(57)【要約】【課題】本発明の目的は、最大短径１０ｍｍ以下のリンパ節の微小転移巣やリンパ節転移経路を同定することが可能であり、かつ、腫瘍として検出できるほどに転移が進んでいない状態で、予測的に転移リンパ節を特定することが可能である、リンパ節における転移のリスクを評価する方法を提供することにある。【解決手段】上記目的は、（１）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力を測定する工程と、（２）前記節内圧力が上昇傾向にある場合に、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する工程とを含む、リンパ節における転移のリスクを評価する方法により解決される。【選択図】図８Ｂ
2015192670.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るステップと、
（Ｂ）前記測定値から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価するステップと
をコンピュータに実現させるための、リンパ節における転移のリスクを評価するプログラム。
【請求項２】
前記所属リンパ節は、センチネルリンパ節である、請求項１に記載のプログラム。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプログラムを記録したコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項４】
（ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るリンパ節内圧力測定手段と、
（ｂ）前記リンパ節内圧力測定手段によって得られた節内圧力を解析して節内圧力の傾向を算出する演算手段と、
（ｃ）前記演算手段により算出された節内圧力の傾向から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する評価手段と
を備える、リンパ節における転移のリスクを評価するリンパ節転移評価装置。
【請求項５】
前記所属リンパ節は、センチネルリンパ節である、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
（１）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力を測定する工程と、
（２）前記節内圧力が上昇傾向にある場合に、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する工程と
を含む、リンパ節における転移のリスクを評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ節における転移のリスクを評価する方法に基づくプログラム、記憶媒体及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本における乳がん患者数は、女性のがん腫において第一位であり、乳がんの罹患者数及び死亡数の両方ともに年々増加傾向にある。２０１１年の乳がん罹患率は１８人に１人であり、死亡率も２０％にまで上昇している。乳がんは他の臓器と比べても転移が起こりやすく、近年の研究では比較的早期の段階でリンパ節転移が起こることが報告されている。このリンパ節転移の有無は、罹患者の生存率を大きく左右することから、乳がんのリンパ節転移の早期診断及び早期治療法の開発が望まれている。
【０００３】
リンパ節転移は、乳がんなどの悪性腫瘍を持つ患者の生存率に関わる重要な予後因子である。乳がんにおけるリンパ節転移の治療法としては、乳房周囲の腋窩リンパ節を取り除く腋窩リンパ節郭清が行われてきた。しかしながら、最近では、リンパ節に明らかに大きい転移がある場合以外は、局所放射線治療法や化学治療法と併用することで腋窩リンパ節郭清の有無による生存率に有意な差がないと報告され、臨床的意義が再検討されている。最低限のリンパ節郭清をおこなうためには、腋窩リンパ節の術前診断が有効である。腋窩リンパ節の術前診断としては、超音波機器で確認しながらリンパ節内に針を挿入して組織を取り出す針生検が知られている（非特許文献１を参照）。
【０００４】
リンパ系は、リンパ節の節内圧力（Ｉｎｔｅｒｎｏｄａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：ＩＮＰ）を一定に保つために重要な役割を担っている。回収系としての機能をもったリンパ管は、がん転移のルートになり得る。腫瘍細胞は周囲のリンパ管に浸潤すると、近傍にあるリンパ節へ移動する。腫瘍細胞が初めに浸潤したリンパ節はセンチネルリンパ節とよばれる。腫瘍を有するセンチネルリンパ節は腫瘍を有していないセンチネルリンパ節に比べて節内圧力が統計的に有意に高いことが報告されている（非特許文献２を参照）。また、非特許文献２では、腫瘍転移が見られた腋窩部におけるＩＮＰは、腫瘍が見出されなかった腋窩部におけるＩＮＰよりも、統計的有意に高かったことが報告されている。
【０００５】
固形腫瘍内及び腫瘍周辺において、正常な組織に比べてＩＦＰ（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が高い値を示すことが報告されている（非特許文献３〜７を参照）。特に、正常組織のＩＦＰが０ｍｍＨｇに近い値を示すのに対して、腫瘍内では１０〜４０ｍｍＨｇ程度の値になることが報告されている（非特許文献５〜７を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nathanson SD，B urke M，Slater R，Kapke A. Ann Surg Oncol. 2007; 14:3102-10
【非特許文献２】Nathanson SD，Mahan M. Ann Surg Oncol. 2011;18:3791-6.
【非特許文献３】Heldin CH, Rubin K，Pietras K，Ostman A. Nature reviews Cancer. 2004;4:806-13
【非特許文献４】Jain RK. Science.1996;271:1079-80
【非特許文献５】Curti BD，Urba WJ，Alvord WG，Janik JE，Smith JW，2 nd，Madara K，et al. Cancer research. 1993;53:2204-7.
【非特許文献６】MiIosevic MF，Fyles AW，Wong R，Pintilie M，Kavanagh MC，Levin，W et al. Cancer. 1998;82:2418-26
【非特許文献７】Swartz MA，Lund AW. Nature reviews Cancer. 2012;12:210-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に記載されているような従前の超音波、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴなどを用いた転移リンパ節の特定方法では、最大短径１０ｍｍ以下のリンパ節の微小転移巣やリンパ節転移経路を同定することが困難であるという問題がある。
【０００８】
そこで、従前の方法に見られる問題点を解決し得る方法が望まれる。特に、転移発見後の致死率が非常に高いことから、腫瘍として検出できるほどに転移が進んでいない状態で、予測的に転移リンパ節を特定することができる方法が望まれる。
【０００９】
そこでリンパ節内のＩＮＰの圧力を計測することによって、転移リンパ節を特定することが考えられる。確かに、非特許文献５〜７には、すでに腫瘍が形成された、又はすでに転移が見出されたリンパ節関連組織において、ＩＮＰなどが上昇することが記載されている。しかし、これらの文献には、ＩＮＰを測定することによって、予測的な転移リンパ節の特定が可能であることについて記載がない。
【００１０】
そこで、本発明は、従前の転移リンパ節の特定方法では困難である、最大短径１０ｍｍ以下のリンパ節の微小転移巣やリンパ節転移経路を同定することが可能であり、かつ、腫瘍として検出できるほどに転移が進んでいない状態で、予測的に転移リンパ節を特定することが可能である、リンパ節における転移のリスクを評価する方法並びに該方法の達成手段を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、ＭＸＨ１０／Ｍｏ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（略称：ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒ）マウスを用いて、腸骨下リンパ節に腫瘍細胞を接種し、この腸骨下リンパ節の所属リンパ節である腋窩リンパ節に転移巣を形成させ、センチネルリンパ節と二次リンパ節の両方のＩＮＰ値を測定することに成功した。そして、これらの測定結果により、二次リンパ節内ＩＮＰ値は腫瘍成長度と相関関係にあり、しかも驚くべきことに二次リンパ節の体積変化が生じる前にＩＮＰ値が増加することを突き止めた。センチネルリンパ節と二次転移リンパ節の両方のＩＮＰ値の計測から、リンパ節の転移経路を同定することができたという事実は、今回本発明者らによって初めてなされたものである。
【００１２】
このような本発明者らによってなし得たことに基づいて、二次リンパ節の圧力変化を測定することにより、腫瘍細胞の転移が起こり得るリンパ節を特定及び判定することに成功した。また、二次リンパ節の圧力変化を測定することにより、化学療法や放射線療法などによる抗腫瘍効果を判定し得るという知見を得た。本発明は、このような成功例や知見に基づき、完成された発明である。
【００１３】
したがって、本発明によれば、
（１）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力を測定する工程と、
（２）前記節内圧力が上昇傾向にある場合に、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する工程とを含む、
リンパ節における転移のリスクを評価する方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、
（Ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るステップと、
（Ｂ）前記測定値から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価するステップと、
をコンピュータに実現させるための、リンパ節における転移のリスクを評価するプログラムが提供される。
【００１５】
本発明の別の側面によれば、本発明のプログラムを記録したコンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、
（ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るリンパ節内圧力測定手段と、
（ｂ）前記リンパ節内圧力測定手段によって得られた節内圧力を解析して節内圧力の傾向を算出する演算手段と、
（ｃ）前記演算手段により算出された節内圧力の傾向から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する評価手段と
を備える、リンパ節における転移のリスクを評価するリンパ節転移評価装置が提供される。
【００１７】
本発明の方法、プログラム、媒体及び装置において、好ましくは、前記所属リンパ節が、センチネルリンパ節である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、従前のＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、超音波画像などを用いた方法では困難であった、最大短径１０ｍｍ以下のリンパ節の微小転移巣を同定することが可能である。また、リンパ節の節内圧力を測定することにより、従前の方法では困難であった、センチネルリンパ節やその下流に位置する二次リンパ節、三次リンパ節などの下流リンパ節などの所属リンパ節を同定することが可能である。これにより二次、三次リンパ節を確認することができ、低侵襲のリンパ節転移の治療法の開発や郭清範囲を低減することが期待できる。
【００１９】
本発明によれば、腫瘍として検出できるほどに転移が進んでいない状態で、予測的に転移リンパ節を特定することが可能であるという、格別顕著な効果が得られる。また、本発明によれば、化学療法や放射線療法などによる治療効果の判定が期待できる。特に、このような治療効果の判定は、超音波画像と併用して使用することによって、リアルタイムで、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴなどの非経済的な装置を使用せずに実施することが期待できる。
【００２０】
本発明によれば、上記した同定や判定を低コストかつリアルタイムで実施することが期待でき、さらにパソコン上で自動的に処理できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各遺伝子に対応する６種類のプライマーによりＰＣＲを実施した後、ゲル電気泳動を実施することによって、ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞が、血管新生に関与することで知られているＶＥＧＦファミリーやｂＦＧＦを発現することを確認した写真図である。
【図２】ＶＥＧＦ−Ａに対応するプライマーを用いてＰＣＲを実施した後、ゲル電気泳動を実施することによって、ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞がＶＥＧＦ−Ａを発現することを確認した写真図である。
【図３Ａ】腫瘍細胞接種直前に取得した、小動物用超音波高解像度イメージングシステム （ＶＥＶＯ）による腸骨下リンパ節内の超音波像を示した図である。
【図３Ｂ】腫瘍細胞接種直後に取得した、ＶＥＶＯによる腸骨下リンパ節内の超音波像を示した図である。
【図４】ＶＥＶＯで作成した腋窩リンパ節の三次元超音波画像を示した図である。
【図５】ＩＮＰ圧力測定システムの概略図である。ＳｉＬＮ：腸骨下リンパ節、ＰＡＬＮ：腋窩リンパ節
【図６】ＩＮＰ圧力測定システムを用いてＩＮＰを測定している最中の写真図である。
【図７Ａ】コントロール群マウスのＩＮＰ測定計画の簡略図である。図中の「ＩＶＩＳ」は生体イメージング観察装置（ＩＶＩＳ）で測定したルシフェラーゼ活性の測定日を表わし、「ＶＥＶＯ」は腋窩リンパ節の体積測定日を表わす。
【図７Ｂ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞接種群マウスのＩＮＰ測定計画の簡略図である。図中の「ＩＶＩＳ」はルシフェラーゼ活性の測定日を表わし、「ＶＥＶＯ」は腋窩リンパ節の体積測定日を表わす。
【図７Ｃ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞接種群マウスのＩＮＰ測定計画の簡略図である。図中の「ＩＶＩＳ」はルシフェラーゼ活性の測定日を表わし、「ＶＥＶＯ」は腋窩リンパ節の体積測定日を表わす。
【図８Ａ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスのＩＶＩＳにより取得したルシフェラーゼの発光を可視化した画像図である。
【図８Ｂ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスのＩＶＩＳにより腸骨下及び腋窩リンパ節のルシフェラーゼ発光量を算出して得たグラフ図である。
【図９Ａ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、ＩＶＩＳにより取得したルシフェラーゼの発光を可視化した画像図である。
【図９Ｂ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、ＩＶＩＳにより腸骨下及び腋窩リンパ節のルシフェラーゼ発光量を算出して得たグラフ図である。
【図１０Ａ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスについて、ＶＥＶＯにより取得した腋窩リンパ節最大滑面のＢ−ｍｏｄｅ超音波像図である。
【図１０Ｂ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスについて、ＶＥＶＯで取得した超音波像より腋窩リンパ節の体積の測定結果を算出して得たグラフ図である。
【図１１Ａ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、ＶＥＶＯにより取得した腋窩リンパ節最大滑面のＢ−ｍｏｄｅ超音波像図である。
【図１１Ｂ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、ＶＥＶＯで取得した超音波像より腋窩リンパ節の体積の測定結果を算出して得たグラフ図である。
【図１２Ａ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスについて、腸骨下リンパ節内のＩＮＰ測定値を表わしたグラフ図である。
【図１２Ｂ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスについて、腋窩リンパ節内のＩＮＰ測定値を表わしたグラフ図である。
【図１３Ａ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、腸骨下リンパ節内のＩＮＰ測定値を表わしたグラフ図である。
【図１３Ｂ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、腋窩リンパ節内のＩＮＰ測定値を表わしたグラフ図である。
【図１４Ａ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスについて、腸骨下リンパ節におけるルシフェラーゼ活性測定値とＩＮＰ測定値との関係を示した散布図である。
【図１４Ｂ】ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウスについて、腋窩リンパ節におけるルシフェラーゼ活性測定値とＩＮＰ測定値との関係を示した散布図である。
【図１５Ａ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、腸骨下リンパ節におけるルシフェラーゼ活性測定値とＩＮＰ測定値との関係を示した散布図である。
【図１５Ｂ】ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスについて、腋窩リンパ節におけるルシフェラーゼ活性測定値とＩＮＰ測定値との関係を示した散布図である。
【図１６】センチネルリンパ節切除後の二次リンパ節のＩＮＰ測定値を表わしたグラフ図である。
【図１７Ａ】実施例３に記載の担癌リンパ節の継時的なルシフェラーゼ活性の変化を示したグラフ図である。
【図１７Ｂ】実施例３におけるモデルマウスのＩＶＩＳにより取得したルシフェラーゼの発光を可視化した画像図である。
【図１８】実施例３における担癌リンパ節ＩＮＰの継時的な変化を示したグラフ図である。
【図１９】実施例３におけるＶＥＶＯを用いて測定したリンパ節の体積の継時的な変化を示したグラフ図である。
【図２０Ａ】実施例３におけるＶＥＶＯを用いて測定したリンパ節の血管密度の継時的な変化を示したグラフ図である。
【図２０Ｂ】実施例３におけるＶＥＶＯを用いて測定したリンパ節の血管密度に係る最大滑面のＢ−ｍｏｄｅ超音波像図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の詳細について説明する。
本発明は、リンパ節における転移のリスクを評価するプログラムに関し、少なくとも以下のステップ（Ａ）及び（Ｂ）をコンピュータに実現させるためのプログラムである。
（Ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るステップ
（Ｂ）前記測定値から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価するステップ
【００２３】
本発明のプログラムは、リンパ節における転移のリスクを評価する方法に基づき、該方法は少なくとも以下の工程（１）及び（２）を有する。
（１）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力を測定する工程
（２）前記節内圧力が上昇傾向にある場合に、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する工程
【００２４】
本発明において、「リンパ節における転移のリスクを評価する」こととは、例えば、原発巣から腫瘍細胞が初めに転移するリンパ節と呼ばれるセンチネルリンパ節、並びに、このセンチネルリンパ節から下流の所属リンパ節に腫瘍細胞が移動することによって生じる転移のリスクを評価することであると理解できる。また、転移のリスクの評価は、転移が現に見出せなくとも将来的に転移が見られる可能性があるという転移予測と、現に転移が発生していることを確認する転移検出との両方の意味を包含する。
【００２５】
固形腫瘍内及び腫瘍周辺においてＩＦＰが高くなる理由は、未だ明確な機序が解明されておらず、本発明の技術的範囲は如何なる推論によっても拘泥されるわけではないが、例えば、腫瘍生成にともない生じた腫瘍新生血管と、リンパ管の構造及び機能の異常に伴う微小血管とからの間質への間質液の流入が原因である可能性がある。一方で、ＩＮＰの上昇には、腫瘍新生血管からの漏出は寄与していない蓋然性がある。そこで、例えば、ＩＮＰの上昇は、被膜をもつエンカプセルドな領域であるリンパ節内において腫瘍が増殖したために引き起こされた可能性がある。ただし、ＩＮＰの上昇はリンパ節内腫瘍の増殖そのものと相関している蓋然性がある。
【００２６】
工程（１）では、被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力（ＩＮＰ）を測定する。
【００２７】
被験体はリンパ節を有する生物体であれば特に限定されず、例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコなどの哺乳動物などが挙げられるが、好ましくはヒトである。
【００２８】
所属リンパ節は原発巣から腫瘍細胞が移動して転移を発症する可能性が高いリンパ節であれば特に限定されず、例えば、原発巣と直結したリンパ節に加えて、原発巣の近傍の下流にあるリンパ節が含まれる。
【００２９】
本発明において、被験体における原発巣の所属リンパ節は、好ましくは原発巣の下流の所属リンパ節である。所属リンパ節は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、腋窩リンパ節、頸部リンパ節、胸部リンパ節、腹部リンパ節などが挙げられる。
【００３０】
リンパ節のＩＮＰを測定する手法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載のように、一つ目の口に圧力トランスデューサーを接続し、二つ目の口に生理食塩水を含んだシリンジを接続し、及び三つ目の口に注射針を接続する三方活栓を装備する装置を利用する手法が挙げられる。この装置を利用する場合、シリンジを押し込むことによって、注射針及び圧力トランスデューサー内を生理食塩水で満たし、注射針をリンパ節内に挿入することによって圧力を測定する。このようにして測定される圧力が節内圧力（ＩＮＰ）である。圧力トランスデューサーで検出した圧力は、圧力トランスデューサーと接続したトランスデューサー用増幅器により増幅した値として得ることが好ましい。さらに、トランスデューサー用増幅器と解析ソフトを搭載したパソコンとを接続し、パソコン上で連続的又は断続的に測定された圧力を収集及び解析することがより好ましい。
【００３１】
ＩＮＰは、例えば、リンパ節内に挿入する前後の差の値である節内ＩＮＰ値とする。ＩＮＰを測定するに際して、被験体の皮膚を切開して露わになったリンパ節に注射針を挿入してもよいし、被験体の皮膚の上からリンパ節の位置として見当をつけた部位に注射針を刺してもよい。ＩＮＰの測定中は、被験体を固定することが好ましく、麻酔下において被験体を固定することがより好ましい。
【００３２】
工程（２）では、工程（１）で測定したＩＮＰが上昇傾向にある場合に、ＩＮＰを測定した所属リンパ節又は別の所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する。
【００３３】
ＩＮＰが上昇傾向にあるか否かを判定する手法は特に限定されず、例えば、ＩＮＰを経時的に測定することによって、ＩＮＰが経時的に上昇する場合に、ＩＮＰが上昇傾向にあると判定することができる。この場合、ＩＮＰを測定する期間は特に限定されず、例えば、数時間〜数十日間を挙げることができ、好ましくは１日以上、より好ましくは３日以上、さらに好ましくは６日以上である。ＩＮＰを測定する間隔や回数は特に限定されず、例えば、測定期間内に等間隔又は不等間隔に数回〜数十回測定することを挙げることができ、測定期間内に６時間、１２時間、２４時間又は４８時間毎に測定することが好ましい。
【００３４】
例えば、原発巣が確認され次第、所属リンパ節のＩＮＰを測定し、ＩＮＰ値、例えば、検出下限のＩＮＰ値、好ましくは０．１Ｐａ以上のＩＮＰ値、より好ましくは１Ｐａ以上のＩＮＰ値、さらに好ましくは１０Ｐａ以上のＩＮＰ値、なおさらに好ましくは２０Ｐａ以上のＩＮＰ値を検出した場合に、ＩＮＰが上昇傾向にあるとして、測定したリンパ節には転移のリスクがあると評価することができる。
【００３５】
評価結果はどのように表わしてもよいが、例えば、測定したリンパ節が二次転移リンパ節になると予測すること、及び測定したリンパ節が二次転移リンパ節であると判定することなどのように表わすことができる。
【００３６】
本発明の方法を応用すれば、原発巣の治療の予後や効果を確認することができる。このような本発明の別の態様の方法として、例えば、以下の工程（１’）及び（２’）を含む、治療された原発巣の予後を評価する方法が挙げられる。
（１’）被験体における治療された原発巣の所属リンパ節の節内圧力を測定する工程
（２’）前記節内圧力が上昇傾向にある場合に、前記原発巣における治療が不十分であると評価する工程
【００３７】
また、本発明の別の態様の方法として、例えば、以下の工程（１’’）及び（２’’）を含む、原発巣を治療するための薬剤を評価する方法が挙げられる。
（１’’）被験体における治療された原発巣の所属リンパ節の節内圧力を測定する工程
（２’’）前記節内圧力が維持傾向にある場合に、前記治療が原発巣に対して効果を有すると評価する工程
【００３８】
本発明の別の態様の方法において、原発巣の治療は特に限定されず、例えば、原発巣の一部又は全部を切除する郭清治療、薬剤を投与する化学治療、放射線を照射する放射線治療などが挙げられる。このような治療を原発巣に施したとしても、所属リンパ節のＩＮＰが上昇傾向にある場合には、転移が発生する可能性があり、原発巣の治療が不十分であると評価できる。これとは逆に、所属リンパ節のＩＮＰが維持傾向にある場合には、転移が発生する可能性が減少しており、原発巣に対する一定の治療効果が得られたということができる。これらの本発明の別の態様の方法によれば、低侵襲の郭清や郭清回数の低減；薬剤のスクリーニングや薬剤投与の用法・用量を決定すること；放射線照射の時間や間隔を決定することなどが期待できる。
【００３９】
本発明の方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程の途中に、種々の工程や操作を加入することができる。そのような工程として、例えば、所属リンパ節のＩＮＰ測定以外の、他の転移や腫瘍の存在を確認する工程が挙げられる。例えば、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、超音波などのリンパ節画像を得る工程；所属リンパ節の間質液容量（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ：ＩＦＶ）を測定する工程；所属リンパ節の体積を測定する工程などが挙げられる。所属リンパ節のＩＮＰを測定する工程は、例えば、非特許文献２を参照して実施してもよい。また、所属リンパ節の体積を測定する工程は、後述する実施例の記載を参照して、ＶＥＶＯで連続的に撮影した所属リンパ節の二次元超音波画像をつなぎ合わせて三次元画像を作製し、次いでこの三次元画像の体積をＶＥＶＯソフト上で算出して所属リンパ節全体の体積を測定することにより実施できる。
【００４０】
本発明の方法の具体的態様は、例えば、以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
［具体的態様］
原発巣が発見された、又は原発巣が治療された被験体を麻酔下において、該原発巣の所属リンパ節が存在する位置の皮膚を切開し、皮膚組織を筋組織筋膜上で剥離した状態で固定する。次いで一つ目の口に圧力トランスデューサーを接続し、二つ目の口に生理食塩水を含んだシリンジを接続し、及び三つ目の口に注射針を接続する三方活栓を備える装置のシリンジを押し込むことで注射針及び圧力トランスデューサー内を生理食塩水で満たし、注射針を所属リンパ節内に挿入することによってＩＮＰを測定する。注射針をリンパ節の中心付近に挿入することによって、ＩＮＰを測定してもよい。得られたＩＮＰ測定値は、圧力トランスデューサーに接続したトランスデューサー用増幅器及びパソコンにより収集及び解析する。ＩＮＰが測定開始時から経時的に上昇する場合は、ＩＮＰが上昇傾向にある場合であり、測定した所属リンパ節には転移の可能性がある、又はすでに転移があると判定する。
【００４１】
本発明の方法において、リンパ節において転移のリスクがあると評価されたときは、ＩＮＰを測定した所属リンパ節やそれ以外の所属リンパ節に対して抗腫瘍治療を施すことが好ましい。このように本発明の方法によって、原発巣の下流側に存在する所属リンパ節の転移の早期治療や予防的治療が可能となる。
【００４２】
本発明のプログラムは、基本的に、上記した本発明の方法をコンピュータに実現させるための、リンパ節における転移のリスクを評価するプログラムである。
【００４３】
本発明の別の側面によれば、本発明のプログラムを記録したコンピュータ可読記憶媒体が提供される。媒体の種類は、例えば、磁気的又は電気的な媒体などを挙げることができるが、これらに限定されない。媒体の種類に応じて本発明のプログラムは記録され、その記録の方法は当業界において知られている方法を制限することなく利用できる。
【００４４】
本発明の別の側面によれば、本発明の方法、プログラムや媒体に基づく、リンパ節における転移のリスクを評価するリンパ節転移評価装置が提供され、このような装置は下記の通りの構成を採り得る：
（ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るリンパ節内圧力測定手段と、
（ｂ）前記リンパ節内圧力測定手段によって得られた節内圧力を解析して節内圧力の傾向を算出する演算手段と、
（ｃ）前記演算手段により算出された節内圧力の傾向から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価する評価手段。
【００４５】
本発明のリンパ節転移評価装置は、本発明のプログラムの実現を可能とする装置であり、本発明の技術的範囲に属するものである。本発明のリンパ節転移評価装置は、例えば、図５に示すとおりに、注射針、シリンジ及び圧力トランスデューサーを備えたＴ型コック栓並びに圧力トランスデューサー増幅装置（（ａ）リンパ節内圧力測定手段）と、本発明のプログラムをインストールしたコンピュータ（（ｂ）演算手段及び（ｃ）評価手段）とによって、本発明のプログラムを実現させるものとして構成することができる。
【００４６】
本発明のリンパ節転移評価装置の作動方法は、例えば、以下のステップ（Ａ）及び（Ｂ）を含む：
（Ａ）被験体における原発巣の所属リンパ節の節内圧力の測定値を得るステップ
（Ｂ）前記測定値から、節内圧力の上昇傾向を確認することにより、所属リンパ節において転移のリスクがあると評価するステップ
【００４７】
本発明のリンパ節転移評価装置の作動方法は、上記手順でデータを処理できる適当なコンピュータ・プログラム（又はソフトウェア）を作成することによって、コンピュータを用いて簡便に実施できる。そのようなコンピュータ・プログラムは、リンパ節転移評価装置の作動方法を実施するために使用できるものとして、それ自体有用なものとなり得る。このようなコンピュータ・プログラムの一例が、本発明のプログラムである。
【００４８】
本発明のプログラムや装置は、臨床の場面以外にも、試験や研究などの場面において使用することができる。また、本発明のプログラムや装置は、医師などの臨床での専門家だけでなく、専門家の補助者や装置の製造業者など特に限定することなく扱うことができる。臨床場面で使用する場合、医師の診断の前段・最中・後段の任意の段階で使用できる。したがって、本発明のプログラム及び装置は、所属リンパ節の転移を早期に発見する手段、又は所属リンパ節の転移を予防する目的で予備的な判定手段として使用することができ、さらに原発巣の抗腫瘍治療後の転移を防止する目的で事後的な判定手段としても使用できる。本発明のプログラム及び装置を用いた判定結果と医師の診断結果とを併用すれば、非常に高い精度で所属リンパ節の転移のリスクを評価できる。本発明のプログラム及び装置を、抗癌剤のスクリーニングや抗癌剤の性能評価に用いてもよい。
【００４９】
また、本発明のプログラムや装置は、原発巣からのがん転移によって誘発される所属リンパ節のＩＮＰの上昇を測定することで、リンパ節微小転移の有無やリンパ節間のリンパ流の方向の検出を可能にするものである。そこで、超音波画像診断装置と併用することにより、リアルタイムで術前、術中、術後の所属リンパ節における微小転移の検出を可能にすることに加えて、リンパネットワークの流れを把握することができることから、低侵襲のリンパ節郭清術や新たなリンパ行性の薬剤投与システムの開発が期待できる。
【００５０】
また、腫瘍内のＩＦＰの増加は薬剤送達量を減少させることや、低酸素状態を引き起こして放射線治療効果を低下させることが知られている。そこで、所属リンパ節の転移のリスクを早期に発見できれば、その分、効率的な化学治療や放射線治療が期待できる。したがって、本発明は、所属リンパ節における転移のリスクを評価することのみならず、所属リンパ節における転移の効率的な治療を達成することに資する。
【００５１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例１】
【００５２】
センチネルリンパ節及び二次リンパ節の両方の節内圧力（ＩＮＰ）を測定することにより、腫瘍細胞の転移が想定されるリンパ節を評価することが可能であり、かつ、化学療法や放射線療法などによる抗腫瘍効果の判定が可能であることを、下記のとおりに実証した。
【００５３】
［１．実験材料及び方法］
１−１．動物モデル
本発明者らが独自に開発したリンパ節腫脹マウスモデルＭＸＨ１０／Ｍｏ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（以下、ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒともよぶ。）を用いた（後述する参考文献１及び２を参照）。ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒは、ＭＲＬ／Ｍｐ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）マウス及びＣ３Ｈ／ＨｅＪ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（Ｃ３Ｈ／ｌｐｒ）マウスを基に２０世代以上兄妹交配して得られるリコンビナント近交系（ＲＩ）マウス群である。この系統群には、ランダムに糸球体腎炎、血管炎、関節炎などを種々の組み合わせで発症するラインが認められている。この群系統の中で特にリンパ節腫脹の発症度に安定性がみられる第１０系統がＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウスである。特に、ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウスの腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）及び腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）は、１２週齢程度でヒトのリンパ節と同等の大きさ（長径１０ｍｍ程度）まで腫脹し、可視化性及びアクセス性に優れている。ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウスは、アポトーシスに関するＦａｓ遺伝子を欠損しているが、髄質、皮質、傍皮質といった基本的なリンパ節の解剖学的構造は維持されている。さらに、このマウスの始祖であり、膠原病の疾患モデルマウスであるＭＲＬ／ＭｐＪ−ｌｐｒ／ｌｐｒにみられる致死的な糸球体腎炎を発症しない。
【００５４】
本実施例では、１４週齢から１６週齢のＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウス雌の合計７２匹を用いた。体重は２７〜３７ｇのものを用い、ノギスで測定した腸骨下及び内側腋窩リンパ節の長径はそれぞれ１０．８±１．９ｍｍ（ｍｅａｎ±ＳＤ；ｎ＝１２）及び１０．４±１．６ｍｍ（ｎ＝１２）であった。
【００５５】
１−２．腫瘍細胞
接種細胞には、マウス繊維芽細胞由来のＭＲＬ／ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞（参考文献３〜５を参照；以下、ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞ともよぶ。）及びマウス乳癌細胞由来のＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を使用した。ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞は、ＭＲＬ／ＭｐＴｎ−ｇｌｄ／ｇｌｄマウスの線維芽細胞由来の腫瘍細胞であるＭＲＬ／Ｎ１細胞にｐＥＧＦＰＬｕｃプラスミドをトランスフェクションしたものであり、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現している（参考文献４及び５を参照）。１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清；サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社）、１％（Ｖ／Ｖ）Ｌ−グルタミン−Ｐ．Ｓ．溶液（シグマ−アルドリッチ社）を含むダルベッコ変法イーグル培地（シグマ−アルドリッチ社）を培地とし、３７℃、５％  ＣＯ２＋９５％  空気下で培養した。また、ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞は、マウス乳癌細胞であるＦＭ３Ａ細胞に、ジーン・パルサー・エックスセル（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ；バイオラド社）を用いてｐＧＬ４．５１（インビトロジェン社）を電気穿孔法により導入したものであり、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現している。１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１％（Ｖ／Ｖ）Ｌ−グルタミン−Ｐ．Ｓ．溶液を含むＲＰＭＩ−１６４０（シグマ−アルドリッチ社）を培地とし、３７℃、５％  ＣＯ２＋９５％  空気下で培養した。ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞はＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ及びＶＥＧＦ−Ｄを発現し、ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞はＶＥＧＦ−Ａを発現する（図１及び２を参照）。
【００５６】
１−３．細胞接種
腫瘍細胞は、懸濁液にＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；シグマ−アルドリッチ社）とマトリゲル（コラボレティブ・バイオメディカル・プロダクツ社）を使用して３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度調整した後、マウスの片側腸骨下リンパ節に接種した。その際、１〜２％（Ｖ／Ｖ）イソフルラン（アボット・ジャパン社）による吸入麻酔下において、小型動物用高周波超音波画像装置（ＶＥＶＯ）（ビジュアルソニック社）でリンパ節内に注射針の針先を確認しながら行った（図３Ａ及び３Ｂを参照）。注射針の先端が腸骨下リンパ節中央に位置していることが確認でき（図３Ａ）、接種直後には腫瘍細胞の塊が形成されていることが確認できる（図３Ｂ）。腫瘍細胞接種後に腫瘍細胞が滲出しないように、接種した状態を１分間程度に保ち静置した。トランスデューサーは中心周波数２５ＭＨｚ、距離分解能７０μｍ、方位分解能１４０μｍのものを用いた。接種量は６０μＬである。なお、測定時にはマウスは吸入麻酔下に置いている。コントロール群としてＰＢＳ及びマトリゲルの混濁液のみを接種したマウスを用意した（ｎ＝１２）。
【００５７】
１−４．ルシフェラーゼ活性の測定
本実施例で使用したＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ及びＦＭ３Ａ−Ｌｕｃはルシフェラーゼ発現細胞であり、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応によりその細胞数を確認できる。ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を起こした細胞は発光を生じることから、その発光量を生体発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ；ルミナ・イメージング・システム）（ゼノゲン社）を用いて測定した。本実施例では、腫瘍細胞を直接接種した腸骨下リンパ節と、転移巣だと想定される腋窩リンパ節についてのルシフェラーゼ活性を測定した。１５ｍｇ／ｍｌに濃度調整したルシフェリン（Ｄ−ルシフェリンカリウム塩）  ２００μｌを腹腔内に注射し、１０分後にＩＶＩＳを使用して測定した。なお、測定時にはマウスは吸入麻酔下に置いた。
【００５８】
１−５．腋窩リンパ節の体積測定
腫瘍細胞を接種したマウスを吸入麻酔下で固定し、腋窩リンパ節の体積をＶＥＶＯで経時的に測定した。ＶＥＶＯソフト上で超音波画像を統合し、連続的に撮影した二次元画像をつなぎ合わせて三次元画像を作製した（図４を参照）。この三次元画像の体積をＶＥＶＯソフト上で算出して、 腋窩リンパ節全体の体積変化を測定した。この際、トランスデューサーは中心周波数２５ＭＨｚ、距離分解能７０μｍ、方位分解能１４０μｍのものを用いた。
【００５９】
１−６．リンパ節内のＩＮＰ測定
コントロール群及び腫瘍細胞を接種したマウスについて、腸骨下リンパ節及び腋窩リンパ節内のＩＮＰ値を測定した。測定機器は圧力トランスデューサー（ＢＬＰＲ２；ワールド・プレシジョン・インストラメンツ社）及びトランスデューサー用増幅器（Ｂｒｉｄｇｅ−８；ワールド・プレシジョン・インストラメンツ社）を使用した。解析ソフト（ＬａｂＳｃｒｉｂｅ２；ｉＷｏｒｋ社）を搭載したパソコンと、増幅器及び圧力トランスデューサーを接続した。トランスデューサーには三方活栓（テルモ社）を介して、生理食塩水を含んだテルモシリンジ（テルモ社）と２１Ｇテルモ注射針（テルモ社）を接続した。シリンジを押し込むことで注射針及び圧力トランスデューサー内を生理食塩水で満たし、注射針を節内に挿入することによって圧力を測定した。リンパ節内に挿入する前と後の差を節内ＩＮＰ値とした。測定中は、マウスを、小動物用卓上型麻酔装置（シナノ社）を用いて、１〜２％（Ｖ／Ｖ）イソフルランで吸入麻酔した。麻酔下においてマウス方側腹部に腸骨下から腋窩部にいたる皮膚切開を加え、皮膚組織を腹部筋組織筋膜上で剥離した状態で固定し、ＩＮＰを測定した（図５及び６を参照）。測定後、マウスに頸椎脱臼による安楽死処理を施し、次いでリンパ節を摘出して１０％（Ｖ／Ｖ）ホルマリンで一晩保存した。圧力の測定日ごとにマウスを振り分けてＩＮＰ圧力を測定した。腫瘍細胞の接種日を０日目（Ｄａｙ  ０）として、ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞についてはＤａｙ  ３及びＤａｙ  ６にそれぞれ１２匹ずつに分けた（図７Ｂを参照）。Ｄａｙ  ６の群に関してはルシフェラーゼ活性の測定と腋窩リンパ節の体積測定を経時的に行った。ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞についてはＤａｙ  ６、Ｄａｙ  １０及びＤａｙ  １４にそれぞれ１２匹ずつのグループに分けた（図７Ｃを参照）。Ｄａｙ  １４の群に関してはルシフェラーゼ活性の測定と腋窩リンパ節の体積測定を経時的に行った。また、細胞未接種のコントロール群についても１２匹を圧力測定に用いた（図７Ａを参照）。
【００６０】
１−７．統計処理
ＩＶＩＳによるルシフェラーゼ活性の測定結果については平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）、それ以外の測定値に関しては平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示す。多群検定は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、多重比較検定はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒテストを行った。Ｐ＜０．０１（＊＊）及びＰ＜０．０５（＊）の場合、統計的に有意であると評価した。使用したソフトウェアはＪＭＰ１１．０アカデミック版（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎｓ社）であった。
【００６１】
［２．結果］
２−１．腸骨下及び腋窩リンパ節のルシフェラーゼ活性測定
ＩＶＩＳによるルシフェラーゼ活性の測定結果を図８及び９に示す。図８はＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウス、図９はＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスの測定結果である。図８Ａ及び図９Ａから、腸骨下及び腋窩リンパ節における腫瘍の生着を確認することができた。特に、ＩＶＩＳによる腋窩リンパ節の発光は、ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞接種群ではＤａｙ  ６で、ＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞接種群ではＤａｙ  １４で確認することができた。また、図８Ｂ及び図９Ｂは、ＩＶＩＳにより腸骨下及び腋窩リンパ節のルシフェラーゼ発光量を算出してグラフ化することによって、ルシフェラーゼ発光量の経時変化を示す。図８Ｂでは、腸骨下及び腋窩リンパ節の両方ともにＤａｙ  ６におけるルシフェラーゼ活性の値はＤａｙ  ０と比較して統計的有意差が得られた。同様に、図９Ｂでは、腸骨下及び腋窩リンパ節の両方ともにＤａｙ  １４におけるルシフェラーゼ活性の値はＤａｙ  ０と比較して統計的有意差が得られた。図８Ｂ及び図９Ｂから、２種類の細胞ともに、先に腸骨下リンパ節において腫瘍は成長し、遅れて腋窩リンパ節で腫瘍が生着及び成長することが確認された。
【００６２】
２−２．腋窩リンパ節の体積変化
ＶＥＶＯによる腋窩リンパ節の体積変化を図１０及び１１に示す。図１０はＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウス、図１１はＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスの測定結果である。  図１０Ａ及び１１Ａは腋窩リンパ節の最大滑面の超音波像を示したものであり、図１０Ｂ及び１１ＢはＶＥＶＯのソフトウェアで算出したリンパ節体積の変化を示したグラフである。ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ及びＦＭ３Ａ−Ｌｕｃの両方ともに体積は若干の増加傾向が見られたが、その変化量は微差であった。
【００６３】
２−３．腸骨下及び腋窩リンパ節内のＩＮＰ測定
リンパ節内のＩＮＰ測定結果を図１２及び１３に示す。また、ＩＮＰ値とルシフェラーゼ活性との関係を示した散布図を図１４及び１５に示す。図１２及び１４はＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を接種したマウス、図１３及び１５はＦＭ３Ａ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスの測定結果である。さらに図１２Ａ〜１５Ａは腸骨下リンパ節、図１２Ｂ〜１５Ｂは腋窩リンパ節の測定結果である。図１２及び１３から、２種類の細胞ともに、腸骨下及び腋窩リンパ節内のＩＮＰ値は増加傾向にあり、その傾向は腸骨下において統計的有意差が得られるほどに顕著であることが確認された。図１４及び１５から、腸骨下及び腋窩リンパ節の両方ともに、ＩＮＰ値が高くなるほどルシフェラーゼ活性の値が高くなる、すなわち腫瘍サイズが大きくなると考えることができる。
【００６４】
［３．評価］
ＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウスを用いて腋窩リンパ節に転移巣を作製することにより、転移の過程でのセンチネルリンパ節及び二次転移リンパ節におけるＩＮＰ値の変化を把握した。その結果、腫瘍の成長度とリンパ節内ＩＮＰ値との間に相関関係があることが示唆された。これにより、リンパ節の圧力変化を測定することで、リンパ節への腫瘍細胞の転移を想定することが可能であることが示された。また、化学療法や放射線療法などによる抗腫瘍効果の判定にも、リンパ節内ＩＮＰ値の測定が有効である可能性が示唆された。
【００６５】
［４．参考文献］
1. Shao L, Mori S, Yagishita Y, Okuno T, Hatakeyama Y, Sato T, et al. Lymphatic mapping of mice with systemic lymphoproliferative disorder: Usefulness as an inter-lymph node metastasis model of cancer. J Immunol Methods. 2013;389:69-78.
2. Tanaka Y, Komori H, Mori S, Soga Y, Tsubaki T, Terada M, et al. Evaluating the role of rheumatoid factors for the development of rheumatoid arthritis in a mouse model with a newly established ELISA system. The Tohoku journal of experimental medicine. 2010;220:199-206.
3. Li L, Mori S, Kodama M, Sakamoto M, Takahashi S, Kodama T. Enhanced Sonographic Imaging to Diagnose Lymph Node Metastasis: Importance of Blood Vessel Volume and Density. Cancer research. 2013;73:2082-92.
4. Ito MR, Terasaki S, Itoh J, Katoh H, Yonehara S, Nose M. Rheumatic diseases in an MRL strain of mice with a deficit in the functional Fas ligand. Arthritis Rheum. 1997;40:1054-63.
5. Furukawa H, Kitazawa H, Kaneko I, Kikuchi K, Tohma S, Nose M, et al. Mast cells inhibit CD8+ T cell-mediated rejection of a malignant fibrous histiocytoma-like tumor: Involvement of Fas-Fas ligand axis. Am J Immunol. 2009;5:89-97.
6. Rofstad EK, Tunheim SH, Mathiesen B, Graff BA, Halsor EF, Nilsen K, et al. Pulmonary and lymph node metastasis is associated with primary tumor interstitial fluid pressure in human melanoma xenografts. Cancer research. 2002;62:661-4.
7. Ellingsen C, Hompland T, Mathiesen B, Rofstad EK. Microenvironment-associated lymph node metastasis of human cervical carcinoma xenografts. Acta Oncol. 2012;51:465-72.
8. Hompland T, Ellingsen C, Ovrebo KM, Rofstad EK. Interstitial Fluid Pressure and Associated Lymph Node Metastasis Revealed in Tumors by Dynamic Contrast-Enhanced MRI. Cancer research. 2012;72:4899-908.
【実施例２】
【００６６】
センチネルリンパ節を除去した後も、転移が生じた場合に、二次転移リンパ節のＩＮＰ値が上昇することを、下記のとおりに実証した。
【００６７】
［１．実験材料及び方法］
１−１．動物モデル
１３週齢から１５週齢のＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウス雌の１６匹を用いた。体重は２７〜３７ｇのものを用い、ノギスで測定した腸骨下及び内側腋窩リンパ節の長径はそれぞれ１０．８±１．９ｍｍ（ｍｅａｎ±ＳＤ；ｎ＝１６）及び１０．４±１．６ｍｍ（ｎ＝１６）であった。
【００６８】
１−２．細胞培養
マウス由来線維芽細胞ＫＭ／Ｌｕｃを使用した。１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社）、１％（Ｖ／Ｖ）Ｌ−グルタミン−Ｐ．Ｓ．溶液（シグマ−アルドリッチ社）を含むＤＭＥＭ（シグマ−アルドリッチ社）を培地とし、３７℃、５％  ＣＯ２＋９５％  空気下で培養した。
【００６９】
１−３．細胞接種
細胞溶液としてＰＢＳに希釈した細胞懸濁液とマトリゲル（Ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍａｔｒｉｘ；ベクトン・ディッキンソン社）とを２：１の割合で混合して最終濃度を３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。麻酔は２％（Ｖ／Ｖ）イソフルラン（アボット・ジャパン社）で行い、細胞溶液は高周波超音波画像診断装置によるガイド下でマウスの腸骨下リンパ節内に局注で６０μＬ接種した。
【００７０】
１−４．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるセンチネルリンパ節切除
腫瘍細胞接種後６時間後、３日目および９日目に、センチネルリンパ節である腸骨下リンパ節を露出して高周波凝固切開装置（Ｅｒｂｏｔｏｍ  ＶＩ０５０Ｃ；ＥＲＢＥ  Ｅｌｅｋｔｒｏｍｅｄｉｚｉｎ社）で切除した。切除術後、露出部位を縫合及び結紮した。９日目に腋窩リンパ節の節内圧力（ＩＮＰ）値を測定した。
【００７１】
［２．結果及び評価］
腫瘍細胞を接種させた腸骨下リンパ節を、接種後６時間後、３日後及び６日後に摘出したところ、接種後６時間後にセンチネルリンパ節を摘出した場合は二次リンパ節ではＩＮＰ値の上昇は認められず、接種後３日後及び６日後ではＩＮＰ値の顕著な上昇が認められた（図１６を参照）。実施例１で示した図８Ａ及び図８Ｂの結果から、腫瘍細胞接種から６時間後にセンチネルリンパ節を切除した場合は転移が生じないが、接種から３日後以降では転移が起こり得る。したがって、図１６より、二次リンパ節において転移が生じたことにより、接種後３日後及び６日後にＩＮＰ値の顕著な上昇が認められたという結果は、二次リンパ節のＩＮＰ値上昇は転移により生じたということを示す。
【実施例３】
【００７２】
従前のイメージングモダリティでは検出が困難である超早期のリンパ節転移を節内圧力（ＩＮＰ）を計測することにより検出できること、及び超早期のリンパ節転移が認められた腫瘍の治療実験を行い、抗がん剤による治療効果をＩＮＰで評価可能であることを以下のとおりに実証した。
【００７３】
［１．実験材料及び方法］
１−１．細胞培養
ＭＲＬ／Ｔｎ−ｇｌｄ／ｇｌｄマウス脾臓由来ＭＲＬ／Ｎ１細胞を形質転換させたＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞株を使用した。培地には、１０％ＦＢＳ（シグマ−アルドリッチ社）、１％Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（シグマ−アルドリッチ社）及び０．５％Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  Ｇ４１８（和光純薬工業社）を含むＤ−ＭＥＭ（シグマ−アルドリッチ社）を用いた。ＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞は、マウスに接種する前に、マイコプラズマ検出キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて、細胞培養内にマイコプラズマ汚染が無いことを確認した。
【００７４】
１−２．リンパ節担癌モデルの作製
恒常的なリンパ腫脹をともなうリンパ節転移マウスモデルであるＭＸＨ１０／Ｍｏ／ｌｐｒマウス（ｎ＝５１）を使用した。１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにＰＢＳを用いて濃度希釈したＭＲＬ／ＫＭ−Ｌｕｃ細胞混濁液２０μＬとＭａｔｒｉｇｅｌ  ４０μＬとを混合した６０μＬの細胞溶液をマウスの腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）に接種しリンパ節担癌モデルを作製した。接種日を０日目と定め、３及び６日目に１５ｍｇ／ｍＬに濃度調整したルシフェリン（プロメガ社）  ２００μＬをマウス腹腔内に注射し、その１０分後にＩＶＩＳ（ゼノゲン社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７５】
１−３．ＩＮＰの計測
２％イソフルラン麻酔科でマウスを開腹し、ＳｉＬＮ及びＰＡＬＮを露出させ、圧力トランスデューサー（ワールド・プレシジョン・インストラメンツ社）を接続し、先端まで生理食塩水で満たした２１Ｇ注射針をリンパ節の中心へ挿入した。５分間の測定を行い、その平均値をＩＮＰとし、測定終了後はマウスを麻酔科で直ちに安楽死させた。
【００７６】
１−４．抗がん剤による治療介入
抗がん剤であるシスプラチン（ＣＤＤＰ）を生理食塩水によりマウスの体重３ｍｇ／ｋｇに希釈し、腫瘍接種後１日目及び４日目にＣＤＤＰ溶液６０μＬを腫瘍接種した腸骨下リンパ節へ注射した。腫瘍接種３日後及び６日後に生体発光イメージング装置（ＩＶＩＳ）による生体発光イメージングから治療評価を定量的に解析した。
【００７７】
１−５．超音波造影剤による血管密度の計測
超音波診断用造影剤であるソナゾイド  （ソナゾイド注射用１６μｌ；第一三共社）を使用した。ペルフルブタンマイクロバブル１６μｌを添付の注射用水２ｍｌで懸濁し、１匹あたり１００μｌで尾静脈注射してＶＥＶＯ（Ｖｅｖｏ７７０；ヴィジュアルソニックス社）を用いてＳｉＬＮの撮影をおこなった。画像取得中は、マウスは３７℃前後に設定したヒートステージ上に麻酔下で静置した。ＳｉＬＮ長径方向に０．５ｍｍごとに３００フレームの撮影をコントラストモードでおこない、独自に開発した造影剤検出ソフトを用いて血管の造影をおこなった．
【００７８】
１−６．統計分析
ルシフェラーゼ活性及びＩＮＰの計測結果について、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（グラフパッド・ソフトウェア社）を用いて統計分析をおこなった。値はｍｅａｎ±ＳＤで表現し、Ｐ＜０．０５のとき、統計的に有意とした。
【００７９】
［２．結果及び評価］
２−１．ルシフェラーゼ活性の測定
リンパ節への腫瘍接種後のルシフェラーゼ活性の継時的な変化の様子を図１７Ａ及びＢに示す。図１７Ａ及びＢが示すとおり、リンパ節に腫瘍接種し治療介入を行わなかった（□：Ｔｕｍｏｒ＋ＰＢＳ）は継時的な上昇を示した（Ｐ＜０．００１）。一方で、治療介入した群（○：Ｔｕｍｏｒ＋ＣＤＤＰ）は腫瘍接種６日後において有意な活性の上昇はなかった。また、治療未介入群は治療介入群及び腫瘍未接種群と比較して有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）．
【００８０】
２−２．リンパ節内の腫瘍増殖及びＩＮＰ
ＩＮＰの継時的な変化の様子を図１８に示す。未治療群においてＩＮＰは腫瘍の進行ともに増大した（Ｐ＜０．００１）。また、治療群のＩＮＰは未治療群と比較して小さいことが確認された（Ｐ＜０．００１）。ＣＤＤＰのみを投与した群ではＩＮＰに変化は見られず未治療群と比較して小さかった（Ｐ＜０．００１）。
【００８１】
２−３．リンパ節体積の測定
リンパ節体積の継時的な変化の様子を図１９に示す。未治療群において腫瘍接種６日後までに変化は見られなかった。また治療群及びＣＤＤＰのみ接種群は継時的な体積の縮小が確認され、未治療群と比較して腫瘍接種６日後における体積が小さいことが確認された（Ｐ＜０．００１）。
【００８２】
ＣＤＤＰを接種した群は、腫瘍の有無にかかわらず体積の減少がみられた（Ｐ＜０．００１）。
【００８３】
２−４．血管密度の測定
腫瘍接種３日後と６日後におけるリンパ節の血管密度の変化を図２０Ａ及びＢに示す。腫瘍の増殖及びＣＤＤＰの接種により血管密度は変化しなかった。すなわち、最大滑面における血管密度はどの群においても継時的な変化はなく、群間においても差はなかった。
【００８４】
２−５．評価
上記の結果から、ＣＤＤＰの投与が本来上昇するはずの担癌リンパ節におけるＩＮＰを低い値に抑えることを示した。ＣＤＤＰは塩基原子部位でＤＮＡに結合してＤＮＡ合成を阻害し、抗腫瘍効果を発揮することから、腫瘍誘導の血管新生を阻害しない。また、ＩＮＰが高くなる腫瘍接種６日後における血管密度は腫瘍接種３日目と変化がなく、ＣＤＤＰを投与した群においても担癌の有無にかかわらず血管密度に変化はなかった。したがって、ＩＮＰの上昇について、腫瘍新生血管からの漏出は寄与していないことが示唆される。ＩＮＰの上昇は被膜をもつエンカプセルドな領域であるリンパ節内において腫瘍が増殖したために引き起こされたものである可能性がある。したがって、ＣＤＤＰの投与がリンパ節内での腫瘍増殖を阻害したことから、ＩＮＰが減少した可能性があり、もってＩＮＰの計測が担癌リンパ節における腫瘍増殖を評価し得ることが確認された。また、ＩＮＰの計測は早期段階の転移リンパ節の診断に利用できることが示された。ＩＮＰの上昇はリンパ節内腫瘍の増殖そのものと相関しており、リンパ節内での腫瘍新生血管はＩＮＰの上昇に影響しない可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の方法及びプログラムによれば、従前のＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、超音波画像などを用いた方法と比べて、効率的にリンパ節における転移のリスクを評価することができることから、腫瘍の転移確率を低減することができ、がん罹患者の生存率を高めることが期待できる。このように、本発明の方法及びプログラムは、人類の健康と福祉に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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