(57)【要約】      （修正有）【課題】膨大な数の遺伝子配列の中から特定の遺伝子配列を選択的に増幅させるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法に関し、励起光の反射成分による影響をうけずに、蛍光の光量を精度よく測定することができる核酸増幅チップを提供する。【解決手段】核酸増幅チップ１はＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡの核酸増幅を行うものであり、核酸増幅チップ１は２本鎖核酸の増幅のための複数のウェル３が形成された基板２を備え、複数のウェル３内の底面は、２本鎖核酸に照射される励起光の反射を抑制する反射防止機能を有する。【選択図】図１
2015169477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖核酸の増幅のための複数のウェルが形成された基板を備え、
前記複数のウェル内の底面は、前記２本鎖核酸に照射される励起光の反射を抑制する反射防止機能を有する核酸増幅チップ。
【請求項２】
前記複数のウェル内の底面は、前記ウェル内で増幅した前記２本鎖核酸に照射される励起光により励起される蛍光の励起波長以下のピッチの凹凸構造を有する請求項１に記載の核酸増幅チップ。
【請求項３】
前記複数のウェル内の底面は、前記ウェル内で増幅した前記２本鎖核酸に照射される励起光の波長以下のピッチの凹凸構造を有する請求項１または２に記載の核酸増幅チップ。
【請求項４】
前記２本鎖核酸に蛍光分子を結合させた状態で前記励起光を照射したときに発光する蛍光の中心波長は、前記励起光の中心波長よりも長く、
前記複数のウェル内の底面は、前記励起光の最大波長以下のピッチの凹凸構造を有する請求項３に記載の核酸増幅チップ。
【請求項５】
前記複数のウェル内の底面は、前記基板を貫通しない深さを有する窪み部の底面を粗面化して形成される請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
【請求項６】
前記基板を貫通する孔と、
前記ウェルの底面側に配置され、前記孔を塞ぐように前記基板に積層される反射防止膜と、を備える請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
【請求項７】
前記複数のウェル内の底面は黒色である請求項１乃至６のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
【請求項８】
前記複数のウェルのそれぞれには、検体と、この検体に含まれる２本鎖核酸を抽出する試薬と、特定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマと、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた蛍光を生じさせる試薬と、前記２本鎖核酸の転写を促す酵素と、が収納される請求項１乃至７のいずれかに記載の核酸増幅チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本鎖核酸を増幅させる核酸増幅チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大な数の遺伝子配列の中から特定の遺伝子配列を選択的に増幅させる技術として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法と呼ばれる技術が知られている。ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させた後、特定の１本鎖ＤＮＡの特定の部位にのみ結合するプライマを用いて、特定の２本鎖ＤＮＡのみを増幅させる技術である。増幅させた特定の２本鎖ＤＮＡに蛍光分子を結合させると、２本鎖ＤＮＡの増幅数が多いほど蛍光量が増加するため、この蛍光量を測定することで、増幅した２本鎖ＤＮＡを有する病原体等を特定することができる。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅に要する時間が２時間ほどと短く、増幅のプロセスも簡易であるため、全自動の卓上用のＰＣＲ測定装置で２本鎖ＤＮＡの増幅と特定とを行うことができる。従来のＰＣＲ測定装置では、例えばチューブの中に、検体、複数の試薬、酵素およびプライマなどを収納して、蛍光の光量を測定していた。ＰＣＲ法では、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させる際には高い温度に設定し、また１本鎖ＤＮＡにプライマを結合させた後は冷却する必要があり、温度を迅速に変化させることが測定時間の短縮化のためにも重要となる。
【０００４】
従来のＰＣＲ法で用いられるチューブは、測定に必要な試薬が２０から１００μリットル程度と多く、チューブ内の温度を均一にするのに時間がかかってしまう。温度が均一にならないと、非特異的な反応が起こり、目的とする核酸以外の核酸が増幅されるおそれがある。また、使用する試薬の価格は高いため、試薬の使用量をできるだけ少なくしたいという要望もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2008-232899号公報
【特許文献２】特開2010-32487号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景から、マイクロ流路やマイクロウェルを有する核酸増幅チップを用いて、使用する試薬の量を減らす工夫がなされている。
【０００７】
しかしながら、マイクロ流路では、試薬が予め決められた流路を通過するため、増幅の状態を調整することはできない。また、流路は通常一つしかないため、プライマごとに別個のチップを設けなければならず、手間がかかってしまう。
【０００８】
また、マイクロ流路とマイクロウェルの共通の問題として、蛍光の光量を測定する際に励起光自身がノイズになるという問題がある。すなわち、マイクロ流路やマイクロウェルに励起光を照射すると、その一部は反射し、蛍光と同じ方向に進行する。しかも、励起光の波長範囲と蛍光の波長範囲は一部が重複しているため、蛍光の光量成分だけを抽出するのが容易ではなく、励起光の反射光は蛍光の光量を測定する際のノイズ成分となってしまう。
【０００９】
さらに、蛍光波長と重複しない波長範囲で励起した場合、励起光自身によるノイズは問題なくなるが、吸収量が大幅に減るため、結果として蛍光量も減少してしまう。そうなると、必要な蛍光量を得るのに時間がかかり、本来の目的の一つである「測定時間の短縮化」と逆行してしまう。
【００１０】
本発明は、上述した課題を解決するためになされたものであり、その目的は、励起光の反射成分によるノイズの影響を抑制可能な核酸増幅チップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様では、２本鎖核酸の増幅のための複数のウェルが形成された基板を備え、
前記複数のウェル内の底面は、前記２本鎖核酸に照射される励起光の反射を抑制する反射防止機能を有する核酸増幅チップが提供される。
【００１２】
前記複数のウェル内の底面は、前記ウェル内で増幅した前記２本鎖核酸に照射される励起光により励起される蛍光の励起波長以下のピッチの凹凸構造を有していてもよい。
【００１３】
前記複数のウェル内の底面は、前記ウェル内で増幅した前記２本鎖核酸に照射される励起光の波長以下のピッチの凹凸構造を有していてもよい。
【００１４】
前記蛍光の中心波長は、前記励起光の中心波長よりも高く、
前記複数のウェル内の底面は、前記励起光の最大波長以下のピッチの凹凸構造を有していてもよい。
【００１５】
前記複数のウェルは、前記基板を貫通しない程度の深さを有する孔部の底面を粗面化して形成されてもよい。
【００１６】
前記基板の前記ウェルの開口部が配置される一主面とは反対側の主面に積層される反射防止膜を備え、
前記ウェル内の底面は、前記基板を貫通して前記反射防止膜の表面に設けられてもよい。
【００１７】
前記複数のウェル内の底面は黒色でもよい。
【００１８】
前記複数のウェルのそれぞれには、検体と、この検体に含まれる２本鎖核酸を抽出する試薬と、特定の１本鎖核酸の特定の部位に結合するプライマと、励起光の照射時に２本鎖核酸の数に応じた蛍光を生じさせる試薬と、前記２本鎖核酸の転写を促す酵素と、が収納されてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、励起光の反射成分による影響をうけずに、蛍光の光量を精度よく測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸増幅チップ１の上面図。
【図２】図１のＡ−Ａ線断面図。
【図３】図２の一部の拡大断面図。
【図４】励起光と蛍光の波長範囲を示す図。
【図５】ウェルの一変形例を示す断面図。
【図６】本実施形態による核酸増幅チップ１を用いたＰＣＲ法による遺伝子解析の処理手順の一例を示すフローチャート。
【図７】相補的に結合した２本鎖ＤＮＡを示す図。
【図８】相補的に結合した２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに分離されることを示す図。
【図９】１本鎖ＤＮＡにプライマが結合した様子を示す図。
【図１０】２つの２本鎖ＤＮＡが生成された様子を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本件明細書に添付する図面においては、図示と理解のしやすさの便宜上、縮尺および縦横の寸法比等を、実物のそれらから適宜変更したり、誇張してある。
【００２２】
図１は本発明の一実施形態に係る核酸増幅チップ１の上面図、図２は図１のＡ−Ａ線断面図、図３は図２の一部の拡大断面図である。
【００２３】
本実施形態に係る核酸増幅チップ１は、例えばＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡの核酸増幅を行うものであり、図１に示すように、基板２の一主面に沿って離隔して配置される複数のウェル３を備えている。図１では、一主面に４つのウェル３を設ける例を示しているが、ウェル３の数や配置場所には特に制限はない。
【００２４】
核酸増幅チップ１は、例えば矩形状の基板２を用いて構成されており、基板２の一辺は１０〜１５ｍｍ程度で、その厚さは０．５〜３．０ｍｍ程度である。また、ウェル３の開口径は１〜２ｍｍ程度、ウェル３の深さは１．０〜２．０ｍｍ程度である。なお、核酸増幅チップ１の縦横サイズと深さ、およびウェル３の開口径と深さには特に制限はない。ただし、本実施形態では、一つのウェル３内に収納可能な試薬の量をできるだけ少なくすることを念頭に置いており、例えば、ウェル３内に収納される試薬の総量を０．５〜３．０μリットル程度に抑えることを想定している。
【００２５】
後述するように、核酸増幅チップ１は、ウェル３内の温度を短時間で５０℃以上上下させる必要があるため、基板２の材料として、熱伝導性に優れていることと、例えば０〜１００℃程度の温度範囲での耐熱性が求められる。
【００２６】
本実施形態による核酸増幅チップ１が増幅する対象となる核酸とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、その他のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどである。以下では、ＤＮＡを増幅する例について説明する。
【００２７】
図３に示すように、ウェル３内の底面は、反射防止処理が施されている。反射防止処理を施す理由は、以下の通りである。
【００２８】
遺伝子増幅法の一例であるＰＣＲ法等では、ウェル３内で増幅した２本鎖ＤＮＡの種類を特定するために、ウェル３の上方からウェル３の底面に向かって励起光を照射する。励起光の中心波長は、例えば４９０ｎｍ程度であり、２本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光を発する蛍光分子の蛍光波長は５２０ｎｍ程度である（http://hikari2.med.okayama-u.ac.jp/download/ff_ls_appli01.pdf、5ページ目参照）。
【００２９】
理想的には、励起光は、核酸増幅チップ１の基板面の法線方向に略平行にウェル３に入射される。この励起光により、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光が放射される。図４に示すように、蛍光の中心波長は、励起光の中心波長よりも大きいのが一般的であるが、蛍光の波長範囲と励起光の波長範囲はその一部が互いに重複している。このため、励起光がウェル３内の底面で反射してしまうと、蛍光だけでなく、励起光の反射光も検出されてしまう。すなわち、励起光の反射光は、蛍光の光量を測定する際のノイズ成分となる。
【００３０】
そこで、本実施形態では、ウェル３内の底面に反射防止処理を施して、励起光ができるだけ反射しないようにする。すなわち、ウェル３内の底面は、２本鎖核酸に照射される励起光の反射を抑制する反射防止機能を有する。これにより、励起光の影響をほとんど受けずに、蛍光の光量を測定可能となり、測定精度が向上する。
【００３１】
ウェル３内の底面は、例えば図２に示すように、多数の凹凸構造４が形成された、いわゆるモスアイ構造である。凹凸構造４のピッチは、励起光の波長以下である。より詳しくは、凹凸構造４のピッチは、励起光により励起される蛍光の励起波長以下のピッチである。より具体的には、蛍光の中心波長が励起光の中心波長よりも高い場合には、凹凸構造４のピッチは、励起光の最大波長以下に設定するのが望ましい。これにより、励起光の大部分はウェル３内の底面に吸収されることになる。なお、ピッチとは、底面方向に隣接する２つの凸部の最頂部同士の距離である。図２のウェル３は、基板２を貫通しない程度の深さを有する窪み部の底面を粗面化して形成されている。ここで、粗面化とは、ウェル３の底面に上述した凹凸構造を形成することである。
【００３２】
また、凹凸構造４の凸部の高さは、１５０ｎｍ〜４５０ｎｍ程度である。凹凸構造４の凸部の高さとは、凹凸構造４の凸部の最頂部から凹部の最底部までの高低差である。多数の凹凸構造４の各凸部の高さは、同じでもよいし、異なっていてもよい。ここで、凹凸構造は、基準面に対して凸部を形成した凹凸でもよい。この場合、基準面が凹部になる。あるいは、凹凸構造は、基準面に対して凹部を形成した凹凸でもよい。この場合、基準面が凸部になる。あるいは、凹凸構造は、基準面に対して凹部と凸部の両方を形成した凹凸でもよい。
【００３３】
凹凸構造４は、その断面積が凸部の最頂部から凹部の最底部に至る過程で漸増するようにすれば、入射光に対する屈折率の急激な変化がなくなり、物質界面での不連続な屈折率変化に起因する入射光の反射が起きなくなるので望ましい。
【００３４】
ウェル３内の底面を図２に示すようにモスアイ構造にすることで、上方からウェル３に照射された励起光は、底面で吸収されて、ほとんど反射されなくなる。これにより、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を精度よく検出できる。
【００３５】
また、基板２の全体、または少なくともウェル３内の底面を、可視光の吸収性能に優れた色すなわち黒色にすることで、底面での励起光の反射をより抑制できる。
【００３６】
図２に示すモスアイ構造を形成するには、例えば、基板２を一体成形するための成形型を用意し、この成形型に予めウェル３の形状と、ウェル３の底面部分の凹凸構造４の形状とを作り込んでおき、この成形型に硬化性樹脂等を流し込んで硬化させることにより、図２のモスアイ構造を有する基板２を一体成形することができる。あるいは、基板２にエッチングや切削加工等によりウェル３を形成した後に、ウェル３の底面にプラズマ処理や研磨等により多数の凹凸構造４を形成してもよい。あるいは、他の手法により凹凸構造４を形成してもよい。
【００３７】
基板２の材料としては、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＥ（ポリエチレン）、ポリエステルなどが用いられ、これらの材料に熱伝導性を向上させるための熱伝導率の高いフィラーを含有させるのが望ましい。
【００３８】
なお、図２では、基板２の一部を除去してウェル３を形成しているが、図５に示すように、基板２を貫通する孔を形成し、この孔に接するように基板２の裏面側に反射防止膜５を積層してもよい。この場合、基板２に形成された孔と反射防止膜５とによりウェル３が形成され、ウェル３の底面は反射防止膜５の表面となる。反射防止膜５の表面、すなわち孔に接する側の面は例えばモスアイ構造になっており、図２のウェル３と同様に、ウェル３の底面にて励起光を吸収することができる。
【００３９】
反射防止膜５は、汎用のものを利用できる。反射防止膜５の材料としては、ウレタン系やエポキシ系などの熱硬化性樹脂、アクリル系やエポキシ系などの電離放射線硬化性樹脂などを用いることができる。反射防止膜５のモスアイ構造は、例えば、熱プレス法、射出成形法、溶融押出法などを利用して形成可能である。
【００４０】
図２よりも図５の方がウェル３の形成が容易であるが、反射防止膜５が別に必要になり、また、基板２と反射防止膜５との接着が強固でないと、ウェル３内の試薬が漏れるおそれがあり、また、基板２と反射防止膜５との接着材がウェル３内の試薬等と反応しないことが重要である。
【００４１】
図２や図５に示すように、ウェル３の底面に多数の凹凸構造４を設けると、励起光の反射を防止できるだけでなく、ウェル３の底面の表面積が増大することから、基板２の裏面側に配置される不図示の熱源からの熱がウェル３に伝達しやすくなる。これにより、熱源の温度に応じて、迅速にウェル３内の試薬の温度を調整できるようになる。なお、熱源としては、例えばペルチェ素子が用いられる。ペルチェ素子は、基板２の裏面側に例えば２層に分けて配置され、これら２層に流す直流電流の向きを変えることで、発熱と吸熱を切り替えることができる。あるいは、熱源として、温度を調整可能な液体が流れる流路をウェル３の底面に沿って配置して、流路内の液体の温度を変えることで、ウェル３の温度を調節してもよい。
【００４２】
図６は本実施形態による核酸増幅チップ１を用いたＰＣＲ法による遺伝子解析の処理手順の一例を示すフローチャートである。図６のフローチャートは、不図示のＰＣＲ測定装置にて行われる。
【００４３】
ＰＣＲ測定装置に、核酸増幅チップ１をセットするにあたって、遺伝子解析を行う対象である検体とＤＮＡ抽出用の試薬とを所定の容器に入れて混合し、その一部を核酸増幅チップ１の各ウェル３内に注入する（ステップＳ１）。なお、各ウェル３内には、それぞれ別個のプライマが予め収納されているものとする。プライマは、特定の１本鎖ＤＮＡの特定の部位に結合する性質を持っている。よって、例えば、核酸増幅チップ１に４個のウェル３があり、各ウェル３に別種類のプライマをそれぞれ収納しておけば、検体に４種類のプライマに対応する１本鎖ＤＮＡのいずれかが含まれているか否かを検出できることになる。なお、場合によっては、２つ以上のウェル３内に、同一のプライマを入れておいてもよい。
【００４４】
この他、ウェル３内には、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を発生させるためのＰＣＲ反応用の試薬や、二本鎖ＤＮＡの転写を促す酵素であるポリメラーゼも収納される。このように、ウェル３には、検体と、ＤＮＡ抽出用の試薬と、プライマと、ＰＣＲ反応用の試薬および酵素とが少なくとも収納される。なお、ＤＮＡ抽出用の試薬で抽出されるＤＮＡは、図７に示すように、相補的に結合した２本鎖ＤＮＡ１１である。
【００４５】
次に、ウェル３内の温度を上げることで、図８に示すように、検体中の２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離させる（ステップＳ２）。このときの温度は９０℃以上に設定される。２本鎖ＤＮＡが分離されることで、２つの１本鎖ＤＮＡ１２が生成されることになる。
【００４６】
次に、温度を４０〜６５℃程度に下げて、図９に示すように、分離した１本鎖ＤＮＡの特定の部位にプライマ１３を結合させる（ステップＳ３）。
【００４７】
その後、温度を７０℃程度にまで上げて、図１０に示すように、プライマ１３部分の２本鎖ＤＮＡを伸長させる（ステップＳ４）。この２つの１本鎖ＤＮＡのそれぞれが２本鎖ＤＮＡ１１になるため、元の２本鎖ＤＮＡ１１が２倍に増えたことになる。ステップＳ４の処理が終了すると、ステップＳ２の処理に戻って、所定回数に達するまでステップＳ２〜Ｓ４の処理が繰り返される。
【００４８】
このように、図６のステップＳ１〜Ｓ４の処理を行うたびに、２本鎖ＤＮＡを２倍に増やすことができる。ＰＣＲ法では、ステップＳ１〜Ｓ４の処理を３０回程度繰り返して、２本鎖ＤＮＡの数を増幅する。一つのウェル３内で増幅する２本鎖ＤＮＡは、そこに収納されているプライマに依存する１種類だけであるため、それぞれ異なるプライマを入れた複数のウェル３では、それぞれ異なる２本鎖ＤＮＡを増やすことができる。よって、例えば、検体の中に、ある特定の病原体が含まれているか否かを検査する際には、この特定の病原体に対応した１本鎖ＤＮＡに結合するプライマをいずれかのウェル３の中に入れておけば、このウェル３内の２本鎖ＤＮＡの数が増えるかどうかで、検体に特定の病原体が含まれているか否かを検出できる。
【００４９】
ＰＣＲ測定装置では、核酸増幅チップ１内の各ウェル３に対して励起光を照射して、蛍光の光量すなわち強度を測定する。２本鎖ＤＮＡの数が多いほど、蛍光の光量は増大するため、蛍光の光量により、各ウェル３内で２本鎖ＤＮＡが増幅したか否かを判別することができる。ＰＣＲ測定装置では、各ウェル３に入れたプライマの種類を把握しているため、蛍光の光量により、２本鎖ＤＮＡの数が増幅したと判断されたウェル３内のプライマの種類により、検体に含まれる特定の病原体等の遺伝子配列を特定することができる。
【００５０】
図６では、ＰＣＲ法による遺伝子増幅の処理手順を説明したが、本実施形態は、ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅手法にも適用可能である。より具体的には、本実施形態は、ＳＭＡＰ（SMart Amplification Process）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法などに幅広く適用可能である。
【００５１】
これらの方法はいずれも、結果として、２本鎖ＤＮＡを増幅するため、２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を発する試薬をウェル３の中に入れておくことで、ＰＣＲ法と同様に、特定の遺伝子配列が増幅したか否かを判別できる。
【００５２】
上述した実施形態では、２本鎖ＤＮＡを増幅する例を説明したが、本実施形態は、ＤＮＡではなく、ＲＮＡを増幅する場合にも適用可能である。すなわち、本実施形態による核酸増幅チップ１は、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる２本鎖核酸を増幅する場合に適用可能である。
【００５３】
このように、本実施形態では、遺伝子増幅を行わせるウェル３内の底面に反射防止処理を施すため、ウェル３に励起光を照射したときに、その励起光が反射されにくくなり、増幅された２本鎖ＤＮＡの数に応じた光量の蛍光を測定する際に、励起光がノイズとなる可能性が低くなり、蛍光の強度を精度よく検出できる。したがって、微量の試料で、迅速かつ高速に検体の遺伝子解析を行うことができる。
【００５４】
本発明の態様は、上述した個々の実施形態に限定されるものではなく、当業者が想到しうる種々の変形も含むものであり、本発明の効果も上述した内容に限定されない。すなわち、特許請求の範囲に規定された内容およびその均等物から導き出される本発明の概念的な思想と趣旨を逸脱しない範囲で種々の追加、変更および部分的削除が可能である。
【符号の説明】
【００５５】
１  核酸増幅チップ、２  基板、３  ウェル、４  凹凸構造、５  反射防止膜、１１  ２本鎖ＤＮＡ、１２  １本鎖ＤＮＡ、１３  プライマ
【図１】
2015169477.tif 000003
【図２】
2015169477.tif 000004
【図３】
2015169477.tif 000005
【図４】
2015169477.tif 000006
【図５】
2015169477.tif 000007
【図６】
2015169477.tif 000008
【図７】
2015169477.tif 000009
【図８】
2015169477.tif 000010
【図９】
2015169477.tif 000011
【図１０】
2015169477.tif 000012