(57)【要約】      （修正有）【課題】多能性細胞を処理し、増殖及び分化するための方法の提供。【解決手段】胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する多能性細胞を培養液中でＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理することによって、効率的に増殖させ、かつ分化させることができる。酵素活性阻害剤が、３−［１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンであり、多能性マーカーを発現する細胞が、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーのうちの少なくとも１つを発現し、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性細胞を増殖及び分化するための方法であって、
ａ．前記多能性細胞を培養する過程と、
ｂ．前記多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理する過程とを含み、
ここで、前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が、３−［１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、
上記方法。
【請求項２】
前記多能性細胞が胚幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性細胞が、胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性マーカーを発現する細胞が、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーのうちの少なくとも１つを発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性細胞が胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性細胞が前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で１〜７２時間処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多能性細胞が前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で１２〜４８時間処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性細胞が前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で４８時間処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が濃度１００ｎＭ〜１００μＭで用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が濃度１μＭ〜１０μＭで用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が濃度１０μＭで用いられる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性細胞を処理するための方法を目的とし、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で多能性細胞を処理することによって、多能性細胞を培養液中で効率的に増殖させ、かつ分化させることができる。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病のための細胞代替療法における進歩と、移植可能なランゲルハウス島の不足により、インスリン産生細胞、又は移植に適した細胞の源を開発することに、興味の焦点が当てられている。１つの手法は、例えば、胚幹細胞等の多能性細胞から機能的β細胞を生成することである。
【０００３】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ−１７などの多くのマーカーを発現する。
【０００４】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ−１を発現する。ＰＤＸ−１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ−１の発現は、膵臓の器官形成における重要な過程である。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００５】
移植に十分な量の細胞物質を生成するには、培養液中で効率的に増殖することができ、かつ関心対象の組織、例えば、機能的β細胞に効率的に分化することができる、細胞物質の供給源が必要である。
【０００６】
ヒト胚幹細胞を培養するための現行法は複雑であり、これらの方法は、細胞がその多能性を失わずに増殖するために、外生要因、つまり合成培地の使用を必要とする。更に、胚幹細胞の分化は、多くの場合、培養液中における細胞増殖の低下を引き起こす。
【０００７】
一例を挙げれば、Ｃｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献１）は、無フィーダー、無血清培養システムを開示し、ここで胚幹細胞は、胚幹細胞の自己複製を誘発することができる異なる増殖因子で補充された非血清代替（ＳＲ）培地中で維持される。
【０００８】
別の例において、特許文献１は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張等浸透圧である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【０００９】
別の例において、特許文献２は、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示し、同方法は、幹細胞を、細胞を未分化の状態に維持するのに十分な量のタンパク質のトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）ファミリーのメンバー、タンパク質の繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果
を達成するのに十分な時間、暴露することを含む。
【００１０】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害剤は、成体幹細胞の拡散及び増殖を促進することで知られている。一例では、Ｔａｔｅｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２）は、ＧＳＫ−３阻害剤は、新生児又は成人の心臓から回収され、間葉系の特徴を有するヒト心臓幹細胞（ｈＣＳＣ）の増殖及び生存を亢進させることを示している。
【００１１】
例えば、Ｒｕｌｉｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献３）は、Ｗｎｔシグナルは島β細胞の増殖を刺激すると記載している。
【００１２】
別の例では、特許文献３は、骨髄成体多能性幹細胞を含む非胚幹細胞の培養液にＧＳＫ−３阻害剤を添加すると、増殖中の多能性表現型を維持させ、その結果よりロバストな分化応答をもたらすことを報告している。
【００１３】
別の例では、特許文献４は、フィーダー細胞層を使用せずに胚幹細胞を維持するために、Ｗｎｔの添加又はＧＳＫ−３酵素活性の小分子阻害剤の添加のいずれかによって、ＧＳＫ−３を阻害する方法を用いている。
【００１４】
別の例では、特許文献５は、ｃ−ｍｙｃの転写活性化及びｃ−ｍｙｃタンパク質の安定化を通じて多能性細胞を安定させるために、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を添加することを報告している。
【００１５】
別の例では、特許文献６は、マウス又はヒト胚幹細胞を含む多能性幹細胞の自己複製集団を維持するために、ＧＳＫ−３阻害剤とｇｐ１３０アゴニストとを含有する幹細胞培地の使用を報告している。
【００１６】
別の例では、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献４）は、特定の薬理化合物を有するＧＳＫ−３阻害剤は、胚幹細胞の未分化の表現型を維持し、かつＯｃｔ−３／４、Ｒｅｘ−１、及びＮａｎｏｇなどの多能性状態特異的転写因子の発現を持続させることができることを示している。
【００１７】
別の例では、Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献５）は、ＧＳＫ−３阻害剤で処理された成体神経幹細胞は、特にβカテニン標的遺伝子の転写を促進し、かつアポトーシスを減少させることによって、神経分化を亢進させることを示すことを明らかにしている。
【００１８】
別の例では、Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献６）は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤がインビトロでの骨形成を亢進させることを報告している。
【００１９】
別の例では、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（非特許文献７）は、胚幹細胞の造血分化は、ＷｎｔがＧＳＫ３の天然阻害剤である場合にはＷｎｔ／βカテニン経路の抑制を伴うことを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号
【特許文献２】ＷＯ２００５０８６８４５
【特許文献３】ＷＯ２００７０１６４８５
【特許文献４】ＵＳ２００６０３００４２
【特許文献５】ＷＯ２００６０２６４７３
【特許文献６】ＷＯ２００６１００４９０
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０、２００５年１０月１９日
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００７）３５２：６３５
【非特許文献３】ＰＮＡＳ  １４４，６２４７〜６２５２，（２００７）
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４）１０：５５〜６３
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）６：１１９８〜１２０８
【非特許文献６】Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２００５）１０４９：９７〜１０６
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｃａｔｉｏｎｓ（２００４）３２４：１３３３〜１３３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するために増殖され得るように多能性幹細胞株を処理する方法を開発する重大な必要性が今尚存在している。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理することによって、多能性細胞を増殖及び分化するための方法を提供する。
【００２４】
一実施形態において、本発明は多能性細胞を増殖及び分化するための方法を提供し、該方法は：
ａ．多能性細胞を培養する過程と、
ｂ．多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理する過程と、を含む。
【００２５】
一実施形態において、多能性細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される。
【００２６】
多能性細胞はヒト胚幹細胞であってもよく、又は６０／９１３４７５に開示される方法に従ってヒト胚幹細胞から誘導した多能性マーカーを発現する細胞であってもよい。
【００２７】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は式（Ｉ）の化合物である。
【００２８】
【化１】
2015119724.tif 000002
【００２９】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物である。
【００３０】
【化２】
2015119724.tif 000003
【００３１】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は、式（ＩＩＩ）の化合物である。
【００３２】
【化３】
2015119724.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】化合物ＪＮＪ  １７１８９７３１の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図２】化合物ＪＮＪ  １７１６３７９６の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図３】化合物ＪＮＪ  １７２２３３７５の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図４】化合物ＪＮＪ  １８１５７６９８の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図５】化合物ＪＮＪ  ２６１５８０１５の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図６】化合物ＪＮＪ  ２６４８３１９７の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図７】化合物ＪＮＪ  ２６４８３２４９の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図８】化合物ＪＮＪ  １０２２００６７の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＳｏｘ−１７の発現（パネルＢ）に与える影響を示す。結果は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒト胚幹細胞系Ｈ１細胞（白色バー）、又はヒト胚幹細胞系Ｈ９細胞（黒色バー）から得た。
【図９】実施例８に記載の方法に従って、示されている化合物で処理された細胞を用いた免疫蛍光染色法及びフローサイトメトリー分析によって測定された細胞の表面上におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。
【図１０】実施例８に記載の方法に従って、示されている化合物で処理された細胞における、リアルタイムＰＣＲによって測定されたＨＮＦ−３β（パネルＢ）及びＳｏｘ−１７（パネルＣ）の発現を示す。
【図１１】ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた、示されている化合物の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞の数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるＰｄｘ−１の発現（パネルＢ）、に与える影響を示す。細胞は、実施例９に記載の方法に従って処理された。
【図１２】リアルタイムＰＣＲによって測定された、示されている化合物の濃度範囲が、Ｐｄｘ−１の発現（白色バー）及びＨＮＦ−６（黒色バー）に与える影響を示す。細胞は、実施例９に記載の方法に従って処理された。
【図１３】ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた、示されている化合物の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞の数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるインスリンの発現（パネルＢ）に与える影響を示す。細胞は、実施例１０に記載の方法に従って処理された。
【図１４】リアルタイムＰＣＲによって測定された、示されている化合物の濃度範囲が、Ｐｄｘ−１の発現（白色バー）及びインスリン（黒色バー）に与える影響を示す。細胞は、実施例１０に記載の方法に従って処理された。
【図１５】ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた、示されている化合物の濃度範囲が、観察される細胞核の数によって決定される細胞の数（パネルＡ）、及び免疫蛍光染色の強度によって決定されるインスリンの発現（パネルＢ）に与える影響を示す。細胞は、実施例１１に記載の方法に従って処理された。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明又は図示した以下の小項目に分ける。
【００３５】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００３６】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００３７】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系統内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系統は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系統特異的なマーカーは、関心対象の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の関心対象系統への分化を評価する際に使用することができる。
【００３８】
「β−細胞系統」は、転写因子ＰＤＸ−１と、次の転写因子、即ちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６うちの少なくとも１つとに関する遺伝子発現が陽性の細胞を指す。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞を含む。
【００３９】
本明細書で言うところの「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、次のマーカー、即ちＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、ブラキュリ（Brachyury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は
、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１α。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系統の細胞が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する：ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞の集団を指す：ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣ。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、関心対象の細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して関心対象の細胞内で十分高く又は低く、そのため当技術分野で公知の多様な方法のいずれかを使用して、関心対象の細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」は、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「前原始線条細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「原始線条細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現している細胞を指す：ブラキュリ（Brachyury）、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパ
ク質、又はＦＧＦ４。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理することを含む、多能性細胞を増殖及び分化する方法を提供する。
【００５１】
一実施形態において、本発明は、次の過程を含む、多能性細胞を増殖及び分化するための方法を提供する：
ｃ．多能性細胞を培養する過程と、
ｄ．多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理する過程。
【００５２】
一実施形態において、多能性細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される。
【００５３】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、ブラキュリ（Brachyury）、Ｍｉｘ−様ホメオボ
ックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーの少なくとも１つを発現している多能性細胞から誘導される細胞が、本発明において想到される。本発明の一態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００５４】
多能性細胞は、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で約１〜約７２時間処理されてもよい。あるいは、多能性細胞は、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で約１２〜約４８時間処理されてもよい。あるいは、多能性細胞は、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で約４８時間処理されてもよい。
【００５５】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は、濃度約１００ｎＭ〜約１００μＭで使用される。あるいは、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は、濃度約１μＭ〜約１０μＭで使用される。あるいは、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は、濃度約１０μＭで使用される。
【００５６】
本発明の方法で使用するのに好適な化合物
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は式（Ｉ）の化合物：
【００５７】
【化４】
2015119724.tif 000005
［式中、
Ｒ1はフェニル、置換フェニルであり、フェニル置換基はＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリル、又はピリミジニルからなる群から選択され；
Ｒ2はフェニル、置換フェニル（ここでフェニル置換基はＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリル、からなる群から選択される）、又は任意にＣ1〜4アルキルで置換されていてもよいピリミジニルであり、及びＲ1及びＲ2の少なくとも一方はピリミジニルである、
Ｒ3は水素、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、Ｃ1〜5アルキルカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキルオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキル、置換アリールＣ1〜5アルキル（ここで１つ以上のアリール置換基は、独立して、Ｃ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、及びジＣ1〜5アルキルアミノからなる群から選択される）、フタルイミドＣ1〜5アルキル、アミノＣ1〜5アルキル、ジアミノＣ1〜5アルキル、スクシンイミドＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5
アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルＣ1〜5アルキル及びアリールオキシカルボニルＣ1〜5アルキルであり；
Ｒ4は、−（Ａ）−（ＣＨ2）q−Ｘであり；
Ａは、ビニレン、エチニレン又は
【００５８】
【化５】
2015119724.tif 000006
であり、
Ｒ5は、水素、Ｃ1〜5アルキル、フェニル、及びフェニルＣ1〜5アルキルからなる群から選択され；
ｑは０〜９であり；
Ｘは、水素、ヒドロキシ、ビニル、置換ビニル（ここで１つ以上のビニル置換基はそれぞれ、フッ素、臭素、塩素、及びヨウ素からなる群から選択される）、エチニル、置換エチニル（ここでエチニル置換基は、フッ素、臭素塩素、及びヨウ素からなる群から選択される）、Ｃ1〜5アルキル、置換されたＣ1〜5アルキル（ここで１つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド、及びアミノからなる群から選択される）、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、置換されたＣ1〜5アルコキシ（ここでアルキル置換基は、フタルイミド及びアミノらなる群から選択される）、フタルイミドオキシ、フェノキシ、置換フェノキシ（ここで１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、フェニル、置換フェニル（ここで１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、アリールＣ1〜5アルキル、置換アリールＣ1〜5アルキル（ここで１つ以上のアリール置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、アリールオキシＣ1〜5アルキルアミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンジルオキシイミノ（benxyloxyimino）、Ｃ1〜5アルキルオキシイミノ、フタルイミド、スクシンイミド、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、置換フェニルカルボニルオキシ（ここで１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、フェニルＣ1〜5アルキルカルボニルオキシ（ここで１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、アミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、ジＣ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、置換されたＣ1〜5アルキルカルボニルオキシ（ここで１つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、メチル、エチル、イソプロピル、及びヘキシルからなる群から選択される）、フェノキシカルボニルオキシ、置換フェノキシカルボニルオキシ（ここで１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される）、Ｃ1〜5アルキルチオ、置換されたＣ1〜5アルキルチオ（ここでアルキル置換基は、ヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される）、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、フェニルスルホニル、置換フェニルスルホニル（ここで１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、臭素、フッ素、塩素、Ｃ1〜5アルコキシ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択される）；但し、Ａが
【００５９】
【化６】
2015119724.tif 000007
【００６０】
ｑが０、及びＸがＨの場合は、Ｒ3は２−（トリメチルシリル）エトキシメチルでなくてもよい］；及びその薬学上許容し得る塩からなる群から選択される。
【００６１】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ1は置換フェニル及びＲ2はピリミジン］−３−イルである。
【００６２】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ1は４−フルオロフェニルである。
【００６３】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ3は水素、アリールＣ1〜5アルキル、又は置換アリールＣ1〜5アルキルである。
【００６４】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｒ3は水素又はフェニルＣ1〜5アルキルである。
【００６５】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ａはエチニレン、及びｑは０〜５である。
【００６６】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、式中、Ｘは、スクシンイミド、ヒドロキシ、メチル、フェニル、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、Ｃ3〜6シクロアルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルコキシ、フェニルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ、又はニトリルである。
【００６７】
式（Ｉ）の化合物は、同一出願人による米国特許第６，２１４，８３０号に開示されており、該特許の完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、この化合物は次のものからなる群から選択される：
【００６９】
【表１】
2015119724.tif 000008
【００７０】
本発明の実施例は式（Ｉ）の化合物を含み、この化合物は次の式の化合物５である。
【００７１】
【化７】
2015119724.tif 000009
【００７２】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は式（ＩＩ）の化合物：
【００７３】
【化８】
2015119724.tif 000010
［式中、
Ｒは、Ｒa、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒa、及びシアノからなる群から選択され；
Ｒaは、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択され；
Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され；ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して１の位置のアザインドール窒素原子と結合しており；
Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）ア
ルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基であり；
Ｒ6は、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8）アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8、及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基であり；但し、Ｒ6が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ6は、−Ｃ1〜8アルコキシ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択され；
Ｒ7は、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8、及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２個の置換基であり；
Ｒ8は、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基であり；但し、Ｒ8が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ8は、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から更に選択され；
Ｒ9は、水素、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基であり；
Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基であり；但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択され；
Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜３個の置換基であり；
Ｒ4は、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基であり；
Ｒ10は、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基であり；並びに
Ｙ及びＺは、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択され；但し、Ｙ及びＺの一方がＯであり且つ他方がＯ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される］；及びそれらの薬学上許容し得る塩である。
【００７４】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒは、Ｒa、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒa、及びシアノからなる群から選択される。
【００７５】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒaは、複素環、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択される。
【００７６】
一実施形態において、Ｒaは、ジヒドロ−ピラニル、フェニル、ナフチル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、アザインドリル、インダゾリル、ベ
ンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾフリル、及びジベンゾチエニルからなる群から選択される。
【００７７】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され；ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して１の位置のアザインドール窒素原子と結合している。
【００７８】
一実施形態において、Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−アリール−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され；ここで、ヘテロアリールは、ヘテロアリール環の炭素原子を通して１の位置のアザインドール窒素原子に結合されている。
【００７９】
一実施形態において、Ｒ1は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、及び−ナフチル−Ｒ6からなる群から選択される。
【００８０】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【００８１】
一実施形態において、Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【００８２】
一実施形態において、Ｒ5は、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ、−イミダゾリル−Ｒ6、−トリアゾリル−Ｒ6及び−テトラゾリル−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【００８３】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ6は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4）アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基である；但し、Ｒ6が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ6は、−Ｃ1〜4アルコキシ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択される。
【００８４】
一実施形態では、Ｒ6は水素である。
【００８５】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ7は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8、及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２個の置換基である。
【００８６】
一実施形態において、Ｒ7は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）及び−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2からなる群から独立して選択される２個の置換基である。
【００８７】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ8は、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3、及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基である；但し、Ｒ8が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ8は、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から更に選択される。
【００８８】
一実施形態では、Ｒ8は水素である。
【００８９】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ9は、水素、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、（ハ
ロ）1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【００９０】
一実施形態では、Ｒ9は水素である。
【００９１】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される。
【００９２】
一実施形態において、Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6、及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群から選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が窒素原子に結合されている場合には、クオーターニウム塩（quaterniumsalt）は形成されず；そして但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−Ｒ6、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される。
【００９３】
一実施形態において、Ｒ2は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、及び−アリール−Ｒ6からなる群から選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が窒素原子に結合されている場合には、クオーターニウム塩（quaterniumsalt）は形成されず；そして但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｎ−Ｒ7、ハロゲン、ヒドロキシ、及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される。
【００９４】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に結合された１〜３個の置換基である。
【００９５】
一実施形態において、Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から選択される、炭素原子に結合された１個の置換基である。
【００９６】
一実施形態において、Ｒ3は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン、及びヒドロキシからなる群から選択される、炭素原子に結合された１個の置換基である。
【００９７】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ4は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である。
【００９８】
一実施形態において、Ｒ4は、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル、−複素環、−アリール、及び−ヘテロアリールからなる群から独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である。
【００９９】
一実施形態において、Ｒ4は、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン、及びヒドロキシからなる群から独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である。
【０１００】
一実施形態において、Ｒ4は、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、塩素、フッ素、及びヒドロキシからなる群から独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である。
【０１０１】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｒ10は、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【０１０２】
一実施形態において、Ｒ10は、水素及び（ハロ）1〜3からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【０１０３】
一実施形態において、Ｒ10は、水素及び（フルオロ）3からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である。
【０１０４】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物を含み、式中、Ｙ及びＺは、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される；但し、Ｙ及びＺの一方がＯであり且つ他方がＯ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される。
【０１０５】
一実施形態において、Ｙ及びＺは、Ｏ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される；但し、Ｙ及びＺの一方がＯであり且つ他方がＯ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択さ
れる。
【０１０６】
一実施形態において、Ｙ及びＺは独立してＯから選択される。
【０１０７】
式（ＩＩ）の化合物は、同一出願人による米国特許第７，１２５，８７８号に開示されており、該特許の完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
本発明の実施例は式（ＩＩ）の化合物を含み、この化合物は次のものからなる群から選択される：
【０１０９】
【表２−１】
2015119724.tif 000011
【０１１０】
【表２−２】
2015119724.tif 000012
【０１１１】
本発明の実施例は式（ＩＩ）の化合物を含み、この化合物は次のものからなる群から選択される：
【０１１２】
【化９】
2015119724.tif 000013
【０１１３】
一実施形態において、ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤は、式（ＩＩＩ）の化合物：
【０１１４】
【化１０】
2015119724.tif 000014
［式中、
Ａ及びＥは、水素置換された炭素原子及び窒素原子からなる群から独立して選択され；ここで、
【０１１５】
【化１１】
2015119724.tif 000015
は、１Ｈ−インドール、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン、及び１Ｈ−インダゾールからなる群から独立して選択され；
ＺはＯから選択され；あるいは、Ｚはジヒドロから選択され；ここで、それぞれの水素原子は単結合で結合されている；
Ｒ4及びＲ5は、場合によりオキソで置換されているＣ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、及びＣ2〜8アルキニルから独立して選択され；
Ｒ2は、−Ｃ1〜8アルキル−、−Ｃ2〜8アルケニル−、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選ばれた１個〜４個の置換基で場合により置換されている直炭素鎖であり；そして、式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル、及びスピロ複素環（式中、上記のシクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、上記の複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている）からなる群から独立して選択された１個〜２個の置換基で場合により置換されている）、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール（式中、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−ＮＲ6−、−���−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ6−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、及び−ＳＯ2−（式中、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（式中、上記の複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）からなる群から独立して選択される）からなる群から選択され；但し、Ａ及びＥが水素置換された炭素原子から選択された場合には、Ｒ2は、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換された直炭素鎖であり；そして式中、上記���アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル、及びスピロ複素環（式中、上記のシクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）
アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、上記の複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている）からなる群から独立して選択された１個〜２個の置換基で場合により置換されている）、シクロアルキル（式中、シクロアルキルは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されている）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ9−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ9−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−及び−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（式中、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（式中、上記の複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及び水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）よりなる群より独立して選ばれ；そ��て式中、Ｒ9は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（式中、上記の複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換され；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）よりなる群より独立して選ばれる）よりなる群より選ばれ；並びに
Ｒ1及びＲ3は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル（式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、（ハロ）1〜3、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から選択された置換基で場合により置換されている）、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルキルカルボニル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、Ｃ1〜8アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール（式中、アリール及びヘテロアリールはＣ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から選択された置換基で場合により置換されている）、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で場合により置換されている）、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、及びニトロ、からなる群から独立して選択される］；及びそれらの薬学上許容し得る塩である。
【０１１６】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、以下からなる群から選択される化合物：
【０１１７】
【化１２】
2015119724.tif 000016
【０１１８】
【化１３】
2015119724.tif 000017
【０１１９】
【化１４】
2015119724.tif 000018
（式中、すべてのその他の変数は前記に定義されている）；及びそれらの薬学上許容し
得る塩である。
【０１２０】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、以下からなる群から選択される化合物：
【０１２１】
【化１５】
2015119724.tif 000019
（式中、すべてのその他の変数は前記に定義されている）；及びそれらの薬学上許容し得る塩である。
【０１２２】
式（ＩＩＩ）の化合物は、同一出願人による米国特許第６，８２８，３２７号に開示されており、該特許の完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
本発明の実施例は式（ＩＩＩ）の化合物を含み、この化合物は次のものからなる群から選択される：
【０１２４】
【表３−１】
2015119724.tif 000020
【０１２５】
【表３−２】
2015119724.tif 000021
【０１２６】
本発明の実施例は式（ＩＩＩ）の化合物を含み、この化合物は次のものからなる群から選択される。
【０１２７】
【化１６】
2015119724.tif 000022
【０１２８】
本発明の別の実施例は、以下から成る群から選択される化合物を含む：
【０１２９】
【表４−１】
2015119724.tif 000023
【０１３０】
【表４−２】
2015119724.tif 000024
【０１３１】
本発明の別の実施例は、以下からなる群から選択される。
【０１３２】
【化１７】
2015119724.tif 000025
【０１３３】
【化１８】
2015119724.tif 000026
【０１３４】
【化１９】
2015119724.tif 000027
【０１３５】
【化２０】
2015119724.tif 000028
【０１３６】
本発明の方法による処理に好適な細胞
本発明で使用するのに好適な多能性細胞は、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する。
【０１３７】
一実施形態において、多能性細胞は胚幹細胞である。代替的な実施形態において、多能性細胞は、胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞である。一実施形態において、胚幹細胞はヒト細胞である。
【０１３８】
ヒト胚幹細胞の分離、増殖及び培養
ヒト胚幹細胞の特長：ヒト胚幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上、及びＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでのヒト胚幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現（存在する場合）を消失させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増大させる。未分化のヒト胚幹細胞は、通常、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。
【０１３９】
増殖したヒト胚幹細胞の他の望ましい表現型は、３つの全胚葉、即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する可能性である。ヒト胚幹細胞の多能性は、例えば細胞をＳＣＩＤマウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚層からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【０１４０】
増殖させたヒト胚幹細胞系は、標準的なＧバンド法を用いて核型を決定し、対応する霊長類種の公表されている核型と比較することができる。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、これは細胞が正倍数体であることを意味し、全ヒト染色体が存在しかつ著しく変更されてはいない。
【０１４１】
ヒト胚幹細胞の供給源：使用が可能なヒト胚幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来するヒト胚細胞の樹立株が挙げられる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）等の変異ヒト胚幹細胞株も好適である。
【０１４２】
一実施形態において、ヒト胚幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４、１９９５年）に記載されているように調製される。
【０１４３】
ヒト胚幹細胞の培養：一実施形態において、ヒト胚幹細胞は、本質的にフィーダー細胞を含有しないが、それでもなお、実質的な分化を受けずにヒト胚幹細胞の増殖を支持する培養システムで培養される。分化をともなわない無フィーダー細胞培養液中でのヒト胚幹細胞の増殖は、別の細胞種と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。代替的に、無フィーダー培養液中での分化なしでのヒト胚幹細胞の増殖は、合成培地を使用して支持される。
【０１４４】
代替的な実施形態において、ヒト胚幹細胞は、様々な方法で胚幹細胞を支持する、初期培養されたフィーダー細胞層である。次に、ヒト胚を、本質的にフィーダー細胞を含有しないが、それでもなお、実質的な分化を受けずにヒト胚幹細胞の増殖を支持する培養システムに移す。
【０１４５】
本発明で使用するのに好適な馴化培地の例は、ＵＳ２００２００７２１１７、ＵＳ６６４２０４８、ＷＯ２００５０１４７９９、及びＸｕ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ
２２：９７２〜９８０、２００４）に開示されている。
【０１４６】
本発明で使用するのに好適な合成培地の例は、ＵＳ２００７００１００１１に見出すことができる。
【０１４７】
好適な培地は以下の構成要素、例えば、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃  １１９６５−０９２、ノックアウトダルベッコ修正イーグル培地（ＫＯ  Ｄ
ＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃  １０８２９−０１８、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃  １５０３９−０２７、非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃  Ｍ７５２２、ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃  １３２５６−０２９から作製されてもよい。
【０１４８】
一実施形態において、ヒト胚幹細胞は、本発明の方法により処理される前に、処理された好適な培養基質に播かれる。一実施形態において、処理は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成された基底膜を形成する。
【０１４９】
他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、硫酸ヘパリンなどを、単独又は異なる組合せで含んでもよい。
【０１５０】
ヒト胚幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布にて播かれる。この特徴の全部は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【０１５１】
ヒト胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞の分離、増殖、及び培養
一実施形態において、多能性マーカーを発現する細胞は、次の過程を含む方法によってヒト胚幹細胞から誘導される：
ａ．ヒト胚幹細胞を培養する過程、
ｂ．ヒト胚幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる過程、及び
ｃ．細胞を除去し、続いてこの細胞を、細胞を培養する前にタンパク質又は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養する過程。
【０１５２】
一実施形態において、多能性マーカーを発現する細胞は、次の過程を含む方法によってヒト胚幹細胞から誘導される：
ａ．ヒト胚幹細胞を培養する過程、
ｂ．細胞を除去し、続いてこの細胞を、タンパク質又は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養する過程。
【０１５３】
タンパク質又は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上における低酸素状態下での細胞培養
一実施形態では、細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で、約１〜約２０日間培養される。代替的な実施形態では、細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で、約５〜約２０日間培養される。代替的な実施形態では、細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で、約１５日間培養される。
【０１５４】
一実施形態では、低酸素状態は約１％  Ｏ2〜約２０％  Ｏ2である。代替的な実施形態では、低酸素状態は約２％  Ｏ2〜約１０％  Ｏ2である。代替的な実施形態において、低酸素状態は約３％  Ｏ2である。
【０１５５】
細胞は、血清と、アクチビンＡと、Ｗｎｔリガンドとを含有する培地で、タンパク質又
は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養される。あるいは、培地は、ＩＧＦ−１を含有していてもよい。
【０１５６】
培地は、約２％〜約５％の範囲内の血清濃度を有してもよい。代替的な実施形態において、血清濃度は約２％であってもよい。
【０１５７】
アクチビンＡは、濃度約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬで使用されてもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１５８】
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群から選択されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１５９】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬで使用されてもよい。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、濃度約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬで使用されてもよい。一実施形態において、Ｗｎｔリガンドの濃度は約２０ｎｇ／ｍＬである。
【０１６０】
ＩＧＦ−１は、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬで使用されてもよい。代替的な実施形態において、ＧＦ−１は、濃度約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬで使用されてもよい。一実施形態において、ＩＧＦ−１の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１６１】
本発明の方法によって誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、タンパク質又は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上において、低酸素状態下で、培養液中で増殖することができる。
【０１６２】
本発明の方法によって誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する。
【０１６３】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の更なる分化
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野の任意の方法によって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【０１６４】
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’ＡｍｏｕｒらＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
【０１６５】
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸と、繊維芽細胞増殖因子と、ＫＡＡＤ−シクロパミンとを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に
分化される。この方法の一例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：１３９２〜１４０１，（２００６）に開示されている。
【０１６６】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明における使用に好適なものは、膵臓内胚葉系統の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１６７】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の更なる分化
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当技術分野の任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
【０１６８】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’ＡｍｏｕｒらＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。
【０１６９】
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１αからなる群から選択される。一実施形態において、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる。インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。本発明で使用するに好適なものは、膵臓内分泌系統の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。代替的に、膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【０１７０】
本発明の一態様において、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１と、次の転写因子、即ち、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【０１７１】
胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞系統（linage）の検出
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【０１７２】
分化の効率は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１７３】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイト
メトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０１７４】
所定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例は、表ＩＡに列挙されている。表ＩＡに列挙した抗体により認識されるものと同一のマーカーに指向される代替的な抗体が利用可能であり、又は容易に開発し得ることに留意するべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１７５】
例えば、多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の追加の特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞マーカーは、例えば、次のうちの１つ以上の発現を含む：ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１。
【０１７６】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１７７】
膵臓内胚葉系統（linage）に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーは、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１β等の１つ以上の転写因子の発現を含む。
【０１７８】
分化の効率は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１７９】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０１８０】
所定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例は、表ＩＡに列挙されている。表ＩＡに列挙した抗体により認識されるものと同一のマーカーに指向される代替的な抗体が利用可能であり、又は容易に開発し得ることに留意するべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１８１】
膵臓内分泌系統（linage）に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内分泌系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内分泌系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーは、１つ以上の、例えばＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１等の転写因子の発現を含む。
【０１８２】
β細胞系統の細胞に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、β細胞系統の細胞の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β−細胞系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用し得る。β細胞系統に特異的な特徴は、１つ以上の、中でも例えば、Ｐｄｘ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡ等の転写因子の発現を含む。これらの転写因子は、内分泌細胞の確認に関して当技術分野にて定着している。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：５２４〜６３２（２００２年））を参照されたい。
【０１８３】
分化の効率は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。代替的に、分化の効率は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体等）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。
【０１８４】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。
【０１８５】
所定のタンパク質マーカーの検出に有用な抗体の例は、表ＩＡに列挙されている。表ＩＡに列挙した抗体により認識されるものと同一のマーカーに指向される代替的な抗体が利用可能であり、又は容易に開発し得ることに留意するべきである。それらの代替的な抗体を、本発明に従って単離された細胞内のマーカーの発現を評価するために、使用してもよい。
【０１８６】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１８７】
（実施例１）
ヒト胚幹細胞の培養
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植
後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【０１８８】
ヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から獲得し、供給元の研究所から提供された取扱説明書に従って培養した。手短には、細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を有する２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯより）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）からなるＥＳ細胞培地中にてマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養した。Ｅ１３〜１３．５マウス胚由来のＭＥＦ細胞をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。ＭＥＦ細胞を、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸で補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。サブコンフルエントなＭＥＦ細胞培養物を１０ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により３時間処理して、細胞分割を停止させた後、トリプシン処理し、２×１０４／ｃｍ２で０．１％ウシゼラチン−被覆皿上に播いた。継代２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞のフィーダー層に播いたヒト胚幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した。コンフルエントとなった際（播いてから約５〜７日後）、ヒト胚幹細胞を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩＶ（インビトロジェン／ＧＩＢＣＯ）により５〜１０分間処理し、次に５ｍＬピペットを使用して表面を穏やかに擦り落とした。細胞を９００ｒｐｍで５分間回転させ、ペレットを再懸濁し、１：３〜１：４の細胞の比で新鮮培地に再び播いた。
【０１８９】
平行して、Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９ヒト胚幹細胞もまた、１：３０希釈の成長因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされているプレートに播種し、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ馴化培地で培養した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で培養した細胞を、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、Ｄｉｓｐａｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＬｉｂｅｒａｓｅ
ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｏｕｒｃｅ）と共にルーチン的に継代させた。ヒト胚幹細胞培養物の一部を低酸素状態下（約３％  Ｏ２）でインキュベートした。
【０１９０】
（実施例２）
ヒト胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞の誘導及び培養
ヒト胚幹細胞系Ｈ１及びＨ９由来の種々の継代数（継代３０〜５４）の細胞を、低酸素状態下（約３％  Ｏ２）で少なくとも３継代の間培養した。細胞は、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ−ＣＭ中で培養され、実施例１に従ってＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされたプレートに播かれた。
【０１９１】
次に、細胞を、０．５％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｃａｔａｌｏｇ＃
１３２４−ＷＮ−００２，ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２日間処理し、続いて２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＡＡ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３〜４日間処理した。このプロトコルは、胚体内胚葉マーカーの有意な増加をもたらした。
【０１９２】
次に、細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で５分間処理された。放出された細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地で再懸濁し、遠心分離によって回収し、血球計を用いてカウントした。放出された細胞を、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）で処理されたフラスコに、１０００−１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２
０ｎｇ／ｍＬＷｎｔ−３Ａの中で、低酸素状態（約３％  Ｏ２）下において３７℃で標準組織培養インキュベーター中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ又はその他の細胞外マトリクスタンパク質でコーティングされていなかった。培地は毎日交換された。いくつかの培養物において、培地は、１０−５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ（インスリン成長因子−Ｉ、ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮより入手）又は１Ｘ  ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、及びセレン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより入手）で更に補充された。培養条件の一部において、基本培地（ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ）は、０．１ｍＭのメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）及び非必須アミノ酸（１Ｘ，ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより入手）で更に補充された。
【０１９３】
培養後５〜１５日目に、老化して見える多数の巨細胞に囲まれた明確な細胞群体が出現した。約５０〜６０％コンフルエンシーの時点で、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液に室温で５分間暴露させることによって培養物を継代させた。放出された細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地で再懸濁し、遠心分離によって回収し、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）で処理されたフラスコに１０，０００細胞／ｃｍ２でＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬＷｎｔ−３Ａ＋／−５０ｎｇ／ｍＬＩＧＦ−Ｉの中に播種した。この培地は以後「培養基」とも呼ぶ。
【０１９４】
（実施例３）
多能性マーカーを発現する細胞のヒト胚幹細胞の単個細胞浮遊液からの誘導
ヒト胚幹細胞系Ｈ１  Ｐ３３及びＨ９  Ｐ４５からの細胞を、低酸素状態（約３％  Ｏ２）下で少なくとも３継代の間培養した。細胞は、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ−ＣＭ中で培養され、実施例１に従ってＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングされたプレートに播かれた。約６０％コンフルエンシーの時点で、培養物はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に５分間暴露された。放出された細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地で再懸濁し、遠心分離によって回収し、血球計を用いてカウントした。放出された細胞を、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）で処理されたフラスコに、１０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬＷｎｔ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬＩＧＦ−Ｉ＋０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）及び非必須アミノ酸（１Ｘ，ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより入手）の中で、低酸素状態（約３％Ｏ２）下において３７℃で標準組織培養インキュベーター中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ又はその他の細胞外マトリクスタンパク質でコーティングされていなかった。培地は毎日交換された。第１継代細胞をＰ１と呼ぶ。
【０１９５】
（実施例４）
ヒト胚幹細由来の多能性マーカーを発現する細胞の増殖に有用な種々の培養基
ヒト胚幹細由来の多能性マーカーを発現する細胞は、以下の培地組成物中において少なくとも２〜３０継代の培養に成功した。
１．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ
２．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
３．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
４．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
５．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
６．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−
３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
７．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋１０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
８．ＨＥＳｃＧＲＯ合成培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）
【０１９６】
上記で列挙された培地の基礎組成物は、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＣＲＭＬ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＤＭＥＭ、及びＦ１２などの同様の培地で置き換えられてもよい。
【０１９７】
（実施例４）
ＧＳＫ−３βの酵素活性阻害剤が多能性マーカーを発現する細胞の生存率に与える影響
多能性マーカーを発現する細胞の誘導及び維持を、実施例２に記載された通りに行った。細胞は、２％  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬＷｎｔ−３ａ、及び５０ｎｇ／ｍＬＩＧＦ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２で増殖させた。細胞を、Ｆａｌｃｏｎポリスチレンフラスコに密度１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％ＣＯ２、低酸素において単層培養で増殖させた。６０〜７０％コンフルエンスに達した後、ＰＢＳで単層を洗い、かつＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３〜５分間でインキュベートして剥離及び単一細胞分散させることによって、細胞を継代させた。
【０１９８】
小分子の商標ライブラリーからＧＳＫ−３Ｂの酵素活性を阻害する能力に関して選択された試験化合物を使用して、スクリーニングを行った。このライブラリーからの化合物は、９６ウェルプレートのフォーマットの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３０％  ＤＭＳＯ中の１ｍＭストックとして利用することができた。アッセイのため、多能性マーカーを発現する細胞を洗浄し、カウントし、かつ、９６ウェルの底が透明で色の濃いウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にウェルあたり２０，０００細胞の播種密度で通常の培養液中に播いた。この播種密度は、一晩培養物で最適な単層形成を得るために予め決定された。翌日、培養液を除去し、細胞単層をＰＢＳで３回すすぎ、試験化合物を、最終アッセイ濃度１０μＭとなるようにそれぞれアッセイ培地で希釈した８０μＬアリコートでウェルに添加した。アッセイ２日目に、培地を各ウェルから除去して、アッセイ培地で希釈した新しいアリコートの試験化合物と交換した。１日目及び２日目のアッセイ培地は、０．５％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２で構成された。培養３日及び４日目に、培地を各ウェルから除去して、２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（試験化合物なし）と交換した。アッセイ４日目に、１５μＬのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置によって４９０ｎｍで光学密度を読み取みとる前に、プレートを３７℃で１．５〜４時間インキュベートした。平均、標準偏差、及び変動係数からなる統計的測定値を各二重セットごとに計算した。陽性対照（培養１日及び２日目にアクチビンＡ及びＷｎｔ３ａで処理されたウェル）に対する各試験ウェルごとの毒性を計算した。
【０１９９】
表ＩＩは、全スクリーニング結果を集めたものである。このアッセイでは多能性マーカーを発現する細胞は当初コンフルエント単層として播かれたので、この結果は４日間の培養期間にわたる毒性測定を表している。結果は対照の生存率の割合として表され、１０μＭスクリーニング濃度で使用されたある化合物の可変毒性を示している。この細胞を用いたアッセイでは、化合物の割合が多いと、毒性は最小又は測定不可能となる。
【０２００】
選択した化合物の小パネルを、多能性マーカーを発現する細胞を用いて上記と同様のアッセイにおいて狭い用量漸増範囲にわたって繰り返し試験した。表ＩＩＩはこれらの結果をまとめたものであり、様々な毒性及び非毒性化合物に対する可変用量漸増効果を示している。
【０２０１】
（実施例５）
高含量スクリーニングアッセイを用いて測定したＧＳＫ−３βの酵素活性阻害剤がヒト胚幹細胞の分化及び増殖に与える影響
ヒト胚幹細胞（Ｈ９系）の維持を実施例１に記載の通りに実施した。細胞コロニーを、平均して４日ごとに継代させて未分化多能性状態のまま維持した。継代は、細胞培養物をコラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に３７℃で１０〜３０分間暴露し、続いてピペットの先端で穏やかに擦り落として細胞塊を回収することによって行われた。塊を重力によって沈降させ、続いて洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、ルーチン維持培養用に１：３の比、又は直接アッセイ用に１：１の比で分割した。用いたヒト胚幹細胞系は継代５０未満の継代数に維持され、正常核型の表現型及びマイコプラズマ汚染の欠如に関してルーチン的に評価された。
【０２０２】
アッセイで用いる細胞塊を通常の培養液で均一に再懸濁し、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた９６ウェルＰａｃｋａｒｄ  ＶＩＥＷＰＬＡＴＥＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１００μＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地を初期播種及び回収に用いた。各ウェルから使用済みの培養液を吸引し、かつ同量の新しい培地と交換することによって、毎日の栄養補給を行った。プレートは、アッセイ期間中ずっと加湿した箱の中に入れられて３７℃、５％ＣＯ２に保たれた。
【０２０３】
小分子の商標ライブラリーからＧＳＫ−３Ｂの酵素活性を阻害する能力に関して選択された試験化合物を使用して、スクリーニングを行った。このライブラリーからの化合物は、９６ウェルプレートのフォーマットの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３０％ＤＭＳＯ中の１ｍＭストックとして利用することができた。スクリーニング化合物は三重又は二重セットで試験された。各ウェルから培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去して一次スクリーニングアッセイを開始した。０．５％ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）と、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、試験化合物１０μＭとを含有するウェル当たり８０〜１００μＬの試験量を加え戻した。陽性対照ウェルは同じ基本培地を収容したが、試験化合物を１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で置き換えた。陰性対照ウェルは、０．５％ＦＣＳ及びアクチビンＡのみ（ＡＡのみ）を有する、あるいは、アクチビンＡ若しくはＷｎｔ３ａなしに０．５％ＦＣＳを有する（未処理）基本培地を収容した。アッセイ２日目にウェルを吸引し、同一溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルは吸引され、２％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充された（試験化合物又はＷｎｔ３ａを有さない）ＤＭＥＭ：Ｆ１２に変更され、一方、平行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ及びアクチビンＡのみ（ＡＡのみ）を有する、あるいは、アクチビンＡなしに２％  ＦＣＳを有する（未処理）ＤＭＥＭ：Ｆ１２に維持された。
【０２０４】
培養の最後に、９６ウェルプレートの中の細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、次に０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で２０分間透明処理した。あるいは、細胞を氷冷７０％エタノールで−２０℃で一晩固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、次に０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて４℃で５分間透明処理した。固定及び透明処理の後、細胞をＰＢＳで再度３回洗浄し、次に、室温で３０分間ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳｏｘ１７及びヤギ抗ヒトＨｎｆ−３β；ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を４％ニワトリ血清で１：１００に希釈し、細胞に室温で１時間添加した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳで１：２００に希釈し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後に添加した。細胞核を対比染色するために、５ｍＭのＤｒａｑ５（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）を室温で５分間添加した。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化するために１００ｍＬ／ウェルＰＢＳ中に放置した。
【０２０５】
Ｄｒａｑ５及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色された細胞用の二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び未処理の陰性対照のみに関しては二次抗体を有するウェルを使用して最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェル当たり１２の領域を得た。Ｓｏｘ−１７及びＨｎｆ−３βに関する全細胞数及び全細胞強度を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．６（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して測定した。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。平均値及び標準偏差を複製に関して計算した。全タンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲、及び０．４以上の形状因子の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をＷｎｔ３ａ／アクチビンＡ陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各複製セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
【０２０６】
表ＩＶは、全スクリーニング結果をまとめて示している。表Ｖは、このスクリーニングのヒットの一覧である。強いヒットは対照値の１２０％以上と定義され、中程度のヒットは対照値の６０〜１２０％の区間内に含まれると定義されている。有意な数の化合物がこのアッセイにおいて両方の増殖反応を誘導する。同時に、Ｓｏｘ１７及びＨｎｆ−３ｂ転写因子のタンパク質発現量で測定した場合、有意な数の化合物がこのアッセイにおいて分化を誘発する。
【０２０７】
（実施例６）
プレートリーダーアッセイを用いて測定されたＧＳＫ−３βの酵素活性阻害剤がヒト胚幹細胞の増殖に与える影響
ヒト胚幹細胞（Ｈ９又はＨ１系）の維持を実施例１に記載の通りに実施した。細胞コロニーを、平均して４日ごとに継代させて未分化多能性状態のまま維持した。継代は、細胞培養物をコラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に３７℃で１０〜３０分間暴露し、続いてピペットの先端で穏やかに擦り落として細胞塊を回収することによって行われた。塊を沈降させ、洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、ルーチン維持培養用に１：３の単層部分比、又は直接アッセイ用に１：１の比で分割した。これら実施例で用いたヒト胚幹細胞系は継代５０未満の継代数に維持され、正常核型の表現型、並びにマイコプラズマ汚染の欠如に関してルーチン的に評価された。
【０２０８】
アッセイで使用する細胞塊を通常の培養液で均一に再懸濁し、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた９６ウェルＰａｃｋａｒｄ  ＶＩＥＷＰＬＡＴＥＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１００μＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地を初期播種及び回収に用いた。各ウェルから使用済みの培養液を吸引し、かつ同量の新しい培地と交換することによって、毎日の栄養補給を行った。プレートは、アッセイ期間中ずっと加湿した箱の中に入れられて３７℃、５％  ＣＯ２に保たれた。
【０２０９】
各ウェルから培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去して一次スクリーニングアッセイを開始した。０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）と、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、試験化合物１０μＭとを含有するウェル当たり８０〜１００μＬの試験量を加え戻した。陽性対照ウェルは同じ基本培地を収容したが、１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で置き換え
た。陰性対照ウェルは、アクチビンＡ又はＷｎｔ３ａなしに０．５％  ＦＣＳを有する基本培地を収容した。スクリーニング化合物は三重に試験された。アッセイ２日目にウェルを吸引し、同一溶液を再度供給した。３日及び４日目に、２％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された陰性対照ウェルを除いて、全アッセイウェルは吸引されて、２％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２に変更された。
【０２１０】
アッセイ４日目に、１５〜２０μＬのＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１．５〜４時間インキュベートした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓの光分析装置のプレートリーダーを使用して、ＯＤ４９０における濃度計測定値を測定した。複製セットの平均測定値を標準偏差及び変動係数とともに計算した。増殖の目安として対照値の割合を計算するために、実験ウェルをアクチビンＡ／Ｗｎｔ３ａ陽性対照と比較した。
【０２１１】
表ＶＩは、全スクリーニング結果をまとめて示している。表ＶＩＩは、このスクリーニングのヒットの一覧である。強いヒットは対照値の１２０％以上と定義され、中程度のヒットは対照値の６０〜１２０％の区間内に含まれると定義されている。有意な数の化合物がこのアッセイにおいて増殖反応を誘導する。
【０２１２】
（実施例７）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤がヒト胚幹細胞の分化及び増殖に与える影響：リード化合物の用量漸増
一次スクリーニングで同定されたヒットの活性を確認し、かつ用量漸増によって活性範囲を更に分析することが重要であった。一次スクリーニングヒットの選択的サブセットの新しいサンプルを乾燥粉末として入手し、可溶化して新しいストック試薬を作り、二次確認アッセイで希釈してヒト胚幹細胞への影響を評価した。
【０２１３】
２つの株のヒト胚幹細胞（Ｈ１及びＨ９）の培養を実施例１に記載の通りに実施した。細胞コロニーを、ＤＭＥＭ：Ｆ１２で１：３０に希釈されたＭＡＴＲＩＧＥ（商標）を用いてｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングされたポリスチレンプラスチック上で未分化多能性状態のまま維持した。細胞は平均して４日ごとの酵素継代によって分割された。継代は、細胞単層をコラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に３７℃で１０〜６０分間暴露し、続いてピペットの先端で穏やかに擦り落として細胞塊を回収することによって行われた。塊を重力によって沈降させ、続いて洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、維持培養用に１：３の比、又は後続アッセイ用に１：１の比で分割した。ヒト胚幹細胞系は継代５０未満に維持され、正常核型の表現型及びマイコプラズマ汚染の欠如に関してルーチン的に評価された。
【０２１４】
アッセイ用細胞の調製：アッセイで用いるＨ１又はＨ９胚幹細胞系の細胞塊を培養液で均一に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた９６ウェルＰａｃｋａｒｄ  ＶＩＥＷＰＬＡＴＥＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に１００μＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地を初期播種及び増殖に用いた。各ウェルから使用済みの培養液を吸引し、かつ同量の新しい培地と交換することによって、毎日の栄養補給を行った。アッセイを開始する前に、培養物を播種後１〜３日間増殖させた。プレートは、アッセイ期間中ずっと加湿した箱の中に入れられて３７℃、５％
ＣＯ２に保たれた。
【０２１５】
化合物及びアッセイ培地の調製：一次スクリーニングで得たヒットのサブセットを、追跡調査及び後続の二次アッセイに用いた。乾燥粉末として入手可能な１２の化合物を、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭストックとして可溶化し、−２０℃で脱水して使用するまで保管した
。アッセイ直前に、化合物ストックを０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：１０００に希釈して１０μＭ試験化合物を作った。これを更に、同様に０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地で連続して倍数希釈して各化合物ごとに７点希釈曲線を作った。
【０２１６】
二次スクリーニングアッセイ：アッセイは、各ウェルの細胞単層から培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去して開始された。０．５％ＦＣＳと、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有しＷｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とで補充された培地を含有するウェル当たり１００μＬの試験量を加え戻した。陽性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するが、試験化合物のない状態の同じ基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、０．５％ＦＣＳを有するが、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物のない状態の同じ基本培地を収容した。アッセイ２日目に、アッセイウェルは吸引され、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給された。３日及び４日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はＷｎｔ３ａの両方がない状態で２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。平行陰性対照ウェルは、３日及び４日目は２％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に維持された。
【０２１７】
アッセイ評価：培養の最後に、９６ウェルプレートの中の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次に０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で２０分間透明処理した。固定及び透明処理の後、細胞をＰＢＳで再度３回洗浄し、次に、室温で３０分間ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（ヤギ抗ヒトＳｏｘ１７；ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を４％ニワトリ血清で１：１００に希釈し、細胞に室温で１時間添加した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳで１：２００に希釈し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後各ウェルに添加した。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１０分間添加した。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化するために１００μＬ／ウェルＰＢＳ中に放置した。
【０２１８】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色された細胞用の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び未処理の陰性対照として二次抗体のみで染色されたウェルを使用して最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェル当たり１５の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全Ｓｏｘ−１７強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製セットごとの平均値及び標準偏差が計算された。全Ｓｏｘ１７タンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲、及び０．４以上の形状因子の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をＷｎｔ３ａ／アクチビンＡ陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各複製セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
【０２１９】
結果
この二次アッセイにおける用量漸増によって活性が確認され、かつ作用強度が測定され
た８つのＧＳＫ−３Ｂ酵素阻害剤に関する結果が示されている。示したデータは、細胞の数及びＳｏｘ１７に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は二重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。この実施例において、Ｓｏｘ１７の発現は胚体内胚葉分化を示している。Ｈ１ヒト胚幹細胞系を用いた細胞の数及びＳｏｘ１７強度に関する結果はそれぞれ表ＶＩＩＩ及び表Ｉに示されている。Ｈ９ヒト胚幹細胞系に関する結果は表Ｘ及び表ＸＩに示されている。陽性対照値は、細胞の数及びＳｏｘ１７強度に関して１．０００に正規化された。陰性対照値は、両方の細胞株で、細胞の数は０．３８８未満、及びＳｏｘ１７強度は０．０６５未満であった。両方のヒト胚幹細胞系を比較し、かつ各化合物の用量漸増を含むこれらのデータの図式表現が、図１〜図８に示されている。細胞の数はパネルＡに示され、Ｓｏｘ１７強度はパネルＢに示される。これらのデータは、各化合物がｈＥＳ細胞の増殖及び胚体内胚葉の分化を促進することができ、かつ活性の最適範囲を同定することができることを確認している。
【０２２０】
（実施例８）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤が胚体内胚葉に関連した追加のマーカーの発現に与える影響
リード化合物は、転写因子Ｓｏｘ１７に加えて、胚体内胚葉分化を示す他のマーカーもまた誘導することができることを証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、ＣＸＣＲ４、表面受容体タンパク質、及び胚体内胚葉の分化にも関連する転写因子であるＨＮＦ−３βの発現を促進する能力に関して試験した。
【０２２１】
アッセイ用細胞の調製：アッセイで用いるＨ１ヒト胚幹細胞系からの細胞塊を培養液で均一に再懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた（１：３０希釈物）６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２ｍＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地を初期播種及び増殖に用いた。各ウェルから使用済みの培養液を吸引し、かつ同量の新しい培地と交換することによって、毎日の栄養補給を行った。アッセイを開始する前に、培養物を播種後１〜３日間増殖させた。プレートは、アッセイ期間中ずっと３７℃、５％  ＣＯ２に保たれた。
【０２２２】
化合物及びアッセイ培地の調製：一次スクリーニングで得た７つのヒットのサブセットを、追跡調査及び後続の二次アッセイに用いた。適切な化合物を、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭストックとして可溶化し、−２０℃で脱水して使用するまで保管した。アッセイ直前に、化合物ストックを０．５％  ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１μＭ〜５μＭの範囲の最終濃度に希釈した。
【０２２３】
アッセイ：アッセイは、各ウェルの細胞単層から培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去して開始された。０．５％ＦＣＳと、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有しＷｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とで補充された培地を含有するウェル当たり２ｍＬの試験量を加え戻した。陽性対照ウェルは、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と０．５％  ＦＣＳとを有するが試験化合物がない状態の同じ基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物がない状態の基本培地を収容した。アッセイ２日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はＷｎｔ３ａの両方がない状態で２％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。平行陰性対照ウェルは、３日及び４日目は２％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に維持された。
【０２２４】
アッセイ評価：培養の最後に、細胞単層はＰＢＳで洗浄され、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で５分間インキュベートすることにより培養プレートから収集された。細胞をＭＥＦ調整培地で再懸濁し、２つの等しいサンプルに分割した。サンプルの１セットを様々な蛍光標識抗体で更に染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を施した。サンプルの第２の並列セットに定量ＰＣＲを施した。
【０２２５】
ＦＡＣＳ分析を受けた細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ及びＢＤ  ＦＡＣＳ染色緩衝液で希釈した０．１２５％ヒトγグロブリン（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ＃  Ｇ−４３８６）の中で４℃で１５分間ブロックした。細胞のアリコート（それぞれ約１０５細胞）を、蛍光タグに直接結合され、かつＣＤ９  ＰＥ（ＢＤ＃５５５３７２）、ＣＤ９  ＰＥ（ＢＤ＃５５５３７２）、又はＣＸＣＲ−４  ＡＰＣ（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃  ＦＡＢ１７３Ａ）に対する特異性を有する抗体で、４℃で３０分間染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ染色緩衝液中における一連の洗浄後、生存率を評価するために細胞を７−ＡＡＤ（ＢＤ＃５５９９２５）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析し、少なくとも１０，０００の事象を収集した。ＰＥ及びＡＰＣのマウスＩｇＧ１ｋイソタイプコントロール抗体を用いて陽性細胞の割合をゲートした。
【０２２６】
定量ＰＣＲ用の細胞を、ＲＮＡを抽出、精製しかつｃＤＮＡを合成するために処理した。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（ＲＮｅａｓｙミニキット、（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，ＩＮＣ）を使用して更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを水中に溶出した。収率及び純度を分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０測定値によって評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＣＡ）大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２２７】
特に指定のない限り、リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量化のための全ての試薬はＡＢＩから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００配列検出システムを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＴＡＱＭＡＮＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（ＡＢＩ，ＣＡ）を、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、２０μＬの全反応容積にて使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用（run）して、ピペッティング誤差に関して補正し
た。プライマー及びＦＡＭ標識ＴＡＱＭＡＮプローブを濃度２００ｎＭで使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にＡＢＩにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を使用して正規化した。プライマー及びプローブの組合せを次に示す：ＣＸＣＲ４（Ｈｓ００２３７０５２）、ＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ）、ＨＮＦ３ｂ（Ｈｓ００２３２７６４）、Ｓｏｘ１７（ｐｒｏｂｅ  ｐａｒｔ＃  ４５００２５，ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐａｒｔ＃４３０４９７１）。
【０２２８】
最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間のインキュベーションの後、サンプルを２段階、即ち、−９５℃で１５秒間の変性過程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸長過程と、で４０回サイクルした。ＧＥＮＥＡＭＰ  ７０００配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー／プローブセットに関して、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを計算した。手短に言えば、各ｃＤＮＡサンプルに関して、内在性対照Ｃｔ値を関心対象遺伝子のＣｔから減算して、ＤＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。標的の正規化した量を２−ΔＣｔとして計算し、増幅を１００％効率と仮定した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２２９】
結果
図９は、様々なＧＳＫ３阻害剤で処理した後にＣＸＣＲ４表面受容体を発現する陽性細
胞の割合のＦＡＣＳ分析を示す。未処理の細胞集団（陰性対照）又はアクチビンＡ及びＷｎｔ３で処理されている細胞（陽性対照）に対する、各化合物の１μＭ〜５μＭの範囲の２種類の濃度が示されている。図１０のパネルａ、ｂ、及びｃは、やはり胚体内胚葉のマーカーであると考慮されるＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ１７、及びＨＮＦ３βに関するリアルタイムＰＣＲデータを示している。ＦＡＣＳ及びリアルタイムＰＣＲ分析は共に、未処理の対照細胞と比べて、分化した細胞ではこれらマーカーのそれぞれの有意な増加が見られるを明示している。一部の例では、これらの胚体内胚葉マーカーの発現レベルは陽性対照と等しく、分化のこの段階においてＧＳＫ３阻害剤がＷｎｔ３ａに取って代わることができることを実証している。
【０２３０】
（実施例９）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤が膵臓内胚葉の形成に与える影響
胚体内胚葉の誘導の間にＧＳＫ３β阻害剤で処理することが、例えば、膵臓内胚葉などの他の細胞型のその後の分化を阻害しないこと証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓内胚葉に関連する鍵となる転写因子であるＰＤＸ１及びＨＮＦ６の発現を促進する能力に関して試験した。
【０２３１】
ヒト胚幹細胞（Ｈ１及びＨ９系）の維持を実施例１に記載の通りに実施した。細胞コロニーを、平均して４日ごとに継代させて未分化多能性状態のまま維持した。継代は、細胞培養物をコラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に３７℃で１０〜３０分間暴露し、続いてピペットの先端で穏やかに擦り落として細胞塊を回収することによって行われた。塊を重力によって沈降させ、続いて洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、ルーチン維持培養用に１：３の比で、又は後続アッセイ用に１：１の比で分割した。用いたヒト胚幹細胞系は継代５０未満に維持され、正常核型の表現型及びマイコプラズマ汚染の欠如に関してルーチン的に評価された。
【０２３２】
アッセイの細胞調製：アッセイで使用するＨ１ヒト胚幹細胞系の細胞塊を培養液で均一に再懸濁し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされた（１：３０希釈）２４ウェルプレート（ｂｌａｃｋ  ｗｅｌｌ；Ａｒｃｔｉｃ  Ｗｈｉｔｅ）に１ｍＬ／ウェルの容量で播いた。８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦで補充されたＭＥＦ調整培地をを初期播種及び増殖に用いた。２回目の実験において、Ｈ９系からのｈＥＳ細胞の塊を９６ウェルプレートの、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）で処理することによって予め不活性化されていたマウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）層に播いた。ＭＥＦ単層上のｈＥＳ細胞の培養液は、最小必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、及び２−メルカプトエタノールで補充された２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ：Ｆ１２で構成された。各ウェルから使用済みの培養液を吸引し、かつ同量の新しい培地と交換することによって、毎日の栄養補給を行った。アッセイを開始する前に、培養物を播種後１〜３日間増殖させた。プレートは、アッセイ期間中３７℃、５％ＣＯ２に保たれた。
【０２３３】
化合物及びアッセイ培地の調製：一次スクリーニングで得た８つのヒットのサブセットを、追跡調査及び後続の二次アッセイに用いた。適切な化合物を、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭストックとして可溶化し、−２０℃で脱水して使用するまで保管した。アッセイ直前に、化合物ストックを添加剤を有する基本培地で１μＭ〜５μＭの範囲の最終濃度に希釈した。
【０２３４】
アッセイ：このアッセイでは、ＧＳＫ３阻害剤は、胚体内胚葉分化過程の１日目及び２日目のみにＷｎｔ３ａの代わりに含められた。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上の胚幹細胞培養物は、各ウェルの細胞単層から培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去することによって、実施例７及び８に記載の通りに開始された。胚体
内胚葉へ分化させるために、０．５％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地と、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有しＷｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とを含有する試験量（２４ウェルプレートに関してはウェル当たり０．５ｍＬ、９６ウェルプレートに関してはウェル当たり１００μＬ）を加え戻した。陽性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを有するが試験化合物がない状態の同じ基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物のない状態の同じ基本培地を収容した。アッセイ２日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はＷｎｔ３ａの両方がない状態で２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。平行陰性対照ウェルは、３日及び４日目は２％  ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に維持された。胚体内胚葉へ分化させるために、細胞を３日間処理し、２％  ＦＣＳと、０．２５μＭ  ＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。次に、細胞を更に４日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５μＭ  ＫＡＡＤシクロパミンと、２μＭレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ（段階２）又は１％  Ｂ２７（段階３）を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。
【０２３５】
Ｈ９ヒト胚細胞の平行培養物はＭＥＦフィーダー層の上で増殖され、膵臓内胚葉へと分化した。胚体内胚葉分化は、異なる濃度の阻害化合物と１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと共に、１日目は血清を含有せず、２日及び３日目は０．２％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる培地で細胞を培養することで達成された。陽性対照ウェルは、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するが試験化合物が存在しない状態の（血清を有する又は有さない）基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物のない状態で血清を有する又は有さない同じ基本培地を収容した。アッセイ２日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。３日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はＷｎｔ３ａの両方がない状態で２％ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＲＰＭＩ−１６４０が供給された。平行陰性対照ウェルは、３日目は２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０基本培地に維持された。細胞を４日間処理し、２％ＦＣＳと０．２５ｍＭ  ＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＲＰＭＩ−１６４０基本培地を毎日供給することによって、細胞を膵臓内胚葉に分化させた。続いて、細胞を３日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と０．２５ｍＭ  ＫＡＡＤシクロパミンと２ｍＭレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ１０とを含有するＲＰＭＩ−１６４０を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ（段階２）又は１％  Ｂ２７（段階３）を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないＲＰＭＩ−１６４０基本培地にずっと維持された。
【０２３６】
アッセイ評価：分化の最後に、細胞をリアルタイムＰＣＲによって実施例８に記載の通りに遺伝子発現に関して検査した。高含量蛍光染色のため、６ウェルプレートの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次に０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で２０分間透明処理した。固定及び透明処理の後、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（ヤギ抗ヒトＰｄｘ１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を４％ニワトリ血清で１：１００に希釈し、室温で２
時間細胞に添加した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８共役二次抗体（ニワトリ抗ヤギＩｇＧ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳで１：２００に希釈し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後各ウェルに添加した。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１０分間添加した。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化するために１００μＬ／ウェルＰＢＳ中に放置した。
【０２３７】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色された細胞用の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び二次抗体のみで染色されたウェルを用いて最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェル当たり１５の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全Ｐｄｘ１強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製データセットに関して平均値及び標準偏差を計算した。全Ｐｄｘ１タンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をＷｎｔ３ａ／アクチビンＡ陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各複製セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
【０２３８】
定量ＰＣＲ用の細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解し、次にＲＮＡを抽出、精製しかつｃＤＮＡを合成するために処理した。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ、ＩＮＣ）を使用して更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを水中に溶出した。収率及び純度を分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０測定値によって評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＣＡ）大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２３９】
特に指定のない限り、リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量化のための全ての試薬はＡＢＩから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００配列検出システムを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＴＡＱＭＡＮ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸを、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、２０μＬの全反応容積にて使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用（run）して、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマー及
びＦＡＭ標識ＴＡＱＭＡＮプローブを濃度２００ｎＭで使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にＡＢＩにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を使用して正規化した。プライマー及びプローブの組合せを次に示す：ＰＤＸ１（Ｈｓ００２３６８３０＿ｍ１）、ＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ）、及びＨＮＦ６（Ｈｓ００４１３５５４＿ｍ１）。
【０２４０】
最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間のインキュベーションの後、サンプルを２段階、即ち、−９５℃で１５秒間の変性過程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸長過程と、で４０回サイクルした。ＧＥＮＥＡＭＰＯ７０００配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー／プローブセットに関して、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを計算した。手短に言えば、各ｃＤＮＡサンプルに関して、内在性対照Ｃｔ値を関心対象遺伝子のＣｔから減算して、ΔＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。標的の正規化した量を２−ΔＣｔとして計算し、増幅を１００％効率と仮定した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２４１】
結果
８つのＧＳＫ−３β酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析で得た図１に示されるデータは、Ｈ１ｈＥＳ細胞系の細胞の数（パネルＡ）及びＰｄｘ１強度（パネルＢ）に与える影響を示しており、それぞれのデータ点は二重サンプルセットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。リアルタイムＰＣＲで得た図１２に示されるデータは、これら小分子阻害剤が２つの転写因子であるＰｄｘ１及びＨＮＦ６の誘導発現に与える影響を示している。これらの実施例において、Ｐｄｘ１及びＨＮＦ６の発現は膵臓内胚葉分化を示している。これらのアッセイのＧＳＫ３β阻害化合物は、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にＷｎｔ３ａの代替となることができ、結果生じる細胞は、分化の続いて起こる後期段階中に膵臓内胚葉を形成する能力を維持する。
【０２４２】
（実施例１０）
ＧＳＫ−３β酵素阻害剤が膵臓内分泌細胞の形成に与える影響
胚体内胚葉の誘導の間にＧＳＫ３β阻害剤で処理することが、例えば、膵臓内分泌細胞又はインスリン産生細胞などの他の細胞型のその後の分化を阻害しないこと証明することが重要であった。ヒットの選択したサブセットを、膵臓ホルモンの発現を促進する能力に関して試験した。
【０２４３】
アッセイのための細胞調製：実施例９に記載した方法に従って得た膵臓内胚葉細胞（９６ウェルプレート及び２４ウェルプレート上で培養した）を、続いて、細胞を膵臓ホルモン発現細胞に分化させる薬剤にさらした。
【０２４４】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上のＨ１ヒト胚幹細胞系の培養物のアッセイは、各ウェルの細胞単層から培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去することによって、実施例７〜９に記載の通りに開始された。胚体内胚葉へ分化させるために、０．５％  ＦＣＳを有する培地と、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有しＷｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とを含有する試験量（２４ウェルプレートに関してはウェル当たり０．５ｍＬ、９６ウェルプレートに関してはウェル当たり１００μＬ）を添加した。陽性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するが、試験化合物のない状態の同じ基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物のない状態の同じ基本培地を収容した。アッセイ２日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。３日及び４日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はＷｎｔ３ａの両方がない状態で２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。平行陰性対照ウェルは、３日、４日、及び５日目は２％  ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地に維持された。胚体内胚葉へ分化させるために、細胞を３日間処理し、２％  ＦＣＳと、０．２５μＭ  ＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。続いて細胞を４日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５μＭ  ＫＡＡＤシクロパミンと、２μＭレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２を毎日供給した。段階２及び３の間の平行陰性対照ウェルは、２％ＦＣＳ又は１％  Ｂ２７を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。膵臓内胚葉の形成後、細胞を更に６日間継続して処理し、１％  Ｂ２７と、１μＭ  ＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤：ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。次に、細胞を別の３日間連続して処
理し、１％  Ｂ２７、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ４と、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、１％Ｂ２７を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。
【０２４５】
アッセイ評価：培養の最後に、高含量分析又はリアルタイムＰＣＲによって評価するために細胞を実施例７及び８と同様に処理した。
【０２４６】
高含量蛍光染色のため、９６ウェルプレートの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次に０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で２０分間透明処理した。固定及び透明処理の後、細胞をＰＢＳで再度３回洗浄し、次に、室温で３０分間ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（モルモット抗ブタインスリン、ヒトインスリンと交差反応する；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を４％ヤギ血清で１：５００に希釈し、細胞に室温で１時間添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、４％ヤギ血清で１：１００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ヤギ抗モルモットＩｇＧ；分子プローブ）で染色した。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１０分間添加した。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化するために１００μＬ／ウェルＰＢＳ中に放置した。
【０２４７】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色された細胞用の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び二次抗体のみで染色されたウェルを用いて最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェル当たり１５の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全インスリン強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製セットごとの平均値及び標準偏差が計算された。全インスリンタンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をＷｎｔ３ａ／アクチビンＡ陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各三重セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
【０２４８】
定量ＰＣＲ用の細胞をＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解し、次にＲＮＡを抽出、精製しかつｃＤＮＡを合成するために処理した。ＲＮＡサンプルを、エタノール−含有、高塩濃度緩衝液の存在下、シリカゲル膜（Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、混入物を洗浄することにより精製した。ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，ＩＮＣ）を使用して更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを水中に溶出した。収率及び純度を分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０測定値によって評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＣＡ）大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて精製したＲＮＡからｃＤＮＡコピーを作製した。
【０２４９】
特に指定のない限り、リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量化のための全ての試薬はＡＢＩから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システムを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ，ＣＡ）を、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、２０μＬの全反応容積にて使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用（run）して
、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマー及びＦＡＭ−ラベルＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを、濃度２００ｎＭにて使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にＡＢＩにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を使用して正規化した。プライマー及びプローブの組合せを次に示す：ＰＤＸ１（Ｈｓ００２３６８３０＿ｍ１）、インスリン（Ｈｓ００３５５７７３）、及びＧＡＰＤＨ（４３１０８８４Ｅ）。
【０２５０】
最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間のインキュベーション後、サンプルを２段階、即ち、−９５℃で１５秒間の変性過程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸長過程と、で４０回サイクルした。ＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー／プローブセットに関して、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを計算した。手短には、各ｃＤＮＡサンプルに関して、内在性対照Ｃｔ値を関心対象遺伝子のＣｔから減算して、Ｃｔ値（ΔＣｔ）を得た。標的の正規化した量を２−ΔＣｔ、として計算し、増幅を１００％効率と仮定した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０２５１】
結果
８つのＧＳＫ−３Ｂ酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析で得た図１３に示されるデータは、Ｈ１ｈＥＳ細胞系の細胞の数（パネルＡ）及びインスリン強度（パネルＢ）に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は三重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。リアルタイムＰＣＲで得た図１４に示されるデータは、Ｐｄｘ１及びインスリンに対する化合物の影響を示している。これらの実施例において、Ｐｄｘ１及びインスリンの発現は膵臓内胚葉分化及びホルモン陽性細胞の生成を示している。これらのアッセイの選択ＧＳＫ３β阻害化合物は、インスリン免疫染色及びリアルタイムＰＣＲの両方から明らかなように、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にＷｎｔ３ａの代替となることができ、分化の続いて起こる後期段階中に膵臓β細胞の形成を誘導しかつ維持することができる。
【０２５２】
（実施例１１）
膵臓内分泌細胞の形成に与えるＧＳＫ−３β酵素阻害剤の相加効果
細胞運命決定の複数段階の間に添加される場合は、ＧＳＫ３β阻害剤で処理することにより膵臓β細胞の分化を改善することができることを証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓ホルモン陽性細胞に関連するインスリンの発現を促進するために逐次定期的な添加によって試験した。
【０２５３】
アッセイ用細胞の調製：アッセイのための細胞調製：実施例９及び１０に記載した方法に従って得た膵臓内胚葉細胞を（９６ウェルプレート上で培養した）、続いて、後細胞を膵臓ホルモン発現細胞に分化させる薬剤にさらした。
【０２５４】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上のＨ１ヒト胚幹細胞系の培養物のアッセイは、各ウェルの細胞単層から培養液を吸引し、続いてＰＢＳで３回洗浄して残留増殖因子及び血清を除去することによって、実施例７〜９に記載の通りに開始された。胚体内胚葉へ分化させるために、０．５％  ＦＣＳを有する培地と、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡを有しＷｎｔ３ａを有さない異なる濃度の阻害化合物とを含有する試験量（９６ウェルプレートに関してはウェル当たり１００μＬ）を添加した。陽性対照ウェルは、試験化合物がない状態で基本培地と０．５％  ＦＣＳと１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡと２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを収容した。陰性対照ウェルは、０．５％  ＦＣＳを有するが、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、又は試験化合物のない状態の同じ基本培地を収
容した。アッセイ２日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。３日、４日及び５日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はＷｎｔ３ａの両方がない状態で２％  ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２が供給された。平行陰性対照ウェルは、３日、４日及び５日目は２％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２に維持された。胚体内胚葉へ分化させるために、細胞を３日間処理し、２％  ＦＣＳと、０．２５μＭ  ＫＡＡＤシクロパミン（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を毎日供給した。続いて細胞を４日間処理し、１％  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、０．２５μＭ  ＫＡＡＤシクロパミンと、２μＭレチノイン酸（ＲＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、２％  ＦＣＳ又は１％Ｂ２７を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。膵臓内胚葉の形成後、細胞を更に６日間継続して処理し、１％  Ｂ２７と、１μＭ  ＤＡＰＴ（γセクレターゼ阻害剤：ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ  ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、１μＭ  ＴＧＦｂｅｔａ  Ｒ１阻害剤ＩＩ（ＡＬＫ５阻害剤：ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を隔日で供給した。この６日間の間、ＧＳＫ３β阻害剤を、分化の開始時の前回の処理と同じ濃度を用いてそれぞれにウェルに加え戻した。次に、細胞を別の３日間連続して処理し、１％  Ｂ２７、５０ｎｇ／ｍＬ  Ｅｘｅｎｄｉｎ  ４と、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、１μＭ  ＴＧＦβ  Ｒ１阻害剤ＩＩ（ＡＬＫ５阻害剤；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地を隔日で供給した。この３日間の間、ＧＳＫ３β阻害剤を、分化の開始時の前回の処理と同じ濃度を用いてそれぞれにウェルに加え戻した。陽性対照ウェルの平行セットを２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａの存在下又は非存在下で処理した。平行陰性対照ウェルは、１％Ｂ２７を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないＤＭＥＭ：Ｆ１２基本培地にずっと維持された。
【０２５５】
アッセイ評価：アッセイ評価：培養の最後に、高含量分析によって評価するために細胞を上記実施例１０と同様に処理した。
【０２５６】
高含量蛍光染色のため、９６ウェルプレートの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定し、ＰＢＳで更に３回洗浄し、次に０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて室温で２０分間透明処理した。固定及び透明処理の後、細胞をＰＢＳで再度３回洗浄し、次に、室温で３０分間ＰＢＳ中において４％ニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックした。一次抗体（モルモット抗ブタインスリン、ヒトインスリンと交差反応する；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を４％ニワトリ血清で１：５００に希釈し、室温で１時間細胞に添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、４％ヤギ血清で１：１００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役二次抗体（ヤギ抗モルモットＩｇＧ；分子プローブ）で染色した。細胞核を対比染色するために、２μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で１０分間添加した。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、画像化するために１００μＬ／ウェルＰＢＳ中に放置した。
【０２５７】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で染色された細胞用の５１００８ｂｓ二色性を利用するＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び二次抗体のみで染色されたウェルを用いて最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、１ウェル当たり１５の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全インスリン強度の測定値を、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏ
ｌｂｏｘ  １．７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル（基準線範囲１００〜３００）及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製データセットに関して平均値及び標準偏差を計算した。全インスリンタンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。３００〜３０００のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をＷｎｔ３ａ／アクチビンＡ陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各三重セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
【０２５８】
結果
８つのＧＳＫ−３Ｂ酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析で得た図１５に示されるデータは、Ｈ１ｈＥＳ細胞系の細胞の数（パネルＡ）及びインスリン強度（パネルＢ）に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は三重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。この実施例では、インスリンの発現はホルモン陽性膵臓細胞への分化を示している。これらのアッセイの選択ＧＳＫ３Ｂ阻害化合物は、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にＷｎｔ３ａの代替となることができ、後期段階で添加される場合、陽性対照サンプルに比べて高度のインスリン発現を促進すると思われる。
【０２５９】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【０２６０】
【表５】
2015119724.tif 000029
【０２６１】
【表６】
2015119724.tif 000030
【０２６２】
【表７−１】
2015119724.tif 000031
【０２６３】
【表７−２】
2015119724.tif 000032
【０２６４】
【表７−３】
2015119724.tif 000033
【０２６５】
【表７−４】
2015119724.tif 000034
【０２６６】
【表７−５】
2015119724.tif 000035
【０２６７】
【表７−６】
2015119724.tif 000036
【０２６８】
【表８−１】
2015119724.tif 000037
【０２６９】
【表８−２】
2015119724.tif 000038
【０２７０】
【表９−１】
2015119724.tif 000039
【０２７１】
【表９−２】
2015119724.tif 000040
【０２７２】
【表９−３】
2015119724.tif 000041
【０２７３】
【表９−４】
2015119724.tif 000042
【０２７４】
【表９−５】
2015119724.tif 000043
【０２７５】
【表９−６】
2015119724.tif 000044
【０２７６】
【表９−７】
2015119724.tif 000045
【０２７７】
【表１０】
2015119724.tif 000046
【０２７８】
【表１１−１】
2015119724.tif 000047
【０２７９】
【表１１−２】
2015119724.tif 000048
【０２８０】
【表１１−３】
2015119724.tif 000049
【０２８１】
【表１１−４】
2015119724.tif 000050
【０２８２】
【表１１−５】
2015119724.tif 000051
【０２８３】
【表１１−６】
2015119724.tif 000052
【０２８４】
【表１１−７】
2015119724.tif 000053
【０２８５】
【表１２】
2015119724.tif 000054
【０２８６】
【表１３】
2015119724.tif 000055
【０２８７】
【表１４】
2015119724.tif 000056
【０２８８】
【表１５】
2015119724.tif 000057
【０２８９】
【表１６】
2015119724.tif 000058
【０２９０】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【０２９１】
１．
多能性細胞を増殖及び分化するための方法であって、
ａ．前記多能性細胞を培養する過程と、
ｂ．前記多能性細胞をＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で処理する過程と、を含む方法。
【０２９２】
２．
前記多能性細胞が胚幹細胞である、１．に記載の方法。
【０２９３】
３．
前記多能性細胞が、胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞である、１．に記載の方法。
【０２９４】
４．
前記多能性マーカーを発現する細胞が、ＡＢＣＧ２、クリプト、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーのうちの少なくとも１つを発現する、３．に記載の方法。
【０２９５】
５．
前記多能性細胞が胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される、１．に記載の方法。
【０２９６】
６．
前記多能性細胞が前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で約１〜約７２時間処理される、１．に記載の方法。
【０２９７】
７．
前記多能性細胞が前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で約１２〜約４８時間処理される、１．に記載の方法。
【０２９８】
８．
前記多能性細胞が前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤で約４８時間処理される、１．に記載の方法。
【０２９９】
９．
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が濃度約１００ｎＭ〜約１００μＭで用いられる、１．に記載の方法。
【０３００】
１０．
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が濃度約１μＭ〜約１０μＭで用いられる、１．に記載の方法。
【０３０１】
１１．
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が濃度約１０μＭで用いられる、１．に記載の方法。
【０３０２】
１２．
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が式（Ｉ）の化合物である、１．に記載の方法：
【化２１】
2015119724.tif 000059
【０３０３】
１３．
Ｒ1が、フェニル、置換フェニル（ここで該フェニル置換基はＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される）、又はピリミジニルである、１２．に記載の方法。
【０３０４】
１４．
Ｒ2がフェニル、置換フェニル（ここで該フェニル置換基はＣ1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される）、又は任意にＣ1〜4アルキルで置換されていてもよいピリミジニルであり、及びＲ1及びＲ2の少なくとも一方はピリミジニルである、１２．に記載の方法。
【０３０５】
１５．
Ｒ3は水素、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、Ｃ1〜5アルキルカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキルオキシカルボニル、アリールＣ1〜5アルキル、置換アリールＣ1〜5アルキル（ここで該１つ以上のアリール置換基は、独立して、Ｃ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、及びジＣ1〜5アルキルアミノからなる群から選択される）、フタルイミドＣ1〜5アルキル、アミノＣ1〜5アルキル、ジアミノＣ1〜5アルキル、スクシンイミドＣ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルＣ1〜5アルキル及びアリールオキシカルボニルＣ1〜5アルキルアルキルである、１２．に記載の方法。
【０３０６】
１６．
Ｒ4が−（Ａ）−（ＣＨ2）q−Ｘである、１２．に記載の方法。
【０３０７】
１７．
Ａが、ビニレン、エチニレン、又は
【化２２】
2015119724.tif 000060
である、１６．に記載の方法。
【０３０８】
１８．
Ｒ5が、水素、Ｃ1〜5アルキル、フェニル及びフェニルＣ1〜5アルキルからなる群から選択される、１７．に記載の方法。
【０３０９】
１９．
ｑが０〜９である、１６．に記載の方法。
【０３１０】
２０．
Ｘが、水素、ヒドロキシ、ビニル、置換ビニル（ここで該１つ以上のビニル置換基はそれぞれ、フッ素、臭素、塩素、及びヨウ素から選択される）、エチニル、置換エチニル（ここで該エチニル置換基は、フッ素、臭素塩素、及びヨウ素からなる群から選択される）、Ｃ1〜5アルキル、置換されたＣ1〜5アルキル（ここで該１つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド、及びアミノからなる群から選択される）、Ｃ3〜7シクロアルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、置換されたＣ1〜5アルコキシ（ここで該アルキル置換基は、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される）、フタルイミドオキシ、フェノキシ、置換フェノキシ（ここで該１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、フェニル、置換フェニル（ここで該１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、アリールＣ1〜5アルキル、置換アリールＣ1〜5アルキル（ここで該１つ以上のアリール置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、アリールオキシＣ1〜5アルキルアミノ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンジルオキシイミノ（Benxyloxyimino）、Ｃ1〜5アルキルオキシイミノ、フタルイミド、スクシンイミド、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、置換フェニルカルボニルオキシ（ここで該１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される）、フェニルＣ1〜5アルキルカルボニルオキシ（ここで該１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、ハロゲン、及びＣ1〜5アルコキシからなる群から選択される
）、アミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、ジＣ1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、置換されたＣ1〜5アルキルカルボニルオキシ（ここで該１つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、メチル、エチル、イソプロピル、及びヘキシルからなる群から選択される）、フェノキシカルボニルオキシ、置換フェノキシカルボニルオキシ（ここで該１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、Ｃ1〜5アルキル、Ｃ1〜5アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される）、Ｃ1〜5アルキルチオ、置換されたＣ1〜5アルキルチオ（ここで該アルキル置換基は、ヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される）、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、フェニルスルホニル、置換フェニルスルホニル（ここで該１つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、臭素、フッ素、塩素、Ｃ1〜5アルコキシ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択される）；但し、Ａが
【化２３】
2015119724.tif 000061
ｑが０、及びＸがＨの場合は、Ｒ3は２−（トリメチルシリル）エトキシメチルでなくてもよい］；及びその薬学上許容し得る塩、からなる群から選択される、１６．に記載の方法。
【０３１１】
２１．
Ｒ1が置換フェニルであり、Ｒ2がピリミジン−３−イルである、１２．に記載の方法。
【０３１２】
２２．
Ｒ1が４−フルオロフェニルである、１２．に記載の方法。
【０３１３】
２３．
Ｒ3が、水素、アリールＣ1〜5アルキル、又は置換アリールＣ1〜5アルキルである、１２．に記載の方法。
【０３１４】
２４．
Ｒ3が水素又はフェニルＣ1〜5アルキルである、１２．に記載の方法。
【０３１５】
２５．
Ａがエチニレンであり、ｑが０〜５である、１６．に記載の方法。
【０３１６】
２６．
Ｘが、スクシンイミド、ヒドロキシ、メチル、フェニル、Ｃ1〜5アルキルスルホニル、Ｃ3〜6シクロアルキル、Ｃ1〜5アルキルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルコキシ、フェニルカルボニルオキシ、Ｃ1〜5アルキルアミノ、ジＣ1〜5アルキルアミノ又はニトリルである、１６．に記載の方法。
【０３１７】
２７．
前記式１の化合物が、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシブチン−１−イル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾールである、１２．に記載の方法。
【０３１８】
２８．
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が式（ＩＩ）の化合物である、１．に記載の方法：
【化２４】
2015119724.tif 000062
【０３１９】
２９．
Ｒが、Ｒa、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒa及びシアノからなる群から選択される、２８．に記載の方法。
【０３２０】
３０．
Ｒaが、シクロアルキル、複素環、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、２９．に記載の方法。
【０３２１】
３１．
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され；ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して１の位置のアザインドール窒素原子と結合する、２８．に記載の方法。
【０３２２】
３２．
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（
Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３１．に記載の方法。
【０３２３】
３３．
Ｒ6が、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8）アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基である；但し、Ｒ6が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ6は、−Ｃ1〜8アルコキシ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択される、３１．に記載の方法。
【０３２４】
３４．
Ｒ7が、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−Ｃ2〜8アルケニル、−Ｃ2〜8アルキニル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜8）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜8）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２個の置換基である、３３．に記載の方法。
【０３２５】
３５．
Ｒ8が、水素、−Ｃ1〜8アルキル、−（Ｃ1〜8）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜8）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基である；但し、Ｒ8が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ8は、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜8）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択される、３１．に記載の方法。
【０３２６】
３６．
Ｒ9が、水素、−Ｃ1〜8アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ、（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して
選択される１〜２個の置換基である、３１．に記載の方法。
【０３２７】
３７．
Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される、２８．に記載の方法。
【０３２８】
３８．
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜３個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３２９】
３９．
Ｒ10が、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３８．に記載の方法。
【０３３０】
４０．
Ｒ4が、水素、−Ｃ1〜8アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜8アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜8アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３３１】
４１．
Ｒ10が、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜8アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜8アルキル）2、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１
〜２個の置換基である、４０．に記載の方法。
【０３３２】
４２．
Ｙ及びＺが、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される；但し、Ｙ及びＺの一方がＯであり且つ他方がＯ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される；及びそれらの薬学上許容し得る塩である、２８．に記載の方法。
【０３３３】
４３．
Ｒが、Ｒa、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒa、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒa及びシアノからなる群から選択される、２８．に記載の方法。
【０３３４】
４４．
Ｒaが、複素環、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、２９．に記載の方法。
【０３３５】
４５．
Ｒaが、ジヒドロ−ピラニル、フェニル、ナフチル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、アザインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾフリル及びジベンゾチエニルからなる群から選択される、２９．に記載の方法。
【０３３６】
４６．
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され；ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して１の位置のアザインドール窒素原子と結合している、２８．に記載の方法。
【０３３７】
４７．
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から選択され；ここで、ヘテロアリールは、ヘテロアリール環の炭素原子を通して１の位置のアザインドール窒素原子に結合されている、２８．に記載の方法。
【０３３８】
４８．
Ｒ1が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5及び−ナフチル−Ｒ6からなる群から選択される、２８．に記載の方法。
【０３３９】
４９．
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）ア
ルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＣＯ2Ｈ、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−Ｒ6、−複素環−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３１．に記載の方法。
【０３４０】
５０．
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３１．に記載の方法。
【０３４１】
５１．
Ｒ5が、水素、−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、ヒドロキシ、−イミダゾリル−Ｒ6、−トリアゾリル−Ｒ6及び−テトラゾリル−Ｒ6からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３１．に記載の方法。
【０３４２】
５２．
Ｒ6が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4）アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基である；但し、Ｒ6が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ6は、−Ｃ1〜4アルコキシ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から更に選択される、３１．に記載の方法。
【０３４３】
５３．
Ｒ6が水素である、３１．に記載の方法。
【０３４４】
５４．
Ｒ7が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ2〜4アルケニル、−Ｃ2〜4アルキニル、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨ、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−（Ｃ1〜4）
アルキル−ＮＨ2、−（Ｃ1〜4）アルキル−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、−Ｃ（Ｎ）−ＮＨ2、−シクロアルキル−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8、−（Ｃ1〜4）アルキル−アリール−Ｒ8及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群から独立して選択される２個の置換基である、３３．に記載の方法。
【０３４５】
５５．
Ｒ7が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）及び−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2からなる群から独立して選択される２個の置換基である、３３．に記載の方法。
【０３４６】
５６．
Ｒ8が、水素、−Ｃ1〜4アルキル、−（Ｃ1〜4）アルキル−（ハロ）1〜3及び−（Ｃ1〜4）アルキル−ＯＨからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１〜４個の置換基である；但し、Ｒ8が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ8は、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロ、−（Ｃ1〜4）アルコキシ−（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択される、３１．に記載の方法。
【０３４７】
５７．
Ｒ8が水素である、３１．に記載の方法。
【０３４８】
５８．
Ｒ9が、水素、−Ｃ1〜4アルコキシ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３１．に記載の方法。
【０３４９】
５９．
Ｒ9が水素である、３１．に記載の方法。
【０３５０】
６０．
Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アリール−Ｒ8）、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される、２８．に記載の方法。
【０３５１】
６１．
Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ5、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ5、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−シクロアルキル−Ｒ6、−アリール−Ｒ6及び−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が窒素原子に結合されている場合には、クオーターニウム塩（quaterniumsalt）は形成されず；そして但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ5、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−Ｒ6及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される、２８．に記載の方法。
【０３５２】
６２．
Ｒ2が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ5及び−アリール−Ｒ6からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された１個の置換基である；但し、Ｒ2が窒素原子に結合されている場合には、クオーターニウム塩（quaterniumsalt）は形成されず；そして但し、Ｒ2が炭素原子に結合されている場合には、Ｒ2は、−Ｎ−Ｒ7、ハロゲン、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−Ｒ6からなる群から更に選択される、２８．に記載の方法。
【０３５３】
６３．
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−Ｎ−Ｒ7、−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜３個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３５４】
６４．
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びニトロからなる群から選択される、炭素原子に結合された１個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３５５】
６５．
Ｒ3が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群から選択される、炭素原子に結合された１個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３５６】
６６．
Ｒ4が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキル−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−複素環−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−アリール−Ｒ8、−Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリール−Ｒ8、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ9、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリール−Ｒ8、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜4）アルキル−Ｒ10、−ＳＯ2−（Ｃ1〜4）アルキ
ル−Ｒ9、−ＳＯ2−アリール−Ｒ8、−ＳＯ2−ＮＨ2、−ＳＯ2−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）、−ＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル−Ｒ9）2、−Ｎ−Ｒ7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−Ｒ8、−複素環−Ｒ8、−アリール−Ｒ8及び−ヘテロアリール−Ｒ8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３５７】
６７．
Ｒ4が、水素、−Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルケニル−Ｒ10、−Ｃ2〜4アルキニル−Ｒ10、−Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル、−複素環、−アリール及び−ヘテロアリールからなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３５８】
６８．
Ｒ4が、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３５９】
６９．
Ｒ4が、水素、Ｃ1〜4アルキル−Ｒ10、Ｃ1〜4アルコキシ−Ｒ10、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、塩素、フッ素及びヒドロキシからなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された１〜４個の置換基である、２８．に記載の方法。
【０３６０】
７０．
Ｒ10が、水素、−ＮＨ2、−ＮＨ（Ｃ1〜4アルキル）、−Ｎ（Ｃ1〜4アルキル）2、シアノ，（ハロ）1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される１〜２個の置換基でありる、３８．及び４１．に記載の方法。
【０３６１】
７１．
Ｒ10が、水素及び（ハロ）1〜3からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３８．及び４１．に記載の方法。
【０３６２】
７２．
Ｒ10水素及び（フルオロ）3からなる群から独立して選択される１〜２個の置換基である、３８．及び４１．に記載の方法。
【０３６３】
７３．
Ｙ及びＺが、Ｏ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される；但し、Ｙ及びＺの一方がＯであり且つ他方がＯ、Ｓ、（Ｈ，ＯＨ）、及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される、２８．に記載の方法。
【０３６４】
７４．
Ｙ及びＺが、Ｏ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から独立して選択される；但し、Ｙ及びＺの一方がＯであり且つ他方がＯ及び（Ｈ，Ｈ）からなる群から選択される、２８．に記載の方法。
【０３６５】
７５．
Ｙ及びＺが独立してＯから選択される、２８．に記載の方法。
【０３６６】
７６．
前記式ＩＩの化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、２８．に記載の方法。
【０３６７】
７７．
前記式ＩＩの化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、２８．に記載の方法。
【０３６８】
７８．
前記式ＩＩの化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオンである、２８．に記載の方法。
【０３６９】
７９．
前記式ＩＩの化合物が、３−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−４−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、２８．に記載の方法。
【０３７０】
８０．
前記式ＩＩの化合物が、４−｛３−［４−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル｝−ブチロニトリルである、２８．に記載の方法。
【０３７１】
８１．
前記式ＩＩの化合物が、４−｛３−［４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル｝−ブチロニトリルである、２８．に記載の方法。
【０３７２】
８２．
前記式ＩＩの化合物が、３−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−４−（１−フェネチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、２８．に記載の方法。
【０３７３】
８３．
前記ＧＳＫ−３Ｂの酵素活性阻害剤が式（ＩＩＩ）の化合物である、１．に記載の方法：
【化２５】
2015119724.tif 000063
【０３７４】
８４．
Ａ及びＥが、水素置換された炭素原子及び窒素原子からなる群から独立して選択され；ここで、
【化２６】
2015119724.tif 000064
は、１Ｈ−インドール、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン及び１Ｈ−インダゾールからなる群から独立して選択される、８３．に記載の方法。
【０３７５】
８５．
ＺがＯから選択され；あるいは、Ｚがジヒドロから選択され；ここで、それぞれの水素原子が単結合で結合されている、８３．に記載の方法。
【０３７６】
８６．
Ｒ4及びＲ5が、場合によりオキソで置換されているＣ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、及びＣ2〜8アルキニルから独立して選択される、８３．に記載の方法。
【０３７７】
８７．
Ｒ2が、−Ｃ1〜8アルキル−、−Ｃ2〜8アルケニル−、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている）、ハロゲン，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選ばれた１個〜４個の置換基で場合により置換されている直炭素鎖であり；そして、式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル、及
びスピロ複素環（式中、該シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル，カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、上記の複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている）からなる群から独立して選択された１個〜２個の置換基で場合により置換されている）、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール（式中、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ6−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、及び−ＳＯ2−（式中、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（式中、該複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）からなる群から独立して選択される）からなる群から選択され；但し、Ａ及びＥが水素置換された炭素原子から選択された場合には、Ｒ2は、−Ｃ2〜8アルキニル−、−Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルケニル−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ2〜8）アルキニル−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ1〜8）アルキル−Ｃ（Ｏ）−（式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、−Ｃ1〜8アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ1〜8）アルキル、ア
ミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは、水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換された直炭素鎖であり；そして式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル、スピロシクロアルキル、及びスピロ複素環（式中、該シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、該複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている）からなる群から独立して選択された１個〜２個の置換基で場合により置換されている）、シクロアルキル（式中、シクロアルキルは、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されている）、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）1〜5−ＮＲ6−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−、−（Ｏ−（ＣＨ2）1〜6）0〜5−Ｓ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−ＮＲ6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ8−、−ＮＲ9−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ9−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ6−（ＣＨ2）0〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）1〜6−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）0〜6−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ7−、−ＮＲ6−Ｃ（ＮＲ7）−ＮＲ8−、−Ｏ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1��6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｏ−、−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−及び−ＮＲ6−（ＣＨ2）1〜6−Ｓ−（ＣＨ2）1〜6−ＮＲ7−（式中、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8は、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル、及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（式中、該複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及び水素及びＣ1〜4アルキル）、ハロゲン，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換されており；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）よりなる群より独立して選ばれ；そして式中、Ｒ9は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル、複素環（Ｃ1〜8）アルキル、アリール（Ｃ1〜8）アルキル及びヘテロアリール（Ｃ1〜8）アルキル（式中、該複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル，（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から独立して選択された１個〜４個の置換基で場合により置換され；そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている）よりなる群より独立して選ばれる）よりなる群より選ばれる、８３．に記載の方法。
【０３７８】
８８．
Ｒ1及びＲ3が、水素、Ｃ1〜8アルキル、Ｃ2〜8アルケニル、Ｃ2〜8アルキニル（式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、（ハロ）1〜3、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキル及びオキソからなる群から選択された置換基で場合により置換されている）、Ｃ1〜8アルコキシ、Ｃ1〜8アルキルカルボニル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、Ｃ1〜8アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール（式中、アリール及びヘテロアリールはＣ1〜8アルキル、Ｃ1〜8アルコキシ、アルコキシ（Ｃ1〜8）アルキル、カルボキシル、カルボキシル（Ｃ1〜8）アルキル、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、アミノ（Ｃ1〜8）アルキル（式中、アミノは水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている）、ハロゲン、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルキル、（ハロ）1〜3（Ｃ1〜8）アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ（Ｃ1〜8）アルキルからなる群から選択された置換基で場合により置換されている）、アミノ（水素及びＣ1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で場合により置換されている）、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、及びニトロ；及びそれらの薬学上許容し得る塩からなる群から独立して選択される、８３．に記載の方法。
【０３７９】
８９．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、６，７，９，１０，１２，１３，１５，１６−オクタヒドロ−２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジメテノ−５Ｈ−ジピリド［２，３−ｋ：３’，２’−ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］トリオキサジアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８０】
９０．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２２，２３−デカヒドロ−９，４：２４，２９−ジメテノ−１Ｈ−ジピリド［２，３−ｎ：３’，２’−ｔ］ピロロ［３，４−ｑ］［１，４，７，１０，１３，２２］テトラオキサジアザシクロテトラコシン−１，３（２Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８１】
９１．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２
２，２３，２５，２６−ドデカヒドロ−９，４：２７，３２−ジメテノ−１Ｈ−ジピリド［２，３−ｑ：３’，２’−ｗ］ピロロ［３，４−ｔ］［１，４，７，１０，１３，１６，２５］ペンタオキサジアザシクロヘプタコシン−１，３（２Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８２】
９２．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、６，７，９，１０，１２，１３−ヘキサヒドロ−２０Ｈ−５，２３：１４，１９−ジメテノ−５Ｈ−ジベンゾ［ｈ，ｎ］ピロロ［３，４−ｋ］［１，４，７，１６］ジオキサジアザシクロオクタデシン−２０，２２（２１Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８３】
９３．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、６，７，９，１０，１２，１３，１５，１６−オクタヒドロ−２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジメテノ−５Ｈ−ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］トリオキサジアザシクロヘンエイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８４】
９４．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１０，１１，１３，１４，１６，１７，１９，２０，２２，２３−デカヒドロ−９，４：２４，２９−ジメテノ−１Ｈ−ジベンゾ［ｎ，ｔ］ピロロ［３，４−ｑ］［１，４，７，１０，１３，２２］テトラオキサジアザシクロテトラコシン−１，３（２Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８５】
９５．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が化合物１ａである、８３．に記載の方法。
【０３８６】
９６．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−［３−［（２−ヒドロキシエチル）メチルアミノ］プロピル］−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−［１−（３−ピリジニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８７】
９７．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３，５−ジクロロ−Ｎ−［３−クロロ−４−［（３，４，１２，１２ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−［１，４］チアジノ［３，４−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−１１（６Ｈ）−イル）カルボニル］フェニル］−ベンズアミドである、８３．に記載の方法。
【０３８８】
９８．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３８９】
９９．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−（２−メトキシ−フェニル）−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９０】
１００．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−
５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリルである、８３．に記載の方法。
【０３９１】
１０１．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−（５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９２】
１０２．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−（５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（３−［１，２，３］トリアゾール−１−イル−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９３】
１０３．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９４】
１０４．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が化合物１０ａである、８３．に記載の方法。
【０３９５】
１０５．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−３−メチル−ブチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−（１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９６】
１０６．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−（１−ピリミジン−５−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９７】
１０７．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１−ピリミジン−５−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９８】
１０８．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、（１１Ｚ）−８，９，１０，１３，１４，１５−ヘキサヒドロ−２，６：１７，２１−ジ（メテノ）ピロロ［３，４−ｈ］［１，１５，７］ジオキサザシクロトリコシン−２２，２４（１Ｈ，２３Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０３９９】
１０９．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−（５−クロロ−１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４００】
１１０．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−（２−メトキシ−フェニル）−４−［１−（３−メ
トキシ−プロピル）−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０１】
１１１．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（３−ヒドロキシ−プロピル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−４−［１−（テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０２】
１１２．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、２−｛３−［４−（５−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−インダゾール−１−イル｝−Ｎ−（２−ヒドロキシ−エチル）−アセトアミドである、８３．に記載の方法。
【０４０３】
１１３．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、４−（３−クロロ−フェニル）−６−（３−ジメチルアミノ−プロピル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−２，４，６−トリアザ−シクロペンタ［ｃ］フッ素−１，３−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０４】
１１４．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１４−エチル−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジメテノジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンエイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０５】
１１５．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１４−ベンジル−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０６】
１１６．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−（１−｛２−［２−（２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０７】
１１７．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、６，７，８，９，１０，１１，１２，１３−オクタヒドロ−８，１１−ジメチル−５，２３：１４，１９−ジメテノ−２０Ｈ−ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０］テトラアザシクロオクタデシン−２０，２２（２１Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０８】
１１８．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、７，８，９，１０，１２，１３，１６，１７，１８，１９−デカヒドロ−８，１７−ジメチル−１５Ｈ，２６Ｈ−５，２９：２０，２５−ジメテノ−６Ｈ−ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９，２２］ジオキサテトラアザシクロテトラコシン−２６，２８（２７Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４０９】
１１９．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１４−（２−フリルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１０】
１２０．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１４−（２−チエニルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１１】
１２１．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１４−（１−ナフチルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１２】
１２２．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、１４−（ピリジン−４−イルメチル）−６，７，９，１０，１３，１４，１５，１６−オクタヒドロ−１２Ｈ，２３Ｈ−５，２６：１７，２２−ジ（メテノ）ジベンゾ［ｋ，ｑ］ピロロ［３，４−ｎ］［１，４，７，１０，１９］ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−２３，２５（２４Ｈ）−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１３】
１２３．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（２−｛２−［２−（１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−１−イルアミノ）−エトキシ］−エトキシ｝−エチル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−｛１−［２−（１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−１−イルアミノ）−エチル］−１Ｈ−インドール−３−イル｝−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１４】
１２４．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［１−（３−ジメチルアミノ−フェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１５】
１２５．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、３−［５−クロロ−１−（６−ジメチルアミノ−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−ピロール−２，５−ジオンである、８３．に記載の方法。
【０４１６】
１２６．
前記式（ＩＩＩ）の化合物が、５−（５−クロロ−３−｛４−［１−（２−ヒドロキシ−エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル｝−インドール−１−イル）−ニコチン酸メチルエステルであ
る、８３．に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015119724.tif 000068
【図３Ａ】
2015119724.tif 000069
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2015119724.tif 000071
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2015119724.tif 000079
【図８Ｂ】
2015119724.tif 000080
【図９】
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【図１０Ａ】
2015119724.tif 000082
【図１０Ｂ】
2015119724.tif 000083
【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
2015119724.tif 000085
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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