(57)【要約】      （修正有）【課題】天然ではナデシコ目の植物及びある種の高等菌類のみに含まれ、色素増感型太陽電池の増感色素等へ利用されるベタレイン色素を安定的亦効率的に一貫生産することが可能な微生物の提供。【解決手段】遺伝子工学的手法により作製された、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、特に酵素としてチロシナーゼ、及びＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性、特に酵素としてＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼやＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０レダクターゼ、を有するベタレイン色素の生産に必要な遺伝子群を導入したベタレイン色素高生産微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有することを特徴とする微生物。
【請求項２】
前記チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素がチロシナーゼである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
さらに、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性および／またはフェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性を有する、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
前記Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素が、シトクロムＰ４５０である、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
さらに、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有する、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
前記フェノール性水酸基に糖を付加する酵素において、該フェノール性水酸基はｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ骨格のフェノール性水酸基である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
前記フェノール性水酸基に糖を付加する酵素において、該糖がグルコースである、請求項３〜６のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項８】
前記微生物が、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素および／またはＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を、形質転換により導入されているものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
前記微生物が、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼおよび／またはフェノール性水酸基に糖を付加する酵素をコードする遺伝子を、形質転換により導入されているものである、請求項３〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
チロシン、および／または糖質を原料としてベタレイン色素を一貫生産するベタレイン色素生産能を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１１】
糖質原料を含む水性媒体中で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の微生物を培養することを特徴とする、微生物の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベタレイン色素を生産可能な微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベタレイン色素とは、天然では、ナデシコ目の植物およびある種の高等菌類にのみ含まれ、その化学構造中に窒素を含有することを特徴とする水溶性の色素である。ベタレイン色素は、構造上の特徴からベタキサンチンとベタシアニン類に分類されている。ベタキサンチンは黄色に発色し、ベタシアニン類は赤紫に発色するため従来から天然着色料として利用されている。
【０００３】
近年、ベタレイン色素が強力な抗酸化作用を有することが見出され、抗酸化剤としての活用も検討されている。さらに、ベタレイン色素が太陽エネルギーを効率よく吸収する性質を有することも見出され、色素増感型太陽電池の増感色素等への利用も期待されている。このベタレイン色素の製造方法としては、植物から抽出し、精製する方法が一般的であるが、ベタレイン色素を含む植物は、マツバギク、ビート、サボテンなどのナデシコ目（ツルナ科、ヒユ科、スベリヒユ科、ツルムラサキ科、サボテン科、アカザ科、オシロイバナ科など）に限られている。そのため、高価であり、また、安定して供給することも難しい。
【０００４】
近年、新たなベタレイン色素の製造方法として、各種キノコが含まれる担子菌類等の菌類由来のチロシナーゼ遺伝子およびオシロイバナ由来のＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ） ４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子を、植物プロモーターの制御
下で導入した形質転換植物細胞を用いたベタレイン色素の一種であるベタキサンチンの製造方法が報告されている（特許文献１）。また、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ） ４，５−ジオキシゲナーゼおよびＣＹＰ７６ＡＤ１遺伝子を導入した
酵母を用いて、ＤＯＰＡをベタニジンへと変換させた例（非特許文献１）やｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入した酵母の無細胞抽出液を用いてｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡとベタラミン酸をベタニンへと変換させた例も報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
また、チロシナーゼをコードする遺伝子としては、植物や微生物由来のものが数多く知られており（非特許文献３）、ＤＯＰＡ ４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子
としては、オシロイバナやテンサイ由来のものが知られている（非特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−５５２０８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gregory J Hatlestad et al, NATURE GENETICS, Volume 44, Number 7, July 2012, p.816-820
【非特許文献２】Sasaki N. et al, Plant Cell Physiol. 46(4):666-670 (2005)
【非特許文献３】Michael Fairhead et al, New Biotechnology, Volume 29, Issue 2, 15 January 2012, p.183-191
【非特許文献４】Sasaki N. et al, Plant Cell Physiol. 50(5):1012-1026 (2009)
【非特許文献５】Fernando Gandia-Herrero et al, Planta(2012) 236:91-100
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、一般的に用いられている植物からベタレイン色素を抽出する製造方法では、上述のとおり、ごく限られた植物から抽出する必要があること、また含有量が極めて少ないこと等により、安定して持続的に供給することが難しく、製造コストが高いものとなっている。また、特許文献１のように植物細胞を用いた方法では、植物細胞の細胞増殖速度が極めて遅いため、生産効率が低く、工業化は難しいものと考えられる。
【０００９】
また近年において、動物、植物、微生物などの生物により生産されている多くの化合物の生合成経路が遺伝子レベルで解明されてきている。このような生合成知識と遺伝子工学、代謝工学技術を利用することで、細胞増殖が速く、高密度培養可能な微生物の代謝改変を実施し、本来的に生産することが無い多種多様な化学物質を効率的に微生物内にて生産させることが可能となってきている。
【００１０】
ベタレイン色素に関しては、生合成に必要なチロシナーゼをコードする遺伝子（非特許文献３）や、ＤＯＰＡ ４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（非特許文献４、
５）をそれぞれ単独で大腸菌や酵母などの微生物へ導入し、それぞれの酵素活性を個別に確認した例が知られている。しかし、これらベタレイン色素の生産に必要な遺伝子群を全て同時に微生物へ導入した例は知られておらず、またベタレイン色素の生産に必要な遺伝子群を導入した微生物であって、グルコースなどの基質からベタレイン色素を一貫生産可能な微生物の例もこれまで知られていない。
本発明は、ベタレイン色素を安定的また効率的に生産することが可能な微生物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性が、微生物におけるベタレイン色素の生合成に必須であることから、このような酵素活性を有する微生物の作製に成功した。当該微生物を用いれば、効率よくベタレイン色素を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
即ち、本発明の要旨は、以下の（１）〜（１１）に存する。
（１）チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物。
（２）前記チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素がチロシナーゼである（１）に記載の微生物。
（３）さらに、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性および／またはフェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性を有する（１）または（２）に記載の微生物。
【００１３】
（４）前記Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素が、シトクロムＰ４５０である（３）に記載の微生物。
（５）さらに、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有する（４）に記載の微生物。
（６）前記フェノール性水酸基に糖を付加する酵素において、該フェノール性水酸基はｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ骨格のフェノール性水酸基である（３）〜（５）のいずれかに記載の微生物。
【００１４】
（７）前記フェノール性水酸基に糖を付加する酵素において、該糖がグルコースである（３）〜（６）のいずれかに記載の微生物。
（８）前記微生物が、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素および／またはＤ
ＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を、形質転換により導入されているものである（１）〜（７）のいずれかに記載の微生物。
【００１５】
（９）前記微生物が、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼおよび／またはフェノール性水酸基に糖を付加する酵素をコードする遺伝子を、形質転換により導入されているものである（３）〜（８）のいずれかに記載の微生物。
（１０）チロシン、および／または糖質を原料としてベタレイン色素を一貫生産するベタレイン色素生産能を有する（１）〜（９）のいずれかに記載の微生物。
（１１）糖質原料を含む水性媒体中で（１）〜（１０）のいずれかに記載の微生物を培養する、微生物の培養方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の微生物によれば、グルコースなどの糖質やアミノ酸などの安価な原料から効率良くベタレイン色素を製造することができ、さらに、安定して供給することも可能となる。
また、本発明の微生物が生産可能なベタレイン色素は、増感剤、抗酸化剤等の広範な各種用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例４においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合のＬＣＭＳ分析結果を示す。
【図２】実施例５においてＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡｆｂｒ＋ＡｒｏＧｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤを用いた場合のＬＣＭＳ分析結果を示す。
【図３】実施例６においてＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いた場合のＬＣＭＳ分析結果を示す。
【図４】実施例７においてＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／ＣＹＰ７６ＡＤ３／ＡｔＡＴＲ１／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１を用いた場合のＬＣＭＳ分析結果１（ベタニン生産）を示す。
【図５】実施例７においてＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／ＣＹＰ７６ＡＤ３／ＡｔＡＴＲ１／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１を用いた場合のＬＣＭＳ分析結果２（ベタキサンチン生産）を示す。
【図６】実施例８においてＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１およびＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｍｊ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１を用いた場合に得られたＬＣ／ＭＳ分析結果を示す。
【図７−１】本発明の微生物が有する代謝経路の一例を示す。
【図７−２】本発明の微生物が有する代謝経路の別の一例を示す。
【図７−３】本発明の微生物が有する代謝経路の別の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ベタレイン色素を生産可能な微生物に関するものであり、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有することを特徴とする。さらに、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性および／またはフェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性を有する微生物であることが好ましく、これに加えて、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有する微生物であることがより好ましい。
【００１９】
ここで、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼとは、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン：オキシゲン  ４，５−オキシドレダクターゼのことであり、Ｌ−ＤＯＰＡを４，５−ｓｅｃｏ−ＤＯＰＡへと変換する酵素のことである。
ここで、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼとは、Ｌ−ＤＯＰＡをｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡへと変換する酵素のことである。
ここで、Ｌ−ＤＯＰＡとは、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンのことであり、以下の式（１）で表される。
【００２０】
【化１】
2015192669.tif 000002
【００２１】
ここで、４，５−ｓｅｃｏ−ＤＯＰＡとは以下の式（２）で表される化合物のことである。
【００２２】
【化２】
2015192669.tif 000003
【００２３】
ここで、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡとは、以下の式（３）で表される化合物のことである。
【００２４】
【化３】
2015192669.tif 000004
【００２５】
ここで、ＵＤＰ−グルコースとは、ウリジン二リン酸グルコースのことであり、以下の式（４）で表される。
【００２６】
【化４】
2015192669.tif 000005
【００２７】
［本発明の微生物］
本発明の微生物は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有することを特徴とする。通常、ベタレイン色素を生産可能な微生物である。
本発明の微生物は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するものであれば特に制限はなく、本来的にこれらの酵
素活性を有する微生物であってもよいし、育種によりこれらの酵素活性を付与したものであってもよい。育種によりこれらの酵素活性を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現強化や副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現低減など、公知の方法を採用することができる。
【００２８】
さらに、本発明の微生物がＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性および／またはフェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性を有することが好ましい。本発明の微生物がこれらの酵素活性を有すると、微生物が有する酵素反応のみで種々のベタレイン色素を生産可能である。例えば、ベタキサンチンやベタシアニン類といった種々のベタレイン色素を、チロシン、および／または糖質を原料として一貫生産することができるため好ましい。
【００２９】
さらに、本発明の微生物を用いてベタレイン色素を生産する際にチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素および／またはＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としてシトクロムＰ４５０を用いる場合には、本発明の微生物が、前記酵素活性に加えてＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有することが好ましい。ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有することで、シトクロムＰ４５０が有効に働くことができる。特に、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としてシトクロムＰ４５０を有する本発明の微生物は、ベタシアニン類の生産効率が特に高くなるので、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有することがさらに好ましい。
【００３０】
本発明の微生物によりベタレイン色素を生産する方法については、後述する[ベタレイ
ン色素の生産方法]の項で詳細の説明をするが、本発明の微生物を用いれば、例えば、図
７に示す経路によりベタレイン色素を生産することが可能である。具体的には、本発明の微生物が図７に示す代謝経路を有する微生物である場合には本発明の微生物を培養することによってベタレイン色素を製造することができる。一方で、例えば、本発明の微生物が図７−２や図７−３の代謝経路に関する酵素活性のすべてを有していない場合であっても、必要な酵素や当該酵素反応で得られるベタレイン色素中間体を添加して、本発明の微生物を培養することによって種々のベタレイン色素を製造することができる。
【００３１】
なお、図７においてＳｐと表記されている化学反応は酵素が不要な自発反応である。よって、少なくともチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性、およびＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用いれば、図７に示す経路でベタレイン色素を製造することができる。ここで、Ｓｐと表記されている反応は酵素反応ではないことから、必ずしも微生物の代謝において行われる必要はない。例えば、微生物により生産させたｃｙｃｌｏ−Ｄｏｐａグルコシドとベタラミン酸とを菌体外へと取り出し、適切な溶媒中で混合することでベタシアニンを製造することが可能である。
【００３２】
本発明における微生物は、生きている微生物に限らず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含む。
また、本発明の微生物を処理して得られた処理物も、ベタレイン色素生産能としては同等の効果を有する。本発明の微生物の処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）等が挙げられる。また、これらの微生物の処理物を、常法により担体に固定化した固定化物も処理物に含まれる。
【００３３】
以下、本発明で開発した微生物の個別の特徴について説明する。
（宿主微生物）
育種により所望の酵素活性を付与するための宿主微生物としては、微生物の種類は特に
限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示され、これらの中でも、大腸菌、酵母、コリネ型細菌が好ましく、大腸菌、酵母がより好ましく、酵母が最も好ましい。
【００３４】
（チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性）
チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性とは、チロシンが有するフェノール環の３位に水酸基を付加することができる酵素活性である。この酵素活性を有するか否かは、発現されたタンパク質が、チロシンの３位を水酸化する活性を通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、チロシンに、測定の対象とする酵素を作用させ、チロシンから変換されたＬ−ＤＯＰＡ量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
【００３５】
チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素としては、例えば、チロシナーゼ、シトクロムＰ４５０、カテコールオキシダーゼ、チロシン  ３‐モノオキシゲナーゼ、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ等が挙げられる。
チロシナーゼとしては、エアロモナス・メディア菌（Aeromonas media）、マッシュル
ーム（Agaricus bisporus）、アゾスピリラム菌（Azospirillum sp.）、バチルス・メガ
テリウム菌（Bacillus megaterium）、バチルス・スリンジェンシス菌（Bacillus thuringiensis）、テンサイ（Beta vulgaris）、キャベツ（Brassica oleracea）、チャノキ（Camellia sinensis）、アラビカコーヒーノキ（Coffea arabica）、アサイー（Euterpe oleracea）、ヒト（Homo sapiens）、レタス（Lactuca sativa）、マリノモラス・メディテラニア菌（Marinomonas mediterranea）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ニューロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ナメコ（Pholiota nameko）、シュードモナス・プチダ  Ｆ６菌（Pseudomonas putida F6）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、リゾビウム・エトリ菌（Rhizobium etli）、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラス菌（Streptomyces castaneoglobisporus）、ストレプトマイセス・グロセッセンス菌（Streptomyces glauescens）、ストレプトマイセス・リンコルネンシス菌（Streptomyces lincolnensis）、ストレプト
マイセス・リビダンス菌（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス属  ＲＥＮ−
２１菌（Streptomyces sp.REN-21）、サーモミクロビウム・ロゼウム菌（Thermomicrobium roseum）、バニラ（Vanilla planifolia）、ベルコミクロビウム・スピノサム菌（Verrucomicrobium spinosum）、ソラマメ（Vicia faba）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、バチルス・メガテリウム菌、バチルス・ス
リンジェンシス菌、ラルストニア・ソラナセアラム菌に由来するものが好ましい。
【００３６】
シトクロムＰ４５０としては、アースロバクター属菌（Arthrobacter spp.）、アスコ
キタ属菌（Ascochyta spp.）、アスペルギルス・フラバス菌（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・ニドランス菌（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー菌（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryze）、バチルス・メガテリウム菌（Bacillus megaterium）、カルダリオミセス・フマゴ菌（Caldariomyces fumago）、カンジダ・アルビカンス菌（Candida albicans）、カンジダ・マルトーサ菌（Candida maltosa）、カンジダ・トロピカリス菌（Candida tropicalis）、フザリウム属菌（Fusarium spp.）、フザリウム・オキシスポラム菌（Fusarium oxysporum）、フザリウム
・スポロトリキオイデス菌（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・バーティシリ
オイデス菌（Fusarium verticillioides）、マイクロコッカス属菌（Micrococcus spp.）、モルティエレラ・イサベリナ菌（Mortierella isabellina）、マイコバクテリウム・チ
ューバキュロシス菌（Mycobacterium tuberculosis）、ネクトリア・ハエマトコッカ菌（Nectria haematoccoca）、ネウロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、ノカルデ
ィア属菌（Nocardia spp.）、ファネロケーテ・クリソスポリウム菌（Phanerochaete chrisosporium）、シュードモナス・プチダ菌（Pseudomonas putida）、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces spp.）、リゾビウム属菌（Rhizobium spp.）、サッカロミセス・セ
レビシエ菌（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ菌（Saccharomyces pombe）、ストレプトミセス・エバーミチリス菌（Streptomyces avermitilis）、スト
レプトミセス・セリカラー菌（Streptomyces coelicolor）、スルホロブス・ソルファタ
リカス菌（Sulfolobus solfataricus）、ヤロウィア・リポリティカ菌（Yarrowia lipolutica）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、アースロバクター属菌（Arthrobacter spp.）、アスコキタ属菌（Ascochyta spp.）、フザリウム属菌（Fusarium spp.）、マイクロコッカス属菌（Micrococcus spp.）、モルティエレラ・イサベリナ（Mortierella isabellina）、ノカルディア属菌（Nocardia spp.）、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces spp.）、リゾビウム属菌（Rhizobium spp.）、ストレプトミセス・エバーミチリス（Streptomyces avermitilis）菌に由来するものが好ましい。
【００３７】
カテコールオキシダーゼとしては、マッシュルーム（Agaricus bisporus）、アスペル
ギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryze）、アスペルギルス・ニガー菌（Aspergillus niger）、ポーポー（Asimina triloba）、テンサイ（Beta vulgaris）、ウシ（Bos taurus）、チャノキ（Camellia sinensis）、ヘンリーグリ（Castanea henryi）、アラビカコーヒーノキ（Caffea arabica）、メロン（Cucumis melo）、ビワ（Eriobotrya japonica）、
ヒト（Homo sapiens）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、フジマメ（Lablab purpureus
）、マグワ（Morus alba）、バナナ（Musa acuminata）、ニューロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、バジリコ（Ocimum basilicum）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、アンズ（Prunus armeniaca）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトミセス・グラウセッセンス菌（Streptomyces glaucescens）、ストレプトマイセス・グリセウス菌（Streptomyces griseus）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来する酵素が挙げられる。中でもアスペルギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryze）、チャノキ（Camellia sinensis）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、ストレプトマイセス・グリセウス菌（Streptomyces griseus）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来するものが好ましい。
【００３８】
チロシン  ３‐モノオキシゲナーゼとしては、ウシ（Bos taurus）、モルモット（Cavia porcellus）、アズマニシキ（Chlamys farreri nipponensis）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ゴリラ（Gorilla gorilla）、ヒト（Homo sapiens）、アカゲザル（Macaca mulatta）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ウサギ（Oryctolagus cuniculus）、チンパンジー（Pan troqlodytes）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨーロッパトノサマガエル（Rana esculenta）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）等に由来する酵素が挙げられる。中でもキ
イロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ヒト（Homo sapiens）、ドブネズ
ミ（Rattus norvegicus）に由来するものが好ましい。
【００３９】
芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとしては、アルスロバクター属菌（Arthrobacter sp.）、アシネトバクター・カルコアセチカス菌（Acinetobacter calcoaceticus）、バークホ
ルデリア・セパシア菌（Barkholderia cepacia）、バークホルデリア・テラ菌（Burkholderia terrae）、コマモナス・テストステローニ菌（Comamonas testosteroni）、クロモ
ハロバクター属菌（Chromohalobacter sp.）、メソリゾビウム・ロティ菌（Mesorhizobium loti）、シュードモナス・アエルギノサ菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナ
ス・フルオレッセンス菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ菌（Pseudomonas putida）、シュードモナス・レシノボランス菌（Pseudomonas resinovorans）
、ロドコッカス・オパカス菌（Rhodococcus opacus）、トリコスポロン・クタネウム菌（Trichosporon cutaneum）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、シュードモナス・プ
チダ菌（Pseudomonas putida）、アシネトバクター・カルコアセチカス菌（Acinetobacter calcoaceticus）、メソリゾビウム・ロティ菌（Mesorhizobium loti）、バークホルデ
リア・セパシア菌（Barkholderia cepacia）に由来するものが好ましい。
【００４０】
上述した中でも、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素としては、微生物内にて酵素発現させた例が多く比較的高い活性を有するとの理由から、チロシナーゼが好ましい。
チロシナーゼの具体例としては、上述した通りであるが、中でも、以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）の塩基配列でコードされる酵素であることが特に好ましい。配列番号１はバチルス・メガテリウム菌に、配列番号２はラルストニア・ソラナセアラム菌に、配列番号３はバチルス・スリンジェンシス菌に由来する塩基配列である。
【００４１】
（Ａ) 配列番号１、２、または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｂ）配列番号１、２、または３で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列番号 １、２、または３で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな
条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ここで「１または（もしくは）数個の塩基」とは、例えば、１個〜３００個、好ましくは１個〜１５０個、より好ましくは１個〜６０個、さらに好ましくは１個〜３０個、特に好ましくは１個〜１５個、の塩基である。以下、本明細書において同様である。
【００４２】
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００４３】
また、上述のチロシナーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（Ｄ）、（Ｅ）、または（Ｆ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（Ｄ）、（Ｅ）、または（Ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。
配列番号４はバチルス・メガテリウム菌に、配列番号５はラルストニア・ソラナセアラム菌に、配列番号６はバチルス・スリンジェンシス菌に由来するアミノ酸配列である。
【００４４】
（Ｄ)  配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列
（Ｅ） 配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミ
ノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（Ｆ）配列番号 ４、５または６で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有す
るアミノ酸配列を有し、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
ここで「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、１個〜１００個、好ましくは１個〜５０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個、のアミノ酸である。以下、本明細書において同様である。
【００４５】
また、前記（Ｆ）に記載の通り、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を保持する限り、配列番号４、５または６に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。コドン最適化は、例えば、J.
Microbiol. Biotechnol. (2012), 22(3), 316-325に記載の方法や、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅTMサービスを利用する方法がある。コドン最適化を行なうと、ベタレイン色素の生産性が向上するので好ましい。
【００４６】
即ち、大腸菌を宿主微生物とする場合は、配列番号１、２または３の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｇ）、（Ｈ）、または（Ｉ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
（Ｇ) 配列番号７、８、または９で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｈ）配列番号７、８、または９で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｉ）配列番号７、８、または９で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、酵母を宿主微生物とする場合は、配列番号１、２の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｊ）、（Ｋ）、または（Ｌ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００４７】
（Ｊ）配列番号１０、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｋ）配列番号１０、配列番号１１で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｌ）配列番号１０、配列番号１１で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４８】
また、上述のチロシナーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（Ｄ）、（Ｅ）、または（Ｆ）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（Ｆ）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
なお、配列番号１、２、３に対して大腸菌発現用にコドン最適化を行なったものが、それぞれ、配列番号７、８、９であり、配列番号１、２に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが、それぞれ、配列番号１０、１１であるが、これらは、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一である。つまり、配列番号１、７、１０の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号４であり、配列番号２、８、１１の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号５であり、配列番号３、９の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号６となる。
【００４９】
（ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性）
ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性とは、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）のエクストラジオール開裂を触媒する活性を有し、該Ｌ−ＤＯＰＡを４，５−ｓｅｃｏ−ＤＯＰＡに変換する反応、さらに、それに続く自発的反応を経て、該Ｌ
−ＤＯＰＡをベタラミン酸へと変換する酵素活性のことである。この酵素活性を有するか否かは、測定の対象とするタンパク質が、Ｌ−ＤＯＰＡのフェノール環の４位、５位の炭素間でのエクストラジオール開裂を引き起こし、その結果としてベタラミン酸を生成することができるかどうかを通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、Ｌ−ＤＯＰＡに、測定の対象とする酵素を作用させ、Ｌ−ＤＯＰＡから変換されたベタラミン酸の生成量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
【００５０】
ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼとしては、ベニテングダケ（Amanita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、テンサイ（Beta vulgaris）、ケイトウ（Celosia argentea）、キヌア（Chenopodium quinoa）
、リビングストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）、オシロイバナ（Mirabilis
jalapa）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボテン（Opuntia stricta）
、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、レッドビート（Red beet）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）等に由来するものが好ましい。
【００５１】
上述した中でも、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼとしては、以下の（Ｍ）、（Ｎ）、または（Ｏ）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号１２はオシロイバナに由来する塩基配列である。
（Ｍ）配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｎ）配列番号１２で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｏ）配列番号 １２で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブ
リダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００５２】
また、上述のＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（Ｐ）、（Ｑ）、または（Ｒ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（Ｐ）、（Ｑ）、または（Ｒ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号１３はオシロイバナに由来するアミノ酸配列である。
（Ｐ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列
（Ｑ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
【００５３】
（Ｒ）配列番号 １３で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するアミノ酸
配列を有し、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
また、前記（Ｒ）に記載の通り、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を保持する限り、配列番号１３に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００５４】
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。
即ち、大腸菌を宿主微生物とする場合は配列番号１２の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｓ）、（Ｔ）、または（Ｕ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００５５】
（Ｓ) 配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｔ）配列番号１４で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｕ）配列番号１４で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号１２の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（Ｖ）、（Ｗ）、または（Ｘ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００５６】
（Ｖ）配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（Ｗ）配列番号１５で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｘ）配列番号１５で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００５７】
また、上述のＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（Ｐ）、（Ｑ）、（Ｒ）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（Ｐ）、（Ｑ）、または（Ｒ）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（Ｒ）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
なお、配列番号１２に対して大腸菌発現用にコドン最適化を行なったものが配列番号１４、酵母発現用にコドン最適化を行ったものが配列番号１５であるが、両者は、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一であり、いずれの塩基配列でも規定されるアミノ酸配列は配列番号１３となる。
【００５８】
（Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性）
Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性とは、Ｌ−ＤＯＰＡを酸化しｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡへと変換する酵素活性のことである。この酵素活性を有するか否かは、測定の対象とするタンパク質が、Ｌ−ＤＯＰＡを酸化してｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡを生成することができるかどうかを通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、Ｌ−ＤＯＰＡに、測定の対象とする酵素を作用させ、Ｌ−ＤＯＰＡから変換されたｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡの生成量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
【００５９】
本発明の微生物が、さらにＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有していると、図７−２および図７−３の代謝経路におけるｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡを微生物が有する酵素活性で生産できるため好ましい。つまり、[ベタレイン色素の生産方法]の項で後述するように、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼや当該酵素反応で得られるベタレイン色素中間体を培地中に添加して培養する必要がなく、ベタレイン色素の製造が容易になるため好ましい。
【００６０】
Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としては、例えば、チロシナーゼ、シトクロムＰ４５０であるＣＹＰ７６ＡＤ１、ＣＹＰ７６ＡＤ２、ＣＹＰ７６ＡＤ３等が挙げられる。
チロシナーゼとしては、エアロモナス・メディア菌（Aeromonas media）、マッシュル
ーム（Agaricus bisporus）、アゾスピリラム菌（Azospirillum sp.）、バチルス・メガ
テリウム菌（Bacillus megaterium）、バチルス・スリンジェンシス菌（Bacillus thuringiensis）、テンサイ（Beta vulgaris）、キャベツ（Brassica oleracea）、チャノキ（Camellia sinensis）、アラビカコーヒーノキ（Coffea arabica）、アサイー（Euterpe oleracea）、ヒト（Homo sapiens）、レタス（Lactuca sativa）、マリノモラス・メディテラニア菌（Marinomonas mediterranea）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ニューロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ナメコ（Pholiota nameko）、シュードモナス・プチダ  Ｆ６菌（Pseudomonas putida F6）、ラルストニア・ソラナセアラム菌（Ralstonia solanacearum）、リゾビウム・エトリ菌（Rhizobium etli）、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラス菌（Streptomyces castaneoglobisporus）、ストレプトマイセス・グロセッセンス菌（Streptomyces glauescens）、ストレプトマイセス・リンコルネンシス菌（Streptomyces lincolnensis）、ストレプト
マイセス・リビダンス菌（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス属  ＲＥＮ−
２１菌（Streptomyces sp.REN-21）、サーモミクロビウム・ロゼウム菌（Thermomicrobium roseum）、バニラ（Vanilla planifolia）、ベルコミクロビウム・スピノサム菌（Verrucomicrobium spinosum）、ソラマメ（Vicia faba）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）等に由来する酵素が挙げられる。中でも、バチルス・メガテリウム菌、バチルス・ス
リンジェンシス菌、ラルストニア・ソラナセアラム菌に由来するものが好ましい。
【００６１】
ＣＹＰ７６ＡＤ１、ＣＹＰ７６ＡＤ２、ＣＹＰ７６ＡＤ３としては、ベニテングダケ（Amanita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）、ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、テンサイ（Beta vulgaris）、ケイトウ（Celosia argentea）、リビン
グストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）、キヌア（Chenopodium quinoa）、
オシロイバナ（Mirabilis jalapa）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボ
テン（Opuntia stricta）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、レッドビート（Red beet）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）等に由来する酵素が挙げられる。
【００６２】
チロシナーゼは、ベタシアニン生合成経路中で生産したｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡを過剰酸化してメラニンへと変換する酵素活性も保持しており、当該副反応とベタシアニン生合成経路が競合することでベタシアニン生産性の低下を引き起こす可能性があることから、上述した中でも、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としては、副反応を保持しないＣＹＰ７６ＡＤ１、ＣＹＰ７６ＡＤ２およびＣＹＰ７６ＡＤ３が好ましく、微生物内にて発現例があるという理由からＣＹＰ７６ＡＤ３およびＣＹＰ７６ＡＤ１がより好ましい。
【００６３】
先に記載した通り、チロシナーゼは、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素として挙げられ、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としても機能することが可能である。このことより、チロシナーゼを有する微生物は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素活性およびＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素活性を有しているといえるが、さらにＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としてＣＹＰ７６ＡＤ１またはＣＹＰ７６ＡＤ３を有していると、ベタシアニン類生産量が顕著に向上し、特に好ましい。
【００６４】
上述した中でも、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼとしては、以下の（あ）、（い）、または（う）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号１６はオシロイバナに由来するＣＹＰ７６ＡＤ３の塩基配列、配列番号５０はテンサイに由来するＣＹＰ７６ＡＤ１の塩基配列である。
（あ）配列番号１６、５０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（い）配列番号１６、５０で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００６５】
（う）配列番号 １６、５０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件で
ハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００６６】
また、上述のＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（え）、（お）、または（か）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（え）、（お）、または（か）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号１７はオシロイバナに由来するアミノ酸配列、配列番号５１はテンサイに由来するアミノ酸配列である。
【００６７】
（え）配列番号１７、５１で表されるアミノ酸配列
（お）配列番号１７、５１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（か）配列番号 １７、５１で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するア
ミノ酸配列を有し、かつＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
また、前記（か）に記載の通り、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を保持する限り、配列番号１７、５１に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００６８】
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。
即ち、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号１６、５０の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（き）、（く）、または（け）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００６９】
（き) 配列番号１８、５２で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（く）配列番号１８、５２で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（け）配列番号１８、５２で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、上述のＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（え）、（お）、（か）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（え）、（お）、または（か）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（か）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
【００７０】
なお、配列番号１６、５０に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが配列番号１８、５２であるが、両者は、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一であり、配列番号１６、１８の塩基配列で規定されるアミノ酸配列は配列番号１７であり、配列番号５０、５２の塩基配列で規定されるアミノ酸配列は配列番号５１となる。
【００７１】
（ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性）
ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性とは、真核生物由来シトクロムＰ４５０の触媒サイクルを回す上で必須であるＰ４５０への電子の供給を行う酵素活性のことである。よって、本発明の微生物を用いてベタレイン色素を生産する際にチロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素および／またはＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としてシトクロムＰ４５０を用いる場合には、本発明の微生物が、前記酵素活性に加えてＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有することが好ましい。本発明の微生物が、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有することで、シトクロムＰ４５０が有効に働くことができる。特に、Ｌ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼ活性を有する酵素としてシトクロムＰ４５０を有する本発明の微生物は、ベタシアニン類の生産効率が特に高くなるので、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有することがさらに好ましい。
【００７２】
上記酵素活性を有するか否かは、測定の対象とするタンパク質がＮＡＤＰＨ存在下でＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃを還元できるかを通常の方法にて測定することにより判定が可能である。例えば、ＮＡＤＰＨ存在下で、測定の対象とするタンパク質をＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃと作用させ、還元されたＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃに特徴的な５５０ｎｍの吸収を測定することで、その酵素活性を確認することができる。
【００７３】
ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼとしては、ベニテングダケ（Amanita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）、ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、ドクゼリモドキ（Ammi majus）、ハマダラカ（Anopheles minimus
）、クソニンジン（Artemisia annua）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ア
スペルギルス・フミガーツス菌（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニガー菌
（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ菌（Aspergillus oryzae ）、アスペルギルス・テレウス菌（Aspergillus terreus）、バチルス・メガテリウム菌（Bacillus megaterium）、テンサイ（Beta vulgaris）、ウシ（Bos taurus）、カンジダ・アルビカン
ス菌（Candida albicans）、カンジダ・アピコラ菌（Candida apicola）、カンジダ・グ
ラブラータ菌（Candida glabrata）、イヌ（Canis lupus）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、ケイトウ（Celosia argentea）、ベニバ
ナセンブリ（Centaurium erythraea）、ケタマカビ（Chaetomium globosum）、キヌア（Chenopodium quinoa）、ニカメイガ（Chilo suppressalis）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、コクシディオイデス・イミティス菌（Coccidioides immitis）、クチベニガイ（Corbula caribea）、デバリオマイセス・ハンセニイ菌（Debaryomyces hansenii）、キイロタマホコリカビ菌（Dictyostelium discoideum）、エメリセラ・ニドランス菌（Emericella nidulans）、ウマ（Equus caballus）、エレモテシウム・ゴシッピー
（Eremothecium gossypii）、ハナビシソウ（Eschscholzia californica）、ジベレラ・
ゼアエ菌（Gibberella zeae）、ダイズ（Glycine max）、ワタ（Gossypium hirsutum）、ニワトリ（Gallus gallus）、キクイモ（Helianthus tuberosus）、ヒト（Homo sapiens
）、コボウズオトギリ（Hypericum androsaemum）、クルイベロマイセス・ラクティス菌
（Kluyveromyces lactis）、ミヤコグサ（Lotus japonicus）、マグナポリテ・グリセア
菌（Magnaporthe grisea）、マラセチア・グロボーサ菌（Malassezia globosa）、オシロイバナ（Mirabilis jalapa）、ハツカネズミ（Mus musculus）、イエバエ（Musca domestica）、ニューロスポラ・クラッサ菌（Neurospora crassa）、チャボイナモリ（Ophiorrhiza pumila）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボテン（Opuntia stricta）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）、イネ（Oryza sativa）、ヒツジ（Ovis aries）、ケシ（Papaver somniferum）、パセリ（Petroselinum crispum）、ファエオスフェ
リア・ノドラム菌（Phaeosphaeria nodorum）、ファネロカエテ・クリソスポリウム菌（Phanerochaete chrysosporium）、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）、ヨウシ
ュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、フィトフトラ・ラモルム菌（Phytophthora ramorum）、フィトフトラ・ソジャエ菌（Phytophthora sojae）、エンドウ（Pisum sativum
）、ポプラ（Populus trichocarpa）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）、ラット（Rattus norvegicus）、レッドビート（Red beet）、リゾプス・オリゼ菌（Rhizopus oryze）、リゾプス・ストロニファー菌（Rhizopus stolonifer）、トウゴマ（Ricinus communis）、サッカロミセス・セレビシエ菌（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ菌（Schizosaccharomyces pombe）、イヌカタヒバ（Selaginella moellendorffii）、キンランジソ（Solenostemon scutellarioides）、モロコシ（Sorghum bicolor）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）、ハスモントヨウ（Spodoptera litura）、スタルメレラ・ボンビコラ菌（Starmerella bombicola）、ステビア（Stevia rebaudiana）、イチイ（Taxus cuspidata）、カワラタケ（Trametes versicolor）、パンコムギ（Triticum aestivum）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ヤハズエンドウ（Vicia sativa）、リョクトウ（Vigana radiata）、ヨ
ーロッパブドウ（Vitis vinifera）、アシュワガンダ（Withania somnifera）、アフリカツメガエル（Xenopus lavis）、トウモロコシ（Zea mays）等に由来する酵素が挙げられ
る。中でも、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、オシロイバナ（Mirabilis jalapa）に由来するものが好ましい。
【００７４】
上述した中でも、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼとしては、以下の（こ）、（さ）、または（し）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号１９、２０はシロイヌナズナに由来する塩基配列である。
（こ）配列番号１９または２０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（さ）配列番号１９または２０で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（し）配列番号 １９または２０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条
件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００７５】
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００７６】
また、上述のＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（す）、（せ）、または（そ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（す）、（せ）、または（そ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号２１、２２はシロイヌナズナに由来するアミノ酸配列で
ある。
【００７７】
（す）配列番号２１または２２で表されるアミノ酸配列
（せ）配列番号２１または２２で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（そ）配列番号２１または２２で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
また、前記（そ）に記載の通り、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を保持する限り、配列番号２１または２２に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００７８】
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。
即ち、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号１９または２０の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（た）、（ち）、または（つ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００７９】
（た) 配列番号２３または２４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ち）配列番号２３または２４で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（つ）配列番号２３または２４で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、上述のＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（す）、（せ）、（そ）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（す）、（せ）、または（そ）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（そ）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
【００８０】
なお、配列番号１９、２０に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが、それぞれ、配列番号２３、２４であるが、これらは、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一である。つまり、配列番号１９、２３の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号２１であり、配列番号２０、２４の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号２２である。
【００８１】
（フェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性）
フェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性とは、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡやベタニジンが有するｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ骨格の５位や６位に存在するフェノール性水酸基に糖を付加することができる酵素活性である。この酵素活性を有するか否かは、測定の対象とするタンパク質が、糖供与体の存在下、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡからｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  グルコシドを、またはベタニジンからベタシアニンを生成することができるかどうかを通常のアッセイ方法で測定することにより判定が可能である。例えば、糖供与体であるＵＤＰ−ｇｌｕｓｏｓｅ存在下、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡに測定の対象とする酵素を作用させ、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡから変換されたｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  グルコシドの生成量を直接的に測定すること、もしくは、ＵＤＰ−ｇｌｕｓｏｓｅ存在下、ベタニジンに測定の対象と
する酵素を作用させ、ベタニジンから変換されたベタニンの生成量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
【００８２】
本発明の微生物が、さらにフェノール性水酸基に糖を付加する酵素活性を有していると、図７−２および図７−３の代謝経路におけるｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  グルコシドやベタシアニンを、微生物が有する酵素活性で生産できるため好ましい。つまり、[ベタレイン
色素の生産方法]の項で後述するように、フェノール性水酸基に糖を付加する酵素や当該
酵素反応で得られるベタレイン色素中間体を培地中に添加して培養する必要がなく、ベタレイン色素の製造が容易になるため好ましい。
【００８３】
フェノール性水酸基に糖を付加する酵素としては、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ骨格のフェノール性水酸基に糖を付加する酵素であることが好ましく、より好ましくはｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡのフェノール性水酸基またはベタニジンのフェノール性水酸基に糖を付加する酵素であって、具体的には、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、ベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、ベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００８４】
ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する場合には、図７−２の代謝経路によりベタシアニン類を合成することが可能である。また、ベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する場合には、図７−３の代謝経路によりベタシアニン類を合成することが可能であり、ベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する場合には、図７−３に準じる代謝経路によりｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡの６位に糖が付加されたベタシアニン類を合成することができる。
【００８５】
また、フェノール性水酸基に付加させる糖は、ＵＤＰ糖、ＡＤＰ糖、ＧＤＰ糖、ＴＤＰ糖に由来する糖であることが好ましく、ＵＤＰ糖が特に好ましい。また、前記糖は、グルコース、ソホロース、６−Ｏ−マロニルグルコース、６−Ｏ−カフェオイルグルコース、６−Ｏ−クマロイルグルコース、２−Ｏ−アピオシルグルコース、５’−Ｏ−フェルロイルアピオシルグルコース、６−Ｏ−マロニル−（５’−Ｏ−フェルロイルアピオシル）グルコース、６−Ｏ−カフェオイルソホロース、６−Ｏ−クマロイルソホロース、６’−Ｏ−クマロイルソホロース、６，６’−ジクマロイルソホロース等であることが好ましく、グルコースであることが特に好ましい。このことより、例えばフェノール性水酸基にＵＤＰ−グルコースに由来するグルコースを転移させることが好ましい。
【００８６】
ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしては、ベニテングダケ（Amanita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）、ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、テンサイ（Beta vulgaris）、ケイトウ（Celosia argentea）、
キヌア（Chenopodium quinoa）、リビングストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）、オシロイバナ（Mirabilis jalapa）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボテン（Opuntia stricta）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、レッドビート（Red beet）、ホウレンソウ（Spinacia
oleracea）等に由来する酵素が挙げられる。  
【００８７】
上述した中でもｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしては、以下の（て）、（と）、または（な）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号２５はオシロイバナに由来する塩基配列である。
（て）配列番号２５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（と）配列番号２５で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（な）配列番号 ２５で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブ
リダイズする塩基配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００８８】
また、上述のｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（に）、（ぬ）、または（ね）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（に）、（ぬ）、または（ね）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号２６はオシロイバナに由来するアミノ酸配列である。
（に）配列番号２６で表されるアミノ酸配列
（ぬ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（ね）配列番号２６で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
また、前記（ね）に記載の通り、ｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を保持する限り、配列番号２６に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００８９】
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。
即ち、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号２５の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（の）、（は）、または（ひ）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００９０】
（の) 配列番号２７で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（は）配列番号２７で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ひ）配列番号２７で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、上述のｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（に）、（ぬ）、（ね）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（に）、（ぬ）、または（ね）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（ね）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
【００９１】
なお、配列番号２５に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが、配列番号２７であるが、これらは、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一である。つまり、配列番号２５、２７の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号２６である。
ベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしては、ベニテングダケ（Aman
ita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）、ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、テンサイ（Beta vulgaris）、ケイトウ（Celosia argentea）、キヌア（Chenopodium quinoa）、リビングストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）、オシロイバナ（Mirabilis jalapa）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボテン（Opuntia stricta）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、レッドビート（Red beet）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）等に由来する酵素が挙げられる。
【００９２】
上述した中でもベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしては、以下の（ふ）、（へ）、または（ほ）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号２８はリビングストンデージーに由来する塩基配列である。
（ふ）配列番号２８で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（へ）配列番号２８で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ほ）配列番号２８で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００９３】
また、上述のベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（ま）、（み）、または（む）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（ま）、（み）、または（む）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号２９はリビングストンデージーに由来するアミノ酸配列である。
（ま）配列番号２９で表されるアミノ酸配列
（み）配列番号２９で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
（む）配列番号２９で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
また、前記（む）に記載の通り、ベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を保持する限り、配列番号２９に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００９４】
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。
即ち、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号２８の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（め）、（も）、または（や）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【００９５】
（め) 配列番号３０で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（も）配列番号３０で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、お
よび／または付加された塩基配列を含み、かつベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（や）配列番号３０で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
また、上述のベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（ま）、（み）、（む）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（ま）、（み）、または（む）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（む）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
【００９６】
なお、配列番号２８に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが、配列番号３０であるが、これらは、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一である。つまり、配列番号２８、３０の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号２９である。
ベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしては、ベニテングダケ（Amanita muscaria）、スギモリケイトウ（Amaranthus cruentus）、ハゲイトウ（Amaranthus tricolor）、テンサイ（Beta vulgaris）、ケイトウ（Celosia argentea）、キヌア（Chenopodium quinoa）、リビングストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）、オシロイバナ（Mirabilis jalapa）、ウチワサボテン（Opuntia ficus）、センニンサボテン（Opuntia stricta）、マツバボタン（Portulaca grandiflora）、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）、レッドビート（Red beet）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）等に由来する酵素が挙げられる。  
【００９７】
上述した中でもベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしては、以下の（ゆ）、（よ）、または（ら）の塩基配列でコードされる酵素であることが好ましい。配列番号５３はリビングストンデージーに由来する塩基配列である。
（ゆ）配列番号５３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（よ）配列番号５３で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ら）配列番号５３で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００９８】
また、１もしくは数個の塩基が欠失、追加、挿入、および／または置換された塩基配列の作製は、突然変異・BR>ワを用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によっ
て得ることができる。これらは、例えばＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）やＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の市販キットで容易に行うことができる。
【００９９】
また、上述のベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをアミノ酸配列で規定すると、以下の（り）、（る）、または（れ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、以下の（り）、（る）、または（れ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。配列番号５４リビングストンデージーに由来するアミノ酸配列である。
（り）配列番号５４で表されるアミノ酸配列
（る）配列番号５４で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
【０１００】
（れ）配列番号５４で表されるアミノ酸配列の６０％以上の同一性を有するアミノ酸配
列を有し、かつｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
また、前記（れ）に記載の通り、ベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を保持する限り、配列番号５４に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
【０１０１】
上記に例示したように、自然界に存在する生物のゲノム情報に基づく塩基配列、またはそのホモログを用いることもできるが、各々の遺伝子は、必要に応じて宿主微生物のコドン使用頻度にあわせて塩基配列を最適化することができる。
即ち、酵母を宿主微生物とする場合は配列番号５３の塩基配列に対してコドン最適化を実施して得られた以下の（ろ）、（わ）、または（を）の塩基配列でコードされる酵素であることがより好ましい。
【０１０２】
（ろ) 配列番号５５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（わ）配列番号５５で表される塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、および／または付加された塩基配列を含み、かつベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（を）配列番号５５で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【０１０３】
また、上述のベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをアミノ酸配列で規定すると、前述の（り）、（る）、（れ）と同様のアミノ酸配列を有するものが好ましく、（り）、（る）、または（れ）のアミノ酸配列からなるものがより好ましい。前記（れ）のアミノ酸配列の配列同一性の好ましい範囲についても、同様に考えることができる。
【０１０４】
なお、配列番号５３に対して酵母発現用にコドン最適化を行ったものが、配列番号５５であるが、これらは、翻訳後のアミノ酸配列としては最適化前後で同一である。つまり、配列番号５３、５５の塩基配列により規定されるアミノ酸配列は配列番号５４である。
【０１０５】
［本発明の微生物の作製方法］
以下、本発明の微生物の作製方法について説明する。
本発明の微生物は、チロシンのフェノール環の３位を水酸化する酵素をコードするＤＮＡ（例えば、前記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）等）、ＤＯＰＡ４，５−ジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（Ｍ）、（Ｎ）、（Ｏ）、（Ｓ）、（Ｔ）、（Ｕ）、（Ｖ）、（Ｗ）、（Ｘ）等）を上記宿主微生物に、プラスミドベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。
【０１０６】
上述のＤＮＡを宿主となる微生物に導入する際、プラスミドベクター上に該ＤＮＡを導入しても、染色体（ゲノム）上に該ＤＮＡを導入してもよい。宿主微生物が染色体上に該酵素をコードする遺伝子を有する場合は、該遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても本発明で用いる微生物を得ることもできる。宿主微生物の染色体上に該酵素遺伝子がない場合は、該酵素遺伝子を染色体上へ相同組換え法により導入したり、プラスミドベクターにより該酵素遺伝子を導入したりすることもできる。
【０１０７】
微生物に該ＤＮＡを導入する際には、適当なプロモーターを該遺伝子の５'-側上流に組み込むことが好ましく、加えてターミネーターを３'-側下流にそれぞれ組み込むことがより好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物
において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、該酵素遺伝子自身のプロモーター及びターミネーターであってもよいし、他のプロモーター及びターミネーターに置換してもよい。これら各微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【０１０８】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【０１０９】
本発明の微生物の好ましい形態として、さらにＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（あ）、（い）、（う）、（き）、（く）、（け））、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（こ）、（さ）、（し）、（た）、（ち）、（つ））、ならびにｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（て）、（と）、（な）、（の）、（は）、（ひ））、ベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（ふ）、（へ）、（ほ）、（め）、（も）、（や））、およびベタニジン  ６−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、前記の（ゆ）、（よ）、（ら）、（ろ）、（わ）、（を））から選ばれる１以上のＤＮＡを上記宿主微生物に、プラスミドベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。
以下、微生物の種類ごとに、該酵素および／または該酵素反応系の活性が付与された微生物を得る方法について説明する。
【０１１０】
（大腸菌）
宿主微生物として大腸菌を用いる場合、大腸菌の親株としては、例えば、Ｋ１２株またはＢ株、加えてこれらの誘導体を用いることが好ましい。本発明で用いることのできる親株としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＴＨ２、ＴＯＰ１０、及びこれらの改良株が挙げられ、これらの菌株は市販されている。加えて、例えば一遺伝子破壊株であるＫＥＩＯコレクションで使用されているＢＷ２５１１３株なども利用可能であり、これらはナショナルバイオリソースプロジェクトより分与が可能である。
【０１１１】
大腸菌の組換え方法としては、目的とする遺伝子または配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクターに導入することにより、大腸菌内で前記酵素遺伝子の発現増強が可能な組換えプラスミドベクターを得て、このプラスミドベクターを菌体内へ導入する方法等が挙げられる。
大腸菌に目的とする遺伝子または配列を導入することができるプラスミドベクターとしては、大腸菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。プラスミドベクターとしては、例えば、Ｐ１５Ａ、ＣｏｌＥ１（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ）、ＲＳＦ１０３０、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ１３などの複製開始点をもつものを好適に用いることができる。
【０１１２】
また、プロモーターとしては、大腸菌において機能するものであればいかなるプロモーターであってもよく、導入される遺伝子自身のプロモーターであってもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びλＰＬプロモーター等を用いることができる。
【０１１３】
本発明で用いることができるプラスミドベクターは、例えば、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン）、Ｄｕｅｔ  Ｖｅｃｔｏｒシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＤＵＡＬシリーズ（ストラタジェン）、ｐＭＡＬシリーズ（ＮＥＢ）、ｐＧＥＸシリーズ（ＧＥヘルスケア）、ｐＫＫ２２３（ＧＥヘルスケア）ｐＴｒｃシリーズ（ライフテクノロジーズ）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ）等が挙がられる。
【０１１４】
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、前述した外来および内在の遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
【０１１５】
（コリネ型細菌）
宿主微生物として、コリネ型細菌（coryneform bacterium）を用いる場合、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌等が挙げられ、これらのうち、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に属する
細菌がより好ましい。
【０１１６】
本発明において用いることのできる親株としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−
１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテ
リウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２、ココリネバクテリウム・グルタミカムＡＴ
ＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。
【０１１７】
なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W. et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭＰ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【０１１８】
本発明の方法において親株として用いられる上記の微生物としては、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
目的とする遺伝子または配列は、以下に示す方法によりコリネ型細菌に導入することができる。
【０１１９】
コリネ型細菌に前記遺伝子をプラスミドベクターにより導入する際、利用できるプラスミドベクターの具体例は、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐ
ＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１；Plasmid vol.36(1)p62-66(1996)
に記載のｐＣ２又はその改変プラスミド等を挙げることができる。
【０１２０】
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、前述した外来遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
【０１２１】
（酵母）
宿主微生物として、酵母を用いる場合、親株として用いる酵母の種類は特に限定されないが、サッカロミセス属、デバリオマイセス属、シゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、ヤロウィア属、ロドトルラ属、リポマイセス属、クルイベロマイセス属、ロドスポリジウム属、トリコデルマ属または、トルロプシス属、ピキア属等に属する酵母を親株として用いることが好ましい。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、デバリオマイセス・ニ
ルソニ（Debaryomyces nilssonii）、デバリオマイセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ・グ
ルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ロドスポリジウム
・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）、トリコデルマ・リセイ（Trichoderma
reesei）、トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）、ピキア・ファリ
ノサ（Pichia farinosa）等が挙げられる。これらの中で、代謝工学的手法が用いやすい
ことからサッカロミセス属が最も好ましい。
【０１２２】
さらに、サッカロミセス属は、ｈｉｓ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ４９９株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ａｄｅ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２）（ＡＴＣＣ２０４６７９：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ又はＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＦＹ１６７９−０６ｃ株（ＭＡＴα  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３）（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエＢＹ４７４１株（ＭＡＴａ，ｈｉｓ３Δ１，ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔ１５Δ０，ｕｒａ３Δ０）（Ｙｅａｓｔ  １４：１１５−１３２（１９９８）、ＡＴＣＣ２０１３８８）なども用いることができる。
【０１２３】
目的とする遺伝子または配列は、以下に示す方法により酵母に導入することができる。酵母において外来遺伝子を導入する方法としては、公知の手法を用いることができ、形質転換体において形質転換の目的とした酵素が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。用いるプラスミドベクターとしては、例えば、後述する３つのプラスミドベクターが挙げられる。（ｉ）酵母に常在する２μｍプラスミドの複製配列を利用した多コピーのＹＥｐ型ベクターを用いることができる。本発明において酵母に遺伝子を導入す
るために使用できるプラスミドの具体例としては、２μｍプラスミド由来のｐＡＵＲ１１２ベクター（タカラバイオ社製）やｐＥＳＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＹＥＳベクター（ライフテクノロジーズ）などが挙げられる。これらのベクターは市販されている。（ｉｉ）自立複製配列（ＡＲＳ）とセントロメア配列（ＣＥＮ）を利用した低コピー安定型のＹＣｐ型ベクターを用いることができる。本発明において用いることのできるプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ）等が挙げられる。（ｉｉｉ）染色体組込みを目的とした酵母内では自律複製をしないＹＩｐ型のプラスミドを用いることができる。これは、酵母の高い相同組換え能を利用するものであり、染色体ゲノムと相同な配列を両端に置き、選択可能なマーカー遺伝子、プロモーター及びターミネーターに挟まれた形で希望の遺伝子をＹＩｐ型のプラスミドに組み込み、これを酵母内に導入することで、外来遺伝子は染色体内に組み込まれ、安定的に外来遺伝子を発現することが期待できる。これは一般的な大腸菌や酵母用のプラスミドを用いて構築することが可能であるほか、ＰＣＲや合成ＤＮＡを用いて作製することが可能である。
【０１２４】
本発明において用いることのできるプロモーターとしては、宿主酵母で機能しうるものであれば特に制限されないが、例えば、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター（３−ホスホグリセラートキナーゼ  1983、Science、219、620-625）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドホ
スフェートデヒドロゲナーゼ  1979、J.Biol.Chem.、254、9839-9845）をコードするＴＤＨ遺伝子のプロモーター、ＴＥＦ１遺伝子（伸長因子１  1985、J.Biol.Chem.、260、3090-3096）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ遺伝子のプロモーター、グルコースの存在下に抑制される調節可能なＣＹＣ１遺伝子のプロモーター（1981、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、78、2199-2203）、チアミンにより調節され得るＰＨ
Ｏ５遺伝子のプロモーター（1982、EMBO J.、1、675-680）、グルコース非存在下でガラ
クトースにより誘導されるＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【０１２５】
また、上記の組換え方法に代えて、あるいは、上記の組換え方法に加えて、公知の相同組換え法によって、外来および内在遺伝子の一部または全部を導入したり、置換したり、増幅したり、加えて、染色体上へ導入された当該遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによっても高発現株を得ることができる。
なお、酵母の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al. Nature 1986, 319(6056):791-793）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）等によって行うことができ、二種以上のプラス
ミドを導入することもできる。また、酵母における遺伝子の発現増強は、公知の相同組換え法によって宿主のゲノム上で該遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。例えば、ゲノム組込型プラスミドのうち多コピーがゲノムに組み込まれるベクターを用いる方法（Bio/Technol. 1991, 9, 1382-1385）が挙げられる。ゲノム上の各遺伝子を
含む発現単位の挿入箇所は、クロチルアルコールもしくはその異性体の合成関連遺伝子や生育関連遺伝子の発現が阻害されない箇所であれば何れのものでもよい。
【０１２６】
［ベタレイン色素の生産方法］
本発明の微生物を用いてベタレイン色素を生産する場合、原料および必要に応じて添加物を含む水性媒体中で、本発明の微生物またはその処理物の存在下ベタレイン色素を生産することができる。ベタレイン色素の生産方法としては、微生物の培養工程、ベタレイン色素を生産する変換工程、ベタレイン色素を回収する回収工程を含む例が挙げられる。
以下、ベタレイン色素の生産に関する個別の特徴について説明する。
【０１２７】
（原料）
ベタレイン色素生産の原料としては、チロシン、および／または糖質原料を用いることができる。ここでチロシンとしては、純度９０％以上の市販品を好適に用いることができ
る。
糖質原料としては、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、ラフィノース、サッカロース、デンプン、セルロースなどの炭水化物やグリセリン、マンニトール、リビトール、キシリトールなどのポリアルコール類等の発酵性糖質類等を用いることができ、中でもグルコースが好ましい。
【０１２８】
また、ベタシアニン類縁体である式（１０）の化合物を生産させる場合は、上記原料に追加してチラミンまたはドーパミンを添加すればよい。チラミンまたはドーパミンの追加方法としては試薬として直接添加するのみならず、予め本製造方法にて用いる微生物に、チロシンからチラミン、Ｌ−ＤＯＰＡからドーパミンへと変換する酵素であるチロシン脱炭酸酵素等を導入することで微生物内にて生産させる、もしくは反応系にチロシン脱炭酸酵素を添加することでチロシンから変換させてもよい。用いる微生物が本来的にチロシン脱炭酸酵素を有している場合は、特に添加する必要はない。
【０１２９】
ベタシアニン類縁体である式（１１）の化合物を生産させる場合は、上記原料に追加して４−（２−アミノビニル）フェノールまたは４−（２−アミノビニル）ベンゼン−１，２−ジオールを試薬として添加すればよい。  
本発明の微生物において、糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが充分に強くない場合は、原料として糖質原料およびチロシンを用いることが好ましく、特にグルコースおよびチロシンを用いることが好ましい。
一方で、本発明の微生物において、糖質原料からチロシンを合成する代謝フラックスが強い場合は、原料として糖質原料のみを用いることができる。目的とするベタレイン色素の生産プロセスの低コスト化のためには、より安価原料である糖質原料のみを用いることが好ましい。
【０１３０】
（添加物）
本発明の微生物が有する酵素活性に応じて、ベタレイン色素を生産するために必要な酵素または該酵素反応で得られるベタレイン色素中間体を添加することができる。例えば、本発明の微生物がチロシナーゼ活性及びＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ活性しか有していない場合であっても、添加物としてＣＹＰ７６ＡＤ３、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ、およびｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを添加して変換工程を実施することで図７−２の経路でベタシアニン類を生産することができる。または、添加物として前記酵素の代わりに当該酵素反応で得られるベタレイン中間体であるｃｙｃｌｏ−ＤＯＰＡ  グルコシドを添加して変換工程を実施することで図７−２の経路でベタシアニン類を生産することができる。同様にして、本発明の微生物がチロシナーゼ活性及びＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ活性しか有していない場合であっても、添加物としてＣＹＰ７６ＡＤ３、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ、およびベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを添加して変換工程を実施することで図７−３の経路でベタシアニン類を生産することができる。
【０１３１】
（培養工程）
培養工程は、上述のようにして得られた本発明の微生物を水性媒体中で培養する工程である。本工程は、本発明の微生物を培養して増殖させたり、本発明の微生物の状態を調えたりするために行なうものであるので、通常、本工程では、上述した原料のうち、本発明の微生物の生育に必要な原料のみを、具体的には、糖質原料（好ましくはグルコース）のみを用いる。
【０１３２】
ただし、ベタレイン色素生産に必要な酵素を何らかの誘導性プロモーター下に配置している場合は、上記プロモーターの種類により適切に選択される誘導剤を培養工程途中に添
加する必要がある。
なお、本発明の微生物が充分な量、存在する場合等は、本工程は省略して、次の変換工程を行なうことができる。
【０１３３】
本工程で用いる水性媒体（培地）に特に制限はなく、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、例えば、以下のような条件で行なうことができる。
水性媒体としては、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができるが、後述の炭素源等を含む培地や、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類等が挙げられる。
【０１３４】
炭素源は、上記微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
【０１３５】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。
また、培養条件は、用いる微生物の生育が可能であれば特に制限はなく、通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施することができる。本発明の微生物が、酵母である場合、水性媒体の温度を、好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下とするとベタレイン色素の生産効率が向上する傾向にあり、好ましい。
【０１３６】
（変換工程）
変換工程は、本発明の微生物またはその処理物の存在下、水性媒体中で原料をベタレイン色素へと変換する工程である。本工程は、原料をベタレイン色素へと変換することを目的とするものであり、原料としては、上述の糖質原料、および／またはチロシンが用いられる。
【０１３７】
また、上述の培養工程で培養された本発明の微生物の菌体を、休止菌体として、当該休止菌体を、本工程において、本発明の微生物として用いることも好ましい。本発明の微生物の菌体を休止菌体とする方法としては、培養工程で得られた培養液から遠心操作等による菌体を回収する方法や、水、または、微生物の生育に必要な炭素源、および窒素源を含有しないバッファー等により洗浄することにより、菌体を回収する方法等が挙げられる。
【０１３８】
なお、本発明の微生物が糖質原料からベタレイン色素を合成する代謝経路をすべて有するものである場合は、上述の培養工程と特に区別することなく連続して本工程を実施してもよい。
用いる水性媒体（培地）に特に制限はなく、用いる微生物の種類に応じて適宜設定することができ、前記培養工程に記載したものと同様のものを用いることができる。本工程においては、水性媒体が、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅および鉄からなる群から選ばれる少なくとも一種を含むものであることが好ましく、アスコルビン酸、ＵＤＰ−グルコース、銅および鉄を含むことがより好ましい。
【０１３９】
また、反応は、用いる微生物の生育が可能な条件、またはベタレイン色素生産のために導入した酵素が完全に酵素活性を失わない条件であれば特に制限はなく、通常、反応温度１０℃〜４５℃で１２時間〜９６時間実施する。本発明の微生物が、酵母である場合、水性媒体の温度を、好ましくは１６℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃以下とするとベタレイン色素の生産効率が向上する傾向にあり、好ましい。
【０１４０】
（回収工程）
上述の変換工程の後に、必要に応じて、水性媒体からベタレイン色素を回収する工程を有することが好ましい。
周知の方法、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、水性媒体または菌体内から回収することができ、必要に応じてさらに精製することができる。
【０１４１】
［ベタレイン色素］
本発明の微生物を用いれば種々のベタレイン色素を生産することができる。ベタレイン色素はベタキサンチンとベタシアニン類に大別することができる。
ベタキサンチンは、ベタラミン酸に、アミノ酸またはアミンがイミン結合した化合物群の総称であり、その構造は、以下の式（５）または式（６）として表される。
【０１４２】
【化５】
2015192669.tif 000006
【０１４３】
【化６】
2015192669.tif 000007
【０１４４】
式（５）、（６）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３は、水素原子、炭素数１〜４０の直鎖または分岐鎖または環状の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されて
いてもよく、該炭化水素基は、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成していてもよい。さらに該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。また、該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
【０１４５】
例えば、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数３の直鎖炭化水素基であり、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成する化合物は、プロリン−ベタキサンチンである。また、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数３の直鎖炭化水素基であり、該炭化水素基の末端の水素原子の一つがグアニジノ基で置換された化合物は、アルギニン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがイミダゾール基で置換された化合物は、ヒスチジン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数４の直鎖炭化水素基であり、該炭化水素基の末端から２番目の炭素原子が硫黄原子に置換された化合物は、メチオニン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがインドール基で置換された化合物は、トリプトファン−ベタキサンチンである。Ｒ１が水素原子、Ｒ２が炭素数１の炭化水素基であり、該炭化水素基の水素原子の一つがフェニル基で置換され、さらに該フェニル基のパラ位の水素原子がヒドロキシル基で置換された化合物は、チロシン−ベタキサンチンである。
【０１４６】
生産可能なベタキサンチンとしては、公知のベタキサンチンはもちろん、原料として、任意の非天然型アミノ酸を用いれば、非天然型のアミノ酸が付加されたベタキサンチンを製造することができる。このような非天然型のアミノ酸が付加されたベタキサンチンとしては、例えば、以下の式（７）で表されるものが挙げられる。
【０１４７】
【化７】
2015192669.tif 000008
【０１４８】
式（７）において、Ｒは、炭素数１〜４０の直鎖または分岐鎖または環状の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよく、該炭化水素基は、イミニウムの窒素を含有する形で環を形成していてもよい。さらに、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。  
【０１４９】
式（７）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルキル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、エチ
ル基、プロピル基、およびイソブチル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（７）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルケニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、アリル基、１−ブテニル基、および２−ブテニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
【０１５０】
式（７）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアルキニル基である場合、その炭素数が１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。この場合、Ｒが、エチニル基、１−ブチニル基、および２−ブチニル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
式（７）において、Ｒが、直鎖または分岐鎖のアリール基である場合、その炭素数が１〜２０であることが好ましく、１〜１０であることがより好ましい。この場合、Ｒが、ベンジル基、トリル基、およびフェネシル基からなる群から選ばれる少なくとも一種であることが特に好ましい。
【０１５１】
前記式（７）で表される化合物は、強力な抗酸化活性を有するという性質を生かし、抗酸化剤等に好適に用いることができる。
一方、ベタシアニンとは、ベタニジンのフェノール性水酸基に糖類がグリコシド結合した化合物群の総称であり、その構造は以下の式（８）で表される。
【０１５２】
【化８】
2015192669.tif 000009
【０１５３】
式（８）において、Ｒ４およびＲ５のうちどちらかは水素原子であり、もう一方は式（９）で表される糖鎖である。
【０１５４】
【化９】
2015192669.tif 000010
【０１５５】
式（９）においてＲ６は、水素原子、炭素数１〜２０の直鎖または分岐鎖の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種である。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。また、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素
原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
【０１５６】
式（９）においてＲ７は、水素原子またはグリコシル基からなる群から選択される１種である。ただし、該グリコシル基の水素原子の一部または全部は、炭素数１〜２０の直鎖または分岐鎖の飽和もしくは不飽和炭化水素基からなる群から選択される１種で置換されていてもよい。ただし該炭化水素基の水素原子の一部または全部は、ハロゲン原子、アシル基、アミド基、アミノ基、アルコキシ基、アルデヒド基、イミダゾール基、インドール基、オキソ基、カルボキシル基、グアニジノ基、シアノ基、スルホ基、チオール基、ニトロ基、ヒドロキシル基およびフェニル基からなる群から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。また、該イミダゾール基、該インドール基および該フェニル基の芳香環の一部または全部は、上記と同様の置換基群から選択される少なくとも一種にて置換されていてもよい。さらに該炭化水素基の炭素原子の一部は、硫黄原子、酸素原子、窒素原子、リン原子から選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。
【０１５７】
例えば、Ｒ５が水素原子、Ｒ４がＲ６、Ｒ７が水素であるグルコース鎖である場合は、ベタニンである。Ｒ４が水素原子、Ｒ５がＲ６、Ｒ７が水素であるグルコース鎖である場合は、ゴンフレニンＩである。
さらに、本明細書においては、ベタシアニン類は上記のベタシアニンの類縁体も含む概念であり、例えば式（８）で、２位のカルボキシル基が脱離した式（１０）で表される構造の化合物や、１４、１５位の炭素間が不飽和化された式（１１）で表される構造の化合物などもベタシアニン類である。ここでＲ４、Ｒ５の定義は上述と同様である。
【０１５８】
【化１０】
2015192669.tif 000011
【０１５９】
【化１１】
2015192669.tif 000012
【０１６０】
生産可能なベタシアニン類としては、ベタニン、ゴンフレニンＩといった天然に存在するベタシアニンはもちろん、付加させる糖の種類を変えることで非天然型のベタシアニン類を製造することもできる。例えば、糖供与体として、ＵＤＰ−ガラクトースを用いれば
、ベタニジンにガラクトースが付加した式（１２）に表される非天然型ベタシアニン類が製造できる。同様に、糖供与体として、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−イズロン酸、ＵＤＰ−キシロース、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース等を用いれば、ＵＤＰやＧＤＰに結合した糖がベタニジンに付加した非天然型ベタシアニン類を製造することができる。これら化合物は強力な抗酸化活性を有することから、抗酸化剤等に好適に利用することができる。
【０１６１】
【化１２】
2015192669.tif 000013
【実施例】
【０１６２】
次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］チロシナーゼ活性、およびＤＯＰＡ ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有
する大腸菌の作製
【０１６３】
（１）大腸菌用チロシナーゼ（ＴＹＲ）発現プラスミドの構築
Ralstonia solanacearum GMI100由来のチロシナーゼ(以下、ＲＳＴＹＲと称する。）の遺伝子配列情報をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から得て、遺伝子合成により大腸菌のコドン頻度に最適化した。得られた最適化された遺伝子断片の全遺伝子配列を、配列番号８に示す。配列番号８の遺伝子断片を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミドを作製した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＮｄｅＩサイトを、３’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを付加したプライマー（配列番号３１、３２）を用いたＰＣＲにより各遺伝子断片を得た。
【０１６４】
ＰＣＲ反応液組成：  鋳型ＤＮＡ  ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）  ０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、２μＭ各々プライマー  ５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）反応温度条件：  ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｌｃｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ  （型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分３０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。
【０１６５】
ＰＣＲの増幅産物の確認は、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。得られたチロシナーゼのＰＣＲ断片を、それぞれ、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換
した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０１６６】
次に、上記ＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。分離されたＲＳＴＹＲ由来の約１．５ｋｂ遺伝子断片を、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
【０１６７】
大腸菌用発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ製）についても、同様の方法で制限酵素処理、および分離を行ない、約５．４ｋｂの遺伝子断片を回収した。
次いで、上記で得られた、チロシナーゼ遺伝子断片と、大腸菌発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０１６８】
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１と命名した。
【０１６９】
（２）大腸菌用ＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）発現プラスミドの構築
オシロイバナ（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ｊａｌａｐａ）由来のＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ  （以下、「ＭｊＤＯＤ」と称する。）  遺伝子配列情報１種類をＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により大腸菌のコドン頻度に最適化した。最適化したＭｊＤＯＤの全遺伝子配列を配列番号１４に示す。配列番号１４に記載の配列を、ｐＵＣ５７ベクター  （ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＮｄｅＩサイトを、３’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを付加したプライマー（配列番号４１、および４２）  を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
【０１７０】
ＰＣＲ反応液組成：  鋳型ＤＮＡ  ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （タカラバイオ株式会社製）  ０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、２μＭ各々プライマー  ５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：  ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｌｃｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ  （型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。
【０１７１】
増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）大腸菌用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約０．８ｋｂのＭｊＤＯＤ由来遺伝子断片を検出し、回収した。
得られたＭｊＤＯＤのＰＣＲ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）  Ｐ
ＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０１７２】
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０１７３】
次に、上記ＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約０．８ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ
（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターと共存可能な大腸菌発現ベクターであるｐＲＳＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ製）についてもＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約３．８ｋｂの遺伝子断片を回収した。
【０１７４】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のＭｊＤＯＤ遺伝子断片と大腸菌発現ベクターｐＲＳＦＤｕｅｔ−１とを連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１と命名した。
【０１７５】
（３）大腸菌用チロシナーゼ、ＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）共発現プラスミドの構築上記ｐＵＣ５７に挿入された大腸菌用コドン最適化済みＭｊＤＯＤ遺伝子断片を鋳型として、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
【０１７６】
ＭｊＤＯＤ遺伝子増幅用プライマー：配列番号４３、４４
ＰＣＲ反応液組成、反応温度条件は（２）大腸菌用ＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）発現プラスミドの構築の記載と同様である。得られた遺伝子断片をｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−２と命名した。
【０１７７】
次に、上記ＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−２および先に（１）大腸菌用チロシナーゼ発現プラスミドの構築にて記載のＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカ
ライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。ＭｊＤＯＤ由来約０．８ｋｂ遺伝子断片とＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１由来約６．９ｋｂ遺伝子断片をＬｉｇａｔｉｏｎ
ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（TOYOBO製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１と命名した。
【０１７８】
（４）チロシナーゼおよびＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ共発現大腸菌株の作製
上記（１）および（２）で作製したＲＳＴＹＲ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１およびＭｊＤＯＤ／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１の混合プラスミドで、それぞれ、大腸菌（ＢＬ２１  ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）株）を形質転換した。得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤと命名し、ベタレイン色素生産大腸菌株として以下のベタレイン色素生産試験に用いた。
【０１７９】
（５）チロシナーゼおよびＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ共発現チロシン生産大腸菌株の作製
上記（３）で得られたＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤ／ｐＥＴＤｕｅｔ−１を用いて、芳香族アミノ酸生合成に関与する遺伝子の転写制御因子であるｔｙｒＲの遺伝子破壊およびチロシンによるフィードバック阻害に耐性を有するコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ＴｙｒＡｆｂｒ）、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性を有するＤＡＨＰ合成酵素（ＡｒｏＧｆｂｒ）の増強により育種したチロシン生産大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  （ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ  ／ＴｙｒＡｆｂｒ＋ＡｒｏＧｆｂｒを形質転換した。なお、ＴｙｒＡｆｂｒは、大腸菌由来の野生型酵素ＴｙｒＡのアミノ酸配列５３番目のメチオニンをイソロイシン、３５４番目のアラニンをバリンに置換して得た。ＡｒｏＧｆｂｒは、大腸菌由来の野生型酵素ＡｒｏＧのアミノ酸配列１４６番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換して得た。得られた組換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  カナマイシン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡｆｂｒ＋ＡｒｏＧｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤと命名し、ベタレイン色素生産株として以下の糖質を原料としたベタレイン色素生産試験に用いた。
【０１８０】
［実施例２］チロシナーゼ活性、およびＤＯＰＡ ４，５−ジオキシゲナーゼ活性を有
する酵母の作製
（１）酵母用チロシナーゼ（ＴＹＲ）発現プラスミドの構築
Ralstonia solanacearum GMI1000由来のチロシナーゼ（以下、ＲＳＴＹＲと称する）の遺伝子配列情報をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。得られた最適化された遺伝子断片の全遺伝子配列（ｙＲＳＴＹＲ）を、それぞれ、配列番号１１に示す。配列番号１１の遺伝子断片を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入したプラスミドを作製した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより各遺伝子断片を得た。
【０１８１】
ｙＲＳＴＹＲ遺伝子増幅用プライマー：  配列番号３３、３４
ＰＣＲの反応液組成および反応温度条件は、前記「（１）大腸菌用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」記載の方法と同様にして行った。
ＰＣＲの増幅産物の確認は、前記「（１）大腸菌用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」記載の方法と同様にして行い、約１．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的断片の回収はＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて行った。
【０１８２】
得られたチロシナーゼのＰＣＲ断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）
ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０１８３】
次に、上記ｙＲＳＴＹＲ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロース（アガロース−ＲＥ：ナカライテスク株式会社）ゲル電気泳動により分離した。分離されたｙＢＭＴＹＲ由来の約０．９ｋｂ遺伝子断片、ｙＲＳＴＹＲ由来の約１．５ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
【０１８４】
酵母用発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）についても、同様の方法で制限酵素処理、および分離を行ない、約７．８ｋｂの遺伝子断片を回収した。
次いで、上記で得られた、それぞれのチロシナーゼ遺伝子断片と、酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵとをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵと命名した。
【０１８５】
（２）酵母用ＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）発現プラスミドの構築
オシロイバナ（Mirabilis jalapa）由来のＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ  （以下、「ＭｊＤＯＤ」と称する。）  遺伝子配列情報１種類をＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。最適化したＭｊＤＯＤの全遺伝子配列（ｙＭｊＤＯＤ）を配列番号１５に示す。配列番号１５に記載の配列を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加したプライマー（配列番号３５、および３６）  を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
【０１８６】
ＰＣＲ反応液組成、反応温度条件は前記「（２）大腸菌用ＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ（ＤＯＤ）発現プラスミドの構築」記載の方法と同様にして行った。
増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）酵母用チロシナー
ゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約０．８ｋｂのｙＭｊＤＯＤ由来遺伝子断片を検出し、回収した。
【０１８７】
得られたｙＭｊＤＯＤのＰＣＲ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｙＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０１８８】
次に、上記ｙＭｊＤＯＤ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約０．８ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ｐＥＳＣ−ＬＥＵベクターと共存可能な酵母発現ベクターであるｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）についてもＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約６．６ｋｂの遺伝子断片を回収した。
【０１８９】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のｙＭｊＤＯＤ遺伝子断片と酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡとを連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡと命名した。
【０１９０】
（３）チロシナーゼおよびＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼ共発現酵母株の作製
上記（１）および（２）で作製した、ｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵおよびｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡの混合プラスミドで、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ５００株（ＭＡＴα  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ａｄｅ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）、もしくはエレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）で形質転換した。得られた組換え酵母をＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）および２０ｍｇ／Ｌトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含有するＳＤ寒天培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％  グルコース、２％  寒天）に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤと命名し、ベタレイン色素生産酵母株として以下のベタレイン色素生産試験に用いた。
【０１９１】
［実施例３］チロシナーゼ活性、ＤＯＰＡ ４，５−ジオキシゲナーゼ活性、ＣＹＰ７
６ＡＤ３活性、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ（ＡＴＲ１
）活性およびベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵母の作製
【０１９２】
（１）酵母用ＣＹＰ７６ＡＤ３発現プラスミドの構築
オシロイバナ（Mirabilis jalapa）由来のＣＹＰ７６ＡＤ３の遺伝子配列情報１種類をＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。最適化したＣＹＰ７６ＡＤ３の全遺伝子配列（ｙＣＹＰ７６ＡＤ３）を配列番号１８に示す。配列番号１８に記載の配列を、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３’末端に制限酵素ＳａｃＩサイトを付加したプライマー（配列番号３７、および３８）  を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
【０１９３】
反応液組成：  鋳型ＤＮＡ  ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）  ０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、２μＭ各々プライマー  ５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：  ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ  （型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分３０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。
【０１９４】
増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）酵母用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約１．５ｋｂのｙＣＹＰ７６ＡＤ３由来遺伝子断片を検出し、回収した。
得られたｙＣＹＰ７６ＡＤ３のＰＣＲ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０１９５】
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｙＣＹＰ７６ＡＤ３／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０１９６】
次に、上記ｙＣＹＰ７６ＡＤ３／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約１．５ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター、ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクターと共存可能な酵母発現ベクターであるｐＥＳＣ−ＨＩＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）についてもＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約６．７ｋｂの遺伝子断片を回収した。
【０１９７】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のｙＣＹＰ７６ＡＤ３遺伝子断片と酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＨＩＳとを連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  
アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをｙＣＹＰ７６ＡＤ３／ｐＥＳＣ−ＨＩＳと命名した。
【０１９８】
（２）酵母用ＣＹＰ７６ＡＤ３、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ（ＡＴＲ１）共発現プラスミドの構築
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の２種類のＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼＡｔＡＴＲ１の遺伝子配列情報をそれぞれＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。最適化したＡｔＡＴＲ１の全遺伝子配列（ｙＡｔＡＴＲ１）を配列番号２３に示す。配列番号２３に記載の配列を、各々ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを、３’末端に制限酵素ＳａｌＩサイトを付加したプライマー（配列番号３９、４０）を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を得た。
【０１９９】
反応液組成：  鋳型ＤＮＡ  ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）  ０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、２μＭ各々プライマー  ５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：  ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ  （型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で２分からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。
【０２００】
増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）酵母用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約２．１ｋｂのｙＡｔＡＴＲ１由来遺伝子断片を検出し、回収した。
得られたｙＡｔＡＴＲ１のＰＣＲ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）
ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０２０１】
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｙＡｔＡＴＲ１／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０２０２】
次に、上記ｙＡｔＡＴＲ１／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、各々ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約２．１ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
先に作成したｙＣＹＰ７６ＡＤ３／ｐＥＳＣ−ＨＩＳについてもＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約８．２ｋｂの遺伝子断片を回収した。
【０２０３】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のｙＡｔＡＴＲ１の遺伝子断片と酵母用発現プラスミドｙＣＹＰ７６ＡＤ３／ｐＥＳＣ−ＨＩＳと
を連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをｙＣＹＰ７６ＡＤ３＋ｙＡｔＡＴＲ１／ｐＥＳＣ−ＨＩＳと命名した。
【０２０４】
（３）酵母用ベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ発現プラスミドの構築
リビングストンデージー（Dorotheanthus bellidiformis）由来のベタニジン  ５−Ｏ
−グルコシルトランスフェラーゼ（以下、「Ｄｂ５ＧＴ」と称する。）の遺伝子配列情報をそれぞれＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。最適化したＤｂ５ＧＴの全遺伝子配列（ｙＤｂ５ＧＴ）を配列番号３０に示す。配列番号３０に記載の配列を、各々ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを、３’末端に制限酵素ＫｐｎＩサイトを付加したプライマー（配列番号４５、４６）を用いたＰＣＲにより各々の遺伝子断片を得た。
【０２０５】
反応液組成：  鋳型ＤＮＡ  ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）  ０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、２μＭ各々プライマー  ５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：  ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ  （型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１分３０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。
【０２０６】
増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）酵母用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約１．５ｋｂのｙＤｂ５ＧＴ由来遺伝子断片を検出し、各々回収した。
得られたｙＤｂ５ＧＴのＰＣＲ断片を各々Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０２０７】
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｙＤｂ５ＧＴ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０２０８】
次に、上記ｙＤｂ５ＧＴ／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約１．５ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
ｐＥＳＣ−ＬＥＵベクター、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｐＥＳＣ−ＨＩＳベクターと共存可能な酵母発現ベクターであるｐＥＳＣ−ＴＲＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）についてもＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約６．５ｋｂの遺
伝子断片を回収した。
【０２０９】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のｙＤｂ５ＧＴ遺伝子断片と酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰとを連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをｙＤｂ５ＧＴ／ｐＥＳＣ−ＴＲＰと命名した。
【０２１０】
（４）酵母用５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、スクロース合成酵素共発現プラスミドの構築
スクロース合成酵素は、ＵＤＰとスクロースからＵＤＰ−グルコースを再生する酵素活性を示す。変換工程にて添加するグルコシルトランスフェラーゼの基質であるＵＤＰ−グルコースを再生する目的でグルコシルトランスフェラーゼと共に導入することとした。なおＡｔＳＵＳ１は、ＵＤＰ−グルコース使用量の低減化を目的としており、特に導入しなくてもベタシアニンは生産される。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のスクロース合成酵素（以下、ＡｔＳＵＳ１と称する）の遺伝子配列情報をＮＣＢＩから得て、遺伝子合成により酵母のコドン頻度に最適化した。最適化したＡｔＳＵＳ１の全遺伝子配列（ｙＡｔＳＵＳ１）を配列番号４７に示す。配列番号４７に記載の配列を、各々ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）のＥｃｏＲＶサイトに挿入した。得られたプラスミドを鋳型として、５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを、３’末端に制限酵素ＳａｃＩサイトを付加したプライマー（配列番号４８、４９）を用いたＰＣＲにより各々の遺伝子断片を得た。
【０２１１】
反応液組成：  鋳型ＤＮＡ  ２μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（Ｒ）  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）  ０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、２μＭ各々プライマー  ５μｌ、滅菌水２４μｌ（これらを混合して全量５０μｌとした。）
反応温度条件：  ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｔｏｕｃｈ  （型式ＴＰ３５０）を用い、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で２分３０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。ただし、１サイクル目の９８℃での保温は１分１０秒とした。
【０２１２】
増幅産物の確認、およびゲルからの目的断片の回収は、前記「（１）酵母用チロシナーゼ発現プラスミドの構築」に記載の方法と同様にして行い、約２．５ｋｂのｙＡｔＳＵＳ１由来遺伝子断片を検出し、各々回収した。
得られたｙＡｔＳＵＳ１のＰＣＲ断片を各々Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｒ）  ＴＯＰＯ（Ｒ）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｐＣＲＴＭ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター  （ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ製）に連結した後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０２１３】
このようにして得られた組み換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ここで得られたプラスミドＤＮＡをｙＡｔＳＵＳ１／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩと命名した。
【０２１４】
次に、上記ｙＡｔＳＵＳ１／ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにて制限酵素処理した後、１％アガロースゲル電気泳動により分離し、約２．５ｋｂ遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて回収した。
先に構築したｙＤｂ５ＧＴ／ｐＥＳＣ−ＴＲＰについても各々ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩにて制限酵素処理した後、同様の方法で分離し、約８ｋｂの遺伝子断片を回収した。
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて、上記のｙＡｔＳＵＳ１遺伝子断片と酵母発現プラスミドｙＤｂ５ＧＴ／ｐＥＳＣ−ＴＲＰとを各々連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。
【０２１５】
このようにして得られた組み換え大腸菌を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて液体培養した後、得られた菌体からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをｙＤｂ５ＧＴ＋ＡｔＳＵＳ１／ｐＥＳＣ−ＴＲＰと命名した。
【０２１６】
（５）ＲＳＴＹＲ、ＭｊＤＯＤ、ＣＹＰ７６ＡＤ３、ＡｔＡＴＲ１、Ｄｂ５ＧＴ、ＡｔＳＵＳ１共発現酵母株の作製
先に構築したｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｙＣＹＰ７６ＡＤ３＋ｙＡｔＡＴＲ１／ｐＥＳＣ−ＨＩＳ、ｙＤｂ５ＧＴ＋ＡｔＳＵＳ１／ｐＥＳＣ−ＴＲＰおよびｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｙＣＹＰ７６ＡＤ３＋ｙＡｔＡＴＲ１／ｐＥＳＣ−ＨＩＳ、ｙＤｂ５ＧＴ＋ＡｔＳＵＳ１／ｐＥＳＣ−ＴＲＰの混合プラスミドで、それぞれ、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ５００株（ＭＡＴα  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ａｄｅ２  ｔｒｐ１  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を酢酸リチウム法（Ito,H.et al, (1983) J. Bacteriol. 153(1), 163-168）、もしくはエレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）で形質転換した。得られた組換え酵母をＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を含有するＳＤ寒天培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％  グルコース、２％  寒天）に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／ＣＹＰ７６ＡＤ３／ＡｔＡＴＲ１／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１と命名し、以下のベタレイン色素生産試験に用いた。
【０２１７】
（６）チロシナーゼ、ＭｊＤＯＤ、Ｄｂ５ＧＴ、ＡｔＳＵＳ１共発現酵母株の作製
（５）と同様、（１）〜（４）で作成したｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｙＤｂ５ＧＴ＋ＡｔＳＵＳ１／ｐＥＳＣ−ＴＲＰの混合プラスミドで、それぞれ、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ５００株を形質転換した。得られた組換え酵母をＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）およびヒスチジン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を含有するＳＤ寒天培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％  グルコース、２％  寒天）に塗抹した。この培地上でコロニーを形成したクローンを、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１と命名し、ベタレイン色素生産酵母株として以下のベタシアニン生産試験に用いた。
【０２１８】
（７）チロシナーゼ、ＭｊＤＯＤ、Ｍｊ５ＧＴ、ＡｔＳＵＳ１共発現酵母株の作製
５）と同様、（１）〜（４）で作成したｙＲＳＴＹＲ／ｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｙＭｊＤＯＤ／ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｙＭｊ５ＧＴ＋ＡｔＳＵＳ１／ｐＥＳＣ−ＴＲＰの混合プラスミドで、それぞれ、サッカロミセス・セレビジエＹＰＨ５００株を形質転換した。続いて（１２）と同様の手法にてセレクションを行い、得られたクローンをＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｍｊ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１と命名し、ベタレイン色素生産酵母株として以下のベタシアニン生産試験に用いた。
【０２１９】
［実施例４］
実施例１の（４）で作製した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いて、ベタレイン色素の一種であるベタキサンチンの生産を行った実施例を以下に示す。
（前培養工程）
上記Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを、前培養培地［５×Ｍ９  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｓａｌｔｓ  ４００μｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  ０．２μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ４μｌ、１００ｇ／Ｌ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ２００μｌ、１Ｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ４４μｌ、１％  Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ４μｌ、５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４  ２μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ  ＣｕＳＯ４  ２μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ２μｌ、および１００ｍｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ２μｌを、全量２ｍｌとなるように滅菌水に溶解したもの］２ｍｌに植菌し、培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
【０２２０】
（本培養工程）
上記で得られた前培養液５００μｌを、本培養培地［５×Ｍ９  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｓａｌｔｓ  １０ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  ５μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １００μｌ、４０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ  ３．７５ｍｌ、１００ｇ／Ｌ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ５ｍｌ、１％  Ｔｈｉａｍｉｎｅ  １００μｌ、５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４  ５０μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ  ＣｕＳＯ４  ５０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ５０μｌ、１００ｍｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ５０μｌ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ１  ＯｎＥｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１  １ｍｌ、ＯｎＥｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２  ２．５ｍｌ、およびＯｎＥｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３  ５０μｌを、全量５０ｍｌになるように滅菌水に溶解したもの］５０ｍｌに植菌し、培養温度２０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養することで、タンパク質の発現を誘導した。
【０２２１】
（変換工程）
上記で得られた本培養液に、Ｌ−チロシン（終濃度１ｍＭ）および１Ｍアスコルビン酸５００μｌを添加することでベタレイン色素の生産反応を開始し、反応温度２０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養してベタレイン色素を生産させた。得られた培養液１ｍｌから遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
【０２２２】
（解析）
解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６４６０  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ＬＣ／ＭＳを用いて行なった。カラムはＳｕｎＦｉｒｅＴＭ  Ｃ１８  ３．５μｍ
２．１×１５０ｍｍ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。溶出は１％ギ酸（ＳｏｌｖｅｎｔＡ）と８０％アセトニトリル（ＳｏｌｖｅｎｔＢ）を用い、ＳｏｌｖｅｎｔＢの混合比を０％（０分）→０％（２分）→２０％（２０分）→１００％（２４分）→１００％（２６分）と経時的に増加させることにより行った（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ、温度４０℃）。ベタレイン色素の一種であるベタキサンチンはｍ／ｚおよび４７０ｎｍのＵ
Ｖ吸収をモニタリングすることで検出した。
【０２２３】
（解析結果）
得られたＬＣ／ＭＳ分析結果（全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ））を図１に示す。また、生成したベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値の経時変化を表１に示す。
分析の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤにおいて数種類のベタキサンチン類および生合成前駆体であるベタラミン酸の生産が検出された。いずれの共発現株においてもバリン−ベタキサンチンの蓄積量が最も高く、続いてイソロイシン−ベタキサンチン、ロイシン−ベタキサンチン、フェニルアラニン−ベタキサンチンの順で生産量が高いことが示された。
【０２２４】
以上より、微生物にチロシナーゼおよびＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼを導入することでベタレイン色素が効率よく生産可能であることが示された。
【０２２５】
【表１】
2015192669.tif 000014
【０２２６】
［実施例５］
実施例１の（５）で作製した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡｆｂｒ＋ＡｒｏＧｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤを用いて、ベタレイン色素の一種であるベタキサンチンの生産を行った実施例を以下に示す。
（前培養工程）
上記Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）ΔｔｙｒＲ：：Ｋａｎ／ＴｙｒＡｆｂｒ＋ＡｒｏＧｆｂｒ／ＲＳＴＹＲ＋ＭｊＤＯＤを、それぞれ前培養培地［５×Ｍ９  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｓａｌｔｓ  ４００μｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  ０．２μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ４μｌ、１００ｇ／Ｌ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ２００μｌ、１Ｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ４４μｌ、１％  Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ４μｌ、５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４  ２μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ  ＣｕＳＯ４  ２μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ２μｌ、１００ｍｇ／ｍｌ
Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ２μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ２μｌ  を、全量２ｍｌとなるように滅菌水に溶解したもの］２ｍｌに植菌し、培養温度３２℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養した。
【０２２７】
（本培養、変換工程）
上記で得られた前培養液を、本培養培地［５×Ｍ９  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｓａｌｔｓ  ４ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  ２μｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ４０μｌ、４０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ  １．５ｍｌ、１００ｇ／Ｌ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ２ｍｌ、１％  Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ４０μｌ、５０ｍＭ  ＦｅＳＯ４  ２０μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ  ＣｕＳＯ４  ２０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ２０μｌ、１００ｍｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ２０μｌ、５０ｍｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ２０μｌ  、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ１  ＯｎＥｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１  ４００μｌ、ＯｎＥｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２  １ｍｌ、およびＯｎＥｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３  ２０μｌを、全量２０ｍｌになるように滅菌水に溶解したもの］２０ｍｌにＯＤ６００＝０．３となるように植菌し、培養温度２０℃、１８０ｒｐｍ、２７時間培養し、タンパク発現誘導を行った。その後、１Ｍアスコルビン酸を２００μｌ添加し、さらに２１時間培養することで糖質を原料としたベタレイン色素生産を行った。得られた培養液１ｍｌから遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）して得られた上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
【０２２８】
解析は、実施例４と同様の方法で行なった。
（解析結果）
得られたＬＣ／ＭＳ分析結果（全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）およびＵＶ４７０ｎｍ）を図２（に示す。また、培養４８時間目の生成した各ベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値の値を表２に示す。
【０２２９】
分析の結果、培地中の糖質を原料として自ら生産したチロシンを利用することで、数種のベタキサンチン類およびベタキサンチンの前駆体であるベタラミン酸を生産することが確認された。特にバリン‐ベタキサンチンの蓄積量が最も多く、次いでＬ−ＤＯＰＡ−ベタキサンチン、ロイシン‐ベタキサンチン、イソロイシン‐ベタキサンチン、プロリン‐ベタキサンチン、フェニルアラニン‐ベタキサンチン、リシン‐ベタキサンチンの順で多く生産していた。以上より、チロシン生産大腸菌にチロシナーゼおよびＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼを導入することでチロシンを添加することなく、糖質を原料としてベタレイン色素が効率よく生産可能であることが示された。
【０２３０】
【表２】
2015192669.tif 000015
【０２３１】
［実施例６］
実施例２の（３）で作製した酵母株ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤを用いて、ベタレイン色素の一種であるベタキサンチンの生産を行った実施例を以下に示す。
（前培養工程）
上記ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤをＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）および２０ｍｇ／Ｌトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含有するＳＤ培地２ｍｌに植菌し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで１８時間培養した。
【０２３２】
（本培養工程）
得られた前培養液をＯＤ６００＝０．２となるようにＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）および２０ｍｇ／Ｌトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを含有するＳＲ培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ
Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％  ラフィノース）２０ｍｌに添加し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００＝０．７となった時点でガラクトース（終濃度２％）及びＣｕＳＯ４（終濃度４０μｇ／ｍｌ）、ＦｅＳＯ４（終濃度５０μＭ）を添加し、タンパク発現誘導を行った。引き続き、培養を継続し、培養後９時間においてガラクトース（終濃度１％）及びラフィノース（終濃度１％）を、培養後２４時間目においてリシン（終濃度３０ｍｇ／Ｌ）及びトリプトファン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）、ヒスチジン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）、アデニン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、５０時間目まで培養を実施した。
【０２３３】
（変換工程）
上記の方法で得られた培養液全量を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）して得た菌体を一度５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌにて洗浄後、再度、遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体を反応バッファー［５０μＭ  ＦｅＳＯ４、４μｇ／ｍｌ  ＣｕＳＯ４、１０ｍＭ  アスコルビン酸を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］４ｍｌにて懸濁した。得られた懸濁液に基質となるＬ−チロシンを添加することで反応を開始し、３０  ℃、１８０ｒｐｍにて２４時間反応させた。得られた反応液から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）した上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
【０２３４】
（解析）
実施例４（解析）と同様の手法で実施した。
（解析結果）
得られたＬＣ／ＭＳ分析結果（抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）およびＵＶ４７０ｎｍ）を図３に示す。また、生成したベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値の経時変化を表３に示す。
【０２３５】
分析の結果、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤにおいて数種のベタキサンチン類およびベタキサンチンの前駆体であるベタラミン酸を生産することが確認された。中でもグリシン‐ベタキサンチンの蓄積量が最も多く、次いでＤＯＰＡ−ベタキサンチン、プロリン‐ベタキサンチン、イソロイシン−ベタキサンチン、バリン−ベタキサンチンの順で多く生産していた。以上より、酵母にチロシナーゼおよびＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼを導入することでベタレイン色素が生産可能であることが示された。
【０２３６】
【表３】
2015192669.tif 000016
【０２３７】
［実施例７］
実施例３の（５）で作製した酵母株ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／ＣＹＰ７６ＡＤ３／ＡｔＡＴＲ１／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１を用いて、ベタシアニンの一種であるベタニンおよびベタキサンチンの同時生産を行った実施例を以下に示す。
【０２３８】
（前培養工程）
上記ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／ＣＹＰ７６ＡＤ３／ＡｔＡＴＲ１／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１をＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を含有するＳＤ培地２ｍｌに植菌し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養した。
【０２３９】
（本培養工程）
得られた前培養液をＯＤ６００＝０．２となるようにＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を含有するＳＲ培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％  ラフィノース）２０ｍｌに添加し、培養温度２５℃、１８０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００＝０．７となった時点でガラクトース（終濃度２％）及びＣｕＳＯ４（終濃度４０μｇ／ｍｌ）、ＦｅＳＯ４（終濃度５０μＭ）を添加し、タンパク発現誘導を行った。引き続き、培養を継続し、培養後３２時間においてガラクトース（終濃度１％）及びラフィノース（終濃度１％）を、培養後４８時間目においてリシン（終濃度３０ｍｇ／Ｌ）及びアデニン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、５０時間目まで培養を実施した。
【０２４０】
（変換工程）
上記の方法で得られた培養液全量を遠心分離（４℃、５０００ｒｐｍ、５分間）して得た菌体を一度５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌにて洗浄後、再度、遠心分離して菌体を回収した。回収された菌体を反応バッファー［５０μＭ  ＦｅＳＯ４、４μｇ／ｍｌ  ＣｕＳＯ４、２％  スクロースを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］４ｍｌにて懸濁した。得られた懸濁液にアスコルビン酸を終濃度１０ｍＭおよび基質となるＬ−チロシン、ＵＤＰ−グルコースを終濃度１ｍＭとなるように添加することで反応を開始し、反応温度をそれぞれ２０℃、２５℃、３０℃、３５℃として、１８０ｒｐｍにて２４時間反応させた。得られた反応液から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）した上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
【０２４１】
（解析）
解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６４６０  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ＬＣ／ＭＳを用いて行なった。カラムはＳｕｎＦｉｒｅＴＭ  Ｃ１８  ３．５μｍ
２．１×１５０ｍｍ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。溶出は１％ギ酸（ＳｏｌｖｅｎｔＡ）と８０％アセトニトリル（ＳｏｌｖｅｎｔＢ）を用い、ＳｏｌｖｅｎｔＢの混合比を０％（０分）→０％（２分）→２０％（２０分）→１００％（２４分）→１００％（２６分）と経時的に増加させることにより行った（流速０．３ｍｌ／ｍｉｎ、温度４０℃）。ベタシアニンの一種であるベタニンはｍ／ｚ＝５５１および５４０ｎｍのＵＶ吸収、ベタキサンチンはｍ／ｚおよび４７０ｎｍのＵＶ吸収をモニタリングすることで検出した。
【０２４２】
（解析結果）
反応温度２０℃のサンプルにおけるベタニン由来の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ
）およびＵＶ５４０ｎｍを図４に、ベタキサンチン由来の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）およびＵＶ４７０ｎｍを図５に示す。また、各反応温度における反応後２４時間目のベタニンの生成量を表４に、各ベタキサンチンの分子イオンピークのシグナルＡｒｅａ値を表５に示す。
【０２４３】
分析の結果、全ての反応温度条件でベタニンおよびベタキサンチンの生産を確認した。反応温度が低くなるほどベタニンの蓄積量が増える傾向にあり、反応温度２０℃において最も高い５．７ｍＭの蓄積が確認された。外から添加したチロシン（１ｍＭ）以上のベタニン蓄積量が確認されていることから、反応バッファーに含有されているスクロースを糖質原料としてベタニンの一貫生産が可能であることも確認された。
【０２４４】
一方、ベタキサンチンはベタニンの傾向とは異なり、反応温度が高くなるほど各ベタキサンチン蓄積量の総和が増える傾向にあり、反応温度３５℃において最も高い蓄積を示した。以上より、チロシナーゼ、ＤＯＰＡ  ４，５−ジオキシゲナーゼに加え、ＣＹＰ７６ＡＤ３、ＮＡＤＰＨ−Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  レダクターゼ（ＡＴＲ１）およびベタニジン  ５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼを導入した微生物の休止菌体を用いることでベタシアニンの一種であるベタニンおよびベタキサンチンが効率よく生産可能であることが示された。
【０２４５】
【表４】
2015192669.tif 000017
【０２４６】
【表５】
2015192669.tif 000018
【０２４７】
［実施例８］
実施例３の（６）で作製した酵母株ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１、および実施例３の（７）で作製した酵母株ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｍｊ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１を用いて、チロシナーゼがＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼとしても機能する微生物でのベタシアニン生産を行った実施例を以下に示す。
【０２４８】
（前培養工程）
上記ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１およびＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｍｊ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１をＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ
ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）およびヒスチジン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を含有するＳＤ培地２ｍｌに植菌し、培養温度３０℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養した。
【０２４９】
（本培養工程）
得られた前培養液をＯＤ６００＝０．２となるようにＹｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）およびヒスチジン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を含有するＳＲ培地
（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ社）、２％  ラフィノース）２０ｍｌに添加し、培養温度２５℃、１８０ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００＝０．７となった時点でガラクトース（終濃度２％）及びＣｕＳＯ４（終濃度４０μｇ／ｍｌ）、ＦｅＳＯ４（終濃度５０μＭ）を添加し、タンパク発現誘導を行った。引き続き、培養を継続し、培養後３２時間においてガラクトース（終濃度１％）及びラフィノース（終濃度１％）を、培養後４８時間目においてリシン（終濃度３０ｍｇ／Ｌ）、アデニン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）およびヒスチジンヒスチジン（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、５０時間目まで培養を実施した。
【０２５０】
（変換工程）
実施例７（変換工程）と同様の方法で反応を開始し、２５℃、１８０ｒｐｍにて２４時間反応させた。得られた反応液から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分間）した上清を０．４５μｍコスモスピンフィルター（日本ミリポア株式会社製）に通し、ろ液を分析サンプルとした。
【０２５１】
（解析）
実施例７（解析）と同様の手法で実施した。
（解析結果）
ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１の反応サンプルのＬＣ／ＭＳ分析結果（抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）およびＵＶ５４０ｎｍ）を図６に示す。また、各株の反応後２４時間目のベタニンの生成量を表６に示す。
【０２５２】
分析の結果、ＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｄｂ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１およびＹＰＨ５００／ＲＳＴＹＲ／ＭｊＤＯＤ／Ｍｊ５ＧＴ／ＡｔＳＵＳ１両株でベタニンの生産を確認した。このことから、ベタニン生産にはＬ−ＤＯＰＡ  オキシダーゼとしてＣＹＰ７６ＡＤ１、ＣＹＰ７６ＡＤ３は必須ではなく、チロシナーゼで代用可能であることが明らかとなった。しかしながら、蓄積量は極めて低く、ベタシアニンの高生産のためにはＣＹＰ７６ＡＤ１またはＣＹＰ７６ＡＤ３を導入しておくことが好ましい。
【０２５３】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【配列表】
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