(57)【要約】【課題】ツキヨタケおよびこの近縁種を迅速かつ正確に同定できるきのこの同定方法および同定キットを提供する。【解決手段】きのこの同定方法は、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素で、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、前記切断工程で切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素で、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、
前記切断工程で切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、
を含むきのこの同定方法。
【請求項２】
前記制限酵素は、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩまたはＳｆｃＩである、
請求項１に記載のきのこの同定方法。
【請求項３】
前記切断工程では、前記Ｓａｕ９６Ｉが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から２７０〜５９０番目の塩基の範囲内にある塩基配列を認識して切断し、
前記同定工程では、前記Ｓａｕ９６Ｉが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する、
請求項２に記載のきのこの同定方法。
【請求項４】
前記切断工程では、前記Ｂｐｕ１０Ｉが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から５６０〜５９０番目の塩基の範囲内にある塩基配列を認識して切断し、
前記同定工程では、前記Ｂｐｕ１０Ｉが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する、
請求項２または３に記載のきのこの同定方法。
【請求項５】
前記切断工程では、前記ＳｆｃＩが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から１４０〜１７０番目の塩基の範囲内にある塩基配列を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＳｆｃＩが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこれらの近縁種を同定する、
請求項２から４のいずれか１項に記載のきのこの同定方法。
【請求項６】
前記ツキヨタケおよびこの近縁種は、ツキヨタケ（Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ）属のきのこである、
請求項１から５のいずれか１項に記載のきのこの同定方法。
【請求項７】
前記同定工程では、前記切断工程で切断されたＤＮＡを電気泳動する、
請求項１から６のいずれか１項に記載のきのこの同定方法。
【請求項８】
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する増幅工程をさらに含み、
前記切断工程では、前記増幅工程で増幅されたＰＣＲ産物を切断する、
請求項１から７のいずれか１項に記載のきのこの同定方法。
【請求項９】
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する増幅工程と、
前記増幅工程で増幅されたＰＣＲ産物に結合するプローブを用いて前記ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、
を含むきのこの同定方法。
【請求項１０】
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩの少なくとも１つ、
を備えるツキヨタケおよびこの近縁種同定用の同定キット。
【請求項１１】
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーをさらに備える、
請求項１０に記載の同定キット。
【請求項１２】
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーと、
前記プライマーで増幅されたＰＣＲ産物に結合するプローブと、
を備えるツキヨタケおよびこの近縁種同定用の同定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、きのこの同定方法および同定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
きのこを原因とする食中毒の多くは、食用きのこと勘違いすることによる誤食で発生する。ツキヨタケ（Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ  ｇｕｅｐｉｎｉｆｏｒｍｉｓ、あるいはＯｍｐｈａｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓともいう）は、クサウラベニタケとともに、日本国内で食中毒の事例が最も多いきのこの一つである。ツキヨタケおよびクサウラベニタケが原因の食中毒は、きのこによる食中毒全体の大部分を占める。
【０００３】
ツキヨタケは、食用きのこであるシイタケ、ヒラタケおよびムキタケなどと間違えられやすい。ツキヨタケの形態的特徴として、かさが紫褐色または黄褐色であること、短い柄で付け根につば状の突起があること、および柄を裂くと黒いシミがあること、が挙げられる。しかし、ツキヨタケには、黒いシミがないもの、または黒いシミが不鮮明なものがある。このように、ツキヨタケを形態的に確実に判別できないうえ、ツキヨタケはムキタケの群生の中に生えていることもあるので誤食が多い。
【０００４】
また、ツキヨタケを誤食してしまい、食中毒が疑われる患者が発生した場合、迅速に適切な治療をする必要がある。そのためには原因となった毒きのこであるツキヨタケを正確に同定することが重要である。
【０００５】
ツキヨタケが原因となる食中毒被害を防止するため、さらには、ツキヨタケを原因とする中毒を迅速かつ適切に治療するために、形態学的な判別に依存しない検査法の開発が急務となっている。特に、食中毒被害を防ぐためには、きのこの採取から調理までの間に迅速かつ正確に判別する方法が必要である。
【０００６】
毒きのこであるクサウラベニタケを同定する方法として、特許文献１には、クサウラベニタケのリボソームＲＮＡ遺伝子の一部を含むＤＮＡに特異的に反応するプライマーを用いる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１９４０１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に開示される同定方法では、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の公的なデータベースに公開されているクサウラベニタケのＤＮＡに特異的に反応するプライマーを用いている。しかしながら、ツキヨタケの判別に特許文献１に開示される同定方法を応用しても、ＤＮＡ塩基配列が異なり、毒性を有する変種（近縁種）を同定することはできない。このため、ＤＮＡが公的に公開されているツキヨタケだけではなく、ツキヨタケの近縁種をも同定するための新たな方法が求められている。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ツキヨタケおよびこの近縁種を迅速かつ正確に同定できるきのこの同定方法および同定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るきのこの同定方法は、
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素で、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、
前記切断工程で切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、前記ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、
を含む。
【００１１】
この場合、前記制限酵素は、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩまたはＳｆｃＩである、
こととしてもよい。
【００１２】
また、前記切断工程では、前記Ｓａｕ９６Ｉが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から２７０〜５９０番目の塩基の範囲内にある塩基配列を認識して切断し、
前記同定工程では、前記Ｓａｕ９６Ｉが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記切断工程では、前記Ｂｐｕ１０Ｉが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から５６０〜５９０番目の塩基の範囲内にある塩基配列を認識して切断し、
前記同定工程では、前記Ｂｐｕ１０Ｉが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する、
こととしてもよい。
【００１４】
また、前記切断工程では、前記ＳｆｃＩが、前記ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から１４０〜１７０番目の塩基の範囲内にある塩基配列を認識して切断し、
前記同定工程では、前記ＳｆｃＩが切断したＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこれらの近縁種を同定する、
こととしてもよい。
【００１５】
また、前記ツキヨタケおよびこの近縁種は、ツキヨタケ（Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ）属のきのこである、
こととしてもよい。
【００１６】
また、前記同定工程では、前記切断工程で切断されたＤＮＡを電気泳動する、
こととしてもよい。
【００１７】
また、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する増幅工程をさらに含み、
前記切断工程では、前記増幅工程で増幅されたＰＣＲ産物を切断する、
こととしてもよい。
【００１８】
本発明の第２の観点に係るきのこの同定方法は、
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する増幅工程と、
前記増幅工程で増幅されたＰＣＲ産物に結合するプローブを用いて前記ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、
を含む。
【００１９】
本発明の第３の観点に係るツキヨタケおよびこの近縁種同定用の同定キットは、
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩの少なくとも１つ、
を備える。
【００２０】
この場合、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーをさらに備える、
こととしてもよい。
【００２１】
本発明の第４の観点に係るツキヨタケおよびこの近縁種同定用の同定キットは、
ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーと、
前記プライマーで増幅されたＰＣＲ産物に結合するプローブと、
を備える。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ツキヨタケおよびこの近縁種を迅速かつ正確に同定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ゲノムＤＮＡ上でリボソームＲＮＡをコードする領域を示す図である。
【図２Ａ】ダイレクトシークエンスの結果を示す図（その１）である。
【図２Ｂ】ダイレクトシークエンスの結果を示す図（その２）である。
【図２Ｃ】ダイレクトシークエンスの結果を示す図（その３）である。
【図２Ｄ】ダイレクトシークエンスの結果を示す図（その４）である。
【図２Ｅ】ダイレクトシークエンスの結果を示す図（その５）である。
【図３】制限酵素Ｓａｕ９６ＩでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図４】制限酵素Ｂｐｕ１０ＩでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図５】制限酵素ＳｆｃＩでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図６】制限酵素Ｓａｕ９６Ｉが切断した塩基の位置を示す図である。
【図７】制限酵素Ｂｐｕ１０Ｉが切断した塩基の位置を示す図である。
【図８】制限酵素ＳｆｃＩが切断した塩基の位置を示す図である。
【図９】制限酵素Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩでダイジェストしたＤＮＡを電気泳動した結果を示す図である。
【図１０Ａ】ツキヨタケ由来のサンプルに対するリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図１０Ｂ】食用きのこ由来のサンプルに対するリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。
【００２５】
（実施の形態１）
本実施の形態に係るきのこの同定方法は、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素で、当該塩基配列に対応する領域を含むＤＮＡを切断する切断工程と、切断工程で切断されたＤＮＡの塩基配列の長さの違いに基づいて、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、を含む。
【００２６】
まず、切断工程について説明する。「近縁種」とは、ツキヨタケに形態が類似しているツキヨタケ（Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ）属のきのこであり、ＮＣＢＩのデータベースに公開されていない塩基配列からなるツキヨタケ属のきのこを含む。
【００２７】
ｒＤＮＡ（核ｒＤＮＡ）は、核リボソームＲＮＡをコードする遺伝子である。図１は、ゲノムＤＮＡ上でリボソームＲＮＡをコードする領域を示す図である。図１に示すｒＤＮＡのＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ）１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域は約８００塩基対からなる。
【００２８】
ＤＮＡは、ツキヨタケおよびこの近縁種から抽出される。ＤＮＡを抽出するきのこは、日本の野山に自生しているきのこに限定されず、世界各地に自生しているきのこも含まれる。また、同定するきのこは、生のきのこに限定されず、冷凍きのこ、乾燥きのこ、および、裁断されたきのこ、加熱調理されたきのこなど任意である。きのこからＤＮＡを抽出する方法は、通常公知の方法が使用できる。具体的には、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、タカラバイオ社製など）により、このきのこ由来の試料からＤＮＡを抽出する。
【００２９】
切断工程で切断するＤＮＡを効率よく得るために、本実施の形態に係る同定方法は、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する増幅工程をさらに含む。
【００３０】
ＰＣＲ法に用いるプライマーは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域を増幅し得るものであれば任意である。プライマーの塩基長としては１０塩基以上が好ましく、１５塩基以上がさらに好ましい。また、各プライマーは、単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。ＰＣＲにおけるプライマーの例として、配列表の配列番号１、２に示す塩基配列のプライマーが挙げられる。プライマーは、特に限定されず、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部を増幅できるプライマーであれば任意である。
【００３１】
ＰＣＲ増幅されたＰＣＲ産物の長さは選択したプライマーによって規定される。ＰＣＲ産物の長さは、１０塩基対から１０００塩基対、電気泳動および観察のしやすさから特に１００塩基対から７００塩基対が好ましい。
【００３２】
ＤＮＡを増幅する方法は、ＰＣＲ法に限らず他の方法が使用できる。具体的には、リアルタイムＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ）法およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法などの通常公知の方法を用いることもできる。
【００３３】
切断工程では、例えば、ＰＣＲ増幅されたＰＣＲ産物に制限酵素を添加してＰＣＲ産物を切断（ダイジェスト）する。制限酵素は、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識し、認識した塩基配列の部位を切断する。添加する制限酵素としては、具体的には、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩが挙げられる。これら制限酵素に認識される塩基配列を含むＰＣＲ産物を、それぞれの制限酵素で処理することによって、制限酵素に認識される塩基配列の位置を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。
【００３４】
Ｓａｕ９６Ｉは、ツキヨタケ、ヒラタケならびにムキタケ、およびこれらの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列を認識し、ＤＮＡを切断する。具体的には、Ｓａｕ９６Ｉは、ツキヨタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から２７０〜５９０番目の塩基の範囲内にある塩基（２８６番目の塩基、５７３番目の塩基）を切断する。Ｓａｕ９６Ｉは、ヒラタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から２４０〜２７０番目の塩基の範囲内にある塩基（２５４番目の塩基）を切断する。また、Ｓａｕ９６Ｉは、ムキタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から１９０〜６２０番目の塩基の範囲内にある塩基（２０５番目の塩基、６００番目の塩基）を切断する。一方、Ｓａｕ９６Ｉは、シイタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列は認識せず切断しない。このため、Ｓａｕ９６Ｉは、ツキヨタケ、ヒラタケおよびムキタケ、およびこれらの近縁種を同定するための制限酵素として用いることができる。
【００３５】
Ｂｐｕ１０Ｉは、ツキヨタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の塩基を認識し、ＤＮＡを切断する。具体的には、Ｂｐｕ１０Ｉは、ツキヨタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から５６０〜５９０番目の塩基の範囲内にある塩基（５７６番目の塩基）を切断する。一方、Ｂｐｕ１０Ｉは、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケおよびこれらの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列は認識せず切断しない。このため、Ｂｐｕ１０Ｉは、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定するための制限酵素として用いることができる。
【００３６】
ＳｆｃＩは、ツキヨタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の塩基を認識し、ＤＮＡを切断する。具体的には、ＳｆｃＩは、ツキヨタケおよびこの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から１４０〜１７０番目の塩基の範囲内にある塩基（１５８番目の塩基）を切断する。一方、ＳｆｃＩは、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケ、およびこれらの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列は認識せず切断しない。このため、ＳｆｃＩは、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定するための制限酵素として用いることができる。
【００３７】
制限酵素は、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩに限定されず、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列を認識し、ＤＮＡを切断できる制限酵素であれば任意である。また、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を制限酵素処理に用いることにより、５〜１５分程度の短時間でＤＮＡを切断することができる。なお、短時間でＤＮＡを切断する制限酵素は、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社などからも入手できる。
【００３８】
制限酵素の反応時間・温度に制限はないが、一般的には３７℃で３時間から一晩反応させる。反応バッファーも制限はないが、市販の酵素に添付されるものを用いるのが通常である。反応条件（温度、時間等）は、ＤＮＡ含有量、並びに、制限酵素の種類および量によって変化するものであり、上記の値に限定されるものではない。
【００３９】
次に、同定工程について説明する。同定工程では、例えば、切断工程で切断されたＤＮＡを電気泳動する。電気泳動は、通常公知の方法で行うことができる。電気泳動後のバンドの有無、あるいはバンドの移動度の差から、ツキヨタケ、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケ、およびこれらの近縁種を同定する。きのこの種類が同定されれば、同定したきのこが食用であるか毒性を有するのか（食毒）を判定できる。
【００４０】
より詳細には、ツキヨタケおよびこの近縁種に関して、Ｓａｕ９６Ｉで切断したＰＣＲ産物を電気泳動すると、２９０塩基対付近に２本のバンドおよび２３０塩基対付近に１本のバンドが得られる。また、ヒラタケおよびこの近縁種に関して、Ｓａｕ９６Ｉで切断したＰＣＲ産物を電気泳動すると、２５０塩基対および４７０塩基対付近にバンドが得られる。さらに、ムキタケおよびこの近縁種に関して、Ｓａｕ９６Ｉで切断したＰＣＲ産物を電気泳動すると、１６０塩基対、２００塩基対および４００塩基対付近にバンドが得られる。このため、Ｓａｕ９６Ｉで切断したＰＣＲ産物の電気泳動のバンド位置から、ツキヨタケ、ヒラタケ、ムキタケおよびこれら近縁種を同定できる。そして、ツキヨタケは毒性のあるきのこであり、ヒラタケおよびムキタケは食用のきのこであるため、きのこの食毒の判定も行うことができる。
【００４１】
ツキヨタケおよびこの近縁種に関して、Ｂｐｕ１０Ｉで切断したＰＣＲ産物を電気泳動すると、２２０塩基対付近および５８０塩基対付近にバンドが得られる。一方、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケおよびこれらの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域は、Ｂｐｕ１０Ｉで切断されない。したがって、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定することができる。さらに、きのこの食毒の判定も行うことができる。
【００４２】
ツキヨタケおよびこの近縁種に関して、ＳｆｃＩで切断したＰＣＲ産物を電気泳動すると、１６０塩基対付近および６４０塩基対にバンドが得られる。一方、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケおよびこれらの近縁種のＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域は、ＳｆｃＩで切断されない。このため、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定することができる。さらに、きのこの食毒の判定も行うことができる。
【００４３】
電気泳動の方法は、スラブゲル型、サブマリン型、キャピラリーなど核酸が電気的に分離できるものであればいずれの方法を用いてもよい。ゲルの材料についてもアガロースやアクリルアミドなどが一般的であるが、特に制限はない。ＤＮＡ断片の検出は電気的、紫外線吸収、染色など種々の方法を用いることができる。また、電気泳動は、通常のアガロースのほか、マイクロチップ電気泳動装置を用いることもできる。例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いることにより、アガロースを用いた場合より短時間で、高分解能でＰＣＲ産物を電気泳動することができる。
【００４４】
以上説明したように、本実施の形態に係るきのこの同定方法によれば、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、短時間で、きのこを同定することができる。さらに、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定できるので、きのこの食毒判定を行うこともできる。
【００４５】
なお、ＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で切断した際の長さの違いによってＤＮＡの塩基配列の構造多型を見出す上記の方法は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）として知られている。
【００４６】
また、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーは、例えばＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から４５０〜７００番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーであってもよい。当該プライマーで増幅される領域には、Ｂｐｕ１０Ｉで切断される塩基配列が、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケおよびこれらの近縁種にはなく、ツキヨタケおよびこの近縁種のみにある。このため、当該プライマーによるＰＣＲ産物に対してＢｐｕ１０Ｉを用いることで、ツキヨタケおよびこの近縁種を効率よく同定できる。
【００４７】
また、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーは、例えばＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域における塩基配列の５’側から１００〜３００番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーであってもよい。当該プライマーで増幅される領域には、ＳｆｃＩで切断される塩基配列が、シイタケ、ヒラタケならびにムキタケおよびこれらの近縁種にはなく、ツキヨタケおよびこの近縁種のみにある。このため、当該プライマーによるＰＣＲ産物に対してＳｆｃＩを用いることで、ツキヨタケおよびこの近縁種を効率よく同定できる。
【００４８】
（実施の形態２）
本実施の形態におけるきのこの同定方法は、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する増幅工程と、増幅工程で増幅されたＰＣＲ産物に結合するプローブを用いてツキヨタケおよびこの近縁種を同定する同定工程と、を含む。
【００４９】
増幅工程は、上記実施の形態１と同様である。同定工程で用いるプローブとは、核酸の相補性に基づいたハイブリダイゼーションを利用して核酸またはその塩基配列中の特定の部位について解析するための核酸の断片をいう。プローブは、例えば、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の連続する少なくとも１０塩基対以上、好ましくは１０〜１００塩基対、より好ましくは、１０〜５０塩基対のＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００５０】
プローブは、ツキヨタケおよびこの近縁種に特有の塩基配列からなる領域を含むＰＣＲ産物に特異的に結合するものが好ましい。特異的に結合するとは、プローブが、特定の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするが、当該塩基配列を有していないＤＮＡにはハイブリダイズしないことをいう。ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内のツキヨタケおよびこの近縁種に特有の塩基配列を標的としてプライマーを設計することで、当該プライマーは標的とする塩基配列を有するＤＮＡに特異的にハイブリダイズする。プローブは、配列表の配列番号３に示されるものが好ましい。プローブを蛍光物質または放射性物質で標識することで、ＰＣＲ産物を定量できる。
【００５１】
一例としてリアルタイムＰＣＲ法を利用して、増幅工程および同定工程を同時に行ってもよい。リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、上述のように、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅する。ここでのプライマーとしては、配列表の配列番号４、５に示すプライマーが挙げられるが、これらのプライマーに限定されず、ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅できるプライマーであれば任意である。
【００５２】
リアルタイムＰＣＲにおけるハイブリダイゼーションの条件は、標的の塩基配列を区別するのに十分な条件であればよい。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、プローブが、ある一定温度条件で標的の塩基配列のＤＮＡとはハイブリダイズするが、標的の塩基配列ではないＤＮＡとはハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。例えば、プライマーのアニーリング温度より１０度高い温度、である。他の一般的なハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）等に基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
【００５３】
リアルタイムＰＣＲ法を適用する場合、例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）等を用いて、蛍光強度を測定することで、ＰＣＲのサイクル数に応じて、ツキヨタケに特有のパターンが得られる。こうすることで、試料内のツキヨタケを同定でき、食毒も判定できる。
【００５４】
以上説明したように、本同定方法によれば、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、迅速に、ツキヨタケを同定することができる。
【００５５】
（実施の形態３）
本実施の形態に係る同定キットは、上記実施の形態１に記載の同定方法によって、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定するためのキットである。当該同定キットは、ツキヨタケのｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域内の塩基配列を認識する制限酵素Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩの少なくとも１つを備える。同定キットの形態として、例えば、上述したプライマー、およびプライマーを用いる際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。また、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩またはマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類をキット化することもできる。
【００５６】
同定キットは、通常公知の方法で使用する。具体的には、同定するきのこを洗浄後に、フェノール法或いは市販の核酸抽出用のキット（ＱＩＡＧＥＮ社製、タカラバイオ社製など）により、きのこ由来の試料からＤＮＡを抽出する。抽出したＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、同定キットが備える制限酵素で処理することによって、制限酵素に認識される塩基配列の位置を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出する。そして、バンドの移動度の差に基づいて、ツキヨタケを同定する。
【００５７】
以上説明したように、本実施の形態に係る同定キットを用いて制限酵素に認識される塩基配列を検出することにより、煩雑なシークエンス解析することなく簡便な操作で、短時間で、きのこを同定することができる。
【００５８】
なお、本同定キットは、上記実施の形態１と同様に、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーをさらに備えてもよい。
【００５９】
（実施の形態４）
本実施の形態に係る同定キットは、ＰＣＲ法を用いて、ツキヨタケおよびこの近縁種を同定するキットである。同定キットは、ツキヨタケおよびこの近縁種のｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の全長または一部をＰＣＲ増幅するためのプライマーと、当該プライマーで増幅されたＰＣＲ産物に結合するプローブと、を備える。同定キットは、緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩またはマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類を備えていてもよい。
【００６０】
本同定キットを用いることで、ＰＣＲ法を用いたきのこの同定方法を簡便に行うことができる。
【００６１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１：きのこの同定）
使用する制限酵素を選定するために、ツキヨタケおよび食用きのこであるシイタケ、ムキタケ、ヒラタケの核リボソームＲＮＡをコードする遺伝子ｒＤＮＡのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基配列を以下のように決定した。
【００６３】
国内より広く収集したツキヨタケおよび食用きのこから２１サンプルを採取した。各サンプルを滅菌蒸留水でよく洗浄し、湿重量で１００ｇから５００ｇの試料を採取し、マイクロ乳棒（エッペンドルフ製）でホモジナイズした後に、ＡＰ１  ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅ  Ａを加えて１０分間、６５℃でインキュベートした。次に、ＡＰ２  ｂｕｆｆｅｒを添加して、よく混合後氷上に１０分間置いた。１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに負荷し、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた溶出液の１．５倍量のＡＰ３／Ｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、ＤＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに負荷した。ＡＷ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＡＥ  ｂｕｆｆｅｒでＤＮＡを溶出した。そして、分離した各サンプルのＤＮＡをダイレクトシークエンスした。
【００６４】
図２Ａ〜図２Ｅは、２１サンプルの塩基配列をダイレクトシークエンスした結果を示す図である。同図に示す、「Ｓｈｉｉ−」で始まるサンプル名はシイタケを、「Ｔｕｋｉｙｏ」または「Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ」で始まるサンプル名はツキヨタケを、「Ｍｕｋｉ」で始まるサンプル名はムキタケを、「Ｈｉｒａ」で始まるサンプル名はヒラタケを示す。同図に示す「Ｓｈｉｉ−ＨｏｋｋａＲ」から「Ｈｉｒａ−１９４９３ｒ」までの塩基配列は、配列表の配列番号６〜２６に示す塩基配列にそれぞれ該当する。
【００６５】
ツキヨタケの８サンプル、シイタケの５サンプル、ヒラタケの４サンプルおよびムキタケの５サンプルにおけるＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基配列を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて解析することにより、きのこの同定を行った。
【００６６】
採取したきのこを、湿重量の場合には１００ｍｇ以上、凍結乾燥の場合には２０ｍｇ以上マイクロチューブに取った。マイクロチューブに取った各サンプルに、４００μｌのサンプル懸濁バッファーＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を添加し、底部を高速旋回して内容液を撹拌（ボルテックス）した。これらを、１００℃で１０分間処理し、１３０００×ｇで２分間遠心して上清をとり、ＰＣＲのテンプレートとした。そして、ＰＣＲチューブに、５０μｌ反応系において、２×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓ  ２５μｌ、ＢＩＯＴＡＱ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、１０μＭ  ５’−Ｐｒｉｍｅｒ  ２．５μｌ、１０μＭ  ３’−Ｐｒｉｍｅｒ  ２．５μｌ、テンプレート  １μｌ、蒸留水  １８．７５μｌを添加して、調製した。調製したＰＣＲチューブにおいて、ＰＣＲ装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ製ｉＣｙｃｌｅｒ  １７０−８７２０ＪＡ、９６ウェル×０．２ｍｌリアクションモジュール）、ＰＣＲ試薬Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓ（島津製作所製）、ＰＣＲ用酵素ＢＩＯＴＡＱ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＣＲ用バッファー２×Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓを用いて、９５℃で３分間を１サイクル、次に９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして４５サイクル、その後４℃で保持するＰＣＲ増幅を行った。なお、５’−Ｐｒｉｍｅｒおよび３’−Ｐｒｉｍｅｒ（ＦＡＳＭＡＣ製）の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号１、２に示す。
【００６７】
次に、ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を精製しないまま、制限酵素（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ製）で処理をした。未精製ＰＣＲ産物１μｇにつき制限酵素１０ユニット以上使用した。ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）の制限酵素であるＳａｕ９６Ｉ（ダイジェスト条件：３７℃、１５分間）、Ｂｐｕ１０Ｉ（ダイジェスト条件：３７℃、１５分間）、ＳｆｃＩ（ダイジェスト条件：３７℃、１５分間）の３つを用いて、各々ダイジェストした。
【００６８】
次に、各制限酵素でダイジェストしたＰＣＲ産物を電気泳動した。低電気浸透高ゲル強度の微粉末アガロース（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ製）に、バッファーｎａｃａｒａｉ  ｔｅｓｑｕｅ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０×）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｅｓｔｅｄ  ［ＴＡＥ  Ｂｕｆｆｅｒ］（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ製）を添加することにより作成した３％アガロースゲルに、６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ  （ニッポン・ジーン製）を添加し、泳動装置（ＡＤＶＡＮＣＥ製Ｍｕｐｉｄ  ２−ｐｌｕｓ）を用いてゲルを電気泳動した。そして、ゲルの泳動後、エチジウムブロマイドにて３０分間染色した後、アガロースゲル撮影装置Ｄｉａｎａ−ＩＩＩ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｒａｙｔｅｓｔ製）でゲルを撮影した。その撮影した泳動パターンに基づいてきのこの同定を行った。
【００６９】
図３〜図５は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において、制限酵素Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩでそれぞれダイジェストしたＤＮＡの電気泳動の結果を示す図である。図３に示すように、Ｓａｕ９６Ｉでダイジェストすることによりツキヨタケを検出することができた。また、ヒラタケおよびムキタケにもそれぞれに対応するバンドパターンが見られた。このため、Ｓａｕ９６Ｉでダイジェストすることで、ヒラタケおよびムキタケを識別することができた。
【００７０】
図４に示すように、Ｂｐｕ１０Ｉでダイジェストすることにより、ツキヨタケ特有のバンドパターンが得られ、ツキヨタケを検出することができた。また、図５に示すように、ＳｆｃＩでダイジェストすることにより、ツキヨタケ特有のバンドパターンが得られ、ツキヨタケを検出することができた。これらの結果から、３種類の制限酵素処理のいずれでも毒性のあるツキヨタケの判別が可能である。
【００７１】
図６に示すように、Ｓａｕ９６Ｉは、ツキヨタケの２８６番目および５７３番目、ヒラタケの２５４番目、ムキタケの２０５番目および６００番目の塩基を切断する。一方で、Ｓａｕ９６Ｉは、シイタケケでは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基は切断されない。したがって、Ｓａｕ９６Ｉでダイジェストして生成した断片の長さに基づいて、ツキヨタケ、ヒラタケおよびムキタケをそれぞれ同定できる。
【００７２】
また、図７に示すように、Ｂｐｕ１０Ｉは、ツキヨタケの５７６番目の塩基を切断するが、シイタケ、ヒラタケおよびムキタケではＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基を切断しない。したがって、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いてツキヨタケおよびこの近縁種を同定できることが明らかとなった。また、図８に示すように、ＳｆｃＩは、ツキヨタケの１５８番目の塩基を切断するが、シイタケ、ヒラタケおよびムキタケではＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基を切断しない。このため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いてツキヨタケ、ヒラタケおよびムキタケおよびこれらの近縁種を同定できる。
【００７３】
以上の結果から、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて、制限酵素Ｓａｕ９６Ｉでダイジェストした塩基配列を解析することにより、ツキヨタケ、ヒラタケ、ムキタケ、およびこれらの近縁種を分類でき、さらに、きのこの食毒判定を行うことができる。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて解析することにより、煩雑で時間のかかるシークエンス解析を行うことなく、簡便な操作で、短時間で、きのこの同定およびきのこの食毒判定を行うことができる。
【００７４】
（実施例２：市販食用きのことの比較）
複数の市販食用きのこに対しても、上記実施例１の方法を用いて毒きのこを判定できることを確認した。
【００７５】
サンプルとして、それぞれ湿重量で０．１ｇのツキヨタケ、シイタケ、ブナシメジ、マッシュルーム（白および茶）、ナメコ、エノキ、エリンギ、およびマイタケを、バイオマッシャーＩＩ（ニッピ製）を用いて、それぞれホモジナイズしたものを用いた。
【００７６】
図９は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において、制限酵素Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩおよびＳｆｃＩでダイジェストしたＤＮＡの電気泳動の結果を示す図である。Ｓａｕ９６Ｉでシイタケ、マッシュルームおよびナメコは、ＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基が切断されなかったが、ツキヨタケに加え、ブナシメジ、エノキ、エリンギおよびマイタケではＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基が切断された。ツキヨタケのバンドパターンは、塩基が切断されたブナシメジ、エノキ、エリンギおよびマイタケのすべてと異なるため、ツキヨタケを同定することができた。
【００７７】
Ｂｐｕ１０Ｉでは、ツキヨタケを除く、シイタケ、ブナシメジ、マッシュルーム、ナメコ、エノキ、エリンギおよびマイタケのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基が切断されなかった。複数のバンドが現れるのは、ツキヨタケのみなので、ツキヨタケを同定することができた。
【００７８】
ＳｆｃＩでは、シイタケ、ブナシメジ、マッシュルーム、ナメコ、エリンギのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基が切断されなかったが、ツキヨタケ、エノキ、マイタケのＩＴＳ１−５．８Ｓ−ＩＴＳ２領域の塩基は切断された。毒性のツキヨタケのバンドパターンは、切断されたエノキおよびマイタケと異なるため、ツキヨタケを同定することができた。したがって、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｂｐｕ１０ＩまたはＳｆｃＩを用いるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法で、種々の市販食用きのことツキヨタケとの区別も可能である。
【００７９】
（実施例３：リアルタイムＰＣＲ法に基づくきのこの同定）
リアルタイムＰＣＲ法を用いてツキヨタケを同定できるか検討した。ＰＣＲチューブに、２５μｌ反応系において、２×ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １２．５μｌ、５０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ−ｐｒｉｍｅｒ  ０．２５μｌ、５０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｒｉｍｅｒ  ０．２５μｌ、１０μＭツキヨタケ特異的プローブ  ０．５μｌ、サンプル（テンプレート）  ０．５μｌ、蒸留水  ９．５μｌを添加して、調製した。リアルタイムＰＣＲ装置は、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６を用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃で１０分間を１サイクル、次に９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を１サイクルとして４０サイクルとした。サンプルは、毒性のきのこであるツキヨタケ、および食用のシイタケ、ムキタケ、ヒラタケのものを用いた。ツキヨタケでは、サンプルＤＮＡの濃度を調整して、反応系のサンプルＤＮＡ量が５０ｎｇ、１２．５ｎｇ、２．５ｎｇ、０．５ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０２ｎｇとなるようにした。また、シイタケ、ムキタケおよびヒラタケでは、反応系のサンプルＤＮＡ量が５０ｎｇとなるようにした。
【００８０】
ツキヨタケ特異的プローブの塩基配列は、配列表の配列番号３に示す。ツキヨタケ特異的プローブはＦＡＭで蛍光標識したＭＧＢプローブ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。また、Ｆｏｒｗａｒｄ−ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は、配列表の配列番号４に示す。Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｒｉｍｅｒの塩基配列は、配列表の配列番号５に示す。
【００８１】
図１０Ａは、ツキヨタケのサンプルに対するリアルタイムＰＣＲ法の結果を示す。サイクルに応じて、蛍光強度の増加が見られた。また、蛍光強度はサンプルＤＮＡ量に依存していた。一方、図１０Ｂは、シイタケ、ムキタケおよびヒラタケのサンプルに対するリアルタイムＰＣＲ法の結果を示す。ツキヨタケ特異的プローブは、シイタケ、ムキタケおよびヒラタケそれぞれのサンプルには、反応しなかった。このため、リアルタイムＰＣＲ法を用いることで、食用であるシイタケ、ムキタケ、ヒラタケそれぞれに交差反応することなくツキヨタケのみを検出できることが示された。
【００８２】
したがって、リアルタイムＰＣＲ法を用いることで、ツキヨタケおよびこの近縁種を高感度で、迅速に同定できた。
【図１】
2015216884.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2015216884.tif 000006
【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
2015216884.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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