(57)【要約】【課題】肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、または土壌中に含まれるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物とその最終代謝産物であるシアヌル酸を分解する細菌（分解菌）を提供すること。【解決手段】アルスロバクターエスピー  ＭＣＯ株またはアルスロバクターエスピー  ＣＳＰ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌、またはこれらの分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含んでなる分解菌保持単体や微生物製剤である。これらの分解菌等によれば、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解能を有することを特徴とするアルスロバクター属の細菌。
【請求項２】
アルスロバクター属の細菌が、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７１２として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＭＣＯ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する請求項１記載の細菌。
【請求項３】
アルスロバクター属の細菌が、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７１１として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＣＳＰ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する請求項１記載の細菌。
【請求項４】
請求項１〜請求項３何れか１項記載の細菌を有効成分として含有するアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解する微生物製剤。
【請求項５】
請求項１〜請求項３何れか１項記載の細菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含んでなる分解菌保持担体。
【請求項６】
請求項１〜請求項３何れか１項記載の細菌、請求項４記載の微生物製剤または請求項５記載の分解菌保持担体を含有してなる汚染環境の浄化装置。
【請求項７】
請求項１〜請求項３何れか１項記載の細菌、請求項４記載の微生物製剤または請求項５記載の分解菌保持担体を使用することを特徴とするアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ｓ−トリアジン系化合物は、炭素３、窒素３原子よりなる対称型のトリアジン環を基本骨格として持つ化合物の総称であり、樹脂、塗料、肥料、除草剤および殺菌剤等といった広範囲な用途に製造・利用されている。これらの物質は、環境中で比較的安定であり、使用に伴い環境中へ蓄積する。また、メラミン、アトラジン、およびシメトリン等のいくつかのｓ−トリアジン系化合物は環境省（旧環境庁）の「水環境保全に向けた取組のための要調査項目リスト（平成１０年６月５日報道発表）」にも挙げられている。
【０００２】
環境中に蓄積したｓ−トリアジン系化合物による被害例として、たとえば米国国内では、アトラジンの大量使用による飲料用地下水の汚染が報告されている。また、メラミンが混入したペットフードを食べた犬や猫が腎不全を起こして死亡する事件、およびメラミンが混入したミルクを飲んだ乳幼児が腎臓結石を発症した事件等、人畜への健康被害例が多数報告されている。また、これらの健康被害はメラミン並びにその代謝物であるシアヌル酸との複合的な作用により生じるものと推定されている。このような点から、ｓ−トリアジン系化合物が肥料、飼料や食品に添加され、あるいは残存し、土壌や水域等の環境中に大量排出された場合、深刻な問題となる可能性がある。
【０００３】
ｓ−トリアジン系の化合物、特にメラミンおよびその水酸基置換体であるシアヌル酸は、他のｓ−トリアジン系化合物と比較して工業的に大量に製造されており、工業廃棄物に含まれ、また、難分解性であることから水域および土壌環境中に放出された場合、蓄積する可能性が高いといえる。
【０００４】
メラミンおよびその水酸基置換体を含むｓ−トリアジン化合物がいったん環境中に放出された場合には、これを回収して通常の化学反応によって分解するという方法は現実的ではない。そこで、環境中に放出されたこれらの化合物を微生物等により生分解する手段が試みられてきた。このような方法として、特開昭５４−１６３８９２号公報（特許文献１）には、メラミンの水溶液または懸濁液を嫌気条件下でメラミナーゼ活性を持つ微生物または酵素剤に接触させることによってメラミンを生物学的に減成する方法が開示されている。また、特開昭５７−８６２９３号公報（特許文献２）には、シュードモナス属の特定の菌株に好気条件下で接触させることによってアンメリンまたはアンメリドをシアヌル酸に分解する方法が開示されている。
【０００５】
特開昭６０−１１４１９１号公報（特許文献３）には、ロドコッカス属の特定の菌株に好気条件下で接触させることにより塩素化トリアジンまたはヒドロキシトリアジンを対応するアンメリドへ生分解する方法が開示されている。さらに、特開２００５−２７５３６号公報（特許文献４）および特開２００７−６７１４号公報（特許文献５）には、トリアジン系農薬を好気条件下で分解する方法が開示されている。さらに、特開２００７−２８２６３１号公報（特許文献６）にはアグロバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オクロバクトラム属、フィロバクテリウム属に属する菌株によりメラミンを分解する方法が示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの文献記載の細菌並びに方法は、メラミンをシアヌル酸に加水分解することができない、あるいはメラミンをシアヌル酸に分解するもののシアヌル酸を分解することができず、シアヌル酸が蓄積する、もしくは分解物の残存、残留が懸念される等の問題点がある。
【０００７】
また、本発明者らは、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解菌としてノカルディオイデスｓｐ．ＡＴＤ６（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１７１０）を特開２０１０−１３０９６５号公報（特許文献７）で開示しているが、この細菌単独ではアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の最終代謝産物であるシアヌル酸の分解が不可能であった。そこで、この細菌と、シアヌル酸を分解できる細菌とのコンソーシア（複合菌群）とする方法もあるが、コンソーシアでは各菌体の制御を行うことに難点であり、単独の細菌で最終代謝産物まで分解できることに勝る方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭５４−１６３８９２号公報
【特許文献２】特開昭５７−８６２９３号公報
【特許文献３】特開昭６０−１１４１９１号公報
【特許文献４】特開２００５−２７５３６号公報
【特許文献５】特開２００７−６７１４号公報
【特許文献６】特開２００７−２８２６３１号公報
【特許文献７】特開２０１０−１３０９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の目的は、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、または土壌中に含まれるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物とその最終代謝産物であるシアヌル酸を単独で分解することが可能な細菌（分解菌）を提供すること、この分解菌を用いた微生物製剤および分解菌保持担体を提供すること、またはこうした分解菌等を用いた汚染環境の浄化装置を提供すること、あるいはこうした分解菌等を用いたアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解能を有することを特徴とするアルスロバクター属の細菌を提供する。
特に、アルスロバクター属の細菌が、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７１２として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＭＣＯ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する細菌を提供する。
また、アルスロバクター属の細菌が、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７１１として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＣＳＰ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する細菌を提供する。
【００１１】
こうしたアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解菌は、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解する新規に発見された菌株であり、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を含む汚染土壌に代表される汚染環境を効果的に浄化することが期待できる。
ここでアミノ−ｓ−トリアジン系化合物とは、次の式（Ｉ）で表される化合物である。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
式（Ｉ）において、Ｘ１は、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基であり、特に好ましくはアミノ基であり、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、水素原子、アルキル基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基である。
【００１４】
アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロパン−１−イル基、プロパン−２−イル基（イソプロピル基）、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはメチル基、エチル基、特に好ましくはメチル基を挙げることができる。
アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基を例示することができ、好ましくはメチルチオ基を挙げることができる。
【００１５】
アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロパン−１−イルアミノ基、プロパン−２−イルアミノ基（イソプロピルアミノ基）、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基を例示することができ、好ましくはエチルアミノ基を挙げることができる。
ジアルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはジメチルアミノ基を挙げることができる。
【００１６】
アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、アミノエチル基、アミノプロパン−１−イル基、アミノプロパン−２−イル（アミノイソプロピル基）、アミノイソブチル基、アミノｓｅｃ−ブチル基、アミノｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはアミノメチル基を挙げることができる。
ヒドロキシアルキルアミノ基としては、例えば、ヒドロキシメチルアミノ基、ヒドロキシエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはヒドロキシメチルアミノ基を挙げることができる。
【００１７】
ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、ビス（ヒドロキシメチル）アミノ基、ビス（ヒドロキシエチル）アミノ基を例示することができ、好ましくはビス（ヒドロキシメチル）アミノ基を挙げることができる。
ハロゲン原子としては、フッ素原子または塩素原子、好ましくは塩素原子を挙げることができる。
【００１８】
好適な実施態様において、Ｘ１はアミノ基とすることができ、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基、または水素原子とすることができ、好ましくは、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、または水素原子、さらに好ましくはアミノ基、水酸基、または水素原子、さらに好ましくは、アミノ基または水酸基とすることができる。
【００１９】
好適な実施態様において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物は、上記式（Ｉ）において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３がアミノ基である化合物（メラミン）、Ｘ１およびＸ２がアミノ基であり且つＸ３が水酸基である化合物（アンメリン）、Ｘ１がアミノ基であり且つＸ２およびＸ３が水酸基である化合物（アンメリド）とすることができる。
【００２０】
また、上記分解菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号１、２または３に記載する塩基配列、またはメラミン、アンメリン、およびアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号１、２または３に記載された塩基配列と相同性を有する塩基配列を有し、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物、より好ましくはメラミン、アンメリン、またはアンメリド分解能を有する細菌とすることができる。
【００２１】
そして、こうした分解菌が１種以上の共存菌を含有してなる、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解するための複合微生物、および複合微生物系、さらにはアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解用複合微生物製剤とすることもできる。
このような複合微生物、複合微生物系または複合微生物製剤とすることによって、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物に加えて、その代謝産物や別の有機汚染物質を分解することが可能となる。
【００２２】
また、アルスロバクターエスピー  ＭＣＯ株またはアルスロバクターエスピー  ＣＳＰ株の２菌株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌であるため、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物を分解し、その最終代謝産物であるシアヌル酸をも分解できる。そのため、メラミン等のアミノ−ｓ−トリアジン系化合物を完全分解することができる。
【００２３】
そしてまた、前記細菌を有効成分として含有するアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解する微生物製剤を提供する。ここで微生物製剤とは、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能およびシアヌル酸の分解能を有する細菌を含んでいる製剤であり、当該細菌の生育が許容される関係物質を含有していることが好ましい。当該関係物質としては、土壌、活性汚泥、培地、資化材等が挙げられる。このような関係物質に、当該細菌を添加、混合または付着させて、飼料や肥料、土壌や水系に添加または散布することによって、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解を図ることができる。
【００２４】
また、これらの分解菌の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有するアミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含んでなる分解菌保持担体を提供する。
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解菌である上記２菌株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含むため、この分解菌を安定的に保持し、生育させることができる。また、分解菌を多孔質材中に含む担体として取り扱えるため、分解菌の取扱いが容易である。
【００２５】
この分解菌保持担体は、分解菌とともにその分解菌の炭素源となる基質として、ピルビン酸やグルコースを含むものとすることができる。炭素源となる基質として、ピルビン酸またはグルコースを含むため、分解菌保持担体中での分解菌の生育を良くすることができる。そのため、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解能を高めることができる。
【００２６】
さらに、こうした分解菌や微生物製剤、分解菌保持担体を含有した汚染環境の浄化装置を提供する。アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解する能力のある分解菌や微生物製剤、分解菌保持担体を含むため、汚染土壌や汚染水の浄化を行うことができる。
【００２７】
上記分解菌や微生物製剤、分解菌保持担体を使用するアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解方法を提供する。
上記分解菌を利用するため、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解を好適に行うことができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、肥料、飼料、工業廃材、工場排水、環境水、および土壌中に含まれるメラミン等のアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を速やかに分解することができる。そして、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸によって汚染された土壌等の汚染環境を簡易に浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】塩基配列をもとにした２菌株の分子系統樹を示す説明図である。
【図２】分解菌の集積を行う還流装置の概要図である。
【図３】混合土壌での還流工程における培養液中のメラミン濃度の経時変化を示すグラフ図である。
【図４】多孔質材土壌での還流工程における培養液（ＰＢ区）中のメラミン濃度の経時変化を示すグラフ図である。
【図５】多孔質材土壌での還流工程における培養液（ＤＷ区）中のメラミン濃度の経時変化を示すグラフ図である。
【図６】２菌株の培養日数と菌体密度の関係を示すグラフ図である。
【図７】アルスロバクターエスピーＭＣＯ株のアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解と菌体密度を示すグラフ図である。
【図８】アルスロバクターエスピーＣＳＰ株のアミノ−ｓ−トリアジン系化合物の分解と菌体密度を示すグラフ図である。
【図９】アルスロバクターエスピーＭＣＯ株のシアヌル酸の分解と菌体密度を示すグラフ図である。
【図１０】アルスロバクターエスピーＣＳＰ株のシアヌル酸の分解と菌体密度を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解するための技術について以下に詳細に説明する。より具体的にはアミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解することができる細菌（以下「分解菌」ともいう）と、これを用いた微生物製剤、分解菌保持担体、そしてこれらを用いた汚染環境の浄化装置と、これら汚染物質の分解方法である。
【００３１】
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解する分解菌：
好適な実施形態において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解可能な分解菌には次の２菌株、即ち、アルスロバクターエスピーＭＣＯ株（Arthrobacter sp. strain MCO）またはアルスロバクターエスピーＣＳＰ株（Arthrobacter sp. strain CSP）が挙げられる。
【００３２】
これらの２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、アルスロバクターエスピーＭＣＯ株は、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７１２、受託日：２０１３年１０月８日として、アルスロバクターエスピーＣＳＰ株は、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−０１７１１、受託日：２０１３年１０月８日としてそれぞれ寄託されている。また、これら２菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列をそれぞれ配列番号１、２の配列表に示す。アルスロバクターエスピーＭＣＯ株の配列表を配列番号１とし、アルスロバクターＥＳＵＰＩ−ＣＳＰ株の配列表を配列番号２としている。
【００３３】
２菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列に基づく分子系統樹を図１に示す。図１中のノカルディオイデスエスピーＡＴＤ６株はメラミン分解能が知られた細菌であるが、上記２菌株は、メラミンを分解するアルスロバクター属に属する細菌として新規な細菌である。
【００３４】
アルスロバクターエスピーＭＣＯ株の菌学的特徴は、桿菌(rod-coccus cycle有)、0.7-0.8×1.5-2.5μm(24時間後)、0.8×0.9μm(72時間後)、グラム陽性、胞子形成無し、運動性無し、カタラーゼ陽性、コロニー形状：φ1.0-2.0mm、淡黄色、円形、レンズ状、全縁、表面スムーズ、バター様である。
【００３５】
アルスロバクターエスピーＣＳＰ株の菌学的特徴は、桿菌(rod-coccus cycle有)、0.7-0.8×1.5-3.0μm(24時間後)、0.8×0.9μm(72時間後)、グラム陽性、胞子形成無し、運動性無し、カタラーゼ陽性、コロニー形状：φ1.0-2.0mm、淡黄色、円形、レンズ状、全縁、表面スムーズ、バター様である。
【００３６】
メラミンを含有させた培養液でアルスロバクターエスピーＭＣＯ株またはアルスロバクターエスピーＣＳＰ株を培養し、数日後の培養液のアンモニア濃度を測定すると、当初含有させたメラミンに由来する全ＮＨ４＋の理論値に対し、測定時のＮＨ４＋の濃度が２０％〜３０％分しか残らないことがわかっている。即ち、メラミン由来窒素の７０％〜８０％はこれらの分解菌内へ取り込まれ、蓄積していると解釈できる。
【００３７】
好適な実施態様において、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解可能な分解菌には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が配列表の配列番号１または２に記載する塩基配列、またはメラミン、アンメリン、およびアンメリドの分解能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号１または２に記載されたそれぞれの塩基配列との相同性を有する塩基配列を有し、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物、より好ましくはメラミン、アンメリン、またはアンメリド分解能を有するアルスロバクター属の細菌を挙げることができる。あるいは、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解可能な分解菌には、アルスロバクターエスピーＭＣＯまたはアルスロバクターエスピーＣＳＰと菌学的の一部が同じである細菌を挙げることができる。
【００３８】
分解菌保持担体、微生物製剤：
有機汚染物質であるアミノ−ｓ−トリアジン系化合物を土壌中や水中などの汚染環境中で効果的に分解するためには、分解菌を土壌中や水中に高密度で長期間存在させる必要がある。そのため、分解菌の餌となる基質とともに分解菌の住みかとなる多孔質材に担持させることが好ましい。こうした担体には、木質炭化素材やヤシ殻炭化素材など、比表面積が５０ｍ２／ｇ〜６００ｍ２ ／ｇである多孔質材が好ましい。分解菌が利用しやすい形態に資化材が吸着されやすく、また、担体への分解菌の安定的な集積が可能となるからである。
また、多孔質材は分解菌の含有率を高めるため、２μｍ〜５０μｍ、より好ましくは５μｍ〜２０μｍの大きさの細孔が容積比率で１０％以上あることが好ましい。
【００３９】
また、前記分解菌を含んでいる微生物製剤もまた好ましい一実施態様である。
微生物製剤は、当該細菌の生育が許容される関係物質を含有していることが好ましく、また、関係物質としては、土壌、活性汚泥、培地等が挙げられる。
【００４０】
分解菌の取得：
上記分解菌は、土壌木炭還流法を応用した手段を用いて取得することができる。この手法は目的の微生物が生息していると思われる土壌に、微生物の住みかとなる多孔質材を混合して混合土壌を作製し、これに所定の培養液を還流させて、即ち、目的の微生物の培養液を混合土壌に散布し、混合土壌を通過した培養液を再び元の混合土壌に散布するという操作を繰り返して、目的の微生物を多孔質材中に集積させる方法である。
【００４１】
より具体的な方法を以下に示す。１００ｋｇ／１０アールの石灰窒素を１年以上使用したハウス栽培用地から採取した土壌（黒ボク土（ｐＨ６．４３））の１５ｇ（乾土相当）に対して、微生物の住みかとなる多孔質材１ｇを混合して混合土壌を作製する。多孔質材には、例えば、木質炭化素材Ａ１３０（広葉樹を４００℃〜６００℃で焼成、比表面積１３０ｍ２／ｇ、ｐＨ６．５）や、ヤシ殻炭化素材ＣＣ１００（ヤシ殻を４００℃〜６００℃で焼成、比表面積１００ｍ２／ｇ、ｐＨ７．４）を挙げることができる。
【００４２】
なお、多孔質材として木炭とヤシ殻炭を挙げたのは、微生物の集積にｐＨが影響する場合があるためで、Ａ１３０は酸性性質を有し、ＣＣ１００はアルカリ性性質を有するからである。
【００４３】
こうした混合土壌を、還流装置であるパーコレータ１（「分解菌迅速集積装置」藤原製作所社製）（図２参照）に充填し、還流液（培養液）２を、２５℃で５０日〜６０日程度の間、前記混合土壌３中にポンプＰで還流させて、採取土壌中に存在すると予想される分解菌を木質炭化素材中に集積させる。還流液２には、例えば、下記のリン酸バッファ２５０ｍＬに対しメラミンを２０ｐｐｍを含有させた還流液（以下「ＰＢ区」とも略称する）や、このリン酸バッファに代えて、水：１０００ｍＬにトレースエレメントを１０ｍＬ加えた組成からなる蒸留水２５０ｍＬに対しメラミンを２０ｐｐｍを含有させた還流液（以下「ＤＷ区」とも略称する）を用いることができる。
【００４４】
なお、上記ＰＢ区を構成するリン酸バッファは、水：１０００ｍＬに、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを１．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．５ｇ、トレースエレメントを１０ｍＬ加えたｐＨ：６．８の培地である。ここで、トレースエレメントは、、水：１０００ｍＬに、ＥＤＴＡ：５００ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２０００ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２００ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ：５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３：３０ｍｇ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２４ｍｇ、ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：５ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４：５ｍｇ、Ｃａ（ＯＨ）２：５０ｍｇを加えたものである。ＤＷ区に含まれるトレースエレメントも同様のものである。
なお、ＰＢ区とＤＷ区の両培地を用いたのは、ｐＨや塩によって微生物の集積に影響が出る場合があるためである。
【００４５】
６０日の還流工程中、適宜、還流液中のメラミン濃度を調べるとともに、メラミン濃度が下がった時に何度か還流液を新しいものに変えている。
還流液にＰＢ区またはＤＷ区を用い、多孔質材に木質炭化素材を用いて還流操作を行った際の還流液中のメラミン濃度の推移と、還流液交換のタイミングを図３に示す。
図３の縦軸は還流液中のメラミン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示し、横軸は還流日数を示す。図３の下向き矢印は還流液を全量、新鮮なものと交換した時点（還流液交換時期）を示す。
図３から、ＰＢ区を用いた場合も、ＤＷ区を用いた場合も、２回目の還流液交換の後、メラミン濃度が横ばい状にならずに、減少していく状態が見られる。こうしたメラミン濃度の変位から分解菌が木質炭化素材に集積していることが予測される。
【００４６】
分解菌の純化・集積、メラミンの分解：
次に、前記混合土壌において、多孔質材１ｇ（乾物）当たり分解菌数が約１０２個（＝１０２／ｇ）になったときに、混合土壌から分解菌が集積した多孔質材のみを取り出し、これを滅菌処理した新たな多孔質材に混合して多孔質材のみの多孔質材土壌とし、前記同様の還流をさらに４０日〜５０日間程度繰り返す。こうした操作を行うのは、多孔質材中で目的の微生物である分解菌の生育が有利に働き、分解菌以外の微生物は増殖し難くなるためで、分解菌の純化、集積が進むからである。
【００４７】
なお、還流液の交換とは別に、炭素源としてピルビン酸またはグルコースを１ｇ／Ｌ添加している。これは分解菌の増殖を高めるためである。またここで、多孔質材土壌は、混合土壌から取り出した多孔質材：０．２５ｇに対して新たな多孔質材：７．５ｇの割合で混合したものである。
【００４８】
還流液にＰＢ区を用い、炭素源として適宜ピルビン酸を添加し、多孔質材に木質炭化素材（Ａ１３０）またはヤシ殻炭化素材（ＣＣ１００）を用いて還流操作を行った際の還流液中のメラミン濃度の推移と、還流液交換のタイミングを図４に示す。図４において、縦軸は還流液中のメラミン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示し、横軸は還流日数を示す。
なお、ＰＢ区でピルビン酸を添加したのは、ＰＢ区でピルビン酸のような炭素源が無いと、土壌由来の炭素源が無くなった後は、分解菌の集積が進まないことがわかったからである。
【００４９】
また、還流液にＤＷ区を用い、炭素源として適宜グルコースを添加し、多孔質材に木質炭化素材（Ａ１３０）またはヤシ殻炭化素材（ＣＣ１００）を用いて還流操作を行った際の還流液中のメラミン濃度の推移と、還流液交換のタイミングを図５に示す。図５において、縦軸は還流液中のメラミン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示し、横軸は還流日数を示す。なお、ＤＷ区でグルコースを添加したのは、ＤＷ区でグルコースのような炭素源が無いと、土壌由来の炭素源が無くなった後は、分解菌の集積が進まないことがわかったからである。
【００５０】
図４や図５よりピルビン酸やグルコースなどの炭素源を加えることで，メラミンの減少程度が急激になり、さらにはメラミン濃度が０になったことから、土壌を離れた多孔質材への分解菌の集積と、その分解菌の集積のために炭素源が必要であることがわかる。
【００５１】
最後に、所望の分解菌が集積した多孔質材土壌をパーコレータから取り出し粉砕して、限界希釈法によりリン酸バッファで１０−５倍〜１０−６倍まで段階希釈し、これをＲ２Ａ寒天培地に平板塗抹後、３日間培養し、形成されたクリアゾーンから微生物を単離した。リン酸バッファに代えてＲ２Ａ寒天培地を用いたのは分解菌の生育を高めるためである。これらの微生物を上記リン酸バッファ１Ｌに対しグルコース１ｇ、メラミン２０ｐｐｍを加えた培養液（ｐＨ６．８）中で培養し、メラミンを分解する上記分解菌２菌株を単離し、同定した。
【００５２】
２菌株の生育速度試験（その１）：
上記２菌株のそれぞれを、初発ＯＤ６００菌体密度が０．０１になるようにＲ２Ａ培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで振とう培養した。経時的に菌体密度を測定した結果を以下の図６に示す。
図６より、２菌株の何れも培養１日目でＯＤ６００が１．５以上となり、生育がとても早いことがわかる。
【００５３】
２菌株の生育速度試験（その２）：
２菌株のそれぞれの生育試験を、上記生育速度試験（その１）に対して初期菌体密度と培地を変えて行った。培地を前記リン酸バッファ１Ｌにメラミン：２０ｐｐｍと、グルコース：０．１ｇを加えた培地に変更し、各菌株の初発ＯＤ６００を０．０２として、３０℃、１８０ｒｐｍで振とう培養した。それらの結果を、図７、図８に示す。
図７、図８の結果から、上記２菌株は、初発ＯＤ６００や、グルコース濃度を抑えても、メラミンを完全分解することがわかった。また、途中の代謝産物であるアンメリン、アンメリドが生成し、これらもまた分解されることが判明した。
【００５４】
シアヌル酸分解：
培地を前記リン酸バッファ１Ｌにシアヌル酸：２０ｐｐｍと、グルコース：０．２ｇを加えた培地に変更し、各菌株の初発ＯＤ６００を０．０１とし、３０℃、１８０ｒｐｍで振とう培養した。そして、経時的にＯＤ６００およびシアヌル酸濃度を測定した。それらの結果を、図９、図１０に示す。
図９、図１０の結果から、上記２菌株は、シアヌル酸も唯一の窒素源として分解資化（無機化）が可能であることがわかる。
【００５５】
分解菌を用いた汚染物質の浄化方法：
分解菌を用いて、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸によって汚染された物質を浄化するには次のような方法がある。
アミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸で汚染された汚染土壌に関しては、分解菌を上記多孔質材に含有させた分解菌保持担体や分解菌を含有する微生物製剤を汚染土壌中に埋設して混和する。土壌中に埋設しておくことで、土壌中に含まれているアミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸は分解菌によって分解される。この方法によれば、土壌中のアミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸が地下水に混入することを避けることができ、地下水汚染の防止を図ることが可能となる。
【００５６】
この技術の応用として、分解菌保持担体や微生物製剤をアミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸の存在する表層および下層土壌への混入、ゴルフ場のグリーン面の下層土壌への混入、産業破棄物処理場の下層土壌への混入、工場等における有機廃液置き場の下層土壌への混入などが挙げられ、こうした応用によりアミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸を処理することができる。
特に、世界中で利用されているメラミン製品の廃棄物やメラミン廃液、および近年需要が高まっている水溶性塗料(メラミン含有)の処理等に対する応用が有効と考えられ期待されている。
【００５７】
汚染環境の浄化装置：
分解菌保持担体や微生物製剤を通気性のある筐体内に詰め込むなどして保持すれば簡単にバイオリアクターとして、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸を分解除去する汚染環境の浄化装置（アミノ−ｓ−トリアジン系化合物分解除去装置）とすることができる。
例えば、該装置にアミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸で汚染された水を還流させることで、この汚染水を浄化することができる。あるいは、この装置を、生活排水路、水田地帯の農業排水路、ゴルフ場の排水路などの水路の一部に設けることにより、水中に溶解、分散したアミノ−ｓ−トリアジン系化合物やシアヌル酸を分解除去し、汚染環境を浄化する汚染環境の浄化装置として利用することができる。
【符号の説明】
【００５８】
１    パーコレータ
２    還流液
３    混合土壌
Ｐ    ポンプ
【図１】
2015084678.tif 000004
【図２】
2015084678.tif 000005
【図３】
2015084678.tif 000006
【図４】
2015084678.tif 000007
【図５】
2015084678.tif 000008
【図６】
2015084678.tif 000009
【図７】
2015084678.tif 000010
【図８】
2015084678.tif 000011
【図９】
2015084678.tif 000012
【図１０】
2015084678.tif 000013
【配列表】
2015084678000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月13日(2013.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
アルスロバクター属の細菌が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７１２として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＭＣＯ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する請求項１記載の細菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
アルスロバクター属の細菌が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７１１として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＣＳＰ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する請求項１記載の細菌。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
上記目的を達成するため、アミノ−ｓ−トリアジン系化合物およびシアヌル酸の分解能を有することを特徴とするアルスロバクター属の細菌を提供する。
特に、アルスロバクター属の細菌が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７１２として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＭＣＯ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する細菌を提供する。
また、アルスロバクター属の細菌が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７１１として寄託されたアルスロバクターエスピー  ＣＳＰ株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する細菌を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
これらの２菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、アルスロバクターエスピーＭＣＯ株は、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７１２、受託日：２０１３年１０月８日として、アルスロバクターエスピーＣＳＰ株は、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７１１、受託日：２０１３年１０月８日としてそれぞれ寄託されている。また、これら２菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列をそれぞれ配列番号１、２の配列表に示す。アルスロバクターエスピーＭＣＯ株の配列表を配列番号１とし、アルスロバクターＥＳＵＰＩ−ＣＳＰ株の配列表を配列番号２としている。