(57)【要約】      （修正有）【課題】走査型電子顕微鏡による含水試料の観察において、水分の蒸発による試料形状の変化、及び、試料のダメージを防ぐ方法を提供する。【解決手段】含水試料３を疎水性材料１でコーティング処理することにより含水試料の水分蒸発を抑制する手法と、試料基板４に含水性材料２のコーティングを行い試料の水分蒸発を抑制する手法、の何れか、または二法による、走査型電子顕微鏡による含水試料の観察方法、および、試料と試料基板のコーティング処理方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
走査型電子顕微鏡により
含水試料を観察する際に
試料
を疎水性材料でコーティング処理することにより、
試料の水分の蒸発を低減化することができることを特徴とする方法。
【請求項２】
含水試料を
水溶液中で疎水材料と混合することにより、
試料を疎水性材料でコーティングすることを特徴とする
請求項１に記載のコーティング処理方法。
【請求項３】
含水試料を疎水性材料で
コーティングする際に
疎水性材料を含む溶液中に試料を混合し、
試料基板上で、水溶液の水分を乾燥処理することにより
試料表面を疎水性材料でコーティングすることを特徴とする
請求項２に記載のコーティング処理方法。
【請求項４】
含水試料を疎水性材料で
コーティングする際に
閉鎖空間内に疎水材料を含む溶液中で含水試料を閉じ込めることにより
試料表面を疎水性材料でコーティングすることを特徴とする
請求項２に記載のコーティング処理方法。
【請求項５】
含水試料をコーティングするための
前記疎水性材料は
食用油脂、植物油、グリセリン、リン脂質、ポリエチレングリコール、流動パラフィン
の何れかを主成分とする材料からなる
請求項１に記載の疎水性材料。
【請求項６】
走査型電子顕微鏡において
含水試料を観察する際に
試料基板
を含水材料によりコーティング処理することにより
試料への水分を供給し、観察時の試料の水分蒸発を低減化することができる
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
試料基板を含水材料で
コーティングする際に
含水材料を試料基板上に滴下し、乾燥させることで、
試料基板へ含水材料をコーティング処理することができることを特徴とする
請求項６に記載のコーティング方法。
【請求項８】
試料基板を含水材料で
コーティングする際に
スピンコーティング処理することにより
試料基板へ含水材料をコーティング処理することができることを特徴とする
請求項６に記載のコーティング方法。
【請求項９】
試料基板を含水材料で
コーティングする際に
ディップコーティング処理することにより
効率的に試料基板へ含水材料をコーティング処理することができることを特徴とする
請求項６に記載のコーティング方法。
【請求項１０】
請求項１、６の何れかのコーティング方法、
のいずれか、もしくは全てを備えた、
前記、含水試料の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、走査型電子顕微鏡により、含水試料に対して、含水試料及び試料基板をコーティング処理することにより、観察時の電子線によるダメージを低減化するためのコーティング処理方法及びコーティング処理装置に関する。【０００２】含水試料は、電子顕微鏡で観察するためには、試料は真空中に設置されるため、直接観察することはできず、乾燥や染色などの前処理が必要であり、乾燥処理や染色処理に伴って、試料にダメージや、試料の形状の変化などが生じることが問題であった。【０００３】特に、生物試料などの含水試料は、凍結乾燥処理を行った後に、重金属や放射性物質などの処理を施すことで、電子顕微鏡観察時のコントラストを増大させるための前処理を要してきた。このような処理を経ることにより、生物試料は、生物試料が含水状態と同等の形状を保つことが困難である、また特殊かつ高度な前処理が必要であった。【０００４】一方で、低真空走査型電子顕微鏡や環境制御型電子顕微鏡などの、試料室の圧力を高め、また温度を冷却制御することにより、試料を湿潤状態に保った状態で観察することが可能である。【０００４】しかし、電子顕微鏡で観察する際には、試料に電子線が照射し、それに伴い、例えば生物試料の場合、加熱・ラジカル反応・ＤＮＡ損傷などの影響により、試料にダメージが生じることが問題である。【０００５】特に、高分解能観察、長時間観察を実施した場合、電子線の照射量が局所的になるため、上記の反応が促進される、また、電子線の照射量が増大するために、生物試料に対して損傷が生じて、観察が不可能になる問題がある。
【背景技術】
【０００５】特許文献１では、試料の変形がない走査電子顕微鏡用生物試料作製方法及び生物試料観察方法並びに走査電子顕微鏡用生物試料作製装置として、凍結した試料を真空引きされた試料室の中で、零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする方法及び装置であるが、凍結乾燥処理をさせる処理において、含水試料に収縮変形等のダメージが生じると共に、試料が含水状態での観察手法を提案するものではない。【０００６】特許文献２では、試料作製をより迅速かつ確実に固定できる電子顕微鏡試料作製装置及び電子顕微鏡試料作成方法として、生物組織内に浸透してきた固定剤を、マイクロ波照射方法と加圧方法という両技術を併用することによって、相乗的な試料の固定効果を得る方法であって、本研究で提案するような含水試料の水分蒸発を防止する手法ではない。【０００６】特許文献３では、高倍率でも明瞭なＳＥＭ像を得るための、非導電性試料の導電性付与方法、及び非導電性試料の観察方法として、導電性粒子を５ｎｍ以下の厚さでコーティングする、非導電性試料の導電性付与方法に関するものであって、本研究で提案するような含水試料の水分蒸発を防止する手法ではない。【０００７】特許文献４では、コンピュータ化された電子顕微鏡視覚システムを使用して希少細胞および関心の核酸配列を示す蛍光信号について、前記細胞試料の少なくとも一部を覆う光場が観察される。各信号が検出されると、前記信号が検出された座標が識別され、診断手順に用いるものであって、本研究で提案するような含水試料の水分蒸発を防止する手法ではない。【０００８】特許文献５では、試料に導電膜を形成することなく試料の帯電を抑制して、適性に試料の観察や分析を行うことができる試料の分析方法として、試料に中性原子線又はイオン線を照射する過程と、中性原子線又はイオン線の照射後に、試料に対して放射線を照射し、試料からの電子を分析する過程とを含む。この分析方法によれば、導電膜を試料の観察面にコーティングしなくても、試料の帯電に伴う異常な分析結果の発生を回避することができるものであるが、本研究で提案するような含水試料の水分蒸発を防止する手法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許公開平７−２８０７１４
【特許文献２】特許公開２００１−４５０６
【特許文献３】特許公開２００８−７５１０４
【特許文献４】特許公表２００９−５１１００２
【特許文献５】特許公開２０１０−２５６０９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】生物試料を電子顕微鏡により観察するため、生物試料を真空中に設置する必要があるため、凍結乾燥後に重金属による処理をするなどの方法による前処理を要してきた。【００１１】このような前処理をなく、生物試料を直接、電子顕微鏡により観察するための観察方法が望まれている。【００１２】一方で、低真空走査型電子顕微鏡や環境制御型電子顕微鏡などの、試料室の圧力を高め、また温度を冷却制御することにより、試料を湿潤状態で観察することが可能である。【００１３】しかし、電子顕微鏡で観察する際には、試料に電子線が照射し、それに伴い、生物試料の場合、加熱・ラジカル反応・ＤＮＡ損傷などの影響により、試料にダメージが生じることが問題である。特に、高分解能観察、長時間観察、において、電子線の照射量が局所的になる、また電線の照射量が増大するために、生物試料に対するダメージが深刻に生じることが問題である。【００１４】したがって、電子顕微鏡観察による電子線照射に伴った、生物試料のダメージを低減化し、また生存状態を保った状態で、試料を観察するための方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねてきた結果、次なる構成の本発明に想到した。
本発明の走査型電子顕微鏡により、含水試料をコーティングすることにより、電子線によるダメージを低減化するためのコーティングすることにより、生物試料を湿潤の状態に保ち、高分解能観察及び長時間観察においても、ダメージを低減化する。【００１６】疎水性材料を含む溶液中に試料を混合し、試料基板上で、水溶液の水分を乾燥処理することにより、効率的に試料を疎水性材料によりコーティング処理を行う。【００１７】閉鎖空間内に含水試料を、疎水材料を含む溶液中で閉じ込めることにより、試料表面を疎水性材料でコーティング処理を行う。【００１８】  疎水性材料は、食用油脂、植物油、グリセリン、リン脂質、ポリエチレングリコール、流動パラフィンの何れかを主成分とする材料からなる。【００１９】さらに、試料基板を含水性材料によりコーティング処理することにより、試料への水分を供給し、観察時の試料の水分蒸発を低減化する。【００２０】含水性材料を試料基板上に滴下し、乾燥させることで、試料基板へ含水材料を効率的にコーティング処理する。【００２１】含水性材料を試料基板上にコーティングする際に、スピンコーティング処理することにより、試料基板へ含水材料を効率的にコーティング処理する。【００２２】  試料基板を含水材料でコーティングする際に、ディップコーティング処理することにより、効率的に試料基板へ含水材料をコーティング処理する。
【発明の効果】
【００２３】上記のように構成された方法によれば、含水試料を、高分解能かつ長時間観察することが可能となる。【００２４】上記のように構成された方法によれば、含水試料を疎水性材料でコーティングすることにより、減圧環境下においても、生物試料の水分蒸発を低減化することで、試料のダメージを低減化し、走査型電子顕微鏡による観察時に、試料の変形を防ぐことが可能となる。【００２５】上記のように構成された方法によれば、含水試料を設置する、試料基板表面を、吸水性材料によりコーティングすることにより、減圧環境下においても、含水試料の水分蒸発を低減化することで、試料のダメージを低減化し、走査型電子顕微鏡による観察時に、試料の変形を防ぐことが可能となる。【００２６】上記のように構成された方法によれば、試料基板を効率的にコーティング処理することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明の含水試料及び試料基板のコーティングの構成を示す。
【図２】図２は、本発明の含水試料の疎水性材料によるコーティングの構成を示す。
【図３】図３は、本発明の試料基板の含水性材料によりコーティングの構成を示す。
【図４】図４は、本発明の含水試料及び試料基板のコーティング処理を併用するための手順を、図４（ａ）から図４（ｂ）の順で行うことを示す。
【図５】図５は、実施例として、含水試料及び試料基板にコーティング処理を行わなかった場合の実験結果を示す。
【図６】図６は、実施例として、含水試料のみにコーティング処理を行った場合の実験結果を示す。
【図７】図７は、実施例として、試料基板のみにコーティング処理を行った場合の実験結果を示す。
【図８】図８は、実施例として、含水試料及び試料基板にコーティング処理を行った場合の実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】本発明の含水試料のコーティングの構成を図１に示す。含水試料（３）を、疎水性材料（１）でコーティング処理する。また、試料基板（４）を含水性材料によりコーティング処理する。これらを組み合わせることで、走査型電子顕微鏡による観察時のダメージを大幅に低減化し、かつ十分なコントラスト及び分解能を得ることが可能となる。
【００２９】含水試料（３）を疎水性材料（１）でコーティングする構成を図２に示す。含水試料の全体を、コーティング処理することにより、試料室内で減圧した状態で、試料からの水分の蒸発を防ぎ、試料のダメージを低減化することが可能となる。
【００３０】試料基板（４）を含水性材料（２）でコーティングする構成を図３に示す。試料を設置する表面を、含水性材料でコーティング処理することにより、含水性試料に含まれる水分を含水材料（３）に供給することができ、試料室内で減圧した状態で、試料からの水分の蒸発を防ぎ、試料のダメージを低減化することが可能となる。
【００３１】これらのコーティング方法を組み合わせるためには、図４（ａ）に示すように、試料基板を含水性材料でコーティング処理したものを準備し、図４（ｂ）に示すように、試料を疎水性材料でコーティング処理したものを設置する、試料準備手順となる。
【００３２】以下の実施例では、環境制御型電子顕微鏡を用いて観察を実施した。試料室の圧力は、約６００Ｐａ、試料の温度は約０℃とした。これにより、含水試料は含水状態を保つことができる。
【００３３】また、以下の実施例では、また含水試料としては、モデル生物として実験環境にて広く用いられている、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ。  ｅｌｅｇａｎｓ））を用いた。
【００３４】また、以下の実施例では、疎水性材料として、流動パラフィン、含水性材料として、アガロースを用いた。
【００３５】［図５］含水試料及び試料基板にコーティング処理を行わなかった場合の構成を図５（ａ）に示す。含水試料（３）は、試料基板（４）に直接設置されることとなる。電子顕微鏡での観察結果を図５（ｂ）に示す。図５（ｂ）から、線虫の表面に凹凸が生じて、ダメージが生じていることが確認された。
【００３６】含水試料のみにコーティング処理を行った場合の構成を図６（ａ）に示す。含水試料（３）は、疎水材料（１）によりコーティングされた状態で、試料基板（４）に設置される。電子顕微鏡での観察結果を図６（ｂ）に示す。図６（ｂ）から、表面に凹凸は見られず、非常にスムーズな形状を保っており、含水試料（３）へのダメージが低減できることが確認された。
【００３７】試料基板のみにコーティング処理を行った場合の構成を図７（ａ）に示す。試料基板（４）は、含水性材料（２）によりコーティグされ、この上に含水試料（３）が設置される。電子顕微鏡での観察結果を図７（ｂ）に示す。図７（ｂ）から、線虫の表面に凹凸が見られず、非常にスムーズな形状を保っており、含水試料（３）へのダメージが低減できることが確認された。さらに、線虫の表面に側翼（ｌａｔｅｒａｌ  ａｌａｅ）と呼ばれる、ナノメートルスケールの微細な形状が観察でき、十分なコントラストと観察分解能が得られたことが確認された。
【００３８】［図８］含水試料及び試料基板にコーティング処理を行った場合の実験結果を図８（ａ）に示す。ｇ試料基板（４）は、含水性材料（２）によりコーティグされ、この上に疎水性材料（１）をコーティングした含水試料（３）が設置される。
電子顕微鏡での観察結果を図８（ｂ）に示す。図８（ｂ）から、線虫の表面に凹凸が見られず、非常にスムーズな形状を保っており、含水試料（３）へのダメージが低減できることが確認された。さらに、線虫の表面に側翼（ｌａｔｅｒａｌ  ａｌａｅ）と呼ばれる、ナノメートルスケールの微細な形状が観察でき、十分なコントラストと観察分解能が得られたことが確認された。
【符号の説明】１      疎水性材料
２      含水性材料
３      含水試料
４      試料基板
５      側翼（ｌａｔｅｒａｌ  ａｌａｅ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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