(57)【要約】【課題】細胞小塊を形成する細胞が幹細胞であるか否かを判定する細胞判定方法、細胞判定装置、及び細胞判定プログラムを提供すること。【解決手段】  細胞小塊の光路長画像を取得する取得ステップと、  取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出ステップと、  抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較する比較ステップと、  比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定ステップと、  を備えることを特徴とする細胞判定方法。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞小塊の光路長画像を取得する取得ステップと、
取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出ステップと、
抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較する比較ステップと、
比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定ステップと、
を備えることを特徴とする細胞判定方法。
【請求項２】
前記細胞小塊は、多能性幹細胞コロニーの小塊化物である請求項１に記載の細胞判定方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である請求項２に記載の細胞判定方法。
【請求項４】
前記細胞小塊は、単一細胞である請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞判定方法。
【請求項５】
取得した光路長画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出ステップをさらに備える請求項４に記載の細胞判定方法。
【請求項６】
細胞小塊の光路長画像を取得する取得手段と、
取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出手段と、
抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較する比較手段と、
比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定手段と、
を備えることを特徴とする細胞判定装置。
【請求項７】
取得した光路長画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出手段をさらに備える請求項６に記載の細胞判定装置。
【請求項８】
コンピュータを、
細胞小塊の光路長画像を取得する取得手段、
取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出手段、
抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較する比較手段、
比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定手段、
として機能させるための細胞判定プログラム。
【請求項９】
前記コンピュータを、
取得した光路長画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出手段、
としてさらに機能させることを含む、請求項８に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト由来のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの幹細胞は、多種類の細胞に分化する能力（多能性）を持ち、病気の解明や創薬スクリーニング、毒性試験、再生医療等、これまで困難であったヒト細胞を用いた大規模な薬効評価や医療への応用が可能であることで注目されている。これらの幹細胞から目的の細胞に分化誘導を行う際の分化効率は、出発材料である幹細胞の状態に大きく依存するとされている。つまり幹細胞が多能性を維持し、未分化な状態を保持していないと、分化誘導の効率が低下する。そのためこれらの幹細胞を産業応用するためには、幹細胞の品質を管理することが極めて重要であり、幹細胞をモニタリングし、状態を非侵襲で判定する必要がある。
【０００３】
そして、これらの幹細胞は、数千〜数万個程度の複数の幹細胞が接着（接触）して密集した細胞集団（コロニー）を形成するため、品質の管理もコロニー単位で行われるのが通常である。
【０００４】
例えば、特許文献１は、多数の細胞から構成される細胞コロニーの光路長画像を用いて、前記細胞コロニーの解析を行う細胞解析装置における細胞解析方法であって、前記細胞解析装置の取得手段が、前記細胞コロニーの光路長画像を取得する取得ステップと、前記細胞解析装置の抽出手段が、当該取得した光路長画像中において、前記細胞の細胞核に対応する円形形状を抽出する抽出ステップと、前記細胞解析装置の比較手段が、当該抽出した円形形状に対し、その内側の光路長および外側の光路長を比較する比較ステップと、前記細胞解析装置の解析手段が、当該比較結果に基づき、前記細胞コロニーの解析を行う解析ステップと、を備えることを特徴とする細胞解析方法を開示する。
【０００５】
また、非特許文献１には、分化細胞であるＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、破骨細胞様（ＯＣ）細胞における細胞質領域の平均光路長が核領域の平均光路長よりも低かったのに対し、コロニー中の各ｈｉＰＳ細胞における細胞質領域の平均光路長が核領域の平均光路長よりも大きかったこと、光路長の比（細胞質／核）がｈｉＰＳ細胞と他のタイプの分化細胞を区別するための簡単な指標となり得ること、が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２３１７０９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌ．３，Ｉｓｓｕｅ  ９，ｐｐ．２１７５−２１８３（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１によれば、「光路長」は「屈折率」に「物理的厚さ」を乗じたものであり（光路長＝屈折率×物理的厚さ）、細胞核（細胞核の内側）の屈折率は、一般に、細胞質（細胞核の外側）の屈折率よりも低い（細胞核の内側の屈折率＜細胞核の外側の屈折率）。
【０００９】
そして、コロニーを形成する品質の良い幹細胞は図１２のような形状を有し、隣接する幹細胞の距離が近く、細胞核間の細胞質が厚くなるので、細胞核の内側と外側の物理的厚さがほぼ同じとなり（細胞核の内側の物理的厚さ≒細胞核の外側の物理的厚さ）、光路長については、「細胞核の内側の光路長＜細胞核の外側の光路長」が成立するとされている。
【００１０】
これに対し、コロニーを形成する品質の悪い幹細胞は、隣接する幹細胞の距離が遠く、細胞核間の細胞質が薄くなるので、細胞核の内側の物理的厚さが外側の物理的厚さに比べて遥かに厚くなり（細胞核の内側の物理的厚さ＞＞細胞核の外側の物理的厚さ）、光路長については、「細胞核の内側の光路長＞細胞核の外側の光路長」が成立するとされている。
【００１１】
このように、特許文献１では、「細胞核の内側の光路長＜細胞核の外側の光路長」が成立するか否かは、細胞核の外側の物理的厚さによるとされ、そして、細胞核の外側の物理的厚さは細胞の形状に依存する。
【００１２】
一方、幹細胞を維持するためには、幹細胞コロニーを小塊化し、増殖させる継代が必須である。継代時に幹細胞コロニーの小塊化物の品質を判定して増殖させることが望ましいが、幹細胞コロニーを小塊化する際、幹細胞と他の細胞との接着（接触）が一部又は全部断たれるため、幹細胞コロニーを形成する幹細胞の形状は必ずしも維持されない。例えば、図１はＥＳ細胞コロニーの小塊化物である単一ＥＳ細胞を明視野顕微鏡で観察して取得した画像（明視野画像。単一ＥＳ細胞領域に符号Ｗが付されている）であるが、図１によれば、当該単一ＥＳ細胞の細胞核は偏り、細胞質の厚さも不均一である。
【００１３】
そのため、細胞小塊を形成する幹細胞については、「細胞核の内側の光路長＜細胞核の外側の光路長」は成立しないと考えられていた。
【００１４】
一方、分化細胞の細胞質領域の平均光路長が核領域の平均光路長よりも低いこと、コロニー中の各ｈｉＰＳ細胞における細胞質領域の平均光路長が核領域の平均光路長よりも大きいことは知られていたが（図１３）、上述のとおり、ｈｉＰＳ細胞コロニーを小塊化すると「細胞核の内側の光路長＜細胞核の外側の光路長」は成立しないと予想された。
【００１５】
ところが、本発明者らは、細胞小塊を形成する幹細胞についても、形状によらず「細胞核の内側の光路長＜細胞核の外側の光路長」が成立することを見出し、細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較して、細胞小塊を形成する細胞が幹細胞であるか否かを判定できることに気付いた。
【００１６】
本発明は、この意外な知見に基づくものであり、細胞小塊を形成する細胞が幹細胞であるか否かを判定する細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述の目的を達成する本発明は、細胞小塊の光路長画像を取得する取得ステップと、取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出ステップと、抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較する比較ステップと、比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定ステップと、を備えることを特徴とする細胞判定方法である。
【００１８】
また、本発明は、細胞小塊の光路長画像を取得する取得手段と、取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出手段と、抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較する比較手段と、比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定手段と、を備えることを特徴とする細胞判定装置である。
【００１９】
さらに、本発明は、コンピュータを、細胞小塊の光路長画像を取得する取得手段、取得した光路長画像中の細胞核領域を抽出する抽出手段、抽出した細胞核領域の内側の光路長および外側の光路長を比較する比較手段、比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する判定手段、として機能させるためのプログラムである。
【００２０】
本発明における「細胞小塊」は２００個以下の細胞を含む細胞集団を意味し、「幹細胞」は、複数系統の細胞に分化する能力（多分化能）及び細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を有する細胞を意味する。
【００２１】
また、「光路長」は、「位相差」または「光学厚さ」と同じ意味であり、「屈折率」に「物理的厚さ」を乗じたものである（光路長＝屈折率×物理的厚さ）。そして、「光路長画像」とは光路長が取得可能な画像である。
【００２２】
細胞小塊を形成する幹細胞については、形状によらず「細胞核領域の内側の光路長＜細胞核領域の外側の光路長」が成立するので、本発明により、細胞小塊を形成する細胞についても幹細胞であるか否かを判定することができる。
【００２３】
また、細胞小塊が多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞、のコロニーの小塊化物である場合は、判定の結果に基づいて、その小塊化物、例えば増殖させて多能性幹細胞コロニーとするのに適当なもの、遺伝子クローニングに適当なもの、を選択して使用することができる。
【００２４】
また、細胞小塊は単一細胞であってよい。取得した光路長画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出ステップをさらに備える本発明の細胞判定方法により、単一細胞領域のみを抽出することが可能となる。当該細胞判定方法は、取得した光路長画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出手段をさらに備える本発明の細胞判定装置で行うことができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、細胞小塊を形成する細胞が幹細胞であるか否かを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】単一ＥＳ細胞の明視野画像である。
【図２】単一ＥＳ細胞の定量位相画像である。
【図３】単一ＥＳ細胞の光路長を輝度で表現した三次元プロット画像である。
【図４】抗ｎａｎｏｇ抗体により免疫染色したＥＳ細胞小塊の画像である。
【図５】ＥＳ細胞小塊を形成するＥＳ細胞の光路長のグラフ（図中（Ａ））及びＣＮ比のグラフ（図中（Ｂ））である。
【図６】抗ｎａｎｏｇ抗体により免疫染色した分化細胞小塊の画像である。
【図７】分化細胞小塊を形成する分化細胞の光路長のグラフ（図中（Ａ）及びＣＮ比のグラフ（図中（Ｂ））である。
【図８】サイトメーター１の構成図である。
【図９】細胞判定装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。
【図１０】細胞判定装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【図１１】細胞判定方法のフローチャートである。
【図１２】幹細胞コロニーの幹細胞の定量位相画像である。
【図１３】ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＯＣ細胞及びｈｉＰＳ細胞の明視野画像（図中（Ａ）上欄）及び定量位相画像（図中（Ａ）下欄）、細胞核と細胞質の光路長のグラフ（図中（Ｂ））並びに光路長比（細胞質／核）のグラフ（図中（Ｃ））である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、細胞小塊を形成する幹細胞についても、形状によらず「細胞核領域の内側の光路長＜細胞核領域の外側の光路長」が成立するという意外な知見に基づくものであるので、まず、この知見について説明する。
【００２８】
図２は単一ＥＳ細胞を定量位相顕微鏡で観察して取得した画像（定量位相画像）であり（符号Ｗが付されている）、図３は当該単一ＥＳ細胞の光路長を輝度で表現した三次元プロット画像である。図３の横軸（Ｘ及びＹ方向）はいずれも画素（ピクセル）の個数を表し、そして縦軸（Ｚ方向）は輝度を表す。縦軸の数値が大きいほど輝度が大きく、光路長が小さいことを示す。
【００２９】
図３から、幹細胞コロニーの幹細胞のような形状を有さない単一ＥＳ細胞であっても、「細胞核領域の内側の光路長＜細胞核領域の外側の光路長」が成立することがわかる。
【００３０】
また、図４及び図５から、ＥＳ細胞小塊においては、「細胞核領域の内側の光路長＜細胞核領域の外側の光路長」、すなわち「細胞核領域の外側の光路長／細胞核領域の内側の光路長」（ＣＮ比）が１より大きいということがわかり、図６及び図７から、レチノイン酸でＥＳ細胞から誘導した分化細胞小塊（分化細胞小塊）においては、ＣＮ比が１より小さいことがわかる。
【００３１】
図４は、未分化マーカーである抗ｎａｎｏｇ抗体により免疫染色したＥＳ細胞小塊の画像であり、画像の明るい領域がＥＳ細胞小塊を形成するＥＳ細胞に対応している。そして、図５は、同じＥＳ細胞小塊を形成する細胞の光路長のグラフ（図中（Ａ））及びＣＮ比のグラフ（図中（Ｂ））であり、図５より計算すると、ＥＳ細胞小塊を形成するＥＳ細胞においては、ＣＮ比＝１．０６±０．０６４２（ｎ＝３４。±の値は標準偏差）となる。図４と図５を対比すると、ＥＳ細胞小塊を形成する細胞のＣＮ比が１より大きいことがわかる。
【００３２】
一方、図６は、未分化マーカーである抗ｎａｎｏｇ抗体により免疫染色した、レチノイン酸でＥＳ細胞から誘導した細胞小塊の画像であり、画像の明るい領域がないことから、この細胞小塊は分化細胞小塊であることが確認される。そして、図７は、同じ分化細胞小塊を形成する細胞の光路長のグラフ（図中（Ａ）及びＣＮ比のグラフ（図中（Ｂ））であり、図７より計算すると、分化細胞小塊を形成する分化細胞においては、ＣＮ比＝０．９７３±０．１２２（ｎ＝２７。±の値は標準偏差）となる。図６と図７を対比すると、分化細胞小塊を形成する分化細胞のＣＮ比が１より小さいことがわかる。
【００３３】
次に、本発明の細胞判定方法、細胞判定装置及び細胞判定プログラムの好適な実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００３４】
（細胞小塊）
「細胞小塊」は２００個以下の細胞を含む細胞集団を意味する。細胞の個数は、１個でもよく２個以上でもよいが、１〜１００個、特に１〜６０個、とりわけ１〜２０個である。細胞の個数が１個であるとき、細胞小塊は単一細胞である。細胞小塊は、アポトーシス阻害剤（例えばＲＯＣＫ阻害剤）不存在下で増殖できないものも含む。
【００３５】
細胞小塊は幹細胞を含んでいてもよく（幹細胞小塊）、特に幹細胞のみからなるものでもよい。単一幹細胞は、幹細胞の個数が１個でありかつ幹細胞以外の細胞を含まない細胞小塊である。細胞小塊に含まれる幹細胞以外の細胞には、例えば分化細胞がある。
【００３６】
「幹細胞」は、複数系統の細胞に分化する能力（多分化能）及び細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を有する細胞を意味する。幹細胞としては、例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等の多能性幹細胞が挙げられ、また、幹細胞はヒト幹細胞だけでなく、マウス、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等の幹細胞でもよい。
【００３７】
細胞小塊は幹細胞コロニーの小塊化物でもよい。幹細胞コロニーの小塊化物としては、物理的又は化学的手段により幹細胞コロニーを小塊化したもの、例えばピペッティングしたもの、トリプシン、アキュターゼなどの酵素で処理したもの、が挙げられる。幹細胞コロニーの小塊化で他の細胞との接着（接触）が一部又は全部断たれた幹細胞は、通常、幹細胞コロニーを形成していたときの形状を維持していない。
【００３８】
多能性幹細胞コロニーの小塊化物には、増殖して再び多能性幹細胞コロニーを形成できるものも、増殖して再び多能性幹細胞コロニーを形成できないものも含まれる。
【００３９】
細胞小塊の取得方法に制限はないが、細胞小塊の取得方法としては幹細胞コロニーを小塊化し細胞小塊とする方法が挙げられ、この小塊化は幹細胞の継代時に行われてよい。上述したように、小塊化手段には、物理的又は化学的手段、例えばピペッティング、トリプシン、アキュターゼなどによる酵素処理がある。
【００４０】
（測定試料）
次に、細胞小塊を測定試料Ｓとする。測定試料Ｓは、例えば細胞小塊を含む溶液をスライドチャンバに注入して準備する。多能性幹細胞の小塊は通常スライドチャンバに接着（接触）させる。
【００４１】
（サイトメーター）
次に、使用するサイトメーター１の構成について説明する。図８はサイトメーター１の構成図である。
【００４２】
図８に示すように、サイトメーター１は、主に、定量位相顕微鏡Ａ及び細胞判定装置Ｄにより構成される。
【００４３】
（定量位相顕微鏡）
定量位相顕微鏡Ａは、光の入射側に、図示しない光出射部からの照射光Ｈ０（レーザ光）を導く光ファイバＢの出射側端面Ｂ１に臨ませたレンズＡ２と、このレンズＡ２を透過する照射光Ｈ０を反射する反射部Ａ３を具備する。一方、定量位相顕微鏡の光の出射側には、光干渉部Ａ７で生成される干渉縞（図示せず、以下同様）を撮像して画像とするＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃが設けられる。
【００４４】
定量位相顕微鏡Ａは、測定試料Ｓを支持する試料台Ａ４、対物レンズＡ５、反射部Ａ６、光干渉部Ａ７を備える顕微鏡本体Ａ１を具備する。
【００４５】
試料台Ａ４は、例えば、中央に光を透過可能な光透過部Ａ４１を備えるとともに、上向き面に測定試料Ｓを載置可能な載置面Ａ４２を有する略板状のものである。載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で上方から光を照射することにより、測定試料Ｓを透過した光（被測定光Ｈ１）が光透過部Ａ４１を透過して対物レンズＡ５に向かうようにしている。なお、光透過部Ａ４１は、例えばガラス等の光を透過可能な部材より形成したものであってもよいし、単なる孔であってもよい。対物レンズＡ５は、例えば、操作部（図示しない）の操作に基づいて、入射してくる被測定光Ｈ１をその操作に係る所定の倍率で拡大させて平行光として出射するものである。反射部Ａ６は、例えば全反射型のミラーであって、対物レンズＡ５からの被測定光Ｈ１を全反射させて光干渉部Ａ７に導入できるようにしている。光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、この光分離素子Ａ７１が出射する被測定光Ｈ１（Ｈ１ａ、Ｈ１ｂ）を収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５とを具備するものである。ここで、光分離素子Ａ７１は、回折格子を用いて構成したものである。さらには、光分離素子Ａ７１は、偏光方向が互いに異なる２つの光に分離する偏光分離素子であってもよい。その場合、光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、偏光方向が互いに異なる２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４と、この空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４と、この半波長板Ａ７４により偏光方向を揃えられた物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５と、を具備するものである。もしくは、空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４に代えて偏光子を配して物体光Ｈ３と参照光Ｈ４の偏光方向を揃えてもよい。
【００４６】
（細胞判定装置）
細胞判定装置Ｄの構成について説明する。図９は細胞判定装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図であり、図１０は細胞判定装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【００４７】
図９に示すように、細胞判定装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２及びＲＡＭ  Ｄ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、例えば撮像装置Ｃ等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７などを含む通常のコンピュータとして構成される。後述する細胞判定装置Ｄの各機能は、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２、ＲＡＭ  Ｄ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ  Ｄ１１の制御の下で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させるとともに、主記憶装置Ｄ１２、Ｄ１３や補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
【００４８】
図１０に示すように、細胞判定装置Ｄは、機能的構成要素として、取得手段Ｄ１、抽出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５を備える。
【００４９】
取得手段Ｄ１は、撮像装置Ｃからの画像（定量位相画像）を取得するものである。抽出手段Ｄ２は、取得した定量位相画像中の細胞核領域を抽出するものである。定量位相画像中から単一細胞領域を抽出する場合、細胞判定装置Ｄは、取得した定量位相画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出手段（図示せず）をさらに備える。比較手段Ｄ３は、抽出した細胞核領域の内側の光路長および外側の光路長を比較するものである。判定手段Ｄ４は、比較した結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定するものである。表示手段Ｄ５は、判定した結果を表示するものである。
【００５０】
（細胞判定プログラム）
細胞判定プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段Ｄ１、抽出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５として機能させるものである。コンピュータに細胞判定プログラムを読み込ませることにより、コンピュータは細胞判定装置Ｄとして動作する。細胞判定プログラムは、例えば、記録媒体に格納されて提供される。なお、記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、または半導体メモリ等が例示される。
【００５１】
（細胞判定方法）
細胞判定装置Ｄにより行われる細胞判定方法について説明する。図１１は細胞判定方法のフローチャートである。細胞判定装置Ｄにより行われる細胞判定方法により、細胞小塊を形成する細胞が幹細胞であるか否かの判定を定量的且つ自動的に精度高く行うことができる。これまで細胞が幹細胞であるか否かは、判定者により主観的に判定されていたが、判定者によらず客観的に判定できるようになる。すなわち、判定者の主観、体調、判定者間のばらつきといったあいまいな要素を排除でき、判定者の技能によらない一定の判断基準に基づいた細胞の判定を行うことが可能になる。
【００５２】
［取得ステップＳ１］
最初に、取得手段Ｄ１が撮像装置Ｃから細胞小塊の定量位相画像を取得する。必要に応じて、定量位相画像の画像処理、例えば、拡大、縮小、輝度調整、変換、を行ってもよい。
【００５３】
［抽出ステップＳ２］
次に、抽出手段Ｄ２が取得した定量位相画像中の細胞核領域を抽出する。抽出手段には特に制限はないが、定量位相画像の輝度が光路長に比例するものである場合、定量位相画像から細胞核領域を抽出することも可能である。また、同じ細胞小塊を別の顕微鏡で観察して取得した画像、例えば、同じ細胞小塊の明視野画像、から細胞核領域を抽出し、それに対応する定量位相画像中の細胞核領域を抽出するようにしてもよい。
【００５４】
細胞小塊が２個以上の細胞からなり、定量位相画像中にその２個以上の細胞の画像が含まれる場合は、定量位相画像中の２個以上の細胞の細胞核領域を抽出するようにしてもよい。
【００５５】
定量位相画像中から単一細胞領域を抽出する場合、取得した定量位相画像中の単一細胞領域を抽出する第２の抽出ステップをさらに備える。第２の抽出手段は、定量位相画像中に存在する独立した細胞領域の面積を算出し、その面積が、予め設定した単一細胞領域の面積よりも小さいときは、その細胞領域を単一細胞領域と判定して抽出し、逆に予め設定した単一細胞領域の面積よりも大きいときは、その細胞領域を単一細胞領域でないと判定して抽出しないようにするものである。
【００５６】
また、サイトメーター１が干渉反射顕微鏡を備える場合は、スライドチャンバに接着（接触）している細胞小塊の領域のみを抽出することもできる。
【００５７】
［比較ステップＳ３］
次に、比較手段Ｄ３が、抽出ステップＳ２にて抽出した細胞核領域の内側の光路長及び外側の光路長を比較し、その結果を抽出する。比較手段Ｄ３は、「細胞核領域の外側の光路長／細胞核領域の内側の光路長」（ＣＮ比）の値を結果として抽出することもできる。
【００５８】
細胞小塊が２個以上の細胞からなり、定量位相画像中にその２個以上の細胞の画像が含まれる場合は、その２個以上の細胞について、比較の結果を抽出するようにしてもよい。
【００５９】
［判定ステップＳ４］
次に、判定手段Ｄ４が、比較ステップＳ３にて抽出した比較の結果に基づき、細胞が幹細胞であるか否かを判定する。判定手段Ｄ４は、比較ステップＳ３の比較の結果が、細胞核領域の内側の光路長と比較して外側の光路長が大きい場合、すなわち「細胞核領域の内側の光路長＜細胞核領域の外側の光路長」の場合、に細胞が幹細胞であると判定し、細胞核領域の内側の光路長と比較して外側の光路長が小さい場合、すなわち「細胞核領域の内側の光路長＞細胞核領域の外側の光路長」の場合、に細胞が幹細胞でないと判定する。比較した結果がＣＮ比であるときは、ＣＮ比が１より大きい場合、細胞が幹細胞であると判定し、ＣＮ比が１より小さい場合、細胞が幹細胞でないと判定する。
【００６０】
また、ＣＮ比に基づき、細胞の分化度を判定することもできる。その値が１より大きい場合、細胞の分化度も低くなり、その値が１より小さい場合、細胞の分化度も高くなる。
【００６１】
細胞小塊が２個以上の細胞からなり、定量位相画像中にその２個以上の細胞の画像が含まれる場合は、２個以上の細胞について、幹細胞であるか否かを判定するようにしてもよいし、細胞小塊中の幹細胞の割合を判定するようにしてもよい。
【００６２】
［表示ステップＳ５］
次に、表示手段Ｄ５が、判定ステップＳ４にて判定した結果を表示する。例えば、細胞が幹細胞であるか否か、「細胞核領域の外側の光路長／細胞核領域の内側の光路長」の値、細胞の分化度、などが表示手段Ｄ５によって表示される。
【００６３】
（判定終了後）
判定終了後の細胞小塊は、廃棄してもよいし、他の目的に使用してもよい。
【００６４】
特に、細胞小塊が多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞、のコロニーの小塊化物である場合は、判定の結果に基づいて、小塊化物、例えば増殖させて多能性幹細胞コロニーとするのに適当なもの、遺伝子クローニングに適当なもの、を選択して使用することができる。
【００６５】
以上、光路長画像が定量位相画像である実施形態について詳細に説明したが、光路長画像は定量位相画像に限定されるものではない。光路長画像は光路長が取得可能な画像であればよいので、光路長画像は、位相差顕微鏡を使用して取得した画像、例えば、位相差コントラスト顕微鏡の画像（位相差コントラスト画像）であってもよい。この場合は、装置が安価となり、コスト節約につながる。
【００６６】
なお、図１〜図３の画像を取得するのに使用した単一ＥＳ細胞は、次のように取得した。
【００６７】
ヒトＥＳ細胞（ｋｈＥＳ３）をｍＴｅＳＲ１培地（ステムセルテクノロジーズ社製。登録商標）で、マトリゲル（ベクトンデッキンソン社製。登録商標）を基質として培養し、ヒトＥＳ細胞のコロニーを形成させた。その後細胞を基質から剥がし、０．２５％トリプシンで処理してヒトの単一ＥＳ細胞を培地に分散させた。培地にはＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２：トランス−４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−４−ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）１０μＭを加えた。単一ＥＳ細胞の状態で３時間程度培養しディッシュ底面に接着させた。
【符号の説明】
【００６８】
Ｗ…単一ＥＳ細胞、１…サイトメーター、Ａ…定量位相顕微鏡、Ａ１…顕微鏡本体、Ｂ…光ファイバ、Ｃ…撮像装置、Ｄ…細胞判定装置、Ｄ１…取得手段、Ｄ２…抽出手段、Ｄ３…比較手段、Ｄ４…判定手段、Ｄ５…表示手段。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３】
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