(57)【要約】【課題】多臓器不全、特に急性腎障害に起因する多臓器不全の有効な予防又は治療手段を提供する。【解決手段】本発明は、アドレノメデュリン若しくは多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体又はそれらの塩、或いはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、急性腎障害に起因する多臓器不全の予防又は治療薬に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドレノメデュリン若しくは多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体又はそれらの塩、或いはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、急性腎障害に起因する多臓器不全の予防又は治療薬。
【請求項２】
前記アドレノメデュリン又は多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体が、下記：
（i）アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
（ii）アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
（iii）（ii）のペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド、
（iv）（i）〜（iii）のいずれかのペプチドにおいて、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド、
（v）（i）〜（iv）のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
（vi）（i）〜（iv）のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドである、請求項1に記載の予防又は治療薬。
【請求項３】
前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記：
（a）配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（b）配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（c）配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（d）配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（e）配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（f）配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（g）前記（a）〜（f）のいずれかのペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド；
（h）前記（a）〜（g）のいずれかのペプチドにおいて、1〜15個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド；
（i）前記（a）〜（h）のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド；並びに
（j）前記（a）〜（h）のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドである、請求項1又は2に記載の予防又は治療薬。
【請求項４】
前記急性腎障害に起因する多臓器不全が、急性腎障害に起因する肝障害である、請求項1〜3のいずれか１項に記載の予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する、急性腎障害に起因する多臓器不全の予防又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
多臓器不全（multiple organ failure、以下、「MOF」とも記載する）は、腎、肝、心血管系、呼吸器系、血液凝固系、消化器系及び神経系の7個の臓器系のうち、2個以上が同時に、又は連鎖的に機能不全に陥った病態と定義される（非特許文献1及び2）。多臓器不全の一部として発症することの多い急性腎障害（acute kidney injury、以下、「AKI」とも記載する）は、急激な腎機能の低下により、水電解質異常、代謝性アシドーシス又は高窒素血症等が生じた病態と定義される（非特許文献3）。急性腎障害は、集中治療室に入院する患者の17.7〜59.4％に発症し、その死亡率は、44.1〜72.6％であったことが報告されている（非特許文献4及び5）。また、急性腎障害患者における、死亡に対する心血管不全及び肝不全のオッズ比は、それぞれ1.68〜7.7及び5.37〜6.3であったことも報告されている（非特許文献1及び6）。この結果は、急性腎障害に他の臓器不全、特に心又は肝の臓器不全が合併した場合、予後が極めて悪くなる可能性があることを示唆する。最近、腎障害後に血中で増加する尿毒症物質が、低酸素に関連するメカニズムを介して、組織障害を引き起こす可能性が報告されている（非特許文献7）。
【０００３】
アドレノメデュリン（adrenomedullin、以下、「AM」とも記載する）は、1993年に褐色細胞組織より単離及び同定された生理活性ペプチドである（非特許文献8）。発見当初、AMは、強力な血管拡張性の降圧作用を発揮することが判明した。例えば、特許文献1は、ヒトAMのアミノ酸配列を含む血圧降下作用を有するペプチドを記載する。
【０００４】
その後の研究により、AMは、心血管保護作用、抗炎症作用、血管新生作用及び組織修復促進作用等の、多彩な薬理作用を発揮する多機能性生理活性物質であることが明らかになった。また、AMの薬理作用を、疾患治療に応用することを目指して、種々の疾患患者に対するAMの投与研究が行われてきた。例えば、炎症性腸疾患、末梢血管疾患又は急性心筋梗塞の治療薬としてのAMの有用性が期待されている。
【０００５】
特許文献2は、アドレノメデュリン若しくはその誘導体であって、非細菌性の炎症を抑制する活性を有するもの、又はそれらの塩であって非細菌性の炎症を抑制する活性を有するものを有効成分として含有する非細菌性の炎症性腸疾患の予防又は治療剤を記載する。
【０００６】
特許文献3は、ステロイド製剤、免疫抑制剤又は生物学的製剤の使用が困難又は効果不十分な炎症性腸疾患の予防又は治療を必要とする患者における前記炎症性腸疾患の予防又は治療方法であって、有効量のアドレノメデュリン、その修飾体であって炎症を抑制する活性を有するもの、又は前記アドレノメデュリン若しくは前記修飾体の塩であって炎症を抑制する活性を有するものを前記患者に投与することを含む前記予防又は治療方法を記載する。
【０００７】
AMは、臓器保護作用を有することも判明した（非特許文献9）。しかしながら、AMが、多臓器不全を発症した対象において臓器保護作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第2774769号公報
【特許文献２】特許第4830093号公報
【特許文献３】国際公開第2012/096411号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Schwilk B, Wiedeck H, Stein B, Reinelt H, Treiber H, Bothner U. 1997年, Epidemiology of acute renal failure and outcome of haemodiafiltration in intensive care. Intensive Care Med, 第23巻, p. 1204-1211.
【非特許文献２】Lefering R, Goris RJ, van Nieuwenhoven EJ, Neugebauer E. 2002年, Revision of the multiple organ failure score. Langenbecks Arch Surg, 第387巻, p. 14-20.
【非特許文献３】Levey AS, Levin A, Kellum JA. 2013年, Definition and classification of kidney diseases. Am J Kidney Dis, 第61巻, p. 686-688.
【非特許文献４】Samimagham HR, Kheirkhah S, Haghighi A, Najmi Z. 2011年, Acute kidney injury in intensive care unit: incidence, risk factors and mortality rate. Saudi J Kidney Dis Transpl, 第22巻, p. 464-470.
【非特許文献５】Martin-Loeches I, Papiol E, Rodriguez A, Diaz E, Zaragoza R, Granada RM, Socias L, Bonastre J, Valverdu M, Pozo JC, Luque P, Julia-Narvaez JA, Cordero L, Albaya A, Seron D, Rello J. 2011年, H1N1 SEMICYUC Working Group: Acute kidney injury in critical ill patients affected by influenza A (H1N1) virus infection. Crit Care, 第22巻, R66.
【非特許文献６】Mehta RL, Pascual MT, Gruta CG, Zhuang S, Chertow GM. 2002年, Refining predictive models in critically ill patients with acute renal failure. J Am Soc Nephrol, 第13巻, p. 1350-1357.
【非特許文献７】Palm F, Nangaku M, Fasching A, Tanaka T, Nordquist L, Hansell P, Kawakami T, Nishijima F, Fujita T. 2010年, Uremia induces abnormal oxygen consumption in tubules and aggravates chronic hypoxia of the kidney via oxidative stress. Am J Physiol Renal Physiol, 第299巻, F380-F386.
【非特許文献８】Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun, 1993年4月30日, 第192(2)巻, pp. 553-601.
【非特許文献９】Kato J, Tsuruda T, Kita T, Kitamura K, Eto T. 2005年, Adrenomedullin: a protective factor for blood vessels. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 第25巻, p. 2480-2487.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
多臓器不全のなかでも、急性腎障害に起因する多臓器不全、例えば、急性腎障害に起因する心障害又は肝障害は、予後が極めて悪くなる可能性がある。しかしながら、多臓器不全の病態において、腎及び心、腎及び肝等の特定の臓器間における連関不全のメカニズムについては、大部分が不明のままである。このため、多臓器不全に対する特異的な治療薬は、未だ開発されていない。また、特定の臓器不全に対する治療薬が、このような多臓器不全の予防又は治療に使用し得ることは知られていない。それ故、多臓器不全、特に急性腎障害に起因する多臓器不全の有効な予防又は治療手段の開発が必要とされていた。
【００１１】
それ故、本発明は、多臓器不全、特に急性腎障害に起因する多臓器不全の有効な予防又は治療手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、アドレノメデュリンが、急性腎障害に起因する多臓器不全の一病態である肝障害を軽減する効果を有することを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【００１４】
（1）  アドレノメデュリン若しくは多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体又はそれらの塩、或いはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、急性腎障害に起因する多臓器不全の予防又は治療薬。
【００１５】
（2）  前記アドレノメデュリン又は多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体が、下記：
（i）アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
（ii）アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
（iii）（ii）のペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド、
（iv）（i）〜（iii）のいずれかのペプチドにおいて、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド、
（v）（i）〜（iv）のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
（vi）（i）〜（iv）のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドである、前記（1）に記載の予防又は治療薬。
【００１６】
（3）  前記アドレノメデュリン又はその修飾体が、下記：
（a）配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（b）配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（c）配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（d）配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（e）配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（f）配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（g）前記（a）〜（f）のいずれかのペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド；
（h）前記（a）〜（g）のいずれかのペプチドにおいて、1〜15個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド；
（i）前記（a）〜（h）のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド；並びに
（j）前記（a）〜（h）のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドである、前記（1）又は（2）に記載の予防又は治療薬。
【００１７】
（4）  前記急性腎障害に起因する多臓器不全が、急性腎障害に起因する肝障害である、前記（1）〜（3）のいずれかに記載の予防又は治療薬。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、多臓器不全、特に急性腎障害に起因する多臓器不全の有効な予防又は治療手段を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、BNx処置又は腎I/R処置後6、24及び32時間における血漿尿素窒素 (UN) 濃度及び血漿クレアチニン (CRE) 濃度を示す図である。A：BNx処置後の血漿尿素窒素 (UN) 濃度；B：腎I/R処置後の血漿尿素窒素 (UN) 濃度；C：BNx処置後の血漿クレアチニン (CRE) 濃度；D：腎I/R処置後の血漿クレアチニン (CRE) 濃度。
【図２】図2は、BNx処置又は腎I/R処置後6、24及び32時間における血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性を示す図である。A：BNx処置後の血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；B：腎I/R処置後の血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；C：BNx処置後のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性；D：腎I/R処置後のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性。
【図３】図3は、AMを投与したBNx処置又は腎I/R処置マウスにおける血漿尿素窒素 (UN) 濃度及び血漿クレアチニン (CRE) 濃度を示す図である。A：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおける血漿尿素窒素 (UN) 濃度；B：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおける血漿尿素窒素 (UN) 濃度；C：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおける血漿クレアチニン (CRE) 濃度；D：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおける血漿クレアチニン (CRE) 濃度。
【図４】図4は、AMを投与したBNx処置又は腎I/R処置マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性示す図である。A：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；B：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；C：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性；D：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜1. アドレノメデュリンを含有する医薬＞
本発明において、アドレノメデュリン（AM）は、ヒト褐色細胞組織より単離及び同定されたヒト由来のペプチド（配列番号1、非特許文献1）だけでなく、例えばブタ（配列番号3）、イヌ（配列番号5）、ウシ（配列番号7）、ラット（配列番号9）又はマウス（配列番号11）等の他の非ヒト哺乳動物（例えば温血動物）由来のペプチド（オーソログ）であってもよい。生体内において、これらのペプチドは、そのアミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しており、且つC末端がアミド化されている。本明細書において、前記ペプチドであってジスルフィド結合及びC末端アミド基を有するものを、「天然型アドレノメデュリン」又は単に「アドレノメデュリン」と記載する場合がある。本発明は、前記のいずれのペプチドに対しても適用することができる。
【００２１】
本明細書において、「C末端のアミド化」は、生体内におけるペプチドの翻訳後修飾の一態様を意味し、具体的には、ペプチドのC末端アミノ酸残基の主鎖カルボキシル基がアミド基の形態へ変換される反応を意味する。また、本明細書において、「システイン残基のジスルフィド結合の形成」又は「システイン残基のジスルフィド化」は、生体内におけるペプチドの翻訳後修飾の一態様を意味し、具体的には、ペプチドのアミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合（-S-S-）を形成する反応を意味する。生体内で産生される多くの生理活性ペプチドは、はじめ分子量のより大きな前駆体タンパク質として生合成され、これが細胞内移行の過程で、C末端アミド化及び／又はシステイン残基のジスルフィド化のような翻訳後修飾反応を受けて、成熟した生理活性ペプチドとなる。C末端のアミド化は、通常は、前駆体タンパク質に対し、C末端アミド化酵素が作用することによって進行する。C末端アミド基を有する生理活性ペプチドの場合、その前駆体タンパク質においては、アミド化されるC末端カルボキシル基にGly残基が結合しており、該Gly残基がC末端アミド化酵素によってC末端アミド基に変換される。また、前駆体タンパク質のC末端側プロペプチドには、例えばLys-Arg又はArg-Arg等の塩基性アミノ酸残基の組合せの繰返し配列が存在する（水野、生化学第61巻、第12号、1435〜1461頁（1989））。システイン残基のジスルフィド化は、酸化的条件下で進行し得る。生体内においては、システイン残基のジスルフィド化は、通常は、前駆体タンパク質に対し、タンパク質ジスルフィド異性化酵素が作用することによって進行する。
【００２２】
本発明者らは、アドレノメデュリンが、急性腎障害に起因する多臓器不全の一病態である肝障害を軽減する効果を有することを見出した。それ故、本発明は、多臓器不全の予防又は治療に使用するための、アドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬を提供する。アドレノメデュリン又はその修飾体を、多臓器不全を有する対象に適用することにより、多臓器不全の発症又は進行を実質的に抑制することができる。
【００２３】
本発明の医薬の一態様は、アドレノメデュリン若しくは多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体又はそれらの塩、或いはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、多臓器不全の予防又は治療薬である。本発明の医薬の別の態様は、アドレノメデュリン若しくは多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体又はそれらの塩、或いはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する、多臓器不全の予防又は治療剤である。
【００２４】
本発明において、多臓器不全は、急性腎障害に起因する多臓器不全であることが必要である。急性腎障害に起因する多臓器不全は、急性腎障害に起因する肝障害又は心障害であることが好ましく、急性腎障害に起因する肝障害であることがより好ましい。前記急性腎障害に起因する肝障害は、低酸素（hypoxia）に関連するメカニズムを介して発症する肝障害であることが好ましい。アドレノメデュリンは、急性腎障害に起因する多臓器不全の一病態である肝障害を軽減することができる。前記肝障害は、低酸素に関連するメカニズムを介して発症すると考えられる。それ故、アドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有することにより、本発明の医薬は、前記の病態を包含する多臓器不全を実質的に予防又は治療することができる。
【００２５】
なお、急性腎障害の発症又は進行は、限定するものではないが、例えば、対象において、血漿尿素窒素 (UN) 濃度又は血漿クレアチニン (CRE) 濃度のような腎機能のマーカーの変動を測定することにより、評価することができる。また、急性肝障害の発症又は進行は、限定するものではないが、例えば、対象において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性のような肝機能のマーカーの変動を測定することにより、評価することができる。
【００２６】
本発明において、有効成分として含有されるアドレノメデュリンの修飾体は、多臓器不全の抑制活性を有するアドレノメデュリンの修飾体であることが必要である。多臓器不全の抑制活性は、急性腎障害に起因する多臓器不全の抑制活性であることが好ましく、急性腎障害に起因する肝障害又は心障害の抑制活性であることがより好ましく、急性腎障害に起因する肝障害の抑制活性であることが特に好ましい。本発明において、「アドレノメデュリンの修飾体」は、前記で説明した天然型アドレノメデュリンが化学修飾されたペプチドを意味する。また、本発明において、「多臓器不全の抑制活性」は、前記の病態を包含する多臓器不全の発症又は進行を実質的に抑制する活性を意味する。多臓器不全の抑制活性を有するアドレノメデュリンの修飾体を有効成分として含有することにより、本発明の医薬は、前記の病態を包含する多臓器不全を実質的に予防又は治療することができる。
【００２７】
なお、多臓器不全の抑制活性は、前記で説明した手段によって多臓器不全の発症又は進行を評価することにより、決定することができる。
【００２８】
本明細書において、多臓器不全の「予防」は、多臓器不全の発生（発症又は発現）を実質的に防止することを意味する。また、本明細書において、多臓器不全の「治療」は、発生（発症又は発現）した多臓器不全を抑制（例えば進行の抑制）、軽快、修復及び／又は治癒することを意味する。
【００２９】
前記アドレノメデュリン又は多臓器不全の抑制活性を有するその修飾体は、下記：
（i）アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチド、
（ii）アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチド、
（iii）（ii）のペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド、
（iv）（i）〜（iii）のいずれかのペプチドにおいて、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド、
（v）（i）〜（iv）のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド、並びに
（vi）（i）〜（iv）のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド
からなる群より選択されるペプチドであることが好ましい。
【００３０】
前記（i）〜（vi）のペプチドにおいて、（v）に包含される、アドレノメデュリンのアミノ酸配列からなり、C末端がアミド化されており、且つ該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチドは、成熟した天然型アドレノメデュリンに相当する。（i）のアドレノメデュリンのアミノ酸配列からなるペプチドは、C末端アミド化及びシステイン残基のジスルフィド化の翻訳後修飾を受ける前の（すなわち未成熟な）形態の天然型アドレノメデュリンに相当する。前記（i）〜（vi）のペプチドにおいて、前記で説明したペプチドを除く他のペプチドは、アドレノメデュリンの修飾体に相当する。
【００３１】
前記（ii）のペプチドは、前記（i）のペプチドの2個のシステイン残基のチオール基を空気酸化するか、又は適切な酸化剤を用いて酸化してジスルフィド結合に変換することにより、形成させることができる。前記（ii）のペプチドの立体構造は、天然型アドレノメデュリンの立体構造と実質的に略同等となる。これにより、アドレノメデュリンの修飾体の多臓器不全の抑制活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。
【００３２】
前記（iii）のペプチドは、前記（ii）のペプチドのジスルフィド結合をエチレン基に変換することにより、形成させることができる。ジスルフィド結合からエチレン基への置換は、当該技術分野で周知の方法により、行うことができる（O. Kellerら, Helv. Chim. Acta, 1974年, 第57巻, p. 1253）。前記（iii）のペプチドを用いることにより、該ペプチドの立体構造を安定化させることができる。それ故、前記（iii）のペプチドからなるアドレノメデュリンの修飾体は、生体内において、持続的に多臓器不全の抑制活性を発現することができる。
【００３３】
前記（iv）のペプチドにおいて、欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸残基は、1〜12個の範囲であることが好ましく、1〜10個の範囲であることがより好ましく、1〜8個の範囲であることがさらに好ましく、1〜5個の範囲であることが特に好ましく、1〜3個の範囲であることがもっとも好ましい。好適な（iv）のペプチドは、（i）〜（iii）のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1〜15位、1〜12位、1〜10位、1〜8位、1〜5位又は1〜3位のアミノ酸が欠失されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチドである。前記好適なペプチドにおいて、1又は複数個（例えば、1〜5個、1〜3個、又は1若しくは2個）のアミノ酸がさらに欠失、置換若しくは付加されていてもよい。前記（iv）のペプチドを用いることにより、該ペプチドの多臓器不全の抑制活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。
【００３４】
前記（vi）のペプチドは、C末端アミド化酵素の作用によってC末端のグリシン残基がC末端アミド基に変換されて、前記（v）のペプチドに変換されることができる。それ故、前記（vi）のペプチドを対象に投与することにより、該対象の生体内において、一定時間経過後に、C末端アミド化されたペプチドを形成させることができる。これにより、前記（vi）のペプチドからなるアドレノメデュリンの修飾体は、生体内において、持続的に多臓器不全の抑制活性を発現することができる。
【００３５】
前記アドレノメデュリン又はその修飾体は、下記：
（a）配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号1のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（b）配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号3のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（c）配列番号5のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号5のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（d）配列番号7のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号7のアミノ酸配列からなり、且つ16位のシステイン残基と21位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（e）配列番号9のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号9のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（f）配列番号11のアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号11のアミノ酸配列からなり、且つ14位のシステイン残基と19位のシステイン残基とがジスルフィド結合を形成しているペプチド；
（g）前記（a）〜（f）のいずれかのペプチドにおいて、前記ジスルフィド結合が、エチレン基によって置換されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド；
（h）前記（a）〜（g）のいずれかのペプチドにおいて、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチド；
（i）前記（a）〜（h）のいずれかのペプチドにおいて、C末端がアミド化されているペプチド；並びに
（j）前記（a）〜（h）のいずれかのペプチドにおいて、C末端にグリシン残基が付加されているペプチド；
からなる群より選択されるペプチドであることがより好ましい。
【００３６】
前記（h）のペプチドにおいて、欠失、置換若しくは付加されているアミノ酸残基は、1〜12個の範囲であることが好ましく、1〜10個の範囲であることがより好ましく、1〜8個の範囲であることがさらに好ましく、1〜5個の範囲であることが特に好ましく、1〜3個の範囲であることがもっとも好ましい。好適な（h）のペプチドは、（a）〜（g）のいずれかのペプチドにおいて、N末端側から1〜15位、1〜12位、1〜10位、1〜8位、1〜5位又は1〜3位のアミノ酸が欠失されており、且つ多臓器不全の抑制活性を有するペプチドである。前記好適なペプチドにおいて、1又は複数個（例えば、1〜5個、1〜3個、又は1若しくは2個）のアミノ酸がさらに欠失、置換若しくは付加されていてもよい。前記（h）のペプチドを用いることにより、該ペプチドの多臓器不全の抑制活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。
【００３７】
本発明において、アドレノメデュリン又はその修飾体は、該化合物自体だけでなく、その塩も包含する。アドレノメデュリン又はその修飾体が塩の形態である場合、薬学的に許容し得る塩であることが好ましく、多臓器不全の抑制活性を有する薬学的に許容し得る塩であることがより好ましい。本発明の化合物の塩の対イオンとしては、限定するものではないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、若しくは置換若しくは非置換のアンモニウムイオンのようなカチオン、又は塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、過塩素酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン、プロピオン酸イオン、乳酸イオン、マレイン酸イオン、ヒドロキシマレイン酸イオン、メチルマレイン酸イオン、フマル酸イオン、アジピン酸イオン、安息香酸イオン、2-アセトキシ安息香酸イオン、p-アミノ安息香酸イオン、ニコチン酸イオン、ケイ皮酸イオン、アスコルビン酸イオン、パモ酸イオン、コハク酸イオン、サリチル酸イオン、ビスメチレンサリチル酸イオン、シュウ酸イオン、酒石酸イオン、リンゴ酸イオン、クエン酸イオン、グルコン酸イオン、アスパラギン酸イオン、ステアリン酸イオン、パルミチン酸イオン、イタコン酸イオン、グリコール酸イオン、グルタミン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、シクロヘキシルスルファミン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、イセチオン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸イオン、若しくはナフタレンスルホン酸イオンのようなアニオンが好ましい。アドレノメデュリン又はその修飾体が前記の対イオンとの塩の形態である場合、該化合物の多臓器不全の抑制活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。
【００３８】
アドレノメデュリン又はその修飾体は、前記の化合物自体だけでなく、アドレノメデュリン若しくはその修飾体、又はその塩の溶媒和物も包含する。アドレノメデュリン若しくはその修飾体、又はその塩が溶媒和物の形態である場合、薬学的に許容し得る溶媒和物であることが好ましく、多臓器不全の抑制活性を有する薬学的に許容し得る溶媒和物であることがより好ましい。前記アドレノメデュリン若しくはその修飾体、又はその塩と溶媒和物を形成し得る溶媒としては、限定するものではないが、例えば、水、或いはメタノール、エタノール、2-プロパノール（イソプロピルアルコール）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、酢酸、エタノールアミン又は酢酸エチルのような有機溶媒が好ましく、水がより好ましい。特に好ましい溶媒和物は、水和物である。アドレノメデュリン若しくはその修飾体、又はその塩が前記の溶媒との溶媒和物の形態である場合、該化合物の多臓器不全の抑制活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。
【００３９】
アドレノメデュリン又はその修飾体は、前記の化合物自体だけでなく、その保護形態も包含する。本明細書において、「保護形態」は、1個又は複数個の官能基（例えばリジン残基の側鎖アミノ基）に保護基が導入された形態を意味する。また、本明細書において、「保護基」は、望ましくない反応の進行を防止するために、特定の官能基に導入される基であって、特定の反応条件において定量的に除去され、且つそれ以外の反応条件においては実質的に安定、即ち反応不活性である基を意味する。前記化合物の保護形態を形成し得る保護基としては、限定するものではないが、例えば、t-ブトキシカルボニル（Boc）、2-ブロモベンジルオキシカルボニル（Brz）、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、p-トルエンスルホニル（Tos）、ベンジル（Bzl）、4-メチルベンジル（4-MeBzl）、及び2-クロロベンジルオキシカルボニル（Cl-Z）等を挙げることができる。アドレノメデュリン又はその修飾体が前記の保護基による保護形態である場合、該化合物の多臓器不全の抑制活性を、天然型アドレノメデュリンと実質的に略同等のものとすることができる。
【００４０】
また、アドレノメデュリン又はその修飾体は、該化合物の個々のエナンチオマー及びジアステレオマー、並びにラセミ体のような、該化合物の立体異性体の混合物も包含する。
【００４１】
前記特徴を有することにより、アドレノメデュリン又はその修飾体は、多臓器不全の抑制活性を発現することができる。
【００４２】
本発明の医薬において、アドレノメデュリン又はその修飾体を単独で使用してもよく、1種以上の薬学的に許容し得る成分と組み合わせて使用してもよい。本発明の医薬は、所望の投与方法に応じて、当該技術分野で通常使用される様々な剤形に製剤されることができる。それ故、本発明の医薬はまた、アドレノメデュリン又はその修飾体と、1種以上の薬学的に許容し得る担体とを含有する医薬組成物の形態で提供されることもできる。本発明の医薬組成物は、前記成分に加えて、薬学的に許容し得る1種以上の担体、賦形剤、結合剤、ビヒクル、溶解補助剤、防腐剤、安定剤、膨化剤、潤滑剤、界面活性剤、油性液、緩衝剤、無痛化剤、酸化防止剤、甘味剤及び香味剤等を含んでもよい。
【００４３】
本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬の剤形は、特に限定されず、非経口投与に使用するための製剤であってもよく、経口投与に使用するための製剤であってもよい。また、本発明の医薬の剤形は、単位用量形態の製剤であってもよく、複数投与形態の製剤であってもよい。非経口投与に使用するための製剤としては、例えば、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液等の注射剤を挙げることができる。注射剤に混和することができる添加剤としては、限定するものではないが、例えば、生理食塩水、ブドウ糖若しくはその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール若しくは塩化ナトリウム）を含む等張液のようなビヒクル、アルコール（例えばエタノール若しくはベンジルアルコール）、エステル（例えば安息香酸ベンジル）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール）のような溶解補助剤、ポリソルベート80又はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油のような非イオン性界面活性剤、ゴマ油又は大豆油のような油性液、リン酸塩緩衝液又は酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝剤、塩化ベンザルコニウム又は塩酸プロカインのような無痛化剤、ヒト血清アルブミン又はポリエチレングリコールのような安定剤、保存剤、並びに酸化防止剤等を挙げることができる。調製された注射剤は、通常、適当なバイアル（例えばアンプル）に充填され、使用時まで適切な環境下で保存される。
【００４４】
経口投与に使用するための製剤としては、例えば、必要に応じて糖衣や溶解性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、タブレット、シロップ、懸濁液等を挙げることができる。錠剤又はカプセル剤等に混和することができる添加剤としては、限定するものではないが、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム及びアラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン及びアルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤等を挙げることができる。製剤がカプセル剤の場合、さらに油脂のような液状担体を含有してもよい。
【００４５】
本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬は、デポー製剤として製剤化することもできる。この場合、デポー製剤の剤形の本発明の医薬を、例えば皮下若しくは筋肉に埋め込み、又は筋肉注射により投与することができる。本発明の医薬をデポー製剤に適用することにより、アドレノメデュリン又はその修飾体の多臓器不全の抑制活性を、長期間に亘って持続的に発現することができる。
【００４６】
本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬は、医薬として有用な1種以上の他の薬剤と併用することもできる。この場合、本発明の医薬は、アドレノメデュリン又はその修飾体と1種以上の他の薬剤とを含む単一の医薬の形態で提供されてもよく、アドレノメデュリン又はその修飾体と1種以上の他の薬剤とが別々に製剤化された複数の製剤を含む医薬組合せの形態で提供されてもよい。医薬組合せの形態の場合、それぞれの製剤を同時又は別々に（例えば連続的に）投与することができる。
【００４７】
アドレノメデュリン又はその修飾体は、天然の生理活性ペプチドであるアドレノメデュリンと同一又は類似する構造を有する。このため、アドレノメデュリン又はその修飾体は、安全で低毒性である。それ故、本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬は、多臓器不全の予防又は治療を必要とする様々な対象に適用することができる。前記対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ、イヌ、ウシ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ネコ、サル、マントヒヒ、チンパンジー等の温血動物）の被験体又は患者であることが好ましい。前記対象に本発明の医薬を投与することにより、多臓器不全を予防又は治療することができる。
【００４８】
本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬を、対象、特にヒト患者に投与する場合、正確な投与量及び投与回数は、対象の年齢、性別、予防又は治療されるべき症状、疾患及び／又は障害の正確な状態（例えば重症度）、並びに投与経路等の多くの要因を鑑みて、担当医が治療上有効な投与量及び投与回数を最終的に決定すべきである。それ故、本発明の医薬において、有効成分であるアドレノメデュリン又はその修飾体は、治療上有効な量及び回数で、対象に投与される。例えば、本発明の医薬をヒト患者に投与する場合、有効成分であるアドレノメデュリン又はその修飾体の投与量は、通常は、1日に体重60 kg当り0.01〜10 mgの範囲であり、典型的には、1日に体重60 kg当り0.01〜1 mgの範囲である。
【００４９】
本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬の投与経路及び投与回数は、特に限定されず、経口的に単回若しくは複数回投与されてもよく、非経口的に単回若しくは複数回投与されてもよい。本発明の医薬は、静脈投与、注腸投与、皮下投与、筋肉内投与又は腹腔内投与のような非経口的経路で投与されることが好ましく、静脈投与されることがより好ましい。また、本発明の医薬は、単回投与されることが好ましい。本発明の医薬は、静脈に単回投与するために使用されることが特に好ましい。アドレノメデュリンは、強力な血管拡張作用を有する。このため、治療上有効な量のアドレノメデュリンを単回投与する場合、強力な血管拡張作用により、過度の血圧低下、反射性の交感神経活性上昇に伴う頻脈、及び／又はレニン活性の上昇のような望ましくない副反応を引き起こす可能性がある。それ故、本発明のアドレノメデュリン又はその修飾体を有効成分として含有する医薬を対象の静脈に単回投与することにより、アドレノメデュリンの血管拡張作用に起因する望ましくない副反応を抑制しつつ、対象の多臓器不全を予防又は治療することができる。
【００５０】
＜2. アドレノメデュリンを含有する医薬の製造方法＞
本発明の医薬の有効成分であるアドレノメデュリン又はその修飾体は、当該技術分野で通常使用される手段により製造することができる。アドレノメデュリン又はその修飾体の製造は、例えば、固相系又は液相系のペプチド合成法を用いてもよく、アドレノメデュリンを産生し得るヒト又は非ヒト哺乳動物の組織又は細胞から、天然ペプチドを精製する方法を用いてもよい。或いは、アドレノメデュリンを産生し得るヒト又は非ヒト哺乳動物におけるアドレノメデュリンをコードするDNA（例えば、配列番号2、4、6、8、10又は12）を使用して、大腸菌又は出芽酵母等の形質転換系で組換えタンパク質を大量発現させる方法を用いてもよい。或いは、予め製造されたペプチドを購入等して用いてもよい。いずれの場合も、本発明の医薬の製造方法の実施形態に包含される。
【００５１】
前記の手段によって製造されたペプチドにおいて、該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基のチオール基をジスルフィド化することにより、該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しているペプチドを得ることができる。また、前記の手段によって製造されたペプチドにおいて、該アミノ酸配列中の2個のシステイン残基の間で形成されたジスルフィド結合をエチレン基によって置換することにより、該ジスルフィド結合がエチレン基によって置換されたペプチドを得ることができる。前記ジスルフィド化反応及びエチレン基による置換反応は、当該技術分野で通常使用される条件に基づき実施することができる。
【００５２】
アドレノメデュリン又はその修飾体がそれらの保護形態である場合、本発明の医薬の製造方法において、所望により、前記の手段によって製造されたペプチドに1種以上の保護基を導入する保護工程、並びに／又は、前記の手段によって製造されたペプチドの保護形態の1種以上の保護基を脱保護する脱保護工程を実施してもよい。前記保護工程及び脱保護工程は、当該技術分野で通常使用される保護化反応及び脱保護化反応によって実施することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５４】
以下の動物実験は、宮崎大学の承認のもとに実施した。
【００５５】
＜I：モデルマウスの作製＞
［I-1：両側腎臓摘出（BNx）モデルの作製］
10週齢の雄性ddy系マウス (九動株式会社) を、ペントバルビタール (64.8 mg/kg、腹腔注射) で麻酔した。正中切開による開腹後、両側腎門部周囲の結合組織を鈍性剥離して、両側腎門部を2ヶ所結紮した。結紮部分より腎の遠位側で切断することにより、両腎を摘出した。その後、腹膜および皮膚を縫合して、マウスを麻酔から覚醒させた。偽処置のマウスにおいては、両側腎門部周囲における結合組織の鈍性剥離のみを行った。また、循環血液量を維持するために、閉腹前に、生理食塩水を腹腔内に投与した。
【００５６】
［I-2：腎虚血再灌流（腎I/R）モデルの作製］
前記I-1と同様の手順で、腎にアプローチした。両側腎門部周囲の結合組織を鈍性剥離して、微小血管クリップ（microvascular clip, ROBOZ）を使用して両側腎門部の血流を35分間遮断した。その後、微小血管クリップを外して血流を再灌流させた。閉腹後、マウスを麻酔から覚醒させた。偽処置のマウスにおいては、開腹後、両側腎門部周囲の結合組織を鈍性剥離して、35分間開腹した状態を維持した。その後、BNx処置と同様に縫合して、マウスを麻酔から覚醒させた。前記処置中は、マウスをホットプレート上に置き、体温を36〜38℃に保持した。生理食塩水の投与は、BNxモデルの作製と同様に行った。
【００５７】
なお、各モデル動物から、術後6時間、24時間及び32時間において、血液及び肝臓を採材した。
【００５８】
＜II：アドレノメデュリンの投与試験＞
［II-1：アドレノメデュリンの投与］
10週齢の雄性ddy系マウス (九動株式会社) に、生理食塩水又はアドレノメデュリン（AM）（0.5又は5 μg/kg体重）を投与した。30分後に、前記I-1又はI-2と同様の手順で、BNx又は腎I/R処置を行った。それぞれの処置直後に、再度、生理食塩水又はAM（0.5又は5 μg/kg体重）を投与した。したがって、2回の投与量の総計は、1 μg/kg体重（AM 1）及び10 μg/kg体重（AM 10）であった。
【００５９】
［II-2：腎機能及び肝機能の評価］
前記II-1の手順に従ってAMの投与を行ったBNxマウス又は腎I/Rマウスから採血した。ヘパリンで処理した前記血液を、10,000×gで10分間遠心して、血漿を分離した。富士ドライケムスライド (BUN-PIII、CRE-PIII、GGT-PIII、GOT/AST-PIII；富士フィルム株式会社) を使用して、尿素窒素 (UN) 濃度、クレアチニン (Cre) 濃度、アスパラギン酸アミノ基転移酵素活性（AST）及びアラニンアミノ基転移酵素活性（ALT）を、それぞれ測定した。
【００６０】
［II-3：肝からの全RNA抽出］
全RNAの抽出には、RNeasy（登録商標） 保護ミニキット（Protect Mini Kit、QIAGEN）を使用した。抽出した全RNAを鋳型として、iScriptTM cDNA 合成キット（カタログ番号：170-8891、Bio-Radラボラトリーズ）を用いてcDNAを合成した。全RNAの抽出及びcDNA合成のいずれの場合においても、前記キット附属のマニュアルに従って実施した。
【００６１】
［II-4：PCRアレイ］
前記II-3の手順に従って調製されたcDNAサンプルの10倍希釈溶液（試料の総体積に対して5体積％）と、TaqMan（登録商標） 遺伝子発現マスターミックス（Gene Expression Master Mix）（試料の総体積に対して50体積％）とを混合し、該混合液をTaqMan（登録商標） カスタムアレイ−マウスハイポキシア（Custom Arrays-Mouse Hypoxia、Mouse hypoxia array、Applied Biosystems）にロードした。また、偽処置群のマウスから得たcDNAサンプルを混合して、偽処置サンプル混合液を作製した。前記偽処置サンプル混合液を各アレイにロードして内部標準とすることにより、アレイ間の遺伝子発現量の変動を補正した。各アレイについては、リアルタイムPCRシステム（7900HT Fast Real-Time PCR System、Applied Biosystems）を用いて、定量的に解析した。PCRについては、50℃、2分間及び94.5℃、10分間の反応の後、97℃、30秒間及び59.7℃、1分間のセットを40サイクル実施する条件で行った。前記マウスハイポキシアアレイにスポットされているプローブセットのアレイマップを表１に示す。表中、各遺伝子名を、遺伝子シンボルで表す。
【００６２】
【表１】
2015160827.tif 000002
【００６３】
＜III：結果＞
［III-1：BNx処置又は腎I/R処置後の腎機能及び肝障害の評価］
BNx処置又は腎I/R処置後6、24及び32時間における血漿尿素窒素 (UN) 濃度及び血漿クレアチニン (CRE) 濃度を図1に示す。A：BNx処置後の血漿尿素窒素 (UN) 濃度；B：腎I/R処置後の血漿尿素窒素 (UN) 濃度；C：BNx処置後の血漿クレアチニン (CRE) 濃度；D：腎I/R処置後の血漿クレアチニン (CRE) 濃度を示す。図中、白塗りの棒は偽処置群を、黒塗りの棒はBNx処置群を、斜線パターンの棒は腎I/R処置群を、括弧内の数値は偽処置群又は各処置群の例数を、それぞれ示す。偽処置群又は各処置群の値を、平均値±標準誤差で表す。*及び**は、各経過時間において、偽処置群と処置群の間に有意な差 (P < 0.05, P < 0.01) があったことをそれぞれ示す。
【００６４】
血漿尿素窒素 (UN) 濃度及び血漿クレアチニン (CRE) 濃度は、腎機能のマーカーとして知られている。これらのマーカーの上昇は、腎機能の低下、すなわち腎障害の発生を示す。図1に示すように、BNx群及び腎I/R群において、血漿UN濃度及び血漿CRE濃度は、いずれの時間においても、偽処置群と比較して有意に増加していた。
【００６５】
BNx処置又は腎I/R処置後6、24及び32時間における血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性を図2に示す。A：BNx処置後の血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；B：腎I/R処置後の血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；C：BNx処置後のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性；D：腎I/R処置後のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性を示す。図中、白塗りの棒は偽処置群を、黒塗りの棒はBNx処置群を、斜線パターンの棒は腎I/R処置群を、括弧内の数値は偽処置群又は各処置群の例数を、それぞれ示す。偽処置群又は各処置群の値を、平均値±標準誤差で表す。*及び**は、各経過時間において、偽処置群と処置群の間に有意な差 (P < 0.05, P < 0.01) があったことをそれぞれ示す。
【００６６】
血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性は、肝機能のマーカーとして知られている。これらのマーカーの上昇は、肝機能の低下、すなわち肝障害の発生を示す。図2に示すように、BNx群及び腎I/R群において、血漿ALT活性及び血漿AST活性は、いずれの時間においても、偽処置群と比較して有意に増加していた。
【００６７】
以上の結果から、BNx処置又は腎I/R処置によって腎障害が生じており、その程度は、同程度であることが示された。また、いずれの腎に対する処置によっても肝障害が生じていること、すなわち、急性腎障害に起因する肝障害が生じていることが示された。さらに、その障害の程度は、BNx群と比較して腎I/R群が高いことが示された。
【００６８】
［III-2：低酸素関連遺伝子の発現量変化］
BNx処置又は腎I/R処置後の肝における47種類の低酸素（hypoxia）関連遺伝子の発現量を、マウスハイポキシアアレイを用いたリアルタイムPCR法により解析した。BNx処置又は腎I/R処置後の肝における低酸素関連遺伝子の発現量の変化を表2に示す。表中、発現量の増加を正の数値で、発現量の減少を負の数値で、それぞれ示す。*及び**は、偽処置群と処置群の間に有意な差 (P < 0.05, P < 0.01) があったことをそれぞれ示す。発現量が空欄の遺伝子は、有意な増幅が確認されなかったことを示す。
【００６９】
【表２】
2015160827.tif 000003
【００７０】
表2に示すように、BNx処置又は腎I/R処置後6時間において検出された遺伝子のうち、偽処置群と比較して、いずれの処置群においても共通して発現量が増加していた遺伝子は、35種類であった。また、BNx又は腎I/R処置後24時間において検出された遺伝子のうち、偽処置群と比較して、いずれの処置群においても共通して発現量が増加していた遺伝子は、20種類であり、減少していた遺伝子は、6種類であった。
【００７１】
表2に示す遺伝子のうち、BNx処置又は腎I/R処置後6時間の早期から発現量が有意に変化した遺伝子は、インスリン様増殖因子結合タンパク質1（insulin-like growth factor binding protein 1、Igfbp1）及びアドレノメデュリン（adrenomedulin、Adm）の2種類であった。
【００７２】
［III-3：AM投与後のBNx処置又は腎I/R処置マウスの腎機能及び肝障害の評価］
前記II-1の手順に従い、マウスに、生理食塩水又はアドレノメデュリン（AM）の投与、並びにBNx処置又は腎I/R処置を行った。AMを投与したBNx処置又は腎I/R処置マウスにおける血漿尿素窒素 (UN) 濃度及び血漿クレアチニン (CRE) 濃度を図3に示す。A：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおける血漿尿素窒素 (UN) 濃度；B：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおける血漿尿素窒素 (UN) 濃度；C：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおける血漿クレアチニン (CRE) 濃度；D：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおける血漿クレアチニン (CRE) 濃度を示す。図中、白塗りの棒は偽処置群を、黒塗り又は網掛けの棒はBNx処置群を、斜線パターンの棒は腎I/R処置群を、括弧内の数値は偽処置群又は各処置群の例数を、それぞれ示す。偽処置群又は各処置群の値を、平均値±標準誤差で表す。*は、各経過時間において、偽処置且つ生理食塩水投与群と処置群との間に有意な差 (P < 0.05) があったことをそれぞれ示す。
【００７３】
図3に示すように、血漿UN濃度及び血漿CRE濃度は、偽処置且つ生理食塩水投与群と比較して、BNx処置且つ生理食塩水投与群及び腎I/R処置且つ生理食塩水投与群において有意に増加した。これは、BNx処置又は腎I/R処置によって腎障害が生じていることを意味する。BNx処置且つ生理食塩水投与群又は腎I/R処置且つ生理食塩水投与群と、BNx処置且つAM投与群又は腎I/R処置且つAM投与群とを比較すると、血漿UN濃度及び血漿CRE濃度に有意な差は認められなかった。すなわち、AMの投与は、腎障害に対して有意な作用を示さなかった。
【００７４】
AMを投与したBNx処置又は腎I/R処置マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性を図4に示す。A：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；B：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおける血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) 活性；C：AM投与後24時間後のBNx処置マウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性；D：AM投与後24時間後の腎I/R処置マウスにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) 活性を示す。図中、白塗りの棒は偽処置群を、黒塗り又は網掛けの棒はBNx処置群を、斜線パターンの棒は腎I/R処置群を、括弧内の数値は偽処置群又は各処置群の例数を、それぞれ示す。偽処置群又は各処置群の値を、平均値±標準誤差で表す。*及び**は、各経過時間において、偽処置且つ生理食塩水投与群と処置群との間に有意な差 (P < 0.05, P < 0.01) があったことをそれぞれ示す。
【００７５】
図4に示すように、血漿ALT活性及び血漿AST活性は、偽処置且つ生理食塩水投与群と比較して、BNx処置且つ生理食塩水投与群及び腎I/R処置且つ生理食塩水投与群において有意に増加した。これは、BNx処置又は腎I/R処置という腎に対する処置によって肝障害が生じていること、すなわち、急性腎障害に起因する肝障害が生じていることを意味する。
【００７６】
AMの投与は、これらの増加に対して用量依存性の抑制効果を示した。具体的には、AMの投与は、BNx処置群における血漿ALT活性に対しては、10 μg/kg体重の用量において、BNx処置群における血漿AST活性に対しては、1及び10 μg/kg体重の用量において、それぞれ有意な抑制効果を生じさせた。同様に、AMの投与は、腎I/R処置群における血漿ALT活性に対しては、10 μg/kg体重の用量において、それぞれ有意な抑制効果を生じさせた。以上の結果から、急性腎障害（BNx処置又は腎I/R処置）に伴う肝障害は、AM投与によって、腎障害の軽減を介さずに抑制されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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