(57)【要約】      （修正有）【課題】卵巣明細胞腺癌の診断方法の提供。【解決手段】被験者から取得した染色体DNAにおいて、染色体8qの少なくとも一部の増幅、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、染色体8qの少なくとも一部の増幅、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法。
【請求項２】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
【請求項３】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、EGFR遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症との関連性を診断する方法。
【請求項４】
前記欠失又は増幅の検出を、該当領域を含むDNAコピー数の変化を検出することによって行う、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記DNAコピー数の変化を、PCR法、FISH法、CGH法、ISH法、定量PCR法又はシーケンシング法によって検出することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験者から取得した染色体DNAが、被験者の腫瘍組織、子宮頸部・内膜細胞診サンプル、脳脊髄液、血液又は尿から抽出したものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒト染色体8q領域、染色体9q領域、染色体3q26-29領域、染色体12p13.33-12.2領域、染色体4p15.2-15.32領域、染色体11q22.2-25領域、EGFR遺伝子領域、LRP1B遺伝子領域、TPRG1遺伝子領域、LRBA遺伝子領域、PDE4D遺伝子領域から選択される１以上の染色体領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含む、卵巣明細胞腺癌の診断、卵巣明細胞腺癌の悪性度若しくは予後の診断方法、又は、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症の関連性を診断する方法に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣明細胞腺癌の診断方法に関する。より具体的には、患者由来の染色体の特定領域における増幅、又は、欠失を検出することによって、卵巣明細腺癌の罹患の有無、あるいは、予後の評価を含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
上皮性卵巣癌は、米国において９番目に多い癌であり、日本においては、１４番目に多く、徐々に患者数が増加している。上皮性卵巣癌は主として４つの組織学的なサブグループから構成されている。すなわち、漿液性腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌及び明細胞腺癌である。なかでも、明細胞腺癌は北米及び欧州においては、２番目に多く、その罹患率は１−１２％と見積もられており、日本においては１５−２５％の罹患率である。さらに、日本では、過去２０年間、５０歳以上の年齢層において、４つのサブグループのうち明細胞腺癌の増加率が最も高かった。また、明細胞腺癌患者の多くは、初期段階（I又はII）で診断され、その腫瘍は無痛性であるのに対し、進行期（III又はIV）の患者は、通常、予後が悪く（非特許文献１及び非特許文献２）、早期発見の必要性の高い癌の一つである。
また、最近の報告によれば、子宮内膜症が、明細胞腺癌及び子宮内膜腺癌のリスクを増加させることが明らかとなっている（非特許文献３）。
アジア系の女性における子宮内膜症の発症率は、白人系の女性の９倍高いことが報告されており、特に、日本において、子宮内膜症の発症率が増加している。その理由の一つとして、晩婚化と出産数の減少によるものと考えられる。さらに、日本人においては、子宮内膜症と明細胞腺癌との間に特有の疫学的関連性が存在している可能性も示唆されている。
【０００３】
上皮性卵巣癌の組織型における疫学的な相違に加えて、分子学的特徴の相違も報告されている。ARID1A腫瘍抑制遺伝子の変異及び、ARID1Aがコードするタンパク質であるBAF3250aの機能喪失が、明細胞腺癌の４６％に、子宮内膜癌及び類子宮内膜癌の３０％に確認されているが、漿液性腺癌ではそのような報告はない。この結果に鑑みるに、体細胞性の突然変異のいくつかが、子宮内膜症から明細胞腺癌又は子宮内膜腺癌へと移行する引き金となっていることが示唆される。また、染色体CGH法を用いて、染色体の特定領域の増幅又は欠失が子宮内膜癌の予後と関連性があることを見出し、その結果を利用して、子宮内膜癌の予後の診断を行うことが可能であることなども報告されている（特許文献１）。
その他、遺伝学的解析あるいはゲノム解析により、明細胞腺癌においてTP53突然変異は比較的低いが（非特許文献４）、進行度の高い漿液性腺癌ではほぼ全ての腫瘍においてTP53の突然変異が生じていること、また、頻度は低いが統計的に有意なものとして、NF1、BRCA1、BRCA2、RB1、CDK12の突然変異が生じていることなどが報告されている(非特許文献５)。
これらの知見は、注目に値するものであるが、卵巣明細胞腺癌の発症の有無の診断、あるいは、子宮内膜症と卵巣明細胞腺癌との関連性につき、確実な診断方法を提供するまでには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2000-166557
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takanoら, Br J Cancer 94:1369?1374 2006
【非特許文献２】Mizunoら, J Surg Oncol 94:138?143 2006
【非特許文献３】Pearceら, Lancet Oncol. 13:385-394 2012
【非特許文献４】Kuoら, Am J Pathol. 174:1597-1601 2009
【非特許文献５】Bellら, Nature 474:609-615 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、染色体の構造変化に基づき、卵巣明細胞腺癌の発症の有無又は発症の可能性、卵巣明細胞腺癌の悪性度もしくは予後の診断方法の適用を目的とする。さらに、本発明は、子宮内膜症と卵巣明細胞腺癌との関連性を診断する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者ら、上記課題を解決するために、卵巣明細胞腺癌患者由来の染色体（又は染色体DNA）に対し、アレイCGH（Comparative Genomic Hybridization）法を用いて解析を行ったところ、いくつかの染色体DNA領域における増幅、欠失が卵巣明細胞腺癌の発症、悪性度、予後等と関連性を有することを初めて明かにした。
卵巣明細胞腺癌の臨床的特徴として、日本人において多く発生する、子宮内膜症と関連性を有する、といった特徴を挙げることができる。そこで、これらの臨床的特徴と関連する体細胞性コピー数変化（SCNAs ;somatic copy number alterations ）を解析するために、高解像度のアレイCGH法を使用した。
その結果、染色体8qの増幅が高い頻度で観察された。さらに、染色体3q26-29の増幅、染色体12p13.33-12.2の増幅、染色体4p15.2-15.32の欠失、染色体11q22.2-25の欠失が、無増悪生存期間が短いことと関連性を有していた。さらに、子宮内膜症を合併している患者においては、EGFR遺伝子の増幅及びその他いくつかのSCNAsが検出された。
これらの結果は、特定の染色領域の異常が、卵巣明細胞腺癌の発症の有無もしくは発症の可能性を診断する手がかり、卵巣明細胞腺癌の悪性度もしくは予後の予測、子宮内膜症との合併の有無あるいは明細胞腺癌に進行する可能性のある子宮内膜症の罹患の有無等を予測する手がかりを提供する。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）である。
（１）被験者から取得した染色体DNAにおいて、染色体8qの少なくとも一部の増幅、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法。
（２）被験者から取得した染色体DNAにおいて、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
（３）被験者から取得した染色体DNAにおいて、EGFR遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症との関連性を診断する方法。
（４）前記欠失又は増幅の検出を、該当領域を含むDNAコピー数の変化を検出することによって行う、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記DNAコピー数の変化を、PCR法、FISH法、CGH法、ISH法、定量PCR法又はシーケンシング法によって検出することを特徴とする上記（４）に記載の方法。
（６）被験者から取得した染色体DNAが、被験者の腫瘍組織、子宮頸部・内膜細胞診サンプル、脳脊髄液、血液又は尿から抽出したものであることを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ヒト染色体8q領域、染色体9q領域、染色体3q26-29領域、染色体12p13.33-12.2領域、染色体4p15.2-15.32領域、染色体11q22.2-25領域、EGFR遺伝子領域、LRP1B遺伝子領域、TPRG1遺伝子領域、LRBA遺伝子領域、PDE4D遺伝子領域から選択される１以上の染色体領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含む、卵巣明細胞腺癌の診断、卵巣明細胞腺癌の悪性度若しくは予後の診断方法、又は、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症の関連性を診断する方法に使用されるキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、卵巣明細胞腺癌の早期発見、悪性度もしくは予後の予測が可能となる。卵巣明細胞腺癌の悪性度もしくは予後予測が可能になることから、術前又は術後の療法の選択の幅が広がり、より適切な治療を行うことができる。
【００１０】
また、本発明により、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症との合併の有無、さらには、卵巣明細胞腺癌へ進行する可能性のある子宮内膜症の罹患の有無あるいは罹患の可能性を判断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】22対の常染色体とX染色体におけるSCNAsの増加及び欠失の頻度を示す。  染色体コピー数の増加の頻度（%）（中心軸より右側のピーク）及び染色体コピー数の欠失の頻度（%）（中心軸より左側のピーク）をまとめた結果である。中心軸は、「０」で示している。
【図２】局所的な染色体異常の増幅又は欠失に関するKaplan-Meierの無増悪生存曲線。3q26-29領域の増幅と無増悪生存期間との関係。
【図３】局所的な染色体異常の増幅又は欠失に関するKaplan-Meierの無増悪生存曲線。312p13.33-12.2領域の欠失と無増悪生存期間との関係。
【図４】局所的な染色体異常の増幅又は欠失に関するKaplan-Meierの無増悪生存曲線。4p15.2-15.32領域の欠失と無増悪生存期間との関係。
【図５】局所的な染色体異常の増幅又は欠失に関するKaplan-Meierの無増悪生存曲線。11q22.2-25領域の欠失と無増悪生存期間との関係。
【図６】局所的な染色体異常の増幅又は欠失に関するKaplan-Meierの無増悪生存曲線。図２〜５に挙げた領域において、３〜４領域に異常がある患者と０〜２領域に異常がある患者の無増悪生存期間の比較を行った結果である。
【図７】子宮内膜症を合併している卵巣明細胞腺癌患者の体細胞性コピー数変化の有意な増減（染色体7p上のEGFR遺伝子）。  右上のパネルは、全ゲノムにおいて、体細胞性コピー数が有意変化した領域を示す。赤は有意なコピー数の変化領域が最も集中している部分を示し、次いで、黄色、灰色、濃紺の順に変化領域が集中していた。左上のパネルは、有意なコピー数の変化示す領域が、赤又は黄色の部分であることを示している。下のパネルは、典型的な体細胞性コピー数変化を示す。
【図８】子宮内膜症を合併している患者と合併していない患者におけるEGFR RNAの発現レベルの比較を示す。EGFR RNAの発現レベルをRT-PCRで測定し、Mann-Whitneyテストを用いて、子宮内膜症を併発する患者と併発していない患者において比較を行った。
【図９】子宮内膜症を合併している卵巣明細胞腺癌患者の体細胞性コピー数変化の有意な増減（染色体2q上のLRP1B遺伝子）。  右上のパネルは、全ゲノムにおいて、体細胞性コピー数が有意変化した領域を示す。赤は有意なコピー数の変化領域が最も集中している部分を示し、次いで、黄色、灰色、濃紺の順に変化領域が集中していた。左上のパネルは、有意なコピー数の変化示す領域が、赤又は黄色の部分であることを示している。下のパネルは、典型的な体細胞性コピー数変化を示す。
【図１０】子宮内膜症を合併している卵巣明細胞腺癌患者の体細胞性コピー数変化の有意な増減（染色体3q上のTPRG1遺伝子）。  右上のパネルは、全ゲノムにおいて、体細胞性コピー数が有意変化した領域を示す。赤は有意なコピー数の変化領域が最も集中している部分を示し、次いで、黄色、灰色、濃紺の順に変化領域が集中していた。左上のパネルは、有意なコピー数の変化示す領域が、赤又は黄色の部分であることを示している。下のパネルは、典型的な体細胞性コピー数変化を示す。
【図１１】子宮内膜症を合併している卵巣明細胞腺癌患者の体細胞性コピー数変化の有意な増減（染色体4q上のLRBA遺伝子）。  右上のパネルは、全ゲノムにおいて、体細胞性コピー数が有意変化した領域を示す。赤は有意なコピー数の変化領域が最も集中している部分を示し、次いで、黄色、灰色、濃紺の順に変化領域が集中していた。左上のパネルは、有意なコピー数の変化示す領域が、赤又は黄色の部分であることを示している。下のパネルは、典型的な体細胞性コピー数変化を示す。
【図１２】子宮内膜症を合併している卵巣明細胞腺癌患者の体細胞性コピー数変化の有意な増減（染色体5q上のPDE4D遺伝子）。  右上のパネルは、全ゲノムにおいて、体細胞性コピー数が有意変化した領域を示す。赤は有意なコピー数の変化領域が最も集中している部分を示し、次いで、黄色、灰色、濃紺の順に変化領域が集中していた。左上のパネルは、有意なコピー数の変化示す領域が、赤又は黄色の部分であることを示している。下のパネルは、典型的な体細胞性コピー数変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、被験者（卵巣明細胞腺癌の患者、又は、卵巣明細胞腺癌に罹患している可能性のある者など、本発明の方法を適用する対象者）から取得した染色体（又は染色体DNA）において、染色体8qの少なくとも一部の増幅、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法である。
本発明によれば、染色体8qの少なくとも一部の増幅、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失のいずれか１つでも検出されれば、その染色体が由来する被験者は、卵巣明細胞腺癌に罹患しているか、もしくは、罹患している可能性があると診断することができるが、好ましくは、これらの染色体領域の１〜２カ所、好ましくは３〜６カ所、より好ましくは７カ所〜１０カ所の異常（欠失又は増幅）を検出し、診断を行うことが望ましい。これら１０カ所のうち、複数の箇所における異常の有無を検出する場合、どのような組み合わせで検出してもよい。
【００１３】
また、特に、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失が検出された場合、その染色体DNAが由来する被験者は、卵巣明細胞腺癌に罹患している可能性があり、卵巣明細胞腺癌に罹患している場合には、悪性度が高い、又は、予後不良（無増悪生存期間が短い）と判断することができる。
従って、本発明には、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法が含まれる。
本診断方法においては、染色体3q26-29の少なくとも一部の増幅、染色体12p13.33-12.2の少なくとも一部の増幅、染色体4p15.2-15.32の少なくとも一部の欠失、染色体11q22.2-25の少なくとも一部の欠失のいずれか１つでも検出されれば、卵巣明細胞腺癌に罹患している可能性があり、卵巣明細胞腺癌に罹患している場合には、予後不良と判断することができるが、好ましくは、これらの染色体領域の１〜２カ所、より好ましくは３カ所、さらに好ましくは４カ所の異常（欠失又は増幅）を検出し、診断を行うことが望ましい。これら４カ所のうち、複数の箇所における異常の有無を検出する場合、どのような組み合わせで検出してもよい。
【００１４】
本発明の診断方法は、上述の通り、卵巣明細胞腺癌の罹患の有無、卵巣明細胞腺癌に罹患した場合の予後の良又は不良を判断する方法として使用可能である。すなわち、本発明の卵巣明細胞腺癌の診断には、特に限定しないが、例えば、卵巣明細胞腺癌の罹患の有無、卵巣明細胞腺癌に罹患している患者又は罹患した場合の被験者における、該卵巣明細胞腺癌の予後を判断することが含まれる。
ここで、癌の「悪性度」とは、医学分野において通常用いられている言葉の意味と、特に異なる意味を表すものではなく、限定はしないが、例えば、卵巣明細胞腺癌の予後が良好か、あるいは、予後が不良か等を判断するための癌の状態を意味する。本発明の悪性度の診断方法により判断された悪性度もしくは予後の判断は、該腫瘍の外科的手術による切除範囲の決定、術前又は術後の補助療法若しくは内科的療法（化学療法剤や、分子標的薬を使用した療法など）の要否などの治療方法の選択を行う上でも有効である。
また、「予後」とは、医学分野において通常用いられている言葉の意味と、特に異なる意味を表すものではなく、限定はしないが、例えば、予想される医学的な状態（健康状態）に関する見解、病気・創傷の将来的な状態のことである。また、疾患が癌等である場合に、予後の評価又は予後の診断としては、例えば、癌のグレード診断、悪性度診断、将来における転移の有無の予測、手術後の症状の悪化の有無の予測、無増悪生存期間の長短の予測等を挙げることができる。そして、予後が不良であるとは、例えば、無増悪生存期間の短縮、再発リスクの増大及び／又は腫瘍が他の部位に転移している可能性がある場合を指す。
【００１５】
さらに、本発明は、被験者から採取した染色体（又は染色体DNA）において、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失を検出し、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症との関連性を診断する方法を提供する。
子宮内膜症と卵巣明細胞癌とが何らかの関連性を有していることは以前から指摘されていた（非特許文献３）。本発明者らは、卵巣明細胞腺癌患者由来の染色体DNAに存在する遺伝子の増幅又は欠失の有無を調べたところ、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失が検出された患者の多くが子宮内膜症を合併していることを明かにしている（実施例を参照のこと）。
従って、本発明は、被験者由来の染色体DNAに存在する、EGF受容体（EGFR）遺伝子の少なくとも一部の増幅、LRP1B遺伝子（染色体2q上）の少なくとも一部の欠失、TPRG1遺伝子（染色体3q上）の少なくとも一部の欠失、LRBA遺伝子（染色体4q上）の少なくとも一部の欠失、PDE4D遺伝子（染色体5q上）の少なくとも一部の欠失を検出し、卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症との関連性を診断する方法を提供する。ここで、「卵巣明細胞腺癌と子宮内膜症との関連性」とは、被験者において、卵巣明細胞腺癌を合併する可能性のある子宮内膜症の罹患の有無、又は、卵巣明細胞腺癌を合併する可能性のある子宮内膜症の罹患の可能性の有無のことである。あるいは、卵巣明細胞腺癌に移行する可能性のある子宮内膜症の罹患の有無もしくは罹患の可能性の有無のことである。
【００１６】
本発明の方法は、上述の染色体領域における少なくとも一部の増幅又は欠失を検出することを特徴とする。ここで、「少なくとも一部」とは、1〜10bp、10bp以上、又は、15bp以上、好ましくは60bp以上、より好ましくは1kb以上、さらに好ましくは100kb以上の連続した配列のことである。また、少なくとも一部とは、全部の欠失又は増幅をも包含する表現である。
本発明において、染色体上のゲノムDNAの目的領域の増幅又は欠失を検出するには、如何なる方法を用いてもよく、例えば、BAC（bacterial artificial Chromosome） クローン、PAC（P1- derived artificial chromosome）クローンなどのヒトゲノムライブラリーに対する被験者由来のDNAとコントロールのDNA（正常者、すなわち、本発明が対象とする染色体領域の異常を含んでいない者由来のDNA）との競合ハイブリダイゼーション法（例えば、染色体CGH法など）、PCR法、FISH（fluorescence in situ hybridization）法、ISH（in situ hybridization）法、定量PCR法又はシーケンシング（エクソンシークエンスなど）法など、当該分野において使用され得る如何なる方法を用いてもよい。
【００１７】
例えば、CGH（Comparative Genomic Hybridization）法は、染色体の欠失と増幅を同時に検出することが可能であるため、簡便な検出方法である。
アレイCGH法は、染色体の欠失、増幅の有無を調べるゲノム領域に対応するDNA配列（プローブと呼ぶ）を、固相（例えば、スライドグラス、又は、ガラス、金属若しくは樹脂製の板状のチップなど）に固定化したもの（アレイ）を使用する。プローブは、例えば、BACクローン、PACクローンなどを使用することができる。アレイは、公知の方法により製造してもよいし、市販のものを購入し、使用説明書に従って、使用してもよい。
CGH法を使用する場合、被験者由来のDNA及びコントロールのDNAをそれぞれ異なる標識物質により標識する。蛍光色素を標識として使用する場合、DNAを直接標識するには、DNAを鋳型としてランダムプライマー法、ニックトランスレーション法などで標識することができる。
標識したDNAは、繰り返し配列等をブロックするために、ブロック用のDNA（例えば、Cot-1DNA）を〜100μg程度加え、周知の方法により標識されたDNAを調製する。ハイブリダイゼーションを行う条件は、CGHアレイの状況等に依存するが、例えば、50%ホルムアミド、2×SSC（標準クエン酸緩衝液）、10%硫酸デキストラン、4%SDS、100mg/ml 酵母tRNA、pH7.0などの溶液中にて、例えば、37℃で60分間インキュベートすることで、繰り返し配列等のブロッキングが可能となる。
【００１８】
上述した各方法を用いる場合、被験者由来のDNAの他に、必要に応じてコントロールとして、正常細胞（調べるDNA領域に変異を有さない染色体のみからなる細胞）由来のDNAを取得する。この場合、被験者由来のDNAは、被験者から手術により摘出した腫瘍組織、病理組織切片、バイオプシーにより取得した組織（例えば、子宮頸部細胞診サンプル、子宮内膜細胞診サンプルなど）の他、被験者由来の脳脊髄液、尿又は血液中の遊離DNAを公知の一般的な方法により単離精製することができる。
【００１９】
また、本発明は、染色体8q領域、染色体3q26-29領域、染色体12p13.33-12.2領域、染色体4p15.2-15.32領域、染色体11q22.2-25領域、EGF受容体（EGFR）遺伝子領域、LRP1B遺伝子（染色体2q上）領域、TPRG1遺伝子（染色体3q上）領域、LRBA遺伝子（染色体4q上）領域、PDE4D遺伝子（染色体5q上）領域から選択される１以上の染色体領域の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブを含むキットであって、卵巣明細胞腺癌の診断方法、卵巣明細胞腺癌の悪性度の診断方法、あるいは、卵巣明細胞腺癌を合併する可能性のある子宮内膜症の罹患の有無など、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
プローブは、上記染色体領域の増幅又は欠失を検出するために利用可能な核酸、又は核酸誘導体であれば如何なるものであってもよく、その塩基配列情報は、すでに公知のヒトゲノム情報から入手することができる。プローブの長さは、特に限定しないが、例えば、好ましくは15bp以上、より好ましくは60bp以上、1kbp以上、さらに好ましくは100bp以上である。
また、本発明のキットには、染色体8q領域、染色体3q26-29領域、染色体12p13.33-12.2領域、染色体4p15.2-15.32領域、染色体11q22.2-25領域、EGF受容体（EGFR）遺伝子領域、LRP1B遺伝子（染色体2q上）領域、TPRG1遺伝子（染色体3q上）領域、LRBA遺伝子（染色体4q上）領域、PDE4D遺伝子（染色体5q上）領域の全部又は一部をPCR法（RT-PCR法など）により増幅し、該当領域の増幅又は欠失を検出するためのプライマーペアが含まれていてもよい。
【００２０】
さらに、本発明のキットには、上記1種以上のプローブが支持体上に固定された、例えば、アレイなどが含まれていてもよい。その他、検出を行うために必要な緩衝液、洗浄液等、さらに、コントロールとなる正常ヒト由来DNAなどが適宜含まれていてもよい。
【００２１】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
１．実験方法
１−１．被験者
本発明に係る、卵巣明細胞腺癌と関連性を有する体細胞性コピー数変化（SCNAs; somatic copy number alterations）を検出するための研究は、慈恵大学、治験委員会のバイオメディカルリサーチ倫理委員会により承認されたものである。また、卵巣明細胞腺癌と診断された患者由来の外科的サンプルは、慈恵大学（東京、日本）、新潟大学大学院医歯学総合研究科（新潟、日本）、鳥取大学医学部（鳥取、日本）、京都大学大学院医学系研究科（京都、日本）、韓国成均館大学校医科大学（ソウル、韓国）、シャリテ大学病院（ベルリン、ドイツ）から提供頂いた。アフィメトリックス  マッピング  アレイ（アフィメトリック社）によるデータは、ピーター・マッカラン癌センター（メルボルン、オーストラリア）から取得し、国による差異に関する所見を確認するために使用した。
【００２３】
１−２．試料
腫瘍サンプルは、全て、患者のインフォームドコンセントを得た上で外科的手法により取得した。全てのサンプルは、凍結材料として集めた。癌細胞を80%以上含むクリオスタット切片を、顕微解剖し（Okamotoら, Clin Cancer Res. 11:6030-6039 2005）、DNAを抽出した。
【００２４】
１−３．アレイCGH法（Array comparative genomic hybridization）
体細胞性コピー数変化を検出するために、ヒトゲノムCGH 244A Oligo Microarray Kit (Agilent Technologie社)を使用した。染色体DNAの切断、標識及びハイブリダイゼーションは、キットに付属のプロトコルに従って行った。すなわち、腫瘍サンプル由来のDNA (2 μg) とコントロールDNA (2 μg)を、Rsa I及びAlu Iで切断し、各々、Cy5-dUTP及びCy3-dUTPで標識し、混合した。DNAの混合物をヒトゲノムCGH 244K  マイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイズ後、スライドガラスをDNAマイクロアレイスキャナー（Agilent Technologies社）でスキャンした。データは、スキャンイメージからFeature Extraction software, version 10.7.3.1 (Agilent Technologies社)を用いて抽出した。
【００２５】
１−４．定量RT-PCR
異常な体細胞性コピー数変化を示す領域を、CGHマイクロアレイを用いてスクリーニングし、140のサブセットに対し、定量RT-PCRを行った（詳細は、Hamaら, Oncologist 14:900-908 2009を参照のこと）。
細胞当たりのDNAコピー数を標準化するために、s-globin 及びWNT9A由来の配列を内在性のレファレンスとして使用した。定量RT-PCR反応は、各サンプル及び各遺伝子に対して３回行った。ランダムに選択した正常組織由来のDNAをコントロールとして使用した。
【００２６】
１−５．EGFR遺伝子の突然変異解析
RNeasy kit (Qiagen社)を用いて、凍結腫瘍サンプルから全RNAを抽出し、SuperScriptIII-Strand Synthesis System (Invitrogen社)を用いて、付属のプロトコルに従い、一本鎖cDNAを合成した。その後、全長のEGFRをコードする配列をPCRにより増幅した（Hamaら, Oncologist 14:900-908 2009）。
【００２７】
１−６．統計処理
ゲノム上に存在する異常な染色体領域の浸透率は、Agilent Genomic Workbench Lite Edition 6.5.0.18 (Agilent Technologie社)のAberration Detection Method 2 quality-weighted interval score algorithmを用いて表した。DNAコピー数の異常は、Gene Springs 11.5 (Gene Springs社)によりプロットした。遺伝子の位置は、National Center for Biotechnology Information (NCBI) build 36 (hg 19)で検索を行った。
ステップ１：Benjamin Hochberg false discovery rate法を使用して MTC(multiple testing crrection)によって適正化された独立tテストによりプローブを選択する（q テスト）。
ステップ２：MTC(multiple testing crrection)を使用して、遺伝子の４又はそれ以上の連続するオリゴヌクレオチドが有意に増幅、又は、欠失している場合にのみ、その遺伝子座における染色体数の増幅又は欠失を有意とする。
バリアンス解析、Kruskal-Wallis equality-of-populations rank test、カイ２乗検定及びsingle-ordered logistic regression modelは、国毎に階層化された患者の特徴における差異を評価するために使用した。PFS（progression-free survival、無増悪生存期間）は、Kaplan-Meier法を用い、ログランクテストにより、体細胞性コピー数変化による比較を行った。全ての統計的解析は、STATA 12.0 (STATA Corp., College Station, TX)を使用して行った。P<0.05の場合に統計的に有意であるとした。
【００２８】
２．結果
２−１．被験者の特徴
臨床データが利用可能な日本人、韓国人及びドイツ人144名の特徴を表１に示した。日本人の65名（56%）、韓国人の6名（40%）、ドイツ人の2名（22%）が子宮内膜症と診断された。
【表１】
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【００２９】
２−２．異常な浸透率及び患者の予後
体細胞性コピー数の増幅及び欠失の頻度を図１に示した。主な体細胞性コピー数変化（SCNAs）は、局所的な領域、あるいは、ほぼ染色体の腕領域又は染色体全領域に及んでいた。
染色体の増幅は、8q（第8染色体長腕）において最も高い頻度で観察され（>60%）、他方、染色体の欠失は、9q（第9染色体長腕）及び13q（第13染色体長腕）において最も高頻度に観察された（>40%）。
次に、局所的な染色体の異常について、患者の生存期間との関連性について検討を行った。3q26-29（第3染色体長腕26−第3染色体長腕29)の増幅（図２）、12p13.33−12.2（第12染色体短腕13.33−第12染色体短腕12.2)の増幅（図３）、4p15.2-15.32（第4染色体短腕15.2−第4染色体短腕15.32)の欠失（図４）及び11q22.2-25（第11染色体長腕22.2−第11染色体長腕25)の欠失（図５）は、無増悪生存期間（PFS）の短縮と有意に関連していた。これら４領域のデータを考慮すると、３〜４箇所のコピー数の変化がある場合に、無増悪生存期間が有意に短縮されることが示唆された（図６）。
【００３０】
２−３．子宮内膜症と体細胞性コピー数変化との関係
EGFR遺伝子は、子宮内膜症を合併していない卵巣明細胞腺癌患者よりも、子宮内膜症を合併している患者において、より有意に増幅されていた（図７）。すなわち、子宮内膜症を合併している卵巣明細胞腺癌患者の73人中22人（52%）においてEGFR遺伝子の増幅が認められたのに対し、子宮内膜症を合併していない患者では、68人中6人（9%）においてのみEGFR遺伝子の増幅が認められた。そして、EGFR RNAの発現が、子宮内膜症を合併している患者のサンプルにおいて、合併していない患者のサンプルより、有意に高いことをRT-PCR法を用いて確認した（P<0.02）（図８）。RT-PCRのためのプライマーは、Applied Biosystems社から入手した（assay ID:Hs01076078_m1）
さらに、2q（第2染色体長腕）に存在するLRP1Bの全体又はその一部（(図９)、3q（第3染色体長腕）に存在するTPRG1全体又はその一部（図１０）、4q（第4染色体長腕）に存在するLRBA全体又はその一部（図１１）及び5q（第5染色体長腕）に存在するPDE4D全体又はその一部（図１２）の欠失が、子宮内膜症と関連性を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の卵巣明細胞腺癌の診断方法を使用することで、卵巣明細胞腺癌の罹患の有無や、予後の診断を容易に行うことが可能となる。従って、本発明は卵巣明細胞腺癌の診断、さらに、治療分野においてその使用が期待される。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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