(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＥＳＴ機能の喪失によるＳＣＮ２Ｂ遺伝子によってコード化されるβ２の発現及び／又はＮｏｔｃｈの活性化によって特徴を表される腫瘍の分類、診断、治療及び予防のための組成物及び方法。【解決手段】上皮間葉転換（ＥＭＴ）、細胞移動およびアポトーシスなどの細胞プロセスの調節する、β２に結合し、Ｎｏｔｃｈ１へのβ２の結合をブロックするモノクローナル抗体。【選択図】図８
2015096502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２に結合し、Ｎｏｔｃｈ１へのβ２の結合をブロックするモノクローナル抗体。
【請求項２】
a. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８４０４、ＰＴＡ−８４０５およびＰＴＡ−８４０６から選択されるハイブリドーマによって生産されるモノクローナル抗体、
b. (a)の抗体のヒト化形態であるモノクローナル抗体、
c. (a)の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体、又は、
d.β２への結合について(a)の抗体と競合するモノクローナル抗体
である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈ１の断片を含む、単離された可溶性ポリペプチド。
【請求項４】
腫瘍をβ２のアンタゴニストにさらすことを含む、腫瘍進行の阻害方法。
【請求項５】
β２のアンタゴニストがＳＣＮ２Ｂに特異的なアンチセンス核酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アンチセンス核酸がＲＮＡｉ能を有する調節ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
β２のアンタゴニストが、β２に結合し、Ｎｏｔｃｈ１へのβ２の結合をブロックする抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
a. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８４０４、ＰＴＡ−８４０５およびＰＴＡ−８４０６から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体、
b. (a)の抗体のヒト化形態である抗体、
c. (a)の抗体と同じエピトープに結合する抗体、又は
d.β２への結合について(a)の抗体と競合する抗体
である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
β２のアンタゴニストが、Ｎｏｔｃｈ１に結合し、β２へのＮｏｔｃｈ１の結合をブロックする抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
抗体がＥＧＦリピート１０−２１を含むＮｏｔｃｈ１の領域内で結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
β２のアンタゴニストが、β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈ１の断片を含む可溶性ポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が転移性である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍が化学療法に対して抵抗力がある、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍が結腸腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍がＲＥＳＴ活性を低減しているか、又はβ２活性を増加している、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞をβ２のアンタゴニストにさらすことを含む、細胞のＥＭＴの阻害方法。
【請求項１７】
β２のアンタゴニストがＳＣＮ２Ｂに特異的なアンチセンス核酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アンチセンス核酸がＲＮＡｉ能を有する調節ＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
β２のアンタゴニストが、β２に結合し、Ｎｏｔｃｈ１へのβ２の結合をブロックする抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
a. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８４０４、ＰＴＡ−８４０５およびＰＴＡ−８４０６から選択されるハイブリドーマによって生産される抗体、
b. (a)の抗体のヒト化形態である抗体、
c. (a)の抗体と同じエピトープに結合する抗体、又は、
d.β２への結合について(a)の抗体と競合する抗体
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
β２のアンタゴニストが、Ｎｏｔｃｈ１に結合し、β２へのＮｏｔｃｈ１の結合をブロックする抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
抗体がＥＧＦリピート１０−２１を含むＮｏｔｃｈ１の領域内で結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
β２のアンタゴニストが、β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈ１の断片を含む可溶性ポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が腫瘍細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍細胞が転移性腫瘍に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍細胞が化学療法に対して抵抗力がある腫瘍に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
腫瘍細胞が結腸腫瘍細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
細胞がインビトロである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
細胞がインビボである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍がβ２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈ１のアンタゴニストに応答するか否かの決定方法であって、腫瘍においてＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加を検出することを含み、このとき腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加が、腫瘍がβ２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈ１のアンタゴニストに応答することを示す、方法。
【請求項３１】
ＲＥＳＴ活性の低減を検出することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
β２活性の増加を検出することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が転移性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍が化学療法に対して抵抗力がある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍が結腸腫瘍である、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の説明）
本出願は、２００７年１１月１９日に出願の米国特許仮出願６０／９８８８７４の優先権を主張する。その開示内容は出典明記によって本明細書において援用される  
（技術分野）
本発明は、腫瘍進行および他の細胞過程に伴われる遺伝子およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＭＴ
腫瘍形成の間に、カルシノーマ細胞は、通常の上皮の特徴の多くを失い、「上皮間葉転換」又はＥＭＴと称されるプロセスにより間葉系性質を獲得する。ＥＭＴは、局所の浸潤と遠隔部位への転移の両方を促す細胞接着および運動性の変化と関係している。モデル系においてＥＭＴを誘導することが可能ないくつかの遺伝子、例えばＭＭＰ１１およびＴＧＦＢ１が記述されている。参考のために、例としてHuber et al., Curr. Opin. Cell Biol. 17:548-558, 2005；Lee et al., J. Cell Biol. 172:973-981, 2006；Theiry et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:131-142, 2006を参照のこと。しかしながら、当分野では、腫瘍細胞におけるＥＭＴの誘導と関係している遺伝子をさらに同定する必要がある。このような遺伝子およびそのコード化されたタンパク質は、例えば、癌の治療において有用な標的である。本明細書において記述される本発明は、この必要性を満たして、他の利点を提供するものである。
【０００３】
β２
ＳＣＮ２Ｂ遺伝子によってコード化されるβ２は、細胞接着タンパク質に見られるものと類似する免疫グロブリンフォールドを含む細胞外ドメインを有する一回膜貫通タンパク質である(Eubanks et al., Neuroreport 8:2775-2779, 1997；Isom et al., Cell 83:433-442, 1995)。また、β１サブユニットと同様に、当初ナトリウムチャネル性質および表層膜領域の活性調節因子として特徴付けられたβ２(上掲のEubanks et al.)は、ナトリウムチャネルとは関係なく、細胞接着分子として働くことができる。ショウジョウバエＳ２細胞では、β１及びβ２サブユニットは、トランスホモフィリックな様式で、ＥＧＦリピートモチーフを介してマトリックスタンパク質であるテネイシンＣ及びテネイシンＲと結合し、その結果、細胞骨格の変化並びに細胞接着と凝集性質の変化が生じうる(Malhotra et al., J. Biol. Chem. 275:11383-11388, 2000；Xiao et al., J. Biol. Chem. 274:26511-26517, 1999)。さらに、β２は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において移動を誘導するγ-分泌酵素としての特徴を有していた(Kim et al., J. Biol. Chem. 280:23251-23261, 2005)。また、これらの研究は、β２がα-分泌酵素様プロテアーゼによって媒介されて外部ドメインが分離されることを示唆していた。上掲のKim et al.。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈ
Ｎｏｔｃｈレセプターファミリーは、ウニやヒトと同じくらい多様な有機体の発達に作用するシグナルを伝達する、進化上保存された膜貫通型レセプターの一種である。Ｎｏｔｃｈレセプター及びリガンドＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ(哺乳動物ではＪａｇｇｅｄとして知られる)のファミリーは、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様レセプターを含有する大きな細胞外ドメインを有する膜貫通型タンパク質である。Ｎｏｔｃｈパラログの数は種間で異なる。例えば、哺乳動物では４つ(Ｎｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ４)、線虫では２つ(ＬＩＮ-１２及びＧＬＰ-１)、及びキイロショウジョウバエでは１つ(Ｎｏｔｃｈ)のＮｏｔｃｈレセプターがある。Ｎｏｔｃｈレセプターは、膜貫通ドメインに対して外側の部位Ｓ１でｆｕｒｉｎ様プロテアーゼによって細胞表面への運搬の間にタンパク分解性にプロセシングされ、細胞外Ｎｏｔｃｈ(ＥＣＮ)サブユニット及びＮｏｔｃｈ膜貫通サブユニット(ＮＴＭ)が生じる。これら２つのサブユニットは、非共有的に結合したままで、成熟したヘテロダイマー細胞表面レセプターを構成する。Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＮサブユニットは、３６のＮ末端ＥＧＦ様リピートの後に、Ｓ１部位に先行する３つのタンデムリピートＬｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈリピート(ＬＮＲ)モジュールを含有する。各ＬＮＲモジュールは、カルシウムイオンを調整することが予測される３つのジスルフィド結合及び一群の保存された酸性かつ極性の残基を含有する。ＥＧＦリピート領域内に、活性化リガンドのための結合部位が位置する。Ｎｏｔｃｈレセプターの固有のドメインを含むＬＮＲモジュールは、リガンドが誘導する活性化の前に静止高次構造にＮｏｔｃｈを維持することに関与する。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＴＭは、細胞外領域(Ｓ２切断部位を内部に持つ)、膜貫通部分(Ｓ３切断部位を内部に持つ)、及びＲＡＭドメイン、アンキリンリピート、トランスアクチベーションドメイン及びカルボキシ末端ＰＥＳＴ配列を含む大きな細胞内部分を含む。ＥＣＮ及びＮＴＭサブユニットの安定な結合は、ＥＣＮのカルボキシ終末端(ＨＤ−Ｃと称される)及びＮＴＭの細胞外アミノ末端(ＨＤ−Ｎと称される)を含むヘテロ二量体化ドメイン(ＨＤ)に依存している。ＥＣＮサブユニットへのＮｏｔｃｈリガンドの結合により、制御された細胞内タンパク質分解により生じる２つの連続的なタンパク質分解性切断が開始する。部位Ｓ２のメタロプロテアーゼによる第一切断によって、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの、原形質膜の内側の小葉の近くの部位Ｓ３での第二切断が起こりやすくなる。プレセニリンとニカストリンを含む多タンパク質複合体により触媒される部位Ｓ３切断は、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの細胞内部分を遊離し、核に転位させ、標的の遺伝子の転写を活性化する。
【０００５】
Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａ様クラスの５つのＮｏｔｃｈリガンドは、ヒト(Ｊａｇｇｅｄ1(Ｓｅｒｒａｔｅ１とも称される)、Ｊａｇｇｅｄ２(Ｓｅｒｒａｔｅ２とも称される)、Ｄｅｌｔａ様１(ＤＬＬ１とも称される)、Ｄｅｌｔａ様３(ＤＬＬ３とも称される)、及びＤｅｌｔａ様４(ＤＬＬとも称される))において同定された。各々のリガンドは、Ｎｏｔｃｈを結合するために必須の、保存されたN末端のＤｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、ＬＡＧ−２(ＤＳＬ)モチーフを有するシングルパス膜貫通タンパク質である。ＤＳＬモチーフに対する一連のＥＧＦ様モジュールＣ末端は膜に拡がる(membrane-spanning)部分に先行する。Ｎｏｔｃｈレセプターとは異なり、リガンドは、Ｃ末端に７０−２１５アミノ酸の短い細胞質の尾部を有する。さらに、他のタイプのリガンドも報告されている(例えばＤＮＥＲ、ＮＢ３、及びＦ３／コンタクチン)。
Ｎｏｔｃｈ経路は、ハエ及び脊椎動物の神経発生に作用するプロセスなど、多様な発達上及び生理学上のプロセスに際に機能する。通常は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、側方抑制、系統決定及び複数の細胞群間の境界の形成に関与する(例としてBray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006を参照)。癌及び神経変性障害を含む多様なヒトの疾患は、Ｎｏｔｃｈレセプター又はそのリガンドをコードする遺伝子の突然変異によるものであることが示されている(例としてNam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501-509, 2002を参照)。ヒトＮｏｔｃｈ１の切断された構造的に活性な変異体を造る反復性のｔ(７;９)(ｑ３４;ｑ３４.３)染色体転座がヒト急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)のサブセットにおいて同定された時に、無制限のＮｏｔｃｈシグナル伝達と悪性腫瘍との関連が初めて認識された。マウスモデルでは、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達はＴ細胞発達に必須であり、Ｎｏｔｃｈ１が媒介するシグナルがＢ細胞発達を犠牲にしてＴ細胞の発達を促すことが示された。また、マウスモデルでは、発達の間の過剰なＮｏｔｃｈシグナル伝達によりＴ細胞腫瘍形成が引き起こされる。
【０００６】
さらに、Ｎｏｔｃｈレセプターはヒトの癌及び腫瘍由来の細胞株の広い範囲で発現され、ヒトの胚性幹細胞の神経運命を促す。例えば、Ｎｏｔｃｈは、ヒトの子宮頸管、及びヒトの腎臓細胞カルシノーマ細胞の腫瘍性病変において高く発現される。多くのヒトの疾患にＮｏｔｃｈシグナル伝達が関与していることを考えると、治療薬としての開発に適する臨床上の特性を有するＮｏｔｃｈシグナル伝達を制御する薬剤が求められていることは明らかである。本明細書中に記載の本発明はこの要求を満たし、他の利点を提供する。
【０００７】
ＲＥＳＴ
ＲＥＳＴ(ＮＲＳＦとも称される)は、非神経性組織の神経系遺伝子発現の転写リプレッサーである(Westbrook et al., Cell: 121:837-848, 2005)。ＲＥＳＴは腫瘍抑制遺伝子としての特徴を有する。ＲＥＳＴ遺伝子は、結腸直腸癌において欠失していることが多いことが確認された。さらに、上皮細胞を転換することができる、ＲＥＳＴのドミナントネガティブな形態が同定されている。当分野では、ＲＥＳＴ腫瘍抑制に関与する遺伝子を同定することが求められている。このような遺伝子およびそのコードされたタンパク質は、例えば、癌の治療の有用な標的である。本明細書において記述される本発明は、この必要性を満たして、他の利点を提供するものである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、転写リプレッサーであるＲＥＳＴの欠失がβ２の発現を引き起こし、次に腫瘍のＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するという発見に、ある程度基づく。さらに、本発明は、Ｎｏｔｃｈの新規のリガンドとしてβ２を同定し、そのβ２がＮｏｔｃｈに結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化することによってＥＭＴを誘導するということにある程度基づく。これらの発見は、ＲＥＳＴ／β２／Ｎｏｔｃｈ経路が腫瘍進行および／または転移を促進することを示す。
【０００９】
一態様では、ＲＥＳＴ機能の喪失、β２の発現および／またはＮｏｔｃｈの活性化に特徴がある腫瘍の分類、診断、治療および予防のための組成物および方法が提供される。
他の態様では、β２に結合し、Ｎｏｔｃｈへのβ２の結合をブロックするモノクローナル抗体が提供される。一実施態様では、モノクローナル抗体は、(a) ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８４０４、ＰＴＡ−８４０５およびＰＴＡ−８４０６から選択されるハイブリドーマによって生産されるか、(b) (a)の抗体のヒト化形態であるか、(c) (a)の抗体と同じエピトープに結合するか、又は、(d)β２への結合について(a)の抗体と競合する。
他の態様では、β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈの断片を含む、単離された可溶性ポリペプチドが提供される。
【００１０】
他の態様では、腫瘍をβ２のアンタゴニストにさらすことを含む、腫瘍進行の阻害方法が提供される。一実施態様では、β２のアンタゴニストは、ＳＣＮ２Ｂに特異的なアンチセンス核酸である。そのような実施態様では、アンチセンス核酸は、ＲＮＡｉ能を有する調節ＲＮＡである。他の実施態様では、β２のアンタゴニストは、β２に結合し、Ｎｏｔｃｈへのβ２の結合をブロックする抗体である。そのような実施態様では、抗体は、(a) ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８４０４、ＰＴＡ−８４０５およびＰＴＡ−８４０６から選択されるハイブリドーマによって生産されるか、(b) (a)の抗体のヒト化形態であるか、(c) (a)の抗体と同じエピトープに結合するか、又は、(d) β２への結合について(a)の抗体と競合する。他の実施態様では、β２のアンタゴニストは、Ｎｏｔｃｈに結合し、β２へのＮｏｔｃｈの結合をブロックする抗体である。そのような実施態様では、抗体は、ＥＧＦリピート１０−２１を含むＮｏｔｃｈ１の領域内で結合する。他の実施態様では、β２のアンタゴニストは、β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈの断片を含む可溶性ポリペプチドを含む。他の実施態様では、腫瘍は転移性である。他の実施態様では、腫瘍は化学療法に対して抵抗力がある。他の実施態様では、腫瘍は結腸腫瘍である。他の実施態様では、腫瘍は、ＲＥＳＴ活性を低減しているか、又はβ２活性を増加させている。
【００１１】
他の態様では、細胞をβ２のアンタゴニストにさらすことを含む、細胞のＥＭＴの阻害方法が提供される。一実施態様では、β２のアンタゴニストは、ＳＣＮ２Ｂに特異的なアンチセンス核酸である。そのような実施態様では、アンチセンス核酸は、ＲＮＡｉ能を有する調節ＲＮＡである。他の実施態様では、β２のアンタゴニストは、β２に結合し、Ｎｏｔｃｈへのβ２の結合をブロックする抗体である。そのような実施態様では、抗体は、(a) ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８４０４、ＰＴＡ−８４０５およびＰＴＡ−８４０６から選択されるハイブリドーマによって生産されるか、(b) (a)の抗体のヒト化形態であるか、(c) (a)の抗体と同じエピトープに結合するか、又は、(d) β２への結合について(a)の抗体と競合する。他の実施態様では、β２のアンタゴニストは、Ｎｏｔｃｈに結合し、β２へのＮｏｔｃｈの結合をブロックする抗体である。そのような実施態様では、抗体は、ＥＧＦリピート１０−２１を含むＮｏｔｃｈ１の領域内で結合する。他の実施態様では、β２のアンタゴニストは、β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈの断片を含む可溶性ポリペプチドを含む。他の実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。他の実施態様では、腫瘍細胞は転移性腫瘍に由来する。他の実施態様では、腫瘍細胞は、化学療法に対して抵抗力がある腫瘍に由来する。他の実施態様では、腫瘍細胞は結腸腫瘍細胞である。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。
【００１２】
他の態様では、腫瘍がβ２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストに応答するか否かの決定方法であって、腫瘍においてＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加を検出することを含み、このとき腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加が、腫瘍がβ２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストに応答することを示す方法が提供される。一実施態様では、方法はＲＥＳＴ活性の低減を検出することを含む。他の実施態様では、方法はβ２活性の増加を検出することを含む。他の実施態様では、腫瘍は転移性である。他の実施態様では、腫瘍は化学療法に対して抵抗力がある。他の実施態様では、腫瘍は結腸腫瘍である。
前記実施態様および更なる実施態様は、下記の説明において示される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ：正常な結腸上皮(レーン１−５)および結腸腫瘍上皮(レーン６−１３)におけるＳＣＮ２Ｂ発現。ＲＮＡはレーザーキャプチャ顕微解剖後に単離し、ＳＣＮ２Ｂ発現はマイクロアレイ分析によって測定した。値は、汎用比較ＲＮＡ(腫瘍細胞株のプールから入手)に対するＳＣＮ２Ｂ転写産物の比率として、相対的な発現レベルを表す。レーン７の試料では３３の値を切り捨て、バーで表す。図１Ｂ：α−β２モノクローナル抗体(３Ｄ１)を用いた、結腸腫瘍および正常な結腸におけるβ２のタンパク質発現の例。
【図２】図２Ａ：コントロール調整培地(Ｃ−ＣＭ)又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地(β２-ＣＭ)にて処理した細胞株、又は完全長β２を形質移入した細胞株(ＦＬ：β２)(左上の名称)のアクチン細胞骨格の可視化。実験群の画像は同じ条件を用いて撮影した。アクチン細胞骨格はファロイジンにて、核はＤＡＰＩにて染色した。１５μｍスケールバーを左下角に示す。図２Ｂ：ブタクサ(ＲＷ、左パネル)又はβ２(右パネル)に対する抗体にて処理した、β２形質移入ＣＨＯ細胞(上２パネル)又はβ２形質移入ＳＷ６２０細胞(下２パネル)におけるβ２誘導表現型変化の抗体ブロック。アクチン細胞骨格はファロイジンにて、核はＤＡＰＩにて染色した。実験群の画像はすべて同じ条件を用いて撮影した。スケールバー：１５μｍ。図２Ｃ：β２ ＥＣＤ枯渇アッセイ：ＮＣＩ-Ｈ２２６細胞は、偽(mock)β２枯渇又は部分的ないしは完全なβ２枯渇を受けたコントロール(Ｃ−ＣＭ)又はβ２調整培地(β２−ＣＭ)にて処理した。対応するタンパク質回復は、α−β２イムノブロットにてレーンごとに示す。レーン１はポジティブコントロールとして調整培地から単離されるβ２を含む。アクチン細胞骨格はファロイジンにて、核はＤＡＰＩにて染色した。画像はすべて同じ条件を用いて撮影した。スケールバー：１５μｍ。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ：０．１％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)中の、ベクター形質移入(Ｖｅｃ)ＳＷ６２０コントロール細胞又はβ２形質移入(ＦＬ：β２)ＳＷ６２０細胞、又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地(β２−ＣＭ)又はコントロール調整培地(Ｃ−ＣＭ)にて処理したＳＷ６２０細胞の移動。血清がない場合(０％ＦＢＳ)には移動は観察されなかった。蛍光強度はＹＯ−ＰＲＯ−１にて染色した移動した細胞のものである。誤差バーは３通りの結果から求めた平均値の標準偏差を表す。β２形質移入ＳＷ６２０細胞又はβ２−ＥＣＤ処理ＳＷ６２０細胞の両方において、移動の統計学的に有意な増加が観察された(それぞれｐ＝０．０３、ｐ＝０．０００９)。図３Ｂ：α−ブタクサ(ＲＷ)抗体又は２つの異なるα−β２抗体(３Ｄ１又は１２Ａ９)にて処理したＳＷ４８０細胞の移動。蛍光強度はＹＯ−ＰＲＯ−１にて染色した移動した細胞のものである。誤差バーは３通りの結果から求めた平均値の標準偏差を表す。両方のα−β２抗体の存在下において、移動の統計学的に有意な減少が観察された(それぞれｐ＝０．００１)。
【図３Ｃ−Ｅ】図３Ｃ：飢餓アッセイ：飢餓後の全細胞中の割合としての、ベクター形質移入(Ｖｅｃ)ＳＷ６２０コントロール細胞又はβ２形質移入(ＦＬ：β２)ＳＷ６２０細胞の細胞死。実験は３回行い、誤差バーは平均値の標準偏差を表す。β２を形質移入したＳＷ６２０細胞に、細胞死の統計学的に有意な減少が観察された(ｐ＝０．００２)。図３Ｄ：ＳＷ６２０細胞のドキソルビシン耐性：ベクターのみ(Ｖｅｃ)又は完全長β２(ＦＬ：β２)を形質移入した細胞についての、ドキソルビシン(μｇ／ｍｌ、Ｘ軸)存在下における細胞生存率(Ｙ軸)。実験は３回行い、誤差バーは平均値の標準偏差を表す。図３Ｅ：ＣＨＯ細胞のメトトレキセート耐性：全体中の割合としての、コントロール調整培地(Ｃ−ＣＭ)又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地(β２-ＣＭ)にて処理した細胞の細胞死。実験は３回行い、誤差バーは平均値の標準偏差を表す。β２ ＥＣＤにて処理したＣＨＯ細胞では、細胞死の統計学的に有意な減少が観察された(ｐ＝０．０１)。
【図４Ａ−Ｃ】図４Ａ：ＳＷ６２０コントロール処理細胞(Ｃ−ＣＭ)又は、β２タンパク質を形質移入した細胞(ＦＬ：β２)ないしはβ２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理した細胞(β２−ＣＭ)の、Ｅカドヘリン染色。核はＤＡＰＩにて染色した。画像はすべて同じ条件を用いて撮影した。スケールバー：１５μｍ。図４Ｂ：(i) ベクター(Ｖｅｃ)又は完全長β２(ＦＬ：β２)を形質移入した細胞、又は(ii) コントロール調整培地(Ｃ-ＣＭ)又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地(β２−ＣＭ)にて処理した細胞における、ＳＷ６２０のＥカドヘリン染色のＦＡＣＳ分析。中央の比率値をプロットし、誤差バーは２つの実験結果の標準偏差を表す。図４Ｃ：ＳＷ６２０コントロール処理細胞(Ｃ−ＣＭ)又は、β２タンパク質を形質移入した細胞(ＦＬ：β２)ないしはβ２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理した細胞(β２−ＣＭ)の、Ｅビメンチン染色。核はＤＡＰＩにて染色した。画像はすべて同じ条件を用いて撮影した。スケールバー：１５μｍ。
【図４Ｄ−Ｅ】図４Ｄ：Ｔｗｉｓｔ１枯渇：非ターゲティングコントロール配列(ｓｉＮＴ)又はｓｉＲＮＡターゲティングＴｗｉｓｔ１(ｓｉＴｗｉｓｔ１)を用いてｓｉＲＮＡノックダウンを行った後の、β２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理したＳＷ６２０細胞(β２−ＣＭ)のアクチン細胞骨格(ファロイジン、上パネル)およびＥカドヘリン(下パネル)染色。コントロール調整培地(Ｃ−ＣＭ)にて処理したｓｉＮＴ細胞又はｓｉＴｗｉｓｔ１細胞では、表現型又はＥカドヘリン染色の変化は検出されなかった。実験群の画像は同じ条件を用いて撮影した。核はＤＡＰＩにて染色した。スケールバー：１５μｍ。図４Ｅ：Ｅカドヘリンレベル：コントロール調整培地(Ｃ−ＣＭ)又はβ２調整培地(β２−ＣＭ)にて処理したＳＷ６２０細胞についての、Ｔｗｉｓｔ１枯渇実験におけるＥカドヘリン染色の定量分析。統計学的分析は、Ｔｗｉｓｔ１を枯渇させたβ２−ＥＣＤ処理細胞(ｓｉＴｗｉｓｔ１およびｓｉＴｗｉｓｔ１(３))のＥカドヘリンレベルが、非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ)を形質移入したβ２−ＥＣＤ処理細胞と比較して有意に異なる(ｐ＝０．００１および０．００９)ことを示した。最後のカラムであるｓｉＴｗｉｓｔ１(３)は、Ｔｗｉｓｔ１をターゲティングする３つの更なる独立したｓｉＲＮＡ配列についてのデータの併用分析を表す。記述されるように、細胞の少なくとも５つの別々のフィールドをＭｅｔａｍｏｒｐｈを用いた定量分析に使用した。誤差バーは標準誤差を表す。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ：ＳＷ６２０およびＳＷ４８０細胞(上方２つのパネル)と結腸腫瘍および正常結腸(下方２つのパネル)のβ２(左列)およびＲＥＳＴ(右列)染色。実験群の画像はすべて同じ条件を用いて撮影した。スケールバー：１５μｍ。図５Ｂ：非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ)と比較したときの、ＲＥＳＴのｓｉＲＮＡノックダウン後のＳＷ６２０(ｓｉＲＥＳＴ)におけるＲＥＳＴ(上方パネル)とβ２(下方パネル)のイムノブロット分析。分子量(ＫＤａ)を左に示す。また、ブロットは、β-チューブリンをローディングコントロールとしてプロットした(中央のパネル)。図５Ｃ：非ターゲッティングｓｉＲＮＡコントロール(ｓｉＮＴ、１００％とする)に関して基準化したときの、ｓｉＲＮＡによるＲＥＳＴノックダウン後のＲＥＳＴタンパク質(ＲＥＳＴ)の相対的な減少とβ２(β２)の相対的な増加。図５ＢのイムノブロットのＬｉｃｏｒ強度読み取り値から決定された、バックグラウンドを減算し、β-チューブリンに基準化した値。
【図５Ｄ−Ｅ】図５Ｄ：ＲＥＳＴ枯渇：ｓｉＲＮＡによりＲＥＳＴをノックダウンした後(ｓｉＲＥＳＴ)又は非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ)、及びα-ブタクサ(ｓｉＲＥＳＴ、α-ＲＷ)又はα−β２(ｓｉＲＥＳＴ、α−β２)抗体の存在下での、ＳＷ６２０細胞のアクチン細胞骨格(ファロイジン、上方パネル)、Ｅカドヘリン(中央パネル)およびビメンチン(下方パネル)染色。実験群の画像はすべて同じ条件を用いて撮影した。核はＤＡＰＩにて染色した。スケールバー：１５μｍ。図５Ｅ：Ｅカドヘリンレベル：図５ＤのＳＷ６２０細胞実験グループについてのｓｉＲＥＳＴ枯渇のＥカドヘリン染色の定量分析。ＲＥＳＴ特異的ｓｉＲＮＡを形質移入した細胞(ｓｉＲＥＳＴ)のＥカドヘリンレベルは、非ターゲッティングコントロールを形質移入した細胞において検出されたレベル(ｓｉＮＴ；ｐ＝０．００１)と比較して、有意に低減していた。α−β２抗体である３Ｄ１(ｓｉＲＥＳＴ：３Ｄ１)および２Ｅ３(ｓｉＲＥＳＴ：２Ｅ３)の存在下でのＲＥＳＴ枯渇は、ＲＥＳＴ枯渇細胞(ｓｉＲＥＳＴ)又はα-ブタクサ抗体にて処理したＲＥＳＴ枯渇細胞(ｓｉＲＥＳＴ：α-ＲＷ)と比較して有意に増加した野生型レベルのＥカドヘリン染色となった(ｐ＝０．０２およびｐ＝０．０１)。記述したように、細胞の少なくとも５つの独立したフィールドをＭｅｔａｍｏｒｐｈを用いた定量分析に使用した。誤差バーは標準誤差を表す。
【図６】図６Ａ：Ｎｏｔｃｈ１枯渇：非ターゲッティングコントロール配列(ｓｉＮＴ)又はｓｉＲＮＡターゲティングＮｏｔｃｈ１(ｓｉＮｏｔｃｈ１)によりｓｉＲＮＡノックダウンした後の、β２ ＥＣＤを含む調整培地(β２-ＣＭ)にて処理したＳＷ６２０細胞のアクチン細胞骨格(ファロイジン、上方パネル)及びＥカドヘリン(下方パネル)染色。コントロール調整培地(Ｃ-ＣＭ)にて処理したｓｉＮＴ又はｓｉＮｏｔｃｈ１細胞において、表現型又はＥカドヘリン染色の変化は検出されなかった。実験群の画像は同じ条件を用いて撮影した。核はＤＡＰＩにて染色した。スケールバー：１５μｍ。図６Ｂ：Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の化学的な阻害：ＤＭＳＯ又はＤＡＰＴを含むＤＭＳＯ(ＤＡＰＴ)の添加後のβ２ ＥＣＤを含む調整培地(β２-ＣＭ)にて処理したＳＷ６２０細胞のＥカドヘリン染色。ＤＭＳＯ中のコントロール調整培地(Ｃ-ＣＭ)にて処理した細胞では、Ｅカドヘリン染色の変化は検出されなかった。実験群の画像は同じ条件を用いて撮影した。核はＤＡＰＩにて染色した。スケールバー：１５μｍ。図６Ｃ：Ｅカドヘリンレベル：コントロール調整培地(Ｃ−ＣＭ)又はβ２調整培地(β２-ＣＭ)にて処理した、ｓｉＮｏｔｃｈ１枯渇及びＤＡＰＴ処理のＳＷ６２０細胞におけるＥカドヘリン染色の定量分析。統計学的分析は、Ｎｏｔｃｈ１(ｓｉＮｏｔｃｈ１およびｓｉＮｏｔｃｈ１(３))を枯渇させたβ２-ＥＣＤ処理細胞のＥカドヘリンレベルが、非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ)を形質移入したβ２−ＥＣＤ処理細胞と比較して、有意に異なる(ｐ＝０．０３および０．０３)ことを示した。ｓｉＮｏｔｃｈ１(３)と表示した列は、３つの更なる別々のＮｏｔｃｈ１をターゲティングするｓｉＲＮＡ配列についてのデータを併用した分析を表す。ＤＭＳＯ中のβ２−ＥＣＤ処理細胞(ＤＭＳＯ)と比較して、β２−ＥＣＤ(β２−ＣＭ)にて処理したＤＡＰＴ処理細胞(ＤＡＰＴ)のＥカドヘリンレベルもまた有意に異なっていた(ｐ＝０．００００１)。記述したように、細胞の少なくとも５つの独立したフィールドをＭｅｔａｍｏｒｐｈを用いた定量分析に使用した。誤差バーは標準誤差を表す。
【図７】図７Ａ：ベクターのみ(Ｖｅｃ：レーン１−３)又はβ２(ＦＬ：β２：レーン４−６)を形質移入したＳＷ６２０細胞における、α−β２抗体(β２：レーン２、３、５、６)又はα-ブタクサ抗体(ＲＷ：レーン１、４)を用いた、ＳＷ６２０細胞の内在性Ｎｏｔｃｈ１の共免疫沈降。イムノブロットはＮｏｔｃｈ１ポリクローナル抗体(Ｇ２０)にてプローブし、バンドは該抗体の予測された大きさに(およそ１２０ｋＤａ、左に示す)検出された。内在性Ｎｏｔｃｈ１のレベルおよび二重バンドパターンをレーン７に示す。このレーン７はＳＷ６２０細胞溶解物(２５μｇの総タンパク質)を含む。図７Ｂ：Ｎｏｔｃｈ１およびβ２ ＥＣＤの結合。レーン１および３はＣＨＯ細胞からのβ２調整培地(Ｈｉｓ(８)タグ付加β２ ＥＣＤを含む)を含み、レーン２及び４は無関係なＨｉｓ(８)タグ付加タンパク質(Ｇｌｉ-１)を含むＣＨＯ細胞からのコントロール調整培地を含む。Ｆｌａｇタグ付加Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＤタンパク質を、記載のようにレーン１−４に加えた。レーン５は１００ｎｇの精製されたＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤを含み、レーン６は５０ｎｇのβ２ ＥＣＤ(大腸菌から発現されて精製されたもの)を含む。ブロットは、α-Ｆｌａｇ抗体(標識したＮｏｔｃｈ１、イムノブロットの上部)を用いてＮｏｔｃｈ１についてプローブし、次いで取り除き、α−β２モノクローナル抗体(３Ｄ１、標識したβ２、イムノブロットの下部)を用いてβ２について再プローブした。分子量(ＫＤａ)を左に示す。図７Ｃ：ＥＧＦリピート領域１０−２１およびβ２ ＥＣＤを含むＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤ断片の結合。レーン１および３はＣＨＯ細胞からのβ２調整培地(Ｈｉｓ(８)タグ付加β２ ＥＣＤを含む)を含み、レーン２及び４は無関係なＨｉｓ(８)タグ付加タンパク質を含むＣＨＯ細胞からのコントロール調整培地を含む。Ｆｌａｇタグ付加Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＤ ＥＧＦリピート領域を、レーン１および２(ＥＧＦ１０−２１)とレーン３および４(ＥＧＦ２２−３３)に加えた。レーン５および６は、それぞれ、７５ｎｇの精製したＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤ、ＥＧＦ１０−２１又はＥＧＦ２２−３３を含む。ブロットは、α-Ｆｌａｇ抗体を用いてＮｏｔｃｈ ＥＣＤをプローブした。分子量(ＫＤａ)を左に示す。 図７Ｄ：β２に応答する核へのＮｏｔｃｈ１ ＮＩＣＤの転移。ベクターのみ(Ｖｅｃ)又は完全長β２タンパク質(ＦＬ：β２)を形質移入したＳＷ６２０細胞におけるＮｏｔｃｈ１ ＮＩＣＤ染色は左の２つのパネルに示し、コントロール調整培地(Ｃ-ＣＭ)又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地(β２-ＣＭ)にて処理したＳＷ６２０細胞のＮＩＣＤ染色は右の２つのパネルに示す。核はＤＡＰＩにて染色した。スケールバー：１５μｍ。パネルの下列は、上パネルの画像から拡大した領域を含む。
【図８】ＲＥＳＴの喪失、β２の発現およびＮｏｔｃｈ経路シグナル伝達の活性化から生じるＥＭＴの誘導についての提唱される経路の概略。ＣＤＨ１＝Ｅ-カドヘリン。
【図９】腫瘍細胞株におけるＲＥＳＴ及びβ２の反相関：ＲＥＳＴおよびβ２の発現についての腫瘍細胞株の免疫蛍光分析の概要。染色の半定量的評価を＋によって示す。
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａ：十分に分化した原発性結腸腫瘍(ＨＦ３７６６、上パネル)およびあまり分化していない浸潤性原発性結腸腫瘍(ＨＦ３５４６、下パネル)の例による、新鮮凍結結腸腫瘍切片のＬＣＭ実験。キャプチャした細胞を左パネルに概説する。図１０Ｂ：β-アクチン発現に基準化した、ＬＣＭおよびマイクロアレイ分析に用いた試料からの切片におけるβ２転写産物発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。図１０Ｃ：ＬＣＭに用いたものに対応する結腸腫瘍切片(新鮮凍結切片)上のβ２転写産物についての非アイソトープインサイツハイブリダイゼーション(ＩＳＨ)。センスコントロールを一致する切片について実行し、下パネルの各画像について示す。
【図１０Ｄ−Ｅ】図１０Ｄ：ベクターのみ(ＶＥＣ：レーン２)又は完全長β２(β２：レーン３)を形質移入したＳＷ６２０における、α−β２モノクローナル抗体(３Ｄ１)を用いたイムノブロット上のβ２タンパク質の検出。２５μｇの総細胞タンパク質をレーン２および３に流した。精製したβ２ ＥＣＤ(４ｎｇ)をレーン１(標識したＥＣＤ)に流した。分子量(ＫＤａ)を右に示す。図１０Ｅ：α−β２モノクローナル抗体(３Ｄ１、上パネル)を用いたイムノブロット分析によるヒト腫瘍全体に対する検出。すべての試料は腫瘍試料であり、起源の組織を初めに列挙する。また、ブロットは、ローディングコントロールとしてβ-チューブリンを用いてプローブした(下パネル)。分子量(ＫＤａ)を左に示す。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ：β２ ＥＣＤを含む調整培地(β２-ＣＭ、右パネル)又はコントロール調製培地(Ｃ-ＣＭ、左パネル)にて処理した様々な細胞株についてのアクチン細胞骨格の染色(ファロイジン)。細胞株(名称は左に列挙する)：ＳＷ４８０、ＰＣ３、ＨＵＶＥＣ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３。核はＤＡＰＩにて染色した。図１１Ｂ：β２応答性の腫瘍細胞株ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＰＣ−３と、内皮細胞株ＨＵＶＥＣにおけるＮｏｔｃｈ１転写産物発現。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータから、ＭＡＳ５強度値をＹ軸にプロットする。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１Ｃ：β２応答性の腫瘍細胞株ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＰＣ−３と、内皮細胞株ＨＵＶＥＣにおけるＮｏｔｃｈ２転写産物発現。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータから、ＭＡＳ５強度値をＹ軸にプロットする。図１１Ｄ：ＳＷ６２０における他のＮｏｔｃｈリガンドとレセプターの発現：Ｊａｇｇｅｄ１(ＪＡＧ１)、Ｊａｇｇｅｄ２(ＪＡＧ２)、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータから、ＭＡＳ５強度値をＹ軸にプロットする。
【図１２】図１２Ａ：β２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理したＳＷ６２０細胞における、０〜７２時間のＨＥＳ１およびＴｗｉｓｔ１転写産物発現。ＲＮＡは０、６、１８、２４、４８および７２時間の時点に細胞から抽出し、汎用比較ＲＮＡに対してＡｇｉｌｅｎｔ全ヒトゲノムマイクロアレイによりマイクロアレイ分析を行った。ログ比率(Ｙ軸)は時間ごとにプロットした(Ｘ軸)。２つの独立したＨＥＳ１オリゴヌクレオチドプローブ配列、及びＴｗｉｓｔ１についての転写産物データを示す。図１２Ｂ：β２ ＥＣＤにて処理したＳＷ６２０細胞における０、６および１８時間のＴｗｉｓｔ１転写産物発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｔｗｉｓｔ１発現は、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に対して基準化した。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ：ＲＥＳＴ枯渇：ＲＥＳＴに特異的なｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＥＳＴ)又は非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ)を形質移入したＳＷ６２０細胞における、ＲＥＳＴ(i)及びβ２(ii)の転写産物発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。転写産物レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に基準化した。図１３Ｂ：ＲＥＳＴ枯渇：ＲＥＳＴに特異的なｓｉＲＮＡ(ｓｉＲＥＳＴ：右パネル)又は非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ：左パネル)を形質移入したＳＷ６２０細胞における、ＲＥＳＴ(上パネル)及びβ２(下パネル)の免疫蛍光分析。核はＤＡＰＩにて染色した。すべての実験群は同じ条件を用いて撮影した。スケールバー：１５μｍ。
【図１３Ｃ】図１３Ｃ：Ｎｏｔｃｈ１枯渇：Ｎｏｔｃｈ１に特異的なｓｉＲＮＡ(ｓｉＮｏｔｃｈ１)又は非ターゲッティングコントロール(ｓｉＮＴ)を形質移入したＳＷ６２０細胞における、Ｎｏｔｃｈ１転写産物発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。転写産物レベルはハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に対して基準化した。
【図１４】抗体ブロック実験。５つの異なる抗β２抗体を競合結合アッセイに用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＲＥＳＴの喪失をＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性化と結びつけるＮｏｔｃｈの新規リガンドとしてのβ２の同定にある程度基づき、それによって腫瘍進行および転移におけるβ２、ＲＥＳＴおよびＮｏｔｃｈのための役割を定める。
【００１５】
Ｉ．定義
特に明記しない限り、「β２」なる用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む、任意の脊椎動物の供与源からの任意の天然のナトリウムチャネルβ２サブユニットを指す。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないβ２、並びに細胞でのプロセシングから生じるβ２の任意の形態を包含する。また、この用語は、β２の天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
本願明細書において用いられる「Ｎｏｔｃｈ」又は「Ｎｏｔｃｈレセプター」なる用語は、一回貫通ヘテロ二量体膜貫通レセプターのＮｏｔｃｈファミリーに属する任意のタンパク質を指す。特に明記しない限り、この用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む、任意の脊椎動物の供与源からの天然のＮｏｔｃｈを包含する。この用語は、哺乳類のＮｏｔｃｈレセプター(Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３及びＮｏｔｃｈ４)を包含する。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＮｏｔｃｈ、並びに細胞でのプロセシングから生じるＮｏｔｃｈの任意の形態を包含する。また、この用語は、Ｎｏｔｃｈの天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００１６】
本願明細書において用いられる「Ｊａｇｇｅｄ」なる用語は、ＮｏｔｃｈのためのリガンドのＪａｇｇｅｄ(または、「Ｓｅｒｒａｔｅ」)ファミリに属する任意のタンパク質を指す。特に明記しない限り、この用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物の供与源からの天然のＪａｇｇｅｄを包含する。この用語は、Ｊａｇｇｅｄ１(Ｓｅｒｒａｔｅ１とも称される)およびＪａｇｇｅｄ２(Ｓｅｒｒａｔｅ２とも称される)と称される哺乳動物のＪａｇｇｅｄファミリを包含する。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＪａｇｇｅｄ、並びに細胞でのプロセシングから生じるＪａｇｇｅｄの任意の形態を包含する。また、この用語は、Ｊａｇｇｅｄの天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
本願明細書において用いられる「ＤＬＬ」は、ＮｏｔｃｈのためのリガンドのＤｅｌｔａ様ファミリに属する任意のタンパク質を指す。特に明記しない限り、この用語は、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物の供与源からの天然のＤＬＬを包含する。この用語は、Ｄｅｌｔａ様１(ＤＬＬ１)、Ｄｅｌｔａ-様３(ＤＬＬ３)およびＤｅｌｔａ-様４(ＤＬＬ４)と称される哺乳動物のＤＬＬファミリメンバーを包含する。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＤＬＬ、並びに細胞でのプロセシングから生じるＤＬＬの任意の形態を包含する。また、この用語は、ＤＬＬの天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００１７】
本明細書において用いられる「ＲＥＳＴ」なる用語は、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)および齧歯動物(例えばマウスおよびラット)のような哺乳動物を含む任意の脊椎動物の供与源からの任意の天然のリプレッサーエレメント１サイレンシング転写(ＲＥＳＴ)因子を指す。この用語は、「完全長」、プロセシングされていないＲＥＳＴ、並びに細胞でのプロセシングから生じるＲＥＳＴの任意の形態を包含する。また、この用語は、ＲＥＳＴの天然に生じる変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
「ＰＲＯ」なる用語は、概して、限定するものではないが、β２、Ｎｏｔｃｈ、Ｊａｇｇｅｄ、ＤＬＬおよびＲＥＳＴのいずれかを含む、本明細書中に記載の任意のタンパク質を指す。
「β２のアンタゴニスト」は、β２又はβ２をコードする核酸(例えばＳＣＮ２Ｂ核酸)の産生を阻害する薬剤；β２のプロセシングを阻害する薬剤(例えばβ２からのＥＣＤの放出)；又は、Ｎｏｔｃｈへのβ２の結合を阻害するためにβ２又はＮｏｔｃｈと直接相互作用する薬剤を指す。
【００１８】
「疾患」は、本発明の組成物又は方法による処置により利益を得るであろう任意の症状又は疾患である。これには、哺乳動物を問題の疾患に罹りやすくする病的状態を含む、慢性及び急性の疾患が含まれる。本明細書において治療される疾患の非限定的な例には、抵抗性又は転移性の癌を含む、癌(例えば結腸癌)などの症状が含まれる。
ここで使用される「治療」（及び「治療する」又は「治療している」などの変形）とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は、疾患又は疾病の発達を遅らせるか、又は疾患又は疾病の進行を緩徐化するために用いられる。
【００１９】
「個体」、「被検体」又は「患者」は脊椎動物である。特定の実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定されないが、家畜(例えばウシ)、スポーツ用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌ及びウマ）、霊長類、マウス及びラットが含まれる。特定の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「薬学的製剤」なる用語は、活性成分の生物学的活性が有効となるような形態であり、製剤が投与される被検体に対して許容できない毒性がある付加的化合物を含まない調製物を指す。このような製剤は無菌でもよい。
【００２０】
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
個体に所望する反応を引き出すための本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量を含む。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００２１】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な影響を有する任意の物質である。
【００２２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばNicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)；ＣＤＰ３２３、経口α-４インテグリンインヒビター；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(ＤＯＸＩＬ(登録商標))、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、��ソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、テガフール(ＵＦＴＯＲＡＬ(登録商標))、カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))、エポチロン及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)およびドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ薬剤、例えばシス��ラチン、オキサリプラチン(例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標))及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))およびビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えばベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロネート(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロネート(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリホシン、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；ティピファニブ(Ｒ１１５７７)；オラフェニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２インヒビター、例えばオブリメルセンナトリウム(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲインヒビター(下記の定義を参照)；チロシンキナーゼインヒビター(下記の定義を参照)；セリン-スレオニンキナーゼインヒビター、例えばラパマイシン(シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標))；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、例えばロナファーニブ(ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ)；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
【００２３】
本明細書において定義する化学療法剤には、癌の増殖を促しうるホルモンの影響を調節する、低減する、ブロックする又は妨げるように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌療法」が含まれる。それらは、それ自体ホルモン類であり、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニスト性質を有する抗エストロゲン類、例えば、タモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標))、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標))、イドキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、ラロキシフェン(ＥＶＩＳＴＡ(登録商標))、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)およびＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲンレセプター調節因子(ＳＥＲＭ)；アゴニスト性質を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))およびＥＭ８００(このような薬剤は、エストロゲンレセプター(ＥＲ)二量体化をブロックする、ＤＮＡ結合を阻害する、ＥＲ代謝回転を増やす、および／またはＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタンおよびエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標))などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))およびアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、メゲストロールアセテート(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール及び４(５)-イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)およびＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリンおよびトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテートおよびメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、およびアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、すべてのトランスレチオニン酸およびフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；及び上記いずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。
【００２４】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、例えば１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００２５】
「癌」及び「癌性」は、一般的に、無秩序な細胞成長／増殖により特徴付けられる哺乳動物の生理的状況を意味する。このような癌の例には、これに限定されないが、カルシノーマ、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含む。癌のより詳細な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、グリオーマ、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病及び他のリンパ球増殖性疾患、及び様々な型の頭部癌及び頸部癌が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」は、無視できない程の異常な細胞増殖に関連した疾患を意味する。一実施態様において、細胞増殖性疾患は癌である。
「細胞成長又は増殖を阻害する」とは、細胞の成長又は増殖が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％減少することを意味し、細胞死を誘導することを含む。
【００２６】
本明細書中で用いる「腫瘍」なる用語は、悪性、良性を問わずすべての腫瘍性細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」は、ここで述べられるように、相互に排他的ではない。
「結腸直腸腫瘍」又は「結腸直腸癌」なる用語は、大腸の任意の腫瘍又は癌を指し、結腸(盲腸から直腸の大腸)および直腸を含む。
「結腸直腸癌細胞」は、インビボ又はインビトロの結腸癌細胞又は直腸癌細胞を指し、結腸直腸癌細胞由来の細胞株を包含する。
「結腸腫瘍」又は「結腸癌」は、結腸の任意の腫瘍又は癌を指す。
「結腸癌細胞」は、インビボ又はインビトロの結腸癌細胞を指し、結腸癌細胞由来の細胞株を包含する。
「新生物」又は「新生物性細胞」なる用語は、対応する正常な組織又は細胞より早く増殖し、増殖を開始させた刺激の除去の後にも増殖し続ける異常な組織又は細胞を指す。
【００２７】
「上皮間葉相互作用」又は「ＥＭＴ」なる用語は、細胞が上皮性質を喪失し、細胞接着の喪失及び移動の増加などの間葉性質を獲得するプロセスを指す。腫瘍細胞の場合、局所の浸潤および／または転移を促進する。
「腫瘍進行」なる用語は、腫瘍形成、腫瘍成長および増殖、浸潤および転移を含む腫瘍のすべての段階を指す。  
「腫瘍進行を阻害する」なる用語は、腫瘍の発達、成長、増殖又は拡散を阻害することを意味し、限定するものではないが以下の効果を含む。(1) 緩徐化又は完全な増殖停止を含む、腫瘍増殖のある程度の阻害；(2) 腫瘍細胞の数の減少；(3) 腫瘍サイズの低減；(4) 隣接した末梢臓器および／または組織への腫瘍細胞浸潤の阻害(すなわち緩徐化又は完全な停止)；(5) 転移の阻害(すなわち緩徐化又は完全な停止)；(6) 腫瘍治療後の患者又は患者集団の生存率の増加；および／または、(7) 腫瘍治療後のある時点での患者又は患者集団の死亡率の低下。
腫瘍進行が上記の通り阻害される場合、腫瘍は特定の薬剤に「反応する」。
【００２８】
「アンチセンス核酸」なる用語は、部分的又は完全に相補的である標的ポリヌクレオチドの発現を低減する核酸を指す。アンチセンス核酸は、標的ポリヌクレオチドのために「特定である」、(a)標的ポリヌクレオチド又はコードされたｍＲＮＡに選択的に結合し、(b)標的ポリヌクレオチドの発現を少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％低減する場合、標的ポリヌクレオチドに「特異的で」ある。
「ＲＮＡｉ」又は「ＲＮＡ干渉」は、例えば二本鎖ＲＮＡ媒介メカニズムによるＲＮＡ媒介メカニズムによる遺伝子発現の部分的な又は完全な阻害を意味する。「ノックダウン」なる用語は、遺伝子発現の一部又は完全な阻害を指す。
「調節ＲＮＡ」又は「調節ＲＮＡ分子」なる用語は、例えば対応するｍＲＮＡの発現を調節することにより、遺伝子の発現を調節することができるＲＮＡを意味する。かかる調節ＲＮＡには、限定するものではないが、ＲＮＡｉ可能なＲＮＡが含まれる。調節ＲＮＡは、もしそれが、（ａ）標的ポリヌクレオチド又はこのコードされたｍＲＮＡに選択的に結合し、及び／又は（ｂ）標的ポリヌクレオチドを発現する細胞において調節ＲＮＡが発現される場合、標的ポリヌクレオチドの発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ低減させるならば、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的」である。
【００２９】
「ｓｉＲＮＡ」又は「低分子干渉ＲＮＡ」なる用語は、ｓｉＲＮＡが標的ポリヌクレオチドと同じ細胞中で発現される場合に標的ポリヌクレオチドの発現を減少させ又は阻害する能力を有している二本鎖ＲＮＡを意味する。二本鎖ＲＮＡを形成するｓｉＲＮＡの相補鎖は典型的には実質的な又は完全な同一性を有している。一実施態様では、ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡであって、その一方の鎖（「アンチセンス」鎖とも呼ぶ）が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的な又は完全な同一性を有している。ある実施態様では、ｓｉＲＮＡは、約１５−５０ヌクレオチド長、約２０−３０ヌクレオチド長、約２０−２５ヌクレオチド長、又は２４−２９ヌクレオチド長であり、上述の範囲内の整数である任意の長さを含む。その全体が出典明示によりここに援用されるＷＯ０３０７６５９２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２３７もまた参照のこと。ｓｉＲＮＡ分子は、もしそれが、（ａ）標的ポリヌクレオチド又はそのコードされたｍＲＮＡに選択的に結合し、及び／又は（ｂ）標的ポリヌクレオチドを発現する細胞においてｓｉＲＮＡが発現される場合、標的ポリヌクレオチドの発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ低減させるならば、標的ポリヌクレオチドに対して「特異的」である。
「ｓｉＲＮＡ」なる用語は、例えばミクロＲＮＡ前躯体（プレ-ｍｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のようなヘアピン構造を形成可能なＲＮＡを包含する。例えば、Brummelkamp等 (2002) Science 550-553を参照のこと。プレ−ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、センス領域、アンチセンス領域、及びループ領域を有し、ヘアピン構造を形成可能である自己相補的なＲＮＡ分子である。ある実施態様では、センス及びアンチセンス領域はそれぞれ約１５−５０ヌクレオチド長、約２０−３０ヌクレオチド長、約２０−２５ヌクレオチド長、又は２４−２９ヌクレオチド長であり、前記範囲内の整数である任意の長さを含む；またループ部分は約２−１５ヌクレオチド長又は約６−９ヌクレオチド長であり、前記範囲内の整数である任意の長さを含む。
【００３０】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」なる用語は、膜貫通及び細胞質のドメインの実質すべてを除外する膜貫通タンパク質の領域を指す。
「可溶性ポリペプチド」は、膜結合性でないポリペプチドを指す。
「抵抗性」腫瘍は、関連する分野の臨床医が、治療に対して有意に耐性がある及び／又は有意に応答しない(又はそのことが予測される)(例えば、治療が施される場合であっても、腫瘍体積、癌細胞の数及び／又は癌の拡散の増加がある)と結論付けるであろう腫瘍を指す。この文脈において、このような治療には、限定するものではないが、化学療法、放射線、幹細胞移植および外科的処置が含まれるが、ＲＥＳＴのアゴニスト、β２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストによる処置は除外される。「化学療法に耐性がある」なる表現は、関連する分野の臨床医が、ＲＥＳＴのアゴニスト、β２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストによる化学療法を除く、化学療法に対して有意に耐性がある及び／又は有意に応答しない(又はそのことが予測される)腫瘍を指す。
「再発した」とは、治療後に以前の罹患状態に実質的に戻る患者の疾患の退行、特に、治療に応答して見かけの回復又は部分的な回復(例えば寛解)後の症状(例えば癌細胞)の戻りを指す。この文脈において、このような治療には、限定するものではないが、化学療法、放射線、幹細胞移植および外科的処置が含まれるが、ＲＥＳＴのアゴニスト、β２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストによる処置は除かれる。
【００３１】
本明細書中の「抗体」は最も広義に用いられ、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２のインタクトな抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を表す限りにおける抗体断片を包含する。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、タンパク質は、(１)例えばローリー法で測定した場合９５％を超える抗体、ある実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで十分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００３２】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間のインターフェイスを形成すると考えられている。
「抗ＰＲＯ抗体」又は「ＰＲＯに結合する抗体」は、抗体がＰＲＯをターゲッティングする際に診断用及び／又は治療用の薬剤として有用である程度に十分な親和性を有してＰＲＯを結合することが可能である抗体を指す。好ましくは、関係がなくＰＲＯでないタンパク質への抗ＰＲＯ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、ＰＲＯへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、ＰＲＯに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０.１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＰＲＯ抗体は、異なる種のＰＲＯ間で保存されるＰＲＯのエピトープに結合する。
【００３３】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＨＶＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００３４】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)(W.B. Saunders, Co., 2000)に概説されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された融合大分子の一部であり得る。
【００３５】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ほぼインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
本明細書中の「ネイキッド抗体」は、細胞障害性部分又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくは抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【００３６】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００３７】
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００３８】
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
【００３９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
【００４０】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体には、抗体の抗原結合領域が例えば対象の抗原をマカクザルに免疫投与することによって作製される抗体に由来している、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ(登録商標)抗体が含まれる。
【００４１】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えばJones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また例としてVaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；米国特許第6982321号及び同第7087409号も参照のこと。
【００４２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)において記述される方法は、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されるヒト抗体に関するLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。
【００４３】
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つの高頻度可変領域のうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例としてXu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。例としてHamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736を参照。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４４】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られているある手順を用いて生産されてよい。例えば、Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、例としてBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「遮断(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、ほぼ又は完全に遮断しうる。
本明細書において使用する「アゴニスト」抗体は、対象とするポリペプチドの機能活性の少なくとも一つを部分的に又は完全に模倣する抗体である。
【００４５】
「増殖阻害性」抗体は、抗体が結合する抗原を発現している細胞の増殖を妨げるか又は低減するものである。例えば、抗体は、インビトロおよび／またはインビボの癌細胞の増殖を妨げる又は低減しうる。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００４６】
「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中の定義に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
【００４７】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の配列同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
【００４８】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 例としてRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)：国際公開２００４／９２２１９(Hinton et al.)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
【００４９】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
【００５０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００５１】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更して(変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド)Ｃ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、例として米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体とＫ４４７残基を有さない抗体の混合集団を包含しうる。
【００５２】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に結合親和性を測定するための具体的な例示的実施態様を記載する。
【００５３】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで示されるような、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する(例としてChen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをTopcountＴＭγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
【００５４】
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる用語は、当業者が２つの数値(例えば、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較値の例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
ここで用いる「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
【００５５】
「精製」とは、分子が、含まれる試料中の重量にして少なくとも９５％、又は重量にして少なくとも９８％の濃度で試料中に存在することを意味する。
「単離された」核酸分子は、例えば天然の環境に通常付随している少なくとも一の他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子を通常発現するが、その核酸分子がその天然の染色体位置と異なる染色体位置にあるか又は染色体外に存在する、細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００５６】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二本鎖ＤＮＡを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００５７】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後になされる修飾(一又は複数)、例えば標識との結合を含みうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロア���ケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００５８】
ＩＩ．本発明の実施態様
様々な実施態様では、ＲＥＳＴ機能の喪失、β２の発現および／またはＮｏｔｃｈの活性化に特徴がある腫瘍の分類、診断、治療および予防のための組成物および方法が提供される。更なる実施態様では、ＥＭＴ、細胞移動およびアポトーシスなどの細胞プロセスの調節のための組成物および方法が提供される。これらおよび本発明の更なる実施態様は、転写リプレッサＲＥＳＴの喪失によりβ２が発現され、次に結合し、腫瘍におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するという発見に基づく。
【００５９】
Ａ．組成物
抵抗性腫瘍を含む腫瘍の治療又は予防のための組成物が提供される。このような組成物は、ＲＥＳＴアゴニスト、β２アンタゴニストおよびＮｏｔｃｈアンタゴニストを、単独又は組み合わせて含みうる。
一態様では、β２アンタゴニストは、β２に結合するブロック抗体である。一実施態様では、このような抗体はＮｏｔｃｈへのβ２の結合を(部分的に又は完全に)ブロックする。一実施態様では、ブロック抗体はβ２のＥＣＤに結合する。β２に結合するある抗体は本明細書において記述され、３Ｄ１.４.１(「３Ｄ１」)、１２Ａ９.２２.１(「１２Ａ９」)、２Ｅ３.１.１(「２Ｅ３」)、１２Ｅ３又は３Ｇ５と称される。また、本明細書において、３Ｄ１、１２Ａ９、２Ｅ３、１２Ｅ３又は３Ｇ５のいずれかと同じエピトープに結合する抗体、並びにβ２への結合について３Ｄ１、１２Ａ９、２Ｅ３、１２Ｅ３又は３Ｇ５のいずれかと競合する抗体が提供される。一実施態様では、ブロック抗体は３Ｄ１、１２Ａ９、２Ｅ３又は３Ｇ５から選択される。一実施態様では、ブロック抗体は３Ｄ１、１２Ａ９、２Ｅ３又は３Ｇ５と同じエピトープに結合する。一実施態様では、ブロック抗体は、β２への結合について３Ｄ１、１２Ａ９、２Ｅ３又は３Ｇ５のいずれかと競合する。
ある実施態様では、本明細書において提供される抗体はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２断片、又は単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例として米国特許第６２４８５１６号Ｂ１参照)。ある実施態様では、抗体は二重特異性抗体である(例として国際公開９４／０４６９０およびSuresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121:210を参照)。ある実施態様では、抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒトの抗体である。例えば、３Ｄ１、１２Ａ９、２Ｅ３、１２Ｅ３又は３Ｇ５のいずれかのヒト化形態が本願明細書において提供される。
【００６０】
他の態様では、β２アンタゴニストは、ＳＣＮ２Ｂ発現を減少させる核酸である。一実施態様では、核酸は、ＳＣＮ２Ｂに特異的なアンチセンス核酸である。そのような実施態様では、核酸は調節ＲＮＡである。そのような実施態様では、核酸は、ＲＮＡｉによってＳＣＮ２Ｂ発現を低減する。そのような実施態様では、核酸はｓｉＲＮＡである。あるＳＣＮ２Ｂ特異的ｓｉＲＮＡは当分野で公知である。例えば、あるＳＣＮ２Ｂ特異的ｓｈＲＮＡは市販されている(例えばSigma-Aldrich, St. Louis, MOから)。特定の他のβ２アンタゴニストは当分野で知られていてよい。例えば、α-分泌酵素の小分子インヒビターであるＴＡＰＩ-１は、β２からの外部ドメイン分断を阻害するために用いられうる。(Kim et al., J. Biol. Chem. 280:23251-23261, 2005を参照)。
他の態様では、β２アンタゴニストは、β２に結合するＮｏｔｃｈの断片を含む、単離されたポリペプチド、好ましくは可溶性ポリペプチドである。β２に結合するＮｏｔｃｈの断片は、β２への結合について内在性Ｎｏｔｃｈと競合すると思われる。ある実施態様では、このような断片は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達をもたらすことが実質的にできない。一実施態様では、ポリペプチドは、ＥＧＦリピート１０−２１又は１４−２１を含む哺乳動物のＮｏｔｃｈ１の断片、又はＮｏｔｃｈファミリ、例えばＮｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３又はＮｏｔｃｈ４のメンバーの機能的に等価な断片を含む。このような機能的に等価な断片は、例えばＮｏｔｃｈ１のアミノ酸配列を第二のＮｏｔｃｈファミリメンバーのポリペプチド配列と整列させ、後者において対応する断片を同定し、場合によってβ２結合について同定された断片を試験することによって、常法で確認されてよい。ヒトＮｏｔｃｈのアミノ酸配列は配列番号：１に示される。ＥＧＦリピート１０−２１は、配列番号：１のおよそ以下の位置に位置する。  
【００６１】
2015096502.tif 000003
【００６２】
他の実施態様では、単離されたポリペプチドは、β２に特異的に結合するＮｏｔｃｈの断片を含み、このときこの文脈において「特異的に結合する」とは、この断片が他のいかなるＮｏｔｃｈリガンドにも実質的に結合しないことを意味する。他の実施態様では、単離されたポリペプチドは、β２に結合するが、Ｊａｇｇｅｄおよび／またはＤＬＬに結合しないＮｏｔｃｈの断片を含む。他の実施態様では、単離されたポリペプチドは、β２に結合し、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０又は１００のアミノ酸以下の長さであるＮｏｔｃｈの断片を含む。
他の態様では、β２アンタゴニストは、β２に結合するＮｏｔｃｈの領域に結合する抗体である。一実施態様では、領域は、ＥＧＦリピート１０−２１又は１４−２１を含む哺乳動物のＮｏｔｃｈ１の領域、又はＮｏｔｃｈファミリ、例えばＮｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３又はＮｏｔｃｈ４のメンバーの機能的に等価な領域である。このような機能的に等価な断片は、例えばＮｏｔｃｈ１のポリペプチド配列を第二のＮｏｔｃｈファミリメンバーのポリペプチド配列と整列させ、後者において対応する領域を同定し、場合によってβ２結合について同定された領域を試験することによって、常法で確認されてよい。ある実施態様では、β２に結合するＮｏｔｃｈの領域に結合する抗体は、Ｎｏｔｃｈへのβ２の結合を特異的にブロックし、このときこの文脈において「特異的に結合する」とは、この抗体が他のいかなるＮｏｔｃｈへのＮｏｔｃｈリガンドの結合もブロックしないことを意味する。ある実施態様では、β２に結合するＮｏｔｃｈの領域に結合する抗体は、Ｊａｇｇｅｄおよび／またはＤＬＬの結合をブロックしない。
【００６３】
他の態様では、組成物はＲＥＳＴアゴニストを含む。一実施態様では、ＲＥＳＴアゴニストはＲＥＳＴであり、ＲＥＳＴの生物学的活性(例えば腫瘍サプレッサー活性)を保持する完全長ＲＥＳＴの断片又は変異体を含む。他の実施態様では、ＲＥＳＴアゴニストは前記いずれかをコードする核酸である。
他の態様では、組成物はＮｏｔｃｈアンタゴニストを含む。Ｎｏｔｃｈ活性は、様々な選択的な手法(例えばアンチセンス、モノクローナル抗体およびＲＮＡｉ)、および選択的でない手法(例えばＮｏｔｃｈの可溶型又はＮｏｔｃｈデコイ、γ-分泌酵素インヒビター、細胞内ＭＡＭＬ１デコイおよびＲａｓシグナル伝達インヒビター)によってアンタゴナイズされ得、様々なＮｏｔｃｈアンタゴニストは当分野で公知である。例えば、様々なγ-分泌酵素インヒビターは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性を阻害することが知られている。Zayzafoon et al., J. Biol. Chem. 279:3662-3670, 2004(ペプチド模倣薬Ｌ−６８５４５８のＮｏｔｃｈ阻害効果を記載している)；及びCurry et al., Oncogene 24:6333-6344, 2005(トリペプチドアルデヒドインヒビターおよびγ-分泌酵素のペプチド模倣インヒビター(ＬＹ−４１１５７５)のＮｏｔｃｈ阻害効果を記載している)を参照のこと。γ-分泌酵素の小分子インヒビターおよびＮｏｔｃｈシグナル伝達活性のインヒビターであるＭＫ-０７５２は、現在臨床試験が実施されている。J. Clin. Oncol., 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: 6585を参照。
【００６４】
また、本明細書において、ＥＭＴ、細胞移動および／またはアポトーシスへの耐性を促すための組成物が提供される。例えば、細胞生存率及び／又は細胞移動の増加が望ましい場合(例えば創傷治癒)、このような組成物は治療的環境において有用である。また、このような組成物は研究環境において有用である。このような組成物は、β２アゴニスト、ＲＥＳＴアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈアゴニストを単独又は組み合わせて含んでいてよい。 
一態様では、例示的なβ２アゴニストは、β２の生物活性(例えばＮｏｔｃｈを結合するおよび／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する能力)を保持する完全長β２の断片又は変異体を含む、β２を含む。β２アゴニストは、例えば、β２のＥＣＤ、又はＮｏｔｃｈを結合しておよび／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する能力を保持する断片ないしは変異体を含んでいてよい。他の実施態様では、β２アゴニストは前述のいずれかをコードする核酸である。ヒトβ２のアミノ酸配列は配列番号：２に示される。以下の形質のおよその位置を示す。アミノ酸１−２９のシグナルペプチド；アミノ酸３０−１５９のＥＣＤ；アミノ酸１６０−１８０の膜貫通ドメイン；アミノ酸１８１−２１５の細胞質ドメイン、およびアミノ酸３２−１５４のＩｇ様ドメイン。
【００６５】
他の態様では、例示的なＮｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈの生物活性(例えば標的遺伝子の発現を活性化する能力)を保持する完全長Ｎｏｔｃｈの断片ないしは変異体を含むＮｏｔｃｈを含む。例えば、細胞外サブユニットを欠いているＮｏｔｃｈレセプターは構成的に活性化され、インビトロ及び動物モデルでトランスフォーミング活性を有する。Nickoloff et al., Oncogene 22:6598-6608を参照。他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈアゴニストは、Ｎｏｔｃｈに結合するアゴニスト抗体である。
他の態様では、例示的なＲＥＳＴアンタゴニストには、欠失突然変異体と、ＲＥＳＴ活性を低減させた(例えば、腫瘍サプレッサー活性を低減させた)ＲＥＳＴの他の変異型が含まれる。例としてWestbrook et al., Cell 121:837-848, 2005参照。
【００６６】
Ｂ．方法
一態様では、本明細書において、抵抗性腫瘍の進行を含む腫瘍進行の治療又は防止のための方法が提供される。ある実施態様では、腫瘍進行の阻害方法であって、腫瘍をβ２のアンタゴニスト、ＮｏｔｃｈのアンタゴニストおよびＲＥＳＴのアゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアンタゴニスト、ＮｏｔｃｈのアンタゴニストおよびＲＥＳＴのアゴニストが上記されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアンタゴニストである。
他の実施態様では、腫瘍はＲＥＳＴ活性を低減させた。「低減したＲＥＳＴ活性」は、例えば、限定するものではないがＲＥＳＴ遺伝子の一部又はすべての欠損を含むＲＥＳＴ遺伝子における突然変異、又はＲＥＳＴの生物活性を低減する任意の他の事象(例えば転写レプレッサー活性及び／又は腫瘍サプレッサー活性)による、ＲＥＳＴのレベルの有意な減少又はＲＥＳＴ機能の有意な喪失(ＲＥＳＴ機能の完全又は一部の喪失)を指す。腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の減少は、例えば、腫瘍と同じ組織タイプの正常組織におけるＲＥＳＴのレベル又は活性と比較して、腫瘍におけるＲＥＳＴのレベル又は活性を比較することによって検出されてもよい。
【００６７】
他の実施態様では、腫瘍はβ２活性を増加させている。「増加したβ２活性」は、β２のレベル又は活性(例えば、Ｎｏｔｃｈを結合する能力；ＥＭＴを誘導する能力；細胞移動を誘導する能力；又はアポトーシスをブロックする能力)の有意な増加を指す。β２活性の増加は、例えば、腫瘍と同じ組織タイプの正常組織におけるβ２のレベル又は活性と比較して、腫瘍におけるβ２のレベル又は活性を比較することによって検出されてもよい。
他の実施態様では、腫瘍はＮｏｔｃｈ活性を増加させている。「増加したＮｏｔｃｈ活性」は、Ｎｏｔｃｈのレベル又は活性(例えば一又は複数の標的遺伝子、例えばＨＥＳファミリ遺伝子、細胞周期調節遺伝子(例えばｐ２１ｃｉｐ１／ｗａｆ１、サイクリンＤ１)、ＮＦ−κＢファミリ遺伝子、又はＰＰＡＲファミリ遺伝子の発現を増やす能力)の有意な増加を指す。Ｎｏｔｃｈ活性の増加は、例えば、腫瘍と同じ組織タイプの正常組織におけるＮｏｔｃｈのレベル又は活性と比較して、腫瘍におけるＮｏｔｃｈのレベル又は活性を比較することによって検出されてもよい。
他の実施態様では、腫瘍は抵抗性腫瘍である。そのような実施態様では、腫瘍は化学療法に抵抗力がある。他の実施態様では、腫瘍は転移性である。他の実施態様では、腫瘍は、結腸腫瘍又は図１０Ｅに示される腫瘍タイプから選択される腫瘍である。他の実施態様では、腫瘍は再発した患者に起こる。
【００６８】
他の態様では、細胞におけるＥＭＴの阻害方法であって、細胞をβ２のアンタゴニスト、ＲＥＳＴのアゴニストおよびＮｏｔｃｈのアンタゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアンタゴニスト、ＮｏｔｃｈのアンタゴニストおよびＲＥＳＴのアゴニストは上記されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアンタゴニストである。他の実施態様では、上記の通り、細胞はＲＥＳＴ活性を低減させている。他の実施態様では、上記の通り、細胞はβ２活性を増加させている。他の実施態様では、上記の通り、細胞はＮｏｔｃｈ活性を増加させている。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。他の実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。そのような実施態様では、腫瘍細胞は抵抗性腫瘍由来である。そのような実施態様では、腫瘍は化学療法に耐性がある。他の実施態様では、腫瘍細胞は転移性腫瘍由来である。他の実施態様では、腫瘍細胞は、結腸腫瘍細胞又は図１０Ｅから選択される腫瘍細胞型である。他の実施態様では、腫瘍細胞は再発した患者から得られる。
【００６９】
他の態様では、細胞の移動の阻害方法であって、細胞をβ２のアンタゴニスト、ＲＥＳＴのアゴニストおよびＮｏｔｃｈのアンタゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアンタゴニスト、ＮｏｔｃｈのアンタゴニストおよびＲＥＳＴのアゴニストは上記で検討されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアンタゴニストである。他の実施態様では、上記の通り、細胞はＲＥＳＴ活性を減少させている。他の実施態様では、上記の通り、細胞はβ２活性を増加させている。他の実施態様では、上記の通り、細胞はＮｏｔｃｈ活性を増加させている。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。他の実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。そのような実施態様では、腫瘍細胞は抵抗性腫瘍に由来する。そのような実施態様では、腫瘍は化学療法に耐性がある。他の実施態様では、腫瘍細胞は転移性腫瘍に由来する。他の実施態様では、腫瘍細胞は、結腸腫瘍細胞又は図１０Ｅから選択される腫瘍細胞型である。他の実施態様では、腫瘍細胞は再発した患者から得られる。
【００７０】
他の態様では、細胞のアポトーシスの促進方法であって、細胞をβ２のアンタゴニスト、ＲＥＳＴのアゴニストおよびＮｏｔｃｈのアンタゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアンタゴニスト、ＮｏｔｃｈのアンタゴニストおよびＲＥＳＴのアゴニストは上記で検討されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアンタゴニストである。他の実施態様では、上記の通り、細胞はＲＥＳＴ活性を低減させている。他の実施態様では、上記の通り、細胞はβ２活性を増加させている。他の実施態様では、上記の通り、細胞はＮｏｔｃｈ活性を増加させている。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。他の実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。そのような実施態様では、腫瘍細胞は抵抗性腫瘍に由来する。そのような実施態様では、腫瘍は化学療法に耐性がある。他の実施態様では、腫瘍細胞は転移性腫瘍に由来する。他の実施態様では、腫瘍細胞は、結腸腫瘍細胞又は図１０Ｅから選択される腫瘍細胞型である。他の実施態様では、腫瘍細胞は再発した患者から得られる。
【００７１】
他の態様では、細胞におけるＥＭＴの促進方法であって、細胞をβ２のアゴニスト、ＲＥＳＴのアンタゴニストおよびＮｏｔｃｈのアゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアゴニスト、ＮｏｔｃｈのアゴニストおよびＲＥＳＴのアンタゴニストは上記で検討されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアゴニストである。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。
他の態様では、細胞移動の促進方法であって、細胞をβ２のアゴニスト、ＲＥＳＴのアンタゴニストおよびＮｏｔｃｈのアゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアゴニスト、ＮｏｔｃｈのアゴニストおよびＲＥＳＴのアンタゴニストは上記で検討されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアゴニストである。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。
他の態様では、アポトーシスの遮断方法であって、細胞をβ２のアゴニスト、ＲＥＳＴのアンタゴニストおよびＮｏｔｃｈのアゴニストから選択される一又は複数の薬剤にさらすことを含む方法が提供される。特定のβ２のアゴニスト、ＮｏｔｃｈのアゴニストおよびＲＥＳＴのアンタゴニストは上記で検討されており、本明細書において記述される方法で用いられてよい。一実施態様では、薬剤はβ２のアゴニストである。他の実施態様では、細胞はインビトロである。他の実施態様では、細胞はインビボである。
【００７２】
他の態様では、腫瘍がβ２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストに応答するか否かの決定方法であって、腫瘍においてＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加を検出することを含み、このとき腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加が、腫瘍がβ２のアンタゴニスト又はＮｏｔｃｈのアンタゴニストに応答することを示す方法が提供される。一実施態様では、方法は、腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＲＥＳＴ活性の低減をもたらすＲＥＳＴ遺伝子の突然変異を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＲＥＳＴ遺伝子の欠失を検出することを含む。他の実施態様では、方法は、腫瘍におけるβ２活性の増加を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＳＣＮ２Ｂ ｍＲＮＡのレベルの増加を検出することを含む。他の実施態様では、方法は、β２タンパク質のレベルの増加を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、細胞外環境におけるβ２ ＥＣＤのレベルの増加を検出することを含む。他の実施態様では、腫瘍は抵抗性腫瘍である。そのような実施態様では、腫瘍は化学療法に耐性がある。他の実施態様では、腫瘍は転移性である。他の実施態様では、腫瘍は、結腸腫瘍又は図１０Ｅに示される腫瘍タイプから選択される腫瘍である。他の実施態様では、腫瘍は再発した患者に由来する。
【００７３】
他の態様では、腫瘍の予後の評価方法であって、腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加を検出することを含み、このときＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加が、腫瘍の予後が悪いことを示す方法が提供される。「予後が悪い」とは、腫瘍が抵抗性および／または転移性であるという実質的な可能性(＞５０％の見込み)があることを意味する。一実施態様では、方法は、腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＲＥＳＴ活性の低減をもたらすＲＥＳＴ遺伝子の突然変異を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＲＥＳＴ遺伝子の欠失を検出することを含む。他の実施態様では、方法は、腫瘍におけるβ２活性の増加を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＳＣＮ２Ｂ ｍＲＮＡのレベルの増加を検出することを含む。別の実施態様では、方法は、β２タンパク質のレベルの増加を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、細胞外環境におけるβ２ ＥＣＤのレベルの増加を検出することを含む。他の実施態様では、腫瘍は、結腸腫瘍又は図１０Ｅに示される腫瘍タイプから選択される腫瘍である。
【００７４】
他の態様では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が活性化されるものとして腫瘍を分類する方法であって、腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加を検出することを含み、このときＲＥＳＴ活性の低減又はβ２活性の増加が、腫瘍がＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性化されるものであることを示す方法が提供される。一実施態様では、方法は、腫瘍におけるＲＥＳＴ活性の低減を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＲＥＳＴ活性の低減をもたらすＲＥＳＴ遺伝子の突然変異を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＲＥＳＴ遺伝子の欠失を検出することを含む。他の実施態様では、方法は、腫瘍におけるβ２活性の増加を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、ＳＣＮ２Ｂ ｍＲＮＡのレベルの増加を検出することを含む。別の実施態様では、方法は、β２タンパク質のレベルの増加を検出することを含む。そのような実施態様では、方法は、細胞外環境におけるβ２ ＥＣＤのレベルの増加を検出することを含む。他の実施態様では、腫瘍は、結腸腫瘍又は図１０Ｅに示される腫瘍タイプから選択される腫瘍である。他の実施態様では、腫瘍は抵抗性腫瘍である。そのような実施態様では、腫瘍は化学療法に耐性がある。他の実施態様では、腫瘍は転移性である。他の実施態様では、腫瘍は再発した患者に由来する。
【００７５】
Ｃ．薬学的製剤と投与
薬剤、例えば上記のセクションＩＩ．Ａに示す抗体、タンパク質又は核酸を含んでなる薬学的製剤は、一般に当分野で公知の方法に従って調整されうる。このような製剤は、所望の純度を持つ薬剤と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに一般に低毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与に使用される薬学的製剤は一般に無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【００７６】
また薬剤は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)において開示される。
【００７７】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、活性な薬剤を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された薬剤が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ抗体の場合に免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【００７８】
他の態様では、治療又は予防のために、上記セクションＩＩ．Ａに示す薬剤、例えば抗体、タンパク質又は核酸を投与するための方法が提供される。ある実施態様では、薬剤は、少なくとも一の更なる治療薬および／またはアジュバントと組み合わせて投与される。ある実施態様では、更なる治療的薬剤は、細胞障害性剤、化学療法剤又は増殖阻害性剤である。このような実施態様のうちの１において、化学療法剤は、結腸癌の治療で用いられる薬剤又は薬剤の組み合わせてある。このような薬剤には、限定するものではないが、フルオロウラシル(５ＦＵ)単独、又はロイコボリン又はレバミゾール；エドレコロマブ；イリノテカン；オキサリプラチン；raltitrexed；及びフルオロピリミジンとの組合せが含まれる。
上記した併用療法は、併用投与(２以上の治療薬が同じ又は別々の製剤に含まれる場合)、及び別々の投与を包含し、その場合、薬剤の投与は、更なる治療的薬剤および／またはアジュバントの投与の前、同時及び／又は後に行うことができる。また、薬剤は放射線療法と組み合わせて用いられてよい。 
【００７９】
薬剤(と任意の更なる治療薬又はアジュバント)は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内、及び望ましい場合には局所治療の場合には病巣内投与を含む任意の適切な方法により投与されうる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。加えて、薬剤は、特に薬剤の用量を漸減しながらパルス注入によって投与されてもよい。投薬は、投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば静脈内注射又は皮下注射などの注射により任意の好適な経路により行われる。
遺伝子治療方法は、例えば本明細書中に記載の核酸のいずれかをインビボの細胞に運搬するために用いられてよい。一実施態様では、ターゲッティング薬剤は、核酸を含有している媒介物を所望の組織へ導くために用いられる。
【００８０】
現在、核酸（場合により、ベクターを含む）を哺乳動物の細胞に導入するためには、２つの主用なアプローチ：インビボおよびエクスビボがある。インビボデリバリー用には、核酸を、哺乳動物内の、通常は核酸及び該当する場合にはコードされたポリペプチドが必要とされる部位に間接的に注入する。エクスビボ処置用には、哺乳動物の細胞を取り出し、これらの単離された細胞に核酸を導入し、この修飾された細胞を直接哺乳動物に投与するか、あるいは、例えば多孔性膜内に包んで哺乳動物に移植する(例えば米国特許第４８９２５３８号および第５２８３１８７号を参照のこと)。 
生存能力のある細胞に核酸を導入するための種々の利用可能な技術が存在する。この技術は、核酸を意図される宿主のインビトロ培養細胞に移すのか、あるいはインビボ細胞に移すのかに依存して変化する。核酸をインビトロ哺乳類細胞に移すのに適当な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法の使用などが含まれる。形質導入には、複製欠損性組換えウイルス（レトロウイルスを含むがこれに限定しない）粒子を細胞レセプターと結合させ、次いで粒子内に含まれる核酸を細胞に導入することが含まれる。遺伝子のエクスビボデリバリー用に一般に用いられるベクターはレトロウイルスベクターである。
【００８１】
一般に用いられるインビボ核酸輸送技術には、ウイルス性または非ウイルス性ベクター（例えばアデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））でのトランスフェクションおよび脂質に基づく系（核酸の脂質媒介性輸送に有用な脂質は例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである；例えば Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) を参照のこと）が含まれる。このようなベクターを用いて、本発明のアンタゴニストや核酸分子などのデリバリー薬剤のための媒介物として用いられうるウイルスを合成する。遺伝子治療に用いるために最も一般的に用いられるベクターはウイルスであり、例えばアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。一実施態様では、ウイルス性ベクター、例えばレトロウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定因子(locus-defining element)（群）、または、メッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸出または翻訳後修飾のような他の手段によって遺伝子発現を制御する他の因子が含まれる。さらに、ウイルス性ベクター、例えばレトロウイルスベクターには、対象の核酸に作動可能に連結されており、翻訳開始配列として作用する核酸分子が含まれる。このようなベクターコンストラクトにはまた、用いられるウイルスに適当な、パッケージングシグナル、長末端反復（ＬＴＲ群）またはその一部、およびポジティブおよびネガティブ鎖プライマー結合部位が含まれる（これらが該ウイルス性ベクターに存在しない場合）。さらに、このようなベクターコンストラクトは、置き換えられている宿主細胞からのコードされたポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含んでよい。場合により、このベクターコンストラクトは、ポリアデニル化用のシグナル、ならびに１つまたはそれ以上の制限部位および翻訳終結配列が含まれることもある。例示として、このようなベクターには典型的に、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはその一部が含まれる。非ウイルス性の他のベクター、例えばカチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマー(dendrimers)を用いることもできる。
【００８２】
いくつかの状況では、核酸又は他の分子の運搬に用いられる媒介物は、特定の細胞集団に媒介物をターゲティングする標的薬剤と関連している。一実施態様では、標的薬剤は、標的細胞上の細胞−表面膜タンパク質、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどに特異的な抗体である。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質を、標的化のために用い、ならびに／あるいはこれを用いて取り込みを促進してもよい。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)； および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990) に記載されている。
現在既知の遺伝子マーキング(gene marking)および遺伝子治療プロトコルの総括に関しては、Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992) を参照のこと。また、国際公開９３／２５６７３およびその引用文献を参照のこと。適当な遺伝子治療およびレトロウイルス粒子および構造タンパク質の作製方法は、例えば米国特許第５６８１７４６号に見出すことができる。
【００８３】
本発明の抗体は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個体の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、対象の疾患を予防するか又は治療するために現在用いられる一又は複数の薬剤と抗体とが調製される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中の抗体の量、疾患又は治療の種類、及び上記の他の因子に依存する。これらは一般的に、本明細書中に記載されるように同じ用量及び投与経路で、又は本明細書中に記載される用量のおよそ１〜９９％で、又は経験的／臨床的に適切であることが決定される任意の用量及び経路で用いられる。
【００８４】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は一又は複数の他の更なる治療薬と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に個体に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による個体投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量を(又はそれらを組み合わせて)個体に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期の比較的高い負荷用量の後、一又は複数の比較的低い用量が投与されてもよい。例示的用量計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量の抗体が投与されることを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【実施例】
【００８５】
III．実施例
Ａ．材料および方法
１．腫瘍組織におけるβ２の検出
新鮮凍結大腸腫瘍組織をグラススライド上で５〜１０ｍｍに切断した。ＬＣＭは、Arcturus PixCellシステムを使用して実行した。腫瘍細胞又は正常上皮を、１５又は３０ｍｍのレーザーピクセルサイズを用いてＨ＆Ｅ染色切片から切り出し、１試料当たり１００〜３０００の細胞等価物を回収した。ＲＮＡを単離し、プローブを生成し、ｃＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズさせた。製造業者の指示に従ってBiocare Medical (Concord, CA)のＭＡＣＨ３ウサギプローブＨＲＰポリマーキット又はＭＡＣＨ３マウスプローブＨＲＰポリマーキットを用いて免疫組織化学法(ＩＨＣ)を行った。α-ＲＥＳＴポリクローナル抗体(Upstate, Lake Placid, NY)又はα−β２モノクローナル抗体(３Ｄ１、Genentech, Inc.)を、ヒトの結腸腺癌(グレードＩＩＩ)および結腸転移性カルチノーマ組織アレイ(Cybrdi, Gaithersburg,MD)とともに用いた。
【００８６】
２．ＳＣＮ２Ｂ(β２)プラスミド構築および形質移入
ＳＣＮ２Ｂ.ＥＣＤ.ＨＩＳコンストラクト：ＳＣＮ２ＢのＣ末端ポリヒスチジンタグ化(ＨＩＳ８) ＥＣＤをコードする核酸を、ｐＳＶＩ７ベクター(ＤＨＦＲ)にクローニングし、Ｆｕｇｅｎｅ６(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を用いてＤＰ１２ ＣＨＯ細胞に形質移入した。クローンは、２００ｎＭメトトレキセートを含有する培地中で選択した。β２タンパク質は、表現型研究、モノクローナル抗体の生成及びＮｏｔｃｈ１結合研究のためにＮｉ-ＮＴＡビーズ(Qiagen, Valencia, CA)を用いてＤＰ１２細胞培養液から精製した。ＳＣＮ２Ｂ.ＦＬ.ＧＦＰ：完全長ＳＣＮ２Ｂコンストラクトは、ｐＳＶＩＰＤ.ＩＲＥＳ.ＧＦＰベクター(ピューロマイシン耐性マーカー)にクローニングし、抗体スクリーニングおよび表現型アッセイのためにＣＨＯ又はＳＷ６２０細胞に形質移入した。
【００８７】
３．細胞培養
ヒト腫瘍細胞株は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０又はＦ１２：ＤＭＥＭ５０：５０培地にて維持した。ＣＨＯ細胞は、１０％ＦＢＳ、ＧＨＴ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン-ストレプトマイシンを添加したＦ１２：ＤＭＥＭ５０：５０中で維持した。ＨＵＶＥＣ細胞は、ＥＧＭ-２ (Cambrex, Valkersville, MD)を添加したＥＢＭ−２培地中で維持した。
【００８８】
４．免疫ブロット分析
細胞は超音波処理により溶解緩衝液(１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ トリス-ＨＣＬ、８Ｍ 尿素及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０)中で溶解させ、溶解物(一般的に２５μｇ総タンパク質)を４−１２％トリス−グリシンゲル(Invitrogen)に流した。タンパク質は、ＰＶＤＦメンブレン(Invitrogen, Carlsbad, CA)又はニクトロセルソースメンブレン(Invitrogen)に移した。免疫ブロットは、２％ＢＳＡ、５％粉ミルクを含むＰＢＳ中で４℃で終夜遮断した。以下の抗体、マウスα−β２モノクローナル又はウサギα−β２ポリクローナル(Genentech, Inc.)、α-ＲＥＳＴポリクローナル抗体(Upstate, Lake Placid, NY)、α-Ｎｏｔｃｈ１(Ｇ２０)ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、α-ＦＬＡＧ抗体(Sigma)を用いた。ＩＲＤｙｅ６８０コンジュゲートヤギα-マウスＩｇＧ又はＩＲＤｙｅ６８０コンジュゲートロバα-ウサギＩｇＧ (Rockland Inc., Gilbertsville, PA)を用いて二次検出を行った。免疫反応バンドを検出し、Odyssey Infrared画像システム(LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)にてブロットをスキャニングすることによって分析した。あるいは、二次検出は、ＥＣＬα-マウスＩｇＧＨＲＰ(Amersham)を用いて行い、Chemiglow West (Alpha Innotech)を用いて検出した。
【００８９】
５．β２抗体の生成
５匹のＢａｌｂ／ｃマウス(Charles River Laboratories, Hollister, CA)を、Ｒｉｂｉアジュバント(Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO)のＣＨＯ細胞(Genentech, Inc., South San Francisco, CA)からの組み換えポリヒスチジンタグ化(ＨＩＳ８)ヒトβ２ ＥＣＤにて過剰免疫化した。直接ＥＬＩＳＡにて高いα−β２抗体力価とＦＡＣＳにてＣＨＯ細胞上に発現されるβ２への特異的結合を示すこれらマウスのＢ細胞を、既に開示されているもの(Kohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975；Hongo et al., Hybridoma 14:253-260, 1995)に類似の変更プロトコールを用いて、マウス骨髄腫細胞(Ｘ６３.Ａｇ８.６５３；American Type Culture Collection, Rockville, MD)と融合させた。１０〜１２日後に、上清を回収し、直接ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳによって抗体産生を検査した。２回のサブクローニングの後、最も高い免疫結合を示すクローンを播種して培養した。各々のハイブリドーマ系統から回収した上清は、既に開示されているもの(上掲のHongo et al.)に類似の変更プロトコールを用いて、親和性クロマトグラフィ(ファルマシア高速タンパク質液体クロマトグラフィ[ＦＰＬＣ]；Pharmacia, Uppsala, Sweden)によって精製した。次いで、精製された抗体調製物をフィルター滅菌し(０．２-μｍ細孔径；Nalgene, Rochester NY)、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)中で４℃に保存した。
【００９０】
６．免疫蛍光法
ビメンチンおよびアクチン細胞骨格(ローダミン-ファロイジン)：細胞は、４％パラホルムアルデヒドにて室温で２０分間固定し、０．０５％サポニンにて室温で５分間透過処理した。β２、ＲＥＳＴ、切断Ｎｏｔｃｈ１ ＮＩＣＤおよびＥカドヘリン染色のために、細胞は、メタノール中で４℃で２分間固定した。一次抗体インキュベートは、室温で１時間(ビメンチン染色のため)、または１５分(ローダミン-ファロイジン染色のため)、または３７℃で１時間(β２、ＲＥＳＴ、分割Ｎｏｔｃｈ１ ＮＩＣＤおよびＥカドヘリン染色のため)行った。二次抗体インキュベートは３０分間室温で行った。使用する抗体は以下の通りとした：α-アンキリンモノクローナル抗体(Chemincon International, Temecula, CA)；α-ビメンチンモノクローナル抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)；ローダミン-ファロイジン(Molecular Probes, Eugene, OR)、α-ＲＥＳＴポリクローナル抗体(Upstate, Lake Placid, NY)、α-Ｅカドヘリンモノクローナル抗体(Invitrogen, Carlsbad, CA)、α-Ｎｏｔｃｈ１(Ｖａｌ１７４４ペプチド、完全及び切断のＮｏｔｃｈ１ ＮＩＣＤを検出する) (Cell Signaling, Danvers, MA)又はα−β２モノクローナル抗体(Genentech, Inc.)。二次抗体は以下の通りとした：Ｃｙ３コンジュゲートウサギα-マウスＩｇＧ又はＣｙ３コンジュゲートロバα-ウサギＩｇＧ (Jackson Lab, Bar Harbor, Maine)。スライドは、ＤＡＰＩ(４',６-ジアミジノ-２−フェニルインドール) (Vector Lab, Burlingame, CA)を有するVectashieldマウント培地にてマウントした。画像は、カメラを具備する顕微鏡の６０Ｘ拡大を用いて撮像した。画像の上敷は、Adobe Photoshopソフトウェアを使用して生成した。完全又は切断のＮｏｔｃｈ１ ＮＩＣＤ染色のために、二次抗体インキュベートの後に、スライドをヘキスト４４２５７とともに２０分間インキュベートし、室温で２０分間核を染色し、Prolong Gold抗fade試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)にてマウントした。画像は、ＬＳＭ５１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Micro Imaging, Inc., Thornwood, NY)を用いて撮像した。全開ピンホールにて、カメレオンレーザー(Coherent, Santa Clara, CA)による二光子励起を、ＤＡＰＩ視覚化のために用いた。１Ａｉｒｙ単位に設定したピンホールにて、ＨｅＮｅ(５４３ｎｍ)レーザーを蛍光色素励起に用いた。画像は、ＴＩＦＦ形式で保存し、フォトショップに蓄積した。
【００９１】
７．β２およびβ２-ＥＣＤ誘導表現型アッセイ
β２ ＥＣＤを発現するＣＨＯ細胞は、８０％コンフルエンスまで増殖させ、培地を回収し、遠心して細胞片を取り除いた。この調整培地を用いて、記述した分析のために細胞株を処理した。ベクターを形質移入したＣＨＯ細胞から回収した培地をコントロールとして用いた。ファロイジン、ビメンチンおよびＥカドヘリン染色のために、調整培地で処理した細胞を、４８又は７２時間に抗体にて染色した。
【００９２】
８．抗体遮断アッセイ
ＳＣＮ２Ｂおよびベクターを形質移入したＣＨＯ細胞とＳＷ６２０細胞は、２５％コンフルエンス時に１ウェルのチャンバガラススライド(Nalge Nunc International, Rochester, New York)上に播種した。１００ｎｇ／ｍｌのα−β２モノクローナル抗体を細胞培養液に加えた。７２時間後に、細胞をローダミンファロイジンにて染色した。
【００９３】
９．β２枯渇アッセイ
α−β２モノクローナル抗体結合ゲルは、製造業者の指示に従いSeize Primary免疫沈降キット(Pierce, Rockford, IL)を用いて作製した。ＤＰ１２／ＳＣＮ２Ｂ.ＥＣＤ.ＨＩＳ細胞から回収した細胞培養液をα−β２モノクローナル抗体結合ゲルとともに２時間インキュベートしβ２を取り除いた。流したものを表現型分析のために細胞に加えた。同じ手順を用いて、ＰＢＳ結合ゲルにてβ２の擬枯渇を行った。また、β２は、Ｎｉ-ＮＴＡビーズ(Qiagen)を使用して枯渇させた。
【００９４】
１０．移動アッセイ
移動アッセイは、８ｍｍの細孔径(BD Biosciences, Bedford, MA)を有するHTS FluoroBlockマルチウェルインサートシステムを使用して実行した。１０５細胞／ウェルを上のウェルに播き、ＦＢＳを底のウェルに加えた。１８時間後、トランスウェルメンブレンの反対側に移動した細胞は、１０ｕｍのＹＯ−ＰＲＯ−１ヨウ素(Invitrogen, Eugene, OR)にて染色し、蛍光プレート読み取り機Spectra Max GeminiEM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用して定量した。
【００９５】
１１．細胞死および薬剤耐性：
飢餓に対する耐性：ＳＷ６２０細胞を完全培地中で終夜２５％コンフルエンスで６ウェルプレートに播種した。この培地は、翌朝ＦＢＳを欠く培地と交換した。アッセイのために、細胞をトリプシンを用いて剥離させ、洗浄し、０．４％トリパンブルー(Invitrogen, Carlsbad, CA)にて染色した。すべての細胞と死細胞は血球計数器を使用して計数した。アッセイは３通り実行した。ドキソルビシン耐性：２×１０４のＳＷ６２０細胞を、塩酸ドキソルビシン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)の階段希釈とともに９６ウェルの透明な黒底プレート(Corning Inc., Corning, NY)に播種し、５日間インキュベートした。細胞生存率は、Cell Titer Glo発光細胞生存率キット(Promega, Madison, WI)を用いて測定した。発光は、Envision 2103マルチラベル読み取り機(PerkinElmer, Finland)を使用して定量した。メトトレキセート耐性：５×１０５のＣＨＯ細胞を、２００ｎｍのメトトレキセート(Genentech Inc.)を含有する調整培地又はコントロール調整培地中のβ２ ＥＣＤとともに６ウェルプレートに播種した。細胞は、プレートから分離されて引き剥がし、記載のようにトリパンブルー０．４％(Invitrogen, Carlsbad, CA)にて染色した。
【００９６】
１２．ｓｉＲＮＡノックダウン
ＳＷ６２０細胞のＲＥＳＴ、Ｔｗｉｓｔ１又はＮｏｔｃｈ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、形質移入体としてDharmaFECT 2を有する６０ｎｍのｓｉＲＮＡを使用して実行した。ネガティブコントロールとして、非ターゲッティングｓｉＲＮＡ配列(Dharmacon, Lafayette, CO)を用いた。免疫蛍光染色およびＲＴ-ＰＣＲ分析はｓｉＲＥＳＴ形質移入の４日後に実施した。Ｔｗｉｓｔ１およびＮｏｔｃｈ１ノックダウンのために、細胞は、形質移入の２４〜４８時間後に調整培地中のβ２ ＥＣＤにて処理し、そのインキュベートの更に２４〜４８時間後に免疫蛍光染色又はＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ｓｉＲＥＳＴ実験のために、形質移入の１２時間後にα−β２抗体を加えた。ｓｉＲＮＡ二本鎖を設定し、Dharmacon (Lafayette, CO)によって合成した。一次標的配列は以下の通りである：
ｓｉＲＥＳＴ：5'-CAACGAAUCUACCCAUAUUUU-3'(配列番号：３)。
ｓｉＴｗｉｓｔ１：5'-GCGACGAGCUGGACUCCAAUU-3'(配列番号：４)。
ｓｉＮｏｔｃｈ１：5'-GCGACAAGGUGUUGACGUUUU-3'(配列番号：５)。
更なるｓｉＲＮＡ配列：ｓｉＴＷＩＳＴ１：5'-CUGCAGACGCAGCGGGUCAUU-3'(配列番号：６)、
5'-GGAGUCCGCAGUCUUACGAUU-3'(配列番号：７)、
5'-GAGCAAGAUUCAGACCCUCUU-3'(配列番号：８)；
ＳｉＮＯＴＣＨ１：5'-GAUGCGAGAUCGACGUCAAUU-3'(配列番号：９)、
5'-GAACGGGGCUAACAAAGAUUU-3'(配列番号：１０)、
5'-GCAAGGACCACUUCAGCGAUU-3'(配列番号：１１)。
【００９７】
１３．Ｅカドヘリン強度計算のための画像処理
画像は、フォトショップ形式からフォトショップＣＳ２(version 9.0.2, Adobe; San Jose, CA)のＴｉｆに変換した。画像は、Metamorph (version 7.0r4, Molecular Devices; Sunnyvale, CA)に開き、オートメーション化した分析処理を行った。簡単に言うと、閾値を画像の各々の設定(最大画素値の約１０〜１５％)に適用しバックグラウンドを除いた。標準的なエロード機能を用いて更にバックグラウンドを減らし、残りの領域の端をスムースにした。個々の領域についての領域および強度測定値は、直接エクセル(Microsoft, Redmond, WA)へ出力した。画像の小さいサブセットは、バックグラウンドより上でかつ閾値より下の特異的な染色を示した。領域及び強度測定値を得るために、このサブセットについて、対象の領域を手動で作成した。一般的に、５つの別々の領域を分析し、各分析のために組み合わせた。
【００９８】
１４．統計学的分析
分析は３通り(またはそれ以上)行い、マイクロソフトエクセルのスチューデントＴ検定(等しい分散量、１テール分布)を使用して分析した。
【００９９】
１５．結合アッセイ
免疫沈降：細胞は、５ｍｍのＥＤＴＡを用いて培養プレートから取り除き、０．５％ＮＰ−４０、ＥＤＴＡのないプロテアーゼインヒビター(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)および１ｍｍのＰＭＳＦを含むＴＢＳバッファに溶解した。細胞溶解物は、予め飽和させたプロテインＧアガロース(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)とともに４℃で１．５時間インキュベートし、その後α−β２モノクローナル抗体とともに４℃で２時間インキュベートした。次いで、この細胞溶解物と抗体の混合物を予め飽和させたプロテインＧアガロースとともに４℃で終夜インキュベートした。アガロースを回収し、タンパク質は免疫ブロット分析のためにトリス-グリシンゲルローディングバッファ(Invitrogen, Carlsbad, CA)において溶出させた。直接結合：調整培地を上記のように回収し、１５ｍｌのＦＬＡＧタグ付加Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＤ：６−３６(５μｇ)とともに室温で２時間振とうさせながらインキュベートした。５０μｌのＮｉ-ＮＴＡアガロースビーズスラリー(Qiagen)を加え、振とうさせながら室温で２時間インキュベートした。遠心によりＮｉ-ＮＴＡビーズを回収し、ＰＢＳにて３回洗浄した。あるいは、調整培地をＮｉ-ＮＴＡビーズにて処理し、β２について濃縮し、結果として得たスラリーを１ｍｌＰＢＳ中のＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤ：６−３６(５μｇ)とともにインキュベートし、上記のようにインキュベートし、洗浄した。試料を２Ｘローディングバッファに溶出させた。
【０１００】
１６．マイクロアレイ分析
９０３１個の遺伝子を表しているマイクロアレイは、robotic arrayer (Norgren Systems, Mountain View, California)を用いて、３-アミノプロピルトリエトキシシラン(Aldrich, Milwaukee WI)と１,４-フェニレンジイソチオシアネート(Aldrich, Milwaukee, WI)にてコートしたガラススライド上に、ｃＤＮＡクローン(Invitrogen, Carlsbad, California and Genentech, Inc.)から得られるＰＣＲ生成物をプリンティングすることによって生成した。ＬＣＭ材料からのＲＮＡ単離は、ＣｓＣｌ処置勾配(Kingston RE, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 (Ausubel FM, et al.編集) 4.2.5-4.2.6 (John Wiley and Sons, Inc., USA, 1998))によって行った。アレイ分析のためのプローブは、以下のような保存的増幅とその後のラベリングにより生成した：総ＲＮＡ(Invitrogen, Carlsbad, CA)のオリゴｄＴプライミングから生成される二本鎖ＤＮＡは、単回の変更インビトロ転写プロトコール(Ambion, Austin, TexasのＭＥＧＡＳＣｒｉｐｔ Ｔ７)を用いて増幅した。結果として生じたｃＲＮＡを鋳型として用い、ＭＭＬＶ由来のリバーストランスクリプターゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてランダムプライマー(９ｍｅｒ、０．１５ｍｇ／ｍｌ)、Ａｌｅｘａ４８８ ｄＵＴＰ又はＡｌｅｘａ５４６ ｄＵＴＰ(４０μＭおよび６μＭ、それぞれ、Molecular Probes, Eugene, Oregon)を用いてセンスＤＮＡプローブを生成した。一般的な上皮細胞発現を反映する比較プローブは、汎用比較ＲＮＡ(Strategene, La Jolla, CA)により０．１μｇの総ＲＮＡから生成した。プローブは、５０％ホルムアミド／５×ＳＳＣ中で３７℃で終夜アレイにハイブリダイズさせ、翌日２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、その後０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳにて洗浄した。アレイ画像は、各々の色素に適切なXenon光源および光学フィルターを具備するＣＣＤ−カメラベースの画像システム(Norgren Systems, Mountain View, California)を用いて撮像した。完全な動的範囲画像を収集し(Autograb, Genentech Inc)、強度および比率は、Matlab (the MathWorks, Natick, Massachusetts)プラットフォームに構築されるオートメーション化したグリッド作成とデータ抽出ソフトウェア(gImage, Genentech, Inc.)を用いて導いた。
【０１０１】
１７．マイクロアレイデータ分析
比率値は、Ｎ強度に対するログ比率をプロットし、各強度レベルでの正常な分布をフィットさせることによって、各実験内の異なる強度値で実験的散乱について基準化した。平均ゼロ前後の標準偏差(Ｚスコア)の測定値を各実験の各転写産物について得、この値をデータマイニングに用いた。具体的には、各々のマイクロアレイについて、我々は、試験データと比較データの最小の対数に対する試験データと比較データの比率の対数の散乱プロットから得たＺスコアを算出することによってデータを基準化した。我々は、散乱プロットにレスアルゴリズムを適用することによって、強度に対する比率の中央値を推定した。我々は、絶対残差の平方根にレスを適用し、結果を二乗して中央値の絶対偏差(ＭＡＤ)を得、乗法的補正を行ってＭＡＤから標準誤差に変換することによって、標準誤差を推定した。各比率について、中央値のレス曲線からの垂直距離をその強度での標準誤差で除して、Ｚスコアを決定した。腫瘍と正常な上皮の間で差次的に発現された遺伝子は、Rosetta Resolverの統計的検定(スチューデントＴ検定、等しい分散量、２テール分布)を用いて同定した。
【０１０２】
Ｂ．結果
１．β２は腫瘍において発現される
我々は、レーザーキャプチャの顕微解剖した材料のマイクロアレイ発現プロファイルにより結腸腫瘍細胞におけるβ２発現を発見した。この技術は、複雑な組織及び腫瘍などの罹患部位から別々の細胞集団を単離する際に有用性を示し、以前はこれらの細胞との関連付けがされていなかった遺伝子発現の同定を可能にする(Buckanovich et al., Cancer Biol. Ther. 5:635-642, 2006；Espina et al., Methods Mol. Biol. 319:213-229, 2006)。
レーザーキャプチャ顕微解剖(ＬＣＭ)および転写産物プロファイリングは、新鮮凍結結腸腫瘍切片に実行した。試料採取は腫瘍間質境界近くの腫瘍細胞に偏っている。５組の正常な結腸上皮もＬＣＭを用いて単離した。試料集団を比較するスチューデントＴ検定において、正常上皮と比較して腫瘍上皮でのβ２転写が過剰発現していることが同定された(ｐ値＝０．００１４、図１Ａ；図１０Ａ)。β２転写産物の検出は、隣接した腫瘍切片のサブセットから単離されたＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲを使用して有効であることが認められた(図１０Ｂ)。更なる確認のために、いくつかの隣接した腫瘍切片に対して非アイソトープインサイツハイブリダイゼーションを行い(図１０Ｃ)、腫瘍細胞発現を確認した。
α−β２モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学と組織マイクロアレイによる結腸腫瘍におけるβ２発現の詳細な分析により、４１人の患者のうちの２２人(５４％)のグレードＩＩＩ原発性腫瘍および転移性腫瘍(一般的にリンパ節)の腫瘍細胞、そして、６２のうちの５(８％)の正常結腸試料での発現が明らかとなった。腫瘍染色は異種性であり、実際は斑点状であることが多かったことから、腫瘍上皮全体の強度と分布の変化を示す(図１Ｂ)。ＬＣＭ分析は腫瘍間質境界に偏っているが、これは他の場所での発現を妨げることにはならず、β２は腫瘍端だけでなく間質に明らかに囲まれていない腫瘍上皮の他の領域で検出された。５つのβ２ポジティブ正常結腸において観察された染色は弱〜中程度であって、周辺細胞にのみに存在し、上皮腺窩細胞には存在しなかった。概して、これらのデータは、β２の転写産物およびタンパク質が５０％以上の結腸腫瘍において発現されるのに対して、正常な結腸上皮では非常に限られた発現であることを示す。同様に、腫瘍組織から単離されるタンパク質のイムノブロット分析は、β２が他の腫瘍種類でも発現されることを示した(図１０Ｅ)。
【０１０３】
２．β２は細胞の形態学的変換を誘導する
ＥＭＴは、上皮細胞が紡錘様の線維芽細胞形態の発達を含む運動性の浸潤性細胞の多くの特質を獲得する分化転換プロセスである。β２の完全長タンパク質の発現又はβ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)のみを含有する調整培地による細胞の処理は、細胞の有意な伸長と拡大とアクチン細胞骨格の再構築を誘導した(図２Ａ)。これらの変化は、ＣＨＯ細胞(チャイニーズハムスター卵巣；図２Ａ)並びにＮＣＩ−Ｈ２２６およびＳＷ６２０のような腫瘍細胞株を含む多数の細胞株において観察された。これらの変化がβ２タンパク質の発現から生じたことが確認され、これらの作用は、β２のＥＣＤに特異的なモノクローナル抗体を用いてブロックされうる(図２Ｂ)。多くの新しく分化した細胞は正常な円形の外観に回復した。無関係なコントロール抗体(α-ブタクサ)にて処理された細胞はβ２が誘導する形態学的変化を保持した。
β２は、およそ１２９アミノ酸の予測される成熟ＥＣＤを含み、膜貫通領域と短い(およそ３５アミノ酸)細胞内ドメインとともに、主にＩｇドメインからなる。我々は、ＣＨＯ細胞から分泌されるように設定されたＣ末端ｈｉｓ(８)タグ付加ＥＣＤコンストラクトを発現させることによって、ＥＣＤ単独で形態学的変化を誘導するか否かを調べた。β２ ＥＣＤを含む調整培地は、様々な異なる細胞種(ナイーブＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＵＶＥＣ(内皮)又は腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０およびＰＣ-３；図２Ａ、図１１Ａ)に置いた場合に、４８〜７２時間後に上記と同様な表現型変化を誘導することが可能であった。これらの作用がβ２ ＥＣＤの存在によるものであることを確認するために、β２タンパク質を培地から枯渇させ、次いでナイーブＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に加えた。アクチン細胞骨格の変化は、ローダミン-ファロイジン染色を用いて評価し、各試料を、β２タンパク質についてのイムノブロッティングによっても分析した(図２Ｃ)。偽枯渇調整培地は、β２タンパク質を含み、完全な表現型変化を誘導した。β２が実質的に枯渇された(＞９０％)調整培地から検出可能な表現型変化は得られなかったが、β２が部分的に枯渇された調整培地は、細胞が伸長及び拡大しているが偽処理細胞よりは小さい程度である中間的な表現型を示した。これらのデータは、β２ ＥＣＤ調整培地において観察される表現型変化はβ２ ＥＣＤに依存しており、β２タンパク質のレベルを反映することを示す。
【０１０４】
３．β２は移動を促進し、細胞死から守る
ＥＭＴを経る細胞と密接に関係する物理学的性質は運動性の増加である。腫瘍細胞の移動に対するβ２の作用は、β２形質移入とベクター形質移入のＳＷ６２０細胞、又はβ２ ＥＣＤ処理細胞の、貫通膜をまたいでの胎児ウシ血清(０．１％)を含む培地へ移動させる能力を比較することによって調べた。形質移入効率はおよそ７５％であり、ＳＣＮ２Ｂ形質移入プールのおよそ４０％の細胞は代表的なβ２が誘導する表現型変化を表した。１８時間後、β２形質移入細胞とβ２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理した細胞について移動の有意な増加が観察された(図３Ａ；それぞれｐ＝０．０３および０．０００９)。対照的に、β２を内在的に発現するＳＷ４８０細胞(図５Ａ)を異なる２つのα−β２抗体にて処理すると、移動が増加した(図３Ｂ、各抗体についてｐ＝０．００１)ことから、さらに細胞性移動を促進する際のβ２の役割が裏付けられた。
ＥＭＴの他の特徴は細胞死への耐性の増加である(Lee et al., 2006)。この性質に影響するβ２の能力を、飢餓及び化学療法剤による処理を行ったＳＷ６２０細胞において調査した。β２形質移入細胞又はベクター形質移入コントロール細胞は、血清を欠く培地中で２週間飢餓状態にし、トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞生存率をベクター形質移入コントロール細胞と比較した。β２は細胞生存率を有意に増加し、３５％のベクター形質移入コントロール細胞と比較して１０％未満の細胞死であった(ｐ＝０．００２、図３Ｃ)。また、β２は、化学療法剤であるドキソルビシンへの曝露による細胞死への耐性を促進した(図３Ｄ)。定量的細胞生存率アッセイ(Cell Titer Glo, Promega, Madison, WI)によって測定したところ、β２を形質移入したＳＷ６２０細胞は、ベクターを形質移入したコントロール細胞と比較して、薬剤濃度の１０倍範囲を上回る有意な生存率増加を表した。最後に、我々は、ＣＨＯ細胞によるβ２の発現が、完全長β２形質移入ＣＨＯ細胞の選別に用いられる化学療法剤、メトトレキセートに対する耐性を増加させたことを観察した。これを別々に評価するために、β２ ＥＣＤのみを発現するＣＨＯ細胞の調整培地をナイーブＣＨＯ細胞に加え、コントロール調整培地処理細胞と比較した。４８時間２００ｎＭメトトレキセートがある場合には、６０％のコントロール処理細胞が死んだのに対して、β２ ＥＣＤ処理細胞の多くが生存したままであり(図３Ｅ、ｐ＝０．０１)、１０％の細胞死のみであった。これらのデータは、β２ ＥＣＤのみが化学療法剤への耐性を与えることを示す。
【０１０５】
４．β２はＥカドヘリンの喪失とビメンチンの獲得を誘導し、このプロセスはＥＭＴ−関連転写因子Ｔｗｉｓｔ１に依存している
Ｅカドヘリンは上皮表現型を管理するものの一つとして働き、その喪失は腫瘍の開始と進行に関連している(Thiery and Sleeman, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:131-142, 2006)。また、Ｅカドヘリンの喪失はＥＭＴを経る細胞と強く関係している。免疫蛍光(図４Ａ)およびＦＡＣＳ分析(図４Ｂ)によって明らかなように、ＳＷ６２０細胞はＥカドヘリンを発現し(図４Ａ)、β２の形質移入又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地による４８時間の処理によりＥカドヘリンタンパク質レベルが大きく減少した。中葉中間生成物フィラメントタンパク質であるビメンチンの発現の誘導はＥＭＴを経る上皮細胞のもう一つの特徴である(Huber et al., Curr. Opin. Cell Biol. 17:548-558, 2005；Lee et al., J. Cell Biol. 172:973-981, 2006；上掲のThiery and Sleeman)。完全長β２を発現するＳＷ６２０細胞又はβ２ ＥＣＤを含む調整培地により処理されたＳＷ６２０細胞をαビメンチン抗体にて免疫蛍光染色すると、他の検出されないレベルからビメンチンタンパク質発現における実質的な増加が明らかとなった(図４Ｃ)。
完全長β２とβ２ ＥＣＤのＥカドヘリンの喪失と形態学的転換を誘導する能力をかんがみて、ＥＭＴを媒介することが可能な転写因子の発現を調べた。過渡的な発現を表すか又はフィードバック調節の対象となりうる転写の検出を容易にするために、ＳＷ６２０細胞をβ２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理し、異なる時間にＲＮＡを抽出した。マイクロアレイ分析により、β２ ＥＣＤに処置の６時間後にＴｗｉｓｔ１転写産物の誘導が明らかとなり、その後の時点で発現は振動パターンを示した(図１２Ａ)。ＲＴ-ＰＣＲ分析により、Ｔｗｉｓｔ１の発現(図１２Ｂ)とＳｎａｉｌ及びＳｌｕｇ／Ｓｎａｉｌ２などの他の特徴的なＥＭＴ転写因子の転写産物の誘導の証拠が有意又は強くないことが確認された(データは示さない)。調節の振動パターンは、独自のネガティブ調節を媒介するＨＥＳ１などの転写因子について報告されており(Hirata et al., Science 298:840-843, 2002)、Ｔｗｉｓｔ１についての我々の所見は、この様式で振動する転写因子によって同様に調節又は誘導される可能性を示唆している。Ｔｗｉｓｔ１は、ＥカドヘリンのプロモーターのＥｂｏｘ配列に作用し、上皮細胞のＥＭＴを誘導することが可能である転写リプレッサーであるので(Batlle et al., Nat. Cell Biol. 2:84-89, 2000；Bolos et al., J. Cell Sci. 116: 499-511, 2003；Cano et al., Nat. Cell Biol. 2:76-83, 2000；Conacci-Sorrell et al., J. Cell Biol. 163:847-857, 2003；Yang et al., Cell 117:927-939, 2004)、これらのデータは、β２への曝露の後のＴｗｉｓｔ１発現の誘導は観察される形態学的転換において有意な役割を果たしうることを示唆する。
【０１０６】
β２により誘導されるＥＭＴ様形態学的転換におけるＴｗｉｓｔ１の役割を調査するために、Ｔｗｉｓｔ１をｓｉＲＮＡノックダウンを用いてＳＷ６２０細胞から枯渇させた。次いで細胞を、β２ ＥＣＤを含む調培地にて処理し(図４Ｄ)、アクチン細胞骨格およびＥカドヘリン染色を評価した。非ターゲッティングｓｉＲＮＡにて処置したコントロール細胞では、β２による処置はアクチン細胞骨格の再構築とＥカドヘリンの喪失を誘導したのに対して、コントロール調整培地は細胞に対して作用を示さなかった。しかしながら、Ｔｗｉｓｔ１に特異的なｓｉＲＮＡがある場合には、β２は、ＥＭＴを誘導することがもはやできず、Ｅカドヘリン染色はポジティブのままで、細胞の形態は正常であった(図４Ｄ)。細胞の複数の別々の分野からのＥカドヘリン染色の定量分析により、コントロール細胞と比較してＴｗｉｓｔ１について枯渇されたβ２ ＥＣＤ処理細胞について統計学的に有意な相違が明らかとなった(図４Ｅ、ｐ＝０．００１および０．００９)。これらのデータは、ＳＷ６２０においてβ２により誘導されるＥＭＴがＴｗｉｓｔ１の存在に依存していることを示す。発達におけるＥＭＴ関連転写因子間のクロストークと協力が記載されており(Aybar et al., Development 130:483-494, 2003；Ganguly et al., Development 132:3419-3429, 2005)、この実験ではそれらの転写産物は強く検出されなかったが、ＳｎａｉｌおよびＳｌｕｇのような転写因子もまた、これらの細胞又は異なる種類の細胞でのβ２誘導ＥＭＴにおいて役割を有する可能性がある。概して、β２ ＥＣＤによる処置の際のＴｗｉｓｔ１の誘導と、β２誘導性の形態学的転換のＴｗｉｓｔ１(特徴的なＥＭＴ誘導転写因子)への依存をかんがみて、これらの結果は、β２が実際にＥＭＴを誘導するという我々の表現型データ所見を強く裏付けるものである。
【０１０７】
５．腫瘍細胞におけるＲＥＳＴのノックダウンにより、β２によって誘導されるＥＭＴ様形態学的転換が生じる
非神経組織における神経系遺伝子の発現を制限するネガティブ転写調節因子であるＲＥＳＴは、結腸およびおそらく他の癌における腫瘍抑制遺伝子として最近特徴づけされた(Westbrook et al., Cell 121:837-848, 2005)。タイプＩＩ電位依存的ナトリウムチャネルおよび関連のタンパク質は神経系及び発生的に発現され、ＳＣＮ２Ａは同定された初めのＲＥＳＴ調節遺伝子の一つであった。ＳＣＮ２Ｂゲノム領域(β２をコードする)の分析により、第一イントロンの４つのコンセンサスＲＥＳＴ結合部位のクラスターが明らかとなったことから、ＲＥＳＴがβ２の発現を制御しうることが示唆された。我々は、さらに、腫瘍細胞のβ２の発現と結腸腫瘍細胞株を用いたＲＥＳＴ非制御との間の関係を調べた。ＲＥＳＴおよびβ２のタンパク質について細胞株を染色したところ相反的な発現が示された。結腸細胞株ＳＷ４８０、ＲＥＳＴネガティブとして示されたＳＷ１４１７(上掲のWestbrook et al.)、並びにＳＷ１１１６はβ２ポジティブであったのに対して、ＲＥＳＴポジティブ株であるＳＷ６２０ではβ２は検出されなかった(図９、図５Ａ)。ＤＬＤ-１は抑制因子ドメインを欠く変異型ＲＥＳＴタンパク質を発現し(上掲のWestbrook et al.)、β２についてはポジティブに染色された(図９)。これらのデータはＲＥＳＴによって転写が抑制されるβ２と直接的又は間接的に一致している。免疫組織化学による結腸腫瘍におけるＲＥＳＴ及びβ２のタンパク質発現の分析により、この関係が持続することが明らかとなった。我々は、先に記載したグレードＩＩＩの腺癌と転移性結腸腫瘍の試料におけるＲＥＳＴとβの相反的な染色パターンを発見した。斑状ＲＥＳＴ染色は４１人の患者のうちの１８人(４４％；図５Ａ)の腫瘍において観察され、１の腫瘍でのみＲＥＳＴとβ２との染色にオーバーラップがあった(この発現は、４１の症例のうちの２２において検出された)。ＲＥＳＴ染色は６２の正常結腸試料のうちの４０(６５％)において検出され、いずれもβ２ポジティブではなかった。これらの結果は、発現の反相関性はまさに細胞株の現象ではなく、腫瘍組織について真性であり、ヒト腫瘍細胞におけるＲＥＳＴの喪失がβ２の発現に寄与しうるという仮説を裏付けることを示す。
【０１０８】
我々は、さらにＲＥＳＴ腫瘍抑制遺伝子とβ２の生物学的に関係のある機能的関係の可能性を調べた。ＲＥＳＴの喪失が腫瘍細胞状況においてβ２の発現とＥＭＴの誘導を生じるか否かを決定するために、ＲＥＳＴをＲＮＡｉを用いてＳＷ６２０において枯渇させた。ＳＷ６２０は、ＳＷ４８０のＲＥＳＴ及びβ２染色のパターンと反対のパターンを示すが(図５Ａ)、同じ個体からの腫瘍に由来する。ＲＥＳＴ特異的なｓｉＲＮＡの形質移入の５日後のイムノブロット分析により、非ターゲッティングコントロールｓｉＲＮＡを形質移入した細胞と比較して、ＲＥＳＴの実質的な減少とβ２タンパク質の有意な増加が確認された(図５Ｂ、Ｃ；図１３Ａ、Ｂ)。アクチン細胞骨格のローダミン-ファロイジン染色を用いて可視化したように、細胞形態の変化はβ２誘導性のＥＭＴと一致しており、Ｅカドヘリンの実質的な減少とビメンチンの誘導もまた、ＲＥＳＴノックダウン細胞において明らかであった(図５Ｄ)。細胞の複数の別々のフィールドからのＥカドヘリン染色の定量分析により、非ターゲッティングコントロールｓｉＲＮＡを形質移入した細胞と比較して、ＲＥＳＴ特異的ｓｉＲＮＡを形質移入した細胞では統計学的に有意な減少が明らかとなった(図５Ｅ；ｐ＝０．００１)。概して、これらのデータは、腫瘍細胞状況において、ＲＥＳＴの喪失の一つの結果は、β２の発現とＥＭＴと一致した形態学的変化の誘導であることを示す。
【０１０９】
ＲＥＳＴのノックダウンが形態の変化とＥＭＴと一致した形態マーカー発現を誘導したことを示したので、我々は、ＲＥＳＴの喪失により生じるＥＭＴの誘導が主にβ２の発現によって媒介されるか否かを決定するために機能的にブロックするβ２モノクローナル抗体を用いた。ＲＥＳＴはｓｉＲＮＡを用いてＳＷ６２０細胞において枯渇させ、β２又は無関係な標的(ブタクサ)に対する抗体の存在下にて、細胞を４日間増殖させた。次いで、細胞を、アクチン細胞骨格を可視化するためにファロイジンにて、又はα-Ｅカドヘリン又はα-ビメンチン抗体にて染色した。α-ブタクサ抗体処理細胞は、形態学的に変化し、β２誘導性のＥＭＴの代表であるＥカドヘリンが喪失し、ＲＥＳＴがノックダウンされた。しかしながら、β２特異的なブロックモノクローナル抗体３Ｄ１および２Ｅ３にて処理したＲＥＳＴ枯渇細胞は、正常な形態であり、Ｅカドヘリンを強力に発現し、ビメンチンをわずか又は全く発現しなかった。これは非ターゲッティングｓｉＲＮＡコントロールにより観察されるものと類似していた(図５Ｄ)。細胞の複数の別々のフィールドからのＥカドヘリン染色の定量分析により、無処置のｓｉＲＥＳＴ細胞又はα-ブタクサ処理ｓｉＲＮＡ細胞と比較して、各々の異なるβ２機能的ブロック抗体３Ｄ１および２Ｅ３にて処理されたｓｉＲＥＳＴ細胞のＥカドヘリンレベルに統計学的に有意な増加が明らかとなった(図５Ｅ、それぞれｐ＝０．０２および０．０１)。これらの結果は、β２によって媒介され、実際にβ２の細胞外発現を必要とするＲＥＳＴ喪失により誘導されるＥＭＴ様形態転換と一致している。
【０１１０】
６．β２によるＥＭＴ様形態転換の誘導はＮｏｔｃｈ１に依存する
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、発生及び成体の自己再生細胞における細胞運命を調節する古代からの保存されたシステムである(Artavanis-Tsakonas et al., Science 284:770-776, 1999)。ＨＥＳ１は、自己媒介ネガティブ調節により(Hirata et al., Science 298:840-843, 2002)、転写発現の振動サイクルを経るＮｏｔｃｈ経路シグナル伝達の特徴的な標的である(Jarriault et al., Nature 377:355-358, 1995)。ＥＣＤにて処理したＳＷ６２０細胞から得られる転写発現データにおける早い時点(６−２４時間)の振動ＨＥＳ１発現は(図１２Ａ)、β２により誘導されるＥＭＴにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割を示唆した。転写産物分析は、Ｎｏｔｃｈ１がＳＷ６２０細胞において有意なレベルで発現される唯一のＮｏｔｃｈファミリレセプターであったことを示唆した(図１１Ｂ、Ｃ、Ｄ)。Ｎｏｔｃｈ１がＳＷ６２０細胞のＥＭＴを誘導するためにβ２ ＥＣＤを必要としたか否かを決定するために、細胞にＮｏｔｃｈ１に特異的なｓｉＲＮＡ又は非ターゲティングコントロールｓｉＲＮＡを形質移入し、β２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理し、Ｔｗｉｓｔ１活性及びＥＭＴの一次マーカーとしてＥカゼインの喪失について分析した。非ターゲッティングｓｉＲＮＡを形質移入した細胞及びβ２ ＥＣＤにて処理した細胞は、コントロール培地処理細胞と比較してＥカゼイン染色の喪失を示したが、Ｎｏｔｃｈ１の枯渇はこの形態学的転換をブロックし、正常なアクチン細胞骨格を有する細胞となり、Ｅカゼインについてポジティブであった(図６Ａ、Ｃ)。これらのデータは、Ｎｏｔｃｈ１がβ２によるＥＭＴ様形態転換の誘導に必要であることを示す。
【０１１１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン(ＮＩＣＤ)を放出するために、ＡＤＡＭプロテアーゼおよびγ−分泌酵素によるレセプターの切断を必要とする。ゆえに、我々は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を妨げる(De Strooper et al., Nature 398:518-522, 1999)γ−分泌酵素がβ２誘導性のＥＭＴも阻害するか否かを調べた。ＳＷ６２０細胞を、ＤＭＳＯ(ベヒクルコントロール)又は５００ｎＭの特定のγ−分泌酵素インヒビターＤＡＰＴ(Ｎ-[Ｎ-(３,５−ジフルオロフェニルアセチル-Ｌ-アラニン)]-Ｓ-フェニルグリシン ｔ−ブチルエステル)を含むＤＭＳＯと混合し、β２ ＥＣＤを含む調整培地にて処理し、Ｅカドヘリンの喪失について分析した。完全長β２とは異なり、β２ ＥＣＤコンストラクトは、特徴的なγ−分泌酵素切断部位を含んでおらず(Kim et al., J. Biol. Chem. 280:23251-23261, 2005)、ゆえにＤＡＰＴによるプロセシングの阻害のための標的とならない。コントロール調整培地にて処理された細胞と比較すると、ＤＭＳＯ存在下でβ２ ＥＣＤにて処理された細胞は、Ｅカドヘリンの代表的な喪失を示した。しかしながら、ＤＡＰＴ存在下でβ２ ＥＣＤにて処理された細胞はＥカドヘリンポジティブのままであることから、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達がβ２によるＥＭＴの誘導に必要であることが示唆された(図６Ｂ、Ｃ)。ｓｉＲＮＡノックダウンおよびγ-分泌酵素阻害実験におけるＥカドヘリンの定量分析により、Ｎｏｔｃｈ１が枯渇されたか又はＮｏｔｃｈ１シグナル伝達が阻害されたβ２ ＥＣＤ処理細胞においてＥカドヘリンレベルが統計学的に有意に異なることが確認された(図６Ｃ)。
【０１１２】
ＳＷ６２０細胞は、ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２を発現するが(図１１Ｄ)、ＥＭＴを経ていない。β２によって誘導されるＥＭＴにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の見かけの役割をかんがみて、我々は、Ｊａｇｇｅｄ又はＤｅｌｔａ様ファミリのＮｏｔｃｈリガンドがＥＭＴを誘導することができるか否かを調べた。細胞は、リガンドを発現している細胞と共に培養することによるトランス又はプレートに結合させたリガンドを用いてなどして、様々な形式のリガンドＪａｇｇｅｄ１又はＤＬＬ１の外因性添加によって刺激されるが、用いたいずれの条件下でもＥＭＴの所見が観察されなかった(データは示さない)。ポジティブコントロールとして、Ｎｏｔｃｈ１を形質移入した３Ｔ３細胞と共にＮｏｔｃｈリガンドを発現する細胞を培養すると、ＣＳＬ-結合プロモーターコンストラクトからのルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されるように、Ｎｏｔｃｈ経路シグナル伝達の所見が示された(データは示さない)。しかしながら、Ｊａｇｇｅｄ１を発現する細胞又はＤＬＬ１を発現する細胞による類似の共培養アッセイにおけるＳＷ６２０の処置は、レポーターコンストラクトによるＥＭＴ様形態学的変化又は有意な活性を誘導しなかった(データは示さない)。このレポーターコンストラクトはＳＷ６２０における内因性のＮｏｔｃｈシグナル伝達を検出するほど十分な感度がなく、にもかかわらず、Ｊａｇｇｅｄ１又はＤＬＬ１によるＥＭＴの誘導や関連の形態学的変化の所見がなかったことから、トランスのこれら特徴的なＮｏｔｃｈリガンドの発現と提示はこれら細胞におけるＥＭＴ誘導に十分なものではなかったことが示唆される可能性がある。
【０１１３】
７． β２は、Ｎｏｔｃｈ１を結合し、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン(ＮＩＣＤ)の核移行を誘導する
β２ ＥＣＤによる細胞の処理が、β２を内在的に発現しない細胞(例えば、ＳＷ６２０)において表現型変化を誘導することから、β２が作用するレセプターはβ２自体ではないことが示唆される。β２によって誘導されるＥＭＴはＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ経路シグナル伝達に依存することが提唱され、表現型変化の出現(２４〜７２時間)の十分前である６時間の時点でＨＥＳ１転写の誘導が観察されたことから(図１２Ａ)、我々は、β２がＮｏｔｃｈ１のリガンド又は結合パートナーであるかもしれないという可能性を調査した。Ｉｇドメインタンパク質であるβ２は、Ｊａｇｇｅｄ-１又は２及びＤＬＬ１のような典型的なＮｏｔｃｈリガンドの配列特性を共有しない。しかしながら、コンタクチン／Ｆ３およびＮＢ３の２つの他のＩｇドメインタンパク質は、神経系前駆体の細胞運命の決定に寄与する新規のＮｏｔｃｈリガンドとして記述された(Cui et al., J. Biol. Chem. 279:25858-25865, 2004；Hu et al., Cell 115:163-175, 2003)。β２の候補レセプターとしてＮｏｔｃｈ１を考慮すると、Ｎｏｔｃｈ１(または、おそらくＮｏｔｃｈ２)発現は、β２ ＥＣＤに応答して形態学的変化を経る細胞において予想される。転写分析により、β２応答性腫瘍細胞株がＮｏｔｃｈ１(時にＮｏｔｃｈ２；図１１Ｂ、Ｃの実施例)を発現したことが明らかになった。内皮のＨＵＶＥＣ細胞はＮｏｔｃｈ１を発現し、β２に応答したのに対して、β２に応答して表現型変化を示さなかったＨＥＫ２９３細胞(図１１Ａ)はＮｏｔｃｈ１を発現しない(Hicks et al., Nat. Cell Biol. 2:515-520, 2000；Ray et al., J. Biol. Chem. 274:36801-36807, 1999)。これらの所見は、β２のエフェクター又はレセプターであるＮｏｔｃｈ１と一致している。
【０１１４】
Ｎｏｔｃｈ１および２が物理的に結びつくか否かを決定するために、我々は、免疫沈降法においてα−β２モノクローナル抗体又は無関係なコントロール抗体(α-ブタクサ)を用いて、完全長β２形質移入ＳＷ６２０細胞の共免疫沈降法およびイムノブロット分析を行った。Ｎｏｔｃｈ１特異的モノクローナル抗体によるイムノブロッティングにより、α−β２抗体はβ２形質移入細胞溶解物からの内在性Ｎｏｔｃｈ１を共沈降したことが明らかになった。我々は、コントロール抗体を用いて、又はβ２を発現しない細胞のコントロール溶解物によるα−β２抗体を用いてはＮｏｔｃｈ１沈降を観察しなかったので、この共沈降は特異的であった(図７Ａ)。
β２が直接Ｎｏｔｃｈ１を結合する可能性は、Ｃ末端ヒスチジンタグ付加β２ ＥＣＤと、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有する大部分のＥＧＦリピート領域(リピート６−３６)を含有する精製されたＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤ領域を用いて調査した。Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＤ(０．３３μｇ／ｍｌ)は、β２ ＥＣＤを含む調整培地(０．４μｇ／ｍｌと推定されるβ２)と共にインキュベートし、次いでβ２タンパク質をＮｉ-ＮＴＡビーズを用いて回収した。あるいは、β２はＮｉ-ＮＴＡビーズを用いて調整培地から濃縮し、その後ＰＢＳ中でタグ付加したＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤ(３．３μｇ／ｍｌ)と共にインキュベートした。無関係なヒスチジンタグ付加タンパク質を含むコントロール調整培地と比較すると、いずれの方法においてもβ２によるタグ付加Ｎｏｔｃｈ１が回復した(図７Ｂ)。特に、低濃度の両タンパク質(およそ１ｎＭのＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤおよび２０ｎＭのβ２ ＥＣＤ、図７Ｂレーン１)、及び血清、他のＣＨＯ産生タンパク質及び調整培地中に存在する分解性酵素の存在下でも、β２−Ｎｏｔｃｈ１結合が生じた。精製されたＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤは、おそらくグリコシル化又は他の修飾により、二重バンドとして移動した(図７Ｂ)。しかしながら、β２への結合により、タグ付加Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＤの単一の明確なバンドが生じたことから、結合に関連した特異性又は修飾の可能性が示唆される。概して、これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ１の結合パートナーとしてのβ２の役割を裏付けるものである。他のＮｏｔｃｈリガンドと同様に、我々は、β２もまた、いくつかのβ２応答性細胞株上で高く発現される非常にホモログなＮｏｔｃｈ２を結合することを予測する。
【０１１５】
さらにβ２およびＮｏｔｃｈ１の結合の特徴を特徴付けするために、タグ付加β２ ＥＣＤを含む調整培地を、ＥＧＦリピート１０−２１又は２２−３３を含むＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤの精製された断片と共に、上記の通りにインキュベートした。(Ｊａｇｇｅｄ１はＮｏｔｃｈ１のＥＧＦリピート１１−１３を結合し、ショウジョウバエＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅはＮｏｔｃｈのＥＧＦリピート１１−１２を結合する)。これらＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤ断片の各々はＣ末端ＦＬＡＧタグを含み、α-ＦＬＡＧ抗体によるイムノブロットでの検出を可能とする。β２ ＥＣＤはＥＧＦリピート１０−２１を含むＮｏｔｃｈ１ ＥＣＤを特異的に結合し、ＥＧＦリピート２２−３３を含むＥＣＤ断片の結合は検出されない(図７Ｃ)。これらのデータは、β２およびＮｏｔｃｈ１の結合は、ＥＧＦリピート構造を介した非特異的な結合というよりも、特異的であることを示す。
リガンドによるＮｏｔｃｈ１の活性化によりＮＩＣＤを放出するための切断が生じ、このＮＩＣＤは核に転移させ、他のタンパク質と協働して直接Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子転写を調節する。我々は、核のＮＩＣＤがβ２に応答して細胞において検出されうるか否かを分析した。ＮＩＣＤは昔から検出が困難であったので、我々は、プロテアソームインヒビター(１００ｕｍのラクタシスチン)の存在下で細胞を増殖させ、タンパク質安定化を促し、撮像のための高解像度共焦点電子顕微鏡法を用いた。１の細胞を除いて細胞質染色又は膜染色のみが観察されたベクターを形質移入したコントロールと比較して、核のＮＩＣＤは、β２を形質移入した細胞の大多数において検出された(図７Ｄ)。同様に、核ＮＩＣＤは、β２ ＥＣＤを含む調整培地による処理の６時間後にＳＷ６２０細胞において検出され(図７Ｄ)、これは６時間目のこれら細胞において観察される高いＨＥＳ１転写産物と一致している。これらのデータは、β２がＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化を誘導することを示す。
【０１１６】
まとめると、我々のデータは、補助的タンパク質又は接着分子としての役割を越え、    ＥＭＴと一致した形態転換を誘導しうることを示す。腫瘍におけるこの神経系タンパク質の発現は、非神経組織の神経系遺伝子発現の転写リプレッサーであるＲＥＳＴの喪失から生じうる。さらに、β２によって誘導される形態    転換は、発達、分化および細胞運命の進化的に保存されたマスター調節因子であるＮｏｔｃｈに依存する(Artavanis-Tsakonas et al., Science 284:770-776, 1999)。新規のＮｏｔｃｈ結合パートナーβ２によるＲＥＳＴの喪失およびＮｏｔｃｈ経路シグナル伝達を関連づける場合に、我々は、腫瘍進行および転移において３つすべての役割を記述する。
【０１１７】
８．抗体交差ブロック実験により３つの異なるエピトープが示唆される
以下のα−β２モノクローナル抗体が同じ又は異なるエピトープに結合するか否かを決定するために、抗体交差ブロック実験を行った。３Ｄ１、１２Ａ９、１２Ｅ３、２Ｅ３および３Ｇ５。それらの実験において、図１４にて図示するように、β２抗原に対するビオチン化された抗体の結合を、非標識の「競争者」抗体の存在下で評価した。結果は、抗体３Ｄ１および１２Ａ９は第一エピトープ(「エピトープＡ」)に結合し、抗体１２Ｅ３は第二エピトープ(「エピトープＢ」)に結合し、そして、抗体２Ｅ３および３Ｇ５は第３エピトープ(「エピトープＣ」)に結合したことを示す。
【０１１８】
９．ＡＴＣＣ寄託
以下のハイブリドーマ細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA(ATCC)に寄託した。
ハイブリドーマ／抗体名称      ＡＴＣＣ番号        寄託日         
１２Ａ９.２２.１(１２Ａ９)    ＰＴＡ−８４０４    ２００７年５月２日
３Ｄ１.４.１(３Ｄ１)          ＰＴＡ−８４０５    ２００７年５月２日
２Ｅ３.１.１(２Ｅ１)          ＰＴＡ−８４０６    ２００７年５月２日
【０１１９】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、そして寄託物の試料の供給の直近の要請後少なくとも５年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、関連米国特許の特許査定時に、寄託した材料を公的に入手する際に寄託者により課せられる制限をすべて取消不能に排除されることを保証し、関連米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願のいずれか早いものの公開時に、寄託培養物の後代が永久かつ非制限的に一般に入手可能となることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１.１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者が後代を入手できることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されているときに死亡もしくは損失又は破壊された場合、通知時に材料を同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
前述の発明は、理解を明確にするための図説及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、この説明及び実施例は本発明の権利範囲を限定するものとみなされるものではない。本明細書中において引用したすべての特許文献及び科学文献の開示内容は、出典明記によってその全体が特別に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｅ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｅ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月4日(2014.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２に結合し、Ｎｏｔｃｈ１へのβ２の結合をブロックするモノクローナル抗体。
【外国語明細書】
2015096502000001.pdf