(57)【要約】【課題】生体への安全性が高く、かつ安価な概日リズム改善剤を提供すること。【解決手段】次の（ａ）乃至（ｃ）の理化学的性質を有するカゼイン加水分解物を有効成分とする概日リズム改善剤：（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８０質量％以上、（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１質量％未満、（ｃ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が１０質量％未満。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）乃至（ｃ）の理化学的性質を有するカゼイン加水分解物を有効成分とする概日リズム改善剤：
（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８０質量％以上、
（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１質量％未満、
（ｃ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が１０質量％未満。
【請求項２】
前記概日リズム改善が、睡眠・覚醒リズム障害の改善及び／又は過眠障害の改善である請求項１に記載の概日リズム改善剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の概日リズム改善剤を含む、概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、概日リズム改善剤に関する。より詳しくは、カゼイン加水分解物を有効成分とする概日リズム改善剤及び該概日リズム改善剤を用いた概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間の周期で変動する生理現象である。概日リズムは、脳波、ホルモン分泌、細胞の再生等の生命活動にも存在しており、睡眠及び摂食のパターン決定において重要な役割を果たしている。概日リズム障害により、例えば、睡眠・覚醒リズム障害、過眠障害、自律神経失調症及び内分泌障害等の様々な変調が引き起こされる。
【０００３】
例えば、睡眠相後進症候群（Delayed Sleep Phase Syndrome、以下「ＤＳＰＳ」とする）は、概日リズム障害に起因する睡眠・覚醒リズム障害として知られている（非特許文献１）。ＤＳＰＳの症状としては、慢性不眠症と過度の日中の眠気等であり、仕事、社会生活、気分及び学習等に多大な影響を及ぼす（非特許文献２）。
【０００４】
また、ほぼ全ての哺乳類で、生理学的及び行動学的な概日リズムは体内時計により調節されていることが明らかとなっている（非特許文献３）。
【０００５】
さらに、体内時計のリズム異常は、ブルーライトへの暴露、ストレス等により誘導されることが知られている（非特許文献４及び５）。
また、体内時計のリズム異常は、ジェットラグ、肥満等によっても誘導され、かつ、肥満によりジェットラグ等による体内時計のリズム異常が促進されることも知られている（非特許文献６及び７）。
【０００６】
このような観点から、体内時計のリズム異常に効果のある物質は、極めて有用である。これまでに体内時計のリズム異常に効果のある物質として、いくつかの物質が報告されている。例えば、カロテノイドの一種である、クリプトキサンチン、フコキサンチン等が報告されている（例えば、特許文献１及び２）。また、ステロイドホルモンの一種であるプロゲステロンも報告されている（例えば、特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−８４１９２号公報
【特許文献２】特開２０１３−１３３２９５号公報
【特許文献３】特開２０１０−７７０８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Regestein, Q.R. et al., General hospital psychiatry 17, 335-345 （1995）
【非特許文献２】Czeisler, C.A. et al., Sleep, 4, 1-21 （1981）
【非特許文献３】Pando, M.P. et al., Sci STKE, 107, re16 （2001）
【非特許文献４】Berson D.M. et al., Science, 295, 1070-1073 （2002）
【非特許文献５】Stewart K.T. et al., Physiol. Behav., 48, 149-155 （1990）
【非特許文献６】Kohsaka A. et al., Cell Metabolism, 6, 414-421 （2007）
【非特許文献７】Mendoza J. et al., J Physiol., 586, 5901-5910 （2008）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、体内時計のリズム異常に効果のある物質として、これまでに多くの研究が行われている。報告されている物質としては、植物由来の抽出成分の他、化学合成等の人工的な方法で合成された薬品等もあり、安全性や効果の観点からは、更なる開発が望まれているのが実情である。
【００１０】
そこで、本技術は、生体への安全性が高く、かつ安価な概日リズム改善剤を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、乳由来の成分であるカゼイン加水分解物が、良好な概日リズム改善効果を有することを見出し、本技術を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本技術は、次の（ａ）乃至（ｃ）の理化学的性質を有するカゼイン加水分解物を有効成分とする、概日リズム改善剤である。
（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８０質量％以上、
（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１質量％未満、
（ｃ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が１０質量％未満。
本技術に係る概日リズム改善剤は、これまで体内時計のリズム異常に効果のある物質としては知られていなかった乳由来の成分であるカゼイン加水分解物を有効成分とすることを特徴とする。
本技術に係る概日リズム改善剤は、睡眠・覚醒リズム障害の改善及び／又は過眠障害の改善を目的として用いることができる。また、本技術は、本技術に係る概日リズム改善剤を含む、概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療薬も提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本技術によれば、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を概日リズム改善剤の有効成分とするため、生体への安全性が高く、かつ安価な概日リズム改善剤を提供することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】通常食を摂取したマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。
【図２】高脂肪食を摂取したマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。
【図３】図１及び図２のマウスの輪回し行動の日内リズムを数値化したグラフである。
【図４】高脂肪食を摂取し続け、体内時計リズムが異常なままのマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。
【図５】通常食に切替えたマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。
【図６】通常食＋０．２５％カゼインに切替えたマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。
【図７】通常食＋０．２５％カゼイン加水分解物に切替えたマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。
【図８】図４〜７のマウスの輪回し行動の日内リズムを数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１６】
＜１．概日リズム改善剤＞
本技術に係る概日リズム改善剤は、乳由来の成分であるカゼイン加水分解物を有効成分とすることを特徴とする。
【００１７】
（１）カゼイン加水分解物
原料であるカゼインは、乳由来の蛋白質を主成分とするものであり、該カゼインは特に限定されないが、例えば、市販の各種カゼイン、カゼイネート等が利用することができる。より具体的には、乳酸カゼイン、硫酸カゼイン、塩酸カゼイン、ナトリウムカゼイネート、カリウムカゼイネート、カルシウムカゼイネート、マグネシウムカゼイネート又はこれらの任意の混合物等が挙げられる。また、牛乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳から常法により精製したカゼイン等を利用することもできる。
【００１８】
本技術の有効成分であるカゼイン加水分解物は、生体材料として比較的安価な乳由来の原料であるカゼインを加水分解することにより製造されるため、安定して簡便に、しかも大量に製造することができる。
【００１９】
（２）カゼイン加水分解物の製造方法
カゼイン加水分解物の製造方法は特に限定されないが、蛋白分解酵素等の酵素を用いて製造する方法等が挙げられる。以下、蛋白分解酵素を用いて、カゼイン加水分解物を製造する方法について、具体的に説明する。
【００２０】
まず、原料（カゼイン）を水に分散し溶解させる。
該溶解液の濃度は特に限定されないが、通常、蛋白質換算で５〜１５質量％前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から好ましい。
【００２１】
次に、溶解液のｐＨを、使用する蛋白分解酵素の至適ｐＨ付近に調整することにより原料水溶液を調製する。具体的には、溶解液のｐＨを、アルカリ溶液を用いて、多くの蛋白質分解酵素の至適ｐＨがその範囲内に含まれるｐＨ７〜１０に調整することが好ましい。
ｐＨ調整に用いるアルカリ剤は特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等が挙げられる。
【００２２】
次に、調製した原料水溶液に蛋白質分解酵素を添加する。
蛋白質分解酵素としては、細菌由来、動物由来、植物由来の蛋白質分解酵素等があり、いずれのものも使用することができる。
【００２３】
細菌由来の蛋白質分解酵素は特に限定されないが、例えば、バシラス属由来のエンドプロテアーゼとして、アルカラーゼ（ノボザイムズ社製）、ニュートラーゼ（ノボザイムズ社製）、プロチンＡ（大和化成社製）、プロチンＰ（大和化成社製）、プロレザー（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）、コロラーゼ７０８９（樋口商会社製）、ビオプラーゼ（ナガセケムテック社製）、オリエンターゼ９０Ｎ（エイチビイアイ社製）、オリエンターゼ２２ＢＦ（エイチビイアイ社製）等が挙げられる。
動物由来の蛋白質分解酵素は特に限定されないが、例えば、トリプシンを主成分とするＰＴＮ（ノボザイムズ社製）、トリプシンＶ（日本バイオコン社製）等が挙げられる。
植物由来の蛋白質分解酵素は特に限定されないが、パパイン（天野エンザイム社製）、ブロメライン（天野エンザイム社製）等が挙げられる。
また、上述した蛋白質分解酵素は、単独又は２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２４】
蛋白質分解酵素は、４〜１０℃の冷水に分散し、溶解して使用することが好ましい。該蛋白質分解酵素の溶解液の濃度は特に限定されないが、通常、酵素濃度が３〜１０％程度となる量で使用することが効率性及び操作性の点から望ましい。
【００２５】
カゼイン加水分解に用いる蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度、及び反応時間等により異なるが、一般的には、カゼインの蛋白質換算質量１ｇ当たり１０００〜２００００単位（活性単位）の割合を望ましい態様として挙げられる。
【００２６】
蛋白質分解酵素の活性単位は、使用する蛋白質分解酵素の種類に応じて測定することができる。
【００２７】
蛋白質分解酵素の添加に当たっては、１種類ずつ溶解し、添加することが望ましいが、添加の順番は特に制限されない。
【００２８】
酵素反応中、反応系の温度は特に限定されず、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供され得る範囲から選ばれ、通常３０〜６０℃の範囲から選ばれる。
反応継続時間は、反応温度、初発ｐＨ等の反応条件によって進行状態が異なり、例えば、酵素反応の反応継続時間を一定とすると製造バッチ毎に異なる理化学的性質を有する分解物が生じる可能性等の問題があるため、一該に決定することができない。したがって、酵素反応をモニターすることにより、カゼイン加水分解物の理化学的性質が所望の値となるように反応継続時間を決定する。
【００２９】
ここで、本技術に係るカゼイン加水分解物は、（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８０質量％以上及び（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１質量％未満であることを特徴とする。そのため、本技術においては、加水分解の程度を、加水分解に伴って発生する不溶物を濾過により除去した後の濾液中に含まれるカゼイン加水分解物が、（ａ）及び（ｂ）の条件を満たすように、反応温度、反応継続時間等の反応条件を決定する。
【００３０】
なお、酵素反応のモニタリング方法としては、例えば、前記反応溶液の一部を採取し、蛋白質の分解率等を測定する方法等が挙げられる。
【００３１】
次に、酵素反応を停止させる。
酵素反応の停止は、加水分解液中の酵素を失活させることにより行われる。失活処理は、常法、例えば、加熱失活処理等により実施することができる。
加熱失活処理の条件（加熱温度、加熱時間等）は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができ、例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。
【００３２】
酵素反応停止後、得られた加水分解失活液を、（ａ）濾過、（ｂ）精密濾過、限外濾過膜等の膜分離処理及び（ｃ）樹脂吸着分離からなる群から選択される、いずれか１種又はこれらの２種以上の組合せによって精製することが好ましい。
【００３３】
上述した精製を行うことにより、当該失活液中に含まれる不溶物の除去、脂肪や乳糖、その他の不要な成分の低減等を行うことができる。その結果、溶液状態で透明であり、かつ、溶液状態での長期保存においても混濁、沈殿、凝集及び褐変等が生じない、いわゆる保存安定性に優れたカゼイン加水分解物を得ることができる。
【００３４】
また、上述した精製を行うことにより、本技術に係るカゼイン加水分解物の風味、外観等も向上させることができる。
【００３５】
（ａ）の濾過は、公知の方法により実施することができ、例えば、珪藻土を用い、公知の装置により実施することができる。
濾過を行うことにより、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００３６】
（ｂ）の膜分離処理は、公知の装置を用いて行うことができる。公知の装置としては特に限定されないが、例えば、精密濾過モジュール等、限外濾過モジュールＳＥＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量３，０００）、ＳＩＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量６，０００）、ＳＬＰ１０５３（旭化成社製、分画分子量１０，０００）等が挙げられる。
この場合、膜分離処理後の膜透過画分としてカゼイン加水分解物を含有する溶液が得られる。
膜分離処理を行うことにより、（１）の濾過と同様、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００３７】
（ｃ）の樹脂吸着分離は、公知の方法により実施することができ、例えば、樹脂をカラムに充填し、前記加水分解失活液を、当該カラムを通過させることにより実施することができる。樹脂としては特に限定されないが、例えば、商品名：ダイヤイオン、セパビーズ（三菱化学社製）、アンバーライトＸＡＤ（オルガノ社製）、ＫＳ−３５（味の素ファインテクノ社製）等が挙げられる。
樹脂吸着分離は、これらの樹脂をカラムに充填して前記加水分解失活液を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記加水分解失活液中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、加水分解失活液と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。
加水分解失活液中には、保存期間中に混濁、沈殿、凝集及び褐変等を惹起する因子（例えば、疎水性アミノ酸を多く含むペプチド等）が残存している可能性があり、樹脂吸着分離を行うことにより、これらの因子を除去できる。
【００３８】
また、精製後、得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液を殺菌してもよい。
殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。
加熱処理時の加熱温度と保持時間は、充分に殺菌できる条件を適宜設定すればよく、例えば、７０〜１４０℃で２秒間〜３０分間加熱処理することにより殺菌できる。
加熱殺菌の方式は、バッチ方式、連続方式のいずれの方式も可能であり、連続方式においてもプレート熱交換方式、インフュージョン方式、インジェクション方式等の方式を用いることができる。
【００３９】
さらに、得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、該溶液を公知の方法により、濃縮した濃縮液として使用することもできる。また、該濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末にして使用することもできる。
【００４０】
加えて、本技術のカゼイン加水分解物の前記不溶物の成分を除去した後、風味改善又は物性改善等を目的として、エンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼを添加して、二次的な加水分解を行い、以後の処理を行うこともできる。
【００４１】
（３）遊離アミノ酸の質量合計の割合
本技術に係るカゼイン加水分解物は、上述した（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８０質量％以上、及び（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１質量％未満であることに加え、（ｃ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が１０質量％未満であることを特徴としている。本技術において、遊離アミノ酸の質量合計の割合は、例えば、以下の手順で求めることができる。
【００４２】
（ａ）アミノ酸組成の測定
トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及びメチオニンについては、過ギ酸処理後、６Ｎ塩酸で１１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析機（日立製作所製、８３５型）により分析し、アミノ酸の質量を測定する。
なお、この方法では、試料のグルタミンとグルタミン酸の量は、両者を合わせた合計量であるグルタミン酸分析値として定量される。
【００４３】
（ｂ）遊離アミノ酸の質量合計の割合の算定
試料中の各アミノ酸組成を前記（ａ）の方法により測定し、これを合計して試料中の全アミノ酸の質量を算出する。次いで、スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、残留する各遊離アミノ酸の質量を前記（ａ）の方法により測定し、これを合計して試料中の全遊離アミノ酸の質量を算出する。これらの値から、試料中の遊離アミノ酸の質量合計の割合を次式により算出する。
【００４４】
【数１】
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【００４５】
遊離アミノ酸の質量合計の割合は、カゼインを加水分解させる際の酵素の種類、酵素の添加量、反応時間、及び／又は加水分解後の精製条件（膜分離、樹脂吸着分離）等により調整することができる。
【００４６】
（４）概日リズム改善剤の特徴及び効果
以上のようにして得られた、本技術で用いるカゼイン加水分解物は、後述する実施例からも明らかなように、次の（ａ）乃至（ｃ）の理化学的性質を有している。
（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８０質量％以上、
（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率が１質量％未満、
（ｃ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が１０質量％未満。
【００４７】
本技術で用いるカゼイン加水分解物は、十分な分解率で分子量１０００ダルトンを越えるペプチドを低減し、（ａ）分子量１０００ダルトン以下の画分の比率を８０質量％以上、及び（ｂ）分子量３５００ダルトン以上の画分の比率を１質量％未満、とすることにより、腸管からの消化吸収性に優れている。そのため、このカゼイン加水分解物を有効成分として用いた概日リズム改善剤は、その概日リズム改善効果が優れている。
【００４８】
また、本技術で用いるカゼイン加水分解物は、アミノ酸の遊離を抑制し、（ｃ）カゼイン加水分解物に含まれる全アミノ酸の質量合計に占める遊離アミノ酸の質量合計の割合が１０質量％未満であるため、遊離アミノ酸に由来する不快味を抑え、風味がほとんど無味無臭である。そのため、該カゼイン加水分解物を有効成分とする概日リズム改善剤は、様々な医薬品、飲食品、飼料等に配合して使用することができる。
【００４９】
本技術に係る概日リズム改善剤は、睡眠・覚醒リズム障害の改善及び／又は過眠障害の改善を目的として用いることができる。「睡眠・覚醒リズム障害」とは、概日リズム障害に起因する障害の一つであって、具体的には、上述したＤＳＰＳ、睡眠相前進症候群（Advanced sleep phase syndrome）等が挙げられる。また、「過眠障害」も、概日リズム障害に起因する障害の一つであって、具体的には、反復性過眠症、周期性傾眠症、クライン・レビン症候群、ナルコレプシー等が挙げられる。
【００５０】
また、本技術に係る概日リズム改善剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等に応じて適宜設定することができる。
【００５１】
以上説明した本技術に係る概日リズム改善剤は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、生体への安全性が高い。そのため、副作用や依存性が生じる等の危険性がなく、長期間、連続的に摂取することが可能である。
【００５２】
また、本技術に係る概日リズム改善剤の有効成分であるカゼイン加水分解物は、生体材料として比較的安価な乳由来の原料から安定して簡便に、しかも大量に製造することができるので、概日リズム改善剤を安価に提供することが可能である。そのため、費用負担の面からも、長期間に渡って継続して摂取することが容易な概日リズム改善剤を提供することができる。
【００５３】
＜２．概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療薬＞
上述した通り、本技術に係る概日リズム改善剤の有効成分であるカゼイン加水分解物は、腸管からの消化吸収性に優れ、風味がほとんど無味無臭であって、かつ、後述するように概日リズム改善効果を有するため、概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療のためのヒト若しくは動物用の医薬品として用いることができる。
【００５４】
また、本技術に係る概日リズム改善剤は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、種々の疾患を罹患した患者に対しても安心して投与できる可能性が高い。また、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ない。更に、他の薬剤との併用においても安全性が高い。
【００５５】
本技術に係る概日リズム改善剤を医薬品に利用する場合、該医薬品は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。非経口投与としては、例えば、静注、直腸投与、吸入等が挙げられる。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、顆粒剤、酸剤、軟膏等が挙げられる。
【００５６】
また、製剤化に際しては、本技術に係るカゼイン加水分解物の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、本技術に係る概日リズム改善剤を含有しているものであれば、公知の又は将来的に見出される概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療の効果を有する成分を、本技術に係る概日リズム改善剤と併用することもできる。
【００５７】
さらに、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、噴霧剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤等に製剤化することができる。
【００５８】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるカゼイン加水分解物のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００５９】
なお、製剤担体を配合する場合、概日リズム改善剤の有効成分であるカゼイン加水分解物の含有量は特に限定されず、剤形に合わせて一日あたりの摂取量又は投与量に基づいて適宜選択することができる。なお、当該カゼイン加水分解物の一日の摂取量又は投与量は、１００ｍｇ／日〜５ｇ／日の範囲であることが好ましい。
【００６０】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体を用いることができる。固形製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００６１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００６２】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００６３】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００６４】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００６５】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００６６】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００６７】
＜飲食品、飼料＞
上述した通り、本技術に係る概日リズム改善剤の有効成分であるカゼイン加水分解物は、腸管からの消化吸収性に優れ、風味がほとんど無味無臭であって、かつ、後述するように概日リズム改善効果を有するため、概日リズム障害に起因した疾患の予防又は治療のためのヒト若しくは動物用の飲食品、飼料等の有効成分としてこれらに配合して使用することができる。
【００６８】
（１）飲食品
本技術に係る概日リズム改善剤を飲食品に利用する場合、公知の飲食品に添加して概日リズム改善効果を有する飲食品を調製することもできるし、飲食品の原料中混合して概日リズム改善効果を有する新たな飲食品を製造することもできる。
【００６９】
前記飲食品は、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、飲料、これら以外の市販品等が挙げられる。
【００７０】
小麦粉製品としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
【００７１】
また、本技術で定義される飲食品は、概日リズム障害の予防又は治療用との保健用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
【００７２】
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００７３】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００７４】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
【００７５】
なお、飲食品を製造する際に添加する概日リズム改善剤の有効成分であるカゼイン加水分解物の含有量は特に限定されず、一日あたりの摂取量に基づいて適宜選択することができる。なお、当該カゼイン加水分解物の一日の摂取量は、１００ｍｇ／日〜５ｇ／日の範囲であることが好ましい。
【００７６】
（２）飼料
本技術に係る概日リズム改善剤を飼料に利用する場合、公知の飼料に添加して概日リズム改善効果を有する飼料を調製することもできるし、飼料の原料中混合して概日リズム改善効果を有する新たな飼料を製造することもできる。
【００７７】
前記飼料の原料としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。また、前記飼料の形態としては、例えば、愛玩動物用飼料（ペットフード等）、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００７８】
なお、飼料を製造する際に添加する概日リズム改善剤の有効成分であるカゼイン加水分解物の含有量は特に限定されず、一日あたりの摂餌量に基づいて適宜選択することができる。なお、当該カゼイン加水分解物の一日の摂餌量、１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であることが好ましい。
【実施例１】
【００７９】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００８０】
実施例１では、本技術の有効成分であるカゼイン加水分解物を、２つの方法により製造した。
【００８１】
（１）製造例１
市販のカゼイン（ニュージーランドデイリーボード社製）１ｋｇに水９ｋｇを添加し、均一に分散させ、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、溶液のｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約１０％のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を８５℃で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．５に調整し、ビオプラ−ゼｓｐ−２０（長瀬生化学工業社製）１,００８,０００活性単位（蛋白質１ｇ当り１,２００活性単位）、プロテア−ゼＮ（天野製薬社製）１,６８０,０００活性単位（蛋白質１ｇ当り２,０００活性単位）及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボ・ノルディスク社製）５,８８０,０００活性単位（蛋白質１ｇ当り７,０００活性単位）を添加して加水分解反応を開始し、経時的に酵素反応を蛋白質の分解率によりモニターし、分解率が２４．１％に達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。この加水分解液に濾過助剤としてスタンダードスーパーセル（東京硅藻土社製）を添加し、吸引濾過し、次いで得られた濾過液をイオン交換樹脂［アンバ−ライトＸＡＤ−７（オルガノ社製）］に対して、ＳＶ（空間速度）＝２．５ｈ-1、温度１０℃の条件で接触処理し、得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液を常法により濃縮し、噴霧乾燥し、噴霧乾燥品（粉末状のカゼイン加水分解物）０．９０ｋｇを得た。
【００８２】
製造例１に示す方法により得られたカゼイン加水分解物は、分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８３．１％、３５００ダルトン以上の画分の比率が０．１％、遊離アミノ酸の質量合計の割合が６．７％、１ｇ中に含まれるトリプトファンが３．４ｍｇ及び透過率が９９．４％であった。また、該カゼイン加水分解物は、風味（匂い、呈味）は、ほとんど無味無臭であり、保存安定性（沈殿は無く、着色も無い。）に優れた物質であった。
【００８３】
（２）製造例２
市販のカゼインナトリウム（蛋白質含量８５％、ユニ−レ・フランス社製）１ｋｇに水９ｋｇを加え、よく攪拌混合し、カゼインナトリウムを完全に溶解し、濃度約１０％のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を８０℃で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．０に調整し、ブロメライン（天野製薬社製）１３,６００,０００活性単位（蛋白質１ｇ当り１６,０００活性単位）、ニュートラーゼ（ノボ・ノルディスク社製）１,７７０,０００活性単位（蛋白質１ｇ当り２,０００活性単位）及びプロテア−ゼＳ（天野製薬社製）１,０２０,０００活性単位（蛋白質１ｇ当り１,２００活性単位）を添加して加水分解反応を開始し、経時的に酵素反応を蛋白質の分解率によりモニターし、分解率が２５．６％に達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。この加水分解液をマイクローザＥＭＰ−３１３（孔径０．２５μｍ、旭化成社製）を用い、膜分離法（マイクロフィルトレーション）により、不溶物を濾過し、次いで得られた濾過液を疎水性樹脂［ＫＳ−３５（北越炭素社製）］に対して、該濾過液をＳＶ（空間速度）＝２ｈ−１、温度１０℃の条件で接触処理し、得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液を常法により濃縮し、噴霧乾燥し、噴霧乾燥品０．７４ｋｇ（粉末状のカゼイン加水分解物）を得た。
【００８４】
製造例２に示す方法により得られたカゼイン加水分解物は、分子量１０００ダルトン以下の画分の比率が８２．５％、３５００ダルトン以上の画分の比率が０．２％、遊離アミノ酸の質量合計の割合が５．３％、１ｇ中に含まれるトリプトファンが３．５ｍｇ及び透過率が９９．４％であった。また、該カゼイン加水分解物は、風味（匂い、呈味）は、ほとんど無味無臭であり、保存安定性（沈殿は無く、着色も無い。）に優れた物質であった。
【実施例２】
【００８５】
実施例２では、本技術に係る概日リズム改善剤の効果を検討した。
【００８６】
（１）高脂肪食によるマウスへの体内時計リズム異常の誘導
（ａ）試験方法
非特許文献６（Kohsaka A. et al., Cell Metabolism, 6, 414-421 （2007））の方法に従い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（５週齢♂、日本チャールスリバー社）に、脂質含量４５％fat／kcalの餌を摂取させ、体内時計リズム異常を誘導した。
【００８７】
（ｂ）試験結果
図１は、通常食（脂質含量１０％fat／kcal）を摂取したマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。また、図２は、高脂肪食（脂質含量４５％fat／kcal）を摂取したマウスの輪回し行動の日内リズムを示す図である。図１及び２において、マウスが回転カゴを回した回数を縦軸に表し、横軸は時間を表す。
【００８８】
マウスは、明期１２時間・暗期１２時間の明暗サイクル下にて飼育した。より具体的には、午前８時〜午後８時を明期、午後８時〜午前８時を暗期として明暗サイクルを設定した（図中上部黒白バー参照）。なお、この図１及び２の横軸は、２日分をプロットしている。行の左側のデータは、その上の行の右側の１日のデータと同じである。２日分をプロットすることで活動パターンが見えやすくなる。
【００８９】
（ｃ）考察
マウスは夜行性で、明暗周期下で飼育すると、一日の活動は暗期に集中する。図１に示すように、通常食で飼育している動物は、明期に休止し、暗期に活動する日内リズムがはっきりしていた。一方で、図２に示すように、高脂肪食で飼育している動物は、明期の行動量が増加し、かつ、暗期の行動量が減少することで明暗のメリハリが曖昧になり、日内リズムに異常が誘導されることが確認された。
【００９０】
下記表１に、図１及び図２のマウスの輪回し行動の日内リズムを数値化した表を示す。また、図３に、図１及び２のマウスの輪回し行動の日内リズムを数値化した表を示す。即ち、明期（休止期）の運動量を、一日の運動量で除した５匹／群の値の平均値で比較すると、高脂肪食摂取によって明期の運動量割合が有意に増加し、日内リズム異常が誘導されていることが明らかとなった。
【００９１】
【表１】
2015189672.tif 000003
【００９２】
（２）体内時計リズム異常マウスに対する本技術に係る概日リズム改善剤の効果の検討
（ａ）試験方法
上記（１）で示す通り、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（５週齢♂、日本チャールスリバー社）に、脂質含量４５％fat／kcalの餌を５ヶ月間摂取させることで日内リズム異常を誘導した。その後、餌を通常食、通常食＋０．２５％カゼイン、通常食＋０．２５％カゼイン加水分解物、にそれぞれ切替えた３群を設定した。また対象群として、そのまま高脂肪食の摂取を続けた群を１群設定し、計４群で比較した。
【００９３】
（ｂ）試験結果
図４は、高脂肪食を摂取し続け、体内時計リズムが異常なままのマウス、図５は、通常食に切替えたマウス、図６は、通常食＋０．２５％カゼインに切替えたマウス、図７は、通常食＋０．２５％カゼイン加水分解物に切替えたマウス、の輪回し行動の日内リズムを示す図である。図４〜７において、マウスが回転カゴを回した回数を縦軸に表し、横軸は時間を表す。
【００９４】
マウスは、明期１２時間・暗期１２時間の明暗サイクル下にて飼育した。より具体的には、午前８時〜午後８時を明期、午後８時〜午前８時を暗期として明暗サイクルを設定した（図中上部黒白バー参照）。なお、この図４〜７の横軸は、２日分をプロットしている。行の左側のデータは、その上の行の右側の１日のデータと同じである。２日分をプロットすることで活動パターンが見えやすくなる。
【００９５】
（ｃ）考察
図４に示すように、高脂肪食で飼育を継続した動物は明暗期のメリハリが曖昧であり、図５に示すように、通常食に切り替えることによって明暗期のメリハリが回復した。また、図６に示すように、通常食＋０．２５％のカゼインに切替えたマウスにおいても、通常食を摂取した動物と同様に、明暗期のメリハリが回復した。さらに、図７に示すように、通常食＋０．２５％カゼイン加水分解物に切替えたマウスでは、明暗期のメリハリが、より明確となった。
【００９６】
下記表２に、図４〜７のマウスの輪回し行動の日内リズムを数値化した表を示す。また、図８に、図４〜７のマウスの輪回し行動の日内リズムを数値化したグラフを示す。即ち、明期（休止期）の運動量を、一日の運動量で除した値の５匹／群の平均値で比較すると、高脂肪食摂取を継続した動物と比較して、途中通常食及び通常食＋０．２５％カゼインに切替えた動物では、明期運動量が低下し、明暗期の行動リズムにメリハリが誘導されたが、その差は有意ではなかった。その一方で、通常食＋０．２５％カゼイン加水分解物に切替えた動物では、明期の運動量割合がより低下し、高脂肪食摂取を継続した動物との差が有意となった。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
（３）まとめ
以上の結果から、本技術に係る概日リズム改善剤を投与することにより、マウスの活動期の運動量が向上し、かつ、休止期の運動量が低下することが明らかとなった。これらの効果は、概日リズム障害において見られる、睡眠・覚醒リズム障害の改善及び／又は過眠障害の改善に非常に有効であると考えられる。また、本技術に係る概日リズム改善剤を用いることで、概日リズム障害に起因した疾病の予防又は治療へも貢献可能と示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015189672.tif 000009
【図６】
2015189672.tif 000010
【図７】
2015189672.tif 000011
【図８】
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