(57)【要約】      （修正有）【課題】高水温耐性遺伝子、及びその遺伝子を利用して、高水温耐性株を選抜する方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列並びにこれらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドのいずれか１種からなるノリの高水温耐性遺伝子、および高水温処理によって誘導される前記ノリの高水温耐性遺伝子の発現量を指標にして、当該遺伝子の発現量が多いノリを高水温耐性の高いノリとして選抜する、高水温耐性ノリの選抜方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２で示される塩基配列並びにこれらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドのいずれか１種からなるノリの高水温耐性遺伝子。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列のポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドのいずれか１種からなる新規遺伝子。
【請求項３】
高水温処理によって誘導される請求項１に記載のノリの高水温耐性遺伝子の発現量を指標にして、当該遺伝子の発現量が多いノリを高水温耐性の高いノリとして選抜する、高水温耐性ノリの選抜方法。
【請求項４】
被検ノリの葉体を２３〜２８℃の高水温で培養し、請求項１に記載のノリの高水温耐性遺伝子の発現量を定量し、当該発現量を複数の被検ノリ株間で比較し、前記遺伝子の発現量の多いノリを高水温耐性の高いノリとする請求項３に記載の選抜方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノリの高水温耐性に関与する遺伝子およびその利用に係るもので、より詳細には、スサビノリから単離された高水温耐性に関与する遺伝子およびそれを用いた高水温耐性株の選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スサビノリは紅藻類の海藻で、現在のほとんど（一説には９９％）の養殖海苔の原種である。元来、このノリは北方系の種であり、高水温に弱い傾向にある。このため、通常、漁場の水温が約２３℃以下で育苗が開始されている。
近年、海水温の上昇により、多くの漁場で、漁期の短縮化や品質の低下等の問題が発生している。この品質の低下は、本来は細胞一層からなるシート状のノリ葉状体が高水温の影響で多層化することにより生じ、生長不良とともに、食感或いは口どけの悪化等を惹き起す。なお、この高水温耐性は品種によって相違することが知られている（非特許文献１参照）
今後も地球温暖化等による海域の高水温化が懸念され、高水温耐性、中でも多層化耐性を有するノリの作出へのニーズが高まっている。
しかし、高水温耐性の品種間の相違が遺伝的な要因（遺伝子の関与）によるものかは分かっておらず、高水温耐性に関与する遺伝子も知られていなかった。
【０００３】
一方、陸上植物では高温により低分子量ＨＳＰ（ＨＳＰ２０）の発現量が増加し、ＨＳＰ２０が高温耐性に重要な役割を担うことが示唆されており、本発明者らは、高水温に対するスサビノリの応答を分子レベルで明らかにするため、スサビノリＨＳＰ２０ホモログ遺伝子の単離と発現解析を行い、スサビノリの高水温耐性への関与を報告した（非特許文献２）。
しかし、このＨＳＰ２０ホモログ遺伝子の多層化耐性への寄与度は不明であり、必ずしも高水温耐性株の選抜に適さないことから、選抜に適した高水温耐性への寄与の高い遺伝子が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】漁場環境・水産資源持続的利用型技術開発事業のうち「水産物の原産地判別手法等の技術開発委託事業」（室内培養試験による評価法の開発）総括報告書、「高温耐性の品種特性評価」、第４７頁〜第５２頁、ノリ原産地判別手法等技術開発共同研究機関、平成２４年３月発行
【非特許文献２】日本水産学会秋季大会講演要旨集、「スサビノリＨＰＳ２０ホモログ遺伝子の単離と発現解析」、第１１４頁、２０１１年９月２８日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、ノリの高水温耐性が遺伝子の関与によるものであることを明らかにするとともに、高水温耐性に関与する遺伝子を同定し、その遺伝子を利用して、耐性株を選抜する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は次の通りである。
（１）配列番号１または２で示される塩基配列並びにこれらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドのいずれか１種からなるノリの高水温耐性遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列のポリヌクレオチド、またはこれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドのいずれか１種からなる新規遺伝子。
（３）高水温処理によって誘導される上記（１）に記載のノリの高水温耐性遺伝子の発現量を指標にして、当該遺伝子の発現量が多いノリを高水温耐性の高いノリとして選抜する、高水温耐性ノリの選抜方法。
（４）被検ノリの葉体を２３〜２８℃の高水温で培養し、上記（１）に記載のノリの高水温耐性遺伝子の発現量を定量し、当該発現量を複数の被検ノリ株間で比較し、前記遺伝子の発現量の多いノリを高水温耐性の高いノリとする上記（３）に記載の選抜方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、高水温耐性、中でも多層化耐性を有するノリを選抜でき、効率的に高水温耐性のノリ品種、例えば日本の南方海域で養殖しても品質の低下がないノリ品種を作出できるという格別の効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、高水温処理および未処理の葉体における各遺伝子の発現量を示したグラフである。
【図２】図２は、高水温（多層化）耐性が異なるスサビノリ６品種を高水温処理した際の高水温耐性関連候補遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図３】図３は、配列番号１および２の遺伝子の発現量と高水温（多層化）耐性との間のピアソンの相関係数検定および単回帰分析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の配列番号１および２で表される塩基配列は次の通りである。
【００１０】
（配列番号１）
ＡＴＣＣＧＧＡＧＣＧＡＣＡＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＧＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣＧＴＣＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＴＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＣＣＡＣＴＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＧＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＴＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＴＣＡＣＧＴＣＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＣＧＧＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＡＡＴＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＧＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＧＧＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＧＴＧＴＣＴＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＴ
【００１１】
（配列番号２）
ＧＴＡＴＡＡＧＡＧＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＣＣＡＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＧＴＡＴＡＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＧＣＴＡＣＣＧＧＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＴＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＣＧＴＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＧＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＣＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＴＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＴＧＡＧＣＧＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＧＴＴＧＡＧＣＧＣ
【００１２】
なお、上記配列番号１および２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、国際ＤＮＡデータベースには未登録であるが、配列番号２のポリヌクレオチドはスサビノリＥＳＴ配列（発現断片配列）として登録されている。すなわち、配列番号１のポリヌクレオチドは新規な遺伝子であり、また両配列のポリヌクレオチドとも高水温耐性遺伝子、特には多層化耐性遺伝子であることは知られていない。
【００１３】
これらの遺伝子は、後述の実施例に記載した方法で特定されたものである。
すなわち、１７℃の低水温で生育したノリ葉体を、２７℃の高水温に２４時間程度曝し、高水温処理葉体のｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを、また未処理（低水温生育）葉体のｐｏｌｙＡ  ＲＮＡをそれぞれ調製した後、ｃＤＮＡを得、高水温処理葉体のｃＤＮＡから未処理葉体のｃＤＮＡを差し引くｃＤＮＡサブトラクション処理を行い、サブトラクトｃＤＮＡを取得する。このサブトラクトｃＤＮＡをＰＣＲ法で増殖し、ベクターにサブクローニングしてプラスミドｃＤＮＡライブラリーを作製し、大腸菌に導入して複製した後、ベクター挿入部分の塩基配列情報を取得し、重複して単離された遺伝子を選択する。
【００１４】
一方、高水温処理および未処理のノリ葉体より全ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを逆転写反応によってｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法で増殖して各遺伝子の発現量を測定し、上記の重複単離された遺伝子と比較検証して、顕著に高水温誘導性を示す遺伝子を選択する。
さらに、あらかじめ知られている高水温耐性の異なる６種のノリ品種を用いて、高水温処理および未処理のノリ葉体より全ＲＮＡを抽出、ｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法で増殖して各遺伝子の発現量を測定し、２種類の遺伝子が高水温耐性を有するノリ品種と統計学的に相関関係にあることが確認できたので、この遺伝子が高水温耐性に関与する遺伝子として特定された。
【００１５】
本発明における遺伝子としては、上記配列番号１または２の塩基配列のポリヌクレオチド以外に、これらと相補的な塩基配列のポリヌクレオチドでもよく、また、高水温耐性を実質的に損なわない範囲の、すなわちストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドのいずれか１種でもよい。
【００１６】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、５〜６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ中、４０〜４５℃でハイブリダイゼーションを行い、ついで０.１〜２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、４５〜６８℃で複数回の洗浄を行う、などの条件をあげることができる。また、バッファーにはホルムアミドを添加することも可能である。ハイブリダイゼーションは、例えばMolecular Cloning: A laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012.等に記載されている公知の方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとしては、配列番号１または２の塩基配列あるいはこれらと相補的な塩基配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００１７】
選抜方法の発明について、被検ノリとしてフリー糸状体からスタートした場合の一実施態様について説明する。
先ず、被検ノリのフリー糸状体を粉砕し、カキ殻糸状体に播種後、１／２ＳＷＭ‐III改変培地、ＳＷＭ‐III改変培地、ＰＥＳ培地、ＰＥＳ改変培地、Ｇｒｕｎｄ培地等を用いて、１０〜２３℃、光周期１０Ｌ１４Ｄ〜１８Ｌ６Ｄ、光量子密度３〜１５μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で、３０〜３６５日間静置培養し、さらに成熟条件（２４〜２６℃、光周期１０Ｌ１４Ｄ〜１２Ｌ１２Ｄ、光量子密度１０〜３０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、１／２ＳＷＭ‐III改変培地等）で３０〜３６５日間培養したのち、殻胞子放出誘導条件（１７〜２３℃、光周期１０Ｌ１４Ｄ〜１２Ｌ１２Ｄ、光量子密度３０〜１００μｍｏｌ／ｍ２ｓ、１／２ＳＷＭ‐III改変培地等）に変更して、３〜１４日間通気培養して、採苗により殻胞子をビニロン単糸等に付着させる。
【００１８】
被検ノリの殻胞子が付着した付着糸をＰＥＳ培地、ＳＷＭ‐III改変培地、１／２ＳＷＭ‐III改変培地、ＰＥＳ改変培地、Ｇｒｕｎｄ培地等の培地を用いて、１６〜１８℃、光周期１０Ｌ１４Ｄ〜１１Ｌ１３Ｄ、光量子密度５０〜７０μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で、１〜２回／週、換水を行い、２０〜２８日間、通気培養する。次に、葉体を付着糸からはぎ取り、同様の条件で、葉長が５〜２０ｃｍになるまで生長させる。これを、あらかじめ２３〜２８℃、好ましくは、２３〜２５℃に調温したＰＥＳ培地で、光周期１０Ｌ１４Ｄ〜１１Ｌ１３Ｄ、光量子密度５０〜７０μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で、１２〜２４時間培養して、高水温処理を行う。
【００１９】
上記高水温処理された被検ノリの葉体より、例えば、RNAqueous kitおよびPlant RNA Isolation Aid（いずれもライフテクノロジーズ社）等を用いて、全ＲＮＡを抽出し、この抽出された全ＲＮＡを鋳型とし、例えば、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（タカラバイオ社）等を用いて、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製する。
このｃＤＮＡを鋳型とし、例えば、ユニバーサルプローブライブラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプローブとPremix Ex Taq (Probe qPCR)（タカラバイオ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行ない、上記本発明の高水温耐性遺伝子の発現量を、例えば、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）等を内部標準遺伝子として使用して定量する。
このようにして測定された発現量を、複数の被検スサビノリ間で比較し、発現量の多い株を高水温耐性の株として選抜する。
【実施例】
【００２０】
〔高水温誘導性遺伝子の単離〕
生物は高温に曝された際に細胞内で一群の遺伝子の発現量を増加させ、高温に対処することが知られている。そこで、ノリにおいても高水温で誘導される遺伝子が高水温耐性に関与する遺伝子であるという仮説を立て、まずはスサビノリの高水温誘導性遺伝子を単離した。
【００２１】
（ノリ葉体の培養）
スサビノリＵ‐５１株の殻胞子が付着したビニロン単糸をＰＥＳ培地入り１Ｌ枝付きフラスコに投入し、１７℃、光周期１１Ｌ１３Ｄ、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で通気培養した。培養期間中は１週間に２回、換水を行った。２７日目に葉体を付着糸からはぎ取り、葉長が５ｃｍ前後に生長するまで室内培養した。
【００２２】
（高水温処理および葉体試料の調製）
１７℃で培養したスサビノリＵ‐５１株の葉体を、あらかじめ２７℃に調温したＰＥＳ培地入り１Ｌ枝付きフラスコに投入し、光周期１１Ｌ１３Ｄ、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で２４時間培養した。処理終了後、直ちに葉体表面の海水を除去し、１７℃に調温した滅菌蒸留水で軽く洗浄した。葉体表面の水分を除去したのち１７℃に調温したRNA later（ライフテクノロジーズ社）入りの５０ｍＬコニカルチューブに葉体を浸漬し、４℃で保存した。
【００２３】
（ｃＤＮＡサブトラクションおよび塩基配列解析）
４℃で保存された高水温処理および未処理のスサビノリＵ‐５１葉体（各３枚）よりμMACS mRNAアイソレーションキット（ミルテニーバイオテク社）にてｐｏｌｙＡ  ＲＮＡを調製した。これらｐｏｌｙＡ  ＲＮＡ各１２０ｎｇを出発原料とし、SMART cDNAライブラリー作製キット（クロンテック社）を用いて完全長ｃＤＮＡを合成した。
高水温処理葉体のｃＤＮＡから未処理葉体のｃＤＮＡを差し引くｃＤＮＡサブトラクション処理をDsDD cDNA Subtraction Kit（和光純薬工業社）を用いて行い、完全長率の高いサブトラクトｃＤＮＡを取得した。サブトラクトｃＤＮＡのＰＣＲ産物をpCR-Blunt II-TOPOベクター（ライフテクノロジーズ社）にサブクローニングしてプラスミドｃＤＮＡライブラリーを作製し、大腸菌ＴＯＰ１０（ライフテクノロジーズ社）に導入した。
このプラスミドｃＤＮＡライブラリーからランダムに１０２クローンを選択し、プラスミドＤＮＡを抽出して3130xlジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズ社）によりベクター挿入部分の塩基配列情報を取得した。１０２クローンの塩基配列を解析した結果、重複して単離されていた遺伝子が１５種類あり、これら遺伝子が高水温による誘導量が多く、ノリの高水温耐性に重要なものであることが推測された。
【００２４】
〔候補遺伝子の高水温誘導性の検証〕
ｃＤＮＡサブトラクションによって得られた１５種類の遺伝子の中には、実際には高水温誘導性ではなく、もともと多量に発現していた遺伝子も含まれている可能性がある。そこで、これら遺伝子の発現が真に高水温処理により誘導されるのかについてリアルタイムＰＣＲ法により検証した。
高水温処理および未処理のスサビノリＵ‐５１葉体（各６枚）よりRNAqueous kitおよびPlant RNA Isolation Aid（いずれもライフテクノロジーズ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（タカラバイオ社）を用いた逆転写反応によってｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（タカラバイオ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法により各遺伝子の相対定量を行った。リアルタイムＰＣＲ機器はThermal Cycler Dice Real Time System（TP860；タカラバイオ社）を使用した。ＰＣＲ条件はタカラバイオ社のプロトコールに従った。各遺伝子の発現量は、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準遺伝子として使用し、相対値で、図１に示した。
【００２５】
この結果から、１５種類のうち５種類が実際に高水温誘導性遺伝子であることが確認された。これら５種類のうち３種類の遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、高水温処理により数十から数千倍に増加していた。この値は、他の２種類の遺伝子のｍＲＮＡ増加量（５.６倍および８.５倍）に比べて極端に高かった。このことから、顕著な高水温誘導性を示す３種類の遺伝子が、ノリの高水温耐性に関与する有力候補遺伝子であると推測された。
【００２６】
〔遺伝子の発現量とノリの高水温（多層化）耐性との相関性〕
顕著な高水温誘導性を示す３種類の遺伝子がノリの高水温耐性に関与する有力候補遺伝子であると予想されたことから、これら遺伝子を中心に各発現量とノリの高水温（多層化）耐性との相関を調べた。
【００２７】
（高水温耐性関連遺伝子の同定に用いる葉体試料の調製）
高水温（多層化）耐性が異なるスサビノリ品種６種類（湯の浦、Ｕ‐５１、水呑、佐賀５号、アオクビ、ＭＣＦ１）を以下に示す方法により室内培養した。試験区として、高水温処理区（２４℃あるいは２７℃に２４時間曝露）および未処理区（１７℃培養）の計３区を設定した。
フリー糸状体を粉砕後にカキ殻糸状体に播種後、１８℃、光周期１３Ｌ１１Ｄ、光量子密度１０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、１／２ＳＷＭ‐III改変培地の条件下で静置培養した。４８日後に成熟条件（２６℃、光周期１０Ｌ１４Ｄ、１５μｍｏｌ／ｍ２ｓ、１／２ＳＷＭ‐III改変培地）へ移行した。さらに５５日間培養したのち殻胞子放出誘導条件（２０℃、１０Ｌ１４Ｄ、６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、ＰＥＳ培地）に変更して通気培養を開始し、７〜８日後に室内採苗により殻胞子をビニロン単糸に付着させた。なお、株の区別をするために株毎に異なる色のビニロン単糸を用いた。採苗後は付着糸を一旦−３０℃で保管した。
【００２８】
付着糸をＰＥＳ培地入りの１Ｌ枝付きフラスコに投入し、１７℃、光周期１１Ｌ１３Ｄ、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で通気培養した。培養期間中は１週間に２回、換水を行った。２７日目に葉体を付着糸からはぎ取り、株別の培養に変更した。葉長が５ｃｍ前後まで生長した３４日目に、あらかじめ２４℃および２７℃に調温したＰＥＳ培地入り１Ｌ枝付きフラスコにそれぞれの葉体を投入し、光周期１１Ｌ１３Ｄ、光量子密度６０μｍｏｌ／ｍ２ｓの条件下で２４時間培養した。高水温処理終了後には直ちに試験区毎に次のとおり試料の処理を行った。葉体表面の海水を除去し、１７℃に調温した滅菌蒸留水で軽く洗浄した。葉体表面の水分を除去したのち１７℃に調温したRNAlater（ライフテクノロジーズ社）入りの５０ｍＬコニカルチューブに葉体を浸漬し、４℃で保存した。
【００２９】
（ノリ葉体からのＲＮＡ抽出）
４℃で保存されたスサビノリ葉体（１品種１試験区あたり１０枚）よりRNAqueous kitおよびPlant RNA Isolation Aid（いずれもライフテクノロジーズ社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ノリ葉体は、当該キットに含まれるLysis/Binding Solutionに浸漬し、TissueRuptorホモジナイザー（キアゲン社）により破砕した。以降のＲＮＡ抽出はライフテクノロジーズ社のプロトコールに従って行った。
【００３０】
（リアルタイムＰＣＲ法による候補遺伝子の定量）
ノリ葉体から抽出した全ＲＮＡ（１μｇ）を鋳型とし、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（タカラバイオ社）を用いた逆転写反応によってｃＤＮＡを調製した。合成したｃＤＮＡはEASY Dilution（タカラバイオ社）を用いて１２.５ｎｇ／μＬの濃度に希釈した。
希釈したｃＤＮＡを鋳型とし、ユニバーサルプローブライブラリー（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプローブとPremix Ex Taq (Probe qPCR)（タカラバイオ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲ機器はThermal Cycler Dice Real Time System（TP860；タカラバイオ社）を使用した。プローブの最終濃度は０.２μＭとし、ＰＣＲサイクル数を４５回とした。その他の反応条件はタカラバイオ社のプロトコールに従った。各遺伝子のプライマー配列およびユニバーサルプローブライブラリーのプローブ番号を表１に示した。
【００３１】
【表１】
2015181363.tif 000002
【００３２】
各遺伝子の発現量は、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を内部標準遺伝子として使用し、スサビノリ６品種を高水温処理した際の、高水温耐性関連候補遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、相対値で、図２に示した。
この結果から、有力候補遺伝子３種類のうち２種類の遺伝子の発現量と高水温（多層化）耐性との間に相関する傾向が認められた。ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のＢＬＡＳＴで相同性検索を行った結果、これら２種類の遺伝子は既知の遺伝子との相同性が認められなかった。一方、これら遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列は、既報のスサビノリゲノム配列上にマッピングされることが確認されたことから、間違いなくノリ由来の遺伝子であると考えられた。そこで、これら遺伝子を新規スサビノリ遺伝子として、配列番号１の遺伝子をhiperion A（hipnA）、配列番号２のものをhiperion B（hipnB）と称することにした。
【００３３】
〔相関関係の解析〕
遺伝子hiperion Aおよびhiperion Bの発現量と高水温（多層化）耐性との間に相関する傾向が認められたことから、その相関関係を統計学的に検討した。
スサビノリ６品種の高水温耐性を表す数値として、２４℃における各品種の多層化葉体発生率に基づき、非多層化発生率（１００−多層化葉体発生率（％））の値を算定した。この数値と各遺伝子ｍＲＮＡ量の値を用いてピアソンの相関係数検定を行った。
この結果を図３に示す。図のように、高水温処理（２４℃、２４時間）下の葉体におけるhipnAのｍＲＮＡ発現量、および未処理（１７℃）下の葉体におけるhipnBの発現量に、それぞれ高水温（多層化）耐性との有意な正の相関が認められた（hipnA：ｒ＝０.９６５、Ｐ＜０.０５；hipnB：ｒ＝０.８３０、Ｐ＜０.０５）。さらに単回帰分析によって得られた各回帰直線は高水温（多層化）耐性度の予測に役立つことが示された（Ｐ＜０.０５）。
以上により、スサビノリの高水温（多層化）耐性に関与する新規遺伝子を２種類同定した。また、これらの発現量を複数の被検スサビノリ株間で比較することにより、発現量の多い株を高水温（多層化）耐性の高い株であると判定できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
高水温で多層化しにくいノリ株を選抜でき、ノリの高水温耐性育種に利用できるとともに、他の有用形質（例えば、色落ち耐性等）を持つノリ株における高水温（多層化）耐性の評価に利用できる。また、高水温耐性株を選抜することにより、地球温暖化等で海水温が上昇しても、さらには日本の南方海域で養殖しても品質の低下しないノリの養殖品種の作出にも利用できる。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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