(57)【要約】【課題】基質として天然基質と構造が同一又は類似する二糖を用いたイズロン酸−２−スルファターゼの活性測定法を提供すること。【解決手段】イズロン酸−２−スルファターゼの酵素を測定する方法であって，次のステップすなわち，（ａ）試料に含まれるイズロン酸−２−スルファターゼを，２位に硫酸基を有するウロン酸と，アミノ糖とが，１，４結合により結合したものである二糖若しくはその塩を基質として，該基質と反応させるステップ，（ｂ）上記ステップ（ａ）の反応により，該２位の硫酸基が脱硫酸化されることにより生じた生成物を，カラムクロマトグラフィーに付して，該基質から分離させるステップと，（ｃ）上記ステップ（ｂ）のカラムクロマトグラフィーにより該基質から分離された該生成物を検出するステップとからなる，方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イズロン酸−２−スルファターゼの酵素活性を測定する方法であって，次のステップすなわち，
（ａ）イズロン酸−２−スルファターゼを，２位に硫酸基を有するウロン酸と，アミノ糖とが，１，４−グリコシド結合又は１，３−グリコシド結合により結合したものである二糖若しくはその塩を基質として，該基質と反応させるステップ，
（ｂ）上記ステップ（ａ）の反応により，該２位の硫酸基が脱硫酸化されることにより生じた生成物を，カラムクロマトグラフィーに付して，該基質から分離させるステップと，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）のカラムクロマトグラフィーにより該基質から分離された該生成物を検出するステップとからなる，方法。
【請求項２】
該二糖が，下記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
【化１】
2015096063.tif 000007
［式（Ｉ）〜（ＩＶ）中，Ｒ１は−ＮＨ２，−ＮＨＣＯＣＨ３又は−ＮＨＳＯ３Ｈ；Ｒ１はＯＳＯ３Ｈ；Ｒ３はＣＯＯＨ；Ｒ４はＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＳＯ３Ｈ；Ｒ５はＯＨ又はＯＳＯ３Ｈを，それぞれ独立して示す。］，
で示される群から選択される二糖若しくはその塩である，請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該二糖が，下記の化学式（Ｖ）：
【化２】
2015096063.tif 000008
で示される二糖若しくはその塩である，請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該カラムクロマトグラフィーが，疎水性カラムクロマトグラフィー用カラムと順相／親水性相互作用カラムクロマトグラフィー用カラムとを，この順で接続したものが用いられるものである，請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該イズロン酸−２−スルファターゼが，組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼである，請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は，イズロン酸−２−スルファターゼの天然基質であるヘパラン硫酸，デルマタン硫酸等の繰り返し構造を形成する二糖若しくはその類似体を基質として用いて，試料中に含まれるイズロン酸−２−スルファターゼの酵素活性を測定する方法に関し，より詳しくは，当該二糖を，試料中に含まれるイズロン酸−２−スルファターゼと反応させて，イズロン酸−２−スルファターゼによる当該二糖の加水分解によって生じる脱硫酸化物の生成速度を測定することにより，Ｋｍ値及び最大反応速度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  イズロン酸−２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）は，ヘパラン硫酸やデルマタン硫酸のようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子内に存在する硫酸エステル結合を加水分解する活性を有するライソゾーム酵素の１つである。ハンター症候群の患者では，イズロン酸−２−スルファターゼ活性が遺伝的に欠損している。この酵素活性の欠損は，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の代謝異常を引き起こし，それは次いで肝臓や腎臓のような組織中にそれらの分子の断片の蓄積や，更には尿中へのヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の排泄をも引き起こす。その結果，これらの異常により，骨格の変形及び重症の精神遅滞を含む，ハンター症候群の患者における種々の症状が引き起こされる。【０００３】  ハンター症候群の患者がＩ２Ｓ活性を僅かしか示さないという事実は，１９７０年代に既に知られており，Ｉ２Ｓ遺伝子の異常がこの疾病の原因であると予想されていた。１９９９年には，Ｉ２Ｓをコードするヒト遺伝子が単離され，この疾患に対する原因遺伝子であることが確認された（非特許文献１）。【０００４】  現在では，ハンター症候群の患者の体内で不足しているＩ２Ｓ活性を補充するために，遺伝子組換え技術で製造した組換えヒトＩ２Ｓ（ｒｈＩ２Ｓ）を有効成分として含有する製剤を静注して投与する，酵素補充療法が行われている。【０００５】  Ｉ２Ｓの酵素活性の測定法として，合成基質である４−メチルウンベリフェリル硫酸を基質として用いる方法が知られている（特許文献１，２）。しかしながら，遺伝子組換え技術を用いて製造したヒトＩ２Ｓ（ｒｈＩ２Ｓ）は，糖鎖構造等においてヒト生体内に存在するＩ２Ｓと異なるので，かかる合成基質で測定した活性測定値は，Ｉ２Ｓ本来の酵素活性を反映しないおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１０１９９８号
【特許文献２】米国公開第２００４−０２２９２５０号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｉｌｓｏｎ  ＰＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８７：８５３１−５，１９９０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  上記背景の下で，本発明の目的は，Ｉ２Ｓの酵素活性の測定法として，生体内における本来のＩ２Ｓの基質に構造が同一若しくは類似の，２位に硫酸基を有するウロン酸と，アミノ糖とが，１，４−グリコシド結合又は１，３−グリコシド結合により結合したものである二糖を基質として用いる測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，組換え技術を用いて製造したｒｈＩ２Ｓの酵素活性が，イズロン酸２硫酸とアセチルグルコサミン６硫酸とが，α１，４−グリコシド結合により結合した二糖の類縁体を基質として用いて，ｒｈＩ２Ｓと当該基質を反応させたときに生じる脱硫酸化物の生成速度を測定することにより測定できることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）イズロン酸−２−スルファターゼの酵素活性を測定する方法であって，次のステップすなわち，
（ａ）イズロン酸−２−スルファターゼを，２位に硫酸基を有するウロン酸と，アミノ糖とが，１，４−グリコシド結合又は１，３−グリコシド結合により結合したものである二糖若しくはその塩を基質として，該基質と反応させるステップ，
（ｂ）上記ステップ（ａ）の反応により，該２位の硫酸基が脱硫酸化されることにより生じた生成物を，カラムクロマトグラフィーに付して，該基質から分離させるステップと，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）のカラムクロマトグラフィーにより該基質から分離された該生成物を検出するステップとからなる，方法。
（２）該二糖が，下記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
【化１】
2015096063.tif 000002
［式（Ｉ）〜（ＩＶ）中，Ｒ１は−ＮＨ２，−ＮＨＣＯＣＨ３又は−ＮＨＳＯ３Ｈ；Ｒ１はＯＳＯ３Ｈ；Ｒ３はＣＯＯＨ；Ｒ４はＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＳＯ３Ｈ；Ｒ５はＯＨ又はＯＳＯ３Ｈを，それぞれ独立して示す。］，
で示される群から選択される二糖若しくはその塩である，上記（１）に記載の方法。
（３）該二糖が，下記の化学式（Ｖ）：
【化２】
2015096063.tif 000003
で示される二糖若しくはその塩である，上記（１）に記載の方法。
（４）該カラムクロマトグラフィーが，疎水性カラムクロマトグラフィー用カラムと順相／親水性相互作用カラムクロマトグラフィー用カラムとを，この順で接続したものが用いられるものである，上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）該イズロン酸−２−スルファターゼが，組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼである，上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】  Ｉ２Ｓの酵素活性の測定法として，合成基質である４−メチルウンベリフェリル硫酸を基質として用いる方法が知られている。しかしながら，例えば遺伝子組換え技術を用いて製造したヒトＩ２Ｓ（ｒｈＩ２Ｓ）は，糖鎖構造等においてヒト生体内に存在するＩ２Ｓと異なるので，かかる合成基質で測定した活性測定値は，Ｉ２Ｓ本来の酵素活性を反映しないおそれがある。仮に，ｒｈＩ２Ｓが，合成基質を分解するものの，ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を効率良く分解できないものであった場合，これを酵素補充療法において患者に投与しても，十分な治療効果が得られない結果となる。本発明によれば，ヒト生体内におけるＩ２Ｓ本来の基質と構造が同一又は類似の物質を，基質として使用して酵素活性を測定するので，組換え技術を用いて製造したヒトＩ２Ｓが，酵素補充療法に適したものであるか否かをより的確に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例の酵素反応１において，反応時間を６０分としたときの，酵素反応終了後の反応溶液をカラムに通過させたときに得られたチャート。横軸は反応溶液をカラムに付してからの経過時間（分），縦軸は２３２ｎｍの吸光度をそれぞれ示す。ピークＡはＨＤ−Ｉ−Ａに由来するピーク，ピークＢはＨＤ−ＩＩ−Ａに由来するピークをそれぞれ示す。
【図２】実施例の酵素反応２において得られたＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す。横軸は基質初濃度［Ｓ］０の逆数（／ｍＭ），縦軸は反応速度の逆数（分／ｍＭ）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】  本発明において，「イズロン酸−２−スルファターゼ（又はＩ２Ｓ）」というときは，特にヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩ２Ｓ）であるが，これに限らず，牛，馬等の家畜，イヌ，ネコ等の愛玩動物，マウス，ラット等の実験動物を含む哺乳動物のイズロン酸−２−スルファターゼをも含む。また，「イズロン酸−２−スルファターゼ」には，イズロン酸−２−スルファターゼを構成する１つ又は複数のアミノ酸残基を，置換，欠失，付加又は挿入させたヒトイズロン酸−２−スルファターゼの類似物も含む。
【００１３】  イズロン酸−２−スルファターゼは，遺伝子組換え技術を用いて，遺伝子組換えイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒＩ２Ｓ）として生産することができる。ｒＩ２Ｓは，イズロン酸−２−スルファターゼを組込んだ発現ベクターを導入した，ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞，昆虫細胞，酵母等を用いて生産することができる。例えば，ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ遺伝子を発現ベクターに組込み，これを用いて哺乳細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞）を形質転換し，形質転換細胞を培養することにより，生物学的に活性な組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈＩ２Ｓ）を製造する方法は，当業者に周知である（ＷＯ２０１２／１０１９９８）。組換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈＩ２Ｓ）は，好ましくは５２５個のアミノ酸残基からなり単一の糖鎖ポリペプチドを含んでなるヒト野生型Ｉ２Ｓである組換えタンパク質であるが，野生型ヒトＩ２Ｓと比較して１個又は２個以上のアミノ酸の置換，欠失，付加又は挿入を有するものであるヒト変異型のＩ２Ｓである組換えタンパク質を排除するものではない。
【００１４】  本発明において，酵素活性の測定対象となるべきｒＩ２Ｓは，例えば，ハンター症候群の患者の治療剤として製造されたｒＩ２Ｓである。かかるｒＩ２Ｓは，ハンター症候群の患者体内において，ヘパラン硫酸やデルマタン硫酸のようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子内に存在する硫酸エステル結合を加水分解して薬効を示すので，これら天然基質を加水分解する活性を有するか否かを，製造工程において予め評価する必要がある。なお，本発明において「天然基質」というときは，生体内においてｒＩ２Ｓの酵素活性によって脱硫化される物質と同一若しくは類似の構造を有する物質又はその塩のことをいう。
【００１５】  本発明において，イズロン酸−２−スルファターゼの基質として用いられるものは，２位に硫酸基を有するウロン酸と，アミノ糖とが，１，４−グリコシド結合又は１，３−グリコシド結合により，特に，α１，４−グリコシド結合又はα１，３−グリコシド結合により結合したものである二糖であり，好ましくは，下記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示されるものである。なお，式（Ｉ）〜（ＩＶ）中，Ｒ１は−ＮＨ２，−ＮＨＣＯＣＨ３又は−ＮＨＳＯ３Ｈ；Ｒ２はＯＳＯ３Ｈ；Ｒ３はＣＯＯＨ；Ｒ４はＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＳＯ３Ｈ；Ｒ５はＯＨ又はＯＳＯ３Ｈを，それぞれ独立して示す。ここで，１，４−グリコシド結合というときは，ウロン酸の１位の炭素に結合した水酸基とアミノ糖の４位の炭素に結合した水酸基とが脱水縮合した化学式で示されるものをいい，１，３−グリコシド結合とは，ウロン酸の１位の炭素に結合した水酸基とアミノ糖の３位の炭素に結合した水酸基とが，脱水縮合した化学式で示されるものをいう。
【００１６】
【化１】
2015096063.tif 000004
上記式（Ｉ）〜（ＩＶ）で示される二糖は塩であってもよく，その場合，例えば，Ｒ２がＯＳＯ３Ｎａ，Ｒ３がＣＯＯＮａ，Ｒ４がＣＨ２ＯＳＯ３Ｎａであるナトリウム塩が好適に使用できる。
【００１７】  下記の一般式（Ｖ）で示される二糖は，本発明において，基質として好適に用いることができる。当該二糖は塩であってもよく，その場合，例えば，Ｒ２がＯＳＯ３Ｎａ，Ｒ３がＣＯＯＮａ，Ｒ４がＣＨ２ＯＳＯ３Ｎａであるナトリウム塩が好適に使用できる。また，当該二糖は，Ｈｅｐａｒｉｎ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ａ又はＨｅｐａｒｉｎ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｉ−Ａの名称で，そのナトリウム塩が市販されている。
【００１８】
【化２】
2015096063.tif 000005
【００１９】  上記一般式（Ｉ）〜（Ｖ）で示される糖は，Ｉ２Ｓによってウロン酸の２位の硫酸基が脱硫化される。上記一般式（Ｖ）で示される二糖は，Ｉ２Ｓによって脱硫化されることにより，下記の一般式（ＶＩ）で示される生成物を生じる。この物質は，Ｈｅｐａｒｉｎ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ＩＩ−Ａの名称で，そのナトリウム塩が市販されている。
【００２０】
【化７】
2015096063.tif 000006
【００２１】  本発明において，Ｉ２Ｓの反応速度は，上記一般式（Ｉ）〜（Ｖ）で示される糖が脱硫化されて生じる脱硫化物の，単位時間当たりの生成量又は反応溶液中における濃度の増加量として測定される。
【００２２】  Ｉ２Ｓの反応速度は，上記の一般式（Ｖ）で示される二糖若しくはその塩を基質として用いた場合，反応終了後の反応溶液を，疎水性カラムクロマトグラフィーと順相／親水性相互作用カラムクロマトグラフィーとに，この順で連続して通過させることにより，上記の一般式（Ｖ）で示される二糖が脱硫化されて生じる上記の一般式（ＶＩ）で示される脱硫化物を，上記の一般式（Ｖ）で示される二糖から分離して定量することにより，単位時間当たりに生成した当該脱硫化物の量として求めることができる。このとき用いられる疎水性カラムクロマトグラフィー用カラムは，好ましくは充填剤としてブチル化シリカゲルを充填したものであり，順相／親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムは，好ましくは充填剤としてアミノ基を結合させたシリカゲルを充填したものである。また，このときのカラムクロマトグラフィーの移動相は，好ましくはリン酸二水素ナトリウム水溶液又はリン酸緩衝液である。リン酸二水素ナトリウム水溶液を移動相として用いる場合，その濃度は，好ましくは０．３〜０．５Ｍであり，より好ましくは０．４Ｍである。
【００２３】  また，Ｉ２Ｓの反応速度は，上記の一般式（Ｖ）で示される二糖若しくはその塩を基質として用いた場合，反応溶液中に含まれるＩ２Ｓの濃度を，好ましくは０．０００１〜０．０２５ｍｇ／ｍＬ，より好ましくは０．０００５〜０．０２ｍｇ／ｍＬ，更に好ましくは０．００１〜０．０１ｍｇ／ｍＬに調整して測定される。また，このとき反応溶液中に含まれる基質の初濃度は，好ましくは０．０２〜３．０ｍＭの範囲であり，より好ましくは０．０２〜１．５ｍＭの範囲であり，更に好ましくは０．１０〜１．２ｍＭの範囲である。また，このときの反応時間は，好ましくは３０秒から１０分間であり，より好ましくは１分から５分間である。
【００２４】  Ｉ２Ｓの反応速度は，基質の初濃度（Ｓ０）の逆数に対して，単位時間当たりに生成した脱硫化物の量を反応速度（Ｖ）としてその逆数（１／Ｖ）をプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット）して回帰分析し，得られた直線のｙ軸との切片を１／Ｖｍａｘ（Ｖｍａｘは酵素反応の最大速度），ｘ軸との切片を−１／Ｋｍ（Ｋｍはミカエリス定数）とし，ＶｍａｘとＫｍとして求めることができる。
【実施例】
【００２５】  以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００２６】〔試薬の調製〕
２５０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．５ｇのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を，全量が５００ｍＬとなるように５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し，試液除粒子用フィルター（Ｂｏｔｔｌｅ  Ｔｏｐ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｆｉｌｔｅｒ，０．２２μｍ  ＣＡ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，コーニング製）でフィルター濾過したものを，希釈用緩衝液とした。リン酸二水素ナトリウム二水和物６２．４ｇに水を加えて全量を１０００ｍＬにした後，孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過したものを，移動相とした。５ｍｇのＨｅｐａｒｉｎ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｉ  −Ａ（ＨＤ−Ｉ−Ａ，Ｄｅｘｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に，１ｍＬの希釈用緩衝液を添加して混和したものを基質原液（ＨＤ−Ｉ−Ａの濃度：１６．５２ｍＭ）とした。５ｍｇのＨｅｐａｒｉｎ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ＩＩ  −Ａ（ＨＤ−ＩＩ−Ａ，Ｄｅｘｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に，５００μＬの希釈用緩衝液を添加して混和したものを，希釈用緩衝液で２倍希釈したものを標準原液（ＨＤ−ＩＩ−Ａの濃度：１０ｍＭ）とした。５０μＬの標準原液に，２５μＬの希釈用緩衝液と１２５μＬの移動相とを加えて混和し，これを標準溶液とした（ＨＤ−ＩＩ−Ａの濃度：２５ｍＭ）。【００２７】〔ｒｈＩ２Ｓ溶液の調製〕
組換え体ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（ｒｈＩ２Ｓ）の精製品を，公知の手法（米国特許公報５７９８２３９，国際公開公報ＷＯ２０１２／１０１９９８）に準じて調製した。ｒｈＩ２Ｓの精製品を含有する溶液（ｒｈＩ２Ｓ溶液）を，純水で３〜５倍希釈した後に，遠心式ろ過ユニット（アミコンウルトラ−４，ミリポア製）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を純水で３〜５倍希釈した後に，再度遠心式ろ過ユニットを用いて濃縮した。この希釈−濃縮操作を，元の溶液の純水での総希釈倍率が１万倍に達するまで繰り返して行い，ｒｈＩ２Ｓ溶液を脱塩した。脱塩したｒｈＩ２Ｓ溶液に含まれる蛋白質の濃度を測定し，蛋白質濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように純水でｒｈＩ２Ｓ溶液を希釈し，さらに，この希釈溶液を蛋白質濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈用緩衝液で希釈し，次いで，３７℃に加温した。【００２８】〔酵素反応１〕
基質原液を，ＨＤ−Ｉ−Ａの濃度が２．４８ｍＭとなるように，希釈用緩衝液で希釈して基質溶液とした。基質溶液を５０μＬずつ試験管にとり３７℃に加温し，これに上記の３７℃に加温したｒｈＩ２Ｓ溶液を２５μＬ添加して混和し反応溶液とした。従って，このときの反応溶液中のＨＤ−Ｉ−Ａの初濃度は，１．６５ｍＭであった。次いで，反応溶液を３７℃で反応開始から３分，５分，１０分，３０分及び６０間静置して，ｒｈＩ２ＳによるＨＤ−Ｉ−Ａの脱硫化反応をさせた。次いで，反応溶液を１００℃で５分間加熱して酵素を失活させて反応を停止させた。【００２９】〔酵素反応２〕
基質原液を，ＨＤ−Ｉ−Ａの濃度が０．１５，０．３０，０．４５，０．６０，０．７５及び１．５ｍＭとなるように，希釈用緩衝液で希釈して基質溶液とした。各濃度の基質溶液を５０μＬずつ試験管にとり３７℃に加温し，これに上記の３７℃に加温したｒｈＩ２Ｓ溶液を２５μＬずつ添加して混和して反応溶液とした。従って，このときの反応溶液中のＨＤ−Ｉ−Ａの初濃度は，各々，０．１０，０．２０，０．３０，０．４０，０．５０及び１．０ｍＭであった。次いで，反応溶液を３７℃で５分間静置して，ｒｈＩ２ＳによるＨＤ−Ｉ−Ａの脱硫化反応をさせた。次いで，反応溶液を１００℃で５分間加熱して酵素を失活させて反応を停止させた。【００３０】〔酵素反応速度の測定〕
（１）装置
島津ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０Ａ（島津製作所）に，疎水性カラムクロマトグラフィー用カラム（ＣＨＥＭＣＯＳＯＲＢＴＭ  ３００−７Ｃ４，４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×５０ｍｍ，充填剤：ブチル化シリカゲル，ケムコ製）と，その下流に順相／親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＮＨ２−１００，４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ，充填剤：アミノ基を結合させたシリカゲル，東ソー製）とをセットした。カラムオーブンでカラムを５０℃に加熱するとともに，順相／親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムの出口からの流路に吸光光度計を設置し，カラム通過後の溶液の，波長２３２ｎｍにおける吸光度を連続的に測定できるようにした。【００３１】（２）操作手順
移動相を，０．５ｍＬ／分の流速で上記カラムに流し，カラムを平衡化させた。次いで，同流速で，１０μＬの酵素反応終了後の反応溶液及び標準溶液を各々カラムに負荷し，更に，同流速で，移動相を５０分間流した。このとき，カラム通過後の溶液の波長２３２ｎｍにおける吸光度を連続的に測定してチャート上に検出するようにし，ＨＤ−Ｉ−ＡがｒｈＩ２Ｓにより脱硫化されて生じたＨＤ−ＩＩ−Ａに由来するピークの，チャート上の面積を求めた。標準溶液を分析したときのＨＤ−ＩＩ−Ａに由来するピーク面積との比較から，酵素反応により生じた各反応溶液中のＨＤ−ＩＩ−Ａの濃度（単位：ｍＭ）を算出した。【００３２】（３）Ｖｍａｘ及びＫｍの決定
上記酵素反応２において，酵素反応時間が５分間であることから，酵素反応後の各反応溶液中のＨＤ−ＩＩ−Ａの濃度（単位：ｍＭ）を５で除した１分間当たりの当該濃度の変化値を，各反応溶液における反応速度Ｖ（単位：ｍＭ／分）として求めた。次いで，各反応溶液の基質の初濃度（反応開始前の基質濃度）をＳ０（単位：ｍＭ）とし，反応速度Ｖの逆数（１／Ｖ）を縦軸に，Ｓ０の逆数（１／Ｓ０）を横軸にプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット）し，回帰分析を行った。こうして得られた直線のｙ軸との切片を１／Ｖｍａｘ（Ｖｍａｘは酵素反応の最大速度），ｘ軸との切片を−１／Ｋｍ（Ｋｍはミカエリス定数）として，ＶｍａｘとＫｍとを求めた。【００３３】〔解析結果〕
上記酵素反応１において，反応時間を６０分としたときの反応溶液を，カラムに通過させたときのチャートを図１に示した。図１において，ピークＡが基質のＨＤ−Ｉ−Ａに由来し，ピークＢがｒｈＩ２ＳによりＨＤ−Ｉ−Ａが脱硫化されて生じたＨＤ−ＩＩ−Ａに由来するものであった。反応時間（分）に対してピークＢの面積をプロットした結果，酵素反応１の反応条件において，反応開始から５〜１０分までの反応速度が，当該反応の初速度に近似することがわかった。【００３４】  そこで，上記酵素反応２において，反応時間を５分間に設定して，各反応溶液における反応の初速度を測定した。測定結果をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットしたものを図２に示した。回帰直線の相関係数は０．９９８３であり，最大速度（Ｖｍａｘ）は３４μＭ／分，ミカエリス定数（Ｋｍ）は１１７μＭであった。これらの結果は，基質として合成基質である４−メチルウンベリフェリル硫酸を使用することなく，ｒｈＩ２Ｓの天然基質と同一若しくは類似の構造を有する二糖を用いて，ｒｈＩ２Ｓの活性を測定できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３５】  本発明によれば，Ｉ２Ｓの酵素活性を，生体内に存在するＩ２Ｓ本来の基質と構造が類似するか，若しくは構造が同一の基質を用いて測定することができるので，医薬品として製造したｒｈＩ２Ｓの品質をより適切に評価できる。
【図１】
2015096063.tif 000009
【図２】
2015096063.tif 000010