(57)【要約】【課題】酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌を用いて、化学品の工業生産に適した粉末化触媒を製造する方法の提供。【解決手段】遺伝子組換え大腸菌を含有する菌体含有液を噴霧乾燥して粉末化触媒を得ること、を含む粉末化触媒の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え大腸菌を含有する菌体含有液を噴霧乾燥して粉末化触媒を得ること、を含む粉末化触媒の製造方法。
【請求項２】
前記菌体含有液に含まれる水の含有量が、該菌体含有液の全質量に対して９５質量％以下である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記菌体含有液に含まれる水の含有量が、該菌体含有液の全質量に対して８２質量％以上９０質量％以下である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記粉末化触媒の活性残存率が５０％以上である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記遺伝子組換え大腸菌内で、転移酵素（ＥＣ．２）、加水分解酵素（ＥＣ．３）、付加脱離酵素（ＥＣ．４）及び異性化酵素（ＥＣ．５）からなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素が発現している、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記転移酵素（ＥＣ．２）が、一炭素原子基転移酵素（ＥＣ．２．１）及びグリコシル基転移酵素（ＥＣ．２．４）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記転移酵素（ＥＣ．２）が、ヒドロキシメチル基又はホルミル基転移酵素（ＥＣ．２．１．２）及び五炭糖残基転移酵素（ＥＣ．２．４．２）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５又は請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記転移酵素（ＥＣ．２）が、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．１．２．１）及びチミジンホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．２．４）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記加水分解酵素（ＥＣ．３）が、エステル加水分解酵素（ＥＣ．３．１）である、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記加水分解酵素（ＥＣ．３）が、リン酸エステル加水分解酵素（ＥＣ．３．１．３）である、請求項５〜請求項９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記加水分解酵素（ＥＣ．３）が、酸性ホスファターゼ（ＥＣ．３．１．３．２）である、請求項５〜請求項１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記付加脱離酵素（ＥＣ．４）が、炭素−炭素付加脱離酵素（ＥＣ．４．１）及び炭素−酸素付加脱離酵素（ＥＣ．４．２）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜請求項１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記付加脱離酵素（ＥＣ．４）が、カルボキシル基付加脱離酵素（ＥＣ．４．１．１）、アルデヒド基付加脱離酵素（ＥＣ．４．１．２）及びデヒドラターゼ類の酵素（ＥＣ．４．２．１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記付加脱離酵素（ＥＣ．４）が、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ．４．１．１．７）、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ（ＥＣ．４．１．２．４２）、トリプトファンシンターゼ（ＥＣ．４．２．１．２０）及びグルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．３９）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜請求項１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記異性化酵素（ＥＣ．５）が、分子内転移酵素（ＥＣ．５．４）である、請求項５〜請求項１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記異性化酵素（ＥＣ．５）が、リン酸基転移酵素（ＥＣ．５．４．２）である、請求項５〜請求項１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記異性化酵素（ＥＣ．５）が、ホスホペントムターゼ（ＥＣ．５．４．２．７）である、請求項５〜請求項１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
さらに、前記遺伝子組換え大腸菌を培養すること、及び、培養した前記遺伝子組換え大腸菌を集菌すること、を含む請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学品を製造する際に用いる粉末化触媒の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素を微生物に生産させ、その微生物をそのまま、または酵素を微生物から取り出し、触媒として化学品の製造に用いる。その触媒が液体の状態では微生物汚染等の可能性があり、長期保存には向かない。そこで触媒含有液を凍結保存する手段をとるが、液体を凍結する際又は凍結物を融解する際に、触媒活性が低下するリスクがある。この問題を解決するために、例えば、触媒含有液を乾燥させ、固形の状態にする。この場合の乾燥方法としては、凍結乾燥、真空凍結乾燥、噴霧乾燥などがある。
【０００３】
しかし、凍結乾燥又は真空凍結乾燥を行うには、大規模な設備が必要であり、その設備投資に多大な費用がかかる。また、凍結乾燥又は真空凍結乾燥を採用すると、製造工程全体の連続化が難しい。さらに、凍結乾燥又は真空凍結乾燥の後、乾燥した触媒の粉砕及び均質化等の工程が必要となり、製造工程が煩雑になる。
【０００４】
一方、噴霧乾燥は、液体を微粒化装置により液滴にし、その液滴に比較的高温の乾燥風を接触させることで水分を蒸発させ乾燥させる方法である。噴霧乾燥を採用すると製造工程全体の連続化が可能であり、製造現場において作業性がよい。
【０００５】
微生物又は酵素の噴霧乾燥に関して、例えば以下の技術が提案されている。
特許文献１には、生菌率を高くすることを目的とした乳酸菌の乾燥方法が開示されている。
特許文献２には、触媒としての菌体を乾燥する方法として、β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵母乾燥粉末の製造方法が開示されている。
特許文献３には、種々の活性を有する乾燥微生物の製造方法が開示されている。
特許文献４及び５には、菌体ではなく酵素そのものを乾燥粉末化する方法として、リパーゼ活性が向上したリパーゼ粉末製剤の製造方法が開示されている。
特許文献６には、賦形剤とＤＮアーゼを噴霧乾燥し、薬効成分として生物活性形態のＤＮアーゼを含有する乾燥粉末の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１７３３７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／１４１２４４号
【特許文献３】特開平２−１７１１８４号公報
【特許文献４】国際公開第２０１１／６８０７６号
【特許文献５】国際公開第２００８／１１４６５６号
【特許文献６】特表平９−５０９９２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
工業的な使用の実績が豊富な大腸菌から、化学品の工業生産に適した粉末化触媒を直接的に得ることができれば、工業的な利便性が高い。
【０００８】
本発明は、上記状況のもとになされた。
本発明は、酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌を用いて、化学品の工業生産に適した粉末化触媒を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
課題を解決するための手段は以下の通りである。
［１］  遺伝子組換え大腸菌を含有する菌体含有液を噴霧乾燥して粉末化触媒を得ること、を含む粉末化触媒の製造方法。
［２］  前記菌体含有液に含まれる水の含有量が、該菌体含有液の全質量に対して９５質量％以下である、［１］に記載の製造方法。
［３］  前記菌体含有液に含まれる水の含有量が、該菌体含有液の全質量に対して８２質量％以上９０質量％以下である、［１］に記載の製造方法。
［４］  前記粉末化触媒の活性残存率が５０％以上である、［１］から［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［５］  前記遺伝子組換え大腸菌内で、転移酵素（ＥＣ．２）、加水分解酵素（ＥＣ．３）、付加脱離酵素（ＥＣ．４）及び異性化酵素（ＥＣ．５）からなる群より選ばれる少なくとも１種の酵素が発現している、［１］から［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］  前記転移酵素（ＥＣ．２）が、一炭素原子基転移酵素（ＥＣ．２．１）及びグリコシル基転移酵素（ＥＣ．２．４）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［５］に記載の製造方法。
［７］  前記転移酵素（ＥＣ．２）が、ヒドロキシメチル基又はホルミル基転移酵素（ＥＣ．２．１．２）及び五炭糖残基転移酵素（ＥＣ．２．４．２）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］  前記転移酵素（ＥＣ．２）が、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．１．２．１）及びチミジンホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．２．４）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［５］〜［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］  前記加水分解酵素（ＥＣ．３）が、エステル加水分解酵素（ＥＣ．３．１）である、［５］〜［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］  前記加水分解酵素（ＥＣ．３）が、リン酸エステル加水分解酵素（ＥＣ．３．１．３）である、［５］〜［９］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１１］  前記加水分解酵素（ＥＣ．３）が、酸性ホスファターゼ（ＥＣ．３．１．３．２）である、［５］〜［１０］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１２］  前記付加脱離酵素（ＥＣ．４）が、炭素−炭素付加脱離酵素（ＥＣ．４．１）及び炭素−酸素付加脱離酵素（ＥＣ．４．２）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［５］〜［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１３］  前記付加脱離酵素（ＥＣ．４）が、カルボキシル基付加脱離酵素（ＥＣ．４．１．１）、アルデヒド基付加脱離酵素（ＥＣ．４．１．２）及びデヒドラターゼ類の酵素（ＥＣ．４．２．１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［５］〜［１２］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１４］  前記付加脱離酵素（ＥＣ．４）が、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ．４．１．１．７）、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ（ＥＣ．４．１．２．４２）、トリプトファンシンターゼ（ＥＣ．４．２．１．２０）及びグルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．３９）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［５］〜［１３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１５］  前記異性化酵素（ＥＣ．５）が、分子内転移酵素（ＥＣ．５．４）である、［５］〜［１４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１６］  前記異性化酵素（ＥＣ．５）が、リン酸基転移酵素（ＥＣ．５．４．２）である、［５］〜［１５］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１７］  前記異性化酵素（ＥＣ．５）が、ホスホペントムターゼ（ＥＣ．５．４．２．７）である、［５］〜［１６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１８］  さらに、前記遺伝子組換え大腸菌を培養すること、及び、培養した前記遺伝子組換え大腸菌を集菌すること、を含む［１］〜［１７］のいずれか１つに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵素をコードする遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌を用いて、化学品の工業生産に適した粉末化触媒を製造する方法を提供しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】噴霧乾燥前後での活性値の比較結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の粉末化触媒の製造方法について説明する。以下の説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００１３】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１４】
＜粉末化触媒の製造方法＞
本発明の粉末化触媒の製造方法は、遺伝子組換え大腸菌を含有する菌体含有液（以下、「菌体含有液」とも称する。）を噴霧乾燥して粉末化触媒を得ること（以下、「噴霧乾燥工程」とも称する。）、を含む。
本発明の粉末化触媒の製造方法は、必要に応じて他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、遺伝子組換え大腸菌を培養すること（以下、「培養工程」とも称する。）、培養した遺伝子組換え大腸菌を集菌すること（以下、「集菌工程」とも称する。）等が挙げられる。
【００１５】
［菌体含有液］
本発明の粉末化触媒の製造方法に用いる菌体含有液は、遺伝子組換え大腸菌を含有する。遺伝子組換え大腸菌の調製方法は公知の方法に従えばよい。遺伝子組換え大腸菌の調製方法としては、目的とする酵素をコードする遺伝子を、公知のプラスミドに組込み、大腸菌の遺伝子に組み込む方法等が挙げられる。具体的には、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に記載の方法に従えばよい。遺伝子組換え大腸菌を調製する際に使用する大腸菌（Escherichia coli）の種類、プラスミドの種類、遺伝子を供与する微生物の種類等についても特に制限されるものではない。
【００１６】
本発明の粉末化触媒の製造方法に用いる菌体含有液は、水を含む。菌体含有液に含まれる水の含有量について、本発明者が鋭意検討したところ、以下の知見が得られた。
【００１７】
菌体含有液を噴霧乾燥する場合、付与された熱によって、菌体含有液中の水が蒸発する。与えられた熱エネルギーが全て水の蒸発エネルギーに費やされている間は、熱は菌体内の酵素に作用しないため酵素の活性は保持される。しかし、菌体含有液中の水がほとんど蒸発してしまった後にも熱エネルギーが付与される又は残存していると、熱が菌体内の酵素に作用し、酵素の活性は低下してしまう。したがって、一般的には、噴霧乾燥に供する菌体含有液中の水の含有割合が高い程、噴霧乾燥する際に菌体内の酵素はダメージを受けにくいと考えられる。ところが、本発明者が検討したところ、菌体含有液に含まれる水の含有割合が高い程よいわけではないことが明らかとなった。
【００１８】
本発明の粉末化触媒の製造方法に用いる菌体含有液は、水の含有量が、菌体含有液の全質量に対して９５質量％以下であることが好ましい。菌体含有液に含まれる水の含有量がこの範囲であると、そうでない場合に比べ、噴霧乾燥して得られた粉末化触媒が高い活性を示し得る。また、菌体含有液に含まれる水の含有量がこの範囲であると、そうでない場合に比べ、菌体含有液に安定化剤を添加せずとも高い活性を示し得る。
上記の観点で、菌体含有液に含まれる水の含有量は、菌体含有液の全質量に対して９５質量％以下であることが好ましく、９２質量％以下であることがより好ましく、９０質量％以下であることが更に好ましい。
菌体含有液に含まれる水の含有量の下限は、特に制限されるものではないが、上記の観点で、菌体含有液の全質量に対して８０質量％以上であることが好ましく、８２質量％以上であることがより好ましく、８５質量％以上であることが更に好ましい。
また、噴霧乾燥を容易に行うために固形分量を適切な範囲で含む観点で、菌体含有液に含まれる水の含有量の下限は８０質量％以上であることが好ましい。
上記の上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、８０質量％〜９５質量％が好ましく、８２質量％〜９５質量％がより好ましく、８２質量％〜９２質量％がより好ましく、８２質量％〜９０質量％が更に好ましく、８５質量％〜９０質量％が更に好ましい。
【００１９】
本明細書において、菌体含有液に含まれる水の含有量とは、菌体含有液の全質量から固形分質量を差し引いた値であり、赤外線水分計（例えばケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）により測定しうる。
【００２０】
本発明は、菌体含有液を噴霧乾燥して得られた粉末化触媒の活性残存率を５０％以上とすることが好ましく、６０％以上とすることがより好ましい。
ここで、粉末化触媒の活性残存率は、噴霧乾燥前の菌体含有液に含まれる固形分１グラム当たりの活性値（噴霧乾燥前活性値（Ｕ／ｇ））と、菌体含有液を噴霧乾燥して粉末化触媒を得た後２４時間以内に測定した、粉末化触媒１グラム当たりの活性値（噴霧乾燥後活性値（Ｕ／ｇ））と、から算出するものとする。
【００２１】
本発明は、より好ましくは、菌体含有液に含まれる水の含有量を、菌体含有液の全質量に対して９５質量％以下とし、且つ、該菌体含有液を噴霧乾燥して得られた粉末化触媒の活性残存率を５０％以上とすることが好ましい。
本発明は、更に好ましくは、菌体含有液に含まれる水の含有量を、菌体含有液の全質量に対して８２質量％〜９０質量％とし、且つ、該菌体含有液を噴霧乾燥して得られた粉末化触媒の活性残存率を６０％以上とすることが好ましい。
本発明は、更に好ましくは、菌体含有液に含まれる水の含有量を、菌体含有液の全質量に対して８５質量％〜９０質量％とし、且つ、該菌体含有液を噴霧乾燥して得られた粉末化触媒の活性残存率を６０％以上とすることが好ましい。
【００２２】
これまで、例えば特許文献２〜６のとおり、微生物又は酵素の噴霧乾燥の技術が開示されてはいるが、噴霧乾燥に供する大腸菌を含む菌体含有液について、水の含有量の適切な範囲を、これらの従来技術から予測することは容易ではなかった。以下に詳しく説明する。
【００２３】
酵素そのものを含有する酵素液を噴霧乾燥する場合、酵素は酵素液の水の含有量の影響を直接受ける。
一方、酵素を発現している菌体を含有する菌体含有液を噴霧乾燥する場合、酵素は菌体内の水の含有量の影響を受け、また、目的の酵素は菌体内に存在するその他の酵素（例えばプロテアーゼ）の影響も受け、さらに、菌体内に存在するその他の酵素も菌体内の水の含有量の影響を受ける。その上、菌体内の水の含有量は菌体含有液の水の含有量の影響を受ける。具体的には、菌体含有液の水の含有量の変化によって菌体内の水の含有量が変化し、菌体内の水の含有量の変化によって例えばプロテアーゼが活性化され、噴霧乾燥時にプロテアーゼが目的の酵素に影響を及ぼして該酵素の活性残存率が大きく低下することが考えられる。
以上のとおり、酵素そのものを含有する酵素液を噴霧乾燥する場合と、酵素を発現している菌体を含有する菌体含有液を噴霧乾燥する場合とでは、水の含有量について考慮すべき因子が異なる。つまり、酵素そのものと菌体内に存在する酵素とでは、噴霧乾燥する際に用いる液体における適切な水の含有量は異なる。菌体含有液を噴霧乾燥する際の当該液の水含有量が目的とする酵素に及ぼす影響の程度は、容易に予測できるものではない。
【００２４】
特許文献４〜６は、菌体ではなく酵素そのものを乾燥粉末化する方法を開示している。したがって、当該文献から、菌体含有液を噴霧乾燥する場合の、菌体含有液における適切な水の含有量を予測することは難しい。
しかも、特許文献４、５には、噴霧乾燥する際のリパーゼに対する水の含有比は記載されているが、水の含有比が噴霧乾燥後のリパーゼの活性残存率にどのように影響するかは示されていない。特許文献６には、噴霧乾燥に供する溶液中のＤＮアーゼ濃度は記載されているが、水の含有量については記載されていない。また、特許文献４〜６には、噴霧乾燥する際の酵素に対する水の含有量が噴霧乾燥後の酵素の活性残存率にどのように影響するかは示されていない。
【００２５】
特許文献２には、Sporobolomyces singularis、Cryptococcus laurentii、Rhodotorula lactosa、Sirobasidium magnum、Rhodotorula minutaといった酵母を噴霧乾燥して粉末化触媒を得た例が記載されている。特許文献３には、Pseudomonas putida、Fusarium lateritium、Methylophilus methylotrophus、Candida utilis、Lactobacillus plantarumといった微生物を噴霧乾燥して粉末化触媒を得た例が記載されている。
しかしながら、特許文献２及び３に記載されている微生物を噴霧乾燥して得られた粉末化触媒が高い活性を保持していたとしても、大腸菌においても同様の結果が得られるとは限らない。
さらに、特許文献２には、噴霧乾燥に用いる菌体含有液の菌体濃度が開示されているが、水の含有量は開示されていない。特許文献２においては、菌体含有液に安定化剤として糖を添加しているので、菌体濃度からだけでは正確な水の含有量を把握することができない。特許文献３にも、噴霧乾燥に用いる菌体含有液の菌体濃度が開示されているが、水の含有量は開示されていない。
また、特許文献２及び３では、水の含有量が噴霧乾燥後の触媒活性残存率にどのように影響するかは検討されていない。
【００２６】
以上に説明したとおり、従来技術から、噴霧乾燥に供する大腸菌を含む菌体含有液について、水の含有量の適切な範囲を予測することは容易ではなかった。
【００２７】
以下、本発明における菌体含有液の説明を続ける。
本発明における菌体含有液は、安定化剤を含有していてもよい。安定化剤としては、様々な化合物を利用することができる。具体的には例えば、ブドウ糖、乳糖、果糖、澱粉、シクロデキストリン等の糖類；グリシン、アラニン、グルタミン酸等のアミノ酸類；チミジン、グアニル酸、アデノシン三リン酸等の核酸類；クエン酸、フマル酸、乳酸等の有機酸類；マグネシウム、カルシウム、ナトリウム等の金属類；大豆タンパク加水分解物、小麦グルテン加水分解物、酵母エキス等の生体由来成分を酵素処理した混合物；目的の活性を示す酵素の基質、生成物、補酵素、補欠分子族；などが挙げられる。
【００２８】
本発明における菌体含有液のｐＨは、目的とする酵素の触媒活性が過度に失わなければ特に制限されず、酵素が変性しないｐＨ領域であればよい。具体的にはｐＨ４〜１０の範囲であり、且つ目的とする酵素の触媒活性が失われないｐＨを示すことが好ましい。
酵素の種類によっては酸性領域で安定な酵素もあれば中性領域あるいはアルカリ領域で安定な酵素もある。それぞれの酵素に適したｐＨを選択して菌体含有液のｐＨをｐＨ調整剤などを用いて調整すればよい。ｐＨ調整剤の種類は特に制限されない。
本明細書において菌体含有液のｐＨは、菌体含有液の温度を２５℃にして、例えばｐＨメータ（堀場製作所製Ｄ−５２）により測定する。
【００２９】
［粉末化触媒に含まれる酵素］
本発明において粉末化触媒に含まれる酵素は、菌体含有液に含まれる遺伝子組換え大腸菌に由来する。一般的に、酵素はＥＣ．１〜ＥＣ．６の６つに分類される。ＥＣ．１は酸化還元酵素、ＥＣ．２は転移酵素、ＥＣ．３は加水分解酵素、ＥＣ．４は付加脱離酵素、ＥＣ．５は異性化酵素、ＥＣ．６は合成酵素である。
【００３０】
従来、微生物を噴霧乾燥した場合に、酵素の触媒活性がどの程度保たれるか検討されてきた。例えば、特許文献３には、微生物を噴霧乾燥した際の酵素活性保持率が開示されており、Lactobacillus plantarumを噴霧乾燥した際の解糖系およびアミノ酸生合成系における酵素活性保持率は１００％と記載されている。
しかし、噴霧乾燥に供する微生物が大腸菌である場合について、酵素の触媒活性の保持の程度を、当該従来技術から予測することは容易ではなかった。以下に詳しく説明する。
【００３１】
後述する参考例１に示す通り、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ＥＣ．１．１．１．７７）について、遺伝子組換え大腸菌を含有する菌体含有液を噴霧乾燥して粉末化触媒を得たところ、粉末化触媒の活性は大きく低下する結果が得られた。
プロパンジオールオキシドレダクターゼと同分類ＥＣ．１に属する酵素にグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（グリセルアルデヒド−３−リン酸：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ）（ＥＣ．１．２．１．１２）がある。この酵素は解糖系に関与する酵素である。特許文献３に示されている解糖系の酵素活性保持率から類推される、ＥＣ．１に属する酵素の触媒活性残存率と、本発明者が後述の参考例１で得たＥＣ．１に属する酵素の触媒活性残存率とは大きく解離しており、このことは、大腸菌を含む菌体含有液を噴霧乾燥した場合について、従来技術から触媒活性の保持の程度を予測することの困難さを示している。
【００３２】
特許文献３には、他にも、ＥＣ．３に属するＤ−２−ハロアルカン酸ハリドヒドロラーゼ（Pseudomonasputida）やアミダーゼ（Methylophilus methylotrophus）、ＥＣ．４に属するシアニドヒドラターゼ（Fusarium lateritium）やピルビン酸デカルボキシラーゼ（Candida utilis）等の酵素を、菌体内に元来保持する微生物を噴霧乾燥した例が記載されている。しかし、ＥＣ．３やＥＣ．４に属する酵素の活性保持率が示されてはいても、上述したＥＣ．１に属する酵素と同様に、遺伝子組換え大腸菌においてどの程度の触媒活性残存率となるかは予測困難である。
【００３３】
本発明者が鋭意検討したところ、菌体含有液を噴霧乾燥した場合、噴霧乾燥後の触媒活性残存率は、微生物の種類によって大きく変化し、また、酵素の種類と微生物の種類との組合せにも依存するとの知見が得られた。粉末化触媒の活性残存率は、噴霧乾燥する酵素種の酵素の分類に応じて変動しうるので、本発明に適用される酵素としてはＥＣ．２〜ＥＣ．６が好ましく、ＥＣ．２〜ＥＣ．５がより好ましい。
【００３４】
酸化還元酵素（ＥＣ．１）は電子供与体や電子受容体と電子の授受を行う酵素であり、その多くは反応に補酵素が関与する。酸化還元酵素を含む菌体含有液を噴霧乾燥した場合には、後述する参考例１に示す通り、噴霧乾燥して得られた粉末化触媒の活性の程度が他の酵素に比べて過度に失われる。そのため、ＥＣ．１に分類される酵素は、噴霧乾燥による粉末化触媒の製造方法には適さない。
酸化還元酵素（ＥＣ．１）の具体的な例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．１）、プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ＥＣ．１．１．１．７７）、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．４）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．４．１．２）、シアノコバラミンレダクターゼ（ＥＣ．１．１６．１．６）等が挙げられる。
【００３５】
本発明の粉末化触媒の製造方法に適する酵素としては、転移酵素（ＥＣ．２）、加水分解酵素（ＥＣ．３）、付加脱離酵素（ＥＣ．４）、異性化酵素（ＥＣ．５）及び合成酵素（ＥＣ．６）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられ、より好ましくは転移酵素（ＥＣ．２）、加水分解酵素（ＥＣ．３）、付加脱離酵素（ＥＣ．４）及び異性化酵素（ＥＣ．５）からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
本発明における遺伝子組換え大腸菌内において、これらの酵素の少なくとも１種の酵素が発現していればよく、２つ以上の酵素が発現していてもよい。
【００３６】
転移酵素（ＥＣ．２）としては、一炭素原子基転移酵素（ＥＣ．２．１）、グリコシル基転移酵素（ＥＣ．２．４）が好ましい。より好ましくはヒドロキシメチル基又はホルミル基転移酵素（ＥＣ．２．１．２）、五炭糖残基転移酵素（ＥＣ．２．４．２）であり、更に好ましくはグリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．１．２．１）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．２．４）である。
これらの転移酵素は、少なくとも１種が遺伝子組換え大腸菌内で発現していればよく、２種以上が遺伝子組換え大腸菌内で発現していてもよい。
【００３７】
加水分解酵素（ＥＣ．３）としては、エステル加水分解酵素（ＥＣ．３．１）が好ましく、より好ましくはリン酸エステル加水分解酵素（ＥＣ．３．１．３）であり、更に好ましくは酸性ホスファターゼ（ＥＣ．３．１．３．２）である。
【００３８】
付加脱離酵素（ＥＣ．４）としては、炭素−炭素付加脱離酵素（ＥＣ．４．１）、炭素−酸素付加脱離酵素（ＥＣ．４．２）が好ましく、より好ましくはカルボキシル基付加脱離酵素（ＥＣ．４．１．１）、アルデヒド基付加脱離酵素（ＥＣ．４．１．２）、デヒドラターゼ類の酵素（ＥＣ．４．２．１）であり、更に好ましくはベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ．４．１．１．７）、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ（ＥＣ．４．１．２．４２）、トリプトファンシンターゼ（ＥＣ．４．２．１．２０）、グルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．３９）である。
これらの付加脱離酵素は、少なくとも１種が遺伝子組換え大腸菌内で発現していればよく、２種以上が遺伝子組換え大腸菌内で発現していてもよい。
【００３９】
異性化酵素（ＥＣ．５）としては、分子内転移酵素（ＥＣ．５．４）が好ましく、より好ましくはリン酸基転移酵素（ＥＣ．５．４．２）であり、更に好ましくはホスホペントムターゼ（ＥＣ．５．４．２．７）である。
【００４０】
合成酵素（ＥＣ．６）としては、アセチルＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ．６．２．１．１）、グルタミン酸シンテターゼ（ＥＣ．６．３．１．２）、ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ．６．５．１．１）等が挙げられる。
【００４１】
［噴霧乾燥工程］
本発明における噴霧乾燥工程において、遺伝子組換え大腸菌を含有する菌体含有液を調製する方法は特に制限されるものではない。
例えば、後述する培養工程で得られる培養液を菌体含有液として利用することができる。また、後述する集菌工程で得られた菌体に、水；バッファー；培地；補酵素及び／又は補欠金属を含む水溶液；各種の化合物を含む水溶液；からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することによって調製してもよい。
菌体含有液を調製する際には、菌体含有液の光学濃度（ＯＤ値）が８０〜５００を示すように調製することが好ましい。これにより、噴霧乾燥するのに適した水含量にすることができ、好ましい。菌体含有液の光学濃度（ＯＤ値）は、分光光度計（例えば島津製作所製ＵＶ−１８００）により測定しうる。
【００４２】
本発明における噴霧乾燥工程において、菌体含有液を噴霧乾燥して粉末化触媒を得る方法は特に制限されるものではなく、例えば、菌体含有液をスプレードライヤー等により噴霧乾燥することで、菌体含有液の粉末化触媒を得ることができる。
スプレードライヤーとしては、噴霧によって菌体含有液を乾燥しうるものであればいずれの種類を使用してもよい。
菌体含有液の噴霧方式としては、一流体ノズル方式、二流体ノズル方式、省ガス微粒化ノズル方式、ツインジェットノズル方式、ロータリーアトマイザー方式などが挙げられ、菌体含有液を噴霧乾燥することができればいずれの方式を用いてもよい。中でも、大腸菌という微粒子を含む液を噴霧乾燥するには、二流体ノズル方式、又はロータリーアトマイザー方式を採用することが好ましい。
【００４３】
本発明における噴霧乾燥工程において、菌体含有液を噴霧乾燥する際のスプレードライヤーの乾燥空気量としては、菌体含有液を噴霧乾燥することができる乾燥空気量であれば特に制限されない。スプレードライヤーの大きさ、種類等に応じて処理能力が変わるため、スプレードライヤーの乾燥空気量は、スプレードライヤーの大きさ、種類等に応じて決定すればよい。例えばスプレードライヤーとしてＥＹＥＬＡ  ＳＤ−１０００（東京理科器械社製）等を使用する場合には、スプレードライヤーの乾燥空気量としては、具体的には、好ましくは０．３ｍ３／ｍｉｎ〜０．７５ｍ３／ｍｉｎであり、より好ましくは０．５ｍ３／ｍｉｎ〜０．７５ｍ３／ｍｉｎである。
【００４４】
本発明における噴霧乾燥工程において、菌体含有液を噴霧乾燥する際のスプレードライヤーの入口温度としては、菌体含有液を噴霧乾燥することができ、且つ目的とする酵素の触媒活性が過度に失われない温度であれば特に制限されない。スプレードライヤーの入口温度としては、具体的には、好ましくは１００℃〜２５０℃であり、より好ましくは１３０℃〜２００℃である。
ここで、目的とする酵素の触媒活性が過度に失われないとは、例えば、噴霧乾燥前の酵素の触媒活性に比して、噴霧乾燥後の酵素の触媒活性が５０％以上であることを意味する。
【００４５】
本発明における噴霧乾燥工程において、菌体含有液を噴霧乾燥する際のスプレードライヤーの出口温度としては、菌体含有液を噴霧乾燥することができ、且つ目的とする酵素の触媒活性が過度に失われない温度であれば特に制限されない。スプレードライヤーの出口温度としては、具体的には、好ましくは５０℃〜１５０℃であり、より好ましくは７０℃〜１２０℃である。
【００４６】
本発明における噴霧乾燥工程において、菌体含有液を噴霧乾燥する際の送液速度は、菌体含有液を乾燥でき、且つ粉末化触媒を製造することができれば、特に制限されない。
スプレードライヤーの大きさ、種類等に応じて処理能力が変わるため、菌体含有液の送液速度はスプレードライヤーの大きさ、種類等に応じて決定すればよい。
具体的には、各スプレードライヤーに付属の機器仕様書に記載されている能力の５０％〜１００％の送液速度を採用することが好ましく、より好ましくは７０％〜９０％の送液速度を採用することができる。例えばスプレードライヤーとして、ＥＹＥＬＡ  ＳＤ−１０００（東京理科器械社製）等を使用する場合には、菌体含有液の送液速度を３００ｇ／ｈｒ〜１５００ｇ／ｈｒに調整することが好ましく、５００ｇ／ｈｒ〜１２００ｇ／ｈｒに調整することがより好ましく、７００ｇ／ｈｒ〜１０００ｇ／ｈｒに調整することが更に好ましい。
【００４７】
本発明における噴霧乾燥工程において、噴霧乾燥は、粉末化触媒の水の含有量が、粉末化触媒の全質量に対して２質量％〜２０質量％（より好ましくは２質量％〜１５質量％、更に好ましくは３質量％〜１２質量％）の範囲になるまで行うことが好ましい。これにより、得られた粉末化触媒の活性残存率を好ましい範囲に維持しうる。
本明細書において、粉末化触媒の水の含有量は、粉末化触媒の全質量から固形分質量を差し引いた値であり、赤外線水分計（例えばケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）により測定しうる。
【００４８】
使用するスプレードライヤーの噴霧方式が二流体ノズル方式の場合、噴霧乾燥する際の噴霧圧力が、噴霧乾燥により得られる粉末化触媒の体積平均粒子径に影響を及ぼす。そのため、二流体ノズル方式を使用する際には、菌体含有液を噴霧乾燥する際の噴霧圧力を、１５０ｋＰａ〜２５０ｋＰａに調整することが好ましく、１５０ｋＰａ〜２２０ｋＰａに調整することがより好ましく、１８０ｋＰａ〜２２０ｋＰａに調整することが更に好ましい。
【００４９】
使用するスプレードライヤーの噴霧方式がロータリーアトマイザー方式の場合、アトマイザーの回転数が、噴霧乾燥により得られる粉末化触媒の体積平均粒子径に影響を及ぼす。そのため、ロータリーアトマイザー方式を使用する際には、ロータリーアトマイザーの回転数を、例えば、１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍにすることが好ましく、２００００ｒｐｍ〜２５０００ｒｐｍにすることがより好ましい。
【００５０】
噴霧乾燥工程により得られる粉末化触媒の平均体積粒子径は、５ｎｍ〜１００ｎｍ（より好ましくは１０ｎｍ〜８０ｎｍ、更に好ましくは１０ｎｍ〜６０ｎｍ）であることが好ましい。これにより、粉末化触媒の溶媒に対する溶解性がよく、触媒能を発揮することができる。
本明細書において、粉末化触媒の平均体積粒子径の測定は、粒度分布測定装置（例えば日機装社製マイクロトラックＭＴ−３２００）により測定しうる。
【００５１】
［培養工程］
本発明の粉末化触媒の製造方法は、さらに、遺伝子組換え大腸菌を培養する培養工程を含んでいてもよい。
培養工程は、本発明の粉末化触媒の製造方法に使用する、遺伝子組換え大腸菌の種類に応じてその条件を決定すればよい。培養は、例えば、２５℃〜３７℃の培養温度で６時間〜２４時間撹拌しながら前培養し、２５℃〜３７℃の培養温度で２０時間〜５０時間撹拌しながら本培養する。培地は特に制限されるものではなく、例えば、ＬＢ培地、ＮＢ培地、マッコンキー培地、ペプトンに無機塩を添加した培地等が挙げられる。
【００５２】
本発明の粉末化触媒の製造方法においては、培養工程により得られた培養液を菌体含有液として使用してもよい。また、培養工程を行った後に、後述する集菌工程を行ってもよい。
【００５３】
［集菌工程］
本発明の粉末化触媒の製造方法は、さらに、培養した遺伝子組換え大腸菌を集菌する集菌工程を含んでいてもよい。
集菌方法は特に制限されるものではない。集菌方法としては、例えば、培養工程により得られた培養液をボトルに入れ、遠心分離機を用いて２０分程度遠心分離することにより集菌する方法が挙げられる。また、培養液を連続遠心機で遠心分離することにより集菌する方法も挙げられる。
【００５４】
本発明の粉末化触媒の製造方法においては、集菌工程で得られた菌体に、水；バッファー；培地；補酵素及び／又は補欠金属を含む水溶液；各種の化合物を含む水溶液；からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することによって、菌体含有液を調製してもよい。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５６】
＜参考例１＞
［プロパンジオールオキシドレダクターゼ発現大腸菌の構築］
Escherichia coliのプロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子の公知情報（GenBank accession number M31059）をもとに、配列番号１と配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを合成した。Escherichia coli  ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号１と配列番号２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．２ｋｂｐのｆｕｃＯフラグメントを得た。
ｆｕｃＯフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントとを、リガーゼを用いて連結した後、Escherichia coli  ＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。
得られた形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からプラスミドを回収し、このプラスミドをｐＧＡＰｆｕｃＯと命名した。
プラスミドｐＧＡＰｆｕｃＯを用いてEscherichia coli  ＭＧ１６５５株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより、ＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株を得た。
【００５７】
［プロパンジオールオキシドレダクターゼ発現大腸菌の培養］
ＭＧ１６５５／ｐＧＡＰｆｕｃＯ株を、三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬに植菌し、温度３５℃、撹拌速度１２０ｒｐｍで一晩培養した。この前培養液全量を、以下に示す組成の培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養装置（ＡＢＬＥ社製ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．２（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。当初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの培養時間にわたって、培地中のグルコース濃度が０．１ｇ／Ｌ未満となる可変速度で、グルコースを全量で４０ｇ供給した。
【００５８】
−培地組成−
ポリペプトン：７ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４：０．０９ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：１．５ｇ／Ｌ
グルコース：３０ｇ／Ｌ
【００５９】
［菌体含有液の調製］
培養開始後２４時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌した。集菌した菌体に水を添加し、水の含有量が異なる菌体含有液を３種調製した（サンプル１〜３）。調製した菌体含有液の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定した。測定結果を表１に示す。
【００６０】
［プロパンジオールオキシドレダクターゼ発現大腸菌の噴霧乾燥］
サンプル１〜３の菌体含有液をスプレードライヤーＥＹＥＬＡ  ＳＤ−１０００（東京理科器械社製）で噴霧乾燥した。噴霧乾燥の条件は以下の通りである。
【００６１】
−噴霧乾燥条件−
噴霧方式：二流体ノズル
乾燥空気量：０．６６ｍ３／ｍｉｎ〜０．８１ｍ３／ｍｉｎ
噴霧圧力：１９０ｋＰａ
入口温度：１４０℃〜１４６℃
送液速度：６１４ｇ／ｈｒ〜６３８ｇ／ｈｒ
【００６２】
得られた粉末化菌体（粉末化触媒）の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定した。測定結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2015181397.tif 000002
【００６４】
［噴霧乾燥前後での活性値の比較］
サンプル１〜３の菌体含有液をそれぞれ８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、集菌体を５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。同じバッファーに懸濁後、超音波破砕機で破砕し、遠心によって得られた上清を酵素液として活性測定に使用した。
また、サンプル１〜３の噴霧乾燥後の粉末化菌体（粉末化触媒）をそれぞれ５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）で懸濁後、超音波破砕機で破砕し、遠心によって得られた上清を酵素液として活性測定に使用した。
【００６５】
２５０ｍＭ  エチレングリコール、２ｍＭ  ＮＡＤ、１００ｍＭ  グリシンバッファー（ｐＨ９．５）を含む水溶液を分光光度計（島津製作所製ＢｉｏＳｐｅｃ−１６００）にセットしてＣＰＳ−ＣＯＮＴＲＯＬＬＥＲで温度を３０℃に保持し、酵素液３０μＬを添加して３４０ｎｍにおけるＯＤ値の吸光度変化を測定した。
活性値は、１分間に３４０ｎｍにおけるＯＤ値の値を１変化させることができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
測定結果を表２及び図１に示す。図１中、サンプル１〜３についての結果をＰＯ菌として示す。
【００６６】
【表２】
2015181397.tif 000003
【００６７】
＜実施例１＞
［グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ発現大腸菌の構築］
Escherichia coliのグリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の公知情報（GenBank accession number AP009048）をもとに、配列番号３と配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを合成した。Escherichia coli  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号３と配列番号４に示すオリゴヌクレオチドをプライマーにしてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．３ｋｂｐのｇｌｙＡフラグメントを得た。
ｇｌｙＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡績社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントとを、リガーゼを用いて連結した後、Escherichia coli  ＤＨ５α株（東洋紡績社製）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。
得られた形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からプラスミドを回収し、このプラスミドをｐＵＣｇｌｙＡと命名した。
プラスミドｐＵＣｇｌｙＡを用いてEscherichia coli  Ｗ３１１０株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより、Ｗ３１１０／ｐＵＣｇｌｙＡ株を得た。
【００６８】
［グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ発現大腸菌の培養］
Ｗ３１１０／ｐＵＣｇｌｙＡ株を、三角フラスコに入れたＬＢ Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２００ｍＬに植菌し、温度３３℃、撹拌速度１２０ｒｐｍで一晩培養した。この前培養液全量を、以下に示す組成の培地５Ｌの入った１０Ｌ容の培養装置（ＡＢＬＥ社製ＢＭＳ−１０ＰＩ）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度６００ｒｐｍ、培養温度２８℃、ｐＨ７．３（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。当初のグルコースが完全に枯渇した後、残りの培養時間にわたって、培地中のグルコース濃度が０．１ｇ／Ｌ未満となる可変速度で、グルコースを供給した。
【００６９】
−培地組成−
ポリペプトン：７ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４：０．０９ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：１．５ｇ／Ｌ
グルコース：１５ｇ／Ｌ
【００７０】
［菌体含有液の調製］
培養開始後４８時間の菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により集菌した。集菌した菌体に水を添加し、水の含有量が異なる菌体含有液を４種調製した（サンプル４〜７）。調製した菌体含有液の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定した。測定結果を表３に示す。
【００７１】
［グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ発現大腸菌の噴霧乾燥］
サンプル４〜７の菌体含有液を、参考例１における噴霧乾燥と同様にして、スプレードライヤーで噴霧乾燥し、粉末化菌体（粉末化触媒）を得た。得られた粉末化菌体（粉末化触媒）の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定した。測定結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
2015181397.tif 000004
【００７３】
［噴霧乾燥前後での活性値の比較］
噴霧乾燥前の酵素液は参考例１と同様にして調製した。噴霧乾燥後の酵素液は、１０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）を用いた以外は参考例１と同様にして調製した。
【００７４】
５００ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．３）、４００ｍＭ  テトラヒドロ葉酸を含む水溶液をスクリュー管に入れ、水浴で４５℃に保持し、酵素液０．１ｍＬを添加して反応を開始した。１０分後に１／４量の１５％（ｗ／ｗ）トリクロロ酢酸を添加して反応を停止し、生成したＬ−セリン量をＨＰＬＣで分析した。
活性値は、１分間に１μｍｏｌのＬ−セリンを生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
測定結果を表４及び図１に示す。図１中、サンプル４〜７についての結果をＧＴ菌として示す。
【００７５】
【表４】
2015181397.tif 000005
【００７６】
＜実施例２＞
［各種の酵素を発現する大腸菌の構築］
実施例１における発現大腸菌の構築と同様にして、各種の酵素を発現する大腸菌を作製した。詳細を表５に示す。グルコン酸デヒドラターゼはＧｅｎＢａｎｋに登録されていないため、特許４３９１３２８号公報に記載されている配列情報をもとに配列番号１３と配列番号１４に示すオリゴヌクレオチドを合成した。
【００７７】
【表５】
2015181397.tif 000006
【００７８】
［発現大腸菌の培養、及び菌体含有液の調製］
各酵素の発現大腸菌を、実施例１における大腸菌培養と同様にして培養し、培養液から実施例１と同様にして、表６に記載のとおり菌体含有液を調製した（サンプル８〜３５）。調製した菌体含有液の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定した。測定結果を表６に示す。
【００７９】
［二流体ノズル方式での噴霧乾燥］
サンプル８〜３５の菌体含有液を、参考例１における噴霧乾燥と同様にしてスプレードライヤーで噴霧乾燥し、粉末化菌体（粉末化触媒）を得た。得られた粉末化菌体（粉末化触媒）の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定した。測定結果を表６に示す。
【００８０】
【表６】
2015181397.tif 000007
【００８１】
［噴霧乾燥前後での活性値の比較］
酵素液は実施例１と同様にして調製した。各酵素の活性測定方法および活性値の定義については以下の通りである。
【００８２】
−チミジンホスホリラーゼ−
１００ｍＭ  チミン、１００ｍＭ  ２−デオキシリボース−１−リン酸（ｄＲ１Ｐ）アンモニウム塩、１８０ｍＭ  水酸化マグネシウムを含む水溶液をスクリュー管に入れ、水浴で４０℃に保持し、酵素液０．２ｍＬを添加して反応を開始した。３０分後に等量の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して反応を停止し、生成したチミジン量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌのチミジンを生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８３】
−酸性ホスファターゼ−
３００ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、６００ｍＭ  ２−デオキシリボースを含む水溶液をスクリュー管に入れ、水浴で１０℃に保持し、酵素液１ｍＬを添加して反応を開始した。３０分後に３倍量の１Ｎ塩酸を添加して反応を停止し、生成した２−デオキシリボース−５−リン酸量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌの２−デオキシリボース−５−リン酸を生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８４】
−Ｄ−スレオニンアルドラーゼ−
２Ｍ  グリシン、５００ｍＭ  ホルマリン、０．１ｍＭ  ピリドキサールリン酸、１０ｍＭ  塩化マグネシウムを含む水溶液をスクリュー管に入れ、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．６に調整後、水浴で３５℃に保持し、酵素液０．５ｍＬを添加して反応を開始した。２０分後に等量の２Ｎ塩酸を添加して反応を停止し、生成したＤ−セリン量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌのＤ−セリンを生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８５】
−ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ−
２００ｍＭ  ２−ケト−３−デオキシグルコン酸、２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  チアミンピロリン酸を含む水溶液をスクリュー管に入れ、水浴で５０℃に保持し、酵素液１ｍＬを添加して反応を開始した。６０分後に１／１０量の１Ｎ塩酸を添加して反応を停止し、生成した２−デオキシリボース量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌの２−デオキシリボースを生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８６】
−グルコン酸デヒドラターゼ−
４０ｍＭ  グルコン酸ナトリウム、１００ｍＭ  トリスバッファー（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  塩化マグネシウムを含む水溶液をスクリュー管に入れ、水浴で３７℃に保持し、酵素液０．５ｍＬを添加して反応を開始した。１０分後に１／５量の１Ｎ塩酸を添加して反応を停止し、生成した２−ケト−３−デオキシグルコン酸量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌの２−ケト−３−デオキシグルコン酸を生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８７】
−トリプトファンシンターゼ−
７５０ｍＭ  Ｌ−セリン、３ｍＭ  インドール、０．０５ｍＭ  ピリドキサールリン酸を含む水溶液をスクリュー管に入れ、水浴で４５℃に保持し、酵素液０．０５ｍＬを添加して反応を開始した。１０分後に１／５量の１Ｎリン酸を添加して反応を停止し、生成したトリプトファン量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌのトリプトファンを生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８８】
−ホスホペントムターゼ−
１００ｍＭ  チミン、１００ｍＭ  ２−デオキシリボース−５−リン酸、１８０ｍＭ  水酸化マグネシウム、５０ｍＭ  塩化マンガン、０．４５％（ｗ／ｗ）のチミジンホスホリラーゼ発現菌体を含む液体をスクリュー管に入れ、水浴で４０℃に保持し、酵素液０．４５ｍＬを添加して反応を開始した。３０分後に等量の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加して反応を停止し、生成したチミジン量をＨＰＬＣで分析した。活性値は、１分間に１μｍｏｌのチミジンを生成することができる乾燥菌体量を１Ｕと定義した。
【００８９】
測定結果を表７及び図１に示す。図１中、サンプル８〜１１についての結果をＴＰ菌、サンプル１２〜１５についての結果をＡＰ菌、サンプル１６〜１９についての結果をＤＴ菌、サンプル２０〜２３についての結果をＢＤ菌、サンプル２４〜２７についての結果をＧＤ菌、サンプル２８〜３１についての結果をＴＳ菌、サンプル３２〜３５についての結果をＰＭ菌として示す。
【００９０】
【表７】
2015181397.tif 000008
【００９１】
［ロータリーアトマイザー方式での噴霧乾燥］
サンプル２９と同様にして調製した菌体含有液をスプレードライヤーＬ−８ｉ（大川原化工機社製）で噴霧乾燥した。噴霧乾燥の条件は以下の通りである。
【００９２】
−噴霧乾燥条件−
噴霧方式：ロータリーアトマイザー
回転数：２００００ｒｐｍ
入口温度：１５０℃
送液速度：１．１ｋｇ／ｈｒ
【００９３】
得られた粉末化菌体（粉末化触媒）の水の含有量は、赤外線水分計（ケツト科学研究所製ＦＤ−６１０）で測定したところ、粉末化菌体の全質量に対して７．５質量％だった。前述と同様にしてトリプトファンシンターゼの活性測定をした結果を表８に示す。
【００９４】
【表８】
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【図１】
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【配列表】
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