(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的なセラミド生産方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド；特定のアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるか、または特定のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド；および特定のアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるか、または特定のアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群より選択されるポリペプチドと複合体を形成し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性の発現を強化させることによる、スターメレラ・ボンビコーラにおけるセラミド生産性の向上させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スターメレラ・ボンビコーラにおいて、以下の（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現を強化することを特徴とする、スターメレラ・ボンビコーラにおけるセラミド生産性向上方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；および
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドが、配列番号２の１６３位、またはそれらに相当する位置にシステイン残基を有する請求項１記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項３】
前記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドが、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する請求項１又は２記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項４】
前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドと、前記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドとを発現強化する、請求項１〜３のいずれか１項記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項５】
前記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現の強化が、前記スターメレラ・ボンビコーラにおいて、該（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させることである、請求項１〜４のいずれか１項記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項６】
前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子と、前記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させる、請求項５記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項７】
配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子と、配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を増加させる、請求項５又は６記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項８】
ＧＡＰＤＨ、ＰＨＯ、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、又はＴＥＦ１のプロモーターのいずれか１以上と連結された前記遺伝子を含むベクターまたは該遺伝子の断片を、前記スターメレラ・ボンビコーラに導入する、請求項５〜７のいずれか１項記載のセラミド生産性向上方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法でセラミド生産性を向上させたスターメレラ・ボンビコーラを用いることを特徴とするセラミド製造方法。
【請求項１０】
セラミドがセラミドＮＰまたはセラミドＡＰである請求項９記載のセラミド製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）におけるセラミド生産性向上方法、および該方法を用いたセラミド製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の最外層には、水分を保持する保湿機能と外部刺激から肌を保護するバリア機能を司る角質層という組織が存在する。角質層は角質細胞と天然保湿因子、そして細胞間脂質等から構成されているが、その中でも特に細胞間脂質の約半分を占めるセラミドが、それらの機能に極めて重要な役割を担っている。セラミドは脂肪酸とスフィンゴイド塩基がアミド結合した化合物群であり、脂肪酸として飽和脂肪酸（Ｎ）、２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）、エステル化−ω−ヒドロキシ脂肪酸（ＥＯ）の３種類、スフィンゴイド塩基としてジヒドロスフィンゴシン（ＤＳ）、スフィンゴシン（Ｓ）、フィトスフィンゴシン（Ｐ）、６−ヒドロキシスフィンゴシン（Ｈ）の４種類があること、それらの組み合わせによって多様な分子種が存在することが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
セラミドは、皮膚からの水分蒸散を防止し、外界からの様々な刺激から人体を守る役割を担っている。加齢等によりセラミドが減少すると、皮膚の保湿機能やバリア機能が低下するが、セラミドやその前駆体を外的に補うことにより、これらの皮膚機能低下を改善させることができる。これまで、加齢やアトピー性皮膚炎、老人性乾皮症においてセラミド量が減少すること（非特許文献２および３）、特に健常な皮膚においてはＮＰタイプ（飽和脂肪酸とフィトスフィンゴシンで構成されるセラミド）とＮＨタイプ（飽和脂肪酸と６−ヒドロキシスフィンゴシンで構成されるセラミド）のセラミドが多いが、皮膚疾患においてこれらのセラミドが大幅に減少すること（非特許文献４）、セラミドを補うことによってバリア機能が回復し（非特許文献５）、メラニン生成が抑制される（非特許文献６）ことが知られている。
【０００４】
近年、セラミドは乾燥敏感肌を伴う皮膚疾患に対する治療薬あるいは化粧品・美容健康食品の素材として大変注目されている。実際、化粧品、食品・サプリメント等として、セラミドを配合した多くの製品がすでに市販されており、さらに、セラミド原料市場規模は拡大傾向が続いている。
【０００５】
これまで、セラミドの多くは動物組織（主に脳または脊髄）または植物体から抽出されていた。しかし、動物組織からの抽出物は、狂牛病の因子であるｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ（ＢＳＥ）の感染の恐れがあることから、近年ではその使用が禁止されている。さらに、上記動物組織または植物由来のセラミド前駆体は、分離精製が困難なため、化粧品原料として求められる純度にするために手間と費用がかかる。そこで近年、酵母による発酵を用いた安価で安全なセラミド前駆体の生産法の開発が進められている（特許文献１）。
【０００６】
サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、ペニシリウム・ノテータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）などのカビ、およびスフィンゴバクテリウム・マルチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ）、デロビブリオ・ストルピー（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｔｏｌｐｉｉ）などのバクテリア等において、セラミドが産生されることが報告されている。しかし、上記微生物によるセラミドまたはセラミド前駆体の産生量は微量である。そのため、変異育種や遺伝子組換え等による上記微生物のセラミドの生産性向上が試みられている（特許文献２）。
【０００７】
セラミドは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応から始まる経路により生合成される。当該縮合反応は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５０）により触媒されている。
【０００８】
真核生物のセリンパルミトイルトランスフェラーゼは、ＬＣＢ１、ＬＣＢ２、ＴＳＣ３などのサブユニットから成る複合体で、ＬＣＢ１、ＬＣＢ２が複合体を形成し、セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応の中心的役割を担い、ＴＳＣ３が酵素活性の調節に寄与することが知られている（非特許文献７および８）。
【０００９】
スターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）は、カンジダ・ボンビコーラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）またはトルロプシス・ボンビコーラ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）とも呼ばれ、ヒルガオ科植物やそれに寄生する昆虫などから分離される酵母である。スターメレラ・ボンビコーラは、バイオサーファクタントの一種であるソホロリピッドを著量生産することが知られている（非特許文献９）が、セラミドやその前駆体を生産することは知られておらず、またセラミド生合成に関わる遺伝子群も明らかにされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６１９４１９６号
【特許文献２】特許第４７３７５３１号
【００１１】
【非特許文献１】J. Lipid. Res., 49:1466-1476 (2008)
【非特許文献２】J. Invest. Dermatol., 96:523-526 (1991)
【非特許文献３】Arch. Dermatol. Res., 283:219-223 (1991)
【非特許文献４】J. Invest. Dermatol., 130:2511-2514 (2010)
【非特許文献５】J. Invest. Dermatol., 106:1096-1101 (1996)
【非特許文献６】Cell. Signal., 14:779-785 (2002)
【非特許文献７】Biochim. Biophys. Acta, 1632:16-30 (2003)
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 275(11):7597-7603 (2000)
【非特許文献９】Appl. Microbiol. Biotechnol., 38:6-11 (1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、スターメレラ・ボンビコーラにおいてセラミドの生産性を向上させる方法、および該方法によりセラミドの生産性が向上した該微生物を用いたセラミド製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、スターメレラ・ボンビコーラが、従来セラミドやその前駆体を生産することが知られていなかった微生物であるが、その能力を有することを見出し、さらにセリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現を強化することにより、セラミドを高生産する能力が向上することを見出した。
【００１４】
すなわち本発明は、スターメレラ・ボンビコーラにおいて、以下の（Ａ）〜（Ｆ）より選択されるポリペプチドの発現を強化することを特徴とする、スターメレラ・ボンビコーラにおけるセラミド生産性向上方法を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；および
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド
さらに、本発明は、上記方法でセラミド生産性を向上させたスターメレラ・ボンビコーラを用いることを特徴とするセラミド製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、スターメレラ・ボンビコーラのセラミド生産性を向上させることができる。また、該セラミド生産性が向上したスターメレラ・ボンビコーラを用いることにより、セラミドを効率的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 1985, 227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を２として解析を行うことにより算出される。
【００１７】
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」としては、１〜２００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個、さらにより好ましくは１〜１０個、なお好ましくは１〜５個、なおさらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
また本明細書において、「１〜複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」としては、１〜８００個、好ましくは１〜４００個、より好ましくは１〜２００個、さらに好ましくは１〜１００個、さらにより好ましくは１〜５０個、なお好ましくは１〜２０個、なおさらに好ましくは１〜１０個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、上記「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列（配列番号２または４で示されるアミノ酸配列）と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００１９】
本明細書において、ポリペプチドまたは遺伝子の「発現強化」または「発現量の増加」とは、当該強化または増加前に比較して、目的のポリペプチドまたは遺伝子の発現を強くすること、または発現量を増加させることを意味する。
【００２０】
本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。本明細書における「セリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット」とは、複数のサブユニットが複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現する限りにおいて、全長タンパク質、またはその部分ポリペプチドを含み得る。
【００２１】
本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性」とは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応を触媒する活性であり得る。また本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質またはポリペプチド」とは、Ｌ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応によるセラミド前駆体（例えば３−ケトスフィンガニン、スフィンガニンなど）の生産を触媒するタンパク質またはポリペプチド、あるいは複数のタンパク質またはポリペプチドからなる複合体であり得る。タンパク質、ポリペプチドまたはこれらの複合体のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性は、それらにより生成されるセラミド前駆体を測定することで決定することができる。例えば、一定の条件においてＬ−セリンと、パルミトイル−ＣｏＡと、あるタンパク質との存在下で生成されるセラミド前駆体（例えば３−ケトスフィンガニン、スフィンガニンなど）を測定することにより、当該タンパク質がセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有すると判断できる。
生成されるセラミド前駆体の量は、反応液からセラミド前駆体を抽出し、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどに供することによって測定することができる。また、基質に放射性同位体を使用すれば、生成物の放射性同位体量を定量することによって生成されるセラミド前駆体の量を測定することができる。例えば、細胞培養液からのセラミド前駆体の抽出には、クロロホルム、メタノール、アセトンなどの有機溶媒を使用することができる。
【００２２】
本発明の方法において製造される「セラミド」としては、セラミドＮＰ：飽和脂肪酸（Ｎ）とフィトスフィンゴシン（Ｐ）から構成されるセラミド、セラミドＡＰ：２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）とフィトスフィンゴシン（Ｐ）から構成されるセラミド、セラミドＥＯＰ：エステル化−ω−ヒドロキシ脂肪酸（ＥＯ）とフィトスフィンゴシン（Ｐ）から構成されるセラミド、セラミドＮＳ：飽和脂肪酸（Ｎ）とスフィンゴシン（Ｓ）から構成されるセラミド、セラミドＡＳ：２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）とスフィンゴシン（Ｓ）から構成されるセラミド、セラミドＥＯＳ：エステル化−ω−ヒドロキシ脂肪酸（ＥＯ）とスフィンゴシン（Ｓ）から構成されるセラミド、セラミドＮＨ：飽和脂肪酸（Ｎ）と６−ヒドロキシスフィンゴシン（Ｈ）から構成されるセラミド、セラミドＡＨ：２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）と６−ヒドロキシスフィンゴシン（Ｈ）から構成されるセラミド、セラミドＥＯＨ：エステル化−ω−ヒドロキシ脂肪酸（ＥＯ）と６−ヒドロキシスフィンゴシン（Ｈ）から構成されるセラミド、セラミドＮＤＳ：飽和脂肪酸（Ｎ）とジヒドロスフィンゴシン（ＤＳ）から構成されるセラミド、セラミドＡＤＳ：２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）とジヒドロスフィンゴシン（ＤＳ）から構成されるセラミド、セラミドＥＯＤＳ：エステル化−ω−ヒドロキシ脂肪酸（ＥＯ）とジヒドロスフィンゴシン（ＤＳ）から構成されるセラミドが挙げられる。
【００２３】
本発明は、スターメレラ・ボンビコーラにおいて、スターメレラ・ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットまたはそれに相当するポリペプチドの発現を強化することによる、当該スターメレラ・ボンビコーラにおけるセラミド生産性を向上させる方法を提供する。
一実施形態において、本発明で発現強化されるスターメレラ・ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ａ）：配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとの配列同一性は低いにもかかわらず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットＬＣＢ１として機能するポリペプチドである。つまり、後述の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成してセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現することができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはスターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、例えばＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）などから取得することができる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｂ）：配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ後述の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、上記（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。
【００２５】
また別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｃ）：配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ後述の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては１００個、好ましくは５０個、より好ましくは２５個、さらに好ましくは１０個であり得る。
【００２６】
好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置のアミノ酸残基はシステインである。上記システイン残基は、上述した公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼＬＣＢ１サブユニットのポリペプチドにおいて高度に保存されているアミノ酸残基である。
【００２７】
さらに別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｄ）：配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。上記配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとの配列同一性は低いにもかかわらず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットＬＣＢ２として機能するポリペプチドである。つまり、前述の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成してセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現することができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、例えばＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）などから取得することができる。
【００２８】
さらにまた別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｅ）：配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、上記（Ｅ）のポリペプチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明で発現強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットとしては、（Ｆ）：配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチドが挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては１１５個、好ましくは５８個、より好ましくは２９個、さらに好ましくは１２個であり得る。
【００３０】
好ましくは、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドは、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する。より好ましくは、当該（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドにおけるピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフは、配列番号４の３８１位から３８８位、またはそれに相当する領域に存在する。当該ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフは、上述した公知のセリンパルミトイルトランスフェラーゼＬＣＢ２サブユニットのポリペプチドにおいて高度に保存されている。
【００３１】
本発明において発現を強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットは、上記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドのいずれか１つを含み得る。すなわち、本発明において発現を強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットは、上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つであってもよく、または上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。
【００３２】
組み合わせの例としては、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つと、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせ；上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つ以上と、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのうちのいずれか１つと上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドのうちのいずれか１つとの組み合わせが好ましい。
【００３３】
本発明において発現を強化されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの好ましい例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現を、スターメレラ・ボンビコーラにおいて強化するためには、当該スターメレラ・ボンビコーラにおける当該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させればよい。該遺伝子の発現量を増加させる方法としては、例えば、高発現制御領域の制御下に配置した当該（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターをスターメレラ・ボンビコーラに導入するか、当該（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子の複数コピーをスターメレラ・ボンビコーラのゲノムに導入するか、または、スターメレラ・ボンビコーラに内在するセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子の発現制御領域を野生型に比較して高発現となる発現制御領域に改変して、該遺伝子の発現を高度に誘導させる方法、さらには上記方法を組み合わせる方法などを挙げることができる。
【００３５】
本発明において発現量を増加させるべき上記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドをコードする遺伝子の例としては、（ａ）：配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、および（ｄ）：配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、および配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子は、それぞれ、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット（ポリペプチド（Ａ））、および配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニット（ポリペプチド（Ｄ））をコードしている。
【００３６】
本発明において発現量を増加させるべき遺伝子の別の例としては、（ｂ）：配列番号１で示される塩基配列と４０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｂ）をコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態において、当該遺伝子（ｂ）は、配列番号１で示される塩基配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる。
【００３７】
本発明において発現量を増加させるべき遺伝子のまた別の例としては、（ｃ）：配列番号１で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｃ）をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては３０５個、好ましくは１５２個、より好ましくは７６個、さらに好ましくは３１個であり得る。
【００３８】
本発明において発現量を増加させるべき遺伝子のさらなる例としては、（ｅ）：配列番号３で示される塩基配列と５０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｅ）をコードする遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子はまた、配列番号３で示される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる。
【００３９】
本発明において発現量を増加させるべき遺伝子のさらなる例としては、（ｆ）：配列番号３で示される塩基配列において１〜複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットの機能を保持するポリペプチド（Ｆ）をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、当該複数個とは、前述で定義したとおりであるが、より具体的な例としては３４６個、好ましくは１７３個、より好ましくは８７個、さらに好ましくは３５個であり得る。
【００４０】
上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子は、好ましくは、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置のアミノ酸残基がシステインであるポリペプチドをコードしている。
上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子は、好ましくは、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有するポリペプチドをコードしている。より好ましくは、当該ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフが配列番号４の３８１位から３８８位、またはそれに相当する領域に存在するポリペプチドをコードしている。
【００４１】
本発明において上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現を強化する場合、上記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される遺伝子のいずれか１つ、または上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子のうちいずれか２つ以上の組み合わせの発現量を増加させればよい。
【００４２】
組み合わせの例としては、上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか２つ以上の組み合わせ；上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つと、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つとの組み合わせ；上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つ以上と、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つ以上との組み合わせ、などが挙げられる。このうち、上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子のうちのいずれか１つと上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のうちのいずれか１つとの組み合わせが好ましい。
【００４３】
本発明において発現量を増加させるべき遺伝子の好ましい例としては、配列番号１で示される塩基配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子、配列番号３で示される塩基配列からなるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４４】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子は、スターメレラ・ボンビコーラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、例えばＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ（ＮＢＲＣ１０２４３）またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）などから、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、上記（ａ）および（ｄ）の遺伝子は、スターメレラ・ボンビコーラの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１または３の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。あるいは、上記（ａ）および（ｄ）の遺伝子は、配列番号２または４で示されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的または化学的に合成することができる。
【００４５】
上記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）の遺伝子は、上記の手順で単離または合成された遺伝子（ａ）または（ｄ）の塩基配列に対して、紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、当該遺伝子は、配列番号１または３で示される塩基配列に公知の方法で突然変異導入し、得られた塩基配列を発現させてセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を調べ、所望のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択することによって、得ることができる。
【００４６】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子）を含むベクターは、当該遺伝子をベクターに導入することによって作製することができる。当該遺伝子を導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、タンパク質の高発現を誘導するプラスミドベクターがより好ましい。当業者は、宿主細胞の種類にあわせて、好適なベクターを選択することができる。タンパク質発現用プラスミドベクターは、宿主に応じて作製してもよいが、市販品を使用してもよい。
【００４７】
上記ベクターにおいては、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）がさらに組み込まれていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、当該制御領域による制御の下に発現し得るように当該遺伝子が配置されていることをいう。当該制御配列の例としては、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターｐＧＡＰＤＨ、酸性ホスファターゼのプロモーターｐＰＨＯ１、ガラクトキナーゼのプロモーターｐＧＡＬ１、アルドース１−エピメラーゼのプロモーターｐＧＡＬ１０、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターｐＡＤＨ１などの、後述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターが挙げられる。上記各プロモーターは酵母由来のプロモーターが好ましく、スターメレラ・ボンビコーラ、ピヒア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）、およびサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のプロモーターがより好ましく、スターメレラ・ボンビコーラ由来のプロモーターがさらに好ましい。
【００４８】
上記宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーターとしては、上述した制御配列の例に挙げたプロモーターｐＧＡＰＤＨ、ｐＰＨＯ１、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１０およびｐＡＤＨ１に加えて、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）のプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）のプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）のプロモーター、翻訳伸長因子（ＴＥＦ１）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ１）のプロモーターなどが挙げられる。上記各プロモーターは酵母由来のプロモーターが好ましく、スターメレラ・ボンビコーラ、ピヒア・シフェリイ、およびサッカロマイセス・セルビシエ由来のプロモーターがより好ましく、スターメレラ・ボンビコーラ由来のプロモーターがさらに好ましい。
【００４９】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子（例えば、上記（ａ）〜（ｆ）の遺伝子）を宿主細胞のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、ＳＯＥ（splicing by overhang extension）−ＰＣＲ法（Gene, 77, 61, 1989）等により調製された当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該遺伝子を含むＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め当該遺伝子を含むＤＮＡ断片と当該プロモーター配列とを作動可能に連結した断片を作製し、当該断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片はまた、当該遺伝子が適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。
【００５０】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子またはそれを含むベクターをスターメレラ・ボンビコーラに導入する手段としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、酢酸リチウム法、熱処理法など、通常使用されるいずれの方法でも用いることができる。
【００５１】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子を内在的に有するスターメレラ・ボンビコーラにおいては、当該遺伝子（例えば、上記（ａ）または（ｄ）の遺伝子）の上流に、野生型または発現強化前に比較して発現量を多くできるプロモーター、例えば上述した宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター、を導入し、該遺伝子と作動可能に連結することにより、当該内在的遺伝子の発現量を増加させることもできる。これに加えて、さらに上述したように、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子を外部から導入してもよい。
【００５２】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増加させ方法の好ましい例としては、上記（ａ）〜（ｃ）として例示した遺伝子または上記（ｄ）〜（ｆ）として例示した遺伝子を上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子と当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を両方とも上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子と当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子のぞれぞれの上流にＧＡＰＤＨプロモーターを連結する方法、当該（ａ）〜（ｃ）の遺伝子を上記ＧＡＰＤＨのプロモーターの下流に連結し、且つ当該（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を上記ＴＤＨ３のプロモーターの下流に連結する方法などにより、これらの遺伝子を過剰発現させるベクターを構築するか、またはこれらの遺伝子が過剰発現するようにゲノムを改変する方法を挙げることができる。遺伝子の種類とプロモーターの組み合わせは、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現が強化できればどのような組み合わせでも良い。また上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子を含むベクターと、上記（ｄ）〜（ｆ）の遺伝子を含む別のベクターは、それぞれ別個に構築してもよく、１つのベクターとして構築してもよい。
【００５３】
上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が適切に導入されたスターメレラ・ボンビコーラは、当該遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子などのマーカー遺伝子を導入すれば、当該マーカー遺伝子の発現を指標として選択することができ、あるいは、当該遺伝子の機能を欠損したスターメレラ・ボンビコーラに当該遺伝子を導入すれば、フィトスフィンゴシンを添加しない培地での生育を指標として選抜することができる。
【００５４】
これらの方法により、スターメレラ・ボンビコーラ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットを発現強化したスターメレラ・ボンビコーラを得ることができる。当該発現強化した株を培養すれば、当該株内でセリンパルミトイルトランスフェラーゼが高発現され、それらの働きでＬ−セリンとパルミトイル−ＣｏＡとの縮合反応が促進されて、セラミドが高生産される。したがって、スターメレラ・ボンビコーラにおいて当該スターメレラ・ボンビコーラ由来セリンパルミトイルトランスフェラーゼサブユニットまたはそれに相当するポリペプチドの発現を強化することによって、該スターメレラ・ボンビコーラにおけるセラミドの生産性を向上させることができる。特に、発現強化前に比較して、セラミドＮＰおよびセラミドＡＰの生産性を向上させることができる。
【００５５】
また、該セラミドの生産性が向上したスターメレラ・ボンビコーラを用いることにより、セラミドを効率的に製造することができる。特に、セラミドＮＰおよびセラミドＡＰを効率的に製造することができる。
【００５６】
上記セラミドの生産性が向上したスターメレラ・ボンビコーラは、一般的な当該株（生産性が向上前の株）の培養条件と同様の条件で培養することができる。生産されたセラミドは、公知の方法で回収した菌体から抽出、精製することにより回収できる。例えば、細胞培養液からのセラミド前駆体の抽出には、クロロホルム、メタノール、アセトンなどの有機溶媒を使用することができる。本発明のセラミドの製造方法は、セラミドの生産性が向上したスターメレラ・ボンビコーラを使用するため、大量の培養およびセラミドの簡便な回収・精製が可能である。さらに、本発明のスターメレラ・ボンビコーラを用いたセラミドの製造方法は、ソホロリピッドとの併産も可能であり、工業的に有利である。
【００５７】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
【００５８】
＜１＞スターメレラ・ボンビコーラにおいて、以下の（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現を強化することを特徴とする、スターメレラ・ボンビコーラにおけるセラミド生産性向上方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と４３％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド；および
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドと複合体を形成しセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性を発現するポリペプチド
【００５９】
＜２＞好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドが、配列番号２の１６３位、またはそれに相当する位置にシステイン残基を有する＜１＞記載のセラミド生産性向上方法。
【００６０】
＜３＞好ましくは、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のポリペプチドが、ピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を有する＜１＞又は＜２＞記載のセラミド生産性向上方法。
【００６１】
＜４＞上記（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらにり好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上、なおより好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、上記（Ｅ）のポリペプチドは配列番号４で示されるアミノ酸配列と、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、なおより好ましくは９８％以上の配列同一性を有する、＜１＞〜＜３＞ののいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６２】
＜５＞好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドと、上記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドとを発現強化する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６３】
＜６＞好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドの発現の強化が、上記スターメレラ・ボンビコーラにおいて、該（Ａ）〜（Ｆ）から選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させることである、＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６４】
＜７＞好ましくは、上記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子と、上記（Ｄ）〜（Ｆ）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させる、＜５＞又は＜６＞記載のセラミド生産性向上方法。
【００６５】
＜８＞好ましくは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子と、配列番号３で示される塩基配列からなる遺伝子の発現量を増加させる、＜５＞〜＜７＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６６】
＜９＞好ましくは、ＧＡＰＤＨ、ＰＨＯ、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、又はＴＥＦ１のプロモーターのいずれか１以上と連結された上記遺伝子を含むベクターまたは該遺伝子の断片を、上記スターメレラ・ボンビコーラに導入する、＜６＞〜＜８＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６７】
＜１０＞好ましくは、ＧＡＰＤＨのプロモーターと連結された上記遺伝子を含むベクターまたは該遺伝子の断片を、上記スターメレラ・ボンビコーラに導入する、＜６＞〜＜９＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６８】
＜１１＞好ましくは、セラミドがセラミドＮＰまたはセラミドＡＰである＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００６９】
＜１２＞好ましくは、上記スターメレラ・ボンビコーラがＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３またはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株である、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の項記載のセラミド生産性向上方法。
【００７０】
＜１３＞好ましくは、セラミドの生産がソホロリピッドとの併産である、＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載のセラミド生産性向上方法。
【００７１】
＜１４＞＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の方法でセラミド生産性を向上させたスターメレラ・ボンビコーラを用いることを特徴とするセラミド製造方法。
【００７２】
＜１５＞好ましくは、セラミドがセラミドＮＰまたはセラミドＡＰである＜１４＞記載のセラミド製造方法。
【００７３】
＜１６＞好ましくは、セラミドをソホロリピッドと併産させる、＜１４＞又は＜１５＞記載のセラミド製造方法。
【００７４】
以下、実験例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【実施例】
【００７５】
実施例１  Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ由来セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の探索
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株を、５０ｇ／ＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ（日本ＢＤ製）５ｍＬを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＳＬ培地（１０％（Ｄ）−グルコース、１％尿素、０．５％ＢａｃｔｏTMＹｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１０％パルミチン酸エチル（東京化成工業）、塩酸にてｐＨ５．０となるよう調整）５ｍＬに２％植菌した。培養器は１００ｍＬ容試験管を用い、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養し、菌体を回収した。
回収した菌体のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、方法は添付のプロトコールを一部改変した。すなわち、回収した菌体にＢｕｆｆｅｒ  Ｙ１（１ｍＬ）を添加し、３０℃で３０分振とうする際に、バッファーにザイモリエイス−２０Ｔを１００Ｕ／ｍＬとなるよう添加し、細胞壁を溶解させた。得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡよりＳＭＡＲＴｅｒ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いて、完全長ｃＤＮＡライブラリを合成した。遺伝子発現解析は株式会社ジナリスに委託し、ｃＤＮＡ配列情報、およびアノテーションデータを得た。
【００７６】
遺伝子発現解析により取得した配列を、ＢＬＡＳＴ解析することにより、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの候補遺伝子として２種類の配列を見出した（配列番号１および３）。これらの配列は、それぞれ、配列番号２および４に示すアミノ酸配列をコードすると推定された。配列番号２は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットとして知られるＬＣＢ１と低い配列同一性を示した。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢ１と４２％、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ由来ＬＣＢ１と３５％の同一性であった。一方、配列番号２の配列にＬＣＢ１の機能発現に関与するシステイン残基（１６３位）が保存されていることを確認した（Gableら、Journal of Biological Chemistry Vol.277, No.12, pp.10194-10200, 2002）。配列番号４はセリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットとして知られるＬＣＢ２と低い配列同一性を示した。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢ２と５２％、Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ由来ＬＣＢ２と５０％の同一性であった。一方、配列番号４の配列において、ＬＣＢ２の機能発現に関与するピリドキサール−５’−リン酸結合モチーフ（ＧＴ（Ｆ／Ｌ）ＴＫＳＦＧ）を３８１位から３８８位に確認した（Gableら、 Journal of Biological Chemistry Vol.277, No.12, pp.10194-10200, 2002、Tamuraら、Plant Cell Physiology Vol.42, No.11, pp.1274-1281, 2001）。
なお、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＬＣＢの１９１位に相当するアミノ酸残基はバリンであることがセリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性に必要であるとされているが、配列番号２および４に示すアミノ酸配列ではバリンではなくアラニンであった。
さらに、配列番号１示される遺伝子および配列番号３で示される遺伝子は、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株ゲノムにも存在することが分かった。以後の実施例において、配列番号１および配列番号３で示されるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を、それぞれ本発明のＬＣＢ１遺伝子およびＬＣＢ２遺伝子と称する。
【００７７】
実施例２
（１）ウラシル要求性株の取得
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９）を０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％  グルコース、０．０３％ウラシルおよび１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ−Ｕ寒天培地に接種したのち、３０℃で１ヶ月間培養し、得られた菌体を１ｍＬの０．８％食塩水に一白金耳懸濁し、０．６８％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地に１００μＬ塗抹し３０℃で２週間培養した。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得した。
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株および得られたウラシル要求性株を５０ｇ／ＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ（日本ＢＤ製）５ｍＬを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。培養液１ｍＬを５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集めた菌体からＧｅｎとるくんTM（ＴＡＫＡＲＡバイオ）を用い、添付のマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。表１記載のプライマー（配列番号５，６）およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ．ｖｅｒ２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてウラシル生合成に関わるオロチジンでカルボキシラーゼをコードするＵＲＡ３遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物を鋳型としてＵＲＡ３遺伝子の配列をシーケンス解析し、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ９１６８２８）と比較した。その結果、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株はＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＮＢＲＣ１０２４３株のＵＲＡ３遺伝子と同じ配列を有すること、ウラシル要求性株は皆５４位のシステインがチロシンに変異していることが確認された。得られた変異体をＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株として取得した。
【００７８】
【表１】
2015097493.tif 000002
【００７９】
（２）ウラシル要求性株の取得方法
実施例２において、ウラシル要求性株の変異位置が確定されたので、例えば下記の遺伝子組換え手段を用いて容易にウラシル要求性株の調製が可能である。
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａのゲノムをテンプレートとしてＵｒａ３遺伝子を配列番号５、６のプライマーを用いて増幅する。増幅した遺伝子断片を適当なベクターに導入し、５４位のシステインをチロシンに点変異を導入する。点変異を導入したベクターを配列番号５，６のプライマーを用いて増幅し、Ｕｒａ３遺伝子に変異の導入された形質転換断片を得る。Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６を、５ｍＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ形試験管に位置白金耳植菌し、３０度、２５０ｒｐｍで２４時間培養する。得られた培養液を、ＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養する。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄する。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上におき、ピペッティングで懸濁する。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、形質転換用のＤＮＡ溶液を１μｇ加える。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５ｕＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかける。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養する。選択培地には、０．６８％Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２％グルコース、０．０３％ウラシル、および５−フルオロオロチン酸、１．５％Ａｇａｒを含むＳＤ-ＵＦ寒天培地を使用する。生育したコロニーを再度ＳＤ−ＵＦ寒天培地で培養した後、それぞれについてウラシル要求性、５−フルオロオロチン酸耐性を確認し、ウラシル要求性株を取得する。
【００８０】
実施例３  プロモーターの選抜
実施例１の遺伝子発現解析より、高発現プロモーターを探索した。遺伝子発現解析でシーケンスしたリードをアセンブルし、ゲノム配列にマッピングした後、遺伝子発現強度を示すＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）を求めて遺伝子発現量とした。本情報より、ＧＡＰＤＨ、ＰＨＯ、ＧＡＬ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＴＰＩ１、ＴＥＦ１はＬＣＢ１およびＬＣＢ２よりも優位に発現量が高いことが確認され、高発現プロモーターとして有望であると考えられた。
【００８１】
実施例４  ＬＣＢ１またはＬＣＢ２過剰発現株の作製
（１）ＬＣＢ１またはＬＣＢ２欠損用プラスミドの作製
実施例２で得られたＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株ゲノムＤＮＡを鋳型に、表２記載の配列番号７と８および９と１０のプライマーを用いて、本発明のＬＣＢ１遺伝子の上流領域および下流領域を増幅した。同様に、配列番号１３と１４のプライマーおよび配列番号１５と１６のプライマーを用いて、本発明のＬＣＢ２遺伝子の上流領域および下流領域を増幅した。さらに、配列番号１１と１２および１７と１８のプライマーを用いて、当該プライマー領域を含むＵＲＡ３遺伝子領域を増幅した。次に得られたＰＣＲ産物を鋳型にＳＯＥ-ＰＣＲによって本発明のＬＣＢ１遺伝子上流領域とＵＲＡ３遺伝子と該ＬＣＢ１遺伝子下流領域（配列番号７、１０のプライマー）、または本発明のＬＣＢ２遺伝子上流領域とＵＲＡ３遺伝子と該ＬＣＢ２遺伝子下流領域（配列番号１３、１６のプライマー）の組み合わせでＤＮＡを連結させ、ｐＴＡ２ベクターとライゲーションすることによってｐＴＡ２-ｌｃｂ１：：ＵＲＡ３プラスミドおよびｐＴＡ２-ｌｃｂ２：：ＵＲＡ３プラスミドを構築した。さらに、ｐＴＡ２-ｌｃｂ１：：ＵＲＡ３プラスミドを鋳型に表２記載の配列番号７、１０のプライマーを使用してＬＣＢ１遺伝子欠損用カセットを増幅し、またｐＴＡ２-ｌｃｂ２：：ＵＲＡ３プラスミドを鋳型に表２記載の配列番号１３、１６のプライマーを使用してＬＣＢ２遺伝子欠損用カセットを増幅したのち、Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。
【００８２】
【表２】
2015097493.tif 000003
【００８３】
（２）Δｌｃｂ１株およびΔｌｃｂ２株の作製
上記実施例２で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株を、５ｍＬのＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈを含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈ５０ｍＬを含む坂口フラスコに１％植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍでＯＤ６００＝１〜２になるまで培養した。増殖した菌体を３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して集菌した後、氷上で冷やした滅菌水２０ｍＬで２回洗浄した。菌体を氷冷した１ｍＬの１Ｍソルビトール溶液に懸濁し、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てたのち、４００μＬの１Ｍソルビトール溶液を加えて氷上に置き、ピペッティングで懸濁した。この酵母懸濁液を５０μＬずつ分注し、ＬＣＢ１またはＬＣＢ２遺伝子欠損用のＤＮＡ断片を１μｇ加えた。酵母懸濁液を氷冷した０．２ｃｍギャップのチャンバーに移したのち、ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて２５μＦ，３５０Ω、２．５ｋＶのパルスをかけた。氷冷した１Ｍソルビトール入りＹＰＤ  Ｂｒｏｔｈを加えて１．５ｍＬ容チューブに移し、３０℃で２時間振とうした後、５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して菌体を回収し、２００μＬの１Ｍソルビトール溶液に再懸濁して１００μＬずつ選択培地に塗抹し、３０℃で約１週間培養した。選択培地には、０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２％  グルコース、０．０７７％  ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）、２０〜２００μＭ  フィトスフィンゴシン（Ｃｏｓｍｏｆｅｒｍ）、０．０５％  レオドールＯ３２０Ｖ（花王）、および１．５％  Ａｇａｒを含むＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ寒天培地を使用した。生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地および０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２％  グルコース、０．０７７％  ＣＳＭ−ｕｒａ（フナコシ）、および１．５％  Ａｇａｒを含むＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、表２記載の配列番号７と１０または１３と１６のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株、およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ２株として取得した。
【００８４】
（３）ＬＣＢ１またはＬＣＢ２過剰発現用プラスミドの作製
実施例２で得られたＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６株ゲノムＤＮＡを鋳型に、表３記載の配列番号１９と２０のプライマーを用いて、上流および下流領域を含む本発明のＬＣＢ１遺伝子を、配列番号２１と２２のプライマーを用いて、上流および下流領域を含む本発明のＬＣＢ２遺伝子を増幅した。同様に配列番号２３と２４または２５と２６のプライマーを用いてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター領域を増幅した。次に、ＬＣＢ１およびＬＣＢ２を含む遺伝子増幅断片をｐＴＡ２ベクターにライゲーションし、ｐＴＡ２−ＬＣＢ１プラスミドおよびｐＴＡ２−ＬＣＢ２プラスミドを構築した。さらに、ｐＴＡ２−ＬＣＢ１プラスミドには配列番号２７と２８のプライマー、ｐＴＡ２−ＬＣＢ２プラスミドには配列番号２９と３０のプライマーで、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いて変異導入することにより各遺伝子のＯＲＦ開始点に制限酵素ＮｄｅＩ用サイトを導入した。それぞれの改変プラスミドをＮｄｅＩで切断した後、ＧＡＰＤＨプロモーター領域をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結した。シーケンス解析によってＧＡＰＤＨプロモーター領域が正しく挿入されたプラスミドを選抜し、ｐＴＡ２−ＧＡＰＤＨ−ＬＣＢ１プラスミドおよびｐＴＡ２−ＧＡＰＤＨ−ＬＣＢ２プラスミドとした。それぞれのプラスミドを鋳型に配列番号１９と２０または２１と２２のプライマーを用いてＧＡＰＤＨプロモーターを含むＬＣＢ１遺伝子およびＬＣＢ２遺伝子を増幅し、Ｈｉｇｈ  ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。
【００８５】
【表３】
2015097493.tif 000004
【００８６】
（４）ＬＣＢ１過剰発現株およびＬＣＢ２過剰発現株の作製
上記実施例４（２）で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株お
よびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ２株に対して、実施例４（１）と同
様の方法を用いて、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ１株にはＬＣＢ１過
剰発現用ＤＮＡ断片を、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−Δｌｃｂ２株にはＬＣＢ
２過剰発現用のＤＮＡ断片を形質転換した。選択培地にはＹＰＤ培地を使用し、生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ培地および０．６８％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，２％  グルコース、０．０７７％  ＣＳＭ（フナコシ）、および１．５％  Ａｇａｒを含むＳＤ-ＣＳＭ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ−ＣＳＭ寒天培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、表３記載の配列番号１９と２０または２１と２２のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株、およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ２ＯＥ株として取得した。
【００８７】
（５）ＬＣＢ１過剰発現ＬＣＢ２欠損株の作製
上記実施例４（４）で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株を培養し、実施例４（２）と同様の方法でＬＣＢ２遺伝子欠損用のＤＮＡ断片を形質転換した。選択培地には、ＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ寒天培地を使用した。生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地およびＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ＋ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、表２記載の配列番号１３、１６のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−Δｌｃｂ２株として取得した。
【００８８】
（６）ＬＣＢ１／ＬＣＢ２過剰発現株の作製
上記実施例４（５）で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−Δｌｃｂ２株を培養し、実施例４（１）と同様の方法でＬＣＢ２過剰発現用のＤＮＡ断片
を形質転換した。選択培地にはＹＰＤ培地を使用し、生育したコロニーをＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地およびＳＤ-ｕｒａ寒天培地にレプリカし、３０℃で約１週間培養した後、ＳＤ-ｕｒａ+ＰＨＳ培地のみで生育するコロニーを選抜した。選抜した変異株は、表３記載の配列番号２１、２２のプライマーでＫＯＤ-ＦＸ-Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてコロニーＰＣＲし、増幅される配列長が変化していること、およびシーケンス解析により配列が設計どおりに変異していることを確認したのち、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株として取得した。
【００８９】
実施例５  過剰発現株の遺伝子発現量評価
実施例４で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ２ＯＥ株、およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株、ならびにコントロールとして、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株をＹＰＤ培地（１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、２％  Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）を５ｍＬ含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＳＤ＋Ｕ３００培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．０３％  ウラシル、２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）３０ｍＬに１％植菌した。培養器は５００ｍＬ容ひだ付フラスコを用い、３０℃、２１０ｒｐｍで７２時間培養したのち、菌体を回収した。回収した菌体から、実施例１同様の方法でＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＴｏｔａｌＲＮＡはＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  きｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて逆転写し、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩＩ  Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて定量的ＰＣＲによって遺伝子発現量を解析した。比較対象としてＡＣＴ１遺伝子を選抜し、それとの発現量比を求めた。プライマーはＬＣＢ１遺伝子の発現解析には配列番号３１と３２のプライマー、ＬＣＢ２遺伝子の発現解析には配列番号３３と３４のプライマー、ＡＣＴ１の発現解析には配列番号３５と３６のプライマーを使用した（表４参照）。定量は、先述のプライマーにて増幅される対象領域をｐＴＡ２ベクターに連結したプラスミドを用いて求めた検量線を使用した。Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株の発現量比を１とした場合の結果を表５に示す。この結果より、それぞれの株において設計通りに遺伝子発現が強化されていることが確かめられた。
【００９０】
【表４】
2015097493.tif 000005
【００９１】
【表５】
2015097493.tif 000006
【００９２】
実施例６  過剰発現株のセラミド生産性評価
実施例４で作製したＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株、およびＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ２ＯＥ株、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株、およびコントロールとして、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株をＹＰＤ培地（１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、２％  Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）を５ｍＬ含む１００ｍＬ容試験管に一白金耳植菌し、３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。得られた培養液を、ＳＤ＋Ｕ３００培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．０３％  ウラシル、２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）３０ｍＬに１％植菌した。培養器は５００ｍＬ容ひだ付フラスコを用い、３０℃、２１０ｒｐｍで７２時間培養したのち、菌体を回収し、凍結乾燥にて乾燥させた。
【００９３】
乾燥菌体５０ｍｇを１ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に懸濁したのち、３．７５ｍＬの内部標準を含むクロロホルム：メタノール＝１：２（ｖ／ｖ）溶液を添加し、１５分間ボルテックスした。この時、内部標準としてＮ−Ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（総炭素鎖長３５−ＮＳセラミド）を添加した。次に１．２５ｍＬのクロロホルムを添加して１分間ボルテックスし、さらに１．２５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加して1分間ボルテックスした後、３０００ｒｐｍ、２０℃にて５分間遠心して下層を回収した。回収したクロロホルム層は窒素ガス吹きつけによって乾燥させ、脂質抽出サンプルとした。
【００９４】
各脂質サンプルをメタノール：ＩＰＡ＝１：１の溶液に再懸濁し、ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳ解析に供した。ＨＰＬＣはＡｃｕｒｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）、カラムはＡｃｕｒｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  ２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．×１００ｍｍ（１．７ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた。溶離液Ａには０．１％酢酸および０．０２８％アンモニアを含むアセトニトリル／メタノール／水＝１８／１８／４（ｖ／ｖ／ｖ）、溶離液Ｂには０．１％酢酸および０．０２８％アンモニアを含むＩＰＡを使用した。溶離液のグラジエントは溶離液Ｂ２％→３０％（４０分）→４０％（４０．１分）→５５％（８０分）→６０％（９０分）となるように設定した。質量分析は、ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用し、エレクトロスプレーイオン化法にてイオン化した。内部標準の面積値と比較することにより定量を行った。
【００９５】
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株において、セラミドＮＰ（総炭素数Ｃ４２〜４６）、セラミドＡＰ（総炭素数Ｃ４２〜４６）、セラミドＮＳ（総炭素数Ｃ３４〜３８）及びセラミドＡＳ（総炭素数Ｃ３４〜３６）の生産が初めて確認された。セラミドＮＰとは飽和脂肪酸（Ｎ）とフィトスフィンゴシン（Ｐ）から構成されるセラミドであり、セラミドＡＰとは２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）とフィトスフィンゴシン（Ｐ）から構成されるセラミドであり、セラミドＮＳとは飽和脂肪酸（Ｎ）とスフィンゴシン（Ｓ）から構成されるセラミドであり、セラミドＡＳとは２−ヒドロキシ脂肪酸（Ａ）とスフィンゴシン（Ｓ）から構成されるセラミドである。
Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株における各セラミドの中で、最も特徴的な分子の量を１とした場合の各発現強化株におけるセラミド生産性の相対値を示す（表６）。コントロールとして用いたＳ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株と比較して、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株においてはセラミドＡＰおよびセラミドＡＳの生産量が、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ２ＯＥ株においてはセラミドＮＰおよびセラミドＮＳの生産量が、それぞれ増加していた。さらに、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ  ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株においては、セラミドＡＰおよびセラミドＮＰの生産量が顕著に増加しており、コントロールと比較してそれぞれ５．０倍、２．３倍の生産量であった。
なお、定法により培養液中のソホロリピッドを測定した。ＫＳＭ３６−ｕｒａ３株、ＫＳＭ３６−ＬＣＢ１ＯＥ株、ＫＳＭ３６−ＬＣＢ２ＯＥ株及びＬＣＢ１ＯＥ−ＬＣＢ２ＯＥ株において、ソホロリピッドの生産が確認され、ソホロリピッドとの併産が可能であることが確かめられた。
【００９６】
【表６】
2015097493.tif 000007
【配列表】
2015097493000001.app