(57)【要約】【課題】魚類の防疫能を安価かつ簡便に高める方法を提供する。【解決手段】本発明の魚類の防疫方法は、蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含む飼料であって、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜５０重量％である前記飼料を魚類に投与して魚類の防疫能を強化することを含む。本発明によれば、特に血清の殺菌活性が幼魚又は稚魚の段階から強化される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含む飼料であって、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜５０重量％である前記飼料を魚類に投与して魚類の防疫能を強化することを含む、魚類の防疫方法。
【請求項２】
前記防疫能が血清の殺菌活性である、請求項１に記載の魚類の防疫方法。
【請求項３】
前記飼料が、さらに大豆粕を配合することを含む、請求項１に記載の魚類の防疫方法。
【請求項４】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合が、１５〜３０重量％である、請求項３に記載の魚類の防疫方法。
【請求項５】
蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含む飼料であって、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜５０重量％である前記飼料を魚類に投与することを含む、魚の筋肉脂質の調節方法。
【請求項６】
蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含み、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜５０重量％である養魚用飼料。
【請求項７】
さらに、大豆粕を含む、請求項６に記載の養魚用飼料。
【請求項８】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合が、１５〜３０重量％である、請求項７に記載の養魚用飼料。
【請求項９】
蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜５０重量％となるように配合することを含む、養魚用飼料の製造方法。
【請求項１０】
さらに、大豆粕を配合することを含む、請求項９に記載の養魚用飼料の製造方法。
【請求項１１】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合が、１０〜３０重量％である、請求項１０に記載の養魚用飼料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の防疫方法に関し、より詳細には、魚類を簡易かつ安価に防疫する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類の養殖現場において、養魚がウイルス性感染症、細菌病、真菌病等の魚病に罹患して大量死することがある。魚病発生による漁獲量の減少は、稚魚代、飼料代、人件費等の養殖にかけた費用や時間が無駄になるため、養魚の防疫対策がきわめて重要である。防疫対策として、従来、抗生物質、抗菌剤、ワクチン、化学薬品等の投与が行なわれてきた。しかし、抗生物質等の投与は、抗生物質耐性菌の誘発、環境水への負荷、コスト、投薬時の労傾の増大等の問題が危惧される。
【０００３】
養魚の免疫活性を高めて疾病の発生を予防することが望まれる。現在、βグルカン、ペプチドグリカン、リポ多糖類、キチン・キトサン、ラクトフェリン等の免疫賦活物質を魚に投与することが実施されている。また、アスタキサンチンを含む酵母（特許文献１）、ラクトコッカス属等に属する細菌に由来する不活化死菌体とグラム陽性細菌由来の細胞破砕物（特許文献２）、特定の塩基性アミノ酸を含むポリペプチド（特許文献３）、ビタミン、消化酵素、生菌剤及び免疫腑活剤の組み合わせ（特許文献４）、バチルス・ツリンゲスとバチルス・プミラスの混合培養によって得られたペプチド（特許文献５）、酵母細胞壁溶解酵素で処理した酵母菌体（特許文献６）、特定のサイトカインと腸溶保護ポリマーとの組み合わせ（特許文献７）等の投与も提案されている。
【０００４】
養殖現場では、また、飼料の栄養成分としての蛋白源を魚に効率的に摂取させ、成長を促進させることも重要である。従来、養魚用飼料中に一般的に用いられる蛋白源に魚粉がある。しかし、魚粉は、漁獲量によってその相場が左右されやすいという問題を有する点から、魚粉代替原料の探索が行なわれ、代替蛋白源として大豆粕や菜種粕が知られている。しかし、菜種粕は、蛋白含量及び消化利用性が低いことから、蛋白質要求量がウシ、ブタ等の家畜よりも高い魚類に用いることは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−０８０３５１
【特許文献２】特開２００１−３４２１４０
【特許文献３】特開２０００−３２５０２６
【特許文献４】特開２００１−１９０２３１
【特許文献５】特開２０００−１０３７４０
【特許文献６】特開平８−２８０３３２
【特許文献７】特開２０１２−５０５１９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、魚類の防疫能を安価かつ簡便に高める方法を提供することにある。本発明は、また、従来、栄養分摂取率が低いために養魚用飼料の魚粉代替原料として適さなかった菜種粕の改良方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を鋭意研究した結果、特定の蛋白質含量を有する菜種粕を特定量配合した飼料によれば、上記二つの課題を同時に解決できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含む飼料であって、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜３０重量％である前記飼料を魚類に投与して魚類の防疫能を強化することを含む、魚類の防疫方法を提供する。
【０００８】
前記防疫能は、例えば血清の殺菌活性である。
【０００９】
前記飼料は、さらに大豆粕を配合することを含むことが好ましい。
【００１０】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合が、１０〜３０重量％であることが好ましい。
【００１１】
本発明者らは、上記方法により飼養された魚の筋肉脂質が顕著に増大することもまた見出した。したがって、本発明は、また、蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含む飼料であって、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜３０重量％である前記飼料を魚類に投与することを含む、魚の筋肉脂質の調節方法を提供する。
【００１２】
本発明は、また、蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含み、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜３０重量％である養魚用飼料を提供する。
【００１３】
上記養魚用飼料は、さらに、大豆粕を含むことが好ましい。
【００１４】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合は１０〜３０重量％であることが好ましい。
【００１５】
本発明は、また、蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１０〜３０重量％となるように配合することを含む、養魚用飼料の製造方法を提供する。
【００１６】
上記養魚用飼料の製造方法は、さらに、大豆粕を配合することを含むことが好ましい。
【００１７】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合が、１０〜３０重量％であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、魚粉飼料と比べて、血清の殺菌活性や白血球貪食能が強化される。また、体表粘液中の蛋白質量が低下し、これは、ムコ多糖の増大と防疫能の強化を意味する。特に、血清の殺菌活性は、魚粉の一部を従来の菜種粕で置換した場合よりも強化される。しかも、この強化は、幼魚又は稚魚の時期から発揮されるので、本発明の方法の優位性が高い。
【００１９】
魚粉の一部を従来の菜種粕で置換した飼料を用いて魚を飼育すると、蛋白含量をそろえた魚粉主体飼料と比べて、魚の増重率（育ち具合）が明らかに劣る。すなわち、菜種粕由来の栄養分の摂取率が悪い。一方、魚粉の一部を高蛋白菜種粕で置換した飼料を用いる本発明の方法によれば、魚の増重率が改善される。
【００２０】
本発明の方法で使用する高蛋白菜種粕の蛋白含量は、魚粉より低いものの、大豆粕と同程度まで改善されている。そして、本願発明で使用する飼料の製造コストは、魚粉主体飼料と比べて安い。
【００２１】
本発明の方法で飼養された魚類は、筋肉脂質の蓄積作用が高い。これにより、畜水産物の価値を高めることができる。
【００２２】
したがって、本発明の方法は、魚粉を主体とする飼料の代替案として、十分な産業上の利用価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】魚粉主体飼料（対照）、魚粉の一部を従来の菜種粕で置換した飼料（比較例１及び２）、並びに魚粉の一部を高蛋白菜種粕で置換した飼料（実施例１及び２）を用いてヒラメを４週間飼養した際の、４週間後の筋肉脂質（ＣＬ）を測定した結果を示す。比較例１及び２では、対照より減少している。一方、実施例１及び２では、筋肉脂質が顕著に増大している。
【図２】図１と同様に、魚粉主体飼料（対照）、従来の菜種粕で置換した飼料（比較例１及び２）、並びに高蛋白菜種粕で置換した飼料（実施例１及び２）を用いてヒラメを４週間飼養した際の、２週間（２Ｗ）及び４週間（４Ｗ）後の魚の白血球の貪食率を測定した結果を示す。実施例２及び比較例２は、魚粉主体飼料（対照）と比べて白血球の貪食率が強化されている。
【図３】図１と同様に、魚粉主体飼料（対照）、従来の菜種粕で置換した飼料（比較例１及び２）、並びに高蛋白菜種粕で置換した飼料（実施例１及び２）を用いてヒラメを４週間飼養した際の、２週間（２Ｗ）及び４週間（４Ｗ）後の魚の体表粘液中の蛋白質量を測定した結果を示す。比較例１及び２並びに実施例１及び２は、体表粘液中の蛋白質量の低下（多糖類の増加）が対照より強化される。特に、実施例２では、２週目の早期から、体表粘液中の蛋白質量が減少している。このことから、本発明の方法に従って、魚粉の一部を高蛋白菜種粕で置換した飼料を幼魚又は稚魚の時期から投与することで、防疫能の高い魚の育養が可能である。
【図４】図１と同様に、魚粉主体飼料（対照）、従来の菜種粕で置換した飼料（比較例１及び２）、並びに高蛋白菜種粕で置換した飼料（実施例１及び２）を用いてヒラメを４週間飼養した際の、２週間及び４週間後の血清中殺菌活性（Ｅ．ｃｏｌｉ生残率）を測定した結果を示す。比較例１及び２の血清の殺菌活性は、対照区とあまり変わらない。一方、実施例１及び２の両方とも、４週間目の殺菌活性が強化されている。特に、実施例２では、２週間目という早期から殺菌活性が高くなっていることから、魚粉の一部を高蛋白菜種粕で置換した飼料を幼魚又は稚魚の時期から投与することで、防疫能の高い魚の育養が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に、本発明の方法の一実施態様を具体的に説明する。本発明の魚類の防疫方法の対象は、魚類であれば、特に制限されない。本発明の方法は、特に養殖魚に適用される。養殖魚には、ヒラメ、マダイ、クロダイ、チダイ、イシダイ、ブリ・ハマチ、カンパチ、マグロ、トラフグ、シマアジ、マアジ、ヒラマサ、カワハギ、カサゴ、メバル、クロソイ、スズキ、イサキ、マサバ、クエ、ギンザケ、タイセイヨウサケ、ニジマス、コイ、フナ、ウナギ、ナマズ等が含まれる。
【００２５】
前記飼料は、蛋白源として、魚粉を含む。魚粉は、従来汎用のものを特に制限なく使用可能である。飼料中の魚粉の割合は、通常、３０〜７０重量％でよく、好ましくは４０〜６０重量％である。
【００２６】
本発明の方法に使用する飼料は、蛋白質含量が含水基準で、４０〜５０重量％、好ましくは４０〜４８重量％、特に好ましくは４０〜４６重量％の高蛋白菜種粕を含む。蛋白質含量が４０％未満であると、本発明の効果が低下し、成長悪化や生残率低下を招く恐れがあり、逆に５０％を超えると窒素排泄量増加による環境への負荷（水質汚染等）となることがある。
【００２７】
前記高蛋白菜種粕の粗脂質は、通常、５％以下であり、好ましくは１〜４％、より好ましくは１．５〜３％である。
【００２８】
前記高蛋白菜種粕の粗繊維含量は、通常、８％以下であり、好ましくは１〜７％、より好ましくは１〜６％である。
【００２９】
前記粗繊維のうち、ＮＤＦ（中性デタージェント繊維）は、通常、２０％以下、好ましくは１８％以下である。ＡＤＦ（酸性デタージェント繊維）は、通常、１５％以下、好ましくは１３．４％以下である。リグニンは、通常、４％以下、好ましくは３％以下である。
【００３０】
前記高蛋白菜種粕のグルコシノレート含量は、通常、３０μｍｏｌ／ｇ以下であり、好ましくは２０μｍｏｌ／ｇ以下、より好ましくは１０μｍｏｌ／ｇ以下である。
【００３１】
高蛋白菜種粕は、菜種の脱皮、洗浄や酵素処理、アルコール処理、篩分け処理等により製造可能である。中でも、３２メッシュ（目開き５００μｍ）以下、好ましくは４８メッシュ（目開き３００μｍ）以下の篩で篩分け処理した際の篩下分級物が、蛋白含量、粗脂質及び粗繊維が上記の好ましい範囲に入るものを容易に得られる点で好ましい。
【００３２】
前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合は、１０〜５０重量％であり、好ましくは１０〜３０重量％である。上記割合が１０重量％以下では、魚類の防疫能を有効に強化しない。逆に、５０重量％を超えると、飼料の蛋白量を確保するために他の蛋白源が多く必要になり、粗繊維が必要以上に添加されるといった不具合を生じる。
【００３３】
上記飼料は、高蛋白菜種粕の使用によって減じた蛋白分を補うために、他の蛋白源が添加されることが好ましい。そのような例には、大豆粕、脱皮大豆粕、大豆蛋白濃縮物、分離大豆蛋白、菜種粕、綿実粕、ルピナス種粕、コーン蒸留粕、コーングルテンミール、コーングルテンフィード、アルファルファ粉、ポテトプロテイン、ヒヨコマメ、エンドウマメ、インゲンマメ、レンズマメ、ブラックビーン等の植物性蛋白源；肉骨粉、血粉、フェザーミール、ポークミール、チキンミール、脱脂粉乳等の動物性蛋白源が挙げられる。大豆粕が、高蛋白菜種粕では不足しがちなリジンを補填する点で好ましい。
【００３４】
前記大豆粕及び前記魚粉の合計に対する前記大豆粕の割合は、通常、
１０〜３０重量％であり、好ましくは１５〜２６重量％である。割合が１０％未満であると効果が低下し、逆に５０％を超えると成長不良や摂餌量低下となることがある。
【００３５】
上記飼料は、魚粉、高蛋白菜種粕、その他の蛋白源の他に、養魚用飼料の原料として汎用されているものを特に制限なく使用可能である。そのような例には、米、玄米、ライ麦、小麦、大麦、トウモロコシ、マイロ、大豆等の穀類；植物性油脂、動物性油脂、粉末精製牛脂、肝油等の油脂類；リジン、メチオニン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸、ビタミンC、ビオチン、コリン等のビタミン類又はビタミン様作用物質；亜鉛、カルシウム、セレン、鉄、リン等のミネラル類；硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ヨウ化カリウム、硫酸コバルト、炭酸カルシウム、リン酸三カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、塩化コリンなどの無機塩類；色素等が挙げられる。
【００３６】
上記飼料には、飼料の品質の低下防止、栄養成分の有効利用の促進等に用いられる汎用の飼料添加物を本発明の効果を阻害しない範囲で使用してもよい。そのような例には、抗酸化剤、防カビ剤、粘結剤、乳化剤、ｐH調整剤、抗菌剤、呈味料、着香料、酵素、生菌剤、有機酸、摂餌誘引剤、酵母等が挙げられる。
【００３７】
本発明の方法に使用する飼料は、上記原料を配合することによって得られる。飼料の形状は、エクストルーデッドペレット、ドライペレット、モイストペレット、練り餌等であり得る。
【００３８】
本発明の方法は、魚粉主体飼料と比べて、魚類の血清の殺菌活性、白血球の貪食率を強化する。体表粘液は、上皮細胞や杯状細胞から分泌され、表皮の最外層部を覆う。体表粘液は、主としてムコ多糖類よりなり、特に細菌性疾病防御機構として大きな役割を担っている。本発明の方法は、魚類の体表粘液中の蛋白質量を低下させ、これは、粘液中のムコ多糖の増加を意味する。ムコ多糖類は、対外から侵入する細菌やウイルスを防御するので、蛋白質量の低下は防疫能の強化につながる。本発明の方法は、魚類のレンサ球菌症、類結節症、ノカルジア症、ビブリオ病、イリドウイルス感染症、エドワジエラ症、寄生虫病等への耐性向上が期待できる。
【００３９】
本発明者らは、また、上記方法で飼養された魚類の筋肉脂質が顕著に増大すること、及びこの結果を利用すれば魚類の筋肉脂肪を調節、特に上方調節できることを見出した。したがって、本発明は、また、蛋白質含量が４０〜５０％の高蛋白菜種粕及び魚粉を含む飼料であって、前記高蛋白菜種粕及び前記魚粉の合計に対する前記高蛋白菜種粕の割合が１５〜３０重量％である前記飼料を魚類に投与することを含む、魚類の筋肉脂質の調節方法を提供する。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例及び比較例を用いて、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１及び２〕
１．飼料の調製
対照区として、魚粉（製品名フィッシュミール、日本水産株式会社製）を主体とする対照飼料を表１に示す組成で作製した。対照飼料の魚粉の２０％及び３０％を高蛋白菜種粕及び大豆粕で置換した飼料をそれぞれ実施例１及び２として作製した。高蛋白菜種粕及び魚粉の合計に対する高蛋白菜種粕の割合を、実施例１で１７．２％とし、実施例２で２５．０％とした。魚粉を高蛋白菜種粕で置換したことで減じた蛋白分を、大豆粕（製品名：大豆油粕、株式会社J-オイルミルズ製）の添加で補った。大豆粕及び魚粉の合計に対する大豆粕の割合は、実施例１で１５．８％、そして実施例２で２５％であった。
【００４１】
比較のため、対照飼料の魚粉の２０％及び３０％を従来の菜種粕（製品名：菜種油粕、株式会社J-オイルミルズ製）で置換した飼料をそれぞれ比較例１及び２として作製した。菜種粕及び魚粉の合計に対する菜種粕の割合を、比較例１で１８．６％とし、比較例２で２６．３％とした。なお、魚粉を菜種粕で置換したことで減じた蛋白分を前記大豆粕の添加で補った。
【００４２】
全例の油分が同じになるように、各例のタラ肝油の添加量を調整した。全例のエネルギーが同じになるように、各例の小麦粉の添加量を調整した。表２に魚粉及び代替蛋白の成分表を示す。表３に各飼料の粗蛋白質、粗脂質及びアミノ酸の含有量を示す。
【００４３】
【表１】
2015181452.tif 000003
高蛋白菜種粕：菜種粕（（株）Ｊ−オイルミルズ製）の４８メッシュ（目開き３００μｍ）篩による篩下分級物
ビタミンＭＩＸ：βカロテン、ビタミンＤ３、ビタミンＫ３、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、アスコルビン酸、ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸、葉酸、塩化コリン、及びｐアミノ安息香酸の混合物（コーキン化学株式会社製）
ミネラルＭＩＸ：ＮａＣｌ，ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ，ＮａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，ＫＨ２ＰＯ４，Ｆｅ  Ｃｉｔｒａｔｅ，Ｃａ  ｌａｃｔａｔｅ，Ａｌ（ＯＨ）３，ＺｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ，ＣｕＳＯ４，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，Ｃａ（ＩＯ３）２，及びＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏの混合物（コーキン化学株式会社製）
Ｓｔａｙ−Ｃ：アスコルビルモノフォスフェイト（ＤＳＭ社製）
【００４４】
【表２】
2015181452.tif 000004
【００４５】
【表３】
2015181452.tif 000005
【００４６】
２．飼養条件
ヒラメの稚魚を表４に示す飼育環境で飼養した。
【表４】
2015181452.tif 000006
【００４７】
３．成長指標の測定  
対照、比較例及び実施例の区において、それぞれ、飼料投与から２週間及び４週間後に、魚体重を測定した。さらに、摂餌量及び増重率を、以下の式により求めた。
【数１】
2015181452.tif 000007
【数２】
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【００４８】
魚体重、摂餌量及び増重率の測定結果を表５に示す。
【表５】
2015181452.tif 000009
【００４９】
表５を見ると、比較例１及び２の増重率（育ち具合）が対照よりも明らかに劣る。すなわち、魚粉を従来の菜種粕に置換すると、栄養分の摂取率は悪化する。一方、実施例１及び２では、高蛋白菜種粕を用いることで、増重率が比較例よりも改善される。このことから、魚粉の一部を高蛋白菜種粕に代える本発明の方法は、魚粉を主体とする飼料の代替策となり得る。
【００５０】
４．成長魚の成分測定
飼料の投与前（Ｉｎｉｔｉａｌ）、投与２週間（２Ｗ）に１尾、４週間（４Ｗ）では全生残個体サンプリングした。魚を解剖して、比肝重量、肝臓粗脂質、筋肉の粗蛋白質（ＣＰ）、粗脂質（ＣＬ）、灰分及び水分をケルダール法、ソックスレー法、直接灰化法及び常圧加熱乾燥法に従って求めた。
【００５１】
魚の成分測定結果を表６に示す。
【表６】
2015181452.tif 000010
【００５２】
表６を見ると、従来の菜種粕を用いた比較例１及び２では、筋肉ＣＰと筋肉ＣＬの両方とも、対照より減少している。一方、高蛋白菜種粕を用いた実施例１及び２では、筋肉ＣＰが下がり、筋肉ＣＬが上がっている。４週後の筋肉CLを図１に示す。本発明の方法は、魚の筋肉脂質を増大させる機能により、該筋肉脂質を調節することができ、魚の価値を高める。
【００５３】
肝臓は一般的に脂質の蓄積器官であり、植物性蛋白を給与すると肝臓に脂質が溜まりやすくなる。脂質過多となるとＧＯＴやＧＰＴの値が高くなり、不健康な状態となる。実施例では比肝重量が投与２週間（２Ｗ）から４週間（４Ｗ）にかけて減少または一定であるのに対して、比較例２では急激に増加している。肝臓粗脂質は投与４週間（４Ｗ）の時点では有意差は見られないが、比較例については肝臓の肥大と共により長期間に渡り投与した場合、脂質過多となり好ましくない。
【００５４】
５．成長魚の防疫能の測定
（１）  白血球の貪食率
飼料投与２週間（２Ｗ）及び４週間（４Ｗ）後に魚を捕獲し、白血球の貪食率を
白血球単離法（Ｐｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配遠心法）に基づいて、下記式により算出した。
【数３】
2015181452.tif 000011
【００５５】
具体的には、以下の手順で活性を求めた。腎臓をメッシュ（１００mesh）（コメント：このままでよいとのことです。）に入れてＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社製）３ｍLで濾過し、白血球懸濁液を調製する。Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を１．０４０ｇ／ｍＬ及び１．０７０ｇ／ｍＬに調製した。調製した液に白血球懸濁液に加えて、遠心分離により下層の白血球を採取した。
【００５６】
酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳＩＧＭＡ社製）をオプソニン化してＲＰＭＩ１６４０で希釈した。この混合液０．５ｍＬをヒラメの血清０．５ｍＬを混合して２５℃条件で１時間インキュベートし、遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５ｍｉｎ）後、上澄み０．８ｍＬを取り除いた。ＲＰＭＩ１６４０を０．８ｍＬ加えてピペッティングした後、遠心分離を２回繰り返した。この反応液２００μＬずつ取り、ＲＰＭＩ１６４０を０．８ｍＬ加えて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。この酵母液と白血球懸濁液を２００μＬずつ混合して２５℃で２時間インキュベートした。この混合液２００μLをスライドガラスに塗抹してギムザ染色した。乾燥後、染色を顕微鏡で貪食率を測定した。
【００５７】
さらに、各例の白血球貪食率を、対照を１００としたときの相対値として求めた。数値が高い方が、対照より防疫能が高いことを意味する。
【００５８】
（２）  体表粘液中の蛋白質量
体表粘液の分泌が増加すると、主成分の多糖類が増加し、その結果、蛋白質量が低下する。多糖類の増加は、魚の防疫に寄与する。したがって、体表粘液中の蛋白質量は、魚の防疫能を示す指標となる。そこで、飼料投与２週（２Ｗ）及び４週（４Ｗ）後に魚を捕獲し、蛋白質量をＬｏｗｒｙ法に基づいて測定した。具体的には、以下の手順で活性を求めた。
【００５９】
各試験区より５尾をサンプリングし、体表の一定面積に分泌された粘液を滅菌脱脂綿で一定回数かきとった。この脱脂綿を、ＰＢＳを入れたマイクロチューブに回収し、粘液を懸濁させた。室温で３０００ｒｐｍ×１０分間、遠心分離して上清を回収し、上清中の蛋白質をＬｏｗｒｙ法で測定した。
【００６０】
各例の数値を、対照を１００としたときの相対値として求めた。数値が低い方が、多糖類の割合が高く、よって防疫能が高いことを意味する。
【００６１】
（３）  血清の殺菌活性
血清の殺菌活性は、魚の防疫能を示す指標となる。そこで、飼料投与２週（２Ｗ）及び４週（４Ｗ）後に魚を捕獲し、血清の殺菌活性（Ｅ．ｃｏｌｉ生存率）をＹａｍａｍｏｔｏらの方法（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，１９９５，ｐ１２３−１２４）に基づいて測定した。具体的には、以下の手順で活性を求めた。
【００６２】
ＴＳＡ培地でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを培養して２〜３ｍｇを蓋付き試験管に釣菌し、トリス緩衝液で１ｍｇ／ｍＬの濃度にしてさらに１０００倍希釈してＥ．ｃｏｌｉ懸濁液とした。２本のマイクロチューブの一方に血清５０μＬを、他方にＥ．ｃｏｌｉ懸濁液５０μＬを加えた後、それぞれにトリス緩衝液１５０μＬを加えてピペッティングし、１００μＬを別のマイクロチューブに移した。そこにトリス緩衝液１００μＬとＥ．ｃｏｌｉ懸濁液２００μＬを加えて２４℃で１時間インキュベートした。反応液４００μLを生理食塩水で１０２〜５倍まで１０倍ごとに段階希釈して、４段階希釈列を作った。その希釈列をＴＳＡ培地に５０μＬずつ接種し、コンラージ棒で広げた。ブランクは、Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液とトリス緩衝液をそれぞれ２００μＬマイクロチューブに加えて混合し、その混合液から１００μＬをサンプルと同様にインキュベート・希釈して、ＴＳＡ培地に塗抹した。２５℃で培養し、コロニーをカウントして生菌数を計算し、接種時に対するＥ．ｃｏｌｉの生残率を求めた。なお、ブランクのＥ．ｃｏｌｉ生残率を１００％とした。
【００６３】
各例の数値を、対照を１００としたときの相対値として求めた。数値が低い方が、対照より活性が高いことを意味する。
【００６４】
Ｓｕｐｅｒ  ＡＮＯＶＡを用いて一元配置の分散分析を行い、有意差が認められた場合、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法で平均値の多重比較を行なった。ｐ値＜０．０５で有意差ありと判定した。
【００６５】
白血球貪食率、体表粘液中の蛋白質量、及び血清の殺菌活性を表７及び図２〜４に、対照を１００としたときの相対値で示す。
【表７】
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【００６６】
比較例１及び２では、白血球の貪食率が対照より強化される。また、体表粘液中の蛋白質量（多糖類の増加）が対照より低い。しかし、血清の殺菌活性は、対照区と比べてあまり変わらないか悪化する。実施例１及び２では、白血球の貪食率が強化され、体表粘液中の蛋白質量が低下するのに加えて、殺菌活性も強化されている。これから、本発明の方法は、白血球貪食率、体表粘液中の蛋白質量及び血清の殺菌活性の点で防疫能を総合的に強化する点で、通常の菜種粕を使用する方法よりも優れるといえる。
【００６７】
魚粉の３０％を高蛋白菜種粕及び大豆粕で置換した実施例２では、２週目の早期から、体表粘液中の蛋白質量が減少していること、及び殺菌活性が高くなっていることがわかる。これから、本発明の方法に従って、魚粉の一部を高蛋白菜種粕で置換した飼料を幼魚又は稚魚の時期から投与することで、防疫能の高い魚の育養が可能であるといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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