(57)【要約】    【課題】  本発明の目的は、メナキノン−７の製造において新規な製造技術を提供し、そして該技術を利用してメナキノン−７を含有する食品を提供することも目的とする。    【解決手段】  高温下で増殖可能であり、かつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させて得られる培養物を含むか、又は、該培養物から精製したメナキノン−７もしくはこれを含有する抽出物を含むことを特徴とする食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高温下で増殖可能であり、かつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させて得られる培養物を含むか、又は、該培養物から精製したメナキノン−７もしくはこれを含有する抽出物を含むことを特徴とする食品。
【請求項２】
骨粗鬆症の予防用又は治療用である、請求項１記載の食品。
【請求項３】
窒素源を少なくとも含む原料を用いて高温下で増殖可能であり、かつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とするメナキノン−７の製造法。
【請求項４】
前記バクテリアが、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産するバクテリアである、請求項３記載の製造法。
【請求項５】
培養を５０℃以上の温度で行う、請求項３又は４に記載のメナキノン−７の製造法。
【請求項６】
培養物からさらにメナキノン−７を精製する、請求項３〜５の何れか１項記載のメナキノン−７の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリアの発酵によりメナキノン−７を製造する方法とこれにより得られるメナキノン−７を含む食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、脂溶性ビタミンの一種で、血液凝固や骨形成に関与する重要なビタミンである。自然界には植物にビタミンＫ１（フィロキノン）が、バクテリア等にビタミンＫ２（メナキノン）が存在し、ビタミンＫには骨粗鬆症の予防効果が期待できることや、新生児・乳児出血症がビタミンＫの欠乏から起きることなどから注目されている。
【０００３】
従来、ビタミンＫ２の一種であるメナキノン−７の製造は、高いメナキノン−７の含有率を有するバチルス・ズブチリス菌株が使用されてきた（特許文献１，２）。バチルス以外の細菌を用いた例として乳酸菌や大腸菌を用いた製造方法も知られている（特許文献３，４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３４５５４号公報
【特許文献２】特開平８−７３３９６号公報
【特許文献３】特開平１０−５６９５９号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６０８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１〜４に開示される納豆菌や乳酸菌、大腸菌等のバクテリアの培養に適した温度帯は、通常30〜45℃付近の中温域であるが、他の多くの雑菌もこの中温域が最適増殖温度域となっており、培養中に雑菌が増殖することが懸念される。雑菌が増殖した場合には、メナキノン−７の安定な生産に影響を及ぼすため、雑菌が増殖しないように生産管理に留意が必要である。また、メナキノン−７の製造に最も一般的に使用される納豆菌は独特の風味を培養物に付加し、またポリグルタミン酸の放出によるネバネバとした粘質を付加することから、用途の汎用性を高めるにはメナキノン−７を高度に精製しなければならない。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、メナキノン−７の製造において新規な製造技術を提供することである。そして該技術を利用してメナキノン−７を含有する食品を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者は広範な種類のバクテリアを培養して鋭意検討を行った。そして、高温環境下で増殖可能なバクテリアの中で、高いメナキノン−７の発現率を有するバクテリアを見出し、本菌を培養することで課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成を包含する。
（１）高温下で増殖可能であり、かつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させて得られる培養物を含むか、又は、該培養物から精製したメナキノン−７もしくはこれを含有する抽出物を含むことを特徴とする食品、
（２）骨粗鬆症の予防用又は治療用である、前記（１）記載の食品、
（３）窒素源を少なくとも含む原料を用いて高温下で増殖可能であり、かつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とするメナキノン−７の製造法、
（４）前記バクテリアが、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産するバクテリアである、前記（３）記載の製造法、
（５）培養を５０℃以上の温度で行う、前記（３）又は（４）に記載のメナキノン−７の製造法、
（６）培養物からさらにメナキノン−７を精製する、前記（３）〜（５）の何れか１項に記載のメナキノン−７の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、高温下でも増殖可能で、かつメナキノン−７を生成しうるバクテリアを選択して培養することにより、雑菌の増殖を抑制しつつ安定的に大量のメナキノン−７の製造が可能となる。また納豆菌のように納豆の独特の風味を呈したり、粘質性を示すことがなく、培養物からメナキノン−７を高度に精製しなくとも培養物のまま、あるいは低い精製度で利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のメナキノン−７の製造法は、高温下で増殖可能であり、かつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とする。以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
（培養原料）
本発明において、バクテリアを培養するための原料は、通常バクテリアの培養に必要な窒素源や炭素源を含むものであれば特に限定されない。窒素源としてはタンパク質やタンパク質加水分解物、アミノ酸、アンモニア、硫酸アンモニウムや塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等を含有させることができる。タンパク質としては動物性、植物性の何れを問わず使用することができ、例えば市販の乳タンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質、コラーゲンや、これらの加水分解物などを用いることができる。また、これらのタンパク質を含む乳原料や小麦、あるいは大豆や緑豆などの豆類、該豆類から取り出した子葉や胚軸などの天然原料を用いることもできる。また豆類の場合はそれから調製した豆乳や、副産物のオカラを用いることもできる。なお培地成分として一般に使用されるコーンスティープリカー、ポリペプトン、ペプトン、酵母エキス、小麦ふすま等も使用することができる。
本発明では、培養原料として窒素源の他に炭素源、無機塩、ビタミン類も適宜含めることができる。炭素源としては、グルコース、シュークロース等の糖類、有機酸、ｎ−パラフィン等を使用することができる。無機塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩、リン酸塩、重炭酸塩等を使用することができる。
【００１２】
（バクテリア）
本発明のメナキノン−７の製造において、培養に使用するバクテリアとしては50℃以上の高温環境下で増殖可能であり、かつメナキノン−７を産生する能力を有する必要がある。これら二つの特徴を併せ持ったバクテリアを下記の通り本発明者らは見出した。
これらバクテリアの中でもメナキノン−７産生能力のより高い菌種を選択することが望ましい。当業者は適宜産生能の高い菌種、さらには菌株を培養試験によりスクリーニングして用いることができる。
【００１３】
本発明者らが見出した、高温域で増殖可能でかつメナキノン−７生成能を有するバクテリアとしては、一つの菌種としてはアノキシバチルス属細菌が挙げられ、例えばアノキシバチルス・アミロリティカス、アノキシバチルス・アイデレンシス、アノキシバチルス・ボグロベンシス、アノキシバチルス・カルディプロテオリティカス、アノキシバチルス・コンタミナンス、アノキシバチルス・エリュアネンシス、アノキシバチルス・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・ユナネンシス、アノキシバチルス・ゴネンシス、アノキシバチルス・カムチャツケンシス、アノキシバチルス・ケスタンボレンシス、アノキシバチルス・モンゴリエンシス、アノキシバチルス・プシュチネンシス、アノキシバチルス・プシュチノエンシス、アノキシバチルス・ルピエンシス、アノキシバチルス・サラバトリエンシス、アノキシバチルス・テンチョンエンシス、アノキシバチルス・テピダマンス、アノキシバチルス・サーマラム、アノキシバチルス・ボイノスキエンシス等が挙げられる。
またアノキシバチルス属細菌以外の高温域で増殖可能な菌種としてジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・シュレゲリ、バチルス・アシドカルダリウス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・バディウス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ファームス、デサルフォトマキュラム・ニグリフィカンス、サリニビブリオ・コスティコラ、サーモプラズマ・アシドフィラム、サーマス・アクアティカス、サーマス・サーモフィラス等が挙げられる。当業者はこれらの菌種から選択されるいずれか一種又は二種以上を選択することができる。
さらに前者（アノキシバチルス属）及び後者（アノキシバチルス属以外）の菌種を組み合わせてもよい。
なお、後述した実施例ではアノキシバチルス属細菌、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミスの４種類の菌種による培養例を記載している。またこれら以外の上記の菌種についても、いずれも高温域で増殖可能な菌種であり、しかも電子伝達系の補酵素としてバクテリアが菌体内に保有しているキノン類の主要なものにメナキノン−７を含んでいることから、これら４種類の菌種以外の高温域で増殖可能な菌種もメナキノン−７生成能を有することは認識できる。そして製造者はこれらの市販の菌種を入手して使用することもできる。
特に、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産するものを選択して使用することが好ましい。そのスクリーニング方法としては、例えば試験菌株を10cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、その菌株に適した５０℃以上の温度で２４時間培養したときの培養液100ml中のメナキノン−７の含量を測定する方法で行うことができる。
【００１４】
（培養温度）
一般のバチルス属を含む多くのバクテリアの最適増殖温度域が30〜45℃であるのに対し、最適増殖温度域が50〜80℃であるバクテリアも存在する。30〜45℃では多くのバクテリアが活発に増殖可能なため、培養中に雑菌が増殖してしまう可能性があるが、５０℃以上の高温域では他のバクテリアが増殖しにくいため純化培養に適している。
【００１５】
したがって、高温環境下で増殖可能なバクテリアを50℃以上で培養することが雑菌の増殖を抑制しつつメナキノン−７を製造するのに適している。より好ましくは55℃以上の高温域で培養することが好ましい。また培養温度の上限はバクテリアが死滅しない常識的な範囲とすればよく、通常は80℃以下、好ましくは70℃以下、より好ましくは60℃以下で培養することで効率良く増殖させることができる。また、本発明者らが見出したバクテリアの増殖に必要な倍化時間が15分〜30分程度と非常に短いため（参考文献１：The formation of thermophilic spores during the manufacture of whole milk powder : SCOTT et al., Int. J. Dairy Tech., 60 (2), p109-117 (2007)）、本菌のみを効率良く純化培養させるのに適している。
【００１６】
（その他の各種培養条件）
培養は好気的条件、微好気的条件、嫌気的条件など目的のバクテリアが増殖する条件で行うことが好ましい。培養時のpHは通常６〜１１が好適であるが酸性下が適している場合もある。
培養方法は特に限定されず、一般的に知られている液体培養や平板培養などの公知の方法を用いると良いが、一例としてトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）等の大豆由来成分を含むものが使用できる。
培養工程において用いられる細菌は予備培養しておくこともできる。予備培養後は菌液をそのまま加えるか、菌体を遠心分離やフィルターを用いて回収し工程中に加えることができる。
培養工程における初期菌数は、１０の１乗〜１０の６乗cfu/ml、好ましくは１０の３乗〜１０の５乗cfu/mlあればより効率的に発酵させることができる。
前記条件下で例えば４〜２４時間、好ましくは４〜１２時間程度培養するとメナキノン−７が培養物中に生成されるので、生成量が最大になった時点、例えば細菌数が１０の６乗〜１０の８乗cfu/ml程度まで十分増殖した時点で培養を停止すればよい。
【００１７】
（培養物の加工）
得られた培養物は必要であれば加熱殺菌を行い、培養物をそのまま回収し、必要により乾燥や濃縮、粉砕、凍結するなどして加工し、得られたメナキノン−７含有発酵物を添加した食品又は食品素材、あるいは薬剤や飼料を製造することができる。
また、培養物からメナキノン−７を抽出、分離等することによりさらに精製し、得られたメナキノン−７の純品もしくはこれを含有する抽出物を添加した食品又は食品素材、あるいは薬剤とすることもできる。なお、ここでいう食品には飲料も包含される。
これらの食品や食品素材、あるいは薬剤は、メナキノン−７で知られている生理機能の用途、例えば骨粗鬆症、動脈硬化等の予防用又は治療用、あるいは抗酸化用として用いることができる。
【００１８】
なお、培養物からのメナキノン−７の抽出方法は、培養物に対して最も効果的な方法を選択すればよく、特に限定されるものではない。例えば水、あるいはメタノールやエタノール等の有機溶剤を用いて抽出し、メナキノン−７含有抽出物を得ることができる。具体的な態様として、例えば大豆などの豆類を培養した場合には、該培養物に水を加え、蛋白質や糖質などの他の成分と共にメナキノン−７を抽出し、不溶物を除去してメナキノン−７が富化された豆乳を得るような態様も含まれる。
また必要により有機溶剤による分配抽出やカラムクロマトグラフィーなどを行ってさらにメナキノン−７含量を高純度に精製したメナキノン−７含有抽出物を得ることができる。また培養物から菌体そのものを回収し、乾燥することでも高濃度のメナキノン−７含有素材として回収できる。
【実施例】
【００１９】
次に実施例によって本発明についてより詳しく説明する。なお、以下の実施例においてメナキノン−７含量の測定は佐藤らの方法（参考文献２）に従って実施した。
参考文献２: Production of Menaquinone (Vitamin K2)-7 by Bacillus subtilis (2001) J.B.B., 91(1) 16-20
【００２０】
■実施例１
「トリプチケース・ソイブロス」培地（ベクトン・ディッキントン社製）３０ｇを蒸留水1000mlに溶解し、オートクレーブにより滅菌し、液体培地を得た。無菌環境ではない開放環境下において、この液体培地にアノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種のバクテリアをそれぞれ１０cfu/mlになるように接種して５５℃で培養し、定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。両者のメナキノン−７産生量は30μg/100mlおよび25μg/100mlであった。
【００２１】
■実施例２
ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（NBRC 12550）を実施例１と同様の方法及び条件で、６０℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。本菌のメナキノン−７産生量は25μg/100mlであった。
【００２２】
■実施例３
バチルス・コアギュランス（NBRC 12583）を実施例１と同様の方法及び条件で、５５℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。本菌のメナキノン−７産生量は20μg/100mlであった。
【００２３】
■実施例４
バチルス・リケニフォルミス（NBRC 12200）を実施例１と同様の方法及び条件で、５０℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。本菌のメナキノン−７産生量は20μg/100mlであった。
【００２４】
■実施例５
アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を実施例１と同様の方法及び条件で、５５℃で6.5時間培養した（最終菌数：１０の７乗cfu/ml）。アノキシバチルス・フラビサーマスは短時間でメナキノン−７を蓄積し、その含量は13μg/100mlであった。
【００２５】
■比較例１
バチルス・ズブチリス（NBRC 3013）を実施例１と同様の方法及び条件で、４０℃で6.5時間培養した（最終菌数：１０の５乗cfu/ml）。蓄積されたメナキノン−７含量は３μg/100mlと低いレベルであった。さらに定常期（１０の８乗cfu/ml）まで１０時間かけて十分増殖させたところ、蓄積されたメナキノン−７含量は20μg/100mlであった。
【００２６】
■比較例２
実施例１において、液体培地にバクテリアを接種することなく、無菌環境ではない開放環境下において、該液体培地を４０℃で培養し、雑菌を定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた。この培養液のメナキノン−７の含量を測定したが、検出されなかった。
【００２７】
■実施例６
実施例１と同様にして滅菌された液体培地を得た。次に無菌環境下において、この液体培地に標準菌株アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を接種して５５℃で前培養した。次に培養原料として、市販の粉末状大豆タンパク「フジプロＲ」（不二製油(株)製）100gを水900mlに分散させた。得られた大豆タンパク質溶液に前培養液を１０の３乗cfu/mlの濃度になるよう接種した。次に無菌環境ではない開放環境下において、この溶液を５５℃で８時間培養した後（最終菌数：１０の８乗cfu/ml）、加熱殺菌して培養物を得た。得られた培養物のメナキノン−７含量は固形分100gあたり300μgであった。
【００２８】
（品質比較）
実施例１〜４及び比較例１，２で得られた各培養物の品質を表１で比較した。実施例１〜４はいずれも無菌環境ではない開放環境下で培養したにもかかわらず、接種したバクテリアの増殖によりメナキノン−７が生成されており、物性は納豆のような粘性物質を産生することなく低粘度の溶液であった。また風味は納豆のような独特の異臭はなく、バクテリアを培養したときの特有の発酵臭のみが感じられたが、総じて良好であった。特に実施例１、２は発酵臭も少なくさらに良好であった。
比較例１ではメナキノン−７が生成されたが、納豆臭が発生しており粘ついた溶液となっていた。また比較例２ではメナキノン−７は生成されず、雑菌が増殖して腐敗臭を感じた。
以上の結果から、実施例１〜４で用いた菌種の菌学的特徴を考察すると、いずれも高温で増殖が可能な高温菌であり、さらにいずれも電子伝達系の主要な補酵素としてメナキノン−７を菌体内に有するものであった。
【００２９】
（表１）
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【００３０】
以上の通り、高温で増殖可能であり、かつ電子伝達系の補酵素としてメナキノン−７を持つバクテリアを培養すれば、培養物中に他の雑菌が増殖せずに該バクテリアが優勢となり、風味や物性に影響を与えることなくメナキノン−７を有意に生成することが示された。