(57)【要約】【課題】ラマン分光装置において、試料セル中の被測定物質をラマン散乱デバイスの表面又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度且つ高精度なラマン分光分析を行う。【解決手段】ラマン分光装置１は、流動性を有する試料が充填または流下される試料セル２０と、試料接触面１０Ｓに対して励起光Ｌ１を照射させることによりプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体１０と、測定光照射光学系４０と、被測定物質から生じ、プラズモン増強場により増強されたラマン散乱光Ｌｓを試料接触面１０Ｓと反対側から検出する検出手段５０と、試料Ｓに対して電圧を印加して、被測定物質を試料接触面側に電気泳動させる電圧印加手段３０とを備えてなる。プラズモン活性基体１０は、透明基板上に、透明電極層と、親水性の透明絶縁体層と、金属微細凹凸構造とを順次備えてなり、試料接触面に前記透明絶縁体層の一部が露出されている。【選択図】図１
2015096829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調製された被測定物質を含んでなる流動性を有する試料が充填または流下される試料セルと、
前記試料に接触するように配置されてなり、試料接触面に対して励起光を照射させることにより前記試料接触面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と、
前記試料接触面に測定光を照射する測定光照射光学系と、
前記測定光の照射により前記被測定物質から生じ、且つ、前記プラズモン増強場により増強されたラマン散乱光を前記プラズモン活性基体の前記試料接触面と反対側の表面側から検出する検出手段と、
前記試料に対して電圧を印加して、該試料中の前記被測定物質を前記プラズモン活性基体の前記試料接触面側に電気泳動させる電圧印加手段とを備えてなるラマン分光装置であって、
前記プラズモン活性基体が、透明基板上に、透明電極層と、該透明電極層を被覆してなる親水性の透明絶縁体層と、該透明絶縁体層上に形成されてなる金属微細凹凸構造とを順次備えてなり、
前記試料接触面に前記透明絶縁体層の一部が露出されており、
前記電圧印加手段は、前記透明電極層と、前記試料を介して前記プラズモン活性基体に対して対向配置された対向電極とを備えたものであるラマン分光装置。
【請求項２】
前記透明絶縁体層の主成分が金属水酸化物又は金属酸化物の水和物である請求項１に記載のラマン分光装置。
【請求項３】
前記透明絶縁体層が微細凹凸構造を有する請求項１又は２記載のラマン分光装置。
【請求項４】
前記透明絶縁体層の少なくとも微細凹凸構造がバイヤーライト又はベーマイトからなる請求項３記載のラマン分光装置。
【請求項５】
前記試料接触面に、前記被測定物質と化学結合する表面修飾が施されたものである請求項１〜４いずれか１項記載のラマン分光装置。
【請求項６】
前記試料が複数種の前記被測定物質を含むものであり、
前記透明電極層が、独立して電圧印加が可能な複数の領域を備え、且つ、
該領域に電圧を印加することによって前記被測定物質が電気泳動される前記試料接触面が、前記領域毎に異なる前記表面修飾が施されてなる請求項１〜５いずれか１項記載のラマン分光装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定物質を含む試料を、光照射により表面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と接触させ、活性基体表面の被測定物質に測定光を照射することにより生じるラマン散乱光の検出を実施する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光分析は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）を得る分析法であり、物質の同定等に利用されている。ラマン散乱光は微弱な光であるが、光照射によりプラズモン増強場を生じうる金属微細凹凸構造等を表面に備えたプラズモン活性基体を利用して、ラマン散乱光の信号光を増強させて感度良く検出するＳＥＲＳ（Surface Enhanced Raman Scattering: 表面増強ラマン散乱）デバイスやそれらを用いたセンシング装置の研究開発が活発に行われている。
【０００３】
プラズモン増強場は、プラズモン増強場を生じる表面（センシング面）上が最も強く、該面からの距離に対して指数関数的にその強度が減少することが知られており、センシング時に、被測定物質がセンシング面の近くにあればあるほど高感度なセンシングを行うことができる。従って、ＳＥＲＳデバイスを用いたラマン分光分析では、試料溶液中の被測定物質のセンシング面近傍における濃度をできるだけ高くすることが重要な課題の１つとなっている。
【０００４】
本出願人は、電気泳動法により被測定物質をＳＥＲＳデバイスのセンシング面に被測定物質を引き寄せた状態でラマン分光分析を行うことができる装置及びその方法を既に出願している（特許文献１）。特許文献１によれば、試料セル中の被測定物質を、ラマン散乱デバイスのセンシング面又はその近傍に効果的に引き寄せて高感度なラマン分光分析が可能となる。
【０００５】
一方、特許文献１のように、流下させたサンプル側からラマン散乱光を検出する場合、サンプル自体がラマン散乱光に対する遮蔽体となり、微弱なラマン散乱光を高いＳ／Ｎで受光するのは困難である。
本発明者は、かかる課題を解決しうるものとして、表面に透明な微細凹凸構造を備えた透明基板と、この微細凹凸構造表面に形成された金属膜とを備えたＳＥＲＳデバイス、及びそれを備えたラマン分光装置を出願している（特許文献２）。特許文献２によれば、試料接触面とは反対側からラマン散乱光を検出することができるため、液体サンプルが散乱体となることによるS/Nの低下を抑制して高精度なラマン分光分析を実施することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１６４５８４号公報
【特許文献２】特開２０１２−０６３２９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１及び特許文献２のラマン分光装置では、測定時に、いずれもＳＥＲＳデバイスの微細凹凸構造を有する試料接触面近傍に微細な気泡を生じやすく、この気泡により試料接触面近傍における被測定物質濃度の向上効果を最大限に得られているとは言い難い。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、試料セル中の被測定物質をラマン散乱デバイスの表面又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度且つ高精度なラマン分光分析を行うことができるラマン分光装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のラマン分光装置は、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調製された被測定物質を含んでなる流動性を有する試料が充填または流下される試料セルと、
試料に接触するように配置されてなり、試料接触面に対して励起光を照射させることにより試料接触面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と、
試料接触面に測定光を照射する測定光照射光学系と、
測定光の照射により被測定物質から生じ、且つ、プラズモン増強場により増強されたラマン散乱光を、プラズモン活性基体の試料接触面と反対側の表面側から検出する検出手段と、
試料に対して電圧を印加して、試料中の被測定物質をプラズモン活性基体の試料接触面側に電気泳動させる電圧印加手段とを備えてなるラマン分光装置であって、
プラズモン活性基体が、透明基板上に、透明電極層と、この透明電極層を被覆してなる親水性の透明絶縁体層と、この透明絶縁体層上に形成されてなる金属微細凹凸構造とを順次備えてなり、
試料接触面に透明絶縁体層の一部が露出されており、
電圧印加手段は、透明電極層と、試料を介してプラズモン活性基体に対して対向配置された対向電極とを備えたものである。
【００１０】
本明細書において、「被測定物質が電気泳動性を有する」とは、被測定物質が荷電状態にあり、電場によって移動できる性質を有することを意味する。
また、試料は、試料セル内全体に充填又は流下されてもよいし、試料セル内の一部に充填又は流下されてもよい。
【００１１】
本明細書において、「透明」とは、プラズモン活性基体に照射される光、および該光により被検体から生じる光、照明光に対し、透過率が５０％以上であることをいうものとする。なお、これらの光に対して、透過率は７５％以上、さらには９０％以上であることが好ましい。
【００１２】
本明細書において、「対向電極」は、プラズモン活性基体に対して正面対向でも斜め対向でも構わない。また、プラズモン活性基体と対向電極との間に試料が存在するのであれば、対向電極の位置は特に制限されない。したがって、対向電極は試料中には配置されずに試料セルに取り付けられてもよいし、試料中に配置されてもよい。
【００１３】
本発明のラマン分光装置において、透明絶縁体層が微細凹凸構造を有することが好ましい。また、透明絶縁体層の主成分は、金属水酸化物又は金属酸化物の水酸化物であることが好ましく、透明絶縁体層の少なくとも微細凹凸構造は、バイヤーライト又はベーマイトからなることが好ましい。
【００１４】
本明細書において、「主成分」とは、含量８０質量％以上の成分を意味する。
【００１５】
試料接触面には、被測定物質と化学結合する表面修飾が施されていることが好ましい。試料が複数種の前記被測定物質を含むものである場合は、透明電極層が、独立して電圧印加が可能な複数の領域を備え、且つ、この領域に電圧を印加することによって被測定物質が電気泳動される試料接触面が、領域毎に異なる表面修飾が施されてなることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のラマン分光装置は、透明基板上に、透明電極層と、この透明電極層を被覆してなる親水性の透明絶縁体層と、この層上に形成されてなる金属微細凹凸構造を順次備えたプラズモン活性基体をラマン散乱デバイスとして備え、試料接触面である金属微細凹凸構造を有する面に試料中の被測定物質を電気泳動により引き寄せた状態で、プラズモン活性基体の裏面側（試料接触面と反対側）からプラズモン増強場によって増強されたラマン散乱光を検出する。かかる構成では、ラマン散乱デバイスの試料接触面に、親水性の透明絶縁体層の一部が露出されていることから、試料接触面近傍に微細な気泡を多量に生じる虞がない。また、金属微細凹凸構造との絶縁性が確保された状態で透明電極層に電圧を印加することができるので、電気泳動時の電圧印加で生じるラマン散乱デバイス表面を構成する金属微細凹凸構造からの金属溶出及びそれに伴う構造破壊を生じる虞もない。従って、本発明によれば、電気泳動により液体試料中の被測定物質をプラズモン増強場である試料接触面又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度且つ高精度なラマン分光分析を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係る一実施形態のラマン分光装置の概略構成図
【図２】本発明に係る一実施形態のラマン分光装置のプラズモン活性基体の構成を示す斜視図
【図３】図２のプラズモン活性基体の構成を示す厚み方向断面模式図
【図４】図３のプラズモン活性基体の製造方法を説明するための断面模式図
【図５】プラズモン活性基体の透明電極層の構成の一例を示す上面図
【図６】図２のプラズモン活性基体の上面及び厚み方向断面のＳＥＭ像。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「ラマン分光装置」
以下、図面を参照して本発明に係る一実施形態のラマン分光装置について説明する。
図１は、本実施形態のラマン分光装置１の概略構成図、図２はラマン分光装置１においてラマン散乱デバイスを構成するプラズモン活性基体１０の構成を示す斜視図、図３は、同概略断面図である。なお、本明細書では、視認しやすくするために、各部の縮尺は適宜変更して示してある。
【００１９】
本実施形態のラマン分光装置１は、試料接触面１０Ｓに励起光Ｌ１が照射されることにより、試料接触面１０Ｓにプラズモン増強場を生じる板状のプラズモン活性基体（ラマン散乱デバイス）１０と、ラマン散乱デバイス１０上に備えられて、ラマン散乱デバイス１０上に液体試料Ｓを保持可能とする筒体２１と蓋体２２とにより構成される試料セル２０と、試料Ｓに対して電圧を印加して、試料Ｓ中の被測定物質をプラズモン活性基体１０の試料接触面側１０Ｓに電気泳動させる電圧印加手段３０と、ラマン散乱デバイス１０の試料接触面１０Ｓに測定光Ｌ１を照射する測定光照射光学系４０と、測定光Ｌ１の照射により被検出物質により発せられるラマン散乱光Ｌｓを検出する検出手段５０と、測定位置を特定するための照明観察系６０とを備えたものである。
【００２０】
図２，図３に示されるように、ラマン散乱デバイス１０は、透明基板１１上に、透明電極層１２と、透明電極層１２を被覆してなる親水性の透明絶縁体層１３と、その上に形成されてなる金属微細凹凸構造１４とを順次備えてなる。ラマン散乱デバイス１０の試料接触面１０Ｓは、金属微細凹凸構造１４と、金属微細凹凸構造１４のギャップ部分（凹部）に露出された透明絶縁体層１３とにより構成されており、励起光の照射により、局在プラズモン共鳴が誘起され、この局在プラズモン共鳴により金属膜２４の表面に増強された光電場を生じさせるものである。
【００２１】
試料Ｓ中の被測定物質をラマン散乱デバイス１０の試料接触面側１０Ｓに電気泳動させる電圧印加手段３０は、試料セル２０の外側に配設されており、ラマン散乱デバイス１０の透明電極層１２と、試料セル２０の蓋体２２からなる対向電極とに電圧を印加するための電源３１及び配線３２とにより構成されている。
【００２２】
本実施形態において、試料セル２０は、絶縁体の筒体２１と、そのものが透明な対向電極である蓋体２２とからなる態様について示してあるが、蓋体２２は、試料接触面１０Ｓに被測定物質を効果的に電気泳動可能な構成であればよく、かかる態様に限定されるものではない。例えば、蓋体２２の試料接触面側に、電圧印加を大きく阻害しない絶縁体層を備えた構成としてもよい。また、本実施形態のように照明観察系を備え、試料セル上面より照明光Ｌ２を照射する場合は、蓋体２２は照明光Ｌ２に対して透明である必要があるが、それ以外の場合は蓋体２２に透明性は必ずしも必要ではない。
【００２３】
試料セル２０には、電気泳動性を有する、若しくは電気泳動性を有するようあらかじめ調製された被測定物質を含んでなる流動性を有する試料Ｓが充填されている。本実施形態において、試料Ｓは試料セル内に充填されてなる態様についてのみ示してあるが、試料セル２０がフローセルであり、試料Ｓが流下される態様であってもよい。
【００２４】
測定光照射系４０は、ＤＦＢレーザ等の単波長光源４１と、光源４１から出射された測定光（励起光）Ｌ１のスペクトルを先鋭化するレーザラインフィルタ４２と、測定光Ｌ１を反射するダイクロイックミラー４３，４４と、ラマン散乱デバイス１０の試料接触面１０Ｓに測定光を集光させる集光レンズ４５を備えている。ダイクロイックミラー４３，４５は、測定光Ｌ１の９０％以上反射するものであることが好ましい。本実施形態では、測定光Ｌ１が試料接触面１０Ｓと反対側の面から照射される態様について示してあるが、測定光Ｌ１の照射は試料接触面１０Ｓ側から実施してもよい。
【００２５】
検出手段５０は、測定光Ｌ１の照射により被検出物質により発せられる増強ラマン散乱光Ｌｓと試料接触面における被測定物質の位置情報を含む透過光Ｌｐを含む光Ｌ３を集光させる集光レンズ５７と、集光した光Ｌ３のうち光Ｌｐ以外の光Ｌ４を反射するダイクロイックミラー５３と、光Ｌ４を透過するダイクロイックミラー５５と、光Ｌ４のうち測定光Ｌ１を反射し、それ以外の光を透過するノッチフィルタ５４と、ノイズ光を除去するためのピンホール板５３と、ノッチフィルタ５４を透過した増強ラマン散乱光Ｌｓを、ピンホール板５３のピンホールへ集光するためのレンズ対５２と、ピンホールを通った増強ラマン散乱光Ｌｓを検出してラマンスペクトルを得る分光検出器５１とを備えている。
【００２６】
測定位置を特定するための照明観察系６０は、キセノンランプ光源等の光源６１と、光源６１から発せられる照明光Ｌ２と、照明光Ｌ２を平行化させて試料セル２０中に入射させて試料接触面１０Ｓを照明させるレンズ６２と、被検出物質により発せられる増強ラマン散乱光Ｌｓ及び試料接触面における透過光Ｌｐを含む光Ｌ３のうち、透過光Ｌｐを透過させるダイクロイックミラー６４と、ダイクロイックミラー６４を透過した透過光Ｌｐを検出するＣＣＤカメラ６７とにより構成されている。本実施形態では、ダイクロイックミラー６４を透過した透過光Ｌｐは、ミラー６５で反射され、集光レンズ６６により、ＣＣＤカメラに結像されている。
【００２７】
光源６１から発せられる照明光Ｌ２は、金属微細凹凸構造の金属が金である場合は、波長４００〜５３０ｎｍの光であることが好ましく、ラマン散乱デバイス１０の一表面側から照明光Ｌ２を照射した際に、裏面側に透過してくる全光量（可視領域４００〜７５０ｎｍ）のうち、４０％以上がこの波長範囲内の光であることがより好ましい。
【００２８】
ラマン分光装置１を用いた測定は、まず、試料Ｓを調製し、試料Ｓを試料セル２０内に充填した後、電圧印加手段３０によって試料Ｓに電圧を印加して被測定物質を電気泳動させてラマン散乱デバイス１０の試料接触面１０Ｓに被測定物質を引き寄せる。被測定物質を引き寄せた状態で、照明観察系６０により試料接触面１０Ｓの位置情報を取得し、結像された情報に基づいて測定光Ｌ１の照射位置を決定し、その位置に励起光Ｌ１が集光させ、被測定物質からのラマン散乱光Ｌｓを、ラマン散乱デバイス１０の試料接触面と反対側から、検出手段５０により検出する。
【００２９】
電圧印加手段３０により印加する電圧の極性は、電気泳動性を有する被測定物質が帯びている電荷と反対の極性とし、印加する電圧の大きさは、被測定物質を熱的あるいは電気的に破壊しない大きさとする。
【００３０】
このように、ラマン分光装置１は、透明基板１１上に、透明電極層１２と、透明電極層１２を被覆してなる親水性の透明絶縁体層１３と、この層上に形成されてなる金属微細凹凸構造１４を順次備えたラマン散乱デバイス（プラズモン活性基体）１０を備え、試料接触面１０Ｓである金属微細凹凸構造１４を有する面に試料Ｓ中の被測定物質を電気泳動により引き寄せた状態で、ラマン散乱デバイス１０の裏面側（試料接触面１０Ｓと反対側）からプラズモン増強場によって増強されたラマン散乱光Ｌｓを検出する。かかる構成では、金属微細凹凸構造１４との絶縁性が確保された状態で透明電極層１２に電圧を印加することができるので、電気泳動時の電圧印加で生じるラマン散乱デバイス表面１０Ｓを構成する金属微細凹凸構造１４からの金属溶出及びそれに伴う構造破壊を生じる虞がない。また、ラマン散乱デバイスの試料接触面に、親水性の透明絶縁体層１３の一部が露出されていることから、試料接触面近傍に微細な気泡を多量に生じる虞もない。従って、本発明によれば、電気泳動により液体試料中の被測定物質をプラズモン増強場である試料接触面１０Ｓ又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度且つ高精度なラマン分光分析を行うことができる。
【００３１】
本実施形態でのラマン分光装置１では、複数の被測定物質を含む試料Ｓの測定も可能である。この場合には、電気泳動速度の違いを利用して試料を分離し、ラマン散乱デバイス１０の試料接触面１０Ｓに引き寄せられた順に測定を実施することができる。かかる測定を実施する場合には、１種の被測定物質の測定を終えるごとに、ラマン散乱デバイス１０を取り出して、試料接触面１０Ｓの洗浄を実施することが好ましい。
【００３２】
ラマン散乱デバイス１０は、試料接触面１０Ｓに被測定物質とイオン結合する表面修飾又は共有結合する表面修飾が施されたものであることが好ましい。かかる構成では、被測定物質がイオン結合又は共有結合によって試料接触面１０Ｓに対して強固に吸着され、好ましい。かかる場合には、試料接触面１０Ｓにおける被測定物質の濃度が高くなり、好ましい。
【００３３】
被測定物質とイオン結合する表面修飾と、被測定物質と共有結合する表面修飾とを同時に施してもよいし、これらの表面修飾を順次実施しても構わない。また、これらの表面修飾の表面修飾位置は特に制限されず、これらの表面修飾同士が互いに結合していてもよいし、これらの表面修飾は互いに独立して試料接触面１０Ｓに結合していてもよい。
【００３４】
被測定物質が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被測定物質とイオン結合する表面修飾としては、被測定物質と反対荷電を有する表面修飾基を用いることができ、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、４級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジニウム基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基を有するものが挙げられる。試料接触面１０Ｓは、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
【００３５】
被測定物質が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被測定物質と共有結合する表面修飾としては、Ｎ−ヒドロキシスクニンイミジルエステル等の反応性エステル基、カルボジイミド基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基、ヒドラジド基、チオール基、反応性ジスルフィド基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシド基、（メタ）アクリレート基、ヒドロキシル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基を有するものが挙げられる。試料接触面１０Ｓは、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
例示した表面修飾基の中でも、反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等が好ましい。
【００３６】
試料接触面１０Ｓに対して、被測定物質とイオン結合する表面修飾を施し、さらにこの表面修飾を、被測定物質と共有結合する表面修飾で活性化することが特に好ましい。この場合、被測定物質とイオン結合する表面修飾と、被測定物質と共有結合する表面修飾とが互いに近接しており、１つ1つの被測定物質がイオン結合及び共有結合によって試料接触面１０Ｓに対して強固に吸着されることとなり、好ましい。
【００３７】
例えば、はじめに試料接触面１０Ｓに被測定物質とイオン結合するカルボキシ基を導入し、さらに導入したカルボキシ基を反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等の被測定物質と共有結合する官能基の形態に誘導して、活性化することが好ましい。
【００３８】
被測定物質とイオン結合する表面修飾基と、被測定物質と共有結合する表面修飾基とを両方備えた表面修飾物質としては、
４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−へプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸、１１，１１’−チオジウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する分子；
アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、及びセルロース等のヒドロゲル、又はこれらの誘導体（例えばカルボキシメチル誘導体）；
ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリエチレングリコール等の水膨潤性有機ポリマー等が挙げられる。
例えば被測定物質がアデニンの場合、被測定物質とイオン結合する表面修飾基と、被測定物質と共有結合する表面修飾基とを両方備えた表面修飾物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、及びカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等が好ましく用いられる。
【００３９】
ラマン散乱デバイス１０として、上記のような試料接触面１０Ｓに被測定物質とイオン結合する表面修飾又は共有結合する表面修飾が施されたものを用いる場合は、試料接触面１０Ｓに被測定物質が化学結合によって吸着されているので、表面修飾と被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後、電圧印加を止めてからラマン散乱光Ｌｓの検出を実施しても高感度な測定を安定して実施することができる。
【００４０】
上記のように電圧印加を止めることができれば、ラマン散乱光Ｌｓの検出を実施する前に、ノイズとなる試料液を除去してからラマン散乱光の検出を実施することも可能である。ラマン散乱光Ｌｓの検出の際、試料液中で測定を実施する場合は、試料液中の測定対象ではない物質や溶媒のラマン散乱ピークが、被測定物質のラマン散乱ピークと重なって検出されることがあり、この場合、これら被測定物質以外のラマン散乱光はノイズとなるため、Ｓ／Ｎ比が低下してしまう。従って、表面修飾と被測定物質とを共有結合又はイオン結合させた後に、試料液が除去された状態でラマン散乱光の検出が実施される方が、高感度な検出をより安定して実施することが可能となり、好ましい。
【００４１】
試料液の除去は、試料接触面１０Ｓに被測定物質を結合させた後、電圧印加を止める前に実施してもよいし、止めた後に実施してもよい。
試料液の除去後のラマン散乱光の検出方法は、被測定物質と表面修飾との結合が切れない方法であれば特に制限されない。例えば、試料液を除去後、そのまま試料セル１０に液体のない状態でラマン散乱光の検出を実施してもよいし、溶液を除去した後、試料セル１０及び試料接触面１０Ｓを１回以上洗浄してからラマン散乱光の検出を実施してもよい。
【００４２】
洗浄の方法としては、超音波洗浄やラマン非活性かつ被測定物質に対して反応性を有さない溶媒を用いて洗浄する方法等が挙げられる。超音波洗浄を行う際は、被測定物質と表面修飾間の結合が切れない条件となるように注意する必要がある。ラマン非活性かつ被測定物質に対して反応性を有さない溶媒としては純水等が挙げられる。ここで、「ラマン非活性」とは、ラマン散乱ピークが、被測定物質のラマン散乱ピークと重ならないことを意味する。
【００４３】
洗浄後のラマン散乱光の検出は、試料セル１０に液体のない状態で実施してもよいし、試料セル１０をラマン非活性かつ被測定物質に対して反応性を有さない溶媒を注入してから実施してもよい。
【００４４】
「ラマン散乱デバイス（プラズモン活性基体）」
以下にラマン散乱デバイスであるプラズモン活性基体１０について、図２〜図５を参照して説明する。
【００４５】
既に述べたように、図２，図３に示されるように、ラマン散乱デバイス１０は、透明基板１１上に、透明電極層１２と、透明電極層１２を被覆してなる親水性の透明絶縁体層１３と、その上に形成されてなる金属微細凹凸構造１４とを順次備えてなる。ラマン散乱デバイス１０の試料接触面１０Ｓは、金属微細凹凸構造１４と、その凹部に露出された透明絶縁体層１４とにより構成されており、励起光の照射により、局在プラズモン共鳴が誘起され、この局在プラズモン共鳴により金属膜２４の表面に増強された光電場を生じさせるものである。
【００４６】
透明基板１１は特に制限されないが、ガラスや透明樹脂等の透明誘電体であれば特に制限されない。
【００４７】
透明電極層１２は、特に制限されないが、透明導電性酸化物を主成分とする層であることが好ましい。透明導電性酸化物としては、酸化インジウム錫（ＩＴＯ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）等が挙げられる。酸化亜鉛は、金属元素がドープされたものが、導電性優れることから好ましい。
【００４８】
図３の断面図において、透明電極層１２は、複数の領域に分割されている態様が示されている。透明電極層１２は、このように分割されていなくてもよいが、例えば、透明電極層１２が図５に示されるような複数領域に分割されており、複数領域で個別に電気泳動が可能なように配線３２を施してある態様とすることにより、複数回にわけてラマン散乱測定を実施することができる。
【００４９】
透明電極層１２を被覆してなる透明絶縁体層１３は、少なくとも金属微細凹凸構造１４を形成する面が親水性を有していれば特に制限されないが、水の接触角が５°未満（超親水性）であることが好ましい。透明絶縁体層１３の親水性を有する表面は、平坦なものであってもよいが、微細凹凸構造を備えていることが好ましい。透明絶縁体層１３の表面に微細凹凸構造を備えている場合は、その上に形成する金属微細凹凸構造１４を形成しやすく好ましい。
【００５０】
微細凹凸構造を表面に備え、水の接触角が５°未満の超親水性を有する透明絶縁体層１３としては、金属水酸化物又は金属酸化物の水酸化物が好ましく、ベーマイト層、バイヤーライト層等の金属酸化物の水和物層が特に好ましい。ベーマイト層及びバイヤーライト層は、親水性が高い上、微細で複雑な凹凸構造を表面に有しており、更に、金属または金属酸化物を水熱反応させることで形成できることから、簡単かつ大面積なデバイスを作製できるため好ましい。
【００５１】
ベーマイトとは、アルミニウムの水和物である。ベーマイト層１３は、例えば、透明電極層１２を備えた透明基板１１を純水洗浄した後、透明電極層１２上に、スパッタ法等によりアルミニウムを数十ｎｍ程度成膜した後、純水を沸騰させた中に、アルミニウム付き透明基板１１を浸水させ、煮沸処理することにより水熱反応させて形成することができる（ベーマイト処理）。
【００５２】
水熱反応の方法は、煮沸処理に限定されず、高温の水蒸気と反応させる工程であってもよい。なお、アルミニウム膜厚が数十ｎｍである場合は数分で透明なベーマイト層になるが、ベーマイト化する膜厚に応じて煮沸処理時間は適宜調整することが好ましい。
【００５３】
また、水熱反応させる金属としてアルミニウムを用いたが、金属酸化物又は水酸化物の水和物層を形成しうる他の金属であってもよい。また、アルミナ(Ａｌ２Ｏ３)のような金属酸化物であっても、同様に針状微細凹凸構造を形成することが可能である。また、これらの金属をガラス基板に積層する方法として、本実施形態ではスパッタ法を用いているが、加熱蒸着法やソルゲル法を用いてもよい。
【００５４】
その他、親水性を有する透明絶縁体層は、疎水性の透明絶縁体層の表面を親水化処理したものを用いてもよい。例えば、ガラス層の表面をリソグラフィーとドライエッチング処理することにより表面に微細凹凸構造を形成し、その後に親水化処理を施すことにより作成することができる。
【００５５】
微細凹凸構造は、金属微細凹凸構造１４を形成した試料接触面１０Ｓにおいて、励起光の照射により局在プラズモンを生じさせうる構造であれば特に制限されない。かかる構造は、一般に、凹凸の凸部の平均的な大きさおよび平均ピッチが励起光の波長より短いものとなる程度の微細な凹凸構造であればよいとされており、凸部頂点から隣接する凹部の底部までの平均深さが２００ｎｍ以下、凹部を隔てた最隣接凸部の頂点同士の平均ピッチが２００ｎｍ以下であることが望ましい。
【００５６】
透明絶縁体層１３の膜厚は、電気泳動において印加する電圧を印加した際に、透明絶縁体層１３上に形成される金属微細凹凸構造１４とが充分絶縁されていれば特に制限されないが、良好な絶縁性を有することから、１０ｎｍ以上であることが好ましい。
【００５７】
微細凹凸構造を有する透明絶縁体層１３の場合は、凹凸構造による絶縁性の低下を考慮し、上記絶縁性を充分確保できる膜厚となるように膜厚を調整すればよい。ベーマイト層の場合は、凸部における平均膜厚は、１７ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。
【００５８】
透明絶縁体層１３がベーマイト層のように微細凹凸構造を表面に備えている場合は、金属微細凹凸構造１４は、例えば、ベーマイト層１３が試料接触面１０Ｓに露出されるようにベーマイト層１３上に金属を蒸着等の気相成膜することにより形成することができる。金属微細凹凸構造１４の凸部同士ができるだけ接触せずに、ベーマイト層１３の表面の一部を面内均一性良く露出させるためには、金属微細凹凸構造１４は斜め蒸着法により形成することが好ましい。斜め蒸着法における蒸着方向は、基板面の法線対して６５°以上傾斜していることが好ましく、８０°以上９０°未満の角度傾斜していることがより好ましい。また、金属の蒸着膜厚は１０ｎｍ以上６０ｎｍ以下であることが好ましい。
【００５９】
蒸着法としては特に制限されず、ＥＢ蒸着等が挙げられる。また、ベーマイト層１３と金属微細凹凸構造１４との間に、クロム、チタン、ニッケル、鉄、ゲルマニウム、アルミニウムまたは亜酸化銅（Ｃｕ２Ｏ）などの金属の亜酸化物等のアンカー剤を挿入することで、ベーマイトと金属微細凹凸構造との密着性を高め、金属微細凹凸構造１４の耐久性を向上させることができる。アンカー剤の挿入は、金属微細構造１４を形成する前に、斜め蒸着等によって行うことが好ましい。
【００６０】
金属微細凹凸構造１４としては、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる金属からなるものであればよいが、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、およびこれらを主成分とする合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属からなるものである。特には、ＡｕあるいはＡｇが好ましい。
【００６１】
図６は、後記実施例において、実際に製造したラマン分光用デバイス（プラズモン活性基体）１０の上面及び厚み方向断面のＳＥＭ像である。図示されるラマン分光デバイス１０では、試料接触面１０Ｓは、複数の金属粒子からなる金属微細構造１４と、金属粒子間のギャップ（凹部）に露出されてなるベーマイト層１３とにより構成されている。
【００６２】
試料接触面１０Ｓが、金属微細凹凸構造１４と、その凹部に露出された親水性の透明絶縁体層１４とにより構成されている場合、液体試料はこの微細凹凸構造の間（凹部）に毛細管現象により浸透する。
毛細管現象により液体試料が微細凹凸構造に浸透する深さｈは、
ｈ＝２Ｔｃｏｓθ/ρｇｒ
（ただし、θ：接触角、Ｔ：表面張力、ρ：液体密度、ｇ：重力加速度、ｒ：微細凹凸構造間隔）
であるから、液体試料Ｓが浸透する深さは、接触角のｃｏｓθ倍となる。例えば、接触角８０°の誘電体と、接触角５°のベーマイトとを比較した場合、ベーマイト微細構造間を浸透する深さは、接触角８０°の誘電体微細構造間を浸透する深さの５．７倍以上になる。実際、接触角８０°の誘電体微細構造を用いた場合、電気泳動を行っても、試料接触面近傍に微細な気泡を多量に生じてしまい、電気泳動により被検出物質を引き寄せる効果を充分に得ることが難しい。
【００６３】
ラマン分光用デバイス１０は、親水性、好ましくは超親水性のベーマイト等の微細凹凸構造が試料接触面Ｓに露出されているので、液体試料に含まれる被測定物質をプラズモン増強場の生じる金属微細凹凸構造のギャップ部分（凹部）へ、効果的に引き寄せることができる。
【００６４】
また、ラマン分光用デバイス１０は、金属微細凹凸構造１３との絶縁性が確保された状態で透明電極層１２に電圧を印加することができるので、電気泳動時の電圧印加で生じるラマン散乱デバイス表面１０Ｓを構成する金属微細凹凸構造１３からの金属溶出及びそれに伴う構造破壊を生じる虞がない。
【００６５】
金属微細構造１３を形成している金属材料がＡｇである場合を例に説明すると、この金属微細構造１３自体を電極として動作させた場合、液体試料と接触し、直流電圧が印加されているＡｇの陽極においては、以下のような化学反応が起こる。
Ａｇ＋ＯＨ−  →  ＡｇＯＨ  ＋  ｅ−
これにより発生したＡｇＯＨは以下のように分解する。
２ＡｇＯＨ  →  Ａｇ２Ｏ  ＋  Ｈ２Ｏ
また、このＡｇ２Ｏは以下のように反応する。
Ａｇ２Ｏ  ＋  Ｈ２Ｏ  ⇔  ２ＡｇＯＨ  ⇔  ２Ａｇ＋  ＋  ２ＯＨ−
こうして発生したＡｇ＋は電解により陰極に引き付けられると、以下のように還元され析出する。
Ａｇ＋  ＋  ｅ−  →  Ａｇ
【００６６】
溶出するＡｇの量は、ファラデーの電気分解の法則より、流れた電気量Ｑ＝電流×時間に比例するから、測定時間が長く、また、印加する電圧が高いほど、その溶出量が増加し、その結果、Ａｇの微細凹凸構造が破壊され、プラズモン増強場を発生することができなくなる。したがって、電圧の大きさや時間に依存する、電気泳動パラメータの制御を行うことが不可能となってしまう。
【００６７】
一方で、本発明においては、Ａｇの金属微細凹凸構造は１３、電極１１とベーマイト１２の絶縁体層１３を介して接触しているため、電極間に電圧を印加した場合においても、電気的に浮いた状態となり、Ａｇが溶出するのを防ぐことができる。これにより、電圧を印可してもＡｇの微細凹凸構造を破壊することなく、電気泳動性を利用して、被測定物質をプラズモン増強場の生じる金属微細凹凸構造のギャップ部分（凹部）へ、ひきつけることができる。
【００６８】
従って、ラマン分光用デバイス１０は、電気泳動により液体試料中の被測定物質を、プラズモン増強場である試料接触面１０Ｓ又はその近傍に効果的に引き寄せて、高感度且つ高精度なラマン分光分析を行うことができる。
【００６９】
既に述べたように、試料接触面１０Ｓには、被測定物質と化学結合する表面修飾が施されていることが好ましい。試料が複数種の前記被測定物質を含むものである場合は、図５に示されるように、透明電極層１２が、独立して電圧印加が可能な複数の領域を備え、且つ、この領域に電圧を印加することによって被測定物質が電気泳動される試料接触面１０Ｓが、領域毎に異なる表面修飾（１５Ａ，１５Ｂ，１５Ｃ）を備えてなることが好ましい。かかる態様とすることにより、印加電圧による電気泳動と、被測定物質と表面修飾との親和性の組み合わせにより、被測定物質をより選択的にラマン散乱デバイスに近づけることができる。
【００７０】
図４は、ラマン散乱デバイス１０の製造方法の一例を示す模式図である。ラマン散乱デバイス１０の製造方法の一例として、透明絶縁体層１３にベーマイトを用いた場合について説明する。
【００７１】
まず、純水洗浄した板状の透明基板１１を用意し、その上に、透明導電層１２を形成する。透明導電層１２として、図５に示されるような電極層を形成する場合は、例えば、透明導電層１２としてＩＴＯやＺｎＯ等を透明基板１１上に成膜した後、リソグラフィーによりパターンを描画し、ドライエッチングにより透明導電層にパターンを形成する。あるいは、透明導電層として、ＩＴＯやＺｎＯ等透明基板１１上に成膜する際に、電極を形成しない部分にマスキングを施して、透明導電層のパターンを形成する。
【００７２】
次に、透明導電層１２上に、微細凹凸構造を有する親水性の透明絶縁体層１３（ベーマイト層）を形成する。まず、透明導電層１２の表面にスパッタ法によりアルミニウム層を数十ｎｍ程度成膜し、その後、純水を沸騰させた中に、アルミニウム層付き基板を浸水させ、数分（５分程度）後に取り出す。この煮沸処理（ベーマイト処理）により、アルミニウム層は透明化し、微細凹凸構造有する親水性の透明絶縁体層（ベーマイト層）となる。
次に、このベーマイト層１３上に金属微細凹凸構造１４を斜め蒸着により形成してラマン散乱デバイス１０を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の技術は、物質に単波長光を照射して得られる散乱光を分光してラマンスペクトルを得、物質の同定等を行うラマン分光装置に適用できる。
【符号の説明】
【００７４】
１  ラマン分光装置
１０  ラマン散乱デバイス（プラズモン活性基体）
１０Ｓ  試料接触面
１１  透明基板
１２  透明電極層、
１３  透明絶縁体層
１４  金属微細凹凸構造
２０  試料セル
２２  対向電極
３０  電圧印加手段
４０  測定光照射光学系
５０  検出手段
Ｓ  試料
Ｌ１  測定光、励起光
Ｌｓ  ラマン散乱光
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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