(57)【要約】【課題】本発明は、コレステロール吸収阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】次の化学式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とするコレステロール吸収阻害剤。【化１】2015098465.tif 000006【選択図】図２
2015098465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とするコレステロール吸収阻害剤。
【化１】
2015098465.tif 000005
【請求項２】
請求項１記載のコレステロール吸収阻害剤を含む高コレステロール血症改善剤。
【請求項３】
請求項１記載のコレステロール吸収阻害剤を含む高脂血症改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール吸収阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中コレステロールの上昇は冠状動脈性心疾患の主要な危険因子である。血中コレステロールを低下させるためには、基本的に、低コレステロールの食物、胆汁酸性の金属イオン封鎖剤（コレスチラミンおよびコレスチポール）、ニコチン酸（ナイアシン）、フィブラート類およびプロブコールなどに限られていた。しかしこれらの薬剤や療法には治療の限界があった。
近年、ロバスタチン、シンバスタチンおよびプラバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤）が、冠動脈および頸動脈におけるアテローム性病変の進行を遅延させることが確認された。さらにシンバスタチンおよびプラバスタチンが冠状動脈性心臓病のリスクを低下させることが明らかとなった。
【０００３】
動脈硬化疾患において、コレステリルエステルは、アテローム性病変の主要な構成成分であり、動脈壁細胞におけるコレステロールの主要な貯蔵形態である。このコレステリルエステルの形成は、食事性コレステロールの腸管吸収における重要なステップでもある。
小腸上皮細胞に取り込まれたコレステロールは、小腸上皮細胞内の小胞体にてコレステリルエステルに変換された後、カイロミクロンを形成して体内に吸収されることが知られている。従って、コレステリルエステルの形成阻害が、食事性コレステロールの腸管吸収を阻止することが推測され、これに伴う血中コレステロールの減少が、アテローム性病変形成の進行を抑制し、動脈硬化の予防や改善につながるものと考えられている。
【０００４】
またエゼチミブ（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）などの特定のヒドロキシ置換アゼチジノン（特許文献１：米国特許第５，７６７，１１５号明細書）は、アテローム性動脈硬化症の治療および予防におけるコレステロール低下剤として有用であることが知られている。エゼチミブのコレステロール低下作用は、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの研究から、小腸のコレステロール吸収を担う膜蛋白質であるＮｉｅｍａｎｎ  Ｐｉｃｋ  Ｔｙｐｅ  Ｃ  １  ｌｉｋｅ  １（以下ＮＰＣ１Ｌ１という）とエゼチミブが結合することによって阻害されることが明らかとなった（特許文献２：特開２０１０−２５２７９８号公報）。
従って、エゼチミブとＮＰＣ１Ｌ１の結合を阻害する物質は、消化管内のコレステロール吸収を阻害し、アテローム性動脈硬化を改善することが期待されている。
【０００５】
近年キノコの子実体から血中コレステロール低下効果のある物質や、動脈硬化の予防効果を有するものが得られている。特許文献３にはプレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉ）ｖａｒ．  ｆｅｒｕｌａｅやプロウロツス・オストレアツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｕｔｒｅａｔｕｓｕ）などプレウロツス属のキノコが高コレステロール血症の治療剤であるロバスタチンを産生することが開示されている（特許文献３：特表２００３−５２０５７６号公報）。また特許文献４には担子菌類のシイタケ、キクラゲ、マイタケ、レイシがアディポネクチンを分泌促進しコレステロール低下に効果を示すことが開示されている（特許文献４：特開２００８−２９７２５６号公報）。このようにキノコ類の特定の種の子実体がコレステロールを低下させ、動脈硬化を軽減する作用を示すことは従前から知られていた。
【０００６】
本発明者らは、担子菌の一種であるクロサルノコシカケ抽出物中に、ＮＰＣ１Ｌ１蛋白質と結合し、コレステロールの吸収を抑制する成分が存在し、コレステロール低下剤として有用であることを見出してすでに特許出願している（特願２０１３−０３３０８９号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７６７，１１５号明細書
【特許文献２】特開２０１０−２５２７９８号公報
【特許文献３】特表２００３−５２０５７６号公報
【特許文献４】特開２００８−２９７２５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規な高コレステロール吸収阻害剤、高コレステロール血症の改善剤、高脂血症の改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らはクロサルノコシカケの示すコレステロール吸収阻害剤について研究を行い、コレステロール吸収阻害を示す物質を単離し、化学構造を決定した。
【００１０】
本発明の構成は次の通りである。
（１）次の化学式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とするコレステロール吸収阻害剤。
【化１】
2015098465.tif 000003
（２）（１）記載のコレステロール吸収阻害剤を含む高コレステロール血症改善剤。
（３）（１）記載のコレステロール吸収阻害剤を含む高脂血症改善剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新規なコレステロール吸収阻害剤及び高コレステロール血症改善剤が提供される。また高脂血症改善剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】化学式（Ｉ）の化合物がエゼチミブとＮＰＣ１Ｌ１の結合阻害することを示すグラフである。
【図２】化学式（Ｉ）の化合物を含む抽出物がコレステロール血症の改善作用を有することを示すグラフである。
【図３】化学式（Ｉ）の化合物を含む抽出物が高脂血症の改善作用を有することを示すグラフである。
【図４】化学式（Ｉ）の化合物がエゼチミブと同様にヒト大腸がん由来の細胞株であるCaco-2細胞へのＮＰＣ１Ｌ１を介したコレステロールの吸収を阻害することを示すグラフである。
【図５】化学式（Ｉ）の化合物がエゼチミブと同様にヒト大腸がん由来の細胞株であるCaco-2細胞へのＮＰＣ１Ｌ１を介したコレステロールの吸収を阻害して細胞内のコレステロールエステル濃度を低下させることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は下記の化学式（Ｉ）で表される化合物を有効成分とするコレステロール吸収阻害剤及び高コレステロール血症改善剤である。
【００１４】
【化１】
2015098465.tif 000004
【００１５】
本発明のコレステロール吸収阻害剤に用いる化合物は、ＩＵＰＡＣ名称  １５−Ｈｙｄｒｏｘｙ−１７−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−５−methyl−hex−4−enyl）−４，４，１０，１３，１４−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌ−１，２，４，５，６，７，１０, １１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−tetraｄｅｃａｈｙｄｒｏ−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ａ］ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎ−３−ｏｎｅである。この化合物は化学合成することもできる。また、クロサルノコシカケ（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ  ｎｉｇｒａ）の子実体若しくは菌糸体から抽出しても良い。抽出は、水、低級脂肪族アルコール（メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなど）、低級脂肪族ケトン（アセトンなど）、ヘキサンなどの溶媒を用いる。抽出物を含む溶媒はあるいは、これらを含む溶媒により当業者が通常行う抽出処理により抽出する。抽出した溶液は容易に製造することができる。製造したエキスは、加熱処理、凍結乾燥あるいは減圧乾燥等の処理により、濃縮エキスや乾燥エキスにすることができる。
【００１６】
本発明の阻害剤または予防もしくは改善剤は、通常使用される任意成分を含有する錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤などの剤形で経口により投与することができる。任意成分としては、例えば、賦形剤、結合剤、被覆剤、滑沢剤、糖衣剤、崩壊剤、増量剤、矯味矯臭剤、乳化・可溶化・分散剤、安定剤、ｐＨ調整剤、等張剤などが挙げられる。これらを常法に従って処理することにより、本発明の阻害剤等を製造することができる。
【００１７】
コレステロール吸収抑制剤又は高コレステロール血症改善剤として使用する場合の投与量は、年齢、性別、体重などによって異なるが、通常、原抽出物換算で成人１日あたり約１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは５ｍｇ〜５００ｍｇである。
なお、剤には、医薬品のみならず、医薬部外品、健康食品なども包含される。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例および試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する。
（コレステロール吸収阻害剤の製造例）
天然より採集したクロサルノコシカケ（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ  ｎｉｇｒａ）の未乾燥の子実体４２ｋｇを約４倍量のエタノール（Ｗａｋｏ）及び１倍量のアセトン（Ｗａｋｏ）で室温下、順次浸漬抽出後、エタノール及びアセトンの抽出液を混合し、ロータリーエバポレーターを用いて不溶物が析出しないよう溶媒を減圧濃縮した。次に、濃縮液５００ｍｌにヘキサン（Ｗａｋｏ）１Ｌを加え、分液漏斗を用いて液々分配した。この操作を複数回繰返し、回収したヘキサン層はロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固させ、４０．３ｇのヘキサン抽出部を得た。この内、ヘキサン抽出部２８．３ｇを１００ｍｌメタノール（Ｗａｋｏ）に溶解させ、９５０ｍｌヘキサン、９５０ｍｌの８０％アセトニトリル水を加えて液々分配し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固させた。その結果、ヘキサン層６．８ｇ、中間層５．２ｇ、８０％アセトニトリル層１３．６ｇを得た。この液々分配による分画物は、後述する動物試験に供した。
【００１９】
次に８０％アセトニトリル層１１．６ｇをＯＤＳ（ＹＭＣ製）オープンクロマトグラフィー（桐山製作所製φ４×３０  ｃｍ）に供した。７５％アセトニトリル水にて溶出させ８画分に分離し、減圧下溶媒除去し、Ｆｒ２  ７２１．８ｍｇを得た。
更にＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０（ＧＥヘルスジャパン製）及びメタノールを用いたオープンクロマトグラフィー（桐山製作所製φ２．２×１００  ｃｍ）を行い、Ｆｒ２全量を２２画分に分離し減圧下溶媒除去後、分画物を得た。この２２画分の内６画分を合わせ、ＯＤＳ（ＹＭＣ製）オープンクロマトグラフィー（桐山製作所製φ１．１×１４５  ｃｍ）に供した。７０％アセトニトリル水にて溶出させ８画分に分離し、更にＤｅｖｅｌｏｓｉｌＸＧ  Ｃ３０（Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）、アセトニトリル：０．１％ギ酸水（６：４）にてピーク分取を行い、最後に、ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＸＧ  Ｃ３０（Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）、アセトニトリル：水（６：４）にてピーク分取を行い、減圧下溶媒除去後、化学式（Ｉ）の化合物  ４．０７ｍｇを単離した。
【００２０】
（クロサルノコシカケ抽出物中のコレステロール阻害剤の構造決定）
単離した画分をＬＣ／ＭＳ、ＮＭＲにより構造を決定し、化学式（Ｉ）の化合物であることを確認した。
【００２１】
（試験１：エゼチミブの結合阻害試験）
製造例で得られた化学式（Ｉ）の化合物を、下記の試験法でＮＰＣ１Ｌ１とエゼチミブの結合阻害活性を評価する試験を行った。
（１）ラットＮＰＣ１Ｌ１遺伝子のクローニング
ラット空腸由来１本鎖ｃＤＮＡ（ジェノスタッフ株式会社）を鋳型にｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いたＰＣＲ法により、５’端にＨｉｎｄ  ＩＩＩ、３’端にＸｂａ  Ｉを付加したｒＮＰＣ１Ｌ１全長を増幅し、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニング  キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクターにクローニングした。クローニングしたＤＮＡ配列を配列表配列番号１に示す。
なお、ｒＮＰＣ１Ｌ１全長増幅に使用したプライマー及びＰＣＲ条件は次のとおりである。
Ｓｅｎｓｅ：  ５’−  ａａｇｃｔｔａｃｃａｔｇｇｃａｇｃｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇｇａｔｇｇｃ−３’（配列番号２）
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：  ５’−  ｔｃｔａｇａｔｔａｇａａｃｔｔｔｔｇｇｔｃａｃｔｔｔｔｇｇｇｃ−３’  （配列番号３）
【００２２】
ＰＣＲ条件
１．９８℃  ３０秒、２．９８℃  １０秒、３．６８℃  ３０秒、４．７２℃  １．５分、５．７２℃  １０分、２〜４を３５サイクル実施する。
【００２３】
（２）ラットＮＰＣ１Ｌ１安定発現細胞の作製
ｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ｒＮＰＣ１Ｌ１ベクターをＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｂａ  Ｉ処理し、アガロース電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｒＮＰＣ１Ｌ１を抽出し、発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｘｂａ  Ｉサイトにサブクローニングした。作製したｐｃＤＮＡ３．１  ｒＮＰＣ１Ｌ１の配列はプレミックスシーケンス解析サービス（タカラバイオ）を利用して確認を行った。
シーケンス用ｐｒｉｍｅｒ
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｃａｃｔｇｃｔｔａｃｔｇｇｃｔｔａｔｃｇ−３’（配列番号４）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｇｃｃｔｔｔｔａｔｃａｇｃｇｃａｇｃｔｔｔ−３’（配列番号５）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ａａｃｔｃｔｃａｃｃｃｃａｔａｃｃａｔｃ−３’（配列番号６）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｃａｇｔａｃｔｔｃｃａｇａａｃａａｃｃｇ−３’（配列番号７）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｔｔｃｔａｃｔｃｃｔａｃｃｔｇｇｇｔｇｔ−３’（配列番号８）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｃｔｔｃｔｔｃｃｇｃａａｇａｔａｔａｃｇｃ−３’（配列番号９）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｃｃａｃａｇｃｇｇａａｃａｇｔｔｔｃａｔ−３’（配列番号１０）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｔｃｃｃｔｃａｔｃａａｃｃｔｔｇｔｃａｃ−３’（配列番号１１）
Ｓｅｎｓｅ：５’−ｇｔｃｃａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｃｔｇａｔｇ−３’（配列番号１２）
【００２４】
次いで、ヒト腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１  ｒＮＰＣ１Ｌ１をトランスフェクションし、最終濃度１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８−ｓｕｌｆａｔｅ（Ｗａｋｏ）にてセレクションを行った。更に限界希釈法によりセレクションを行い、ＨＥＫ／ｒＮＰＣ１Ｌ１安定発現細胞の単一クローンを得た。
【００２５】
（３）膜画分の調製
φ１５０ｍｍｄｉｓｈ（Ｎｕｎｃ）にＨＥＫ２９３／ｒＮＰＣ１Ｌ１安定発現細胞を播種し、ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）にてコンフルエントになるまで培養し、最終濃度４ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｕｔｙｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）２４時間処理後の細胞をＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて回収した。８００ｒｐｍ、３分の遠心後、残渣の細胞を８％Ｓｕｃｒｏｓｅ含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）＋ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）に懸濁し、超音波を用いて破砕した。４０００ｒｐｍ、４℃、１０分の遠心後、上清を４８０００ｒｐｍ（１２５０００Ｇ）、４℃、３時間、超遠心し、残渣を膜画分として回収した。膜画分は１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ含有２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、ＢＣＡ  ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）にて蛋白質濃度を定量後、使用するまで−８０℃に保存した。
【００２６】
（４）結合阻害実験
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に最終濃度２５ｎＭ  ［３Ｈ］Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）、１．２５ｍｇ／ｍｌ  ＨＥＫ／ｒＮＰＣ１Ｌ１由来膜蛋白質、各濃度の被験物質を緩衝液Ａ（２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．９６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．５ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１１７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．０３％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ、０．０５％  Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、ｐＨ７．４）に加えＴｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ３０μｌとなるよう調製し、室温、１時間反応させた。反応液はＨａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＵｎｉＦｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｃ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にトラップし、ミリＱ水（ミリポア）を用いて遊離［３Ｈ］Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを洗浄した。乾燥後、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を１５μｌ／ｗｅｌｌ添加し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によりｒＮＰＣ１Ｌ１と結合した［３Ｈ］Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの放射活性を測定した。
【００２７】
（５）結果
クロサルノコシカケから抽出し、単離された化学式（Ｉ）の化合物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌから８段階の３倍希釈系列を作製し、上記の手順で放射活性を測定し、その結果からＩＣ５０を算出した。ＩＣ５０は１５．３μｇ／ｍｌと低濃度でＮＰＣ１Ｌ１とエゼチミブの結合を阻害した。
【００２８】
ＩＣ５０を算出した希釈系列の阻害を図１に示す。
クロサルノコシカケから単離した化合物は、エゼチミブがＮＰＣ１Ｌ１に結合する反応を強く抑制した。従ってエゼチミブと同様に、ＮＰＣ１Ｌ１の機能を阻害し、コレステロールの腸管吸収を阻害する。
【００２９】
（試験例２：高コレステロール血症ラットを用いたコレステロール低下試験）
本発明の化合物を含む抽出物（製造例に記載したヘキサン層、中間層、８０％アセトニトリル層）を用いて、高コレステロール含有食餌を摂取した場合に発生する高コレステロール血症に対する治療効果を確認した。
【００３０】
１．試験動物
１週間の馴化後、体重測定を行い、層別連続無作為化法により群分けした８週齢のＷｉｓｔａｒ雄ラット（日本ＳＬＣ）を実験に供した。
高コレステロール血症は、高コレステロール食（ＣＲＦ−１を元に１％コレステロール、０．５％コール酸を添加；オリエンタル酵母工業株式会社）を与え、誘導した。高コレステロール血症を確認するため、通常食（ＣＲＦ−１；オリエンタル酵母工業株式会社）を与えたノーマル群を設定した。
群設定は、通常食を与えたノーマル群に加え、高コレステロール食を与えて、高コレステロール血症を誘導した状態にコーン油を投与したコントロール群、エゼチミブ（コスモバイオ株式会社）０．３ｍｇ／ｋｇを投与した陽性対照のエゼチミブ群、上記方法で製造したクロサルノコシカケヘキサン抽出部（分離前）、ヘキサン層、中間層、８０％アセトニトリル層を各５００ｍｇ／ｋｇ投与した（各群６匹の設定）。
【００３１】
２．試験方法
通常食、高コレステロール食、及び水は３日間自由摂取させ、被験物質はコーン油に溶解させ、試験開始の２日目から１日１回、２日間（初日は投与なし）、胃ゾンデを用いて強制経口投与した（２ｍｌ／ｋｇ）。ノーマル群及びコントロール群はコーン油を投与した。飼育は個別飼育（１匹／ケージ）とし、３日間の摂餌量を記録した。また、被験物質投与開始の２日目に床敷（パルソフト；オリエンタル酵母工業株式会社）を交換した。血液は、被験物質の最終投与から２時間絶食させた後（水は自由摂取）、ジエチルエーテル麻酔下、腹部大動脈からヘパリン処理した真空採血管（テルモ株式会社）を用いて回収した。回収した血液は、直ちに３，０００ｒｐｍ、１５分、４℃の条件下で遠心分離し、得られた血漿を分析するまで−８０℃に保存した。血漿中コレステロール量は、コレステロールＥテストワコー（和光純薬工業株式会社）、中性脂肪はトリグリセライドＥテストワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。
【００３２】
３．試験結果
結果は全て平均値±Ｓ．Ｅで表記した。統計解析はエクセル統計２０１０を使用し、ノーマル群を除いた高コレステロール食摂取の５群で行った。各測定データは一次元配置分散分析及びＤｕｎｎｅｔｔの多重検定を行った。有意水準はいずれの場合も両側５％未満とした。
血中総コレステロールの測定結果を図２、血中トリグリセライドの測定結果を図３に示す。
試験の結果、高コレステロール食を摂取させた５群間の摂餌量に差はなく、また体重に変動がなかった。このことから、高コレステロール血症の誘導は群間差なく行われたものと評価した。
血中コレステロールは、陽性対照のエゼチミブ投与群（Ｅｚｅ）、分離前群及び８０％アセトニトリル層群（ＡＣＮ層）においてコントロール群の血漿中コレステロールと比較して有意差が認められ、コレステロール低下作用が明らかとなった。ヘキサン層（ＨＥＸ層）、中間層は有意なコレステロール低下が認められなかった。
また、中性脂肪を測定した結果、コレステロールの測定結果と同様に、分離前群及び８０％アセトニトリル群において有意差が認められた。
したがって、クロサルノコシカケから単離した化学式（Ｉ）の化合物を含む層（ＡＣＮ層）は血漿中のコレステロールの低下作用と中性脂肪の低下作用を有していることが明らかとなった。
以上の試験結果から、ＮＰＣ１Ｌ１の阻害作用を有する化学式（Ｉ）の化合物は、食餌性高コレステロール血症及び高脂血症の改善剤として有用であることが明らかとなった。
【００３３】
（試験３：Ｃａｃｏ−２細胞を用いたコレステロールの細胞内取り込み阻害試験）
ヒト大腸がん由来細胞株Ｃａｃｏ−２細胞を用いて試験を行った。
１．レンチウイルス溶液及びCaco2/mock、Caco2/rNPC1L1安定発現細胞の作製
レンチウイルス用ベクターpCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（System Biosciences）のSwaＩ、SgfＩサイトを利用して、同制限酵素サイトを付加したrNPC1L1全長をPCR法にて増幅し、サブクローニングした（以下、pCDH-rNPC1L1とする）。pCDH-rNPC1L1、エンベロープベクターのpMD2.G（Addgene）、パッキングベクターのpsPAX2（Addgene）の3種のベクターをリポフェクション用試薬LTX（invitrogen）を用いて293T（ATCC）細胞にトランスフェクションし、96時間後に培地を回収した。2500rpm、10分の遠心を2回行い、得られた上清を0.45μmのフィルター（ミリポア）を通し、レンチウイルス溶液を作製した。
ヒト大腸癌由来Caco2細胞（ATCC）にレンチウイルス溶液を添加して感染させ、更に限界希釈法を用いて最終濃度5μg/mlのpuromycin（Sigma Aldrich）にてセレクションを行いCaco2/rNPC1L1安定発現細胞の単一クローンを作製した。また、同様の方法よりインサートDNAを含まないpCDH-CMV-MCS-EF1-Puroベクターを用いて単一クローンを作製し、Caco2/mockとした。
【００３４】
２−１．[3H］ラベルコレステロールを用いた評価試験
Caco2/mock及びCaco2/rNPC1L1安定発現細胞のそれぞれを12well plate（Falcon）に5×105 cells/wellとなるよう播種し、2日置きに培地DMEM+10%FBSを交換して、オーバーコンフルエントの状態を14日間維持し、小腸様細胞に分化させた。DMEMにて細胞を洗浄後、最終濃度2mMタウロコール酸ナトリウム（Wako）、50μMフォスファチジルコリン（Sigma Aldrich）、1μMコレステロール（Sigma Aldrich）、1μCi/ml[3H]コレステロール（PerkinElmer）、各濃度のEzetimibeあるいは化合物Ｉを含有したDMEMミセル溶液を1ml/well添加し、37℃、1時間、処理した。1ml/well PBS+にて細胞を2回洗浄後、0.1%ドデシル硫酸リチウム（WAKO）、0.2N水酸化ナトリウム（Nacalai tesque）含有蒸留水を1ml/well添加し、室温48時間処理後、BCA assayにて蛋白質濃度を測定した。また、その細胞溶解液100μlを、2mlのクリアゾルII（Nacalai tesque）に加え、液体シンチレーションカウンター（ALOKA）にて総[3H]コレステロールの放射活性を測定し、蛋白質当りの量に換算して取り込み量とした。
【００３５】
２−２．結果
Caco2/mock及びCaco2/rNPC1L1細胞それぞれに対し、溶媒を添加したContorol群、最終濃度3、10、30μM添加したEzetimibe群、最終濃度1、3、10、30μM添加した化合物Ｉ群の総[3H]コレステロールの測定結果を下記図４に示す。
Ezetimibe及び化合物Ｉ添加群は、mock及びrNPC1L1細胞のそれぞれのコントロールと比較し、いずれも取り込まれた[3H]コレステロール量が有意に減少しており、化合物Ｉはコレステロールの細胞内取り込みを顕著に抑制した。
【００３６】
３−１．［3H］ラベルコレステロールエステルを用いた評価試験
Caco2/mock及びCaco2/rNPC1L1安定発現細胞を12well plate（Falcon）に5×105 cells/wellとなるよう播種し、2日置きに培地DMEM+10%FBSを交換して、オーバーコンフルエントの状態を14日間維持し、小腸様細胞に分化させた。DMEMにて細胞を洗浄後、最終濃度5mMタウロコール酸ナトリウム（Wako）、500μMオレイン酸（Sigma Aldrich）、10μMコレステロール（Sigma Aldrich）、1μCi/ml[3H]コレステロール（PerkinElmer）、各濃度の被験物質を含有したDMEMミセル溶液を1ml/well添加し、37℃、1時間、処理した。DMEMにて洗浄後、無血清用カクテルITS（Thermo Fisher Scientific）含有DMEMに交換し、更に37℃、8時間、インキュベートし、エステル化を誘導した。PBS+で細胞を洗浄後、ヘキサン：イソプロパノール（3:2）（Nacalai tesque）混合液を用いて細胞から脂質を抽出し、クロロホルム：メタノール（2:1）（Nacalai tesque）に置換後、全量をTLC（Roche）にスポットし、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（60:40:1）（Nacalai tesque）を用いて展開した。展開したTLCはヨウ素（Nacalai tesque）を用いて発色させ、分離した[3H]コレステロール、[3H]コレステロールエステルをかきとり、クリアゾルII（Nacalai tesque）に浸し、液体シンチレーションカウンター（ALOKA）を用いて放射活性を測定した。
また、脂質抽出後の細胞は、0.1%ドデシル硫酸リチウム（WAKO）、0.2N水酸化ナトリウム（Nacalai tesque）含有蒸留水を添加し、室温48時間処理後、BCA assayにて蛋白質濃度を測定した。細胞中に取り込まれ、エステル化されたコレステロールを蛋白質当りの量に換算して取り込み量とした。
【００３７】
３−２．結果
Caco2/mock及びCaco2/rNPC1L1細胞それぞれに対し、溶媒を添加したContorol群、最終濃度3、10、30μM添加したEzetimibe群、最終濃度1、3、10、30μM添加した化合物Ｉ群の [3H]コレステロールエステル量の測定結果を下記図５に示す。
Ezetimibe及び化合物Ｉ添加群は、mock及びrNPC1L1細胞のそれぞれのコントロールと比較し、いずれもコレステロールを細胞内に取り込んだ後に生成される [3H]コレステロールエステル量を濃度依存的に抑制し、細胞内へのコレステロール取り込み量を顕著に減少させた。
以上2つの試験から、化合物Ｉは、コレステロールの吸収部位である腸管壁の細胞であるCaco２へのコレステロールの取り込みを阻害していることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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