(57)【要約】      （修正有）【課題】セレン含有蛋白質に関連する糖尿病、特に２型糖尿病の治療及び／又は予防剤の有効成分の提供。【解決手段】主に肝臓で生合成される６９ｋＤａ（３６２アミノ酸）の糖タンパク質であるセレノプロテインＰの特定の領域（２０４〜２６１番目のアミノ配列内、好ましくは、２０４〜２５４番目のアミノ配列内、より好ましくは、２０４〜２１７番目のアミノ配列内）をエピトープする抗体。イムノグロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、テトラボディー及びミニボディーより選択される少なくとも一つの構造を有する前記抗体。【効果】前記抗体がセレノプロテインＰの細胞内への取り込みを阻害し、また、前記抗体が、細胞内におけるグルタチオンペルオキシダーゼの増加を抑制し、糖尿病、特に２型糖尿病の治療及び／又は予防剤としての有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
エピトープが、セレノプロテインＰの２０４〜２５４番目のアミノ酸配列内に存在する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
エピトープが、セレノプロテインＰの２０４〜２１７番目のアミノ酸配列内に存在する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
イムノグロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、テトラボディー及びミニボディーからなる群より選択される少なくとも１つの構造を有する、請求項１〜３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、
配列番号３又は１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４又は１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
及び
配列番号５又は１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、
及び／又は
配列番号８又は１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９又は１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
及び
配列番号１０又は２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する、請求項１〜４の何れか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、又は
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域及び／又は
配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する、請求項１〜５の何れか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する、請求項１〜６の何れか１項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、
配列番号２又は１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
配列番号７又は１７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する、請求項１〜７の何れか１項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する、請求項１〜８の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が定常領域を含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、
配列番号１又は１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖、及び／又は
配列番号６又は１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する、請求項１〜１１の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖、及び
配列番号６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖、及び
配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する、請求項１〜１２の何れか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の抗体を含む、セレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤。
【請求項１５】
項１〜１３の何れか１項に記載の抗体を含む、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤。
【請求項１６】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の抗体を含む、２型糖尿病の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病の治療及び／又は予防薬に関する
【背景技術】
【０００２】
セレンは、生体にとって重要な役割を果たしている。例えば、中国の克山（ケシャン）地方は土壌中のセレンが少なく、これに起因してこの地区の住民の多くがセレン欠乏状態となり、延いては重篤な心筋症を生じることが知られている。また、土壌中のセレン濃度が低い地域の住民は、それによって血中のセレン濃度が低下し、動脈硬化・ガン等の発症率が増加することも知られている。そして、ＨＩＶ感染者は血中のセレン濃度が低下する傾向となり、これによってＨＩＶ感染者の生存率が低下することが知られている。
【０００３】
また、セレン濃度の異なる餌を用いた動物実験の結果から、免疫機能、精子形成といった雄性生殖機能等に影響を及ぼすことも知られている。更に、セレン含有タンパク質（セレノプロテイン）形成不全トランスジェニックマウスを創出したところ、これが初期胚性致死のフェノタイプを示すことも知られている。
【０００４】
日本人のセレンの平均摂取量は１００μｇ／日と言われ、３０μｇ／日を摂取することが推奨されている。セレンを多く含む食材としては、カツオ、カキ、ホタテ貝、タラ、イワシなどの魚介類及び肉類等が知られている。
【０００５】
ところが、８００μｇ／日以上の摂取量となると、これが過剰摂取の域に達し、結果として下痢、脱毛、末梢神経障害等といった、水銀と同レベルの中毒症状を引き起こすと言われている。すなわち、セレンの適正摂取量の範囲は非常に狭いことが知られている。
【０００６】
このようなセレンのサプリメント効果に関して、１３１２人が参加する大規模な臨床試験（ｔｈｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｉａｌ：ＮＰＣ試験）が行われ、１日のセレン摂取量を２００μｇとした場合に、糖尿病を発症するリスクが高まるとの報告がされている（非特許文献１）。このような報告に関し、今もなお、セレン及び抗酸化物質であるビタミンＥのサプリメントとしての有用性評価（３万５千人が参加する、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ：ＳＥＬＥＣＴ試験）が検証されている。
【０００７】
セレノプロテインは、システイン残基の硫黄がセレンに置き換わったセレノシステイン残基を含むタンパク質の総称である。哺乳類のセレノプロテインとして、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）、ヨードチロニン脱ヨード酵素、セレノホスフェートシンセターゼ、セレノプロテインＰ（ＳｅＰ）、セレノプロテインＷ、１５ｋＤａセレノプロテイン等が知られ、これらは細胞内の酸化還元に関与するタンパク質であることも知られている。
【０００８】
中でも、主に肝臓で生合成されるセレノプロテインＰは、血漿中の主要なセレノプロテインで（血漿中の濃度は５．３μｇ／ｍｌ）、６９ｋＤａ（３６２アミノ酸）の糖タンパク質であることが知られている。セレノプロテインＰのアミノ酸一次構造と機能との関係が詳細に研究されており、Ｎ末端側に酵素活性部位を有し、セレノシステイン残基に富むＣ末端側が細胞へセレンを供給する機能を発揮していると考えられている。また、Ｎ末端でもＣ末端でもない領域にヒスチジンリッチドメインを有していることも知られている（非特許文献２〜５）。
【０００９】
そしてセレノプロテインＰは、その肝臓での発現量、血漿中における濃度、並びに糖尿病病態との間で、相関関係が存在する研究結果が報告されている。より詳細には、セレノプロテインＰが増加することによって、インスリン抵抗性が増大することが明らかとなっている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．（２００７）２１；１４７（４）：２１７−２３．
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００４）３８１，８４１−８４６
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４，２８６６−２８７１
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００２）２７７，４１２５４−４１２５８
【非特許文献５】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００２）２６９，５７４６−５７５１
【非特許文献６】Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２０１０）１２，４８３−４９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、セレノプロテインＰは、糖尿病に関連することが知られているにもかかわらず、セレノプロテインＰとの関係で、どのような化合物が糖尿病の治療薬の候補となるかという知見すら見当たらない。然るに、本発明は糖尿病、特に２型糖尿病の治療及び／又は予防剤の有効成分を提供する事である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく、発明者らは鋭意研究を重ねた結果、セレノプロテインＰの特定の領域をエピトープとする抗体が、セレノプロテインＰの細胞内への取り込みを阻害することを見出した。また、斯かる抗体が、細胞内におけるグルタチオンペルオキシダーゼの増加を抑制することも見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。
［項１］
セレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体。
［項２］
エピトープが、セレノプロテインＰの２０４〜２５４番目のアミノ酸配列内に存在する、項１に記載の抗体。
［項３］
エピトープが、セレノプロテインＰの２０４〜２１７番目のアミノ酸配列内に存在する、項１又は項２に記載の抗体。
［項４］
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である項１〜項３の何れか一項に記載の抗体。
［項５］
イムノグロブリン、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、テトラボディー及びミニボディーからなる群より選択される少なくとも１つの構造を有する、項１〜項４に記載の抗体。
［項６］
前記抗体が、
配列番号３又は１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４又は１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
及び
配列番号５又は１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、
及び／又は
配列番号８又は１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９又は１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
及び
配列番号１０又は２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を有する、項１〜項５の何れか１項に記載の抗体。
［項７］
前記抗体が、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、又は
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域及び／又は
配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する、項１〜項６の何れか１項に記載の抗体。
［項８］
前記抗体が、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域を有する、項１〜項７の何れか１項に記載の抗体。
［項９］
前記抗体が、
配列番号２又は１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
配列番号７又は１７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する、項１〜項８の何れか１項に記載の抗体。
［項１０］
前記抗体が、
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する、項１〜項９の何れか１項に記載の抗体。
［項１１］
前記抗体が定常領域を含む、項１〜項１０の何れか１項に記載の抗体。
［項１２］
前記抗体がキメラ抗体である、項１〜項１１の何れか１項に記載の抗体。
［項１３］
前記抗体がヒト化抗体である、項１〜項１２の何れか１項に記載の抗体。
［項１４］
前記抗体が、
配列番号１又は１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖、及び／又は配列番号６又は１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、項１〜項１３の何れか１項に記載の抗体。
［項１５］
前記抗体が、
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖、及び
配列番号６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖、及び
配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する、項１〜項１４の何れか１項に記載の抗体。
［項１６］
項１〜項１５の何れか１項に記載の抗体を含む、セレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤。
［項１７］
項１〜項１５の何れか１項に記載の抗体を含む、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤。
［項１８］
項１〜項１５の何れか１項に記載の抗体を含む、２型糖尿病の治療薬。
［項１９］
項１〜項１５の何れか１項に記載の抗体を生体に投与する工程を含む、セレノプロテインＰの細胞内取り込みを阻害する方法。
［項２０］
項１〜項１５の何れか１項に記載の抗体を生体に投与する工程を含む、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導を抑制する方法。
［項２１］
項１〜項１５の何れか１項に記載の抗体を生体に投与する工程を含む、２型糖尿病の治療方法。
【発明の効果】
【００１３】
以下に、本発明の効果を説明するが、本発明は以下に示すすべての効果を発揮する発明に限定されないのは言うまでもない。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体は、セレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤の有効成分として効果を発揮する。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤の有効成分として効果を発揮する。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、２型糖尿病の治療薬の有効成分として効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＥ２の可変領域のアミノ酸配列を示す図。
【図２】ＢＤ１の可変領域のアミノ酸配列を示す図。
【図３】エピトープの探索実験におけるＡＥ２を用いたウエスタンブロッティング実験結果を示す図。
【図４】エピトープの探索実験におけるＢＤ１を用いたウエスタンブロッティング実験結果を示す図。
【図５】細胞内へのＳｅＰ取り込み阻害実験・ＧＰｘ誘導阻害実験における各種モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング実験結果を示す図。
【図６】図３の結果を定量化したグラフ。
【図７】Ｃ２Ｃ１２細胞内へのＳｅＰ取り込み阻害及びＣ２Ｃ１２細胞内でのＧＰｘ誘導阻害実験。各種モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング実験結果を示す図。
【図８】図５の結果を定量化したグラフ。
【図９】高濃度のＳｅＰを用いたＣ２Ｃ１２細胞内へのＳｅＰ取り込み阻害及びＣ２Ｃ１２細胞内でのＧＰｘ誘導阻害実験。ＳＥ２を用いたウエスタンブロッティング実験結果を示す図。
【図１０】Ｊｕｒｋａｔ細胞内へのＳｅＰ取り込み阻害誘導阻害実験。各種モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング実験結果を示す図。
【図１１】ＡＥ２投与による血中濃度を測定した実験結果を示す図。
【図１２】ＡＥ２投与によるＳｅＰによって誘導されたインスリン抵抗性の改善効果を確認する実験結果を示す図。
【図１３】図１２に示す結果から、ＡＵＣを算出した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，．ＮＹ等の文献を参照
すればよい。
【００１９】
また、抗体工学的技術であれば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｄuｂｅｌ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等の文献を参照すればよい。
【００２０】
〔抗体〕
本発明に係る抗体は、セレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体を含む。より好ましくは２０４〜２５４番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに、更に好ましくは、２０４〜２１７番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体である。
【００２１】
セレノプロテインＰのアミノ酸配列は、例えばＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０７８９５５  ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＰ＿００１０７８９５５．１  ＧＩ：１４８２７７０１８として収載されている。より具体的には、配列番号２５に示すものである。
【００２２】
上述の用語“特異的な結合”とは、セレノプロテインＰの例えば２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに選択的に結合することに限定されず、セレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列に、特にセレノプロテインＰのホモログ等といった、セレノプロテインＰと一次又は高次構造的に類似する分子がセレノプロテインＰと共存している場合に、セレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープと優先的に結合することで説明される。
【００２３】
なお、上述のような本発明の抗体が、セレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに特異的に結合するということは、上述したセレノプロテインＰのホモログ等の特定のアミノ酸配列内に存在するエピトープとの結合が排除されるものではない。
【００２４】
このような上述の抗体の、セレノプロテインＰの例えば２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープとの特異的な結合の程度は、Ｋｄ値、Ｋｏｆｆ値、又はＫｏｎ値といった反応速度定数でも評価される。なお、Ｋｄ値とは、Ｋｏｆｆ値をＫｏｎ値で除して得られる値である。
【００２５】
このような本発明に係る抗体のセレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープとの結合に関する反応速度定数は特に限定されないが、例えばＫｄ値であれば、通常０．０１〜１００ｎＭ程度である。
【００２６】
本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、抗体の由来も特に限定はされない。
【００２７】
本発明に係る抗体の構造は、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子に限定はされず、その断片であってもよい。この様な断片としては重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含んでいればよく、斯かる断片を適宜再構成した構造であってもよい。
【００２８】
このような本発明の抗体の具体的な構造として、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、テトラボディー、ミニボディー等が挙げられる。
【００２９】
また、上記イムノグロブリンも、そのアイソタイプは限定されず、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ等が挙げられる。そして、ＩｇＧのサブクラスも特に限定はされず、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。
【００３０】
本発明の抗体は、特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する態様であることができる。具体的には、
配列番号３又は１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４又は１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５又は１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び／又は
配列番号８又は１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９又は１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０又は２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する抗体が挙げられる。
【００３１】
更に好ましくは、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、又は
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域及び／又は
配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域、又は
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する抗体が挙げられる。
【００３２】
更に好ましくは、
配列番号３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び
配列番号８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１４に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１８に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を有する抗体が挙げられる。
【００３３】
上述の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する抗体は、更にフレームワーク領域（ＦＲ）又はその準領域を含んでいてもよい。ＦＲを構成するアミノ酸配列は、公知の方法によって適宜決定することができる。具体的には、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に記載の情報を参照すればよい。
【００３４】
ヒト由来の機能的生殖細胞から得られるＦＲとして、例えばＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、ＰＯＭ等が挙げられる。これらのヒト型のＦＲの例は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ．”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”：ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＮＤ  ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ（１９９１）  ＵＳＡ、又はＷｕ  ＴＴ，Ｋａｂａｔ  ＥＡ．“Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２：２１１−５０（１９７０）等を参照すればよい。
【００３５】
このようなＦＲを含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する抗体として、例えば
配列番号２又は１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
配列番号７又は１７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する抗体が挙げられる。
【００３６】
より好ましくは、
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を有する抗体が挙げられる。
【００３７】
上述重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を有する抗体は、更に定常領域を有していてもよい。また、これらの抗体は、ヒト化されていても、キメラ化されていてもよい。
【００３８】
ヒト化抗体とは、定常領域及び可変領域のＦＲがヒト由来のアミノ酸配列であり、それ以外の部分がヒト以外の生物種に由来するアミノ酸配列である抗体を意味する。また、キメラ化とは、定常領域がヒト由来のアミノ酸配列であり、可変領域がヒト以外の生物種に由来するアミノ酸配列である。
【００３９】
このようなヒト以外の生物種とは、特に限定はされないが、例えばマウス、ラット、ウサギ、ダチョウ、サル、チンパンジー、ウマ、ロバ、ハムスター、モルモット等が挙げられる。
【００４０】
このような定常領域は、例えば重鎖定常領域であれば、Ｎ末端から順にＥＴＴを有するアミノ酸配列、より好ましくはＮ末端から順にＥＴＴＡを有するアミノ酸配列を含む定常領域が挙げられる。また、軽鎖定常領域であれば、Ｎ末端から順にＲＡを有するアミノ酸配列、より好ましくはＮ末端から順にＲＡＡを有するアミノ酸配列を含む定常領域が挙げられる。
【００４１】
上述の定常領域を有する抗体として、例えば、
配列番号１又は１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は
配列番号６又は１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する抗体が挙げられる。
【００４２】
好ましくは、
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び
配列番号６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖又は
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖及び
配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖
を有する抗体が挙げられる。
【００４３】
なお、上記のアミノ酸配列には、本発明の抗体の機能、効果等を減衰させない範囲に限り、適宜変異が施されていてもよい。具体的な変異導入の数は、共に特に限定はされないが、通常は変異前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。
【００４４】
変異の導入箇所は、特に限定はされないが、本発明の抗体の機能、効果等を減衰させないことに鑑みて、例えば、上述したＦＲ領域、定常領域等に変異を導入することが好ましい。
【００４５】
本明細書にて使用する用語、『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列又は塩基配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列又は塩基配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列又は塩基配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又は塩基配列の同一性のレベルは、通常は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメーターを用いて決定される。
【００４６】
若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８７：２２６４−２２６８（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３）等）を用いて決定できる。このようなＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ＧｉｓｈＷ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）等）。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮＣＢＩのウェブサイトが提供しているＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を参照すればよい。
【００４７】
上述の変異導入とは、置換、欠失、挿入等である。具体的な変異導入については、公知の方法を採用することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。
【００４８】
本明細書にて使用する用語『保存的な置換技術』とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される技術を意味する。
【００４９】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換技術にあたる。
【００５０】
本発明に係る抗体の製造方法は公知の方法を用いて作成すればよい。例えば、上述のセレノプロテインＰの全長又は少なくともセレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列を有するペプチド断片を、動物に免疫付与した後に斯かる動物から抗体を回収し、次いで回収した抗体の中からセレノプロテインＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープと特異的に結合する抗体を選択又はスクリーニングすればよい。
【００５１】
なお、セレノシステインＰの全長又はそのペプチド断片の作成方法は、以下の実施例にて示す方法を採用すればよい。
【００５２】
具体的な選択方法又はスクリーニング方法は特に限定はされないが、例えばＥＬＩＳＡ法等といった公知の免疫科学的手段を適宜改変して用いればよい。
【００５３】
本発明に係る抗体がモノクローナル抗体であれば、上述の免疫付与の後に抗体産生Ｂ細胞をリンパ節、脾臓等から採取し、これとミエローマ細胞等といった公知の細胞を融合させたハイブリドーマを作成し、斯かるハイブリドーマが産生する抗体を回収した後に、上述のような選択手段又はスクリーニング手段に供すればよい。
【００５４】
他の方法としては、本発明に係る抗体のアミノ酸配列コードする塩基配列を、例えば上述のハイブリドーマ細胞から解析し、これをコードする塩基配列を含む核酸を作成した後に、斯かる核酸を含む遺伝子断片を抗体産生に適した公知のＣＨＯ等の細胞に導入して、これを発現させるといった方法が挙げられる。
【００５５】
また、上述のアミノ酸配列を基にペプチド合成機を用いて製造することも可能である。
【００５６】
本発明に係る抗体は、セレノプロテインＰのＰの２０４〜２６１番目のアミノ酸配列内に存在するエピトープに特異的に結合することによって、セレノプロテインＰの細胞内取り込みを阻害する効果を発揮する。従って、本発明に係る抗体は、セレノプロテインＰの細胞内への取り込み阻害剤の有効成分とすることができる。また、本発明に係る抗体を、ヒトのみならず生体に投与することによって、セレノプロテインＰの細胞内への取り込みを阻害することができる。
【００５７】
また、本発明に係る抗体は、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導を抑制する効果を発揮する。従って、本発明に係る抗体は、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤の有効成分とすることができる。そして、本発明に係る抗体を、ヒトのみならず生体に投与することによって、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導を抑制することができる。
【００５８】
セレノプロテインＰの細胞内への取り込み上昇や、細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導は、２型糖尿病の発症機序に深く関与するものである。これらの作用を阻害する効果を発揮する、本発明に係る抗体は２型糖尿病の治療剤の有効成分として優れた効果を発揮することが期待される。そして、本発明に係る抗体を、ヒトのみならず生体に投与することによって、２型糖尿病の治療することが期待される。
【００５９】
〔セレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤〕
本発明に係るセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤は、上述の抗体を有効成分として含む。セレノプロテインＰの細胞内への取り込みを阻害する態様には、細胞表面上に存在するセレノプロテインＰを選択的に通過させる機能を有するレセプターを通過させないのみならず、細胞表面に結合する事も阻害する態様も包含する。
【００６０】
本発明に係るセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤における、上述の抗体の含有量は、セレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤１００重量部に対して、通常は０．００１〜１００重量部程度とすればよい。すなわち、上述の抗体そのものを、本発明に係るセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤としてもよい。
【００６１】
本発明に係るセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤の使用対象動物は、生体であればヒトに限らずあらゆる動物個体を対象とできる。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、チンパンジー等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物；その他保護を必要とするあらゆる動物種などが挙げられる。
【００６２】
本発明に係るセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤は、上述の生体から取出した組織及び／又は細胞に対して使用してもよい。具体的な細胞とは、特に限定はされないが、例えば筋芽細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋管細胞等の筋肉細胞、Ｔ細胞等が挙げられる。そして、細胞とは初代培養細胞であっても、不死化された細胞であってもよい。
【００６３】
本発明に係るセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤の使用量は、例えば生体に対して使用する場合、上述の抗体の量に換算して、通常であれば０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ（個体体重）程度の量で使用すればよい。細胞に対して使用する場合も、上述の抗体の量に換算して、通常であれば、１μｇ〜１ｍｇ／ｍｌ（培地）程度の量で使用すればよい。
【００６４】
〔細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤〕
本発明に係るグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤は、上述の抗体を有効成分として含む。誘導抑制には、単にグルタチオンペルオキシダーゼの発現量の抑制のみならず、細胞においてグルタチオンペルオキシダーゼの活性の低下も意味する。
【００６５】
用語、「誘導」とは、グルタチオンペルオキシダーゼの発現誘導することも包含する。
【００６６】
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）とは、還元型グルタチオンを利用して、過酸化水素、過酸化脂質等を基質として、これを水、ヒドロキシ型脂質を生成する酵素である。また、活性中心にセレン含有タンパク質であるセレノシステインを有するタンパク質である。
【００６７】
グルタチオンペルオキシダーゼは、ＧＰｘ１、ＧＰｘ２、ＧＰｘ３、ＧＰｘ４、ＧＰｘ５、ＧＰｘ６、ＧＰｘ７、ＧＰｘ８等の何れにも限定はされないが、好ましくはＧＰｘ１である。
【００６８】
例えば、ＧＰｘ１の具体的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ０７２０３  ＶＥＲＳＩＯＮ  Ｐ０７２０３．４  ＧＩ：３１１０３３４８１として収載されている。より具体的には、配列番号２６に示すものである。
【００６９】
本発明に係るグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤における、上述の抗体の含有量は、グルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤１００重量部に対して、通常は０．００１〜１００重量程度とすればよい。すなわち、上述の抗体そのものを、本発明に係るグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤としてもよい。
【００７０】
本発明に係るグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤の使用対象及び使用量は、上述の同様とすればよい。
【００７１】
〔２型糖尿病の治療薬〕
本発明に係る２型糖尿病の治療薬は、上述の抗体を有効成分として含む。
【００７２】
糖尿病とは、血糖値、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の値が一定の基準値を超えていることを診断基準とする疾患であり、中でも２型糖尿病はインスリンの抵抗性が高い状態、膵臓のランゲルハンス島からのインスリンの分泌能が低下していることを主な原因とする疾患である。この意味で、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン分泌細胞であるβ細胞が死滅することを原因とする１型糖尿病とは区別される。より詳細には、『糖尿病の分類と診断基準に関する委員会報告（国際標準化対応版）』糖尿病  第５５巻７号（２０１２）を参照すればよい。
【００７３】
２型糖尿病治療薬のメトフォルミンは、ＡＭＰＫ／ＦｏｘＯ３ａを介してセレノプロテインＰの発現量を低下させることが知られるので、メトフォルミンがインスリン抵抗性を改善する作用には、セレノプロテインＰ発現量の低下が関与する可能性が考えられる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１４．２８９．３３５−３４５）。
【００７４】
したがって、上述の２型糖尿病の中でも、セレノプロテインＰによってインスリンの抵抗性が高い状態にある２型糖尿病が、本発明に係る治療薬の対象疾患として好ましい。
【００７５】
用語『治療』とは、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）を、部分的又は完全に治癒することを含む。また、上記効果には、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）の進行を阻止又は遅延する効果、病態や症状を緩和する（疾病、症状等の後退、又は進行の逆転を引き起こす）効果、再発を阻止する効果等が含まれる。
【００７６】
また、上記効果には、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）の素因を持ち得るが、まだ持っていると診断されていない個体において、疾病及び／又は疾病に起因する悪影響（病態、症状等）が起こることを部分的又は完全に防止する効果が含まれる。従って、『治療』なる用語には、『緩解』、『再発防止』、『予防』等の意味も含まれる。
【００７７】
本発明に係る２型糖尿病の治療薬における、上述の抗体の含有量は、２型糖尿病の治療薬１００重量部に対して、通常は０．００１〜１００重量程度とすればよい。すなわち、上述の抗体そのものを、本発明に係る２型糖尿病の治療薬としてもよい。
【００７８】
本発明に係る２型糖尿病の治療剤には、薬学分野の組成物を製造する際に使用される薬学的に許容可能な公知の担体又は添加物を配合してもよい。この様な担体或いは添加物の具体例として、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、または甘味料等が挙げられる。
【００７９】
本発明に係る２型糖尿病の治療剤は上述の担体又は配合物を適宜組み合わせてあらゆる剤形とすることができる。具体的には、具体的な剤形としては、輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射剤等の注射剤；腹膜透析用剤、血液透析用剤等を含む透析用剤；口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠、溶解錠等等の錠剤；硬カプセル錠、軟カプセル錠等のカプセル剤；発泡顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤等を含む顆粒剤；散剤；エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤等の経口液剤；シロップ用剤等のシロップ剤；経口ゼリー剤；トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠、ガム剤等の口腔用錠剤；口腔用スプレー剤；口腔用半固形剤；含嗽剤；吸入粉末剤、吸入液剤、吸入エアゾール剤等の吸入剤；眼軟膏剤等の点眼剤；点耳剤；点鼻粉末剤、点鼻液剤等の点鼻剤；坐剤；直腸用半固形剤；注腸剤；膣錠；膣用坐剤；外用散剤等の外用固形剤；リニメント剤、ローション剤等の外用液剤；外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等のスプレー剤；軟膏剤；クリーム剤；ゲル剤；テープ剤、パップ剤等の貼付剤等が挙げられる。
【００８０】
これらの剤形は、第１６改正日本薬局方解説書等の公知の文献に基づいて製造することができる。
【００８１】
本発明に係る２型糖尿病の治療薬の投与対象動物は、上述のセレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤の使用対象とそれぞれ同様とすればよい。
【００８２】
本発明に係る２型糖尿病の治療薬の投与方法は、特に限定されず、上述の投与対象、剤形等を適宜勘案して公知の投与方法を採用すればよい。具体的には、経口、筋肉内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、皮内、腹腔内、鼻腔内、肺内、眼内、腟内、頸部内、直腸内、皮下等へ投与する方法が挙げられる。
【００８３】
本発明に係る２型糖尿病の治療薬の投与量は、投与対象動物がヒトであれば、通常は１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度とすればよく、投与対象動物がマウスであれば、通常は１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度とすればよい。その他の投与対象動物であれば、上述のヒト及びマウスにおける投与量を基に適宜設定することができる。
【００８４】
本発明に係る２型糖尿病の治療薬の投与は、上記の量を一日に一度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２〜３週毎、毎月、隔月または２〜３ヶ月毎でもよい。
【００８５】
〔セレノプロテインの細胞内取り込みを阻害する方法〕
本発明に係るセレノプロテインの細胞内取り込みを阻害する方法は、上述の抗体を生体に投与する工程を含む方法である。
【００８６】
上記〔セレノプロテインＰの細胞内取り込み阻害剤〕に関する各種説明を参照することで、本発明に係るセレノプロテインの細胞内取り込みを阻害する方法が実施できる。
【００８７】
〔細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導を抑制する方法〕
本発明に係る細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導を抑制は、上述の抗体を生体に投与する工程を含む方法である。
【００８８】
上記〔細胞内のグルタチオンペルオキシダーゼの誘導抑制剤〕に関する各種説明を参照することで、本発明に係るセレノプロテインの細胞内取り込みを阻害する方法が実施できる。
【００８９】
〔２型糖尿病の治療方法〕
本発明に係る２型糖尿病の治療方法は、上述の抗体を生体に投与する工程を含む方法である。
【００９０】
上記〔２型糖尿病の治療剤〕に関する各種説明を参照することで、本発明に係る２型糖尿病の治療方法が実施できる。
【実施例】
【００９１】
以下に、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００９２】
＜実験例１：抗体の作製＞
８週齢のメスのＳＤラット（１５０〜２００ｇ）に、ヒト血漿から精製した２５０μｇのセレノプロテインＰ（ＳｅＰ）を免疫付与し、二週間後にリンパ節を回収した。回収したリンパ節とマウス由来のメラノーマを融合させてハイブリドーマを作成し、斯かるハイブリドーマが産生する抗体の中で、ＳｅＰと結合する１１クローンを、ＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングした。
【００９３】
得られた１１クローンが産生する抗ＳｅＰモノクローナル抗体をそれぞれ、ＡＡ３、ＡＢ１、ＡＥ２、ＡＨ５、ＢＤ１、ＢＤ３、ＢＦ２、ＤＨ６、ＤＨ７、ＤＨ９、ＤＣ１２と命名した。
【００９４】
得られた各種抗ＳｅＰモノクローナル抗体のアミノ酸配列を検討した。各種モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。濃度測定後、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成し、Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ  ＧＸＬ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて抗体の可変領域の増幅を行った。増幅したＤＮＡをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから抽出し、ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＡ付加を行った後にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃｌｏｎｉｎｇを行った。単離したＰｌａｓｍｉｄの塩基配列はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＫｉｔとＡＢＩ  ３１００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて特定した。特定された塩基配列をＮＣＢＩが提供しているＩｇＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）で解析することによりＦＲ部位、ＣＤＲ部位を決定した。
【００９５】
各種モノクローナル抗体の可変領域中のＣＤＲ１〜３、ＦＲ１〜３及びＪ領域を図１及び図２に示す。また、各種モノクローナル抗体のアミノ酸及び核酸配列を表１に示す。
【００９６】
【表１】
2015063513.tif 000002
【００９７】
表１中の※について、配列番号５は、Ｎ末端から順にＳＲＨ、配列番号１０は、Ｎ末端から順にＱ  ＱＹ、配列番号１５は、Ｎ末端から順にＱＱＹ、配列番号１９はＮ末端から  順にＣＳＳである。また、表中の§について、「全長」とは、「可変領域」の全てと、一部の定常領域を含む配列である。
【００９８】
＜実験例２：エピトープの探索＞
次いで、１１種類のモノクローナル抗体に関して、ＳｅＰのどの部位をエピトープとするか確認する実験を行った。以下の（１）〜（８）に示す８種類のＣ末端にＥＧＦＰタグを有するＳｅＰ変異体を、ＨＥＫ２９３細胞を用いて発現させた。
【００９９】
ＳｅＰ変異体
（１）は示す変異体は、ＳｅＰの６０〜２９９番目のアミノ酸配列を含む。
（２）に示す変異体は、ＳｅＰの６０〜１０７番目のアミノ酸配列を含む。
（３）に示す変異体は、ＳｅＰの１０８〜１５５番目のアミノ酸配列を含む。
（４）に示す変異体は、ＳｅＰの１５６〜２０３番目のアミノ酸配列を含む。
（５）に示す変異体は、ＳｅＰの１５６〜２１７番目のアミノ酸配列を含む。
（６）に示す変異体は、ＳｅＰの２０４〜２５４のアミノ酸配列を含む。
（７）に示す変異体は、ＳｅＰの２０４〜２６１のアミノ酸配列を含む。
（８）に示す変異体は、ＳｅＰの２６２〜２９９番目のアミノ酸配列を含む。
【０１００】
なお、２０４番目〜２１７番目及び２４４番目〜２４９番目のアミノ酸配列はヒスチジンリッチ領域であり、２５４番目〜２５５番目及び２６１〜２６２番目のアミノ酸配列は、カリクレイン認識サイトである。また、上記の各種ＳｅＰ変異体はＧＦＰタグを含んでいる。
【０１０１】
各種ＳｅＰ変異体コードするプラスミドを作成し、これをＨＥＫ２９３細胞に導入して発現させた。次いで、斯かる細胞を溶解させ、その細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、次いでウエスタンブロッティングに供した。使用した抗体は、上述の１１個のモノクローナル抗体であり、二次抗体にはＨＰＲ結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。また、発現の確認には抗ＧＦＰ抗体を用いた。ウエスタンブロッティングの結果を図３〜図４に示す。
【０１０２】
以上の結果から、上述のモノクローナル抗体は、ＳｅＰの２０４〜２６１、詳細には２０４〜２５４番目、さらに詳細には２０４〜２１７番目のアミノ酸配列をエピトープとすることが強く示唆された。
【０１０３】
＜実験例３：細胞内へのＳｅＰ取り込み阻害実験・ＧＰｘ誘導阻害実験＞
セレノプロテインＰ及び上述の各種モノクローナル抗体をそれぞれ終濃度が０．５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌとなるように０．５％非働化処理ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地中で混合し、室温で２時間反応させた。
【０１０４】
これを筋肉細胞に分化誘導させたＣ２Ｃ１２細胞の培養培地（０．５％非働化処理ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地）にそのまま添加して、３７℃で２４時間培養を行った。
【０１０５】
次いで、培養後のＣ２Ｃ１２細胞を回収し、この細胞の溶解液をウエスタンブロッティングに供して、細胞内のＳｅＰ及びＧＰｘ１の量を確認した。用いた抗体はそれぞれ上述の各種抗ＳｅＰモノクローナル抗体及び抗ＧＰｘ１抗体（ａｂ２２６０４（アブカム社）Ａｎｔｉ−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  １  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。また、内部コントロールとして、抗βアクチン抗体（Ｋ４８００（シグマ社）ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いてβアクチンの発現量を検討した。結果を図５〜図８に示す。
【０１０６】
図中のＳｅＰは全長のＳｅＰを示し、Ｎ−ＳｅＰは全長ＳｅＰをカリクレイン処理して得られるＮ末端側の断片（２５４番目以降）を示す。各種モノクローナル抗体の中でも、ＡＥ２、ＡＡ３、及びＢＤ１はＣ２Ｃ１２細胞内へのＳｅＰ取り込みが阻害されることを示すことが明らかとなった。また、これらの抗体では、Ｃ２Ｃ１２細胞内のＧＰｘ１の量が少なくなることも明らかとなった。従って、上記３種類のモノクローナル抗体は、細胞内のＧＰｘ１の誘導を阻害することが強く示唆された。
【０１０７】
次いで、ＳｅＰの濃度を１０μｇ／ｍＬと、２型糖尿病患者の血中濃度と同様の高濃度として、上述と同様の実験を行った。抗ＳｅＰ抗体はＡＥ２を用いた。結果を図９に示す。この結果、ＡＥ３は１０μｇ／ｍＬもの高い濃度のＳｅＰであっても、十分にＳｅＰの細胞内の取り込みも、細胞内でのＧＰｘ１の誘導も阻害することが明らかとなった。これは、少なくともＡＥ２抗体が、２型糖尿病の治療効果を発揮することを強く示唆している。
【０１０８】
さらに、細胞をＪｕｒｋａｔ細胞に代え、ＳｅＰの濃度を２７０ｎｇ／ｍＬ、とし、室温で１時間反応させたものを、Ｓｅ欠乏無血清培地で培養する上記Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加した。引き続き３７℃で１２時間培養後に、細胞を回収し、細胞内のＳｅＰ及びＧＰｘ１の量をウエスタンブロッティングに供した。結果を図１０に示す。
【０１０９】
この結果、ＤＣ１２及びＡＥ２は、上記Ｃ２Ｃ１２細胞の場合と同様に共に細胞内へのＳｅＰの取り込みを阻害することが明らかとなった。
【０１１０】
〔インビボ実験〕
ＡＥ２を５ｍｇ／ｋｇの濃度でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢、雌に投与し、その後１、３、６、１２、２４時間後の血中での濃度を測定した。測定方法は、直接ＥＬＩＳＡ法に基づいて行った。また、投与方法は腹腔内投与と眼静脈投与の２種類の投与方法を試みた。結果を図１１に示す。
【０１１１】
図１１に示すように、ＩＰ（腹腔内投与）であっても、ＩＶ（眼静脈投与）であっても、同様の血中濃度パターンを示し、共に投与から２４時間後もＡＥ２は血中に存在することが明らかとなった。
【０１１２】
次いで、ＳｅＰによるインスリン抵抗性の誘導をＡＥ２が阻害するかどうかを確認する実験を行った。先ず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢、雌）マウスにＡＥ２を１０ｍｇ／ｋｇの量の濃度で腹腔内投与し、２時間後に絶食環境下におくと共に１ｍｇ／ｋｇの量濃度でＳｅＰを腹腔内投与した。用いたＳｅＰは上述の全長のＳｅＰである。Ｓｅｐの投与から１０時間後に再度同量のＳｅＰを投与し、その２時間後に糖負荷行った。糖負荷は、マウスに１．５ｇ／ｋｇとなる量でグルコースを投与した。
【０１１３】
そして、糖負荷後の血中グルコース濃度を測定した。なお、コントロールとして、ＳｅＰを加えなかった実験群及びＡＥ２に代えてコントロール抗体であるラットＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇの量を投与した実験群を用意した。結果を図１２及び図１３に示す。
【０１１４】
図１２（Ａ）に示すように、ＳｅＰ非投与群ではＡＥ２の投与、コントロール抗体の投与の間で糖負荷をかけても顕著な差は見られなかったが、ＳｅＰを投与してインスリン抵抗性が誘導されたマウス個体に糖負荷をかけた場合、ＡＥ２はコントロール抗体と比べて血中グルコース濃度を減少させることが明らかとなった。このような結果は、図１３に示す図１２の（Ａ）及び（Ｂ）のグラフから算出されたＡＵＣ値からも明らかである。これらの結果から、ＡＥ２はＳｅＰ誘導性のインスリン抵抗性を改善し、血糖値を下げる効果を発揮することが明らかとなった。従って、２型糖尿病の治療薬としてＡＥ２が有用であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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