(57)【要約】      （修正有）【課題】（６ＲＳ）−又は（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールとの安定な錯体、及びその製造法の提供。【解決手段】式（１）で表される（６ＲＳ）−又は（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とマンニトール等のポリオールをエタノール等の溶媒に溶解し、これを凍結乾燥又はスプレー乾燥することにより製造した、活性成分単独又は他の方法で製造された同一の成分に比べて安定である、Ｎメチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールとの錯体。前記錯体は医薬製剤又は栄養補助食品製剤として使用する。2015110567.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（６ＲＳ）−または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールによる安定な錯体。
【請求項２】
適切な溶液を凍結乾燥またはスプレー乾燥して得られた、（６ＲＳ）−または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ金属塩とポリオールによる安定な錯体。
【請求項３】
前記ポリオールがマンニトール、ソルビトール、イソマルトール、およびイノシトールから選択される請求項１または２に記載の錯体。
【請求項４】
前記アルカリ土類金属塩がカルシウム塩である、請求項１〜３のいずれかに記載の錯体。
【請求項５】
前記ポリオールと前記Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸塩のモル比が１〜１０である、請求項１〜４のいずれかに記載の錯体。
【請求項６】
（６ＲＳ）−または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールによる安定な錯体を製造する方法であって、
当該テトラヒドロ葉酸塩とポリオールが適切な溶媒中に存在する溶液を凍結乾燥する工程を含む、方法。
【請求項７】
（６ＲＳ）−または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールによる安定な錯体を製造する方法であって、
当該テトラヒドロ葉酸塩とポリオールが適切な溶媒中に存在する溶液をスプレー乾燥する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記スプレー乾燥を、入口温度１２０〜１５０℃、出口温度５０〜８０℃、かつ圧力２０〜５０ｍｍＨｇで実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒が水または水と低級アルコールとの混合物である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールとの安定な錯体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
医薬製剤または栄養補助食品製剤を調製するための、請求項１〜５のいずれかに記載の錯体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（６ＲＳ）−または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールとの安定な錯体、およびこれらの医薬製剤または栄養補助食品製剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
葉酸およびこれに対応する（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸塩は、いくつかの治療分野において非常に重要である。葉酸は、二分脊椎、無脳症、脳ヘルニア等の神経管欠損を含むいくつかの先天性異常の危険に対する防御を促進する。
治療において幅広く使用されている葉酸は、（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（１）である（(C20H25N7O6*Ca; CAS Registry Number: 151533-22-1)。
【０００３】
【化１】
2015110567.tif 000002
【０００４】
Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸およびその塩は、巨赤芽球性貧血の治療において葉酸拮抗体、特に、癌治療（“レスキュー療法”）におけるアミノプテリンおよびメトトレキサートの親和性向上の阻害剤として関与し、フッ化ピリミジンの治療効果の向上、乾癬やリューマチ関節炎等の自己免疫疾患治療の治療効果の向上、特定の抗寄生虫製剤例えばトリメトプリム−スルファメトキサゾールの適合性の向上、かつジデアザテトラヒドロ葉酸の毒性の低減にも関与する。
【０００５】
Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩は、特に食品添加物として、または神経管欠損予防、うつ病の治療、およびホモシステイン量の低減のためのビタミン製剤として使用される。
Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸およびその塩は極めて不安定であり、特に非常に酸化されやすい（例えばA. L. Fitzhugh, Pteridines 4 (4), 187-191 (1993)を参照）。
したがって、薬理活性性部分または食品添加物として許容できる純度レベルの当該化合物を製造することは困難である。
【０００６】
Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸の、特徴的な不純物である４α−ヒドロキシ−５−メチルテトラヒドロ葉酸（Ｄ１）およびピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体（Ｄ２ａおよびＤ２ｂ）への典型的な分解経路はスキーム１および２で表される。
【０００７】
【化２】
2015110567.tif 000003
スキーム１
４α−ヒドロキシ−５−メチルテトラヒドロ葉酸（Ｄ１）
【０００８】
【化３】
2015110567.tif 000004
スキーム２
ピラジノ−ｓ−トリアジン誘導体（Ｄ２）
【０００９】
５−メチルテトラヒドロ葉酸の不安定性を克服するために、可能な限り酸素を完全に遮断する、アスコルビン酸または還元Ｌ−グルタチオン等の抗酸化剤を添加する等の種々の方法がこれまで採用されてきた。しかしながら、使用中に酸素を完全に遮断することはほとんど不可能であり、仮に完全に遮断するとすれば相当なコストがかかる。そして抗酸化剤を添加することは常に可能であるとは限らない。
以上から、（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸塩の安定化のための方法が求められている。
【００１０】
先行文献には安定化剤の使用が開示されている。
例えば、国際公開２０１１／０１８４８２（バイエルシェリングファーマＡＧ）は、結晶形態の（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩と少なくともひとつの保護剤を含む安定化された粒子を開示する。
国際公開第２００８／００３４３２（バイエルシェリングファーマＡＧ）に開示されているとおり、Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸塩製剤の調製は、有効成分の部分的な分解を引き起こしうるので困難であると考えられている。
ＥＰ１０４４９７５（エプローバＡＧ）は、高温で生成物を処理することによって（６Ｓ）−Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム塩の安定した結晶形態を調製することを開示する。高温での処理は大スケールでの製造において技術的に困難である。
米国特許７，９４７，６６２（グノシスＳｐＡ）はグルコサミン塩のように安定化した葉酸誘導体の医薬組成物を開示する。
米国特許５，４５５，２３６（エプローバＡＧ）はテトラヒドロ葉酸を包接して安定化するためにシクロデキストリンを使用することを開示する。
医薬組成物においてこれらの添加物を用いることは、常に望ましいとは限らない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開２０１１／０１８４８２
【特許文献２】国際公開第２００８／００３４３２
【特許文献３】ＥＰ１０４４９７５
【特許文献４】米国特許７，９４７，６６２
【特許文献５】米国特許５，４５５，２３６
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】A. L. Fitzhugh, Pteridines 4 (4), 187-191 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
我々はＮ５−メチルテトラヒドロ葉酸塩とポリオールとの錯体の形成が、医薬製剤または栄養補助食品製剤に安全に使用しうる安定な製品を与えることを見出した。
すなわち、本発明の対象は（６ＳＲ）または（６Ｓ）−Ｎ５−メチルテトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールとの安定な錯体である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
好ましくは、（６ＳＲ）または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩はカルシウム塩である。
安定なポリオールは、環状ポリオール、特に例えばマンニトール、ソルビトール、イソマルトール、およびイノシトール等の医薬製剤または栄養補助食品製剤の分野で従来用いられているポリオールを含む。
マンニトールが特に好ましい。
本発明の錯体におけるポリオールとＮ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸塩のモル比は、１〜１０である。
【００１５】
本発明の錯体は種々の方法で得ることができる。これらの方法の中でスプレー乾燥および凍結乾燥が特に好ましい。これらの方法は高純度で高安定性の生成物を得るのに有効であることが見出されたからである。
スプレー乾燥や凍結乾燥のために、（６ＳＲ）または（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩およびポリオールが適切な溶媒中に存在する溶液を調製する。
【００１６】
好ましい溶媒は水であり、場合によっては水と他の溶媒（好ましくはメタノールやエタノール等の低級アルコール）との混合物でもよい。
本発明の錯体の製造のために凍結乾燥を用いるときは、好ましい溶媒は水と低級アルコールの混合物である。
【００１７】
本発明の錯体の製造のためのスプレー乾燥および凍結乾燥は従来の手法に従って実施される。好ましくは、スプレー乾燥工程は入口温度が１２０〜１５０℃、出口温度が５０〜８０℃であり、工程における圧力は２０〜５０ｍｍＨｇで実施される。
【００１８】
本発明の錯体の製造のためのスプレー乾燥および凍結乾燥の使用は、他の方法に比べて、製造方法をより良く制御できる、容易にスケールアップできる等の付加的な利点をもたらしうる。本発明のＮ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸のアルカリ土類金属塩とポリオールのとの錯体は、対応するＮ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸塩単独に比べてより安定である。
この安定性により、当該錯体は医薬製剤または栄養補助食品製剤として特に好適である。
以下の限定されない実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００１９】
実施例１
ＣＨ６９９４２６に従った（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩の製造
１０６．９ｇの（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸を４００ｍｌの水に４０℃で溶解し、ｐＨを６．８にするためにＮａＯＨ水溶液を加えた。
０．９０当量のＣａＣｌ２を当該溶液に加えたところ、（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩の析出が始まり１００ｍｇの生成物を得た。当該混合物を４０℃で１時間撹拌し、２３℃で２時間冷却した。この温度を１８時間維持した。懸濁物をろ過し、固形分を水とエタノールで洗浄した。減圧乾燥を行った後、４７．３ｇの（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（５ＭｅＴＨＦ）を得た。
【００２０】
実施例２
室温での蒸発実験
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（３ｇ）とマンニトール（６ｇ）を３００ｍｌの水に溶解し、室温で撹拌した。溶液を減圧下室温での蒸発に供し、比較物質ＥＶＲＴを得た。
ＥＶＲＴを促進安定性試験に供した。表２に安定性のデータを示す。
【００２１】
実施例３
４℃での蒸発実験
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（３ｇ）とマンニトール（６ｇ）を３００ｍｌの水に溶解し、室温で撹拌した。溶液を減圧下４℃での蒸発に供し、比較物質ＥＶＬＴを得た。
ＥＶＬＴを促進安定性試験に供した。表２に安定性のデータを示す。
【００２２】
実施例４
６０℃での蒸発実験
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（３ｇ）とマンニトール（６ｇ）を３００ｍｌの水に溶解し、室温で撹拌した。溶液を減圧下６０℃での蒸発に供し、比較物質ＥＶＨＴを得た。
ＥＶＨＴを促進安定性試験に供した。表２に安定性のデータを示す。
【００２３】
実施例５
スプレー乾燥実験
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（５ｇ）とマンニトール（１０ｇ、５当量）を３００〜１０００ｍｌの水、あるいは水とメタノール（ＭＥＴ）またはエタノール（ＥＴＨ）との混合物に室温にて溶解した。ミニスプレードライヤー（Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０、Ｂｕｃｈｉ製）を用いて溶液をスプレー乾燥し、錯体を回収した。表１に重要な実験条件および装置条件を示す。
得られたいくつかの生成物、すなわちＳＤ−３、ＳＤ−４、ＳＤ−６、ＳＤ−７、ＳＤ−８、ＳＤ−９、ＳＤ−１０（これらの番号は実験番号に対応する）を促進安定試験に供した。表２に安定性のデータを示す。
【００２４】
【表１】
2015110567.tif 000005
【００２５】
実施例６
スプレー乾燥実験
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（５ｇ）とイノシトール（１０ｇ）を５００ｍｌの水に室温で溶解した。ミニスプレードライヤー（Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０、Ｂｕｃｈｉ製）を用いて溶液をスプレー乾燥し、錯体を回収した。
【００２６】
実施例７
凍結乾燥実験
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩（３ｇ）とマンニトール（ＡＰＩ／マンニトール比を１／１０〜１／１で変化させた）を水中（３００ｍｌ）で混合し、室温にて透明黄色の溶液となるまで撹拌した。撹拌時間は生成物と水の比率に依存し、１０〜３０分であった。得られた溶液のｐＨは６．７〜７．３の範囲であった。溶液を、再凍結乾燥装置（エドワードミニファスト２０００ＳＮ：３０２８、Ｅｄｗａｒｄ  Ｍｉｎｉｆａｓｔ  ２０００ＳＮ：３０２８）内の褐色のガラスフラスコに入れた。生成物を真空下で１日間凍結した。系を０℃にし、０℃を１日間維持した。系の温度を、２０℃に達するまで、約６時間毎に５℃ずつ上昇させた。
生成物を回収した。Ｌｙｏ−１〜Ｌｙｏ−６の生成物を安定性試験に供した。結果を表２に示す。
【００２７】
実施例８
（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−（５，６，７，８）−テトラヒドロ葉酸塩関連物質のＨＰＬＣによる同定
試料準備：（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩を乾燥重量基準で２５±３ｍｇ秤量し５０ｍｌの容量フラスコに入れ、最終容量になるまで３２０μｌのアスコルビン酸溶液と水を加えた。当該溶液をＨＰＬＣのバイアルに入れ、速やかに注入した。
分析：１０μｌの標準溶液を注入した。クロマトグラム（分析波長は２８０±１６ｎｍ）とピークを測定した。
クロマトグラフィーシステム：Ｈｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳカラム（長さ  ２５０ｎｍ、ＩＤ  ４ｍｍ、粒径  ５μｍ）を溶液クロマトグラフに配置した。２８０±１６ｎｍ分析波長のために、カラムダイオードアレイ検出器をカラムに接続した。
移動相：
溶液Ａ：０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５０，
溶液Ｂ：０．０３Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（水／メタノール＝６５／３５中）、ｐＨ８．０
傾斜：１００％Ａ〜１００％Ｂ
流速：１．１ｍｌ／分、カラム温度  ３０℃、実行時間  ２２分。
【００２８】
実施例９
ＨＰＬＣ分析による（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩の同定
試料準備：２５０ｍｌの容量フラスコ内で、７５〜８５ｍｇの試料を２００ｍｌの水に溶解した。１ｍｌのアスコルビン酸溶液を加え、そして水を加えて２５０ｍｌに希釈した。合計で３つの試料溶液を調製した。
分析：標準溶液を注入してＨＰＬＣを検証および校正した。前記３つの試料溶液の各溶液を注入した後、すぐに標準溶液を注入して校正管理した。
クロマトグラフィシステム：液体クロマトグラフに、ＡＣＥ５Ｃ１８、２５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径５μｍの分析カラムを接続した。
移動相の組成：アクリロニトリル１２％、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）８０％、メタノール＋２−メルカプトエタノール８％
他のクロマトグラフパラメータ：
カラム温度：２５℃、アイソクラチックモード、流速：０．４１ｍｌ／分、注入量：５μｌ、実行時間：１３．５分、分析波長：２９０ｎｍ
【００２９】
実施例１０
安定性試験
実施例５および７に記載のとおり、スプレー乾燥または凍結乾燥により得た本発明の錯体の安定性試験を、（６Ｓ）−Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸カルシウム塩単独を比較として行った。実施例２、３、および４で報告した溶液から溶媒を蒸発させるというような異なる手法による製法についても安定性試験を行った。
２５℃かつ４０％の相対湿度における促進安定性試験を行った。
表２に得られた安定性のデータを示す。
【００３０】
【表２】
2015110567.tif 000006
【００３１】
表２の結果は、Ｎ５−メチル−テトラヒドロ葉酸塩とポリオールの錯体が、単独の活性成分（５ＭｅＴＨＦ）、またはメチル−テトラヒドロ葉酸塩とポリオールとの溶液を単純に蒸発させただけで得た生成物（ＥＶＬＴ、ＥＶＲＴ、ＥＶＨＴ）に比べてより安定であることを示した。凍結乾燥（Ｌｙｏ−１、Ｌｙｏ−２、Ｌｙｏ−３、Ｌｙｏ−４、Ｌｙｏ−５、Ｌｙｏ−６）およびスプレー乾燥（ＳＤ−３、ＳＤ−４、ＳＤ−６、ＳＤ−７、ＳＤ−８、ＳＤ−９、ＳＤ−１０）技術による製法が最善の結果を示した。
【外国語明細書】
2015110567000001.pdf