(57)【要約】      （修正有）【課題】微細藻類の培養を液面上で行う液面浮遊培養法において、微細藻類中のオイル含有量を向上させる培養方法、底面藻の回収確率を下げる方法、更に、微細藻類の増殖速度を向上させる培養方法の提供。【解決手段】液面と底面との間の微細藻類の存在が少ない領域から培地を吸い出し、廃棄し、窒素化合物やリン化合物の濃度が前記培地よりも低い培地に置換して培養する。また、液面上の微細藻類の回収直前に液体を添加し、培養器中の水深を深くする。また、糖を含有する培地を用いて微細藻類を液面浮遊培養する。液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、特定の特徴を有する、微細藻類を用いてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用物質生産性である微細藻類の培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程；及び  
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程
を含み、成分の濃度を変化させることにより微細藻類の産生する有用物質を増加させるものである、微細藻類の培養方法。
【請求項２】
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内に、培地とは異なる組成の液体を添加することによる、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内の培地の一部又は全部を除去し、培地とは異なる組成を有する液体を添加することによる、請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、窒素又はリンを含む成分の濃度を低減させることによる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
培地の除去又は添加が、液面上のバイオフィルムと培養器底面との間において、培地を除去するか、又は異なる組成を有する液体を添加するものである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程において、液面上に形成されたバイオフィルムを除去しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
有用物質生産性である微細藻類の液面浮遊培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程；
培養器内に液体を添加する工程；及び
液体を添加して水深が増した培養器から、バイオフィルムを回収する工程
を含む、微細藻類の培養方法。
【請求項８】
バイオフィルムと培養器内壁との付着部位を剥がす処理を行う工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項９】
培養器内の糖を含有する培地中で微細藻類を培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させる工程を含む、微細藻類の培養方法。
【請求項１０】
培地が、微細藻類が資化可能な糖を含み、このとき微細藻類が資化可能な糖が、五炭糖又は六炭糖である単糖、二糖、三糖及び多糖からなる群より選択されるいずれかである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１１】
培地中の糖の濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項９又は１０に記載の培養方法。
【請求項１２】
グルコースを含有する培地を用いる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１３】
微細藻類が緑藻である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１４】
微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｓｐ．に属するものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１５】
微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２と同じ種に属するものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１６】
微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株である、である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項の培養方法を含む培養工程；及び
形成されたバイオフィルムを回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
【請求項１８】
藻類バイオマスが、オイルである、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、下記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する、微細藻類：
（１）液面上及び液面下１ｃｍから液面までの領域に存在する微細藻類の藻体量と培養器の底面上の微細藻類の藻体量との合計が、培養器内のそれ以外の領域に存在する藻体量の１０倍以上である；
（２）液面上の微細藻類の比重が、培養器の底面上の微細藻類の比重より小さい；
（３）液面上の微細藻類の比重が、水の比重より大きい；
（４）液面上の微細藻類のオイル含有量が、底面上の微細藻類のオイル含有量より高い；
（５）液面上の微細藻類のサイズが、底面上の微細藻類のサイズより大きい；
（６）形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とを含み、外側の層が内側の層より厚い；
（７）形成されるバイオフィルムの一部が培地中でひだ状の構造をとる；
（８）形成されたバイオフィルムを回収し、懸濁処理することにより得られた微細藻類を培地の液面上に播種した場合、培地中に沈降しうる。
【請求項２０】
微細藻類が、請求項１３〜１６のいずれか１項に定義した微細藻類である、請求項１９に記載の微細藻類。
【請求項２１】
液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類の培養方法であって、用いる微細藻類が請求項１９又は２０に記載の微細藻類である、培養方法。
【請求項２２】
微細藻類が、請求項１９に記載した微細藻類である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養方法、又は請求項１７もしくは１８に記載の製造方法。
【請求項２３】
１８Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＲＫ２６１に相当する塩基配列との同一性が９５．００％以上９９．９９％以下であるか、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．に属する微生物であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有する、微細藻類。
【請求項２４】
Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．ＦＦＧ０３９株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２）、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の液面浮遊培養法において、培地組成の改良で回収物中のバイオマス含有率を向上しうる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的には、微細藻類の培養は、培地中に分散させながら行われている（以下、分散培養という）。しかしこの様な培養法では、攪拌を行うためのエネルギー源が必要となり、分散している微細藻類を回収するためには、遠心分離機や凝集剤などが必要となる。そのために、培養および回収は非常にコスト高となり、菌体内外に燃料に応用できる可能性を持ったオイルを含有する微細藻類が発見されているものの、その商業化の成功例はまだない。
【０００３】
培地中の窒素含量が藻類の生育や物質生産に与える影響について、非特許文献１及び２に報告されている。また、藻類による具体的な物質生産への適用として、例えば、特許文献１には、微細藻ユーグレナを好気的に培養する第１の工程と、上記微細藻ユーグレナが培養されている培地を窒素飢餓状態としてさらに培養する第２の工程と、細胞を嫌気状態下に保持する第３の工程とから成るワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法が記載されている。また特許文献２には、窒素含量が一定値以上である培養液中で脂肪酸系炭化水素を藻体内に蓄積しうる緑藻イカダモが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−０２３９７７
【特許文献２】特開２０１２−０４４９２３
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，１２１−１２４，１９９２
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ  （２００５）  １７：３０９−３１５．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微細藻類由来の有用物質の生産性を向上させる方法として、培養途中で培地の組成を変えること（以下、培地置換ともいう）が行われている。しかし、ほとんどの微細藻類の培養には、分散培養が採用されており、培地置換を行うためには、培地と微細藻類とが同一の空間に存在していることから、藻体分散液をろ過することや遠心分離するなどの藻体濃縮を行わなければ、培地置換を行うことができなかった。しかしこの様な工程は、高価格な装置が必要で、非常に煩雑かつ投入エネルギーが大きいという問題があった。そのため、高価格な有用物質の生産しか産業として成立していなかった。本発明では、ろ過装置や遠心分離機のような高価格な装置の導入を行うことなく、簡便かつ大量の投入エネルギーを使用することなく培地置換を行い、有用物質の生産性を向上させる方法を提供することを課題としている。
【０００７】
液面浮遊培養法の場合には、分散培養法と比較して、培地量を少なくすることで水の使用量を減らすことができ、この点からも低コスト培養を行うことができる。しかしながら、培地の水深が浅すぎると、堆積法で回収を行った場合、液面上の微細藻類バイオフィルムを回収するための第二の基板が培養器の底面と接触し、一部の底面藻を回収してしまうことや、剥がしてしまうことがあった。このことが原因で、回収物中のオイル含有量を低下させ、底面藻を種藻とした場合の培養にも悪影響を及ぼす可能性があることがわかった。本発明は、この様な問題を解決することも課題としている。なお一般的には、底面藻の方が水面藻よりもオイル含有量が低い場合が多い。
【０００８】
さらに、培養器中の培地を培養器外へと排出する場合に、液面上の微細藻類バイオフィルムが培養器の壁面に付着していることが多く、培地置換に伴う液面の移動と共に、培養器表面の想定外の場所に微細藻類バイオフィルムが付着したり、バイオフィルムが破壊されたりする結果、回収の難度が上がり、回収時の藻体量が減少するなどの問題点があった。
【０００９】
本発明の別の課題は、微細藻類の液面浮遊培養において、炭素源として、培地への拡散速度が遅い二酸化炭素以外の物質を使用することで、より効率的な培養を達成しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下を提供する。
［１］  有用物質生産性である微細藻類の液面浮遊培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程；及び
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程
を含み、成分の濃度を変化させることにより微細藻類の産生する有用物質を増加させるものである、微細藻類の培養方法。
［２］  培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内に、培地とは異なる組成の液体を添加することによる、［１］に記載の培養方法。
［３］  培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内の培地の一部又は全部を除去し、培地とは異なる組成を有する液体を添加することによる、［１］に記載の培養方法。
［４］  培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、窒素又はリンを含む成分の濃度を低減させることによる、［１］〜［３］のいずれか一に記載の培養方法。
［５］  培地の除去又は添加が、液面上のバイオフィルムと培養器底面との間において、培地を除去するか、又は異なる組成を有する液体を添加するものである、［２］〜［４］のいずれか一に記載の培養方法。
［６］  培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程において、液面上に形成されたバイオフィルムを除去しない、［１］〜［５］のいずれか一に記載の培養方法。
［７］  有用物質生産性である微細藻類の液面浮遊培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程；
培養器内に液体を添加する工程；及び
液体を添加して水深が増した培養器から、バイオフィルムを回収する工程
を含む、微細藻類の培養方法。
［８］  バイオフィルムと培養器内壁との付着部位を剥がす処理を行うことを含む、［１］〜［７］のいずれか一に記載の培養方法。
［９］  液面上で微細藻類の培養が可能な液面浮遊培養法において、糖を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、微細藻類の培養方法
［１０］  培地が、微細藻類が資化可能な糖を含み、このとき微細藻類が資化可能な糖が、五炭糖又は六炭糖である単糖、二糖、三糖及び多糖からなる群より選択されるいずれかである、［１］〜［９］のいずれか一に記載の培養方法。
［１１］  培地中の糖の濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上である、［９］又は［１０］に記載の培養方法。
［１２］  グルコースを含有する培地を用いる、［９］〜［１１］のいずれか一に記載の培養方法。
［１３］  微細藻類が緑藻である、［１］〜［１２］のいずれか一に記載の培養方法。
［１４］  微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ  ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ  ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ  ｓｐ．に属するものである、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の培養方法。
［１５］  微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２と同じ種に属するものである、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の培養方法。
［１６］  微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株である、［１］〜［１５］のいずれか一に記載の培養方法。
［１７］  ［１］〜［１６］のいずれか一の培養方法を含む培養工程；及び
形成されたバイオフィルムを回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
［１８］  藻類バイオマスが、オイルである、［１７］に記載の製造方法。
［１９］  液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、下記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する、微細藻類：
（１）液面上及び液面下１ｃｍから液面までの領域に存在する微細藻類の藻体量と培養器の底面上の微細藻類の藻体量との合計が、培養器内のそれ以外の領域に存在する藻体量の１０倍以上である；
（２）液面上の微細藻類の比重が、培養器の底面上の微細藻類の比重より小さい；
（３）液面上の微細藻類の比重が、水の比重より大きい；
（４）液面上の微細藻類のオイル含有量が、底面上の微細藻類のオイル含有量より高い；
（５）液面上の微細藻類のサイズが、底面上の微細藻類のサイズより大きい；
（６）形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とを含み、外側の層が内側の層より厚い；
（７）形成されるバイオフィルムの一部が培地中でひだ状の構造をとる；
（８）形成されたバイオフィルムを回収し、懸濁処理することにより得られた微細藻類を培地の液面上に播種した場合、培地中に沈降しうる。
［２０］  微細藻類が、［１３］〜［１６］のいずれか一に定義した微細藻類である、［１９］に記載の微細藻類。
［２１］  液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類の培養方法であって、用いる微細藻類が［１９］又は［２０］に記載の微細藻類である、培養方法。
［２２］  微細藻類が、［１９］に記載した微細藻類である、［１］〜［１６］のいずれか一に記載の培養方法、又は［１７］もしくは［１８］に記載の製造方法。
［２３］  １８Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＲＫ２６１に相当する塩基配列との同一性が９５．００％以上９９．９９％以下であるか、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．に属する微生物であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有する、微細藻類。
［２４］  Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．ＦＦＧ０３９株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２）、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法を用いることで、煩雑、高価かつ投入エネルギーが大きなろ過機や遠心分離機などを用いずに、回収対象である微細藻類バイオフィルム構造体への影響を最小限にしつつ容易に培地置換を行うことができる。さらに、培地の水位を上昇させることで、堆積法による回収時、底面藻への影響を最小限にしつつ回収を行うことができ、有用物質の含有量低下や種藻としての底面藻の減少を抑制することができる。また、窒素化合物やリン化合物などの栄養源濃度の少ない培地を培養途中で添加することにより、これら栄養源の濃度を低下させることができ、培地置換と同じ効果をより低コストで達成することができる。さらに、培養器壁面と微細藻類バイオフィルムとの接点の付着を剥がすことで、培地置換などの液面の変化に伴う微細藻類バイオフィルムの不測の位置への付着を抑制し、回収性を改善することができる。
また、糖を含む培地を液面浮遊培養に用いることで、高い増殖速度が得られるとともに、高いオイル含有量を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の模式図。（ａ）微細藻類懸濁液を培養器に入れたところ、（ｂ）数秒〜数十分間静置することで、微細藻類が培養器底面に沈んだ様子、（ｃ）培養を行うことで、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された状態。同時に底面上の微細藻類も増殖している、（ｄ）培地を除去した後の状態で、水面藻と底面藻とがほぼ接触しているところ、（ｅ）培地を添加し、培養を再開しているところ、（ｆ）液面上の微細藻類バイオフィルムに対して第一の基板を接触、すなわち、転写による回収を開始したところ、（ｇ）微細藻類バイオフィルム付着基板を培養器外へと取り出したところ、（ｈ）第二の基板を用い、堆積法によって液面上の微細藻類バイオフィルムを回収しているところ、（ｉ）第二の基板とともに堆積物を培養器外に取り出したところ、（ｊ）液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した後の培養器
【図２】（ａ）図１の（ｃ）と同じ状態、（ｂ）培地を添加することで水深を深くしたところ。
【図３】ＣＳｉＦＦ０３培地の組成
【図４】ＣＳｉＦＦ０４培地の組成
【図５】各実験を行ったときの乾燥藻体量およびオイル含有量。実験例１−ａは、培地置換直前に、液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した結果。実験例１−ｂは、培養途中でＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）へと培地置換を行い、さらに培養を継続した場合の結果。実験例１−ｃは、培養途中でＣＳｉＦＦ０４培地に置換を行い（すなわち新しい培地に培地置換した）、さらに培養を継続した場合の結果。実験例１−ｄは、培地置換を行わずにそのまま培養を継続した場合の結果。
【図６】ＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）培地の組成
【図７】図５の結果をオイル量生産性で再計算したもの
【図８】（ａ）藻類としてＦＦＧ０３９株を用い、窒素化合物除去培地に交換した後に得られた水面浮遊藻、（ｂ）上記試料からヘキサンを用いて藻体のオイルを抽出したもの、（ｃ）上記オイルをＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析計）によって、分析したもの
【図９】培養途中で蒸留水を添加し、培地中の窒素化合物濃度を減らした後、継続培養した場合のオイル含有量。なお、オイル含有量は、乾燥重量に対する比率を用いた。
【図１０】（上段）蒸留水を添加せずに、堆積法で回収を行ったもの、（下段）蒸留水を添加して水位を上昇させた後に堆積法で回収を行ったもの。
【図１１】種々の濃度のグルコースを含む培地で微細藻類を液面浮遊培養した場合の、回収藻体の乾燥重量
【図１２】種々糖を添加した培地でＦＦＧ０３９株を液面浮遊培養した場合の、回収藻体の乾燥重量
【図１３】種々糖を添加した培地でＡＶＦＦ００７株を液面浮遊培養した場合の、回収藻体の乾燥重量
【図１４】微細藻類ボツリオコッカス  スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）ＡＶＦＦ００７株の１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列の一部（配列番号１）
【図１５】Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＦＧ０３９株の顕微鏡写真。（ａ）は、通常の状態、（ｂ）は、遊走子を放出して増殖している状態
【図１６】１８Ｓ  ｒＤＮＡ解析によるＦＦＧ０３９株の遺伝子配列
【図１７】ＦＦＧ０３９株の系統樹
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明による微細藻類の培養方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。なお、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【００１４】
［本発明の方法］
本発明の基本的な培養方法を図１に示した。なお、本模式図は、本発明を説明するためのものであることから、簡略化して表記されている部分がある。
【００１５】
図１の（ａ）に示した様に、微細藻類の懸濁液を調製し、培養器に入れる。次に、培養器を静置状態にしておくと、図１の（ｂ）に示したように、微細藻類の種類に応じて、数秒から数十分で微細藻類は底面に沈む。なお、微細藻類が底面に沈むとは、大部分が底面に沈むことをいい、液面上や液中、培養器側面、その他表面や培地中から完全に微細藻類が存在しなくなる状態をいうものではない。この状態でしばらく培養すると、図１の（ｃ）に示した様に、液面上に微細藻類から構成されたバイオフィルムが形成される。なお、培養条件によっては、培養の進行に伴って、フィルム状構造体から三次元状構造体へと変化する。また、図１の（ｃ）に示した様に、培養器底面にも微細藻類は存在し、図には記載していないが、培養器側面やその他の表面にも存在し、存在量は少ないが培地中にも存在する。本発明では、この工程で糖を含有する培地を用いることもできる。
この（ｃ）の状態で、例えば、微細藻類の有用物質含有量（例えばオイルなど）を向上させるために、少なくとも一部の培地を置換しても良い。例えば、窒素化合物もしくはリン化合物の少なくとも一方の濃度が、置換前の培養開始時に使用していた濃度と異なる濃度もしくは組成の培地と置換することができる。例えば、より低濃度の培地と置換することができる。本発明では、この様な方法を培地置換と呼ぶ。培地置換は、図１の（ｃ）から（ｅ）に示した工程である。なお、本発明の方法は、糖や窒素等の培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程を含むが、この工程は人為的に行われる。すなわち、一般に、微細藻類の培養においては、微細藻類が栄養成分を代謝することによっても培地成分の濃度が変化するが、本発明でいう培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程は、そのような代謝による変化を指す趣旨ではない。
【００１６】
培地を除去すると、液面上の微細藻類バイオフィルムが液面の低下と共に底面へと近づき、図１の（ｄ）に示した様に、培地をほぼ完全に除去した場合には、液面上と底面上の微細藻類バイオフィルムとが接触するようになる。
【００１７】
なお、培地の除去とは、完全に培地を除去しなくても良い。すなわち、一部残しておいても良い。培養開始時の培地液量と比べて、２０％以上を除去することが好ましく、５０％以上を除去することがさらに好ましく、８０％以上を除去することが最も好ましい。２０％以上を除去することによって、培地の置換効率が向上し、微細藻類が有するオイルなどの有用物質の量が増加するからである。なお、２０％の除去では、図１の（ｃ）のように、液面上と底面上の微細藻類バイオフィルムはほとんど接触することはない。
【００１８】
次に、図１の（ｅ）の様に、培地を添加することで、底面に接触していた微細藻類バイオフィルムが再び液面に浮くようになる。この時、培地は、培地除去前の水深になるように培地を添加しても良いし、培地除去前の水深よりも深くても、浅くてもかまわない。また、培養開始時と異なる組成の培地を添加することが好ましいが、培養開始時と同じ組成の培地を添加しても良い。さらに、栄養分を全く含まない蒸留水やイオン交換水などを添加しても良い。
【００１９】
なお、培地の添加であるが、培養開始時の培地液量と比べて、２０％以上にすることが好ましく、５０％以上にすることが更に好ましく、８０％以上にすることが最も好ましい。培地の添加量の上限は特に設けないが、培養器に導入することができる培地量の２０％以下が好ましく、５０％以下がさらに好ましく、９０％以下が最も好ましい。
培地置換は、液面と底面との間の領域から行うことが好ましい。これは、培地置換操作によって、液面上の微細藻類バイオフィルムの構造が大きく破壊されることを防ぐため、微細藻類バイオフィルムの多くが除去されることを防ぐためである。この様な目的を達成するためには、培養器の側面などに培地置換のための配管を設置することや、移動式の配管を設置することなどによって行うことができる。また、液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの構造体の一部を破壊し、そこから培地吸引のための吸入口を差し込み、液面と底面との間の領域から培地を汲み上げることもできる。これにより、ごく一部のバイオフィルム構造が破壊されるが、大部分は破壊されないので好ましい。なお、液面と底面との間の領域から培地の除去を行うとは、液面上と底面上の微細藻類バイオフィルムとの間の微細藻類がほとんど存在しない領域に対して培地置換を行うものである。この領域では、遊走子などを除けば、少なくとも目視では、微細藻類はほとんどいないように見えるからである。また、液面上と底面上の微細藻類バイオフィルムとが接触している場合には、液面上と底面上との微細藻類バイオフィルムの間に配管などを挿入しての培地の添加は不可能であるため、液面上の微細藻類バイオフィルムよりも上方に位置した注入口からに培地を供給することが望ましい。
【００２０】
また、図２の（ａ）から（ｂ）への工程で図示したように、培地を除去せずに、培養開始時の培地よりも窒素化合物やリン化合物などの濃度が低い培地を添加することで、培地中の窒素化合物、リン化合物の濃度を減らすこともできる。なお、図２の（ａ）は、図１の（ｃ）に相当し、図２の（ｂ）は、図１の（ｅ）に相当する。また、本発明では、この様な方法も培地置換というものとする。
液面上の微細藻類と培養器の壁面とが接触している部位では、微細藻類バイオフィルムが壁面に付着していることが多い。この場合、培地置換による液面の変動と共に微細藻類バイオフィルムが予定外の部位に付着したり、微細藻類バイオフィルムの構造が破壊されたりする問題があった。この問題を解決するために、液面上の微細藻類バイオフィルムと培養器壁面との付着部位を金属へらのようなもので剥がす操作を行うことができる。これにより、微細藻類バイオフィルムは、液面の変動にあわせて、その形態を保ったまま移動できるようになる。なお、培養の進行に伴って培地の液量が蒸発などにより徐々に減少する場合がある。その場合には、失われた液量に相当する液量を添加してから、バイオフィルムと壁面との付着部位を剥がすこともできる。剥がす方法は、目的を達成できるものであれば特に限定しない。金属製のへらのようなものや棒、フィルムなどを用いることができる。また、道具を使わなくとも、液面の波や超音波などで剥がすこともできる。
【００２１】
このような処理を行った後、しばらく培養を継続する。この工程によって、微細藻類はオイルなどの有用物質を蓄積する。
【００２２】
その後、液面上の微細藻類バイオマスを回収する。図１の（ｆ）のように、第一の基板を用いて転写法によって回収することもできるし、図１の（ｈ）の様に、第二の基板を用いて堆積法によって回収することもできる。基板を培養器から取り出した状態が、それぞれ、図１の（ｇ）と（ｉ）の状態である。基板上の微細藻類を回収した後、必要な工程を経由して生産物を得る。なお、模式図では、微細藻類が付着した基板を培養器外へと移動させているが、培養器内で基板から回収物を回収しても良い。
液面上のバイオフィルムを回収した後の状態が、図１の（ｊ）である。ここで、培養器の底面には、微細藻類が残存している。この微細藻類を使用して、何度でも繰り返して培養することができる。この時にも培地置換しても良いが、窒素化合物やリン化合物を多く含む培地に交換した方が良い。
【００２３】
［窒素化合物等を含まない培地、または窒素化合物を低減した培地］
本発明の実施態様の一例によれば、純菌化工程を経て得られた微細藻類を、人工培地を含む液体培地中に分散させることにより、微細藻類を含む懸濁液または分散液を調製し、培養器中で培養を行うことにより、液体培地の液面上で微細藻類バイオフィルムを形成させ、培地置換を行った後、継続して培養を行うものである。
本発明では、すでに述べたように、硝酸化合物のような窒素化合物を含まないか、または低減させた培地（この様な培地を「Ｎ−」と表すことがある。）を用いることができる。微細藻類培養のための窒素化合物を含まない培地は、例えば、図６に示したＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）、ＩＭＫ（Ｎ−）培地等が例示できる。なお、培地組成は窒素化合物が含まれていない限り、これらに限定されるものでない。
窒素化合物を含まないとは、培養を開始する時点（初濃度）において、硝酸体（より具体的には硝酸カリウムなど）に代表される窒素化合物を含まないこと（検出されないか、又は硝酸体窒素量として４０μｇ／ｍＬ未満であること）をいう。窒素化合物を低減させた培地とは、培養開始時に使用される培地における窒素化合物濃度の３／４以下、好ましくは２／３以下、より好ましくは１／２以下である窒素化合物濃度の培地をいう。このような培地は、標準的な組成の培地を、水または適切な緩衝液で希釈することや、培地調製時に窒素化合物やリン化合物を含まないようにすることで調製することができる。
同様に、本発明においては、リン化合物を含まないか、または低減させた培地を利用できる場合がある。
【００２４】
［糖］
本発明の実施態様の一例によれば、純菌化工程を経て得られた微細藻類を、微細藻類が資化可能な糖を含む液体培地中（人工培地を含む）に分散させることにより、微細藻類を含む懸濁液もしくは分散液を調製し、培養器中で培養を行うことにより、微細藻類バイオフィルムを液体培地の液面上で形成させるものである。
糖を含む培地を用いることで、光と二酸化炭素を用いた場合と比べて、好適に増殖速度を向上させることが可能な場合がある。また、オイル含有量も高くなる傾向がある。
本発明で用いることのできる微細藻類が資化可能な糖とは、単糖、二糖、三糖もしくは多糖の少なくとも一つを含むものである。単糖としては、公知のいかなるものも用いることができるが、ガラクトース、マンノース、タロース、リボース、キシロース、アラビノース、エリトロース、トレオース、グリセルアルデヒド、フルクトース、キシルロース、エリトルロースなどを用いることができる。二糖としては、公知のいかなるものも使用することができるが、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトースなどを用いることができる。また、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖のいずれも用いることができる。多糖としては、デンプン、アミロース、グリコヘゲン、セルロースなどを用いることができ、その他、オリゴ糖として、ガラクトオリゴ糖やデオキシリボース、グルクロン酸、グルコサミン、グリセリン、キシリトールなどを用いることができる。
培地中の糖の濃度としては、０．１μｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以上が最も好ましい。０．１μｇ／ｍＬ以上であると、微細藻類の増殖速度を好適に向上させることができることから好ましい。また、上限は特に設けないが、好ましくは、溶解度以下、より好ましくは、溶解度の半分以下、さらに好ましくは、溶解度の１／１０濃度である。より具体的には、糖としてグルコースを用いる場合、３０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができ、１０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。なお、糖の濃度とは、培養を開始する直前の濃度（初濃度）のことであり、培養中の糖の濃度は、継続的に変化することが多い。
糖としては、単一種の糖を用いても良いし、二種以上の糖を用いても良い。
【００２５】
本発明では、光と糖との両方を用いることもできるし、光を用いずに糖だけで培養することも可能である。
糖を用いた場合には、光と二酸化炭素を用いた場合と比較して、微細藻類以外のバクテリアの増殖速度も向上するために、閉鎖型培養器を用いる方が好ましい。すなわち、開放型培養器を用いた場合、外気中のバクテリアが混入し、培地中の糖を消費してしまう。
また、光と糖、光と二酸化炭素と糖、二酸化炭素と糖との組み合わせで培養を行っても良い。
【００２６】
また、本発明では、微生物の代謝などによって生成された糖を用いることもできる。さらに、培養器外の微生物の代謝によって生成された糖を用いることもできるし、微細藻類と微生物とを同時に培養し、微生物の代謝などによって生成された糖を用いることも可能である。
【００２７】
［微細藻類］
本発明の微細藻類とは、人の肉眼では、個々の存在が識別できないような微小な藻類を指す。微細藻類としては、液面上においてバイオフィルム形成能を有するものであれば特に制限はなく、原核生物、真核生物のいずれであってもよい。
上記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などがあげられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、上記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、緑藻であることがより好ましい。バイオマスを産生する点で、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）属、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）属がより好ましい。
上記微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などがあげられる。なお、本発明で用いられる微細藻類は、純化工程を経由したものであることが好ましい。純化工程とは、微細藻類を単一の種類にする目的で行う工程であり、必ずしも完全に単独の微細藻類のみにすることをいうものではない。
【００２８】
本発明では、上記微細藻類の中でも有用物質を生産できることが好ましい。特に、医薬品、化粧品、健康食品の中間体や最終生成物、合成化学で使用する原料、炭化水素化合物やトリグリセリド、脂肪酸化合物のようなオイル状物、水素のような気体などを生成する微細藻類が好ましい。なお、本発明では、これらを生産物と呼ぶことがある。さらに本発明では、液面上での培養および液面からの回収が良好であること、高い増殖速度を持つこと、高いオイル含有率を有していること、少なくとも培養中は臭いが殆どなく、有毒物質の発生も確認されていないこと、のいずれかを満たす微細藻類を用いることが好ましい。
【００２９】
［バイオフィルム］
本発明でのバイオフィルムとは、岩などの表面に付着している微細藻類構造体（微細藻類集合体もしくは微細藻類膜、生物膜）のことを言うが、これらに加えて本発明では、液面のような流動性のある表面に存在している、微細藻類から構成されたフィルム状構造体または三次元状構造体のこともバイオフィルムという。なお、自然界でのバイオフィルムは、目的微細藻類とともに、ゴミや植物の破片などを含んでいることがあるが、本発明では純化工程を経由して得られた試料であれば、これらを含んでいてもよい。しかし、理想的には、本発明に係る微細藻類と該微細藻類の増殖時に分泌される細胞間マトリックスなどのような物質のみから構成されていることがより好ましい。また、底面上の微細藻類もフィルム状構造体を形成していれば、バイオフィルムということができる。
またバイオフィルムは、個々の微細藻類同士が直接もしくは細胞間マトリックスのような物質（例えば、多糖等）を介して付着しあっている構造であることが好ましい。
【００３０】
本発明では、液面上でバイオフィルムが形成可能な微細藻類を用いる必要がある。そのような微細藻類の好ましい例は、ボツリオコッカス  スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）やクロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属をあげることができる。より具体的な例として、ボツリオコッカス  スデティクス  ＡＶＦＦ００７株（以下、ＡＶＦＦ００７株と略称する。）やＦＦＧ０３９株をあげることができる。なお１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列解析の結果、ＦＦＧ０３９株はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．と同定されている。
【００３１】
［ＡＶＦＦ００７株］
本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＡＶＦＦ００７株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４２０として、２０１１年（平成２３年）９月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託されている。なお、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターの業務は、２０１２年（平成２４年）４月１日より、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に引き継がれている。
【００３２】
ＡＶＦＦ００７株は、本発明者らが、日本国京都府の淡水池から単離した淡水微細藻類の新規株である。ＡＶＦＦ００７株は、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部（配列番号：１、図１４）を国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータに基づき、ＢＬＡＳＴで解析した結果、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＵＴＥＸ２６２９（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）株に近縁の微細藻類であると同定された（ＵＴＥＸ２６２９株側の１１１８塩基中、ＡＶＦＦ００７株側の１１０９塩基が同一であった。）。ＡＶＦＦ００７株は、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｍａｒｙ  ９／２１  Ｔ−３ｗとも近縁の微細藻類であり、今後、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属に変更される可能性もある。その場合、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとし、また、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属以外に変更された場合にも、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとする。
【００３３】
本発明には、ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質を以下に示す。
【００３４】
ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質
１．形態的性質
緑色円形状である。浮遊性であり、液面及び底面で増殖することができる。サイズは４〜３０μｍである（液面上のものは比較的大きく、底面上のものは比較的小さい。）。液面上で増殖し、フィルム状構造体を形成する。増殖に伴って、液面上に気泡を発生し、これらが重なり合って液面上に三次元構造体を形成する。また、オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４（ＣＳｉ培地を改良したもの。組成を図４に示した。）ＮａＯＨもしくはＨＣｌにてｐＨ  ６．０に調整する。培地は、１２１℃、１０分で滅菌することができる。）
（２）培養温度：好適温度は２３℃であり、３７℃以下であれば培養できる。
（３）培養期間（概ね定常期に達するまでの期間）は、初期使用藻体量によるが、２週間〜１ヶ月である。通常、１×１０５個／ｍＬで培養することができる。
（４）培養方法：好気培養、静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００〜１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。継代培養の際は、４０００ルクスで培養することができる。
【００３５】
なお、ＡＶＦＦ００７株は、上記の培養的性質（培養方法）にしたがった継代培養により、保管することができる。植え継ぎは、液面上に浮いている微細藻類を採取し、ピペッティングなどの分散を行った後、新しい培地に分散させることにより、行うことができる。なお、継代直後は、培養器底面に沈んでいるが、1週間程度で液面上にバイオフィルムを形成し始める。継代直後から液面上に存在させても、増殖することができる。植え継ぎ間隔は、約1ヶ月である。なお黄色味を帯びてきたら、継代する。
【００３６】
ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株には、微細藻類であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５．０％、好ましくは９８．０％、より好ましくは９９．０％、さらに好ましくは９９．５％、最も好ましくは９９．９％の配列同一性を有するものが含まれる。
【００３７】
本発明で塩基配列について配列同一性というときは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、整列した領域内の２つの配列間で共有する一致した塩基の数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した塩基の数／塩基の全数）×１００で算出でき、市販もしくは一般に公開されているアルゴリズムを用いて計算することができる。塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者にはよく知られている。
【００３８】
［ＦＦＧ０３９株］
本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＦＦＧ０３９株は、本発明者らが日本国奈良県において採取したものである。ＡＶＦＦ００７株に比較して、増殖性が良く、オイル生産性に優れる。また、バイオフィルムの構造が壊れにくく、回収が容易であるという特徴を有する。なお、ＦＦＧ０３９株はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．であり、１８Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列解析の結果、微細藻類クロロコックム属ＲＫ２６１株（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＲＫ２６１）に近縁の種類であった。本発明では、新規に単離した微細藻類をＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．ＦＦＧ０３９と名付けた。本発明に係る微細藻類の遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、クロロコックム属ＲＫ２６１に相当する塩基配列との同一性が９５．００％以上９９．９９％以下であることがより好ましい。なお、ここで言う「一部の領域」とは、１０００塩基配列以上の領域を意味する。同一性を試験するにあたっては、全塩基配列を用いての同一性の試験が最も信頼性が高いが、全塩基配列を決定することは極少数の生物種を除いて技術的にもコスト的にも困難であり、またクロロコックム属ＲＫ２６１株の塩基配列も特定の一部（具体的には、後述する比較対象としたＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＦＦＧ０３９株（以下、ＦＦＧ０３９株と略称する。）の塩基配列に対応する塩基配列の近傍）しか公開されて
いない。更に、一般的には１０００塩基配列程度読めば帰属は可能といわれている。以上のことから、本発明では「一部の領域」の塩基配列の比較により同一性を試験したが、その信頼性は十分に高いものと考えられる。なお、クロロコックムの和名は、淡水藻類、山岸高旺著、内田老鶴圃に記載の和名に準じた。
【００３９】
本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＦＦＧ０３９株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２６２として、２０１４年（平成２６年）２月６日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託されている。
【００４０】
ＦＦＧ０３９株は、本発明者らが京都府の池から単離したクロロコックム属に属する淡水微細藻類の新規株である。
以下に、該微細藻類の単離方法（以下、純菌化ともいう）及び該微細藻類のＦＦＧ０３９株を新規株と判定するに至った経緯を説明する。
【００４１】
［微細藻類ＦＦＧ０３９株の純菌化］
奈良県の池から自然淡水を５ｍＬのホモジナイズ用チューブ（株式会社トミー精工、ＴＭ−６５５Ｓ）に入れることで採取した。図４に示すＣＳｉＦＦ０４培地を１．９ｍＬ入れた２４穴プレート（アズワン株式会社、微生物培養プレート１−８３５５−０２）に、採取してきた自然淡水を１００μＬ加え、プラントバイオシェルフ組織培養用（株式会社池田理化、ＡＶ１５２２６１−１２−２）に設置し、４０００ルクスの連続光照射下、２３℃で培養を行った。約１ヵ月後、２４穴プレートのウェル内に緑色の凝集物が生じたので、光学顕微鏡で観察したところ、多数の微生物の存在を確認した。
【００４２】
アガロース（ｉｎｖｉｔｅｒｏｇｅｎ，  ＵｌｔｒａＰｕｒｅＴＭ  Ａｇａｒｏｓｅ）を１ｇ秤量し、２００ｍＬのＣＳｉＦＦ０４培地を５００ｍＬ三角フラスコに入れた。これを１２１℃で１０分間オートクレーブ処理し、クリーンベンチ内でアズノールシャーレ（アズワン株式会社、１−８５４９−０４）の中に、冷えて固まる前に約２０ｍＬずつ入れることで、アガロースゲルを作製した。
２４穴プレート内の微細藻類を含む溶液を希釈し、ディスポスティック（アズワン株式会社、１−４６３３−１２）のループ部分に溶液を付着させ、前記にて準備したアガロースゲル上に塗ることで、アガロースゲル上に微細藻類を塗布したシャーレを調製した。
【００４３】
このシャーレを、プラントバイオシェルフ組織培養用に設置し、４０００ルクスの連続光照射下、２３℃で培養を行った。約２週間後、緑色のコロニーが、アガロースゲル上に現れたので、滅菌竹串（アズワン株式会社、１−５９８０−０１）を用いて、コロニーをその先端に付着させ、ＣＳｉＦＦ０４培地を２ｍＬ入れた２４穴プレートのウェル内に懸濁させた。この様にして調製した微細藻類を含む２４穴プレートをプラントバイオシェルフ組織培養用に設置し、４０００ルクスの連続光照射下、２３℃で培養を行った。約２週間後、ウェル内の水溶液が緑色を呈してくるので、すべてのウェルから少量の溶液を採取し、光学顕微鏡を用いて微細藻類を観察し、単一の微細藻類しか存在していないと考えられるウェルを見つけ出すことで、純菌化を行った。
また、ＦＦＧ０３９株の４０倍での顕微鏡写真を図１５に示した。（ａ）が通常の状態、（ｂ）が多数の遊走子を放出して増殖しているところである。
【００４４】
［形態的性質］
・分散処理を行った後にしばらく時間を置くと、底面にすべて沈む。
・しばらく培養を行うと、液面上に浮くものが現れる。従って、底面に沈んでいるものと液面に浮いているものとに分かれる。さらに培養を継続すると、液面上にフィルム状の構
造物が現れる。さらに培養を行うと、三次元状の構造物が現れる。
・液面のもの、及び、底面のもの、いずれも形態は球状であり、それぞれサイズは一定ではなく分布を持つ。
・凝集性があり、巨大なコロニーを形成する
・色は緑色であり、培養の進行に伴って、黄色く変色する。
・培養中及び回収物の臭いはほとんどない。
【００４５】
［培養的性質］
・細胞増殖時には、遊走子によって増殖する。１個の細胞から、多数の遊走子が発生する。
・光合成による光独立栄養培養が可能である。
・増殖には、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、鉄が必須である。他に、亜鉛、コバルト、モリブデン、ホウ素が入っていると好適に増殖する。ビタミン類の添加も増殖を促す。
【００４６】
［生理学的性質］
・藻体内にオイルを蓄積し、乾燥重量比で最大４０重量％近く蓄積する。
・オイルは、炭化水素化合物と脂肪酸を蓄積する。脂肪酸は、パルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸などを産生し、特に、パルミチン酸、オレイン酸が主成分である。炭化水素化合物は、デカン、ヘプタデカンなどを産生する。
・Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ染色したＦＦＧ０３９株を蛍光顕微鏡で観察すると、蛍光視野中の藻体において、明るい蛍光発色の領域としてＮｉｌｅ  ｒｅｄで発色したオイルの存在が確認される。該オイルは藻体細胞内の比較的広い領域に蓄積されうる。
更に以下の方法に従って、ＦＦＧ０３９株の同定を行った。
【００４７】
（微細藻類ＦＦＧ０３９株の同定）
ＦＦＧ０３９株の培養法は、１００ｍＬ容量の三角フラスコに５０ｍＬのＣＳｉＦＦ０４培地を導入し、１０００×１０４個／ｍＬのＦＦＧ０３９株溶液を０．５ｍＬ添加し、２５℃、光照射下で振盪培養を１４日間行った。
ＦＦＧ０３９株の乾燥粉末を得るために、前記によって得られたＦＦＧ０３９株を含む培地４０ｍＬを遠心機（ＭＸ−３００（トミー精工製）を用いて、６０００×ｇ、４℃下、１０分間遠心操作を行った。上清を除去した後、液体窒素を使用して固形物を容器ごと凍結し、これを予め液体窒素によって冷やしておいた乳鉢に全量移し、予め液体窒素にて冷やしておいた乳棒を用いて粉砕した。
【００４８】
微細藻類からのＤＮＡの抽出は、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ製）  を用いて、記載されているマニュアルに従って抽出を行った。抽出後のＤＮＡは、ｅ−ｓｐｅｃｔ  （ｍａｌｃｏｍ製）を用いて、純度、量を測定した。抽出後のＤＮＡは、精製度の指標であるＡ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ＝１．８以上を達成しており、約５ｎｇ／μＬのＤＮＡが取得されたことを確認した。
【００４９】
抽出後のＤＮＡの純度は問題なかったことから、超純水を用いて１０４倍に希釈することで、ＰＣＲ用の試料を準備した。ＰＣＲ用の試料としては、１８Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子領域（ｒＤＮＡ領域）を使用した。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、９８℃１０秒間、６０℃５０秒間、７２℃１０秒間のサイクルを３０回行った。なお、使用した酵素は、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ  （タカラバイオ製）である。得られたＰＣＲ産物は１  ％アガロース電気泳動により、単一バンドであることを確認した。
ＰＣＲ生成物の精製は、ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ
製）を用いて行った。方法は、マニュアルに記載の方法に従って行った。ＰＣＲ反応が十分にできたかどうか、また、精製度を確認するために、ｅ−ｓｐｅｃｔを用いて、純度、量を測定し、Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ＝１．８以上であったことから、問題ないと判断した。
【００５０】
次に、精製物を鋳型とし、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、サイクルシークエンスを行った。条件は、マニュアルに従った。得られた反応物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、塩基配列の解読を行った。
これをＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）による同一解析を行った。方法は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータ上の全塩基配列情報に対し、上記配列をＢＬＡＳＴ検索し、最も同一性の高い生物種をＦＦＧ０３９株の近縁種とした。比較対象とした塩基配列（１６５０塩基、配列番号１）についてのみ、図１６に示した。具体的には、解読した塩基配列の両端の数塩基は、ＢＬＡＳＴ解析によって比較対象とされなかったので、図１６には示さなかった。なお、図１６に示した塩基配列の左上が５’末端であり、右下が３’末端である。
【００５１】
同一解析の結果、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＲＫ２６１株と、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＲＫ２６１株側の１６５０塩基中、ＦＦＧ０３９株側の１６４９塩基に同一性（すなわち、９９．９４％の同一性）があった。従って、ＦＦＧ０３９株は、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．  ＲＫ２６１株に近縁の微細藻類であると分類した。
以上の解析の結果得られた系統図を図１７に示す。なお、本発明では、クロロコックムの名称が変更された場合には、ＦＦＧ０３９株も同様に名称が変更されるものとする。
本発明には、ＦＦＧ０３９株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＦＦＧ０３９株の分類学的性質を以下に示す。
【００５２】
ＦＦＧ０３９株の分類学的性質
１．形態的性質
円状である。静置培養を行うと、液面上にフィルム状の構造物を形成する。オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４培地又はＣＳｉ改良培地（Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ  １５０  ｍｇ／Ｌ、ＫＮＯ３  １００  ｍｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２８．４  ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２２．２  ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４０  ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ５８８  ｕｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １０８  ｕｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６６  ｕｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １２  ｕｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７．５  ｕｇ／Ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  ３  ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．１  ｕｇ／Ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ  ０．１  ｕｇ／Ｌ、チアミン・ＨＣｌ  １０  ｕｇ／Ｌ、ｐＨ  ７．０）
（２）培養温度：１５〜２５℃で培養できる。
（３）培養期間：２〜４週間
（４）培養方法：静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００〜１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。
ＦＦＧ０３９株と分類学的に同一の性質を有する微細藻類には、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃ
ｕｍ  ｓｐ．属に属する微細藻類であって、その１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有するものが含まれる。
【００５３】
［微細藻類の存在状態］
本発明においては、液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、下記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する、微細藻類を用いてもよい。このような微細藻類を用いることにより、培地置換、バイオフィルムの回収、培養の再開等の操作がより容易となり、より低コストである本発明の実施が期待できる。
（１）液面上及び液面下１ｃｍから液面までの領域に存在する微細藻類の藻体量と培養器の底面上の微細藻類の藻体量との合計が、培養器内のそれ以外の領域に存在する藻体量の１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは３０倍以上である。ここでいう培養器内のそれ以外の領域とは、液面上と液面近傍、すなわち液面下１ｃｍから液面までの領域、及び底面を除いた領域を指す。培養器の側面、及び培養をモニターするセンサーなどの培養器内に設置する各種構造物の表面に微細藻類が付着することがあるが、そのような微細藻類はどちらの領域にも含めなくてよい。藻体量は、培養器の底面積当たりの藻体重量として表すことができる。
（２）液面上の微細藻類の比重が、培養器の底面上の微細藻類の比重より小さい。微細藻類の比重は、公知の方法、例えば濃度勾配法により求めることができる。底面上の微細藻類の比重を１としたときの液面上の微細藻類の比重は、微細藻類の種類にも拠るが、例えば０．９９以下であり、好ましくは０．９８以下であり、より好ましくは０．９６以下である。下限値には特に制限はないが、上限値がいずれの場合であっても例えば０．７５以上であり、好ましくは０．７７以上であり、より好ましくは０．７９以上である。
（３）液面上の微細藻類の比重が、水の比重より大きい。
（４）液面上の微細藻類のオイル含有量が、底面上の微細藻類のオイル含有量より高い。底面上の微細藻類のオイル含有量を１としたときに、液面上の微細藻類のオイル含有量は、例えば１．１以上であり、好ましくは１．２以上であり、より好ましくは１．３以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば３．０以下であり、好ましくは２．５以下であり、より好ましくは２．０以下である。
（５）液面上の微細藻類のサイズ（直径）が、底面上の微細藻類のサイズより大きい。微細藻類のサイズは、公知の方法により求めることができる。底面上の微細藻類のサイズを１としたときに、液面上の微細藻類のサイズは、例えば１．５以上であり、好ましくは１．８以上であり、より好ましくは２．０以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば４．０以下であり、好ましくは３．５以下であり、より好ましくは３．０以下である。
（６）形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とを含み、外側の層が内側の層より厚い。層の厚みは、公知の方法により求めることができる。内側の層の厚みを１としたときに、外側の層の厚みは、例えば２．０以上であり、好ましくは３．０以上であり、より好ましくは５．０以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば１８．０以下であり、好ましくは１４．０以下であり、より好ましくは１０．０以下である。形成されるバイオフィルムはまた、外側の層だけの場合もある。従って、形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とのいずれか一方を有することも、本発明の微細藻類が有する特徴の一つということができる。
（７）形成されるバイオフィルムの一部が培地中でひだ状の構造をとる。
（８）形成されたバイオフィルムを回収し、懸濁処理することにより得られた微細藻類を培地の液面上に播種した場合、培地中に沈降しうる。通常、液面上に形成されたバイオフィルムは、回収後、懸濁処理せずにそのまま液面上に注意深くアプライすることにより、液面に浮かせることができる。しかしながら、懸濁処理することにより、液面に浮きにくくなり、沈降することが多くなる。
なお、本発明でいう液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、上記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する微細藻類とは、上記（１）〜（８）からなる群より選択される少なくとも一つの特徴によって他の藻類の集合と区別することができ、かつ、その少なくとも一つの特徴を保持しつつ繁殖させることができる微細藻類の集合をいう。上記の（３）（４）（５）に関しては、対象となる微細藻類の平均の比重、オイル含有量又はサイズを求めて判断することができる。
【００５４】
［浮遊培養］
本発明では、微細藻類を培地中に分散させた状態で培養することを浮遊培養と呼んでいる。なお本発明では、液面上での培養を浮遊培養とは呼ばないものとする。浮遊培養は、本培養工程では行わないが、前培養工程では目的に応じて使用できる。
【００５５】
［静置培養］
本発明での本培養工程では、静置培養を行うことが好ましい。静置培養とは、培養中に意図的に培地などを動かさない培養法のことである。
【００５６】
［液面浮遊培養］
本発明では、液面上で微細藻類を培養する培養方法のことを液面浮遊培養という。なお、培養器底面、側面、その他表面上や培地中などに微細藻類が同時に存在していても、主たる目的が液面上での培養である場合には、液面浮遊培養という。また液面上にはバイオフィルムとともに泡沫がたくさん存在し、液面がどの位置か必ずしも明確でない場合があり、またバイオフィルムが自重によって液面下に多少沈んでいる場合があるが、本発明で液面上というときは、完全な液面のみならず、このような場合も含む。ただし、微細藻類を液中、培養器の底面のいずれか一方のみ、または、両方のみで培養する培養方法は液面浮遊培養には含まれない。
【００５７】
なお本発明における液面とは、典型的には後述する液体培地の液面であり、通常、液体培地と空気との界面である。また、水が主成分となる場合は、水面のことである。また、本発明での液面浮遊培養を行っていると、液面上バイオフィルムからひだ状の構造体が液中へと侵入する現象が見られることがある。本発明では、この様な状況での培養も液面浮遊培養に含むものとしている。
【００５８】
液面浮遊培養を行うための種藻としては、懸濁処理を行った後、培養器に添加してもよく、種藻の添加後、液体培地との混合を促進するために攪拌を行っても良い。また、微細藻類バイオフィルムを培養器の液面に対して添加し、浮かせた状態で培養を開始しても良いし、浮かせてから微細藻類バイオフィルムの液面からの離脱が最小限になるように、微細藻類バイオフィルムを可能な限り沈まないように液面上で分割処理し、さらに、培養器液面上に分散するように攪拌してもかまわない。
【００５９】
［前培養工程］
本発明の前培養工程とは、純化工程を終了した後に得られた保存用微細藻類を増殖させ、本培養を行えるまで微細藻類の数を増やす工程のことである。前培養工程の培養法は、公知のいかなる培養方法でも選択可能である。例えば、分散培養法や付着培養法、本発明者らにより開発された液面浮遊培養や本発明の培養法などを行うことも可能である。また、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養を数回行っても良い。また、前培養工程では、目的に応じて静置培養を行っても良いし、振盪培養などの非静置培養を行っても良い。
また、一般的には、１ｃｍ２〜１ｍ２以下の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能である。
【００６０】
［本培養工程］
本培養工程とは、前培養工程を行った後の培養工程のことであり、最終回収工程を行う直前までの培養工程のことをいう。本培養工程は、液面上のフィルム状構造体もしくは三次元状構造体が十分な量形成されたときに終了することができる。本培養工程は、例えば、数日〜数週間で、より特定すると、５日〜４週間で終了することができる。また、本培養工程は、複数回行っても良いものとする。
【００６１】
また、一般的には、１００ｃｍ２以上の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能であるが、屋外での培養の方が好ましい。
【００６２】
［種藻］
本発明での種藻とは、前培養工程や本培養工程の開始時に使用する微細藻類のことを指し、前培養工程や本培養工程における微細藻類の培養の元となる微細藻類のことをいう。
また、液面に微細藻類バイオフィルムを浮かせた状態や底面に微細藻類が存在している状態で培養を開始することもでき、それらの場合にも、これらの微細藻類を種藻として利用することができる。さらに、底面や培養器のその他の場所、培養を構成するその他の治具などに付着存在している微細藻類も、種藻として利用することができる。
また、回収工程の後に、液面上に残存している微細藻類を種藻として用いて、培養を再開することもできる。
【００６３】
［液面上の微細藻類の種藻としての利用］
本発明では、液面上の微細藻類バイオフィルムを種藻として使用し、培養を行うこともできる。図１の（ｆ）や（ｈ）の工程で、液面上の微細藻類バイオフィルムの一部を残しておく方法である。また、図１の（ｇ）や（ｉ）の工程の後、一部の微細藻類バイオフィルムを採取し、これを液面上に浮かせることで培養を開始することも可能である。さらに、液面上のバイオフィルムを可能な限り液面に浮かせた状態で分割処理を行い、培養を開始することもできる。この様にすることで、培養器の液面を有効活用することができ、微細藻類非存在領域に対しても存在させることができることから、増殖速度を向上させることができる場合が多いからである。
また、底面上および液面上に微細藻類バイオフィルムの一部を残した状態から培養を開始することも可能である。
【００６４】
［底面藻］
本発明での底面藻とは、培養器底面近傍に存在している微細藻類のことを指す。この中には、底面に付着し、軽い液流程度では剥がれないものや、底面近傍に存在し、軽い液流程度でも移動してしまう非付着性底面藻も存在している。また、回収操作によって微細藻類バイオフィルムから離れ、底面近傍へと沈んでしまった液面藻も、本発明では非付着性底面藻に含めることができる。
なお、本発明の模式図では液面上への微細藻類の供給が底面から行われるように記されているが、液面や底面以外の培地中にも低濃度ながら微細藻類が存在している場合には、これらが種藻の供給源となる可能性もある。また、培養器底面から液面上への微細藻類の供給とは、底面の微細藻類の増殖を伴わずに液面上に移動する場合と、微細藻類が底面から液面上に移動しながら増殖する場合との両方がある。
【００６５】
［底面上の微細藻類の種藻としての利用］
本発明では、図１の（ｊ）から（ｃ）への工程のように、底面上の微細藻類を種藻として使用し、培養を継続することもできる。培地中に栄養成分が残っていれば、使用済みの培地をそのまま使用して培養を継続しても良いし、使用済みの培地の一部を廃棄し、新しい培地を添加しても良い。新しい培地の添加量は、廃棄量と同等の液量を加えても良いし、それよりも少なくても多くてもかまわない。なお、新しい培地を添加する方が、後段の本培養での微細藻類の増殖速度を向上させることができる観点からより好ましい。
【００６６】
底面上の微細藻類を種藻として利用する場合、底面藻の一部を剥がし、それを培地中へと分散させても良い。この様にすることによって、藻体の一部しか培地と接触することができない状態の微細藻類を、より多くの培地と接触させることが可能となり、増殖速度を好適に向上させることが可能だからである。
【００６７】
底面上に存在する非付着性微細藻類を除去しても良い。底面上に不必要に微細藻類が存在していると、栄養成分の不必要な消費が原因と考えられる増殖速度の低下が見られるからである。また、種藻として使用する底面藻の存在量を調整しても良い。このことにより、適切な培養を行うことが可能だからである。培養を開始するにあたっての底面上での微細藻類の存在量は、０．００１μｇ／ｃｍ２以上１００ｍｇ／ｃｍ２以下が好ましく、０．１μｇ／ｃｍ２以上１０ｍｇ／ｃｍ２がさらに好ましく、１ｍｇ／ｃｍ２以上５ｍｇ／ｃｍ２が最も好ましい。０．１μｇ／ｃｍ２以上であれば、培養前後の微細藻類量の比を短時間で大きくすることができるから好ましい。
【００６８】
［懸濁処理］
本発明では、懸濁処理した微細藻類試料を用いても良い。懸濁処理を行うことで、溶液中の微細藻類が均一化し、培養後の膜厚が均一化する結果、培養面積あたりの微細藻類量が増加する場合があるからである。懸濁処理としては、公知のいかなる方法でも用いることができるが、ピペッティングや容器内に入れた微細藻類溶液を手で振る処理、スターラーチップや攪拌棒による処理などの弱い処理、超音波処理や高速振盪処理などの強い処理、細胞間マトリックスのような接着物質を分解する酵素などの物質を用いる方法などをあげることができる。
【００６９】
［培養器］
培養器（培養池）の形状は、培地を保持できる限り、公知のいかなる形状でも用いることができる。例えば、円柱状、方形状、球状、板状、チューブ状、プラスチックバッグなどの不定形状のものを使用することができる。また、オープンポンド（開放池）型、レースウェイ型、チューブ型（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ９２，  １１３，  ２００１）など様々な公知の方式を用いることができる。培養器として使用することの可能な形状は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０  （１９９９）  ３１３−３２１，  Ｅｎｇ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ９，  １６５−１７７  （２００９）．  に記載の培養器をあげることができる。これらの中で、オープンポンド型もしくはレースウェイ型を用いることが、コスト面からは好ましい。
【００７０】
本発明で使用可能な培養器は、開放型、閉鎖型のいずれでも使用することができるが、大気中よりも高い二酸化炭素濃度を使用した際の、培養器外への二酸化炭素の拡散を防ぐために、閉鎖型の培養器を用いる方が好ましい。閉鎖型の培養器を用いることで、培養目的外微生物やゴミの混入防止、培地の蒸発抑制、風によるバイオフィルム構造体への影響などを最小限にすることができる。しかし、商業生産を行う場合には、建設コストが安価であるなどの観点から、開放系での培養が好ましい。
【００７１】
［基板］
本発明での基板とは、図１の（ｆ）や（ｈ）で使用される固体状物のことである。基板の形状は、フィルム状、板状、繊維状、多孔質状、凸状、波状などいかなる形状のものでも良いが、転写のしやすさ、及び基板からの微細藻類の回収のしやすさから、フィルム状又は板状であることが好ましい。
【００７２】
［貫通状構造体］
本発明の方法では、貫通状構造体を使用することもできる。本構造体の使用で、回収後の微細藻類バイオマス中の含水率を大幅に下げることができる。
具体的には、培地中に貫通状構造体を浸漬し、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された後、該貫通状構造体を培養器内で上昇させ、気相中へと移動後、しばらく静置した後回収工程を行う方法、あるいは、培養を継続した後回収を行う方法がある。また、培養器の気相中に貫通状構造体を設置しておき、液面上の微細藻類バイオフィルムの三次元状構造体が、該貫通状構造体に接触、又は、該貫通状構造体の貫通部位を通過した状態で回収することもできる。さらに、微細藻類バイオフィルムが接触、または、貫通部位を通過した状態で、貫通構造体を培養器内の気相中でさらに上昇させることで、しばらく静置した後回収工程を行う方法、あるいは、培養を継続した後回収を行う方法がある。これにより、回収物中の含水率が大幅に下げることができることから好ましい。
貫通状構造体の培地中、気相中での移動は、培地を添加することで行っても良いし、培地を除去することで行っても良い。さらに、本方法と、培地の置換とを組み合わせても良い。
【００７３】
本発明に用いられる貫通状構造体は、少なくとも一つの貫通部位を有する。貫通部位とは、構造体に対して貫通穴を開いたもののことをいい、貫通穴の形成法についてはどの様な方法で形成しても良い。例えば、シート状物に穴を開けても良いし、糸状物を重ねることで織物や編物状にしても良い。
【００７４】
膜貫通の数も特に制限なく設置することができ、そのサイズは均一であっても良く、不均一であっても良い。貫通部位の形は、円形、方形、線形、不定形など様々な形を用いることができる。なお、貫通状構造体とは、例えば、金網などをあげることができる。また、貫通状構造体は、移動を行っていないときは培養器に固定できるほうが好ましい。
【００７５】
［素材］
本発明で使用可能な培養器、基板、貫通状構造体の素材は、特に限定することはなく、公知のものを使用することができる。例えば、有機高分子化合物や無機化合物、金属、それらの複合体から構成された素材を使用することができる。また、それらの混合物を用いることも可能である。
【００７６】
有機高分子化合物としては、ポリエチレン誘導体、ポリ塩化ビニル誘導体、ポリエステル誘導体、ポリアミド誘導体、ポリスチレン誘導体、ポリプロピレン誘導体、ポリアクリル誘導体、ポリエチレンテレフタレート誘導体、ポリブチレンテレフタレート誘導体、ナイロン誘導体、ポリエチレンナフタレート誘導体、ポリカーボネート誘導体、ポリ塩化ビニリデン誘導体、ポリアクリロニトリル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエーテルスルホン誘導体、ポリアリレート誘導体、アリルジグリコールカーボネート誘導体、エチレン−酢酸ビニル共重合体誘導体、フッ素樹脂誘導体、ポリ乳酸誘導体、アクリル樹脂誘導体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体等などを用いることができる。
【００７７】
無機化合物としては、ガラス、セラミックス、コンクリートなどを用いることができる。
【００７８】
金属化合物としては、鉄、アルミニウム、銅やステンレスなどの合金を用いることができる。
【００７９】
上記の中でも、基板や培養器の素材の一部は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリエステルの中から選ばれる少なくとも一つから構成されていることが好ましい。
【００８０】
また、培養器、基板、貫通状構造体の素材が同一であっても良く、異なっていても良い。
【００８１】
また、閉鎖型の培養器を用いる場合には、受光面は、光が透過する素材である方が良く、透明材料であればさらに良い。
【００８２】
［培地（液体培地）］
本発明では、微細藻類を培養できる限り、公知のいかなる培地（液体培地）も使用することができる。公知の培地として、ＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＦ培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＫＭ培地、ＭＮＫ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＷＥＳＭ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地などを挙げることができる。このうち淡水性のものはＡＦ−６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＨＵＴ培地、Ｍ−１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ−６培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地である。前述のＡＶＦＦ００７株を培養する培地としては、Ｃ培地、ＣＳｉ培地、ＣＨＵ培地、及びこれら培地の混合物が好ましい。なお培地は、培養する微細藻類の種類に応じて選択することが望ましい。
【００８３】
培地は、紫外線滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌しても良く、しなくても良い。
【００８４】
培地は、前培養工程と本培養工程で異なる培地を使用しても良い。また、培養工程の途中で異なる培地に変更しても良い。
【００８５】
［二酸化炭素］
多くの微細藻類の培養には、二酸化炭素の供給が必要である。
【００８６】
前培養工程で分散培養を行った場合には、従来法のようにバブリングによって二酸化炭素を培地中に供給しても良いが、液面浮遊培養を行った場合には、二酸化炭素を気相中から供給した方が好ましい。これは、培地中に二酸化炭素をバブリングなどの方法で供給すると液面上の微細藻類バイオフィルムの構造が破壊され、藻体量の斑が発生し、回収工程で基板上へのバイオフィルム回収効率が悪く、回収藻体量が減少する可能性があるからである。
【００８７】
本発明では、大気中の二酸化炭素の利用も可能であるが、大気濃度よりも高濃度の二酸化炭素を利用することもできる。この場合には、拡散による二酸化炭素の損失を防ぐために、閉鎖型の培養器または農業用フィルムなどの被覆物で覆った培養器中で培養することが望ましい。この場合の二酸化炭素の濃度は本発明の効果が達成できる限り特に限定しないが、好ましくは大気濃度以上、２０体積％未満であり、好ましくは０．０１〜１５体積％であり、より好ましくは０．１〜１０体積％である。また、二酸化炭素は、燃焼装置によって排出された二酸化炭素であってもよい。また、試薬によって二酸化炭素を発生させてもよい。
［光源及び光量］
本発明で用いることのできる光源は、公知のいかなる光源も用いることができるが、太陽光、ＬＥＤ光、蛍光燈、白熱球、キセノンランプ光、ハロゲンランプなどを用いることができ、この中でも、自然エネルギーである太陽光、発光効率の良いＬＥＤ、簡便に使用することのできる蛍光燈を用いることが好ましい。
【００８８】
光量は、１００ルクス以上１００万ルクス以下であることが好ましく、３００ルクス以上５０万ルクス以下がさらに好ましい。最も好ましい光量は、１０００ルクス以上２０万ルクス以下である。光量が１０００ルクス以上であると、微細藻類の培養が可能であり、２０万ルクス以下であると、光障害による培養への悪影響が少ない。
【００８９】
光は、連続照射、ある一定の時間間隔で照射と非照射を繰り返す方法のいずれでもかまわないが、１２時間間隔で光をＯＮ、ＯＦＦすることが好ましい。
【００９０】
光の波長は、光合成が行える波長であれば、どの様な波長でも用いることができ、その制限を設けないが、好ましい波長は、太陽光もしくは太陽光に類似の波長である。単一の波長を照射することで光合成生物の育成速度が向上する例も報告されており、本発明でもこの様な照射方法を用いることもできる。
［その他の培養条件］
本発明では、前培養工程や本培養工程で使用する液体培地（以下、液体培地のことを培地ともいう）のｐＨは、１〜１３の範囲内であることが好ましく、３〜１１の範囲内であることがより好ましく、５〜９の範囲内であることがさらに好ましく、６〜８の範囲内であることが最も好ましい。
【００９１】
また、微細藻類の種類に応じて、好適なｐＨは変化することから、微細藻類の種類に応じたｐＨを選択することが好ましい。なお、液体培地のｐＨとは、培養開始時のｐＨのことである。また、培養工程内のｐＨとは、培養に伴って変化する場合があることから、培養工程内でｐＨは変化しても良い。
【００９２】
本発明では、培地中のｐＨを一定に保つ緩衝作用を持った物質を培地中に添加することができる。これにより、微細藻類の培養の進行とともに培地中のｐＨが変化する問題を抑制することや、培地中への二酸化炭素の供給でｐＨが変化する現象を抑制できる場合がある。緩衝作用を持った物質としては、公知の物質を使用することができ、その使用には制限がないが、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）や、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などを好適に用いることができる。これら、緩衝物質の濃度や種類は、微細藻類の種類や培養環境に応じて決めることができる。
【００９３】
分散培養を行った場合の液体培地の水深が深いと、光が届かず、攪拌効率が悪くなる問題があり、限度があった。しかし、液面浮遊培養の場合には、液面上に高密度に微細藻類が増殖していることから、培養器深部に対して光を供給する必要がなく、基本的には攪拌も行わないことから、その水深は、浅くすることができる。これにより、水の使用量が少なく、ハンドリング効率が良くなることから、水深を浅くすることは好ましい。水深は０．４ｃｍ以上が好ましく、１ｃｍ〜１０ｍがより好ましく、２ｃｍ〜１ｍがさらに好ましく、４ｃｍ〜３０ｃｍが最も好ましい。水深が０．４ｃｍ以上であるとバイオフィルムの形成が可能となり、水深が１０ｍ以下であると、ハンドリングが容易である。水深が４ｃｍ〜３０ｃｍであると、水分の蒸発による影響が最小限であり、培地や微細藻類を含む溶液のハンドリングが容易である。
【００９４】
培養温度は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、０℃以上９０℃以下であることが好ましく、１５℃以上５０℃以下がより好ましく、２０℃以上４０℃未満が最も好ましい。培養温度が２０℃以上４０℃未満であると、微細藻類を好適に増殖させることができる。
【００９５】
微細藻類の下限投入微細藻類量、すなわち、培養開始時に使用する微細藻類量は、培養範囲内において１個あれば、時間をかけさえすれば増殖は可能であるため、その制限は特に設けないが、好ましくは１個／ｃｍ３以上であり、より好ましくは１０００個／ｃｍ３以上であり、さらに好ましくは１×１０４個／ｃｍ３以上である。微細藻類の上限投入微細藻類量は、基本的にはどの様な高濃度でも増殖が可能であるため、その制限は特に設けないが、ある濃度以上であると微細藻類量が多ければ多いほど、投入微細藻類量と増殖後の微細藻類量の比が低下することから、１×１０９個／ｃｍ３以下が好ましく、１×１０８個／ｃｍ３以下がより好ましく、５×１０７個／ｃｍ３以下がさらに好ましい。
【００９６】
本発明での前培養期間、本培養期間は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、１日以上３００日以下が好ましく、３日以上１００日以下がより好ましく、７日以上５０日以下がさらに好ましい。
【００９７】
［微細藻類バイオフィルムの繰り返し培養］
本発明においては、微細藻類バイオフィルムを回収した後、増殖のための栄養成分が培地中に残っている限り、底面上やその他の部位に残っている微細藻類を種藻として再度培養することが、何度でも可能である。しかし、あまりにも低濃度であると増殖速度が遅くなってしまう可能性が高いため、その様な場合には、培地を新たに添加したり、少なくとも一部の培地を置換したり、固形物状の栄養成分や高濃度の栄養成分を培地に添加したりすることができる。
【００９８】
［多段培養］
本発明の培養は、少なくとも２台の培養器を重ねて培養を行う、多段培養として実施することができる。多段培養においては、一方の培養器における培養ステージが、誘導期、対数増殖期、有用物質蓄積期又は培養停止期であり、他方の培養器における培養ステージとは異なるように実施してもよい。また、上段の培養器による培養が種藻を提供するために行われ、下段の培養器による培養が、有用物質を提供するために行われてもよい。
さらに、多段培養においては、上段は光を用いて培養し、下段は上段ほど光の利用はせずに糖を主として用いることで、培養しても良い。これにより、下段になるほど光量が低下し、その結果増殖量が低下する問題点を改善することができる。
多段培養においては、光を供給するための光源および導光手段を使用してもよい。
【００９９】
［液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの大きさと増殖速度］
微細藻類バイオフィルムの大きさは０．１ｃｍ２以上であることが好ましく、１ｃｍ２以上がより好ましく、１０ｃｍ２以上がさらに好ましく、培養器の液面面積と等しいことが最も好ましい。０．１ｃｍ２以上であれば、培養開始時の微細藻類量に対する培養終了時の微細藻類量との比を短時間で大きくすることができることから好ましい。
また、微細藻類バイオフィルムは、培養領域内で複数個存在していても良い。
微細藻類バイオフィルムの厚さは、１μｍ〜１００００μｍの範囲であることが好ましく、１μｍ〜１０００μｍの範囲であることがより好ましく、１０μｍ〜１０００μｍの範囲であることが最も好ましい。１０μｍ〜１０００μｍの範囲であると、強度が高く、十分な量のバイオフィルムを収穫することができる。
【０１００】
本発明に係るバイオフィルムが、フィルム状構造体の一部または複数の部分で気泡状に盛り上がることで形成された立体的な三次元状構造体である場合、培地の液面を基準とした該三次元状構造体の一般的な高さは、０．０１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲であることが好ましく、０．１ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であることがより好ましく、５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であることが最も好ましい。５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲であると、含水率を十分に下げることができ、培養器の高さを低く抑えることができる。
また本発明にかかる微細藻類は、液面上における増殖速度が大きいことが好ましく、対数増殖期における増殖速度（すなわち、対数増殖期の期間における一日あたりの平均増殖速度）が、乾燥重量で０．１ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることが好ましく、０．５ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることがより好ましく、１ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることがさらに好ましく、３ｇ／ｍ２／ｄａｙ以上であることが最も好ましい。微細藻類の対数増殖期における増殖速度は、乾燥重量で一般的に１０００ｇ／ｍ２／ｄａｙ以下である。
【０１０１】
本発明に係るバイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は、０．００１ｍｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、０．１ｍｇ／ｃｍ２以上であることがより好ましく、１ｍｇ／ｃｍ２以上であることが特に好ましい。最も好ましくは、５ｍｇ／ｃｍ２以上である。単位面積あたりの乾燥藻体重量が大きい方が、得られるオイルなどのバイオマスの量が大きくなることが見込まれるからである。バイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は通常１００ｍｇ／ｃｍ２以下である。
【０１０２】
また本発明の微細藻類としては、上記の構造や、上記範囲の面積、厚さ、高さ、増殖速度、単位面積あたりの乾燥藻体重量を有するバイオフィルムを液面上に形成可能な微細藻類であることが、上記と同様の理由で好ましい。
【０１０３】
［回収］
液面上の微細藻類バイオフィルムは、培養器内の液面がバイオフィルムで部分的に覆われている状態で回収することも可能であるが、微細藻類の藻体量が多いことから、培養器内の液面が全てバイオフィルムで覆われてから回収することが好ましい。また、バイオフィルムが液面を全て覆いつくした後に、しばらく培養を継続してから回収を行っても良い。
【０１０４】
特に、液面上に三次元の構造体が形成された後に回収することが好ましい。三次元状構造体は、フィルム状構造体がさらに増殖した時に見られる構造であり、二次元的なフィルム状構造体と比較して、回収可能な微細藻類の量が多いこと、および含水率がより低いことから好ましい。
【０１０５】
上述の回収方法は、液面上に形成されたバイオフィルムの７０％以上を回収することが好ましく、より好ましくは８０％以上を回収することであり、さらに好ましくは９０％以上を回収することであり、最も好ましくは１００％回収することである。液面上に形成されたバイオフィルムの回収率は、例えば、目視で確認することができる。
【０１０６】
また、液面上のバイオフィルムのみ回収しても良いし、液面上のバイオフィルム、および底面上の微細藻類の少なくとも一部の両方を回収しても良い。これは、液面上の微細藻類も底面上の微細藻類もバイオマスとして利用が可能だからである。ただし、一般的には、有用物質としてオイルを考慮すると、液面上の微細藻類の方が底面上の微細藻類よりもオイル含有量は高くなる。従って、底面藻を回収することは可能な限り避けた方が良い。
【０１０７】
［液面上の微細藻類バイオフィルムの転写法による回収］
転写法とは、図１の（ｆ）から（ｇ）に示されるように、液面上の微細藻類バイオフィルム（フィルム状構造体もしくは三次元状構造体）を第一の基板に写し取る工程のことであり、付着の一種で、実質的に増殖を伴わない付着である。第一の基板を液面に対して、平行、もしくは、それに近い角度になるように静かに挿入し、液面上の微細藻類バイオフィルムを第一の基板の表面に付着させる。なお、挿入を行う際、第一の基板を液面に対して若干斜めに挿入し、最終的に液面に対して平行にするようにすると、多くのバイオフィルムを少ない転写回数で回収でき好ましい。転写は、転写効率が向上することから、複数回行っても良い。
【０１０８】
［液面上の微細藻類バイオフィルムの堆積法による回収］
図１の（ｈ）に示した様に、第二の基板を用いて、液面上の微細藻類を回収する方法が堆積法による回収法である。図に示した様に、培養器の液面上の微細藻類バイオフィルムに対して、第二の基板を垂直もしくは斜めに挿入し、バイオフィルム面をなぞるように挿引するとともに、第二の基板の表面にバイオフィルムを堆積させながら回収する方法である。
図では、右側から左側に第二の基板を移動させているが、第二の基板の移動方向は、逆方向（すなわち、左側から右側への移動）でも良いし、複数回回収しても良い。複数回回収を行うことによって、回収率が向上するからである。複数回回収する場合には、バイオフィルムを付着させたままの第二の基板を用いても良いし、新しい第二の基板を準備して使用しても良い。また、図１では１枚の第二の基板しか記していないが、複数枚の第二の基板を同時に用いても良い。これにより、回収率が向上する。なお、この中で第二の基板の強度が許す限り、一枚の第二の基板を用い、回収したバイオフィルムを除去した後、次の回収に用いることが、回収装置の設置コストの観点などから好ましい。また、第二の基板の大きさ、液面に対する第二の基板の角度や移動速度などは目的に応じて自由に設定することができる。なお、図１の（ｇ）は、第二の基板上にバイオフィルムが回収された状態である。
第二の基板のサイズは、培養器のサイズに応じて適宜変更できるが、培養器の内壁の短径よりも少し小さな第二の基板を用いる方が好ましい。これにより、第二の基板を移動している時に、培養器の内壁に対して不必要な接触を避けることができるとともに、液面上の微細藻類バイオフィルムが、培養器と第二の基板との間の隙間を通ることによる回収漏れが発生しにくくなるためである。
【０１０９】
また、培養の状態によっては、培養器内の液面上で増殖している微細藻類のバイオフィルムは、フィルム状からひだ状に培養培地内で成長することがある。この場合には、第二の基板の液中への挿入深度を深くすることによって、ひだ状になったバイオフィルムを採取することもできる。
【０１１０】
［基板からの微細藻類バイオフィルムの脱着］
脱着は、回収の一部の工程である。
基板上の微細藻類バイオフィルムを脱着する方法としては、基板上から微細藻類を剥がすことのできる方法であればいかなる方法を用いても良いが、水流を加えたり、基板を入れた容器を超音波処理したり、基板を入れた容器の蓋を閉めた後、激しく振ったり、高速振盪処理を行ったり、セルスクレーバーのようなものを用いたりすることで微細藻類バイオフィルムを基板から剥ぎ取ることができる。このうち、基板を傷つけない素材が使用されている治具、例えば、セルスクレーバーのようなものを用いて基板から微細藻類バイオフィルムを剥ぎ取る方法が好ましい。さらに、基板を傾けるだけで、基板上から微細藻類バイオフィルムを剥がすこともできる。本方法は、簡便であることから、最も好ましい方法である。また、基板は、何度でも再利用してもかまわない。
また、図１の模式図では、基板を培養器外へと取り出してから、微細藻類バイオフィルムを脱着しているが、培養器の中で脱着してもかまわない。
【０１１１】
［乾燥藻体］
本発明における乾燥藻体は、本発明によって得られた微細藻類回収物を乾燥させたものである。
当該微細藻類回収物を乾燥させる方法としては、微細藻類回収物中の水分を減らすことができる方法であれば、いかなる公知の方法を用いることができ、特に制限されない。例えば、微細藻類回収物を天日干しにする方法、微細藻類回収物を加熱乾燥させる方法、微細藻類回収物を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法、微細藻類回収物に乾燥空気を吹き付ける方法等があげられる。これらのうち、微細藻類回収物に含まれる成分の分解を抑制できる観点から凍結乾燥、短時間で効率的に乾燥できる観点から加熱乾燥または天日干しする方法が好ましい。
【０１１２】
［含水率］
本発明での含水率とは、回収物中に含まれる水分の重量を、回収物の重量で割って、１００を掛けたものである。本発明での微細藻類バイオフィルムの含水率は、９９〜６０％が好ましく、９５〜８０％がさらに好ましく、９０〜８５％が最も好ましい。なお、貫通状構造体を用いて培養した場合には、この限りではない。
分散培養で培養し、遠心分離機を用いて微細藻類を回収した場合の含水率は、一般的に９０％程度とされ、本発明での培養法によって得られた液面上バイオフィルムの含水率は、それよりも低く、従来法と比べて優れている点である。なお、フィルム状構造体よりも三次元状構造体の方が含水率は低い。これは、三次元状構造体の方が液面から離れており、かつ、光源に近く、ある程度の乾燥が進行していることが原因と推定している。
【０１１３】
［有用物質］
本発明での有用物質とは、微細藻類由来のバイオマスの一種で、バイオマスから抽出工程、精製工程などの工程を経由することによって得られた産業にとって有益な物質の総称である。この様な物質として、医薬品や化粧品や健康食品などの最終生成物や中間物や原料、化学合成物の原料、中間物や最終生成物、炭化水素化合物、さらにはオイル、アルコール化合物、水素やメタンなどのエネルギー代替物質、酵素、タンパク、核酸、糖やＤＨＡなどの脂質化合物、アスタキサンチンなどを含む。有用物質は、有用物質蓄積工程によって、微細藻類中に蓄積させることもできる。
【０１１４】
［バイオマス及びオイル］
本発明でのバイオマスとは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などをあげることができる。藻類バイオマスには、微細藻類自体（バイオフィルム状であってもよい。）、有用物質を採取した後の微細藻類残滓が含まれる。
本発明でのオイルとは、可燃性の流動性物質のことであり、主として、炭素、水素から構成された化合物のことであり、場合によっては、酸素原子、窒素原子などを含む物質のことである。オイルは、一般的に混合物であり、ヘキサンやアセトンなどの低極性溶媒を用いて抽出される物質である。その組成は、炭化水素化合物や脂肪酸、トリグリセリドなどから構成される場合や、これらから選ばれる複数種の組成から構成されている場合もある。また、エステル化して、バイオディーゼルとして使用することもできる。
【０１１５】
微細藻類回収物中に含まれる有用物質やオイルを採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。
【０１１６】
オイルの一般的な抽出方法は、最終回収物を加熱乾燥させて、乾燥藻体を得た後、細胞破砕を行い、有機溶媒を用いてオイルを抽出する。抽出したオイルは、一般的に、クロロフィルなどの不純物を含むため精製を行う。精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるもの、蒸留（例えば、特表２０１０−５３９３００に記載の蒸留方法）によるものなどがある。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
【０１１７】
また、超音波処理によって微細藻類を破砕したり、プロテアーゼや酵素などによって微細藻類を溶解したりした後、有機溶媒を用いて藻体内のオイルを抽出する方法もある（例えば、特表２０１０−５３０７４１に記載の方法）。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
【０１１８】
また本発明に係るバイオフィルムは、バイオマスとしての有用性の観点から、オイル含有量が高いことが好ましい。具体的には、バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量が５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることが特に好ましい。バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量は通常８０質量％以下である。
【実施例】
【０１１９】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【０１２０】
［実施例１：窒素化合物カット培養］
【０１２１】
微細藻類ＡＶＦＦ００７株の投入藻体濃度を１×１０５個／ｍＬに調製し、前培養工程を行った。上記微細藻類の懸濁液を図３に示した組成を有するＣＳｉＦＦ０３培地を使用し調製し、プロビオペトリディッシュ（アズワン株式会社、２−４７２７−０１）に５５ｍＬ入れ、これをプラントバイオシェルフ組織培養用（株式会社池田理化、ＡＶ１５２２６１−１２−２）に設置することで、静置培養条件下、液面浮遊培養を行った。培養は、４０００ルクスの蛍光灯を、１２時間毎にＯＮとＯＦＦとを切り替える光照射を行い、室温（２３℃）で行った。液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの採取は、ポリエチレンフィルムを用いて行った。
【０１２２】
これを５ｍＬホモジナイズ用チューブ（株式会社トミー精工、ＴＭ−６５５）に、少量のＣＳｉＦＦ０４培地（図４）を入れ、ビーズ式細胞破砕装置ＭＳ−１００（株式会社トミー精工）にセットし、４２００ｒｐｍで２０秒間のホモジナイズ処理を３回行い、微細藻類懸濁液ａを得た。ただし、ビーズは使用していない。
【０１２３】
この懸濁液ａを希釈し、６６０ｎｍの吸光度を測定することで濁度を算出し、予め算出していた濁度と藻体数との関係式から、藻体量を計算し、ＣＳｉＦＦ０４培地で希釈することで、５×１０５個／ｍＬの濃度の懸濁液ｂを９７０ｍＬ得た。
【０１２４】
第一の本培養として、ＰＳ製ケース２８号（アズワン株式会社、４−５６０５−０５）に懸濁液ｂを４０ｍＬ入れ、これを真空デシケーター（アズワン株式会社、１−０７０−０１）に入れ、二酸化炭素濃度を５％にし、液面浮遊培養を行った。その他の培養条件としては、１５０００ルクスに設定した蛍光灯を用いて、１２時間毎にＯＮとＯＦＦとを切り替える光照射を行い、室温（２３℃）での静置培養を行った。なお、ＰＳ製ケース２８号は、黒色の遮光板を底面及び側面に設置し、ＰＳ製ケース２８号は、全部で１６個使用した。
【０１２５】
培養開始から１４日後に以下の処理を行った。
【０１２６】
実施例１−ａ
培養後のＰＳ製ケース２８号上の水面藻を、第二の基板として、ナイロンフィルムを用い、堆積法にて液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した。回収物の重量を測定し、さらに凍結乾燥後に重量を測定し、培地成分に相当する質量を減じた後、乾燥重量及び含水率を計算した。なお、藻体量は、４試料の平均値を計算した結果、４．６６ｍｇ／ｃｍ２であった。
【０１２７】
実施例１−ｂ
培養後のＰＳ製ケース２８号上の水面藻と底面藻との間の実質的に微細藻類が存在しない領域の培地を、１ｍＬロングチップを用いて可能な限り吸い出した。なお、ロングチップは、水面藻の一部を破壊することによって培地中へと挿入した。水面上の微細藻類は、ほぼ無傷で底面上の微細藻類と接触した。続いて、新しいＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）（図６）培地を、１ｍＬロングチップを用いて、可能な限り水面藻の構造を乱さないように３５ｍＬ添加した。この工程では、底面に接触した水面藻は、培地の添加と共に底面から離れ、水面の上昇と共に水面上に浮きながら上昇していった。目視の限りでは、概ね培地置換前と同じようなフィルム状構造体を形成した。従って、一連の工程で、１ｍＬロングチップを差し込んだ部位を除いて、基本的な構造体の乱れはほとんどなかった。なお、この工程では、水面藻の回収は行っていない。また、試料数は４である。
【０１２８】
実施例１−ｃ
実施例１−ｂと同じ工程で培地置換を行った。ただし、ここではＣＳｉＦＦ０４培地を用いた。
【０１２９】
実施例１−ｄ
培地置換を行わなかった。
【０１３０】
第二の本培養として、実施例１−ｂ、１−ｃ、１−ｄの処理を行った後、第一の本培養と同様の条件で培養を行った。
【０１３１】
培養７日後、すべての試料について、水面上の微細藻類バイオフィルムの回収を、実施例１−ａと同様の方法で行った。
【０１３２】
結果を図５に示した。新しい培地の供給で栄養成分を供給した実施例１−ｃが最も藻体量が高く、ついで、ＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）培地と置換した実施例１−ｂであり、実施例１−ａと１−ｄとは同程度であった。
【０１３３】
細胞破砕装置を用いて回収した微細藻類を破砕後、ヘキサン抽出法によりオイルを抽出し、オイル含有量（ｇ／ｇ乾燥重量、ｄｒｙ％）を求めた。オイル含有量は、実施例１−ｃが最も少なく、それ以外は同程度であった。
【０１３４】
図７に、乾燥重量とオイル含有量とを乗じることによって算出したオイル生産性の結果を示した。最も良好な値を示したのが、ＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）培地に置換した実施例１−ｂの結果である。それ以外は、ほぼ同等のオイル性産性となった。以上から、窒素化合物を削除した培地に置換することでオイル性産生を向上させることができることがわかった。
【０１３５】
さらに微細藻類としてＦＦＧ０３９株を用い、実施例１−ｂと同様の方法で培養を行った。ただし、ＰＳ製ケース２８号を１６個用いた。培養後の様子を図８（ａ）に示した。この試料を堆積法によって回収した後、凍結乾燥し、含水率を計算すると８６％になった。さらに、オイル含有量は、３５ｄｒｙ％になった（図８（ｂ））。さらに、ＧＣ−ＭＳスペトクルによる分析を行った結果、パルミチン酸とオレイン酸とが主な生成物であった。なお、炭化水素の分析も行ったが、微量であった。
【０１３６】
［実施例２：蒸留水添加によるオイル収量の向上］
実施例１と同様に、前培養、第一の本培養を行った。ただし、第一の本培養は、培養器として、ＰＳ製ケース２８号の代わりに、染色バット（アズワン株式会社、１−１４１３−０１）を用い、藻体懸濁液ｂを７０ｍＬ、すなわち、水深１ｃｍでの培養を行った。また、培養器は、６個準備した。
【０１３７】
培養１４日後に、６個の培養器の内、２個に対して７０ｍＬの蒸留水を添加し（添加後水深２ｃｍ）、さらに、２個に対して２８０ｍＬの蒸留水を添加（添加後水深５ｃｍ）した。なお、蒸留水添加前のＮＯ３濃度は７０１ｍｇ／Ｌ、７０ｍＬ添加した場合は３５０ｍｇ／Ｌ、２８０ｍＬ添加した場合は１４０ｍｇ／Ｌである。
【０１３８】
実施例１と同様の方法で、第二の本培養を行い、水面上の微細藻類を実施例１と同様の方法で回収し、凍結乾燥、重量測定を行った。その結果を図９に示した。第二の本培養時の蒸留水添加量が多いほど、オイル含有量が増した。この結果は、実施例１の窒素化合物を含まない培地に置換する効果と同じ理由でオイル量が増したものと考えている。
【０１３９】
［実施例３：蒸留水添加による回収性の向上］
実施例２と同様の方法で、前培養、第一の本培養を行った。ただし、培地量は、１０５ｍＬ、すなわち水深１．５ｃｍで培養し、合計４個の培養器を用いて培養を行った。
【０１４０】
培養１４日後に、培養器４個の内、２個に対して蒸留水２４５ｍＬを添加した。すなわち、水深は、５ｃｍになった。回収量は、いずれの場合も７．４ｍｇ／ｃｍ２となったが、図１０に示した様に、蒸留水を添加しない場合、底面藻の一部を回収してしまったが、蒸留水を添加しない場合には、その様なことはなかった。
【０１４１】
［実施例４：水面藻と壁面との接点部位の付着を剥がす方法］
実施例２と同様の方法で、前培養、第一の本培養を行った。ただし、培地量は、３３０ｍＬ、すなわち水深１．５ｃｍで培養し、合計８個の培養器を用い、藻類種として、ＦＦＧ０３９株を用いて培養を行った。
【０１４２】
培養１４日後に、培養器８個のうち、４個について液面と壁面とが接触している部位の壁面に付着している微細藻類バイオフィルムを、金属へらを用いて剥がした。なおこの際、可能な限りバイオフィルムの構造を壊さずに、液面に浮かせたまま、壁面から剥がすようにした。
【０１４３】
次に、すべての培養器に対して、培地を可能な限り除去し、ＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）培地を４０ｍＬ入れた。この時、壁面に付着した微細藻類を剥がさなかった試料は、培地の除去に伴って液面上の微細藻類バイオフィルムが破け、壁面にバイオフィルムの一部が付着したり、バイオフィルムが破れたりした。一方、壁面に付着した微細藻類を剥がした試料については、培地の除去と共に、液面上のバイオフィルムが途中で引っかかることなくそのままの状態で液面に浮いたまま液面と共に沈んでいった。
【０１４４】
さらに７日間の培養を行った後の水面上の微細藻類の乾燥重量を求めた。壁面との接点の付着を剥がさなかった試料の乾燥重量は、５．７ｍｇ／ｃｍ２、壁面との接点の付着を剥がした試料の乾燥藻体量は６．２ｍｇ／ｃｍ２になり、壁面との接点の付着を剥がした試料の方が藻体量は多くなった。これは前者の方が、不必要な付着の結果、水面上の微細藻類量が減少したためと推定している。
【０１４５】
［実施例５：糖含有培地］
前培養として、ＰＳ製ケース２８号にＣＳｉＦＦ０４培地（図４）４０ｍＬとＡＶＦＦ００７株（藻体濃度５×１０５個／ｍＬ）との混合物を入れ、これを真空デシケーター中に入れ、１５０００ルクスの蛍光灯照射下（１２時間ごとに光照射ＯＮ−ＯＦＦ）、２３℃、二酸化炭素濃度５％で静置培養を行った。なお、ＰＳ製ケース２８号の側面、底面は黒いプラスチックケースで覆った。
【０１４６】
１４日後、真空デシケーターから培養器を取り出し、ＰＳ製ケース２８号の短辺と同じ長さのナイロンフィルムを用いて、培地水面上の微細藻類バイオフィルムを堆積法によって回収した。これを５ｍＬホモジナイズ用チューブに、少量のＣＳｉＦＦ０４培地と共に入れ、ビーズ式細胞破砕装置ＭＳ−１００にセットし、４２００ｒｐｍで２０秒間のホモジナイズ処理を３回行い、微細藻類懸濁液ａを得た。ただし、ビーズは使用していない。
【０１４７】
この溶液を希釈し、６６０ｎｍの吸光度を測定することで濁度を算出し、予め算出していた濁度と藻体数との関係式から、上記懸濁液ａの藻体量を計算し、培地で希釈することで、５×１０５個／ｍＬの濃度の懸濁液ｂを１７０ｍＬ得た。なお、培地には、０〜１０ｍｇ／ｍＬのグルコースを含むＣＳｉＦＦ０４培地を用いた。
【０１４８】
前培養と同様の培養条件で培養を行い、培養開始後８日目と１４日目に水面上の微細藻類バイオフィルムをナイロンフィルムの使用で堆積法にて回収した。回収物の凍結乾燥を行い、乾燥重量を算出した。
【０１４９】
図１１に、その結果を示した。グルコース濃度が高いほど乾燥藻体量は多くなり、３ｍｇ／ｍＬ以上の濃度では変わらなかった。すなわち、糖の培地への添加によってバイオマス量は多くなった。このことは、微細藻類ＡＶＦＦ００７株は、糖を栄養源として増殖できることを示している。また、培地に糖を加えることにより、藻類の回収量増加が期待できることを示している。
【０１５０】
［実施例６：Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｓｐ．での実施］
実施例５と同様の方法で前培養を行った。ただし、藻体種として、ＦＦＧ０３９ｐ１株（藻体濃度０．０３２ｍｇ／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ相当）とＡＶＦＦ００７株（藻体濃度５×１０５個／ｍＬ）とを用いた。
【０１５１】
実施例５と同様の方法で試料の調製を行い、微細藻類懸濁液ａ（ＦＦＧ０３９株）、微細藻類懸濁液ｂ（ＡＶＦＦ００７）を得た。
【０１５２】
この溶液を希釈し、６６０ｎｍの吸光度を測定することで濁度を算出し、予め算出していた濁度と藻体数との関係式から、上記懸濁液ａの藻体量を計算し、ＣＳｉＦＦ０４培地で希釈することで、０．０３２ｍｇ／ｍＬの濃度の懸濁液ｃを９０ｍＬ得た。なお、培地には、１０ｍｇ／ｍＬの糖を含むＣＳｉＦＦ０４培地を用いた。それぞれの糖（単糖（グルコース、ガラクトース、フルクトース）、単糖・五炭糖（キシロース）、二糖類（スクロース）、三糖類（ラフィノース）、多糖類（でんぷん、セルロース））について培地を調製した。また、同様にＡＶＦＦ００７株についても行い、懸濁液ｄを得た。
【０１５３】
ＰＳ製ケース２８号に、ＦＦＧ０３９株を含む懸濁液ｃを４０ｍＬ入れ、底面を含む外壁を黒い板でシールした。これを、前培養と同様の条件で培養した。１４日後に、ナイロンフィルムを用いて、堆積法によって水面上の微細藻類バイオフィルムを回収し、凍結乾燥後、乾燥藻体量を測定した。また、ヘキサン抽出によって、オイルを抽出した。また、同様に、ＡＶＦＦ００７株を含む溶液を調製後、培養、回収、定量、オイル抽出を行った。
【０１５４】
図１２にＦＦＧ０３９株の場合の結果を示した。単糖、二糖、三糖、五炭糖、六炭糖、多糖のいずれも、糖を添加していない実験条件下よりも増殖速度は向上した。特に、セルロースを糖として用いた場合には、大幅な増殖量向上が確認できた。図１３にＡＶＦＦ００７株の場合の結果を示した。ＡＶＦＦ００７株は、一部の糖について増殖量の低下が見られたが、二糖類、多糖に増殖量の増加が見られた。なお、オイル含有量は、乾燥重量比で、ＦＦＧ０３９の場合には、糖がない場合、２７．８ｄｒｙ％、糖がある場合、３０〜３５ｄｒｙ％、ＡＶＦＦ００７株の場合には、糖がない場合、１９ｄｒｙ％、糖がある場合、２０〜２５ｄｒｙ％であった。なお、ｄｒｙ％とは、乾燥藻体重量あたりのオイル重量比である。
以上から、糖を含む培地を用いると、オイル量を向上させることができることがわかった。
【０１５５】
［実施例７：光を使用せず、糖だけを使用した場合］
実施例５と同様に、前培養、懸濁液の調製、本培養を行った。ただし、グルコース濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、光は、照射するものと照射しないものとを、それぞれ４試料ずつ準備し、藻体種としてＦＦＧ０３９株を用いた。なお、照射しないものは、真空デシケーターをアルミホイルで遮光した。
【０１５６】
培養１４日後、実施例５と同様に、水面上の微細藻類バイオフィルムを回収し、乾燥重量を測定したところ、糖を培地に含み、光を照射した試料は、８．５ｍｇ／ｃｍ２、一方、糖を培地に含み、光を照射しなかった試料は、７．２ｍｇ／ｃｍ２になった。
以上から、光を用いずとも、糖を含んでいればＦＦＧ０３９株は増殖が可能であることがわかった。
【０１５７】
［実施例８：窒素化合物不含、糖含有培地］
実施例７と同様の方法で、前培養、第一の本培養を行った。ただし、すべて光は照射した。
培養１４日後に、糖を含むＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）培地と置換した。ただし、準備した試料の中で４試料は、糖を含まないＣＳｉＦＦ０４（Ｎ−）培地を使用した。
培地置換後、さらに７日間の第二の本培養を行い、実施例７と同様の方法で回収、凍結乾燥、オイル抽出を行った。
【０１５８】
糖を含む窒素制限培地を使用した場合の乾燥藻体量は、８．２ｍｇ／ｃｍ２になり、糖を含まない窒素制限培地を使用した場合には、６．９ｍｇ／ｃｍ２になった。また、オイル含有量は、それぞれ、３８．７ｄｒｙ％、３３．４ｄｒｙ％になった。
以上から、糖を含有し、窒素化合物を含まない培地を使用することで、乾燥藻体量は増加し、オイル含有量も向上した。
【０１５９】
［実施例９］
実施例１−ａと同様に水面上の微細藻類バイオフィルムを回収した。回収量は、４．８３ｍｇ／ｃｍ２であった。なお、ナイロンフィルムを用いて、堆積法によって、ナイロンフィルムの下端が水深０．５ｃｍになるようにしながら、数回回収を行った。
可能な限り底面上の微細藻類バイオフィルムを回収しないように培地を採取した後、全量を遠心分離し、上清を除去した後、残渣の乾燥重量を測定した。その結果、０．０８ｍｇ／ｃｍ２になった。
セルスクレーバーを用いて、底面上の微細藻類を回収した。この全量を遠心分離し、上清を除去した後、残渣の乾燥重量を測定した。その結果、２．８２ｍｇ／ｃｍ２になった。
なお、培養器側面に付着していた微細藻類は回収しなかった。
同様の実験を、ＦＦＧ０３９株に対して行った結果、水面藻、培地中、底面藻は、それぞれ、７．５２ｍｇ／ｃｍ２、０．１３ｍｇ／ｃｍ２、２．５７ｍｇ／ｃｍ２となった。
以上から、水面藻と底面藻の藻体量は、培養器側面を除く培養器中の藻体量の９８％以上であることがわかった。なお、本藻体の場合には、１０ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む培地を用いた。
【０１６０】
［実施例１０］  
実施例９で得られた試料を以下の方法によって、藻体の比重を測定した。ただし、ＡＶＦＦ００７株を用いた。
１０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，  Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）  ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．５）の溶液に塩化セシウムを溶解させることで、塩化セシウム濃度１０％ごとに塩化セシウム濃度が３５〜１０５％  （ｗ／ｖ）の溶液を調製し、Ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ  ｔｕｂｅ  （日立工機製）内にｔｕｂｅ先端部から液面部に向かって濃度が薄くなるように濃度勾配を作成した。
このチューブの上面に５×１０６個／ｍＬのＡＶＦＦ００７株をアプライし、遠心機を用いて、２００００×ｇ、４℃、３０分間の遠心処理を行った。
液面上に浮遊している藻体の比重は１．３３から１．４１ｇ／ｍＬであった。一方、底面上の藻体の比重は、１．４１から１．４８ｇ／ｍＬであった。
以上から、底面藻の方が液面藻よりも比重が高いことがわかった。
【０１６１】
実施例９と同様に、糖を含む培地を用い、藻体種として、ＦＦＧ０３９株を用いた場合に同様の実験を行った。その結果、液面上の藻体が１．２３から１．３７、底面藻が１．３９から１．５１であった。
【０１６２】
［実施例１１］
実施例９で得られた水面藻と底面藻のオイル含有量を、実施例６に記載した方法と同様の方法で測定した。ただし、ＡＶＦＦ００７株を用いた。
その結果、水面藻のオイル含有量が２４．４％、底面藻のオイル含有量が１５．３％であった。
以上から、水面藻の方がオイル含有量は高いことがわかった。
実施例９と同様に、糖を含む培地を用い、藻体種として、ＦＦＧ０３９株を用いた場合に同様の実験を行った。その結果、液面上の藻体が３４．６％、底面藻が２８．５％であった。
【０１６３】
［実施例１２］
実施例９で得られた水面藻と底面藻のサイズ（直径）を、顕微鏡下で観察しながら測定した。なお、藻体サイズは、それぞれ２７個ずつ測定し、その平均値を用いた。ただし、ＡＶＦＦ００７株を用いた。
水面藻の平均サイズは、２２．１μｍであった。底面藻の平均サイズは、７．８μｍであった。
以上から、水面藻の方が底面藻よりも約３倍、大きいことがわかった。
【０１６４】
糖を含む培地を用いて同様の実験を行った。その結果、液面上の藻体が２１．７μｍ、底面藻が８．９μｍであった。
【０１６５】
［実施例１３］
実施例９と同様の方法で試料を得た。ただし、ＦＦＧ０３９株を用いた。
液面上の微細藻類バイオフィルムの構造をピンセットで壊したところ、内部に多数の気泡から構成されていた構造が見られた。ピンセットで破壊した構造物を、ピンセットでつまんで、スライドガラスの上においた。さらに、気泡状の構造物の一部分を転写法を用いて、スライドガラス上に転写した。
上記二つの試料を顕微鏡にセットし、ガラス表面と微細藻類バイオフィルム表面との焦点距離の差を利用して、それぞれの厚みを測定した。その結果、外側の微細藻類バイオフィルムの厚みが１．８ｍｍ、内側の厚みが０．２ｍｍであった。
以上から、液面上の微細藻類バイオフィルムの三次元状構造物は、構造物の外側に厚いバイオフィルムが形成され、その内部に、薄いバイオフィルムが構成された多数の泡沫から構成されていることがわかった。
【０１６６】
糖を用いた培地で培養した水面藻についても同様の観測を行った結果、同じような構造が確認できた。
【０１６７】
［実施例１４］
実施例９と同様に培養を行った。ただし、ＡＶＦＦ００７株を培養試料として用い、培養７日目で、液面上の微細藻類バイオフィルムの構造を観察した。
その結果、部分的に泡沫を伴った構造を形成していたが、主な構造体は、二次元状構造物のフィルム状構造体から構成されていた。また、フィルム状構造物の増殖により、ランダムにフィルム状構造物から液面中へとひだ状の構造物が侵入していた。
【０１６８】
糖を用いた培地で培養した水面藻についても同様の観測を行った結果、同じような構造が確認できた。
【０１６９】
［実施例１５］
実施例９と同様の方法で培養を行い、ナイロンフィルムを用いて、堆積法によって、水面藻を回収した。この中の一部分を、新しい培地を入れた培養器の水面上にゆっくりとアプライすると、ほぼ全量を液面に浮かすことができた。
一方、上記回収物を少量の培地を入れたマイクロチューブの中に入れ、ピペッティングを数回行い、新しい培地を入れた培養器の水面上にゆっくりとアプライしても、液面に浮く藻体はほとんどなかった。
それぞれの培養器を実施例９と同様の方法で培養を行うと、両試料とも、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された。
【０１７０】
糖を用いた培地で培養した水面藻についても同様の観測を行った結果、同じような性質が確認できた。
【配列表フリーテキスト】
【０１７１】
配列番号１：ＡＶＦ００７株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部
配列番号２：ＦＦＧ０３９株の１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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