(57)【要約】【課題】血液試料から好中球細胞を分離することなく、好中球細胞の活性を評価できる方法の提供。【解決手段】好中球細胞の活性を評価する方法であって、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を、全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及びスーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ励起光源及び蛍光検出器が、試料容器の励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて好中球細胞の活性を評価する方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球細胞の活性を評価する方法であって、
ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を、全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、
前記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び前記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、
前記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を前記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ前記励起光源及び前記蛍光検出器が、前記試料容器の前記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、
測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて好中球細胞の活性を評価する方法。
【請求項２】
前記試料に好中球刺激剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体の酸化ストレス状態を評価する方法であって、
ミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを、前記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、
前記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び前記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、
前記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を前記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ前記励起光源及び前記蛍光検出器が、前記試料容器の前記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、
測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて前記生体の酸化ストレス状態を評価する方法。
【請求項４】
生体の酸化ストレス状態を評価するためのデータを収集する方法であって、
前記データが、血液中のミエロペルオキシダーゼ活性のデータ、及び血液中のスーパーオキシド産生活性のデータであり、
前記ミエロペルオキシダーゼ活性と前記スーパーオキシド産生活性とを、前記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、
前記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び前記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、
前記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を前記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ前記励起光源及び前記蛍光検出器が、前記試料容器の前記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、方法。
【請求項５】
飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法であって、
評価対象となる飲食品を生体に摂取させるステップと、
ミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを、前記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップと、を含み、
前記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び前記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、
前記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を前記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ前記励起光源及び前記蛍光検出器が、前記試料容器の前記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、
測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて前記食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法。
【請求項６】
前記試料に含まれる前記全血の量が、０μＬを超え、かつ１０μＬ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料容器が、プレート型容器である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定が蛍光の検出に基づくものであり、かつ前記スーパーオキシド産生活性の測定が化学発光の検出に基づくものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を前記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、
前記化学発光の検出が、放出された光を化学発光検出器により検出するものであり、
前記励起光源、前記蛍光検出器及び前記化学発光検出器が、前記試料容器の前記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されており、かつ前記蛍光検出器及び前記化学発光検出器の検出範囲が一致している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光検出器と前記化学発光検出器が、単一の検出器である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球細胞の活性を評価する方法に関する。本発明はまた、生体の酸化ストレス状態を評価する方法、及び飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好中球細胞は、炎症性サイトカイン及び細菌等に対し遊走性を示し、これにより炎症部に集合し、細菌等を貪食殺菌する機能を有しており、生体防御において重要な役割を演じている。細菌等を貪食殺菌する作用機序として、活性酸素（スーパーオキシド、過酸化水素等）の産生、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）による次亜塩素酸の産生等が知られている。
【０００３】
一方、好中球細胞の過剰な活性化による活性酸素の産生は、酸化ストレスの原因となり、細胞や組織の障害を惹き起こし種々の病態に関与することが指摘されている（例えば、非特許文献１参照）。また近年、好中球細胞から放出されるＭＰＯは、酸化ストレスのもう一つの原因である脂質の過酸化にも関与していることがわかってきた（例えば、非特許文献１）。
【０００４】
好中球細胞等の機能の測定方法として、例えば、特許文献１には、中心線平均粗さＲａ値が０．２μｍ〜１０μｍであり、でこぼこ平均間隔Ｓｍ値が５μｍ〜２００μｍの範囲にある凹凸を表面に有する材料と血液とを接触させることにより、ミエロペルオキシダーゼの産生を誘導させ、該ミエロペルオキシダーゼの産生量を測定することを特徴とする細胞機能測定方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２０６０９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】生物試料分析，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ２，２０１２年，ｐｐ．１３３〜１３９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
酸化ストレスは、生活習慣病をはじめ種々の疾患の原因とされている。好中球細胞の活性を評価する技術があれば、酸化ストレス状態の手前にある危険な状態を検出することができるため、従来行われている酸化ストレス状態を評価する技術に比べて、より早期での対処が可能となる。
【０００８】
好中球細胞の活性を評価する従来の技術では、血液試料から好中球細胞を分離する必要があり、複雑な操作や専門技術が必要とされ簡便性に欠ける。また、分離の過程で好中球細胞の活性低下又は不要な活性化が生じるおそれもあり、正確な評価ができるとはいえない。なお、特許文献１には、全血を用いて細胞機能測定を行うことが記載されているが、ＭＰＯの産生量を評価しているにすぎない。これまでに全血を用いてＭＰＯ活性を評価した例は知られていない。
【０００９】
そこで、本発明は、血液試料から好中球細胞を分離することなく、好中球細胞の活性を評価できる方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、好中球細胞の活性を評価する方法であって、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド（Ｏ２−）産生活性を、全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、上記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び上記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、上記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を上記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ上記励起光源及び上記蛍光検出器が、上記試料容器の上記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて好中球細胞の活性を評価する方法を提供する。
【００１１】
当該方法は、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定データに基づいて評価するものであるため、ＭＰＯ産生量に基づく場合と比較して、好中球細胞の活性を直接的に評価することが可能である。また、好中球細胞を分離することなく全血を含む試料を用いるため、操作が簡便なことに加え、血液中に含まれる様々な液性因子等との相互作用を含め生体内での動態により近い情報を得ることができる。
【００１２】
従来、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定には、蛍光検出及び化学発光検出が用いられている。このため、全血を含む試料を用いた場合、血液中の赤血球（ヘモグロビン）等による吸光の影響が大きく（図３参照）、従来の方法では、特に蛍光及びその励起光が試料に吸収されることによる検出感度の低下が著しく測定はほぼ不可能であった。本発明の方法によれば、試料への励起光の照射と蛍光の検出を、試料容器の励起光の照射面に対して同じ側で行うため、血液中の赤血球（ヘモグロビン）等による吸光の影響を大きく低減することが可能となり、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及びスーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであっても評価が可能である。また、これにより、数μＬ程度の少ない血液量での評価も可能である。
【００１３】
上記好中球細胞の活性を評価する方法は、試料に好中球刺激剤を添加することを含んでいてもよい。好中球刺激剤を添加することにより、試料中の好中球細胞に擬似的刺激を与えて自然免疫反応（生体防御反応）を惹起させ、好中球細胞の炎症防御能力（抗酸化能又は酸化ストレス防止能）を評価することができる。
【００１４】
本発明はまた、生体の酸化ストレス状態を評価する方法であって、ミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを、上記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、上記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び上記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、上記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を上記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ上記励起光源及び上記蛍光検出器が、上記試料容器の上記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて上記生体の酸化ストレス状態を評価する方法を提供する。
【００１５】
上記生体の酸化ストレス状態を評価する方法は、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定データに基づいて評価するものであるため、好中球細胞の過剰活性化による生体の酸化ストレス状態及び酸化ストレス状態の手前にある危険な状態を評価することができる。また、好中球細胞を分離することなく全血を含む試料を用いるため、操作が簡便なことに加え、生体の状態を精度よく評価することができる。
【００１６】
上記生体の酸化ストレス状態を評価する方法は、生体の酸化ストレス状態を評価するためのデータを収集する方法であって、上記データが、血液中のミエロペルオキシダーゼ活性のデータ、及び血液中のスーパーオキシド産生活性のデータであり、上記ミエロペルオキシダーゼ活性と上記スーパーオキシド産生活性とを、上記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、上記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び上記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、上記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を上記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ上記励起光源及び上記蛍光検出器が、上記試料容器の上記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、方法であってもよい。
【００１７】
本発明はさらに、飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法であって、評価対象となる飲食品を生体に摂取させるステップと、ミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを、上記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップと、を含み、上記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び上記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、上記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を上記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ上記励起光源及び上記蛍光検出器が、上記試料容器の上記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて上記飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法も提供する。
【００１８】
上記飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法は、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定データに基づいて評価するものであるため、上述のとおり、生体の酸化ストレス状態及び酸化ストレス状態の手前にある危険な状態を評価することができる。したがって、飲食品を摂取した後の当該酸化ストレス状態等を評価することによって、飲食品の抗酸化活性を評価することができる。また、生体のストレス状態を反映した評価であることから、化学物質としての飲食品の抗酸化活性を評価する従来の方法（ＤＰＰＨ法、ＯＲＡＣ法等）に対し、飲食品を摂取し、消化及び吸収を経た後の生体内での真の抗酸化活性の評価が可能となる。さらに、好中球細胞を分離することなく全血を含む試料を用いるため、操作が簡便なことに加え、生体の状態をより正確に反映した評価ができる。
【００１９】
上述した本発明に係るいずれの方法においても、試料に含まれる全血の量が、０μＬを超え、かつ１０μＬ以下であってもよい。また、試料容器が、プレート型容器であってもよい。
【００２０】
さらに、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定が蛍光の検出に基づくものであり、かつスーパーオキシド産生活性の測定が化学発光の検出に基づくものであってもよい。この場合、上記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を上記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、上記化学発光の検出が、放出された光を化学発光検出器により検出するものであり、上記励起光源、上記蛍光検出器及び上記化学発光検出器が、上記試料容器の上記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されており、かつ上記蛍光検出器及び上記化学発光検出器の検出範囲が一致しているものであってもよい。また、上記蛍光検出器と上記化学発光検出器が、単一の検出器であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、血液試料から好中球細胞を分離することなく、好中球細胞の活性を評価できる方法が提供される。また、本発明によれば、酸化ストレス状態の手前にある危険な状態（未病状態）を検出することができるため、従来の酸化ストレス状態を検出する手法よりさらに早い段階での対処が可能になる。
【００２２】
日本は、２０１０年、全人口に占める６５歳以上の高齢者の割合が２３．３％となり、世界に先駆けて超高齢化社会を迎え、さらに２０６０年には３９．９％になることも予想されている。加齢とともに動脈硬化性疾患、代謝性疾患、神経変性疾患、悪性腫瘍等の加齢関連疾患の発症頻度が増加することはよく知られている。また、食の欧米化に伴い、生活習慣病が増加し、今では死因の約６割を占めるほどになっている。生活習慣病の原因とされている酸化ストレスには、活性酸素が大きく関わっていることが知られている。これらの疾患を発症する前の未病の段階で、飲食品の第３次機能である生体調節機能（例えば、抗酸化活性）によりこれらを予防し、健康寿命を延長させることが期待されている。
【００２３】
飲食品の抗酸化活性を統一的に評価する指標として、ＡＯＵ（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ−ｕｎｉｔ）研究会が中心となり、ＡＯＵ値が定義されている。ＡＯＵ値は、水溶性物質を評価するＨ−ＯＲＡＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ）法、脂溶性物質を評価するＬ−ＯＲＡＣ（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ）法、及びカロテノイド類を評価するＳＯＡＣ法（Ｓｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｃａｐａｃｉｔｙ）の３つの方法でそれぞれ得られる３つの値を合算したものである。一方、飲食品を摂取し、消化及び吸収を経た後の生体内での真の抗酸化活性を評価する手段は未だ整備されていない。前述したＡＯＵ研究会でも、生体内での抗酸化活性の指標化が今後最優先に取り組むべき課題として取り上げられている。
【００２４】
本発明によれば、飲食品を摂取し、消化及び吸収を経た後の生体内での真の抗酸化活性の評価が可能となる。
【００２５】
本発明に係る方法は、煩雑な操作や専門技術を必要としない簡便性から、一般に広く普及させることが可能であり、個々人の体質及び体調管理ツール、個々人に適した食品、いわゆるテーラーメイド食品の選択ツール、並びに食生活の改善ツールとして利用できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】蛍光の検出（プレパラート）の一例を示す模式図である。
【図２】蛍光の検出（キュベット）の一例を示す模式図である。
【図３】全血の吸光スペクトル測定の結果を示すグラフである。
【図４】蛍光及び化学発光の同時測定（キュベット）の結果を示すグラフである。
【図５】蛍光及び化学発光の同時測定（プレパラート）の結果を示すグラフである。
【図６】従来の蛍光の検出（キュベット）を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、必要に応じて添付図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００２８】
本実施形態に係る好中球細胞の活性を評価する方法は、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド（Ｏ２−）産生活性を、全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含む。当該方法において、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及びスーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方は蛍光の検出に基づくものである。また、蛍光の検出を、励起光源から出力された励起光を試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ励起光源及び蛍光検出器が、試料容器の励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている。このようにして得られたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性のデータに基づいて、好中球細胞の活性を評価する。
【００２９】
好中球細胞は、白血球細胞の１種である。好中球細胞の主な役割は、生体内に侵入してきた細菌及び真菌類を貪食殺菌し感染を防ぐものである。好中球細胞は、細菌及び真菌類に接触すると好中球形質膜で包むようにして好中球内に取り込み食胞を形成する。次いで食胞が顆粒と融合し、顆粒内容物が食胞内に放出される。細胞膜（食胞の膜）に形成されたＮＡＤＰＨ酸化酵素系により活性酸素（スーパーオキシド、過酸化水素）が発生し、細菌及び真菌類を殺菌する。また、顆粒内容物に含まれるミエロペルオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．２）の酵素反応により、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と塩素イオン（Ｃｌ−）から次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）（又はそのハロゲン等価体）が産生され、細菌及び真菌類を殺菌する。したがって、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を指標として、好中球細胞の活性を評価することができる。
【００３０】
試料は全血を含む。「全血」とは、生体から採取された血液そのものを意味する。試料は全血そのものであってもよく、全血を生理食塩水、緩衝液等で希釈したものであってもよい。希釈する場合、希釈率は適宜設定してもよいが、検出感度の向上の観点からは、１０〜２００倍に希釈するのが好ましく、２０〜１８０倍に希釈するのがより好ましく、５０〜１５０倍に希釈するのが更に好ましく、８０〜１２０倍に希釈するのが更により好ましく、９０〜１１０倍に希釈するのが特に好ましい。
【００３１】
試料として用いる全血の量（血液量）は、特に制限されない。一方、本実施形態の方法によれば、血液中の赤血球（ヘモグロビン）等による吸光の影響を大きく低減することが可能となるため、数μＬ程度の少ない血液量での評価も可能である。したがって、試料に含まれる全血の量が、０μＬを超え、かつ１０μＬ以下であってもよい。また、試料に含まれる全血の量は、０μＬを超え、かつ８μＬ以下であってもよく、０μＬを超え、かつ６μＬ以下であってもよい。
【００３２】
例えば、糖尿病患者が日々の血糖値の測定の際に使用する採血器具（例えば、ランセット）を用いて、指先等から微量末梢血（２〜３μＬ）を採取して試料に用いてもよい。このような微量の血液量であれば負荷が少ないため、日常的に好中球細胞の活性を評価することも可能となる。
【００３３】
試料容器としては、立方体形状又は直方体形状等のキュベット型容器であってもよく、試料を薄く引き伸ばすことができるプレート型容器（例えば、プレパラート）であってもよい。測定効率を向上させる観点からは、プレート型容器が好ましい。プレート型容器は、好中球細胞が試料容器面の近くに存在する可能性が高くなるため、後述するとおり、赤血球（ヘモグロビン）による励起光及び蛍光の吸収の問題を解消することができる。試料容器は、蛍光等の検出効率を向上させる観点から透明試料容器であることが好ましい。
【００３４】
試料中のミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性は、例えば、蛍光指示薬、発光（例えば、化学発光）指示薬又は吸光指示薬を利用して、蛍光、発光又は吸光を経時的に検出することにより測定することができる。指示薬は、市販されているものを使用してもよく、市販されている測定キットを使用してもよい。
【００３５】
ミエロペルオキシダーゼ活性の測定は、例えば、ミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜塩素酸（又はそのハロゲン等価体）と反応する蛍光指示薬、発光指示薬又は吸光指示薬を使用して測定することができる。そのような指示薬として、例えば、アミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ：Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、タウリン／ＴＮＢ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．７０，ｐｐ．５９８〜６０７，１９８２年参照）、８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド［３，４−ｄ］ピリダジン−１，４−（２Ｈ，３Ｈ）ジオン（Ｌ−０１２：Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１（１），ｐｐ．５３−５８，１９９９年参照）が挙げられる。これら指示薬は、スーパーオキシドとの反応性に乏しいものが好ましい。
【００３６】
ＡＰＦとＨＯＣｌとの反応は蛍光（例えば、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）で検出することができる。タウリン／ＴＮＢとＨＯＣｌとの反応は吸光（例えば、波長４１２ｎｍ）で検出することができる。Ｌ−０１２とＨＯＣｌとの反応は、特異性は低いが化学発光（例えば、波長４５５ｎｍ）で検出することができる。
【００３７】
スーパーオキシド産生活性の測定は、例えば、スーパーオキシドと反応する蛍光指示薬、発光指示薬又は吸光指示薬を使用して測定することができる。そのような指示薬として、例えば、２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ）、２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＭＣＬＡ）、２-メチル‐６−ｐ−メトキシフェニルエチニルイミダゾピラジノン（ＭＰＥＣ）、インドシアニン型イミダゾピラノジン化合物（ＮＩＲ−ＣＬＡ）、２−［２，４，５，７−テトラフルオロ−６−（２−ニトロ−４，５−ジメトキシフェニルスルホニルオキシ）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸（ＢＥＳ−Ｓｏ）が挙げられる。これら指示薬は、ミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜塩素酸（又はそのハロゲン等価体）等との反応性に乏しいものが好ましい。
【００３８】
ＣＬＡとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長３８０ｎｍ）で検出することができる。ＭＣＬＡとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長４６５ｎｍ）で検出することができる。ＭＰＥＣとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長４３０ｎｍ）で検出することができる。ＮＩＲ−ＣＬＡとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長８００ｎｍ）で検出することができる。ＢＥＳ−Ｓｏとスーパーオキシドとの反応は蛍光（例えば、励起波長５０５ｎｍ、蛍光波長５４４ｎｍ）で検出することができる。
【００３９】
ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及びスーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方は蛍光の検出に基づく。検出感度を向上させるという観点からは、ミエロペルオキシダーゼ活性を蛍光の検出により測定し、かつスーパーオキシド産生活性を化学発光の検出により測定することが好ましく、ミエロペルオキシダーゼ活性を蛍光指示薬（例えば、ＡＰＦ）を用いて測定し、かつスーパーオキシド産生活性を化学発光指示薬（例えば、ＭＣＬＡ）を用いて測定することがより好ましい。
【００４０】
ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定は、全血を含む同一の試料を用いて測定する。また、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定を略同時に測定してもよい。これにより、同一の条件下における両活性を測定することができ、好中球細胞の活性をより正確に評価することができる。
【００４１】
蛍光の検出は、励起光源から出力された励起光を試料を含む試料容器に照射し、試料からの蛍光を、試料容器の励起光の照射面に対して同じ側に配置された蛍光検出器により検出するものである。ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定を蛍光と化学発光により略同時に測定する場合を例にとり、蛍光の検出についてより具体的に説明する。
【００４２】
図１及び図２は、蛍光の検出の一例を示す模式図である。図６は、従来の蛍光の検出を示す模式図である。
【００４３】
図６は、蛍光及び化学発光を同時に測定する従来の装置（例えば、特開２００４−６１４３８号公報、特開２０００−１３１２３４号公報等に記載）における試料容器を示している。図６では、励起光源（図示せず）から出力された励起光３０を試料を含む試料容器（キュベット）１０に照射し、放出された蛍光４０を蛍光検出器（図示せず）により検出するものであるが、蛍光４０は、励起光源及び蛍光検出器が、試料容器１０の励起光３０の照射面に対して、励起光源とは異なる側に配置された蛍光検出器により検出される。
【００４４】
試料容器１０に収容された試料は全血を含むため、好中球細胞２０と赤血球（ヘモグロビン）５０が存在する。通常、全血中に含まれる好中球細胞２０の数は、赤血球５０の数の１／１０００程度である。蛍光及び化学発光を同時に測定する場合、赤血球５０に含まれるヘモグロビンが化学発光指示薬の発光（例えば、３８０〜４５０ｎｍ）と、蛍光指示薬の励起光（例えば、４８８ｎｍ）及び蛍光（例えば、５００〜５３０ｎｍ）と、を強く吸収する問題がある。図３に、全血の吸光スペクトル測定の結果を示す。このため、図６に示す従来の手法では、特に蛍光について、好中球細胞２０に届くまでの励起光の減衰、及び蛍光検出器に届くまでの蛍光の減衰が著しく、全血を用いた場合の測定が極めて困難である。
【００４５】
図１及び図２に示す本実施形態に係る手法では、励起光源（図示せず）から出力された励起光３０を試料を含む試料容器（図１ではプレパラート、図２ではキュベット）１０に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器（図示せず）により検出するものであり、励起光源及び蛍光検出器が、試料容器１０の励起光３０の照射面に対して、同じ側に配置されている。このような手法により、少なくとも試料容器面に接している好中球細胞２０について、赤血球（ヘモグロビン）５０による励起光及び蛍光の吸収の問題を解消することができ、後述の試験例で具体的に示されるとおり、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定を蛍光と化学発光により略同時に測定することが可能となる。
【００４６】
蛍光と化学発光により測定する場合、励起光源、蛍光検出器及び化学発光検出器が、試料容器の励起光の照射面に対して、同じ側に配置されており、かつ蛍光検出器及び化学発光検出器の検出範囲が一致しているものであってもよい。また、蛍光検出器と化学発光検出器が、単一の検出器であってもよい。
【００４７】
本実施形態に係る好中球細胞の活性を評価する方法は、試料に好中球刺激剤を添加することを含んでいてもよい。
【００４８】
好中球刺激剤は、好中球細胞の機能（例えば、遊走、貪食）を活性化する物質であればよい。好中球刺激剤としては、例えば、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ：好中球遊走性ペプチド）、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩（ＰＭＡ）、オプソニン化ザイモン（ＯＺ）が挙げられる。これらは１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
好中球刺激剤を添加することにより、試料中の好中球細胞に擬似的刺激を与えて自然免疫反応（生体防御反応）を惹起させ、好中球細胞の炎症防御能力（抗酸化能又は酸化ストレス防止能ともいえる。）を評価することができる。これに対し、当該擬似的刺激を与えない場合は、末梢血内に存在する好中球細胞のそのままの状態を評価することができ、例えば激しい運動、喫煙等によって好中球細胞が活性化して活性酸素を出している様な状態（酸化ストレス状態）を評価することができる。
【００５０】
ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の導出について図５を参照しながら説明する。図５は、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を蛍光と化学発光で検出した例である。「刺激」と矢印で示した時点で好中球刺激剤を添加している。好中球刺激剤の添加前においては、例えば、発光量（又は蛍光量）の積算値又は平均値を算出することでミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を導出することができる。他方、好中球刺激剤の添加後においては、例えば、ピーク面積を算出することでミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を導出することができる。
【００５１】
好中球細胞の活性は、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて評価することができる。上述のとおり、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性が亢進している場合は、好中球細胞の活性が亢進していることを意味する。例えば、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性が、ある所定の基準値を超えた場合に、好中球細胞の活性が亢進していると評価するものであってよい。同様に、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性が、ある所定の基準値を下回った場合に、好中球細胞の活性が低下していると評価するものであってよい。
【００５２】
基準値は、目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、多数のヒト検体について測定したミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性から平均値等により基準値を導出してもよい。基準値は、例えば、性別、年齢等に応じて複数あってもよい。また、特定の個人については、健康状態の時の測定値を基準値としてもよい。さらに、飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法においては、飲食品の摂取前の測定値を基準値とすることができる。
【００５３】
好中球刺激剤を添加した場合の炎症防御能力についても同様に評価することができる。また、炎症防御能力が極端にある基準値を下回った場合、好中球細胞の活性が何らかの原因で低下し、自然免疫力が低下した状態であると評価するものであってもよい。
【００５４】
本実施形態に係る好中球細胞の活性を評価する方法は、好中球細胞の活性を評価するためのデータを収集する方法ということもできる。
【００５５】
本実施形態に係る生体の酸化ストレス状態を評価する方法は、ミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを、酸化ストレス状態を評価する生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含む。ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及びスーパーオキシド産生活性の測定については、上述したとおりである。
【００５６】
生体の酸化ストレス状態は、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて評価することができる。上述のとおり、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性が亢進している場合は、好中球細胞の活性が亢進しており、好中球細胞の過剰活性化による生体の酸化ストレス状態又は酸化ストレス状態の手前にある危険な状態にあることを意味する。例えば、ある所定の基準値を超えた場合に、酸化ストレス状態又は酸化ストレス状態の手前にある危険な状態であると評価するものであってよい。同様に、ある所定の基準値を下回った場合に、酸化ストレス状態又は酸化ストレス状態の手前にある危険な状態ではないと評価するものであってよい。基準値は、上述したとおり設定することができる。
【００５７】
本実施形態に係る生体の酸化ストレス状態を評価する方法は、生体の酸化ストレス状態を評価するためのデータを収集する方法ということもできる。
【００５８】
本実施形態に係る飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法は、評価対象となる飲食品を生体に摂取させるステップと、ミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを、上記生体由来の全血を含む同一の試料を用いて測定するステップと、を含む。ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及びスーパーオキシド産生活性の測定については、上述したとおりである。
【００５９】
飲食品の生体内での抗酸化活性は、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて評価することができる。上述のとおり、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を指標として、酸化ストレス状態又は酸化ストレス状態の手前にある危険な状態を評価することができる。したがって、飲食品を摂取した後、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性が低下した場合、当該飲食品は生体内での抗酸化活性を有すると評価することができる。
【００６０】
本実施形態に係る飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法は、評価対象となる飲食品を生体に摂取させるステップの前に、当該生体由来の全血を含む同一の試料を用いてミエロペルオキシダーゼ活性とスーパーオキシド産生活性とを測定するステップを更に含んでいてもよい。評価対象となる飲食品を摂取する前後におけるミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を比較することにより、より定量的な評価が可能になる。
【００６１】
本実施形態に係る飲食品の生体内での抗酸化活性を評価する方法は、飲食品の生体内での抗酸化活性を評価するためのデータを収集する方法ということもできる。
【実施例】
【００６２】
以下、試験例に基づいて本発明をより具体的に説明する。
【００６３】
試料容器としてプレパラート及びキュベット（１０ｍｍ角）を用いた。プレパラートの場合、ランセット（ベクトンディッキンソン社製）で、健常人から２μＬの血液を採取した。これを３７℃に保温したＲＨバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１００倍に希釈し、下記式（１）で表されるＭＣＬＡ（ＭＣＬＡ商品名、東京化成工業株式会社製）を３μＭとなるように、下記式（２）で表されるＡＰＦ（ＡＰＦ商品名、積水メディカル株式会社製）を１μＭとなるように添加し、プレパラートに試料を載せて、１分間、３７℃でインキュベートした後、図１に示すとおり蛍光及び発光同時測定装置を用いて測定を開始した。キュベットの場合、２０μＬの血液を３７℃に保温したＲＨバッファーで１００倍に希釈し、ＭＣＬＡを９μＭとなるように、ＡＰＦを１０μＭとなるように添加し、キュベットに試料を移して、５分間インキュベートした後、図２に示すとおり蛍光及び発光同時測定装置を用いて測定を開始した。
【化１】
2015084757.tif 000003
【化２】
2015084757.tif 000004
【００６４】
励起光として１２５ｍ秒間隔でＬＥＤ（４８８ｎｍ）を点滅させながら、上述した試料への照射を開始した。その１．２５分後（プレパラートの場合）、２．５分後（キュベットの場合）に、好中球遊走性ペプチド（ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン：好中球刺激剤）を５μＭ（プレパラートの場合）、１μＭ（キュベットの場合）となるように試料に添加した（図４及び図５中「刺激」と矢印で示した時点）。ＡＰＦの蛍光強度とＭＣＬＡの化学発光強度の測定結果を図４及び図５に示す。
【００６５】
図４は、蛍光及び化学発光の同時測定（キュベット）の結果を示すグラフである。図５は、蛍光及び化学発光の同時測定（プレパラート）の結果を示すグラフである。図４及び図５の結果から明らかなとおり、全血を含む試料を用いた場合であっても蛍光及び化学発光の同時検出が可能であった。特にプレパラートを用いた場合には、より高い感度での検出が可能であった。
【符号の説明】
【００６６】
１０…試料容器、２０…好中球細胞、３０…励起光、４０…蛍光、５０…赤血球（ヘモグロビン）。
【図１】
2015084757.tif 000005
【図２】
2015084757.tif 000006
【図３】
2015084757.tif 000007
【図４】
2015084757.tif 000008
【図５】
2015084757.tif 000009
【図６】
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