(57)【要約】【課題】エキソソームの特性をより簡便に判定する方法を提供する。【解決手段】実施形態によれば、検体に含まれるエキソソームの特性を判定する方法は、検体を準備することと、前記検体からエキソソームの粒子を分離することと、分離された粒子の粒子径と側方散乱光強度とを測定することと、得られた粒子径と側方散乱光強度とから前記検体中のエキソソームの特性を判定することと、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を準備することと、前記検体からエキソソームの粒子を分離することと、分離された粒子の粒子径と側方散乱光強度とを測定することと、得られた粒子径と側方散乱光強度とから前記検体中のエキソソームの特性を判定することと、を含む検体に含まれるエキソソームの特性を判定する方法。
【請求項２】
当該エキソソームの特性の判定が、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する粒子の側方散乱光強度に基づいて行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記側方散乱光強度が、３００〜７００ｎｍの波長のレーザーを前記分離されたエキソソームに対して照射して測定される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該エキソソームの特性の判定が、９０〜１２０nmの粒子径を有する粒子について、４０５nmの波長のレーザーを照射したときの側方散乱光強度に基づいて行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子径が、前記検体に含まれる複数のエキソソームに関して経時的または連続して測定された当該側方散乱光から計算された粒子移動距離に基づいて求められ、当該エキソソームの特性を判定することが、前記検体に含まれる複数のエキソソームに関して測定された当該側方散乱光強度から求めた相対側方散乱光強度および当該粒子径に関する情報と、予め測定された標準的な情報または予め設定されたしきい値とを比較することによって行われる請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記エキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体が、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体および抗Ｒａｂ５ｂ抗体の群から選択される請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検体が、対象から採取された体液または対象から採取された細胞を培養して得られた細胞培養液である請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記検体が、対象から採取された体液である請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記エキソソームの特性を判定することが、前記対象における疾患の有無および／または疾患の程度を判定することである請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の方法により判定されたエキソソームの特性に基づいて、検体が由来する対象について疾患の有無および／または疾患の程度を診断する方法。
【請求項１１】
前記疾患が癌である請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記エキソソームの粒子の抽出が、前記検体をエキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体に接触させることと、前記抗体に結合した粒子を検体から分離することにより行われることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記エキソソームの粒子の抽出が、前記検体の準備の後に、前記検体を濾過することと、得られた濾液をエキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体を担持している担体に接触されることと、前記抗体に結合した粒子をエキソソームとして当該抗体及び担体から分離することにより行われることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
検体から分離されたエキソソームの粒子からの側方散乱光を経時的または連続して撮像する測定部と、測定部により撮像された複数の画像から得られた粒子の移動距離に基づいて粒子径を算出し、前記側方散乱光の強度と当該粒子径とに基づいて前記検体中のエキソソームの特性を判定する判定部とを具備する、検体に含まれるエキソソーム特性を判定する装置。
【請求項１５】
検体から分離されたエキソソーム粒子を含む液体を収容する収容部と、
前記収容部に含まれる液体に対して光を照射する照射部と、
前記エキソソームからの側方散乱光を経時的または連続して撮像する撮像部と、
前記撮像部により得られた複数の画像から、エキソソーム粒子の移動速度と平均側方散乱光強度を算出し、算出された移動速度と、前記光の波長、エキソソーム粒子の屈折率、前記液体中の溶媒の屈折率、粘度および温度の値とをストークス・アインシュタイン式に当て嵌めることにより、粒子径を算出し、得られた各粒子についての粒子径と側方散乱光の強度とを予め定められた判定基準と比較することによって検体中のエキソソームの特性を評価する評価部と、
を具備する、検体に含まれるエキソソーム特性を判定する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、検体に含まれるエキソソームの特性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソーム（Exosomes）は、細胞から分泌される、粒子径が５０〜１００ｎｍ程度の脂質膜小胞である。エキソソームの役割として、例えば、細胞内で不要になった成分を細胞外に輸送すること、由来となる細胞の成分を細胞外に分泌することによって他の細胞にシグナルを伝達することなどが考えられている。エキソソームは、それを分泌した細胞の成分を含んでおり、そのような細胞の性質を色濃く反映している可能性があるとして注目されている。例えば、癌細胞から分泌されたエキソソームは、癌性エキソソームとして知られ、癌マーカーなどの癌に特異的な物質を含むことが明らかにされている。また例えば、エキソソームの脂質膜には、テトラスパニンなどの膜貫通型蛋白質が存在している。そして、エキソソームの内部には、例えば、種々の蛋白質、脂質、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡなどのＲＮＡが含まれている。
【０００３】
現在、エキソソームおよびそれに含まれる成分を解析することにより、その由来となる細胞に関する情報を得る方法やそれを利用した診断・治療方法などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５１３２１７号公報
【特許文献２】特表２０１１−５２４１６４号公報
【特許文献３】特表２０１２−５０８５７７号公報
【特許文献４】特表２００７−５０６１０１号公報
【特許文献５】特開２００３−１２５７６１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．２００８；１１０（１）：１３−２１、Ｔａｙｌｏｒ  ＤＤ．、Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ  Ｃ．
【非特許文献２】ＣＡＲＩＳ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０、ＡＡＣＲ  ２０１０、Ｄａｖｉｄ  Ｓｐｅｔｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献３】ＣＡＲＩＳ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０、ＡＡＣＲ  ２０１０、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｋｕｓｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献４】ＣＡＲＩＳ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０、ＡＡＣＲ  ２０１０、Ｔｅｒｅｓａ  Ｔｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献５】ＣＡＲＩＳ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０、ＡＡＣＲ  ２０１０、Ｔｒａｃｉ  Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
実施形態は、エキソソームの特性をより簡便に判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、検体に含まれるエキソソームの特性を判定する方法が提供される。実施形態の方法は、検体を準備することと、前記検体からエキソソームの粒子を分離することと、分離された粒子の粒子径と側方散乱光強度とを測定することと、得られた粒子径と側方散乱光強度とから前記検体中のエキソソームの特性を判定することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】エキソソームを示す略図。
【図２】実施形態の例を示すフローチャート。
【図３】実施形態の測定装置の例を示す略図。
【図４】実施形態のエキソソームの特性の判定におけるデータ解析のイメージ図。
【図５】実施形態のサンプル容器を示す略図。
【図６】実施形態のエキソソームの特性を判定する装置を示すブロック図。
【図７】実施形態のエキソソームの特性を判定する装置を示すブロック図。
【図８】対照マウスと担癌マウスにおける腫瘍の状態を示す図。
【図９】フローサイトメトリーによる測定結果を示す図。
【図１０】散乱光強度の測定結果を示す図。
【図１１】実施形態の方法により得られた結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１０】
実施形態のエキソソームの特性を判定する方法は、検体を準備することと、前記検体からエキソソームの粒子を分離することと、分離された粒子の粒子径と側方散乱光強度とを測定することと、得られた粒子径と側方散乱光強度とから前記検体中のエキソソームの特性を判定することとを含む。
【００１１】
実施形態は、エキソソームの粒子径と側方散乱光強度とを、エキソソームの特性を判定するための指標としている。これらの指標を利用することにより、エキソソームに含まれる成分、例えば、表面および内部に存在する物質の種類を特定することなく、エキソソームの特性を総合的に評価することができる。当該方法は、エキソソームの特性、例えば、エキソソームの大きさ、表面蛋白質、内部に含まれる蛋白質、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの種類および量に関する情報が、エキソソームの粒子径と側方散乱光強度とに反映していることを見出したことに基づいて達成された。
【００１２】
エキソソームについて図１を用いて説明する。エキソソーム１は、一般的に約５０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子径の粒子であるといわれている。エキソソームは、由来となる細胞の細胞膜の一部分に由来する脂質二重膜２と、膜蛋白質、例えば、脂質二重膜を４回貫通する膜蛋白質であるテトラスパニン３，４，５、脂質二重膜２の内側に含まれる蛋白質６、ＤＮＡ７、ｍＲＮＡ８、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）９などを含む。エキソソームの特性は、それが由来する細胞の構成に依存する。一般的にエキソソームは、ユビキタスにＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１などのテトラスパニンを有している。従って、このような膜蛋白質は、エキソソームに特異的な表面蛋白質であるといえる。これらの表面蛋白質は、エキソソームを特異的に分離する際に利用できる。例えば、実施形態に従う１つの方法では、これらの表面蛋白質を特異的に認識して結合する抗体を用いて、エキソソームを分離し、得られたエキソソームの粒子径と散乱光強度とを測定する。
【００１３】
検体からのエキソソーム粒子の分離は、エキソソームに対して特異的に結合する抗体を利用して行うことが可能である。このような抗体と検体とを接触させ、それにより、検体に含まれるエキソソームと抗体とを結合させ、抗体の特性を利用してエキソソームを分離すればよい。エキソソームと結合した抗体を検体の他の成分から分離する手段は、予め抗体を結合させた担体を使用すること、二次抗体を利用すること、タグ化抗体を利用することなどにより行えばよい。検体から分離されたエキソソームは、抗体に結合したままでその粒子径および側方散乱強度が測定されてもよく、抗体から遊離された状態でその粒子径および側方散乱強度が測定されてもよく、抗体とエキソソームとが共存する混合物の状態においてその粒子径および側方散乱強度が測定されてもよく、或いはこれらを組み合わせた状態でその粒子径および側方散乱強度が測定されてもよい。
【００１４】
実施形態のエキソソームの特性を判定する方法の１例について図２の（ａ）を参照しながら説明する。当該方法は、例えば、次の工程を含む。まず、検体を準備する（Ｓ１）。次に、準備された検体をエキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体と接触させ、それによりエキソソームと抗体とを結合させ、エキソソームを得る（Ｓ２）。得られたエキソソームの粒子径と散乱光強度とを測定する（Ｓ３）。測定された粒子径の値と散乱光強度の値とからエキソソームの特性を判定する（Ｓ４）。
【００１５】
また例えば、エキソソームの特性を判定する方法は、次のように行ってもよい。実施形態のエキソソームの特性を判定する方法の更なる例について図２の（ｂ）を参照しながら説明する。まず、検体を準備する（Ｓ’１）。次に、準備された検体を濾過する（Ｓ’２）。濾過により得られた濾液をエキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体を担持している担体に接触される（Ｓ’３）。前記担体からエキソソームを分離する（Ｓ’４）。分離されたエキソソームの粒子径と散乱光強度とを測定する（Ｓ’５）。得られた粒子径の値と散乱光強度の値とからエキソソームの特性を判定する（Ｓ’６）。
【００１６】
これらの方法に含まれる各工程は、例えば、次のように行えばよい。
【００１７】
「検体」の準備は、例えば、体液の場合、対象から採取された体液を検体として用意することにより行ってよい。体液の例は、血清、血漿、尿、唾液、精液、羊水、腹水、その他の体腔液などであってもよい。或いは、「検体」の準備は、対象から採取された試料を前処理して検体を調製することによって行ってもよい。試料の例は、血液、リンパ液、便、喀痰、バイオプシーまたは外科的手段によって対象から得られた器官、臓器、組織、細胞群若しくは口腔内粘膜などであってもよい。前処理の例は、希釈、混合、粗濾過および培養などを含む。例えば、便の場合には、対象から採取された便を緩衝液などの溶媒で希釈し、濾紙やメッシュなどを用いて粗濾過すればよい。例えば、器官、臓器および組織の場合には、これらを適当な大きさに切断し、所望により酵素処理で細胞間の組織を消化する。その後、細胞を、初代培養または継代培養し、その培養液を回収する。そして回収された培養液を検体として用いればよい。対象は、ヒトを含む哺乳類、家畜、愛玩動物および産業用動物などの個体であってよい。
【００１８】
所望に応じて、準備された検体を濾過する。この濾過は、任意の工程であるが、検体に含まれるエキソソームよりも大きい成分を除去するためには、濾過を行うことがより好ましい。エキソソームの大きさは、文献により若干の違いはあり、３０ｎｍ〜１００ｎｍであるとも言われている。検体の濾過は、この範囲を、上方に外れた粒子径をもつ物質を取り除くために行う。それによって、その後の抗原抗体反応によるエキソソームの捕捉をより円滑に行うことができる。検体の濾過は、例えば、０．１μｍ〜３μｍのポアサイズのフィルター、例えば、０．１μｍ、０．２μｍ、０．４５μｍ、０．８μｍ、１μｍおよび３μｍのポアサイズのフィルターを用いて行ってもよい。例えば、０．２μｍまたは０．２２μｍのポアサイズのフィルターは、濾過滅菌のために広範に使用されるフィルターであり、入手が容易であり、且つ濾過時にエキソソームに掛かる圧力が少なく、且つよりエキソソームの大きさに近い範囲の粒子のみを回収できることからより好ましい。検体を濾過した後に得られた濾液を回収し、次の工程において使用する。
【００１９】
検体または検体を濾過して得られた濾液からのエキソソームの回収は、検体または濾液と、エキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体とを接触させることにより行ってよい。この接触において、検体または濾液中にエキソソームが存在すれば、エキソソームと抗体とが特異的に反応する。このようなエキソソームと抗体との特異的な結合を利用することによってエキソソームが回収されてよい。
【００２０】
エキソソームの表面蛋白質に特異的に結合する抗体は、エキソソームの表面にユビキタスに存在する蛋白質であればよい。例えば、そのような蛋白質は、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１などのテトラスパニン、ＣＤ３１などの接着因子、並びにＲａｂ５ｂおよびＨＳＰ７０などであってよい。エキソソーム表面上の発現量が多いＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＲａｂ５ｂの使用がより好ましい。当該抗体は、これらの蛋白質に対する抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
担体は、ビーズ状、板状、膜状または棒状の基体であってよい。例えば、ビーズ状の基体の場合、バイオ系の研究において一般的に使用されるそれ自身公知の何れのビーズが使用されてよい。そのような例は、磁気ビーズ、ポリッシュビーズおよびポリスチレンビーズなどである。担体への抗体の固定は、それ自身公知の何れかの方法により行えばよい。また、例えば、システムバイオサイエンス社（ＳＢＩ社）などから市販されている抗体固定化ビーズを使用することも好ましい。
【００２２】
検体または濾液と当該抗体を担持している担体との接触は、室温で行えばよい。例えば、検体または濾液に、抗体を担持している担体を添加することにより接触させればよい。この際に、所望に応じて撹拌を行ってもよい。抗体へのエキソソームの結合は、例えば、エキソソーム染色試薬（ＦＩＴＣ−ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｔａｉｎ、ＳＢＩ社製）により染色することにより確認することが可能である。
【００２３】
担体からのエキソソームの回収は、抗体を溶出する溶液、例えば、クエン酸-塩酸緩衝液や、グリシン-塩酸緩衝液のような酸性緩衝液や、例えば、ＳＢＩ社製のＥｘｏｓｏｍｅ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒや、ＰｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社のＤｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ中で、室温で約３０分間に亘り静置することによって処理して行えばよい。
【００２４】
その後、磁石または遠心分離またはろ過によって担体を取り除く。その上清がエキソソーム溶液である。
【００２５】
エキソソームの粒子径の測定は、それ自身公知の何れかの粒子径を測定する方法により行えばよい。散乱光強度の測定は、回収されたエキソソームを含むエキソソーム溶液をサンプルとして用い、サンプルに対して光を照射し、サンプル中のエキソソーム粒子からそれぞれ生じる側方散乱光をそれぞれ測定すればよい。側方散乱光強度の測定と共に粒子径を得るためには、側方散乱光強度を測定することと、側方散乱光強度の経時的な動きを観察し、各粒子についての移動距離と時間とから粒子の移動速度を算出し、更に、以下に示すストークス・アインシュタイン式（式１）を用いて粒子径を算出することとを行えばよい。
【数１】
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【００２６】
粒子の経時的な移動の観察は、特定の粒子の移動と特定の光信号との対応付けを維持しながら経時的に側方散乱光を測定すればよい。例えば、粒子の経時的な移動の観察は、それ自身公知の何れかの自動認識トラッキングによって行えばよい。自動認識トラッキングとは、光学的な観察において、観察対象としての特定の粒子を認識し、その動きを追跡する方法である。従って、粒子の経時的な移動の観察は、粒子を認識し、その動きを追跡しながら、粒子の側方散乱光を持続的または経時的に測定すればよい。特定の粒子の側方散乱光を指標とし、単位時間当たりの移動距離を粒子の移動速度とすればよい。溶媒の粘度および温度は、それ自身公知の手段により測定されればよい。溶媒の粘度および温度は、粒子の経時的な移動の観察に先駆けて測定されてもよく、粒子の経時的な移動の観察と同時に行われてもよく、粒子の経時的な移動の観察の後に行われてもよい。
【００２７】
エキソソームの粒子径と側方散乱光とを同時に測定するための装置の１例について図３を用いて説明する。測定装置３０は、観察対象を載せるためのステージ３１と、観察対象を観察するための対物レンズ３２と、対物レンズ３２により得られた情報を撮像する撮像部３４と、対物レンズ３２からの光学情報を撮像部３４に送る光学系３３と、測定装置３０に含まれる一部分または全体を制御し、得られた情報を処理する制御部３５と、撮像部３４で得た情報、プログラムおよびテーブルなどを記憶する記憶部３６と、得られた結果を表示するための表示部３７と、制御部３５に指示を与える入力部３８と、測定対象に対して光を照射するための光源３９とを備える。撮像部３４と、表示部３７と、光源３９は、制御部３５により記憶部３６から呼び出されたプログラムに従って、制御部３５によって制御される。撮像部３４は、例えば、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラであってよい。従って、例えば、対物レンズ３２、光学系３３および撮像部３４は、ＣＣＤカメラおよび／またはＣＭＯＳカメラを備えた顕微鏡であってもよい。制御部３５は、コンピュータであってもよい。また、測定装置３０は、図示はしていないが、画像処理、データ処理、計算および判定を行うための処理部を更に備えてもよく、或いは画像の処理を行う画像処理部、データを処理するデータ処理部、得られたデータの解析や制御に必要な計算を行う計算部、得られたデータまたは数値について解析および判定を行う解析部を備えてもよい。或いは、制御部３５が処理部としての機能を有してもよい。
【００２８】
測定は次のように行ってよい。ステージ３１に、観察対象４０を載置する。観察対象４０は、容器４１と、容器４１に収容された溶媒４２と、溶媒４２に分散されたエキソソーム４３を含む。ステージ３１の溶媒４２の側方に向けて光源３９から照射光４４を照射する。照射光４４を受けたエキソソーム４３の側方散乱光４５を対物レンズ３２で捉える。対物レンズ３２で捕捉された側方散乱光４５は、光学系３３を通り、撮像部３４で撮像される。撮像部３４での撮像は、記憶部３６に予め記憶されたプログラムに従い制御部３５から出される命令により制御されて行われる。撮像部３４で得られた画像は、記憶部３６に予め記憶されたプログラムに従い制御部３５から出される命令により制御され、表示部３７に表示される。撮像部３４で得られた画像は、所望に応じて、予め設定されたプログラムに従って制御部３５において画像処理されてから、表示部３７に表示されてもよい。表示部３７に示された画像は、入力部３８からの指示に従って、記憶部３６に記憶される。撮像部３４での撮像が、連続して行われて動画として表示部３７に同時に出力されてもよく、この出力と同時に記憶部３６に記録されてもよい。照射される光の波長は、３００ｎｍ〜７００ｎｍ、好ましくは約４００ｎｍであってよい。また、光源３９はレーザーであってもよい。
【００２９】
撮像部３４により経時的または連続して得られた画像における側方散乱光４５の強度、測定時間および位置情報に基づいて、制御部３５が、測定された複数の粒子のそれぞれについて平均側方散乱光強度と移動速度とを算出する。これらの値と、照射された光の波長、粒子の屈折率、溶媒の屈折率、溶媒の粘度および溶媒の温度の値をストークス・アインシュタイン式に当て嵌めることにより、粒子径を算出する。
【００３０】
エキソソームについての側方散乱光強度および粒子径の測定は、例えば、ナノサイト社から市販されているナノ粒子トラッキング解析装置（例えば、ＬＭ１０）などを使用して行ってもよい。
【００３１】
エキソソームの特性を判定することは、検体に含まれる複数のエキソソームに関してそれぞれ測定された粒子径と側方散乱光強度とに関する情報から判定すればよい。また、データを標準化するために、側方散乱光強度の実測値を基準値に基づいて加工して使用してもよい。また、エキソソームの特性の判定は、予め測定された標準的な情報、即ち、既知の特性を有するエキソソームについて得られた粒子径および側方散乱光強度に関する情報と比較することにより行ってもよい。
【００３２】
測定において、１つの検体について、そこに含まれる複数のエキソソームについて各々の粒子径と側方散乱光強度とを測定してよい。例えば、得られた複数のエキソソームから得られた複数の値の分布を、予め既知の状態にある対象から得られた複数のエキソソームから得られた複数の値の分布と比較することによって、エキソソームの特性を判定する。
【００３３】
得られた粒子径と側方散乱光強度から、例えば、以下のようにエキソソームの特性を判定できる。複数のエキソソームについて得られる粒子径と散乱光強度とに関する複数の値をプロットしたグラフを図４に示す。グラフの縦軸は相対散乱光強度であり、横軸は粒子径（ｎｍ）である。相対散乱光強度は、１つの検体について測定された複数のエキソソームの側方散乱光強度の実測値のうち、最大値を１としたときの相対的な散乱光強度である。グラフ中、楕円で囲まれたサンプルＡと記載された領域は、特定の疾患に罹患した患者の検体から得た複数のエキソソームのそれぞれについての粒子径と相対側方散乱光強度とをプロットした領域である。グラフ中、楕円で囲まれたサンプルＢと記載された領域は、健常人の検体から得た複数のエキソソームについての粒子径と相対側方散乱光強度とをそれぞれプロットした図である。サンプルＡの値は、サンプルＢの値よりも相対側方散乱光強度がより大きい領域に分散していることが分かる。測定されるべき検体を評価する前に、このような異なる２つの状態にある対象からそれぞれ得た標準データ、例えば、陽性データと陰性データとを用意しておくことが好ましい。次いで、このような標準データと、検体について得られたデータとを比較する。それにより、検体からのデータが、特定の疾患に罹患している患者からの陽性データに近いのか、健常人からの検体の陰性データに近いのかを判断することによって、検体のエキソソームの特性を判定する。或いは、特定の特徴を有するエキソソームから得られた粒子径および相対散乱強度の範囲を「比較対象粒子群」とし、検体がこの領域に含まれるか、否かを判定することによって、検体中のエキソソームの特性を判定してもよい。
【００３４】
このような判断は、特定の粒子径の範囲についてのみ比較することにより行ってもよい。そのような粒子径の範囲は、例えば、５０ｎｍ〜１５０ｎｍまたは９０ｎｍ〜１２０ｎｍであってもよい。
【００３５】
更に、陽性データと陰性データとを比較して、予めしきい値を設定してもよい。例えば、検体からのデータをしきい値と比較して、相対側方散乱光強度の平均値がしきい値よりも大きい場合に、陽性であると判断し、小さい場合には陰性であると判断してもよい。
【００３６】
或いは、検体に含まれるエキソソームが、高い値の相対散乱光強度を有すると判断し、このこと自体をエキソソームの特性であると判定してもよい。反対に、検体に含まれるエキソソームが、低い値の相対散乱光強度を有すると判断し、このこと自体をエキソソームの特性であると判定してもよい。エキソソームの特性が具体的にどのような検体または対象の状態を表しているかについて、実際に粒子径と側方散乱光強度とを測定することにより作製したデータベースを用いて更に判定してもよい。
【００３７】
また、エキソソームの特性を判定する方法を用いて、検体の供給源である対象について、特定の疾患を有するか否か、或いは特定の疾患に罹患している可能性が高いか、低いかを診断する方法が、更なる実施形態として提供されてもよい。このように当該方法は、対象における疾患を診断する方法として利用されてもよい。
【００３８】
疾患の有無または疾患に罹患した可能性の大小を判断するのみならず、特定の疾患の進行度を判断してもよい。その場合、特定の疾患の進行度の異なる対象から得た複数の検体について、予め標準データを取得しておき、この標準データと測定されるべき対象からの検体についてのデータとを比較すればよい。同様にして、疾患の病態の判定、疾患の型の判定などについても診断することが可能である。或いは、標準データから予め設定された判定基準と検体についてのデータとを比較することにより、検体中のエキソソームの特性の判定が行われてもよい。判定基準は、例えば、特定の特性とエキソソーム粒子の粒子径および側方散乱光強度の値とを対応付けたテーブル、または特定の疾患とエキソソーム粒子の粒子径および側方散乱光強度の値とを対応付けたテーブルであってもよい。判定基準は、エキソソーム粒子の粒子径および側方散乱光強度の値とエキソソームの特定の特性または疾患などとを対応付けた情報であればよく、テーブルに限らず、それ自身公知の何れかの他の形態であってもよい。
【００３９】
また、エキソソームの特性を判定することにより、対象または試料が、特定の状況にあるのか否かを判定してもよい。
【００４０】
またここで「特定の状況」とは、特定の健康状態、例えば、特定の疾患に罹患した状態などであってよい。特定の疾患は、例えば、癌、精神疾患、生活習慣病、神経疾患、自己免疫疾患、および循環器疾患などであってよい。或いは、検体の由来する対象について、薬剤感受性を判断すること、または外科的手術後に使用されるべき薬剤若しくは免疫療法剤の種類を選択すること、患者の予後が良好か否かを判断するための方法として使用されてもよい。
【００４１】
更なる実施形態として、検体に含まれるエキソソーム特性を判定する装置（以下「判定装置」と記す）が提供される。図５に判定装置の１例のブロック図を示す。図５を参照しながら判定装置について説明する。判定装置は、検体から分離されたエキソソームの粒子からの側方散乱光強度を経時的または連続して撮像する測定部と、測定部により撮像された画像から粒子径と側方散乱光強度とを計算し、計算された値に基づいて前記検体中のエキソソームの特性を判定する判定部とを備える（図５（ａ））。測定部は、観察対象を収容する収容部と、収容部に収容された観察対象に対して光を照射する照射部と、観察対象を観察する撮像部とを備える（図５（ｂ））。判定部は、撮像部により撮像された画像の処理、画像データの数値化、計算および解析、参照値との比較による判定などを行う。収容部と撮像部とは光路により接続されている。収容部から集められた光情報は、光学系を通り撮像部に送られる。照射部は、収容部に光を照射する光源を備える。照射部と収容部とは光路により接続されている。照射部からの光は、収容部に収容された観察対象に対して照射される。収容部が照射部から受けた光は、収容部に設けられた照射窓から収容されている観察対象に側方から照射される。観察対象からの散乱光は、収容部に設けられた観察窓を経て光路を経て撮像部に送られる。撮像部は、観察窓から収容部内の観察対象を撮像する。光路は、例えば、集光用レンズ、レンズ、光ファイバなどを含む光学系であってよい。
【００４２】
判定部は、撮像部において撮像された画像を解析し、解析により得られた情報に基づいてエキソソームの特性を判定する。判定部と撮像部は配線により接続されており、電気信号により情報が受け渡しされる。
【００４３】
判定部は、当該測定装置の一部分または全体を制御し、得られた情報を処理する制御部と、撮像部で得た情報、プログラムおよびテーブルなどを記憶する記憶部と、得られた結果を表示するための表示部と、制御部に指示を与える入力部とを更に備えてもよい。判定部は、更に撮像部により撮像された画像の処理、画像データの数値化、計算および解析、参照値との比較による判定などを行う評価部を備えてもよい（図５（ｃ））。この場合、測定部および判定部は、制御部を介して情報を受け渡し可能に接続されている。
【００４４】
収容部は、液体を収容するためのサンプル収容部、サンプル収容部に流体を出し入れするための流入出口と、光を照射するための照射窓と、観察対象を観察するための観察窓を備える。例えば、収容部は、ＭＥＭＳ（Mecro Electro Mechanica System）型サンプル容器であってもよい。流入出口は、開閉可能であってもよい。流入出口の開閉は、制御部により制御されているポンプの作動および停止または弁の開閉によって行われてもよい。
【００４５】
図６にＭＥＭＳ型サンプル容器（以下「サンプル容器」と記す）の１例を示し、これを用いて説明する。図６（ａ）は、サンプル容器の平面図であり、図６（ｂ）は図６（ａ）に示すサンプル容器を線Ｌ−Ｌで切断した断面図である。サンプル容器６１は、容器本体６２と、容器本体６２の第１の面に取り付けられた蓋部材６３と、容器本体６２と同心にその第１の面に形成された凹部と蓋部材６３とにより形成された空間であるサンプル収容部６４と、サンプル容器６１の側面からサンプル収容部６４内部に光を通すための光路である照射窓６５と、サンプル容器６１外部からサンプル収容部６４に流体を出し入れする流入出口６６と、サンプル収容部６４内部と対向するように、サンプル収容部６４内部を観察するための観察窓６７とを備える。
【００４６】
サンプル容器６１は、例えば次のように製造される。まず、円盤状のシリコン基板を容器本体６２のために準備する。シリコン基板の第１の面を、サンプル収容部６４と流入出口６６に対応する領域を残してレジストでマスキングした後に、第１の面をエッチングする。次に照射窓６５に対応する領域以外を窒化膜で覆った後に、第１の面を酸化してＳｉＯ２を形成し、これを観察窓６７とする。次に窒化膜を除去する。シリコン基板と同じ円板形状であり、少なくとも観察窓６７に対応する領域が光透過性である蓋部材６３を第１の面に固定してその全体を覆う。サンプル収容部６４に対応する蓋部材６３の領域が観察窓６７である。照射窓６５および観察窓６７は、光源から照射される光が照射窓６５を通り、サンプル中のエキソソームに当たり反射して生じた側散乱光を観察窓６７から観察することを妨げない程度にそれぞれ光透過性であればよい。例えば、照射窓６５および観察窓６７は、ガラス、石英、合成石英、ＳｉＯ２などで構成されてもよい。
【００４７】
サンプル容器６１のサンプル収容部６４にサンプルを流入する、またはサンプル収容部６４から外部へサンプルを排出するために流入出口６６にチューブが連結されてもよく、更にチューブにポンプが介在してもよい。更に、ポンプの先にサンプル収容器が接続していてもよい。また、流入出口６６の代わりに流入口と流出口がそれぞれ形成されてもよい（図示せず）。流入出口６６は、シリコン基板の第１の面において、サンプル収容部６４側からサンプル容器６１の外側側面までを貫通する流路である。この流路の途中、または流路の何れかの末端部にナノポアメンブレン、ナノピラーまたはマイクロポストなどを装着してもよい。それにより、観察対象であるサンプル中のごみや凝集物など、エキソソームよりも径の大きい粒子用物質を夾雑物として排除することができる。
【００４８】
また収容部は、更に超音波ユニットをサンプル容器６１の外に固定して備えてもよい。それによりサンプル収容部６４内部に存在する凝集体を解離することができる。また、収容部が、サンプル収容部６４内部を所望の温度に維持する、または所望の温度まで加温するようにヒーターとサーモセンターを備えてもよい。収容部は制御部に接続され、制御部により制御されてもよい（図示せず）。或いは、収容部は、液体を収容するための容器であってもよい。
【００４９】
また、判定装置は、検体からエキソソームの粒子を分離する分離部を更に備えてもよい（図７）。分離部は、収容部と流路により接続されていればよい。分離部は、その内部に検体を収容し検体からエキソソームを分離する。分離した後に得られたサンプルは流入出口６６を通り、サンプル収容部６４に送られる。分離部は制御部と接続されていてもよく、それにより分離部が制御部により制御されてもよい。
【００５０】
撮像部おより照射部が顕微鏡により構成されてもよい。その場合、顕微鏡のステージに収容部がセットされてもよく、ステージの位置にステージの代わりに配置されてもよい。判定部、例えば、制御部、表示部、記憶部、評価部および入力部はコンピュータであってもよい。また、判定装置における２つまたは２つ以上の部材は、各々の配線により接続されてもよく、バスを介して接続されていてもよい。
【００５１】
図５（ｃ）に示す判定装置における測定は次のように行ってよい。なおここでは、収容部は、ＭＥＭＳ型サンプル容器６１を用いる例を説明する。入力部からの命令により制御部は測定を開始する。制御部の指示によりＭＥＭＳ型サンプル容器６１の流入出口６６に接続されたポンプが起動し、サンプル収容器からサンプルを吸い上げ、流入出口６６を通り、サンプル収容部６４に送り出す。制御部からの指示により、超音波ユニットが稼働し、サンプル収容部６４内部のサンプルに一定時間振動を伝えた後に停止する。制御部からの指示により、照射部がサンプル収容部６４に収容されたサンプルに対して光を照射する。照射された光は、光路を通り、ＭＥＭＳ型サンプル容器６１の照射窓６５を通り、サンプル収容部６４内部に照射される。制御部からの指示により、サンプルからの側方散乱光を撮像部が経時的または連続して撮像する。撮像部での撮像は、記憶部に予め記憶されたプログラムに従い制御部から出される命令により制御されて行われる。撮像部で得られた連続または複数の画像は、記憶部に予め記憶されたプログラムに従い制御部から出される命令により制御され、表示部に表示される。撮像部で得られた画像は、所望に応じて、予め設定されたプログラムに従って制御部において画像処理されてから、表示部に表示されてもよい。表示部に示された画像は、任意に入力部からの指示に従って、記憶部に記憶される。或いは、撮像部での撮像が、連続して行われて動画として表示部に同時に出力されてもよく、この出力と同時に記憶部に記録されてもよい。
【００５２】
撮像部により経時的または連続して得られた画像における側方散乱光の強度、測定時間および位置情報に基づいて、制御部の指示により評価部が、測定された複数の粒子のそれぞれについて平均側方散乱光強度と移動速度とを算出する。続けて評価部は、算出された値と、入力部から入力され予め記憶部に記憶されていた照射光の波長、粒子の屈折率、溶媒の屈折率、溶媒の粘度および溶媒の温度の値とをストークス・アインシュタイン式に当て嵌めることにより、粒子径を算出する。更に、評価部は、予め記憶部に記憶されていた陽性データおよび陰性データを含む標準データと、算出された値とを比較し、検体中のエキソソームの特性を評価する。得られた結果は、制御部の指示により表示部に示されると共に、記憶部に記憶される。
【００５３】
ここで、撮像部において得られた画像から光および位置、並びにそれらの変化に関する情報に基づいて、粒子径および側方散乱光強度の値を得ることが、撮像部に接続され、測定部に備えられている計算部によって行われてもよい。その場合、測定部において行われる測定は、エキソソーム粒子についての粒子径と側方散乱光強度または平均側方散乱光強度までを含む。言い換えれば、測定部は、経時的にエキソソーム粒子からの側方散乱強度をする観察すると共に粒子の移動速度を測定する。また、計算部により算出された値は、計算部に接続されている判定部に送られ、判定部において評価および判定がなされる。計算部の制御は、撮像部および計算部に接続された更なる制御部において行われてもよく、判定部に備えられた制御部により行われてもよい。
【００５４】
なお、当該判定装置の構成および動作は、上述した図３に示す測定装置３０の構成および動作と交換可能、または一方の一部を他方に追加してもよい。また、上述した方法を行うように当該判定装置がプログラムされてもよい。
【００５５】
このような判定装置により、エキソソームの特性をより簡便に判定することが可能となる。
【００５６】
[例]
例１．エキソソームの分離
（１）Ｈｕｈ−７細胞の培養
癌化モデル血清採取用担癌マウスは、ヒト肝細胞がんＨｕｈ−７を移植して作製した。Ｈｕｈ−７細胞は、牛胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２、水蒸気飽和条件下で培養を行った。牛胎児血清は、使用する前に５６℃の温浴中で３０分間加温することにより非働化し、その後０．２μｍフィルター濾過を行った。その後、０．２５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡ液を用いて、３〜４日毎に継代を行い、対数増殖期の細胞を１０×１０８ｃｅｌｌ作製した。
【００５７】
（２）担癌マウスの作製
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）は特定病原菌を含まない条件下で維持および飼育を行った。飼育はクリーンラック内で行った。飼育の条件は、許容温度１８〜２８℃、許容湿度３０〜８０％、換気回数１０回以上／時間、明暗サイクルは１２時間点灯、１２時間消灯であった。
【００５８】
６週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右側脇腹皮下に、Ｈｕｈ−７細胞１０×１０８ｃｅｌｌとマトリゲル（フェノールレッドフリー、ＢＤバイオサイエンス社製）１００μＬとを混合したものを注射した。これを５例のマウスについて行った。
【００５９】
移植後、７日目、１０日目、１４日目、１７日目および２０日目にそれぞれ移植細胞を電子ノギスにより測定し、腫瘍体積を長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×０．５として算出した。更に、５例のマウスからのデータの平均値および標準偏差を算出した。
【００６０】
表１にそれぞれの個体の腫瘍体積の変化を示した。また、２１日目のラットの腫瘍を撮影した写真を図８に示す。図８（ａ）が対照マウス（Ｎ１）であり、（ｂ）が１例目の担癌マウス（Ｈ１）であり、（ｃ）が２例目の担癌マウス（Ｈ２）であり、（ｄ）が３例目の担癌マウス（Ｈ３）である。
【表１】
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【００６１】
表１に示したように、全てのマウスについて移植した腫瘍体積は経時的に増加した。
【００６２】
（３）血清の採取
腫瘍体積が５００ｍｍ３以上の個体および移植を行っていない対照個体からイソフルラン吸入麻酔下にて５００μＬの血液を採取し、安楽死処置を行った。それぞれの血液を冷蔵下にて３０分以上静置した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、２０分）し、血清を採取した。血清は２本のチューブに小分けした後に、−２０℃の冷凍下にて使用時まで保管した。
【００６３】
（４）抗体結合磁気ビーズを用いたエキソソームの分離
それぞれの血清を解凍後０．２μｍのフィルターで濾過し、ビオチン化抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ６３抗体または抗Ｒａｂ５ｂ抗体をあらかじめ結合させたアビジン化磁気ビーズ（Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ、ＳＢＩ社製）と反応させて、血清中からエキソソームを分離した。
【００６４】
まず、ＰＢＳで洗浄したアビジン化ビーズ２０μＬと各抗体１０μＬとを、１０％ＢＳＡを含む５０μＬのＰＢＳ中で、氷上に２時間静置して反応させた。反応後、ＰＢＳによりビーズを洗浄し、５０μＬのフィルター濾過済み血清と５０μＬのＰＢＳとを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後ビーズをＰＢＳで洗浄した。
【００６５】
磁気ビーズによるエキソソームの分離の確認は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いておこなった。血清と反応させた磁気ビーズをエキソソーム染色試薬（ＦＩＴＣ−ｅｘｏｓｏｍｅ  ｓｔａｉｎ、ＳＢＩ社製）またはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ９抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）と室温で２時間反応させた後にＰＢＳで洗浄した。その後、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ  （ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて解析した。
【００６６】
抗ＣＤ８１抗体を結合させた磁気ビーズに、血清を反応させて、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ９抗体で確認した結果を図９の（ａ）に示し、エキソソーム染色試薬で染色して確認した結果を図９（ｂ）、に示す。この結果から、抗体を結合させた磁気ビーズで血清中のエキソソームを分離できることが分かった。
【００６７】
例２．散乱光強度の測定
（１）エキソソームの分離
例１の（１）と同様に調製したＨｕｈ−７細胞を培養した。例１の（２）と同様の方法により、５例のマウスに２１日間に亘り腫瘍を形成した。例１（３）と同様の方法により血清を採取した。このようにして得た対照マウス（Ｎ１）および担癌マウス（Ｈ１）〜（Ｈ５）の血清を用いて以下の実験を行った。それぞれの血清を解凍した。その後、０．２μｍのフィルターで濾過し、ビオチン化抗ＣＤ８１抗体をあらかじめ結合させたアビジン化磁気ビーズ（Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ（ＳＢＩ社製）または、抗ＣＤ９抗体をあらかじめ結合させたポリスチレンビーズ（Ｓ−Ｂｅａｄｓ（ＰｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製））と反応させて、血清中からエキソソームを分離した。
【００６８】
血中のエキソソームが結合したそれぞれのビーズ２０μＬに０．２μｍフィルターで濾過したＥｘｏｓｏｍｅ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢＩ社製）３００μＬまたはＤｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＰｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製）を加えて室温で３０分静置した。その後、磁石または遠心分離によってビーズを取り除いた。それらの上清をエキソソーム溶液とした。
【００６９】
（２）散乱光強度の測定
（１）で得たそれぞれのエキソソーム溶液にＰＢＳ２００μＬを加えて５００μＬの溶液を作製した。同試料の全量をナノ粒子測定装置ＬＭ１０（ナノサイト社製）に供試し、試料に含まれる粒子の数、それぞれの粒子径および４０５ｎｍレーザー光に対する側方散乱光強度を測定した。粒子径に対する粒子の数の分布を図１０に示した。横軸は粒子径を、縦軸は粒子数を示した。全粒子の数を表２に示した。
【表２】
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【００７０】
粒子の数は、抗ＣＤ９抗体を使用した場合も、抗ＣＤ８１抗体を使用した場合も大きく異ならなかった。従って、何れの抗体も同様にエキソソームを分離することが可能であることが示された。
【００７１】
３．担癌マウスと対照マウスのエキソソームの相対散乱光強度の比較
（１）相対散乱光強度の算出
粒子の散乱光強度含有比を個体間で標準化するため、各個体の血清中粒子の相対散乱光強度を算出した。まず、粒子径が９０〜１２０ｎｍの粒子に限定し、各個体血清中の当該粒子の散乱光強度（Intensity）の最高値を１とし、最低値を０として相対散乱光強度を算出した。その結果を図１１に示す。縦軸は相対散乱光強度を示し、横軸は粒子径を示す。
【００７２】
（２）散乱光強度の比較
図１１に示すように、担癌マウスと対照マウスの血清から分離したエキソソームについて、粒子径と相対散乱光強度を比較したところ、担癌マウスから単離したエキソソームは、相対散乱光強度０．２以上のものを５０％以上含んでいた。
【００７３】
これらの結果から、実施形態において、腫瘍の有無を相対散乱光強度の異なるエキソソームの含有比から予測できた。この結果は、特性の異なるエキソソームを粒子径と側方散乱光強度とを指標として識別できることを証明している。
【００７４】
以上の結果から、実施形態に従い粒子径と側方散乱光強度とを測定することによって、エキソソームの特性を総合的に、且つ簡便に判定することができた。実施形態に従いエキソソームの特性を判定することにより、エキソソームが由来する対象における特定の疾患の有無または程度などを診断できる可能性が示唆された。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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