(57)【要約】【課題】タンパク質やペプチド、とりわけ親水性に富むタンパク質／ペプチドを基板上にスポッティングする際に、滲むことなく固定化することができるより安価な支持体や、該支持体に抗原、抗体等のタンパク質／ペプチドが担持された基板を提供すること。【解決手段】アミノ基等の正の電荷、又はカルボキシル基等の負の電荷を帯びる官能基が結合した基板や、正又は負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板、好ましくは化学架橋剤により活性化した基板に、シリコーン表面処理を施した後に乾燥したシリコーン表面処理支持体に、抗原や抗体等のタンパク質又はペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板に、シリコーン表面処理を施したことを特徴とする表面処理支持体。
【請求項２】
正の電荷を帯びる官能基がアミノ基であることを特徴とする請求項１記載の表面処理支持体。
【請求項３】
負の電荷を帯びる官能基がカルボキシル基であることを特徴とする請求項１記載の表面処理支持体。
【請求項４】
正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板が、さらに化学架橋剤により活性化されたことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の表面処理支持体。
【請求項５】
シリコーン表面処理後に、さらに、乾燥処理が行われていることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の表面処理支持体。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の表面処理支持体に、タンパク質又はペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理が行われていることを特徴とする表面担持基板。
【請求項７】
タンパク質又はペプチドが、タンパク質又はペプチド抗原若しくは抗体であることを特徴とする請求項６記載の表面担持基板。
【請求項８】
ブロッキング処理を、プロテインフリーバッファー、あるいは検出に障害を及ぼすことなくブロッキングに有効な生体成分を含有するバッファーで行ったことを特徴とする請求項６又は７記載の表面担持基板。
【請求項９】
請求項７又は８記載の表面担持基板と、抗体を含む試料とを接触させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗体の検出方法。
【請求項１０】
請求項７又は８記載の表面担持基板と、抗原を含む試料とを接触させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗原の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質又はペプチドを担持しうるシリコーン表面処理支持体や、該タンパク質又はペプチドを担持しうるシリコーン表面処理支持体に抗原等のタンパク質又はペプチドが担持された表面担持基板等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーの原因には、食物を原因とする食物アレルギー、ごみ・埃を原因とする塵アレルギー、家ダニ、花粉を原因とする吸入アレルギー、花粉症、接触性皮膚炎、金属アレルギー、薬物アレルギー、アトピーなど様々なアレルギーが知られている。これらの中でも、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、食品成分から抽出したアレルゲンを付着させた基板をアレルギー疾患患者から得た検体と反応させることによって、特定アレルゲンにより起こされるアレルギー反応に関連する抗体の種類を検出することができるアレルギー診断法の開発がすすめられている。また居住環境からのアレルゲンを原因とする吸入アレルギーも年々増加しており、環境変化に対応したアレルギー診断法の開発が求められている。一方、加工食品中のアレルゲン含量を測定して、国民に食の安全と安心を提供する必要性から、アレルゲンを特異的に認識する抗体を固定化した基板を用いたアレルゲン含量測定方法の開発もすすめられている。
【０００３】
本発明者らは、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ（Diamond-like Carbon）基板を活性化試薬により活性化した後、蛋白質／ペプチドを前記基板上にスポッティングしてカップリング反応を行う、基板上に蛋白質／ペプチドを固定する方法であって、スポッティング添加剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる蛋白質／ペプチドの固定化方法（例えば、特許文献１参照）や、化学修飾したダイヤモンド／ＤＬＣ基板を活性化試薬により活性化した後、アレルゲンのアレルゲンエピトープ又はアレルゲンエピトープを含むペプチドのカップリング反応を行い、次いで未反応活性基のブロッキング操作を行ったアレルゲンエピトープ判定基板に、検体を接触させ、アレルゲンエピトープ判定基板に捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体をイムノアッセイにより検出し、アレルゲンの拡大／縮小パターン及び／又はアレルゲンエピトープの拡大／縮小パターンを判定するアレルギー疾患の判定方法（例えば、特許文献２参照）を提案してきた。
【０００４】
生体分子を検出する装置としては、基板上に、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する固体支持体（例えば、特許文献３参照）や、基板と、前記基板上に形成された、核酸分子を静電的に引き寄せる静電層と、前記静電層上に形成された核酸分子と共有結合しうる官能基とを有する固体支持体（例えば、特許文献４参照）や、シリコン（Ｓｉ）基体上に、ＳｉＯ２層及び生体分子と共有結合しうる官能基を有する担体（例えば、特許文献５参照）等が提案されている。これらの基板は、ＤＮＡ等の核酸分子を固定化し、ハイブリダイゼーション等の反応を行うためには有利な基板であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２６７０５８号公報
【特許文献２】特開２００６−２６７０６３号公報
【特許文献３】特開２００５−１９５４６５号公報
【特許文献４】特開２００８−２９２４８２号公報
【特許文献５】特開２００７−１１４０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、タンパク質やペプチド、とりわけ親水性に富むタンパク質／ペプチドを基板上にスポッティングする際に、滲むことなく固定化することができるより安価な支持体や、該支持体にタンパク質／ペプチドが担持された基板を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、前記特許文献３や４記載のＤＮＡ等の核酸分子の固定化用支持体に、タンパク質やペプチド抗原のスポッティングによる固定化を試みたところ、殆どの基板において、タンパク質／ペプチド抗原の滲み現象が観察された。この結果は、かかる基板に固定化したタンパク質やペプチド抗原と試料中の抗体との抗原抗体反応検査を行う上で正確性に問題があるということを意味する。すなわち、カチオンやアニオンの層を有する固体支持体は表面が親水性に富むため、支持体に固定化するタンパク質／ペプチドの親水性が高い場合、タンパク質／ペプチドのスポッティング後に基板表面で滲みが生じ、解析が困難であった。
【０００８】
本発明者らは、かかる課題を解決するために、検量用の内部標準としても使用しているがスポッティング後の基板上において滲みが特に生じていた、ヒト非特異的ＩｇＥ抗体や、同様にスポッティング時に滲みが特に生じていた牛アルブミン抗原とを用いて検討を続けてきたが、シリコーン溶液を用いて基板の表面処理を行った場合に、滲みを防止することができ、基板表面上のカルボキシル基を損なわずに固定化することができることを見いだした。さらに、タンパク質／ペプチドの基板上への固定化がより効率よく行われる詳細な条件についても確認し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明を以下に示す。
（１）正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板に、シリコーン表面処理を施したことを特徴とする表面処理支持体；
（２）正の電荷を帯びる官能基がアミノ基であることを特徴とする上記（１）記載の表面処理支持体；
（３）負の電荷を帯びる官能基がカルボキシル基であることを特徴とする上記（１）記載の表面処理支持体；
（４）正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板が、さらに化学架橋剤により活性化されたことを特徴とする上記（１）〜（３）いずれか記載の表面処理支持体；
（５）シリコーン表面処理後に、さらに、乾燥処理が行われていることを特徴とする上記（１）〜（４）いずれか記載の表面処理支持体；
（６）上記（１）〜（５）いずれか記載の表面処理支持体に、タンパク質又はペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理が行われていることを特徴とする表面担持基板；
（７）タンパク質又はペプチドが、タンパク質又はペプチド抗原、若しくは抗体であることを特徴とする上記（６）記載の表面担持基板；
（８）ブロッキング処理を、プロテインフリーバッファー、あるいは検出に障害を及ぼすことなくブロッキングに有効な生体成分を含有するバッファーで行ったことを特徴とする上記（６）又は（７）記載の表面担持基板；
（９）上記（７）又は（８）記載の表面担持基板と、抗体を含む試料とを接触させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗体の検出方法；    
（１０）上記（７）又は（８）記載の表面担持基板と、抗原を含む試料とを接触させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする抗原の検出方法；  
【発明の効果】
【００１０】
本発明のシリコーン表面処理支持体を用いることにより、微量のタンパク質／ペプチドを、そのコンフォメーションが維持されて、活性が損なわれないまま支持体に滲むことなく固定化することができ、例えば、アレルゲン候補となる様々なタンパク質／ペプチド抗原をシリコーン表面処理支持体に固定した表面担持基板とアレルギー疾患患者から得た検体とを反応させることによって、各種アレルゲンに対する抗体の種類とその存在量を特定することができる。また、特定アレルゲンに反応する抗体を固定化した本発明の基板と食品試料とを接触させることにより、食品中のアレルゲンを検出、定量することができる。
【００１１】
また本発明によると、スポッティングされるタンパク質／ペプチドに対して基板表面の親和性が高い場合に発生する滲み現象を抑制・防止することができるので、固定化されたタンパク質／ペプチドと反応する抗体／抗原を画像情報として取得する際の、画像情報の境界の不明瞭さを解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】基板に結合したアミノ基がジカルボン酸によりさらに修飾されている分子種に、化学架橋剤を構成する脱水縮合剤である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）とエステル化剤であるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを反応させ、前記分子種のカルボン酸とＮＨＳとが脱水縮合することにより、不安定なエステル結合（活性エステル）が形成される反応の概略を示す図である。なおジカルボン酸の代わりに多価カルボン酸で修飾される場合も、ＷＳＣとＮＨＳにより活性エステルが同様に形成される。
【図２】シリコーン表面処理支持体に、スポッティングしたＩｇＥ抗体を標識二次抗体と反応させた場合の各々の蛍光画像と、シリコーン表面処理支持体にスポッティングした標識牛アルブミン抗原の蛍光画像とを蛍光スキャナー３Ｄ−Ｇｅｎｅ（東レ株式会社）を用いて取得した場合のスポッティング形状を示した図である。（ｂ）は０．０００１％シリコーンにより、（ｃ）は０．００１％シリコーンにより、（ｄ）は０．０１％シリコーンにより、シリコーン表面処理を行った場合を示す。（ａ）は、シリコーン表面処理を行わないネガティブコントロールである。（ｅ）は、（ａ）〜（ｄ）においてスポッティングした抗原や抗体のレイアウト図を示す。
【図３】１２ウェル毎のスポット形成不良数を比較した結果を示すグラフである。
【図４】化学架橋剤に含まれる緩衝液のｐＨによる標識二次抗体の蛍光強度の相違を示した図である。（ａ）酢酸緩衝液、（ｂ）リン酸緩衝液、（ｃ）炭酸緩衝液の結果を示す。
【図５】シリコーン表面処理後の乾燥処理温度が、（ａ）３７℃、（ｂ）１２０℃、（ｃ）１５０℃、及び（ｄ）１８０℃である場合の、それぞれの温度におけるスポットの標識二次抗体の蛍光強度を表す図である。（ｅ）は、（ａ）〜（ｄ）においてスポッティングした抗原や抗体のレイアウト図を示す。
【図６】シリコーン表面処理後の乾燥処理温度が、３７℃、１２０℃、１５０℃及び１８０℃である場合の、それぞれの温度におけるバックグラウンドの値を示すグラフである。
【図７】市販のＤＮＡ等の核酸分子固定化用活性化静電層基板（シリコーン表面処理支持体、ジーンスライド）の再活性化の有無による基板へのＩｇＥ抗体の結合量を、標識二次抗体の蛍光量として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の表面処理支持体としては、正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板に、シリコーン表面処理を施したシリコーン表面処理支持体であれば特に限定されず、上記基板の材質としては、シリコン；ガラス；シリカガラス；ステンレス；セラミックス；ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等のプラスチック；を例示することができる。また、かかる基板の表面がダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質又は炭化物から選ばれる１又は２以上により表面処理されているものや、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂がバインダーとして混合されている態様のものも基板として用いることができる。上記シリカガラスとしては、ガラス表面にＳｉＯ４四面体がランダム結合している、Ｎａ+、Ｃｌ−、（Ｂ３）３−等のイオンが共存するガラス基板を挙げることができるが、かかるシリカガラスも本発明の基板を調製する方法に従うことにより、本発明の基板として利用可能である。
【００１４】
上記正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板としては、正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板や、正又は負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板を挙げることができる。
【００１５】
上記正の電荷を帯びる官能基を有する基板を調製するために用いることができる化合物としては、ＮＨ３、及び、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物を挙げることができ、具体的には、ＮＨ３；エチレンジアミン；ヘキサメチレンジアミン；ｎ−プロピルアミン；モノメチルアミン；ジメチルアミン；モノエチルアミン；ジエチルアミン；アリルアミン；アミノアゾベンゼン；エタノールアミン等のアミノアルコール；アクリノール；アミノ安息香酸；アミノアントラキノン；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸；アニリン；又はこれらの重合体としてのポリアリルアミン、ポリリシンや、４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどの多価アミン；を挙げることができ、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを好適に例示することができる。必要に応じてこれらの２種以上を用いることもできる。
【００１６】
上記負の電荷を帯びる官能基が結合した基板を調製するために用いることができる化合物としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基を有する化合物を挙げることができ、必要に応じてこれらの２種以上を用いることもできる。
【００１７】
上記正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板は、常法により調製することができ、例えば、上記アミノ基を有する化合物と上記基板とを共有結合させて調製する場合には、塩素ガス中で基板に紫外線を照射することにより基板表面を塩素化し、次いで、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させることにより基板と結合していない側の自由端にアミノ基を導入する方法や、基板表面を塩素化した後、ＮＨ３ガス中でＵＶ照射することにより、アミノ基を導入する方法を挙げることができる。
【００１８】
前記アミノ基を有する化合物と基板とを共有結合以外の態様にて結合させる方法としては、前記ＮＨ３と基板とを製膜装置内に導入する方法を好適に例示することができる。
【００１９】
上記正の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板の一態様として、上記正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板を、それぞれ正の電荷を帯びる官能基を有する分子によって修飾した基板を挙げることができ、同様に、上記負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板の一態様として、上記正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板を、それぞれ負の電荷を帯びる官能基を有する分子によって修飾した基板を挙げることができるが、中でも上記正の電荷を帯びる官能基が結合した基板が、さらにカルボキシル基を有する分子によって修飾されている、負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板を好適に挙げることができる。
【００２０】
上記カルボキシル基を有する分子によって修飾されている基板を調製するために用いられる化合物としては、式：Ｘ−Ｒ1−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ1は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示される、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸等のハロカルボン酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ2は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示される、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸等のジカルボン酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸等の多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ4は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示される、コハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド等のジカルボン酸のモノハライド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸等の酸無水物を例示することができるが、中でもジカルボン酸や多価カルボン酸を好適に例示することができる。
【００２１】
上記正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板が、それぞれ負又は正の電荷を帯びる官能基を有する分子によって修飾されている基板を調製する方法としては、例えば、アミノ基を有する基板におけるアミノ基と上記ジカルボン酸や多価カルボン酸のカルボキシル基が脱水縮合してアミド結合を形成する反応により調製する公知の方法を挙げることができ、また、市販の「ジーンスライド（登録商標）」（東洋鋼鈑社製）を利用することもできる。
【００２２】
正又は負の電荷を帯びる官能基を有する基板は、化学架橋剤により活性化することが好ましい。かかる活性化された基板としては、上記負の電荷を帯びる官能基が結合した基板や、上記負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板を、化学架橋剤中で振盪する活性化処理が施された基板を挙げることができ、かかる活性化処理は、遮光した状態で行うことがより好ましい。上記化学架橋剤としては、脱水縮合剤とエステル化剤と緩衝液とを含む溶液を挙げることができる。
【００２３】
上記脱水縮合剤としては、例えば、カルボン酸を活性化する脱水縮合剤として、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジ−ｐ−トルオイルカルボジイミド、ベンジルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(ＢＤＣ)、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドヨージド（ＥＡＣ）等のカルボジイミド誘導体や、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート等のイソキサゾリウム誘導体や、１，１'−カルボン−イルジイミダゾール等のカルボニルジイミダゾールや、ｎ−(エトキシカルボニル)−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＱＤ)、ｎ−(イソブトキシカルボニル)−２−イソブトキシ−１，２−ジヒドロキノリン(ＩＩＤＱ)等のｎ−カルバルコキシジヒドロキノリンを例示することができる。
【００２４】
上記エステル化剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ；N-Hydroxy-succinimide）、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン等を例示することができる。
【００２５】
上記緩衝液としては、アミノ基を含まないｐＨ３.０〜８．０の緩衝液が好ましく、具体的にはｐＨ３.０〜８．０のリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ジメチールグルタル酸緩衝液、こはく酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリメチルピリジン緩衝液、モルフォリンプロパンスルフォン酸緩衝液、ジエチールバルビタール酸緩衝液、エチールモルフォリン緩衝液、水酸化エチレンピペラジン、エタンスルフォン酸緩衝液、水酸化エチレンピペラジン、プロパンスルフォン酸緩衝液を例示することができる。
【００２６】
上記活性化処理によって、例えば、図１に示すとおり、ＮＨＳがカルボン酸と脱水縮合し、不安定なエステル結合であるＮＨＳ体が活性エステルとして形成されることにより、活性化された基板が調製される。
【００２７】
アミノ基を有する基板にさらにカルボキシル基を有する分子によって修飾されている、カルボキシル基を自由端に有する分子種が結合した基板を活性化する別法としては、上記ジカルボン酸又は多価カルボン酸等を予め上記脱水縮合剤やエステル化剤を用いて活性化させた後、水、Ｎ−メチルピロリドン又はエタノールの溶液中において、上記アミノ基を有する基板を化学修飾する方法（別法１）や、アミノ基を有する基板にカルボキシル基を有する分子を修飾する反応を上記脱水縮合剤やエステル化剤の存在下に行う方法（別法２）を挙げることができる。活性化された基板としては、市販の「ジーンスライド（登録商標）（活性化済）」（東洋鋼鈑社製）も利用することができる。
【００２８】
本発明におけるシリコーン表面処理は、（１）正又は負の電荷を帯びる官能基が結合した基板；（２）正又は負の電荷を帯びる官能基を自由端に有する分子種が結合した基板；（３）上記（１）又は（２）の基板がさらに活性化された基板；（これら３種の基板を総称して「表面処理基板類」ということもある）において、表面処理基板類表面の官能基とタンパク質／ペプチドの官能基との反応性が損なわれない程度に、表面処理基板類表面に疎水性のシリコーン表面膜を形成するもので、本発明の表面処理支持体の調製における必須の構成である。
【００２９】
上記シリコーン表面膜を表面処理基板類表面に形成するためのシリコーン表面処理の方法としては、上記表面処理基板類をシリコーン水溶液中に浸漬する方法を挙げることができ、表面処理基板類表面においてより均一にシリコーン表面処理を行うために、ソニケーター等による超音波処理を併用することが好ましい。上記シリコーンの水溶液の濃度としては、０．０００２％〜０．１％ｖ／ｖが好ましく、０．０００５％〜０．０５％ｖ／ｖがより好ましく、０．００１〜０．０２％ｖ／ｖがさらに好ましく、０．００５〜０．０１５％ｖ／ｖが特に好ましい。
【００３０】
上記シリコーン表面処理の工程における、シリコーン水溶液中の浸漬処理時間としては、１０秒〜１時間、好ましくは１〜４５分間、より好ましくは２〜３０分間、さらに好ましくは３〜２０分間、特に好ましくは５〜１５分間を挙げることができる。上記シリコーン水溶液浸漬後の表面処理基板類は、余分なシリコーンのゲル化を防ぐため、ＭｉｌｌｉＱ水等で１回又は２回以上洗浄することが好ましい。
【００３１】
上記シリコーンとしては、表面処理基板類表面に、タンパク質／ペプチドが滲むことなく固定化される程度に、表面処理基板類に疎水性を付加することができるシリコーンであれば特に制限されず、ヘキサメチルシクロトリシロキサン，オクタメチルシクロテトラシロキサン，デカメチルシクロペンタシロキサン，ドデカメチルシクロヘキサシロキサンなどの環状体シリコーンオイル、ポリジメチルシロキサンのメチル基の一部又は全部がフェニル基、水素原子、炭素数２以上のアルキル基、ハロゲン化フェニル基、フルオロエステル基で置換されたシリコーンオイルを挙げることができ、具体的には、ポリジメチルシロキサン、分子鎖両末端トリメチルシロキシ基封鎖ジメチルポリシロキサン等のポリアルキルシロキサン、分子鎖両末端トリメチルシロキシ基封鎖ジメチルシロキサン・メチルフェニルシロキサン共重合体，分子鎖両末端トリメチルシロキシ基封鎖ジメチルシロキサン・メチル（３,３,３−トリフルオロプロピル）シロキサン共重合体等の直鎖状の非反応性シリコーンオイル等を挙げることができ、中でもポリアルキル（Ｃ１〜２０）シロキサン(ＣＡＳ ６３１４８−６２−９)を好適に挙げることができる。これらは１種類又は２種類以上併用することもできる。
【００３２】
シリコーン表面処理後に、乾燥処理を行うことが好ましい。かかる乾燥処理は、本発明のシリコーン表面処理支持体の調製工程において、タンパク質／ペプチドの固定化の前処理として、タンパク質／ペプチドの固定化量の均一性を維持するために実施することが好ましい。かかる乾燥処理としては、ドライオーブン、真空デシケーター及び／又は乾燥剤を用いて行う処理を挙げることができ、乾燥処理温度としては、３０〜１７８℃、好ましくは３７〜１７５℃、より好ましくは８０〜１７０℃、さらに好ましくは１２０〜１６０℃、特に好ましくは１４０〜１５５℃を挙げることができ、１８０℃以上になるとバックグラウンドが上昇するおそれがある。乾燥処理時間としては、３０分〜１２時間、好ましくは１〜６時間、より好ましくは２〜４時間、特に好ましくは２．５〜３．５時間を挙げることができる。
【００３３】
本発明のシリコーン表面処理支持体に、周知のスポッティング用器材を用いて、タンパク質又はペプチド等を基板表面に固定化することができる。タンパク質／ペプチドの固定化の態様としては、アミド結合反応を好適に挙げることができ、具体的には、加熱により、又は、上記活性化した基板における活性エステルを介するカップリング反応させることにより、タンパク質／ペプチドにおけるアミンと基板上のカルボキシル基とのアミド結合を形成する反応を挙げることができる。また、スポッティング後２０〜４２℃で１〜５時間、好ましくは２５℃で３時間インキュベーションすることにより固定化することが好ましい。
【００３４】
上記タンパク質／ペプチドのスポッティングの際には、タンパク質／ペプチドの機能を維持するため、及び／又は、タンパク質／ペプチドの基板への結合量を増加させるために、ＰＥＧ；ＤＭＳＯ；グリシン；ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）；グリセロール、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、又はシクロデキストリン等の溶解液；から選ばれる１又は２以上をスポッティング添加剤として混合してスポッティングすることが好ましい。これらのスポッティング添加剤は、N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＣＡＰＳ）緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解して用いることもできる。
【００３５】
本発明の表面処理支持体に、タンパク質／ペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理を行うことが好ましい。かかるブロッキング処理は、残存する正又は負の電荷を帯びる官能基を不活化するためにブロッキング剤を用いて行う処理であり、バックグラウンドを低下させると同時に、相対的に蛍光強度や発色強度を上昇させ、測定感度を向上させることができる。上記ブロッキング剤としては、生体成分を含まないブロッキング剤を用いることが好ましい。生体成分を含まない成分を使用することにより、牛血清アルブミン等の生体成分を含むブロッキング剤を用いた場合と比べ、動物性アレルゲンとの交叉反応を減少させ、バックグラウンドノイズやシグナル減退を防止できる。具体的には、サーモフィッシャー社、Ｂｌｏｋ−ＦＬ社、ミリポア社、Ｐｒｏ−Ｂｌｏｃｋ社、ＳｃｙＴｅｃ社、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ社、ＪＳＲ社製等のプロテインフリー・ブロッキングバッファーを挙げることができる。これらのブロッキング剤を希釈せずに添加後、一晩ブロッキング反応を行った後、ブロッキング剤を洗浄し、水分を除去することが好ましい。なお、目的物の検出に障害を及ぼすことなくブロッキングに有効な生体成分の場合は、生体成分であってもブロッキング剤としてバッファー中に含有することもある。
【００３６】
本発明の表面処理支持体に固定化するタンパク質／ペプチドとしては、抗原タンパク質／抗原ペプチド、又は抗体タンパク質／抗体ペプチドを好適に例示することができる。抗原タンパク質／抗原ペプチドとしては、アレルゲン、各種ガン抗原、サイトカイン等を例示することができる。上記アレルゲンとしては、免疫原性を有するものであれば特に制限されず、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類及び軟体動物類、穀類、豆類及びナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母、ゼラチンなどの食物アレルゲンとハウスダスト、ダニ類、花粉類、動物皮屑類、真菌類等の吸入アレルゲンを好適に例示することができ、中でも乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミンや、β−ラクトグロブリン、卵白アレルゲンの主要成分としてのオボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンや、小麦アレルゲンの主要成分としてのグルテンやグリアジンや、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質や、落花生の主要タンパク質であるＡｒａ ｈ１等のアレルギーを引き起こす原因物質を具体的に例示することができる。抗タンパク質抗体／抗ペプチド抗体としては、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＡ抗体を挙げることができ、具体的には、抗オボムコイド−ＩｇＧ抗体、抗オボアルブミン−ＩｇＧ抗体、抗α−カゼイン−ＩｇＧ抗体、抗β−カゼイン−ＩｇＧ抗体、抗β−ラクトグロブリン−ＩｇＧ抗体、抗グルテン−ＩｇＧ抗体、抗グリアジン−ＩｇＧ抗体、抗ミオグロビン−ＩｇＧ抗体や、抗オボムコイド−ＩｇＥ抗体、抗オボアルブミン−ＩｇＥ抗体、抗α−カゼイン−ＩｇＥ抗体、抗β−カゼイン−ＩｇＥ抗体、抗β−ラクトグロブリン−ＩｇＥ抗体、抗グルテン−ＩｇＥ抗体、抗グリアジン−ＩｇＥ抗体、抗ミオグロビン−ＩｇＥ抗体や、抗オボムコイド−ＩｇＡ抗体、抗オボアルブミン−ＩｇＡ抗体、抗α−カゼイン−ＩｇＡ抗体、抗β−カゼイン−ＩｇＡ抗体、抗β−ラクトグロブリン−ＩｇＡ抗体、抗グルテン−ＩｇＡ抗体、抗グリアジン−ＩｇＡ抗体、抗ミオグロビン−ＩｇＡ抗体、さらにこれらのタンパク質のフラグメント認識抗体を例示することができる。
【００３７】
上記抗原ペプチドとしては、糖鎖修飾ペプチド、リン酸化ペプチド、アシール化ペプチド、アセチル化ペプチド、メチル化ペプチド、ユビキチン化ペプチド等の化学修飾ペプチドを用いることもでき、かかる化学修飾ペプチドは、天然の化学修飾ペプチドであっても、人為的な化学修飾ペプチドであってもよい。さらに、アレルゲンエピトープを含むペプチドとして、ＭＨＣクラスII分子に結合する７〜１５アミノ酸サイズ等のペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチドを用いると、患者抗体と数倍から数十倍高感度に反応する点で好ましい。かかるＭＨＣクラスII分子に結合するペプチド部分のＮ末端側及び／又はＣ末端側に少なくとも２個以上のアミノ酸が付加されたエピトープ含有ペプチド等のアレルゲンエピトープを含むペプチドは、ペプチド合成により作製することもできるが、アレルゲンのエピトープを含むプロテアーゼ分解ペプチドとして作製することもできる。かかるプロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、リジルエンドペプチダーゼを挙げることができる。特に、アレルゲンが食物アレルゲンのとき、トリプシン分解ペプチドをプロテアーゼ分解ペプチドとして好適に例示することができる。
【００３８】
本発明の表面処理支持体に、タンパク質又はペプチドの固定化を行い、次いでブロッキング処理が行われている本発明の表面担持基板を用いると、例えば、イムノアッセイにより有利にアレルゲンエピトープの判定を行うことができる。かかるイムノアッセイとしては、本発明の表面担持基板に捕捉された検体中のアレルゲン認識抗体を検出することができる公知のイムノアッセイを用いることができ、標識二次抗体を用いるＥＬＩＳＡが好ましい。標識二次抗体としては、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５，Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミン等の蛍光標識二次抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識二次抗体、磁気ビーズ標識二次抗体、赤外標識二次抗体、標識抗ヒトＩｇＥ抗体、標識抗ヒトＩｇＧ抗体、標識抗ヒトＩｇＡ抗体、標識抗ヒトＩｇＭ抗体や、標識抗アレルゲン抗体を好適に挙げることができる。上記二次抗体としては、抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用することができ、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００３９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
（１）基板の活性化処理
シリカガラスを公知の方法（例えば特許文献３等）にしたがって、ガラス表面にポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した上記表面担持基板、あるいは市販品では例えば東洋鋼鈑株式会社より購入した基板（ジーンスライド（登録商標））は、活性エステル化したカルボキシル基が導入されており、かかる基板を化学架橋剤（１００ｍＭ ＷＳＣ・ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮＨＳ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０））中で、遮光した状態で室温にて３０分間振盪しながら再活性化処理を行った。反応後の化学架橋剤を廃棄後、基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機（ＡｌｌｅｇｒａＴＭ  Ｘ−２２Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｒ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて水分を除去し、活性化基板１を調製した。
【００４１】
（２）シリコーン表面処理
シリコーンポリアルキル：（Ｃ１〜２０）シロキサン(ＣＡＳ ６３１４８−６２−９)（Ａ１２７２８  １００％、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）をＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、０．０００１％、０．００１％、０．０１％及び０．１％のシリコーン水溶液を作製した。上記活性化基板１を上記各濃度のシリコーン水溶液に入れ、ソニケーター（ＵＳ−２：エスエヌディ社製）を用いて超音波処理を行いながら、１０分間シリコーン表面処理を行った。シリコーン表面処理後の基板をＭｉｌｌｉＱ水で振盪しながら１分間の洗浄を２回行った後、直ちに卓上遠心機を用いて水分を除去し、濃度の異なるシリコーン水溶液にて表面処理された各基板を、表面処理支持体シリーズ１として調製した。なお、上記Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製シリコーンの原液の吸光度は、１１００ｎｍ＝０．２９５、２１５ｎｍ＝０．８４７であった。
【００４２】
（３）乾燥処理
上記表面処理支持体シリーズ１の各基板について、ドライオーブンを用い１２０℃にて３時間乾燥させることにより、表面処理支持体乾燥シリーズ１として作製した。
【００４３】
（４）固定化処理
上記表面処理支持体乾燥シリーズ１の各支持体に、スポッティングレイアウト用のシール（スワショーテクノ社製）を貼り、それぞれのスポッティング領域枠を設定した。それぞれの支持体に５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００及び２００００ＩＵ／ｍＬの各非特異的ヒトＩｇＥ（カタログ番号２５０２０５、Ａｂｂｉｏｔｅｃ社製）を１スポット当たり４．４ｎＬをマイクロアレイ用スポッター（OmniGrid Accent：ＤＩＧＩＬＡＢ社製）を使用してスポッティングし、スポッティング後２５℃にて３時間インキュベーションしてＩｇＥ固定化基板を調製した。スポッティング溶液には、最終濃度０．１Ｍ N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＣＡＰＳ）ｐＨ１０．０の緩衝液と、１０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をスポッティング溶液添加剤として加えた。また、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）標識牛アルブミン（ＢＳＡ）抗原（２．５μｇ/ｍＬ）４．４ｎＬについても、１０％ＰＥＧと０．１ＭＣＡＰＳを加え、上記同様マイクロアレイ用スポッターを使用して、上記ＩｇＥ固定化基板上の図２の（ｅ）に示される標識牛アルブミンのスポッティング箇所（ＢＳＡ）にスポッティングを行い、スポッティング後２５℃にて３時間インキュベーションした。なお、標識牛アルブミンのスポッティングは、以下の実施例２〜４においても同様に行った。
【００４４】
上記ＩｇＥ固定化基板における残存する活性基を不活化するため、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ社製）を希釈せずに添加してブロッキング処理を行った。４℃にて一晩ブロッキング反応を行った後、ＭｉｌｌｉＱ水で１分間の洗浄を振盪しながら２回行うことによりブロッキング剤を洗浄後、上記卓上遠心機を用いて水分を除去し、表面担持基板シリーズ１として作製した。
【００４５】
（５）二次抗体との反応処理
上記表面担持基板シリーズ１の各基板に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５で蛍光標識した１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＥ抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製）を二次抗体として２０μＬ添加し、３７℃にて標識二次抗体との反応を２時間行った。標識二次抗体との反応後、０．５ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、０.１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％（ｖ/ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０:ＴＴＢＳ ｐＨ７．５の混合液を用いて５分間の洗浄を２回行い、次いでＭｉｌｌｉＱ水を用いて、振盪しながら１分間の洗浄を３回行って標識二次抗体を洗浄後、卓上遠心機を用いて水分を除去した。なお、上記「（２）シリコーン表面処理」を行わなかった他は、実施例１の各工程に従い作製された基板をコントロール基板とした。蛍光スキャナー３Ｄ−Ｇｅｎｅ（東レ株式会社製）を用いて各々の蛍光画像を取得した結果を図２に示す。また、１５０個のスポッティングが可能なウェルが１２個設定されたスライドにおいて、１以上のスポットに滲みが生じていたウェルを１スポット形成不良ウェルとした場合の、スポット形成不良数を示したグラフを図３に示す。
【００４６】
（結果）
図２から明らかなとおり、シリコーン表面処理が施されていないコントロール基板では、標識二次抗体を介して蛍光画像を取得したＩｇＥ抗体のスポットの形状が崩れ、スポット形状をまったく維持することができなかった。０．０００１％のシリコーン溶液にて処理を行った表面処理支持体においては、滲むことなく、スポットの形状がおおむね良好に維持されたが、スポット形状が一部くずれたところがあった。一方、０．００１％及び０．０１％の濃度のシリコーン溶液にて処理を行った表面処理支持体にスポッティングを行った場合には、スポット形状を明確に維持することができた。かかる結果は、蛍光標識したＢＳＡの蛍光画像についても同様であった。また０．１％と０．１％を超えるシリコーン溶液にて処理を行った表面処理支持体では、スライド上にスポッティングレイアウト用シールを貼りにくい場合があった（データ示さず）。
【００４７】
図３から明らかなとおり、シリコーン表面処理が施されていないコントロール基板と比較した場合、スポット形成不良率は、シリコーン濃度０．００１％において２０％未満となり、０．０１％においてスポット形成不良数がゼロとなる良好な結果が得られた。
【００４８】
なお、ＩｇＥは、５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００及び２００００ＩＵ／μＬと異なる濃度のＩｇＥ溶液をスポッティングしたが、いずれのスポッティング濃度においても検出可能で蛍光強度は定量的に変化した。
【実施例２】
【００４９】
（活性化処理における条件の検討）
（１）基板の活性化処理
市販のジーンスライド（登録商標）の再活性化において、化学架橋剤に含まれる緩衝液の適用可能なｐＨの範囲を検討した。検討に用いたアミノ基を含まない８種類の緩衝液は以下のとおりである。
１）０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ３．０
２）０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４．０
３）０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ５．０
４）０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０
５）０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０
６）０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０
７）０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ９．０
８）０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ１０．０
上記８種類の緩衝液を各化学架橋剤に用いたほかは、実施例１の「（１）基板の活性化処理」と同様の処理を行うことにより、上記８種類の緩衝液を用いた各基板を活性化基板シリーズ２として調製した。
【００５０】
（２）シリコーン表面処理
上記８種類の活性化基板シリーズ２について、０．０１％のシリコーン水溶液のみを用いて、シリコーン表面処理を行ったほかは、実施例１の「（２）シリコーン表面処理」と同様の処理を行うことにより、各活性化基板を表面処理支持体シリーズ２として調製した。
【００５１】
（３）乾燥処理
上記表面処理支持体シリーズ２の各支持体について、実施例１の「（３）乾燥処理」と同様の処理を行うことにより、各支持体を表面処理支持体乾燥シリーズ２として調製した。
【００５２】
（４）固定化処理
上記表面処理支持体乾燥シリーズ２の各支持体について、ヒトＩｇＥ１００００ＩＵ／ｍＬをスポッティングしたほかは、実施例１の「（４）スポッティング処理」と同様の処理を行うことにより、各支持体を表面担持基板シリーズ２として作製した。
【００５３】
（５）二次抗体との反応処理
上記表面担持基板シリーズ２の各基板について、実施例１の「（５）二次抗体との反応処理」と同様の処理を行い、蛍光画像を取得し蛍光強度を測定した。結果を図４のグラフに示す。
【００５４】
（結果）
図４から明らかなとおり、０．１Ｍの酢酸緩衝液（図４ａ）（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０）、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（図４ｂ）（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０とｐＨ８．０）における蛍光強度の相違は特になかった。しかし、０．１Ｍの炭酸緩衝液（図４ｃ）（ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０）では蛍光強度が減少する傾向を示した。以上から、化学架橋剤における緩衝液の種類は特に限定されず、ｐＨ３．０〜ｐＨ８．０の範囲であれば使用可能であると判断した。
【実施例３】
【００５５】
（乾燥処理条件の検討）
（１）基板の活性化処理
実施例１の「（１）基板の活性化処理」と同様の処理を行うことにより、活性化基板シリーズ３として調製した。
【００５６】
（２）シリコーン表面処理
上記活性化基板シリーズ３について、０．０１％のシリコーン水溶液を用いて、シリコーン表面処理を行ったほかは、実施例１の「（２）シリコーン表面処理」と同様の処理を行うことにより、表面処理支持体シリーズ３を調製した。
【００５７】
（３）乾燥処理
上記表面処理支持体シリーズ３について、ドライオーブンを用いて３７℃、１２０℃、１５０℃又は１８０℃にて３時間乾燥させることにより、乾燥処理温度の異なる４種類の支持体を表面処理支持体乾燥シリーズ３として調製した。
【００５８】
（４）固定化処理
上記表面処理支持体乾燥シリーズ３の各支持体について、実施例１の「（４）固定化処理」と同様の処理を行うことにより、各支持体を表面担持基板シリーズ３として作製した。
【００５９】
（５）二次抗体との反応処理
上記表面担持基板シリーズ３の各基板について、実施例１の「（５）二次抗体との反応処理」と同様の処理を行い、蛍光画像を取得した。結果を図５及び図６に示す。
【００６０】
（結果）
図５及び図６から明らかなとおり、表面処理支持体シリーズ３の調製工程において、１８０℃にて乾燥を行った支持体は、全般的に蛍光強度が低下する傾向を示す一方、スポッティングしていない部分が示すバックグラウンド蛍光強度値が高くなり、スポットを明確に読み取ることが困難となった。１５０℃にて乾燥を行った支持体は調べた条件下においては最も顕著にスポットの蛍光強度が強くなった。３７℃〜１２０℃にて乾燥を行った場合は、バックグラウンド蛍光強度値は乾燥温度の変更による変化は特になかった。またＩｇＥ抗体と蛍光標識牛アルブミン（ＢＳＡ）抗原の蛍光強度は、３７℃〜１５０℃の条件下で大きな変化はなかった。
【実施例４】
【００６１】
（再活性化処理効果の検討）
市販の活性化されたジーンスライド（東洋鋼鈑社製）を購入した場合に、再活性化した基板と再活性化しない基板について、基板へのＩｇＥ抗体(５０〜２０，０００ＩＵ／ｍＬ)の結合量を検討した。
【００６２】
［市販の活性化静電層基板を再活性化したシリコーン表面処理支持体の作製］
市販の活性化ジーンスライド（東洋鋼鈑社製）は、実施例１の「（１）基板の活性化処理」と同様の処理を行うことにより再活性化した。その後、実施例１に記載されている「（２）シリコーン表面処理」において、０．０１％のシリコーン水溶液を用いてシリコーン表面処理を行い、引き続いて「（３）乾燥処理」、「（４）固定化処理」に供されることにより、再活性化基表面処理支持体（支持体Ａ）が作製された。
【００６３】
［市販の活性化静電層基板を再活性化しないシリコーン表面処理支持体の作製］
市販の活性化ジーンスライドを、実施例１の「（１）静電層基板の活性化処理」を行うことなしに「（２）シリコーン表面処理」において、０．０１％のシリコーン水溶液を用いてシリコーン表面処理を行い、引き続いて実施例１に記載されている「（３）乾燥処理」及び「（４）固定化処理」に供されることにより、非再活性化表面処理支持体（支持体Ｂ）が作製された。
【００６４】
シリカガラスを公知の方法（例えば特許文献３等）にしたがって、ガラス表面にポリアクリル酸による負の電荷を帯びるカルボキシル基を導入した上記表面担持基板を、シリーズ１のうち「（２）シリコーン表面処理」において、０．０１％のシリコーン水溶液を用いてシリコーン表面処理を行った支持体をコントロール支持体とした。
【００６５】
上記支持体ＡとＢ及びコントロール支持体について実施例１の「（５）二次抗体との反応処理」と同様の処理を行った。５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００及び２００００ＩＵ／ｍＬの非特異的ヒトＩｇＥをスポッティングした場合の各表面担持基板の蛍光値を図７のグラフに示す。
【００６６】
（結果）
図７より明らかなとおり、市販の活性化処理済み静電層基板を再活性化処理した支持体Ａは、スポットされた各濃度のＩｇＥに応じて、コントロール支持体と同程度のＩｇＥ抗体の結合量（蛍光量）を示したが、市販の活性化処理済み静電層基板を再活性化せずに、シリコーン表面処理を行った支持体Ｂは、ＩｇＥ抗体の基板への結合量が顕著に減少していた。なおスポットされた各濃度のＩｇＥは定量的に固定化されていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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