(57)【要約】【課題】本発明は、被検出物質の高感度検出と、簡素な試験片の構造という通常相容れがたい項目について、両立を可能とするイムノクロマト法試験片の提供を目的とする。【解決手段】被検出物質に結合するリガンドである捕捉物質を固定化したメンブレンを含み、被検出物質に結合するリガンドを結合させた不溶性担体粒子を用い、該不溶性担体粒子をメンブレン上に固定化した捕捉物質に捕捉させることにより集積させ、メンブレンに光を照射して、該不溶性担体粒子が集積した部位または不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において発する光を検出することにより被検出物質を測定するイムノクロマト試験片であって、メンブレンの光が照射される側とは反対側に光反射材を設けた、イムノクロマト試験片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質に結合するリガンドである捕捉物質を固定化したメンブレンを含み、被検出物質に結合するリガンドを結合させた不溶性担体粒子を用い、該不溶性担体粒子をメンブレン上に固定化した捕捉物質に捕捉させることにより集積させ、メンブレンに光を照射して、該不溶性担体粒子が集積した部位または不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において発する光を検出することにより被検出物質を測定するイムノクロマト試験片であって、メンブレンの光が照射される側とは反対側に光反射材を設けた、イムノクロマト試験片。
【請求項２】
不溶性担体粒子が蛍光標識された不溶性担体粒子であり、照射光として励起光を照射し、不溶性担体粒子が集積した部位から発する蛍光を検出することにより被検出物質を測定する、請求項１記載のイムノクロマト試験片。
【請求項３】
不溶性担体粒子が着色不溶性担体粒子であり、照射光を照射し不溶性担体粒子が集積した部位および不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射する反射光を検出することにより被検出物質を測定する、請求項１記載のイムノクロマト試験片。
【請求項４】
照射光の全反射率が85％以上の光反射材を用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項５】
さらに、試料添加部位、吸収帯および標識部位を有している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項６】
光反射材が金属でできた反射材である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項７】
金属がアルミニウムまたは銅である、請求項６記載のイムノクロマト試験片。
【請求項８】
金属がアルミニウムである場合は250nm〜1000nmの照射光を用い、銅である場合は600nm〜1000nmの照射光を用いる、請求項７記載のイムノクロマト試験片。
【請求項９】
光反射材が、メンブレンの照射光が照射される側とは反対側に接触して設けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項１０】
格納容器に収納された、請求項１〜９のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片であって、格納容器の内面であって、メンブレンの照射光が照射される側とは反対側の格納容器内面に光反射材を設けた、イムノクロマト試験片。
【請求項１１】
光反射材が、反射した照射光をイムノクロマト試験片の検出部位付近に集める構造を有している、請求項１０記載のイムノクロマト試験片。
【請求項１２】
格納容器自体が光反射材でできている、請求項１０または１１に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項１３】
被検出物質と被検出物質に結合するリガンドが抗原と抗体であるか、または抗体と抗原である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項１４】
被検出物質に結合するリガンドである捕捉物質を固定化したメンブレンを含み、被検出物質に結合するリガンドを結合させた不溶性担体粒子を用い、該不溶性担体粒子をメンブレン上に固定化した捕捉物質に捕捉させることにより集積させ、メンブレンに光を照射して、該不溶性担体粒子が集積した部位または不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において発する光を検出することにより被検出物質を測定するイムノクロマト法において、メンブレンの光が照射される側とは反対側に光反射材を設けることにより、検出光を増強する方法。
【請求項１５】
不溶性担体粒子が蛍光標識された不溶性担体粒子であり、照射光として励起光を照射し、不溶性担体粒子が集積した部位から発する蛍光を検出することにより被検出物質を測定する、請求項１４記載の検出光を増強する方法。
【請求項１６】
不溶性担体粒子が着色不溶性担体粒子であり、照射光を照射し不溶性担体粒子が集積した部位および不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射する反射光を検出することにより被検出物質を測定する、請求項１４記載の検出光を増強する方法。
【請求項１７】
照射光の全反射率が85％以上の光反射材を用いる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の検出光を増強する方法。
【請求項１８】
光反射材が金属でできた反射材である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の検出光を増強する方法。
【請求項１９】
金属がアルミニウムまたは銅である、請求項１８記載の検出光を増強する方法。
【請求項２０】
金属がアルミニウムである場合は250nm〜1000nmの照射光を用い、銅である場合は600nm〜1000nmの照射光を用いる、請求項１９記載の検出光を増強する方法。
【請求項２１】
被検出物質と被検出物質に結合するリガンドが抗原と抗体であるか、または抗体と抗原である、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の検出光を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の被検出物質を特異的に、迅速に検出するための方法およびそれを用いたキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノクロマト法とは、被検出物質を特異的に認識するリガンドを結合させた不溶性担体粒子を用いて、該担体粒子が被検出物質を捕捉し、繊維構造を持つ試験片中を毛細管現象を利用して移動し、試験片中の所定の位置に固定化された被検出物質に特異的に結合する捕捉物質と結合することにより、試験片中の所定の位置に、凝集した不溶性担体粒子が集積することを利用し、目視または検出装置により不溶性担体粒子の集積の有無を検出し、被検出物質の有無を分析する免疫学的方法である。その簡便さにより、実験室用ではないPOCT（Point Of Care Test）の体外診断用医薬品として広く利用されている。
【０００３】
従来、被検出物質を特異的に認識するリガンドを標識する対象である粒子としては、金コロイド、白金金コロイド、着色ポリスチレン粒子など不溶性担体粒子を用い、各種粒子の色相を利用して、目視または専用の装置を用いて粒子の集積の有無が判断されてきた。
【０００４】
さらに高感度化を課題として、蛍光を発する微粒子を用いることで免疫学的凝集反応による簡便性を生かしたまま感度を向上させることが提案されている（特許文献１参照）。
【０００５】
また、蛍光を発する微粒子を用いる場合は、その高感度検出のために専用の装置が必須となる。その可搬性はPOCTとしての利用を考慮に入れた場合非常に重要な課題である。
【０００６】
この課題を解決するべく、非常に可搬性があり安く、かつ頑健で感度の高い蛍光検出用の装置も提案されている（特許文献２参照）。
【０００７】
このような蛍光を発する粒子や装置を用いてのイムノクロマト法の高感度検出法のための提案はなされているものの、試験片上の所定位置に集積した蛍光を発する粒子に光を照射し、励起され前記粒子から発生する光を検出するという試験系において、粒子ではなく、その試験片および試験片を格納するケースを改良することで高感度検出を可能とする技術は提案されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2012-32263号公報
【特許文献２】特表2005-515429号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
専用の検出装置による高感度化において、検出装置側の検出機構は少なからず複雑化せざるを得ない一方で、被検出物質を含有する生体由来物質を用いて試験を行った試験片（POCTキット本体）は、使用後は廃棄が必須となる。臨床の現場で広く普及し、様々な分野に適応されるためには、試験片の取扱いは簡便であり、かつ安価であることが求められる。このためには試験片の構造は簡素でなければならない。
【００１０】
本発明は、被検出物質の高感度検出と、簡素な試験片の構造という通常相容れがたい項目について、両立を可能とするイムノクロマト試験片の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
蛍光検出装置等の検出装置を用いての測定においては、検出装置に含まれる光源より一定波長の励起光が試験片へと照射される。試験片上の集積した蛍光を発する粒子はこの励起光を受け、特定の波長の蛍光を発する。この蛍光を発する粒子より発された特定波長の光を検出装置により検出する。
【００１２】
検出装置から照射される励起光は試験片上の蛍光を発する粒子が集積した部位に照射されるが、この際すべての励起光が粒子に照射されるのではなく、少なからずの光は試験片下部へと通り抜けてしまい、蛍光の発生に関与せず減光してしまう。
【００１３】
本発明の試験片は、この試験片下部へと通り抜けてしまう照射光を、試験片下部に照射光を反射する光反射材を設置することで反射させ、集積した蛍光を発する粒子に、照射光を効率的に当てることで発生する蛍光、すなわち最終的に検出する光を増強させる。本発明の試験片は従来の試験片と大きく変わらず、複雑な構造を有しない簡素な構造を有する試験片であるが、反射材を設けることで高感度で被検出物質を検出することを可能とした。
【００１４】
また、蛍光を発する粒子ではなく、可視域の色に着色された粒子を用いる場合も、試験片下部に照射光を反射する光反射材を設置することで、粒子が集積した部位において照射された光の反射光が粒子の存在により減衰する一方で、粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射して検出される光の強度が増強し、最終的に検出する光が増強し、高感度で被検出物質を検出することを可能とした。
【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  被検出物質に結合するリガンドである捕捉物質を固定化したメンブレンを含み、被検出物質に結合するリガンドを結合させた不溶性担体粒子を用い、該不溶性担体粒子をメンブレン上に固定化した捕捉物質に捕捉させることにより集積させ、メンブレンに光を照射して、該不溶性担体粒子が集積した部位または不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において発する光を検出することにより被検出物質を測定するイムノクロマト試験片であって、メンブレンの光が照射される側とは反対側に光反射材を設けた、イムノクロマト試験片。
[２]  不溶性担体粒子が蛍光標識された不溶性担体粒子であり、照射光として励起光を照射し、不溶性担体粒子が集積した部位から発する蛍光を検出することにより被検出物質を測定する、[１]のイムノクロマト試験片。
[３]  不溶性担体粒子が着色不溶性担体粒子であり、照射光を照射し不溶性担体粒子が集積した部位および不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射する反射光を検出することにより被検出物質を測定する、[１]のイムノクロマト試験片。
[４]  照射光の全反射率が85％以上の光反射材を用いる、[１]〜[３]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[５]  さらに、試料添加部位、吸収帯および標識部位を有している、[１]〜[４]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[６]  光反射材が金属でできた反射材である、[１]〜[５]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[７]  金属がアルミニウムまたは銅である、[６]のイムノクロマト試験片。
[８]  金属がアルミニウムである場合は250nm〜1000nmの照射光を用い、銅である場合は600nm〜1000nmの照射光を用いる、[７]のイムノクロマト試験片。
[９]  光反射材が、メンブレンの照射光が照射される側とは反対側に接触して設けられる、[１]〜[８]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[１０]  格納容器に収納された、[１]〜[９]のいずれかのイムノクロマト試験片であって、格納容器の内面であって、メンブレンの照射光が照射される側とは反対側の格納容器内面に光反射材を設けた、イムノクロマト試験片。
[１１]  光反射材が、反射した照射光をイムノクロマト試験片の検出部位付近に集める構造を有している、[１０]のイムノクロマト試験片。
[１２]  格納容器自体が光反射材でできている、[１０]または[１１]のイムノクロマト試験片。
[１３]  被検出物質と被検出物質に結合するリガンドが抗原と抗体であるか、または抗体と抗原である、[１]〜[１２]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[１４]  被検出物質に結合するリガンドである捕捉物質を固定化したメンブレンを含み、被検出物質に結合するリガンドを結合させた不溶性担体粒子を用い、該不溶性担体粒子をメンブレン上に固定化した捕捉物質に捕捉させることにより集積させ、メンブレンに光を照射して、該不溶性担体粒子が集積した部位または不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において発する光を検出することにより被検出物質を測定するイムノクロマト法において、メンブレンの光が照射される側とは反対側に光反射材を設けることにより、検出光を増強する方法。
[１５]  不溶性担体粒子が蛍光標識された不溶性担体粒子であり、照射光として励起光を照射し、不溶性担体粒子が集積した部位から発する蛍光を検出することにより被検出物質を測定する、[１４]の検出光を増強する方法。
[１６]  不溶性担体粒子が着色不溶性担体粒子であり、照射光を照射し不溶性担体粒子が集積した部位および不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射する反射光を検出することにより被検出物質を測定する、[１４]の検出光を増強する方法。
[１７]  照射光の全反射率が85％以上の光反射材を用いる、[１４]〜[１６]のいずれかの検出光を増強する方法。
[１８]  光反射材が金属でできた反射材である、[１４]〜[１７]のいずれかの検出光を増強する方法。
[１９]  金属がアルミニウムまたは銅である、[１８]の検出光を増強する方法。
[２０]  金属がアルミニウムである場合は250nm〜1000nmの照射光を用い、銅である場合は600nm〜1000nmの照射光を用いる、[１９]の検出光を増強する方法。
[２１]  被検出物質と被検出物質に結合するリガンドが抗原と抗体であるか、または抗体と抗原である、[１４]〜[２０]のいずれかの検出光を増強する方法。
【発明の効果】
【００１６】
蛍光色素で標識された不溶性担体粒子または着色された不溶性担体粒子を用い、該粒子をイムノクロマト試験片上に集積させ、該粒子から発せられる蛍光を検出する、あるいは、着色された不溶性担体粒子を用い、該粒子をイムノクロマト試験片上に集積させ、該粒子が集積した部位および集積した部位以外の周囲の部位を含む部位において反射光を検出する、イムノクロマト試験において、本発明においては、イムノクロマト試験片上の不溶性担体粒子が集積する部位の下側に光反射材を設ける。そのため、蛍光色素で標識された不溶性担体粒子を用いた場合、蛍光色素で標識した不溶性担体粒子が集積した部位に照射した励起光がメンブレンを透過した場合でも、光反射材で反射して、蛍光色素に当たり、蛍光色素を励起することができる。また、発生した蛍光の一部は光反射材で反射して検出光として検出される。その結果、蛍光である検出光の強度が増強される。また、着色された不溶性担体粒子を用いた場合、照射光は不溶性担体粒子に吸収されるので、照射した光の反射光が不溶性担体粒子により減衰し、その一方で、照射光が不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位で反射し、反射した光が増強した検出光として検出される。この結果、被検出物質の検出感度を高くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の光反射材を備えたイムノクロマト試験片を用いた場合の検出光の増強の原理を示す図である。
【図２】各種金属の全反射率を示す図である。
【図３】本発明の光反射材を含むイムノクロマト試験片、デバイスにおける、光反射材の位置および形状を示す図である。
【図４】本発明の光反射材を含むイムノクロマト試験片および従来のイムノクロマト法試験片の構造を示す図である。
【図５】本発明の光反射材を含むイムノクロマト試験片および従来のイムノクロマト法試験片の検出部位における蛍光を示す図である。
【図６】本発明の光反射材を含むイムノクロマト試験片および従来のイムノクロマト法試験片の構造、ならびに実施例２における切断部位を示す図である。
【図７】光反射材として種々の金属箔を用いた場合の反射効果を示す図である。
【図８】光反射材として種々の金属箔を用いた場合の反射効果を示す図である。
【図９−１】着色ポリスチレン粒子を用いた場合の光反射材を用いての反射効果を示す図である。
【図９−２】着色ポリスチレン粒子を用いた場合の、照射した光の反射光の粒子による減衰を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、イムノクロマト法による被検出物質の検出に用いる試験片である。イムノクロマト法においては、被検出物質を特異的に認識し結合するリガンドを固定化した試験片と被検出物質を特異的に認識するリガンドを結合させ、かつ不溶性担体粒子を用いて、該不溶性担体粒子が被検出物質と結合し、繊維構造を持つ試験片中を毛細管現象を利用して移動し、試験片中の所定の部位に固定化された被検出物質に特異的に結合する捕捉物質と結合することにより、試験片上の所定の部位に、捕捉物質-被検出物質-不溶性担体粒子の複合体を形成し、凝集した不溶性担体粒子が集積することを利用し、不溶性担体粒子が集積した部位を含む試験片上に光を照射し、試験片上の部位において発せられる光を検出光として検出装置または目視により測定し、不溶性担体粒子の集積の有無を検出し、被検出物質の有無を分析する。
【００１９】
本発明のイムノクロマト試験片は、試験片上の光を照射する側と反対側に光反射材を備えたことを特徴とする。被検出物質が存在する場合、不溶性担体粒子は試験片上の捕捉物質が固定化された部位、すなわち検出部位に集積する。光反射材を備えることにより、試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位において発せられ、光検出装置または目視により検出される検出光が増強される。すなわち、試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位において発する光が増強され、あるいは該検出部位において発する光に比較して該検出部位以外の周囲の部位において発する光の強度が増強し、その結果検出光の強度が増強される。ここで、検出光とは、試験片上に光を照射した後に、試験片上から発せられ、光検出装置または目視により検出される光をいう。具体的には、光反射材を備えているイムノクロマト試験片を用いることにより、試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位において発する光の強度と該検出部位以外の周囲の部位において発する光の強度のコントラストが大きくなり、その結果検出部位に集積した不溶性担体粒子の存在を検出することができる。本発明において、「試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位において発する光」という場合、検出部位に集積した不溶性担体粒子自体から発生する光も、検出部位で反射する光、もしくは試験片の光を照射する側と反対側に備えられた光反射材で反射して検出部位を通って検出される光も含まれる。また、「試験片上の検出部位以外の周囲の部位において発する光」とは、検出部位の周囲の部位、すなわち、試験片上の不溶性担体粒子が集積していない部位で反射する光、または試験片の光を照射する側と反対側に供えられた光反射材で反射して検出部以外の部位を通って検出される光が含まれる。
【００２０】
不溶性担体粒子とは、粒子自体が液体に不溶性であり、抗原や抗体を結合させ保持する担体となる粒子をいう。本発明においては、検査薬等の技術分野で用いられるラテックス粒子を用いることができる。ラテックス粒子とは、コロイド状に水中に分散した乳濁液を形成する粒子をいう。粒子の材質は限定されないが、検査薬等の技術分野で抗体、抗原、リガンド、レセプター等のタンパク質を結合する固相担体の材料に用いられるものを用いることができる。例えば、ポリスチレン、スチレン-アクリル酸共重合体などのスチレン共重合体、ポリカーボネート、ポリメチレンメタアクリレート（PMMA）、ポリビニルトルエン、などの樹脂、シリカ、セルロース等が挙げられる。この中でも、スチレンをベースとする粒子が好ましい。スチレンをベースとする粒子とは、ポリスチレンやスチレンまたはスチレンの誘導体と重合性不飽和カルボン酸や重合性不飽和スルホン酸等との共重合体をいう。スチレンの誘導体としては、クロロメチルスチレン、ジビニルベンゼン等が挙げられ、重合性不飽和カルボン酸としては、アクリル酸、メタクリル酸等が挙げられ、重合性不飽和スルホン酸としては、スチレンスルホン酸ソーダ等が挙げられる。本発明において、スチレンをベースとするラテックス粒子をポリスチレンラテックス粒子という。
【００２１】
用いる粒子の粒径は、10nm〜数百nm、好ましくは30nm〜500nmである。
不溶性担体粒子には、蛍光色素で標識された蛍光標識不溶性担体粒子と着色色素で着色された着色不溶性担体粒子が含まれる。
【００２２】
蛍光標識不溶性担体粒子としては、蛍光色素を蛍光標識剤として結合させることにより、蛍光色素で標識したものを用いることができる。結合させる蛍光色素の種類は限定されず、検査薬等の分野で用いられているものを用いることができる。
【００２３】
例えば、蛍光標識に用いる蛍光色素としては、フルオレセイン（fluorescein）、ローダミン(rhodamine)、クマリン、Cy dye、Alexa（登録商標） Fluor、EvoBlue、オキサジン、Carbopyronin、naphthalene、biphenyl、anthracene、phenenthrene、pyrene、carbazole等を基本骨格として有する有機蛍光色素やその蛍光色素の誘導体が挙げられる。また、ユウロピウム（EU3+)キレートやテルピウム（Tb3+)キレート等の希土類錯体も用いることができる。ユウロピウム（EU3+)キレートとしてアミノ基を有するATBTA-EU3+等を用いることができる。さらに、Green Fluorescent Protein(GFP)等の蛍光タンパク質も用いることができる。
【００２４】
蛍光色素による不溶性担体粒子の標識は、あらかじめ上記の不溶性担体粒子にカルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、チオール基、アルデヒド基等の官能基を導入しておき、上記蛍光色素にも官能基を導入し、官能基同士の結合反応により蛍光色素を不溶性担体粒子に結合させることにより行うことができる。例えば、アミノ基とカルボキシル基をアミド結合により結合させたり、チオール基同士をジスルフィド結合により結合させることができる。また、官能基同士を架橋試薬を用いて結合させてもよい。架橋試薬として、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、EDAC(N-(3-ジメチルアミノプロピル）-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩）、グルタルアルデヒド等が挙げられる。また、蛍光色素として希土類錯体を用いる場合、アミノ基を導入したATBTA-EU3+等を用いればよい。さらに、蛍光タンパク質を用いる場合は、官能基同士の結合を利用してもよいが、蛍光タンパク質を不溶性担体粒子に物理的吸着を利用して結合させることもできる。アミノ基やカルボキシル基を導入した蛍光色素は市販のものを用いることができる。
【００２５】
本発明に用い得る蛍光色素を以下に示す。それぞれの蛍光色素の励起波長(nm)および蛍光波長(nm)をかっこ内に励起波長／蛍光波長で示す。励起波長および蛍光波長は測定条件等により、前後する。下記波長の±数十nm、例えば、±25nmの範囲で測定することができる。これらの蛍光色素は一例であり、これらには限定されず、種々の蛍光色素をその蛍光波長に基づいて使用することができる。
【００２６】
有機蛍光色素
Dylight（登録商標）405(400/420)、DY-405(400/420)、Cascade Blue(400/420)、Alexa Fluor（登録商標）405(401/421)、AMCA(353/440)、Alexa-350(346/442)、AMCA-X(347/447)、Pacific Blue（商標）(405/455)、Marine Blue(365/460)、DY-415(418/467)、Royal Blue(426/480)、ATTO425(436/484)、Cy（商標）2(489/505)、ATTO465(453/508)、DY-475XL(492/509)、Northern Lights（商標）493(493/514)、BODIPY（登録商標） 505/515(505/515)、DY-490(490/516)、DyLight（登録商標） 488(493/518)、Alexa-488(495/519)、5-FITC(494/519)、FAM(495/520)、DY-495-X5(495/520)、DY-495(493/521)、フルオレセイン（Fluorescein)(494/521)、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）(498/522)、ATTO488(501/523)、HiLyte Flour（商標）488(499/523)、MFP488(501/523)、ATTO495(495/527)、OG-488(496/524)、Rhodamine110(500/525)、OG-514(511/530)、Oyster（登録商標）500(505/530)、Spectrum Green(497/538)、Alexa-430(431/541)、ATTO520(525/545)、ATTO532(532/553)、Cas Y(402/554)、Alexa-532(530/554)、DY-500XL(505/555)、DY-485XL(485/560)、Alexa-555(555/565)、HiLyte Plus555(552/567)、DyLight549(550/568)、HiLyte Fluor555(553/568)、Cy3(550/565)、Dylight547(557/570)、Rhodamine(550/570)、TRITC(550/570)、DY-548(558/572)、DY-554(551/572)、DY-555(547/572)、Alexa Fluor 546(556/573)、DY-556(548/573)、Northern Lights557(557/574)、Oyster 550(555/574)、5-TAMRA(547/574）、DY-505-X5(505/574)、DY-547(557/574)、Oyster 556(562/575)、DY-549(560/575)、Alexa-546(556/575)、ATTO550(554/576)、PE(488/578)、B-PE(545/578）、R-PE(566/578)、DY-560(559/578)、TAMRA(555/580)、Tetramethyl rhodamine(552/578)、RITC/TMR(555/580)、MFP555(560/585)、Spectrum Orange(559/588)、DY-510XL(509/590)、Rhodamine B(570/590)、ATTO565(563/592)、Cy3.5(581/596)、ROX(Rhodamine Red X)(587/599)、DY-590(580/599)、5-ROX(573/602)、Alexa-568(578/603)、BODIPY 580/605(580/605)、Spectrum Red(587/612)、ECD(488/613)、Texas Red（登録商標）(596/615)、DyLight594(593/618)、Alexa Flour594(590/619)、HiLyte Fluor TR(591/622)、ATTO590(594/624)、MFP590(597/624)、DY-610(610/630)、DY-480XL(500/630)、ATTO610(615/634)、DY-615(621/641)、C-Phycocyanin(616/647)、ATTO620(619/643)、Alexa-633(632/647)、Phycocianin(620/650)、DY-481XL(515/650)、ATTO633(629/657)、DY-630(636/657)、DY-632(637/657)、DY-633(637/657)、MFP631(633/658)、DyLight633(638/658)、Northern Lights637(637/658)、DY-631(637/658)、DY-634(635/658)、APC(Allophycocyanin)(650/660)、APC-XL(650/660)、DY-520XL(520/664)、Alexa-647(650/668)、Cy5(643/667)、DY-521XL(523/668)、Oyster 645(650/669)、Quantum Red(488/670)、DY-635(645/671)、DY-636(645/671)、DY-647(653/673)、DyLight647(652/673)、HiLyte Fluor(653/647)、DyLight649(646/674)、HiLyte Plus647(649/674)、Oyster650(655/674)、DY-648(653/674)、DY-650(653/674)、PerCP(488/675)、DY-652(654/675)、DY-649(655/676)、DY-651(656/678)、Oyster656(662/679)、ATTO655(663/684)、Alexa-660(663/690)、Cy5.5(675/694)、DY-677(673/694)、DY-678(674/698)、HiLyte Fluor680(678/699)、DY-675(674/699)、DY-676(674/699)、IRDye（登録商標）700DX(689/700)、Alexa-680(679/702)、DY-681(691/708)、DY-680(690/709)、DY-682(690/709)、DyLight680(682/715)、Alexa Fluor700(702/723)、DY-700(707/730)、DY-701(706/731)、DY-730(732/758)、DY-732(736/759)、DY-734(736/759)、DY-731(736/760)、DY-752(748/772)、DY-750(747/776)、DyLight750(752/778)、HiLyte Fluor750(751/778)、DY-749(752/778）、HiLyte Plus750(751/779)、DY-751(751/779)、DyLight800(770/794)、IRDye800CW(774/800)、DY-780(782/800)、DY-781(783/800)、DY-782(784/800)、DY-776(771/801)、DY-777(771/801)、IRDye800(778/806)等
希土類錯体
ATBTA-EU3+(335/616）等
蛍光タンパク質
Sirius(355/424)、CFP(452/505)、AcGFP(475/505)、EGFP(488/509)、EYFP(513/527)、YFP(514/527)、ZsYellow(529/539)、mOrange(548/562)、DsRed2(563/582)、AsRed2(576/592)、mRFP1(584/607)、mCherry(587/610)、HcRed(588/618)、mRasberry(598/625)、mPlum(590/649)等
【００２７】
また、蛍光を発しえる物質でできた不溶性担体粒子も用いることもできる。このような粒子として、例えば、ユウロピウム（Eu）、テルビウム（Tb）等の希土類元素が付活されたMIMIIO4またはMIAl5O12（ＭIはイットリウム（Ｙ）、ランタン（La）またはガドリニウム（Gd）、ＭIIはニオブ（Nb）、リン（Ｐ）またはバナジウム（Ｖ））からなる粒子が挙げられ、特開2012-32263号公報に記載のものを用いることができる。本発明においては、これらの蛍光を発し得る物質でできた不溶性担体粒子も蛍光色素で標識された不溶性担体粒子に包含される。
【００２８】
蛍光標識不溶性担体粒子は、上記の励起光を照射光として照射した場合に、励起され、励起光とは異なる波長の蛍光を発する。従って、蛍光標識不溶性担体粒子を用いる場合、蛍光色素が発する光を検出光として検出する。すなわち、蛍光標識不溶性担体粒子を用いる場合、不溶性担体粒子が集積した検出部位において発する検出光とは、蛍光色素から発生する蛍光をいう。
【００２９】
光反射材を備えた試験片を用いて試験する際に、蛍光標識不溶性担体粒子を用いる場合、不溶性担体粒子が集積した検出部位を含む試験片上に、励起光である照射光を照射すると、励起光が蛍光標識不溶性担体粒子の蛍光色素を励起する。また、照射光の一部は一旦光反射材に当たり反射して蛍光標識不溶性担体粒子の蛍光色素を励起する。励起光が当たった蛍光色素から蛍光が発生し、検出される。また、発生した蛍光の一部は上記光反射材で反射し、検出される。この結果、蛍光である検出光の強度が増強される。
【００３０】
着色不溶性担体粒子は、可視域着色不溶性担体粒子であり、可視域着色不溶性担体粒子とは、人が目で見て認識できる色で着色された不溶性担体粒子をいう。該可視域着色不溶性担体粒子は、特定の波長の可視光線を反射することにより、人がその反射された可視光線により色を認識することができる。可視光線は、波長380nm〜750nm程度の光線である。着色粒子の色は、有彩色として色相で表現され、赤色、橙色、黄色、緑色、青色、紫色等があり、各色は以下の特定の波長の可視光線を反射することにより人にその色に着色されていると認識される。
赤色  620〜750nm
橙色  590〜620nm
黄色  570〜590nm
緑色  495〜570nm
青色  450〜495nm
紫色  380〜450nm
【００３１】
可視域着色不溶性担体粒子は、上記の粒子を各色の色素で染色することにより製造することができる。色素による染色は、粒子表面の染色でもよいが、色素の脱離を防ぐため、色素を粒子に染み込ませることにより粒子内部も染色することが好ましい。また、単独の色素で染色することもできるが、複数の色素で染色することにより任意の色に着色された可視域着色不溶性担体粒子を得ることができる。例えば、赤色粒子、青色粒子、緑色粒子、黄色粒子、ピンク色粒子などの各色の着色不溶性担体粒子を製造することができる。着色に用いる色素は樹脂等の染色に用い得る公知の色素を用いることができ、例えば、スダンブルー、スダンIII、スダンレッドIV、キニザリングリーン、オイルオレンジ等の染料や顔料を用いて着色することができる。また、種々の材質でできた種々の色に着色された粒子が市販されており、それらの市販着色不溶性担体粒子を用いることもできる。
【００３２】
可視域着色不溶性担体粒子は、色に応じて上記の波長域の光を反射し、一方上記の波長域の光と補色関係にある波長域の光を吸収する。例えば、赤色不溶性担体粒子は、赤色と補色の関係にある色の光を吸収する。赤色光の波長は620〜750nm付近である。赤色と補色の関係にある色は青色から緑色であり、青色光の波長は450〜495nm付近、緑色光の波長は495nm〜570nm付近である。また、青色不溶性担体粒子は、青色と補色の関係にある色の光を吸収する。青色光の波長は450〜495nm付近である。青色と補色の関係にある色は橙色から赤色であり、橙色光の波長は590〜620nm付近、赤色光の波長は620nm〜750nm付近である。
【００３３】
本発明において、着色不溶性担体粒子を用いる場合、試験片上の着色不溶性担体粒子が集積した検出部位から発する光と検出部位以外の周囲の部位から発する光の強度のコントラストを高めるために、着色不溶性担体粒子が吸収し得る波長域の光、すなわち、着色不溶性担体粒子の色と補色関係にある色の波長域の光を照射することが望ましい。その結果、照射した光が着色不溶性担体粒子に当たると光の大部分は反射されずに吸収され、照射した光の反射光の強度が減衰する。一方、着色不溶性担体粒子が集積していない検出部位以外の周囲の部位に当たった光は吸収されることなく、試験片を透過し光反射材に当たって反射される。反射した光の一部はさらに着色不溶性担体粒子に吸収されるか、または着色不溶性担体粒子によりさえぎられる。従って、不溶性担体粒子が集積した検出部位において、照射された光の反射光は減衰し、検出部位以外の周囲の部位において発する検出光が増強される。別の言い方をすれば、検出部における反射光は弱く、検出部以外のその周囲の部位における反射光は強くなる。着色不溶性担体粒子を用いる場合、不溶性担体粒子が集積した検出部位から発する光、および検出部位以外の周囲の部位から発する光とは、照射された光が反射した光をいう。従って、照射光と反射光の波長は同じである。
【００３４】
図１に本発明の光反射材を備えたイムノクロマト試験片を用いた場合の検出光の増強の原理を示す。図１Aは蛍光標識不溶性担体粒子を用いた場合であり、図１Bは着色不溶性担体粒子を用いた場合である。また、図中のグラフは横軸に試験片上の位置を示し、縦軸に試験片上の、ある位置における検出される光の強度を示す。図１Aの蛍光標識不溶性担体粒子を用いた場合の光の強度は蛍光強度であり、図１Bの着色不溶性担体粒子を用いた場合の光の強度は反射光強度である。図中の横軸の下のバーは、不溶性担体粒子が集積した部位を示す。また、図中、従来法は光反射材を備えていないイムノクロマト試験片を用いた方法であり、本発明法は光反射材を備えたイムノクロマト試験片を用いた方法である。蛍光標識不溶性担体粒子を用いた場合、図１Aに示すように、不溶性担体粒子が集積した部位において蛍光が強くなるが、本発明法では従来法に比べて、該部位における蛍光強度が増強される。また、着色不溶性担体粒子を用いた場合、図１Bに示すように、不溶性担体粒子が集積した部位において、不溶性担体粒子の存在の影響で照射した光の反射光は減衰し、不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位で反射光が強くなる。本発明法では、従来法に比べて、不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射光がより強くなり、不溶性担体粒子が集積した部位における照射した光の反射光は減衰したままなので、不溶性担体粒子が集積した部位以外の周囲の部位において反射光の強度が増強され、結果的に検出光が増強される。
【００３５】
本発明のイムノクロマト試験片は、多孔性の吸水性の材質でできており、検体試料液が毛細管現象により移動し得る材質でできた部材を有し、該部材をメンブレンと呼ぶ。蛍光標識不溶性担体粒子または着色不溶性担体粒子が集積する位置を検出部位と呼び、該メンブレンは、被検出物質と結合し得る捕捉物質を固定化した検出部位を含む。メンブレンは、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる材質からできており、好ましくはニトロセルロースメンブランでできている。メンブランの厚さは特に限定されないが、好ましくは100〜200μm程度である。また、メンブランは長方形のストリップとして用い、その大きさは、特に限定されないが、通常、３mm〜９mm×40mm〜60mm程度である。
【００３６】
メンブレン上の検出部位は、検出すべき被検出物質と特異的に結合して被検出物質を捕捉し得るリガンドが固定化されている。検出部位を捕捉部位と呼ぶこともある。検出部位において、リガンドは例えばライン状に固定化される。本発明において「試験片上の検出部位以外の周囲の部位」とは検出部位に隣接した試験片上の部位をいう。被検出物質に結合するリガンドは、典型的には被検出物質が抗原の場合は、該抗原に特異的に結合する抗体であり、被検出物質が抗体の場合は該抗体が特異的に結合する抗原である。その他、被検出物質-リガンドの組合せとして、受容体-リガンド、リガンド-受容体等の組合せが挙げられる。イムノクロマト法という場合、通常は抗体と抗原の結合を利用した試験法をいうが、本発明においてイムノクロマト法という場合、広義に解釈し、抗原と抗体の組合せではない被検出物質-リガンドの組合せを用いた試験法も含まれる。以下においては、抗原と抗体の組合せを用いた試験法について説明する。被検出物質が抗原の場合には、該抗原を特異的に認識する抗体を固定化し、被検出物質が抗体の場合には、該抗体が特異的に認識する抗原を固定化すればよい。抗体または抗原は、例えばライン状やドット状に固定化すればよく、好ましくはライン状に固定化する。固定化は、タンパク質をニトロセルロースメンブラン等の固相に固定化するための公知の方法で行うことができる。例えば、吸着による方法、アミノ基、カルボキシル基等の官能基を利用して化学的に結合させる方法等が挙げられる。抗体は、精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。
【００３７】
上記の抗原または抗体が固定化された検出部位が存在する試験片に、被検出物質を含む液体試料と該被検出物質に結合する抗体または抗原を結合させた不溶性担体粒子との混合物を試験片上の検出部位以外の部分に添加することにより、不溶性担体粒子と被検出物質は、抗原抗体反応により複合体を形成しながら、試験片上を毛細管現象により移動する。不溶性担体粒子と抗原または抗体を介して結合した被検出物質が、検出部位に固定化された抗体または抗原と結合し、検出部位において、固定化抗体または固定化抗原-被検出物質-不溶性担体粒子の複合体が形成される。該不溶性担体粒子の存在を、光を照射し、試験片上の検出部位または検出部位以外の周囲の部位において発する光を測定することにより検出することができ、その結果被検出物質の有無を検出することができる。
【００３８】
メンブレン上には、さらに対照表示部位が存在していてもよい。対照表示部位は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示部位は、検出部位の下流に存在し、検体試料が検出部位を通過し、対照表示部位に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示部には、不溶性担体粒子に結合させたリガンドに結合する物質を固定化しておいてもよいし、検体試料が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固定化しておいてもよい。
【００３９】
本発明のイムノクロマト試験片は、さらに、試料添加部位、吸収帯、標識部位を有していてもよい。
【００４０】
試料添加部位は、検体試料液を添加する部位で、検体試料液を上記のメンブレン上に直接添加してもよいが、吸水性のある材質、例えばスポンジ、ガラス繊維などの不織布等のパッドを試験片上に設けその部分に添加してもよい。パッドを用いる場合、該パッドをサンプルパッドと呼ぶことができる。試料添加部位は試験片上の一端に設けるのが好ましい。
【００４１】
吸収帯は、吸収パッド部位とも呼び、本発明のイムノクロマト試験片の試料添加部位とは異なる一端に設けられ、試料添加部位に添加した後、試験片上を移動する試料液体を吸収することにより試験片上の試料液体の流れを促進する。吸収帯は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。また、その大きさは、特に限定されないが、通常、３mm〜15mm×10mm〜40mm、厚さ0.5mm〜３mm程度である。
【００４２】
標識部位は、蛍光標識不溶性担体または着色不溶性担体が含有された部位である。標識部位は、吸水性の材質、例えばスポンジおよびガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、３mm〜10mm×３mm〜10mm、厚さ0.5mm〜３mm程度で、不溶性担体粒子が乾燥状態で含有されている。標識部位として上記の吸水性の材質に標識された不溶性担体粒子を含有させて用いる場合、該標識部位をコンジュゲートパッドと呼ぶことができる。標識部位は、上記の吸水性の材質に不溶性担体粒子を含浸させ、乾燥させればよい。試験片上を検体試料液が試料添加部位から吸収帯に流れるときの試料添加部位側を上流、吸収帯側を下流とした場合、標識部位は、試料添加部位の下流であって、検出部位の上流に設ければよい。この場合、試料添加部位のサンプルパッドと標識部位のコンジュゲートパッドは接触していてもいなくてもよい。
【００４３】
試験片の試料検体部位に液体試料を添加すると、液体試料は毛細管現象により標識部位に移動し、標識部位に含有されている不溶性担体粒子が液体試料中に溶解し、不溶性担体粒子に結合させた抗原または抗体が液体試料中の被検出物資と結合し、複合体を形成しながら、試験片のメンブレン上を下流に移動する。不溶性担体粒子に抗原または抗体を介して結合した被検出物質が検出部位に固定化した抗体または抗原と結合することにより、不溶性担体粒子と被検出物質の複合体が検出部位に固定化された抗体または抗原により捕捉され、検出部位において、不溶性担体粒子が集積する。残りの液体試料は検出部位を通過し、吸収帯に吸収される。
【００４４】
本発明の試験片はバッキングシートを有していてもよい。バッキングシートは支持シートということもでき、上記のメンブレン、試料添加部位、吸収帯、標識部位を裏張りするために用いられる。メンブレン、試料添加部位、吸収帯、標識部位は、バッキングシートに貼り付けてもよい。バッキングシートは、液体を透過しないプラスチック等でできたシートであり、メンブレンやその他の試料添加部位等の部材が一定の構造や強度を保つように支持し、かつ試料検体が試験片から流出してしまうのを防止することができる。バッキンングシートがある場合、バッキングシートも含めて試験片と呼ぶ。バッキングシートはメンブレンと後述の光反射材の間に存在していても、光反射材の下側に存在していてもよい。バッキングシートが光反射材の下側に存在する場合、バッキングシートは光を透過しない素材でできていてもよいが、バッキングシートがメンブレンと光反射材の間に存在する場合、バッキングシートは光を著しく減衰させることなく透過させる素材、例えば、透明なプラスチックでできている必要がある。
【００４５】
本発明のイムノクロマト試験片は、格納容器内に収められていてもよく、該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、検体試料としてウイルスや細菌等の感染性の微生物を含み得るものを用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者がこれらの微生物と接触するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の装置を収納すればよい。また、抗原または抗体を固定化した試験片の表面を樹脂製フィルム等（トップラミネート）で覆ってもよい。格納容器とその中に納められた試験片を、一体としてイムノクロマトデバイスという場合がある。
【００４６】
本発明のイムノクロマト試験片においては、不溶性担体粒子が集積する検出部位を含む試験片上の光が照射される側と反対側に光反射材を設けておくことにより、本来ならば、試験片を透過してしまう照射光が光反射材に当たり、反射される。
【００４７】
光反射材は、照射光を反射し得る材質である限りいかなる材質のものも用いることができる。また、光反射材が光を反射する物質で形成されていてもよいし、本来は光を反射しない材質を光を反射する物質で被覆してもよい。光を反射する物質として、金属やガラス、マイカ、シリカ等の無機物が挙げられる。光を反射する物質は、好ましくは金属であり、光反射材自体が金属でできていることが好ましい。金属としては、光の反射率が高いものが好ましく、アルミニウム、タンタル、ニッケル、タングステン、銅、真鍮、ニッケルチタン、金、白金等やこれらの合金が挙げられる。光反射材の表面は、光が鏡面反射するように光沢を有するように処理してもよいし、光が拡散反射するように表面に粗さが残るように処理してもよいが、鏡面反射するように処理することが好ましい。また、本来は光を反射しない材質を光を反射する物質で被覆する例として、樹脂等の物質で形成されたものの表面を金属でコーティングしたものが挙げられる。さらに、表面を金属粉末でコーティングし、金属膜を形成させてもよい。金属薄膜を表面に形成するには、メッキ、スパッタリング、蒸着等の方法により行うことができる。また、無電解ニッケル-リンメッキにより厚膜（例えば、膜厚５〜20μm）を形成させることもできる。
【００４８】
金属により反射率の高い光線の波長が異なる。従って、光反射材として金属を用いる場合、照射光の波長に応じて、金属の種類を選択すればよい。すなわち、検出部位に照射する照射光の波長の光の反射率が高い金属を選択すればよい。金属の光の波長に対する反射率は、金属の反射スペクトルを分光光度計等で測定することにより決定することができる。従って、各金属の反射スペクトルを測定し、用いる照射光の波長の光の反射率が高い金属を用いればよい。図２にアルミニウム、銅等の金属の全反射率を示す（該図は、Mc Leed." Thin film optical filters", A.Hilger, London, 1985からの引用である）。図２において、横軸は波長を示し、縦軸は全反射率を示す。例えば、該図を参照にして、照射光の波長と金属の組合せを選択することができる。
【００４９】
例えば、45度入射の全反射率が80％以上、好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の波長と金属の組合せを用いればよい。
【００５０】
例えば、アルミニウムは、250nm〜1000nmの範囲での全反射率は85％以上であるので、250nm〜1000nmの照射光に対して使用することができる。また、銅は、600nm以上の波長の光の全反射率が90％以上であるので、600nm〜1000nmの照射光を用いる場合は、銅を用いてもよい。
【００５１】
なお、イムノクロマト試験片は１回ごとの使い捨てであるので、装置の製造コストを低くするため、金属も低コストで入手できるものが好ましく、この点でアルミニウムや銅が好ましい。
【００５２】
イムノクロマト試験片において、光反射材はシート状、または箔状のものを用いることが好ましい。このような光反射材として、アルミ箔や銅箔を用いることができ、市販のものを用いればよい。
【００５３】
光反射材は、イムノクロマト試験片の検出部位に照射された照射光が試験片を透過した場合に、その照射光を反射させるために用いられる。従って、光反射材は、イムノクロマト試験片に対して、光が照射される側、すなわち光源が存在する側と反対側に設ける。通常、イムノクロマト試験片は、抗体または抗原が固定化された面を上にして、水平に置いて用いられる。従って、光反射材は、イムノクロマト試験片の下側に設ける。本願発明において、光反射材を設ける位置を試験片の下側という場合があるが、試験片の下側とは、重力場の向かう方向を基準にした上下に基づいて決まるのではなく、光が照射される側と反対側をいう。
【００５４】
光反射材は、少なくとも試験片上の検出部位の下側あるいは下部に設ける。光反射材の大きさは少なくとも試験片上の検出部位をカバーできる大きさであればよいが、好ましくは検出部位以外の周囲の部位を透過した照射光も反射できるように、検出部位の大きさより大きくし、例えば、試験片のメンブレン全体をカバーする大きさのものを用いる。
【００５５】
光反射材は、試験片と一体であって、試験片の格納容器と一体であってもよく、また、試験片の格納容器中に試験片と共に格納されていてもよい。また、上記のバッキングシート自体が光反射材であってもよく、例えば、アルミ箔や銅箔をバッキングシートとして用いればよい。
【００５６】
図３に本発明のイムノクロマト試験片、または格納容器を含むイムノクロマトデバイスにおける光反射材を設ける位置や光反射材の形状を変えた形態例を示す。図３において、aは吸収帯を、bはメンブレンを、b'はメンブレン上の検出部位を、cはコンジュゲートパッドを、dはサンプルパッドを、eはバッキングシートを、fは光反射材を、gは光を透過するバッキングシートを、hは格納容器を表す。
【００５７】
図３Aは、光反射材を用いない従来のイムノクロマト法で使用する形態例を示す。図３B１および図３B２が光反射材を設けた本発明のイムノクロマト試験片の形態例１および２を示す図であり、光反射材は試験片と一体になっている。図３B３、図３B４および図３B５が光反射材が取り付けられた格納容器に収容された試験片の形態例３、４、５を示す図であり、図３B３および図３B４に示すデバイスにおいては、光反射材は格納容器に試験片と共に格納され、図３B５に示す装置においては、光反射材は格納容器と一体になっている。図３B1に示すイムノクロマト試験片は、メンブレンｂの検出部位b'の下側に光反射材ｆがメンブレンｂに接触するように設けられ、さらにその下側にバッキングシートeが貼り付けられている。図３B２に示すイムノクロマト試験片は、メンブレンｂの下側にバッキングシートgが貼り付けられ、さらにその下側に光反射材fが設けられている。図３B１に示す装置においては、バッキングシートeは光を遮断する材質でもよいが、図３B２に示す装置においては、バッキングシートgは透明で光を透過する材質でできている必要がある。
【００５８】
図３B３、図３B４および図３B５は、試験片が格納容器内に収められたデバイスを示し、格納容器hの内面に光反射材fが設けられている。図３B３に示すイムノクロマトデバイスにおいては、試験片の検出部位b'の下側部分に相当する、格納容器hの内面に光反射材fが設けられている。図３B４に示すイムノクロマトデバイスにおいては、図３B３に示す装置と同様の位置に光反射材fが取り付けられているが、光反射材fは曲面を有するように加工されており、該曲面の存在により反射された光が試験片上の検出部位b'とその周囲の部位に集まる。すなわち、図３B３に示す装置の光反射材fは反射した光が試験片上の検出部位b'とその周囲の部位で焦点を結ぶような曲面を有している。光反射材の形状は限定されず、半球上、半円柱状でも多面構造を有していてもよく、その構造によって、照射光が効率的に検出部位を含むイムノクロマト試験片に当たるように、反射されればよい。さらに、図３B５に示すイムノクロマトデバイスにおいては、格納容器hの内面自体が光反射材となっている。この場合、格納容器内面の全体が光反射材となっていてもよく、一部が光反射材となっていてもよい。また、格納容器自体がアルミニウムや銅の光反射材で形成されていてもよいし、あるいは、格納容器の内面をアルミニウムや銅でコーティングしてもよい。
【００５９】
本発明のイムノクロマト試験片を用いて検出する被検出物質や検体試料は限定されない。例えば、検体試料液は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、唾液、血清、血漿、全血、便懸濁液、尿、培養液およびそれらを緩衝液で希釈したもの等を用いることができる。被検出物質も何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。たとえば、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、レジオネラ属菌、溶連菌、MRSA等の細菌抗原、ホルモン等の抗原を挙げることができ、さらに、上記細菌、ウイルス等に対する抗体を挙げることができる。
【００６０】
本発明のイムノクロマト試験片を用いた検出方法においては、イムノクロマト試験を行い、試験片上の検出部位に集積した、蛍光標識不溶性担体粒子または着色不溶性担体粒子に光を照射する。
【００６１】
本発明のイムノクロマト試験片を用いたアッセイにおいて、蛍光標識不溶性担体粒子を用いる場合、不溶性担体粒子が集積した検出部位を含む試験片上に試験片上部から励起光を照射する。照射した励起光は試験片上の検出部位に集積した蛍光標識不溶性担体粒子の蛍光色素を励起して蛍光を発生させる。本発明のイムノクロマト法試験片においては、試験片上の励起光を照射する側と反対側に光反射材が備えられているので、照射した励起光が光反射材で反射し、検出部位に集積した不溶性担体粒子の蛍光色素に当たる励起光の強度を増強することができる。また、励起光の照射により発生した蛍光も一部は光反射材で反射し、検出光として検出される。そのため、効率的に蛍光色素を励起し、蛍光を発生させ、試験片上の検出部において発する蛍光の強度が増強される。蛍光標識不溶性担体粒子が存在しない、検出部位以外の周囲部位には、蛍光色素が存在しないため、蛍光が発することがなく、検出部において発する蛍光と検出部位以外の周囲の部位において発する蛍光のコントラストが高くなり、検出される光が増強され、試験片上の検出部における蛍光標識不溶性担体粒子の集積を高感度で検出することができる。その結果、被検出物質の高感度での検出が可能になる。
【００６２】
蛍光の測定は、励起光を照射する光照射手段と発生した蛍光を検出する光検出手段を含む蛍光検出装置を用いて行うことができる。このような装置として公知の蛍光検出装置を用いることができる。また、試験片あるいは収納容器を含むデバイスを収納する部位を有し、該部位に試験片またはデバイスを設置することにより蛍光を検出する装置も適宜設計することができる。また、目視で測定することもできる。被検出物質として特定の抗原を測定する場合、あらかじめ抗原濃度を変えた場合に得られる蛍光強度を測定しておき、該測定値に基づいて検量線を作成することにより、得られた蛍光強度から検体試料中に含まれる抗原の濃度を決定することができる。
【００６３】
また、着色不溶性担体粒子を用いる場合、不溶性担体粒子が集積した検出部位を含む試験片上の試験片上部から光を照射する。照射した光の一部は着色不溶性担体粒子により吸収される。また、照射した光の一部は、試験片を透過し試験片上の光を照射する側と反対側に備えられた光反射材で反射する。反射した光が着色不溶性担体粒子に当たると再び不溶性担体粒子により吸収されるか、あるいは不溶性担体粒子により遮られる。一方、照射した光の一部は、不溶性担体粒子が集積している検出部位以外の周囲の部位に照射され、該光は、試験片を透過し試験片上の光を照射する側と反対側に備えられた光反射材で反射し、不溶性担体粒子に当たることなく、検出光として検出される。そのため、照射した光の反射光は、試験片上に集積した不溶性担体粒子により減衰し、該検出部位において発する光、すなわち反射する光の強度は低くなり、試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位以外の周囲の部位において発する光、すなわち反射する光の強度は高くなる。その結果、試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位において発する光と試験片上の不溶性担体粒子が集積した検出部位以外の周囲の部位において発する光のコントラストが高くなり、検出される光が増強され、試験片上の検出部における着色不溶性担体粒子の集積を高感度で検出することができる。その結果、被検出物質の高感度の検出が可能になる。
【００６４】
反射した照射光の測定は、光を検出する光検出手段を含む光検出装置を用いて行うことができる。このような装置として、例えばイムノクロマト専用リーダーを用いることができる。また、目視で測定することもできる。被検出物質として特定の抗原を測定する場合、あらかじめ抗原濃度を変えた場合に得られる光強度を測定しておき、該測定値に基づいて検量線を作成することにより、得られた光強度から検体試料中に含まれる抗原の濃度を決定することができる。
【００６５】
以下、本発明のイムノクロマト試験片を用いた被検出物質の検出の一例として、図３B２に示す本発明の試験片と蛍光標識不溶性担体粒子を組合せて用い、血清中のウイルス抗原を検出する方法について説明する。
【００６６】
メンブレンb上には、抗ウイルス抗原抗体をライン状に固定化した検出部位b'が存在する。コンジュゲートパッドｃは、蛍光標識不溶性担体粒子であって、抗ウイルス抗原抗体を結合させた不溶性担体粒子を含浸させ乾燥させてある。検出しようとするウイルス抗原を含む検体試料液体をサンプルパッドに数十μL〜数百μL添加する。検体試料液体はサンプルパッドからコンジュゲートパッドに流れ、コンジュゲートパッド中に乾燥含浸させた不溶性担体粒子を溶解する。検体試料液体は不溶性担体粒子を溶解させ下流へと流れ、このとき、不溶性担体粒子に結合させた抗ウイルス抗原抗体とウイルス抗原が結合し、不溶性担体粒子-ウイルス抗原の複合体を形成する。該複合体がメンブレン上の検出部位に到達するとウイルス抗原が検出部位に固定化された抗ウイルス抗原抗体に捕捉され、検出部位に、抗ウイルス抗原抗体-ウイルス抗原-不溶性担体粒子の複合体が形成される。残りの検体試料液体は、検出部位を通過し、メンブレン上を下流に移動し、吸収帯に吸収される。不溶性担体粒子の蛍光色素に励起光を当てると蛍光色素が蛍光を発する。この際、メンブレンを通過した励起光はメンブレン下側に設けられた光反射材で反射し、再度蛍光色素を励起し、蛍光強度が増強される。
【００６７】
着色不溶性担体粒子を用いる場合も、同様に検出部位に、抗ウイルス抗原抗体-ウイルス抗原-不溶性担体粒子の複合体を形成させ、試験片に光を照射すればよい。
【００６８】
本発明は、さらに、本発明のイムノクロマト試験片またはイムノクロマトデバイスを含むイムノクロマトキットも包含する。
【実施例】
【００６９】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。実施例の記載において、％は重量％を示す。
【００７０】
実施例１  イムノクロマト試験片下部に設置した金属（アルミニウム）箔による蛍光ポリスチレン粒子より発される検出光の増強
１．プロテインAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製されたマウスIgGを、1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これにユウロピウム（EU3+)キレートを含む蛍光ポリスチレン粒子（Thermo scientific社製：製品名；FluoroMax）を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、マウス由来抗体標識蛍光ポリスチレン粒子を得た。
【００７１】
２．抗マウスIgG抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
抗マウスIgG抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の部位に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗体固定化メンブレンを得た（以下、抗体固定化メンブレンとする）。
【００７２】
３．イムノクロマト法による標識粒子の固定部位における集積
２．で得た抗体固定化メンブレンとバッキングシート、吸収帯、コンジュゲートパッド、サンプルパッドを貼り合せて試験片とした、光反射材を含まないものを従来試験片とした（図４A）。また、抗体固定化メンブレンの下であってバッキングシートの上にアルミホイル金属箔を光反射材として挟み張り合わせて試験片とした、光反射材を含むものを本発明法試験片とした（図４B）。
【００７３】
試験片に検体浮遊液（10mM Tris（pH7.0）、3％BSA、0.2％Triton X-100）を試験片のサンプルパッドに50μl滴下した。15分間静置後、UVトランスイルミネーター（Benchtop 2UV transilluminator；UVP社製）上で、蛍光を目視により確認した。
【００７４】
結果、抗体が固定化された部位上に蛍光ポリスチレン粒子の集積が確認できた。その発する光の強度は、目視において従来試験片に比べ本発明法試験片で明らかに増加していることが確認できた（図５）。
【００７５】
以上の結果から、本法を用いて作成した試験片を用いることで検出光の増強が可能となる。本実施例では蛍光を目視で判定しているが、装置を使って検出することでさらに高感度に検出できると考えられる。
【００７６】
実施例２  イムノクロマト試験片下部に設置した各種金属箔による蛍光ポリスチレン粒子より発される検出光の増強
１．プロテインAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製されたマウスIgGを、1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これにユウロピウムキレートを含む蛍光ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、マウス由来抗体標識蛍光ポリスチレン粒子を得た。
【００７７】
２．抗マウスIgG抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
抗マウスIgG抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の部位に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗体固定化メンブレンを得た（以下、抗体固定化メンブレンとする）。
【００７８】
３．イムノクロマト法による蛍光ポリスチレン粒子の固定化部位における集積
２．で得た抗体固定化メンブレンとバッキングシート、吸収帯、コンジュゲートパッド、サンプルパッドを貼り合せて試験片とした、光反射材を含まないものを従来試験片（図６A）とした。また、抗体固定化メンブレンの下であってバッキングシートの上に光反射材として金属（アルミニウム、銅、ステンレス）箔を挟み張り合わせて試験片とした、光反射材を含むものを本発明法試験片とした（図６B）。
【００７９】
試験片に検体浮遊液（10mM Tris（pH7.0）、3％BSA、0.2％Triton X-100）を試験片のサンプルパッドに50μl滴下した。15分間静置後、試験片の抗体固定部位を、図６の四角で囲んだ部位（h)を切断し、蛍光プレートリーダー（MTP-650FA MICROPLATE READER；CORONA社製）で照射光（365nm）を照射し、蛍光ポリスチレン粒子より発せられた検出光（615nm）の強度を測定した。
【００８０】
結果、発せられた蛍光の強度は、従来試験片に比べアルミニウム箔を使用することで明確に増強しており、銅、ステンレス箔においても増強がみられた。3者を比べると検出光の増強の程度はアルミニウム箔が最も顕著だった（図７）。
【００８１】
光反射材固有の波長ごとの反射率が存在する（図２）。本実施例において使用したアルミニウムは365nmの照射光を約90％と効率よく反射する一方で、銅は365nmの照射光の反射率は40％以下である。
【００８２】
本実施例においてアルミニウムが銅に比べて検出光の増強の程度が大きかったことは、光反射材の持つ照射光に対する反射効率が本法において重要であることを示している。
【００８３】
本実施例においては365nmを照射光として用いているが、照射光の波長は365nmに限定されるものではない。600nmを照射光として用いる場合には、銅はアルミニウムと同等に約90％と効率よく反射し、600nmの照射光に対して銅は光反射材として効果的といえる。570nmにて励起され600nmの蛍光を発する粒子を使用し、照射光490nmを照射し615nmの蛍光を検出した時、銅はアルミニウムと同等に検出光を増強していた（図８）。
用いる照射光の波長を問わず、その波長を効率よく反射する素材を選択することが重要である。
【００８４】
実施例３  着色ポリスチレン粒子を用いた場合のイムノクロマト試験片下部に設置した光反射材による検出光の増強
１．プロテインAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製されたマウスIgGを、1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに赤色に着色されたポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、マウス由来抗体標識着色ポリスチレン粒子を得た。
【００８５】
２．抗マウスIgG抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
抗マウスIgG抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗体固定化メンブレンを得た（以下、抗体固定化メンブレンとする）。
【００８６】
３．イムノクロマト法による着色ポリスチレン粒子の固定化部位における集積
２．で得た抗体固定化メンブレンとバッキングシート、吸収帯、コンジュゲートパッド、サンプルパッドを貼り合せて試験片とした、光反射材を含まないものを従来試験片（図４A）とした。また、抗体を固定化したメンブレンの下であってバッキングシートの上に光反射材をメンブレンと挟み張り合わせて試験片とした、光反射材を含むものを本発明法試験片とした（図４B）。
【００８７】
試験片に検体浮遊液（10mM Tris（pH7.0）、3％BSA、0.2％Triton X-100）を試験片のサンプルパッドに50μl滴下した。15分間静置後、試験片の抗体固定化部位およびその周囲部位に、イムノクロマト専用リーダーを用いて、照射光（緑色LED）を照射し試験片および着色ポリスチレン粒子により反射された検出光の強度を測定した。
【００８８】
図９−１に、イムノクロマト試験片上の位置とその位置における反射光の強度の関係を示す。図９−１には従来法試験片の結果と本発明法試験片の結果を示してある。中央の反射光強度が低い部位（位置201〜251付近）は着色ポリスチレン粒子が集積した部位を示す。また、図９−２は図９−１のグラフ中、反射光が着色ポリスチレン粒子の影響で減衰し、反射光強度が低下している部位のピーク面積を表した図である。図９−１に示すように、着色ポリスチレン粒子が集積した部位以外の周囲の部位において発せられた反射光の強度は、従来試験片に比べ本発明法を使用した場合に明確に増強している。また、図９−２に示すように、反射光が着色ポリスチレン粒子の影響で減衰し、反射光強度が低下している部位のピーク面積は本発明法で従来法よりも高くなっている。この結果は、着色ポリスチレン粒子により照射した光の反射光の減衰がより明確に検出されることを示す。
【符号の説明】
【００８９】
a  吸収帯
b  メンブレン
b'  検出部位
c  コンジュゲートパッド
d  サンプルパッド
e  バッキングシート
f  反射材
g  バッキングシート
h  切断部位
【図１】
2015031610.tif 000002
【図２】
2015031610.tif 000003
【図３】
2015031610.tif 000004
【図４】
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【図５】
2015031610.tif 000006
【図６】
2015031610.tif 000007
【図７】
2015031610.tif 000008
【図８】
2015031610.tif 000009
【図９−１】
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【図９−２】
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