(57)【要約】【課題】ウイルスの細胞内への侵入（感染）を抑制できる新規の抗ウイルス剤を提供することを目的とする。【解決手段】カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有する抗ウイルス剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記生体適合性ナノ粒子が、リポソーム、エマルション、及びナノスフェアからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記カチオン性物質が、カチオン性脂質、及びカチオン性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
有効成分である前記粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有するウイルス感染予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤、及びウイルス感染予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ウイルス剤は、そのほとんどが細胞内に侵入（感染）後のウイルス増殖等を阻害することによって抗ウイルス効果を発揮する。しかしながら、ウイルスの増殖メカニズムはウイルスの種類によって多様であるので、一般に、ある抗ウイルス剤がその効果を発揮できるウイルスの種類は限定されている。また、ウイルス増殖のように、細胞内でのウイルス活動を標的とすると、薬剤耐性ウイルスが出現してしまう恐れがある。さらに、通常、抗ウイルス剤は、特定の医薬化合物を有効成分とするものであり、その製造には相応のコストがかかる。
【０００３】
ポリエチレンイミン等のカチオン性物質は、ウイルスが細胞内に侵入（感染）する前に不活化するので、ウイルス感染の予防に有用であることが知られている（特許文献１）。したがって、カチオン性物質であれば、薬剤耐性ウイルスの出現を抑えることが期待できる。しかしながら、カチオン性物質は細胞に対して高い毒性を示すので、医薬への応用が妨げられている。
【０００４】
一方、現在、リポソームやナノスフェア等の生体適合性粒子は、種々の有効成分を包含するキャリアとして利用されているが、これらの粒子そのものを有効成分として利用することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−８０５２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ウイルスの細胞内への侵入（感染）を抑制できる新規の抗ウイルス剤を提供することを目的とする。さらには、より抗ウイルススペクトルが広い抗ウイルス剤、細胞毒性がより低い抗ウイルス剤、及びより安価に調製できる抗ウイルス剤を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子が、ウイルスの細胞内への侵入（感染）を抑制できることを見出した。さらに、該粒子は、カチオン性物質単独に比べて細胞毒性が低いことも見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
項１．  カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
項２．  前記生体適合性ナノ粒子が、リポソーム、エマルション、及びナノスフェアからなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の抗ウイルス剤。
項３．  前記カチオン性物質が、カチオン性脂質、及びカチオン性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
項４．  有効成分である前記粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下である、項１〜３のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
項５．  カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有するウイルス感染予防剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ウイルスの細胞内への侵入（感染）を抑制できる新規の抗ウイルス剤を提供することができる。本発明のウイルス剤は、カチオン性物質に比べて細胞毒性がより低減されているので、生体に対してより安全に用いることができる。また、本発明のウイルス剤は有効成分として比較的安価であるカチオン性物質及び生体適合性粒子を用いているので、医療経済学の観点からも優れたものである。さらに、本発明のウイルス剤は、カチオン性物質の電荷がウイルスの細胞膜への結合を阻害することによって、抗ウイルス作用を発揮すると考えられるところ、多様なウイルスに対して作用を発揮することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試験例１で観察された細胞像を示す。
【図２】試験例２で測定された、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を示す。
【図３】試験例３で測定された、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を示す。
【図４】試験例４で測定された、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を示す。
【図５】試験例５で測定された、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を示す。
【図６】試験例６で測定された、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を示す。
【図７】試験例７で測定された細胞生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有する抗ウイルス剤（以下、「本発明の抗ウイルス剤」と表記することもある。）、及びカチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子を有効成分として含有するウイルス感染予防剤（以下、「本発明のウイルス感染予防剤」と表記することもある。）について説明する。
【００１１】
カチオン性物質は、正電荷を有する物質であれば特に限定されない。例えば、カチオン性脂質やカチオン性ポリマーが挙げられる。
【００１２】
カチオン性脂質としては、例えば、ラウリルアミン、ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ステアリルアミン、オレイルアミン等の脂肪族第１級アミン、DOTAP（N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl-sulfate）、DC-Cholesterol、DOBAQ（N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium）、14:0 DAP（1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane）、16:0 DAP（1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane）、18:0 DAP（1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane）、18:0 DDAB（Dimethyldioctadecylammonium (Bromide Salt)）、12:0 EPC (Cl Salt)（
1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、14:0 EPC (Cl Salt)（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、14:1 EPC (Tf Salt)（1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (Tf salt)）、16:0 EPC (Cl Salt)（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、18:0 EPC (Cl Salt)（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、18:1 EPC (Cl Salt)（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、16:0-18:1 EPC (Cl Salt)（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt)）、DOTMA（1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane (chloride salt)）、MVL5（N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide）等が挙げられる
カチオン性ポリマーとしては、ポリアルキレンイミン、キトサン、ポリリジン、ポリアルギニン等が挙げられる
ポリアルキレンイミンとは、例えばエチレンイミン、プロピレンイミン、ブチレンイミン、ジメチルエチレンイミン、ペンチレンイミン、ヘキシレンイミン、ヘプチレンイミン、オクチレンイミンといった炭素数２〜８のアルキレンイミン、特に炭素数２〜４のアルキレンイミンの１種または２種以上を常法により重合して得られるポリマー、ならびにそれらを種々の化合物と反応させて化学的に変性させたポリマーを意味する。これらのポリアルキレンイミンの中でも、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が本発明において特に好ましい
ポリアルキレンイミンは直鎖或いは分枝状のいずれでもよい。またポリアルキレンイミンは様々な分子量をとりうるが、本発明で用いるポリアルキレンイミンの重量平均分子量は３００〜３，０００，０００の範囲内である。特に重量平均分子量が５，０００〜２，０００，０００、中でも５０，０００〜１，５００，０００、とりわけ３００，０００〜１，０００，０００の範囲であるとより好ましい。
【００１３】
カチオン性物質は１種単独でもよいし、２種又は３種以上の組み合わせであってもよい。
【００１４】
生体適合性ナノ粒子は、生体適合性材料から構成されるナノ粒子である限り特に限定されない。例えば、ドラッグデリバリーシステムのキャリアとして利用されているナノ粒子が挙げられる。具体的には、リポソーム、エマルション、ナノスフェア、ナノカプセル、高分子ミセル等が挙げられる
これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮するという観点から、好ましくはリポソーム、エマルション（特にリピッドエマルション）、ナノスフェア等、より好ましくはリポソーム、エマルション等が挙げられる。
【００１５】
リポソーム又はエマルションにおいて、脂質層を構成する成分については、リポソーム又はエマルションの膜を構成する成分（以下、「膜構成成分」と略記することもある。）として一般に使用されるものであれば特に限定されない。膜構成成分として、具体的には、脂質、膜安定化剤、荷電物質、抗酸化剤、膜タンパク質等が挙げられる。
【００１６】
脂質は、リポソーム又はエマルションにおいて必須成分であり、その具体例としては、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が例示される。
【００１７】
リン脂質の具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルパルミトイルホスファチジルグリセロール、ミリストイルステアロイルホスファチジルグリセロール、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリン；カルジオリピン；卵黄レシチン；大豆レシチン；及びこれらの水素添加物等が例示される。
【００１８】
糖脂質の具体例としては、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；ステアリルグルコシド、エステル化ステアリルグリコシド等が例示される。
【００１９】
ステロールの具体例としては、コレステロール、コレステリルヘミスクシネート、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール、フィトステロール、フィトステロール、スチグマステロール、チモステロール、エルゴステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、等が例示される。特に、当該ステロールには、リポソーム膜を安定化させたり、リポソーム膜の流動性を調節したりする作用があるため、リポソーム膜の構成脂質として含まれていることが望ましい。
【００２０】
飽和又は不飽和の脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ドコサン酸等の炭素数１０〜２２の飽和又は不飽和の脂肪酸が例示される。
【００２１】
上記のリポソーム又はエマルションの膜構成脂質は、１種単独で使用してもよいが、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの膜構成脂質中でも、好ましくはリン脂質とステロールの組み合わせであり、更に好ましくはホスファチジルコリン（特に字ステアロイルホスファチジルコリン）とコレステロールの組み合わせが挙げられる。リン脂質とステロールを組み合わせる場合、両者の比率については、特に制限されないが、例えば、リン脂質１００モルに対して、ステロールが１〜１００モル、好ましくは５〜５０モル、更に好ましくは１０〜３０モルとなる比率が挙げられる。
【００２２】
上記の膜構成脂質の含有量としては、特に制限されないが、例えば、膜構成成分の総量に対して、モル比で１〜１００％、好ましくは６０〜９５％、更に好ましくは７０〜９０％が例示される。
【００２３】
抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンE、アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
【００２４】
膜に含まれる上記酸化防止剤の割合については、特に制限されないが、例えば、膜の構成成分の総量に対して、モル比で０〜４０％、好ましくは５〜２０％、更に好ましくは２．５〜１０％が例示される。
【００２５】
また、膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。
【００２６】
膜に含まれる上記膜タンパク質の割合については、特に制限されないが、例えば、膜の構成成分の総量に対して、モル比で０〜２０％、好ましくは２．５〜１０％、更に好ましくは５〜８％が例示される。
【００２７】
ナノスフェアとは生体適合性高分子が凝集してナノサイズの粒子となったものである。ナノスフェアを構成する生体適合性高分子としては、特に限定されない。例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、乳酸・アスパラギン酸共重合体、ポリアクリルシアノアクリレート等が挙げられ、好ましくは乳酸・グリコール酸共重合体が挙げられる。生体適合性高分子は１種単独でもよいし、２種又は３種以上の組み合わせであってもよい。
【００２８】
「カチオン性物質を保持する生体適合性ナノ粒子（以下、「本発明の粒子」と表記することもある。）」とは、生体適合性ナノ粒子の表面及び／又は内部にカチオン性物質を保持するナノ粒子である限り特に限定されない。本発明の粒子は、「ナノ粒子」であるので、カチオン性物質と生体適合性ナノ粒子とが凝集して安定に分散されない複合体は包含されない。
【００２９】
本発明の粒子は、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、生体適合性ナノ粒子がリポソームやエマルションである場合は、カチオン性物質を生体適合性ナノ粒子の内部に保持していることが好ましく、カチオン性物質を生体適合性ナノ粒子の脂質層中に保持していることがより好ましい。また、本発明の粒子は、生体適合性ナノ粒子がナノスフェアである場合は、カチオン性物質を生体適合性ナノ粒子の表面に保持していることが好ましい。
【００３０】
本発明の粒子の平均粒子径は、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、例えば１０００ｎｍ以下であることができ、好ましくは８００ｎｍ以下であることができ、より好ましくは６５０ｎｍ以下であることができ、さらに好ましくは１０〜５００ｎｍであることができ、よりさらに好ましくは５０〜４００ｎｍであることができる
本発明のナノ粒子は、例えば、生体適合性ナノ粒子がリポソームである場合は、脂質膜を構成する荷電物質としてカチオン性物質を用いて、リポソームの公知の製造方法に従って製造することができる。よって、この場合、カチオン性物質として、好ましくは膜構成成分になり得る成分、より好ましくはカチオン性脂質等、さらに好ましくはラウリルアミン、ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ステアリルアミン、オレイルアミン等の脂肪族第１級アミン、DOTAP等、よりさらに好ましくはステアリルアミン、DOTAP等が挙げられる。カチオン性物質の割合については、特に制限されないが、例えば、リポソーム膜の構成成分の総量に対して、モル比で１〜５０％、好ましくは２〜３０％、さらに好ましくは３〜２０％、よりさらに好ましくは４〜１５％が例示される。
【００３１】
リポソームの公知の製造方法としては、例えば薄膜水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法、薄膜水和−超音波法等を採用することができる。また、リポソームの粒子径は、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等の公知の方法により調節することができる。
【００３２】
本発明のナノ粒子は、例えば、生体適合性ナノ粒子がエマルションである場合は、生体適合性ナノ粒子がリポソームである場合と同様の方法に従って製造することができる。
【００３３】
本発明のナノ粒子は、例えば、生体適合性ナノ粒子がナノスフェアである場合は、公知の製造方法に従って製造されたナノスフェアと、カチオン性物質とを溶媒中で混合することによって製造することができる。この場合のカチオン性物質としては、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、好ましくはカチオン性ポリマー等、より好ましくはポリアルキレンイミン等、さらに好ましくはポリエチレンイミン等が挙げられる。
【００３４】
本発明の粒子は、ウイルスの細胞内への侵入（感染）を抑制することができるので、抗ウイルス剤、又はウイルス感染予防剤の有効成分として有用である。
【００３５】
本発明の粒子は、保持されるカチオン性物質の電荷がウイルスの細胞膜への結合を阻害することによって、抗ウイルス作用を発揮すると考えられるところ、多様なウイルスに対して作用を発揮することが期待できる。対象ウイルスとしては、例えばＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ＲＳウイルス等を挙げることができる。
【００３６】
本発明の粒子は、従来の医薬化合物を含まなくとも、抗ウイルス作用やウイルス感染予防作用を発揮することができる。したがって、本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤は、より安価に調製できるという観点から、抗ウイルス作用やウイルス感染予防作用を有する医薬化合物を含まないことが好ましい。
【００３７】
また、本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤は、抗ウイルス作用やウイルス感染予防作用をより向上させるという観点からは、抗ウイルス作用やウイルス感染予防作用を有する医薬化合物をさらに含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤の使用用途及び態様は、抗ウイルス作用を目的とするものであれば特に限定されない。例えば、抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤としてそのまま用いてもよいし、各種組成物（医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物、医療用洗浄用組成物、食器用洗浄用組成物、口腔用組成物、表面抗ウイルス用組成物等）に配合して使用してもよい。
【００３９】
上記のような使用用途及び態様に応じて、本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤は、添加剤を含有する組成物であることができる。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤、防錆剤、金属防食剤、消泡剤、防錆剤、極圧添加剤、金属防食剤、消泡剤、染料等が挙げられる。使用目的に応じて、これらの添加剤のうち、薬学的に許容される成分、香粧品学的に許容される成分を選択して使用することが好ましい。本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤は、使用目的に応じて、慣用の方法により適切な形態（錠剤、丸剤、散剤、液剤、注射剤、懸濁剤、乳剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等）に調製して使用することができる。
【００４０】
本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤中の、本発明の粒子の含有量は、抗ウイルス作用又はウイルス感染予防作用が発揮される限りにおいて特に限定されるものではない。例えば、０．０００１〜５０重量％であることができる。
【００４１】
本発明の抗ウイルス剤又はウイルス感染予防剤を医薬目的で使用する場合、又は医薬組成物に配合して使用する場合、投与方法や投与量等は、含有する本発明の粒子の含有量、剤形、投与対象の年齢・体重などにより適宜選択される。
【実施例】
【００４２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
製造例１：正電荷リポソームの調製
脂質組成がジステアロイルホスファチジルコリン（日油株式会社、COATSOME MC-8080）:コレステロール（Sigma, C8667）：ステアリルアミン（東京化成工業株式会社、O0014） = 7:3:1（モル比）であるリポソームを薄膜水和-超音波法により調製した。具体的には次のとおりである。ナスフラスコ中で、ジステアロイルホスファチジルコリン（59.25mg）、コレステロール（12.43 mg）、及びステアリルアミン（2.89mg）をクロロホルム（25〜30 mL）に溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いて、2時間、40℃の水浴上で溶媒を減圧留去して、ナスフラスコの壁面上に脂質薄膜を得た。一晩減圧乾燥させた後、これを3 mLのPBS(−)で水和することにより、リポソーム溶液を調製した。
【００４４】
溶液中のリポソームの粒子径、リポソームの多分散指数、及びゼータ電位をマルバーン社製のゼータサイザーナノ ZSで測定した）。平均粒子径は106.1 nmであり、多分散指数は0.032であり、ゼータ電位は36.5 mVであった。この結果から明らかなように、得られたリポソームは、サブミクロンサイズの粒子径を有し、溶液中に安定に分散していた。
【００４５】
製造例２：正電荷リポソームの調製
脂質組成がジステアロイルホスファチジルコリン:コレステロール：DOTAP（N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N, N, N-trimethylammonium methyl-sulfate）（Avanti Polar Lipids, Inc., 890890） = 7:3:1（モル比）である以外は、製造例１と同様に調製した。
【００４６】
比較製造例１：中性リポソームの調製
脂質組成がジステアロイルホスファチジルコリン:コレステロール= 7:3（モル比）である以外は、製造例１と同様に調製した。平均粒子径は113.4 nmであり、多分散指数は0.184であり、ゼータ電位は2.51 mVであった。
【００４７】
比較製造例２：負電荷リポソームの調製
脂質組成がジステアロイルホスファチジルコリン:コレステロール：ジセチルホスフェート（Sigma, D2631） = 7:3:1（モル比）である以外は、製造例１と同様に調製した。平均粒子径は95.28nmであり、多分散指数は0.187であり、ゼータ電位は-29.9 mVであった。
【００４８】
比較製造例３：負電荷リポソームとキトサンの混合液の調製
比較製造例２で得られた負電荷リポソーム溶液と、0.1％キトサン（Sigma, 448877）溶液／酢酸緩衝液との混合液を得た。平均粒子径は6815 nmであり、多分散指数は1.000であり、ゼータ電位は45.4 mVであった。この結果から明らかなように、リポソームとカチオン性物質（キトサン）とを混合して得られたものは、粒子が凝集・沈降し、安定に分散することができなかった。
【００４９】
製造例３：正電荷リピッドエマルションの調製
ナスフラスコにジステアロイルホスファチジルコリン（59.25 mg）、ステアリルアミン（1.93 mg）、triester F-810（日本サーファクタント工業社製）（55 mg）を計り取り、25 mL程度のクロロホルムに溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いて、40℃の水浴上で溶媒を減圧留去して、ナスフラスコの壁面上に脂質薄膜を得た。一晩減圧乾燥した後、これを70℃の水浴中でPBSを用いて水和した。さらに超音波処理（Sonifier 250）を10分間施すことにより、平均粒子径約100 nmのリピッドエマルションを調製した。最終脂質（DSPC）濃度は、10mMとした。
【００５０】
製造例４：正電荷リピッドエマルションの調製
ステアリルアミンに替えてDOTAPを用いる以外は製造例３と同様に調製した。
【００５１】
製造例５：カチオン性物質修飾ナノスフェアの調製
水中エマルション溶媒拡散法によりPLGA（乳酸・グリコール酸共重合体）ナノスフェアを調製した。具体的には次のとおりである。100 mgの PLGA（PLGA7520、和光純薬社製）をアセトン 2 ml 中に溶解し、さらにそこへエタノールを 1 ml加え、得られた溶液をポリマー溶液とした。一方で、2% PVA溶液 25 ml と、1% ポリエチレンイミン（Sigma P3143 Poly(ethyleneimine) solution, Mw 750,000）溶液 25 mlとを等量混合し、得られた溶液を外水層とした。400 rpm で撹拌（スリーワンモーター1200G、HEIDON）された状態の外水層 50 ml 中に、ポリマー溶液をパスツールピペットにより滴下した。得られた懸濁液中に残存する過剰な PVAや修飾剤を取り除くために遠心分離（43,400 g、4°C、10 min）した。得られたペレットを精製水で再懸濁した後、再度遠心分離（20,000 rpm、4°C、10 min）を行った。この洗浄操作を2回繰り返した。最終的に得られたペレットを精製水10 mlに再懸濁し、24 時間凍結乾燥（-120°C、EYELA、FD-81型、東京理化器械）した。平均粒子径は293.6 nmであり、多分散指数は0.357であり、ゼータ電位は2.82 mVであった。
【００５２】
比較製造例４：カチオン性物質非修飾ナノスフェアの調製
ポリエチレンイミンを用いない以外は製造例５と同様に調製した。平均粒子径は206.8 nmであり、多分散指数は0.141であり、ゼータ電位は-18.7 mVであった。
【００５３】
試験例１：正電荷リポソーム（製造例１）の抗ウイルス効果
細胞に感染すると該細胞内で赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現させるバキュロウイルス（以下、「RFP発現バキュロウイルス」と略記する。）（CellLightTMNucleus-RFP、インビトロジェン社製）を用いて、正電荷リポソームの抗ウイルス性を調べた。具体的には次のとおりである。定法に従ってA549細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）を培養中の培地に対して、製造例１の正電荷リポソーム溶液、比較製造例１の中性リポソーム溶液、又は比較製造例２の負電荷リポソーム溶液を（DSPC濃度25 mM）、培地（500 μL）におけるリポソーム由来のDSPCの濃度が2 mM又は4 mMになるように添加し、2時間培養した。リポソームを除去し細胞を洗浄後、RFP発現バキュロウイルスを加え、さらに22時間培養した。これとは別に、定法に従ってA549細胞を培養中の培地に対して、製造例１の正電荷リポソーム溶液、比較製造例１の中性リポソーム溶液、又は比較製造例２の負電荷リポソーム溶液を（25 mM））、培地（500 μL）中のDSPC濃度が2 mM又は4 mMになるように添加し、同時にRFP発現バキュロウイルスも加え、24時間培養した。なお、RFP発現バキュロウイルスの添加量は、添付プロトコールに従って定めた。培養後の細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【００５４】
結果を図１に示す。図１中、左側の2列の写真はリポソーム溶液添加から2時間培養後にRFP発現バキュロウイルスを添加した場合の細胞観察像を示し、右側の2列の写真はリポソーム溶液とRFP発現バキュロウイルスを同時に添加した場合の細胞観察像を示す。また、controlは、リポソームを添加せずに、RFP発現バキュロウイルスのみを添加した場合の細胞観察像を示す。
【００５５】
図１より、中性リポソーム（比較製造例１）又は負電荷リポソーム（比較製造例２）を添加してもRFP発現バキュロウイルス由来の蛍光は減少しなかったが、正電荷リポソーム（製造例１）の添加により、RFP発現バキュロウイルス由来の蛍光が顕著に減少した。このことは、細胞内へのウイルスの侵入（ウイルス感染）が正電荷リポソームによって妨げられたことを示す。
【００５６】
試験例２：正電荷リポソーム（製造例２）の抗ウイルス効果
製造例２の正電荷リポソームを用いる以外は試験例１と同様に細胞を操作した。具体的には、リポソーム由来の脂質の濃度が10 mMになるように添加（1 mL）し、2時間培養した後リポソームを除去し細胞を洗浄後、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現させるバキュロウイルス（以下、「GFP発現バキュロウイルス」と略記する。）（CellLightTM Nucleus-GFP、インビトロジェン社製）を加え、さらに22時間培養した。培養後、培養皿中のGFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（GFP発現バキュロウイルス感染量を意味する）を、フローサイトメーター（FACSCaliburTM、Beckton Dickinson）で定量した。
【００５７】
定量結果を図２に示す。図２中、Untreatedはリポソーム溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加しない場合を示し、Virus treatmentはGFP発現バキュロウイルスのみを添加した場合を示し、DOTAP liposomeはリポソーム溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加した場合を示す。
【００５８】
図２より、製造例１とはカチオン性物質が異なる正電荷リポソーム（製造例２）を用いても、細胞内へのウイルスの侵入（ウイルス感染）を抑制できることが示された。このことから、カチオン性物質の種類によらずに、抗ウイルス効果が発揮されることが示唆された。
【００５９】
試験例３：正電荷リポソームの濃度依存的な抗ウイルス効果の発現
製造例１の正電荷リポソームを用いて、試験例２と同様に、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を定量した。
【００６０】
結果を図３に示す。横軸は、培地中のリポソーム由来の脂質の濃度を示す。
【００６１】
図３より、培地における正電荷リポソーム濃度依存的に、GFP発現バキュロウイルスの細胞内への侵入（ウイルス感染）が抑制されることが示された。
【００６２】
試験例４：既存の抗ウイルス剤との比較
ポリエチレンイミンは抗ウイルス効果を発揮することが知られている。そこで、正電荷リポソーム（製造例１）とポリエチレンイミンとで、抗ウイルス効果を比較した。抗ウイルス効果は試験例２と同様に測定した。なお、事前の実験により、ポリエチレンイミンの培地中の濃度が500 nMの場合は細胞毒性が発現せず、約1μM以上の場合は細胞毒性が発現するという結果が得られたので、培地中のポリエチレンイミンの濃度としては500 nMを採用した。
【００６３】
結果を図４に示す。図４中、Non virusはリポソーム溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加しない場合を示し、Virus treatmentはGFP発現バキュロウイルスのみを添加した場合を示し、SA-liposomeはリポソーム溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加した場合を示し、PEI solutionはポリエチレンイミンを及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加した場合を示す。
【００６４】
図４より、正電荷リポソームの抗ウイルス効果は、ポリエチレンイミンを500 nMで添加した場合よりも高いことが示された。
【００６５】
試験例５：正電荷リピッドエマルションの抗ウイルス効果
製造例３又は４の正電荷リピッドエマルションを用いて、試験例２と同様にGFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を定量した。
【００６６】
製造例３のリピッドエマルションを用いた場合の結果を図５に示す。図５中、Untreatedはリピッドエマルション溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加しない場合を示し、Virus treatmentはGFP発現バキュロウイルスのみを添加した場合を示し、SA-lipid emulsionはリピッドエマルション溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加した場合を示す。
【００６７】
図５より、正電荷リピッドエマルション（製造例３）の添加により、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光が顕著に減少した。このことは、細胞内へのウイルスの侵入（ウイルス感染）が正電荷リピッドエマルションによって妨げられたことを示す。また、カチオン性物質が異なる、製造例４の正電荷リピッドエマルションを用いても、同様の結果が得られた。このことより、カチオン性物質の種類によらずに、抗ウイルス効果が発揮されることが示唆された。
【００６８】
試験例６：カチオン性物質修飾ナノスフェアの抗ウイルス効果
製造例５又は比較製造例４のナノスフェアを用いて、試験例２と同様に、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光量（＝GFP発現バキュロウイルス感染量）を定量した。培地中のナノスフェアの濃度は1 mg/mLとした。
【００６９】
結果を図６に示す。図６中、Untreatedはナノスフェア溶液及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加しない場合を示し、Virus treatmentはGFP発現バキュロウイルスのみを添加した場合を示し、PLGA NPsはナノスフェア溶液（比較製造例４）及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加した場合、PEI-PLGA NPsはナノスフェア溶液（製造例５）及びGFP発現バキュロウイルスを両方とも添加した場合を示す。
【００７０】
図６より、カチオン性物質修飾ナノスフェア（製造例５）の添加により、GFP発現バキュロウイルス由来の蛍光が顕著に減少した。このことは、細胞内へのウイルスの侵入（ウイルス感染）がカチオン性物質修飾ナノスフェアによって妨げられたことを示す。
【００７１】
試験例７：細胞毒性の評価
正電荷リポソーム（製造例１）、正電荷リピッドエマルション（製造例３）、及びこれらに正電荷物質として用いているステアリルアミンについて、細胞毒性を評価した。具体的には次のとおりである。定法に従って培養されたA549細胞に対して、正電荷リポソーム（製造例１）、正電荷リピッドエマルション（製造例３）、又はステアリルアミンを添加し、2時間培養した。PBSで細胞を洗浄後さらに20時間培養した。培養後の生存細胞数を、CellTiter 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（プロメガ）を用いたMTS法で測定した。
【００７２】
結果を図７に示す。縦軸は、正電荷リポソーム（製造例１）、正電荷リピッドエマルション（製造例３）、及びステアリルアミンのいずれも添加しない場合の細胞数を100％とした場合の相対値（細胞生存率）を示す。横軸は、培地中のステアリルアミン濃度を示す。
【００７３】
図７より、正電荷リポソーム及び正電荷リピッドエマルションは比較的高濃度であっても細胞毒性が無いことが示された。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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