(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な形態の二重標的抗体、この二重標的抗体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換え発現ベクター、この組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、この宿主細胞を培養して二重標的抗体を製造する方法、及び前記二重標的抗体を含む薬学的組成物の提供。【解決手段】抗体の重鎖又は軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された二重標的抗体。具体的には血管新生機序に密接に関わる２つの受容体ＶＥＧＦＲ−２及びＴｉｅ−２を同時に中和させることのできる二重標的抗体を作製、水溶性リガンドは細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する。前記水溶性リガンドが、リンカーを介して、前記抗体の重鎖又は軽鎖のＮ−末端に融合される二重標的抗体。【選択図】図１０
2015119705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された、二重標的抗体。
【請求項２】
前記抗体が、腫瘍細胞、癌間質細胞、腫瘍関連内皮細胞、腫瘍関連内皮前駆細胞、腫瘍関連循環内皮細胞、循環腫瘍細胞および癌幹細胞からなる群より選ばれた細胞で特異的に発現する抗原に対する抗体である、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項３】
前記抗原が、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ３、ｃ−ＦＭＳ／ＣＳＦ１Ｒ、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＣＲ、インテグリンおよびＭＭＰからなる群より選択される、請求項２に記載の二重標的抗体。
【請求項４】
前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲに対する中和抗体ＴＴＡＣ０００１である、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項５】
前記水溶性リガンドが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦおよびアンジオポエチンからなる群より選択される、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項６】
前記水溶性リガンドが、アンジオポエチン２のＴｉｅ−２に対する結合ドメインである、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項７】
前記水溶性リガンドが、リンカーを介して前記抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に融合される、請求項１に記載の二重標的抗体。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の二重標的抗体をコードする、ＤＮＡ。
【請求項９】
前記抗体の軽鎖および水溶性リガンドが、配列番号：６に示す塩基配列からなる、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
【請求項１１】
図２に示す切断地図を有するｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ Ｌｇｔを含む、請求項１０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換え発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養する段階；および
前記宿主細胞の培養液から二重標的抗体を単離する段階
を含む、二重標的抗体を製造する方法。
【請求項１４】
二重標的抗体が、プロテインＡ親和性カラム、ＳＰ−セファロースカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィによる高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）を用いてさらに精製される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の二重標的抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
血管新生関連疾患の治療に用いられる、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
血管新生関連疾患が、癌、老人性黄斑変性、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性炎症からなる群より選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
癌が、胃癌、肝癌、肺癌、甲状腺癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、膵臓癌、直腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌の骨転移癌、卵巣癌および血液癌からなる群より選択される、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された新規な形態の二重標的抗体、この二重標的抗体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含む組換え発現ベクター、この組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、この宿主細胞を培養して二重標的抗体を製造する方法、および前記二重標的抗体を含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、内皮細胞の成長、分裂、移動などによって既存の血管から新たな血管が生成される機序であり、傷の治癒や女性の生理周期を含む正常的な成長過程で重要な役割を果たしており（Ｒｉｓａｕ，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６７１，１９９７）、のみならず、異常に過剰な血管新生は腫瘍の成長と転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、老人性黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、および慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）などの疾患に決定的な役割を果たすことが知られている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００）。
【０００３】
１９７１年にＪ．Ｆｏｌｋｍａｎ博士によって、腫瘍の成長と転移は血管新生に依存的であり、このため、抗血管新生に焦点をあてた治療法は固形癌に対する新規な治療剤になり得るという仮説が提起されて以来、過剰な血管新生機序の抑制に関する研究は多数の研究者の関心を集めている（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｋｅｒｂｅｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：９６７，２００５）。血管新生過程の進行パターンは、血管新生誘発因子と血管新生阻害因子の総合的なバランスによって決められ、多段階に亘っての複雑で且つ順次的な過程によってなされる。その過程を述べると、まず、腫瘍または傷を有する組織から分泌される血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ ）をはじめとする様々な血管新生誘発因子が既存の血管内皮細胞の周囲の対応する受容体に結合することにより、血管内皮細胞を活性化させて血管内皮細胞の透過性を増大させ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）などの蛋白質分解酵素を分泌することにより、血管内皮細胞の周りの基底膜と細胞外基質を分解して、血管内皮細胞が既存の毛細血管から外れて血管新生誘発因子を分泌する組織に向けて移動・増殖することとなる。移動・増殖した血管内皮細胞は血管内で管状構造をなし、この管状構造に、血管内皮細胞の構造的な支持体である周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）が流入することに伴い、安定して且つ成熟した血管が形成される。このとき、血管内皮細胞から分泌されるアンジオポエチン１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ１；Ａｎｇ１）は、その受容体であるＴｉｅ−２と結合することにより、周皮細胞の流入と血管の安定化に重要な役割を果たすことが知られている（Ｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１，１９９６）。一方、Ａｎｇ１とＴｉｅ−２との相互作用を阻害するアンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として知られているアンジオポエチン２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ２；Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ−２に対してＡｎｇ１とほとんど同じレベルの親和度を示しているため、Ａｎｇ１によって誘導されるＴｉｅ−２のリン酸化過程を競合的に阻害することができる（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５，１９９７）。しかしながら、Ａｎｇ２の機能は、細胞の形態や実験方式によって、Ｔｉｅ−２のリン酸化を誘導することもあるということが報告されており（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：４５４９，２０００）、血管新生の初期段階で血管内皮細胞と周皮細胞との間の相互作用を阻害することにより、血管を不安定化させ、ＶＥＧＦなどの刺激に対して血管内皮細胞を敏感化させることも報告されている（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：Ｒ２１７，１９９９；Ｖｅｉｋｋｏｌａ  ａｎｄ  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．，９：２１１，１９９９；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００）。特に、Ａｎｇ１の場合、正常組織で比較的広範に発現され（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５，１９９７）、腫瘍組織では発現が高くない傾向（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：１１５４，２０００）を示すのに対し、Ａｎｇ２は、血管新生の度合いが大きな癌組織や血管リモデリングが活発な正常組織である胎盤、子宮、卵巣などで過発現様相を示すということは（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：６２４８，２００１；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，９２：１１３８，２００１）、相対的にＡｎｇ２がＡｎｇ１よりも高くなる場合、結果的に腫瘍血管新生を開始するものと推認可能にする。このため、Ａｎｇ２がＴｉｅ−２シグナル伝達機序においてアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）としての役割も果たすことが可能であるものと推測されており、そこで検討するに、アンジオポエチンとＴｉｅ−２のシグナル伝達機序は未だ判明しておらず、さらなる研究が行われる必要があると認められる。しかし、Ａｎｇ１とＡｎｇ２は血管新生に重要でありながらも、互いに異なる役割を果たすものと解釈されている。
【０００４】
アンジオポエチンは、約５０個のアミノ酸からなるＮ−末端ドメイン（Ｎ−ドメイン）と、２１５個のアミノ酸からなるコイルドコイルドメイン（Ｃ−ドメイン）と、約２１５個のアミノ酸からなるフィブリノーゲン様ドメイン（Ｆ−ドメイン）と、から構成されており、これらのうち、Ｎ−およびＣ−ドメインは、アンジオポエチンの多重体の形成に関与しており、Ｆ−ドメインは、受容体であるＴｉｅ−２結合に関与している（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｔ．Ｂｉｏｌ．，１０：３８，２００３）。Ｔｉｅ−２のシグナルを引き起こすために必要とされるリン酸化は、他のチロシンキナーゼ受容体と同様に受容体の二重化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を通じて行われ、このためには、アンジオポエチンが多重化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅ）される必要があるということ（Ｐｒｏｃｏｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３０１９６，１９９９；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ，１０３：２１１，２０００）は、これらのリガンドが、血管新生の阻害を用いる新薬開発戦略の標的として利用可能であることを示唆している。特に、Ｄａｖｉｓ等は、Ｔｉｅ−２のリン酸化のためのアンジオポエチンの最小モジュールは、遺伝子工学的な方法を通じて確認したところ、テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒ）であり、ダイマー（ｄｉｍｅｒ）からモジュールを構成した場合、アンタゴニストとして使用可能であることを主張している（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｔ．Ｂｉｏｌ．，１０：３８，２００３）。他の研究でも、Ａｎｇ１ダイマー変異体はＴｉｅ−２に対するシグナル伝達を有効に行えないということが報告されている（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０１：５５４７，２００４）。換言すれば、Ａｎｇ１のアンタゴニストとしての役割が報告されていないにも拘わらず、この分子のオリゴマーパターンを変形することにより、Ｔｉｅ−２に対するシグナル伝達を阻害したことは、結局のところ、アンジオポエチンの多重化を防ぐ戦略がＴｉｅ−２シグナル伝達機序を妨げるのに使用し得ることを示唆している。報告されたアンジオポエチンとＴｉｅ−２との結合構造によれば、アンジオポエチン内のＴｉｅ−２結合部位を確認することができ、Ａｎｇ１とＴｉｅ−２との間の結合構造がＡｎｇ２とＴｉｅ−２との間の結合構造と類似していることを確認することができる（Ｂａｒｔｏｎ  Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１３：５２４，２００６）。このため、本発明者らは、アンジオポエチン、特に、本発明においては、Ａｎｇ２のＴｉｅ−２結合部位を既存の抗体に融合させた二重標的抗体を構築することにより、血管新生を有効に抑えようとした。
【０００５】
一方、血管新生を抑えるための他の標的として、本発明においては、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達機序に着目した。血管新生過程のほとんどの段階において大きな影響を及ぼすものと知られているＶＥＧＦは、腫瘍組織領域の低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）部位で広範に分泌される。ＶＥＧＦは、１９８９年にジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社のＮ．Ｆｅｒｒａｒａ博士らのグループによって蛋白質の分離・精製およびｃＤＮＡクローニングが行われた（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６，１９８９）。ＶＥＧＦ−Ａとも呼ばれるＶＥＧＦは、これまで４つのアイソタイプ（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６）が存在することが知られており、これらの中で、ＶＥＧＦ１６５は、胎盤を除く全てのヒト組織で最も豊富であることが報告されている（Ｔｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１９４７，１９９１）。ＶＥＧＦは、その受容体であるＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２／に極めて高い親和度をもって結合するが、主としてＶＥＧＦＲ−２を介してそのシグナルを伝達することにより、血管内皮細胞の増殖と移動などの血管新生と関連する機序を誘導するものと知られている。この理由から、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦによって誘導される血管新生機序を抑えるための主な標的となってきており、これに関する多数の論文がこれらを扱っている（Ｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｈｉｃｋｌｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，８：５７９，２００８；Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：５５４４ｓ，２００７）。例えば、ジェネンテック社のアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）は、ＶＥＧＦ−Ａを標的とするヒト化抗体（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３３３：３２８，２００５）として、２００４年に転移性大腸癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、２００６年に非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、そして２００８年にＨｅｒ−２陰性転移性乳癌（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）に対してそれぞれ米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を得て市販されており、現在も、適応症を拡大するために、様々な固形癌腫に対して臨床試験を行っている。さらに、同社で販売しているルセンティス（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）は、老人性黄斑変性の主な様相である黄斑周囲の過剰な血管新生を抑えるために、網膜に注射したときに、その透過性を良好にするために、アバスチンからＦａｂ断片のみを切り出して製造された抗体であって（Ｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｄｒｇｕｓ，２０：１６７，２００６）、湿性老人性黄斑変性（ｗｅｔ−ＡＲＭＤ）に対する治療薬として２００６年に米国ＦＤＡの承認を獲得している。ＶＥＧＦを標的とする他の治療用抗体としては、リジェネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）社のＶＥＧＦ−ｔｒａｐが挙げられる（Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９９：１１３９３，２００２）。これは、ＶＥＧＦＲ−１の２番目の免疫グロブリンドメインとＶＥＧＦＲ−２の３番目の免疫グロブリンドメインをヒトのＦｃに融合した形態の水溶性「デコイ受容体（ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」であり、未だ米国ＦＤＡの承認を得てはいないものの、転移性乳癌、転移性肺癌および転移性大腸癌、並びにホルモン不応性前立腺癌（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）などについて、現在、第ＩＩＩ相治験を進めている。
【０００６】
一方、ＶＥＧＦ受容体であるＶＥＧＦＲ−２を標的とする血管新生抑制抗体には、イムクローン（Ｉｍｃｌｏｎｅ）社のＩＭＣ−１１２１Ｂ（ＥＰ１９１６００１Ａ２）とＵＣＢ社のＣＤＰ−７９１（ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４６１９）、そして本発明者らが開発したＴＴＡＣ−０００１（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）などがある。ＩＭＣ−１１２１Ｂは、完全ヒトＦａｂライブラリーから選別されたモノクローナル抗体であり、現在、転移性乳癌について第ＩＩＩ相治験を進めており、２００９年に胃癌について第ＩＩＩ相治験を行う計画中である。ＵＣＢ社のＣＤＰ−７９１は、ヒト化抗体であり、ＰＥＧ化Ｄｉ−Ｆａｂの形態で非小細胞性肺癌について、現在、第ＩＩ相治験を進めている。この抗体は、Ｆｃを有していないため、抗体依存的な細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）や補体依存的細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を期待することができない。最後に、本発明者らが開発して、現在、前臨床段階において研究中のＴＴＡＣ−０００１は、完全ヒトＳｃＦｖライブラリーから選別されたモノクローナル抗体であり、ＶＥＧＦＲ−２を標的とし、且つ、マウスやラット由来のｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２相同体）に対しても反応性を有する唯一の抗体であり、これは、イムクローン社のＩＭＣ−１１２１Ｂと区別される重要な特徴の一つである（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）。とりわけ、ＴＴＡＣ−０００１が示す異種間交差反応性 （ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）は、動物疾患モデルに関する研究を可能にすることにより、今後、特定の癌腫に対する抗癌剤の開発を段階的に進めて関連研究をなお一層容易に完成させる上で役立つものである。
【０００７】
このようにＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−２を標的とする研究は、最近５年間に亘って飛躍的に発展して、多数の治療剤が市場および臨床研究を通じて開発されている。血管新生の抑制を通じた治療用抗体を開発する他にも、疾患別の単一標的に対する多数の抗体治療剤がＦＤＡ許可を得て市販されているが、例えば、上皮細胞成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＧＦＲ）を標的とする、転移性大腸癌治療剤として販売中のイムクローン社のＥｒｉｂｉｔｕｘや、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする、転移性乳癌治療剤として販売中のジェネンテック社のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、そしてＣＤ−２０を標的とする、非ホジキンリンパ腫治療剤として使用されているＲｉｔｕｘａｎ（商標）などは、全世界のモノクローナル抗体市場を主導する重要な抗体治療剤である。
【０００８】
一方、最近の抗体市場の動向は、単一標的に対して機能性を有する抗体を開発することに加えて、二種類またはそれ以上の標的を同時に取り得る、いわゆる、二重標的抗体（二重特異性抗体）または多重標的抗体（多重特異性抗体）に関する研究が盛んに行われている（Ｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１：３９１，２０００；  Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：２３８，２００４；Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖ．，９：１８４，２００６）。この部類に属する抗体の中で、ＦＤＡの承認を得て商品化がなされたケースは未だないものの、持続的な関心と潜在力を元に実験室および臨床レベルで絶えず研究・開発がなされている。この部類に属する抗体は、大きく、１）ＳｃＦｖ基盤の抗体、２）Ｆａｂ基盤の抗体、３）ＩｇＧ基盤の抗体などに分けられる。
【０００９】
まず、第一に、ＳｃＦｖを基盤とする多重標的抗体の場合、異なるＳｃＦｖのＶＬとＶＨをそれぞれ組み合わせて得た、ハイブリッドＳｃＦｖをヘテロ二量体の形態にしたダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）がある（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：６４４４，１９９３）。しかしながら、この形態の抗体は、ヘテロダイマーの結合力が弱くて安定性に劣るという欠点がある。また、異なるＳｃＦｖを互いに連結して得たタンデムＳｃＦｖ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９３：４１，１９９９；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９９：１４１５，２００８）、異なるＳｃＦｖ末端に相互間の結合能があるＪｕｎおよびＦｏｓをそれぞれ発現させて得たヘテロ二量体のＳｃＦｖ（Ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ａｎｄ  Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：７６３０，１９９６）、ＦａｂのＣＨ１とＣＬをそれぞれのＳｃＦｖの末端に発現させて得たヘテロ二量体のミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．，４３２：４５，１９９８）、そして、Ｆｃのホモ二量体のドメインであるＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸を置換して、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅ）」の形態のヘテロ二量体の構造に変更させて、これらの変更されたＣＨ３ドメインを異なるそれぞれのＳｃＦｖ末端に発現させることにより、ヘテロ二量体のＳｃＦｖ形態のミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を製造する方法などが報告されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７，１９９８）。これらに加えて、ＳｃＦｖを基盤とする様々な類似体が学術的に報告されており（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖ．，７：２３３，２００４）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）を用いた三重標的ＳｃＦｖまたはテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）を用いた四重標的ＳｃＦｖも科学文献に報告されている（Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｒｔｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３１：１７７，１９９９）。
【００１０】
第二に、Ｆａｂを基盤とする多重標的抗体の場合、特定の抗原に対する個別のＦａｂ’をジスルフィド結合または媒介物を用いて組み合わせて得たヘテロ二量体のＦａｂ（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１，１９８５；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７，１９９）の形態がほとんどを占める。一方、特定のＦａｂの重鎖または軽鎖の末端に異なる抗原に対するＳｃＦｖを発現させることにより、抗原結合価（ａｎｔｉｇｅｎ ｖａｌｅｎｃｙ）を２つにしたり（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：７０５０，２０００；  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２６７：２１３，２００２）、ＦａｂとＳｃＦｖとの間にヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を設けることにより、ホモ二量体の形態で４つの抗原結合価を有するようにした二重標的抗体も報告されている（Ｃｏｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：１５９，１９９７）。また、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に異なる抗原に対するＳｃＦｖを融合させることにより、抗原に対する結合価を３つにした二重標的バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）と、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に異なるＳｃＦｖをそれぞれ融合させることにより、抗原に対する結合価を３つ有するようにした三重標的バイボディもまた科学文献に報告されており（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：７０５０，２０００）、異なる３つのＦａｂを化学的に結合することにより得られる簡単な形態の三重標的抗体Ｆ（ａｂ’）３も報告されている（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０，１９９１）。
【００１１】
第三に、ＩｇＧを基盤とする多重標的抗体の場合、トリオンファーマ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）社がマウスとラットのハイブリドーマをハイブリダイズすることにより、二重標的抗体を産生するハイブリッドハイブリドーマ、別名、クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）を得た。同社の二重標的抗体Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ（抗原：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＣＤ３）は、転移性乳癌について第ＩＩ相治験に進んでおり（Ｋｉｅｗｅ  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｌ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１７：１５５３，２００８）、Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（抗原：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）は、胃癌と卵巣癌について第ＩＩ相治験、悪性腹水（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｓｃｉｔｅｓ）について第ＩＩＩ相治験に進んでいる（Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１０：２７３，２００８）。但し、これらの抗体は、繰り返し投与によるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはヒト抗ラット抗体（ＨＡＲＡ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）反応を排除することができない。一方、軽鎖部分は共有しつつ、異なる重鎖に対してＦｃのＣＨ３ホモ二量体のドメインの一部のアミノ酸を変形させてヘテロ二量体の形態にした、いわゆる、「ホールズ・アンド・ノブ（Ｈｏｌｅｓ ａｎｄ  Ｋｎｏｂ）」の形態の二重標的抗体も報告されている（Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６７７，１９９８）。ヘテロ二量体の形態の二重標的抗体の他に、異なる２種のＳｃＦｖをＩｇＧの軽鎖と重鎖の可変ドメインの代わりに、定常ドメインにそれぞれ融合発現させてホモ二量体の形態の（ＳｃＦｖ）４−ＩｇＧ（抗原：ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ）として発現させるケースが報告されている（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：２８５６，２００４）。しかしながら、この抗体の場合、生産性が格段に低いことが問題点として取り上げられており、このため、同研究グループでは（ＳｃＦｖ）４−ＩｇＧを補完して同じ標的に対して生産性を向上させたジ-ダイアボディ（ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）を製作してその可能性を確認した（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：１９６６５，２００５）。しかしながら、この形態の抗体は、ジ-ダイアボディそのものの問題点である安定性が劣るという欠点を克服することはできなかった。また、イムクローン社のＳｈｅｎ等がヒトＶＥＧＦＲ−２に対するキメラモノクローナル抗体であるＩＭＣ−１Ｃ１１を基盤として、この抗体の軽鎖Ｎ−末端にマウス血小板由来成長因子受容体−α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−α；ＰＤＧＦＲ−α）に対する単一の可変ドメインのみを融合させて二重標的抗体を製作してその可能性を報告している（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：１０７０６，２００６；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３１８：６５，２００７）。最近、Ｒｏｓｓｉ等は、プロテインキナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ；ＰＫＡ）Ｒサブユニットの二量体化およびドッキン���ドメイン（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＤＤＤ）とＰＫＡのアンカリングドメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を用いたいわゆる「ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ；ＤＮＬ）」と呼ばれる方法を用いてＣＤ２０に対する多数の抗原結合価を有する抗体を開示しており（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０３：６８４１，２００６；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８：８３８４，２００８）、同研究グループにおいてそのような技術に基づく二重標的抗体を報告している（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３：５５８６，２００７）。ＤＮＬ方法を用いる抗体は、適用が簡単であり、モジュール形式であるため、様々な組み合わせが可能であり、生体内安定性に優れているというメリットを有するが、生体内蛋白質分解酵素による分解が起こり得、しかも、免疫原性に関連する問題があり得ることが知られている。
【００１２】
これまでに学術的に報告された二重標的または多重標的抗体は多数存在し、それらの抗体はその使用目的に応じた形態学的な特徴によって各々機能上の長短所を有する。特に、癌を治療するための治療用二重標的および多重標的抗体の開発に関する研究は盛んに行われているのが現状である。しかしながら、このような研究を通じて得られた抗体が正常にその機能を発揮するためには、何よりも抗体が標的とする抗原の選択が極めて重要である。
【発明の概要】
【００１３】
発明の開示
発明が解決しようとする技術的課題
そこで、本発明者らは、血管新生の抑制を通じた抗癌治療用の二重標的抗体の開発のために、血管新生機序に密接に関わる２つの受容体ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２を同時に中和させることのできる二重標的抗体を、これまで報告されていない新たな形態にて製作することにより、前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−２またはＴｉｅ−２に対する単一標的抗体に比べて、細胞レベルだけではなく、生体内でも同等あるいはより優れた抗癌効果を示すということを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明の目的は、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された新規な形態の二重標的抗体を提供するところにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記二重標的抗体をコードするＤＮＡを提供するところにある。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記ＤＮＡを含む組換え発現ベクターを提供するところにある。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供するところにある。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、前記宿主細胞を培養することで二重標的抗体を製造する方法を提供するところにある。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、前記二重標的抗体を含む薬学的組成物を提供するところにある。
【００２０】
課題を解決するための手段
本発明は、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された新規な形態の二重標的抗体に関する。
【００２１】
本発明の明細書において用いられる用語「抗体」とは、様々な種類の抗原を特異的に認識するようにＢ細胞によって生成され、Ｂ細胞の抗原受容体の役割を果たす蛋白質分子のことをいう。この分子は、Ｙ字状であり、２つの同じ軽鎖と２つの同じ重鎖とから構成される。軽鎖と重鎖はすべて、可変領域および定常領域を含む。４つの鎖は、ヒンジ領域と呼ばれる重鎖のフレキシブル領域（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）に位置しているジスルフィド結合によって一緒に固定されている。重鎖と軽鎖のすべての可変領域は互いに結合して２つの同じ抗原−結合部位を形成する。抗体は、重鎖定常領域によってＡ（ＩｇＡ）、Ｄ（ＩｇＤ）、Ｅ（ＩｇＥ）、Ｇ（ＩｇＧ）およびＭ（ＩｇＭ）といった５つの部類に分けられる。それぞれの部類は、アイソタイプとも呼ばれ、独特な構造的特徴と異なる生物学的特性を有している。本発明は、全てのアイソタイプの抗体を含み、好ましくは、ＩｇＧを用いる。
【００２２】
本発明の抗体は、これに制限されるものではないが、腫瘍細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ）、癌間質細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）、腫瘍関連内皮細胞（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、腫瘍関連内皮前駆細胞（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、腫瘍関連循環内皮細胞（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、癌幹細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などにおいて特異的に発現する抗原に対する抗体であることが好ましい。
【００２３】
より具体的には、本発明の抗体は、ＶＥＧＦＲ−１（血管内皮細胞成長因子受容体−１）、ＶＥＧＦＲ−２（血管内皮細胞成長因子受容体−２）、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞成長因子受容体−３）、ＦＬＴ３（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３）、ｃ−ＦＭＳ／ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＲＥＴ（トランスフェクション時に再構成）、ｃ−Ｍｅｔ（間葉上皮転換因子）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）、ＩＧＦＲ（インスリン様成長因子受容体）、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、ｃ−ＫＩＴ（幹細胞因子受容体）、ＢＣＲ（切断点クラスター領域）、インテグリン、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）などの細胞の表面に発現する蛋白質に対する抗体であるが、これに制限されることはない。
【００２４】
本発明において、抗体は、「ポリクローナル」抗体であっても「モノクローナル」抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることがより好ましい。モノクローナル抗体とは、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体のことをいい、すなわち、このような集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る自然発生の突然変異を除いては、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性領域に対して高度に特異的である。さらに、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは逆に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一のエピトープに対して誘導される。モノクローンは、任意の特定の方法により抗体を生成することを必要とするという意味として解釈されてはならない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、文献［Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）］に記載のハイブリドーマ法により製造するか、あるいは、組換えＤＮＡ法［米国特許第４、８１６、５６７号公報参照］により製造することができる。また、モノクローナル抗体は、例えば、文献［Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）］に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００２５】
本発明の抗体は、「ヒト化抗体」であることが好ましい。ヒト化抗体とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を保有する抗体の配列を変更することにより、一部または全体がヒト抗体生殖細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）に由来するアミノ酸配列から構成された抗体を意味する。このような変更法として最も簡単な方法は、単にマウス定常領域をヒト抗体の定常領域で置換することであり、これにより、製薬上の用途に許容可能な程度に免疫原性が十分に低いヒト／マウスキメラが生成される。しかしながら、抗体の可変領域および、さらには、ＣＤＲも、現在当業界における公知の技術を用いてヒト化させることが好ましい。非ヒトＣＤＲを実質的にインタクトに維持するか、ＣＤＲをヒトゲノムに由来する配列に取り替えると同時に、可変領域のフレームワーク領域を対応するヒトフレームワーク領域に置き換える。インタクトなヒト抗体は、免疫システムがヒト免疫システムに対応するように改変された遺伝的に改変されたマウスから生成される。
【００２６】
本発明の抗体は、「ヒト抗体」であることが特に好ましい。ヒト抗体は、ヒトによって産生された抗体またはヒト抗体を製造するための技術のうちの任意の技術を用いて製造した抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体は、当業界で知られている様々な技術を用いて製造することができる。一態様において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選別する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。ヒト抗体は、形質転換動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されたマウスに、ヒト免疫グロブリン座位を導入することにより製造することもできる。抗原投与時に、遺伝子再配列、アセンブリーおよび抗体レパートリーをはじめとするあらゆる点でヒトに見られるのと極めて類似するヒト抗体の生成が認められる。この方法は、例えば、米国特許第５、５４５、８０７号；第５、５４５、８０６号；第５、５６９、８２５号；第５、６２５、１２６号；第５、６３３、４２５号；第５、６６１、０１６号および文献［Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｍ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５））］に記載されている。別の方法として、ヒト抗体は、標的抗原に対して誘導された抗体を産生するヒトＢリンパ球（例えば、Ｂリンパ球は個体から回収するか、あるいは、試験管内において免疫化させることができる）の不死化を通じて製造することができる（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５、７５０、３７３号）。
【００２７】
本発明の明細書において用いられる用語「水溶性リガンド」は、細胞に存在する、特に、細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する蛋白質であり、水に溶解可能な水溶性特性を示す蛋白質の全体または一部を意味する。水溶性リガンドとしては、例えば、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＰｌＧＦ（胎盤成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、アンジオポエチンなどが挙げられるが、これらに制限されることはない。
【００２８】
本発明の新規な形態の二重標的抗体において、抗体とリガンドは、それぞれの固有な役割をそのまま発揮する。
【００２９】
但し、二重標的抗体の場合、二つのシグナルを同時に抑制または増幅させることができるので、一つのシグナルを抑制／増幅する場合に比べて一層効果的であり、それぞれのシグナルをそれぞれのシグナル抑制剤で処理した場合と比較したとき、低用量投薬が可能であり、同じ時間および空間における二つのシグナルを抑制／増幅させることができる。
【００３０】
本発明においては、抗体と水溶性リガンドをリンカーを介して融合させることが好ましい。本発明において、「リンカー」とは、融合蛋白質の二つの部分を連結するペプチド断片のことをいう。本発明において好適なリンカーは、５〜２５個のアミノ酸、好ましくは、１０〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは、１０〜１５個のアミノ酸を有するペプチドを含む。
【００３１】
本発明の二重標的抗体を製造するために、この二重標的抗体をコードする核酸配列を作製する。前記核酸配列は、抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列の５’末端に水溶性リガンドをコードする核酸配列の３’末端を融合させることにより作製することができる。一態様として、リンカーを介して融合された二重標的抗体をコードする核酸配列は、プライマーにリンカーの核酸配列が含まれるように設計した後、ＰＣＲを行うことにより得られる。
【００３２】
このようにして製造された二重標的抗体のコード遺伝子をベクターに挿入して組換え発現プラスミドを製造した後、このプラスミドを宿主細胞に導入して形質移入体または形質転換細胞を製造し、この宿主細胞を増幅および培養し、生成された二重標的抗体を分離および精製することにより、目的とする二重標的抗体が得られる。
【００３３】
本発明において、二重標的抗体の発現に用いられる宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。また、通常、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が用いられる。使用可能な宿主細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、細菌および酵母などの周知の真核および原核宿主、スポドプテラ・フルギペルダ９（ＳＦ９）などの昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびマウス細胞などの動物細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３  ｃｅｌｌ）、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０などのアフリカミドリザル細胞、および組織培養されたヒト細胞が挙げられる。
【００３４】
本発明において、二重標的抗体を発現するために極めて多岐に亘る発現宿主／ベクターの組み合わせが使用可能である。真核宿主に適した発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。細菌宿主に使用可能な発現ベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびこれらの誘導体などの細菌プラスミド、ＲＰ４などの一層広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０、λ１１、ＮＭ９８９などの極めて様々なファージラムダ（ｐｈａｇｅ ｌａｍｄａ）誘導体に代表されるファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および繊維状単一鎖ＤＮＡファージなどのその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞において好適な発現ベクターは、２μプラスミドおよびその誘導体である。昆虫細胞において好適なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
【００３５】
組換え発現ベクターの宿主細胞への形質転換には、例えば、ＤＥＡＥ−デキストランを介した形質転換（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム法（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、カチオン脂質を介した形質転換（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）及び感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）などが含まれる。
【００３６】
本発明において、宿主細胞は、適切な培地中で、かつ二重標的抗体の発現および／または分離を許容する条件下で、実験室用または産業用発酵機において小規模あるいは大規模発酵およびシェークフラスコ培養によって培養可能である。培養は、公知の技術を用いて、炭素、窒素供給源および無機塩を含む好適な培養培地において行う。好適な培地は、商業的に入手可能であり、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログなどに記載の成分およびこれらの組成比に応じて作成可能である。
【００３７】
このような培養物から、二重標的抗体は、当業界における公知の方法によって単離可能である。例えば、二重標的抗体は、これに制限されるものではないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿をはじめとする通常の方法によって培養物から単離可能である。さらには、二重標的抗体は、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）、電気泳動、分画（例えば、硫安塩析）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出をはじめとする当業界における公知の様々な方法によって精製可能である。
【００３８】
本発明の組成物は、適切な任意の経路によって特定の分子に投与することができる。本発明の組成物は、任意の適切な手段を用いて、ヒトをはじめとする動物に直接的に（例えば、注射、皮下注入または組織位置への局所的な投与など局所的に）または全身的に（例えば、非経口または経口的に）提供可能である。本発明に係る組成物が、非経口、例えば、静脈、皮下、眼、腹腔、筋肉内、口腔、直腸、膣、眼窩内、大脳内、脊髄内、心室内、鞘内、槽内、嚢内、鼻腔内、または噴霧投与によって提供される場合、組成物は、水性または生理適合性である流体懸濁液または溶液を含むことが好ましい。このため、担体または賦形剤は、生理的に許容可能なものとするため、所望の組成物を患者に送達することに加えて、患者の電解質および／または体積バランスに不利な影響を及ぼさないことが求められる。
【００３９】
本発明の二重標的抗体を含有する薬学的組成物は、通常の方法に従い、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、乳化剤、シロップ、エアロゾールなど経口投与用の剤形、滅菌注射溶液、坐剤および経皮投与用製剤に調製して使用可能である。組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。必要に応じて、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製する。
【００４０】
一態様として、本発明の二重標的抗体は、経口投与用固体製剤に調製することができる。経口投与のための固体製剤には、製剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれるが、このような固体製剤は、前記抽出物に少なくとも一種以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して調製される。なお、単なる賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用可能である。
【００４１】
他の態様として、本発明の二重標的抗体を含有する薬学的組成物を経口投与用液体製剤に調製することもできる。経口投与のための液体製剤としては、懸濁剤、耐溶液剤、乳化剤、シロップ剤などが挙げられるが、このような液体製剤には、通常的に用いられる不活性希釈剤（例えば、精製水、エタノール、液状パラフィン）の他に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。
【００４２】
さらに他の態様として、本発明の二重標的抗体を含有する薬学的組成物は、非経口、好ましくは、腹腔内投与のための製剤に調製することもできる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳化剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。滅菌された水溶液としては、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンガー溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝された塩水などの適切な緩衝溶液が使用可能であり、非水性溶剤の懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油脂、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどが使用可能である。必要に応じて、防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、浸透圧の調節のための塩および／または緩衝剤を用いることもできる。一方、坐剤の場合には、通常の基剤であるウィテップゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用可能である。
【００４３】
本発明の二重標的抗体としては、本発明の一実施形態に従って得られたＤＩＧ ０００１が最も好ましい。
【００４４】
本発明の二重標的抗体ＤＩＧ ０００１は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７号に開示されたＴＴＡＣ０００１に基づいて、特定のリンカーを介してＴｉｅ−２と結合するＡｎｇ２の結合ドメインをこの抗体の軽鎖アミノ末端部位に融合させることにより完成した（実施例１および２）。
【００４５】
このようにして完成された二重標的抗体ＤＩＧ ０００１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより同定し、より詳細な研究のために、プロテインＡ親和性カラム、ＳＰ−セファロースカラム、およびサイズ排除カラムを用いた液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）を用いて純度９５％以上に精製された抗体のみを確保した（実施例３）。
【００４６】
このようにして精製された二重標的抗体ＤＩＧ ０００１は、ＥＬＩＳＡを用いた結合アッセイを通じてＶＥＧＦＲ−２Ｄ１〜Ｄ３−ＦｃとＴｉｅ−２−Ｆｃとの結合能を確認し、且つ、ＥＬＩＳＡを用いてＶＥＧＦ１６５およびＡｎｇ２に対する競合アッセイを行うことにより、二重標的抗体としての機能性を確認した（実施例４）。
【００４７】
本発明においては、初代培養したＨＵＶＥＣ細胞に対する細胞生存能アッセイを通じて、ＤＩＧ ０００１二重標的抗体がＶＥＧＦまたはＡｎｇ１のいずれかによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の生存能を阻害し得ることを確認し、且つ、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１が協同して誘導するＨＵＶＥＣ細胞の生存能もまた効果的に阻害し得ることを確認した（実施例５）。
【００４８】
本発明のＤＩＧ ０００１二重標的抗体は、細胞移動アッセイを通じて、ＶＥＧＦとＡｎｇ１のいずれかによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の移動性を阻害し得ることを確認し、且つ、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１が協同して誘導するＨＵＶＥＣ細胞の移動性を効果的に阻害し得ることを確認した（実施例６）。
【００４９】
本発明のＤＩＧ ０００１二重標的抗体は、Ａｎｇ１によって誘導されるＴｉｅ−２のシグナル伝達機序を阻害し、ＶＥＧＦによるＶＥＧＦＲ−２のシグナル伝達機序を阻害し得ることをウエスタンブロッティングにより確認し、且つ、Ａｎｇ１とＶＥＧＦによるシグナル伝達機序を同時に阻害し得ることもウエスタンブロッティングにより確認した（実施例７）。
【００５０】
特に、本発明のＤＩＧ ０００１二重標的抗体を膠芽細胞腫の動物モデルに投与したところ、腫瘍の体積が大幅に減少されていることを確認した（実施例８）。
【００５１】
上記の抗体は、下記に示す方法により製造された。まず、Ｔｉｅ−２に対してアンタゴニストとして作用し得るＡｎｇ２のＴｉｅ−２に対する結合ドメインＤＮＡ配列を、ＰＣＲを通じて増幅した。このとき、増幅されたＤＮＡ断片の３’−末端にはリンカーＤＮＡが含まれるように抗体を設計した。この断片をリンカーＤＮＡの一部を含むＴＴＡＣ０００１の軽鎖ＤＮＡ配列５’−末端にＳＯＥ−ＰＣＲを通じて融合させることにより、ＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２に対して特異的に結合し得る二重標的抗体を完成した。
【００５２】
本発明のＤＩＧ ０００１二重標的抗体は、血管新生を抑制することにより、血管新生関連疾患を治療するのに使用可能である。
【００５３】
本発明において、「血管新生関連疾患」は、癌、老人性黄斑変性、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性炎症を含むが、これらに限定されることはない。
【００５４】
本発明において、前記癌は、胃癌、肝癌、肺癌、甲状腺癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、膵臓癌、直腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌の骨転移癌、卵巣癌および血液癌を含むが、これらに限定されることはない。
【００５５】
本発明の二重標的抗体は、癌患者の治療的措置のために腫瘍の進行、例えば、腫瘍の成長、浸潤、転移および（または）再発を防止、抑制または減少させるのに十分な量で投与可能である。前記目的を達成するための適正量を治療有効量として定義する。前記用途に有効な量は、疾病の重症度および患者自身の免疫系の全体的な状態によるものである。
【００５６】
本発明の好ましい用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは、０．１ｍｇ／ｍ２〜１０ｍｇ／ｍ２である。
【００５７】
しかしながら、最適投与量は、治療する疾患と副作用の存否に応じて異なり、通常の実験により決めることができる。抗体の投与は、周期的な丸剤投入、または外部貯蔵容器（例えば、静脈袋（ｖｅｉｎ  ｂａｇ））または内部貯蔵容器（例えば、生体分解性インプラント）からの連続した静脈または腹腔注射で行うことができる。また、本発明の抗体蛋白質は、多数の異なる生物学的活性分子と共に投与可能である。しかしながら、抗体蛋白質およびその他の分子の最適な組み合わせ、投与方式、投与量は、当業者の技術レベルにおける通常の実験によって決めることができる。
【００５８】
本発明に係る組成物は、当該疾患と関連する他の治療剤と併用または混用することができる。
【００５９】
ヒト腫瘍を含む腫瘍を、本発明の二重標的抗体を化学療法剤、放射線、またはさらなる受容体アンタゴニストまたはこれらの組み合わせと併用して治療する場合、相乗作用が得られる。換言すれば、本発明の二重標的抗体による腫瘍成長の抑制は、化学療法剤、放射線、またはさらなる受容体アンタゴニストまたはこれらの組み合わせと併用する場合に予想以上に増強可能である。相乗作用は、例えば、本発明の二重標的抗体および化学療法剤、放射線、またはさらなる受容体アンタゴニストによる治療の効果から予想されるものより、併用治療法の利用によってさらに大きな腫瘍成長抑制効果が示されることによって例示される。好ましくは、相乗作用は、本発明の二重標的抗体と化学療法剤、放射線、またはさらなる受容体アンタゴニストとの組み合わせを用いた治療からは緩和が期待されない癌の緩和によって裏付けられる。
【００６０】
本発明の二重標的抗体は、化学療法または放射線療法の着手前、これらの療法の着手後、およびこれらの組み合わせ、すなわち、化学療法および／または放射線療法の着手前および着手間、これらの療法の着手前および着手後、これらの療法の着手間および着手後、またはこれらの療法の着手前、着手間、および着手後に投与される。例えば、ＤＩＧ ０００１抗体の場合、一般的に、抗体は、放射線療法および／または化学療法の着手１日から３０日前、好ましくは、３日から２０日前、さらに好ましくは、５日から１２日前に投与される。
【００６１】
このため、本発明の抗体は、当業界における周知の研究、予防または治療方法のために生体内および試験管内において使用可能である。もちろん、当業界における熟練者は本明細書に開示された本発明の原理を変動させることができ、このような変形は本発明の範囲内に含まれるものであることはいうまでもない。
【００６２】
発明の効果
本発明は、血管新生に関わるＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２受容体を同時に中和させることにより、血管新生関連シグナル伝達機序を効果的に抑制し得るヒトモノクローナル抗体由来の二重標的抗体と、前記二重標的抗体を含有する血管新生抑制用および癌治療用組成物を提供する。本発明に係る二重標的抗体は、血管新生に関わる二種類の標的を同時に中和させることにより、既存の単一標的抗体に比べて優れた中和能を示すだけではなく、癌治療にも極めて有効である。なお、相互関連性のある二種類の標的に対して、本発明者によって発明された形態の二重標的抗体を構築することにより、単一標的抗体の措置による実益よりも遥かに優れた効果を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、ｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔベクターに挿入された遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号：６）および機能を示すものである。
【図２】図２は、本発明に係るｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔベクターの構築のための方法を図式化して示すものである。
【図３】図３は、本発明に係るベクターをＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中でランダムに発現させた後、二重標的抗体ＤＩＧ ０００１の産生をウエスタンブロッティングを通じて確認した結果である。
【図４】図４は、本発明に係る高生産性細胞株の確立のために、ＭＴＸ繰り返し処理（７００ｎＭまで）を通じた高生産性クローンの選別結果を示すものである。
【図５】図５は、精製されたＤＩＧ ０００１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示すものである。
【図６】図６は、ＤＩＧ ０００１を用いたＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２−Ｆｃについての競合アッセイをＥＬＩＳＡによって分析した結果を示すものである。
【図７】図７は、本発明に係るＤＩＧ ０００１のＨＵＶＥＣに対する生存性を表す生存率アッセイの結果を示すものである。
【図８】図８は、本発明に係るＤＩＧ ０００１のＨＵＶＥＣに対する移動性を表す移動性アッセイの結果を示すものである。
【図９】図９は、本発明に係るＤＩＧ ０００１のＶＥＧＦによるＶＥＧＦＲ−２およびＥＲＫのリン酸化抑制能と同抗体のＡｎｇ１によるＴｉｅ−２、ＥＲＫ、並びにＡＫＴのリン酸化抑制能をウエスタンブロッティングを通じて確認した結果である。
【図１０】図１０は、本発明に係るＤＩＧ ０００１の膠芽細胞腫マウスモデルにおける腫瘍成長抑制効果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
発明を実施するための最良の態様
以下に掲げる実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨を逸脱しない限り、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは本発明が属する技術分野において通常の知識を持った者にとって自明である。
【実施例】
【００６５】
実施例１：ＤＩＧ ０００１産生用発現ベクターの構築
Ｔｉｅ−２と結合するＡｎｇ２の結合ドメイン関連ＤＮＡをＰＣＲを通じて増幅した。このための鋳型として用いられたＤＮＡは、米国メモリアル・スローン・ケタリング 癌センターのＤｉｍｉｔａｒ  Ｂ．Ｎｉｋｏｌｏｖ博士からヒトＡｎｇ２−ＲＢＤを産生するＨＥＫ２９３細胞株を（Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１３：８２５，２００５）贈与されて、ゲノムＤＮＡを抽出して鋳型として用いた。抽出されたＤＮＡから、Ａｎｇ２結合ドメイン（Ｆ２８１−Ｆ４９６）のみを増幅するために、下記の条件下でＰＣＲを行った：９４℃で４分１回、（９４℃で４５秒／５０℃で４５秒／７２℃で１分）３０回、７２℃で７分１回、４℃で∞。このときに用いられた反応物の組成は、下記の通りである：ＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位を有するプライマー
2015119705.tif 000003
と逆方向プライマー
2015119705.tif 000004
のそれぞれ２μｌ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、鋳型ＤＮＡとしてのゲノムＤＮＡ１μｌ（１００ｎｇ／μｌ）、ポリメラーゼとしてのｉ−Ｍａｘ（商標）II  Ｔａｑ  ２．５  Ｕ（Ｉｎｔｒｏｎ  ＃２５２６１、大韓民国）、１０Ｘバッファ５μｌ、ｄＮＴＰ２μｌ（それぞれ２．５ｍＭ）、および蒸留水３７．５μｌ。ＰＣＲにより得られた産物は、１％アガロースゲル中で電気泳動に供し、この後、７００ｂｐに達しない微かなバンドをＨｉＹｉｅｌｄ（商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＲＢＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃ＹＤＦ３００、台湾）を用いて単離した。単離したＤＮＡを鋳型として用いて、さらにＰＣＲを行うことにより、リンカーが融合されたＡｎｇ２結合ドメイン断片を得た（「ｍＡｎｇ２」と命名）。このときに用いられたＰＣＲ法は、逆方向プライマーとして
2015119705.tif 000005
を用いた以外は、上述した方法と同様である。
【００６６】
一方、Ａｎｇ２結合ドメインを融合させるＴＴＡＣ０００１の軽鎖部分を下記の条件下でＰＣＲを通じて増幅させた：９４℃で４分１回、（９４℃で３０秒／５０℃で３０秒／７２℃で３０秒）３０回、７２℃で５分１回、４℃で∞。このときに用いられたＰＣＲ反応物の組成は、下記の通りである：リンカーの一部が添加されたプライマー
2015119705.tif 000006
とＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位を含有するプライマー
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のそれぞれ２μｌ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、鋳型ＤＮＡとしてのｐＩｇＧＬＤ−ＴＴＡＣ０００１  Ｌｇｔ  １０ｎｇ（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）、ポリメラーゼとしてのｉ−Ｍａｘ（商標）II  Ｔａｑ  ２．５Ｕ（Ｉｎｔｒｏｎ  ＃２５２６１、大韓民国）、１０Ｘバッファ５μｌ、ｄＮＴＰ２μｌ（それぞれ２．５ｍＭ）、および蒸留水３７．５μｌ。ＰＣＲにより得られた産物は、１％アガロースゲル中で電気泳動に供し、約３５０ｂｐに相当するＴＴＡＣ０００１軽鎖断片をＨｉＹｉｅｌｄ（商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＲＢＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃ＹＤＦ３００、台湾）を用いて単離した（「ＴＴＡＣ０００１  ｌｇｔ」と命名）。
【００６７】
ＰＣＲを通じて得たＡｎｇ２断片部分（ｍＡｎｇ２）とＴＴＡＣ０００１軽鎖部位（ＴＴＡＣ０００１＿ｌｇｔ）のそれぞれを融合させるために、ＳＯＥ−ＰＣＲを行った。このときのＰＣＲ条件は、下記の通りである：９４℃で４分１回、（９４℃で４５秒／５０℃で４５秒／７２℃で１分）３０回、７２℃で７分１回、４℃で∞。また、このときに用いられたＰＣＲ反応物の組成は、下記の通りである：ＢｓｔＸＩ制限酵素認識部位を有するプライマーＦ−ｋｓｗ００１およびＲ−ｋｓｗ００２のそれぞれ２μｌ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）、鋳型ＤＮＡとしてのｍＡｎｇ２およびＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔのそれぞれ１０ｎｇ、ポリメラーゼとしてのｉ−Ｍａｘ（商標）II  Ｔａｑ  ２．５  Ｕ（Ｉｎｔｒｏｎ  ＃２５２６１、大韓民国）、１０Ｘバッファ５μｌ、ｄＮＴＰ２μｌ（それぞれ２．５ｍＭ）、および蒸留水３７．５μｌ。ＰＣＲにより得られた産物は、１％アガロースゲル中で電気泳動に供し、約１ｋｂに相当するｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔ融合ＰＣＲ産物をＨｉＹｉｅｌｄ（商標）Ｇｅｌ／ＰＣＲ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＲＢＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃ＹＤＦ３００、台湾）を用いて単離した（ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔと命名）。分離したＰＣＲ産物は、ＴＯＰｃｌｏｎｅｒ ＴＡクローニングキット（Ｅｎｚｙｍｏｎｉｃｓ ＃ＥＺ１１１、大韓民国）を用いてＴ−ベクターに挿入させた後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してミニプレップおよび制限酵素ＢｓｔＸＩ処理後、約１ｋｂの標的ＤＮＡを含有するベクターに対してＤＮＡ塩基配列を確認するために外注および配列決定した（図１および配列番号：６）。
【００６８】
ＤＩＧ ０００１二重標的抗体の発現のための軽鎖発現ベクターの構築方法は、下記の通りである（図２）。まず、本発明者らが保有しているＴＴＡＣ０００１軽鎖発現ベクターｐＩｇＧＬＤ−ＴＴＡＣ０００１ Ｌｇｔ（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）をＢｓｔＸＩで消化し、ベクターとして使用可能な断片のみを電気泳動により１％アガロースゲルから分離した。また、ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔが挿入されたＴ−ベクターを同様にＢｓｔＸＩで消化し、消化された断片のみを電気泳動により１％アガロースゲルから分離した。この後、分離された両断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ ＃Ｍ００１Ｓ、大韓民国）の存在下で４℃で約１２時間維持して、一つのインタクトなベクターを構築した。構築されたベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ミニプレップ後にＢｓｔＸＩ消化して、構築されたベクターへのｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ ｌｇｔの挿入有無を確認した。確認された組換えベクターは、「ｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ Ｌｇｔ」と命名した。
【００６９】
実施例２：ＤＩＧ ０００１の産生および同定
構築された軽鎖発現ベクターｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ Ｌｇｔと既存の重鎖発現ベクターｐＩｇＧＨＤ−ＴＴＡＣ０００１ Ｈｖｙ（ＰＣＴ／ＫＲ０７／００３０７７）をＣＨＯ−ＤＧ４４（ｄｈｆｒ−欠失ＣＨＯ）細胞に同時形質導入して任意発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いてその発現有無を確認した。形質導入は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１１６６８−０１９、米国）を用いて行い、その方法は製造業者の指示に従った。略述すれば、αＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、大韓民国）入りの６−ウェルプレートに１ウェル当たりに５ｘ１０５個のＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を播種した後、加湿が保たれたＣＯ２（５％）インキュベーターを用いて３７℃で２４時間維持することにより、細胞密度が８０〜９０％程度になるように稠密に培養した。組換えベクター３μｇ（ｐＩｇＧＨＤ−ＴＴＡＣ０００１  ＨｖｙとｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１ Ｌｇｔのそれぞれ１．５μｇずつ）と６μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００をそれぞれ２５０μｌの無血清αＭＥＭ培地に希釈して、室温で５分間維持した。ＤＮＡ希釈液とｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００希釈液とを混ぜ合わせて室温で２０分間反応させて、ＤＮＡ−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００複合体を形成した。培養された細胞から既存の培地を除去した後、ＤＮＡ−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００複合体５００μｌと無血清αＭＥＭ培地５００μｌを各ウェルに付加して、３７℃で６時間ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。透析されたウシ胎児血清を２０％含むαＭＥＭ培地１ｍｌを追加して４８〜７２時間培養した後、その上澄み液だけを分離して抗体の発現有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングを用いて確認した（図３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングは、当業界における通常の方法に従い行い、用いられた試料は、下記の通りである：１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ０００１０、米国）、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ）抗体、およびＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）。
【００７０】
実施例３：ＤＩＧ ０００１産生のための細胞株確立ならびに抗体の分離および精製
ＣＨＯ−ＤＧ４４（ｄｈｆｒ−欠失ＣＨＯ）細胞を用いてＤＩＧ ０００１産生細胞株を構築した。組換え抗体発現ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株を確立するための形質導入過程は、上述の通りである。形質導入されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（ｄｈｆｒ−陽性）の選別のために、ヒポキサンチンおよびチミジンが除去されたαＭＥＭ培地を使用し、選別マーカーとして、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）と４００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて、形質導入されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を一次的に選別した。組換え抗体が発現されるモノクローナルコロニーを得るために、一次的に選別された細胞を１０細胞／ｍｌの密度に希釈して９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、米国）に播種して２週間培養し、単細胞から分化した単一コロニーを分離して母細胞クローンを確立した。高発現細胞株を得るために様々な濃度（４０ｎＭ、８０ｎＭ、１６０ｎＭ、３２０ｎＭ、７００ｎＭ）のメトトレキセート（ＭＴＸ）が添加された培地で母細胞クローンを段階的に３〜５回継代培養し、発現の度合いはＥＬＩＳＡを用いて確認した。このために、９６−ウェルプレートに１次抗体として、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）を１００μｌずつ添加し、４℃で１２時間維持することによりコーティングを終えた。この後、各ウェル中に残留している溶液を捨てた後、１ｘＰＢＳに２％脱脂乳を含有するブロッキング液を２００μｌずつ添加し、３７℃で１時間維持した。１ｘＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する洗浄緩衝液で各ウェルを３回繰り返し洗浄した後、抗体発現ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株から得た細胞培養液１００μｌずつを添加して室温で１時間反応させた。さらに洗浄緩衝液で各ウェルを３回繰り返し洗浄した後、２次抗体としてのＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧ（κ）を洗浄緩衝液に１：５、０００の割合にて希釈して１００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。さらに洗浄緩衝液で各ウェルを３回繰り返し洗浄した後、ＴＭＢ基質液（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を１００μｌずつ添加し、５〜１０分間反応させた後、２Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液を５０μｌずつ添加して発色反応を止めた。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて吸光度Ｏ．Ｄ４５０〜６５０ｎｍ値を得た。この方法と同様にして１次抗体としてＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２を使用し、２次抗体としてＨＲＰ共役抗ヒトＩｇＧ（κ）を用いてＥＬＩＳＡを行うことにより、結果を再確認した。最終的に、ＭＴＸ７００ｎＭで高い発現率を示すクローンを高発現細胞株として確立した（図４）。高発現細胞株の培養は、１０％の透析されたウシ胎児血清（ＫＤＲ、大韓民国）、１００単位／ｍｌのペニシリン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）を添加したαＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、大韓民国）を用いて行い、細胞培養は、３７℃のインキュベーターを用いて加湿された５％ＣＯ２混合空気の条件下で行われた。
【００７１】
高発現細胞株の培養から得た二重標的抗体ＤＩＧ ０００１は、一層詳細な研究のために、プロテインＡ親和性カラムおよびＳＰ−セファロースカラムまたはサイズ排除カラムを有するＦＰＬＣを用いて純度９５％以上の精製された抗体のみを確保した（図５）。まず、培養液を遠心分離を通じて細胞塊と培地とに分離し、分離された培地内のＤＩＧ ０００１を、分子量カットオフ値（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）が１０、０００Ｄａ以下であるＵＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を通じて濃縮した。ＵＦ膜を通った培地は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィを用いて１次精製した。その過程を簡略に説明すれば、下記の通りである。２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で安定化された、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有のプロテインＡカラムに、ＵＦ膜を通った培地を入れた後、未結合蛋白質を同じバッファを用いて洗い流し、さらに０．５Ｍ ＮａＣｌ含有の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）バッファ溶液を用いて、非特異的にプロテインＡレジンに結合した蛋白質を洗い流した。プロテインＡに特異的に結合する蛋白質は、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有の０．１Ｍグリシン−Ｃｌ（ｐＨ３．５）バッファを用いて溶出し、１Ｍトリス溶液を用いて試料をｐＨ６．０に中和させた。この後、親和性カラムを通じて分画された試料内に残存するかもしれないＤＮＡ、エンドトキシン、プロテインＡの汚染を防ぐために、陽イオン交換クロマトグラフィを次の手順に従い行った。まず、プロテインＡカラムから溶出された試料は、同じ体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）バッファと混ぜておく。この後、５０ｍＭのＮａＣｌ含有の１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）バッファでＳＰ−セファロース（５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）カラムを安定化させた後、試料を添加して、未結合のＤＮＡ、エンドトキシンなどを洗浄した。レジンに結合された抗体分子は、ｐＨ値、塩勾配（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１Ｍ ＮａＣｌ）を用いて溶出した。最後に、多量体抗体を除去するために、試料を、ＰＢＳで安定化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（１６ｍｍｘ６０ｃｍ、ＧＥヘルスケア）カラムに入れて、サイズ排除クロマトグラフィに供した。上記の精製過程を終えた抗体を用いて細胞分析および生体内分析を行った。
【００７２】
実施例４：ＤＩＧ ０００１の競合アッセイ
二重標的抗体ＤＩＧ ０００１がＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２に関してＶＥＧＦおよびＡｎｇ２と競合可能であるかどうかを調べる競合アッセイをＥＬＩＳＡを用いて行った。このために、９６−ウェルプレートにＶＥＧＦ１６５とＡｎｇ２−ＲＢＤをそれぞれ２００ｎｇずつウェルに分注して室温で一晩中コーティングした後、２％脱脂乳／ＰＢＳを用いて３７℃で２時間反応させた。反応の終わった９６−ウェルプレートをＰＢＳで洗浄した後、室温で１時間予め反応させた混合液グループＡ（１００ｎｇのＦｃが切断された形態のＶＥＧＦＲ−２（ＥＣＤ１−３）に様々な濃度（０〜２５０ｎＭ）のＤＩＧ ０００１を混ぜたもの）をＶＥＧＦ１６５がコーティングされたウェルに入れ、室温で２時間反応させた。この方法と同様にして、Ａｎｇ２−ＲＢＤがコーティングされたウェルには、室温で１時間予め反応させた混合液グループＢ（５００ｎｇのＴｉｅ−２−Ｆｃに様々な濃度（０〜２５０ｎＭ）のＤＩＧ ０００１を混ぜたもの）を入れ、室温で２時間反応させた。２時間の反応が終わった後、ＰＢＳを用いて９６−ウェルプレートの洗浄を行い、ＶＥＧＦ１６５がコーティングされたウェルに対して１次反応抗体として、５μｇ／ｍｌの抗−ＶＥＧＦＲ−２マウス抗体（Ｒｅｌｉａｔｅｃｈ、ドイツ）を添加した後、３７℃で１時間反応させた。Ａｎｇ２−ＲＢＤがコーティングされたウェルに対しても同様に、ＰＢＳを用いて洗浄した後、１次抗体として５μｇ／ｍｌの抗Ｔｉｅ−２マウス抗体（Ａｂｃａｍ、英国）を添加し、３７℃で１時間反応させた。この後、２次抗体として、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、英国）を１：５０００に希釈して、ＶＥＧＦ１６５およびＡｎｇ２−ＲＢＤがコーティングされたウェルの両方に添加し、３７℃で１時間反応させた後、ＴＭＢ基質液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５５２１４、米国）を用いて発色反応を誘導し、２Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液５０μｌずつを添加して発色反応を止めた。発色反応の測定は、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて、吸光度４５０ｎｍと６５０ｎｍにおいて行った（図６）。
【００７３】
実施例５：ＤＩＧ ０００１処理後のＨＵＶＥＣの生存アッセイ
ＤＩＧ ０００１処理後、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ；ＨＵＶＥＣ）の生存率の変化を確認するために、細胞生存率の分析を行った。ＨＵＶＥＣの培養は、２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、ペニシリン１００単位／ｍｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、繊維芽細胞成長因子（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）３ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン５単位／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加したフェノールレッド不含のＭ１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用い、細胞培養は、加湿された５％ＣＯ２混合空気条件の３７℃インキュベーターにおいて培養した。血管内皮細胞の生存率の分析のために、これらの細胞を２４−ウェルプレートに２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で入れ、２４時間培養した。この後、２４−ウェルプレートをＭ１９９培地で２回洗い流した後、１％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）含有のＭ１９９培地中、低い血清濃度条件下で６時間培養した。様々な濃度の抗体で細胞を３０分間前処理した後、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）と１００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）で処理した。４８時間培養後、ＷＳＴ−８（株式会社同仁化学研究所、日本）で２時間処理して、４５０ｎｍ波長における吸光度を測定することにより、各条件下での細胞生存率を比較した（図７）。
【００７４】
実施例６：ＤＩＧ ０００１処理後のＨＵＶＥＣの移動アッセイ
ＤＩＧ ０００１のＨＵＶＥＣに対する移動性（走化性）の抑制を確認するために、細胞移動性の分析を行った。ＨＵＶＥＣの移動性の分析のために、８μｍ孔径のポリカーボネートフィルタートランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を用い、使用前にフィルターの下面を１０μｇゼラチンでコーティングした後、乾燥して用いた。下側のウェルには１％ウシ胎児血清を含むＭ１９９培地に１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと１００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ１を添加した。低い血清濃度で６時間培養した血管内皮細胞をトリプシン処理して分離した後、１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で１％ウシ胎児血清を含むＭ１９９培地に懸濁した。様々な濃度の抗体で３０分間前処理した細胞を上側トランスウェルに１００μｌずつ均一に散布した後、細胞インキュベーターにおいて３７℃で３．５時間培養した。細胞をヘマトキシリン・エオジン（Ｓｉｇｍａ、米国）またはクリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ、米国）で染色し、フィルターの上面についている未移動細胞は、綿棒を用いて除去して、フィルターの下面の移動した細胞のみを残しておいた。デジタルカメラ付き光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＩＸ７１、日本）で１００倍率にて撮像を行い、移動した細胞数を比較し、各条件別に１０個の画像を計数および分析した（図８）。
【００７５】
実施例７：免疫沈降法とウエスタンブロッティング法を用いた、細胞内におけるＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２のリン酸化の阻害の分析
二重標的抗体ＤＩＧ ０００１のＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２に対するリン酸化阻害を確認するために、免疫沈降法とウエスタンブロッティング法を行った。２４時間培養された血管内皮細胞を１％ウシ胎児血清を含むＭ１９９培地の条件下で６時間培養後、２６．７μｇ／ｍｌのＤＩＧ ０００１抗体で３０分間前処理した。この後、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦと１００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ１で１５分間処理した。免疫沈降法を用いた分析を行うために、冷却されたＰＢＳで洗い流し、免疫沈降用緩衝液（１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、および１ｍＭ  フッ化ナトリウム）で５００μｌ処理した。スクラッパーで掻き集めた溶質を２６ゲージの注射器に数回通させて、十分に溶解させた後、１２、０００ｇで１０分間遠心分離して、上澄み液を回収した。３００μｇの溶質に２μｇの抗Ｔｉｅ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）免疫沈降用抗体を添加して８時間以上反応させた後、プロテインＡ／Ｇプラスアガロース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を添加して結合させた。プロテインＡ／Ｇプラスアガロースに結合された免疫複合体を遠心分離し、緩衝液で３〜５回繰り返し洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファを加えて沸騰させた後、遠心分離を通じてアガロース沈殿物を除去した。
【００７６】
ウエスタンブロッティング法を用いた分析のために、溶解緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）、２ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、および１ｍＭ  フッ化ナトリウム）で処理して溶質を得、この溶質を沸騰させた後、４℃で５分間１０、０００ｇで遠心分離して非溶解性沈殿物を除去した。上澄み液をＳＤＳサンプルバッファと混ぜて１０分間沸騰させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングは、当業界における通常の方法に従い行い、用いられた試料は、下記の通りである：１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ０００１０、米国）、Ｔｉｅ−２リン酸化阻害活性の分析のための１次抗体としての抗Ｔｉｅ−２抗体（ａｂｃａｍ、英国）と抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）；抗ｐ４４／４２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）と抗ホスホｐ４４／４２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）；抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）と抗ホスホＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＶＥＧＦＲ−２リン酸化阻害活性の分析のための１次抗体としての抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）と抗ホスホＶＥＧＦＲ−２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）；抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）と抗ホスホＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、そして、化学発光法のために１次抗体と結合する２次抗体としてのＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）およびＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）（図９）。
【００７７】
実施例８：膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）動物モデルにおけるＤＩＧ−０００１による腫瘍成長の抑制
同所移植膠芽細胞腫の成長のために、特定の病原体が除去された雄性Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕマウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）が用いられた。Ｕ−８７ＭＧ膠芽細胞腫（２ｘ１０５ 細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の脳内移植が公知の方法に従い行われた。膠芽細胞腫の脳内移植の翌日に、マウスを２つのグループ（ｎ＝４）に分けて以下の処置を行った：（ａ）ＰＢＳの腹膜内注入、（ｂ）０．５ｍｇ／ｋｇのＤＩＧ−０００１の腹膜内注入。全ての処置は、５回（腫瘍細胞の播種後の１５、１８、２１、２４および２７日目）に亘って行われた。腫瘍細胞の移植後の２９日目にマウスを屠殺し、脳を取り出して冠状に切断した。一つの断片は１０％緩衝ホルマリンで固定し、ホルマリンで包埋し、残りの断片はＯＣＴ化合物に包埋した。腫瘍の体積は、最も大きな腫瘍部分を有する断片の体積を測定し、次式を適用することにより計算した：
幅２ ｘ 長さ ｘ ０．５（図１０）。
【００７８】
産業上の利用可能性
本発明の組成物は、血管新生関連疾患、特に、癌を治療するのに利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月22日(2015.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された、二重標的抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
発明の効果
本発明は、血管新生に関わるＶＥＧＦＲ−２およびＴｉｅ−２受容体を同時に中和させることにより、血管新生関連シグナル伝達機序を効果的に抑制し得るヒトモノクローナル抗体由来の二重標的抗体と、前記二重標的抗体を含有する血管新生抑制用および癌治療用組成物を提供する。本発明に係る二重標的抗体は、血管新生に関わる二種類の標的を同時に中和させることにより、既存の単一標的抗体に比べて優れた中和能を示すだけではなく、癌治療にも極めて有効である。なお、相互関連性のある二種類の標的に対して、本発明者によって発明された形態の二重標的抗体を構築することにより、単一標的抗体の措置による実益よりも遥かに優れた効果を期待することができる。
[本発明1001]
抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に水溶性リガンドが融合された、二重標的抗体。
[本発明1002]
前記抗体が、腫瘍細胞、癌間質細胞、腫瘍関連内皮細胞、腫瘍関連内皮前駆細胞、腫瘍関連循環内皮細胞、循環腫瘍細胞および癌幹細胞からなる群より選ばれた細胞で特異的に発現する抗原に対する抗体である、本発明1001の二重標的抗体。
[本発明1003]
前記抗原が、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＦＬＴ３、ｃ−ＦＭＳ／ＣＳＦ１Ｒ、ＲＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＢＣＲ、インテグリンおよびＭＭＰからなる群より選択される、本発明1002の二重標的抗体。
[本発明1004]
前記抗体が、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲに対する中和抗体ＴＴＡＣ０００１である、本発明1001の二重標的抗体。
[本発明1005]
前記水溶性リガンドが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦおよびアンジオポエチンからなる群より選択される、本発明1001の二重標的抗体。
[本発明1006]
前記水溶性リガンドが、アンジオポエチン２のＴｉｅ−２に対する結合ドメインである、本発明1001の二重標的抗体。
[本発明1007]
前記水溶性リガンドが、リンカーを介して前記抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端に融合される、本発明1001の二重標的抗体。
[本発明1008]
本発明1001から本発明1007のいずれかの二重標的抗体をコードする、ＤＮＡ。
[本発明1009]
前記抗体の軽鎖および水溶性リガンドが、配列番号：６に示す塩基配列からなる、本発明1008のＤＮＡ。
[本発明1010]
本発明1008のＤＮＡを含む、組換え発現ベクター。
[本発明1011]
図２に示す切断地図を有するｐＩｇＧＬＤ−ｍＡｎｇ２−ＴＴＡＣ０００１  Ｌｇｔを含む、本発明1010の組換え発現ベクター。
[本発明1012]
本発明1010の組換え発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
[本発明1013]
本発明1012の宿主細胞を培養する段階；および
前記宿主細胞の培養液から二重標的抗体を単離する段階
を含む、二重標的抗体を製造する方法。
[本発明1014]
二重標的抗体が、プロテインＡ親和性カラム、ＳＰ−セファロースカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィによる高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）を用いてさらに精製される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
本発明1001から本発明1007のいずれかの二重標的抗体を含む、薬学的組成物。
[本発明1016]
血管新生関連疾患の治療に用いられる、本発明1015の薬学的組成物。
[本発明1017]
血管新生関連疾患が、癌、老人性黄斑変性、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬および慢性炎症からなる群より選択される、本発明1016の薬学的組成物。
[本発明1018]
癌が、胃癌、肝癌、肺癌、甲状腺癌、乳癌、子宮頸部癌、大腸癌、膵臓癌、直腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌の骨転移癌、卵巣癌および血液癌からなる群より選択される、本発明1017の薬学的組成物。