(57)【要約】      （修正有）【課題】魚類から、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を取得し、該遺伝子を改変して、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ脂肪酸不飽和化酵素を調製すると共に、該脂肪酸不飽和化酵素を用いて、植物由来の脂肪酸からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成する方法の提供。【解決手段】アイゴのΔ４脂肪酸不飽和化酵素活性を持つアミノ酸配列をコードする遺伝子のΔ４脂肪酸不飽和化酵素活性を示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を特定し、該配列を、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列の特定部位をコードする塩基配列と置換し、導入することで、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を持つ脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を取得した。該遺伝子を細胞に導入して、該酵素を取得し、該酵素を用いて、植物由来の不飽和脂肪酸を合成する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号５に示されるΔ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドの３２２−３２５位の配列であるIle−Val−Phe−Thrのペプチド配列を、配列表の配列番号４に示されるΔ４脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドの３２４−３２７位の配列であるMet−Met−Phe−Alaのペプチド配列で、置換したキメラ脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなる請求項２に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；又は、
（ｂ）以下の（ｉ）若しくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；若しくは、
（ｉｉ）配列表の配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２に示されるΔ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの９６４−９７５位の配列であるatt gta ttt acaの塩基配列を、配列表の配列番号１に示されるΔ４脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの９７０−９８１位の配列であるatg atg ttt gccの塩基配列で、置換したキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードする請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載のΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが、酵母発現ベクターであることを特徴とする請求項６に記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞。
【請求項９】
微生物細胞が、酵母細胞であることを特徴とする請求項８に記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した微生物細胞。
【請求項１０】
特許微生物寄託センターに、受託受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８３７として寄託された、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入したサッカロマイセス・ｓｐに属する酵母細胞株。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞を培養し、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドを発現、取得することを特徴とするΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素、又は、該酵素を生成する請求項８〜１０のいずれかに記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞、又は、該細胞の培養ブロスを、脂肪酸基質に作用させて、Δ４、Δ５及びΔ６部位が不飽和化された脂肪酸を製造することを特徴とするΔ４、Δ５及びΔ６部位が不飽和化された不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項１３】
脂肪酸基質が、α−リノレン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、又は、エイコサトリエン酸であることを特徴とする請求項１２に記載のΔ４、Δ５及びΔ６不飽和脂肪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類に由来する脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いて構築した、キメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を組み換えた発現ベクター、該発現ベクターを導入した宿主細胞、該細胞を用いたキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素の製造方法、及び、該キメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素を用いたΔ４、Δ５及びΔ６不飽和脂肪酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪は、エネルギー源として重要な栄養成分であるとともに、同時に動物にとって正常な発育と機能維持に欠くことができない成分である。近年、エイコペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）や、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）のようなｎ−３系多価不飽和脂肪酸が、乳児における脳の成長及び発達、成人における正常な脳機能の維持に不可欠であること（J. Pediatr. 120:S129−S138, 1992）や、アトピー性皮膚炎、血栓性疾患、癌、冠動脈疾患などに低減効果のあること（Am. J. Clin. Nutr. 71, 171S−175S,2000;77, p. 532-5543, 2003）等が報告され、ヒトが健康を維持するための成分として、注目を浴びている。
【０００３】
生体中における脂肪酸の合成では、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素により、オレイン酸（１８：１）からリノール酸（１８：２ｎ−６）が合成され、更に、ω３脂肪酸不飽和化酵素により、リノール酸（１８：２ｎ−６）からα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が合成される。しかし、哺乳動物などの高等動物では、上記酵素を有さないため、食物からこれらの脂肪酸を摂取することが要求される。ヒトにおいては、このような必須脂肪酸として、リノール酸（１８：２）、α−リノレン酸（１８：３）、及び、アラキドン酸（Ｃ２０：４）がある。α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）からは、エイコペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）が、ＥＰＡからは、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）が合成される。これらの合成に関与する酵素として、Δ４不飽和化酵素（Fad４）、Δ５不飽和化酵素（Fad５）、及び、Δ６不飽和化酵素（Fad６）酵素がある。
【０００４】
近年、不飽和脂肪酸の合成に関与する脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子が取得され、該遺伝子を細胞に導入して、発現させることにより、細胞を改変したり、酵素蛋白質を製造する技術が開示されている。例えば、特表２００４−５１６０１７号公報、特開２００６−３１４３２１号公報、特開２００９−１４８２９７号公報には、多価不飽和脂肪酸を産生するヤブレツボカビ（Thraustochytrium）、ピティウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）、スキゾキトリウム（Schizochytrium）及びクリテコジニウム（Crythecodinium）から、Δ４不飽和化酵素（Fad４）、Δ５不飽和化酵素（Fad５）、及び、Δ６不飽和化酵素（Fad６）をコードする遺伝子を取得し、該不飽和化酵素遺伝子からなる発現ベクター構築して、該ベクターを、植物細胞、微生物細胞、或いは動物細胞に導入して、該不飽和化酵素ペプチドを取得する方法が開示されている。
【０００５】
また、特開２００３−２４５０７０号公報には、ホウレンソウの根部に由来するΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、ブタ等の動物で発現させることにより、不飽和脂肪酸の含量を増加させる方法が、特開２０１０−２７９３８７号公報には、ゼニゴケ由来のΔ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びΔ６脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子を取得し、これを高等植物に導入して発現させることにより、アラキドン酸や、エイコペンタエン酸を生産し得る形質転換植物体を取得する方法が開示されている。
【０００６】
魚類においても、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を用いて、魚体の不飽和脂肪酸含量を変える方法が開示されている。例えば、ヤマメ由来の脂肪酸代謝酵素遺伝子をニベに導入することで、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）等の割合を増加する方法が（Kabeya, N., Takeuchi, Y., Yamamoto, Y., Yazawa, R., Haga, Y., Satoh, S., Yoshizaki, G. Modification of the n-3 HUFA biosynthetic pathway by transgenesis in a marine teleost, nibe croaker. J. Biotechnol. 172, 46-54(2014).「日本水産学会大会講演要旨集」Vol. 2013  春季 p.133,2013.）、微細藻類由来のΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(Tonon, T., Harvey, D., Larson, T. R., and Graham, I. A. Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acidΔ4-desaturase from the microalga Pavlova lutheri.FEBS Lett.553,440-444(2003).）、大西洋産サケ由来のΔ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ジーンバンク：AF478472）、ヤマメ由来のΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ジーンバンク：AB074149,AB070444）等の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子魚類に導入して、魚類のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸含量を増加させる方法（特開２００５―２８７４２４号公報）が開示されている。
【０００７】
多くの海産魚は、Δ６脂肪酸不飽和化酵素（Fad６）を保持しているが、Δ５及びΔ４脂肪酸不飽和化酵素（Fad５及びFad４）を保持していない。したがって、該脂肪酸不飽和化酵素を単離して、植物由来の脂肪酸からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成しようとしても、合成することができない。最近になって、アイゴ（シモフリアイゴ：Siganus canaliculatus）が、Δ５脂肪酸不飽和化酵素活性とΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ、Δ５/Δ６脂肪酸不飽和化酵素とΔ４脂肪酸不飽和化酵素を持っていることが分かったことが報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Vol. 107 No. 39，Page. 16840−16845, 2010.）。しかしながら、該脂肪酸不飽和化酵素を用いて、植物由来の脂肪酸からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成することについては、今までに報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２４５０７０号公報。
【特許文献２】特開２００５―２８７４２４号公報。
【特許文献３】特開２００６−３１４３２１号公報。
【特許文献４】特開２００９−１４８２９７号公報。
【特許文献５】特開２０１０−２７９３８７号公報。
【特許文献６】特表２００４−５１６０１７号公報。
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Pediatr. 120:S129−S138, 1992.
【非特許文献２】Am. J. Clin. Nutr. 71, 171S−175S, 2000;77, p. 532-5543, 2003.
【非特許文献３】「日本水産学会大会講演要旨集」Vol. 2013 春季 p.133,2013.
【非特許文献４】FEBS Lett.553, 440-444(2003).
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 107 No. 39， Page. 16840−16845, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、アイゴ（Siganus fuscescens）のような魚類から、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を取得し、該遺伝子を改変して、Δ４脂肪酸不飽和化酵素活性、Δ５脂肪酸不飽和化酵素活性、及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を構築し、該遺伝子を用いて、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ脂肪酸不飽和化酵素を調製すると共に、該脂肪酸不飽和化酵素を用いて、植物由来の脂肪酸からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成する方法を提供することからなる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、アイゴのΔ４脂肪酸不飽和化酵素活性を持つアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び、Δ５脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ、Δ６脂肪酸不飽和化酵素活性を持つアミノ酸配列をコードする遺伝子の脂肪酸不飽和化酵素活性を示すアミノ酸配列を特定すべく鋭意検討する中で、Δ４脂肪酸不飽和化酵素活性を持つアミノ酸配列をコードする遺伝子のΔ４脂肪酸不飽和化酵素活性を示すアミノ酸配列を特定し、該配列を、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列の特定部位と置換し、導入することで、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を持つ脂肪酸不飽和化酵素を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、前記するように、多くの海産魚は、Δ６脂肪酸不飽和化酵素（Fad６）を保持しているが、Δ５及びΔ４脂肪酸不飽和化酵素（Fad５及びFad４）を保持していない。したがって、該脂肪酸不飽和化酵素を単離して、植物由来の脂肪酸からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成しようとしても、合成することができない。しかし、最近になって、アイゴ（Siganus fuscescens）が、Δ５脂肪酸不飽和化酵素活性とΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つΔ５/Δ６脂肪酸不飽和化酵素と、Δ４脂肪酸不飽和化酵素を持っていることが分かったことから、該脂肪酸不飽和化酵素のΔ５/Δ６不飽和化酵素とΔ４不飽和化酵素のアミノ酸配列を元に，Δ６、Δ４活性を示すアミノ酸配列を特定するとともに，各活性を保持できる置換部位を特定し，Δ４活性示すアミノ酸配列で、Δ５／Δ６不飽和化酵素の置換部位を置換することにより、Δ４、Δ５、Δ６脂肪酸不飽和化酵素活性を全て持つ、キメラ脂肪酸不飽和化酵素を作製した。したがって、本発明は、魚類に由来する脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いて構築した、キメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を組み換えた発現ベクター、該発現ベクターを導入した宿主細胞、該細胞を用いたキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素の製造方法、及び、該キメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素を用いたΔ４、Δ５及びΔ６不飽和脂肪酸の製造方法からなる。なお、本発明で作製したキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素は、アイゴのΔ５/Δ６脂肪酸不飽和化酵素が、α−リノレン酸からのＤＨＡの合成過程に関与する、Δ８脂肪酸不飽和化酵素活性を有していることから、同脂肪酸不飽和化酵素もΔ８脂肪酸不飽和化酵素活性を有している。
【００１３】
すなわち、本発明は具体的には以下の発明よりなる。
［１］Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
［２］配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号５に示されるΔ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドの３２２−３２５位の配列であるIle−Val−Phe−Thrのペプチド配列を、配列表の配列番号４に示されるΔ４脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドの３２４−３２７位の配列であるMet−Met−Phe−Alaのペプチド配列で、置換したキメラ脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドであることを特徴とする上記［１］に記載のポリペプチド。
［３］上記［１］又は［２］に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
［４］下記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなる上記［２］に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；又は、
（ｂ）以下の（ｉ）若しくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；若しくは、
（ｉｉ）配列表の配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
［５］配列表の配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列表の配列番号２に示されるΔ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの９６４−９７５位の配列であるatt gta ttt acaの塩基配列を、配列表の配列番号１に示されるΔ４脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの９７０−９８１位の配列であるatg atg ttt gccの塩基配列で、置換したキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードする上記［４］に記載のポリヌクレオチド。
【００１４】
［６］上記［３］〜［５］のいずれかに記載のΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクター。
［７］発現ベクターが、酵母発現ベクターであることを特徴とする上記［６］に記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクター。
［８］上記［６］又は［７］に記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞。
［９］微生物細胞が、酵母細胞であることを特徴とする上記［８］に記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した微生物細胞。
［１０］特許微生物寄託センターに、受託受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１８３７として寄託された、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入したサッカロマイセス・ｓｐに属する酵母細胞株。
【００１５】
［１１］上記［８］〜［１０］のいずれかに記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞を培養し、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドを発現、取得することを特徴とするΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素の製造方法。
［１２］上記［１１］に記載のΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素、又は、該酵素を生成する上記［８］〜［１０］のいずれかに記載の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞、又は、該細胞の培養ブロスを、脂肪酸基質に作用させて、Δ４、Δ５及びΔ６部位が不飽和化された脂肪酸を製造することを特徴とするΔ４、Δ５及びΔ６部位が不飽和化された不飽和脂肪酸の製造方法。
［１３］脂肪酸基質が、α−リノレン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、又は、エイコサトリエン酸であることを特徴とする上記［１２］に記載のΔ４、Δ５及びΔ６不飽和脂肪酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を持つ脂肪酸不飽和化酵素を取得する方法を提供し、該脂肪酸不飽和化酵素を用いることにより、植物由来の脂肪酸からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の実施例におけるキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の作製の流れを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、魚類に由来する脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を用いて構築した、キメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を組み換えた発現ベクター、該発現ベクターを導入した宿主細胞、該細胞を用いたキメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素の製造方法、及び、該キメラΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素を用いたΔ４、Δ５及びΔ６不飽和脂肪酸の製造方法からなる。
【００１９】
本発明において、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を構築するための遺伝子源としては、アイゴ（Siganus fuscescens）を用いることができる。アイゴは、スズキ目・アイゴ科に分類される魚の一種であり、西太平洋の暖海域に生息する沿岸性の海水魚であり、従来、沖縄のものは、シモフリアイゴ（S. canaliculatus）と呼ばれていた。
該遺伝子源から、スクリーニングするには、ライブラリーを作製し、遺伝子に特有の適当なプローブを用いて、クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。ｃＤＮＡライブラリーから、本発明の遺伝子をスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）に記載の方法等、当業者により常用される方法により行うことができる。該クローンから、本発明のΔ４或いはΔ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子を取得するには、表１のようなプライマーを用い、ＰＣＲ反応を行って、増幅し、アガロースゲルのような分離手段を用いて、常法により、分離・精製する。該増幅断片を、適当なプラスミドベクターにサブクローニングし、塩基配列の決定を行う。
【００２０】
【表１】
2015181477.tif 000003
【００２１】
本発明で、構造決定されたΔ４或いはΔ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、Δ４脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１に、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号２に示されている。該遺伝子の塩基配列は、それぞれΔ４脂肪酸不飽和化酵素（配列表の配列番号４）、及び、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素（配列表の配列番号５）のアミノ酸配列をコードする。
【００２２】
本発明においては、Δ４脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の塩基配列、及び、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の塩基配列において、「Δ４不飽和化酵素活性領域」、及び、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素における「Δ４不飽和化酵素活性領域との置換領域」を決定するために、領域区分を組合わせた領域活性解析を行った。領域活性解析の結果、Δ４脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列表の配列番号１に示される塩基配列）の９７０−９８１位の配列であるatg atg ttt gccの塩基配列（配列表の配列番号４に示されるΔ４脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドの３２４−３２７位の配列であるMet−Met−Phe−Ala のペプチド配列をコードする）が、「Δ４不飽和化酵素活性領域」をコードする塩基配列であること、及び、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素をコードするポリヌクレオチド（配列表の配列番号２に示される塩基配列）の９６４−９７５位の配列であるatt gta ttt aca の塩基配列（Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素ポリペプチドの３２２−３２５位の配列であるIle−Val−Phe−Thr のペプチド配列をコードする）が、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素における「Δ４不飽和化酵素活性領域との置換領域」であることを特定した。そして、該「Δ４不飽和化酵素活性領域」で、Δ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素における「Δ４不飽和化酵素活性領域との置換領域」を置換することにより、Δ４及びΔ５／Δ６脂肪酸不飽和化酵素活性を併せ持つ、脂肪酸不飽和化酵素をコードするキメラ遺伝子を構築した。
【００２３】
本発明においては、上記のとおり構築した脂肪酸不飽和化酵素をコードするキメラ遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を特定する。該「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２４】
本発明において、本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクター及び該発現ベクターを導入した宿主細胞を作製するには、該発現ベクターを導入した植物、動物又は微生物細胞に適合した公知の発現ベクターを用いることができる。好ましい宿主細胞としては酵母を挙げることができ、該発現ベクターとしては、酵母発現ベクターを用いることが望ましく、かかる場合の適当な酵母発現ベクターとしては例えば、ｐＡＡＨ５（Ammerer，1983）など、又は、適当な酵母の調節領域を含有する、酵母発現ベクターから誘導されるベクター（Ruohonen et al.，1991; Ruohonen etal.，manuscript in preparation，a）を用いることができる。
【００２５】
本発明においては、本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することにより、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子の発現により、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素を生成し、取得する。該Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素のペプチド配列については、配列表の配列番号６に示されている。
【００２６】
本発明は、配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を有するポリペプチドを特定する。該「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００２７】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２８】
本発明においては、本発明により取得したΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素を用い、該酵素を、植物由来のα−リノレン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、又は、エイコサトリエン酸のような脂肪酸基質に作用させて、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成する。該酵素作用に際しては、精製・分離したΔ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素を用いることができるが、本発明の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入した植物、動物又は微生物細胞、或いは、該細胞の培養ブロスの形で、脂肪酸基質に作用させ、酵素反応を行うことができる。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［アイゴ不飽和化酵素遺伝子の塩基配列決定］
実験には、千葉県館山市の定置網で採捕されたアイゴ Siganus fuscescensを用いた。２−フェノキシエタノール（和光純薬工業株式会社，大阪）を用いて麻酔した供試魚から脳を摘出した後、これをドライアイス上で瞬間凍結した。凍結した脳はＲＮＡ抽出実験まで−８０℃にて保管した。凍結したアイゴ脳からISOGEN（株式会社ニッポンジーン，東京）により、添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。続いて、TURBO DNase（Ambion, TX, USA）を用いて添付のプロトコールに従い残存ＤＮＡの分解反応を行った後に、フェノール抽出、エタノール沈澱にて精製した。得られた全ＲＮＡのうち１μｇを鋳型としてSuperScript III RT（Invitrogen, CA, USA）により、添付のプロトコールに従いオリゴ（ｄＴ）アダプタープライマー（表１）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００３１】
ＲＴ−ＰＣＲは、シモフリアイゴの不飽和化酵素遺伝子の配列（GenBank:EF424276.2）を元に設計した翻訳領域全長を増幅できると考えられるプライマー（表１）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、アイゴ脳ｃＤＮＡ（２０倍希釈）を鋳型とし、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社，滋賀）を用いて行った。反応条件は、表２に示した。得られたＰＣＲ反応液を０．７％のアガロース電気泳動に供し、予想されるサイズの増幅断片をHigh Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science, Upper Bavaria, Germany）を用いてアガロースゲルより切り出して、精製した。続いて、Mighty TA-Cloning Kit for PrimeSTAR（タカラバイオ株式会社，滋賀）に付属のA-overhang mixtureを用いて末端A付加反応を行った。得られたA付加増幅断片をpGEM-T Easy Vector System I（Promega, WI, USA）を用いてpGEM-T Easyプラスミドベクターにサブクローニングし塩基配列を決定した。なお、全ての行程はキットに付属のプロトコールに従って行った。
【００３２】
【表２】
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【実施例２】
【００３３】
［キメラ酵素遺伝子導入酵母の作製］
【００３４】
＜キメラ酵素遺伝子の調製＞
キメラ酵素遺伝子調製の流れを図１に示した。５‘末端用プライマー（表３）にはHindIIIの認識配列の一部を、３’末端用プライマー（表３）にはXbaIの認識配列の一部を組み、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）用のプライマーを設計した。また、キメラ酵素の切り替え位置に用いるプライマー（表３）にはアイゴΔ４ 不飽和化酵素遺伝子配列の一部を組み、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）用のプライマーを設計した。なお、これらのプライマーは、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）のプロトコールに従い設計した。ＰＣＲ反応は、Δ5/6不飽和化酵素遺伝子のクローンを鋳型としてPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いて行った。反応条件は表４に示した。
【００３５】
なお、酵母発現ベクターであるpYES2（Invitrogen, CA, USA）にはあらかじめHindIIIとXbaIで制限酵素処理を行い、マルチクローニングサイトを切断した。得られたＰＣＲ反応液を２％のアガロース電気泳動に供し、予想されるサイズの増幅断片を、アガロースゲルより切り出して、Gel/PCR Extraction Kit（日本ジェネティックス株式会社，東京）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片はIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用いて、HindIII及びXbaI制限酵素処理済のpYES2（Invitrogen）と接合し、環状にした。
続いて、キメラ酵素遺伝子が導入された酵母発現ベクターをDH5α（ニッポンジーン，東京）にトランスフォーメーションした。大腸菌を１２時間培養した後、Fast Gene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティックス株式会社）を用いて酵母発現ベクターを抽出した。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
【表４】
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【００３８】
＜酵母へのキメラ酵素遺伝子の導入＞
キメラ酵素遺伝子を組み込んだ酵母発現ベクターはS.c. EasyComp Transformation Kit（Invitrogen）を用いて添付のプロトコールに従い酵母にトランスフォーメーションした。なお、酵母の系統はウラシル合成酵素を欠損したInvSc1系統（Invitrogen）を用いた。トランスフォーメーション後の酵母を、２％のラフィノースを含むウラシル欠乏complete minimal dropout（CMD）寒天培地に播種し、３０℃にて７２時間培養した。
【実施例３】
【００３９】
［キメラ酵素による脂肪酸の不飽和化酵素処理］
【００４０】
＜キメラ酵素の調製と脂肪酸酵素処理＞
キメラ酵素液をキメラ酵素遺伝子導入酵母の培養液の形で調製し、脂肪酸の酵素処理を行った：酵母へのキメラ酵素遺伝子導入後、得られたコロニーを３ｍＬの２％のラフィノースを含むウラシル欠乏ＣＭＤ液体培地で３０℃にて４８時間振盪培養し、飽和菌液を作製した。続いて、脂肪酸添加による活性測定の実験を行った。まず、導入したキメラ酵素遺伝子を発現させるための発現誘導培地（１％ラフィノース及び２％ガラクトースを含むウラシル欠乏ＣＭＤ液体）を作製し、それぞれ３ｍＬずつＬ字型試験管に分注した後、不飽和化酵素の基質として、α-リノレン酸（ＡＬＡ；１８：３ｎ−３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；２２：５ｎ−３）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ；２０：４ｎ−３）、エイコサトリエン酸ＥＴＡ；２０：３ｎ−３））が０．５ｍＭとなるように加えた。
【００４１】
続いて、上述の飽和菌液をそれぞれ３００μＬずつ各培地に加え、３０ ℃にて４８時間振盪培養した。培養後の菌液を１５ｍＬの遠沈管に移し、４℃、５００×ｇにて２分間遠心した。培養液を捨て、得られた酵母のペレットに５ｍＬの氷冷したハンクス平衡塩溶液を加え、ボルテックスで再懸濁した後、上述の遠心条件にて２回洗浄した。洗浄後のペレットは分析開始まで−８０℃にて保存した。
【００４２】
＜ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸分析＞
上記酵素処理した脂肪酸について、ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸分析を行った：
酵母のペレットを凍結乾燥した後、脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク株式会社，京都）を用いて添付のプロトコールに従い全脂肪酸をメチル化した。得られたメチル化脂肪酸を、メチル化脂肪酸精製キット（ナカライテスク株式会社）を用いて精製し、後述の分析に用いた。脂肪酸分析は、汎用シリカキャピラリーカラム（SUPELCOWAX 10TM, 30 m×I.D. 0.32 mm, df 0.25 μm, Supelco Analytical）を装着したガスクロマトグラフィー（GC-2025，株式会社島津製作所，京都）により行った。キャリアガスにはヘリウムを用い、線速度を30 cm/secに設定した。カラムは初期温度を１７０ ℃とし、分析開始から１分あたり２℃ずつ昇温させ、最終温度を２６０℃とした。インジェクションポート、検出器の温度は、ともに２６０℃とした。脂肪酸メチルエステルのピークはQualmix Fish S, Eicosatetraenoic acid methyl ester,  Tetracosapentaenoic acid methyl ester, Tetracosahexaenoic acid methyl ester (Larodan Fine Chemicals, Malmo, Sweden)のピークを参考に同定した。基質から不飽和化された代謝産物の割合、転換効率（％）は［産物のピーク面積×100÷（産物のピーク面積＋基質のピーク面積）］により計算した。
【００４３】
＜結果＞
上記キメラ脂肪酸不飽和化酵素で酵素処理した脂肪酸のガスクロマトグラフィーによる脂肪酸分析の結果を表５に示す。なお、本発明の脂肪酸不飽和化酵素はΔ８脂肪酸不飽和化酵素活性も有し、表５には、Δ４、Δ５、Δ６、Δ８脂肪酸不飽和化酵素の転換効率（％）を、表６には、平均転換効率（％）を示す。
【００４４】
【表５】
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【００４５】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、Δ４、Δ５及びΔ６脂肪酸不飽和化酵素活性を持つ脂肪酸不飽和化酵素を取得する方法を提供し、該脂肪酸不飽和化酵素を用いることにより、植物由来の脂肪酸からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような不飽和脂肪酸を合成する方法を提供する。
【図１】
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【配列表】
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