(57)【要約】【課題】試料中に含まれている細胞の数や種類が不明である場合であっても、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度を評価する方法の提供。【解決手段】（ａ）細胞を含有する試料から細胞破砕液を調製する工程と、（ｂ）工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のプロテアーゼにより、プロテアーゼ基質を分解し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する工程と、（ｃ）工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のヌクレアーゼにより、ヌクレアーゼ基質を分解し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において測定した分解されたプロテアーゼ基質の量と、工程（ｃ）において測定した分解されたヌクレアーゼ基質の量の比を算出する工程と、（ｅ）工程（ｄ）において算出された比に基づいて、前記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価する工程とを有する単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞を含有する試料から細胞破砕液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のプロテアーゼにより、プロテアーゼ基質を分解し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のヌクレアーゼにより、ヌクレアーゼ基質を分解し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において測定した分解されたプロテアーゼ基質の量と、前記工程（ｃ）において測定した分解されたヌクレアーゼ基質の量の比を算出する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において算出された比に基づいて、前記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価する工程と、
を有することを特徴とする、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼ基質及び前記ヌクレアーゼ基質が、蛍光物質により標識されている、請求項１に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）において、
前記工程（ｂ）においてプロテアーゼ基質の分解により遊離した蛍光物質の量を、前記分解されたプロテアーゼ基質の量とし、
前記工程（ｃ）においてヌクレアーゼ基質の分解により遊離した蛍光物質の量を、前記分解されたヌクレアーゼ基質の量とする、請求項２に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼ基質を標識する蛍光物質が発する蛍光と、前記ヌクレアーゼ基質を標識する蛍光物質が発する蛍光が、互いに光学的特性が異なる、請求項２に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）及び（ｃ）を、前記細胞破砕液と前記プロテアーゼ基質と前記ヌクレアーゼ基質とを含有する一の試料溶液内において行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼ基質及び前記ヌクレアーゼ基質が、消光物質と結合している、請求項２〜５のいずれか一項に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼ基質及び前記ヌクレアーゼ基質が、固相担体に結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼ基質又は前記ヌクレアーゼ基質の分解により遊離した蛍光物質の量を、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は走査分子計数法により測定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、含有される細胞の量が未知である試料について、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の相対的強度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的にプロテアーゼ活性の測定は、一定時間基質とプロテアーゼを含む試料とを反応させた後にプロテアーゼ基質の分解量を計測し、その分解量からプロテアーゼ活性を推定する方法によりなされる。プロテアーゼ基質の分解量は、測定に供された試料中に含まれているプロテアーゼの量と比活性に影響を受ける。複数の試料のプロテアーゼ活性を比較する際に、測定に供された試料中に含まれているプロテアーゼの比活性がほぼ同程度である場合には、プロテアーゼを多く含む試料ほど、同一条件下での基質の分解量は多くなる。つまり、同一の条件での基質の分解量を比較することにより、各試料のプロテアーゼ活性の強度を比較したり、評価することができる。
【０００３】
基質の分解量の計測は、高感度であることから、蛍光標識した基質を用い、基質の分解により遊離した蛍光物質から発される蛍光を指標とする方法が好まれている。例えば、特許文献１には、プロテアーゼ認識配列の両端に蛍光物質と消光物質をそれぞれ有する基質を用いてプロテアーゼ活性を測定する方法が開示されている。当該方法においては、プロテアーゼによって基質が切断されると、蛍光物質が消光物質から遊離するために蛍光強度が増大する原理に基づく。すなわち、プロテアーゼ反応により増大した蛍光強度が、プロテアーゼ反応により生じた基質の分解量の指標となる。また、「ＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）  Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）のように、基質のプロテアーゼ認識配列の片端を蛍光物質で修飾し、もう一方の端を９６ウェルプレートの各ウェルの底に固定したプロテアーゼ活性測定用プレートも市販されている。このようなプロテアーゼ活性測定用プレートにおいては、測定に供する試料をウェルに注入すると、当該試料中のプロテアーゼにより基質が分解されて蛍光物質が遊離する。この遊離した蛍光物質を測定することによって、プロテアーゼ活性を測定することができる。
【０００４】
細胞を破砕させ、得られた細胞破砕液にプロテアーゼ基質を添加し、分解した基質量を調べることによって、細胞のプロテアーゼ活性を測定することができる。細胞のプロテアーゼ活性は、細胞の種類や状態によって大きく変動する場合がある。例えば、一般的に癌細胞では、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）等のプロテアーゼの発現が高く、正常細胞よりもプロテアーゼ活性が高い。また、アポトーシスを起こしている細胞も、カスパーゼ等のプロテアーゼの活性が亢進されている。このため、一般的に、正常細胞の細胞破砕液よりも、癌細胞の細胞破砕液のほうが、プロテアーゼ基質の分解量が多くなり、アポトーシス誘導前の細胞の細胞破砕液よりも、アポトーシス誘導後の細胞破砕液のほうが、プロテアーゼ基質の分解量が多くなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３−１７２１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞当たりのプロテアーゼ活性を調べることにより、当該細胞が正常細胞か癌細胞かを識別したり、アポトーシスが誘導されているかいないかを判断することが可能になると期待される。
【０００７】
しかしながら、生体から細胞を含む検体を採取する場合には、採取する部位や個体によって、検体に含まれる細胞数や細胞の種類は大きく変動する。つまり、生体から採取された検体中には、どのような細胞がどれだけ含有されているか、通常は不明である。このため、生体から採取された検体について従来の方法でプロテアーゼ活性を測定すると、基質の分解量が比較的多い検体が、癌細胞等のプロテアーゼ活性の高い細胞を含んでいるためなのか、単に含まれている細胞数が多いのかを区別できない。このように、従来のプロテアーゼ基質の分解量を指標とする方法では、単に検体のプロテアーゼ活性を測定するだけでは、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度（すなわち、含有される細胞数を等しくした場合のプロテアーゼ活性）を評価することが困難であった。
【０００８】
本発明は、試料中に含まれている細胞の数や種類が不明である場合であっても、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、細胞のプロテアーゼ活性は、癌化の有無や細胞種等によって変動するが、細胞のヌクレアーゼ活性は癌化の有無や細胞種等による変動が小さく、ほぼ一定であるため、ヌクレアーゼ活性の強度を細胞数の指標とし得ること、そこで、プロテアーゼ活性自体ではなく、プロテアーゼ活性とヌクレアーゼ活性の比に基づくことにより、試料に含まれている細胞について、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度を評価し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］  （ａ）細胞を含有する試料から細胞破砕液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のプロテアーゼにより、プロテアーゼ基質を分解し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のヌクレアーゼにより、ヌクレアーゼ基質を分解し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において測定した分解されたプロテアーゼ基質の量と、前記工程（ｃ）において測定した分解されたヌクレアーゼ基質の量の比を算出する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において算出された比に基づいて、前記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価する工程と、
を有することを特徴とする、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［２］  前記プロテアーゼ基質及び前記ヌクレアーゼ基質が、蛍光物質により標識されている、前記［１］の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［３］  前記工程（ｄ）において、
前記工程（ｂ）においてプロテアーゼ基質の分解により遊離した蛍光物質の量を、前記分解されたプロテアーゼ基質の量とし、
前記工程（ｃ）においてヌクレアーゼ基質の分解により遊離した蛍光物質の量を、前記分解されたヌクレアーゼ基質の量とする、前記［２］の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［４］  前記プロテアーゼ基質を標識する蛍光物質が発する蛍光と、前記ヌクレアーゼ基質を標識する蛍光物質が発する蛍光が、互いに光学的特性が異なる、前記［２］の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［５］  前記工程（ｂ）及び（ｃ）を、前記細胞破砕液と前記プロテアーゼ基質と前記ヌクレアーゼ基質とを含有する一の試料溶液内において行う、前記［１］〜［４］のいずれかの単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［６］  前記プロテアーゼ基質及び前記ヌクレアーゼ基質が、消光物質と結合している、前記［２］〜［５］のいずれかの単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［７］  前記プロテアーゼ基質及び前記ヌクレアーゼ基質が、固相担体に結合している、前記［１］〜［５］のいずれかの単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
［８］  前記プロテアーゼ基質又は前記ヌクレアーゼ基質の分解により遊離した蛍光物質の量を、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法、又は走査分子計数法により測定する、前記［２］〜［７］のいずれかの単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法は、プロテアーゼ活性自体ではなく、プロテアーゼ活性とヌクレアーゼ活性の比を指標とするため、含まれている細胞の量が不明である試料についても、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度を従来法よりも精度よく評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、細胞破砕液に含まれる細胞数と分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質（ａ）及びヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質（ｂ）の蛍光強度との関係を示した図である。
【図２】実施例１において、細胞破砕液に含まれる細胞数と分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質（ａ）及びヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質（ｂ）の分子数との関係を示した図である。
【図３】実施例２において、細胞破砕液に含まれる細胞数と分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質（ａ）及びヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質（ｂ）の蛍光強度との関係を示した図である。
【図４】実施例３において、アポトーシス誘導前後のＰ／Ｎ比（［分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光強度］／［分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光強度］）の算出結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の評価方法（以下、「本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法」ということがある。）は、試料中に含まれている細胞の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度を、当該試料のプロテアーゼ活性とヌクレアーゼ活性の比を指標として評価する。ヌクレアーゼ活性は、細胞の種類や状態の影響を比較的受けにくいため、ヌクレアーゼ活性の強度は、試料中の細胞の数の指標となり得る。すなわち、比較的多くの細胞が含まれていた試料から調製された細胞破砕液のヌクレアーゼ活性は比較的高く、逆に比較的少数の細胞が含まれていた試料から調製された細胞破砕液のヌクレアーゼ活性は比較的低い。そこで、プロテアーゼ活性自体ではなく、プロテアーゼ活性とヌクレアーゼ活性の比をとることにより、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を調べることができる。
【００１４】
本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法において、評価対象となるプロテアーゼは、細胞内において産生されるものであれば、特に限定されるものではなく、セリンプロテアーゼであってもよく、システインプロテアーゼであってもよく、アスパラギン酸プロテアーゼであってもよく、メタロプロテアーゼであってもよい。本発明において評価対象となるプロテアーゼとしては、特に、細胞の種類や癌化の有無、アポトーシス誘導の有無等により発現量が影響を受けるものが好ましい。このようなプロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、プラスミン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）等が挙げられる。
【００１５】
本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法は、具体的には、下記工程（ａ）〜（ｅ）を有する。
（ａ）細胞を含有する試料から細胞破砕液を調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のプロテアーゼにより、プロテアーゼ基質を分解し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する工程と、
（ｃ）前記工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のヌクレアーゼにより、ヌクレアーゼ基質を分解し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において測定した分解されたプロテアーゼ基質の量と、前記工程（ｃ）において測定した分解されたヌクレアーゼ基質の量の比を算出する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において算出された比に基づいて、前記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価する工程。
【００１６】
本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法に供される試料は、細胞を含有するものであれば特に限定されるものではない。当該試料としては、例えば、生体試料（生物から採取された試料）や、生体試料から分離された細胞、生体試料から分離された細胞の培養物、及び培養細胞の培養物等が挙げられる。生体試料としては、生体から採取された組織片、血液、リンパ液、骨髄液、腹水、滲出液、羊膜液、喀痰、唾液、精液、胆汁、膵液、尿等の体液、糞便、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、又は膀胱洗浄液等が挙げられる。また、生体試料から分離された細胞としては、例えば、血液から分離回収された単核球成分（バッフィーコート）、リンパ液等から分離回収された細胞成分、組織片の結合組織を分解して細胞をばらばらにした溶液、組織片をばらばらにした後に分離回収された細胞成分等が挙げられる。なお、組織片の生体からの採取方法は特に限定されず、ニードル穿刺や内視鏡下等で採取されたバイオプシー検体、手術サンプル等が挙げられる。
【００１７】
本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法においては、まず、工程（ａ）として、細胞を含有する試料から細胞破砕液を調製する。試料中の細胞を破砕して細胞破砕液を調製する方法としては、細胞が有するプロテアーゼやヌクレアーゼの活性を失活させないものであれば特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、超音波処理により細胞を破砕してもよく、フレンチプレスやホモジナイザー、ガラスビーズ等を用いて機械的に細胞を破砕してもよく、乳鉢と乳棒によりすりつぶすことによって細胞を破砕してもよい。また、細胞懸濁液を液体窒素で急速に凍結したのち、解凍させる凍結融解法により破砕してもよく、界面活性剤溶液に溶解させることにより細胞を破砕してもよく、評価する目的のプロテアーゼとは活性の異なる消化酵素を用いて細胞を破砕してもよい。その他、各種の市販の細胞からのタンパク質の抽出キットを使用してもよい。
【００１８】
細胞を懸濁させた状態で破砕する場合には、細胞を懸濁させる溶媒としては、測定対象であるプロテアーゼやヌクレアーゼを失活させないものであれば特に限定されるものではなく、精製水であってもよく、各種バッファーを用いてもよい。バッファーを用いる場合には、測定対象であるプロテアーゼやヌクレアーゼが活性を発揮するｐＨのバッファーを用いることにより、以降の工程において、プロテアーゼ活性やヌクレアーゼ活性を測定する際に反応溶液のｐＨを調整する必要がなく、好ましい。当該技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。当該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｈｕｎｋｓバッファー等が挙げられる。
【００１９】
次いで、工程（ｂ）として、工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のプロテアーゼにより、プロテアーゼ基質を分解し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する。プロテアーゼ基質の分解は、具体的には、工程（ａ）において調製された細胞破砕液と、評価対象であるプロテアーゼの基質を混合して反応溶液を調製し、この反応溶液をインキュベートする。当該反応溶液を調製する際には、プロテアーゼ活性に適するよう、適当なバッファーで希釈してもよく、適宜、金属イオン等を添加してもよい。インキュベートの温度は、評価対象であるプロテアーゼが酵素活性を示す温度帯の温度であればよいが、当該プロテアーゼの至適温度又はその近傍であることが好ましい。インキュベート時間は、プロテアーゼ反応が起こるために充分な時間であればよく、例えば、５分間〜２時間とすることができる。
【００２０】
本発明において用いられるプロテアーゼ基質は、評価対象であるプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を有するペプチド又はタンパク質であればよく、その分子量は特に限定されるものではないが、細胞破砕液への溶解し易さや合成し易さ等から、３〜１００アミノ酸残基からなるペプチドが好ましく、３〜５０アミノ酸残基からなるペプチドがより好ましく、３〜１０アミノ酸残基からなるペプチドがさらに好ましい。また、当該プロテアーゼ基質は、糖やリン酸、脂質等により修飾されていてもよい。
【００２１】
インキュベート後の反応溶液中のプロテアーゼ基質と、プロテアーゼにより切断されたプロテアーゼ基質の分解物とを区別して検出し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する。例えば、分解前のプロテアーゼ基質と分解後の分解物の大きさが十分に相違する場合には、物の大きさにより区別して検出する方法を利用して、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定する。当該検出方法としては、例えば、インキュベート後の反応溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて未分解のプロテアーゼ基質から分離した分解物は、ＣＢＢ染色、シルバーステイン染色等により検出することができる。分解物の量は、染色強度により求められる。また、インキュベート後の反応溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて未分解のプロテアーゼ基質から分離した分解物のクロマトグラフ上のピークから、分解物の量を求めることもできる。
【００２２】
分解されたプロテアーゼ基質の検出は、プロテアーゼ基質の分解物自体を検出してもよいが、予めプロテアーゼ基質に標識物質を結合させておき、分解されたプロテアーゼ基質に由来する当該標識物質を検出することによって行うことが好ましい。特に、感度に優れることから、予めプロテアーゼ基質を蛍光物質により標識し、分解されたプロテアーゼ基質に由来する蛍光物質から発される蛍光を検出することが好ましい。当該蛍光物質としては、特定の波長の光を放射することにより蛍光を放出する物質であれば特に限定されるものではなく、タンパク質や核酸等の標識に通常使用されている蛍光物質や量子ドット等の中から適宜選択して用いることができる。具体的には、蛍光物質としては、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ｃｙ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ ｄｙｅシリーズ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）等が挙げられる。量子ドットとしては、ＣｄＳｅ等が挙げられる。
【００２３】
例えば、プロテアーゼ基質に対して、ドナーである蛍光物質とアクセプターとなる消光物質とをプロテアーゼ認識配列を挟むようにして結合させ、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）を利用することにより、プロテアーゼ基質の分解物を、未分解のプロテアーゼ基質と区別して検出することができる。この場合、未分解のプロテアーゼ基質では、ＦＲＥＴにより蛍光をほぼ生じないが、プロテアーゼによりプロテアーゼ認識配列で切断されると、蛍光物質と消光物質の距離が開くことから、ＦＲＥＴが生じなくなり、蛍光物質からの蛍光が強く検出される。すなわち、分解されたプロテアーゼ基質の量は、インキュベート後の反応溶液中の蛍光を発している蛍光物質の量により表される。
【００２４】
また、プロテアーゼ基質に対して、固相担体と直接又は間接的に結合可能な物質（以下、「リンカー物質」という。）と蛍光物質とをプロテアーゼ認識配列を挟むようにして結合させておき、固相担体を用いた固液分離処理を利用して、プロテアーゼ基質の分解物を、未分解のプロテアーゼ基質と区別して検出することができる。インキュベート後の反応溶液を固相担体に接触させると、未分解のプロテアーゼ基質はリンカー物質と結合しているため、蛍光物質は当該リンカー物質を介して固相担体と結合する。一方で、プロテアーゼ基質が分解されると、蛍光物質はリンカー物質とは分離するため、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質は、溶液中に遊離し、固相担体とは結合しない。このため、インキュベート後の反応溶液を固相担体に接触させた後に固液分離処理を行うことにより、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質のみを液相に回収することができる。つまり、分解されたプロテアーゼ基質の量は、当該液相中の蛍光物質の量により表される。
【００２５】
当該固相担体としては、プロテアーゼ基質と結合しているリンカー物質と直接又は間接的に結合する部位を備えている固体であれば、その形状、材質等は特に限定されるものではない。例えば、ビーズ等の水に懸濁可能であり、かつ一般的な固液分離処理によって液体と分離可能な粒子であってもよく、メンブレンであってもよく、容器やチップ基板等であってもよい。固相担体としては具体的には、例えば、磁気ビーズ、シリカビーズ、アガロースゲルビーズ、ポリアクリルアミド樹脂ビーズ、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等のプラスチックビーズ、セラミックスビーズ、ジルコニアビーズ、シリカメンブレン、シリカフィルター、プラスチックプレート等が挙げられる。
【００２６】
当該リンカー物質としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、グルタチオン、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、２以上の糖からなる糖鎖、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ等の４以上のアミノ酸からなるポリペプチド、オーキシン、ジベレリン、ステロイド、タンパク質、親水性有機化合物、及び、それらの類縁体等が挙げられる。例えば、リンカー物質がビオチンの場合には、アビジン又はストレプトアビジンが表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。同様に、リンカー物質がグルタチオン、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ等の場合には、これらに対する抗体が表面に結合しているビーズやフィルターを固相担体として用いることができる。
【００２７】
プロテアーゼ基質は、不可逆的に固相担体と結合していてもよい。例えば、プロテアーゼ基質のうちプロテアーゼ認識配列に対して蛍光物質とは反対側の部分を容器の内壁面に共有結合により結合させた容器を用いることができる。まず、試料を含む溶液を当該容器に注入し、必要に応じて所定時間インキュベートした後、反応溶液を当該容器から回収することにより、分解されたプロテアーゼ基質のみを回収することができる。つまり、分解されたプロテアーゼ基質の量は、当該容器から回収された反応溶液中の蛍光物質の量により表される。
【００２８】
固液分離処理としては、溶液中の固相担体を液体成分とは分離して回収可能な方法であれば、特に限定されるものではなく、固液分離処理に用いられる公知の処理の中から適宜選択して用いることができる。例えば、固相担体がビーズ等の粒子の場合、固相担体を含む懸濁液に対して静置したり、遠心分離処理を行うことにより、固相担体を沈殿させ、上清を除去してもよく、当該溶液を濾紙又は濾過フィルターを用いて濾過し、濾紙等の表面に残留した固相担体を回収してもよい。また、固相担体が磁気ビーズである場合には、当該溶液が入れられている容器に磁石を接近させ、該容器の該磁石に最も近接する面に固相担体を収束させた後、上清を除去してもよい。なお、固相担体がメンブレンやフィルターの場合、インキュベート後の反応溶液を当該固相担体に透過させることにより、当該反応溶液から、未分解のプロテアーゼ基質を分離除去することができる。
【００２９】
分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質の量は、一般的な蛍光測定法により測定することができる。例えば、溶液中の全蛍光分子から発される蛍光強度を測定する方法であってもよく、一分子ごとに蛍光強度を測定する方法であってもよい。
【００３０】
溶液の蛍光強度は、蛍光プレートリーダー等の蛍光分光光度計等を用いて常法により測定することができる。溶液の蛍光強度は、溶液中の蛍光物質の量に依存する。そこで、例えば、予め検出対象である蛍光物質の濃度と蛍光強度との関係を示す検量線を作成しておくことにより、溶液中の蛍光物質の量、すなわち、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質の量を定量することができる。
【００３１】
試料溶液中の一分子ごとに蛍光強度を測定する方法としては、蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＣＳ）（例えば、特開２００５−０９８８７６号公報参照。）、蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｃｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ， ＦＩＤＡ）（例えば、特許第４０２３５２３号公報参照。）、走査分子計数法（（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ，ＳＳＭＣ）（例えば、特許０５２５０１５２号公報参照。）が挙げられる。その他、特表２０１１−５０８２１９号公報に記載されている単一分子検出走査分析器や特開２０１２−７３０３２号公報で開示されている蛍光１粒子検出装置等を用いて測定してもよい。本発明においては、より微量の試料から高感度に蛍光物質を定量的に検出できることから、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質は、ＳＳＭＣ法により測定することが好ましい。
【００３２】
例えば、ＦＣＳにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、溶液中の分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質の分子数を算出することができる。
また、ＦＩＤＡにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、溶液中の分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質の分子数を算出することができる。
また、ＳＳＭＣにより、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの蛍光を検出することにより、溶液中に遊離している分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質の分子数を算出することができる。
なお、ＦＣＳやＦＩＤＡ、ＳＳＭＣは、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。
【００３３】
プロテアーゼ基質由来の蛍光物質の量を、蛍光シグナルを利用して測定する場合、測定された蛍光シグナルをそのまま当該蛍光物質の量としてもよいが、測定バックグラウンドレベルが無視できない場合には、バックグラウンドを差し引いたものを、当該蛍光物質の量とすることが好ましい。
【００３４】
また、本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法においては、さらに、工程（ｃ）として、工程（ａ）において調製された細胞破砕液中のヌクレアーゼにより、ヌクレアーゼ基質を分解し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定する。ヌクレアーゼ基質の分解は、具体的には、工程（ａ）において調製された細胞破砕液と、ヌクレアーゼの基質を混合して反応溶液を調製し、この反応溶液をインキュベートする。当該反応溶液を調製する際には、ヌクレアーゼ活性に適するよう、適当なバッファーで希釈してもよく、適宜、金属イオン等を添加してもよい。インキュベートの温度は、細胞由来のヌクレアーゼが酵素活性を示す温度帯の温度であればよいが、当該ヌクレアーゼの至適温度又はその近傍であることが好ましい。インキュベート時間は、ヌクレアーゼ反応が起こるために充分な時間であればよく、例えば、５分間〜２時間とすることができる。
【００３５】
ヌクレアーゼには、様々な種類があるが、大きくはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）に分類される。本発明において測定されるヌクレアーゼ活性は、デオキシリボヌクレアーゼ活性であってもよく、リボヌクレアーゼ活性であってもよい。例えば、デオキシリボヌクレアーゼ活性を測定する場合には、少なくとも一部にＤＮＡを有する物質をヌクレアーゼ基質とし、リボヌクレアーゼ活性を測定する場合には、少なくとも一部にＲＮＡを有する物質をヌクレアーゼ基質とする。
【００３６】
本発明において用いられるヌクレアーゼ基質は、ヌクレアーゼにより切断される部位を有していればよく、その塩基配列は特に限定されるものではない。また、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよい。例えば、ＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとからなるキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部に含むものであってもよい。核酸類似物質としては、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
【００３７】
ヌクレアーゼ基質として、１本鎖又は２本鎖のオリゴヌクレオチドを用いる場合、その分子量は特に限定されるものではない。例えば、１０〜１００塩基長からなるオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ基質としてもよく、３〜５ｋｂｐのプラスミドをヌクレアーゼ基質としてもよい。また、当該ヌクレアーゼ基質は、糖やリン酸、脂質等により修飾されていてもよい。
【００３８】
インキュベート後の反応溶液中のヌクレアーゼ基質と、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ基質の分解物とを区別して検出し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定する。例えば、ヌクレアーゼ基質が核酸のみからなり、ヌクレアーゼにより１〜数塩基ずつに分解されてしまう場合には、インキュベート後の反応溶液をアガロース電気泳動にかけて未分解のヌクレアーゼ基質と分解物とを分離してＥｔＢｒ染色した後、未分解のヌクレアーゼ基質のバンド強度を指標として、未分解のヌクレアーゼ基質の量を測定する。反応に供したヌクレアーゼ基質の量から未分解のヌクレアーゼ基質の量を除いたものは、分解されたヌクレアーゼ基質の量となる。
【００３９】
また、プロテアーゼ基質の検出と同様に、予めヌクレアーゼ基質に標識物質を結合させておき、分解されたヌクレアーゼ基質に由来する標識物質を検出することによって行うことが好ましい。当該標識物質としては、プロテアーゼ基質の標識で挙げられたものと同様のものが挙げられ、蛍光物質が好ましい。
【００４０】
分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質の量は、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質の量と同様にして求めることができる。例えば、ヌクレアーゼ基質に対して、ドナーである蛍光物質とアクセプターとなる消光物質とをヌクレアーゼ認識配列を挟むようにして結合させ、ＦＲＥＴを利用することにより、分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質を、未分解のヌクレアーゼ基質と区別して検出することができる。また、ヌクレアーゼ基質に対して、前記リンカー物質と蛍光物質とをヌクレアーゼ認識配列を挟むようにして結合させておき、固相担体を用いた固液分離処理を利用して、分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質を、未分解のヌクレアーゼ基質と区別して検出することができる。ヌクレアーゼ基質は、不可逆的に固相担体と結合していてもよい。
【００４１】
工程（ａ）において調製された細胞破砕液の一部を用いて工程（ｂ）を行い、当該細胞破砕液の別の一部を用いて工程（ｃ）を行ってもよい。この場合、工程（ｂ）を先に行った後に工程（ｃ）を行ってもよく、工程（ｃ）を行った後に工程（ｂ）を行ってもよい。また、工程（ｂ）と工程（ｃ）は、それぞれ独立しつつ、実施的に同時に行ってもよい。
【００４２】
また、工程（ｂ）と工程（ｃ）は、同一の細胞破砕液に対して行ってもよい。例えば、プロテアーゼ基質を混合し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定した後の細胞破砕液に対して、ヌクレアーゼ基質を混合し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定してもよく、ヌクレアーゼ基質を混合し、分解されたヌクレアーゼ基質の量を測定した後の細胞破砕液に対して、プロテアーゼ基質を混合し、分解されたプロテアーゼ基質の量を測定してもよい。また、同一の細胞破砕液に、プロテアーゼ基質とヌクレアーゼ基質を同時に又は順次混合して反応溶液を調製し、当該反応溶液をインキュベートすることによりプロテアーゼ反応とヌクレアーゼ反応を行った後、分解されたプロテアーゼ基質と分解されたヌクレアーゼ基質を測定してもよい。
【００４３】
例えば、プロテアーゼ基質とヌクレアーゼ基質として、それぞれ蛍光物質とリンカー物質が結合したものを用い、工程（ａ）において調製した細胞破砕液にプロテアーゼ基質を添加してインキュベートした後、当該細胞破砕液を固相担体と接触させた後に固液分離処理を行うことによって未分解のプロテアーゼ基質を除去した液体成分（溶液）を得、当該溶液にヌクレアーゼ基質を添加してインキュベートした後、当該細胞破砕液を固相担体と接触させた後に固液分離処理を行うことによって未分解のヌクレアーゼ基質を除去する。得られた溶液中の、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質と分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質をそれぞれ区別して、定量的又は半定量的に測定する。プロテアーゼ基質よりも先にヌクレアーゼ基質を添加し、同様に行ってもよい。また、プロテアーゼ基質とヌクレアーゼ基質が有するリンカー物質は、互いに異なるものであってもよいが、共通している場合には、未分解のプロテアーゼ基質と未分解のヌクレアーゼ基質を除去するための固相担体を同じものを用いることができる。
【００４４】
プロテアーゼ基質とヌクレアーゼ基質を共に蛍光物質により標識したものを用いる場合、両者を標識する蛍光物質は、同じであってもよく、違っていてもよい。同一の細胞破砕液に対して工程（ｂ）と工程（ｃ）を行う場合には、プロテアーゼ基質とヌクレアーゼ基質は、互いに蛍光特性が異なる蛍光物質で標識する。ここで、蛍光特性が異なるとは、ＦＩＴＣとローダミンのように、励起光照射により発される蛍光の波長が、区別して検出し得るほど異なることを意味する。
【００４５】
工程（ｂ）及び（ｃ）の後、工程（ｄ）として、工程（ｂ）において測定した分解されたプロテアーゼ基質の量と、工程（ｃ）において測定した分解されたヌクレアーゼ基質の量の比を算出する。当該比は、分解されたヌクレアーゼ基質の量に対する分解されたプロテアーゼ基質の量の比（［分解されたプロテアーゼ基質の量］／［分解されたヌクレアーゼ基質の量］）（以下、「Ｐ／Ｓ比」ということがある。）でもよく、分解されたプロテアーゼ基質の量に対する分解されたヌクレアーゼ基質の量の比（［分解されたヌクレアーゼ基質の量］／［分解されたプロテアーゼ基質の量］）（以下、「Ｓ／Ｐ比」ということがある。）でもよいが、Ｐ／Ｓ比が好ましい。
【００４６】
分解されたプロテアーゼ基質の量及び分解されたヌクレアーゼ基質の量が、それぞれ蛍光強度で表される場合、Ｐ／Ｓ比は、［分解されたプロテアーゼ基質に由来する蛍光強度］／［分解されたヌクレアーゼ基質に由来する蛍光強度］であり、分解されたプロテアーゼ基質の量及び分解されたヌクレアーゼ基質の量が、それぞれ蛍光物質の分子数で表される場合、Ｐ／Ｓ比は、［分解されたプロテアーゼ基質に由来する蛍光物質の分子数］／［分解されたヌクレアーゼ基質に由来する蛍光物質の分子数］である。
【００４７】
最後に、工程（ｅ）として、工程（ｄ）において算出された比に基づいて、前記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価する。当該比がＰ／Ｓ比の場合、Ｐ／Ｓ比が大きいほど記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性が高く、Ｐ／Ｓ比が小さいほど記試料の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性が低い、と評価する。
【００４８】
例えば、含まれている細胞の種類等が未知である生体試料について、工程（ａ）〜（ｄ）を行い、求められたＰ／Ｓ比が、予め含まれている細胞の種類が既知である対照試料について、同じ条件で工程（ａ）〜（ｄ）を行って求めたＰ／Ｓ比よりも大きい場合には、当該生体試料に含まれている細胞の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性は、当該対照試料に含まれている細胞の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性よりも高いと評価することができ、当該生体試料のＰ／Ｓ比が当該対照試料のＰ／Ｓ比よりも小さい場合には、当該生体試料に含まれている細胞の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性は、当該対照試料に含まれている細胞の単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性よりも低いと評価することができる。また、例えば、内視鏡下で、正常組織部位と腫瘍等の病変が疑われる被検部位から採取された各生体試料について、特定のプロテアーゼ活性を調べるべく、それぞれ同一の条件で工程（ａ）〜（ｄ）を行い、被検部位から採取された生体試料から求められたＰ／Ｓ比が、正常組織部位から採取された生体試料から求められたＰ／Ｓ比よりも大きい場合には、被検部位から採取された生体試料のほうが正常組織部位から採取された生体試料よりも単位細胞数当たりの当該特定のプロテアーゼ活性が高く、被検部位から採取された生体試料には、正常細胞よりも当該特定のプロテアーゼ活性の高い細胞（例えば、腫瘍細胞等）が含まれていると評価できる。
【実施例】
【００４９】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実施例１］
カスパーゼ−３が認識するアミノ酸配列（ＤＥＶＤ）（配列番号１）のＮ末端側に蛍光物質ＡＴＴＯ（登録商標） ６４７Ｎを、Ｃ末端側にビオチンを修飾したプロテアーゼ基質（シグマジェノシス社製）と、ポリＡ（２０塩基対長）（配列番号２）の５’末端にＴＡＭＲＡを、３’末端にビオチンを修飾したヌクレアーゼ基質（シグマジェノシス社製）とを用いて、細胞数の異なる複数のＨｅＬａ細胞から調製された細胞破砕液について、本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法により、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価した。
【００５１】
具体的には、まず、ＨｅＬａ細胞から調製した細胞破砕液に、プロテアーゼ基質を１ｐＭになるように、ヌクレアーゼ基質を１００ｐＭになるようにそれぞれ添加し、最終容量が３０μＬになるように反応溶液を調製した。当該反応溶液を３７℃で３０分間インキュベーションした後、１０μｇのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号：６５０−０１）と混合し、振とうさせながら室温で５分間インキュベーションした。次いで、磁石を用いて当該反応溶液中の磁気ビーズを集め、上清を回収した。
【００５２】
当該上清の１０倍希釈した溶液中の、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質と分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質の量を測定した。計測は、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス）を用いて、カスパーゼ−３による基質の切断は６４２ｎｍ（１ｍＷ）の励起によって検出し、ヌクレアーゼによる基質の切断は５４３ｎｍ（５００μＷ）の励起によって、一分子ずつ検出した。計測時間は２０秒間、計測回数は３回とした。蛍光強度を計測すると同時に、ＳＳＭＣによる計測も行った。
【００５３】
図１に蛍光強度の測定結果（平均値）を、図２に、ＳＳＭＣにより求めた蛍光物質の分子数（ピーク数）の測定結果（平均値）を、それぞれ細胞破砕液を調製した際の細胞数ごとに示す。図１及び２中、（ａ）は分解されたプロテアーゼ基質の由来蛍光物質の結果を、（ｂ）は分解されたヌクレアーゼ基質の由来蛍光物質の結果を、それぞれ示す。
この結果、図１に示すように、細胞破砕液とプロテアーゼ基質及びヌクレアーゼ基質を混合することによって、それぞれの基質が分解されて蛍光が検出されるが、細胞破砕液の細胞数が多くなるほど、蛍光強度（光子数）が増加していることがわかった。また、Ｐ／Ｎ比は、細胞破砕液中の細胞数が１５００００個では０．５６であり、細胞数が３０００００個では０．４４であり、両細胞破砕液においてほぼ同程度であった。当該結果は、プロテアーゼ基質の分解による蛍光強度増加とヌクレアーゼ基質の分解による蛍光強度増加が、細胞数に応じて同様に変化することを示しており、プロテアーゼ基質の分解による蛍光強度増加とヌクレアーゼ基質の分解による蛍光強度増加を併せて計測することによって、単位細胞数あたりのプロテアーゼ活性を算出することが可能であることが明らかである。
【００５４】
また、図２に示すように、ＳＳＭＣによって得られたピーク数についても、蛍光強度と同様に、細胞数に応じたプロテアーゼ基質の分解による蛍光強度増加とヌクレアーゼ基質の分解による蛍光強度増加が確認された。
【００５５】
［実施例２］
実施例１で用いたプロテアーゼ基質とヌクレアーゼ基質がストレプトアビジン修飾磁気ビーズに結合したもの用いて、細胞数の異なる複数のＨｅＬａ細胞から調製された細胞破砕液について、本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法により、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性を評価した。
【００５６】
具体的には、まず、リン酸バッファー（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する。）に、プロテアーゼ基質を１ｐＭになるように、ヌクレアーゼ基質を１００ｐＭになるようにそれぞれ添加し、最終容量が３０μＬになるように基質溶液を調製した。当該基質溶液を、１０μｇのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号：６５０−０１）と混合し、振とうさせながら室温で５分間インキュベーションした。インキュベーション後のストレプトアビジン修飾磁気ビーズをリン酸バッファー（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する。）で１回洗浄し、当該磁気ビーズに結合しなかったプロテアーゼ基質及びヌクレアーゼ基質を除去した。
【００５７】
次いで、プロテアーゼ基質等が結合したストレプトアビジン修飾磁気ビーズを、ＨｅＬａ細胞から調製した細胞破砕液３０μＬに混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、磁石を用いて当該反応溶液中の磁気ビーズを集め、上清を回収した。実施例１と同様にして、当該上清の１０倍希釈した溶液中の、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質と分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質の量（蛍光強度）を測定した。
【００５８】
測定結果（平均値）を図３に示す。細胞破砕液を混合する前に基質を固相に結合した場合においても、細胞数に応じたプロテアーゼ基質の分解による蛍光強度増加とヌクレアーゼ基質の分解による蛍光強度増加が確認された。事前に固相化した基質を用意しておくことで、迅速に単位細胞あたりのプロテアーゼ活性を算出することが可能になった。
【００５９】
［実施例３］
アポトーシス誘導前と誘導後の細胞について、単位細胞数当たりのカスパーゼ−３のプロテアーゼ活性を評価した。
まず、ＨｅＬａ細胞が３×１０６個になるまで培養を行った後、培地を５μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤと２００ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）と１．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地に交換し、３７℃で４時間インキュベーションし、アポトーシスを誘導した。このアポトーシスを誘導した細胞と、アポトーシス誘導前のＨｅＬａ細胞について、それぞれ細胞破砕液を調製した。
【００６０】
調製された細胞破砕液に、プロテアーゼ基質を１ｐＭになるように、ヌクレアーゼ基質を１００ｐＭになるようにそれぞれ添加し、最終容量が３０μＬになるように反応溶液を調製した。プロテアーゼ基質及びヌクレアーゼ基質は、実施例１で用いたものと同じものを用いた。当該反応溶液を３７℃で３０分間インキュベーションした後、１０μｇのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品番号：６５０−０１）と混合し、振とうさせながら室温で５分間インキュベーションした。次いで、磁石を用いて当該反応溶液中の磁気ビーズを集め、上清を回収した。実施例１と同様にして、当該上清の１０倍希釈した溶液中の、分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光物質と分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光物質の量（蛍光強度）を測定した。
【００６１】
蛍光強度の測定結果の平均値を用いて、Ｐ／Ｎ比（［分解されたプロテアーゼ基質由来の蛍光強度］／［分解されたヌクレアーゼ基質由来の蛍光強度］）を算出した。算出結果を図４に示す。Ｐ／Ｎ比は、アポトーシス誘導前に対して、誘導後は顕著に大きくなっていた。これは、アポトーシス誘導によってカスパーゼ−３が高発現し、その結果、多くのカスパーゼ基質が切断されたためだと考えられる。これらの結果から、本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法を用いることによって、特性の異なる細胞を識別することが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法は、含まれている細胞の量が不明である試料についても、単位細胞数当たりのプロテアーゼ活性の強度を評価することができるため、本発明に係る本発明に係るプロテアーゼ活性評価方法は、臨床検体等の生体試料のプロテアーゼ活性の検査等の分野で特に好適に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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