(57)【要約】      （修正有）【課題】癌（例えば、乳癌および肺癌）の進行に関連したマーカーおよびそのようなマーカーに基づいて疾患進行を予測するための診断方法を提供する。【解決手段】癌に侵された患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップを含む、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に侵された患者の予後診断方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
癌に侵された患者の予後診断方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ
を含む、上記方法。
【請求項３】
癌に侵された患者の予後診断方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ、
該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを標準と比較し、それにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した予後診断を提供するステップ
を含む、上記方法。
【請求項４】
癌を有する患者の全生存期間の長さを予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い全生存期間を示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した全生存期間の長さを予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項５】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い全生存期間の長さと関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
癌患者の無病生存期間の長さを予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無病生存期間を示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した無病生存期間の長さを予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項７】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い無病生存期間の長さと関連する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
癌患者の無進行生存期間を予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無進行期間を示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した無進行生存期間を予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い無進行期間と関連する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
癌患者の短い無病生存期間のリスクを予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準または短い無病生存期間のより高いかもしくは低いリスクを示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した短い無病生存期間のリスクを予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１１】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い無病生存期間のリスクと関連する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌患者の短い全生存期間のリスクを予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準または短い全生存期間のより高いかもしくは低いリスクを示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した短い全生存期間のリスクを予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１３】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い全生存期間のリスクと関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
癌を有する患者の回復可能性を予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い回復可能性を示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した回復可能性を予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１５】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、該患者の回復可能性の低下と関連する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者における癌の再発可能性を予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の再発可能性を示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した癌の再発可能性を予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１７】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の癌の再発可能性の低下と関連する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
患者における癌の転移可能性を予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の転移可能性を示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した癌の転移可能性を予測するステップ
を含む、上記方法
【請求項１９】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の癌の転移可能性の低下と関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者における癌の再発リスクを予測する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ；
該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の再発リスクを示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質レベルと関連した癌の再発リスクを予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２１】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の癌の再発リスクの上昇と関連する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌に罹患した患者に対する治療コースの有効性をモニタリングする方法であって、以下のステップ：
該治療前の該患者由来の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現の第１レベルを測定するステップ；および
続いて、該治療中の該患者由来の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現の第２レベルを測定するステップ、
ここで、ＧＰ８８発現レベルを測定するステップがＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含み、および
該ＧＰ８８発現の第１レベルを該ＧＰ８８発現の第２レベルと比較することにより、該治療の有効性を示すステップ
を含む、上記方法。
【請求項２３】
癌に侵された患者をスクリーニングして、腫瘍転移リスクを決定する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ、
該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い腫瘍転移リスクを示す標準と比較し、それにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した腫瘍転移リスクを予測するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２４】
癌に罹患した患者に対する適正な治療コースを決定する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ、および
該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い腫瘍転移リスクを示す標準と比較するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２５】
癌が、以下：乳癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、脳の癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、造血系の癌（リンパ性および骨髄性）、消化器の癌（例えば、大腸）、泌尿生殖管の癌（例えば、腎細胞、尿路上皮細胞）、子宮癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、小細胞癌、非小細胞癌、ユーイング腫瘍、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的サンプルが、以下：血液、脳脊髄液、血清、血漿、尿、乳頭吸引液、細針吸引液、管洗浄液を含む組織洗浄液、唾液、喀痰、腹水、精液、リンパ、膣プール（vaginal pool）、滑液、脊髄液、羊水、母乳、肺喀痰または肺表面活物質、尿、糞便、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、骨腫瘍、骨髄腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、甲状腺腫瘍、膵臓腫瘍、子宮頸部腫瘍、胃の腫瘍、腸の腫瘍、結腸直腸腫瘍、脳腫瘍、膀胱腫瘍、大腸腫瘍および子宮腫瘍、頭頸部腫瘍、鼻咽頭腫瘍のいずれかから回収した液体、ならびに生物学的起源の他の液体サンプルからなる群より選択される、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２，２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的サンプルが組織サンプルである、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が乳癌である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が浸潤性腺管癌である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌がエストロゲン受容体陰性である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌がエストロゲン受容体陽性かつリンパ節陰性である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌がエストロゲン受容体陽性かつリンパ節陽性である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＧＰ８８結合性組成物が、抗ＧＰ８８抗体またはその抗原結合性フラグメントより選択される、請求項２〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体またはそのフラグメントが、ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原結合性フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体またはそのフラグメントが、ヒト化抗体またはキメラ化抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が肺癌である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３および２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記非小細胞肺癌が、扁平上皮癌および腺癌からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
ＧＰ８８発現に正または負に影響するその能力についてスクリーニングする対象の化合物を取得するステップ、
適切な生物学的サンプルを該化合物と接触させるステップ、および
該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルに対する該化合物の影響を決定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項４１】
ＧＰ８８結合性組成物を含む容器を含む、生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、癌の診断およびモニタリングの方法およびアッセイ、ならびに該方法で用いることができるキットに関する。より詳細には、本出願は、癌患者の転移可能性、無病生存期間の長さおよび全生存期間の長さならびに癌療法の結果を予測するためのＧＰ８８発現の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は女性の癌の主要な型であり、米国での癌による死亡の肺癌に次ぐ２番目の主な原因である。先進工業国では、９人に１人の女性が人生のうちで乳癌を発症すると考えることができる。米国では、乳癌の年間発生数は約１８０，０００件の新規症例であり、年間約４８，０００名が死亡する（Parkin 1998；Apantaku 2000）。米国に住んでいるだけで約２００万人の女性が、人生のいずれかの時点で乳癌と診断されている。この疾患についての理解の改善の進行にもかかわらず、乳癌は未だ大部分が臨床的介入に抵抗性である。最も多くの臨床的戦略は早期診断に的を絞っており、慣用的な形態の介入、特に手術、放射線照射、ホルモン抑制、および化学療法がそれに次ぐ。そのような介入は、特に腫瘍が転移している患者では、限られた成功しか収めることができない。可能な限り侵襲性を少なくした治療の成功を可能にするであろう、より正確でより有効な情報を提供することができる診断ツールおよび方法の備蓄を改善する緊迫した必要性がある。具体的には、最初の手術後の疾患再発、転移および死亡のリスクが非常に低い患者を特定することができるマーカーは、高価でありかつ毒性である可能性がある追加的療法を伴う過度の治療の程度を減らすであろう。本発明は、乳癌をモニタリングするための新規な方法およびマーカーを提供することにより、そのような必要性を満たす。
【０００３】
局所的な腫瘍を有し、近接するリンパ節への検出可能な転移を有しない乳癌患者の大きな群の中で、多くの患者は、腫瘍がまだ周囲組織およびリンパ節に転移していないために、手術による治療を受けるであろう。しかしながら、他の患者は、肉眼で発見できない転移性疾患を有し、追加の放射線照射または補助的な抗ホルモン療法もしくは化学療法の恩恵に与る可能性がある。転移性転移（metastatic metastasis）のリスクが低い腫瘍と、より高いリスクを有する腫瘍とを区別する診断マーカーの必要性がある。転移性疾患の低いリスクを示す腫瘍マーカーは、追加の放射線照射または補助的なホルモン療法もしくは化学療法を用いるか否かの治療方針の決定に直接的に影響し得る。さらに、そのような腫瘍マーカーは、乳房温存手術または乳房切除術を選択することの執刀医の推奨にも影響する場合がある。
【０００４】
乳癌の診断
全てのタイプの乳癌の確定診断は、光学顕微鏡を用いた組織サンプルの組織学的評価に基づく。最も多くの乳房病変を定義するのに用いられる組織学的基準は、歴史あるものであるが、完全に浸潤性の乳癌を特定するには非常に再現性が高い。近年の成果には、臨床転帰および療法に対する応答を予測するのに役立つ、組織に基づく少数のバイオマーカーの同定（例えば、Ｓ期画分（S-phase fraction）、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体、ｃ−ｅｒｂＢ−２）ならびに乳癌の家系リスクに関連する遺伝子の発見（ＢＲＣＡ−１およびＢＲＣＡ−２）が含まれる（Dahiya and Deng 1998; Fitzgibbons, Page et al. 2000）。
【０００５】
癌の分子的基盤は、未だ調査中である。乳癌では、エストロゲンに対する受容体とプロゲステロンに対する受容体が乳房上皮細胞の分化状態に関連し、一部の症例では疾患の転帰についての予後診断的価値を有する。エストロゲンは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性のヒト乳癌細胞増殖に対する主要な刺激因子であることが知られている。エストロゲンは乳房腫瘍の確立および増殖に最初に必要とされるが、乳癌の経過中でのエストロゲン非依存性腫瘍の形成は、予後が悪いことを示唆する。乳癌細胞でのエストロゲンの細胞分裂促進作用が、少なくとも部分的には、エストロゲンにより調節されている増殖因子を含む自己分泌性増殖因子により仲介されていることが予測されている。つまり、エストロゲン応答性遺伝子、特に増殖因子をコードする遺伝子を同定および特性決定することが、乳癌細胞でのエストロゲンの作用の理解に貢献する。
【０００６】
しかしながら、乳癌を診断するには依然として何らかのタイプの生検手順を必要とする。さらに、現行の診断方法および予後診断方法は、手術のみで治療可能な乳癌と、再発しやすいかまたは一箇所から複数箇所の転移を既に有している乳癌とを絶対的に区別することはできない。結果として、少なくとも５０％の乳癌患者が何らかの形の補助的療法で治療を受ける。また、利用可能な方法は、特定のタイプの補助的療法に対する乳癌の応答を予測するのには不十分である。
【０００７】
乳癌に侵された個体に関する治療についての意思決定は、多くの場合、疾患に巻き込まれた腋窩リンパ節の数、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の状態、原発腫瘍のサイズ、ならびに診断時の疾患のステージに基づく（Tandon, Clark et al. 1989）。しかしながら、この広範な因子をもってしても、現状では疾患の経過を正確に予測することは不可能である。予後の良好な患者（悪性乳房腫瘍の外科的除去を超える追加の療法を必要としない）と、より再発しやすい癌を有している患者および追加のより徹底的な治療形態により恩恵を受ける可能性がある患者とを分けるために、新規なマーカーを同定することへの明確な必要性がある。
【０００８】
乳癌の進行に関連したマーカーの同定、疾患進行をモニタリングするための診断方法の開発ならびに乳房疾患および乳癌を治療するための治療方法および組成物の開発に関して、当技術分野には未だ不足がある。乳癌で示差的に発現するかまたは活性化されるマーカーの同定は、乳癌の診断を改善するための、また患者の予後および個々の治療オプションに対する反応性に関しての腫瘍の挙動を予測するための、迅速で高価でない方法の開発において非常に重要であろう。
【０００９】
ＧＰ８８
８８ｋＤａの糖タンパク質であるＰＣ細胞由来増殖因子（ＰＣＤＧＦ）は、自己分泌性増殖因子であり、非常に腫瘍形成性が高いマウスの奇形腫ＰＣ細胞から最初に単離された。ＰＣＤＧＦは、当技術分野では、ＧＰ８８、グラニュリン−エピセリン前駆体（ＧＥＰ；Granulin-Epithelin Precursor）、グラニュリン前駆体、プログラニュリン、エピセリン前駆体、プロエピセリン（ＰＥＰＩ）およびアクログラニンとしても知られ（本明細書中では、以下ＧＰ８8と称する）、システインリッチポリペプチド増殖モジュレーターのグラニュリン／エピセリンファミリーの最も大きなメンバーである。ＧＰ８８は、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ−３キナーゼおよびＦＡＫキナーゼ経路を刺激することにより、間葉系および上皮由来の数種の細胞タイプの増殖と生存を刺激したことが報告されている。興味深いことに、乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、多発性骨髄腫および膠芽腫を含む数種の癌細胞株および／または腫瘍組織で、ＧＰ８８の過剰発現が見出された。
【００１０】
乳癌細胞では、ＧＰ８８が腫瘍形成において重要な役割を果たしていることが示されている。ＧＰ８８の過剰発現は、エストロゲン非依存性増殖、タモキシフェン耐性および腫瘍形成性の獲得と正に相関した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞でのアンチセンスｃＤＮＡトランスフェクションによるＧＰ８８発現の阻害は、ヌードマウスで腫瘍増殖の完全な阻害をもたらした。さらに、ＧＰ８８がエストロゲン受容体陽性乳癌細胞でのタモキシフェンのアポトーシス作用を防止することが実証された。乳癌生検の病理学的研究により、ＧＰ８８は浸潤性腺管癌の８０％で発現していることが明らかになり、これは予後不良のマーカー（例えば腫瘍グレード、ｐ５３発現およびＫｉ６７指数）と相関し、良性の病変では大部分が陰性であった。また、卵巣腫瘍での病理学的研究から、悪性度の低い腫瘍と比較した場合、ＧＰ８８は浸潤性卵巣上皮腫瘍での発現が上昇していることが示された。これらの研究は、ＧＰ８８が、腫瘍細胞の増殖を刺激することに加えて、浸潤において機能していることを実証している。
【００１１】
グラニュリン／エピセリン（「ｇｒｎ／ｅｐｉ」）は６ｋＤａのポリペプチドであり、二重システインリッチポリペプチドの新規ファミリーに属する。米国特許第５，４１６，１９２号（Shoyab et al.）は、６ｋＤａのエピセリン、特にエピセリン１およびエピセリン２を対象としている。Ｓｈｏｙａｂによれば、両方のエピセリンが共通の６３．５ｋＤａの前駆体によりコードされ、これが合成されるなりより小さい形にプロセシングされるので、生物学的サンプル中に見出される天然の産物は６ｋＤａの型のみとなる。ＧＰ８８はこのエピセリン前駆体であり、ＳｈｏｙａｂらはＧＰ８８が生物学的に不活性であると教示している。
【００１２】
Ｓｈｏｙａｂらの教示とは逆に、本発明者らの研究室では、この前駆体が合成されるなり常にプロセシングを受ける訳ではないことを実証している。研究により、この前駆体（すなわち、ＧＰ８８）が実際に２０ｋＤａのＮ末端連結炭水化物部分を有する８８ｋＤａの糖タンパク質として分泌されることを実証している。ＧＰ８８のＮ末端配列の解析により、ＧＰ８８はｇｒｎ／ｅｐｉ前駆体のアミノ酸１７から始まっていることが示され、このことは、前駆体ｃＤＮＡから推定されるタンパク質配列に由来する最初の１７アミノ酸が、膜局在化または分泌のためのターゲティングに適合するシグナルペプチドに対応することを実証している。Ｓｈｏｙａｂらの教示とは異なり、ＧＰ８８は生物学的に活性であり、特にプロデューサー細胞に対する自己分泌性増殖因子として、増殖促進活性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
当技術分野には、癌（例えば、乳癌および肺癌）の進行に関連したマーカーおよびそのようなマーカーに基づいて疾患進行を予測するための診断方法に対する必要性が依然として存在する。これらのニーズその他は、本発明により解決する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、癌（例えば、乳癌および肺癌）に侵された患者の高い転移可能性、低い全生存率、および低い無病生存率に関連していることが、本発明者らにより見出された。この関連性は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）乳癌、エストロゲン受容体陽性／リンパ節陰性（ＥＲ＋／ＬＮ−）乳癌、およびエストロゲン受容体陽性／リンパ節陽性（ＥＲ＋／ＬＮ＋）乳癌に対して特に強い。そのような関連性は、本発明者らの知見以前には知られていなかった。本発明者らは、ヒト乳癌（特に、浸潤性腺管癌）での上昇したＧＰ８８発現の存在が、高い転移可能性、低い無病生存率および低い全生存率と関連していること、したがって、ＧＰ８８発現は、乳癌進行の新しい新規な予後診断マーカーであることを示す。患者の原発腫瘍でのＧＰ８８発現レベルの上昇は、強力な正の予後診断因子である。
【００１５】
本発明者らは、ヒト肺癌（特に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））での上昇したＧＰ８８発現の存在が、高い転移可能性、低い無病生存率および低い全生存率と関連していること、したがって、ＧＰ８８発現は、肺癌進行の新しい新規な予後診断マーカーであることを示す。患者の原発腫瘍でのＧＰ８８発現レベルの上昇は、強力な正の予後診断因子である。
【００１６】
ＧＰ８８発現レベルは、当業者に公知のいずれかの技術を用いて、例えば、ＧＰ８８に結合することが可能な抗体その他の組成物（例えば、リガンド等）を用いて分析することができる。つまり、ＧＰ８８発現の分析は、現行の癌（例えば、乳癌および肺癌）マーカーに新たなレベルの情報を追加し、癌に侵された患者由来のサンプル中の癌の信頼性の高い予後診断分子／生化学マーカーである。また、ＧＰ８８発現レベルをモニタリングすることにより、乳癌患者に対する有効な治療戦略の結果を予測することができる。
【００１７】
本発明では、癌に罹患した患者における無病生存期間または全生存期間の長さの予後診断のための方法が提供される。一実施形態では、ＧＰ８８発現レベルの上昇は、短縮した無病生存期間／全生存期間の長さに対して、予期せぬ、驚くべき程上昇した相関を示す。
【００１８】
したがって、腫瘍再発または転移のリスクがある患者の早期の特定が、生存可能性が顕著に高められる積極的な早期治療を可能にするであろうことから、本発明は、有利なことに、癌の管理における著明な進展をもたらす。
【００１９】
あるいは、本発明は、無病生存期間および全生存期間の長さを予測するための方法；無進行生存期間を予測するための方法、無事象生存期間を予測するための方法、短い無病生存期間または全生存期間のリスクを予測するための方法、癌に罹患した患者の回復可能性を予測するための方法、癌性腫瘍を有する個体での癌の再発および／または転移の可能性を予測するための方法；癌の再発リスクを予測するための方法、腫瘍転移のリスクを決定するために癌に罹患した患者をスクリーニングするための方法；癌に罹患した患者に対する適正な治療コースを決定するための方法；癌に罹患した患者に対する治療コースの有効性をモニタリングするための方法；ならびに本発明の方法の実施に使用するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】抗ＧＰ８８抗体を用いた染色に基づく予後分類後に、ＥＲ−患者について作成したカプラン・マイヤー曲線を示す図である。
【図２】抗ＧＰ８８抗体を用いた染色に基づく無病生存率の予後分類後に、ＥＲ＋／ＬＮ−患者について作成したカプラン・マイヤー曲線を示す図である。
【図３】抗ＧＰ８８抗体を用いた染色に基づく全生存率の予後分類後に、ＥＲ＋／ＬＮ−患者について作成したカプラン・マイヤー曲線を示す図である。
【図４】抗ＧＰ８８抗体を用いた染色に基づく無病生存率の予後分類後に、ＥＲ＋／ＬＮ＋患者について作成したカプラン・マイヤー曲線を示す図である。
【図５】抗ＧＰ８８抗体を用いた染色に基づく全生存率の予後分類後に、ＥＲ＋／ＬＮ＋患者について作成したカプラン・マイヤー曲線を示す図である。
【図６】抗ＧＰ８８抗体を用いた、正常組織および乳癌組織での種々のＧＰ８８発現レベルの免疫組織化学的検出を示す図である。
【図７】既知の量のＧＰ８８（ｘ軸）を含有するサンプルの光学密度（ｙ軸）を示すグラフである。このグラフは、血清などの生物学的液体サンプル中のＧＰ８８の濃度を測定するための参照として用いることができる。
【図８】疾患の徴候を有さず、進行性疾患を有していない乳癌患者（ＢＣ  Ｐｔｓ）についてのＧＰ８８の循環レベルを示す図である。
【図９】疾患の徴候を有しない初期ステージ（ステージ２）疾患を有する乳癌患者についてのＧＰ８８レベルを示す図である。
【図１０】初期ステージ疾患を有する患者がステージ４（転移性疾患）まで再発（悪化）する場合のＧＰ８８レベルを示す図である。
【図１１】数週間にわたる上昇したＧＰ８８レベルの維持が、生存率の低下をもたらすことを示す図である。（Ａ）患者１、（Ｂ）患者２。
【図１２Ａ】マウスＧＰ８８のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１２Ｂ】マウスＧＰ８８のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１２Ｃ】マウスＧＰ８８のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１３Ａ】ヒトＧＰ８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。
【図１３Ｂ】ヒトＧＰ８８のアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】無病生存率（ＤＦＳ）についてフィッティングした、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）生検由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織でのＧＰ８８染色スコアを示す図である。ＧＰ８８発現の増加が、ＧＦＳの低下と相関することを示す。生物統計学（Ｂｉｏｓｔａｔ）解析は、ＧＰ８８と再発との強力な関連を示した。
【図１５】全生存率（ＯＳ）についてフィッティングした、ステージ１およびステージ２のＮＳＣＬＣ生検由来のＦＦＰＥ組織でのＧＰ８８染色スコアを示す図である。生物統計学解析は、ＧＰ８８と死亡との強力な関連を明らかにした（ｐ＝０．００３８）。ＧＰ８８の１単位の増加が、それぞれ、６５％〜８３％の死亡リスクの増大と関連する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明において、癌に侵された患者の予後診断のための方法が提供され、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップを含む。
【００２２】
一実施形態では、本方法は、該生物学的サンプルをＧＰ８８結合性組成物と接触させるステップを含むことができる。
【００２３】
別の実施形態では、本方法は、該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現の測定レベルと関連した予後診断を提供するステップを含む。
【００２４】
例えば、本発明の一実施形態では、ＧＰ８８発現レベルの上昇が、生存期間の長さが短い患者に関連することが見出された。
【００２５】
例えば、本発明の一実施形態では、ＧＰ８８発現レベルの上昇が、全生存期間の長さが短い患者に関連することが見出された。
【００２６】
別の実施形態では、ＧＰ８８発現レベルの上昇が、無病生存期間の長さが短い患者に関連することが見出された。
【００２７】
本発明の一実施形態では、ＧＰ８８発現レベルの上昇が、無進行生存期間が短い患者に関連することが見出された。
【００２８】
別の実施形態では、ＧＰ８８発現レベルの上昇が、無事象生存期間の長さが短い患者に関連することが見出された。
【００２９】
ＧＰ８８発現レベルは、疾患状態の評価において唯一の因子として用いることができ、または、乳癌の代表的な事例では、リンパ節状態、エストロゲン受容体状態等をはじめとする追加の因子とともに用いることができる。
【００３０】
本発明の方法は、固形腫瘍および造血系の癌の両方を含む新生物疾患を有する個体の予後診断において有用である。例示的な新生物疾患としては、癌（例えば、腺癌および黒色腫）；および肉腫（例えば、種々の白血病またはリンパ腫）が挙げられる。特に注目されるのは、乳癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、脳の癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、造血系の癌（リンパ性および骨髄性）、消化器系の癌（例えば、大腸）、泌尿生殖管の癌（例えば、腎細胞、尿路上皮細胞）、子宮癌、頭頸部および鼻咽頭の癌；特に乳癌、より詳細には浸潤性腺管癌である。腫瘍のさらなる例としては、良性腫瘍（限定するものではないが、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫が含まれる）；他の悪性腫瘍（例えば、大部分の直腸癌（most rectal cancer）、腎細胞癌、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌）が挙げられる。腫瘍のさらなる例としては、以下が挙げられる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、消化器系の癌、大腸癌、泌尿生殖系の癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺腫、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫（セミノーマ）、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系の癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、稀突起膠細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【００３１】
本出願で用いる場合、「予後診断」とは、疾患からの回復可能性、または疾患の考えられる発症もしくは転帰の予測を意味し、限定するものではないが、全生存期間の長さ、無病生存期間の長さ、無進行生存期間、無事象生存期間、患者における癌の再発可能性および腫瘍転移の可能性が挙げられる。
【００３２】
「全生存期間（全生存率）」との用語は、当業者には周知であり、患者における死亡の原因が直接的に癌の影響によるものではないという可能性にもかかわらず、診断後の患者の運命を指す。「無病生存期間（無病生存率）」との用語は、当業者には周知であり、モニタリングされている疾患がなく生存することを意味する。例えば、ＧＰ８８発現を、乳癌を診断またはモニタリングするために用いる場合、無病生存とは、検出可能な乳癌が存在しないことを意味する。「回復可能性」との用語は、当業者には周知であり、腫瘍の消失または腫瘍再発の欠如により癌の診断後に患者が回復する確率を指し、この場合、確率は本発明の方法に従い決定される。「再発の可能性」との用語は、当業者には周知であり、癌の診断後の患者での腫瘍再発または転移の確率を意味し、この場合、確率は本発明の方法に従い決定される。「無事象生存期間（無事象生存率）」との用語は、当業者には周知であり、特定の行為（例えば、治療）後に所定の事象の特定の群（例えば、癌の進行）の発生なしに生存することを意味する。「無進行生存期間（無進行生存率）」との用語は、当業者には周知であり、疾患が悪化（再発）せずに患者が生存している治療中および治療後の時間の長さを指し、ある治療がどれだけうまくいっているかを確かめるのを助けるために、臨床試験または治験で用いることができる。「転移」との用語は、当業者には周知であり、原発性癌性腫瘍の臓器とは直接連絡していない臓器または身体部位でも癌性腫瘍の増殖を指す。転移は、微小転移も含むものと理解され、これは原発性癌性腫瘍の臓器とは直接連絡していない臓器または身体部分での検出不可能な量の癌細胞の存在である。したがって、本発明は、原発性癌性腫瘍の臓器とは直接連絡していない臓器または身体部分での１以上の癌性腫瘍のさらなる増殖のリスクの決定方法を意図する。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「生物学的サンプル」との用語は、被験体から取得され、本発明の手順で有用な様々なサンプルタイプを包含する。生物学的サンプルとしては、限定するものではないが、固形組織サンプル、液体組織サンプル、生物学的液体、吸引液、細胞および細胞断片が挙げられる。生物学的サンプルの具体例としては、限定するものではないが、外科的切除により取得した固形組織サンプル、病理標本、保管サンプル、または生検標本、組織培養物もしくはそれに由来する細胞およびその子孫、ならびにそれらの供給源のいずれかから調製された切片または塗抹標本が挙げられる。非限定的な例は、乳房組織、リンパ節、および乳房腫瘍から取得したサンプルである。生物学的サンプルは、脊椎動物の身体に由来するいずれかの物質も含み、そのようなものとしては、限定するものではないが、血液、脳脊髄液、血清、血漿、尿、乳頭吸引液、細針吸引液、組織洗浄液（例えば、管洗浄液）、唾液、喀痰、腹水、肝臓、腎臓、乳房、骨、骨髄、精巣、脳、卵巣、皮膚、肺、前立腺、甲状腺、膵臓、子宮頸部、胃、腸、結腸直腸、脳、膀胱、大腸、子宮、精液、リンパ、膣プール（vaginal pool）、滑液、脊髄液、頭頸部、鼻咽頭腫瘍、羊水、母乳、肺喀痰または肺表面活性物質、尿、糞便ならびに生物学的起源の他の液体サンプルが挙げられ、それらに懸濁されている細胞もしくは細胞断片を指すか、または液体媒体およびその溶質を指す場合がある。生物学的サンプルの全部または一部分が、１種以上の疾患状態の特徴であるＧＰ８８発現レベルを有し得る。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、「標準」とは、他のデータの比較のための基礎となる参照である。標準としては、生物学的サンプル、生物学的サンプルの写真もしくは顕微鏡写真、または生物学的サンプルの分析に由来する正常範囲（例えば、健常個体の範囲内）が挙げられる。例えば、標準としては、正常組織、ならびに／あるいは癌組織、無癌組織または陽性対照として用いるための種々のレベルでのＧＰ８８タンパク質発現を含有する保管病理サンプル、および陰性対照サンプルとしてのＧＰ８８発現レベルを有しない腫瘍組織もしくは他の組織、写真もしくは顕微鏡写真、または該サンプルに由来する正常範囲が含まれる。例えば、図６の写真は、標準とみなすことができる。そのような標準は、限定するものではないが、無病生存期間および全生存期間の長さを予測するための方法、無進行生存期間を予測するための方法、短い無病生存期間または全生存期間のリスクを予測するための方法、癌に罹患した患者の回復可能性を予測するための方法、癌腫瘍を有する個体での癌の再発および／または転移の可能性を予測するための方法、癌の再発のリスクを予測するための方法、癌に罹患した患者をスクリーニングして、腫瘍転移のリスクを決定するための方法、癌に罹患した患者に対する適正な治療コースを決定するための方法、ならびに癌に罹患した患者に対する治療コースの有効性をモニタリングするための方法で用いることができる。
【００３５】
「ＧＰ８８結合性組成物」としては、限定するものではないが、リガンド、抗ＧＰ８８抗体またはその抗原結合性フラグメントをはじめとする、ＧＰ８８に特異的に結合することが可能ないずれかの物質が挙げられる。本明細書中で用いる場合、「ＧＰ８８に結合する（結合することが可能な）物質」との用語は、ＧＰ８８またはそのポリペプチド断片に特異的に結合するいずれかの分子を指し、そのようなものとしては、限定するものではないが、抗体またはその抗原結合性フラグメントが挙げられ、それによりＧＰ８８発現レベルを検出する。そのような物質は、好ましくは、当業者に周知の方法を用いた検出のために標識されている。標識の例としては、限定するものではないが、放射線標識、発色団、蛍光団、酵素、結合性部分（例えば、ビオチン）などが挙げられる。
【００３６】
抗体またはその抗原結合性フラグメント（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）は、ＧＰ８８タンパク質またはそのポリペプチド断片に結合するＧＰ８８結合性組成物として用いることができる。本明細書中では、欠失（上記に例示した通り）、付加（例えば、ＧＳＴドメインもしくはＧＦＰドメインの付加）、または配列改変（例えば、部位特異的突然変異誘発）などのいずれによるかにかかわらず、ＧＰ８８に特異的に結合するタンパク質のいずれかの突然変異体もＧＰ８８結合性組成物として意図される。
【００３７】
生物学的液体サンプル中のＧＰ８８濃度を測定するのに用いることができる抗ＧＰ８８抗体の例は、限定するものではないが、以下をはじめとするハイブリドーマ細胞株から生成される：６Ｂ３ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２６２）、６Ｂ２ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２６１）、６Ｃ１２ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５９７）、５Ｂ４ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５２６０）、５Ｇ６ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５９５）、４Ｄ１ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５９３）、３Ｆ８ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５９１）、３Ｆ５ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２５９）、３Ｆ４ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５９０）、３Ｇ２（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５９２）、２Ａ５ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５８９）、および４Ｆ１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８７６３）。寄託材料の公衆への利用可能性に対する寄託者による全ての制限は、特許の付与に際し取り消し不能の形で除去されるであろう。本発明の一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６２）により産生されるＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３を、免疫組織化学およびサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて一次抗体として用いる。
【００３８】
本明細書中では、抗体との用語には、限定するものではないが、ヒトおよび非ヒトポリクローナル抗体、ヒトおよび非ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体（抗ＩｄＡｂ）ならびにヒト化抗体が含まれる。
【００３９】
抗体との用語はまた、完全な分子ならびにそのフラグメント（例えば、抗原に結合することが可能な、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｄ’、ＦｖおよびｓｃＦｖ、単鎖抗体（天然または組み換え））の両者を包含するものとする。抗体または抗原結合性成分は、溶液中に存在してもよいし、または支持体（プレート、ビーズ、磁性ビーズ、等）に結合させてもよい。
【００４０】
抗体または抗体のフラグメントは、蛍光標識抗体（下記を参照されたい）を用いる免疫蛍光技術（蛍光顕微鏡観察、フローサイトメーター、または蛍光検出法による）で有用である。抗体と本発明のポリペプチドとの反応は、当技術分野で周知のイムノアッセイ法により検出することができる。本発明の抗体は、光学顕微鏡観察、イメージング、免疫蛍光顕微鏡観察または免疫電子顕微鏡観察のように、組織サンプルまたは生検におけるＧＰ８８タンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、組織学的に用いることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、患者から組織学的標本を採取し、適切に標識した本発明の抗体をアプライすることにより行なうことができる。
【００４１】
生物学的サンプルは、細胞もしくは細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化することが可能なニトロセルロースもしくは他の固体支持体などの固相支持体または担体を用いて処理することができる。続いて、支持体を洗浄し、検出可能に標識した抗ＧＰ８８抗体で処理することができる。これに続いて支持体を洗浄して、未結合の抗体を除去する。次に、該支持体上に結合した標識の量を慣用の手段により検出することができる。固相支持体としては、抗原または抗体に結合することが可能ないずれかの支持体が意図され、そのようなものとしては例えば、限定するものではないが、ガラス、ポリスチレンポリプロピレン、ナイロン、変性セルロース、およびポリアクリルアミドがある。あるいは、抗原が溶液中に存在してもよく、抗体を支持体（プレート、ビーズ、磁性ビーズ、等）に結合させる。
【００４２】
所与のロットの抗体のＧＰ８８タンパク質への結合活性は、周知の方法に従い測定することができる。当業者であれば、常用の実験手順を用いることにより、それぞれの測定のための有効な最適アッセイ条件を決定することができるであろう。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、ＧＰ８８の示差的（例えば、異常に高い、および／または異常に低い）発現を特徴とするか、またはそれを伴う１種以上の疾患の予後診断方法を提供する。ＧＰ８８発現レベルが高い（または上昇している）疾患としては、限定するものではないが、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮内膜癌、等が挙げられ、ＧＰ８８発現レベルが低い疾患としては、限定するものではないが、神経変性疾患が挙げられ、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを標準と比較するステップ、およびそれによりＧＰ８８発現レベルと関連した予後を予測するステップを含む。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、ＧＰ８８の示差的（例えば、異常に高い、および／または異常に低い）発現を特徴とするか、またはそれを伴う１種以上の疾患に罹患した患者の無病生存期間の長さを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無病生存期間の長さを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した無病生存期間の長さを予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が短い無病生存期間の長さと関連する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態は、ＧＰ８８の示差的（例えば、異常に高い、および／または異常に低い）発現を特徴とするか、またはそれを伴う１種以上の疾患に罹患した患者の全生存期間の長さを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無病生存期間の長さを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した無病生存期間の長さを予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が短い全生存期間の長さと関連する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態は、ＧＰ８８の示差的（例えば、異常に高い、および／または異常に低い）発現を特徴とするか、またはそれを伴う１種以上の疾患の再発可能性を予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い該疾患の再発可能性を示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した該疾患の再発可能性を予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が該疾患の再発可能性の低下と関連する。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態は、ＧＰ８８の示差的（例えば、異常に高い、および／または異常に低い）発現を特徴とするか、またはそれを伴う１種以上の疾患に罹患した患者の無進行生存期間の長さを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無病生存期間の長さを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した無進行生存期間の長さを予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が短い無進行生存期間と関連する。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態は、癌に罹患した患者の無病生存期間の長さを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無病生存期間の長さを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した無病生存期間の長さを予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が短い無病生存期間の長さと関連する。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、癌に罹患した患者の全生存期間の長さを予測するための方法を提供し、該方法は、該サンプルから取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い全生存期間の長さを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した全生存期間の長さを予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が短い全生存期間の長さと関連する。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、癌に侵された患者の回復可能性を予測するための方法を提供し、該方法は、該サンプルから取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い回復可能性を示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した回復可能性を予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が回復可能性の低下と関連する。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、癌患者の無進行生存期間を予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無進行生存期間を示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した無進行生存期間を予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が該患者の短い無進行生存期間と関連する。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、癌患者の短い無病生存期間のリスクを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準または短い無病生存期間のより高いかもしくは低いリスクを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した短い無病生存期間のリスクを予測するステップを含む。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、癌患者の短い全生存期間のリスクを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準または短い全生存期間のより高いかもしくは低いリスクを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した短い全生存期間のリスクを予測するステップを含む。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、患者の回復可能性を予測するための方法を提供し、該方法は、該サンプルから取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の回復可能性を示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した回復可能性を予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が該患者の回復可能性の低下と関連する。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、患者における癌の再発可能性を予測するための方法を提供し、該方法は、該サンプルから取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の再発可能性を示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した癌の再発可能性を予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が癌の再発可能性の低下と関連する。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、患者における癌の転移可能性を予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の転移可能性を示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した癌の転移可能性を予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が患者における癌の転移可能性の増大と関連する。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、患者における癌の再発リスクを予測するための方法を提供し、該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の再発リスクを示す標準と比較するステップ、およびそれにより該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した癌の再発リスクを予測するステップを含み、この場合、ＧＰ８８発現レベルの上昇が患者における癌の再発リスクの上昇と関連する。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態では、癌に罹患した患者に対する治療コースの有効性をモニタリングするための方法が提供される。この方法は、（ａ）該治療前の該患者由来の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現の第１レベルを測定するステップ、および（ｂ）続いて、該治療中の該患者由来の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現の第２レベルを測定するステップを含む。そして、ＧＰ８８発現の第１レベルとＧＰ８８発現の第２レベルとの比較が、該治療の有効性を示すであろう。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、癌に侵された患者をスクリーニングすることにより、腫瘍再発または腫瘍転移のリスクを決定する方法を提供する。該方法は、該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、該レベルを標準と比較するステップを含む。標準と比較して上昇したＧＰ８８レベルを有することが見出された患者は、腫瘍再発または腫瘍転移により罹患しやすいと分類される。
【００６０】
本発明のさらに好ましい実施形態は、癌に罹患した患者に対する適正な治療コースを決定するための方法を提供する。この方法は、患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップを含む。続いて、ＧＰ８８発現レベルが低いとして患者の第１グループを特定し、この患者グループはより高い生存チャンスまたは腫瘍再発もしくは転移までの長い時間を有する患者に適した治療を必要とする可能性がある。該方法はさらに、ＧＰ８８発現レベルが上昇しているとして患者の第２グループを特定するステップを含み、この患者グループは、より低い生存チャンスおよび腫瘍再発または転移により罹患しやすい患者に適した治療を必要とする可能性がある。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態では、腫瘍発達の初期ステージにＧＰ８８発現レベルを決定するための方法が提供される。腫瘍発達の種々のステージが当業者に周知であり、例えば、Ｍａｒｋｍａｎ  １９９７，Ｂａｓｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅに例示されている。
【００６２】
本発明はまた、リンパ節転移陰性の乳癌の治療のための乳房温存手術（腫瘍摘出手術（lumpectomy））の有効性を決定するための方法に関し、該方法は、（ａ）乳房温存手術の必要がある個体由来の生物学的サンプルを取得するステップ、（ｂ）該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、および（ｃ）該レベルを標準のレベルと比較することにより乳房温存手術への該乳癌の応答性を予測するステップを含む。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、癌を有する患者の予後診断のための方法を提供し、該方法は、（ａ）予後診断の必要がある個体由来の生物学的サンプルを取得するステップ、（ｂ）該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、（ｃ）ＧＰ８８発現レベルに関して該サンプルをスコア付けするステップ、および（ｄ）該スコアを対照サンプル（または標準）から取得したスコアと比較するステップを含む。
【００６４】
本発明はまた、抗エストロゲン治療の効果を決定するための方法に関し、該方法は、（ａ）抗エストロゲン治療の必要がある個体由来の生物学的サンプルを取得するステップ、（ｂ）該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップ、および（ｃ）該レベルを標準と比較することにより、抗エストロゲン治療に対する応答性を予測するステップを含む。この方法は、上記の方法に従って、そのような患者に対する適正な治療コースを決定するステップをさらに含むことができる。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「抗エストロゲン療法」とは、腫瘍増殖を予防するかまたは治療する目的での抗エストロゲン組成物の投与に関する。抗エストロゲン剤の例としては、エストロゲン受容体アンタゴニストまたはＳＥＲＭ（タモキシフェンおよびラロキシフェン）が挙げられる。他の抗エストロゲン組成物としては、アロマターゼ阻害剤（例えば、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）（アナストロゾール）、Ｆｅｍｅｒａ（登録商標））、およびエストロゲン受容体ダウンレギュレーター（例えば、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））が挙げられる。タモキシフェンの抗エストロゲン作用は、標的組織で結合部位に関してエストロゲンと競合するその能力に関連する可能性がある。他の抗エストロゲン剤（例えば、アロマターゼ阻害剤）は、利用可能なエストロゲンの量を阻害するかまたは減少させる。
【００６６】
本発明はまた、化合物をスクリーニングするための方法に関し、該方法は、（ａ）ＧＰ８８発現に正または負に影響するその能力に関してスクリーニングする対象の化合物を取得するステップ、（ｂ）適切な生物学的サンプルを該化合物と接触させるステップ、および（ｃ）該生物学的サンプル中でのＧＰ８８発現レベルに対する該化合物の影響を決定するステップを含む。好ましくは、該化合物の影響を、標準と比較した該サンプルに対するＧＰ８８抗体の結合により測定する。
【００６７】
ＧＰ８８発現レベルの測定
ＧＰ８８発現の測定は、当業者に公知の１以上の方法により行なうことができる。例えば、ＧＰ８８発現レベルは、（ａ）ＧＰ８８ポリペプチド、（ｂ）ＧＰ８８タンパク質をコードするｍＲＮＡ、（ｃ）ＧＰ８８遺伝子を構成するＤＮＡの一部分、または（ｄ）それらのいずれかの組み合わせの検出により測定することができる。
【００６８】
例えば、ＧＰ８８発現レベルは、ＧＰ８８結合性組成物を用いてＧＰ８８タンパク質レベルを測定することにより検出することができる。ＧＰ８８タンパク質レベルの検出は、当業者に公知の方法のいずれかを用いて行なうことができ、そのようなものとしては、限定するものではないが、化学発光法、組織化学染色または生化学的検出（すなわち、免疫組織化学アッセイ）、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー、免疫沈降（または非抗体物質に対する同等の方法）、プラズモン共鳴吸光測定、などが挙げられる。本発明の一実施形態では、ＧＰ８８タンパク質レベルの検出方法は、少なくとも１種の抗体の使用を含むイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）である。本発明のさらに別の実施形態では、組織サンプル、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片でのＧＰ８８染色は、抗ＧＰ８８抗体を用いて、ＧＰ８８発現を測定する免疫組織化学により行なうことができる。
【００６９】
例えば、本発明の一実施形態は、ＯｎｃｏＳｔａｉｎ  ８８ＴＭＩＨＣキットを用いて実施することができ、このキットはマウスモノクローナル一次抗体、抗マウスＩｇＧ二次抗体、内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするためのペルオキシダーゼブロッカーおよび発色基質を使用する。ＧＰ８８遺伝子によりコードされるポリペプチドの測定は、ポリペプチドの断片の測定を含む場合があり、この断片は遺伝子の転写もしくは翻訳変異体から生じるか、あるいは、異なるサイズのポリペプチドが、ＧＰ８８ポリペプチドのより大きな一部分のタンパク質分解をはじめとする翻訳後修飾の結果生じる。
【００７０】
ＧＰ８８をコードするｍＲＮＡのレベルの検出も、ＧＰ８８発現の指標となる場合がある。ｍＲＮＡレベルを検出するために用いる方法は当技術分野で周知であり、ＧＰ８８をコードするｍＲＮＡを用いたハイブリダイゼーションまたは増幅の検出が挙げられる。この検出は、ｔｈｅ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（John Wiley & Sons, 1999）；米国特許第５，８８２，８６４号などに例示されている当業者に公知の方法の１つを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕ（例えば、組織サンプル中）のいずれかでのｍＲＮＡの分析により行なうことができる。検出されるＧＰ８８  ｍＲＮＡはＧＰ８８遺伝子のいずれかのＲＮＡ転写産物、またはその断片であろう。
【００７１】
患者の分類
患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを標準と比較することにより患者を分類することができる。例えば、サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定した後、測定したレベルを標準と比較する。この標準は患者の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを評価するのに用いられるＧＰ８８の発現レベルである。例えば、一実施形態では、患者サンプル中のＧＰ８８発現レベルが標準のものより高い場合、患者サンプルは上昇したＧＰ８８発現レベルを有するとみなされるであろう。逆に、別の実施形態では、サンプル中のＧＰ８８発現レベルが標準より低い場合、サンプルは低いＧＰ８８発現レベルを有するとみなされるであろう。
【００７２】
別の実施形態では、患者に、所与の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現に関連した「スコア」を割り当てることができる。サンプルは、乳癌の診断またはモニタリング中に「スコア付け」することができる。スコアは、生物学的サンプル中のＧＰ８８の発現レベルにより決定することができる。一実施形態では、生物学的サンプル中の上昇したＧＰ８８発現レベルには、比較的低いスコアが与えられる低いＧＰ８８発現レベルと比較して高いスコアが与えられる。スコアはまた、免疫組織化学によるサンプルの目視検査によっても決定することができる。別の実施形態では、より定量的なスコア付けは、２以上のパラメータの測定を含み、パラメータとは例えば、（ｉ）染色強度、および（ｉｉ）サンプリングされた染色（「陽性」）細胞の割合である。これら複数のパラメータに基づいて、陽性染色のレベルの上昇を反映したスコアを割り当てることができる。
【００７３】
したがって、一実施形態では、患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルに関連したスコアを、標準のＧＰ８８発現レベルに関連したスコアと、または対照として用いるＧＰ８８発現レベルを有しないか、低いかもしくは上昇したＧＰ８８発現レベルを有する細胞と比較することができる。そのような比較により、患者のより良好な予後診断を提供することができる。例えば、一実施形態では、本発明の方法により、０〜３＋のスケールを用いてＧＰ８８発現レベルをスコア付けし、ここで０は陰性（検出可能なＧＰ８８発現がない）、１＋および２＋はそれぞれ弱い染色と弱い〜中程度の染色に関連付けられ、３＋は１０％超の腫瘍細胞での高強度の染色に関連付けられ、より低いスコアが患者のより良好な予後を示す。
【００７４】
様々なレベルのＧＰ８８を発現する患者の予後診断は、単一変数解析または多変数解析を用いて行なうことができる。これらの方法は、１つまたは複数の変数と所与の帰結との間の相関の尤度を決定する。一実施形態では、本方法により、癌患者のＧＰ８８発現レベル（または他の変数と組み合わせたＧＰ８８発現レベル）と無病生存期間または全生存期間との間の相関の尤度が決定されるであろう。これらの解析を行なうための当業者に周知の複数の方法のいずれか１つを用いることができる。単一変数解析の例は、カプラン・マイヤー法またはログランク検定である。多変数解析の例は、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルである。本発明の方法は、追加の乳癌マーカーと組み合わせてＧＰ８８発現レベルを解析するステップをさらに含むことができる。Ｃｏｘ比例比（Cox proportional ratio）は、様々なレベルのＧＰ８８発現を有する患者に関するハザード比または無病生存期間および全生存期間についてのリスクを提供する。
【００７５】
ＫａｐｌａｎおよびＭｅｉｅｒの方法を用いる生存解析は、癌の治験で用いるための推奨される統計学的技法である。これは、研究への参加後の患者の生存期間の分布を解析することにより用いられる。この解析は、これらを、参加後の所与の時点まで生存している患者の割合に関して表現する。グラフに関して、生存患者の割合の、時間に対するプロットは、特徴的な減衰（多くの場合指数関数的）を有し、曲線の傾斜は研究対象の治療の有効性を示す。生存曲線の傾斜がより緩やかであれば、治療はより有効である。カプラン・マイヤー解析は、２種類の異なる治療に関連する生存曲線の間の差異の統計学的有意性を調べるために用いることができる。
【００７６】
一実施形態では、患者から取得したサンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定し、標準と比較した後で、続いて患者を特定の無病生存期間または全生存期間の尤度を有する群に分類する。次に、該患者についての無病生存期間または全生存期間の尤度を、その群内の患者の無病生存期間または全生存期間の尤度に基づいて評価する。例えば、患者から取得した生物学的サンプルを、標準と比較して上昇したＧＰ８８発現レベルを有すると決定される。この患者は、続いて、ＧＰ８８発現レベルが上昇した患者の群に分類されるであろう。本発明において、上昇したレベルのＧＰ８８を発現する患者の群に対して無病生存期間または全生存期間が短縮することが見出されているので、癌に侵された特定の患者が無病生存期間または全生存期間の長さが短縮しているとみなされるであろう。
【００７７】
キット
本発明は、生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するためのキットを提供する。そのようなキットは、ＧＰ８８をコードするｍＲＮＡ、ＧＰ８８ポリペプチド、またはそれらのいずれかの組み合わせもしくは断片を検出するための試薬を含むであろう。試薬は、ＧＰ８８をコードする核酸配列（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、またはＧＰ８８ポリペプチドに特異的に結合することが可能な１種以上の分子を含むであろう。
【００７８】
キットは、ＧＰ８８をコードするｍＲＮＡ（センスまたはアンチセンスのいずれか）の検出のための１種以上の核酸試薬を含むことができる。１種以上の核酸試薬は、ＧＰ８８をコードするｍＲＮＡのハイブリダイゼーションおよび／または増幅のために用いることができる。キットは、ＧＰ８８をコードするｍＲＮＡを増幅するための１以上のプライマーペアを含むことができる。キットは、例えば、対照として用いるために、様々な生理学的状態の組織（例えば、正常、および転移性進行性腫瘍）に由来するトータルｍＲＮＡのサンプルをさらに含むことができる。キットはまた、ハイブリダイゼーション反応および／または増幅反応で用いるための、バッファー、ヌクレオチド塩基、および他の組成物も含むことができる。それぞれの溶液または組成物はバイアルまたは瓶に収容することができ、全てのバイアルは販売のために箱に封入されている。本発明の他の実施形態は、生物学的サンプル中のＧＰ８８をコードするｍＲＮＡの検出に使用するためのキットを包含し、該キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕでＧＰ８８をコードするｍＲＮＡに対して上昇した親和性で結合するのに有効なオリゴヌクレオチドプローブおよびこれらのプローブのそれぞれのための容器を含む。
【００７９】
さらなる実施形態では、本発明は、生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルの測定に使用するためのキットを包含し、該キットは、１種以上のＧＰ８８ポリペプチドまたは断片に特異的な１種以上の物質、例えば、１種以上の抗体を含む。特定の一実施形態では、キットは１種以上の物質および１種以上の核酸マーカーを含み、この場合、該物質および核酸マーカーは、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイを行なうために適した様式で修飾されている。
【００８０】
本発明の好ましい一実施形態は、哺乳動物の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するためのキットに関し、この場合、該ＧＰ８８発現レベルは乳癌の予後診断の指標であり、該キットは以下の要素：（ａ）ＧＰ８８に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント；（ｂ）該抗体とＧＰ８８との相互作用の程度を検出するのに有用な試薬；（ｃ）抗原検索のために有用な試薬または溶液；ならびに（ｃ）陽性および／または陰性対照サンプルを含む。該抗体は指示試薬に直接連結されていてもよく、この場合、該指示試薬は、蛍光試薬、比色試薬、免疫ペルオキシダーゼ試薬および同位体試薬からなる群より選択される。あるいは、キットは指示試薬に連結された指示二次抗体をさらに含むことができ、この場合、該指示試薬は、蛍光試薬、比色（calorimetric）試薬、免疫ペルオキシダーゼ試薬および同位体試薬からなる群より選択される。
【００８１】
一実施形態では、キットは、少なくとも１種の一次抗体（例えば、抗ＧＰ８８モノクロナル抗体６Ｂ３）、少なくとも１種の標識二次試薬（例えば、ＨＲＰなどの検出酵素で標識された抗ヒトＧＰ８８ポリクローナル抗体）、および少なくとも１種の基質（例えば、ＴＭＢ）を含む。あるいは、キットは、酵素で標識された二次抗体に代わって、放射性標識二次抗体を含むことができる。キットはまた、検出アッセイを行なうための使い捨ての供給品（例えば、マイクロタイタープレート、ピペット）を含むこともできる。
【実施例】
【００８２】
具体的な課題または環境への本発明の教示の適用は、本明細書中に含まれる教示に照らして当業者の技能の範囲内であろう。本発明を、以下の非限定的な実施例によりさらに完全に説明する。
【００８３】
実施例１
浸潤性腺管癌におけるＧＰ８８発現
現行の方法論は、ホルマリン固定パラフフィン包埋ヒト乳房病変部でのＧＰ８８染色を臨床病理学的変数で調べることに基づいている。乳癌で細胞質ＧＰ８８染色が観察されたが、良性乳房上皮ではほぼ常に陰性であった。２０３個のホルマリン固定パラフィン包埋生検由来の４〜６ミクロン組織切片を準備した。抗ヒトＧＰ８８抗体を用いた免疫組織化学によりＧＰ８８染色を行ない、正常組織、良性病変部、腺管癌および小葉癌でのＧＰ８８発現を調べた（表１；ＤＣＩＳ：腺管癌ｉｎ  ｓｉｔｕ、ＩＤＣ：浸潤している癌ｉｎ  ｓｉｔｕ、ＬＣＩＳ：小葉癌ｉｎ  ｓｉｔｕ、ＩＬＣ：浸潤している小葉癌）。さらに、ＩＤＣでのＧＰ８８発現と、組織学的グレード、増殖指数（Ｋｉ６７）、ｐ５３、ＥＲおよびＨｅｒ−２発現との相関研究を行なった。
【表１】
2015158498.tif 000003
【００８４】
ＥＲ＋腫瘍およびＥＲ−腫瘍の両方でＧＰ８８が発現していることが観察され、ＩＤＣで優勢的に発現されており、これは組織学的グレードおよびＫｉ６７増殖指数と相関していた。
【００８５】
実施例２
ＥＲ−、ＥＲ＋／ＬＮ−およびＥＲ＋／ＬＮ＋患者の乳癌組織におけるＧＰ８８発現レベルの解析
研究デザイン
３８９の乳癌症例で臨床試験を実施し（臨床試験で考慮された被験者の特性については表２を参照されたい）、具体的には、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックとして保存されていた浸潤性腺管癌組織サンプルであり、３つの組織保存機関から入手した。試験対象患者基準は以下の通りである：診断の年および年齢、腫瘍特性：エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、腫瘍グレード、腫瘍サイズ、リンパ節状態、最後の経過観察での状態、全生存期間（ＯＳ）、再発状態、最初の再発までの期間、治療（ＥＲ＋、ＬＮ０タモキシフェン）。試験対象患者基準を満たす症例を研究のためのスライド調製のために抜き出した。
【００８６】
研究方法
各症例について、保管機関の処理場からの組織学研究室で、４〜６ミクロンの組織切片を正に荷電した顕微鏡スライド上に新たに切り出した。ブロックの選択を担当する病理学者により、スライドを切片の適切性について調べた。スライドをＯｎｃｏｓｔａｉｎ  ８８ＴＭキットで染色することによりＧＰ８８発現を測定し、資格のある病理学者によりスコア付けした。
【００８７】
材料および方法
今回の方法は、ＯｎｃｏＳｔａｉｎ  ８８ＴＭＩＨＣキットを用いて実施することができ、これは、マウスモノクローナル一次抗体、抗マウスＩｇＧ二次抗体、内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするためのペルオキシダーゼブロッカーおよび発色基質を用いる。マウス一次抗体は、乳癌細胞の細胞質で発現されるヒトＧＰ８８に結合する。このステップに続いて、一次抗体に結合するペルオキシダーゼ結合二次抗体を添加した。次に、特異的一次抗体−二次抗体複合体を、適切に希釈した発色基質を用いて可視化し、対比染色し、カバーガラスをかぶせた。光学顕微鏡を用いて結果を解釈した。
【００８８】
結果
組織サンプルの染色パターンを、表３に示したように解析し、分類した（すなわち、スコア付けした）。ＧＰ８８発現レベルは、腫瘍細胞のうち１０％超で細胞質染色に関して観察された。腫瘍細胞のうち１０％未満で観察された染色の欠如またはごく薄い染色には、「０」のスコアを付けた。腫瘍細胞のうち１０％超で観察された弱い細胞質染色には「１＋」のスコアを付け、腫瘍細胞のうち１０％超で観察された弱い〜中程度の細胞質染色には「２＋」のスコアを付け、腫瘍細胞のうち１０％超で観察された強い細胞質染色には「３＋」のスコアを付けた。図６は、抗ＧＰ８８と、ホルマリン固定パラフィン包埋乳癌生検との反応性および染色パターンを、間接的免疫組織化学染色法により示している。
【００８９】
上記で得られた染色パターンを、乳房腫瘍の予後評価に役立つさらなる解釈に供した（以下の表４を参照されたい）。３＋未満のスコア（すなわち、０、１＋および２＋）はＧＰ８８低リスク群として分類し、再発もしくは死亡の低下またはより低いリスクを有するとみなした。３＋のスコアはＧＰ８８上昇リスク群として分類し、再発もしくは死亡の上昇またはより高いリスクを有するとみなした。
【００９０】
統計学的プランおよび解析
結果の統計学的解析は、生物統計学者（Biostatistician）により実施した。統計学的解析のプランは、無病生存率および／または全生存率を予測するその能力による試験性能の評価に基づいていた。診断群のペアの特定のための指数ランク検定、およびリンパ節状態により分離されたＥＲ＋集団でのリスクの定量化のためのＣｏｘ比例ハザードモデルを用いるように設計した（以下の表５を参照されたい；ＯＳ＝全生存率、ＤＦＳ＝無病生存率、ＬＮｎ＝リンパ節陰性およびＬＮｐ＝リンパ節陽性）。さらに、全生存率および無病生存率についての生存関数を、ＧＰ８８  ３＋群およびＧＰ８８＜３＋（ＧＰ８８  ０、１および２）についてのカプラン・マイヤー曲線により決定した。
【００９１】
ＥＲ−患者の中では、ＧＰ８８は全死亡率と統計学的に有意な関連を示した（図１）。データにより、上昇したＧＰ８８レベル（ＧＰ８８  ３＋）を発現するＥＲ−癌を有する患者は、より低いＧＰ８８発現（ＧＰ８８  ０、１＋または２＋）を有するＥＲ−癌よりも低い全生存可能性を有することが示された。
【００９２】
ＧＰ８８レベルの上昇（３＋）は、ＥＲ＋／ＬＮ−集団での腫瘍再発リスクの、非常に統計学的に有意な指標であり、全死亡率と有意に関連する。ＧＰ８８発現レベルの上昇（細胞質染色で３＋のスコアを有するＧＰ８８上昇リスク群）は、無病生存率の低下（図２）および全生存率の低下（図３）と関連していた。
【００９３】
ＧＰ８８発現の上昇（３＋）はまた、ＥＲ＋／ＬＮ＋集団での再発リスクおよび全死亡率の非常に統計学的に有意な指標である。ＧＰ８８発現レベルの上昇（細胞質染色で３＋のスコアを有するＧＰ８８上昇リスク群）は、無病生存率の低下（図４）および全生存率の低下（図５）と関連していた。
【表２】
2015158498.tif 000004
【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
2015158498.tif 000006
【００９６】
実施例３
乳癌患者から取得した生物学的液体におけるＧＰ８８発現レベルの解析
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、３回測定で、ヒト血清サンプル中のＧＰ８８濃度を測定した。標準ＧＰ８８サンプルは、３０％グリセロールおよび１％ミルク−ＰＢＳ中に０、０．１、０．２５、０．５、１、３、１０および２０ｎｇ／ｍｌの濃度で希釈した組換えＧＰ８８から調製した。マイクロタイタープレート上の１００マイクロリットルウェルを、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．７８ｍｇ／ｍｌの６Ｂ３抗体）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて抗ヒトＰＣＤＧＦポリクローナル抗体（ＩｇＧ画分）を各ウェルに３μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１．５時間、添加した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて検出抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ヤギ−ウサギＩｇＧ）を各ウェルに添加した。ＴＭＢ（基質）を添加し、サンプルと共に１時間インキュベートさせた。サンプルの光学密度を、６２０ｎｍの波長に設定したＥＬＩＳＡ分光光度リーダーを用いて測定した。標準ＧＰ８８サンプルの光学密度（ｙ軸）を各サンプル中のＧＰ８８の量（ｘ軸）に対してプロットして、標準曲線を作成した（図７）。未知サンプルのＧＰ８８濃度を、光学密度を測定し、標準曲線（図６）を用いて決定して、ＧＰ８８濃度を決定した。
【００９７】
疾患の徴候を有さず、進行性疾患を有しない乳癌に侵された患者について、ＧＰ８８の循環レベルを測定した。疾患の徴候を有しない乳癌患者（ＢＣ  Ｐｔｓ）の血清中のＧＰ８８レベル（ベースライン）は、健常個体の範囲内であることが観察された（図８）。しかしながら、進行性疾患を有するＢＣ  Ｐｔｓは著明に高いＧＰ８８循環レベルを有する。
【００９８】
研究により、疾患の徴候を有しない乳癌患者におけるＧＰ８８発現の循環レベルは低く留まり、健常個体の範囲内であることがさらに示された。ＧＰ８８発現レベルを、疾患の徴候を有しない患者で、長期間にわたって（すなわち、４年：図９に示されているように、２００４年１０月〜２００８年４月）測定した（図９）。結果から、疾患の徴候を有しない初期ステージ疾患（ステージ２）の患者は、健常個体の範囲内の安定したＧＰ８８レベルを維持したことが示された。
【００９９】
初期ステージ（ステージ２）で上昇したＧＰ８８レベルを発現していた患者についてＧＰ８８の循環レベルを観察し、この患者は時間が経つとステージ４疾患まで悪化（再発）した（概ね１．５年：本例では、２００６年１月〜２００７年５月）。データから、患者は、後期ステージには異常に高いレベルのＧＰ８８を発現したことが示された（図１０）。
【０１００】
上昇したＧＰ８８レベルは生存期間の欠如に関連する
乳癌により死亡した２名の患者の血清中のＧＰ８８レベルを標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定し、数週間にわたる上昇したＧＰ８８レベルの維持が生存率の低下をもたらすことが観察された。２名の患者は、疾患の徴候を有しない（ＮＥＤ）と決定されたときに研究を終了し、この場合、ＧＰ８８レベルは低く、健常個体の範囲内であった（約２０単位：２０ｎｇ／ｍｌ）。しかしながら、時間が経つと、ＧＰ８８レベルは１６０〜２００単位（１６０〜２００ｎｇ／ｍｌ）に達し、この時点で、患者１は１週間以内に死亡し（図１１Ａ）、患者２は３週間以内に死亡した（図１１Ｂ）。
【０１０１】
乳癌患者の血漿中でＧＰ８８発現レベルを測定した場合（すなわち、健常個体と比較して上昇したＧＰ８８レベルが観察された場合）に、同様の結果が観察された。
【０１０２】
本発明を、開示された実施形態を参照して説明してきたが、種々の改変を本発明の精神から逸脱することなく行なうことができることが理解されるべきである。したがって、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０１０３】
実施例４
肺癌における予後診断因子としてのＧＰ８８を確証するための研究
上記の実施例２の材料および方法に記載されている通り、Ｏｎｃｏｓｔａｉｎ  ８８ＴＭＩＨＣキットを用いた組織マイクロアッセイでのＧＰ８８発現の検査は、扁平上皮癌および腺癌の両方に由来する肺癌組織におけるＧＰ８８発現、ならびに正常ヒト肺組織を含めた正常ヒト組織におけるＧＰ８８発現の欠如を実証した（以下の表５）。
【表５】
2015158498.tif 000007
【０１０４】
実施例５
肺癌組織におけるＧＰ８８発現レベルの解析
ステージＩ／ＩＩ肺癌組織におけるＧＰ８８レベルの上昇が肺癌患者の無病生存率（ＤＦＳ）の低下と相関するかどうかを決定するために、臨床データおよび帰結データが提供された８５症例の切除可能なステージＩ／ＩＩ  ＮＳＣＬＣでＧＰ８８発現を算出した。Ｏｎｃｏｓｔａｉｎ  ８８ＴＭＩＨＣキットを用いて組織を染色し、得られた染色スライドを委員会が承認した病理学者によりＧＰ８８染色についてスコア付けした。
【０１０５】
カプラン・マイヤープロットを用いてＧＰ８８スコアおよび生存率データを解析すると、ＧＰ８８レベルが上昇するとＤＦＳが統計学的に有意に低下することが観察された。このことは、ＳＡＳ  ＰＲＯＣ  ＰＨＲＥＧを用いたＣｏｘ比例ハザードモデルをフィッティングすることにより正式に試験し、ＧＰ８８レベルは再発の間隔でスケールした予測因子（interval-scaled predictor of reocurrence）として扱われる。このことは、ＧＰ８８と再発との間の非常に有意な関連をもたらした（Ｐ＝０．００９１）。ＧＰ８８の係数は０．６７６であり、このことは、ＧＰ８８の各１単位の増加が、概ね２倍の再発ハザードに対応することを示す（図１４）。
【０１０６】
同じ８５症例でのＧＰ８８発現と全生存率との相関は、ＧＰ８８スコアの１の増加に対する、死亡リスクの７４％の上昇を実証した（図１５）。これらのデータは、乳癌と同様に、ＧＰ８８発現は肺癌（例えば、初期ステージのＮＳＣＬＣ）における再発のリスク予測因子として用いることができることを実証している。
【０１０７】
実施例６
肺癌患者から取得した生物学的液体中のＧＰ８８発現レベルの解析
肺癌患者および健常な非肺癌患者から取得したヒト血清サンプル中のＧＰ８８濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。データを以下の表６に示す。
【表６】
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【０１０８】
表７に示したデータは、血清ＧＰ８８を肺癌の予測的指標として用いることができることを示している。さらに、比較箱髭図（comparative box and whisker plot）を用いたデータ解析により、肺癌患者と健常な非肺癌患者から取得したサンプル間の明白な差異が示された。ウィルコクソンランク積算検定により、この視覚的印象が確認され、０．０００４のおおよそのＰ値が得られた。
【０１０９】
前述の発明を明白性と理解の目的でいくぶんか詳細に説明してきたが、本開示の意味から、形式および詳細での種々の変更を、本発明の真の精神および特許請求の範囲から逸脱することなく行なうことができることが当業者には理解されるであろう。本明細書中で引用した全ての特許および刊行物は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
【図１】
2015158498.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2015158498.tif 000021
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2015158498.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
2015158498.tif 000026
【配列表】
2015158498000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月17日(2015.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に侵された患者の予後診断のためのデータを取得する方法であって、以下のステップ：
該患者から取得した生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するステップであって、該生物学的サンプルを該ＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含むステップ、
該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを標準と比較し、それにより該ＧＰ８８発現レベルと関連した予後診断のためのデータを取得するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
予後診断が、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い全生存期間を示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８発現レベルと関連した全生存期間の長さを予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い全生存期間の長さと関連する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
予後診断が、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無病生存期間を示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した無病生存期間の長さを予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い無病生存期間の長さと関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
予後診断が、健常個体を示す標準またはより長いかもしくは短い無進行期間を示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した無進行生存期間を予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い無進行期間と関連する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予後診断が、健常個体を示す標準または短い無病生存期間のより高いかもしくは低いリスクを示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した短い無病生存期間のリスクを予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い無病生存期間のリスクと関連する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
予後診断が、健常個体を示す標準または短い全生存期間のより高いかもしくは低いリスクを示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した短い全生存期間のリスクを予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の短い全生存期間のリスクと関連する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
予後診断が、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い回復可能性を示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した回復可能性を予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、該患者の回復可能性の低下と関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
予後診断が、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の再発可能性を示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した癌の再発可能性を予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の癌の再発可能性の低下と関連する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
予後診断が、健常個体を示す標準またはより高いかもしくは低い癌の再発リスクを示す標準と比較したＧＰ８８発現レベルに基づいて、該ＧＰ８８タンパク質発現レベルと関連した癌の再発リスクを予測することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＰ８８発現レベルの上昇が、前記患者の癌の再発リスクの上昇と関連する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌に罹患した患者に対する治療コースの有効性をモニタリングするためのデータを取得する方法であって、以下のステップ：
該治療前の該患者由来の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現の第１レベルを測定するステップ；および
続いて、該治療中の該患者由来の生物学的サンプル中のＧＰ８８発現の第２レベルを測定するステップ、
ここで、ＧＰ８８発現レベルを測定するステップがＧＰ８８結合性組成物と接触させることを含み、および
該ＧＰ８８発現の第１レベルを該ＧＰ８８発現の第２レベルと比較することにより、該治療の有効性が示される、上記方法。
【請求項１９】
癌が、以下：乳癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、脳の癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、膵臓癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、造血系の癌（リンパ性および骨髄性）、消化器の癌（例えば、大腸）、泌尿生殖管の癌（例えば、腎細胞、尿路上皮細胞）、子宮癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、小細胞癌、非小細胞癌、ユーイング腫瘍、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的サンプルが、以下：血液、脳脊髄液、血清、血漿、尿、乳頭吸引液、細針吸引液、管洗浄液を含む組織洗浄液、唾液、喀痰、腹水、精液、リンパ、膣プール（vaginal pool）、滑液、脊髄液、羊水、母乳、肺喀痰または肺表面活物質、尿、糞便、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、乳房腫瘍、骨腫瘍、骨髄腫瘍、精巣腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、甲状腺腫瘍、膵臓腫瘍、子宮頸部腫瘍、胃の腫瘍、腸の腫瘍、結腸直腸腫瘍、脳腫瘍、膀胱腫瘍、大腸腫瘍および子宮腫瘍、頭頸部腫瘍、鼻咽頭腫瘍のいずれかから回収した液体、ならびに生物学的起源の他の液体サンプルからなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的サンプルが組織サンプルである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が浸潤性腺管癌である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌がエストロゲン受容体陰性である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌がエストロゲン受容体陽性かつリンパ節陰性である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌がエストロゲン受容体陽性かつリンパ節陽性である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＧＰ８８結合性組成物が、抗ＧＰ８８抗体またはその抗原結合性フラグメントより選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記非小細胞肺癌が、扁平上皮癌および腺癌からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
ＧＰ８８発現に正または負に影響するその能力についてスクリーニングする対象の化合物を取得するステップ、
適切な生物学的サンプルを該化合物とin vitroで接触させるステップ、および
該生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルに対する該化合物の影響を決定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３０】
ＧＰ８８結合性組成物を含む容器を含む、生物学的サンプル中のＧＰ８８発現レベルを測定するためのキット。
【外国語明細書】
2015158498000001.pdf