(57)【要約】【課題】ＧＩＰ上昇抑制剤を評価又は選択する方法の提供。【解決手段】以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法：（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）前記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）前記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、食欲抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、食欲抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項３】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）前記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、肥満予防又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、肥満予防又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項４】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）前記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、体重増加抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、体重増加抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項５】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）前記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、消化促進剤として評価又は選択する工程、
を含む、消化促進剤の評価又は選択方法。
【請求項６】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）前記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、胃もたれ改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、胃もたれ改善剤の評価又は選択方法。
【請求項７】
前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性が、前記対照群における発現量又は活性に対して統計学的に有意に減少していた場合に、前記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記（Ｂ）で測定した発現量又は活性が、前記対照群における発現量又は活性を１００％としたときに９０％以下である場合に、前記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）前記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項１０】
以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）前記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、食欲抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、食欲抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項１１】
以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）前記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、肥満予防又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、肥満予防又は改善剤の評価又は選択方法。
【請求項１２】
以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）前記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、体重増加抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、体重増加抑制剤の評価又は選択方法。
【請求項１３】
以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）前記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、消化促進剤として評価又は選択する工程、
を含む、消化促進剤の評価又は選択方法。
【請求項１４】
以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）前記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、胃もたれ改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、胃もたれ改善剤の評価又は選択方法。
【請求項１５】
前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性が、前記対照群における発現量又は活性に対して統計学的に有意に減少していた場合に、前記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、請求項９〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性が、前記対照群における発現量又は活性を１００％としたときに９０％以下である場合に、前記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、請求項９〜１４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＩＰ（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、脂質や糖質、アミノ酸を摂取することで、消化管上皮の分泌細胞（Ｋ細胞）より分泌されるインクレチンである。ＧＩＰは、グルコース依存的に膵臓β細胞からインスリン分泌を促進し、血糖値の調節に寄与する。近年、人為的に血中ＧＩＰ濃度を高くしたマウスは、高脂肪食摂取下において脂質燃焼が抑制されることが報告されている。また、ＧＩＰ受容体欠損マウスは高脂肪食負荷による内臓脂肪や皮下脂肪の蓄積が抑制されることが明らかになっている。これらの知見から、食後のＧＩＰ調節が肥満予防や改善に有効であると考えられる。さらにＧＩＰは、胃酸分泌抑制作用や胃運動抑制作用を有することが知られていることから、ＧＩＰの上昇抑制は、食後の消化促進や胃もたれの改善に有効であると考えられる。したがって、ＧＩＰの上昇を抑制する物質の開発が望まれており、そのために、物質のＧＩＰの上昇抑制能を高感度で迅速に評価することができる方法の開発が求められている。
【０００３】
従来のＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法としては、細胞におけるＣＰＴ１遺伝子やＣＰＴ１蛋白質の発現、又はＣＰＴ１蛋白質の活性を指標とする方法（特許文献１）、ＦＡＴ／ＣＤ３６遺伝子又はＦＡＴ／ＣＤ３６蛋白質の発現を指標とする方法（特許文献２）などが知られている。
【０００４】
ＦＡＢＰｓ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、細胞内の脂肪酸結合蛋白質ファミリーであり、脂肪酸に高い結合性を有する１４〜１５ｋＤａのタンパク質である（非特許文献１、２）。脂肪酸はエネルギー源、代謝制御のシグナル分子など細胞内で多岐にわたる機能を有する。ＦＡＢＰｓは、不溶性の脂肪酸に結合して細胞内の様々な器官への輸送を可能にすることにより、脂肪酸の機能発現に重要な役割を果たしている。
【０００５】
ＦＡＢＰｓのアイソフォームであるＦＡＢＰ４とＦＡＢＰ５は、アミノ酸配列と立体構造の相同性が高く脂肪細胞とマクロファージに共発現している（非特許文献２〜４）。ＦＡＢＰ４とＦＡＢＰ５に関してノックアウトマウスを用いた機能解析が行われている（非特許文献２〜１５）。ＦＡＢＰ４は、脂肪細胞の細胞質タンパク質の１〜３％を占めており、脂肪細胞の分化マーカーとして広く利用されている（非特許文献５）。ＦＡＢＰ４については、脂肪細胞においては分子シャペロンとしての機能以外に、脂質によるシグナル伝達や細胞小器官の応答にも関わっていること、またマクロファージにおいては炎症反応に関わっていることが報告されている（非特許文献２、６、９）。ＦＡＢＰ５については、ケラチノサイトにおける乾癬の病変形成への関与が示唆され（非特許文献７）、また膵臓において自然免疫応答キー分子であるサイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０）の制御に関与することが報告されている（非特許文献８）。
【０００６】
２型糖尿病モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおいてＦＡＢＰ４をノックアウトしたマウスはインスリン感受性低下の抑制が認められた（非特許文献１１）。また、ＦＡＢＰ４ノックアウトマウスに高脂肪食を与えると野生型と比較してインスリン感受性の低下は抑制されるが、体重増加や脂肪肝には影響が認められなかった（非特許文献４、１０）。ＦＡＢＰ４ノックアウトマウスの脂肪細胞ではＦＡＢＰ５の発現が上昇していることから、ＦＡＢＰ５が代償的に働いていると考えられている（非特許文献１６、１７）。ＦＡＢＰ５ノックアウトマウスでもＦＡＢＰ４ノックアウトマウスと同様の傾向が認められている（非特許文献１２）。シングルノックアウトマウスでの結果を受けて、ＦＡＢＰ４／５ダブルノックアウトでの解析が行われ、高脂肪食を与えた際に野生型と比較して、食事誘導性肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、脂肪肝の惹起が抑制されたことが報告されている（非特許文献１３、１４、１５）。
【０００７】
ＦＡＢＰの阻害剤であるＢＭＳ３０９４０３を２型糖尿病又は動脈硬化のモデルマウスに経口投与すると、病態の改善が認められた（非特許文献１８）。食事誘導性肥満のマウスに対するＦＡＢＰ４／５阻害剤の投与は、血中のトリグリセリド値、遊離脂肪酸値の低減等、脂質異常症の改善をもたらした（非特許文献１９)。
【０００８】
しかしながら、腸で主に発現しているＦＡＢＰは、ＦＡＢＰ２であり、そのため、腸における脂質代謝の役割はＦＡＢＰ２が果たしていると従来考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−０８０８０４号公報
【特許文献２】特開２０１１−０８０８０３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｕｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，５：１７０−１９１
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，２００８，７：４８９−５０３
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８６，８３：３７８６−３７９０
【非特許文献４】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００１，７：６９９−７０５
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９９９，１４４１：１０６−１１６．
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：３２４２４−３２４３２．
【非特許文献７】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２０１１，１３１：６０４−６１２
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，３４５：４５９−４６６
【非特許文献９】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０：１２８８８−１２８９５
【非特許文献１０】Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７４：１３７７−１３７９
【非特許文献１１】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０００，１４１：３３８８−３３９６
【非特許文献１２】Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００３，５２：３００−３０７
【非特許文献１３】Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．，２００５，１：１０７−１１９
【非特許文献１４】Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００６，５５：１９１５−１９２２
【非特許文献１５】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００４，１１０：１４９２−１４９８
【非特許文献１６】Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０００，４９：９０４−９１１
【非特許文献１７】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２００６，２９０：Ｅ８１４−Ｅ８２３
【非特許文献１８】Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４７：９５９−９６５
【非特許文献１９】Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，２０１１，５２：６４６−６５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＧＩＰを分泌する腸細胞にＦＡＢＰ４及びＦＡＢＰ５（本明細書において、これらをまとめてＦＡＢＰ４／５とも称することがある）が発現していること、当該ＦＡＢＰ４／５を阻害することによって血中ＧＩＰ濃度が低下すること、したがってＦＡＢＰ４／５を阻害する物質がＧＩＰ上昇抑制剤として有用であることを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ＦＡＢＰ４／５の発現又は活性の抑制作用を指標として、ＧＩＰ上昇抑制剤を評価又は選択することが可能であることを見出した。
【００１３】
したがって、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法を提供する。
【００１４】
また本発明は、以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、各種物質のＧＩＰ上昇抑制効果をより簡便かつ正確に評価することができ、優れたＧＩＰ上昇抑制剤を選択することが可能となる。また、本発明の方法により選択されたＧＩＰ上昇抑制剤は、肥満等の発症可能性の低下、予防若しくは改善、体重増加の予防若しくは体重の低下、又は食後の消化促進や胃もたれの改善をするための有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】腸細胞におけるＦＡＢＰ５とＧＩＰの共免疫染色。
【図２】脂質乳剤単回投与後のマウスにおける血中ＴＧ及び血中ＧＩＰ濃度。Ａ：血中ΔＴＧ及び血中ΔＧＩＰの経時変化、Ｂ：血中ＧＩＰ濃度のｉＡＵＣ（０−１ｈ）及びＣｍａｘ。
【図３】小腸初代培養細胞における脂質誘導性ＧＩＰ分泌に対するＦＡＢＰ４／５阻害剤の影響。Ａ：ＢＭＳ３０９４０３による影響、Ｂ：Ｃｏｍｐｏｕｎｄ２による影響。
【図４】実施例４で用いたＦＡＢＰ５活性測定法の原理。
【図５】ＧＩＰ上昇抑制物質によるＦＡＢＰ５阻害活性。
【図６】魚油のＧＩＰ上昇抑制作用。Ａ：血中ＧＩＰ濃度変化量（ΔＧＩＰ）、Ｂ：血中ＧＩＰ濃度のｉＡＵＣ（０−４ｈ）。＊：Ｐ＜０．０５．
【発明を実施するための形態】
【００１７】
従来、腸にＦＡＢＰｓが発現していることは知られており、またマウス腸管組織切片の免疫染色により、ＦＡＢＰ４が腸腺上皮細胞の細胞膜上に局在していることが知られていた（[www.rndsystems.com/ihc_molecule_images.aspx?m=1416]）。一方で従来、腸で主に発現しているＦＡＢＰはＦＡＢＰ２であることが知られており、そのため腸における脂質代謝はＦＡＢＰ２が担っていると考えられていた。
【００１８】
しかしながら、本発明者らが腸管組織切片においてＧＩＰとＦＡＢＰ５との共免疫染色を行ったところ、ＧＩＰのシグナルが検出される細胞において、ＦＡＢＰ５の強いシグナルが認められた（図１）。この結果から、ＦＡＢＰ４／５がともに腸上皮細胞に発現している蛋白質であることが明らかになった。また後述の実施例に示すように、ＦＡＢＰ４／５を阻害することによってＧＩＰ濃度が低下したことから、ＦＡＢＰ４／５がＧＩＰ分泌に関わっていることが判明した。したがって、ＦＡＢＰ４／５を阻害する物質はＧＩＰ上昇抑制剤として有用であり、かつＦＡＢＰ４／５遺伝子の発現量、又はＦＡＢＰ４／５蛋白質の発現量や活性を測定することにより、各種物質のＧＩＰ上昇抑制効果を評価することができ、またＧＩＰ上昇抑制剤を選択することができる。
【００１９】
したがって、本発明においては、ＦＡＢＰ４／５阻害作用を指標として、各種物質のＧＩＰ上昇抑制作用を評価し、又当該評価結果に基づいてＧＩＰ上昇抑制剤を選択する。本明細書において「ＧＩＰ上昇抑制」とは、脂質及び糖質を含む食事、特に脂質を多く含む食事、そのなかでもトリアシルグリセロールを多く含む食事を摂取することにより、小腸に存在するＫ細胞から分泌されたＧＩＰの上昇を抑制することをいう。すなわち、本明細書における「ＧＩＰ上昇抑制」とは、主として食後に生じるＧＩＰ上昇を抑制することをいう。そして、本明細書における「ＧＩＰ上昇抑制作用」は、Ｋ細胞からのＧＩＰ分泌を抑制することでＧＩＰ上昇を抑制するＧＩＰ分泌抑制作用、及び血中ＧＩＰ濃度を低下させることによりＧＩＰ上昇を抑制するＧＩＰ低下作用のいずれをも含む概念である。
【００２０】
本明細書において「ＦＡＢＰ４／５の発現」とは、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現をいう。また本明細書において「ＦＡＢＰ４／５の活性」とは、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性をいう。
【００２１】
本発明のＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行うことも、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともできる。
【００２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行う場合、本発明のＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む。
（Ａ）ＦＡＢＰ４／５を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程。
【００２３】
上記本発明の方法に使用される被験物質は、ＧＩＰ上昇抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。被験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
【００２４】
上記工程（Ａ）に用いられる、ＦＡＢＰ４／５を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞の例としては、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現している、哺乳動物から単離された組織若しくは細胞、又はその培養物が挙げられる。当該単離された組織若しくは細胞、又はその培養物としては、哺乳動物から採取された十二指腸や空腸等の小腸組織又は細胞、脂肪組織又は細胞、胸腺上皮組織又は細胞、皮膚上皮組織又は細胞、及びそれらの培養物；小腸初代培養細胞；Ｃａｃｏ−２細胞、ＩＥＣ−６細胞、ＩＥＣ−１８細胞、ＳＴＣ−１細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞等の小腸培養細胞；３Ｔ３−Ｌ１細胞、などが挙げられる。
【００２５】
あるいは、上記工程（Ａ）に用いられる、ＦＡＢＰ４／５を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞の例としては、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織若しくは細胞、又はその培養物が挙げられる。当該遺伝的に改変された哺乳動物の組織又は細胞、及びその培養物は、例えば、哺乳動物の任意の組織又は細胞にＦＡＢＰ４蛋白質又はＦＡＢＰ５蛋白質をコードする遺伝子を導入して、該組織又は細胞がＦＡＢＰ４／５を発現するように、あるいはＦＡＢＰ４／５の発現が強化されるように形質転換することによって作製することができる。遺伝子を細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーションやリポフェクションなどによるベクター導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明の方法で使用されるＦＡＢＰ４／５を発現可能な組織又は細胞が由来する哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が挙げられる。
【００２７】
上記ＦＡＢＰ４／５を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞と被験物質との接触は、例えば被験物質を所定の濃度になるように予め培養液中に添加した後、当該組織又は細胞を培養液に載置すること、あるいは、当該組織又は細胞が載置された培養液に、被験物質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。接触後の組織又は細胞は、例えば室温（２５℃）〜３７℃で通常３〜４８時間程度、好ましくは６〜２４時間程度培養するのが好ましい。
【００２８】
上記培養液に対する上記組織又は細胞の播種時の濃度は、細胞が増殖可能な濃度であれば特に限定されない。また、被験物質の添加濃度は、０．００００１〜１０質量％（乾燥残分）とするのが好ましく、特に０．０００１〜３質量％（乾燥残分）とするのが好ましい。
【００２９】
上記組織又は細胞を培養する培地は、常用の培地を用いることができ、例えば１０％ＦＢＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、血清、増殖因子、インスリン等の増殖添加剤や抗菌剤等を添加することが好ましい。
【００３０】
次いで、工程（Ｂ）において、上記組織又は細胞を回収して、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する。遺伝子の発現量の測定は、ｍＲＮＡレベルで検出する場合は、例えば細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、あるいはノーザンブロット解析法等を利用して、ＦＡＢＰ４／５遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出定量することにより行うことができる。
【００３１】
ＦＡＢＰ４／５蛋白質の発現量の測定は、通常の免疫測定法、例えばＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、ウェスタンブロットなどにより行うことができるが、ウェスタンブロットが安価かつ簡便で望ましい。ＦＡＢＰ４／５蛋白質の活性の測定は、ＦＡＢＰ４／５蛋白質に対する結合基質の結合量を測定することなどにより行うことができる。
【００３２】
工程（Ｃ）〜（Ｄ）においては、上記工程（Ｂ）で測定した、被験物質に接触させたＦＡＢＰ４／５を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞（試験群）におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性と比較し、当該比較結果に基づいて、ＧＩＰ上昇抑制剤として使用できる被験物質を選択する。
【００３３】
対照群としては、試験群と同じＦＡＢＰ４／５を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞であって、被験物質に接触させなかったものが挙げられる。あるいは、対照群としては、生来的にＦＡＢＰ４／５の発現能がない又はほとんどない哺乳動物由来の組織又は細胞；試験群と同じ組織又は細胞を、ＦＡＢＰ４／５が発現しないように改変したもの；さらにこれら組織又は細胞を被験物質に接触させたもの、などが挙げられる。ＦＡＢＰ４／５が発現しないように改変した組織又は細胞としては、ｓｉＲＮＡによるＦＡＢＰ４／５ノックダウン細胞、ＦＡＢＰ４／５ノックアウトマウス由来の組織又は細胞などが挙げられる。対照群におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性の測定は、上記工程（Ｂ）に関して説明した試験群の場合と同様の手順で行うことができる。
【００３４】
次いで、試験群におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性と、対照群におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性とを比較する。試験群における発現量又は活性が対照群と比べて減少した場合、被験物質にはＧＩＰ上昇抑制効果があると評価し、該被験物質をＧＩＰ上昇抑制剤として選択する。例えば、対照群における発現量又は活性に対して、試験群における発現量又は活性が統計学的に有意に減少していた場合に、被験物質にはＧＩＰ上昇抑制効果があると評価する。別の例としては、対照群における発現量又は活性を１００％としたときに、試験群における発現量又は活性が９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下である場合に、被験物質にはＧＩＰ上昇抑制効果があると評価する。ＧＩＰ上昇抑制効果があると評価された被験物質は、ＧＩＰ上昇抑制剤として選択される。
【００３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合、本発明のＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法は、以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）を含む。
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程。
【００３６】
上記工程（Ａ'）に用いられる非ヒト哺乳動物としては、性別、月齢を問わず、いかなる種類の動物でもよい。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、及びサル等の霊長類を挙げることができるが、入手や取扱いが容易な点から、ラットやマウスなどのげっ歯類が好ましい。
【００３７】
上記非ヒト哺乳動物への被験物質の投与方法としては、例えば、経口投与、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等が挙げられる。簡便さや低侵襲性の点からは経口投与する方法が好ましい。あるいは、ＧＩＰは十二指腸及び空腸のＫ細胞より分泌されることから、カニュレーション等を用い、十二指腸や空腸に直接還流させる方法も好ましい。
【００３８】
被験物質の投与量は、０．０００４ｍｇ／ｇ体重以上、好ましくは０．０４〜２ｍｇ／ｇ体重である。投与回数は単回であっても、間隔をあけて数回に分けて投与してもよい。食餌毎の投与が好ましく、食前６０分〜食後６０分の間に投与することがより好ましい。
【００３９】
次いで、工程（Ｂ'）において、被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の小腸におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を測定する。測定の方法は、侵襲的方法でも非侵襲的方法でもよく、特に限定されない。
【００４０】
例えば、被験物質の投与１〜３６０分後、好ましくは５〜１２０分後に、上記非ヒト哺乳動物から小腸を採取する。小腸の採取は、麻酔下又は安楽死直後に開腹し、胃の幽門より下部を採取する。次いで、採取した細胞のＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を測定する。
【００４１】
工程（Ｃ'）〜（Ｄ'）においては、上記で得られた被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の小腸（試験群）におけるＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を、被験物質を投与しなかった同じ非ヒト哺乳動物から採取した小腸（対照群）の発現量又は活性と比較する。試験群における発現量又は活性が対照群と比べて減少した場合、被験物質にはＧＩＰ上昇抑制効果があると評価し、該被験物質をＧＩＰ上昇抑制剤として選択する。
【００４２】
本方法におけるその他の手法、例えば使用できる被験物質の種類、ＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性の測定手順、試験群と対照群との比較手順、被験物質の評価又は選択の手順は、上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行う方法の場合と同じである。
【００４３】
必要に応じて、選択された物質をさらなるスクリーニングにかけてもよい。例えば、上記方法でＧＩＰ上昇抑制効果があると評価又は選択された試験物質について、哺乳類小腸Ｋ細胞モデルの培養細胞株を用いた分泌刺激試験や実験動物を用いた単回投与実験によってＫ細胞からのＧＩＰ上昇抑制能を直接測定することにより、より強力なＧＩＰ上昇抑制作用を有する物質をさらに選別することができる。
【００４４】
以上の手順で本発明により選択されたＧＩＰ上昇抑制剤は、食後のＧＩＰを減少させ、肥満の発症可能性の低下、予防若しくは改善のため、体重減少や体重の増加抑制のため、又は消化促進や胃もたれを改善するための有効成分として使用される。
【００４５】
したがって、別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ）〜（Ｄ）又は（Ａ'）〜（Ｄ'）を含む食欲抑制剤の評価又は選択方法を提供する。さらに別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ）〜（Ｄ）又は（Ａ'）〜（Ｄ'）を含む肥満予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法を提供する。さらに別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ）〜（Ｄ）又は（Ａ'）〜（Ｄ'）を含む体重増加抑制剤の評価又は選択方法を提供する。なお別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ）〜（Ｄ）又は（Ａ'）〜（Ｄ'）を含む消化促進剤又は胃もたれ改善剤の評価又は選択方法を提供する。
これらの方法の工程（Ｄ）又は（Ｄ'）では、工程（Ｃ）又は（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４／５の発現量又は活性を減少させる被験物質を、食欲抑制剤、肥満予防及び／又は改善剤、体重増加抑制剤、あるいは消化促進剤又は胃もたれ改善剤として、それぞれ評価又は選択する。
【００４６】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００４７】
＜１＞以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法。
【００４８】
＜２＞以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、食欲抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、食欲抑制剤の評価又は選択方法。
【００４９】
＜３＞以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、肥満予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、肥満予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【００５０】
＜４＞以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、体重増加抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、体重増加抑制剤の評価又は選択方法。
【００５１】
＜５＞以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、消化促進剤として評価又は選択する工程、
を含む、消化促進剤の評価又は選択方法。
【００５２】
＜６＞以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）該哺乳動物由来の組織又は細胞におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性を、対照群におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、胃もたれ改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、胃もたれ改善剤の評価又は選択方法。
【００５３】
＜７＞好ましくは、上記ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞が以下である、
＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の方法：
（１）哺乳動物から採取された小腸組織若しくは細胞、又はその培養物；
（２）哺乳動物から採取された脂肪組織若しくは細胞、胸腺上皮組織若しくは細胞、皮膚上皮組織若しくは細胞、又はその培養物；
（３）ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織若しくは細胞、又はその培養物；
（４）小腸初代培養細胞；又は、
（５）Ｃａｃｏ−２細胞、ＩＥＣ−６細胞、ＩＥＣ−１８細胞、ＳＴＣ−１細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞、又は３Ｔ３−Ｌ１細胞。
【００５４】
＜８＞好ましくは、上記対照群が以下である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法：
（１）上記ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞であって、上記被験物質に接触させなかったもの；
（２）生来的にＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現能がない又はほとんどない哺乳動物由来の組織又は細胞；
（３）上記ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質を発現可能な哺乳動物由来の組織又は細胞を、当該遺伝子又は蛋白質が発現しないように改変したもの；又は
（４）該（２）又は（３）の組織又は細胞を被験物質に接触させたもの。
【００５５】
＜９＞好ましくは、上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性が、上記対照群における発現量又は活性に対して統計学的に有意に減少していた場合に、上記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法。
【００５６】
＜１０＞好ましくは、上記（Ｂ）で測定した発現量又は活性が、上記対照群における発現量又は活性を１００％としたときに９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下である場合に、上記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の方法。
【００５７】
＜１１＞以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、ＧＩＰ上昇抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、ＧＩＰ上昇抑制剤の評価又は選択方法。
【００５８】
＜１２＞以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、食欲抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、食欲抑制剤の評価又は選択方法。
【００５９】
＜１３＞以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、肥満予防及び／又は改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、肥満予防及び／又は改善剤の評価又は選択方法。
【００６０】
＜１４＞以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、体重増加抑制剤として評価又は選択する工程、
を含む、体重増加抑制剤の評価又は選択方法。
【００６１】
＜１５＞以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、消化促進剤として評価又は選択する工程、
を含む、消化促進剤の評価又は選択方法。
【００６２】
＜１６＞以下の工程（Ａ'）〜（Ｄ'）：
（Ａ'）被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程、
（Ｂ'）該非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を測定する工程、
（Ｃ'）上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性を、対照群の非ヒト哺乳動物から採取した小腸におけるＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性と比較する工程、
（Ｄ'）上記（Ｃ'）の結果に基づいて、ＦＡＢＰ４遺伝子若しくはＦＡＢＰ５遺伝子の発現量、ＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の発現量、又はＦＡＢＰ４蛋白質若しくはＦＡＢＰ５蛋白質の活性を減少させる被験物質を、胃もたれ改善剤として評価又は選択する工程、
を含む、胃もたれ改善剤の評価又は選択方法。
【００６３】
＜１７＞好ましくは、上記対照群が被験物質を投与しなかった上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸である、＜１１＞〜＜１６＞のいずれか１に記載の方法。
【００６４】
＜１８＞好ましくは、上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性が、上記対照群における発現量又は活性に対して統計学的に有意に減少していた場合に、上記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、＜１１＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法。
【００６５】
＜１９＞好ましくは、上記（Ｂ'）で測定した発現量又は活性が、上記対照群における発現量又は活性を１００％としたときに９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは６０％以下である場合に、上記被験物質はＧＩＰ上昇抑制効果、食欲抑制効果、肥満予防及び／又は改善効果、体重増加抑制効果、消化促進効果、あるいは胃もたれ改善効果があると評価される、＜１１＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００６７】
（ＦＡＢＰ４／５阻害剤）
以下の実施例では、ＦＡＢＰ４／５阻害剤として、下記のＢＭＳ３０９４０３（ＡｓｔａＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）又はＣｏｍｐｏｕｎｄ２（Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０１１，５２，６４６−６５６）を用いた。
【００６８】
【化１】
2015194481.tif 000002
【００６９】
実施例１  腸細胞におけるＦＡＢＰ４／５の発現
（免疫染色）
Ｃ５７ＢＬ/６Ｊマウス（雄）（日本クレア）より採取した十二指腸を４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ水溶液で固定後、凍結切片を作製し、免疫染色を行った。ＧＩＰ及びＦＡＢＰ５における抗体を用いて二重蛍光染色を行い、腸細胞におけるＦＡＢＰ５の発現を検討した。一次抗体として、ＧＩＰの抗体にはＴ−４３４０（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ製）を用いた。また、ＦＡＢＰ５の抗体にはＡＦ１４７６（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いた。また二次抗体にはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｄｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  Ｄｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。常法に従い、４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ水溶液において４℃にて１０分間固定し、ＰＢＳ洗浄後、一次抗体（１００倍ブロッキング液：１０％Ｄｏｎｋｅｙ  Ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ＰＢＳ）において室温で３時間反応させた。再度ＰＢＳ洗浄した後、二次抗体（５００倍ブロッキング液）を室温で１時間反応させ、ＰＢＳ洗浄後、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にて核染色及び封入し、顕微鏡下で観察した（４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６８ｎｍのレーザー使用）。
【００７０】
（結果）
染色像を図１に示した。マウス小腸において、絨毛に存在する細胞の管腔側に連続的にＦＡＢＰ５の発現が認められた（矢印）。また、ＧＩＰ陽性であるＫ細胞（白点線内）においてもＦＡＢＰ５の発現が認められた。なお、ＦＡＢＰ４が腸腺上皮の細胞膜上に局在していることは既に知られている（[www.rndsystems.com/ihc_molecule_images.aspx?m=1416]）。したがって本実施例の結果から、ＦＡＢＰ４／５がともに腸の上皮細胞で発現していることが明らかにされた。
【００７１】
実施例２  ＦＡＢＰ４／５阻害がＧＩＰ分泌に及ぼす影響
（マウス単回投与試験）
１８時間絶食したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄性、９週齢、ｎ＝４−５、日本クレア）に、麻酔下にてＦＡＢＰ４／５阻害剤ＢＭＳ３０９４０３（３０ｍｇ／ｋｇ体重）を含む溶媒（１０％ １−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｒｏｌｉｏｎｅ、５％ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ、２％ｅｔｈａｎｏｌ）、又は溶媒のみ（コントロール）を経口ゾンデにて胃内投与した。３０分後、脂質乳剤（トリオレイン；２ｍｇ／ｇ体重）を胃内投与した。採血は、脂質乳剤投与前、投与後１０、３０、及び６０分において眼窩静脈叢採血により行った。採取した血液を１１，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離を行い、血漿を調製した。血中ＧＩＰ濃度、血中トリグリセリド（ＴＧ）濃度については、それぞれＧＩＰ ＥＬＩＳＡキット（ラット／マウス用）（ミリポア）及びトリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬工業）用いて測定した。
【００７２】
（結果）
脂質乳剤単回投与後のマウスにおける血中のＴＧ濃度変化量（ΔＴＧ）及びＧＩＰ濃度変化量（ΔＧＩＰ）の経時変化、ならびに血中ＧＩＰ濃度のｉＡＵＣ（０−１ｈ）及びＣｍａｘを図２に示す。脂質乳剤投与後における血中ＴＧ濃度及び血中ＧＩＰ濃度の上昇は、コントロール群と比較して阻害剤添加群において統計学的に有意に低減した（図２Ａ）。また、血中ＧＩＰ濃度のｉＡＵＣ及びＣｍａｘもまた、コントロール群と比較して阻害剤添加群において統計学的に有意に低減した（図２Ｂ）。
【００７３】
実施例３  小腸初代培養細胞でのＦＡＢＰ４／５阻害試験
（小腸初代培養細胞の調製）
１３〜１７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させた後、上部小腸（胃幽門直下から１０ｃｍ）を摘出して、氷冷したＬ−１５培地（Ｓｉｇｍａ）に浸透した。これを氷冷ＰＢＳ中に移し、腸管に付着した脂肪及び血管等を丁寧に除去し、管腔内を氷冷ＰＢＳで洗浄した後、メスを用いて組織を微塵切り（２ｍｍ2以下の小片）にした。小片をＰＢＳで３〜４回洗浄した後、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＸＩ（Ｓｉｇｍａ；０．４ｍｇ／ｍＬ）を溶解したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＬ添加し、１０秒間激しく振とうしてから３７℃で５分間インキュベートした。上清を除去した後、再びＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ溶液を１０ｍＬ添加して１０秒間激しく振とうし、３７℃で５分間インキュベートした。その後、上清を除去し、再びＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ溶液を１０ｍＬ添加して１０秒間激しく振とうし、３７℃で１５分間インキュベートした。その間、５分ごとに１０秒間の振とうを行った。インキュベート後に上清を回収し（上清１）、同様にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ溶液を添加して１５分間インキュベートし、上清を回収した（上清２）。上清１と上清２を１００ｒｃｆ（約８００ｒｐｍ）で３分間遠心した（室温）。上清を除去し、それぞれ１０ｍＬのＤＭＥＭに懸濁した後、これらを合わせて１００ｒｃｆで３分間遠心した（室温）。上清を除去し、７ｍＬのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有）に懸濁した。これをｍａｔｒｉｇｅｌTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートした４８ウェルプレートに播種し（１匹辺り２４ウェル）、３７℃、５％ＣＯ2下でインキュベートした。
【００７４】
（ＧＩＰ分泌刺激）
２４時間培養した小腸初代培養細胞を刺激培地（４．５ｍＭ  ＫＣｌ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、２．６ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨ（ｐＨ７．４に調整））で１回穏やかに洗浄した後、刺激培地のみ、又はＦＡＢＰ４／５阻害剤（１０又は２５μＭ）を含む刺激培地を添加してインキュベートした。３０分後、刺激培地で１回穏やかに洗浄し、刺激培地のみ（コントロール）、脂質ミセル（ＰＰＭ：刺激培地＋５００μＭタウロコール酸Ｎａ、２００μＭオレイン酸、５０μＭ  ２−モノオレイン）、又はＰＰＭ＋ＦＡＢＰ４／５阻害剤（１０又は２５μＭ）を添加し、３０分後に培地を回収した。ＦＡＢＰ４／５阻害剤としては、ＢＭＳ３０９４０３又はＣｏｍｐｏｕｎｄ２を用いた。
【００７５】
（ＧＩＰ分泌率の測定）
回収した培地を、８，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して上清を得た（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓａｍｐｌｅ）。上清回収後のプレートにＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５％（ｗ／ｖ）Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、１％（ｖ／ｖ）Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、５０ｍｍｏＬ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ ｔａｂｌｅｔ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ））を添加し、凍結融解した後に細胞を回収した。これを１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を得た（Ｌｙｓｉｓ ｓａｍｐｌｅ）。これらのサンプルについてＧＩＰ ＥＬＩＳＡキット（ラット／マウス用）（ミリポア）を用いてＧＩＰの定量を行い、ＧＩＰ分泌率を求めた。ＧＩＰ分泌率の算出方法を下記に示す。
【００７６】
【化２】
2015194481.tif 000003
【００７７】
（結果）
ＰＰＭ刺激された小腸初代培養細胞におけるＧＩＰ分泌率を図３に示す。ＰＰＭ刺激された細胞（ＰＰＭ群）では、コントロール群と比較して、刺激後３０分でのＧＩＰ分泌率が統計学的に有意に上昇した。一方、ＰＰＭ刺激に加えてＦＡＢＰ４／５阻害剤を添加した細胞（ＰＰＭ＋阻害剤群）では、ＰＰＭ群に対してＧＩＰ分泌率の上昇が統計学的に有意に抑制された。ＰＰＭ刺激＋ＢＭＳ３０９４０３添加群では、用量依存的なＧＩＰ分泌の上昇抑制傾向が認められた（図３Ａ）。
【００７８】
実施例４  ＦＡＢＰ５活性に基づくＧＩＰ上昇抑制剤のスクリーニング
ＦＡＢＰ５活性に基づいてＧＩＰ上昇抑制剤をスクリーニングした。試験物質のＦＡＢＰ５活性に及ぼす影響は、ＦＡＢＰ５蛋白質への試験物質の拮抗的な結合を利用してＦＡＢＰ５活性を測定することにより調べた。本実施例で用いたＦＡＢＰ５活性測定法の原理を図４に示す。１−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−８−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（１，８−ＡＮＳ）は、ＦＡＢＰ５に結合することで蛍光を発することが報告されている物質である（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１４，２３（２４）：６４９５−６５１１）。１，８−ＡＮＳは、疎水性環境下でのみ蛍光を発する物質であり、親水性環境下では蛍光を発しない（図４Ａ）。一方、ＦＡＢＰ５存在下では、１，８−ＡＮＳはＦＡＢＰ５との結合により分子周辺が疎水性環境となるため蛍光を発するようになる（図４Ｂ）。しかし、ＦＡＢＰ５に対する結合定数がより小さい物質がさらに存在すると、その物質が１，８−ＡＮＳより優先的にＦＡＢＰ５に結合するため、１，８−ＡＮＳは蛍光を発しなくなる（図４Ｃ）。上記方法で蛍光強度の上昇を抑制した試験物質は、ＦＡＢＰ５蛋白質と結合してその活性を阻害する物質である。
【００７９】
（試験物質によるＦＡＢＰ５阻害活性の測定）
大腸菌由来組換型ＦＡＢＰ５を定法により発現させ、精製した。９６穴プレートに、精製したＦＡＢＰ５蛋白質、１，８−ＡＮＳ及び試験物質を添加し、室温にて５分間静置した後、プレートリーダーにて蛍光強度（励起波長：３５５ｎｍ、蛍光波長：４８０ｎｍ）を測定した。試験物質としては、実施例３で用いたＧＩＰ上昇抑制作用を有するＦＡＢＰ５阻害剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ２）、及び後述の参考例1で示すようにＧＩＰ上昇抑制作用を有する油脂である魚油を用いた。評価系中の試験物質の最終濃度は０．００２％〜０．１％（ｗ／ｖ）とした。
【００８０】
（結果）
評価結果を図５に示す。ＦＡＢＰ５と１，８−ＡＮＳが共存することによりｂｕｆｆｅｒのみ、又はＦＡＢＰ５や１，８−ＡＮＳ単独と比較して有意な蛍光強度の上昇が認められた。この蛍光強度の上昇は、ＧＩＰ上昇抑制作用を有するＦＡＢＰ５阻害剤の添加により統計学的に有意に抑制された（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。また、ＧＩＰ上昇抑制作用を有する油脂である魚油を添加した場合も、蛍光強度は統計学的に有意に低下した（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＜０．０５）。一方、ＧＩＰ上昇抑制作用を有さない試験物質を添加した場合は、蛍光強度は低下しなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＦＡＢＰ５の活性を指標に、試験物質のＧＩＰ上昇抑制作用を評価することができることを示している。
【００８１】
参考例１  魚油のＧＩＰ上昇抑制作用
マウス単回食餌試験により、魚油のＧＩＰ上昇抑制作用を調べた。１８時間絶食したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄性、８週齢、ｎ＝１０、日本クレア）に、６０分間、高脂肪食（ＨＦ）食（２５％なたね油＋５％パーム油）又は、魚油食(１５．４％なたね油＋５％パーム油＋９．６％魚油（１０％ＤＨＡ））を粉末飼料として自由摂餌させた。自由摂餌前、摂餌後６０、１２０、及び２４０分において各マウスの眼窩静脈叢から採血した。採取した血液を１１，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離を行い、血漿を調製し、ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡキット（ラット／マウス用）（ミリポア）を用いて血中ＧＩＰ濃度を測定した。試験食摂餌後のマウスにおける血中ＧＩＰ濃度変化量（ΔＧＩＰ）の経時変化、および血中ＧＩＰ濃度のｉＡＵＣ（０−４ｈ）を図６Ａ、Ｂに示す。血中ＧＩＰ濃度の上昇は、ＨＦ食群と比較して魚油食群において統計学的に有意に低減した。
【図１】
2015194481.tif 000004
【図２】
2015194481.tif 000005
【図３】
2015194481.tif 000006
【図４】
2015194481.tif 000007
【図５】
2015194481.tif 000008
【図６】
2015194481.tif 000009