(57)【要約】【課題】ＨｂＡ１ｃの検出を簡便かつ精度高く行なうために、レクチンを利用した検出方法、及びそれを利用した糖尿病の検出用診断薬又はキットを提供する。【解決手段】本発明の方法は、生体の血液から取得した検体に含まれるＨｂ１Ａｃに、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）又は麹菌レクチン（ＡＯＬ）を作用させることを特徴とする。本発明の糖尿病の検出用診断薬又はキットは、ＡＡＬ又はＡＯＬを含む。【選択図】図１
2015143640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の血液から取得した検体に含まれるＨｂ１Ａｃに、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）又は麹菌レクチン（ＡＯＬ）を作用させることを特徴とする、糖尿病の検出方法。
【請求項２】
前記検体は、ヒトから採取した赤血球であることを特徴とする、請求項１に記載の糖尿病の検出方法。
【請求項３】
前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬは、標識されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の糖尿病の検出方法。
【請求項４】
前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬ及び、１種以上のレクチン又は抗体を用いてＨｂＡ１ｃを検出することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の糖尿病の検出方法。
【請求項５】
前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬと抗Ｈｂ抗体とを用いたアッセイによりＨｂＡ１ｃを検出することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の糖尿病の検出方法。
【請求項６】
ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）又は麹菌レクチン（ＡＯＬ）を含む、糖尿病の検出用診断薬又はキット。
【請求項７】
さらに、抗Ｈｂ抗体を含む、請求項６に記載の糖尿病の検出用診断薬又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の検出方法に関し、より詳細には、レクチンを使用して糖尿病を簡易かつ精度高く検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血液中のグルコース濃度である血糖値が異常に高い状態を示す疾患である。年齢層別に見ると、４０歳以上で罹患率が高くなり、加齢に伴い増加傾向が高い疾患である。２０１１年の統計によれば、日本の糖尿病人口は１０００万人を超えており、糖尿病予備群を含めると２０００万人を超える。先進国の中でも、日本は患者数が多い。しかし、糖尿病は、患者数の多い先進国だけでなく、患者数の増加率の高い新興国においても深刻な問題である。
【０００３】
糖尿病は、発症に自己免疫機序の関与が考えられている１型糖尿病と、カロリーの過剰摂取や運動不足に基づく肥満状態の継続により、インスリン分泌低下と感受性低下を原因として発症する２型糖尿病とに大別される。患者の大部分は２型糖尿病である。
【０００４】
２型糖尿病では、血糖値が１型糖尿病ほど上昇することはないが、高血糖状態が長期にわたると、血中の高濃度グルコースが血管内皮タンパク質と糖化反応を生起し、微小血管を徐々に破壊する。その結果、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等の合併症を引き起こす。腎臓病では人工透析治療が必要になる等、糖尿病は患者のＱＯＬを損ない、医療コストを引き上げる端緒となる。
【０００５】
生活習慣病の一種である糖尿病の発症やそれに基づく合併症を未然に防止するには、保険指導型の予防医療、すなわち、日常の健康診断や糖尿病検診での糖尿病マーカーに基づいた血糖コントロールが重要となる。
【０００６】
現在行なわれている生化学検査には、血中や尿中のグルコース濃度を直接測定する方法、血中のグルコースがヘモグロビンに結合した糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビンともいう）の割合や血中のグルコースがアルブミンに結合した糖化アルブミン（グリコアルブミンともいう）の割合を測定する方法等がある。
【０００７】
血中グルコース濃度の測定は、グルコース酸化酵素を含んだ診断用テープに血液を滴下して、グルコース酸化酵素とグルコースとの反応を自動分析器にかけて検出するものである。血糖値の基準値は、早朝空腹時血糖で７０〜１０９ｍｇ／ｄＬ、食後２時間血糖で１４０ｍｇ／ｄＬである。早朝空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ、食後血糖値が２００ｍｇ／ｍＬ以上であれば、糖尿病の疑いがある。しかし、一日の血糖値は健常人でも大きく変動し、食事の前と後では大きな差がある。血中グルコース測定法は、数時間〜数日間にわたる平均血中グルコース濃度を反映しない。測定精度を高めるために、血中グルコース濃度を頻繁に測定する必要があり、被験者に相当な負担となる。
【０００８】
高血糖状態が長期間続くと、血管内の余分なグルコースは体内のヘモグロビンやアルブミンと結合する。アルブミンは血中タンパク質の主要成分である。グリコアルブミン検査は、アルブミンがどのくらいの割合でブドウ糖と結合しているかを調べる検査である。グリコアルブミンの数値は、過去約２週間の血糖コントロールを表す指標となる。
【０００９】
ヘモグロビンは、赤血球の中に大量に存在し、身体の隅々まで酸素を運搬する役割を担うタンパク質である。血中でヘモグロビン（Ｈｂ）とグルコースが結合したものが糖化ヘモグロビンである。血糖値が高いほど、糖化ヘモグロビンが形成されやすく、糖尿病患者では糖化ヘモグロビンの割合が顕著に高い。
【００１０】
後述するように、糖化ヘモグロビンの一種であるＨｂＡ１ｃは、糖化ヘモグロビン中の割合が高く、血糖の変化を最も反映しやすい。ＨｂＡ１ｃは、半減期が約１ヶ月、寿命が約４ヶ月と長いため、ＨｂＡ１ｃの測定値は、過去１〜２カ月間の平均血糖値を反映する。また、ＨｂＡ１ｃ測定は、検査当日の食事制限がなく、被験者にとって負担が少ない。ＨｂＡ１ｃ測定法は、糖尿病患者の血糖コントロールの状態を知るのに極めて有効である。
【００１１】
ＨｂＡ１ｃの測定原理には、現在、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）法、免疫法（ラテックス法を含む）、酵素法等が知られている。
【００１２】
ＨＰＬＣ法は、現在、最も汎用される方法である。溶血血液検体に含まれる各種ヘモグロビンの分離に、非多孔性陽イオン交換充填剤を充填した分離カラムを用いる。検体がカラム中を流れる際、種々のヘモグロビン成分は、それぞれが持つ電荷とカラム充填剤の官能基との相互作用によって分離され、正電荷の小さい順に溶出される。こうして分離されたＨｂＡ１ｃを測定する。ＨＰＬＣ法の利点は、高分解能であり、また、ＨｂＡ１ｃ以外にＨｂＦも測定できることである。しかし、検査コスト高い、時間が要する等の欠点がある。
【００１３】
免疫法は、ＨｂＡ１ｃ（抗原）の抗体を用いた測定法であり、ＨｂＡ１ｃのみを選択的に測定することができる。ラテックス法は、溶血血液検体をラテックス粒子に吸着させ、ＨｂＡ１ｃに特異的な抗体を添加し、ラテックス表面に吸着したＨｂＡ１ｃと特異的な凝集塊を形成させる方法である。ラテックスに吸着されるＨｂＡ１ｃ量は、試料中に存在するヘモグロビンとＨｂＡ１ｃの比率に依存し、凝集塊は吸着したＨｂＡ１ｃ量に依存するため、凝集塊を吸光度変化量として測定することで、血液検体中のＨｂＡ１ｃ濃度を求めることができる。ラテックス法の利点は、自動分析装置を用いた大量処理が可能で検査コストが安い、ＨｂＡ１ｃのみを測定可能であることである。しかし、ＨｂＡ１ｃの測定精度が低いという問題がある。
【００１４】
酵素法は、溶血血液検体に含まれるＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端の糖化ジペプチドを特異的に分解するプロテアーゼを用いて、アミノ酸やペプチドに糖が結合した糖化アミノ酸や糖化ペプチドを生成させ、得られた糖化ペプチドにフルクトシルペプチドオキシダーゼ（非特許文献１）を作用させ、あるいは糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、これらを発色系に導く方法である。酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ法は、自動分析装置を用いた大量処理が可能で検査コストが安い、ＨｂＡ１ｃのみを測定可能であるという長所を有する。しかし、ＨｂＡ１ｃ分解操作が必要である、熱に弱い、糖化したｅ−Ｌｙｓにも反応する点で特異性が低い、Ｋｍが高い等の問題がある。
【００１５】
上記の汎用法以外にも、糖尿病を検出する方法が提案されている。例えば特許文献１は、唾液にＤＳＬ、ＥＣＬ、ＰＳＡ、ＷＧＡ、ＵＥＡ、ＭＡＬ  Ｉ、ＭＡＡ、ＰＮＡ、ＡＡＬ、ＬＴＬ、ＭＡＬ  ＩＩ、ＪＡＣ、ＬＥＬ、ＳＮＡ、ＰＴＬ  Ｉ、ＡＣＬ、ＧＳＬ  ＩＩ、ＶＶＡ、ＢＰＬ、ＷＦＬ、ＳＪＡ、ＭＰＬ、ＧＮＬ、ＨＨＬ、ＣＣＡ、ＮＰＬ、ＳＴＬ、ＰＨＡ−Ｌ、ＰＨＡ−Ｅ、ＧＳＬ  Ｉ、ＤＢＡ、ＨＭＡ、ＥＥＡ、ＬＰＡ、及びＰＴＬ  ＩＩからなる群より選択されるレクチンを反応させ、レクチン反応体を分析することによって、う食、歯周病、肺疾患、呼吸疾患、心血管疾患、糖尿病、周産期障害、粘膜感染、口腔癌、咽頭癌、前癌性病変、関連する自己免疫疾患、ＨＩＶ及び骨粗しょう症、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される疾患のリスクを予測、評価及び診断する方法を開示する。特許文献２では、血液、血清、骨髄液、尿、唾液等の体液、病理標本から抽出した組織可溶化物、生組織可溶化物、細胞可溶化物から選択される被検体由来サンプルに対して、ロータスレクチン、エンドウマメレクチン、レンズマメレクチン、ハリエニシダレクチン−Ｉ、コウジカビレクチン、ヒイロチャワンタケレクチン、キカラスウリレクチン−ＩＩから成る群から選択されるレクチンとの相互作用測定を行って、前記レクチンと親和性を有する糖鎖の量を測定し、測定された糖鎖の量により糖尿病性腎症の進行度を検出することを特徴とする糖尿病性腎症の進行度の検出方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表２００７−５２６８９８
【特許文献２】特開２０１０−２５６１３２
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】五味恵子等、「新規フルクトシルペプチドオキシターゼの開発とそれを用いた糖尿病診断法の構築」、２０１３年度生物工学会発表
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、従来技術の方法と同様に、ＨｂＡ１ｃの検出をすることにより、糖尿病を簡便かつ精度高く検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者等は、上記課題を鋭意検討した結果、以下の発明により解決できることを見出した。すなわち、本発明は、生体の血液から取得した検体に含まれるＨｂ１Ａｃに、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）又は麹菌レクチン（ＡＯＬ）を作用させることを特徴とする、糖尿病の検出方法である。特許文献１や２には、ＡＡＬやＡＯＬと糖尿病や糖尿病合併症の記載があるものの、本発明のようにＡＡＬ又はＡＯＬのみが生体の血液から取得した検体に含まれるＨｂＡ１ｃと作用して糖尿病の検出を可能とすることは教示されない。
【００２０】
前記検体は、ヒトから採取した赤血球であることが好ましい。
【００２１】
前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬは、標識されていることが好ましい。
【００２２】
本発明の方法は、前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬ、及び、１種以上のレクチン又は抗体を用いてＨｂＡ１ｃを検出することが好ましい。
【００２３】
本発明の方法は、前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬと抗Ｈｂ抗体とを用いたアッセイにより、ＨｂＡ１ｃを検出することが好ましい。
【００２４】
本発明は、また、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）又は麹菌レクチン（ＡＯＬ）を含む、糖尿病の検出用診断薬又はキットを提供する。
【００２５】
本発明の糖尿病の検出用診断薬又はキットは、さらに、抗Ｈｂ抗体を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
糖尿病が疑われるヒト等から採血して得られる検体にＡＡＬ又はＡＯＬを作用させることを必須に含む本発明は、ＨｂよりもＨｂＡ１ｃを優先して検出することができる。ＨｂＡ１ｃは血中グルコース濃度と相関することが公知であるため、本発明によれば、被験者の糖尿病の検出や血糖コントロールが可能となる。
【００２７】
本発明の検出方法は、従来技術の検出方法と比較して、コストが安い、安定性がある、ラテックス法と同様に測定が簡便である等の利点を有する。
【００２８】
ＡＡＬ又はＡＯＬを含む本発明の糖尿病検出用診断薬又はキットによれば、糖尿病やそれに基づく合併症の検出、これらの疾病の治療、予後の観察等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ｈｂ（−○−）又はＨｂＡ１ｃ（−■−）とＡＡＬとの反応性との反応性を示す図である。ＡＡＬは、Ｈｂ（○）よりもＨｂＡ１ｃ（■）に対して高い反応性を示す。
【図２】抗Ｈｂ抗体で捕獲した抗原（Ｈｂ（−○−）又はＨｂＡ１ｃ（−■−））とＡＡＬとの反応性との反応性を示す図である。ＡＡＬは、Ｈｂ（○）よりもＨｂＡ１ｃ（■）に対して高い反応性を示す。
【図３】抗ＨｂＡ１ｃ抗体で捕獲した抗原（Ｈｂ（−○−）又はＨｂＡ１ｃ（−■−））とＡＡＬとの反応性との反応性を示す図である。ＡＡＬは、抗ＨｂＡ１ｃ抗体で捕獲したＨｂＡ１ｃ（■）には反応しない。これは、ＨｂＡ１ｃのエピトープが抗ＨｂＡ１ｃ抗体によって保護されると、ＡＡＬが結合できないことを示唆する。
【図４】抗Ｈｂ抗体で捕獲した抗原（Ｈｂ（−○−）又はＨｂＡ１ｃ（−■−））とＡＯＬとの反応性との反応性を示す図である。ＡＯＬは、Ｈｂ（○）よりもＨｂＡ１ｃ（■）に対して高い反応性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の糖尿病の検出方法の実施の形態をより詳細に説明する。本発明の糖尿病の検出方法には、ヒトを含む動物の生体の血液から取得した検体を使用する。後述するように、ＡＡＬがＨｂＡ１ｃを検出する限界濃度は約５０μｇ／ｍＬである。したがって、検体の由来は、ヘモグロビンを多量に含んだ血液である必要がある。本発明の検出方法は、健康診断や糖尿病検診で採取した血液に適用することが好ましくは、特に好ましくは赤血球である。血液から赤血球を分離・精製する方法は、常法に基づく。
【００３１】
健常者の血中モグロビンの組成は、
約９０％のＨｂＡ０：α鎖２本とβ鎖２本からなる成人型Ｈｂ、
約７％のＨｂＡ１：ＨｂＡ０のβ鎖にグルコース、リン酸化糖等が結合したＨｂ、
約２％のヘモグロビンＡ２：α鎖２本とδ鎖２本からなるＨｂ、及び
約０．５％のＨｂＦ：α鎖２本とγ鎖２本からなる胎児型Ｈｂ、
で構成される。
【００３２】
このうち、ＨｂＡ１は、β鎖に結合した糖の種類によって、さらに以下の４種類：
ＨｂＡ１ａ１：２つのグルコース６リン酸が付加したＨｂ、
ＨｂＡ１ａ２：１つのグルコース６リン酸が付加したＨｂ、
ＨｂＡ１ｂ：グルコース以外の糖が付加したＨｂ、及び
ＨｂＡ１ｃ：ｂ鎖Ｎ末端にグルコースが付加したＨｂ
に分かれる。
【００３３】
４種類のうち最も多いものが、ＨｂＡ１ｃである。Ｈｂが糖化してＨｂＡ１ｃ糖化を生成する反応は非酵素的に起こるので、総ヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの割合は、血中グルコース濃度（血糖値）に依存する。これらのことを総合して、糖尿病治療における血糖コントロールの指標として、ＨｂＡ１ｃの測定値が使用されている。健常者のＨｂＡ１ｃの基準値は、総ヘモグロビンの４．３〜５．８％と規定されている。測定値が基準値をゆうに超えると（例えば６．１％以上）、糖尿病の疑いが濃厚となる。
【００３４】
本発明の糖尿病の検出方法は、前記検体に、ヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ、ＡＡＬ）又は麹菌レクチン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｌｅｃｔｉｎ、ＡＯＬ）を作用させることを必須に含む。ＡＡＬは、分子量約３６ｋＤａの二つのサブユニットからなる二量体タンパク質である。ＡＯＬは分子量約３５ｋＤａの二つのサブユニットからなる二量体タンパク質である。本発明者等は、意外にも、ＡＡＬやＡＯＬがＨｂよりもＨｂＡ１ｃに親和性を有することを発見した。ＡＡＬやＡＯＬは、Ｎ−アセチルグルコサミンにα−１，６結合したフコースや、Ｎ−アセチルラクトサミンにα−１，３結合したフコースに親和性を有することが知られているが、Ｈｂ１Ａ１ｃに親和性を有することは従来知られていない。
【００３５】
上記ＡＡＬには、ヒイロチャワンタケから抽出精製した天然由来のＡＡＬ、又は遺伝子組み換えのＡＡＬ（ｒＡＡＬ、例えば、株式会社Ｊ−オイルミルズ製の組換え遺伝子型のヒイロチャワンレクチン）も使用可能である。上記ＡＯＬには、遺伝子組み換えのＡＯＬ（例えば、月桂冠株式会社製、東京化成工業株式会社販売）が使用可能である。
【００３６】
前記ＡＡＬ又は前記ＡＯＬは、予め、標識手段が組み込まれていることが好ましい。このようなレクチンを以下、標識レクチンということがある。すなわち、標識レクチンは、ＡＡＬ又はＡＯＬと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されている。
【００３７】
前記標識手段としては、特に制限なく、公知の標識方法を適用でき、例えば、標識化合物の結合、放射性同位元素による標識化等を挙げることができる。
【００３８】
前記標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。
【００３９】
ＡＡＬやＡＯＬは、ＨｂＡ１ｃ以外に、フコースを有するタンパク質等にも高い親和性を有する。これらのタンパク質を検出から排除するために、血液中の赤血球を単離することが好ましい。単離は、遠心分離等の公知の方法で行うことができる。さらに、赤血球に低張液（例えば水）を加えバーストさせたものを使用してもよい。また、同様の理由で、本発明の検出方法は、ＨｂＡ１ｃと親和性を有する１種以上のレクチン又は抗体を用いて、ＨｂＡ１ｃを一次スクリーニングすることが好ましい。
【００４０】
前記スクリーニングのためのレクチンの例は、ＨｂＡ１ｃとの反応性を有するものであれば特に制限されない。例えば、後述する比較例によってヘモグロビン（ＨｂやＨｂＡ１ｃを含む）との親和性が明らかになったＵＡＥ−１（ハリエニシダレクチン）、ＨＨＡ（アマリリスレクチン）、ＭＰＡ（オサジオレンジレクチン）、ＬＣＡ（レンチルマメレクチン）、Ｌｏｔｕｓ（ロータスレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、及びＤＢＡ（ドリコスマメレクチン）が挙げられる。これらのレクチンを用いたレクチンクロマトグラフィーによって、血漿、血清等の検体からヘモグロビン（ＨｂやＨｂＡ１ｃを含む）を精製する。
【００４１】
前記抗体の具体例としては、抗Ｈｂ抗体が挙げられる。抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、実施例２に示すように、一次スクリーニングした抗原抗体反応物がＡＡＬと反応しなくなるので使用できない。
【００４２】
本発明の検出方法は、ＨｂＡ１ｃを含む赤血球タンパク質に直接、ＡＡＬやＡＯＬを作用させる。より好ましくは、ＡＡＬやＡＯＬと抗Ｈｂ抗体とを用いたサンドイッチアッセイによりＨｂＡ１ｃを検出することが特に好ましい。
【００４３】
サンドイッチアッセイでは、まず、得られた血液検体を抗Ｈｂ抗体と反応させて、Ｈｂ及びＨｂＡ１ｃと抗Ｈｂ抗体との結合体を得る。これらの結合体を、アフィニティクロマトグラフィー、免役沈降等で単離精製する。次いで、結合体にＡＡＬ（又はＡＯＬ）と反応させ、ＡＡＬ（又はＡＯＬ）−ＨｂＡ１ｃ−抗Ｈｂ抗体結合体を得る。
【００４４】
なお、サンドイッチアッセイは、まず、ＨｂＡ１ｃを含む検体とＡＡＬ（又はＡＯＬ）とを反応させて、ＡＡＬ（又はＡＯＬ）−ＨｂＡ１ｃ結合体を得、次いで、このＡＡＬ（又はＡＯＬ）−ＨｂＡ１ｃ結合体に抗Ｈｂ抗体を反応させて、ＡＡＬ（又はＡＯＬ）−ＨｂＡ１ｃ−抗Ｈｂ結合体を得てもよい。
【００４５】
ＨｂＡ１ｃを認識する抗Ｈｂ抗体は、常法に基づいて得ることができる。一例として、抗原としてのＨｂを動物に免疫することにより得る方法がある。抗Ｈｂ抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。
【００４６】
ＡＡＬ（又はＡＯＬ）とＨｂＡ１ｃとの結合の検出には、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ等）、レクチンクロマトグラフィー、レクチンブロット、レクチン染色、レクチンチップ、凝集法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等の表面プラズモン共鳴法、等が挙げられる。特に、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いる検出が、感度が高い点で好ましい。
【００４７】
ＥＬＩＳＡ法（直接吸着法）では、プレートに血液等の検体を添加し、固定化する。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、反応させる。２次標識化合物としてＨＲＰ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン溶液を添加して、アビジンとストレプトアビジンとを反応させる。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計（ＨＲＰの場合、波長４５０ｎｍ−６００ｎｍ）で測定する。予め、既知の濃度のＨｂＡ１ｃを含む標準試料によって検量線を作成しておけば、ＨｂＡ１ｃの定量化も可能である。
【００４８】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、プレートに抗Ｈｂ抗体を添加し固定化してから、血清等の検体を添加する。次いで、ビオチン標識したレクチンを添加して、赤血球に含まれるＨｂＡ１ｃとレクチンとを反応させる。２次標識化合物としてＨＲＰ（ホースラディッシュパーオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン溶液を添加して、アビジンとストレプトアビジンとを反応させる。次いで、ＨＲＰ用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計（ＨＲＰの場合、波長４５０ｎｍ−６００ｎｍ）で測定する。予め、既知の濃度のＨｂＡ１ｃを含む標準試料によって検量線を作成しておけば、ＨｂＡ１ｃの定量化も可能である。
【００４９】
健常者は、総ヘモグロビン中に５％程度のＨｂＡ１ｃを含む。本発明の検出方法を用いて、予め、健常者のＨｂＡ１ｃの基準レベルを測定しておくとよい。健常者の数値を閾値として、糖尿病が疑われる患者から取得したＨｂＡ１ｃ測定値が前記閾値よりも高ければ、糖尿病の疑いが濃厚である。
【００５０】
レクチンクロマトグラフィーは、担体に固定化されたレクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。ＨＰＬＣと組み合わせることでハイスループットを期待することができる。
【００５１】
レクチンの固定化担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミド等のゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Ｂやセファロース６Ｂ（共にＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）が挙げられる。レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。
【００５２】
固定化するＡＡＬやＡＯＬの濃度は、通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。
【００５３】
被検体をカラムにかけた後、洗浄の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭであり、ｐＨが４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０であり、ＮａＣｌ含量が０〜０．５Ｍ、好ましくは０．１〜０．２Ｍであり、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２含量が０〜１０ｍＭ、好ましくは０〜５ｍＭの緩衝液である。
【００５４】
アフィニティカラムの洗浄後、ＨｂＡ１ｃの溶出は、糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０〜２００ｍＭ濃度である。
【００５５】
本発明は、またＡＡＬやＡＯＬを含む、糖尿病の検出用診断薬又はキット（以下、本発明の診断薬という）を提供する。ＡＡＬやＡＯＬは、標識されていることが好ましい。
【００５６】
上記診断薬又はキットには、適宜、標識（酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質）、緩衝液、プレート、反応停止液等の診断薬キットに公知のものを含む。特に、生体の血液から取得した検体からＨｂＡ１ｃを抽出するための試薬（例えば抗Ｈｂ抗体やＨｂＡ１ｃと親和性を有するレクチン）を含むことが好ましい。
【００５７】
本発明の診断薬の用途として、糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等の細小血管障害、脳血管障害、虚血性心疾患、糖尿病性壊疽等の大血管障害、高脂血症、冠動脈、能動脈や手足での動脈硬化症、慢性感染症、胆石症、白内障や血管新生緑内障による失明等の慢性合併症の検出、これらの疾病の治療、予後の観察が挙げられる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明の実施例及び比較例を示して、本発明をより詳細に説明する。
〔実施１及び２、比較例１〜３１〕ＡＡＬとＨｂＡ１ｃとの結合試験
１．被検液の調製
精製したヒト由来ＨｂＡ１ｃ（ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社より入手、以下、ＨｂＡ１ｃという）、又はヒト由来Ｈｂ（ＳＩＧＭＡ社より入手、以下、Ｈｂという）を、ダルベッコＰＢＳ（和光純薬社製）でタンパク質濃度３００μｇ／ｍｌになるように溶解した（Ｈｂ液、又は、ＨｂＡ１ｃ液）。一方、ヒト赤血球（Ｌｅｅ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．より入手、以下、ＲＢＣという）に等量の蒸留水を添加後、振盪混和して溶血させた。この試料を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で３７℃、３０分間、放置して変性させた。変性液のタンパク濃度をＢＣＡタンパク質測定キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）で測定し、タンパク質濃度３００μｇ／ｍｌになるようダルベッコＰＢＳで希釈した（ＲＢＣ液）。Ｈｂ液、ＨｂＡ１ｃ液、又はＲＢＣ液２５μＬを、ＥＩＡプレート（グライナー社、ハーフエリア、平底、高結合、９６穴）に入れ、４℃で１７時間、静置した。
【００５９】
ダルベッコＰＢＳ（和光純薬社製）にＴｗｅｅｎ２０を０．０５ｖ／ｖ％加えたＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加えて洗浄した。ダルベッコＰＢＳで溶解した１ｗ／ｖ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ溶液）を６０μＬずつ入れ、３７℃で６０分間、静置した。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加えて捨てる洗浄操作を３回繰り返した。
【００６０】
２．ＥＬＩＳＡを用いたレクチン反応の検出
表１に示す３１種類のビオチン標識レクチンを１〜２０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈したレクチン溶液を調製した。各レクチン溶液２５μＬ加え、４℃で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加える洗浄操作を３回繰り返した。西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンを１μｇ／ｍＬに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製した検出用試薬を２５μＬ加え、３７℃で３０分間、静置した。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加えて捨てる洗浄操作を３回繰り返した。発色試薬としてＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社製）を使用し、そのマニュアルに記載に従って、４５０ｎｍと６００ｎｍの吸光度を測定し、その差ＯＤ（４５０−６００ｎｍ）を計算し、標識抗体の結合量とした。
【００６１】
ＨｂＡ１ｃ、Ｈｂ又はＲＢＣ（濃度３００μｇ／ｍＬ）に対する各レクチンの反応性を、表１に示す。
【表１】
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１：株式会社Ｊ−オイルミルズ
２：東京化成工業株式会社
【００６２】
表１から、ＨｂＡ１ｃに一定の親和性を有するレクチンは、実施例１〜３のＡＡＬ、ｒＡＡＬ及びＡＯＬ、並びに比較例１〜７のＵＨＡ−１、ＨＨＡ、ＭＰＡ、ＬＣＡ、Ｌｏｔｕｓ、ＥＣＡ及びＤＢＡである。比較例のレクチンは、ＨｂＡ１ｃよりもＨｂに高い親和性を有するため、糖尿病のマーカーであるＨｂＡ１ｃを優先的に検出できない。一方、本願発明に使用するＡＡＬ等は、ＨｂよりもＨｂＡ１ｃに高い親和性を有するため、ＨｂＡ１ｃの優先的な検出が可能である。したがって、本発明の方法は、糖尿病マーカーであるＨｂＡ１ｃの検出と、それに基づく糖尿病の検出が期待できる。
【００６３】
ＡＡＬやＡＯＬは、ＨｂよりもＨｂＡ１ｃに対して高い親和性を示すことから、ＡＡＬは、ＨｂになくＨｂＡ１ｃのみが有する糖鎖、すなわち、β鎖のＮ末端アミノ基に結合したグルコースを認識している可能性が高い。ＡＡＬやＡＯＬは、従来、フコースとの親和性が高いレクチンであることが知られている。しかし、ＡＡＬやＡＯＬがフコースと関連しないＨｂＡ１ｃと高い親和性を有することは、従来の知見から予測できない。また、阻害糖として、フコースを添加した場合、ＨｂＡ１ｃとの結合が見られなくなることより、レクチンの糖結合部位との結合であることも明らかとなった。
【００６４】
Ｈｂ液及びＨｂＡ１ｃ液のタンパク質濃度を変更した以外は実施例１と同様の手順で行った結果を、図１に示す。図１は、ＡＡＬとＨｂＡ１ｃとの反応性を示している。ＡＡＬがＨｂＡ１ｃを検出するのに必要なＨｂＡ１ｃ濃度（ＨｂＡ１ｃ検出限界濃度／陰性対照の標準偏差の３．３倍で算出）を測定したところ、５０μｇ／ｍＬであった。血液中のＨｂ濃度が１００ｍｇ／ｍＬと高く、糖尿病患者やその予備群はその約５％を超える量がＨｂ１Ａｃに変性しているため、この検出限界濃度でも充分に血液検査が可能である。
【００６５】
３．サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたレクチン反応の検出
レクチンの発見が動物血球を凝集させることに始まったように、Ｈｂ以外の血球成分と反応するレクチンも多い。ＡＡＬレクチンが赤血球に含まれるＨｂＡ１ｃ以外の成分と結合している可能性を調べる必要がある。それは、固定化抗Ｈｂ抗体に捕獲させたＨｂ又はＨｂＡ１ｃとレクチンとの反応性を調べることで、夾雑タンパク質との反応を除くことができる。
【００６６】
まず、抗Ｈｂシープポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社より入手）又は抗ＨｂＡ１ｃラビットポリクローナル抗体（Ｇｏｏｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社より入手）を、１０μｇ／ｍＬになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で調製した。この溶液５０μＬをＥＩＡプレートに入れ４℃で１７時間、静置した。１５０μＬのＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＢＳＡ溶液を６０μＬ入れ、３７℃で６０分間、静置した。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加えて捨てる洗浄操作を３回繰り返した。
【００６７】
Ｈｂ溶液（０〜２００μｇ／ｍＬ）は、ヒト由来Ｈｂ（ＳＩＧＭＡ社より入手）を０〜２００μｇ／ｍＬになるように、ダルベッコＰＢＳで調製した。また、ＨｂＡ１ｃ溶液（０〜２００μｇ／ｍＬ）は、ヒト由来ＨｂＡ１ｃ（ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社より入手）を０〜２００μｇ／ｍＬになるようにダルベッコＰＢＳで調製した。
【００６８】
プレートにＨｂ溶液、又は、ＨｂＡ１ｃ溶液を２５μＬ添加し、３７℃で６０分間、予め固定化した抗体と反応させた。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加える洗浄操作を３回繰り返した。ビオチン標識ＡＡＬ（５μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製）を２５μＬ加え、４℃で３０分間、静置した。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加える洗浄操作を３回繰り返した。ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを１μｇ／ｍＬに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製した検出用試薬を２５μＬ加え、３７℃で３０分間、静置した。ＰＢＳ−Ｔを１５０μＬ加えて捨てる洗浄操作を３回繰り返した。
【００６９】
発色試薬には上記ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍを使用し、マニュアルに記載の通り、４５０ｎｍと６００ｎｍの吸光度を測定しその差を標識抗体の結合量として計算した。結果を、図２及び図３に示す。
【００７０】
図２は、抗Ｈｂ抗体で捕獲した抗原とＡＡＬとの反応性を示す。図２から、ＡＡＬは、Ｈｂ（○）よりもＨｂＡ１ｃ（■）に対して高い反応性を示すことがわかる。これは、表１の結果と一致する。
【００７１】
図３は、抗ＨｂＡｌｃ抗体で捕獲した抗原とＡＡＬとの反応性を示す。図３に示すように、ＡＡＬは、抗ＨｂＡ１ｃ抗体で捕獲したＨｂＡ１ｃ（■）には反応しない。これは、ＨｂＡ１ｃのエピトープが抗ＨｂＡ１ｃ抗体によって保護されると、ＡＡＬが結合できないことを示唆する。
【００７２】
ビオチン標識ＡＡＬに代えてビオチン標識ＡＯＬを用いた以外はＡＡＬと同様の実験（抗Ｈｂシープポリクローナル抗体を使用）を行った。図４は、抗Ｈｂ抗体で捕獲した抗原とＡＯＬとの反応性を示す。図４に示すように、ＡＯＬは、Ｈｂ（○）よりもＨｂＡ１ｃ（■）に対して高い反応性を示す。これは、表１の結果と一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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