(57)【要約】【課題】新たなネザートン症候群予防及び／又は治療剤の提供。【解決手段】ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするネザートン症候群予防及び／又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするネザートン症候群の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするKLK遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
KLKがKLK7である請求項２に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
KLKがKLK14である請求項２に記載の遺伝子発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネザートン症候群の予防及び／又は治療剤並びにKLK遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮角化細胞同士をつなげる構造であるデスモソームは、顆粒層の上層で形態と成分を変化させてコルネオデスモソームとなる。表皮細胞は角層の最表層から順次落屑することで皮膚が入れ替わりバリア機能を保っているが、これはコルネオデスモソームが秩序だって細胞外部分で分解されることによる。そしてコルネオデスモソームの分解に関与する内因性プロテアーゼとして、KLK（Kallikrein-related Peptidase）が知られている。
【０００３】
KLKファミリーには、15種類のトリプシン様又はキモトリプシン様セリンプロテアーゼが属している。皮膚ではKLK5とKLK7を含む少なくとも8種類のKLKが発現しており、顆粒層と角層間で細胞外に分泌されている。これらの中で、活性化されたKLK5、KLK7、KLK14がコルネオデスモソームの分解に関与することが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
KLKは通常そのプロテアーゼ活性が抑制されていて、過剰な皮膚の落屑は起こらないよう調節されている。この調節を担うのが、角層解離酵素を阻害するLEKTI（Lympho epithelial Kazal-type related inhibitor）である。LEKTIはその配列内に15個のセリンプロテアーゼ阻害ドメインを有しており、この阻害ドメインがKLK5、KLK7、KLK14と強固に結合し、それらのプロテアーゼ活性を適度に抑制している。
【０００５】
ネザートン症候群（Netherton Syndrome）は、上記LEKTIをコードする遺伝子SPINK5（Serin specific inhibitor Kazal type 5）に変異があり、LEKTIの産生が不十分であるために発症する常染色体劣性遺伝性の疾患である（非特許文献２）。この疾患では常時KLKが活性化した状態で角層解離にブレーキが効かず、角質層菲薄化と角質バリア障害を引き起こしている。このため、魚鱗癬、毛髪異常、アトピー性皮膚炎を思わせる徴候を示す。また、ネザートン症候群では表皮バリア機能障害が顕著であるため、経皮水分蒸散の異常亢進やアレルギー性過敏性腸炎、反復する感染症の合併も多いことが特徴である。
【０００６】
ネザートン症候群の治療としては、皮膚乾燥を予防するために保湿剤の全身塗布を励行し、皮膚の二次感染に対しては外用抗菌剤を適宜使用することが行われている。また、掻痒が激しい部位にはマイルドクラスのステロイド外用を塗布することが行われているが、いずれもネザートン症候群の症状を改善するための対症療法となっている。ネザートン症候群の原因がLEKTIの産生不足とそれに基づくKLK酵素群の恒常的な活性化であることを考慮すれば、様々な分子生物学的手法で正常のSPINK5遺伝子を導入する、LEKTIを代替できるような酵素阻害物質を投与する、恒常的に活性化しているKLK酵素群を阻害するなどの手法が、将来的な治療法と考えられる。このような中、皮膚カリクレイン酵素群を阻害することによりネザートン症候群を治療するという試みがいくつか報告されている。たとえば、KLK7阻害活性を持つ環状デプシペプチド（特許文献１）、KLK5とKLK7の阻害活性を持つ環状ペプチド化合物（特許文献２）、KLK5とKLK7の阻害活性を持つクマリン誘導体（特許文献３）などがネザートン症候群の治療に利用できるということが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2009/024527
【特許文献２】WO2012/083385
【特許文献３】WO2013/010963
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yamamoto A, et al; 臨床皮膚科, 66(5), 59-62 (2012)
【非特許文献２】Chavanas S. et al, Nat. Genet., 25, 141-142 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ネザートン症候群の予防及び／又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Nrf2ノックアウトマウスを用いたタバコ誘発慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease : COPD）モデルに対するピタバスタチンの効果を検討する中で、マウスにタバコ煙暴露を行う過程でKLK7、KLK14といったKLK酵素群の遺伝子の発現上昇が見られること、また、該発現上昇が脂質異常症治療薬として知られているピタバスタチンの前投与により、非タバコ煙暴露マウスと同程度まで抑制されることを見出した。KLK酵素群の抑制はネザートン症候群の予防及び／又は治療に有効であると考えられることから、上記知見に基づいて本発明の完成に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするネザートン症候群の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
また、本発明は、ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするKLKの遺伝子発現抑制剤を提供するものである。より詳細には、本発明は、ピタバスタチン又はその塩を有効成分とするKLK7又はKLK14の遺伝子発現抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の医薬を用いれば、KLK酵素群の遺伝子発現が顕著に抑制され、ネザートン症候群の予防及び／又は治療効果が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「カリクレイン」という用語は、ペプチダーゼ（タンパク質中のペプチド結合を切断する酵素）、セリンプロテアーゼファミリーのサブファミリーを指す。これまでに、15個の既知の組織カリクレイン（KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14およびKLK15）および単一の血漿カリクレイン（KLKb1）が知られている。KLK5は、SCTE（stratum corneum trypic enzyme）とも呼ばれる分子量33kDaの分泌型糖タンパク質で、セリンプロテアーゼである組織カリクレインファミリーに属しており、不活性型として分泌され、トリプシン様活性による切断を受けて活性化する。KLK7は、SCCE（stratum corneum chymotrypic enzyme）とも呼ばれ、キモトリプシン様活性を提示する組織カリクレインファミリーのセリンプロテアーゼである。KLK4〜7は、限定発現されるサブグループを形成しており、構造的にも機能的にも類似している。KLK14は、限られた組織発現パターンを有しており、中枢神経系（特に、脳、小脳および脊髄）ならびに内分泌腺関連組織（例えば、子宮、卵巣、胸腺および精巣など）において見出されている。KLK5、KLK7およびKLK14がコルネオデスモソームの成分を分解することで角層解離に関与すること以外にも、多くのカリクレインが内分泌腺関連の悪性腫瘍において発現することが見出されている（Diamandis EP, et al;Mol. Diagn., 2001, 1, 182〜190）。
したがって、本発明のKLKの遺伝子発現抑制剤は、KLKの過剰発現や過剰活性が関与する各種の疾患の予防や治療に効果があると考えられる。特に、KLK7又はKLK14の遺伝子発現抑制剤は、コルネオデスモソームの分解に関与しており、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚疾患などの予防や治療にも効果があると考えられる。
【００１４】
Nrf2ノックアウトマウスは、異物代謝や酸化ストレス応答において重要な転写因子であるNrf2（NF-E2 related factor 2）が欠損したモデル動物である。Nrf2の活性化は抗酸化蛋白質の発現を亢進させ、酸化ストレスに対する生体防御で中心的な役割を担っていることから、Nrf2ノックアウトマウスでは酸化ストレスが亢進している。Nrf2ノックアウトマウスでは肺気腫の自然発症は認めないが、喫煙暴露による肺気腫発症の感受性が顕著に亢進する。
【００１５】
本発明のネザートン症候群予防及び／又は治療剤及びKLK酵素の遺伝子発現抑制剤の有効成分は、ピタバスタチン又はその塩である。ピタバスタチン又はその塩は、例えば米国特許第5856336号、日本国特許第2569746号等に記載されている、(3R,5S,6E)-7-[2-シクロプロピル-4-(4-フルオロフェニル)-3-キノリル]-3,5-ジヒドロキシ-6-ヘプテン酸又はその塩であり、強力なHMG-CoA還元酵素阻害作用を有し、コレステロール低下剤として知られている。しかし、当該ピタバスタチン又はその塩が、ネザートン症候群及びカリクレイン酵素に対してどのような作用を示すかについては全く知られていない。ピタバスタチンの塩としては、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が挙げられるが、このうちカルシウム塩が特に好ましい。
【００１６】
本発明におけるピタバスタチン又はその塩の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与及び静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられるが、経口投与又は経皮吸収剤が好ましい。またこのような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、又は他の１種以上の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌昧剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１７】
これらの投与形態のうち、経口投与及び経皮吸収剤が好ましい。経口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮してpHを調整（特開平2-6406号、日本国特許第2774037号、WO97/23200号等）するのが好ましい。経皮吸収剤の形態としては、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤等が好ましい。
【００１８】
これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別及び症状によって異なるが、通常成人の場合、ピタバスタチンとして、一日0.01〜100mg、さらに0.1〜50mg、特に1〜30mgを、１回又は数回に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  
慢性閉塞性肺疾患（COPD）モデルマウスに対するピタバスタチンの効果
１．COPDモデルの作成、薬物投与
COPDモデルは文献（Allergology International. 2013;62:309-322）を参考に作成し、以下の手順により薬物の効果を検討した。すなわち、理研バイオリソースセンター（茨城）より入手したNrf2ノックアウトマウス(-/-)に、セボフルラン麻酔下、ピタバスタチン(20μg/100μL)の１％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液又は溶媒（１％ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液）を100μL点鼻投与し、投与1時間後に以下の条件にてタバコ煙暴露を５時間行った。この操作（投与−暴露）を週５回、４週間実施し、４週間投与終了後、肺組織の遺伝子発現を検討した。なお、溶媒投与、空気暴露のマウスを対照とした。
【００２１】
タバコ煙暴露条件
使用機材：SG-200（柴田科学）、喫煙スピード：5puff/min、喫煙時間：300min、喫煙量：35.00ｍL/puff、希釈流量：32252.50mL/min、希釈濃度率：3.00％、希釈係数：0.95、クリーンエア換気流量：20.00L/min
【００２２】
２．DNAマイクロアレー実験
DNAマイクロアレー実験は、公知の方法、例えばAllergology International, 60, 291-298(2011)等に記載の方法に従って実施した。摘出した肺組織からのtotal RNA抽出は、miRNA Isolation Kit (アプライドバイオシステムズ社)を用いて、製品手順書に従って実施した。
total RNAから、ラベル化cRNAの合成はQuick Amp Linear Amplification Kit (アジレント社)を使用した。total RNA（500ng/8.3μL）に1.2μLのT7 promoter Primerと適当量のSpike-In mixを加え、総量を1.1μLになるようにNuclease-free水で調整し、65℃で10分間インキュベーション後、5分間急冷した。さらにこの溶液に5xFirst Standard buffer 4μL、0.1M DTT 2μL、10mM dNTP 1μL、MMLV-RT 1μL, RNaseOUT 0.5μLを加え40℃で２時間インキュベーションした。次いで65℃で15分インキュベーションし、MMLV-RTを失活させ、氷上で5分間冷却した。Cy3標識はNuclease-free水 15.3μL、4xTranscription buffer 20μL、0.1M DTT 6μL、NTP mix 8.0μL、50%PEG 6.46μL、RNaseOUT 0.5μL、inorganic pyrophoshatase 0.6μL、T7 RNA polymerase 0.8μL、Cyanine3-CTP 2.4μLを加え、40℃で2時間インキュベーションして行った。ラベル化cRNA はRNeasy column（キアジェン社）で精製した。各cRNAサンプルの純度は、NanoDrop ND-1000 spectrophotometer measurement (ナノドロップテクノロジー社)を用いて収率と特異性を測定することで検証した。DNAマイクロアレー（Whole human Genome 4 x44ｋ、アジレント社）へのハイブリダイゼーションはin situ Hybridaization kit plus（アジレント社）を用い、65℃で17時間行った。ハイブリダイゼーション終了後、Gene Expression Wash Pack（アジレント社）でDNAマイクロアレーの洗浄を行なった。データの読み込みはDNA Microarray Scanner G2505C（アジレント社）で行い、解析はFeature Extraction Software 10.5.1.1（アジレント社）で行った。
【００２３】
DNAマイクロアレーで確認されたKLK関連遺伝子の変動結果を表１に示す。なお、表中の数字は、PBS投与でタバコ煙暴露を行っていないマウス（Nrf2ノックアウトマウス）の各遺伝子発現量を１としたときの相対値で示した。表１から明らかなように、Krf2ノックアウトマウスにタバコ煙を吸入させたところ、KLK14では21倍、KLK7においては実に184倍の遺伝子発現上昇が確認された。一方、同じモデルにピタバスタチンを前投与することによりKLK7およびKLK14遺伝子の発現上昇がタバコ煙暴露を行っていないマウスと同レベルまで低下し、顕著な抑制効果を示した。従って、ピタバスタチン又はその塩は、ネザートン症候群の予防及び／又は治療剤として有用である。
【００２４】
【表１】
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