(57)【要約】【課題】親水化処理された細胞培養容器において、簡便な工程で、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する手段を提供する。【解決手段】本発明は、少なくとも一部の表面が親水化処理された底部と、該底部に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルとを含む細胞培養容器を準備する、細胞培養容器準備工程；前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程；前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程；前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程；を含む、細胞培養容器の管理方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一部の表面が親水化処理された底部と、該底部に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルとを含む細胞培養容器を準備する、細胞培養容器準備工程；
前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程；
前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程；
前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程；
を含む、細胞培養容器の管理方法。
【請求項２】
前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する、接触角及び気泡量の関係取得工程をさらに含む、請求項1に記載の細胞培養容器の管理方法。
【請求項３】
前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する、接触角の経時変化の関係取得工程をさらに含む、請求項1又は2に記載の細胞培養容器の管理方法。
【請求項４】
前記細胞培養容器が、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養容器の管理方法。
【請求項５】
前記液体が水である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養容器の管理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器の管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野では、患者から採取した細胞を生体外で培養し、シート形状の細胞構造体（以下、「細胞シート」とも記載する）を作製した上で、該細胞シートを患者の生体内へ移植する技術が開発されている。また、不妊治療等の生殖医療分野では、患者から採取した未受精卵又は体外受精後の受精卵を、液滴状の培養液中で一定期間培養することが行われている。
【０００３】
前記のような用途に使用される細胞培養容器では、細胞の接着性及び／又は培養液の均一な広がりを確保することを目的として、通常は、細胞を収容する内部（例えば底部）の表面が親水化処理される。前記親水化処理により、細胞培養容器の内部の表面における水との接触角を低くすることができる。前記親水化処理としては、プラズマ照射処理等の粒子線又は電磁波照射処理、及び親水化処理剤を用いる化学的処理等を挙げることができる。或いは、細胞培養容器自体を親水性の高い材料で作製することもできる。
【０００４】
例えば、特許文献1は、底面が角度120度以下のロート状、曲率半径が10 mm以下の半球状、又はそれらの底面の中心部を平面にした形状をなし、容器内面の少なくとも底面が水接触角30度以下の親水性を有する培養容器を使用する、細胞凝集体の形成方法を記載する。当該文献は、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、又はリン脂質若しくはその誘導体等を塗布することによって該塗布面を親水化処理する方法を記載する。
【０００５】
特許文献2は、容器の培養液が接触する内面に水との接触角が10度以下の親水性の層を有し、該容器の内面の細胞が接触する部分に細胞培養に適した培養床を有する事を特徴とする細胞培養容器を記載する。当該文献は、前記親水性の層が、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシC2-C4アルキレン基含有メタクリレート重合体又はこれを含む共重合体、ポリビニルピロリドン、リン脂質・高分子複合体、及び2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体又はこれを含む共重合体、から選ばれる少なくとも1つの材料からなることが好ましいことを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第2716646号公報
【特許文献２】特開2004-290111号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞培養容器の内部の表面を親水化処理する手段は、細胞培養容器の内部の表面に極性基を結合又は形成させることにより、該表面の親水性を向上させる。しかしながら、これらの手段によって結合又は形成された極性基は、時間経過に伴って徐々に脱離するか、又は非極性基へ変化し得る。このため、親水化処理によって親水化された表面は、時間経過に伴って親水性が徐々に失われていく可能性がある。
【０００８】
前記のように、親水化処理された細胞培養容器においては、所定の親水性を発揮するために、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する必要がある。しかしながら、多数の細胞培養容器を使用する際に、1個ずつの細胞培養容器の経過時間を記録することは煩雑である。このため、多数の細胞培養容器を使用する際に、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理することは困難であった。
【０００９】
それ故、本発明は、親水化処理された細胞培養容器において、簡便な工程で、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、細胞培養容器の底部に配置されたマイクロウェルに水等を滴下した際に形成される気泡量を指標とすることにより、該細胞培養容器の表面が親水化処理された時点からの経過時間を簡便に算出し得ることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【００１１】
（1）少なくとも一部の表面が親水化処理された底部と、該底部に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルとを含む細胞培養容器を準備する、細胞培養容器準備工程；
前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程；
前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程；
前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程；
を含む、細胞培養容器の管理方法。
【００１２】
（2）前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する、接触角及び気泡量の関係取得工程をさらに含む、前記（1）に記載の細胞培養容器の管理方法。
【００１３】
（3）前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する、接触角の経時変化の関係取得工程をさらに含む、前記（1）又は（2）に記載の細胞培養容器の管理方法。
【００１４】
（4）前記細胞培養容器が、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む、前記（1）〜（3）のいずれかに記載の細胞培養容器の管理方法。
【００１５】
（5）前記液体が水である、前記（1）〜（4）のいずれかに記載の細胞培養容器の管理方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、親水化処理された細胞培養容器において、簡便な工程で、親水化処理された時点からの経過時間を正確に管理する手段を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、本発明の細胞培養容器の管理方法に使用される細胞培養容器の一実施形態を示す断面図である。
【図２】図2は、プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡形成率との関係を示す図である。
【図３】図3は、プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角の経時変化の関係を示す図である。菱形のデータは、100 Wの出力で1分間、プラズマ照射処理した場合の結果を、四角形のデータは、100 Wの出力で3分間、プラズマ照射処理した場合の結果を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書では、適宜図面を参照して本発明の特徴を説明する。図面では、明確化のために各部の寸法及び形状を誇張しており、実際の寸法及び形状を正確に描写してはいない。それ故、本発明の技術的範囲は、これら図面に表された各部の寸法及び形状に限定されるものではない。
【００１９】
＜1. 細胞培養容器の管理方法＞
本発明は、細胞培養容器の管理方法に関する。本発明の細胞培養容器の管理方法は、細胞培養容器準備工程、気泡量測定工程、接触角取得工程、及び経過時間取得工程を含むことが必要である。以下、各工程について、詳細に説明する。
【００２０】
［1-1. 細胞培養容器準備工程］
本発明の方法は、細胞培養容器を準備する、細胞培養容器準備工程を含むことが必要である。
【００２１】
本工程において準備される細胞培養容器は、少なくとも一部の表面が親水化処理された底部と、該底部に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルとを含むことが必要である。前記特徴を備える細胞培養容器を準備することにより、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを用いて、該細胞培養容器を親水化処理した時点からの経過時間を算出することができる。
【００２２】
本工程において準備される細胞培養容器の好ましい一実施形態を図1に示す。図1に示すように、本工程において準備される細胞培養容器1は、少なくとも一部の表面14が親水化処理された底部11と、該底部11に配置され、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェル12とを含む。本工程において準備される細胞培養容器1は、底部11と、該底部11の上面においてその周縁に立設された側壁部13と、該側壁部13の上端側の外縁によって画定される上方に開放した開放口とを有する形状であることが好ましい。この場合、底部11及び側壁部13によって画定される空間が、細胞を収容するための収容部として使用される。本明細書において、前記形状を「ディッシュ型」又は「プレート型」と記載する場合がある。本工程において準備される細胞培養容器1がディッシュ型の形状の場合、その具体的な形状は特に限定されず、当該技術分野で通常使用される楕円形、方形又は多角形等の各種の形状を採用することができる。或いは、本工程において準備される細胞培養容器は、フラスコ型等の他の形状であってもよい。本工程において準備される細胞培養容器は、当該技術分野で通常使用される各種の形状を採用することができる。また、本工程において準備される細胞培養容器の大きさは、特に限定されない。当該技術分野で通常使用される各種の大きさを採用することができる。例えば、前記細胞培養容器が円形のディッシュ型の場合、その直径は、通常は、10〜100 mmの範囲であり、典型的には、10〜50 mmの範囲である。
【００２３】
本工程において準備される細胞培養容器において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの形状は、円柱形状であることが好ましく、該細胞培養容器の底部に対して略平行な底部を有する円柱形状、又は該細胞培養容器の底部に対して特定の傾斜角を有する逆円錐形状の底部を有する円柱形状であることがより好ましい。この場合、円柱形状である前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの開口部の直径は、600 μm以下であることが好ましく、100〜600 μmの範囲であることがより好ましく、100〜300 μmの範囲であることがさらに好ましい。円柱形状である前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの深さは、300 μm以下であることが好ましく、50〜300 μmの範囲であることがより好ましく、100〜200 μmの範囲であることがさらに好ましい。前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの底部の形状が逆円錐形状の場合、該円錐形状の傾斜角は、前記細胞培養容器の底部の表面と略平行な面を基準として1〜15°の範囲であることが好ましく、5〜10°の範囲であることがより好ましい。前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルが前記形状の場合、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの形状に起因する気泡の形成を実質的に抑制することができる。それ故、前記形状の少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを含む細胞培養容器を用いることにより、該マイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量をより正確に測定することができる。
【００２４】
本工程において準備される細胞培養容器は、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含むことが好ましい。この場合、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの数は、通常は50個以下であり、2〜50個の範囲であることが好ましく、2〜30個の範囲であることがより好ましく、5〜25個の範囲であることがさらに好ましい。少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む前記細胞培養容器を用いることにより、親水化処理された時点からの経過時間をより正確に算出することができる。
【００２５】
本工程において準備される細胞培養容器は、少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに加えて、場合により、表面が親水化処理されていない少なくとも1個のマイクロウェルを含んでもよい。この場合、表面が親水化処理されていないマイクロウェルの特徴（例えば形状、位置又は材質等）は、所望の用途に応じて適宜設定することができる。表面が親水化処理されていないマイクロウェルは、表面の親水化処理以外の特徴に関して、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルと同様の特徴を有することが好ましい。前記の特徴を有することにより、表面が親水化処理されていないマイクロウェルは、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルと実質的に同様に取り扱うことができる。
【００２６】
本工程において準備される細胞培養容器において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル及び場合により表面が親水化処理されていないマイクロウェルは、該細胞培養容器の底部に配置される限り、その位置は特に限定されない。例えば、前記細胞培養容器の底部の中央部分に配置されていてもよく、該底部の外縁部分に配置されていてもよい。前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル及び場合により表面が親水化処理されていないマイクロウェルが複数配置される場合、全ての該マイクロウェルを特定の位置（例えば、前記細胞培養容器の底部の中央部分又は外縁部分）に配置してもよく、一部を特定の位置（例えば、前記細胞培養容器の底部の中央部分）に、残りを別の特定の位置（例えば、前記細胞培養容器の底部の外縁部分）に配置してもよい。いずれの場合も、本工程において準備される細胞培養容器の実施形態に包含される。
【００２７】
本工程において準備される細胞培養容器を形成する材料は、特に限定されない。当該技術分野で細胞培養容器に通常使用される材料を使用することができる。また、前記細胞培養容器において、該細胞培養容器の収容部を構成する部材、すなわち底部及び側壁部と、該底部の表面に配置される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル及び場合により表面が親水化処理されていないマイクロウェルとは、通常は、同一の材料からなる。前記材料としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、並びにガラス及び石英等の無機材料を挙げることができる。前記樹脂材料は、所望により、1種以上の樹脂材料を組み合わせて使用してもよい。本工程において準備される細胞培養容器を形成する材料は、前記群より選択される少なくとも1種の樹脂材料であることが好ましく、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることがより好ましく、ポリスチレン樹脂であることがさらに好ましい。前記材料を用いることにより、生体適合性の高い細胞培養容器を形成することができる。
【００２８】
本発明において、表面の「親水化処理」は、該表面の親水性を向上させる処理を意味し、通常は、該表面に極性基を結合又は形成させることにより、該表面の親水性を向上させる処理を意味する。本工程において準備される細胞培養容器において、底部の少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とを親水化処理する手段は特に限定されず、該細胞培養容器の材料等に基づき、当業者が適宜選択することができる。前記親水化処理の手段としては、プラズマ照射処理、コロナ照射処理、紫外線（UV）照射処理、放射線照射処理、及び親水化処理剤を用いる化学的処理等を挙げることができる。前記親水化処理の手段がプラズマ照射処理の場合、使用されるプラズマの種類は、高温プラズマ又は低温プラズマのような熱プラズマであることが好ましい。プラズマ照射出力は、100〜500 Wの範囲であることが好ましく、100〜400 Wの範囲であることがより好ましい。プラズマ照射時間は、10秒〜5分の範囲であることが好ましく、30秒〜1分の範囲であることがより好ましい。前記親水化処理の手段がコロナ照射処理の場合、使用されるコロナの種類は、グロー放電によるものが好ましい。コロナ照射出力は、10〜500 Wの範囲であることが好ましく、50〜300 Wの範囲であることがより好ましい。コロナ照射時間は、10秒〜1分の範囲であることが好ましく、20〜40秒の範囲であることがより好ましい。前記親水化処理の手段がUV照射処理の場合、使用されるUVの波長は、172〜254 nmの範囲であることが好ましい。UV照射出力は、0.5〜40 Wの範囲であることが好ましい。UV照射時間は、1〜60分の範囲であることが好ましい。照度は10〜50 mW/cm2の範囲であることが好ましい。照射源と被処理物との距離は適宜調整されるが、通常は、10〜200 mm程度である。或いは、本工程において準備される細胞培養容器自体を親水性の高い材料で作製することにより、底部の少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とが親水化処理された細胞培養容器を得てもよい。このような場合も、本発明における親水化処理の実施形態に包含される。本工程において準備される細胞培養容器を前記の条件で親水化処理することにより、細胞の接着性及び／又は培養液の均一な広がりを確保することができる。
【００２９】
本工程において準備される細胞培養容器において、底部の少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とを親水化処理する手段及び条件は、通常は、実質的に同一である。この場合、前記細胞培養容器の底部の親水化処理された少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの親水化処理された少なくとも一部の表面との親水性を、実質的に同調させることができる。それ故、本発明の方法を実施することにより、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル内に形成される気泡量を指標として、前記細胞培養容器における底部の表面の親水性の経時変化を正確に予測することができる。
【００３０】
本工程において準備される細胞培養容器において、底部の表面の少なくとも80％が親水化処理されていることが好ましく、底部の表面の少なくとも90％が親水化処理されていることがより好ましく、底部の表面の少なくとも95％が親水化処理されていることがさらに好ましく、底部の表面の略全面、すなわち約100％が親水化処理されていることが特に好ましい。本工程において準備される細胞培養容器の底部の表面を前記範囲に亘って親水化処理することにより、細胞の接着性及び／又は培養液の均一な広がりを確保することができる。
【００３１】
本工程において準備される細胞培養容器において、前記マイクロウェルの1個の表面の少なくとも80％が親水化処理されていることが好ましく、前記マイクロウェルの1個の表面の少なくとも90％が親水化処理されていることがより好ましく、前記マイクロウェルの1個の表面の少なくとも95％が親水化処理されていることがさらに好ましく、前記マイクロウェルの1個の表面の略全面、すなわち約100％が親水化処理されていることが特に好ましい。本工程において準備される細胞培養容器において、前記マイクロウェルの表面を前記範囲に亘って親水化処理することにより、親水化処理された時点からの経過時間をより正確に算出することができる。
【００３２】
本工程において準備される細胞培養容器は、所望により、滅菌処理されていてもよい。前記滅菌処理としては、例えば、放射線照射処理（例えばガンマ線照射処理）、プラズマ照射処理、コロナ照射処理、紫外線（UV）照射処理、又はエチレンオキシドガスを用いる化学的処理等の当該技術分野で通常使用される処理を適宜採用することができる。前記滅菌処理は、前記で説明した親水化処理から一定時間経過後、好ましくは親水化処理直後に実施することが好ましい。前記親水化処理から滅菌処理までの経過時間を一定とすることにより、本発明の方法によって算出される親水化処理された時点からの経過時間に基づき、滅菌処理された時点からの経過時間を合わせて算出することができる。
【００３３】
［1-2. 気泡量測定工程］
本発明の方法は、前記親水化処理からの経過時間txにおいて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する、気泡量測定工程を含むことが必要である。
【００３４】
本発明の方法において、経過時間txは、本発明の方法で使用される細胞培養容器を親水化処理した時点からの経過時間を意味する。細胞培養容器を親水化処理することによって結合又は形成された極性基は、時間経過に伴って徐々に脱離するか、又は非極性基へ変化し得る。このため、親水化処理された細胞培養容器の底部及びマイクロウェルの表面は、時間経過に伴って親水性が徐々に失われていく可能性がある。本発明の方法を実施することにより、本発明の方法で使用される細胞培養容器を親水化処理した時点からの経過時間txを算出することができる。
【００３５】
本工程において使用される液体は、水、又は本発明の方法で使用される細胞培養容器で細胞培養に使用される新鮮培地であることが好ましく、水（例えば純水）であることがより好ましい。前記液体として水を用いる場合、以下において説明する各工程において、該液体との接触角を正確に測定又は算出することができる。また、前記液体として細胞培養に使用される新鮮培地を用いる場合、実際の使用条件において形成し得る量に略等しい気泡量を得ることができる。
【００３６】
本工程において、液体が導入される少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルは、前記細胞培養容器に含まれる少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの全てであってもよく、一部であってもよい。この場合、液体が導入される前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの数は、通常は50個以下であり、2〜50個の範囲であることが好ましく、2〜30個の範囲であることがより好ましく、5〜25個の範囲であることがさらに好ましい。前記細胞培養容器が少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルを複数個含む場合、本工程において、液体が導入される少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルは、該少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの複数個の中から任意に選択することができる。例えば、少なくとも一部の表面が親水化処理された複数のマイクロウェルのうち、一部が前記細胞培養容器の底部の中央部分に配置され、残りが該細胞培養容器の底部の外縁部分に配置されている場合、本工程において、液体が導入される少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルは、該細胞培養容器の底部の中央部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択されてもよく、該細胞培養容器の底部の外縁部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択されてもよい。前記細胞培養容器の底部の中央部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択される場合、気泡の観察が容易になることから、気泡量の測定を容易に実施することができる。前記細胞培養容器の底部の外縁部分に配置された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの中から選択される場合、該底部の中央部分で行われる細胞の培養を阻害することなく、気泡量の測定を実施することができる。
【００３７】
本工程において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに液体を導入する手段は特に限定されない。例えばマイクロピペット等の当該技術分野で通常使用される分注器具を用いて、前記少なくとも一部の表面が親水化処理された少なくとも1個のマイクロウェルに前記液体を穏やかに滴下しながら導入することが好ましい。前記の手段で前記液体を導入することにより、該液体の導入時の衝撃によって気泡が形成又は消失することを実質的に防止することができる。
【００３８】
本工程において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルに導入された液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する。気泡量axは、気泡が形成された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの総数として表してもよく、使用される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの総数に対する気泡が形成された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの個数の百分率として算出される、気泡形成率（％）として表してもよい。使用される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルが1個の場合、気泡量axは、気泡が形成された少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルの総数、すなわち、少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルにおいて気泡が形成されるときを1、形成されないときを0として表すことが好ましい。また、使用される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルが複数個の場合、気泡量axは、気泡形成率（％）として表すことが好ましい。前記の方法により、気泡量axの測定を容易に実施することができる。なお、気泡の形成は、限定するものではないが、例えば、肉眼又は顕微鏡による観察によって、確認することができる。
【００３９】
［1-3. 接触角及び気泡量の関係取得工程］
本発明の方法は、場合により、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する、接触角及び気泡量の関係取得工程を含んでもよい。
【００４０】
本工程は、例えば、以下の手順で実施することができる。前記細胞培養容器準備工程において準備された細胞培養容器を、前記で説明した手段によって親水化処理することにより、親水化処理の程度が異なる複数の細胞培養容器を準備する。ここで、親水化処理の程度は、前記で説明した親水化処理の手段における各種条件（例えば、照射出力又は照射時間等）を変化させることにより、調節することができる。前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角を測定する。前記で説明したように、本発明の方法で使用される細胞培養容器において、底部の少なくとも一部の表面と、該底部の表面に配置されるマイクロウェルの少なくとも一部の表面とを親水化処理する手段及び条件は、通常は、実質的に同一である。また、前記細胞培養容器において、該細胞培養容器の収容部を構成する部材、すなわち底部及び側壁部と、該底部に配置される少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルとは、通常は、同一の材料からなる。このため、前記細胞培養容器の底部の親水化処理された少なくとも一部の表面と、該底部に配置されるマイクロウェルの親水化処理された少なくとも一部の表面とは、実質的に同程度まで親水化処理されて、実質的に同一の接触角を有する。それ故、本工程において、前記親水化処理後の細胞培養容器の底部の表面における前記液体との接触角を測定して、その値を、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角として取り扱うことが好ましい。ここで、接触角の測定は、当該技術分野で通常使用される接触角計等の測定機器を用いることにより、測定することができる。前記手順で本工程を実施することにより、接触角を容易に測定することができる。
【００４１】
本工程において使用される液体は、前記気泡量測定工程において使用される液体と同一であることが好ましい。前記液体を使用することにより、本発明の方法に基づき親水化処理された時点からの経過時間をより正確に算出することができる。
【００４２】
本工程において、前記少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルに前記液体を導入して、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aを測定する。ここで、気泡量aは、前記で説明した気泡量axの測定と同様の手段により、実施することができる。得られた結果に基づき、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係を取得する。前記接触角θと気泡量aとの関係は、例えば、接触角θ及び気泡量aの測定値を用いて回帰分析を行うことにより、接触角θと気泡量aとの関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。前記手順は、複数の細胞培養容器を用いて反復実施して、得られた結果を統計的に処理することにより、実施してもよい。
【００４３】
本工程は、以下において説明する接触角の経時変化の関係取得工程の前に実施してもよく、後に実施してもよい。しかしながら、本工程は、以下において説明する接触角取得工程の前に実施することが好ましい。接触角取得工程の前に本工程を実施することにより、本工程において得られる前記液体との接触角と気泡形成率との関係を、接触角取得工程で使用することができる。
【００４４】
本工程は、本発明の方法を実施する度に行ってもよい。しかしながら、本工程において得られる前記液体との接触角と気泡形成率との関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器に対して同様に適用することができる。このため、前記液体との接触角と気泡形成率との関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器について、少なくとも一回、本工程を実施することにより取得すればよい。このようにして取得された前記液体との接触角と気泡形成率との関係は、例えば演算装置等に蓄積しておき、以下において説明する接触角取得工程を実施する際に、該演算装置等から呼び出して使用することが好ましい。前記のように、予め演算装置等に蓄積された前記液体との接触角と気泡形成率との関係を該演算装置等から呼び出して取得する場合、本発明の方法において、本工程を実施する必要はない。それ故、前記の場合、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。
【００４５】
［1-4. 接触角の経時変化の関係取得工程］
本発明の方法は、場合により、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する、接触角の経時変化の関係取得工程を含んでもよい。
【００４６】
本工程は、例えば、以下の手順で実施することができる。前記細胞培養容器準備工程において準備された細胞培養容器において、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角を測定する。接触角の測定は、前記接触角及び気泡量の関係取得工程と同様の手段によって実施することができる。次に、前記細胞培養容器を所定の外部環境下で静置する。所定時間経過後、前記と同様の手順で、前記マイクロウェルの親水化された表面における液体との接触角を経時的に測定する。ここで、前記外部環境（例えば、温度、湿度、気相雰囲気及び光等）及び時間は、前記細胞培養容器を使用又は保管する外部環境に基づき、適宜設定することができる。例えば、前記外部環境の温度は、0℃〜50℃の範囲であることが好ましく、4℃〜30℃の範囲であることがより好ましい。前記外部環境の湿度（相対湿度）は、0〜70％の範囲であることが好ましい。前記外部環境の気相雰囲気は、空気であることが好ましい。前記外部環境の光の照度は、0〜10,000 lxの範囲であることが好ましい。また、前記外部環境下で前記細胞培養容器を静置する時間は、0〜52週の範囲であることが好ましく、0〜12週の範囲であることがより好ましい。得られた結果に基づき、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係を取得する。前記接触角θの経時変化の関係は、例えば、接触角θ及び経過時間の測定値を用いて回帰分析を行うことにより、接触角θと経過時間との関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。前記手順は、複数の細胞培養容器を用いて反復実施して、得られた結果を統計的に処理することにより、実施してもよい。
【００４７】
本工程は、前記接触角及び気泡量の関係取得工程の前に実施してもよく、後に実施してもよい。しかしながら、本工程は、以下において説明する経過時間取得工程の前に実施することが好ましい。経過時間取得工程の前に本工程を実施することにより、本工程において得られる前記液体との接触角θの経時変化の関係を、経過時間取得工程で使用することができる。
【００４８】
本工程は、本発明の方法を実施する度に行ってもよい。しかしながら、本工程において得られる液体との接触角θの経時変化の関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器に対して同様に適用することができる。このため、前記液体との接触角θの経時変化の関係は、同一の条件で作製された細胞培養容器について、少なくとも一回、本工程を実施することにより取得すればよい。このようにして取得された前記液体との接触角θの経時変化の関係は、例えば演算装置等に蓄積しておき、以下において説明する経過時間取得工程を実施する際に、該演算装置等から呼び出して使用することが好ましい。前記のように、予め演算装置等に蓄積された前記液体との接触角θの経時変化の関係を該演算装置等から呼び出して取得する場合、本発明の方法において、本工程を実施する必要はない。それ故、前記の場合、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。
【００４９】
［1-5. 接触角取得工程］
本発明の方法は、前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θと、該液体中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量aとの関係に適用して、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る、接触角取得工程を含むことが必要である。
【００５０】
本工程において使用される接触角θと気泡量aとの関係は、前記で説明した接触角及び気泡量の関係取得工程を実施することにより、取得することができる。
【００５１】
本工程において、前記接触角及び気泡量の関係取得工程を実施することによって取得された接触角θと気泡量aとの関係に対し、前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを適用することにより、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得ることができる。例えば、前記接触角及び気泡量の関係取得工程において説明した接触角θと気泡量aとの関係を表す数式又は回帰曲線に対し、前記気泡量測定工程で得られる気泡量axを代入することにより、気泡量axに対応する該液体との接触角θxを得る。これにより、気泡量axが、前記接触角及び気泡量の関係取得工程における気泡量aの測定値と一致しない場合であっても、接触角θxを得ることができる。この場合、予め前記接触角及び気泡量の関係取得工程を実施することによって取得され、演算装置に蓄積された前記接触角θと気泡量aとの関係を、該演算装置から呼び出して、本工程を実施することが好ましい。このようにすることで、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。
【００５２】
［1-6. 経過時間取得工程］
本発明の方法は、前記接触角取得工程で得られる前記液体との接触角θxを、前記マイクロウェルの親水化された表面における前記液体との接触角θの経時変化の関係に適用して、該液体との接触角θxに対応する経過時間txを得る、経過時間取得工程を含むことが必要である。
【００５３】
本工程において使用される接触角θの経時変化の関係は、前記で説明した接触角の経時変化の関係取得工程を実施することにより、取得することができる。
【００５４】
本工程において、前記接触角の経時変化の関係取得工程を実施することによって取得された接触角θの経時変化の関係に対し、前記接触角取得工程で得られる接触角θxを適用することにより、該接触角θxに対応する経過時間txを得ることができる。例えば、前記接触角の経時変化の関係取得工程において説明した接触角θの経時変化の関係を表す数式又は回帰曲線に対し、前記接触角取得工程で得られる接触角θxを代入することにより、接触角θxに対応する経過時間txを得る。これにより、接触角θxが、前記接触角の経時変化の関係取得工程における接触角θの測定値と一致しない場合であっても、経過時間txを得ることができる。この場合、予め前記接触角取得工程を実施することによって取得され、演算装置に蓄積された前記接触角θの経時変化の関係を、該演算装置から呼び出して、本工程を実施することが好ましい。このようにすることで、本発明の方法の実施時間を短縮することができる。
【００５５】
本発明の方法に使用される細胞培養容器において、前記接触角取得工程において取得される接触角θxは、前記液体が水の場合、通常は、0〜90°の範囲であり、典型的には、0〜40°の範囲である。前記範囲の接触角θxを有する細胞培養容器は、表面を親水化処理した時点からの経過時間txが、通常は、0〜20週の範囲であり、典型的には、0〜10週の範囲である。
【００５６】
以上、詳細に説明したように、本発明の方法により、親水化処理されたそれぞれの細胞培養容器について、親水化処理された時点からの経過時間を1個ずつ管理することなく、任意の時点における表面の親水化処理からの経過時間、及び場合により滅菌処理からの経過時間を簡便に算出することができる。これにより、それぞれの細胞培養容器の使用期限を、容易に管理することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５８】
［実施例1：水との接触角と気泡量との関係］
3.5 cmサイズのポリスチレン製ディッシュの底部の表面に、直径286 μm、深さ167 μmのマイクロウェルを25個有する細胞培養用ディッシュを作製した。前記マイクロウェルの底部は、前記ディッシュの底部の表面と略平行な面を基準として7°の傾斜角を有する逆円錐形状とした。前記細胞培養用ディッシュの底部及びマイクロウェルの表面に、プラズマ照射（種類：熱プラズマ；出力：100 W；照射時間：1分）して、該底部及び25個全てのマイクロウェルの表面の略全面を親水化処理した。前記プラズマ照射処理の照射時間の条件を変化させて、親水化処理の程度が異なる複数の細胞培養用ディッシュを準備した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面のうち、表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの開口部の近傍における水との接触角を測定した。また、前記プラズマ照射処理後の表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルに水を滴下して、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量を測定した。前記試験を、25個のマイクロウェルを有する細胞培養用ディッシュを用いて三連で実施した。このため、気泡量の測定は、一処理区について、合計75個の表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルを用いて実施した。水との接触角は、各試験区における三連の測定値の平均値として算出した。また、気泡量は、使用された表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの総数75個に対する気泡が形成された表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの個数の百分率である、気泡の形成率（％）として算出した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化処理された表面に形成される気泡形成率との関係を図2に示す。図中、点線で示す直線及び数式は、水との接触角及び気泡形成率の測定値を用いて回帰分析を行うことによって得られた回帰曲線及び回帰式である。
【００５９】
図2に示すように、前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡形成率との間には、一定の相関関係があることが確認された。
【００６０】
なお、前記プラズマ照射処理において、細胞培養用ディッシュの底部の表面及び25個全てのマイクロウェルの表面は、実質的に同程度まで親水化処理された。また、細胞培養用ディッシュの底部の表面及び25個全てのマイクロウェルの表面は、同一の材料（ポリスチレン）から作製された。それ故、前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角は、同一の細胞培養用ディッシュの底部に形成された表面の略全面が親水化処理されたマイクロウェルの表面における水との接触角と実質的に同一となる。
【００６１】
［実施例2：水との接触角の経時変化］
実施例1と同様の細胞培養用ディッシュを準備した。前記細胞培養用ディッシュの底部及びマイクロウェルの表面に、プラズマ照射（種類：熱プラズマ；出力：100 W；照射時間：1分又は3分）して、該底部及びマイクロウェルの表面の略全面を親水化処理した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュを、所定時間、25℃、空気雰囲気の外部環境下で静置した。所定時間経過後、細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角を測定した。前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角の経時変化を図3に示す。図中、菱形のデータは、100 Wの出力で1分間、プラズマ照射処理した場合の結果を、四角形のデータは、100 Wの出力で3分間、プラズマ照射処理した場合の結果を、それぞれ示す。図中、点線で示す直線及び数式は、水との接触角及び経過時間の測定値を用いて回帰分析を行うことによって得られた回帰曲線及び回帰式である。
【００６２】
図3に示すように、前記プラズマ照射処理後の細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角は、時間の経過に伴い高くなることが確認された。
【００６３】
［実施例3：細胞培養用ディッシュの管理方法］
以下の手順で、細胞培養用ディッシュの底部に配置されたマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量を測定することにより、該細胞培養用ディッシュを親水化処理した時点からの経過時間を算出することができる。
【００６４】
実施例1と同様の手順により、プラズマ照射処理によって表面が親水化処理された細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角と、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡形成率との関係を取得する。前記水との接触角と気泡形成率との関係は、図2に示すように、水との接触角及び気泡形成率の測定値を用いて回帰分析を行うことにより、水との接触角と気泡形成率との関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。また、実施例2と同様の手順により、プラズマ照射処理によって表面が親水化処理された細胞培養用ディッシュの底部の表面における水との接触角の経時変化の関係を取得する。前記水との接触角の経時変化の関係は、図3に示すように、水との接触角及び経過時間の測定値を用いて回帰分析を行うことにより、水との接触角と経過時間との関係を表す数式又は回帰曲線として取得することができる。前記水との接触角と気泡形成率との関係、及び水との接触角の経時変化の関係は、同一の条件で作製された細胞培養用ディッシュに対して同様に適用することができる。このため、前記水との接触角と気泡形成率との関係、及び水との接触角の経時変化の関係は、例えばプラズマ照射処理直後に所定の個数の細胞培養用ディッシュを用いて取得すればよく、細胞培養用ディッシュを使用する度に該関係を取得する必要はない。
【００６５】
細胞培養用ディッシュを任意の時間に亘って使用又は保管した後、該細胞培養用ディッシュの少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェルに水を滴下して、水中においてマイクロウェルの親水化された表面に形成される気泡量axを測定する。得られた気泡量axを、予め取得された前記水との接触角と気泡形成率との関係に適用して、気泡量axに対応する水との接触角θxを得る。例えば、前記手順で取得した水との接触角と気泡形成率との関係を表す数式又は回帰曲線に対し、気泡量axを代入することにより、気泡量axに対応する水との接触角θxを得る。得られた水との接触角θxを、予め取得された前記水との接触角の経時変化の関係に適用して、水との接触角θxに対応する経過時間txを得る。例えば、前記手順で取得した水との接触角の経時変化を表す数式又は回帰曲線に対し、得られた水との接触角θxを代入することにより、水との接触角θxに対応する経過時間txを得ることができる。
【００６６】
以上の方法により、それぞれの細胞培養用ディッシュについて、親水化処理された時点からの経過時間を1個ずつ管理することなく、任意の時点における表面の親水化処理からの経過時間を簡便に算出することができる。これにより、それぞれの細胞培養用ディッシュの使用期限を、容易に管理することができる。
【符号の説明】
【００６７】
1…細胞培養容器
11…底部
12…少なくとも一部の表面が親水化処理されたマイクロウェル
13…側壁部
14…底部の表面
【図１】
2015216913.tif 000002
【図２】
2015216913.tif 000003
【図３】
2015216913.tif 000004