(57)【要約】【課題】新規な抗マダニワクチン及び該ワクチンを用いるマダニの駆除方法を提供すること。【解決手段】マダニフェリチン1若しくはそのエピトープ含有断片及び／又はマダニフェリチン2若しくはそのエピトープ含有断片を含む抗マダニワクチン、並びに該ワクチンを非ヒト動物に投与すること。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マダニフェリチン1若しくはそのエピトープ含有断片及び／又はマダニフェリチン2若しくはそのエピトープ含有断片を含む、抗マダニワクチン。
【請求項２】
マダニフェリチン1若しくはそのエピトープ含有断片及び／又はマダニフェリチン2若しくはそのエピトープ含有断片が組み換え体である、請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】
マダニフェリチン１が、
（a）配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（b）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（c）配列番号1と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
のいずれかのポリペプチドである、請求項1又は2に記載のワクチン。
【請求項４】
マダニフェリチン2が、
（a）配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（b）配列番号2で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（c）配列番号2と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
のいずれかのポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチンを非ヒト動物に投与することを含む、マダニの駆除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マダニフェリチンを含む抗マダニワクチン及び該ワクチンを用いるマダニの駆除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
畜産業に甚大な被害をもたらすマダニは、現在主に化学物質(殺ダニ剤)により駆除されているが、化学的殺ダニ剤では、抵抗性マダニの出現、残留殺ダニ剤による環境汚染、及び安全性試験による新規薬剤開発費の増大等の問題が深刻化している。そこで、現行の化学的殺ダニ剤に代わる安全性、有効性、及び経済性に優れた新しいマダニ防除技術の開発が急務となっている。
【０００３】
ワクチネーションによってマダニを駆除しようという抗マダニワクチンのアイデアはかなり古くからあったが、1994年に市販されたオウシマダニ防除を目的としたBm86ベースの抗マダニワクチンを唯一の例外として、今日に至るまで実用化されたワクチンは皆無である。理想的な抗マダニワクチンとは、（１）人獣加害性のすべてのマダニに対して有効であるとともに、（２）卵、幼ダニ、若ダニ、成ダニの発育期のすべてに有効性を発揮し、（３）付与した免疫能が長期間継続し、（４）媒介疾病の感染を阻止するとともに、（５）ワクチン抵抗性の獲得がなく、（６）低価格である等の特徴を備えているべきであると考えられるが、上記のBm86ワクチンを含めて、これらの条件をすべて満足させるものは存在しないのが現状である(非特許文献1)。したがって、有用な新規抗マダニワクチンの開発が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】de la Fuente and Merino, Vaccine, 31 (50): 5923-5929, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な抗マダニワクチン及び該ワクチンを用いるマダニの駆除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鉄分子由来の酸化ストレスに対する防御に重要な役割を担っているマダニフェリチンに着目し、マダニフェリチンの活性阻害によって、吸血プロセスの破綻が起こり、マダニを駆除できるのではないかと考えた。本発明者らは、組換えフェリチンを作製し、これを宿主に免疫することによって、抗マダニ効果が認められることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
１．マダニフェリチン1若しくはそのエピトープ含有断片及び／又はマダニフェリチン2若しくはそのエピトープ含有断片を含む、抗マダニワクチン。
２．マダニフェリチン1若しくはそのエピトープ含有断片及び／又はマダニフェリチン2若しくはそのエピトープ含有断片が組み換え体である、上記1に記載のワクチン。
３．マダニフェリチン１が、
（a）配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（b）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（c）配列番号1と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
のいずれかのポリペプチドである、上記1又は2に記載のワクチン。
４．マダニフェリチン2が、
（a）配列番号2で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（b）配列番号2で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（c）配列番号2と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
のいずれかのポリペプチドである、上記1〜3のいずれかに記載のワクチン。
５．上記1〜4のいずれかに記載のワクチンを非ヒト動物に投与することを含む、マダニの駆除方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明はマダニの生存基盤である吸血消化を標的とするため、多くの予防治療薬が抱えている、安全性や畜産物への薬物残留等の諸問題を解決できる革新的技術を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、組み換えフェリチン1（FER1）又は組み換えフェリチン2（FER2）で免疫した抗血清の、ELISAによって測定したフェリチン1抗原に対する抗体価を示す。
【図２】図２は、組み換えフェリチン１（FER1）又は組み換えフェリチン2（FER2）で免疫した抗血清の、ELISAによって測定したフェリチン2抗原に対する抗体価を示す。
【図３】図３は、組み換えフェリチン１（FER1）又は組み換えフェリチン2（FER2）で免疫した抗血清の、フェリチン１及びフェリチン２に対するウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図４】図４は、組み換えフェリチン１（FER1）又は組み換えフェリチン2（FER2）で免疫したウサギに雌成ダニを吸血させた後の、飽血マダニの概観及びマダニの飽血体重を示す。図中、矢印は、マダニの卵の色素異常（正常な卵に対し、やや白い）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第一の態様は、マダニフェリチンを含む抗マダニワクチンである。
フェリチンとは、鉄結合性タンパク質の一種である。鉄分子はマダニの生命恒常維持において不可欠である一方、その過剰摂取はマダニにとって有毒になることも考えられる。特に、吸血の際は、マダニ体内は血液に含まれる大量の鉄分子に暴露されると考えられる。本発明者らは、これまでにフタトゲチマダニが2種類のフェリチン、すなわち、フェリチン１（細胞内型）及びフェリチン2（分泌型）を有し、これらが吸血や産卵、鉄分子由来の酸化ストレスに対する防御に重要な役割を担っていることを見出した(Galay et al., J. Exp. Biol., 2013)。したがって、本発明の抗マダニワクチンは、有効成分としてマダニフェリチン1及び／又はマダニフェリチン2、あるいはそれらのエピトープ含有断片を含んでよい。
【００１１】
本発明のマダニフェリチンの由来は、特に限定するものではないが、フタトゲチマダニ（Haemaphysalis longicornis）、ヤマトチマダニ(Haemaphysalis japonica)、アミメカクマダニ(Dermacentor recticulatus)、タイワンカクマダニ(Dermacentor taiwanensis)、キチマダニ(Haemaphysalis flava)、ヤマトマダニ(Ixodes ovatus)、シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)、オウシマダニ（Rhipicephalus (Boophilus）microplus）等のマダニ類が好ましく、特にフタトゲチマダニが好ましい。したがって、本発明のマダニフェリチン1は、好ましくはフタトゲチマダニフェリチン1であり、マダニフェリチン2はフタトゲチマダニフェリチン2である。
【００１２】
本発明のマダニフェリチンは、投与対象に投与した場合に、抗原性を有し、免疫反応を誘導する限り、マダニフェリチンタンパク質の断片であってよい。したがって、本発明の抗マダニワクチンは、マダニフェリチンのエピトープ含有断片を含んでよい。そのようなタンパク質断片は、上記のタンパク質に基づいて任意のペプチドを、DNA組み換え技術及びペプチド合成技術等の慣用技術により作製し、そのペプチドの抗原性及び免疫原性を、ウエスタンブロッティング、ELISA、ワクチン接種等により確認することによって作製することができる。当該断片は、少なくとも８〜１０個以上のアミノ酸、例えば２０〜５０個以上のアミノ酸を有するマダニフェリチン1又は2の一部からなるポリペプチドである。
【００１３】
本発明において、マダニフェリチンタンパク質の抗原性とは、抗マダニフェリチン抗体を作製することができる抗原としての能力を意味する。あるペプチドがマダニフェリチンタンパク質の抗原性を有するか否かは、該ペプチドに対する抗体を作製し、作製した抗体が全長のマダニフェリチンタンパク質又はそれに由来するタンパク質（例えば分子切断部位において切断された後のタンパク質）と反応するか否かを検出することによって確認することができる。このような操作は当技術分野で公知である。
【００１４】
また、マダニフェリチンタンパク質の免疫原性とは、動物において該タンパク質に対する免疫応答を誘発する性質を意味する。免疫応答により生体内で該タンパク質に対する抗体が産生される。そのような抗体がマダニに対する生体防御に機能する。
【００１５】
マダニフェリチンタンパク質の調製は、当業者にとって周知の方法を用いて行うことができる。例えば、マダニフェリチンタンパク質を生産する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離し、必要に応じて精製して、マダニフェリチンタンパク質を得ることができる。
【００１６】
あるいは、本発明のマダニフェリチンタンパク質又はそのエピトープ含有断片は、組み換え体であってよい。組み換えマダニフェリチンタンパク質又は断片は、当業者にとって周知の遺伝子工学的手法を用いて、製造・精製することができる。例えば、マダニフェリチンタンパク質をコードするDNA又はその断片を適当なベクターに組込み、このベクターを適当な宿主細胞に導入し、当該ペプチドを発現させることが可能である。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Sambrookら,“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harber Laboratory Press, 1989）に従って実施することが可能である。
【００１７】
ベクターとしては、例えばウイルスベクター又はプラスミドベクターが挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えばセンダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等が挙げられる。プラスミドベクターは、原核生物用、酵母用、真核生物用の市販プラスミド又は文献記載のプラスミドを使用できる。例えば、原核生物用プラスミドとしては、pBR322、pUC系、pQE系、pET系、pBluescript系等、酵母用プラスミドとしては、2μ、yEP系、pHS系等が挙げられる。ベクターは、発現されるDNAの他に、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び必要に応じて選択マーカー等を含む。
【００１８】
組み換え発現に好適な宿主細胞としては、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母、あるいは、公知の培養細胞、例えば、哺乳類細胞（例えば、CHO細胞、HEK-293細胞、又はCOS細胞）又は昆虫細胞（例えば、BmN4細胞又はSF9細胞）等が挙げられ、好ましい宿主生物は大腸菌である。
【００１９】
発現されたポリペプチドは、宿主細胞の培養上清から、タンパク質やペプチド精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体等を利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理等、を1以上組み合わせて用いて精製することが可能である。
【００２０】
本発明のマダニフェリチン1は、好ましくは配列番号1で示されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のマダニフェリチン1は、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる。同様に、本発明のマダニフェリチン2は、好ましくは配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のマダニフェリチン2は、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる。
【００２１】
本発明で用いるマダニフェリチン1は、配列番号1で示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、その抗原性及び免疫原性を維持している限り、配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。同様に、マダニフェリチン2は、配列番号2で示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、その抗原性及び免疫原性を維持している限り、配列番号2で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。ここで、「1若しくは数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個または2個である。
【００２２】
さらに、本発明で用いるマダニフェリチン1は、その抗原性及び免疫原性を維持している限り、配列番号1と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上の同一性、例えば97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。同様に、マダニフェリチン2は、その抗原性及び免疫原性を維持している限り、配列番号2と70%以上の同一性、好ましくは80%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、最も好ましくは95%以上の同一性、例えば97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであってよい。同一性の値は、複数のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。
【００２３】
本発明の抗マダニワクチンを投与すると、本発明のマダニフェリチンに対する抗体産生を誘導することができ、宿主の再感染防御能を介してマダニを駆除することができる。
【００２４】
本発明の抗マダニワクチンは、マダニ駆除用医薬組成物、あるいは、マダニ媒介性感染症の治療又は予防用医薬組成物として使用することも可能である。
【００２５】
本発明におけるマダニの「駆除」とは、マダニの完全な駆除のみならず、部分的な駆除も含む。マダニの駆除の程度は、飽血後のマダニの体重、生存率、産卵量、及び／又は幼ダニの孵化率若しくは生存率等により判断することができる。
【００２６】
本発明において、マダニの「飽血」とは、マダニが吸血することによって、マダニ体内が血液で満たされることを意味する。吸血すると、マダニの口器は皮膚に突き刺さった状態になるが、飽血するとマダニの口器は自然に外れることが知られている。
【００２７】
本発明の抗マダニワクチンは、さらに当業者に公知である１種又は数種のアジュバント、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、コレラトキシン、易熱性大腸菌毒素、水酸化アルミニウム、カリウムミョウバン、サポニン若しくはその誘導体、ムラミルジペプチド、鉱物油又は植物油、ＮＡＧＯ、ノバソーム又は非イオン性ブロック共重合体、ＤＥＡＥデキストラン等を含むことができ、マダニに対するワクチンとして、適当な間隔で動物（例えば、家畜等）に接種することができる。あるいは、本発明のポリペプチドを直接、適当な溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできるし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用することもできる。また、必要に応じて、本発明のポリペプチドに薬学的に許容し得る担体を添加し、例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、坐剤、噴霧剤、又はパップ剤等の適当な剤型にして使用することができる。
【００２８】
薬学的に許容し得る担体には、当業者には周知の溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、及び緩衝剤等が含まれる。
【００２９】
本発明の抗マダニワクチンの投与方法として、経口投与と非経口投与が挙げられる。経口投与には舌下投与を含む。非経口投与としては、例えば、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、動脈内投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、経粘膜投与、皮下投与、及び腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与することができる。
【００３０】
本発明の抗マダニワクチンを投与する対象としては、ヒト並びに非ヒト動物、例えば家畜及び愛玩動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、リス、フェレット、アヒル、ニワトリ、ハト等）が挙げられ、特に哺乳動物を対象とするのが好ましい。
【００３１】
本発明のマダニ駆除方法において、抗マダニワクチンの有効量は、投与対象とする動物の症状、性別、年齢、体重、及び／又は投与経路等に応じて適宜決定することができる。例えば、インビトロにおける試験又はインビボの動物モデル試験系から導くことができる。例えば、1回につき体重1kgあたり0.0001mg〜100mgの用量で、2日から8週間間隔で投与することができる。
【００３２】
本発明の第二の態様は、マダニ駆除の必要な動物に、本発明の上記抗マダニワクチンを有効量で投与することを含む、マダニの駆除方法である。
【００３３】
本発明のマダニ駆除方法は、抗マダニワクチンを投与することにより、マダニの飽血体重、産卵率、脱皮率等を低下させ、マダニを駆除することが可能である。
【００３４】
本発明の方法により駆除し得る対象しては、フタトゲチマダニ（Haemaphysalis longicornis）、ヤマトチマダニ(Haemaphysalis japonica)、アミメカクマダニ(Dermacentor recticulatus)、タイワンカクマダニ(Dermacentor taiwanensis)、キチマダニ(Haemaphysalis flava)、ヤマトマダニ(Ixodes ovatus)、シュルツェマダニ(Ixodes persulcatus)、オウシマダニ（Boophilus microplus）等のマダニ類が挙げられ、特にフタトゲチマダニが好ましい。さらに、ヒメダニ類（例えば、ツバメヒメダニ（Argas japonicus）等）等の他のダニ類を駆除することも可能である。
【００３５】
本発明の方法によりマダニを駆除することによって、さらにマダニ媒介性感染症（例えば、人獣のピロプラズマ症、紅斑熱、又はウイルス性脳炎等）を治療又は予防することも可能である。
【実施例】
【００３６】
実施例１．組み換えフェリチンの作製
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いてフェリチン1遺伝子とフェリチン2遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の増幅を行い、得られた増幅産物をGENECLEAN II KIT（フナコシ、東京）を用いて精製した。得られたDNAをpRSETA ベクター（Invitrogen, CA, USA）に組み込み、ヒートショック法にて大腸菌BL21株に形質転換した。この大腸菌を50 μg/mlのアンピシリンを添加した15 mlのLuria-Bertani（LB）培養液にて37℃で一晩前培養し、これをさらにアンピシリン添加LB培養液500 mlに添加しOD600=0.5になるまで37℃で培養した。その後、最終濃度が1 mMになるように1 M のイソプロピルチオ-β-ガラクトシド（IPTG）を500 μl添加後、再び37℃で4時間培養し、フェリチンを発現させた。
【００３７】
フェリチンを不溶性画分から得るため、上記の大腸菌培養液を遠心分離（650 ×g、30分、4℃）し、上清を取り除いたペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁し超音波処理を行った。溶解した菌体懸濁液を室温で20分間ローターにて撹拌後、遠心分離（20,000 ×g、15分、4℃）を行い、上清を取り除いたペレットに再び0.5%TritonX-100を含む20 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）を40ml添加し、4℃で1時間ローターにて撹拌した。その後、撹拌液は遠心分離（25,000 ×g、30分、4℃）を行い、上清を取り除いたペレットに 6 M尿素及び500 mM NaClを含む20 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）を20 ml添加し、ローターにて4℃で一晩撹拌した。翌日、撹拌液は遠心分離（25,000 ×g、30分、4℃）を行い、回収した上清をNi sepharoseカラムであるHisTrap FF カラム 0.7 × 2.5 cm（GE Healthcare UK Ltd., Buckinghamshire, England）に供し、フェリチンの精製を行った。
【００３８】
分取した溶出画分は、透析によってPBSに置換し、SDS-PAGEによって純度を測定した。
得られたフェリチンの濃度測定はMicro BCA Protein Assay Kit（PIERCE, IL, USA）を用いて行った。なお標準直線は牛血清アルブミン溶液（2 mg/ml）を用いて作製した。
【００３９】
実施例２．組換えフェリチンで免疫した抗血清の抗原に対する反応性
ウサギ一匹あたり、同量のアジュバント（Freund’s adjuvant, Incomplete、Sigma-Aldrich）と混合した100gの組換えフェリチン1（配列番号1）又は組換えフェリチン2（配列番号2）を、それぞれ2週間間隔で3回皮下に投与した。コントロール群にはアジュバントのみを投与した。抗血清の抗原に対する反応性を確認するために、投与０、１、３、５週間後に抗血清を回収し、以下の通りELISAにより抗体価を測定した。
【００４０】
まず、Carbonate buffer（15 mM 炭酸ナトリウム、35 mM 炭酸水素ナトリウム、0.2 g/L アジ化ナトリウム、pH 9.6）で1 μg/mlまで希釈したフェリチン溶液を作製し、これをNunc Immuno-Plate 96 well F Maxisorp（Nunc、IL、USA）に100 μl/wellとなるように分注した後、4℃、1晩静置した。翌日タンパク質溶液を取り除き、PBST（0.05% tween20、PBS）で200 μl/wellずつ分注し3回洗浄した。次に、Blocking buffer（3% skim milk、PBS）を150 μl/wellとなるように分注し、攪拌後37℃で1時間静置した。blocking buffer を取り除き、PBST（0.05% tween20、PBS）で200 μl/wellずつ分注し1回洗浄した。10000倍希釈した抗血清を100 μl/wellずつ分注し、攪拌後37℃で1時間静置した。抗血清希釈液を取り除き、PBSTで7回洗浄し、2000倍に希釈したヤギHRP標識抗ウサギIgG血清（DakoCytomation、Glostrup、Denmark）を100 μl/wellずつ分注し、攪拌後37℃で1時間静置した。抗体希釈液を取り除き、PBSTで7回洗浄し、BioFX（登録商標）TMB HRP microwell substrate（SurModics, MN, USA）を100 μlずつ分注し、遮光して37℃で30分間反応させた。0.6N硫酸と1 N 塩酸を等量で混ぜた混合液を100 μlずつ分注し反応を停止させ、OD450 nmを測定した。結果を図１及び図２に示す。
【００４１】
図１から明らかなように、組み換えフェリチン１又は組み換えフェリチン2で免疫した抗血清のフェリチン1抗原に対する抗体価は2回目の免疫後、顕著に増加し、その抗体価は、組み換えフェリチン1で免疫した抗血清と組み換えフェリチン2で免疫した抗血清とで同程度であった。
【００４２】
一方、図２から明らかなように、組み換えフェリチン１又は組み換えフェリチン2で免疫した抗血清のフェリチン2抗原に対する抗体価は3回目の免疫後までに徐々に増加し、その抗体価は、組み換えフェリチン2で免疫した抗血清の方が、組み換えフェリチン1で免疫した抗血清よりも高かった。
【００４３】
続いて、組み換えフェリチン１又は組み換えフェリチン2で免疫した抗血清を用いてウエスタンブロッティングを行った。すなわち、組換えフェリチンは等量の2× sample buffer（4% ドデシル硫酸ナトリウム、20% グリセロール、125 mM トリス、0.2% ブロモフェノールブルー、10% 2-メルカプトエタノール、pH 6.8）と混合し、5分間煮沸後急冷してSDS-PAGEを行った。フェリチンの検出では分離ゲルに12%ポリアクリルアミドゲルを使用し、1レーンあたり2.5 μgのフェリチンを泳動した。泳動後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜（Millipore Corporation、MA、USA）に転写し、ブロッキング溶液（5% skim milk、PBS）に浸し4℃、1晩静置した後、洗浄液（10 mM トリス、150 mM塩化ナトリウム、0.1% Tween20、pH 7.5）で5分間ずつ3回洗浄し、500倍希釈したウサギ抗血清と37℃で1時間反応させた。洗浄液で5分間ずつ3回洗浄し、30000倍に希釈したヒツジHRP標識抗マウスIgG抗体（GE Healthcare UK Ltd、Buckinghamshire、England）を37℃で1時間反応させた。1次抗血清、2次抗体ともに希釈はブロッキング溶液で行った。洗浄液で5分間ずつ3回洗浄し、ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare UK Ltd、Buckinghamshire、England）を用いて室温で5分間反応させた。検出はFluorChem（登録商標）FC2 system（Cell Biosciences、CA、USA）によって行った。
【００４４】
その結果、これらの抗血清はいずれもフェリチン１及びフェリチン２の両方に対して反応したことから（図3）、これらの抗血清が免疫交差性を有することが示された。
【００４５】
実施例３．組換えフェリチンで免疫したウサギに対するマダニ吸血試験
実施例２に準じて各100μgのアジュバントとフェリチンを混合し2週間間隔で3回ウサギへ皮内投与した。コントロール群には、アジュバントのみを投与した。3回目の免疫から2週間後、ウサギに30匹のフタトゲチマダニ雌成ダニを吸血させ、飽血後、マダニの体重、生存率、産卵量と幼ダニの孵化率を調べた。結果を図4及び表1に示す。
【００４６】
フェリチン1を免疫したウサギに吸血させたマダニの飽血体重は、コントロール群に比べて低下する傾向があり、フェリチン２を免疫したウサギに吸血させたマダニの飽血体重は、コントロール群に比べて有意に低下した（図4）。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
また、表１に示す様に、組換えフェリチンを免疫したウサギに吸血させたマダニの飽血体重、産卵量、幼ダニの孵化率、幼ダニの生存率はコントロール群に比べて低下し、特にフェリチン2免疫群ではフェリチン1免疫群に比べてワクチン効果が認められた。
【００４９】
これらの結果から、組換えフェリチンをウサギに免疫することによって、抗フェリチン抗体がフェリチンの機能を抑制し、行き場を失った鉄イオンがマダニの生体や産卵に悪影響を及ぼしたと考えられる。特に、卵では酸化ストレスによって細胞傷害がもたらされ、幼ダニの孵化率が低下したと考えられる。
【００５０】
以上の結果から、組換えフェリチンが新規の抗マダニワクチン抗原として有望であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明はマダニの生存基盤である吸血消化を標的とするため、多くの予防治療薬が抱えている、安全性や畜産物への薬物残留等の諸問題を解決できる革新的技術を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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