(57)【要約】【課題】本発明は、機能獲得型の変異体を効率よく取得する方法及び超耐熱性セロビオハイドロラーゼを提供する。【解決手段】環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質のＯＲＦ配列を検出し、当該ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングし、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列又はそれらの１若しくは数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなる１又は複数のＰＣＲクローンを得、得られた各ＰＣＲクローンについて塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を決定し、得られた各ＰＣＲクローンがコードするタンパク質及び前記ＯＲＦ配列がコードするタンパク質からなる群より選択される１以上の酵素活性を測定する、酵素の自然変異体の取得方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の自然変異体を取得する方法であって、
（１）環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ＯＲＦ配列を検出する工程と、
（２）前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行い、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる１又は複数のＰＣＲクローンを得る工程と、
（３）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
（４）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の自然変異体の取得方法。
【請求項２】
酵素の変異体を製造する方法であって、
（１）環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ＯＲＦ配列を検出する工程と、
（２）前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行い、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる１又は複数のＰＣＲクローンを得る工程と、
（３）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
（４）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
（５）前記工程（３）及び前記工程（４）の後、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列における差異と前記酵素活性との関係を調べる工程と、
（６）前記工程（５）において得られたアミノ酸配列の差異と酵素活性との関係性に基づき、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することにより、前記酵素活性が向上した変異体を製造する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の変異体の製造方法。
【請求項３】
前記環境微生物叢のメタゲノムＤＮＡが、高温土壌由来メタゲノムＤＮＡであり、前記酵素が、少なくとも７０℃以上で酵素活性を示す耐熱性酵素である、請求項２に記載の酵素の変異体の製造方法。
【請求項４】
前記酵素がセルラーゼである、請求項２又は３に記載の酵素の変異体の製造方法。
【請求項５】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、８８位のセリンと、２３０位のフェニルアラニンと、４１４位のセリンを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、８８位がセリンであり、２３０位がフェニルアラニンであり、４１４位がセリンである。）からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項６】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、８８位のセリンと、２３０位のフェニルアラニンと、４１４位のセリンを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、８８位がセリンであり、２３０位がフェニルアラニンであり、４１４位がセリンである。）からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ) 配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｅ） 配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項９】
真核微生物である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の形質転換体内で、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項６に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項１０に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
【請求項１２】
セルロースを含む材料を、請求項５に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項６に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項８又は９に記載の形質転換体、又は請求項１０に記載の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
【請求項１３】
前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを接触させる、請求項１２に記載のセルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素の自然変異体の取得方法、及び当該方法により得られた超耐熱性セロビオハイドロラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロースバイオマスは地球上に豊富に存在し、これを原料とするエタノールなどのバイオ燃料は化石燃料に代わる輸送用エネルギーとして期待されている。リグノセルロースをエタノールに変換するにはセルロース、へミセルロースの糖化が必要である。セルロース糖化には、硫酸糖化と酵素糖化の２つの方法がある。一般にセルラーゼ酵素と総称されるグリコシド加水分解酵素による糖化は、硫酸糖化と比べ、硫酸スラッジを生じない、エネルギー投入量が少ない、過分解が起こらず収率が高いなどの利点がある。
【０００３】
一方、植物細胞壁を構成するセルロースは互いに強固な水素結合で結び付いた結晶構造を持つため、ほとんど水に溶けず、酵素によるセルロース加水分解は固液反応である。固液反応は、固体表面上で結晶性セルロースの加水分解が進むため、酵素による糖化効率は著しく低い。例えば、主要なセルロース加水分解酵素であるセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）は他の多糖類分解酵素と比べて一桁から二桁程度加水分解速度が遅く、このため、セルロースバイオマスの糖化には多量の酵素を必要とし、セルロース系バイオ燃料の主要なコスト要因となっている。セルロースエタノールの低コスト化のためには、セルラーゼ酵素の糖化効率を格段に向上させることが必要である。
【０００４】
酵素効率を高める一つの方法は、酵素タンパク質の耐熱性を上げることである。酵素タンパク質の耐熱性向上のため、ランダムにアミノ酸配列を置換するｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＥ）法、特定部位に限定してアミノ酸置換するｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＤＭ）法、複数の遺伝子を数ヶ所で切断、シャッフリングすることによりキメラ配列を作る方法など、アミノ酸変異を導入する様々な酵素改良手段が試されている。
【０００５】
ＤＥ法による酵素改変は、理論上、効率が極めて悪い。点突然変異の数とともに、変異体の数が天文学的な数に増える、いわゆる「組合せ爆発問題」が生じるからである。最適なアミノ酸配置を得ようとすれば、すべてのアミノ酸残基の組合せについて突然変異体ライブラリーを作製し、機能アッセイする必要があるが、原理的に不可能である。また、突然変異のほとんどが機能を失う機能不全（ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）型であり、中立な突然変異や有利な機能を獲得する機能獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）型はきわめて稀であることも、ＤＥ法による最適アミノ酸配列の探索効率を悪くしている。膨大な数の突然変異体ライブラリーをスクリーニングしなければ有効な突然変異体が得られないこと、効果的なハイスループットスクリーニング法や安定した遺伝子発現システムがない等の理由から（例えば、非特許文献１参照。）、このＤＥ法によるセルラーゼ酵素の機能改良は十分には進んでいない。
【０００６】
例えば、ナカザワらは、木材腐朽菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのエンドグルカナーゼＥＧIIIをＤＥ法により改良を行ったことを報告している（非特許文献２参照。）。このＥＧIIIは、２１８アミノ酸残基から構成される比較的小さな分子量を持つタンパク質である。しかし、この小さなタンパク質であっても、任意の１ヵ所にアミノ酸置換を起こす突然変異が入った変異体の数は４，３６０通り（２０×２１８）、任意の２ヶ所に突然変異が入った変異体の数は９４６万通り（２０×２０×２１８×２１７÷２）、さらに、任意の３ヶ所に突然変異が入った変異体の数は、組合せ爆発により、１３６億２４１３万通り（２０×２０×２０×（２１８×２１７×２１６÷６））も生じてしまう。たった２、３ヶ所に変異が入った変異体を得るだけでも、数千万〜数百億個の突然変異ライブラリー作製とその機能スクリーニングが必要であり、現実的ではない。ナカザワらは、第一世代及び第二世代突然変異体合計１１，０００個体について機能スクリーニングを行ったが、至適温度はわずか＋５℃の改善にとどまり、耐熱性の大幅な向上は達成されることはなかった。突然変異体ライブラリーの規模が小さければ、有効な変異体が見つからないのは当然であろう。また、機能スクリーニングを行った第一世代突然変異ライブラリー９，０００コロニーのうち、ＣＭＣ加水分解活性を有する変異体は４６コロニーしか得られていない。残りの突然変異体８，９５４個はアミノ酸変異による機能喪失、あるいは、遺伝子の発現不全であると考えられ、ＤＥ法のエラーＰＣＲによるランダム突然変異のほとんどが、酵素タンパク質の機能喪失をもたらしている。このように、ＤＥ法は機能喪失変異体が大量に発生するため、スクリーニング効率が非常に悪い。
【０００７】
遺伝子シャッフル法は、いまだ、耐熱性において親遺伝子を超えるキメラ遺伝子が得られていない。例えば、Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎらにより、複数のセロビオハイドロラーゼ遺伝子を数ヶ所で切断、シャッフリングすることによりキメラ遺伝子を作り、酵素機能の改善を図る方法が提案されている（非特許文献３参照。）。この方法によれば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのエキソグルカナーゼＣＢＨ IIの耐熱性向上を目的として、好熱性糸状菌Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓとＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのＣＢＨ II酵素遺伝子を遺伝子シャッフリングにより組合せ、キメラ酵素を作製したが、当該キメラ酵素の耐熱性は、親となった好熱性糸状菌Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのＣＢＨ IIを超えることはなく、有効な遺伝子シャフリング効果は得られていない。
【０００８】
ＤＥ法がランダムな突然変異によるアミノ酸置換によるのに対して、ＳＤＭ法は、酵素タンパク質の三次元立体構造データに基づいてアミノ酸置換、欠損、あるいは挿入等の突然変異を起こす方法である。ＤＥ法のように膨大な突然変異体のスクリーニングを必要としないが、酵素機能の向上に関わる部位の特定は一般には予想が困難であり、ＳＤＭ法によりセルラーゼ酵素機能改善に顕著な効果が見られた例は多くない。
【０００９】
例えばセロビオハイドロラーゼは、Ｎ末端とＣ末端にそれぞれループ構造があり、活性中心を覆うトンネル構造を形成している。この構造に着目し、ループ内のアミノ酸を置換するＳＤＭ法が試されている。Ｚｈａｎｇらは、好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａのセロビオハイドロラーゼＴｆＣｅｌ６Ｂの三次元立体構造を推定し、活性部位のトンネル構造を形成するＮ末端、Ｃ末端のループに二重突然変異によりジスルフィド結合を導入し、耐熱性の向上を試みたが、期待とは裏腹に、得られた変異体では酵素活性の半減温度Ｔ５０が１０℃減少した（非特許文献４参照。）。Ｚｈａｎｇらは、さらに４ヶ所のグリシン残基をアラニン、セリン、プロリンに置換したが、突然変異により耐熱性の向上したセロビオハイドロラーゼは一つも得られず、ほとんどの突然変異体で耐熱性が５〜１０℃低下したことも報告されている。
【００１０】
また、Ｗｏｈｌｆａｈｒｔらは、糸状菌Ｔ.ｒｅｅｓｅｉのＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼＴｒＣｅｌ６Ａの熱安定性を向上させるため、Ｎ末ループ及びＣ末ループ上と、その近くに位置しているアミノ酸残基に変異を加えた変異体を製造し、当該変異体は、ｐＨ７．０では熱変性温度（Ｔｍ）が上昇したが、野生型ＴｒＣｅｌ６Ａの至適ｐＨであるｐＨ５．０では、むしろＴｍ値は劣化したことが報告されている（非特許文献５参照。）。一方、ｖｏｎ Ｏｓｓｏｗｓｋｉらは、糸状菌Ｔ.ｒｅｅｓｅｉのＧＨ７ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼＴｒＣｅｌ７Ａ活性中心のトンネルループを形成しているｅｘｏ−ｌｏｏｐの構造を安定化させるため、当該ループ内にＳＳ（ジスルフィド）結合を導入した変異体を作製したが、当該変異体では何ら熱安定性の改善が認められなかった（非特許文献６参照。）。このように、セロビオハイドロラーゼ酵素機能に深くかかわると考えられているループ構造を形成するＣ末ループに水素結合やＳＳ結合を導入する試みが多数行われているが、いまのところ、耐熱性の向上等、酵素機能改善は成功していない。
【００１１】
相同な遺伝子を生物種間比較すると、よく保存されている領域と頻繁にアミノ酸変異が入る領域があることが分かる。この保存領域は、特定カテゴリーのタンパク質を特徴付ける共通した配列であることから「コンセンサス配列」と呼ばれている。このコンセンサス配列中のアミノ酸残基が変異すると酵素機能が失われやすい部位であり、それゆえ長い進化の過程で良く保存されてきたと考えられる。したがって、コンセンサス配列にアミノ酸変異を起こす突然変異は、機能喪失する可能性が高い。そこで、コンセンサス配列を避けて突然変異を加えるＳＤＭ法が試みられている。しかし、この方法が適用できるのは、Ｘ線結晶構造解析等によりタンパク質の三次元構造が決定された酵素に限られ、そうした三次元構造の判明している酵素タンパク質は少ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Himmel，et al.，Current Opinion in Biotechnology，1999，vol.10，p.358〜364.
【非特許文献２】Nakazawa，et al.，Applied Microbiology and Biotechnology，2009，vol.83，p.649〜657.
【非特許文献３】Heinzelman，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，vol.106，p.5610〜5615.
【非特許文献４】Zhang，et al.，European Journal of Biochemistry，2000，vol.267，p.3101〜3115.
【非特許文献５】Wohlfahrt，et al.，Biochemistry，2003，vol.42，p.10095〜10103.
【非特許文献６】von Ossowski，et al.，Journal of Molecular Biology，2003，vol.333，p.817〜829.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、機能獲得型の変異体を効率よく取得する方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、前記方法により得られた新規な超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、高温土壌に含まれていた微生物叢のメタゲノムＤＮＡから分離したセロビオハイドロラーゼ酵素の塩基配列から設計したプライマーを使い、高温土壌微生物叢のメタゲノムＤＮＡに対し、多数個、例えば〜３００個のコロニーＰＣＲを行うことにより、複数のアミノ酸置換を伴う、又はサイレントな一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）を持つ複数の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ活性を有する自然変異体が取得できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明に係る酵素の自然変異体の取得方法、酵素の変異体の製造方法、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、軽質転換体、超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、セルラーゼ混合物及びセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１３］である。
［１］  酵素の自然変異体を取得する方法であって、
（１）環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ＯＲＦ配列を検出する工程と、
（２）前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行い、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる１又は複数のＰＣＲクローンを得る工程と、
（３）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
（４）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の自然変異体の取得方法。
［２］  酵素の変異体を製造する方法であって、
（１）環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ＯＲＦ配列を検出する工程と、
（２）前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行い、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる１又は複数のＰＣＲクローンを得る工程と、
（３）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
（４）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程と、
（５）前記工程（３）及び前記工程（４）の後、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列における差異と前記酵素活性との関係を調べる工程と、
（６）前記工程（５）において得られたアミノ酸配列の差異と酵素活性との関係性に基づき、前記オープンリーディングフレーム配列がコードするアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することにより、前記酵素活性が向上した変異体を製造する工程と、
を有することを特徴とする、酵素の変異体の製造方法。
［３］  前記環境微生物叢のメタゲノムＤＮＡが、高温土壌由来メタゲノムＤＮＡであり、前記酵素が、少なくとも７０℃以上で酵素活性を示す耐熱性酵素である、前記［２］の酵素の変異体の製造方法。
［４］  前記酵素がセルラーゼである、前記［２］又は［３］の酵素の変異体の製造方法。
［５］  （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、８８位のセリンと、２３０位のフェニルアラニンと、４１４位のセリンを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、８８位がセリンであり、２３０位がフェニルアラニンであり、４１４位がセリンである。）からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［６］  （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、８８位のセリンと、２３０位のフェニルアラニンと、４１４位のセリンを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、８８位がセリンであり、２３０位がフェニルアラニンであり、４１４位がセリンである。）からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ) 配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｅ） 配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［７］  前記［６］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［８］  前記［７］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［９］  真核微生物である、前記［８］の形質転換体。
［１０］  前記［８］又は［９］の形質転換体内で、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
［１１］  前記［５］の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［６］の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［１０］の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
［１２］  セルロースを含む材料を、前記［５］の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［６］の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［８］又は［９］の形質転換体、又は前記［１０］の超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
［１３］  前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを接触させる、前記［１２］のセルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る酵素の自然変異体の取得方法、及び当該取得方法を利用した酵素の変異体の製造方法により、機能獲得型の酵素の変異体を効率よく得ることができる。
また、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも８０℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡ、及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのアミノ酸配列アライメント図である。
【図２】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子の自然変異体がコードするセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示した図である。
【図３】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子の自然変異体がコードするセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質のＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図４】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの各基質に対するセロビオハイドロラーゼ活性の測定結果を示した図である。
【図５】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図６】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性（５０℃、７０℃、又は９０℃）を計測した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、４０分間のプリインキュベーション後のＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのＰＳＡ加水分解活性が５０％に減少する温度Ｔ５０を計測した結果を示した図である。
【図８】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのアミノ酸置換変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの各酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［酵素の自然変異体の取得方法］
本発明に係る酵素の自然変異体の取得方法（以下、「本発明に係る自然変異体取得方法」ということがある。）は、酵素遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、環境微生物叢から調製されたメタゲノムＤＮＡから、当該酵素遺伝子の自然変異体を取得することを特徴とする。
機能獲得型の突然変異だけを集め、変異体ライブラリーを作ることができれば、膨大に発生する機能不全突然変異体除去のための無駄なスクリーニングを回避でき、比較的少数のアミノ酸置換変異体の機能アッセイにより、機能向上した変異体を効率よく得ることが可能である。環境微生物叢から調製されたメタゲノムＤＮＡには、機能獲得型の自然変異体が多く含まれている。このため、当該メタゲノムＤＮＡを母体とすることにより、機能獲得型の変異体を効率よく取得することができる。
【００１９】
環境微生物叢から調製されたメタゲノムＤＮＡに機能獲得型の自然変異体が多く含まれている理由は、分子進化の中立説に基づく。ＳＮＰはゲノムＤＮＡに頻繁に見られる塩基配列多型の一つである。例えば、ヒトゲノムＤＮＡの場合、おおよそ１，０００塩基あたり１塩基程度のＳＮＰが出現すると言われている。遺伝子に出現するＳＮＰは、アミノ酸変異を伴うこともあれば、同義的置換やイントロン上のＳＮＰなどアミノ酸変異を伴わないサイレント変異のこともある。ＳＮＰがアミノ酸変異を伴う場合、遺伝子がコードするタンパク質に何らかの構造上又は機能上の変化が起こることがある。広く受け入れられている分子進化の中立説（Kimura，Nature，1968，vol.217(5129)，p. 624〜626）によれば、機能劣化や機能不全などの個体の生存価に悪影響を与えるような進化的に不利なアミノ酸置換を起こす遺伝的変異は集団から排除される。一方、突然変異が進化的に中立又は有利であれば、この変異遺伝子を持つ個体は集団から排除されることなく、遺伝子は次世代に受け継がれ、ＳＮＰ等の遺伝的多様性が蓄積していく。この分子進化の中立説によれば、アミノ酸置換を伴うＳＮＰを有する自然変異体には、機能不全を起こすことのない、中立又は有利な変異、すなわち、機能獲得型の突然変異が含まれていると考えられる。
【００２０】
すなわち、本発明に係る自然変異体取得方法は、酵素の自然変異体を取得する方法であって、下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする。
（１）環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ＯＲＦ配列を検出する工程と、
（２）前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行い、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる１又は複数のＰＣＲクローンを得る工程と、
（３）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンについて、塩基配列及び当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定する工程と、
（４）前記工程（２）において得られた各ＰＣＲクローンがコードするタンパク質の酵素活性を測定する工程。
【００２１】
環境微生物叢メタゲノムＤＮＡは、環境微生物叢（環境サンプルに含有されている微生物集団）のゲノムＤＮＡを物理的に細かく断片化したものである。本発明において用いられる環境微生物叢メタゲノムＤＮＡとしては、土壌や汚泥、湖水、海水などの微生物叢から作製されたメタゲノムＤＮＡを用いることができる。耐熱性に優れた酵素変異体の取得を目的とする場合には、高温環境から採取されたサンプルの微生物叢から作製されたメタゲノムＤＮＡを用いることが好ましい。高温環境から採取されたサンプルとしては、高温温泉土壌サンプル等が挙げられる。
【００２２】
本発明に係る自然変異体取得方法としては、まず、工程（１）として、環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について決定された塩基配列からなるゲノムデータベースから、酵素活性を有するタンパク質ＯＲＦ配列を検出する。当該ゲノムデータベースは、環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部について、ショットガンシークエンス法等の長鎖ＤＮＡのシークエンス解析に使用される方法により作成することができる。
【００２３】
具体的には、環境微生物叢メタゲノムＤＮＡの一部に対して、ショットガンシーケンスデータのアセンブル、及びアノテーションを行い、特定のアミノ酸配列をもつＯＲＦ配列を検出する。目的の酵素活性を有するタンパク質のＯＲＦ配列は、当該酵素活性を有する塩基配列既知の遺伝子の塩基配列に基づき、塩基配列の相同性（配列同一性）解析等の公知の手法により検出することができる。
【００２４】
次いで、工程（２）として、前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、１又は複数の環境微生物叢メタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行う。使用するプライマーは、当該ＯＲＦ配列のうち、当該酵素の触媒領域（触媒ドメイン）を少なくとも含む領域をＰＣＲ増幅可能なように設計されたものが好ましい。メタゲノムＤＮＡからＰＣＲクローニングを行うことにより、当該ＯＲＦ配列の全長又は部分領域がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＰＣＲクローンだけではなく、アミノ酸残基が１若しくは数個程度、欠失、置換若しくは付加された自然変異体が含まれているＰＣＲクローンが、１又は複数個クローニングされる。
【００２５】
次いで、工程（２）により得られた各ＰＣＲクローンの塩基配列を解析し、当該ＰＣＲクローンがコードするアミノ酸配列を決定する（工程（３））。また、当該ＰＣＲクローンの酵素活性を測定する（工程（４））。これにより、酵素活性を有する変異体を取得できる。
【００２６】
本発明においては、由来の異なる複数のメタゲノムＤＮＡに対して、同一のプライマーを用いてＰＣＲクローニングを行うことが好ましい。プライマー設計の元となったメタゲノムＤＮＡばかりでなく、由来の異なる複数のメタゲノムＤＮＡに対してＰＣＲクローニングを行い、かつ、設計されたプライマーの増幅断片を含むプラスミドを取り込んだコロニーを大規模に、例えば、数百個以上拾い、ＰＣＲライブラリーを構築することにより、より多くの当該酵素遺伝子のアミノ酸置換変異体が得られる。
【００２７】
［酵素の変異体の製造方法］
ＰＣＲクローニングでは通常、〜１０個コロニーを拾い、目的の遺伝子のクローニングを行うが、本発明に係る自然変異体取得方法では、各メタゲノムＤＮＡサンプル当り１００〜個の多数個のコロニーを拾い、遺伝子クローニングを行うことが好ましい。これにより、目的酵素遺伝子の多様なＳＮＰを含む自然変異体から構成されるライブラリーを構築し、この自然変異体ライブラリーに対し、機能スクリーニングを行うことにより、耐熱性の向上等の酵素機能の改良を効率よく行い、酵素活性が改良された新たな変異体を効率よく製造できる。
【００２８】
すなわち、本発明に係る酵素の変異体の製造方法（以下、「本発明に係る変異体製造方法」ということがある。）は、前記工程（１）〜（４）に加えて、さらに下記工程（５）及び（６）を有することを特徴とする。
（５）前記工程（３）及び前記工程（４）の後、前記ＯＲＦ配列がコードするアミノ酸配列における差異と前記酵素活性との関係を調べる工程と、
（６）前記工程（５）において得られたアミノ酸配列の差異と酵素活性との関係性に基づき、前記ＯＲＦ配列がコードするアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することにより、前記酵素活性が向上した変異体を製造する工程。
【００２９】
例えば、工程（５）において、アミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸残基が相違する２つのＰＣＲクローンがコードするタンパク質について酵素活性を比較することにより、酵素活性を向上し得るアミノ酸変異が明らかになる。次いで、工程（６）において、前記ＯＲＦ配列からなるＤＮＡ断片、又は前記工程（２）で得られたＰＣＲクローンに、より酵素活性を向上させ得るアミノ酸変異を実現するための塩基変異をさらに導入することにより、酵素活性が向上した変異体が製造される。なお、１又は２以上のアミノ酸残基の変異を実現するための塩基の置換等は、常法により行うことができる。
【００３０】
［超耐熱性セロビオハイドロラーゼ］
本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内の１ヶ所、５地点から採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、各メタゲノムＤＮＡを用いて、本発明に係る自然変異体取得方法を行い、耐熱性に優れた新規セロビオハイドロラーゼを得た。
【００３１】
具体的には、まず、１つのメタゲノムＤＮＡから、既知セロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）酵素とアミノ酸配列相同性の高いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を１３個得た。これらのＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡからセロビオハイドロラーゼ触媒領域をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）分解活性及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。
最終的に、１個のオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６から、ＰＳＡ分解活性を持つ新規の超耐熱性セロビオハイドロラーゼ（ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ）を得た。オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６は開始コドンのメチオニンが欠損した不完全長配列であったため、当該ＯＲＦからクローニングされたＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ遺伝子は、ＧＨ６触媒領域のみから構成される部分遺伝子である。
【００３２】
次いで、５つのメタゲノムＤＮＡに対して、前記ＯＲＦ配列に基づいて設計されたプライマーを用いてＰＣＲクローニングを行うことにより、最終的には、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのアミノ酸置換変異体を１２種類得た。本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡの変異体のうち、最も高い耐熱性を示したＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳ（２９９位のアミノ酸残基がアルギニンであり、３５１位のアミノ酸残基がアラニンであり、８８位のアミノ酸残基がセリンであり、２３０位のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、４１４位のアミノ酸残基がセリンである変異体）である。最も出現頻度が高かったＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡのアミノ酸配列を配列番号３に、これをコードする塩基配列を配列番号４に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのアミノ酸配列を配列番号１に、これをコードする塩基配列を配列番号２に示す。
【００３３】
後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるＬｉｃｈｅｎａｎや結晶性セルロースのアビセルに対し、弱いながらも分解活性を示した。一方、ＣＭＣやβ−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるＬａｍｉｎａｒｉｎに対し、ほとんど分解活性は示さなかった。また、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、既知のクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＧＨ６ファミリーに属するグリコシドハイドロラーゼ（配列番号１１）であり、その配列同一性はわずか６６％しかなかった。基質特異性、ＰＳＡ加水分解反応産物のＨＰＬＣ分析、及び既知のセロビオハイドロラーゼとのアミノ酸配列の配列同一性（相同性）から、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、ＧＨ６ファミリーに属する新規なセロビオハイドロラーゼであることが明らかとなった。
【００３４】
ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１＜９＞に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、５０〜９５℃の広い温度範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。大腸菌を宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのセロビオハイドロラーゼ活性は、５０〜９５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡのアミノ酸置換変異体よりもはるかに耐熱性に優れていた。
【００３５】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳに対しても、セロビオハイドロラーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００３６】
すなわち、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、超耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、８８位のセリンと、２３０位のフェニルアラニンと、４１４位のセリンを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、８８位がセリンであり、２３０位がフェニルアラニンであり、４１４位がセリンである。）からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
【００３７】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００３８】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であれば特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
【００３９】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４０】
前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ−１６６等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００４１】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００４２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。８０〜１００℃においても非常に高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことから、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域として有することにより、超耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られる。
【００４３】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡを基質とする。当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡ以外のその他のβグルカンを基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるＬｉｃｈｅｎａｎ、Ａｖｉｃｅｌ、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＣＭＣ）、β−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン、β−１，３結合からなるグルカン、β−１，６結合からなるグルカン、及びキシラン等が挙げられる。本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、ＰＳＡに加えて、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカンと結晶性セルロースの少なくとも一方を基質とするものが好ましく、ＰＳＡ、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン、及び結晶性セルロースを基質とするものがより好ましい。
【００４４】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ５．０〜６．５の範囲内にある。本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、少なくともｐＨ５．０〜６．５の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０〜７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましい。
【００４５】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、セロビオハイドロラーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性等が挙げられる。
【００４６】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のセロビオハイドロラーゼが有する、セロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼには、公知のセロビオハイドロラーゼに対し、セロビオハイドロラーゼ触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００４７】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００４８】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
【００４９】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
【００５０】
また、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００５１】
［超耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００５２】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、８８位のセリンと、２３０位のフェニルアラニンと、４１４位のセリンを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、８８位がセリンであり、２３０位がフェニルアラニンであり、４１４位がセリンである。）からなり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｄ） 配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ） 配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００５３】
なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００５４】
前記（ａ）〜（ｅ)の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子組換え技術によって行うことができる。
【００５５】
配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ−１６６をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子」ということがある。）の全長若しくはセロビオハイドロラーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００５６】
前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上であれば特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
【００５７】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００５８】
例えば、前記（ｂ）又は（ｃ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は複数個の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）又は（ｃ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００５９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００６０】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも８０℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００６１】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００６２】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００６３】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
【００６４】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００６５】
発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産できる。特に、当該形質転換体がコウジカビ等の糸状菌や酵母等の真核微生物である場合には、より耐熱性に優れた超耐熱性セロビオハイドロラーゼを比較的簡便に大量生産することができる。
【００６６】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００６７】
本発明に係る形質転換体が植物である場合、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
【００６８】
［超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法］
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に超耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させる。
【００６９】
形質転換体によって生産された超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００７０】
形質転換体から超耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出・精製する方法は、超耐熱性セロビオハイドロラーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、超耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、塩析法、限外濾過法、クロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００７１】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に超耐熱性セロビオハイドロラーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の超耐熱性セロビオハイドロラーゼを簡便に精製することができる。
【００７２】
［セルラーゼ混合物］
前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含むセルラーゼ混合物として使用することもできる。前記本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出・精製されたものであってもよい。本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００７３】
当該セルラーゼ混合物に含まれる前記超耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のセルラーゼとしては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るセルラーゼ混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
【００７４】
当該セルラーゼ混合物に含まれるその他のセルラーゼは、少なくとも７０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましく、７０〜９０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることがより好ましい。当該セルラーゼ混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該セルラーゼ混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該セルラーゼ混合物が耐熱性セルラーセのみを含む場合、当該セルラーゼ混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００７５】
［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
【００７６】
セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、破砕・細断等の物理的処理、酸・アルカリ等の化学処理、適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００７７】
本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該超耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、５５〜１００℃、ｐＨ３．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、７０〜１００℃、ｐＨ４．０〜６．０で反応を行うことがより好ましい。反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で行うことができる。
【００７８】
セルロースの加水分解反応には、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを用いることも好ましい。当該その他のセルラーゼとしては、前記セルラーゼ混合物に含められるセルラーゼと同様のものを用いることができ、少なくとも７０℃で、好ましくは少なくとも７０〜１００℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る超耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された超耐熱性セロビオハイドロラーゼに代えて、前記セルラーゼ混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００７９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８０】
［実施例１］温泉土壌からの新規超耐熱性セロビオハイドロラーゼのクローニング
＜１＞  高温土壌メタゲノムＤＮＡの調製
日本国内の、高温の温泉が噴き出している地域から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらのサンプルは、採取時の温度３３〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。これら温泉土壌サンプルの内、メタゲノムＤＮＡサンプル名称が、それぞれ、ＡＲ１９、ＯＪＳ２、ＯＪＳ４、ＯＪＳ７、ＯＪＳ９である５サンプルについて、ＤＮＡを抽出した。採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。ＡＲ１９はＤＮＡ量が１０μｇ以上得られ、このうち５μｇを使用し、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４を用いてメタゲノムシーケンスを行った。残りのＤＮＡはセルラーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。一方、ＤＮＡ量が少なかった（１０μｇ以下）試料では、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてゲノム増幅を行った。
【００８１】
＜２＞  温泉土壌メタゲノムデータのアセンブルと統計量
温泉土壌メタゲノムから抽出したゲノムＤＮＡサンプルの一つＡＲ１９を使い、Ｒｏｃｈｅ社製  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙショットガンシーケンス用の標準プロトコールに従って、ショットガンシーケンスを３回行った。Ｒｏｃｈｅ  ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｍａｔｃｈ  （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ  ｕｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
Ｑｕａｌｉｔｙフィルター処理したリードと１００ｂｐ以上のアセンブルコンティグは、合計３３０Ｍｂｐあり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２，７６６，３３２リードのうち２，０４０，６５１リードが、平均で１０２７ｂｐ以上のコンティグにアセンブルされ（計１０１，３７２コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１８７，９７０ｂｐであった。
【００８２】
アセンブル後の配列は、ＫＥＧＧデータベース（Kanehisa, M. Science & Technology Japan，1996，No.59，p.34-38、http://www.genome.jp/kegg/、2011/5/11（検索））に参照し、全てのコンティグ及びシングルトンを、バクテリア、アーキア（古細菌）、真核生物、ウィルス、いずれにも属さないものの５カテゴリーに系統分類した。アセンブル後の配列長（＝総コンティグ長＋総シングルトン長）３３０Ｍｂｐのうち、バクテリアにヒットした配列長５９．９Ｍｂｐ、アーキアにヒットした配列長３．１Ｍｂｐ、真核生物にヒットした配列長２５，４９９ｂｐ、ウィルスにヒットした配列長３８４，２５５ｂｐであった。これらの結果から、このメタゲノムデータベースは、わずか１９．２％の既知ＤＮＡ配列を含んでいるにすぎないことがわかった。いずれにも属さない配列長は２６６．７Ｍｂｐあり、アセンブル後の配列全体の８０．８％を占めた。これらは、バクテリア、アーキア、又は真核生物のいずれかに由来する新規な配列である。
【００８３】
＜３＞  セロビオハイドロラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルロース）、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２００９／４／１３）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105)を使用し、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｏｒｐｈｅｌｉａ  ｏｐｔｉｏｎ：ｄｅｆａｕｌｔ（ｍｏｄｅｌ＝Ｎｅｔ７００，ｍａｘｏｖｅｒｌａｐ＝６０）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
【００８４】
こうして得られたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、隠れマルコフモデルを応用した配列相同性検索アルゴリズムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からこれら配列のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類を行った。
【００８５】
＜４＞  ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶのクローニング
温泉土壌メタゲノムＡＲ１９から、ＧＨ６、ＧＨ９，ＧＨ４８及びその他のＧＨファミリーに属するセロビオハイドロラーゼ触媒領域配列を含む１３個のＯＲＦが得られた。これらのＯＲＦについて、プライマーを設計し、ＰＣＲにより温泉土壌メタゲノムＡＲ１９から当該遺伝子のクローニングを行った。最終的にオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６から、ＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼ遺伝子（ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ）がクローニングされた。
【００８６】
＜５＞  オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６は、４７４アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号５）をコードしていたが、開始コドンが失われている不完全長配列であって、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域だけから構成されていた。ＡＲ１９Ｇ−１６６のＧＨ６触媒領域は、遺伝子ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶとしてＰＣＲクローニングされ、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＧＨ６グリコシドハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）と６６％のアミノ酸配列同一性を示した。配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＡＧ−３’： 配列番号６で表される塩基配列の５’末端側に７塩基（ＣＡＣＣＡＴＧ）付加したもの。当該付加配列中、３’側のＡＴＧは開始コドンであり、５’側のＣＡＣＣはベクターに挿入するための配列である。）と配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＧ−３’）を用いたＰＣＲクローニングにより、ＡＲ１９Ｇ−１６６から２個の遺伝子クローン（ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡとＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ）が得られた。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡとＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶは、２９９位と３５１位の２アミノ酸残基のみが相違していた。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡは、２９９位のアミノ酸残基がアルギニンであり、３５１位のアミノ酸残基がアラニンであった。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶは、２９９位のアミノ酸残基がグルタミンであり、３５１位のアミノ酸残基がバリンであった。
【００８７】
＜６＞  自然変異体（nａｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ）のＰＣＲクローニング
前記の５つのメタゲノムＤＮＡ（ＡＲ１９、ＯＪＳ２、ＯＪＳ４、ＯＪＳ７、ＯＪＳ９）に対し、配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、セロビオハイドロラーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングを行った。ヒットしたクローンをサンガーシーケンサで配列解読し、各クローンの遺伝子型とアミノ酸変異を表１及び２に示した。複数メタゲノムＤＮＡサンプルに対してＰＣＲクローニングを行うことにより、ＳＮＰを多数持つ自然変異体が総計４６クローン得られた。これら変異体は、ｃ６ｔ, ｇ５１ａ, ａ６９ｇ, ａ２０１ｇ, ｃ２５９ｔ, ｃ４３３ｔ, ｃ４５０ｔ, ｇ４５６ｃ, ｃ５３１ｔ, ａ６２７ｇ, ａ８９６ｇ, ｃ１１１６ｔ, ｃ９８ｔ（Ａ３３Ｖ）, ｔ２５１ｃ（Ｉ８４Ｔ）, ｃ２６２ｔ （Ｐ８８Ｓ）, ｇ４９７ａ（Ｒ１６６Ｈ）, ｃ６８３ｔ（Ｔ２２８Ｉ）, ｃ６８８ｔ（Ｌ２３０Ｆ）, ａ７６２ｔ（Ｅ２５４Ｄ）, ａ７６１ｇ（Ｅ２５４Ｇ）, ｃ８０５ｔ（Ｒ２６９Ｃ）, ａ８９６ｇ（Ｒ２９９Ｑ）, ａ９１６ｇ（Ｓ３０６Ｇ）, ｃ１０５２ｔ（Ａ３５１Ｖ）, ｇ１０７８ａ（Ｅ３６０Ｋ）, ｇ１２１６ａ（Ａ４０６Ｔ）, ｔ１２４１ｃ（Ｆ４１４Ｓ）の合計、２７ヵ所のＳＮＰを示した（ＳＮＰは小文字で示し、カッコ内は、ＳＮＰにより引き起こされたアミノ酸置換を示す。）。この２７ヵ所のＳＮＰの中、１４ヵ所においてアミノ酸変異が引き起こされていた（表１、表２）。これらのＳＮＰを示したクローンは、全てにおいて、ＩＮ／ＤＥＬ突然変異（ＤＮＡ塩基配列の挿入及び欠損）は認められなかった。
【００８８】
【表１】
2015173602.tif 000002
【００８９】
【表２】
2015173602.tif 000003
【００９０】
このようにして得られた４６クローンの中、半数以上の２９クローンが、２９９位のアミノ酸残基がグルタミン、３５１位のアミノ酸残基がアラニンである変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡ（以下、ＱＡと略称する。配列番号３）であり、１クローンが、２９９位のアミノ酸残基がグルタミン、３５１位のアミノ酸残基がバリンである変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ（以下、ＱＶと略称する。配列番号９）、４クローンが２９９位のアミノ酸残基がアルギニン、３５１位のアミノ酸残基がアラニンである変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ（以下、ＲＡと略称する。配列番号１０）であった（表１）。
【００９１】
その他の１２クローンは、これらＱＡ、ＲＡ、又はＱＶから１〜３アミノ酸残基が変異した変異体であった。１２クローンの中、９クローンは、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡに１〜２アミノ酸残基の置換が起こった変異体であった（表１）。それらは、３３位のアラニンがバリンに置換したＱＡ／Ａ３３Ｖが２クローン、２２８位のスレオニンがイソロイシンに置換したＱＡ／Ｔ２２８Ｉが１クローン、２６９位のアルギニンがシステインに置換したＱＡ／Ｒ２６９Ｃが１クローン、２５４位のグルタミン酸がグリシンに置換したＱＡ／Ｅ２５４Ｇが１クローン、３０６位のセリンがグリシンに置換したＱＡ／Ｓ３０６Ｇが２クローン、１６６位のアルギニンはヒスチジンに、３６０位のグルタミン酸がリジンに置換したＱＡ／Ｒ１６６Ｈ／Ｅ３６０Ｋが１クローン、８４位のイソロイシンがスレオニンに、４０６位のアラニンがスレオニンに置換したＱＡ／Ｉ８４Ｔ／Ａ４０６Ｔが１クローンであった。
【００９２】
また、その他の３クローンはＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡに１又は３アミノ酸残基の置換が起こった変異体であり、それらは、２５４位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換したＲＡ／Ｅ２５４Ｄが１クローン、８８位のプロリンがセリンに、２３０位のロイシンがフェニルアラニンに、４１４位のフェニルアラニンがセリンに置換したＲＡ／Ｐ８８Ｓ／Ｌ２３０Ｆ／Ｆ４１４Ｓ（「ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳ」とも称す。配列番号１）が２クローンであった。
【００９３】
図１に、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡ、及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのアミノ酸残基の配列アライメントを示した。これら４種の遺伝子は、同じプライマーセットにより高温土壌メタゲノム５サンプルからＰＣＲクローニングされた遺伝子である。図中、「・」は同一のアミノ酸残基を示し、置換されたアミノ酸残基を白抜き文字で示す。
【００９４】
最も頻繁に出現したクローンはＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡであり、５種のメタゲノムＤＮＡの総計で２９クローン得られた（表２）。これら２９個のＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡクローンは、塩基配列に７ヵ所のＳＮＰ（ｃ６ｔ、ａ２０１ｇ、ｃ２５９ｔ、ｃ４５０ｔ、ｇ４５６ｃ、ｃ５３１ｔ、ａ６２７ｇ）を含んでいた。
【００９５】
ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ遺伝子の塩基配列は、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡ遺伝子と比較すると、３ヶ所のＳＮＰ（ａ５１ｇ、ａ２０１ｇ、ａ８９６ｇ）があった（表２）。このうち２ヶ所はサイレント突然変異であり、塩基配列５１位と２０１位が、いずれもグアニンがアデニンに置換されていた。残りの１ヶ所はアミノ酸置換を伴うＳＮＰであり、８９６位のアデニンがグアニンに変異し、このＳＮＰにより、２９９位アミノ酸残基がＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡではアルギニンに置換されていた。
【００９６】
ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ遺伝子の塩基配列は、１ヶ所のＳＮＰがあった（表２）。塩基配列１０５２位のシトシンがチミンに変異しており、このため、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡの３５１位のアミノ酸残基がアラニンから、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶではバリンに置き換わっている。
【００９７】
これら１２種のＡＲ１９Ｇ−１６６ＳＮＰ変異体の中で、最も高い耐熱性を示したＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡと比較し、５ヶ所のＳＮＰ（ａ２０１ｇ, ｃ２６２ｔ（Ｐ８８Ｓ）, ｃ６８８ｔ（Ｌ２３０Ｆ）, ａ８９６ｇ（Ｑ２９９Ｒ）, ｔ１２４１ｃ（Ｆ４１４Ｓ））があった（表２）。この中の４ヵ所がアミノ酸置換を伴っており、そのうちの１ヵ所は、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ同様、８９６位のアデニンがグアニンに変異し、２９９位のアミノ酸残基がアルギニンに置換されていた。他の３ヵ所は、２６２位のシトシンがチミンに、６８８位のシトシンがチミンンに、１２４１位のチミンがシトシンに変異し、これらのＳＮＰにより、それぞれ、８８位のプロリンがセリンへ、２３０位のロイシンがフェニルアラニンンへ、４１４位のフェニルアラニンがセリンへ、置換されている。
【００９８】
＜７＞  アミノ酸置換自然変異体の発現及び精製
ＰＣＲクローニングにより得られたプラスミドをヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）へ導入した。目的の遺伝子をもつ大腸菌を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／２０容量の２００ｍＭ  酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製)を用いて、３０秒間破砕した後に３０秒間休止する処理プロセスを１０回繰り返し、アミノ酸置換された目的タンパク質を含む上清を得、これを粗酵素サンプル液とした。
【００９９】
粗酵素サンプル液中の目的タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。図２に、ＡＲ１９Ｇ−１６６遺伝子の自然変異体がコードするセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（ＣＢＢ染色）の結果を示す。
【０１００】
粗酵素サンプル液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて１００〜０％の濃度勾配でタンパク質を溶出した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素サンプル液を得た。
【０１０１】
＜８＞  ＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性測定（ＰＳＡ加水分解活性）
セロビオハオドラーゼ活性測定には、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）を基質として用いた。ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨ５．０以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【０１０２】
ＰＳＡ活性測定のための反応溶液の組成は、終濃度０．５％のＰＳＡ溶液、５０ｍＭ  酢酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）、適宜希釈した粗酵素サンプル液（前記＜７＞で調製したもの。）からなり、この反応溶液を５０〜９０℃で２０分間反応させた。反応終了後、３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳＡ）を用いて加水分解された還元末端量を分光光度計（５４０ｎｍ）により測定し、グルコースで作成した検量線を用いて還元糖量を算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。最も高い還元糖量の値を１００とし、各温度における還元糖量を相対値でプロットした。
【０１０３】
ＰＳＡ活性測定結果を図３に示す。高温土壌メタゲノムＤＮＡからクローニングされた全てのセロビオハイドロラーゼ酵素遺伝子ＡＲ１９Ｇ−１６６のアミノ酸置換変異体は、ＰＳＡ加水分解活性を示した。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡのアミノ酸置換変異体の至適温度は、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのアミノ酸置換変異体よりも低かった。ＱＡ／Ｔ２２８ＩではＴｏｐｔ＝８０℃、ＱＡ／Ｓ３０６ＧではＴｏｐｔ＝７０℃、それ以外のＡＲ１９Ｇ−１６６ＱＡのアミノ酸置換変異体ではＴｏｐｔ＝７５℃であった。一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡとそのアミノ酸置換変異体ＲＡ／Ｅ２５４ＤではＴｏｐｔ＝８０℃、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのアミノ酸置換変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳではＴｏｐｔ＞９０℃を示した。
【０１０４】
人為的に突然変異を起こすＤＥ法では、膨大な数の機能欠損変異体が生じ、機能アッセイの無駄が非常に多い。ところが、本発明に係る自然変異体取得方法によってクローニングされた多数の変異体は全てが酵素活性を有しており、比較的少数のクローンから構成される変異体ライブラリーから、１５℃以上も熱安定性の高いセロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳが得られた。
【０１０５】
＜９＞  酵素特性の検討
ＰＳＡ加水分解活性アッセイにおいて最も高い至適温度Ｔｏｐｔを示したＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡの３アミノ酸（Ｐ８８Ｓ／Ｌ２３０Ｆ／Ｆ４１４Ｓ）変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳについて、酵素タンパク質を精製し、基質特異性、ｐＨ特性、温度特性（至適温度、及び熱安定性）について、詳細に酵素特性を計測した。
【０１０６】
（基質特異性）
基質特異性はＰＳＡ、アビセル粉末、カルボキシメチルセルロース(ＣＭＣ、Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（ｆｒｏｍ Ｂｅｅｃｈｗｏｏｄ、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（ｆｒｏｍ Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて測定した。反応溶液の組成は、各基質の１％水溶液１００μＬ、２００ｍＭ  酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）５０μＬ、精製水４０μＬ、及び精製酵素サンプル液１０μＬからなり、反応溶液を７０℃で２０分間反応させた。前記＜８＞と同様にして酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
【０１０７】
測定結果を図４に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、水溶性リン酸膨潤アビセルＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、また、β−１,３ 結合とβ−１,４結合グルカンから成るリケナンに対して分解活性を示した。一方、ＣＭＣや、β−１,３結合とβ−１,６結合グルカンから成るラミナリンに対し、ほとんど分解活性は示さなかった。結晶性セルロースＡｖｉｃｅｌに対する加水分解活性は非常に弱いが、２時間の反応時間によるアッセイでは、明瞭な加水分解活性を示した。キシランに対し、加水分解活性を示さなかった。
【０１０８】
（温度依存性）
ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳによるＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。ＰＳＡ加水分解活性は、反応溶液の組成を、１％ ＰＳＡ溶液１００μＬ、酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）５０μＬ、精製水４０μＬ、精製酵素サンプル液１０μＬとし、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９℃で２０分間反応させた。酵素の加水分解反応により生成された還元糖量を求め、１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。また、反応溶液に、０．５ｍＭカルシウムイオン又は０．５ｍＭマンガンイオンを添加して同様にしてＰＳＡ加水分解活性を測定した。
【０１０９】
測定結果を図５に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのＰＳＡ加水分解活性は、ｐＨ５．５においてＴｏｐｔ＝９０℃であった。また、０．５ｍＭカルシウムイオン又は０．５ｍＭマンガンイオンを酵素−基質反応液中に添加すると、Ｔｏｐｔはいずれの場合も、９５℃に上昇した。全ての温度域において、カルシウムイオン又はマンガンイオン添加により、ＰＳＡ加水分解活性の向上が認められた。特に顕著なのは、マンガンイオン投与により、至適温度におけるＰＳＡ加水分解活性が２倍程度上昇したことであり、これは、二価金属陽イオンの投与による酵素タンパク質の安定化がもたらした効果であると考えられる。
【０１１０】
（ｐＨ依存性）
ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳによるＰＳＡ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。ＰＳＡ加水分解活性の測定においては、基質として０．５質量％ＰＳＡを用い、マッキルベインｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３〜８） により各ｐＨに反応液を調整し、５０、７０、又は９０℃で各ｐＨにおける加水分解反応を計測した。測定結果を図６に示す。反応液の実測ｐＨ値に対する、５０℃、７０℃、及び９０℃におけるＰＳＡ加水分解活性を計測し、プロットした。
【０１１１】
図６に示すように、精製した変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、ＰＳＡ加水分解反応の至適ｐＨは反応温度に依存して変化し、９０℃ではｐＨ５〜６.５の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示した。５０℃及び７０℃では至適ｐＨは４〜６の範囲にあった。いずれも、ｐＨ７以上において低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた。
【０１１２】
（ＰＳＡ加水分解活性を用いた熱安定性測定）
タンパク質の熱安定性に関わる指標として、熱変性温度又は熱崩壊温度Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）がしばしば使われる。一定時間の予備加温（プリインキュベーション）により酵素活性が無処理区の５０％に減少するプリインキュベーション温度はタンパク質の熱崩壊温度Ｔｍにほぼ等しく、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの熱崩壊温度Ｔｍを求めた。
【０１１３】
具体的には、基質無添加条件下での４０分間の予備加熱により、ＰＳＡ加水分解活性が５０％に減少する温度Ｔ５０を指標として、変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの熱安定性を調べた。各データはロジスティック関数による近似を行い、近似曲線が相対活性値５０％となる温度をＴ５０とした。
【０１１４】
測定結果を図７に示す。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡはＴ５０＝７５．６℃であったのに対して、３アミノ酸残基が置換された変異体ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳはＴ５０＝９１．２℃（５０℃でＰＳＡ活性測定時）、又はＴ５０＝９２．０℃（７０℃でＰＳＡ活性測定時）であり、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡよりも１５℃以上も高い熱安定性を示した。
【０１１５】
（ＤＳＦ法による熱安定性測定）
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
【０１１６】
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６  Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ  ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬ濃度の酵素タンパク質を１μＬ、２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を５μＬ、精製水を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)で０．５℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから３０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０−４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図８の下段グラフのＹ軸に示した「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」の極大値として定義した。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。また、各反応溶液に３ｍＭのカルシウムイオンを添加し、同様にして測定した。
【０１１７】
図８には、ＤＳＦ法により計測したＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳの各酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図８の上段グラフは実測データであり、図８の下段グラフには、図８の上段グラフの蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。また、表３には、ＤＳＦ法により、各酵素タンパク質の熱崩壊温度を独立して各３回計測し、その平均値を示した。
【０１１８】
【表３】
2015173602.tif 000004
【０１１９】
ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳがコードする酵素タンパク質のＤＳＦ蛍光強度曲線は、９５℃付近にピークを示し、熱変性温度Ｔｍ＝９３．０±０．０（ｎ＝３）であった（表３）。この熱変性温度の値は、ＰＳＡ加水分解活性から求めたこの酵素の至適温度Ｔｏｐｔ＞９０℃や、酵素活性半減温度Ｔ５０＝９１．２℃及び９２．０℃と近い値を示した。一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのＤＳＦ蛍光強度曲線は、８３℃付近にピークを示し、Ｔｍ値は８０．５±０．０ ℃（ｎ＝３）であり、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳのほうが１２．５℃も熱安定性を高めていることがわかった。
【０１２０】
一般に二価金属イオンは、タンパク質に結合することでタンパク質の構造を安定させ、耐熱性を向上させることが知られている。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡでは、３ｍＭＣａ２＋の投与により、ＤＳＦから算出した熱変性温度Ｔｍが５．２℃上昇し、８５．７±０．２℃（ｎ＝３）となった。ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、３ｍＭＣａ２＋の投与により、Ｔｍが５．２℃上昇し、９６．０±０．０℃（ｎ＝３）となった。この熱変性温度９６．０℃は、これまで知られているセロビオハイドロラーゼの中で最も高い値である。
【０１２１】
難分解性の結晶性セルロースは、主に３種類のグリコシド加水分解酵素が協調して作用することで、単糖のグルコースまで加水分解される。エンドグルカナーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅあるいはｅｎｄｏ−１,４−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ、ＥＣ ３．２.１．４）は、グルカン鎖の１，４−βグリコシド結合をランダムに切断し、様々な長さのオリゴ糖を生成する。エキソ型のグルカナーゼであるセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅあるいはｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ＥＣ ３．２.１．９１）は、グルカン鎖の還元末端（ＧＨ７ファミリーに属するＣＢＨで、たとえばＴｒＣｅｌ７Ａ、あるいはＣＢＨ Ｉ）、あるいは、非還元末端（ＧＨ６ファミリーに属するＣＢＨ、ＴｒＣｅｌ６Ａ、あるいはＣＢＨ ＩＩ）から、グルカン鎖の端から連続して切断し、セロビオースを生成する。β-グルコシダーゼ（β−１,４−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ＥＣ ３．２.１．２１）がセロビオースを加水分解し、グルコースを生成する。
【０１２２】
以上の結果をまとめると、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡの３アミノ酸残基置換された変異体であるＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳは、至適温度及び熱変性温度のいずれも著しく向上し、ＰＳＡ加水分解活性が５０％減少する酵素活性半減温度Ｔ５０及びＤＳＦによる熱変性温度Ｔｍが、それぞれ１０．５℃と１２．５℃高く、熱安定性が顕著に改善された変異体であった。
【０１２３】
熱水噴出孔など極限環境を生存圏とする微生物から８０℃以上で機能する超耐熱性セルラーゼ酵素が多数分離されているが、糖化効率に最も影響を与えるセロビオハイドロラーゼについては、十分な耐熱性を有する酵素が得られていない。このため、８０℃以上の高温でリグノセルロースバイオマスを分解、糖化する超耐熱性酵素混合液を調製することが、これまでは実現できていなかった。極めて高い耐熱性を有するセロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡＳＦＳを用いることにより、高温でリグノセルロースの酵素糖化を可能にする酵素ミックス液の構成が可能になる。
【図１】
2015173602.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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