(57)【要約】【課題】難水溶性物質が必須の細胞培養において、難水溶性物質が培地中で細胞培養に対して有効かつ適切に働き、よって、細胞毒性を与えることなく細胞培養に資することができる、難水溶性物質を含有する細胞培養用組成物及びそれを使用する細胞培養方法を提供する。【解決手段】難水溶性物質と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ステアリルメタクリレートとの共重合体（共重合体（Ａ））、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ラウリルメタクリレートとの共重合体（共重合体（Ｂ））、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物とを含有する細胞培養用組成物とする。また、当該難水溶性物質と、これらの共重合体を含有する細胞培養用組成物を、細胞培養用の培地に添加して細胞を培養する細胞培養方法とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
難水溶性物質と、共重合体（Ａ）、共重合体（Ｂ）、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物と、を含有し、
前記共重合体（Ａ）は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ステアリルメタクリレートとの共重合体であり、前記共重合体（Ｂ）は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ラウリルメタクリレートとの共重合体である、
細胞培養用組成物。
【請求項２】
前記共重合体（Ａ）及び（Ｂ）は、当該各共重合体中の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来部の組成比がいずれも１０〜９０モル％である、
請求項１に記載の細胞培養用組成物。
【請求項３】
前記共重合体（Ａ）及び（Ｂ）は、その重量平均分子量がいずれも５，０００〜１，０００，０００である、
請求項１又は２に記載の細胞培養用組成物。
【請求項４】
難水溶性物質と、共重合体（Ａ）、共重合体（Ｂ）、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物と、を含有する細胞培養用組成物を調製する工程と、
該細胞培養用組成物を細胞培養用の培地に添加して細胞を培養する工程と、を有し、
前記共重合体（Ａ）は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ステアリルメタクリレートとの共重合体であり、前記共重合体（Ｂ）は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ラウリルメタクリレートとの共重合体である、
細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難水溶性物質及び特定組成の共重合体を有する新規な細胞培養用組成物に関する。さらに、当該難水溶性物質及び特定組成の共重合体の混合物を、細胞培養用培地に添加して細胞を培養する細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外にて細胞を培養する技術は２０世紀初頭には見出されていたが、当時の技術では限られた種類の細胞しか培養することができなかった。しかし、近年の分子生物学や遺伝学、細胞生物学などの発展により、培養できる細胞の種類もニワトリやカエルの細胞から哺乳類の細胞へと拡大していった。これに伴い、数多くの生命現象が解明され、その現象を利用・応用することで、有用物質の生産や生体への影響を予測することができるようになった。これらの技術は医薬品開発・食品開発・化成品開発という幅広い分野で活用されており、必要不可欠な技術となっている。さらに胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の登場により、細胞培養に関する技術はさらに必要とされつつある。
【０００３】
一般的に細胞の培養は液体培地中にて行われる。培地にはグルコースやアミノ酸、無機塩類、ビタミンを中心とした各種栄養素が添加されており、培養する細胞種に合わせた培地が開発され、細胞培養に使用されている。現在ではＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０といった基礎培地が各社から販売されている。さらに、培養する細胞種に応じて、これらの基礎培地にウシ胎児血清や増殖因子、抗生物質などが添加され、細胞培養されている。
【０００４】
培地に添加されている大部分の成分（グルコース、アミノ酸、血清、増殖因子、抗生物質等）は水溶性であるため、容易に培地に添加して細胞培養することができる。しかし、脂肪酸類やステロイド類、脂溶性ビタミン類、一部の抗生物質といった難水溶性物質（疎水性物質）を培地に添加し、細胞培養しなければならない場合も多い。加えて、新規化合物の細胞毒性を評価する際、被検物質が培地に難溶である場合もある。
【０００５】
難水溶性物質を培地に添加して細胞培養する場合、エタノールやジメチルスルホキシドといった有機溶媒と混合し、その混合物を培地に添加して細胞培養する。この手法は難水溶性物質だけでなく、有機溶媒も培地に添加されてしまうため、有機溶媒自体の細胞毒性が懸念される。さらに、有機溶媒の種類によっては細胞分化を誘導することが知られている。
例えば、非特許文献１は、ジメチルスルホキシドがマウス胚性癌細胞（Ｐ１９細胞）の心筋への分化を促進することを開示している。また、非特許文献２は、ジメチルスルホキシドがＨＬ６０細胞の顆粒球への分化を促進することを開示している。
【０００６】
一方、有機溶媒以外に難水溶性物質を培地に添加して細胞培養する方法として、特許文献１は各種界面活性剤を使用する方法、特許文献２はシクロデキストリン等を使用する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2001-505058号公報
【特許文献２】特開2010-000088号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】CELL STRUCTURE AND FUNCTION １９９６，２１，１０１−１１０
【非特許文献２】THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE １９７９，１４９，９６９−９７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記界面活性剤やシクロデキストリン、ウシアルブミンなどを使用する方法は、被可溶化物である難水溶性物質の可溶化又は分散性が不十分であるという問題がある。
そこで、本発明の課題は、難水溶性物質が必須の細胞培養において、難水溶性物質が培地中で細胞培養に対して有効かつ適切に働き、よって、細胞毒性を与えることなく細胞培養に資することができる、難水溶性物質を含有する細胞培養用組成物及びそれを使用する細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、難水溶性物質が培地中で細胞培養に対して有効かつ適切に働くための、該難水溶性物質と特定組成の共重合体との混合物の開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、難水溶性物質と、下記共重合体（Ａ）、共重合体（Ｂ）、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物とを含有する細胞培養用組成物が提供される。また、当該難水溶性物質と、共重合体（Ａ）、共重合体（Ｂ）、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物と、を含有する細胞培養用組成物を、細胞培養用の培地に添加して細胞を培養する細胞培養方法が提供される。
ここで、共重合体（Ａ）は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ステアリルメタクリレートとの共重合体、共重合体（Ｂ）は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ラウリルメタクリレートとの共重合体である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細胞培養用組成物は、共重合体（Ａ）、共重合体（Ｂ）、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物を含むことにより、難水溶性物質が培地中で細胞培養に対して有効かつ適切に働き、よって、細胞毒性を与えることなく細胞を培養することができる。また、本発明の細胞培養方法によれば、細胞毒性を与えることなく細胞を培養することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の細胞培養用組成物は、難水溶性物質と、上記共重合体（Ａ）、共重合体（Ｂ）、又は共重合体（Ａ）及び(Ｂ)の混合物とを含有する。なお、以後、「細胞培養用組成物」と称した場合、特に断らない限り、当該本発明の細胞培養用組成物を指すものとする。
【００１４】
ここで、本発明において難水溶性物質は、第十六改正日本薬局方に記載される「やや溶けにくい」、「溶けにくい」、「極めて溶けにくい」、「ほとんど溶けない」のいずれに当てはまるものであってもよい。
なお、上記それぞれの難溶性は次の基準により判定される。すなわち、対象物が固形の場合は粉末とした後、水中に入れ、２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜて、３０分以内に溶ける度合を検討し、対象物１ｇ又は１ｍＬを溶かすのに要する水量が３０ｍＬ以上１００ｍＬ未満のものを「やや溶けにくい」、１００ｍＬ以上１，０００ｍＬ未満のものを「溶けにくい」、１，０００ｍＬ以上１０，０００ｍＬ未満のものを「極めて溶けにくい」、１０，０００ｍＬ以上のものを「ほとんど溶けない」とする。
【００１５】
本発明における、細胞培養に用いられる難水溶性物質の具体例としては、脂肪酸（リノール酸、リノレン酸など）やステロイド類（ハイドロコルチゾン、インドメタシンなど）、脂溶性ビタミン（トコフェロール、レチノール、βカロテンなど）、抗生物質（アンホテリシンＢ等）などを挙げることができる。
【００１６】
また、本発明の共重合体は、共重合体（Ａ）：２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ステアリルメタクリレートとの共重合体（以下、ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体と称する）と、共重合体（Ｂ）：２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ラウリルメタクリレートとの共重合体（以下、ＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体と称する）の２種類である。
ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体及びＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体は、各々、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単量体（以下、ＭＰＣと称する）とｎ−ステアリルメタクリレート単量体（以下、ＳＭＡと称する）、ＭＰＣとｎ−ラウリルメタクリレート単量体（以下、ＬＭＡと称する）、を溶液重合、乳化重合、懸濁重合等、公知の重合方法に従って重合することで得ることができる。
【００１７】
具体的な重合方法としては、例えば、溶液重合の場合、単量体組成物を低級アルコールなどの有機溶媒中に溶解し、窒素、アルゴン等不活性ガス雰囲気下、過酸化物やアゾ化合物等のラジカル重合開始剤を添加して加熱、攪拌することにより得ることができる。また、ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体及びＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体の形態としては、粉状、溶液状のいずれでもよいが、水に溶解した際には透明溶液状態がよい。
なお、これらの共重合体を精製する場合は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
【００１８】
本発明のＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体及びＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体は、いずれも、共重合体中のＭＰＣ由来部の組成比が１０〜９０モル％が好ましく、難水溶性物質との配合のし易さから３０〜９０％の範囲がより好ましい。当該組成比が１０モル％未満、又は９０モル％を超えると、難水溶性物質との均一な配合が困難となるおそれがある。
【００１９】
また、ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体及びＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体は、いずれも、その重量平均分子量が、５，０００以上が好ましく、また、１，０００，０００以下が好ましい。難水溶性物質との混合のし易さの点で、２００，０００以下がより好ましい。
なお、本発明の両共重合体はいずれも、本発明の効果が発揮される範囲内において、ＭＰＣ、ＳＭＡ及びＬＭＡ以外の単量体由来部を含む共重合体であってもよい。
【００２０】
さらに、ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体及びＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体は、いずれも、ランダム共重合体であってもよく、ブロック共重合体であってもよく、あるいは、ランダム部とブロック部が混在する共重合体であってもよい。また、交互共重合体部が存在してもよい。
以後、ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体、ＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体又は両共重合体の混合物を総称して、単に共重合体と称することもある。
【００２１】
難水溶性物質とこれら共重合体を含有する細胞培養用組成物は、取り扱い易さの点で、溶液、分散液等の液状が好ましく、安全性の点で水溶液又は水分散液が好ましい。なお、水分散液の場合、分散質は難水溶性物質の未溶解部分であり、共重合体は水に溶解していることが好ましい。しかし、共重合体の一部が水中に分散していてもよい。なお、下記に示すように、難水溶性物質とこれら共重合体の他に、緩衝剤等が溶液中に含有されていてもよい。緩衝剤等が含有される場合も、溶媒又は分散媒は水が好ましい。
【００２２】
細胞培養用組成物が水溶液等の溶液状形態の場合は、ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体、ＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体又はこの両者の混合物は、溶液中に０．１〜５．０重量％の範囲で含まれて入ることが好ましい。難水溶性物質との混合のし易さから、０．２５〜２．５重量％の範囲がより好ましい。また、難水溶性物質は、溶液中に０．０１〜５．０ｍｇ／ｍＬ含有されていることが好ましい。難水溶性物質の水等の溶媒への溶解性の点で０．１〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲がより好ましい。
なお、溶媒への溶解又は分散の順番は、難水溶性物質が先であっても、あるいは共重合体が先であってもよい。
【００２３】
細胞培養用組成物に使用する溶媒としては、水、あるいは難水溶性物質及び共重合体以外の、細胞培養に一般的に使用される成分を含んだ溶液、分散液等を使用できる。具体的には、純水、各種緩衝液（ダルベッコリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など）、生理食塩水、市販されている細胞培養用基礎培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）又は、１０体積％の動物血清（例えばウシ胎児血清、ウシ血清、ウマ血清など）を含む細胞培養用基礎培地から適宜選定することができる。細胞培養用培地に加えることを考慮すると、ダルベッコリン酸緩衝液や１０体積％の動物血清を含む細胞培養用基礎培地が好ましい。
【００２４】
次に、本発明の細胞培養方法について説明する。
本発明の細胞培養方法は、上記説明した細胞培養用組成物を培養する細胞の要求性に応じて細胞培養用の培地に添加し、得られた難水溶性物質が添加された培地を用いて、細胞を３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で培養する細胞培養方法である。本発明により、難水溶性物質が添加された細胞培養用培地を用い、細胞毒性を与えることなく、細胞を培養することができる。
【００２５】
本発明の細胞培養方法を用いて培養できる細胞はヒトやマウスといった哺乳類由来細胞である。また、それらの培養に用いる培地の種類は細胞が増殖−生存できるものであればいずれでもよい。例えば、市販されている細胞培養用基礎培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）、又はこれらの組み合わせであればいずれでもよい。さらに、細胞培養用基礎培地には目的とする細胞の要求性に応じて各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール等）や各種動物血清（ウシ胎児血清やウシ血清など）、血清代替物、抗生物質などを添加してもよい。
【００２６】
本発明の細胞培養方法を用いて細胞培養する場合、通常の培養に用いられる容器を用いることができる。例えば、ポリスチレン製マルチウェルプレートやシャーレ、培養フラスコ等を使用できる。
これら容器に培養する細胞と、その細胞に適した培地、上記各種増殖因子等、及び細胞培養用組成物を加え、温度および湿度、炭酸ガス濃度が制御されたインキュベーター内にて培養する。例えば、培養条件は細胞の種類によるが、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下での培養でよい。
【００２７】
以上説明した本発明の細胞培養方法を用いることで、細胞毒性を与えることなく、細胞を培養することができる。細胞毒性の抑制効果は、例えば、アラマーブルーアッセイ法、ＭＴＴアッセイ法、ニュートラルレッドアッセイ法、ＷＳＴ−８アッセイ法、血球計算盤による細胞数測定法などの細胞増殖判定法にて確認することができる。これらの中でも、アラマーブルーアッセイ法はその操作が簡便であるという点において、特に好ましい細胞毒性の抑制効果の確認方法である。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中の各種試験、測定は以下に示す方法に従って実施した。
【００２９】
＜アラマーブルーアッセイ法による細胞毒性試験＞
アラマーブルーアッセイ法は、動物細胞を中心とした細胞代謝を測定するために開発されたバイオアッセイ法の一つである。アラマーブルーは、その還元に細胞への取込みを必要とする酸化還元色素であり、ミトコンドリア内で行われている呼吸代謝系の還元反応により、酸化型（無蛍光・青色）から還元型（蛍光・赤色）に変化する性質を持つ。細胞代謝が正常であると還元反応が進行する一方、細胞増殖に異常をきたすと酸化型のままである。すなわち、細胞代謝が正常であれば、細胞数に比例して還元型色素量が増大していく。本発明では、培地中の蛍光強度（励起波長５３０ｎｍ〜５６０ｎｍ、検出波長５８０〜６００ｎｍ）を測定し、その蛍光強度から細胞毒性の有無を判断した。
具体的には、「有機溶媒と難水溶性物質との混合物」が添加された培地で細胞を培養した場合の蛍光強度を基準として、当該基準蛍光強度と、細胞培養用組成物で細胞培養した場合の蛍光強度を比較して判断する。ここで、アラマーブルーは細胞数が多いほど蛍光強度が高くなる。従って、上記基準蛍光強度より高い蛍光強度を示せば、細胞毒性抑制効果が高いと判断できる。
アラマーブルーアッセイ法に使用する試薬としては、市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製など）を用いることができる。
また、蛍光強度は、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用して測定した。
【００３０】
＜共重合体の重量平均分量＞
得られた共重合体５ｍｇを、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）１ｇへ溶解し、ＧＰＣにより重量平均分量を測定する。測定条件は以下の通りである。
装置：ＲＩ−８０２０（東ソー社製）、ＤＰ−８０２０（東ソー社製）、ＳＤ−８０２２（東ソー社製）、ＡＳ−８０２０（東ソー社製）、８６５−ＣＯ（ＪＡＳＣＯ社製）、カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（ＧＳＭ−７００又はＯＨｐａｋ  ＳＢ-８０２．５  ＨＱ）、移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）、標準物質：ポリエチレングリコール、検出：視差屈折率計ＲＩ−８０２０（東ソー社製）、重量平均分子量（Ｍｗ）の算出：分子量計プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）、流速１．０ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、試料溶液注入量：１００μＬ、測定時間：３０分間。
【００３１】
＜共重合体の元素分析＞
有機元素分析（２４００ＩＩ−ＣＨＮＳ／ｉアナライザー、パーキンエルマー社製）を使用して測定した。
【００３２】
以下に、本発明の細胞培養用組成物の成分であるＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体及びＭＰＣ−ＬＭＡ共重合体の合成例を示す。
合成例１
ＭＰＣとＳＭＡを、仕込みモル比で、ＭＰＣ／ＳＭＡ＝８／２とし、以下のようにしてＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体（共重合体１）を合成した。
ＭＰＣとＳＭＡの総濃度が１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように重合容器に秤量し、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）がモノマーに対して１ｍｏｌ％となるように加えた。なお、反応溶媒としてはエタノールを用いた。重合容器内を充分に窒素置換した後、２４時間６０℃に加温することにより重合反応を行なった。得られた反応混合物を氷冷した後、ジエチルエーテルに滴下することによりポリマーを沈殿させた。これを濾別し、ジエチルエーテルにて洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の共重合体１を得た。
得られた共重合体１について、上記方法で重量平均分子量（ポリエチレングリコール換算）を測定した。
さらに、共重合体１中の各単量体由来部の組成比（モル比）を元素分析で分析した結果、ほぼ仕込み組成比通りであった。得られた共重合体１を５重量％となるように純水に溶解し、保存した。合成例１の共重合体の分析結果等を表１に示す。
【００３３】
合成例２〜６
単量体（モノマー）種、単量体のモル比を表１に示した以外は、合成例１と同様にして各共重合体を合成し、さらに各分析を行った。結果を表１に示す。
なお、いずれの共重合体も、合成例１の共重合体と同様、元素分析による共重合体中の各単量体由来部の組成比（モル比）は、ほぼ仕込み組成比通りであった。従って、表１のモル比は、対応する単量体のモル比でもある。
【００３４】
比較合成例
単量体として、ＭＰＣ及びｎ−ブチルアクリレート（ＢＭＡ）を使用し、単量体のモル比を表１に示した以外は、合成例１と同様にして比較合成例として共重合体７を合成し、さらに各分析を行った。結果を表１に示す。また、共重合体７も、元素分析による共重合体中の各単量体由来部の組成比（モル比）は、ほぼ仕込み組成比通りであった。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
細胞毒性試験用ＴＩＧ細胞懸濁液
１０体積％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳとする）を含有したＭＥＭ培地（以下１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地）にてヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞ＴＩＧ−３−２０細胞（ＪＣＲＢ０５０６、以下ＴＩＧ細胞とする）を３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で培養し、トリプシン処理と遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、３分）にてＴＩＧ細胞を回収した。その後、血球計算盤を用いて細胞数を計算し、１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地に８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。以下、この細胞懸濁液をＴＩＧ細胞懸濁液とする。なお、ＴＩＧ細胞は集団倍化数（ＰＤＬ）が４５以下のものを使用した。
【００３７】
細胞毒性試験用正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液
正常ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清液体培地（クラボウ社製、FibroLife（登録商標） S2 Comp kit）を用いて、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（クラボウ社製、製品番号ＫＦ−４１０９）を３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内で培養し、トリプシン処理と遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、３分）にて正常ヒト皮膚繊維芽細胞を回収した。その後、血球計算盤を用いて細胞数を計算し、下記細胞毒性試験用繊維芽細胞用培地に８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。以下、この細胞懸濁液を正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液とする。
【００３８】
細胞毒性試験用繊維芽細胞用培地
正常ヒト皮膚繊維芽細胞用基礎培地（クラボウ社製FibroLife（登録商標） Basal Medium）にＬ−グルタミンを終濃度７．５ｍＭ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を終濃度５ｎｇ／ｍＬ、インスリンを終濃度５μｇ／ｍＬ、アスコルビン酸を終濃度５０μｇ／ｍＬ、ＦＢＳを終濃度２体積％となるように添加し、攪拌した。以下、これを繊維芽細胞用培地とする。
【００３９】
＜細胞毒性試験１＞
実施例１−１
以下のようにして、アラマーブルーアッセイ法による細胞毒性試験１を行い、実施例１−１の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
２ｍｇのアンホテリシンＢと、２．５重量％の共重合体１を含むダルベッコリン酸緩衝液（以下Ｄ−ＰＢＳ）１０ｇとを混合して３７℃で２０分間加熱した。アンホテリシンＢは共重合体１を含むＤ−ＰＢＳに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物２０μＬを、上記８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＴＩＧ細胞懸濁液２ｍＬに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用９６ウェルプレート（平底）に１００μＬ／ウェルで分注し、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて４日間培養した。培養４日目にアラマーブルーを１０μＬ／ウェル加え、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて３時間培養した後に蛍光強度（励起波長５５０ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ）を測定した。結果を表２に示す。
上記したように、アラマーブルーは細胞数が多いほど蛍光強度が高くなる。従って、より高い蛍光強度を示した方が、培養された細胞数が多い、すなわち細胞毒性抑制効果が高いことを示す。
【００４０】
実施例１−２〜１−２４
使用共重合体種及びＤ−ＰＢＳ中の共重合体濃度を表２に示すものとした以外は実施例１−１と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験１を実施した。結果を表２に示す。
【００４１】
比較例１−１
使用共重合体種及びＤ−ＰＢＳ中の共重合体濃度を表２に示すものとした以外は実施例１−１と同様にして、アンホテリシンＢと共重合体７を含む溶液組成物の調製を試みた。
しかし、共重合体７を含むＤ−ＰＢＳにはアンホテリシンＢは溶解しなかったため、ＴＩＧ細胞懸濁液に添加することができず、細胞毒性試験を実施できなかった。結果を表２に示す。
【００４２】
比較例１−２
１ｍｇのアンホテリシンＢを１０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した溶液を細胞培養用組成物の代わりに使用した以外は、実施例１−１と同様にして細胞毒性試験１を実施した。結果を表２に示す。なお、比較例１−２における蛍光強度を、細胞毒性試験１での基準蛍光強度とする。
【００４３】
実施例１−２５
以下のようにして細胞毒性試験１を行い、実施例１−２５の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
９．７５ｍＬの１０体積％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（以下、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭとする）に、２ｍｇのアンホテリシンＢを加え、十分に攪拌した。この溶液と０．２５ｇの共重合体１とを混合して３７℃で２０分間加熱した。アンホテリシンＢは共重合体１を含む１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物２０μＬを、上記８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＴＩＧ細胞懸濁液２ｍＬに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用９６ウェルプレート（平底）に１００μＬ／ウェルで分注し、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて４日間培養した。培養４日目にアラマーブルーを１０μＬ／ウェル加え、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて３時間培養した後に蛍光強度（励起波長５５０ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ）を測定した。結果を表３に示す。
【００４４】
実施例１−２６〜２８
共重合体１及び１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭの使用量を表３に示すものとした以外は実施例１−２５と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験１を実施した。結果を表３に示す。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
【表３】
2015119687.tif 000004
【００４７】
上記細胞毒性試験１の各実施例の細胞培養用組成物でＴＩＧ細胞を培養した場合、培養後のＴＩＧ細胞懸濁液は、比較例１−２の基準蛍光強度より高い蛍光強度を示した。
従って、各実施例の細胞培養用組成物でＴＩＧ細胞を培養することにより、比較例１−２に比較して細胞毒性を顕著に抑制してＴＩＧ細胞を培養できることが判る。
【００４８】
＜細胞毒性試験２＞
実施例２−１
以下のようにして、アラマーブルーアッセイ法による細胞毒性試験２を行い、実施例２−１の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
１５ｍｇのハイドロコルチゾンと、２．５重量％の共重合体１を含むＤ−ＰＢＳ１０ｇとを混合し、３７℃で２０分間加熱した。ハイドロコルチゾンは共重合体１を含むＤ−ＰＢＳに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物４μＬを、上記８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液２ｍＬに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用９６ウェルプレート（平底）に１００μＬ／ウェルで分注し、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて４日間培養した。培養４日目にアラマーブルーを１０μＬ／ウェル加え、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて３時間培養した後に蛍光強度（励起波長５５０ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ）を測定した。結果を表４に示す。
【００４９】
実施例２−２〜２−２４
使用共重合体種及びＤ−ＰＢＳ中の共重合体濃度を表４に示すものとした以外は実施例２−１と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験２を実施した。結果を表４に示す。
【００５０】
比較例２−１
使用共重合体種及びＤ−ＰＢＳ中の共重合体濃度を表２に示すものとした以外は実施例２−１と同様にして、ハイドロコルチゾンと共重合体７を含む溶液組成物の調製を試みた。
しかし、共重合体７を含むＤ−ＰＢＳにはハイドロコルチゾンは溶解しなかったため、正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液に添加することができず、細胞毒性試験を実施できなかった。結果を表４に示す。
【００５１】
比較例２−２
７．５ｍｇのハイドロコルチゾンを１０ｍＬのエタノール（キシダ化学株式会社製）に溶解した溶液を細胞培養用組成物の代わりに使用した以外は、実施例２−１と同様にして細胞毒性試験２を実施した。結果を表４に示す。なお、比較例２−２における蛍光強度を、細胞毒性試験２での基準蛍光強度とする。
【００５２】
実施例２−２５
以下のようにして細胞毒性試験２を行い、実施例２−２５の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
９．７５ｍＬの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに、１５ｍｇのハイドロコルチゾンを加え、十分に攪拌した。この溶液と０．２５ｇの共重合体１とを混合して３７℃で２０分間加熱した。ハイドロコルチゾンは共重合体１を含む１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物４μＬを、上記８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液２ｍＬに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用９６ウェルプレート（平底）に１００μＬ／ウェルで分注し、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて４日間培養した。培養４日目にアラマーブルーを１０μＬ／ウェル加え、３７℃の５％ＣＯ2インキュベーターにて３時間培養した後に蛍光強度（励起波長５５０ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ）を測定した。結果を表５に示す。
【００５３】
実施例２−２６〜２８
共重合体１及び１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭの使用量を表５に示すものとした以外は実施例２−２５と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験２を実施した。結果を表５に示す。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
上記細胞毒性試験２の各実施例の細胞培養用組成物で正常ヒト繊維芽細胞を培養した場合、培養後の正常ヒト繊維芽細胞懸濁液は、比較例２−２の基準蛍光強度より高い蛍光強度を示した。
従って、各実施例の細胞培養用組成物で正常ヒト繊維芽細胞を培養することにより、比較例２−２に比較して細胞毒性を顕著に抑制して正常ヒト繊維芽細胞を培養できることが判る。
【００５７】
以上の結果から、本発明の実施形態に係る細胞培養用組成物を使用することにより、細胞毒性を顕著に抑制して、細胞を培養することができることが示された。