(57)【要約】【課題】本発明は、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を得る方法を提供することを目的とする。【解決手段】骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去する方法であって、２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液を重層し、さらにその上層に骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を重層して遠心分離する工程を含むことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去する方法であって、２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液を重層し、さらにその上層に骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を重層して遠心分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
石灰化物が除去された骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の生細胞が、２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液の液−液界面に濃縮されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生細胞が、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記密度勾配媒体がポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製密度勾配媒体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上層に濃度５％〜４０％（ｖ／ｖ）、下層に濃度５０％〜９５％（ｖ／ｖ）の密度勾配媒体液を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
上層に濃度８％〜２０％（ｖ／ｖ）、下層に濃度６０％〜８０％（ｖ／ｖ）の密度勾配媒体液を用いることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上層に濃度１０％（ｖ／ｖ）、下層に濃度７０％（ｖ／ｖ）の密度勾配媒体液を用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られ、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を用いて、該細胞の細胞表面マーカーを分析することを特徴とする骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞表面マーカー分析方法。
【請求項１０】
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去するためのキットであって、高濃度の密度勾配媒体液が入っている第一容器及び低濃度の密度勾配媒体液が入っている第二容器を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を得る方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨などの硬組織に分化し得る幹細胞であり、硬組織の再生医療では不可欠な要素であるが、未だ、その幹細胞の単離には成功していない。一方で、同じく成人性幹細胞である造血幹細胞の単離法は、既に確立されている。その造血幹細胞の単離方法とは、細胞表面マーカーの発現パターンの違いを利用して、セルソーターで単離するというものである。同様の戦略で単離を行うためには、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの発現パターンを知る必要性があった。発明者らは、間葉系幹細胞を含む未熟な細胞集団から骨芽細胞へ分化する過程で、細胞表面マーカーの発現に変化が生じると考えた。しかしながら、大きな問題点があった。骨芽細胞に分化すると、骨芽細胞は石灰化物を産生し、その石灰化物がノイズとなりフローサイトメーターを用いての正確な細胞表面マーカー解析の妨げになることだった。
また、間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化するまでに骨芽細胞前駆体が存在すると考えられているが、上記理由により実証することはできていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去する方法であって、２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液を重層し、さらにその上層に骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を重層して遠心分離する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］石灰化物が除去された骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の生細胞が、２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液の液−液界面に濃縮されることを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］前記生細胞が、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な細胞であることを特徴とする前記［２］に記載の方法。
［４］前記密度勾配媒体がポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製密度勾配媒体であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］上層に濃度５％〜４０％（ｖ／ｖ）、下層に濃度５０％〜９５％（ｖ／ｖ）の密度勾配媒体液を用いることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］上層に濃度８％〜２０％（ｖ／ｖ）、下層に濃度６０％〜８０％（ｖ／ｖ）の密度勾配媒体液を用いることを特徴とする前記［５］に記載の方法。
［７］上層に濃度１０％（ｖ／ｖ）、下層に濃度７０％（ｖ／ｖ）の密度勾配媒体液を用いることを特徴とする前記［６］に記載の方法。
［８］前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法により得られ、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞。
［９］前記［８］に記載の細胞を用いて、該細胞の細胞表面マーカーを分析することを特徴とする骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞表面マーカー分析方法。
［１０］骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去するためのキットであって、高濃度の密度勾配媒体液が入っている第一容器及び低濃度の密度勾配媒体液が入っている第二容器を備えるキット。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により細胞表面マーカーを分析可能な骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を得る方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の実施の一形態を示す概念図である。
【図２】１０％−７０％界面に存在する細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。
【図３】０％−１００％界面に存在する細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。
【図４】５％−１００％界面に存在する細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。
【図５】マウス骨芽細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去する方法（以下、本発明の石灰化物除去方法という）を提供する。本発明の石灰化物除去方法は、２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液を重層し、さらにその上層に骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を重層して遠心分離する工程を含んでいればよく、本発明の目的を損なわない限り、さらに他の工程を含んでいてもよい。
【０００８】
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞は、間葉系幹細胞由来の細胞であって、骨芽細胞に至るまでの分化過程にある石灰化物形成能を有する細胞であればよい。骨芽細胞に分化し得る細胞は、例えば、間葉系幹細胞、骨芽前駆細胞等が挙げられる。
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の取得方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９年  １０８巻  ３６８−３７７頁に記載の方法が知られている。骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の供給源となる生物としては、ニワトリ等の鳥類、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ、ブタ等の哺乳類が挙げられる。
例えば、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の供給源がマウスの場合、間葉系幹細胞は大腿骨又は脛骨から骨髄細胞を採取し、適切な条件で培養した後、抗Ｌｉｎｅａｇｅ／ＣＤ４５磁気ビーズによるネガティブセレクション等の方法で精製することによって取得することができ、骨芽細胞又は分化過程にある細胞は間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導培地にて一定期間（例えば１週間）培養すること等によって取得することができる。
【０００９】
密度勾配媒体は特に限定されるものではなく、例えば、ショ糖、グリセロール、コロイド状シリカ製密度勾配媒体（シリカゾル）等が挙げられる。中でも、コロイド状シリカ製密度勾配媒体が好ましい。「コロイド状シリカ製密度勾配媒体」とは、表面処理されたコロイド状シリカを分散させて調製した密度勾配媒体をいう。コロイド状シリカ製密度勾配媒体として、具体的には、例えば、パーコール（商品名、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を挙げることができる。パーコールはポリビニルピロリドンの被膜を持つコロイド状シリカ製品で、密度１．１３ｇ／ｍＬの溶液として販売されており、密度勾配遠心用媒体として、広く使用されている。ただし、コロイド状シリカ製密度勾配媒体はパーコールに限定されるものではなく、同等の性質を有するものであれば、好適に用いることができる。
【００１０】
２種類の濃度の異なる密度勾配媒体液のうち、高濃度の密度勾配媒体液の濃度は５０％〜９５％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、６０％〜８０％（ｖ／ｖ）であることがさらに好ましく、７０％（ｖ／ｖ）であることが特に好ましい。低濃度の密度勾配媒体液の濃度は５％〜４０％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、８％〜２０％（ｖ／ｖ）であることがさらに好ましく、１０％（ｖ／ｖ）であることが特に好ましい。
目的の濃度の密度勾配媒体液は密度勾配媒体を、Ｈａｎｋｓ溶液、αＭＥＭ等の生理的塩類溶液又は培地で希釈することにより調製することができる。
【００１１】
遠心分離する工程では、２種類の密度勾配媒体液を遠心管に重層し、さらにその上層に骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞を重層して遠心する。重層する順番は下層から順に高濃度の密度勾配媒体液、低濃度の密度勾配媒体液、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞である。骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞は、培地、生理的塩類溶液に懸濁された状態で重層することが好ましい。細胞懸濁液の細胞濃度は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０４〜１．０×１０７個／ｍｌが好ましく、５．０×１０４〜１．０×１０６個／ｍｌがより好ましく、１．０×１０５〜５．０×１０５個／ｍｌが特に好ましい。また、遠心管は遠心分離機に対応した形態のものであればよく、市販の遠心管を用いることができる。
【００１２】
遠心分離する工程では、遠心加速度は１８０〜４３９０Ｇが好ましく、４００〜２８１０Ｇがより好ましく、７００〜１５８０Ｇが特に好ましい。時間は１〜３０分間が好ましく、５〜２５分間がより好ましく、８〜２０分間がさらに好ましく、１０〜１５分間が特に好ましい。温度は、２〜３０℃が好ましく、２〜２０℃がより好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。
【００１３】
遠心分離によって、高濃度の密度勾配媒体液より下層に石灰化物が沈降し、低濃度の密度勾配媒体液に死細胞が浮遊し、２種類の密度勾配媒体液の液−液界面に石灰化物が除去された骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の生細胞が濃縮される。
２種類の密度勾配媒体液の液−液界面に位置している層を回収し、さらに遠心分離することにより、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な生細胞を得ることができる。
この細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能な生細胞は、本発明に含まれ、以下、本発明の細胞という。本発明の細胞は石灰化物が除去されているので、石灰化物によるノイズを受けることなく、本発明の細胞の細胞表面マーカーをフローサイトメトリー等の免疫学的手法で分析することができる。本発明の細胞は、細胞表面マーカーをフローサイトメトリーで分析可能である点で、自然界に存在する骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と異なる。
【００１４】
本発明の細胞を用いて、該細胞の細胞表面マーカーを分析する骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞表面マーカーを分析することができる。この骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞表面マーカーを分析する方法は本発明に含まれ、以下、本発明の細胞表面マーカー分析方法という。
本発明の細胞の細胞表面マーカーを分析することにより、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞表面マーカーを分析することができる。本発明の細胞表面マーカー分析方法はフローサイトメトリーに限定されず、例えば、免疫組織化学染色等を用いることができる。フローサイトメトリーでは公知の手法、すなわちフローサイトメーターを用いることにより液体中に懸濁する細胞等の個々の物理的・化学的・生物学的性状を分析し得る。
【００１５】
本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去するためのキッ
媒体液が入っている第一容器及び低濃度の密度勾配媒体液が入っている第二容器を備えていればよく、本発明の目的を損なわない限り、さらに他の物を備えていてもよい。
【００１６】
高濃度の密度勾配媒体液が入っている第一容器は、本発明の石灰化物除去方法の遠心分離に直接使用可能である遠心管であることが好ましく、市販の遠心管を用いることができる。第二容器は特に限定されない。
【００１７】
本発明のキットを本発明の石灰化物除去方法に使用することで、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞から石灰化物を除去することができる。本発明のキットを本発明の石灰化物除去方法に使用して本発明の細胞が得られる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
〔１：細胞の準備〕
生後４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、１０ｍｌのαＭＥＭ（１０％ＦＣＳ及びペニシリン・ストレプトマイシン含有）の入った１０ｃｍディッシュ上に播種した。その後、２〜３日ごとに培養液を交換し、１４日目にトリプシン・ＥＤＴＡ液にて付着細胞を剥がし、間葉系幹細胞を回収した。
その後、間葉系幹細胞を抗Ｌｉｎｅａｇｅ／ＣＤ４５磁気ビーズによるネガティブセレクションによって精製した。精製した細胞集団を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、１０ｍＭグリセルフォスフェイト及び１０−8Ｍデキサメタゾン（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）を添加した骨芽細胞分化誘導培地にて５×１０５個／５ｍｌの濃度で１週間培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製）にて付着細胞を回収し、細胞懸濁液を得た。
【００２０】
〔２：遠心分離〕
（実施例１）
１５ｍｌ遠心チューブに、Ｈａｎｋｓ溶液で希釈した７０％ｐｅｒｃｏｌｌ（商品名、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）液２ｍｌをあらかじめ入れた（下層）。別の容器にＨａｎｋｓ溶液で希釈した１０％ｐｅｒｃｏｌｌ液を入れた。骨芽細胞を分離するときに１０％ｐｅｒｃｏｌｌ液２ｍｌ（上層）、細胞懸濁液１ｍｌを順に上記遠心チューブに注ぎ込んだ。ＡＸ−３１０（株式会社トミー精工社製）を用いて遠心チューブを４℃、１５８０Ｇで１０分間遠心分離した（図１を参照）。
（比較例１）
下層に１００％ｐｅｒｃｏｌｌ液、上層に０％ｐｅｒｃｏｌｌ液（１００％Ｈａｎｋｓ溶液）を用いた以外は実施例１と同様の手順で行った。
（比較例２）
下層に１００％ｐｅｒｃｏｌｌ液、上層に５％ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた以外は実施例１と同様の手順で行った。
【００２１】
〔３：フローサイトメトリー〕
両ｐｅｒｃｏｌｌ液の界面に位置している層を１５ｍｌ遠心チューブに回収し、４℃、５分間、４００Ｇにて遠心分離した。遠心分離後、１００〜２００μｌのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに最終濃度１ｍＭになるようにＥＤＴＡを添加したもの）にて懸濁し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに注ぎ込んだ。エッペンドルフチューブ内の細胞懸濁液をｇｕａｖａ  ｅａｓｙ  Ｃｙｔｅ６−２Ｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にてフローサイトメトリー分析を行い、両溶液の界面に位置している層において骨芽細胞の生細胞が単離されているかどうかを確認した。
【００２２】
〔４：結果〕
実施例１（１０％ｐｅｒｃｏｌｌ液−７０％ｐｅｒｃｏｌｌ液）において石灰化物及び死細胞が除去された骨芽細胞の生細胞が単離されたことを確認した（図２）。また、石灰化物が７０％ｐｅｒｃｏｌｌ液の下層に沈降し、死細胞が１０％ｐｅｒｃｏｌｌ液に浮遊していることを確認した。
一方、比較例１（０％ｐｅｒｃｏｌｌ液−１００％ｐｅｒｃｏｌｌ液）及び比較例２（５％ｐｅｒｃｏｌｌ液−１００％ｐｅｒｃｏｌｌ液）では細胞は回収されたがフローサイトメトリーにての細胞表面マーカーの分析を行うための細胞数が十分ではないこと、及び石灰化物及び死細胞が混入することが確認された（図３、４）。なお、遠心分離を行わない場合には多量の石灰化物がノイズとなり正確な細胞表面マーカー解析の妨げになることが確認された（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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