(57)【要約】【課題】簡便で効率のよい一本鎖ＤＮＡ合成方法、該方法で調製された一本鎖ＤＮＡが固相上に固定されてなるＤＮＡチップ、及びＤＮＡ合成キットを提供する。【解決手段】本発明の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、鋳型のＲＮＡ鎖を逆転写反応に付し、ＤＮＡ鎖と前記ＲＮＡ鎖との複合体を合成する工程Ｅと、前記複合体を熱処理して前記ＲＮＡ鎖と前記ＤＮＡ鎖とに解離させ、ＲＮａｓｅ処理により前記ＲＮＡ鎖を分解する工程Ｆと、を含むことを特徴とする。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型のＲＮＡ鎖を逆転写反応に付し、ＤＮＡ鎖と前記ＲＮＡ鎖との複合体を合成する工程Ｅと、
前記複合体を熱処理して前記ＲＮＡ鎖と前記ＤＮＡ鎖とに解離させ、ＲＮａｓｅ処理により前記ＲＮＡ鎖を分解する工程Ｆと、
を含むことを特徴とする一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項２】
前記工程Ｆにおいて、ＲＮａｓｅを添加して前記複合体を熱処理に付す請求項１に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項３】
前記工程ＦにおいてＲＮａｓｅＡを用いる請求項１又は２に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項４】
前記工程Ｅの前に、
二本鎖ＤＮＡから標的遺伝子を含む断片を増幅する工程Ｂと、
前記断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する工程Ｃと、
前記プロモーターを付加された断片から、ＲＮＡ鎖を合成する工程Ｄと、
を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項５】
前記工程Ｂ及び前記工程Ｃは同時に行われる請求項４に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項６】
前記プロモーターは、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＳＰ６プロモーターである請求項４又は５に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項７】
前記工程Ｂの前に、
リンパ球から二本鎖ＤＮＡを抽出する工程を有する請求項４〜６のいずれか一項に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製された一本鎖ＤＮＡを固相上に固定する工程を有することを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製された一本鎖ＤＮＡと、固相上に固定された核酸とを接触させて複合体を形成させるハイブリダイズ工程を備えたことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項１０】
一本鎖核酸が固定されているＤＮＡチップを用意する工程を含む、請求項９に記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
逆転写酵素と、逆転写用プライマーと、ＲＮａｓｅと、プロモーター配列を有するマイナス鎖合成用プライマーと、を有することを特徴とする一本鎖ＤＮＡ合成キット。
【請求項１２】
前記プロモーターは、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＳＰ６プロモーターである請求項１１に記載の一本鎖ＤＮＡ合成キット。
【請求項１３】
更に、血液からＤＮＡを抽出するキットを含む請求項１１又は１２に記載の一本鎖ＤＮＡ合成キット。
【請求項１４】
更に、ヒトリンパ球分離キットを含む請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の一本鎖ＤＮＡ合成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖ＤＮＡ合成方法、ＤＮＡチップの製造方法、核酸検出方法、及び一本鎖ＤＮＡ合成キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物において、表現型を決定する遺伝子が塩基配列の多様性を有している場合がある。例えば、ＲＮＡウイルス、特にＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ヒト免疫不全ウイルス）は、フィデリティ（正確性）の低い逆転写酵素を有しているため、非常に変異しやすいウイルスである。そのため、ＨＩＶは、遺伝子変異に伴い、抗ＨＩＶ薬に対する抵抗性を獲得する等、多様な表現型を獲得する。
【０００３】
近年、抗ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）薬として、ＣＣＲ５阻害薬が開発されている。ＨＩＶは、ＣＤ４陽性リンパ球に侵入する際、その細胞膜上にある補体受容体ＣＣＲ５（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ５）又はＣＸＣＲ４（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）に選択的に結合し、細胞内へ侵入する。ＣＣＲ５阻害薬は選択的にＣＣＲ５に結合し、その立体構造を変化させることによりＣＣＲ５指向性ＨＩＶの細胞内への侵入を阻害する。
【０００４】
このように、ＣＣＲ５阻害薬はＣＣＲ５に選択的に結合し、ＣＸＣＲ４には結合しないため、患者は、指向性検査（Ｔｒｏｐｉｓｍ ａｓｓａｙ）を受け、感染ウイルスが、ＣＣＲ５指向性ウイルスであることを確認してからＣＣＲ５阻害薬による治療を受ける必要がある。
【０００５】
指向性検査としては、ジェノタイプ検査及びフェノタイプ検査が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
ジェノタイプ検査は、体内で増殖しているＨＩＶ のｅｎｖ領域の遺伝子解析を行い、得られた塩基配列をデータベースや一定のアルゴリズムと照合して感染ウイルスの指向性を評価する方法である。
フェノタイプ検査は、感染者ウイルス由来のｅｎｖ領域を増幅させ、この増幅した領域の遺伝子を有する感染性ウイルスを再構築し、ＣＣＲ５阻害薬存在下でのＨＩＶ由来のプロテアーゼ活性を測定することにより、感染ウイルスの指向性を評価する方法である。
ここで、ｅｎｖ領域とは、ウイルスを覆う殻となるタンパク質をコードする領域であり、該タンパク質は、宿主細胞表面の受容体に結合し、宿主細胞へウイルスの侵入を可能にする役割を有する。
【０００６】
上述した検査においては、感染者の試料中のＨＩＶ由来のＲＮＡを逆転写反応に付して一本鎖ＤＮＡを合成し、該一本鎖ＤＮＡをその後の解析に用いる場合がある。係る一本鎖ＤＮＡの合成方法としては、例えば、鋳型ＲＮＡを逆転写反応に付した後、アルカリ処理を行って該鋳型ＲＮＡを分解する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０４４７８２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sing, T., Low, A.J., Beerenwinkel, N., Sander, O., Cheung, P.K., Domingues, F.S., Buch, J., Daumer, M., Kaiser, R., Lengauer, T., Harrigan, P.R.,Antivir Ther 12, 1097-1106(2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上述した一本鎖ＤＮＡ合成方法は、ＮａＯＨ等のアルカリ溶液を高温で処理する工程を要し、簡便性の観点から未だ改良の余地がある。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便で効率のよい一本鎖ＤＮＡ合成方法、該方法で調製された一本鎖ＤＮＡが固相上に固定されてなるＤＮＡチップの製造方法、核酸検出方法、及び一本鎖ＤＮＡ合成キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、熱処理工程とＲＮａｓｅ処理工程の所定の組み合わせにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（４）を提供するものである。
【００１２】
（１）本発明の一実施態様における一本鎖ＤＮＡ合成方法は、鋳型のＲＮＡ鎖を逆転写反応に付し、ＤＮＡ鎖と前記ＲＮＡ鎖との複合体を合成する工程Ｅと、
前記複合体を熱処理して前記ＲＮＡ鎖と前記ＤＮＡ鎖とに解離させ、ＲＮａｓｅ処理により前記ＲＮＡ鎖を分解する工程Ｆと、
を含むことを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるＤＮＡチップの製造方法は、先に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製された一本鎖ＤＮＡを固相上に固定する工程を有することを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における核酸検出方法は、先に記載の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製された一本鎖ＤＮＡと、固相上に固定された核酸とを接触させて複合体を形成させるハイブリダイズ工程を備えたことを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における一本鎖ＤＮＡ合成キットは、逆転写酵素と、逆転写用プライマーと、ＲＮａｓｅと、プロモーター配列を有するマイナス鎖合成用プライマーと、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡便で効率のよい一本鎖ＤＮＡ合成方法、該方法で調製された一本鎖ＤＮＡが固相上に固定されてなるＤＮＡチップ、及びＤＮＡ合成キットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一本鎖ＤＮＡ合成方法における工程の一態様を示した図である。
【図２】本発明の一本鎖ＤＮＡ合成方法における工程の一態様を示した図である。
【図３】本発明の一本鎖ＤＮＡ合成方法における工程の一態様を示した図である。
【図４】本発明の一本鎖ＤＮＡ合成方法における工程の一態様を示した図である。
【図５】実施例における電気泳動の結果である。
【図６】実施例における電気泳動の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪一本鎖ＤＮＡ合成方法≫
本発明の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、鋳型のＲＮＡ鎖を逆転写反応に付し、ＤＮＡ鎖と前記ＲＮＡ鎖との複合体を合成する工程Ｅと、
前記複合体を熱処理して前記ＲＮＡ鎖と前記ＤＮＡ鎖とに解離させ、ＲＮａｓｅ処理により前記ＲＮＡ鎖を分解する工程Ｆと、を含む方法である。
以下、本発明の一実施形態による一本鎖ＤＮＡ合成方法について説明する。
【００１６】
［工程Ａ］
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、試料から二本鎖ＤＮＡを抽出する工程Ａを有する。試料としては、例えば血清、リンパ球、喀痰、尿、髄液、胸液、腹水等が挙げられ、一例としてＨＩＶ−１由来の二本鎖ＤＮＡを抽出する観点からはリンパ球が好ましい。
例えば、血清から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。血清試料に緩衝液を加え、５０℃で一昼夜反応させた後、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）で細胞を溶解するとともに、ＲＮａｓｅでＲＮＡを消化する。次いで、タンパク質をプロテイナーゼＫで消化し、抽出液中のタンパク質をフェノール抽出で除去する。残液にエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿として回収する。
また、例えば、リンパ球から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ法でリンパ球分画を得た後に、フェノール・クロロホルム法でＤＮＡを抽出する。赤血球の混入の多い検体は、１０倍量のＴＥ緩衝液を加えて溶血させ、１０，０００回転で１０分間遠心する。この操作を２回行い、ペレット試料とした後にＤＮＡを抽出する。
また、例えば、喀痰から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。  １Ｎ ＮａＯＨを等量の試料に加えて室温で１０分間混和した後、そのまま、あるいは１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４を加えて、１００００回転で１０分間遠心を行う。ＰＢＳで２回洗浄後、得られた残渣を４０〜１００μＬのリゾチーム溶液で溶解する。その後、３７℃で３０分から２時間ほど反応させ、さらにプロテイナーゼＫを２００μｇ／ｍｌの濃度で加えて３７℃で一昼夜反応させる。試料中には細胞や夾雑物を多く含むため、ＤＮＡの抽出はフェノール・クロロホルム法を用いて行うことが好ましい。
また、例えば、尿、髄液、胸液、腹水から二本鎖ＤＮＡを抽出する場合には、以下の方法が挙げられる。遠心操作で細胞成分をペレットにして試料とするか、または何ら濃縮操作をせずに直接ＰＣＲ検体としてもよい。また、一例として赤血球の混入の多い試料は、溶血操作を行うことが好ましい。これら試料からのＤＮＡ抽出法は例えばフェノール・クロロホルム法が用いて行う。
【００１７】
［工程Ｂ］
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、工程Ａに次いで、二本鎖ＤＮＡから標的遺伝子を含む断片を増幅する工程Ｂを有する。核酸増幅反応としては、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００１８】
核酸増幅反応に用いられる試薬は、採用する核酸増幅反応に合わせて適当な核酸増幅反応用試薬を使用することが好ましい。例えば、核酸増幅反応としてＰＣＲを採用する場合には、ＰＣＲを構成する各反応に必要な試薬、即ちｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼが用いられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用い、一例として、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼや、プルーフリーディング（校正）機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらの試薬は市販されており、容易に入手可能である。
【００１９】
鋳型ＤＮＡや核酸増幅に必要な試薬等を含む水性成分は、核酸増幅反応に適した溶液として調製される。例えば、ＰＣＲ反応が良好に進行するように、トリス−塩酸等のバッファーを用いて、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０程度の溶液とする。
【００２０】
本実施形態では、標的遺伝子を含む断片を例えばＰＣＲ反応で増幅可能な一対のプライマーセットが用いられる。
【００２１】
［工程Ｃ］
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、工程Ｂに次いで、前記断片のマイナス鎖にプロモーターを付加する工程Ｃを有する。具体的には、前記断片のプラス鎖の３’末端にハイブリダイズし得る配列の５’末端にプロモーターの配列を付加してなるプライマーを用いて上記核酸増幅反応を行う方法が挙げられる（図１参照）。プロモーターとしては、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター等が挙げられる。
工程Ｂ及び工程Ｃは同時に行われてもよい。即ち、二本鎖ＤＮＡから標的遺伝子を含む断片を増幅する際に、プロモーター配列を有するプライマーを用いて増幅反応を行ってもよい。
【００２２】
［工程Ｄ］
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、工程Ｃに次いで、前記プロモーターを付加された断片から、ＲＮＡ鎖を合成する工程Ｄを有する（図２参照）。ＲＮＡ鎖合成における転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００２３】
［工程Ｅ］
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、工程Ｄに次いで、鋳型のＲＮＡ鎖を逆転写反応に付し、ＤＮＡ鎖と前記ＲＮＡ鎖との複合体を合成する工程Ｅを有する（図３参照）。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。逆転写されたＤＮＡはＲＮＡとの複合体を形成する。
【００２４】
［工程Ｆ］
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法は、前記複合体を熱処理して前記ＲＮＡ鎖と前記ＤＮＡ鎖とに解離させ、ＲＮａｓｅ処理により前記ＲＮＡ鎖を分解する工程Ｆを有する。
ＲＮａｓｅとしては、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＴ２ 、ＲＮａｓｅＵ２ｉ、ＲＮａｓｅＶ１等が挙げられる。一例として汎用性の観点からＲＮａｓｅＡが好ましい。また一例として、安価であることから、ウシ膵臓由来ＲＮａｓｅＡが使用される。
【００２５】
当該工程において、例えばＲＮａｓｅを添加して前記複合体を熱処理に付する（図４参照）。熱処理によりＤＮＡ−ＲＮＡ複合体からＤＮＡとＲＮＡを解離させると同時に、解離したＲＮＡを効率よく分解する観点から、加熱温度としては、例えば６５℃〜１００℃、一例として８０℃〜１００℃、更に一例として９０℃〜９５℃である。処理時間としては、例えば２秒〜１分、一例として２秒〜３０秒、更に一例として２秒〜６秒である。上記ＲＮａｓｅＡは特に耐熱性に優れているため、当該熱処理工程に好適に用いられる。
【００２６】
本実施形態によれば、ＮａＯＨ等のアルカリ溶液を高温で処理する工程を要さずとも、簡便に効率よくＲＮＡ鎖を分解し、一本鎖ＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
≪ＤＮＡチップの製造方法≫
本実施形態のＤＮＡチップの製造方法は、本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製された一本鎖ＤＮＡを固相上に固定する工程を有する。本実施形態によれば、簡便にＤＮＡチップが得られる。
本実施形態により製造されるＤＮＡチップは、一本鎖ＤＮＡを固相上に固定したものである。そのため、検体の核酸が一本鎖である場合には、検体の核酸を添加するのみで容易に発現解析等を行うことができる。
また、検体の核酸がＰＣＲにより増幅されたものである場合、検体の核酸のみを高温処理等により一本鎖にすればよい。
このように、本実施形態により製造されるＤＮＡチップによれば、ハイブリダイゼーションに要する時間を短縮できる。
【００２８】
≪核酸検出方法≫
本実施形態の核酸検出方法は、本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製された一本鎖ＤＮＡと、固相上に固定された核酸とを接触させて複合体を形成させるハイブリダイズ工程を備える。
一本鎖ＤＮＡと、固相上に固定された核酸とを接触させる際、例えば、一本鎖ＤＮＡを９５℃で５分間程度インキュベーションして、熱変性させ、固相上に固定された核酸とハイブリダイズしやすい状態にしておく。
ハイブリダイゼーションは、特に限定されるものではなく、固相上に固定された核酸のＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができる。例えば、高精度に核酸を検出する観点から、ストリンジェントな条件で行う。
ストリンジェントな条件とは、例えば、３０℃程度の温度条件（プローブの配列のＴｍより５℃〜１０℃程低い温度条件）、１Ｍ未満の塩濃度条件等が挙げられる。
ハイブリダイゼーション反応終了後、非特異的にハイブリダイズしたものを除去するために、複合体を洗浄することが好ましい。洗浄方法についても通常の条件下で行うことができる。高精度に核酸を検出する観点から、例えばストリンジェントな条件で行い、一例として、複合体を塩濃度の低い溶液中を振とうさせて数回洗浄する方法が挙げられる。
【００２９】
本実施形態の検出工程としては、例えば、蛍光色素を用いて複合体を検出する工程が挙げられる。
蛍光色素を用いる工程として、一例として、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発するサイバーグリーン、ＳＹＴＯ９等の色素を用いる方法と、蛍光物質を結合させたプローブを用いる方法が挙げられる。蛍光物質としては、例えばＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態において、一本鎖核酸が固定されているＤＮＡチップを用意する工程を含むことが好ましい。簡便で効率がよいという観点から、前記一本鎖核酸は、本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法で調製されたものであることがより好ましい。
即ち、ＤＮＡチップに固定された核酸及び検体の核酸の両方を本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法により合成することにより、より簡便に効率よく核酸を検出することができる。
【００３１】
≪一本鎖ＤＮＡ合成キット≫
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成キットは、上述した本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成方法に好適に用いられるものである。即ち、本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成キットは、逆転写酵素と、逆転写用プライマーと、ＲＮａｓｅと、プロモーター配列を有するマイナス鎖合成用プライマーと、を有する。該プロモーターは、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター等が挙げられ、例えば汎用性の観点からＴ７プロモーターを有する。
本実施形態の一本鎖ＤＮＡ合成キットは、更に血液からＤＮＡを抽出するキットを含んでいてもよく、ヒトリンパ球分離キットを含んでいてもよい。これらのキットを含むことにより、例えば、ＨＩＶ等の感染症検査に好適に用いられる。
【００３２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの抽出］
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にＨＩＶ患者（３６検体）の血液を重層し、室温、１５００ｒｐｍで４０分遠心分離をし、リンパ球層を採取した。
採取したリンパ球に、２％ＦＣＳ（ウシ胎児血清；Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）含有ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）１０ｍＬを加え、室温、１２００ｒｐｍで１０分遠心分離をし、上清を除いた。沈澱を２％ＦＣＳ含有ＰＢＳ５ｍＬに溶解したのち、室温、１０００ｒｐｍで１０分遠心分離をし、上清を除いた。
次いで、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて沈澱からＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した。詳細には、沈澱を２００μＬ  ＰＢＳに懸濁し、２０μＬ  ＱＩＡＧＥＮ  ｐｒｏｔｅａｓｅ及び、２００μＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬを加え、５６℃で１０分インキュベートしリンパ球を溶解した。これに、２００μＬエタノールを加えた後、溶液全量をスピンカラムに移し、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、このカラムに５００μＬ  ＢｕｆｆｅｒＡＷ１を加え、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。更に、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、このカラムに５００μＬ  ＢｕｆｆｅｒＡＷ２を加え、８０００ｒｐｍで１分間遠心した。更に、スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、１４０００ｒｐｍで１分間遠心した。スピンカラムを１．５ｍＬチューブに移した後、このカラムに２００μＬ  ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１分間インキュベートし、８０００ｒｐｍで１分間遠心し、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ溶解液を回収した。
【００３４】
［１ｓｔＰＣＲ］
ＨＩＶ−１のＣ２Ｖ３領域約４２０ｂｐ（７３７７−６９５５）をＰＣＲにより増幅した。反応液を表１に記載の組成となるように調製し、９４℃で１分間保持した後、９４℃１０秒、４８℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを５サイクル行い、９４℃５秒、５２℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを２５サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（１）ｅｎｖ６９５５−Ｆ (２１ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＹＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡ−３’］（配列番号１）
（２）ｅｎｖ７３７７Ｌ−Ｒ (２６ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＴＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＹＡＣＡＡＴＴＡＡＡ−３’］（配列番号２）
【００３５】
【表１】
2015089345.tif 000003
【００３６】
［２ｎｄＰＣＲ］
１ｓｔＰＣＲで得られた反応液１μＬを用いて、ＨＩＶ−１のＣ２Ｖ３領域約３３０ｂｐ（７３３７−７００５）をＰＣＲにより増幅した。２ｎｄＰＣＲ用の反応液を表２に記載の組成となるように調製し、１ｓｔＰＣＲで得られた反応液１μＬを添加し、９４℃で１分間保持した後、９４℃５秒、４８℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを５サイクル行い、９４℃５秒、６０℃１０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを３０サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（３）ｅｎｖ７００５−Ｆ (２０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＴＴＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＣＴＡＧＣＡＧＡ−３’］（配列番号３）
（４）ｅｎｖ７３３７Ｂ−Ｒ (２０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧ−３’］（配列番号４）
（５）ｅｎｖ７３３７Ｅ−Ｒ (２０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＡＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧ−３’］（配列番号５）
【００３７】
【表２】
2015089345.tif 000004
【００３８】
［３ｒｄＰＣＲ］
２ｎｄＰＣＲで得られた反応液５０μＬを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、５０μＬの溶解液を得た。この溶解液を水で１０倍希釈した後、３ｒｄＰＣＲ用の反応液を表３に記載の組成となるように調製し、上記１０倍希釈した溶解液１０μＬを添加し、９４℃で１分間保持した後、９４℃５秒、６０℃１０秒、７２℃１５秒の３ステップＰＣＲを３０サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。（６）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ (３０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡ−３’］（配列番号６）
（７）ｅｎｖ−Ｔ７−Ｒ(４０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴ−３’］（配列番号７）
【００３９】
【表３】
2015089345.tif 000005
【００４０】
３ｒｄＰＣＲにより、２ｎｄＰＣＲで得られた２本鎖ＤＮＡのマイナス鎖の５’末端にＴ７プロモーターを有する増幅産物が得られた。尚、本実施例においてはＰＣＲを３回に分けているが、まとめて１度に行ってもよい。
【００４１】
［ＲＮＡの合成］
３ｒｄＰＣＲにより得られたＤＮＡからＲｉｂｏＭＡＸ（商標名）Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）を用いて、ＲＮＡを合成した。
先ず表４に記載の組成となるように反応液を調製した後、３７℃で２時間反応させた。
【００４２】
【表４】
2015089345.tif 000006
【００４３】
上記反応後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１μｌ添加し、３７℃３０分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製を行った。
【００４４】
［ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの合成］
上記［ＲＮＡの合成］で得られたＲＮＡを用いて、表５に記載の組成となるように反応液を調製した後、６５℃で５分間保持した後、氷上に２分おいた。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（８）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ (３０ｍｅｒ、２０μＭ)
［配列：５’−ＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡ−３’］（配列番号８）
【００４５】
【表５】
2015089345.tif 000007
【００４６】
次いで、上記反応液に５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒを４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴを１μＬ、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を１μＬ加え、５０℃で１５分反応させた後、５００ｍＭ  ＥＤＴＡを１μＬ加えて反応を停止させＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを合成した。
【００４７】
［一本鎖ＤＮＡの合成１（ＲＮａｓｅ処理）］
上記ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いて、表６に記載の組成となるように反応液を調製した後、９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持した。反応液のうち１０μＬについて、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、反応液中のＲＮＡが分解されていることを確認した。結果を図５に示す。
【００４８】
【表６】
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【００４９】
図５中、左端のレーンから、ＲＮＡのみを泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持した後、泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅＡを加え、３７℃１５分保持した後、泳動したもの；ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅＡを加え、９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持した後、泳動したものを示す。
図５の右端のレーンに示されるように、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドにＲＮａｓｅＡを加え、９４℃で５秒加熱した後、３７℃１５分保持することによりＲＮＡが分解されていることが確認された。
【００５０】
［一本鎖ＤＮＡ（プラス鎖）の確認］
上記［一本鎖ＤＮＡの合成１（ＲＮａｓｅ処理）］で得られた一本鎖核酸がＤＮＡ（プラス鎖）であることを確認するために、表７に記載の組成となるように反応液を調製した後、９４℃で１分間保持した後、９４℃５秒、６０℃１０秒、７２℃１５秒の３ステップＰＣＲを１サイクル行い、７２℃で１分間保持した後、４℃で冷却した。反応液のうち２０μＬについて、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図６に示す。
尚、表７中の２μＭ  Ｐｒｉｍｅｒは下記のいずれかの配列を示す。
（９）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ (３０ｍｅｒ、２μＭ)
［配列：５’−ＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＡ−３’］（配列番号９）
（１０）ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｒ(３１ｍｅｒ、２μＭ)
［配列：５’−ＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴ−３’］（配列番号１０）
【００５１】
【表７】
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【００５２】
図６中、左端のレーンから、ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡのみを泳動した未処理のもの（図６中、未処理と表記）；２μＭ  Ｐｒｉｍｅｒに替えて水を加えた反応産物を泳動したもの（図６中、なしと表記）；プライマー（ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｆ）を加えた反応産物を泳動したもの（図６中、（＋）と表記）；プライマー（ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｒ）を加えた反応産物を泳動したもの（図６中、（−）と表記）を示す。
図６の右端のレーンに示されるように、プライマー（ｅｎｖ−ｂｒｉｄｇｅ−Ｒ）を加えた反応産物からバンドが検出されたことから、［一本鎖ＤＮＡの合成１（ＲＮａｓｅ処理）］で得られた一本鎖核酸がＤＮＡ（プラス鎖）であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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