(57)【要約】【課題】核酸増幅反応を阻害する物質、特に、多糖類を含む試料に対して、容易に核酸増幅反応を可能にすること。【解決手段】試料中に含まれるターゲット核酸を増幅する方法であって、（ａ）試料中の多糖類を分解する工程、（ｂ）工程（ａ）で得られた試料を、試料の分離をともなう精製を行わずに核酸増幅反応液に添加する工程、（ｃ）ターゲットとなる核酸を増幅する工程、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるターゲット核酸を増幅する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）試料中の多糖類を分解する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた試料を、試料の分離をともなう精製を行わずに核酸増幅反応液に添加する工程  
（ｃ）ターゲットとなる核酸を増幅する工程
【請求項２】
多糖類を分解する工程が酵素反応である、請求項１に記載の核酸増幅法。
【請求項３】
多糖類がペクチンである、請求項１または２に記載の核酸増幅法。
【請求項４】
酵素反応がペクチナーゼによる反応である、請求項２または３に記載の核酸増幅法。
【請求項５】
試料が、血液、尿、糞便、喀痰、鼻腔液、膣分泌物および口腔内粘膜からなる群から選ばれるいずれかに由来するものである、請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項６】
増幅のターゲットとなる核酸が、腸管感染症の原因となる菌またはウイルスの遺伝子である、請求項１から５のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための試薬であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）で示される組成物を含む試薬。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
（Ｂ）以下の（ｉｉ）から（ｖ）を含む組成物
（ｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）少なくとも一対のプライマー
（ｉｖ）ｄＮＴＰ
（ｖ）２価イオンおよび１価イオンを含む緩衝液
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための試薬であって、以下の（Ａ）から（Ｃ）で示される組成物を含む試薬。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
（Ｂ）以下の（ｉｉ）から（ｖ）を含む組成物
（ｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）少なくとも一対のプライマー
（ｉｖ）ｄＮＴＰ
（ｖ）２価イオンおよび１価イオンを含む緩衝液
（Ｃ）以下の（ｖｉ）を含む組成物
（ｖｉ）逆転写活性を有する酵素
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための前処理試薬であって、以下の（Ａ）で示される組成物を含む試薬。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
【請求項１０】
請求項７から９のいずれかに記載の試薬を含むプロダクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅法に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【０００３】
核酸増幅法を利用した検査の対象となる試料は目的に応じて様々である。ゲノムＤＮＡを対象とした遺伝子診断であれば侵襲性が低く採取が容易な試料、例えば、口腔内粘膜細胞や血液である。感染症原因菌の検出であれば、原因菌が存在しうる試料すなわち、尿、喀痰、糞便、血液、鼻腔液、膣分泌液などである。食品衛生検査であれば食品、あるいは食品取扱者から採取された糞便や尿、環境衛生検査であれば土壌や河川水、雨水、海水などの環境水、製造設備等の拭き取り物などである。
【０００４】
このような試料は多くの核酸以外の物質も多量に含んでおり、ＰＣＲを効率的に行うには通常は試料中の核酸の分離精製が必要とされている。核酸の分離精製には様々な手法があるが、基本的には核酸と他の物質を固体相と液体相に分けて固液分離する工程から構成される。例えばエタノール沈殿で核酸を固体相とし遠心分離で分離する方法、固相ビーズに核酸をハイブリダイズし、遠心分離や磁性化体で分離する方法がある。しかし、試料の分離をともなうこれらの精製法は、操作が煩雑で、かつ時間を要し、操作中に分解やコンタミネーションを生じる危険性があり、また、試料中の核酸含量が少ない場合には、増幅反応に必要な量を回収することができない場合もある。これらの理由から、試料を、試料の分離をともなう精製工程を経ることなく反応液へ持込み、標的核酸を増幅する方法が求められていた。
【０００５】
特許文献１では試料中に含まれるタンパク質をプロテアーゼを用いて分解し、核酸を分離精製することなく核酸増幅反応に添加する方法が記載されている。また、特許文献２、３には、核酸増幅反応液のｐＨを８．９以上にすることによりタンパク質等を変性し、核酸を分離精製することなく試料を添加し核酸増幅反応を可能にする方法が記載されている。特許文献４には、水溶性有機溶媒と酸性ｐＨにより核酸を安定させ、核酸を分離精製することなく試料を添加し核酸増幅反応を可能にする方法が記載されている。これらの方法で処理した試料は、試料の分離をともなう精製を行わずに、直接、または、遠心分離を行ったあとに、核酸増幅反応に供することができる。
【０００６】
しかしながら、試料にこのような処理を施しても、なお、ＰＣＲが効率よく進まないケースが散見され、さらなる改良が要望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１８８８５６
【特許文献２】特許３４９４５０９
【特許文献３】特許３４５２７１７
【特許文献４】特開２０１１−２５０７５７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，  ４１，  １５４８−１５５７  （２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、核酸増幅反応を阻害する物質を含む試料に対して、容易に核酸増幅反応を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、核酸増幅反応が効率よく進まないケースにおいて、その原因を検討した結果、多糖類が核酸増幅反応を阻害することを見出した。
さらに本発明者らは、この問題点を解決する方法を検討した結果、多糖類を含む試料を多糖類分解反応に付した後、核酸増幅反応液に添加することで、試料中の核酸を試料の分離をともなう精製を行わずに増幅反応に供することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
代表的な本願発明は以下の通りである。
［項１］
試料中に含まれるターゲット核酸を増幅する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）試料中の多糖類を分解する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた試料を、試料の分離をともなう精製を行わずに核酸増幅反応液に添加する工程  
（ｃ）ターゲットとなる核酸を増幅する工程
［項２］
多糖類を分解する工程が酵素反応である、項１に記載の核酸増幅法。
［項３］
多糖類がペクチンである、項１または２に記載の核酸増幅法。
［項４］
酵素反応がペクチナーゼによる反応である、項２または３に記載の核酸増幅法。
［項５］
試料が、血液、尿、糞便、喀痰、鼻腔液、膣分泌物および口腔内粘膜からなる群から選ばれるいずれかに由来するものである、項１から４のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項５−１］
試料が糞便である、項５に記載の核酸増幅法。
［項６］
増幅のターゲットとなる核酸が、腸管感染症の原因となる菌またはウイルスの遺伝子である、項１から５のいずれかに記載の核酸増幅法。
［項６−１］
腸管感染症の原因となる菌またはウイルスが、サルモネラ菌、赤痢菌、腸管出血性大腸菌、ノロウイルス、サポウイルスおよびロタウイルスからなる群から選ばれる、項６に記載の核酸増幅法。
［項７］
項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための試薬であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）で示される組成物を含む試薬。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
（Ｂ）以下の（ｉｉ）から（ｖ）を含む組成物
（ｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）少なくとも一対のプライマー
（ｉｖ）ｄＮＴＰ
（ｖ）２価イオンおよび１価イオンを含む緩衝液
［項８］
項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための試薬であって、以下の（Ａ）から（Ｃ）で示される組成物を含む試薬。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
（Ｂ）以下の（ｉｉ）から（ｖ）を含む組成物
（ｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）少なくとも一対のプライマー
（ｉｖ）ｄＮＴＰ
（ｖ）２価イオンおよび１価イオンを含む緩衝液
（Ｃ）以下の（ｖｉ）を含む組成物
（ｖｉ）逆転写活性を有する酵素
［項９］
項１〜６のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための前処理試薬であって、以下の（Ａ）で示される組成物を含む試薬。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
［項１０］
項７から９のいずれかに記載の試薬を含むプロダクト。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、核酸増幅反応に先立ち核酸を分離精製するための時間・コストを削減することができる。さらに核酸を分離精製する際に生じる可能性のあるリスク、すなわち試料ロスやキャリーオーバーの危険性を低減することができる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ペクチンを含む反応液でＲＴ−ＰＣＲを行った場合の融解曲線解析
【図２】ペクチンをペクチナーゼで処理した反応液でＲＴ−ＰＣＲを行った場合の融解曲線解析
【図３】ヒト糞便を含む反応液でＲＴ−ＰＣＲを行った場合の融解曲線解析
【図４】ヒト糞便をペクチナーゼで処理した反応液でＲＴ−ＰＣＲを行った場合の融解曲線解析
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１５】
本発明の一局面は、試料中に含まれるターゲット核酸を増幅する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む方法である。
（ａ）試料中の多糖類を分解する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた試料を、試料の分離をともなう精製を行わずに核酸増幅反応液に添加する工程
（ｃ）ターゲットとなる核酸を増幅する工程
【００１６】
本発明の核酸増幅法の試料は特に限定されない。一例としては、主に臨床検査や食品衛生管理に供される検体、すなわち、血液、尿、糞便、喀痰、鼻腔液、膣分泌物および口腔内粘膜からなる群から選ばれるいずれかに由来するものが挙げられる。具体的には、全血、血漿、尿、糞便、喀痰、唾液、口腔内擦過物、鼻腔液、鼻腔ぬぐい液、膣ぬぐい液、尿道擦過物などが例示できる。あるいは、食品における品種の特定や遺伝子組み換えの有無の判別などに供される検体、米、小麦、大麦、大豆などの穀物や果物、野菜などの植物、肉類、魚介類などの動物、細菌、真菌、きのこ類などの微生物などが挙げられる。
【００１７】
本発明の核酸増幅法のターゲット核酸は特に限定されない。一例としてはＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。
【００１８】
ターゲットとして、感染症の原因となる菌に由来するＤＮＡまたはウイルスに由来するＲＮＡなどを糞便から検出する検査は、食中毒の原因の特定、感染経路の特定、またその予防のために幅広く行われている。たとえば、ノロウイルスの検査は糞便を試料とし、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子を検出する方法で行われることが多い。糞便は腸内細菌、腸管上皮細胞、食物由来物質などから構成されており、特に食物由来の多糖類が多量に含まれることが知られている。
【００１９】
ターゲットとして、食品における品種の特定や遺伝子組み換えの有無の判別などを目的とする検査も幅広く行われている。たとえば、果物の品種の特定であれば窄汁を試料とし、ＰＣＲ法により遺伝子を検出する方法で行われることが多い。果物の窄汁には多量の多糖類が含まれることが知られている。
【００２０】
前記多糖類としては、ペクチンが挙げられる。ペクチンは多くの果物や野菜など食物に含まれる多糖で、ヒトの消化管では分解されずに排泄される。従い、特に糞便や果物、野菜などを試料として用いる核酸増幅反応において本発明は特に有効である。あるいは、本発明の方法は、そのターゲット核酸を、腸管感染症の原因となる菌またはウイルス、たとえばサルモネラ菌、赤痢菌、腸管出血性大腸菌、ノロウイルス、サポウイルスおよびロタウイルスからなる群から選ばれる遺伝子とした場合にも有効である。
【００２１】
本発明は、試料を、多糖類を分解反応に付し核酸増幅反応を阻害しうる多糖類を分解してから核酸増幅反応液に添加する方法である。核酸増幅反応を阻害しうる多糖類としてはペクチンが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、分解反応とは多糖類を核酸増幅反応を阻害しない程度まで分解することを意味しているが、その反応産物については特定されるものではない。分解反応は、酵素により触媒される加水分解反応が上げられるが、これに限定されるものではない。酵素はペクチンを分解するためには、ペクチナーゼが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２２】
ペクチナーゼの反応は、その至適反応条件で行われることが望ましい。ペクチナーゼはｐＨ３−５の範囲に至適領域を持つものが多いが、クエン酸バッファーでｐＨ３−５に緩衝化したような反応液が好ましい。ペクチナーゼの濃度は好ましくは０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍｌで実施される。
反応温度は、用いられるペクチナーゼの至適温度にあわせて設定される。ただし、この方法の運用が大量の検体を処理する検査などの態様であれば、特別の処理が必要ない室温付近１５−２５℃が好ましい。
反応時間も同様の理由で、３０分以内、さらに好ましくは１５分以内に完了するのがよい。
【００２３】
試料は、核酸増幅反応液に添加される前、上記の多糖類分解反応後に核酸増幅反応を阻害しうる物質、例えばタンパク質を不活化する工程を含んでもよい。不活化する工程は、アルカリ処理、加熱処理、有機溶媒による処理または、これらの処理を複数組み合わせた処理、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一方、これらの処理は、核酸が増幅の鋳型としての機能を保持されるように行われなければならない。すなわち、アルカリ処理のｐＨは９−１１の範囲が好ましい。熱処理の条件にはさらに注意が必要で、特にＲＮＡを鋳型とする場合は、８５℃以下、かつ２分以下が好ましい。
【００２４】
上記の処理を終えた試料は、試料の分離をともなう精製を経ることなく核酸増幅反応液に添加される。前記処理により沈殿物などが生じた場合は遠心分離を行ってもよい。この場合、遠心分離に適用できる容器を用いて前記処理を行えば、試料の分離をともなう必要がない。
【００２５】
本発明の核酸増幅反応の一例としては、ターゲットがＤＮＡの場合はＰＣＲが挙げられる。さらにターゲットのゲノム遺伝子がＲＮＡであるような場合、逆転写酵素によりＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応を（逆転写反応）をＰＣＲの前工程に含んでもよい。
【００２６】
逆転写反応を工程に含む場合、逆転写反応と核酸増幅反応は同一の反応液中で行われることが好ましいが、逆転写反応後に核酸増幅反応に適した組成に調整しなおす工程を含む場合もある。逆転写反応液中には、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含んでいてもよい。
【００２７】
ＰＣＲの反応組成の一例としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマー、ｄＮＴＰ、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。
また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。
【００２８】
増幅反応の一例としては、上記反応組成に、多糖類分解処理を行った生体試料を試料の分離をともなう精製を行うことなく添加し、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを行う方法、あるいは（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリングおよびプライマーの伸長を同時に行う熱サイクル（シャトルＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。
【００３０】
反応終了後に増幅生成したＤＮＡ断片は、電気泳動法、融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブなど）で検出、識別することができる。また、温度昇降機能と蛍光測定機能を備えた機器であればＴａｑＭａｎプローブ、蛍光色素法などを用いれば、反応中にリアルタイムに増幅生成したＤＮＡ断片を検出識別することができる。
【００３１】
本発明の別の一局面は、上記の核酸増幅法を実施するための試薬であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）で示される組成物を含む試薬である。この試薬を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行うことができる。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
（Ｂ）以下の（ｉｉ）から（ｖ）を含む組成物
（ｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）少なくとも一対のプライマー
（ｉｖ）ｄＮＴＰ
（ｖ）２価イオンおよび１価イオンを含む緩衝液
【００３２】
上記試薬において、組成物（Ａ）は組成物（Ｂ）とは分離して構成されている必要がある。
【００３３】
また、本発明の別の一局面は、上記の核酸増幅法を実施するための試薬であって、以下の（Ａ）から（Ｃ）で示される組成物を含む試薬である。この試薬を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＲＮＡを逆転写したのち、得られたｃＤＮＡの増幅を行うことができる。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
（Ｂ）以下の（ｉｉ）から（ｖ）を含む組成物
（ｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）少なくとも一対のプライマー
（ｉｖ）ｄＮＴＰ
（ｖ）２価イオンおよび１価イオンを含む緩衝液
（Ｃ）以下の（ｖｉ）を含む組成物
（ｖｉ）逆転写活性を有する酵素
【００３４】
上記試薬において、組成物（Ａ）は組成物（Ｂ）および（Ｃ）とは分離して構成されている必要がある。
なお、組成物（Ｂ）および（Ｃ）は、逆転写反応とＰＣＲとをいわゆる１ステップで行う場合は両方合わせて１つの組成物として構成されていてもよいし、分離していてもよい。
【００３５】
また、本発明の別の一局面は、上記の核酸増幅法を実施するための前処理試薬であって、以下の（Ａ）で示される組成物を含む試薬である。この試薬を用いて、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに供する試料の前処理を行うことができる。
（Ａ）以下の（ｉ）を含む組成物
（ｉ）多糖類分解酵素
【００３６】
さらに、本発明の別の一局面は、上記のいずれかに記載の試薬を含むプロダクトである。
本明細書において「プロダクト」とは、使用者が或る用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明の前記いずれかの試薬を含むものを意味する。
前記プロダクトの典型はキットである。該キットは、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたは前処理を少なくとも１回実行するために十分な量の試薬、および、使用の指針を含む。本発明のプロダクトは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【実施例】
【００３７】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１．  ペクチンを含む反応液からのノロウイルス遺伝子の増幅
（１）試料
以下の試料を調製した。
精製水（ペクチン濃度０％）
０．１％のペクチン（ナカライテスク）を含む水溶液
（２）ペクチナーゼ処理
（２−１）ペクチナーゼ溶液
ペクチナーゼＳＳ（ヤクルト）を１０ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４．２）に、溶解した。
（２−２）ペクチナーゼ処理
前記各試料５μｌと前記ペクチナーゼ溶液５μｌとを混合し、２０℃で１５分間放置した。
（３）タンパク質変性処理
（３−１）前処理液
グリシン１０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭを含む水溶液を調製した。
（３−２）タンパク質変性処理
前記前処理液４μｌと（２−２）で作製したペクチナーゼ処理を施した各試料１μｌとを混合し、８５℃で１分間インキュベートした。
（４）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（４−１）反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
７５ｍＭ  トリス硫酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ  硫酸マグネシウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー
（上記２種のプライマーは非特許文献１に記載の配列である。）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ  ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
５コピー／μｌ  人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片
（４−２）反応
前記反応液４５μｌを（３−２）で処理した各試料に添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  ５分、
９５℃  ５分、
９４℃  １０秒−５８℃  ４５秒  ５サイクル、
９４℃  １０秒−５６℃  ４５秒  １０サイクル、
９４℃  １０秒−５４℃  ４５秒  １５サイクル、
９４℃  １０秒−５２℃  ４５秒  ２０サイクル
（５）融解曲線解析
反応終了後、直ちに「７０℃  ０．５℃／秒  ９０℃融解曲線解析」に供した。すなわち、７０℃から  ０．５℃／秒  で９０℃まで上昇させた。
（６）結果
図１および図２にその結果を示す。使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ２ＦおよびＣＯＧ２Ｒ）は、ノロウイルスＧ２タイプが存在すると８０℃付近にピークを与えることがわかっている。
ペクチナーゼ処理を経ずにＲＴ−ＰＣＲを行った場合（図１）：ペクチンを添加しない場合（０％）は８０℃にピークが検出されたが、ペクチンを０．１％添加した場合は８０℃にピークが検出されず、反応が阻害された。
ペクチナーゼ処理を経てＲＴ−ＰＣＲを行った場合（図２）：ペクチンを０．１％添加した場合でも８０℃にピークが検出され反応阻害が回避された。一方ペクチンを添加しない場合でも８０℃にピークが検出されペクチナーゼそのものの影響はないことが示された。
このように、ペクチンを含みＲＴ−ＰＣＲが阻害されるような場合でも、ペクチナーゼで反応前に分解することにより、阻害を回避できることが見出された。これにより、糞便からの核酸の抽出精製せずにノロウイルスを検出すること（ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで検出すること）ノロウイルスの検出が可能となり、検査時間の大幅な短縮を実現することができた。
【００３９】
実施例２．  ペクチンを含む試料からのノロウイルス遺伝子の増幅
（１）試料
以下の試料を調製した。
糞便溶液の懸濁
１０％（重量％）となるようにヒト糞便を含む懸濁液を１ｍｌ調製した。（４検体）
（２）ペクチナーゼ処理
（２−１）ペクチナーゼ溶液
ペクチナーゼＳＳ（ヤクルト）を１０ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４．２）に、溶解した。
（２−２）ペクチナーゼ処理
前記各試料８０μｌと前記ペクチナーゼ溶液２０μｌとを混合し、２０℃で１５分間放置した。１０，０００ｇで５分間遠心分離した。
（３）タンパク質変性処理
（３−１）前処理液
グリシン１０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭを含む水溶液を調製した。
（３−２）タンパク質変性処理
前記前処理液４μｌと（２−２）で作製したペクチナーゼ処理を施した各試料１μｌとを混合し、８５℃で１分間インキュベートした。
（４）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
（４−１）反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
７５ｍＭ  トリス硫酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ  硫酸マグネシウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー
（上記４種のプライマーは非特許文献１に記載の配列である。）
０．１μＭ  内部標準配列Ｆプライマー（配列番号１）
０．１μＭ  内部標準配列Ｆプライマー（配列番号２）
１０００コピー  内部標準配列ＤＮＡ  ｐＢＲ３２２  プラスミドＤNA
０．０１％  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ（ライフテクノロジー）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ  ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）
０．０５ｕｎｉｔ／μｌ  ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（４−２）反応
前記反応液４５μｌを（３−２）で処理した各試料に添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  ５分、
９５℃  ５分、
９４℃  １０秒−５８℃  ４５秒  ５サイクル、
９４℃  １０秒−５６℃  ４５秒  １０サイクル、
９４℃  １０秒−５４℃  ４５秒  １５サイクル、
９４℃  １０秒−５２℃  ４５秒  ２０サイクル
（５）融解曲線解析
反応終了後、直ちに「７０℃  ０．５℃／秒  ９０℃融解曲線解析」に供した。すなわち、７０℃から  ０．５℃／秒  で９０℃まで上昇させた。
（６）結果
図３および図４にその結果を示す。
使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ１ＦおよびＣＯＧ１Ｒ）は、ノロウイルスＧ１タイプが存在すると７６℃付近にピークを与えることがわかっている。また、使用した前記プライマーセット（ＣＯＧ２ＦおよびＣＯＧ２Ｒ）は、ノロウイルスＧ２タイプが存在すると８０℃付近にピークを与えることがわかっている。また、使用した内部標準配列プライマーセットは、反応液に含まれる内部標準配列ＤＮＡのピークを８５℃付近に与えることがわかっている。
４種の検体を用いて検討を行った。ペクチナーゼ処理後にＲＴ−ＰＣＲを行った結果、Ｇ１陽性検体が１種、Ｇ２陽性検体が１種、陰性検体が２種あることが確認できた（図４）。
一方、同じ検体を用いてペクチナーゼ処理を経ずにＲＴ−ＰＣＲを行った場合は、ＰＣＲが阻害され、Ｇ１タイプ、Ｇ２タイプ、内部標準のすべてのピークが検出されず、ＰＣＲ反応が阻害を受けていることが示された（図３）。
以上のように、ＰＣＲを行う前にペクチナーゼ処理をすることで、反応阻害を回避できることが見出された。これにより、糞便からの核酸の抽出精製せずにノロウイルスの検出が可能となり、検査時間の大幅な短縮を実現することができた。
【００４０】
実施例３．  ペクチンを含む反応液からのノロウイルス遺伝子の増幅
（１）試料
以下の試料を調製した。
精製水（ペクチン濃度０％）
０．１％のペクチン（ナカライテスク）を含む水溶液
リンゴ果汁
（２）ペクチナーゼ処理
実施例１と同様に行った。
（３）タンパク質変性処理
実施しなかった。
（４）１ステップＲＴ−ＰＣＲ
反応液・反応条件ともに、実施例１と同様に行った。（反応液には、人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片が含まれている。）
（５）融解曲線解析
実施例１と同様に行った。
（６）結果
表１にその結果を示す。
【００４１】
【表１】
2015119656.tif 000002
【００４２】
ペクチナーゼ処理を経ずにＲＴ−ＰＣＲを行った場合、０．１％ペクチン水溶液およびリンゴ果汁を試料とした場合はノロウイルス遺伝子（ＲＮＡ）をＲＴ−ＰＣＲで検出できなかった。
ペクチナーゼ処理を経てＲＴ−ＰＣＲを行った場合、０．１％ペクチン水溶液およびリンゴ果汁を試料とした場合でもノロウイルス遺伝子（ＲＮＡ）をＲＴ−ＰＣＲで検出できた。
一方ペクチンを添加しない場合（精製水を用いた場合）は、ペクチナーゼの処理を実施する／しないに関わらずノロウイルス遺伝子（ＲＮＡ）をＲＴ−ＰＣＲで検出でき、ペクチナーゼそのものの影響はないことが示された。
【００４３】
実施例４．  ペクチンを含む反応液からのノロウイルス遺伝子のｃＤＮＡの増幅
（１）試料
以下の試料を調製した。
精製水（ペクチン濃度０％）
０．１％のペクチン（ナカライテスク）を含む水溶液
リンゴ果汁
糞便溶液の懸濁（実施例２と同様に調製した。）
（２）ペクチナーゼ処理
実施例１と同様に行った。
（３）タンパク質変性処理
実施しなかった。
（４）ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ
（４−１）ｃＤＮＡ合成反応液
１Ｘ  ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ  （東洋紡）
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー
（上記４種のプライマーは非特許文献１に記載の配列である。）
１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０５ｕｎｉｔ／μＬ  ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  （東洋紡）
（４−２）反応条件
５０℃  ５分、
９５℃  ５分
（４−３）ＰＣＲ反応液
以下に示される組成の反応液を調製した。
７５ｍＭ  トリス硫酸（ｐＨ７．５）
３．７５ｍＭ  硫酸マグネシウム
０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミ
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．１μＭ  内部標準配列Ｆプライマー（配列番号１）
０．１μＭ  内部標準配列Ｆプライマー（配列番号２）
１０００コピー  内部標準配列ＤＮＡ  ｐＢＲ３２２  プラスミドＤＮＡ
０．０１％  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ（ライフテクノロジー）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ  ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．２ｕｎｉｔ／μｌ  ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）
これの４６μｌに（４−２）で反応した液を４μｌ加えた。
（４−４）反応条件
９４℃  １０秒−５８℃  ４５秒  ５サイクル、
９４℃  １０秒−５６℃  ４５秒  １０サイクル、
９４℃  １０秒−５４℃  ４５秒  １５サイクル、
９４℃  １０秒−５２℃  ４５秒  ２０サイクル
（５）融解曲線解析
実施例１と同様に行った。
（６）結果
表２にその結果を示す。
【００４４】
【表２】
2015119656.tif 000003
【００４５】
ペクチナーゼ処理を経ずにＰＣＲを行った場合、０．１％ペクチン水溶液、リンゴ果汁および糞便を試料とした場合はノロウイルス遺伝子のｃＤＮＡの増幅産物が検出できなかった。
ペクチナーゼ処理を経てＰＣＲを行った場合、０．１％ペクチン水溶液、リンゴ果汁および糞便を試料とした場合でもノロウイルス遺伝子のｃＤＮＡの増幅産物が検出できた。
一方ペクチンを添加しない場合（精製水を用いた場合）は、ペクチナーゼの処理を実施する／しないに関わらずノロウイルス遺伝子のｃＤＮＡの増幅産物を検出でき、ペクチナーゼそのものの影響はないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、臨床検査や食品衛生管理、食品における品種の特定や遺伝子組み換えの有無の判別などを目的とした検査に用いられる。
【図１】
2015119656.tif 000004
【図２】
2015119656.tif 000005
【図３】
2015119656.tif 000006
【図４】
2015119656.tif 000007
【配列表】
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