(57)【要約】【課題】病原菌感染の有無を早期に診断できるとともに、問題となる病原菌の種類を特定できる病原菌感染診断方法の提供。【解決手段】検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定するステップと、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、上記１又は複数の励起波長に対応する励起光を照射し、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光を測定するステップと、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が全て検出された場合に前記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断するステップと、を含む、植物体の病原菌感染診断方法。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体の病原菌感染診断方法であって、
検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定するステップと、
植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、前記１又は複数の励起波長に対応する励起光を照射し、前記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光を測定するステップと、
前記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が検出された場合に前記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断するステップと、
を含む、植物体の病原菌感染診断方法。
【請求項２】
前記病原菌が、イチゴ炭疽病菌、メロン炭疽病菌、イチゴうどんこ病菌、小麦うどんこ病菌、トマト萎凋病菌、イチゴ萎凋病菌及びハクサイ萎凋病菌からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１に記載の病原菌感染診断方法。
【請求項３】
前記被検物質が水を含む、請求項１又は２に記載の病原菌感染診断方法。
【請求項４】
植物体の病原菌感染診断装置であって、
植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の１又は複数の励起波長の励起光を照射する励起光照射手段と、
前記植物体からの１又は複数の蛍光波長の蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備える、
植物体の病原菌感染診断装置。
【請求項５】
前記励起光照射手段が１又は複数の光源を含む、請求項４に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項６】
前記蛍光検出手段が１つ又は複数の蛍光検出器を含む、請求項４又は５に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項７】
前記蛍光検出手段が１次元蛍光検出器及び２次元蛍光検出器のうち少なくとも１種である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項８】
前記蛍光検出手段により検出された蛍光の強度が閾値を超えた場合に、前記検出対象となる病原菌に感染していること、又は感染するおそれがあることを示す表示手段を更に備える、請求項４〜７のいずれか一項に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項９】
前記病原菌が、イチゴ炭疽病菌、メロン炭疽病菌、イチゴうどんこ病菌、小麦うどんこ病菌、トマト萎凋病菌、イチゴ萎凋病菌及びハクサイ萎凋病菌からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項４〜８のいずれか一項に記載の病原菌感染診断装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体の病原菌感染診断方法及び病原菌感染診断装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物体が病原菌に感染しているか否かを診断する方法として、例えば、特許文献１に開示された方法がある。特許文献１に記載の方法は、植物体の病原菌感染診断方法であって、前記植物体の診断対象部位及び該診断対象部位周辺の健常部位に、３００〜５００ｎｍの波長の第１の励起光を照射する励起光照射工程と、前記診断対象部位及び前記健常部位からの近赤外蛍光を検出する第１の蛍光検出工程と、前記診断対象部位及び前記健常部位からの４１０ｎｍ以上の波長の可視光蛍光を検出する第２の蛍光検出工程と、診断工程と、を含み、前記診断工程においては、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位における蛍光強度が、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに５０％未満であり、かつ、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位の蛍光強度が、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに１５０％より大きい場合に、前記植物体が病原菌に感染していると診断し、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位における蛍光強度が、前記第１の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに５０％以上であり、かつ、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記診断対象部位の蛍光強度が、前記第２の蛍光検出工程により検出された前記健常部位における蛍光強度を１００％としたときに１５０％以下である場合に、前記植物体が前記病原菌に感染していないと診断する、植物体の病原菌感染診断方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−３６８８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載の方法では、クロロフィルに由来する近赤外蛍光及び病原菌に由来する可視光蛍光の両方の蛍光を検出することにより、病原菌に感染しているか否かを確度よく診断することができるものである。一方、感染している病原菌の種類を特定することは困難である。
【０００５】
ところで、植物育種において、植物体の病原菌感染予防及び防除は、一般的に農薬を用いて行われる。しかしながら、頻繁な予防的散布、及び過剰防除による耐性菌の出現が問題となってきている。また、最近では環境負荷などの問題や消費者意識の変化などから低農薬化が一部では行われてきているものの、多くの生産者は病原菌感染への不安から許容されている範囲での農薬散布を積極的に行っているのが実情である。
【０００６】
これらの問題の一つの解決方法として、適量の農薬散布を的確なタイミングで行うことが有効であると考えられる。そのためには、病原菌感染の有無を早期に診断できるとともに、問題となる病原菌の種類を特定できる診断方法が必要である。
【０００７】
そこで、本発明は、病原菌感染の有無を早期に診断できるとともに、問題となる病原菌の種類を特定できる病原菌感染診断方法及び病原菌感染診断装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、植物体の病原菌感染診断方法であって、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定するステップと、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、上記１又は複数の励起波長に対応する励起光を照射し、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光を測定するステップと、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が検出された場合に上記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断するステップと、を含む、植物体の病原菌感染診断方法を提供する。
【０００９】
本発明は、本発明者らが、植物体の病原菌がそれぞれ固有の自家蛍光スペクトルを有することを見出したことに基づいている。すなわち、本発明の植物体の病原菌感染診断方法によれば、病原菌固有の自家蛍光スペクトルに基づいて、病原菌感染の有無を診断する（すなわち、病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断する）ため、病原菌の種類をも特定した高感度な診断が可能である。また、病原菌固有の自家蛍光スペクトルに基づいているため、初期段階での発見が可能となる。さらに、病原菌の種類も特定できることから、適量の農薬散布を的確なタイミングで行うことも可能となる。
【００１０】
上記病原菌感染診断方法における病原菌は、イチゴ炭疽病菌、メロン炭疽病菌、イチゴうどんこ病菌、小麦うどんこ病菌、トマト萎凋病菌、イチゴ萎凋病菌及びハクサイ萎凋病菌からなる群より選択される１種又は２種以上であってもよい。
【００１１】
上記病原菌感染診断方法において、上記被験物質は水を含むことが好ましい。被験物質が水を含むことにより、病原菌が分泌する水溶性分泌物質が水不溶性物質から分離されるため、より一層精度の高い診断が可能となる。
【００１２】
本発明はまた、植物体の病原菌感染診断装置であって、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の１又は複数の励起波長の励起光を照射する励起光照射手段と、上記植物体からの１又は複数の蛍光波長の蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備える、植物体の病原菌感染診断装置を提供する。
【００１３】
上記病原菌感染診断装置によれば、励起光照射手段により、上記被験物質に病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の１又は複数の励起波長の励起光が照射される。この励起光は病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質を励起し、当該励起光に対応する自家蛍光が発せられ、当該蛍光が病原菌感染診断装置の蛍光検出手段により検出される。被検物質に病原菌が存在する場合、上記蛍光が検出される。本発明の病原菌感染診断装置は、病原菌固有の自家蛍光スペクトルに基づいて決定される自家蛍光を検出することにより、病原菌感染の有無を高感度に診断することができる。
【００１４】
上記励起光照射手段は、１又は複数の光源を含んでいてもよい。
【００１５】
上記蛍光検出手段は、１つ又は複数の蛍光検出器を含んでいてもよい。また、上記蛍光検出手段は、１次元蛍光検出器及び２次元蛍光検出器のうち少なくとも１種であってもよい。
【００１６】
上記病原菌感染診断装置は、上記蛍光検出手段により検出された蛍光の強度が閾値を超えた場合に、上記検出対象となる病原菌に感染していること、又は感染するおそれがあることを示す表示手段を更に備えていてもよい。
【００１７】
上記病原菌感染診断装置は、イチゴ炭疽病菌、メロン炭疽病菌、イチゴうどんこ病菌、小麦うどんこ病菌、トマト萎凋病菌、イチゴ萎凋病菌及びハクサイ萎凋病菌からなる群より選択される１種又は２種以上の病原菌用であってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の植物体の病原菌感染診断方法及び病原菌感染診断装置は、病原菌固有の自家蛍光スペクトルに基づいて、病原菌感染の有無を診断するため、病原菌の種類をも特定した高感度な診断が可能である。したがって、初期段階での発見が可能となり、また、病原菌の種類も特定できることから、適量の農薬散布を的確なタイミングで行うことも可能となる。したがって、低農薬化や耐性菌出現の低減が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８５５４）の自家蛍光スペクトルである。
【図２】イチゴうどんこ病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）の自家蛍光スペクトルである。
【図３】ムギうどんこ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）の自家蛍光スペクトルである。
【図４】イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８５５４）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図５】イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８５５５）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図６】イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号７４４１０６）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図７】イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３９７７３）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図８】メロン炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８６５９）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図９】メロン炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８６５７）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図１０】小麦うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図１１】トマト萎凋病菌（ＭＡＦＦ番号１０３０３６）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図１２】イチゴ萎凋病菌（ＭＡＦＦ番号２３５６４１）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図１３】ハクサイ萎凋病菌（ＭＡＦＦ番号２３５６５７）の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。
【図１４】各種病原菌の自家蛍光の励起波長と蛍光波長の分布を示すグラフである。
【図１５】一実施形態に係る病原菌感染診断装置を示す模式図である。
【図１６】一実施形態に係る病原菌感染診断装置を示す模式図である。
【図１７】一実施形態に係る病原菌感染診断装置を示す模式図である。
【図１８】一実施形態に係る病原菌感染診断装置を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一要素には同一符号を付すこととし、重複する説明は省略する。図面の寸法比率は図示の比率に限られるものではない。
【００２１】
〔病原菌感染診断方法〕
本発明の植物体の病原菌感染診断方法は、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定するステップ（以下、「決定ステップ」ともいう。）と、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、上記１又は複数の励起波長に対応する励起光を照射し、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光を測定するステップ（以下、「測定ステップ」ともいう。）と、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が検出された場合に上記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断するステップ（以下、「診断ステップ」ともいう。）と、を含む。
【００２２】
（決定ステップ）
このステップでは、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定する。上述したとおり、植物体の病原菌はそれぞれ固有の自家蛍光スペクトルを有する。病原菌の種類に応じて、自家蛍光は１つのみ（すなわち、１つの励起波長及び１つの蛍光波長）の場合もあるし、自家蛍光が複数（すなわち、複数の励起波長と、それらにそれぞれ対応する複数の蛍光波長）の場合もある。
【００２３】
決定ステップでは、検出対象とする病原菌の蛍光スペクトルから、測定ステップで使用する励起波長及びそれに対応する蛍光波長を決定する。病原菌が複数の自家蛍光を有する場合、それら全ての励起波長及び蛍光波長を測定ステップで使用することが好ましい。これにより、より精度の高い診断が可能となる。
【００２４】
各病原菌固有の蛍光スペクトルは、予め取得しておいてもよい。蛍光スペクトルの取得方法としては、例えば、病原菌を無蛍光培地で培養した後、培地を脱イオン水で洗浄し、洗浄水を回収することによって、病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質を得ることができる。次いで、回収した洗浄水を、蛍光分光光度計を用いて、波長２００〜６５０ｎｍで励起、波長３００〜８００ｎｍで蛍光計測することにより蛍光スペクトルを得ることができる。図１〜３に、自家蛍光スペクトルの一例として、イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８５５４）、イチゴうどんこ病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）及びムギうどんこ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）の自家蛍光スペクトルを示す。
【００２５】
（測定ステップ）
このステップでは、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、決定ステップで決定した励起波長に対応する励起光を照射し、蛍光波長に対応する蛍光を測定する。
【００２６】
被験物質は、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される。植物体自体を被験物質として病原菌の自家蛍光を測定することで、植物体に病原菌が存在するか否かを診断することが可能となる。また、植物体を純水、イオン交換水、水道水等で洗浄して得られる洗浄液（水溶液）を被験物質としてもよい。植物体は、葉、茎、根、花、果実等のいずれを測定対象としてもよい。
【００２７】
また、上記被験物質として、植物体に接触する、若しくは接触した物質を使用してもよい。具体的には、上述の洗浄液、又は土壌、散布水、排水若しくは循環水溶液等が挙げられる。本来病原菌に感染するのは植物体自体であるが、土壌、散布水、排水、循環水溶液等に病原菌は潜んでいる。また、水は植物体が感染したときには、他の植物体に対して感染源になる場合もある。そのため、植物体のみならず土壌、散布水、排水、循環水溶液等のモニタリングも重要である。これにより将来的な感染のおそれ（可能性）を診断することができる。例えば、温室等の施設栽培においては、その排水中の病原菌を自動モニタリングすることによって将来的な感染の可能性を診断できる。
【００２８】
（診断ステップ）
このステップでは、上記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が検出された場合に上記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断する。具体的には、例えば、病原菌が存在していないことが確かめられている対照と比較して、検出された蛍光強度が高い場合に蛍光が検出されたと判断してよい。
【００２９】
（病原菌）
本発明の病原菌感染診断方法を適用する対象となる病原菌としては、植物が感染する病原菌であれば種類を問わない。具体的には、例えば、炭疽病菌、うどんこ病菌、萎凋病菌半身萎凋病菌、萎黄病菌、葉カビ病菌、すすカビ病菌、つる割れ病菌が挙げられる。図４〜１３には、各種病原菌の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示した。図１４は、これらの分布を示すグラフである。
【００３０】
炭疽病菌としては、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属等の炭疽病菌が挙げられ、例えば、グロメレラ・シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、コレトトリカム・アキュテータム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。
【００３１】
うどんこ病菌としては、ウドンコカビ科（Ｅｒｙｓｉｐｈａｃｅａｅ）に属する子嚢菌類が挙げられ、例えば、スファエロテカ・パンノサ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｐａｎｎｏｓａ）、スファエロテカ・フムリ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）、スファエロテカ・キュキュルビタエ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）、スファエロテカ・フリジネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、オイディウム・リコペルシシ（Ｏｉｄｉｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、ウンシヌラ・シムランス（Ｕｎｃｉｎｕｌａ  ｓｉｍｕｌａｎｓ）、エリシフェ・ネカトル（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｎｅｃａｔｏｒ）、エリシフェ・ポリゴニ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｐｏｌｙｇｏｎｉ）、ブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィラクチニア・モリコラ（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ  ｍｏｒｉｃｏｌａ）等が挙げられる。
【００３２】
萎凋病菌としては、ネコブカビ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ）属、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属等の萎凋病菌が挙げられ、例えば、プラスモディフォラ・ブラシカエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、スクレロチニア・スクレロチウム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、バーティシリウム・ダリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅ）、バーティシリウム・アルボ・アトラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）等が挙げられる。
【００３３】
（植物体）
本発明の方法により診断できる植物としては、草本でも木本でもよい。また、種子植物、シダ植物、コケ植物であってもよいが、種子植物が好ましい。その中でも、イチゴ、スイカ、メロン、キュウリ、トウガン、カボチャ、ナス、トウガラシ、ピーマン、トマト、ムギ、ハクサイ、マンゴー、ナシ、カキ、リンゴ、ブドウ、シクラメン、ベゴニア、バラ、ユリ、シバ、チャが好ましい。
【００３４】
〔病原菌感染診断装置〕
図１５〜１８は、それぞれ本発明の一実施形態に係る病原菌感染診断装置を示す模式図である。図１５に示す病原菌感染診断装置１００は、１の励起波長及び蛍光波長による診断に用いられる。図１６に示す病原菌感染診断装置１１０、図１７に示す病原菌感染診断装置１２０、及び図１８に示す病原菌感染診断装置１３０は、それぞれ複数の励起波長及び蛍光波長による診断に用いられる。
【００３５】
（励起光照射手段）
励起光照射手段１は、被験試料３に励起光（励起光７１及び励起光７２）を照射する。励起光照射手段１としては、例えば、２００〜６５０ｎｍの波長の光を照射できる光源（光源１１及び光源１２）である。このような光源としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー半導体（ＬＤ）、固体レーザー、液体レーザー、ガスレーザー、自由電子レーザー、化学レーザー等のレーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ナトリウムランプ、重水素ランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯を挙げることができ、この中でも水銀ランプ、重水素ランプ、キセノンランプ並びに半導体光源であるＬＥＤ及びＬＤが好ましい。
【００３６】
励起光７１及び励起光７２は、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の自家蛍光の励起波長を有する。励起波長は複数あってもよい。図１５は１つの励起波長による照射のみ行う場合を示しており、励起光７１のみ図示してある。図１６〜１８は２つの励起波長による照射を行う場合を示しており、励起光７１及び励起光７２を図示してある。また、図示はしていないが、励起波長が３以上あってもよい。
【００３７】
所望の波長の励起光７１及び励起光７２を得るために、励起光照射手段１に分光素子（分光素子４１及び分光素子４２）を設けてもよい。分光素子４１及び分光素子４２としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルターが挙げられる。また、被験物質３が植物体自体である場合、植物体への影響を低減するために、励起光７１及び励起光７２は、植物体に照射される光強度が低いことが好ましく、例えば、検出器がＣＣＤの場合、受光面での強度が０．０１〜１００ルクスが好ましく、検出器が冷却ＣＣＤの場合、受光面での強度が０．０００００００１〜０．０１ルクスが好ましい。
【００３８】
（蛍光検出手段）
蛍光検出手段２は、被験物質３からの蛍光（蛍光８１及び蛍光８２）を検出する。蛍光検出手段２としては、例えば、３００〜８００ｎｍの波長の光を検出できる蛍光検出器（蛍光検出器２１及び蛍光検出器２２）であればよい。蛍光検出器２１及び蛍光検出器２２としては、例えば、ラインセンサー型のＣＣＤ、ラインセンサー型のＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、フォトダイオードアレイや、スポット型検出器であるフォトダイオード、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、光電子増倍管）等の１次元蛍光検出器や、２次元ＣＣＤや２次元ＣＭＯＳ等の２次元蛍光検出器を挙げることができる。１次元蛍光検出器では、検出した蛍光の蛍光強度をそのまま数値として測定することができる。２次元蛍光検出器では、検出した蛍光の蛍光強度を画像として確認することができる。また、２次元蛍光検出器を用いた場合でも、画像の画素から蛍光強度を数値として測定することができる。１次元蛍光検出器を用いた場合、装置の構成が簡単になるという利点があり、２次元蛍光検出器を用いた場合、蛍光を視覚的に確認できるという利点がある。なお、１次元蛍光検出器を用いる場合であっても、ラインセンサー型ＣＣＤやラインセンサー型ＣＭＯＳを用いてスキャンしたり、ＰＭＴ等のスポット型検出器を用いてスキャンしたりすることによって、被験物質３からの蛍光を２次元で検出することは可能である。
【００３９】
蛍光８１及び蛍光８２は、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の自家蛍光の蛍光波長を有する。蛍光波長の数は、励起波長の数と同じである。
【００４０】
被検物質３から放出される光８から所望の波長の蛍光８１及び蛍光８２を得るために、蛍光検出手段２に分光素子（分光素子５１及び分光素子５２）を設けてもよい。分光素子５１及び分光素子５２としては、例えば、分光素子４１及び分光素子４２で例示したものが挙げられる。
【００４１】
励起光が複数ある場合、励起光照射手段１は、複数の励起光を同時に照射してもよいし、それぞれ異なるタイミングで照射してもよい。複数の励起光を同時に照射する場合、それぞれの励起光に由来する蛍光の同時検出が容易になる。また、複数の励起光をそれぞれ異なるタイミングで照射する場合、それぞれの励起光に由来する蛍光を精度よく検出することができる。例えば、励起光７１と励起光７２とを同時に照射するために、励起光７１と励起光７２とを通過させるフィルター等の分光素子を用いてもよい。また、励起光７１と励起光７２とをそれぞれ異なるタイミングで照射するために、図１６のように、それぞれの励起光７１，７２を通過させるためのフィルター４１，４２を入れ替えて使用してもよい。
【００４２】
被験物質に照射される光は、励起光７１と励起光７２以外の波長の光を含んでいてもよいが、含まないことが好ましい。被験物質に照射される光の総光強度を１００％としたときに、励起光７１と励起光７２以外の光の光強度は、好ましくは０．１％未満、より好ましくは０．０１％未満、さらに好ましくは０．００１％未満である。
【００４３】
励起光照射手段１は、図１６に示すように１つの光源１１であってもよいし、複数の光源であってもよい。図１７は、複数の光源（光源１１及び光源１２）を用いて励起光７１と励起光７２とを照射する実施形態にかかる、植物体の病原菌感染診断装置１２０を示す図である。励起光７１と励起光７２とは、それぞれ異なる光源１１，１２から照射される。ただし、分光素子を用いたり、異なるタイミングで照射したりすることによって、光源１１，１２それぞれが励起光７１と励起光７２との両方を照射することも可能である。
【００４４】
また、蛍光検出手段２は、図１５〜１７に示すように１つの検出器２１であってもよいし、複数の検出器であってもよい。図１８は、複数の検出器（検出器２１及び検出器２２）を用いて蛍光８１及び蛍光８２を検出する実施形態にかかる、植物体の病原菌感染診断装置１３０を示す図である。励起光７１と励起光７２とが、それぞれ異なる光源１１，１２から照射され、被験物質３からの光８が分光素子５１，５２によってそれぞれ蛍光８１及び蛍光８２に分光され、それぞれ異なる蛍光検出器２１，２２によって検出される。２つの蛍光を異なる蛍光検出器によって検出する場合、２つの蛍光の同時検出が容易になる。なお、蛍光検出器２１，２２がそれぞれ蛍光８１及び蛍光８２を検出可能であれば、分光素子５１，５２は設けなくてもよい。また、この複数の検出器を用いる実施形態において、励起光７１と励起光７２とは、同一の光源から照射されてもよく、また、１つの光源から照射されてもよい。さらに、分光素子を用いたり、異なるタイミングで検出したりすることによって、蛍光８１及び蛍光８２の両方を検出する蛍光検出器を複数用いることも可能である。
【００４５】
蛍光検出手段２は、蛍光８１及び蛍光８２を同時に検出してもよいし、それぞれ異なるタイミングで検出してもよい。蛍光８１及び蛍光８２を同時に検出する場合、測定時間が短くなり、診断に要する時間が短くなる。また、蛍光８１及び蛍光８２をそれぞれ異なるタイミングで検出する場合、検出器が１つの場合でも確度よく測定を行える。蛍光８１及び蛍光８２を同時に検出するために、蛍光８１及び蛍光８２を通過させるバンドパスフィルター等の分光素子を用いてもよい。また、蛍光８１及び蛍光８２をそれぞれ異なるタイミングで検出するために、図１５〜図１７のように、それぞれの蛍光８１，８２を通過させるための分光素子５１，５２を入れ替えて使用してもよい。
【００４６】
また、本実施形態に係る病原菌感染診断装置は、蛍光検出手段により検出された蛍光の強度が閾値を超えた場合に、前記検出対象となる病原菌に感染していること、又は感染するおそれがあることを示す表示手段（図示せず）を更に備えていてもよい。
【００４７】
なお、本発明は上記説明した実施形態に限定されず様々な変形態様が可能である。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるべきものではない。
【００４９】
〔実施例１〕
農業生物資源ジーンバンク（独立行政法人農業生物資源研究所、郵便番号３０５−８６０２、茨城県つくば市観音台２−１−２）から入手したイチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８５５４）を無蛍光培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＭＳ  Ａｇａｒ）で培養し、培地を脱イオン水で洗浄し、洗浄水を回収することによって自家蛍光物質を得た。蛍光は、蛍光分光光度計を用いて、波長２００〜６５０ｎｍの範囲で１０ｎｍ間隔で走査して励起し、波長３００〜８００ｎｍの範囲で１０ｎｍ間隔で走査して蛍光計測することにより測定した。図１に得られた蛍光スペクトルの一例を示す。自家蛍光物質による蛍光は、イチゴ炭疽病菌の播種後４日前後から強く観察された。波長２５０ｎｍで励起したときの波長４１０ｎｍの蛍光、波長２８０ｎｍで励起したときの波長３４０ｎｍの蛍光、波長３２０ｎｍで励起したときの波長４００ｎｍの蛍光、及び波長３７５ｎｍで励起したときの波長４５０ｎｍの蛍光にピークが認められた。なお、図１は、蛍光スペクトルを拡大して表示している（励起波長２００〜４００ｎｍ、蛍光波長３００〜５００ｎｍ）。
【００５０】
〔実施例２〕
イチゴ生葉からイチゴうどんこ病菌（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ）を回収し、その分生子から自家蛍光物質を抽出した。蛍光スペクトルを、実施例１と同様にして測定した。図２に得られた蛍光スペクトルの一例を示す。波長３４５ｎｍで励起したときの波長４２０ｎｍの蛍光にピークが認められた。なお、図２は、蛍光スペクトルを拡大して表示している（励起波長３００〜４００ｎｍ、蛍光波長３５０〜５００ｎｍ）。
【００５１】
〔実施例３〕
コムギ生葉からムギうどんこ病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）を回収し、その分生子から自家蛍光物質を抽出した。蛍光スペクトルを、実施例１と同様にして測定した。図３に得られた蛍光スペクトルの一例を示す。波長３２０ｎｍで励起したときの波長４２５ｎｍの蛍光にピークが認められた。ムギうどんこ病菌もイチゴうどんこ病菌と同様に強い自家蛍光が存在したが、イチゴうどんこ病菌とは異なるピーク波長を有していた。なお、図３は、蛍光スペクトルを拡大して表示している（励起波長３００〜４００ｎｍ、蛍光波長３５０〜５００ｎｍ）。
【００５２】
〔実施例４〕
農業生物資源ジーンバンクから入手した病原菌、及び独立行政法人農業環境技術研究所主任研究員小板橋基夫氏から入手した小麦うどんこ病菌（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）の各種病原菌について、励起光及び蛍光の走査間隔を１０ｎｍから１ｎｍに変更したこと以外は、実施例１と同様にして自家蛍光物質を得て、蛍光スペクトルを測定した。
【００５３】
なお、農業生物資源ジーンバンクから入手した病原菌は以下のとおりである。イチゴ炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８５５４、ＭＡＦＦ番号２３８５５５、ＭＡＦＦ番号７４４１０６、ＭＡＦＦ番号２３９７７３）、メロン炭疽病菌（ＭＡＦＦ番号２３８６５９、ＭＡＦＦ番号２３８６５７）、トマト萎凋病菌（ＭＡＦＦ番号１０３０３６）、イチゴ萎凋病菌（ＭＡＦＦ番号２３５６４１）、ハクサイ萎凋病菌（ＭＡＦＦ番号２３５６５７）。
【００５４】
得られた励起スペクトルと蛍光スペクトルから、蛍光のピーク波長を抽出し、その励起波長と蛍光波長を求めた。結果を表１及び図４〜１４に示す。
【表１】
2015031517.tif 000003
【００５５】
図４〜図１３は、各種病原菌の自家蛍光の励起波長と蛍光波長を示すグラフである。図１４は、表１に示すピーク１、ピーク２及びピーク３について、各種病原菌のピーク波長を励起波長と蛍光波長とに基づいてプロットした図である。これらの結果から明らかなとおり、各種病原菌はそれぞれ異なるピーク波長を有しており、ピーク波長の励起波長及び蛍光波長に基づいて、病原菌を検出できるほか、病原菌の種類も特定することができる。
【符号の説明】
【００５６】
１…励起光照射手段、２…蛍光検出手段、３…被験物質、８…光、１１，１２…光源、２１，２２…蛍光検出器、４１，４２，５１，５２…分光素子、７１、７２…励起光、８１，８２…蛍光、１００…病原菌感染診断装置。
【図４】
2015031517.tif 000004
【図５】
2015031517.tif 000005
【図６】
2015031517.tif 000006
【図７】
2015031517.tif 000007
【図８】
2015031517.tif 000008
【図９】
2015031517.tif 000009
【図１０】
2015031517.tif 000010
【図１１】
2015031517.tif 000011
【図１２】
2015031517.tif 000012
【図１３】
2015031517.tif 000013
【図１４】
2015031517.tif 000014
【図１５】
2015031517.tif 000015
【図１６】
2015031517.tif 000016
【図１７】
2015031517.tif 000017
【図１８】
2015031517.tif 000018
【図１】
2015031517.tif 000019
【図２】
2015031517.tif 000020
【図３】
2015031517.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月12日(2014.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体の病原菌感染診断方法であって、
検出対象となる病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定するステップと、
植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、前記１又は複数の励起波長に対応する励起光を照射し、前記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光を測定するステップと、
前記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が検出された場合に前記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断するステップと、
を含む、植物体の病原菌感染診断方法。
【請求項２】
前記病原菌が、イチゴ炭疽病菌、メロン炭疽病菌、イチゴうどんこ病菌、小麦うどんこ病菌、トマト萎凋病菌、イチゴ萎凋病菌及びハクサイ萎凋病菌からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項１に記載の病原菌感染診断方法。
【請求項３】
前記被検物質が水を含む、請求項１又は２に記載の病原菌感染診断方法。
【請求項４】
植物体の病原菌感染診断装置であって、
植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に、検出対象となる病原菌が分泌する水溶性分泌物質の１又は複数の励起波長の励起光を照射する励起光照射手段と、
前記植物体からの１又は複数の蛍光波長の蛍光を検出する蛍光検出手段と、を備える、
植物体の病原菌感染診断装置。
【請求項５】
前記励起光照射手段が１又は複数の光源を含む、請求項４に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項６】
前記蛍光検出手段が１つ又は複数の蛍光検出器を含む、請求項４又は５に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項７】
前記蛍光検出手段が１次元蛍光検出器及び２次元蛍光検出器のうち少なくとも１種である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項８】
前記蛍光検出手段により検出された蛍光の強度が閾値を超えた場合に、前記検出対象となる病原菌に感染していること、又は感染するおそれがあることを示す表示手段を更に備える、請求項４〜７のいずれか一項に記載の病原菌感染診断装置。
【請求項９】
前記病原菌が、イチゴ炭疽病菌、メロン炭疽病菌、イチゴうどんこ病菌、小麦うどんこ病菌、トマト萎凋病菌、イチゴ萎凋病菌及びハクサイ萎凋病菌からなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項４〜８のいずれか一項に記載の病原菌感染診断装置。