(57)【要約】【課題】新規な抗ウイルス剤を提供することを目的とする。【解決手段】微細藻類シュードコリシスチス  エリプソイディア  セキグチ  エト  クラノ  ジェン  エト  エスピー  ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.）ＭＢＩＣ１１２０４株から抽出された抽出物を有効成分として含有する抗ウイルス剤。前記抽出物としては、例えば、前記微細藻類からアルコールを用いて抽出された抽出物が挙げられる。前記アルコールとしては、例えば、エタノールが挙げられる。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類シュードコリシスチス  エリプソイディア  セキグチ  エト  クラノ  ジェン  エト  エスピー  ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.）ＭＢＩＣ１１２０４株から抽出された抽出物を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記抽出物は、前記微細藻類からアルコールを用いて抽出された抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記アルコールは、エタノールであることを特徴とする請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
前記抽出物は、前記微細藻類からアルコールを用いて抽出を行った後の前記微細藻類から、熱水を用いて抽出された抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、藻類は、食品、飼料等に利用されている。藻類の利用方法の一つとして、コッコミクサ藻体の抽出物を有効成分とする抗ウイルス剤が開示されている（特許文献１参照）。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４４１１５２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１で示されるような藻体は細胞単独に対して抗ウイルス活性があるのみで、様々な感染防御機能も考慮した生体試験で抗ウイルス活性を示す藻体は知られていない。本発明は以上の点に鑑みなされたものであり、新規な抗ウイルス剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の抗ウイルス剤は、微細藻類シュードコリシスチス  エリプソイディア  セキグチ  エト  クラノ  ジェン  エト  エスピー  ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.）ＭＢＩＣ１１２０４株から抽出された抽出物を有効成分として含有する。本発明の抗ウイルス剤は、高い抗ウイルス活性を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】性器ヘルペスの重症度（ｌｅｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）の記録結果を表すグラフである。
【図２】感染３日後における性器内の単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の量を表すグラフである。
【図３】感染３日後におけるＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮＷＳ／３３株、Ｈ１Ｎ１亜型）の量を表すグラフである。
【図４】Ａ型インフルエンザウイルス感染後におけるマウス体重の推移を表すグラフである。
【図５】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス血清中の中和抗体価を表すグラフである。
【図６】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス気道洗浄液（ＢＡＬＦ）中の中和抗体価を表すグラフである。
【図７】感染３日後におけるＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮＷＳ／３３株、Ｈ１Ｎ１亜型）の量を表すグラフである。
【図８】Ａ型インフルエンザウイルス感染後におけるマウス体重の推移を表すグラフである。
【図９】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス血清中の中和抗体価を表すグラフである。
【図１０】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス気道洗浄液（ＢＡＬＦ）中の中和抗体価を表すグラフである。
【図１１】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後における糞便抽出物のＩｇＡ量を表すグラフである。
【図１２】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス気道洗浄液（ＢＡＬＦ）中のＩｇＡ量を表すグラフである。
【図１３】Ａ型インフルエンザウイルス感染後におけるマウス体重の推移を表すグラフである。
【図１４】感染３日後におけるＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮＷＳ／３３株、Ｈ１Ｎ１亜型）の量を表すグラフである。
【図１５】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス血清中の中和抗体価を表すグラフである。
【図１６】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス気道洗浄液（ＢＡＬＦ）中の中和抗体価を表すグラフである。
【図１７】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス糞便抽出物のＩｇＡ量を表すグラフである。
【図１８】Ａ型インフルエンザウイルス感染１４日後におけるマウス気道洗浄液（ＢＡＬＦ）のＩｇＡ量を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の実施形態を説明する。本発明で用いる微細藻類シュードコリシスチス  エリプソイディア  セキグチ  エト  クラノ  ジェン  エト  エスピー  ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.）ＭＢＩＣ１１２０４株は、２００５年２月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４０１として寄託され、２００６年１月１８日付でプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４８４として国際寄託に移管されている。
【０００８】
ＭＢＩＣ１１２０４株は、窒素を充分に含む培地で培養してもよいし、この後窒素欠乏培地で培養してもよい。抽出物は、例えば、ＭＢＩＣ１１２０４株から、アルコール(例えばエタノール)、熱水等を抽出溶媒として用いた抽出により得ることができる。抽出は、例えば、複数種類の抽出媒体を用いて順次行うことができる。例えば、ＭＢＩＣ１１２０４株から、アルコールを用いて抽出を行い、その残渣から、熱水を用いて抽出を行うことができる。抗ウイルス剤は、例えば、１つの抽出溶媒における抽出物を含んでいてもよいし、複数の抽出溶媒における各抽出物の混合物を含んでいてもよい。
【０００９】
抽出を行う際、例えば、ＭＢＩＣ１１２０４株を乾燥（例えば凍結乾燥）させた乾燥藻体を作成し、その乾燥藻体から抽出を行うことができる。
抽出物は、例えば、カラムクロマトグラフィー等の方法で分画することができる。抗ウイルス剤は、抽出物全体を含むものであってもよいし、一部の画分（例えば、抗ウイルス活性が特に高い画分）を含むものであってもよい。
【００１０】
抗ウイルス剤の剤型は特に限定されず、例えば、液状、粉末状、固形状等とすることができる。抗ウイルス剤における抽出物の濃度は特に限定されず、容量、用途、用法等に応じて適宜設定することができる。抗ウイルス剤は、適宜、抽出物以外の各種成分を含んでいてもよい。
＜実施例＞
（１）Ｎ充分の培地での微細藻類の培養
脱塩水を用いて下記表１に示す組成の培地を５００ｍＬ作り、これを扁平なガラスフラスコ（稼働容量５００ｍＬ）に入れ加圧滅菌した。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
この培地にＭＢＩＣ１１２０４株を植菌し、フラスコに通気性のある栓をした。フラスコ内に３％のＣＯ２を付加した空気を通気すると同時に、フラスコ内の培養液を攪拌した。このとき、フラスコの周囲から白色蛍光ランプにより光を照射した。また、フラスコを恒温水槽に浸けて内部の温度を２８℃付近に調節した。
【００１３】
藻体の乾燥重量をＭＢＩＣ１１２０４株の生育の指標として経時的に測定した。対数増殖期の比増殖速度は０．０７９ｈ−１であり、８．８時間に１回細胞分裂した。藻体が充分増殖したとき、上記培養液のうち３００ｍＬを回収し、その３００ｍＬから藻体を遠心分離した。その後、藻体を凍結乾燥し、５２０．４ｍｇの乾燥藻体Ｓ１を得た。
（２）Ｎ欠乏培地で微細藻類の培養
上記（１）と同様に、上記表１に示す組成の培地５００ｍＬでＭＢＩＣ１１２０４株を培養した。培養液のうち４００ｍＬを回収し、その４００ｍＬから藻体を遠心分離した。遠心分離の条件は、１５、０００ｒｐｍ、１０分間とした。
【００１４】
次に、遠心分離した藻体を、上記表１に示す組成からＮａＮＯ３を除いた窒素欠乏培地で２回洗浄し、さらに該窒素欠乏培地を用いて同じ条件で３日間培養した。このことにより、細胞内に炭化水素を蓄積した藻体を含む培養液が得られた。上記培養液のうち３００ｍＬを回収し、回収した３００ｍＬから藻体を遠心分離した。その後、藻体を凍結乾燥し、８８４．７ｍｇの乾燥藻体Ｓ２を得た。
（３）エタノールを用いた抽出
１００ｇの乾燥藻体Ｓ１に対し、１Lのエタノールを添加して分散させ、暗所で３日間静置した。静置後、ろ過して、１次ろ液と残渣とに分離した。この残渣に上記と同様に１Ｌのエタノールを添加して分散させ、３日間静置した後再度ろ過して２次ろ液と残渣とに分離した。このろ過操作をもう一度繰り返し、３次ろ液と残渣とを得た。
【００１５】
１次ろ液、２次ろ液、及び３次ろ液を混合し、エバポレーターでエタノールを留去し、減圧乾燥してエタノール抽出物ＤＥを８．５ｇ得た。また、乾燥藻体Ｓ１の代わりに同量の乾燥藻体Ｓ２を用い、上と同様の方法で、エタノール抽出物ＤＥ’を８．７ｇ得た。
【００１６】
８．５ｇのエタノール抽出物ＤＥをメタノールに懸濁させた後、合成吸着剤（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０  三菱化学（株）製）を充填したカラムに付した。合成吸着剤の量は５００ｇであり、カラムの内径は３．５ｍｍであり、カラムの軸長は６０ｃｍである。
【００１７】
カラムに対し、第１の展開溶媒（蒸留水）、第２の展開溶媒（メタノールと蒸留水とを体積比１：１で含む溶媒）、第３の展開溶媒（メタノール）、及び第４の展開溶媒（アセトン）を、この順序で、それぞれ、１．５Lずつ流し、エタノール抽出物ＤＥを分画した。それぞれの画分を室温で減圧乾燥し、分画されたエタノール抽出物を得た。
【００１８】
第１の展開溶媒の画分に含まれる成分をエタノール抽出物ＤＥ１とした。得られたエタノール抽出物ＤＥ１は７７７．９ｍｇであった。第２の展開溶媒の画分に含まれる成分をエタノール抽出物ＤＥ２とした。得られたエタノール抽出物ＤＥ２は１３９．１ｍｇであった。第３の展開溶媒の画分に含まれる成分をエタノール抽出物ＤＥ３とした。得られたエタノール抽出物ＤＥ３は１．７８ｇであった。第４の展開溶媒の画分に含まれる成分をエタノール抽出物ＤＥ４とした。得られたエタノール抽出物ＤＥ４は３．２６ｇであった。
【００１９】
２．１ｇのエタノール抽出物ＤＥ４を、分取クロマトグラフィー用シリカゲル（シリカゲル６０、メルク製）を充填したカラムに付した。シリカゲルの充填量は３０ｇであり、シリカゲルの粒径は０．０６３−０．２００ｍｍであり、カラムの内径は２ｃｍであり、カラムの軸長は２０ｃｍである。
【００２０】
カラムに対し、展開溶媒Ａ〜Ｇをこの順序で流し、エタノール抽出物ＤＥ４をさらに分画した。展開溶媒Ａ〜Ｇは、それぞれ、以下のものである。
展開溶媒Ａ：ｎ−ヘキサン
展開溶媒Ｂ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチルとを、体積比５：１で混合した溶媒
展開溶媒Ｃ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチルとを、体積比３：１で混合した溶媒
展開溶媒Ｄ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチルとを、体積比１：１で混合した溶媒
展開溶媒Ｅ：ｎ−ヘキサンと酢酸エチルとを、体積比１：３で混合した溶媒
展開溶媒Ｆ：酢酸エチル
展開溶媒Ｇ：酢酸エチルとメタノールとを、体積比１：１で混合した溶媒
展開溶媒Ａの画分を室温で減圧乾燥させ、２１６．３ｍｇの抽出物（以下、エタノール抽出物ＤＥ４−ａとする）を得た。また、展開溶媒Ｅの画分を室温で減圧乾燥させ、１７０．３ｍｇの抽出物（以下、エタノール抽出物ＤＥ４−ｂとする）を得た。
（４）熱水を用いた抽出
上記（３）において乾燥藻体Ｓ１からエタノール抽出物ＤＥを抽出した後の残渣に蒸留水１Ｌを加え、８５℃で１ｈ加熱後、ろ過して１次ろ液と残渣とに分離した。さらに、その残渣に１Lの蒸留水を添加して残渣を分散させ、再度８５℃で１ｈ加熱後、ろ過して２次ろ液と残渣とに分離した。
【００２１】
得られた１次ろ液と２次ろ液とを混合し、室温で減圧濃縮し、凍結乾燥させることにより熱水抽出物ＤＷ１７．０ｇを得た。
次に、熱水抽出物ＤＷに４Ｌのエタノールを加えて４℃で一晩静置した。静置後、上清と沈殿とに分離した。上清は室温で減圧濃縮し、凍結乾燥させることにより上清成分ＤＬ７．５ｇを得た。一方、上記沈殿を遠心分離し、得られた沈降をエタノール１Ｌで洗浄後、蒸留水１Ｌに溶解させた後に凍結乾燥させ、沈降成分ＤＨ８．２ｇを得た。
【００２２】
また、上記（３）において乾燥藻体Ｓ２からエタノール抽出物ＤＥ‘を抽出した後の残渣に蒸留水１Ｌを加え、８５℃で１ｈ加熱後、ろ過して１次ろ液と残渣とに分離した。さらに、その残渣に１Lの蒸留水を添加して残渣を分散させ、再度８５℃で１ｈ加熱後、ろ過して２次ろ液と残渣とに分離した。得られた１次ろ液と２次ろ液とを混合し、室温で減圧濃縮し、凍結乾燥させることにより熱水抽出物ＤＷ’１０．５ｇを得た。
（５）オイル抽出残渣からの熱水を用いた抽出
１９．７ｇの乾燥藻体Ｓ２に対し、５００ｍＬのｎ−ヘキサンを添加して乾燥粉体Ｓ２を分散させた。その後、室温で１日静置し、オイルを抽出した。静置後、ろ過してオイルを含むろ液とオイル抽出残渣とに分離した。残渣には上記と同様に５００ｍＬのｎ−ヘキサンを添加して残渣を分散させ、１日静置した後、再度ろ過してろ液とオイル抽出残渣とに分離した。この操作をもう一度繰り返し、ろ液とオイル抽出残渣とを得た。
【００２３】
オイル抽出残渣を室温で減圧乾燥した。得られたオイル抽出残渣に蒸留水１Ｌを加え、８５℃で１ｈ加熱後、ろ過して１次ろ液と残渣とに分離した。残渣に上記と同様に１Lの蒸留水を添加して残渣を分散させ、再度８５℃で１ｈ加熱後、ろ過して２次ろ液と残渣とに分離した。得られた１次ろ液と２次ろ液とを混合し、室温で減圧濃縮し、凍結乾燥させることにより、オイル抽出残渣からの熱水抽出物ＤＯを７．０ｇ得た。
（６）単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に対する抗ウイルス剤の効果を確認するための試験
サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ２、ＤＥ４、ＤＥ４−ａ、ＤＥ４−ｂを用い、以下の方法で、ＨＳＶ−２に対する効果を試験した。
【００２４】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、５週齢）（ｎ＝５）に、ＨＳＶ−２を接種し、感染させた。ＨＳＶ−２は１回、局所投与した。１回の投与量は、１×１０４ＰＦＵ（プラーク形成単位）／２０μＬ／ｍｏｕｓｅとした。この「１×１０４ＰＦＵ／２０μＬ／ｍｏｕｓｅ」とは、１×１０４ＰＦＵのウイルスを２０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えたものを、１匹のマウスに投与することを意味する。
【００２５】
なお、ウイルス接種の６日前、及び１日前に、それぞれ、ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ 17-acetate（３ｍｇ／０．１ｍＬ／ｍｏｕｓｅ）をマウスに皮下注射しておいた。
【００２６】
また、ウイルス接種の１時間前から７日後まで、１日２回サンプルを局所投与した。１回のサンプル投与量は、１ｍｇ／２０μＬ／ｍｏｕｓｅとした。この「１ｍｇ／２０μＬ／ｍｏｕｓｅ」とは、１ｍｇのサンプルを２０μＬの１％ＤＭＳＯ添加ＰＢＳに溶解したものを、１匹のマウスに投与することを意味する。
【００２７】
ウイルス接種の３日後に、マウスの局所をＰＢＳで洗浄し、その中のウイルス量をプラーク法で測定した。ウイルス量については、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対する有意差を、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１で表した。
【００２８】
また、ウイルス接種の日から、その１４日後まで、死亡例や性器ヘルペスの発症の程度（ｌｅｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）を記録した。ｌｅｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅの記録結果を図１に示す。図１における「１」〜「５」はそれぞれ以下を意味する。
【００２９】
１：腫脹あり
２：腫脹及び発赤あり
３：液滲出あり
４：後ろ足麻痺
５：死亡
この結果から、エタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ２、ＤＥ４、ＤＥ４−ａ、ＤＥ４−ｂは、ヘルペスウイルスの発症程度を抑制することがわかった。また、感染３日後におけるウイルス量を図２に示す。この結果から、エタノール抽出物ＤＥは、ウイルス生産量を有意に低下させることがわかった。
（７）Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤の効果を確認するための試験
サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ’、熱水抽出物ＤＷ、ＤＷ’、ＤＯ、上清成分ＤＬ、沈降成分ＤＨを用い、以下の方法で、Ａ型インフルエンザウイルスに対する効果を試験した。
（７−１）体重、ウイルス量、及び中和抗体価の測定
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、６週齢）（ｎ＝１０）に、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮＷＳ／３３株、Ｈ１Ｎ１亜型）を経鼻接種し、感染させた。ウイルスの接種量は、１×１０４ＰＦＵ／５０μＬ／ｍｏｕｓｅとした。この「１×１０４ＰＦＵ／５０μＬ／ｍｏｕｓｅ」とは、１×１０４ＰＦＵのウイルスを５０μＬのＰＢＳに加えたものを、１匹のマウスに投与することを意味する。
【００３０】
ウイルス接種の日の１週間前から、１週間後までの２週間にわたって、サンプルを１日２回（９時および１８時）、マウスに経口投与した。投与量は、５ｍｇ／ｄａｙとした。
ウイルス接種の日から、２週間にわたって、マウスの体重及び死亡数を記録した。サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、ＤＷ、ＤＬ、ＤＨを投与した群では死亡例はなかった。一方、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、感染６日後に１匹が死亡した。
【００３１】
マウス体重の推移を図４、図８、図１３に示す。図４に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、熱水抽出物ＤＷを投与した群は、感染７日後まではＣｏｎｔｒｏｌ群と同程度の体重減少を示したが、８日後からの体重の回復はＣｏｎｔｒｏｌ群よりも早かった。特に、エタノール抽出物ＤＥを投与した群の回復は一層早かった。
【００３２】
また、図８に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、熱水抽出物ＤＷ、ＤＷ’、ＤＯを投与した群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、感染７日後までの体重減少が少なく、その後の回復が早かった。また、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ‘を投与した群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、感染１０日後までの体重変化は同程度であったが、その後の回復は早かった。
【００３３】
また、図１３に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、上清成分ＤＬ、沈降成分ＤＨを投与した群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、体重減少が少なかった。
また、ウイルス接種の日から３日後に、半数（５匹）のマウスから、気道洗浄液（ＢＡＬＦ）及び肺を採取した。ＢＡＬＦは、０．８ｍＬの氷冷したＰＢＳをカテーテルから気道に入れ、気道を洗浄して得た液である。ＢＡＬＦを採取した後に、肺を摘出した。肺及びＢＡＬＦのそれぞれについて、それらに含まれるウイルス量を測定した。感染３日後におけるウイルス量を図３、図７、図１４に示す。
【００３４】
図３に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、熱水抽出物ＤＷを投与した群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、ウイルス増殖を抑制していた。特に、ＤＷを投与した群は、ウイルス増殖を顕著に抑制していた。
【００３５】
また、図７に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ’、熱水抽出物ＤＷ、ＤＷ’、ＤＯを投与した群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、ウイルス増殖を抑制していた。
【００３６】
また、図１４に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、上清成分ＤＬ、沈降成分ＤＨを投与した群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べ、ウイルス増殖を抑制していた。
また、ウイルス接種の日から１４日後に、残り半数のマウスから、血液、ＢＡＬＦ、及び糞便を採取した。そして、この血液及びＢＡＬＦを用いて、以下に示すとおり、中和抗体価格を測定した。
【００３７】
血液から血清を遠心分離し、非働化した。このとき、遠心分離の条件は、３、０００ｒｐｍ、４℃とし、非働化の条件は５６℃、３０分間とした。一方、ＢＡＬＦは、採取後すぐに−８０℃で保存した。
【００３８】
血清をＰＢＳで適宜希釈した液（以下、血清希釈液とする）と、ＢＡＬＦをＰＢＳで適宜希釈した液（以下、ＢＡＬＦ希釈液とする）とをそれぞれ作成した。
血清希釈液１００μｌと、ウイルス液（Ａ型インフルエンザウイルスを２、０００ＰＦＵ／ｍＬの濃度で含む液）１００μｌとを、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓに加えて混合した。以下では、この混合液を、血清−ウイルス混合液とする。血清−ウイルス混合液は、体積が２００μｌであり、その中に２００ＰＦＵのＡ型インフルエンザウイルスを含む。
【００３９】
また、ＢＡＬＦ希釈液１００μｌと、ウイルス液１００μｌとを、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓに加えて混合した。以下では、この混合液を、ＢＡＬＦ−ウイルス混合液とする。ＢＡＬＦ−ウイルス混合液は、体積が２００μｌであり、その中に２００ＰＦＵのＡ型インフルエンザウイルスを含む。
【００４０】
また、ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＢＳ１００μｌと、ウイルス液１００μｌとを、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓに加えて混合した。以下では、この混合液を、ｃｏｎｔｒｏｌ液とする。ｃｏｎｔｒｏｌ液は、体積が２００μｌであり、その中に２００ＰＦＵのＡ型インフルエンザウイルスを含む。
【００４１】
血清−ウイルス混合液、ＢＡＬＦ−ウイルス混合液、及びｃｏｎｔｒｏｌ液を、それぞれ、３７℃で１時間処理してから、３５−ｍｍ  ｄｉｓｈｅｓに単層状に培養したＭＤＣＫ 細胞へ、１００μＬ／ｄｉｓｈの量で加えて、室温で感染させた。１時間後に、寒天培地（２ｍＬ／ｄｉｓｈ）を重層し、３７℃で２日間培養した。培地を除去後、クリスタルバイオレット液で固定・染色し、プラーク数を測定した。血清−ウイルス混合液、及びＢＡＬＦ−ウイルス混合液におけるプラーク数を計算し、Ｃｏｎｔｒｏｌ液におけるプラーク数を１００％とした時の５０％阻害希釈倍数を求め、それを中和抗体価とした。
【００４２】
感染１４日後における血清−ウイルス混合液の中和抗体価を図５、図９、図１５に示す。また、感染１４日後におけるＢＡＬＦ−ウイルス混合液の中和抗体価を図６、図１０、図１６に示す。
【００４３】
図５、図６に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、熱水抽出物ＤＷを投与した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びオセルタミビル（Ｆ．ホフマン・ラ・ロシュ製）を投与した群に比べて、中和抗体価が高かった。  
【００４４】
また、図９、図１０に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ’、熱水抽出物ＤＷ、ＤＷ’、ＤＯを投与した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びオセルタミビルを投与した群に比べて、中和抗体価が高かった。  
【００４５】
また、図１５、図１６に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、上清成分ＤＬ、沈降成分ＤＨを投与した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びオセルタミビルを投与した群に比べて、中和抗体価が高かった。  
【００４６】
なお、上記のように、中和抗体価が高くなる原因としては、エタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ’、熱水抽出物ＤＷ、ＤＷ’、ＤＯ、上清成分ＤＬ、沈降成分ＤＨが免疫系刺激効果を有するためであると推定される。
（７−２）ＩｇＡの測定
ウイルス接種の日から１４日後に採取した糞便に、１０倍量のＰＢＳを加え、室温で１５分間放置した後、ボルテックスミキサーで処理した。その後さらに１５分間放置してから、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）により上清を得た。以下では、この上澄みを糞便抽出物とする。一方、ウイルス接種の日から１４日後に採取したＢＡＬＦをＰＢＳで５倍希釈した。以下では、この希釈液を５倍希釈ＢＡＬＦとする。  
【００４７】
次に、以下の手順でＥＬＩＳＡを実施し、ＩｇＡを測定した。
ａ）抗原（精製したウイルス、１μｇ／ｍＬ ｏｆ ＰＢＳ）を、ＥＬＩＳＡ用９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ （ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ製）に５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃で１時間処理した。
【００４８】
ｂ）ＰＢＳ−Ｔ液でｗｅｌｌを３回洗浄した。ここで、ＰＢＳ−Ｔ液とは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（製品名Ｔｗｅｅｎ−２０）を、０．５％の濃度で含むＰＢＳ溶液である。
【００４９】
ｃ）５％スキムミルク（ＰＢＳに溶解したもの）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、４℃で一晩ブロッキング処理した。
ｄ）ＰＢＳ−Ｔでｗｅｌｌを３回洗浄した。
【００５０】
ｅ）上記の糞便抽出物または５倍希釈ＢＡＬＦを５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間処理した。
ｆ）ＰＢＳ−Ｔでｗｅｌｌを３回洗浄した。
【００５１】
ｇ）二次抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間処理した。
【００５２】
ｈ）ＰＢＳ−Ｔでｗｅｌｌを３回洗浄した。
ｉ）基質溶液（０．４ｍｇ／ｍＬ ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ＋ １０μＬ／ｍＬ Ｈ２Ｏ２）を５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２０分間放置した。
【００５３】
ｊ）４Ｎ硫酸（２５μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、反応を停止させた。
ｋ）４９０ｎｍで吸光度を測定し、糞便抽出物の場合には３本のチューブに分割してそれぞれを測定し、５倍希釈ＢＡＬＦの場合には各サンプルを２回測定した。その平均値を用いて、検量線からＩｇＡ量を求めた。
【００５４】
なお、検量線は、次のように作成した。すなわち、マウスＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、６．２５、  １２．５、  ２５、  ５０、  １００、  ２００、  １０００、  及び５０００ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ調製し、各濃度のマウスＩｇＡを、５０μＬ／ｗｅｌｌずつＥＬＩＳＡ用９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓに加え（各濃度当たり３ｗｅｌｌｓ）、３７℃、１時間処理後、上記のｂ）→ｃ）→ｄ）→ｇ）〜ｋ）の操作を行い、ＩｇＡ量と４９０ｎｍでの吸光度測定値から、検量線を作成した。
【００５５】
感染１４日後における糞便抽出物のＩｇＡ量を図１１、図１７に示す。また、  感染１４日後における５倍希釈ＢＡＬＦのＩｇＡ量を図１２、図１８に示す。
図１１、図１２に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、ＤＥ’、熱水抽出物ＤＷ、ＤＷ’、ＤＯを投与した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びオセルタミビルを投与した群に比べて、ＩｇＡ量が高かった。特に、エタノール抽出物ＤＥを投与した群におけるＩｇＡ量の増加が顕著であった。
【００５６】
また、図１７、図１８に示すように、サンプルとしてエタノール抽出物ＤＥ、上清成分ＤＬ、沈降成分ＤＨを投与した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びオセルタミビルを投与した群に比べて、ＩｇＡ量が高かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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