(57)【要約】【課題】合成樹脂基板はシリコウェハほど平坦でないため、合成樹脂基板上でフォトリソグラフィ加工を行うことが難しく、直径300nmもの微小なパターンを形成することが困難である。【解決手段】本発明の核酸分析用基板は、合成樹脂基板と、グリッド状に配置したサンプル固定用スポットとを備え、当該サンプル固定用スポットと前記合成樹脂基板との間には、無機酸化物が設けられている。【選択図】図4
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成樹脂基板と、グリッド状に配置したサンプル固定用スポットとを備え、当該サンプル固定用スポットと前記合成樹脂基板との間には、無機酸化物が設けられていること特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分析用基板において、
前記無機酸化物は、前記合成樹脂基板上にグリッド状に設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分析用基板において、
前記サンプル固定用スポットは前記無機酸化物の上にグリッド状に配置されていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分析用基板において、
前記無機酸化物上の前記サンプル固定用スポットが配置されていない箇所には疎水性の膜が設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分析用基板において、
前記サンプル固定用スポットと前記無機酸化物との間にはさらにシリカから成るスポットがグリッド状に設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分析用基板において、
前記前記無機酸化物上の前記サンプル固定用スポットおよびシリカから成るスポットが配置されていない箇所には疎水性の膜が設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分析用基板において、
前記合成樹脂基板が、シクレオレフィンポリマー樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリイミド樹脂、アダマンテート樹脂、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項８】
請求項２に記載の核酸分析用基板において、
前記無機酸酸化物が、シリカ、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項９】
請求項４に記載の核酸分析用基板において、
前記疎水性の膜が、シランカップリング剤、またはシランカップリング剤上に導入された多価性有機化合物、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分析用基板において、
前記無機酸酸化物が、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項１１】
請求項６に記載の核酸分析用基板において、前記疎水性の膜が、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項１２】
請求項５に記載の核酸分析用基板において、
前記サンプル固定用スポットが、シランカップリング剤、またはシランカップリング剤上に導入された多価性有機化合物からなるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項１３】
請求項１に記載の核酸分析用基板において、
前記サンプル固定用スポットのスポット径の直径が100μm以下であることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項１４】
第１合成樹脂基板と、グリッド状に配置したサンプル固定用スポットとを備え、当該サンプル固定用スポットと前記合成樹脂基板との間には、無機酸化物が設けられている、核酸分析用基板と、
第２合成樹脂基板と、を積層して成り、
前記核酸分析用基板と前記第２合成樹脂基板との間に流路が形成された、核酸分析用フローセル。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記核酸分析用基板と前記第２合成樹脂基板との間には、貫通孔を有する中抜きシートが配置されており、貫通孔の部分が流路を成す、核酸分析用フローセル。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記第２合成樹脂基板が、シクレオレフィンポリマー樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリイミド樹脂、アダマンテート樹脂、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されるいずれかであることを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１７】
請求項１４に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記サンプル固定用スポットのスポット径の直径が100μm以下であることを特徴とする、核酸分析用フローセル。
【請求項１８】
請求項１４に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記無機酸化物は、前記合成樹脂基板上にグリッド状に設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項１９】
請求項１４に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記サンプル固定用スポットは前記無機酸化物の上にグリッド状に配置され、前記無機酸化物上の前記サンプル固定用スポットが配置されていない箇所には疎水性の膜が設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【請求項２０】
請求項１４に記載の核酸分析用フローセルにおいて、
前記サンプル固定用スポットと前記無機酸化物との間にはさらにシリカから成るスポットがグリッド状に設けられ、前記前記無機酸化物上の前記サンプル固定用スポットおよびシリカから成るスポットが配置されていない箇所には疎水性の膜が設けられていることを特徴とする、核酸分析用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析用基板、及び核酸分析用フローセルに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、これらの核酸分析法で用いられる基板が開示されている。基板にはサンプルDNAが結合するスポットが一定ピッチでグリッド配置されている。スポットの直径は300nmである。基板にはシリコンウェハが用いられ、フォトリソグラフィ技術とエッチング技術で作られる。詳細には、シリコンウェハ上にHMDS（Hexamethyldisilizane）層を形成した後、ポジ型レジストを塗布する。フォトリソグラフィ技術を用いてレジストの所定の位置に開口部を設けた後、酸素プラズマを用いて開口部底のHMDSを除去する。その後、ウェハをアミノシラン気相中に保持し、開口部底にアミノシランを導入する。ウェハ上にレジスト塗布した後ダイシング加工し基板を切り出す。切り出された基板上のレジストを有機溶剤用いた超音波洗浄で除去した後、ポリウレタン製接着材を介してカバーガラスを貼りつけ核酸分析用のフローセルを作製する。親水性が高くDNA固定可能なアミノシランをDNAボール固定スポットに用い、その他の領域にDNAの吸着を防ぎ、疏水性が高いHMDSを用いることで、DNAボール含む溶液を基板上に導入した時、自然にDNAボールをスポット上にのみ固定することを可能にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第US2009/0270273号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の方法は、出発材質に高価なシリコンウェハを用いているため核酸分析用基板のコストが高いという課題がある。コストを下げる方法として、基板に合成樹脂を用いることが有効である。しかしながら、合成樹脂基板はシリコウェハほど平坦でないため、合成樹脂基板上でフォトリソグラフィ加工を行うことが難しく、直径300nmもの微小なパターンを形成することが困難である。本発明の上記の課題を解決するための核酸分析用基板を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の核酸分析用基板は、合成樹脂基板と、グリッド状に配置したサンプル固定用スポットとを備え、当該サンプル固定用スポットと前記合成樹脂基板との間には、無機酸化物が設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、合成樹脂基板を用いても微小なパターンを形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の核酸分析用フローセルの構成の一例を説明するための図である。
【図２】本発明の核酸分析用基板の一例を説明するための図である。
【図３】本発明の核酸分析用基板の一例を説明するための図である。
【図４】本発明の核酸分析用基板の一例を説明するための図である。
【図５】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図６】本発明の核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図７】本本発明の核酸分析装置の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の発明者は、鋭意研究の結果、低コストな合成樹脂基板を用いて、基板表面に300nmもの微小なパターンを形成し、DNA固定可能な官能基を導入し、DNAサンプル含む溶液に接触させると自然に微小なパターン上にDNAサンプル固定可能で、合成樹脂基板からの蛍光発光なく、光透過性高く、DNAや酵素が吸着せず、反応中の温度上げ下げで基板がそらない核酸分析用基板を完成させた。
本発明は、第一の合成樹脂基板と、該第一の合成樹脂基板上に第一の無機酸化物からなるスポットをグリッド状に配置し、該第一の無機酸化物からなるスポット上にサンプル固定用スポットを備えることを特徴とする。合成樹脂基板上に無機酸化物を導入することで無機酸化物上にDNA固定可能な官能基を導入することができる。
また、本発明は、前記第一の合成樹脂基板がシクレオレフィンポリマー樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリイミド樹脂、アダマンテート樹脂、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする。これらの樹脂はDNA吸着少なく、疏水性も高いので、無機酸化物上に導入された官能基との組み合わせで、DNAボール含む溶液を基板上に導入した時、自然にDNAボールをスポット上にのみ導入することができる。また、耐熱性高く反応中の温度上げ下げによる基板のソリも低減することができる。
また、本発明は、第一の合成樹脂基板と、第一の合成樹脂基板上の第一の無機酸化物からなる膜と、第一の無機酸化物からなる膜上にサンプル固定用スポットをグリッド状に配置し、サンプル固定用スポットがない領域が疎水性の膜で覆われていることを特徴とする。疎水性の膜にランカップリング剤、またはシランカップリング剤上に導入された多価性有機化合物、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類以上の混合物からなる群を選択することでDNAや酵素の吸着防止を防ぐことができる。
また、本発明は、第一の合成樹脂基板と、第一の合成樹脂基板上の第二の無機酸化物からなる膜と、第二の無機酸化物からなる膜上にシリカからなるスポットをグリッド状に配置し、シリカからなるスポット上にサンプル固定用スポットを備え、第二の無機酸酸化物からなる膜上のサンプル固定用スポットがない領域が疎水性の膜で覆われていることを特徴とする。前記第二の無機酸酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物を用いることで、シリカからなるスポットをエッチングで形成する時（図4H）、第二の無機酸化物をエッチング停止層として用いることができるため、エッチング時間の終点を容易に管理することができ、エッチング時の第一の合成樹脂基板のエグレを防止することができる。また、前記疎水性の膜にカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択される化合物を用いる。これらの化合物は、固定用スポットであるシリカとは反応せずに、第二の無機酸酸化物と特異的に反応するため、第二の無機酸酸化物表面のみに疏水性の膜を導入することができる（図4I）。疏水性の膜導入後にシランカップリング剤、またはシランカップリング剤導入後に多価性有機化合物で処理することで、シリカなるスポット上にサンプル固定用スポットを導入することができる。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
〔1〕  第一の合成樹脂基板と、
該第一の合成樹脂基板上に第一の無機酸化物からなるスポットをグリッド状に配置し、
該第一の無機酸化物からなるスポット上にサンプル固定用スポットを備えることを特徴とする核酸分析用基板。
【００１１】
〔2〕  第一の合成樹脂基板がシクレオレフィンポリマー樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリイミド樹脂、アダマンテート樹脂、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択される〔1〕に記載の核酸分析用基板。
【００１２】
この〔2〕に記載の構成を採用することにより、「合成樹脂基板は、合成樹脂に含む物質に由来する蛍光発光があり、核酸分析中の蛍光検出のノイズになる」という課題を解決することができる。
【００１３】
〔3〕第一の合成樹脂基板と、
該第一の合成樹脂基板上の第一の無機酸化物からなる膜と、
該第一の無機酸化物からなる膜上にサンプル固定用スポットをグリッド状に配置し、
該第一の無機酸酸化物からなる膜上のサンプル固定用スポットがない領域が疎水性の膜で覆われていることを特徴とする核酸分析用基板。
【００１４】
〔4〕第一の無機酸酸化物がシリカ、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択される〔1〕〜〔3〕に記載の核酸分析用基板。
【００１５】
〔5〕疎水性の膜がシランカップリング剤、またはシランカップリング剤上に導入された多価性有機化合物、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択される〔3〕 〜〔4〕に記載の核酸分析用基板。
【００１６】
〔6〕第一の合成樹脂基板と、
該第一の合成樹脂基板上の第二の無機酸化物からなる膜と、
該第二の無機酸化物からなる膜上にシリカからなるスポットをグリッド状に配置し、
該シリカからなるスポット上にサンプル固定用スポットを備え、
該第二の無機酸酸化物からなる膜上のサンプル固定用スポットがない領域が疎水性の膜で覆われていることを特徴とする核酸分析用基板。
【００１７】
〔7〕第二の無機酸酸化物がチタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタル、及びそれらの少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択される〔6〕に記載の核酸分析用基板。
【００１８】
〔8〕疎水性の膜がカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、それらの塩、及びそれらの化合物の少なくとも2種類以上の混合物からなる群から選択される〔6〕 〜〔7〕に記載の核酸分析用基板。
【００１９】
〔9〕サンプル固定用スポットがシランカップリング剤、またはシランカップリング剤上に導入された多価性有機化合物からなることを特徴とする〔6〕 〜〔8〕に記載の核酸分析用基板。
【００２０】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
【００２１】
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
【実施例１】
【００２２】
図１に本発明の核酸分析用反応フローセルの一例を示す。
フローセルは、第一の合成樹脂基板101、中央部がくり抜かれた中抜き部103を持つ中抜きシート102、第二の合成樹脂基板104を貼合わせる。中抜き部103と第一の合成樹脂基板101と第二の合成樹脂基板104で囲まれた中空部が流路となる。注入口107と排出口108が液の出入口となる。図1の実施例では、第一の合成樹脂基板101の穴が注入口107、排出口108となっているが、別の形態では、第二の合成樹脂基板の穴が注入口、及び排出口となっても良い。また、さらなる別の形態として、中抜きシート102の側面に開けられた穴が注入口、及び排出口となっても良い。
【００２３】
本発明の核酸分析用フローセルの断面図を示す（図5）。断面図は、図1のA-A´断面におけるものである。図5Aは、図1の第一の合成樹脂基板、中抜きシート、第二の合成樹脂基板を貼り合わせた構造によるものである。また、本発明のフローセルは、中抜きシート502と第二の合成樹脂基板504aが一体となった第二の合成樹脂基板504bを貼り合わせた構造（図5B）でも良い。
【００２４】
第一の合成樹脂基板101に用いられる樹脂としては、特に制限なく、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、透明ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ABS樹脂、AS樹脂、アクリル樹脂 、ポリアミド、ナイロン、ポリアセタール、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、グラスファイバー強化ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン、ポリフェニレンスルファイド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、非晶ポリアリレート、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、及びこれらの混合材料やガラス繊維や炭素繊維強化無機材料、または金属材料などを内部に微細分散させた複合材料などを用いることもできる。
一般に、核酸分析反応では、15℃から90℃の範囲で温度の上げ下げが行われる。耐熱性が低い樹脂は、この温度変化中に基板がそってしまい、検出系の焦点深度から外れてしまうため、一視野内で観察できるスポット数が減ってスループットが低下する課題がある。また、第一の無機酸化物からなるスポット214、第一の無機酸化物からなる膜309、及び第二の無機酸化物からなる膜418との接着性が低く、核酸分析中に無機酸化物のスポットや膜が剥がれてしまう課題もある。また、DNAや酵素の吸着防止性能が低いものがあったり、樹脂自身に蛍光物質含みこれがバックラウンドとなって検出感度を下げてしまうものがある。耐熱性高く、無機酸化物との接着性高く、DNAや酵素の吸着防止し、樹脂自身の蛍光強度低い材料として、透明ポリイミド、ポリカーボネート、または、環状ポリオレフィンなどが特に良い。透明ポリイミドとしては、ネオプリムL（三菱ガス化学株式会社製）、ルセラフィルム（JSR株式会社）などがある。ポリカーボネ−トとしては、SDポリカ（住友ダウ株式会社）、アペック HT（バイエル マテリアルサイエンス株式会社）、サイコロイ（SABICイノベーティブプラスチックスジャパン社製）、タフロン（出光興産株式会社）、ノバレックス（三菱エンジニアリングプラスチックス株式会社製）、レキサン（SABICイノベーティブプラスチックスジャパン）、パンライト（帝人株式会社製）などがある。環状ポリオレフィンとしては、TOPAS（TOPAS Advanced Polymers社製）、ZEONOR（日本ゼオン株式会社）、ARTON（JSR株式会社製）などがある。
【００２５】
第一の合成樹脂基板101の厚さは、特に制限ないが、第一の合成樹脂基板自身が核酸分析装置内の温調ユニットに直接設置される様な場合は、熱伝導性を高めるために10mm以下であることが好ましく、1mm以下であることが特に好ましい。
【００２６】
中抜きシート102は、第一の合成樹脂基板101、第二の合成樹脂基板104と接着、または接合できれば良く、特に制限はない。この様なものとして、感圧性両面テープ、感熱性両面テープ、UV硬化性両面テープなどが挙げられる。合成樹脂基板の表面の無機酸化物の膜623と中抜きシート602が直接接する様な構造（図6）においては、無機酸化物と接合可能なシリコンゴムなどを用いても良い。感圧性両面テープとしては、ハイボン（日立化成工業株式会社製）、No.500両面テープ（日東電工株式会社製）、織布基材両面粘着テープ9075（住友3M株式会社製）などが挙げられる。感熱性両面テープとしては、研磨布固定用両面テープ（積水化学工業株式会社製）、ダブルフェース（トーヨーケム株式会社製）などが挙げられる。UV硬化性両面テープとしては、デクセリアルズ（ソニーケミカル株式会社製）、DC1000UV（イッコーズ株式会社）などが挙げられる。
【００２７】
中抜きシートの厚さ102は、特に制限がないが、シートの厚さが薄いと、中抜きシート部103、第一の合成樹脂基板101、第二の合成樹脂基板104で囲まれる流路部の容量を低減できるため、核酸分析反応で使う試薬容量を低減できるため、解析のコストを低減することができる。この様な厚さとしては、0.1mm以下であることが望ましい。
【００２８】
流路部を構成する第二の合成樹脂基板102は、流路内で行われる核酸分析反応を検出するための検出窓の役割も持つ。一般に、核酸検出には蛍光を用いるため、蛍光色素の励起波長、または発光波長の光が透過しやすい透明樹脂が望ましい。このように第二の合成樹脂基板を「透明樹脂」にすることにより、「合成樹脂基板は光透過性が低く、蛍光検出の感度が低い」という課題を解決することができる。
【００２９】
一般的な蛍光色素の励起波長、発光波長は、波長450nmから750nmの範囲である。この様な光の波長を透過しやすい透明樹脂としては、透明ポリイミド、ポリカーボネート、または、環状ポリオレフィンなどが特に良い。透明ポリイミドとしては、ネオプリムL（三菱ガス化学株式会社製）、ルセラフィルム（JSR株式会社）などがある。ポリカーボネ−トとしては、SDポリカ（住友ダウ株式会社）、アペック HT（バイエル マテリアルサイエンス株式会社）、サイコロイ（SABICイノベーティブプラスチックスジャパン社製）、タフロン（出光興産株式会社）、ノバレックス（三菱エンジニアリングプラスチックス株式会社製）、レキサン（SABICイノベーティブプラスチックスジャパン）、パンライト（帝人株式会社製）などがある。環状ポリオレフィンとしては、TOPAS（TOPAS Advanced Polymers社製）、ZEONOR（日本ゼオン株式会社）、ARTON（JSR株式会社製）などがある。
【００３０】
サンプル固定用スポット106は、サンプルDNAを固定するためのスポットである。サンプルDNAは、測定対象DNAを一定の長さに切断したものを出発物質し、これらの切断サンプルを鋳型に測定対象配列部が複数コピーされた長鎖分子であることが望ましい。この様なサンプルDNAとして、非特許文献（Science 2010, Vol. 327, pp. 78-81）には、DNAナノボ−ルが開示されている。一つのサンプル固定用スポット106に複数種類のDNAナノボールが固定されると、一つのサンプル固定用スポット106から複数種類の蛍光色素が検出されるので誤検出となる。一方、サンプル固定用スポット106が小さいと溶液中のDNAボールとの接触確立が低下し、DNAボールが固定されていないスポットが増えてDNA塩基配列決定のスループットが低下する。従って、サンプル固定用スポット106の直径は、DNAボールが一個のみが固定され、且つ、最も大きなサイズとして、直径50nm以上500nm以下が望ましい。
【００３１】
サンプル固定用スポット106の材質は、DNAが固定でき、且つサンプル固定用スポットと第一の合成樹脂基板樹脂基板との間に存在する無機酸化物と良好な接着力が得られる必要がある。このような化合物として、シランカップリング剤、またはシランカップリング剤処理で導入された官能基に、二価性の化合物を反応させたものなどが好ましい。二価性の化合物としては、分子内にＮＨＳ−エステル基、イミドエステル基、スルフィジル基、エポキシ基、ヒドラジド基などを持つものが挙げられる。また、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物を用いて、無機酸化物上に官能基を導入しても良い。また、シランカップリング剤と同様に、導入された官能基に二価性の化合物を処理して、さらなる官能基を導入しても良い。スポット表面に導入された官能基は、DNA分子内の官能基との相互作用、または共有結合を介してDNAを固定することができる。
【００３２】
本発明の核酸分析用基材（図2H）は、第一の合成樹脂基板201上の第一の無機酸化物からなるスポット214の上にサンプル固定用スポット206がある構造を特徴とする。第一の合成樹脂基板201が流路と接する構造のため、第一の合成樹脂基板201にはDNAや酵素の吸着防止性能が高いものが求められる。この様な材料として、透明ポリイミド、ポリカーボネート、または、環状ポリオレフィンなどが特に良い。
【００３３】
製造方法は、第一の合成樹脂基板201上に、蒸着法、CVD法、ゾルゲル法などを用いて第一の無機酸化物からなる膜209を成膜する（図2B）。無機酸化物の材質は、第一の合成樹脂基板201、且つスポット形成用膜210とも良好な接着性が得られるものが良く、この様な材質として、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライト、五酸化バナジウム、シリカ、サファイア、酸化タングステン、五酸化タンタルやこれらの混合物が挙げられる。次に、スポット形成用膜210を成膜した後（図2C）、パターン形成材料211を塗布する（図2D）。スポット形成用膜210は、サンプル固定用スポット206を形成するための膜であり、この様な膜として、前述のシランカップリング剤、またはシランカップリング剤処理で導入された官能基に、二価性の化合物を反応させたもの、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物を用いて、無機酸化物上に官能基を導入したもの、また、シランカップリング剤と同様に、導入された官能基に二価性の化合物を処理して、さらなる官能基を導入したものなどが用いられる。パターン形成方法は、コスト面で有利なナノインプリント方式（図2E）が望ましい。ナノインプリント方式で用いられるパターン形成材料211としては、PMMAや熱で硬化するタイプのUN-NIL（ダイセル化学工業社製）や光で硬化するPAK-01（東洋合成工業社製）などが挙げられる。パターン形成後（図2F）に、酸素アッシングやドライエッチングを行い、スポット形成部以外の領域のスポット形成用膜210、パターン形成材料211を除去する（図2G）。その後、基材を有機溶剤に浸漬した状態で、超音波洗浄を行いパターン形成材料211を除去する（図2H）。
【００３４】
本実施例はスポット形成用膜210を成膜後にパターニングを行いサンプル固定用スポット206を作製しているが、第一の無機酸化物からなるスポット214作製後に、サンプル固定用スポット206を作製しても良い。
【００３５】
本発明の核酸分析用基材（図3H）は、第一の合成樹脂基板301上に第一の無機酸化物からなる膜309が存在し、第一の無機酸化物からなる膜309上にサンプル固定用スポット306が存在し、サンプル固定用スポット306が存在しない領域に疎水性の膜317が存在することを特徴とする。疎水性の膜317導入時（図3H）、サンプル固定用スポット306上に疎水性の膜317が導入されるとDNAサンプルが固定されるサンプル固定用スポット306の割合が低下するため、第一の無機酸化物からなる膜309表面のみに疎水性の膜309を導入可能な無機酸化膜材質とサンプル固定用スポット材質と疎水性の膜の材質の最適な組み合わせが必要である。
【００３６】
製造方法は、第一の合成樹脂基板301上に第一の無機酸化物からなる膜309を成膜する（図3B）。第一の無機酸化物からなる膜309の材質は、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライトやこれらの混合物が特に好ましい。これらの無機材料は、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物と特異的に反応するため、これらの材料の中から、サンプル固定用スポット306を形成する材料と反応しない材料を選定することによって、第一の無機酸化物からなる膜309表面のみに疎水性の膜309を導入することができる。次に、非特許文献（Langmuir 2010, Vol.26, pp. 5603-5609）に示された方法に従い、サンプル固定用スポット306を作製する。PDMS（Polydimethylsiloxane）製のスタンパー315上にアミノシラン含むスポットインク316を保持させた後（図3C）、これを第一の無機酸化物からなる膜に転写してサンプル固定用スポット306を作製する（図3D〜図3G）。その後、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物含む水溶液に基材を浸漬して第一の無機酸化物からなる膜309上に疎水性の膜317を導入する。この様な化合物として、分子内に長鎖アルキルなどの疎水性部位を持つ化合物が望ましい。ブロッキング層の形成に用い得るカルボン酸化合物として、イミノ二酢酸ナトリウムエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸、10-カルボキシ-1-デカンチオール、7-カルボキシ-1-ヘプタンチオール、5-カルボキシ-1-ペンタンチオール、10-カルボキシルジスルフィド、7-カルボキシルヘプチルジスルフィド、5-カルボキシルペンチルスルフィド、15-カルボキシル-1-ペンタデカンチオール、カルボキシ-EG6-ウンデカンチオール、カルボキシ-EG6-ヘキサデカンチオール、ギ酸ブチル、ギ酸シトロネリル、ギ酸エチル、ギ酸ゲラニルウンデカン酸、及びこれらの塩が挙げられる。また、リン酸化合物としては、グリセルアルデヒド 3-リン酸スフィンゴシン 、1-リン酸1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸、3-sn-ホスファチジン酸、O-ホスホリルエタノールアミン  リン酸二水素2-アミノエチル及びこれらの塩が挙げられる。また、硫酸化合物としては、デシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びオクチル硫酸ナトリウムが挙げられる。また、ニトリル化合物としては、ジシアノペンタン、ジシアノヘキサン、(ブチルアミノ)アセトニトリル、(ジメチルアミノ)プロピオニトリル、ヘキシンニトリルなどが挙げられる。
【００３７】
本発明の核酸分析用基材（図4J）は、第一の合成樹脂基板401上に第二の無機酸化物からなる膜418が存在し、第二の無機酸化物からなる膜418上にシリカからなるスポット421が存在し、シリカからなるスポット421上にサンプル固定用スポット406が存在し、サンプル固定用スポット406が存在しない領域に疎水性の膜420が存在することを特徴とする。第一の無機酸化物エッチング時（図4G）、第二の無機酸化物からなる膜418がエッチング停止層となるため、過エッチングによる第一の合成樹脂基板樹脂基板のエグレを防止することができ、量産時の製造歩留まりを高めることができる。
【００３８】
第一の合成樹脂基板401上に第二の無機酸化物からなる膜418を成膜する（図4B）。第二の無機酸化物からなる膜418の材質は、チタニア、ジルコニア、アルミナ、ゼオライトやこれらの混合物が特に好ましい。これらの無機材料は、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物と特異的に反応するため、これらの材料の中から、シリカからなるスポット421を形成する材料との反応性低い材料を選定することによって、シリカからなるスポット421に反応することなく、第二の無機酸化物からなる膜418表面のみに疎水性の膜420を導入することができる（図4I）。
【００３９】
その後、シリカからなる膜419を導入する。シリカは、カルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物との反応性低いため、疏水性の膜420導入時にシリカからなるスポット421上へのルイス塩基化合物の導入を防止することができる。
【００４０】
次に、パターン形成材料411を塗工した後、スタンパーを用いてスポット形成部を作製する（図4D〜図4F）。その後、ドライエッチングプロセスを用いて、スポット形成部以外の領域のパターン形成材料411とシリカからなる膜を除去する（図4G）。この時、ドライエッチングプロセスの反応性ガスにCF4とCHFの混合ガスやSF6の混合ガスを用いることで、第二の無機酸化物からなる膜418をエッチング停止層として活用することができる。
次に、酸素アッシングなどを用いてパターン形成材料を除去した後（図4H）、基材をカルボン酸化合物、リン酸化合物、硫酸化合物、ニトリル化合物、又はそれらの塩等のルイス塩基化合物からなる溶液に浸漬して疏水性の膜420を導入する（図4I）。最後に基材をシランカップリング剤で処理して、シリカからなるスポット421上にサンプル固定用スポット406を導入する。
【００４１】
このようにして作製した核酸分析用フローセルを、核酸分析装置にセットし核酸分析を行う。核酸分析装置724は、本発明の核酸分析用フローセル725；、核酸分析用フローセル725を固定し、なおかつ核酸分析用フローセル725のを温度を調整することができるホルダユニット726；、核酸分析用フローセル725とホルダユニット726を移動させるステージユニット727；、複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器728；、試薬容器728に収容された試薬を吸引し核酸分析用フローセル725に注入するための駆動源である送液ユニット729；、試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器728や核酸分析用フローセル725にアクセスするノズル730；、ノズル730を搬送させるノズル搬送ユニット731；、核酸分析用フローセル725に固定された試料を観察するための検出ユニット732；、及び廃液を収容する廃液容器733等を有する。検出ユニットは、例えば、蛍光検出装置からなり、ステージユニット上の核酸分析用フローセルに励起光を照射し、発生した蛍光を検出することができる。
【００４２】
核酸分析装置は以下の通りに動作する。まず、測定対象の核酸試料を保持した核酸分析用フローセル725をホルダユニット726に設置する。次に、ノズル730が試薬容器728にアクセスし、試薬を送液ユニット729により吸引する。ノズル730は、ノズル搬送ユニット731により核酸分析用フローセル725上面に搬送され、核酸分析用フローセル725に試薬を注入する。そして、ホルダユニット726にて、核酸分析用フローセル725の流路内に含まれた核酸試料と試薬を温度調整することで反応が起こる。反応した核酸試料を観察するために、核酸分析用フローセル725をステージユニット727にて移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料の蛍光を検出する。この際、好ましくは、核酸試料又は核酸試料を表面に有する担体が固定された側の基板を通して励起光を当て、蛍光を検出すればよい。検出後、核酸分析用フローセル725を微小に動かし同様の方法で検出、という動作を複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器728に収容された洗浄水を送液ユニット729により吸引し、核酸分析用フローセル725へ注入することで、核酸分析用フローセル725の流路内を洗浄する。また、別の試薬を注入し検出、という動作を複数回繰り返すことで、核酸試料を読み取ることが出来る。核酸分析装置は、コンピュータにより制御され、上記動作を自動的に行うことができる。
【００４３】
本発明の核酸分析装置を用いて種々の核酸分析を実施することができ、例えば、DNA配列決定やハイブリダイゼーションを行うことができる。特に本発明の核酸分析装置を用いてDNA配列決定（DNAシークエンス）を行うことができる。DNAシークエンスの方法は限定されないが、段階的ライゲーションを利用した方法（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)によるDNA配列決定が好ましい。段階的ライゲーション法とは、微粒子上の１本鎖DNAを鋳型に蛍光標識されたプローブを順次結合させ、２塩基ずつ配列を決定する手法をいう。該方法により、１サイクルで数十〜数百bpの解読を行うことができ、１ランで数十Gbのデータを解析することが可能である。段階的ライゲーション法においては、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを繰り返しハイブリダイズすることで並列シーケンシングすることができる。段階的ライゲーションを利用した配列決定法は、例えばScience 2010, Vol. 327, pp. 78-81（非特許文献4）の記載に従って行うことができる。
【実施例２】
【００４４】
本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。分析方法はScience 2010, Vol. 327, pp. 78-81に開示されている方法に準じる。
（１）環状ライブラリー作製
測定対象DNAを超音波で断片化した後、アクリルアミドゲル電気泳動で500塩基長のDNA断片を回収しQiaQuick column purification kit(QIAGEN社)で精製した。FastAP（Thermo scientific社）を用いてDNA断片の末端を脱リン酸化した後、Ad1アダプターをライゲーションした。AMPure（ベックマン・コールター社）を用いて未反応のアダプターを除去した後、PfuTurbo Cx（アジレント・テクノロジー社）を用いてPCR増幅を行った。得られた増幅産物の末端部をUSER（New England BioLabs社）で切断した後、Eco57I（Thermo scientific社）を用いて酵素認識部位の一部の塩基をメチル化した。T4 DNA ligase (Enzymatics社) を用いて環状DNAを合成した後、PlasmidSafe exonuclease（Epicentre社）を用いて未反応の直鎖DNAを切断除去した。AcuI（New England BioLabs社）を用いて環状DNAを切断した後、Taq DNA polymerase （New England BioLabs社）を用いて増幅した。同様の反応を行い、Ad2アダプター、Ad3アダプター、Ad4アダプターが導入された直鎖DNAを合成した。Pfu Turbo Cx（アジレント・テクノロジー社）を用いて増幅反応した後、CircLigase（Epicentre社）を用いて環状DNAを合成した。
最後に、ExoI （Epicentre社）とExoIII （Epicentre社）を用いて未反応の直鎖DNAを分解除去した。
（２）DNAボール作製。及び核酸分析用フローセルへのDNAボール固定
環状ライブラリーを鋳型にPhi29 DNA polymerase（New England BioLabs社）を用いて増幅反応行いDNAボールを合成した。その後、DNAボールを含む水溶液を本発明の核酸分析用フローセルに注入し、23℃で2時間保持し、サンプル固定用スポット206にDNAボールを固定した。最後に、中性の水を用いてフローセル内を洗浄し、未固定のDNAボールを除去した。
（３）核酸分析
本発明の核酸分析装置725にDNAボールが固定された核酸分析用フローセルを設置した。アンカープライマを含む水溶液をノズル730を介して核酸分析用フローセル725に注入した。ホルダユニット726を用いて核酸分析用フローセル725内の水溶液を28℃で30分保持した。配列決定用の色素でラベル化されたプライマ、ライゲーション酵素を含む水溶液を注入した後28℃で60分保持した。バッファーで核酸分析用フローセル725内の流路を洗浄し、未反応のラベル化プライマを除去した。核酸分析用フローセル725をステージユニット727にて移動させた後、検出ユニット732にて励起光を当てて検出領域内にある複数のDNAボールに導入された蛍光を検出した。ライゲーション反応と洗浄、及び蛍光検出を複数サイクル繰り返しDNA配列を決定した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の核酸分析用フローセル又は核酸分析装置を用いて、種々の核酸反応を行うことができ、DNAシーケンス等の核酸の分析を行うことができる。
【符号の説明】
【００４６】
101,201,301,401,501,601  第一の合成樹脂基板
102,502,602  中抜きシート
103,603  中抜き部
104,504a,504b,604  第二の合成樹脂基板
105,505a,505b  スポットグリッド配列部
106,206,306,406,606  サンプル固定用スポット
107,607  注入口
108,608  排出口
209,309  第一の無機酸化物からなる膜
210  スポット形成用膜
211,411  パターン形成材料
212,315,412  スタンパー
213,413  スポット形成部
214  第一の無機酸化物からなるスポット
316  スポットインク
317,420,622  疎水性の膜
418  第二の無機酸化物からなる膜
419  シリカなる膜
421  シリカなるスポット
623  第一の無機酸化物、及び第二の無機酸化物からなる膜
724  核酸分析装置
725  核酸分析用フローセル
726  ホルダユニット
727  ステージユニット
728  試薬容器
729  送液ユニット
730  ノズル
731  ノズル搬送ユニット
732  検出ユニット
733  廃液容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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