(57)【要約】【課題】一酸化炭素等の特定のＣ１化合物を炭素源として、環式モノテルペンを高純度かつ大量に取得するための一連の技術を提供する。【解決手段】環式モノテルペンを生産可能な組換え細胞であって、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞、又はメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、環式モノテルペン合成酵素をコードする核酸とが導入されてなるものであり、これらの核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から環式モノテルペンを生産可能である組換え細胞が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環式モノテルペンを生産可能な組換え細胞であって、
非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞、又はメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、環式モノテルペン合成酵素をコードする核酸とが導入されてなるものであり、
これらの核酸が前記宿主細胞内で発現し、
一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から環式モノテルペンを生産可能である組換え細胞。
【請求項２】
一酸化炭素脱水素酵素を有するものである請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
前記宿主細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞は、Clostridium ljungdahlii又はClostridium autoethanogenumである請求項３に記載の組換え細胞。
【請求項５】
一酸化炭素を主成分とするガス、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガスから環式モノテルペンを生産可能である請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項６】
ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである請求項１〜５のいずれかに記載の組換え細胞。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項７】
ネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードするものである請求項１〜６のいずれかに記載の組換え細胞。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項８】
前記環式モノテルペン合成酵素はβ−フェランドレン合成酵素であり、環式モノテルペンとしてβ−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンを生産可能である請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項９】
少なくともネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸が導入されたものである請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードするものである請求項８又は９に記載の組換え細胞。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸がさらに導入され、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有する請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１２】
前記メバロン酸経路は、酵母、原核生物、又は放線菌のメバロン酸経路である請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記非メバロン酸経路は、宿主細胞以外の非メバロン酸経路である請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
宿主細胞に導入された核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている請求項１〜１４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１６】
宿主細胞に導入された核酸は、プラスミドに組み込まれている請求項１〜１４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１７】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上の環式モノテルペンを生産可能である請求項１〜１６のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１８】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産可能である請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項１９】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり６ｍｇ以上の４−カレンを生産可能である請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項２０】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり２ｍｇ以上のリモネンを生産可能である請求項１７に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の組換え細胞を、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に環式モノテルペンを生産させる環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の組換え細胞に、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から環式モノテルペンを生産させる環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２３】
一酸化炭素を主成分とするガス、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する請求項２１又は２２に記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２４】
さらに、ギ酸又はメタノールを前記組換え細胞に提供する請求項２３に記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２５】
組換え細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とするものである請求項２１〜２４のいずれかに環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２６】
前記環式モノテルペン合成酵素はβ−フェランドレン合成酵素であり、環式モノテルペンとしてβ−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンを生産させる請求項２１〜２５のいずれかに環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２７】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上の環式モノテルペンを生産させる請求項２１〜２６のいずれかに記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２８】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産させる請求項２７に記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項２９】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり６ｍｇ以上の４−カレンを生産させる請求項２７に記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項３０】
組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり２ｍｇ以上のリモネンを生産させる請求項２７に記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項３１】
組換え細胞の細胞外に放出された環式モノテルペンを回収する請求項２１〜３０のいずれかに記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項３２】
組換え細胞の培養系の気相から環式モノテルペンを回収する請求項２１〜３１のいずれかに記載の環式モノテルペンの生産方法。
【請求項３３】
二酸化炭素に代えて、重炭酸塩を用いる請求項２１〜３２のいずれかに記載の環式モノテルペンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素等の特定のＣ１化合物から環式モノテルペンを生産可能な組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いる環式モノテルペンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノテルペン（Monoterpene）は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とが縮合したゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を生合成前駆体とする、炭素１０個を持つイソプレン則に従う化合物の総称である。モノテルペンは、現在９００種類以上のものが知られている。
【０００３】
環式モノテルペンはバラや柑橘類のような芳香を持ち、香水などにも多用されている。例えば、リモネン（Limonene）はレモンなど柑橘類に含まれる香気成分であり、溶剤や接着剤原料などとしても利用されている。また、メントールは爽やかな芳香を持ち、菓子や医薬品に清涼剤として用いられている。一方、樹脂産業では、β−ピネン（β-Pinene）、α−ピネン（α-Pinene）、リモネン、α−フェランドレン（α-Phellandrene）等が、接着剤や透明樹脂等のモノマー原料として検討されている（非特許文献１）。
【０００４】
合成ガス（Synthesis gas, Syngas）は、廃棄物、天然ガス、及び石炭から高温・高圧下で金属触媒の作用によって効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。合成ガスを起点とする金属触媒によるＣ１ケミストリーの分野では、メタノール、ギ酸、ホルムアルデヒド等の液状の化学品を安価かつ大量に生産するプロセスが開発されている。
【０００５】
そして、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素は、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスに含まれており、ほぼ永久的に利用可能である。しかしながら、合成ガスをはじめとするＣ１炭素源とした、微生物による化学品生産の例は、極めて少ないのが現状である。現在のところ、開発が進んでいるのは、合成ガスからのエタノール、２，３−ブタンジオール等の生産のみである。特に、組換え体による合成ガス資化性物の利用に関する報告は少ない。特許文献１には、大腸菌の組換え体によるイソプロパノールの生産技術が開示されている。この技術では、大腸菌に複数のＣＯ代謝酵素遺伝子を導入して合成ガス資化能を付与し、合成ガスからイソプロパノールを生産している。しかし、この技術は環式モノテルペンを生産するものではない。また、本来合成ガス資化性微生物が保有するＣＯ代謝酵素遺伝子群を大腸菌で効率良く機能的に発現させることは難しく、さらに大腸菌のＣＯ耐性も低いこと等から、ＣＯ代謝を有する組換え大腸菌を用いる系は、目的物質の高い生産性が期待できない。
【０００６】
環式モノテルペンの一種であるβ−フェランドレン（β-Phellandrene）は、新たなポリマー材料としての用途が期待されている。β−フェランドレンは、α−フェランドレンに比べてより高分子量のポリマーを得る可能性がある。しかし、合成化学的手法によってβ−フェランドレンを得る場合には、その異性体であるα−フェランドレンの生成が避けられず、またこれらの異性体の分離は極めて困難である（非特許文献２）。そのため、高純度のβ−フェランドレンを得ることは難しく、このことがβ−フェランドレンのポリマー物性等を調べることを困難にしている。
【０００７】
一方、β−フェランドレンの生合成経路としては、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素の作用によって、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）が生合成される。続いて、β−フェランドレン合成酵素の作用により、ＧＰＰ又はＮＰＰからβ−フェランドレンが生合成される。そして、トマトとラベンダーにおいて、β−フェランドレン合成酵素が見出されている（非特許文献３，４）。
【０００８】
特許文献２には、環式テルペンシンターゼ（環式テルペン合成酵素）をコードする核酸が導入されたＣ１代謝宿主細胞の形質転換体を用いて、モノテルペンを製造する方法について記載されている。その実施例として、メチロモナス属細菌の形質転換体を用いてリモネンを製造した実験例が記載されている。β−フェランドレン合成酵素に関する言及もあるが、β−フェランドレン合成酵素とその遺伝子の具体例や取得方法、さらにβ−フェランドレンを生産できる形質転換体の具体的構成や構築方法については示されていない。また、この技術は、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素又は、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスを炭素源として用いるものではない。
【０００９】
特許文献３にはＣ１代謝宿主細胞の形質転換体を用いたテルペンの生産方法に関して記載されており、セスキテルペンの一種のファルネセン生産の実施例がある。しかし、Ｃ１代謝宿主細胞を用いた環式モノテルペンの実用的な生産方法は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２０１１−５０９６９１号公報
【特許文献２】特表２００５−５００８０５号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１８０５８４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Satou K., et al., Green Chemistry 2006, 8, 878-882
【非特許文献２】Mori K., Tetrahedron： Asymmetry 2006, 17, 2133-2142
【非特許文献３】Demissie, Z. A., et al.,, Planta. 2011, 233, 685-96.
【非特許文献４】Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記現状に鑑み、本発明は、合成ガスなどのＣ１炭素源から、環式モノテルペンを大量に取得するための一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、環式モノテルペンを生産可能な組換え細胞であって、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞、又はメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、環式モノテルペン合成酵素をコードする核酸とが導入されてなるものであり、これらの核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から環式モノテルペンを生産可能である組換え細胞である。
【００１４】
本発明は環式モノテルペンを生産可能な組換え細胞に係るものである。本発明の組換え細胞は、「非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）合成能」又は「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有する細胞を宿主細胞とする。そして、当該宿主細胞に「ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸」と、「環式モノテルペン合成酵素をコードする核酸」とが導入されてなるもので、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する。
すなわち、本発明の組換え細胞では、ＧＰＰ合成酵素及び／又はＮＰＰ合成酵素の発現能と環式モノテルペン合成酵素の発現能とが、宿主細胞に対して新たに付加又は増強されている。
本発明の組換え細胞によれば、前記したＣ１化合物からイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が合成される。そして、細胞内で発現されたＧＰＰ合成酵素の作用によってＩＰＰからＧＰＰが合成され、及び／又は、細胞内で発現されたＮＰＰ合成酵素の作用によってＩＰＰからＮＰＰが合成される。さらに、細胞内で発現された環式モノテルペン合成酵素の作用によって、ＧＰＰ及び／又はＮＰＰから環式モノテルペンが合成される。その結果、本発明の組換え細胞を培養することにより、環式モノテルペンを大量に生産することができる。
【００１５】
環式モノテルペンとは、六員環等の環状構造を含むモノテルペンを指し、リモネン、α−ピネン、β−ピネン、α−フェランドレン、β−フェランドレン、メントール、チモール、カルバクロール、カレン、サビネン、カンフェン、ツジェン、カンフル、ボルネオール、シネオール等を含む。
【００１６】
イソプレノイドの生合成経路はメバロン酸経路（ＭＶＡ経路ともいう）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路ともいう）に大別される。非メバロン酸経路は、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸から、最終的にイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）又はジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する経路である。本発明の一態様に係る宿主細胞は、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有するものである。
また本発明の別の態様に係る宿主細胞である「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有する細胞としては、図１に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）及びメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性微生物が例示される。
【００１７】
好ましくは、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。
【００１８】
一酸化炭素脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．２．９９．２／１．２．７．４）（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、CO dehydrogenase、ＣＯＤＨ）は、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを生成させる作用、及びその逆反応である、二酸化炭素とプロトンから一酸化炭素と水を生成させる作用、を有する。一酸化炭素脱水素酵素は、アセチルＣｏＡ経路（図１）で作用する酵素の１つである。
【００１９】
好ましくは、前記宿主細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である請求項１又は２に記載の組換え細胞である。
【００２０】
好ましくは、前記宿主細胞は、Clostridium ljungdahlii又はClostridium autoethanogenumである。
【００２１】
好ましくは、一酸化炭素を主成分とするガス、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガスから環式モノテルペンを生産可能である。
【００２２】
好ましくは、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００２３】
好ましくは、ネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードするものである。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質
【００２４】
好ましくは、イソペンテニル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。
【００２５】
かかる構成により、ＧＰＰ合成酵素やＮＰＰ合成酵素の基質となるＩＰＰが効率的に供給される。
【００２６】
好ましくは、前記環式モノテルペン合成酵素はβ−フェランドレン合成酵素であり、環式モノテルペンとしてβ−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンを生産可能である。
【００２７】
この好ましい様相によれば、細胞内で発現されたβ−フェランドレン合成酵素の作用によって、ＧＰＰ及び／又はＮＰＰからβ−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンが合成される。その結果、本発明の組換え細胞を培養することにより、β−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンを大量に生産することができる。
【００２８】
好ましくは、少なくともネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸が導入されたものである。
【００２９】
好ましくは、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードするものである。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００３０】
好ましくは、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸がさらに導入され、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有する。
【００３１】
かかる構成により、ＧＰＰ合成酵素やＮＰＰ合成酵素の基質となるＩＰＰが、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方から合成され、ＩＰＰの供給が効率的に行われる。その結果、本発明の組換え細胞は、環式モノテルペンの生産能がさらに高いものとなる。
【００３２】
好ましくは、前記メバロン酸経路は、酵母、原核生物、又は放線菌のメバロン酸経路である。
【００３３】
好ましくは、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。
【００３４】
かかる構成により、非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能が増強される。その結果、本発明の組換え細胞は、環式モノテルペンの生産能がさらに高いものとなる。
【００３５】
好ましくは、前記非メバロン酸経路は、宿主細胞以外の非メバロン酸経路である。
【００３６】
好ましくは、宿主細胞に導入された核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている。
【００３７】
好ましくは、宿主細胞に導入された核酸は、プラスミドに組み込まれている。
【００３８】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上の環式モノテルペンを生産可能である。
【００３９】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産可能である。
【００４０】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり６ｍｇ以上の４−カレンを生産可能である。
【００４１】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり２ｍｇ以上のリモネンを生産可能である。
【００４２】
本発明の他の様相は、上記した組換え細胞を、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に環式モノテルペンを生産させる環式モノテルペンの生産方法である。
【００４３】
本発明は、環式モノテルペンの生産方法に係るものである。本発明では、上記した組換え細胞を、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として培養することにより、当該組換え細胞に環式モノテルペンを生産させる。本発明によれば、例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスから環式モノテルペンを生産することができる。
【００４４】
本発明の他の様相は、上記した組換え細胞に、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から環式モノテルペンを生産させる環式モノテルペンの生産方法である。
【００４５】
本発明では、上記した組換え細胞に、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物から環式モノテルペンを生産させる。本発明によっても、例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスから環式モノテルペンを生産することができる。
【００４６】
好ましくは、一酸化炭素を主成分とするガス、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する。
【００４７】
「組換え細胞にガスを提供する」とは、炭素源等としてガスを組換え細胞に与える、あるいは、組換え細胞にガスを接触させる、という意味である。
【００４８】
好ましくは、さらに、ギ酸又はメタノールを前記組換え細胞に提供する。
【００４９】
「組換え細胞にガスとメタノールを提供する」とは、炭素源等としてガスとメタノールを組換え細胞に与える、あるいは、組換え細胞にガスとメタノールを接触させる、という意味である。ギ酸についても同様である。
【００５０】
好ましくは、組換え細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とするものである。
【００５１】
好ましくは、前記環式モノテルペン合成酵素はβ−フェランドレン合成酵素であり、環式モノテルペンとしてβ−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンを生産させる。
【００５２】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上の環式モノテルペンを生産させる。
【００５３】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ−フェランドレンを生産させる。
【００５４】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり６ｍｇ以上の４−カレンを生産させる。
【００５５】
好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり２ｍｇ以上のリモネンを生産させる。
【００５６】
好ましくは、組換え細胞の細胞外に放出された環式モノテルペンを回収する。
【００５７】
好ましくは、組換え細胞の培養系の気相から環式モノテルペンを回収する。
【００５８】
二酸化炭素に代えて、重炭酸塩を用いてもよい。
【発明の効果】
【００５９】
本発明によれば、環式モノテルペンを高純度かつ大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００６２】
本発明の組換え細胞は、環式モノテルペンを生産可能なものである。本発明の組換え細胞は、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞、又はメチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、環式モノテルペン合成酵素をコードする核酸とが導入されてなり、これらの核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から環式モノテルペンを生産可能なものである。
【００６３】
まず、宿主細胞について説明する。本発明の組換え細胞における宿主細胞は、「非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能を有する宿主細胞」又は「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞」である。
【００６４】
上述したように、一般に、ＩＰＰの合成経路はメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の２つに大別される。メバロン酸経路は真核生物が備えているものであり、アセチルＣｏＡを出発物質としている。メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。
【００６５】
一方、非メバロン酸経路は原核生物や葉緑体・色素体が備えているものであり、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸を出発物質としている。非メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。
そして本発明の一態様では、「非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能を有する宿主細胞」を用いる。
【００６６】
一方、「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有する宿主細胞については、メチルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨ3］−ＴＨＦ）、一酸化炭素（ＣＯ）、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、例えば、図１に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）に含まれている。
【００６７】
図１に示すように、アセチルＣｏＡ経路では、二酸化炭素（ＣＯ2）が２つの経路で別々に、一酸化炭素（ＣＯ）とメチルカチオン源に還元される。そして、これら２つの炭素源を基質としてＣｏＡ（図１ではＨＳＣｏＡと表記）のチオール基がアセチル化され、１分子のアセチルＣｏＡが合成される。アセチルＣｏＡ経路では、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（Formate dehydrogenase、ＦＤＨ）、等の酵素が作用している。なお、ホルミルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨＯ］−ＴＨＦ）から［ＣＨ3］−ＴＨＦに至る経路は、メチルブランチ（Methyl branch）と呼ばれる。
一方、メタノール経路は、メタノールをホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）、さらにギ酸（ＨＣＯＯＨ）に変換する経路と、メタノールから［ＣＨ3］−ＴＨＦを誘導する経路を含んでいる。
すなわち、メチルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨ3］−ＴＨＦ）、一酸化炭素（ＣＯ）、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路とで共通している。
【００６８】
好ましい実施形態では、組換え細胞が一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）を有する。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する細胞が好ましい。アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有する嫌気性微生物は、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）を有している。
【００６９】
当該嫌気性微生物として、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenum、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ) (Pierce EG. Et al., Environ. Microbiol. 2008, 10, 2550-2573)、Acetobacterium woodii（Dilling S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73(11), 3630-3636）等のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌が代表例として挙げられる。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明における宿主細胞として好適である。
上記５種のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
【００７０】
Clostridium属細菌、Moorella属細菌、及びAcetobacterium属細菌以外では、Carboxydocella sporoducens sp. Nov. (Slepova TV. et al., Inter. J. Sys. Evol. Microbiol. 2006, 56, 797-800)、Rhodopseudomonas gelatinosa(Uffen RL, J. Bacteriol. 1983, 155(3), 956-965)、Eubacterium limosum (Roh H. et al., J. Bacteriol. 2011, 193(1), 307-308)，Butyribacterium methylotrophicum (Lynd, LH. Et al., J. Bacteriol. 1983, 153(3), 1415-1423)等の細菌を宿主細胞として用いることができる。
【００７１】
なお、上記した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Oligotropha carboxidovorans (Schubel, U. et al., J. Bacteriol., 1995, 2197-2203)、Bradyrhizobium japonicum (Lorite MJ. Et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(5), 1871-1876)を始め、その他のバクテリア種には酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69 (12), 7257-7265）。好気性水素酸化細菌であるRalsotonia属菌にも酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する (NCBI Gene ID: 4249199, 8019399)。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明で用いる宿主細胞を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、もしくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気、微好気、もしくは好気的条件で、宿主細胞として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
【００７２】
次に、ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、及び環式モノテルペン合成酵素、並びにこれらの酵素をコードする核酸について説明する。
【００７３】
ＧＰＰ合成酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（遺伝子）についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。
ＮＰＰ合成酵素、環式モノテルペン合成酵素、及びこれらをコードする核酸についても同様である。
【００７４】
ＧＰＰ合成酵素の具体例としては、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの（GenBank Accession No.: Y17376/At2g34630; Bouvier, F., et al., Plant J,. 2000, 24, 241-52.）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のもの;（GenBank Accession No.: NP_215504; Mann, F. M., et al., FEBS Lett., 2011, 585, 549-54.）、等が挙げられる。
配列番号１に上記シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００７５】
さらに、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｃ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００７６】
ＮＰＰ合成酵素の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797956）、等が挙げられる。
配列番号３に上記トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００７７】
さらに、ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｆ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００７８】
本発明の組換え細胞において、「ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸」と「ネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸」については、いずれか一方の核酸のみが導入されたものでもよいし、両方の核酸が導入されたものでもよい。
【００７９】
環式モノテルペン合成酵素の例としては、β−フェランドレン合成酵素が挙げられる。β−フェランドレン合成酵素の作用により、ＧＰＰ及び／又はＮＰＰからβ−フェランドレンが合成される。また、副産物として４−カレンやリモネンも合成され得る。
【００８０】
β−フェランドレン合成酵素及びそれをコードする核酸の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797957; Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）由来のもの（GenBank Accession No.： HQ404305; Demissie, Z. A., et al., Planta, 2011,. 233, 685-96）、等が挙げられる。
配列番号５に上記トマト由来β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号６にアミノ酸配列のみを示す。
配列番号７に上記ラベンダー由来のβ−フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号８にアミノ酸配列のみを示す。
配列番号５又は配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡは、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００８１】
さらに、β−フェランドレン合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ−フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｉ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００８２】
本発明の組換え細胞においては、ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、環式モノテルペン合成酵素をコードする各核酸に加えて、他の核酸がさらに導入されていてもよい。１つの実施形態では、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸がさらに導入され、メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能をさらに有する。かかる構成によれば、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方からＩＰＰが合成されるので、ＩＰＰ合成能が増強され、結果として環式モノテルペンの生産がより効率的に行われる。
【００８３】
上述したように、メバロン酸経路で作用する酵素群としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。このうち、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する核酸を選択すればよい。これらの核酸についても、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものを採用することができる。
【００８４】
なお、メバロン酸経路は全ての真核生物が保有しているが、原核生物でも見出されている。原核生物でメバロン酸経路を有するものとしては、放線菌では、Streptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7)、Streptomyces griseolosporeus MF730-N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35）が挙げられる。
細菌では、Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190)、Corynebacterium amycolatum、Mycobacterium marinum、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Streptococuss agalactiae、Myxococcus xanthus等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99)。
アーキアでは、Aeropyrum属、Sulfolobus属、Desulfurococcus属、Thermoproteus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Thermococcus属、Pyrococcus属、Methanopyrus属、Thermoplasma属等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99）。
【００８５】
上記メバロン酸経路で作用する酵素群の由来としては特に限定はないが、酵母のメバロン酸経路で作用する酵素群が好ましい。その他、放線菌のメバロン酸経路で作用する酵素群も好ましく採用される。
【００８６】
別の実施形態では、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。本実施形態においても、ＩＰＰ合成能が増強され、結果として環式モノテルペンの生産がより効率的に行われる。導入される当該核酸は１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
上述したように、非メバロン酸経路で作用する酵素としては、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入すればよい。
また、非メバロン酸経路で作用する酵素は、宿主細胞以外の由来であることが好ましい。かかる構成により、反応生成物による反応抑制を避けることができる。
これらの核酸についても、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものを採用することができる。
【００８７】
メバロン酸経路あるいは非メバロン酸経路で作用するこれらの酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
【００８８】
宿主細胞に核酸を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた核酸を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記核酸（ＤＮＡ）、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【００８９】
宿主細胞がClostridium属細菌（Moorella属細菌のような近縁種を含む）の場合には、Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターpIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）を用いることができる。本シャトルベクターは、pUC9 (ATCC 37252)とBacillus subtilisから分離されたpIM13 (Projan SJ et al., J. Bacteriol. 1987, 169 (11), 5131-5139)との融合ベクターであり、Clostridium属細菌内でも安定的に保持される。Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターの他の例としては、pSOS95（GenBank: AY187686.1）が挙げられる。
【００９０】
なお、Clostridium属細菌への遺伝子導入には、通常、エレクトロポレーション法が使用されるが、遺伝子導入直後の導入された外来プラスミドは制限酵素Cac824I等による分解を受けやすく極めて不安定である。そのため、Bacillus subtilis ファージΦ3T1由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子が保持されたpAN1 (Mermelstein LD et al., Apply. Environ. Microbiol. 1993, 59(4), 1077-1081)を保有する大腸菌、例えばER2275株等で、pIMP1に由来するベクターを一旦増幅し、メチル化処理を行ってから、これを大腸菌から回収しエレクトロポレーションによる形質転換に使用することが好ましい。なお最近では、Cac824I遺伝子が欠損したClostridium acetobuthylicumが開発されており、メチル化処理されていないベクターも安定的に可能である(Dong H. et al., PLoS ONE 2010, 5 (2), e9038)。また、大腸菌ＢＬ２１株の改良株であるNEB expressを用いてベクターを増幅して、メチル化されていないベクターを効率よく導入する手法が知られている（Leang C. et al.,Appl Environ Microbiol. 2013 79(4), 1102-9）。
【００９１】
Clostridium属細菌における異種遺伝子発現のプロモーターとしては、例えばthl (thiolase)プロモーター(Perret S et al., J. Bacteriol. 2004, 186(1), 253-257)、Dha (glycerol dehydratase)プロモーター(Raynaud C. et al., PNAS 2003, 100(9), 5010-5015)、ptb (phosphotransbutyrylase)プロモーター (Desai RP et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(3), 936-945)、adc (acetoacetate decarboxylase)プロモーター(Lee J et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (5), 1416-1423)等がある。ただし、本発明ではこれらに限定されることなく、宿主細胞等に見出される様々な代謝系のオペロンに使用されているプロモーター領域の配列が使用可能である。
【００９２】
またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、環式モノテルペン合成酵素をコードする各核酸に加えて、上記したアセチルＣｏＡ経路やメタノール経路で作用する酵素をコードする遺伝子を導入する態様が挙げられる。
【００９３】
以上のように、本発明で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主細胞、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
【００９４】
また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、宿主細胞での導入遺伝子の発現量、宿主細胞の環式モノテルペンの排出機能、特定の環式モノテルペン耐性、等を向上させることにより、環式モノテルペンの生産性をさらに向上させることが可能となる。
【００９５】
すなわち、本発明においては、外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、プラスミドに組み込んでもよい。
【００９６】
１つの好ましい実施形態では、組換え細胞が、少なくとも４００ｍＭの環式モノテルペンに対する耐性を有する。かかる構成により、環式モノテルペンの高生産が可能となる。このような特性を有する組換え細胞は、例えば、適宜の変異処理を宿主細胞に施して目的の特性を有する宿主細胞を選抜し、その宿主細胞を用いることにより得ることができる。
【００９７】
本発明の環式モノテルペンの生産方法の１つの様相では、上記した組換え細胞を、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に環式モノテルペンを生産させる。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に提供することが好ましい。
【００９８】
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。組換え細胞がClostridium属細菌（偏性嫌気性、絶対嫌気性）の場合には、例えば、生育に必要な無機塩類及び、合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養する。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
【００９９】
なお、組換え細胞が好気性や通性嫌気性の場合には、例えば、液体培地を用いた通気・撹拌培養を行うことができる。
【０１００】
本発明の環式モノテルペンの生産方法の別の様相では、上記した組換え細胞に、一酸化炭素及び二酸化炭素からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から環式モノテルペンを生産させる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、環式モノテルペンを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、環式モノテルペンを連続的に生産させることができる。
本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に接触させることが好ましい。
【０１０１】
好ましい実施形態では、一酸化炭素を主成分とするガス、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する。すなわち、これらのガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、これらのガスを組換え細胞に接触させて、ガス中の一酸化炭素又は二酸化炭素から環式モノテルペンを生産させる。この場合も、水素はエネルギー源として使用される。
【０１０２】
これらのＣ１化合物に加えて、さらにギ酸又はメタノールを前記組換え細胞に提供してもよい。すなわち、ギ酸又はメタノールとこれらのガスとを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、ギ酸又はメタノールとこれらのガスとを組換え細胞に接触させる。ギ酸又はメタノールを添加することにより、培養効率及び環式モノテルペン生産の効率化が図られる。提供の態様としては、例えば、組み換え細胞に対して、ギ酸又はメタノールとこれらのガスを同時に提供することが挙げられる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、前記環式モノテルペン合成酵素はβ−フェランドレン合成酵素であり、環式モノテルペンとしてβ−フェランドレン、４−カレン、又はリモネンを生産させる。すなわち前述したように、β−フェランドレン合成酵素の作用により、ＧＰＰ及び／又はＮＰＰからβ−フェランドレンが合成され、また副産物として４−カレンやリモネンも合成され得る。
【０１０４】
本発明の組換え細胞を培養することにより、環式モノテルペンを大量に生産することができる。環式モノテルペンの生産能力としては、湿潤菌体１ｇあたり環式モノテルペン１０ｍｇ以上の生産量が実現可能である。例えば、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり、１０ｍｇ以上のβ−フェランドレン、６ｍｇ以上の４−カレン、２ｍｇ以上のリモネンを生産することができる。なお、本発明の組換え細胞を培養してβ−フェランドレンを生産する場合には、合成化学的手法で生産する場合と異なり、α−フェランドレンの混入は実質的に起こらない。
【０１０５】
生産された環式モノテルペンは、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、上述したClostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とした組換え細胞を用い、細胞外に放出された環式モノテルペンを回収し、蒸留等によって単離精製することにより、純化された環式モノテルペンを取得することができる。
【０１０６】
組換え細胞の培養物から環式モノテルペンを単離・精製する方法としては、例えば、培養液（培養上清）をペンタン等の適切な溶媒で抽出し、さらに逆相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによって高純度に精製することできる。細胞外に放出された環式モノテルペンの多くは、気相にも蒸発するため、コールドトラップ等でこれらを液化し、回収することも可能である。
【０１０７】
なお、二酸化炭素に代えて重炭酸塩を用いることができる場合がある。すなわち、Clostridium属細菌及びその近縁種は、炭酸脱水素酵素（Carbonic anhydrase, ＣＡ）(ＥＣ ４．２．１．１： Ｈ2Ｏ＋ＣＯ2 ⇔ ＨＣＯ3-＋Ｈ+）を有することが知られており（Braus-Stromeyer SA et al., J. Bacteriol. 1997, 179(22), 7197-7200)、ＣＯ2源として、ＨＣＯ3-源となるＮａＨＣＯ3等の重炭酸塩を用いることができる。
【０１０８】
ここで、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路（図１）を有している場合において、組換え細胞に提供され得る一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールの組み合わせについて説明する。
【０１０９】
アセチルＣｏＡ経路によるアセチルＣｏＡ合成では、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（Corrinoid iron-sulfur protein、ＣｏＦｅＳ−Ｐ)、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、及びＣＯＤＨの作用による、ＣｏＡ、メチルテトラヒドロ葉酸（methyltetrahydrofolate、［ＣＨ3］−ＴＨＦ)、及びＣＯからのアセチルＣｏＡの合成過程が必須である（Ragsdale SW et al., B.B.R.C. 2008, 1784(12), 1873-1898）。
【０１１０】
一方、Butyribacterium methylotrophicumの培養において、炭素源としてＣＯやＣＯ2以外にギ酸やメタノールを添加することは、ＣＯ代謝すなわち、アセチルＣｏＡ経路のメチルブランチ（Methyl branch）におけるテトラヒドロ葉酸（tetrahydrofolate、ＴＨＦ）含量、及び、ＣＯ代謝で必要とされるＣＯＤＨ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase、ＦＤＨ）及びヒドロゲナーゼ（hydrogenase）の活性を増大させることが知られている（Kerby R. et al., J. Bacteriol. 1987, 169(12), 5605-5609）。Eubacterium limosum等においても、嫌気条件下ＣＯ2及びメタノールを炭素源とした場合でも、高い増殖を得ることが示されている（Genthner BRS. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53(3), 471-476）。
【０１１１】
これらのメタノールの合成ガス資化性微生物へ影響、及びMoorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticum）及びClostridium ljungdahlii等のゲノム解析(Pierce E. et al., Environ. Microbiol. 2008, 10(10), 2550-2573; Durre P. et al., PNAS 2010, 107(29), 13087-13092)の結果から、これらの微生物種では、図１に示されるようなメタノール経路（methanol pathway）がアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）にメチル基のドナーとして関与することが説明できる。
【０１１２】
また実際に、いくつかのClostridium属菌ではギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）(ＥＣ １．２．１．２／１．２．１．４３：Formate＋ＮＡＤ（Ｐ）+ ⇔ ＣＯ2＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の正方向の活性（FormateからのＣＯ2形成）が確認されている（Liu CL et al., J. Bacteriol. 1984, 159(1), 375-380; Keamy JJ et al., J. Bacteriol. 1972, 109(1), 152-161)。このことから、これらの株ではＣＯ2やＣＯが欠乏状態にある場合、部分的にメタノール（ＣＨ3ＯＨ）やギ酸（ＨＣＯＯＨ）からＣＯ2の生成方向の反応が働くことができる（図１）。このことは、前述したＣＨ3ＯＨを加えることによる、ギ酸ヒドロゲナーゼ（formatede hydrogenase）活性、及びＣＯＤＨの活性増大の現象 (Kerby R et al., J. Bateriol. 1987, 169(12), 5605-5609)からも説明できる。すなわち、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）もしくはメタノール（ＣＨ3ＯＨ）を唯一の炭素源としても増殖可能である。
【０１１３】
宿主細胞が、元々、ギ酸デヒドロゲナーゼの正方向の活性を有しない株であっても、変異導入、外来遺伝子導入、もしくはゲノムシャッフリングのような遺伝子改変によって、正方向の活性を付与させればよい。
【０１１４】
以上のことから、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有している場合には、以下のガスや液体を用いて、環式モノテルペンを生産することができる。
・ＣＯ
・ＣＯ2
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
・ＣＨ3ＯＨ
・ＨＣＯＯＨ
【０１１５】
なお、本発明の組換え細胞について、環式モノテルペンの生産を目的とせず、専ら細胞を増やす目的で培養する場合には、一酸化炭素や二酸化炭素を炭素源として用いる必要はない。例えば糖類やグリセリンといった他の炭素源を用いて、組換え細胞を培養すればよい。
【０１１６】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１７】
本実施例では、環式モノテルペンの一種であるβ−フェランドレンを、合成ガス資化細菌の一種であるClostridium ljungdahliiの組換え細胞によって生産した。
【０１１８】
（１）各種ベクターの構築
β−フェランドレン合成酵素遺伝子を含む遺伝子クラスターとして、配列番号９（３１２５ｂｐ）と配列番号１０（３６１１ｂｐ）で表される人工合成遺伝子をそれぞれ構築した。配列番号９、１０はいずれもトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子（GenBank Accession No.: FJ797957）の改変配列とT7ターミネーターを含み、さらに、両末端にBamHIとXhoIの認識配列を含む。また、配列番号９はトマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子（GenBank Accession No.: FJ797956）の改変配列を含む。一方、配列番号１０は、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子（配列番号５、GenBank Accession No: Y17376）を含む。
【０１１９】
Clostridium/E. coliシャトルベクターpSOS95（GenBank: AY187686.1）のBamHI/EheIサイトに配列番号１１の人工合成ＤＮＡ（１２０ｂｐ）をクローニングし、pSOS-MSとした。さらに、pSOS-MSのBamHI/XhoIサイトに、配列番号９の人工合成遺伝子をBamHI/XhoIで制限酵素処理した遺伝子断片をクローニングし、pSOS-PHS-NPPとした。また同様にpSOS-MSのBamHI/XhoIサイトに配列番号１０の人工合成遺伝子をクローニングしたものをpSOS-PHS-GPPとした。pSOS-PHS-NPP、pSOS-PHS-GPPはpSOS95と同様にシャトルベクターとして機能する。これらのクローニングの際にはNEB express（New England Biolabs社）を用いた。
【０１２０】
（２）β−フェランドレン生産能を有する組換え体の作製
上記（１）で作製したpSOS-PHS-NPPとpSOS-PHS-GPPを、それぞれエレクトロポレーションにてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。コントロールとして、pSOS-MSを同様にしてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。エレクトロポレーションは、Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9で推奨されている方法によって行った。
【０１２１】
（３）β−フェランドレン生産
上記（２）で取得したpSOS-PHS-NPPとpSOS-PHS-GPPの各組換え体を、それぞれ３７℃、嫌気条件下で培養した。培地として、４μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するATCC medium 1754 PETC培地（ただし、フルクトース非含有）を用いた。２７ｍＬ容の密閉可能なヘッドスペースバイアル容器に１０ｍＬの培地を仕込み、ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝３３／３３／３４％（体積比）の混合ガスを０．２５ＭＰａ（絶対圧）のガス圧で充填し、アルミキャップで密封した後、振とう培養した。ＯＤ６００が０．９に到達した時点で培養を終了し、気相をガスクロマトグラフィー（島津GCMS-QP2010 Ultra）にて分析したところ、それぞれβ−フェランドレンが検出された。またpSOS-PHS-NPP組換え体からは、pSOS-PHS-GPP組換え体の培地の２〜６倍程度のβ−フェランドレンが検出された。また、pSOS-PHS-NPPにおいてβ−フェランドレンに加えて、環式モノテルペンである４−カレンが、β−フェランドレンの約６０％、リモネンが、約２０％検出された。
一方、pSOS-MSベクターのみを導入したコントロールの組換え体では、β−フェランドレンは検出できなかった。
【０１２２】
以上のことから、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、あるいはシロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を導入したClostridium ljungdahliiの組換え体を、炭素源としてＣＯ、ＣＯ2を用いて培養することにより、β−フェランドレンを生産できることが示された。さらにトマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子と、トマト由来β−フェランドレン合成酵素遺伝子を組み合わせることで、効率よくβ−フェランドレン生産がなされることが示された。
【図１】
2015181428.tif 000002
【配列表】
2015181428000001.app