(57)【要約】【課題】多能性細胞の分化の提供。【解決手段】多能性細胞（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）など）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの維持、増殖、培養、および／または造血前駆細胞もしくは内皮細胞への分化のための方法を本明細書中に提供する。多能性細胞を、特定の条件下で維持および分化することができる。したがって、多能性細胞の造血前駆細胞または内皮細胞への分化のための一定の実施形態においてマウスフィーダー細胞や血清を使用する必要がない。得られた造血前駆細胞を、種々の骨髄細胞系列またはリンパ系細胞系列にさらに分化することができる。【選択図】図５
2015192681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年２月２７日に出願された米国出願第６１／１５６，３０４号（この全体の開示は、放棄されることなく、その全体が、参考として具体的に本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、一般に、分子生物学分野および医学分野に関する。より具体的には、本発明は、胚性幹細胞から造血前駆細胞を産生するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
造血幹細胞および造血前駆細胞の有意な医学的潜在能力により、多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化方法を改良するための相当数の研究が行われている。ヒト成人では、主に骨髄中に存在する少数の造血幹細胞は、活発に分割する造血（ＣＤ３４＋）前駆細胞の不均一な集団を産生し、これらが血液系の全細胞に分化する。しかし、他の細胞型、特に内皮細胞（血管）もＣＤ３４を発現するので、ＣＤ３４＋マーカーは造血細胞の不正確な定義である。他のマーカー（ＣＤ４３マーカーなど）を使用して、造血前駆細胞の同定に役立てることもできる（例えば、Ｋａｄａｊａ−Ｓａａｒｅｐｕｕら、２００７；非特許文献１）。ヒト成人では、造血前駆体が増殖および分化して、数千億個の成熟血球を毎日生成する。造血前駆細胞はまた、臍帯血中に存在する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ヒト胚性幹細胞は、培養において不定の増殖が可能であり、したがって、少なくとも原理的には、不全または欠損したヒト組織の代わりの細胞および組織を供給することができる。
【０００４】
ヒト多能性細胞のフィーダー細胞株（マウス線維芽細胞など）との培養には、共培養中の種間曝露に事前に関連した予想外の形質転換のリスクがある。ヒト多能性幹細胞培養の目的の１つがヒトの身体に最終的に移植することができる組織を作製することであるので、幹細胞が別の種の細胞や別の種の細胞を培養するために使用した培地に曝露されないことが非常に望ましい。したがって、いかなる種類の共培養工程も使用しないでヒト多能性幹細胞を造血系列に分化することが可能な培養条件を定めることは、ヒト多能性幹細胞からのヒト造血前駆細胞の産生技術の持続的進展において非常に興味深い。
【０００５】
分化培地中での血清の使用には、一定の欠点および制限もあり得る。例えば、非特許文献２に示すように、血清は、異なるバッチ間の血清の組成に関する（例えば、成長因子の存在および／または濃度などのばらつきに関する）不確定要素が存在する動物生成物である。これらの不確定要素はまた、実験間で生じる造血細胞の割合のばらつきの増加に寄与し得る。さらに、血清の使用によって臨床開発中に実質的な規制問題が生じ、さらに、商業化が複雑になり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｖｏｄｙａｎｉｋら、Ｂｌｏｏｄ（２００６）１０８（６）：２０９５−１０５
【非特許文献２】Ｃｈａｄｗｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ（２００３）１０２（３）：９０６−９１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
別の動物種由来の物質に細胞が曝露されることなく多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる方法は、現在必要とされていることが明確である。多能性細胞の維持および分化に関連する複雑さのために、マウスフィーダー細胞上での維持と比較して、どのようにして種々の多能性細胞が種々の特定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）中での維持後の成長因子への曝露に応答することができるのかについて、現在のところ明らかにされていない。明らかに、多能性細胞の造血前駆細胞への改良された分化方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
特定の条件下で増殖（ｅｘｐａｎｄ）および／または維持した多能性細胞の造血前駆細胞または内皮細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法を本明細書中に提供する。これらの方法は、特定の条件下で行うことができる過程の提供によって先行技術における制限を克服する。したがって、これらの方法を、有利に使用して、例えば、造血前駆細胞（ＨＰＣ）またはさらに分化した骨髄細胞系列またはリンパ系細胞系列を産生することができる。これらは、マウス線維芽細胞および／または血清などの動物生成物に曝露した細胞の使用に関連するであろう臨床的懸念を軽減しながら被験体（例えば、ヒト患者）に投与することができる。
【０００９】
本発明の１つの態様は、多能性細胞を造血前駆細胞または内皮細胞に分化させる方法であって、以下の逐次的工程：（ａ）少なくとも１つの成長因子を含む第１の特定培地中で複数の実質的に未分化の多能性細胞を培養または維持する工程、（ｂ）ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを本質的に含まない第２の特定培地中で細胞をインキュベートする工程、（ｃ）複数の細胞を増殖するか分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む第３の特定培地中で細胞を培養する工程、および（ｄ）複数の細胞を増殖するか分化を促進するのに十分な量の（１）ＩＬ−３およびＦｌｔ３リガンド、または（２）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−２模倣物、およびＩＧＦのいずれかを含む第４の特定培地中で細胞を培養する工程を含み、複数の多能性細胞が造血前駆細胞または内皮細胞に分化する、方法に関する。一定の実施形態では、上記の組み合わせ（１）を使用して、造血前駆細胞への分化を促進することができる。上記の組み合わせ（２）を使用して、内皮細胞または内皮前駆細胞への分化を促進することができる。第２の特定培地は、ＦＧＦ−２、ＩＬ６、ＳＣＦ、および／またはＴＰＯを含まないか本質的に含まなくてよい。第３の特定培地は、ＦＧＦ−２（例えば、約５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは約１０〜２５ｎｇ／ｍｌ）またはＦＧＦ−２模倣物も含むことができる。以下の実施例に示すように、第３の培地中にＦＧＦ−２を含めることにより、多能性細胞の造血前駆細胞への分化の効率を増大させることができる。一定の実施形態では、第４の特定培地は、ＧＭＣＳＦ、またはＩＬ−６、ＳＣＦ、またはＴＰＯのうちの少なくとも１つをさらに含む。一定の実施形態では、第４の特定培地は、細胞分化の促進に十分な量の以下のいずれかを含む：（１）ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦ、または（２）ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＩＬ−６、およびＴＰＯ。第３の特定培地および／または第４の特定培地は、ＢＩＴ９５００または血清代替物（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）３をさらに含むことができる。本方法は、ＢＩＴ９５００または血清代替物３を含む特定培地中で細胞を培養する工程を含むことができる。少なくともいくつかの細胞を、工程（ｂ）の前に少なくとも部分的に分離することができるか、実質的に個別化する。酵素（トリプシンなど）を使用して、細胞を実質的に個別化することができる。細胞を、個別化後にＲＯＣＫインヒビターおよびトリプシンインヒビター（例えば、ダイズトリプシンインヒビター）に接触させることができる。ＲＯＣＫインヒビターを、ＨＡ−１００、Ｈ−１１５２、およびＹ−２７６３２からなるリストより選択することができる。複数の多能性細胞は、胚様体（ＥＢ）を形成することができる。約２００〜約１０００細胞／凝集体を使用して、少なくとも１つのＥＢを生成することができる。本方法は、２０％酸素未満の気圧または約５％酸素の気圧で細胞を培養する工程を含むことができる。以下の実施例に示すように、低酸素条件下（約５％Ｏ２雰囲気下など）での細胞の分化により、細胞の、例えば、造血前駆細胞および／または内皮前駆細胞への分化を増加させることができ���。
【００１０】
一定の実施形態では、細胞を、少なくとも１回部分的または実質的に再凝集することができる。細胞を、第３の特定培地中での培養後および第４の特定培地中での培養前または培養中に再凝集することができる。再凝集は、細胞をトリプシンまたはＴＲＹＰＬＥに曝露することを含むことができる。細胞を再凝集後にＲＯＣＫインヒビターに曝露することができるか、細胞を再凝集後にＲＯＣＫインヒビターを本質的に含まない培地中で培養することができる。本方法は、約２０％酸素未満の気圧で細胞を培養する工程をさらに含むことができ、約２００〜約１０００細胞／凝集体を使用して複数の胚様体（ＥＢ）を生成する。第１の特定培地は、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、またはｍＴｅＳＲ１を含むことができる。工程（ａ）は、マトリックスでコーティングされた表面上での細胞培養を含むことができる。マトリックスは、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、ポリリジン、トロンボスポンジン、またはマトリゲル（商標）を含むことができる。第２の特定培地は、ＴｅＳＲ−ＧＦまたはＸ−ｖｉｖｏ１５培地を含むことができる。第２の特定培地は、約０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび約２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２をさらに含むことができる。工程（ｂ）は、約１２時間〜約３日間細胞をインキュベートすることを含むことができる。工程（ｃ）は、約４〜約８日間細胞を培養または分化することを含むことができる。工程（ｄ）は、少なくとも約４日間または約４〜約８日間細胞を培養することを含むことができる。複数の多能性細胞を、多分化能の造血前駆細胞または骨髄性前駆細胞に分化することができる。一定の実施形態では、骨髄性前駆細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ４３、およびＣＤ４５を同時発現する。骨髄性前駆細胞は、一般的な骨髄性前駆体であり得る。第３の特定培地は、約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４および約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを含む。一定の実施形態では、第３の特定培地は、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２をさらに含む。第３の特定培地は、約２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４および約２５ｎｇ／ｍｌ
ＶＥＧＦを含む。第４の特定培地は、約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３および約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３リガンドを含むことができる。第４の特定培地は、約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦまたは約１０〜１００ｎｇ／ｍｌもしくは約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、および約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３をさらに含むことができる。第４の特定培地は、約１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、約２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３リガンド、および約１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦを含むことができる。複数の造血前駆細胞は、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＣＤ４５を含むリストより選択される少なくとも２つの細胞マーカーを発現することができる。複数の造血前駆細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、およびＣＤ３１を発現することができる。一定の実施形態では、造血前駆細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、およびＣＤ３１を同時発現する多分化能造血前駆細胞である。
【００１１】
１つまたは複数の造血前駆細胞を、骨髄性細胞またはリンパ球系細胞に分化することができる。骨髄性細胞は、マクロファージ、肥満細胞、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、または多形核顆粒球（例えば、好酸球、好塩基球、好中球、単球、またはマクロファージ）であり得る。
【００１２】
一定の実施形態では、第５の特定培地を使用して、細胞の特定の細胞型への分化をさらに促進することができる。例えば、種々の培地を使用して、造血前駆細胞のさらに分化した細胞型（例えば、赤芽球、ＮＫ細胞、またはＴ細胞など）への分化を促進することができる。本方法は、複数の細胞の赤芽球への分化の促進に十分な量のＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、およびＴＰＯからなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で複数の細胞を培養する工程をさらに含むことができる。複数の細胞を、細胞のＮＫ細胞への分化の促進に十分な量のＩＬ−７、ＳＣＦ、およびＩＬ−２からなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で培養する。本方法は、細胞のＴ細胞への分化の促進に十分な量のＮｏｔｃｈリガンドならびにＩＬ−７、ＳＣＦ、およびＩＬ−２からなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で複数の細胞を培養する工程をさらに含むことができる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＦｃキメラＮｏｔｃｈ  ＤＬＬ−１リガンドまたはＮｏｔｃｈリガンドを過剰発現する間質細胞株によって産生されるＮｏｔｃｈリガンドであり得る。一定の実施形態では、胸腺ペプチド（サイモシンα、チモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｉｎ）、またはサイモシンＢ４など）を使用して、細胞のＴ細胞への分化をさらに促進することができる（例えば、Ｐｅｎｇら、２００８に記載）。一定の実施形態では、複数の細胞は造血前駆細胞を含む。第３の特定培地は、細胞の増殖またはさらなる分化の促進に十分な量のＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＧＦ２、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、またはＭ−ＣＳＦからなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含むことができる。第４の特定培地は、細胞の増殖またはさらなる分化の促進に十分な量のＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、またはＭ−ＣＳＦからなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含むことができる。一定の実施形態では、本方法は、細胞の増殖またはさらなる分化の促進に十分な量のＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＧＦ２、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、またはＭ−ＣＳＦからなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で細胞をインキュベートする工程を含むことができる。
【００１３】
多能性細胞は、好ましくは、哺乳動物多能性細胞である。一定の実施形態では、多能性細胞は、ヒト多能性細胞（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）など）である。ｈＥＳＣは、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、およびＨ１４からなるリストより選択され得る細胞を含む。ｉＰＳＣを、ｉＰＳ６．１、ｉＰＳ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ５．６、ｉＰＳｉＰＳ５．１２、ｉＰＳ５．２．１５、ｉＰＳｉＰＳ５．２．２４、ｉＰＳ５．２．２０、ｉＰＳ６．２．１、ｉＰＳ−Ｂｌ−ＳＯＮＬ、ｉＰＳ−Ｂｌ−ＳＯＣＫ、ｉＰＳ−ＴｉＰＳ１ＥＥ、ｉＰＳ−ＴｉＰＳＩＢ、ｉＰＳ−ＫｉＰＳ−５、およびｉＰＳ５／３−４．３からなるリストより選択することができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、本明細書中に記載の方法にしたがって分化したか、本明細書中に記載の方法にしたがって分化した個別の造血前駆細胞に由来する造血前駆細胞に関する。造血前駆細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、およびＣＤ３１のうちの２つ、３つ、または全てを発現することができる。本発明の別の態様は、本明細書中に記載の方法にしたがって分化した造血前駆細胞に由来する骨髄性細胞、骨髄性前駆体、または一般的な骨髄性前駆体に関する。骨髄性細胞を、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、および樹状細胞からなるリストより選択することができる。一定の実施形態では、骨髄性細胞は赤血球である。骨髄性細胞、骨髄性前駆体、または一般的な骨髄性前駆体を、薬学的調製物中に含めることができる。
【００１５】
本発明の別の態様は、本明細書中に記載の方法にしたがって分化した造血前駆細胞由来のリンパ球系細胞に関する。リンパ球系細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞であり得る。リンパ球系細胞を、薬学的調製物中に含めることができる。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、本明細書中に記載の方法にしたがって分化した内皮細胞、内皮前駆細胞、または間葉細胞に関する。本明細書中に記載の方法によって種々の内皮細胞群を産生することができると予測される。内皮細胞は、特定の内皮細胞型（リンパまたは血管（例えば、ＬＹＶＥ１またはポドプラニンを発現する）、動脈（例えば、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ、Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２を発現する）、静脈（例えば、ＥｐｈＢ４、Ｌｅｆｔｙ１、およびＬｅｆｔｙ２を発現する）、または器官特異的内皮細胞（例えば、心内膜細胞、腎臓細胞、肺または血液内の細胞、および血液脳関門細胞）など）に由来し得る。形態学的には、内皮細胞は、連続性、有窓性、または不連続性を示し得る。
【００１７】
「細胞を個別化すること」は、本明細書中で使用する場合、例えば、機械的分離またはタンパク質分解酵素（トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）など）への曝露の結果として、細胞がより小さな細胞群または個別の細胞に解離または分離することをいう。一定の実施形態では、個別化された培養物は、細胞の小集塊（例えば、約２〜１０個の細胞を含む細胞の集塊）を依然として含むことができる。
【００１８】
培地が成長因子を欠いているか、培地中での細胞のいかなる実質的な増殖および／または分化の促進にも不十分な量で培地中に成長因子が存在するか、検出可能限度未満の濃度で存在する場合、培地は、成長因子を「本質的に含まない」という。成長因子を本質的に含まない培地がそれでもなお培地中に微量の成長因子を含み得ると認識されるであろう。
【００１９】
用語「阻害すること」、「減少すること」、または「防止」、またはこれらの用語の任意のバリエーションには、特許請求の範囲および／または本明細書中で使用する場合、所望の結果を達成するための任意の測定可能な減少または完全な阻害が含まれる。
【００２０】
用語「有効な」は、この用語を明細書中および／または特許請求の範囲で使用する場合、所望されるか、期待されるか、意図される結果を達成するのに適切であることを意味する。
【００２１】
用語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中で用語「含む」と併せて使用する場合、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つ以上」の意味とも一致する。
【００２２】
本明細書中で考察した任意の実施形態を本発明の任意の方法または組成物に関して実施することができる（その逆も真なり）ことを意図する。さらに、本発明の組成物を使用して、本発明の方法を達成することができる。
【００２３】
本出願を通して、用語「約」を使用して、値がデバイス（値を決定するために使用した方法）固有のエラーのばらつきまたは研究用被験体の間に存在するばらつきを含むことを示す。
【００２４】
特許請求の範囲中の用語「または」は、開示が代替物のみおよび「および／または」をいう定義を支持するが、代替物のみをいうことを明確に示すか、代替物が互いに矛盾しない限り、「および／または」を意味するために使用する。
【００２５】
明細書および特許請求の範囲で使用する場合、用語  「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態（「有する（ｈａｖｅ）」  および「有する（ｈａｓ）」など））、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」など））または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態（「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」など）は、包括的または無制限であり、さらなる引用されていない要素または方法の工程を排除しない。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、本発明の精神内および範囲内の種々の変更形態および修正形態がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうという理由で、詳細な説明および具体例が、本発明の特定の実施形態を示す一方で、例示のみを目的として示されると理解すべきである。
【００２７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の一定の態様をさらに証明するために含まれる。本発明を、本明細書中に示した特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて１つまたは複数のこれらの図面を参照することによってより深く理解することができる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
多能性細胞を造血前駆細胞または内皮細胞に分化させる方法であって、以下の逐次的な工程：
ａ）少なくとも１つの成長因子を含む第１の特定培地中で複数の実質的に未分化の多能性細胞を培養または維持する工程；
ｂ）ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含まないか本質的に含まない第２の特定培地中で該細胞をインキュベートする工程、
ｃ）複数の該細胞を増殖するか分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む第３の特定培地中で該細胞を培養する工程、ならびに
ｄ）複数の該細胞を増殖するか分化を促進するのに十分な量の（１）ＩＬ−３およびＦｌｔ３リガンド、または（２）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＦＧＦ−２模倣物、およびＩＧＦのいずれかを含む第４の特定培地中で該細胞を培養する工程
を含み、
複数の該多能性細胞が造血前駆細胞または内皮細胞に分化する、方法。
（項目２）
上記第３の特定培地がＦＧＦ−２またはＦＧＦ−２模倣物をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記第４の特定培地がＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記第４の特定培地が、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＩＬ−６、ＳＣＦ、またはＴＰＯの少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記第４の特定培地がＩＬ−６、ＳＣＦ、およびＴＰＯをさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記第４の特定培地が血清代替物３をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記多能性細胞がｉＰＳＣである、項目６に記載の方法。
（項目８）
工程（ｂ）の前に上記細胞の少なくとも一部を少なくとも部分的に分離するか、実質的に個別化する、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記細胞を、酵素を使用して実質的に個別化する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記酵素がトリプシンである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記個別化後に上記細胞をＲＯＣＫインヒビターおよびトリプシンインヒビターに接触させる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記ＲＯＣＫインヒビターが、ＨＡ−１００、Ｈ−１１５２、およびＹ−２７６３２からなるリストより選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記トリプシンインヒビターがダイズトリプシンインヒビターである、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
複数の上記多能性細胞が胚様体（ＥＢ）を形成する、項目１に記載の方法。
（項目１５）
約２００〜約１０００細胞／凝集体を使用して少なくとも１つの上記ＥＢを生成する、請求項１４に記載の方法。
（項目１６）
上記方法が、２０％酸素未満の気圧で上記細胞を培養する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記方法が、約５％酸素の気圧で上記細胞を培養する工程を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記細胞が、少なくとも１回部分的または実質的に再凝集する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
上記細胞が、上記第３の特定培地中での培養後および上記第４の特定培地中での培養前または培養中に再凝集する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記再凝集が、トリプシンまたはＴＲＹＰＬＥへの上記細胞の曝露を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記再凝集後に上記細胞をＲＯＣＫインヒビターに曝露する、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
上記細胞を、上記再凝集後にＲＯＣＫインヒビターを本質的に含まない培地中で培養する、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
上記方法が、約２０％酸素未満の気圧で上記細胞を培養する工程をさらに含み、約２００〜約１０００細胞／凝集体を使用して複数の胚様体（ＥＢ）を生成する、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
上記第３の特定培地または上記第４の特定培地が血清代替物３を含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
上記第１の特定培地が、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、またはｍＴｅＳＲ１を含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）
工程（ａ）が、マトリックスでコーティングされた表面上で上記細胞を培養する工程を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記マトリックスが、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、ポリリジン、トロンボスポンジン、またはマトリゲル（商標）を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記第２の特定培地がＴｅＳＲ−ＧＦまたはＸ−ｖｉｖｏ１５培地を含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
上記第２の特定培地が、約０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび約２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２をさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
工程（ｂ）が、約１２時間〜約３日間、上記細胞をインキュベートする工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目３１）
工程（ｃ）が、約４〜約８日間、上記細胞を培養または分化させる工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
工程（ｄ）が、少なくとも４日間、上記細胞を培養する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
複数の上記多能性細胞が骨髄性前駆細胞に分化する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
上記骨髄性前駆細胞がＣＤ３１、ＣＤ４３、およびＣＤ４５を同時発現する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記第３の特定培地が約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４および約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ
ＶＥＧＦを含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
上記第３の特定培地が約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２をさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記第４の特定培地が約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３および約１０〜５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３リガンドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３８）
上記第４の培地が約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記第４の培地が約１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、および約５〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３をさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
複数の上記造血前駆細胞が、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１、およびＣＤ４５を含むリストより選択される少なくとも２つのマーカーを発現する、項目１に記載の方法。
（項目４１）
複数の上記造血前駆細胞がＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、およびＣＤ３１を発現する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
１つまたは複数の上記造血前駆細胞が、赤血球系細胞、骨髄性細胞、またはリンパ球系細胞に分化する、項目１に記載の方法。
（項目４３）
１つまたは複数の上記造血前駆細胞が骨髄性細胞に分化し、該骨髄性細胞が、マクロファージ、肥満細胞、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞、および多形核顆粒球からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
１つまたは複数の該造血前駆細胞が、好酸球、好塩基球、好中球、単球、およびマクロファージからなるリストより選択される顆粒球に分化する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
方法が、複数の上記細胞を、複数の該細胞の赤芽球への分化を促進するのに十分な量のＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＥＰＯ、およびＴＰＯからなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で培養する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目４６）
上記方法が、第５の特定培地中で複数の上記細胞を培養する工程を含み、該第５の特定培地が、該細胞の増殖またはさらなる分化を促進するのに十分な量のＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＧＦ２、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、またはＭ−ＣＳＦからなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目４７）
複数の上記細胞を、該細胞のＮＫ細胞への分化を促進するのに十分な量のＩＬ−７、ＳＣＦ、およびＩＬ−２からなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で培養する、項目１に記載の方法。
（項目４８）
上記方法が、上記細胞のＴ細胞への分化を促進するのに十分な量のＦｃキメラＮｏｔｃｈ  ＤＬＬ−１リガンドならびにＩＬ−７、ＳＣＦ、およびＩＬ−２からなるリストより選択される１つまたは複数の成長因子を含む第５の特定培地中で複数の該細胞を培養する工程をさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
上記多能性細胞が哺乳動物多能性細胞である、項目１に記載の方法。
（項目５０）
上記哺乳動物多能性細胞がヒト多能性細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
上記ヒト多能性細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記ｈＥＳＣが、Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、およびＨ１４からなるリストより選択される細胞を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記ヒト多能性細胞が誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）である、項目５０に記載の方法。
（項目５４）
上記ｉＰＳＣが、ｉＰＳ６．１、ｉＰＳ６．６、ｉＰＳ、ｉＰＳ５．６、ｉＰＳｉＰＳ５．１２、ｉＰＳ５．２．１５、ｉＰＳｉＰＳ５．２．２４、ｉＰＳ５．２．２０、ｉＰＳ６．２．１、ｉＰＳ−Ｂｌ−ＳＯＮＬ、ｉＰＳ−Ｂｌ−ＳＯＣＫ、ｉＰＳ−ＴｉＰＳ１ＥＥ、ｉＰＳ−ＴｉＰＳＩＢ、ｉＰＳ−ＫｉＰＳ−５、およびｉＰＳ５／３−４．３からなるリストより選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
項目１に記載の方法にしたがって分化したか、項目１に記載の方法にしたがって分化した個別の造血前駆細胞由来の造血前駆細胞。
（項目５６）
上記造血前駆細胞がＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、およびＣＤ３１を含むリストより選択される少なくとも２つのマーカーを発現する、項目５５に記載の造血前駆細胞。
（項目５７）
上記造血前駆細胞がＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、およびＣＤ３１を発現する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
項目１に記載の方法にしたがって分化した造血前駆細胞由来の細胞であって、該細胞が骨髄性細胞または一般的な骨髄性前駆体である、細胞。
（項目５９）
上記細胞が、単球、マクロファージ、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球、血小板、および樹状細胞からなるリストより選択される、項目５８に記載の細胞。
（項目６０）
上記細胞が赤血球である、項目５９に記載の細胞。
（項目６１）
上記骨髄性細胞が薬学的調製物中に含まれる、項目５８に記載の細胞。
（項目６２）
項目１に記載の方法にしたがって分化した造血前駆細胞由来のリンパ球系細胞。
（項目６３）
上記リンパ球系細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、項目６２に記載のリンパ球系細胞。
（項目６４）
上記リンパ球系細胞が薬学的調製物中に含まれる、項目６２に記載のリンパ球系細胞。
（項目６５）
項目１に記載の方法にしたがって分化した内皮細胞。
（項目６６）
上記内皮細胞が、リンパ内皮細胞、血管内皮細胞、動脈内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、静脈内皮細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｖｅｎｏｕｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、または器官特異的内皮細胞である、項目６５に記載の内皮細胞。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】継代数５０（Ａ）および４０（Ｂ）でのＨ１  ｈＥＳＣの造血分化（８、１２、および１６日目についてのｎ＝３実験）。
【図２】前条件付け特定培地への曝露によって造血分化が改善する。特定条件で維持し、ｍＴＥＳＲを使用したマトリゲルコーティングプレート上での無フィーダー細胞成長に適合させたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを使用した。
【図３】胚様体（ＥＢ）サイズはＣＤ４３発現と相関する。
【図４】低酸素状態は造血分化を促進する。
【図５】多能性細胞の単一細胞懸濁液からの造血前駆細胞の生成効率。
【図６】ＥＢ分化の概観ならびにスピナーフラスコを使用したＨＰＣおよび種々の系列特異的細胞型の生成。
【図７】９６ウェル形式でのｈＥＳＣのＥＢ分化。
【図８】ｉＰＳＣ由来の内皮細胞の磁性選別前および後の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図９】ＥＢ分化培地中のＦＧＦ−２補足により、ｈＥＳＣ（Ｈ１）および種々のｉＰＳＣ細胞株における造血前駆細胞（ＨＰＣ）の生成が増加した。
【図１０】（５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、および２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２）を含むＥＢ分化培地の存在下での種々のｉＰＳ細胞株の分化。
【図１１】成長因子を補足したＥＢ基本培地を使用したｈＥＳＣ（Ｈ１）およびｉＰＳ（ＳＯＮＬ）細胞株の造血前駆細胞（ＨＰＣ）への分化を示す。ＩＬ−３およびＦｌｔ−３を含む培地にＳＣＦ、ＩＬ−６、およびＴＰＯを補足した場合、分化の増加が認められた。
【図１２】（Ｈ１）およびｉＰＳ（ＳＯＮＬ）細胞株において改変ＥＢ２組み合わせ（Ｄ）を使用して、多能性細胞のＨＰＣへの分化効率の増加が認められた。培地中に補足した成長因子を示す。血清代替物３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、分化過程における血清代替物としてＢＩＴ−９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）より優れていることが認められた。
【図１３】酸素正常状態（「Ｎ」）および低酸素（「Ｈ」）条件下でのｉＰＳ細胞からのＨＰＣの生成。未分化細胞株を酸素正常状態条件下または低酸素条件下で維持し、酸素正常状態条件下または低酸素条件下で分化させた。例えば、「Ｈ−Ｎ」は、細胞を低酸素条件下で維持し、酸素正常状態条件下で分化させたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
例示的実施形態の説明
多能性細胞（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）など）の造血前駆細胞および／または内皮細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法を本明細書中に提供する。多能性細胞を、特定条件下で維持し、増殖し、分化することができる。したがって、多能性細胞の造血前駆細胞および／または内皮細胞への分化にはマウスフィーダー細胞または血清を使用する必要がない。得られた造血前駆細胞を、種々の骨髄細胞系列（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、または樹状細胞）またはリンパ系細胞系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞）にさらに分化することができる。多能性細胞を、多能性細胞の分化前に特定条件下（例えば、ＴｅＳＲ培地を使用）で本質的に未分化状態にて増殖および維持することができる。
【００３０】
特に、本発明者は、一定の成長因子が特定条件下で維持した多能性細胞の分化に特に重要であることを発見した。一定の実施形態では、多能性細胞をいくつかの特定培地に逐次的に曝露して、造血前駆細胞への分化を促進することができる。第１の特定培地中（例えば、ＴｅＳＲ培地中）での本質的に未分化状態での多能性細胞の培養および維持後、細胞を、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、またはＧＭＣＳＦを含まないか本質的に含まない第２の特定培地に曝露することができる。次いで、細胞をＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含む第３の特定培地に曝露して、造血分化を促進することができる。あるいは、細胞を、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦ、および任意選択的にＦＧＦ−２を含む第３の特定培地に曝露し、その後に、ＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含む第４の培地に曝露することができる。本発明者は、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む第３の特定培地への逐次的曝露およびその後のＩＬ−３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含む第４の培地への曝露によって、驚くべきことに造血前駆細胞の生成を実質的に増加させることができることを発見した。以下の実施例に示すように、第３の特定培地中にＦＧＦ−２を含めることにより、多能性細胞の造血前駆細胞への分化が驚異的に増加した。また、低酸素条件（例えば、気圧５％Ｏ２への曝露）、少なくとも部分的な細胞の再凝集（例えば、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）の使用）、および／または胚様体（例えば、約２００〜１０００細胞／凝集体）の形成における特定範囲の細胞を使用した凝集体の形成を使用して、造血前駆細胞への分化をさらに促進することもできることが発見されている。
【００３１】
Ｉ．胚性幹細胞の調製および維持
多能性細胞を、造血分化前に種々の方法を使用して未分化状態で培養および維持することができる。一定の実施形態では、多能性細胞を、特定のフィーダー非依存性培養系（ＴｅＳＲ培地など）を使用して、本質的に未分化の状態で培養および維持することができる。あるいは、非特定条件を使用することができる。例えば、多能性細胞を、未分化状態の幹細胞を維持するために線維芽細胞のフィーダー細胞または線維芽細胞のフィーダー細胞に曝露した培地上で培養することができる。
【００３２】
フィーダー非依存性の培養系および培地を使用して、多能性細胞（ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなど）を培養および維持することができる。これらのアプローチにより、ヒト胚性幹細胞をマウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずに本質的に未分化の状態で保持することが可能である。本明細書中に記載するように、必要に応じて、費用などを軽減するために、これらの方法を様々に修正することができる。
【００３３】
実質的に任意の多能性幹細胞株またはヒト胚性幹細胞株を、本明細書中に記載の特定条件下で造血前駆細胞に分化することができると予測される。例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ９、ｈＥＳ２、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、ｈＥＳ６、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＨＳＦ１、ＨＳＦ６、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３Ｂ、および／またはＨ１４などを、本明細書中に記載の方法によって造血前駆細胞に分化することができる。その後に利用可能になる幹細胞株も本明細書中に記載の方法によって造血前駆細胞に分化することができると予測される。一定の実施形態でヒト多能性細胞を好んで使用することができるが、ある場合には、他の多能性細胞（哺乳動物、マウス、霊長類など）を造血分化のために使用することも可能である。
【００３４】
ヒト胚性幹細胞に加えて、ｉＰＳ細胞を、本明細書中に記載の方法によって培養し、そして／または造血前駆細胞に分化することができる。ｉＰＳ細胞は、幹細胞のように作用する再プログラミングされた体細胞である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７；Ｎａｋａｇａｗａら、２００７）。当業者に認識されるように、用語「多能性細胞」には、天然に存在するか胚盤胞に由来する細胞および幹細胞に脱分化するか幹細胞様状態に戻るように誘導された細胞の両方が含まれる（例えば、Ｎａｋａｇａｗａら、２００７；Ｙｕら、２００７を参照のこと）。
【００３５】
Ａ．ＴｅＳＲ培地
ＴｅＳＲ培地は、未分化ヒト胚性幹細胞を培養するために使用することができる特定培地である。ＴｅＳＲ培地には、ＴｅＳＲ１培地およびｍＴｅＳＲ培地の両方が含まれる。ＴｅＳＲには、ｂＦＧＦ、ＬｉＣｌ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ピペコリン酸、およびＴＧＦβが含まれ、ＴｅＳＲを使用した種々の方法が以前に記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００６／００８４１６８号およびＬｕｄｗｉｇら（２００６ａ；２００６ｂ）（その全体が参考として援用される））。
【００３６】
ＴｅＳＲ培地は、典型的には、無機塩、微量ミネラル、エネルギー基質、脂質、アミノ酸、ビタミン、成長因子、およびタンパク質、ならびに他の成分を含む。ＴｅＳＲ１培地のための完全処方物を、以下の表１に示す。
【００３７】
【表１】
2015192681.tif 000003
上記処方物中の一定の成分を、例えば、研究または節約のためのＴｅＳＲの使用を容易にするために置換することもできる。例えば、培地ｍＴｅＳＲ１をＴｅＳＲ１の代わりに使用することができ、この培地は、ＴｅＳＲ１と以下の点で異なる：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をヒト血清アルブミンの代わりに使用することができ、クローン化したゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞成長因子（ｚｂＦＧＦ）をｂＦＧＦの代わりに使用することができる。ＴｅＳＲ１は、例えば、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００３８】
「ＴｅＳＲ−ＧＦ」または「ｍＴｅＳＲ−ＧＦ」は、ｂＦＧＦおよびＴＧＦ−βを欠くＴｅＳＲ培地をいう。「ＥＢ基本培地」は、約２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または血清代替物３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉ  ｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、約１％ＮＥＡＡ、約１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、約０．１ｍＭメルカプトエタノール、約０．７５％ＢＳＡ、および約５０  ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したＩＭＤＭを含む培地をいう。用語「ＴｅＳＲ培地」は、本明細書中で使用する場合、ＴｅＳＲ１培地、ＴｅＳＲ２培地、またはｍＴｅＳＲ培地を含む。ＴｅＳＲ２培地は、ＴｅＳＲ２培地がヒト化されていることを除いてＴｅＳＲ１培地と本質的に同一である。ＴｅＳＲ１培地、ＴｅＳＲ２培地、またはｍＴｅＳＲ培地を、本明細書中に開示の方法で使用することができる。
【００３９】
１．成長因子含有量を減少させた特定培地における前条件付け
（例えば、ＴｅＳＲ培地およびマトリックス成分（マトリゲル（商標）またはフィブロネクチンなど）を含む二次元培養系における）多能性細胞培養物の培養および／または維持後且つ造血分化前に、多能性細胞を、成長因子が減少しているか、本質的に排除されているか、欠いている特定培地に有利に曝露するか、この特定培地中で培養することができる。一定の実施形態では、培地に、ＴＧＦ−βおよび／またはＦＧＦ−２を補足することができる。例えば、成長因子レベルが実質的に減少した（例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βおよび約２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２が補足されているが、全ての他の非インスリン成長因子を欠く）ＴｅＳＲ培地を使用して、さらなる成長因子への曝露前に細胞を培養または「前条件付け」して、例えば、造血細胞への分化を促進することができる。
【００４０】
この「前条件付け」培養工程は、多能性細胞を約１２時間〜約７日間以上培養する工程を含み得る。一定の実施形態では、前条件付け工程は、約１〜約７日間、約１〜約３日間、または約１、２、３、４、５、６、または７日間、またはこれらから導き出される任意の範囲の期間細胞を培養することを含み得る。以下の実施例に示すように、約１〜約３日目の前条件付け培養物は、その後の多能性細胞の造血分化を有意に改善するのに十分であり得る。
【００４１】
前条件付け培養物で使用される特定培地は、ＦＧＦ−２および／またはＴＧＦ−βを含むことができる。典型的には、前条件付け培養物に補足されるＦＧＦ−２および／またはＴＧＦ−βの量を、本質的に未分化の状態で細胞を維持するために使用される特定培地と比較して減少させることができる。一定の実施形態では、約１０ｐｇ／ｍＬ〜約５ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ〜約０．５ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲のＴＧＦ−βを、前条件付け培養の間に特定培地中に含めることができる。種々の実施形態では、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２を、前条件付け培養の間に特定培地中に含めることができる。ＦＧＦ−２は、組換え的に産生されたヒトまたはゼブラフィッシュＦＧＦ−２であり得る。
【００４２】
Ｂ．マトリックス成分
マトリックス成分を、実質的または本質的に未分化の状態で多能性細胞を培養および維持するために特定培地中に有利に含めることができる。適切な半固体マトリックス中で培養する場合、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）と呼ばれる個別の前駆体が増殖して個別の細胞クラスターまたはコロニーを形成することができる。ＣＦＣアッセイを、栄養素およびサイトカインを補足した半固体培地（メチルセルロースまたはコラーゲンなど）に細胞懸濁液を入れ、その後に例えば、約３７℃でインキュベートすることによって行うことができる。
【００４３】
種々のマトリックス成分を使用して、多能性細胞（ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなど）を培養および維持することができる。例えば、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）（その全体が参考として援用される）に記載のように、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、およびビトロネクチンの組み合わせを使用して、胚細胞の培養および維持のための固体支持体を得ることができる。
【００４４】
マトリゲル（商標）を使用して、多能性細胞の細胞培養および維持のための基質を得ることもできる。マトリゲル（商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン様タンパク質混合物であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から市販されている。この混合物は、多数の組織で認められる複雑な細胞外環境に類似し、細胞培養用基質として細胞生物学者によって使用されている。マトリゲル（商標）を使用した特定培地中でのヒト胚性幹細胞の培養および維持方法は、例えば、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６）に記載されており、この方法を使用して造血分化前の多能性細胞を培養することができる。当業者に公知のように、ヒト胚性幹細胞のさらなる培養および維持方法を本発明と共に使用することができることが認識される。
【００４５】
ＩＩ．ＥＳ細胞の播種および分化
多能性細胞を、造血分化前に部分的、本質的、または完全に解離または個別化することができる。多能性細胞を、単一のコロニーまたはクローン群としてか、培養組織から解離した細胞の集塊としてか、個別化した細胞として播種して造血分化を促進することができる。多能性細胞を、機械的方法または酵素的方法（多能性細胞を含む組織のトリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）への曝露など）を使用して、本質的に個別の細胞に個別化または分離することができる。タンパク質分解酵素を使用して、培養表面から細胞を解離し、細胞自体を分離することができる。分化のためにＥＳ細胞を個別化するために使用することができる酵素には、セリンプロテアーゼ（トリプシンなど）および酵素の混合物（アクターゼ（商標）中に見出される酵素など）が含まれる。
【００４６】
多能性細胞を、本質的に個別の（または分散した）細胞として播種培地に添加または播種することができる。一定の実施形態では、分散したＥＳ細胞を、約５０万〜３００万細胞／ｍｌの密度にて表面（低付着表面など）上の播種培地中に播種する。一定の実施形態では、播種培地は特定培地である。一定の実施形態では、低付着表面を有利に使用することができるが、標準的な無菌細胞培養物に適合する本質的に任意の材料を培養表面に使用することができると予測される。播種培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地、マトリックス成分、およびＲＯＣＫインヒビターを含むことができる。
【００４７】
多能性細胞を、ＲＯＣＫインヒビター、プロテアーゼインヒビター（例えば、トリプシンインヒビター）、および／またはＰＫＣインヒビターを含むか含まない播種培地中で培養するかこの播種培地に曝露することができ、細胞を、１つまたは複数の成長因子を含む特定培養培地中にて低酸素雰囲気下で培養することができる。一定の実施形態では、ダイズトリプシンインヒビター（例えば、約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍｌ）を播種培地中に含めることができる。播種培地および特定培養培地は、それぞれ、フィーダー細胞を含まないか、本質的に含まないかもしれない。さらなる分化細胞をその後に回収することができる。例えば、造血前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞は、播種後約８日間〜約１２日間以上または約６日間〜約９日間の培養時に生じ得る。
【００４８】
任意選択的に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を、胚様体（ＥＢ）の形成の間にＲＯＣＫインヒビターを含む培地中に含めることができる。本発明者らは、ＲＯＣＫインヒビターを含む培地中でのＥＢ形成のためにＰＶＡが必要でないが、それにもかかわらず、ＥＢ形成の間の培地（例えば、低レベルのＴＧＦ−βおよびＦＧＦ−２以外の成長因子（ｇｒｏｗｔｈ）を欠くＴｅＳＲ培地）中にＰＶＡを含めることができることを認めた。ＴｒｙｐＬＥ（商標）または他の酵素消化物を使用して、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはトリプシンインヒビター（および／または、任意選択的に、ＰＶＡ）の曝露およびＥＢ形成前に多能性細胞を実質的に個別化するかバラバラにすることができる。
【００４９】
ＩＩＩ．多能性細胞の造血前駆細胞への分化
部分的、本質的、または完全な多能性細胞の解離または個別化後、細胞を特定培地中でさらに培養して造血分化を促進することができる。成長因子の特定の組み合わせが多能性細胞の造血前駆体および造血細胞系列への分化を実質的に促進することができることが発見された。成長因子の特定の組み合わせの逐次的適用を使用して多能性細胞の分化をさらに促進することができることがさらに発見された。一定の実施形態では、成長因子の特定の組み合わせは多能性細胞の造血分化に極めて重要である。例えば、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦの組み合わせを使用して造血分化を促進することができることを本明細書中に示す。一定の実施形態では、本発明者は、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦ（および任意選択的にＦＧＦ−２）を含む第１の培地への細胞培養物の逐次的曝露およびその後のＦｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦを含む第２の培地中での培養によって多能性細胞の造血前駆細胞および造血細胞への分化を驚異的に増大させることができることを発見した。例えば、以下の実施例に示すように、この逐次的曝露により、特定条件下で同一時間にわたって産生される造血前駆細胞数がほぼ倍増した。さらに、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む培地中にＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）を含めることにより、多能性細胞からの造血前駆細胞生成の効率が少なくとも倍増した。
【００５０】
多能性細胞の造血前駆細胞への分化を、特定条件または非特定条件を使用して行うことができる。一般に、特定条件は、一般に、得られた細胞がヒト被験体への投与を意図される実施形態で好ましいと認識されるであろう。造血幹細胞を、特定条件下（例えば、ＴｅＳＲ培地およびマトリックス成分（マトリゲル（商標）など）を使用）にて多能性幹細胞から培養することができ、造血細胞を、多能性細胞由来の胚様体から生成することができる。他の実施形態では、多能性細胞を、ＯＰ９細胞またはマウス胚線維芽細胞上で共培養し、その後に分化させることができる。
【００５１】
多能性細胞は、分化過程の一部として胚様体を形成することが可能である。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）（すなわち、成長中の細胞のクラスター）の形成は、一般に、ヒト多能性幹細胞のＥＢへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝集を含み、ヒト多能性幹細胞の内胚葉、外胚葉、および中胚葉起源の複数の組織型への自発的および無作為な分化が可能である。したがって、三次元ＥＢを使用して、造血細胞および内皮細胞のいくつかの画分を産生することができる。
【００５２】
以下のプロトコールを使用してＥＢを形成することができる。マトリゲル（商標）コーティングプレート上でのフィーダー無しでの成長に適合させた未分化のｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを、３７℃で約１０分間のコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ）処理を使用して、コンフルエンスで回収することができる。インキュベーション後にウェルのコラゲナーゼを洗い流し、ＥＢ基本培地中へのウェルの掻爬によってＥＢを形成させることができる。翌日、培地を、異なるサイトカイン処方物を含むＥＢ分化培地に交換することができる。
【００５３】
ＥＢ形成を促進するために、細胞を、約２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または血清代替物３、約１％ＮＥＡＡ、約１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および約０．１ｍＭメルカプトエタノール、約０．７５％ＢＳＡ、および約５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したＩＭＤＭを含む「ＥＢ基本培地」中での一晩のインキュベーションのための低付着プレートに移すことができる。翌日、細胞を各ウェルから回収し、遠心分離することができる。次いで、細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、約５０ｎｇ／ｍｌ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、約２５ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、約２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、約１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−３（ＩＬ−３）、約１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６（ＩＬ−６）、約２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、約２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、約０．２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（ＥＰＯ）、約２５ｎｇ／ｍｌトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｉｔｉｎ）（ＴＰＯ）、および約２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したＥＢ基本培地からなる「ＥＢ分化培地」に再懸濁することができる。１５ｍＬ管にＥＢを移し、凝集体を約５分間静置することによって、４日毎に培地を交換することができる。一定の実施形態では、ＥＢ分化培地は、およそＢＭＰ４（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、および任意選択的にＦＧＦ−２（例えば、約２５〜７５ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌ）を含むことができる。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換することができる。あるいは、細胞に、２日毎に新鮮な培地の半量を補給することができる。細胞を、分化過程中の異なる時点で回収することができる。
【００５４】
造血前駆細胞を、特定培地を使用して多能性幹細胞から培養することができる。特定培地を使用した多能性細胞の造血ＣＤ３４＋幹細胞への分化方法は、例えば、米国特許出願第６１／０１５，８１３号（放棄することなくその全体が参考として援用される）中に記載されている。これらの方法を本発明と共に使用することができると予測される。
【００５５】
例えば、特定培地を使用して、造血ＣＤ３４＋分化を誘導することができる。特定培地は、成長因子ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、および／またはＧＭＣＳＦを含むことができる。多能性細胞を、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および任意選択的にＦＧＦ−２を含む第１の特定培地中で培養し、その後に（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）または（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、およびＴＰＯ）のいずれかを含む第２の培地中で培養することができる。第１および第２の培地はまた、１つまたは複数のＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ−２、および／またはＴＰＯを含むことができる。実質的な低酸素条件（例えば、２０％Ｏ２未満）は、造血分化または内皮分化をさらに促進することができる。
【００５６】
細胞を、機械的手段または酵素的手段（例えば、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用）によって実質的に個別化することができる。ＲＯＣＫインヒビター（例えば、Ｈ１１５２またはＹ−２７６３２）を、培地に含めることもできる。これらのアプローチを、例えば、ロボットによる自動化を使用して自動化することができると予測される。
【００５７】
多能性細胞の造血前駆細胞への分化のための特定の方法の使用が場合によっては好ましいかもしれないが、特定しないアプローチを種々の実施形態で使用することができる。ヒトＥＳＣから造血幹細胞を分化するための１つの特定しない方法は、ＣＤ３４＋への頑強な分化を誘導するフィーダー細胞（マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層またはマウス間質細胞株ＯＰ９など）上でＥＳＣを培養する工程を含む。簡潔に述べれば、ＥＳＣを成長因子の存在下でＭＥＦ上で成長させることができ、ＭＥＦは、細胞のための基質およびおそらくいくつかの栄養物を提供する。特定条件と対照的に、ＯＰ９細胞の使用は、一般に、ＣＤ３４＋分化を誘導するための追加の成長因子を必要としない。これらの過程が生じる機構は完全に理解されていない。このアプローチを、一定の成長因子および血清と組み合わせて使用することもできる（Ｗａｎｇ、２００７）。ＭＥＦも、ヒトＥＳＣの培養および維持のためにしばしば使用する。マウス胚線維芽細胞上での培養を使用する方法（以下のプロトコールなど）を、ＦＢＳの代わりにノックアウト（商標）血清代替物を含むように修正することができる。
【００５８】
以下の特定しないプロトコールを、多能性細胞の造血細胞への分化のために使用することができる。Ｈ１細胞を、ＭＥＦ上で日常的に維持し、次いで、αＭＥＭ＋２０％の特定のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ中のほとんどコンフルエントなＯＰ９間質細胞上に１×１０５細胞／ウェル（１ウェルは９．６ｃｍ２である）で継代することができる。２日目および４日目に、細胞に新鮮な培地を補給することができる。７日目に、細胞を、コラゲナーゼＩＶを使用して新鮮なＯＰ９細胞上に１：３に分割することができる。８日目および１０日目に、細胞に新鮮な培地を補給することができる。１１日目に、細胞を、コラゲナーゼＩＶを使用して新鮮なＯＰ９細胞上に１：１に分割し、その後にトリプシン／ＥＤＴＡを使用して単一の細胞を得て、培地をαＭＥＭ＋１０％特定ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯに交換し得る。１４〜１６日目に毎日さらなる１ｍｌのこの培地を添加することによって細胞に補給することができる。一定の実施形態では、ＯＰ９細胞に関与する分化方法を、Ｇａｕｒら、２００６（その全体が参考として具体的に援用される）に記載のように行うことができる。
【００５９】
ＩＶ．造血前駆細胞の骨髄細胞系列またはリンパ系細胞系列への分化
種々のアプローチを本発明と共に使用して、造血前駆幹細胞を細胞系列（赤血球、顆粒球、マクロファージ、および巨核球が含まれる）にさらに分化することができる。これらのアプローチは、赤血球分化培地、メチルセルロース、および巨核球分化培地の使用を含むことができる。一定の実施形態では、造血前駆細胞を、内皮細胞に分化するか、血管産生のために使用することもできる。
【００６０】
これらの細胞系列を、種々の医学的処置および適用で使用することができる。例えば、赤血球系列を、血液移植のための血液の産生で使用することができる。他の実施形態では、内皮細胞を使用して、局所虚血を処置するために使用することができる新規の血管を産生することができる。あるいは、一定の実施形態では、本発明にしたがって分化した造血細胞を、鎌状赤血球貧血などの疾患を処置するために投与することができる（Ｈａｎｎａら、２００７）。
【００６１】
赤血球、顆粒球、単球−マクロファージ、および巨核球骨髄細胞系列の多分化能前駆体および系列制限前駆体を定量するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系が開発されている。コロニー内の造血系列細胞の１つまたは複数の型の形態学的認識に基づいて、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）を分類および列挙することができる。コロニーの評価および列挙を、光学顕微鏡法または各コロニーの引き抜きおよびその後の細胞化学的方法および免疫細胞化学的方法を使用した細胞の染色によってｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。種々のゲル化剤（寒天、アガロース、メチルセルロース、コラーゲン、およびフィブリン塊が含まれる）が、ＣＦＣアッセイのために使用されている。
【００６２】
Ａ．赤血球分化
造血前駆細胞を、例えば、赤血球分化培地を使用して赤血球系細胞に分化することができる。赤血球分化培地は無血清培地または特定培地であり得る。この培地は、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、インスリン、デキサメタゾンまたはヒドロコルチゾン、およびトランスフェリンを含むことができる（Ｓｌｕｋｖｉｎら、２００７）。
【００６３】
以下のプロトコールを使用して、造血前駆細胞を赤血球系細胞に分化することができる。赤血球前駆体を、ＩＬ−３、ＦＬＴ−３、ＳＣＦ、およびＴＰＯから導いた造血前駆細胞をヒドロコルチゾン（１０−６Ｍ）、ホロトランスフェリン、およびエキサイトを含む培地中に入れることによって生成することができる。以下の実施例に示すように、１００万個のｈＥＳＣは、２００万個の赤血球前駆体を生成することができた。
【００６４】
Ｂ．メチルセルロース
メチルセルロースを使用して、造血前駆細胞からの赤血球、マクロファージおよび／または顆粒球の分化を誘導することができる。メチルセルロースは、比較的不活性なポリマーであり、良好な光学的透明度を有する安定なゲルを形成する。これは、一般に、化合物（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２−メルカプトエタノール、インスリン、トランスフェリン、および組換えサイトカインが含まれる）を補足した培養培地またはコロニー刺激因子の供給源としての馴化培地中にて最終濃度０．９〜１．２％で使用される。細胞のメチルセルロース分化を含む方法は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎら（２００１）に記載されている。
【００６５】
メチルセルロースベースの培地は、他の型の半固体マトリックスよりも赤血球系列細胞のより良好な成長が可能であり、したがって、同一培養物内での赤血球、顆粒球、単球、および多分化能ＣＦＣのアッセイが可能である。巨核球前駆体を、補足コラーゲンベース培地中で適切に培養し、免疫細胞化学染色を使用して具体的に同定する。
【００６６】
Ｃ．巨核球への分化
造血前駆細胞を、巨核球にさらに分化することができる。体内では、巨核球は、骨髄中で見出され、細胞上で形成される突起（すなわち、血小板前駆体）から血小板を産生する。ヒトの体内の巨核球は、骨髄細胞のわずかな割合しか示さないが、一定の疾患に応答してその数が１０倍まで増加し得る。体内では、巨核球は、典型的には、以下のように造血細胞から分化する：血球芽細胞（ｈｅｍａｃｙｔｏｃｌａｓｔ）が巨核芽球に分化し、次いで巨核芽球が前巨核球に分化し、次いで前巨核球が巨核球に分化する。
【００６７】
種々の培地および方法を使用して、多能性細胞または造血前駆細胞を巨核球に分化することができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／００７７６５４（放棄することなくその全体が参考として援用される）に記載の多能性細胞の巨核球への分化のための方法および培地を、本発明と共に使用することができる。
【００６８】
成長因子を、巨核球分化培地中に優先的に含める。例えば、巨核球分化培地は、ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または全てを含むことができる。一定の実施形態では、ＳＣＦのみを巨核球分化培地中に含めることができる。他の実施形態では、ＳＣＦを、ＩＬ−３および／またはＩＬ−６の一方または両方と組み合わせて使用することができる。種々の実施形態では、ＦＬＴ−３リガンドおよび／またはＴＰＯを、本発明の巨核球分化培地から排除することができる。
【００６９】
造血細胞を、以下のプロトコールによって巨核球に分化することができる。巨核球を、（１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３、２０％ＢＩＴ９５００）を含む培地中に造血前駆細胞を入れることによって産生することができる。以下の実施例に示すように、１００万個のｈＥＳＣは、６万個の巨核球を生成することができた。
【００７０】
巨核細胞分化培地を使用して、巨核細胞の生成を誘導することができる。巨核細胞生成のための種々の生成物およびアプローチは記載されてきており、本発明と共に使用することができる（ＷＯ２００６／０５０３３０号などに記載）。さらに、メガカルト（商標）はＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから利用可能であり、巨核球の産生／分化のために使用することができる。種々の実施形態では、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｉｔｉｎ）（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および／または幹細胞因子を、巨核細胞分化培地中に含めることができる。細胞からの巨核細胞の分化方法は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎら（２００１）に記載されている。
【００７１】
Ｄ．内皮細胞への分化
造血細胞を、内皮細胞に分化させることもできる。内皮細胞を、例えば、動物被験体またはヒト被験体への移植のための以下のプロトコールを使用して生成することができる。ヒトＥＳ細胞由来ＣＤ３１＋細胞を、ＥＧＭ（商標）−２培地（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または５０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＶＥＧＦおよび５ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＦＧＦ−２を含む分化培地中で７〜１０日間培養することができる。
【００７２】
内皮細胞のさらなる増殖および分化のために、単離したＣＤ３１＋細胞を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、アスコルビン酸、およびＦＢＳを含む内皮分化培地（Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ３２０２）または５０ｎｇ／ｍｌの血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、およびＦＧＦ−２（例えば、５０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２）を含む分化培地中で培養することができる。細胞を２〜３週間培養することができる。
【００７３】
以下のプロトコールを使用して、内皮分化を誘導することができる。内皮細胞の増殖および分化のために、単離したＣＤ３４＋細胞を、ゼラチンコーティングしたウェル（１．５〜２×１０４細胞／ｃｍ２）上のＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中に播種することができる。ゼラチンは、典型的には、Ｉ型コラーゲンコーティングウェルよりも安価だが、Ｉ型コラーゲンコーティングウェル（ＢＤ  ｌａｂｗａｒｅ）も使用することができる。ＣＤ３４＋細胞を、内皮成長因子、ｈＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍＬ）、およびＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍＬ）を含むｈＥＳＣ分化培地中で培養することができる。約７〜１０日間のインキュベーション後、付着細胞をトリプシン処理によって回収し、分析のための使用することができる。
【００７４】
内皮細胞を、マトリゲルプラグの画像化によって評価することができる。例えば、以下のプロトコールを使用して、細胞を画像化することができる：ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ由来の内皮細胞（ＥＣ）を、マトリゲル中に懸濁し（例えば、約１００万個／ｍｌ）、ＳＣＩＤベージュマウスに皮下注射することができる。次いで、ＦＩＴＣデキストランを、マトリゲルプラグ除去の約１４日前に静脈内注射することができる。プラグを採取し、蛍光画像化技術を使用した画像化に供し、血管新生の有無についてプラグを分析することができる。
【００７５】
Ｅ．肥満細胞生成
造血前駆細胞を、肥満細胞にさらに分化することができる。幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、および／またはＩＬ−１０への多能性細胞の曝露により、肥満細胞分化を促進することができる。
【００７６】
一定の実施形態では、以下のプロトコールを使用して、肥満細胞への分化を促進することができる。造血細胞を、（１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３、２０％ＢＩＴ９５００）を含む培地「ＭＫ３」中に造血前駆細胞を入れることによって最初に巨核球に分化することができる。肥満細胞を、その後に、ＭＫ３増殖およびその後の５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６含有培地中での前駆体の増殖によって産生することができる。
【００７７】
種々の実施形態では、臍帯血または末梢血の肥満細胞への分化方法を使用して、巨核球分化を促進することもできる。例えば、Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒら（２００１）は、種々の時点でＩＬ−６または（ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）と組み合わせたＳＣＦを使用した臍帯血前駆体の肥満細胞への分化方法を記載している。Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら（２００７）は、種々の期間添加したＳＣＦおよび他のサイトカイン（ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−９、およびＩＬ−４）を使用した細胞の培養による末梢血の肥満細胞への分化方法を提供する。これらの方法のいずれかを本発明と共に首尾よく使用することができると予測される。
【００７８】
Ｆ．マクロファージおよび樹状細胞
造血前駆細胞を、樹状細胞にさらに分化することができる。例えば、造血前駆細胞を、２００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦを含む培地中に８日間入れることができる。次いで、これらの細胞を、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中に細胞を２週間入れることによってマクロファージにさらに分化するか、（２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４）中に細胞を入れることによって樹状細胞にさらに分化することができる。以下の実施例に示すように、１００万個のｈＥＳＣは、約２０万個〜２５０万個の樹状細胞および約５０万個〜２５０万個のマクロファージを生成することができた。
【００７９】
Ｖ．多能性細胞の内皮細胞への分化
多能性細胞（ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）を、本発明の種々の実施形態で内皮細胞に分化することができる。内皮細胞が血管の一部を構成するので、これらの細胞は、例えば、血管または内皮細胞に及ぼす化合物の影響、薬理学、または毒性学を決定するための化合物のスクリーニングまたは試験に特に有用であり得る。内皮細胞を、１つまたは複数の以下の性質を使用した評価または同定のために使用することもできる：血管収縮または血管拡張、血圧の調節、血液凝固（例えば、血栓症または線維素溶解）、アテローム性動脈硬化症の促進または軽減、血管形成、炎症、および／または化合物のバリア機能（例えば、血液脳関門機能）または輸送に及ぼす影響。内皮細胞はまた、冠状動脈疾患、真性糖尿病、高血圧症、または高コレステロール血症を促進または軽減することができる化合物のスクリーニングまたは同定に有用であり得る。
【００８０】
一定の実施形態では、多能性細胞を、ＴＧＦ（例えば、約０．１ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）を補足した特定培地（例えば、ＴｅＳＲ培地）中で約１２〜３６時間または約２４時間前条件付けすることができる。次いで、細胞を、例えば、約３７℃で約５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を使用して、コンフルエンスで採取することができる。細胞を、ＥＢ基本培地（例えば、約２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または血清代替物−３（商標）、約１％ＮＥＡＡ、約１ｍＭ
Ｌ−グルタミン、約０．１ｍＭメルカプトエタノール、約０．７５％ＢＳＡ、約５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸、およびＲＯＣＫインヒビター（１μＭのＨ−１１５２など）を補足したＩＭＤＭを含む）中で回収することができる。次いで、細胞を、低付着培養表面またはプレート、バイオリアクター、またはスピナーフラスコなどにて培養することができる。
【００８１】
培養約１２〜２４時間後、細胞を回収し、ＢＭＰ−４（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＦＧＦ−２（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）を補足したＥＢ基本培地中に再懸濁することができる。培地を、約４日目で新鮮な培地と少なくとも部分的に置換することができる。ＥＢ分化の約７日目に、細胞を内皮分化培地（ＥＧＭ−２ＭＶ、Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ３２０２など）中に入れることができる。一定の実施形態では、内皮分化培地は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、アスコルビン酸、および／またはＦＢＳのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全てを含む。内皮細胞を、その後に（例えば、培養１０日目に）回収することができる。１つまたは複数の細胞マーカー（ＣＤ３１および／またはＣＤ１０５など）を使用して、例えば、ＦＡＣＳのＭＡＣＳを使用して、細胞集団から内皮細胞集団を実質的に精製することができる。以下の実施例に示すように、内皮細胞を、本発明の一定の実施形態で、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣから首尾よく生成することができる。内皮細胞を同定するか実質的に精製するために使用することができる細胞マーカーには、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）、ＣＤ１０６、ＣＤ１４６、およびＺ０１（密着結合タンパク質）が含まれる。
【００８２】
ＶＩ．低酸素状態および分化
一定の実施形態では、実質的に低酸素の条件を使用して、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。当業者に認識されるように、約２０．８％未満の大気中酸素含有量が低酸素と見なされるであろう。培養物中のヒト細胞は、周囲の空気と比較して低い酸素含有量の大気条件で成長することができる。この相対的低酸素状態を、培養培地に曝露した大気中酸素の減少によって達成することができる。胚細胞は、典型的には、一般に約１％と約６％との間の大気中酸素の、酸素低減条件および環境レベルの二酸化炭素にてｉｎ  ｖｉｖｏで発生する。理論に拘束されることを望まないが、低酸素条件は一定の胚発生条件の態様を模倣し得ると予測される。以下の実施例に示すように、低酸素条件を一定の実施形態で使用して、多能性細胞（ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣなど）のより分化された細胞型（造血前駆細胞など）へのさらなる分化を促進することができる。
【００８３】
以下の低酸素条件を使用して、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。一定の実施形態では、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％の大気中酸素含有量を使用して、造血前駆細胞への分化を促進することができる。一定の実施形態では、低酸素雰囲気は約５％酸素ガスを含む。
【００８４】
ＶＩＩ．特定培養培地
本明細書中に記載のように、１つまたは複数の特定培養培地を有利に使用して、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。特に、動物生成物（血清およびマウスフィーダー層など）の排除により、動物生成物への細胞の曝露に関連するリスクを軽減することができ、ヒト被験体により安全に投与することができる細胞の生成が可能である。幹細胞の種々の細胞型への分化のための伝統的な幹細胞培養の開発は血清生成物およびマウスフィーダー層に依存していたので、これらの伝統的な手順は、分化することができる規模を制限し、生物学的変動性および潜在的汚染を増加させ、他に有用であると証明され得る探索的治療におけるＥＳ細胞の使用を重度に阻止してきた。
【００８５】
特に、本発明者は、培地中に同時または逐次的に含まれる非常に制限された数のサイトカイン（例えば、任意選択的にＧＭＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＴＰＯ、および／またはＦＧＦ−２を組み合わせたＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＬＴ−３、およびＩＬ−３）を含む特定培養培地への多能性細胞の曝露を使用して造血前駆細胞への分化を促進することができることを同定した。驚くべきことに、細胞培養培地中のＢＭＰ−４のみおよびＶＥＧＦのみでは造血分化を促進しなかった一方で、細胞培養培地中にＢＭＰ４およびＶＥＧＦの両方を含めた場合に協力作用を示し、一定の実施形態では、前駆細胞の造血細胞への分化を促進するために必要であったことが認められた。ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを有する特定培地中にＦＧＦ−２を含めることによって多能性細胞の分化を促進することができ、例えば、以下の実験に例示するように、この培地中にＦＧＦ−２を含めることによって多能性細胞からの造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）の生成効率が少なくとも倍増した。
【００８６】
本発明者らは、一定の実施形態では、（ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および任意選択的にＦＧＦ−２）の第１の組み合わせへの前駆細胞の逐次的曝露およびその後の（ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）または（ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６）のいずれかへの細胞の曝露により、これらの全てのサイトカインを同一期間中に細胞に同時曝露した場合と比較して、分化（例えば、造血前駆細胞への分化）を驚異的にさらに促進することができることをさらに同定した。（ＢＭＰ４およびＶＥＧＦ）への曝露後且つ（ＦＬＴ−３およびＩＬ−３）への曝露前に細胞を再凝集させて、その後の成長因子への細胞の曝露を促進または改善することができる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、この再凝集工程によって細胞の造血前駆細胞への分化をさらに促進することができると予測される。
【００８７】
培養培地は、典型的には、さらなる栄養素、アミノ酸、抗生物質、および緩衝剤などを含む。一定の実施形態では、特定培養培地は、以下の表１に列挙した１つまたは複数の成分を含む。以下の培養培地は、約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３、約１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、および約１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦを含むことができる。培地は１つまたは複数の抗生物質を含むことができるが、抗生物質の非存在下で細胞に対して分化方法を実施することができる。以下の実施例に例示するように、ＩＭＤＭ培養培地中に血清代替物３を含めることにより、多能性細胞の分化および増加をさらに促進することができる。
【００８８】
【表２】
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Ａ．成長因子
種々の成長因子を使用して、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。一定の実施形態では、本発明の特定培養培地は、１つ、２つ、またはそれを超える成長因子（例えば、（ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ）または（ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）など）を含むことができる。
【００８９】
本発明の特定培養培地中に含むことができる成長因子には、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、インスリン関連成長因子１（ＩＧＦ１）、インスリン関連成長因子２（ＩＧＦ２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定培養培地は、１つ、２つ、３つ、またはそれを超えるこれらの因子を含むことができる。例えば、細胞の増殖を増加させるか分化状態を調整するために、他の成長因子を特定培地中に含めることができる。一定の実施形態では、特定培地は、少なくとも（ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ、および任意選択的にＦＧＦ−２）または（ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、およびＧＭＣＳＦ）を含むことができる。これらの実施形態では、必ずではないが、１つまたは複数のさらなる成長因子を特定培地中に含めることができる。例えば、分化過程の第２の工程で約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯまたはＳＣＦを使用してＧＭＣＳＦを置換することができる。種々の量のこれらの因子を使用して、細胞応答を刺激することができる（例えば、Ｙａｍａｍｕｒａら、２００８；Ｆａｄｉｌａｈら、２００７；Ｂａｓｈｅｙら、２００７に記載の量）。例えば、細胞の増殖または細胞分化を促進するために、約１〜５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜２５ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＰＯを含めることができる。種々の実施形態では、約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、約１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、または約２５ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦを特定培地中に含めることができる。種々の実施形態では、約５〜５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜２５ｎｇ／ｍＬ、または約１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−６を特定培地中に含めることができる。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、造血前駆細胞からの顆粒球の生成のために使用することができる。
【００９０】
１．ＢＭＰ−４
骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）は、骨形態形成タンパク質および腹側中胚葉誘導因子群のメンバーである。ＢＭＰは成人ヒト骨髄（ＢＭ）中に発現し、骨のリモデリングおよび成長に重要である。一定の実施形態では、ＢＭＰ４の含有は培養の最初の２〜３日間のみ必要であり、その後に分化に有害な影響を及ぼすことなく系から除去することができる。
【００９１】
ＢＭＰ−４は、造血前駆細胞の増殖および分化の潜在能力の調整に重要である（Ｂｈａｒｄｗａｊら、２００１；Ｂｈａｔｉａら、１９９９；Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ２００３）。さらに、ＢＭＰ−４は、ヒト胎児、新生児、および成人の造血前駆細胞における初期造血細胞発生を調整することができる（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｚｏｎ，２０００；Ｈｕｂｅｒら、１９９８；Ｍａｒｓｈａｌｌら、２０００）。例えば、ＢＭＰ−４は成人および新生児起源の高度に精製された原始ヒト造血細胞の増殖および分化を調節することができ（Ｂｈａｔｉａら、１９９９）、ＢＭＰ−４はヒト胚性幹細胞の造血分化を促進することができる（Ｃｈａｄｗｉｃｋ，２００３）。
【００９２】
約５〜１００ｎｇ／ｍＬ、約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、約２０〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１０〜３０ｎｇ／ｍＬ、約１５〜３０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜３０ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＢＭＰ−４を特定培養培地中に含めることができる。一定の実施形態では、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ−４を特定培養培地中に含める。
【００９３】
２．ＶＥＧＦ
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、胚循環器系の形成および血管形成に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。ＶＥＧＦは、種々の細胞型（血管内皮および他の細胞型（例えば、ニューロン、癌細胞、腎臓上皮細胞）が含まれる）に影響を及ぼし得る。ｉｎ
ｖｉｔｒｏでは、ＶＥＧＦは、内皮細胞有糸分裂誘発および細胞遊走を刺激することができる。ＶＥＧＦ機能はまた、種々の病状（癌、糖尿病、自己免疫疾患、および眼血管疾患が含まれる）で重要であることが示されている。
【００９４】
約１０〜１００ｎｇ／ｍＬ、約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、約１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、約１５〜３０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜３０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜５０ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＶＥＧＦを、特定培養培地中に含めることができる。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＶＥＧＦを特定培養培地中に含める。
【００９５】
３．ＦＧＦ−２
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２ともいわれる）は、様々な生物学的過程（肢および神経系の発生、創傷治癒、および腫瘍成長が含まれる）に関与している成長因子である。ｂＦＧＦはヒト胚性幹細胞のフィーダー非依存性成長を支持するために使用されていたが（Ｌｕｄｗｉｇら、（２００６）、以前の研究ではｂＦＧＦは造血細胞の発生または生存に影響を及ぼす可能性は低いと示されていた（Ｒａｔａｊｃｚａｋら、１９９６．）。一定の実施形態では、ｂＦＧＦは分化を誘導するために必要ではない。したがって、種々の実施形態では、ｂＦＧＦは、本発明の培地中に含めても排除してもよい。
【００９６】
約５〜約１００ｎｇ／ｍＬ、５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約２５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のｂＦＧＦを特定培養培地中に含めることができる。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または約７５ｎｇ／ｍＬの濃度のｂＦＧＦを特定培養培地中に含める。これらの濃度は、未分化状態または実質的に未分化状態の多能性細胞の維持のために使用される培地に特に有用であり得る。種々の実施形態では、ＦＧ２（例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ）を、細胞の多能性の維持のために使用することができる。造血分化を促進するために、細胞を約５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ２に曝露することができる。
【００９７】
種々の実施形態では、より低い濃度のｂＦＧＦを造血分化前の「前条件付け」培養段階で特定培地中に含めることができることが本発明者によって発見された。例えば、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ未満、約４０ｎｇ／ｍＬ未満、約３０ｎｇ／ｍＬ未満、または約１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを、細胞の造血前駆細胞への分化前に多能性細胞の前条件付け培養中の特定培地中に含めることができる。一定の実施形態では、ｂＦＧＦ（例えば、約２５〜７５ｎｇ／ｍＬまたは約５０ｎｇ／ｍｌ）またはＦＧＦ−２および０．１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βを補足した成長因子を含まないＴｅＳＲ培地を、造血分化前の多能性細胞の前条件付け培養中で使用することができる。一定の実施形態では、この前条件付け工程は、その後の造血分化を促進するために不可欠であり得る。
【００９８】
多能性細胞を前条件付けした後（例えば、ＴＧＦ−βおよびＦＧＦ−２を補足した成長因子を含まないＴｅＳＲ培地中で約１日間）、細胞を、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＦＧＦ−２（例えば、約２５〜５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＥＢ分化培地中に入れることができる。以下の実施例に示すように、ＦＧＦ−２を含めることにより、多能性細胞（ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣなど）の造血前駆細胞への分化効率が少なくとも倍増し得る。
【００９９】
一定の実施形態では、他の線維芽細胞成長因子（酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、またはＦＧＦ１８など）を、例えば、上記の濃度でｂＦＧＦの代わりに使用することができるか、ｂＦＧＦと共に含めることができると想定される。あるいは、ＦＧＦ−２模倣化合物を、ＦＧＦ−２の代わりに使用して実質的または本質的に同一の効果を得ることができる。ＦＧＦ−２模倣物には、ＦＧＦ−２を模倣するペプチド、抗体、および小分子が含まれる。例えば、合成ペプチドＦ２Ａ４−Ｋ−ＮＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＦＧＦ−２の影響を模倣し（Ｌｉｎら、２００６）、本発明の種々の実施形態においてＦＧＦ−２の代わりに使用することができる。
【０１００】
ＦＧループ（ＦＧＬ）ペプチドは、本発明の一定の実施形態で使用することができるＦＧＦ−２模倣物の別の例である。ＦＧＬは、ＦＧＦＲ１へのＮＣＡＭの結合部位の一部を示すＮＣＡＭの第２のＦ３モジュール中の１５アミノ酸配列である。ＦＧＬは、ＦＧＦＲ１に結合して活性化し、神経突起の伸長を刺激することが示されている（Ｋｉｓｅｌｙｏｖら、２００３）。
【０１０１】
ＢｉｏＳＥＴ  Ｆ２Ａペプチドを、ＦＧＦ−２の代わりに使用することもできる。ＢｉｏＳＥＴ  Ｆ２Ａペプチドは、天然ヒトＦＧＦ−２成長因子の合成模倣物である。ＢｉｏＳＥＴ  Ｆ２ＡペプチドおよびＦ２Ａ４−ＫＮＳペプチドは、ＦＹＩ  Ｔｏｒｎｉｅｒ，Ｉｎｃ．またはＢｉｏＳｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（「ＢｉｏＳＥＴ」）から利用可能である。ＦＧＦ−２模倣化合物の組み合わせを本発明の種々の実施形態でＦＧＦ−２の代わりに使用することもできることが想定される。
【０１０２】
４．ＩＬ−３
インターロイキン−３（ＩＬ−３）は、多分化能造血細胞の生存、増殖、および分化に関与する造血成長因子である。５つの哺乳動物種（ヒトが含まれる）では、ＩＬ−３をコードする遺伝子が単離されて、発現され、成熟組換えタンパク質を得ている。ヒトＩＬ−３遺伝子は、２つの保存システイン残基および２つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を有する１３３アミノ酸のタンパク質をコードする（Ｗａｇｅｍａｋｅｒら、１９９０）。
【０１０３】
一定の実施形態では、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＩＬ−３を、本発明の培養培地中に含める。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−３を特定培養培地中に含める。以下の実施例に示すように、Ｆｌｔ３リガンドおよびＩＬ−３は、多能性細胞の造血前駆細胞への分化に対して相乗作用を発揮し得る。一定の実施形態では、ＩＬ−３を、多能性細胞培養において培地中に最初のおよそ１〜３週間含めるか、多能性細胞の分化を促進するために培地に培養約５日目から約７日目まで含め、その後に分化にほとんどまたは本質的に全く有害作用を及ぼすことなく系から除去することができる。
【０１０４】
５．ＦＬＴ３リガンド
Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬＴ−３リガンドとも呼ばれる）は、ＦＬＴ３の内因性リガンドである。ＦＬＴ３は、未熟造血前駆細胞によって発現される受容体チロシンキナーゼである。ＦＬＴ３のリガンドは、膜貫通タンパク質または可溶性タンパク質であり、種々の細胞（造血細胞および骨髄間質細胞が含まれる）によって発現される。他の成長因子と組み合わせて、Ｆｌｔ３リガンドは幹細胞、骨髄前駆細胞およびリンパ前駆細胞、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞の増殖および発生を刺激することができる。受容体の活性化により、造血細胞の増殖、生存、および他の過程を調節する異なるシグナル伝達経路に関与することが公知の種々の重要なアダプタータンパク質のチロシンリン酸化が導かれる。ＦＬＴ３およびＦＬＴ３に影響を及ぼす変異はまた、病理学的疾患（白血病の予後および治療など）で重要である（Ｄｒｅｘｌｅｒら、２００４）。
【０１０５】
一定の実施形態では、５〜約１００ｎｇ／ｍＬ、５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０〜約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５〜約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜約３０ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＦｌｔ３リガンドを、本発明の培養培地に含める。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦｌｔ３リガンドを特定培養培地中に含める。一定の実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドを、多能性細胞培養において培地中に最初のおよそ１〜３週間含めるか、多能性細胞の分化を促進するために培地中に培養約５日目から約７日目まで含め、その後に分化にほとんどまたは本質的に全く有害作用を及ぼすことなく系から除去することができる。
【０１０６】
６．顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭＣＳＦとも省略される）は、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、内皮細胞、および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。ＧＭＣＳＦは白血球成長因子として機能することができるサイトカインであり、ＧＭＣＳＦは、幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生することができる。単球は循環血中に存在し、マクロファージに成熟することができる。したがって、ＧＭＣＳＦは、少数のマクロファージの活性化によってその数を迅速に増加させることができる免疫／炎症カスケード（感染との戦いに不可欠な過程）で役割を果たし得る。ＧＭＣＳＦの活性形態は、典型的には、ホモ二量体としてｉｎ  ｖｉｖｏで細胞外に見出される。ＧＭＣＳＦはまた、酵母細胞中で発現する場合、モルグラモスチムまたはサルグラモスチム（ロイカイン）と呼ばれる。一定の実施形態では、組換え産生した成長因子を使用して多能性細胞の造血分化を促進することができる。
【０１０７】
一定の実施形態では、約２．５〜約１００ｎｇ／ｍＬ、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＧＭＣＳＦを、本発明の培養培地中に含める。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、または約３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＭＣＳＦを特定培養培地中に含める。一定の実施形態では、ＧＭＣＳＦリガンドを、多能性細胞培養において培地中に最初のおよそ１〜３週間含めるか、多能性細胞の分化を促進するために培地中に培養約５日目から約７日目まで含め、その後に分化にほとんどまたは本質的に全く有害作用を及ぼすことなく系から除去することができる。
【０１０８】
７．幹細胞因子
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）に結合するサイトカインである。ＳＣＦは、「ＫＩＴリガンド」、「ｃ−ｋｉｔリガンド」、または「ＳＬ因子」としても公知である。ＳＣＦは以下の２つの形態で存在する：細胞表面結合ＳＣＦおよび可溶性（または遊離）ＳＣＦ。可溶性ＳＣＦは、典型的には、メタロプロテアーゼによる表面結合ＳＣＦの切断によってｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。ＳＣＦは、造血幹細胞および他の造血前駆細胞の生存、増殖、および分化に重要であり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＳＣＦは、ＢＦＵ−Ｅ（赤芽球バースト形成単位）細胞（赤血球系における最初期の赤血球前駆体である）をＣＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー形成単位）に変化させることができる。
【０１０９】
一定の実施形態では、約５〜約１００ｎｇ／ｍＬ、５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０〜約３０ｎｇ／ｍＬ、約１５〜約３０ｎｇ／ｍＬ、約２０〜約３０ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＳＣＦを、本発明の培養培地中に含める。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＣＦを特定培養培地中に含める。
【０１１０】
８．ＩＬ−６
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は炎症促進性サイトカインである。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＩＬ−６はＴ細胞およびマクロファージによって分泌され、外傷または他の組織損傷に対する免疫応答を刺激して、炎症を引き起こす。ＩＬ−６は一定の細菌に対する応答でも役割を果たすことができ、骨芽細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−６を分泌して破骨細胞形成を刺激する。ヒトでは、多数の血管の中膜中の平滑筋細胞は、炎症促進性サイトカインとしてＩＬ−６を産生することができ、ＩＬ−６は発熱の重要なｉｎ  ｖｉｖｏメディエーターである。
【０１１１】
一定の実施形態では、約２．５〜約１００ｎｇ／ｍＬ、２．５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約５〜約２５ｎｇ／ｍＬ、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＩＬ−６を、本発明の培養培地中に含める。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、または約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−６を特定培養培地中に含める。
【０１１２】
９．ＴＰＯ
トロンボポエチン（すなわち、ＴＰＯ）は、肝臓および腎臓によってｉｎ  ｖｉｖｏで主に産生され、骨髄中での血小板のｉｎ  ｖｉｖｏ生成に関与する糖タンパク質ホルモンである。一定の実施形態では、約２．５〜約１００ｎｇ／ｍＬ、５〜約７５ｎｇ／ｍＬ、約１０〜約５０ｎｇ／ｍＬ、約１５〜約３５ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍｌ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度のＴＰＯを、本発明の培養培地中に含める。一定の実施形態では、約２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＰＯを特定培養培地中に含める。
【０１１３】
Ｂ．マトリックス成分
培養培地は、１つまたは複数のマトリックス成分（フィブロネクチンまたはＲＧＤペプチドなど）を含むことができる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、マトリックス成分により、胚性幹細胞の成長のための固体支持体を得ることができる。一定の実施形態では、マトリックス成分を、培養表面に適用し、細胞の培地への播種前に培養培地と接触させることができる。例えば、細胞を、フィブロネクチンまたはマトリゲル（商標）でコーティングしたプレート上の特定培地（例えば、ＴｅＳＲ培地）中で培養し、その後に細胞を凝集塊に機械的に分離するかまたは細胞を個別化し、造血前駆細胞への分化を誘導することができる。
【０１１４】
種々のマトリックス成分（コラーゲン（例えば、ＩＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、マトリゲル（商標）、ゼラチン、ポリリジン、トロンボスポンジン（例えば、ＴＳＰ−１、−２、−３、−４、および／または−５）、および／またはプロネクチン−Ｆ（商標）が含まれる）を使用して、多能性細胞を培養することができる。一定の実施形態では、ＴｅＳＲを使用して予め培養した細胞と共にマトリゲル（商標）、ＩＶ型コラーゲン、またはラミニンのみを使用することは、細胞生存度への可能性のある有害作用のために回避され得る。それにもかかわらず、これらの組成物を他のマトリックス成分と組み合わせて有利に使用することができる。これらのマトリックス成分の組み合わせは、細胞成長および細胞生存度の促進のためのさらなる利点を得ることができる。一定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、またはそれを超える上記マトリックス成分を使用して、例えば、造血分化前に細胞を培養することができる。
【０１１５】
１．ＲＧＤペプチド
ＲＧＤペプチドを、特定細胞培養培地中でマトリックス成分として使用することができる。ＲＧＤペプチドは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含む接着タンパク質であり、一定のＲＧＤペプチドは細胞の接着、移動、および成長で重要な役割を果たし得る。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ＲＧＤペプチドにより、胚性幹細胞の分化および成長を可能にするためのフィブロネクチンに類似の胚性幹細胞の物理的基質を得ることができる。一定の実施形態では、合成ＲＧＤペプチドを本発明と共に使用することができる。
【０１１６】
例えば、約０．０５〜０．２ｍｇ／ｍＬまたは約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＧＤペプチドを特定培養培地中に含めることができる。一定の実施形態では、プロネクチンＦを使用して、細胞培養のために表面をコーティングすることができる。プロネクチンＦ（ＰｎＦ）は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）の１３の部位を典型的に含む市販のＲＧＤペプチドである。
【０１１７】
Ｃ．ＲＯＣＫインヒビターおよびＰＫＣインヒビター
本発明のなおさらなる態様では、さらなる培地成分（細胞の解離後（例えば、細胞集団の分割中またはＥＢ形成前）のＥＳ細胞のアポトーシスを軽減するか、生存を促進する分子など）をＥＳ細胞成長培地中に含めることができる。特定培養培地を使用してＥＳ細胞を播種、培養、維持、または分化することができ、この培地は、Ｒｈｏ非依存性キナーゼ（ＲＯＣＫ）のインヒビターおよび／またはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のインヒビターを含むことができる。一定の実施形態では、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはＰＫＣインヒビターを使用して、個別化後の多能性細胞の生存および分化効率を強化することができる。一定の実施形態では、ＲＯＣＫインヒビターおよび／またはＰＫＣインヒビターを、ＴｅＳＲまたはｍＴｅＳＲ培地およびマトリックス成分を含む播種培地中に含めることができる。
【０１１８】
一定の実施形態では、特定培養培地は、１つまたは複数のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター（Ｙ−２７６３２またはその誘導体など）を含むことができる。さらに、いくつかの態様では、特定培地は、ＨＡ−１００：
【０１１９】
【化１】
2015192681.tif 000005
またはその誘導体を含むことができる。
【０１２０】
ＨＡ−１００またはＹ−２７６３２は、ＥＳ細胞成長培地中に、例えば、約１〜１５μＭ、５〜１５μＭ、１〜３０μＭ、５〜３０μＭ、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０μＭ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度で存在し得る。一定の実施形態では、ＨＡ−１００またはＹ−２７６３２は、約１０〜２０μＭでＥＳ細胞成長培地中に存在する。
【０１２１】
本発明のＥＳ細胞成長培地中に含めることができる他のＲＯＣＫインヒビターには、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン）が含まれる。Ｈ−１１５２は、ＨＡ−１００のおよそ１０倍の効力を示す。したがって、Ｈ−１１５２は、ＥＳ細胞成長培地中に、例えば、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜５μＭ、約１〜３μＭ、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５μＭ、またはこれらから導き出される任意の範囲の濃度で存在し得る。一定の実施形態では、ＨＡ−１００は、約１μＭでＥＳ細胞成長培地中に存在する。Ｈ−１１５２は、９６ウェルプレート中での個別化ヒトＥＳ細胞の非常に効率的な播種を可能にする（ＨＡ−１００に類似するが、濃度が１／１０）。個別化ＨＥＳ細胞（そうでなければ、細胞凝集塊において継代される）は、ウェルあたりのより均一な細胞密度を可能にし、このことは、細胞ベースの小分子スクリーニングにとって厳格な必須条件である。したがって、Ｈ−１１５２を、本発明の自動化細胞培養を含むＥＳ細胞ベースの小分子スクリーニングのためのプロトコールで使用することができる。Ｈ−１１５２は、例えば、Ｉｋｅｎｏｙａら（２００２）およびＳａｓａｋｉら（２００２）（本明細書中で参考として援用される）に以前に記載されている。
【０１２２】
【化２】
2015192681.tif 000006
ＥＳ細胞成長培地中に含めることができる他のＲＯＣＫインヒビターには、Ｙ−２７６３２、Ｎ−（４−ピリジル）−Ｎ′−（２，４，６−トリクロロフェニル）尿素、３−（４−ピリジル）−１Ｈ−インドール、グリシル−Ｈ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジン）、および／またはＨＡ１１００（ヒドロキシファスジル）が含まれる。Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されており、以前に記載されている（例えば、Ｍａｅｋａｗａら、１９９９；Ｄａｖｉｅｓら、２０００を参照のこと）。
【０１２３】
【化３】
2015192681.tif 000007
細胞生存を促進するために使用することができる例示的なＲＯＣＫインヒビターには、ＨＡ１００、Ｈ１１５２、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（ピリジン−４−イルアミノカルボニル）シクロヘキサンジヒドロクロリド一水和物（例えば、ＷＯ０００７８３５１、ＷＯ０００５７９１３）、イミダゾピリジン誘導体（例えば、ＵＳ７３４８３３９）、置換ピリミジンおよびピリジン誘導体（例えば、ＵＳ６９４３１７２）、および置換イソキノリン−スルホニル化合物（例えば、ＥＰ００１８７３７１）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
ＰＫＣインヒビターをＲＯＣＫインヒビターと組み合わせるかその代替物として使用することができることが予測される。例えば、多能性細胞の解離または個別化後且つ造血前駆細胞への分化前に、例えば、ＰＫＣインヒビターを使用して、細胞生存を促進することができる。使用することができるＰＫＣインヒビターには、例えば、Ｖ５ペプチド（例えば、ＵＳ７４５９４２４）、ポリミキシンＢ、カルホスチンＣ、パルミトイル−ＤＬ−カルニチン、ステアロイルカルニチン、ヘキサデシルホスホコリン、スタウロスポリンおよびその誘導体、サンギバマイシン；サフィンゴール、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン；塩化ケレリトリン、メリチン；塩化デカリニウム；エラグ酸、ＨＢＤＤＥ、１−Ｏ−ヘキサデシル−２−Ｏ−メチル−ラック−グリセロール、ヒペリシン、Ｋ−２５２、ＮＧＩＣ−Ｊ、フロレチン、ピセアタンノール、クエン酸タモキシフェン、置換ピペラジンおよびチアジン（例えば、ＵＳ６８１５４５０）が含まれる。
【０１２５】
Ｄ．他の成分
特定培養培地はまた、さらなる成分（栄養素、アミノ酸、抗生物質、緩衝剤など）を含むことができる。一定の実施形態では、本発明の特定培養培地は、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、およびモノチオグリセロールを含むことができる。
【０１２６】
例えば、約１０％〜約３０％の量または約２０％の量のＢＩＴ  ９５００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を本発明の特定培養培地中に含めることもできる。ＢＩＴ  ９５００は、ＩｓｃｏｖｅのＭＤＭ中にウシ血清アルブミン、インスリン、およびトランスフェリン（ＢＩＴ）の予め試験したバッチを含む。ＢＩＴ  ９５００は、５０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＮａＨＣＯ３で緩衝化）、５０μｇ／ｍＬｒｈインスリン、１ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン（鉄飽和）を含む。一定の実施形態では、特定培地を必要としない実施形態においてＫＯＳＲをＢＩＴ  ９５００の代わりに使用することができる。ＫＯＳＲは市販の非特定培地であり（例えば、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１０８２８）、以前にＷＯ９８／３０６７９に記載されている。
【０１２７】
上記のように、ＢＩＴの使用をＨＩＴに置換することができる。ＨＩＴは、成分（血清アルブミンなど）がヒト成分（例えば、ヒト血清アルブミン）であることを除いて、ＢＩＴについて記載の組成物を含む。例えば、ＨＩＴの使用は、潜在的な感染リスクなどが特に懸念される実施形態で好ましいかもしれない。
【０１２８】
血清代替物３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、ＢＩＴ９５００の代わりに使用することもできる。血清代替物３は、ヒトタンパク質（すなわち、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒト組換えインスリン）のみを含む。血清代替物３は、成長因子、ステロイドホルモン、糖質コルチコイド、細胞接着因子、検出可能なＩｇ、または分裂促進因子を含まない。以下の実施例に示すように、血清代替物３を含めることにより、一定の実施形態では、分化をさらに促進することができる。
【０１２９】
種々の実施形態では、特定培養培地は、１つまたは複数のビタミン、ミネラル、塩、脂質、アミノ酸、または他の成分を含むことができる。例えば、本発明の特定培地は、ＴｅＳＲ培地中に存在する１つまたは複数の成分（例えば、ＴｅＳＲ中に含まれる濃度に同一または匹敵する濃度）を含むことができる。
【０１３０】
ＶＩＩＩ．細胞の分離
胚性幹細胞からの造血（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ４３＋）前駆細胞または内皮細胞（例えば、ＣＤ３１＋）の調製後、細胞集団から、さらにまたは実質的に分化された細胞（例えば、造血前駆細胞、内皮細胞など）の１つまたは複数の亜集団を実質的に精製または分離することが望ましいかもしれない。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳなど）または磁性活性化細胞分取を使用した細胞の分離方法を使用して、不均一な細胞集団から造血細胞を分離することができる。
【０１３１】
Ａ．磁性活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）
ＣＤ３４＋、ＣＤ４３＋、ＣＤ３１＋、および／またはＣＤ４５＋細胞を、磁性活性化細胞分取器（ＭＡＣＳ）を使用して分化したｈＥＳＣから単離することができる。ＭＡＣＳは、典型的には、カラムにわたって、細胞を分離するための磁性ビーズと組み合わせて抗体（抗ＣＤ３４抗体など）を使用する。ＭＡＣＳは、一定の実施形態では、ＦＡＣＳと比較して細胞に対して穏やかであり、細胞生存度および完全性に好ましい影響を及ぼし得る。これはおそらくＦＡＣＳに関連する細胞のレーザー照射に起因する。
【０１３２】
種々のＭＡＣＳ製品は市販されている（ＭＡＣＳ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（商標）カラムまたはＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）（製造者の説明書にしたがって使用することができる）が含まれる）。ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ（ＥＤＴＡなし）を、細胞単離のための緩衝液として使用することができる。いくつかの実験では、死細胞除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ３４＋細胞の単離前に死細胞を除去することができる。必要に応じて、ＭＡＣＳカラムを繰り返し使用することができる。
【０１３３】
Ｂ．ＦＡＣＳ
蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、ＣＤ３４＋細胞を分離することもできる。ＦＡＣＳは、例えば、細胞を分離するための蛍光タグを含む抗ＣＤ３４抗体への結合に起因する細胞によって示される蛍光の程度を使用する。このような方法で、ＦＡＣＳを使用して不均一な細胞集団から造血ＣＤ３４＋細胞を分離することができる。
【０１３４】
例えば、以下のプロトコールを使用してＦＡＣＳを実施し、造血細胞を定量することができる。１％ＦＢＳまたは０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で細胞を調製し、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の組み合わせ（ＣＤ３１−ＰＥ（クローンＷＭ−５９）、ＣＤ３４−ＡＰＣ（クローン５８１、８Ｇ１２）、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（クローンＨＩ３０）（全てＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）、およびＫＤＲ−ＰＥ（クローン８９１０６）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）など）を用いて４℃で１５〜３０分間標識することができる。５０倍希釈の特異的抗体および２００倍希釈のＩｇＧコントロールを使用することができる。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｓｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって分析することができる。
【０１３５】
ＩＸ．バイオリアクターおよびロボット自動化
幹細胞の培養および／または胚性幹細胞からの造血前駆細胞の分化のための１つまたは複数の工程を自動化することができる。ロボット自動化または他の自動化を使用した過程の自動化により、細胞をより効率的且つ経済的に産生、培養、および分化する方法を得ることが可能である。例えば、ロボット自動化を、ヒト胚性幹細胞の培養、継代、培地の添加、分化培地の添加、分化培地での培養、および細胞型の分離（例えば、磁性分離またはＦＡＣＳの使用）の１つまたは複数と併せて使用することができる。
【０１３６】
バイオリアクターを本発明と併せて使用して、本発明にしたがって細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血細胞など）を培養、維持、および／または分化することもできる。バイオリアクターにより、大量の細胞を産生するための過程の「スケールアップ」が可能という利点が得られる。種々のバイオリアクター（バッチバイオリアクター、フェドバッチバイオリアクター、連続バイオリアクター（例えば、連続撹拌タンクリアクターモデル）、および／またはケモスタットが含まれる）を本発明と共に使用することができる。
【０１３７】
例えば、スピナーフラスコを使用して、多能性細胞を維持および／または分化するための方法をスケールアップして、多数の細胞を生成することができる。一定の実施形態では、以下のプロトコールを使用してスピナーフラスコ中でのＥＢ形成を促進することができる：未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させ、例えば、約３７℃で約５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を使用してコンフルエンスで採取することができる。細胞を、約２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または血清代替物−３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、約１％ＮＥＡＡ、約１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および約０．１ｍＭメルカプトエタノール、約０．７５％ＢＳＡ、約５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸、および約１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（例えば、Ｈ−１１５２）を補足したＩＭＤＭを含むＥＢ基本培地中で採取することができる。次いで、細胞を、約５０〜２００万個／ｍｌの密度でスピナーフラスコ（例えば、１２５ｍｌコーニング）中に入れることができる。スピナーを３０〜４０ｒｐｍで一晩に設定してＥＢ形成を促進することができる。あるいは、細胞を、低付着プレート中に静止条件下で２４時間置くことができる。一般に、使用した特定のスピナーフラスコまたはバイオリアクターに応じて細胞密度および／またはスピナーフラスコの移動速度を変化させることができると認識される。培養約１２〜２４時間後、細胞を、例えば、約６０ＲＰＭの速度で回転しているスピナーフラスコ中の磁性撹拌プラットフォーム上のサイトカインを含むがＲＯＣＫインヒビターを含まないＥＢ分化培地中に入れることができる。スピナーフラスコのサイドキャップを緩めて気体を移動させることができる。細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、約５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および約２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を補足したＥＢ基本培地中に入れることができる。分化約４日目に、懸濁したＥＢ凝集体がフラスコの底部に１５〜２０分間沈殿することができるようにスピナーフラスコを静止させたままにすることによって細胞に補給することができる。次いで、消費した培地を吸引することができる（例えば、１２５ｍｌスピナー中に約２０ｍＬが残存する）。次いで、細胞を穏やかに旋回させ、約５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、約５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および約２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含む新鮮な培地を細胞に添加することができる。実質的により高いか低い回転速度を使用することができると予測されるにもかかわらず、スピナーフラスコを、全造血分化過程を通して約４０〜６０ｒｐｍの速度に設定することができる。分化約５〜６日目に、消費した培地を上記のように吸引し、細胞を、例えば、（１）約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、約１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−３、および約１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ、または（２）約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、約２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、および約１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６のいずれかを補足したＥＢ基本培地中に入れることができる。消費した培地を、約８日目および１０日目に上記のように吸引することができる。ＥＢ培養物を、分化約１２日目に採取することができる。細胞を、表面マーカー（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ４３＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ３１＋）の表現型発現について染色して、集団の造血前駆体含有量を定量することができる。以下の実施例に示すように、これらのアプローチを首尾よく使用して種々の細胞系列（例えば、赤血球、巨核球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、顆粒球）を生成することができ、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを使用して類似の結果を得ることができる。
【０１３８】
本発明との使用を特に想定したロボット自動化は、例えば、Ｔｅｃａｎ（ＣＡ，ＵＳＡ）から得ることができる。ロボティクスは、液体操作ツール（サンプル間の繰越し汚染を最小にするためのキャップ貫通プローブおよび使い捨てチップなど）を含むことができる。種々の実施形態では、ロボティクスを、１つまたは複数の細胞培養用のバイオリアクターと併せて（例えば、ｈＥＳＣの維持または成長、ｈＥＳＣの造血細胞への分化、または造血細胞の次の系列（赤血球など）への分化の間に）使用することができる。以下の実施例に示すように、造血前駆細胞の維持および生成のための条件を、Ｔｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙ（商標）システム（産業的に関連するロボットプラットフォーム）を使用して少なくとも部分的または完全に自動化することができる。Ｔｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙ（商標）は、Ｔｅｃａｎ液体操作ロボット（Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００）、自動化インキュベーター（Ｓｔｏｒｅｘ５００）（５００  Ｒｏｂｏｆｌａｓｋｓ（商標）用の容量）、培地保存用冷却装置、Ｃｅｄｅｘ細胞カウンター、懸濁細胞の増殖および播種用のスピナーフラスコ、ならびにプレートおよび８チャネル固定チップピペットを操作するためのＲＯＭＡロボットアームを備えている。ＥＢ分化プロトコールの一部、本質的に全て、または全てを自動化することができる。例えば、分化１２日目に、細胞をＴｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙシステムによって採取し、マーカーの細胞表面染色のために手作業で洗浄することができる。染色後、細胞を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターに接続したＨｙｐｅｒｃｙｔを使用して分析することができる。この過程を、造血前駆体集団の高処理スクリーニングのために使用することができる。一定の実施形態では、未分化のｈＥＳＣまたはｉＰＳＣを、上記の方法によって、例えば、マトリゲル（商標）コーティングしたロボフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用してロボット上で培養することができる。ＥＢの維持、播種、補給、および／または採取を、例えば、Ｔｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙ（商標）システムを使用して、部分的または完全に自動化することができる。このロボットはスピナーフラスコを含める収容力を有し、またはバイオリアクターを使用して多数の細胞を生成することができる。
【０１３９】
一定の実施形態では、本発明の方法を小型化または「スケールダウン」することが有用であり得る。これらのアプローチは、例えば、方法が、例えば、細胞の特定の系列への脱分化または分化を促進することができる化合物の高処理スクリーニングを含む場合、特に有用であり得る。高処理スクリーニングを使用して、候補物質の１つまたは複数の性質（例えば、毒性、分化を促進または軽減する能力など）を評価することもできる。方法の小型化は、低付着プレート（例えば、９６ウェルプレート）および／または低酸素（例えば、約２５％Ｏ２または約５％Ｏ２未満）条件下での細胞培養の使用を含むことができる。一定の実施形態では、以下の方法を使用することができる：マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣまたはｉＰＳＣに、約０．１ｎｇ／ｍｌＴＧＦおよび約２０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦを補足した成長因子を含まないＴｅＳＲを使用して２４時間、前条件付けすることができる。細胞を、例えば、約３７℃で約５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を使用してコンフルエンスで採取することができる。細胞を、約２０％ＢＩＴ９５００または血清代替物−３、約１％ＮＥＡＡ、約１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および約０．１ｍＭメルカプトエタノール、約０．７５％ＢＳＡ、約５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、および約１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（例えば、Ｈ−１１５２）を補足したＩＭＤＭを含むＥＢ基本培地中で採取することができる。ＥＢ形成を開始させるために、細胞を、ＲＯＣＫインヒビターを含むＥＢ基本培地中に約１０万個の細胞／ウェルの密度で低付着９６ウェルプレート中に入れることができる。正確な細胞の使用濃度を類似の結果を達成するために変化させることができると予測される。ＥＢ形成を、低Ｏ２条件でプレートをインキュベートすることによって容易にすることもできる。約１２〜２４時間後、細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、約５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および約２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含むＥＢ分化培地中に入れることができる。例えば、９６ウェルプレート中のウェルあたり約３００μｌの培地を使用することができる。分化約３〜４日目に、消費培地体積の半分（例えば、１００〜１５０μｌ）を穏やかに除去し、且つ同体積の新鮮な培地を添加することによって、細胞に培地の半分を補給することができる。分化約５〜６日目に、消費した培地を上記のように吸引することができ、細胞を、例えば、（１）約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、約１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−３、および約１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ、または（２）約２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、約２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、および約１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を含む培地のいずれかを補足したＥＢ基本培地中に入れることができる。上記のように、分化約８日目および１０日目に、分化ＥＢ培養物に新鮮な培地を半分補給することができる。分化約１２日目に、ＥＢ培養物を採取することができる。以下の実施例に示すように、これらのアプローチを首尾よく使用して種々の細胞系列（例えば、赤血球、巨核球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、顆粒球）を生成することができ、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを使用して類似の結果を得ることができる。
【０１４０】
本発明の方法を、ロボット自動化を使用して、プレートに単一の細胞を付着させるように細胞を誘導するために培地中にＲＯＣＫインヒビターＨＡ１００および／またはＨ１１５２を含めることによって、単一細胞アッセイで使用することができる。ロボットでの培養系への小分子ＨＡ１００またはＨ１１５２またはＹ−２７６３２の添加により、多能性細胞（ＥＳ、ｈＥＳＣ、およびｉＰＳ細胞が含まれる）の生存度を非常に改善することができる。一定の実施形態では、ＴｅＳＲ培地中での多能性細胞の生存を、特に細胞をタンパク質分解的または機械的に凝集塊に分離するか個別化した後に、ＲＯＣＫインヒビターまたはＰＫＣインヒビターを含めることによって改善することができる。ＲＯＣＫインヒビターは、個別化したｈＥＳ細胞の表面への付着および成長を促進することができる。多能性細胞の維持または増殖および造血前駆細胞または特異的造血系列への分化の過程のいくつかまたは全てを自動化することができる。自動化方法の一部または全部は、特定条件を使用することができる。
【０１４１】
Ｘ．キット
本発明はまた、本発明で用いるキットを意図する。例えば、キットは、１つまたは複数の密封バイアル中に本明細書中に記載の分化培地を含むことができる。キットは、細胞（多能性幹細胞、前駆細胞、造血前駆細胞、または内皮前駆細胞など）を含むことができる。
【０１４２】
キットはまた、前駆細胞（造血前駆細胞または内皮前駆細胞など）の産生のための説明書を含むことができる。あるいは、説明書は、造血細胞、内皮細胞、肥満細胞、樹状細胞、巨核球、顆粒球、マクロファージ、または赤血球の産生を指示することができる。
【０１４３】
適切なキットは、適切な容器および包装材料（管、バイアル、ならびに収縮包装および中空成形包装が含まれる）中に本発明で用いる種々の試薬を含む。本発明のキット中に含めるのに適切な材料には、１つまたは複数の本明細書中に記載の特定培地および１つまたは複数の細胞が含まれるが、これらに限定されない。ここで、細胞は、多能性細胞または本明細書中に示す方法にしたがって少なくとも部分的に分化した多能性細胞である。一定の好ましい実施形態では、複数の多能性細胞または少なくとも部分的に分化した細胞を、本発明のキット中に含む。
【０１４４】
ＸＩ．スクリーニングアッセイ
本発明は、スクリーニングアッセイ（多能性幹細胞の前駆細胞への分化を促進する能力についての候補物質の同定に有用なスクリーニングアッセイなど）を意図する。例えば、造血細胞、造血前駆細胞、および／または内皮細胞を使用して、候補物質の薬理学および／または毒性学を評価することができる。したがって、本明細書中に記載の方法によって分化した細胞を使用したスクリーニング方法を使用して、細胞に影響を及ぼし得る疾患に関連する１つまたは複数の症状を緩和することができる治療化合物を同定することができる。他の実施形態では、分化細胞を利用して、細胞に有毒な化合物を同定することができる。あるいは、スクリーニング法は、細胞の分化または脱分化を促進することができる候補物質に細胞を曝露する工程を含むことができる。
【０１４５】
本明細書中で使用する場合、用語「候補物質」は、多能性幹細胞の前駆細胞への分化を促進する任意の物質をいう。候補物質には、天然に存在する化合物のフラグメントまたは一部が含まれ得、または、候補物質は、そうでなければ不活性な公知の化合物の活性な組み合わせとしてのみ見出され得る。１つの実施形態では、候補物質は小分子である。さらに他の実施形態では、候補物質には、有機小分子、そのペプチドまたはフラグメント、ペプチド様分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質、タンパク質、酵素、塩、アミノ酸、ビタミン、マトリックス成分、インヒビター、抗生物質、抗体、抗体フラグメント、ミネラル、脂質、または他の有機（炭素含有）分子または無機分子が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１４６】
ＸＩＩ．薬学的調製物
本明細書中に記載の方法にしたがって分化したか、本明細書中に記載の方法にしたがって分化した細胞に由来する細胞を薬学的調製物中に含め、被験体（ヒト患者など）に投与することができる。薬学的調製物を、一定の実施形態では、非経口または静脈内に投与することができる。
【０１４７】
本発明の薬学的組成物は、有効量の１つまたは複数の造血細胞、骨髄性細胞、もしくは赤血球系細胞、または薬学的に許容可能なキャリア中に溶解または分散したさらなる薬剤を含む。句「薬学的または薬理学的に許容可能な」は、必要に応じて動物（例えば、ヒトなど）に投与した場合に有害反応、アレルギー反応、または他の副作用を生じない分子的実体および組成物をいう。少なくとも１つの造血細胞、骨髄性細胞、もしくは赤血球系細胞またはさらなる有効成分を含む薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（本明細書中で参考として援用される）に例示のように、本開示を考慮して当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のために、調製物はＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓが定める無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の標準を満たさなければならないと理解されるであろう。一般に、薬学的調製物を、典型的には、処方物中に存在する種々の造血細胞、骨髄性細胞、もしくは赤血球系細胞の生存性が促進されるように処方すると認識されるであろう。例えば、一定の実施形態では、組成物は、ヒト患者への静脈内投与のために溶液中に赤血球を含むことができる。
【０１４８】
本発明は、さらに、本明細書中に開示の方法によって得た薬学的有効量の前駆細胞、造血細胞、または内皮細胞を被験体に投与することにより、疾患、障害、または損傷を処置する方法を意図する。本発明のこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的経路による投与であろう。これには、全身的または非経口方法（静脈内注射、脊髄内注射、または脳内、皮内、皮下、筋肉内、もしくは腹腔内方法が含まれる）による投与が含まれる。治療の性質に応じて、投与はまた、経口、鼻、口内、直腸、膣、または局所手段による投与であり得る。
【０１４９】
本明細書中に開示の方法によって処置することができる疾患または障害には、脈管の疾患または障害、免疫学的疾患または障害、神経の疾患または障害、血液の疾患または障害、または損傷が含まれるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１５０】
ＸＩＩＩ．実施例
以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態を証明するために含める。以下の実施例中に開示の技術が本発明者によって本発明の実施で十分に機能することが発見された技術を示し、したがって、その実施に好ましい様式を構成すると見なすことができると当業者は認識すべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示の特定の実施形態で多数の変更形態を得ることができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を依然として得ることができると認識すべきである。
【０１５１】
実施例１
ＥＢの作製：マトリゲル（商標）コーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、３７℃で１０分間のコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ）処理を使用してコンフルエンスで採取した。インキュベーション後にウェルを洗浄してコラゲナーゼを洗い流し、ＥＢ基本培地中へのウェルの掻爬によってＥＢを形成させた。翌日、培地を、異なるサイトカイン処方物を含むＥＢ分化培地と交換した。
【０１５２】
マトリゲル（商標）コーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、３７℃で６分間のＴｒｙｐＬＥ（商標）処理を使用してコンフルエンスで採取した。ウェル中のＴｒｙｐＬＥ（商標）を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む「ＥＢ基本培地」を使用して中和した。細胞を回収し、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地で洗浄した。細胞を計数して生存度をチェックし、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の、低付着プレート中に入れた。翌日、培地を、異なるサイトカイン処方物を含むＥＢ分化培地と交換した。
【０１５３】
ＥＢ形成および分化プロトコール：上記酵素を使用してＥＢ形成を促進するために、細胞を、２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭメルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、０．７５％ＢＳＡ、５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したＩＭＤＭを含む「ＥＢ基本培地」中での一晩のインキュベーションのために６ウェル低付着プレートに移した。翌日、細胞を各ウェルから回収し、遠心分離した。細胞を、以下の成長因子およびサイトカインを補足したＥＢ基本培地からなる「ＥＢ−分化培地」に再懸濁した：５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、２５ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）；２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−３（ＩＬ−３）、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６（ＩＬ−６）、２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）；２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ）、０．２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（ＥＰＯ）、２５ｎｇ／ｍｌトロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｉｔｉｎ）（ＴＰＯ）（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、および２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２。ＥＢを１５ｍＬ管に移し、凝集体を５分間沈殿させることによって４日毎に培地を交換した。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換した。あるいは、細胞に、半量の新鮮な培地を２日毎に補給した。分化過程の間の異なる時点で細胞を採取し、フローサイトメトリーによって表現型を評価し、ＣＦＵアッセイを使用して機能的能力を評価した。
【０１５４】
フローサイトメトリー：細胞を各ウェル／条件から回収し、培地で１回洗浄した。細胞ペレットを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンを使用して３７℃のインキュベーター中で５〜１０分間消化し、その後に培地で洗浄し、７０μｍ細胞ストレーナーに通した。細胞をＰＢＳ−ＦＢＳ含有ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、計数して細胞生存度を評価し、以下の蛍光色素結合体化モノクローナル抗体で染色した：抗ヒトＣＤ４３（１Ｇ１０）、抗ヒトＣＤ３１（ＷＭ−５９）、抗ヒトＣＤ４１（ＨＩＰ８）；抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）、および抗ヒトＣＤ３４（５８１、８Ｇ１２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；抗ヒトｆｌｋ−１（８９１０６）、（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ製）。非生存細胞を、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して排除した。生細胞分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）またはＡｃｃｕｒｉフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアによって行った。
【０１５５】
クローン原性造血前駆体アッセイ（ＣＦＵアッセイ）：ＥＢを、ＴｒｙｐｌＥまたは０．５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して単一細胞懸濁液に分散させた。生細胞を定量し、プレートに入れ（５０，０００〜３００，０００細胞／ｍＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）５０ｎｇ／ｍＬ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）３Ｕ／ｍＬ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）１０ｎｇ／ｍＬ、インターロイキン−３（ＩＬ−３）１０ｎｇ／ｍＬを含むヒトメチルセルロース完全培地（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、湿室中で造血ＣＦＣについてアッセイした。１４日後、コロニーをその形態学にしたがってスコアリングし、プレートに入れた１０５個の細胞あたりのコロニー数を定量した。血清含有または無血清のＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、コロニーを生成することができる。
【０１５６】
サイトスピン（Ｃｙｔｏｐｓｐｉｎ）：製造者の説明書にしたがって、細胞を固定し、ライト・ギムザ試薬（Ｈｅｍａ３染色；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）で染色した。
【０１５７】
実施例２
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）またはｉＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝集により、胚様体（ＥＢ）と呼ばれるクラスターが誘導され、内胚葉系列、中胚葉系列、および外胚葉系列を示す細胞への分化が可能になる。ＥＢ形成についてのこの確率過程を、外因性成長因子の添加によって、造血前駆細胞型を生成するように導くことができる。
【０１５８】
本発明者は、分化の９〜１３日目に細胞表面上にＣＤ４３＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋、およびＣＤ４５＋を発現する造血前駆細胞を生成するための５つの不可欠なサイトカイン組を使用した新規の無フィーダー且つ無血清の特定のＥＢベースの造血分化プロトコールを確立した。前駆細胞型の生成効率は、２つのヒトｈＥＳＣおよび４つのｉＰＳＣにわたって５〜８％であった。分化過程中に２００〜１０００細胞／凝集体、低酸素、および再凝集工程を使用して形成されたＥＢは、造血前駆細胞型の生成を好む。
【０１５９】
本方法は、５つのサイトカインの存在下での培養１６〜２４日後に細胞表面上にＣＤ３１、ＣＤ４３、およびＣＤ４５を共発現する骨髄性前駆細胞を効率よく生成することができる。あるいは、造血前駆細胞を単離することができ、これは、各特異的細胞系列のための特殊化サイトカイン富化培地処方物に入れた場合に巨核球系列、赤血球系列、および骨髄細胞系列にさらに分化することができる（例えば、未熟から成熟の多形核顆粒球、マクロファージ、樹状細胞）。
【０１６０】
胚性幹細胞
未分化ヒト胚性幹細胞株（ｈＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞株ｉＰＳＣを、１５％ＫＯ−血清サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）中での照射マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）との共培養によって維持した。培地に、ｈＥＳＣについては４ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補足し、ｉＰＳＣについては１００ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補足した。
【０１６１】
照射マウス胚線維芽細胞上で成長させたか、ＭＥＦ馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）またはｍＴｅＳＲ培地を使用して維持したマトリゲル（商標）コーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、ＥＢ分化プロトコールのための出発物質として使用した。
【０１６２】
分化前の細胞の前条件付け
ｍＴｅＳＲ培地を使用してマトリゲルコーティングしたプレート上で維持したｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ細胞を、分化開始前に前条件付け工程に供した。前条件付け工程は１〜３日の間で変動した。
【０１６３】
０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｃａｍｂｒｅｘ）または０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したが成長因子を欠くｍＴｅＳＲ（「ｍＴｅＳＲ−ＧＦ」）を、ＥＢ分化開始前の前条件付け工程のために使用した。
【０１６４】
ＥＢ形成のための細胞の採取
方法１：ＭＥＦ上で成長しているか、マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、３７℃で１０分間のコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ）処理を使用してコンフルエンスで採取した。インキュベーション後にウェルのコラゲナーゼを洗い流し、ＥＢ基本培地中でのウェルの掻爬によってＥＢを形成させた。翌日、培地を、異なるサイトカイン処方物を含むＥＢ分化培地と交換した。
【０１６５】
方法２：マトリゲル（商標）コーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、３７℃で６分間のＴｒｙｐＬＥ（商標）処理を使用してコンフルエンスで採取した。ウェル中のＴｒｙｐＬＥ（商標）を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）または１０μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｙ−２７６３２）、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地を使用して中和した。細胞を回収し、１μＭ〜１０μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地で洗浄した。細胞個別化のためにトリプシンを使用した場合にダイズトリプシンインヒビターを含めた。ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を個別化した場合、ダイズトリプシンインヒビターを排除することができる。細胞を計数して生存度をチェックし、１μＭ〜１０μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に入れた。翌日、培地を、異なるサイトカイン処方物を含むＥＢ分化培地と交換した。
【０１６６】
ＥＢ形成および分化プロトコール
上記酵素を使用してＥＢ形成を促進するために、細胞を、ｍＴｅＳＲ培地または２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭメルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製）、０．７５％ＢＳＡ、５０ｕｇ／ｍｌアスコルビン酸を補足したＩＭＤＭを含むＥＢ基本培地中で一晩のインキュベーションのために６ウェル低付着プレートに移した。翌日、細胞を各ウェルから回収し、遠心分離した。細胞をＥＢ−分化培地に再懸濁した。ＥＢ−分化培地は、以下の成長因子およびサイトカインを補足したＥＢ基本培地からなる：５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、２５ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）；２５ｎｇ／ｍｌ
Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−３（ＩＬ−３）、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６（ＩＬ−６）、２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；２０ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、０．２Ｕ／ｍｌエリスロポエチン（ＥＰＯ）、２５ｎｇ／ｍｌトロンボポエチン（ＴＰＯ）（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ製）、および２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２。ＥＢを１５ｍＬ管に移し、凝集体を５分間沈殿させることによって４日毎に培地を交換した。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換した。あるいは、細胞に、半量の新鮮な培地を２日毎に補給した。分化過程の間の異なる時点で細胞を採取し、フローサイトメトリーによって表現型を評価し、ＣＦＵアッセイを使用して機能的能力を評価した。
【０１６７】
ＥＢを１５ｍＬ管に移し、凝集体を５分間沈殿させることによって４日毎に培地を交換したか、４８時間毎に培地を半分ずつ交換した。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換した。
【０１６８】
結果
ｍＴｅｓＲに適合させたｈＥＳＣ由来のｍＴＥＳＲ培地中で作製したＥＢから、照射マウス胚線維芽細胞上で維持したか、ｍＴｅＳＲの代わりにＭＥＦ馴化培地を使用して維持したマトリゲル（商標）コーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣから作製したＥＢと比較して、分化１６日後により低い頻度（４％未満）の造血前駆体が明らかとなった。後者の条件により、１０〜１５％の造血前駆細胞が生成された。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、ｍＴｅＳＲ培地中のより高いレベルのＴＧＦ−βは、最も原始的な幹細胞／前駆細胞に対して優先的な成長阻害効果を発揮することができる。
【０１６９】
サイトカインの存在は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの両方の無血清造血分化過程を誘導するのに不可欠であることが認められた。最初のサイトカイン処方物は、ＥＢ分化培地中に列挙した１１種のサイトカインを含んでいた。造血前駆細胞の頻度は、血清およびサイトカインの非存在下で０．５〜２％であり、サイトカインを含まない血清の存在下で２〜１０％であった。造血前駆細胞の頻度は、血清の非存在下且つサイトカインの存在下で１６日間の分化の後、１０〜４０％であった。サイトカインを含む培地への血清の添加による、前駆細胞の増加はわずかであった。したがって、無血清でサイトカイン豊富なＥＢ分化培地は、ｍＴｅＳＲ培地を使用してマトリゲルコーティングしたプレート上で維持し、ＭＥＦ−ＣＭを使用して前条件付けしたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ、ならびに照射マウス胚線維芽細胞上で維持したｈＥＳＣおよびｉＰＳＣから、造血前駆細胞を生成することができた。
【０１７０】
ＥＢ分化の１６〜１８日間の分化終了時の細胞の主な表現型は、ＣＤ４５＋、ＣＤ４３＋、およびＣＤ３１＋細胞であった。ＣＦＵアッセイにより、顆粒球（例えば、好酸球、好塩基球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞）を生成することができる骨髄前駆体の存在が明らかとなった。
【０１７１】
図１は、継代数５０（Ａ）および４０（Ｂ）でのＨ１  ＥＳＣの造血分化を示す。両ｈＥＳＣを、ｍＴｅＳＲを使用してマトリゲル（商標）上で１０継代維持した。ｈＥＳＣを、造血分化開始前にＭＥＦ−ＣＭを使用して３日間前条件付けした。コラゲナーゼを使用して細胞を採取し、無血清サイトカイン富化培地を使用してＥＢ分化させた。ＥＢ細胞を、造血前駆細胞型（ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、およびＣＤ４１）の存在について異なる時点でのフローサイトメトリーによって分析した。値は、３つの個別の実験の平均ＳＥＭを示す。
【０１７２】
ＦＧＦ−２およびＴＧＦ−β量を減少させた特定培地中での細胞の前条件付けによって造血分化が改善された。図２は、ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル（商標）上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣのための前条件付け特定培地への曝露によって、その後の造血分化が増大することを示す。より具体的には、マトリゲル（商標）コーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させたＨ１  ｈＥＳＣを、ＭＥＦＣＭ、または０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したＸ−ｖｉｖｏ  １５、または０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したｍＴｅＳＲ（成長因子を欠く）のいずれかを使用して３日間前条件付けした。前条件付け培地を、３日間にわたって毎日交換した。コラゲナーゼを使用して細胞を採取し、ＥＢ基本培地中への掻爬によってＥＢを形成させた。ＥＢ基本培地へのプレーティングの２４時間後に１１種のサイトカインを含むＥＢ分化培地に細胞を移した。分化１２日目に細胞を採取し、細胞の表現型をフローサイトメトリーによって定量した。
【０１７３】
前条件付け時間枠を１日間もの短さにしても、依然として造血分化を改善することができることがさらに認められた。低レベルのＴＧＦ−β（０．１ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）を補足した成長因子を欠くｍＴｅＳＲ（ｍＴｅＳＲ−ＧＦ）は好ましい前条件付け培地である。トリプシン（例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標））を使用して個別化または小さな凝集塊に分離されたＥＢについても、前条件付けの有利な影響が認められると予測される。
【０１７４】
実施例３
造血前駆体を、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの単一細胞懸濁液から産生した。単一細胞懸濁液（すなわち、個別化した細胞）を、トリプシン消化によって産生した。
単一細胞からＥＢを作製するために使用した方法
ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅｓＲ−ＧＦの存在下で３日間前条件付けした。単一細胞からの分化を開始させるために、培養物をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で６分間処理し、細胞懸濁液を、（１）単純なＥＢ基本培地、（２）ＰＶＡを含むＥＢ基本培地、（３）０．５％ＰＶＡおよび１μＭ  Ｈ１１５２、または１０μＭ  Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫインヒビターを含むＥＢ基本培地、または（４）１ｕＭ  Ｈ１１５２  ＲＯＣＫインヒビターのみを含むＥＢ基本培地中に回収した。細胞を回収し、１回洗浄し、３７℃で低付着プレート上の各培地処方物中に入れた。ＥＢ形成状態を、１８〜２４時間後に位相差顕微鏡下でチェックした。
【０１７５】
【表３−１】
2015192681.tif 000008
造血分化に必要なサイトカイン
サイトカインマトリックス実験プロトコール：ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むＸ−ｖｉｖｏ−１５の存在下で３日間前条件付けした。細胞を、３７℃で６分間のＴｒｙｐＬＥを使用して採取した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地を使用して中和した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビターおよびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地で１回洗浄した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビターおよびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に入れた。翌日、培地を、異なるサイトカイン処方物を含むＥＢ基本培地と交換した。
【０１７６】
サイトカインの使用濃度は以下である：２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４、２５ｎｇ／ｍｌ
ＶＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３Ｌ、１０ｎｇ／ｍｌ
ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ；２０ｎｇ／ｍｌ
ＧＭ−ＣＳＦ、０．２Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、および１０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２。
【０１７７】
使用したサイトカイン組み合わせを、以下の表３に列挙する。ＥＢ培養物に、２日毎に半量の新鮮な分化培地を補給した。ＥＢ培養物を、分化８、１２、および１７日目に採取した。ＥＢ培養物を、全細胞を遠心沈殿し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンを使用してＥＢを消化することによって採取した。前駆細胞型の表現型をフローサイトメトリーによって分析し、細胞をＣＦＵアッセイのためにメチルセルロース培地中に入れた。「ＦＬＴ３」は、以下のＦｌｔ３リガンドをいう。
【０１７８】
【表３−２】
2015192681.tif 000009
これらの異なる組み合わせに基づいたこれらの結果を、以下の表４に示す。以下に列挙するように、成長因子のこれらの異なる組み合わせにおける培養に起因する細胞を評価して、種々の細胞表面マーカーの発現を決定した。
【０１７９】
【表４】
2015192681.tif 000010
ＥＢサイトカイン混合物中の１１種のサイトカインのうち、５種のサイトカイン組（ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ−３、Ｆｌｔ−３、ＧＭＣＳＦ）が、無血清造血分化プロトコールの実施に特に有効であるか不可欠であることが同定された。５種のサイトカインのうち、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦはＥＢ分化の間の全ての時点で有意な役割を果たすようであった一方で、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−３はＥＢ分化の後期段階で役割を果たすようであった。
【０１８０】
造血分化の各時点の終了時にコロニー形成アッセイを行った。ＣＦＵアッセイにより、５種のサイトカイン組み合わせによって全ての時点で１１種のサイトカインカクテルに類似する総コロニー数が得られることが明らかとなった。ＧＥＭＭコロニーの頻度（３〜５／１０５細胞）は、ＥＢ分化１２日目で１１種のサイトカイン組み合わせと５種のサイトカイン組み合わせとの間で類似していた。５種のサイトカインを含むＥＢ分化培地を使用して、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣから造血前駆細胞を首尾よく生成した。
【０１８１】
５種のサイトカインを含むＥＢ分化培地は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣから造血前駆細胞を生成するのに十分であった。ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル（商標）上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅｓＲ−ＧＦまたはＸ−ｖｉｖｏ  １５の存在下で３日間前条件付けした。
【０１８２】
造血分化のためのサイトカインの使用濃度の決定
実験プロトコール：ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅＳＲ−ＧＦの存在下で３日間前条件付けした。細胞を、３７℃で６分間のＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して採取した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビターおよびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地を使用して中和した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地で１回洗浄した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に１００万個の細胞／ｍｌの細胞密度で入れた。翌日、培地を、異なる濃度の５種のサイトカインを含むＥＢ基本培地に交換した。サイトカインの使用濃度は以下である：ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンド（５０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲）；ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ（１０〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲）。
【０１８３】
ＥＢ培養物に２日毎に半量の新鮮な分化培地を補給した。ＥＢ培養物を、分化９日および１２日目に採取した。ＥＢ培養物を、全細胞を遠心沈殿し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンを使用してＥＢを消化することによって採取した。前駆細胞型の表現型をフローサイトメトリーによって分析し、細胞をＣＦＵアッセイのためにメチルセルロース培地中に入れた。
【０１８４】
結果（５種サイトカインの用量組み合わせ）
結果は、造血前駆細胞を生成させる５種の必須サイトカインのおおよその最適用量がＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＦｌｔ−３リガンドについては２５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３およびＧＭＣＳＦについては１０ｎｇ／ｍｌであることを示す。サイトカインのこの組み合わせにより、ＥＢ分化１２日目に、多分化能ＧＥＭＭコロニー（３〜５／１０５細胞）を生成する造血前駆体を生成することができる。
ＥＢ培養物の再凝集によって造血が増大する
無血清で１２日間のＥＢ分化プロトコールを、分化プロトコール中に再凝集工程を含めることによってさらに最適化した。
【０１８５】
実験プロトコール：ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅＳＲ−ＧＦの存在下で２日間前条件付けした。細胞を、３７℃で６分間のＴｒｙｐＬＥを使用して採取した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビターを含むＥＢ基本培地を使用して中和した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地で１回洗浄した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）およびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に１２〜２４時間入れた。
【０１８６】
翌日、培地を、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦを共に２５ｎｇ／ｍｌ含むＥＢ基本培地に交換した。細胞を、最初のサイトカイン組中で４、５、または６日間分化させた。ＥＢ培養物を、その後、２種のサイトカインの最初のパルス後さらに４、５、または６日間ＩＬ−３／ＧＭＣＳＦ／ＦＬＴ−３リガンドに曝露した。最初のサイトカイン組から他の組への移行中に、１組のＥＢをＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して消化し、第２の培地中で再凝集させた一方で、脱凝集工程を行わずに他の組を第２の培地中に入れた。分化過程を通して、ＥＢ培養物に、２日毎に半量の新鮮な分化培地を補給した。ＥＢ培養物を、ＥＢ分化９、１０、１１、および１４日目に採取した。実験終了時に、ＥＢ培養物を、全細胞の遠心沈殿およびＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンでのＥＢの消化によって採取した。前駆細胞型の表現型をフローサイトメトリーによって分析し、細胞をＣＦＵアッセイのためにメチルセルロース中に入れた。
【０１８７】
結果
ＥＢ培養物の部分的再凝集によって造血分化が増加した。最初の４〜５日間のＢＭＰ４およびＶＥＧＦの存在、およびその後の次の７〜８日間のＩＬ−３／Ｆｌｔ３リガンド／ＧＭＣＳＦの添加により、ＣＤ４３＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、およびＣＤ３１＋を発現する最も多数の造血前駆体（１０％超）が得られた。
【０１８８】
コロニー形成アッセイの結果は、フローサイトメトリー分析によって得られたデータによく似ていた。最初の４〜５日間ＢＭＰ４およびＶＥＧＦをパルスし、その後に次の７〜８日間ＩＬ−３／ＦＬＴ３リガンド／ＧＭＣＳＦを添加したＥＢ培養物により、最高のコロニー形成単位が明らかとなった。総ＣＦＵ値は、再凝集工程後、１００超から２５０まで上昇した。ＧＥＭＭ保有コロニーの頻度は、３〜５／１０５から１５〜２０／１０５細胞に急上昇した。
【０１８９】
実施例４
ＥＢサイズは造血分化に影響を及ぼし得る。
【０１９０】
ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたｈＥＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅＳＲ−ＧＦの存在下で２日間前条件付けした。細胞を、３７℃で６分間のＴｒｙｐＬＥを使用して採取した。ＴｒｙｐＬＥ（商標）を、１０μＭ  Ｙ−２７６３２  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地を使用して中和した。細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地で１回洗浄した。
【０１９１】
生細胞数を決定し、所望の細胞数を、製造者の説明書にしたがってＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレートの各ウェルに入れた：１．２×１０５細胞をプレートに入れて１００細胞凝集体ＥＢを得た。２．４×１０５細胞をプレートに入れて２００細胞凝集体ＥＢを得た。６×１０５細胞をプレートに入れて５００細胞凝集体ＥＢを得た。１．２×１０６細胞をプレートに入れて１０００細胞凝集体ＥＢを得た。２．４×１０６細胞をプレートに入れて２０００細胞凝集体ＥＢを得た。３．６×１０６細胞をプレートに入れて２０００細胞凝集体ＥＢを得た。４．８×１０６細胞をプレートに入れて２０００細胞凝集体ＥＢを得た。
【０１９２】
細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）、ダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中のＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）（製造者の説明書を使用）プレートに入れて、１８〜２４時間ＥＢを形成させた。細胞を低付着プレートに移し、写真撮影して種々の細胞数を使用して形成させたＥＢのサイズを測定した。
【０１９３】
ＥＢ培養物を、５種サイトカイン（ＢＭＰ４／ＶＥＧＦ／ＩＬ−３／ＦＬＴ−３リガンド／ＧＭＣＳＦ）を含む培地中で分化させた。ＥＢ培養物に、２日毎に５種全てのサイトカインを含む半量の新鮮な分化培地を補給した。分化１１日目に、ＥＢ培養物を採取した。実験終了時に、ＥＢ培養物を、全細胞の遠心沈殿およびＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンでのＥＢの消化によって採取し、ＣＤ４３値をフローサイトメトリーによって定量した。図３に示すように、ＥＢサイズとＣＤ４３発現との間の相関関係が認められた。
【０１９４】
限定数の細胞を含むＨ１  ｈＥＳＣ凝集体を、ＥＢ基本培地中のＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製造者の説明書を使用）中で１８〜２４時間形成させた。細胞を後に低付着プレートに移し、μＭ単位で、異なる細胞数によって生成されたＥＢサイズを、顕微鏡上のスケールバーを使用して記録した。ＥＢを含む細胞数およびＥＢの凝集体サイズを、分化開始前に定量した。ＥＢ培養物を、ＢＭＰ４／ＶＥＧＦ／ＩＬ−３／ＦＬＴ−３リガンド／ＧＭＣＳＦの存在下で１１日間分化させた。実験終了時に、ＥＢ培養物を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用したＥＢの個別化によって採取し、ＣＤ４３値をフローサイトメトリーによって定量した。
【０１９５】
結果
造血分化のための至適細胞数は、１００〜２５０μｍの寸法がある２００〜１０００細胞／凝集体である。１０００μｍ超の寸法があるより多数の細胞凝集体（２０００個超）は、造血前駆細胞の生成を促進しなかった。
【０１９６】
実施例５
低酸素条件によって造血分化が増大する
ｍＴｅＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたＨ１  ｈＥＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅＳＲ−ＧＦの存在下で２日間前条件付けした。細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して採取し、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）およびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に１００万細胞／ｍｌの細胞密度で１２〜２４時間入れた。
【０１９７】
ＥＢ培養物を、５種のサイトカイン（ＢＭＰ４／ＶＥＧＦ／ＩＬ−３／ＦＬＴ−３リガンド／ＧＭＣＳＦ）を含む培地中で分化させた。ＥＢ培養物に、２日毎に５種全てのサイトカインを含む半量の新鮮な分化培地を補給した。ＥＢ培養物を、再凝集工程を行わずに分化８、１２、および１６日目に採取した。実験終了時に、ＥＢ培養物を、全細胞の遠心沈殿およびＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンでのＥＢの消化によって採取し、造血に関連する種々の表面マーカーの表現型発現を、フローサイトメトリーによって定量した。
【０１９８】
結果
ＥＢ培養物は、高酸素条件下と比較した場合、低酸素条件下で、ＣＤ４３、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３４発現細胞の生成率がより高かった。この影響は、ＥＢ分化８日後でより明白であった。総細胞数は、両条件下で類似していた。
【０１９９】
マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させたＨ１  ｈＥＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したｍＴｅＳＲ−ＧＦを使用して２日間前条件付けした。細胞を、ＲＯＣＫインヒビターの存在下でＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して採取した。ＥＢを、低（５％Ｏ２）および高（２０％Ｏ２）酸素条件下でＶＥＧＦ、ＢＭＰ４、ＩＬ−３、ＧＭＣＳＦ、およびＦｌｔ−３リガンドを含むＥＢ分化培地に移した。細胞を分化の８、１１、および１６日目に採取し、細胞の表現型をフローサイトメトリーによって定量した。
【０２００】
造血前駆体の生成効率
ｍＴｅＳＲ（商標）を使用して維持したマトリゲル（商標）上での無フィーダー成長に適合させたＨ１  ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅＳＲ−ＧＦの存在下で２日間前条件付けした。細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して採取した。生細胞数を評価し、細胞を、１００万細胞／ｍｌの密度でプレートに入れた。
【０２０１】
細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）およびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に２４時間に入れた。ＥＢ培養物を、２工程の分化過程で分化するように誘導した。培養物を、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む培地中に低酸素条件下で４日間入れた。ＥＢ培養物を、分化５日目にＴｒｙｐＬＥを使用して再凝集させ、（１）ＩＬ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＧＭＣＳＦ；（２）ＩＬ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＳＣＦ；または（３）ＩＬ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯのいずれかを有する第２の分化培地中に低酸素条件下でさらに７日間入れた。ＥＢ培養物に、２日毎に半量の新鮮な分化培地を補給した。ＥＢ培養物を、分化１２日目に採取した。実験終了時に、ＥＢ培養物を、全細胞を遠心沈殿し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンを使用してＥＢを消化することによって採取した。実験終了時の総生細胞数を評価した。造血に関連する種々の表面マーカーの表現型発現を、フローサイトメトリーによって定量した。造血前駆細胞（ＣＤ４３＋／ＣＤ３４＋）の比率および絶対数を定量した。したがって、造血前駆細胞の生成効率を、初期細胞数を分化実験終了時の造血前駆体の生成数で割ることによって決定した。
【０２０２】
結果：２工程ＥＢ分化プロトコールを使用したｈＥＳＣおよびｉＰＳＣからの造血前駆体集団の生成効率は、５〜８％であることが認められた。結果を図５に示す。
【０２０３】
実施例６
上記ＥＢ分化プロトコールを使用して生成した造血前駆細胞は、赤血球前駆体、巨核球、マクロファージ、単球、および樹状細胞を生成することができることが見出された。具体的には、ｍＴＥＳＲを使用して維持したマトリゲル上での無フィーダー成長に適合させたＨ１  ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含むｍＴｅＳＲ−ＧＦの存在下で２日間前条件付けした。ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を採取した。全細胞株についての生細胞数を評価した。
【０２０４】
細胞を、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）およびダイズトリプシンインヒビター（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含むＥＢ基本培地中の低付着プレート中に１００万細胞／ｍｌの細胞密度で２４時間入れた。ＥＢ培養物を、２工程の分化過程で分化するように誘導した。培養物を、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む培地中に４日間入れた。ＥＢ培養物を、５日目にＴｒｙｐＬＥを使用して再凝集させ、（１）ＩＬ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＧＭＣＳＦ；（２）ＩＬ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＳＣＦ、または（３）ＩＬ−３、ＦＬＴ−３、ＴＰＯのいずれかを含む第２の分化培地中にさらに７日間入れた。ＥＢ培養物に、２日毎に半量の新鮮な分化培地を補給した。低酸素条件下で全１２日間の分化を行った。ＥＢ培養物を、分化１２日目に採取した。実験終了時に、ＥＢ培養物を、全細胞を遠心沈殿し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）または０．５％トリプシンを使用してＥＢを消化することによって採取した。実験終了時の総細胞数を評価した。１００万個のｈＥＳＣは、８０，０００個の造血前駆細胞を生成することができた。
【０２０５】
ＩＬ−３、ＦＬＴ−３、ＧＭＣＳＦ組（１）由来の前駆体を、２００ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦを含む培地中に８日間入れた。これらの細胞を、以下にさらに分化させた：（１）Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地中に細胞を２週間入れることによってマクロファージに分化させるか、（２）２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含む培地中に細胞を入れることによって樹状細胞に分化させた。１００万個のｈＥＳＣは、２０万個の樹状細胞を生成することができた。全系列の分化実験を、非低酸素の酸素濃度（約２０％）で行った。
【０２０６】
巨核球を、ＩＬ−３、ＦＬＴ−３リガンド、ＳＣＦ組（２）由来の前駆細胞を（１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３、２０％ＢＩＴ９５００）を含むＭＫ３培地に入れることによって産生した。肥満細胞を、ＭＫ３増殖培地およびその後の５ｎｇ／ｍｌ
ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を含む培地中での前駆体の増殖によって産生した。１００万個のｈＥＳＣは、６万〜１２０万個の巨核球を生成することができた。系列分化実験を、非低酸素の酸素濃度（約２０％）で行った。
【０２０７】
赤血球前駆体を、ＩＬ−３、ＦＬＴ−３  ＳＣＦ  ＴＰＯ由来の前駆体をヒドロコルチゾン（１０−６Ｍ）ホロトランスフェリン、エキサイト（ＥｘＣｙｔｅ）を含む培地中に入れることによって生成した。系列分化実験を、酸素正常状態（約２０％酸素）条件下で行った。ヒトＡＢ血清の補足および低酸素条件により、赤血球前駆体の収量が増大した。これらの方法を使用して、培養で１００万個のｈＥＳＣをおよそ１億個の赤芽球に増殖させた。
スピナーフラスコを使用したＥＢ分化プロトコールのスケールアップ
細胞を、分化前に最初に前条件付けした。マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦを補足した成長因子を含まないＴｅＳＲを使用して２４時間個別に前条件付けした。
【０２０８】
細胞を、３７℃で５分間のＴｒｙｐＬＥ（商標）処理を使用してコンフルエンスで採取した。細胞を、２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または血清代替物  ３（  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭメルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製）、０．７５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、および１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）を補足したＩＭＤＭを含むＥＢ基本培地中に回収した。
【０２０９】
次いで、細胞を、５０万個〜２００万細胞／ｍｌの密度で１２５ｍｌのコーニングスピナーフラスコ中に入れた。スピナーを、ＥＢ形成を促進するために、３０〜４０ｒｐｍで一晩に設定した。あるいは、細胞を、低付着プレート中の低付着コーニングフラスコ中に静止条件下で２４時間置くことができる。細胞を最初に１２〜２４時間培養した場合、細胞生存が改善された。１２〜２４時間後、細胞を、速度６０ＲＰＭの電磁式撹拌プラットフォーム上のスピナーフラスコ中のＲＯＣＫインヒビター含まずサイトカインを含むＥＢ分化培地中に入れた。スピナーフラスコを２５〜３０ＲＰＭで最初の１２〜２４時間維持した場合にＥＢが生成し、次いで、その後の分化のために４０〜６０に増加させた。スピナーフラスコのサイドキャップを緩めてガスを移動させた。細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ、血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を補足したＥＢ基本培地中に入れた。
【０２１０】
分化４日目に、細胞に、懸濁したＥＢ凝集体がフラスコの底部に１５〜２０分間沈殿することができるように細胞培養フード中にスピナーフラスコを設置することによって補給した。消費した培地を吸引した（１２５ｍｌスピナーについて約２０ｍＬ残した）。細胞を穏やかに旋回させ、５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ、血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含む新鮮な培地を細胞に添加した。スピナーフラスコを、全造血分化過程を通して、６０ｒｐｍの速度に設定した。
【０２１１】
分化５〜６日目に、消費した培地を上記のように吸引し、細胞を、（１）２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−３、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ、または（２）２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６のいずれかを補足したＥＢ基本培地中に入れた。消費した培地を、８日目および１０日目に上記のように吸引した。
【０２１２】
ＥＢ培養物を、分化約１２日目に採取した。分析終了時に、総細胞数を定量した。細胞を、表面マーカー（ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ４３＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ３１＋）の表現型発現について染色して、集団の造血前駆体数を定量した。表５は、Ｈ１  ＥＳ細胞を使用して種々の細胞密度で生成したスピナーデータをまとめている。類似の結果を、ｉＰＳ細胞を使用して得た。スピナーフラスコにおけるＥＢ分化過程の概要および得られた結果を図６に示す。造血前駆体は、異なる系列に属する種々の細胞型（赤芽球、巨核球、樹状細胞、肥満細胞、顆粒球、およびマクロファージが含まれる）を生成することができた。
【０２１３】
【表５】
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実施例７
９６ウェルプレートを使用したＥＢ分化の小型化：
マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦを補足した成長因子を含まないＴｅＳＲを使用して２４時間個別に前条件付けした。細胞を、３７℃で５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を使用してコンフルエンスで採取した。細胞を、２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または血清代替物−３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭメルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製）、０．７５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、および１μＭ
ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）を補足したＩＭＤＭを含むＥＢ基本培地中に回収した。
【０２１４】
細胞を、ＲＯＣＫインヒビターを含むＥＢ基本培地中の低付着９６ウェルプレート中に１０万細胞／ウェルの密度で入れた。ＥＢ形成を、低酸素（５％Ｏ２）条件下でプレートに入れた細胞をインキュベートすることによって促進した。１２〜２４時間後、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ、血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含むＥＢ分化培地中に入れた。９６ウェルプレートのウェルあたりおよそ３００μｌの培地を使用した。
【０２１５】
分化３〜４日目に、消費した培地の半分の体積（１００〜１５０μｌ）を穏やかに除去し、５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および２５ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含む同体積の新鮮な培地を細胞に添加することによって、細胞に半分の培地を補給した。
【０２１６】
分化５〜６日目に、消費した培地を上記のように吸引し、細胞を、（１）２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−３、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦ、または（２）２５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、２５ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を含む培地のいずれかを補足したＥＢ基本培地中に入れた。分化ＥＢ培養物に、上記のように分化８日目および１０日目に半量の新鮮な培地を補給した。
【０２１７】
ＥＢ培養物を、分化１２日目に採取した。分析終了時に、総細胞数を定量した。細胞を、表面マーカー（ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ４３＋、ＣＤ４１＋、ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ３１＋）の表現型発現について染色して、集団の造血前駆体数を定量した。Ｈ１  ＥＳ細胞を使用して作成したデータを図７にまとめている。ｉＰＳ細胞を使用して類似の結果を得た。
【０２１８】
図７に示すように、１０００００個の細胞を、低付着９６ウェルプレート上に置いた。細胞を、サイトカイン（ＢＭＰ４／ＶＥＧＦ／ＦＧＦ）の存在下にて低酸素（５％Ｏ２）条件下で最初の４〜５日間分化させ、サイトカイン（ＳＣＦ／ＦＬｔ−３／ＴＰＯ／ＩＬ−３／ＩＬ−６）の存在下にて低酸素（５％Ｏ２）条件下で次の７〜８日間分化させた。分化の１２日間の後に細胞を採取し、ＨＰＣをフローサイトメトリーによって定量した。
【０２１９】
実施例８
ロボット自動化
Ｔｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙシステム（産業的に関連するロボットプラットフォーム）を使用した造血前駆細胞の維持および生成のための条件。実施例８で使用したプロトコールに基づいて、分化１２日目に、Ｔｅｃａｎ  Ｃｅｌｌｅｒｉｔｙシステムによって細胞を採取し、マーカーの細胞表面染色のために手作業で洗浄した。染色後、細胞を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターに接続したＨｙｐｅｒｃｙｔを使用して分析した。
【０２２０】
実施例９
多能性細胞からの内皮細胞の生成
マトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を補足した成長因子を含まないＴｅＳＲを使用して２４時間個別に前条件付けした。細胞を、３７℃で５分間のＴｒｙｐＬＥ処理を使用してコンフルエンスで採取した。細胞を、２０％ＢＩＴ９５００（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または血清代替物−３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭメルカプトエタノール（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ製）、０．７５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、および１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）を補足したＩＭＤＭを含むＥＢ基本培地中に回収した。細胞を、ＥＢ形成を促進するために１００〜２００万細胞／ｍｌの密度で低付着プレート中に入れた。
【０２２１】
ＥＢ分化を誘導するために、以下のプロトコールを使用した。１２〜２４時間後、細胞をプレートから回収し、１０００ｒｐｍで５分間遠心沈殿した。細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ−４）、５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、および５０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を補足したＥＢ基本培地に再懸濁した。
【０２２２】
ＥＢ分化４日目に、細胞を、プレートを傾斜させることによって沈殿させた。上清培地の半分を吸引し、５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および５０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２をそれぞれ含む新鮮な分化培地と置換した。
【０２２３】
ＥＢ分化７日目に、ＥＢ培養物を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、アスコルビン酸、およびＦＢＳを含む内皮分化培地（Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ３２０２，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または５０ｎｇ／ｍｌ血管（ｖａｓｕｌａｒ）内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および５０ｎｇ／ｍｌゼブラフィッシュＦＧＦ−２を含む新鮮な分化培地中に入れた。
【０２２４】
細胞を、分化１０日目に内皮細胞の存在について分析した。細胞を回収し、コニカルチューブ中に遠心沈殿させた。細胞ペレットを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）セレクトまたは０．５％トリプシンを使用して３７℃で５分間消化した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液を含むＰＢＳ−ＦＢＳに再懸濁し、細胞数および生存状態を決定した。細胞を、蛍光色素結合体化モノクローナル抗体である抗ヒトＣＤ３１（ＷＭ−５９）および抗ヒトＣＤ１０５で染色した。非生存細胞を、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）を使用して排除した。生細胞分析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）またはＡｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーターで行った。図８は、ＥＢ分化１０日目のＣＤ３１＋細胞の生成を示す。
【０２２５】
内皮細胞の精製：ＥＢを単一細胞懸濁液へと分散させ、製造者の説明書にしたがって抗ＣＤ３１マイクロビーズ（Ｍｉｌｅｎｙｉカタログ番号１３０−０９１−９３５）を使用して精製した。磁性分取後に得られた集団は、（ＣＤ３１＋ＣＤ１０５＋）内皮細胞の精製された集団を生じた。内皮細胞を、アセチル化ＬＤＬの取り込み、フォンウィルブランド因子染色の発現、およびマトリゲルチューブ形成アッセイについて試験した。マトリゲルチューブ形成アッセイは、ｉＰＳＣ由来の内皮細胞の首尾のよい生成を示した。
【０２２６】
実施例１０
ＥＢ分化培地中にＦＧＦ−２を含めることによって造血前駆細胞の分化効率を増加させることができる
ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの分化を、以下の条件下で個別に評価した。細胞を、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足した成長因子を含まないＴｅＳＲ中で１日間前条件付けした。１００万細胞／ｍｌの細胞密度において、ＥＢを、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビターを補足したＥＢ基本培地（２０％ＢＩＴ−９５００、０．７５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（ａｃｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｎｉｎｅ）、ＮＥＡＡ、および０．１ｍＭモノチオグリセロールを補足したＩＭＤＭ）中で作製した。
【０２２７】
１２〜２４時間後、細胞を、以下の改変ＥＢ分化培地のうちの１つに入れた：（Ａ）  ２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２；（Ｂ）２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２５ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２；（Ｃ）５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２。ＥＢ培養物に、分化過程を通して４日毎に半量を補給した。ＥＢ培養物は、分化４〜５日目に部分的に再凝集させた。次いで、ＥＢ培養物を、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＬｔ−３リガンド、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、および１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦを含む培地に入れた。ＥＢ培養物に、分化過程を通して４日毎に半量を補給した。
【０２２８】
ＥＢ培養物を分化１２日目に採取し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａ（Ｇｌｙ−ａ）の発現率を定量した。ＨＰＣの生成効率を、ＥＢ分化１２日目のＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋二重陽性細胞の絶対数を開始時のＥＳ／ｉＰＳ細胞数で割ることによって決定した。
【０２２９】
結果：ＥＢ１分化におけるＦＧＦ−２の補足により、過程の効率がｉＰＳＣ（ｉＰＳ−ＳＯＮＬ）について６〜１２％およびｈＥＳＣ（Ｈ１  ＥＳ細胞）について８〜２１％増加した。図９は、ｈＥＳＣ（Ｈ１）およびｉＰＳＣ（ＳＯＮＬ）細胞株におけるＦＧＦ補足を使用した効率の増加をまとめている。図１０は、（５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、および２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２）を含む改変ＥＢ１培地の存在下での種々のｉＰＳ細胞株の全分化を示す。
【０２３０】
実施例１１
ＥＢ分化培地へのＴＰＯ、ＩＬ−６、およびＩＬ−３の含有
ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足した成長因子を含まないＴｅＳＲ中で１日間個別に前条件付けした。ＥＢを、１μＭ  ＲＯＣＫインヒビター（Ｈ−１１５２）を補足したＥＢ基本培地（２０％ＢＩＴ−９５００、０．７５％ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（ａｃｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｎｉｎｅ）、ＮＥＡＡ、および０．１ｍＭモノチオグリセロールを補足したＩＭＤＭ）中での細胞（１００万〜２００万細胞／ｍｌの細胞密度）の次の培養によって生成した。１２〜２４時間後、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ
ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足したＥＢ基本培地中に入れた。ＥＢ培養物に、分化過程を通して４日毎に半量を補給した。ＥＢ培養物は、分化４〜５日目に部分的に再凝集した。
【０２３１】
次いで、ＥＢ培養物を、（Ａ）２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、１０ｎｇ／ｍｌ
ＧＭＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３；（Ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６；（Ｃ）５０ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６；または（Ｄ）２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６のいずれかを補足したＥＢ基本培地であった第２のＥＢ培地（「ＥＢ２」）中で培養した。
【０２３２】
ＥＢ培養物に、分化過程を通して４日毎に半量を補給し、ＥＢ培養物を、分化１２日目に採取した。ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａ（Ｇｌｙ−ａ）のそれぞれの細胞発現率を定量した。造血前駆細胞（ＨＰＣ）の生成効率を、ＥＢ分化１２日目のＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋二重陽性細胞の絶対数を開始時のＥＳ／ｉＰＳ細胞数で割ることによって決定した。
【０２３３】
結果：ＥＢ２培地へのＴＰＯ、ＩＬ−６、およびＳＣＦの補足により、ＨＰＣの生成効率がｉＰＳ−ＳＯＮＬについて１５〜５５％さらに増加した。Ｈ１  ＥＳ細胞は、２１〜２８％の増加が明らかとなった。図１１に示すように、上記の改変ＥＢ２培地を使用してｈＥＳＣ（Ｈ１）およびｉＰＳ（ＳＯＮＬ）細胞株においてＨＰＣへの分化の増加が認められた。図１２は、（Ｈ１）およびｉＰＳ（ＳＯＮＬ）細胞株における改変ＥＢ２組み合わせ（Ｄ）を使用した効率の増加を示す。血清代替物３（Ｓｉｇｍａ）は、分化過程の血清代替物としてＢＩＴ−９５００より優れていることが認められた。
【０２３４】
実施例１２
分化培養条件における低酸素および酸素正常状態の評価
ｍＴｅＳＲを使用してマトリゲルコーティングしたプレート上での無フィーダー成長に適合させた未分化のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを、５％Ｏ２（低酸素）および２０％Ｏ２（酸素正常状態）条件の存在下で少なくとも５継代維持した。
【０２３５】
ＥＢ分化を、以下の条件下で評価した：
（Ａ）酸素正常状態条件下での未分化細胞の維持および酸素正常状態条件下での１２日間のＥＢ分化（「Ｎ−Ｎ」）；
（Ｂ）酸素正常状態条件下での未分化細胞の維持および低酸素条件下での１２日間のＥＢ分化（「Ｎ−Ｈ」）；
（Ｃ）低酸素条件下での未分化細胞の維持および酸素正常状態条件下での１２日間のＥＢ分化（「Ｈ−Ｎ」）；
（Ｄ）低酸素条件下での未分化細胞の維持および低酸素条件下での１２日間のＥＢ分化（「Ｈ−Ｈ」）。
【０２３６】
細胞を、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−βおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補足した成長因子を含まないＴｅＳＲ中で１日間前条件付けした。１２〜２４時間後、１００万細胞／ｍｌの細胞密度の細胞を、上記の実施例に記載のように５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含む改変されたＥＢ基本培地中に入れた。ＥＢ培養物に、分化過程を通して４日毎に半量を補給した。ＥＢ培養物は、分化４〜５日目に部分的に再凝集した。次いで、ＥＢ培養物を、２５ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、２５ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６を補足したＥＢ基本培地中でさらに培養した。ＥＢ培養物に、分化過程を通して４日毎に半量を補給した。
【０２３７】
ＥＢ培養物を分化１２日目に採取し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４１、およびＣＤ２３５ａ（Ｇｌｙ−ａ）をそれぞれ発現した細胞の比率を定量した。ＨＰＣの生成効率を、ＥＢ分化１２日目のＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋二重陽性細胞の絶対数を開始時のＥＳ／ｉＰＳ細胞数で割ることによって決定した。
【０２３８】
結果：図１３は、酸素正常状態条件および低酸素条件でのｉＰＳ細胞からのＨＰＣの生成を示す。ＥＢ分化は、低酸素条件および酸素正常状態条件下で行われた。ＥＢ分化を低酸素条件で行った場合、より高いＨＰＣレベルが認められた。低酸素条件下での未分化のＥＳ／ｉＰＳ細胞の維持は、分化過程にいかなる有意な利点も付加しなかった。グルコホリンＡ発現細胞は、酸素正常状態条件下で減少した。
【０２３９】
本明細書中に開示された全ての方法および組成物、ならびに特許請求の範囲に記載の全ての方法および組成物を、本開示を考慮して過度の実験を行うことなく作製および実施することができる。本発明の組成物および方法が好ましい実施形態の立場から記載されているが、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなく、変更形態を、本明細書中に記載の方法および組成物に、ならびに方法の工程または一連の工程で適用することができることが当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的、および生理学的に関連する一定の薬剤を本明細書中に記載の薬剤の代わりに使用することができ、同一または類似の結果が達成されるであろうということが明らかであろう。当業者に明らかな全てのかかる類似の代替形態および修正形態は、添付の特許請求の範囲に定義の本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
【０２４０】
参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書中に記載のものを補足する例示的手順または他の詳説を提供する範囲で、本明細書中で具体的に参考として援用される。
【０２４１】
【化４】
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【０２４２】
【化５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【外国語明細書】
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