(57)【要約】【課題】合成培地における幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の培養に有用な合成表面を提供する。【解決手段】  本発明の幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養するために適切な合成表面は、一ないし複数のアクリレートモノマーから形成されるアクリレートポリマーを含有する。アクリレート表面は、多くの場合、幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞を合成培地中で培養するために適切である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は、２００８年１月３０日出願の米国仮出願番号６１／０６３０１０の優先権を主張するものであって、出典明記によってその全体が援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示内容は、細胞培養物品及びその使用方法、特に幹細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養を支援するための物品に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト胚性幹細胞(ｈＥＳＣ)などの多能性幹細胞には、ヒトの身体のいずれかの種類の成熟細胞を生じる３つの胚葉のいずれかに分化する能力を有する。この優れた特性は、糖尿病、脊髄損傷、心臓病などといった多くの重症細胞変性疾患のための新規の治療を開発する可能性をもたらす。例えば、脊髄損傷は一般に、現在の治療によっては回復不可能であり、約２５万人のアメリカ人を絶望的な状況にしている。しかしながら、幹細胞研究が進んでいるので、脊髄損傷に苦しむ人々に新しい可能性への期待をもたらしている。ＥＳ細胞由来の神経系細胞は、動物モデルにおける神経系障害を治療するために研究者によって使用されている。以前の研究では、研究者は、マウスＥＳ細胞が、神経障害を有するマウスに移植すると正常な機能の回復を促す神経系細胞に分化するように刺激されうることを示した。
【０００４】
しかしながら、前記のようなｈＥＳＣを基にした治療の開発には障害が残っている。この障害とは、組織培養中に十分な数の未分化ｈＥＳＣを得て維持することと、特定の細胞種を産生させるために細胞の分化を制御することなどである。ｈＥＳＣ細胞培養物などの幹細胞培養物は、一般に、細胞バンクないし貯蔵物から少量の細胞を播種し、次いで所定の医療用途のために分化が望まれるまで未分化状態で増幅させる。これを達成するために、ｈＥＳＣないしその分化細胞は、現在のところ、フィーダー層、胎児ウシ血清又はマトリゲル(登録商標)といった動物由来の成分を含有する表面又は培地の存在下で培養される。培養環境に対するこれら動物由来添加物は、細胞を、患者に移すか又はｈＥＳＣの培養全般及び維持を損なわせる有害になりうるウイルスや他の感染性因子に曝す。さらに、このような生物由来物質はバッチ変異、免疫応答及び有効期間の制限を受けやすい。
【０００５】
動物由来の成分を含んでいない培地又は表面上でｈＥＳＣを培養するためにいくつかの工程が取られていた。しかしながら、ｈＥＳＣないしはその分化した誘導体の反応は、表面又は培養培地の変化の要素として予測することが難しい。にもかかわらずいくらかの進歩があった。例えば、ｈＥＳＣ由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞(ＯＰＣ)は規定の無血清培地中で培養されている。このような培養系は、使用するマトリクスがゼラチンやマトリゲルのような動物由来の成分を含む場合に完全に無異物培養系とはならないが、ｈＥＳＣ由来ＯＰＣの最終的な臨床応用に向けての一歩となる。更なる例として、ヒト上皮幹細胞の上皮細胞への分化を促しうる合成表面がいくつか同定された。しかしながら、使用する系は細胞培養のために血清培地に頼っており、やはりすべての生物学的な動物由来成分について前述のような問題が起こる可能性がある。今まで、幹細胞又は幹細胞由来の細胞を培養するために、合成培地及び合成表面を用いた完全に動物を含まない系は、未だ同定されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本開示内容は、とりわけ、合成培地における幹細胞由来のＯＰＣの培養に有用な合成表面を開示する。
【０００７】
ある実施態様では、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養方法が提供される。この方法には、ポリマー物質上にオリゴデンドロサイト前駆細胞を含有する懸濁液を沈着させること、及び細胞培養培地中で沈着したオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養することが含まれる。ポリマー物質には、選択された一ないし複数のアクリレートモノマーのホモポリマー又はコポリマーが含まれる。
【０００８】
ある実施態様では、オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養物が提供される。この培養物には、表面上に配置されたポリマー物質を有する物品が含まれる。この培養物にはさらに、ポリマー物質上に配置されたオリゴデンドロサイト前駆細胞及び、オリゴデンドロサイト前駆細胞が培養された培養培地が含まれる。ポリマー物質には、選択された一ないし複数のアクリレートモノマーのホモポリマー又はコポリマーが含まれる。
【０００９】
ある実施態様では、合成培地においてオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養するための細胞培養物品が提供される。この物品には、表面と表面上に配置されたポリマー物質が含まれる。ポリマー物質には、選択された一ないし複数のアクリレートモノマーのホモポリマー又はコポリマーが含まれる。
【００１０】
本明細書中で示す様々な実施様態の一ないし複数は、幹細胞由来のＯＰＣを培養するための従来の表面よりも一ないし複数の利点を提供する。例えば、本合成表面は、動物源から生じるないしは動物源由来の成分を有する表面に関連する起こりうる混入物の問題を低減する。また、このような表面は、生物学的成分を含む表面と比較して保存期間を改善しうる。さらに、合成培地中での幹細胞由来ＯＰＣを培養する能力は、潜在的な混入物の問題を低減する。さらに、合成表面又は合成培地の能力においてバッチ間変異がほとんどなく、培養産物及び予測値の再現性が改善されるであろう。添付の図面と合わせて読むと以下の詳細な説明からこれら及び他の利点は容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ−Ｂは、合成ポリマー層でコートした物品の側面の略図である。
【図２】図２Ａ−Ｃは、壁を有する細胞培養物品の横断面の略図である。未コート表面(図２Ａ)、コート表面(図２Ｂ)、及びコートした表面と側壁(図２Ｃ)。
【図３】図３Ａ−Ｃは、２８日目から３５日目の間の、アクリレートコート表面１２３−２(Ａ)及び９５−２(Ｂ)、そしてポジティブコントロール表面のマトリゲル(Ｃ)上に再プレーティングした後に免疫染色したｈＥＳ細胞由来のＯＰＣの蛍光画像である。ヒトＥＳ細胞由来のＯＰＣをＯＰＣマーカーであるＯｌｉｇｌ(緑)及びネスチン(赤)について免疫染色した。
【図４】図４Ａ−Ｃは、２８日目から３５日目の間並びに３５日目から４２日目の間の、アクリレートコート表面１２３−２(Ａ)、１２２−３(Ｂ)、及びマトリゲルＴＭ(Ｃ)上に再プレーティングした後に免疫染色したｈＥＳ細胞由来のＯＰＣの蛍光画像である。ヒトＥＳ細胞由来のＯＰＣをＯＰＣマーカーであるＯｌｉｇｌ(緑)及びネスチン(赤)について免疫染色した。
【図５】図５Ａ−Ｆは、マトリゲルＴＭ(Ａ)、及びアクリレートコート表面２２−２(Ｂ)、２２−３(Ｃ)、１３３−４(Ｄ)、２４−１０(Ｅ)及び７２−２(Ｆ)上のｈＥＳ細胞由来ＯＰＣの蛍光画像である。
【００１２】
図は必ずしも目盛りを必要としない。図に用いた数字類は成分、工程などを指す。しかしながら、図中の成分を指すための数字の使用は、同じ番号を付した他の図中の成分を限定するものではないことは理解されるであろう。さらに、成分を指すための異なる数字の使用は、異なる番号を付した成分が同じ又は類似のものではないことを表すことを意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（詳細な説明）
以下の詳細な説明では、この一部となる添付の図を参照されたい。これらの図は、装置、システム及び方法のいくつかの具体的な実施態様を例として示す。他の実施態様が考慮され、本開示内容の権利範囲又は要旨を逸脱しないで実施されうることは理解されるであろう。したがって、以下の詳細な説明は限定的に捉えられるものではない。
【００１４】
特に定めのない限り、本明細書中で用いるすべての科学的及び技術的用語は、当分野で通常用いられる意味を有する。本明細書中で示す定義は、本明細書中でたびたび用いる特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示内容の権利範囲を限定することを意味するものではない。
【００１５】
内容から明示的に決定されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数形のものを有する実施態様も包含する。内容から明示的に決定されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、「又は」なる用語は一般に、「及び／又は」を含む趣旨で用いられる。
【００１６】
特別に記載しない限り、溶液などの組成物中の化合物の比率は容量を基準に表す。
本明細書中で用いられるように、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」、「含む」、「含んでいる」などはオープンエンドな趣旨で用いられ、一般に「含むがこれらに限定しない」ことを意味する。
【００１７】
本開示内容は、とりわけ、幹細胞由来ＯＰＣを培養するための合成表面を有する物品、及び該表面上での幹細胞由来ＯＰＣの培養方法を記載する。いくつかの実施態様では、合成表面は、幹細胞由来ＯＰＣを培養するために合成培地と組み合わせて用いられる。表面は、ｈＥＳＣといった幹細胞をＯＰＣに分化させる際に、又はこのような幹細胞由来ＯＰＣを増殖させるために有用であろう。
【００１８】
１．細胞培養物品
図１に関して、細胞を培養するための物品(１００)の略図を示す。物品(１００)は、表面(１５)を有する基材物質(１０)を具備する。合成ポリマーコーティング層(２０)は基材物質(１０)の表面(１５)上に配置される。図示していないが、合成ポリマーコーティング(２０)は基材物質(１０)の一部の上に配置されてもよい。基材物質(１０)は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーないしはコポリマー、これらいずれかの組み合わせ、又は他のものの上にある物質のコーティングといった、細胞を培養するために適する任意の物質でよい。このような基材物質(１０)には、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコールガラス、シリカガラスといったガラス物質；シリコン；樹枝状ポリマー類を含むプラスチック類ないしはポリマー類、例えばポリ(ビニルクロライド)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアセテート-無水マレイン酸)、ポリ(ジメチルシロキサン)モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー類、フッ素樹脂類、ポリスチレン類、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン；コポリマー、例えばポリ(ビニルアセテート-コ無水マレイン酸)、ポリ(スチレン-コ無水マレイン酸)、ポリ(エチレン-コアクリル酸)ないしはこれらの誘導体などが含まれる。
【００１９】
細胞培養に適する物品(１００)の例には、６、１２、９６、３８４及び１５３６ウェルプレートといったマルチウェル及びシングルウェルのプレート、広口瓶、シャーレ、フラスコ、ビーカー、プレート、回転瓶、チャンバー及びマルチチャンバー培養スライドといったスライド、チューブ、カバースライド、カップ、攪拌瓶、灌流チャンバー、バイオリアクター、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ(登録商標)及び発酵槽が含まれる。
【００２０】
合成ポリマーコーティング(２０)は、細胞が培養される表面(２５)を提供する。合成ポリマー表面(２０)には、以下の表１に示されるモノマーの群から選択される、重合化アクリレートモノマー類が含まれる。生物模倣表面を製造するために、ペプチド類といった他の物質(表に示していない)が合成ポリマー表面に組み込まれるか又は接合されてもよい。
【００２１】
【表１】
2015097533.tif 000002
2015097533.tif 000003
2015097533.tif 000004
【００２２】
表１に列挙されるアクリレートは、当分野において周知なように合成されても、又はポリサイエンス社、シグマ・アルドリッヒ社及びサートーマー社といった販売会社から入手してもよい。
【００２３】
図１Ｂに示すように、基材(１０)の表面(１５)と合成ポリマーコーティング(２０)との間に中間層(３０)が配置されてもよい。中間層(３０)は基体(１０)へのコーティング(２０)の結合を向上するように構成され、モノマー伸展を容易にし、コートした領域上での細胞増殖を促すためにコートされていない表面(１０)の部分に細胞を寄せ付けなくさせ、モノマー又は溶媒が基材(１０)に適合しない場合にモノマー又は溶媒に適合する基体を提供し、必要であれば例えばパターン化されたプリンティングなどにより地形的な特徴を提供する。例えば、基体(１０)がガラス基体である場合、ガラス基体の表面をシラン分子又はエポキシコーティングにて処理することが望ましい。様々なポリマー基材(１０)のために、ポリアミド、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリエチレン(polyethtylene)又はポリアクリラートの中間層(３０)を提供することが望ましい。図示されてはいないが、合成ポリマーコーティング(２０)が中間層(３０)の一部に配置されてもよいことは理解されるであろう。さらに、中間層(３０)が基材(１０)の一部に配置されてもよいことは理解されるであろう。
【００２４】
様々な実施態様では、基材(１０)の表面(１５)は物理的又は化学的に処理され、望ましい性質又は特徴を表面(１５)に与える。例えば、そして、後述するように、表面(１５)はコロナ処理又はプラズマ処理されてよい。真空又は大気圧プラズマの例には、一次及び二次の高周波(ＲＦ)及びマイクロ波プラズマ、誘電バリア放電、及び分子ないしは空気、酸素、窒素、アルゴン、二酸化炭素、亜酸化窒素又は水蒸気を含む混合ガスにおいて生成されるコロナ放電が含まれる。
【００２５】
中間層(３０)に配置されているか又は基材(１０)に配置されているかにかかわらず、合成ポリマーコーティング層(２０)は下層の基体を均一にコートするのが好ましい。「均一にコートされる」とは、所定の領域、例えば培養プレートのウェルの表面の層(２０)がおよそ５ｎｍ以上の厚で完全にその領域をコートしていることを意味する。均一にコートされた表面の厚が表面全体にわたって変化してもよいが、均一にコートされた表面の領域には下層の層(中間層(３０)又は基材(１０))が露出している領域はない。均一でない表面全体の細胞応答は、均一表面全体の細胞応答より可変性が高い傾向がある。
【００２６】
合成ポリマーコーティング層(２０)は任意の望ましい厚を有してよい。しかしながら、厚いコーティング、例えばおよそ１０マイクロメートルを超えるコーティングは表面張力によりコーティング表面周辺に起伏を起こす傾向があることがわかっている。様々な実施態様では、コーティング層(２０)の厚は、およそ１０マイクロメートル未満である。例えば、厚は、およそ５マイクロメートル未満、およそ２マイクロメートル未満、およそ１マイクロメートル未満、およそ０．５マイクロメートル未満又はおよそ０．１マイクロメートル未満でもよい。
【００２７】
合成ポリマー層(２０)を形成しているポリマー物質は任意の適切な程度に架橋されてよい。高い架橋度は、老廃物を減らし、細胞毒性を減らす結果となりうる。
【００２８】
多数の実施態様では、物品(１００)は、ウェルを有する細胞培養製品、例えばシャーレ、マルチウェルプレート、フラスコ、ビーカー又はウェルを有する他の容器である。図２に関して、基材(１０)から形成される物品(１００)は一ないし複数のウェル(５０)を具備してよい。ウェル(５０)は側壁(５５)及び表面(１５)を含む。図２Ｂ−Ｃに関して、合成ポリマーコーティング(２０)が、表面(１５)又は側壁(５５)(又は、上記の図１について述べたように、一ないし複数の中間層(３０)が表面(１５)又は側壁(５５)と合成ポリマーコーティング(２０)との間に配置されてもよい)又はその一部に配置されていてもよい。
【００２９】
様々な実施態様では、物品(１００)は、およそ５ｍｍ２より大きい領域を有する表面(２５)を有する均一にコートされた層(２０)を具備する。ヒト胚性幹細胞といったいくつかの細胞は(例えば、およそ０．５ｍｍの直径を有する)細胞のコロニー又はクラスターとして播かれ、定量的な細胞応答を生産させるために十分な数のコロニーを接着させるための十分な表面が望ましいので、表面(１５)の領域が小さすぎる場合、確実な細胞応答が容易に観察されない。多数の実施態様では、物品(１００)は、均一にコートされた表面(１５)を有するウェル(５５)を有し、この表面(１５)はおよそ０．１ｃｍ２より大きい、およそ０．３ｃｍ２より大きい、およそ０．９ｃｍ２より大きい、又はおよそ１ｃｍ２より大きい領域を有する。
【００３０】
２．合成ポリマー層のコーティング
合成ポリマー層は、公知又は将来開発される工程により細胞培養物品の表面に配置されてよい。好ましくは、合成ポリマー層は、典型的な細胞培養状態の間に剥離しない均一層を提供する。合成ポリマー表面は、共有結合性又は非共有結合性の相互作用により基材物質と結合してもよい。合成ポリマー表面を基体と結合させうる非共有結合性の相互作用の例には、化学的吸着、水素結合、表面相互浸透、イオン的結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、双極子相互作用、力学的連動、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００３１】
様々な実施態様では、基材物質表面は、同時係属中出願番号＿の教示にしたがってコートされる。この出願は、本願と同日に出願され、ゲーマン等を発明者とし、代理人番号２０７２６であり、幹細胞培養物品及びスクリーニングと題するものであり、本明細書において示す開示内容と矛盾しない範囲で、すべての目的のために、出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。
【００３２】
多数の実施態様では、モノマーは、細胞培養物品の表面上に沈着され、インサイツで重合化される。このような実施態様では、基材は、本明細書において、合成ポリマー物質が沈着される「基体」と称される。重合化は、溶液相中で起こっても、凝集相中で起こってもよい。
【００３３】
上の表１に示されるモノマーの多くは粘性があるので、適切な溶媒にモノマーを希釈させて、表面上に分注される前に粘性を低減するのが望ましい。粘性を低減することによって形成される合成ポリマー物質の層が薄くより均一になりうる。当業者は適切な溶媒を容易に選択することができるであろう。溶媒は、細胞培養物品を形成している材料及びモノマーに適合するのが好ましい。培養される細胞に毒性がなく、重合化反応に干渉しない溶媒を選択することが望ましい。あるいは、又は、加えて、実質的に完全に取り除かれうるか又は、毒性がないないしは重合化にもはや干渉しない程度にまで取り除かれうる溶媒を選択することが望ましい。更なる実施態様では、基体と相互作用しない溶媒を選択することが望ましい。さらに、溶媒は、真空又は高温といった過酷な条件なしに容易に取り除かれることが望ましい。揮発性溶媒は、このような容易に取り除くことができる溶媒の例である。同時係属中の出願番号＿にて記載されるように、重合化前に溶媒を取り除くことが望ましい場合には、エタノールは特に適切な溶媒でありうる。
【００３４】
モノマーは、所望の粘度及びモノマー濃度を達成するために適切な任意の量に溶媒で希釈されてよい。一般に、本明細書において示される教示に従って用いられるモノマー組成物は、およそ０．１％〜およそ９９％のモノマーを含有する。例として、モノマーは、体積にしておよそ０．１％からおよそ５０％のモノマー、又はおよそ０．１％からおよそ１０％のモノマーを有する組成物となるようにエタノール溶媒で希釈されてよい。ポリマー層(２０)が所望の厚となるように、モノマーが溶媒で希釈されてもよい。上記のように、沈着されたモノマーが厚すぎる場合、起伏のある表面となりうる。実施例において更に詳細に説明するように、モノマー−溶媒組成物が１平方センチメートルの表面(１５)につきおよそ８マイクロリットルより多い容量でウェル(５０)の表面(１５)上に沈着される場合、起伏のある表面が観察されうる。様々な実施態様では、モノマー−溶媒組成物は、１平方センチメートルの表面(１５)につきおよそ７マイクロリットル以下の容量でウェル(５０)の表面(１５)上に沈着される。例えば、モノマー−溶媒組成物は、１平方センチメートルの表面(１５)につきおよそ５マイクロリットル以下、又は１平方センチメートルの表面(１５)につきおよそ２マイクロリットル以下の容量でウェル(５０)の表面(１５)上に沈着されてよい。
【００３５】
様々な実施態様では、物品(１００)は、およそ５ｍｍ２より大きい領域を有する表面(２５)を有する均一にコートされた層(２０)を具備する。ヒト胚性幹細胞といったいくつかの細胞は(例えば、およそ０．５ｍｍの直径を有する)細胞のコロニー又はクラスターとして播かれ、定量的な細胞応答を生産させるために十分な数のコロニーを接着させるために十分な表面が望ましいので、表面(１５)の領域が小さすぎる場合、確実な細胞応答が容易に観察されない。多数の実施態様では、物品(１００)は、均一にコートされた表面(１５)を有するウェル(５５)を有し、この表面(１５)はおよそ０．１ｃｍ２より大きい、およそ０．３ｃｍ２より大きい、およそ０．９ｃｍ２より大きい、又はおよそ１ｃｍ２より大きい領域を有する。
【００３６】
様々な実施態様では、直接、又は、一ないし複数の付加的な中間層により、合成ポリマー表面が、共有結合的又は非共有結合的な相互作用により基材と結合している中間層の表面上に沈着される(図示しない)。このような実施態様では、中間層は、本明細書において、合成ポリマー表面が沈着される「基体」と称される。
【００３７】
様々な実施態様では、基材の表面は処理される。表面は、基材表面への合成ポリマー表面の結合を向上させるために処理され、基材表面上でのモノマー伸展などを促しうる。もちろん、基材は、中間層と同様の目的のために処理されてもよい。様々な実施態様では、表面はコロナ処理されても真空プラズマ処理されてもよい。このような処理から得られる高い表面エネルギーは、モノマー伸展及び均一なコーティングを容易にしうる。使用されうる真空プラズマ処理の例には、マイクロ波真空プラズマ処理と高周波真空プラズマ処理が含まれる。真空プラズマ処理は、反応性ガス、例えば酸素、窒素、アンモニア又は亜酸化窒素の存在下で実施されてもよい。
【００３８】
合成ポリマー表面を形成するために、上の表１に示される一ないし複数のモノマーが重合化される。１つのモノマーが使われる場合、ポリマーはモノマーのホモポリマーと称されるであろう。２つ以上の異なるモノマーが使われる場合、ポリマーはモノマーのコポリマーと称されるであろう。使用されるモノマーは、単官能基、二官能基、又は高次官能基であってよい。２つ以上のモノマーが使われる場合、モノマーの比率は変化してもよい。様々な実施態様では、２つのモノマーが使われ、第一モノマーの第二モノマーに対する体積当たりの比率は、およそ５：９５からおよそ９５：５である。例えば、第一モノマーの第二モノマーに対する比率は、およそ１０：９０からおよそ９０：１０、およそ２０：８０からおよそ８０：２０、およそ３０：７０からおよそ７０：３０である。いくつかの実施態様では、第一モノマーの第二モノマーに対する比率は、およそ５０：５０、３０：７０又は１０：９０である。ポリマーの架橋の程度が、モノマーの濃度又は、単官能基のモノマーに対する二官能基又は高次官能基のモノマーの比率を変化させることによって制御されうることは理解されるであろう。二官能基又は高次官能基のモノマーの濃度の増加は、鎖の架橋度を増やすであろう。
【００３９】
ポリマー層を形成するモノマーに加えて、層を形成する組成物は、一ないし複数の更なる化合物、例えば界面活性剤、湿潤剤、光発動因子、熱発動因子、触媒、活性化因子及び架橋剤を含んでもよい。
【００４０】
任意の適切な重合発動因子が使用されてよい。当業者は、表１に列挙されるモノマーの使用に適する適切な発動因子、例えばラジカル発動因子又はカチオン発動因子を容易に選択することができるであろう。様々な実施態様では、紫外線を用いて、連鎖重合を開始させるためにフリーラジカルモノマーを生成させる。
【００４１】
任意の適切な発動因子が用いられてよい。重合発動因子の例には、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン類、ニトロソ化合物、ハロゲン化アシル類、ヒドラゾン類、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール類、クロロトリアジン類、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル類、ジケトン類、フェノン類(phenones)、又はこれらの混合物が含まれる。適切に市販されており、紫外線により活性化される及び可視光により活性化される光誘導因子の例は、チバ・スペシャルティ・ケミカルズ(ニューヨーク州タリータウン)から市販されているＩＲＧＡＣＵＲＥ６５１、ＩＲＧＡＣＵＲＥ１８４、ＩＲＧＡＣＵＲＥ３６９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ８１９、ＤＡＲＯＣＵＲ４２６５及びＤＡＲＯＣＵＲ１１７３や、ＢＡＳＦ(ノースカロライナ州シャーロット)から市販されているＬＵＣＩＲＴＮ ＴＰＯ及びＬＵＣＩＲＩＮ ＴＰＯ-Ｌといった商標を有する。
【００４２】
また、光感受性物質が適切な発動因子系に含まれてもよい。代表的な光感受性物質は、カルボニル基又は第三アミノ基又はこれらの混合を有する。カルボニル基を有する光感受性物質には、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ-クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９,１０-アントラキノン、及び他の芳香族ケトン類が含まれる。第三アミンを有する光感受性物質には、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチル−エタノールアミン、及びジメチルアミノエチルベンゾエートが含まれる。市販の光感受性物質には、ビドル・ソイヤー・コーポレーションのＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＩＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＱＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＰＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ ＥＰＤが含まれる。
【００４３】
一般に、光感受性物質又は光発動因子系の量は、およそ０．０１から１０重量％でよい。
【００４４】
カチオン発動因子の例には、アリールスルホニウム塩類といったオニウム陽イオンの塩類、並びにイオンアレーンシステムといった有機金属塩類が含まれる。
【００４５】
モノマーが基体表面上に沈着される前に溶媒中で希釈される様々な実施態様では、溶媒は重合する前に取り除かれる。溶媒は、任意の適切なメカニズム又は工程によって取り除かれてよい。同時係属中の出願番号＿にて記載されるように、硬化(curing)前に実質的にすべての溶媒が除去されると、硬化動態及び転換されるモノマーの量が良好に制御される。モノマーの転換速度が増すと、老廃物の生成及び細胞毒性は低減される。
【００４６】
凝集相(実質的に溶媒を含まない)で重合されるか溶媒相で重合されるかにかかわらず、モノマーは適切な発動メカニズムにより重合化される。このようなメカニズムの多くは当分野で公知である。例えば、温度は熱発動因子を活性化するために上げられてもよいし、光発動因子は適切な波長の光に曝されることによって活性化されるなどしてよい。多数の実施態様によると、モノマー又はモノマー混合物は紫外線を使用して硬化される。酸素阻害を予防するために、硬化は、窒素保護などの不活性ガス保護下で起こすのが好ましい。ガス保護と組み合わされる適切な紫外線は、ポリマー転換を増やし、コーティング完全性を保証し、細胞毒性を低減しうる。
【００４７】
硬化した合成ポリマー層は、溶媒にて一ないし複数回洗浄され、反応していないモノマー又は低分子量のポリマー種といった不純物が除去される。様々な実施態様では、層は、エタノール溶媒、例えば７０％エタノール、およそ９０％を超えるエタノール、およそ９５％を超えるエタノール、又はおよそ９９％を超えるエタノールにて洗浄される。エタノール溶媒による洗浄は、不純物を除去するのに役立つだけでなく、細胞とインキュベートする前に表面を殺菌するのにも役立ちうる。
【００４８】
３．合成ポリマー層上での細胞のインキュベート
幹細胞由来のＯＰＣは、任意の好適なプロトコールに従って、上記のような合成ポリマー層上で培養されてよい。ここで使用しているように、「幹細胞由来のＯＰＣ」とは、幹細胞の分化から得られるＯＰＣを意味する。いくつかの実施態様では、幹細胞は、多分化能、分化全能性、又は多能性の幹細胞である。幹細胞は被検体の臓器又は組織にも存在しうる。多数の実施態様では、幹細胞は、胚性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞である。ここで使用しているように、「ＯＰＣ」又は「オリゴデンドロサイト前駆細胞」は、ミエリン形成オリゴデンドロサイトへの前駆細胞を意味する。
【００４９】
ヒト胚性幹細胞(ｈＥＳＣ)は未分化状態で培養中で継続的に増殖する能力を有し、本発明に用いられるｈＥＳＣは樹立された細胞株から得られてよい。樹立されているヒトの胚性幹細胞株の例には、Ｈｌ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３又はＨｌ４(ウィスコンシン州大学により樹立されたWiCeIlから入手可能) (Thompson (1998) Science 282:1145 )；ｈＥＳＢＧＮ-０１、ｈＥＳＢＧＮ-０２、ｈＥＳＢＧＮ-０３ (ブレサジェン社、ジョージア州アセンズ)；ＨＥＳ-１、ＨＥＳ-２、ＨＥＳ-３、ＨＥＳ-４、ＨＥＳ-５、ＨＥＳ-６(シンガポールのＥＳセル・インターナショナル社から)；ＨＳＦ-１、ＨＳＦ-６(サンフランシスコのカリフォルニア州立大学から)；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２(イスラエル、ハイファ市のテクニオン-イスラエル工科大学で得られる)；ＵＣＳＦ-１及びＵＣＳＦ-２ (Genbacev et al., Fertil. Steril. 83(5): 1517-29, 2005)；株ＨＵＥＳ１-１７ (Cowan et al., NEJM 350(13): 1353-56, 2004)；及び、株ＡＣＴ-１４(Klimanskaya et al., Lancet, 365(9471): 1636-41, 2005)が含まれるがこれらに限定されない。また、本発明で使用する胚性幹細胞は、一次胚組織から直接得られてもよい。一般的に、胚盤胞段階、そうでなければ廃棄される凍結インビトロ受精卵を使用して行われる。
【００５０】
また、本発明に記載のＯＰＣは、誘導された霊長類多能性幹(ｉＰＳ)細胞から分化されてもよい。ｉＰＳ細胞は、例えば一ないし複数の適切なベクターによる形質移入によって遺伝学的に変更され、ｈＥＳＣなどの多能性幹細胞の表現型を達成するように再プログラミングされた、ヒトなどの若年又は成熟した哺乳動物から得られた細胞を指す。これらの再プロミングされた細胞によって達成される表現型の特徴には、胚盤胞から単離される幹細胞に似た形態、並びに胚盤胞由来の胚性幹細胞に似た表面抗原発現、遺伝子発現及びテロメラーゼ活性が含まれる。ｉＰＳ細胞は、一般に、一次胚葉である外胚葉、内胚葉及び中胚葉の各々から少なくとも一つの細胞種に分化する能力を有するので、ＯＰＣへの分化に適する。また、ｈＥＳＣのようなｉＰＳ細胞は、免疫欠陥マウス、例えばＳＣＩＤマウスに注射されると、テラトーマを形成する。(Takahashi et al., (2007) Cell 131(5): 861；Yu et al., (2007) Science318: 5858)。
【００５１】
幹細胞由来のＯＰＣは任意の適切な方法によって得られてよい。このような細胞を得る１つの方法は、Nistor et al., Human embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes in high purity and mylenate after spinal cord transplantation, GUa 49: 385-396 (2005)を引用する、Zhang et al.., "Oligodendrocyte progenitor cells derived from human embryonic stem cells express neurotrophic factors, Stem Cells and Development, 15: 943-952 (2006)において記述される。簡単にいうと、未分化なヒト胚性幹細胞、例えばＨｌ又はＨ７のヒト胚性幹細胞株から得られる細胞を、およそ８ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子-２(ＦＧＦ-２)を添加したマウス胎仔線維芽細胞(ＭＥＦ)条件培地(ＣＭ)中、又はおよそ８０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ-２及び０．５ｎｇ／ｍｌの形質転換増殖因子-βｌ(ＴＧＦ-βｌ)を添加した、Ｃａｍｂｒｅｘ社のＸ−ＶＩＶＯ１０などの合成培地中で、マトリゲルコートプレート上で培養してよい。分化を誘導するために、ニストール等によって記述されるプロトコールが使用されてもよい。簡単にいうと、ヒト胚性幹細胞は、コラゲナーゼ消化し、掻爬し、そして、超低接着プレート上で２８日間、インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、セレニウム、トリヨードチロイジン(triiodothyroidin)及びＢ２７を添加した限定培地中で培養してよい。次いで、細胞は、増殖因子を減らしたマトリゲル上でさらに１４日間、限定培地中で培養してよい。次いで、細胞は、分化の間、一定の日にＦＧＦ-２、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)及びオールトランスレチノイン酸にて処理してよい。分化は、数日、例えば４２日にわたって起こりうる。もちろん、任意の他の好適な方法が用いられてもよい。
【００５２】
細胞を播く前に、細胞は回収され、いったん細胞が表面上に播かれて培養される成長培地などの好適な培地に懸濁されてよい。例えば、細胞は、血清添加培地、条件培地又は合成培地に懸濁され、培養されてよい。ここで使用しているように、「合成培地」とは、組成が不明な構成成分を含有しない細胞培養培地を意味する。合成培地は、様々な実施態様では、組成が不明なタンパク質、ヒドロシレート類(hydrosylates)又はペプチドを含有しない。いくつかの実施態様では、条件培地は、組み換え成長ホルモンなどの、組成が明らかなポリペプチド又はタンパク質を含有する。合成培地中のすべての成分は公知の化学構造を有するので、培養条件及びそれによる細胞応答の多様性は減少し、再現性が上がりうる。さらに、混入の可能性が減少する。さらに、上記の要因の少なくとも一部により、スケールアップが容易になる。
【００５３】
細胞は任意の適切な濃度で播かれてよい。一般的に、細胞は、基体当たりおよそ１００００細胞／ｃｍ２からおよそ５０００００の細胞／ｃｍ２で播かれる。例えば、細胞は、基体当たりおよそ５００００細胞／ｃｍ２からおよそ１５００００細胞／ｃｍ２で播かれてもよい。しかしながら、さらに高い又は低い濃度が容易に用いられてよい。インキュベート時間や、温度、ＣＯ２及びＯ２レベル、増殖培地などといった条件は培養する細胞の性質に依存し、容易に変更されうる。細胞が表面上でインキュベートされる時間量は、調べる細胞応答又は所望の細胞応答に応じて変化してもよい。
【００５４】
必要に応じて任意の適切な方法を用い、幹細胞由来ＯＰＣが実際にＯＰＣであること、又は、使用する幹細胞がＯＰＣにうまく分化したことを確認してよい。例えば、特定のＯＰＣ選択マーカーの存在が調査されてもよい。このようなマーカーには、ネスチン、Ｏｌｉｇｏｌ、血小板由来増殖因子レセプターα(ＰＤＧＦＲα)及びＮＧ２が含まれる。このようなマーカーに対する抗体が、標準的な免疫細胞化学技術又はフローサイトメトリー技術に用いられてよい。さらに、又は、あるいは、培地中で検出可能な細胞の形態又は増殖因子の生産が評価されてもよい。例えば、培養されたＯＰＣは、一ないし複数のアクチビンＡ、ＨＧＦ、ミッドカイン及びＴＧＦ-β２を生産し得、これらは、ＥＬＩＳＡなどの標準的なアッセイにより培養培地中で検出されうる。
【００５５】
培養された幹細胞由来ＯＰＣは、治療用途の開発又は治療目的のための培養物、動物における調査研究といった、任意の適切な目的のために使用されうる。ある一つの治療ないし調査目的は脊髄損傷による障害の修復である。
【００５６】
以下に、非制限的な実施例を示し、先に述べた物品及び方法の様々な実施態様を記述する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：合成培地中で幹細胞由来のＯＰＣを培養するために適するアクリルコーティング表面の同定
１．コーティング調製物
アクリルコーティング表面は、様々なアクリレートモノマーのホモモノマー又はコポリマーから調製した。コポリマーのために、２つの異なるアクリレートモノマーを用いた。合計２４のホモポリマーと５５２のコポリマーの組合せをウェルに加えた。簡単にいうと、モノマーを、エタノールとＩＲＧＡＣＵＲＥ８１９光誘導因子に１：９：０．０１(モノマー[容量]／エタノール[容量]／光誘導因子[重量])の比に希釈し、製剤を調製した。コポリマーのために、２つの異なるモノマーを、７０：３０又は３０：７０の容量比で混合した。コポリマー製剤において、総モノマー[容量]／エタノール[容量]／光誘導因子[重量]は、依然として１：９：０．０１の比率のままである。製剤は、バイオテック社のＰｒｅｃｅｓｓｉｏｎマイクロプレートピペッティングシステムを用いて、プラズマ処理した環状オレフィンコポリマー９６ウェルプレート(コーニング・ライフ・サイエンスの開発グループによって提供される)のウェルに５μＬの容量で置いた。各ウェルに、所定のホモポリマー又はコポリマーの組合せを入れ、いくつかのウェルはポジティブコントロールとしてのマトリゲルにてコートした。アクリレートモノマーにてコートしたウェルについて、室温で３時間蒸発させることによってエタノール溶媒を取り除き、＞９９％のエタノールを取り除いた。次いで、コーティングは、Ｎ２浄化ボックス(溶融シリカ窓を有する)中で１分間、１３ｍＷ／ｃｍ２パルス(１００Ｈｚ)紫外光(Ｘｅｎｏｎ ＲＣ−８０１)にて硬化した。硬化後、洗浄工程を行った。簡単にいうと、９６ウェルプレートの各ウェルの表面を、２００μＬの＞９９％エタノールと１時間インキュベートし、その後２００μＬの水と終夜インキュベートして、抽出されうるものを移動させた。最後に、表面を空気乾燥し、その後殺菌した。
【００５８】
２．細胞調製物とアッセイ
ｈＥＳＣ由来のＯＰＣのために、Ｈ１ ｈＥＳＣコロニーを、２００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶを用いて分離し、コーニング超低接着(ＵＬＡ)プレートへ移し、胚様体(ＥＢ)を形成させた。神経分化を誘導するために、ＥＢを、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＦＧＦ-２(線維芽細胞増殖因子-２)及びレチノイン酸(ＲＡ)にて９日間処理した後に、ＥＧＦのみにて１８日間処理した。(基本培地：インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、プトレシン、セレニウム、トリヨードチロイジン(シグマ社)及びＢ２７(インビトロゲン社)を添加した限定培地)。
【００５９】
この時点で２つの異なるアクリレート再プレーティング計画を試験した。第一プロトコールでは、２８日目に、ＥＢを、９６ウェルプレートの異なるアクリル表面に又はポジティブコントロールとしてのマトリゲルコートウェルに再プレーティングした。７日後(３５日目)に、細胞を４％ＰＦＡにて固定した。第二プロトコールでは、２８日目に、ＥＢを、マトリゲル上に再プレートし、７日間培養し、次いで(３５日目)９６ウェルプレートの異なるアクリル表面に又はポジティブコントロールとしてのマトリゲルコートウェルに再プレーティングした。７日後(４２日目)に、細胞を４％ＰＦＡにて固定した。
【００６０】
両プロトコールからの細胞を、ＯＰＣ特異的マーカー、ネスチン、Ｏｌｉｇｌについて免疫染色し、４’-６-ジアミジノ-２-フェニルインドールＤＡＰＩ(核染色)にて対比染色した。
【００６１】
アレイスキャンにて各プレートをスキャンした後に、各表面について以下の定量分析を実施した。１) ＴＮＣ：ＤＡＰＩポジティブ細胞数に基づいた細胞の総数、２) ＴＮＯ：ｏｌｉｇ１ポジティブ細胞に基づいたＯＰＣの総数。
【００６２】
３．結果
試験した表面のごく一部だけが合成培地における接着とＥＢからの細胞増殖を支持したことが明らかとなった。図３は、分化の２８日目から３５日目の間の、選択したアクリレートコート表面と、ポジティブコントロールのマトリゲル表面上に再プレーティングした後に免疫染色したｈＥＳ細胞由来のＯＰＣの蛍光画像である。図４は、分化の２８日目から３５日目の間、並びに３５日目から４２日目の間の、選択したアクリレートコート表面と、ポジティブコントロールのマトリゲル表面上に２回再プレーティングした後に免疫染色したｈＥＳ細胞由来のＯＰＣの蛍光画像である。免疫染色画像は、分化した細胞がいくつかのアクリレートコーティング表面上でＯＰＣマーカーを発現したことを示した。アクリレート表面上で増殖した細胞において観察される染色は、マトリゲルコントロール表面上で増殖した細胞において観察される染色と類似していた。合成培地において分化したヒトＯＰＣを支持したコーティング表面の例を表２に挙げる。ここで、モノマー(２)に対するモノマー(１)の容量比は７０：３０である。
【００６３】
【表２】
2015097533.tif 000005
2015097533.tif 000006
【００６４】
図５Ａ−Ｆは、ポジティブコントロールとしてのマトリゲルＴＭ、及び本発明の表面の選択した実施態様である２２−２(Ｂ)、２２−３(Ｃ)、１３３−４(Ｄ)、２４−１０(Ｅ)及び７２−２(Ｆ)上で増殖するｈＥＳ細胞由来ＯＰＣの顕微鏡写真から撮影した画像である。図５Ａ−Ｆは、ヘキスト核染色にて染色された、マトリゲル又は上記の本発明の表面の実施態様上のｈＥＳＣ由来のＯＰＣの核染色を示す。図５Ａ−Ｆは、本発明の表面の実施態様は、合成培地におけるｈＥＳＣ由来ＯＰＣの接着と増殖を支持する好適な表面を提供することを表す。他の試験したホモポリマーとコポリマーの組み合わせについては、先の表２に挙げていない組み合わせのものであり、表面へのＥＢ接着やＥＢからの細胞増殖は観察されなかった。
【００６５】
ゆえに、幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養するための合成表面の実施態様が開示される。当業者は、本明細書中に記述されるアレイ、組成物、キット及び方法が、開示されるもの以外の実施態様によっても実施されうることを理解するであろう。開示された実施態様は例示するためのものであって、限定するためのものではない。
【００６６】
本発明は以下の態様を包含する。
（１）合成培地中でオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養するための細胞培養物品であって、
表面を有する基体と、
該表面上に配置されるポリマー物質とを具備し、このとき該ポリマー物質が、
(i) テトラ(エチレングリコール)ジアクリレートから形成されるホモポリマー、又は、
(ii)
テトラ(エチレングリコール)ジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートとテトラ(エチレングリコール)ジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートとトリ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートとテトラエチレングリコールジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートと１,６-ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
トリ(エチレングリコール)ジメタクリレートとトリメチロールプロパントリアクリレート、
１,４-ブタンジオールジメタクリレートと１,９ ノナンジオールジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールプロポキシレート(１ＰＯ／ＯＨ)ジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ジ(エチレングリコール)ジメタクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、
ジ(エチレングリコール)ジメタクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
テトラ(エチレングリコール)ジメタクリレートと１,４-ブタンジオールジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール)ジメタクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートとポリ(プロピレングリコール)ジアクリレート、
トリメチロールプロパンエトキシレート(１ＥＯ／ＯＨ)メチルジアクリレートと２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレート、
ネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートと１,４-ブタンジオールジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとネオペンチルグリコールジメタクリレート、
２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレートとテトラ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、又は
ポリ(プロピレングリコール)ジアクリレートとグリセロール １,３-ジグリセロレートジアクリレート
から形成されるコポリマーを含むものである、細胞培養物品。
（２）揮発性有機溶媒に一ないし複数のモノマーを希釈し、
希釈したモノマーを物品の基体表面上に沈着させ、
実質的にすべての溶媒を蒸発させ、そして、
モノマーを重合化させて、表面に接着したポリマー層を形成させる
といった工程によって製造される、（１）に記載の物品。
（３）揮発性溶媒がエタノールである、（２）に記載の物品。
（４）物品の表面上に配置されたポリマー物質がおよそ５ｍｍ２より大きな表面領域を有する、（１）に記載の物品。
（５）さらにウェルを具備し、このとき該ウェルにポリマー物質が配置される基体の表面がある、（１）に記載の物品。
（６）物品がマルチウェルプレート、シャーレ、ビーカー、チューブ及びフラスコからなる群から選択される、（５）に記載の物品。
（７）オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養物であって、
表面上に配置されたポリマー物質を含む物品と、
ポリマー物質上に配置されたオリゴデンドロサイト前駆細胞と、
該オリゴデンドロサイト前駆細胞が培養される培養培地とを具備し、このとき該ポリマー物質が、
(i) テトラ(エチレングリコール)ジアクリレートから形成されるホモポリマー、又は、
(ii)
テトラ(エチレングリコール)ジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートとテトラ(エチレングリコール)ジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートとトリ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートとテトラエチレングリコールジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートと１,６-ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
トリ(エチレングリコール)ジメタクリレートとトリメチロールプロパントリアクリレート、
１,４-ブタンジオールジメタクリレートと１,９ ノナンジオールジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールプロポキシレート(１ＰＯ／ＯＨ)ジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ジ(エチレングリコール)ジメタクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、
ジ(エチレングリコール)ジメタクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
テトラ(エチレングリコール)ジメタクリレートと１,４-ブタンジオールジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール)ジメタクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートとポリ(プロピレングリコール)ジアクリレート、
トリメチロールプロパンエトキシレート(１ＥＯ／ＯＨ)メチルジアクリレートと２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレート、
ネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートと１,４-ブタンジオールジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとネオペンチルグリコールジメタクリレート、
２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレートとテトラ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、又は、
ポリ(プロピレングリコール)ジアクリレートとグリセロール １,３-ジグリセロレートジアクリレート
から形成されるコポリマーを含むものである、培養物。
（８）オリゴデンドロサイト前駆細胞が幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞である、（７）に記載の培養物。
（９）オリゴデンドロサイト前駆細胞がヒト胚性幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞である、（７）に記載の培養物。
（１０）オリゴデンドロサイト前駆細胞の培養方法であって、
オリゴデンドロサイト前駆細胞を含む懸濁物をポリマー物質上に沈着させ、そして、
沈着させたオリゴデンドロサイト前駆細胞を細胞培養培地中で培養することを含み、このとき該ポリマー物質が、
(i) テトラ(エチレングリコール)ジアクリレートから形成されるホモポリマー、又は、
(ii)
テトラ(エチレングリコール)ジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートとテトラ(エチレングリコール)ジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートとトリ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートとテトラエチレングリコールジメタクリレート、
グリセロールジメタクリレートと１,６-ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、
グリセロールジメタクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
トリ(エチレングリコール)ジメタクリレートとトリメチロールプロパントリアクリレート、
１,４-ブタンジオールジメタクリレートと１,９ ノナンジオールジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールプロポキシレート(１ＰＯ／ＯＨ)ジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ジ(エチレングリコール)ジメタクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、
ジ(エチレングリコール)ジメタクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
テトラ(エチレングリコール)ジメタクリレートと１,４-ブタンジオールジメタクリレート、
テトラ(エチレングリコール)ジメタクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
１,６-ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレートとネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートとトリシクロ[５.２.１.０２,６]デカンジメタノールジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートと１,６-ヘキサンジオールエトキシレートジアクリレート、
ネオペンチルグリコールジアクリレートとポリ(プロピレングリコール)ジアクリレート、
トリメチロールプロパンエトキシレート(１ＥＯ／ＯＨ)メチルジアクリレートと２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレート、
ネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートと１,４-ブタンジオールジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとジ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、
トリメチロールプロパントリアクリレートとネオペンチルグリコールジメタクリレート、
２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレートとテトラ(エチレングリコール)ジメタクリレート、
２,２,３,３,４,４,５,５ オクタフルオロ １,６ ヘキサンジオールジアクリレートとネオペンチルグリコールジアクリレート、又は、
ポリ(プロピレングリコール)ジアクリレートとグリセロール １,３-ジグリセロレートジアクリレート
から形成されるコポリマーを含むものである、方法。
（１１）細胞培養培地が合成培地である、（１０）に記載の方法。
（１２）オリゴデンドロサイト前駆細胞が幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞である、（１０）に記載の方法。
（１３）オリゴデンドロサイト前駆細胞がヒト胚性幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞である、（１０）に記載の方法。
【図１】
2015097533.tif 000007
【図２】
2015097533.tif 000008
【図３】
2015097533.tif 000009
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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