を評価した。
【００３３】
２−５  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定
２−４−２に従いゲルから抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、５０ｋＤａ付近に見られたバンドを切り出し、トリプシン消化後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりタンパク質の分析を行った。
【００３４】
硫安分画により分画したところ、図１に示すように、硫安濃度４０％〜６０％で沈殿する画分にバイオフィルム抑制活性がみられた。５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用いた硫安分画物の陰イオン交換クロマトグラフィーの結果、２つ目のタンパク質溶出ピークにバイオフィルム抑制活性がみられた（図２）。この活性フラクションを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した結果、１つのタンパク質溶出ピークがみられた（図３（ａ））。このタンパク質の溶出ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドパターンにより３つのグループに分けて（グループＩ：フラクションＮｏ.３１〜３６、グループＩＩ：フラクションＮｏ.３７〜４０、グループＩＩＩフラクションＮｏ.４１〜５０）、透析後に凍結乾燥することで回収し、バイオフィルム抑制活性を評価した（図３（ｂ））。その結果、グループＩに最も強いバイオフィルム抑制活性がみられた（図３（ｃ））。活性画分（グループＩ）をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに供した結果、１つのメジャーバンドが見られた（図４（ａ））。そのメジャーバンドをゲルから切り出し、抽出し、バイオフィルム抑制活性を評価したところ、バイオフィルム抑制活性がみられた（図４（ｂ））。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ５０ｋＤａ付近にのみメジャーバンドが見られたことから、このタンパク質がアズキ熱水抽出物中の活性成分であることが示唆された（図４（ｃ））。この約５０ｋＤａのタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析を行った結果、アズキ７Ｓグロブリン−３と最も相同性が高かった（相同性５６％）。
【００３５】
（実施例３）アズキ７Ｓグロブリンの分画とバイオフィルム抑制活性評価
３−１  アズキ７Ｓグロブリンの分画
特許文献４を参考に、アズキから７Ｓグロブリンを分画した。粉砕機にて細かく粉砕したアズキに対して１０倍量の蒸留水を加え、ｐＨ７．０に調整した後、室温にて１時間攪拌した。または、粉砕機にて細かく粉砕したアズキに対して１０倍量の蒸留水を加え、７０℃にて１時間攪拌した。遠心および吸引濾過にて上清を回収した後、ＨＣｌにてｐＨ４．５に調整し、一晩静置し、２０，０００×ｇで１０分間遠心して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を蒸留水に懸濁し、ＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整後に攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心にて上清を回収した。回収した上清を透析し、凍結乾燥にて回収した。
３−２  バイオフィルム抑制活性評価
１−１に従い、アズキ７Ｓグロブリンのバイオフィルム抑制活性を評価した。
【００３６】
（実施例４）ダイズ７Ｓグロブリンの分画とバイオフィルム抑制活性評価
４−１  ダイズ７Ｓグロブリンの分画
特許文献４を参考に、ダイズから７Ｓグロブリンを分画した。粉砕機にて細かく粉砕したダイズに対して１０倍量の蒸留水を添加し、ｐＨ７．０に調製した後、室温で１時間攪拌した。または、粉砕機にて細かく粉砕したダイズに対して１０倍量の蒸留水を加え、７０℃にて１時間攪拌した。遠心および吸引濾過にて上清を回収した後、ＨＣｌにてｐＨ６．０に調整し、４℃で一晩静置後、２０，０００×ｇで１０分間遠心して上清を回収した。ＨＣｌにてｐＨ４．５に調整し、２０，０００×ｇで１０分間遠心して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を蒸留水に懸濁し、ＮａＯＨにてｐＨ７．０に調整後に攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心にて上清を回収した。回収した上清を透析し、凍結乾燥にて回収した。
【００３７】
４−２  バイオフィルム抑制活性評価
１−１に従い、ダイズ７Ｓグロブリンのバイオフィルム抑制活性を評価した。
【００３８】
（実施例５）インゲンマメ７Ｓグロブリンの分画とバイオフィルム抑制活性評価
５−１  インゲンマメ７Ｓグロブリンの分画  
非特許文献１を参考に、インゲンマメから７Ｓグロブリンを分画した。インゲンマメの種子を莢から取り出し、凍結乾燥にて乾燥後、１００倍量の０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）を添加し、２時間撹拌し、遠心および吸引濾過にて上清を回収した。ＨＣｌにてｐＨ４．５に調整し、４℃で一晩撹拌後、２０，０００×ｇで１０分間遠心して沈殿物を回収した。回収した沈殿物を蒸留水に懸濁し、ＮａＯＨにてｐＨ７．０に調製した後撹拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心して上清を回収した。回収した上清を透析し、凍結乾燥にて乾燥させた。
５−２  バイオフィルム抑制活性評価
１−１に従い、インゲンマメ７Ｓグロブリンのバイオフィルム抑制活性を評価した。
図５、６、７から明らかなように、アズキ、ダイズ、インゲンマメから室温にてｐＨを７．０に調整しながら抽出後に分画した７Ｓグロブリン画分にバイオフィルム抑制活性がみられた。また、アズキ、ダイズから７０℃の熱水にて抽出した後に分画した７Ｓグロブリン画分に活性がみられた。
なお、分画した７Ｓグロブリン画分には、各マメの７Ｓグロブリンのバンドが確認された（アズキ：約５０ｋＤａ、ダイズ：約７５ｋＤａ、７０ｋＤａ、５０ｋＤａ、インゲンマメ：約５０ｋＤａ）。
【００３９】
次に、７ＳグロブリンがＣＳＰ依存性のＳ．ｍｕｔａｎｓのバイオフィルム形成を阻害するメカニズムについて以下検討した。
【００４０】
（実施例６）
齲蝕原因菌であるStreptococcus mutansは、本菌が持つQuorum sensing system(QS)により、遺伝子の転写を制御していることが明らかとなっている。S. mutans のQSは、21個のアミノ酸からなるCompetence stimulating peptide (CSP) と呼ばれるぺプチドをシグナル因子とするメカニズムである。他の構成因子としてレセプターであるComD、各遺伝子を活性化するパスウェイに関わるComEおよびComXが存在していることが明らかとなっている。本菌のQSメカニズムの上流部位であるCSPの阻害や、本菌とCSPとの結合阻害によるQSの制御が可能であれば、本菌のバイオフィルム形成能の低下、さらには本菌の定着阻害効果を期待できるものと考えられる。
そこで本実施例では、S. mutansのバイオフィルム形成阻害を目的として、ＣＳＰの阻害もしくはＣＳＰへの拮抗阻害をもたらすような物質を見つけ出し、S. mutansへの影響について検討を行なった。
本発明は、食品に応用可能な齲蝕バイオフィルム形成阻害剤の開発を目指し、見出されたアズキ抽出物から精製されたアズキ７ＳグロブリンのＣＳＰに対する阻害活性を検討した。ＣＳＰの不活性化を測定する方法は、バクテリオシン産生試験により行った。
【００４１】
６−１．バクテリオシン産生実験を用いたＣＳＰ阻害効果の検討
ＣＳＰの特異的な阻害活性を検討するため S. mutans GS-5ΔcomC を用いる試験を行った。S. mutans GS-5ΔcomC はインディケーター strain である Streptococcal RP66 に対して バクテリオシンを産生しないが、その野生株は産生する。しかし、S. mutans GS-5ΔcomC にＣＳＰを加えるとバクテリオシンを産生するようになる。この性質を利用して、ＣＳＰを加える前にアズキ抽出物（７Ｓグロブリン）を作用させ、ＣＳＰに対する阻害効果を評価した。もしＣＳＰを抑制する作用があれば、バクテリオシンが産生されなくなる。その評価法として、RP66 に対する増殖阻止円を観察した。
【００４２】
６−２．方法
以下のような実験方法を行なった。
１）１ｍＭ  ＣＳＰ ２μｌと様々な濃度のサンプル  １８μｌを混ぜ（１００μＭ ＣＳＰ）、３７℃で１時間培養した。
２）Brain Heart Infusion （ＢＨＩ）にてあらかじめ培養したS. mutans GS-5ΔcomC をＰＢＳにて洗浄した。ＰＢＳにてＡ６００、ＯＤ＝０．５の濁度に調整した菌液３６μｌと １）で用意した反応液４μｌを混ぜた（１０μＭ  ＣＳＰ）。対照として、サンプルを加えない １００μｌ  ＣＳＰ４μｌを混ぜた。
３）ＢＨＩ寒天培地を用意し、サンプル処理したＣＳＰまたは未処理ＣＳＰをS. mutans とＴＳＢＳに混合し、穿刺培養を行った。
４）６時間または２４時間培養後、あらかじめＢＨＩにて培養したインディケーター株である Streptococcal RP66をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳにてＡ６００、ＯＤ＝０．５の濁度に調整した。
５）ＢＨＩ寒天培地を６ｍｌ用意し、固まらない状態で Streptococcal RP66 の菌液を３００μｌ入れよくかきまぜた。
６）４）で培養したＢＨＩ寒天プレートに５）の菌液を重層し、３７℃の恒温器に入れ一昼夜培養した。
７）コントロールである未処理サンプルの場合は、増殖阻止円が観察される。サンプルがＣＳＰを阻害するのであれば、阻止円は観察されない。
８）この阻止円の有無によってサンプルのＣＳＰへの阻害効果を判定した。
【００４３】
６−３．その他の使用サンプル
アズキ抽出物および７Ｓグロブリンは６−３−１および６−３−２に従い調製したものを使用した。
６−３−１  アズキ抽出物の調製
粉砕機にて粉砕したアズキ粉末１ｇに対して、蒸留水（ＤＷ）１００ｍｌを加えて室温にて２時間抽出を行った。吸引濾過および２０，０００×ｇ・１０分間の遠心にてアズキ残渣を除去し、その上清を凍結乾燥しアズキ抽出物として回収した。
６−３−２  アズキ７Ｓグロブリンの調製
アズキ抽出物を硫安分画・陰イオン交換クロマトグラフィー・NATIVE-PAGEにて分画し、アズキ７Ｓグロブリンを調製した。本試験に用いたアズキ７Ｓグロブリンは、上記した硫安分画・陰イオン交換クロマトグラフィー・NATIVE-PAGEにて分画したアズキ７Ｓグロブリンを用いた。
【００４４】
実験結果
１）添加ＣＳＰ濃度の検討  
バクテリオシン産生が促進されるＣＳＰ濃度を検討するために、ＣＳＰを０．０１、０．１、１．０、１０．０μＭの濃度にて添加した時のバクテリオシン産生能を検討した。寒天プレートでの培養時間は２４時間にて行った。その結果、ＣＳＰを１０μＭ加えた時に十分な阻止円を観察することができた。しかし、他の低い濃度では、十分な阻止円を観察することができなかった。そのため、以下の評価は１０μＭのＣＳＰを添加して行った。
【００４５】
２）アズキ抽出物のＣＳＰへの効果
アズキ抽出物のＣＳＰへの効果を検討した。その結果、阻止円が抑制されることはなかった。アズキ抽出物は、ｐＨが低下すると凝集する性質を有している。そこで、ＣＳＰをアズキ抽出物で処理する際に、ｐＨを低下させてアズキ抽出物の凝集によりＣＳＰ活性に影響を与えるか検討を行うことにした。その結果、ｐＨを低下させても阻止円が抑制されることはなかった。かりにアズキ抽出物がＣＳＰの活性を抑制していても、培養時間が長すぎることによりそれが失われてしまう可能性がある。アズキ抽出物のＣＳＰへの作用が分解などの不可逆的なものではなく、ＣＳＰと結合することでＣＳＰの作用を阻害するような可逆的なものであると、アズキ抽出物未添加条件下に比べ、ゆっくりではあるがバクテリオシンが産生されると考えられるためである。
そこで、穿刺培養時間を６時間という短い時間で行うことにした。その結果、培養６時間の場合、０．１８ｍｇ／ｍｌのアズキ抽出物が阻止円形成を抑制することが明らかとなった。
【００４６】
３）アズキ７ＳグロブリンのＣＳＰへの効果
以下の表１の結果から明らかなように、アズキ抽出物から精製された７Ｓグロブリンを０．４３μｇ／ｍｌの濃度にて１０μＭ  ＣＳＰと処理したときに形成される阻止円の大きさは、対照のS. mutans GS-5ΔcomCが形成する阻止円の大きさと違いがみられなかった。このことから、この７Ｓグロブリンは、ＣＳＰ活性を完全に抑制する効果を有していることが明らかとなった。 
【００４７】
【表１】
2015166334.tif 000002
【００４８】
アズキ抽出物はＣＳＰ活性の阻害効果を有しており、アズキ抽出物の中に含まれる５０ｋＤａの７Ｓグロブリンが、その阻害物質であることが考えられた。これらのことから、アズキからの抽出物質は口腔バイオフィルム形成を阻害し、またバイオフィルム形成に重要なクオラムセンシングシステムにおいて機能するＣＳＰ活性を阻害する新たな製剤として有用となる可能性が考えられた。従って、アズキからの抽出物質は、食品に応用可能な齲蝕バイオフィルム形成阻害剤として有用である。
【００４９】
（実施例７）バクテリオシン産生試験を用いた７Ｓグロブリンによるバイオフィルム抑制メカニズムの検討
Streptococcus mutans は２１個のアミノ酸からなるペプチドCompetence stimulating peptide（ＣＳＰ）を産生している。S. mutans は、ＣＳＰをシグナル因子として、本菌が有するQuorum sensing system（ＱＳ）により、遺伝子の転写を制御していることが明らかとなっている。他のＱＳ構成因子としてレセプターであるＣｏｍＤ、各遺伝子を活性化するパスウェイに関わるＣｏｍＥおよびＣｏｍＸが存在していることが明らかとなっている。S. mutans が産生するバクテリオシンも、ＣＳＰを介して発現が制御される遺伝子の一つである。そのため、バクテリオシン産生を評価することで、ＣＳＰの作用を阻害しているか評価することができる。ＣＳＰをアズキ抽出物またはアズキ７Ｓグロブリンにより処理してからS. mutansと混合し、ＣＳＰにより誘導されるバクテリオシン産生量を評価したところ、アズキ抽出物とアズキ７Ｓグロブリンにバクテリオシン産生抑制効果が認められた。
【００５０】
７−１  供試菌株
供試菌株としては、Streptococcus mutans GS5、S. mutans GS-5ΔcomC、Streptococcal ＲＰ６６を使用した。
７−２  アズキ抽出物の調製
粉砕機にて粉砕したアズキ粉末１ｇに対して、蒸留水（ＤＷ）１００ｍｌを加えて室温にて２時間抽出を行った。吸引濾過および２０，０００×ｇ・１０分間の遠心にてアズキ残渣を除去し、その上清を凍結乾燥しアズキ抽出物として回収した。
７−３  アズキ７Ｓグロブリンの調製
アズキ抽出物を硫安分画・陰イオン交換クロマトグラフィー・NATIVE-PAGEにて分画し、アズキ７Ｓグロブリンを調製した。本試験に用いたアズキ７Ｓグロブリンは、上記した硫安分画・陰イオン交換クロマトグラフィー・NATIVE-PAGEにて分画したアズキ７Ｓグロブリンを用いた。
【００５１】
７−４  アズキ抽出物のバクテリオシン産生抑制評価
７−４−１  アズキ抽出物処理済みＣＳＰの調製
２μｌの１ｍｌＣＳＰと１８μｌの２ｍｇ／ｍｌのアズキ抽出物を混合し、３７℃で１時間インキュベートし、アズキ抽出物処理済みＣＳＰとした。
７−４−２  S. mutans GS-5 ΔcomC 供試菌液の調製
ＢＨＩ培地にてS. mutans GS-5 ΔcomC を３７℃、５％炭酸ガス条件下にて一晩培養し、ＰＢＳにて遠心集菌した後、ＰＢＳにてＯ．Ｄ．＝０．５に調製し、S. mutans GS-5 ΔcomC 供試菌液とした。
７−４−３  Streptococcal ＲＰ６６供試菌液の調製
ＢＨＩ培地にてStreptococcal ＲＰ６６を３７℃、５％炭酸ガス条件下にて一晩培養し、ＰＢＳにて遠心集菌した後、ＰＢＳにてＯ．Ｄ．＝０．５に調製した。ＢＨＩ寒天培地をオートクレーブにて滅菌した後、固まる前のＢＨＩ寒天培地に調製したStreptococcal ＲＰ６６菌液３００μｌを懸濁し、これをStreptococcal ＲＰ６６供試菌液とした。
７−４−４  バクテリオシン産生試験
７−４−１にて調製したアズキ抽出物処理済みＣＳＰ  ４μｌと７−４−２にて調製したS. mutans ＧＳ−５ ΔcomC 供試菌液３６μｌを混合し、ＢＨＩ寒天培地上に穿刺し、３７℃、好気条件下にて６時間または２４時間培養した。培養後、７−４−３にて調製したStreptococcal ＲＰ６６供試菌液を重層し、３７℃、好気条件下にて２４時間培養した。培養後、阻止円の直径を測定することで、バクテリオシン産生量を評価した。
【００５２】
７−５  アズキ７Ｓグロブリンのバクテリオシン産生抑制評価
７−５−１  アズキ７Ｓグロブリン処理済みＣＳＰの調製
２μｌの１ｍＭ  ＣＳＰと７−３にて調製した ０．４３μｇ／ｍｌのアズキ７Ｓグロブリンを１８μｌ混合し、３７℃で１時間インキュベートし、アズキ７Ｓグロブリン処理済みＣＳＰとした。
７−５−２  バクテリオシン産生試験
７−５−１にて調製したアズキ７Ｓグロブリン処理済みＣＳＰ  ４μｌと７−４−２にて調製した S. mutans GS-5 ΔcomC 供試菌液３６μｌを混合し、ＢＨＩ寒天培地上に穿刺し、３７℃、好気条件下にて２４時間培養した。培養後、７−４−３にて調製した Streptococcal ＲＰ６６供試菌液を重層し、３７℃、好気条件下にて培養した。培養後、阻止円の直径を測定することで、バクテリオシン産生量を評価した。
【００５３】
７−６  アズキ抽出物のバクテリオシン産生抑制効果
７−２−４に従い、アズキ抽出物のバクテリオシン産生抑制効果を評価した。その結果、表２に示すように、培養時間６時間の条件下において、アズキ抽出物の添加により、形成される阻止円の縮小が認められた。アズキ抽出物がＣＳＰにより誘導されるS. mutansのバクテリオシン産生を抑制したことから、アズキ抽出物がＣＳＰの働きを阻害することが示唆された。ただし、培養時間２４時間の条件下においてはバクテリオシン産生抑制効果がみられなくなった。アズキ抽出物のＣＳＰへの作用が分解などの不可逆的なものではなく、ＣＳＰと結合することでＣＳＰの作用を阻害するような可逆的なものであり、アズキ抽出物未添加条件下に比べ、ゆっくりではあるがバクテリオシンが産生される可能性が考えられた。
【００５４】
【表２】
2015166334.tif 000003
【００５５】
７−７  アズキ７Ｓグロブリンのバクテリオシン産生抑制効果
７−５−２に従い、アズキ抽出物から分画された７Ｓグロブリンのバクテリオシン産生抑制効果を評価した。その結果、表３に示すように、アズキ７Ｓグロブリンの添加により、形成される阻止円の縮小が認められた。アズキ抽出物の添加量に比べ、少ない添加量にて抑制効果が認められた。また、培養時間が２４時間の条件下においてはアズキ抽出物にはバクテリオシン産生抑制効果が認められなかったが、アズキ７Ｓグロブリンには認められた。これらのことから、アズキ７Ｓグロブリンのバクテリオシン産生抑制効果はアズキ抽出物よりも強いことが示唆された。
【００５６】
【表３】
2015166334.tif 000004
【００５７】
さらに、実施例３−１、４−１、５−１で調製したアズキ７Ｓグロブリン、ダイズ７Ｓグロブリン、インゲンマメ７Ｓグロブリンを用いて、チューインガム、キャンディ、練り歯磨を常法にて調製した。以下にその処方を示す。なお、これらは本発明品の範囲をなんら制限するものではない。
【００５８】
（実施例８）
以下の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース                                            ２０．０重量％
キシリトール                                          ５５．０重量％
グルコース                                            １５．０重量％
水飴                                                    ９．０重量％
香料                                                    ０．５重量％
アズキ７Ｓグロブリン（実施例３−１）                    ０．５重量％
１００．０
【００５９】
（実施例９）
以下の処方に従ってチューインガムを調製した。
ガムベース                                            ２０．０重量％
キシリトール                                          ５０．０重量％
マルチトール                                          ２０．０重量％
水飴                                                    ９．０重量％
香料                                                    ０．５重量％
ダイズ７Ｓグロブリン（実施例４−１）                    ０．５重量％
１００．０
【００６０】
（実施例１０）
以下の処方に従ってキャンディを調製した。
砂糖                                                  ５０．０重量％
水飴                                                  ３４．０重量％
香料                                                    ０．５重量％
アズキ７Ｓグロブリン（実施例３−１）                    ０．５重量％
水                                                        残         
１００．０
【００６１】
（実施例１１）
以下の処方に従って練り歯磨を調製した。
炭酸カルシウム                                        ５０．０重量％
グリセリン                                            ２０．０重量％
カルボオキシメチルセルロース                            ２．０重量％
ラウリル硫酸ナトリウム                                  ２．０重量％
香料                                                    １．０重量％
サッカリン                                              ０．１重量％
インゲンマメ７Ｓグロブリン（実施例５−１）              １．０重量％
クロルヘキシジン                                      ０．０１重量％
水                                                        残         
１００．０
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、新しい着眼点での虫歯予防剤である。虫歯の原因である虫歯バイオフィルムの形成を抑制することにより虫歯を予防するものであり、その虫歯バイオフィルム抑制効果を豆類の７Ｓグロブリンに見出したものである。既存の抗菌剤等と比較して、菌交代症の発生や耐性菌の出現リスクが低いと考えられ、オリジナル素材として、種々の製品への応用展開が可能である。
【図１】
2015166334.tif 000005
【図２】
2015166334.tif 000006
【図３】
2015166334.tif 000007
【図４】
2015166334.tif 000008
【図５】
2015166334.tif 000009
【図６】
2015166334.tif 000010
【図７】
2015166334.tif 000011