(57)【要約】【課題】迅速かつ効率的な低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法を提供する。【解決手段】低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。【選択図】図１
2015119637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記低分子化抗体がscFv抗体、ラクダ科動物由来VHH抗体又はサメ由来IgNAR抗体である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記低分子化抗体がラクダ科動物由来VHH抗体である、請求項１又は２に記載のスクリー
ニング方法。
【請求項４】
前記相互作用検出プロセスがファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法である、請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程、選別された低分子化抗体をコードするＤＮＡを発現させて低分子化抗体を得る工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体の製造方法。
【請求項６】
前記低分子化抗体がscFv抗体、ラクダ科動物由来VHH抗体又はサメ由来IgNAR抗体である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記低分子化抗体がラクダ科動物由来VHH抗体である、請求項５又は６に記載の製造方法
。
【請求項８】
前記相互作用検出プロセスがファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法である、請求項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体のスクリーニング法としてin vitroスクリーニング（ファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ）法が利用されている。その際、出現頻度の低いクローンが選択から漏れる問題点があった。
【０００３】
非特許文献１は、ペプチドファージディスプレイ(7アミノ酸残基)前後の塩基配列を大
規模配列解析し、出現頻度の向上した配列を選択する方法を開示するが、抗体への適用についての開示はない。
【０００４】
非特許文献２は、動物の免疫後に数多く出現する抗体をギガシーケンサーで解析、軽鎖と重鎖で極めて出現頻度の高い組み合わせで抗体を作製すると、抗原に結合することを確認している。しかしながら、出現頻度の低い軽鎖、重鎖の適切な組み合わせを予測することは困難である。また本文献は生体への抗原免疫前後において抗体の配列解析を行ったものであり、in vitroスクリーニングでの有効性は開示されていない。また本文献で用いられた免疫用動物は清浄な環境で飼育されているものであり、野外環境などの自然抗原に暴露された動物での当該方法の有効性は明らかではない。
【０００５】
非特許文献3は、非免疫のscFVライブラリーをファージディプレイでスクリーニングし
、３回ラウンド後に大規模配列解析し、出現数の向上した配列を選択する方法を開示するが、ファージディスプレイでは取得できなかった配列についてスクリーニング前後での発現頻度の比較による抗原結合能を有さない、或はこれが低い抗体配列を排除する情報は開示されていない。
【０００６】
特許文献１は、ギガシーケンサーによる配列解析方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2012-018592
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Analytical Biochemistry 421, 622-631 (2012).
【非特許文献２】Nat Biotechnol 28, 965-969 (2010).
【非特許文献３】Nucleic Acids Res 38, e193 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、迅速かつ効率的な低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の低分子化抗体のスクリーニング方法及び製造方法を提供するものである。
項１．  低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記
塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体のスクリーニング方法。
項２．  前記低分子化抗体がscFv抗体、ラクダ科動物由来VHH抗体又はサメ由来IgNAR抗体である、項１に記載のスクリーニング方法。
項３．  前記低分子化抗体がラクダ科動物由来VHH抗体である、項１又は２に記載のスク
リーニング方法。
項４．  前記相互作用検出プロセスがファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法である、項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。項５．  低分子化抗体の可変領域を含む抗原免疫された脊椎動物の塩基配列ライブラリーについて抗原抗体間の相互作用検出プロセスを実施する工程、大規模配列解析による前記塩基配列の出現頻度を前記プロセスの前後で比較する工程、前記相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別する工程、選別された低分子化抗体をコードするＤＮＡを発現させて低分子化抗体を得る工程を含むことを特徴とする、抗原特異的低分子化抗体の製造方法。
項６．  前記低分子化抗体がscFv抗体、ラクダ科動物由来VHH抗体又はサメ由来IgNAR抗体である、項５に記載の製造方法。
項７．  前記低分子化抗体がラクダ科動物由来VHH抗体である、項５又は６に記載の製造
方法。
項８．  前記相互作用検出プロセスがファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法である、項５〜７のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
抗原免疫したアルパカ白血球より作製した抗体の可変領域をコードする塩基配列ライブラリーをファージディスプレイでスクリーニングしたところ１種類のVH型抗体を取得できたが、より有用な抗体であるVHH抗体は取得できなかった。この実験に用いたファージデ
ィスプレイ前後のライブラリーをギガシーケンサーにより大規模配列解析を行ったところ、スクリーニングにより顕著に出現頻度が向上した抗体配列を得た。この配列からラクダ科動物由来VHH抗体を作製し、その結合活性、特異性を評価したところ、抗原特異性であ
り、数nM〜数十nMの解離定数を有することが明らかとなった。なお、ラクダ科動物由来VHH抗体はシングルドメイン抗体であるために、重鎖-軽鎖の組み合わせは存在しない。このことからinvitroスクリーニング或は抗原免疫前後のラクダ科動物由来白血球よりVHH抗体配列を大規模にシーケンスし、個々の配列の出現頻度を調べることで、それ以上のスクリーニング無しに抗原特異的なVHH抗体が取得できることが初めて明らかとなった。
【００１２】
また、本発明で発現頻度の向上により見出された抗体は、結合性により見出された抗体よりも優れた結合特性を有していた。従って、発現頻度による複数の抗体の選別により、複数の優れた特異性を有する抗体が得られることが明らかになった。この方法は、VHH抗
体だけでなくscFvのような単鎖抗体の取得にも同様に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】相互作用検出プロセスとしてファージディスプレイ法を用いた本発明のスクリーニング方法の概要を模式的に示す。
【図２】大規模塩基配列解析により得られた抗体2種について抗体を固定化したセンサーチップを用いて抗原であるIZUMO1PFFとの相互作用をビアコア2000を用いて測定した結果を示す。
【図３】大規模塩基配列解析により得られた抗体2種について抗体を固定化したセンサーチップを用いて抗原であるIZUMO1PFF及び4つのアミノ酸を変異させたIZUMO1PFF-Proとの相互作用を検証した。変異体との相互作用が見られなかったことからこの2つの抗体はIZUMO1PFFに対して高い特異性を有することが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抗原抗体間の相互作用検出プロセスの前後での抗体の大規模配列解析結果を比較し、相互作用検出プロセスの前後で塩基配列出現頻度が一定以上上昇した低分子化抗体を選別することで、ハイブリドーマ作製と抗原特異的クローンの選択、或いは抗体ライブラリーからファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ等の相互作用検出プロセスにより選択する方法よりも高い抗原特異性を有し得る低分子化抗体を提供するものである。ラクダ科動物由来VHH抗体及びサメ由来IgNAR抗体は、完全抗体のように重鎖と軽鎖の組み合わせがなく、抗原特異的な抗体を効率よく決定できる。
【００１５】
相互作用検出プロセスとしては、ファージディスプレイ法、インビトロウイルス法又はリボソームディスプレイ法が挙げられる。このプロセスは１回のみ行ってもよく、複数回行ってもよい。例えばファージディスプレイにおけるパニング工程は、1回のみ行っても
よく、複数回行うこともできる。
【００１６】
低分子化抗体は抗原免疫された脊椎動物由来、好ましくは抗原免疫された哺乳動物由来、または軟骨魚類由来である。該当する哺乳動物としては、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコ）、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒトなどが挙げられ、好ましくはラクダ科動物である。該当する軟骨魚類としてはサメ、エイが挙げられる。なお、「抗原免疫された脊椎動物」とは、抗原特異的低分子化抗体に認識される抗原で免疫された脊椎動物を意味する。
【００１７】
本発明では、相互作用検出プロセスの前後での低分子化抗体の可変領域をコードする塩基配列の出現頻度の上昇倍率をもとにして低分子化抗体を選別する。相互作用検出プロセス前の低分子化抗体をコードする塩基配列の出現頻度と比較して該プロセス後の塩基配列の出現頻度は、１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは３０倍以上、さらに好ましくは５０倍以上、特に好ましくは６０倍以上である。塩基配列の出現頻度の比較は、大規模配列解析とファージディスプレイ法とを組み合わせて行うのが好ましい。また塩基配列はBlast検索等により配列相同性（Identity）が95％以上のもの、好ましくは97％
以上のもの、より好ましくは98％以上のもの、さらに好ましくは99％以上のものは同一配列として取り扱って良い。
【００１８】
大規模配列解析は、従来公知の方法に従い行うことができ、例えば特許文献１に記載の方法や、ギガシーケンサーなどの大量の塩基配列情報を処理できるDNAシーケンサーを用
いることにより行うことができる。このようなシーケンサーとしては、イルミナ社製の次世代DNAシーケンサーMiSeqが挙げられる。大規模配列解析に供する塩基配列は低分子化抗体の可変領域をコードする塩基配列であり、CDR1、CDR2、CDR3の少なくとも１つをコードする配列であり、CDR1、CDR2、CDR3を全て含むか、可変領域全体を含む塩基配列であるのが好ましい。
【００１９】
相互作用検出プロセスは、抗原と結合性を有する低分子化抗体をコードする塩基配列を濃縮する操作であり、抗原に対する特異性は該プロセス前後における出現頻度の上昇倍率が重要であり、プロセス前の出現頻度は重要ではない。低分子化抗体の可変領域をコードする塩基配列において、プロセス前後で出現頻度が上昇したものを本発明では選択する。これにより、抗原に対する高い特異性を有する低分子化抗体を多数獲得することができる。本発明の方法は、免疫工程を必要としないため、免疫により抗体産生が十分でない抗原に対しても有効であり、特異性の高い低分子化抗体を取得できる。
【００２０】
このような塩基配列の出現頻度の上昇倍率の大きな抗体を複数（例えば３〜２０程度）
リストアップし、その抗体を作製することで、抗体産生細胞のハイブリドーマを用いる一般的な抗体産生方法では見出すことのできないような優れた抗原特異性を有する低分子化抗体が多数得られる。
【００２１】
配列解析の対象となる低分子化抗体をコードする塩基配列のライブラリーは、例えば、ラクダ科動物を含む脊椎動物の胸腺、骨髄、末梢血等の白血球から抽出した核酸から可変領域をPCRなどにより増幅させることによって得ることができる。
【００２２】
配列解析の対象となる低分子化抗体をコードする塩基配列のライブラリーは非免疫或いは抗原を免疫した生物から得られたライブラリーであり、好ましくは抗原を免疫したラクダ科動物を含む脊椎動物の胸腺、骨髄、末梢血等の白血球から抽出した核酸から得られたものである。
【００２３】
低分子化抗体のスクリーニング及び製造方法に使用する低分子化抗体の塩基配列ライブラリーは、複数の異なる抗原をそれぞれ認識する複数の抗体が含まれていればよいが、スクリーニングの効率を考慮すると、より多くの種類の抗原に対する低分子化抗体が含まれていることが好ましい。他方で大規模塩基配列解析では、低分子化抗体をコードする塩基配列の数が多くなると計算に時間がかかるため、抗体ライブラリーについても適正な規模がある。抗体ライブラリーに含まれる低分子化抗体の数としては、例えば、１０４〜１０１３程度、好ましくは１０５〜１０１１程度である。
【００２４】
低分子化抗体の塩基配列ライブラリーにおける各抗体をコードする塩基配列の出現数は、相互作用検出プロセスの前後で変化する。大規模発現解析で、低分子化抗体をコードする塩基配列断片について解析を行う場合、低分子化抗体全長の配列決定、或は抗体の相補性決定領域（CDR1、2、3）の配列を決定し、これとフレームワーク領域及び非可変領域の配列を組み合わせることで、実際に製造される抗体配列を決定できる。
【００２５】
相互作用検出プロセスとしてファージディスプレイを用いる場合、低分子化抗体の出現数及び出現頻度はファージディスプレイのパニング(panning)前後におけるクローン数を
測定することで決定できる。抗体を提示したファージが宿主バクテリア細胞に対する感染能を維持しており、スクリーニングにより選択された抗体を提示するファージを宿主バクテリア細胞に感染させることによって、スクリーニングにより選択された抗体を容易に複製することができる。
【００２６】
ファージディスプレイ法を用いる場合、パニング後のファージを用いてそのままVHH抗
体を得ることができるが、下記の1)又は2)の方法によりVHH抗体を得ることもできる：
1）ファージからVHHをコードした遺伝子をPCRで増やし、大腸菌用の発現ベクターにクロ
ーニングして、VHH抗体を生産する方法、
2）ファージに含まれるVHHのDNA配列をアミノ酸に変換し、大腸菌のコドン頻度に最適化
したDNA配列を化学合成で完全合成（人工遺伝子）し、大腸菌発現ベクターにクローニン
グして、VHH抗体を生産する方法。
【００２７】
抗原は、抗体を作製できるものであればよく、特に限定されないが、例えばタンパク質、ペプチド、多糖類、脂質、低分子化合物などが挙げられ、タンパク質が好ましく例示できる。
【００２８】
出現頻度の向上により選別された低分子化抗体は、該抗体をコードするDNAを人工的に
合成して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞で発現させることにより製造することができる。
【００２９】
ファージディスプレイなどの相互作用検出プロセスで出現頻度の向上した抗体をコードする塩基配列を決定した場合には、選択された抗体をコードするＤＮＡをPCRで増幅、或
は制限酵素で切り出し、発現ベクターに導入して抗体を製図するための組換え発現ベクターを作製する。得られた発現ベクターを用いて、または抗体をコードするＤＮＡを相同的あるいは非相同的組換えにより染色体に組み込むことで、適当な宿主細胞で発現させることにより目的とする低分子化抗体を製造することができる。
【００３０】
ここで、発現ベクターは、宿主細胞の種類、宿主細胞への組換え発現ベクターの導入方法、タンパク質発現効率などを考慮して、当業者が周知の発現ベクターから適宜選択することができ、プラスミドベクターであっても、レトロウイルスやアデノウイルスに由来するウイルスベクターであってもよい。なお、発現ベクターは、導入したＤＮＡを発現するのに適したプロモーターやターミネーター等を予め含んでいることが好ましい。
【００３１】
次に、調製した組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する。この際、宿主細胞としては、組換え発現ベクターから所望の抗ＲＮＡ抗体を発現できる細胞であれば制限されず、大腸菌、又は、Saccaromyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris
等の酵母、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ−３Ｔ３等の哺乳類培養細胞、又は、ＳＦ９等の昆虫培養細胞であってもよい。
【００３２】
組換え発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、当業者に周知の方法から、宿主細胞や発現ベクターの種類を考慮して適宜選択することができ、例えば、エレクトロポーテーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法や、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（ロシュアプライドサイエンス社）、ＦｕＧＥＮ
Ｅ６トランスフェクション試薬（ロシュアプライドサイエンス社）、Lipofextamine LTX
（インビトロジェン社）、Lipofextamine 2000（インビトロジェン社）、polyethyleneimine等の市販の試薬を用いた方法が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００３４】
［実施例１］
ギガシーケンスによる抗原特異的抗体のスクリーニング法
（１）概要（図１）
抗原免疫したアルパカ白血球より作製した抗体ライブラリーをファージディスプレイでスクリーニングしたところ1種類の配列ファミリーに属する抗体配列を取得した。この実
験に用いたファージディスプレイ前後のライブラリーをギガシーケンサーにより大規模配列解析を行ったところ、通常のファージディスプレイで選択されたクローンの以外にも、ファージディスプレイによるスクリーニングの前後で顕著に出現頻度が向上した配列を得た。この配列からラクダ科動物由来VHH抗体を作製し、その結合活性、特異性を評価した
ところ、抗原特性であり、数〜数十nMの解離定数を有することが明らかとなった。なおラクダ科動物由来VHH抗体はシングルドメイン抗体であるために、重鎖-軽鎖の組み合わせ問題は無い。このことからin vitroスクリーニング前後の抗体ライブラリーを大規模配列解析し、個々の配列の出現頻度を調べることで、通常のファージディスプレイ法では取得できなかった抗原特異的な抗体を取得できることができることを明らかとした。
【００３５】
（２）具体的手順
IZUMO1PFF免疫して作製したファージディスプレイについて、抗原を固定化したプレー
トに対するファージディスプレイを用いたスクリーニング前後の配列を大規模解析し、出現頻度、割合の高いもの選ぶことで抗原特異的な抗体を得た。
【００３６】
抗原調製は、下記文献に従った：
Inoue, N. et al. Molecular dissection of IZUMO1, a sperm protein essential for sperm-egg fusion. Development 140, 3221-3229 (2013).
【００３７】
（３）抗原配列
IZUMO1PFF-Flag
アミノ酸配列（配列番号1）
DNA配列（配列番号2）
IZUMO1PFF-myc
アミノ酸配列（配列番号3）
DNA配列（配列番号4）
【００３８】
（４）大規模塩基配列解析により選択された抗体配列
I_1R_013
アミノ酸配列（配列番号5）
DNA配列（配列番号6）
I_1R_038
アミノ酸配列（配列番号7）
DNA配列（配列番号8）
【００３９】
（５）免疫方法
5週齢の雄のアルパカを免疫動物として用いた。免疫は、計3回実施した。初回免疫前に採血を行い免疫前コントロール血清とし、その後初回免疫を実施した。初回免疫は、アジュバントとしてFreund's Complete Adjuvant (FCA)を使用し、3.3mgの免疫抗原（IZUMO1PFF-Flag（配列番号1）、IZUMO1PFF-myc（配列番号3））とエマルジョンし、アルパカの皮下複数個所への免疫を実施した。2回目、3回目の免疫は、アジュバントとしてFreund's Incomplete Adjuvant (FIA)を使用し、それぞれ3.3mgの免疫抗原（IZUMO1PFF-Flag、IZUMO1PFF-myc）とエマルジョンし、アルパカの皮下複数個所への免疫を実施した。3回の免疫終
了後に、アルパカ頸静脈より採血を実施し、アルパカ血液を取得した。アルパカ血液からフィコールを用いた密度勾配遠心によってアルパカ末梢血リンパ球とプラズマ画分へ分離した。プラズマ画分から、Protein GアフィニティーカラムとProtein Aアフィニティーカラムを用いて、アルパカ重鎖抗体を精製した。具体的には、まずProtein Gアフィニティ
ーカラムにアルパカプラズマ画分を結合させ、0.15％ NaCl、0.58％ 酢酸（pH3.5）で、
溶出を行いIgG3（ヒンジ領域が長い重鎖抗体）を取得し、Protein Gアフィニティーカラ
ムの素通り画分をProtein Aアフィニティーカラムへ結合させ、0.15％ NaCl、0.58％ 酢
酸（pH4.5）溶出を行いIgG2（ヒンジ領域が短い重鎖抗体）を取得した。精製した重鎖抗
体を使用し、抗原固相化ELISAを実施し、IgG3の抗原に対する力価が有意に上昇している
ことを確認した。
そこで、アルパカ末梢血リンパ球を使用しファージディスプレイの作製工程へ移った。
【００４０】
（６）ライブラリーの構築方法
アルパカ血液をEDTA血として採取後、Leukosep（Greiner）に加えたFicoll-1077上に重層、遠心後、末梢血リンパ球を分離した。PBSに分散したリンパ球を遠心分離によって回
収後、RNAiso plus (Takara Bio Inc.)を加え破砕し、その溶液（5ml）に、0.2Volのクロロホルムを加え撹拌後、５分静置した。12000g×15min（4℃）による遠心後の最上層の水溶液に、0.8Volのイソプロパノールを加え撹拌し、室温で10分静置後、12000g×10min（4℃）遠心分離した。沈殿物は、75％エタノールで洗浄し、風乾後、DEPC水100μlに分散した（全RNA量として78ugを回収）。
【００４１】
SuperScript III (Life Tecnology Inc.)キットによる、オリゴdTプライマーを用いた
逆転写反応によって、ｃDNAを得た。
【００４２】
VHH遺伝子の増幅のためのPCRは、プライマー１（5’-AG GTG CAG CTC GTG GAG TCT GGG
GG-3（配列番号9）並びに5´-AG KTG CAG CTC GTG GAG TCN GGN GG-3´（配列番号10）
）とプライマー２（5´-TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3´（配列番号11）、LongHing用）を用
いて、KOD-plus neoDNAポリメラーゼ（Toyobo Co., Lt.）による、典型的には、94℃（2min）で変性処理反応と、引き続く、98℃-10sec)-58℃(30sec)-68℃(20sec)の22回のサイ
クルにて増幅を行った。PCR産物は、DNA精製キットを用いて精製後、２次PCRに供した。
２次PCRは、プライマー３(5’-TG CTC CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCT CAG GTG CAG CTC GTG GAG TCT GGG GG-3’ （配列番号12）、SfiI制限酵素サイトを含む)とプライマー
４(5'-ATGATGATGTGCACTAGTTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG-3'（配列番号13）、SpeI制限酵素サイトを含む)の２種のプライマーを用い、Gene taq DNA polymerase (Nippon Gene Co., Ltd.)によって行った。反応条件は、94℃（2min）で変性処理、引き続く、94℃(30sec)-58℃(30sec)-72℃(120sec)のサイクルを15回で行った。
【００４３】
２次PCR産物は、アガロース電気泳動後、ゲル精製キットにより精製し、制限酵素SfiI ならびにSpe I (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)に供し、DNA精製キットにより精製した。一方、ファージミドベクターpKSTV-02は、同じ２種の制限酵素で処理後、ゲル精製キットにより精製し、調製したVHH遺伝子と、T4リガーゼにより連結した。得られた
ベクターは、エレクトロポーレーションによる大腸菌TG1の形質転換に用いた。一部のサ
ンプルの滴定により評価された形質転換体の総数は、8.4×107と計算された。文献に従い、TG1形質転換体にヘルパーファージM13KO7を重感染させることで、ファージディスプレ
イの調製を行った。
【００４４】
NDOMに対するバイオパニングは、以下の方法にて行った。96穴プレートのウェルに、500ng/200ul PBSで、２時間コートし、0.5％BSA（PBS）にて、１晩ブロッキングを行った。これに、ファージディスプレイを、109 cfu分（200μl）を加え、室温１時間反応後、0.1％Tweenを含むPBSで5回洗浄した。0.1Mグリシン塩酸溶液（pH2.2、300μl）を加えて結合したファージを回収後、Tris-HCl（pH9.1）で中和し、大腸菌TG-1に感染させた。最後に
、ヘルパーファージの重感染により、ファージを回収した。
【００４５】
次世代シークエンサー用のサンプルの調製は、ライブラリ構築に用いた大腸菌ストックならびに１回のパニング後の大腸菌ストック、それぞれから、ファージミドDNAを調製し
、プライマー５（5'-GGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGG-3'（配列番号14））とプライマー６(5'-GTGGTTTTGGTGTCTTGGGTTC-3'（配列番号15）)を用いて、PCRを行い、増幅したPCR産物をNGSシークエンス解析サンプルとした。
【００４６】
（７）配列解析の方法
ライブラリーの塩基配列決定は、次世代DNAシーケンサーMiSeq（イルミナ社）で行った。ライブラリー１０ngを使って、TruSeqTM DNA Sample Preparation v2（イルミナ社）により、シーケンスサンプルを調整した。シーケンス反応はMiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)を用いて行った。
【００４７】
シーケンスデータはCLC Genomics Workbench ver5 (CLC Bio社)を用いて解析した。まず
、クオリティの低いデータを削除したのち、Merge Overlapping Pairsツールにより、両
側から250塩基ずつ読まれたデータを一つの配列にまとめた。そのデータをもとに次のよ
うに特異的抗体配列候補を選定した。なお配列相同性（Identity）がBLAST検索（CLC Genomics Workbench）において97%以上になるものについては同一配列として取り扱った。
【００４８】
（８）特異的抗体配列候補の選択方法
パニング後の出現数上位8配列の内、VHH抗体のホールマーク配列（Kabat(IMGT)表記で37(42)番目のアミノ酸がF、YかL、44(49)番目がE、DかQ、45(50)番目がRであり、47(52)番目がWでは無い（S、F、A、V、L、R、I、YかGである））を有する、パニング前後で出現頻度が50倍以上向上した2つの配列（I_1R_013、I_1R_038）を選んだ（表1）。なおI_1R_001は通常のファージディスプレイによるスクリーニングで同定されたクローンの配列と同一であった。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
表1：ファージディスプレイによるスクリーニング後の出現頻度の高かった配列、上位8位。VHH型の配列を持ち、増幅率が50以上の配列であり、通常のファージディスプレイによ
るスクリーニングでは選択されなかった配列を太字下線つきで示している。
【００５１】
（９）VHH抗体の調製
大腸菌のコドン頻度に合わせ、cDNA（配列番号17、19）を作製し、C末端側に3アミノ酸残基のリンカー及び6xヒスチジンタグ付加し、大腸菌用発現ベクターpAED4〔Biochemistry 35, 12677-12685 (1996)〕にクローニングした。VHH抗体は大腸菌BL-21pLysSで発現し、AKTA FPLC（GEヘルスケア社）を用いたニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。サンプルは20mM Tris-HCl（pH8.5）,6M尿素, 250mM NaClで平衡化したHiTrap Chelating 5mL（GEヘルスケア社）にアプライし、平衡化に用いたバファーと20mM Tris-HCl（pH8.5）, 6M尿素, 500mM Imidazole, 250mM NaClのグラディエントにより溶出した。またコントロールとして配列出現数第2位で出現頻度が5倍程度以上向上したI_1R_003に相当する大腸菌のコドン頻度に合わせたcDNA（配列番号19）を作製し、VHH抗体を調製
した。
【００５２】
（１０）発現した配列
I_1R_013
アミノ酸配列（配列番号16）
DNA配列（配列番号I_1R_013_02）（配列番号17）
I_1R_038
アミノ酸配列（配列番号18）
DNA配列（配列番号I_1R_038_02）（配列番号19）
I_1R_003
アミノ酸配列（配列番号20）
DNA配列（配列番号I_1R_003）（配列番号21）
【００５３】
（１１）活性測定
活性は抗原であるIZUMO1PFF（配列番号22）或は選択したVHH抗体をM5センサーチップに固定化し、20℃においてGEヘルスケア社のBiacore2000によって測定した。その結果I_1R_013とI_1R_038は抗原であるIZUMO1PFFに強固に結合することが明らかとなった。しかし出現頻度のスクリーニング前後の出現頻度の増加が少なかったI_1R_003は抗原と結合しなかった（図2）。また本VHH抗体は抗原であるIZUMO1PFFの4つのアミノ酸を変異させたIZUMO1PFF-pro（配列番号24）とは結合せず、IZUMO1PFFに特異的である（図3）。これらから大規
模配列解析を用いてスクリーニング前後の出現頻度の増加を調べることで通常のファージディスプレイ法での選択からは漏れた、特異的に抗原に結合する抗体配列を取得可能であることが明らかとなった。
【００５４】
（１２）センサーチップに固定化した抗原及び抗原類似配列
IZUMO1PFF
アミノ酸配列（配列番号22）
mus musculus
DNA配列（配列番号23）
Artificial (mus musculus)
IZUMO1PFF-pro
アミノ酸配列（配列番号24）
mus musculus
DNA配列（配列番号25）
Artificial (mus musculus)
【図３】
2015119637.tif 000004
【図１】
2015119637.tif 000005
【図２】
2015119637.tif 000006
【配列表】
2015119637000001.app