(57)【要約】【課題】ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、ヒト多能性幹細胞を効率よく増殖させる、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物、培地、及び培養方法を提供する。【解決手段】細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物、該組成物を含むヒト多能性幹細胞の培養用の培地、該培地で培養を行うヒト多能性幹細胞の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物。
【請求項２】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、心房性ナトリウム利尿ペプチド及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する、ヒト多能性幹細胞の培養用の培地。
【請求項７】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質である、請求項６に記載の培地。
【請求項８】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、心房性ナトリウム利尿ペプチド及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される少なくとも１種である、請求項７に記載の培地。
【請求項９】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項７に記載の培地。
【請求項１０】
塩基性線維芽細胞増殖因子を含まない、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１１】
血清を含まない、請求項６〜請求項１０のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１２】
フィーダー細胞を含まない、請求項６〜請求項１１のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１３】
ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、請求項６〜請求項１２のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１４】
ヒト多能性幹細胞を、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質の存在下で培養する、ヒト多能性幹細胞の培養方法。
【請求項１５】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質である、請求項１４に記載の培養方法。
【請求項１６】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、心房性ナトリウム利尿ペプチド及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される少なくとも１種である、請求項１５に記載の培養方法。
【請求項１７】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項１５に記載の培養方法。
【請求項１８】
ヒト多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子の非存在下で培養する、請求項１４〜請求項１７のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１９】
ヒト多能性幹細胞を、血清の非存在下で培養する、請求項１４〜請求項１８のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項２０】
ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞の非存在下で培養する、請求項１４〜請求項１９のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項２１】
ヒト多能性幹細胞を、下記第１の領域及び第２の領域を含み且つ４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドと接触させて培養する、請求項１４〜請求項２０のいずれか１項に記載の培養方法：
配列番号２で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の少なくとも一方を含む第１の領域；
配列番号３で示されるアミノ酸配列、
配列番号３で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への接着能を有するアミノ酸配列、及び
配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、培養器への接着能を有するアミノ酸配列、
のいずれか一つを含む第２の領域。
【請求項２２】
ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、請求項１４〜請求項２１のいずれか１項に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物、培地、及び培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性、即ち未分化状態を維持したまま多能性幹細胞を増殖させる培養技術が提案されている。
例えば、特許文献１には、支持細胞を含まず、マトリックスと、ＴＧＦ−β１及びｂＦＧＦを含有する培地とを含む培養条件下でヒトＥＳ細胞を培養する技術が開示されている。
例えば、特許文献２には、脳性ナトリウム利尿ペプチドと血清代替物ＫＳＲとを含む培地で、マウスＥＳ細胞を培養する技術が開示されている。
例えば、非特許文献１及び２には、心房性ナトリウム利尿ペプチド又は脳性ナトリウム利尿ペプチドとウシ胎仔血清とを含む培地で、マウスＥＳ細胞を培養する技術が開示されている。
例えば、非特許文献３には、副腎皮質刺激ホルモンとウシ胎仔血清とを含む培地で、マウスＥＳ細胞を培養する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４６１３０６９号
【特許文献２】特許第４３７４４１９号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cell Death and Disease (2011) 2, e127
【非特許文献２】PLoS ONE (2009)4, e5341
【非特許文献３】Genes to Cells (2004)9, 471-477
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多能性幹細胞を医療に応用するために、ヒト多能性幹細胞を、未分化状態を維持しつつ、効率よく増殖させる培養技術が求められている。
さらに、医療応用のためには、ヒト多能性幹細胞を、異種動物由来の成分を含まない培地で維持する培養技術が求められている。
【０００６】
本発明は、上記状況のもとになされた。
本発明の目的は、ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、ヒト多能性幹細胞を効率よく増殖させる、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物、培地、及び培養方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、異種動物由来の成分を使用しない、ヒト多能性幹細胞の培養用の培地及び培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
課題を達成するための具体的手段は以下のとおりである。
［Ａ１］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物。
［Ａ２］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質である、［Ａ１］に記載の組成物。
［Ａ３］  グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、心房性ナトリウム利尿ペプチド及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される少なくとも１種である、［Ａ２］に記載の組成物。
［Ａ４］  グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、脳性ナトリウム利尿ペプチドである、［Ａ２］に記載の組成物。
［Ａ５］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、ｃＧＭＰである、［Ａ１］に記載の組成物。
［Ａ６］  ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、ヒト多能性幹細胞を増殖するための、［Ａ１］〜［Ａ５］のいずれか１項に記載の組成物。
［Ａ７］  培地補充物である、［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれか１項に記載の組成物。
［Ａ８］  ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、［Ａ１］〜［Ａ７］のいずれか１項に記載の組成物。
【０００８】
［Ｂ１］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する、ヒト多能性幹細胞の培養用の培地。
［Ｂ２］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質である、［Ｂ１］に記載の培地。
［Ｂ３］  グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、心房性ナトリウム利尿ペプチド及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される少なくとも１種である、［Ｂ２］に記載の培地。
［Ｂ４］  グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、脳性ナトリウム利尿ペプチドである、［Ｂ２］に記載の培地。
［Ｂ５］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、ｃＧＭＰである、［Ｂ１］に記載の培地。
［Ｂ６］  ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、ヒト多能性幹細胞を増殖するための、［Ｂ１］〜［Ｂ５］のいずれか１項に記載の培地。
［Ｂ７］  ［Ａ１］〜［Ａ８］のいずれか１項に記載の組成物を含む、ヒト多能性幹細胞の培養用の培地。
［Ｂ８］  塩基性線維芽細胞増殖因子を含まない、［Ｂ１］〜［Ｂ７］のいずれか１項に記載の培地。
［Ｂ９］  血清を含まない、［Ｂ１］〜［Ｂ８］のいずれか１項に記載の培地。
［Ｂ１０］  フィーダー細胞を含まない、［Ｂ１］〜［Ｂ９］のいずれか１項に記載の培地。
［Ｂ１１］  ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、［Ｂ１］〜［Ｂ１０］のいずれか１項に記載の培地。
【０００９】
［Ｃ１］  ヒト多能性幹細胞を、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質の存在下で培養する、ヒト多能性幹細胞の培養方法。
［Ｃ２］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質である、［Ｃ１］に記載の培養方法。
［Ｃ３］  グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、心房性ナトリウム利尿ペプチド及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される少なくとも１種である、［Ｃ２］に記載の培養方法。
［Ｃ４］  グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が、脳性ナトリウム利尿ペプチドである、［Ｃ２］に記載の培養方法。
［Ｃ５］  細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質が、ｃＧＭＰである、［Ｃ１］に記載の培養方法。
［Ｃ６］  ヒト多能性幹細胞を塩基性線維芽細胞増殖因子の非存在下で培養する、［Ｃ１］〜［Ｃ５］のいずれか１項に記載の培養方法。
［Ｃ７］  ヒト多能性幹細胞を血清の非存在下で培養する、［Ｃ１］〜［Ｃ６］のいずれか１項に記載の培養方法。
［Ｃ８］  ヒト多能性幹細胞をフィーダー細胞の非存在下で培養する、［Ｃ１］〜［Ｃ７］のいずれか１項に記載の培養方法。
［Ｃ９］  ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、ヒト多能性幹細胞を増殖するためのヒト多能性幹細胞の培養方法である、［Ｃ１］〜［Ｃ８］のいずれか１項に記載の培養方法。
［Ｃ１０］  ヒト多能性幹細胞の培養を［Ｂ１］〜［Ｂ１１］のいずれか１項に記載の培地で行う、ヒト多能性幹細胞の培養方法。
【００１０】
［Ｃ１１］  ヒト多能性幹細胞を、下記第１の領域及び第２の領域を含み且つ４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドと接触させて培養する、［Ｃ１］〜［Ｃ１０］のいずれか１項に記載の培養方法：
配列番号２で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の少なくとも一方を含む第１の領域；
配列番号３で示されるアミノ酸配列、
配列番号３で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への接着能を有するアミノ酸配列、及び
配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、培養器への接着能を有するアミノ酸配列、
のいずれか一つを含む第２の領域。
［Ｃ１２］  第１の領域が、配列番号２で示されるアミノ酸配列及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の双方を含む、［Ｃ１１］に記載の培養方法。
［Ｃ１３］  第１の領域が第２の領域のＮ末端側に位置する、［Ｃ１１］又は［Ｃ１２］のいずれか１項に記載の培養方法。
［Ｃ１４］  ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である、［Ｃ１１］〜［Ｃ１３］のいずれか１項に記載の培養方法。
［Ｃ１５］  ポリペプチドが下記第３の領域をさらに含む、［Ｃ１１］〜［Ｃ１４］のいずれか１項に記載の培養方法：
（３−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５６番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
（３−ｉｉ）（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列、
のいずれか一つのアミノ酸配列からなる第３の領域。
［Ｃ１６］  ポリペプチドが下記第４の領域をさらに含む、［Ｃ１１］〜［Ｃ１５］のいずれか１項に記載の培養方法：
（４−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列、
（４−ｉｉ）（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び
（４−ｉｉｉ）（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列、
のいずれか一つのアミノ酸配列からなる第４の領域。
［Ｃ１７］  ポリペプチドが第３の領域を含み、第３の領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応する位置にセリン残基、アラニン残基又はグリシン残基を有する、［Ｃ１５］又は［Ｃ１６］に記載の培養方法。
［Ｃ１８］  ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、［Ｃ１］〜［Ｃ１７］のいずれか１項に記載の培養方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、ヒト多能性幹細胞を効率よく増殖させる、ヒト多能性幹細胞の培養用の組成物、培地、及び培養方法が提供される。
さらに、本発明によれば、異種動物由来の成分を使用しない、ヒト多能性幹細胞の培養用の培地及び培養方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。なお、これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００１３】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
【００１４】
本明細書において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
【００１５】
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の、一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表記する場合がある。
【００１６】
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「同一性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４ｔｈＥｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）を用いて計算される値を指すことができる。例えば、配列番号３に対して同一性５０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ．Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓの値が５０以上であることを示す。
【００１７】
本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知の仕方で、挿入、欠失、及び置換を考慮に入れた上で、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させたときに、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示すことを意味する。
【００１８】
本明細書において、「同種」とは、ヒトを意味し、「異種」とは、ヒト以外の動物を意味する。
【００１９】
＜組成物＞
本発明に係るヒト多能性幹細胞の培養用の組成物（単に「培養用組成物」とも称する。）は、ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、ヒト多能性幹細胞を増殖するための培養用組成物であり、細胞内のｃＧＭＰ（cyclic guanosine monophosphate、環状グアノシン一リン酸）の濃度を上昇させる物質を含有する。ヒト多能性幹細胞は、本発明の培養用組成物が作用することにより、細胞内ｃＧＭＰ濃度が上昇し、細胞周期が亢進して、細胞増殖率が増大するものと推測される。
【００２０】
本発明の培養用組成物は、例えば、培地補充物として培地に添加して使用されるほか、培地そのものとしても使用されうる。
【００２１】
本発明において細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質は、結果的に細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質であればよい。細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質は、細胞内及び細胞外のいずれの酵素又はいずれのシグナル伝達経路に作用する物質であってもよく、細胞内及び細胞外の酵素及びシグナル伝達経路に作用しない物質であってもよい。
ある物質が細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させるか否かは、培養細胞の培地にその物質を添加した前後の、その培養細胞の細胞内ｃＧＭＰ濃度を比較することで確認できる。具体的には、細胞を破壊して得た細胞の抽出物とｃＧＭＰに対する抗体とを用いたＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法による濃度定量によって確認しうる。
【００２２】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質としては、グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質が挙げられる。
グアニル酸シクラーゼは、ＧＴＰをｃＧＭＰに変換する酵素である。グアニル酸シクラーゼには、細胞膜１回貫通型の膜結合性グアニル酸シクラーゼと、細胞質に存在する可溶性グアニル酸シクラーゼの２種がある。膜結合性グアニル酸シクラーゼは、ナトリウム利尿ペプチド等のペプチドホルモンの受容体であり、細胞外ドメインにペプチドホルモンが結合すると、細胞内ドメインであるグアニル酸シクラーゼが活性化される。可溶性グアニル酸シクラーゼは、一酸化窒素（ＮＯ）によって活性化される。
【００２３】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質としては、膜結合性グアニル酸シクラーゼのリガンドである、心房性ナトリウム利尿ペプチド（atrial natriuretic peptide；ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide；ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；ＣＮＰ）、これらと実質的に同様の生理活性を有するペプチド；可溶性グアニル酸シクラーゼのリガンドであるＮＯ；ＮＯを発生する化合物、例えば、ニトログリセリン等のニトロ化合物、ペンスリット等の硝酸エステル、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミンやＳ−ニトロソグルタチオン等のＳ−ニトロソ化合物；などが挙げられる。
【００２４】
グアニル酸シクラーゼ活性を上昇させる物質としては、細胞増殖活性がより高い点で、ＡＮＰ及びＢＮＰの少なくとも１種が好ましく、ＢＮＰがより好ましい。ＡＮＰ及びＢＮＰには、これらと実質的に同様の生理活性を有するペプチドも含まれ、例えば、ヒト天然型のＡＮＰ又はＢＮＰのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる活性を有するペプチド；ヒト天然型のＡＮＰ又はＢＮＰのアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列からなり、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる活性を有するペプチド；などが含まれる。
【００２５】
ほかに、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質としては、ｃＧＭＰも挙げられる。細胞外に存在するｃＧＭＰは、細胞膜を透過して細胞内に移行し、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させうる。ｃＧＭＰには、細胞膜透過性ｃＧＭＰアナログが含まれる。細胞膜透過性ｃＧＭＰアナログとしては、ジブチリルｃＧＭＰ等が挙げられる。
【００２６】
細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質がペプチド又はタンパク質である場合、抗原性物質及び感染源の混入の虞が少ない点で、組換え体が好ましい。ペプチド又はタンパク質の組換え体は、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができる。
【００２７】
本発明の培養用組成物としては、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質の固形物、粉末、溶液、又はガス；リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水、水等に、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を溶解又は分散させた液体組成物；従来公知の培地に、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を溶解又は分散させた液体組成物；培地の濃縮形態；などが挙げられる。本発明の培養用組成物において、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質の濃度は、該物質の種類ごとに設定してよく、後述する培地の終濃度に合わせて設定してよい。
【００２８】
本発明の培養用組成物は、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を、１種含んでもよく、複数種含んでもよい。
【００２９】
＜培地＞
本発明に係るヒト多能性幹細胞の培養用の培地（単に「培地」とも称する。）は、ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、ヒト多能性幹細胞を増殖するための培地であり、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する。
【００３０】
本発明の培地は、本発明の培養用組成物そのものでもよく、本発明の培養用組成物とその他の成分を混合した培地でもよく、従来公知の培地に本発明の培養用組成物を添加した培地でもよい。
【００３１】
本発明の培地における細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質は、本発明の培養用組成物における細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質と同義であり、好ましい態様も同様である。
【００３２】
本発明の培地において、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質の濃度は、該物質の種類ごとに設定してよい。
【００３３】
培地中のＡＮＰ又はＢＮＰの終濃度は、０．１μＭ以上が好ましく、０．５μＭ以上がより好ましく、１μＭ以上が更に好ましく、１００μＭ以下が好ましく、５０μＭ以下がより好ましく、１０μＭ以下が更に好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、０．１μＭ〜１００μＭが好ましく、０．５μＭ〜５０μＭがより好ましく、１μＭ〜５０μＭが更に好ましい。
【００３４】
培地中のｃＧＭＰの終濃度は、０．１μＭ以上が好ましく、０．５μＭ以上がより好ましく、１μＭ以上が更に好ましく、１００μＭ以下が好ましく、５０μＭ以下がより好ましく、１０μＭ以下が更に好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、０．１μＭ〜１００μＭが好ましく、０．５μＭ〜５０μＭがより好ましく、１μＭ〜１０μＭが更に好ましい。
【００３５】
本発明の培地は、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を、１種含んでもよく、複数種含んでもよい。
【００３６】
本発明の培地は、培養対象となるヒト多能性幹細胞の種類に応じて、成分を選択することができ、当技術分野で周知の成分を含んでいてよい。
【００３７】
本発明の培地は、抗原性物質や感染源などの異物が培養物に混入することを抑制する観点で、異種動物由来成分を含まないことが好ましく、また、血清及び／又はフィーダー細胞を含まないことが好ましい。
【００３８】
したがって、本発明の培地は、従来公知の哺乳動物細胞用の基本培地（好ましくはヒト細胞用の基本培地、より好ましくはヒト幹細胞用の基本培地）に、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を添加した培地が好ましい。本発明に適用しうる哺乳動物細胞用の基本培地としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ−１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、１９９、ＭＣＤＢ１５３、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８ ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍ（Nature Protocols (2012)7, 2029-2040）等が挙げられる。
【００３９】
上記の基本培地には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；成長因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；などを通常の濃度で添加してもよい。
【００４０】
本発明の培地は、ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持する観点で、ＴＧＦ−β１（transforming growth factor-β1）を含むことが好ましい。ＴＧＦ−β１の終濃度は、０．１μｇ／Ｌ以上が好ましく、０．５μｇ／Ｌ以上がより好ましく、１．０μｇ／Ｌ以上が更に好ましく、１０μｇ／Ｌ以下が好ましく、５．０μｇ／Ｌ以下がより好ましく、３．０μｇ／Ｌ以下が更に好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、０．１μｇ／Ｌ〜１０μｇ／Ｌが好ましく、０．５μｇ／Ｌ〜５．０μｇ／Ｌがより好ましく、１．０μｇ／Ｌ〜３．０μｇ／Ｌが更に好ましい。
【００４１】
本発明の培地の一態様として、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；ｂＦＧＦ）を含まない培地が提供される。
ｂＦＧＦは、ヒト多能性幹細胞の増殖に重要な因子と考えられており、特許文献１に開示されているとおり、従来、ヒト多能性幹細胞の培地の補充物として使用されている。ｂＦＧＦは、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清等）及び血清代替物ＫＳＲに含まれており、したがって、特許文献２及び非特許文献１〜３の培地に含まれている。
これに対して、本発明によれば、本発明の培地の一態様として、ｂＦＧＦを含まない培地が提供され、ｂＦＧＦを含まなくても、ヒト多能性幹細胞を効率よく増殖させる。ｂＦＧＦを含まない培地は、従来用いられてきた天然又は組換え体ｂＦＧＦに混入している可能性のある抗原性物質および感染源物質が、ｂＦＧＦの使用によって培地に持ち込まれることを懸念する必要がなく、より安全である点で好ましい。また、ｂＦＧＦを含まない培地で培養されたヒト多能性幹細胞は、分化用培地に移された際に速やかに分化段階へと移行しうる点で好ましい。
【００４２】
本発明の培地としては、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's medium）とＦ−１２とを体積比１：１で混合した培地に、アスコルビン酸、無機塩（例えば、亜セレン酸ナトリウム、塩化ナトリウム）、トランスフェリン、インスリン、ＴＧＦ−β１、及び細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質（好ましくは、ＡＮＰ、ＢＮＰ、及びｃＧＭＰから選ばれる少なくとも１種）を混合した培地が好ましい。ここで、トランスフェリン、インスリン、ＴＧＦ−β１、ＡＮＰ、及びＢＮＰは、これらと実質的に同様の生理活性を有するペプチド又は代替物でもよい。上記の培地は、ｂＦＧＦを含まないことが好ましい。上記の培地は、血清及び／又はフィーダー細胞を含まないことが好ましい。上記の培地は、ｂＦＧＦ及び血清及びフィーダー細胞を含まないことが好ましい。
【００４３】
本発明の培地のｐＨは、例えばｐＨ７．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．４である。
【００４４】
＜培養方法＞
本発明に係るヒト多能性幹細胞の培養方法（単に「培養方法」とも称する。）は、本発明の培地を用いてヒト多能性幹細胞を培養する方法であり、ヒト多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、ヒト多能性幹細胞を増殖するための培養方法である。本発明の培養方法に使用する培地は、本発明の培地として前述したとおりである。
【００４５】
本発明の培養方法は、ｂＦＧＦの非存在下で行うことが好ましい。ｂＦＧＦの非存在下で行うヒト多能性幹細胞の培養は、従来用いられてきた天然又は組換え体ｂＦＧＦに混入している可能性のある抗原性物質および感染源物質が、ｂＦＧＦの使用によって培養物に持ち込まれることを懸念する必要がなく、より安全である点で好ましい。また、ｂＦＧＦの非存在下で培養されたヒト多能性幹細胞は、分化用培地に移された際に速やかに分化段階へと移行しうる点で好ましい。
【００４６】
本発明の培養方法は、抗原性物質や感染源などの異物が培養物に混入することを抑制する観点で、血清の非存在下でヒト多能性幹細胞を培養すること好ましく、また、マウス線維芽細胞等のフィーダー細胞の非存在下でヒト多能性幹細胞を培養することが好ましい。
【００４７】
したがって、本発明の培養方法は、フィーダー細胞に替えて、ポリペプチドを細胞培養用の細胞外マトリックスとして使用し、該ポリペプチドにヒト多能性幹細胞を接触させて培養することが好ましい。フィーダー細胞をポリペプチドに替えることにより、抗原性物質や感染源などの異物が培養物に混入することを抑制する。以下、本明細書では、細胞培養用の細胞外マトリックスとして使用するポリペプチドを「培養用ポリペプチド」と称する。
【００４８】
［培養用ポリペプチド］
培養用ポリペプチドとしては、例えば、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００４９】
ビトロネクチンとしては、ヒトビトロネクチンが好ましく、具体的には、配列番号１で示される４５９アミノ酸残基のポリペプチドが好ましい。なお、天然ヒトビトロネクチンは、配列の一部に糖鎖を有する糖タンパク質であることが確認されている。
【００５０】
配列番号１：
DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGPSLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLFAFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGIPDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSAGTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSLFSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
【００５１】
配列番号１で示されるビトロネクチンは、多能性幹細胞に対する接着性、細胞増殖活性、及び未分化維持性を有し、また、培養器への接着能を有する。
【００５２】
本明細書において、ポリペプチド又はアミノ酸配列について「培養器への接着能を有する」とは、対象となる培養器の細胞培養表面（以下「培養表面」と称することがある。）に対して、そのアミノ酸配列のポリペプチドが、化学的な反応によることなく物理的に接着することを意味する。培養器の培養表面に対して接着能を有するか否かは、例えば、プラズマ処理したポリスチレン製培養器に、２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２となるようにポリペプチド含有溶液を添加して３７℃下２時間放置した後、リン酸緩衝液にて２回洗浄したときに、培養表面に当該ポリペプチドが１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上残存するか否かにより評価する。培養表面に残存するポリペプチド量は、ポリペプチドを認識する抗体との結合量を測定するＥＬＩＳＡ、又は、接着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸量を測定するＨＰＬＣ等によって定量しうる。
【００５３】
培養用ポリペプチドとしては、抗原性物質及び感染源の混入の虞が少ない点で、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に基いて設計された組換え体が好ましい。以下に、培養用ポリペプチドとして用いうる組換え体の好ましい態様を説明する。
【００５４】
天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に基いて設計された組換え体としては、下記の第１の領域及び第２の領域を含み、且つ４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが好ましい。当該組換え体は、天然ヒトビトロネクチンと同等の性能、即ち多能性幹細胞に対する接着性、細胞増殖活性、未分化維持性、及び培養器への接着能を有する。以下、このポリペプチドを「組換えビトロネクチン」と称する。
【００５５】
第１の領域：配列番号２で示されるアミノ酸配列、及びＲＧＤで示されるアミノ酸配列の少なくとも一方を含む領域。
【００５６】
第２の領域：（２−ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、（２−ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有し、培養器への接着能を有するアミノ酸配列、及び（２−ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、培養器への接着能を有するアミノ酸配列、のいずれか一つを含む領域。
【００５７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＣＳＹＹＱＳＣ、以下「ＣＳＹＹＱＳＣ配列」と称する。）は、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における２５番目〜３１番目の７アミノ酸残基に相当する。ＣＳＹＹＱＳＣ配列における２つのシステイン残基は、両者間で架橋していてもよい。
【００５８】
ＲＧＤで示されるアミノ酸配列（以下「ＲＧＤ配列」と称する。）は、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における４５番目〜４７番目の３アミノ酸残基に相当する、細胞接着性を有する配列である。
【００５９】
配列番号３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ）は、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における３４２番目〜３７３番目の３２アミノ酸残基であり、ヘパリン結合ドメインに相当し、ヘモペキシン様ドメインＩＩの一部に含まれる。以下、配列番号３で示されるアミノ酸配列、及びこれに同一性を有するアミノ酸配列を「ヘパリン結合ドメイン」と称する場合がある。
【００６０】
第１の領域は、ＣＳＹＹＱＳＣ配列及びＲＧＤ配列の少なくともいずれかを含んでいればよく、双方を含むことが好ましい。第１の領域は、優れた細胞接着性を有し、多能性幹細胞を増殖させる活性を示す。
【００６１】
第１の領域は、ＣＳＹＹＱＳＣ配列及びＲＧＤ配列以外の他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。他のアミノ酸配列としては、例えば、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖活性の観点から、下記の（１ａ）、（１ｂ）、（１ｃ）、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００６２】
（１ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目〜２４番目のアミノ酸配列。
（１ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３２番目〜４４番目のアミノ酸配列。
（１ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の４８番目〜５５番目のアミノ酸配列。
【００６３】
（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列はそれぞれ、第１の領域の細胞接着性及び細胞増殖活性を損なわない範囲で、１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した配列であってもよく、（１ａ）〜（１ｃ）のアミノ酸配列それぞれと５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００６４】
第１の領域は、細胞接着性及び細胞増殖活性の観点から、３〜６０アミノ酸残基であることが好ましく、１０〜５５アミノ酸残基であることがより好ましい。
【００６５】
第２の領域は、前述の（２−ｉ）〜（２−ｉｉｉ）のいずれかを含んでいればよい。第２の領域は、ヘパリン結合ドメインを含むことにより、培養器への接着能を有する。したがって、第２の領域を含むポリペプチドは、化学結合による培養器への固定処理を必要としない。
また、第２の領域は、ヘパリン結合ドメインを含むことにより、ポリペプチドの親水性を担保しポリペプチドの疎水凝集を抑制するので、ポリペプチドの製造効率を高める。
【００６６】
（２−ｉｉ）は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有することが好ましい。
（２−ｉｉｉ）は、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、好ましくは１個〜１５個、より好ましくは１個〜６個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であることが好ましい。
【００６７】
第２の領域は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００６８】
組換えビトロネクチンは、第１の領域と第２の領域とを有していればよく、その相対位置には特に制限はない。組換えビトロネクチンは、第１の領域が、第２の領域のＮ末端側に位置していることが好ましい。
【００６９】
組換えビトロネクチンは、４０個〜４５０個のアミノ酸残基からなる。４０アミノ酸残基未満では、細胞接着性、又は細胞増殖活性、又は培養器への接着能が充分でない。一方、４５０アミノ酸残基を超えると、細胞接着性、又は細胞増殖活性、又は培養器への接着能が適切に発揮されない場合があり、さらに、タンパク質同士の会合又は架橋又は凝集が起こりやすくなる。組換えビトロネクチンのアミノ酸残基は、上記の観点で、８０個以上が好ましく、９０個以上がより好ましく、１００個以上が更に好ましく、４００個以下が好ましく、３００個以下がより好ましく、２５０個以下が更に好ましく、２００個以下が更に好ましく、１７０個以下が更に好ましく、１５０個以下が更に好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、例えば、４０個〜４００個のアミノ酸残基からなることが好ましく、８０個〜３００個のアミノ酸残基からなることがより好ましく、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなることが更に好ましく、８０個〜１５０個のアミノ酸残基からなることが更に好ましく、１００個〜１５０個のアミノ酸残基からなることが更に好ましい。
【００７０】
組換えビトロネクチンは、−２．０〜−０．９５のＧＲＡＶＹ値を有することが、疎水凝集を防ぐ観点から好ましい。ＧＲＡＶＹ値（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132）は、その値が大きいほどポリペプチドの疎水度が高いことを意味する。ＧＲＡＶＹ値が−０．９５以下であると、疎水凝集が発生しにくい。一方、ＧＲＡＶＹ値が−２．０以上であると、細胞増殖活性及び培養器への接着能が発揮されやすく、ＧＲＡＶＹ値が大きくなるにつれて上記効果がよい傾向がある。ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、上記の観点で、−１．７０〜−０．９７５がより好ましく、−１．６０〜−１．１０が更に好ましい。ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、例えば、アミノ酸配列中の疎水性アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）の割合の増減、アミノ酸残基数の増減等により調整しうる。
【００７１】
組換えビトロネクチンは、第１の領域及び第２の領域以外の他のアミノ酸配列を有することが好ましい。組換えビトロネクチンは、細胞接着性及び細胞増殖活性、又は培養器への接着能、又は凝集抑制の観点で、第１の領域及び第２の領域以外に、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）の部分配列を含むことが好ましい。これにより、組換えビトロネクチンは、ヒトビトロネクチンに近い性質、例えば、多能性幹細胞に対する優れた接着性及び増殖活性を具備しうる。
【００７２】
組換えビトロネクチンは、細胞接着性及び細胞増殖活性、又は培養器への接着能、又は凝集抑制の観点で、下記の第３の領域及び第４の領域の少なくともいずれかを含むことが好ましい。
【００７３】
第３の領域は、下記の（３−ｉ）〜（３−ｉｉｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなる領域である。
【００７４】
（３−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５６番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（３−ｉｉ）上記（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（３−ｉｉｉ）上記（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列。
【００７５】
第４の領域は、下記の（４−ｉ）〜（４−ｉｉｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなる領域である。
【００７６】
（４−ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（４−ｉｉ）上記（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
（４−ｉｉｉ）上記（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列。
【００７７】
第３の領域及び第４の領域を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列とは、所定範囲のアミノ酸残基のうち、連続する３アミノ酸残基以上で構成されたアミノ酸配列を意味する。
【００７８】
（３−ｉ）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の５６番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列であり、好ましくは、１３２番目〜３４１番目、２６９番目〜３４１番目、２７４番目〜３４１番目、又は２９４番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列である。
【００７９】
（３−ｉｉ）は、（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有する配列であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有することが好ましい。
【００８０】
（３−ｉｉｉ）は、（３−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、好ましくは１個〜１５個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であることが好ましい。
【００８１】
（４−ｉ）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列であり、好ましくは、３７４番目〜４０９番目、又は３７４番目〜３７９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列である。
【００８２】
（４−ｉｉ）は、（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と５０％以上の同一性を有する配列であり、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有することが好ましい。
【００８３】
（４−ｉｉｉ）は、（４−ｉ）のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個〜３０個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、好ましくは１個〜１５個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であることが好ましい。
【００８４】
第３の領域は、ポリペプチドの作製時に疎水凝集を抑制する観点から、下記の（３ａ）、（３ｂ）、（３ｃ）、及び（３ｄ）が好ましい。中でも（３ｄ）が、ポリペプチドの作製時に疎水凝集をより確実に抑制する観点で好ましい。
【００８５】
（３ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３２番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（３ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（３ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２７４番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（３ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２９４番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
【００８６】
第４の領域は、培養器への接着性の観点から、下記の（４ａ）、（４ｂ）、及び（４ｃ）が好ましい。中でも（４ｃ）が、培養器への接着性に加えて、ポリペプチドの作製時に疎水凝集を抑制する観点で好ましい。
【００８７】
（４ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（４ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４０９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
（４ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜３７９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列。
【００８８】
第３の領域が、配列番号１で示されるアミノ酸配列のシステイン残基に対応するアミノ酸残基を含む場合、当該システイン残基の位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有していてもよい。これにより、システイン残基による分子内架橋又は分子間架橋の形成を防ぐことができ、好ましい。システイン残基を置換する他のアミノ酸残基としては、セリン残基、アラニン残基、グリシン残基等を挙げることができる。中でも、システインと類似の構造を有する点で、セリン残基、アラニン残基が好ましい。
【００８９】
組換えビトロネクチンのＧＲＡＶＹ値は、調整容易性の観点から、第３の領域及び第４の領域のアミノ酸残基数の増減、又はアミノ酸残基の置換、欠失、付加により調整されることが好ましく、第３の領域の長さの増減により調整されることがより好ましい。
【００９０】
組換えビトロネクチンは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、下記のアミノ酸残基は含まなくてもよい。これらの領域は、本発明において組換えビトロネクチンに要求される性能への寄与が少ないと考えられる。
・５６番目〜１３１番目のアミノ酸残基
・５６番目〜２６８番目のアミノ酸残基
・２６９番目〜２７３番目のアミノ酸残基
・５０番目〜２９３番目のアミノ酸残基
【００９１】
組換えビトロネクチンは、細胞接着性及び培養器への接着能が損なわれない範囲で、これまで述べた以外の他の付加的なアミノ酸残基を有していてもよい。このようなアミノ酸残基としては、例えば、ポリペプチドを組換え技術によって作製するために付加される付加配列が挙げられる。具体的には、Ｎ末端側のメチオニン残基、Ｎ末端側のＧＰＬＧ配列、タグ配列（例えばＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等）、各領域間に付加可能なリンカー配列（例えば、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＧＳ等）等が挙げられる。
【００９２】
組換えビトロネクチンは、多能性幹細胞に対する接着性若しくは細胞増殖活性若しくは未分化維持性、又は培養器への接着能の観点で、第１の領域として下記（Ａ１）を含み、第２の領域として下記（Ａ２）を含み、第３の領域及び第４の領域の少なくとも一方として下記（Ａ３）及び下記（Ａ４）の少なくとも一方を含み、８０個〜４５０個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド（Ａ）が好ましい。
【００９３】
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２５番目〜４７番目のアミノ酸配列からなる領域。
（Ａ２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸配列からなる領域。
（Ａ３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる領域。
（Ａ４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる領域。
【００９４】
組換えビトロネクチンは、多能性幹細胞に対する接着性若しくは細胞増殖活性若しくは未分化維持性、又は培養器への接着能の観点で、第１の領域として下記（Ｂ１）を含み、第２の領域として下記（Ｂ２）を含み、第３の領域及び第４の領域の少なくとも一方として下記（Ｂ３）及び下記（Ｂ４）の少なくとも一方を含み、１００個〜４５０個のアミノ酸残基からなる、ポリペプチド（Ｂ）が好ましい。
【００９５】
（Ｂ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目〜５５番目のアミノ酸配列からなる領域。
（Ｂ２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４２番目〜３７３番目のアミノ酸配列からなる領域。
（Ｂ３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる領域。
（Ｂ４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる領域。
【００９６】
ポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ｂ）は、ＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５であることが好ましく、−１．７０〜−０．９７５であることがより好ましく、−１．６０〜−１．１０であることが更に好ましい。ポリペプチド（Ａ）は、アミノ酸残基数が８０個〜２５０個であることが好ましく、１００個〜２５０個であることがより好ましく、１００個〜１７０個であることが更に好ましい。ポリペプチド（Ｂ）は、アミノ酸残基数が１００個〜２５０個であることが好ましく、１００個〜２００個であることがより好ましく、１００個〜１７０個であることが更に好ましい。
【００９７】
組換えビトロネクチンのアミノ酸配列の一例を表１に挙げる。ＣＳＹＹＱＳＣ配列、ＲＧＤ配列、及びヘパリン結合ドメインに下線を付す。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
組換えビトロネクチンのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号４〜１４で示されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加されたアミノ酸配列も挙げられる。該メチオニン残基は、例えば、ポリペプチドを組換え技術によって作製する際に付加される。
【０１００】
組換えビトロネクチンは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができ、例えば、ＷＯ２０１３／１６４９７０Ａ１に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に基いて設計されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、組換えビトロネクチンを含む培養物を生産し、培養物から組換えビトロネクチンを回収することにより、組換えビトロネクチンを得る。
【０１０１】
組換えビトロネクチンは、化学結合による培養器への固定処理を必要としない。組換えビトロネクチンを含有する液を培養器の表面に付与し、例えば温度２５℃〜４０℃下に３０分間〜２４時間静置することで、組換えビトロネクチンは培養器の表面に接着し、該表面を被覆しうる。組換えビトロネクチンを含有する液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、水等に、組換えビトロネクチンを分散させて調製すればよい。該液の組換えビトロネクチン濃度は、例えば、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬとしてよい。
【０１０２】
組換えビトロネクチンは、培養器の表面に、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲で接着させることが好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲で接着させることがより好ましい。
【０１０３】
組換えビトロネクチンを接着させる培養器は、当技術分野で細胞培養用として周知の培養器を用いてよい。材質は特に制限されず、例えば、樹脂、ガラス、多孔質フィルター、中空繊維、セラミック等が挙げられる。形状も特に制限されず、マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、チューブ、フラスコ、ローラーボトル等が挙げられる。
【０１０４】
［培養条件］
ヒト多能性幹細胞の培養条件及び継代方法は、一般の条件をそのまま適用してよい。例えば、温度３７℃且つ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
【０１０５】
ヒト多能性幹細胞の播種密度は、特に制限はなく、一般の条件をそのまま適用してよい。例えば、１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０５個／ｃｍ２程度の播種密度としてよい。また、１０μｍ〜１００μｍの細胞塊を１個／ｃｍ２〜５個／ｃｍ２程度の播種密度としてもよい。
【０１０６】
本発明の培養方法は、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質を含有する培地を使用する。培地中の上記物質の濃度は、培地に関して前述した範囲が好ましく、培養期間にわたって濃度を前述した範囲に保つために、上記物質を追添加してもよい。
【０１０７】
本発明の培養方法において、一連の継代に用いる培地は必ずしも同一でなくてもよく、ヒト多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる培地であってもよい。
【０１０８】
＜ヒト多能性幹細胞＞
本発明の組成物、培地、及び培養方法の対象となる細胞は、ヒト多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、少なくともそれぞれ１種類ずつの外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する分化細胞に分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞であり、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）などを包含する。
【０１０９】
本発明の対象となるヒト多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞が好ましい。ｉＰＳ細胞には、Nature 448:313-317 (2007)、及びCell 126:663-676 (2006)に記載されている細胞、又はこれに類する細胞が包含される。
【０１１０】
ヒト多能性幹細胞が未分化状態を維持しているか否かは、従来公知の方法で確認しうる。例えば、未分化マーカーの発現をフローサイトメトリー又は免疫染色により確認する方法、免疫不全マウスの皮下にインジェクションした際のテラトーマ形成の確認、等によりなされる。
【０１１１】
ヒト多能性幹細胞は、フィーダー細胞依存性の細胞でもよいが、フィーダー細胞非依存性の細胞が好ましい。フィーダー細胞非依存性の細胞は、前述の組換えビトロネクチンを付与した培養器と本発明の培地とを用いて、フィーダー細胞の非存在下で、数次にわたる継代操作を行うことで選抜しうる。
【実施例】
【０１１２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
下記において、物質濃度に関し、特に断りのない限り「％」は質量基準である。
【０１１３】
＜培養用ポリペプチドの調製＞
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した常法にて、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）をコードするＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを鋳型として、配列番号１４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅した。以下、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを、ＲＣＰ−１４と称する。ＲＣＰ−１４のＮ末端には、ポリペプチドを組換え技術によって作製する際に付加されるメチオニン残基が付加している。
【０１１４】
ＲＣＰ−１４は、予め制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社）にて切断処理したｐＥＴ−２８ｂ（＋）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて目的遺伝子を挿入し、その発現ベクターを構築した。発現用ベクターの配列は、シークエンス解析により確認した。
【０１１５】
作製したＲＣＰ−１４発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法によりトランスフォーメーションし、カナマイシン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃下１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬工業）を添加して、３７℃下５時間振盪培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。
【０１１６】
菌体を遠心処理にて回収し、菌体を洗浄用バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）にて再懸濁した。ソニケーションにて菌体を破砕した後、４℃下、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心し、不溶性画分を回収した。０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む洗浄用バッファで洗浄した後、低濃度尿素バッファ（Ｌｏｗ Ｕｒｅａ Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）にて再懸濁し、ソニケーション処理を行った。遠心処理にて不溶性各分を回収した後、高濃度尿素バッファ（Ｈｉｇｈ Ｕｒｅａ Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を添加し、ソニケーション処理にて不溶性各分を可溶化した。
【０１１７】
上記の方法により得られた目的ペプチドを含む溶液を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社）及びＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。前記高濃度尿素バッファを結合用バッファとして、高塩濃度調整バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を溶出用バッファとして段階的溶出を行い、目的のポリペプチドを精製した。
【０１１８】
精製後のポリペプチド溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本とし、段階透析にて尿素を除去した。最終透析産物はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。
【０１１９】
＜ヒトｉＰＳ細胞の準備＞
ヒトｉＰＳ細胞は、独立行政法人医薬基盤研究所（郵便番号５６７−００８５大阪府茨木市彩都あさぎ７丁目６番８号）から分譲された、Ｔｉｃ（細胞番号Ｎｏ．ＪＣＲＢ１３３１）を用いた。
ヒトｉＰＳ細胞を維持するためのフィーダー細胞として、ＥｍｂｒｙｏＭａｘ（登録商標）（初代マウス胚性線維芽細胞：ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンＣ処理済み、Ｃ５７／ＢＬ６由来、継代３代目）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ (ｖ／ｖ) ウシ胎児血清培地を使用して２４時間培養し、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）上に接着させた。使用したヒトｉＰＳ細胞用培地は、表２の組成の培地に、ＦＧＦ−２（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）を終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した培地である。
【０１２０】
【表２】
2015173606.tif 000003
【０１２１】
ｉＰＳ細胞は、上記培地を用いて、３７℃／５％ＣＯ２（ｖ／ｖ、以下同じ）インキュベーター内で維持培養した。培地はｉＰＳ細胞の播種翌日を除き、毎日新たな培地に交換した。継代操作はディスパーゼＩＩ（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＧｒａｄｅＩＩ、Ｒｏｃｈｅ社）で細胞を剥離し、ピペッティング操作にて細胞を適切なサイズに分離することで実施した。
【０１２２】
上述のようにして培養したヒトｉＰＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて３７℃で５分間処理し、シングルセルに分離した。３００ｒｐｍで２分間遠心して細胞を回収し、終濃度１０μＭ Ｙ−２７３６２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁した。
【０１２３】
ＲＣＰ−１４を、１００μｇ／ｍＬの添加濃度となるように調製し、Ｔ−２５フラスコに添加して、３７℃下２時間保持して接着させた。得られたペプチド処理Ｔ−２５フラスコに対し、ｉＰＳ細胞を１００００ｃｅｌｌｓ播種し、３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター内で維持培養した。容器表面に対し、細胞が８０％コンフルエントになる度に、同様の条件で継代を実施し、合計三度の継代を行うことで完全にフィーダー細胞を除去した。
【０１２４】
＜実施例１〜１２、比較例１〜２＞
ｉＰＳ細胞を接着させるための足場として、ＲＣＰ−１４を１００μｇ／ｍＬの添加濃度となるように、又は、市販の組換え型ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０μｇ／ｍＬの添加濃度となるように、９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、３７℃下２時間保持して接着させた。得られたペプチド処理９６ウェルプレートの各ウェルに対し、１０００個／ウェルとなるよう、表３及び表４に示す培地組成にてｉＰＳ細胞を懸濁し、播種した。７２時間培養した後、非接着細胞をＰＢＳ洗浄にて取り除き、接着細胞のみを４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業）にて固定した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標）ＡＰ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にてＡＬＰ活性を算出し、検量線からＡＬＰ活性を有する未分化ｉＰＳ細胞数を算出した。結果を表３及び表４に示す。細胞増殖率は、比較例１又は比較例２を１００％とした相対値として算出した。各実施例及び比較例につき、ｎ＝６。
【０１２５】
［培地の組成］
表３及び表４に示す培地は、下記の成分で構成される。
【０１２６】
−基本培地−
本実施例における基本培地とは、ＢｅｅｒｓらがＮａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１２年、第７巻、１１号、２０３１ページ、Ｔａｂｌｅ１）に報告しているＥ８ ｂａｓｅ ｍｅｄｉｕｍと呼ばれる培地であり、組成物、濃度共に同様の培地を調製した。即ち、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３３０−０３２）に対し、Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ、Ａ８９６０）を終濃度６４ｍｇ／Ｌ、Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５２６１）を終濃度１３．６μｇ／Ｌ、Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５８８６）を終濃度１ｇ／Ｌとなるよう添加し、ｐＨを７．４に調整した。
【０１２７】
−タンパク質−
基本培地に、ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｌｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ、１２２−００１）を終濃度１０μｇ／ｍＬ、ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ９２７８）を終濃度２０ｍｇ／Ｌ、ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２４０−Ｂ／ＣＦ）を終濃度１．７４μｇ／Ｌとなるよう添加した。これらのタンパク質は全て動物由来成分を含まない遺伝子組換えタンパク質である。
【０１２８】
−細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させる物質−
基本培地に、ＡＮＰ（ペプチド研究所）又はＢＮＰ（ペプチド研究所）を、終濃度１０μＭ、３μＭ、又は１μＭとなるように添加した。
【０１２９】
【表３】
2015173606.tif 000004
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
実施例１〜６、７〜１２にて、比較例１、２に比べて、細胞増殖率の上昇が認められた。上記の結果から、基本培地にトランスフェリン、インスリン、及びＴＧＦ−β１を添加した培地に、さらにＡＮＰ又はＢＮＰを添加することでｉＰＳ細胞の増殖率が上昇することが分かる。
【配列表】
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