(57)【要約】【課題】ＣＡＲＳ顕微鏡法または分光法システムなどにおいてより効率的でかつ経済的な分析システムを提供する。【解決手段】第１電磁界および第２電磁界を、第１電磁界の第１周波数と第２電磁界の第２周波数との差に応答する振動分析機器に提供するシステムが開示される。システムは、信号電界周波数のパルス信号電界およびアイドラ電界周波数のパルスアイドラ電界を出力として提供するために、高い繰返しレートでポンピングされてもよい非線形結晶を含む。信号電界は第１電磁界を提供し、アイドラ電界は第２電磁界を提供する。システムはまた、信号電界周波数とアイドラ電界周波数との差が変更されることを可能にする同調システムを含む。システムはまた、第１および第２電磁界を振動分析機器に提供する出力ユニットを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１周波数のポンプ電磁界および第２周波数のストークス電磁界を、前記第１周波数と前記第２周波数との差に応答する振動分析機器に提供する、コヒーレントアンチストークスラマン散乱分光システムにおいて、
ピコ秒の信号電界周波数のパルス信号電界およびピコ秒のアイドラ電界周波数のパルスアイドラ電界を出力として提供するために、反復してポンピング可能な非線形結晶であって、前記信号電界が前記ポンプ電磁界を提供し、前記パルスアイドラ電界が前記ストークス電磁界を提供し、前記パルス信号電界は前記パルスアイドラ電界と前記振動分析機器上においてコリニアとする非線形結晶と、
前記信号電界周波数と前記アイドラ電界周波数との差が変更されることを可能にする同調手段と、
前記パルス信号電界及び前記パルスアイドラ電界との少なくとも一つに可変遅延を与える可変遅延手段と、
前記ポンプおよびストークス電磁界をコリニアに前記振動分析機器に提供する出力手段とを備え、低い平均パワー及び高いピークパワーを利用した生物学的用途に用いられることを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する信号によってポンピングされることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、チタン酸リン酸カリウム、ニオブ酸リチウム、三ホウ酸リチウム、およびタンタル酸リチウムの少なくとも１つからなることを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、バルク材料であることを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項１に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、周期分極反転材料であることを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムであって、前記同調手段は、前記非線形結晶の温度を変化させる手段を含むことを特徴とするシステム。
【請求項７】
請求項１に記載のシステムであって、前記同調手段は、前記非線形結晶へのポンプ電界の入射角度を変化させる手段を含むことを特徴とするシステム。
【請求項８】
請求項１に記載のシステムであって、光学パラメトリック発振器キャビティを含むことを特徴とするシステム。
【請求項９】
第１周波数のポンプ電界および第２周波数のストークス電磁界を提供する、コヒーレントアンチストークスラマン散乱分光システムにおいて、
少なくとも２つのミラーで構成される共鳴キャビティ内に配置され、信号電界周波数のパルス信号電界およびアイドラ電界周波数のパルスアイドラ電界を出力として提供するために、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する信号によって反復してポンピング可能な非線形結晶であって、前記信号電界が前記ポンプ電界を提供し、前記パルスアイドラ電界が前記ストークス電界を提供し、前記パルス信号電界は前記パルスアイドラ電界と前記共鳴キャビティ上においてコリニアとする非線形結晶と、
低い平均パワー及び高いピークパワーを利用した生物学的用途において、前記信号電界周波数と前記アイドラ電界周波数との差が、約５０ｃｍ−１〜３５００ｃｍ−１のラマン共鳴をもたらすように前記差を変更する同調手段と、
焦点を合わせたときに前記信号電界及び前記パルスアイドラ電界が空間的に十分に重なり合うように、前記パルス信号電界及び前記パルスアイドラ電界との少なくとも一つに可変遅延を与える可変遅延手段と、
を備えることを特徴とするシステム。
【請求項１０】
請求項９に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、５３２ｎｍの波長を有する信号によってポンピングされることを特徴とするシステム。
【請求項１１】
請求項９に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、チタン酸リン酸カリウム、ニオブ酸リチウム、三ホウ酸リチウム、およびタンタル酸リチウムの少なくとも１つからなることを特徴とするシステム。
【請求項１２】
請求項９に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、バルク材料であることを特徴とするシステム。
【請求項１３】
請求項９に記載のシステムであって、前記非線形結晶は、周期分極反転材料であることを特徴とするシステム。
【請求項１４】
請求項９に記載のシステムであって、前記同調手段は、前記非線形結晶へのポンプ電界の入射角度を変化させる手段を含むことを特徴とするシステム。
【請求項１５】
請求項９に記載のシステムであって、光学パラメトリック発振器キャビティを含むことを特徴とするシステム。
【請求項１６】
請求項９に記載のシステムであって、光ファイバを介して前記顕微鏡に結合されることを特徴とするシステム。
【請求項１７】
第１周波数のポンプ電磁界および前記第１周波数と異なる第２周波数のストークス電磁界を用いてコヒーレントアンチストークスラマン散乱分光を提供する方法であって、前記第１周波数と前記第２周波数との差に応答する振動分析機器を用いて、
信号電界周波数のポンピングされたポンプ信号電界およびアイドラ電界周波数のポンピングされたパルスアイドラ電界を出力として提供するように、リングキャビティ内に配置された非線形結晶を少なくとも８０ＭＨｚ以上の周波数でポンピングするステップであって、前記ポンプ信号電界が前記ポンプ電磁界を提供し、前記パルスアイドラ電界が前記ストークス電磁界を提供し、パルス信号電界は前記パルスアイドラ電界と前記リングキャビティ上においてコリニアとするステップと、
前記パルス信号電界と前記パルスアイドラ電界をコリニアに提供するステップと、
前記信号電界周波数と前記アイドラ電界周波数との差が変化するように、前記信号電界周波数と前記アイドラ電界周波数を同調するステップと、
前記パルス信号電界及び前記パルスアイドラ電界との少なくとも一つに可変遅延を与えるステップと、
低い平均パワー及び高いピークパワーを利用して高い開口数のレンズを用いて前記信号電界及び前記パルスアイドル電界の焦点を合わせるステップと、
前記ポンプ信号電界と前記パルスアイドラ電界から電磁界を前記振動分析機器に提供するステップとを含み、生物学的用途に用いられることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のシステムであって、
コリニアな前記ポンプ電磁界及び前記ストークス電磁界は、少なくとも８０ＭＨｚ以上の繰り返しレートの３〜５ピコ秒のパルスであることを特徴とするシステム。
【請求項１９】
請求項９に記載のシステムであって、
前記共鳴キャビティは、４つのミラーで構成されることを特徴とするシステム。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、
組織の画像化において透過深さが少なくとも１０μｍ以上であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、レーザ源に関し、特に、コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡法（ＣＡＲＳ）などの用途に対して２周波出力を提供するレーザ源に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の開発は、スペイン教育科学省と共同のフルブライトプログラム下で、米国国立衛生研究所からの認可第ＲＯＩ  ＧＭ０６２５３６号、米国科学財団からの認可第ＤＢＩ０１３８０２８号、および、米国国務省によって部分的に支援される。
【０００３】
本出願は、２００５年１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／６４５，８９０号に対する優先権を主張する。
【０００４】
ＣＡＲＳ顕微鏡法は、コントラストメカニズムとして分子振動を使用することによって、化学的および生物学的試料のイメージングを可能にする。従来のＣＡＲＳ顕微鏡法は、３次非線形プロセスであり、２つのレーザ電界、すなわち、ωｐに中心周波数を有するポンプ電磁界とωｓに中心周波数を有するストークス電磁界を使用する。ポンプ電界とストークス電界は、試料と相互作用し、ωＡＳ＝２（Ｘ）ｐ−ωｓの周波数を有するコヒーレント反ストークス電界を生成する。ωｐ−ωｓのラマンシフトが、所定の振動モードで共鳴するように同調されると、増大したＣＡＲＳ信号が、反ストークス周波数ωΛｓで観測される。たとえば、米国特許第６，８０９，８１４号および第６，７９８，５０７号（その開示は、参照により組み込まれる）は、それぞれ、エピ検出されたＣＡＲＳ信号と偏光ＣＡＲＳ信号を採用するＣＡＲＳ顕微鏡法システムを開示する。
【０００５】
ＣＡＲＳ顕微鏡法用の従来のレーザ源は、たとえば、電子的に位相同期される２モードロックチタンサファイア（Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ）レーザを使用して、広い同調範囲を提供する。こうした電子的にロックされた光源は、広い同調範囲、高いスペクトル分解能を提供し、種々の用途について、超短パルス状態で機能することができるが、こうした光源はまた、電子的位相同期化の難しさによるタイミングジッタを示し、比較的複雑で、かつ、費用がかかるとみなされる。
【０００６】
ＣＡＲＳ顕微鏡法用の別の従来のレーザ源は、モードロックＮｄ、すなわち、高スペクトル分解能（約１ｃｍ−１）を提供し、タイミングジッタがない、ＹＶＯ４ポンプレーザ（１０６４ｎｍ）および位相同期ポンピング光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）を含む。ＯＰＯは、ＣＡＲＳ顕微鏡法用のポンプビームを提供するためにキャビティ内部で倍化される。Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザのごく一部分が、ストークスビームを提供する。しかし、こうしたレーザ源は、間隙を含んでもよい狭い同調範囲を含み、複数の結晶が、ラマンスペクトル範囲全体をカバーするために必要とされることがあり、空間モード品質は、キャビティ内部での倍化のために、望まれるよりも低い場合があり、ポンプおよびストークス波長は、望まれるより短い場合がある。
【０００７】
生物学的および分子用途における生きた組織などの、ある用途の共鳴のほとんどをカバーするラマン周波数の領域（たとえば、５００ｃｍ−１〜３５００ｃｍ−１）について、連続同調可能性を提供するＣＡＲＳ顕微鏡法用のレーザ源を提供することが望ましい。他の望ましい特徴は、わずか数ｃｍ−１の周波数を有する高スペクトル分解能、低い強度ノイズ（高安定性）、ポンプパルスとストークスパルスとの非常に良好な位相同期、高フレームレートイメージングについての高い繰返しレート、および、光損傷を回避するかまたは減少させ、より深い侵入深さを得るための有利な波長を含む。したがって、本発明のいくつかのシステムにおいて、動作波長が、９００〜１３００ｎｍの間で変わってもよいため、システムは、ＣＡＲＳについて、大きな柔軟性および機能性を提供する。これは、細胞および光学的に密な軟部組織についての侵入深さおよび非侵襲性を含む、システムの能力に著しく影響を及ぼす。光源はまた、コンパクトで、使用するのが容易でかつ信頼性があり、コストが安くあるべきである。
【０００８】
ＣＡＲＳは、生物学的用途についての非線形分析プロセスであるため、生物学的試料を劣化させることなく、要求される信号を生成するために、平均パワーが低くピークパワーが高いことを要求される。したがって、高いパワーのピコ秒またはフェムト秒パルスが望まれる。米国特許第５，０１７，８０６号は、フェムト秒パルス列を提供し、フェムト秒パルス駆動式ダイレーザによってポンピングされる位相同期ポンピング光パラメトリック発振器を開示する。広い同調範囲に関して使用するのに適したシステムが、開示されるが、ダイレーザは、使用中に比較的不安定であり、振動性の生物学的分析での使用にとって、所定期間の間、あまりにも信頼性が低いと考えられる。
【０００９】
モードロック式チタン：サファイア（Ｔｉ：Ｓａ）レーザもまた、光パラメトリック発振器をポンピングするのに使用されることが知られているが、こうしたシステムはまた、生物学的試料の振動性分析についてスペクトル範囲全体をカバーすることができる十分に広いスペクトル範囲の出力を提供しない。たとえば、Ｐ．Ｅ．パワーズ（Ｐ．Ｅ．Ｐｏｗｅｒｓ）、Ｒ．Ｊ．エリントン（Ｒ．Ｊ．Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）、およびＷ．Ｓ．ペロウチ（Ｗ．Ｓ．Ｐｅｌｏｕｃｈ）著「Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅ−ｐｕｍｐｅｄ  ｈｉｇｈ−ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ−ｒａｔｅ  ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ」Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８を参照されたい。
【００１０】
可視範囲（約４００〜約７００ｎｍ）の周波数の連続波長（ＣＷ）レーザによってポンピングされる非線形結晶は、固体レーザを使用して提供されてもよいことも知られている。たとえば、Ｒ．Ｇ．バチコ（Ｒ．Ｇ．Ｂａｔｃｈｋｏ），Ｄ．Ｒ．ワイズ（Ｄ．Ｒ．Ｗｅｉｓｅ），Ｔ．プレトナー（Ｔ．Ｐｌｅｔｔｎｅｒ），Ｇ．Ｄ．ミラー（Ｇ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ），Ｍ．Ｍ．フェジャ（Ｍ．Ｍ．Ｆｅｊｅｒ），およびＲ．Ｌ．バイヤ（Ｒ．Ｌ．Ｂｙｅｒ）著「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−Ｗａｖｅ  ５３２−ｎｍ−Ｐｕｍｐｅｄ  Ｓｉｎｇｌｙ  Ｒｅｓｏｎａｎｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｌｙ  Ｐｏｌｅｄ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｎｉｏｂａｔｅ」Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，（Ｆｅｂ．１  １９９８）を参照されたい。しかし、こうしたシステムは、平均パワーが高過ぎて、振動性の生物学的分析に使用することができないＣＷ信号を提供する。可視範囲の周波数のピコ秒Ｎｄ：ＹＬＦレーザによって位相同期してポンピングされる光パラメトリック発振器もまた報告された。たとえば、Ｐ．ハインツ（Ｐ．Ｈｅｉｎｚ），Ａ．シールマイヤ（Ａ．Ｓｅｉｌｍｅｉｅｒ），およびＡ．ピスカルスカス（Ａ．Ｐｉｓｋａｒｓｋａｓ）著「Ｐｉｃｏｓｅｃｏｎｄ  Ｎｄ：ＹＬＦ  ｌａｓｅｒ−ｍｕｌｔｉｐａｓｓ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｓｏｕｒｃｅ  ｐｕｍｐｅｄ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ  ｄｉｏｄｅｓｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ＯＰＯＳ」Ｏｐｔｉｃｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖ．１３６，ｐｐ．４３３−４３６（１９９７）を参照されたい。しかし、これらのシステムの低い繰返しレートは、振動性の生物学的分析に適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＣＡＲＳ顕微鏡法または分光法システムなどの、振動性の生物学的分析システムにおいて照明を提供する、より効率的でかつ経済的な分析システムについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態によれば、本発明は、第１電磁界および第２電磁界を、第１電磁界の第１周波数と第２電磁界の第２周波数との差に応答する振動分析機器に提供するシステムを提供する。システムは、ピコ秒の信号電界周波数のパルス信号電界およびピコ秒のアイドラ電界周波数のパルスアイドラ電界を出力として提供するために、反復してポンピングされてもよい非線形結晶を含む。信号電界は第１電磁界を提供し、アイドラ電界は第２電磁界を提供し、前記パルス信号電界は前記アイドラ電界とが前記振動分析機器上においてコリニアとする。システムはまた、信号電界周波数とアイドラ電界周波数との差が変更されることを可能にする同調システムを含む。システムはまた、パルス信号電界及びアイドラ電界との少なくとも一つに可変遅延を与える可変遅延手段を含む。システムはまた、第１および第２電磁界をコリニアに振動分析機器に提供する出力ユニットを含む。
【００１３】
別の実施形態によれば、本発明は、コヒーレント反ストークスラマン散乱システムのための、第１周波数のポンプ電界および第２周波数のストークス電磁界を提供するシステムを提供する。システムは、少なくとも２つのミラーで構成される共鳴キャビティ内に配置され、信号電界周波数のパルス信号電界およびアイドラ電界周波数のパルスアイドラ電界を出力として提供するために、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの波長を有する信号によって反復してポンピングされてもよい非線形結晶を含む。信号電界はポンプ電界を提供し、アイドラ電界はストークス電界を提供し、前記パルス信号電界は前記アイドラ電界とが前記共鳴キャビティ上においてコリニアとする。システムはまた、信号電界周波数とアイドラ電界周波数との差が、約５０ｃｍ−１〜約３５００ｃｍ−１のラマン共鳴をもたらすことができるようにその差を変更する同調手段を含む。システムはまた、パルス信号電界及びアイドラ電界との少なくとも一つに可変遅延を与える可変遅延手段を含む。
【００１４】
さらなる実施形態によれば、本発明は、第１周波数の第１電磁界および第１周波数と異なる第２周波数の第２電磁界を、第１周波数と第２周波数との差に応答する振動分析機器に提供する方法を提供する。この方法は、信号電界周波数のポンピングされた信号電界およびアイドラ電界周波数のポンピングされたアイドラ電界を出力として提供するように、リングキャビティ内に配置された非線形結晶を少なくとも８０ＭＨｚ以上の周波数でポンピングするステップを含む。信号電界は第１電磁界を提供し、アイドラ電界は第２電磁界を提供し、前記パルス信号電界は前記アイドラ電界とが前記リングキャビティ上においてコリニアとする。この方法はまた、信号電界とアイドラ電界をコリニアに焦点エリアに提供するステップと、焦点エリアにおける信号電界周波数とアイドラ電界周波数との差が変化するように、信号電界周波数とアイドラ電界周波数を同調するステップとを含む。この方法は、さらに、パルス信号電界及びアイドラ電界との少なくとも一つに可変遅延を与えるステップとを含む。この方法は、さらに、前記焦点エリアから検出された電磁界を振動分析機器に提供するステップと含む。
【００１５】
以下の説明は、添付図面を参照してさらに理解されることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＣＡＲＳ顕微鏡法または分光法システムなどの、振動性の生物学的分析システムにおいて照明を提供する、より効率的でかつ経済的な分析システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のある実施形態によるシステムの例示的な線図である。
【図２Ａ】本発明のある実施形態によるシステムについての波長同調の例示的なグラフである。
【図２Ｂ】本発明のある実施形態によるシステムについてのパワー伝達の例示的なグラフである。
【図２Ｃ】本発明のある実施形態によるシステムについての信号パルスパワースペクトルの例示的なグラフである。
【図２Ｄ】本発明のある実施形態によるシステムについての自己相関トレースの例示的なグラフである。
【図３Ａ】本発明のある実施形態によるシステムによる、異なる同調波長での異なる被検体のＣＡＲＳイメージの例示的な図である。
【図３Ｂ】本発明のある実施形態によるシステムによる、異なる同調波長での異なる被検体のＣＡＲＳイメージの例示的な図である。
【図３Ｃ】本発明のある実施形態によるシステムによる、異なる同調波長での異なる被検体のＣＡＲＳイメージの例示的な図である。
【図３Ｄ】本発明のある実施形態によるシステムによる、異なる同調波長での異なる被検体のＣＡＲＳイメージの例示的な図である。
【図４Ａ】本発明のある実施形態によるシステムによる、２つの異なる試料についての脂質構造に富む組織のＣＡＲＳイメージの例示的な図である。
【図４Ｂ】本発明のある実施形態によるシステムによる、２つの異なる試料についての脂質構造に富む組織のＣＡＲＳイメージの例示的な図である。
【図５】本発明の別の実施形態によるシステムの例示的な線図である。
【図６】本発明のさらなる実施形態によるシステムの例示的な線図である。
【図７】本発明のさらなる実施形態によるシステムの例示的な線図である。
【図８】本発明のさらなる実施形態によるシステムの例示的な線図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、非侵襲的コヒーレント反ストークスラマン散乱顕微鏡法のための、同調可能なピコ秒２周波近赤外光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）を提供する。
【００１９】
ＯＰＯは、光子の周波数を信号およびアイドラ電界に変換する非線形結晶を使用する受動デバイスである。ＯＰＯデバイスでは、各ポンプ光子の光子エネルギーは、低い周波数の２つの光子に分割される。これらの周波数の１つまたは２つは、パワーを増大するために、共鳴するようにされてもよい。しかし、全エネルギーは、ポンプエネルギーが、信号光子エネルギーとアイドラ光子エネルギーに等しくなるように保存される。本発明は、レーザによって生成される２つのビームが、ある実施形態によるラマンプロセス（ポンプおよびストークス用の信号およびアイドラ）で使用される、位相同期ポンピングＯＰＯを含むレーザ源を提供する。出願人は、所望の範囲内でラマン共鳴をカバーするために、いくつかの実施形態では、５３２ｎｍの波長が適切であることを発見した。そのため、システムは、ラマン周波数が、数百ｃｍ−１の周波数から数千ｃｍ−１の周波数をカバーすることができる、中間点の近くでレーザを同調してもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、性能の高いＣＡＲＳ顕微鏡法用の新規なピコ秒ＯＰＯに基づくコンパクトなレーザ源を提供する。安定した動作、非侵襲性、単一の非線形結晶によるラマン周波数領域全体にわたる広い同調可能性、および改善された侵入深さは、本システムを、化学的および生物学的研究におけるＣＡＲＳイメージングのための最適な光源にする。結晶は、可視範囲（約４００ｎｍ〜約７００ｎｍ）の周波数でポンピングされてもよい。レーザ源は、非侵襲イメージングにとって重要な９００ｎｍ〜１３００ｎｍ範囲で動作してもよい。５０ｃｍ−１〜３５００ｃｍ−１のラマン共鳴の連続カバーを可能にするＯＰＯの同調可能な２波長出力が使用されてきた。より長い波長は、近赤外ポンプおよびストークス波長において、生物学的試料の光損傷の低減、および、近赤外波長の光散乱の低減による、ＣＡＲＳイメージングのための深い侵入深さをもたらす場合がある。
【００２１】
ある実施形態によれば、周期分極反転チタン酸リン酸カリウム（ＰＰ−ＫＴＰ）結晶に基づく、広く同調可能なピコ秒ＯＰＯが、モードロック式Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザの第２高調波（５３２ｎｍ）出力によって位相同期してポンピングされる、ＣＡＲＳ顕微鏡法用のレーザ源が提供される。ＯＰＯは、ほぼ縮退点（１０６４ｎｍ）から、信号ビーム用の８９０ｎｍまで、また、アイドラビーム用の１３２５ｎｍまで、連続して温度同調可能である。ある実施形態では、システムは、８０ＭＨｚ繰返しレートで発生した３〜５ｐｓパルスなどのパルスを提供する。さらなる実施形態では、繰返しレートは、使用される波長、たとえば、５３２ｎｍについてのポンプ光源特徴に応じて、約１ＭＨｚ〜約１ＧＨｚの範囲にあってよい。ＣＡＲＳのために、ポンプおよびストークスビームとして、それぞれ、ＯＰＯからの信号およびアイドラビームを使用することによって、１００ｃｍ−１〜３７００ｃｍ−１の化学的に重要な振動周波数範囲全体をカバーすることが可能である。この新しいシステムを用いて、化学的および生物学的システムにおいて波長以下の分解能を有するＣＡＲＳイメージングが達成されてもよい。既存のシステムで使用されるよりもポンプおよびストークス波長が長いために、組織イメージングにおける深い侵入深さもまた得られる。
【００２２】
図１は、ＯＰＯ共鳴器１０が、約１１００ｎｍ〜約１３５０ｎｍのアイドラビーム波長範囲内で共鳴する、本発明の実施形態によるシステムを示す。ＯＰＯ設計は、合焦レンズ１２と１４、凹面ミラー１６と１８、ミラー２０と２２、および結晶２４を含む。ポンプレンズＬ１は、５３２ｎｍであり、ｆ＝５０ｍｍを有する。ＣＭ１凹面ミラーは、アイドラビーム波長範囲内で高い反射率（Ｒ＞９９％）を有するｒ＝１００ｍｍのミラーである。ＣＭ２ミラーは、信号ビーム波長（約８５０ｎｍ〜約１０２０ｎｍ）において７０〜８０％透過度を有する。Ｍ１ミラー２０は、高反射（ｈｉｇｈ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ）ミラーであり、Ｍ２ミラー２２は、アイドラビームについて１０％出力カプラである。アイドラビーム２６は、ストークスビームを提供するために使用され、信号２８ビームは、ポンプビームを提供する。システムはまた、ダイクロイックミラー３０、可変遅延ユニット３２、レンズ３４、およびミラー３６と３８を含む。２つのビームは、同時伝播ビームであり、ＯＰＯの動作条件によって設定された調整可能な発散を共有するように、結晶から出力結合される。ポンプおよびストークスビームは、従来の光学機器および／または光ファイバを介してＣＡＲＳ顕微鏡または分光計３５に提供される。顕微鏡における反ストークス信号の検出は、米国特許第６，８０９，８１４号に開示されるように、前方向か、エピ方向のいずれかであってよい。以下でより詳細に説明するように、システムは、熱源３７およびフィードバックユニット３９を使用して共鳴器１０の温度を調整することによって同調されてもよく、または、図１のＡで示す光学ビーム経路に対して結晶２４を回転させることによって同調されてもよい。
【００２３】
５３２ｎｍでかつ８０ＭＨｚ繰返しレートの６ピコ秒パルスは、周波数２倍受動モードロック式Ｎｄ：ＹＶＯ４Ｈｉ−Ｑレーザによって送出された。レーザの最大利用可能平均パワー（５Ｗ）は、外部可変減衰器によって低減された。ＯＰＯ利得材料は、約４１℃における２次高調波発生についての１次位相整合条件を満たす、Λ＝８．９９μｍの単一回折格子周期を有する、Ｚ軸カットでかつ分極した、フラックス法成長ＫＴｉＯＰＯ４結晶、０．５×２．８×１０．８ｍｍ３（Ｔ×Ｈ×Ｌ）である。ＰＰ−ＫＴＰ結晶は、１０６４ｎｍのターゲット波長で反射防止コーティングされ（Ｒ＜０．２％）、約１３００ｎｍにおいて１％までの残留反射があった。結晶の長さは、６ｐｓポンプパルスとアイドラパルスとの時間的ウォークオフ相互作用長をわずかに超える。同調曲線の縮退点（２重共鳴動作）近くで１ｍＷ未満、および、９２４ｎｍ／１２５４ｎｍ信号／アイドラ波長について約４０ｍＷの非常に低いポンピング閾値が発見された。結晶の温度は、たとえば、熱源３７および共鳴器１０に結合したセンサ３９を使用して、サーモスタットによって制御された環境において、電気誘導または流体加熱によって変えられてもよい。さらなる実施形態では、システムは、図１のＡで示す光学軸に対して結晶２４を回転させることによって同調されてもよい。
【００２４】
図２Ａは、４０（空白の円）のＰＰ−ＫＴＰ結晶についての、温度の関数としての波長同調実験結果を示し、ＫＴＰ材料の屈折率データに基づく、実線の４０の理論計算値を示す。図２Ａはまた、４２（閉じた円）での温度の関数としての対応するアクセス可能なラマン周波数を示し、実線の４２の理論計算結果を示す。１８０℃の最大設定結晶温度において、対応するＯＰＯ信号（ポンプ）およびアイドラ（ストークス）対の波長は、それぞれ、８Ｓ９．４ｎｍおよび１３２３．９ｎｍであり、３６９０ｃｍ−１のラマンシフトに相当する。
【００２５】
図２Ｂは、温度Ｔ＝１３２℃のときの、結晶の入口における入力パワーの関数としての出力ＯＰＯパワーを示す。アイドラについての出力パワーは、５０で示され、信号の出力パワーは、５２で示され、総合の出力パワーは、５４で示される。５０、５２、および５４の黒塗りの正方形は、測定されたパワー結果を示し、実線は、それぞれについて線形にフィッティングしたものである。
【００２６】
出力信号、アイドラ、および総合パワーの入力ポンプパワーに対する依存性は、図２Ｂの、それぞれ、５０、５２、および５４で示され、この時、ＯＰＯ結晶は、それぞれ、９２１ｎｍおよび１２６０ｎｍの波長で信号およびアイドラビームを送出するために、温度１３２℃に維持される。それぞれ、４３％、２８％、および７１％から最大ポンプパワーレベルまで、信号パワー、アイドラパワー、および総合パワーについて線形傾斜効率が観察される。両方のビームについての出力パワーは、固定ポンプパワーにおける同調範囲全体を通して、かなり一定であり、約１０％〜約１５％の余裕があった。
【００２７】
最大ＯＰＯ出力パワーにおいて、ＯＰＯは、約１００ｃｍ−１の典型的なパワースペクトル（ＦＷＨＭ）および約７．５ｐｓのパルス幅を有するパルスを送出する。群速度不整合の適切な状態の場合、かつ、一定のパラメトリック利得値では、種々の強度プロファイルおよびスペクトルが観察される場合がある。たとえば、７１５ｍＷの入力ポンプパワーレベルで、かつ、３６μｍの負の単一パスキャビティ離調下で、約１１ｃｍ−１以下へのスペクトル狭化が起こり、共鳴高コントラストＣＡＲＳイメージングのために、チャープが小さいパルスおよび許容可能でないパルススペクトル帯域幅に通じる。図２Ｃに示すように、特徴的なパルスパワースペクトルは、信号６０のスペクトル狭化を示す。図２Ｄの６２で示すように、３６μｍの負の単一パスキャビティ離調について、１３２℃における自己相関トレース（ピコ秒単位の遅延時間の関数）は、より短いパルスを示す。実際に、ほぼ２．５分の１に短くなった信号パルスが、図２Ｄの６２に示すように観察される。負の離調は、最大レベルから２０％のパワー低下をもたらした。したがって、ＣＡＲＳイメージングのためのほぼ最適な性能、および、異なる結晶温度における信頼性のある長期にわたる毎日の動作が、キャビティ内に受動スペクトルフィルタリング素子を用いずに可能である。
【００２８】
信号およびアイドラビーム２６および２８は、それぞれ、図１に示すようにキャビティから出力結合された。アイドラパルスは、可変遅延ユニット３２によって遅延され、ダイクロイックミラー（ＤＭ）３０上で空間的に結合された。２つのビームは、１．２開口数の水浸漬対物レンズを利用する走査型顕微鏡内に送られる。ＰＰ−ＫＴＰ結晶内でいくつかの非位相整合非線形相互作用が起こるため、短い（＜８５０ｎｍ）波長のＯＰＯ出力を阻止するために、ロングパスフィルタ（Ｆ１、Ｆ２）が使用された。ビーム経路内の２つのレンズ（Ｌ２、Ｌ３、ｆ２＝１５０ｍｍ、およびｆ３＝１０００ｍｍ）は、対物レンズ入射瞳のビームについて最適スポットサイズを達成するために使用された。顕微鏡の像面における総合平均パワーは、２０〜３０ｍＷ未満に減衰した。異なる周波数における２つの出力ビームは、よく相関した空間的および時間的特徴を有していると仮定すると、こうした顕微鏡に非常に適している。
【００２９】
システムの空間分解能を求めるために、多くの生きた細胞および組織構成要素の主要な化学結合である、ＣＨ芳香族帯（約２８５０ｃｍ−１）をコヒーレントに励起することによって、異なるサイズのポリスチレンビーズを有する試料の一連の共鳴ＣＡＲＳイメージスキャンが実施された。この実験条件は、信号−アイドラ対のパルスを、それぞれ、９２４ｎｍと１２５４ｎｍの波長に選択することによって達成された。特徴的な横方向（ｘ−ｙ）分解能は、約４２０ｎｍであると判定され、一方、縦方向（ｚ）分解能は、回折限界から予想されるように、約１．１μｍであった。
【００３０】
図３Ａおよび図３Ｂは、異なるラマン帯にわたるＣＡＲＳイメージを示す。図３Ａは、１．５ミクロン径のポリスチレンビーズクラスタのイメージを７０に示す。ＯＰＯ波長は、ターゲットＣ＝Ｃ伸縮振動周波数（ωｐ−ωｓ＝１６００ｃｍ−１）に同調された。図３Ｂは、（ＣＤ２基がＣＨ２基を置換えるため）ωｐ−ωｓ＝２１００ｃｍ−１のＣ−Ｄ伸縮振動を使用して、重水素でラベルした脂肪酸で培養した線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１を示す。イメージサイズは、４７μｍ×４７μｍである。強い信号が、高密度脂質構造から生じる。図３Ｃは、ＣＨ２について、ωｐ−ωｓ＝２８５０ｃｍ−１のＣ−Ｄ伸縮振動を用いて、重水素なしの媒体内で培養された同じ細胞タイプ（ＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１）を７４に示す。イメージサイズは、７８μｍ×７８μｍである。図３Ｄは、ラメラ間の水の（ωｐ−ωｓ＝３３７５ｃｍ−１の）ＯＨ伸縮振動によって得られる脂質と水の５ミクロンサイズのＰＯＰＳ（１−パルミトール−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォ−Ｌ−セリーン）複数ラメラ小胞イメージを７６に示す。
【００３１】
したがって、システムは、非常に不均質な組織試料をイメージングしてもよい。波長以下のサイズ特徴部を有する媒体についてのレイリー散乱断面は、波長の４乗に逆比例することが知られている。したがって、より長いポンプおよびストークス波長は、組織内への侵入深さを増加させるはずである。９００〜１３００ｎｍ範囲で動作する本発明のシステムを用いると、直接ＩＲ遷移による水吸収は無視してよい。しかし、より深い侵入深さは、空間分解能の低下を伴う場合がある。
【００３２】
図４Ａおよび図４Ｂは、ωｐ−ωｓ＝２８５０ｃｍ−１の脂肪族Ｃ−Ｈ伸縮振動周波数における脂質構造に富む組織の前方向伝播ＣＡＲＳ信号イメージを示す。図４Ａは、１０ミクロンの侵入深さにおける腸間膜の大網からの被検者の白色脂肪組織を８０に示す。イメージサイズは、１１７μｍ×１１７μｍである。このイメージは、表面エリアから１０μｍの一定深さにおける、大網からの被検者の白色脂肪組織の場合について、Ｃ＝Ｈ振動共鳴による、かき乱されない脂質に富む組織構造の高コントラスト共鳴イメージングの例を立証する。ＯＰＯシステム用の、ポンプ、ストークスパルスについての対応する波長のセットは、９２４ｎｍ、１２５４ｎｍである。
【００３３】
対照的に、同じラマンシフトの場合、２つの位相同期したＴｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅレーザは、通常、ポンプおよびストークスビームについて、７１１ｎｍおよび８９２ｎｍの波長を有することになる。しかし、こうしたシステムは、不均質な組織内でずっと強い散乱を生じることになる。たとえば、ＯＰＯおよび電子的に位相同期したＴｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅパルス列を用いた、被検者の耳からのエクスビボ組織のＣＡＲＳイメージは、図４Ｂに示される。特に、図４Ｂは、ＯＰＯレーザを使用してＣ＝Ｈ伸縮振動周波数に同調することによる、１３０μｍの皮膚からの侵入深さにおけるエクスビボ被検者耳組織を８２に示し、皮下層内の脂質に富む脂肪細胞の共鳴特徴部を示す。２つの電子的に位相同期したＴｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅパルス列からのポンプおよびストークスビームに関して、コントラストは検出されない。しかし、ＯＰＯベースレーザシステムは、Ｔｉ：ｓａｐｐｈｉｒｅレーザベースシステムによってかすかに見える特徴部よりも、少なくとも７０ミクロン深くに配置された共鳴特徴部の検出を可能にした。
【００３４】
先に採用された励起パワーにおいて、試料のいずれについての光損傷も観察されなかった。モードロック式パルス列によって誘導される多光子プロセスは、試料の光損傷の主な原因となることが知られており、試料の光損傷は、長い波長で大幅に低減される。したがって、本発明の種々の実施形態によるシステムは、ＣＡＲＳ顕微鏡法において光損傷を低減するのに有利である場合がある。
【００３５】
２、３の例について、可視レーザ源によってポンピングされるＯＰＯの近赤外／赤外波長動作範囲は、以下の表１に示される。信号ビームとアイドラビームとの周波数差は、約１００ｃｍ−１〜約３７００ｃｍ−１まで変わることが予想される。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
別の実施形態によれば、本発明は、光源自体から直接に、コリニアなポンプおよびストークスビームを提供するシステムを提供してもよい。図５は、本発明のある実施形態によるシステムを示し、結晶１００、凹面ミラー１０２と１０４、ミラー１０６と１０８、レンズ１１０と１１２、フィルタ１１４、および顕微鏡１１６を含む。やはり、システムは、熱源およびフィードバックユニットを使用して共鳴器の温度を調整することによって同調されてもよく、または、図１を参照して先に説明した光学軸に対して結晶１００を回転させることによって同調されてもよい。図５のシステムにおいて、全体の調整の容易性が得られないため、アイドラビームの光学経路が、正確に設計されなければならないことを除いて、素子は、図１を参照して先に説明した素子と類似であってもよい。さらに、ミラー１０４は、図１でミラー１４がそうであるように高反射性であるのと対照的に、部分的に反射性があってもよく、ミラー１０８は、図１のミラー２２がそうであるように部分的に反射性がある出力カプラであるのと対照的に、高反射性であってもよい。信号およびアイドラビームは、従来の光学機器および／または光ファイバを介してＣＡＲＳ顕微鏡１１６に、それぞれ、ポンプおよびストークスビームを提供する。やはり、顕微鏡内での反ストークス信号の検出は、米国特許第６，８０９，８１４号に開示されるように、前方向か、エピ方向のいずれかであってよい。
【００３８】
さらなる実施形態では、共鳴器は、リングキャビティ構成か、線形キャビティ構成のいずれかを含んでもよい。リングキャビティ構成は、低利得材料が使用されてもよいことを可能にする。線形キャビティ構成は、リングキャビティ構成に比較して２倍の損失を伴い、したがって、高利得材料用に適する。同調は、信号周波数とアイドラ周波数との差を変えるように温度を調整することによって達成されてもよく、または、ニオブ酸リチウムなどの一定の複屈折材料の入射角を変えることによって達成されてもよい。たとえば、図６は、共鳴器が、リングキャビティ構成として構成される、図５に示すシステムと類似のシステムを示す。特に、図６のシステムは、結晶１３０、凹面ミラー１３２と１３４、ミラー１３６と１３８、レンズ１４０と１４２、フィルタ１４４、および顕微鏡１４６を含む。やはり、システムは、熱源およびフィードバックユニットを使用して共鳴器の温度を調整することによって同調されてもよく、または、図１を参照して先に説明した光学軸に対して結晶１３０を回転させることによって同調されてもよい。共鳴器内の光学経路が、キャビティを出る前に結晶を通過することがそれほど多くないことを除いて、素子は、図１および図５を参照して先に説明した素子と類似であってもよい。信号およびアイドラビームは、従来の光学機器および／または光ファイバを介してＣＡＲＳ顕微鏡１４６に、それぞれ、ポンプおよびストークスビームを提供する。やはり、顕微鏡内での反ストークス信号の検出は、米国特許第６，８０９，８１４号に開示されるように、前方向か、エピ方向のいずれかであってよい。
【００３９】
本発明のシステムはまた、フェムト秒パルスで動作してもよい。特に、以下の構成のいずれかが、可視範囲のフェムト秒パルスによってポンピングされた位相同期ポンピングＯＰＯを使用して、要求される波長範囲内で同調可能な超短パルスを提供してもよい。たとえば、図７は、結晶１６０、凹面ミラー１６２と１６４、ミラー１６６と１６８、レンズ１７０、および顕微鏡１７４を含むシステムを示す。システムはまた、一対のチャープ誘電体コーティングミラー１７６および１７８を含む。やはり、システムは、熱源およびフィードバックユニットを使用して共鳴器の温度を調整することによって同調されてもよく、または、図１を参照して先に説明した光学軸に対して結晶１３０を回転させることによって同調されてもよい。線形共鳴器内の光学経路が、単一パスで多数回、ミラー１７６と１７８との間を通過することを除いて、素子は、図１を参照して先に説明した素子と類似であってもよい。信号およびアイドラビームは、従来の光学機器および／または光ファイバを介してＣＡＲＳ顕微鏡１７４に、それぞれ、ポンプおよびストークスビームを提供する。やはり、顕微鏡内での反ストークス信号の検出は、米国特許第６，８０９，８１４号に開示されるように、前方向か、エピ方向のいずれかであってよい。
【００４０】
図８は、結晶１９０、凹面ミラー１９２と１９４、ミラー１９６と１９８、レンズ２００、および顕微鏡２０４を含むシステムを示す。システムはまた、一対のプリズム２０６および２０８を含む。やはり、システムは、熱源およびフィードバックユニットを使用して共鳴器の温度を調整することによって同調されてもよく、または、図１を参照して先に説明した光学軸に対して結晶１９０を回転させることによって同調されてもよい。線形共鳴器内の光学経路が、線形共鳴器内のパスごとにプリズム２０６と２０８を通過することを除いて、素子は、図１を参照して先に説明した素子と類似であってもよい。信号およびアイドラビームは、従来の光学機器および／または光ファイバを介してＣＡＲＳ顕微鏡２０４に、それぞれ、ポンプおよびストークスビームを提供する。やはり、顕微鏡内での反ストークス信号の検出は、米国特許第６，８０９，８１４号に開示されるように、前方向か、エピ方向のいずれかであってよい。
【００４１】
プリズム対を利用するキャビティの場合、対間の距離およびビーム内へのプリズム（図８）挿入深さは、最も短い可能なパルスを達成するために変わる。特別に設計されたチャープ誘電体コーティング（図７）の場合、ビーム跳ね返り数は、可変パラメータである。結晶内での群速度不整合（ＧＶＭ）による、可視ポンプおよび近赤外信号とアイドラパルスとの間で時間的ウォークオフを整合させるために、結晶長が低減される。
【００４２】
他のタイプの結晶が使用されてもよい。たとえば、Ｘ−Ｙ平面（角度＜９＝９０°）でカットされた、ノンクリティカルに位相整合された三ホウ酸リチウム（ＬＢＯ）結晶が、著しく広い範囲の波長同調を実施するために使用されてもよい。結晶の温度を変えることによって、数百ｃｍ−１〜数千ｃｍ−１のラマン周波数が得られてもよい。１００〜１５０℃の温度範囲についての同調曲線全体は、リング構成を有するこうした結晶を用いて達成されてもよい。パルスの線幅は、２０ｃｍ−１より大きくてもよいが、生成される線幅が狭化されるように、複屈折フィルタを内部で使用することによって、線幅が減らされてもよい。バルク特徴によって、ＬＢＯの利点は明らかである。４ワットほどのポンプパワーの場合、結晶は、安定であり、抑制した外部変化効率は、５０％より大きい。これは、ＫＴＰと対照的であり、ＫＴＰは、高い非線形性と著しく低い閾値を持っていても、２ワットのパワーに耐えられない場合がある。すなわち、結晶は、損傷するであろう。実現することができる最大出力パワーは、５００ｍＷである（各ビームは２５０ｍＷである）。
【００４３】
したがって、結晶は、たとえば、１）バルクまたは周期分極反転ＫＴＰ結晶（チタン酸リン酸カリウム）、２）バルクまたは周期分極反転ニオブ酸リチウム、３）酸化マグネシウム（ＭｇＯ）をドープした周期分極反転ニオブ酸リチウム（ＰＰ−ＬＮＢ（ＭｇＯ））、４）三ホウ酸リチウム（ＬＢＯ）結晶、５）周期分極反転タンタル酸リチウム（ＰＰＬＴ）、および６）バルクまたは周期分極反転チタン酸ヒ酸カリウム（ＰＰ−ＫＴＡ）からなってもよい。ＫＴＰは、有用な低パワー出力範囲を提供してもよいが、結晶は、約２０００ｍＷのポンプパワーレベルで過剰の損傷を受ける場合がある。他方、ＬＢＯは、閾値が高い（約１０００ｍＷ）が、より大きなパワー（たとえば、３５００ｍＷまで）が得られてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、信号およびアイドラビームは、バルク複屈折位相整合ＫＴＰ結晶（０＝９０°、φ−２？＞°）によって、差が４０ｃｍ−１に過ぎない場合がある。信号およびアイドラビームについての自己相関トレース幅（ＦＷＨＭ）は、約１ｐｓ〜約６ｐｓであってよい。いくつかの用途の場合、誘導光学機器は、同時伝播ビームを分離し、次に、同時伝播ビームが、顕微鏡内で一致する焦点を生成するように同時伝播ビームを成形してもよい。望遠鏡は、これを達成するための光学機器処理を行うために使用されてもよい。
【００４５】
本発明の思想および範囲から逸脱することなく、先に開示した実施形態に対して、多数の変更および変形が行われてもよいことが当業者は理解するであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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