(57)【要約】【課題】物体面の走査や高精度な構成が不要で、高品質なセクショニング効果を与える【解決手段】照明光学系１１０の瞳面１１３に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、複数の光源領域のそれぞれの中心と照明光学系１１０の瞳面の中心との距離のうち少なくとも１つの距離が他の距離と異なる。また、複数の光源領域のうちの少なくとも２つの光源領域の中心間の、対物レンズ１０２の瞳面に対応する座標上での距離Ｃが結像光学系の瞳面の半径の０．７倍以上１．３倍以下である。【選択図】図１
2015179208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本を照明する照明光学系と、前記標本からの散乱光により前記標本の像を形成する結像光学系と、前記標本の像を光電変換する撮像素子と、を有する撮像装置であって、
前記照明光学系の瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、前記照明光学系の瞳面の中心と前記複数の光源領域のそれぞれの中心との距離のうち少なくとも１つの距離は他の距離と異なり、
前記複数の光源領域のうち少なくとも２つの光源領域の中心間の、前記結像光学系の瞳面に対応する座標上での距離は、前記結像光学系の瞳面の半径の０．７倍以上１．３倍以下であることを特徴とする撮像装置。
【請求項２】
前記照明光学系は、前記光源からの光を前記複数の光源領域に分ける光学素子を有することを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
【請求項３】
前記照明光学系の瞳面に配置される前記複数の光源領域は２つの光源領域であることを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。
【請求項４】
前記照明光学系の瞳面に配置される前記複数の光源領域は３つの光源領域であることを特徴とする請求項１または２に記載の撮像装置。
【請求項５】
前記散乱光は、蛍光または燐光であることを特徴とする請求項１乃至４のうちいずれか１項に記載の撮像装置。
【請求項６】
請求項１乃至５のうちいずれか１項に記載の撮像装置と、
前記撮像装置から出力される信号を処理する手段と、
を有することを特徴とする画像処理システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、撮像装置および画像処理システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の蛍光顕微鏡で厚みのある試料を観察すると、試料内部の光が透過した全ての深さ位置にある画像が重畳された画像が観察され、所望の合焦面の画像だけを選択的に分離して取り出すこと（セクショニング）はできない。セクショニング効果が得られる蛍光顕微鏡は３次元蛍光顕微鏡と呼ばれ、通常の蛍光顕微鏡と区別される。
【０００３】
共焦点顕微鏡は代表的な３次元蛍光顕微鏡である。非特許文献１は、画像処理を援用してセクショニング効果を実現する構造化照明法を提案している。特許文献１及び非特許文献２〜７は、ランダムに生成されたスペックルを照明として利用する方法を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２２４７９６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ．Ａ．Ａ．Ｎｅｉｌ  ａｎｄ  Ｔ．Ｗｉｌｓｏｎ，“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏＰｅ，”  ＯＰｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２２，  １９０５  （１９９７）．
【非特許文献２】Ｃ．  Ｖｅｎｔａｌｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｒｔｚ，  “Ｑｕａｓｉ−ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｐｅｃｋｌｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ，”  ＯＰｔ．  Ｌｅｔｔ．  ３０，  ３３５０-３３５２  （２００５）．
【非特許文献３】Ｃ．  Ｖｅｎｔａｌｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｒｔｚ，  “Ｄｙｎａｍｉｃ  ｓＰｅｃｋｌｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｐｅｃｋｌｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ，”  ＯＰｔ．  ＥｘＰｒｅｓｓ  １４，  ７１９８−７２０９  （２００６）．
【非特許文献４】Ｃ．  Ｖｅｎｔａｌｏｎ，  Ｒ．  Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｒｔｚ，  “Ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｐｅｃｋｌｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｗａｖｅｌｅｔ  Ｐｒｅｆｉｌｔｅｒｉｎｇ，”  Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  ３２，  １４１７−１４１９  （２００７）．
【非特許文献５】Ｄａｒｙｌ  Ｌｉｍ，  Ｋｅｎｇｙｅｈ  Ｋ．  Ｃｈｕ，  ａｎｄ  Ｊｅｒｏｍｅ  Ｍｅｒｔｚ，“Ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｐｅｃｋｌｅ  ａｎｄ  ｕｎｉｆｏｒｍ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏＰｙ，”  Ｏｐｔ．  Ｌｅｔｔ．  ３３，  １８１９−１８２１  （２００８）．
【非特許文献６】Ｄａｒｙｌ  Ｌｉｍ，  Ｎ．Ｆｏｒｄ，Ｋｅｎｇｙｅｈ  Ｋ．  Ｃｈｕ，  ａｎｄ  Ｊｅｒｏｍｅ  Ｍｅｒｔｚ，“Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｋｌｅ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ＨｉＬｏ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ．  １６，  ０１６０１４  （２０１１）．
【非特許文献７】Ｐｅｒ  Ａ．Ｓｔｏｋｅｔｈ，  “Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｆｏｃｕｓｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  ５９，  １３１４  （１９６９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、共焦点顕微鏡は、試料の全領域を観察するためには走査が必要である。非特許文献１の方式は、高精度で位相すなわち位置を制御された正弦波構造を作り出すことが要求される。また、特許文献１及び非特許文献２〜７は、物体面の照明光強度がランダムなスペックルに依存するため最終画像に不均一な強度ムラが発生する。
【０００７】
本発明は、物体面の走査や高精度な構成が不要で、高品質なセクショニング効果を与えることが可能な撮像装置および画像処理システムを提供することを例示的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の撮像装置は、標本を照明する照明光学系と、前記標本からの散乱光により前記標本の像を形成する結像光学系と、前記標本の像を光電変換する撮像素子と、を有する撮像装置であって、前記照明光学系の瞳面に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、前記照明光学系の瞳面の中心と前記複数の光源領域のそれぞれの中心との距離のうち少なくとも１つの距離は他の距離と異なり、前記複数の光源領域のうち少なくとも２つの光源領域の中心間の、前記結像光学系の瞳面に対応する座標上での距離は、前記結像光学系の瞳面の半径の０．７倍以上１．３倍以下であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、物体面の走査や高精度な構成が不要で、高品質なセクショニング効果を与えることが可能な撮像装置および画像処理システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施形態の照明光学系を有する蛍光顕微鏡の光路図である。
【図２】本実施形態の瞳関数と照明光強度分布、および蛍光光分布との関係を示す図である。
【図３】本実施形態の瞳関数の座標の定義を説明するための図である。
【図４】本発明の瞳関数の配置とその性能評価の結果を示す図である。（実施例１）
【図５】本発明の照明光強度分布のｚ方向の位置ずれに対応する横ずれを示す図である。（実施例１）
【図６】本発明の性能評価と瞳関数の配置例を示した図である。（実施例２）
【図７】本発明の瞳関数配置の候補を示す図と性能を評価した図である。（実施例３）
【図８】本発明の瞳関数の座標決定のプロセスとその配置の一例を示す図である。（実施例３）
【図９】従来の画像処理方法を説明するための図である。
【図１０】図９に示す画像処理方法の問題を説明するための図である。
【図１１】ｃｏｍｂ関数状の照明光強度分布を実現するための瞳関数の例と、その瞳関数を用いた時にできる各位置における照明光強度分布を表す図である。
【図１２】ｃｏｍｂ関数状の照明光強度分布を実現するための瞳関数の例とその瞳関数を用いた時にできる各位置の照明光強度分布を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
まず、本発明の背景について説明する。非特許文献５及び６は、一様な強度で照明された画像１とスペックルで照明された画像２の２枚の画像を用いて、合焦面にある蛍光物体の画像のみを抽出する画像処理方法を提案している。かかる画像処理方法は、コンピュータによって実行され、コンピュータが、画像１と画像２の強度差である画像３を作成する。
【００１２】
物体をスペックルで照明するためにはコヒ−レントな励起光を光源に持つ照明光学系の瞳面にすりガラスなどのランダムな位相擾乱を与える物体を挿入すればよい。説明の簡単化のため、蛍光物体の強度分布Ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）としてＯ（ｘ，ｙ，ｚ）＝δ（ｚ）であるようなものを考える。本明細書においては、蛍光物体の強度分布Ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）を物体Ｏと略称することがある。これはｚ＝０の平面にだけ、局所的にかつｘ−ｙ方向には一様な強度分布を持つような仮想的な物体である。そしてｚ＝０を合焦面とする。またｚ＝ａ（ａ≠０）の平面を非合焦面の代表とする。
【００１３】
図９（ａ）は、一様な強度分布をもつ照明で物体Ｏを照明し、合焦面（ピントが合っている高さ位置の平面）にピントを合わせて観察した時の画像である。この一様な強度分布を持つ照明によって撮影された像をＩｕ（ｘ，ｙ，ｚ）とする。図９（ｂ）は、同様の照明で非合焦面（ピントが外れている高さ位置の平面）にピントを合わせて観察した時の画像である。これらが画像１に対応する。
【００１４】
図９（ｃ）はスペックルで物体Ｏを照明し、合焦面にピントを合わせて観察した時の画像である。図９（ｄ）は、スペックル照明で非合焦面にピントを合わせて観察した時の画像である。これらが画像２に対応する。
【００１５】
図９（ｅ）は、図９（ａ）に示す画像の強度分布と図９（ｃ）に示す画像の強度分布の双方の面内強度分布の平均強度が一致するようにスケーリングした後、それぞれのデータの差をとったものである。図９（ｆ）は、同様にして図９（ｂ）に示す画像の強度分布と図９（ｄ）に示す画像の強度分布の差をとったものである。これらが画像３に対応する。なお、図９（ａ）〜（ｆ）において、横軸はｘ座標［μｍ］、縦軸はｙ座標［μｍ］である。
【００１６】
通常の蛍光顕微鏡においてはセクショニング効果がないため、図９（ａ）及び図９（ｂ）に示すように、通常の一様な照明では、物体Ｏが存在するｚ＝０にピントを合わせた画像と、物体Ｏが存在しないｚ＝ａにピントを合わせた時に得られる画像は区別できない。
【００１７】
そこで、非特許文献５及び６は、図９（ｅ）及び図９（ｆ）に示すデータをコンピュータに取り込んで、点（ｘ，ｙ）の近傍の領域でとられた強度差の空間分散値σを計算する。図１０（ａ）は、図９（ｅ）にそのような領域を白枠で示している。そのようにして得られた分散値のマップσ（ｘ，ｙ，ｚ）を構成する。
【００１８】
この時、合焦面に対応する図９（ｅ）は、白黒のコントラストが鮮鋭であるため、σ（ｘ，ｙ，０）は高い値をとる。一方、非合焦面に対応する図９（ｆ）はスペックル像のボケによりコントラストがほとんどないため、σ（ｘ，ｙ，ａ）はほぼ一様に０に近い値をとる。
【００１９】
Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）＝Ｉｕ（ｘ，ｙ，ｚ）・σ（ｘ，ｙ，ｚ）        （１）
数式１に従ってＩ（ｘ，ｙ，ｚ）を計算すれば、Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）はσ（ｘ，ｙ，ｚ）によってセクショニング効果を獲得した画像となる。即ち、Ｉ（ｘ，ｙ，０）は値を持つが、Ｉ（ｘ，ｙ，ａ）はほとんど値を持たない。このようにして物体Ｏに近い画像をコンピュータ上で再構成する。しかし、この方法は、照明に本質的にランダムなスペックルを利用するため、照明光の平均強度が均一にならず、ｘ−ｙ方向に均質な物体の像はｘ−ｙ方向に均質にならない。この原因は、図１０（ｂ）に示すように、σ（ｘ，ｙ，ｚ）の分布が照明光強度のランダムパターンを検出してしまうからである。これが最終的なＩ（ｘ，ｙ，０）の画質を大きく損ねる。
【００２０】
なお、図１０（ａ）は、図９（ｅ）の点（ｘ，ｙ）の近傍における強度の空間分散値を計算する領域を模式的に表す図であり、図１０（ｂ）は、分散値マップσ（ｘ，ｙ，ｚ）のｘ−ｙ方向の不均一性を表す図である。図１０（ａ）、（ｂ）において、横軸はｘ座標［μｍ］、縦軸はｙ座標［μｍ］である。
【００２１】
そこで、特願第２０１３−１７４７４２号は、照明ムラによる画質劣化を防止しつつ、セクショニング効果を持った照明方法を提案した。まず、同出願に記載された発明の原理について説明する。一般に数式２で表される関数をｃｏｍｂ関数（くし関数）という。
【００２２】
ｃｏｍｂ（ｘ，ｙ）＝Σδ（ｘ−ｎａ）δ（ｙ−ｍａ）            （２）
ここで、δはディラックのデルタ関数、ａは無限の値をとる点同士の座標軸に沿った方向の間隔（ピッチ）、和記号は−∞＜ｍ，ｎ＜∞の整数でとる。数式３に示すように、ｃｏｍｂ関数のフーリエ変換は、ピッチ１／ａのｃｏｍｂ関数となっている。なお、Ｆをフーリエ変換、ｌｘ，ｌｙをそれぞれｘ，ｙに対応する空間周波数とする。
【００２３】
Ｆ［ｃｏｍｂ（ｘ，ｙ）］（ｌｘ，ｌｙ）＝Σδ（ｌｘ−ｍ／ａ）δ（ｌｙ−ｎ／ａ）  （３）
光学系の瞳面における振幅分布Ｐ（ｌｘ，ｌｙ）（瞳関数）をフーリエ変換したものが像面での振幅分布になる。照明光学系では、像面での振幅分布の絶対値の二乗が物体を照明する光の強度分布となる。照明光学系の瞳関数をｃｏｍｂ関数にすれば、ｃｏｍｂ関数状の照明光が実現する。ｃｏｍｂ関数状の照明光は物体面上において均一のピッチで均一の強度の光が分布しているものであるから、照明ムラが発生することがない。
【００２４】
非特許文献５及び６によれば、物体面上での照明光のピッチが細かい方が、図１０（ａ）に示すσ計算領域を小さくできるため、ｘ−ｙ方向の解像度が向上する。従って、照明光学系の瞳面上におけるピッチは可能な限り大きいほうがよい。実際には光学系の瞳面は有限の大きさを有するため、数式３で表されるｌｘ，ｌｙ方向に無限に続く照明を実現することはできない。しかしながら、ｃｏｍｂ関数の最小構成単位だけを瞳面上の振幅分布としても、上記の議論は利点を失わない。
【００２５】
図１１（ａ）は、瞳関数として、数式３に示す照明光分布のｃｏｍｂ関数に現れる最小のピッチを採用した例を示す図である。横軸は正規化された周波数ｌｘであり、横軸は正規化された周波数ｌｙである。
【００２６】
図１１（ｂ）は、その瞳関数を用いた時にできる実際の照明光強度分布（物体面上にできる照明光強度）である。但し、使用波長λを５１２ｎｍ、ＮＡを０．７、ｎを１、ＮＡを照明光学系の開口数、ｎは媒質屈折率とする。図１１（ｂ）において、横軸はｙ座標［μｍ］、縦軸はｘ座標［μｍ］である。照明光学系の瞳面は半径をＮＡ／ｎとして規格化したものを用いており、その際振幅をもつ位置の座標は（０．７／√２，０．７／√２），（−０．７／√２，０．７／√２），（−０．７／√２，−０．７／√２），  （０．７／√２，０．７／√２）である。
【００２７】
図１１（ｂ）に示すように、周期的な照明光で照明された物体の像に対して、σ（ｘ，ｙ，０）を計算する方法を用いれば、照明ムラがないため、非常に均一性の高いσ（ｘ，ｙ，０）が得られる。
【００２８】
図１１（ｃ）は合焦面から２．０μｍ離れた位置の、光軸に対称な照明光のパターン（試料中ｚ＝±２μｍの平面にできる照明光強度分布）である。図１１（ｃ）において、横軸はｙ座標［μｍ］、縦軸はｘ座標［μｍ］である。図１１（ｃ）を図１１（ｂ）と比較すると、強度分布のパターンはｚ座標によらないことが理解される。
【００２９】
ここで、物体Ｏ２（ｘ，ｙ，ｚ）＝δ（ｚ＋１）＋δ（ｚ−１）を考える。ｚの単位はμｍとする。物体Ｏ２を撮像する場合、ｚ＝０で強度を持ってはならない。強度を持ったとしてもそれはｚ＝±１における画像の強度よりも非常に低いものであることが要請される。
【００３０】
物体Ｏ２の上側ｚ＝１に位置する蛍光物体も下側ｚ＝−１に位置する蛍光物体もほぼ同様の照明形状で照明したとする。図１１（ａ）の照明はボケ量が小さいため、図１１（ｄ）に示すように、ｚ＝０の位置において上側蛍光物体から到達するｃｏｍｂ関数状蛍光と下側蛍光物体から到達するｃｏｍｂ関数状蛍光が重なり合って非常にコントラストの高い光強度分布が形成される。図１１（ｄ）は、図１１（ａ）の瞳関数を用いて物体Ｏ２を照明した時の試料中ｚ＝０μｍの平面で観察される蛍光強度分布を表す図である。図１１（ｄ）において、横軸はｘ座標［μｍ］、縦軸はｙ座標［μｍ］である。図１１（ａ）の照明は、物体Ｏ２の存在しないｚ＝０の位置にあたかも蛍光物体が存在するかのような画像が得られてしまう。
【００３１】
この問題を解決するために、特願第２０１３−１７４７４２号は、図１２（ａ）に示すように、照明光学系の瞳面上振幅分布を原点に対して非対称な瞳関数Ｐ２にすることを提案している。これにより、光強度分布のパターンが光軸方向に平行な図１１（ａ）の照明の問題を解決することができる。
【００３２】
図１２（ａ）は、ｃｏｍｂ関数状の照明光強度分布を実現するための瞳関数の例を示す図である。横軸は正規化された周波数ｌｘであり、横軸は正規化された周波数ｌｙである。
【００３３】
図１２（ｂ）は、実際にできる物体面上での照明光強度分布を示す図であり、横軸はｙ座標［μｍ］、縦軸はｘ座標［μｍ］である。照明パタ−ンは周期的であるため、照明ムラはない。瞳関数Ｐ２は原点に非対称であり、照明光を斜入射させているためにｚが変化すると照明光の強度分布が横ずれする。
【００３４】
図１２（ａ）の照明で物体Ｏ２を照明すると、ｚ＝０の位置において上側蛍光物体から到達する蛍光と下側蛍光物体から到達する蛍光がずれ、図１２（ｃ）に示すように、非常にコントラストの低い光強度分布が形成される。図１２（ｃ）は、図１２（ａ）の瞳関数を用いて物体Ｏ２を照明した際に、試料中ｚ＝０μｍの平面で観察される蛍光強度分布を示す図である。図１２（ｃ）において、横軸はｘ座標［μｍ］、縦軸はｙ座標［μｍ］である。図１１（ｄ）と比較するとｚ＝０のコントラストが低くなっており、解像を抑制することができる。
【００３５】
以上に説明してきたように、照明パタ−ンを格子状照明にし、かつ瞳面上の振幅分布を原点に対して非対称にする照明と非特許文献５及び６に記載の方法と合わせて用いることで、強度ムラのない良好な画像が時間のかかる走査なしに得られる。
【００３６】
本実施形態は、照明光学系の瞳面上振幅分布を原点に対して非対称な瞳関数を設定する場合に、より高いセクショニング効果を得ることができるような瞳関数を設定する方法を提供する。つまり、本実施形態の方法は、より高いセクショニング効果を得るのにどの程度、非対称な瞳関数にすればよいかを設定する。
【００３７】
図１は、本実施形態の照明光学系を有する落射型の３次元蛍光顕微鏡１００およびそれを有する画像処理システム２００のブロック図である。画像処理システム２００は、３次元蛍光顕微鏡１００と、画像処理手段１５０と、を有する。
【００３８】
配置は落射型でも透過型でもよい。３次元蛍光顕微鏡１００は、（物体としての標本ＳＰを保持する保持部１０１、対物レンズ（結像光学系）１０２、撮像素子１０３からなる）顕微鏡に照明光学系１１０を付加したものである。照明光学系１１０は、通常の顕微鏡に容易に後から付加することができる。
【００３９】
照明光学系１１０は、コヒーレント光源１１１、光学素子１１２、ダイクロイックミラー１１５を有する。
【００４０】
コヒーレント光源１１１は、蛍光体としての標本ＳＰに照射されてそこから蛍光を励起できる波長のレーザーなどを用いることができる。光学素子１１２は、回折格子、プリズム、光ファイバ、ＳＬＭ（ｓｐａｔｉａｌｌｉｇｈｔ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）などであるが、これらに限定されない。光学素子１１２を設けずに３つの光源を設けて３方向から照明してもよい。光学素子１１２は、コヒーレント光源１１１から発せられる一本のビ−ムを複数に分け、照明光学系１１０の瞳面１１３に瞳関数成分１１４を生成する。瞳関数成分１１４の生成は光学素子１１２の構造によって制御することができる。
【００４１】
光学素子１１２によって分けられた複数のビームは、ダイクロイックミラー１１５を経て対物レンズ１０２を通過し、標本ＳＰを格子状の照明光分布で照明する。ダイクロイックミラー１１５は、励起光の波長を反射し、蛍光の波長を透過する。対物レンズ１０２は、励起光を照射されることによって標本ＳＰから生じた蛍光（散乱光）により、標本ＳＰの像を撮像素子１０３の像面に形成する。標本ＳＰから出た蛍光は、ダイクロイックミラー１１５を透過し、対物レンズ１０２によって撮像素子１０３に結像される。
【００４２】
なお、一様な照明の場合は光学素子１１２が光軸から退避される。また、コヒーレント光源１１１を別の光源に交換してもよいし、交換しなくてもよい。
【００４３】
撮像素子１０３は、対物レンズ１０２が形成した像を光電変換する。撮像素子１０３から出力される画像信号は、不図示のＡ／Ｄ変換器によってデジタル信号に変換され、画像処理手段１５０によって各種の処理を施される。これによって標本の画像を取得することができ、特に、所望の合焦面の画像だけを選択的に分離して取り出すことができる。
【００４４】
以下、瞳関数成分１１４とセクショニング効果の関係について説明する。
【００４５】
図２は、瞳関数Ｐと、瞳関数Ｐによって形成された照明光及び物体の蛍光光分布を示す。図２（ａ）は、３つの光源領域から構成される瞳関数Ｐの例を示している。光源領域の数は複数であれば足りる。図２（ｂ）は、照明光強度分布Ｉｌｌのｘ−ｙ方向の断面であり、瞳関数Ｐのフーリエ変換し、数式４に示すように、その値の絶対値の２乗したものである。
【００４６】
Ｉｌｌ（ｘ，ｙ）＝｜Ｆ［Ｐ（ｌｘ，ｌｙ）］｜２                    （４）
図２（ｃ）はＩｌｌの周波数成分であり、これをＳｐｅｃと定義する。Ｓｐｅｃは数式４の量をフーリエ変換して得られるので、瞳関数の自己相関で表される。
【００４７】
【数１】
2015179208.tif 000003
【００４８】
数式５の記号
2015179208.tif 000004
【００４９】
は畳み込みを表し、＊は複素共役を表す。図２（ｄ）は、物体Ｏが発光する蛍光強度分布であり、この分布は照明光強度分布と物体Ｏの積で表現され、この量をＩｌｌ２と置く。図２（ｅ）は、Ｉｌｌ２の周波数成分でありＳｐｅｃ２と定義する。Ｉｌｌ２とＳｐｅｃ２は下記の式でそれぞれ表現される。
【００５０】
Ｉｌｌ２（ｘ，ｙ）＝Ｉｌｌ（ｘ，ｙ）×Ｏ（ｘ，ｙ）              （６）
【００５１】
【数２】
2015179208.tif 000005
【００５２】
但し、Ｏｓｐｅｃは物体Ｏの周波数成分を表し、Ｏのフーリエ変換で得られる。数式４から数式７はフーリエ光学の基礎理論に基づく。自己相関関数の性質から、Ｓｐｅｃが値を持つ座標の、瞳面中心からの距離（以下「動径」と呼ぶ）は、瞳関数Ｐのいずれか２つの座標を結んだ距離と一致する。言い換えると、Ｓｐｅｃが値を持つ座標の動径は、瞳関数Ｐの座標、２点間の距離に等しい。また、物体Ｏはｘ−ｙ断面で一様な構造をしているので、Ｏｓｐｅｃ＝δ（ｌｘ）δ（ｌｙ）となり、数式６に代入すると、Ｓｐｅｃ２＝Ｓｐｅｃが導かれる。
【００５３】
つまり、物体が発光する強度の分布の周波数成分Ｓｐｅｃ２の座標の動径は瞳関数Ｐで制御できる。なお、上記説明ではｘ−ｙ方向に一様な構造を持つ物体Ｏで説明したが、自然な構造を持つ物体の周波数成分は殆どがｌｘ＝０，ｌｙ＝０周辺に大きな値を持つので、Ｏｓｐｅｃはδ（ｌｘ）δ（ｌｙ）に近い分布を持つ。よって、自然な構造を持つ物体に対しても、Ｓｐｅｃ２の分布を瞳関数Ｐによって制御することは可能である。
【００５４】
蛍光強度分布Ｉｌｌ２は対物レンズ１０２によって撮像素子１０３上に像を形成する。この像は、Ｓｐｅｃ２と同じ周波数成分の座標を持ち、その周波数成分の絶対値の比は、対物レンズ特有の光学伝達関数（ＯＴＦ：Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で表される。ＯＴＦを、対物レンズ１０２に対応する瞳面の半径を１に規格化した周波数成分の動径ｋと物体の対物レンズの焦点位置からのズレ（デフォーカス量）をｚで表すと、数式８で近似される（非特許文献７参照）
【００５５】
【数３】
2015179208.tif 000006
【００５６】
ここで、Ｊ１は１次の第一種ベッセル関数、Ａは光学系に依存する定数である。
【００５７】
３次元蛍光顕微鏡が高いセクショニング効果を持つためには、対物レンズのデフォーカスに対して分散マップσの値が急激に減少することが必要である。分散マップσは、撮像素子１０３上に結ばれる像のコントラストの大きさで決まる。このため、その像のコントラストがデフォーカスに敏感に反応するように、Ｓｐｅｃ２の持つ各座標（及び撮像素子１０３上に像の周波数成分の各座標）の動径ｋとＯＴＦがデフォーカスに最も敏感な周波数成分の動径ｋを一致させればよい。
【００５８】
数式８に示すＯＴＦにおいて、デフォーカス量ｚに依存する右辺第一項に注目すると、ｋ＝１が最もデフォーカスに対して敏感に値が低下し、ｋが１からずれるほどデフォーカスに対して値が低下しにくくなる。よってＳｐｅｃ２の周波数成分の座標の動径がｋ＝１が好ましい。
【００５９】
以上をまとめると、照明光学系１１０に実質的に存在する瞳関数Ｐの各座標を結ぶ距離は対物レンズ１０２に対応する瞳面の半径に近いとセクショニング効果は強くなる。本実施形態の瞳関数Ｐは、２点の振幅幅を持つ座標間に距離が対物レンズ１０２に対応する瞳面の半径程度離れた組み合わせを持つ。
【００６０】
格子照明を形成する複数の光束のサンプルへの照射方向は、円筒座標系表示において、長さ１の単位ベクトルを用いて数式９のように表される。
【００６１】
【数４】
2015179208.tif 000007
【００６２】
但し、１＞ＮＡ／ｎ＞ｌ１＞ｌ２＞ｌ３＞…＞０、ＮＡは照明光学系の開口数、ｎは媒質屈折率である。ベクトルの第一成分はｘ−ｙ方向における動径であり、第二成分はｘ−ｙ方向における偏角を表す。第三成分はｚ方向の要素である。
【００６３】
図３は、上記方向ベクトルを瞳面上で記述した図である。極座標ｋ１（ｌ１，θ１），ｋ２（ｌ２，θ２）…は、半径ＮＡ／ｎの瞳面の内部に配置され、それぞれの成分は数式４のベクトルの第一成分と第二成分に対応する。各座標ｋ１，ｋ２…は瞳関数Ｐの振幅のある座標であり、複数の光源領域に対応する。
【００６４】
本実施形態によれば、照明光学系１１０の瞳面１１３に、互いにコヒーレントな複数の光源領域が互いに離れて配置され、複数の光源領域のそれぞれの中心と照明光学系１１０の瞳面の中心との距離のうち少なくとも１つの距離が他の距離と異なる。また、複数の光源領域の少なくとも２つの光源領域の中心間の、対物レンズ１０２の瞳面に対応する座標上の距離（例えば、図３のＡ〜Ｃのいずれか）が結像光学系の瞳面の半径の０．７倍以上１．３倍以下、好ましくは、０．８倍以上１．２倍以下である。
【実施例１】
【００６５】
実施例１は、２つの光源領域ｋ１、ｋ２を有する瞳関数Ｐの配置においてセクショニング効果の高い配置を決定する。光学パラメ−タとしては、波長λ＝５１２ｎｍ、照明光学系のＮＡ＝０．７、対物レンズのＮＡ＝０．７、媒質の屈折率ｎ＝１、物体Ｏを用いる。ｋ１，ｋ２間の距離をＣとし、０．３×（対物レンズのＮＡ）／ｎ≦Ｃ≦１．７×（対物レンズのＮＡ）／ｎにおけるセクショニング効果を比較する。評価基準は、非特許文献５及び６記載の手法で最終出力像を作成し、対物レンズのデフォーカス量に対する最終出力像の半値全幅（ＦＷＨＭ）とする。
【００６６】
図４（ａ）は、実施例１の瞳関数Ｐの配置を示す図である。瞳関数Ｐは２つの光源領域を持ち、それぞれの座標ｋ１，ｋ２を極座標表示で示す。動径ｌ１とｌ２の差が大きいと、照明光強度分布が光軸に対して角度を持ち、高いセクショニング効果を得ることができる。この条件を満たす座標の条件はｌ１＝（照明光学系のＮＡ）／ｎ、かつ、ｋ１，ｋ２，瞳面の中心が一直線上に並ぶ時である。この時、ｌ２＝｜Ｃ−ｌ１｜となる。
【００６７】
図４（ｂ）は、横軸に距離Ｃ、縦軸に対応する最終出力像のＦＷＨＭ［μｍ］をプロットしたグラフである。距離Ｃが（対物レンズのＮＡ）／ｎ（＝０．７）の時に最も良好な値１．３０μｍを示す。０．７×（対物レンズのＮＡ）／ｎ≦Ｃ≦１．３×（対物レンズのＮＡ）／ｎ  なるＣにおいてはＦＷＨＭが最良値の１．２倍未満に収まり、高いセクショニング効果を示す。
【実施例２】
【００６８】
実施例２は、３つの光源領域ｋ１、ｋ２、ｋ３を有する瞳関数Ｐの配置においてセクショニング効果の最大になる配置を決定する。光学パラメ−タ及び物体は、実施例１と同様である。図３において、Ａ＝Ｂ＝Ｃとなるように配置する。評価基準は、非特許文献５及び６記載の手法で最終出力像を作成し、対物レンズのデフォーカス量に対する最終出力像の半値全幅（ＦＷＨＭ）とする。０．３×（対物レンズのＮＡ）／ｎ≦Ａ≦１．６×（対物レンズのＮＡ）／ｎにおけるセクショニング効果を比較する。また、配置を決定するにあたって、焦点面を照射するｘ−ｙ方向における照明光強度分布と焦点からｚ方向に位置をずらした照明光強度分布が可能な限り重ならないようにするように各座標を決定する。
【００６９】
ある瞳関数Ｐによる照明光の分布例を図５に示す。図５（ａ）は、焦点面を照射するｘ−ｙ方向における照明光強度分布であり、図５（ｂ）は、焦点からｚ方向に位置をずらした照明光強度分布である。横軸はｙ座標［μｍ］、縦軸はｘ座標［μｍ］である。
【００７０】
図５（ｃ）は、それぞれの照明光強度分布の強度ピ−クを取る座標を模式的に示す図である。図５（ｃ）は、照明パタ−ンのｚ方向位置の変化による照明光分布の横ずれを模式的に表している。１は焦点面における周期パターンの強度ピーク、２は焦点面からｚ方向にずれたｘ−ｙ平面における周期パターンの強度ピーク、３は周期パタ−ンを形成する格子、４はｚ方向シフトによる照明ピークの移動方向を表す。
【００７１】
図５（ｃ）は、焦点面からある量だけｚ方向の位置をずらした時に、４で特徴づけられる照明光のシフトの距離が格子パタ−ン３の１周期分に相当した様子を示す。その移動方向はｐＢ／ｐＡで特徴づけられ、横方向に形成される照明光がｚ方向に積算した時に重ならない条件は、ｐＢ／ｐＡ＝０．５であり、この時に最もセクショニング効果に寄与する。この分数をｐと表記すると、数式１０で表現できる。
【００７２】
【数５】
2015179208.tif 000008
【００７３】
ｐは０以上１以下の範囲をとることができる。ｐが小さいとｌ２がｌ１に近づき、ｐが大きいとｌ２がｌ３に近くなる。ｐが０．５から離れた値を取ると、焦点面における周期パターンの強度ピーク１と焦点面からｚ方向にずれたｘ−ｙ平面における周期パターンの強度ピーク２が重なってしまうので、セクショニング効果が減少してしまう。セクショニング効果を最大限に保つためには、ｐは数式１１記載の条件を満たすことが望ましい。
【００７４】
０．４≦ｐ≦０．６                                        （１１）
本実施例ではｐ＝０．５を使用する。また、ｌ１とｌ３の差が大きいと照明光強度分布が光軸に対して角度を持ち、セクショニング効果の減少を防止することができる。ｌ１とｌ３の差を大きくするために、ｌ３＝（照明光学系のＮＡ）／ｎ＝０．７に設定する。以上の条件で瞳関数Ｐの配置を決定する。条件に用いられる式は数式１１及びｐ＝０．５、ｌ１＝０．７、そして以下の数式１３である。
【００７５】
Ａ２＝ｌ２２＋ｌ３２−２ｌ２ｌ３ｃｏｓ（θ２−θ３）        （１２）
Ｂ２＝ｌ３２＋ｌ１２−２ｌ３ｌ１ｃｏｓ（θ３−θ１）        （１３）
Ｂ２＝ｌ１２＋ｌ２２−２ｌ１ｌ２ｃｏｓ（θ１−θ２）        （１４）
数式１２〜１４は図３に余弦定理を適用したものである。図６（ａ）は横軸に距離Ａ＝Ｂ＝Ｃ、縦軸に対応する最終出力像のＦＷＨＭをプロットした図であり、図６（ｂ）は瞳関数Ｐの配置の一例を示した表である。距離Ａが（対物レンズのＮＡ）／ｎ（＝０．７）の時に最も良好な値１．３３μｍを示す。０．７×（対物レンズのＮＡ）／ｎ≦Ａ≦１．３×（対物レンズのＮＡ）／ｎ  なるＡにおいてはＦＷＨＭが最良値の１．２倍未満に収まり、高いセクショニング効果を示す。
【実施例３】
【００７６】
図７は、実施例３の瞳関数Ｐの配置を示す図である。３つの光源領域ｋ１，ｋ２，ｋ３の３点を結んでできる三角形の辺の長さを短い順にＡ，Ｂ，Ｃとし、（Ａ≦Ｂ≦Ｃ）辺Ａに対応する三角形の高さをＨとする。実施例３では、照明光強度分布の周期パターンがｘ−ｙ方向に等方的になるように設定するため、Ａ＝Ｈとする。このような周期パターンを作成すると、解像度が方位によってムラの少ない画像を取得できる。光学パラメ−タ、物体及び評価基準は、実施例２と同様である。
【００７７】
実施例３においては辺Ａと高さＨの交点は辺Ａの中点に一致するようにＢ，Ｃの長さを与え、Ｂ＝Ｃ＝√５／２×Ａとなる。Ａの値は０．３×（対レンズのＮＡ）／ｎ≦Ａ≦１．７×（対レンズのＮＡ）／ｎの範囲で評価し、それぞれのＡに対して瞳関数Ｐを決定する。配置の決定に用いる式は実施例２と同様である。
【００７８】
一般に、Ａ，Ｂ，Ｃの内少なくとも１辺の長さが異なる時、その３辺でなる三角形の頂点とｋ１，ｋ２，ｋ３の対応は順列組み合わせの６通りあり、それぞれの対応の仕方によって、回転対称ではない解の組み合わせが生じる。図８（ａ）に本実施例においてＡ＝（対物レンズのＮＡ）／ｎとした時の解の組み合わせを示す。本実施例ではＢ＝Ｃであるので６通りの解は３組の２重解となる。このような６つの解の内、実施例２において説明したように、ｌ１とｌ３の差が最大のものを選択する事が望ましい。図８（ａ）に示す最上段の解を選択することが望ましい。
【００７９】
図８（ｂ）は以上のプロセスによって選択された瞳関数Ｐによって生成された最終出力像のＦＷＨＭをプロットした図である。横軸は距離Ａ、縦軸はＦＭＨＭ［μｍ］である。距離Ａ，Ｂ，Ｃの全ての長さが等しくないので若干の最適な変数のズレ有るものの、（対物レンズのＮＡ）／ｎ（＝０．７）付近で最も良好な値１．３３μｍを示す。０．７×（対物レンズのＮＡ）／ｎ≦Ａ≦１．３×（対物レンズのＮＡ）／ｎの条件を満たすＡにおいてはＦＷＨＭが最良値の１．２倍未満に収まっており、高いセクショニング効果を示す。
【００８０】
以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限定されないことはいうまでもなく、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。例えば、自家発光体である標本から散乱する散乱光は、蛍光または燐光でよい。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
撮像装置は、蛍光顕微鏡の分野に適用することができる。
【符号の説明】
【００８２】
１００…３次元蛍光顕微鏡、１０２…対物レンズ（結像光学系）、１１０…照明光学系、１１１…コヒーレント光源、１２０…対物レンズ（結像光学系）、ＳＰ…標本
【図４】
2015179208.tif 000009
【図６】
2015179208.tif 000010
【図７】
2015179208.tif 000011
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
2015179208.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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