(57)【要約】【課題】  生物的に安全な微生物を利用した微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法を確立すること。【解決手段】  ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）および該工程で得られた培養液から２，３−ブタンジオールを単離・精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３−ブタンジオールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）および該工程で得られた培養液から２，３−ブタンジオールを単離・精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項２】
前記微生物がザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）である、請求項１に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項３】
前記工程Ａが通気条件下での培養である、請求項１または２に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項４】
前記工程Ａが酸素移動容量係数（ｋＬａ）９ｈ−１以上の条件での培養である、請求項１から３のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項５】
前記工程ＡがｐＨ５〜７の条件での培養である、請求項１から４のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項６】
前記工程Ａが糖濃度２０ｇ／Ｌ以上の培地での培養である、請求項１から５のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項７】
前記工程Ａで発酵原料として使用される窒素源がコーンスティープリカーである、請求項１から６のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項８】
前記工程Ｂが蒸留工程を含む、請求項１から７のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項９】
前記蒸留工程前に脱塩処理工程を含む、請求項８に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【請求項１０】
前記脱塩処理工程として少なくともイオン交換処理工程を含む、請求項９に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２，３−ブタンジオールは（２，３−ＢＤＯ）は、医薬品や化粧品の中間体原料、インク、香水、液晶、殺虫剤、軟化試薬、爆薬、可塑剤などの原料として用いられる有用な化合物であり、具体例として、メチルエチルケトン（非特許文献１）や１，３−ブタジエン（非特許文献２）の原料となりうる。２，３−ＢＤＯは工業的には２−ブテンオキシドを過塩素酸水溶液中で加水分解する方法で製造されている。また、近年では石油資源の枯渇や温暖化問題への対応として持続可能な循環型社会への転換が迫られており、化学産業においても、石油原料からバイオマス由来原料へのシフトが盛んに研究されている中で、微生物発酵法による２，３−ブタンジオールの製造方法が注目されつつある。
【０００３】
２，３−ブタンジオールを効率よく発酵生産する微生物にはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（非特許文献３）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ（非特許文献４）などの腸内細菌が知られている。これらの微生物は発酵に特定のビタミンやアミノ酸等を必要としないため、発酵液から２，３−ブタンジオールを単離・精製する際に必要となる工程が少なくすむという利点がある。しかしながら、これらの微生物には病原性があり、呼吸器感染症などを引き起こすことが知られている。そのため産業的な２，３−ブタンジオール製造を目的としてこれらの発酵菌を大量培養しようとした場合には厳重な管理のための設備が必要であり、コストの増大に繋がる。
【０００４】
生物的に安全であり、かつ発酵効率のよい２，３−ブタンジオール発酵微生物としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（非特許文献５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（非特許文献６）などのバチルス科細菌を用いる方法が開示されている。しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓによる２，３−ブタンジオール発酵では発酵を促進するための栄養源として高価な動物性エキスを使用する必要がある。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓによる２，３−ブタンジオール発酵では発酵を促進するためにクエン酸アンモニウムが使用されるが、クエン酸は２，３−ブタンジオールと沸点が近いため、培養液中に残存した場合には２，３−ブタンジオールの単離・精製が困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａ．Ｎ．Ｂｏｕｒｎｓ，Ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  Ｓｉｌｉｃａｔｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｒｅｓ．（１９４７年）
【非特許文献２】Ｎａｔｈａｎ  Ｓｈｌｅｃｈｔｅｒ，Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２，３−ｂｕｔｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｔｏ  Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ，Ｉｎｄｕ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．９０５（１９４５年）
【非特許文献３】Ｍａ  ＣＱ，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＳＤＭ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９；８２：４９-５７
【非特許文献４】Ｊｉ  ＸＪ，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１０；８５：１７５１-８．
【非特許文献５】Ｓ．  Ｓ．  Ｎｉｌｅｇａｏｎｋａｒ，  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２，  ３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ８２，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  １９９６，  Ｐａｇｅｓ  ４０８-４１０
【非特許文献６】Ｙａｎｇ  Ｔ，  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｂ１０−１２７．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１２  Ａｐｒ；２８（４）：１５６３−７４
【非特許文献７】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ  ｇｅｎ．  ｎｏｖ．，  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ａ  ｎｅｗ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ  ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｌｍ  ｓａｐ．  Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９３；１６０（５）：３３３−７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述のとおり、従来の微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法において生物的に安全な微生物を用いる場合、高コストになる、あるいは副生物との分離が困難であることが課題であった。
【０００７】
そこで本発明は、生物的に安全な微生物を利用した微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造方法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、これまで２，３−ブタンジオール発酵微生物としては知られていなかったザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が２，３−ブタンジオール発酵能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）の通りである。
（１）ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）および該工程で得られた培養液から２，３−ブタンジオールを単離・精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３−ブタンジオールの製造方法。
（２）前記微生物がザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｌｍａｅ）である、（１）に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（３）前記工程Ａが通気条件下での培養である、（１）または（２）に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（４）前記工程Ａが酸素移動容量係数（ｋＬａ）９ｈ−１以上の条件での培養である、（１）から（３）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（５）前記工程ＡがｐＨ５〜７の条件での培養である、（１）から（４）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（６）前記工程Ａが糖濃度２０ｇ／Ｌ以上の培地での培養である、（１）から（５）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（７）前記工程Ａの発酵原料がコーンスティープリカーを含む、（１）から（６）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（８）前記工程Ｂが蒸留工程を含む、（１）から（７）のいずれかに記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（９）前記蒸留工程前に脱塩処理工程を含む、（８）に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
（１０）前記脱塩処理工程として少なくともイオン交換処理工程を含む、（９）に記載の２，３−ブタンジオールの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微生物発酵にて２，３−ブタンジオールを製造する方法において、従来技術に比べて安全かつ効率的に２，３−ブタンジオールを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（工程Ａ：２，３−ブタンジオール発酵工程）
本発明では２，３−ブタンジオール発酵微生物としてザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌を使用することを特徴とする。使用する微生物は自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。２，３−ブタンジオールの発酵能を有するザイモバクター属細菌の具体例としては、２，３−ブタンジオール発酵能の観点からザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｔｃｅｒ  ｐａｌｍａｅ）が好ましく利用される。
【００１２】
発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。
【００１３】
炭素源の具体例としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、シュクロース、スターチ、廃糖蜜、澱粉などの糖類、クエン酸、コハク酸、酢酸などの有機酸、グリセロール、エタノールなどのアルコールが用いられるが、好ましくは糖類が用いられる。糖類が用いられる場合の培地中の糖類の濃度は、後段の２，３−ブタンジオールの精製工程を効率よく行うために２０ｇ／Ｌ以上とするのが好ましい。
【００１４】
窒素源の具体例としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、アミノ酸、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解物液、カゼイン加水分解物、動物組織加水分解物、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。このうち有機窒素源としては大豆加水分解物またはコーンスティープリカーが好ましく、コーンスティープリカーがより好ましい。発酵原料に含まれるコーンスティープリカーの濃度は特に限定されないが、例えばコーンスティープリカーに含まれる固形分として、通常、２．５ｇ／Ｌ〜３５ｇ／Ｌ、好ましくは５ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌである。コーンスティープリカーに含まれる固形分の測定方法としては特に限定されないが、例えば、加熱乾燥における乾燥前後の重量差を水分含量とし、乾燥前の重量より水分含量を引いた残りを固形分として求めることができる。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００１５】
その他、微生物の生育に応じてニコチン酸を培地に適宜添加使用してもよく、また、消泡剤を適宜添加使用してもよい。
【００１６】
培養温度は、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、通常、温度が２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の範囲で行われる。
【００１７】
培養時の培地ｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８の範囲内に維持されるが、ｐＨ５〜７に調節して培養を行うことが好ましく、ｐＨ５以上６未満がより好ましい。
【００１８】
微生物の培養形態には特に制限はなく、バッチ培養、流加発酵、連続培養などで行う。
【００１９】
本発明では通気条件下で微生物を培養することが好ましい。本発明における通気とは、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。通気方法としては特に制限はないが、例えば、培養液中に酸素を含んだ気体を通過させる方法のほかに、培養液上の空気層を、酸素を含む気体で置換する上面通気も含まれる。また、上面通気には培養槽に酸素を含む気体を吹き込む方法のほかに、大気開放された状態で培養液を攪拌することで培養液上に空気の流れを生じさせ、培養液中に酸素を供給する方法も含まれる。本発明では、培養液中に酸素を含んだ気体を通過させる方法によって通気することが好ましい。
【００２０】
微生物の培養における培地への酸素供給条件は、通気と攪拌とを組み合わせることで適宜設定でき、常圧で３０℃の水を対象とした場合の酸素移動容量係数ｋＬａ（ｈ−１）（以下、単にｋＬａと略す。）で表される。ｋＬａとは、通気攪拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で定義される。（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊−Ｃ）・・・式（１）。
【００２１】
ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、ｋＬａ：酸素移動容量係数（ｈｒ−１）である。上記式（１）より、下記式（２）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊−Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊−Ｃ）＝−ｋＬａ×ｔ・・・式（２）。
【００２２】
本発明でのｋＬａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気攪拌培養装置に水を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、攪拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりｋＬａを計算する方法である。
【００２３】
本発明での培養時に設定するｋＬａは特に制限されないが、好ましくは９ｈ−１以上である。
【００２４】
２，３−ブタンジオール発酵工程で得られる培養液には、２，３−ブタンジオールの他、発酵原料由来の不純物や発酵副産物であるエタノールなどが含まれるため、後段のプロセスおいて培養液に含まれる２，３−ブタンジオールを単離・精製する必要がある。
【００２５】
（単離・精製工程）
２，３−ブタンジオール培養液からの２，３−ブタンジオールの単離・精製工程は特に制限はなく、当業者に公知の手法によって実施すればよいが、本発明では２，３−ブタンジオール培養液を蒸留する工程を含むことが好ましい。
【００２６】
２，３−ブタンジオール培養液の蒸留では、２，３−ブタンジオールは蒸気側から回収される。蒸留法は特に限定されないが、一般的に適応される単蒸留や精密蒸留、常圧蒸留や減圧蒸留のいずれでもよく、薄膜蒸留装置や棚段式蒸留装置、充填式蒸留装置などから選択することができる。また、回分式であっても連続式であっても本発明に適用できる。中でも好ましくは、減圧蒸留であり、沸点を下げることができるため、不純物の発生を抑制することができる。具体的には、加熱温度が６０℃以上１５０℃以下で行うのが好ましい。６０℃未満の場合は減圧度を著しく下げる必要があるため、工業レベルでは装置の維持が非常に困難となる。また、１５０℃より高くなる場合には、２，３−ブタンジオール溶液中に残存する微量の糖などが分解し、着色性物質の副生が起こるため好ましくない。そのため、上記加熱温度範囲で２，３−ブタンジオールが留出するよう、減圧度を調節するのがよい。
【００２７】
なお、２，３−ブタンジオール培養液をそのまま蒸留工程に供してもよいが、蒸留工程に先立ち、脱塩工程や濃縮工程に供することが好ましい。  脱塩工程の具体例としては、イオン交換処理が挙げられる。イオン交換処理は、イオン交換体を用いて２，３−ブタンジオール培養液中のイオン成分を除去する方法である。イオン交換体としては、イオン交換樹脂、イオン交換膜、イオン交換繊維、イオン交換紙、ゲルイオン交換体、液状イオン交換体、ゼオライト、炭質イオン交換体、モンモリロン石を用いることができるが、本発明ではイオン交換樹脂を用いた処理が好ましく採用される。
【００２８】
イオン交換樹脂にはその官能基の違いにより、強アニオン交換樹脂、弱アニオン交換樹脂、強カチオン交換樹脂、弱カチオン交換樹脂、キレート交換樹脂などがある。例えば、強アニオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ４１１、ＩＲＡ９１０ＣＴや三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ、ＵＢＫ５１０Ｌ、ＵＢＫ５３０、ＵＢＫ５５０、ＵＢＫ５３５、ＵＢＫ５５５などから選定される。また、弱アニオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲＡ４７８ＲＦ、ＩＲＡ６７、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＩＲＡ９８、ＸＥ５８３や三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０などがある。一方、強カチオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ１２４、２００ＣＴ、２５２の他、三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＳＫ１０４、ＳＫ１Ｂ、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６、ＰＫ２１８，ＰＫ２２０、ＰＫ２２８などがあり、弱カチオン交換樹脂としては、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＦＰＣ３５００、ＩＲＣ７６や三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＷＫ１０、ＷＫ１１、ＷＫ１００、ＷＫ４０Ｌなどから選定することができる。
【００２９】
本発明では、イオン交換樹脂としてアニオン交換樹脂およびカチオン交換樹脂を併用することが好ましく、中でも、多様なイオンを除去することができる強アニオン樹脂および強カチオン樹脂を用いる方がよい。また、アニオン交換樹脂は水酸化ナトリウムなどの希アルカリ性水溶液により再生し、ＯＨ型として用いることが好ましく、カチオン交換樹脂の場合は、塩酸などの希酸性水溶液により再生し、Ｈ型として用いることが好ましい。イオン交換樹脂による脱塩方法はバッチ法でもカラム法でもよく、効率的に脱塩出来る方法であれば特に制限はない。しかしながら、製造プロセスにおいては、繰り返し利用が容易なカラム法が好ましく採用される。通液速度は通常、ＳＶ（空間速度）で制御され、ＳＶ＝２〜５０が好ましく、より高度に精製できるＳＶ＝２〜１０で通液することが好ましい。樹脂はゲル型でもポーラス型、ハイポーラス型、ＭＲ型などの種類が市販されており、これらイオン交換樹脂の形状はいずれでもよく、溶液の品質に合わせて最適な形状を選択すればよい。
【００３０】
また、ナノ濾過膜処理も脱塩工程の具体例として挙げられる。２，３−ブタンジオール培養液のナノ濾過膜処理は、例えば特開２０１０−１５０２４８号公報にも開示されているように、２，３−ブタンジオール培養液をナノ濾過膜に通じて濾過することによって透過液側に２，３−ブタンジオール、非透過液側に無機塩、糖類および着色成分を効率的に分離することができる。
【００３１】
ナノ濾過膜の素材としては、ピペラジンポリアミドやポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコール、ポリイミド、ポリエステルなどのポリマー系素材のほか、セラミックスなどの無機材料が用いられている。また、ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントの他、平膜や中空糸膜として使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜は、スパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。
【００３２】
本発明で用いられるナノ濾過膜エレメントの好ましい具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜の“ＧＥｓｅｐａ”、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、中でも好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００３３】
ナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、２，３−ブタンジオール発酵液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
【００３４】
ナノ濾過膜に通じて濾過する２，３−ブタンジオール溶液の２，３−ブタンジオールの濃度は特に限定されないが、高濃度であれば透過液中に含まれる２，３−ブタンジオール濃度も高いため、濃縮する際のエネルギー削減ができ、コスト削減にも好適である。
【００３５】
脱塩工程においては、イオン交換処理またはナノ濾過膜処理のいずれかであってもよく、それらを併用してもよいが、少なくともイオン交換処理をすることが好ましい。また、イオン交換処理とナノ濾過膜処理を併用する場合の順序は特に制限はないが、２，３−ブタンジオール培養液をナノ濾過膜処理して透過液側から得られる無機塩が低減した２，３−ブタンジオール培養液をイオン交換処理することが好ましい。これにより、ナノ濾過膜を一部通過する無機塩や有機酸をイオン交換樹脂で除去することで、無機塩類の除去率を上げることができる。
【００３６】
２，３−ブタンジオール培養液の濃縮方法としては当業者が公知の一般的な方法でよく、例えば、逆浸透膜を用いる方法や、エバポレーターによる加熱濃縮などが挙げられるが、逆浸透膜を用いる方法が好ましく適用される。
【００３７】
逆浸透膜を用いる方法は、２，３−ブタンジオール溶液を逆浸透膜に通じて濾過することで透過液側に水を透過させ、２，３−ブタンジオールを膜の非透過液側に保持することで濃縮する方法である。本発明で好ましく使用される逆浸透膜としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。
【００３８】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製“ＧＥＳｅｐａ”、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０などが挙げられる。
【００３９】
逆浸透膜による濃縮は、圧力をかけて行うが、その濾過圧は、１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲であることが好ましい。また、濾過圧が１ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲であれば、膜透過流束が高いことから、２，３−ブタンジオール溶液を効率的に濃縮することができる。膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことから最も好ましくは、２ＭＰａ以上６ＭＰａ以下の範囲である。低濃度の２，３−ブタンジオール溶液においては、逆浸透膜を用いる方法が低コストであるため好ましい。
【００４０】
その他、上記工程に先立ち、２，３−ブタンジオール培養液に含まれる菌体を分離する工程を含むことが好ましい。菌体の分離工程としては、例えば遠心分離、ろ過分離などの方法を用いることができる。これらの方法はどちらか一方のみでもよいし、組み合わせてもよい。
【００４１】
本発明によって製造される２，３−ブタンジオールは高純度であることを特徴とする。２，３−ブタンジオールに含まれる不純物を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による純度測定や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いたＵＶ検出による純度測定などを併用して評価することができ、これらは全検出ピーク面積中の２，３−ブタンジオール面積の比率で評価するため、比率が高いほど２，３−ブタンジオールが高純度であることを意味する。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
（参考例１）ｋＬａ測定
培養装置（エイブル株式会社製、ジャー容量１．５Ｌ）に溶存酸素電極（エイブル株式会社製）を挿入して各通気攪拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりｋＬａを求めた。まず、培養槽に水１Ｌを投入し、水温を３０℃に調整しながら一定の速度で攪拌して窒素ガスを十分に水中に吹き込み、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行った。そののち通気ガスを窒素ガスから所定の通気速度の空気あるいは窒素ガスに切り替えてからの溶存酸素濃度の経時変化を測定してｋＬａを求めた。得られた各通気攪拌条件に対するｋＬａを表１に示す。
【００４４】
【表１】
2015119702.tif 000002
【００４５】
（実施例１〜６：ｋＬａ）
＜２，３−ブタンジオール発酵＞
ザイモバクター・パルメ（Ｚ．ｐａｌｍａｅ）  ＡＴＣＣ５１６２３株を、Ｔ培地（２０ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  １０ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  １０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、  ２ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、  ０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、  ｐＨ６．０）を５ｍＬ入れた試験管にて３０℃で２４時間静置培養を行い、前々培養とした。この前々培養液を、Ｔ培地を５０ｍＬ入れた三角フラスコに全量添加したのち、３０℃で１６時間静置培養を行い、前培養とした。前培養液を表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨ５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら温度３０℃で表１に記載のｋＬａにて培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２時間おきに最大４０時間まで行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を測定した。
【００４６】
【表２】
2015119702.tif 000003
【００４７】
以下に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、株式会社島津製作所製）によるそれぞれの濃度測定条件を示す。発酵後の２，３−ブタンジオール濃度、グルコース濃度、発酵収率は以下の測定方法によって求めた。
【００４８】
（２，３−ブタンジオール濃度測定）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
カラム温度：６５℃
移動相：０．０５Ｍ  硫酸水溶液、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
【００４９】
（グルコース濃度測定）
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ５０  ４Ｅ（昭和電工株式会社製）
カラム温度：３０℃
移動相：水：アセトニトリル＝１：３、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
【００５０】
（発酵収率）
上述のＨＰＬＣ分析により測定した２，３−ブタンジオール濃度およびグルコース濃度より、下式を用いて算出した。
発酵収率（％）＝１００×｛（培養液中２，３−ブタンジオール濃度）−（培地中２，３−ブタンジオール濃度）｝／｛（培地中グルコース濃度）−（培養液中グルコース濃度）｝。
【００５１】
培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表３に示す。得られた２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。
【００５２】
＜２，３−ブタンジオール培養液のイオン交換精製＞
上述の発酵試験により得られた培養液について、イオン交換処理による残留イオンの除去を行った。強アニオン交換樹脂ＩＲＡ１２０Ｊ（株式会社オルガノ製）および強カチオン交換樹脂ＩＲ４１０（株式会社オルガノ製）を用い、それぞれ１Ｎ水酸化ナトリウムおよび１Ｎ塩酸によってＯＨ型およびＨ型に再生して使用した。樹脂量は各種無機塩と有機酸との総量とイオン交換樹脂の交換容量が等量になるように算出した。前述のイオン交換樹脂をカラムに充填し、アニオン交換、カチオン交換の順に通液速度ＳＶ＝５で通液した。
【００５３】
＜２，３−ブタンジオールの蒸留精製＞
イオン交換処理した２，３−ブタンジオール溶液は、薄膜濃縮装置  ＭＦ−１０（東京理化器械株式会社製）によって水を除去した。この時、減圧度は３０ｈＰａ、加熱温度は６０℃で水を蒸発させた。濃縮した２，３−ブタンジオール溶液を減圧蒸留（５ｍｍＨｇ）し、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールの
ＧＣ純度、蒸留収率は以下の測定方法によって求めた。
【００５４】
（ＧＣ純度）
蒸留後の２，３−ブタンジオールをガスクロマトグラフィー（ＧＣ、株式会社島津製作所製）を用いて分析し、全検出ピーク面積中の２，３−ブタンジオールピーク面積の比率から、下式によって算出した。
ＧＣ純度（％）＝１００×（２，３−ブタンジオールピーク面積）／（全検出ピーク面積）。
【００５５】
ガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
カラム：ＲＴ−ＢＤＥＸＭ（０．２５ｍｍ×３０ｍ、Ｒｅｓｔｅｋ社製）
カラム温度：７５℃
気化室、検出器温度：２３０℃
キャリアガス：Ｈｅ
線速度：３５ｃｍ／ｓｅｃ
検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）。
【００５６】
（蒸留収率）
ＨＰＬＣ分析で測定した２，３−ブタンジオール濃度と仕込み液量から算出した蒸留前の２，３−ブタンジオール仕込み量と、蒸留後の留出液量と上述のＧＣ純度から算出した２，３−ブタンジオール回収量から、下式により計算した。
蒸留収率（％）＝１００×｛（蒸留後の留出液量）×（ＧＣ純度）｝／｛（蒸留前２，３−ブタンジオール濃度）×（蒸留前の仕込み液量）｝。
【００５７】
（２，３−ブタンジオール総収率）
発酵工程の結果より算出した発酵収率および精製工程の結果より算出した蒸留収率から、下式により計算した。結果を表３に示す。
２，３−ブタンジオール総収率（ｇ／ｇ糖）＝（発酵収率）／１００×（蒸留収率）／１００。
【００５８】
【表３】
2015119702.tif 000004
【００５９】
（実施例７〜１１：ｐＨ）
Ｚ．ｐａｌｍａｅ  ＡＴＣＣ５１６２３株を、実施例１〜６記載の前々培養方法および前培養方法にて培養した。前培養液を表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨがそれぞれ４．５、４．８、５．２、５．５、６．１、６．５のいずれかとなるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２時間おきに最大４０時間まで行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を実施例１〜６記載の方法にて測定した。培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表４に示す。発酵試験後の２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１〜６記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１〜６記載の方法によって求めた結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
2015119702.tif 000005
【００６１】
（実施例１２〜１６：糖濃度）
Ｚ．ｐａｌｍａｅ  ＡＴＣＣ５１６２３株を、実施例１〜６記載の前々培養方法および前培養方法にて培養した。前培養液をグルコース濃度がそれぞれ１２、２０、１００、１８０、２５０ｇ／Ｌのいずれかとなるように調整した表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２時間おきに最大４０時間まで行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を実施例１〜６記載の方法にて測定した。培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表５に示す。発酵試験後の２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１〜６記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１〜６記載の方法によって求めた結果を表５に示す。
【００６２】
【表５】
2015119702.tif 000006
【００６３】
（実施例１７〜２０：有機窒素源
Ｚ．ｐａｌｍａｅ  ＡＴＣＣ５１６２３株を、実施例１〜６記載の前々培養方法および前培養方法にて培養した。表２に示す組成の２，３−ブタンジオール発酵培地におけるコーンスティープリカーを表６に示す種々の有機窒素源で置き換えた培地１Ｌに前培養液を添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２〜４時間おきに行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３−ブタンジオール濃度を実施例１〜６記載の方法にて測定した。培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３−ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表１２に示す。発酵試験後の２，３−ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３−ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１〜６記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３−ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３−ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１〜６記載の方法によって求めた結果を表７に示す。
【００６４】
いずれの有機窒素源においても良好な２，３−ＢＤＯ収率が得られたが、実施例４に示すコーンスティープリカーを用いた場合に２，３−ＢＤＯ収率が最も高くなった。
【００６５】
【表６】
2015119702.tif 000007
【００６６】
【表７】
2015119702.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明で得られる２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）は、医薬品や化粧品の中間体原料、インク、香水、液晶、殺虫剤、軟化試薬、爆薬、可塑剤などの原料として有用な化合物である。