(57)【要約】【課題】  試料におけるピーク波長のシフトを抑制できる還元力の分析方法を提供する。【解決手段】  本発明の課題を解決するために、本発明の還元力の分析方法は、試料の存在下、ｐＨ２．４以下の条件で、三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬を還元する還元工程、および前記還元工程で得られた還元体のピーク波長を光学的に測定する光学測定工程を含むことを特徴とする。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の存在下、ｐＨ２．４以下の条件で、三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬を還元する還元工程、および
前記還元工程で得られた還元体のピーク波長を光学的に測定する光学測定工程を含むことを特徴とする、還元力の分析方法。
【請求項２】
前記色素試薬が、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とを含むシアン化物鉄錯体である、請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記シアン化物鉄錯体が、溶液である、請求項２記載の分析方法。
【請求項４】
前記ピーク波長が、３６０〜６３０ｎｍの範囲である、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記三価鉄化合物が、塩化鉄（III）および硫酸鉄（III）の少なくとも一方である、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記シアン化合物が、チオシアン酸化合物およびフェリシアン化合物の少なくとも一方である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記チオシアン酸化合物が、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウムおよびチオシアン酸アンモニウムからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項６記載の分析方法。
【請求項８】
前記試料が、アルブミンおよびメチオニンの少なくとも一方を含む試料である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
前記試料が、血液、唾液、尿、涙および汗からなる群から選択された少なくとも一つの生体試料である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１０】
三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬およびｐＨ調整剤を含み、
前記ｐＨ調整剤が、強酸性試薬であり、
請求項１から９のいずれか一項に記載の分析方法に使用することを特徴とする、還元力の分析試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元力の分析方法および還元力の分析試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレス状態下においては、生体内で発生した過酸化物およびフリーラジカルにより、タンパク質、脂質、ＤＮＡ等が傷害される。そして、このような傷害が蓄積することにより、例えば、心血管疾患、神経系疾患等が引き起こされることが知られている。一方、このような過酸化物およびフリーラジカルは、生体内の還元力を有する抗酸化物質により無害化されることが知られている。このため、酸化ストレスに対する抵抗性の指標の１つである、還元力を分析することで、前記疾患を予防することや、前記疾患の病態を把握することが試みられている。
【０００３】
三価の鉄イオンとシアン化合物との反応により生じる血赤色の色素試薬は、還元反応により退色する。そこで、試料の還元力の分析方法として、前記色素試薬と前記試料とを接触させることで、前記試料により前記色素試薬を還元させ、前記色素試薬の退色の度合いを光学的に測定する方法が用いられている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２５７９０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記三価の鉄イオンと前記シアン化合物との色素試薬を利用する還元力の分析方法において、本発明者らは、試料の還元力を分析した場合に、前記色素試薬と前記試料とを含む反応系における光学シグナルのピーク波長がシフトするという問題が生じることを見出した。前記光学シグナルのピーク波長がシフトするということは、試料が示す本来の光学シグナルと、測定により得られた見かけの光学シグナルとの間に誤差が生じることを意味する。このため、光学シグナルから算出する還元力にも誤差が生じることとなり、定量結果の信頼性が不十分となっていた。
【０００６】
そこで、本発明は、試料の還元力を分析した場合に、前記光学シグナルのピーク波長のシフトを抑制できる還元力の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の課題を解決するために、本発明の還元力の分析方法は、試料の存在下、ｐＨ２．４以下の条件で、三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬を還元する還元工程、および前記還元工程で得られた還元体のピーク波長を光学的に測定する光学測定工程を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の還元力の分析試薬は、三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬およびｐＨ調整剤を含み、前記ｐＨ調整剤が、強酸性試薬であり、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者らの鋭意研究により、前記試料の還元力の分析において、前記色素試薬と前記試料とを含む反応系における光学シグナルのピーク波長のシフトは、前記試料に含まれるアルブミンおよびメチオニンが原因であることがわかった。そして、メカニズムは不明であるが、前記還元工程を、ｐＨ２．４以下の条件で行うことにより、前記反応系における光学シグナルのピーク波長のシフトを抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。その結果、本発明によれば、前記試料の還元力の分析において、前記試料中の成分に影響を受けることなく、前記反応系における光学シグナルのピーク波長のシフトを抑制できる。このため、本発明によれば、前記光学シグナルに基づき、還元力を分析した場合の誤差を低減でき、より信頼性に優れた試料の還元力の分析を行うことができる。したがって、本発明は、例えば、生体由来等の種々の試料に対する臨床検査等において、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１における、吸光度の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１における、吸光度の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２における、吸光度の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２における、異なるｐＨにおけるピーク波長の波長を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例３における、還元力の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜還元力の分析方法＞
本発明の還元力の分析方法は、前述のように、試料の存在下、ｐＨ２．４以下の条件で、三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬を還元する還元工程、および前記還元工程で得られた還元体のピーク波長を光学的に測定する光学測定工程を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記還元工程を、ｐＨ２．４以下の条件で行うことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の分析方法は、前述のように、前記反応系における光学シグナルのピーク波長のシフトを抑制できる。このため、本発明の分析方法は、ピーク波長のシフトを抑制する方法ということもできる。本発明において、前記還元工程の前記色素試薬の還元は、前記試料の還元力による還元である。前記光学測定工程において、「前記還元工程で得られた還元体」とは、前記色素試薬が還元されたものを意味する。
【００１２】
本発明の分析方法は、例えば、前記試料の還元力の有無を分析する定性分析であってもよいし、前記試料の還元力の程度を分析する定量分析であってもよい。
【００１３】
本発明において、前記還元工程は、ｐＨ２．４以下の条件で行われる。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記還元工程において、前記試料と前記色素試薬とを含む反応系のｐＨが、ｐＨ２．４以下であるということもできる。前記反応系のｐＨは、例えば、前記色素試薬と前記試料との接触時または、接触後に、ｐＨ２．４以下に調整されていることが好ましい。前記反応系は、例えば、液体系であることが好ましく、前記試料と前記色素試薬とを含む反応液または還元液ということもできる。
【００１４】
本発明の分析方法において、前記試料は、特に制限されない。前述のように、アルブミンおよびメチオニンが、ピーク波長のシフトに影響することから、本発明は、例えば、アルブミンおよびメチオニンの少なくとも一方を含む試料に適用することができる。前記試料は、例えば、生体試料であり、具体例として、例えば、血液、唾液、尿、涙、汗等があげられる。前記血液は、例えば、赤血球、全血、血清、血漿等があげられる。これらの中でも、血液が好ましい。
【００１５】
前記試料は、例えば、取り扱いが容易であることから、液状の試料（液体試料）が好ましい。前記試料は、例えば、前記試料の未希釈液をそのまま液体試料として使用してもよいし、前記試料を溶媒に、懸濁、分散または溶解した希釈液を液体試料として使用してもよい。前記試料が固体の場合、例えば、前記試料を前記溶媒に懸濁、分散または溶解した希釈液を液体試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、各種のグッド緩衝液等があげられる。前記緩衝液の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１６】
本発明の分析方法において、前記色素試薬は、特に制限されず、例えば、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とを混合したシアン化物鉄錯体があげられる。前記シアン化物鉄錯体は、特に制限されず、例えば、チオシアン酸鉄錯体（［Ｆｅ（ＮＣＳ）（Ｈ２Ｏ）５］２＋）、フェリシアン鉄錯体（［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−）等があげられる。
【００１７】
本発明の分析方法において、前記三価鉄化合物は、特に制限されず、例えば、塩化鉄（III）、硫酸鉄（III）等があげられる。本発明の分析方法において、前記三価鉄化合物は、例えば、一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００１８】
本発明の分析方法において、前記シアン化合物は、特に制限されず、例えば、チオシアン酸化合物、フェリシアン化合物等があげられる。前記チオシアン酸化合物は、特に制限されず、例えば、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム等があげられる。本発明の分析方法において、前記シアン化合物は、例えば、一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００１９】
前記還元工程において、例えば、前記色素試薬と前記試料との添加順序は、特に制限されない。前記添加順序は、例えば、予め前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とを含むシアン化物鉄錯体（以下、「混合色素試薬」ともいう。）を前記色素試薬として、前記試料と混合してもよいし、前記三価鉄化合物、前記シアン化合物および前記試料を混合することで、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物との混合色素試薬と前記試料とを混合してもよい。前記還元工程において、例えば、さらに、前述のような溶媒を添加してもよい。
【００２０】
前者の場合、前記混合色素試薬は、例えば、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とを、それぞれ溶媒に添加し、溶液の状態で混合したものを使用してもよいし、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とを溶媒に添加し、溶液の状態で使用してもよい。前記溶媒は、例えば、前述の例示が援用できる。後者の場合、例えば、前記三価鉄化合物、前記シアン化合物および前記試料を前記溶媒に添加し、混合してもよい。
【００２１】
前記還元工程において、前記試料と前記色素試薬とを含む前記反応系の組成比は、特に制限されない。前記反応系における前記試料の割合（ｖ／ｖ％）は、特に制限されず、例えば、５０〜９９％であり、好ましくは８０〜９９％であり、より好ましくは９０〜９９％である。前記反応系において、未希釈の試料の割合が、前記範囲であることが好ましい。
【００２２】
前記反応系において、前記色素試薬の濃度は、特に制限されない。前記反応系における前記色素試薬の濃度は、例えば、前記色素試薬を構成する前記シアン化合物および前記三価鉄化合物の濃度で表すことができる。前記反応系において、前記色素試薬を構成する前記シアン化合物の濃度（Ｃ）は、例えば、０．００６〜０．０９ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１８〜０．０９ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０５〜０．０７５ｍｏｌ／Ｌであり、また、前記色素試薬を構成する前記三価鉄化合物の濃度（Ｆ）は、例えば、０．０００１〜０．００２ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０００１５〜０．００１ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０００２〜０．０００３ｍｏｌ／Ｌである。前記色素試薬の濃度は、例えば、一種類の色素試薬の濃度でもよいし、二種類以上の色素試薬の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。
【００２３】
前記反応系において、前記色素試薬を構成する前記三価鉄化合物と前記試料との混合割合は、特に制限されず、前記試料１ｍＬに対して、前記三価鉄化合物は、例えば、０．００１６〜０．０３２ｍｍｏｌであり、好ましくは０．００２４〜０．０１６ｍｍｏｌであり、より好ましくは０．００３２〜０．００４８ｍｍｏｌである。
【００２４】
前記反応系において、前記色素試薬を構成する前記シアン化合物と前記試料との混合割合は、特に制限されず、前記試料１ｍＬに対して、前記シアン化合物は、例えば、０．０９６〜１．４４ｍｍｏｌであり、好ましくは０．２８８〜１．４４ｍｍｏｌであり、より好ましくは０．８〜１．１２ｍｍｏｌである。
【００２５】
前記反応系において、前記色素試薬を構成する前記三価鉄化合物の割合は、一種類の三価鉄化合物の割合でもよいし、二種類以上の三価鉄化合物の割合の合計の割合でもよい（以下、同様）。前記反応系において、前記色素試薬を構成する前記シアン化合物の割合は、一種類のシアン化合物の割合でもよいし、二種類以上のシアン化合物の割合の合計の割合でもよい（以下、同様）。
【００２６】
前記反応系において、前記三価鉄化合物（Ｆ）と前記シアン化合物（Ｃ）との割合（モル比Ｆ：Ｃ）は、特に制限されず、例えば、１：２４〜１：３５７であり、好ましくは１：７２〜１：３５７であり、より好ましくは１：２００〜１：３００である。
【００２７】
前記還元工程において、前記色素試薬と前記試料とを混合した前記反応系のｐＨは、例えば、ｐＨ２．４以下であり、好ましくはｐＨ２．３以下である。前記反応系のｐＨは、例えば、前記色素試薬と前記試料との混合のみによって調整されてもよいし、前記色素試薬と前記試料とを混合し、且つ、ｐＨ調整剤の添加によって調整されてもよい。前者の場合、例えば、前記色素試薬のｐＨを、前記試料と混合した際に前記ｐＨの条件を満たすように、予め調整してもよい。なお、本発明において、前述のように、前記還元工程の前記反応系のｐＨは、ｐＨを２．４以下である。
【００２８】
前記ｐＨ調整剤は、特に制限されず、例えば、強酸性試薬が使用できる。前記強酸性試薬は、例えば、実質的に酸化剤または還元剤とならない試薬であることが好ましい。具体的には、前記強酸性試薬は、例えば、硫酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等があげられる。前記強酸性試薬は、例えば、一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２９】
前記反応系において、前記ｐＨ調整剤の濃度は、特に制限されず、例えば、０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．００２〜０．０１ｍｏｌ／Ｌである。前記反応系において、前記ｐＨ調整剤の濃度は、例えば、一種類のｐＨ調整剤の濃度でもよいし、二種類以上のｐＨ調整剤の濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。
【００３０】
前記反応系において、前記ｐＨ調整剤と前記試料との混合割合は、特に制限されず、前記試料１ｍＬに対して、前記ｐＨ調整剤は、例えば、０．０１６〜１６ｍｏｌであり、好ましくは０．０１６〜１.６ｍｏｌであり、より好ましくは０．０３２〜０．１６ｍｏｌである。
【００３１】
前記還元工程において、前記色素試薬と前記試料とを混合してから、前記反応系に対する次の光学測定工程までの処理条件は、特に制限されない。前記還元工程において、前記反応系は、例えば、所定温度でインキュベートしてもよいし、インキュベートしなくてもよい。前記インキュベートの温度は、例えば、１〜４０℃であり、好ましくは２５〜３０℃である。前記インキュベートの時間は、特に制限されない。
【００３２】
前記光学測定工程において、測定する光学シグナルは、前述のように、前記還元工程で得られた還元体の光学シグナルであり、例えば、前記還元工程で得られた前記試料と前記色素試薬とを含む前記反応系について測定する光学シグナルが、前記還元体の光学シグナルと対応する。前記光学シグナルは、特に制限されず、例えば、吸光度、反射率、透過率等があげられる。
【００３３】
前記光学測定工程において、前記光学的に測定するピーク波長の範囲は、特に制限されず、前記色素試薬の種類に応じて、適宜決定できる。前記色素試薬が、塩化鉄（III）とチオシアン酸カリウムとを含む色素試薬である場合、前記ピーク波長は、例えば、３６０〜６３０ｎｍの範囲であり、好ましくは４００〜５５０ｎｍの範囲であり、より好ましくは４５０〜５５０ｎｍの範囲である。前記光学測定工程において、前記光学的な測定は、前記範囲における１点の測定でもよいし、前記範囲における一部の範囲の測定でもよいし、前記範囲の全部の測定でもよい。
【００３４】
前記光学測定工程において、例えば、前記ピーク波長の光学測定により得られた光学シグナルを前記試料の還元力としてもよいし、前記ピーク波長の光学測定により得られた光学シグナルから、間接的に前記試料の還元力を算出してもよい。前記間接的な算出方法は、特に制限されず、前記光学シグナルと前記還元力との相関関係に基づき、算出する方法があげられる。
【００３５】
以下に、本発明の分析方法について、例をあげて説明するが、本発明は、これらの実施形態には制限されない。具体的には、本実施形態は、前記色素試薬の構成成分として、前記三価鉄化合物である塩化鉄（III）と、前記シアン化合物であるチオシアン酸カリウムとを使用し、前記試料として前記生体試料である血液を使用し、前記ｐＨ調整剤として、前記強酸性試薬である硫酸を使用し、前記還元工程においてｐＨ２．４以下の前記還元液（反応液）を調製し、ｐＨ２．４以下の前記還元液について、ピーク波長を光学的に測定することによって、還元力を分析する例である。
【００３６】
まず、前記生体試料として前記血液を用意する。つぎに、前記血液を、塩化鉄（III）およびチオシアン酸カリウムと混合し、さらに、硫酸を添加する。これによって、得られる還元液のｐＨを、ｐＨ２．４以下に調整する。
【００３７】
塩化鉄（III）の混合量は、特に制限されず、前記血液１ｍＬに対して、例えば、０．００１６〜０．０３２ｍｍｏｌであり、好ましくは０．００２４〜０．０１６ｍｍｏｌであり、より好ましくは０．００３２〜０．００４８ｍｍｏｌである。チオシアン酸カリウムの混合量は、特に制限されず、前記血液１ｍＬに対して、例えば、０．０９６〜１．４４ｍｍｏｌであり、好ましくは０．２８８〜１．４４ｍｍｏｌであり、より好ましくは０．８〜１．１２ｍｍｏｌである。硫酸の添加量は、特に制限されず、前記血液１ｍＬに対して、例えば、０．０１６〜１６ｍｏｌであり、好ましくは０．０１６〜１.６ｍｏｌであり、より好ましくは０．０３２〜０．１６ｍｏｌである。硫酸添加後の前記還元液において、硫酸の濃度は、特に制限されず、例えば、０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．００２〜０．０１ｍｏｌ／Ｌである。硫酸添加後の前記還元液のｐＨは、例えば、ｐＨ２．４以下であり、好ましくはｐＨ２．３以下である。
【００３８】
前記還元液を、所定時間インキュベートし、前記還元液中で前記血液により前記色素試薬を還元する。前記インキュベートの温度は、例えば、１〜１０℃であり、前記インキュベートの時間は、例えば、０〜５分である。
【００３９】
つぎに、還元後の前記還元液について、ピーク波長を光学的に測定する。前記ピーク波長は、例えば、４５０〜５５０ｎｍの範囲である。
【００４０】
このようにして、前記血液の還元力を分析できる。また、前記ピーク波長の光学測定により得られた光学シグナルを用い、前記光学シグナルと前記還元力との相関関係に基づき、還元力の値を算出し、これを還元力とすることもできる。
【００４１】
＜還元力の分析試薬＞
本発明の還元力の分析試薬は、前述のように、三価鉄化合物とシアン化合物とを含む色素試薬およびｐＨ調整剤を含み、前記ｐＨ調整剤が、強酸性試薬であり、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析試薬は、前記ｐＨ調整剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の分析試薬は、例えば、本発明の分析方法の例示を援用できる。本発明の分析試薬は、例えば、分析キットということもできる。
【００４２】
本発明の分析試薬において、前記色素試薬および前記ｐＨ調整剤は、例えば、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記色素試薬を構成する前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とは、例えば、それぞれ別個の容器に収容されてもよいし、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。前記三価鉄化合物および前記シアン化合物が同じ容器に収容されている場合、前記色素試薬は、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物とを含む溶液であることが好ましい。
【００４３】
本発明の分析試薬は、前記三価鉄化合物と前記シアン化合物との色素試薬および前記ｐＨ調整剤の他に、その他の試薬を含んでもよい。前記その他の試薬は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、有機溶媒、塩等があげられる。前記その他の試薬は、例えば、前記色素試薬および前記ｐＨ調整剤と、別個の容器に収容されてもよいし、いずれかと同一の容器に混合または未混同で収容されてもよいし、前記色素試薬および前記ｐＨ調整剤と、同一の容器に混合または未混同で収容されてもよい。また、本発明の分析試薬が分析キットの場合、本発明の分析キットは、例えば、使用説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００４４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【００４５】
（実施例１）
アルブミンまたはメチオニンを含む試料において、ピーク波長のシフトが起きることを確認し、また、還元工程における還元液（反応液）のｐＨをｐＨ２．４以下とすることにより、ピーク波長のシフトが抑制されることを確認した。
【００４６】
（１）ピーク波長のシフトの確認
生理食塩水に、ヒト血清アルブミンを０．５ｇ／Ｌとなるようなるように添加し、アルブミン試料を調製した。また、生理食塩水に、メチオニンを０．５ｇ／Ｌとなるようなるように添加し、メチオニン試料を調製した。
【００４７】
つぎに、蒸留水に、チオシアン酸カリウムを６０ｍｍｏｌ／Ｌ、および塩化鉄（III）を０．２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、混合色素試薬１を調製した。前記混合色素試薬１と前記アルブミン試料または前記メチオニン試料とを、４９：１の割合（体積比）で混合し、前記混合後３分間２５℃でインキュベートした。
【００４８】
そして、前記インキュベート後の還元液について、吸光光度計（商品名：Ｖ−５５０、日本分光社製）を用いて、４００〜８００ｎｍの吸光度を測定した。コントロールは、混合色素試薬１の４００〜８００ｎｍの吸光度を測定した。なお、前記還元工程における還元液のｐＨは、前記アルブミン試料を含む還元液の場合、ｐＨ２．７であり、前記メチオニン試料を含む還元液の場合、ｐＨ２．７であった。
【００４９】
これらの結果を図１に示す。図１は、前記還元液の吸光度の結果を示すグラフである。図１において、横軸は、波長を示し、縦軸は、吸光度を示す。図１に示すように、コントロールでは、４８０ｎｍ付近にピーク波長が観察されるのに対し、前記アルブミン試料および前記メチオニン試料では、４００ｎｍ以下の領域にピーク波長が観察された。これらの結果から、前記アルブミン試料および前記メチオニン試料では、コントロールに対して、ピーク波長が短波長側へシフトすることがわかった。
【００５０】
（２）強酸性条件によるピーク波長のシフトの抑制の確認
蒸留水に、チオシアン酸カリウムを６０ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化鉄（III）を０．２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、さらに、前記ｐＨ調整剤として、前記強酸性試薬である硫酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、混合色素試薬２を調製した。そして、前記混合色素試薬１に代えて前記混合色素試薬２を用い、前記混合色素試薬２と前記アルブミン試料とを、８０：１の割合（体積比）で混合した以外は、前記（１）と同様にして、３７０〜６５０ｎｍの吸光度を測定した（実施例）。なお、前記還元液のｐＨは、ｐＨ２．１であった。コントロール１は、前記生理食塩水と前記混合色素試薬１とを、コントロール２は、前記アルブミン試料と前記混合色素試薬１とを、コントロール３は、前記生理食塩水と前記混合色素試薬２とを用いた以外は、同様にして、３７０〜６５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５１】
これらの結果を図２に示す。図２は、前記還元液の吸光度の結果を示すグラフである。図２において、横軸は、波長を示し、縦軸は、吸光度を示す。図２に示すように、アルブミンを含まないコントロール１および３では、４８０ｎｍ付近にピーク波長が観察された。また、アルブミンを含むコントロール２では、４４０ｎｍ付近にピーク波長が観察され、アルブミンおよびメチオニンを含まないコントロール１および３に対して、ピーク波長が短波長側へシフトしていた。これに対し、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４以下である実施例では、４８０ｎｍ付近にピーク波長が観察された。これらの結果から、還元工程における前記還元液のｐＨをｐＨ２．４以下とすることで、ピーク波長のシフトを抑制できることがわかった。
【００５２】
（実施例２）
異なるｐＨ調整剤を用い、還元工程における還元液のｐＨをｐＨ２．４以下とすることにより、アルブミンを含む試料において、ピーク波長のシフトが抑制されることを確認した。
【００５３】
生理食塩水に、チオシアン酸カリウムを６０ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化鉄（III）を０．２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、さらに、前記ｐＨ調整剤として、前記強酸性試薬である硫酸を、前記試料と混合後の還元液におけるｐＨが、それぞれｐＨ２．１、２．３、２．５および２．８となるように添加し、混合色素試薬３〜６を調製した。また、硫酸に代えてプロピオン酸を用い、前記試料と混合後の還元液におけるｐＨが、それぞれｐＨ２．０、２．３、２．６および２．７となるように添加し、混合色素試薬７〜１０を調製した。さらに、硫酸に代えてｐ−トルエンスルホン酸を用い、前記試料と混合後の還元液におけるｐＨが、それぞれｐＨ２．０、２．４、２．６および２．８となるように添加し、混合色素試薬１１〜１４を調製した。
【００５４】
つぎに、前記混合色素試薬２に代えて、前記混合色素試薬３〜１４を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、３００〜６５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５５】
これらの結果を図３に示す。図３は、前記還元液の吸光度の結果を示すグラフである。図３において、（Ａ）は、硫酸を用いた結果であり、（Ｂ）は、プロピオン酸を用いた結果であり、（Ｃ）は、ｐ−トルエンスルホン酸を用いた結果である。また、（Ａ）−（Ｃ）において、横軸は、波長を示し、縦軸は、吸光度を示す。（Ａ）に示すように、硫酸を前記ｐＨ調整剤として用いた場合、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４を超える混合色素試薬５および６では、４７０ｎｍ付近にピーク波長が観察されるのに対し、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４以下である混合色素試薬３および４では、４８０ｎｍ付近にピーク波長が観察された。また、（Ｂ）に示すように、プロピオン酸を前記ｐＨ調整剤として用いた場合、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４を超える混合色素試薬９および１０では、４６０〜４７０ｎｍ付近にピーク波長が観察されるのに対し、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４以下である混合色素試薬７および８では、４８０ｎｍ付近にピーク波長が観察された。さらに、（Ｃ）に示すように、ｐ−トルエンスルホン酸を前記ｐＨ調整剤として用いた場合、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４を超える混合色素試薬１３および１４では、４６０〜４７０ｎｍ付近にピーク波長が観察されるのに対し、前記還元液のｐＨがｐＨ２．４以下である混合色素試薬１１および１２では、４８０ｎｍ付近にピーク波長が観察された。これらの結果から、いずれの前記ｐＨ調整剤を用いた場合も、前記還元工程における前記還元液のｐＨを、ｐＨ２．４以下とすることによりピーク波長のシフトが抑制されることがわかった。
【００５６】
また、前記混合色素試薬３〜１４を用いた場合の４００〜６００ｎｍにおけるピーク波長をまとめたグラフを図４に示す。
【００５７】
図４は、異なるｐＨにおけるピーク波長を示すグラフである。図４において、横軸は、ｐＨを示し、縦軸は、ピーク波長を示す。図４に示すように、硫酸（○）、プロピオン酸（△）およびｐ−トルエンスルホン酸（□）のいずれのｐＨ調整剤を用いた場合も、前記還元工程における前記還元液のｐＨの減少と共にピーク波長のシフトが抑制された。さらに前記還元工程における前記還元液のｐＨがｐＨ２．４以下の場合には、ピーク波長がほぼ一定となった。これらの結果から、異なるｐＨ調整剤を用いた場合においても、還元工程における前記還元液のｐＨをｐＨ２．４以下とすることにより、アルブミンを含む試料において、ピーク波長のシフトを抑制できることがわかった。
【００５８】
（実施例３）
本発明の還元力の分析方法を使用し、生体試料の還元力の分析ができることを確認した。
【００５９】
アルブミンを含む試料に代えて、ヒト血清試料（ｎ＝４）用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、４７６ｎｍの吸光度を測定した（実施例）。また、還元力が、１００００μｍｏｌ／Ｌの標準試料を生理食塩水で、２倍ずつ連続希釈し、８倍までの希釈系列を作成し、これらを標準サンプルとした。そして、前記ヒト血清試料に代えて、前記標準サンプルを用いた以外は同様にして、４７６ｎｍの吸光度を測定した。
【００６０】
つぎに、前記標準サンプルの還元力および吸光度に基づき、標準曲線を作製した。そして、前記標準曲線に基づき、前記ヒト血清試料の還元力を算出した。
【００６１】
これらの結果を図５に示す。図５は、前記ヒト血清試料の還元力の結果を示すグラフである。図５において、横軸は、前記ヒト血清試料の種類を示し、縦軸は、還元力を示す。図５に示すように、いずれの前記ヒト血清試料においても、還元力が測定できた。これらの結果から、本発明の分析方法によれば、より信頼性に優れた生体試料の還元力の分析ができることがわかった。
【００６２】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【００６３】
この出願は、２０１４年３月２６日に出願された日本出願特願２０１４−０６３７３５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、前記試料の還元力を分析した場合における前記吸収スペクトルにおけるピーク波長のシフトを抑制できる。このため、前記ピーク波長の光学シグナルに基づき、還元力を分析した場合の誤差を低減でき、より信頼性に優れた試料の還元力の分析を行うことが可能である。したがって、本発明は、例えば、生体由来等の種々の生体試料に対する臨床検査等において、極めて有用である。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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