(57)【要約】【課題】変性ポリオレフィンの変性構造解析において、Ｓ／Ｎ比の非常に高い、即ち、微量分析にも適用し得るマススペクトルを得ることによって、高精度の変性ポリオレフィンの変性構造解析方法を提供する。【解決手段】ポリオレフィンを不飽和カルボン酸によりグラフト変性してなる変性ポリオレフィン試料から不純物を除去する工程、及び前記不純物が除去された変性ポリオレフィン試料を液体クロマトグラフ質量分析により分析し、変性ポリオレフィンの変性構造を解析する工程を具備することを特徴とする変性ポリオレフィンの変性構造解析方法である。【選択図】図１
2015055519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオレフィンを不飽和カルボン酸によりグラフト変性してなる変性ポリオレフィン試料から不純物を除去する工程、及び
前記不純物が除去された変性ポリオレフィン試料を液体クロマトグラフ質量分析により分析し、変性ポリオレフィンの変性構造を解析する工程
を具備することを特徴とする変性ポリオレフィンの変性構造解析方法。
【請求項２】
前記変性ポリオレフィン試料からの不純物の除去は、前記変性ポリオレフィン試料を、変性ポリオレフィン試料を溶解する溶媒に浸漬し、濾過することにより行われることを特徴とする請求項１に記載の無水マレイン酸変性ポリオレフィンの変性構造解析方法。
【請求項３】
前記溶媒は、水、又はアセトン、ヘキサン、クロロホルム、及びメタノールからなる群から選ばれた有機溶媒であることを特徴とする請求項２に記載の変性ポリオレフィンの変性構造解析方法。
【請求項４】
前記ポリオレフィンをグラフト変性する不飽和カルボン酸は、無水マレイン酸であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の変性ポリオレフィンの変性構造解析方法。
【請求項５】
前記変性ポリオレフィンのポリオレフィンは、エチレン、プロピレン、ブテン−１、ヘキセン−１、３−メチルブテン−１、４−メチルペンテン−１、ヘプテン−１、オクテン−１、及びデセン−１からなる群から選ばれた炭素数２以上のα−オレフィンの単独重合体、これら２種以上のα−オレフィンのランダム又はブロック重合体、前記α−オレフィンと他のモノマーとのランダム、ブロック、若しくはグラフト重合体、又はこれらの混合物であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の変性ポリオレフィンの変性構造解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性ポリオレフィンの変性構造解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
変性ポリオレフィンは、無極性のポリオレフィンを極性基である無水マレイン酸等の不飽和カルボン酸によりグラフ卜変性することで得られる、接着性や相容性が付加されたポリマーであり、自動車部材を始めとする広範な領域で使用されている。この変性ポリオレフィンの材料特性には不飽和カルボン酸のグラフト構造が大きく寄与するため、製造・開発現場から不飽和カルボン酸グラフト構造の解析手法の開発が強く望まれてきた。このため、１Ｈ−ＮＭＲを用いた変性ポリオレフィンのグラフト構造の解析手法がこれまで開発されている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
一方で、近年、不飽和カルボン酸のグラフト率が０．１ｗｔ％以下という非常に低い変性ポリオレフィンが実用化されてきている。さらに、これらが複合材料中に使用される場合には、材料全体における不飽和カルボン酸のグラフト率がより極微量となるため、１Ｈ−ＮＭＲ解析のみでは、そのグラフト構造を捉えきれない場合が出現する。
【０００４】
斯かる問題を解決するため、１Ｈ−ＮＭＲに比べて検出感度が非常に高い、質量分析法を用いた変性ポリオレフィンのグラフト構造解析手法の確立が求められている。
【０００５】
しかしながら、これまでに、変性ポリオレフィンの解析に質量分析法を用いた例は少なく、Ｓ／Ｎ比の非常に低い、即ち、微量分析には適用困難なレベルの測定結果しか報告されていない（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋ．  Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒ，  ５２，３５１９−２１  （２０１１）
【非特許文献２】Ｋ．  Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＵＮＳＥＫｌ  ＫＡＧＡＫＵ，  ５５，５４７−５４  （２００６）
【非特許文献３】Ｋ．  Ｍｉｙａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｇｎ．  Ｒｅｓｏｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ５０，５８０−３  （２０１２）
【非特許文献４】Ｄｅａｎ  Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒ，４  ２，５  ５４９−５７  （２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、変性ポリオレフィンの変性構造解析において、Ｓ／Ｎ比の非常に高い、即ち、微量分析にも適用し得るマススペクトルを得ることによって、高精度の変性ポリオレフィンの変性構造解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、変性ポリオレフィンから不純物を除去した後に、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）にて分析することにより、高精度の変性構造解析が可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明の一態様は、ポリオレフィンを不飽和カルボン酸によりグラフト変性してなる変性ポリオレフィン試料から不純物を除去する工程、及び前記不純物が除去された変性ポリオレフィン試料を液体クロマトグラフ質量分析により分析し、変性ポリオレフィンの変性構造を解析する工程を具備することを特徴とする変性ポリオレフィンの変性構造解析方法を提供する。
【００１０】
以上のように構成される本発明の一態様に係る変性ポリオレフィンの変性構造解析方法において、前記変性ポリオレフィン試料からの不純物の除去は、前記変性ポリオレフィン試料を、変性ポリオレフィン試料を溶解する溶媒に浸漬し、濾過することにより行うことができる。この場合、溶媒として、水、又はアセトン、ヘキサン、クロロホルム、及びメタノールからなる群から選ばれた有機溶媒を用いることができる。
【００１１】
前記ポリオレフィンをグラフト変性する不飽和カルボン酸を、無水マレイン酸とすることができる。また、前記変性ポリオレフィンのポリオレフィンを、エチレン、プロピレン、ブテン−１、ヘキセン−１、３−メチルブテン−１、４−メチルペンテン−１、ヘプテン−１、オクテン−１、及びデセン−１からなる群から選ばれた炭素数２以上のα−オレフィンの単独重合体、これら２種以上のα−オレフィンのランダム又はブロック重合体、前記α−オレフィンと他のモノマーとのランダム、ブロック、若しくはグラフト重合体、又はこれらの混合物とすることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、変性ポリオレフィンのＳ／Ｎ比の非常に高い、即ち、微量分析にも適用し得るマススペクトルを得ることができるので、高精度の変性ポリオレフィンの変性構造解析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１におけるＬＣ／ＭＳにより得たＥＩＣを示す図である。
【図２】図１におけるｍ／ｚ４４１のマススペクトルを示す図である。
【図３】無水マレイン酸プロピレンオリゴマーの推定構造を示す図である。
【図４】比較例１におけるＥＳＩ−ＭＳにより得たマススペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、発明を実施するための形態について、詳細に説明する。
本発明の一実施形態に係る変性ポリオレフィンの変性構造解析方法は、変性ポリオレフィン試料から不純物を除去した後、液体クロマトグラフ質量分析により分析し、変性ポリオレフィンの変性構造を解析することを特徴とする。
【００１５】
ここで、変性ポリオレフィンとは、ポリオレフィンに接着性や相溶性を付与するために、ポリオレフィンを、有機過酸化物や熱分解法等により発生させたラジカルを開始剤として、不飽和カルボン酸によりラジカル変性することにより得られるものである。
不飽和カルボン酸としては、無水マレイン酸、フマル酸、メサコン酸、シトラコン酸、イタコン酸、アコニット酸、クロトン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸及び無水コハク酸等が挙げられる。
【００１６】
有機過酸化物としては、ｔ−ブチルパーオキシベンゾエート、２，５−ジメチル−２，５−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）ヘキサン、α，α’−ビス（ｔ−ブチルパーオキシ−ｍ−イソプロピル）ベンゼン、ｔ−ブチルパーオキシベンゾエート、ｔ−ブチルパーオキシイソプロピルモノカルボネート、１，１−ビス（ｔ−ブチルパーオキシ）シクロヘキサン、ベンゾイルパーオキサイド、ジイソプロピルベンゼンハイドロパーオキサイド等が挙げられる。
【００１７】
ポリオレフィンとしては、例えば、エチレン、プロピレン、ブテン−１、ヘキセン−１、３−メチルブテン−１、４−メチルペンテン−１、ヘプテン−１、オクテン−１、デセン−１等の炭素数２以上のα−オレフィンの単独重合体、これら２種類以上のモノマーのランダム又はブロック重合体、炭素数２以上のα−オレフィンを主成分とし、他のモノマーとのランダム若しくはブロック、グラフト等の重合体、又は、これらの混合物が挙げられる。
【００１８】
変性ポリオレフィンの具体例としては、無水マレイン酸変性ポリエチレン、無水マレイン酸変性ポリプロピレン等が挙げられる。
【００１９】
変性ポリオレフィン試料から不純物を除去する方法としては、例えば、変性ポリオレフィン試料を、変性ポリオレフィン試料を溶解する溶媒に浸漬して抽出し、次いで濾過して不溶分を除去する方法が挙げられる。濾過は、例えば、遠心分離と限外濾過との組み合わせにより行ってもよい。
【００２０】
変性ポリオレフィンの抽出に用いる溶媒は、水、又はアセトン、ヘキサン、クロロホルム、メタノール等の有機溶媒が好ましい。溶媒は、変性ポリオレフィンの種類によって適宜選択することができる。例えば、無水マレイン酸変性ポリオレフィンの場合には、アセトンを抽出溶媒として、これに無水マレイン酸変性ポリオレフィンを浸漬することで抽出を行うことが好ましい。
【００２１】
抽出溶媒は、変性ポリオレフィン０．１ｇに対して好ましくは２０〜１００ｍｌ、より好ましくは４０〜６０ｍｌ使用される。抽出温度は好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは２０〜３０℃で、好ましくは６〜３６時間、より好ましくは６〜１２時間静置して抽出される。
【００２２】
次に、得られた抽出液を、メッシュのろ紙にて濾過し、得られたろ液を液体クロマトグラフ質量分析に供試する。
【００２３】
液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）と質量分析（ＭＳ）とを組み合わせた分析法である。液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を行う装置は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）と、質量分析部（ＭＳ部）とから構成される。ＭＳ部は、イオン化部、分析部、及び検出部とから構成される。
まず、ＬＣ部において、不純物が除去された変性ポリオレフィン試料に含まれる検出対象物質が分離される。分離された検出対象物質は、ＭＳ部のイオン化部においてイオン化された後、分析部において質量電荷比（ｍ／ｚ）に応じて分離され、分離されたイオンは検出部において増幅され、検出される。そして、得られた質量スペクトル（マススペクトル）に基づいて、検出対象物質の同定や構造解析が行われる。
【００２４】
ＬＣ部においては、逆相カラム、例えばＯＤＳカラムを用い、溶離液として水系溶媒と水溶性有機溶媒との混液を用いる液体クロマトグラフに付すことにより検出対象物質の分離が行われる。
ＯＤＳカラムとは、例えば、シリカゲル担体に、オクタデシルシリル基（ＯｃｔａＤｅｃｙｌＳｉｌｙｌ＝ＯＤＳ基、Ｃ１８基）が化学結合した充填剤が詰められた逆相クロマトグラフィーで用いられるカラムを意味する。ＯＤＳカラムとしては、具体的には、ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（ＹＭＣ社製）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８（ＹＭＣ社製）、Ｓｕｎｆｉｒｅ  ＴＭ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｘｂｒｉｄｇｅ  ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ社製）、又はＣａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（Ｉｍｔａｋｔ社製）等が挙げられる。中でも、ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８、５  μｍ、４．６ｍｍ（Ｉ．Ｄ．）×２５０ｍｍ（Ｌ．）（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）等が好ましい。
カラム温度としては、２０〜４０℃が好ましく、４０℃がより好ましい。
【００２５】
水系溶媒としては、精製水、蒸留水又はＨＰＬＣ用水等が挙げられる。水系溶媒は、ｐＨ２．０〜４．０に調整されることが好ましい。水系溶媒のｐＨ調整は、例えば、酢酸、ギ酸、酢酸アンモニウム等により行うこと好ましく、ギ酸が特に好ましい。ｐＨ調整物質の濃度は、例えば０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、１０〜２５ｍｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
また、水溶性有機溶媒としては、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。
【００２６】
本実施形態の変性構造解析方法においては、水系溶媒を（Ａ）液とし、水溶性有機溶媒を（Ｂ）液とし、以下の条件で液体クロマトグラフィーにより分離を行うことが好ましい。まず、溶離液の流速を、例えば、約０．２〜１．０ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、（Ｂ）液０〜１００％、好ましくは０〜１０％でカラムを平衡化する。次いで、３０〜１８０分間、好ましくは６０〜１２０分間のリニアグラジエントで、（Ｂ）液の最終濃度を７０〜１００％とする。試料の注入量は、１０〜１００μＬが好ましく、２０〜５０μＬがより好ましい。
【００２７】
次に、ＭＳ部のイオン化部において、分離された検出対象物質がイオン化される。イオン化の方法としては特に制限はなく、エレクトロスプレイイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、光イオン化法（ＰＩ）、電子イオン化法（ＥＩ）、化学イオン化法（ＣＩ）、高速電子衝撃（ＦＡＢ）／液体二次イオン化法（ＬＳＩＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、フィールドイオン化法（ＦＩ）、フィールド脱離法（ＦＤ）、熱スプレー／プラズマスプレーイオン化法、およびパーティクルビーム・イオン化法などの一般に利用されるイオン化法を用いることができる。中でも特に、エレクトロスプレイイオン化法（ＥＳＩ）が好ましい。
【００２８】
次に、ＭＳ部の検出部において、検出対象物質のイオン化によって生成した正または負に帯電したイオンを分析し、質量電荷比（すなわちｍ／ｚ）を測定することができる。好ましくは、負帯電イオンを分析する。質量電荷比を測定するのに好適な分析計には、四重極型分析計、イオントラップ型分析計、および飛行時間型分析計が挙げられる。好ましくは、飛行時間型分析計を用いて質量電荷比を測定する。その後、検出部においてイオンの検出が行われる。イオンの検出は、いくつかの検出法を用いて行ってもよい。例えば、選択イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて選択されたイオンを検出するか、またはスキャンモードを用いてイオンを検出してもよい。
本実施形態の変性構造解析方法においては、スキャンモードで質量分析を行った後に指定のｍ／ｚのピークが検出されているクロマトグラムのみを抽出したＥＩＣ（Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）で解析を行うことが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これは発明を例示するものであって、何ら限定するものではない。
【００３０】
（実施例１）
試料として、無水マレイン酸変性ポリプロピレン（ＭＡ−ｇ−ＰＰ）（商品名：ユーメックス１０１０、三洋化成社製、グラフト率４．９ｗｔ％）を用いた。
このＭＡ−ｇ−ＰＰ試料０．５ｇを０．１Ｌのアセトン中に一晩浸漬した後、不溶分を濾過し、抽出液を得た。なお、この抽出操作は、非特許文献４に記載の方法により行った。
【００３１】
次に、得られた抽出液を、下記の条件により、逆相モードで液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分析した。
（ＬＣ／ＭＳ測定条件）
［ＬＣ条件］
濃度        ：０．１ｗｔ％（アセトン溶液）
カラム      ：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５ｍｍ）Ａｇｉｌｅｎｔ社製
溶離液      ：Ａ＝０．２ｗｔ％ギ酸水溶液、Ｂ＝０．２ｗｔ％ギ酸ＭｅＯＨ
グラジエント：Ｂ＝３０％（０−５ｍｉｎ）−１００％（５−７５ｍｉｎ）−１００％（７５−９０ｍｉｎ）
流速        ：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度  ：４０℃
［ＭＳ条件］
イオン化法  ：ＥＳＩ
検出モード  ：ネガティブ（−）モード
Ｄｒｙ  Ｇａｓ流量  ：８．０Ｌ／ｍｉｎ．
Ｄｒｙ  Ｔｅｍｐ．  ：２００℃
【００３２】
測定結果を図１の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）に示す。図１で検出されているｍ／ｚ４２間隔のピークは、プロピレンオリゴマーの可能性が高い。しかし、ホモプロピレンオリゴマーは極性が低いため、ＥＳＩ−ＭＳでは検出されない。そのため、ｍ／ｚ４２間隔のピークは、極性基が結合したプロピレンオリゴマーと推定される。その例として、今回のサンプルでは、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーが推測される。
もし、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーであれば、Ｏ原子を有するはずである。また、今回の試料調整液および溶離液中には水が含まれているため、グラフトしている無水マレイン酸は開環している可能性が高い。
したがって、図１で検出されているｍ／ｚ４２間隔のピークの成分はＯ原子の含有量が４の倍数であることが推定される。
一例として、ｍ／ｚ４４１が検出されているピークのマススペクトルを図２に示す。ｍ／ｚ４４１が検出されているピークのマススペクトル（図２）を確認したところ、４４１．２４６７のピークが高いＳ／Ｎ比で確認された。
４４１．２４６７のピークについて、下記検索条件にて分子式検索を行った。
［検索条件：誤差±１０ｍＤａ、Ｏの含有量が４の倍数］
その結果、Ｃ２３Ｈ３７Ｏ８（ｍ／ｚ４４１．２４９４、誤差＋２．７ｍＤａ）が推定された。この分子式から、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーとして、図３の構造を推定することができる。
【００３３】
図１〜３より、ＰＰ鎖長の異なるＭＡ−ｇ−ＰＰがＬＣによって分離されており、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーと推測されるｍ／ｚ４４１のピークがＥＩＣ上で検出されていることが分かる。
【００３４】
ＰＰ鎖の長い成分、すなわちｍ／ｚが大きい成分ほど、保持時間が長くなった。また、無極性のＰＰ鎖が長い成分、すなわちｍ／ｚが大きい成分ほど、極性が低くなることが予想される。今回は逆相モードでの測定のため、一般的に極性の低い成分ほど保持時間が長くなる。
ホモプロピレンオリゴマーは、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーと比較して極性が極めて低いと推測され、この条件において、ホモプロピレンオリゴマーと無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーとの分離は、達成されていると考えられる。
【００３５】
以上のことから、ＬＣ／ＭＳを用いることで、ホモプロピレンオリゴマーと無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーの分離に成功したのみならず、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーのＰＰ鎖長の異なる成分についても、分離できる条件を見出すことができた。
【００３６】
（比較例１）
クロマトグラフによる分離を行わず、抽出液を直接ＥＳＩ法によりイオン化し、下記の条件にてＭＳ分析を行った。
（ＥＳＩ−ＭＳ  測定条件）
濃度        ：０．０１ｗｔ％（アセトン溶液［微量の水を加えた］）
導入法      ：直接導入（流速：３ｍＬ／ｍｉｎ）
検出モード  ：ネガティブ（−）モード
Ｄｒｙ  Ｇａｓ流量  ：４．０Ｌ／ｍｉｎ．
Ｄｒｙ  Ｔｅｍｐ．  ：２００℃
【００３７】
結果を図４に示す。図４より、ＰＰにＭＡが２個グラフトした構造に由来する分子量（ｍ／ｚ４４１、５２５、５６７、６０９）が検出された。
【００３８】
ＥＳＩ−ＭＳ測定結果をみると、ｍ／ｚ４２間隔のピークはプロピレンオリゴマーの可能性が高い。しかし、ホモプロピレンオリゴマーは極性が低いため、ＥＳＩ−ＭＳでは検出されない。そのため、ｍ／ｚ４２間隔のピークは、極性基が結合したプロピレンオリゴマーと推定される。その例として、今回のサンプルでは、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーが推測される。
もし、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーであれば、Ｏ原子を有するはずである。また、今回の試料調整液中には水が含まれているため、グラフトしている無水マレイン酸は開環している可能性が高い。
したがって、ｍ／ｚ４２間隔のピークはＯ原子の含有量が４の倍数であることが推定される。
【００３９】
以上のことから、ｍ／ｚ４２間隔のピークの中で、検出感度が高くｍ／ｚが小さい４４１．２４５８のピークについて、下記検索条件にて分子式検索を行った。
［検索条件：誤差±１０ｍＤａ、Ｏの含有量が４の倍数］
その結果、Ｃ２３Ｈ３７Ｏ８（ｍ／ｚ４４１．２４９４、誤差＋３．６ｍＤａ）が推定された。この分子式からも実施例１と同様、無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーとして、図３の構造が推定することができる。
【００４０】
しかしながら、図４のマススペクトルでは非常にＳ／Ｎ比が低く、微量分析へ適用することは困難であった。
測定試料中には、無水マレイン酸がグラフトしていないホモプロピレンオリゴマーが多く混在していると考えられ、このことが無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーのイオン化を阻害している可能性が考えられる。
【００４１】
以上より、高感度化には、液体クロマトグラフ（ＬＣ）によって、ホモプロピレンオリゴマーと無水マレイン酸変性プロピレンオリゴマーの分離を行うことが重要であると考えられる。
【図１】
2015055519.tif 000003
【図２】
2015055519.tif 000004
【図３】
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【図４】
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