(57)【要約】【課題】幹細胞の培養上清の評価に有用な指標及びその利用を提供する。【解決手段】幹細胞の培養上清の評価方法として、幹細胞の培養上清中の以下の成分；  単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及びコンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程を実施するようにする。こうした成分の測定により、幹細胞培養上清の治療用途への有用性を評価できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の培養上清の評価方法であって、
幹細胞の培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、評価方法。
【請求項２】
前記測定工程は、少なくとも前記第１の成分と前記第２の成分とを測定する工程である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記第１の成分は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記第２の成分は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
前記測定工程は、前記第３の成分を測定する工程である、請求項１〜４のいずれかに記載の評価方法。
【請求項６】
前記測定工程は、測定しようとする成分に特異的な抗体を用いて前記成分を測定する工程である、請求項１〜５のいずれかに記載の評価方法。
【請求項７】
前記幹細胞は歯髄幹細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の評価方法。
【請求項８】
幹細胞の培養上清のスクリーニング方法であって、
スクリーニング対象である幹細胞の培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項９】
医薬組成物のスクリーニング方法であって、
スクリーニング対象が幹細胞の培養上清であり、前記培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物は、炎症性疾患の予防又は治療用である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、糖尿病の予防又は治療用である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物は、損傷組織の予防又は治療用である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を１種又は２種以上の疾患の評価系に適用してその作用を評価する工程、
を備える、疾患の予防又は治療用途のスクリーニング方法。
【請求項１４】
幹細胞の培養上清を有効成分とする医薬組成物の品質評価方法であって、
評価対象が幹細胞の培養上清であり、前記培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、品質評価方法。
【請求項１５】
前記医薬組成物は、炎症性疾患の予防又は治療用である、請求項１４に記載の品質評価方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物は、糖尿病の予防又は治療用である、請求項１４に記載の品質評価方法。
【請求項１７】
前記医薬組成物は、損傷組織の予防又は治療用である、請求項１４に記載の品質評価方法。
【請求項１８】
医薬組成物の生産方法であって、
幹細胞の培養上清につき、以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分の測定する測定工程と、
前記成分の測定結果に基づいて前記培養上清を有効成分とする前記医薬組成物の品質について評価する工程と、
を備える、生産方法。
【請求項１９】
医薬組成物の生産方法であって、
幹細胞の培養上清から以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を取得する工程、
を備える、生産方法。
【請求項２０】
医薬組成物の生産方法であって、
以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、及び
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分
の一方又は双方の発現を増強するように遺伝子改変された幹細胞の形質転換体を培養する工程、
を備える、医薬組成物の生産方法。
【請求項２１】
幹細胞の形質転換体であって、
以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、及び
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分
の一方又は双方の発現を増強するように遺伝子改変された幹細胞の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、幹細胞の培養産物の評価指標及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は種々のサイトカインを産生していることが知られている。例えば、歯髄幹細胞の培養上清は損傷部の治療有用であることが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１１／１１８７９５号
【発明の概要】
【０００４】
幹細胞の培養上清には、幹細胞の培養産物が多く分泌されているが、その幹細胞に特有の組成を備えていると考えられる。さらに、幹細胞の培養上清の組成は、幹細胞の種類ほか、幹細胞の取得源や培養条件等によって変動する可能性を否定できない。したがって、治療等に有用な幹細胞の培養上清を用いる場合には、培養上清の有用性等を評価することが要請される。すなわち、幹細胞培養上清の有用性を評価するための指標が必要である。こうした評価指標は、また、有用な幹細胞培養上清を取得したり、品質を管理したりするのにも有用である。
【０００５】
本明細書は、幹細胞の培養上清の評価に有用な指標及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、歯髄幹細胞などの幹細胞の培養上清に含まれる種々の成分について検討していたところ、培養上清中の特定の成分の組合せを、炎症反応が生じている組織に適用したところ、炎症反応が改善するという知見を得た。また、特定の成分の組合せが、炎症組織において組織修復型のミクログリア／マクロファージを誘導し、あるいは抗炎症性サイトカインを亢進するという知見も得た。本明細書はこうした知見に基づき以下の手段を提供する。
【０００７】
（１）幹細胞の培養上清の評価方法であって、
幹細胞の培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、評価方法。
（２）前記測定工程は、少なくとも前記第１の成分と前記第２の成分とを測定する工程である、（１）に記載の評価方法。
（３）前記第１の成分は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）又は（２）に記載の評価方法。
（４）前記第２の成分は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の評価方法。
（５）前記測定工程は、前記第３の成分を測定する工程である、（１）〜（４）のいずれかに記載の評価方法。
（６）前記測定工程は、測定しようとする成分に特異的な抗体を用いて前記成分を測定する工程である、（１）〜（５）のいずれかに記載の評価方法。
（７）前記幹細胞は歯髄幹細胞である、（１）〜（６）のいずれかに記載の評価方法。
（８）幹細胞の培養上清のスクリーニング方法であって、
スクリーニング対象である幹細胞の培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、スクリーニング方法。
（９）医薬組成物のスクリーニング方法であって、
スクリーニング対象が幹細胞の培養上清であり、前記培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、スクリーニング方法。
（１０）前記医薬組成物は、炎症性疾患の予防又は治療用である、（９）に記載のスクリーニング方法。
（１１）前記医薬組成物は、糖尿病の予防又は治療用である、（９）に記載のスクリーニング方法。
（１２）前記医薬組成物は、損傷組織の予防又は治療用である、（９）に記載のスクリーニング方法。
（１３）  以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を１種又は２種以上の疾患の評価系に適用してその作用を評価する工程、
を備える、疾患の予防又は治療用途のスクリーニング方法。
（１４）医薬組成物の品質評価方法であって、
評価対象が幹細胞の培養上清であり、前記培養上清中の以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を測定する測定工程、
を備える、品質評価方法。
（１５）前記医薬組成物は、炎症性疾患の予防又は治療用である、（１４）に記載の品質評価方法。
（１６）前記医薬組成物は、糖尿病の予防又は治療用である、（１４）に記載の品質評価方法。
（１７）前記医薬組成物は、損傷組織の予防又は治療用である、（１４）に記載の品質評価方法。
（１８）医薬組成物の生産方法であって、
幹細胞の培養上清につき、以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分の測定する測定工程と、
前記成分の測定結果に基づいて前記培養上清を有効成分とする前記医薬組成物の品質について評価する工程と、
を備える、生産方法。
（１９）医薬組成物の生産方法であって、
幹細胞の培養上清から以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分、及び
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分
からなる群から選択される１種又は２種以上の成分を取得する工程、
を備える、生産方法。
（２０）医薬組成物の生産方法であって、
以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、及び
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分
の一方又は双方の発現を増強するように遺伝子改変された幹細胞の形質転換体を培養する工程、
を備える、医薬組成物の生産方法。
（２１）幹細胞の形質転換体であって、
以下の成分；
単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、及び
シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分
の一方又は双方の発現を増強するように遺伝子改変された幹細胞の形質転換体。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】劇症肝炎モデルラットにおける生存率を示す図である。
【図２】劇症肝炎モデルラットにおける血液検査による肝障害の評価結果を示す図である。
【図３】劇症肝炎モデルラットにおける肝細胞死（ＨＥ染色及びＴＵＮＥＬ染色）評価結果を示す図Ａ及びＢである。
【図４】劇症肝炎モデルラットにおける炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）死細胞のセンサーであるマンノースレセプターＣＤ２０６、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）の遺伝子発現の解析結果を示す図である。
【図５】劇症肝炎モデルラットにおけるマクロファージ染色結果を示す図である。
【図６】ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの組織修復型ミクログリアの誘導に対する相乗効果を示す図ａ〜ｆである。
【図７】ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの組織修復型ミクログリアの誘導に対する相乗効果を示す図a〜ｃである、ａの上段写真は、ＧＦＡＰ及びＨ−Ｅ染色の結果を示し、下段は、ＳＣＩ後８週での組織腔面積の定量結果を示し、ｂは、５−ＨＴ陽性神経線維の免疫組織学的画像を示し、ｃは、組織腔の中央から５ｍｍ頭部側及び５ｍｍ尾側における５−ＨＴ陽性神経線維の定量結果を示す。
【図８】脊髄損傷部位におけるサイトカインと細胞表面マーカーの遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価した結果を示す図である。
【図９】脊髄損傷から７２時間後の部位を取り囲むミクログリア／マクロファージの典型的画像と定量結果を示す図である。
【図１０】脊髄挫傷後の後肢の機能回復の時間経過を示す図である。
【図１１】（Ａ）は、ＴＨＰ−１溶解物をＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９、ＣＣＲ２で免疫沈降し、抗ＣＣＲ２抗体又はＭＡＨ−レクチンでイムノブロットした結果を示す。（Ｂ）は、ＣＳＰＧ処理が、ミクログリアのＣＣＲ２発言を増大させることを示す。（Ｃ）は、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９がミクログリアにおいてＣＣＲ２と物理的に相互作用することを示す。
【図１２】ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群に関し、生存率及び体重の変化を示す図である。
【図１３】肺組織における構造変化と膠原線維の増殖をＨＥ染色およびマッソントリクローム（ＭＴ）染色にて評価した結果を示す図である。
【図１４】肝硬変モデルマウスにおける肝組織のＨＥ染色結果を示す図である。
【図１５】肝硬変モデルマウスにおける肺組織のシリウスレッド染色（赤染色：線維素の染色）結果を示す図である。
【図１６】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与後３日の肝臓組織における炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法による解析結果を示す図である。
【図１７】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与後３日の肝臓組織における炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法による解析結果を示す図である。
【図１８】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びMCP-1投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群から採取した肝臓組織におけるα-SMAの染色結果を示す図である。
【図１９】関節炎の重症度に関する関節炎スコアの評価基準を示す図である。
【図２０】ＣＩＡマウスにおける、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与による関節炎抑制効果の解析結果を示す図である。
【図２１】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与による長期間の関節炎抑制効果を示す図である。
【図２２】（Ａ）は、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与がＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−αの発現亢進を抑制することを示し、（Ｂ）は、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与がヒト関節リウマチ由来滑膜線維芽細胞において、ＴＮＦ−α刺激によるＭＭＰ−３発現亢進に対して、明らかな抑制効果を示さないことを示す図である。
【図２３】ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１をラット頭蓋骨欠損モデルに投与後、６週間での骨再生効果を示す図であり、Ｈ−Ｅ染色結果、マイクロＣＴ結果及び新生骨％を示す。
【図２４】ＭＩＮ細胞を用いてインスリン分泌能の比較検討を行った結果を示す図である。
【０００９】
【図２５】劇症肝炎モデルラットにおける生存率を示す図である。
【図２６】劇症肝炎モデルラットにおける血液検査による肝障害の評価結果を示す図である。
【図２７】劇症肝炎モデルラットにおける病理学的解析結果を示す図(HE染色)である。
【図２８】劇症肝炎モデルラットにおける炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）、死細胞のセンサーであるマンノースレセプターＣＤ２０６、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）の遺伝子発現の解析結果を示す図である。
【図２９】劇症肝炎モデルラットにおけるＣＤ２０６染色結果を示す図である。
【図３０】肺線維症モデルマウスの体重測定結果を示す図である。
【図３１】肺線維症モデルマウスの生存率を示す図である。
【図３２】肺線維症モデルマウスにおける病理学的解析結果を示す図(HE染色、MT染色)である。
【図３３】肺線維症モデルマウスにおける免疫組織学的解析を示す図である。
【図３４】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵の組織解析結果（ＨＥ染色）を示す図である。
【図３５】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵の組織解析結果（シリウスレッド染色）を示す図である。
【図３６】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵組織における遺伝子解析結果を示す図である。
【図３７】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝蔵組織における遺伝子解析結果を示す図である。
【図３８】肝硬変モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の肝臓組織のおける活性化肝星状細胞のマーカーであるα−ＳＭＡの染色結果を示す図である。
【図３９】心筋虚血再灌流モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の梗塞域の評価結果を示す図である。
【図４０】心筋虚血再灌流モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の血漿中の心筋トロポニン量の評価結果を示す図である。
【図４１】心筋虚血再灌流モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の虚血部における遺伝子発現解析結果を示す図である。
【図４２】多発性硬化症モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後のＥＡＥ臨床スコアの経過を示す図である。
【図４３】多発性硬化症モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の組織解析結果（ＨＥ染色、ＫＢ染色、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ染色）を示す図である。
【図４４】多発性硬化症モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の組織解析結果（ＣＤ３染色）を示す図である。
【図４５】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の脾臓を示す図である。
【図４６】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の脾臓重量の比較結果を示す図である。
【図４７】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の脾臓組織切片のＨＥ染色結果を示す図である。
【図４８】ヒトＳＬＥモデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の血中抗ｄｓ−ＤＮＡＩｇＧ抗体量を示す図である。
【図４９】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の関節炎スコアの経過を示す図である。
【図５０】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の後肢の厚さの経過を示す図である。
【図５１】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の足首の組織切片の染色結果（ＨＥ染色）を示す図である。
【図５２】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の足首の組織切片の染色結果（トルイジンブルー染色）を示す図である。
【図５３】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の足首の組織解析結果を示す図である。
【図５４】関節炎モデルマウスへのＳＨＥＤ−ＣＭ投与後の四肢における遺伝子発現解析結果を示す図である。
【００１０】
【図５５】ＳＴＺ投与量の違いによる血糖値の変化を示す図である。
【図５６】ＳＴＺ低投与量マウスに対するヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。
【図５７】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。
【図５８】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時におけるＩＰＧＴＴ（ｄａｙ２７）結果（血糖値）を示す図である。
【図５９】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時におけるＩＰＧＴＴ（ｄａｙ２７）結果（インスリン）を示す図である。
【図６０】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓中のインスリン含有量の測定結果を示す図である。
【図６１】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓組織のＨＥ染色結果（倍率×４）を示す図である。
【図６２】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓組織のＨＥ染色結果（倍率×４０）を示す図である。
【図６３】ＳＴＺ低投与量マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時（ｄａｙ３４）の膵臓組織の免疫染色結果（倍率×４０）を示す図である。
【図６４】ＳＴＺ大量投与マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。
【図６５】ＳＴＺ大量投与マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。
【図６６】ＳＴＺ大量投与マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ３１）の結果（血糖値）を示す図である。
【図６７】高脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。
【図６８】高脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。
【図６９】高脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ６９）の結果（血糖値）を示す図である。
【図７０】脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ６９）の結果（インスリン）を示す図である。
【図７１】脂肪食マウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＴＴ（ｄａｙ５８）の結果（血糖値及び低下率）を示す図である。
【図７２】マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６を用いたＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＤＡＰ染色結果に基づくネクロシス(％）を示す図である。
【図７３】マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６を用いたインスリン分泌実験結果(content，release/content）を示す図である。
【図７４】マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６を用いたＳＨＥＤ−ＣＭのＡｐｏｐｔｏｓｉｓ対する効果を示す図である。
【図７５】ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の血糖値の変化を示す図である。
【図７６】ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の体重の変化を示す図である。
【図７７】ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ３６）結果（血糖値）を示す図である。
【図７８】ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＰＧＧＴ（ｄａｙ３６）の結果（インスリン）を示す図である。
【図７９】ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時のＩＴＴ（ｄａｙ５１）の結果（血糖値及び低下率）を示す図である。
【図８０】ｄｂｄｂマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ投与時の膵インシュリン含有量（ｄａｙ６１）を示す図である。
【００１１】
【図８１】ＳＨＥＤ−ＣＭ及びｄＳＨＥＤ−ＣＭにおけるＭＣＰ−１及びＳｉｇｌｅｃ−９濃度の測定結果を示す図である。
【図８２】劇症肝炎モデルマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ及びｄＳＨＥＤ−ＣＭの投与効果を示す図である。
【図８３】肺線維症モデルマウスに対するＳＨＥＤ−ＣＭ及びｄＳＨＥＤ−ＣＭの投与効果を示す図である。
【図８４】脊髄損傷モデルラットに対するＳＨＥＤ−ＣＭ及びｄＳＨＥＤ−ＣＭの投与効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書は、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である第１の成分、シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である第２の成分及びコンドロイチン硫酸及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの少なくとも一種である第３の成分からなる群から選択される１又は２以上の成分を幹細胞培養上清の有用性に関する評価指標（以下、単に本指標という。）として用いることを提供する。
【００１３】
本指標の各成分はいずれも歯髄幹細胞の培養上清に含まれているものである。本発明者らは、これらの成分の組合せが多様な疾患に対して改善効果を奏することを見出した。これらの結果に基づいて、これら成分を指標として用いることで、幹細胞培養上清の評価やスクリーニング、有用な医薬組成物の生産に用いることができることを見出した。
【００１４】
本指標を用いることで、幹細胞培養上清の有用性を評価できる。また、本指標を用いることで、有用性の高い幹細胞培養上清をスクリーニングできる。さらに、本指標を用いることで、培養上清を有効成分とする医薬組成物の品質の評価も可能となる。さらにまた、本指標を測定することで有用な医薬組成物を生産することも可能となる。さらに、本指標を用いることで、幹細胞培養上清の医薬組成物として用いる場合において、その規格を設定できるようになる。
【００１５】
また、本指標を幹細胞培養上清から取得することで医薬組成物を生産できる。さらに、本指標の産生が増強された幹細胞形質転換体を培養することで、有用性の高い培養上清を医薬組成物あるいはその原料等として取得できる。
【００１６】
本指標は、各種の損傷組織の組織修復に関連している。したがって、本指標を損傷組織の組織修復用の予防又は治療用途の指標に用いることができる。
【００１７】
本指標は、損傷組織における炎症性疾患を含む炎症性疾患の予防又は治療に関連している。したがって、本指標を炎症性疾患の予防又は治療用途の指標に用いることができる。第１の成分、第２の成分及び第３の成分は、炎症反応部位に存在しうる。第1の成分は、炎症反応部位に存在することが知られている。また、第３の成分も炎症部位に普遍的に存在する成分である。なかでも、第１の成分は炎症反応部位、特に慢性の炎症反応部位に存在していることが知られている。また、第３の成分は、細胞膜ないし細胞間物質の構成成分である。
【００１８】
本指標のうち少なくとも１種類の成分を指標に用いることができる。本指標のうち少なくとも１種類を炎症反応部位に供給することで、当該部位における残余の成分との相乗効果により、免疫担当細胞であるミクログリア／マクロファージを組織修復型へ分化ないし変換することを誘導することができるからである。また、炎症反応部位にいずれかの成分を送達することにより、組織修復型ミクログリア／マクロファージを積極的に作用させて、炎症反応部位の組織の修復を活性化できるからである。
【００１９】
本指標は、また、糖尿病の予防又は治療にも関連している。糖尿病も炎症との関連があることが考えられている。したがって、本指標を、糖尿病の予防又は治療用途の指標に用いることができる。
【００２０】
本指標としては、好ましくはこれらの成分のうち、２種以上を用いる。２種以上の成分を用いることで、より効果的にミクログリア／マクロファージの変換を促進できる。さらに、３種の成分を用いることがより好ましい。
【００２１】
本指標は、前記３種の成分中、前記第１の成分と前記第２の成分とを用いることが好ましい。コンドロイチン硫酸やコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである第３の成分は炎症部位に常在する成分であり、第１の成分と第２の成分と協動して組織修復型ミクログリア／マクロファージファージを誘導する。したがって、本指標は、前記第１の成分と前記第２の成分とのみを用いてもよい。
【００２２】
以下、本開示の各種実施形態について順次、詳細に説明する。
【００２３】
（幹細胞培養上清のための指標）
（幹細胞）
本明細書において幹細胞としては、体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞及び刺激惹起性多能性獲得幹細胞等が挙げられる。これらの幹細胞は、ヒトを含む哺乳類細胞であることが好ましい。
【００２４】
また幹細胞の由来は特に限定しないが、哺乳類の間葉系細胞、初期発生胚及び間葉系細胞以外の体細胞が挙げられる。哺乳類としては、ヒト、ブタ,ウマ及びサルからなる群から選択されるが、好ましくはヒトである。
【００２５】
間葉系細胞とは、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞等、間葉系に属する細胞への分化能を有するとされる細胞である。より具体的には、歯髄細胞、骨髄細胞、臍帯細胞お脂肪細胞等が挙げられる。初期胚生胚は、ES細胞を樹立するために必要な受精卵より発生が進んだ胚盤胞までの初期段階の胚である。体細胞とは、生物体を構成している細胞のうち、生殖細胞以外の細胞の総称である。また、幹細胞は、特定の遺伝子の発現が増強されあるいは抑制された形質転換体であってもよい。
【００２６】
（歯髄幹細胞）
幹細胞としては歯髄幹細胞を好ましく用いることができる。歯髄幹細胞は、歯髄から得られる歯髄に由来した幹細胞であれば特に限定されない。永久歯歯髄幹細胞であってもよいし、乳歯歯髄幹細胞であってもよいが、好ましくは、細胞増殖能の観点から、脱落した乳歯に由来する歯髄幹細胞を用いる。本組成物を適用する個体との関係においては、拒絶反応を抑制又は回避するため、同一生物種（ヒトであればヒト由来）の歯髄幹細胞であることが好ましく、より好ましくは自家歯髄幹細胞を用いる。
【００２７】
歯髄幹細胞は、歯髄細胞の中の接着性細胞として選別可能である。脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞の中の接着性細胞又はその継代細胞を培養して得られる培養上清を、「歯髄幹細胞の培養上清」として用いることができる。例えば、以下に示す、特開２０１１−２１９４３２号公報に記載の方法等により適宜取得できる。
【００２８】
（不死化細胞）
幹細胞には各種幹細胞の不死化細胞も含まれる。不死化細胞は、初代細胞の有する活発な増殖能を永久的に保持し、しかもその細胞固有の形態・機能を継代培養によって失うことのない細胞である。概して、不死化細胞の樹立には、外来遺伝子が導入が必要となる。通常、体性幹細胞等の不死化にあたり、１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上の遺伝子が導入されている。なお、こうした遺伝子としては、hTERT、bmi-1、E6、E7、Ost3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、p16NK4a等が挙げられる。不死化細胞としては、歯髄幹細胞の不死化細胞であってもよい。
【００２９】
（培養上清）
培養上清は、幹細胞を培養して得られる培養液であって実質的に細胞成分を含まない部分である本組成物は、典型的には、幹細胞及び幹細胞の取得源細胞を含まず、培養上清のみで構成された組成物である。培養液からの細胞成分の分離は、当業者に周知の固液分離方法で可能である。さらに、培養液に対して各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。幹細胞の培養は、既に周知であり、当業者であれば適切に幹細胞を培養できる。以下、歯髄幹細胞の培養及び培養上清の取得方法の概要について例示するが、以下に説明する各種手法や態様は他の幹細胞にも適用することができる。
【００３０】
（歯髄幹細胞の培養）
（１）歯髄の採取
自然に脱落した乳歯（又は抜歯した乳歯、或いは永久歯）をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
（２）酵素処理
採取した歯髄組織を基本培地（１０％ウシ血清・抗生物質含有ダルベッコ変法イーグル培地）に懸濁し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ及びディスパーゼで３７℃、１時間処理する。５分間の遠心操作（５０００回転／分）により酵素処理後の歯髄細胞を回収する。セルストレーナーによる細胞選別はＳＨＥＤやＤＰＳＣの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるので原則、使用しない。
（３）細胞培養（接着性細胞の選択）
細胞を４ｃｃ基本培地で再懸濁し、直径６ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて３日間培養した後、コロニーを形成した接着性細胞を０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理する。ディッシュから剥離した歯髄細胞を直径１０ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜８回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０７個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば−１９８℃）。
【００３１】
（別法）
細胞を４ｃｃ基本培地で再懸濁し、直径６ｃｍの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。培養液（例えば、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ））を添加した後、５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて２週間程度培養する。培養液を除去した後、ＰＢＳ等で細胞を１回又は数回洗浄する。この操作（培養液の除去及び細胞の洗浄）に代えて、コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を回収することにしてもよい。この場合には例えば、０．０５％トリプシン・ＥＤＴＡにて５分間、３７℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収する。
（４）細胞の回収
次に、細胞を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収することができる。このようにして回収した歯髄幹細胞を用いて本発明の組成物を調製する。
【００３２】
（歯髄幹細胞の培養上清の取得）
歯髄幹細胞の培養には、基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。基本培地としてはＤＭＥＭの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、ＩＭＤＭとＨａｍＦ１２を等量混合した培地（例えば商品名：ＩＭＤＭ／ＨａｍＦ１２（ＧＩＢＣＯ社）として市販される）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
【００３３】
本組成物は、血清を含まないことが好ましい。血清を含まないことでその安全性が高められる。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄幹細胞を培養することによって、血清を含まない培養上清を調製することができる。１回又は複数回の継代培養を行うことにし、最後又は最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。
【００３４】
（培養上清の取得）
歯髄幹細胞の培養には、通常幹細胞に用いられる条件をそのまま適用あるいは適宜変更して適用できる。歯髄幹細胞培養上清の製造は、当業者であれば適宜行うことができる。例えば、以下のような操作で培養上清を取得してもよい。
【００３５】
まず、既に説明したように、歯髄から選抜した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、上記した培地で培養する。例えば、細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、５％ＣＯ２、３７℃に調整したインキュベータにて培養する。必要に応じて継代培養を行う。例えば、肉眼で観察してサブコンフルエント（培養容器の表面の約７０％を細胞が占める状態）又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。例えば継代培養を１〜８回行い、必要な細胞数（例えば約１×１０７個／ｍｌ）まで増殖させる。尚、培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい（保存条件は例えば−１９８℃）。
【００３６】
次いで、選抜・培養した歯髄幹細胞の培養上清を回収する。例えば、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま或いは一以上の処理を経た後に本発明の組成物の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、４℃、−８０℃）を例示することができる。
【００３７】
なお、培養上清に対して適宜濃縮処理を施すこともできる。すなわち、本培養上清は濃縮物として含まれていてもよい。一方、培養上清に対して緩衝液など適当な媒体による希釈処理を施すこともできる。こうした濃縮処理や希釈処理は、本指標成分を適切な濃度や総タンパク質量を調節するのに有効である。濃縮方法としては公知の手法から当業者であれば適宜選択して用いることができる。例えば、スピンカラム濃縮法、エタノール沈殿濃縮法により、培養上清の濃縮物を得ることができる。本培養上清は、凍結乾燥処理が施されていてもよい。すなわち、本培養上清は、凍結乾燥物であってもよい。
【００３８】
（幹細胞培養上清のための評価指標）
こうした幹細胞培養上清に関する指標は、以下に説明する第１の成分、第２の成分及び第３の成分から選択される１種又は２種以上である。
【００３９】
（第１の成分）
第１の成分は、単球走化性促進因子−１（ＭＣＰ−１）活性を有するタンパク質である。この種のタンパク質は、ヒトをはじめとして各種動物においてホモログが知られている。本剤においては、こうしたヒトなどの動物に由来する天然のＭＣＰ−１を天然の原料から回収したものであってもよいし、遺伝子工学的又は化学的に取得したものであってもよい。例えば、ヒトのＭＣＰ−１は配列番号２で表されるアミノ酸配列（NCBIアクセッション番号：NP02973.1）を有している。また、ヒトのＭＣＰ−１は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされている。
【００４０】
第１の成分は、ＭＣＰ−１活性を有していれば足りる。すなわち、公知の天然のＭＣＰ−１他、新たに、本剤におけるＭＣＰ−１活性を有することが確認されたタンパク質であってもよい。また、天然のＭＣＰ−１に改変が加えられたものであって本剤におけるＭＣＰ−１活性を有しているものであってもよい。本剤におけるＭＣＰ−１活性としては、第２の成分及びコンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと協動してミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性、あるいは抗炎症性サイトカインの産生促進活性が挙げられる。こうした活性は、後述する実施例を参照すれば当業者であれば容易に評価することができる。
【００４１】
例えば、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立した第２の成分及び必要に応じて後述するＣＳ等の存在下、可能性ある第１の成分を供給して、組織修復型ミクログリア／マクロファージの指標となるＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ１のタンパク質あるいはｍＲＮＡの産生を確認することなどで評価することができる。
【００４２】
また、例えば、抗炎症性サイトカインの産生促進活性は、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立された第２の成分及び必要に応じてＣＳ等の存在下に、可能性ある第１の成分を供給して、例えば、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１などの抗炎症性サイトカインの産生を確認することなどで評価することができる。
【００４３】
なお、改変ＭＣＰ−１など第１の成分のＭＣＰ−１活性は、上記の活性を有していれば足り、その程度は問わない。好ましくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のＭＣＰ−１活性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上であり、最も好ましくは１００％以上である。
【００４４】
公知のＭＣＰ−１以外の第１の成分としては、データベース等において開示されるＭＣＰ−１の配列情報と一定の関係を有するタンパク質であってもよい。こうした一態様としては、開示されたアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換若しくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上１０個以下程度である。より好ましくは、１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００４５】
また、他の一態様としては、開示されるＭＣＰ−１のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。同一性は、より好ましくは６５％以上であり、さらに好ましくは７０％以上であり、さらにまた好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００４６】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で"同一性 "とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００４７】
第１の成分として使用できる各種のタンパク質は、ＭＣＰ−１の公知のアミノ酸配列や塩基配列のほか、ＭＣＰ−１の公知のアミノ酸や塩基配列と一定の関係を有するタンパク質であって本明細書におけるＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。例えば、ケモカインリガンド（ＣＣＬ）ファミリーが挙げられる。典型的には、ＣＣＬ１３，同７、同８、同１１等が挙げられる。
【００４８】
例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列との関係において、同一性が６０％以上のタンパク質としては、以下の４種が挙げられる。
（１）ヒトＣ−Ｃモチーフケモカイン１３プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_005399.1、配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性は６５％、類似性は８２％）
（２）ヒトＣ−Ｃモチーフケモカイン７プレカーサー（NCBIアクセッション番号:NP_6264.2、同同一性７３％、同類似性７８％）
（３）ヒトＣ−Ｃモチーフケモカイン８プレカーサー（NCBIアクセッション番号:NP_005614.2、同同一性６９％、同類似性８４％）
（４）ヒトエオタキシンプレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_002977.1、同同一性７０％、同類似性８４％）
【００４９】
さらに他の一態様として、開示されるＭＣＰ−１をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされ、ＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにまた好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、開示される塩基配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、より一層好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされ、ＭＣＰ−１活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００５０】
（第２の成分）
第２の成分は、シアル酸結合イムノグロブリン様レクチン−９（Ｓｉｇｌｅｃ−９）の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質である。この種のタンパク質及びその全長タンパク質は、ヒトをはじめとして各種動物においてホモログが知られている。Ｓｉｇｌｅｃ−９は、単球、顆粒球及びマクロファージファージにおいて発現する膜貫通タンパク質であって、細胞外ドメインと膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを備えている。本明細書においては、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインを好ましく用いることができる。細胞外ドメインは、免疫グロブリン様ドメインを含んでいることも知られている。
【００５１】
本開示においては、こうしたヒトなどの動物に由来する天然のＳｉｇｌｅｃ−９を天然の原料から回収したものであってもよいし、遺伝子工学的又は化学的に取得したものであってもよい。例えば、ヒトのＳｉｇｌｅｃ−９は配列番号４で表されるアミノ酸配列を有している。また、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされている。
【００５２】
第２の成分は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメイン活性を有していれば足りる。すなわち、公知の天然のＳｉｇｌｅｃ−９の他、新たに本剤におけるＳｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインとして機能することが確認されたタンパク質であってもよい。また、天然のＳｉｇｌｅｃ−９に上述した改変が加えられたものであってもよい。本剤におけるＳｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメイン活性としては、例えば、第１の成分及びコンドロイチン硫酸又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと協動してミクログリアを組織修復型に誘導できる活性、あるいは抗炎症性サイトカインの亢進活性を有しているタンパク質が挙げられる。
【００５３】
ヒトのＳｉｇｌｅｃ−９は、配列番号３７で表される４６３アミノ酸のアミノ酸配列からなる。このうち、第１位から第１７位までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドである。本開示の第２の成分としては、例えば、このアミノ酸配列の第１８位から第３４８位のアミノ酸配列（配列番号４）であってもよいし、このアミノ酸配列の全長アミノ酸を有していてもよいし、同第１８位〜第４６３位までのアミノ酸配列を有していてもよい。
【００５４】
こうした活性は、既述したように、後述する実施例を参照すれば当業者であれば容易に評価することができる。なお、改変Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインにおけるＳｉｇｌｅｃ−９細胞外ドメイン活性は、上記の誘導活性や産生促進活性を有していれば足り、その程度は問わない。
【００５５】
例えば、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立した第１の成分と必要に応じてＣＳ等の存在下に、可能性ある第２の成分を供給して、組織修復型ミクログリア／マクロファージの指標となるＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ１のタンパク質あるいはｍＲＮＡの産生を確認することなどで評価することができる。
【００５６】
また、例えば、抗炎症性サイトカインの産生促進活性は、ミクログリア／マクロファージを組織修復型に誘導できる活性は、マウス等からミクログリア／マクロファージを単離し培養し、この培養細胞に対して、確立された第１の成分及び必要に応じてＣＳ等の存在下に、可能性ある第２の成分を供給して、例えば、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１などの抗炎症性サイトカインの産生を確認することなどで評価することができる。
【００５７】
抗炎症性サイトカインの産生促進活性は、好ましくは配列番号４で表されるアミノ酸からなるタンパク質のＳｉｇｌｅｃ−９細胞外ドメイン活性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上である。
【００５８】
第２の成分として使用できる各種のタンパク質は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインの公知のアミノ酸配列や塩基配列のほか、Ｓｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメインとして知られている公知のアミノ酸や塩基配列と一定の関係を有するタンパク質であって本明細書におけるＳｉｇｌｅｃ−９の細胞外ドメイン活性を有するタンパク質が挙げられる。例えば、Ｓｉｇｌｅｃファミリータンパク質が挙げられる。典型的には、Ｓｉｇｌｅｃ−９、Ｓｉｇｌｅｃ−７，Ｓｉｇｌｅｃ−１２，Ｓｉｇｌｅｃ−８，ＣＤ３３等が挙げられる。
【００５９】
例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列との関係において、同一性が６０％以上のタンパク質としては、以下の１０種が挙げられる。
（１）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン９同位体２プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_055256.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は１００％、類似性は１００％、塩基配列は配列番号５で表され、アミノ酸配列は配列番号６で表される。）
（２）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン９同位体１プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_001185487.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は１００％、類似性は１００％）
（３）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン７同位体１プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_00055220.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は８１％、類似性は８５％）
（４）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン１２同位体ｂプレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_2015856.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６８％、類似性は７９％）
（５）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン１２同位体ａプレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_443729.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６８％、類似性は７９％）
（６）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン８プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_055257.2、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は７０％、類似性は７８％）
（７）ヒトミエロイド細胞表層抗原ＣＤ３３同位体３プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_001171079.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６３％、類似性は７４％）
（８）ヒトミエロイド細胞表層抗原ＣＤ３３同位体１プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP055257.2、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６３％、類似性は７４％）
（９）ヒトシアル酸結合イムノグロブリン様レクチン７同位体２プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_057627.2、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は７８％、類似性は８２％）
（１０）ヒトミエロイド細胞表層抗原ＣＤ３３同位体２プレカーサー（NCBIアクセッション番号：NP_001076087.1、配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性は６５％、類似性は７７％）
【００６０】
（第３の成分）
第３の成分は、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）又はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）である。本発明者らによれば、炎症反応部位など組織損傷部位における組織修復活性は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分の共存下において発揮される。しかしながら、ＣＳ等は、炎症組織においては常在する多糖類であるため、特に、有効成分として含めなくとも、本剤が組織において作用することができる。もっとも、本剤が第３の成分を含むことでより確実にあるいはより広い範囲に適用できる組成物となる。一方、生体外において本剤を炎症部位やミクログリア／マクロファージに適用するときには、第３の成分であるＣＳ等を添加することが好ましい。コンドロイチン硫酸における糖の結合形態も特に限定しない。また、コンドロイチン硫酸は、複数種類の混合物であってもよい。
【００６１】
（幹細胞の培養上清の評価方法）
本開示の幹細胞の培養上清の評価方法は、幹細胞の培養上清中の本指標の１種又は２種以上の成分を測定する測定工程を備えることができる。本評価方法によれば、本指標成分を測定することで、各種の予防又は治療用途に有用な培養上清であるか否かを評価できる。各種幹細胞についての各種条件での培養上清について本指標を用いて評価することで、培養上清自体の評価のほか、幹細胞や培養条件の評価も可能となる。
【００６２】
培養上清中の本指標成分の測定方法は、成分により異なる。例えば、第１及び第２の成分は、当該タンパク質の少なくとも一部に特異的な抗体を用いて例えばELISA等により測定することができる。こうした特定タンパク質に対する抗体は、商業的に入手できるほか、必要に応じて適宜調製できる。また、第３の成分もまた、特異的に結合する抗体によって例えばELISA等により測定できる。また、第３の成分は、硫酸バリウム法（食品 添加物 コンドロイチン硫酸ナトリウムの定量法（２）硫黄参照）、カルバゾール硫酸法（日本薬局方外医薬品規格のコンドロイチン硫酸参照）、ＨＰＬＣを用いたＡＯＡＣ法等が挙げられる。
【００６３】
本指標のうち評価する成分が存在しているか否かのほか、好ましくは、各成分につき１又は２以上の基準値を設定して評価する。例えば、第１の所定値を充足しない場合には、不適あるいは濃縮等が必要であるなどし、第１の所定値を充足しかつ第２の所定値を充足しない場合には「適」とし、第２の所定値を充足するときには「良好」等などとすることができる。なお、こうした所定値の充足性の判定は、当該所定値に対して、当該所定値未満、当該所定値以下、当該所定以上、当該所定超など、必要に応じて適宜設定することができる。
【００６４】
特に限定するものではないが、各種治療用途に有効である歯髄幹細胞の培養上清における本指標の濃度によれば、例えば、幹細胞培養上清において、第１の成分は、１５０ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、１６０ｐｇ／ｍｌ以上、１７０ｐｇ／ｍｌ以上、１８０ｐｇ／ｍｌ以上、１９０ｐｇ／ｍｌ以上）であることが好ましく、より好ましくは２００ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、２１０ｐｇ／ｍｌ以上、２２０ｐｇ／ｍｌ以上、２３０ｐｇ／ｍｌ以上、２４０ｐｇ／ｍｌ以上）であり、さらに好ましくは２５０ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、２６０ｐｇ／ｍｌ以上、２７０ｐｇ／ｍｌ以上、２８０ｐｇ／ｍｌ以上、２９０ｐｇ／ｍｌ以上）であり、一層好ましくは３００ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、３１０ｐｇ／ｍｌ以上、３２０ｐｇ／ｍｌ以上、３３０ｐｇ／ｍｌ以上、３４０ｐｇ／ｍｌ以上、３５０ｐｇ／ｍｌ以上）である。
また、好ましくは３５０ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、３６０ｐｇ／ｍｌ以上、３７０ｐｇ／ｍｌ以上、３８０ｐｇ／ｍｌ以上、３９０ｐｇ／ｍｌ以上）であることが好ましく、さらに好ましくは４００ｐｇ／ｍｌ以上である。
【００６５】
また、第２の成分は、４５０ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましくは、より好ましくは５００ｐｇ／ｍｌ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｍｌ以上であり、一層好ましくは７００ｐｇ／ｍｌ以上であり、より一層好ましくは８００ｐｇ／ｍｌ以上であり、さらに一層好ましくは９００ｐｇ／ｍｌ以上であり、また好ましくは１０００ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、１１００ｐｇ／ｍｌ以上、１２００ｐｇ／ｍｌ以上、１３００ｐｇ／ｍｌ以上、１４００ｐｇ／ｍｌ以上）であることが好ましく、より好ましくは１５００ｐｇ／ｍｌ以上（さらには、１６００ｐｇ／ｍｌ以上、１７００ｐｇ／ｍｌ以上、１８００ｐｇ／ｍｌ以上、１９００ｐｇ／ｍｌ以上、２０００ｐｇ／ｍｌ以上）である。
【００６６】
本指標は、第１の成分、第２の成分及び第３の成分から選択される少なくとも１種を指標として用いることができる。本指標のうち、例えば、第１の成分と第２の成分とを測定することができる。これらは、第３の成分は、生体組織に概して普遍的に存在する傾向がある一方、第１及び第２の成分は治療用途に大きく寄与するからである。例えば、急性的に組織損傷が生じている疾患では、生体側からのＭＣＰ−１の供給が必ずしも十分でないため、第１の成分と第２の成分とを少なくとも投与することが好適であるからである。また、本指標のうち第３の成分を測定することも好ましい。第３の成分も治療用途に大きく寄与するからである。また、本指標のうち第２の成分を測定することも好ましい。例えば、慢性的に組織損傷が生じている疾患として、２型糖尿病、慢性肝炎及び肝硬変のほか、既述したような慢性及び自己免疫疾患において第２の成分が大きく寄与するからである。
【００６７】
（幹細胞の培養上清を有効成分とする医薬組成物の規格化方法）
以上のことから、本開示によれば、幹細胞の培養上清を有効成分とする医薬組成物の規格化方法に提供される。本規格化方法は、幹細胞の培養上清中の本指標の１種又は２種以上の成分を測定する測定工程と、前記測定結果に基づいて、前記医薬組成物あるいは前記医薬組成物に用いる原料としての前記培養上清における前記１種又は２種以上の成分の規格値を設定する工程と、を備えることができる。
【００６８】
本指標のうちの１種又は２種以上の成分は、各種疾患等に対する改善作用に大きく寄与している。このため、幹細胞の培養上清という多種類成分の組成物であっても、本指標のうちの１種又は２種以上の成分の含有量を規定することで、その培養上清の品質や有効量を規格化できる。本指標成分を用いて規格値は、規格化しようとする幹細胞培養上清についての本指標成分の濃度測定結果のほか、本指標成分の各種疾患の治療等や症状の改善等に対する有効量等に基づいて行うことができる。
【００６９】
本規格化方法においては、既に説明した評価方法の各種態様を適宜適用できる。
【００７０】
（幹細胞培養上清のスクリーニング方法）
本開示の幹細胞の培養上清のスクリーニング方法は、スクリーニング対象である幹細胞の培養上清中の本指標のうちの１種又は２種以上の成分を測定する測定工程を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、治療用途等に有用な幹細胞培養上清を効率的にスクリーニングすることができる。幹細胞の種類や培養条件によっても培養上清の組成は相違する。このため、本指標を用いて幹細胞培養上清をスクリーニングすることで効率的に有用な幹細胞培養上清を取得できる。本スクリーニング方法においても、既に説明した幹細胞培養上清の評価方法における測定工程の実施態様を適用することができる。
【００７１】
（医薬組成物のスクリーニング方法）
本開示の医薬組成物のスクリーニング方法は、スクリーニング対象が幹細胞の培養上清であり、前記培養上清中の本指標のうちの１種又は２種以上の成分を測定する工程を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、各種の幹細胞についての様々な培養条件による培養上清に関し、その治療用途についての有用性に基づきスクリーニングできる。
【００７２】
既に説明したように、本指標は、損傷組織の予防又は治療、炎症性疾患の予防又は治療、及び糖尿病の予防又は治療に寄与できる。このため、本指標を用いてスクリーニングすることで、こうした治療用途に有用な培養上清や、そのための幹細胞や培養条件も効率的に決定できる。本スクリーニング方法においても、既に説明した幹細胞培養上清の評価方法における測定工程の実施態様を適用することができる。
【００７３】
ここでいう医薬組成物は、疾患の予防や治療、症状の改善を意図した組成物をいう。医薬組成物は、少なくとも１種の有効成分を含んでいる。本スクリーニング方法における医薬組成物は、幹細胞培養上清を有効成分とすることができる。なお、医薬組成物の形態は特に限定されないで、液体、粉末、ペレット、クリーム状、顆粒状等の医薬品原料のほか、各種の公知の製剤形態を採ることができる。
【００７４】
医薬組成物の投与経路は特に限定されない。適用部位や対象とする疾患に応じて公知の各種投与形態を採用できる。たとえば、非経口投与は、全身投与であってもよいし局所投与であってもよい。より具体的には、炎症部位への注入、塗布又は噴霧が挙げられる。また、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、口腔内投与等が挙げられる。標的部位が脳である場合には、鼻腔内投与が好ましい。
【００７５】
医薬組成物の用法用量は特に限定されない。被験対象の年齢、体重、病態等を勘案して設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００７６】
医薬組成物が適用される対象個体としては、ヒトを含む哺乳動物（ペット、家畜、実験動物等）が挙げられる。例えば、ヒトのほか、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、サル、モルモット、ラット及びマウス等が挙げられる。
本スクリーニング方法は、損傷組織の予防又は治療用の医薬組成物をスクリーニングできる。すなわち、損傷組織の予防又は治療用に適した幹細胞培養上清をスクリーニングできる。ここで、損傷組織とは、潰瘍、褥瘡等が形成された組織、血管の閉塞や細胞の変性によって損傷した脳組織、外科的な操作によって欠損した脳組織、外傷性脳疾患によって損傷した脳組織、炎症性脳疾患によって損傷した脳組織、損傷した骨組織、損傷した歯周組織、中枢神経系疾患によって損傷した組織、難治性皮膚炎によって損傷した組織等が挙げられる。また、
【００７７】
また、具体的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、統合失調症、鬱病、低酸素脳症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脳高速、小脳変性症が挙げられる。また、脳炎脳症、ヤコブ病、ポリオ等が挙げられる。また、脊髄損傷、脊髄症等が挙げられる。また、アトピー性皮膚炎が挙げられる。
【００７８】
本スクリーニング方法は、組織修復用の医薬組成物をスクリーニングできる。すなわち、組織修復に適した幹細胞培養上清をスクリーニングできる。本明細書において「修復」とは、標的組織における損傷によって失われた機能の一部又は全部が、損傷時における損傷部の機能と比較して維持又は拡幅していることを意味している。機能が回復することのみならず、機能的な組織として再生することを包含している。機能が維持又は回復しているか否かの評価手法は損傷部位における損傷内容に応じて異なる。損傷部位の外観、対象となる機能の程度を評価するために通常用いられるアッセイが用いられる。
【００７９】
組織修復用医薬組成物は、各種の炎症に対する予防、治療、緩和する抗炎症剤組成物として利用できる。組織損傷を生じているあるいは生じる可能性のある疾患を、中枢神経系疾患と非中枢神経系疾患とに分類すると、中枢神経系疾患としては、特に限定されないで、中枢神経系における神経細胞の変性・脱落を生じる全ての病態を含むことができる。例えば、脊髄損傷、脳梗塞、新生児低酸素脳症、神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性各上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等）、ウイルス性又は自己免疫性脳炎、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経変性の変性・脱落、神経細胞の障害を伴う網膜疾患が挙げられる。網膜疾患としては、外傷性網膜剥離、網膜裂孔、網膜震盪症、視神経管骨折、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、網膜色素変性症、緑内障、コレイデレミア、レーベル先天盲、錐体ジストロフィ、家族性ドルーセン、中心性輪紋状絡膜ジストロフィ、常染色体優性視神経萎縮等が挙げられる。なかでも、本剤は、急性及び亜急性の疾患や病態に好ましく適用される。例えば、脊髄損傷や脳梗塞等が挙げられる。さらに、末梢神経損傷による運動機能障害や知覚感覚異常が挙げられる。
【００８０】
また、非中枢神経系疾患としては、特に限定されないで、中枢神経系以外の組織における細胞の変性・脱落を生じる全ての病態を含むことができる。例えば、I型およびII型糖尿病、シェーグレン病、ドライアイ、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症及び骨吸収増加に関連した骨疾患などの慢性炎症性関節疾患、回腸炎、潰瘍性大腸炎、バレット症候群及びクローン病などの炎症性腸疾患、喘息、急性および慢性間質性肺炎、成人呼吸窮迫症候群及び慢性閉塞性気道疾患などの炎症性肺疾患、トラコーマ、オンコセルカ症、ブドウ膜炎、交感性眼炎及び眼内炎などの炎症性眼疾患、歯肉炎及び歯周炎などの慢性炎症性歯周疾患、結核、ハンセン病、尿毒症合併症、糸球体腎炎及びネフローゼなどの炎症性腎疾患、硬化性皮膚炎、乾癬及び湿疹などの炎症性皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫複合体血管炎、全身性狼瘡及び紅斑症、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、心筋症、虚血性心疾患、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症などの炎症性心疾患、並びに子癇前症、慢性肝不全、急性肝炎、劇症肝炎、脳、癌などの重大な炎症要素を有する他の様々な疾患が挙げられる。  あるいはグラム陽性又はグラム陰性細菌ショック、出血性若しくはアナフィラキシーショック、又は前炎症性サイトカインに応答する癌化学療法によって誘発されたショック（例えば前炎症性サイトカイン関連ショック）などの全身性の炎症も挙げられる。かかるショックは、例えば癌化学療法に用いられる化学療法剤によって誘発されうる。さらに、皮膚移植拒絶反応などの移植片拒絶反応も挙げられる。なかでも、本剤は、急性及び亜急性の疾患や病態に好ましく適用される。例えば、急性肝炎や劇症肝炎が挙げられる。同時に、各種の肝障害の終末形態である肝硬変においても好ましく適用される。さらに、急性及び慢性の骨髄炎症疾患が挙げられる。かかる疾患としては、ビスホスホネート系薬剤関連顎骨壊死、外傷や感染に起因する急性及び慢性骨髄炎が挙げられる。また、歯周病や外傷などによる骨変形・骨損傷が挙げられる。こうした損傷等に本剤を投与すると新生骨の形成を促進することができる。
【００８１】
なかでも、関節リウマチ（ＲＡ）などの慢性炎症性関節疾患が挙げられる。関節リウマチは、慢性多発性滑膜炎を本体とする原因不明の炎症性自己免疫性疾患であり、遷延する滑膜炎は、骨・軟骨破壊と永続的な機能障害へとつながる。
【００８２】
慢性的に組織損傷を生じている疾患（炎症性疾患）では、継続的に生体側からＭＣＰ−１の供給が可能であるため、第２の成分の単独投与が有効な場合がある。したがって、第２の成分のみを指標として用いることもできる。
【００８３】
また、特発性肺線維症（ＩＰＦ）を含む間質性肺炎が挙げられる。間質性肺炎は肺胞と肺胞の間の隔壁を主座とする炎症性疾患である。ＩＰＦの病態の特徴は、肺胞壁における線維化と肺胞構造の変化（蜂巣肺形成）であり、肺活量・肺コンプライアンス・肺拡散能が低下し、それに伴い患者のＱＯＬは低下する。慢性かつ進行性の経過をたどり、急性転化した場合の致命率は８０％ともいわれる。
【００８４】
本スクリーニング方法は、炎症性疾患の予防又は治療用の医薬組成物をスクリーニングできる。すなわち、炎症性疾患の予防又は治療用に適した幹細胞培養上清をスクリーニングできる。
【００８５】
本明細書において、「炎症」とは、異物の存在又は何らかの原因による組織損傷によって誘発される、身体を保護しようと働く哺乳動物における機構をいう。「炎症反応」とは、炎症において生じる一連のプロセスをいう。「炎症反応」には、炎症により誘発される組織破壊を含むことができる。「炎症性疾患」とは、身体組織の炎症により、又は炎症要素を有することにより特徴付けられる疾病、疾患又は症状を意味する。これらには局所的な炎症反応及び全身性の炎症反応が含まれる。
【００８６】
炎症性疾患としては、特に限定されないで、広く適用される。炎症性疾患としては、例えば、シェーグレン病、ドライアイ、皮膚創傷治癒、心筋梗塞、骨髄移植に伴う免疫拒絶、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症及び骨吸収増加に関連した骨疾患などの慢性炎症性関節疾患、回腸炎、潰瘍性大腸炎、バレット症候群及びクローン病などの炎症性腸疾患、喘息、急性および慢性間質性肺炎、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群及び慢性閉塞性気道疾患などの炎症性肺疾患、トラコーマ、オンコセルカ症、ブドウ膜炎、交感性眼炎及び眼内炎などの炎症性眼疾患、歯肉炎及び歯周炎などの慢性炎症性歯周疾患、結核、ハンセン病、尿毒症合併症、糸球体腎炎及びネフローゼなどの炎症性腎疾患、硬化性皮膚炎、乾癬及び湿疹などの炎症性皮膚疾患、免疫複合体血管炎、全身性狼瘡及び紅斑症、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）などの炎症性自己免疫疾患、心筋症、心筋梗塞などの虚血性心疾患、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症などの炎症性心疾患、並びに子癇前症、慢性肝不全、慢性肝炎、肝硬変、急性肝炎、劇症肝炎、脳、癌などの重大な炎症要素を有する他の様々な疾患が挙げられる。あるいはグラム陽性又はグラム陰性細菌ショック、出血性若しくはアナフィラキシーショック、又は前炎症性サイトカインに応答する癌化学療法によって誘発されたショック（例えば前炎症性サイトカイン関連ショック）などの全身性の炎症も挙げられる。かかるショックは、例えば癌化学療法に用いられる化学療法剤によって誘発されうる。さらに、皮膚移植拒絶反応などの移植片拒絶反応も挙げられる。なかでも、本組成物は、急性及び亜急性の疾患や病態に好ましく適用される。例えば、急性肝炎や劇症肝炎が挙げられる。また、慢性間質性肺炎、急性間質性肺炎及び肺線維症に好ましく適用される。さらに、慢性肝炎、肝硬変などの慢性肝疾患にも好ましく適用される。さらに、心筋梗塞などの虚血性心疾患にも好ましく適用される。また、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスなどの炎症性自己免疫疾患にも好ましく適用される。
【００８７】
本スクリーニング方法は、糖尿病の予防又は治療用の医薬組成物をスクリーニングできる。すなわち、糖尿病の予防又は治療用に適した幹細胞培養上清をスクリーニングできる。
【００８８】
本明細書において、「糖尿病」とは、分類を問わず、血糖値が病的に高い状態を疾患を意味している。より具体的には血糖値及びヘモグロビンA1cが一定以上の数値を超えている場合をいう。さらに、本明細書において、「糖尿病」には、糖尿病に合併する糖尿病性の急性又は慢性障害（合併症）を含むものとする。急性障害としては、糖尿病性昏睡（ケトン性昏睡、非ケトン性高浸透圧性昏睡、乳酸アシドーシス、低血糖性昏睡）、急性感染症が挙げられる。慢性障害としては、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の微小血管障害、脳血管障害、糖尿病性壊疽などの大血管障害、高脂血症・慢性感染症、胆石症、白内障などが挙げられる。
【００８９】
本明細書において、「糖尿病」とは、分類を問わず、血糖値が病的に高い状態を疾患を意味している。より具体的には血糖値及びヘモグロビンA1cが一定以上の数値を超えている場合をいう。さらに、本明細書において、「糖尿病」には、糖尿病に合併する糖尿病性の急性又は慢性障害（合併症）を含むものとする。急性障害としては、糖尿病性昏睡（ケトン性昏睡、非ケトン性高浸透圧性昏睡、乳酸アシドーシス、低血糖性昏睡）、急性感染症が挙げられる。慢性障害としては、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の微小血管障害、脳血管障害、糖尿病性壊疽などの大血管障害、高脂血症・慢性感染症、胆石症、白内障などが挙げられる。
【００９０】
（医薬組成物の品質評価方法）
本開示の医薬組成物の品質評価方法は、評価対象が幹細胞の培養上清であり、幹細胞培養上清中の本指標のうちの１種又は２種以上の成分を測定する測定工程を備えることができる。本品質評価方法によれば、医薬組成物の品質評価をその有効成分量ないし有効性に基づき適切に行うことができる。したがって、本品質評価方法は、医薬組成物の品質管理方法としても利用できる。また、本品質評価方法は、医薬組成物の製造工程における有効成分の定量方法としても利用できる。
【００９１】
本品質評価方法においては、既に説明した評価方法やスクリーニング方法における測定工程の実施態様を適用することができる。したがって、本品質評価方法は、炎症性疾患の予防又は治療用の医薬組成物、糖尿病の予防又は治療用の医薬組成物及び損傷組織の予防又は治療用の医薬組成物に適用できる。
【００９２】
（疾患の予防又は治療用途のスクリーニング方法）
本開示の疾患の予防又は治療用途のスクリーニング方法は、本指標のうち１種又は２種以上の成分を、１種又は２種以上の疾患の評価系に適用してその作用を評価する工程、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、本指標成分のさらに有用な用途を探索し取得できる。例えば、炎症性疾患の評価系としては、既に各種炎症性疾患について公知である。例えば、劇症肝炎、肺線維症、肝硬変、虚血性心疾患、多発性硬化症、ＳＬＥ及び関節炎等の各種炎症性疾患のモデルマウスを利用できるほか、関連する細胞を用いた評価系適宜選択して利用できる。
【００９３】
また、糖尿病に関する評価系は、糖尿病について公知である。例えば、ストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルマウス・ラット、NODマウス(NOD.Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Sug/Jic)、dbdbマウス(C57BLKS/JＩaｒ- +Lepr db /+Lepr db)、obobマウス(C57BL/6JHamSlc ob/ ob)、Goto-Kakizakiラット(GKラット)、Zucker fattyラット(ZDF-Leprfa/ CrlCrlj)=ZDFラット(Zucker Diabetic fatty)、Wistar fatty ラット(Wistar- Leprfa/ Leprfa)、高脂肪食負荷モデル動物等の糖尿病モデル動物を利用できるほか、MIN6細胞、INS-1細胞、βTC細胞、HIT細胞等の膵β細胞株を用いた評価系を適宜選択して利用できる。
【００９４】
こうした各種の評価系については、当業者であれば適宜選択できるほか、本明細書の実施例等を参照することによっても適宜選択することができる。
【００９５】
（医薬組成物の生産方法）
本開示の医薬組成物の生産方法は、幹細胞の培養上清につき、本指標のうちの１種又は２種以上の成分を測定する測定工程と、前記成分の測定結果に基づいて前記培養上清を有効成分とする前記医薬組成物の品質について評価する工程と、を備えることができる。この生産方法によれば、医薬組成物の有効成分量や有効性に基づき品質を評価し管理できるため、品質の確保された医薬組成物を提供できる。なお、本生産方法においても、既に説明した評価方法やスクリーニング方法における測定工程の実施態様を適用することができる。
【００９６】
（医薬組成物の生産方法）
本開示の医薬組成物の生産方法は、幹細胞の培養上清から本指標のうちの１種又は２種以上の成分を取得する工程、を備えることができる。既に説明したように、本指標の成分は、各種治療用途についての有用性の指標であると同時にそうした治療用の有効成分でもある。したがって、幹細胞培養上清を原料として、当該原料から本指標の少なくとも一成分を取得して、本医薬組成物の有効成分して用いることができる。本指標の成分の組合せについては既に説明したように、本指標中の１種成分のみを有効成分としてもよいし、２種を有効成分としてもよいし、３種を有効成分としてもよい。また、こうして取得した成分を有効成分の少なくとも一部として用いれば足りる。したがって、当該取得された本指標成分と同一成分を別途追加して医薬組成物としてもよいし、取得された本指標成分とは別個の本指標成分を別途追加してもよいし、本指標成分でない他の成分を追加してもよい。
【００９７】
（医薬組成物の生産方法）
本開示の医薬組成物の生産方法は、本指標のうちの第１の成分及び第２の成分の一方又は双方の発現を増強するように遺伝子改変された幹細胞の形質転換体を培養する工程を備えることができる。こうすることで、第１の成分及び第２の成分をより多く含有する培養上清を得ることができる。本生産方法によれば、本指標の第１の成分及び第２の成分の含有量が増大された幹細胞培養上清を得ることができる。この培養上清は、それ自体医薬組成物として有用であるほか、第１の成分及び第２の成分の取得源としても有用である。第１の成分及び第２の成分については既に説明したように、そのアミノ酸配列ほか、塩基配列も既に公知である。したがって、当業者であれば、第１の成分及び／又は第２の成分を増強するように幹細胞を形質転換するためのベクターを容易に構築することができ、また、公知の導入方法に基づき、ベクターを幹細胞に導入し、幹細胞の形質転換体を得ることができる。
【００９８】
（幹細胞の形質転換体）
本開示の形質転換体は、本指標のうちの第１の成分及び第２の成分の一方又は双方の発現を増強するように遺伝子改変された幹細胞の形質転換体である。本形質転換体によれば、こうすることで、第１の成分及び第２の成分をより多く含有する培養上清を得ることができる。本生産方法によれば、本指標の第１の成分及び第２の成分の含有量が増大された幹細胞培養上清を得ることができる。この培養上清は、それ自体医薬組成物として有用であるほか、第１の成分及び第２の成分の取得源としても有用である。こうした幹細胞の形質転換体は当業者であれば適宜作製できる。例えば、公知のアデノウイルスベクターを用いて、所望の成分を発現させるように組換えアデノウイルスＤＮＡを取得し、これをHEK293細胞等にトランスフェクトし、組換えアデノウイルスを増殖させる。この組換えアデノウイルスを幹細胞に感染させることで、幹細胞の形質転換体を得ることができる。
【実施例】
【００９９】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例において、％は、いずれも質量％を意味する。
【０１００】
なお、以下の実施例において言及する図面において、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９と表記するほか、単にＳｉｇｌｅｃ−９又はＳｉｇｌｅｃと表記することがある。
【実施例１】
【０１０１】
（劇症肝炎モデルを用いた歯髄幹細胞の治療有用性の解析）
（１）劇症肝炎モデルラットの作製
著しい肝障害を誘発する、Ｄ−ガラクトサミン（D-galactosamine）溶液をＰＢＳ／ＮａＯＨ溶液に溶解し作製した。この溶液をSprague-Dawleyラット（２００〜２５０ｇ）に、Ｄ−ガラクトサミン１．２ｇ／ｋｇ（ラット体重）となるように腹腔内投与した。投与から２４時間後に採血を行ってＡＳＴ及びＡＬＴを測定し、著しい肝障害が誘発（劇症肝炎）されていることを確認した。
【０１０２】
（２）薬剤の調製
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（組換えヒトＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃキメラ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９のＧｌｎ１８〜Ｇｌｙ３４８を含むキメラタンパク質である。）単独１μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液、ＭＣＰ−１リコンビナントタンパク質（組換えヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社））単独１μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１リコンビナントタンパク質各１μｇ／ｍｌ含有ＰＢＳ溶液をそれぞれ調製した。
【０１０３】
（３）投与
（２）で調製した３種の薬剤液各１ｍｌを、劇症肝炎の発症後２４時間（Ｄ−ガラクトサミン投与から４８時間）のラットに頸静脈から静注した。また、対照としてＰＢＳ１ｍｌを劇症肝炎の発症後２４時間のラットに頸静脈から静注した。
【０１０４】
（４）１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価
１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価をそれぞれ図１及び図２に示す。Sprague-Dawley rat（２００〜２５０ｇ）腹腔内に、著しい肝障害を誘発するＤ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ溶液を１．２ｇ／ｋｇの割合で投与した。図１に示すように、ＰＢＳ投与群では一週間生存率が３０％以下に低下した。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合液の静注群においては劇的に病態が改善され、１週間生存率は１００％であった。一方、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９やＭＣＰ−１の各単独投与群では病態改善効果が得られなかった。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９単独投与群の生存率は４０％、ＭＣＰ−１単独投与群の生存率は０％であった。
【０１０５】
また、図２に示すように、対照群では、血中ＡＳＴ及びＡＬＴがそれぞれ８０００Ｕ／Ｌ及び８３００Ｕ／Ｌであったのに対し、混合投与群では、いずれも２０００Ｕ／Ｌ以下、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９単独投与群では６０００／４０００Ｕ／Ｌ、ＭＣＰ−１単独投与群では７０００／５５００Ｕ／Ｌであった。これらの結果は、図１に示す生存率の結果を支持するものであった。なお、細胞傷害の示標値はＡＳＴ＝６０００Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ＝４０００Ｕ／Ｌとした。
【０１０６】
（５）劇症肝炎モデルにおける病理学的解析
劇症肝炎患者の肝臓では、一般に、広範な肝細胞死と肝細胞再生不全が認められる。本モデルラットにおいても、これらの発現を解析することにより、病態を評価した。肝細胞死は、ＨＥ染色及びＴＵＮＥＬ染色により評価を行った。結果を図３に示す。
【０１０７】
図３のＡ及びＢに示すように、対照群では激しい空砲変性や、多くのＴｕｎｅｌ陽性細胞（全肝臓細胞中２０％）を検出した。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与後１２時間の組織像は正常肝組織様であった。
【０１０８】
（６）劇症肝炎モデルにおける遺伝子解析
劇症性炎症反応では、炎症性組織破壊型Ｍ１マクロファージと抗炎症・組織再生型Ｍ２マクロファージが肝組織損傷に重要な役割を果たす。Ｍ１は、前炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の遺伝子発現を亢進する。Ｍ２は、死細胞のセンサー：マンノースレセプターＣＤ２０６、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）を大量に発現する。本モデルラットにおいても、これらの因子の産生量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析することにより、病態を評価した。結果を図４に示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示す。
【０１０９】
図４に示すように、対照群では、各種の炎症性サイトカインの発現が上昇することがわかった。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与群では炎症性サイトカインの発現が抑制され、抗炎症性サイトカインの発現が亢進することがわかった。
【０１１０】
（７）劇症肝炎モデルにおけるＣＤ２０６免疫染色結果
図５には、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与群及び対照群の劇症肝炎モデルの組織におけるＣＤ２０６染色結果を示す。図５に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１混合投与群では、ＣＤ２０６の発現が顕著であり、組織修復型マクロファージへ変換が明らかに認められた。
【実施例２】
【０１１１】
本実施例では、マウスミクログリア及び脊髄損傷ラットを用いて、ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの効果を確認した。以下、実験方法を示し、次いで結果を示す。
【０１１２】
（１）マウスミクログリアの単離と細胞培養
初代神経細胞は、新生児のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した。１４日培養後、ミクログリアは、”振り切り”法（”ｓｈａｋｉｎｇ ｏｆｆ”ｍｅｔｈｏｄ）によって細胞混合物から単離した。Ｆｃ受容体の免疫染色によって決定された培養細胞の純度は９７〜１００％であった。培養物は、１０％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび０．２％グルコースを添加したＤＭＥＭ中で維持した。
【０１１３】
（２）ミクログリアCSPG活性化アッセイ
４８個のウェルの組織培養プレートは１μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ；Ｓｉｇｍａ）又は１００ｎｇ／ｍｌの細胞外コンドロイチン硫酸プロテオグリカン混合物（ＣＳＰＧ；ミリポア）とともにコーティングした。ミクログリアは、ＰＬＬまたはＰＬＬ／ＣＳＰＧ上の無血清ＤＭＥＭ中に２．０×１０５個の細胞／ウェルで播種した。無血清ＤＭＥＭ中には、組換えヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）と組換えヒトＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含んでいた。２４時間培養後、ＣＤ２０６タンパク質とｍＲＮＡの発現を、免疫組織化学的分析及びリアルタイム定量的ＰＣＲでそれぞれ分析した。４８時間培養後には、培養上清のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ＭｏｕｓｅＩＬ−１０，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【０１１４】
（３）リアルタイムＱ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、分光光度計によって定量し、ＲＮＡの状態を１％アガロースゲルで確認した。ＲＴ反応は、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。２５μｌの合計反応体積中全ＲＮＡ０．５μｇで使用した。リアルタイムＱ−ＰＣＲは、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ定量ＰＣＲミックス（東洋紡）を用い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ装置リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を稼働させて行った。ラット及びマウス用のプライマーは、以下のとおりとした。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
（４）ラット挫傷モデルと外科的処置
２００〜２３０グラムの重量の成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いた。ラットは、ケタミン（６０〜９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。Ｔｈ９腰椎椎弓切除後、硬膜を露出させ、市販されている脊髄損傷装置（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｉｍｐａｃｔｏｒ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって２００ｋｄｙｎの外傷力を付与した。脊髄挫傷後すぐに、Ｔｈ１２部分椎弓切除術を行い、髄腔内にＳＭＰ−２００モデル（プライムテック株式会社）：ｉＰＲＥＣＩＯと接続した薄いシリコンチューブを手術用顕微鏡下で挿入した。管はそれを固定する棘突起に縫合して配置し、ポンプは動物の腋窩の皮膚の下に置かれた。術後、膀胱は１日２回手動腹圧によって圧縮して排尿させた。術後翌日に完全な麻痺（ＢＢＢスコア＝０）を示す動物を評価に用いた。後肢を動かすことができた動物、即死した動物は評価から除外した。
【０１１７】
（５）ＢＢＢのオープンフィールド運動スコア
後肢神経行動試験はＢＢＢの運動評価尺度を用いて行った。２２点（０〜２１）ＢＢＢスケールは、関節の動き、ステッピング能力、調整、体幹の安定性を含む後肢運動のリカバリを評価するために使用した。２１のスコアは、無傷のラットにおける損なわれていない運動を意味している。動物の治療内容に関して盲検化された二人の審査官が評価を行った。各セッションの継続時間は、ラットあたり４分であった。スコアは各時点において、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による反復測定分散分析により解析した。
【０１１８】
（６）免疫組織化学的分析
処理された脊髄の組織学的検査のために、動物を麻酔し、挫傷後７２時間後及び８週間後に、経心臓的に４％ＰＦＡの０．１ＭＰＢＳ溶液で灌流した。脊髄をＯＣＴコンパウンド（サクラファイン）に埋め込んで、区画されたクライオスタット（ライカ）に２０μｍで矢状又は横平面で切片とした。組織切片とミクログリアは、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液で５分間浸透処理した。ヤギ血清１０％（ｖ／ｖ）で３０分間ブロッキング後、一次抗体：５−ＨＴ（ウサギＩｇＧ、１：５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＧＦＡＰ（マウスＩｇＧ、１：５００、ミリポア）、Ｉｂａ１（ヤギＩｇＧ、１：５００、アブカム）、ＣＤ２０６（ウサギＩｇＧ、１：１０００、アブカム）、ＩＬ−１０（マウスＩｇＧ、１：２５０、アブカム）とインキュベートした。二次抗体は、抗マウスＩｇＧ−のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、抗ヤギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６及び抗ウサギＩｇＧ−のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とした。ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色後、組織像は、ユニバーサル蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００、キーエンス）で観察した。
【０１１９】
（７）免疫沈降、レクチンブロット及びウェスタンブロット
ＴＨＰ−１細胞の溶解物を、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９またはＣＣＲ２に対する抗体を用いて免疫沈降させ、沈殿物を抗ＣＣＲ２抗体またはＭＡＨ−レクチンでイムノブロットした。レクチンブロットは、ＴＨＰ−１（理研セルバンク、日本）溶解物（溶解緩衝液：１％トリトンＸ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２ｍＭの塩化カルシウム）から抗ＣＣＲ２抗体（ウサギＩｇＧと、１：５０、Ａｂｃａｍ）で免疫沈降させたＣＣＲ２タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イモビロン−ＰのＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。ブロッティング後、その膜を、ＭＡＬ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で、１２時間、４℃でブロックした。その後、ＭＡＬ緩衝液中、１２時間、４℃で、５ｍｇ／ｍｌのビオチン化ＭＡＬ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）でプローブした。ＭＡＬは、アビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）およびＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出し、ＬＡＳ−４０００ミニルミノイメージアナライザー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により分析した。
【０１２０】
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９とＣＣＲ２との間の物理的相互作用を分析するために、ＴＨＰ−１またはネイティブマウスミクログリア溶解物を０．１５ｎＭのＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９−ＦｃまたはＦｃを用いて４℃で一晩インキュベートした後、プロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア）で免疫沈降した。全細胞溶解物および再懸濁沈殿物は、マウスＣＣＲ２に対する抗体（ウサギＩｇＧ、１：５００、Abcam）を用いてイムノブロットした。
【０１２１】
（８）統計
Ｔｕｒｋｅｙの事後検定（ＳＰＳＳ１９．０）による反復測定分散分析を用いた。Ｐ値が０．０５未満を有意とした。
【０１２２】
（結果）
（ＭＣＰ−１、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＣＳＰＧの組織修復型ミクログリアの誘導に対する相乗効果）
マウスミクログリアについての結果を図６に示す。図６のａ〜ｄに示すように、ＣＳＰＧ上においてＭＣＰ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したミクログリアは、有意にＣＤ−２０６のタンパク質レベルでの発現及び遺伝子レベルでの発現を増大させるとともに、ＩＬ−１０の産生を増大させた。また、免疫染色により、ＣＳＰＧ上においてＭＣＰ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したミクログリアに関し、組織修復型ミクログリアの発現をＣＤ２０６で確認することができた。また、図６のｅ及びｆに示すように、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＣＳＰＧの濃度に依存して組織修復型ミクログリアのマーカーであるＣＤ２０６及び抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生が増大した。
【０１２３】
また、処置切片では、図７ａに示すように、ＧＡＦＰ及びＨ−Ｅ染色により、ＳＣＩ後８週で、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトの活性の減少を示すとともに、組織損失面積が減ったことがわかった。また、図７ｂに示すように、５−ＨＴにより、ＳＣＩ後８週で、陽性神経線維の修復が進行していることがわかった。さらに、図７ｃに示すように、５−ＨＴ染色により、損傷中心から頭側及び尾側においても神経線維の修復が進行していることがわかった。
【０１２４】
（ＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の髄腔内投与による炎症性の脊髄損傷の抗炎症状態／組織再生状態への変換）
ＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を各濃度１μｇ／ｍｌでＳＣＩ部位にｉＰＲＥＣＩＯ注入ポンプによって液３μｌ／ｈを送達した。シリコンチューブはくも膜下腔に挿入した。脊髄損傷部位におけるサイトカインと細胞表面マーカーの遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により評価した。総ＲＮＡは、ＳＣＩから７２時間後に病変部位から採取した。結果を図８に示す。Ｙ軸は、ＳＨＡＭモデル（偽手術モデル）での数値に対する比率を表す。
【０１２５】
図８に示すように、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）および誘導型一酸化窒素合成（ｉＮＯＳ）は、コントロールで亢進されたが、ＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の併用投与で顕著に抑制された。これに対して、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与は抗炎症性サイトカインの発現（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β１）およびＭ２ミクログリア／マクロファージのマーカー（ＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ１）を増大させた。なお、実験は３回繰り返しで行い、いずれも同様の結果が得られた。図８中のデータは平均±ＳＥＭを表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１２６】
（ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９による脊髄損傷後のミクログリア／マクロファージの組織修復型への分化促進）
脊髄損傷から７２時間後の損傷部位を取り囲むミクログリア／マクロファージの典型的画像と定量結果を図９に示す。図９の上段に示すように、コントロール群では、Ｉｂａ１＋ミクログリアが観察されたが、ＣＤ２０６＋細胞が全く観察されなかった。これに対して、図９の中段に示すように、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９処理ラットにおいては、脊髄損傷から７２時間後、損傷部位に多数のＩｂａ＋細胞が移動し、これらＩｂａ１＋細胞のほとんどは、ＣＤ２０６を共発現していた。また、図９の下段に示すように、コントロールラットでは、損傷部位におけるＣＤ２０６＋細胞は、ＩＬ−１０も同時に発現することは観察されなかったのに対し、ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９処理された損傷部位におけるＣＤ２０６＋細胞は、ＩＬ−１０も同時に発現していた。図中のデータは、平均±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＰＢＳ処理に対するＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９処理した脊髄損傷モデル）。
【０１２７】
（脊髄損傷におけるＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の治療上の利点）
脊髄挫傷後の後肢の機能回復の時間経過を図１０に示す。ＭＣＰ−１／ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与ラットは、コントロールと異なり早期から明らかな機能回復傾向を呈した。図中のデータは、平均±ＳＤを表す。
【０１２８】
（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９とＭＣＰ−１レセプターであるＣＣＲ２との相互作用）
免疫沈降、レクチンブロット及びウェスタンブロットの結果を図１１に示す。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は、物理的に、ＴＨＰ−１細胞溶解液中のシアル化ＣＣＲ２と相互作用し、ＣＳＰＧ処理は、ミクログリアのＣＣＲ２発現を増加させ、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は物理的にミクログリアのＣＣＲ２と相互作用した。
【０１２９】
豊富に内因性ＣＣＲ２を発現するヒト単球細胞株ＴＨＰ−１を用いて、ＭＣＰ−１受容体、ＣＣＲ２およびＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９の物理的相互作用を分析した。図１１（Ａ）に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＴＨＰ−１は、異なる分子量（図１１（Ａ）Ｔｏｔａｌ ｌｙｓａｔｅ）で複数のＣＣＲ２タンパク質を発現した。また、抗ＣＣＲ２抗体を用いたＴＨＰ−１溶解物の免疫沈降によって、５５および４２ｋＤａでのＣＣＲ２タンパク質の２つの主要な種が検出された（図１１（Ａ）ａｎｔｉ-ＣＣＲ２）。ＭＡＨブロットでは、特にＳｉｇｌｅｃ-9の主要な標的であるα２−３結合シアル酸を含む糖鎖を認識した。さらに、分子量が大きいＣＣＲ２タンパク質のみがＭＡＨによって検出され、シアリダーゼ処理によりＭＡＨは強く減少した（図１１（Ａ）ＭＡＨ-ｂｌｏｔ）。分子量の大きいシアル化ＣＣＲ２は、ＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９-ＦｃとのＴＨＰ−１溶解沈殿物にのみ検出された（図１１（Ａ）ＣＣＲ２-ｂｌｏｔ）。また、シアリダーゼを用いたＴＨＰ−１溶解液の前処理は、ＣＣＲ２およびＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９間の物理的相互作用を阻害した（図１１（Ａ）ＣＣＲ２-ｂｌｏｔ（シアリダーゼ＋））。ＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９及びＣＣＲ２の物理的な相互作用は、α２−３結合シアル酸を含むシアル化されたＣＣＲ２に依存していた。
【０１３０】
ＣＳＰＧ処理したネイティブミクログリアでは、異なる分子量のＣＣＲ２の発現を増加させた（図１１（Ｂ））。ＣＳＰＧがＣＣＲ２の発現の増大によって少なくとも部分的にＭ２の誘導に寄与していた。さらに、ネイティブミクログリアにおいても、分子量がより大きいシアル化ＣＣＲ２がＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９とミクログリア溶解沈殿物中において見出された。ＥＤ-Ｓｉｇｌｅｃ-９が物理的にマウスミクログリアシアル化ＣＣＲ２と相互作用すること示した（図１１（Ｃ））。
【実施例３】
【０１３１】
（急性肺傷害（間質性肺炎）への適用）
本実施例では、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与によって急性肺傷害で生じる炎症および線維化が抑制されることを見出した。
【０１３２】
（急性肺傷害モデルマウス）
肺胞上皮細胞に障害をもたらすＢｌｅｏｍｙｃｉｎ（ＢＬＭ）を３ｍｇ／ｍｌの割合でＰＢＳに溶解しＢＬＭのＰＢＳ溶液を調製した。この溶液をＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（７〜９週齢）に６Ｕ／ｋｇの量気管内投与を行い、２４時間後にベロクロラ音を聴取して肺傷害が起こっていることを確認した。
【０１３３】
ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９のリコンビナントタンパク質の各１μｇ／ｍｌ濃度のＰＢＳ溶液を肺傷害発生後２４時間のモデルマウスに対して頸静脈から静脈内投与し、その後の病態を観察した。ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群に関し、生存率及び体重の変化を図１２に示す。
【０１３４】
（９日間の体重率および１４日間の生存率評価）
図１２に示すように、ＰＢＳ投与群では、ＢＬＭ溶液（６Ｕ／ｋｇ）が気管内投与されて肺傷害が引き起こされたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、９日間の体重率は７０％（ｎ＝１０）に低下し、１４日間の生存率は約４０％（ｎ＝１０）に低下することを確認した。
【０１３５】
一方、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群では、９日間の体重率は約８０％（ｎ＝１５）に留まり、１４日間の生存率は約８０％（ｎ＝１５）であり、肺傷害が軽減されていることを確認した。
【０１３６】
（肺傷害モデルにおける病理学的解析）
肺傷害患者の肺では線維化の進行と、肺胞構造の破壊を認める。ＢＬＭにより傷害されたモデルマウスの肺も同様の構造変化を示すため、その構造変化と膠原線維の増殖をＨＥ染色およびマッソントリクローム（ＭＴ）染色にて評価した。結果を図１３に示す。
【０１３７】
図１３に示すように、ＢＬＭ投与後７日目の非投与群では著しい線維化と肺胞構造の破壊を認めたが、それと比較して、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与群では線維化が抑制され、より正常像に近い肺胞構造を示していた（ｎ＝５）。
【０１３８】
以上の結果から、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９との投与は、肺における炎症性疾患に起因する組織障害に対しても修復活性を有し、その結果、肺線維症などの肺炎症性疾患や急性の肺疾患の治療や予防に有効であることがわかった。
【実施例４】
【０１３９】
（肝硬変（慢性肝炎）への適用）
本実施例では、ＭＣＰ−１とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与によって肝硬変、慢性肝炎が寛解することを見いだした。
【０１４０】
（肝硬変モデルマウスの作製）
四塩化炭素（ＣＣｌ4）を１．０ｍｌ／ｋｇの割合でオリーブオイルに溶解し肝障害を誘発する薬剤を作製した。この溶液をＣ５７ＢＬ６ ｍｉｃｅ（２０〜２５ｇ）に、１週間に２回、４週連続腹腔内投与し、肝硬変モデルマウスを作製した。このモデルマウスに対して、リコンビナントタンパクＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１をＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度で溶解し、混合溶液を調製した。この混合溶液を最終のＣＣｌ4溶液を投与（ＣＣｌ4投与開始から１ヶ月）してから２４時間後に、５００μｌを１回静脈内投与し、病態改善を検証した。
【０１４１】
（肝硬変モデルにおける病理学的解析）
肝硬変、慢性肝炎患者の肝臓では、肝細胞死、炎症性細胞浸潤及び広範に不可逆性の線維性組織の増殖が認められる。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群について組織解析（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１投与から３日後）を行った。ＨＥ染色結果及びシリウスレッド染色（赤染色：コラーゲンＩの染色）結果をそれぞれ図１４及び図１５に示す。
【０１４２】
図１４に示すように、Ｓｈａｍは正常肝臓組織を呈しているが、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与直前）の組織においては、多くの肝臓細胞死及びディッセ腔における線維化の亢進が観察された。一方、ＰＢＳ投与群においては、激しい細胞浸潤と著しい線維化が観察されたが、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群は正常肝像に近い組織像を呈していた。
【０１４３】
また、図１５に示すように、シリウスレッド染色の結果からは、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔとＰＢＳ投与群で激しい線維化を確認した。一方、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群ではほとんど線維化が確認できなかった。
【０１４４】
（肝硬変及び慢性肝炎モデルにおける遺伝子解析）
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与後３日の肝臓組織からＲＮＡを採取し、炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法にて解析した。結果を図１６及び図１７に示す。
【０１４５】
図１６に示すように、ＰＢＳ投与群では炎症促進型Ｍ１マクロファージが産生するＴＮＦ-αの発現が上昇していたのに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群でＴＮＦ−αの発現は抑制されている。一方、抗炎症性Ｍ２マクロファージマーカーＹｍ−１，ＣＤ２０６，Ａｒｇｉｎａｓｅ−１の発現が上昇していた。
【０１４６】
また、図１７に示すように、ＰＢＳ投与群では活性化した肝星状細胞hepatic stellate cellsが産生するα-Smooth muscle actin（α−ＳＭＡ）, Collagen α１の発現が上昇していた。これに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群では、α−ＳＭＡの発現が抑制された。一方、線維化溶解に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）やＩＧＦ−１，ＨＧＦなどの肝再生に関わる因子の発現レベルの上昇が観察できた。
【０１４７】
（活性化hepatic stellate cellsのマーカーであるα-SMAの染色）
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１投与群と非投与（ＰＢＳ投与）群から採取した肝臓組織に関しα−ＳＭＡの染色を行った。結果を図１８に示す。
【０１４８】
図１８に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１投与群では、α−ＳＭＡ陽性細胞数が激減していた。
【０１４９】
以上のことから、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１を肝硬変に至る肝臓に投与することで、肝硬変に特徴的な肝細胞死、炎症性細胞浸潤及び不可逆性の線維性組織の増殖を抑制できることがわかった。
【実施例５】
【０１５０】
本実施例では、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の静注により自己免疫性関節炎が劇的に改善されることを見いだし、その作用点は自己免疫系そのものにあることが考えられた。
【０１５１】
（コラーゲン誘発関節炎モデルマウスを用いた治療有用性の解析）
（コラーゲン誘発関節炎モデルマウスの作製）
コラーゲン誘発関節炎マウスは、関節リウマチの主要な動物モデルとして用いられている。DBA/1Jマウスの尾底部に、異種動物である牛由来の２型コラーゲンを皮下注射、更に21日後に再注射することにより、コラーゲン誘発性関節炎を発症させた。関節炎の重症度は関節炎スコアを用いて評価した。図１９に示すスコアリングシステムを用いて、各群の平均関節炎スコアを算出した。また各マウスで関節炎スコア1以上を、関節炎発症と定義した。
【０１５２】
（１）コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）マウスにおける、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与による関節炎抑制効果の解析
まず、最適なＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与量を決定するために、コントロール群（生食）とＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９群（０．１μｇ、１μｇ、１０μｇ／マウス）の４群（各ｎ＝７）で検討を行った。２回目コラーゲン投与の２日後、頚静脈より生食または各濃度のＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を投与し、その７日後の関節炎スコアを評価した。結果を図２０に示す。
【０１５３】
図２０に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の０．１および１０μｇ群では、コントロール群と有意な違いを認めなかったのに対して、１μｇ投与群では、コントロール群と比較して有意に関節炎スコアが抑制された。同時に、関節リウマチにおける主要な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの血清中濃度を測定したところ、１μｇ群ではコントロール群と比較して有意に抑制されていた。
【０１５４】
次いでＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の繰り返し投与による、長期間の関節炎抑制効果について検討した。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の投与量は、１μｇとした。２回目コラーゲン投与の２日後から、７日に１回の頻度で、頚静脈より生食またはＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を投与した。関節炎スコアの評価結果を図２１に示す。
【０１５５】
図２１に示すように、最終評価時において、コントロール群では関節炎発症率が１００％に達していたのに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与群では発症率４０％と有意に抑制されていた。また関節炎スコアについても、コントロール群では平均４．３３であったのに対して、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９群では１．４と有意に抑制されていた。同時に、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９投与群及びコントロール群について、血清ＴＮＦ−α濃度と関節炎スコアの相関を検討したところ、相関係数（Ｒ）が０．８３７と非常に強い有意な正の相関関係を示した。
【０１５６】
（マウス・マクロファージ、ヒト関節リウマチ由来滑膜線維芽細胞におけるＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９による遺伝子発現変化）
ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９のｉｎ ｖｉｖｏ（ＣＩＡマウス）における関節炎抑制効果の作用機序を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで検討した。関節リウマチでは、活性化された免疫細胞（マクロファージなど）により分泌される炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α等）が滑膜細胞を刺激し、活性化された滑膜細胞が蛋白分解酵素（ＭＭＰ−３等）を分泌して最終的に骨軟骨破壊を引き起こす。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の作用点が免疫系にあるのか、それとも炎症の主座である滑膜にあるのかを探るため、マクロファージ（自己免疫疾患における中心的免疫細胞の一つ）と、関節炎の主座である滑膜細胞を用いて実験を行った。
【０１５７】
ＤＢＡ／１Ｊマウスの腹腔内よりマクロファージを単離（ｎ＝４）した。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５−２０ｎｇ／ｍｌ）で１時間前処置、ＬＰＳ（０．２μｇ／ｍｌ）で１２時間刺激後、ｍＲＮＡを抽出しｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ法にて遺伝子発現を測定した。結果を図２２（Ａ）に示す。
【０１５８】
図２２（Ａ）に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α（関節リウマチにおける代表的な炎症性サイトカイン）の発現亢進を、用量依存的に抑制する傾向を示した。
【０１５９】
次いで、関節リウマチ患者の、人工膝関節置換術施行時に採取した滑膜組織から酵素的に単離した、滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ）を用いて実験を行った（ｎ＝３）。滑膜線維芽細胞を４８時間前培養、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在／非存在下において、ＴＮＦ−α（１０ｍｇ／ｍｌ）で１２時間刺激後、ｍＲＮＡを抽出しｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ法にて遺伝子発現を測定した。結果を図２２（Ｂ）に示す。
【０１６０】
図２２（Ｂ）に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９はヒト関節リウマチ由来滑膜線維芽細胞において、ＴＮＦ−α刺激によるＭＭＰ−３（滑膜炎で産生される代表的蛋白分解酵素）発現亢進に対して、明らかな抑制効果を示さなかった。
【０１６１】
以上の結果からＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９のＣＩＡマウスに対する作用点は、滑膜炎局所に対する抗炎症作用ではなく、自己免疫性関節炎の発症と進展の本体である、自己免疫系そのものであることが示唆された。
【実施例６】
【０１６２】
炎症性／組織破壊型Ｍ１−マクロファージおよび抗炎症性／組織再生型Ｍ２−マクロファージのバランスが組織再生環境の構築に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。急性および慢性炎症では無秩序なＭ１−マクロファージの活性化が組織損傷の拡大や線維化を促進し組織修復を妨げる。一方、抗炎症性Ｍ２−マクロファージは血管再生を促進、死細胞の貪食、生体内幹細胞の増殖や集積を促すことで組織修復を促す。しかしながら、生体のＭ２誘導能は限られており、ほとんどの組織破壊環境がＭ１優位である。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１がＭ１優位な組織破壊的炎症環境を抗炎症・組織再生環境に変換することを見出した。
【０１６３】
（ラット頭蓋骨欠損モデル：形態学的解析）
全身および局所麻酔下にて７週齢ＳＤラットの頭頂部皮膚を骨膜とともに剥離し、直径５ｍｍの骨採取用トレフィンバーにて注水下で頭蓋骨を削除し、骨欠損を形成した。このとき骨膜は温存した。ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１各１００ｎｇ）をＰＢＳに溶解し、アテロコラーゲンをスキャフォールドとして骨欠損部に留置し、皮膚を復位して縫合、閉創した。術後６週で、μＣＴ、組織学的評価（Ｈ−Ｅ染色）を行った。結果を図２３に示す。
【０１６４】
図２３に示すように、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１をラット頭蓋骨欠損モデルに投与し、術後６週間で著明な骨再生効果を、組織学的にもＣＴ上でも確認できた。以上の結果から、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９／ＭＣＰ−１は骨再生促進因子製剤として臨床応用が可能であることが明らかとなった。
【実施例７】
【０１６５】
本実施例では、グルコース応答性インスリン分泌実験を行った。ＭＩＮ６（１×１０6／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した。培養液をそれぞれＳＨＥＤ−ＣＭ，ＳＨＥＤ−ＣＭ＋各種抗体の添加（抗ヒトＩｇＧ：１／５００，抗ヒトＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体：１／５００，抗ＭＣＰ−１抗体１／５００，抗ヒトＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体：１／５００＋抗ＭＣＰ−１抗体：１／５００）に交換し、６時間培養を行った。その後、低グルコースＫＲＢ緩衝液（２．５ｍＭ）で３０分間スタベーションを行った後、低グルコースＫＲＢ緩衝液２．５ｍＭ）および高グルコースＫＲＢ緩衝液（１６．７ｍＭ）で３０分間刺激を行った。刺激後の上清を回収し、上清を回収した後、acid ethanol法にてインスリン含有量を回収した。ＨＴＲＦ（商標）法を用いて、上清中のインスリン量(release)および上清回収後のインスリン含有量(content)を測定し、release/content(%)にてインスリン分泌能の比較検討を行った。結果を図２４に示す。
【０１６６】
図２４に示すように、中和抗体にて因子をブロックしたところ、抗ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９、抗ＭＣＰ−１及び抗ＭＩＸ（ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９＋ＭＣＰ−１）では、SHED-CMに比べ、有意にインスリン分泌能が低下していた。コントロールであるＩｇＧでは、インスリン分泌能が低下していないことから、ＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９及びＭＣＰ−１は膵β細胞に対してインスリン分泌に関与していることがわかった。
【実施例８】
【０１６７】
（ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清（ＳＨＥＤ−ＣＭ）の調製）
１０ｃｍｄｉｓｈを用いてＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ．ＵＳＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ ＵＳＡ）＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ）でヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を培養し、８０〜９０％ｃｏｎｆｕｌになるまで培養を行う。ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培養液（ＤＭＥＭ）に変更し、４８時間培養を行った。上清を回収し、１５００ｒｐｍで４〜５分、３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、その上清を、歯髄幹細胞培養上清として以下の実施例に使用した。
【実施例９】
【０１６８】
（劇症肝炎モデルを用いた歯髄幹細胞の治療有用性の解析）
（１）劇症肝炎モデルラットの作製
著しい肝障害を誘発する、Ｄ−ガラクトサミン（D-galactosamine）溶液をＰＢＳ／ＮａＯＨ溶液に溶解し作製した。この溶液をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）に、Ｄ−ガラクトサミン１．２ｇ／ｋｇ（ラット体重）となるように腹腔内投与した。投与から２４時間後に採血を行ってＡＳＴ及びＡＬＴを測定し、著しい肝障害が誘発（劇症肝炎）されていることを確認した。その後、実施例８で調製した歯髄幹細胞培養上清（無血清）（SHED-CM）１ｍｌを頸静脈から投与し、病態改善を検証した。また、脂肪幹細胞及び骨髄幹細胞の無血清培養上清１ｍｌも比較例として頸静脈から静注した。さらに、対照としてＤＭＥＭ１ｍｌを劇症肝炎の発症後２４時間のラット（ガラクトサミンの投与から２４時間後）に頸静脈から静注した。
【０１６９】
（２）１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価
１週間生存率の判定、血液検査による肝障害の評価をそれぞれ図２５及び図２６に示す。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ（２００〜２５０ｇ）腹腔内に、著しい肝障害を誘発するＤ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ溶液を１．２ｇ／ｋｇの割合で投与した。図２５に示すように、ＤＭＥＭ投与群では一週間生存率が３０％以下に低下した（ｎ＝１０）。これに対して、歯髄幹細胞無血清培養上清の投与群は劇的に病態が改善され、１週間生存率は９０％であった。脂肪幹細胞無血清培養上清の投与群及び／又は骨髄幹細胞無血清培養上清投与群ではそれほど病態改善効果が得られなかった（それぞれ５０％及び４４％）。
【０１７０】
また、図２６に示すように、ＤＭＥＭ投与群では、血中ＡＳＴ及びＡＬＴがそれぞれ約８０００Ｕ／Ｌ及び約８０００Ｕ／Ｌであったのに対し、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、いずれも約１０００Ｕ／Ｌとなった。また、脂肪幹細胞無血清培養上清投与群及び脂肪幹細胞無血清培養上清投与群では、いずれも約４０００Ｕ／Ｌ及び／又は約５０００Ｕ／Ｌであった。これらの結果は、図２５に示す生存率の結果を支持するものであった。なお、細胞傷害の示標値はＡＳＴ＝６０００Ｕ／Ｌ、ＡＬＴ＝４０００Ｕ／Ｌであった。
【０１７１】
（３）劇症肝炎モデルにおける病理学的解析 
劇症肝炎患者の肝臓では、広範な肝細胞死と肝細胞再生不全が認められる。本モデルラットにおいても、これらの発現を解析することにより、病態を評価した。すなわち、肝細胞死を、HE 染色、及び TUNEL 染色、肝細胞再生は、Ki-67 染色を用いて評価した。TUNEL 染色結果を図２７に示す。
【０１７２】
図２７に示すように、ＤＭＥＭ投与群では激しい空砲変性や、多くのＴｕｎｅｌ陽性細胞（全肝臓細胞中２０％）を検出した。歯髄幹細胞の無血清培養上清（ＣＭ）投与後１２時間の組織像は正常肝組織様であった。Ｔｕｎｅｌ陽性細胞数も著しく低下していた。これらの結果は、図２５及び図２６に示す結果を支持していた。
【０１７３】
（４）劇症症肝炎モデルにおける遺伝子解析  
劇症性炎症反応では、炎症性組織破壊型 Ｍ１マクロファージと抗炎症組織再生型Ｍ２マクロファージが肝組織損傷に重要な役割を果たす。Ｍ１マクロファージは、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の遺伝子発現や、活性化酸素の産生（ｉＮＯＳ）を亢進する。Ｍ２マクロファージは、死細胞のセンサー：マンノースレセプターＣＤ２０６、フリーラジカル合成阻害因子Ａｒｇｉｎａｓｅ、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ｂ）を大量に発現する。本モデルラットにおいても、これらの因子の産生量を定量的ＲＴ−ＰＣＲで解析することにより、病態を評価した。これらの結果を図２８に示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは、表２に示す。
【０１７４】
【表２】
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【０１７５】
図２８に示すように、ＤＭＥＭ投与群では、Ｍ１マクロファージ由来の各種の炎症性サイトカインの発現が上昇することがわかった。これに対して、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、Ｍ１マクロファージ由来の炎症性サイトカインの発現が抑制され、Ｍ２マクロファージ由来の各種の抗炎症性サイトカイン（ＴＧＦ−β、ＣＤ２０６、ＡｒｇｉｎａｓｅＩ及びＩＬ−１０）の発現が上昇することがわかった。
【０１７６】
（５）劇症肝炎モデルにおけるＣＤ２０６免疫染色結果
図２９には、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群の及び対照群の劇症肝炎モデルの組織におけるＣＤ２０６染色結果を示す。図２９に示すように、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、ＣＤ２０６の発現が顕著であり、Ｍ２マクロファージの発現が明らかであった。
【実施例１０】
【０１７７】
本実施例では、肺線維症モデル動物を用いた歯髄幹細胞の治療有用性について解析した。
（１）肺線維症モデルマウスの作製
著しい肺障害を誘発する塩酸ブレオマシン溶液を６Ｕ／ｋｇの割合で生理食塩水に溶解し作製した。その溶液をメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ（６〜８週齡、１７〜２０ｇ）に、気管内投与した。それから２４時間後に、ベロクロラ音の聴取から肺障害が誘発されていることを確認した後、実施例８で調製したヒト歯髄幹細胞由来無血清培養上清、骨髄幹細胞無血清培養上清及びＤＭＥＭ５００μｌの各薬剤を頚静脈から静脈内投与し、病態改善を検証した。体重測定結果を図３０に示し、生存率を図３１に示す。
【０１７８】
（２）肺線維症モデルマウスの生存率、体重による肺障害の評価  
図３０及び図３１に示すように、塩酸ブレオマシン溶液をメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ ｍｏｕｓｅ（１７〜２０ｇ）に、気管内投与すると著しい肺障害が引き起こされ、１４日間の生存率が３３％に低下し、９日間の体重率が６６％まで低下することを確認した。
【０１７９】
（３）生存率、体重による歯髄幹細胞無血清培養上清の治療効果の解析
図３０及び図３１に示すように、歯髄幹細胞由来無血清培養上清の静注群においてのみ劇的に病態が改善された。１４日間生存率は７９．４％となり、体重率の減少は７８．５％に抑えられた。一方で、骨髄幹細胞由来無血清培養上清や無血清培地（ＤＭＥＭ）投与群では病態改善効果が得られなかった。骨髄幹細胞由来無血清培養上清投与群の生存率は５０％、体重率の減少は７１．７％。ＤＭＥＭ投与群の生存率は３３．３％、体重率の減少は６６％であった。
【０１８０】
（４）肺線維症モデルマウスにおける病理学的解析
急性肺疾患患者の肺では、肺の支持組織（間質）の、炎症による広範な肥厚が認められる。本モデルマウスにおいても、これらを観察することにより、病態を評価した。肺組織の線維化は、ＨＥ染色および結合組織の特異的染色法であるマッソントリクローム（ＭＴ）染色により評価を行った。結果を図３２に示す。
【０１８１】
図３２に示すように、ＤＭＥＭ投与群ではＨＥ染色およびＭＴ染色で間質の広範な肥厚を認め、ＭＴ染色では線維化面積の著しい増加を認めた。歯髄幹細胞由来無血清培養上清投与後２４時間の組織像は正常肺組織様であった。
【０１８２】
（５）肺線維症モデルマウスにおける免疫組織学的解析
劇症性炎症反応では、抗炎症・組織再生型Ｍ２マクロファージが肺組織の修復に重要な役割を果たす。そこで、急性肺障害の誘発後４８時間において、歯髄幹細胞由来無血清培養上清投与群とＤＭＥＭ群とについて、免疫染色によりＭ２マクロファージのマーカーであるマンノースレセプターＣＤ２０６を測定した。結果を図３３に示す。
【０１８３】
図３３に示すように、歯髄幹細胞無血清培養上清投与群では、ＤＭＥＭ投与群に比較し、ＣＤ２０６陽性細胞が顕著に増加していることを確認した。
【実施例１１】
【０１８４】
本実施例では、肝硬変に対する歯髄幹細胞培養上清投与の治療有用性について解析した。
【０１８５】
（１）肝硬変モデルマウスの作製
四塩化炭素（ＣＣｌ４）を１．０ｍｌ／ｋｇの割合でオリーブオイルに溶解し肝障害を誘発する薬剤を作製したその溶液をＣ５７ＢＬ６マウス（２０〜２５ｇ）に、１週間に２回、４週連続腹腔内投与し、肝硬変モデルマウスを作製した。その後、実施例８で調製した歯髄幹細胞培養上清（無血清）（ＳＨＥＤ−ＣＭ）を最終の四塩化炭素溶液を投与（四塩化炭素投与開始から１ヶ月）してから２４時間後に、１回、５００μｌ静脈内投与し、病態改善を検証した。対照としてＤＭＥＭを同様に投与した。
【０１８６】
（２）肝硬変モデルにおける病理学的解析
肝硬変、慢性肝炎患者の肝臓では、肝細胞死、炎症性細胞浸潤、及び広範に不可逆性の線維性組織の増殖が認められる。そこで、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与後３日後の組織解析を行った。結果を図３４及び図３５に示す。
【０１８７】
図３４に示すように、ＨＥ染色によれば、Ｓｈａｍでは正常肝臓組織が観察されたが、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＳＨＥＤ−ＣＭ投与直前）では、多くの肝臓細胞死が観察されるとともに、ディッセ腔における線維化の亢進が観察された。また、ＤＭＥＭ投与群では、激しい細胞浸潤と著しい線維化が観察された。これに対し、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群は正常肝像に近いことがわかった。
【０１８８】
また、図３５に示すように、シリウスレッド染色（赤染色：繊維素の染色）によれば、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔとＤＭＥＭ投与群で激しい線維化を確認した。一方、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではほとんど線維化が確認できなかった。
【０１８９】
（３）肝硬変、慢性肝炎モデルにおける遺伝子解析
ＤＭＥＭ，ＳＨＥＤ−ＣＭ投与後３日の肝臓組織からＲＮＡを採取し、炎症性サイトカインなどの遺伝子発現を定量的ＰＣＲ法にて解析した。結果を図３６及び図３７に示す。
【０１９０】
図３６に示すように、ＤＭＥＭ投与群では炎症促進型Ｍ１マクロファージが産生するＴＮＦ-αの発現が上昇していたのに対して、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では抗炎症性Ｍ２マクロファージマーカー、ＣＤ２０６、Ａｒｇｉｎａｓｅ−１の発現が上昇していた。
【０１９１】
また、図３７に示すように、ＤＭＥＭ投与群では活性化した肝星状細胞が産生するα−Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ α１の発現が上昇していた、一方、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では線維化溶解に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）やＩＧＦ−１、ＨＧＦなどの肝再生に関わる因子の発現レベルの上昇が観察できた。
【０１９２】
また、図３８に示すように、活性化肝星状細胞のマーカーであるα−ＳＭＡの染色結果によれば、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではα−ＳＭＡ陽性細胞数が激減していた。活性化肝星状細胞の数が、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で著しく低下することが明らかとなった。
【実施例１２】
【０１９３】
本実施例は、虚血性心疾患に対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。
【０１９４】
（１）心筋虚血再灌流モデルマウスの作製
８〜１２週齢の雄性のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内投与で全身麻酔し、仰臥位で四肢を固定の上、２２Ｇテフロンチューブを気管内挿管し、小動物用人工呼吸器に接続した（呼吸回数１５０回／分、換気量０．２ｍＬ／回）。左第３肋間で開胸を行い、実体顕微鏡下に左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）をナイロン糸で結紮した。３０分後にナイロン糸を解き血流を再灌流させた。
【０１９５】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭ投与
再灌流時に頸静脈より、実施例８で調製したＳＨＥＤ−ＣＭ５００μＬを単回投与した。対照群にはＤＭＥＭ５００μＬを投与した。
【０１９６】
（３）梗塞域の評価
再灌流２４時間後、再度ＬＡＤを結紮し、エバンスブルー液１ｍＬを灌流した。心臓を摘出し、横断切片を作製し2,3,5-triphanyl tetrazolium chloride（ＴＴＣ）液と２０分間反応させた。これにより左室（ＬＶ）、危険域（ＡＡＲ）、梗塞域（ＩＡ）を区別し、画像解析ソフトを用いて各面積を定量した。結果を図３９に示す。
【０１９７】
図３９に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群および対照群で、左室に占める危険域の割合（ＡＡＲ／ＬＶ）は同等であることを確認した。ＳＨＥＤ−ＣＭ群では対照群と比較し、危険域に占める梗塞域（ＩＡ／ＡＡＲ）、一方、左室に占める梗塞域（ＩＡ／ＬＶ）の割合はいずれも有意に低下していることが明らかになった。
【０１９８】
（４）血中心筋トロポニン値の評価
再灌流２４時間後マウスより全血を採取し、心組織破壊のマーカーとして用いられる血漿中の心筋トロポニンＩ値をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図４０に示す。図４０に示すように、モデルマウス血漿中の心筋トロポニンの値はＳＨＥＤ−ＣＭ群で対照群と比較し低下する傾向が明らかとなった。
【０１９９】
（５）組織中炎症性サイトカインの評価
再灌流２４時間後に摘出した心臓の虚血部よりＲＮＡを抽出した。組織中の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）の遺伝子発現をリアルタイム定量ＰＣＲ法で評価した。結果を図４１に示す。図４１に示すように、心組織中の炎症性サイトカインの遺伝子発現は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６のいずれにおいてもＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で抑制される傾向が明らかとなった。
【０２００】
以上の結果から、ＳＨＥＤ−ＣＭは急性心筋梗塞発症後投与されると、速やかに発症した炎症を抑制することにより梗塞域を縮小させる効果を持つことがわかった。
【実施例１３】
【０２０１】
本実施例では、多発性硬化症に対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。
【０２０２】
（１）多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス８週齢メスに対して、２００μｇのＭＯＧ３５-５５  蛋白を完全フロイントアジュバントとともにマウス腰背部に皮下注射し免疫した。４００ｎｇの百日咳毒素を０、２日目に腹腔内注射して、ＥＡＥマウスを作製した。
【０２０３】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭ投与
マウスの麻痺の状態はＥＡＥ臨床スコアを用いて毎日観察した。症状がピークである免疫後１４日目に、マウス尾静脈より実施例８で調製したＳＨＥＤ−ＣＭを５００μｌ、コントロール群にはＤＭＥＭを５００μｌ投与し、以後２８日目までＥＡＥ臨床スコアを用いて麻痺の状態を確認した。また、２８日目にマウスを屠殺し、組織解析を行った。
【０２０４】
（３）ＥＡＥ臨床スコアによる麻痺の状態評価
ＥＡＥ臨床スコアは、０：正常、１：尾の下垂、２：後肢の衰弱、３：後肢の不完全麻痺、４：前肢の衰弱、後肢の完全麻痺、５：四肢麻痺として評価した。結果を図４２に示す。図４２に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では免疫後１９日目以降に、有意な麻痺の改善を認めた。
【０２０５】
（４）組織評価
組織評価は、ＨＥ染色、ＫＢ染色、Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ染色、また免疫染色（ＣＤ３：Ｔ細胞）を行なった。結果を図４３及び図４４に示す。図４３に示すように、ＫＢ染色、Ｓｕｄａｎ ｂｌａｃｋ染色ではＳＨＥＤ−ＣＭ投与群にコントロール群と比較して脱髄範囲の減少、また浸潤細胞の減少が認められた。ＨＥ染色でもまた浸潤細胞の減少が認められた。さらに、図４４に示すように、免疫染色では、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で浸潤するＴ細胞の数に減少を認めた。
【０２０６】
以上の結果から、ＳＨＥＤ−ＣＭは、炎症性自己免疫疾患においてその状況を改善できることがわかった。
【実施例１４】
【０２０７】
本実施例では、ヒト全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。
【０２０８】
（１）ヒトＳＬＥ多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＳＬＥ）マウスの作製
ヒトＳＬＥモデルマウスであるＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスを用い、１５週齢の時点において、ヒトＳＬＥの臨床マーカーである末梢血血清での抗ｄｓ−ＤＮＡ ＩｇＧ抗体量をＥＬＩＳＡにて測定し、ＳＬＥ症状が十分に発症していることを確認した。
【０２０９】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭ投与
１６週齢において、外頸静脈より実施例８で調製したＳＨＥＤ−ＣＭを１匹あたり５００μｌ注入した。そして、２０週齢に到達した時点でトサツし、腎臓、脾臓、腋下リンパ節、尿、末梢血血清を採取した。
【０２１０】
（３）免疫抑制作用の評価
歯髄幹細胞培養上清による免役抑制作用の評価を、末梢血血清における抗ds-DNA IgG抗体量、腎臓をホモジナイズして得られたライセートにおける免疫複合体量をELISAにて定量して行った。また、脾臓は重量を計測し、（Ito T, Seo N, Yagi H, et al: Unique therapeutic effects of the Japanese-Chinese herbal medicine, Sairei-to, on Th1/Th2 cytokines balance of the autoimmunity of MRL/lpr mice. J Dermatol Sci. 28: 198-210. 2002）と同様にＳＩを作成し脾腫の程度を観察した。また、腎臓ＨＥ染色を行うとともに、採取した尿中に含まれるタンパク量を計測し腎機能の変化を観察した。
【０２１１】
脾臓における脾腫及び脾臓重量について図４５及び図４６に示す。これらの図に示すように、脾臓では症状の悪化に伴い脾腫を認めるが、ＤＭＥＭ群と比較してＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では脾臓重量、脾臓の大きさともに正常脾臓に近く、脾腫の抑制傾向を認めた。
【０２１２】
得られた組織切片にＨＥ染色結果を図４７に示す。図４７に示すように、腎炎にともなって細胞の増殖を認めるが、ＤＭＥＭ投与群と比較して、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では糸球体の形状が正常糸球体に類似しており、腎炎の改善傾向を認めた。
【０２１３】
さらに、末梢血血清を用いて血中抗ｄｓ−ＤＮＡＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡで計測した結果を図４８に示す。図４８に示すように、ＤＭＥＭ投与群と比較してＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では血中抗ｄｓ−ＤＮＡＩｇＧ抗体の減少傾向を認めた。
【０２１４】
以上のことから、ＳＬＥに対してＳＨＥＤ−ＣＭ投与が有用であることがわかった。
【実施例１５】
【０２１５】
本実施例では、関節リウマチに対する歯髄幹細胞培養上清投与の有用性について解析した。
【０２１６】
（１）コラーゲン抗体誘導性関節炎モデルマウスの作製
８週齢の雄性ＤＢＡ／１Ｊマウスに関節炎惹起用抗体を腹腔内投与することで関節炎を惹起した。３日後にＬＰＳを腹腔内投与することで、関節炎が増悪された。抗体投与後、７〜１０日で炎症はピークに達した。
【０２１７】
（２）ＳＨＥＤ−ＣＭの投与
抗体投与後、５日目に尾静脈より実施例８で調製したＳＨＥＤ−ＣＭ５００μｌを単回投与した。対照群にはＤＭＥＭ５００μｌを単回投与した。
【０２１８】
（３）関節炎スコア評価
抗体投与日より１４日目まで、四肢の関節炎スコアを測定した。指、甲、足首の３つの部位を観察し、それぞれで腫脹が認められた関節数をスコアとした（スコア１〜３）。さらに、３つの部位全てで非常に重篤な腫脹を認めた場合をスコア４とした。四肢についてこれらを観察し、マウス１個体あたりスコア１６を最高点とした。結果を図４９に示す。
【０２１９】
図４９に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、対照群に比較して、有意に関節炎スコアが低下していることが明らかとなった。
【０２２０】
（４）後肢の厚さ（ｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）の評価
抗体投与日より１４日目まで、ｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓを測定した。マウスの両後肢の甲部分の厚さをデジタルノギスにより測定し、それらの平均値をマウス１個体のｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓとした。抗体投与日のｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓとの差をとり、その増加量を評価した。結果を図５０に示す。図５０に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、対照群に比較して、有意にｈｉｎｄ ｐａｗ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓの増加が抑えられており、関節炎による後肢の腫脹を抑制していることが明らかとなった。
【０２２１】
（５）組織学的評価
抗体投与日より１４日目に屠殺したマウスの足首より組織切片を作製し、ＨＥ染色、トルイジンブルー染色を行い、組織学的な変化を評価した。関節部への炎症細胞浸潤、滑膜組織の過形成、関節面の骨破壊の程度を評価し、スコアリングを行った。最高スコア６点とした。結果を図５１〜図５３に示す。図５１〜図５３に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、対照群に比較して、有意に組織学的スコアが低下しており、関節部の炎症細胞浸潤および組織破壊を抑制していることが明らかとなった。
【０２２２】
（６）組織中の炎症性サイトカイン、組織破壊因子の遺伝子発現評価
抗体投与日より７日目に屠殺したマウスの四肢よりＲＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ法で、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６）、組織破壊因子（ＭＭＰ３）の遺伝子発現を評価した。結果を図５４に示す。
【０２２３】
図５４に示すように、組織中の炎症性サイトカイン、組織破壊因子の遺伝子発現は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＭＰ３において、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群で、対照群に比較して、有意に抑制されていた。ＴＮＦ−αに関しては、抑制される傾向が明らかになった。
【０２２４】
以上の結果より、ＳＨＥＤ−ＣＭは関節炎に対して治療効果を有することが示唆された。
【０２２５】
以上の結果から、本組成物は、炎症性疾患の治療に共通して有用であることがわかった。
【実施例１６】
【０２２６】
以下の実施例で用いた実験方法等について以下に記載する。
【０２２７】
（ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞培養上清（ＳＨＥＤ−ＣＭ）の調製）
１０ｃｍｄｉｓｈを用いてＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ  ＵＳＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ ＵＳＡ）＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ）でヒト脱落乳歯歯髄幹細胞を培養し、８０〜９０％コンフルエントになるまで培養を行う。ＰＢＳで２回洗浄した後に、無血清培養液（ＤＭＥＭ）に変更し、４８時間培養を行った。上清を回収し、１５００ｒｐｍで４〜５分、３０００ｒｐｍで５分遠心分離し、その上清を、ＳＨＥＤ−ＣＭとして以下の実施例に使用した。
【０２２８】
（腹腔内ブドウ糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）とインスリン負荷試験（ＩＴＴ））
１６時間絶食マウスにＩＰＧＴＴは２ｇ／ｋｇのグルコース、ＩＴＴはヒューマリンＲを２Ｕ／ｋｇで腹腔内投与した。投与前，投与後１５分，３０分，６０分，１２０分に眼窩採血を行い、血糖値測定および血中インスリン量を測定した。
血糖値測定は、全血をアントセンス（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて測定を行った。また、血中インスリン量測定は、ＥＤＴＡで分離した血清をＥＬＩＳＡ法（モリナガインスリン測定キット：商品名（森永製菓））で測定した。
【０２２９】
（単離膵臓インスリン含有量）
単離した膵臓を、ＫＲＢ１０ｍｌ中でホモゲナイザーを用いて撹拌させ、２５％ａｓｉｄ ｅｔｈａｎｏｌを投与し、一晩反応させた。遠心分離した上清をＨＴＲＦ法（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ． Ｃｉｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）を用いてインスリン含有量を測定した。
【０２３０】
（病理組織学的検討）
単離膵島を４％ＰＦＡに４時間浸水させ、組織を固定した。病理組織学的検討は、免疫染色とＨＥ染色で比較検討を行った。
【０２３１】
（免疫染色）
ＰＦＡ固定後、１０％スクロースに８時間、２０％スクロースに一晩浸水させ、ＯＣＴコンパウンドに包埋した。１０μｍの厚さに切片を作成し、インスリン及びグルカゴンの発現を蛍光免疫染色法を用いて比較検討を行った。
【０２３２】
切片をＰＢＳで３回洗浄した後に、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ ｉｎ ＰＢＳで２分間処理し、１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ ｉｎ ＰＢＳで３０分ブロッキングを行った。その後、ブロッキング溶液で１／５００に希釈した１次抗体を４℃で一晩反応させた（インスリン：ａｂｃａｍ；ａｂ７８４２，ｇｌｕｃａｇｏｎ：ａｂｃａｍ；ａｂ８０５５）。１次抗体反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光標識した２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をブロッキング溶液で１／１０００希釈し、室温で２時間反応させた。２次抗体反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、マウントした後に、蛍光顕微鏡で観察を行った。
【０２３３】
５枚の非連続切片を無作為に選出し、１切片あたり５視野以上観察した（１匹あたり、２５視野以上）。ｉｍａｇｅＪを使用し、蛍光発現した面積評価の解析を行った。
【０２３４】
（ＨＥ染色）
ＰＦＡで固定した組織をＰＢＳ置換し（２時間、８時間及び２時間の順でＰＢＳを交換）、パラフィン包埋器（サクラファインテックスジャパン）を用いてパラフィン包埋し、４μｍの厚さに切片を作成した。切片を脱パラフィン処置（キシレン３分×３回、１００％エタノール３分×３回、９５％エタノール１分、９０％エタノール１分、７０％エタノール１分、９５％エタノール１分、ミリＱ水（ＭＱ）の順で洗浄）し、×５ ヘマトキシリン液（マイヤー：ＭＱで希釈）で５分間反応させ、ＭＱで１０分間洗浄した。その後、×５ １％エオシンＹ液（ＷＡＫＯ：７０％エタノールで希釈）で２分間反応させ、ＭＱで１回洗浄し、脱水処置（７０％エタノール１分、８０％エタノール１分、９０％エタノール１分、１００％エタノール３分×３回、キシレン３分×３回の順で）し、マウントした後に蛍光顕微鏡で観察を行った。
【０２３５】
（核染色）
ＳＴＺ負荷後、スライドガラスをＰＢＳで３回洗浄し、スライドガラス上の細胞を４％ＰＦＡで３０分固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳで１／２０００に希釈したＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ；Ｊａｐａｎ）を５分間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、マウントした後に、蛍光顕微鏡で観察を行った。ｉｍａｇｅ Ｊを使用し、１視野中のｎｅｃｒｏｓｉｓ細胞数／全体の細胞数をカウントし、比較検討をおこなった。（１スライドガラスより６視野ｎ：３）
【０２３６】
（ウェスタンブロッティング）
ＳＴＺ負荷後、ＰＢＳで３回洗浄し、５０×プロテアーゼインヒビター＋Ｃｄｃ４２ライシスバッファー４００μｌ／ｗｅｌｌを投与し、１５分間反応させた。ｗｅｌｌの内容物を全て回収し、４℃で１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離した上清３０μｌ＋１×ＳＤＳ ３０μｌを混和させ、１００℃３分間反応させたものを、サンプルとして使用した。（全てのサンプルのタンパク量：約２０００μｌ／ｍｌであることをＢＣＡ ａｓｓａｙ；ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨを用いて確認している。）
【０２３７】
サンプル１０μｌをＳＤＳポリアミドゲルで電気泳動した後（２０ｍＡ／１．５時間）、メンブレンに転写（２５０ｍＡ／１時間）した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｎｅ（ナカライテスク）で３０分間メンブレンのブロッキングを行い、ブロッキング後、ｃａｎ ｇｅｔ ｓｉｇｎａｌ（東洋紡）で１／３０００に希釈した１次抗体（ｃａｓｐａｓｅ３：ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ：ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を４℃で一晩反応させ、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後ｃａｎ ｇｅｔ ｓｉｇｎａｌ（東洋紡）で１／１００００に希釈した２次抗体（ｒａｂｉｔ：ＳＩＧＭＡ ＡＤＬＩＣＨ）を室温で２時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ−ｐｒｉｍｅを用いて、蛍光発色させ、現像をおこなった。
【実施例１７】
【０２３８】
（ＳＴＺ投与による膵臓β細胞の破壊による糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ−ＣＭの投与）
Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（以下ＳＴＺ、ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ． ＵＳＡ）を生理食塩液に溶解して５ｍｇ／ｍｌの溶液を調整し、この溶液を９〜１０週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに対し、１日１回５０ｍｇ／ｋｇを５日間腹腔内投与を行い、糖尿病モデルマウスを作成した。
【０２３９】
ＳＴＺ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ１より１４日間ＳＨＥＤ−ＣＭを２ｍｌ／ｄａｙ尾静脈内投与を行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ群として、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）を２ｍｌ／ｄａｙで尾静脈内投与し、またＥｘｅｎｄｉｎ−４（以下、Ｅｘ−４）群として、Ｅｘ−４を１４日間４８ｎｍｏｌ／ｄａｙで腹腔内投与を行った。２４時間毎に体重・随時血糖測定を行い、ｄａｙ１５，２７に腹腔内グルコース負荷試験（以下ＩＰＧＴＴ）で血糖値および血中インスリン濃度を測定した。ｄａｙ３４に膵臓を単離し、病理組織学的検討および膵臓のインスリン含有量を測定した。結果を図５５〜図６３に示す。
【０２４０】
図５５に示すように、本実施例で作製したマウスは、徐々に血糖値が高くなり、２週間後程度に最高血糖値（４００ｍｇ／ｍｌ）となった。図５６に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ上清を添加した群において顕著に血糖値低下効果が観察された。これに対して骨髄幹細胞培養上清投与群及びＥｘ−４投与群は、いずれもＣｏｎｔｒｏｌ群と同等の血糖値を示したにすぎなかった。なお、図５７に示すように、各群の体重は、観察期間を通じてほぼ同等であった。
【０２４１】
図５８及び図５９に示すように、ＩＰＧＴＴの結果は、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群において血糖値が最も低下し、血中のインスリン濃度も高くインスリン分泌が促進されていた。また、図６０に示すように、ｄａｙ３４の膵臓中のインスリン含有量は、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群において最も高かった。
【０２４２】
図６１及び図６２に示すように、ｄａｙ３４に採取した膵臓のＨＥ染色の結果からは、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群において最も良好なβ細胞の存在が多数確認された。図６３に示すように、３４日後の免疫染色結果からは、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群においては、インスリンを生成分泌するβ細胞が充実しその周囲をα細胞が取り囲んだ組織を観察できた。これに対して骨髄幹細胞培養上清投与群やＥｘ−４投与群では、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群のような良好な組織形態を観察できなかった。
【実施例１８】
【０２４３】
（ＳＴＺ投与による膵臓β細胞の破壊による糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ−ＣＭの投与）
ＳＴＺの生理食塩溶液１５ｍｇ／ｍｌを９〜１０週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスに対し、１５０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔内投与し、糖尿病モデルマウスを作製した。ＳＴＺ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３に血糖値４００ｍｇ／ｄＬ以上であることを確認した後に、ｄａｙ３〜ｄａｙ１６までＳＨＥＤ−ＣＭ，ＤＭＥＭを各群２ｍｌ／ｄａｙで尾静脈内投与し、Ｅｘ−４を４８ｎｍｏｌ／ｄａｙで腹腔内投与を行った。２４時間毎に体重・随時血糖値の測定を行い、ｄａｙ１７，３１にＩＰＧＴＴで血糖値および血中インスリン濃度を測定した。ｄａｙ３７に膵臓を単離し、膵臓のインスリン含有量を測定した。結果を図５５及び図６４〜６６に示す。
【０２４４】
図５５に示すように、本実施例で作製したマウスは、急激に血糖値が高くなり、最高血糖値（約５００〜６００ｍｇ／ｍｌ）となった。図６４に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、早期に血糖値が低下傾向となり、その効果が維持された。図６５に示すように、体重については、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群とＥｘ−４投与群は同様の体重減少傾向を呈した。図６６に示すように、ｄａｙ１７のＩＰＧＴＴの結果からは、ＳＨＥＤーＣＭ投与群で最も血糖値抑制効果が高いことがわかった。
【実施例１９】
【０２４５】
（高脂肪食による糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ−ＣＭの投与）
４週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊに３６日間、高脂肪食（Ｈｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２：ＨＦＤ）を摂食させ、体重３９．５ｇ血糖値２００ｍｇ／ｄＬまで上昇させた。その後、ＨＦＤの摂食を継続したまま、ＳＨＥＤ−ＣＭ，ＤＭＥＭを２ｍｌ／ｄａｙ腹腔内投与した。体重・随時血糖測定は、高脂肪食開始後から７日毎に行った。ＳＨＥＤ−ＣＭ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ５８にインスリン負荷試験（ＩＴＴ）でインスリン抵抗性の評価を行い、ｄａｙ６９にＩＰＧＴＴで血糖値および血中インスリン濃度を測定した。結果を、図６７〜７１に示す。
【０２４６】
図６７に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して有意に低い血糖値を維持した。図６８に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群とＣｏｎｔｒｏｌ群との体重増加は同程度であった。図６９及び図７０に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群のＩＰＧＴＴの結果は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群より良好であった。図７１に示すように、ＩＴＴの結果によれば、インスリン抵抗性は、ＳＨＥＤ−ＣＭ群とＣｏｎｔｒｏｌ群とはほぼ同程度であった。
【実施例２０】
【０２４７】
（マウス膵β細胞を用いたＳＨＥＤ−ＣＭの評価）
マウス膵β細胞株：ＭＩＮ６（１×１０６／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した後、培養液をそれぞれＳＨＥＤ−ＣＭ，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ＋Ｅｘ−４（１０ｎＭ）に交換した。なお、ＭＩＮ６の培地には、ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ ＡＤＬＩＣＨ Ｃｏ ＵＳＡ）＋１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ ＡＬＯＲＩＣＨ Ｃｏ ＵＳＡ）＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）を用いた。培養液の交換と同時にＳＴＺ（０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）の各濃度となるように添加し、６時間培養を行った。ＰＦＡで細胞を固定した後、スライドガラス上のＭＩＮ６をＤＡＰＩ染色し、蛍光顕微鏡で観察を行った。ｉｍａｇｅＪを用いて、ｎｅｃｒｏｓｉｓ細胞数／全体の細胞数（１００〜２００）をカウントし、各群でのｎｅｃｒｏｓｉｓ（細胞死）の割合の評価を行った。結果を図７２に示す。
【０２４８】
図１８に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、最もｎｅｃｒｏｓｉｓが有意に抑制されていることがわかった。
【実施例２１】
【０２４９】
（マウス膵β細胞を用いたＳＨＥＤ−ＣＭのインスリン分泌促進に対する評価）
ＭＩＮ６（１×１０６／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した後、培養液をそれぞれＳＨＥＤ−ＣＭ，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ＋Ｅｘ−４（１０ｎＭ）に交換した。培養液の交換と同時にＳＴＺ（０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）の各濃度となるように添加し、６時間培養を行った。その後、２．５ｍＭグルコースのＫＲＢ ｂｕｆｆｅｒ で３０分間スタベーションを行った後、低グルコースＫＲＢ ｂｕｆｆｅｒ（２．５ｍＭ）および高グルコースＫＲＢ ｂｕｆｆｅｒ（１６．７ｍＭ）で３０分間刺激を行った。低グルコースと高グルコースそれぞれ刺激後の上清を回収し、上清を回収した後、ａｓｉｄ ｅｔｈａｎｏｌ法にて最終的にインスリン含有量を回収した。ＨＴＲＦ法を用いて、上清中のインスリン量（ｒｅｌｅａｓｅ）および上清回収後のインスリン含有量（ｃｏｎｔｅｎｔ）を測定し、ｒｅｌｅａｓｅ／ｃｏｎｔｅｎｔ（％）にてインスリン分泌能の比較検討を行った。結果を図７３に示す。
【０２５０】
図７３に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では、インスリンの分泌が促進されていることがわかった。
【実施例２２】
【０２５１】
（マウス膵β細胞を用いたＳＨＥＤ−ＣＭのＡｐｏｐｔｏｓｉｓ促進に対する評価）
ＭＩＮ６（１×１０６／ｗｅｌｌ）を９０％コンフルエントになるまで培養し、ＤＭＥＭ（無血清の培養液）で３回洗浄した後、培養液をそれぞれＳＨＥＤ−ＣＭ，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ＋Ｅｘ−４（１０ｎＭ）に交換した。培養液の交換と同時にＳＴＺ（０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）を添加し、６時間培養を行った。その後ＭＩＮ６のタンパク質を回収し、ウェスタンブロット法にて、カスパーゼ３、クリーブドカスパーゼ３の発現量の比較検討を行った。結果を図７４に示す。
【０２５２】
図７４に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群及び骨髄幹細胞培養上清投与群よりも低いクリーブドカスパーゼ３の発現量を呈した。
【０２５３】
以上の結果から、ＳＨＥＤ−ＣＭは、β細胞のｎｅｃｒｏｓｉｓ及びＡｐｏｐｔｏｓｉｓを抑制し、β細胞のインスリン分泌能を促進しているものと考えられた。
【実施例２３】
【０２５４】
（２型糖尿病モデルマウスの作製及びＳＨＥＤ−ＣＭの投与）
レプチン受容体欠損マウス（自然発症型）（dbdbマウス）の１３週齢（雌）に６１日間、１２時間毎に実施例１で調製したＳＨＥＤ−ＣＭ１ｍｌを静注及び腹腔内投与した。また、コントロールとして、ＤＭＥＭを同様にして静注投与した。体重・随時血糖測定は、投与開始後から５日毎に行った。ＳＨＥＤ−ＣＭ投与開始日をｄａｙ１とし、ｄａｙ３６にグルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）で血糖値および血中インスリン濃度を測定した。また、ｄａｙ５１にインスリン負荷試験（ＩＴＴ）でインスリン抵抗性の評価を行った。結果を、図７５〜８０に示す。
【０２５５】
図２１に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群は、Ｃｏｎｔｒｏｌに対して概して低い血糖値を維持した。図２２に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群とＣｏｎｔｒｏｌ群との体重増加は同程度であった。図２３及び図２４に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群のＩＰＧＴＴの結果は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群より良好であった。図２５に示すように、ＩＴＴの結果によれば、インスリン抵抗性は、ＳＨＥＤ−ＣＭ群とＣｏｎｔｒｏｌ群とはほぼ同程度であった。また、図２６に示すように、ｄａｙ６１の膵臓インシュリン含有量はＳＨＥＤ−ＣＭ投与群において高く、ＳＨＥＤ−ＣＭのインスリン分泌促進効果を支持するものであった。
【０２５６】
以上の結果から、本組成物は、糖尿病の治療に有用であることがわかった。
【実施例２４】
【０２５７】
本実施例では、実施例８に準じて調製した歯髄幹細胞の培養上清からＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を抗体を用いて除去して得られたｄＳＨＥＤ−ＣＭを用いて劇症肝炎、肺線維症及び脊髄損傷に関し、実施例９、実施例１０及び実施例２と同様にして評価を行った。なお、抗体としては、ヒトＭＣＰ−１及びヒドＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９についての市販の抗体を用いた。
【０２５８】
（１）ＳＨＥＤ−ＣＭ及びｄＳＨＥＤ−ＣＭにおけるＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の含有量の測定
抗体処理前のＳＨＥＤ−ＣＭ中及び抗体処理後のＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９の含有量の測定結果を図８１に示す。図８１に示すように、抗体処理後のｄ−ＳＨＥＤ−ＣＭにおけるＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９は、抗体処理前にはそれぞれ所定量含まれていたにも関わらずほとんど観察されなかった。なお、対照等として、骨髄幹細胞の培養上清（ＢＭＳＣ−ＣＭ）、線維芽細胞の培養上清（Ｆｉｂｒｏ−ＣＭ）についても測定したが、いずれも、ＳＨＥＤ−ＣＭに比較して少量のＭＣＰ−１及びＳｉｇｌｅｃ−９を分泌生産するのみであった。またＭＣＰ−１及びＥＤ−Ｓｉｇｌｅｃ−９を抗体処理は特異性が高いことがわかった。さらに、IL-6などCMが含有する他の因子組成には影響しないことがわかった。
【０２５９】
（２）劇症肝炎モデルマウスへの適用
実施例９と同様に、劇症肝炎モデルマウスに対してＳＨＥＤ−ＣＭに加えてｄＳＨＥＤ−ＣＭをそれぞれ投与してその効果を評価した。結果を図８２に示す。図８２に示すように、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群では生存率の改善が明らかであったのに対し、ｄＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではほとんど生存率の改善効果を認めることができなかった。
【０２６０】
（３）肺線維症モデルマウスへの適用
実施例１０と同様に、肺線維症モデルマウスに対してＳＨＥＤ−ＣＭに加えてｄＳＨＥＤ−ＣＭをそれぞれ投与してその効果を評価した。結果を図８３に示す。図８３に示すように、ｄＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではＳＨＥＤ−ＣＭ投与群に対して有意に生存率の低下を呈した。なお、図示はしないが、アッシュクロフト値についてもｄＳＨＥＤ−ＣＭ投与群は、ＳＨＥＤ−ＣＭ投与群より高値となり、コントロールであるＤＭＥＭ投与群に近い値を呈した。
【０２６１】
（４）脊髄損傷ラットへの適用
実施例２と同様に、脊髄損傷ラットに対してＳＨＥＤ−ＣＭに加えてｄＳＨＥＤ−ＣＭをそれぞれ投与してその効果を評価した。結果を図８４に示す。図８４に示すように、ｄＳＨＥＤ−ＣＭ投与群ではＳＨＥＤ−ＣＭに対して有意に損傷修復が抑制されていることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０２６２】
配列番号７〜３６：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【配列表】
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