(57)【要約】      （修正有）【課題】実用可能な高尿酸血症モデル、このモデルの製造方法、及びこのモデルを用いた高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】下記(a)又は(b)の非ヒト動物からなる高尿酸血症モデル。(a)免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。(b)免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行うことにより継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。【選択図】図２
2015213453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(a)又は(b)の非ヒト動物からなる高尿酸血症モデル。
(a)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行うことにより継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
【請求項２】
肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が５０％以上である請求項１に記載の高尿酸血症モデル。
【請求項３】
プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌を約７〜２８日間自由摂取させることにより、初代又は継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する請求項１又は２に記載のモデル。
【請求項４】
総量で３０〜３５０ｇ／ｋｇ体重のプリン塩基含有物質を、初代又は継代キメラ非ヒト動物に投与する請求項１又は２に記載のモデル。
【請求項５】
体重が、同種動物の８０％以上である請求項１〜４の何れかに記載の高尿酸血症モデル。
【請求項６】
血漿又は血清中尿酸濃度が４ｍｇ／ｄＬ以上である請求項１〜５の何れかに記載の高尿酸血症モデル。
【請求項７】
下記(c)又は(d)の高尿酸血症モデルの製造方法。
(c)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する方法。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行って継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する方法。
【請求項８】
肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が５０％以上である、初代キメラ非ヒト動物又は継代キメラ非ヒト動物に、プリン塩基含有物質を投与する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌を約７〜２８日間自由摂取させることにより、初代又は継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
総量で３０〜３５０ｇ／ｋｇ体重のプリン塩基含有物質を、初代又は継代キメラ非ヒト動物に投与する請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
（１）  下記(a)又は(b)の非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、
(a)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行うことにより継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
（２）被験物質の投与前後で血漿又は血清中の尿酸濃度を比較する工程と、
（３）血漿又は血清中の尿酸濃度を有意に低下させる被験物質を選択する工程とを含む、高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物質が投与される非ヒト動物の肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が５０％以上である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌を約７〜２８日間自由摂取させることにより、初代又は継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
総量で３０〜３５０ｇ／ｋｇ体重のプリン塩基含有物質を、初代又は継代キメラ非ヒト動物に投与する請求項１１又は１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高尿酸血症モデル、その製造方法、及び高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいて、尿酸はプリン塩基含有物質の最終代謝産物として存在する。尿酸の排泄低下、プリン塩基含有物質の産生過剰、プリン塩基含有物質の代謝の増大等の要因により、血清尿酸値が７mg/dlを越えるものは、高尿酸血症と定義される。2010年において、高尿酸血症発症者は増加傾向にある（非特許文献１）。
高尿酸血症状態が慢性化すると、痛風関節炎、尿路結石、痛風腎等の病状を発症する危険性が高まる。また、近年の疫学研究により、高尿酸血症は、心血管又は脳血管障害の独立した危険因子であることが示唆されている。高尿酸血症は、この他にも糖尿病や高脂血症の増悪因子の性質も持ち合わせており、種々の生活習慣病の臨床上有用な指標（バイオマーカー）としての重要性が指摘されている（非特許文献２）。
【０００３】
高尿酸血症は生活習慣病の側面を持つため、高尿酸血症の増加および若年化が進んでおり、医薬による治療対象外となる軽度及び境界領域高尿酸血症が増加している。このため、高尿酸血症治療薬の他に、サプリメント等の健康食品の開発も進められている（特許文献１、２）。治療薬以外の開発も、今後拡大すると考えられる。
【０００４】
しかし、高尿酸血症を研究するための動物モデルの作製は困難となっている。これは、霊長類以外の哺乳類は尿酸分解酵素であるウリカーゼを肝細胞中に豊富に持つため、尿酸をアラントインに分解することができるからである（非特許文献３）。また、遺伝子組み換えウリカーゼ欠損モデル動物は致死になるため（非特許文献３）、霊長類以外の哺乳類をウリカーゼ欠損により高尿酸血症にすることができないからである。
【０００５】
そこで現在では、ウリカーゼ阻害剤であるオキソン酸投与動物モデル（非特許文献４）が、高尿酸血症の研究に用いられている。しかし、病態維持のためにはオキソン酸を持続投与しなければならないという制限があるため、この動物モデルを用いて高尿酸血症治療薬の評価を行う場合、オキソン酸と評価対象治療薬との相互作用が懸念される。また、ウリカーゼを生産する点で、ウリカーゼ欠損しているヒトとの間で高尿酸血症病態の同等性が疑問視される（非特許文献５、６）。
オキソン酸投与モデル以外に、げっ歯類の高尿酸血症モデルとして、高プリン体食を与える食餌性高尿酸血症モデルがある。これらのモデルは、高プリン体食として、イノシン酸、ヒポキサンチン、RNAなどを混餌又は強制経口投与して得られるものである。しかし、食事性高尿酸血症モデルに利用される哺乳動物はウリカーゼを有するため、血漿中尿酸濃度の上昇率が不十分である場合が多く、通常、オキソン酸投薬と併用される。従って、オキソン酸投与動物モデルと同様の難点がある。
【０００６】
ここで、非特許文献７、８は、高プリン塩基含有物質や薬剤投与によらない高尿酸血症モデルとして、免疫不全肝障害マウスにヒト肝細胞を移植して得たキメラマウスは、高尿酸血症になる場合があることを教えている。
しかし、非特許文献７、８のキメラマウスは、一部が高尿酸血症になるに過ぎない。また、低体重であり、実験動物として実用し難いものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１２１１４５号公報；特許第３７６８７９５号公報
【特許文献２】特開２００９−２６３３４３号公報；特許第５４３７６７２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nat Clin Pract Rheumatol 3: 443-449, 2007
【非特許文献２】Diabetes Res Clin Pract 80: e1-e5, 2008
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 742-746, 1994
【非特許文献４】Clin. Toxicol. 13: 47-74, 1978
【非特許文献５】Gout and Nucleic Acid Metabolism 32: 13-18, 2008
【非特許文献６】Gout and Nucleic Acid Metabolism 33: 45-49, 2009
【非特許文献７】痛風と核酸代謝、32巻、1号、13-18頁
【非特許文献８】痛風と核酸代謝、33巻、1号、45-49頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、実用可能な高尿酸血症モデル、このモデルの製造方法、及びこのモデルを用いた高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
即ち、(a)免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得た初代キメラ非ヒト動物、又は(b)免疫不全肝障害非ヒト動物に、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を移植することにより得られる継代キメラ非ヒト動物に、プリン塩基含有物質を投与することにより、高効率で、血漿中尿酸濃度が向上した非ヒト動物が得られる。この非ヒト動物は、十分な体重及び生存力を有し、実験に耐えるものである。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の高尿酸血症モデル、その製造方法、及び高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
項１．  下記(a)又は(b)の非ヒト動物からなる高尿酸血症モデル。
(a)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行うことにより継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
項２．  肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が５０％以上である項１に記載の高尿酸血症モデル。
項３．  プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌を約７〜２８日間自由摂取させることにより、初代又は継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する項１又は２に記載のモデル。
項４．  総量で３０〜３５０ｇ／ｋｇ体重のプリン塩基含有物質を、初代又は継代キメラ非ヒト動物に投与する項１又は２に記載のモデル。
項５．  体重が、同種動物の８０％以上である項１〜４の何れかに記載の高尿酸血症モデル。
項６．  血漿又は血清中尿酸濃度が４ｍｇ／ｄＬ以上である項１〜５の何れかに記載の高尿酸血症モデル。
項７．  下記(c)又は(d)の高尿酸血症モデルの製造方法。
(c)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する方法。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行って継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する方法。
項８．  肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が５０％以上である、初代キメラ非ヒト動物又は継代キメラ非ヒト動物に、プリン塩基含有物質を投与する項７に記載の方法。
項９．  プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌を約７〜２８日間自由摂取させることにより、初代又は継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する項７又は８に記載の方法。
項１０．  総量で３０〜３５０ｇ／ｋｇ体重のプリン塩基含有物質を、初代又は継代キメラ非ヒト動物に投与する項７又は８に記載の方法。
項１１．  （１）  下記(a)又は(b)の非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、
(a)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行うことにより継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
（２）被験物質の投与前後で血漿又は血清中の尿酸濃度を比較する工程と、
（３）血漿又は血清中の尿酸濃度を有意に低下させる被験物質を選択する工程とを含む、高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法。
項１２．  被験物質が投与される非ヒト動物の肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が５０％以上である項１１に記載の方法。
項１３．  プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌を約７〜２８日間自由摂取させることにより、初代又は継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する項１１又は１２に記載の方法。
項１４．  総量で３０〜３５０ｇ／ｋｇ体重のプリン塩基含有物質を、初代又は継代キメラ非ヒト動物に投与する項１１又は１２に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のモデルは、一部又は全部がヒト肝細胞で置換された肝臓を有するキメラ動物である。ヒト肝細胞はウリカーゼを欠損するため、本発明のモデルは、ウリカーゼの生産が抑えられている。さらに、本発明のモデルは、プリン塩基含有物質が投与されているため、血漿中尿酸濃度が十分に向上している。また、このモデルは、プリン塩基含有物質を投与しない従来のキメラ動物に比べて、十分な体重及び生存力を有し、実験に耐えるものである。また、本発明のモデルは、オキソン酸などを投薬する必要が無いため、高尿酸血症治療薬評価においてオキソン酸と評価対象治療薬との相互作用の懸念がない。なお、プリン塩基は生理物質であり、また食品中に含まれる成分であるため、プリン塩基含有物質と評価対象治療薬との相互作用を懸念する必要性は極めて低い。また、本発明のモデルは、ウリカーゼを欠損する点で、ヒト病態と同等の高尿酸血症病態を示す。従って、ヒト高尿酸血症モデルとなり得る。従って、本発明のモデルは、高尿酸血症治療剤のスクリーニングや、高尿酸血症のメカニズム等の研究に好適に使用できる。
また、一部又は全部がヒト肝細胞で置換された肝臓を有するキメラ動物にプリン塩基含有物質を投与する本発明方法によれば、非常に高い確率で、高尿酸血症を示す動物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】初代キメラマウスにおいて、肝臓の全ての７つの葉から求めたヒト肝細胞置換率と、外側右葉で求めたヒト肝細胞置換率とが相関していることを示す図である。
【図２】初代キメラマウスにイノシン酸混合餌を投与したときの血漿中尿酸濃度の推移を示すグラフである。
【図３】初代キメラマウスにイノシン酸混合餌を投与し、その後混合餌を中断した場合と継続した場合の血漿中尿酸濃度の推移を示すグラフである。
【図４】初代キメラマウスにイノシン酸混合餌を投与し作製した高尿酸血症モデルマウスに、血中尿酸降下薬であるアロプリノールを投与した場合の血漿中尿酸濃度の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）高尿酸血症モデルの製造方法
本発明の高尿酸血症モデルの製造方法は、下記(c)又は(d)の方法である。
(c)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する方法。
(d)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行って継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与する方法。
【００１５】
非ヒト動物
本発明において、非ヒト動物（以下、「動物」と略称することもある）は、哺乳動物であることが好ましく、げっ歯類であることがより好ましい。げっ歯類動物としては、マウス、ラットのようなネズミ、モルモット、リス、ハムスターなどが挙げられるが、実験動物として汎用されているマウス、ラットのようなネズミが使用し易い。
【００１６】
免疫不全肝障害非ヒト動物
免疫不全肝障害非ヒト動物は、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、その非ヒト動物本来の肝臓の細胞が障害を受けている動物である。その動物本来の細胞が障害を受けていることにより、ヒト肝細胞を移植すれば、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれ、ヒト肝細胞の個体内機能を正確に反映した動物となる。また、移植するヒト肝細胞が増殖し易くなる。
【００１７】
免疫不全肝障害動物は、同一個体に、肝障害誘発処理を施すとともに、免疫不全誘発処理を施すことにより作製することができる。肝障害誘発処理としては、四塩化炭素、黄リン、D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレン、ピロロジンアルカロイドのような肝障害誘発物質の投与や、外科的な肝臓の部分切除などが挙げられる。免疫不全誘発処理としては、免疫抑制剤の投与や胸腺摘出などが挙げられる。
【００１８】
また、免疫不全肝障害動物は、遺伝的免疫不全症の動物に、肝障害誘発処理を施すことによっても作製できる。遺伝的免疫不全症動物としては、Ｔ細胞系不全を示す重症複合免疫不全症（SCID：severe combined immunodeficiency）の動物、遺伝的な胸腺の欠損によりT細胞機能を失った動物、RAG2遺伝子を公知のジーンターゲッティング法（Science,244:1288-1292,1989)によりノックアウトした動物などが挙げられる。具体的には、SCIDマウス、NOGマウス、NUDEマウス、RAG2ノックアウトマウス、及びこれらと同様の遺伝的免疫不全症ラットなどが挙げられる。
【００１９】
また、免疫不全肝障害動物は、遺伝的肝障害動物に免疫不全誘発処理を施すことによっても作製できる。遺伝的肝障害動物としては、肝細胞特異的に発現するタンパク質のエンハンサー、及び／又はプロモーターの支配下に連結された肝障害誘発タンパク質遺伝子を用い、公知のトランスジェニック法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77;7380-7384,1980)により作製したトランスジェニック動物が挙げられる。このような動物では、肝障害誘発タンパク質が肝臓特異的に発現するため、肝障害を有するものとなる。肝臓特異的に発現するタンパク質としては、血清アルブミン、コリンエステラーゼ、ハーゲマン因子などが挙げられる。肝障害誘発タンパク質としては、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(uPA)、ティッシュープラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、ヒト単純ヘルペスウイルス１型‐チミジンキナーゼ(HSV-tk)（HSV-tkの場合、ガンシクロビル投与により肝障害を誘発できる。）などが挙げられる。また、例えばフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子のような肝機能を担う遺伝子をノックアウトすることによっても遺伝的肝障害を有する動物を得ることができる。
【００２０】
さらに、免疫不全肝障害動物は、遺伝的免疫不全動物と、それと同種の遺伝的肝障害動物とを交配させることによっても作製することができる。
遺伝的免疫不全肝障害動物としては、肝障害遺伝子がホモ接合体である動物を用いることが好ましい。このようなホモ接合体動物は正常な肝細胞がほとんど増殖しないため、その動物の肝細胞がヒト肝細胞の増殖を妨げることがない。ただし、このようなホモ接合体動物は、ヘミ接合体同士を掛け合わせた場合、確率的に１／４の割合でしか得ることができない。
一方、肝障害遺伝子がヘミ接合体である遺伝的免疫不全肝障害動物（「ヘミ接合体免疫不全肝障害動物」）は、ヘミ接合体同士を掛け合わせた場合、またはヘミ接合体と遺伝的免疫不全動物とを掛け合わせた場合１／２の確立で得ることができるため、低コストで作製できる。
【００２１】
免疫不全肝障害非ヒト動物の作製例としては、例えば、uPA/SCIDマウス(本願実施例)、uPA/RAG-2マウス（「HEPATOLOGY 2001,33,981-988」、「Journal of Hepatology 42(2005)54-60」）、NOD/SCIDマウス、BALB/c-Rag2/Il2rgマウス、NOD/SCID/B2mマウス、NOD/SCID/Tg(HLA-A2)マウス、NOD/SCID/Il2rgマウス、NOD/Ragl/Il2rgマウス、NOD/Raglマウス、NOD/Ragl/Prflマウス、NOD/Ragl/Tg(SOD1-GA)1Gurマウス、NOD/Ragl/Ins2Akitaマウス、NOD-Ragl/Dmdmdx-SCvマウス（以上、「NATURE REVIEWS, Vol.7, February 2007, 118-130」）、uPA/NOGマウス（「Biochemical and Biophysical Research Communications 377(2008)248-252」）、TK-NOGマウス（WO2010／082385号公報；特許第5073836号公報）、 Fah/Rag2/Il2rgマウス（「Nature Biotechnology, Vol.25, No.8, August 2007,903-910」）などのマウスが知られている。
【００２２】
また、マウス以外の動物種としては、免疫不全ノックアウトラットであるX-SCIDラットが知られており（「Plos one, January 2010, Vol.5, Issue 1, e8870」）、一方、部分肝切除ラットに、肝細胞増殖阻害剤のレトロルシンを投与することにより、移植肝細胞が増殖できる程度の肝障害を導入できることが知られている（「American Journal of Pathology, Vol.158, No.1,January 2001」）。従って、部分肝切除X-SCIDラットにレトロルシンを投与することにより、免疫不全肝障害ラットが得られる。
また、レトロルシンを投与した幼若ラットに、ヒト肝細胞を移植すると共に、免疫抑制剤を投与することにより、ヒト肝細胞が増殖したことが知られており（第36回  日本臓器保存生物医学会定期学術集会プログラム・抄録集Vol.16,No.1,2009、第15回肝細胞研究会プログラム・抄録集2008年）、このことは、レトロルシンを投与した幼若ラットに免疫抑制剤を投与することにより、免疫不全肝障害ラットが得られることを示している。
【００２３】
ヒト肝細胞
移植に用いるヒト肝細胞は、正常なヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。また、分離した肝細胞を一旦冷凍保存した後解凍して用いることもできる。
肝細胞を分離するヒトの年齢は特に制限されないが、例えば１４歳以下の小児のヒトの肝細胞を使用することにより、ヒト肝細胞による高置換率が達成される。
また、ｉｎ ｖｉｖｏで活発な増殖能を有する増殖性肝細胞を使用することが好ましい。本発明において、「増殖性ヒト肝細胞」とは、培養条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、単一細胞種の集団としてのコロニーを形成し、そのコロニーを増大させるように増殖するヒト肝細胞を意味する。また、その増殖は、コロニー構成細胞が単一種であるという点において「クローン性増殖」という場合もある。さらに、このような細胞は、継代培養によって細胞数をさらに増加することができる細胞である。
このような増殖性ヒト肝細胞は、一例として、本発明者向谷らが発明したヒト小型肝細胞（特開平０８−１１２０９２号公報；日本特許第３２６６７６６号；米国特許第６，００４，８１０号、特開平１０−１７９１４８号公報：日本特許第３２１１９４１号、特開平７−２７４９５１公報；日本特許第３１５７９８４号、特開平９−３１３１７２号公報；日本特許第３０１４３２２号）を用いることができる。このヒト小型肝細胞は、その優れた増殖能によって、レシピエントの体内で急速に増殖し、正常な肝機能を発揮しうるヒト肝細胞集団を短時間で形成することができる。
このような小型肝細胞の採取は、前記公報に記載されているような遠心分離を用いた方法の他、エルトリエーターやＦＡＣＳ等の細胞分画装置によっても採取することができる。さらには、コロニーを形成しながら増殖する肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって採取することもできる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させたヒト肝細胞、凍結保存肝細胞、テロメラーゼ遺伝子等の導入により不死化させた肝細胞、これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたものも使用できる。
【００２４】
初代キメラ動物の作製
このようなヒト肝細胞は、免疫不全肝障害動物の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、１〜２００万個程度、好ましくは１０万〜１００万個程度とすることができる。
免疫不全肝障害動物の性別は特に限定されない。また、移植時の免疫不全肝障害動物の日齢は、特に限定されないが、当該動物が低週齢のときにヒト肝細胞を移植すると、当該動物の成長とともにヒト肝細胞がより活発に増殖することができる点で、生後０〜４０日程度、中でも生後８〜４０日程度の動物を使用するのが好ましい。
【００２５】
移植後の動物を、常法により飼育し又は生育させればよい。飼育又は生育は、ヒト肝細胞による置換率が、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらにより好ましくは約７０％以上、さらにより好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上になるまで行えばよい。これにより、ウリカーゼ生産が十分に抑制される。
ヒト肝細胞による置換率は、血漿中尿酸濃度を高くする上では高い方が良い。但し、本発明方法では、プリン塩基含有物質を投与するため、置換率がやや低くても血漿中尿酸濃度を十分に高くすることができる。従って、ヒト肝細胞による置換率は、プリン塩基含有物質の投与量によっても異なるが、約９０％以下とすることができ、約８０％以下とすることができ、約７０％以下とすることができ、約６５％以下とすることができ、約６０％以下とすることができ、約５５％以下とすることができ、約５０％以下とすることもできる。この範囲では、十分な体重及び生存力を有する高尿酸血症モデルが得られる。
【００２６】
例えば、移植後、約２０〜２００日間飼育し又は生育させることにより、通常、ヒト肝細胞の置換率が約５０％以上である初代キメラ非ヒト動物が得られる。マウスの場合は、ヒト肝細胞を７．５×１０５個程度移植した場合、約４０〜１２０日間飼育することにより、ヒト肝細胞置換率が約５０％以上となる。
また、ヒト肝細胞の移植数を下げる、又はヒト肝細胞移植後の飼育若しくは生育期間を上記範囲で短くすれば、ヒト肝細胞の置換率を下げることができ、当業者であれば、実験により、ヒト肝細胞の置換率を任意の値に調整できる。
【００２７】
ヒト肝細胞の置換率は、キメラ非ヒト動物の肝臓の、例えば外側右葉の部分から切片を採取し、例えば、ヘマトキシリン・エオジン染色して確認することができる。肝臓の外側右葉での置換率が、全葉から求めた置換率と同等であることは以下の参考実験例から明らかである。
【００２８】
＜参考例＞
キメラマウス肝臓の全ての７つの葉から求めた置換率と外側右葉で求めた置換率を比較すると、高い相関がみられることは以下の実験から明らかである。In Vitro Technology社より購入した凍結ヒト肝細胞Lot. NLR（12才、男児）を移植したキメラマウス14匹（移植後46-102日）について、肝臓組織全7葉から組織切片を作製し、抗ヒトサイトケラチン8/18抗体陽性面積比から置換率を求めた。
肝臓組織全７葉から求めた肝臓全体の置換率と外側右葉の置換率との相関を調べたところ、相関係数R2=0.9357の相関を示した。図１に相関図を示す。
【００２９】
また、キメラ動物の血中ヒトアルブミン濃度は、ヒト肝細胞の置換率の指標となる。動物種や系統によって血中ヒトアルブミン濃度は異なるが、キメラ動物の血中ヒトアルブミン濃度が約３．７ｍｇ／ｍｌ以上の場合に、通常、ヒト肝細胞の置換率約５０％以上になる。キメラ動物の血中ヒトアルブミン濃度は約５．２ ｍｇ／ｍｌ以上が好ましく、約７．４ｍｇ／ｍｌ以上がより好ましく、約１０．６ ｍｇ／ｍｌ以上がさらにより好ましく、約１５．２ｍｇ／ｍｌ以上が特に好ましい。
また、血中ヒトアルブミン濃度は、約１５．２ｍｇ／ｍｌ以下とすることもでき、約１０．６ｍｇ／ｍｌ以下とすることもでき、約７．４ｍｇ／ｍｌ以下とすることもでき、約６．２ｍｇ／ｍｌ以下とすることもでき、約５．２ｍｇ／ｍｌ以下とすることもでき、約４．４ｍｇ／ｍｌ以下とすることもでき、約３．７ｍｇ／ｍｌ以下とすることもできる。
【００３０】
初代キメラ非ヒト動物、及び後述する継代キメラ非ヒト動物のヒト肝細胞置換率は、プリン塩基含有物質を投与しても変化しない、又は実質的に変化しない。
【００３１】
このようにして得られた初代移植キメラ動物は、十分にウリカーゼ生産が抑制されているが、この初代移植キメラ動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、さらに同種の免疫不全肝障害動物に移植して継代移植キメラ動物を得ることもできる。このように１回又は複数回継代移植したキメラ動物も、十分にウリカーゼ生産が抑制されている
【００３２】
継代移植キメラ動物の作製
初代キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞は、例えば、キメラ動物の肝臓組織をコラゲナーゼ処理することにより回収することができる。コラゲナーゼの細胞毒性は、非ヒト動物肝細胞に対する方が、ヒト肝細胞に対するより高いため、コラゲナーゼ処理時間を調節することにより、キメラ動物の肝細胞に障害を与え、実質的にヒト肝細胞だけを分離することができる。コラゲナーゼ処理時間は、ヒト肝細胞と非ヒト肝細胞との存在割合によって異なるが、例えば、ヒト肝細胞置換率が約５０〜１００％である場合、即ち、マウスでは血中アルブミン濃度が約４〜２０ｍｇ／ｍｌの場合は、濃度０．０１〜０．１重量％程度のコラゲナーゼ溶液で５〜３０分間程度処理を行えばよい。回収された肝細胞の中には、キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞の他、肝非実質細胞が少量含まれる。さらに、動物自身の肝細胞も少量含まれる。
【００３３】
回収した肝細胞をそのまま移植に使用してもよいが、ヒト肝細胞あるいはマウス肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いてヒト肝細胞の純度を上げることもできる。分離した肝細胞をヒト肝細胞特異抗体と反応させる場合は、反応した細胞をフローサイトメーター（FACS）や磁気細胞分離装置（MACS）で回収すればよい。また、分離した肝細胞をマウス肝細胞特異的抗体と反応させる場合は、反応しなかった細胞をFACSやMACSを用いて回収すればよい。
【００３４】
ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、本発明者らが作製したハイブリドーマK8216株（2002年3月6日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター 中央第６）にFERM P-18751として寄託済み。また、2003年3月20日に、同センターにFERM BP-8333として国際寄託済み。）細胞を培養することによって得たもの、又はこのハイブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射し、腹水から採取したものが挙げられる。また、マウス肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体として、66Z抗体が挙げられる（「Drug Metab. Pharmacokinet., Vol.25, No.6: 539-550, 2010」）。特に、ヒト増殖性肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、本発明者らが作製したハイブリドーマK8223株（2002年3月6日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P-18752として寄託済み。また、2003年3月20日に、FERM BP-8334として国際寄託済み。）細胞を培養することによって得たもの、又はこのハイブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射し、腹水から採取したものが挙げられる。
【００３５】
初代キメラ動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、新たなないしは別の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植して、継代移植したキメラ動物を作製する。この新たな免疫不全肝障害非ヒト動物は、初代キメラ動物の作製に使用した非ヒト動物と同種の動物であってもよく、異種動物であってもよいが、同種動物であることが好ましい。同種の動物とは、初代キメラ動物の作製に使用した動物がマウスであればマウスを指し、初代キメラ動物の作製に使用した動物がラットであればラットを指す。
異種動物である場合は、初代キメラ動物の作製に使用する非ヒト動物、及び初代キメラ動物のヒト肝細胞を移植する新たな免疫不全肝障害非ヒト動物の双方が齧歯類であることが好ましく、ネズミであることがより好ましい。例えば、初代キメラ動物の作製に使用する非ヒト動物がマウスであり、初代キメラ動物のヒト肝細胞を移植する新たな免疫不全肝障害非ヒト動物がラットである場合や、初代キメラ動物の作製に使用する非ヒト動物がラットであり、初代キメラ動物のヒト肝細胞を移植する新たな免疫不全肝障害非ヒト動物がマウスである場合が挙げられる。
【００３６】
継代移植は１回行ってもよく、２回以上行っても良い。例えば、３回行う場合は、初代キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞を、新たな免疫不全肝障害動物に移植して継代移植キメラ動物を作製し、この継代移植キメラ動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、新たな免疫不全肝障害動物に移植して継代移植キメラ動物を作製すればよい。
初代キメラ動物から分離したヒト肝細胞の非ヒト動物の肝臓への移植経路、細胞数は、初代キメラ動物の作製の場合と同様である。また、移植を受ける非ヒト動物の日齢、性別についても、初代キメラ動物の作製の場合と同様である。
【００３７】
移植後の動物を、常法により飼育し又は生育させることにより、肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された継代移植キメラ動物が得られる。
ヒト肝細胞置換率、ヒト血清アルブミン濃度は、初代キメラマウスについて述べたのと同じである。
【００３８】
プリン塩基含有物質の投与
上記のようにして得られた初代キメラ動物又は継代キメラ動物にプリン塩基含有物質を投与する。
プリン塩基含有物質としては、プリン；アデニン、グアニン、ヒポキサンチンなどの核酸塩基；キサンチン、テオブロミン、カフェイン酸、尿酸、イソグアニンなどのアルカロイドのようなプリン塩基自体を使用できる。また、プリン塩基を含むアデニル酸、グアニル酸、イノシン酸のようなリボヌクレオチドも使用できる。中でも、リボヌクレオチドが好ましく、イノシン酸がより好ましい。
【００３９】
プリン塩基含有物質は、食餌に混ぜて投与しても良く、又は強制的に投与（特に、強制経口投与）してもよい。
プリン塩基含有物質を食餌に混ぜる場合の投与スケジュールとしては、プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌の約７〜２８日間（中でも、１４〜２８日間）の自由摂取、プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含有する食餌の約５〜１０日間（特に、約７日間）の自由摂取、プリン塩基含有物質を約０．１〜５重量％（中でも、約１重量％）含有する食餌の７〜２８日間（中でも、約７〜１４日間）の自由摂取などが挙げられる。上記範囲であれば、血漿中尿酸濃度が十分に高くなる。
【００４０】
何れにしても、プリン塩基含有物質の投与量は、総量で３０g/kg体重以上が好ましく、５０g/kg体重以上がより好ましく、８０g/kg体重以上がさらにより好ましく、８８g/kg体重以上が特に好ましい。上記範囲であれば、血漿中尿酸濃度が十分に高くなると共に、動物の体重減少がない。
また、プリン塩基含有物質の投与量は、総量で３５０g/kg体重以下が好ましく、３００g/kg体重以下がより好ましく、２５０g/kg体重以下がさらにより好ましく、２００g/kg体重以下が特に好ましい。上記範囲であれば、動物の体重減少がない。
【００４１】
例えば、マウスの場合、プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含む食餌を自由摂取させることにより、１日投与量が約１．３〜１１．５ｇ／ｋｇ体重となる。また、プリン塩基含有物質を約１〜１０重量％含む食餌を約１４〜２８日間、自由摂取させることにより、総投与量が約８８〜２６０ｇ／ｋｇ体重となる。
また、プリン塩基含有物質の投与量は、投与により血漿中尿酸濃度が１．３倍以上、中でも１．５倍以上、中でも５倍以上、中でも８倍以上、中でも９．８倍以上、中でも１０倍以上になる量とすることもできる。
【００４２】
（ＩＩ）高尿酸血症モデル
上記のようにしてキメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより、血中尿酸濃度が十分に向上した、本発明の高尿酸血症モデルが得られる。
即ち、本発明の高尿酸血症モデルは、下記(a)又は(b)の非ヒト動物からなる。
(a)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を得て、この初代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
(b)  免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して初代キメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、初代キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを行い、第２工程を１回又は複数回行うことにより継代キメラ非ヒト動物を得て、この継代キメラ非ヒト動物にプリン塩基含有物質を投与することにより得られる非ヒト動物。
本発明は、上記(a)又は(b)の非ヒト動物を高尿酸血症モデルとして使用する方法を包含する。
【００４３】
血漿中尿酸濃度
現在、高尿酸血症治療剤のスクリーニングや高尿酸血症の研究などに実用されている高尿酸血症モデルラットの血漿又は血清中尿酸濃度は、約２〜３ｍｇ／ｄＬである。例えば、「Bioorg Med Chem Lett, 2012 Jan 1, Vol. 22, No.1」、及び「Jpn. J. Pharmacol, 1980, Vol. 30」）は、オキソン酸投与により血漿又は血清中尿酸濃度が約２〜３ｍｇ／ｄＬのラットを得たことを報告している。
この点、本発明の高尿酸血症モデルは、血漿又は血清中尿酸濃度が４ｍｇ／ｄＬ以上となり得る。
【００４４】
体重
また、本発明の高尿酸血症モデルは、体重低下が抑制されていることが特徴であり、同種動物の平均体重である１９．４ｇに対して、例えば約８０％以上、中でも約８５％以上、中でも約９０％以上、中でも約９２％以上となり得る。
【００４５】
（ＩＩＩ）高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法
本発明の高尿酸血症治療剤のスクリーニング方法は、
（１）  上記説明した、血中尿酸濃度が向上した(a)又は(b)の非ヒト動物に、被験物質を投与する工程と、
（２）  被験物質の投与前後で血漿又は血清中の尿酸濃度を比較する工程と、
（３）  血漿又は血清中の尿酸濃度を有意に低下させる被験物質を選択する工程とを含む方法である。
【００４６】
被験物質の種類は特に制限されない。例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、有機低分子化合物、無機低分子化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞の核抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、微生物の培養上清などが挙げられる。
被験物質の投与回数は特に限定されず、通常単回投与すればよい。投与量は、被験物質の種類により異なるために制限されない。例えば、被験物質の最大投与可能量、又は血中濃度推移から設定すれば良い。
投与経路、被験物質の種類により異なるが、経口投与（強制経口投与、混餌投与）、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、筋肉内投与などが挙げられる。中でも、経口投与が好ましく、強制経口投与がより好ましい。
【００４７】
血漿又は血清中の尿酸濃度は、例えば、ドライケム7000（富士フィルム、東京）を用いて測定できる。
【００４８】
血漿又は血清中の尿酸濃度が有意に低下する場合に、その被験物質を高尿酸血症治療剤と判定し、選択できる。本発明において、「有意」とは、一群３匹以上のモデルを使用した場合に、危険率０．０５％のｔ検定で有意差がある場合をいう。
また、被験物質の投与により、血漿中尿酸濃度が、投与前の例えば７０％以下、５０％以下、好ましくは４５％以下、より好ましくは４０％以下になる場合に、その被験物質を高尿酸血症治療剤と判定し、選択できる。
【００４９】
実施例
以下、本発明を実施例を挙げて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）初代キメラマウスの作製
(1-1)免疫不全肝障害マウスの作製
uPA-Tgマウス（hemizygote, +/-）をSCID-bgマウスに2回バッククロスさせ、uPA-Tg(+/-)SCID(+/+)の遺伝子型を持つマウスを得た。そのマウスの雄より精子を採取し、SCIDマウス（homozygote, +/+）の未受精卵と体外受精後、仮腹に戻した。生まれた子マウスの内、Tg遺伝子の入ったマウスを選択肢、自然交配にて、両方の形質を持つマウスuPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)を得た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、導入遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により行った。
フォワードプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’（配列番号１）
リバースプライマー
5’-GGGCGGCGGTACCAATTCTTTGCCAAAATGATGAGA-3’（配列番号２）
また、SCID (+/+)、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。
【００５０】
次に、得られたuPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)同士を交配させ、uPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)とuPA-Tg(+/-)/SCID(+/+)を得た。uPA-Tg(+/+)とuPA-Tg(+/-)の識別はサザンブロット法により実施した。生後8〜10日目のマウスの尾を約5 mm切断し、3 SDS, proteinase K溶液により可溶化し、フェノールおよびクロロホルム抽出により混在するタンパク質成分を除去した。 DNase-free RNase Aを用いて混在するRNAを分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムDNAを析出させた。上記のゲノムDNAを70%エタノールで洗浄して風乾させた後、TEに再溶解させた。検体から抽出したゲノムDNA、陽性および陰性コントロールのゲノムDNA、それぞれ５μgをEcoR1で完全消化させ、生成するDNA断片をアガロース電気泳動により分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。制限酵素EcoR1を用いて、uPA cDNAプローブ/TAからサザンハイブリダイゼーションのプローブに適したDNAフラグメントを精製した(379 bp)。ランダムプライム法により、上記のDNAフラグメントを[32P]ラベルした。ナイロンメンブレンにトランスファーされたDNAフラグメントを、RIラベルしたuPA cDNAプローブとハイブリダイズさせた。洗浄により非特異的に結合したプローブを取り除き、mAlb-uPA-Int2 Tgマウスの候補の個体に導入されている外来遺伝子に由来する放射活性シグナルを、X線フィルムに感光して検出した。野生型遺伝子座由来の1.5 kbの特異的なシグナル、および変異型遺伝子座由来の0.4 kb(wt:1.5kb)の特異的なシグナルを検出して、mAlb-uPA-Int2 Tgマウス個体のジェノタイプを判定した。
【００５１】
(1-2)ヒト肝細胞移植
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞（Lot No.BD85、男児、５才）を使用した。この凍結肝細胞は従来公知の方法（Chise Tateno et al, Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004）に従って融解して用いた。
【００５２】
生後2〜4週齢の#1C2 ホモ7匹、ヘテロ4匹、#2C7ホモ 4匹、ヘテロ7匹のuPA-Tg/SCIDマウスをエーテルで麻酔し、わき腹を約5 mm切開し、脾頭より1.25x105個のヒト肝細胞を注入した後、脾臓を腹腔に戻し縫合した。#1C2 ホモ1匹が移植後30日目に死亡した。
(1-3)キメラマウスの飼育
移植後、CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）、次亜塩素酸ナトリウム（和光純薬）溶液0.012％添加水道水の自由摂取により飼育した。
週に１回マウス尾静脈より採血し、マウス血中のヒトアルブミン濃度を栄研化学株式会社のラテックス試薬‘栄研’ALB-IIを用い、免疫比濁法により測定した。測定条件は同試薬の添付マニュアルに従った。
【００５３】
（２）イノシン酸の投与
混餌開始前日に体重が18.5〜23.8 gであることを確認したヒト肝細胞キメラマウスを用いた。また、混餌開始後13日目に血液中ヒトアルブミン濃度を確認したところ、12.7〜17.5 mg/mLであった。このアルブミン濃度は、ヒト肝細胞の置換率８５〜９４％に相当する。混餌しても血液中ヒトアルブミン濃度は殆ど変化しなかった。
この初代キメラマウス16匹に、1%添加CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）を3日間、3%添加餌を3日間、6%添加餌を2日間、9%添加餌を6日間、自由摂取させた。このイノシン酸の総摂取量は、88 g/kg体重に相当する。飲用水は、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.012％添加水道水を用い、自由摂取させた。
投与開始15日後に、14匹はそのまま9%添加餌を自由摂取させたが、４匹はイノシン酸添加していないCRF-1餌を自由摂取させた。この4匹は給餌中断動物と名付けた。
【００５４】
（３）血漿中尿酸濃度の測定
イノシン酸混餌投与開始前日および13日後に、ドライケム7000（富士フィルム、東京）を用いて血漿中尿酸値を測定した。結果を図２に示す。初代キメラマウス16匹中16匹で血漿中尿酸濃度が１．３〜９．８倍に上昇し、16匹中8匹で尿酸濃度4 mg/dL以上となった。
図３には、投与開始15日後から給餌中断を行った動物の血漿中尿酸濃度の平均値と、給餌続行動物の血漿中尿酸濃度の平均値を示す。給餌続行動物12匹には、投与開始14と15日後に図4に示す投与や採血行ったが、影響は無いと考えられた。投与開始22日後、つまり給餌中断7日後において、両群間で血漿中尿酸値の平均値に明らかな差が認められた。このことからも、イノシン酸投与により、高尿酸モデルを作出できることが分かる。
なお、22日間イノシン酸含有餌を自由摂取させたマウスのイノシン酸総摂取量は191 g/kg体重であった。また、28日間イノシン酸含有餌を自由摂取させたマウスのイノシン酸総摂取量は260 g/kg体重であった。
以上の結果から、ヒト肝細胞キメラマウスにイノシン酸を1%、3%、6%、又は9%含む餌を合計14日間投与することにより、血漿尿酸値4 mg/mL以上を示す高尿酸モデルを作出できたことが分かる。
【００５５】
（４）アロプリノール投与
＜高尿酸血症モデル動物群＞
上記のようにして得た高尿酸血症モデルマウスに、既存の血中尿酸降下薬であるアロプリノールを投与した。アロプリノールを投与した6匹の高尿酸血症モデルマウスは、アロプリノールの投与前日に、血漿尿酸値2.4〜6.0 mg/mL、体重が17.1〜19.8 g、血中アルブミン濃度が12.7〜15.7 mg/mL（ヒト肝細胞置換率85〜91％に相当する）、かつ生後130〜152日であることを確認したものである。
アロプリノール（和光純薬）を0.5w/v% メチルセルロース（MC）４００溶液（滅菌済、和光純薬）に懸濁して、0.5 mg/mL懸濁液を作製した。アプリノールの0.5 mg/mL懸濁液を、10 mL/kg体重（5mg/kg体重）の容量で単回経口投与した。
【００５６】
＜コントロール群＞
コントロール群(１群6匹)は、上記のようにして得た高尿酸血症モデルマウスに、アロプリノールの溶媒である0.5w/v% メチルセルロース400溶液を10 mL/kg体重の容量で単回経口投与した。0.5w/v% メチルセルロース400溶液を投与した6匹の高尿酸血症モデルマウスは、0.5w/v% メチルセルロース400溶液の投与前日に、血漿尿酸値2〜8 mg/mL、体重が17.1〜20.6 g、血中アルブミン濃度が12.7〜15.4 mg/mL（ヒト肝細胞置換率85〜90％に相当する）、かつ生後125〜132日であることを確認したものである。
【００５７】
（５）アロプリノールによる血漿中尿酸値の変化
アロプリノールもしくは0.5w/v% メチルセルロース400溶液の投薬前と投薬2、4および24時間後に採血を行い、上記と同様にして血漿中尿酸濃度を測定した。
【００５８】
この結果、アロプリノール投与群の血漿中尿酸濃度の平均値は、投与前3.8 mg/dL、投与2時間後1.9 mg/dLであり、アロプリノール投与により血漿中尿酸濃度は有意に低下した。これに対して、コントロール群の血漿中尿酸濃度の平均値は、投与前3.0 mg/dL、投与2時間後4.8 mg/dLであり、0.5w/v% メチルセルロース400溶液投与により血漿中尿酸濃度は低下しなかった。
以上の結果、本発明の高尿酸血症モデルは、高尿酸血症治療剤のスクリーニングに使用できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のモデルは、高尿酸血症治療剤のスクリーニングや、高尿酸血症のメカニズムの研究などに好適に使用できる。
【図１】
2015213453.tif 000003
【図２】
2015213453.tif 000004
【図３】
2015213453.tif 000005
【図４】
2015213453.tif 000006
【配列表】
2015213453000001.app