(57)【要約】【課題】５−アミノレブリン酸生産微生物を用いて５−アミノレブリン酸又はその塩を高い濃度でかつ安定的に製造する方法の提供。【解決手段】特定濃度の特定の硫黄分を含む培地を用いて５−アミノレブリン酸生産微生物を培養して得られた菌体を用いて発酵生産することを特徴とする５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸類を０．５〜１．９ｍＭと含硫アミノ酸を０．１〜１．０ｍＭを含有する培地により５−アミノレブリン酸生産微生物を培養して得られた菌体を用いて５−アミノレブリン酸を発酵生産することを特徴とする、５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
【請求項２】
５−アミノレブリン酸生産微生物が光合成細菌である、請求項１記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
【請求項３】
５−アミノレブリン酸生産微生物がＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属の微生物である、請求項１又は２記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
【請求項４】
５−アミノレブリン酸生産微生物がロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２０）である、請求項１〜３のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−アミノレブリン酸生産微生物を用いて高い濃度で安定的に５−アミノレブリン酸又はその塩を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−アミノレブリン酸は、テトラピロール化合物（ビタミンＢ12、ヘム、クロロフィルなど）を生合成する色素生合成経路の代謝中間体として広く生物圈に存在し、生体内で重要な役割を果たしている。５−アミノレブリン酸は、生体系中で、グリシンとスクシニルＣｏＡから５−アミノレブリン酸合成酵素によって、又はグルタミン酸からグルタミルｔＲＮＡを経て生合成され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼに続く代謝によりヘムやクロロフィルなどのポルフィリン化合物に変換される。この５−アミノレブリン酸又はその塩は分解性が高く、環境への残留性もないため多くの産業への応用が期待されている（特許文献１、２）。
【０００３】
５−アミノレブリン酸又はその塩の生産方法については、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物を用いる方法は、他の微生物を用いる方法に比べ生産量が多いものとして提案された（特許文献３）。しかし、この方法で用いるロドバクター属の微生物は、著量な色素合成には光照射を必要とする光合成細菌であり、色素の前駆体である５−アミノレブリン酸の生産においても十分な光の照射が求められる。この光照射により高コストとなる問題を解決するために、光照射を必要としない条件下での５−アミノレブリン酸の製造を可能とするロドバクター属の微生物の変異株が取得された（特許文献４）。
【０００４】
さらにこれらの変異株を用いて高い収率で５−アミノレブリン酸を産生できる製造法の検討が成され、酸素制限条件として培養液中の溶存酸素濃度を１ｐｐｍ未満とする条件、培養液中の酸化還元電位を−１８０〜５０ｍＶとする条件、菌呼吸速度を５×１０-9からＫｒＭ−２×１０-8〔ｍｏｌ  ｏｆ  Ｏ2／ｍＬ・ｍｉｎ・ｃｅｌｌ〕とする条件が見出された（特許文献５）。また、この酸素制限条件を緩和した条件下でも５−アミノレブリン酸を生産するものとしてロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＣＲ−００７２００９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２０として寄託）も取得され（特許文献６）、さらに酸素条件設定方法に関しても酸素移動容量係数ｋLａ（ｈ-1）を好気条件での微生物の呼吸速度ｑＯ2［（ｇ−Ｏ2  ｃｏｎｓｕｍｅｄ）・（ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ）-1・ｈ-1］で除した値による方法が見出されている（特許文献７）。
【０００５】
しかし、上記のように培養条件については鋭意研究が成されているが、生産性を向上するための培地組成や添加剤については鉄分量が示されているのみであり（特許文献６）、その他の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−５０２８１４号公報
【特許文献２】特開平２−１３８２０１号公報
【特許文献３】特開平６−１４１８７５号公報
【特許文献４】特開平６−１５３９１５号公報
【特許文献５】特開平８−１６８３９１号公報
【特許文献６】特開平１１−４２０８３号公報
【特許文献７】特開２００８−２９２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、種々の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法が検討されているが、微生物発酵による５−アミノレブリン酸の蓄積量が大きく変動することからその収率が低下し、更なる収率の向上が望まれている。本発明は、高い濃度でかつ安定的な５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
５−アミノレブリン酸生産微生物の生育培養条件、特に生育培地の成分について種々の検討を重ねた結果、酵母エキス等の通常の栄養成分に加えて、特定濃度の硫酸類および含硫アミノ酸を含有する培地で生育培養して得られた菌体を用いて５−アミノレブリン酸を発酵生産することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩をこれまでの製造方法よりも高い濃度でかつ安定的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕硫酸類を０．５〜１．９ｍＭと含硫アミノ酸を０．１〜１．０ｍＭを含有する培地により５−アミノレブリン酸生産微生物を培養して得られた菌体を用いて５−アミノレブリン酸を発酵生産することを特徴とする、５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔２〕５−アミノレブリン酸生産微生物が光合成細菌である、〔１〕記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔３〕５−アミノレブリン酸生産微生物がＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属の微生物である、〔１〕又は〔２〕記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔４〕５−アミノレブリン酸生産微生物がロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２０）である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法によれば、特定濃度の硫酸類および含硫アミノ酸を含有する培地で５−アミノレブリン酸生産微生物を生育培養した菌体を用いて５−アミノレブリン酸又はその塩を発酵生産することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩を効率的でかつ安定的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法は、０．５〜１．９ｍＭの硫酸類および０．１〜１．０ｍＭの含硫アミノ酸を含む培地で微生物を生育培養して得られた菌体を用いて５−アミノレブリン酸を発酵生産することを特徴とする。
【００１２】
ここでいう培地中の硫酸類とは、硫酸および硫酸化合物に含まれる硫酸のことをいい、硫酸化合物としては、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウムとその水和物、硫酸マンガンとその水和物、硫酸カルシウムなどが挙げられる。また、水溶液中の亜硫酸イオンは空気中の酸素により酸化されて硫酸イオンに変化することから、硫酸および硫酸化合物の代わりに、これらと等モル濃度の亜硫酸または亜硫酸化合物を添加することもできる。この亜硫酸化合物としては、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸マグネシウムなどが挙げられる。培地成分として窒素源やミネラル分も含有するが、これら成分に硫酸や亜硫酸が含まれる場合は、これらの含有量も合算して硫酸類の濃度とする。
【００１３】
培地中の硫酸類の濃度は、５−アミノレブリン酸の蓄積濃度の点から、０．５〜１．９ｍＭが好ましく、０．８〜１．７ｍＭがより好ましく、１．０〜１．５ｍＭが更に好ましい。また、５−アミノレブリン酸の生産安定性の点から、１．９ｍＭ以下が好ましく、１．７ｍＭ以下がより好ましく、１．５ｍＭ以下が更に好ましい。従って、５−アミノレブリン酸の蓄積濃度及び生産安定性の両者の点から、培地中の硫酸類の濃度は、０．５〜１．７ｍＭが好ましく、０．８〜１．５ｍＭがより好ましく、１．０〜１．５ｍＭが更に好ましい。培地への硫酸類の添加は、培地の調製時に添加しても良いが、培地と別に滅菌処理し、５−アミノレブリン酸生産微生物の生育培養を開始する前に添加することもできる。
培地中の含硫アミノ酸とは、システイン、シスチン、メチオニン、タウリンなど、その分子内に硫黄原子を有するアミノ酸のことを指す。
培地中の含硫アミノ酸の濃度は、５−アミノレブリン酸の蓄積濃度の点から、０．１〜１．０ｍＭが好ましく、０．１〜０．８ｍＭがより好ましく、０．１〜０．３ｍＭが更に好ましい。また、５−アミノレブリン酸の生産安定性の点から、１．０ｍＭ以下が好ましく、０．８ｍＭ以下がより好ましく、０．３ｍＭ以下が更に好ましい。従って、５−アミノレブリン酸の蓄積濃度及び生産安定性の両者の点から、培地中の含硫アミノ酸の濃度は、０．１〜１．０ｍＭが好ましく、０．１〜０．８ｍＭがより好ましく、０．１〜０．３ｍＭが更に好ましい。培地への含硫アミノ酸の添加は、酵母エキスなどの栄養成分に含まれる成分として添加しても良いが、精製したアミノ酸として添加することもできる。
【００１４】
本発明の方法に使用される５−アミノレブリン酸生産微生物は、５−アミノレブリン酸を培地中に蓄積する微生物であればよく、例えば、光合成細菌、大腸菌、酵母、コリネ菌、これら微生物の遺伝子組換え体などが挙げられる。特に、光合成細菌が好ましく、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属の微生物、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の微生物が挙げられ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属の微生物が好ましく、更にロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）又はその変異株が好ましく、特には、ロドバクター  スフェロイデス  ＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２０として寄託された微生物が好ましい。
【００１５】
本発明に用いられる培地は、前記成分の他、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）及びＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ）から選ばれる１種以上を含有するのが好ましい。これらの成分のうち、酵母エキス及び乾燥酵母から選ばれる１種以上、特に酵母エキスが好ましい。その含有量は合計で１ｇ／Ｌ以上であるが、より好ましい含有量は１〜２０ｇ／Ｌ、特に好ましくは５〜１０ｇ／Ｌである。
【００１６】
さらに、本発明の方法で培養が行われる培地は、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有するのが好ましい。炭素源としては、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、乳酸、コハク酸等の酸類などを用いることができる。また、窒素源としては、アンモニア、硫安、塩安、リン安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素、ポリペプトン、酵母エキス等の有機態窒素化合物などを用いることができる。
また、本発明の製造方法で用いる培地には、さらに、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン等のアミノ酸等を適宜添加することができる。
【００１７】
本発明においては、さらに、無機塩類等の微量成分、特には、リン化合物、マンガン化合物及び鉄化合物を含有する混合物を１００℃以上で加熱又は０．１ＭＰａ以上で加圧して得られたものを培地に添加するのが、５−アミノレブリン酸の生産性を向上させる点で好ましい。リン化合物としては、リン元素を含むものであればよく、好ましくは、リン酸、リン酸塩、ピロリン酸等が挙げられる。より具体的には、リン酸カルシウム（例えば、Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2、Ｃａ3（ＰＯ4）2）、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸鉄、リン酸マンガンが挙げられ、特に好ましくは、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二アンモニウムが挙げられる。
【００１８】
マンガン化合物としては、マンガン元素を含むものであればよく、好ましくは、有機栄養源に含まれるマンガン元素、酸のマンガン塩、マンガンハロゲン化物等が挙げられ、より具体的には、Ｍｎ含有酵母エキス、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物、塩化マンガン、硝酸マンガン、炭酸マンガン、二酸化マンガンが挙げられ、特に好ましくは、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物が挙げられる。
【００１９】
鉄化合物としては、鉄元素を含むものであればよく、好ましくは、酸の鉄塩、鉄のハロゲン化物、硫化鉄等が挙げられ、より具体的には、ＥＤＴＡ−鉄、塩化鉄（ＩＩ）又はその水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）又はその水和物、硫化鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、酢酸鉄、臭化鉄、乳酸鉄、硝酸鉄、硫酸鉄、リン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、シュウ酸鉄、シュウ酸鉄アンモニウムが挙げられ、特に好ましくは、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）が挙げられる。
加熱又は加圧する混合物には、媒体を用いてもよく、その媒体としては、実質的に培地成分を含有しない液体が挙げられ、好ましくは、水である。
【００２０】
上記混合物の加熱は、１００℃以上で行われるが、加熱温度は、１１０〜１３０℃が好ましい。また、上記混合物の加圧は、０．１ＭＰａ以上で行われるが、加圧圧力は、０．１３〜０．２０ＭＰａとすることが好ましい。上記混合物は、加熱し、かつ加圧するのが好ましい。このような加熱及び加圧は、リン化合物、マンガン化合物、及び鉄化合物を混合した後に行う必要があり、混合前に行った場合、優れた５−アミノレブリン酸生産微生物の増殖促進効果や、５−アミノレブリン酸生産能や酸化酵素活性といった微生物の活性を十分に向上させる効果が得られない。加熱又は加圧の時間は、１０〜３０分が好ましい。
【００２１】
また本発明の製造方法では、菌体が十分に生育した段階で５−アミノレブリン酸発酵生産を行うが、この時点でグリシン、Ｌ−グルタミン酸、糖類、有機酸などの５−アミノレブリン酸の原料やレブリン酸などの５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの阻害剤を添加して５−アミノレブリン酸の生産性を高めることが好ましい。グリシンの添加量は培地全量中の１０〜１０００ｍＭ、特に１０〜４００ｍＭとすることが好ましい。レブリン酸の添加量は培地全量中の０．０１〜２０ｍＭ、特に０．１〜１０ｍＭが好ましい。このグリシンやレブリン酸の過剰な添加は５−アミノレブリン酸の生産性を低下させる場合があるので、そのときは菌体生育時間を延長したり、これら添加剤を数回に分けて添加したりすることにより５−アミノレブリン酸の生産性の低下を回避できる。
【００２２】
培養にあたっての温度、ｐＨは５−アミノレブリン酸生産微生物が生育し、５−アミノレブリン酸を発酵生産する条件でよく、例えば、生育培養の温度は１０〜４０℃、特に２０〜３５℃とするのが好ましく、培地のｐＨは４〜９、特に５〜８とすることが好ましい。なお菌体生育後に５−アミノレブリン酸の生産に適さないｐＨ域に液性が変化した場合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、リン酸等の酸を用いてｐＨを調整した後に、５−アミノレブリン酸の生産を開始することが好ましい。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示の目的で掲げられも
のであって、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（製造例）
２００ｍＬの表１に示す培地を２Ｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間滅菌した後、放冷した。これにロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２０）を植菌後、３２℃、暗所にて２６時間振盪培養した。
得られた培養物を再び、２Ｌ容三角フラスコに２００ｍＬの表１に示す培地を調製したところへ、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．２となるように植菌し、３２℃、暗所にて２４時間撹拌培養した。
【００２４】
【表１】
2015181459.tif 000002
【００２５】
（実施例および比較例）
５００ｍＬ容の三角フラスコに５０ｍＬの表２記載の培地を調製したところへ、製造例で得られた培養物を、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．５となるように植菌し、２８℃、暗所にて撹拌培養した。培養開始２４〜２６時間後に、グリシンを６０ｍＭ、レブリン酸を５ｍＭになるように添加し、硫酸を用いてｐＨを６．４〜６．５に調整した。次いで、この培養液を５本の２０ｍｍφ試験管に５ｍＬずつ分注して、１００ｒｐｍにて往復しんとう培養を行い、培養開始１８時間後に培養を止めた。各試験管における５−アミノレブリン酸蓄積量を表３に示す。
５−アミノレブリン酸の生産性の判定については、５−アミノレブリン酸蓄積量が２０ｍＭを超える場合を良（○）とし、２０ｍＭ未満の場合を不良（×）とした。また、５−アミノレブリン酸の生産安定性の判定については、同一の生育培養条件での５回の繰り返し試験における５−アミノレブリン酸蓄積量のＣＶ値を算出し、ＣＶ値（変動係数）が１０％未満の場合を良（○）とし、１０％以上の場合を不良（×）とした。
【００２６】
【表２】
2015181459.tif 000003
【００２７】
【表３】
2015181459.tif 000004
【００２８】
表２及び表３より、生育培地における硫酸類濃度を０．５〜１．９ｍＭ、含硫アミノ酸濃度を０．１〜１．０ｍＭに調整して５−アミノレブリン酸生産微生物を生育させ、次いで５−アミノレブリン酸の発酵生産を行うと、５−アミノレブリン酸の蓄積量が増大し、かつ５−アミノレブリン酸蓄積量が変動せず安定になることがわかる。特に硫酸濃度が高い場合は５−アミノレブリン酸蓄積量及び生産安定性ともに低下する。