(57)【要約】      （修正有）【課題】大豆胚軸を利用してビタミンＫ２として有用なメナキノン−７を生成させた、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物を提供する。【解決手段】アノキシバチルス属に分類される微生物及びメナキノン−７を含有することを特徴とする、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物。大豆胚軸をアノキシバチルス属に分類され微生物で発酵させ、該大豆胚軸中にメナキノン−７を生成させることを特徴とする、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物の製造方法。前記アノキシバチルス属の菌は５０℃以上の高温下で増殖可能で一般的な菌の増殖を制御できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アノキシバチルス属に分類される微生物及びメナキノン−７を含有することを特徴とする、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物。
【請求項２】
メナキノン−７が、該微生物で大豆胚軸を発酵させることにより生成したものである、請求項１記載のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物。
【請求項３】
メナキノン−７が、乾物100g中1μg以上含有する、請求項１又は２記載のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物。
【請求項４】
大豆胚軸をアノキシバチルス属に分類され微生物で発酵させ、該大豆胚軸中にメナキノン−７を生成させることを特徴とする、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物の製造法。
【請求項５】
発酵を５０℃以上の温度で行う、請求項４記載のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メナキノン−７を含有する大豆胚軸発酵物及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、脂溶性のビタミンの一種で、血液凝固を正常に維持する機能や骨の形成促進、動脈硬化など様々な効果があることが知られている重要なビタミンである。自然界には植物にビタミンＫ１（フィロキノン）が、微生物等にビタミンＫ２（メナキノン）が存在し、ビタミンＫには骨粗鬆症や動脈硬化等の予防又は治療効果も期待できるため日常的に摂取することが望ましい。また新生児・乳児出血症がビタミンＫの欠乏から起こることからも注目されている。
【０００３】
従来、ビタミンＫ２の一種であるメナキノン−７の製造は、高いメナキノン−７の含有率を有する納豆菌であるバチルス・ズブチリス菌株が使用されてきた（特許文献１，２）。バチルス属細菌以外の細菌を用いた例として乳酸菌や大腸菌を用いた製造方法も知られている（特許文献３，４）。
【０００４】
大豆胚軸は、大豆の発芽時に幼芽、幼根となる部分であり、蛋白質、オリゴ糖などの他、イソフラボンやサポニンなどの微量栄養成分が豊富に含まれている。そのため大豆胚軸からアルコールや水などで抽出して必要により精製した大豆胚軸抽出物や、大豆胚軸そのままの形態で健康食品素材としても利用されているが、独特の苦味あるいは収斂味のある風味を有しており、そのままでは食品として供しにくい難点を有する。
一方、大豆胚軸を麹菌や紅麹菌などで発酵させ、大豆胚軸の品質を改善する試みがなされている（特許文献５〜８）。
【０００５】
また、大豆胚軸に含まれる大豆イソフラボンの生理作用の活性本体がダイゼインの代謝物のエクオールである可能性が指摘されて、エクオール産生微生物で大豆胚軸を発酵させる試みも提案されている（特許文献９〜１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３４５５４号公報
【特許文献２】特開平８−７３３９６号公報
【特許文献３】特開平１０−５６９５９号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６０８０３号公報
【特許文献５】特開昭６３−２３００５０号公報
【特許文献６】特開２００２−２８８号公報
【特許文献７】特開２００６−７５００３号公報
【特許文献８】特開２００７−２１５４０６号公報
【特許文献９】特開２０１２−１６１３２３号公報
【特許文献１０】特開２０１２−２２８２５２号公報
【特許文献１１】特開２０１３−１８８２２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、納豆菌は発酵中にγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）を生成してこれに起因する糸曳き性を示すため、納豆の粘ついた食感は特徴的であるものの、それゆえに  食べにくさや口中に残留する糸曳き感を有する。また納豆菌の発酵により特有の発酵臭が生成されることから、その風味が嫌厭されることがあり、万人の食生活に取り入れられにくいのが現状である。 
また特許文献５〜８で得られる大豆胚軸を麹菌で作用させた発酵物は糠のようなクセのある発酵臭があり、メナキノン−７の生成についても言及されていない。
そして、特許文献９〜１１では大豆胚軸を乳酸菌で作用させた発酵物を得ているが、これは大豆胚軸に含まれるイソフラボンを発酵によってさらに有用なエクオールを産生させることを目的としており、メナキノン−７の産生については言及されていない。
【０００８】
本発明の目的は、大豆胚軸を利用してビタミンＫ２として有用なメナキノン−７を生成させた、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するために、本発明者は広範な種類の微生物を培養して鋭意検討を行った。そして、高温環境下で増殖可能であるアノキシバチルス属微生物が高いメナキノン−７の発現率を有することを見出し、本菌で大豆胚軸を発酵させた大豆胚軸発酵物を得ることで前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成を包含する。
（１）アノキシバチルス属に分類される微生物及びメナキノン−７を含有することを特徴とする、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物、
（２）メナキノン−７が、該微生物で大豆胚軸を発酵させることにより生成したものである、前記（１）記載のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物、
（３）メナキノン−７が、乾物100g中1μg以上含有する、前記（１）又は（２）記載のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物、
（４）大豆胚軸をアノキシバチルス属に分類され微生物で発酵させ、該大豆胚軸中にメナキノン−７を生成させることを特徴とする、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物の製造法、
（５）発酵を５０℃以上の温度で行う、前記（４）記載のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、メナキノン−７を発酵により生成させ高度に含有させた大豆胚軸の発酵物を提供することができる。
本発明で用いられるアノキシバチルス属微生物は、高温環境下で増殖してメナキノン−７を生成できるため、中温域で増殖する一般的な菌の増殖が抑制され雑菌の増殖を制御しつつ安定的に大量のメナキノン−７が蓄積した大豆胚軸発酵物の製造が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物は、アノキシバチルス属に分類される微生物及びメナキノン−７を含有することを特徴とする。以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
（大豆胚軸）
本発明において用いられる大豆胚軸は生の大豆胚軸を使用することができ、微生物により発酵させる前に、脱脂，焙煎，粗砕，粉砕，加水，混合，浸漬，磨砕，蒸煮，糖化，加温，殺菌等の前処理をしておくことができる。また水やアルコール類などの水性溶媒に接触させ、イソフラボン、オリゴ糖、サポニンなどの可溶性成分を除去した後の大豆胚軸抽出残渣も使用することができる。一つの好ましい前処理例としては、大豆胚軸を水で浸漬し蒸煮して蒸煮大豆胚軸を得る前処理工程や、大豆胚軸を粗砕し、水で浸漬し蒸煮して粗砕した蒸煮大豆胚軸を得る前処理工程や、大豆胚軸を水で浸漬し磨砕して得られる懸濁液を加温する前処理工程や、大豆胚軸を粉砕したものに加水し混合して得られる懸濁液を加温する前処理工程などが挙げられる。
【００１４】
（アノキシバチルス属微生物）
本発明のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物は、アノキシバチルス属に分類される微生物を含有することを特徴とする。該微生物は、本大豆胚軸発酵物の製造において発酵に利用された後は、本大豆胚軸発酵物中において最終的に生存状態であってもよいし、殺菌工程を経て死滅状態であってもよい。本大豆胚軸発酵物の各種利用形態に応じていずれかを選択することができる。
本発明の大豆胚軸発酵物の製造において発酵に使用される微生物としては、50℃以上の高温環境下で増殖可能であり、かつメナキノン−７を産生する能力を有するという、これら二つの特徴を併せ持った当該微生物を本発明者らは見出した。
該微生物の中でもメナキノン−７産生能力の高い菌種を選択することが望ましい。当業者は適宜産生能の高い菌種、さらには菌株を培養試験によりスクリーニングして用いることができる。
【００１５】
高温域で増殖可能な微生物としてはアノキシバチルス・アミロリティカス、アノキシバチルス・アイデレンシス、アノキシバチルス・ボグロベンシス、アノキシバチルス・カルディプロテオリティカス、アノキシバチルス・コンタミナンス、アノキシバチルス・エリュアネンシス、アノキシバチルス・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・ユナネンシス、アノキシバチルス・ゴネンシス、アノキシバチルス・カムチャツケンシス、アノキシバチルス・ケスタンボレンシス、アノキシバチルス・モンゴリエンシス、アノキシバチルス・プシュチネンシス、アノキシバチルス・プシュチノエンシス、アノキシバチルス・ルピエンシス、アノキシバチルス・サラバトリエンシス、アノキシバチルス・テンチョンエンシス、アノキシバチルス・テピダマンス、アノキシバチルス・サーマラム、アノキシバチルス・ボイノスキエンシスなどから選択される一種又は二種以上が挙げられ、製造者はこれらの市販の菌種を入手して使用することもできる。
特に、メナキノン−７を２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産するものを選択して使用することが好ましい。そのスクリーニング方法としては、例えば試験菌株を10cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、その菌株に適した５０℃以上の温度で２４時間培養したときの培養液100ml中のメナキノン−７の含量を測定する方法で行うことができる。そのような好ましい菌種としては、例えばアノキシバチルス・フラビサーマスやアノキシバチルス・コンタミナンスを使用できる。
【００１６】
本発明の大豆胚軸発酵物に含まれるアノキシバチルス属微生物は、生菌体又は死菌体のいずれであってもよい。すなわち、大豆胚軸発酵物が最終的に加熱や紫外線等により殺菌処理されたものも包含される。
【００１７】
（メナキノン−７）
本発明のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物は、メナキノン−７を含有するものであるが、該メナキノン−７はアノキシバチルス属で大豆胚軸を発酵させることにより生成したものである。ただし、含まれるメナキノン−７の全量が該発酵により生成したものでなくてもよい。
該大豆胚軸発酵物中のメナキノン−７の含量は特に限定されないが、栄養機能的には高い方が好ましく、乾物100g中に１μg以上含有することがより好ましく、10μg以上がさらに好ましい。
【００１８】
（発酵温度）
本発明のメナキノン−７含有大豆胚軸発酵物は、前記大豆胚軸を前記微生物で発酵させ、該大豆胚軸中にメナキノン−７を生成させる工程を経て製造することができる。
一般のバチルス属微生物を含む多くの微生物の最適増殖温度域が３０〜４５℃であるのに対し、アノキシバチルス属のような高温菌の最適増殖温度域は５０〜７０℃である。３０〜４５℃では多くの微生物が活発に増殖可能なため、大豆胚軸の発酵中に雑菌が増殖してしまう可能性があるが、５０℃以上の高温域では他の微生物が増殖しにくいため純化培養に適している。
したがって、発酵温度は50℃以上に設定することが雑菌の増殖を抑制しつつメナキノン−７を大豆胚軸発酵物中に生成蓄積させるのに適している。より好ましくは55℃以上の高温域が好ましい。また発酵温度の上限は該微生物が死滅しない常識的な範囲とすればよく、通常は80℃以下、好ましくは70℃以下、より好ましくは60℃以下とすることで効率良くメナキノン−７を生成蓄積させることができる。また、該微生物の増殖に必要な倍化時間が15分〜30分程度と非常に短いため（参考文献１：The formation of thermophilic spores during the manufacture of whole milk powder : SCOTT et al., Int. J. Dairy Tech., 60 (2), p109-117 (2007)）、本菌のみを効率良く純化培養させるのに適している。
【００１９】
（その他の各種発酵条件）
前記大豆胚軸の発酵は好気的条件、微好気的条件、嫌気的条件など目的の微生物が増殖する条件で行うことが好ましい。発酵時のｐＨは通常６〜１１が好適であるが酸性下が適している場合もある。
発酵方法は特に限定されず、必要により大豆胚軸を粗砕，粉砕，加水，混合，浸漬，蒸煮，糖化，加温，殺菌，ろ過，磨砕等する前処理工程を経て、大豆胚軸に菌体を接触させて発酵を開始することができる。
発酵工程において用いられる前記微生物は予備培養しておくこともできる。予備培養後は菌液をそのまま大豆胚軸に加えるか、菌体を遠心分離やフィルターを用いて回収し工程中に加えることができる。
発酵工程における初期菌数は、１０の１乗〜１０の６乗cfu/g、好ましくは１０の３乗〜１０の５乗cfu/gあればより効率的に発酵させることができる。
前記条件下で例えば４〜２４時間、好ましくは４〜１２時間程度発酵するとメナキノン−７が大豆胚軸発酵物中に生成されるので、生成量が最大になった時点、例えば細菌数が１０の６乗〜１０の８乗cfu/g程度まで十分増殖した時点で発酵を停止することができる。
【００２０】
（発酵後処理）
得られた発酵物は、生菌状態のまま、あるいは必要であれば加熱殺菌や紫外線殺菌等の殺菌処理を行い、該発酵物をそのまま回収し、必要により乾燥，粉砕，圧搾，蒸煮，熟成等の発酵後処理を行い、メナキノン−７含有大豆胚軸発酵物が得られる。大豆胚軸発酵物の形態は、例えば、全粒の状態でもよいし、顆粒状、粉末状、懸濁液状にしてもよい。本大豆胚軸発酵物は納豆菌で発酵させたときのような独特の発酵臭を有さず、まろやかな風味であり、また粘質物質の生成もないため粘ついた性状を示さない。
そのため、得られた本大豆胚軸発酵物は高い汎用性を有し、さらに加工して大豆胚軸発酵物の各種加工品を製造したり、得られた該大豆胚軸発酵物を用いた各種食品を製造することができる。
本大豆胚軸発酵物は、納豆菌で発酵させた場合と同様にメナキノン−７を含有するため、メナキノン−７で知られている生理機能の用途、例えば骨粗鬆症、動脈硬化、脳卒中等の疾病の予防や抗酸化作用の用途としても用いることができる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例によって本発明についてより詳しく説明する。なお、以下の実施例においてメナキノン−７含量の測定は佐藤らの方法（参考文献２）に従って実施した。
参考文献２: Production of Menaquinone (Vitamin K2)-7 by Bacillus subtilis (2001) J.B.B., 91(1) 16-20
【００２２】
■実施例１（大豆胚軸発酵物）
大豆胚軸を３倍加水して一晩静置した。次にこれを蒸煮して得られた蒸煮大豆胚軸に、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ１０cfu/gとなるように接種し、５５℃で発酵させて定常期（１０の８乗cfu/g）まで十分微生物を増殖させ、大豆胚軸発酵物を得た。そして大豆胚軸発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で1295μg/100ｇおよび後者で850μg/100gであった。得られた大豆胚軸発酵物は納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。
【００２３】
■実施例２（大豆胚軸発酵物２）
生の大豆胚軸を１０重量倍の８０％エタノールに浸漬してイソフラボンやサポニンなどのエタノール可溶性成分を抽出し、該抽出液を濾過により除去し、残った残渣を乾燥して大豆胚軸抽出残渣を得た。この大豆胚軸抽出残渣を３倍加水して実施例１と同じ微生物２種をそれぞれ１０cfu/gになるように接種し、その他は実施例１と同様にして大豆胚軸発酵物を得た。そして大豆胚軸発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定した。各菌種のメナキノン−７産生量は前者（NBRC 15317）で1115μg/100ｇおよび後者（DSM 15866）で750μg/100gであった。得られた大豆胚軸発酵物は実施例１と同様に納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。
【００２４】
■比較例１（納豆菌による大豆胚軸発酵物）
大豆胚軸を３倍加水して一晩静置した。次にこれを蒸煮して得られた蒸煮大豆胚軸に、バチルス・ズブチリス（NBRC 3013）を１０cfu/gになるように接種し、４０℃で発酵させた（最終菌数：１０の８乗cfu/g）。蓄積されたメナキノン−７含量は760μg/100mlであった。得られた発酵物は納豆臭が強く感じられた。
【００２５】
（品質比較）
実施例１，２及び比較例１で得られた各大豆胚軸発酵物の品質を表１で比較した。実施例１，２はいずれもメナキノン−７が生成されており、物性は納豆菌で発酵させた比較例１のような粘つきがなく発酵前の物性とほとんど変化がなかった。また風味は比較例１のような独特の発酵臭はなく、まろやかで良好な風味となっていた。
【００２６】
（表１）
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