(57)【要約】【課題】Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物を効率的に作成する方法を提供する。【解決手段】Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含む、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法に関する。【選択図】図１
2015089356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含む、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項２】
不定胚を誘導した後に、シュートを形成させる請求項１記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項３】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む請求項１記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項４】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む請求項１記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項５】
前記伸長培地及び前記発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地である請求項４記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項６】
五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化するグリーン化工程と、グリーン化したカルスから不定胚を誘導する工程とを含む請求項１又は２記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項７】
前記再生誘導工程の前に、五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化するグリーン化工程を有し、
前記再生誘導工程が、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中で、グリーン化したカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる工程である請求項３〜５のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項８】
前記グリーン化培地中の五炭糖の濃度が１〜１０質量％である請求項６又は７に記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項９】
前記感染工程において、アミノ酸含有培地中でカルスにアグロバクテリウム属菌を感染させる請求項１〜８のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸が、アスパラギン酸、及び／又はグルタミンである請求項９記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１１】
前記感染工程において、培地中の窒素源として硝酸アンモニウムを用いない培地で、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させる請求項１〜１０のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１２】
前記感染工程において、アセトシリンゴン含有培地で、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させる請求項１〜１１のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１３】
前記感染工程において、カザミノ酸含有培地で、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させる請求項１〜１２のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１４】
前記感染工程において、カルス６ｇに対し、６００ｎｍで測定した吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．０１〜０．４のアグロバクテリウム属菌懸濁溶液１０〜５０ｍＬに相当する菌体数のアグロバクテリウム属菌を接触させる請求項１〜１３のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１５】
前記感染工程において、アグロバクテリウム属菌とカルスの共存時間が０．５〜６０分である請求項１〜１４のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１６】
前記選択培養工程において、培養温度が２０〜２８℃である請求項１〜１５のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１７】
前記標的遺伝子が、メバロン酸経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子である請求項１〜１６のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１８】
前記標的遺伝子が、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）をコードする遺伝子である請求項１〜１６のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【請求項１９】
前記Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物が、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）である請求項１〜１８のいずれかに記載のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００３】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキを唯一の採取源としている。パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年である。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴム（イソプレノイド）の供給源が望まれている。
【０００４】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物は、ヨーロッパ諸国や日本などのアジアなど、世界各地で自生しており、また、草本類であるため生長が早く、さらに、その茎や根から天然ゴムを含有する乳液が得られる。そのため、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物は、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴム（イソプレノイド）の供給源となり得る可能性を有する。
【０００５】
一方、近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に、好ましい外来遺伝子を導入することによって、形質を改変することができるようになった。植物への外来遺伝子導入方法としては、植物病原菌の１種であるアグロバクテリウム属菌を植物細胞に感染させて遺伝子を導入する方法（アグロバクテリウム法）、遺伝子を担持させた金粒子をパーティクルガンにより植物細胞内に撃ち込む方法等が知られている。
【０００６】
アグロバクテリウム法により、ゴム産生植物であるパラゴムノキの形質転換体作製に成功している事例が報告されている。しかし、パラゴムノキは前述の通り、生産地域が限定されるとともに、ゴムの採取までに７年程度を要する。また、植物により、アグロバクテリウム法の適用の可否、適用条件は様々であり、アグロバクテリウム法の適用条件についても、イネなどの一部の植物において検討されているだけであった。
【０００７】
新たな天然ゴムの供給源として、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物を使用する場合、イソプレノイドの生産量を増大させるために、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞を作成することが望ましいが、これまで、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物へ外来遺伝子を導入した例は報告されておらず、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物に対して、アグロバクテリウム法を適用する試みは行われてこなかった。
【０００８】
また、アグロバクテリウム法を利用する場合、標的遺伝子を導入した植物細胞を植物体へ再分化させる必要がある。すなわち、植物細胞（例えば、カルス）から植物を再生する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記課題を解決し、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物を効率的に作成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞を作成することに成功した。そして、より効率的にＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞を作成するための条件の検討を行い、遺伝子導入効率を高めるためには、アグロバクテリウム属菌の感染力と遺伝子を受ける側のカルスの状態が重要であることがわかった。この知見に基づいて、さらなる検討を行った結果、様々な知見を見出し、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞を作成する手法を完成させた。
本発明者らは、次に、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物のカルスを安定的に植物に再生する方法について鋭意検討した結果、カルスから不定胚を誘導することにより、その後、安定的にシュートが形成され、形成されたシュートが伸長し、発根させることができることを見出した。すなわち、カルスから不定胚を誘導することにより、カルスを安定的に植物に再生できること、更には、安定的に植物の増殖が可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含む、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法に関する。
【００１１】
上記作成方法において、不定胚を誘導した後に、シュートを形成させることが好ましい。
【００１２】
上記作成方法は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましい。
【００１３】
上記作成方法は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましい。
【００１４】
上記伸長培地及び上記発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましい。
【００１５】
上記作成方法は、五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化するグリーン化工程と、グリーン化したカルスから不定胚を誘導する工程とを含むことが好ましい。
【００１６】
上記再生誘導工程の前に、五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化するグリーン化工程を有し、
上記再生誘導工程が、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中で、グリーン化したカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる工程であることが好ましい。
【００１７】
上記グリーン化培地中の五炭糖の濃度が１〜１０質量％であることが好ましい。
【００１８】
上記感染工程において、アミノ酸含有培地中でカルスにアグロバクテリウム属菌を感染させることが好ましい。
【００１９】
上記アミノ酸が、アスパラギン酸、及び／又はグルタミンであることが好ましい。
【００２０】
上記感染工程において、培地中の窒素源として硝酸アンモニウムを用いない培地で、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させることが好ましい。
【００２１】
上記感染工程において、アセトシリンゴン含有培地で、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させることが好ましい。
【００２２】
上記感染工程において、カザミノ酸含有培地で、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させることが好ましい。
【００２３】
上記感染工程において、カルス６ｇに対し、６００ｎｍで測定した吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．０１〜０．４のアグロバクテリウム属菌懸濁溶液１０〜５０ｍＬに相当する菌体数のアグロバクテリウム属菌を接触させることが好ましい。
【００２４】
上記感染工程において、アグロバクテリウム属菌とカルスの共存時間が０．５〜６０分であることが好ましい。
【００２５】
上記選択培養工程において、培養温度が２０〜２８℃であることが好ましい。
【００２６】
上記標的遺伝子が、メバロン酸経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００２７】
上記標的遺伝子が、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）をコードする遺伝子であることが好ましい。
【００２８】
上記Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物が、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含むので、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物を効率的に作成できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】不定胚の形成、シュートの形成、シュートの伸長、発根、グリーン化したカルス及びグリーン化していないカルスの様子を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法（以下においては、本発明の方法ともいう）は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含む。
【００３２】
本発明の方法では、上記感染工程と、上記選択培養工程とを有するので、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞を効率的に作成できる。更に、本発明の方法では、カルスから不定胚を誘導する工程を有するため、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞（形質転換されたカルス）を安定的に植物に再生できる。これは、上述のように、カルスから不定胚を誘導し（図１（ａ）参照）、不定胚を培養することにより、安定的にシュートが形成され（図１（ｂ）参照）、形成されたシュートが伸長し（図１（ｃ）参照）、発根させる（図１（ｄ）参照）ことができるためである。
【００３３】
また、再生された植物は、カルスの状態で維持（継代培養）する場合よりも変異が起こりにくく、安定的に植物を供給することができる。また、再生された植物は、土壌中で生育させることができるため、カルス等の植物細胞と異なり、細胞を維持するために高価な植物成長調整物質を必要としないため、コストを抑制できる。
【００３４】
本発明において、カルスとは、分化していない状態の植物細胞又は分化していない状態の植物細胞塊を意味する。また、本発明において、不定胚とは、カルスから誘導された胚様の組織を意味する。また、本発明において、シュートとは、葉や幼植物を意味する。また、本発明において、カルスをグリーン化するとは、カルスをグリーン化させてグリーン化したカルスを調製することを意味し、グリーン化したカルスとは、再生しやすい状態になったカルスを意味する。
【００３５】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物としては、特に限定されず、例えば、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）、タイワンハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）等が挙げられる。なかでも、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）が好ましい。
【００３６】
パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物であるノゲシはヨーロッパ諸国や日本などのアジアなど、世界各地で自生しており、生産地域を限定することなく、広範囲での栽培が可能である。さらに、パラゴムノキは植樹からゴムの採取まで約７年を要するが、ノゲシは草本類であり、一年草であることから、生育もより早い点で有利である。
【００３７】
以下において、本発明のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法について具体的に説明する。
本発明の方法は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含む。本発明の方法では、上記感染工程と、上記選択培養工程とにより、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞（形質転換されたカルス）を作成した後、該カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養することにより、カルスを植物に再生し、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物を作成すればよい。カルスを植物に再生する方法としては、より具体的には、カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養することにより、シュートを形成させ、該シュートを培養することにより、カルスを植物に再生すればよい。
【００３８】
具体的には、本発明のＳｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物の作成方法は、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことがより好ましい。
【００３９】
また、本発明者らは、鋭意検討した結果、五炭糖を含む培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化できること、グリーン化したカルスは、通常のカルス（グリーン化していないカルス）に比べて、不定胚の形成率が高いこと、すなわちグリーン化したカルスから不定胚を高効率で誘導できることも見出した。そのため、本発明の方法は、五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化するグリーン化工程と、グリーン化したカルスから不定胚を誘導する工程とを含むことが好ましい。具体的には、上記再生誘導工程の前に、五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化するグリーン化工程を有し、上記再生誘導工程が、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中で、グリーン化したカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる工程であることが好ましい。これにより、カルスをより安定的に植物に再生できる。具体的には、カルスをグリーン化し、グリーン化したカルスから不定胚を誘導するため、高効率で不定胚を誘導でき、カルスを高効率で安定的に植物に再生できる。従って、植物の再生に必要なカルス量を低減でき、より安価に植物の再生を行うことができるだけではなく、少量のカルスから植物の再生を行うことが可能となり、植物分野の研究開発の促進にも寄与でき、植物の大量培養、分子育種にも貢献できる。
【００４０】
上述のように、カルスから不定胚を誘導し（図１（ａ）参照）、不定胚を培養することにより、安定的にシュートが形成され（図１（ｂ）参照）、形成されたシュートが伸長し（図１（ｃ）参照）、発根させる（図１（ｄ）参照）ことができ、カルスを安定的に植物に再生できる。また、上述のように、五炭糖を含む培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化でき、グリーン化したカルス（図１（ｅ）参照）は、通常のカルス（グリーン化していないカルス（図１（ｆ）参照））に比べて、不定胚の形成率が高く、高効率で不定胚を誘導できる。
【００４１】
以下において、上記各工程について説明する。
【００４２】
（誘導工程）
まず、カルスの調製方法（誘導工程）について説明する。
誘導工程では、例えば、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物（以下、単に植物ともいう）の組織片（組織）を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
【００４３】
組織片としては、特に限定されないが、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎が好ましい。
【００４４】
誘導工程では、まず、植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄することが好ましい。
【００４５】
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００４６】
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００４７】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００４８】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸がより好ましく、ナフタレン酢酸が更に好ましい。
【００４９】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００５０】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。また、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等の糖アルコールであってもよい。なかでも、スクロース、グルコースが好ましく、スクロースがより好ましい。
【００５１】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００５２】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００５３】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ノゲシの場合は）以下の組成である。
【００５４】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００５５】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【００５６】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下である。
【００５７】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜２６℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。培養時間は、１〜１０週間（好ましくは２〜６週間、より好ましくは３〜５週間）である。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【００５８】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００５９】
上述の条件のなかでも、特に、植物が、ノゲシの場合、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が０．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、培養温度が２０〜２６℃であることが特に好ましい。
【００６０】
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。
【００６１】
本発明の方法では、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件（上記誘導培地）で２〜７週間培養して得られたカルスを用いる。Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で培養を開始した後、アグロバクテリウム属菌感染までの培養期間は、２〜７週間の期間内であれば特に限定されるものではなく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の種類、カルス誘導の材料とする植物組織（組織片）の種類や量、感染に用いるアグロバクテリウム属菌の量等を考慮して、適宜決定することができる。好ましくは、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜６週間培養して得られたカルス、より好ましくは、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で３〜５週間培養して得られたカルス、更に好ましくは、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で４週間培養して得られたカルスを用いる。
【００６２】
なお、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２週間培養して得られたカルスとは、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導培地（上記誘導培地）に移してから２週間培養して得られたカルスを意味する。
【００６３】
（アグロバクテリウム属菌調製工程）
本発明の方法では、標的遺伝子又はそのフラグメント（以下、標的遺伝子等、と記載することがある。）を含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌をカルスに感染させる。そこで、次に、アグロバクテリウム属菌の調製方法（アグロバクテリウム属菌調製工程）について説明する。
【００６４】
本発明において用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミドを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００６５】
標的遺伝子等を含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、標的遺伝子等を組み込んだ標的遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該標的遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに標的遺伝子等を組み込んだ標的遺伝子バイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入してもよい。
【００６６】
本発明において、標的遺伝子とは、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物に導入する目的の遺伝子を意味する。標的遺伝子としては、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物に導入された結果、当該Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の遺伝的形質を変化させ得るものであれば特に限定されるものではなく、導入されるＳｏｎｃｈｕｓ属植物が本来有している遺伝子であってもよく、当該Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物以外の生物由来の遺伝子であってもよく、人工的に作製した遺伝子であってもよい。人工的に作製した遺伝子としては、例えば、２種類以上の遺伝子をつなぎ合わせたキメラ遺伝子であってもよく、いずれかの生物が有する遺伝子を変異させた変異遺伝子であってもよい。変異遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列のうちの一部の塩基を欠損させたものであってもよく、置換させたものであってもよい。また、該塩基配列の途中に部分塩基配列を挿入したものであってもよい。
【００６７】
また、標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、調節領域であってもよい。例えば、プロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む構造遺伝子であってもよい。なお、制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入されるＳｏｎｃｈｕｓ属植物中で機能し得るものであればよく、遺伝子が導入されるＳｏｎｃｈｕｓ属植物と同種の生物由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。このような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。
【００６８】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物に導入される標的遺伝子は、遺伝子の全長であってもよく、フラグメントであってもよい。例えば、構造遺伝子の機能ドメインのみからなるフラグメントを導入するものであってもよい。
【００６９】
Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物に導入する標的遺伝子としては、例えば、ラテックスの生合成機構やポリイソプレン鎖延長反応に関与し、ラテックスの産生量や分子量に対して機能する遺伝子（例えば、メバロン酸経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子）、並びに、ラテックス中に含まれる、タンパク質、イノシトール、ケブラキトールなどの糖類、ビタミンＥの一種であり天然の老化防止剤としても効果のあるトコトリエノールの生合成に関与し、その生産量に対して影響を与える遺伝子、さらには、これらのタンパク質、糖類、トコトリエノールの変異体を生ずる遺伝子等であることが好ましい。なかでも、天然ゴム（イソプレノイド）の増産をより期待できることから、メバロン酸経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子がより好ましく、メバロン酸経路に関与するタンパク質のなかでも、メバロン酸経路の律速段階であるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＨＭＧＲ）をコードする遺伝子が更に好ましい。
なお、本明細書において、ＨＭＧＲは、３−ヒドロキシ−３メチルグルタル−補酵素Ａをメバロン酸に還元的脱アシル化するのを触媒することのできる酵素である。ＨＭＧＲには、ＨＭＧＲの全ての部類、特に部類Ｉ及びＩＩを包含する。また、ＨＭＧＲをコードする遺伝子は、本発明の植物、特にＳｏｎｃｈｕｓ属植物とは異なる植物由来のものであることが好ましい。
また、これらの遺伝子に組織特異的に機能するプロモーター等の調節領域を含ませることにより、標的遺伝子がコードしているタンパク質を、植物体の特定の組織において発現させることもできる。
【００７０】
標的遺伝子等は、好適には、マーカー遺伝子、場合により、レポーター遺伝子とともにベクターに組み込まれる。
マーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等を挙げることができる。
【００７１】
アグロバクテリウム属菌調製工程では、上述の説明等の通りに作製した標的遺伝子等を含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を、常法により培養（例えば、培養温度２０〜３５℃で、ＹＥＢ培地で１０〜３０時間振とう培養）し、増殖させることにより、カルスに感染させるために必要な量を調製することができる。
【００７２】
（感染工程）
感染工程では、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる。
【００７３】
感染工程では、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルス（誘導工程により得られたカルス）に、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌（アグロバクテリウム属菌調製工程により得られたアグロバクテリウム属菌）を感染させる。
【００７４】
感染工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。例えば、アグロバクテリウム属菌を感染培地中に懸濁させ、該懸濁液中に、カルスを浸漬させることにより、感染させることができる。そして、浸漬後、懸濁液と、カルスをろ紙等で分離すればよい。なお、浸漬中は、静置してもよく、振とうしてもよいが、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させやすいことから、振とうすることが好ましい。
【００７５】
感染に用いられるアグロバクテリウム属菌懸濁液の菌濃度は、アグロバクテリウム属菌の種類や増殖活性、感染させるカルスのカルス誘導後の培養期間、浸漬時間等を考慮して適宜決定することができる。例えば、カルス６ｇに対し、６００ｎｍで測定した吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．０１〜０．４（好ましくは０．０５〜０．２、より好ましくは０．０８〜０．１２）のアグロバクテリウム属菌懸濁溶液１０〜５０ｍＬ（好ましくは２０〜４０ｍＬ、より好ましくは２５〜３５ｍＬ）に相当する菌体数のアグロバクテリウム属菌を接触させることが好ましい。これにより、カルスへ感染するアグロバクテリウム数を最適化でき、形質転換細胞を効率的に作成できる。
【００７６】
感染工程におけるアグロバクテリウム属菌とカルスの共存時間、すなわち、アグロバクテリウム属菌とカルスを接触させる時間は、０．５〜６０分が好ましく、１〜４０分がより好ましく、２５〜３５分が更に好ましい。これにより、カルスへ感染するアグロバクテリウム数を最適化でき、形質転換細胞を効率的に作成できる。なお、該共存時間は、例えば、アグロバクテリウム属菌懸濁液中に、カルスを浸漬させる場合、浸漬時間を意味する。
【００７７】
アグロバクテリウム属菌を懸濁させる感染培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地が好ましく、ＭＳ培地がより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できるが、炭素源としては、スクロースとグルコースを併用することが更に好ましい。
【００７８】
好適な感染培地の組成は、植物種により異なるが、通常は（特に、ノゲシの場合は）以下の組成である。
【００７９】
感染培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上、特に好ましくは３質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【００８０】
炭素源として、スクロースとグルコースを併用する場合、感染培地中のスクロースの濃度は、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．５〜５質量％、更に好ましくは１〜４質量％である。一方、感染培地中のグルコースの濃度は、好ましくは０．０１〜５質量％、より好ましくは０．１〜３質量％、更に好ましくは０．５〜１．５質量％である。
【００８１】
カルスがアグロバクテリウム属菌に感染しやすい状態にできるという理由から、感染培地は、窒素源として硝酸アンモニウムを用いないことが好ましい。そして、硝酸アンモニウムの代わりに硝酸カリウムを用いた培地を使用することが好ましい。感染培地中の硝酸カリウムの濃度は、好ましくは１００〜６００ｍｇ／ｌ、より好ましくは２５０〜５００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは３００〜４５０ｍｇ／ｌである。
【００８２】
カルスの状態を良好化できるという理由から、感染培地がアミノ酸含有培地であることが好ましい。アミノ酸としては、特に限定されないが、例えば、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン等が挙げられる。なかでも、アスパラギン酸、グルタミンが好ましく、アスパラギン酸、グルタミンを併用することが好ましい。
【００８３】
感染培地中のアミノ酸の濃度は、好ましくは５００ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは７００ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１０００ｍｇ／ｌ以上である。該アミノ酸の濃度は、好ましくは５０００ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは２０００ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１３００ｍｇ／ｌ以下である。
【００８４】
アスパラギン酸、グルタミンを併用する場合、感染培地中のアスパラギン酸の濃度は、好ましくは１００〜７００ｍｇ／ｌ、より好ましくは２００〜５００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは２５０〜４００ｍｇ／ｌである。一方、感染培地中のグルタミンの濃度は、好ましくは１００〜１５００ｍｇ／ｌ、より好ましくは５００〜１２００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは７００〜１１００ｍｇ／ｌである。
【００８５】
カルスがアグロバクテリウムに感染しやすくなるという理由から、感染培地がアセトシリンゴン含有培地であることが好ましい。感染培地中のアセトシリンゴンの濃度は、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｌ、更に好ましくは５〜１５ｍｇ／ｌである。
【００８６】
カルスの状態及びカルスの生長を良好化できるという理由から、感染培地がカザミノ酸含有培地であることが好ましい。感染培地中のカザミノ酸の濃度は、好ましくは５０〜６００ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｌ、更に好ましくは２００〜４００ｍｇ／ｌである。
【００８７】
感染培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．０がより好ましい。感染させる温度（感染培地の温度）は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２２〜２４℃が更に好ましい。感染工程は、暗所で行っても明所で行ってもよい。
【００８８】
以上のように、感染工程では、例えば、アグロバクテリウム属菌調製工程により得られたアグロバクテリウム属菌を感染培地中に懸濁させ、該懸濁液中に、誘導工程により得られたカルスを浸漬させることにより、カルスにアグロバクテリウム属菌を感染させることができる。そして、浸漬後、懸濁液と、カルスをろ紙等で分離し、分離したカルスは、次の共存培養工程に使用される。
【００８９】
（共存培養工程）
共存培養工程では、例えば、感染工程により得られたカルス（アグロバクテリウム属菌が感染したカルス）を共存培養培地中で培養する。これにより、感染によりカルスに導入された標的遺伝子等の遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換細胞を得ることができる。
【００９０】
なお、共存培養培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、安定した形質転換細胞を得ることができるため、固体培養が好ましい。また、共存培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００９１】
共存培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。具体的には、上記感染培地と同様の培地を同様の好適な態様で好適に使用できる。
【００９２】
共存培養培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００９３】
培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２８℃が更に好ましく、２２〜２４℃が最も好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、暗所で培養を行うことが好ましく、暗所の照度は、０〜０．１ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、２〜４日間培養することが好ましい。
【００９４】
固体培地の場合、共存培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００９５】
以上のように、共存培養工程では、感染工程により得られたカルス（アグロバクテリウム属菌が感染したカルス）を上記共存培養培地中で培養することにより、感染によりカルスに導入された標的遺伝子等の遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換細胞を得ることができる。この共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）は、次の選択培養工程に使用される。
【００９６】
（選択培養工程）
選択培養工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。この工程により、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
【００９７】
選択培養工程では、まず、アグロバクテリウム属菌を滅菌するために、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地にカルベニシリンを加えたものを使用して、共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）の洗浄を行う。なお、滅菌の前に、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地により予め共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）を洗浄しておいてもよい。
【００９８】
次に、カルベニシリンにより滅菌されたカルスは、選択培養培地中で培養される。選択培養工程の培養条件は、形質転換細胞（標的遺伝子を獲得したカルス）が選択的に生育できる条件であれば、特に限定されない。
【００９９】
なお、選択培養培地は、液体であっても固体であってもよい。また、選択培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１００】
選択培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に、マーカー遺伝子（標的遺伝子と共に導入されたマーカー遺伝子）に対応する物質を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に上記マーカー遺伝子に対応する物質を加えたものが好ましく、ＭＳ培地に上記マーカー遺伝子に対応する物質を加えたものがより好ましい。なお、必要に応じて、カルベニシリンを加えてもよい。また、必要に応じて植物生長ホルモンを加えてもよい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【０１０１】
上記マーカー遺伝子に対応する物質としては、特に限定されないが、当業者であれば、使用したマーカー遺伝子に応じて適宜選択することができる。例えば、上記マーカー遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子を使用した場合には、カナマイシンを培地に添加してカルス（カルベニシリンにより滅菌されたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物））を培養することにより、形質転換されたカルスは、標的遺伝子と共にカナマイシン耐性遺伝子も導入されているため当該培地中で生育することができるが、形質転換されていないカルスは、当該培地中で生育することがない。このように、上記マーカー遺伝子に対応する物質を加えた培地で、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物を培養することにより、形質転換されたカルスを選択的に生育させることができる。
【０１０２】
選択培養培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１０３】
選択培養培地のｐＨは、特に限定されないが、５．０〜７．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２８℃が更に好ましく、２２〜２４℃が最も好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、暗所で培養を行うことが好ましく、暗所の照度は、０〜０．１ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜４週間おきに継代培養することが好ましい。
【０１０４】
固体培地の場合、選択培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１０５】
以上のように、選択培養工程では、共存培養工程により得られたカルス（形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスの混合物）をカルベニシリン含有溶液により洗浄し、アグロバクテリウム属菌を滅菌する。次に、カルベニシリンにより滅菌されたカルスを、選択培養培地中で培養することにより、形質転換されたカルスを選択的に生育させることができ、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
【０１０６】
このように上記方法により、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞（形質転換されたカルス）を効率的に作成できる。次に、形質転換されたカルスを安定的に植物に再生する方法について説明する。
【０１０７】
形質転換されたカルスをそのまま再生誘導工程に用いてもよいが、高効率で不定胚を誘導でき、カルスを高効率で安定的に植物に再生できるという理由から、再生誘導工程の前に、グリーン化工程を行うことが好ましい。なお、より多量の植物を作成できるという理由から、形質転換されたカルスをまず増殖させ、増殖させたカルスを再生誘導工程やグリーン化工程に用いることが好ましい。カルスの増殖は、カルスが増殖可能な条件でカルスを培養すればよく、例えば、誘導工程と同様の培地組成、培養条件でカルスの培養を行うことにより、カルスの増殖が可能である。
【０１０８】
（グリーン化工程）
グリーン化工程では、五炭糖を含むグリーン化培地中でカルスを培養することによりカルスをグリーン化する。五炭糖を含む培地中でカルスを培養することにより、カルスをグリーン化できる。
【０１０９】
グリーン化工程では、形質転換されたカルス（形質転換されたカルスを増殖させたものであってもよい）を、五炭糖を含むグリーン化培地中で培養してカルスをグリーン化する。なお、グリーン化培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルスをグリーン化しやすいため、固体培養が好ましい。また、グリーン化培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１１０】
グリーン化培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に五炭糖を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に五炭糖（好ましくは植物生長ホルモンも）を加えたものが好ましく、ＭＳ培地に五炭糖（好ましくは植物生長ホルモンも）を加えたものがより好ましい。植物生長ホルモンとしては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。また、カルスのグリーン化に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【０１１１】
五炭糖（ペントース）としては、例えば、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース等のアルドペントース；リブロース、キシルロース等のケトペントースが挙げられる。なかでも、アルドペントースが好ましく、キシロース、アラビノースがより好ましく、キシロースが更に好ましい。
【０１１２】
グリーン化培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１１３】
好適なグリーン化培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ノゲシの場合は）以下の組成である。
【０１１４】
グリーン化培地中の五炭糖の濃度は、好ましくは１質量％以上、より好ましくは１．５質量％以上、更に好ましくは２質量％以上である。該五炭糖の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１１５】
グリーン化培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１１６】
グリーン化培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１×１０−２ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは５×１０−２ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは１ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下である。
【０１１７】
グリーン化培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２２〜２６℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、２〜１０週間培養することが好ましい。
【０１１８】
固体培地の場合、グリーン化培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．１５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下、特に好ましくは０．３質量％以下である。
【０１１９】
以上のように、グリーン化工程では、カルスを上記グリーン化培地中で培養することにより、カルスをグリーン化することが可能である。このグリーン化工程により得られたグリーン化したカルスは、次の再生誘導工程に使用される。次の再生誘導工程に移るタイミングとしては、カルスがグリーン化した部位が増殖していることが確認できた後が好ましい。
【０１２０】
（再生誘導工程）
再生誘導工程では、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中で、形質転換されたカルス（形質転換されたカルスを増殖させたものであってもよく、グリーン化工程によりグリーン化したカルスであってもよい）を培養することにより不定胚及びシュートを形成させる。カルスから不定胚を誘導（形成）し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートの形成を行うことができるため、再生誘導工程の培養条件は、カルスから不定胚を誘導できる条件であれば、特に限定されない。また、グリーン化したカルスは、通常のカルス（グリーン化していないカルス）に比べて、不定胚の形成率が高く、高効率で不定胚を誘導できる。そのため、グリーン化したカルスから不定胚を誘導することにより、高効率で不定胚を誘導でき、その結果、カルスを高効率で安定的に植物に再生できる。
【０１２１】
再生誘導工程では、形質転換されたカルスを再生誘導培地中で培養して不定胚を誘導する。なお、再生誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、不定胚を誘導しやすいため、固体培養が好ましい。また、再生誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１２２】
再生誘導培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。また、不定胚の誘導に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【０１２３】
再生誘導培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１２４】
好適な再生誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ノゲシの場合は）以下の組成である。
【０１２５】
再生誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１２６】
再生誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは５×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは０．０３ｍｇ／ｌ以下、より最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以下である。
【０１２７】
再生誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、最も好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上、より最も好ましくは１．０ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が上記範囲内の場合に、特に、不定胚を好適に誘導でき、好適にシュートを形成できる。
【０１２８】
再生誘導培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、５〜１０週間培養することが好ましい。
【０１２９】
固体培地の場合、再生誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．１５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下、特に好ましくは０．３質量％以下である。
【０１３０】
ノゲシの場合、再生誘導培地は、ベースとなる培地としてＭＳ培地を使用し、再生誘導培地中のスクロースの濃度が２〜４質量％、ナフタレン酢酸の濃度が１×１０−３〜０．０３ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニンの濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌ、固形化剤（ゲランガム）の濃度が０．１〜０．３質量％であることが好ましい。
【０１３１】
以上のように、再生誘導工程では、カルスを上記再生誘導培地中で培養することにより、不定胚及びシュートを形成させることが可能である。この再生誘導工程により形成されたシュートは、次の伸長工程に使用される。次の伸長工程に移るタイミングとしては、シュートが視認され、その後安定して成長していることが確認できた後が好ましい。なお、次の伸長工程を省略して、再生誘導工程により形成されたシュートを直接発根工程に使用してもよい。
【０１３２】
（伸長工程）
伸長工程では、形成されたシュートを伸長培地で培養することによりシュートを伸長させる。
【０１３３】
伸長工程では、例えば、再生誘導工程により形成されたシュートを伸長培地中で培養してシュートを伸長させる。なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、シュートを伸長させやすいため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１３４】
伸長培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、シュートを好適に伸長できるという理由から、伸長培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地であることがより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【０１３５】
伸長培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１３６】
伸長工程における好適な培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ノゲシの場合は）以下の条件である。
【０１３７】
伸長培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、５〜１０週間培養することが好ましい。
【０１３８】
固体培地の場合、伸長培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１３９】
以上のように、伸長工程では、形成されたシュートを上記伸長培地中で培養することにより、シュートを伸長させることが可能である。また、この伸長工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。この伸長工程により伸長させたシュートは、次の発根工程に使用される。次の発根工程に移るタイミングとしては、シュートが２〜３ｃｍ程度の大きさに伸長した後が好ましい。
【０１４０】
（発根工程）
発根工程では、シュートを発根培地で培養することにより発根させる。ここで、シュートとしては、伸長工程により伸長させたシュートを使用してもよく、再生誘導工程により形成されたシュートを直接使用してもよい。
【０１４１】
発根工程では、例えば、伸長工程により伸長させたシュート又は再生誘導工程により形成されたシュートを発根培地中で培養して発根させる。なお、発根培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、発根させやすいため、固体培養が好ましい。また、発根培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１４２】
発根培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、好適に発根できるという理由から、発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まないＢ５培地がより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、伸長培地と発根培地の組成が同一であってもよい。また、伸長工程において既に発根している場合には、この発根工程を省略してもよい。
【０１４３】
発根培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１４４】
発根工程における好適な培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ノゲシの場合は）以下の条件である。
【０１４５】
発根培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、４〜１０週間培養することが好ましい。
【０１４６】
固体培地の場合、発根培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．３質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【０１４７】
以上のように、発根工程では、伸長したシュートを上記発根培地中で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュート（幼植物（Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物））が得られる。この幼植物は、直接土壌に移植してもよいが、バーキュライト等の人工土壌に移して馴化してから土壌に移植することが好ましい。
【０１４８】
以上の説明の通り、本発明では、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物を効率的に作成できる。
【実施例】
【０１４９】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１５０】
以下、参考実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
アセトシリンゴン：東京化成工業社製の４−ヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシアセトフェノン
カザミノ酸：日本ＢＤ社製のＢａｃｔｏＴＭＣａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ
ノゲシ：神戸市灘区で自生しているノゲシの種子から、無菌的に発芽させた植物体を使用した
【０１５１】
（カルスの誘導（誘導工程））
ノゲシから葉及び茎を採取した。次に、採取した葉及び茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
【０１５２】
次に、滅菌した葉及び茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、スクロースをそれぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１５３】
ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２３℃、暗所（０〜０．１ｌｘ）で２〜６週間培養し、ノゲシの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。
【０１５４】
（アグロバクテリウムの培養（アグロバクテリウム属菌調製工程））
標的遺伝子と共にマーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）を挿入したバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）をＹＥＢ培地で培養温度２８℃、２４時間、振とう培養した。６００ｎｍで測定した吸光度（ＯＤ６００）＝約１．０になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液（表１に記載の感染培地）でＯＤ６００＝０．１になるように希釈した。なお、吸光度は、サーモ・サイエンティフィック社製のＮａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ２０００  ｃにより測定した。
【０１５５】
（アグロバクテリウムのノゲシカルスへの感染及び共存培養（感染工程、共存培養工程））
まず、（カルスの誘導（誘導工程））により得られたカルスを計量した。次に、準備したアグロバクテリウム懸濁液（６００ｎｍで測定した吸光度：０．１）３０ｍｌとカルス６ｇを５０ｍＬチューブに入れ、２３℃で３０分間振とうした（感染工程）。振とう後、カルスを回収し、よく水分を切り、共存培養培地（表１に記載の感染培地と同一の培地（固体培地））に移植し、２３℃で３日間、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養した。なお、表１において、カルス誘導後２週間とは、ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、上記培養条件で２週間培養して得られたカルスを使用したことを意味する。また、「ＭＳ培地−ＮＨ４ＮＯ３」とは、ＭＳ培地からＮＨ４ＮＯ３を除いた培地を意味する。なお、参考実施例及び参考比較例では、ＭＳ培地からＮＨ４ＮＯ３を除く代わりにＫＮＯ３をＭＳ培地に添加した。
【０１５６】
（形質転換されたカルスの選択培養（選択培養工程））
共存培養後のカルスを回収し、ＭＳ培地３０ｍＬで４回洗浄した後、カルベニシリン含有（５００ｍｇ／ｍＬ）ＭＳ培地３０ｍＬで洗浄した。洗浄後、よく水分を切り、抗生物質（ハイグロマイシン）を含有するＭＳ培地（抗生物質濃度１０ｍｇ／ｍＬ、固体培地、ｐＨ：５．８）に移植し、２３℃で、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養した。
なお、標的遺伝子の導入効率の評価は、以下のように行った。
２〜３週間おきに上記抗生物質含有ＭＳ培地で２代に渡って継代培養を行い、生存カルスの個数をカウントし、遺伝子導入効率を算出した。
遺伝子導入効率（％）＝生存カルスの個数（個）／初期培養個数（個）×１００
初期培養個数＝６０個
【０１５７】
（不定胚及びシュート形成（再生誘導工程））
次に、生存カルス（形質転換されたカルス）を用いて、該カルスから不定胚及びシュートを形成させた（再生誘導工程）。
具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、糖類であるスクロースをそれぞれ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３質量％となるように添加した培地を用いた。また、ｐＨは、５．７に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した固体培地（滅菌済み）を用いて、生存カルス（形質転換されたカルス）を培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。その結果、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。
【０１５８】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好にシュート伸長が観察された。
【０１５９】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、植物成長ホルモンを含まないＢ５培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度１６℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好に発根が観察され、形質転換植物が得られた。
【０１６０】
【表１】
2015089356.tif 000003
【０１６１】
表１の結果より、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程とを有する方法により、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換細胞を効率的に作成できることが分かった。
【０１６２】
以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
ノゲシ：神戸市灘区で自生しているノゲシの種子から、無菌的に発芽させた植物体を使用した
【０１６３】
（カルスの誘導（誘導工程））
ノゲシから葉及び茎を採取した。次に、採取した葉及び茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
【０１６４】
次に、滅菌した葉及び茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、スクロースをそれぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１６５】
ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２３℃、明所（１００００ｌｘ）で４週間培養し、ノゲシの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。
【０１６６】
（不定胚及びシュート形成のための培地検討（再生誘導工程））
次に、誘導されたカルスを用いて、カルスから不定胚及びシュートを形成させるための培地（再生誘導培地）条件の検討を基本培地であるＭＳ培地を用いて行った。具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、糖類であるスクロースを種々の濃度となるように添加した培地を用いて検討を行った（表２参照）。また、ｐＨは、５．７〜５．８に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した各固体培地（滅菌済み）を用いて、誘導工程により誘導されたカルスを培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。８週間培養した後の不定胚の形成率を表２に示す。不定胚が形成された培地では、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。一方、不定胚が形成されなかった培地では、シュートも形成されなかった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、安定的にシュートが形成されることが分かった。
なお、不定胚の形成率は、不定胚を形成したカルスの個数を、再生誘導培地に移植したカルスの個数で割ることにより算出した。
【０１６７】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好にシュート伸長が観察された。結果を表２に示す。
【０１６８】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、植物成長ホルモンを含まないＢ５培地に移植した。該培地のｐＨは、５．８に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好に発根が観察された。結果を表２に示す。
なお、表２において、以下の基準でシュートの伸長、発根を評価した。
○：１０％以上でシュートの伸長・発根が見られる
△：１０％未満でシュートの伸長・発根が見られる
×：シュート伸長なし
【０１６９】
【表２】
2015089356.tif 000004
【０１７０】
表２の結果より、再生誘導工程において、不定胚の形成率が高い場合に、その後のシュート形成、伸長、発根が安定的に進行することが分かった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、その後、安定的にシュートが形成され、形成されたシュートが伸長し、発根させることができ、カルスを安定的に植物に再生できることが分かった。
【０１７１】
以下、参考実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
ノゲシ：神戸市灘区で自生しているノゲシの種子から、無菌的に発芽させた植物体を使用した
【０１７２】
（カルスの誘導（誘導工程））
ノゲシから葉及び茎を採取した。次に、採取した葉及び茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
【０１７３】
次に、滅菌した葉及び茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、スクロースをそれぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１７４】
ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２３℃、明所（１００００ｌｘ）で４週間培養し、ノゲシの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。
【０１７５】
（カルスのグリーン化のための培地検討（グリーン化工程））
次に、誘導されたカルスを用いて、カルスをグリーン化するための培地（グリーン化培地）条件の検討を基本培地であるＭＳ培地を用いて行った。具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡを添加し、更に、五炭糖であるキシロースを種々の濃度となるように添加した培地を用いて検討を行った（表３参照）。なお、参考比較例１では、スクロース濃度を３質量％とした。また、ｐＨは、５．７〜５．８に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した各固体培地（滅菌済み）を用いて、誘導工程により誘導されたカルスを培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で４週間培養した。４週間培養した後の成長率、４週間培養した後のグリーン化率を表３に示す。
なお、成長率は、４週間培養した後のカルスの総質量を、再生誘導培地に移植したカルスの総質量で割ることにより算出した。また、グリーン化率は、４週間培養した後、グリーン化したカルスの個数を、再生誘導培地に移植したカルスの個数で割ることにより算出した。
【０１７６】
【表３】
2015089356.tif 000005
【０１７７】
表３の結果より、五炭糖であるキシロースを含む培地中でカルスを培養することにより、カルスをグリーン化できることが分かった。
【０１７８】
（不定胚及びシュート形成（再生誘導工程））
次に、参考実施例２により得られたカルス（グリーン化したカルス）若しくは誘導工程により誘導されたカルス（グリーン化していないカルス）を、カルスから不定胚及びシュートを形成させるために、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、糖類であるスクロースを種々の濃度となるように添加した培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７〜５．８に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した各固体培地（滅菌済み）を用いて、参考実施例２により得られたカルス（グリーン化したカルス）若しくは誘導工程により誘導されたカルス（グリーン化していないカルス）を、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。８週間培養した後の不定胚の形成率を表４に示す。不定胚が形成された培地では、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。一方、不定胚が形成されなかった培地では、シュートも形成されなかった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、安定的にシュートが形成されることが分かった。
なお、不定胚の形成率は、不定胚を形成したカルスの個数を、再生誘導培地に移植したカルスの個数で割ることにより算出した。
【０１７９】
【表４】
2015089356.tif 000006
【０１８０】
表４の結果より、グリーン化したカルス（図１（ｅ）参照）は、通常のカルス（グリーン化していないカルス（図１（ｆ）参照））に比べて、不定胚の形成率が高く、高効率で不定胚を誘導できることが分かった。そして、不定胚が形成された培地では、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。
【０１８１】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュート（参考実施例４、５、参考比較例２、３により得られたシュート）を、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好にシュート伸長が観察された。また、不定胚の形成率が高かったものほど、より良好にシュート伸長が観察された。
【０１８２】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、植物成長ホルモンを含まないＢ５培地に移植した。該培地のｐＨは、５．８に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好に発根が観察された。また、不定胚の形成率が高かったものほど、より良好に発根が観察された。
【０１８３】
再生誘導工程において、不定胚の形成率が高い場合に、その後のシュート形成、伸長、発根が安定的に進行することが分かった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、その後、安定的にシュートが形成され、形成されたシュートが伸長し、発根させることができ、カルスを安定的に植物に再生でき、更には、安定的に植物の増殖が可能であることが分かった。
【０１８４】
以上の結果より、カルスをグリーン化し、グリーン化したカルスから不定胚を誘導することにより、高効率で不定胚を誘導でき、その後のシュート形成、伸長、発根がより安定的に進行するため、カルスを高効率で安定的に植物に再生できることが分かった。
【０１８５】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１８６】
以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
アセトシリンゴン：東京化成工業社製の４−ヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシアセトフェノン
カザミノ酸：日本ＢＤ社製のＢａｃｔｏＴＭＣａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ
ノゲシ：神戸市灘区で自生しているノゲシの種子から、無菌的に発芽させた植物体を使用した
【０１８７】
（カルスの誘導（誘導工程））
ノゲシから葉及び茎を採取した。次に、採取した葉及び茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
【０１８８】
次に、滅菌した葉及び茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、スクロースをそれぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１８９】
ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２３℃、暗所（０〜０．１ｌｘ）で２〜６週間培養し、ノゲシの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。
【０１９０】
（実施例１）
（アグロバクテリウムの培養（アグロバクテリウム属菌調製工程））
標的遺伝子（ＨＭＧＲ）と共にマーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）を挿入したバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）をＹＥＢ培地で培養温度２８℃、２４時間、振とう培養した。６００ｎｍで測定した吸光度（ＯＤ６００）＝約１．０になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液（表５に記載の感染培地）でＯＤ６００＝０．１になるように希釈した。なお、吸光度は、サーモ・サイエンティフィック社製のＮａｎｏ  Ｄｒｏｐ  ２０００  ｃにより測定した。
【０１９１】
（アグロバクテリウムのノゲシカルスへの感染及び共存培養（感染工程、共存培養工程））
まず、（カルスの誘導（誘導工程））により得られたカルスを計量した。次に、準備したアグロバクテリウム懸濁液（６００ｎｍで測定した吸光度：０．１）３０ｍｌとカルス６ｇを５０ｍＬチューブに入れ、２３℃で３０分間振とうした（感染工程）。振とう後、カルスを回収し、よく水分を切り、共存培養培地（表５に記載の感染培地と同一の培地（固体培地））に移植し、２３℃で３日間、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養した。なお、表５において、カルス誘導後４週間とは、ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、上記培養条件で４週間培養して得られたカルスを使用したことを意味する。また、「ＭＳ培地−ＮＨ４ＮＯ３」とは、ＭＳ培地からＮＨ４ＮＯ３を除いた培地を意味する。なお、実施例及び比較例では、ＭＳ培地からＮＨ４ＮＯ３を除く代わりにＫＮＯ３をＭＳ培地に添加した。
【０１９２】
（形質転換されたカルスの選択培養（選択培養工程））
共存培養後のカルスを回収し、ＭＳ培地３０ｍＬで４回洗浄した後、カルベニシリン含有（５００ｍｇ／ｍＬ）ＭＳ培地３０ｍＬで洗浄した。洗浄後、よく水分を切り、抗生物質（ハイグロマイシン）を含有するＭＳ培地（抗生物質濃度１０ｍｇ／ｍＬ、固体培地、ｐＨ：５．８）に移植し、２３℃で、暗所（０〜０．１ｌｘ）の条件下で、２〜３週間おきに上記抗生物質含有ＭＳ培地で２回継代培養を行なった。
【０１９３】
（カルスのグリーン化（グリーン化工程））
次に、形質転換されたカルス（選択培養工程で生存したカルス）を用いて、カルスをグリーン化した。具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、五炭糖類であるキシロースをそれぞれ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、３質量％となるように添加した培地を用いた。また、ｐＨは、５．７に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した固体培地（滅菌済み）を用いて、形質転換されたカルスを培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で４週間培養し、カルスをグリーン化した。
【０１９４】
（不定胚及びシュート形成（再生誘導工程））
次に、グリーン化したカルスを用いて、該カルスから不定胚及びシュートを形成させた（再生誘導工程）。具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、糖類であるスクロースをそれぞれ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、３質量％となるように添加した培地を用いた。また、ｐＨは、５．７に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した固体培地（滅菌済み）を用いて、グリーン化したカルスを培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間以上培養した。その結果、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。
【０１９５】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好にシュート伸長が観察された。
【０１９６】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、植物成長ホルモンを含まないＢ５培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好に発根が観察され、形質転換植物が得られた。
【０１９７】
（比較例１）
形質転換のステップ（アグロバクテリウム属菌調製工程〜選択培養工程）を行わなかった以外は、実施例１と同様の操作を行い、非形質転換植物を得た。
【０１９８】
得られた形質転換植物、非形質転換植物を用いて、以下の評価を行なった。
【０１９９】
（遺伝子発現量の分析）
得られた形質転換植物、非形質転換植物を草丈２０cm程度になるまで栽培したのち、その得られた植物における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）により解析して比較した。比較例１の各遺伝子のＲＮＡ量を１００として、各遺伝子のＲＮＡ量を指数表示した。指数が大きいほど、各遺伝子のＲＮＡ量が多いことを示す。その結果より、非形質転換植物よりも形質転換植物において、ＨＭＧＲ遺伝子発現量、ＩＰＩ遺伝子発現量が増加していることがわかった。
【０２００】
また、形質転換植物、非形質転換植物の茎部分を凍結乾燥させ、乳鉢を用いて粉砕した。その後、メタノールを用いて不純物を除去した後、トルエンを用いてゴム成分を抽出した。比較例１のゴムの合計量を１００として、ゴムの合計量を指数表示した。指数が大きいほど、天然ゴム（イソプレノイド）の生産量が多いことを示す。
【０２０１】
実施例１及び比較例１で得られたゴムの重量平均分子量（Ｍｗ、ポリスチレン換算）を、下記（１）〜（７）の条件で、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリイソプレン、標準ポリスチレン
測定結果を表５に示す。
【０２０２】
【表５】
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【０２０３】
表１〜５より、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物由来の組織をカルス誘導化条件で２〜７週間培養して得られたカルスに、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該標的遺伝子を獲得したカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含む方法により、Ｓｏｎｃｈｕｓ属植物の形質転換植物を効率的に作成できることが分かった。また、ＨＭＧＲの導入により、ＩＰＩの発現量も増加した。
【図１】
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