(57)【要約】【課題】細胞への損傷を低減させつつ、回収効率を向上できるようにする。【解決手段】細胞培養器で培養された細胞を回収する細胞回収方法において、細胞培養器の細胞周囲の温度を所定の培養温度よりも低い所定の範囲の温度となるように所定時間以上制御する温度制御ステップと、細胞培養器にコラゲナーゼを供給し、細胞をコラゲナーゼに浸漬させる浸漬ステップと、細胞培養器から細胞を回収する回収ステップとを有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養器で培養された細胞を回収する細胞回収方法であって、
前記細胞培養器の前記細胞周囲の温度を所定の培養温度よりも低い所定の範囲の温度となるように所定時間以上制御する温度制御ステップと、
前記細胞培養器にコラゲナーゼを供給し、前記細胞をコラゲナーゼに浸漬させる浸漬ステップと、
前記細胞培養器から前記細胞を回収する回収ステップと、を有する細胞回収方法。
【請求項２】
前記温度制御ステップでは、０度以上２０度以下の範囲の温度となるように制御する
請求項１に記載の細胞回収方法。
【請求項３】
前記温度制御ステップでは、所定の温度となるように制御する
請求項２に記載の細胞回収方法。
【請求項４】
前記温度制御ステップの実行を行った後に、前記浸漬ステップを実行する
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞回収方法。
【請求項５】
前記温度制御ステップの前に、前記細胞培養器から前記細胞を培養するための培地を取り除く培地取り除きステップを有する請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞回収方法。
【請求項６】
前記浸漬ステップでは、前記細胞培養器を前記コラゲナーゼの活動に適した温度環境下に配置する
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞回収方法。
【請求項７】
前記温度制御ステップと、前記浸漬ステップとが少なくとも一部の時間において重なっている
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞回収方法。
【請求項８】
前記細胞培養器の前記細胞を培養する培養面は、金属部材で構成されている
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞回収方法。
【請求項９】
前記細胞培養器の培養面を構成する前記金属部材には、ペルチェ素子が熱的に接続されており、
前記温度制御ステップでは、前記金属部材に熱的に接続された前記ペルチェ素子に対して印加する電力を制御することにより温度制御する請求項８に記載の細胞回収方法。
【請求項１０】
前記温度制御ステップでは、前記金属部材の細胞を培養する培養面における温度を前記細胞周囲の温度として測定し、測定した前記温度に基づいて温度制御する請求項８又は請求項９に記載の細胞回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養器で培養された細胞を回収する細胞回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、関節軟骨のように、一度損傷すると自然に治癒することのない組織に対する新しい治療法として、再生医療が検討されている。この治療法では、組織の損傷が広範囲に及ぶ場合には、大量の細胞を必要とする。したがって、より多くの細胞をできるだけ短い期間に培養することが求められる。
【０００３】
一方、軟骨細胞のような接着性細胞を培養して回収する場合には、通常、培養器に接着している細胞を剥離するために、細胞をトリプシンに浸漬させて、培養器に接着しているタンパク質を分解させることが行われる。このように、細胞をトリプシンに浸漬させると、細胞膜が損傷し、細胞の活性が低下することが懸念されている（例えば、非特許文献1参照）。
【０００４】
培養器から細胞を回収する方法としては、例えば、超音波振動を用いた回収方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−２５５４８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈ．Ｈｉｒａｉ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ，  Ｖｏｌ．９４，  Ｎｏ．４，  （２００２），  Ｐａｇｅ３５１−３５６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
より多くの細胞をできるだけ短時間で培養することを実現するためには、細胞の活性の低下を防止しつつ、細胞の回収効率を向上することが要請されている。
【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、細胞への損傷を低減させつつ、回収効率を向上することのできる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を解決するための本発明の一形態に係る細胞回収方法は、細胞培養器で培養された細胞を回収する細胞回収方法であって、細胞培養器の細胞周囲の温度を所定の培養温度よりも低い所定の範囲の温度となるように所定時間以上制御する温度制御ステップと、細胞培養器にコラゲナーゼを供給し、細胞をコラゲナーゼに浸漬させる浸漬ステップと、細胞培養器から細胞を回収する回収ステップと、を有する。
【００１０】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、温度制御ステップでは、０度以上２０度以下の範囲の温度となるように制御する。
【００１１】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、温度制御ステップでは、所定の範囲の所定の温度となるように制御する。
【００１２】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、温度制御ステップの実行を行った後に、浸漬ステップを実行する。
【００１３】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、浸漬ステップでは、細胞培養器をコラゲナーゼの活動に適した温度環境下に配置する。
【００１４】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、また、温度制御ステップと、浸漬ステップとが少なくとも一部の時間において重なっている。
【００１５】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、細胞培養器の細胞を培養する培養面は、金属部材で構成されている。
【００１６】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、細胞培養器の培養面を構成する金属部材には、ペルチェ素子が熱的に接続されており、温度制御ステップでは、金属部材に熱的に接続されたペルチェ素子に対して印加する電力を制御することにより温度制御する。
【００１７】
本発明の別の形態に係る細胞回収方法は、さらに、温度制御ステップでは、金属部材の細胞を培養する培養面における温度を前記細胞周囲の温度として測定し、測定した温度に基づいて温度制御する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞への損傷を低減しつつ、回収効率を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、一実施の形態に係る細胞培養器の分解斜視図である。
【図２】図２は、一実施の形態に係る細胞培養器温度制御装置の構成図である。
【図３】図３は、一実施の形態に係る細胞回収方法のフローチャートである。
【図４】図４は、温度刺激を与えた場合と、温度刺激を与えていない場合との細胞培養器の細胞のＳＥＭ像である。
【図５】図５は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法により回収された細胞数を比較したグラフである。
【図６】図６は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のそれぞれで回収された細胞の位相差顕微鏡による観察写真である。
【図７】図７は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のそれぞれで回収された細胞を培養させた際の位相差顕微鏡による観察写真である。
【図８】図８は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のぞれぞれで回収された細胞を培養して得られた細胞数を比較したグラフである。
【図９】図９は、与える温度刺激の温度を変えた場合における回収される細胞数を比較したグラフである。
【図１０】図１０は、温度刺激を与える時間を変えた場合における回収される細胞数を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する実施の形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではなく、また実施の形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００２１】
まず、本発明の一実施の形態に係る細胞回収方法に用いる細胞培養器について説明する。
【００２２】
図１は、一実施の形態に係る細胞培養器の分解斜視図である。
【００２３】
細胞培養器１００は、ステンレススチール（ＳＵＳ３１６Ｌ）製の矩形の金属板１０１と、中央に円形の貫通孔１０２を有するＳＵＳ３１６Ｌで矩形の金属板１０３とを対向して備える。金属板１０１，１０３の材料には、毒性の低い金属であれば特に限定されず、ＳＵＳ；  チタン、鉄、タンタル、クロム、コバルト、タングステン、アルミニウムまたはそれらの１以上の合金を好適に用いることができ、特にＳＵＳをより好適に用いることができ、ＳＵＳの中でも、生体材料として広く用いられるオーステナイト系ステンレス鋼ＳＵＳ３１６Ｌを、さらに好適に用いることができる。
【００２４】
細胞培養器１００は、金属板１０１，１０３の間に、金属板１０３の貫通孔１０２と略同形態の貫通孔１０４を有するシリコーン樹脂１０５を挟み、金属板１０３の上からシリコーン樹脂製のカバー１０６を被せた構造を有する。
【００２５】
金属板１０１の内面において貫通孔１０４で囲まれた領域は、細胞培養面１０７である。細胞培養面１０７は、この実施の形態では、微粒子ピーニング処理（以後、「ＦＰＰ処理」という）によって形成される微小凹凸を有する面である。ＦＰＰ処理は、微粒子（投射粒子という）をターゲットに高速で衝突させて、その衝突面に微小の凹凸や皮を形成する方法である。ただし、細胞培養面１０７の形成方法は、ＦＰＰ処理に限定されず、酸を金属板１０１の内側の面の所定領域に塗布するウェットプロセスや、所望の表面粗さを形成するのに適した粒度を持つ研磨粒子を用いて研磨する方法等であっても良い。ただし、ＦＰＰ処理（ブラストおよびピーニングの処理）は、比較的低コストで簡便なドライプロセスであり、金属材料の表面改質処理を行うのに適しているので、より好適に用いることができる。金属板１０１、シリコーン樹脂１０５及び金属板１０３は、４本のネジ１０８によって固定されている。
【００２６】
次に、１以上の細胞培養器１００を細胞培養時の温度よりも比較的低い温度とするための細胞培養器温度制御装置に構成を説明する。
【００２７】
図２は、一実施の形態に係る細胞培養器温度制御装置の構成図である。（２Ａ）は、細胞培養器温度制御装置の構成図であり、（２Ｂ）は、細胞培養器温度制御装置の細胞培養器周辺の構成図である。
【００２８】
細胞培養器温度制御装置１０は、複数の細胞培養器１００と、温度センサ２０と、マイコンボード３０と、モニタ４０と、電力調整部５０とを有する。ここで、マイコンボード３０、電力調整部５０、及び後述するペルチェ素子１１１により、細胞培養器１００の細胞の周囲の温度を制御する温度制御部が構成される。
【００２９】
細胞培養器１００の金属板１０１の裏面には、（２Ｂ）に示すように、熱伝導率の高い熱伝導シート（熱伝導部材）１１２を介して、ペルチェ素子１１１が接着されている。なお、金属板１０１とペルチェ素子１１１との接続方法は、他の部材を介した間接的な接続に限られず、例えば、金属板１０１に直接接触させるようにしても良く、要は、金属板１０１とペルチェ素子１１１とが熱的に接続されていれば良い。ペルチェ素子１１１は、供給される電流の向きに応じて、金属板１０１側の面から他方の面への熱の移動又は、他方の面から金属板１０１側の面への熱の移動を行う。本実施形態では、熱伝導シート１１２を介して、ペルチェ素子１１１を複数段にすることにより、冷却効率を高めている。なお、ペルチェ素子１１１は、１段であっても良い。最下段のペルチェ素子１１１は、例えば、熱伝導シート１１３を介してヒートシンク１１４上に設置されている。
【００３０】
温度センサ２０は、熱伝対２０ａを有し、熱伝対２０ａにより発生する電流に基づいて、対象部位の温度を測定し、測定温度をマイコンボード３０に通知する。本実施形態では、熱伝対２０ａは、細胞培養器１００で培養されている細胞の周囲の温度の一例として、１つの細胞培養器１００の基材（金属板１０１）の略中心の温度を測定可能に配置されている。なお、熱伝対２０ａが設置されている細胞培養器１００には、内部に培地は収容されていない。これは、後述する細胞培養器１００の温度制御を行う際に、他の細胞培養器１００では培地による温度変化の影響を考慮せずにすむように培地を取り除くので、これら他の細胞培養器１００とほぼ同じ環境とするためである。
【００３１】
モニタ４０は、各種情報を表示する。マイコンボード３０は、予め設定されたプログラムを実行することにより各種処理を実行する。マイコンボード３０は、例えば、Ａｒｄｕｉｎｏ  ＭＥＧＡ２５６０である。本実施形態では、マイコンボード３０は、温度センサ２０から入力される測定温度を所定時間間隔（例えば、１秒）毎にモニタ４０に表示する。また、マイコンボード３０は、細胞の周囲の温度（ここでは、測定温度）を所定の目標温度（例えば、０℃）に近づけるための制御を行う命令を電力制御部５０に送信する。具体的には、マイコンボード３０は、測定温度が目標温度よりも大きい場合には、細胞培養器１００から熱を奪うようにペルチェ素子１１１を動作させる電流の向きにするための命令を電力調整部５０に送信し、測定温度が目標温度よりも小さい場合には、細胞培養器１００に熱を加えるようにペルチェ素子１１１を動作させるための電流の向きにするための命令を電力調整部５０に送信する。
【００３２】
電力調整部５０は、マイコンボード３０の命令に基づいて、ペルチェ素子１１１に供給する電力を調整する。本実施形態では、電力調整部５０は、ペルチェ素子１１１に供給する電流の向きを調整する。本実施形態では、複数の細胞培養器１００に接着された各ペルチェ素子１１１は直列に繋がれており、電力調整部５０から同じ電流値の電流が供給される。したがって、各ペルチェ素子１１１を同じ状態に制御することができ、各細胞培養器１００の温度を同じように制御することができる。
【００３３】
次に、一実施の形態に係る細胞回収方法について説明する。
【００３４】
図３は、一実施の形態に係る細胞回収方法のフローチャートである。
【００３５】
ここで、細胞回収方法を実行する前においては、細胞培養器１００を用いて細胞が培養されているものとする。ここで、細胞は、一般に、浮遊して生存可能な浮遊性細胞と、何らかの物質に接着しなければ生存できない接着性細胞に大別される。本実施の形態では、培養する細胞としては、接着性細胞としている。接着性細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば、骨芽細胞、線維芽細胞、樹状細胞、肝細胞、間葉系細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを好適に用いることができる。
【００３６】
まず、内部温度が培養に適した所定の温度（培養温度：例えば、３７℃）に維持されたインキュベータ（図示せず）から細胞培養器１００を取り出し、細胞培養器温度制御装置１０を構成する。次いで、細胞培養器温度制御装置１０により、細胞培養器１００の基材（金属板１０１）を培養温度よりも比較的低い所定の温度（温度刺激目標温度：例えば、０℃）に冷却し、所定時間（例えば、２０分）維持する（ステップＳ１：温度制御ステップ）。ここで、細胞培養器１００内の細胞の周囲の温度を培養温度よりも比較的低い温度とすることを、温度刺激を付与するという。なお、温度刺激目標温度としては、例えば、０℃以上２０℃以下の温度であれば良い。本実施の形態では、温度制御ステップを実行する前に、各細胞培養器１００から培地を取り除く培地取り除きステップを実行している。なお、培地取り除きステップは、必ずしも実行しなくても良い。
【００３７】
次いで、細胞培養器温度制御装置１０による金属板１０１の冷却を停止し、コラーゲンを特異的に分解するタンパク質分解酵素（コラゲナーゼ）を細胞培養器１００に添加する（ステップＳ２：浸漬ステップの一部）。
【００３８】
次いで、細胞培養器１００を培養温度に維持されたインキュベータに収容し、所定時間（例えば、３分）静置し（ステップＳ３：浸漬ステップの一部）、その後、細胞培養器１００から細胞を回収する（ステップＳ４）。
【００３９】
次に、温度刺激を与えることによる細胞の接着力についての評価を説明する。
【００４０】
図４は、温度刺激を与えた場合と、温度刺激を与えていない場合との細胞培養器の細胞のＳＥＭ像である。（４Ａ）は、仔ウシ関節由来軟骨細胞を細胞培養器１００に播種し、この細胞培養器１００を３７℃に維持されたインキュベータ内で７２時間静置することにより培養を行った場合、すなわち、温度刺激を与えていない場合の細胞培養器１００の細胞のＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）像であり、（４Ｂ）は、仔ウシ関節由来軟骨細胞を細胞培養器１００に播種し、この細胞培養器１００を３７℃に維持されたインキュベータ内で７２時間静置することにより培養を行った後、細胞培養器１００の金属板１０１を０℃にして２０分間経過させる温度刺激を与えた場合の細胞培養器１００の細胞のＳＥＭ像である。
【００４１】
温度刺激を与えていない場合には、（４Ａ）に示すように、細胞培養器１００の細胞には、仮足が進展した様子が見られ、細胞が基材と良好に接着している状態となっていた。一方、温度刺激を与えた場合には、（４Ｂ）に示すように、細胞培養器１００の細胞には、仮足がほんど見られず、基材と細胞との接着部分が少なかった。このことから、温度刺激を付与することにより、細胞の接着力が低下することがわかった。
【００４２】
次に、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼのみを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法により回収される細胞数についての評価を説明する。
【００４３】
図５は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法により回収された細胞数を比較したグラフである。
【００４４】
ここで、各回収方法は、仔ウシ関節由来軟骨細胞を細胞培養器１００に播種し、この細胞培養器１００を３７℃に維持されたインキュベータ内で７２時間静置することにより培養を行った後の細胞培養器１００を対象にして行われた。トリプシンを用いた回収方法では、対象の細胞培養器１００に対してトリプシンを添加し、培養温度に維持されたインキュベータに収容し、３分静置した後、細胞培養器１００から細胞を回収した。また、コラゲナーゼのみを用いた回収方法では、対象の細胞培養器１００に対してコラゲナーゼを添加し、培養温度に維持されたインキュベータに収容し、３分静置した後、細胞培養器１００から細胞を回収した。また、温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法では、対象の細胞培養器１００に対して、細胞培養器１００の金属板１０１を０℃にして２０分間経過させる温度刺激を与えた後、細胞培養器１００に対してコラゲナーゼを添加し、培養温度に維持されたインキュベータに収容し、３分静置した後、細胞培養器１００から細胞を回収した。なお、各回収方法により回収した細胞の数は、血球計算盤を用いて測定した。
【００４５】
図５に示すように、コラゲナーゼのみを用いた回収方法では、トリプシンを用いた回収方法と比較して、半分程度の細胞しか回収できなかった。これに対して、温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法では、コラゲナーゼのみを用いた回収方法よりも多くの細胞を回収することができ、トリプシンを用いた回収方法と比較して２／３程度の細胞を回収することができた。
【００４６】
次に、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼのみを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法により回収された直後の細胞の状態についての評価を説明する。
【００４７】
図６は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼのみを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のそれぞれで回収された細胞の位相差顕微鏡による観察写真である。各回収方法は、図５で説明した回収方法と同様である。
【００４８】
図６（ａ）に示すように、コラゲナーゼのみを用いた回収方法で得られた細胞は、略球形が維持できており、細胞膜への損傷がほとんどない。また、温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法で得られた細胞も、図６（ｂ）に示すように比較的大きな細胞であり、培養時の増殖性には影響がないと考えられる。一方、トリプシンを用いた回収方法で得られた細胞は、図６（ｃ）に示すように、他の回収方法で得られた細胞と比較してサイズが小さくなっており、トリプシンの作用により細胞膜まで分解されていると考えられる。このため、この細胞を用いて培養する場合には、増殖性に悪影響がある可能性が高い。
【００４９】
次に、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼのみを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法により回収された細胞の増殖性についての評価を説明する。
【００５０】
図７は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のそれぞれで回収された細胞を培養させた際の位相差顕微鏡による観察写真である。
【００５１】
ここで、図７は、図５で説明した各回収方法により回収された細胞を細胞培養器に播種し、培養温度に維持されたインキュベータに収容し、２時間静置した後の細胞の位相差顕微鏡による観察写真である。
【００５２】
コラゲナーゼのみを用いた回収方法で得られた細胞、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法で得られた細胞は、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、複数の方向に仮足を伸展させ、仮足の長さが長い。一方、トリプシンを用いた回収方法で得られた細胞は、図７（ｃ）に示すように、仮足の伸展する方向が少なく、また、仮足の長さも短い。このことから、トリプシンを用いて回収した細胞においては、分解された細胞膜の修復に時間がかかり、仮足の成長が遅れた可能性が考えられる。
【００５３】
図８は、トリプシンを用いた回収方法、コラゲナーゼのみを用いた回収方法、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のそれぞれで回収された細胞を培養して得られた細胞数を比較したグラフである。
【００５４】
ここで、図８に示す細胞数は、各方法によって回収された細胞を、１０×１０４個用意して、これら細胞をシャーレに播種し、シャーレを３７℃に維持されたインキュベータ内で２４時間静置することにより培養を行った後、トリプシンを用いて回収した細胞数である。なお、細胞数は、血球計算盤を用いて測定した。
【００５５】
図８に示すように、コラゲナーゼのみを用いた回収方法で得られた細胞、及び温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法で得られた細胞を培養した場合は、回収された細胞数が多く、高い増殖性を有していることがわかる。一方、トリプシンを用いた回収方法で得られた細胞を培養させた場合は、図８に示すように、回収された細胞数が少ない。このことは、トリプシンを用いた回収方法で得られた細胞を培養した場合には、仮足の伸展が遅れることにより、基材との接着までに時間を要し、結果として増殖性が低下したと考えられる。
【００５６】
なお、図８に示すコラゲナーゼのみを用いた回収方法で得られた細胞を培養した場合に回収された細胞数が、図８に示す温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法で得られた細胞を培養した場合に回収された細胞数よりも多いが、これは、予め同一の数の細胞を用意して培養させたためである。ここで、培養させる細胞を、予め培養してある細胞培養器から回収して用意する段階を含めて考えると、図５に示すように細胞培養器から１度に回収できる細胞数が多い、温度刺激を与え、且つコラゲナーゼを用いた回収方法のほうが、コラゲナーゼのみを用いた回収方法よりも増殖率が高いといえる。
【００５７】
次に、温度刺激を付与する温度による細胞の回収率の違いについて説明する。
【００５８】
図９は、与える温度刺激の温度を変えた場合における回収される細胞数を比較したグラフである。ここで、図９は、与える温度刺激の温度を１０℃とした場合と、与える温度刺激の温度を２０℃とした場合と、３７℃のままの場合（温度刺激を与えなかった場合）とのそれぞれにおいて回収される細胞数を示している。
【００５９】
これらデータを得るために、まず、仔ウシ関節由来軟骨細胞を細胞培養器１００に播種し、この細胞培養器１００を３７℃に維持されたインキュベータ内で７２時間静置することにより培養を行った後の細胞培養器１００を複数用意した。そして、それら細胞培養器１００を用いて、細胞培養器１００の金属板１０１を１０℃にして２０分間経過させたものと、細胞培養器１００の金属板１０１を２０℃にして２０分間経過させたものと、細胞培養器１００の金属板１０１に対して温度を付与せずに２０分間経過させたものとを得た。その後、各細胞培養器１００に対して、トリプシンを添加し、培養温度に維持されたインキュベータに収容し、３分静置した後、各細胞培養器１００から細胞を回収した。そして、それぞれから回収した細胞の数を、血球計算盤を用いて測定した。なお、細胞を回収する酵素としてトリプシンを使用したが、コラゲナーゼを用いた場合も温度刺激の温度と、細胞の回収率との関係については、同様な傾向がある。
【００６０】
図９によると、２０℃の温度刺激を付与した場合には、温度刺激を与えていない場合（図中３７℃の場合）に比して、１．５倍以上の細胞を回収することができる。更に、１０℃の温度刺激を付与した場合には、温度刺激を与えていない場合（図中３７℃の場合）に比して、２倍以上の細胞を回収することができる。従がって、温度刺激として与える温度としては、２０℃以下が好ましく、１０℃以下が更に好ましい。
【００６１】
次に、温度刺激を付与する時間（温度刺激付与時間）による細胞の回収率の違いについて説明する。
【００６２】
図１０は、温度刺激付与時間を変えた場合における回収される細胞数を比較したグラフである。ここで、図１０は、温度刺激を与えていない場合（０ｍｉｎ）と、温度刺激付与時間が１０分の場合（１０ｍｉｎ）と、温度刺激付与時間が２０分の場合（２０ｍｉｎ）と、温度刺激付与時間が３０分の場合（３０ｍｉｎ）とのそれぞれにおいて回収される細胞数を示している。
【００６３】
これらデータを得るために、まず、仔ウシ関節由来軟骨細胞を細胞培養器１００に播種し、この細胞培養器１００を３７℃に維持されたインキュベータ内で７２時間静置することにより培養を行った後の細胞培養器１００を複数用意した。そして、それら細胞培養器１００を用いて、細胞培養器１００の金属板１０１を０℃（０℃の温度刺激）の温度刺激付与時間が０分のもの（すなわち、温度刺激を与えていないもの）と、０℃の温度刺激の温度刺激付与時間が１０分のものと、０℃の温度刺激の温度付与時間が２０分のものと、０℃の温度刺激の温度刺激付与時間が３０分のものとを得た。その後、各細胞培養器１００に対して、トリプシンを添加し、培養温度に維持されたインキュベータに収容し、３分静置した後、各細胞培養器１００から細胞を回収した。そして、それぞれから回収した細胞の数を、血球計算盤を用いて測定した。なお、細胞を回収する酵素としてトリプシンを使用したが、コラゲナーゼを用いた場合も温度刺激付与時間と、細胞の回収率との関係については、同様な傾向がある。
【００６４】
図１０によると、温度刺激付与時間が１０分の場合（１０ｍｉｎ）には、温度刺激を与えていない場合（０ｍｉｎ）に比して、多くの細胞を回収することができた。また、温度刺激付与時間が２０分の場合（２０ｍｉｎ）には、温度刺激を与えていない場合（０ｍｉｎ）に比して、１．５倍程度の細胞を回収することができた。また、温度刺激付与時間が２０分の場合（２０ｍｉｎ）と、温度刺激付与時間が３０分の場合（３０ｍｉｎ）とでは、回収できる細胞数には、大きな差はなかった。このことから、温度刺激付与時間としては、２０分程度でも良く、温度刺激付与時間を、１０分以上２０分以下としても良い。
【００６５】
＜その他の実施の形態＞
以上、本発明に係る細胞回収方法の好適な実施の形態について説明したが、本発明に係る細胞回収方法は、上記各実施の形態に限定されず、種々変更可能である。
【００６６】
例えば、上記実施形態では、細胞培養器１００をインキュベータから取り出して、温度刺激を与えるようにしていたが、本発明はこれに限られず、例えば、インキュベータ内に細胞培養器１００を収容した状態で温度刺激を与えるようにしても良い。この場合には、インキュベータ内に細胞培養器１０を収容した状態で、細胞培養器温度制御装置１を構成しておけば良い。
【００６７】
また、上記実施形態では、温度刺激を与えた後、コラゲナーゼを添加して細胞を回収するようにしていたが、本発明はこれに限られず、例えば、温度刺激による温度変化がコラゲナーゼの細胞の回収に対する影響がない場合には、温度刺激を付与する前にコラゲナーゼを添加しても良く、また、温度刺激を付与している途中にコラゲナーゼを添加するようにしても良い。つまり、温度刺激を行う時間（温度制御ステップ）と、細胞をコラゲナーゼに浸漬させる時間（浸漬ステップ）の少なくとも一部とが重なっても良い。
【００６８】
また、上記実施形態では、ペルチェ素子１１１に供給する電流の方向のみを制御することにより、細胞培養器１００の金属板１０１の温度を制御するようにしていたが、本発明はこれに限られず、例えば、ペルチェ素子１１１に供給する電流の方向のみではなく、更に供給する電流の大きさ、又は印加する電圧の大きさの少なくとも一方を制御するようにしても良い。
【００６９】
また、上記実施形態では、ペルチェ素子１１１により細胞培養器１００の金属板１０１の温度を制御するようにしていたが、本発明はこれに限られず、金属板１０１の温度を制御できる構成であれば、他の構成を用いても良い。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の細胞回収方法は、細胞培養器から細胞を回収する分野において利用可能である。
【符号の説明】
【００７１】
１０  細胞培養器温度制御装置
２０  温度センサ部
３０  マイコンボード
４０  モニタ
５０  電力制御部
１００  細胞培養器
１０１  金属板
１０３  金属板
１０７  細胞培養面
１１１  ペルチェ素子
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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