(57)【要約】【課題】  肝細胞癌の治療のための治療用生物製剤を提供すること。【解決手段】  抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートであって、該抗体が哺乳動物PLVAPの細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートであって、該抗体が哺乳動物PLVAPの細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート。
【請求項２】
凝固剤が凝固タンパク質である、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
凝固タンパク質が組織因子である、請求項２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
組織因子が、配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは、配列番号:1と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは、配列番号:1と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３記載のコンジュゲート。
【請求項５】
配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を有する組織因子を含む、ペプチド結合により抗体にコンジュゲートされたコンジュゲートであって、該抗体が、ヒトPLVAPタンパク質の細胞外ドメイン中のエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート。
【請求項６】
哺乳動物PLVAPタンパク質が、配列番号:2と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは、配列番号:2と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは、配列番号:2と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項７】
該抗体が、PPAGIPVAPSSGまたはLAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPMから選択されるエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項８】
該抗体が、エピトープPPAGIPVAPSSGに特異的に結合する、請求項７記載のコンジュゲート。
【請求項９】
凝固タンパク質と抗体が化学的に架橋している、請求項１〜８いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
凝固タンパク質と抗体がペプチド結合により結合している、請求項１〜９いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
該抗体が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む免疫グロブリンであり、該凝固剤が凝固タンパク質である、請求項１〜１０いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
凝固タンパク質と抗体が、重鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、請求項１１記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
凝固タンパク質と抗体が、軽鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、請求項１１記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
凝固剤が凝固タンパク質であり、凝固タンパク質と抗体が、リンカーペプチドによるペプチド結合により結合している、請求項１〜１３いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
リンカーペプチドが、(Gly4-Ser)n(式中、nは、1、2、3、4、5または6；より好ましくはnは3である)を含む、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
抗体が、
i)  配列番号:3のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号:4のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3もしくは4個までの保存性アミノ酸置換を有する；または
ii)  配列番号:5のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号:6のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3もしくは4個までの保存性アミノ酸置換を有する
を含む免疫グロブリンである、請求項１〜１５いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域がヒト化される、請求項１６記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、
i)  配列番号:7、8、9、10もしくは11から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:11である；および配列番号:12、13もしくは14から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:13である、または
ii)  配列番号:15、16、17、18もしくは19から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:19である；および配列番号:20、21もしくは22から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:22である
で与えられる、請求項１７記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
配列番号:23と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、適切な担体、賦形剤および/または造影剤をさらに含む、医薬組成物。
【請求項２１】
被験体への投与に適した剤型である、請求項２０記載の医薬組成物または請求項１〜１９いずれか記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
請求項１〜８または１０〜１９いずれか記載のコンジュゲートをコードする核酸。
【請求項２３】
請求項２２記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２３記載のベクターまたは請求項２２記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が細菌細胞であり、より具体的には細菌細胞が大腸菌である、請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２６】
発芽酵母を含む酵母などの真菌；Sf0、Sf21もしくはハイファイブ(high five)細胞などの昆虫細胞；またはCHO、VEROもしくはCOS細胞などの哺乳動物細胞から選択される真核生物細胞である、請求項２４記載の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２４〜２６いずれか記載の宿主細胞を、宿主によるコンジュゲートの発現を支持する条件下で培養する工程、および発現されたコンジュゲートを単離する工程を含む、請求項１〜８または１０〜１９いずれか記載のコンジュゲートを作製する方法。
【請求項２８】
PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体において、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減する、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導する方法であって、請求項１〜１９いずれか記載のコンジュゲートまたは請求項２０または２１記載の医薬組成物の治療有効量を該被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】
腫瘍がHCCであり、HCC腫瘍体積が、コンジュゲートの投与後の血栓症および腫瘍壊死により低減される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該被験体がヒトである、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
コンジュゲートが、被験体の腫瘍に静脈内投与される、請求項２８〜３０いずれか記載の方法。
【請求項３２】
コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、請求項２８〜３１いずれか記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１９いずれか記載のコンジュゲートまたは請求項２０または２１記載の医薬組成物の治療有効量を、HCCの治療を必要とするヒト被験体に投与する工程を含む、該被験体においてHCCを治療する方法であって、該コンジュゲートまたは組成物が1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、方法。
【請求項３４】
被験体が、1つ以上の化学療法剤、放射線療法、腫瘍内アルコール注入、手術、寒冷療法、高周波振動または前述の1つ以上の組み合わせによる同時または連続の治療を受けている、請求項２８〜３３いずれか記載の方法。
【請求項３５】
コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤と一緒に被験体に投与される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
1つ以上の化学療法剤が、ソラフェニブ、ベバシズマブまたは他の抗脈管形成治療薬の治療有効量を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤をさらに含む医薬組成物中で被験体に投与される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍が神経膠芽腫である、請求項２８〜３７いずれか記載の方法。
【請求項３９】
コンジュゲートが、腫瘍1cm3あたり約5〜約200μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約10〜約150μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約15〜約100μgの用量で投与される、請求項２８〜３８いずれか記載の方法。
【請求項４０】
コンジュゲートが単一用量で投与される、請求項２８〜３８いずれか記載の方法。
【請求項４１】
コンジュゲートが、2、3、4、5、6、7、8、9、10用量以上で投与される、請求項２８〜３９いずれか記載の方法。
【請求項４２】
該用量が、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月以上の期間にわたり投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜１９いずれか記載のコンジュゲートを含む、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療するため、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減するため、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓形成および腫瘍壊死を誘導するための医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜１９いずれか記載のコンジュゲートを含む、HCCを治療するための医薬組成物であって、該コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌の治療のための治療用生物製剤に関する。
【０００２】
関連出願
本願は、2013年11月15日に出願された米国特許仮出願第61/904,951号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
ASCII TEXT FILEにおける材料の参照による援用
本願は、本明細書と同時に提出された以下のASCII textファイルに含まれる配列表を、参照により援用する：
a)  ファイル名：SEQUENCELISTING.txt；2014年10月28日に38KBのサイズで作成。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
原発性肝臓癌は、世界的に、男性で5番目によくある癌であり、女性で7番目によくある癌である。世界的に、原発性肝臓癌は、男性において2番目の主要な癌の死亡原因であり、女性では6番目の癌の死亡原因である。肝細胞癌(HCC)は、原発性肝臓癌の85%の原因である。HCCは、東南アジアおよびサハラ以南のアフリカに固有のものである。西洋諸国における発病率は近年増加しており、増加し続けることが予想される。HCCは、米国において、男性で5番目、女性で9番目の主要な癌の死亡原因である。HCCについての5年間の生存(5 years overall survival)は、わずか15%である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】米国特許出願公開公報第US 2011/0085973号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この疾患の重大な発病率および患者に対するその甚大な損失を考慮すると、患者のサポート体系および社会全体、さらに中間および進行した病期の疾患を有するHCC患者の治療の改善は、急を要する、より具体的には、HCC腫瘍を特異的に標的化し得、例えば腫瘍の体積を低減してHCCを治療し得、および/または腫瘍を排除し得る薬剤、ならびに該薬剤を作製および使用する方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、とりわけ、HCC腫瘍の血管内皮細胞を特異的に標的化してHCCを治療する薬剤、加えて関連のあるこれらの薬剤の使用方法を提供する。第1の局面において、本発明は、抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートであって、該抗体が哺乳動物PLVAPタンパク質の細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する、コンジュゲートを提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、凝固剤は凝固タンパク質である。より具体的な態様において、凝固タンパク質は組織因子である。さらにより具体的な態様において、組織因子は、配列番号:1と少なくとも約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一、例えば配列番号:1と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一、例えば配列番号:1と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一なアミノ酸配列を含む。
【０００９】
関連のある局面において、本発明は、ペプチド結合により抗体に共役した、配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一なアミノ酸配列を有する組織因子を含むコンジュゲートであって、該抗体が、ヒトPLVAPタンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープに特異的に結合する、コンジュゲートを提供する。
【００１０】
前述の局面および態様のいずれかにおいて、哺乳動物PLVAPタンパク質は、配列番号:2と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一、より好ましくは、配列番号:2と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一、さらにより好ましくは配列番号:2と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一なアミノ酸配列を含み得る。
【００１１】
前述の局面および態様のいずれかについて、該抗体は、PPAGIPVAPSSG(配列番号:25)またはLAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM(配列番号:26)から選択されるエピトープに特異的に結合し得る。より具体的な態様において、該抗体は、エピトープPPAGIPVAPSSG(配列番号:25)に特異的に結合する。
【００１２】
前述の局面および態様のいずれかのコンジュゲートについて、いくつかの態様では、凝固タンパク質と抗体は化学的に架橋している。他の態様において、凝固タンパク質と抗体は、ペプチド結合により結合している。
【００１３】
前述の局面および態様のいずれかのコンジュゲートにおいて、該抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む免疫グロブリンであり得る。より具体的な態様において、凝固タンパク質と抗体は、重鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している。他の態様において、凝固タンパク質と抗体は、軽鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している。
【００１４】
いくつかの態様において、前述の局面または態様のいずれかのコンジュゲートにおいて、凝固タンパク質と抗体は、リンカーペプチドによるペプチド結合により結合している。より具体的な態様において、リンカーペプチドは、(Gly4-Ser)n(式中、nは、1、2、3、4、5または6、より好ましくは、nは3である)を含む。
【００１５】
ある態様において、前述の局面または態様のいずれかのコンジュゲートにおいて、該抗体は、
i)  配列番号:3のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域および配列番号:4のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3または4個までの保存性アミノ酸置換を有する、または
ii)  配列番号:5のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域および配列番号:6のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3または4個までの保存性アミノ酸置換を有する
を含む免疫グロブリンである。
【００１６】
より具体的な態様において、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域はヒト化されている。さらにより具体的な態様において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、
i)  配列番号:7、8、9、10もしくは11から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:11である、および配列番号:12、13もしくは14から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:13である、または
ii)  配列番号:15、16、17、18もしくは19から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:19である、および配列番号:20、21もしくは22から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:22である
で与えられる。
【００１７】
前述の局面および態様のいずれかのある態様において、コンジュゲートは、配列番号:23のアミノ酸配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一なアミノ酸配列を含む。
【００１８】
関連のある局面において、本発明は、前述の局面および態様のいずれかのコンジュゲートをコードする核酸を提供する。具体的な態様において、本発明により提供される核酸はベクターに含まれる。関連のある態様において、該ベクターは宿主細胞内にあり得、ある態様において、該宿主細胞は、細菌(例えば大腸菌など)である。他の態様において、該宿主細胞は真核生物細胞(例えば、発芽酵母を含む酵母などの真菌；Sf0、Sf21もしくはハイファイブ(high five)細胞などの昆虫細胞；またはCHO、VEROもしくはCOS細胞などの哺乳動物細胞)である。
【００１９】
別の関連のある局面において、本発明は、前述の局面および態様のいずれかのコンジュゲートを含む医薬組成物であって、適切な担体、賦形剤または造影剤をさらに含む医薬組成物を提供する。より具体的な態様において、該組成物は、被験体への投与に適した剤型である。
【００２０】
別の局面において、本発明は、前述の局面および態様のいずれかの宿主細胞を、宿主細胞がコンジュゲートを発現することを支持する条件下で培養し、発現されたコンジュゲートを単離することにより、前述の局面および態様のいずれかのコンジュゲートを作製する方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の治療、肝細胞癌(HCC)の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体における、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療する、肝細胞癌(HCC)を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減させる、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導する方法を提供する。これらの方法において、前述の局面および態様のいずれかのコンジュゲートまたは前述の局面および態様のいずれかの医薬組成物の治療有効量が、被験体(例えばヒト)に提供される(例えば任意の適切な手段により投与される)。
【００２２】
いくつかの態様において、HCC腫瘍体積は、コンジュゲートにより誘導される血栓症および腫瘍壊死の後に低減される。
【００２３】
ある態様において、コンジュゲートは、被験体の腫瘍、例えばHCCに静脈内投与される。より具体的な態様において、コンジュゲートは、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される。
【００２４】
いくつかの態様において、被験体は、1つ以上の化学療法剤、放射線治療、腫瘍内(intratumoral)アルコール注入、手術、寒冷療法、高周波振動または前述のものの1つ以上の組み合わせによる同時または連続の治療を受けている。より具体的な態様において、コンジュゲートは、1つ以上の化学療法剤と一緒に被験体に投与される。さらにより具体的な態様において、1つ以上の化学療法剤は、ソラフェニブ(例えばPubChem 216239参照)、ベバシズマブ、または抗脈管形成治療薬の治療有効量を含む。ある態様において、コンジュゲートは、1つ以上の化学療法剤をさらに含む医薬組成物中で被験体に投与される。
【００２５】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、腫瘍1cm3あたり約5〜約200μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約10〜約150μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約15〜約100μgの用量で投与される。
【００２６】
ある態様において、コンジュゲートは単一用量で投与される。他の態様において、コンジュゲートは、2、3、4、5、6、7、8、9、10用量以上で投与される。より具体的な態様において、該用量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月以上の期間にわたり投与される。
【００２７】
即ち、本発明の要旨は、
［１］抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートであって、該抗体が哺乳動物PLVAPの細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート、
［２］凝固剤が凝固タンパク質である、前記［１］記載のコンジュゲート、
［３］凝固タンパク質が組織因子である、前記［２］記載のコンジュゲート、
［４］組織因子が、配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは、配列番号:1と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは、配列番号:1と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記［３］記載のコンジュゲート、
［５］配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を有する組織因子を含む、ペプチド結合により抗体にコンジュゲートされたコンジュゲートであって、該抗体が、ヒトPLVAPタンパク質の細胞外ドメイン中のエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート、
［６］哺乳動物PLVAPタンパク質が、配列番号:2と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは、配列番号:2と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは、配列番号:2と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記［１］〜［５］いずれか記載のコンジュゲート、
［７］該抗体が、PPAGIPVAPSSGまたはLAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPMから選択されるエピトープに特異的に結合する、前記［１］〜［６］いずれか記載のコンジュゲート、
［８］該抗体が、エピトープPPAGIPVAPSSGに特異的に結合する、前記［７］記載のコンジュゲート、
［９］凝固タンパク質と抗体が化学的に架橋している、前記［１］〜［８］いずれか記載のコンジュゲート、
［１０］凝固タンパク質と抗体がペプチド結合により結合している、前記［１］〜［９］いずれか記載のコンジュゲート、
［１１］該抗体が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む免疫グロブリンであり、該凝固剤が凝固タンパク質である、前記［１］〜［１０］いずれか記載のコンジュゲート、
［１２］凝固タンパク質と抗体が、重鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、前記［１１］記載のコンジュゲート、
［１３］凝固タンパク質と抗体が、軽鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、前記［１１］記載のコンジュゲート、
［１４］凝固剤が凝固タンパク質であり、凝固タンパク質と抗体が、リンカーペプチドによるペプチド結合により結合している、前記［１］〜［１３］いずれか記載のコンジュゲート、
［１５］リンカーペプチドが、(Gly4-Ser)n(式中、nは、1、2、3、4、5または6；より好ましくはnは3である)を含む、前記［１４］記載のコンジュゲート、
［１６］抗体が、
i)  配列番号:3のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号:4のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3もしくは4個までの保存性アミノ酸置換を有する；または
ii)  配列番号:5のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号:6のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3もしくは4個までの保存性アミノ酸置換を有する
を含む免疫グロブリンである、前記［１］〜［１５］いずれか記載のコンジュゲート、
［１７］軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域がヒト化される、前記［１６］記載のコンジュゲート、
［１８］軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、
i)  配列番号:7、8、9、10もしくは11から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:11である；および配列番号:12、13もしくは14から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:13である、または
ii)  配列番号:15、16、17、18もしくは19から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:19である；および配列番号:20、21もしくは22から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:22である
で与えられる、前記［１７］記載のコンジュゲート、
［１９］配列番号:23と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記［１４］記載のコンジュゲート、
［２０］前記［１］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、適切な担体、賦形剤および/または造影剤をさらに含む、医薬組成物、
［２１］被験体への投与に適した剤型である、前記［２０］記載の医薬組成物または前記［１］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲート、
［２２］前記［１］〜［８］または［１０］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートをコードする核酸、
［２３］前記［２２］記載の核酸を含むベクター、
［２４］前記［２３］記載のベクターまたは前記［２２］記載の核酸を含む宿主細胞、
［２５］宿主細胞が細菌細胞であり、より具体的には細菌細胞が大腸菌である、前記［２４］記載の宿主細胞、
［２６］発芽酵母を含む酵母などの真菌；Sf0、Sf21もしくはハイファイブ(high five)細胞などの昆虫細胞；またはCHO、VEROもしくはCOS細胞などの哺乳動物細胞から選択される真核生物細胞である、前記［２４］記載の宿主細胞、
［２７］前記［２４］〜［２６］いずれか記載の宿主細胞を、宿主によるコンジュゲートの発現を支持する条件下で培養する工程、および発現されたコンジュゲートを単離する工程を含む、前記［１］〜［８］または［１０］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートを作製する方法、
［２８］PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体において、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減する、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導する方法であって、前記［１］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートまたは前記［２０］または［２１］記載の医薬組成物の治療有効量を該被験体に投与する工程を含む、方法、
［２９］腫瘍がHCCであり、HCC腫瘍体積が、コンジュゲートの投与後の血栓症および腫瘍壊死により低減される、前記［２８］記載の方法、
［３０］該被験体がヒトである、前記［２８］または［２９］記載の方法、
［３１］コンジュゲートが、被験体の腫瘍に静脈内投与される、前記［２８］〜［３０］いずれか記載の方法、
［３２］コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、前記［２８］〜［３１］いずれか記載の方法、
［３３］前記［１］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートまたは前記［２０］または［２１］記載の医薬組成物の治療有効量を、HCCの治療を必要とするヒト被験体に投与する工程を含む、該被験体においてHCCを治療する方法であって、該コンジュゲートまたは組成物が1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、方法、
［３４］被験体が、1つ以上の化学療法剤、放射線療法、腫瘍内アルコール注入、手術、寒冷療法、高周波振動または前述の1つ以上の組み合わせによる同時または連続の治療を受けている、前記［２８］〜［３３］いずれか記載の方法、
［３５］コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤と一緒に被験体に投与される、前記［３４］記載の方法、
［３６］1つ以上の化学療法剤が、ソラフェニブ、ベバシズマブまたは他の抗脈管形成治療薬の治療有効量を含む、前記［３５］記載の方法、
［３７］コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤をさらに含む医薬組成物中で被験体に投与される、前記［３５］記載の方法、
［３８］PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍が神経膠芽腫である、前記［２８］〜［３７］いずれか記載の方法、
［３９］コンジュゲートが、腫瘍1cm3あたり約5〜約200μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約10〜約150μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約15〜約100μgの用量で投与される、前記［２８］〜［３８］いずれか記載の方法、
［４０］コンジュゲートが単一用量で投与される、前記［２８］〜［３８］いずれか記載の方法、
［４１］コンジュゲートが、2、3、4、5、6、7、8、9、10用量以上で投与される、前記［２８］〜［３９］いずれか記載の方法、
［４２］該用量が、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月以上の期間にわたり投与される、前記［４０］記載の方法、
［４３］前記［１］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートを含む、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療するため、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減するため、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導するための医薬組成物、
［４４］前記［１］〜［１９］いずれか記載のコンジュゲートを含む、HCCを治療するための医薬組成物であって、該コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、医薬組成物
に関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、肝細胞癌の治療のための治療用生物製剤が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本特許または特許出願(application file)は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面(1つまたは複数)を有する本特許または特許出願公開公報の謄本は、請求および必要な手数料の支払いに応じて当局により提供される。
前述の記載は、添付の図面において説明される以下の本発明の例示態様のより具体的な記載から明らかとなろう。
【図１】図1は、精製されたGSTタグ付加ヒト組織因子タンパク質のSDS-PAGE分析を示す電気泳動ゲルの写真である。10%ポリアクリルアミドゲルを使用した。3マイクログラムのGSTをタグ付加した組み換えヒト組織因子(GST-hTF)をゲルに載せた。
【図２】図2は、酵素結合免疫アッセイ(enzyme-linked immunoassay)によりヒト組織因子と化学的に共役したMECA32 (MECA32-hTF)のヒトPLVAPに対する結合を示す、タンパク質濃度に関するOD405nmのグラフである。アッセイプレートのそれぞれのウェルは、マウスPLVAPタンパク質の水溶性細胞外ドメインでコートした。ブロッキング後、コートしたウェルを、増加濃度のMECA32-hTFとインキュベートした。1つのウェルをヒト組織因子(hTF)とインキュベートした。PLVAPに対するMECA32-hTFの結合は、R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)のビオチニル化抗hTF抗体およびThermo Scientific, Inc. (Rockford, IL)のストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートにより検出した。結果は、MECA32-hTFが、マウスPLVAPに結合し、抗hTF抗体で検出可能なhTFを有することを示した。抗体なしの対照可溶性hTF(黒丸)は、PLVAPに結合できず検出できなかった。
【図３Ａ】図3Aは、MECA32-Fab-TF発現ベクターの構築を示す模式図である。
【図３Ｂ】図3Bは、MECA32-Fab-TF発現ベクターの構築を示す模式図である。
【図４】図4は、CSRO2-Fab-TFのための発現構築物の模式図である。
【図５】図5は、組み換えのヒトPLVAPおよびマウスPLVAPのSDS-PAGEの写真である。組み換えのヒトPLVAP(5μg)およびマウスPLVAP(2.5μg)は、12%ポリアクリルアミドゲルで分析した。
【図６】図6Aおよび6Bは、SCIDマウス中のHep3B腫瘍異種移植片の脈管内皮細胞中のPLVAP発現の免疫組織化学(IHC)染色を示す顕微鏡写真である。IHC染色(パネルB)についてはMECA32抗マウスPLVAPモノクローナル抗体(10μg/ml)を使用した。左のパネルは、陰性対照と同じ濃度の正常ラットIgGで染色した同じブロックの切片であった(パネルA)。結果は、ヒトHCCと同様に、Hep3B腫瘍異種移植片中の脈管内皮細胞が、PLVAP発現について陽性に染色されたことを示す(パネルBにおいて暗い茶色の沈澱を矢印で示した)。したがって、腫瘍脈管内皮細胞により発現されたPLVAPを標的しては、MECA32-TFおよびMECA32-Fab-TFの治療効果を評価し得る。同じ容器は対照ラットIgGでは染色され得ない(パネルA内の矢印)。
【図７】図7は、腫瘍血流に対する組み換えヒト組織因子と共役した抗PLVAP MECA32モノクローナル抗体(mAb)(MECA32-TF)の効果を示す、超音波検査による腫瘍内の血流の写真を示す。腫瘍血流は、3Dパワードップラー超音波検査により評価した。パワードップラーは、治療の48時間前後に行った。結果は、20μg MECA32-TFで治療した群(白色矢印)において血流は大きく減少したが、24μg MECA32 mAbで治療した対照群では減少しなかったことを示す。治療前は、腫瘍の内部に赤色の血流シグナルが存在した。
【図８】図8は、腫瘍増殖に対するMECA32-TFの効果を示す、経時的な腫瘍体積の線グラフである。この図に示す結果は、図7に記載したものと同じ実験由来のものである。Hep3B腫瘍異種移植片を有するSCIDマウスは、20μg MECA32-TFの腫瘍栄養動脈内への注入により治療された。対照群は24μg MECA32 mAbで治療した。治療0日目の前後に、3D超音波検査を使用して腫瘍体積をモニタリングした。対照群におけるマウスの1匹は、急性進行性腫瘍増殖のために、最初の治療の20日後死亡した(†)。治療群と対照群の増殖速度は、線形混合効果(linear mixed-effects)モデルを使用して比較し、大きく異なっていた(p=0.0002)。この試験の結果(図7および8)は、組織因子と共役した抗PLVAP抗体が、腫瘍血流をブロックし、腫瘍増殖を効果的に阻害し得たことを示した。黒丸(●)：MECA32 mAb対照(n=3)；十字(x)：MECA32-TF治療群(n=3)。
【図９】図9は、組み換えの抗マウスPLVAP MECA32-Fab-TFおよび抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFコンジュゲートの構造の模式図を示す絵である。2つの抗PLVAP Fab-TFの間の主な違いは、MECA32-Fab-TFのκ軽鎖のC末端にヒスチジンタグ(His-tag)があることである。ヒスチジンタグは、精製目的で導入された。CSRO2-Fab-TFは、精製のためのヒスチジンタグを必要としない。
【図１０】図10は、競合酵素結合免疫アッセイによりマウスPLVAPへのMECA32-Fab-TFの結合を示す、OD405nm 対 競合抗体の濃度の線グラフである。ELISAプレートウェルは、組み換え水溶性マウスPLVAP(2.5μg/ml)で一晩コートした。ウシ血清アルブミンを含むバッファでウェルをブロッキングした後、増加濃度のラットIgG(0.5μg/ml〜50μg/ml)、MECA32-Fab-TF(0.5μg/ml〜50μg/ml)またはMECA32 mAb(0.05μg/ml〜5μg/ml)と、0.25μg/mlのビオチニル化MECA32 mAbをインキュベートした。PLVAPに対するビオチニル化MECA32 mAbの結合は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび発色性基質により測定した。結果は、MECA32 mAbおよびMECA32-Fab-TFの両方が、マウスPLVAPへの結合についてビオチニル化MECA32 mAbと競合し得たが、ラットIgG対照は競合し得なかったことを示す。予想されたように、MECA32-Fab-TFの結合親和性は、MECA32 mAbよりも1対数(one log)低いので、MECA32 mAbは、マウスPLVAPへの結合について、MECA32-Fab-TFよりもおよそ1対数潜在力が高かった。
【図１１】図11は、MECA32-Fab-TF(3、6および12μg)および対照MECA32モノクローナル抗体(12μg)によるHep3B腫瘍異種移植片腫瘍壊死の誘導を示す一組の顕微鏡写真である。腫瘍栄養動脈へのMECA32-Fab-TFまたはMECA32 mAbの注入後、治療の72時間後に腫瘍異種移植片を回収して、組織学的切片にした(submitted)。示された顕微鏡写真は、3つ全ての異なる用量のMECA32-Fab-TFについて大規模な腫瘍の壊死(ピンクで強調された領域)を示す。生存能力のある腫瘍組織の残りの領域を青で強調する。対照群由来の3つ全ての腫瘍は、右欄に示されるように、100%生存可能であった。治療した腫瘍の壊死の面積を、腫瘍画像全体の切り抜きと壊死領域の切り抜きの重量を測定することで計算してパーセンテージで表した。赤線および青線で腫瘍の境界の輪郭を取る。それぞれの治療群には3匹のマウスがあった。
【図１２】図12は、MECA32-Fab-TF(2.5、5および10μg)および対照MECA32モノクローナル抗体(10μg)によるHep3B腫瘍異種移植片腫瘍壊死の誘導を示す一組の顕微鏡写真である。この研究は図11に示すものと同様であった。主な違いは、Hep3B腫瘍異種移植片を治療するために使用した用量であった。再度、腫瘍栄養動脈への注入の72時間後に腫瘍を回収し、組織学的切片にした。各群には2匹のマウスがあった。再度、結果は、治療後の3つ全ての用量での大きな腫瘍壊死を示した。ピンクで強調したそれぞれの治療した腫瘍中の壊死面積は、図11で説明されるように腫瘍切片全体中のパーセンテージで決定した。赤線および青線で腫瘍の境界の輪郭を取る。四角内の領域を拡大して(40xおよび100x)、右に示し、残存の生存可能腫瘍細胞(矢印)を示した。それぞれの腫瘍内に示したパーセンテージは、全腫瘍切断面に対する相対的な壊死領域である。
【図１３Ａ】図13Aは、10μgのMECA32-Fab-TFの注入後、2、4、24、48および72時間の腫瘍組織学の変化を示す一組の顕微鏡写真である。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。図13Aでは、注入後2時間で、血管内にフィブリン血栓の出現(矢印)が認められた。その後、フィブリン血栓を含む血管の数はより顕著になった(矢印)。治療前(0時間)には腫瘍血管中にフィブリン血栓は観察されなかった。48および72時間で腫瘍組織は完全に壊死した。100xの倍率で顕微鏡写真を撮った。
【図１３Ｂ】図13Bは、10μgのMECA32-Fab-TFの注入後、2、4、24、48および72時間の腫瘍組織学の変化を示す一組の顕微鏡写真である。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。図13Bでは、腫瘍細胞は、治療の4時間後に、互いの間に透明な空間の増加を伴いながら、わずかな分離を示す。この変化は24時間でより顕著になった。治療の48時間後に、青色の核染色の消失を有する明らかな壊死が明確になり、72時間でより顕著になった。200xの倍率で顕微鏡写真を撮った。
【図１４】図14は、10μgのMECA32-Fab-TFの注入後の異なる時点での腫瘍血流の変化を示す、超音波検査による腫瘍血流の一組の写真である。腫瘍血流は、治療の前後に3Dパワードップラーで評価した。それぞれの時点には2匹のマウスがあった。治療後3Dパワードップラー研究の直後にマウスを安楽死させた。治療の前後のそれぞれの時点で2匹のマウスの1匹由来のパワードップラーシグナル(赤色)を有するソノグラフをここに示した。治療の48時間前に回収した腫瘍のソノグラフを左に示す。治療後を右に示し、腫瘍血流シグナルは2時間で消失し、治療後72時間まで持続した。
【図１５】図15は、Hep3B腫瘍異種移植片の増殖に対するMECA32-Fab-TFの動脈内注入の効果を示す、経時的な腫瘍体積の線グラフである。Hep3Bヒト肝細胞癌異種移植片を有するSCIDマウスを、10μgの対照MECA32モノクローナル抗体(mAb)および5または10μgのMECA32-Fab-TFの1回の注入で、0日目に治療した。3D超音波検査を使用して、治療0日目から-2、9および24日目に腫瘍体積を測定した。MECA32 mAb対照群および2つのMECA32-Fab-TF治療群(10および5μg)についての-2日目に測定した平均初期腫瘍体積は、それぞれ26.8、29.0および23.1mm3であった。それぞれの群の腫瘍体積は、mm3で、平均±SDで表す。治療群と対照群の異なる増殖速度を、線形混合効果モデルを使用して比較した。5μgの治療群と対照群、および10μgの治療群と対照群の間のそれぞれの比較について、P値は、0.0003および0.0001であった。
【図１６】図16Aは、MECA32 mAbまたはMECA32-Fab-TFでの最初の治療の25日後に切除されたHep3B腫瘍の写真および重量を示す(パネルA)。それぞれの治療群および対照群の平均腫瘍重量(平均±SEM)を、棒グラフとして図16Bに示す。それぞれのMECA32-Fab-TF治療群の腫瘍重量を、t検定により対照群の腫瘍重量と比較した。10μgおよび5μgのMECA32-Fab-TF治療群についてのP値は、それぞれ0.01および0.03であった。
【図１７】図17は、Hep3B腫瘍異種移植片の増殖に対するMECA-32-Fab-TFの全身投与の効果を示す、経時的な腫瘍体積の線グラフである。治療についてMECA32-Fab-TFまたは対照についてリン酸緩衝化食塩水の尾静脈を介した全身投与により、マウスを治療した。0日目の治療の前後に、カリパスを用いた3方向の垂直寸法(three perpendicular dimensions)の測定により腫瘍増殖をモニタリングした。3つの群全ての最終腫瘍体積をANOVAにより比較した。結果は、0.96のp値で3つの群全ての間に有意な差はないことを示した。これらの3つの群の平均腫瘍体積(平均±SEM)は、1844±840mm3(対照)、1867±602mm3(20μg MECA32-Fab-TF)および1617±559mm3(10μg MECA32-Fab-TF)であった。
【図１８】図18は、ビオチニル化CSRO2-Fab-TFを用いた、3つの異なる症例のヒト肝細胞癌(HCC)および隣接する非腫瘍肝臓組織由来の切片の免疫組織化学染色を示す、一組の顕微鏡写真である。左欄に示す3つのHCC切片中の全ての血管は、脈管内皮細胞中に茶色の沈澱を有してPLVAPについて陽性に染色された(矢印)。対照的に、肝臓洞様毛細血管、門脈および肝臓静脈の内側の内皮細胞(ひし形)は、検出可能なPLVAP発現を有さない陰性の染色を示した。
【図１９】図19は、配列番号:2の注釈(annotated)配列であり、完全NP_112600.1(hPLVAP)の細胞外領域に下線を引く。
【図２０】図20は、配列番号:3 >KFCC-GY4_VH_ドメイン_4の注釈配列であり、CDRに下線を引く。
【図２１】図21は、配列番号:4 >KFCC-GY4_VL_ドメイン_9の注釈配列であり、CDRに下線を引く。
【図２２】図22は、配列番号:5 >KFCC-GY5_VH_14の注釈配列であり、CDRに下線を引く。
【図２３】図23は、配列番号:6 >KFCC-GY5_VL_19の注釈配列であり、CDRに下線を引く。
【図２４】図24は、配列番号:23、組み換えCSR02-Fd-TF挿入物の注釈配列であり、FdのVHドメイン(1〜114)に下線を引き、FdのCH1ドメイン(115〜216)を太字にし、ヒンジ(217〜225)に二重の下線を引き、リンカー(226〜239)を小文字で表し、ヒト組織因子の細胞外ドメイン(240〜458)を斜体にする。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明の例示態様の説明を以下に示す。特定の用語の定義は、本願を通じて一貫するものである。
【００３１】
本発明により提供されるコンジュゲートおよび組成物
本発明は、抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートを提供し、ここで、該抗体は哺乳動物PLVAPタンパク質の細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する。かかるコンジュゲートは、「本発明により提供されるコンジュゲート(1つまたは複数)」、「本発明のコンジュゲート(1つまたは複数)」などのことをいうが、それらを含む医薬組成物などの組成物は、「本発明により提供される組成物(1つまたは複数)」などとして知られる。本願はまた、「本発明により提供されるコンジュゲート(1つまたは複数)」および「本発明により提供される組成物(1つまたは複数)」を記載するために、「本発明により提供されるコンジュゲート(1つまたは複数)および組成物(1つまたは複数)」のこともいい得る。
【００３２】
「凝固剤」は、哺乳動物の循環系においてインビボで、すなわち機能的な凝固カスケードおよび血小板活性化経路の存在下で、血栓の形成を促進する。ペプチド「凝固剤」は、「凝固タンパク質」である。凝固カスケードの例示的な因子としては、例えば組織因子、ハーゲマン因子(ヒトGeneID No. 2161)、血漿トロンボプラスチン(ヒトGeneID No. 2160)、トロンビン(ヒトGeneID No. 2147)、クリスマス因子(ヒトGeneID No. 2158)、安定第VII因子(ヒトGeneID No. 2155)およびフィブリン安定化因子(ヒトGeneID No. 2162、2165)が挙げられ、ヒトGeneID No. 2156、2157および2159も参照されたい。血小板活性化経路の例示的な因子としては、例えばADP、セロトニン、血小板活性化因子(PAF；ヒトGeneID No. 7941)、ヴォン・ヴィレブランド因子(vWF；ヒトGeneID No. 7450)、血小板因子4(ヒトGeneID No. 5196)およびトロンボキサンA2(TXA2))が挙げられる。凝固剤は、凝固カスケードまたは血小板活性化経路の構成因子または産物(すなわち、内因性、外因性または共通経路の構成因子)、ならびに凝固毒物、例えばコンブルキシン(convulxin)(例えば、αおよびβサブユニットのそれぞれの参照タンパク質についてユニプロットID O93426およびO93427を参照)およびルスセルリシン(Russellysin)(例えば、ユニプロットQ7LZ61)などの異種タンパク質であり得、ただし該因子は、例えば機能的凝固カスケードおよび血小板活性化経路の存在下において、血栓形成を促進する。
【００３３】
具体的な態様において、凝固剤は凝固タンパク質である。凝固タンパク質は、モノマー、またはダイマーもしくはトリマーなどのオリゴマー、または他の高次構造のポリマーとしてコンジュゲート中に存在し得る。より具体的な態様において、凝固タンパク質は組織因子である。第III因子、トロンボプラスチンおよびCD142としても公知である「組織因子」は、血栓形成を促進する第VII因子のレセプターである。組織因子は、ヒトGeneID No. 2152で例示され、ヒト：NP_001984.1、マウス：NP_034301.3、チンパンジー：XP_001156450.1およびイヌNP_001019811.1由来のタンパク質などの多くのホモログが公知である(HomoloGene ID 1511参照)。ヒトタンパク質は、ホモログ間で保存された一組のフィブロネクチン3型ドメイン(cl00065)などのモチーフ、ならびに一組のWKSモチーフ(Uniprot P13726.1)およびインターフェロン結合領域(保存ドメインCDD:204189)を含む。具体的な態様において、組織因子は、NP_001984.1のアミノ酸33〜251である配列番号:1で例示される組織因子の可溶性細胞外部分、および他の生物由来のホモログ配列との整列により同定可能な対応する配列、ならびに(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10残基以上の)置換および切断(truncation)を含むそれらの機能的バリアントである。いくつかの態様において、組織因子は、配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは配列番号:1と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは配列番号:1と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。改変された活性レベルを有するバリアント組織因子も、モノマーまたはいくつかの態様においてはダイマーなどの多量体のいずれかとして本発明に使用され得る。これらには、全体において参照により援用される米国特許第6,156,321号に記載されるような、例えば第VII因子の活性化に関して天然の組織因子よりも100倍以上活性が低い「凝固欠陥」組織因子が含まれる。
【００３４】
「抗体」は、免疫グロブリン(およびその抗原結合断片)、ならびに免疫グロブリンと同様に適用および使用され得る非免疫グロブリン骨格、いわゆる抗体模倣物の両方を包含する。例示的な抗体模倣物としては、フィブロネクチン3ドメイン(Fn3ドメイン；モノボディ(monobody)としても公知；例えば、Koide and Koide, Methods Mol. Biol. 352: 95-109) (2007)参照)、プロテインAのZドメイン(アフィボディ(affibody)としても公知；例えば、Nygren FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008)参照、γ-Bクリスタリンまたはユビキチン(afflin；例えば、Ebersbach, et al.. J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85 (2007)参照)、リポカリン(anticalin；例えば、Skerra, FEBS J., 275 (11): 2677-83(2008)参照)、膜受容体のAドメイン(avimer；例えば、Silverman, et al. Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61 (2005)参照)；アンキリン(ankryn)リピート(darpin；例えば、Stumpp et al., Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701 (2008)参照)、FynのSH3ドメイン(fynomer；例えば、Grabulovski  et al., J Biol Chem 282 (5): 3196-3204(2007)参照)、およびクニッツ型ドメイン(クニッツドメインペプチド；例えば、Nixon and Wood CR, Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8 (2006)参照)に基づくものが挙げられる。
【００３５】
本発明により提供されるコンジュゲートにおける使用のための抗体は、哺乳動物PLVAPタンパク質の細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する。哺乳動物PLVAPの例示的な細胞外ドメインエピトープとしては、(例えば、デフォルトパラメータを使用したBLASTp、ClustalW、COBALTなどの配列整列により評価される場合)、PLVAPの細胞外ドメイン(おおよそのアミノ酸49由来であり配列番号:2上にある)に対応する領域、またはより具体的にはおおよそのアミノ酸238由来であり配列番号:24上(NP_115774.2、マウスPLVAP参照配列、例えば、配列番号:24のアミノ酸238〜413のアミノ酸配列からなるペプチドなど)、または配列番号:2のアミノ酸約370〜約442に含まれる配列、(ヒトPLVAP参照配列、NP_112600.1)、例えば配列番号:2のアミノ酸378〜404または配列番号:2のアミノ酸431〜442などのPLVAPのC末端中の領域が挙げられる。具体的な態様において、本発明により提供されるコンジュゲートにおける使用のための抗体は、配列番号:2のアミノ酸378〜404もしくは配列番号:2のアミノ酸431〜442中のエピトープ；および/またはカニクイザル(XP_005588437.1)およびアカゲザル(AFH29537.1)由来の対応配列などの、これらのいずれかの対応する霊長類ホモログに特異的に結合する。
【００３６】
具体的な態様において、抗体は免疫グロブリンである。「免疫グロブリン」は、全長免疫グロブリン、ならびにFab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAbおよび抗原結合機能を維持する他の免疫グロブリン断片などの免疫グロブリンの抗原結合断片の両方のことをいう。免疫グロブリンは、それらの抗原結合ドメイン内に少なくとも3個のCDR(相補性決定領域)、より具体的な態様において、4、5または6個のCDR、さらに具体的には抗原結合ドメイン内に6個のCDRを有する。本発明における使用のための免疫グロブリンとしては、例えば、ヒト、オランウータン、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウサギおよびニワトリの抗体が挙げられる。免疫グロブリンは、ポリクローナル、モノクローナル、単特異性、多特異性、非特異性、ヒト化、ラクダ化(camelized)、単鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、変異またはCDR移植されたものであり得る。本発明における使用のための具体的な免疫グロブリンとしては、マウスハイブリドーマKFCC-GY4(ATCC特許寄託指定PTA-9963)もしくはマウスハイブリドーマKFCC-GY5(ATCC特許寄託指定PTA-9964)により産生される抗体のCDRを有するもの、またはそれらの保存的置換を有するもの、例えば具体的な態様において、抗原結合ドメイン内に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17もしくは18個までの保存的アミノ酸置換(より具体的には、1、2、3、4、5個以上の置換)、例えばそれぞれのCDR中に約1、2、3もしくは4個までの保存的置換、より具体的には、それぞれのCDR中に1もしくは2個までの保存的置換を有するものが挙げられる。ある態様において、免疫グロブリンは、ヒト化された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。それらの可変ドメインおよびCDRのアミノ酸配列を含むKFCC-GY4およびKFCC-GY5抗体は、米国特許出願公開公報第US 2011/0085973号(マウスにおいて産生されたモノクローナル抗体を最初に記載している)および同第US 2011/0262349号(特定のキメラバリアントおよびヒト化バリアントを記載している)に記載され、その両文献は、それらの全体において参照により援用される。これらの抗体についての可変ドメイン配列および同定されたCDRを示す配列番号:3〜22も参照されたい。
【００３７】
細胞膜小胞関連タンパク質、PV1、FELSおよびgp68としても公知である「PLVAP」は、HCC腫瘍脈管構造などの腫瘍脈管構造中に発現されるタンパク質であり、ヒトGeneID No. 83483に記載される。PLVAPは、ヒト(NP_112600.1、配列番号:2も参照)、チンパンジー(XP_512490.3)、マウス(NP_115774.2)およびイヌ(XP_541953.3)などのいくつかの生物において同定されており(HomoloGene ID 10578参照)、PV-1ドメイン(pfam06637)を含む。哺乳動物PLVAPなどのPLVAPに特異的に結合する抗体は、いくつかの態様において、配列番号:2のおおよそのアミノ酸49〜442または51〜442に対応するPLVAPの細胞外ドメインに結合する。特定の態様において、哺乳動物PLVAPは、配列番号:2(またはその細胞外ドメイン)と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは配列番号:2(またはその細胞外ドメイン)と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは配列番号:2(またはその細胞外ドメイン)と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、PLVAPタンパク質は、配列番号:2またはその細胞外ドメインに対して、(例えば、1、2、3、4、5残基以上の)置換および/または (例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10残基以上の)切断を含む。
【００３８】
本発明にふさわしい使用のためのリンカーペプチドは、抗体と、凝固剤、例えば凝固タンパク質を、ペプチド結合により結合し得、例えば、該抗体(例えば免疫グロブリンの可変ドメインの1つ)および凝固タンパク質は、1つのポリペプチド鎖として発現され得る。リンカーペプチドは、例えば、約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸以上、例えば約75、100、150、200、250または300アミノ酸の長さで変化し得る。いくつかの態様において、リンカーは、天然の免疫グロブリン中に見られるシステインリッチドメインおよびプロリンリッチドメインと類似のヒンジ領域を含み、任意に抗体(例えば免疫グロブリン)と凝固剤(例えば凝固タンパク質)の間にスペースを取るためのさらなるリンカーペプチド、例えば(Gly4-Ser)3を含む。
【００３９】
本発明により提供されるコンジュゲートは任意に、蛍光性、酵素性または放射性の標識などの検出可能な標識などの標識を含み得る。ある態様において、本発明により提供されるコンジュゲートはビオチニル化される。
【００４０】
関連のある局面において、本発明は、本発明により提供されるコンジュゲートをコードする核酸、該核酸を含むベクター、ならびに該核酸およびベクターを含む宿主細胞を提供する。例示的な核酸としては、本発明により提供されるコンジュゲート、具体的な態様において、例えば配列番号:23のアミノ酸を有するコンジュゲートと少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるタンパク質をコードするものが挙げられる。他の態様において、該核酸は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明により提供されるコンジュゲートをコードする核酸にハイブリダイズし得る。「高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件は、65℃で少なくとも約6X SSCおよび1% SDSであり、最初の洗浄が、0.1X SSC中約20%(v/v)ホルムアミドを用いて約42℃で10分であり、その後の洗浄が、65℃で0.2X SSCおよび0.1% SDSを用いるものである。具体的な態様において、本発明により提供される核酸は、例えばコンジュゲートの産生のために使用される特定の宿主細胞について改変されたコドンであり得る。本発明により提供される核酸をコードするベクターは、例えば本発明により提供されるコンジュゲートの発現に必要なさらなる配列(例えば調節配列、プロモーターおよびエンハンサー)、ならびに1つ以上の複製起点、1つ以上の選択可能マーカーおよび組込み配列(例えば、ランダム組込み、転位因子または標的化ヌクレアーゼなどによる相同組み換えによる部位特異的組込みのいずれかによる宿主ゲノムへの組み込みのため)などの特待の適切な補助的な配列を含み得る。
【００４１】
関連のある局面において、本発明は、例えば、(例えば、誘導剤などの添加によりプロモーターが誘導可能な場合)本発明により提供される核酸を含む宿主細胞を、宿主によるコンジュゲートの発現を支持する条件下で培養して、次いで発現したコンジュゲートを単離することにより、本発明により提供されるコンジュゲートを作製する方法を提供する。適切な宿主としては、細菌(例えば大腸菌)、ならびに真核生物細胞、例えば発芽酵母を含む酵母などの真菌、Sf0、Sf21もしくはハイファイブ(high five)細胞などの昆虫細胞、またはCHO、VEROもしくはCOS細胞などの哺乳動物細胞、または間充織幹細胞(MSC)が挙げられる。
【００４２】
本発明により提供されるコンジュゲートは、医薬組成物などの組成物中に有用に調製され得、例えばここで、本発明により提供されるコンジュゲートは、適切な担体または賦形剤を用いて化合物化される。任意の適切な医薬担体が本発明において使用され得る。具体的な態様において、該担体は、例えば保存または輸送のために凍結乾燥した場合にコンジュゲートの安定性を高め、再構成後の水溶液などの溶液中にある場合、最良の薬学的な実施と矛盾しない、本発明により提供されるコンジュゲートの安定性を支持する。医薬組成物は、バッファ(例えばヒスチジン、リン酸またはコハク酸のバッファ)、膨張剤または固化剤(caking agent)(例えばグリシンもしくはソルビトール、またはスクロース、デキストロース、ラクトースもしくはフルクトースなどの糖)、張度調整剤(tonicity modifier)(例えば、塩化ナトリウム、リン酸カリウムまたはリン酸ナトリウムなどの無機塩)、保存剤、湿潤剤、乳化剤等の1つ以上を含み得る。
【００４３】
具体的な態様において、本発明により提供されるコンジュゲートは、例えば経動脈投与などの経脈管投与による、HCC腫瘍脈管構造への直接投与に適した医薬組成物中に調製される。具体的な態様において、本発明により提供されるコンジュゲートは、リピドールオイル(lipidol oil)中に調製され得る。他の態様において、本発明により提供されるコンジュゲートは、約45μm〜約90μmの平均粒径を有する微小粒子、例えばIVALON(登録商標)塞栓性粒子(embolic particles)を用いて調製され得る。かかる賦形剤の存在による注入により、例えば注入後の腫瘍血管内の血液の停止を誘導することにより、治療される腫瘍へと投与される場合、本発明により提供されるコンジュゲートのアベイラビリティが高められ得る。
【００４４】
いくつかの態様において、本発明により提供される組成物は、例えばX線透視検査による治療される腫瘍内の本発明により提供されたコンジュゲートの分布の評価を可能にするため、および/または本発明により提供されるコンジュゲートへの腫瘍の曝露の完全性を評価するために、(放射線写真、MRIまたは超音波適用のための)適合性水溶性造影剤を含み得る。
【００４５】
本発明により提供される医薬組成物は、本発明の医薬組成物の成分の1つ以上で充填される1つ以上の容器を含み得る複数の剤型のキットを含む、該医薬組成物を必要とする被験体への分布および投与のための(本発明により提供される方法にふさわしい)剤型(1つまたは複数)で調製され得る。任意に、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定される形態の注意書きがかかる容器に添付され得、該注意書きは、製造、使用または販売の機関による、ヒト投与のための承認を反映する。梱包またはキットには、投与の形態、薬物投与の順序(例えば複数薬剤キットの場合に別々、連続または同時)等に関する情報が貼付され得る。梱包またはキットはまた、患者に治療を受けることを気付かせるための手段を含み得る。梱包またはキットは、併用療法の一単位用量であり得るか複数の単位用量であり得る。特に、化合物(1つまたは複数)は、単一形態、例えばバイアルまたは錠剤中に存在して、任意の組み合わせで別々であり得るか一緒に混合され得る。本発明の目的で、単位用量は、それぞれの化合物の個々の薬力学に依存して、標準的な時間経過でFDA承認された用量において投与される用量を意味することを意図する。
【００４６】
したがって、本発明により提供されるコンジュゲート、本発明により提供される医薬組成物およびそれらを含む本発明により提供されるキットは、HCCなどのPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を有する被験体を治療する方法、ならびにPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を可視化する方法に有用である。
【００４７】
治療方法
本発明により提供されるコンジュゲートおよび組成物は、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍(例えばHCCまたは神経膠芽腫)の治療、肝細胞癌(HCC)の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の腫瘍体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体において、例えばPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍(例えばHCCまたは神経膠芽腫)を治療する、肝細胞癌(HCC)を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の腫瘍体積を低減する、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導する方法に使用され得る。これらの方法は、該被験体に、本発明により提供されたコンジュゲートまたは本発明により提供された組成物の治療有効量を投与する工程を含む。
【００４８】
「被験体」は、哺乳動物、より具体的にはヒト患者(男性または女性)のことをいい、より具体的な態様において、HCC、神経膠芽腫、またはPLVAP陽性脈管構造を有する任意の腫瘍を有するヒト患者のことをいう。被験体は、生涯の任意の段階および任意の年齢、例えば新生児、歩かない幼児、歩く幼児、小児、若い男性、成体または老体であり得るが、特定の態様において、被験体は成体、例えばヒト成人、すなわち約18歳以上、例えば約18〜70、20〜60、25〜55、25〜50、30〜50、25〜65歳、ならびに約30、40、50、60、70、80または90歳より高齢である。より具体的な態様において、被験体は60歳以上、例えば、より具体的には65歳以上である。さらに具体的な態様において、被験体は、約70〜約79歳である。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「治療する(treat)」、「治療する(treating)」または「治療(treatment)」は、医学的条件(例えば、HCCまたはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍)を打ち消して、臨床的に許容され得る標準に従って医学的条件を改善することを意味する。例えば、HCCの改善としては、低減された腫瘍体積、低減された腫瘍血流、腫瘍壊死および/またはアポトーシス、標準化された肝臓機能等が挙げられる。
【００５０】
「治療有効量」は、HCCを治療するのに十分な量など、投与の条件下で所望の治療的または予防的効果を達成するのに十分な量である。治療の有効性は、標準的な測定および常套的な方法を使用して、当業者により決定され得る。具体的な態様において、コンジュゲートは、腫瘍1cm3あたり約5〜約200μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約10〜約150μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約15〜約100μgの用量で投与される。本明細書において提供されたマウス実施例などのある生物において有効であると分かった用量は、公知の方法を使用して、ヒトなどの別の生物における使用について変換され得る。例えば、Reagan-Shaw et al., FASEB J. 22:659-61 (2008)；Schein et al., Clin. Pharmacol. Ther. 11: 3-40 (1970)；およびFreireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4):219-244 (1966)を参照。例えば動物投与に基づいたmg/kgのヒト当量(HED)は、以下の等式：HED(mg/kg)=動物用量(mg/kg) X (Km動物/Kmヒト)、式中、Km=重量/表面積(kg/m2)により得ることができる。上述の等式に基づいた例示的な変換係数を表Aに示す。
【００５１】
【表１】
2015096065.tif 000002
【００５２】
本発明により提供されるコンジュゲートおよび本発明により提供される組成物は、任意の適切な手段により被験体に提供(例えば投与)され得、例えば、具体的な態様において、被験体の腫瘍に対して脈管内に提供され得、例えばコンジュゲートは、HCCの1つ以上の腫瘍栄養管に直接注入される。
【００５３】
本発明により提供される方法により治療される被験体は、1つ以上の化学療法剤、放射線療法、腫瘍内アルコール注入、手術、寒冷療法、高周波振動または前述の1つ以上の組み合わせによる同時または連続の治療を受けてもよい。ある態様において、1つ以上の化学療法剤は、ソラフェニブ(例えばPubChem 216239を参照)、ベバシズマブ、または他の抗脈管形成治療薬の治療有効量を含む。併用方法について、本発明により提供されるコンジュゲート(または本発明により提供される組成物)は、同時に(単一組成物または別々の組成物のいずれか中)または連続して(他の治療の前後のいずれかで)投与され得る。
【００５４】
該方法が、造影剤を含む本発明により提供される組成物を使用する場合、いくつかの態様において、本発明により提供される方法は、例えば、x線(CATスキャンなど)、MRIまたは超音波により、造影剤を使用して、腫瘍(例えばHCCまたは神経膠芽腫)を可視化する工程を含み得る。
【００５５】
被験体は、本発明により提供されるコンジュゲートまたは組成物を単一用量で投与され得るか、または他の態様において、複数用量、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10用量以上で投与され得る。複数用量で投与される場合、該用量は、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月の期間にわたり投与され得る。
【００５６】
HCCを発症する危険性の高い集団は、HBV陽性である；HCV陽性である；肝臓機能の障害を有する；肝硬変を有する；TP53(OMIM 191170)、MET(OMIM 164860)、CTNNB1(OMIM 116806)、CASP8(OMIM 601763)、PIK3CA(OMIM 171834)、AXIN1(OMIM 603816)、PDGFRL(OMIM 604584)およびAPC(OMIM 611731)の1つ以上に変異を有する；α-1-抗トリプシン欠損(OMIM 613490)；ヘモクロマトーシス(OMIM 235200)；チロシン血症(OMIM 276700)；ならびに前述の組み合わせを有する被験体を含み得る。したがって、ある態様において、本発明により提供される方法は、例えば本発明により提供されるコンジュゲートの投与前に、これらの変異の1つ以上を有する、HCCを有する(または有すると疑われる)被験体、変異の1つ(またはHCCの病理学の増加に関連する任意の変異)を有すると同定された被験体を提供する工程を必要とする。
【００５７】
本発明により提供されるコンジュゲートおよび本発明により提供される組成物は、任意の適切な経路および任意の適切な手段により被験体(例えばヒト)に投与され得る。例えば、該コンジュゲートまたは組成物は、例えば、肝動脈もしくは大腿動脈などの1つ以上の腫瘍栄養血管中へ、または肝門脈を介した直接注入により、被験体のHCCへと脈管内投与され得る。本発明により提供されるコンジュゲートおよび本発明により提供される組成物は、単独で、またはソラフェニブ(例えば、PubChem 216239参照)、ベバシズマブもしくは他の抗脈管形成治療薬の1つ以上などの1つ以上の化学療法剤と一緒に(同じ組成物中、または同時もしくは連続投与のいずれかで)被験体に投与され得る。
【００５８】
本発明により提供される方法のいずれかにおいて、コンジュゲートは、腫瘍1cm3あたり約5μg〜腫瘍1cm3あたり約200μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約10〜約150μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約15〜約100μgの用量で投与される。本発明により提供されるコンジュゲートまたは本発明により提供される組成物は、単一用量、または2、3、4、5、6、7、8、9、10用量以上などの複数用量で投与され得る。複数投与は、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月などの任意の有用な期間にわたりなされ得る。
【実施例】
【００５９】
実施例
PLVAP遺伝子発現は、HCCの脈管内皮細胞に限定され、非腫瘍性肝臓組織にはない。PLVAPタンパク質は、脈管内皮の窓および小胞の構造タンパク質である。PLVAPは、シグナル伝達に関与することは知られていない。最近、抗PLVAP抗体処理が、マウスにおける白血球の脈管内皮細胞の通過に影響することが報告された。
【００６０】
本特許出願において、発明者らは、非腫瘍性肝臓組織ではなく、HCCの脈管内皮細胞におけるPLVAPの差異的な発現を活用した、HCCの治療のための新規の治療用生物製剤の開発を記載する。本発明者らのアプローチのために、本発明者らは、抗PLVAP抗体またはそのFab断片上にヒト組織因子タンパク質を共発現させることにより、この治療用生物製剤を開発する。ヒト組織因子は、凝血の有力な誘発因子である。本発明者により開発されたかかる治療剤のHCCの血管への注入により、該治療剤の腫瘍脈管内皮細胞への結合が誘導され得、HCCの全ての血管における血栓の形成が誘発され得る。HCC腫瘍血管の血栓症は、腫瘍血管供給物の剥脱および虚血性壊死を誘導する。SCIDマウスにおいてHCC異種移植片モデルを使用して、本発明者らは、開発したヒト組織因子を有する抗PLVAPモノクローナル抗体またはそのFab断片の腫瘍栄養動脈への注入により、腫瘍異種移植片の大規模な虚血性壊死が成功裡に誘導され、腫瘍増殖が抑制されたことを示した。末梢静脈を介したかかる治療剤の全身性投与は無効であった。したがって、この新規の薬剤の腫瘍栄養動脈への注入は、治療効果の達成に好ましい。
【００６１】
材料および方法
ラット抗マウスPLVAP MECA32モノクローナル抗体(mAb)
University of IowaのDevelopmental Studies Hybridoma Bank(Iowacity, IA)からMECA 32ハイブリドーマを得た。該ハイブリドーマ細胞を、10%低IgGウシ胎児血清、1% GLUTA-Max (Life Technologies, Carlsbad, CA)、1%抗生物質-抗真菌剤(Life Technologies)および1% HEPES(Life Technologies)を含むRPMI培地中で培養した。製造業者の指示書に従ってGE Healthcare Life SciencesのHiTrapプロテインGカラムを使用して、MECA 32ハイブリドーマ細胞の濁った培養上清からラット抗マウスPLVAP MECA32 mAbを精製した。精製した抗体をリン酸緩衝化食塩水(PBS)、pH7.4に透析した。1mg/mlに対して1.37の励起係数を使用して、280nmの波長での吸光度により抗体の濃度を測定した。
【００６２】
ヒト組織因子タンパク質の水溶性細胞外ドメインの産生
ヒト組織因子タンパク質(hTF)の組み換え水溶性細胞外部分を産生するために、ヒト組織因子の全長cDNAクローン(NM001993.2) (OriGene Corp., Rockville, MD)からヒト組織因子cDNAの細胞外ドメイン(アミノ酸残基33〜251)についてのPCR断片を調製した。PCRに使用したプライマーは、フォワードプライマーおよびバックワードプライマーそれぞれの両方の5'末端にBamH1およびSalIについての制限配列を含んでいた。増幅したcDNA断片を、pGEX(登録商標)-6P-1プラスミド(GE Heathcare Life Sciences)に挿入して、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)でタグ付加した。上述の発現構築物をDNA配列決定により確認して、hTFの産生のために大腸菌株SHuffleTM T7 Express (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA)に形質転換した。大腸菌形質転換体を選択培地に播種した。その後、1〜2mmのコロニーを無作為に選択して、100μg/mlアンピシリンを含む4mlの2xYT培地に30℃で接種して、230rpmインキュベーター振盪器中で一晩インキュベートした。翌日、一晩培養物を100μg/mlアンピシリンを含む400mlの2xYT培地に接種して、230rpmインキュベーター振盪器で一晩、30℃で増殖を続けた。600nmでの吸光度が約0.6〜0.8に達したところで、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.4mMの終濃度まで添加して、タンパク質産生を誘導した。30℃で約20時間振盪を続けた。IPTGでの誘導後、遠心分離(10,000xg、20分)により細胞を回収して、室温で2時間、ライソザイムおよびベンゾナーゼヌクレアーゼ(Novagen)を含む0.2% Tween80を有する1xPBS中の溶解に供した。細胞溶解物を10,000rpmで4℃、30分間遠心分離した。上清を回収して可溶性画分としてろ過した。
【００６３】
GSTでタグ付加した組み換えヒト組織因子(GST-hTF)を、製造業者の指示書に従って、GSTrap FFカラム(GE Helathcare Life Sciences, Piscataway, NJ)から精製した。GST-hTFを含む溶出画分をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で同定して、プールしてPBSに透析した。精製したタンパク質の濃度を、Bradfordタンパク質アッセイ(Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)および標準としてウシ血清アルブミンを使用して決定した。精製したGST-hTFは、SDS-PAGEゲル(10%ポリアクリルアミド)中50kDaの予想分子量を有するタンパク質バンドを示した(図1)。市販のヒト組織因子に対する精製したタンパク質の組織因子活性を、比色アッセイ(chromogenic assay)を使用してアッセイした。市販のhTF標準に対して精製したGST-hTFをアッセイし、タンパク質1μgあたり3ugのhTF活性を有した。このhTF活性アッセイの手順を以下のセクションに詳述する。
【００６４】
ラット抗マウスPLVAP MECA32モノクローナル抗体に対する組み換えGST-hTFのコンジュゲート
第1に、精製したMECA32 mAbを、0.5M NaClを含む0.1M MESバッファ、pH6.0中で透析した。MESは、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。同じMESバッファを使用して、抗体を1mg/mlに調整した。1mlのMECA32 mAbに、1.2mg EDC(1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド)および3.3mgのスルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)を添加した。緩やかにボルテックスにかけて添加した試薬を溶解した後、混合物を室温で1時間インキュベートした。PBSカップリングバッファで予め平衡化したZeba脱塩カラムを使用して、活性化MECA32 mAbを回収した。PBSカップリングバッファは、140mM NaCl、10mMリン酸ナトリウムおよび3mM KCl、pH7.4〜7.5で構成された。次いで、等しい数のGST-hTF(0.66ml中0.33mg)を活性化MECA32-mAbに添加した。混合物を、回転式混合器で、室温で3時間インキュベートした。次いで10mMの終濃度までヒドロキシルアミンを添加して反応をクエンチした。ヒト組織因子タンパク質と共役した抗体を、1xリン酸緩衝化食塩水に対して透析し、全ての小有機化学物質を完全に除去した。280nmでの吸光度により抗体の濃度を測定した。1mg/mlについて1.37の励起係数を、抗体濃度の測定に使用した。ヒト組織因子に共役した抗体を、比色アッセイを使用して組織因子活性について測定した。R&D Systems (Minneapolis, MN)から購入した組み換えヒト組織因子をアッセイの標準として使用した。精製したMECA32モノクローナル抗体のTFコンジュゲート(MECA32-TF)を、マウスPLVAPに対する結合およびマウスPLVAPに結合した抗体上のヒト組織因子の存在についてアッセイした(図2)。
【００６５】
hTFを共発現するMECA32抗マウスPLVAPモノクローナル抗体のFab断片(MECA32-Fab-TF)を発現するプラスミド構築物の開発
MECA32-Fab-TFを産生するためのプラスミド構築物の調製は、4工程で達成した。第1の工程は、MECA32 mAb軽鎖の可変ドメイン(VL)およびMECA32 mAb重鎖の可変ドメイン(VH)のcDNAを調製すること、ならびに第2の工程に使用するプライマーの調製のためにそれらのDNA配列を決定することであった。第2の工程は、カルボキシル末端にHis-タグを有するMECA32 mAbのκ軽鎖についての全長cDNAを調製して、pET26bプラスミドベクターに挿入することであった。第3の工程は、VH1およびCH1ドメイン(Fd)+3'末端にリンカー配列を有するMECA32 mAb重鎖のヒンジ領域のcDNA、ならびにhTFおよび5'末端のリンカー配列についてのcDNAを調製することであった。次いで、オーバーラップPCRを使用して、2つのcDNAを一緒に縫い合わせた(sticth)。MECA32-Fd-ヒンジ-リンカー-TFのこのcDNAをpET26bプラスミドベクターに挿入した。第4の工程は、第2および第3の工程から調製したプラスミドからバイシストロニック(bicistronic)プラスミドベクターを構築することであった。これらの4つの工程を以下により詳細に記載し、図3Aおよび3Bに要約する。
【００６６】
第1の工程：核酸配列決定のためのMECA32 mAbκ軽鎖のVLドメインおよびMECA32 mAb重鎖のVHドメインのcDNAをクローニングする工程
MECA32 mAb軽鎖の可変ドメイン(VL)および重鎖の可変ドメイン(VH)をコードするcDNAを、FirstChoice RLM-RACEキット(Ambion, Inc., Austin, TX)を使用して、製造業者の指示書に従って調製した。簡潔に、MECA32ハイブリドーマから単離した全RNAを鋳型として使用して、VLドメインに続くκ軽鎖の定常ドメインのヌクレオチドに相補的なプライマー(5'TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3')(配列番号:27)およびVHドメインに続く重鎖のCH1ドメインのヌクレオチドに相補的なプライマー(5'TGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3')(配列番号:28)のそれぞれを用いて逆転写PCRにより軽鎖の可変ドメイン(VL)および重鎖の可変ドメイン(VH)を増幅した。
【００６７】
PCR産物を分析して、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)を使用して1.5%アガロースゲルから単離した。精製したPCR断片をプラスミドベクターpGEM-T-easy(Promega, Madison, WI, USA)に挿入して、大腸菌株YE707-J(Yeastern Biotech, Taipei, Taiwan)に形質転換した。VLドメインおよびVHドメインの挿入物を含むプラスミドを、形質転換した大腸菌から調製して、VLドメインおよびVHドメインのDNA配列の決定に使用した。次いで、該配列を使用して第2および第3の工程に使用するプライマーを設計した。
【００６８】
第2の工程：MECA32 mAbκ軽鎖およびHis-タグで構成されるcDNAを調製して、それをpET-26bプラスミドベクターに挿入する工程
第1の工程由来のVL鎖の配列を使用して、MECA32抗体の全長κ軽鎖cDNA配列を得るための適切なプライマーを設計した。第1に、MECA32ハイブリドーマ細胞の全RNAから、以下に記載のプライマー：
フォワードプライマー：5'GATCCTGACATCCAGATGACCCAGACTCC3'(配列番号:29)および
リバースプライマー：5'CACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3'(配列番号:30)
を使用して、RT-PCRによりMECA32 mAbの全長κ鎖cDNAを作製した。
【００６９】
BamHIおよびSal I制限部位を有する精製したPCR断片を、CKドメインのカルボキシル末端に(His)6-タグを有するプラスミドベクターpET26bに挿入し、このプラスミドをpET26b-M32Kと命名した(図3A)。
【００７０】
第3の工程：MECA32-Fd-ヒンジ-リンカー-TF cDNAを調製して、pET26bプラスミドベクターに挿入する工程
本発明者らは最初に、MECA32 mAb Fd、ヒンジ領域およびリンカー配列で構成されるcDNAを、MECA32ハイブリドーマ細胞由来のcDNA鋳型ならびに以下のプライマーペア：
フォワードプライマー：5'GACATCCAGATGACCCAGACTCC3'(配列番号:31)および
ヒンジリンカーリバースプライマー：
5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3'(配列番号:32)
を使用してPCRにより調製した。
【００７１】
次いで、本発明者らは、(Gly4Ser)3リンカー配列およびヒト組織因子の細胞外ドメイン(AA. 33〜251)(hTF)で構成されるcDNAを、クローニングしたhTF cDNA鋳型ならびに以下のプライマーペア：
hTFリンカーフォワードプライマー：
5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG3'(配列番号:33)および
TFリバースプライマー：5'CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3'(配列番号:34)
を使用してPCRにより調製した。
【００７２】
オーバーラップ伸長により2つのPCR産物を縫い合わせた。最終融合PCR産物をpET-26bベクターに挿入した。このベクターをpET26b-M32-Fd-TFと指名した(図3A)。
【００７３】
第4の工程：MECA32 Fd-ヒンジ-(Gly4Ser)3リンカー-TFおよびHis-タグを有するMECA32κ軽鎖の両方を含むバイシストロニックプラスミドベクターの構築
本発明者らは、鋳型としてpET26b-M32-Fd-TFならびに以下のプライマーペア：
26b-RBS-F：5' ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3'(配列番号:35)および
26b-終結-R：5' CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3'(配列番号:36)を使用してPCRによりDNA断片を作製した。
【００７４】
このDNA断片は、リボソーム結合配列(rbs)、MECA32 mAb重鎖のVH1およびCH1、ヒンジ領域、リンカー配列、hTFならびにストップコドンを含んでいた。次いで、この断片をpET26b-M32KのXba I制限部位に挿入した。全挿入物の配列を、色素デオキシ法(dye-deoxy method)を使用してDNA配列決定により確認した。このプラスミド構築物をpET26b MECA32-Fab-TFと指名して(図3B)、タンパク質発現のための大腸菌SHuffle T7発現株(New England Biolabs Corp.)に形質転換した。このMECA32-Fab-TFの産生のためのバイシストロニックプラスミド発現ベクターの構築工程を要約する模式図を図3Aおよび3Bに示す。
【００７５】
ヒト組織因子を共発現するMECA32抗マウスPLVAPモノクローナル抗体(MECA32-Fab-TF)のFabの作製
MECA32-Fab-TFを作製するために、新しい大腸菌培養物のコロニー(1〜2mm)を、30μg/mlカナマイシンを含む4mlの2xYT培地に30℃、230rpmで一晩接種した。翌朝、一晩培養物を、30μg/mlカナマイシンを含む400mlの2xYT培地に接種して、30℃、250rpmで増殖を継続した。600nmでの吸光度が約0.6〜0.8に達した際に、組み換えタンパク質産生の誘導のために、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.4mMの終濃度まで添加した。30℃で約20時間振盪を継続した。
【００７６】
室温で20分間、10000xgの遠心分離により細胞を回収し、これを使用して封入体を単離した。細胞ペーストを、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.17mg/ml PMSFおよび2mg/mlニワトリ卵白リゾチーム(Sigma)を含む4mlの10mM Tris/HCl、pH7.5に懸濁した。ベンゾナーゼ(250単位；EM Science)を添加し、懸濁物を室温で1.5時間緩やかに混合して、次いで12000xgで15分間遠心分離した。ペレットを、1mM EDTAおよび3% Nonidet P40(2ml)を含む10mM Tris/HCl、pH7.5に再懸濁し、50%出力で1分間超音波破砕して、12000gで20分間遠心分離した。ペレットを水に再懸濁し、50%出力で20〜30秒間超音波破砕して、12000xgで20分間遠心分離した。水での洗浄を繰り返し、封入体を多く含んだ(highly enriched)最終ペレットを、室温で一晩緩やかに混合することにより、6M塩化グアニジニウム、0.5M NaCl、20mMリン酸塩および10mM 2-メルカプトエタノールを含んだバッファ、pH8に懸濁した。溶液を室温で一晩静置し、次いで6M尿素/50mM Tris/HCl、pH8中に約1mg/mlのタンパク質濃度まで希釈して、10〜20体積の同バッファに対して4℃で一晩透析した。次いで透析液を、2M尿素、50mM Tris/HCl、300mM NaCl、2.5mM GSH、0.5mM GSSGを含むバッファ、pH8(フォールディングバッファ(folding buffer))に変更した。2日間の透析後、バッファを新しいフォールディングバッファに置き換えて、透析をさらに2日間続けた。次いで、透析バッファを、1M尿素、50mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH8のバッファに変更して、透析をさらに1日間継続した。次いで、尿素の濃度を0.8M尿素から連続的に下げた同バッファ中で6時間、0.56M尿素で一晩、および0.28M尿素で6時間透析を行った。最終的に、尿素を含まないフォールディングバッファで透析を行い一晩継続した。再度フォールディングした(refolded)上清をニッケルニトリロ三酢酸(Ni-NTA；GE Healthcare)カラムに充填して、50mMリン酸ナトリウムおよび0.3M NaCl、pH7.0中500mMイミダゾールで溶出した。組み換えMECA32-Fab-TFを、HiLoad 16/60 Superdex 75調製等級(GE Healthcare)ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによりさらに精製した。目的のMECA32-Fab-TFを含む溶出物をSDS-PAGEで分析してプールした。MECA32-Fab-TFをELISAで特徴付けて、マウスPLVAPに結合することを確認した。MECA32-Fab-TFの組織因子特異的活性を、比色TFアッセイを用いて測定した。
【００７７】
水溶性ヒト組織因子を共発現するCSRO2抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体の組み換えFab断片(CSRO2-Fab-TF)を発現するプラスミド構築物の開発
本発明者らは、MECA32-Fab-TFと同様の組み換え抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFタンパク質も作製した。このタンパク質は、抗ヒトPLVAP mAb CSRO2を基に開発した。この組み換えタンパク質の構造は、異なるAbドメインを有し、κ軽鎖のカルボキシル末端にHis-タグを有さないこと以外は、実質的に上述のMECA32-Fab-TFと同様であった。His-タグは、CSRO2-Fab-TFの精製には必要なかったので除去した。抗ヒトκ軽鎖KappaSelectアフィニティーカラムクロマトグラフィー(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)を使用して、CSRO2-Fab-TFを精製した。CSRO2 mAbは、ヒトPLVAPに対するヒト化モノクローナル抗体である。
【００７８】
CSRO2-Fab-TFの産生のためのプラスミド構築物を調製するために使用した手順は、MECA32-Fab-TFのプラスミド構築物の作製と、いくつかを改変して同様であった。CSRO2 mAb重鎖および軽鎖のcDNA配列は既知であったので、抗体重鎖の5'末端および軽鎖のDNA配列を得るためにcDNAをクローニングするための前述の第1の工程は飛ばした。そのため、CSRO2-Fab-TF発現構築物を調製するにはわずか3つの工程が必要であった。これらの3つの工程を以下に記載する。
【００７９】
第1の工程：pET26bプラスミドベクターへのCSRO2 mAb軽鎖cDNAの挿入
CSRO2 mAbを産生するNS0細胞株由来の全RNAを、プライマーとしてオリゴdTを使用してcDNAに逆転写した。CSR02のκ軽鎖cDNAを、鋳型としてオリゴdTプライマーcDNAおよび以下に示すプライマーペア：
CSR02-VK3F-26b F Nde I フォワードプライマー：
5' TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA 3'(配列番号:37)
κ-R-26b-Not Iリバースプライマー：5' GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'(配列番号:38)
を使用してPCRにより作製した。
【００８０】
次いで、CSRO2mAb軽鎖についての精製したPCR DNA断片をプラスミドベクターpET26bのNde IおよびNot I部位に挿入してpET26b-cVK3を作製した。
【００８１】
第2の工程：CSRO2 mAbのVH1、CH1およびヒンジ領域+(Gly4Ser)3リンカー配列およびヒト組織因子の細胞外ドメイン(AA. 33〜251)(hTF)で構成される融合ポリペプチドの発現のためのcDNAを挿入されたpET26bプラスミドベクターの構築
このプラスミドは、鋳型としてNS0細胞株から調製されたcDNAおよびクローニングされたヒト組織因子cDNAを使用してPCRにより構築した。PCRには以下のプライマーを使用した：
【００８２】
I) CSRO2 mAb重鎖のVH1-CH1-ヒンジ領域およびリンカー配列についてのプライマーペア：
VH5-pro26b-NdeI-F フォワードプライマー：
5' TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG 3'(配列番号:39)および
ヒンジリンカーR：
5' AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC 3'(配列番号:40)。
【００８３】
II) リンカー配列-hTF-+挿入のための制限部位についてのプライマーペア：
hTFリンカーF：5' GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG 3' (配列番号:41)
hTF R-Not I：5' GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG 3'(配列番号:42)。
【００８４】
上述の2回のPCR反応から作製されたPCR断片を、オーバーラッピング伸長によりさらに融合させて増幅した。融合cDNAをpET26bプラスミドベクターに挿入し、これをpET26b-VH5-Fd-TFと指名した。
【００８５】
第3の工程：CSRO2 mAb Fd-ヒンジ-(Gly4Ser)3リンカー-TFおよびCSRO2 mAbκ軽鎖の両方のcDNAを含むバイシストロニックプラスミドベクターの構築
本発明者らは、鋳型としてpET-26b-VH5-Fd-TFならびに以下のプライマーペア：
26b-RBS-F：5' ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3'(配列番号:43)および
26b-終結-R：5' CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3'(配列番号:44)
を使用してPCRによりDNA断片を作製した。
【００８６】
増幅したDNA断片は、リボソーム結合部位(rbs)；VH1、CSRO2重鎖のCH1およびヒンジ領域；リンカー配列；可溶性ヒト組織因子；ならびにストップコドンを含んだ。このDNA断片をpET26b-cVK3ベクターのXba I部位に挿入して、新規のバイシストロニックプラスミドベクターを駆動してpET26b CSR02-Fab-TFと指名した(図4)。このプラスミドを使用して、1つのプロモーターの制御下で、κ軽鎖および融合重鎖の両方を発現させた。全挿入物の配列を、色素デオキシ法を使用してDNA配列決定により確認した。
【００８７】
水溶性ヒト組織因子を共発現するCSRO2抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体の組み換えFab断片(CSRO2-Fab-TF)の作製
組み換えCSR02-Fab-TFタンパク質の発現。コンピテント細胞とpET-26b CSR02-Fab-TFプラスミドDNAを氷上で5分間インキュベートし、42℃の水浴中で正確に30秒間加熱し、次いで氷上に2分間置くことにより、大腸菌Shuffle T7 Express(New England Biolabs)の形質転換を行った。選択培地に播種する前に、形質転換体を、250rpmで浸透しながらSOC培地(0.5%酵母抽出物；2%トリプトン；10mM NaCl；2.5mM KCl；10mM MgCl2；10mM MgSO4；20mMグルコース)で、30℃で60分間インキュベートした。0.05mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドにより、CSR02-Fab-TFの発現を30℃または37℃で16時間誘導した。誘導後、細菌細胞を、0.2% Tween80を含む1xPBS中、リゾチームおよびベンゾナーゼヌクレアーゼの存在下、室温で2時間、溶解に供した。細胞溶解物を、10000rpm、4℃で30分間遠心分離して回収した。上清を回収してろ過し、可溶性画分を単離した。
【００８８】
KappaSelectおよびCapto AdhereMmultimodalカラムクロマトグラフィーによるCSR02-Fab-TFの精製。KappaSelectカラム(1ml)を、リン酸緩衝化食塩水(PBS)、pH7.4(0.01Mリン酸塩バッファ、0.0027M KCl、0.14M NaCl)で平衡化した。CSR02-Fab-TFを含む大腸菌溶解物を、流速1ml/分で充填した。試料の適用後、OD280がベースラインに下がるまで、平衡化バッファでカラムを洗浄した。結合したタンパク質の残りを、0.25Mスクロースを含む0.1Mグリシンバッファ、pH2.7で溶出した。溶出物はすぐに、1mlの溶出物あたり50μlの1M Tris塩基バッファ、pH9.0を添加して、生理学的pHに調整した。
【００８９】
KappaSelectカラムから溶出したCSRO2-Fab-TFをさらに、20mM Trisバッファ、pH7.5で予め平衡化したCapto Adhereカラム(5ml)で精製した。KappaSelectカラムから溶出したCSR02-Fab-TF試料を、20mM Trisバッファ、pH7.5で50倍希釈して、次いで流速1ml/分でCapto Adhereカラムに充填した。試料の適用後、OD280がベースラインに下がるまで、カラムを平衡化バッファで洗浄した。次いで、結合したCSRO2-Fab-TFタンパク質を、200mM NaClを含む20mM Trisバッファ、pH7.5で溶出した。
【００９０】
可溶性組み換えヒトおよびマウスPLVAPタンパク質(hPLVAPおよびmPLVAP)の作製
(hPLVAP)の作製。切断PLVAP(マウスPLVAPの細胞外ドメインを含むアミノ酸残基51〜442)を示すPCR断片をpGEM(登録商標)-T Easyベクター(Promega)に挿入して、プラスミドpGEM(登録商標)-T Easy-hPLVAP51-442を作製した。このPCR断片は、以下のプライマーペア：
【化１】
2015096065.tif 000003
を使用して、PCRによりヒトPLVAPのcDNAクローン(NM_031310) (OriGene, Rockville, MD)から作製した。
【００９１】
組み換えPLVAPタンパク質を産生するためのプラスミドpET-15b-hPLVAP51-442の構築について、PLVAPのアミノ酸残基51〜442をコードし、末端にNdeI/Bam HI認識配列(四角で囲んだ配列)を有するcDNA断片を、pGEM(登録商標)-T Easy-hPLVAP51-442から切り出し、pET-15b(Novagen)に挿入した。上述の発現構築物をDNA配列決定により確認し、大腸菌(Rosetta-gami2(DE3)pLysS) (EMD Millipore Corp.)に形質転換した。
【００９２】
His-タグ付加hPLVAP融合タンパク質を産生して、下記のように精製した。新鮮な培地由来の形質転換した大腸菌のコロニー(1〜2mm)を、100μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラムフェニコール、12.5μg/mlテトラサイクリンを含む4mlのTB培地中に接種し、37℃、230rpmで一晩放置した(overnight)。一晩培養物を、100μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラムフェニコール、12.5μg/mlテトラサイクリンを含む400mlのTB培地に接種し、37℃、250rpmで増殖を継続した。600nmの吸光度が約0.6〜0.8に達した際に、1.66mMの終濃度までイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、タンパク質産生を誘導した。30℃で約20時間、振盪を継続した。10000g、4℃で30分間遠心分離して細胞を回収した。細胞ペレットを、8M尿素を添加した12mlの平衡化-洗浄バッファ(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH7、10mMイミダゾール)に再懸濁し、-20℃で少なくとも2時間保存した。溶解した試料を10秒間超音波破砕し、それぞれの破砕の間に30秒間の休止期間を挟んで、半透明になるまで張度を低下させた。細胞懸濁物を、10,000〜12,000xg、4℃で20分間遠心分離し、任意の不溶性物質をペレット化した。先の工程の上清を、8Mの尿素を添加した10カラム容量の平衡化-洗浄バッファで平衡化したTALON樹脂カラム(Clontech)に供した。カラムを10〜20カラム容量の1X平衡化-洗浄バッファで洗浄した後、組み換えポリヒスチジンタグ付加ヒトPLVAPタンパク質を、6M尿素を含む5カラム容量の溶出バッファ(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH7、500mMイミダゾール)で溶出した。溶出液中の精製した組み換えタンパク質を、3M尿素を含む1X平衡化/洗浄バッファに対して4℃で少なくとも4時間透析し、次いで、バッファを、1M尿素を含む1X平衡化-洗浄バッファに変え、4℃で少なくとも4時間透析した。ブラッドフォード色素結合アッセイ(Bio-Rad, Hercules, CA)によりタンパク質濃度を測定した。次いでタンパク質を、組み換えPLVAPタンパク質1mgあたり1単位のビオチニル化トロンビン(Novagen)により、23℃で16時間消化して、ポリヒスチジンタグを除去した。固相ストレプトアビジン-アガロースによりインキュベーション液からビオチニル化トロンビンを除去した。得られた組み換え水溶性ヒトPLVAP(hPLVAP)を、尿素を含まない1X平衡化-洗浄バッファ(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH7)に対して透析した。タンパク質濃度を測定して、純度についてタンパク質をSDS-PAGEにより分析した(図5)。
【００９３】
mPLVAP(マウスPLVAP)の産生。切断PLVAP(マウスPLVAPの細胞外ドメインを含むアミノ酸残基48〜438)を示すPCR断片をpGEM(登録商標)-T Easyベクター(Promega Corp.)に挿入して、プラスミドpGEM-T Easy-mPLVAP48-438を作製した。このPCR断片は、以下のプライマーペア：
mPLVAP CDS NdeI F：5'CATATGTATGGCAATGTGCACGCCACC3'(配列番号:47)および
mPLVAPストップXho I R：5'CTCGAGATCCACAGGTGGGCGATTCTGGC3'(配列番号:48)
を使用したPCRにより、マウスPLVAPのcDNAクローン(Invitrogen, Life Technologies Corp.)から調製した。
【００９４】
次いで、NdeIおよびXhoI認識配列を各末端に含むPLVAPのアミノ酸残基48〜437をコードするcDNA断片を、pGEM(登録商標)-T Easy-mPLVAP48-438から切り出し、タンパク質発現のためにpET-15b (Novagen-EMD Millipore, Darmstadt, Germany)に挿入した。DNA配列決定による確認後、この発現構築物を大腸菌(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)に形質転換した。大腸菌Rosetta-gami2(DE3)pLysS中のHis-タグ付加融合mPLVAPタンパク質の発現は、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドにより、30℃で16時間誘導した。誘導後、細菌細胞を、8M尿素を添加した平衡化バッファ(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH7)中の超音波破砕による溶解に供して、15,652xg、4℃、30分の遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分離した。His-PLVAP48-438タンパク質を精製するために、可溶性画分をTALON(登録商標)金属アフィニティ樹脂(Clontech, Palo Alto, CA)に充填して、溶出バッファ(50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH7、500mMイミダゾール)で溶出した。溶出液内の得られたマウスPLVAP48-438タンパク質を、PBSに対して透析した。精製したHis-mPLVAPのSDS-PAGE分析を図5に示す。
【００９５】
ELISAによるヒトおよびマウスのPLVAPのそれぞれに結合するCSRO2-Fab-TFおよびMECA32-Fab-TFの試験
組み換え抗PLVAP-Fab-TFタンパク質がヒトまたはマウスのPLVAPタンパク質に結合し得るかを確認するために、ELISAアッセイを開発して使用した。第1に、ELISAプレートの各ウェルを、4℃で一晩、PBS-アジド(0.02%)中50μlの2.5μg/mlヒトまたはマウス組み換えPLVAPタンパク質でコートした。その後、アッセイは室温で行った。各ウェルを150μlの洗浄バッファ(0.2% Tween-20を含むPBS)で3回洗浄した後、各ウェルを150μlのブロッキングバッファ(2% BSAおよび0.05% Tween-20を含むPBS)で30分間ブロッキングした。3回洗浄後、50μlの抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFまたは抗マウスPLVAP MECA32-Fab-TFを、異なる濃度で二重に各ウェルに添加した。全てのウェルは45分間インキュベートして3回洗浄した。次いで、洗浄したウェルを、ブロッキングバッファ中1:500希釈で、50μlのビオチニル化抗ヒトTF抗体(R&D Systems Corp.)と共に45分間インキュベートした。3回洗浄後、各ウェルを、5000x希釈ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートと共に30分間インキュベートした。次いで各ウェルを、100μlのアルカリホスファターゼ基質と共に60分間インキュベートして、マイクロプレートリーダー中405nmで各ウェルの吸光度を測定した。
【００９６】
アッセイは、競合結合アッセイにも改変した。競合結合アッセイについて、増加濃度の抗PLVAP抗体またはFab-TFを、最適量のビオチニル化抗PLVAPモノクローナル抗体とインキュベートして、PLVAPへの結合について競合させた。インキュベーションおよび洗浄後、PLVAPに結合したビオチニル化抗体を、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび発色(chromogenic)基質により定量した。
【００９７】
ヒト組織因子活性についての比色アッセイ
ヒトTFと架橋した組み換えCSRO2-Fab-TF、MECA32-Fab-TFおよびMECA32 mAbのTF活性を、比色アッセイを使用して測定した。このアッセイは、TFの第VIIa因子への結合およびTF/FVIIa複合体の第X因子(FX)活性化能に基づく。産生されたFXaの量により、TF活性を間接的に定量した。産生されたFXaは、405nmでの吸光度の増加に伴ったFXa特異的発色ペプチド基質からのパラニトロアミリン(para-nitroamiline)(pNA)の放出に従って速度論的に測定した。TF活性は、市販の水溶性組み換えTF標準(R&D systems Corp.)に対して決定した。比色TF活性アッセイは、Philipp et al.により報告された手法に基づいた。Philipp J, Dienst A, Unruh Maike, et al. "Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides" Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 23:905-910 (2003)参照。
【００９８】
SCIDマウスにおけるHep3B HCC異種移植片モデル
Hep3BはヒトHCC細胞株である。抗PLVAP Fab-TFの治療有効性を説明するために、本発明者らは、BALB/c C.B-17 SCIDマウスにおけるHEP3B異種移植片モデルを確立する。Hep3B HCC異種移植片は、4百万個のHep3B細胞を、イソフルランの吸入を用いた一般的な麻酔下で、5週齢の雄C.B-17 SCIDマウスの右上部内側大腿に皮下注射することにより確立された。細胞を、血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Life Technologies Corp.)に溶解した60μlの氷冷75% BD MtrigelTM(BD Bioscience Corp.)に懸濁した。29ゲージのインシュリンシリンジを使用して注射を行った。
【００９９】
注射に使用したHep3 B細胞を10%ウシ胎仔血清、1% GLUTA-MAX、1%抗生物質-抗菌剤、および1% HEPESを含むDMEM中で培養した。全ての試薬はLife Technologiesから購入した。注射用の細胞は、80%コンフルエントに達したときに回収した。細胞は、製造業者の指示書に従って、Life Technologiesのトリプシン-EDTA溶液を使用して培養フラスコから輸送して(lift)、腫瘍細胞をDMEMで1回洗浄し、その後注射用の氷冷75% BD MtrigelTMに懸濁した。注射後、マウスは、定期的に腫瘍異種移植片の増殖に従わせた(followed)。通常、腫瘍が、試験の準備ができる状態になるまでに5〜6週間かかった。
【０１００】
腫瘍栄養動脈への抗PLVAP Fab-TFの注入
抗PLVAP MECA32-Fab-TFを用いたHep3B腫瘍異種移植片の治療のために、MATRXTM麻酔器を使用して、イソフルランの吸入によりHep3B腫瘍異種移植片を有するマウスを麻酔した。マウスを切開用顕微鏡下で仰向けに寝かせた。注入の1日前に、Nair毛除去剤(Church & Dwight Co.)を用いて右鼠蹊領域の毛を除去した。75%アルコールで皮膚をきれいにした後、腫瘍上部の右鼠蹊領域で0.5cmの切開を行った。傷は、右大腿動脈および静脈が曝露する深さであった。次いで、右大腿動脈を6-0ナイロン糸で結んだ。動脈を緩く近位に引っ張った。引張の遠位で微小はさみを用いて動脈切開術を行い、遠位部位に、細い33ゲージの針を挿入した。MECA32-Fab-TFまたは対照抗体を、1分あたり約40μlの速度でゆっくり注入した。漏れがないことを確実にするために、注射は近位観察下で行った。注入後、針を引き抜いた。動脈切開部位をHistoacryl(TissueSeal, AnnArbor, MI)で閉じた。引張のためのナイロンを除去した。適切な止血の確認後、連続的な縫合により切開の傷を閉じた。
【０１０１】
腫瘍体積および血流の測定のための3D超音波調査法およびパワードップラー
Vevo 2100高解像画像化システム(Visual Sonics, Inc., Toronto, Canada)を使用して、製造業者の指示書にたがって、3D腫瘍画像を得た。以下の測定を行うことにより、腫瘍の3方向の垂直寸法(three perpendicular dimensions)を決定した。最初に、腫瘍のX軸およびY軸に沿った最大切断面積上の2方向の垂直寸法を測定した。次いで、業者から提供されたソフトウェアを使用して、X軸およびY軸寸法に垂直な、Z軸に沿った最も長い寸法を測定した。長円物質についての以下の式：体積=π/6x長さx幅x高さを使用して腫瘍体積を決定した。Vevo 2100高解像画像化システムのマニュアルに従って、3Dパワードップラーを使用して腫瘍血流画像を得た。
【０１０２】
MECA32-Fab-TFおよびCSRO2-Fab-TFの結合親和性の測定
抗PLVAP-Fab-TFと標的PLVAPの間の結合親和性を測定するために使用したアッセイは、先のセクションで記載した比色TF活性アッセイに基づいた。簡潔に言えば、ELISAプレートのそれぞれのウェルを、2.5μg/ml水溶性組み換えヒトまたはマウスPLVAPで一晩コーティングした。PLVAPに対するCSRO2-Fab-TFおよびMECA32-Fab-TF結合を試験するためのELISAについて記載したとおりに洗浄およびブロッキングした後、ヒトまたはマウスPLVAPタンパク質でコーティングしたウェルを、50μlの増加濃度の0.3125、0.625、1.25、2.5、5および10μg/mlのCSRO2-Fab-TFまたはMECA32-Fab-TFと二重にインキュベートした。室温で3時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、比色TF活性アッセイについての先のセクションで記載したとおりのTF標準曲線を使用してウェル中の結合したTF活性の量についてアッセイした。各ウェルに添加した総CSRO2-Fab-TFまたは総MECA32-Fab-TFの濃度はわかっており、各ウェル中の結合したCSRO2-Fab-TFまたはMECA32-Fab-TFの濃度は、アッセイ結果から計算できた。次いで、スキャッチャードプロット解析を使用してこれらの数字を解析し、CSRO2-Fab-TFまたはMECA32-Fab-TFの結合親和性を決定した。例えば、Scatchard G.  "The attractions of proteins for small molecules and ions" Ann NY Acad Sci. 51:660-672(1949)参照。
【０１０３】
MECA32抗PLVAPモノクローナル抗体を用いたHEP3B腫瘍異種移植片中のPLVAPの免疫組織化学的(IHC)染色
マウスHep3B異種移植片中のPLVAPの発現を調べるために、ホルマリン固定化パラフィン組織ブロックの切片を抗PLVAPモノクローナル抗体による免疫組織化学的染色用に処理した。常套的な手順に従った組織切片の脱パラフィンおよび再水和後、キャリア中の組織切片を有するスライドをビーカーに入れ、標的回復液(Dako, Inc. Carpinteria, CA)に浸漬した。ビーカーをオートクレーブ中に置いて、121℃で10分間加熱した。冷却後、スライドを蒸留水に移した。次いで、それぞれのスライド上の切片を、Ventana iView DAB検出キット(Ventana Medical Systems, Inc.)中で200〜400μlの過酸化水素で処理して内因性のペルオキシダーゼをクエンチした。スライドをTris緩衝化食塩水(TBS)(Dako)でリンスした後、切片を、0.1%ウシ胎仔血清アルブミン含有TBS(TBS-BSA)に希釈した5μg MECA32抗PLVAPモノクローナル抗体と共に、37℃で60分間インキュベートした。スライドをTBSバッファ中に5分間、3回浸漬して洗浄した後、切片を、業者に推奨される希釈で、ビオチニル化二次抗体(例えば、MECA32 mAbについてのビオチニル化ヒツジ抗ラットIgG)と共に、室温で15分間インキュベートした。スライド上の切片を上述と同様に洗浄した。スライド上の切片を、新たに調製したDAB基質と共に30分間キット中でインキュベートした。スライドを蒸留水で数回リンスした。ギルヘマトキシリン溶液で15秒間交差染色した後、スライドをTBS、次いで蒸留水でリンスした。切片を風乾した後、切片を、Permount培地およびカバースリップで覆った。
【０１０４】
結果
HCCおよびHEP3B異種移植片中のPLVAP発現
本発明者らの初期の試験により、PLVAPは、HCCの脈管内皮細胞上に差異的に発現し、非腫瘍肝臓組織の脈管内皮細胞中には発現しないことが示された。PLVAPの差異的な発現は、治療目的のためにHCCを標的化する機会を提供した。本発明者らは、HCCの治療のために、共発現する凝血誘発組織因子タンパク質の担体として機能する抗PLVAPモノクローナル抗体またはそのFab断片を使用する新規のアプローチを考え出した。かかる治療剤を腫瘍栄養動脈に注入することは、この治療抗体またはそのFab断片がHCCの脈管内皮細胞に結合して、腫瘍血管内に血栓の形成を誘発し、腫瘍の虚血性壊死を引き起こすと考えられた。
【０１０５】
このアプローチの実行可能性を示すために、本発明者らは、HEP3B HCC細胞株を使用して、SCIDマウス中でヒトHCC異種移植片モデルを確立した。次いで、本発明者らは、HEP3B腫瘍異種移植片に成長した脈管内皮細胞が、マウスPLVAPを発現したかどうかを、MECA32抗マウスPLVAP mAbを使用した免疫組織化学的(IHC)染色により決定した。図6Bに示されるように、SCIDマウス中のHEP3B腫瘍異種移植片の脈管内皮細胞は、ヒトHCCと同様に、実際にPLVAPを発現した。そのため、HEP3B異種移植片は、ヒト組織因子と共役した抗PLVAP mAbまたはそのFab断片の抗腫瘍効果を示すための試験に使用できた。
【０１０６】
HEP3B異種移植片に対する可溶性ヒトTFと共役したMECA32 mAbの効果
最初に、本発明者らは、HEP3B異種移植片腫瘍を有するSCIDマウスを、組み換え水溶性ヒト組織因子と化学的に共役したMECA32(MECA32-TF)で治療した。ヒトTFは、ヒトおよびマウスの両方で凝血を効果的に誘発し、かつヒトTFのcDNAが市販されていたのでヒトTFを使用した。それぞれの腫瘍保有マウスを、解剖顕微鏡下で、100μlのリン酸緩衝化食塩水(PBS)中24μg MECA32-TF(治療群)または20μg MECA32 mAb(対照群)の腫瘍栄養右大腿動脈への注入により治療した。より高分子量のMECA32-TFに合わせて、わずかに少ない量のMECA32 mAb(20μg)を使用した。3Dパワードップラーを使用して、処理の48時間前後の腫瘍血流を評価した。結果は、治療群においてMECA32-TFでの治療後に腫瘍内血流シグナルの有意な減少を示し、対照群では示されなかった(図7)。腫瘍増殖の追跡により、MECA32-TF治療群において腫瘍増殖の有意な抑制が示され、対照群では示されなかった(図8)。この試験の結果は、ヒトTFと共役した抗PLVAPモノクローナル抗体が、HCC異種移植片の治療に効果的であったことを支持するものである。
【０１０７】
MECA32-Fab-TFの開発および特徴付け
TFとMECA32 mAbの化学的共役について、MECA32 mAbに架橋するTFタンパク質分子の数および部位を一定にかつ再現可能に調節することは困難であった。化学的架橋により調製したMECA32-TFは、均一な産物を生じなかった。高分子量のMECA32-TFコンジュゲート(約170kDa)はまた、有害な副作用の発生の機会の増加を伴って、長い循環半減期をもたらす。
【０１０８】
目標から外れた副作用を制限するためのより短い半減期を有する構造的に良く規定された均一な治療用生物製剤を有するために、本発明者らは、抗PLVAP mAbのFab部分および重鎖定常ドメイン1のカルボキシル末端に結合したヒト組織因子の細胞外ドメインで構成される新規の組み換えタンパク質を開発した。次いで、本発明者らは、抗マウスPLVAP MECA32-Fab-TF組み換えタンパク質(MECA32-Fab-TF)を作製した。この組み換えタンパク質の構造を示す模式図を図9に示す。
【０１０９】
精製MECA32-Fab-TFを使用して、マウスPLVAPへの結合についてビオチニル化MECA32 mAbと競合させた。これらの結果は、MECA32-Fab-TFは、実際にPLVAPに結合する能力を保持していたことを示した(図10)。6つの異なるバッチのMECA-32-Fab-TFのスキャッチャード分析はまた、5.7±1.4x10-8MのKdを有するマウスPLVAPへの高い結合親和性を示した。MECA32 Fdのカルボキシル末端で連結したTFも機能的であり、第VIIa因子と相互作用して第X因子を活性化し得た。測定された組織因子の特異的活性は、MECA32-Fab-TFのそれぞれミリグラム中、90±22μg(n=6)であった。
【０１１０】
SCIDマウス中のHEP3B腫瘍異種移植片に対するMECA32-Fab-TFの効果
組み換えMECA32-Fab-TFの治療有効性を示すために、本発明者らは最初に2用量応答試験を行った。両方の試験について、MECA32-Fab-TFは、腫瘍栄養大腿動脈に注射した。治療の72時間後、治療マウスを屠殺して、組織学的検査のために腫瘍を回収した。第1の試験について、3つの異なる用量のMECA32-Fab-TF(3μg、6μgおよび12μg)を使用して、腫瘍保有マウスを治療し、対照群は、12μgの組織因子なしのMECA32モノクローナル抗体で治療した。それぞれの用量について3匹のマウスがあった。第2の試験について、使用したMECA32-Fab-TFの用量は、2.5μg、5μgおよび10μgであった。それぞれの用量について2匹のマウスがあった。これら2つの試験の結果を要約して図11および12に示した。これらの試験の結果により、MECA32-Fab-TFで治療したマウス由来の腫瘍は、全ての用量で大規模な虚血性壊死を起こしたことが明らかにされた。しかしながら、10μg以上の用量は、より一定な結果を生じた。対照群では腫瘍壊死はなかったか、または最小であった。これらの試験の結果は、抗PLVAP-Fab-TFは、完全に有力で、72時間中マウス1匹当たり2.5μgほどの低用量で、有意な虚血性腫瘍壊死を誘導し得たことを示した。
【０１１１】
注入後の異なる時点でのHEP3B腫瘍異種移植片の組織学に対する抗mPLVAP MECA32-Fab-TFの効果
上述の試験は、治療の72時間後に腫瘍が明白な虚血性壊死を起こしたことを示した。TFを共発現する抗mPLVAP Fabでの治療後に壊死がどのように誘導されたかを調べるために、本発明者らは、腫瘍栄養動脈にMECA32-Fab-TFを注入して、10μgのMECA32-Fab-TFの注入後に、注入の2時間、4時間、24時間、48時間および72時間後にHEP3B腫瘍を回収した。それぞれの時点で2匹の腫瘍保有マウスがあった。0時間ベースライン対照として治療なしの2匹のマウスもこの実験の同日に屠殺した。
【０１１２】
図13Aに示されるように、本発明者らの結果により、治療の2時間後に腫瘍血管中にフィブリン血栓が見られ得ることが明らかになった。フィブリン血栓を有する血管の数は、治療の4時間および24時間後でより顕著になった。4時間で、腫瘍細胞は、透明の空間を増加しながら互いに分離し始め、この変化は24時間でより明らかになった(図13B)。治療の48時間後に、核染色の消失を伴った明らかな虚血性壊死が見られ、72時間でより顕著になった(図13Aおよび13B)。治療前(0時間)には腫瘍血管中にフィブリン血栓は見られなかった(図13A)。パワードップラー試験によっても注入の2時間後に主な腫瘍血管中の血流の停止が停止して、72時間まで続いたことが明らかになった(図14)。これらの所見は、抗PLVAP-Fab-TFが実際に、腫瘍血管内皮細胞のPLVAPに結合し得て、腫瘍血管内に血栓形成を誘導し、血流の封鎖を生じ、腫瘍壊死を引き起こしたことを支持する。
【０１１３】
HEP3B腫瘍異種移植片の増殖に対する抗PLVAP MECA32-Fab-TFの効果
次いで、本発明者らは、腫瘍増殖に対する抗PLVAP Fab-TF治療の治療効果を試験した。2つの異なる試験を行った。第1の試験は、治療後25日間腫瘍増殖を追跡することであった。対照群における大きなサイズの腫瘍は試験を停止することを要したので、この試験は治療後25日間で終えた。腫瘍サイズは3D超音波検査を使用して追跡した。図15、16Aおよび16Bにまとめた結果は、5μgまたは10μgのMECA32-Fab-TFの単一注入により、腫瘍増殖が効果的に抑制されたが、10μgの対照TFなしMECA32抗体では抑制されなかったことを示した。
【０１１４】
第2の試験について、HEP3B腫瘍異種移植片を有するSCIDマウスを、10μgのMECA32-Fab-TF(n=4)または10μgのMECA32モノクローナル抗体(n=2)の動脈内注入で治療した。腫瘍増殖は3D超音波検査で追跡した。HEP3B腫瘍が約2000mm3まで増殖した際に、腫瘍保有マウスを安楽死させた。この試験により、本発明者らが治療群における腫瘍増殖の遅延を評価することが可能になった。図17にまとめた結果は、10μgのMECA32-Fab-TFの腫瘍栄養動脈への単一注入後に腫瘍増殖の有意な遅延があることを示した。対照マウスと比較して、治療群において腫瘍が1600mm3まで増殖するのに42日以上かかった。対照群と治療群の間の腫瘍が1600mm3まで増殖するための平均日数は、それぞれ9.8±3.0日および51.8±3.2日であった(図17)。
【０１１５】
要約すると、これらの2つの異なる試験の結果は、抗PLVAP-Fab-TFの腫瘍栄養動脈への注入が、腫瘍壊死の誘導および腫瘍増殖の調節に効果的であったことをさらに支持した。
【０１１６】
腫瘍増殖に対する抗PLVAP-Fab-TFの全身投与の効果
末梢静脈を介したMECA32-Fab-TFの全身投与も同様の治療効果を達成し得るかどうかを知るために、本発明者らは、10μgまたは20μgのMECA32-Fab-TFを、HEP3B腫瘍異種移植片を有するSCIDマウスの尾静脈に注射して、注射後の腫瘍増殖をモニタリングした。対照マウスにはリン酸緩衝化食塩水を注射した。それぞれの治療群には3匹のマウスがあった。図17にまとめた結果は、尾静脈を介してMECA32-Fab-TFを投与した場合に、腫瘍体積に対して統計的に有意な効果がなかったことを示した。そのため、腫瘍壊死の誘導および治療効果の達成には腫瘍栄養動脈への抗PLVAP MECA32-Fab-TFの注入が必要であった。MECA32-Fab-TFの全身投与は、注射されるMECA32-Fab-TFの希釈および腫瘍血管に到達する前の他の臓器(例えば、肺、腎臓および胃腸臓器)の脈管内皮細胞上のPLVAPに対するMECA32-Fab-TFの結合を生じる可能性がある。
【０１１７】
抗ヒトPLVAP Fab-TFの開発および特徴付け
ヒトPLVAPに対して同様の治療剤を開発し得るかどうかを知るために、ヒトPLVAPのカルボキシル末端のアミノ酸配列PPAGIPVAPSSに残る抗原性エピトープに対するヒト化抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体を使用した。このヒト化抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体は、以前に開発され、米国特許出願公開公報第US20110262349 A1に記載される。この抗ヒトPLVAP-Fab-TFコンジュゲートは、CSRO2-Fab-TFと指名した(図9)。次いで、本発明者らは、組織因子特異的活性および標的PLVAPへの結合親和性に関してCSRO2-Fab-TFとMECA32-Fab-TFを比較するための一連の試験を行った。本発明者らの試験の結果により、抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFは、抗マウスPLVAP MECA32-Fab-TFと比較して、抗PLVAP Fab-TFのミリグラムにおいてより高いTF活性を有することが明らかであり、両方のCSRO2-Fab-TFおよびMECA32-Fab-TFは同様の結合親和性を有することが示された(表1)。この所見は、MECA32-Fab-TFと同様に、CSRO2-Fab-TFは、十分な親和性をもってそのPLVAP標的に結合し得、凝血を開始させて治療効果を達成するのに十分なTF活性を有したことを示した。
【０１１８】
【表２】
2015096065.tif 000004
【０１１９】
表1に要約されるように、3つの異なるバッチのCSRO2-Fab-TFおよび6つの異なるバッチのMECA32-Fab-TFを試験した。結果は、両方のFab-TFが同様の結合親和性を有することを示した。しかしながら、CSRO2-Fab-TFは、MECA32-Fab-TFよりも高い特異的TF活性を有した。結果は、CSRO2-Fab-TFが、肝細胞癌の治療について、MECA32-Fab-TFと同様の治療効果を達成するのに十分な結合親和性および組織因子特異的活性を有することを示す。
【０１２０】
本発明者らのHepB3異種移植片モデルにおける治療の時点の平均腫瘍体積および腫瘍壊死を効果的に誘導するのに必要なMECA32-Fab-TFの用量に基づいて、本発明者らは、腫瘍栄養動脈への注入によりHCCを治療するための抗PLVAP-Fab-TFについての有効な治療用量は、それぞれのミリリットル(cm3)の腫瘍について、15μg〜100μgであると推定した。
【０１２１】
開発されたCSRO2-Fab-TFがヒトHCCの脈管内皮細胞に結合し得ることをさらに示すために、本発明者らは、CSRO2-Fab-TFをビオチニル化して、このFab-TFを使用してヒトHCCの脈管内皮細胞への結合を試験した。本発明者らの試験の結果によると、ビオチニル化CSRO2-Fab-TFは実際に、HCCの脈管内皮細胞に結合し、非腫瘍性肝臓組織の脈管内皮細胞には結合しないことが示された(図18)。この試験の結果は、MECA32-Fab-TFと同様に、腫瘍栄養動脈(1つまたは複数)への注入により、CSRO2-Fab-TFを患者におけるHCCの治療のために使用し得ることを支持した。
【０１２２】
PLVAPは、HCCの血管内に差異的に発現するが、非腫瘍性肝臓組織の血管には発現しないという知識に基づいて、本発明者らは、抗PLVAPモノクローナル抗体またはそのFab断片上にヒト組織因子タンパク質を共発現させることにより、HCCの治療のための新規の治療剤を開発した。本発明者らは、ヒト組織因子の可溶性細胞外ドメインを有する完全抗体およびそのFab断片の両方が、実際に、腫瘍栄養動脈への単一注入後に、腫瘍壊死を誘導し得、腫瘍増殖を抑制したことを示した。
【０１２３】
抗PLVAP抗体への可溶性組織因子の化学的共役は、それぞれの抗体に対して同じ部位で同じ数の組織因子が架橋することを再現可能に調節できないので、本発明者らは、ヒト組織因子の細胞外ドメインを共発現するFd鎖のカルボキシル末端を有する抗PLVAPモノクローナル抗体の組み換えFab断片を作製して、この組み換えタンパク質を、HCCの治療のための治療剤として使用した。HCCの治療のためにかかる治療剤を実際に使用し得ることを示すために、まず、HEP3Bヒト肝細胞癌細胞株由来の腫瘍を有するSCIDマウスを確立して、概念実証試験に使用した。次いで、本発明者らは、MECA32抗マウスPLVAPハイブリドーマを使用して、抗PLVAP-Fab-TFのマウスバージョンを開発した。ヒトHCC異種移植片内に増殖する血管は、マウス由来であり、マウスPLVAPを発現するので、抗PLVAP-Fab-TFのマウスバージョンを開発する必要があった。ヒト組織因子は、マウス凝固第VII因子を活性化し、マウスにおいて凝血を誘導し得るので、本発明者らは、抗PLVAP Fab-TFのヒトおよびマウスバージョンの両方にヒト組織因子を発現させた。CSRO2-Fab-TFとMECA32-Fab-TFの間の本発明者らの比較試験により、CSRO2-Fab-TFとMECA32-Fab-TFの両方が、十分な親和性を持ってヒトおよびマウスPLVAP標的に結合し得、凝血を誘発し、治療効果を達成するのに十分な組織因子活性を有し得ることを確認した。
【０１２４】
本発明者らの試験の結果により、本発明者らに開発された組み換え抗PLVAP-Fab-TFは、末梢静脈を介した全身性の静脈内投与ではなく、腫瘍栄養動脈へのこの新規の治療剤の直接注入後に、腫瘍血管内で血栓形成を誘発し、腫瘍の流れを遮断し、かつ腫瘍壊死を誘導することにより、HCCの治療について治療効果を有することが示された。該試験は、本願において、組織因子タンパク質を共発現する抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体またはそのFab断片は、神経膠芽腫などの腫瘍血管に限局されるPLVAPの発現を示す腫瘍を治療するために使用され得ることの根拠も説明した。
【０１２５】
「約」、「少なくとも」、「より少ない」および「より多い」などの本願におけるいくつかのパラメーターを記載する全ての数値境界について、該記載はまた、記載された値で境界が示される任意の範囲を必ず包含することが理解されるべきである。したがって、例えば、記載少なくとも1、2、3、4または5は、とりわけ、範囲1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、2〜3、2〜4、2〜5、3〜4、3〜5および4〜5なども記載する。
【０１２６】
本明細書に列挙される全ての特許、特許出願または非特許文献および参照配列情報などのその他の参考文献について、それらは、全ての目的および列挙される提案のためにその全体において参照により援用されることが理解されるべきである。参照により援用される書類と本願の間に何らかの摩擦が存在する場合、本願は、調整を意図する(will control)。例えばゲノム座、ゲノム配列、機能的注釈(functional annotation)、対立遺伝子バリアント、および参照mRNA(例えば、エクソン境界または応答因子など)などのGeneIDまたは受託番号(通常NCBI受託番号をいう)、およびタンパク質配列(例えば保存されたドメイン構造、Homologeneエントリーなど)、ならびに化学的参照物(例えば、Pub Chem化合物、Pub Chem物質またはPub Chemバイオアッセイエントリー、例えば構造およびアッセイなどのその中の注釈)などの本願に開示される参照遺伝子配列に関連する全ての情報は、その全体において、参照により本明細書に援用される。
【０１２７】
本願において使用される見出しは、利便性のためだけのものであり、本願の解釈に影響するものではない。
【０１２８】
本発明により提供されるそれぞれの局面の好ましい特徴は、本発明を準用する他の局面の全てに適用可能であり、限定されることなく、独立請求項により例示され、さらに実施例を含む本発明の特定の態様および局面の個々の特徴(例えば、数値範囲および例示的態様を含む要素)の組み合わせおよび並べ替えを包含する。例えば、実施例において例示される特定の実験パラメーターは、本発明を逸脱することなく、特許請求される発明における使用に適合され得る。例えば、開示される物質について、これらの化合物の各々種々の個別および集合的な組み合わせおよび並び替えの具体的な参照は明確には開示されないこともあるが、それぞれは、本明細書において具体的に企図され、記載される。したがって、要素A、BおよびCの群が開示され、要素D、EおよびFの群ならびに要素A〜Dの組み合わせの例が開示される場合、それぞれが個別に列挙されなかったとしても、それぞれは、個別にかつ集合的に企図される。よって、この例において、組み合わせA〜E、A〜F、B〜D、B〜E、B〜F、C〜D、C〜EおよびC〜Fのそれぞれは、具体的に企図されて、A、BおよびC；D、EおよびF；ならびに例示的組み合わせA〜Dの開示から、開示されたとみなされるべきである。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせも具体的に企図され、開示される。よって、例えばA〜E、B〜FおよびC〜Eの下位集団が具体的に企図され、A、BおよびC；D、EおよびF；ならびに例示的組み合わせA〜Dの開示から開示されたとみなされるべきである。この概念は、目的の組成物および該組成物の作製または使用の方法の工程の要素など、本願の全ての局面に適用される。
【０１２９】
明細書の教示に従って当該技術分野における通常の技術を有する者により認識されるように、本発明の前述の局面は、先行技術に対してそれらが新規であり、かつ自明でない程度、例えば、1つの要素が、当該技術分野における通常の技術を有する者に公知である1つ以上の参照中に記載される程度に、任意の組み合わせまたは並び替えにおいて特許請求され得、該局面は、とりわけ、特徴もしくは特徴の組み合わせの否定的な条件または但し書きにより、特許請求される発明から除外され得る。
【０１３０】
本発明は、その例示的な態様に関して、特に示され、記載されるが、形態および詳細における種々の変更は、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲から逸脱することなく本発明においてなされ得ることが当業者には理解されよう。
【０１３１】
【表３】
2015096065.tif 000005
【表４】
2015096065.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
2015096065000001.app
【外国語明細書】
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