(57)【要約】      （修正有）【課題】一又は複数の固定用量のＨＥＲ抗体が癌を治療するために有効な量でヒト患者に投与されることを含む、癌の治療方法の提供。【解決手段】少なくとも一の固定用量のパーツズマブを患者に投与することを含み、該固定用量がパーツズマブのおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである、ヒト患者の癌の治療方法。又、固定用量のＨＥＲ抗体を包含してなるバイアルを具備する製造品であって、該固定用量がＨＥＲ抗体のおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである製造品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の固定用量のパーツズマブを含有してなり、該固定用量が４２０ｍｇ、５２５ｍｇ、８４０ｍｇ又は１０５０ｍｇのパーツズマブである、ヒト患者の癌の治療のための医薬。
【請求項２】
前記固定用量のパーツズマブが３週間ごとに患者に投与される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記癌が、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１又は請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
前記固定用量が４２０ｍｇのパーツズマブである、請求項１から３の何れか一に記載の医薬。
【請求項５】
前記固定用量が５２５ｍｇのパーツズマブである、請求項１から３の何れか一に記載の医薬。
【請求項６】
前記固定用量が８４０ｍｇのパーツズマブである、請求項１から３の何れか一に記載の医薬。
【請求項７】
前記固定用量が１０５０ｍｇのパーツズマブである、請求項１から３の何れか一に記載の医薬。
【請求項８】
さらに、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤を含有してなる、請求項１から７の何れか一に記載の医薬。
【請求項９】
３０ｍｇ／ｍｌのパーツズマブを、ｐＨ６．０の、２０ｍＭ ヒスチジンアセテート、１２０ｍＭ ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０中に含有する、請求項１から８の何れか一に記載の医薬。
【請求項１０】
２５ｍｇ／ｍｌのパーツズマブを、ｐＨ６．０の、１０ｍＭ ヒスチジン-ＨＣｌバッファ、２４０ｍＭ ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０中に含有する、請求項１から８の何れか一に記載の医薬。
【請求項１１】
単一の固定用量のＨＥＲ２抗体を内包するバイアルを具備する製造品であって、該固定用量が４２０ｍｇ、５２５ｍｇ、８４０ｍｇ又は１０５０ｍｇのＨＥＲ２抗体であり、該ＨＥＲ２抗体が配列番号３及び４にそれぞれ示される可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を含むものである、製造品。
【請求項１２】
前記固定用量が４２０ｍｇのＨＥＲ２抗体である、請求項１１に記載の製造品。
【請求項１３】
前記固定用量が５２５ｍｇのＨＥＲ２抗体である、請求項１１に記載の製造品。
【請求項１４】
前記固定用量が８４０ｍｇのＨＥＲ２抗体である、請求項１１に記載の製造品。
【請求項１５】
前記固定用量が１０５０ｍｇのＨＥＲ２抗体である、請求項１１に記載の製造品。
【請求項１６】
前記ＨＥＲ２抗体がパーツズマブである、請求項１１から１５の何れか一に記載の製造品。
【請求項１７】
さらに、使用者に固定用量を癌患者に投与することを指示するパッケージ挿入物を具備する、請求項１１から１６の何れか一に記載の製造品。
【請求項１８】
前記癌が、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の製造品。
【請求項１９】
さらに、前記パッケージ挿入物が、使用者に、ＨＥＲの発現、増幅又は活性化を表す癌患者に固定用量を投与することを指示する、請求項１７又は請求項１８に記載の製造品。
【請求項２０】
第一のバイアルが８４０ｍｇのパーツズマブの固定用量を内包しており、第二のバイアルが４２０ｍｇのパーツズマブの固定用量を内包する、２つのバイアルを具備する、請求項１１から１９の何れか一に記載の製造品。
【請求項２１】
第一のバイアルが１０５０ｍｇのパーツズマブの固定用量を内包しており、第二のバイアルが５２５ｍｇのパーツズマブの固定用量を内包する、２つのバイアルを具備する、請求項１１から１９の何れか一に記載の製造品。
【請求項２２】
前記バイアルが単一用量のバイアルである、請求項１１から１９の何れか一に記載の製造品。
【請求項２３】
前記バイアルが、４２０ｍｇの固定用量のＨＥＲ２抗体を内包する２０ｃｃのバイアルである、請求項１１、１２及び１６から１９の何れか一に記載の製造品。
【請求項２４】
前記バイアルが、１０５０ｍｇの固定用量のＨＥＲ２抗体を内包する５０ｃｃのバイアルである、請求項１１及び１５から１９の何れか一に記載の製造品。
【請求項２５】
前記ＨＥＲ２抗体が薬学的に許容可能な製剤中に提供される、請求項１１から２４の何れか一に記載の製造品。
【請求項２６】
前記製剤が３０ｍｇ／ｍｌのパーツズマブを、ｐＨ６．０の、２０ｍＭ ヒスチジンアセテート、１２０ｍＭ ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０中に含有する、請求項２５に記載の製造品。
【請求項２７】
前記製剤が２５ｍｇ／ｍｌのパーツズマブを、ｐＨ６．０の、１０ｍＭ ヒスチジン-ＨＣｌバッファ、２４０ｍＭ ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０中に含有する、請求項２５に記載の製造品。
【請求項２８】
前記ＨＥＲ２抗体が完全なＩｇＧ１抗体である、請求項１１から２７の何れか一に記載の製造品。
【請求項２９】
前記ＨＥＲ２抗体が、配列番号１３に示す軽鎖アミノ酸配列及び配列番号１４に示す重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１１から２８の何れか一に記載の製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法規則１．５３(ｂ)に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９条(ｅ)に基づき２００５年１月２１日出願の米国特許仮出願番号６０／６４５６９７の優先権を主張するものであり、その内容が出典明記により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、パーツズマブなどのＨＥＲ抗体の一定（固定）投薬に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ＨＥＲレセプターとその抗体
レセプターチロシンキナーゼのＨＥＲファミリーは、細胞成長、分化及び生存の重要な介在物質である。該レセプターファミリーは、上皮細胞成長因子(ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ1又はＨＥＲ１)、ＨＥＲ２(ＥｒｂＢ２又はｐ１８５neu)、ＨＥＲ３(ＥｒｂＢ３)、及びＨＥＲ４(ＥｒｂＢ4又はtyro2)を含む４つの明らかなメンバーを含む。
ｅｒｂＢ１遺伝子にコードされるＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍の原因と示唆されている。特にＥＧＲＦの発現の増加は、乳房、膀胱、肺、頭部、首部及び胃癌、並びに膠芽細胞腫で観察されている。増大したＥＧＦＲ発現は、自己分泌刺激経路によるレセプターの活性化となる、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング成長因子−アルファ(ＴＧＦ-α)の生成の増加にしばしば関連していると報告されている。Baselga及びMendelson Pharmac Ther., 64:127-154 (1994))。ＥＧＦＲ、又はそのリガンドＴＧＦ-α及びＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の治療における治療剤として評価されている。例えば、Baselga及びMendelson 上掲；Masui等, Cancer Research, 44:1002-1007(1984)；及びWu等, J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)参照。
【０００４】
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５neuは、元々は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞種由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。neuプロト癌遺伝子の活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域の点突然変異(バリンからグルタミン酸へ)から生じる。ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、乳房及び卵巣癌で観察され、乏しい予後と相関している(Slamon等, Science, 235:177-182 (1987)；Slamon等, Science, 244:707-712 (1989)；及び米国特許第4,968,603号)。今日まで、ｎｅｕプロト癌遺伝子におけるものに類似した点突然変異はヒトの腫瘍に対しては報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現(増幅のためしばしば見られるが均一にではない)が、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓及び膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても観察されている。特に、King等, Science, 229:974 (1985)；Yokota等, Lancet, 1:765-767 (1986)；Fukushige等, Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986)；Guerin等, Oncogene Res., 3:21-31 (1988)；Cohen等, Oncogene., 4:81-88 (1989)；Yonemura等, Cancer Res., 51:1034 (1991)；Borst等, Gynecol.Oncol., 38:364 (1990)；Weiner等, Cancer Res., 50:421-425 (1990)；Kern等, Cancer Res., 50:5184 (1990)；Park等, Cancer Res., 49:6605 (1989)；Zhau等, Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990)；Aasland等, Br. J. Cancer 57:358-363 (1988)；Williams等, Pathobiology, 59:46-52 (1991)；及びMcCann等, Cancer, 65:88-92 (1990)参照。ＨＥＲ２は前立腺癌で過剰発現されうる(Gu等 Cancer Lett. 99:185-9(1996)；Ross等 Hum. Pathol. 28:827-33(1997)；Ross等 Cancer 79:2162-70(1997)；及びSadasivan等 J. Urol. 150:126-31(1993))。
【０００５】
ラットｐ１８５neu及びヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記述されている。Drebinとその仲間は、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５neuに対する抗体を言及している。例えば、Drebin等, Cell 41:695-706(1985)；Myers等, Meth. Enzym. 198:277-290(1991)；及び国際公開公報94/22478参照。Derbin等, Oncogene 2:273-277(1988)は、ｐ１８５neuの２つの異なる領域と反応性のある抗体混合物が、ヌードマウス中に移植されたｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を生じることを報告している。また1998年10月20日公開の米国特許第5,824,311号参照。
Hudziak等,  Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)には、ヒトの乳房腫瘍株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３を使用して特徴付けられたＨＥＲ２抗体パネルの作成が記載されている。抗体への暴露に続いてＳＫ-ＲＢ-３細胞の相対的細胞増殖が、７２時間後の単層のクリスタルバイオレット染色により測定された。このアッセイを使用して、４Ｄ５と呼ばれる抗体により最大の阻害度が得られ、これは細胞増殖を５６％阻害した。パネルの他の抗体は、このアッセイにおいてより少ない度合いで細胞増殖を低減した。さらに、抗体４Ｄ５は、ＴＮＦ-αの細胞障害効果に対し、ＨＥＲ２過剰発現乳房腫瘍株化細胞を感作させることが見出されている。また、1997年10月14日に公開された米国特許第5,677,171号参照。Hudziak等 により検討されたＨＥＲ２抗体は、Fendly等 Cancer Research 50:1550-1558(1990)；Kotts等 In Vitro 26(3):59A(1990)；Sarup等 Growth Regulation 1:72-82(1991)；Shepard等 J. Clin. Immunol. 11(3):117-127(1991)；Kumar等 Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986(1991)；Lewis等 Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263(1993)；Pietras等 Oncogene 9:1829-1838(1994)；Vitetta等 Cancer Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowski等 J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)；Scott等 J. Biol. Chem. 266:14300-5(1991)；D'souza等 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206(1994)；Lewis等 Cancer Research 56:1457-1465(1996)；及びSchaefer等 Oncogene 15:1385-1394(1997)においてもさらに特徴付けられている。
【０００６】
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン(登録商標)；米国特許第5,821,337号)は、広範な抗癌治療を前に受けたＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性であった(Baselga等, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996))。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、1998年9月25日、食品医薬品局から販売許可を受けた。
様々な特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue等 Int. J. Cancer 47:933-937(1991)；McKenzie等 Oncogene 4:543-548(1989)；Maier等 Cancer Res. 51:5361-5369(1991)；Bacus等 Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Stancovski等 PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacus等 Cancer Research 52:2580-2589(1992)；Xu等 Int. J. Cancer 53:401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等 Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancock等 Cancer Res. 51:4575-4580(1991)；Shawver等 Cancer Res. 54:1367-1373(1994)；Arteaga等 Cancer Res. 54:3758-3765(1994)；Harwerth等 J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)；米国特許第5,783,186号；及びKlapper等 Oncogene 14:2099-2109(1997)に記載されている。
【０００７】
相同性スクリーニングは、結果的に他の２つのＨＥＲレセプターファミリーメンバーを同定した；ＨＥＲ３(米国特許第5,183,884号及び第5,480,968号、並びにKraus等 PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989))、及びＨＥＲ４(欧州特許出願第599,274号、Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)、及びPlowman等, Nature 366: 473-475(1993))。これらのレセプターはどちらも、少なくともいくつかの乳癌株での増加した発現を示す。
ＨＥＲレセプターが一般に、細胞内で様々な組み合わせで発見され、ヘテロ二量化は様々なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加すると考えられる(Earp等 Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132(1995))。ＥＧＦＲは６つの異なるリガンド；上皮成長因子(ＥＧＦ)；トランスフォーミング成長因子アルファ(ＴＧＦ-α)、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮細胞成長因子(ＨＢ-ＥＧＦ)、ベータセルリン及びエピレグリンにより結合される(Groenenら Growth Factors 11:235-257(1994))。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヘレグリンタンパク質のファミリーはＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンドである。ヘレグリンファミリーは、α、β及びγヘレグリン(Holmes等, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第5,641,869号；及びSchaeferら Oncogene 15:1385-1394(1997))；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)、グリア成長因子(ＣＧＦ)；アセチルコリンレセプター促進活性(ＡＲＩＡ)；及び感覚、運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)を含む。概説については、Groenenら Growth Factors 11:235-257(1994)；Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262(1996)及びLeeら Pharm. Rev. 47:51-85(1995)参照。最近になって更に３つのＨＥＲリガンドが同定された；ＨＥＲ３又はＨＥＲ４のどちらかに結合すると報告されたニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)(Chang等 Nature 387 509-512(1997)；及びCarraway等 Nature 387:512-516(1997))；ＨＥＲ４に結合するニューレグリン-３(Zhang等 PNAS(USA)94(18):9562-7(1997))；及びＨＥＲ４に結合するニューレグリン-４(Harariら Oncogene 18:2681-89(1999))ＨＢ-ＥＧＦ、ベータセルリン及びエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【０００８】
ＥＧＦ及びＴＧＦαはＨＥＲ２に結合しないが、ＥＧＦはヘテロ二量体を形成するようにＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を促進し、ＥＧＦＲを活性化し、その結果ヘテロ二量体でＨＥＲ２のトランスリン酸化を生じる。ヘテロ二量体及び／又はトランスリン酸化はＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化するように見える。上掲のEarp等, 参照。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と共に発現しているとき、活性シグナル伝達複合体が形成され、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を分裂させる能力がある(Sliwkowski等, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665(1994))。更に、ヘレグリン(ＨＲＧ)に対するＨＥＲ３の親和性はＨＥＲ２と共に発現するときの高い親和性にまで増加される。また、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi等, Journal of Neuroscience 15:1329-1340(1995)；Morrissey等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435(1995)；及びLewis等, Cancer Res., 56:1457-1564(1996)参照。ＨＥＲ３と同様にＨＥＲ４はＨＥＲ２と活性シグナル伝達複合体を形成する(Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994))。
【０００９】
ＨＥＲ抗体に関する特許文献には以下のものがある：米国特許第5,677,171号、米国特許第 5,720,937号、米国特許第 5,720,954号、米国特許第 5,725,856号、米国特許第5,770,195号、米国特許第5,772,997号、米国特許第6,165,464号、米国特許第6,387,371号、米国特許第6,399,063号、米国公開2002/0192211A1、米国特許第6,015,567号、米国特許第6,333,169号、米国特許第 4,968,603号、米国特許第5,821,337号、米国特許第6,054,297、米国特許第6,407,213号、米国特許第6,719,971号、米国特許第6,800,738号、米国公開2004/0236078A1、米国特許第5,648,237号、米国特許第6,267,958号、米国特許第 6,685,940号、米国特許第6,821,515号、国際公開公報98/17797、米国特許第6,127,526号、米国特許第6,333,398号、米国特許第6,797,814号、米国特許第6,339,142号、米国特許第6,417,335号、米国特許第6,489,447号、国際公開公報99/31140、米国公開2003/0147884A1、米国公開2003/0170234A1、米国公開2005/0002928A1、米国特許第6,573,043号、米国公開2003/0152987A1、国際公開公報99/48527、米国公開2002/0141993A、国際公開公報01/00245、米国公開2003/0086924、米国公開2004/0013667A1、国際公開公報00/69460、国際公開公報01/00238、国際公開公報01/15730、米国特許第6,627,196号B1、米国特許第6,632,979号B1、国際公開公報01/00244、米国公開2002/0090662A1、国際公開公報01/89566、米国公開2002/0064785、米国公開2003/0134344、国際公開公報 04/24866、米国公開2004/0082047、米国公開2003/0175845A1、国際公開公報03/087131、米国公開2003/0228663、国際公開公報2004/008099A2、米国公開2004/0106161、国際公開公報2004/048525、米国公開2004/0258685A1、米国特許第5,985,553号、米国特許第5,747,261号、米国特許第4,935,341号、米国特許第5,401,638号、米国特許第5,604,107号、国際公開公報 87/07646、国際公開公報 89/10412、国際公開公報 91/05264、欧州特許412,116 B1、欧州特許494,135 B1、米国特許第5,824,311号、欧州特許444,181 B1、欧州特許1,006,194 A2、米国公開 2002/0155527A1、国際公開公報 91/02062、米国特許第5,571,894号、米国特許第5,939,531号、欧州特許502,812 B1、国際公開公報 93/03741、欧州特許554,441 B1、欧州特許656,367 A1、米国特許第5,288,477号、米国特許第5,514,554号、米国特許第5,587,458、国際公開公報 93/12220、国際公開公報 93/16185、米国特許第5,877,305号、国際公開公報 93/21319、国際公開公報 93/21232、米国特許第5,856,089号、国際公開公報 94/22478、米国特許第5,910,486号、米国特許第6,028,059号、国際公開公報 96/07321、米国特許第5,804,396号、米国特許第5,846,749号、欧州特許711,565、国際公開公報 96/16673、米国特許第5,783,404号、米国特許第5,977,322号、米国特許第6,512,097号、国際公開公報 97/00271、米国特許第6,270,765号、米国特許第6,395,272号、米国特許第5,837,243号、国際公開公報 96/40789、米国特許第5,783,186号、米国特許第6,458,356号、国際公開公報 97/20858、国際公開公報 97/38731、米国特許第6,214,388号、米国特許第5,925,519号、国際公開公報 98/02463、米国特許第5,922,845号、国際公開公報 98/18489、国際公開公報 98/33914、米国特許第5,994,071号、国際公開公報 98/45479、米国特許第6,358,682号 B1、米国公開2003/0059790、国際公開公報 99/55367、国際公開公報 01/20033、米国公開2002/0076695 A1、国際公開公報 00/78347、国際公開公報 01/09187、国際公開公報 01/21192、国際公開公報 01/32155、国際公開公報 01/53354、国際公開公報 01/56604、国際公開公報 01/76630、国際公開公報02/05791、国際公開公報 02/11677、米国特許第6,582,919号、米国公開2002/0192652A1、米国公開 2003/0211530A1、国際公開公報 02/44413、米国公開2002/0142328、米国特許第6,602,670号 B2、国際公開公報02/45653、国際公開公報02/055106、米国公開2003/0152572、米国公開2003/0165840、国際公開公報02/087619、国際公開公報03/006509、国際公開公報03/012072、国際公開公報03/028638、米国公開2003/0068318、国際公開公報03/041736、欧州特許1,357,132、米国公開2003/0202973、米国公開2004/0138160、米国特許第5,705,157号、米国特許第 6,123,939号、欧州特許616,812 B1、米国公開2003/0103973、米国公開2003/0108545、米国特許第6,403,630号B1、国際公開公報00/61145、国際公開公報00/61185、米国特許第6,333,348号B1、国際公開公報 01/05425、国際公開公報 01/64246、米国公開2003/0022918、米国公開2002/0051785A1、米国特許第6,767,541号、国際公開公報 01/76586、米国公開2003/0144252、国際公開公報01/87336、米国公開2002/0031515A1、国際公開公報01/87334、国際公開公報02/05791、国際公開公報02/09754、米国公開2003/0157097、米国公開2002/0076408、国際公開公報02/055106、国際公開公報02/070008、国際公開公報02/089842及び国際公開公報03/86467。
【００１０】
診断
ＨＥＲ２抗体トラスツズマブで治療される患者は、ＨＥＲ２過剰発現／増幅に基づいた治療のために選択される。例として、国際公開公報99/31140 (Paton 等)、米国特許公開2003/0170234A1 (Hellmann, S.)及び米国特許公開2003/0147884 (Paton 等)、並びに国際公開公報01/89566、米国特許公開2002/0064785及び米国特許公開2003/0134344(Mass 等)を参照。また、ＨＥＲ２過剰発現及び増幅を検出するための免疫組織化学(ＩＨＣ)及び蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)に関する米国特許公開2003/0152987（Cohen 等）を参照。
国際公開公報2004/053497 (Bacus 等)は、ハーセプチン(登録商標)治療への応答を決定するか又は予測することに関する。米国特許公開2004/013297A1 (Bacus 等)は、ＡＢＸ０３０３ ＥＧＦＲ抗体療法への応答を決定するか又は予測することに関する。国際公開公報2004/000094 (Bacus 等)は、ＧＷ５７２０１６、小分子、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２チロシンキナーゼインヒビターへの応答を決定することに関する。国際公開公報2004/063709、Amler 等は、ＥＧＦＲインヒビターであるエルロチニブＨＣｌに対する感受性を決定するためのバイオマーカー及び方法に関する。米国特許公開2004/0209290、Cobleigh 等は、乳癌予後のための遺伝子発現マーカーに関する。
【００１１】
パーツズマブで治療される患者は、ＨＥＲ活性化又は二量体化に基づいた治療のために選択されうる。パーツズマブ及びその治療のための患者の選別に関する特許文献は、国際公開公報01/00245 (Adams 等)、米国特許公開2003/0086924 (Sliwkowski, M.)、米国特許公開2004/0013667A1 (Sliwkowski, M.)、並びに国際公開公報2004/008099A2及び米国特許公開2004/0106161 (Bossenmaier 等)を含む。
Cronin 等, Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004)は、保存用のパラフィン包埋組織における遺伝子発現の測定を記述する。Ma 等 Cancer Cell 5:607-616 (2004)は、保存された一次生検から採取した腫瘍-組織切片から単離されたＲＮＡを用いた遺伝子オリゴヌクレオチドマイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを記述する。
【００１２】
抗癌薬とＨＥＲ抗体の投薬
抗癌薬の投薬について述べている文献は、Egorin, M. J Clin Oncol 2003; 21:182-3 (2003)、Baker 等 J Natl Cancer Inst 94:1883-8 (2002)、Felici 等 Eur J Cancer 38:1677-84 (2002)、Loos 等 Clin. Cancer Res. 6: 2685-9 (2000)、de Jongh 等 J. Clin Oncol. 19:3733-9 (2001)、Mathijssen 等 J. Clin Oncol. 20:81-7 (2002)、及びde Jong 等 Clin Cancer Res 10:4068-71 (2004)などがある。
一般的に、腫瘍学における細胞障害性小分子薬剤及び、市販のヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体(すなわちトラスツズマブ、及びベバシズマブ、Genentech Inc., South San Francisco及びゲムツズマブオゾガマイシン、Wyeth Pharmaceuticals, Philadelphia)は、体重ベース(ｍｇ／ｋｇ)又は体表面積ベース(ＢＳＡ)の投薬法で投与されている。
セツキシマブ(ERBITUX(登録商標))は、ＥＧＦレセプターを結合する抗体であり、結腸直腸癌の治療について承認されている。結腸直腸癌において、セツキシマブ ４００ｍｇ／ｍ２は負荷投与量として２時間にわたる静脈内注入により投与される。この後、１時間以上の週１回２５０ｍｇ／ｍ２の維持用量が続く。セツキシマブ処方の情報を参照。
【００１３】
トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))は、４ｍｇ／ｋｇ負荷投与量、その後週１回の２ｍｇ／ｋｇ用量で転移性乳癌患者に投与される。トラスツズマブ処方の情報を参照。
また、トラスツズマブ投薬に関する、国際公開公報99/31140、米国特許公開2003/0147884Ａ1、米国特許公開2003/0170234A1、米国特許公開2005/0002928A1、国際公開公報00/69460、国際公開公報01/15730及び米国特許第6,627,196号B1を参照。
パーツズマブ(別名組換えヒトモノクローナル抗体２Ｃ４、OMNITARGTM, Genentech, Inc, South San Francisco)は、 ＨＥＲ二量体化インヒビター(ＨＤＩ)として公知の薬剤の新規のクラスにおいて、始めて表れ、他のＨＥＲレセプターとの活性なヘテロ二量体(例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ1、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４)を形成するＨＥＲ２能を阻害するように機能して、ＨＥＲ２発現レベルに関係なく活性である。例として、Harari 及び Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000)、Yarden 及び Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001)、Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003)、 Cho 等 Nature 421:756-60 (2003)、及びMalik 等 Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003)を参照。
【００１４】
腫瘍細胞におけるＨＥＲ２-ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成のパーツズマブによる遮断は、重要な細胞シグナル伝達を阻害して、その結果腫瘍増殖及び生存が減少することが示されている(Agus 等 Cancer Cell 2:127-37 (2002))。
パーツズマブは、進行癌患者の第Ia相臨床試験及び卵巣癌及び乳癌並びに前立腺癌患者の第II相臨床試験において、単剤として試験されている。第I相試験では、標準的な治療の間又はその後に進行した、不治の固形腫瘍患者、局所的に進行した固形腫瘍患者、再発性の固形腫瘍患者、又は転移性の固形腫瘍患者は、３週ごとのパーツズマブの静脈内投与により治療された。通常、パーツズマブは十分に通用した。腫瘍の再発は、応答について評価可能な２０人の患者のうちの３人において、生じた。２人の患者は部分的な応答が確認できた。２．５か月以上の間持続する安定した疾患は、２１人の患者のうちの６人に観察された(Agus 等 Pro Am Soc Clin Oncol 22:192 (2003))。２．０〜１５ｍｇ／ｋｇの用量のパーツズマブの薬物動態は直線的であり、２．６９〜３．７４ｍＬ／日／ｋｇの範囲の平均クリアランスと、１５．３〜２７．６日の範囲の平均終末除去半減期であった。パーツズマブに対する抗体は検出されなかった(Allison 等 Pro Am Soc Clin Oncol 22:197 (2003))。パーツズマブは、第I相試験では重量基準(ｍｇ／ｋｇ)で投薬された。第II相試験は固定用量で開始されている。
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、薬物動態学及び標的薬剤濃度に対する、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体の固定用量の影響及び有用性の最も重要な評価法を提供する。ＨＥＲ抗体パーツズマブのこの分析の第一目標は、1) 癌患者におけるパーツズマブの集団薬物動態学及び予測される共変動を評価すること、及び2) 固定用量、体重に基づく投薬、及び体表面積(ＢＳＡ)ベースの投薬後の定常状態トラフ濃度及び曝露の多様性を調べることである。
したがって、第一の態様では、本発明は、一又は複数の固定用量のＨＥＲ抗体が癌を治療するために有効な量でヒト患者に投与されることを含む、癌の治療方法を提供する。
他の態様では、本発明は、少なくとも一の固定用量のパーツズマブを患者に投与することを含み、該固定用量がパーツズマブのおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである、ヒト患者の癌の治療方法を提供する。
また、本発明は、固定用量のＨＥＲ抗体を包含してなるバイアルを具備する製造品であって、該固定用量がＨＥＲ抗体のおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである、製造品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＨＥＲ２タンパク質構造の概略図、及びその細胞外ドメインのドメイン I〜IV(それぞれ配列番号１９−２２)のアミノ酸配列を提供する。
【図２】図２Ａ：マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖(ＶＬ)ドメイン(配列番号１)、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬドメイン(配列番号３)、ヒトＶＬコンセンサスフレームワーク(hum κ１、軽鎖κサブグループI)(配列番号５)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２Ｂ：マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変重鎖(ＶＨ)ドメインのアミノ酸配列(配列番号２)、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＨドメイン(配列番号４)、ヒトＶＨコンセンサスフレームワーク(humIII、重鎖サブグループIII)(配列番号６)のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アスタリスクは、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間の、又は、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトのフレームワークとの間の相違を識別する。相補性決定領域(ＣＤＲ)は括弧で示す。
【図３】パーツズマブの軽鎖及び重鎖(それぞれ配列番号１３及び１４)のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲはボールドで示す。軽鎖及び重鎖の算出した分子質量は、２３５２６．２２Ｄａ及び４９２１６．５６Ｄａ(還元型のシステイン)である。炭化水素部分は、重鎖のＡｓｎ２９９に付着される。
【図４】ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位での２Ｃ４の結合により、活性化されたＥＧＦＲ又はＨＥＲ３とのヘテロ二量体化の阻害を図解する。
【図５】ＭＡＰＫ及びＡｋｔ経路へのＨＥＲ２／ＨＥＲ３のカップリングを表す。
【図６】トラスツズマブ及びパーツズマブの様々な活動を比較する。
【図７Ａ】トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号１５)を示す。
【図７Ｂ】トラスツズマブ重鎖のアミノ酸配列(配列番号１６)を示す。
【図８Ａ】変異体パーツズマブ軽鎖配列(配列番号１７)を示す。
【図８Ｂ】変異体パーツズマブ重鎖配列(配列番号１８)を示す。
【図９】１区画(コンパートメント)モデル(図９Ａ)又は２区画(コンパートメント)モデル(図９Ｂ)にフィットさせた単一の被検体のＰＫデータの代表的なプロファイルである。○は観察された濃度を示す。実線及び波線は、それぞれ集団の予測される濃度及び個体の予測される濃度を示す。
【図１０】診断用モデルプロット線を表す。図１０Ａは、予測されたパーツズマブ濃度に対する観察されたパーツズマブ濃度を示す。実線は単一の線である。図１０Ｂは、予測されたパーツズマブ濃度に対する重みつき残差を表す。点線は、データのLOESS平滑化である。
【図１１Ａ】ベースモデルについての体重(ＷＴ)によるクリアランス(ＣＬ)及び体表面積(ＢＳＡ)による中心コンパートメント(Ｖｃ)の容積についてのランダム効果(η)を示す。
【図１１Ｂ】最終モデルについての体重(ＷＴ)によるクリアランス(ＣＬ)及び体表面積(ＢＳＡ)による中心コンパートメント(Ｖｃ)の容積についてのランダム効果(η)を示す。
【図１２Ａ−Ｃ】事後モデルチェック(posterior model check)を用いたパーツズマブ最終母集団薬物動態モデルのモデル評価を示す。試験統計学のための事後予測分布(Posterior predictive distribution)及び実測値：図１２Ａ−２．５ｔｈ、図１２Ｂ−５ｔｈ、図１２Ｃ−５０ｔｈ。各々の棒グラフ上の垂直線は、試験統計学の実測値を表す。
【図１２Ｄ−Ｆ】事後モデルチェック(posterior model check)を用いたパーツズマブ最終母集団薬物動態モデルのモデル評価を示す。試験統計学のための事後予測分布(Posterior predictive distribution)及び実測値：図１２Ｄ−９０ｔｈ、図１２Ｅ−９５ｔｈ、図１２Ｆ−９７．５ｔｈ。各々の棒グラフ上の垂直線は、試験統計学の実測値を表す。
【図１３】最終モデルの薬物動態学的(ＰＫ)データセットからブートストラップした１０００のシミュレーションした被検体についての、固定投薬、体重に基づく投薬(ＷＴ)又はＢＳＡに基づく投薬の後の予測されたパーツズマブ定常状態トラフ濃度(第８４日目)を図示する。
【図１４】１０ｔｈ以下(５０．４ｋｇ)(図１４Ａ)又は９０ｔｈ以上(８８．５ｋｇ)(図１４Ｂ)のＷＴ値を有する患者集団についての、固定投薬、体重に基づく投薬(ＷＴ)又はＢＳＡに基づく投薬の後の予測されたパーツズマブ定常状態トラフ濃度(第８４日目)を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
本明細書中の治療薬の「固定（又は一定）」又は「変わらない」用量は、患者の重量(ＷＴ)又は体表面積(ＢＳＡ)にかかわらずヒト患者に投与される用量を指す。したがって、固定用量又は変わらない用量は、ｍｇ／ｋｇの用量又はｍｇ／ｍ２用量としてでなく、むしろ治療薬の絶対的な量として投与されるものである。
本明細書において、「負荷」用量は、一般に、患者に投与される治療薬の初回の用量を含んでおり、その後一又は複数の維持用量が投与される。通常、単一の負荷用量が投与されるが、複数の負荷用量が本願明細書において、考慮される。通常、投与される負荷用量(一又は複数)の量は、投与される維持用量(一又は複数)の量を超えており／又は、負荷用量(一又は複数)が維持用量(一又は複数)よりも多く投与されることが多く、そのため、維持用量で達成されるよりも早く治療薬の所望の定常状態が達成される。
本明細書において、「維持」用量は、治療期間中に患者に投与される治療薬の一又は複数の用量を指す。通常、維持用量は、間をおいた治療間隔、例として、およそ毎週、およそ２週ごと、およそ３週ごと、又はおよそ４週ごとに投与される。
【００１８】
「ＨＥＲレセプター」は、ＨＥＲレセプターファミリーに属するレセプタープロテインキナーゼであり、ＥＧＲＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４レセプターを含む。ＨＥＲレセプターは一般に、ＨＥＲリガンドと結合する、及び／又は他のＨＥＲレセプター分子と二量体化する細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうるいくつかのチロシンキナーゼ残基を抱合するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含んでなりうる。ＨＥＲレセプターは「天然配列」ＨＥＲ又はその「アミノ酸配列変異体」であってもよい。好ましくは、ＨＥＲレセプターは天然配列ヒトＨＥＲレセプターである。
「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」「上皮成長因子レセプター」、及び「ＥＧＦＲ」という用語は、ここで、互換的に使用され、Carpenter等, Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)に開示されているようなＥＧＦＲに相当し、その自然発生突然変異体(例えば、Humphrey等, PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)に記載されているような欠失変異体ＥＧＦＲ)を含む。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子に相当する。
【００１９】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」なる表記は、ここで互換的に使用され、例えばSemba等, PNAS(USA)82:6497-6501(1985)及びYamamoto等, Nature 319:230-234(1986)(Genebank受託番号 X03363)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質に相当する。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子に相当し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子に相当する。好ましくは、ＨＥＲ２は天然配列ヒトＨＥＲ２である。
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、４つのドメイン：「ドメインI」(およそ１−１９５のアミノ酸残基、配列番号：１９)、「ドメインII」(およそ１９６−３１９のアミノ酸残基、配列番号：２０)、「ドメインIII」(およそ３２０−４８８のアミノ酸残基：配列番号：２１)及び「ドメインIV」(およそ４８９−６３０のアミノ酸残基、配列番号：２２)(シグナルペプチドを含まない残基番号付け)を含む。Garrett 等 Mol. Cell.. 11: 495-505 (2003)、Cho 等 Nature 421: 756-760 (2003)、Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)、及びPlowman 等 Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993)並びに本明細書中の図１を参照のこと。
【００２０】
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第5,183,884号及び第5,480,968号、並びにKraus等, PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989)に開示されたレセプターポリペプチドに相当する。
ここでの用語「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」は、例えば、欧州特許出願599,274；Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)；及びPlowman等, Nature 366: 473-475(1993)に開示されたレセプターポリペプチドに相当し、例えば1999年4月22日公開の国際公報99/19488に開示されているような、そのアイソフォームを含む。
【００２１】
「ＨＥＲリガンド」とは、ＨＥＲレセプターに結合する及び／又は活性化するポリペプチドを意味する。ここで特に対象とするＨＥＲリガンドは、例えば上皮細胞成長因子(ＥＧＦ)(Savage等, J. Biol. Chem. 247: 7612-76721(1972))；トランスフォーミング成長因子-α(ＴＧＦ-α)(Marquardt等, Science 223: 1079-1082 (1984))；シュワン細胞腫由来成長因子又はケラチノサイト自己分泌成長因子としても知られているアンフィレグリン(Shoyab等, Science 243:1074-1076(1989)；Kimura等, Nature 348:257-260(1990)；及びCook等, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557(1991))；ベーターセルリン(Shing等, Science 259:1604-1607(1993)；及びSasada等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173(1993))；ヘパリン結合上皮細胞成長因子(ＨＢ-ＥＧＦ)(Higashiyama等, Science 251:936-939(1991))；エピレグリン(Toyoda等, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500(1995)；及びKomurasaki等, Oncogene 15:2841-2848(1997))；ヘレグリン(以下参照)；ニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)(Carraway等, Nature 387: 512-516(1997))；ニューレグリン-３(ＮＲＧ-３)(Zhang等, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567(1997))；及びニューレグリン-４(ＮＲＧ-４)(Harariら Oncogene 18:2681-89(1999))又はクリプト(ＣＲ-１)(Kannan等 J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335(1997))のような天然配列ヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲに結合するＨＥＲリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ-α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ-ＥＧＦ及びエピレグリンを含む。ＨＥＲ３に結合するＨＥＲリガンドは、ヘレグリンを含む。ＨＥＲ４に結合する能力のあるＨＥＲリガンドはベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ-ＥＧＦ、ＮＲＧ-２、ＮＲＧ-３、ＮＲＧ-４及びヘレグリンを含む。
【００２２】
ここで使用される「ヘレグリン」(ＨＲＧ)は、米国特許第5,641,869号又はMarchionniら, Nature, 362:312-318(1993)に開示されているようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドに相当する。ヘレグリンの例は、ヘレグリン-α、ヘレグリン-β１、ヘレグリン-β２、及びヘレグリン-β３（Holmes等, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第5,641,869号）；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)（Peles等, Cell 69:205-216(1992)）；アセチルコリンレセプター誘発活性(ＡＲＩＡ)（Falls等, Cell, 72:801-815(1993)）；グリア成長因子(ＧＧＦ)（Marchionni等, Nature, 362:312-318(1993)）；感覚及び運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)（Ho等, J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995)）；γ-ヘレグリン（Schaefer等, Oncogene 15:1385-1394(1997)）含む。
【００２３】
本明細書中の「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも２つのＨＥＲレセプターを含んでなる非共有結合的に結合する二量体である。このような複合体は、２以上のＨＥＲレセプターを発現する細胞がＨＥＲリガンドに曝される場合に形成され、免疫沈降によって、単離することができ、例えば、Sliwkowski 等, J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載のように、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析されうる。このようなＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３及びＨＥＲ３-ＨＥＲ４ヘテロ二量体などがある。さらに、ＨＥＲ二量体は、異なるＨＥＲレセプター、例えばＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＥＧＦＲと結合した２以上のＨＥＲ２レセプターを含みうる。サイトカインレセプターサブユニット(例えばｇｐ１３０)などの他のタンパク質は、前記の二量体と結合しうる。
「ＨＥＲインヒビター」は、ＨＥＲ活性化又はＨＥＲ機能を妨げる薬剤である。ＨＥＲインヒビターの例には、ＨＥＲ抗体(例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４抗体)、ＥＧＦＲ標的薬剤、小分子ＨＥＲアンタゴニスト、ＨＥＲチロシンキナーゼインヒビター、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼインヒビター、例えばラパチニブ／ＧＷ５７２０１６、アンチセンス分子(例として国際公開公報2004/87207参照)、及び／又は、下流のシグナル伝達分子と結合するか又はその機能を妨げる薬剤、例えば、ＭＡＰＫ又はＡｋｔ(図５を参照)が含まれる。ＨＥＲインヒビターはＨＥＲレセプターと結合する抗体又は小分子であることが望ましい。
【００２４】
「ＨＥＲ抗体」は、ＨＥＲレセプターと結合する抗体である。場合によって、ＨＥＲ抗体は、さらにＨＥＲ活性化又はＨＥＲ機能を妨げる。好ましくは、ＨＥＲ抗体はＨＥＲ２レセプターと結合する。本明細書中で特に対象となるＨＥＲ２抗体は、パーツズマブである。ＨＥＲ２抗体の他の例は、トラスツズマブである。ＥＧＦＲ抗体の例には、セツキシマブと、ＡＢＸ０３０３とが含まれる。
「ＨＥＲ活性化」は、何れか一又は複数のＨＥＲレセプターの活性化又はリン酸化を指す。通常、ＨＥＲ活性化により、シグナル伝達が生じる(例えば、ＨＥＲレセプター又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＨＥＲレセプターの細胞内キナーゼドメインによって、生じる)。ＨＥＲ活性化は、対象のＨＥＲレセプターを含んでなるＨＥＲ二量体に、ＨＥＲリガンドが結合することにより媒介されうる。ＨＥＲ二量体へのＨＥＲリガンドの結合により、二量体のＨＥＲレセプターの一又は複数のキナーゼドメインが活性化され、このことにより一又は複数のＨＥＲレセプターのチロシン残基のリン酸化、及び／又は更なる基質ポリペプチド(一又は複数)、例えばＡｋｔ又はＭＡＰＫ細胞内キナーゼのチロシン残基のリン酸化が生じる。例として図５を参照のこと。
【００２５】
「リン酸化」は、タンパク質、例えばＨＥＲレセプター又はその基質への一又は複数のリン酸基の付加を指す。
「ＨＥＲ二量体化を阻害する」抗体は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害又は妨げる抗体である。好ましくは、このような抗体は、そのヘテロ二量体結合部位でＨＥＲ２に結合する。本明細書中で最も好適な二量体化阻害抗体は、パーツズマブ又はＭＡｂ ２Ｃ４である。ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位への２Ｃ４の結合を図４に例示する。ＨＥＲ二量体化を阻害する抗体の他の例には、ＥＧＦＲと結合して、一又は複数の他のＨＥＲレセプターとＥＧＦＲとの二量体化を阻害する抗体(例えば、活性化されたＥＧＦＲ又は放たれたＥＧＦＲに結合する、ＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、ＭＡｂ８０６、Johns 等, J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)を参照)、ＨＥＲ３と結合して、一又は複数の他のＨＥＲレセプターとＨＥＲ３との二量体化を阻害する抗体、及び、ＨＥＲ４と結合して、一又は複数の他のＨＥＲレセプターとＨＥＲ４との二量体化を阻害する抗体が含まれる。
【００２６】
「トラスツズマブより効果的にＨＥＲ二量体化を阻害する」抗体は、トラスツズマブより効果的に(例えば少なくともおよそ２倍効果的に) ＨＥＲ二量体を減弱又は除去する抗体である。好ましくは、このような抗体は、少なくともおよそ、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４のＦａｂ断片、パーツズマブ及びパーツズマブのＦａｂ断片からなる群から選択される抗体と同じくらい効果的にＨＥＲ２二量体化を阻害する。ＨＥＲ二量体を直接調べることによって、又はＨＥＲ二量体化の結果生じる下流のシグナル伝達、又はＨＥＲ活性化を評価することによって、及び／又は、抗体-ＨＥＲ２結合部位を評価するなどによって、ＨＥＲ二量体化阻害を評価できる。トラスツズマブより効果的にＨＥＲ二量体化を阻害する能力を有する抗体についてのスクリーニングのアッセイは、Agus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)及び国際公開公報01/00245(Adams 等)に記述される。例えば、ＨＥＲ二量体形成の阻害(例としてAgus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図１Ａ-Ｂ、及び、国際公開公報01/00245を参照)、ＨＥＲ二量体を発現する細胞のＨＥＲリガンド活性の減少(例えば、国際公開公報01/00245及びAgus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ａ-Ｂ)、ＨＥＲ二量体を発現する細胞へのＨＥＲリガンド結合のブロッキング(例えば、国際公開公報01/00245、及びAgus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ｅ)、ＨＥＲリガンドの存在(又は不在)下でのＨＥＲ二量体を発現する癌細胞(例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ-ＭＤ-１３４、ＺＲ-７５-１、ＭＤ-ＭＢ-１７５、Ｔ-４７Ｄ細胞)の細胞増殖阻害(例えば、国際公開公報01/00245及びAgus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図３Ａ-Ｄ)、下流のシグナル伝達の阻害(例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化の阻害又はＨＲＧ-又はＴＧＦα-依存性ＭＡＰＫリン酸化の阻害)(例えば、国際公開公報01/00245、及びAgus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ｃ-Ｄ)を評価することによって、ＨＥＲ二量体化の阻害についてアッセイしうる。また、抗体-ＨＥＲ２結合部位を調べる、例えばＨＥＲ２に結合した抗体の構造又はモデル、例えば結晶構造を評価することによって、抗体がＨＥＲ二量体化を阻害するかどうかを評価してもよい (例えば、Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)を参照)。
【００２７】
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、二量体の形成の際にＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４の細胞外ドメインの領域と接触する又は作用するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域を指す。領域は、ＨＥＲ２のドメインIIにみられる。Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブより効果的に(例えば少なくとも２倍効果的に)「ＨＲＧ-依存性ＡＫＴリン酸化を抑制」及び/又は「ＨＲＧ-又はＴＧＦα-依存性ＭＡＰＫリン酸化」を抑制しうる(例えば、Agus 等 Cancer Cell 2: 127-137 (2002)及び国際公開公報01/00245を参照)。
ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２外部ドメイン切断を阻害しないものでありうる(Molina 等 Cancer Res. 61: 4744-4749(2001))。
【００２８】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体はドメインIIの残基に結合し(そして、場合によって、また、ＨＥＲ２細胞外ドメインの他のドメイン、例えばドメインI及びIIIの残基とも結合する)、ＨＥＲ２-ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３又はＨＥＲ２-ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を、少なくともある程度は、立体的に妨げることができる。Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)はＨＥＲ２-パーツズマブ結晶構造の特徴を表しており、ＲＣＳＢタンパク質データバンク(IDコード IS78)に寄託され、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位と結合する例示的な抗体を例示する。
ＨＥＲ２の「ドメインIIに結合する」抗体は、ＨＥＲ２のドメインIIの残基及び場合によってはＨＥＲ２の他のドメイン、例えばドメインI及びIIIの残基に結合する。好ましくは、ドメインIIと結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインI、IIとIIIとの間の接合部と結合する。
【００２９】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチド(例えば、ＨＥＲレセプター又はＨＥＲリガンド)と同一のアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。したがって、天然配列ポリペプチドは、天然に生じるヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、又は特定の他の哺乳動物種のアミノ酸配列を有しうる。
ここでの「抗体」という用語は最も広義に使用され、特に完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
【００３０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般的に微量に存在する変異体など、モノクローナル抗体の産生の際に生じうる突然変異体を除いて同一である、及び／又は同じエピトープに結合する抗体を指す。典型的に、このようなモノクローナル抗体は標的に結合するポリペプチド配列を含んでなる抗体を含んでおり、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって得たものである。例えば、選択方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組み換えＤＮＡクローンのプールなどの、複数のクローンからの特定のクローンの選択でありうる。さらに、選択された標的結合配列を変更して、例えば、標的について親和性を改善する、標的結合配列をヒト化する、細胞培養物でのその産生を改善する、インビボでの免疫原性を減少する、多特異性の抗体を作製するなどを行うことができ、変更した標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるであろう。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル調製物と比べて、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、他の免疫グロブリンと典型的には混入していない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ法(例えばKohler 等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow 等., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling 等,  Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson 等., Nature, 352:624-628 (1991)；Marks 等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu 等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee 等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee 等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004))、及びヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子又はヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又はすべてを含む動物のヒト抗体又はヒト様抗体を産生するための技術(例えば、国際公開公報1998/24893；国際公開公報1996/34096；国際公開公報1996/33735；国際公開公報1991/10741；Jakobovits 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits 等., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann 等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,591,669号 (すべて GenPharm)；米国特許第5,545,807号；国際公開公報1997/17852；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks 等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg 等, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild 等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995))によって作製されうる。
【００３１】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで対象とするキメラ抗体は、非ヒト(例えばオナガザル、サルなど)及びヒト定常領域配列から誘導される可変ドメイン抗原結合配列を含んでなる「霊長類化」抗体を含む。
「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域が含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「完全な抗体」は、２つの抗原結合領域と１つのＦｃ領域を有するものである。好ましくは、完全な抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００３２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な抗体は異なる「クラス」に分類できる。完全な抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
抗体「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰因するこれらの生物学的活性に関する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞障害活性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション(Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)、等を含む。
【００３３】
「抗体依存性細胞媒介細胞障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)を発現する非特異性細胞障害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応に関する。ＡＤＣＣを媒介する第１の細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγII及びＦｃγIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の464ページの表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第5,500,362号又は5,821,337号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。このアッセイで使用できるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。他に、又はさらに対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されている様な哺乳動物のモデルでインビボの評価がされうる。
【００３４】
「ヒトエフェクター細胞」は、一つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は、少なくともＦＣγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然ソースより単離されてもよい；例えばここにおいて記載の血液又はＰＢＭＣ類である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Has等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。また、この用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因であり(Guyer等, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、また免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児レセプターであるＦｃＲｎも含む。
【００３５】
「補体依存性細胞障害活性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で目的物を溶解させる分子の能力に関する。補体活性化経路は、同系の抗原と複合体形成する分子(例えば、抗体)への補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J.Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイが実施されうる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００３６】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
【００３７】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００３８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３９】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は国際公報93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号に記載されている。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号；国際公開公報93/11161；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００４０】
非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」形とは、非非と免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基(ＦＲ)は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に、又はドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものを含んでなる。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichman等, Nature 332, 323-329(1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)を参照。
【００４１】
ヒト化ＨＥＲ２抗体は、出展明示によりここに取り込まれる米国特許第5,821,337号の表３に記載されているようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５-１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８又はトラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))；ヒト化５２０Ｃ９(国際公報93/21319)；及び本明細書中に記載されるようなヒト化２Ｃ４抗体を含む。
本明細書において、「トラスツズマブ」、「ハーセプチン」及び「ｈｕＭＡｂ4Ｄ5-８」は、それぞれ配列番号１５及び１６の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる抗体を指す。
本明細書において、「パーツズマブ」及び「OMNITARGTM」は、それぞれ配列番号１３及び１４の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含んでなる抗体を指す。
トラスツズマブとパーツズマブの機能の相違を図６に示す。
「ネイキッド抗体」は、異種性の分子、例えば細胞障害性成分又は放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
【００４２】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びタンパク質様又は他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上の高頻度可変領域に1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas等、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００４３】
本明細書において、「主な種類の抗体」なる用語は、組成物内に量的に主に存在する抗体分子である組成物の抗体構造を指す。一実施態様では、主要な種類の抗体は、ＨＥＲ２抗体、例えばＨＥＲ２のドメインIIと結合する抗体、トラスツズマブより効果的にＨＥＲ二量体化を阻害する抗体及び／又はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位と結合する抗体である。主な種類の抗体の本明細書において、好適な実施態様は、配列番号３及び４の可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を含有してなるもの、最も好ましくは配列番号１３及び１４の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を含有してなるもの(パーツズマブ)である。
本明細書において、「アミノ酸配列変異形」抗体は、主な種類の抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主な種類の抗体と少なくともおよそ７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは主な種類の抗体と少なくともおよそ８０％、好ましくは少なくともおよそ９０％の相同性である。アミノ酸配列変異体は、主な種類の抗体のアミノ酸配列内の、又は主な種類の抗体のアミノ酸配列に隣接した、特定の位置で置換、欠失及び／又は付加を有する。本明細書中のアミノ酸配列変異体の例には、酸性の変異体(例えば脱アミド化された抗体変異体)、基本的な変異体、抗体の１又は２つの軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展(例えばＶＨＳ)を有する抗体、抗体の１又は２つの重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体などが含まれ、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異体の組合せが含まれる。本明細書中の特に対象とする抗体変異体は、抗体の１又は２つの軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展を含んでなる抗体であり、場合によって、主な種類の抗体と関連して他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の相違を更に含んでなる抗体である。
【００４４】
本明細書中の「グリコシル化変異形」抗体は、主な種類の抗体に接着した一又は複数の炭水化物部分と異なる一又は複数の接着した炭水化物部分を有する抗体である。本明細書において、グリコシル化変異体の例には、抗体のＦｃ領域に接着した、Ｇ１又はＧ２オリゴ糖構造、代わりにＧ０オリゴ糖構造を有する抗体、抗体の１又は２つの軽鎖に接着した炭水化物部分を有する抗体、抗体の１又は２つの重鎖に接着した炭水化物のない抗体など、及びグリコシル化変更の組合せを有する抗体が含まれる。
抗体がＦｃ領域を有する場合、本明細書中の図９に示すオリゴ糖構造は、例えば残基２９９(残基のＥｕ番号付けでは２９８)で、抗体の１又は２つの重鎖に接着してもよい。パーツズマブでは、Ｇ０は、パーツズマブ組成物中に少量見られる他のオリゴ糖構造、例えばＧ０-Ｆ、Ｇ-１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１-１、Ｇ１(１-６)、Ｇ１(１-３)及びＧ２を有する主要なオリゴ糖構造であった。
【００４５】
特に明記しない限り、本明細書中の「Ｇ１オリゴ糖構造」にはＧ-１、Ｇ１-１、Ｇ１(１-６)及びＧ１(１-３)の構造が含まれる。
本明細書中の「アミノ末端リーダー伸展」は、抗体の何れか一又は複数の重鎖ないし軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一又は複数のアミノ酸残基を指す。例示的なアミノ末端リーダー伸展は、抗体変異体の一方又は両方の軽鎖に存在する３つのアミノ酸残基、ＶＨＳを含む、又はこれらから成る。
「脱アミド化」抗体は、抗体の一又は複数のアスパラギン残基が例えばアスパラギン酸、スクシンイミド又はイソ-アスパラギン酸に誘導体化されている抗体である。
【００４６】
「癌」及び「癌性の」なる用語は、一般的に制御不能な細胞成長に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫(髄芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む)、肉腫(脂肪肉腫及び滑液細胞肉腫を含む)、神経内分泌腫瘍(カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ及び膵島細胞癌を含む)、中皮腫、シュワン細胞腫(聴神経腫を含む)、髄膜腫、腺癌、メラノーマ及び白血病ないしリンパ系の悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌(例えば上皮扁平細胞癌)、肺癌、例えば小細胞肺癌(ＳＣＬＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性の癌、胃癌、例えば胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌(転移性乳癌を含む)、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜ないし子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌ないし腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭頸部癌が含まれる。
本明細書において「患者」はヒト患者である。患者は「癌患者」、すなわち癌の一又は複数の症状に罹っているかかかるリスクにある患者であるか、又はＨＥＲ抗体による治療により利益を得ることができた他の患者であってもよい。
【００４７】
「生体試料」は、生物源から得られる試料、一般に細胞又は組織を指す。
「患者試料」は、患者、例えば癌患者から採取した試料を指す。
本明細書中の「腫瘍試料」は、患者の腫瘍から得た試料、又は患者の腫瘍からの腫瘍細胞を含む試料である。本明細書中の腫瘍試料の例には、限定するものではないが、腫瘍生検、循環する腫瘍細胞、循環する血漿タンパク質、腹水、腫瘍由来ないしは腫瘍様性質を表す一次細胞培養物ないし細胞株、並びに保存された腫瘍試料、例えばホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍試料又は凍結腫瘍試料が含まれる。
「固定した」腫瘍試料は、固定液を用いて組織学的に保存されたものである。
「ホルマリン固定」腫瘍試料は、固定液としてホルムアルデヒドを用いて保存されたものである。
「包埋された」腫瘍試料は、堅くて一般に硬質のメディウム、例えばパラフィン、ワックス、セロイジン又は樹脂によって、囲まれたものである。包埋は、顕微鏡試験のため、又は、組織マイクロアレイ(ＴＭＡ)の生成のための薄切片の切り出しを可能にする。
【００４８】
「パラフィン包埋された」腫瘍試料は、石油由来の固体炭化水素の精製された混合物によって、囲まれたものである。
本明細書中の「凍結」腫瘍試料は、凍るか、又は凍っている腫瘍試料を指す。
「ＨＥＲ発現、増幅又は活性化を表す」癌ないし生体の試料は、診断試験において、ＨＥＲレセプターを発現(過剰発現を含む)するもの、ＨＥＲ遺伝子を増幅しているもの、及び／又は、そうでなければＨＥＲレセプターの活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は、直接的に(例えばＨＥＲリン酸化を測定することによって、)決定されてもよいし、間接的に(本明細書中に記載のように、遺伝子発現プロファイリングによって、又はＨＥＲヘテロ二量体を検出することによって、)決定されてもよい。
【００４９】
「ＨＥＲレセプター過剰発現又は増幅」を有する癌は、同じ組織種類の非癌細胞と比較してＨＥＲレセプタータンパク質又は遺伝子のレベルが有意に高いものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、又は、増加した転写ないし翻訳によって、生じうる。ＨＥＲレセプター過剰発現又は増幅は、(例えば免疫組織化学アッセイ、ＩＨＣによって)細胞の表面に存在するＨＥＲタンパク質のレベルの増加を評価することによって、診断アッセイ又は予後予測アッセイにおいて、決定されうる。あるいは又は加えて、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ、1998年10月に公開の国際公開公報98/45479を参照)、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＲＴ-ＰＣＲ)によって、細胞内のＨＥＲコード化核酸のレベルを測定してもよい。また、体液、例えば血清の脱落抗原(例えばＨＥＲ細胞外ドメイン)を測定することによって、ＨＥＲレセプター過剰発現ないし増幅を調べてもよい(例えば、1990年6月12日発行の米国特許第4,933,294号、1991年4月18日公開の国際公開公報91/05264、1995年3月28日発行の米国特許第5,401,638号、及びSias 等 J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990))。上記のアッセイを除き、技術者にとって様々なインビボアッセイが利用できる。例えば、場合によって、検出可能な標識、例えば放射性同位体にて標識した抗体に患者の体内の細胞を曝し、例えば放射能の外的スキャンによって、又は、前もって抗体に曝される患者から採取した生検を分析することによって、患者の細胞に対する抗体の結合を評価してもよい。
【００５０】
それに対して、「ＨＥＲレセプターを過剰発現しない又は増幅しない」癌は、同じ組織種類の非癌性細胞と比較してＨＥＲレセプタータンパク質又は遺伝子の正常レベルよりも高くないものである。ＨＥＲ二量体化を阻害する抗体、例えばパーツズマブは、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現させないか又は増幅しない癌を治療するために用いてもよい。
【００５１】
ここで使用される場合の「増殖阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞、特にＨＥＲ発現癌細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、増殖阻害剤とは、Ｓ期におけるＨＥＲ発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。増殖阻害剤の例には、細胞周期の進行を阻害する薬剤(Ｓ期以外のところで)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。またＧ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、癌遺伝子、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出すことができる。
【００５２】
「増殖阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合して、ＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞の増殖を抑制するものである。好ましい増殖阻害ＨＥＲ２抗体は、増殖阻害がＳＫ-ＢＲ-３細胞の抗体への暴露から６日後に決定される場合に、抗体濃度約０．５から３０μg/mlで２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく(例えば約５０％から１００％)細胞培養物のＳＫ-ＢＲ-３乳癌細胞の増殖を阻害する(1997年10月14日公開の米国特許第5,677,171号参照)。ＳＫ-ＢＲ-３細胞増殖阻害アッセイは、該特許及び以下に更に詳しく記載される。好ましい増殖阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
【００５３】
「アポトーシスを誘発」する抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)により決定されるようなプログラム細胞死を誘発するものである。細胞は、通常ＨＥＲ２レセプターを過剰発現するものである。好ましくは細胞は、腫瘍細胞、例えば乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫ-ＢＲ-３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである(下記参照)。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は７Ｃ２及び７Ｆ３である。
【００５４】
「エピトープ２Ｃ４」は抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。好ましくは、抗体はＨＥＲ２に対する２Ｃ４の結合を５０％以上ブロックする。あるいは、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するか否かを評価するために、エピトープマッピングを行うこともできる。エピトープ２Ｃ４はＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインII由来の残基を有する。２Ｃ４及びパーツズマブはドメインI、II及びIIIの結合部のＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５(ATCC CRL 10463)及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通領域に近接しているか、及びＨＥＲ２のドメインIV内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープに結合するか否かを評価するために、エピトープマッピングを行うこともできる(例えば、シグナルペプチドを含めて残基番号付けした、ＨＥＲ２ ＥＣＤを含む、約残基５２９から約残基６２５までを含む領域における任意の一又は複数の残基)。
【００５５】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は７Ｃ２及び／又は７Ｆ３抗体(各々以下のATCCで寄託)が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインI内のＮ末端領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合するか否かを確認するために、エピトープマッピングを行うこともできる(例えば、シグナルペプチドを含めて残基番号付けした、ＨＥＲ２ ＥＣＤの約残基２２から約残基５３までの領域における任意の一又は複数の残基)。
「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。治療の必要があるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含まれる。したがって、ここでの治療されるべき哺乳動物は、疾患を有すると診断されてもよく、又は疾患に罹りやすい又は敏感であると診断されていてもよい。
【００５６】
「有効量」なる用語は、患者の癌を治療するために効果的な薬剤の量を意味する。有効量の薬剤により、癌細胞の数が減少する；腫瘍の大きさが小さくなる；周辺臓器への癌細胞の浸潤が抑制される（つまり、ある程度ゆっくりになるか止まるのが好ましい）；腫瘍の転移が抑制される（つまり、ある程度ゆっくりになるか止まるのが好ましい）；ある程度腫瘍の成長が抑制される；及び／又は癌関連の症状の一又は複数がある程度軽減される。薬剤が存在する癌細胞の成長を阻害するか及び／又は癌細胞を殺すという意味において、細胞増殖抑制性及び／又は細胞障害性であるといえる。有効量により、進行のない生存期間が延長し(例えば、固形腫瘍のための応答評価基準であるＲＥＣＩＳＴ(Response Evaluation Criteria for Solid Tumors)又はＣＡ-１２５変化により測定される)、奏効し(一部寛解(ＰＲ)又は完全寛解(ＣＲ))、全体の生存期間が増加し、及び／又は癌の一又は複数の症状が改善(ＦＯＳＩにより評価される)しうる。
【００５７】
「全体的な生存」は、診断又は治療の時から一定期間、例えば１年、５年などの間生存している患者を指す。
「進行のない生存」は、癌が悪化することなく生存している患者を指す。「奏効」は、完全寛解(ＣＲ)又は一部寛解(ＰＲ)を含む測定可能な応答を指す。
「完全寛解」又は「完全応答」は、治療に応答した癌のすべての徴候の消滅を意味する。これは、癌が治癒したことを常に意味するものではない。
「一部寛解」は、治療に応答して、一又は複数の腫瘍ないし病変のサイズ、又は、体内の癌の範囲の減少を指す。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む、細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又は小分子毒素を含むように意図されている。
【００５８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；TLK 286 (TELCYTATM)；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TM1を含む)；エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、及びラニムスチン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１(例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと)及びアンスラサイクリン、例えばアンナマイシン(annamycin)、AD 32、アルカルビシン(alcarubicin)、ダウノルビシン、デキサラゾキサン(dexrazoxane)、DX-52-1、エピルビシン、GPX-100、イダルビシン、KRN5500、メノガリル、ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)、エスペラマイシン(esperamicin)、ネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エソルビ���ン(esorubicin)、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、及びゾルビシン(zorubicin)；デノプテリン(denopterin)、プテロプテリン(pteropterin)、及びトリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)(リューコボリン(leucovorin))のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；抗葉酸抗新生物作用剤、例としてALIMTA(登録商標)、LY231514 ペメトレキセド、ジヒドロ葉酸リダクターゼインヒビター、例としてメトトレキセート、抗代謝剤、例として５‐フルオロウラシル(5-FU)及びそのプロドラッグ、例としてUFT、S-1及びカペシタビン、及びチミジル酸合成酵素インヒビター及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼインヒビター、例としてラルチトレキセド(TOMUDEXRM, TDX)；ジヒドロピリミジン脱水素酵素のインヒビター、例としてエニルウラシル(eniluracil)；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ラソキサントロン(losoxantrone)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド及びタキサン、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；白金；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体又はプラチナベースの類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；ビンカアルカロイド；ビノレルビンNAVELBINE(登録商標)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビター RFS 2000；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用治療の略記号であるCHOP、及び５-ＦＵとロイコボリン(leucovorin)と組み合わされるオキサリプラチン(ELOXATINTM)による治療投薬計画の略記号であるFOLFOXが含まれる。
【００５９】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、FEMARA(登録商標)レトロゾールおよびARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばPKC-α、Raf、H-Ras、及び上皮性成長因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン)；PROLEUKIN(登録商標)rIL-2；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)rmRH並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００６０】
「抗代謝化学療法剤」は、代謝産物に構造的に類似しているが、身体によって、生産的な方法で用いられない薬剤である。多くの抗代謝化学療法剤は、核酸、ＲＮＡ及びＤＮＡの産生を妨げる。抗代謝化学療法剤の例には、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))、５‐フルオロウラシル(５−ＦＵ)、カペシタビン(XELODATM)、６‐メルカプトプリン、メトトレキセート、６‐チオグアニンが、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシンＡＲＡ-Ｃシタラビン(CYTOSAR-U(登録商標))、ダカルバジン(DTIC-DOME(登録商標))、アザシトシン、デオキシシトシン、ピリドミデン(pyridmidene)、フルダラビン(FLUDARA(登録商標))、クラドリビン、２-デオキシ-Ｄ-グルコースなどが含まれる。好適な抗代謝化学療法剤はゲムシタビンである。
【００６１】
「ゲムシタビン」又は「２'-デオキシ-２',２'-ジフルオロシチジン モノハイドロクロライド(ｂ異性体)」は、抗腫瘍活性を表すヌクレオシド類似体である。ゲムシタビンＨＣｌの実験式は、C9H11F2N3O4・HClである。ゲムシタビンＨＣｌは、商標GEMZAR(登録商標)としてEli Lillyで販売されている。
「プラチナベースの化学療法剤」は、分子の不可欠な部分にプラチナを含有する有機化合物を含む。プラチナベースの化学療法剤の例には、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチン(oxaliplatinum)が含まれる。
「プラチナベースの化学療法」とは、一又は複数のプラチナベースの化学療法剤による治療、場合によって、一又は複数の他の化学療法剤と組み合わせた治療を意図する。
「プラチナ耐性」癌とは、癌患者がプラチナベースの化学療法を受けているにもかかわらず進行している(すなわち、患者が「プラチナ抵抗性」である)、又は癌患者がプラチナベースの化学療法投薬を完了した後１２か月以内(例えば、６か月以内)に進行していることを意味する。
【００６２】
「抗-血管形成剤」は、血管の発達を阻害する、又はある程度妨げる化合物に相当する。抗-血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子又は成長因子レセプターに結合する小分子又は抗体でありうる。ここでの好ましい抗-血管形成因子は、ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))などの、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体である。
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００６３】
ここで使用されるように、「ＥＧＦＲ標的薬」という用語は、ＥＧＦＲに結合し、場合によってはＥＧＦＲ活性化を抑制する治療薬に相当する。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９(ATCC CRL HB8506)、ＭＡｂ４５５(ATCC CRL HB8507)、Ｍａｂ２２５(ATCC CRL 8509)、ＭＡｂ５２８(ATCC CRL HB8509)(米国特許第4,943,533号、Mendelsohnら参照)及びその変異体、例えばキメラ２２５(Ｃ２２５またはセツキシマブ(Cetuximab)；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標）)及び再構成ヒト２２５(Ｈ２２５)(国際公報96/40210、Imclone Systems社参照)；タイプIIマウスEGFRに結合する抗体(米国特許第5,212,290号)；米国特許第5,891,996号に記載のＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＡＢＸ-ＥＧＦのようなＥＧＦＲに結合するヒト抗体(国際公報98/50433、Abgenix参照)；EMD 55900 (Stragliotto 等. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996))；及びmAb 806又はヒト化mAb 806 (Johns 等, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害剤とコンジュゲートされ、よって免疫コンジュゲートを作る(例えば、欧州特許第659,439号A2、Merck Patent GmbH)。ＥＧＦＲに結合する小分子の例は、ZD1839またはゲフィチニブ(Gefitinib)(IRESSATM；Astra Zeneca)、CP-358774又はエルロチニブＨＣＬ(TARCEVATM；Genentech/OSI)及びAG1478、AG1571(SU5271；Sugen)を含む。
【００６４】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、ＨＥＲレセプターなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。そのような阻害剤の例として、小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼインヒビター、例えばTakedaから入手可能なTAK165、ＥＧＦＲに優先的に結合するが、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ-過剰発現細胞の両方を阻害するＥＫＢ-５６９(Wyethから入手可能)などの二重ＨＥＲインヒビター、経口ＨＥＲ２及びＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるGW572016(Glaxoから入手可能)、PKI-166(Novartisから入手可能)、カネルチニブ(canertinib)などのpan-ＨＥＲインヒビター(CI-1033；Pharmacia)、Raf-1インヒビター、例えばRaf-1シグナル伝達を阻害するISIS Pharmaceuticalsから入手可能なアンチセンス薬剤ISIS-5132、非ＨＥＲ標的ＴＫインヒビター、例えばGlaxoから入手可能なメシル酸イマチニブ(GleevacTM)、ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼIインヒビターであるCI-1040(Pharmaciaから入手可能)；PD 153035、4-(3-クロロアニリン)キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；CGP 59326、CGP 60261、およびCGP 62706などのピルロロピリミジン(pyrrolopyrimidines)；ピラゾロピリミジン(pyrazolopyrimidines)、4-(フェニルアミノ)-7Ｈ-ピルロロ[2,3-d]ピリミジン；カルシウム(ディフェルロイルメタン、4,5-ビス(4-フルオロアニリノ)フタルイミド)；ニトロチオフェン成分を含むトリホスチン(tyrphostines)；PD-0183805 (Warner-Lamber)；アンチセンス分子(例えば、ＨＥＲコード化核酸に結合するもの)；キノキサリン(quinoxalines) (米国特許第5,804,396号)；トリホスチン(米国特許第5,804,396号)；ZD6474 (Astra Zeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；CI-1033 (Pfizer)などのpan-ＨＥＲインヒビター；Affmitac (ISIS 3521; Isis/Lilly)；メシル酸イマチニブ (Gleevac; Novartis)；PKI 166 (Novartis)；GW2016 (Glaxo SmithKline)；CI-1033 (Pfizer)；EKB-569 (Wyeth)；セマキシニブ(Semaxanib) (Sugen)；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；INC-1C11 (Imclone)；又は以下に挙げるいずれかの特許文献に記載されているもの：米国特許第5,804,396号；国際公報99/09016 (American Cyanimid)；国際公報98/43960 (American Cyanamid)；国際公報97/38983 (Warner Lambert)；国際公報99/06378 (Warner Lambert)；国際公報99/06396 (Warner Lambert)；国際公報96/30347 (Pfizer, Inc)；国際公報96/33978 (Zeneca)；国際公報96/3397 (Zeneca)；及び国際公報96/33980 (Zeneca)だけでなく、前段落に記載したＥＧＦＲ標的薬剤を含む。
【００６５】
本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬、アトピー、例えば花粉症及びジョブ症候群などのアトピー性疾患、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプI及びタイプIIを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状及び応答、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、外因性の抗原、例として妊娠中の胎児ＡＢＯ血液型に対する免疫応答、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(I型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(II型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、輸血後紫斑病(ＰＴＰ)、ヘパリン誘発性血小板減少症、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間隙肺線維形成、間質性肺線維症、肺線維症、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性又は慢性)又はFuchの毛様体炎、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ���良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失
調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、ナルコレプシー、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
【００６６】
「良性過剰増殖性疾患」とは、細胞増殖に関連し、医学界のメンバーが異常と認識する患者の状態を意味する。異常な状態は、障害に罹っていない生物体に観察されるレベルとは統計的に異なる特性のレベルによって特徴付けられる。細胞増殖は細胞の増殖(multiplication)による成長又は拡大を意味し、細胞分裂を含む。細胞増殖の速度は与えられた時間単位に産生される細胞数を計数することによって測定することができる。良性過剰増殖性疾患の例には乾癬とポリープが含まれる。
「呼吸器疾患」は呼吸器系に関与し、慢性気管支炎、急性喘息及びアレルギー性喘息を含む喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、アレルギー性又は他の鼻炎又は副鼻腔炎、α１-抗トリプシン欠乏症、咳、肺気腫、肺線維症又は過敏気道、慢性閉塞性肺疾患(pulmonary disease)、及び慢性閉塞性肺障害(lung disorder)を含む。
【００６７】
「乾癬」は、限局性で離散した集簇性で赤みがかり銀色鱗屑を伴った丘疹の発疹によって特徴付けられる症状である。乾癬病変は一般に主として肘、膝、頭皮、及び胴体に生じ、顕微鏡で見ると特徴的なパラケロトーシス(parakerotosis)及び乳頭間隆起の伸長を示す。該用語には、紅皮、膿疱、該疾患の中程度−重症及び困難な形態を含む乾癬の様々な形態が含まれる。
「子宮内膜症」は変質した血液を含む嚢胞をよく形成する子宮内膜組織の異所性発生を意味する。
ここでの「血管疾患又は障害」という用語は、心臓血管系を含む血管系に影響を与える様々な疾患又は障害を意味する。そのような疾患の例には、動脈硬化症、血管再閉塞、アテローム性動脈硬化症、術後血管狭窄、再狭窄、血管閉塞又は頸動脈閉塞性疾患、冠状動脈疾患、狭心症、小血管疾患、高コレステロール血症、高血圧症、及び血管内皮細胞の異常増殖又は機能を含む症状が含まれる。
「狭窄」という用語は体内の中空路(例えば管又は路)の狭小化又は狭窄を意味する。
【００６８】
「血管狭窄」という用語は血管の閉塞又は狭窄を意味する。血管狭窄はしばしば脂肪性沈着物(アテローム性動脈硬化症)又は血管平滑筋細胞及び内皮細胞の過剰な遊走及び増殖から生じる。動脈は特に狭窄を被りやすい。ここで使用される「狭窄」という用語はとくに最初の狭窄と再狭窄を含む。
「再狭窄」という用語は、見かけ上の成功を伴った最初の狭窄の治療後における狭窄の再発を意味する。例えば、血管狭窄の意味での「再狭窄」は、例えば血管形成術(例えば経皮経管冠動脈形成術)による脂肪性沈着物の除去、方向性冠動脈粥腫切除術又はステント等により、血管狭窄が見かけ上の成功を伴って治療された後のその再発を意味する。再狭窄の誘因の一つは内膜肥厚化である。「新生内膜過形成」及び「新生内膜形成」と同義に使用される「内膜肥厚化」という用語は、血管平滑筋細胞及び内皮細胞の過剰な増殖及び遊走の結果としての血管最内層の脈管内膜の肥厚化を意味する。再狭窄の間に生じる様々な変化はしばしば集合的に「血管壁リモデリング」と称される。
【００６９】
「バルーン血管形成術」及び「経皮経管冠動脈形成術」(ＰＴＣＡ)はしばしば同義に用いられ、冠状動脈からのプラークの除去の非外科的カテーテルベースの治療法を意味する。狭窄又は再狭窄は血流に対する抵抗の増加の結果として高血圧を生じることがよくある。
「高血圧」という用語は異常に高い血圧、つまり正常範囲の上限を超える血圧を意味する。
「ポリープ」は正常な表面レベルから外側又は上方に隆起又は突出する組織の塊を意味し、半球状、球状、又は細い茎又は比較的広い基部から広がる不規則なマウンド状構造として肉眼で可視できる。例には大腸、直腸及び鼻ポリープが含まれる。
「線維腺腫」は腺性上皮から誘導された良性腫瘍に関連し、そこには、増殖する線維芽細胞及び結合組織エレメントの明白な基質が存在する。これは胸部組織に共通して起こる。
「喘息」は呼吸困難を生じる症状である。気管支喘息は、気道の広範囲の狭窄がある肺の症状を意味し、平滑筋の収縮(攣縮)、粘膜の浮腫、又は気管支及び気管支梢の管腔中の粘液による場合がある。
「気管支炎」は気管支の粘膜の炎症を意味する。
【００７０】
本明細書中の「バイアル」とは、治療薬を包含する容器を指す。バイアルは、注射器によって穴をあけられる栓によって封をされていてもよい。一般に、バイアルはガラス材で形成される。バイアル中の治療薬は、液体、凍結乾燥、凍結などを含む様々な形態でありうる。
「パッケージ挿入物」なる用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療薬の市販用パッケージに通常含まれる指示書を意味する。
【００７１】
ＩＩ．抗体の製造
本発明で使用されるＨＥＲ抗体を製造するための例示的な技術を以下に説明する。抗体の製造に使用されるＨＥＲ抗原は、例えば所望のエピトープを含むＨＥＲの細胞外ドメイン又はそれらの一部の可溶形態のものであってよい。あるいは、抗体を産生するために、その細胞表面にＨＥＲを発現する細胞(例えばＨＥＲ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ-３Ｔ３細胞；又は癌腫株化細胞、例えばＳＫ-ＢＲ-３細胞、Stancovski等, PNAS(USA)88:8691-8695(1991)を参照)を使用することもできる。抗体の産生に有用な他の形態のＨＥＲレセプターは当業者には明らかであろう。
【００７２】
(i)  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００７３】
(ii)  モノクローナル抗体
本明細書中のモノクローナル抗体を作製するための様々な方法が当分野で利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【００７４】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００７５】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００７６】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００７７】
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；及びMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００７８】
(iii)  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００７９】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
国際公開公報01/00245には、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲレセプターのリガンド活性化を阻害する例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の作成が記載される。ここで特に対象とするヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４(又はそのＦａｂ断片)と実質的に同じくらいの効果でＥＧＦ、ＴＧＦ-α及び／又はＨＲＧ媒介活性化を阻害し、及び／又はマウスモノクローナル抗体２Ｃ４(又はそのＦａｂ断片)と実質的に同じくらいの効果でＨＥＲ２に結合する。ここでのヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに取り込まれた非ヒト高頻度可変領域を含んでいても良く、Kabat等, Sequences of Protains of Immunol Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)に示す可変ドメインの番号付けに従って、６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈからなる群から選択される位置で置換されたフレームワーク領域(ＦＲ)をさらに含んでいてもよい。ある実施態様では、ヒト化抗体は位置６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈの内の２つ又は全てでＦＲ置換を含む。
【００８０】
ここで対象とする例示的なヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ、ここでＸは好ましくはＤ又はＳ(配列番号：７)；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ(配列番号：８)；及び／又はＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ(配列番号：９)を含んでなり、場合によっては、これらのＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含んでなり、例えば、実質的に修飾は抗体の親和性を維持又は向上させる。例えば、対象とする抗体変異体は、前記の可変重鎖ＣＤＲ配列で約１から約７又は約５のアミノ酸置換を有していてもよい。このような抗体変異体は、例えば以下に記載されるような親和性成熟により調製されうる。もっとも好ましいヒト化抗体は、配列番号：４の可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
ヒト化抗体は、可変軽鎖ドメイン相補性決定残基ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ(配列番号：１０)；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３、ここでＸ１は好ましくはＲ又はＬ、Ｘ２は好ましくはＹ又はＥ、及びＸ３は好ましくはＴ又はＳ(配列番号：１１)；及び／又はＱＱＹＹＩＹＰＹＴ(配列番号：１２)、例えば更に前段落の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基を含んでなりうる。このようなヒト化抗体は、場合によっては、例えば、抗体の親和性を実質的に維持又は向上させるような前記ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含む。例えば、対象とする抗体変異体は、前記可変軽鎖ＣＤＲ配列で約１から約７又は約５のアミノ酸置換を有していてもよい。このような抗体変異体は、例えば以下に記載されるような親和性成熟により調製されうる。もっとも好ましいヒト化抗体は、配列番号：３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【００８１】
本出願ではまた、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲレセプターのリガンド活性化を阻害する親和性成熟抗体が考えられる。親抗体はヒト抗体又はヒト化抗体、例えば、それぞれ配列番号．３及び４の軽鎖及び／又は重鎖配列を含むもの(つまり、変異体５７４)であってもよい。親和性成熟抗体は、好ましくはＨＥＲ２レセプターにマウス２Ｃ４又は変異体５７４のものより優れた親和性(例えば、ＨＥＲ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)ＥＬＩＳＡを用いて検討して、例えば約２又は約４倍から１００倍又は約１０００倍の向上した親和性)で結合する。置換ための例示的な可変重鎖ＣＤＲ残基は、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９又は２以上(例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、又は７)の組み合わせを含む。変化のための可変軽鎖ＣＤＲ残基の例は、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、又は２以上(例えば、これらの残基の２から３、４、５又は約１０まで)の組み合わせを含む。
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が、考えられる。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、完全な抗体、例えば完全なＩｇＧ１抗体であってもよい。好適な完全なＩｇＧ１抗体は配列番号１３の軽鎖配列と配列番号１４の重鎖配列を含んでなる。
【００８２】
(iv)  ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号及び同第5,545,807号を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
前記したように、またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同第5,229,275号を参照)。
ヒトＨＥＲ２抗体は1998年6月30日発行の米国特許第5,772,997号；1997年1月3日公開の国際公報97/00271に記載されている。
【００８３】
(v)  抗体断片
一又は複数の抗原結合領域を含んでなる抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００８４】
(vi)  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体ではＥＧＦＲ、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４に対する結合部位と、ＨＥＲ２結合部位とが結合しうる。あるいは、ＨＥＲ２アームは、ＨＥＲ２発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるために、ＦｃγＲI(ＣＤ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＨＥＲ２を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＨＥＲ２結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公報96/16673には、ＨＥＲ２／ＦｃγＲIII抗体が記載され、米国特許第5,837,234号には、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲI抗体ＩＤＭ１(Osidem)が開示されている。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は国際公報98/02463、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示する米国特許第5,821,337号に示されている。ＭＤＸ-２１０は二重特異性ＨＥＲ２-ＦｃγＲIII Ａｂである。
【００８５】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Milstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公報93/8829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００８６】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００８７】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報91/00360、国際公報92/200373及び欧州特許第03089号)等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００８８】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００８９】
(vii)  他のアミノ酸配列の修飾
ここで記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００９０】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つ抗体又は細胞障害ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(ＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドの抗体のＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表１に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００９１】
表１
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【００９２】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はへリックス構造、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩の維持に対する効果に有意に異なる置換基を選択することにより達成される。アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 
(2) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(1) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(3) 酸性：Asp, Glu；
(4) 塩基性：His, Lys, Arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(6) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類のものに交換することが必要であろう。
抗体の適切な配置の維持に含まれない任意のシステイン残基は、一般的にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい(特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合)。
【００９３】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高度可変領域残基の置換を含む(例えばヒト化又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択されて得られた変異体は、それらが生成された親抗体に比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法はファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡単に述べれば、高度可変領域部位(例えば、６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形式で表示される。ファージディスプレイ変異体は、次いで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾の候補となる高度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＨＥＲ２との接点を同定するのが有利である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００９４】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ-結合又はＯ-結合の何れかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。この変化は、元の抗体配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【００９５】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、そのＦｃ領域に接着する炭水化物が変更されてもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠いている成熟した炭水化物構造を有する抗体は、米国特許公開2003/0157108A1、Presta, L.に記述されるまた、米国特許公開2004/0093621A1(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着する炭水化物を二分するＮ‐アセチルグルコサミン(GlcNAc)を有する抗体は、国際公開公報03/011878、Jean-Mairet 等及び米国特許第6,602,684号、Umana 等に参照される。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開公報97/30087、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更した炭水化物を有する抗体に関する、国際公開公報98/58964 (Raju, S.)及び国際公開公報99/22764 (Raju, S.)を参照のこと。
【００９６】
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を増強することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成される。別に、又は付加的にシステイン残基(類)をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善された内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevenson等, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
国際公開公報00/42072 (Presta, L.)はヒトエフェクター細胞の存在下にてＡＤＣＣ機能が向上した抗体を記述する。このとき、抗体はそのＦｃ領域にアミノ酸置換を含有する。好ましくは、ＡＤＣＣが向上した抗体は、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４に置換を含有する。好ましくは、変更したＦｃ領域は、これらの位置のうちの１、２又は３に置換を含有する又はからなるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
【００９７】
Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)が変更している抗体は、国際公開公報99/51642、米国特許第6,194,551号B1、米国特許第6,242,195号B1、米国特許第6,528,624号B1及び米国特許第6,538,124号(Idusogie 等)に記述される。抗体は、そのＦｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３及び／又は３３４の一又は複数に、アミノ酸置換を含有する。
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているようにして、抗体(特に抗体断片)にサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで用いられる場合、「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を向上させる原因となるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【００９８】
新生児のＦｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が向上し、半減期が増加している抗体は、国際公開公報00/42072 (Presta, L.)に記述される。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含有する。例えば、Ｆｃ領域は、位置２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数に置換を有しうる。ＦｃＲｎ結合が改善した好適なＦｃ領域含有抗体変異体は、そのＦｃ領域の位置３０７、３８０及び４３４のうちの１、２又は３にアミノ酸置換を含有する。
また、３以上(好ましくは４)の機能的な抗原結合部位を有する遺伝子操作した抗体も包含される(米国特許公開2002/0004587A1、Miller 等)。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当分野において、公知の様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)、又は早期に調製した変異形ないしは非変異形の抗体のカセット突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びオリゴヌクレオチド媒介性(又は、部位特異的な)突然変異誘発による調製を含むが、これに限定されるものではない。
【００９９】
(viii)  所望の特性を有する抗体のスクリーニング
抗体を生産するための技術は上述した。所望する、任意の生物学的特徴を有する抗体がさらに選択される。
ＨＥＲレセプターのリガンド活性化を阻害する抗体を同定するために、ＨＥＲレセプターを発現する細胞に結合するＨＥＲリガンドを阻害する抗体の能力(例えば、対象とするＨＥＲレセプターがＨＥＲヘテロ-オリゴマーを形成する他のＨＥＲレセプターとのコンジュゲーションで)が決定されうる。例えば、ＨＥＲヘテロ-オリゴマーのＨＥＲレセプターを自然に発現する、又は発現するように形質移入された細胞を、抗体とインキュベートし、ついで標識したＨＥＲリガンドに暴露してもよい。次いで、抗体の、ＨＥＲヘテロ-オリゴマーのＨＥＲレセプターに結合するリガンドを阻害する能力が評価されうる。
例えば、ＨＥＲ２抗体によりＭＣＦ７乳癌細胞株へのＨＲＧ結合の阻害は、国際公開公報01/00245に記載のような２４ウェルプレートフォーマットでの氷上単層ＭＣＦ７培地を用いて実施されてもよい。ＨＥＲ２モノクローナル抗体をそれぞれのウェルに加え、３０分間インキュベートししてもよい。125Ｉ標識化ｒＨＲＧβ１177-224(２５ｐｍ)を、次に加え、インキュベーションを４から１６時間続けてもよい。用量反応曲線が作成され、対象とする抗体のためにＩＣ５０値を算出する。一実施態様では、ＨＥＲレセプターのリガンド活性化を阻害する抗体は、このアッセイで約５０ｎＭ以下の、より好ましくは約１０ｎＭ以下のＭＣＦ７細胞へのＨＲＧ結合抑制のＩＣ５０を有しうる。抗体が、Ｆａｂ断片のような抗体断片である場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞へのＨＲＧ結合抑制のＩＣ５０は、例えば約１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。
【０１００】
あるいは、又は更に加えて、ＨＥＲヘテロ-オリゴマーに存在するＨＥＲレセプターのＨＥＲリガンド刺激性チロシンリン酸化を阻害する抗体の能力が評価されうる。例えば、ＨＥＲレセプターを内性的に発現する又はそれらを発現するように形質移入された細胞は、抗体と共にインキュベートされ、次いでＨＥＲリガンド依存性チロシンリン酸化活性を抗-ホスホチロシンモノクローナル(場合によっては、検出可能なラベルとコンジュゲートされたもの)を用いてアッセイされる。米国特許第5,766,863号に記載されるキナーゼレセプター活性アッセイもまた、ＨＥＲレセプター活性化及び抗体による該活性の阻害を測定するのに利用できる。
【０１０１】
一実施態様では、基本的に国際公開公報01/00245に記載されるようなＭＣＦ７細胞のｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ促進を阻害する抗体をスクリーニングしてもよい。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体をそれぞれのウェルに加え、室温で３０分間インキュベートし；次いで最終濃度が０．２ｎＭになるようにｒＨＲＧβ１177-224をそれぞれの穴に加え、インキュベーションを８分間続けてもよい。培地をそれぞれの穴から吸引し、１００μlのＳＤＳサンプル緩衝液(５％ＳＤＳ、２５ｍＭＤＴＴ、及び２５ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)を加えることで、反応を終了させる。それぞれのサンプル(２５μｌ)を、４−１２％勾配ゲル(Novex)で電気泳動し、二フッ化ビニリデン膜に電気泳動的に形質移入してもよい。抗リン酸化チロシン(１μg/ml)免疫ブロットが進み、Ｍｒ〜１８０，０００の顕著な活性バンドの強度が反射率濃度測定により定量されうる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイのコントロールの約０−３５％まで、ｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激を有意に抑制する。反射率濃度測定により決定されたｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激抑制の用量反応曲線が作成され、対象とする抗体のためにＩＣ５０値を算出してもよい。一実施態様では、ＨＥＲレセプターのリガンド活性化を阻害する抗体は、このアッセイで約５０ｎＭ以下の、より好ましくは約１０ｎＭ以下のｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激抑制のＩＣ５０を有しうる。抗体が、Ｆａｂ断片のような抗体断片である場合、このアッセイにおけるｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激抑制のＩＣ５０は、例えば約１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。
【０１０２】
例えば、基本的にSchaefer等, Oncogene 15:1385-1394(1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞での抗体の成長抑制効果を調べてもよい。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞はＨＥＲ２モノクローナル抗体(１０μg/mL)で４日間処理され、クリスタルバイオレットで染色した。ＨＥＲ２抗体とのインキュベーションにより、この細胞株での成長抑制効果はモノクローナル抗体２Ｃ４により示されたものと同じように示されうる。更なる実施態様においては、外因性ＨＲＧはこの抑制を有意に反転させない。好ましくは、抗体は、外因性ＨＲＧのある又は無い両方の状態で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも広範囲に(及び場合によってはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも広範囲に)ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を抑制することができるであろう。
一実施態様において、対象とするＨＥＲ２抗体は、実質的にモノクローナル抗体４Ｄ５よりも効果的な、更に好ましくは実質的にモノクローナル抗体７Ｆ３よりも効果的な国際公開公報01/00245に記載されたような共免疫沈降実験で決定されているような、ＭＣＦ７とＳＫ-ＢＲ-３細胞両方のＨＥＲ３を用いたＨＥＲ２のヘレグリン依存性結合を阻害してもよい。
【０１０３】
増殖抑制性ＨＥＲ２抗体を同定するために、ＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞の増殖を抑制する抗体をスクリーニングしてもよい。一実施態様において、選別した増殖抑制性抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０−１００％、好ましくは約５０−１００％まで細胞培養物中のＳＫ-ＢＲ-３細胞の増殖を阻害することができる。このような抗体を同定するために、米国特許第5,677,171号に記載のＳＫ-ＢＲ-３アッセイを実施することができる。このアッセイに従って、ＳＫ-ＢＲ-３細胞を１０％のウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリンストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ及びＦ１２培地の１：１混合物で生育させる。ＳＫ-ＢＲ-３細胞を３５ｍｍの細胞培養皿で２０，０００細胞を蒔く(２ｍｌ／３５ｍｍ皿)。１皿当り０．５から３０μｇ／ｍｌのＨＥＲ２抗体を追加する。６日後、未処理細胞と比べた細胞数を電子ＣＯＵＬＴＥＲＴＭ細胞カウンタを使用してカウントする。ＳＫ-ＢＲ-３細胞の成長を約２０−１００％、又は約５０−１００％阻害する抗体が、増殖阻害抗体として選択されうる。４Ｄ５及び３Ｅ８などの増殖阻害性抗体のスクリーニングのためのアッセイについては米国特許第5,677,171号を参照のこと。
【０１０４】
アポトーシスを誘発する抗体を選択するためには、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイが利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養し、先の段落において記載したように皿に播種する。ついで培地を回収し、新鮮培地のみ、又は１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む培地と取り替える。３日間インキュベートした後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離する。ついで細胞を遠心分離し、Ｃａ２＋結合氷冷バッファーに再懸濁させ、細胞死アッセイのために上述したようにチューブに等分する。ついでチューブに標識化アネキシン(例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ)(１μｇ／ｍｌ)を入れる。サンプルをFACSCANTMフローサイトメータとFACSCONVERTTMセルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。対照に対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘発する抗体がアポトーシス誘発抗体として選択される。アネキシン結合アッセイに加えて、ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色アッセイが利用できる。このアッセイを行うために、先の２段落に記載したように関心のある抗体で処理されたＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μｇ／ｍｌのHOECHST33342TMと共にインキュベートし、ついでMODFITLTTMソフトウエア(Verity Software House)を使用し、EPICS ELITETMフローサイトメータ(Coulter Corporation)で分析する。このアッセイを使用し、未処理細胞(最大１００％のアポトーシス細胞)よりも２倍又はそれ以上(好ましくは３倍以上)のアポトーシス細胞のパーセンテージの変化を誘発する抗体が、プロアポトーシス抗体として選択される。７Ｃ２及び７Ｆ３などのアポトーシスを誘導する抗体のスクリーニングのためのアッセイについては国際公開公報98/17797を参照のこと。
対象とする抗体により結合したＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを、抗体がＨＥＲ２への２Ｃ４又はパーツズマブなどの抗体の結合を交差ブロッキングするかどうかを評価するために実施することができる。別法として、従来から公知の方法により、エピトープマッピングを実施すること、及び／又は、ＨＥＲ２のどのドメインが抗体に結合するかを見るために、抗体-ＨＥＲ２構造を調べることもできる(Franklin 等 Cancer Cell 5:317-328 (2004))。
【０１０５】
(ix)  パーツズマブ化合物
ＨＥＲ２抗体組成物の一実施態様では、組成物は、主な種類のパーツズマブ抗体とその一又は複数の変異体の混合物を含んでなる。パーツズマブの主な種類の抗体の本明細書中の好適な実施態様は、配列番号３及び４の可変軽鎖及び可変重鎖アミノ酸配列を含有する抗体、最も好ましくは、配列番号１３及び１７から選択される軽鎖アミノ酸配列と配列番号１４及び１８から選択される重鎖アミノ酸配列を含有する抗体(これらの配列の脱アミド化及び／又は酸化した変異体を含む)である。一実施態様では、組成物は、主要な種のパーツズマブ抗体とアミノ末端リーダー伸展を含有するそのアミノ酸配列変異体との混合物を含有する。好ましくは、アミノ末端リーダー伸展は、抗体変異体の軽鎖に(例えば抗体変異体の１又は２つの軽鎖に)ある。主要な種のＨＥＲ２抗体又は抗体変異体は、完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２断片のＦａｂ)であってもよいが、好ましくは、両方とも完全長抗体でありうる。本明細書中の抗体変異体は、抗体の重鎖又は軽鎖の何れか一又は複数にアミノ末端リーダー伸展を含有しうる。好ましくは、アミノ末端リーダー伸展は、抗体の１又は２つの軽鎖にある。アミノ末端リーダー伸展は、ＶＨＳ-を含むかＶＨＳ-からなるのが好ましい。組成物のアミノ末端リーダー伸展の存在は、Ｎ末端配列分析、電荷不均一性のためのアッセイ(たとえば陽イオン交換クロマトグラフィ又はキャピラリーゾーン電気泳動法)、質量分析などを含むがこれに限らず様々な解析手法により検出されうる。一般に、組成物の抗体変異体の量は、変異体の検出に用いられる任意のアッセイ(好ましくはＮ末端配列分析)の検出限界を構成する量から、主な種類の抗体の量より少ない量までの範囲である。通常、組成物中の２０％以下(例えばおよそ１％からおよそ１５％まで、例えば５％からおよそ１５％)の抗体分子がアミノ末端リーダー伸展を含有する。この量の割合は、定量的Ｎ末端配列分析又は陽イオン交換分析(好ましくは高解像度、弱陽イオン交換カラム、例えばPROPAC WCX-10TM陽イオンカラムを用いたもの)を使用して決定されるのが好ましい。さらに、アミノ末端リーダー伸展変異体のほかに、抗体の一方又は両方の重鎖にＣ末端リジン残基を含有する抗体、脱アミド化された抗体変異体などを含むがこれに限らず、主な種類の抗体及び／又は変異体のアミノ酸配列の変更が包含される。
【０１０６】
さらに、主な種類の抗体又は変異体は、限定するものではないが、抗体のＦｃ領域に接着したＧ１ないしＧ２のオリゴ糖構造を含有する抗体、抗体の軽鎖に接着した炭水化物部分(例えば、抗体の１又は２つの軽鎖に接着した、例えば一又は複数のリジン残基に接着した、１又は２の炭水化物部分、例えばグルコース又はガラクトース)を含有する抗体、１又は２の非グリコシル化重鎖を含有する抗体、又は抗体の１又は２の重鎖に接着したシアリデート化されたオリゴ糖を含有する抗体などを含む、グリコシル化変異体を含有しうる。
組成物は、遺伝子操作した細胞株、例えばＨＥＲ２抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株から回収するか、又はペプチド合成によって、調製してもよい。
【０１０７】
(ix)  免疫コンジュゲート
また本発明は、細胞障害剤、例えば化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒又は小分子毒素、それらの断片及び／又は変異形を含む)、又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を含有する免疫コンジュゲートに関する。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述している。抗体のコンジュゲート及び一つ以上の小分子毒素、例えばカリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号)、トリコテン(trichothene)及びCC1065もここにおいて考慮される。
本発明のひとつの好ましい実施態様では、抗体は、一つ以上のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子)と共役している。マイタンシンは、例えばＭａｙ-ＳＨ３へ還元されるＭａｙ-ＳＳ-Ｍｅへ変換され、修飾抗体(Chariら，Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してマイタンシノイド(maytansinoids)−抗体免疫コンジュゲートを生じる。
その他の対象免疫コンジュゲートは、一つ以上のカリケアマイシン(calicheamicin)分子と共役している抗ＥｒｂＢ２抗体を包含する。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチルγ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research 53:3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58:2925-2928(1998))を含む。また、米国特許第5,714,586号；5,712,374号；5,264,586号；及び5,773,001号参照、文献明示によりここに取り込む。
【０１０８】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日に公開の国際公開第93/21232を参照のこと。
本発明は、更に、抗体と核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；DNA分解酵素)をともなう化合物との間に形成される免疫コンジュゲートについて考慮する。
種々の放射性核種が放射性コンジュゲートＨＥＲ２抗体の生成に利用できる。具体例にはＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射線各種が含まれる。
【０１０９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、スクシインミジル１-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開公報94/11026を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に弱いリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら，Cancer Research 52:127-131[1992])を使用してもよい。
あるいは、抗体及び細胞毒性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。
【０１１０】
他の免疫コンジュゲートがここで検討される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合されてもよい。また抗体は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol編(1980)に開示されている。
ここで開示されている抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら,J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【０１１１】
ＩＩＩ．治療のための患者の選択
本明細書において、患者は、場合によって、治療の前に診断検査を行う。例えば、診断検査は、ＨＥＲ(例えばＨＥＲ２又はＥＧＦＲ)の発現(過剰発現を含む)、増幅及び／又は活性化(リン酸化又は二量体化を含む)を評価してもよい。
通常、診断検査が実行される場合、治療を必要とする患者から試料を得てもよい。被検体が癌を有する場合、通常、試料は腫瘍試料である。この好適な実施態様では、腫瘍試料は、卵巣癌、腹膜の癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌、又は結腸直腸癌腫瘍試料由来のものである。
しかしながら、ＨＥＲ抗体について様々な他の非悪性の治療上の徴候を本明細書中に記載する。患者がこれらの非悪性の徴候について治療される場合、患者から好適な試料を入手して、本明細書中に記載のように診断用のアッセイを行うことができる。
本明細書中の生体試料は、固定試料、例えばホルマリン固定、パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)試料又は凍結試料であってもよい。
【０１１２】
本明細書中の本発明の一実施態様では、治療のために選択される患者は、ＨＥＲ(及び、好ましくはＨＥＲ２)活性化を示す腫瘍を有する。一実施態様では、癌細胞におけるＨＥＲ(又はＨＥＲ２)活性化の程度は、同じ組織型の非癌性細胞におけるレセプターの活性化のレベルを有意に上回る。このような過剰な活性化は、ＨＥＲレセプターの過剰発現により生じ、及び／又は癌細胞のＨＥＲレセプターを活性化するために有用なＨＥＲリガンドの正常なレベルよりも高くなり得る。このような過剰な活性化は、癌細胞の悪性の状態を生じうる、及び／又は癌細胞の悪性の状態に起因しうる。いくつかの実施態様では、癌は、ＨＥＲレセプターの過剰な活性化を生じるＨＥＲレセプターの増幅及び／又は過剰発現が生じているかどうか決定するために、診断用アッセイ又は予後のアッセイの対象となるであろう。あるいは又は加えて、癌は、レセプターの過剰な活性化に寄与するＨＥＲリガンドの増幅及び／又は過剰発現が癌で生じているかどうか決定するために、診断用アッセイ又は予後のアッセイの対象となるうる。このような癌のサブセットにおいて、レセプターの過剰な活性化は、自己分泌刺激性の経路から生じうる。ＨＥＲ活性化を測定するための様々なアッセイを以下に詳述する。
【０１１３】
(i)  ＨＥＲ二量体
腫瘍試料は、ＨＥＲ又はＨＥＲ２活性化を示すとして、ＨＥＲ二量体の存在について評価できる。当分野で公知の任意の方法を用いて、腫瘍中のＨＥＲ２二量体、例として、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３を検出してもよい。以下にいくつかの好適な方法について説明する。これらの方法は、非共有結合のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するものであるか、そうでなければ対象のタンパク質間が近接していることを示す。
免疫親和性ベースの方法、例として、免疫沈降又はＥＬＩＳＡは、ＨＥＲ二量体を検出するために用いてもよい。一実施態様では、ＨＥＲ２抗体を用いて、腫瘍細胞からＨＥＲ２を含有してなる複合体を免疫沈降させ、次いで、結果として生じる免疫沈澱物をイムノブロッティングによって、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３の存在について探索する。他の実施態様では、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３抗体を免疫沈降工程に用いて、次いでＨＥＲ２抗体によって、探索してもよい。更なる実施態様では、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２複合体又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３複合体に特異的なＨＥＲリガンドを用いて複合体を沈殿させ、次いで、ＨＥＲ２の存在について探索する。例えば、リガンドは、ビオチンカラムで精製したアビジン及び複合体にコンジュゲートしてもよい。
【０１１４】
他の実施態様では、ＥＬＩＳＡ又は抗体「サンドイッチ」-タイプアッセイなど、ＨＥＲ２に対する抗体は、固形支持体に固定して、腫瘍細胞又は腫瘍細胞溶解物と反応させ、洗浄して、次いで、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３に対する抗体に曝す。直接又は検出可能な標識にコンジュゲートした二次抗体により検出されうる後者の抗体の結合は、ヘテロ二量体の存在を示す。ある実施態様では、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３抗体を固定して、ＨＥＲ２抗体が検出工程に用いられる。他の実施態様では、ＨＥＲリガンドが、ＨＥＲ抗体の代わりに又はＨＥＲ抗体と組み合わせて用いられうる。
また、化学結合又はＵＶ架橋結合を用いて、生細胞の表面上で二量体を共有結合してもよい。Hunter 等, Biochem. J., 320:847-53。化学架橋剤の例には、ジチオビス(スクシンイミジル)プロピオナート(ＤＳＰ)と、3,3'ジチオビス(スルホスクシンイミジル)プロピオナート(ＤＴＳＳＰ)が含まれる。一実施態様では、化学的に架橋された腫瘍細胞からの細胞抽出物を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥと、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ３に対する抗体によるイムノブロットによって、分析する。ＨＥＲ２がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の好適な二量体化パートナーであるように、好適な分子量のスーパーシフトしたバンドはおそらくＥＧＦＲ-ＨＥＲ２又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体を表す。この結果は、その後のＨＥＲ２抗体によるイムノブロットにより確認されうる。
【０１１５】
また、蛍光共鳴エネルギー転移(ＦＲＥＴ)を用いて、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体を検出してもよい。ＦＲＥＴは、ドナー蛍光体からアクセプター蛍光体へのエネルギーの伝達に基づいて、インビボ及びインビトロでのタンパク質立体配置的変化及びタンパク質-タンパク相互作用を検出する。Selvin, Nat. Struct. Biol. 7:730-34 (2000)。ドナー蛍光体がアクセプター蛍光体の十分近傍にある場合、エネルギー転移が起こる。典型的なＦＲＥＴ実験において、単一のタンパク質の２つのタンパク質又は２つの部位が、異なる蛍光プローブにより標識される。プローブの中の一つであるドナープローブは、特定の波長の入射光線によって、より高いエネルギー状態が励起される。次いで、ドナープローブは第二プローブであるアクセプタープローブにそのエネルギーを伝え、その結果、ドナーの蛍光強度の減少とアクセプターの蛍光発光の増加が起こる。エネルギー転移の範囲を測定するために、ドナープローブ及びアクセプタープローブにより標識した試料中のドナーの強度を、ドナープローブだけで標識した試料中の強度と比較する。場合によって、アクセプター強度を、ドナー／アクセプター及びアクセプターのみの試料中で比較する。好適なプローブが当分野で公知であり、例えば、膜透過性染料、例としてフルオレセイン及びローダミン、有機染料、例えばシアニン染料及びランタニド原子などがある。上掲のSelvin。また、エネルギー転移を検出及び測定するための方法及び器具は当分野で公知である。上掲のSelvin。
また、個々の細胞におけるタンパク質-タンパク質相互作用を検出及び測定するために好適なＦＲＥＴベースの技術は当分野で公知である。例えば、ドナー光退色蛍光共鳴エネルギー転移(ｐｂＦＲＥＴ)電子顕微鏡法及び蛍光存続期間画像診断電子顕微鏡法(ＦＬＩＭ)を用いて、細胞表面レセプターの二量体化を検出してもよい。上掲のSelvin、Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129:1543-58 (1995)。一実施態様では、Nagy 等, Cytometry, 32:120-131 (1998)に記載のように、ｐｂＦＲＥＴを「懸濁液中」又は「インサイツ」の細胞に用いて、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体の形成を検出して、測定する。これらの技術は、エネルギー転移によるドナーの蛍光存続期間の減少を測定するものである。特定の実施態様では、Nagy 等, supra, and Brockhoff 等, Cytometry, 44:338-48 (2001)に記載のように、フローサイトメトリーFoerster型ＦＲＥＴ技術(ＦＣＥＴ)を用いて、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２及びＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体化を調査してもよい。
【０１１６】
ＦＲＥＴが、標準的な免疫組織化学標識技術と組み合わせて用いられるのが好ましい。Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001)。例えば、好適な蛍光色素にコンジュゲートした抗体を、２つの異なるタンパク質を標識するためのプローブとして用いられうる。タンパク質が互いに近接してある場合、蛍光色素はＦＲＥＴのためのドナー及びアクセプターとして機能する。エネルギー転移は標準的な方法により検出される。エネルギー転移は、フローサイトメトリー方法によって、又は、デジタル電子顕微鏡法システム、例えば電荷結合素子(ＣＣＤ)カメラに連結する共焦点電子顕微鏡又は広視野の蛍光顕微鏡法により検出されうる。
本発明の一実施態様では、ＨＥＲ２抗体とＥＧＦＲないしＨＥＲ３抗体は、例えば上掲のNagy 等に記載のように、２つの異なる蛍光体にて直接標識する。腫瘍細胞又は腫瘍細胞溶解物は、差次的に標識した抗体と接触させる。この抗体はＥＧＦＲ-ＨＥＲ２又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体の存在下にてＦＲＥＴのドナー及びアクセプターとして機能する。あるいは、ＨＥＲ２とＥＧＦＲないしＨＥＲ３に対する非標識の抗体を、ドナー及びアクセプターとして機能する差次的に標識した二次抗体とともに用いる。例えば、上掲のBrockhoff 等を参照。エネルギー転移が検出され、二量体の存在により標識が非常に近接して観察されることが確認される。
【０１１７】
他の実施態様では、ＨＥＲ２とＨＥＲ１ないしＨＥＲ３に特異的であるＨＥＲレセプターリガンドは、蛍光標識して、ＦＲＥＴ研究のために使われる。
本発明のさらに他の実施態様では、腫瘍細胞の表面上の二量体の存在は、標準的な直接的又は間接的な免疫蛍光法及び共焦点レーザースキャニング電子顕微鏡法を用いたＥＧＦＲないしＨＥＲ３とＨＥＲ２の共局在性により示される。これに対して、Zuck 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11122-27 (1999)に記載のように、レーザースキャニング画像法(ＬＳＩ)を用いて、ハイスループット形式、例えばマイクロウェルプレートにてＥＧＦＲないしＨＥＲ３とＨＥＲ２の共局在性及び抗体結合を検出する。
更なる実施態様では、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体の存在は、二量体構成成分に依存する酵素活性を同定することにより決定される。ＨＥＲ２抗体は１の酵素とコンジュゲートし、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３抗体は第二酵素とコンジュゲートしている。第一酵素のための第一基質を添加し、該反応により第二酵素のための第二基質が生産される。これにより、検出可能な化合物、例として染料を生産するための他の分子との反応が生じる。他の化学薬品の存在により第二の基質が分解されると、第一と第二の酵素、つまり２つの抗体が近傍になければ、第二の酵素との反応が阻害される。具体的な実施態様では、腫瘍細胞ないし細胞溶解物を、グルコースオキシダーゼとコンジュゲートしたＨＥＲ２抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたＨＥＲ３ないしＨＥＲ１に反応させる。染料前駆体、例えばＤＡＢ及びカタラーゼとともに、グルコースを反応に加える。二量体の存在は、ＤＡＢについて染色したときの発色により決定される。
【０１１８】
また、例えば2001年12月6日に発行の米国特許公開2001/0049105に記載のように、二量体は、ｅＴａｇＴＭアッセイシステム(Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA)に基づく方法を用いて検出されうる。この両文献は出典明記によって、その全体が明確に組み込まれる。ｅＴａｇＴＭ又は「電気泳動的タグ」は、検出可能なリポーター成分、例えば蛍光基を含有する。また、基本的に固有の電気泳動易動度を有する成分から成る「可動性修飾子(mobility modifier)」を含有しうる。これらの成分により、定められた電気泳動条件、例としてキャピラリー電気泳動法(ＣＥ)で、複雑な混合物からｅＴａｇＴＭの単離及び検出が可能となる。リポーター成分と、場合によって、可動性修飾子を含有するｅＴａｇＴＭの一部は、第一結合化合物を生産するために、切断可能な連結基によって、第一標的結合成分に連結される。第一標的結合成分は、特定の第一標的、例えば核酸又はタンパク質を特異的に認識する。第一標的結合成分は何れかの様式に限定されるものではなく、例えばポリヌクレオチドないしポリペプチドであってもよい。第一標的結合成分は抗体ないし抗体断片であることが望ましい。これに対して、第一標的結合成分は、ＨＥＲレセプターリガンド又はその結合適合性断片であってもよい。
【０１１９】
連結基は、切断可能な成分、例えば酵素基質、又は定められた条件下で切断されうる任意の化学結合を含有するのが好ましい。第一標的結合成分がその標的と結合する場合、切断試薬を導入及び／又は活性化し、連結基が切断されて、リポーター成分と可動性修飾子を含有するｅＴａｇＴＭ一部が放出される。ゆえに、「遊離した」ｅＴａｇＴＭの存在は、その標的への標的結合成分の結合を示す。
好ましくは、第二結合化合物は、第二標的を特異的に認識する第二標的結合成分と切断試薬を含んでなる。また、第二標的結合成分は何れかの様式のものに限定されるものではなく、例えば、抗体ないし抗体断片又はＨＥＲレセプターリガンド又は結合適合性リガンド断片であってもよい。切断試薬は、第一結合化合物及び第二結合化合物が非常に近傍にある場合、第一結合化合物の連結基を切断するだけのものである。
【０１２０】
本発明の実施態様では、第一結合化合物は、ＨＥＲ２に対する抗体が第一標的結合成分として機能するｅＴａｇＴＭを含んでなる。第二結合化合物は、ｅＴａｇＴＭの連結基を切断できる切断試薬に結合したＥＧＦＲないしＨＥＲ３に対する抗体を含む。好ましくは、切断試薬は、連結基の切断を可能にするために活性化されなければならない。腫瘍細胞ないし腫瘍細胞溶解物を、ＨＥＲ２に結合するｅＴａｇＴＭと、細胞表面上のＥＧＦＲ又はＨＥＲ３に結合する修飾ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３抗体と反応させる。結合していない結合化合物を取り除くのが好ましく、必要であれば、切断試薬を活性化する。ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２又はＨＥＲ２-ＨＥＲ３二量体が存在する場合、切断試薬は連結基を切断し、連結基に対して切断試薬が近いためにｅＴａｇＴＭを放出するであろう。次いで、遊離したｅＴａｇＴＭを、キャピラリー電気泳動法などの当分野で公知の何れかの方法により検出されてもよい。
一実施態様では、切断試薬は、連結基上で機能する活性な化学種である。例えば、切断試薬は、試料を光に曝すことによって、活性化してもよい。
他の実施態様では、ｅＴａｇＴＭは第一標的結合成分としてＥＧＦＲ又はＨＥＲ３に対する抗体を用いて構築され、第二結合化合物はＨＥＲ２に対する抗体から構築される。
さらに他の実施態様では、ＨＥＲ二量体は、二量体の何れかのＨＥＲレセプターへの結合と比較して、二量体に特異的又は優先して結合する抗体又は他の試薬を用いて検出される。
【０１２１】
(ii)  ＨＥＲ２リン酸化
前段落に記載のように、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３抗体による免疫沈降の後に、場合によって、イムノブロッティングの代替又は付加として、二量体についての機能的なアッセイを行ってもよい。一実施態様では、ＨＥＲ３抗体による免疫沈降の後に、免疫沈澱物中で活性なレセプターチロシンキナーゼについてのアッセイを行う。ＨＥＲ３が本来備っているチロシンキナーゼ活性を有さないので、免疫沈澱物中のチロシンキナーゼ活性の存在によりＨＥＲ３がＨＥＲ２とおそらく関係していることが示される。Graus-Porta 等, EMBO J., 16:1647-55 (1997)、Klapper 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4995-5000 (1999)。この結果は、ＨＥＲ２抗体によるイムノブロッティングにより確認されうる。他の実施態様では、ＨＥＲ２抗体による免疫沈降の後に、ＥＧＦＲレセプターチロシンキナーゼ活性についてのアッセイを行う。このアッセイにおいて、免疫沈澱物は、ＥＧＦＲによるＨＥＲ２のリン酸基転移反応のインビボ部位に擬態するペプチド基質と放射性ＡＴＰに反応する。ペプチドのリン酸化は、共免疫沈降とそれによるＨＥＲ２とＥＧＦＲの二量体化を示す。レセプターチロシンキナーゼ活性アッセイは当分野で周知であり、標的基質のリン酸化を、例えばホスホチロシン抗体、及び同族のシグナル伝達経路、例えばＭＡＰＫ経路の活性化によって、検出するアッセイなどがある。
【０１２２】
ＨＥＲレセプターのリン酸化は、一又は複数のＨＥＲレセプター、例えばＨＥＲ２レセプターの免疫沈降、及びウエスタンブロット分析により評価されてもよい。例えば、陽性は、免疫沈降したＨＥＲレセプター(一又は複数)中のリン酸化されたチロシン残基(一又は複数)を検出するための抗ホスホチロシン抗体を用いて、ゲル上のホスホ-ＨＥＲ２バンドの存在により、決定される。抗ホスホチロシン抗体は、Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, CA)の子会社であるPanVera (Madison, WI)、又はUpstate Biotechnology (Lake Placid, NY)から市販されている。陰性はバンドの欠如で決定される。
他の実施態様では、ＨＥＲ２(ＨＥＲ２)レセプターのリン酸化は、リン酸特異的なＨＥＲ２抗体を用いた免疫組織化学により評価される(クローンＰＮ２Ａ、Thor 等, J. Clin. Oncol,18(18): 3230-3239 (2000))。
ＨＥＲレセプター(一又は複数)のリン酸化を検出するための他の方法には、ＫＩＲＡ  ＥＬＩＳＡ(米国特許第5,766,863号、同第5,891,650号、同第5,914,237号、同第6,025,145号、及び同第6,287,784号)、質量分析法(リン酸化及び非リン酸化ＨＥＲ２のサイズの比較)、及びＨＥＲ(例えばＨＥＲ２)抗体とリン酸特異的抗体ないしはリン酸-チロシン特異的抗体(例えば、Aclara BioSciences (Mountain View, CA)から市販のｅＴａｇＴＭアッセイキットを用いる)によるｅタグ近傍アッセイが含まれるが、これに限定されるものではない。ｅＴａｇアッセイの詳細は前述した。
また、細胞性アレイにリン酸特異的抗体を用いて、シグナル伝達タンパク質の細胞試料におけるリン酸化状態を検出してもよい(米国特許公開2003/0190689)。
【０１２３】
(iii)  遺伝子発現プロファイル
一実施態様では、遺伝子発現分析は、ＨＥＲリン酸化又は活性化を直接測定するための代用物として機能しうる。これは、ＨＥＲリン酸化を確実に定量化するのが困難であり、試料が固定試料(例えば、パラフィン包埋、ホルマリン固定腫瘍試料)である場合に特に有用である。この方法によれば、試料中の一又は複数のＨＥＲリガンドと２以上のＨＥＲレセプターの発現が評価され、このとき、２以上のＨＥＲレセプターと一又は複数のＨＥＲリガンドの発現により試料中でのＨＥＲリン酸化又は活性化の陽性が示される。この方法の一実施態様では、試料中のβセルリン及び／又はアムフィレグリン(amphiregulin)の発現が測定され、このとき、βセルリン及び／又はアムフィレグリンの発現により試料中のＨＥＲリン酸化又は活性化の陽性が示される。
この方法によれば、患者の試料は、２以上のＨＥＲレセプター(好ましくは、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３から選択される)と一又は複数のＨＥＲリガンド(好ましくは、βセルリン、アムフィレグリン、エピレグリン(epiregulin)及びＴＧＦ-αから選択される、最も好ましくはβセルリン又はアムフィレグリン)の発現について試験される。例えば、２以上のＨＥＲレセプターは、ＥＧＦＲとＨＥＲ２、又はＨＥＲ２とＨＥＲ３であってもよい。ＨＥＲ２とＥＧＦＲないしＨＥＲ３、並びにβセルリン又はアムフィレグリンの発現を決定するのが好ましい。試料は、βセルリン又はアムフィレグリンのみの発現について、又は、２以上のＨＥＲレセプターの発現についての試験と組み合わせて試験されてもよい。確認された遺伝子(一又は複数)の発現の陽性により、患者がＨＥＲ抗体、例えばパーツズマブによる治療の候補であることが示される。さらに、遺伝子(一又は複数)の発現の陽性により、該患者が、このような発現の陽性を有しない患者より、ＨＥＲ抗体による治療におそらく有利に応答することが示される。
【０１２４】
ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定するための様々な方法には、遺伝子発現プロファイリング、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＲＴ-ＰＣＲ)、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析(ＳＡＧＥ)、MassARRAY、大容量平行サイン配列決定法(Massively Parallel Signature Sequencing)(ＭＰＳＳ)による遺伝子発現分析、プロテオミクス、免疫組織化学(ＩＨＣ)などが含まれるが、これに限定されるものではない。好ましくは、ｍＲＮＡは定量化される。このようなｍＲＮＡ分析は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の技術を用いて、又は、マイクロアレイ分析にって実行されるのが好ましい。ＰＣＲが行われる場合、ＰＣＲの好適な態様は定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＲＴ-ＰＣＲ)である。一実施態様では、例えば同じ種類の腫瘍の他の試料と比較して中央値又はそれ以上である場合、上記の遺伝子の一又は複数の発現は発現の陽性とみなされる。中央の発現レベルは、基本的に遺伝子発現を測定すると同時に決定されうるか、又は前もって決定されていてもよい。
遺伝子発現を決定するための様々な例示的な方法。ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長及び増幅を含むＲＮＡ供与源として固定されたパラフィン包埋組織を用いた遺伝子発現のプロファイリングのための代表的なプロトコールの工程は、様々な出版された定期刊行物に挙げられる(例えば：Godfrey 等 J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)、Specht 等, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001))。簡潔に言えば、代表的な方法は、パラフィン包埋腫瘍組織試料をおよそ１０マイクログラムの厚さの切片に切ることから始まる。次いでＲＮＡを抽出し、タンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析の後、ＲＮＡ修復及び／又は増幅工程が含まれ、必要に応じて、ＲＮＡは遺伝子特異的なプロモーターを用いて逆転写してＰＣＲを行う。最後に、データを分析して、試験した腫瘍試料中で確認された特徴的な遺伝子発現パターンを元に、患者に有用な最高の治療選択肢(一又は複数)を決定する。
【０１２５】
(iv)  ＨＥＲ発現及び増幅
癌におけるＨＥＲ発現又は増幅を決定するために、種々の診断／予後予測アッセイが利用可能である。一実施態様では、ＨＥＲ過剰発現は、例えばHERCEPTEST(登録商標) (Dako)を用いたＩＨＣにより分析されうる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイへ供してもよいし、次のようなＨＥＲ２タンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０ - 染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋ - わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて検出される。細胞はそれらの膜の一部のみが染色される。
スコア２＋ - 弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋ - 中程度から強度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
ＨＥＲ２過剰発現評価に関して０又は１＋スコアの腫瘍は、ＨＥＲ２を過剰発現していないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアの腫瘍はＨＥＲ２を過剰発現していることを特徴としうる。
【０１２６】
ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍は、１細胞当たりに発現されるＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学スコアによって、評価してもよく、生化学的に決定できる：
０＝０〜１０,０００コピー／細胞、
１＋＝少なくともおよそ２００,０００コピー／細胞、
２＋＝少なくともおよそ５００,０００コピー／細胞、
３＋＝少なくともおよそ２,０００,０００コピー／細胞。
チロシンキナーゼのリガンド非依存性活性を引き起こす(Hudziak 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163 (1987))３＋レベルのＨＥＲ２過剰発現は乳癌のおよそ３０％に生じ、これらの患者では、再発のない生存率及び全体の生存率が減少する(Slamon 等, Science, 244:707-712 (1989)、 Slamon 等, Science, 235:177-182 (1987))。
あるいは又は付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばINFORMTM(Ventana, Arizonaから販売)又はPATHVISIONTM(Vysis, Illinois)を、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織で実施して、(生じているならば)腫瘍におけるＨＥＲ２増幅の程度を測定してもよい。
一実施態様では、癌はＥＧＦＲを発現する(及び、過剰発現しうる)ものであり、このような発現は上記したように、ＨＥＲ２発現を評価するための方法として評価してもよい。
また、例えば検出される分子を結合し、検出可能な標識(例えば放射性同位体)が付加された分子(例えば抗体)を投与して、患者を標識の局在化について外部からスキャニングすることによるインビボ診断検査法を用いて、ＨＥＲレセプター又はＨＥＲリガンドの過剰発現又は増幅を評価してもよい。
【０１２７】
ＩＶ．医薬製剤
本発明に用いられる抗体の治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、好適な製薬上受容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する抗体とを混合することにより、保存用に調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980))。受容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。凍結乾燥抗体の製剤は、国際公報97/04801に記載され、文献明示によりここに取り込む。
【０１２８】
治療への使用のための好適なパーツズマブ製剤は、２０ｍＭ ヒスチジンアセテート、１２０ｍＭ ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０、ｐＨ６．０に３０ｍｇ／ｍｌのパーツズマブを含有する。あるいは、パーツズマブ製剤は、２５ｍｇ／ｍｌのパーツズマブ、１０ｍＭ ヒスチジン-ＨＣｌバッファ、２４０ｍＭ ショ糖、０．０２％ ポリソルベート２０、ｐＨ６．０を含有する。
ここで、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。ＨＥＲ抗体と組み合わせうる様々な薬剤を以下の治療方法の項目に記載する。このような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１２９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌にしなければならない。これは無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に成される。
【０１３０】
Ｖ．ＨＥＲ抗体の投薬と治療
ＨＥＲ抗体の固定用量で治療されうる様々な癌の例は、先の定義の項目に記載する。好適な癌の適応症には、卵巣癌、腹膜の癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)を含む乳癌、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)を含む肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、及び／又はＨＥＲ発現、増幅及び／又は活性化を示す癌が含まれる。一実施態様では、治療される癌は、化学療法剤抵抗性の癌又はプラチナ抵抗性の癌である。抗体の固定用量(一又は複数)の投与により、癌の徴候又は症状が改善しうる。
【０１３１】
癌の他に、本明細書中で開示したＨＥＲ抗体の固定用量(一又は複数)を用いて、様々な非悪性の疾患又は障害を治療してもよい。このような非悪性疾患ないし障害には、自己免疫疾患(例えば、乾癬、前述の定義を参照)、子宮内膜症、強皮症、再狭窄、大腸ポリープ、鼻ポリープ、または消化管ポリープ等のポリープ、線維腺腫、呼吸器疾患(前述の定義を参照)、胆嚢炎、神経線維腫症、多発性嚢胞腎疾患、炎症性疾患、乾癬および皮膚炎を含む皮膚疾患、血管系疾患(前述の定義を参照)、血管上皮細胞の異常増殖が関与する症状、炎症性腸疾患、メネトリエ病、分泌性腺腫、またはタンパク質減少症、副腎性疾患、血管形成性疾患、老年性黄斑変性症、予測される眼性ヒストプラズマ症症候群(presumed ocular histoplasmosis syndrome)、増殖性糖尿病網膜症由来の網膜血管新生、網膜血管新生、糖尿病網膜症、または老年性黄斑変性症等の眼疾患、変形性関節症、くる病および骨粗鬆症等の骨関連病変、脳虚血後障害、肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、甲状腺炎、全身性高粘性症候群(hyperviscosity syndrome systemic)、オースラー-ウェーバー-ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、または火傷、外傷、放射線、脳卒中、低酸素症、または虚血などの線維性または浮腫疾患、皮膚の過敏症反応、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症、ギラン-バレー症候群、移植片対宿主病または移植片拒絶反応、パジェット病、骨または関節炎、フォトエイジング(例えば、ヒトの皮膚のＵＶ照射)、良性前立腺肥大、アデノウイルス、ハンタウイルス、ライム病菌、エルシニア菌、および百日咳菌から選択した微生物性病原体を含む微生物感染症、血小板凝集による血栓、子宮内膜症、卵巣過剰刺激症候群、子癇前症、機能不全子宮出血、または機能性子宮出血等の生殖性症状、滑膜炎、急性および慢性腎症(増殖性糸球体腎炎および糖尿病誘発性腎性疾患を含む)、湿疹、肥大性瘢痕形成、内毒性ショック(endotoxic shockおよび真菌感染：家族性大腸ポリープ症、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー氏病、ＡＩＤＳ関連認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、および小脳変性症)、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、虚血性損傷、肺、腎臓、または肝臓の線維症、Ｔ細胞媒介性過敏症疾患、乳児肥大性幽門狭窄(infantile hypertrophic pyloric stenosis)、泌尿器系閉塞性症候群、乾癬性関節炎、および橋本甲状腺炎が含まれる。ここでの治療に好ましい非悪性の症状には、乾癬、子宮内膜症、強皮症、血管系疾患(例えば、再狭窄、アテローム動脈硬化、冠動脈疾患、または高血圧)、大腸ポリープ、線維腺腫、または呼吸器疾患(例えば、喘息、気管支炎(bronchitis、bronchieactasis)、嚢胞性線維症)が含まれる。
【０１３２】
ＨＥＲ抗体は、公知な方法、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間中の継続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下腔内、経口、局所、又は吸入によりヒト患者に投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
疾患の予防又は治療のために、ＨＥＲ抗体の固定用量は、先に定義した治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、及び主治医の判断によるものである。固定用量は、１回又は一連の治療期間を通して患者に最適に投与される。好ましくは、固定用量は、およそ２０ｍｇからおよそ２０００ｍｇの範囲のＨＥＲ抗体である。例えば、固定用量は、ＨＥＲ抗体のおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ又はおよそ１０５０ｍｇでありうる。
一連の固定用量が投与される場合、例えば、およそ毎週、およそ２週間ごと、およそ３週間ごと又はおよそ４週間ごと、好ましくはおよそ３週間ごとに投与されうる。固定用量は、例えば、疾患の進行、副作用又は医師が決定する時まで投与され続けてもよい。例えば、およそ２、３又は４から最高およそ１７回以上の固定用量が投与されてもよい。
【０１３３】
一実施態様では、抗体の一又は複数の負荷投与用量(一又は複数)の後に、抗体の一又は複数の維持用量(一又は複数)が投与される。他の実施態様では、複数の同じ固定用量が患者に投与される。
本発明の好適な一実施態様では、およそ８４０ｍｇのＨＥＲ抗体(例えばパーツズマブ)の固定用量(負荷投与量)の後に、抗体のおよそ４２０ｍｇ(維持用量)の一又は複数の用量が投与される。維持用量は、合計で少なくとも２回から１７回以上の投薬につき、およそ３週間ごとに投与されるのが好ましい。
本発明の他の好適な実施態様では、ＨＥＲ抗体(例えばパーツズマブ)のおよそ１０５０ｍｇの一又は複数の固定用量が、例えば３週ごとに投与される。この実施態様では、１、２又はそれ以上の固定用量が、例えば最高１年間(１７周期)、及び希望によりそれ以上の間投与される。
他の実施態様では、およそ１０５０ｍｇのＨＥＲ２抗体(例えばパーツズマブ)の固定用量は、負荷投与量として投与され、その後抗体のおよそ５２５ｍｇの維持用量の一又は複数が投与される。この実施態様では、およそ１、２又はそれ以上の維持用量が３週間ごとに患者に投与されうる。
ゆえに、本発明は、少なくとも一の固定用量のパーツズマブが患者に投与されることを含む、ヒト患者の癌の治療方法であって、該固定用量がのおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇのパーツズマブである、治療方法を提供する。
【０１３４】
疾患が癌である場合、患者はＨＥＲ抗体と、一又は複数の化学療法剤の組合せで治療されるのが好ましい。好ましくは、少なくとも一の化学療法剤は抗代謝性化学療法剤、例えばゲムシタビンである。併用投与には、異なる製剤又は単一の薬物製剤を用いて同時投与ないしは同時的な投与、及び何れかの順序での連続投与が含まれ、このとき、両方(又はすべて)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を示す期間であることが好ましい。ゆえに、抗代謝性化学療法剤は、ＨＥＲ抗体の投与の前か後に投与されてもよい。この実施態様では、抗代謝性化学療法剤の少なくとも一の投与とＨＥＲ抗体の少なくとも一の投与間の経過時間は、好ましくはおよそ１か月以下及び最も好ましくはおよそ２週間以下である。それに対して、抗代謝性化学療法剤とＨＥＲ抗体は、単一の製剤又は異なる製剤で同時に患者に投与される。化学療法剤(例えばゲムシタビンなどの抗代謝性化学療法剤)とＨＥＲ抗体(例えばパーツズマブ)の組合せによる治療により、相乗的、又はより大きな付加的な治療的利点を患者にもたらしうる。
【０１３５】
通常、抗代謝性化学療法剤は、投与される場合、公知の用量で、又は抗代謝性化学療法剤の投与に帰因するネガティブな副作用ないし薬剤の組合せ作用に従って、場合によって、低い用量で投与される。このような化学療法剤の調製及び投薬計画は、製造業者の指示に従って用いられるか、技術者によって、経験的に決定されうる。抗代謝性化学療法剤がゲムシタビンである場合、例えば、３週間周期の第１日目と第８日目に、およそ６００ｍｇ／ｍ２から１２５０ｍｇ／ｍ２(例えばおよそ１０００ｍｇ／ｍ２)の用量で投与されるのが好ましい。
ＨＥＲ抗体及び抗代謝性化学療法剤の他に、他の治療的投薬計画を組み合わせてもよい。例えば、第二(第三、第四など)の化学療法剤(一又は複数)が投与されてもよく、このとき、第二の化学療法剤は、その他の異なる抗代謝性化学療法剤ないしは代謝性でない化学療法剤の何れかである。例えば、第二の化学療法剤は、タキサン(例えばパクリタキセル又はドセタキセル)、カペシタビン、又はプラチナベースの化学療法剤(例としてカルボプラチン、シスプラチン又はオキサリプラチン)、アンスラサイクリン(例としてドキソルビシン、例えばリポソームドキソルビシン)、トポテカン、ペメトレキセド、ビンカアルカロイド(例えばビノレルビン)及びTLK 286でもよい。異なる化学療法剤の「混合液」が投与されてもよい。
【０１３６】
ＨＥＲ抗体と組み合わされうる他の治療薬は、第二の、異なるＨＥＲ抗体(例えばトラスツズマブなどの増殖阻害性ＨＥＲ２抗体、又はＨＥＲ２を過剰発現する細胞のアポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体、例として７Ｃ２、７Ｆ３又はそのヒト化変異体)、異なる腫瘍関連抗原、例としてＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４に対する抗体、抗ホルモン化合物、例えば抗卵胞ホルモン化合物、例としてタモキシフェン又はアロマターゼ阻害薬、心臓保護剤(治療に関連する任意の心筋機能不全を予防するか又は軽減する)、サイトカイン、ＥＧＦＲ標的薬剤(例えばTARCEVA(登録商標)、IRESSA(登録商標)又はセツキシマブ(Cetuximab))、抗血管新生剤(特に、商標AVASTINTMとしてGenentechにより市販されるベバシズマブ(Bevacizumab))、チロシンキナーゼインヒビター、ＣＯＸインヒビター(例えばＣＯＸ-１又はＣＯＸ-２インヒビター)、非ステロイド性抗炎症剤、セレコキシブ(CELEBREX(登録商標))、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター(例えば、Johnson and Johnsonから入手可能なチピファーニブ(Tipifarnib)／ZARNESTRA(登録商標) R115777又はSchering-Ploughから入手可能なロナファーニブ(Lonafarnib) SCH66336)、癌胎児性タンパク質ＣＡ１２５を結合する抗体、例えばオレゴボマブ(MoAb B43.13)、ＨＥＲ２ワクチン(例えば、PharmexiaのＨＥＲ２ AutoVacワクチン又はDendreonのAPC8024タンパク質ワクチン又はGSK/CorixaのＨＥＲ２ペプチドワクチン)、他のＨＥＲ標的治療(例えばトラスツズマブ、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、CI1033、GW2016など)、Ｒａｆ及び／又はｒａｓインヒビター(例えば、国際公開公報2003/86467参照)、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(DOXIL(登録商標))、トポイソメラーゼIインヒビター、例えばトポテカン、タキサン、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼインヒビター、例えばラパチニブ／ＧＷ572016、TLK286 (TELCYTA(登録商標))、EMD-7200、嘔気を治療する医薬、例としてセロトニンアンタゴニスト、ステロイド又はベンゾジアゼピン、皮膚発疹を予防するか又は治療する医薬又は標準的なざ瘡治療、局所用又は経口の抗生物質を含む、体温-低減医薬、例としてアセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン又はメペリジン、造血成長因子などの何れかの一又は複数を含む。
【０１３７】
上記の何れかの同時投与薬剤の好適な投薬は、現在用いられているものであり、薬剤とＨＥＲ抗体の併用作用(相乗効果)のために低減してもよい。
上記の療法に加えて、患者は、癌細胞の外科的除去及び／又は放射線療法を受けてもよい。
投与される抗体はネイキッド抗体であることが望ましい。しかしながら、投与される抗体は、細胞障害性剤とコンジュゲートされてもよい。好ましくは、免疫コンジュゲート及び／又は結合する抗原は細胞に内部移行され、その結果、結合する癌細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療的有効性が増加する。好適な実施態様では、細胞障害性剤は癌細胞の核酸を標的とするか又は癌細胞の核酸を妨げる。このような細胞障害性剤の例には、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ＲＮＡ分解酵素及びＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本出願は、遺伝子治療による抗体又はタンパク質インヒビターの投与を考慮する。例として、細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関しては、1996年3月14日に公開の国際公開公報96/07321を参照のこと。
【０１３８】
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常は患者の、抗体が必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する(米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって、異なる。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス)、及び脂質ベースのシステム(例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPE、及びDC-Cholである)での形質移入を含む。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどに特異的な抗体とともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を用いて、ターゲティング及び／又は取り込みを促す。そのタンパク質は、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて、内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)、及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公報 93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
【０１３９】
ＶＩ．製造品
本発明の他の実施態様では、癌の又は上記の他の疾患の治療のために有用な材料を具備する製造品が提供される。製造品は、固定用量のＨＥＲ抗体を包含するバイアルと場合によって、パッケージ挿入物とを具備する。バイアルは、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されてもよく、注射器によって、穴が開けられる栓により密封されていてもよい。例えば、バイアルは、DAIKYO GREYTMフルオロ樹脂ラミネート栓と２０ｍｍのフリップアルミニウムキャップを有するformal vitrum タイプIガラスバイアル(例えば４２０ｍｇの固定用量に対しては２０ｃｃのバイアル又は１０５０ｍｇの固定用量に対しては５０ｃｃのバイアル)であってもよい。さらに、製造品は、その他のバッファ、希釈液、フィルター、針及び注射器などを含む、商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
この好適な実施態様では、製造品はＨＥＲ抗体(例えばパーツズマブ)の固定用量を包含するバイアルを具備しており、このとき、固定用量はおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ又はおよそ１０５０ｍｇのＨＥＲ抗体である。
【０１４０】
製造品はさらにパッケージ挿入物を具備することが好ましい。パッケージ挿入物は、卵巣癌、腹膜の癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌、結腸直腸癌の患者を含むがこれに限らない癌患者に、固定用量を投与するため、及び／又はＨＥＲ発現、増幅及び／又はリン酸化を示す癌患者に固定用量を投与するための指示書を提供してもよい。
一実施態様では、製造品は２つのバイアルを具備しており、このときの第一バイアルはおよそ８４０ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含し、第二バイアルはおよそ４２０ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含する。
他の実施態様では、製造品は２つのバイアルを具備しており、このときの第一バイアルはおよそ１０５０ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含し、第二はおよそ５２５ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含する。
【０１４１】
ＶＩＩ．材料の寄託
以下のハイブリドーマ株化細胞を、アメリカ合衆国、バージニア２０１１０−２２０９、マナッサス、ブールバード大学  １０８０１、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託した。
抗体名      ATCC 番号            寄託日
７Ｃ２      ATCC HB-12215       1996年10月17日
７Ｆ３      ATCC HB-12216       1996年10月17日
４Ｄ５      ATCC CRL 10463      1990年5月24日
２Ｃ４      ATCC HB-12697       1999年4月8日
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例により例証する。本明細書中で開示された全ての引用例は、出典明示によりここに特に取り入れている。
【０１４２】
実施例１
本実施例は、薬物動態学的(ＰＫ)集団およびＨＥＲ抗体パーツズマブのための予測的共変量を評価して、固定の、体重に基づく投薬方法又はＢＳＡに基づく投薬方法後の定常状態トラフ血清中濃度の変動性を調べた。パーツズマブは、体重に基づく用量(０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ)又は固定用量(４２０ｍｇ又は１０５０ｍｇ)の何れかの静脈内(ＩＶ)注入(ｑ３週)により投与した。第Ia相及び２つの第II相試験(卵巣及び胸部)からのパーツズマブ血清中濃度データ(１５３人の患者と１４５８の濃度-時点を含む)をプールして、交互作用項(FOCE交互作用項)法による条件付き一次近似法によるNONMEMTMを用いて分析した。線形２-コンパートメント(区画)モデルは、最も良好にデータを示した。体重、血清アルブミン及び血清アルカリホスファターゼは、クリアランス(ＣＬ)に作用している有意な共変量であり、体表面積(ＢＳＡ)は中央コンパートメント(Ｖｃ)で分布容積に作用している有意な変数であった。最終的なモデルにおいて、ＣＬ及びＶｃはそれぞれ、０．２１４Ｌ／日及び２．７４Ｌであった。体重だけは、ＣＬについて８．３％の患者間の変動性を示した。事後予測分布(posterior predictive check)を用いた最終的な集団ＰＫモデルの評価は、良好な成績を示した。最終のモデルを用いた元のデータセットからブートストラップした１０００のシミュレーションでは、固定の投薬、体重に基づく投薬及びＢＳＡに基づく投薬を比較すると、定常状態トラフ濃度の集団変動性がそれぞれ６．２％及び５．８％減少していたのみであった。また、シミュレーションは、２０ｍｃｇ／ｍＬ以下の標的の予測定常状態トラフ濃度を有する被検体の割合が、固定投薬、体重に基づく投薬ないしＢＳＡに基づく投薬後に同じであることを示した。ヒト化抗体は一般的に体重に応じて投薬されるが、この実施例の分析では、癌を治療するために固定用量により、ＨＥＲ抗体であるパーツズマブを投与することが望ましいことが示された。
【０１４３】
方法
研究及び患者
この分析で使用する３つすべての研究は、参加センターの適当な倫理委員会の承認を得た。すべての患者から書面でのインフォームドコンセントを得た。
研究１は、第Ia相、オープンラベル、多施設、用量増加試験であり、進行した固形悪性腫瘍を有する患者に単剤で静脈内投与されるパーツズマブの安全性、耐容性、及び薬物動態学的プロファイルを評価した。これらの患者に、第１サイクルでは９０分の静脈内注入、その後のサイクルでは３０分の注入として、３週間ごとに静脈経由で、ある用量のパーツズマブを投与した。３人又は６人の被検体コホートにおいて、最大耐量(ＭＴＤ)が定められるまで、又は、最も高い服用レベルに達するまで、用量を増やしていった(０．５、２、５、１０及び１５ｍｇ／ｋｇ)。治療の第１サイクルの間、パーツズマブ濃度の測定のために血清試料を、連続した時点：投薬前、静注終了時、１．５時間後、４時間後及び９時間後、及び第２日目、第５日目、第８日目及び第１５日目に採取した。第２治療サイクルの間、パーツズマブ濃度の測定のためのに血清試料を、投薬前、静注の開始から２９分後及び第８日目に採取した。
【０１４４】
研究２は、第II相、オープンラベル、単一アーム、多施設試験であり、進行した卵巣癌患者におけるパーツズマブの全体的な有効性、安全性、耐容性、及び有効性に対する腫瘍ベースのＨＥＲ２活性化の影響を評価した。このとき、疾患は化学療法に抵抗性であるもの、又は化学療法後に再発したものとした。この女性に、８４０ｍｇの固定用量の治療の第１サイクルではパーツズマブを単剤として９０分間静脈内注入し、その後の治療サイクルでは、４２０ｍｇの維持用量で、３０分間の注入として３週間ごとに注入した。第１及び第２の治療サイクルの間、パーツズマブ濃度の測定のために血清試料を投薬の前、注入後１５分、及び第８日目と第１５日目に採取した。パーツズマブ濃度の測定のために更なる血清試料を、その後の治療サイクルの間、投与の前と静注後１５分に採取した。
【０１４５】
研究３は、第II相、オープンラベル、単一アーム、多施設ランダム化試験であり、ＨＥＲ２を低度に発現する転移性乳癌患者における、単剤として投与したパーツズマブの異なる２つの用量の有効性と安全性を評価した。第１の投薬コホートでは、第１サイクルでは８４０ｍｇの負荷用量として９０分間にわたり静注としてパーツズマブを投与し、その後の治療サイクルでは、４２０ｍｇの維持用量で、３０分間の静注として３週間ごとに注入した。第２の投薬コホートでは、第１サイクルでは１０５０ｍｇの用量として９０分間にわたりパーツズマブを静注し、その後の治療サイクルでは、１０５０ｍｇの用量で、３０分間の静注として３週間ごとに注入した。研究３では、パーツズマブ濃度の測定のために血清試料を、はじめの２つの治療サイクルの間に、投薬の前、注入後１５分、及び第８日目と第１５日目に採取した。パーツズマブ濃度の測定のために更なる血清試料を、その後の治療サイクルの間に、投与の前と静注後１５分に採取した。
【０１４６】
薬剤アッセイ
パーツズマブの血清中濃度を、有効であると認められるレセプター-結合、酵素結合、吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)で測定した。アッセイでは、血清試料からパーツズマブを捕捉するために、ｐ１８５ＨＥＲ２細胞外ドメインを使用した。結合したパーツズマブは、マウス抗ヒトＦｃ-西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)にて検出し、テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ) (KPL, Inc.)を発色のための基質として用いて血清パーツズマブを定量化した。アッセイは、ヒト血清中パーツズマブについて０．２５ｍｃｇ／ｍＬの最小定量化濃度であった。
【０１４７】
母集団薬物動態分析
集団非線形混合効果モデリングは、NM-TRAN及びPREDPP及びCompaqコンパイラー(バージョン６．５)を有するNONMEMTM(Boeckmann and Beal NONMEMTM User Guide. San Francisco: NONMEMTM Project Group, University of California, San Francisco (1994))ソフトウェア(バージョンV, Level 1.0)を用いて実施した。２の異なる基本的な構造モデルである、静脈注入による１及び２区画線形ＰＫモデルを、血清パーツズマブ濃度-時間データにフィットさせた。η-ε相互作用による条件付き一次近似(ＦＯＣＥ)法を、モデル構築手順の全体にわたって用いた。
【０１４８】
指数関数的誤差モデルを用いて、ＰＫパラメータの個体間の変動性を示した：
2015063525.tif 000003
乗法的共変量回帰モデルは、以下の通りに行った：
2015063525.tif 000004
このとき、ηipはith個体患者の「真の」パラメータ(Pi)と母集団の代表的な値(Pi(＾付き))との比例的な差を示し、これは個体患者の値に等しい共変量の値に調整したものである。ηipは、平均ゼロで分散量ω2のランダムな効果である。θX及びθDは回帰係数であり、それぞれ、連続的共変量(例えばＷＴ)又は二分した共変量(例えばSEXとRACE)を推定するものである。連続変数はそれらの中央の(med(X))値に集中しているため、θ1は中央の共変量を有する代表的な患者のクリアランス推定値を表す。二分した共変量は、０又は１を符号化した(例えば、雌の場合SEX=0、雄の場合SEX=1、コーカサス人の場合RACE=0、そしてその他の場合RACE=1)。比例加算性誤差モデルとして残差変動性をモデル化した：
Cpij=Cpij(＾付き) (1+εij,prop)+εij,addであり、CpijとCpij(＾付き)は、ith個体のそれぞれjthの測定濃度とモデル推定濃度であり、εij,propとεij,addは、ゼロ平均値と変動σprop2とσadd2内に分布した比例及び加算性の残差個体内ランダム誤差を表す。
【０１４９】
個体の共変量とＰＫパラメータの構造モデルに基づくベイズ予測値との関係をグラフで調べる。事前の試験分析に基づいて、ＰＫパラメータ上の各々の共変量の効果を試験した。まず最初に、個体ＰＫパラメータ上の共変量の影響(すなわち中央区画のクリアランス及び容量)を調べた。次いで、個体ＰＫパラメータの完全な共変量モデルを、有意な共変量をモデルに組み込むことによって、構築した。変数減少法を用いて、モデルの有意な共変量だけを保持することによって、個々のＰＫパラメータの最終的な共変量モデルを決定した。非常に相関する共変量が同種の薬理学的意味を有する場合(例えば重量及びＢＳＡ)、最も有意な因子だけをモデルに残した。各々のＰＫパラメータについて得られたこの最終的な共変量モデルを組み合わせて新規の完全なモデルを作成し、変数減少法を用いて最終的な母集団ＰＫモデルの精度を高めた。
代替構造モデルの比較と共変量モデルの構築は、代表的な適合度診断用プロット線と尤度比検定に基づいた。代替階層的なモデルを比較する場合、目的関数の値の相違は、自由度ｎ内に分布したしたおよそのχ二乗である(ｎは完全モデルと減少モデルとの間のパラメータ又は数の相違である)。この近似値は、FOCE-INTERACTION評価方法のために信頼できることが示された(Wahlby 等 J Pharmacokinet Pharmacodyn 28:231-52 (2001))。２つの階層的なモデルを識別するために、７．９以上(自由度１)（p＜０．００５の有意水準に対応する）の目的関数の相違を用いた。
与えられたＰＫパラメータ(例えばＣＬ)の回帰モデルの共変量により説明される個体間の分散の比率(％分散量)を、以下の通りに算出した：
2015063525.tif 000005
このとき、ω2ＣＬ,ＢＡＳＥＤ及びω2ＣＬ,ＦＩＮＡＬが、基本のＰＫモデルと最終ＰＫモデルのそれぞれにおいて、クリアランスの個体間の分散量を表す。
【０１５０】
母集団薬物動態モデル評価
この研究のモデル評価により、ブートストラップ再サンプリング技術を利用して、最終的なモデルの安定性を評価して、パラメータの信頼区間を推定した。このモデル評価技術は、まずNONMEMTM (N Holford, バージョン404, 2003年6月, Auckland, New Zealand)のソフトウェアパッケージWingsのブートストラップオプションを用いてデータセットを作製し、各々の反復データセットのパラメータ推定値を得ることからなる。１０００の成功した実験から結果を得て、母集団パラメータについて平均及び2.5th及び97.5thパーセンタイル(９５％の信頼区間を意味する)を決定し、元のデータの推定値と比較した。
【０１５１】
加えて、事後予測モデルチェックを用いて、観察されたデータを表すために最終モデルの能力を評価した(Yano 等 J Pharmacokinet Pharmacodyn 28:171-92 (2001)、Gelman 及び Meng, Model checking and model improvement. In: Gilks WR, Richardson S, Spiegelhalter DJ, 編集 Markov Chain Monte Carlo in Practice. Boca Raton: Chapman & Hall/CRC, 189-202 (1996)、Gelman 等 Bayesian Data Analysis. Boca Raton: Chapman & Hall/CRC (2004)。これらの分析において、観察されたデータの2.5th、5th、10th、25th、50th(中央値)、75th、90th、及び95thパーセンタイル値を算出して、事後予測モデルチェックの検定統計量として選択した。最終的な一定のランダム効果パラメータを含む、最終的な母集団ＰＫモデルを用いて、観察されたデータセットの１０００の複製をシミュレーションして、各々のシミュレーションしたデータセットから検定統計量を算出した。次いで、シミュレーションしたデータセットからの検定統計量の事後予測分布を観察された検定統計量と比較して、シミュレーションしたデータセットからの検定統計量が観察された検定統計量の実現値を上回る場合の割合を、以下の方程式(上掲のGelman and Meng, (1996))に従って算出することによって、ｐ値(pPPC)を推定した。
2015063525.tif 000006
このとき、引数が真性、さもなくば０の場合に、I(.)は値１をとる指標関数である。観察されたデータyによって、認められるので、T(y,θ)は観察される検定統計量の「現実値」である。T(yirep, θ)は、シミュレーションされたデータセットiの検定統計量である(１から１０００までの範囲) (上掲のGelman and Meng, (1996))。
加えて、シミュレーションしたデータの2.5th、5th、95th及び97.5th分位点を、個体患者の各々の時点について算出した。プールしたシミュレーションしたデータの2.5thと95.5thの分位点(９５％の間隔)、5thと95thの分位点(９０％の間隔)の境界内にある観察されたデータの数を決定した。
【０１５２】
固定投薬、ＢＳＡに基づく投薬及び重量ベースの投薬後のパーツズマブの曝露
最終的な母集団ＰＫモデルを用いて、定常状態トラフ濃度を測定して、固定投薬、ＢＳＡに基づく投薬及び重量ベースの投薬後に曝露した。血清中濃度-時間のプロファイルと１０００の被検体のパーツズマブのクリアランスを、元のＰＫデータセットをブートストラッピング(置換によって、)することによって、得られたデータセットと最終的なモデルを用いて、固定投薬計画、ＢＳＡに基づく投薬計画、又は体重に基づく投薬計画についてシミュレーションした。すべてのシミュレーションした被検体に、第０日目に９０分にわたる８４０ｍｇ、１２．２ｍｇ／ｋｇ又は４８５ｍｇ／ｍ２を静脈注入した後、第２１、４２及び６３日目に３０分にわたる４２０ｍｇ、６．１ｍｇ／ｋｇ又は２４２．５ｍｇ／ｍ２を静脈注入した。次いで、異なる投薬計画後の第８４日目(Csstrough)に得られた定常状態トラフ濃度を評価した。加えて、固定投薬、ＢＳＡに基づく投薬、又は体重に基づく投薬後の標的濃度(２０ｍｃｇ／ｍｌ)以下の定常状態トラフ濃度を有する被検体の割合を算出した。シミュレーションしたクリアランス値を用いて、以下の方程式に従って定常状態平均曝露(AUCss0-τ)を決定した：
2015063525.tif 000007
【０１５３】
結果
人口統計学的データ。このＰＫ分析法に含まれる患者の人口統計学的特徴を、表２に挙げる。
表２  この分析に含まれる患者の人口統計学的特徴
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*BSA、体表面積。
【０１５４】
合計１４５８のパーツズマブ血清中濃度時点は、３つの研究の１５３人の患者から集めた。合計のうちの１８人の患者は第Ia相試験、６０人の患者が第II相卵巣癌試験、７５人の患者が第II相乳癌試験から得た。ゆえに、この分析の患者の大多数(９４．８％)は女性であり、血清パーツズマブ濃度データのうちの１１１０(７６％)を占めた。すべての被検体はＦＩＳＨ(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)分析により確認される低ＨＥＲ２発現腫瘍を有し、０又は１のＥＣＯＧ (Eastern Cooperative Oncology Group)一般状態により示されるように、良好な理学的機能的な状態であった。欠測共変量を有する患者数は非常に低く(伸長及びＢＳＡについて４．６％)、欠測共変量は中央値にて帰した。文書化したサンプリングデータのみを有する３８４(２０．８％)の血清パーツズマブ濃度試料では、サンプリング時間を帰して、正午の１２時とした。モデルの母集団のパラメータ推定値に対するこれらの帰した時間の影響を評価するために行われる感受性分析により、有意な影響がなかったことが示された。
【０１５５】
母集団ＰＫ分析。２-区画モデルは、目的関数(δ＝−７３６．２)及び診断用プロット線の変化に基づいて、１-区画モデルより良好なデータを示した。１-及び２-区画モデルにフィットさせた代表的なパーツズマブ血清中濃度-時間のプロファイルを、図９Ａ−Ｂに図示する。
このη項目を除去すると目的関数において、統計学的に有意に増加しなかったので(δ＜７．８８)、Ｋ１２の個体間の変動性項目(η)を２-区画モデルから削除した。したがって、ηCL、ηVc及びηk21のみを最終的な基本のモデルに残した。
次いで、ηCL、ηVc及びηk21間の共分散項目の存在の効果を評価した。ηCL、ηVc及びηk21間の共分散項目の取込みによりフィッティングが改善した(δ＝-23.2、df＝3)。しかしながら、共分散項目は、十分に推定されず(％ＣＶ＞１００)、わずかに予測される相互関係を有し(rCL-Vc=0.37、r CL-K21=0.27、rVc-K21=0.42)、パラメータ評価にほとんど影響を及ぼさないことが明らかとなった(データは示さない)。したがって、共分散項目は、共変量効果モデル設定のために残さなかった。最終的な基本のモデルを用いた試験的な分析では、潜在的な共変量とηk21の見かけの関係は同定されなかった。したがって、ηk21に対する共変量効果は、共変量を有する最終モデルの開発の間、調べなかった。
【０１５６】
共変量を有する最終モデルについて、観察されたパーツズマブに対する予測されたパーツズマブの血清中濃度と予測された血清中濃度プロット線に対する重みつき残差を図１０Ａ−Ｂに示す。最終モデルでは、血清アルブミン(ＡＬＢ)、体重(ＢＷ)及び血清アルカリホスファターゼ(ＡＬＫＰ)は、パーツズマブクリアランス(ＣＬ)の個体間の変動性を説明している最も有意な共変量であった。ＢＳＡは、分布(Ｖｃ)のパーツズマブ中央区画容量の個体間の変動性を説明している最も有意な共変量であった。ηCL、ηVc及びηk21間の共分散項目の取込みにより、フィッティングが改善した(δ＝-14.0、df＝3)。しかしながら、推定された相互関係は大きくなく(rCL-Vc=0.45、rCL-K21=0.28、rVc-K21=0.39)、パラメータ推定値は影響しなかった(データは示さない)。したがって、共分散項目は最終モデルに含まなかった。最終モデルを、以下の通りに例示する：
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【０１５７】
最終モデルのパラメータ推定値を表３に要約する。
表３  最終母集団薬物動態モデルのパラメータ推定値とブートストラップ確認手順を用いたパラメータの安定
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ａ．％ＲＳＥ：推定値のパーセント相対的標準誤差＝ＳＥ／パラメータ推定値×１００
【０１５８】
分析母集団の血清パーツズマブのＣＬは０．２１４Ｌ／日であると推定され、Ｖｃは２．７４Ｌであった。Ｋ12及びＫ21はそれぞれ、０．２０３及び０．２５８日−１であった。個体間の分散量の平方根(ω２)として算出され、％ＣＶとして表される、最終モデルにおけるＣＬ及びＶｃの個体間変動はそれぞれ、３１．１％及び１６．２％であるのに対して、共変量のない基本のモデルでは３８．０％及び２０．８％であった。したがって、最終モデルのＡＬＢ、ＷＴ及びＡＬＫＰの共変量効果は、ＣＬの個体間の分散量のおよそ３３％となった。しかしながら、重量のみは、ＣＬについては８．３％のみの患者間変動となった。ＢＳＡの共変量効果は、最終的なモデルのＶｃのためのおよそ３９％の個人間の分散量を説明した。基本モデルによるＷＴに対するＣＬ及びＢＳＡに対するＶｃの依存性を、図１１Ａ−Ｂに示すように最終モデルにおいて、説明する。推定されたｔ１／２α及びｔ１／２βはそれぞれ、１．４及び１７．２日であった。
【０１５９】
モデル評価。元のデータセットから、１０００の成功したブートストラップ実験を得て、元の観察されたデータと比較した。ブートストラップ法から得た平均母集団ＰＫ推定値は、元のデータセットのパラメータ推定値と類似しており(表３)、これは、開発したモデルが安定していることを示す。一定-効果パラメータの９５％の信頼区間は狭く、良好な精度を示した。
事後予測モデルチェックを用いて、最終モデルの能力を評価して、観察されたデータを示した。最終的に一定のランダムな-効果パラメータを含む、最終的な母集団薬物動態モデルを用いて、１０００の複製をシミュレーションした。次いで、この１０００のシミュレーションしたデータセットの各々について検定統計量を算出した。図１２Ａ−Ｆは、垂直線で示される観察された検定統計量の「現実値」とともに、選択された検定統計量の１０００のシミュレーションした値の棒グラフを示す。事後予測分布は、各々の検定統計量の０．０５より大きい推定されたｐ値を有する実測値に近似していた。加えて、プールしたシミュレーションしたデータの９０％と９５％の分位点範囲内の観察されたパーツズマブ濃度のパーセントはそれぞれ、８９．３％及び９４．７％であった。これらの結果から、本モデルがかなり良好にデータを表し、予測できることが示唆された。
【０１６０】
固定投薬、ＢＳＡに基づく投薬及び体重に基づく投薬後のパーツズマブの曝露。
第８４日目の予測されるパーツズマブ定常状態トラフ血清中濃度(Css,trough)を、方法の項目で概説される投薬スケジュールに従って固定投薬、体重に基づく投薬ないしはＢＳＡに基づく投薬を行った最終モデルと元のＰＫデータセットからブートストラップした１０００のシミュレーションした被検体から推定した。これらのデータは、固定用量と比較して、体重ベース及びＢＳＡに基づく投薬によりCss,troughの母集団変動がそれぞれ６．１７％及び５．７６％減少したことを示した(図１３及び表４)。
【０１６１】
表４  最終モデルによる元のＰＫデータセットからブートストラップした１０００のシミュレーションした被検体についての、固定投薬、体重に基づく投薬又はＢＳＡに基づく投薬後の、予測されるパーツズマブ定常状態トラフ濃度(第８４日目)
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ａ固定用量から変化したパーセント分散量は、以下の方程式を用いて算出した：
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【０１６２】
２０ｍｃｇ／ｍｌの標的血清中濃度以下のCsstroughを有する被検体のパーセンテージは類似しており、固定投薬、体重に基づく投薬又はＢＳＡに基づく投薬ではそれぞれ８．３％、８．７％及び８．３％の値であった(表４)。１０００のシミュレーションした被検体についてパーツズマブ血清定常状態AUCss0-τの分析から同様な結果が得られ、固定投薬と比較すると、体重に基づく投薬とＢＳＡに基づく投薬はそれぞれ２．２％と４．２％だけ母集団変動が減少した。同じシミュレーションしたデータセットを用いて、極端な体重(すなわち、ＷＴ≦１０ｔｈ、及び、≧９０ｔｈパーセンタイル)を有する集団に対して固定投薬、体重に基づく投薬及びＢＳＡに基づく投薬の後にCss,troughを測定した(図１４Ａ−Ｂ)。１０ｔｈのパーセンタイル以下のＷＴを有する集団の中央値パーツズマブCss,troughは、固定投薬、体重に基づく投薬及びＢＳＡに基づく投薬ではそれぞれ７２．３(範囲：８．７〜１６６．５)、５２．８(範囲：６．８〜１２５．７)及び６３．２(範囲：７．８〜１５０．１) ｍｃｇ／ｍｌであった。２０ｍｃｇ／ｍｌの標的血清中濃度以下のCss,troughを有する集団の被検体のパーセンテージは、固定投薬、体重に基づく投薬及びＢＳＡに基づく投薬ではそれぞれ５．４％、１２．６％及び９．０％であった。９０ｔｈのパーセンタイル以上のＷＴを有する集団の中央値パーツズマブCss,troughは、固定投薬、体重に基づく投薬及びＢＳＡに基づく投薬ではそれぞれ４２．１(範囲：７．０〜１１９．８)、６２．８(範囲：１４．４〜１６７．３)及び５２．９(範囲：１０．２〜１３３．３) ｍｃｇ／ｍｌであった。２０ｍｃｇ／ｍｌの標的血清中濃度以下のCss,troughを有する集団の被検体のパーセンテージは類似しており、固定投薬、体重に基づく投薬又はＢＳＡに基づく投薬ではそれぞれ７．４％、２．８％及び５．６％の値であった。１０００のシミュレーションした被検体のこれらサブグループのパーツズマブ血清定常状態AUCss0-τの分析から同様な結果が得られた。
【０１６３】
考察
典型的には、腫瘍学において、ヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体及び細胞障害性小分子薬剤は、体重に基づく(ｍｇ／ｋｇ)又はＢＳＡに基づく用量基準で投与されていた。パーツズマブは、進行癌患者の第Ia相試験と、卵巣、胸部、肺及び前立腺癌患者の第II相試験による臨床試験が行われていた。パーツズマブは、第I相試験では体重に基づいて(ｍｇ／ｋｇ)投与され、次いで、第II相試験では固定用量を用いて開始された。これら３つの試験で集められた人口統計学的データ及び血清パーツズマブ濃度-時点データを用いて、パーツズマブＰＫの予測的共変量を有する母集団ＰＫモデルを本明細書において、構築した。次いで、このモデルを用いて、固定投薬法、体重に基づく投薬法及びＢＳＡに基づく投薬法の後に定常状態濃度を調べた。
この分析から得られるパーツズマブＰＫは、腫瘍学において、用いられる他のヒト化モノクローナルＩｇＧ１剤についての報告と非常に類似していた(Harris 等 Proc Am Soc Clin Oncol 21:488a (2002)、Leyland-Jones 等 J Clin Oncol 21:3965-71 (2003)、及び Lu 等 Clin Pharmacol Ther 75:91 (2004))。
【０１６４】
線形２-区画線形ＰＫモデルは最も良好にデータを表しており、最終のモデルでは、パーツズマブＣＬは０．２１４Ｌ／日であった。パーツズマブの代表的なＶｃは２．７４Ｌ又はおよそ４０ｍｌ／ｋｇであり、これはヒトの血漿容量に等しく、他のモノクローナルＩｇＧ１剤について報告される値と一致していた(上掲のHarris 等 (2002)、及び上掲のLu 等 (2004))。パーツズマブＣＬは体重とアルブミン及びアルカリホスファターゼの血清中濃度に有意に影響を受けるのに対して、ＶｃはＢＳＡに有意に影響を受ける。パーツズマブＰＫに対する性別の影響は、分析に含まれる男性被験者が少なかったために(５．２％)、評価できなかった。ブートストラップ手順及び事後モデルチェックの結果から、最終モデルが安定しており、かなり良好にデータを表して予測できることが示唆された。
ＣＬに対する体重の影響及びＶｃに対するＢＳＡの影響は、パーツズマブが体重又はＢＳＡに基づいて投与されうることを示唆した。しかしながら、モデルにおいて、体重単独及びＢＳＡ単独の共変量効果のみが、それぞれおよそ８．３％及び４０％のＣＬ及びＶｃの個体間効果を説明するのみであった。これは、体重がＣＬの予測因子であり、ＢＳＡがＶｃの予測因子であるのに対して、投与後のパーツズマブ曝露に対する体重及びＢＳＡの影響は測定可能な程度ではあるが、さほど寄与しないことが示唆される。
【０１６５】
したがって、次の工程では、シミュレーションを用いて、パーツズマブ曝露に対する様々な投薬法の影響を評価した。元のデータセットからブートストラップした１０００の被検体において、固定投薬の場合と比較して、体重に基づく投薬又はＢＳＡに基づく投薬により、第８４日目のシミュレーション定常状態トラフ血清中濃度の母集団変動がそれぞれ、６．２％及び５．８％だけ減少したことが明らかとなった。さらに、選択された標的の２０ｍｃｇ／ｍＬ以下の予測された定常状態トラフ血清中濃度を有する被検体のパーセンテージは、すべての３つの投薬法で類似していた。極端な体重(すなわち、ＷＴ≦１０ｔｈ、及び、≧９０ｔｈパーセンタイル)を有する集団において、サブグループの分析をしたところ同様な結果が得られた。
したがって、パーツズマブＰＫがＷＴ及びＢＳＡに関連があると結論付けられる。しかしながら、ＷＴ及びＢＳＡはＣＬ及びＶｃの個体間変動の小さいパーセントだけを説明したのであって、ＷＴ及びＢＳＡに基づく投薬はパーツズマブ定常状態曝露の予測性を向上させるものではないようであった。それは、癌患者のパーツズマブの固定投薬計画を応用することが推奨される。
【０１６６】
本発明は、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体の体重に基づく投薬又はＢＳＡに基づく投薬の、癌患者の定常状態薬剤濃度に対する影響の臨床的評価を初めて開示したものと思われる。一定に固定した投薬の実施は、いくつかの有意な患者ケアと経済的意味を有する：i) 単一単位の用量の製造、保存及び輸送の面で、より効率が上がるため、コストが下がる、ii) 薬剤の面では単一用量が効率よく調製され、病院では患者の個別化を必要としない、iii) 単一単位の用量を処方する医師の効率が高まる、そして、iv) 用量計算誤差による間違った用量を投与される患者の尤度が低い。一般的に、ヒト化抗体は体重又はＢＳＡにより投薬されるが、本明細書における分析では、癌患者に固定用量を用いたＨＥＲ抗体パーツズマブの投与の実現可能性を実証した。
【０１６７】
実施態様
１．  一又は複数の固定用量のＨＥＲ抗体を癌を治療するために有効な量でヒト患者に投与することを含む、癌の治療方法。
２．  前記抗体が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３からなる群から選択されるＨＥＲレセプターに結合する、請求項１に記載の方法。
３．  前記抗体がＨＥＲ２に結合する、請求項２に記載の方法。
４．  前記ＨＥＲ２抗体がＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインIIに結合する、請求項３に記載の方法。
５．  前記抗体がＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインIとIIとIIIとの結合部に結合する、請求項１ないし４の何れか一に記載の方法。
６．  前記ＨＥＲ抗体がＥＧＦＲ又はＨＥＲ３とＨＥＲ２とのヘテロ二量体化を阻害する、請求項１ないし５の何れか一に記載の方法。
７．  前記ＨＥＲ抗体が、それぞれ配列番号３及び４の可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を含有してなる、請求項１ないし６の何れか一に記載の方法。
８．  前記ＨＥＲ抗体がパーツズマブである、請求項１ないし７の何れか一に記載の方法。
９．  前記の固定用量がおよそ２０ｍｇからおよそ２０００ｍｇの範囲のＨＥＲ抗体である、請求項１ないし８の何れか一に記載の方法。
１０．  前記の固定用量が、ＨＥＲ抗体のおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである、請求項１ないし９の何れか一に記載の方法。
１１．  前記の固定用量がおよそ４２０ｍｇのＨＥＲ抗体である、請求項１０に記載の方法。
１２．  前記の固定用量がおよそ１０５０ｍｇのＨＥＲ抗体である、請求項１０に記載の方法。
１３．  ＨＥＲ抗体の固定用量が、およそ毎週、およそ２週間ごと、およそ３週間ごと又はおよそ４週間ごとに患者に投与される、請求項１ないし１２の何れか一に記載の方法。
１４．  前記ＨＥＲ抗体の固定用量がおよそ３週間ごとに患者に投与される、請求項１３に記載の方法。
１５．  前記ＨＥＲ抗体がネイキッド抗体である、請求項１ないし１４の何れか一に記載の方法。
１６．  前記ＨＥＲ抗体が完全な抗体である、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法。
１７．  前記ＨＥＲ抗体が、抗原結合領域を含んでなる抗体断片である、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法。
１８．  前記ＨＥＲ抗体がヒト化ＩｇＧ１抗体又はヒトＩｇＧ１抗体である、請求項１ないし１７の何れか一に記載の方法。
１９．  前記癌がＨＥＲの発現、増幅又は活性化を表す、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法。
２０．  前記癌が、卵巣癌、腹膜癌又は卵管癌である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法。
２１．  前記癌が転移性乳癌(ＭＢＣ)である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法。
２２．  前記癌が非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法。
２３．  前記癌が前立腺癌である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法。
２４．  前記癌が結腸直腸癌である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法。
２５．  前記患者に第二の治療薬が投与されることを含む、請求項１ないし２４の何れか一に記載の方法。
２６．  前記の第二の治療薬が、化学療法剤、異なるＨＥＲ抗体、異なる腫瘍関連抗原に対する抗体、抗ホルモン化合物、心臓保護剤、サイトカイン、ＥＧＦＲ標的薬剤、抗血管形成剤、チロシンキナーゼインヒビター、ＣＯＸインヒビター、非ステロイド系抗炎症薬、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、癌胎児性タンパク質CA 125を結合する抗体、ＨＥＲ２ワクチン、他のＨＥＲ標的治療、Ｒａｆ又はｒａｓ癌遺伝子インヒビター、ドキソルビシンＨＣＬリポソーム注射、トポテカン、タキサン、二重チロシンキナーゼインヒビター、TLK286、EMD-7200、嘔気を治療する医薬、皮膚発疹を予防又は治療する医薬又は標準的なざ瘡治療、体温減少医薬及び造血成長因子からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
２７．  前記の第二の治療薬が化学療法剤である、請求項２６に記載の方法。
２８．  前記の化学療法剤が抗代謝性化学療法剤である、請求項２７に記載の方法。
２９．  前記抗代謝性化学療法剤がゲムシタビンである、請求項２８に記載の方法。
３０．  前記の第二の治療薬がトラスツズマブ、エルロチニブＨＣＬ、又はベバシズマブである、請求項２６に記載の方法。
３１．  少なくとも一の固定用量のパーツズマブを患者に投与することを含み、該固定用量がパーツズマブのおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである、ヒト患者の癌の治療方法。
３２．  固定用量のパーツズマブがおよそ３週間ごとに患者に投与される、請求項３１に記載の方法。
３３．  前記癌が、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項３１又は請求項３２に記載の方法。
３４．  固定用量のＨＥＲ抗体を含有してなるバイアルを具備する製造品であって、該固定用量がＨＥＲ抗体のおよそ４２０ｍｇ、およそ５２５ｍｇ、およそ８４０ｍｇ及びおよそ１０５０ｍｇからなる群から選択されるものである、製造品。
３５．  前記ＨＥＲ抗体がパーツズマブである、請求項３４に記載の製造品。
３６．  さらに、使用者に固定用量を癌患者に投与することを指示するパッケージ挿入物を具備する請求項３４又は請求項３５に記載の製造品。
３７．  前記癌が、卵巣癌、腹膜癌、卵管癌、転移性乳癌(ＭＢＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、前立腺癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項３６に記載の製造品。
３８．  さらに、前記パッケージ挿入物が、使用者に、ＨＥＲ発現、増幅又は活性化を表す癌患者に固定用量を投与することを指示する、請求項３６又は請求項３７に記載の製造品。
３９．  第一のバイアルがおよそ８４０ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含しており、第二のバイアルがおよそ４２０ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含する、２つのバイアルを具備する請求項３４ないし３８の何れか一に記載の製造品。
４０．  第一のバイアルがおよそ１０５０ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含しており、第二のバイアルがおよそ５２５ｍｇのパーツズマブの固定用量を包含する、２つのバイアルを具備する請求項３４ないし３８の何れか一に記載の製造品。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2015063525.tif 000026
【図１１Ｂ】
2015063525.tif 000027
【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１２Ｄ−Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2015063525000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月7日(2014.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2015063525000001.pdf
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