(57)【要約】【課題】均一系によるキトサンのＣＤ固定化方法の提供、さらには構造の明確なＣＤグラフトキトサンの製造法の提供。【解決手段】カルボキシメチル化試薬の反応量を規定してＣＤをカルボキシメチル化した後、そのカルボキシメチル化度を確認してからキトサンとの縮合反応を行う。キトサンとの縮合はモルホリノエタンスルホン酸を含む酸性水溶液中で、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドの存在下水溶性カルボジイミドを用いることで均一系における反応が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）：
（ａ）アルカリ水溶液中でクロロ酢酸とシクロデキストリンを反応させる工程、
によりカルボキシメチル化シクロデキストリンを製造し、次いで下記の工程（ｂ）：
（ｂ）得られたカルボキシメチル化シクロデキストリンを、モルホリノエタンスルホン酸を含む酸性水溶液中、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドの存在下で水溶性カルボジイミドによりキトサンと縮合させる工程、
により、シクロデキストリングラフトキトサンを製造する方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、水酸化ナトリウム水溶液中でシクロデキストリンと等モルのクロロ酢酸を反応させることを特徴とする、請求項１の製造法。
【請求項３】
工程（ａ）において、水酸化ナトリウム水溶液中でシクロデキストリンと５〜１０当量のクロロ酢酸を反応させることを特徴とする、請求項１の製造法。
【請求項４】
工程（ｂ）の反応後、酸性溶液を中和することによりシクロデキストリングラフトキトサンの微粒子を製造する、請求項３の製造法。
【請求項５】
水溶性カルボジイミドが1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。
【請求項６】
シクロデキストリンがβ-シクロデキストリンである、請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロデキストリンを固定化したキトサン、すなわちシクロデキストリングラフトキトサンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロデキストリンはその分子内の空洞中に別の物質を包み込んで包接錯体と呼ばれる複合体を形成することが知られている。そこで、シクロデキストリンを高分子等の不溶性担体に結合することにより、この包接能を利用して種々の機能性材料を開発する試みが広く行われている。中でもキトサンは反応性に富むアミノ基を有していて化学修飾が容易であることからシクロデキストリンの固定化担体としての検討が加えられている。
特許文献１には、分子内に複数のカルボキシル基を有するカルボキシメチル化シクロデキストリンをアルカリ性水溶液中でキトサンと反応させてシクロデキストリン担持キトサンを製造する方法が記載されている。
非特許文献１には、水中でカルボキシメチル化シクロデキストリンとキトサンのオリゴマーを水溶性カルボジイミドにより縮合させてシクロデキストリンを固定化したキトサンオリゴマーを製造する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２８１３７２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】E.Furusaki et al., Carbohydrate Polymers, Vol.29, No.1, pp.29-34(1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、キトサンのシクロデキストリン（以下ＣＤ）固定化反応については不均一系反応しか知られていない。前述の特開２００５−２８１３７２の記載では、先行技術が開示するＣＤ固体化反応がいずれも不均一系であることを指摘しているものの（段落［０００５］）、当該公報に記載された実施例はキトサンビーズを反応させる方法であって依然として不均一系反応に留まっている（特許文献１）。またFurusakiらの報告では、均一系で反応させるためにキトサンをオリゴマー化する必要があった（非特許文献１）。本発明の目的は均一系によるキトサンのＣＤ固定化方法を提供することである。
また、従来法ではキトサンに固定化されたＣＤの構造に混乱があった。例えば、非特許文献１ではカルボキシメチル基がひとつだけ置換したβ-ＣＤが図示されているが、生成物であるβ-ＣＤ化キトサンのＨ１-ＮＭＲから判断するとキトサンオリゴマーに固定化されたＣＤは明らかに複数のカルボキシメチル基が結合した多置換ＣＤである。よって構造の明確なＣＤグラフトキトサン製造法の提供も本発明の目的の一つである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の製造法においては、ＣＤをカルボキシメチル化した後、そのカルボキシメチル化度を確認してからキトサンとの縮合反応を行う。キトサンとの縮合はモルホリノエタンスルホン酸を含む酸性水溶液中で、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドの存在下水溶性カルボジイミドを用いることで均一系における反応が可能となる。
【発明の効果】
【０００７】
特許文献１で開示されているシクロデキストリン化キトサンは直径２〜３ｍｍのビーズであるが、本発明によりカルボキシメチル化ＣＤ（多置換体）を用いてＣＤグラフトキトサンを製造すると目的物をナノサイズの微粒子（粒子径約255ｎｍ）として得ることができる。その結果、本発明により製造されるＣＤグラフトキトサンはＤＤＳ（薬物輸送）手段として極めて有望である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１（１）で製造したカルボキシメチル化β-ＣＤ（モノ置換体）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル測定結果を示す。
【図２】実施例１（１）で製造したカルボキシメチル化β-ＣＤ（モノ置換体）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定結果を示す。
【図３】実施例１（２）で製造したβ-ＣＤグラフトキトサンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．工程（ａ）
本発明の製造法においては工程（ａ）によりＣＤのカルボキシメチル化を行う。この反応は例えば特許文献１に製造例１として記載されているがＣＤに対するカルボキシメチル化試薬のクロロ酢酸の当量比が重要である。同製造例ではβ-ＣＤ５０ｇ（４４．１ｍｍｏｌ）に対してクロロ酢酸２２ｇ（２３３ｍｍｏｌ：５．３当量）を反応させ、ＣＤの１分子あたり平均４．３個のカルボキシメチル基が導入された目的物を得ている。このように複数個のカルボキシメチル基が導入されたＣＤを得るためにはクロロ酢酸をＣＤに対して３〜１５当量、好ましくは５〜８当量用いればよい。カルボキシメチル基は通常、ＣＤの１分子あたり平均２〜５個が導入される。
一方、モノ置換体を得る場合は、クロロ酢酸をＣＤに対して０．８〜１．２当量、好ましくは１．０当量用いる。アルカリ、例えば水酸化ナトリウムをＣＤに対して１０〜４０倍モル、好ましくは２０〜３０倍モルをＣＤの３〜１００倍量、好ましくは５〜２０倍量の水中に溶解し、上記クロロ酢酸をＣＤと反応させる。この場合、クロロ酢酸は１０〜２０％水溶液として加えるのが好ましい。反応温度は室温〜１００℃、好ましくは４０〜６０℃の範囲内で、１０〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間反応させる。
【００１０】
この条件により製造したカルボキシメチル化β−ＣＤのマススペクトルを図１に示した。ａ〜ｅのピークはそれぞれ、β−ＣＤ＋Ｎａ＋、ＣＭ−β−ＣＤ＋Ｎａ＋、ＣＭ−β−ＣＤ＋Ｈ２Ｏ＋Ｎａ＋、ＣＭ２−β−ＣＤ＋Ｎａ＋およびＣＭ２−β−ＣＤ＋Ｈ２Ｏ＋Ｎａ＋に相当する（ＣＭはカルボキシメチル）。また、同じカルボキシメチル化β−ＣＤの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。カルボキシメチル基が付加したＣＤのグルコースユニットの１位プロトンのシグナル（ＢとＢ’）は、カルボキシメチル化されていないもの（Ａ）よりも低磁場にシフトする。純粋なモノ置換体は、Ｂ＋Ｂ’／Ａ＝１／６になるが、多置換体の場合は当該シグナルの積分比が明らかに増加することから両者を容易に区別できる。
【化１】
2015143311.tif 000002
未反応β-ＣＤに対応するピーク（Ａ）とモノカルボキシメチルβ-ＣＤのピーク（Ｂ＋Ｂ’）の積分比より、次式：
【数１】
2015143311.tif 000003
に従ってカルボキシメチル基化β-ＣＤ含有量が計算できる。なお、マススペクトルにおいて二つのカルボキシメチル基が導入されたβ-ＣＤのピークも小さく観測されたが、そのシグナル強度がきわめて小さいことから反応生成物はほぼモノ置換体であることが分かる。
前述したとおり非特許文献１にはカルボキシメチル基がひとつだけ置換したβ-ＣＤが図示されているが、同文献ではβ-ＣＤ１００ｇ（８８．１ｍｍｏｌ）に対してクロロ酢酸４４ｇ（４６６ｍｍｏｌ：５．３当量）を反応させていて、得られたＣＤは実際のところ複数個のカルボキシメチル基が導入されたＣＤである。このことは得られたカルボキシメチル化ＣＤとキトサンの縮合物のＮＭＲスペクトル（同文献、Ｆｉｇ．１）において、上記のＢまたはＢ’に相当するプロトンの積分比（Ｂ＋Ｂ’／Ａ）が１／６をはるかに上回ることから容易に確認できる。
【００１１】
２．工程（ｂ）
次いで工程（ｂ）により、カルボキシメチル化ＣＤとキトサンとの縮合を行う。縮合剤としては水溶性カルボジイミド、好ましくは1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣ）をカルボキシメチル化ＣＤに対して１〜５当量、好ましくは１．５〜３当量を用いる。併せて、添加剤としてＮ-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）をカルボキシメチル化ＣＤに対して０．５〜２当量、好ましくは０．８〜１．２当量を加える。反応溶媒としては酸性水溶液を用い、具体的には０．０１〜３．０Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍの2-モルホリノエタンスルホン酸水溶液中で反応を行う。反応温度は０℃〜１００℃、好ましくは室温〜６０℃の範囲で１０〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間反応させる。反応に供するキトサンはカルボキシメチル化ＣＤに対して５〜２０当量、好ましくは８〜１２当量である。下記にモノカルボキシメチル化ＣＤとキトサンとの縮合反応の結果をまとめた。
【００１２】
【表１】
2015143311.tif 000004
１）カルボメトキシ化ＣＤ：ＣＤのモル比
２）キトサンに対するＣＤの導入率
表中、実施例１〜３よりキトサン量を変えることでＣＤ導入率を制御できることが分かる。また、実施例１、４および５より本法はβ-ＣＤのみならず、その他のデキストリンにも適用可能であることが明らかである。
【００１３】
実施例１で製造したβ-ＣＤグラフトキトサンの１Ｈ-ＮＭＲスペクトルを図３に示した。図中に示されたピークａとｂはＣＤ上のプロトン、ｃとｄはキトサンのプロトン、ｅ〜ｈはその他の糖鎖由来プロトンである（下式参照）。
【化２】
2015143311.tif 000005
ここで担体のキトサンに対するβ-ＣＤ導入率はａ〜ｄの積分比より、次式：
【数２】
2015143311.tif 000006
に従って容易に計算される。
【００１４】
３．ＣＤグラフトキトサン微粒子の製造
本願製造法により多置換体ＣＤをキトサンと縮合させるとＣＤで架橋されたキトサンが製造され、反応終了後、アルカリ水溶液を添加して反応液を中和し遠心分離と水洗を繰り返せばＣＤグラフトキトサンをナノモラーレベルのゲル微粒子として得ることができる。かかるゲル微粒子は例えばＤＤＳの担体として薬物輸送に応用することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。本願発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【実施例】
【００１５】
実施例１
（１）カルボキシメチル化ＣＤ（モノ置換体）の調製
水５ｍＬにβ−ＣＤ ０．５ｇ（０．４４０５ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ ０．４６５ｇ（１１．6ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１時間撹拌した。次いで、１６．２％クロロ酢酸水溶液０．２５５３ｇ（０．４３７０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で２４時間撹拌した。ｐＨが６〜７になるまで、室温で反応液に１Ｍ ＨＣｌを加えた。その溶液をアセトン５００ｍＬに加えて、析出した粗精製物を吸引濾過によって濾別した。１Ｈ-ＮＭＲ測定から、塩や未反応ＣＤも含む粗精製物中のカルボキシメチル化ＣＤの含有量は０．０８７５ｍｍｏｌと見積もられた。
（２）ＣＤグラフトキトサンの製造
次いで、キトサン０．１３４ｇ（０．８７５ｍｍｏｌ）を０．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸１０ｍＬに溶かし、そこに調製した粗精製のカルボキシメチル化ＣＤ全量（０．０８７５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド１０．７ｍｇ（０．０８７５ｍｍｏｌ）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩３３．５ｍｇ（０．１７５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２４時間撹拌した。ｐＨが１０になるまでトリエチルアミンを加えて１時間撹拌した。その溶液をエタノール２５０ｍＬに加えて、析出した沈殿を吸引ろ過によって濾過した。沈殿を水溶媒系にて透析することで精製し、０．２０３２ｇの精製物を得た。
【００１６】
実施例２〜５
ＣＤおよび／または試薬の量以外は実施例１と同様に行った。結果は前述の表１にまとめた。
【００１７】
実施例６
（１）カルボキシメチル化ＣＤ（多置換体）の調製
水１ｍＬにβ−ＣＤ ０．１ｇ（０．０８８１ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ ０．１８６ｇ（４．６６ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１時間撹拌した。次いで、１６．２％クロロ酢酸水溶液を０．３６３ｇ（０．６２２ｍｍｏｌ）を１時間毎に３回加え（添加した全量は１．０８９ｇ（１．８６６ｍｍｏｌ）となる）、５０℃で２４時間撹拌した。その後、ｐＨが６〜７になるまで、室温で反応液に１Ｍ ＨＣｌを加えた。その溶液をアセトン５００ｍＬに加えて、析出した粗成生物を吸引濾過によって濾別した。１Ｈ-ＮＭＲ測定から、塩を含む粗精製物中のカルボキシメチル化ＣＤのカルボキシメチル化度は２．７７と見積もられた。
（２）ＣＤグラフトキトサンの製造
次いで、キトサン０．１０ｇ（０．６２１ｍｍｏｌ）を０．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸１０ｍＬに溶かし、そこに、調製した粗精製のカルボキシメチル化ＣＤ全量、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド２８．７ｍｇ（０．２５００ｍｍｏｌ）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩９５．８ｍｇ（０．５０００ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２４時間撹拌した。ｐＨが１０になるまで１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を加えて１時間撹拌した。その溶液を透析することでβ−ＣＤグラフトキトサンの微粒子を単離精製した。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明によればＣＤグラフトキトサン微粒子を容易に製造するこができ、これは例えばＤＤＳ担体として医薬製剤の調製に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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