(57)【要約】【課題】脂質生産性に優れた緑藻を提供する。【解決手段】二重特異性チロシンリン酸化制御プロテインキナーゼ(DYRK)活性を低下させた緑藻変異体であって、単位時間及び単位培養面積当たりの脂質生産量が親株よりも向上している、前記緑藻変異体。【選択図】図３
2015097504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性チロシンリン酸化制御プロテインキナーゼ(DYRK)活性を低下させた緑藻変異体であって、単位時間及び単位培養面積当たりの脂質生産量が親株よりも向上しており、前記DYRKが配列番号４に示す活性部位及び基質認識部位のアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つDYRK活性を有するタンパク質である、前記緑藻変異体。
【請求項２】
DYRKをコードする遺伝子を破壊した緑藻である、請求項１記載の緑藻変異体。
【請求項３】
DYRKをコードする遺伝子の発現を低下させることで、DYRK活性を低下させた、請求項１記載の緑藻変異体。
【請求項４】
DYRKをコードする遺伝子の翻訳効率を低下させることで、DYRK活性を低下させた、請求項１記載の緑藻変異体。
【請求項５】
トレボキシア藻網に属する、請求項１〜４のいずれか１項記載の緑藻変異体。
【請求項６】
コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、請求項５記載の緑藻変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の緑藻変異体を培養する工程を含む、脂質生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、二重特異性チロシンリン酸化制御プロテインキナーゼ(DYRK：Dual-specificity tYrosine-phosphorylation Regulated protein Kinase)活性が減少した結果、親株又は野生型に比べ脂質生産性が向上した緑藻変異体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
単細胞性の光合成生物(以下、「微細藻類」と呼ぶ)が生産する脂肪酸、あるいは加水分解により脂肪酸を遊離する化合物(以下、「脂質」と呼ぶ)を原料として、バイオディーゼル燃料をはじめとする工業・食品製品(以下、「バイオ燃料等」と呼ぶ）を生産する研究が、世界各地で活発に行われている。しかしながら、現状では、生産コストが高く、商業ベースでのバイオ燃料等の生産は困難である。そのため、バイオ燃料等の生産コスト削減の技術開発が必要である(非特許文献１)。
【０００３】
脂質生産性が上昇した微細藻類を分離し、コスト削減に貢献しようという研究も既にいくつか行われている。光合成生物は、一般に過剰のアンテナクロロフィルを持ち、これが、光利用効率を下げている。そこで、このアンテナクロロフィルの含量を減らすことで、バイオマス生産性が改良されることが、確認されている(非特許文献２〜４）。
【０００４】
また、脂質の回収の省力化を目論んで、脂質を細胞外に分泌する株が作られている。しかしながら、これらの株は実用的に使用されているわけではない(非特許文献５及び６）。
【０００５】
微細藻類を用いたバイオ燃料生産の関心の高さに比して、また、微細藻類バイオマスを用いたバイオ燃料プロセスや微細藻類の育種に関わる総説の数の多さに比べ、育種株の開発例は、上記のように非常に少ない。
【０００６】
一方、シュードコリシスチス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea；P. ellipsoidea)株が、佐藤ら(非特許文献７)に示されている。この株の属及び種名は、国際藻類・菌類・植物命名規約に則り命名されたものではなく、仮称である。その後の遺伝子を用いた系統解析により、これらはCoccomyxa属及びPseudococcomyxa属に近縁であることが示されている。この株は、他の微細藻類と同様に、培地中の窒素源が枯渇すると細胞内に脂質を蓄積する(非特許文献８）。窒素源の枯渇が脂質の蓄積を誘導するという現象の機構は、未だ明らかにされていないが、窒素枯渇というストレスに細胞が応答した結果、脂質の蓄積が起こるのだろうと言われている(非特許文献９)。
【０００７】
本出願人等は、P. ellipsoideaの育種と大量培養技術の改良に取り組んできた。例えば、特許文献１に示すように、P. ellipsoideaの2株(Obi株及びN1株：特許文献２)を屋外開放系で長期に渡り培養することに成功している。
【０００８】
一般の光合成生物と同様に、P. ellipsoideaも過剰のアンテナクロロフィルを持ち、これが、光利用効率を下げている。特許文献３は、P. ellipsoidea Obi株を親株として、アンテナクロロフィルの含量が減少した5P株が分離されたことを開示する。この5P株は、野生型株よりもバイオマス生産性が優れていた(特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2013-90598号公報
【特許文献２】特開2013-102748号公報
【特許文献３】特開2013-102715号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Chisti Y. (2013) Constraints to commercialization of algal fuels. J. Biotechnol. 167:201-214.
【非特許文献２】Nakajima Y, Ueda R. (1997) Improvement of photosynthesis in dense microalgal suspensions by reduction of light harvesting pigments. J. Appl. Phycol. 9:503-510.
【非特許文献３】Nakajima Y, Ueda R. (2000) The effect of reducing light-harvesting pigments on marine microalgal productivity. J. Appl. Phycol. 12:285-290.
【非特許文献４】Oey M, Ross IL, Stephens E, Steinbeck J, Wolf J, Radzun KF, Kugler J, Ringsmuth AK, Kruse O, Hankamer B. (2013) RNAi knock-down of LHCBM1, 2 and 3 increases photosynthetic H2 production efficiency of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. PLOS One 8, e61735.
【非特許文献５】Liu X, Curtiss III FR. (2009) Nickel-inducible lysis system in Synechocystis sp. PCC6803. Proc. Natl. Acad.. Sci. USA. 106:21550-21554.
【非特許文献６】Liu X, Sheng J, Curtiss III R. (2011) Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc. Natl. Acad.. Sci. USA. 108:6899-6904.
【非特許文献７】Satoh A, Kato M, Yamato T, Ikegami Y, Sekiguchi H, Kurano, N, Miyachi S. (2010) Characterization of the lipid accumulation in a new microalgal species, Pseudochoricystis ellipsoidea (Trebouxiophyceae). J. .Jap. Inst. Energy 89, 909-913 (September 2010)
【非特許文献８】Ito T, Tanaka M, Shinkawa H, Nakada T, Ano Y, Kurano N, Soga T, Tomita M. (2013) Metabolic and morphological changes of an oil accumulating trebouxiophycean alga in nitrogen-deficient conditions. Metabolomics. 9:178-187.
【非特許文献９】Wang ZT, Ullrich N, Joo S, Waffenschmidt S, Goodenough U. (2009) Algal lipid bodies: stress induction, purification, and biochemical characterization in wild-type and starchless Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 8:1856-1868.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のごとく、P. ellipsoideaは屋外での大量培養に適した株であり、脂質の商業生産の原料として最も有望な株の1つであると言える。しかしながら、その脂質生産性を更に改良し、脂質生産コストを削減することが望まれている。
【００１２】
そこで、本発明は、脂質生産性が改良された緑藻を分離し、当該緑藻を利用した脂質生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ゲノムDNA上の二重特異性チロシンリン酸化制御プロテインキナーゼ(DYRK：Dual-specificity tYrosine-phosphorylation Regulated protein Kinase、以下、「DYRK」と称する)をコードする遺伝子が変異した緑藻変異体が、親株又は野生株と比較して、脂質生産性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）DYRK活性を低下させた緑藻変異体であって、単位時間及び単位培養面積当たりの脂質生産量が親株よりも向上しており、前記DYRKが配列番号４に示す活性部位及び基質認識部位のアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つDYRK活性を有するタンパク質である、前記緑藻変異体。
（２）DYRKをコードする遺伝子を破壊した緑藻である、（１）記載の緑藻変異体。
（３）DYRKをコードする遺伝子の発現を低下させることで、DYRK活性を低下させた、（１）記載の緑藻変異体。
（４）DYRKをコードする遺伝子の翻訳効率を低下させることで、DYRK活性を低下させた、（１）記載の緑藻変異体。
（５）トレボキシア藻網に属する、（１）〜（４）のいずれか１記載の緑藻変異体。
（６）コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、（５）記載の緑藻変異体。
（７）（１）〜（６）のいずれか１記載の緑藻変異体を培養する工程を含む、脂質生産方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、脂質生産性が向上した緑藻を作出することが可能となる。また、本発明に係る緑藻変異体を培養することにより、バイオ燃料等に供する脂質の生産コストを大幅に削減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】DYRKの活性部位及び基質認識部位を示す。
【図２】DYRKサブファミリー遺伝子の部分塩基配列をPCR増幅するために使用されるプライマーの例を示す。
【図３】P. ellipsoidea Obi株(WT)並びに当該Obi株由来の変異体：5P、JH1011、JH1012及びJH1013株の増殖(パネル(A))と脂質生産(パネル(B))を示すグラフである。A6培地を用いて培養し、14日後に脂質生産性を評価した。
【図４】レースウェイ培養装置の外観を示す。
【図５】レースウェイ培養装置を用いた、P. ellipsoidea Obi株並びに当該Obi株由来の変異体：5P、JH1011、JH1012及びJH1013株の増殖(パネル(A))と脂質生産(パネル(B))を示すグラフである。
【図６−１】P. ellipsoidea変異体：JH1011、JH1012及びJH1013株の持つLMR-DYRK遺伝子変異を示す。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図６−４】図６−３の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、単位時間及び単位培養面積当たりの脂質生産量が親株(又は野生株)よりも向上した、DYRK活性を低下させた緑藻変異体に関する。
【００１８】
微細藻類由来の脂質を原料としたバイオ燃料等の生産コストを削減するための最重要課題の一つは、微細藻類の脂質生産性の大幅向上である。本発明者等は、緑色植物亜界・緑藻植物門(以下、「緑藻」と記す)に属するシュードコリシスチス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea；P. ellipsoidea)(仮称)Obi株(受託番号FERM BP-10484；特許第4748154号公報(当該特許では、「シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ(Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.) MBIC11204株」と称される))由来の配列番号３で示されるアミノ酸配列から成るDYRKサブファミリーに属するタンパク質(ゲノムDNA塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２)を欠損させることにより、この緑藻の脂質生産性を大幅に改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
DYRKは、CMGCセリン/スレオニン・プロテイン・キナーゼ・ファミリーに属し、多くの真核生物に見出され、様々なシグナル伝達の調節に関わっているプロテイン・キナーゼである。本発明者等の知見によれば、P. ellipsoideaの当該DYRKが脂質生産を負に制御していることが推測されたので、以下、脂質生産を負に制御しているDYRKをLipid-Metabolism-Regulating DYRK(略して「LMR-DYRK」)と呼び、他のDYRKから区別することにする。上記知見から、LMR-DYRK活性を遺伝的操作によって低減させることによって緑藻の脂質生産性を向上させること、及び、LMR-DYRK活性低減株を培養することにより、バイオ燃料等に供する脂質の生産コストを大幅削減することが可能となる。
【００２０】
シロイヌナズナ等では、様々な環境ストレスに対する植物の応答が研究されている。そして、環境ストレス応答には、多くのプロテイン・キナーゼが関与していることが明らかになってきた(Wang P, Xue L, Batelli G, Lee S, Hou YJ, Van Oosten MJ, Zhang H, Tao WA, Zhu JK. (2013) Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proc Natl Acad Sci USA. 110:11205-11210)。本発明によれば、CMGCセリン/スレオニン・プロテイン・キナーゼ・ファミリーに属するLMR-DYRKが、窒素枯渇というストレスに応答して起こる脂肪蓄積反応を部分的に阻害することが明らかになった。
【００２１】
本発明において、緑藻により生産される脂質としては、例えば、トリグリセリド、ステロールエステル、炭化水素などの中性脂肪、ガラクトシルジグリセリドなどの糖脂質、フォスファチジルグリセロールなどのリン脂質等が挙げられる。
【００２２】
また、緑藻としては、例えばトレボキシア藻網に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻網に属する緑藻としては、例えば、トレボキシア属、クロレラ属、ボトリオコッカス属、コリシスチス属、コッコミクサ属、シュードコッコミクサ属に属する緑藻が挙げられる。コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する具体的な種としては、コッコミクサ・サブエリプソイディア(Coccomyxa subellipsoidea)(Blanc G, Agarkova I, Grimwood J, Kuo A, Brueggeman A, Dunigan DD, Gurnon J, Ladunga I, Lindquist E, Lucas S, Pangilinan J, Proschold T, Salamov A, Schmutz J, Weeks D, Yamada T, Lomsadze A, Borodovsky M, Claverie JM, Grigoriev IV, Van Etten JL.(2012) The genome of the polar eukaryotic microalga Coccomyxa subellipsoidea reveals traits of cold adaptation. Genome Biol. 13:R39 (PMID: 22630137))、及びシュードコッコミクサ・シンプレックス（Pseudococcomyxa simplex）(Broady PA. (1987) The morphology, distribution and ecology of Pseudococcomyxa simplex (Mainx) Fott (Chlorophyta, Chlorellaceae), a widespread terrestrial antarctic alga. Polar Biol 7:25-30.)が挙げられる。さらに、トレボキシア藻網に属する具体的な株としては、P. ellipsoidea Obi株(受託番号FERM BP-10484；特許第4748154号公報)及びその変異株P. ellipsoidea 5P株(受託番号FERM P-22179;特許文献３)が挙げられる。なお、P. ellipsoidea Obi株とP. ellipsoidea 5P株とは、同一のLMR-DYRKをコードする遺伝子(ゲノムDNA塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)を有する。
【００２３】
トレボキシア藻網に属する緑藻以外の緑藻としては、例えばクラミドモナス属及びイカダモ属(セネデスムス属)に属する緑藻が挙げられる。
【００２４】
本発明に係る緑藻変異体は、上述の緑藻を親株として、LMR-DYRK活性を低下させる方法に供することで得られた緑藻である。
【００２５】
本発明において、LMR-DYRKをコードする遺伝子(以下、「LMR-DYRK遺伝子」と称する)としては、例えば図１に示すLMR-DYRKの活性部位及び基質認識部位のアミノ酸配列(配列番号４に示すアミノ酸配列；配列番号３における175番目〜257番目のアミノ酸配列に相当)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つDYRK活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。図１に示されるLMR-DYRKの活性部位及び基質認識部位は、ヒトのDYRK(DYRK1A)立体構造（Soundararajan M, Roos AK, Savitsky P, Filippakopoulos P, Kettenbach AN, Olsen JV, Gerber SA, Eswaran J, Knapp S, Elkins JM. (2013) Structures of Down syndrome kinases, DYRKs, reveal mechanisms of kinase activation and substrate recognition. Structure21:986-996.)から予測されたP. ellipsoidea DYRKの活性部位及び基質認識部位である。図１において、予測された活性及び基質認識に重要な部位に下線を施す。
【００２６】
また、LMR-DYRK遺伝子としては、例えばP. ellipsoidea Obi株由来の配列番号１に示す塩基配列から成るゲノムDNA(開始コドン：558番目〜560番目の塩基配列、終止コドン：7607番目〜7609番目の塩基配列)(配列番号２に示す塩基配列は、そのmRNAに相当し、配列番号２における388番目〜3495番目の塩基配列がコーディング領域(CDS)である)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも58％、特に好ましくは、少なくとも65％、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有する塩基配列から成り、且つDYRK活性を有するタンパク質をコードするDNA；又は配列番号１に示す塩基配列において1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列から成り、且つDYRK活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
【００２７】
さらに、LMR-DYRK遺伝子としては、例えばP. ellipsoidea Obi株由来の配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つDYRK活性を有するタンパク質をコードするDNA；又は配列番号３に示すアミノ酸配列において1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つDYRK活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
【００２８】
ここで、「DYRK活性」は、DYRK活性部位に存在するチロシン残基を自己リン酸化する活性を意味する。DYRK活性はさまざまな方法で測定できるが、公知の方法、例えば、市販の抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロットによって、自己リン酸化したタンパク質を検出することによって測定できる。
【００２９】
本発明においては、親株の緑藻を、以上に説明したLMR-DYRK遺伝子によりコードされるDYRKの活性を低下させる方法に供することで、本発明に係る緑藻変異体を得ることができる。
【００３０】
ここで、DYRK活性を低下させる方法としては、例えば
(1) LMR-DYRK遺伝子を破壊する；
(2) LMR-DYRK遺伝子の転写を抑制し、該遺伝子の発現を低下させる；
(3) LMR-DYRK遺伝子の翻訳を抑制し、該遺伝子の翻訳効率を低下させる;
方法が挙げられる。
【００３１】
(1) LMR-DYRK遺伝子を破壊する方法
本発明において、LMR-DYRK遺伝子破壊緑藻株とは、本来的には対立遺伝子、アイソマー等の複数のLMR-DYRK遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも1つ又は複数のLMR-DYRK遺伝子を破壊した緑藻株を意味する。
LMR-DYRK遺伝子の破壊方法としては、緑藻のゲノムDNA上のLMR-DYRK遺伝子領域又はその上流にあるプロモーター領域のDNAに塩基の置換、欠失、挿入及び/又は付加を伴う変異を導入する方法が挙げられる。
【００３２】
(2) LMR-DYRK遺伝子の転写を抑制し、該遺伝子の発現を低下させる方法
LMR-DYRK遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる緑藻におけるLMR-DYRK遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型緑藻を調製し、当該変異型緑藻を転写抑制条件下で培養する方法が挙げられる。
また、緑藻におけるLMR-DYRK遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入して作出したものを用いても良い。
【００３３】
(3) LMR-DYRK遺伝子の翻訳を抑制し、該遺伝子の翻訳効率を低下させる方法
LMR-DYRK遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスRNAを用いる方法(例えば、RNAi法)が挙げられる。すなわち、LMR-DYRK遺伝子のmRNAに対するアンチセンスRNAを転写する遺伝子を、緑藻ゲノムに組み込み、当該アンチセンスRNAを過剰発現させることで、LMR-DYRK遺伝子のmRNAの翻訳が抑制される。
【００３４】
具体的に、本発明に係るLMR-DYRK活性を低減した緑藻変異体は、以下の手順に従って作出できる。すなわち、親株の緑藻に突然変異誘起物質を作用させた後、脂質含量が上昇した変異体をスクリーニングし、得られた変異体においてLMR-DYRK遺伝子に変異が起こっていることを確認することによって作出できる。
【００３５】
あるいは、本発明に係るLMR-DYRK活性を低減した緑藻変異体は、以下に示す2段階の遺伝子操作によって、より効率良く作出することができる。
(i) LMR-DYRK遺伝子の部分塩基配列の決定
脂質生産性を向上させる対象とする緑藻の持つLMR-DYRK遺伝子の部分塩基配列を、以下の手順で決定する。P. ellipsoidea Obi株由来の配列番号１に示す塩基配列から成る遺伝子によりコードされるLMR-DYRKを含むDYRKサブファミリーに属するタンパク質には非常に良く保存されたアミノ酸配列が存在するので、そのアミノ酸配列を元に設計されたPCRプライマーを用いてPCR増幅反応を行い、増幅されたDNA断片を大腸菌にクローン化した後、そのDNA断片の塩基配列を決定すれば良い。このPCR増幅反応に用いるプライマーの例を図２に示す。図２において、Forward primer(配列番号５)は、保存されたアミノ酸配列(IHCDLKPEN)から設計した。一方、Reverse primer(配列番号６及び７)は、アミノ酸配列(IDMWSLGC)から設計した。二種類のReverse primerのいずれかで、PCR増幅が達成されることが予想される。塩基配列はIUPACの定める表示に従う。
【００３６】
一つの生物に複数のDYRK遺伝子が含まれている場合があり、PCR増幅されたDNA断片を直接シーケンシング反応に供することは避けるべきである。このようにして得られたDYRK遺伝子部分配列をさらに拡張したい場合は、インバースPCR法(Huang SH. (1994) Inverse polymerase chain reaction. An efficient approach to cloning cDNA ends. Mol Biotechnol. 12:15-22.)等を用いれば良い。また、近年、所謂次世代シーケンシング技術が発達し、ゲノム全塩基配列の決定が非常に容易になった。そこで、対象緑藻のゲノム全塩基配列を先ず決定し、その中から、配列番号１に示したP. ellipsoidea Obi株由来のLMR-DYRK遺伝子配列に最も近縁な配列をLMR-DYRK遺伝子候補として選抜すれば良い。
【００３７】
(ii) LMR-DYRK遺伝子候補ノックアウト
一度、LMR-DYRK遺伝子候補の塩基配列が決定されれば、ZFN、TALENあるいはCRISPR/Casと呼ばれる遺伝子ノックアウト法(Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31:397-405.)を用いることにより、その遺伝子が欠損した変異体を作出できる。
【００３８】
(iii) LMR-DYRK遺伝子候補ノックダウン
あるいは、RNAi法(Cerutti H, Ma X, Msanne J, Repas T. (2011) RNA-mediated silencing in Algae: biological roles and tools for analysis of gene function. Eukaryot Cell. 10:1164-1172.)を用いても、LMR-DYRKの発現を抑制できる。
【００３９】
以上のようにして得られた緑藻変異体の脂質生産性を、実施例１に説明する方法等によって測定し、脂質生産性の向上が確認できれば、本発明に係るLMR-DYRK活性を減少させた緑藻変異体の作出が完成する。
【００４０】
本発明に係る緑藻変異体は、単位時間及び単位培養面積当たりの脂質生産量が親株又は野生株よりも有意に(例えば、1.1倍以上、好ましくは1.3倍以上)向上している。ここで、単位時間及び単位培養面積当たりの脂質生産量は、例えば培養時間(1日)及び培養面積(m2)当たりの脂質生産量(g)(g/m2/day)と表すことができる。
【００４１】
さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係る緑藻変異体を、(大量)培養し、脂質を生産することを含む、脂質生産方法を含む。大量培養法としては、既に確立されている特願2012-273633号(発明の名称：微細藻類の培養方法及び培養システム)に記載の培養法等を用いることができる。具体的には、pHが4以下であり、アンモニア態窒素を含む培養液を用いて、微細藻類を培養する方法である。この培養方法によれば、溶液のpHが4以下であるので、他の微細藻類や原生生物の増殖が生じにくく、特に、培養液がアンモニア態窒素（例えば尿素）を含むことにより、他の微細藻類や原生生物の増殖が一層生じにくい。これらの効果により、屋外における大量培養を容易に実現することができる。また、培養液中にCO2を導入しても、重炭酸イオンが生じないので、培養液のpHが変動しにくい特徴もある。更に、窒素源を尿素とすることで、培養前後における培地pHの変動は生じず、微細藻類の培養に用いた培養液から微細藻類の全部又は一部を回収し、回収後の培養液を用いて新たな微細藻類を培養することができる。この場合、培養液を再利用できるので、微細藻類の培養コストを大幅に低減することができる。
培養後、例えば培養物からヘキサン抽出等によって、脂質を得ることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
〔実施例１〕P. ellipsoidea脂質高蓄積変異体の分離
１−１．P. ellipsoidea脂質高蓄積変異体の分離
P. ellipsoidea 5P株(受託番号FERM P-22179;特許文献３)を、MA5培地［硝酸ナトリウム 1.5 g、硫酸マグネシウム 100 mg、リン酸二水素カリウム 35 mg、リン酸水素二カリウム 45 mg、塩化カルシウム 9 mg、クエン酸鉄アンモニウム 19.6 mg、クエン酸 12 mg、EDTA-2Na 2 mg、ホウ酸 0.07 mg、硫酸マンガン 0.15 mg、硫酸亜鉛 0.30 mg、硫酸銅 0.3 mg、モリブデン酸ナトリウム 0.003 mg、塩化コバルト 0.07 mg、HEPES 4.76 g、蒸留水 1L （pH 7.0）］中で、100 μmol m-2 s-1の光強度の植物用蛍光灯下、1％ CO2を含む空気をバブリングさせて培養した(特に断らない限り、以下同様の培養条件を用いて液体培養を行った)。
【００４４】
対数増殖期の細胞を遠心分離(3,000 rpm、5 min)で集め、クエン酸緩衝液(0.1 M、pH 5.5)中に細胞を懸濁した後、500 μg/mlのNTG(ニトロゾグアニジン（1-methyl-2-nitro-1-nitrosoguanidine）)を1時間、室温で処理した。処理後の細胞を、リン酸緩衝液(0.1 M、pH 7.0)で洗浄した後、MA5培地に懸濁し培養した。
【００４５】
培養後、細胞内の脂質を200 μM BODIPY 505/515で蛍光染色し、セルソーター(FACS)を用いて、蛍光強度の高い、すなわち脂質含量が高いと思われる細胞を濃縮し、濃縮した細胞をMA5培地で培養した。培養後、セルソーターによる濃縮を再度行った。この、「セルソーターによる濃縮と培養」のサイクルを3回繰り返した後、最後の培養液中のP. ellipsoidea細胞をMA5寒天培地上に広げ、生育したシングル・コロニーを、それぞれ新たなプレートに播種した。
【００４６】
このようにして確立された約100個のシングルコロニー由来の株をそれぞれ液体培養し、蛍光強度の測定と生育速度の評価により、生育速度が野生株と同等であり、細胞当たりのBODIPY 505/515蛍光が野生型よりも増加した変異株を選抜した。
【００４７】
このようにして得られた脂質高蓄積変異体の候補を、A6培地［硫酸アンモニウム 50 mg、尿素 150 mg、硫酸マグネシウム7水和物 100 mg、リン酸二水素カリウム 35 mg、リン酸水素二カリウム 45 mg、塩化カルシウム2水和物 9 mg、クエン酸鉄アンモニウム 19.6 mg、クエン酸 12 mg、EDTA-2Na 2 mg、ホウ酸 0.07 mg、硫酸マンガン 0.15 mg、硫酸亜鉛 0.30 mg、硫酸銅 0.3 mg、モリブデン酸ナトリウム 0.003 mg、塩化コバルト 0.07 mg、蒸留水 1 L （pH 4.0）］中で培養し、経時的に乾燥重量と脂質含量とを測定した。
【００４８】
また、P. ellipsoideaの脂質含量は、窒素源が枯渇した後上昇するので、上記MA5培地又はA6培地で前培養した細胞を、窒素源を抜いたMA5培地又はA6培地に移し、移植後0、3、6、9、12、15、18日においてサンプリングを行い、乾燥重量と脂質含量とを測定した。
【００４９】
１−２．脂質含量測定
脂質含量測定は2つの方法で行った。第一の方法は、脂質を抽出し、メチルエステル化した後、GC-FIDで定量するものである。細胞培養液を、105℃で乾燥後秤量したGF/Fガラスフィルター上に捕集し、蒸留水で洗浄後、乾燥重量を測定した。また、同量の培養液から細胞を遠心分離により回収し、0.1 N HClに懸濁し、100℃、5 minの加熱処理を行い、Bligh-Dyer法(Bligh EG and Dyer WJ. (1959) A rapid method for total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37:911-917)に従い、脂質の抽出を行った。これに一定量のn-pentadecaneを内部標準として加えた。
【００５０】
抽出サンプルは遠心濃縮機によって乾固し、脂肪酸メチルエステル化キット(ナカライテスク）及びメチルエステル精製キット(ナカライテスク)を用いて脂肪酸メチルエステルを回収し、再度乾固した。乾固物を5 mlのn-hexaneに溶解して脂肪酸メチルエステル・サンプルとし、下記の条件においてGC-FIDで定量した。
【００５１】
装置：Shimadzu GC-2010 Plus
カラム：factor FOUR VF-5 ms、0.20 nm(内径), 30 m(長さ), 0.33 μm(膜厚)
温度：100℃(2 min)−20℃/min−310℃(10 min)
気化室：240℃ Splitless
検出器：FID 320℃
Carrier Gas：He
【００５２】
定量の対象とした成分は、主成分であるC16:0、C16:1、C16:2、C18:0、C18:1、C18:2、C20:0、C20:1のメチルエステル化合物であり、これらの濃度から、細胞内に蓄積されたトリグリセリドの含量を推定した。
【００５３】
一方、第二の方法として、NMRによる油分含量測定も併せて行った。細胞を8,000 rpm、5分以上の遠心分離で収穫し、凍結乾燥させた後、40 mg程度を量りとり、Oxford Instrumets社製モデルMQC油分測定装置で単位乾燥重量当たりの油分含量を測定した。検量線は、日本薬局方のオリーブ油を標準物質として作成した。
【００５４】
以上のようにして測定された乾燥重量当たりの脂質含量(％)と液体培地1 L当たりの乾燥重量(mg L-1)とを掛け合わせて、培養日数で割ったものを、培地1 L当たりの脂質生産性(mg d-1 L-1)と定義した。
【００５５】
以上の実験から、培地1 L当たりの脂質生産性が優れた3株を選抜し、JH1011、JH1012及びJH1013と命名した。
【００５６】
図３に、JH1011、JH1012及びJH1013株の細胞内脂質含量の変化を示す。JH1011、JH1012及びJH1013株では、野生株であるObi株(WT)、及びこれらの変異株の直接の親株である5P株よりも脂質含量が大幅に上昇していることが分かる。すなわち、野生型及び5P株の最大脂質含量が30％程度であるのに対して、JH1011、JH1012及びJH1013株の最大脂質含量は50％を超えている(図３(Ｂ））。
【００５７】
JH1011、JH1012及びJH1013株の培地1 L当たりの脂質生産性も図３に示す。JH1011、JH1012及びJH1013株では、野生株であるObi株(WT)、及びこれらの変異株の直接の親株である5P株よりも、培地1 L当たりの脂質生産性が大幅に上昇していることが分かる。
【００５８】
１−３．レースウェイを用いた培養評価
室内に設置したレースウェイ(図４)を用いて、JH1011、JH1012及びJH1013株の脂質生産性の評価試験を実施した。レースウェイの設置面積は3.8m2であり、容量は490 Lに設定した。培養については、光量200-300 μmol m-2 sec-1、明暗周期12 h/12 h、CO2濃度は1％の条件下で実施した。使用した培地の組成は、以下の通りである［硫酸アンモニウム 45 mg、硫酸マグネシウム7水和物 30 mg、リン酸二水素カリウム 10 mg、リン酸水素二カリウム 5 mg、塩化カルシウム2水和物 10 mg、炭酸カルシウム 10 mg、クエン酸鉄 2 mg、クエン酸 2 mg、EDTA-2Na 2 mg、ホウ酸 0.07 mg、硫酸マンガン 0.15 mg、硫酸亜鉛 0.30 mg、硫酸銅 0.3 mg、モリブデン酸ナトリウム 0.003 mg、塩化コバルト 0.07 mg、Biotin 2 μg、Thiamine HCl 10 μg、Vitamin B6 1 μg、Vitamin B12 1 μg、蒸留水 1 L （pH 4.0）］。
【００５９】
培養期間中は、培地1 L当たりの藻体乾燥重量を測定した。培養終了後、回収した藻を凍結乾燥し、第１−２節に記載するように、Oxford Instrumets社製モデルMQC油分測定装置を用いてオイル含量を測定した。
【００６０】
JH1011、JH1012及びJH1013株の増殖速度は、5P株とほぼ同等であるが、相対的に脂質含量が高く結果として脂質生産性が大幅に向上している(図５)。培養時間(1日)及び培養面積(m2)当たりの脂質生産性(g)を下記の表１に示す。
【００６１】
【表１】
2015097504.tif 000003
【００６２】
表１に示すように、室内レースウェイ評価の結果、JH1011、JH1012及びJH1013株は、野生株及び5P株に対し、脂質生産性がそれぞれ最大68％及び84％向上している。
【００６３】
〔実施例２〕JH1011、JH1012及びJH1013株のゲノム解析
実施例１で分離したJH1011、JH1012及びJH1013株に見られた脂質生産性の改良がどのような遺伝子の変異によって誘起されたのかを知るために、これら3株のゲノム解析(resequencing)をIllumina HiSeq paired-endsequencingによって行った。そして、このresequencingの結果をELANDv2 ソフトウェアを用いて、既に構築されているP. ellipsoidea Obi株ゲノム配列上にマップした。このP. ellipsoidea Obi株のゲノム配列には、RNA-seqで得られた配列情報から予測された、各遺伝子のエクソン及びイントロンの位置も含まれている。よって、これらの情報をもとに、JH1011、JH1012及びJH1013株において、どの遺伝子に変異が起きたかを、Obi株並びにJH1011、JH1012及びJH1013株の直接の親株である5P株のゲノム配列との比較で解析した。
以下の表２には、JH1013株のゲノム塩基配列比較解析の結果を示している。
【００６４】
【表２】
2015097504.tif 000004
2015097504.tif 000005
【００６５】
JH1013株のゲノム配列は、P. ellipsoidea Obi株ゲノム配列の98.7％をカバーしており、カバーした部分で、54の塩基置換変異が検出された。そのうちの5は転写されない領域(これをintergenic regionと定義した)の変異であった。残りの49の変異は、転写が観察された領域(これを遺伝子と定義した)にあった。変異が起こった遺伝子の機能を、Swiss-Prot protein databaseに対するBlast searchの結果と、InterProでのモチーフ検索の結果とを加味して推定した。
【００６６】
その結果、この45遺伝子の変異のうち、アミノ酸をコードする領域(CDR)に変異が起きていたのは11遺伝子のみであり、その中で、アミノ酸置換を伴う変異(non-synonimous mutation)が起こったのは7遺伝子であった。これら7遺伝子の中で、JH1013株の形質、すなわち、脂質生産性の向上の原因遺伝子となり得るものとして、転写因子の可能性を持つLeu zipper containing protein遺伝子、シグナル伝達に関わると思われるDYRK遺伝子及び3-Phosphoinositide-dependent protein kinase遺伝子、そして機能不明の3遺伝子の計6遺伝子が候補として残った。
【００６７】
同様の解析を、JH1011株で行った。この株には、丁度100の変異が検出されたが、アミノ酸置換を伴う変異は11遺伝子のみで検出された。これら11遺伝子のうち、Predicted proteinとアノテーションされた機能未知の3つの遺伝子を除くと、脂質生産性の向上を説明できる遺伝子変異は見出されなかった。しかしながら、DYRK遺伝子のCDR外のエキソン中に、スプライシングを妨げる変異が存在し、これによってDYRK遺伝子の発現が大きく妨げられていることが予想された。
【００６８】
同様の解析を、JH1012株で行った。この株においても、検出された102の変異のうち、アミノ酸置換を伴うものが8遺伝子で検出された。これらの遺伝子のうち、Predicted proteinとアノテーションされた機能未知の3つの遺伝子を除くと、脂質生産性の向上を説明できる遺伝子変異としては、DYRK遺伝子及び他のファミリーに属するプロテイン・キナーゼ遺伝子のみが候補として残った。
【００６９】
以上の結果から、JH1011、JH1012及びJH1013株には、共通して、DYRKの活性を損なうような変異が見出された。P. ellipsoideaのゲノム中には約10,000の遺伝子が存在する。そして、JH1011、JH1012及びJH1013株には、それぞれ、約100の変異が導入された。このことから、JH1011、JH1012及びJH1013株のそれぞれに、DYRK遺伝子における変異がランダムに導入される確率は、それぞれ1/100であり、3株に同時に、DYRK遺伝子の変異を持つ確率は100万分の1である。
【００７０】
もし、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えるような突然変異を考えるならば、JH1011、JH1012及びJH1013株のそれぞれには、約10の変異が導入されていることから、これら3株が、偶然にDYRKのアミノ酸配列を起こす変異を持つ確率は、10-9となる。
【００７１】
以上の考察から、JH1011、JH1012及びJH1013株の脂質生産性の向上に寄与したのは、配列番号１に記載の塩基配列から成る遺伝子から転写された配列番号２に記載の塩基配列から成るRNAによりコードされる配列番号３に記載のアミノ酸配列から成るDYRKの変異であると結論付けた。JH1011、JH1012及びJH1013株のDYRK遺伝子に起こった変異を図６−１〜図６−４に示す。
【００７２】
図６−１においては、配列番号１で示したDYRK遺伝子配列中に起こったJH1011、JH1012及びJH1013株の変異部位を下線で示し、変化を同じ行の右に示す。JH1011株の変異は、イントロンの5'端のGT配列がATに変化し、その結果イントロンのスプライシングがその部分で起こらなくなったと考えられる。JH1012株では、欠失突然変異がエクソン領域で起こり、その結果、フレームシフトが起こっている。JH1013株では、塩基置換がエクソン領域で起こり、その結果、コドンがTGCからTTCに変化し、その部分でのアミノ酸配列がCからFに変化した。
【受託番号】
【００７３】
FERM BP-10484
FERM P-22179
【図１】
2015097504.tif 000006
【図２】
2015097504.tif 000007
【図３】
2015097504.tif 000008
【図４】
2015097504.tif 000009
【図５】
2015097504.tif 000010
【図６−１】
2015097504.tif 000011
【図６−２】
2015097504.tif 000012
【図６−３】
2015097504.tif 000013
【図６−４】
2015097504.tif 000014
【配列表】
2015097504000001.app