(57)【要約】【課題】実験に要する時間の短縮、標本の低侵襲測定の実現、画像データの保管領域の無駄削減および画像表示の描画速度の向上を図る。【解決手段】パルス状のレーザ光を出射するレーザ光源１と、レーザ光源１から発せられたレーザ光を集光して標本Ｓに照射する対物レンズ７と、レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置近傍から発生する蛍光を検出し、検出した蛍光の輝度に相当する光強度信号を出力する検出装置１１と、検出装置１１から出力された光強度信号に基づいて画像を生成するコンピュータ２９と、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置を標本Ｓの深さ方向に移動させるＺ軸駆動機構２５と、対物レンズ７の焦点位置の標本Ｓにおける深さが深くなるほど焦点位置が深さ方向に大きく切り替わるように、Ｚ軸駆動機構２５を制御する走査制御装置２７とを備えるレーザ走査型顕微鏡１００を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルス状のレーザ光を出射する光源と、
該光源から発せられたレーザ光を走査する走査部と、
該走査部により走査されたレーザ光を集光して標本に照射する対物レンズと、
レーザ光が照射されることにより前記標本における前記対物レンズの焦点位置近傍から発生する蛍光を検出し、検出した蛍光の輝度に相当する光強度信号を出力する検出部と、
該検出部から出力された光強度信号に基づいて画像を生成する画像生成部と、
前記標本における前記対物レンズの焦点位置を該標本の深さ方向に移動させる焦点位置変更部と、
前記対物レンズの焦点位置の前記標本における深さが深くなるほど該焦点位置が深さ方向に大きく切り替わるように、前記焦点位置変更部を制御する焦点位置変更制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記画像生成部が、前記焦点位置変更部により前記標本における前記対物レンズの焦点位置の深さが深くなるにつれて、前記標本の画像における前記深さ方向に交差する交差方向の画素数を減らす請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記画像生成部が、分解能が最も低い前記焦点位置の解像度により、深さが異なる他の複数の前記焦点位置の画像を生成する請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記レーザ光の光束径を調節可能な光束径調節部と、
前記標本における前記焦点位置の深さが深くなるにつれて前記レーザ光の光束径が前記対物レンズの瞳よりも徐々に小さくなるように前記光束径調節部を制御する光束径調節制御部とを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体等の標本に対してその表面から超短パルスレーザ光を照射して、標本の表面または内部から発せられる多光子蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察するレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
超短パルスレーザ光のうちＮＡが大きい光線は、標本内での光路長が長く散乱の影響を受けやすいため、標本の深部に焦点を結ぶことができず２光子励起に寄与し難い。一方、超短パルスレーザ光のうちＮＡが小さい光線は、標本内での光路長が短く散乱の影響を受け難いため、標本の深部に焦点を結び易い。特許文献１に記載のレーザ走査型顕微鏡は、標本に対して対物レンズの瞳よりも小さい光束で短パルスレーザ光を入射させることにより、標本内での光路長を短くして散乱の影響を受け難くし、励起効率を向上している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４７５９４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のレーザ走査型顕微鏡においては、標本における散乱条件や対物レンズの焦点位置の深さに応じて短パルスレーザ光の光束を対物レンズの瞳よりも小さくすることが有効であり、この場合に対物レンズの称呼ＮＡよりも小さな実効ＮＡで結像することになる。
【０００６】
ここで、標本における対物レンズの焦点位置を深さ方向に移動させながら各焦点位置の連続的な光学スライス像を取得する場合において、短パルスレーザ光のＮＡが大きいと、標本の深さ方向の分解能が高く観察領域の層が薄くなるため、対物レンズの焦点位置を深さ方向に小さく切り替えなければならない。一方、短パルスレーザ光のＮＡが小さいと、深さ向の分解能が低く観察領域の層が厚くなるため、対物レンズの焦点位置を深さ方向に大きく切り替えればよい。
【０００７】
そのため、特許文献１に記載のレーザ走査型顕微鏡では、称呼ＮＡで計算される深さ方向の分解能により標本の深さ方向に焦点位置を変えながら光学スライス像を取得していくと、深さ方向に隣接する焦点位置の距離間隔が狭くなりすぎて、ＸＹＺ／ＸＹＺｔ画像やＸＺ／ＸＺｔ画像の取得時間が長くなってしまうという問題がある。また、細胞などの標本に対してレーザ光を長い時間照射し続けてしまうことになるという問題がある。さらに、画像を取得する回数が不必要に増え、画像データを保存する領域が無駄に消費されたり、画像の描画回路に負担が掛かり、画像表示に余計な時間が掛かったりするという問題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、実験に要する時間の短縮、標本の低侵襲測定の実現、画像データの保管領域の無駄削減および画像表示の描画速度の向上を図ることができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、パルス状のレーザ光を出射する光源と、該光源から発せられたレーザ光を走査する走査部と、該走査部により走査されたレーザ光を集光して標本に照射する対物レンズと、レーザ光が照射されることにより前記標本における前記対物レンズの焦点位置近傍から発生する蛍光を検出し、検出した蛍光の輝度に相当する光強度信号を出力する検出部と、該検出部から出力された光強度信号に基づいて画像を生成する画像生成部と、前記標本における前記対物レンズの焦点位置を該標本の深さ方向に移動させる焦点位置変更部と、前記検出部により検出される前記対物レンズの焦点位置の前記標本における深さが深くなるほど該焦点位置が深さ方向に大きく切り替わるように、前記焦点位置変更部を制御する焦点位置変更制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【００１０】
本発明によれば、光源から発せられたパルス状のレーザ光が走査部により走査されて対物レンズにより標本に照射されると、標本における多光子励起効果によって、対物レンズの焦点位置近傍において蛍光が発生する。そして、焦点位置変更部により、標本における対物レンズの焦点位置が深さ方向に移動させられることで、検出部により深さ方向に異なる焦点位置近傍から発せられる蛍光が検出され、画像生成部により、検出された蛍光の輝度に相当する光強度信号に基づいて各焦点位置の画像が生成される。これにより、標本の立体画像を取得することができる。
【００１１】
ここで、標本における対物レンズの焦点位置が浅いと、標本内での光路長が短く散乱の影響を受け難いため、深さ方向の分解能が高く観察領域の層が薄くなるが、標本における対物レンズの焦点位置が深くなるにつれて、標本内での光路長が長くなり散乱の影響を受け易くなるため、深さ方向の分解能が低下し観察領域の層が厚くなる。
【００１２】
この場合において、焦点位置変更制御部の制御により、焦点位置変更部が、標本における対物レンズの焦点位置の深さが深くなるほど焦点位置が深さ方向に大きく切り替わるように対物レンズの焦点位置を標本の深さ方向に移動させることで、標本の深部ほど、深さ方向に隣接する観察領域の層どうしの距離を離間させ、互いに隣接する観察領域からの蛍光を重複して検出するのを防ぐことができる。これにより、標本における深さが異なる所望の観察領域ごとに鮮明な画像を取得することができる。
【００１３】
したがって、画像の取得時間が長くなるのを防ぎ実験に要する時間を短縮するとともに、生体試料のような標本に対してレーザ光が長時間照射され続けてしまうことを防止し、標本の低侵襲測定を実現することができる。また、画像を取得する回数が不必要に増えるのを防ぎ画像データの保管領域の無駄を削減するとともに、画像の描画回路への負担を抑え画像表示の描画速度を向上することができる。
【００１４】
上記構成においては、前記画像生成部が、前記焦点位置変更部により前記標本における前記対物レンズの焦点位置の深さが深くなるにつれて、前記標本の画像における前記深さ方向に交差する交差方向の画素数を減らすこととしてもよい。
【００１５】
このように構成することで、標本における対物レンズの焦点位置が深くなるにつれて分解能が低くなり焦点位置の周囲にぼけが生じても、画像における深さ方向に交差する交差方向の１つ１つの画素サイズを大きくし、分解能に合せた画像を生成することができる。
【００１６】
上記構成においては、前記画像生成部が、分解能が最も低い前記焦点位置の解像度により、深さが異なる他の複数の前記焦点位置の画像を生成することとしてもよい。
このように構成することで、標本の深さが異なる複数の観察領域全体で鮮明度にばらつきがない立体画像を取得することができる。
【００１７】
上記構成においては、前記レーザ光の光束径を調節可能な光束径調節部と、前記標本における前記焦点位置の深さが深くなるにつれて前記レーザ光の光束径が前記対物レンズの瞳よりも徐々に小さくなるように前記光束径調節部を制御する光束径調節制御部とを備えることとしてもよい。
【００１８】
ＮＡが大きいパルス状のレーザ光は、標本内での光路長が長く散乱の影響を受け易いため、標本の深部に届き難いのに対し、ＮＡが小さいパルス状のレーザ光は、標本内での光路長が短く散乱の影響を受け難いため、標本の深部に届き易い。
【００１９】
このように構成することで、光束径調節制御部により、標本における焦点位置の深さが深くなるにつれて、光束径調節部が制御されてレーザ光の光束径が対物レンズの瞳よりも小さくなるので、標本の深部を観察する場合に深部の焦点位置に届かないような余分な光を標本に照射しなくて済み、レーザ光の照射により標本に与える影響を抑制することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、実験に要する時間の短縮、標本の低侵襲測定の実現、画像データの保管領域の無駄削減および画像表示の描画速度の向上を図ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡の概略構成図である。
【図２】レーザ光のＮＡの大きさと散乱の影響との関係を説明する図である。
【図３】２光子励起の分解能（ＦＷＨＭ）と実効ＮＡの関係を示す図である。
【図４】微小ポイントを想定した２光子励起の分解能概算表の一例を示す図である。
【図５】標本のＺ軸方向に異なる観察領域である表層部、中間部および深層部を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の一実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００は、例えば、２光子励起型顕微鏡である。このレーザ走査型顕微鏡１００は、図１に示されるように、パルス状の極短パルスレーザ光を出射するレーザ光源１と、レーザ光源１から出射された極短パルスレーザ光をコリメートするコリメートレンズ光学系（光束径調節部）３と、コリメートレンズ光学系３を通過した極短パルスレーザ光を偏向して標本Ｓにおいて２次元的に走査させる２次元走査機構（走査部）５と、２次元走査機構５により偏向された極短パルスレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ７と、対物レンズ７により集光された蛍光を極短パルスレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー９と、ダイクロイックミラー９により分岐された蛍光を検出する検出装置（検出部）１１とを備えている。
【００２３】
コリメートレンズ光学系３は、極短パルスレーザ光の光軸上でその光軸方向に沿って移動可能に設けられている。このコリメートレンズ光学系３は、極短パルスレーザ光の光軸方向に位置を変更することにより、極短パルスレーザ光のコリメート関係を変化させて、対物レンズ７の瞳位置での光束径を変えることができるようになっている。
【００２４】
２次元走査機構５は、例えば、２軸ガルバノミラーであり、相互に直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー（図示略）を対向させて構成されている。この２次元走査機構５は、２枚のガルバノミラーを揺動させて極短パルスレーザ光を偏向し、標本上で極短パルスレーザ光を２次元的（Ｘ軸方向およびＹ軸方向）に走査することができるようになっている。
【００２５】
ダイクロイックミラー９は、２次元走査機構５からの極短パルスレーザ光を対物レンズ７に向けて反射する一方、対物レンズ７により集光されて極短パルスレーザ光の光路を戻る蛍光を検出装置１１に向けて透過させることができるようになっている。
【００２６】
検出装置１１は、極短パルスレーザ光が照射されることにより標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置近傍から発生する蛍光を検出し、検出した蛍光の輝度に相当する光強度信号を出力するようになっている。
【００２７】
また、レーザ走査型顕微鏡１００には、コリメートレンズ光学系３を光軸方向に移動させる電動駆動部（光束径調節部）１３と、電動駆動部１３を制御するレーザ制御装置（光束径調節制御部）２１と、対物レンズ７を光軸方向に移動させるＺ軸駆動機構（焦点位置変更部）２５と、２次元走査機構５、レーザ制御装置２１およびＺ軸駆動機構２５を制御する走査制御装置（焦点位置制御部）２７と、レーザ制御装置２１および走査制御装置２７の制御や画像処理等を行うコンピュータ（画像生成部）２９とが備えられている。
【００２８】
電動駆動部１３は、コリメートレンズ光学系３の光軸方向の移動をガイドする直動レール１５と、ラックピニオンギヤを持つステッピングモータ１７と、ステッピングモータ１７を駆動するモータドライバ１９とを備えている。
【００２９】
モータドライバ１９は、レーザ制御装置２１からの制御指令に基づいて、ステッピングモータ１７を制御するようになっている。コリメートレンズ光学系３は、ステッピングモータ１７の制御量に応じた移動量で直動レール１５上を移動するようになっている。
【００３０】
レーザ制御装置２１は、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さとコリメートレンズ光学系３の光軸方向の位置とが対応付けられたルックアップテーブルを記憶するＳＲＡＭ（メモリ装置）２３を備えている。ルックアップテーブルには、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるにつれて極短パルスレーザ光の光束径が対物レンズ７の瞳よりも徐々に小さくなるように、対物レンズ７の焦点位置とコリメートレンズ光学系３の位置とが対応付けられている。
【００３１】
また、レーザ制御装置２１は、走査制御装置２７からの同期信号に基づいて、ＳＲＡＭ２３のルックアップテーブルを参照することにより対物レンズ７の焦点位置の深さに対応するコリメートレンズ光学系３の位置を取得し、取得した位置にコリメートレンズ光学系３を移動させる制御指令を電動駆動部１３に送るようになっている。
【００３２】
ここで、図２に示すように、ＮＡが大きい極短パルスレーザ光は、標本Ｓ内での光路長が長く散乱の影響を受けやすいため、標本Ｓの深部に届き難い。一方、ＮＡが小さい極短パルスレーザ光は、標本Ｓ内での光路長が短く散乱の影響を受け難いため、標本Ｓの深部に届き易い。
【００３３】
レーザ制御装置２１からの制御指令に基づいて電動駆動部１３により位置決めされたコリメートレンズ光学系３を極短パルスレーザ光が通過することで、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるにつれて極短パルスレーザ光の光束径が対物レンズ７の瞳よりも徐々に小さくなる。これにより、標本Ｓの深部を観察する場合に深部の焦点位置に届かないような余分な極短パルスレーザ光を標本Ｓに照射しなくて済む。
【００３４】
例えば、２光子励起の分解能（ＦＷＨＭ（Ｆｕｌｌ  Ｗｉｄｔｈ  ａｔ  Ｈａｌｆ  Ｍａｘｉｍｕｍ）：半値全幅）は、下記の式により概算することができる。
Ｚ軸方向の分解能（Ｚ分解能：ＦＷＨＭｚ）を式（１）により示す。
ＦＷＨＭｚ＝０．６２×λ／（ｎ−ＳＱＲＴ（ｎ２−ＮＡ２））      （１）
Ｘ軸方向およびＹ軸方向の分解能（ＸＹ分解能：ＦＷＨＭｘｙ）を式（２）により示す。
ＦＷＨＭｘｙ＝０．３６×λ／ＮＡ      （２）
ここで、λ：励起波長、ｎ：屈折率（通常は水の屈折率１．３３を使用）、ＮＡ：実効ＮＡである。
【００３５】
また、２光子励起の分解能（ＦＷＨＭ）と実効ＮＡの関係は、例えば、図３に示す通りである。図３において、縦軸は分解能（ＦＷＨＭ）を示し、横軸は実効ＮＡを示している。微小ポイントを想定した２光子励起の分解能概算表の例を図４に示す。図３および図４によれば、実効ＮＡが大きいほど高解像となり、分解能（ＦＷＨＭ）の数値が小さくなる。また、実効ＮＡが小さくなった場合、ＸＹ分解能はあまり劣化しないのに対し、Ｚ分解能は著しく劣化することがわかる。
【００３６】
Ｚ軸駆動機構２５は、対物レンズ７と標本Ｓとの光軸方向の距離を変更することにより、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置を標本ＳのＺ軸方向に移動させることができるようになっている。
【００３７】
走査制御装置２７は、コンピュータ２９からの制御指令に基づいて、２次元走査機構５、レーザ制御装置２１およびＺ軸駆動機構２５を制御するようになっている。具体的には、走査制御装置２７は、２次元走査機構５のガルバノミラーを揺動させて、極短パルスレーザ光を標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点面においてＸＹ方向に走査させるようになっている。
【００３８】
また、走査制御装置２７は、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるほど、その焦点位置がＺ軸方向に大きく切り替わるようにＺ軸駆動機構２５を駆動するようになっている。また、走査制御装置２７は、Ｚ軸駆動機構２５を駆動するタイミングで同期信号をレーザ制御装置２１に出力するようになっている。
【００３９】
対物レンズ７の焦点位置をＺ軸方向に切り替える量は、例えば、生体試料の脳神経の異なる深さの部位の明るさとＺ軸方向の特性とを予め測定したり、異なる深さで複数の蛍光ビーズを入れファントムの各蛍光ビーズの明るさとＺ軸方向の特性とを予め測定したりして、得られたＺ半値幅を基準に設定することとしてもよい。また、その設定は、ユーザが行うこととしてもよいし、レーザ走査型顕微鏡１００の製造工程中またはセットアップ時にメーカが実測して行うこととしてもよい。
【００４０】
コンピュータ２９は、内部にＧＵＩなどのユーザインターフェースを有しており、ユーザにより設定された観察スケジュールに基づいて、レーザ制御装置２１および走査制御装置２７に対して制御指令を出力するようになっている。
【００４１】
また、コンピュータ２９は、検出装置１１から出力された光強度信号に基づいて画像を生成し、図示しないモニタに表示させることができるようになっている。これにより、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の観察画像をユーザに提供することができるようになっている。
【００４２】
このように構成されたレーザ走査型顕微鏡１００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００によれば、レーザ光源１から出射された極短パルスレーザ光は、コリメートレンズ光学系３によりコリメートされて２次元走査機構５により偏向される。そして、極短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー９を介して対物レンズ７により集光され、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置に照射される。これにより、２次元走査機構５の一対のガルバノミラーの揺動角度に応じて、標本Ｓの焦点面上で極短パルスレーザ光が２次元的に走査される。また、Ｚ軸駆動機構２５により、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置がＺ軸方向に移動させられる。
【００４３】
極短パルスレーザ光が照射されることにより、標本Ｓにおける多光子励起効果によって、対物レンズ７の焦点位置近傍において蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズ７により集光されて極短パルスレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー９を透過して検出装置１１により検出される。そして、コンピュータ２９により、検出装置１１から出力される蛍光の輝度に相当する光強度信号に基づいて、標本Ｓの焦点面の画像が生成される。
【００４４】
次に、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００により標本Ｓを観察する場合について説明する。
まず、プリスキャンし、ルックアップテーブルを作成する。プリスキャンは、Ｚ軸駆動機構２５を駆動し、ユーザにより入力された標本観察のＺ軸方向における上限（以下、「表層部」という。）に対物レンズ７の焦点位置をセットし、この状態で極短パルスレーザ光を照射して画像を取得しモニタに表示させる。
【００４５】
次いで、コリメートレンズ光学系３を光軸方向に徐々に移動させ、極短パルスレーザ光の光束径を徐々に絞る。ユーザは、モニタに表示された観察画像を確認し、鮮明な画像が得られるコリメートレンズ光学系３の位置をコンピュータ２９に記録させる。
【００４６】
続いて、Ｚ軸駆動機構２５を駆動して、標本観察のＺ軸方向における下限（以下、「深層部」という。）に対物レンズ７の焦点位置をセットし、この状態でレーザ光を照射して画像を取得しモニタに表示させる。そして、表層部の場合と同様にして、コリメートレンズ光学系３の位置を調節して極短パルスレーザ光の光束径を徐々に絞り、ユーザが観察画像を確認して鮮明な画像が得られるコリメートレンズ光学系３の位置をコンピュータ２９に記録させる。
なお、表層部が標本Ｓの表面に設定された場合は、対物レンズ７の本来の性能が出せる光束系が自動的に設定されるので、上述のようなプリスキャンにおける位置記録は不要となる。
【００４７】
このようにして標本Ｓの表層部および深層部におけるコリメートレンズ光学系３の位置を特定したら、これらの値を用いて、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるにつれてレーザ光の光束径が対物レンズ７の瞳よりも徐々に小さくなるように、表層部と深層部との間の中間部における深さが異なる複数の層の対応するコリメートレンズ光学系３の位置を求める。
【００４８】
中間部における各層に対応するコリメートレンズ光学系３の位置決定は、一般的に用いられている補間方法や、観察を行う焦点位置の全ての深さについてプレスキャンを行う方法等を用いることができる。
【００４９】
このような手法により、対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるにつれてレーザ光の光束径が対物レンズ７の瞳よりも徐々に小さくなるように、各焦点位置の深さに対応付けたコリメートレンズ光学系３の位置を決定する。そして、コンピュータ２９により、これらの情報を対応付けてルックアップテーブルを作成し、レーザ制御装置２１のＳＲＡＭ２３に書き込みする。
【００５０】
これにより、レーザ制御装置２１により、ルックアップテーブルに基づいて電動駆動部１３を制御し、対物レンズ７の焦点位置の深さに対応してコリメートレンズ光学系３の位置を調節することで、標本Ｓにおける焦点位置の深さが深くなるにつれて、極短パルスレーザ光のＮＡを対物レンズ７の瞳よりも徐々に小さくしていくことができる。
【００５１】
次に、本観察を行う。
まず、走査制御装置２７により、Ｚ軸駆動機構２５が駆動されて対物レンズ７の焦点位置が標本Ｓの表層部に配置され、走査制御装置２７からレーザ制御装置２１に同期信号が送られる。
【００５２】
レーザ制御装置２１においては、走査制御装置２７からの同期信号が入力されることにより、ＳＲＡＭ２３に記憶されているルックアップテーブルから表層部に対応するコリメートレンズ光学系３の位置が取得され、電動駆動部１３に制御指令が送られる。
【００５３】
電動駆動部１３においては、モータドライバ１９により、レーザ制御装置２１からの制御指令に基づいてステッピングモータ１７が駆動され、コリメートレンズ光学系３が直動レール１５によりガイドされて表層部に対応する位置に移動する。
【００５４】
これにより、レーザ光源１から出射された極短パルスレーザ光は、コリメートレンズ光学系３を通過することで、表層部に対応して対物レンズ７の瞳よりも小さいＮＡに変換され、２次元走査機構５を介して対物レンズ７により標本Ｓに照射される。
【００５５】
そして、２次元走査機構５により、標本Ｓの表層部において極短パルスレーザ光が２次元的に走査されることで、表層部において発生した蛍光が検出装置１１により検出され、コンピュータ２９により、その蛍光の輝度に相当する光強度信号に基づいて、対物レンズ７の焦点位置である表層部の画像が生成される。
【００５６】
続いて、表層部での極短パルスレーザ光の走査が終了すると、走査制御装置２７により、Ｚ軸駆動機構２５が駆動されて標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置が次の深さに切り替えられる。また、走査制御装置２７からレーザ制御装置２１に同期信号が出力され、電動駆動部１３により、次の焦点位置の深さに対応する位置にコリメートレンズ光学系３が移動する。
【００５７】
この場合において、走査制御装置２７の制御により、Ｚ軸駆動機構２５が、図５に示すように、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるほど、Ｚ軸方向に大きく切り替わるように対物レンズ７の焦点位置を移動させる。
【００５８】
次いで、次の深さの焦点位置に対して、コリメートレンズ光学系３によってＮＡが変換された極短パルスレーザ光が２次元走査機構５を介して対物レンズ７によって照射される。そして、その焦点位置近傍において発生した蛍光が検出装置１１によって検出され、コンピュータ２９によってその対物レンズ７の焦点位置である中間部の画像が生成される。
【００５９】
このようにして、Ｚ駆動機構２５により標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが段階的に切り替えられ、各焦点位置近傍において発生した蛍光に基づいて画像が生成される。これにより、標本Ｓの立体画像を取得することができる。
【００６０】
ここで、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置が浅いと、標本Ｓ内での光路長が短く散乱の影響を受け難いため、Ｚ軸方向の分解能が高く観察領域の層が薄くなる。これに対し、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置が深くなるにつれて、標本Ｓ内での光路長が長くなり散乱の影響を受け易くなるため、Ｚ軸方向の分解能が低下し観察領域の層が厚くなる。
【００６１】
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００によれば、走査制御装置２７の制御により、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるほど、対物レンズ７の焦点位置がＺ軸方向に大きく移動するので、標本Ｓの深部ほど、Ｚ軸方向に隣接する観察領域の層どうしの距離を離間させ、互いに隣接する観察領域から発せされる蛍光を重複して検出するのを防ぐことができる。これにより、標本Ｓにおける深さが異なる所望の観察領域ごとに鮮明な画像を取得することができる。
【００６２】
したがって、画像の取得時間が長くなるのを防ぎ実験に要する時間を短縮するとともに、生体試料のような標本Ｓに対して極短パルスレーザ光が長時間照射され続けてしまうことを防止し、標本Ｓの低侵襲測定を実現することができる。また、画像を取得する回数が不必要に増えるのを防ぎ画像データの保管領域の無駄を削減するとともに、画像の描画回路への負担を抑え画像表示の描画速度を向上することができる。
【００６３】
なお、本実施形態においては、焦点位置変更部として、対物レンズ７を光軸方向に移動させるＺ軸駆動機構２５を例示して説明したが、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置を標本ＳのＺ軸方向に移動させることができるものであればよく、例えば、標本Ｓを光軸方向に移動させることにより、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置を標本ＳのＺ軸方向に移動させるステージを採用することとしてもよい。
【００６４】
また、電動駆動部１３は、上述の構成に限られることなく、例えば、ピエゾアクチュエータなど、高精度の位置決めが可能なアクチュエータを採用することとしてもよい。
【００６５】
本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、コンピュータ２９が、Ｚ軸駆動機構２５により標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置の深さが深くなるにつれて、標本Ｓの画像におけるＺ軸方向に交差するＸ軸方向およびＹ軸方向の画素数を減らすこととしてもよい。
【００６６】
この場合、Ｘ軸方向およびＹ軸方向の画素サイズは、例えば、生体試料の脳神経の異なる深さの部位の明るさとＺ軸方向の特性とを予め測定したり、ファントムに異なる深さで複数の蛍光ビーズを入れてその蛍光ビーズの明るさとＺ軸方向の特性とを予め測定したりして、得られたＸＹ半値幅を基準にサンプル面の画素サイズを設定することとしてもよい。また、その画素サイズは、ユーザが設定することとしてもよいし、レーザ走査型顕微鏡１００の製造工程中またはセットアップ時にメーカが実測して設定することとしてもよい。
【００６７】
このようにすることで、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置が深くなるにつれて分解能が低くなり、焦点位置に対してＸ軸方向およびＹ軸方向にぼけが生じても、コンピュータ２９により画像を形成するＸ軸方向およびＹ軸方向の１つ１つの画素サイズを大きくし、分解能に合せた画像を生成することができる。例えば、分解能が１／２になる場合は、Ｘ軸方向およびＹ軸方向の画素数を１／２にしてその分だけ１つ１つの画素サイズを大きくすることとすればよい。
【００６８】
また、通常は、標本Ｓにおける深さが深くなるほど、ＸＹＺ半値幅が大きくなることから、深い領域ほどＸＹＺ分解能が劣化することになる。本変形例によれば、深くなるほどＸＹＺ分解能が劣化するのに合わせて、取得するデータ量を必要最低限に留めるとともに、実験に要する時間をより低減し、標本Ｓをより効果的に低侵襲測定することができる。
【００６９】
また、第２変形例としては、コンピュータ２９が、標本Ｓにおける分解能が最も低い深さの焦点位置の解像度により、深さが異なる他の複数の焦点位置の画像を生成することとしてもよい。この場合、通常は、標本Ｓの深層部におけるＸＹＺ画素サイズ（サンプル面換算）が１番大きくなるため、深層部の解像度により表層部や中間部の他の焦点位置の画像を生成することとすればよい。
【００７０】
このようにすることで、標本Ｓの深さが異なる複数の観察領域全体で鮮明度にばらつきがない立体画像を取得することができる。すなわち、立体画像全体の表示分解能を均一にして見易い３Ｄ画像を表示することができる。また、メモリや画像グラフィクスといった画像データの保管、表示機能の負担を最小限に留め、画像表示の描画速度を向上することができる。
【００７１】
また、本実施形態においては、光束径調節部として、コリメートレンズ光学系３を例示し、コリメートレンズ光学系３の位置を光軸方向にずらすことにより極短パルスレーザ光の光束径を調節することとしたが、第３変形例としては、光束径調節部として、電動式のズーム光学系（例えば、フォーカルズームレンズ等）を採用することとしてもよい。
【００７２】
この場合、電動式のズーム光学系により、コリメートレンズ光学系３によるコリメートの条件に影響を与えることなく極短パルスレーザ光の光束径を変化させることとすればよい。このようにした場合も、光量を低下させることなく、コリメートレンズ光学系３により光束径を調整した場合と同様の効果を得ることができる。
また、光束調節部として、通過させる極短パルスレーザ光の光束を制限する絞りを採用することとしてもよい。
【符号の説明】
【００７３】
１    レーザ光源（光源）
５    ２次元走査機構（走査部）
７    対物レンズ
１１    検出装置（検出部）
１３    電動駆動部（光束径調節部）
２１    レーザ制御装置（光束径調節制御部）
２５    Ｚ軸駆動機構（焦点位置変更部）
２７    走査制御装置（焦点位置制御部）
２９    コンピュータ（画像生成部）
１００    レーザ走査型顕微鏡
Ｓ    標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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