(57)【要約】【課題】本発明は、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）細胞への核酸の導入方法、当該方法により核酸が導入されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞、当該核酸がゲノム内に保持されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞の生産方法、及び当該細胞株により炭化水素を生産する方法を提供する。【解決手段】本発明者らは、ボトリオコッカス・ブラウニーが細胞周囲に形成する外殻の障壁を排除して核酸を細胞内に導入する技術について鋭意研究を行い、試行錯誤の結果、培養の過程で低頻度で生じる外殻を欠損した集団を単離し、その集団に対してエレクトロポレーションを行うことで、良好な効率で核酸導入が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）細胞に核酸を導入する方法であって、以下の工程：
前記細胞の外殻を欠損した集団を取得する工程；
前記集団を核酸導入手段に供する工程；及び
核酸が導入された細胞をスクリーニングする工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸導入手段がエレクトロポレーション法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の外殻を欠損した集団が、ボトリオコッカス・ブラウニー細胞を培養維持する過程で自然発生的に出現するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の外殻を欠損した集団が、外殻の完全性に基づく任意の分画手段を利用して取得される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分画手段が遠心分離である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分画手段において、完全な外殻を有する集団と欠損した集団が混在するボトリオコッカス・ブラウニー細胞培養物を、０．７〜１．０Ｍのショ糖溶液に懸濁し、当該懸濁物を遠心分離して、優先して沈降した分画として外殻を欠損した集団が回収される、請求項４又は５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記エレクトロポレーション法が、以下の工程；
前記外殻を欠損した細胞を、エレクトロポレーション用緩衝液に懸濁する工程；
当該懸濁物に導入すべき核酸を添加する工程；
当該懸濁物をエレクトロポレーション用キュベットの中に配置する工程；及び
当該キュベットをエレクトロポレーション装置に設置し、エレクトロポレーションを実行する工程；
を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記エレクトロポレーション用緩衝液が、マンニトール、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を添加したフェノールレッド不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エレクトロポレーション装置が、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーション装置（ネッパジーン株式会社、市川市、千葉、日本）である、請求項７又は８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸が、導入されたボトリオコッカス・ブラウニーの炭化水素生産効率に影響を及ぼすものである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法を用いて取得された、核酸が導入されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞。
【請求項１２】
以下の工程：
請求項１１に記載の細胞から、導入された核酸がゲノム内に保持されている細胞クローンを単離する工程；
を含む、形質転換ボトリオコッカス・ブラウニー細胞株を生産する方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸が導入されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞、又は請求項１２に記載の方法により生産された形質転換ボトリオコッカス・ブラウニー細胞株を用いて、炭化水素を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）細胞への核酸の導入方法、当該方法により核酸が導入されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞、当該核酸がゲノム内に保持されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞の生産方法、及び当該細胞株により炭化水素を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策として大気中の二酸化炭素削減技術の開発が盛んに進められている。また、化石燃料枯渇に対する危機感から、再生可能なエネルギーの開発も進められている。再生可能エネルギーには太陽光発電、風力発電が実用化されているが、光エネルギーにより水と二酸化炭素を炭化水素に変換する光合成生物の利用も、いわゆるカーボンニュートラルなエネルギー技術として関心が集まっている。
【０００３】
エネルギー資源として注目されている光合成生物として藻類が挙げられ、中でも緑藻類及び珪藻類が注目されている。通常の緑藻類は、その構成成分中の１５〜１７％が脂質であり、この脂質は、中性脂質（３０％）、糖脂質（３７％）、リン脂質（２６％）及び脂肪酸を含まない脂質（７％）等である。
【０００４】
近年、油生産緑藻として注目を集めているのが、群体性単細胞緑藻ボトリオコッカス・ブラウニーである。ボトリオコッカス・ブラウニーは淡水から汽水の湖沼に生息する緑藻類の一種であり、細胞内及び細胞外に直鎖アルケンやトリテルペン等の炭化水素を主成分とする油を蓄積することが知られている。上記のように一般的な藻類が生産する油がトリグリセリド（油脂）を主成分としていることと比較して、特異な性質である（Ｂａｎｅｒｊｅｅ他、２００２年；ＭｅｔｚｇｅｒとＬａｒｇｅａｕ、２００５年）。
【０００５】
ボトリオコッカス・ブラウニーは、工業的利用価値の高い炭化水素を安定供給する技術に繋がるものとして注目されており、事業化を見据えた高効率の培養技術の開発が進められている。例えば、特開２０１０−２５２７００において、新規アスティカカウリス・エキセントリカス菌株とボトリオコッカス藻類を共培養することにより、混入細菌による増殖阻害を軽減しつつ、ボトリオコッカスを高効率で培養できることが示されている。また、特開２０１２−８５５４０において、ボトリオコッカス・ブラウニーに定常的に炭化水素を合成させ、炭化水素抽出に繰り返し利用する炭化水素生産系が開示されている。
【０００６】
ボトリオコッカス・ブラウニーの増殖は遅く、油含有量はさまざまであるため、ボトリオコッカス・ブラウニーを用いたコスト効率のよい油生産を実現するには、改良された株の開発も必要である。炭化水素の生産に適した性質を有するボトリオコッカス・ブラウニー株の単離が試みられている。例えば、特開２０１３−２４３９４３において、直鎖飽和型の炭化水素を生産するボトリオコッカス・ブラウニーの新規株が樹立されており、当該株は、不安定で酸化され易い飽和型炭化水素を生産する通常のボトリオコッカス・ブラウニーと比較して、工業的利用価値が高い。
【０００７】
所望の形質を有する株を樹立する簡便な方法として、遺伝子組み換え技術を利用した品種改良が想定される。例えば、特開２００４−３３０７０において、抗酸化剤アスタキサンチンを生合成する緑藻ヘマトコッカスの遺伝子操作による改良を可能とするため、外来遺伝子を導入する方法が検討されている。また、クラミドモナス・ラインハルドテイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロレラ類（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ドゥナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）やヘマトコッカス・プルヴィアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）などの工業的に重要な藻種の株において、遺伝子組み換えによる改良が行われたことも報告されている（（Ｇｏｎｇ他、２０１１年；Ｂａｉ他、２０１３年；Ｇｅｎｇ他、２００３年；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、２０１１年；ＳｔｅｉｎｂｒｅｎｎｅｒとＳａｎｄｍａｎｎ、２００６年；Ｓａｅｉ他、２０１２年）。
【０００８】
しかしながら、ボトリオコッカス・ブラウニーにおいて、細胞内への核酸導入が従来極めて困難であったため、遺伝子組み換え技術を利用することが出来なかった。そのため、ボトリオコッカス・ブラウニーにおける炭化水素の生産に適した性質を有する株の樹立は、従来、特定の形質を有する株の自然発生、あるいは変異原処理による誘導等の、非効率かつ柔軟性を欠く手段に頼らざるを得なかった。したがって、斯かる障壁を克服して同種への遺伝子導入を達成する技術を開発することは、同種の遺伝子改変技術の足掛かりとなり、炭化水素生産に有利な性質を有する変異株の樹立に大いに貢献するものとして強く望まれていた（Ｂｅｅｒ他、２００９年；Ｉｏｋｉ他、２０１３年；Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓ他、２０１０年）。
【０００９】
また、ボトリオコッカス・ブラウニーにおいて外来遺伝子を少なくとも一過的に強制発現する技術が開発されれば、同藻類において生理的及び発生的事象に関与する細胞内シグナル伝達系の分子メカニズムを解明する試験に直接利用され得る（Ｙｏｏ他、２００７年）。斯かる一過的遺伝子発現系の用途は、近年の同藻類の遺伝学研究者によりなされた、同藻類において油の生合成に関与する重要な遺伝子及び基礎的な遺伝的特徴の解明や、トランスクリプトーム配列のデータベース作成等の成果（Ｎｉｅｈａｕｓ他、２０１１年；Ｂａｂａ他、２０１２年；Ｉｏｋｉ他、２０１２ａ、２０１２ｂ、２０１２ｃ、２０１３年；Ｍｏｌｎａｒ他、２０１２年；Ｏｋａｄａ他、２０１０年）に基づき、顕著に拡張され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】：特開２０１０−２５２７００号公報
【特許文献２】：特開２０１２−８５５４０号公報
【特許文献３】：特開２０１３−２４３９４３号公報
【特許文献４】：特開２００４−３３０７０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】：Banerjee, A., Sharma, R., Chisti, Y., Banerjee, U.C., 2002. Botryococcus braunii: a renewable source of hydrocarbons and other chemicals. Crit Rev Biotechnol. 22(3), 245-279.
【非特許文献２】：Metzger, P., Largeau, C., 2005. Botryococcus braunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids. Appl Microbiol Biotechnol. 66(5), 486-496.
【非特許文献３】：Geng, D., Wang, Y., Wang, P., Li, W., Sun, Y., 2003. Stable expression of hepatitis B surface antigen gene in Dunaliella salina (Chlorophyta). J Appl Phycol 15, 451-456.
【非特許文献４】：Kobayashi, T., Sakaguchi, K., Matsuda, T., Abe, E., Hama, Y., Hayashi, M., Honda, D., Okita, Y., Sugimoto, S., Okino, N., Ito, M., 2011. Increase of eicosapentaenoic acid in thraustochytrids through thraustochytrid ubiquitin promoter-driven expression of a fatty acid Δ5 desaturase gene. Appl Environ Microbiol 77(11), 3870-3876.
【非特許文献５】：Steinbrenner, J., Sandmann, G., 2006. Transformation of the green alga Haematococcus pluvialis with a phytoene desaturase for accelerated astaxanthin biosynthesis. Appl Environ Microbiol 72(12), 7477-7484.
【非特許文献６】：Saei, A.A., Ghanbari, P., Barzegari, A., 2012. Haematococcus as a promising cell factory to produce recombinant pharmaceutical proteins. Mol Biol Rep 39(11), 9931-9939.
【非特許文献７】：Beer, L.L., Boyd, E.S., Peters, J.W and Posewitz, M.C. 2009. Engineering algae for biohydrogen and biofuel production. Current opinion in biotechnology 20: 264-271.
【非特許文献８】：Ioki, M., Baba, M., Nakajima, N., Shiraiwa, Y., Watanabe, M.M., 2013. Codon usage of Botryococcus braunii (Trebouxiophyceae, Chlorophyta): implications for genetic engineering applications. Phycologia 52, 352-356.
【非特許文献９】：Radakovits, R., Jinkerson, R.E., Darzins, A and Posewitz, C. 2010. Genetic Engineering of Algae for Enhanced Biofuel Production. Eukaryotic Cell 9: 486-501.
【非特許文献１０】:Yoo, S.D., Cho, Y.H., Sheen, J., 2007. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols 2, 1565-1572.
【非特許文献１１】:Niehaus, T.D., Okada, S., Devarenne, T.P., Watt, D.S., Sviripa, V., Chappell, J. 2011. Identification of unique mechanisms for triterpene biosynthesis in Botryococcus braunii. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(30), 12260-12265.
【非特許文献１２】:Baba, M., Ioki, M., Nakajima, N., Shiraiwa, Y., Watanabe, M.M., 2012. Transcriptome analysis of an oil-rich race A strain of Botryococcus braunii (BOT-88-2) by de novo assembly of pyrosequencing cDNA reads. Bioresour Technol. 109, 282-286.
【非特許文献１３】:Ioki, M., Baba, M., Nakajima, N., Shiraiwa, Y., Watanabe, M.M., 2012a. Transcriptome analysis of an oil-rich race B strain of Botryococcus braunii (BOT-22) by de novo assembly of pyrosequencing cDNA reads. Bioresour Technol. 109, 292-296.
【非特許文献１４】:Ioki, M., Baba, M., Nakajima, N., Shiraiwa, Y., Watanabe, M.M., 2012b. Transcriptome analysis of an oil-rich race B strain of Botryococcus braunii (BOT-70) by de novo assembly of 5’-end sequences of full-length cDNA clones. Bioresour Technol. 109, 277-281.
【非特許文献１５】:Ioki, M., Baba, M., Bidadi, H., Suzuki, I., Shiraiwa, Y., Watanabe, M.M., Nakajima, N., 2012c. Modes of hydrocarbon oil biosynthesis revealed by comparative gene expression analysis for race A and race B strains of Botryococcus braunii. Bioresour Technol. 109, 271-276.
【非特許文献１６】:Okada, S., Devarenne, T.P., Chappell, J., 2000. Molecular characterization of squalene synthase from the green microalga Botryococcus braunii, race B. Arch. Biochem. Biophys. 373(2), 307-317.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記の状況に鑑み、ボトリオコッカス・ブラウニー細胞への核酸の導入方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ボトリオコッカス・ブラウニーは、化学的に耐性を有する堅固なカプセル状の外殻構造に被覆されていることが知られていた（Ｔａｎｏｉ他、２０１４年；Ｗｅｉｓｓ他、２０１２年；Ｄｅｍｅｔｒｅｓｃｕ、１９９８年；ＭｅｔｚｇｅｒとＬａｒｇｅａｕ、１９９９年；Ｂｅｒｋａｌｏｆｆ他、１９８３年；Ｄｅｒｅｎｎｅ他、１９８９年、１９９０年；Ｋａｄｏｕｒｉ他、１９８８年；Ｌａｒｇｅａｕ他、１９８６年；Ａｌｌａｒｄ他、１９９７年；Ｋａｙａ、２０１０年；Ｔｅｍｐｌｉｅｒ他、１９９２年）。斯かる堅固な外殻は、当該藻類のＤＮＡ操作技術の発達を阻害するものであった。当該外殻は、頂部キャップと底部カップ分離可能な２つの部分から形成される（Ｔａｎｏｉ他、２０１４年；Ｗｅｉｓｓ他、２０１２年；Ｄｅｍｅｔｒｅｓｃｕ、１９９８年；ＭｅｔｚｇｅｒとＬａｒｇｅａｕ、１９９９年）。底部カップが炭化水素バイオポリマー（アルゲナン）で構成されることは判明していたが、頂部キャップの化学組成は不明である（Ｄｅｍｅｔｒｅｓｃｕ、１９９８年；Ｍｅｔｚｇｅｒ及びＬａｒｇｅａｕ、１９９９年；Ｂｅｒｋａｌｏｆｆ他、１９８３年；Ｄｅｒｅｎｎｅ他、１９８９年、１９９０年；Ｋａｄｏｕｒｉ他、１９８８年；Ｌａｒｇｅａｕ他、１９８６年；Ａｌｌａｒｄ他、１９９７年；Ｋａｙａ、２０１０年；Ｔｅｍｐｌｉｅｒ他、１９９２年）。本発明者らは、ボトリオコッカス・ブラウニーが細胞周囲に形成する外殻の障壁を排除して核酸を細胞内に導入する技術について鋭意研究を行い、試行錯誤の結果、培養の過程で低頻度で生じる外殻を欠損した集団を単離し、その集団に対してエレクトロポレーションを行うことで、良好な効率で核酸導入が可能となることを見出した。斯かる驚異的な発見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１４】
従って、本願は、以下の発明を提供する。
【００１５】
１．ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）細胞に核酸を導入する方法であって、以下の工程：
前記細胞の外殻を欠損した集団を取得する工程；
前記集団を核酸導入手段に供する工程；及び
核酸が導入された細胞をスクリーニングする工程；
を含む方法。
２．前記核酸導入手段がエレクトロポレーション法である、項目１に記載の方法。
３．前記細胞の外殻を欠損した集団が、ボトリオコッカス・ブラウニー細胞を培養維持する過程で自然発生的に出現するものである、項目１に記載の方法。
４．前記細胞の外殻を欠損した集団が、外殻の完全性に基づく任意の分画手段を利用して取得される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記分画手段が遠心分離である、項目４に記載の方法。
６．前記分画手段において、完全な外殻を有する集団と欠損した集団が混在するボトリオコッカス・ブラウニー細胞培養物を、０．７〜１．０Ｍのショ糖溶液に懸濁し、当該懸濁物を遠心分離して、優先して沈降した分画として外殻を欠損した集団が回収される、項目４又は５のいずれかに記載の方法。
７．前記エレクトロポレーション法が、以下の工程；
前記外殻を欠損した細胞を、エレクトロポレーション用緩衝液に懸濁する工程；
当該懸濁物に導入すべき核酸を添加する工程；
当該懸濁物をエレクトロポレーション用キュベットの中に配置する工程；及び
当該キュベットをエレクトロポレーション装置に設置し、エレクトロポレーションを実行する工程；
を含む、項目２〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．前記エレクトロポレーション用緩衝液が、マンニトール、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を添加したフェノールレッド不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）である、項目７に記載の方法。
９．前記エレクトロポレーション装置が、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーション装置（ネッパジーン株式会社、市川市、千葉、日本）である、項目７又は８のいずれかに記載の方法。
１０．前記核酸が、導入されたボトリオコッカス・ブラウニーの炭化水素生産効率に影響を及ぼすものである、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
１１．項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法を用いて取得された、核酸が導入されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞。
１２．以下の工程：
項目１１に記載の細胞から、導入された核酸がゲノム内に保持されている細胞クローンを単離する工程；
を含む、形質転換ボトリオコッカス・ブラウニー細胞株を生産する方法。
１３．項目１１に記載の核酸が導入されたボトリオコッカス・ブラウニー細胞、又は項目１２に記載の方法により生産された形質転換ボトリオコッカス・ブラウニー細胞株を用いて、炭化水素を生産する方法。
【発明の効果】
【００１６】
従来不可能であったボトリオコッカス・ブラウニーへの遺伝子導入手段が提供されることにより、遺伝子組み換え技術による所望の形質を有する細胞株の樹立が可能となる。故に、本発明は、同藻類の品種改良を著しく促進し、それらを用いた炭化水素生産技術の発展に大いに貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１ａは、通常の培養条件下でのボトリオコッカス・ブラウニー群体の明視野（左欄）及び蛍光（右欄）の画像を示す。蛍光画像の緑色は、ナイルレッドで染色された油である。下段のパネルは上段の点線で選択した領域の拡大図であり、バーは５μｍを示す。図１ｂは、本発明の方法により単離された外殻を欠損したボトリオコッカス・ブラウニー単細胞の明視野（左欄）及び蛍光（右欄）の画像を示す。蛍光画像の緑色は、ナイルレッドで染色された油である。下段のパネルは上段の点線で選択した領域の拡大図である（図１ａ下段バーが適用）。
【００１８】
【図２】１Ｍショ糖水溶液中における沈降の時間差を利用して単離した外殻を欠損したボトリオコッカス・ブラウニー細胞にエレクトロポレーションでＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子を導入したもの（左）と対照（右）の明視野画像を示す。ＧＵＳが発現した細胞は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）シクロヘキシルアンモニウム塩を分解して青色を呈する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．材料及び装置
１．１．ボトリオコッカス・ブラウニー細胞
本発明において遺伝子導入に使用されるボトリオコッカス・ブラウニーは、湖沼や池から採取した、ボトリオコッカス属の藻類を含むサンプルから、以下の方法を用いて分離することができる。
【００２０】
上記のボトリオコッカス属の藻類を含むサンプルは、例えば、湖沼や池から、網目３０〜１００μｍのプランクトンネット等を用いて採取できる。
【００２１】
上記のボトリオコッカス属の藻類を含むサンプルに、次亜塩素酸ナトリウム（以下有効塩素）を作用させ、ボトリオコッカス属以外の微生物を殺菌する。この場合、処理されるサンプルを、あらかじめ適当な培地で培養して藻類を増殖させておいてもよい。培地としては、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地、ＡＦ−６培地等が挙げられるが、ボトリオコッカス属の藻類の培地として適切なものであれば、特に制限されない。また、この有効塩素を作用させる前に、ボトリオコッカス属のコロニーを、例えば遠心分離、濾過、又は顕微鏡下でマイクロピペットを用いる等の手段により分離してもよい。
【００２２】
上記の通りサンプルを有効塩素で処理した後に、当該サンプルをそのまま本発明の材料として使用してもよいが、藻体を濾過又は遠心分離等により分離し、培養液に懸濁する操作を繰り返すことなどにより洗浄することが好ましい。
【００２３】
続いて、上記有効塩素で処理したサンプルを、ボトリオコッカス属の藻類の培養に適したプレート培地、例えば、ＣＨＵ培地、ＪＭ培地、ＭＤＭ培地、ＡＦ−６培地等のプレート培地に塗布して培養を行う。培地のｐＨは、ｐＨ１〜１４、好ましくは、ｐＨ２〜１３、より好ましくはｐＨ３〜１１、さらにより好ましくは、ｐＨ４〜１０とすることができる。培養温度は、通常１０〜５０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３０℃の範囲で行うことができる。また、培養は蛍光灯等を用いて光照射下で行う。この光照射は、連続で行っても、間隔を置いて一定時間照射してもよい。時間間隔としては、１〜７２時間、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１〜１２時間から選択できる。また、照度は、通常１０〜３００μＥ／ｍ２／秒、好ましくは、４０〜１００μＥ／ｍ２／秒で行う。培養期間は、通常、１〜６０日、好ましくは１〜３０日間行う。
【００２４】
その後、プレート培地に生じたボトリオコッカス・ブラウニーの単一コロニーを採取することにより、ボトリオコッカス・ブラウニーの単一株が得られる。単一コロニーを採取する際は、顕微鏡下で行ってもよい。
【００２５】
採取されたボトリオコッカス・ブラウニー単一株は、当業者にとってありふれた手法を用いて増幅及び凍結保存され、必要に応じてその一部が本発明の核酸導入に供されてもよい。
【００２６】
本発明の方法に供されるボトリオコッカス・ブラウニー株は、適切な培地の中で、適切な通気及び光照射条件下で、所望の細胞密度に達するまで培養される。好ましくは、増殖が定常期に達するまで（例えば日齢３０〜５０日）培養が続行される。当該培養期間中、必要に応じて、使用している培地に適切な頻度で新鮮な培地を追加することにより、好適な培地組成及び細胞密度を維持しつつ培養が続行されてもよい。
【００２７】
ボトリオコッカス・ブラウニーの形態的特徴は、以下のようである。肉眼で見えるコロニーは球形で、黄緑色〜緑色である。顕微鏡下で押し潰すとブドウの房状のコロニーとして観察される。コロニーのサイズは平均的には３０−１００μｍ、最大で５００μｍに達する。コロニーを構成する細胞は、こん棒状で、細胞壁を有し、更にその周りに外殻を形成し得る。細胞の大きさは短径約８μｍ、長径約１４μｍで、その比は１．８程度である。細胞から分泌された炭化水素は細胞と外殻に間に蓄積され得る。
【００２８】
前記外殻は堅固なカプセル様構造を有し、その内部に細胞を閉じ込めている（Ｔａｎｏｉ他、２０１４年；Ｗｅｉｓｓ他、２０１２年；Ｄｅｍｅｔｒｅｓｃｕ、１９９８年；ＭｅｔｚｇｅｒとＬａｒｇｅａｕ、１９９９年；Ｂｅｒｋａｌｏｆｆ他、１９８３年；Ｄｅｒｅｎｎｅ他、１９８９年、１９９０年；Ｋａｄｏｕｒｉ他、１９８８年；Ｌａｒｇｅａｕ他、１９８６年；Ａｌｌａｒｄ他、１９９７年；Ｋａｙａ、２０１０年；Ｔｅｍｐｌｉｅｒ他、１９９２年）。
【００２９】
前記外殻は、２つの分離可能な部分、すなわち頂部キャップと底部カップからなる（Ｔａｎｏｉ他、２０１４年；Ｗｅｉｓｓ他、２０１２年；Ｄｅｍｅｔｒｅｓｃｕ、１９９８年；ＭｅｔｚｇｅｒとＬａｒｇｅａｕ、１９９９年）。発明者らは、これら２つの構造が培養過程で低頻度で分離し、その際に内部に閉じ込められていた細胞が底部カップを脱出することがあることを見出した。
【００３０】
ボトリオコッカス・ブラウニーは、炭素源としてＣＯ２を利用し、光合成で増殖する。
【００３１】
１．２．核酸
核酸は、導入された藻類の生理活性に何らかの影響を及ぼすヌクレオチドであって、好ましくは、核酸としては、任意のポリペプチドをコードするＤＮＡ、トランスポゾン、任意の遺伝子に対する各種ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びそれらをコードするＤＮＡが想定される。
【００３２】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えば任意のポリペプチドをコードするＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの生産を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたベクターとして用いられる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。所望により２種以上の核酸をひとつのベクターに含めることも可能である。
【００３３】
本発明の方法において導入される核酸として、炭化水素の生合成に関連する遺伝子の発現系が想定され得る。例えば、ボトリオコッカス・ブラウニーにおいて、炭化水素生合成関連遺伝子と、トランスクリプトーム配列の大きなデータセットの詳細な分析結果が報告されており（Ｎｉｅｈａｕｓ他、２０１１年；Ｂａｂａ他、２０１２年；Ｉｏｋｉ他、２０１２年ａ、２０１２年ｂ、２０１２年ｃ；Ｍｏｌｎａｒ他、２０１２年；Ｏｋａｄａ他、２０１０年）、それらの情報に基づいて所望の遺伝子発現系を構築することが可能である。また、ボトリオコッカス・ブラウニーは、他の緑藻と比較してコドンの使用に偏りが少ないことから、高等植物や動物に由来する遺伝子の利用も想定され得る（Ｉｏｋｉ他、２０１３年）。
【００３４】
２．核酸導入条件
２．１．細胞の前処理
発明者らは、ボトリオコッカス・ブラウニーが細胞周囲に形成する外殻構造の生理を詳細に研究し、ボトリオコッカス・ブラウニーの培養の過程で、低頻度ながら外殻を欠損した細胞（以下、外殻欠損細胞と表記する）が存在することを初めて見出した。そこで、発明者らは、培養藻類中に僅かに存在するそのような外殻欠損細胞を単離することが出来れば、それらに対して高効率で核酸の導入が可能となると考えた。
【００３５】
外殻欠損細胞は、完全な外殻を有するボトリオコッカス・ブラウニー細胞の外殻の少なくとも一部を欠損した細胞を意味する。外殻の一部が欠損することにより、導入核酸が欠損部位を通って細胞表面（細胞壁）に直接アクセスすることが可能となり、核酸導入効率が増大すると考えられる。外殻欠損細胞は、細胞の外殻を構成する頂部キャップと底部カップの接続部分が開口し、外殻に閉じ込められていた細胞が解放されることにより生じることが観察されている。本発明における外殻欠損細胞の単離工程において、外殻欠損細胞は、外殻のアルゲナン製底部カップが完全に喪失し、多くの場合、頂部キャップも喪失し、細胞壁が露出した単独の細胞が得られる（図１ｂ）。
【００３６】
発明者らはそのような自然発生する外殻欠損細胞を単離する手段を検討し、その結果、完全な外殻を有する細胞を浮力に頼って除去することにより、外殻欠損細胞を単離する方法を開発した。斯かる方法は、高濃度のショ糖溶液の中では、外殻欠損細胞は、遠心分離又は静置したとき、完全な外殻を有する細胞よりも僅かに早く沈殿する傾向があるという、発明者らの独自の知見に基づくものである。かかる現象は、ショ糖溶液中で浮力を有する油が浸含した多孔質アルゲナン製底部カップ部分が、外殻欠損細胞において欠損しているためと考えられる。
【００３７】
前記外殻欠損細胞の分離に用いるショ糖溶液は、水又はＡＦ−６等のボトリオコッカス・ブラウニー用の増殖培地を用いて調製され得る。当該ショ糖溶液の最適な濃度は、株と培養条件の違いによって変化し得るが、当該最適濃度の決定は、当業者にとってありふれた条件検討の範囲内である。本発明において実施された最適濃度の決定の例を挙げると、ある培養条件において、ショ糖濃度が０．７Ｍの場合に取得された細胞の外殻欠損細胞が占める割合は５０％未満であり、０．９Ｍの場合に取得された細胞の外殻欠損細胞が占める割合は９０％超であった。しかしながら、他の培養条件では、ショ糖濃度０．９Ｍの場合に取得された細胞の外殻欠損細胞が占める割合は１０％未満であり、１．０Ｍの場合に取得された細胞の外殻欠損細胞が占める割合は９０％超となった（データは示さず）。標準的なプロトコルでは１．０Ｍのショ糖溶液を使用するが、０．９Ｍまたは０．９５Ｍを使用しても収率が増大する可能性がある一方で、完全な外殻を有する細胞の除去が不十分になる可能性がある。新しい株または培養物を取り扱うときには、好ましくは適切なショ糖濃度範囲、例えば０．８５〜１．０Ｍの範囲での予備的な実験を行い最適な濃度が求められるべきである。斯かる示唆は、本発明の開発において、０．５〜１．０Ｍの範囲で条件検討が行われたことに基づく。上記ショ糖溶液に代えて、同濃度のマンニトール溶液が用いられてもよい。
【００３８】
前記外殻欠損細胞の分離において、好ましくは、遠心分離に先立って、ボトリオコッカス・ブラウニー培養物を一定時間静置することにより、少数の細胞からなるコロニー、完全な外殻を有する単細胞及び外殻欠損細胞の混合物が分離される。
【００３９】
前記外殻欠損細胞の分離において実施される遠心分離は、僅かに存在する外殻欠損細胞と、大多数の完全な外殻を有する細胞との間に存在する僅かな浮力の差に基づいて両者を分離するのに適した条件で行われる。また、当該遠心分離の条件は、細胞にダメージを与えない範囲内で設定される。本発明の方法における遠心分離は、好ましくは、８０×ｇ〜２００×ｇ、５分〜６０分間、室温で行われる。また、当該遠心分離工程は、外殻欠損細胞の純度又は収量を増大させるために、２回以上反復して行われてもよい。
【００４０】
外殻欠損細胞の出現頻度は、対数増殖期には非常に少なく、定常期には比較的頻繁になる傾向が見られる（データ示さず）。定常期の初期から中期（日齢３０〜５０日）の培養物を用いることを推奨する。斯かる期間において、外殻欠損細胞の収率と生存率が相対的に高いからである。
【００４１】
２．２．核酸導入処理
本発明の核酸導入手段において、マルチパルスエレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。当該方法は、任意の核酸を添加した細胞懸濁液に、数千Ｖ／ｃｍの高電圧を数十マイクロ秒のパルスで与えて細胞に核酸を導入するもので、高電圧パルスにより細胞膜に短時間、細孔が生じ、それが修復される前に外液とともにＤＮＡが取り込まれるという原理に基づく。他の遺伝子導入法と比べて再現性が良い点、導入効率が高い点、及び動物細胞、高等植物、真菌、細菌等、様々な種類の細胞に適用できる点で優れている。また、当該方法は、細胞壁を有する藻類細胞で非常に有効であることも報告されている（Ｙａｍａｎｏ他、２０１３年；Ｍｉｙａｈａｒａ他、２０１３年）。エレクトロポレーション法は、リン酸カルシウム法、リポソフェクション、パーティクルガン法やＤＥＡＥデキストラン法と並び細胞に核酸を導入するための当該技術分野においてありふれた技術の一つである。従って、当業者は、使用される核酸や細胞の種類、実験の目的に応じて、処理手順や試薬の構成及び用量等の最適な条件を決定することが出来る。
【００４２】
本発明の核酸導入方法におけるエレクトロポレーションにおいて、哺乳動物のエレクトロポレーション実験で通常用いられている緩衝液をボトリオコッカス・ブラウニーに適合するように適宜改変したエレクトロポレーション用緩衝液（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ他、２００１年；Ｆｌａｎａｇａｎ他、２０１１年、２０１２年；Ｈｅｌｌｅｄｉｅ他、２００８年）が使用される。当該改変エレクトロポレーション緩衝液のベースとして、ＰＢＳやＨＥＰＥＳ等の生化学分野で通常用いられる緩衝液や、様々な細胞培養培地が使用され得る。好ましくは、当該ベースとして、フェノールレッド不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）が用いられる。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍは、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａを改変したもので、ＨＥＰＥＳ及び重炭酸ナトリウムにより緩衝され、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、微量元素及び増殖因子が添加されたものである。より好ましくは、当該改変エレクトロポレーション用緩衝液は、マンニトール、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を添加したフェノールレッド不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍである。一層好ましくは、当該改変エレクトロポレーション用緩衝液は、０．３Ｍのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含有する１容のＭａｎ−ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２溶液を２容のフェノールレッド不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍに添加して調製される。
【００４３】
ボトリオコッカス・ブラウニーの外殻欠損細胞に対して他のさまざまな遺伝子形質転換手法（例えば他の藻種で成果を挙げている微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）やアグロバクテリウムを媒介とした形質転換（Ｈａｌｌｍａｎｎ、２００７年）を用いることも検討している。
【実施例】
【００４４】
藻類の材料と増殖
ボトリオコッカス・ブラウニーＢＯＴ−２２株（ｔｓｕｋｕｂａ−１、受託番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１４４１、受託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構国際特許生物寄託センター）を、２５℃のＡＦ−６培地の中で、濾過した空気を吹き込みながら連続的白色蛍光のもとで無菌培養した。光合成フォトン束密度（ＰＰＦＤ）は、量子計測器（ＬＩ−１０００、Ｌｉ−Ｃｏｒ、Ｌｉｎｃｏｌｎ社、ネブラスカ州、アメリカ合衆国）を用いて測定すると７０モル・フォトン／ｍ２秒であった。ボトリオコッカス・ブラウニーは比較的増殖が遅く、倍化時間は約１週間であるため、培養は、１ヶ月に２回培養物１００ｍｌを新鮮な培地２５０ｍｌに継代することによって対数増殖期の状態で維持した。外殻欠損細胞を単離する時には、培養を定常期の状態にした（日齢３０〜５０日）。
【００４５】
外殻欠損細胞の単離
ＢＯＴ−２２株の培養物（０．１〜１０ｌ）を１６時間以上静置した後、沈殿した細胞を５０ｍｌのピペットを用いて回収し、５０ｍｌの注射器に取り付けた５μｍのフィルタを用いて濃縮し、１Ｍのショ糖を含有するＢＯＴ培地２０ｍｌの中に再度懸濁させ、２５℃、１００×ｇ、４５分間遠心分離した。沈殿した細胞を新しいチューブに移し、細胞とともに移した少量の上清の中に再度懸濁させた。この細胞懸濁液を１．５ｍｌの複数のチューブに分け、２５℃、１００×ｇ、４５分間遠心分離した。その後、すべてのチューブから沈殿した細胞を０．６ｍｌのチューブに移し、移した上清の中で再度懸濁させ、２５℃、１００×ｇ、５分間遠心分離した。遠心分離を経て分離・沈殿した外殻欠損細胞を、その後の実験で使用した。以上の操作は全て無菌条件で実施した。
【００４６】
ナイルレッド染色
ナイルレッドのエタノール溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を上記藻類懸濁液及び単離処理前の群体懸濁液に添加し、最終濃度を１μｇ／ｍｌにした。室温で３０分間インキュベーションした後、明視野画像及び４８８ｎｍ励起によるナイルレッド蛍光の緑色帯域画像を、顕微鏡下で撮像した（ＢＸ  ５１；オリンパス工業株式会社、新宿区、東京、日本）。
【００４７】
プラスミドＤＮＡの精製
ＧＵＳ遺伝子が動作可能に組み込まれた植物形質転換用レポータープラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｒｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、マウンテン・ヴュー、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）を増殖させ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）が記載している塩化セシウム勾配法で精製した。当該プラスミドは、エレクトロポレーションにおいて最終濃度３７．５μｇ／ｍｌに希釈して使用される。当該プラスミドの最終濃度は具体的な実験条件に依存して変動し得て、導入効率が多少低くなる可能性があるが、最終濃度を０．５μｇ／ｍｌ程度まで下げてエレクトロポレーションを行ってもよい。
【００４８】
エレクトロポレーション
０．３Ｍのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含有する１容のＭａｎ−ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２溶液を２容のフェノールレッド不含Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールズバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）に添加して調製したエレクトロポレーション用緩衝液４０μｌに、外殻欠損細胞（１〜５μｌ）を再度懸濁させた。前記プラスミドｐＢＩ２２１を最終濃度３７．５μｇ／ｍｌで添加した後、細胞懸濁液を０．２ｃｍ−ギャップエレクトロポレーション用キュベットの中に注入した。ＮＥＰＡ２１（ネッパジーン株式会社、市川市、千葉、日本）を用いてエレクトロポレーションを実施した。そのときの設定は以下の通りである：減衰率４０％、＋の極性設定、最初のパルスの電圧１８０Ｖにして５ミリ秒のパルスを５０ミリ秒の間隔で３回発生させる穿孔パルスセットの後、減衰率４０％、＋／−の極性設定、最初のパルスの電圧２０Ｖにして５０ミリ秒のパルスを５０ミリ秒の間隔で５回発生させるトランスファーパルスセットが続く。設定範囲はエレクトロポレーションにおいて許容されるものである。当該実験において検討されたエレクトロポレーションの条件を、下記表に示す。
【表１】
2015181402.tif 000003
【００４９】
エレクトロポレーションの後、細胞を２００μｌの増殖培地とともに０．６ｍｌのチューブに移し、増殖チャンバー中４０マイクロモル光子／ｍ２秒となる連続光下でインキュベートした後、ＧＵＳアッセイを実施した。最後の顕微鏡による観察を除いて操作は全て無菌条件で実施した。
【００５０】
ＧＵＳ組織化学染色
ＭａｔｈｕｒとＫｏｎｃｚら（１９９８年）が記載している方法をわずかに改変し、ＧＵＳ発現の組織化学分析を実施した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）シクロヘキシルアンモニウム塩を０．４ｍｇ／μｌの割合でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶かした溶液０．２５μｌを１００μｌの細胞懸濁液に添加した。増殖チャンバー中４０マイクロモル光子／ｍ２秒となる連続光下で１週間にわたってインキュベートした後、青色のＸ−Ｇｌｕｃ分解産物で染色された細胞を、デジタルカメラ（ＤＰ５０；オリンパス工業株式会社、新宿区、東京、日本）を備えた顕微鏡（ＢＸ５１；オリンパス工業株式会社、新宿区、東京、日本）で写真撮影した。最後の顕微鏡による観察を除いて操作は全て無菌条件で実施した。
【００５１】
ｐＢＩ２２１が導入されてＧＵＳが発現した細胞は、図２に示したように、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）シクロヘキシルアンモニウム塩を分解して青色を呈する。この青色を呈した細胞の割合をもって本発明の方法の遺伝子導入効率とした。上記表１の導入効率の欄に示したように、本発明の方法によりボトリオコッカス・ブラウニーへのプラスミド導入が確認され、推奨されるエレクトロポレーション設定（条件＃１、２、３）下では、導入効率はほぼ１００％に達する。また、生存率の欄に示したように、本発明の方法は、細胞を殆ど殺傷せずに核酸を導入することが出来る。エレクトロポレーションが低ダメージで高効率な遺伝子導入を可能とすることは周知である（Ｍａｔｓｕｄａ及びＣｅｐｋｏ、２００４年；Ｓａｉｔｏ、２００６年；Ｙｏｏら、２００７年；Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏら；２００１年）が、同方法を利用して従来遺伝子導入が不可能と考えられていたボトリオコッカス・ブラウニーにおいても同様に優秀な導入効率を達成出来たことは、本発明者らが初めて達成した驚異的な成果である。
【００５２】
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【図１】
2015181402.tif 000004
【図２】
2015181402.tif 000005