(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロチャネルまたは閉じたマイクロ流体系において再現性のある、汚染の無い小滴操作、特に合体を行うデバイスおよび方法を提供する。【解決手段】マイクロ流体デバイス１は、マイクロチャネル２および電極アッセンブリ３を含む。マイクロチャネル２は縦軸Xおよび円形である内部断面を有する。電極４は、マイクロチャネル２の周りに置かれ、軸Xに沿ってギャップ６だけ間隔をあけて置かれる。電極４は、電気ワイヤを含む連結要素８によって発電ユニット９に連結される。合体する小滴は電極４間のギャップ６に入り、一定速度で移動し、次の小滴は前の小滴に誘電力によって近づき合体が達成される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１のパケットの分裂を行うまたは他の変形を行なうための、あるいは少なくとも２のパケットを、特に合体させるために、互いの方に移動させるためのマイクロ流体デバイス（１）において、該デバイスが、軸（Ｘ）を有するマイクロチャネル（２）、および下記の少なくとも１を含むパケット操作手段を含むところのデバイス、
発電ユニット（９）、および上記発電ユニット（９）に連結されかつ、上記マイクロチャネルの少なくとも一部分の内部に、上記マイクロチャネルの軸（Ｘ）と実質的に共線的である電場を作るように構成された電極アッセンブリ（３）、ここで、上記発電ユニット（９）は、マイクロチャネルにおいて少なくとも１のパケットを変形させるまたは少なくとも２のパケットを互いの方に移動させるような振幅および周波数を有する電場を発生させることができる、および
上記マイクロチャネルの一部と連結した第一端および、上記少なくとも２のパケットの間のまたは上記少なくとも１のパケットとその周囲との間の界面張力を変えることができる溶液を運ぶために適したデリバリー系と連結した第二端を有する少なくとも１のサイドチャネル、ここで、上記デリバリー系は、少なくとも上記パケットがマイクロチャネルの上記部分を通過する間、マイクロチャネルの上記部分に上記溶液を運ぶように構成されている。
【請求項２】
電場がマイクロチャネルの軸（Ｘ）と実質的に共線的であるところの上記マイクロチャネルの少なくとも一部分が、該部分の厚さの約１〜約１００倍の長さ、好ましくは該部分の厚さの約１〜約１０倍の長さを有する、請求項１記載のデバイス。
【請求項３】
電極アッセンブリ（３）が、マイクロチャネル（２）の内部表面から電気的に絶縁されている、請求項１または２記載のデバイス。
【請求項４】
電極アッセンブリ（３）が、電極間の電場がマイクロチャネルの軸（Ｘ）と実質的に共線的であるのに十分な距離だけマイクロチャネルの軸に沿って軸方向に間隔をあけて置かれた少なくとも２の電極（４；３５）を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項５】
該電極（４；３５）の少なくとも１が、マイクロチャネル（２）を横切って互いに向かい合う少なくとも２の等電位部分を含む、請求項４記載のデバイス。
【請求項６】
該電極（４）の少なくとも１がモノリシックである、請求項４または５記載のデバイス。
【請求項７】
該電極（４）の少なくとも１がマイクロチャネルを取り囲む円筒状表面を有する、請求項４〜６のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項８】
該電極（３５）の少なくとも１が複合体である、請求項４〜６のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項９】
該電極（３５）の少なくとも１が、マイクロチャネル（２）を挟む少なくとも２の実質的に平行な等電位プレート（３６）を含む、請求項８記載のデバイス。
【請求項１０】
該電極（４；３５）が、マイクロチャネルの厚さより大きい、好ましくはマイクロチャネルの厚さの２倍より大きい長さを有するギャップ（６）だけ間隔をあけて置かれている、請求項４〜９のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項１１】
該電極アッセンブリ（３；３’）が、マイクロチャネルの少なくとも１の断面において電場の振幅が１０倍未満、好ましくは２倍未満で変化し、より好ましくは実質的に均一であるように構成されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項１２】
発電ユニットが連続電場を発生させることができる、請求項１〜１１のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項１３】
発電ユニットが可変電場を発生させることができる、請求項１〜１１のいずれか１項記載のデバイス。
【請求項１４】
発電ユニットがＡＣ電場を発生させることができる、請求項１３記載のデバイス。
【請求項１５】
発電ユニット（９）が、約０．０１Ｈｚ〜約１ＧＨｚ、好ましくは約１Ｈｚ〜約１０ＭＨｚの範囲の周波数を有するＡＣ電場を発生することができる、請求項１４記載のデバイス。
【請求項１６】
発電ユニット（９）が、１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚの周波数を有するＡＣ電場を発生させることができる、小滴を合体するための、請求項１５記載のデバイス。
【請求項１７】
発電ユニット（９）が、５０Ｈｚより低い周波数を有するＡＣ電場を発生させることができる、少なくとも１の小滴を等分するための、請求項１５記載のデバイス。
【請求項１８】
該溶液が界面活性剤を含む、請求項１記載のデバイス。
【請求項１９】
軸を有するマイクロチャネル中で少なくとも１のパケットを移動させるための方法において、
少なくとも１のパケットをマイクロチャネル内に導入すること、および
マイクロチャネルの少なくとも一部分内に電場を発生させること、ここで、少なくとも上記少なくとも１のパケットが上記部分内に位置されているときに、パケットをマイクロチャネルに沿って移動させるように上記電場が好ましくはマイクロチャネルの軸と共線的である、
を含むところの方法。
【請求項２０】
マイクロチャネル（２）中で少なくとも２のパケットを合体させるための方法において、上記マイクロチャネルが縦軸（Ｘ）を有し、上記方法が、
上記少なくとも２のパケットをマイクロチャネル内に導入すること、および
マイクロチャネルの少なくとも一部分内に電場を発生させること、ここで、少なくとも上記パケットがマイクロチャネルの上記部分内に位置されているときに、上記電場が、上記部分においてマイクロチャネルの軸と好ましくは実質的に共線的であり、かつ２つのパケットを互いの方に移動させるように選択された振幅および周波数を有する、
を含むところの方法。
【請求項２１】
上記電場が、マイクロチャネルの軸（Ｘ）に沿って軸方向に間隔をあけて置かれた少なくとも２の電極（４；３５）によって発生され、上記複数の電極がギャップ（６）によって分離されており、上記方法が、
上記電場を発生させる前に、２つのパケットを電極間の上記ギャップ中に位置させること、ここで、上記パケットは静的平衡にある、および
上記電場を発生させること、
を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
上記電場が、マイクロチャネルの軸に沿って軸方向に間隔をあけて置かれた少なくとも２の電極（４；３５）によって発生され、上記電極がギャップによって分離されており、上記方法が、
２つのパケットをマイクロチャネル中に位置させること、ここで、上記パケットの少なくとも１が電極間の上記ギャップの外にある、
上記２つのパケットを上記ギャップの方へ、例えばマイクロチャネル中の流動する流れによって、移動させること、および
上記２つのパケットが上記ギャップ中に位置しているときに少なくとも、上記電場を発生させること、
を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
上記パケットの少なくとも１が生物学的物質を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２のパケットをマイクロチャネル中で合体させるための、または少なくとも１のパケットを分裂させるための方法において、上記マイクロチャネルが軸を有し、上記方法が、
少なくとも２のパケットまたは少なくとも１のパケットをマイクロチャネルの一部分に位置させること、および
上記少なくとも２のパケットの間、または上記少なくとも１のパケットとその周囲との間の界面張力を変えることができる界面活性剤の溶液をマイクロチャネルの上記部分に運ぶこと、
を含むところの方法。
【請求項２５】
縦軸を有するマイクロチャネル中で少なくとも１のパケットを分裂させるための方法において、
上記少なくとも１のパケットをマイクロチャネル内に導入すること、および
マイクロチャネルの少なくとも一部分内に電場を発生させること、ここで、少なくとも上記少なくとも一部分内に上記少なくとも１のパケットが位置されるときに、上記電場が、好ましくは上記部分内でマイクロチャネルの軸と実質的に共線的であり、かつパケットを分裂させるように選択される振幅および周波数を有する、
を含むところの方法。
【請求項２６】
マイクロチャネルまたは他のマイクロ容器中の少なくとも１のパケットに少なくとも１の操作を行なうための方法において、上記マイクロ容器がマイクロ容器の内部空間を規定する少なくとも１の管状部分を有し、
上記管状部分が、内部コーティングされていない、フッ素化されたバルク物質で作られ、または、
上記管状部分が、フッ素化されていないバルク物質で作られ、管状部分の内部表面の周囲全体上を永久の層で被覆されており、上記永久の層が好ましくは疎水性であり、
ここで、上記マイクロ容器が、上記パケットと混和しない担体流体で少なくとも部分的に満たされており、上記担体流体は、上記パケットと上記担体流体との間の界面張力を低下させるのに十分な濃度の少なくとも１の界面活性剤を含むところの方法。
【請求項２７】
マイクロ容器が、一連の少なくとも２の管状部分を含み、第一の管状部分が、フッ素化されたバルク物質で作られ、第二の管状部分が、フッ素化されていないバルク物質で作られかつ内部の周囲全体上を永久の層で被覆されている、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
永久の層が溶融シリカガラス、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ポリエチレン、ポリイミド、エポキシ、テフロン（登録商標）、パリレン（登録商標）、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、環状オレフィンコポリマーおよび他のエラストマーまたはプラスチック；ガラス、二酸化ケイ素および他の非導電性酸化物；ダイアモンド、非導電性セラミック、シリコーン、エラストマー、ガラス状物質、鉱物物質、セラミック、ポリマー、熱可塑性ポリマー、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂、コポリマー、シラン、フルオロシランならびにフルオロポリマーから選択される物質を含む、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
バルク物質が、溶融シリカガラス、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ポリエチレン、ポリイミド、エポキシ、テフロン（登録商標）、パリレン（登録商標）、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、フルオロポリマー、ポリエステル、環状オレフィンコポリマーおよび他のエラストマーまたはプラスチック；ガラス、二酸化ケイ素および他の非導電性酸化物；ダイアモンド、非導電性セラミック、シリコーン、エラストマー、ガラス状物質、鉱物物質、セラミック、ポリマー、熱可塑性ポリマー、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂ならびにコポリマーから選択される、請求項２６〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
マイクロチャネルまたは他のマイクロ容器中の少なくとも１のパケットに少なくとも１の操作を行なうための方法において、上記マイクロ容器が内部の管状疎水性表面を有し、上記マイクロ容器が、上記パケットと混和しない担体流体で少なくとも部分的に満たされており、上記担体流体は、上記パケットと上記担体流体との間の表面張力を低下させるのに十分な濃度の少なくとも１の界面活性剤を含むところの方法。
【請求項３１】
操作が、上記少なくとも１のパケットを移動させること、上記少なくとも１のパケットを分裂させること、上記少なくとも１のパケットを少なくとも１の別のパケットと合体させること、および上記少なくとも１のパケットを反応させることの少なくとも１である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
移動させることが、担体流体をマイクロ容器中で循環させることを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
操作が、電場の不存在下で行なわれる、請求項３０〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
操作が、上記少なくとも１のパケットをマイクロ容器の入り口からマイクロ容器の出口の方に移動させることを含む、請求項３０〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
操作が、上記少なくとも１のパケットを少なくとも２の異なる温度または他の物理的および／または化学的条件に順次暴露させることを含む、請求項３０〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
マイクロチャネルまたは他のマイクロ容器中の少なくとも１のパケットに少なくとも１の操作を行なうための方法において、上記マイクロ容器が内部表面を有し、上記マイクロ容器が、上記パケットと混和せずかつ少なくとも１の界面活性剤を含む担体流体を入れられており、上記パケットと上記マイクロ容器の内壁との間の界面張力と、上記パケットと上記担体流体との間の界面張力との相違が、少なくとも２６ｍＮ／ｍ、好ましくは少なくとも３５ｍＮ／ｍであり、例えば約３５ｍＮ／ｍ〜約４５ｍＮ／ｍであるところの方法。
【請求項３７】
担体流体中の界面活性剤の濃度が、約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．１重量％〜約３重量％である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
上記界面活性剤がフルオロアルコールまたは他のフルオロ界面活性剤である、請求項３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
フルオロ界面活性剤が１H，１H，２H，２Hパーフルオロデカン−１−オールである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
バルク部分がシラン化されている、請求項３６〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
パケットと混和しない担体流体中に入れられた少なくとも１のパケットに少なくとも１の化学的、物理的または生物学的操作を行なうためのデバイスにおいて、上記デバイスが上記パケットを含む上記担体流体を取り囲む少なくとも１のマイクロ容器を含み、上記マイクロ容器の内部表面がフッ素化されており、上記担体流体が少なくとも０．１ｃｍｃ（臨界ミセル濃度）の比濃度の界面活性剤を含むところのデバイス。
【請求項４２】
マイクロチャネルまたは他のマイクロ容器を含むマイクロ流体デバイスにおいて、上記デバイスが、マイクロ容器の内部空間を形成する管状の疎水性バルク部分をさらに含み、上記バルク部分が疎水性層で被覆されているところのデバイス。
【請求項４３】
少なくとも１のパケットを少なくとも１のマイクロチャネルから別のマイクロチャネルの方へ汚染なしで輸送させることができるコネクターにおいて、上記コネクターが、バルク物質を含み、好ましくは上記物質で構成され、その内部表面全体の上に疎水性層を有し、上記層がフッ素化物質およびシラン化物質の１を含むところのコネクター。
【請求項４４】
上記バルク物質がエラストマーである、請求項４３記載のコネクター。
【請求項４５】
少なくとも１のマイクロチャネルまたは他のマイクロ容器および上記マイクロ容器と連絡するコネクターを含むマイクロ流体デバイスにおいて、上記コネクターが上記マイクロ容器を少なくとも１の別のマイクロチャネルまたは他のマイクロ容器および上記デバイスの入り口または出口に連結するように構成されており、上記コネクターが、少なくとも１の疎水性層を含む内部表面を有するところのデバイス。
【請求項４６】
マイクロチャネルを形成する毛細管の一端に取り付けられるように構成されたコネクターにおいて、上記コネクターが、少なくとも１の疎水性層を含む内部表面を有するところのコネクター。
【請求項４７】
マイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイス、および
上記マイクロ流体デバイス上に取り付けられるための、上記したコネクター、
を含むキット。
【請求項４８】
パケットに少なくとも１の操作を行なうためのキットにおいて、
少なくとも１の疎水性物質を含む内部表面を有するマイクロチャネルまたは他のマイクロ容器、および
上記パケットと混和しない担体流体、ここで、上記担体流体は、上記パケットと上記水と混和しない流体との間の表面張力を低下させるのに十分な濃度の少なくとも１の界面活性剤を含む、
を含むところのキット。
【請求項４９】
請求項４３記載のコネクター、および
上記コネクタ−に連結した少なくとも１の毛細管
を含むアッセンブリ。
【請求項５０】
コネクターがＴ−コネクターである、請求項４９記載のアッセンブリ。
【請求項５１】
毛細管が、フッ素化された内部表面を有する、請求項４９または５０記載のアッセンブリ。
【請求項５２】
ＰＣＲを行なうためのデバイスにおいて、上記デバイスが、
界面活性剤を含むフルオロ溶媒で少なくとも部分的に満たされた毛細管で作られたコイルを含むマイクロチャネル
を含み、ここで、上記コイルは、種々の温度に暴露される変性領域、アニーリング領域および伸長領域を含むところのデバイス。
【請求項５３】
下記の少なくとも１を行なうための、請求項１記載の方法、
混合、
核酸のスクリーニング、
核酸の増幅、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル型増幅による核酸の増幅、
ＲＮＡ逆転写、
遺伝子型の決定、
プロテオミクス分析、
トランスクリプトーム分析、
結晶化および特にたんぱく質の結晶化、
医薬標的、薬学的ヒットまたは糸口、または薬物の探索および評価、
酵素−たんぱく質反応、
抗原−抗体反応、
化学的または生物学的生成物のライブラリーのスクリーニング、
高処理量スクリーニング、
薬物デリバリー、
診断、
少なくとも１の生きた細胞または死んだ細胞の分析または溶解、
微生物の分析、
化学反応、
反応性触媒反応、
重合反応、
鎖を形成するためにコロイドまたは他の粒子を融合すること、
コロイド、エマルジョン、小胞、特に単分散コロイド状物体の調製、
ナノ粒子またはミクロ粒子の調製、
環境制御、
汚染物の検出、および
工業的プロセスの制御。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ容器、特にマイクロチャネル中でパケットを操作するためのデバイスに関する。
【０００２】
本明細書で使用されるとき、「パケット」は、区画された物質を意味し、また、流体パケット、カプセル化されたパケットおよび／または固体パケットを意味し得る。
【０００３】
流体パケットは、液体または気体の１以上のパケットを意味する。流体パケットは、１滴または１気泡の液体または気体を意味し得る。流体パケットは、１滴の水、１滴の試薬またはサンプル、１滴の溶媒、１滴の溶液、１つの粒子懸濁物または細胞懸濁物、１滴の中間生成物、１滴の最終反応生成物あるいは１滴の任意の物質を意味し得る。流体パケットの例は、油中に懸濁された１滴の水性溶液である。好ましい実施態様では、流体パケットは、１滴の水または１滴の溶液を意味する。
【０００４】
カプセル化されたパケットは、物質の層で包囲されたパケットを意味する。カプセル化されたパケットの表面は、試薬、サンプル、粒子または細胞、中間生成物、最終反応生成物または任意の物質で被覆され得る。カプセル化されたパケットの例は、水中に懸濁された試薬の水性溶液を含む脂質小胞である。
【０００５】
パケットは例えば、試薬、サンプル、粒子、死細胞または生きている細胞、中間生成物、最終反応生成物または任意の物質を含み得る液体または気体の小胞または他のマイクロカプセルを含み得る。
【０００６】
固体パケットは、試薬、サンプル、粒子または細胞、中間生成物、最終反応生成物または任意の物質を含み得るまたはそれらで被覆され得る固体物質、例えば生物学的物質、を意味する。固体パケットの例は、水性溶液中に懸濁された、その表面に試薬が結合されたラテックス微小球である。パケットは、結晶、多結晶性物質、またはガラス質の物質を含み得る。
【０００７】
パケットは、種々の大きさ及び形状で作られ得、約１００ｎｍ〜約１ｃｍの最大寸法を有し得る。
【背景技術】
【０００８】
小滴系は、オイルまたはフッ素化溶媒中の水系小滴からなり、または水性溶媒中の「油性」（水と混和しない）小滴からなり得る。本発明の小滴系に含まれる流体は、任意の種類の流体、水性の、有機の、鉱物の、親水性のまたは疎水性のものであり得、例えば、水系バッファー、生物学的流体、ハイドロ有機溶媒、炭素−炭素骨格、Ｓｉ−Ｓｉ骨格（シリコーン）またはヘテロ原子骨格を有する分子で作られた液体、例えばポリエチレングリコール、あるいはイオン性液体を包含する。小滴系は、正確なエマルジョンを作るための方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための、速い動力学の測定のためのおよびサンプルアリコートの分散のない輸送および操作のための分離したマイクロリアクターとして、大いに注目されている。従って、長年にわたって、微小滴を作るおよび／または操作するための多大な努力がなされてきた。いくつかのデバイスは、何らかの親水性部分と何らかの疎水性部分を結合するマイクロチャネル中でそのような小滴を移動させることによる、疎水力を使用するものである。例えば、米国特許第６１３００９８号は、
１以上の疎水性領域を有し、気体源と通じる微小滴輸送チャネルを提供すること、
疎水性領域の１つで液体が停止するような条件下で液体を上記チャネルに導入すること、および
小滴を上記疎水性領域上で移動させるように上記気体源によって付与される圧力を増加させることにより小滴を分離すること
を含む、微小滴を移動させるための方法を開示している。
【０００９】
この方法は、種々の小滴が同じ固体表面と接触するものであり、従って汚染する傾向がある。
【００１０】
エレクトロウェッティング（electrowetting）による、電極の平らな配列上での小滴の操作も非常に一般的になっている。なぜならば、小滴を種々の場所へ、および複雑かつプログラム可能な経路に沿って向けることが可能であるからである。例えば、米国特許第６２９４０６３号は、複数のパケットをプログラム可能に操作するための装置を開示しており、上記パケットは所望により小滴であり、上記装置は、上記パケットのための相互作用サイトを提供するように構成された反応表面、入り口、上記パケット上に操作力を生じるための手段、ここで、上記力は、上記パケットを上記反応表面の回りで任意に選択された経路に沿ってプログラム可能に移動させることができる、および位置センサーを含む。
【００１１】
米国特許第６５６５７２７号も、極性液体の小滴を操作するためのデバイスを開示しており、その間にギャップを規定する上側および下側表面を含み、上側表面は複数の相互にかみ合う電極を含み、下側表面は共通の向流電極を含む。上記デバイスはさらに、上記電極と上記ギャップとの間の絶縁層および上記ギャップ中に位置された非極性液体を含む。このデバイスでは、小滴が、上側表面上の第一電極の上部で、該電極と下側表面上の向流電極との間に電位をかけ、第一電極の周囲の小滴のために上側表面を濡らすことにより、操作され得る。ついで、小滴は、第一電極と向流電極との間の電位差を抑え、第二電極と向流電極との間に電位差を付与して第二電極を上記流体に対して湿らせることにより、上記第一電極と相互にかみ合う、上側表面上の第二電極へ移動され得る。
【００１２】
エレクトロウェッティングはまた、例えばM. Washizu, IEEE Trans. Ind. Appl., 34, 732-737(1998)に記載されているように、２つの異なる小滴を混合するために使用され得る。例えば２つの試薬または１つのサンプルと１つの試薬を含む小滴の混合は、マイクロ流体統合系または「ラブ−オン−チップ（lab-on-chips）」の開発のための重要な技術的段階である。
【００１３】
しかし、エレクトロウェッティングによって要求される電極の平らな配列の様式は、重大な欠点を有する。電極の上記配列を作ることは複雑であり、きわめて高価になり、技術上、数ｃｍ平方を超える表面を要求することになる。従って、大きい距離、例えば１０ｃｍを越える距離での小滴の輸送は実際的でない。また、液状の小滴の場合、上記表面は、重力または音波の作用下での小滴の望ましくない動きを避けるために、水平にかつ比較的振動がないように維持されるべきである。平らな様式での小滴の操作はまた、小滴の蒸発による制限を受け得る。これは、定量的生化学用途において重大な障害である。なぜならば、反応収率は濃度に非常に敏感であるからである。エレクトロウェッティングはさらに、表面の汚染を招き得る。別の制限は、エレクトロウェッティングが液体にのみ作用し得、その結果、固体物体の輸送には使用され得ないことである。
【００１４】
誘電泳動は、小滴または固体物体、例えば細胞またはラテックス粒子、を輸送および混合する別の方法である。例えば、Schwartzら、Lab Chip, 4,11-17(2004)は、プログラム可能な流体プロセッサーを開示している。そこでは、上記配列における電極に継続的にエネルギーを付与することにより、小滴が電極の配列の頂部で移動および混合される。しかし、この方法も、平らな表面での電極の複雑な配列を要求し、したがって、エレクトロウェッティングの上記欠点の多くを有する。別の例では、Velevら、Nature,426, 515-516(2003)が、フッ素化されたオイルの層上に浮遊する小滴を移動および混合させるための方法を記載している。上記方法では、オイルが電極のパターンと接触する。これは、エレクトロウェッティングに固有の汚染の問題を除去するが、電極の複雑な配列を作ることをなおも要求する。
【００１５】
細長いマイクロチャネルでの、または連結したマイクロチャネルのネットワークでの小滴の輸送および混合は、上記問題に対しては比較的大丈夫である。例えば、それは、蒸発を回避し、小滴を取り巻く担体流体の簡単な流体力学的流動により長い距離での輸送を可能にする。従って、例えばCurcioおよびRoeraade, Anal. Chem., 75, 1-7(2003)に開示されているように、小滴は、長さ数メーターの毛細管において輸送され得、そしてマイクロリアクターとして使用され得る。壁との相互作用が十分制御されるとき、全ての小滴は同じ速度で移動し、そして非常に安定な列が達成される。しかし、この種の系は、流れにおける付随する小滴の形成に起因するとされている、小滴間の汚染の問題を有する。Parkら、Anal. Chem. 2003, 75, 6029-6033は、多数の水性サンプルプラグが空気のプラグによって分離されている系を提案している。しかし、壁の処理が、汚染を完全に除去するには十分でなく、そのため、サンプル間に「洗浄」小滴を含めることが必要である場合がある。さらに、流れの中の泡が、小滴の熱的履歴に異常を招き得るので、定量的用途に関して、この技術の魅力を小さくしている。
【００１６】
また、誘電泳動によりマイクロチャネル中で固体粒子または細胞を操作することが提案された。誘電泳動は、ある勾配の電場において、周囲の媒体と異なる誘電率を有する粒子に及ぼされる力を使用する。マイクロチャネルでの誘電泳動の適用のために、今日まで、種々の型の配列が使用された。第一の配列では、間隔を密にしておかれた相互にかみ合う電極の配列が、粒子が引き付けられる高い電場勾配のラインを局所的に作る。所望により、これらのラインは、異なる一連の電極に交互にエネルギーを与えることによりやがてシフトされ得る。上記方法は、「進行波誘電泳動（travelling wave dielectrophoresis）」と呼ばれる。例えば、Schnelleら、Electrophoresis, 21, 66-73(2000)は、粒子を分類するための方法を開示している。上記方法では、粒子が、相互にかみ合う配列における多数の電極間での進行波誘電泳動により偏向され、４相交互電気信号によって継続的にエネルギーを与えられる。例えばDurrら、Electrophoresis, 24, 722-731(2003)に記載されているように、マイクロチャネルを横切って互いに向かい合う異なる形状の電極の対を使用し、それらの間に電位差を付与することにより、種々の誘電泳動トラップ、ケージまたは偏向電極を作ることも可能である。
【００１７】
これらの誘電泳動デバイスは、平らな系に対していくつかの利点を示す。特に、傾きや振動に対して比較的大丈夫である。しかし、それらは、複雑なミクロ製作をなおも必要とし、製作は高価である。
【００１８】
マイクロチャネル小滴系、特にマイクロリアクター用途のための開発における別の重要なハードルは、種々の源からのサンプルまたは試薬の混合である。これに関しては、２滴を合体する必要があるが、ラプラス（Ｌａｐｌａｃｅ）および流体力学力がこの合体を困難にする傾向がある。同時にＴ交差に到達すると、１つの小滴が第二の小滴に単純に従い、合体することなくＴになる。合体は、小滴を接触帯電させることにより強制され得るが、これは、ＰＣＲおよび他の生物学的系における汚染の主な源となり得る。より小さい小滴がいったんチャネルに導かれると、より大きい小滴を引きずり、ついにはそれと合体し得る。なぜならば、より小さい小滴はより高い平均速度で移動するからである。しかし、これは、マイクロ流体素子工学における合理的方法ではない。なぜならば、小滴間の膜の排出が非常に遅く、チューブ直径の３０〜１００倍の合体距離をもたらすからである（Olbricht and Kung, J. Colloid Interface Sci., 120, 229-244(1987)。さらに、いくつかの条件（相対的な小滴サイズ、粘度など）下では、合体が達成されず、合体の時間または位置があまり再現できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、マイクロチャネルまたは閉じたマイクロ流体系において再現性のある、汚染の無い小滴操作、特に合体、を提供するデバイスおよび方法が強く要求されている。
【００２０】
本発明の目的は特に、そのようなデバイスおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、その局面の１つによれば、少なくとも１のパケットを変形する、特に分裂させるための、または少なくとも２のパケットを、特に崩壊させるために、互いの方に移動させるためのマイクロ流体デバイスに関し、上記デバイスは、軸を有するマイクロチャネルおよび下記の少なくとも１を含むパケット操作手段を含む：
発電ユニットおよび上記発電ユニットに連結しかつ上記マイクロチャネルの少なくとも一部分の内部にマイクロチャネルの軸（Ｘ）と実質的に共線的である電場を作るように構成された電極アッセンブリ、ここで、上記発電ユニットは、電場が、マイクロチャネルにおいて、少なくとも１のパケットを変形させるまたは少なくとも２のパケットを互いの方に移動させるような振幅および周波数を有する電場を発生させることができる、および
上記マイクロチャネルの一部と連結した第一端および溶液を運ぶために適したデリバリー系と連結した第二端を有する少なくとも１のサイドチャネル、ここで、上記溶液は特に界面活性剤を有し、上記界面活性剤は、上記少なくとも２のパケットの間または上記少なくとも１のパケットとその周囲との間の界面張力を変えることができ、上記デリバリー系は、少なくとも上記パケットがマイクロチャネルの上記部分を通過する間、上記溶液を上記マイクロチャネルに運ぶように構成されている。
【００２２】
言い換えると、本発明に従うデバイスを用いるパケットの操作は、適切な電場を発生させることにより、または液体パケットの表面張力を調節することにより、または両方の技術を組み合わせることにより行なわれ得る。
【００２３】
界面張力は、少なくとも２０％、より好ましくは５０％だけ調節され、好ましくは低下され得る。
【００２４】
２つのパケットを崩壊させるように電場がかけられるマイクロチャネルの上記部分に２つのパケットが導入されると、上記電場によって双極子がパケット中に作られ、上記双極子は、２つのパケットが互いに引き合いそして崩壊するようにマイクロチャネルの軸に実質的に沿って配向される。
【００２５】
表現「実質的に共線的」は、電場の方向の平均が、マイクロチャネルの軸と４５°より小さい角度、例えば３０°より小さい、好ましくは２０°より小さい、より好ましくは１０°または５°より小さい角度を作ることを意味する。
【００２６】
本発明は、２つのパケットの崩壊（collapse）、例えば２つの小滴のマイクロチャネル内での合体、を誘発するために使用され得る。
【００２７】
「電気合体（electrocoalescence）」と呼ばれる一般的な物理現象は、P. Atten, J. Electrostat. 30, 259(1993)に開示されている。電気泳動力のように、また誘電泳動とは対照的に、電気合体は場の勾配を必要としない。
【００２８】
パケットが細胞である、またはいくつかの細胞を含むとき、本発明は、そのような細胞または多数の細胞のエレクトロポレーションを誘発するために使用され得る。
【００２９】
本発明はまた、１つのパケットをより小さい大きさのいくつかのパケットに分裂させる、例えば１つの小滴からより小さい大きさの１つまたはいくつかの小滴を抜き取る、ために使用され得る。
【００３０】
本発明に従うマイクロ容器は、任意の大きさを有し得る。好ましくは、１ミリメートルより小さい少なくとも１の寸法を有する。１実施態様では、上記マイクロ容器が、１ｍｍより小さい直径を有するマイクロ毛細管である。例えば、上記毛細管の断面における少なくとも１の寸法が好ましくは１００μｍ〜１ｍｍである。１実施態様では、上記毛細管の少なくとも１の寸法が、約１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１μｍ〜１００μｍである。別の実施態様では、上記マイクロ容器が、１ｍｍより小さい厚さを有するミクロ製作されたマイクロチャネルである。いくつかの実施態様では、上記マイクロチャネルの厚さが好ましくは約１００μｍ〜１ｍｍである。上記マイクロチャネルの厚さは、約１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは１μｍ〜１００μｍである。
【００３１】
本発明において、「マイクロ容器」、特に「マイクロチャネル」は、固体表面によって少なくとも部分的に包囲された容積を意味し、上記容積は小さい。好ましくは、本発明におけるマイクロ容器、特にマイクロチャネルは、１ｍｍ−１より実質的に大きい、好ましくは４ｍｍ−１より大きい、例えば１０ｍｍ−１より大きい、恐らく１μｍ−１より大きい表面／容積比を有する。マイクロチャネルは、ナノチャネルをも包含する。
【００３２】
１実施態様において、マイクロチャネルは好ましくは細長い、すなわち、その軸に沿った寸法が上記軸に垂直な任意の他の方向に沿った寸法よりも３倍、好ましくは１０倍、例えば１００倍または１０００倍大きい。
【００３３】
マイクロチャネルの軸は、直線であってもなくてもよい。
【００３４】
マイクロチャネルは、断面が一定であってもなくても良い。断面は、例えば円形、楕円形、矩形、正方形であり得、またはお椀形状を有し得る。
【００３５】
本発明において、「厚さ」は、マイクロチャネルの２つの向かい合う面の間の断面の最も小さい内側距離を意味する。例えば、円形の断面を有する円筒形のマイクロチャネルの場合、厚さは直径である。矩形の断面を有するスリット様マイクロチャネルの場合、厚さは矩形の小さい辺の長さである。
【００３６】
マイクロチャネルの暑さは、数ｎｍ〜数ｍｍの任意の値を取り得る。好ましくは、厚さが１μｍ〜１ｍｍである。さらに好ましくは、マイクロチャネルの軸に沿った長さが厚さよりも少なくとも１０倍大きいように選択され得る。マイクロチャネルは、１０ｍｍ〜数ｍの長さ、例えば１ｃｍ〜５０ｃｍの長さを有し得る。
【００３７】
好ましくは、電場がマイクロチャネルの軸と実質的に共線的であるところのマイクロチャネルの部分の軸に沿った長さが、マイクロチャネルの厚さと少なくとも同じ大きさでありかつマイクロチャネルの全長よりも小さい。本発明の好ましい実施態様では、マイクロチャネルの上記部分の長さが、上記部分の厚さの約１〜約１００倍であり、好ましくは、上記部分の厚さの約１〜約１０倍である。
【００３８】
マイクロチャネルは、硬質であっても可撓性であってもよく、たとえば、可撓性の非導電性物質でできたチューブを含む。
【００３９】
マイクロ容器、特にマイクロチャネルは、溶融シリカガラス、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、任意の種類のエラストマーまたはプラスチック、例えばポリエチレン、ポリイミド、エポキシ、テフロン（登録商標）、パリレン（Parylene、商品名）、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、フルオロポリマー、ポリエステル、環状オレフィンコポリマー、非導電性酸化物、例えばガラス、二酸化ケイ素、ダイアモンド、非導電性セラミック、シリコーン、エラストマー、ガラス状物質、鉱物物質、セラミック、ポリマー、熱可塑性ポリマー、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂、コポリマーから選択される少なくとも１の物質から成り得る。
【００４０】
本発明の例示的実施態様では、マイクロチャネルが少なくとも１の入り口および／または少なくとも１の出口を有する。所望により、上記口の少なくとも１が１またはいくつかの貯蔵器、１またはいくつかのポンプ、１またはいくつかの検出器もしくはセンサーあるいは１またはいくつかのサンプリングデバイスに連結され得る。
【００４１】
マイクロチャネルは、連結したマイクロチャネルのネットワークの一部であり得る。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様では、上記電極アッセンブリが、マイクロチャネルの内部表面から、例えば絶縁物質によって、電気的に絶縁されている。絶縁物質は、少なくとも１ｎｍ、例えば少なくとも１０ｎｍ、好ましくは少なくとも１００ｎｍ、最も好ましくは少なくとも１μｍ、例えば数十μｍ乃至数百μｍまでの厚さを有し得る。典型的には、より大きいマイクロチャネルのために、より厚い絶縁層が好ましくあり得る。この絶縁物質は、例えばポリマー状物質、例えばポリエチレン、ポリイミド、エポキシ、テフロン（登録商標）、パリレン、ＰＭＭＡ、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、フルオロポリマー、ポリエステル、環状オレフィンコポリマー、ＰＤＭＳ、非導電性酸化物、例えばガラス、二酸化ケイ素、ダイアモンド、非導電性セラミックから成り得る。
【００４３】
好ましくは、電極アッセンブリが、電極間の電場がマイクロチャネルの軸と実質的に共線的であるのに十分な距離だけ、マイクロチャネルの軸に沿って軸方向に間隔を置かれた少なくとも２の電極を含む。各電極は、マイクロチャネルの軸に関して対称であり得る。有利には、上記電極の少なくとも１が、マイクロチャネルを横切って互いに向かい合う少なくとも２の等電位部分を含む。上記電極の少なくとも１は、例えばマイクロチャネルを取り囲む円筒状の表面を有するモノリシック（monolithic）であり得る。１変形では、上記電極の少なくとも１が複合体である、すなわち、例えばマイクロチャネルを挟む少なくとも２の実質的に平行な等電位プレートを含む、複数の片から成る。電極はまた、上記した以外の形状を有し得る。
【００４４】
これは、特許出願ＦＲ２７９４０３９またはPaikら、Lab Chip, 3, 28-33(2003)に開示された従来技術とは異なる。上記従来技術では、小滴の操作が、異なる構成により、すなわち、操作されるべき小滴が含まれるところのチャンバを横切って互いに向かい合う２の平らな電極の間に電位差を付与することにより得られる。
【００４５】
好ましくは、電極が、マイクロチャネルの厚さよりも大きい、好ましくは厚さの２倍より大きい長さを有するギャップだけ間隔をあけて置かれる。
【００４６】
発電ユニットは有利には、上記２の電極の間に電位差、好ましくは交差電位、を生じるように構成された電流および電圧発生器の少なくとも１を含む。
【００４７】
有利には、電極アッセンブリが、マイクロチャネルの少なくとも１の断面において電場の振幅が１０倍未満だけ、好ましくは５倍未満だけ、より好ましくは２倍未満だけ変化し、好ましくは実質的に同じであり、特に電極間のギャップにおいて実質的に同じであるように構成されている。
【００４８】
電極アッセンブリを介して発電ユニットによって生じた電場は、任意の一時的なプロファイル、例えば連続の、可変のまたは交流（ＡＣ）のプロファイル、またはそのような一時的プロファイルの組み合わせを有し得る。たとえば、電場は可変周波数または二乗平均平方根（ＲＭＳ）振幅を有するＡＣ電場、あるいは連続およびＡＣ成分の重ね合わせであり得る。
【００４９】
「ＡＣ電場」は、時間的に周期的でありかつゼロ時間平均（zero time average）を有する任意の電場を意味する。本発明に従うAC電場の非制限的例は、正弦波、矩形波またはのこぎり波のＡＣ電場である。
【００５０】
発電ユニットは好ましくは、約０．０１Hz〜約１GHｚ、好ましくは約１Hz〜約１０MHｚの範囲の周波数を有するＡＣ電場を発生することができる。
【００５１】
小滴の合体は、例えば１００Hz〜１０KHｚの周波数によって効率的に達成される。少なくとも１の小滴の等分は、好ましくは、５０Hz未満の周波数で達成される。
【００５２】
発電ユニットは、パケットの、パケットを取り囲む流体の、およびマイクロチャネルの性質、ならびにデバイスのサイズに依存して、１V〜３０ｋV、好ましくは６０V〜２ｋVの範囲のＲＭＳ電圧をデリバリーするように構成され得る。電圧は、デバイスのサイズが増加するにつれて増加し得る。電極間のギャップにおけるマイクロチャネル内のＲＭＳ電場は、例えば、１００Ｖ／ｃｍ〜１００ｋＶ／ｃｍ、好ましくは５００Ｖ／ｃｍ〜２０ｋＶ／ｃｍの範囲であり得る。
【００５３】
発電ユニットは、振幅および周波数の少なくとも１が時間と関連して可変である電圧をデリバリーするように構成され得る。例えば、電場の振幅および／または周波数は、２つのパケットが接近接触するとき、変えられ得る。
【００５４】
有利には、電極アッセンブリが支持体中に収容されており、支持体は、固定要素によって一緒に組み立てられた２つの分離した支持部材を有し、各支持部材は、電極アッセンブリの１つの電極を有する。支持体は、マイクロチャネルを受け入れるための少なくとも１のオリフィスを含み得る。
【００５５】
マイクロチャネルがサイドチャネルに連結されるとき、サイドチャネルは、マイクロチャネルの寸法に匹敵する寸法を有する断面を有する。好ましくは、サイドチャネルの断面がマイクロチャネルのものより小さい。１変形では、サイドチャネルの断面がマイクロチャネルのものより大きい。
【００５６】
上記サイドチャネルを伴うデリバリー系は、圧力制御手段または流動制御手段を含み得る。
【００５７】
好ましくは、上記サイドチャネルおよび上記デリバリー系は、界面活性剤を含む溶液をマイクロチャネル中でデリバリーするように構成される。
【００５８】
用語「界面活性剤」は、２つの流体間の界面張力を変えることができる任意の種、分子または分子の組み合わせを意味する。界面活性剤は、例えば、張力活性のまたは両親媒性の種であり得る。
【００５９】
界面活性剤は、水中油系エマルジョンの形成を好むように選択され得る。
【００６０】
パケットが非水性液体中に懸濁された水性小滴であるならば、上記界面活性剤は、典型的には、高ＨＬＢ(親水性/親油性バランス)を有する界面活性剤、例えば１５より大きいＨＬＢ値を有する界面活性剤である。そのような界面活性剤の非制限的例は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、オレイン酸およびCTABである。
【００６１】
パケットが周囲の水性流体中の油性小滴であるならば、上記溶液は、好ましくは、低いＨＬＢ、例えば１５より低いＨＬＢ、好ましくは１０より低いＨＬＢを有する少なくとも１の界面活性剤を含む。
【００６２】
油性相と水相との間の界面張力を減少させることができる、または小滴の合体を選好することができる多数の界面活性剤が、例えばEmulsions, afundamental and practical approach, J. S. Sjoblom Ed, Klumer, Dordrecht(1992)またはP. Becher, Emulsions, Theory and Practice, 第２版、R.E. Krieger Pub. Co, Malabar, Fl (1985)に列挙されている。
【００６３】
デバイスが、デリバリー系に連結した第一のサイドチャネルを含む、２つの小滴を合体または分裂させるための本発明の例示的実施態様では、マイクロチャネルが、第二のサイドチャネルに連結され、第二のサイドチャネルは好ましくは第一のサイドチャネルに関してまたはその近くで連結されかつ最初のパケットの合体または分裂によって形成されたパケットを集めるように構成される。
【００６４】
マイクロチャネルは、広範囲の均一のまたは複合の物質から成り得る。パケットが、上記パケットのための相互作用部位を提供するように構成された反応表面上で操作されるところの、米国特許第６２９４０６３号に開示された従来技術と反対に、本発明に従うマイクロチャネルの壁は、埋め込み用流体の存在下でのパケットとマイクロチャネルの壁との相互作用の危険を減少させる物質で作られ、または上記物質で処理され得る。パケットとマイクロチャネルとの間に化学的相互作用は全くないと考えられる。
【００６５】
パケットが水系小滴である、例示的実施態様では、マイクロチャネル壁を処理することにより、および／または小滴中におよび／または流体添加物中に含めることにより、小滴とマイクロチャネルの壁との間の界面張力が、小滴と周囲の流体との間の界面張力より大きくされている。
【００６６】
水系液体と表面との間の表面張力を高めるために多くの方法が使用され得る。例えば、本来疎水性の表面、例えばフルオロカーボンまたはポリエチレン、を選択することができる。また、表面を疎水性物質、例えばテフロン（登録商標）AF、シランまたはフルオロシラン、で処理することもできる。
【００６７】
水と水素化油系流体との間の表面張力は、表面活性分子の存在によって低下され得る。多くのそのような表面活性分子が従来公知であり、例としてここにほんのいくつか挙げると、Pluronics（商品名）、Symperionics（商品名）、Triton（商品名）、Span（商品名）80、Tergitol（商品名）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、オレイン酸、メチルセルロース、ヒドロキシエチルおよびヒドロキシプロピルセルロース、またはCoatex（商品名）などの表面活性剤が挙げられる。流体がフッ素化されているならば、フッ素化された界面活性剤、例えば１H，１H，２H，２Hパーフルオロデカン−１−オール、または１H，１H，２H，２Hパーフルオロオクタン−１−オールが特に適する。
【００６８】
フッ素化された、水と混和しない流体は、下記要素の少なくとも１を含み得る。部分的にまたは完全にフッ素化されたアルカン、アルセンまたはアルシン、例えばパーフルオロアルカン、例えばパーフルオロデカリンである。本発明の１実施態様では、水と混和しない流体が、フッ素化された分子の混合物、例えば、「フレオン（Freon）」ファミリーのフッ素化された溶媒、またはＦＣフルオロ界面活性剤、例えばＦＣ４０またはＦＣ７５（３Ｍ製）である。好ましくは、上記混合物における所与の分子量の化合物はいずれも、混合物の７５重量％以下である。
【００６９】
本発明の例示的実施態様では、マイクロチャネルが少なくとも１のパケットを取り囲む流体で満たされており、上記流体は、任意の液体または気体状流体であり得る。ただし、それは、パケット中でまたはマイクロチャネルの壁と混和しない。
【００７０】
パケットを取り囲む流体は、液体、例えば水と混和しない有機または無機の液体であり得る。
【００７１】
流体はフッ素化された液体または気体であり得、小滴は有機またはヒドロ有機液体であり得、所望により種（species）を含む。
【００７２】
本発明の例示的実施態様では、パケットおよび周囲の流体が異なる導電性および／または異なる誘電率を有する。例えば、パケットは、取り囲む流体の導電性より高い導電性を有し得る。
【００７３】
本発明の例示的実施態様では、パケットが、非混和性の第二液体中に懸濁された第一液体の小滴であり、上記第一液体が第一よりも電気導電性が大きい。
【００７４】
小滴は、水系小滴であり得る。上記水系小滴歯、任意の種類の天然の、人工の、有機のまたは無機の種、例えば生物学的分子、たんぱく質、たんぱく質複合体、酵素、ハプテン、抗原、抗体、アプタマー、エピトープ、核酸、ペプチド、ポリサッカライド、グリコペプチド、細胞、細胞の集合体、薬物、化学物質、ラテックス、生きたまたは死んだ生物、ウイルス、細胞小器官、リポゾーム、小胞、ミセル、合成または天然ポリマー、ナノ粒子、蛍光分子、量子ドット、化学試薬、バッファー、界面活性剤およびそのような種の任意の組み合わせを含み得る。
【００７５】
本発明の別の例示的実施態様では、パケットが、水と混和しない液体の小滴であり、周囲の流体が水系溶液である。
【００７６】
本発明は、マイクロチャネルの断面に匹敵する大きさを有するパケットの操作を可能にし得る。
【００７７】
例示的実施態様として、上記パケットの最も小さい断面の面積が、どちらが小さいにしても、第一電極の位置または第二電極の位置でのマイクロチャネルの断面の面積の半分に少なくとも等しい。
【００７８】
パケットは、マイクロチャネルの直径に匹敵し得る直径を有する球状の小滴、またはマイクロチャネルの断面全体に広がる細長い小滴であり得る。
【００７９】
本発明に従うデバイスは、コロイドを融合して例えば鎖を形成するために使用され得る。
【００８０】
デバイスはまた、スクリーニング処理のために使用され得る。
【００８１】
本発明はまた、別の局面によれば、少なくとも２のパケットをマイクロチャネル中で互いの方へ移動させるための方法に関し、これは特に、上記少なくとも２のパケットを崩壊させるためであり、上記マイクロチャネルは縦軸を有し、上記方法は、
上記少なくとも２のパケットをマイクロチャネルに導入すること、および
マイクロチャネルの少なくとも一部分内に電場を発生させること
を含み、ここで、上記パケットが上記マイクロチャネル部分内に位置されるとき、上記電場が好ましくは、上記部分におけるマイクロチャネルの軸と実質的に共線的でありかつ上記２つのパケットを互いの方に移動させるように選択される振幅および周波数を有する。
【００８２】
電場が、マイクロチャネルの軸に沿って軸方向に間隔をおいて置かれた少なくとも２の電極によって発生され、上記電極がギャップによって分離されているとき、上記方法は、
上記電場を発生させる前に、２つの電極間の上記ギャップ中に２つのパケットを位置させること、ここで上記パケットは静的平衡にある、および
上記電場を発生させること
を含み得る。
【００８３】
１変形では、崩壊のためのパケットが、崩壊のインフライト（in-flight）操作を行なうように、流動する流れの中に最初に置かれ得る。上記方法は、したがって、
２つのパケットをマイクロチャネル中に置くこと、ここでパケットの少なくとも１は電極間のギャップの外にある、
上記パケットを、例えばマイクロチャネル中の流動する流れによって、ギャップの方に移動させること、および
少なくとも上記パケットがギャップ中に位置されるとき、上記電場を発生させること
を含み得る。
【００８４】
本発明の例示的実施態様では、上記パケットの少なくとも１が生物学的物質、例えば細胞または細胞質核を含む。少なくとも２のパケットを崩壊させるための方法は、パケットが生物学的膜を含むときに特に有利である。
【００８５】
上記方法は、ハイブリドーマを形成するために、または胚発生細胞を操作するために行なわれ得る。
【００８６】
本発明はまた、別の局面によれば、少なくとも２のパケットをマイクロチャネル中で互いの方に移動させるための方法に関し、この方法は特に、それらを崩壊させるため、または少なくとも１のパケットを分裂させるためであり、上記マイクロチャネルは軸を有し、上記方法は、
少なくとも２のパケットまたは少なくとも１のパケットをマイクロチャネルの１つの部分におくこと、および
上記少なくとも２のパケットの間または上記少なくとも１のパケットとその周囲との間の界面張力を変えることができる界面活性剤の溶液をマイクロチャネルの上記部分にデリバリーすること
を含む。
【００８７】
本発明はまた、別の局面によれば、少なくとも１のパケットを、縦軸を有するマイクロチャネル中で分裂させるための方法に関し、上記方法は
少なくとも１のパケットをマイクロチャネル中に導入すること、および
マイクロチャネルの少なくとも一部分に電場を発生させること、ここで、少なくとも上記少なくとも１のパケットが上記少なくとも一部分内に置かれるとき、上記電場が好ましくは上記部分におけるマイクロチャネルの軸と実質的に共線的でありかつパケットを分裂させるように選択される振幅および周波数を有する。
【００８８】
本発明はまた、別の局面によれば、少なくとも２のパケットの崩壊または少なくとも１のパケットの分裂をモニターする方法に関し、上記方法は、
上記で定義されたマイクロ流体デバイスを使用してマイクロチャネル中での崩壊または分裂を引き起こすこと、および
崩壊または分裂を、例えばビデオデバイスを使用することにより、または電気パラメータ、例えば、マイクロチャネルに含まれる少なくとも１の物質と例えば関連する電気抵抗を測定することにより、検出すること
を含む。
【００８９】
本発明はまた、別の局面によれば、少なくとも１のパケットを、軸を有するマイクロチャネル中で移動させる方法に関し、上記方法は、
少なくとも１のパケットをマイクロチャネル中に導入すること、および
マイクロチャネルの少なくとも一部分に電場を発生させること、ここで、少なくとも上記少なくとも１のパケットが上記部分内に置かれるとき、マイクロチャネルに沿ってパケットを移動させるように、上記電場が好ましくはマイクロチャネルの軸と共線的である。
【００９０】
上記電場は連続であり得る。
【００９１】
少なくとも１のパケットをマイクロチャネル中で移動させる操作は、崩壊または分裂の操作とは独立して行なわれ得る。
【００９２】
１変形では、少なくとも１のパケットをマイクロチャネル中で移動させる上記操作が、崩壊または分裂の操作を行なう前に上記少なくとも１のパケットをマイクロチャネル中に適切に位置させるために行なわれ得る。
【００９３】
本発明は、別の局面によれば、マイクロ容器中、特にマイクロチャネル中の少なくとも１のパケットに少なくとも１の操作を行なうための方法に関し、上記マイクロ容器は、マイクロ容器の内部空間を規定する少なくとも１の管状部分を有し、ここで、
上記管状部分が、内部がコーティングされていない、フッ素化されたバルク物質から成り、または
上記管状部分が、フッ素化されていないバルク物質から成りかつ管状部分の内部表面の周囲全ての上を永久の層でコーティングされている、または
マイクロ容器が、少なくとも２の管状部分の連続を含み、第一管状部分がフッ素化されたバルク物質で作られ、第二管状部分が、フッ素化されていないバルク物質で作られかつ内部周囲の全ての上を永久の層でコーティングされており、
上記永久の層が好ましくは疎水性であり、そして
上記マイクロ容器が少なくとも部分的に、上記パケットと混和しない担体流体で満たされ、上記担体流体は、上記パケットと上記担体流体との間の表面張力を減少させるのに十分大きい濃度の少なくとも１の界面活性剤を含む。
【００９４】
表現「バルク（bulk）物質」は、モノリシックな（monolithic）物質を意味する。
【００９５】
例えば、本発明に従うバルク物質は、同じ物質、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で作られた２つの部分のアッセンブリとは異なる。
【００９６】
バルク物質はまた、異なる物質で作られた２つの部分のアッセンブリ、例えばＰＤＭＳで作られた部分がガラスで作られた部分に結合したアッセンブリまたはボロシリケートで作られた部分がシリコーンで作られた部分に結合したアッセンブリとは異なる。
【００９７】
そのような公知の系では、マイクロ容器またはマイクロチャネルの周囲の異なる部分間の化学的性質の相違が、パケットのまたは担体流体の、そのような部分との相互作用を異なるものにする傾向にあり、したがって、上記パケットに行なわれる操作にわたって不十分な制御を与える傾向にある。
【００９８】
「永久の層」は、担体流体によってマイクロ容器の内部表面へ運ばれない、または上記表面から除去されない層を意味し、典型的には、上記流体中に添加された表面活性成分、特に、ＳＰＡＮ、ＳＤＳ、Pluronics（商品名）などの界面活性剤、に関するケースがそうであろう。永久の層の使用は、それが比較的丈夫であり、そして上記担体流体の組成に関してより多くの自由度を与えるので、有利である。
【００９９】
本発明に従う方法では、いくつかの適用のために、上記担体流体にそのような界面活性剤を添加することができる。
【０１００】
管状部分は、円形のまたは円形以外の断面を有する。例えば、断面が矩形であり得る。
【０１０１】
管状部分の断面は、マイクロ容器の長さに沿って変わっても変わらなくてもよい。
【０１０２】
永久の層は、以下から選択される物質を含み得る。すなわち、溶融シリカガラス、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、任意の種類のエラストマーまたはプラスチック、例えばポリエチレン、ポリイミド、エポキシ、テフロン（登録商標）、パリレン（商品名）、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、環状オレフィンコポリマー、非導電性酸化物、例えばガラス、二酸化ケイ素、ダイアモンド、非導電性セラミック、シリコーン、エラストマー、ガラス状物質、鉱物物質、セラミック、ポリマー、熱可塑性ポリマー、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂、コポリマー、シラン、フルオロシラン、フルオロポリマーである。
【０１０３】
本発明はまた、別の局面によれば、パケットと混和しない担体流体中に包埋された少なくとも１のパケットに少なくとも１の化学的、物理的または生物学的操作を行なうためのデバイスに関し、上記デバイスは、上記パケットを含む上記担体流体を取り囲む少なくとも１のマイクロ容器を含み、上記マイクロ容器の内部表面はフッ素化されており、上記担体流体は、少なくとも０．１ｃｍｃ（臨界ミセル濃度）の比濃度の界面活性剤を含む。
【０１０４】
本発明に従うマイクロ容器は、任意の形状であり得る。例えば矩形断面のマイクロチャネル、円筒状のマイクロ毛細管、薄いスラブ様容器、または円筒状、ピラミッド状もしくは矩形のマイクロバイアルであり得る。
【０１０５】
いくつかの用途のために、本発明に従うデバイスは、１より多くの、好ましくは１０より多くまたは１００より多くの、そして数十万までのそのようなマイクロ容器を集めることができる。
【０１０６】
１実施態様では、マイクロ容器が少なくとも１の入り口を有する。マイクロ容器は、少なくとも１の出口を有し得る。所望により、上記口は１またはいくつかの貯蔵器に、１またはいくつかのポンプに、または１またはいくつかのサンプリングデバイスに連結され得る。
【０１０７】
所望により、マイクロ容器はまた、連結したマイクロチャネルおよび貯蔵器のネットワークの一部であり得る。
【０１０８】
本発明はまた、別の局面によれば、マイクロ容器、特にマイクロチャネル中の少なくとも１のパケットに少なくとも１の操作を行なうための方法に関し、上記マイクロ容器は内部の管状疎水性表面を有し、上記マイクロ容器は、少なくとも部分的に、上記パケットと混和しない担体流体で満たされ、上記流体は、上記パケットと上記担体流体との間の表面張力を減少させるのに十分大きい濃度の少なくとも１の表面活性剤を含む。
【０１０９】
上記操作は、少なくとも１のパケットを移動させること、少なくとも１のパケットを分裂させること、少なくとも１のパケットを少なくとも１の別のパケットと合体させること、および少なくとも１のパケットを反応させることの少なくとも１であり得る。
【０１１０】
移動させることは、担体流体をマイクロ容器中で循環させることを含み得る。
【０１１１】
操作は、電場の不存在下で行なわれ得る。
【０１１２】
操作は、少なくとも１のパケットをマイクロ容器の入り口からマイクロ容器の出口の方へ移動させることを含み得る。
【０１１３】
操作は、少なくとも１のパケットを少なくとも２の異なる物理的および／または化学的条件に、特に少なくとも２の異なる温度に順次暴露することを含み得る。
【０１１４】
本発明はまた、別の局面によれば、内部管状表面を有するマイクロ容器、特にマイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイスに関し、上記デバイスは、マイクロ容器の内部空間を形成する管状バルク疎水性部分をさらに含み、ここで、上記バルク部分は、疎水性の層でコーティングされている。
【０１１５】
１実施態様では、バルク部分が、フッ素化された物質で作られている。１変形では、バルク部分が、フッ素化されていない物質で作られ、かつフッ素された層でコーティングされている。
【０１１６】
マイクロ流体デバイスは、連続した少なくとも第一および第二のバルク部分を含み得、第一部分は、フッ素化された物質で作られかつコーティングされた層を有せず、第二部分はフッ素化されていない物質で作られかつフッ素化された層でコーティングされている。
【０１１７】
１変形では、マイクロ流体デバイスが、マイクロ容器の周囲を形成するための一緒に組み立てられた、テフロン（登録商標）で作られた２つの部分を含み得る。
【０１１８】
本発明はまた、別の局面によれば、マイクロ容器中、特にマイクロチャネル中の少なくとも１のパケットに少なくとも１の操作を行なうための方法に関し、上記マイクロ容器は内部表面を有し、上記マイクロ容器は、上記パケットと混和せずかつ少なくとも１の界面活性剤を含む担体流体を入れられており、パケットとマイクロ容器の内壁との間の界面張力と、パケットと担体流体との間の界面張力との間の相違が少なくとも２６ｍＮ／ｍ、好ましくは少なくとも３５ｍＮ／ｍである。上記相違は、約３５ｍＮ／ｍ〜約４５ｍＮ／ｍに含まれ得る。
【０１１９】
Ticeら、Langmuir 2003, 19, 9127-9133では、マイクロチャネル中の担体流体による小滴の輸送が、小滴と担体流体との間の界面張力が小滴とマイクロチャネルとの間の界面張力より小さいならば、マイクロチャネル壁との相互作用なしに行なわれることが提案されている。特に、上記著者らは、ＰＤＭＳマイクロチャネル（界面張力３８ｍＮ／ｍ）中で、フルオロ界面活性剤（界面張力１２〜１４ｍＮ／ｍ）を含むフルオロカーボン中に溶解された水小滴を使用した。
【０１２０】
この場合、小滴／マイクロチャネルと小滴／流体との間の相違が２４〜２６ｍＮ／ｍである。驚いたことに、同様の条件（シリコーン毛細管中での、ＦＣ４０＋１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オール中の水小滴（流体と水との間の界面張力は１２〜２０ｍＮ／ｍ（実施例１１および図１４を参照）であり、水の毛細管に対する界面張力は３８ｍＮ／ｍである））で、この条件（表面張力の差が明確であり、１８〜２６ｍＮ／ｍを含む）が満たされたが、小滴の不完全な挙動および小滴間の汚染（実施例１４を参照）がなおも認められることが見出された。
【０１２１】
これに対して、シリコーンがフルオロシラン（水との界面張力：５５ｍＮ／ｍ）でさらに処理される、すなわち、マイクロチャネルの表面に関してのパケットの界面張力とパケットと流体との間の界面張力との相違が３５〜４５ｍＮ／ｍの値に増加されるならば、汚染は観察されない。
【０１２２】
また、水小滴が、テフロン（登録商標）の毛細管（界面張力５５ｎＮ／ｍ）中の純粋なＦＣ４０（水／ＦＣ４０界面張力：５１．８ｍＮ／ｍ）中で輸送されるとき、Ticeらの文献に述べられた条件が満たされ、それにもかかわらず、満足のいかない小滴輸送が観察され、小滴が破壊する。これに対して、小滴／流体の界面張力が、０．５〜３％の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オールの添加によって１０〜２０ｍＮ／ｍの値に低下されるとき（マイクロチャネルの表面に関してのパケットの界面張力とパケットと流体との間の界面張力との相違が３５〜４５ｍＮ／ｍの値になる）、不規則な小滴運動および汚染は抑制され得る。
【０１２３】
好ましい実施態様では、担体流体中の界面活性剤の比濃度が少なくとも０．１ｃｍｃ（臨界ミセル濃度）であり、好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは１ｃｍｃである。
【０１２４】
有利には、担体流体中の界面活性剤の濃度が約０．０１％〜約１０％（重量／重量）、好ましくは約０．１％〜約３％である。
【０１２５】
好ましい実施態様では、上記界面活性剤がフルオロ界面活性剤、特にフルオロアルコールである。特に好ましい実施態様では、フルオロ界面活性剤が１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オールである。
【０１２６】
特に好ましい実施態様では、バルク部分がシリコーンで作られている。例えば、マイクロチャネルがシリコーン毛細管で形成されている。
【０１２７】
特に好ましい実施態様では、バルク部分がシラン化されている。例えば、バルク部分の内部表面がシランで処理されている。
【０１２８】
１実施態様では、上記シランが、モノメチルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、モノクロロシラン、ジクロロシラン、トリクロロシランなどから選択される。好ましい実施態様では、上記シランが、モノメチルフルオロシラン、ジメチルフルオロシラン、トリメチルフルオロシラン、モノクロロフルオロシラン、ジクロロフルオロシラン、トリクロロフルオロシランなどから選択される。さらに好ましい実施態様では、上記フルオロシランがパーフルオロシランである。１実施態様では、上記シランが少なくとも２の炭素原子、好ましくは４の炭素原子、さらに好ましくは８の炭素原子さらに好ましくは１２、１６またはそれ以上の炭素原子を含む骨格を有する尾部を有する。１実施態様では、上記フルオロシランが、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロオクチルトリメチルシランおよび１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデシルトリエトキシシラン（Fluorochem）から選択される。上記シランは好ましくは、水を含まない溶媒、例えばエタノール、メタノール、オクタン、ＤＭＦなどに溶解される。別の実施態様では、水を含まない担体ガスをシランの表面上に吹きかけることにより、上記シランが気相から直接、表面上に、そしてマイクロチャネル中に沈着される。
【０１２９】
１実施態様では、上記シラン化が、アルゴン雰囲気下で行なわれる。別の実施態様では、上記シラン化が、空気雰囲気下で行なわれる。好ましくは、上記雰囲気が水を含まない。なぜならば、水はシランを加水分解し、そのグラフト化を妨げるからである。
【０１３０】
別の実施態様では、マイクロチャネルの内部表面が、シラン化の前に、当業者に公知のいくつかの方法の１つによって活性化され得る。１実施態様では、上記活性化が、プラズマ活性化である。好ましい実施態様では、上記活性化が、マイクロチャネル中で酸性溶液を流動させることにより行なわれる。１実施態様では、上記溶液が、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、フッ化水素酸から選択される。
【０１３１】
本発明はまた、別の局面によれば、少なくとも１のパケットを少なくとも１のマイクロチャネルから別のマイクロチャネルの方へ汚染なしに輸送することを可能にするコネクターに関し、上記コネクターはバルク物質によって構成され、その内部表面全体に疎水性の層を有し、上記層はフッ素化された物質およびシラン化された物質の１を含む。
【０１３２】
好ましい実施態様では、上記バルク物質がエラストマーである。
【０１３３】
さらに好ましい実施態様では、このコネクターがその入り口または出口の少なくとも１に関連し、異なる物質、好ましくは非エラストマー性物質で作られた別のマイクロチャネルに関連する。
【０１３４】
別の実施態様では、上記コネクターが、マイクロチャネルによって関連される少なくとも３のオリフィスを有する。興味深いことに、このコネクターはまた、上記コネクター内部の流体の流れを制御するために、その種々のオリフィスの間のピンチパルブまたはペリスタルティックポンプの中に挿入され得る部分を含む。
【０１３５】
上記コネクターは、所望により、成形された断片をまず作製し、次いでそのオリフィスの少なくとも１にエラストマー性チューブを連結することにより作製され得る。また、上記エラストマー性チューブは、その内部表面上に疎水性の層を有する。
【０１３６】
好ましくは、そしてマイクロ流体系においてパケットを操作するために従来使用されているほとんどのマイクロチャネルと対照的に、本発明では、マイクロチャネルの断面が円筒状である。これは、流体または固体物質を保持し、接触角を押さえ、従ってパケット間の汚染の危険を増加させる傾向にある鋭角を回避する。
【０１３７】
本発明はまた、別の局面によれば、マイクロ容器が、
フッ素化されたバルク物質で作られたマイクロ容器、
フッ素化されていないバルク物質で作られ、その周囲全体が永久の絶縁層で被覆された表面を有するマイクロ容器、および
フッ素化されたバルク物質で作られた少なくとも一部分およびフッ素化されていないバルク物質で作られた少なくとも一部分を含み、フッ素化されていないバルク物質で作られた部分がその全周囲を永久の絶縁層で被覆されたマイクロチャネル
から選択されるところのマイクロ容器に関し、上記マイクロ容器が、少なくとも部分的に、パケットと混和しない担体流体で満たされ、上記流体が、上記パケットと上記担体流体との間の表面張力を減少させるのに十分な大きさの濃度の少なくとも１の界面活性剤を含む。
【０１３８】
本発明は、別の局面によれば、少なくとも１のマイクロ容器、特に少なくとも１のマイクロチャネル、およびマイクロ容器と連絡するコネクターを含むマイクロ流体デバイスに関し、上記コネクターが、上記マイクロ容器を別のマイクロ容器の少なくとも１、特にマイクロチャネル、およびデバイスの入口または出口に連結するように構成され、上記コネクターが、少なくとも１の疎水性の層を含む内部表面を有する
【０１３９】
本発明はまた、別の局面によれば、マイクロチャネルを形成する毛細管の一端に取り付けられるように構成されたコネクターに関し、上記コネクターが、少なくとも１の疎水性の層を含む内部表面を有する。
【０１４０】
本発明はまた、別の局面によれば、
マイクロチャネルを含むマイクロ流体デバイス、および
上記マイクロ流体デバイスに取り付けられる、上記に開示したコネクター
を含むキットに関する。
【０１４１】
本発明はまた、別の局面によれば、パケットに少なくとも１の操作を行なうためのキットに関し、上記キットが、
少なくとも１の疎水性物質を含む内部表面を有するマイクロ容器、特にマイクロチャネル、および
上記パケットと混和しない担体流体、ここで、上記担体流体が、上記パケットと、水と混和しない流体との間の表面張力を減少させるのに十分な大きさの濃度の少なくとも１の界面活性剤を含む
を含む。
【０１４２】
本発明はまた、
上記に開示したコネクター、および
上記コネクターに連結された少なくとも１の毛細管
を含むアッセンブリに関する。
【０１４３】
上記コネクターはＴ−コネクターであり得る。
【０１４４】
好ましくは、毛細管が、フッ素化されたまたはシラン化された内部表面を有する。
【０１４５】
本発明はまた、別の局面によれば、ＰＣＲを行なうためのデバイスに関し、上記デバイスは、界面活性剤を含むフルオロ溶媒で少なくとも部分的に満たされた毛細管で作られたコイルを含むマイクロチャネルを含み、上記コイルは、種々の温度に暴露される変性領域、アニーリング領域および伸長領域を含む。
【０１４６】
本発明は、非制限的実施態様の下記詳細な説明を読み、添付する図面を見ることにより一層理解され得る。
【０１４７】
図１は、本発明に従うマイクロ流体デバイスの概略部分図である。
図２は、図１のデバイスの断面の概略図である。
図３は、図２のデバイスの支持部材の概略透視図である。
図４Ａ〜４Ｃおよび５Ａ〜５Ｃは、本発明に従う２つの合体操作の３工程をそれぞれ概略的に示す。
図６Ａ〜６Ｃは、本発明に従う、小滴を等分する３工程を概略的にかつ部分的に示す。
図７は、マイクロチャネルの一部における電場分布の概略図である。
図８は、本発明の１変形に従うデバイスの概略的部分図である。
図９および１３は、本発明の他の変形を概略的にかつ部分的に示す。
図１４は、実施例１１で測定された、フルオロ界面活性剤１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オールとフッ素化オイルＦＣ−４０との間の界面張力をプロットしたものである。
図１５は、本発明に従うセグメント化された流れの中でＤＮＡを増幅するために実施例１２および１３で使用されたサイクルＰＣＲシステムを概略的にかつ部分的に示す。
図１６は、実施例１２に記載された、小滴の列における増幅の生成物のゲル電気泳動である。
図１７は、実施例１３に記載された、近隣の小滴間に汚染が無いことの証明である。
図１８は、未処理、未洗浄のシリコーン毛細管における小滴の形状を示す。（ａ）および（ｂ）は担体流体としてＦＣ４０を用い、（ａ）は初期の小滴であり、（ｂ）はそれより後の小滴（上記列の６０個目より後の小滴）である。（ｃ）〜（ｅ）は種々の濃度のフルオロ界面活性剤溶液を使用し、（ｃ）は０．１５重量％のフルオロ界面活性剤、（ｄ）は０．５重量％のフルオロ界面活性剤、（ｅ）は３．０重量％のフルオロ界面活性剤である（実施例１４Ａおよび１４Ｂ）。
図１９は、アルゴン雰囲気中でシラン化されたシリコーンチューブにおける小滴の形状を示す。（ａ）は７．５体積％のシラン、（ｂ）は５体積％のシラン、初期の小滴、（ｃ）は５体積％のシラン、後の小滴（１００個目より後）、（ｄ）は１体積％のシラン、（ｅ）は０．２５体積％のシランである（実施例１４Ｃ）。
図２０は、空気中でシラン化されたチューブにおける小滴の形状を示す。（ａ）は１０体積％のシラン、５分反応、（ｂ）は７．５体積％のシラン、５分反応、後の小滴の形状（列の１１０個目より後の小滴）、（ｃ）は５体積％のシラン、３０分反応、ＨＣｌ活性化、（ｄ）は５体積％のシラン、３０分反応、プラズマ活性化、（ｅ）は２．５体積％のシラン、３０分反応である（実施例１４Ｄ）。
図２１は、０．５重量％のフルオロ界面活性剤でシラン化されたシリコーン管中での小滴の形状を示す。（ａ）は２．５体積％のシラン、３０分反応、２００個目の小滴、（ｂ）は５体積％のシラン、３０分反応、２００個目の小滴である（実施例１４Ｅ）。
図２２〜２４は、本発明に従う、汚染のないコネクターを概略的にかつ部分的に示す。
【実施例】
【０１４８】
１：本発明の第一の実施態様
図１は、本発明に従うマイクロ流体デバイス１を示し、上記デバイスは、マイクロチャネル２および電極アッセンブリ３を含む。マイクロチャネル２は縦軸Xおよび円形である内部断面を有する。
【０１４９】
電極アッセンブリ３は１対の電極４を含み、各電極４は金属の円柱、例えばアルミニウムを含む。各電極４の長さは例えば４ｍｍであり、内径１．５ｍｍおよび外径１．９ｍｍである。
【０１５０】
電極４は、マイクロチャネル２の周りに置かれ、軸Xに沿ってギャップ６だけ間隔をあけて置かれている。電極４は、電気ワイヤを含む連結要素８によって発電ユニット９に連結されている。
【０１５１】
電極４は、２つの支持部材１１を含む支持体１０に収容されており、各支持部材は、Plexiglas（商品名）で作られた実質的に直方体であり、例えば幅２４ｍｍ、高さ２０ｍｍおよび深さ２０ｍｍを有する。
【０１５２】
第一の円筒形の穴１２（例えば直径１．９ｍｍ）が、電極４を保持するために、支持部材１１の中央でＸ軸に沿って各支持部材１１中に通されている。上記第一の穴１２は、支持部材１１の前方面１３から、前方面１３と向かい合う後方面１４の方へ延びている。
【０１５３】
第二の穴１７は、対応する電極４を発電ユニット９に連結する連結要素８を受け入れるために、第一の穴１２に垂直に通されている。
【０１５４】
各支持部材１１は、それらの軸が穴１２の軸に平行であり、それぞれテフロン（登録商標）スクリュ２２および金属ロッド２３を受け入れるように構成されている２つの穴２０および２１をさらに含んで、穴１２と共に組み立てられた支持部材１１を共線的であるように維持している。
【０１５５】
各電極４は、図２に示されるように、電極４が前方面１３と面一であるように対応する支持部材１１に取り付けられている。
【０１５６】
支持部材１の前方面１３は、例えば２ｍｍ長さだけ間隔をあけて置かれて、電極４の間に２ｍｍのギャップ６を規定している。
【０１５７】
発電ユニット９は、例えば、１ｋHzまでの周波数を有する２ｋVまでの正弦波電圧をデリバリーするように増幅器に連結されたファンクションジェネレータを含む。発電ユニット９は、中央処理ユニット、例えば電極４にデリバリーされる電圧をプログラムによって制御するためのコンピュータをも含み得る。
【０１５８】
図３は、等電位線と共に矢印によって示される電場の方向を図式的に示す。
【０１５９】
分かるように、電場はマイクロチャネル２の軸Ｘと実質的に共線的であり、従って電気合体に有利であり、誘電泳動の影響を最小にする。
【０１６０】
デバイス１は、図１に示されるように、ＣＣＤカメラ３１およびビデオレコーダー３２に連結された双眼顕微鏡３０の観察台上に取り付けることができ、従って、マイクロチャネルでの２つのパケットの崩壊または１つのパケットの分裂のモニターを可能にする。
【０１６１】
デバイスは、崩壊または分裂後にパケットが排出されるように構成され得る。
【０１６２】
２．本発明の第二の実施態様
図８は、２つの複合電極３５を含む電極アッセンブリ３’を示す。各複合電極は、互いに向かい合いかつマイクロチャネル２’を挟む１対の実質的に平行な等電位プレート３６を有し、上記マイクロチャネル２’は矩形断面を有する。各対のプレート３６は、発電ユニット９の各極に連結している。
【０１６３】
３．振動法の例
１実施態様では、小滴流体が、マイクロチャネル２の壁との相互作用を防ぐために０．５重量％の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オール（Fluorochem（商品名））が添加されたフッ素化オイル（FC-40、３M）の担体流体中での観察のために０．２５重量％のブロモフェノールブルーで染色されたＴＢＥ５ｘバッファー（０．４５MのTrisbase（商品名）、０．４５Mのホウ酸および０．０１MのＥＤＴＡ；Sigma（商品名））である。小滴の導電性は３ｍS/cmであり、担体流体の導電性は２．５ｘ１０−１３ｍS/cmである。小滴形成のために、２つの流体が、１．５ｍｌエッペンドルフ管中で、下層が約０．６ｍｌの担体流体（FC-40/１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オール）から成り、上層が約０．６ｍｌの小滴流体（TBE５ｘ/ブロモフェノールブルー）から成るように層にされる。
【０１６４】
マイクロチャネル２は、例えば、担体流体で満たされたHamilton Gas-Tight２５０μｌシリンジを使用して、シリンジポンプ（KD Sientificによる市販）から満たされる。マイクロチャネルにポンプ供給された過剰の流体は、排出物用貯蔵器に集められ得る。毛細管を完全に満たした後、マイクロチャネル２は、層を形成したエッペンドルフ管の担体流体相中に置かれる。ついで、ポンプが１ｍｌ/時の速度で吸引される。担体相と小滴相との間のマイクロチャネルを手動によりまたはマイクロチャネルを機械式発振器に取り付けることにより、例えば約２Hzで振動させることにより小滴が形成される。この方法で形成された小滴はチャネルとほぼ同じ直径を有する。
【０１６５】
４．マイクロチャネル中の小滴を移動させる方法の例
この方法は、上記で定義された任意のデバイスを用いて行なわれ得る。
１つの小滴が、上記した振動法によって形成される。シリンジポンプを使用して、小滴が電極４間のギャップ６中に吸引される。小滴が、上流電極の直前のギャップ部分に到達すると、流れが停止され、系が平衡に落ち着くようにされる。次いで連続電圧がかけられて、小滴に最も近い電極４に正の電圧がかけられ、最も遠い電極が接地される。接地された電極の方への小滴の動きがビデオに記録され得、所与の移動のための時間が測定される。小滴は、電極４間にあるときにのみ移動し、接地された電極下にあるときに停止する。
【０１６６】
５．静的合体の例
静的合体は、上記で定義された任意のデバイスによって行なわれ得る。
小滴は、２つの小滴間の空間が電極４間のギャップ６より大きくなるように上記した振動法によって形成される。最初に、第一の小滴がシリンジポンプを使用して電極４間のギャップ６中に導かれる。小滴が上流電極に到達すると、流れが停止する。上記小滴は、下流電極に達するまで、上記の電場の作動を使用して、先に適用された流れの方向と反対に移動される。流れは、第一の小滴が上流電極に戻るまで再開始する。第二の小滴が電極４間に現れるまで、この手順が繰り返される。電極中におけるマイクロチャネルの位置は次いで、第二の小滴が電極間のギャップ６の外になるように調整される。第一の小滴は、２つの小滴間のギャップが例えば０．５ｍｍになるまで、先に適用された流れの方向と反対に移動される。次いで、マイクロチャネルは、小滴の２つの最も接近した端の間の中点が２つの電極間の中心に置かれ、系が平衡に落ち着くようにされるように再配置される。
【０１６７】
図４A〜４Cに示される例では、第一の小滴４０が約５４０μｍの直径を有し、第二の小滴４１が約５６０μｍの直径を有する。２ｋV、１ｋHzの正弦波電圧を電極４にかけると、最初の小滴の移動は一様であり、小さい方の小滴４０がわずかに速い速度で移動する（図４Aおよび図４B）。小滴４０および４１が接近すると、それらは急速に加速し、介在する膜を排出する（図４C）。これは、デバイス１が、最初に互いに接近する小滴の本質的に瞬間の合体を提供することを示し、例えば２つの小滴が同時にT-交差点に到達した後に生じる。
【０１６８】
６．インフライト合体の例
インフライト合体は、上記で定義された任意のデバイスによって行なわれ得る。
第一の小滴４３は約５８０μｍの直径を有し得、第二の小滴は約５６０μｍの直径を有し得る。
【０１６９】
小滴が位置された後、両方の小滴が電極４間のギャップ６の外になるようにマイクロチャネルが移動される。次いで、２ｋV、１ｋHzの正弦波電圧が２ｍｍの間隔で置かれた電極にかけられ、実験の間ずっと保たれる。電場がかけられた後、５０μL/時のシリンジポンプによる吸引によって流動が開示される。
【０１７０】
小滴４２が電極４間のギャップ６に入り、小滴４３の不存在下で一定速度で移動する（図５A）。１３秒後に小滴４３の先導界面が現れるが、小滴４２には影響を及ぼさない。追跡する小滴が電極間のギャップ６の中に十分入ったときにのみ、誘電力が現れる。その後、合体時間は、このような広く分離した小滴の場合には、静的合体の場合と本質的に同じである（約８秒）が、動力学は、流動故にわずかに異なる。誘電力は、小滴４２を停止するのに十分強く（図５B）、その後、小滴４３が一定速度で小滴４２の方に移動し、静的合体の場合と本質的に同じ速度でその距離を詰める。小滴が互いに接近すると、強い誘電力が介在する流体を排出し、合体が達成される（図５C）。
【０１７１】
７．小滴分裂の例
単一の大きい小滴４６が、上記したように、しかしより低い振動数で界面を振動させることにより形成される。小滴４６が、シリンジポンプによる吸引によって電極間のギャップ６に導入される。（図６A）。本実施態様で描かれた小滴は、２．５ｍｍの長軸を有する楕円体である。２ｋV、０．１Hzの矩形波電圧をかけると、小滴４６が２つのより小さく安定な小滴４７に分裂し（図６Ｂおよび６Ｃ）、それらはギャップ６から放出される。
【０１７２】
汚染のない小滴分裂、すなわち、１つの大きい小滴を付随小滴を何ら形成することなく２つのより小さく安定な小滴に分裂すること、を達成するための典型的な操作条件は、０．１〜１Hzの周波数および１ｋV〜２ｋVの振幅を有する矩形波電圧にあり得る。そのような条件下では、小滴が１分未満で分裂し得る。最も低い電圧がかけられると「最もきれいな」分裂が得られるが、より時間がかかり得る。小滴の長さは、ギャップ６の長さ程であり得る。
【０１７３】
８．本発明の他の実施態様
図９および１０に示されるように、電極４間のマイクロチャネル部分５０は、横断チャネル５１とＴ交差を形成し得る。電極４間の電場によって引き起こされる小滴の合体後、得られる小滴５２は、横断チャネル５１中で、例えば横断チャネル５１に連結されたシリンジポンプを使用することによって駆動され得る。
【０１７４】
図１１および１２に示されるように、小滴分裂は、２つの電極４間に電場をかけることにより比較的大きい塊の流体５４から小滴５３を引き抜くことにより行なわれ得る。
【０１７５】
従って、小滴５３は、例えば電極４をプログラムによって制御することにより、所望のときに形成され得る。
【０１７６】
９．本発明の別の実施態様
図１３は、本発明に従うデバイス６０を示し、上記デバイス６０は、部分６２において第一および第二のサイドチャネル６３および６４に連結したマイクロチャネル６１を含む。
【０１７７】
部分６２は例えば、マイクロチャネルの実質的に中央に位置され得る。
【０１７８】
この実施態様では、マイクロチャネル６１が約１００μｍの厚さおよび約３００μｍの幅を有し得、サイドチャネル６３は約１００μｍの厚さおよび約５０μｍの幅を有し得る。
【０１７９】
サイドチャネル６３は、ヘキサデカン中のオレイン酸およびＳＤＳの界面活性剤の溶液を臨界ミセル濃度より上の濃度で含む貯蔵器６７を有するシリンジポンプを含むデリバリー系６６に連結されている。
【０１８０】
マイクロチャネル６１は、水性小滴のマイクロチャネル壁との相互作用を回避するように調整された濃度のＳＰＡＮ（商品名）８０を含むヘキサデカンを含む溶液で満たされている。
【０１８１】
サイドチャネル６４は、溶液をマイクロチャネル６１から吸引するように構成された吸引モードのシリンジポンプ６８に連結されている。
【０１８２】
５ＸＴＢＥバッファーの２つの小滴７０が、マイクロチャネル６１中にその両端によって導入され、そして移動される。両端による小滴７０の吸引は、小滴７０が両側から同時に部分６２に到達するように同時に進行される。小滴７０が部分６２にあるとき、貯蔵器６７中に含まれる界面活性剤の溶液が、小滴７０が合体するような所定の流速で、デリバリー系６６によってマイクロチャネルの部分６２に運ばれる。最適流速は、小滴が各衝突で合体するまで流速を徐々に増加させることにより決定され得、それが最適流速を定める。
【０１８３】
別の実施態様では、界面活性剤の溶液が、連結部分６２への小滴の対の到着と同期したパルスでデリバリーされ得る。
【０１８４】
得られる小滴７１は、更なる使用のためにシリンジポンプ６８に集められ、または例えば検出のために別のマイクロチャネルに運ばれる。
【０１８５】
１０．フルオロポリマー毛細管中に含まれるフッ素化オイル中での規則的な配列の水滴の形成および輸送の例
小滴の列は、電気ピンチバルブ（NResearch、Caldwell NJ）に連結されたＹ−コネクター（Upchurch Scientific）を使用して作られる。Ｙ−コネクターへの１つの入り口は、観察を容易にするために０．２５重量％のブロモフェノールブルーで染色されたＴＢＥ５Ｘバッファー（０．４５ＭのTrisbase、０．４５Ｍのホウ酸および０．０１ＭのＥＤＴＡ、Sigma）で満たされた。Ｙ−コネクターの他の側および試験毛細管（ＰＦＡ、内径８００μｍ、Upchurch Scientific）は、バルク（bulk）フッ素化オイルＦＣ−４０（３Ｍ）または種々の量のフルオロアルコール界面活性剤（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オール、Fluorochem）を含むＦＣ−４０で満たされた。小滴の列は、コンピュータで制御されるHarvardミリリットルモジュールシリンジポンプによって吸引しながらLabViewプログラムによるエレクトロバルブの反復（サイクル）を行うことにより作られた。典型的なサイクルは、ＴＢＥラインからの吸引を６秒およびＦＣ−４０ラインからの吸引を８秒行なうことから成る。小滴は、双眼顕微鏡（オリンパス）によって観察され、ＣＣＤカメラ（日立）およびWinＴＶを使用して記録された。
【０１８６】
流体系における小滴列の安定性が最初に試験される。セグメント化流ＰＣＲ（segmented flow PCR）に関する先の研究では、小滴間のクロス汚染が、小滴の不安定性および小さい付随小滴の形成に起因された。個々の小滴における小滴破損を捜すだけでなく、数百の小滴を含む小滴列の全体の安定性を観察することが望まれた。そのような列の安定性は、本発明者らの技術の高処理量用途のために必須である。
【０１８７】
小滴が純粋なＦＣ−４０に引きずられるとき、それらが壁に固着することが時折あることが観察された。これは予期しなかったことである。なぜならば、壁と担体流体の両方がフッ素化されており、壁はＦＣ−４０によって強く濡らされるであろうことが予期されたからである。固着は、押出し工程によって製造されるバルク毛細管において予期されるであろう、毛細管壁における欠陥（粗さまたは化学的不均一性）に帰された。小滴と毛細管壁の間のＦＣ−４０の層は非常に薄く、壁表面への小さい混乱（perturbation）は、潤滑性を乱し得た。いずれにしても、１つの小滴が壁上に引きずられると、たとえ一時的であっても、列は全体としてその安定性を失う。追跡する小滴は引きずられた小滴と衝突し、流体を交換し、引きずられた小滴は壁から放出され、追跡する小滴は引きずられるようになる。このプロセスは永久に進行し、任意のＰＣＲ用途において破滅的であろう。
【０１８８】
そのとき、フルオロアルコール界面活性剤が０．５〜３．０重量％の範囲でＦＣ−４０に添加される。２００個を超える小滴を含む列を作った後、壁への一時的な付着、付随する小滴の形成および小滴列における不安定性のいずれも観察されない。
【０１８９】
１１．水滴とフルオロ界面活性剤を含む溶媒との間の界面張力の測定
界面張力の測定を、自家製の小滴−体積張力計を使用して行なった。ＦＣ−４０／界面活性剤滴が、０．８ｍｍＩＤテフロン（登録商標）毛細管からＴＢＥ５ｘバッファーの貯蔵器中へ分配される。５０μＬのHamilton気密シリンジおよびHamiltonＰＳＤ／２シリンジポンプを最大分解能で使用して、小滴体積を、工程間の一時的な待ち時間を伴って２５ｎＬの増加量で増加することができた。界面活性剤の平衡を可能にするために、典型的には工程間で３０秒待った。張力測定は、少なくとも１５個の異なる小滴の平均であり、テフロン（登録商標）先端の濡れに関して補正される。
【０１９０】
１２．バルクフルオロポリマーで作られたチャネルを含む、本発明に従うデバイスでのＤＮＡのＰＣＲ増幅の例
ＰＣＲデバイス８０を図１５に示す。上記デバイス８０は、変性８２、アニーリング８３および伸長８４領域に対応する３ピースに機械加工された直径４ｃｍの銅シリンダ８１を含む。伸長領域８４は、他の２つの領域の大きさの２倍であり、従って、シリンダ８１の半分を占める。３つの領域は、ポリカーボネートシート８５によって互いに分離されており、シートは銅シリンダのピース間に添えられている。ヒーターの２つの端はポリカーボネートシリンダによってキャップされて構造的安定性を付与し、一方、２つのゾーンの間の分離を保持している。１／４シリンダにつき３つの小さい穴８８が、デバイス全体を通って開けられて空気冷却のためのベントを付与する。２つの小さい穴８９（熱電対用）および１つの大きい中央の穴９０（ヒーター用）が各温度領域においてシリンダを通って部分的に開けられている。ヒーターおよび熱電対は、ヒーターの空気冷却側には通じていない。各領域は、銅シリンダのそれぞれの領域と接触するアルミニウムホイルの薄い層で被覆されて上からの加熱を付与する。ホイル層は、ポリカーボネートのシェルおよび木綿の層によって被覆され、それによってシリンダを絶縁し、毛細管を横切る均一な温度を付与する。小さいタービンが、１／４シリンダにつき３つの換気孔を通って環境空気を送り、より良好な温度制御および均一性を可能にする。
【０１９１】
各領域は、抵抗ヒーターおよび２つのＰｔ−１００熱電対を含む。抵抗ヒーターは、それぞれのゾーンの中央に位置され、一方、熱電対はゾーン間の界面近くに位置される。加熱要素および熱電対は慣用のエレクトロニクスに連結される。熱電対は、Keithley２７０１マルチメーターを介して、LabViewに書かれた慣用のＰＩＤプログラム制御と連絡する。各ゾーンの温度は一時的に設定され得る。ここで検討される実験に関して、９４℃の変性温度、５５．５℃のアニーリング温度よび７２℃の伸長温度が使用された。本発明者らの設計により、各ゾーンを横切る±０．２℃の温度差が達成される。
【０１９２】
４．５ｍ長さの透明なＰＦＡ毛細管９２（内径８００μｍ、Upchurch Scientific）が変性領域中の溝を通ってシリンダに入り、約１分の最初の変性工程を付与する。次いで、毛細管がシリンダの周りに３５回巻きつけられ、これは３５ＰＣＲサイクルに対応する。毛細管は延長セグメント中の穴を通ってヒーターを出て行き、３５回目のサイクル上で約３０秒の更なる延長を付与する。
【０１９３】
ＰＣＲ増幅：鋳型はLitmus 28i （New England Biolabs）の２８２３塩基対のＤＮＡ断片である。この断片が、Eurogentecプライマー（下流プライマー５’−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＧＣＧ−ＧＴＡ−ＴＣＴ−ＡＧＡ−ＡＣＣ−ＧＧＴ−ＧＡＣ−ＧＴＣ−３’、上流プライマー５’−ＡＧＣ−ＴＴＧ−ＧＡＧ−ＣＧＡ−ＡＣＧ−ＡＣＣ−３’、Eurogentech Oligold）を使用して塩基２００８から塩基２５８０までの５７２塩基対に関して増幅される。５０μＬのＰＣＲミックスが、Ready Mix Taq 反応混合物（Sigma）を使用して製造者の取り扱い説明書に従って最大濃度の鋳型およびプライマーを用いて調製される。
【０１９４】
担体流体は、０．５〜１．０重量％のフルオロアルコール界面活性剤（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロデカン−１−オール、Fluorochem）を含むバルクフッ素化オイルＦＣ−４０（３Ｍ）である。界面活性剤は、毛細管壁への小滴の一時的吸着を防ぐ。２μＬの水性小滴が、HamiltonＰＳＤ／２ポンプおよび１００μＬのHamilton気密シリンジを使用して毛細管の出口からの吸引により入り口に注入される。小滴は、５μＬのＦＣ−４０スペーサーによって互いに分離される。所望の数の小滴を注入した後、出口がHamiltonポンプから外され、次いで入り口が、５ｍｌのHamilton気密シリンジを有するコンピュータ制御されるHarvardミリリットルモジュールポンプに連結される。小滴は、０．１ｃｍ/秒で循環される。
【０１９５】
小滴が出口で集められ、０．５ｘＴＡＥバッファー中の１重量％アガロースゲル上でゲル電気泳動により分析される。対照の増幅サンプルが、９４℃で１分の１サイクル、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分の３５サイクルを有する古典的なPCRサーマルサイクラー（Perkin Elmer）中で５０μLのＰＣＲミックスの残りの体積を増幅することにより作られる。これは、本発明者らの連続流ＰＣＲにおける循環に似ているが、加熱および冷却に関する時間のずれがあり、上記古典サイクラーは、全増幅が本発明らの流体デバイスの約２倍時間がかかることを意味する。増幅された対照系の２μLアリコートがゲル電気泳動のために使用される。
【０１９６】
５小滴の列が作られ、各々がＰＣＲミックスおよび鋳型を含む。全小滴におけるこの成功した増幅の結果を図１６に示す。レーン１：１ｋｂｐのＤＮＡはしご（New England Biolabs）、レーン２：ＤＮＡを有するミックスの２μL対照サンプル、レーン３：小滴１、レーン４：小滴２、レーン５：小滴３、レーン６：小滴４、レーン７：小滴５。
本発明に従うデバイスにおける増幅（レーン３〜７）の程度は、慣用のサーマルサイクラーにおいて得られたもの（レーン２）に匹敵し得る。
【０１９７】
実施例１３：バルクフルオロポリマーで作られたチャネルにおける小滴間の汚染の研究
系が、小滴間の交差汚染に関して試験された。全条件は実施例１２と同じであるが、２つの別個のＰＣＲミックスが作られる。第一のミックスは鋳型、プライマーおよびReady Mix反応混合物を含み、第二のミックスは、何ら鋳型を有しないことを除いて同じである。５つの小滴が吸引され、第３の小滴のみが鋳型を含む。先端からの汚染を回避するために、先端が、各小滴の注入間に蒸留水で洗浄された。図１７は、この実験からのゲル電気泳動結果を示す。レーン１：１ｋｂｐのＤＮＡはしご（New England Biolabs）、レーン２；ＤＮＡを有しないミックスの５μL対照サンプル、レーン３：ＤＮＡを有するミックスの２μL対照サンプル、レーン４；小滴１（鋳型なし）、レーン５：小滴２（鋳型なし）、レーン６：小滴３（鋳型あり）、レーン７：小滴４（鋳型なし）、レーン８：小滴５（鋳型なし）。種々の小滴間に認められ得る汚染はない。何らかのＤＮＡ増幅を示す唯一の小滴は、ＤＮＡを含む第３小滴である。
【０１９８】
実施例１４：フッ素化物質の層を有するコーティングを有するおよび有しない、非フッ素化物質で作られたチャネルでの小滴輸送の例
この一連の実施例では、マイクロチャネルが、Cole Parmerによって市販されているシリコーンチューブ（内径０．８ｍｍ）で作られる。担体流体はＦＣ−４０（３Ｍ）であり、小滴は、水性バッファーＴＢＥ５ｘで作られる。全ての場合において、小滴の列は、実施例１３に記載されたものと同じプロトコルに従って作られ、チューブにおける小滴の形状および移動が、双眼鏡およびＣＣＤカメラを用いて直接観察され写真に撮られた。
【０１９９】
１４Ａ：未処理シリコーンチューブでの純粋なＦＣ４０中のＴＢＥの小滴
いくつかの場合において、長球形状を有する小滴が現れた（図１８ａ）。これは、壁が濡れていなかったことを示す。しかし、数百の小滴を有する小滴列を形成した後、壁が、列の間の何らかの点において濡れてきた（図１８ｂ）。いくつかの場合には、第一の小滴が図１ｂのように見えた。いくつかの場合に観察された最初の濡れていない挙動は、製造プロセスからの残留生成物によると推定された。多くの小滴が系を移動されると、この未知の生成物が壁から除去される。この仮説をテストするために、チューブが５体積の蒸留精製水で洗浄される。その後、最初の小滴は常に図１８ｂのような挙動を有する。その後の全ての実験のために、チューブはいつも５体積の蒸留精製水で洗浄されて初期条件における変動を除去する。
【０２００】
１４Ｂ．未処理のシリコーンチューブにおける、フルオロ界面活性剤が添加されたＦＣ４０中のＴＢＥの小滴
小滴の挙動を、種々の重量％のフルオロ界面活性剤、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカン−１−オール（Fluorochem）、の添加を用いて試験する。上記界面活性剤は小滴とＦＣ−４０との間の界面張力を低下させるが、固体−液体張力には影響を与えない。その結果、小滴は不安定にされ、多くの小さい小滴に壊れる（図１８ｃ、ｄ、ｅ）。崩壊の性質は、界面活性剤濃度に依存するが、フルオロ界面活性剤の極めて低いレベルでさえ、小滴はなおも不安定である。
【０２０１】
１４Ｃ．アルゴン雰囲気中でのシラン化によって処理されたシリコーンチューブにおける、フルオロ界面活性剤が添加されていないＦＣ４０中のＴＢＥの小滴
チューブが、アルゴン雰囲気中で分離されながらシラン化された。少量の１ＮのＨＣｌ（Sigma）がホットプレート上で約６０℃に加熱された。きれいなシリコーンチューブの一端が、チューブの少なくとも２倍の体積のシリンジに連結され、他端が温かいＨＣｌ溶液中に置かれた。ＨＣｌが、シリンジが部分的に満たされるまでチューブ中に吸引された。ＨＣｌが５分間チューブ中に放置され、その間、シリンジポンプを時折振動させて局部的混合を付与した。次いでＨＣｌがチューブから排出され、チューブが、アルゴン流によって乾燥された。次いで、新しいシリンジをチューブの一端に連結し、チューブの他端をフルオロシランおよび顕微鏡用メタノール（Sigma）の溶液中に入れた。フルオロシランは通常、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロオクチルトリメチルシラン（Fluorochem）である。１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデシルトリエトキシシラン（Fluorochem）も試験され、本質的に同じ結果が達成される。ここに示される全ての結果は、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロオクチルトリメチルシラン（Fluorochem）に関するものであり、その使用の選択は、それがあまり高価でないからである。シラン溶液がチューブ中に吸引され、５分間放置される。その間、シリンジポンプを時折振動させて局部的混合を付与する。シラン溶液がチューブから排出され、チューブがアルゴン流によって乾燥された。乾燥されたチューブは次いで、１１０℃のオーブン中に約２０分間置かれて、シランを固定した。次いで、チューブを数体積のメタノールおよびＦＣ−４０で洗浄した後、小滴の試験を行なった。
【０２０２】
アルゴン中でシラン化されたチューブ中での小滴の結果を図１９に示す。７．５より大きい体積％の場合には、少なくとも２００の小滴を含む列に関して付着は認められなかった。５体積％では、小滴は最初、濡らさないように見えたが、ついには壁に付着した。より低い体積％では、小滴はいつも壁を濡らした。結論として、反応がアルゴン下で行なわれるとき、安定で濡らさない表面を形成するために、７．５体積％のフルオロシランが必要である。
【０２０３】
１４Ｄ．空気雰囲気中でのシラン化によって処理されたシリコーンチューブにおける、フルオロ界面活性剤が添加されていないＦＣ４０中のＴＢＥの小滴
シラン化手順を簡単にするために、チューブを空気中でシラン化する。純粋なシランをより良好に保つために、シラン／メタノール混合が最初にアルゴン中で行なわれるが、反応の残りはその後、本質的に上記と同じプロトコルを使用してフード中で行なわれる。シランの体積％およびシランをチューブと反応させた時間（反応時間）が変えられる。一例では、ＨＣｌ活性化工程がプラズマ活性化で置き換えられる。
【０２０４】
１０体積％のシランおよび５分の反応時間の場合には、空気中でのシラン化は、アルゴン中での場合と区別できなかった（図２０ａ）。７．５体積％のシランおよび５分の反応では、小滴が最初、濡らさないように見えたが、ついには壁を濡らした（図２０ｂ）。５体積％のシランでは、小滴がなおも壁を濡らすが、反応時間が３０分に延ばされると、小滴が列全体にわたって濡らさないことがわかった（＞２００の小滴、図２０ｃ）。同じパラメータ（５体積％のシラン、３０分の反応）が試験されるが、チューブは、それをＨＣｌで満たすよりもむしろ、１分間プラズマ中に置かれる。図２０ｄに見られるように、プラズマ活性化は、濡れない表面を生じなかった。プラズマは活性化のためにチューブ全体にわたって拡散しなければならないので、チューブを通ってポンプ供給され得るＨＣｌによる液体活性化よりも効率が小さい。３０分の反応時間を保持しながら、シラン濃度を２．５体積％にさらに低下させて試験した。図２０ｅに見られるように、壁はわずかに濡れている。
【０２０５】
空気中でのシラン化は、アルゴン中におけるよりも均一でないコーティングを表面上に生じる。なぜならば、空気中の水が、活性化された表面部位のためのシランと競合するからである。本質的に、空気中でのシラン化は、アルゴン中でのシラン化ほどには水−固体張力を低下させない。しかし、空気によるプロトコルは、行なうのがより簡単であり、自動化に従い易い。
【０２０６】
１４Ｅ．空気雰囲気中でのシラン化によって処理されたシリコーンチューブにおける、フルオロ界面活性剤が添加されたＦＣ４０中のＴＢＥの小滴
ＦＣ４０／水張力を強く低下させるフルオロ界面活性剤が、空気中でシラン化された表面から生じる不均一性を克服するために（および付随して水−固体張力を低下させるために）十分であるかどうかを検討した。図２１に示されるように、小さい濃度の界面活性剤（０．５重量％）が、２００の小滴の列を形成した後でさえ、２．５体積％のシランおよび５体積％のシランの両方において濡らすことを防ぐのに十分である。
【０２０７】
実施例１５．実施例１４で調製された本発明に従うデバイスにおいて輸送された小滴間におけるＤＮＡによる汚染の定量的ＰＣＲによる検証
付着されない小滴の形状が汚染をもたらさないかどうかを試験するために、種々の小滴におけるＤＮＡ濃度の感覚的試験をするための定量的ＰＣＲを使用して１組の実験を行なった。
【０２０８】
チューブをこれらのプロトコルの１つに従って作製した。
１．シランなし：チューブを単に数倍体積の蒸留水で洗浄した。担体流体は、実施例１４Ａに従って調製されたＦＣ−４０（３Ｍ）である。
２．シラン：チューブを洗浄し、次いで、実施例１４Ｄにおけるプロトコルに従って５体積％のシランおよび３０分の反応時間を用いて空気中でシラン化した。担体流体はＦＣ−４０である。
３．シラン＋界面活性剤：チューブを洗浄し、次いで実施例１４Ｅにおけるプロトコルに従って空気中でシラン化した。担体流体は、０．５重量％の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカン−１−オールを有するＦＣ−４０である。
４．バルクフルオロポリマー＋界面活性剤：小滴列が、実施例１３に従って調製される。テフロン（登録商標）毛細管が、製造者によって供給されたように使用された。担体流体は、０．５重量％の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロデカン−１−オールを有するＦＣ−４０である。
【０２０９】
チューブの一端がＹ−コネクターに連結され、Ｙ−コネクターの出口が電気ピンチバルブを使用して選択された。１つの出口はHarvardミリリットルモジュールシリンジポンプおよび５ｍｌのHamilton気密シリンジに通じ、第二の出口は１００μＬのHamilton気密シリンジを有するHamiltonＰＳＤ／２シリンジポンプに通じる。Hamilton ＰＳＤ／２は、小滴の全てを（吸引によって）作るためまたは小滴をチューブから（ポンプにより）分配するために使用された。Hamiltonミリリットルモジュールは、チューブ内での小滴振動のために使用された。各実験の前に、毛細管が担体流体によって完全に満たされ、開いた端が担体流体の貯蔵器中に置かれた。
【０２１０】
小滴は、Gold Taqポリメラーゼ酵素（Applied Biosystems）、ｑＰＣＲコア試薬キット（Eurogentec）、特異的プライマーおよび蛍光プローブ（３’−ＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧＡＧＣＣＣＡ−５’、Applied Biosystems）を含む定量的ＰＣＲのためのTaqman ＰＣＲミックスの混合物である。「ミックス」サンプルは、鋳型を除いてＰＣＲのための成分の全てを含む。「ＤＮＡ」サンプルは、細胞系Ａ５４９から単離されたｃＤＮＡを６．２５ｎｇ／μｌの濃度で含む。断片が、Proligoプライマー（上流プライマー：３’−ＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴ−５’、下流プライマー：３’−ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣ−５’）を使用してＲＰＬＰＯ遺伝子に対応する１４９ｂｐ上で増幅される。各実験のために２つの貯蔵器を作った。一方は各対照小滴のために十分なミックスを有し（典型的には３０μｌ）、他方はｃＤＮＡ小滴のために十分なミックスおよび鋳型を有する（典型的には２２μｌ）。
【０２１１】
下記手順によって注入の間の汚染が試験された。ＤＮＡ貯蔵器から２μｌが吸引され、次いで担体流体貯蔵器から４μｌが吸引された。次いで先端が、それを蒸留水の貯蔵器に浸漬し、そしてChemWipeによって乾燥することにより洗浄された。続いて、ミックス貯蔵器から２μｌを、担体流体貯蔵器から４μｌを吸引することにより５つの小滴が形成された。全ての小滴が形成された後、手順を逆にし、各小滴を別個のエッペンドルフ管に集めた。エッペンドルフ管は定量的ＰＣＲの前に−８０℃で保管された。
【０２１２】
各小滴の中身をTaqman７７００ｑＰＣＲ機（Applied Biosystems）上で定量的ＰＣＲによって分析した。これらの実験において、３５の値は、小滴中に検出できる量のｃＤＮＡがなかったことを示し（すなわち、増幅の３５サイクルが、ノイズ閾値より上の蛍光信号を有しない）、各整数増加は、ｃＤＮＡ量における半減に対応する。
【０２１３】
表１は、入り口汚染実験の結果を示す。未処理毛細管には、小滴の形状から予期されるように、有意な汚染があった。シラン化された毛細管にも汚染があった。しかし、ミックス貯蔵器では汚染はなかったので、汚染は、毛細管内部での小滴輸送から生じると結論できる。フルオロ界面活性剤を有するシラン化された毛細管では、最初の洗浄小滴に何らかの汚染が観察され、ミックス貯蔵器に同等の汚染が観察された。このことから、汚染は輸送中に先端で生じ、また、ＤＮＡ小滴の吸引後の先端のより激しい洗浄が、シラン化された毛細管およびフルオロ界面活性剤を使用する入り口での汚染の除去に十分であると考えられる。
【０２１４】
次いで、小滴が輸送されている間の汚染を防ぐための、フルオロ界面活性剤およびシラン化された毛細管の能力を試験した。フルオロ界面活性剤およびシラン化された毛細管を使用する上記と本質的に同じ吸引手順を使用して、最初に２つのミックス小滴を作り、次いで１つのｃＤＮＡ滴を、次いで２つのミックス小滴を作った。ここでの注入プロトコルと上記プロトコルとの違いは、ここでは、先端での汚染を減少させる目的で、ＤＮＡ滴を注入した後に２つの別個の蒸留水貯蔵器中で先端を洗浄したことである。手順の終わりに、２μｌのｃＤＮＡ滴がその両側に２つの２μｌミックス小滴を有し（対照１および２：先導、対照３および４：追跡）、ここで、各小滴は４μｌの担体流体だけ間隔をあけて置かれた。
【０２１５】
次いで、Olympus双眼顕微鏡の下に置かれた毛細管のまっすぐな部分に小滴があるように、Harvardミリリットルモジュールを使用して吸引した。コンピュ−ター制御を使用して、小滴が毛細管中で１ｍｍ／秒の平均速度で５ｃｍ引っ張られ、次いで１ｍｍ／秒の平均速度で５ｃｍ押されるようにHarvardミリリットルモジュールを振動させ、その結果、１回のサイクルは小滴のネット移動を生じなかった。そのようなサイクルを５０回行った。その結果、小滴が運ばれる合計距離（５ｍ）は本発明者らの連続流ＰＣＲ機で必要とされる距離に匹敵し得る。５ｍの毛細管の中で小滴を一定速度で押すことよりも、小滴を振動させることにより、高処理量操作での条件をシミュレートする。小滴を顕微鏡で時折観察して、小滴が壁を濡らしていないことを確認した。
【０２１６】
５０サイクルを完了した後、小滴を個々のエッペンドルフ毛細管に集めた。各小滴を排出した後、蒸留水の２μｌ洗浄小滴を吸引して先端をきれいにした。洗浄小滴も集められた。全ての小滴およびミックス貯蔵器が、上記定量的ＰＣＲによって分析された。
【０２１７】
表２は、定量的ＰＣＲの結果を示す。対照滴のいずれにも検出できる汚染はなかった。さらに、洗浄小滴において検出できる汚染はなかった。ミックス貯蔵器には何らかの汚染があったが、これは、対照小滴のいずれにも汚染をもたらさなかった。フルオロ界面活性剤およびシラン化された毛細管の組み合わせは、高処理量用途において汚染を防ぐために十分であると結論される。
【０２１８】
テフロン（登録商標）毛細管およびフルオロ界面活性剤を使用して本質的に同じ振動実験を行なった。唯一の違いは、この実験では、小滴を集めるときに先端を洗浄しなかったし、余分の洗浄小滴を使用しなかったことである。
【０２１９】
テフロンチューブおよびフルオロ界面活性剤を用いた結果を表３に示す。入り口汚染試験に見られるように、ミックスでの汚染はない。これは、洗浄が先端からのＤＮＡの除去に十分であることを示す。小滴２にはなんらかの汚染がある。この汚染は、小滴を集めるときに先端を洗浄しなかったことによると考えられる。小滴２は、ｃＤＮＡ滴の直後に系を出る。ｃＤＮＡ滴の小さい部分が先端表面における不完全性の上にひきずられていき、それが次いで小滴２に運ばれた可能性が考えられる。自動化された小滴収集またはインライン検出手順はこの汚染源を除去するべきである。
【０２２０】
【表１】
2015096257.tif 000003
【０２２１】
【表２】
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【０２２２】
【表３】
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【０２２３】
実施例１６．汚染のないＴ−コネクターの設計および組み立て
この実施例は、ピンチバルブの使用に匹敵し得る３つの異なる入り口を汚染なしに連結することを可能にする非常にデッド体積の低いＰＤＭＳ  Ｔ−コネクター１００の概念を説明する。
【０２２４】
コネクター１００は、１：１０の割合の硬化剤を用いてＰＤＭＳ（ＫＯＤＡＫ  ＳＹＬＧＡＲＤ  １８４）で作られる。コネクター１００を製造するために使用された型１０１はＰＭＭＡ平行六面体（内部長さおよび幅９ｍｍ、内部高さ８ｍｍ）である。内径８００μｍの穴１０２が平行六面体の３つの面１０３の中央に開けられる。テフロン（登録商標）毛細管１０５（外径８００μｍ）の第一の５ｍｍピースが３ｃｍ長さの第二テフロン（登録商標）毛細管（外径１．５ｍｍ、内径８００μｍ）の端の内部に導入され、１．５ｍｍ上に突き出る。３つのピースがこのようにして作られ、導入され、そして互いに向き合う小さい方の管によってＴ字を形成するように平行六面体の内部に保持される（図２２を参照）。次いで、ＰＤＭＳ１０６が２０分間脱ガスされ、そのように構成された型に注がれ、６５℃のオーブンに３時間置かれた。
【０２２５】
３時間後、テフロン（登録商標）ピース１０４および１０５がそれらを静かに引っ張ることにより外され、得られたＴ−コネクターが型１０１から取り出される。Ｔ−コネクター１００は、３つの部分１０８を有する。各部分は互いに従う同軸円筒状中空部分を含み、外側部分１１０は３ｍｍの長さおよび１．５ｍｍの直径を有し、内側部分１１１は１．５ｍｍの長さおよび８００μｍの直径を有する。次いで、シリコンゴム（Dow Corning）でコーティングされた５ｃｍシリコーン毛細管１０９（Cole-Parmer；外径１．８ｍｍ、内径８００μｍ）がＴ−コネクターの各穴の３ｍｍ上（外側の円筒形に対応する）に導入され、コネクターは、ＰＤＭＳ  Ｔの入り口近くの管の周囲にさらにゴムを添加することにより強化される。シリコンおよびＰＤＭＳの弾性故に、１．８ｍｍ外径のシリコーン管をＴの１．５ｍｍ直径の穴に押し込むことが可能であり、したがって、接合を良好に固定する。得られたコネクターは上記オーブンに２時間入れられる。
【０２２６】
シリコーン毛細管を有するＴ−コネクター１００は、実施例１４に記載された方法によってさらにシラン化される。この方法により、非常に小さいデッド体積を有しかつ高圧下ですら漏出のない固体コネクターが得られる。さらに、シリコーン管の使用は、デッド体積のないピンチバルブの使用を可能にする。
【０２２７】
適用例
本発明に従って作られるデバイスは、例えば以下を行なうために使用され得る。
混合、
核酸のスクリーニング、
核酸の増幅、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル型増幅による核酸の増幅、
ＲＮＡ逆転写、
遺伝子型の決定、
プロテオミクス分析、
トランスクリプトーム分析、
結晶化および特にたんぱく質の結晶化、
医薬標的、薬学的ヒットまたは糸口、または薬物の探索および評価、
酵素−たんぱく質反応、
抗原−抗体反応、
化学的または生物学的生成物のライブラリーのスクリーニング、
高処理量スクリーニング、
薬物デリバリー、
診断、
少なくとも１の生きた細胞または死んだ細胞の分析または溶解、
微生物の分析、
化学反応、
反応性触媒反応、
重合反応、
鎖を形成するために粒子、例えばコロイド、を融合すること、
コロイド、エマルジョン、小胞、特に単分散コロイド状物体の調製、
ナノ粒子またはミクロ粒子の調製、
環境制御、
汚染物の検出、および
工業的プロセスの制御。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】図１は、本発明に従うマイクロ流体デバイスの概略部分図である。
【図２】図２は、図１のデバイスの断面の概略図である。
【図３】図３は、図２のデバイスの支持部材の概略透視図である。
【図４】図４のＡ〜Ｃは、本発明に従う合体操作の３工程を概略的に示す。
【図５】図５のＡ〜Ｃは、本発明に従う合体操作の３工程を概略的に示す。
【図６】図６のＡ〜Ｃは、本発明に従う、小滴を等分する３工程を概略的にかつ部分的に示す。
【図７】図７は、マイクロチャネルの一部における電場分布の概略図である。
【図８】図８は、本発明の１変形に従うデバイスの概略的部分図である。
【図９】図９は、本発明の他の変形を概略的にかつ部分的に示す。
【図１０】図１０は、図９における小滴が合体する図を概略的に示す。
【図１１】図１１は、本発明の他の変形を概略的にかつ部分的に示す。
【図１２】図１２は、図１１における小滴が分裂する図を概略的に示す。
【図１３】図１３は、本発明の他の変形を概略的にかつ部分的に示す。
【図１４】図１４は、実施例１１で測定された、フルオロ界面活性剤とフッ素化オイルとの間の界面張力をプロットしたものである。
【図１５】図１５は、実施例１２および１３で使用されたサイクルＰＣＲシステムを概略的にかつ部分的に示す。
【図１６】図１６は、実施例１２におけるゲル電気泳動の結果を示す。
【図１７】図１７は、実施例１３におけるゲル電気泳動の結果を示す。
【図１８】図１８は、実施例１４Ａおよび１４Ｂにおける小滴の形状を示す。
【図１９】図１９は、実施例１４Ｃにおける小滴の形状を示す。
【図２０】図２０は、実施例１４Ｄにおける小滴の形状を示す。
【図２１】図２１は、実施例１４Ｅにおける小滴の形状を示す。
【図２２】図２２は、本発明に従うコネクターを概略的にかつ部分的に示す。
【図２３】図２３は、本発明に従うコネクターを概略的にかつ部分的に示す。
【図２４】図２４は、本発明に従うコネクターを概略的にかつ部分的に示す。
【符号の説明】
【０２２９】
１  マイクロ流体デバイス
２、２’  マイクロチャネル
３、３’  電極アッセンブリ
４  電極
６  ギャップ
８  連結要素
９  発電ユニット
１０  支持体
１１  支持部材
３０  双眼顕微鏡
３１  カメラ
３２  ビデオレコーダー
３５  電極
３６  プレート
６１  マイクロチャネル
６３、６４  サイドチャネル
６６  デリバリー系
６８  シリンジポンプ
８０  ＰＣＲデバイス
８２  変性領域
８３  アニーリング領域
８４  伸長領域
９２  毛細管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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