(57)【要約】【課題】ＥＧＦＲに結合する抗体および免疫抱合体を含むがこれらに限定されない、新規抗癌剤を提供すること。【解決手段】さらに、本薬剤、抗体、または免疫抱合体を使用する方法、例えば、腫瘍成長を阻害する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１９〜２３および６９〜７３からなる群から選択される参照ＶＨ配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択される参照ＶＬ配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列と、を含む、抗体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ＥＧＦＲに結合する、抗体、その抗原結合フラグメント、ポリペプチド、および免疫抱合体に関する。本発明はまた、悪性腫瘍等の疾患の診断および治療のための、このようなＥＧＦＲ結合分子の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１またはＨＥＲ１）は、７ｑ２２染色体に位置する、ｃ−ｅｒｂＢ１癌原遺伝子によってコードされる、１７０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーである。これらのＲＴＫは、触媒−キナーゼドメインおよびＣ末端部を含む、リガンド結合細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、単一スパンの膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメインから構成される、相同な構造体を共有する。ＨＥＲキナーゼのシグナル伝達経路は、受容体と他のＨＥＲキナーゼメンバーとのホモ二量化またはヘテロニ量化、および細胞内領域のリン酸転移を誘発する、細胞外リガンドの結合によって惹起される。これらの事象は、細胞増殖および生存に重要な多数の下流シグナル伝達経路の活性化につながる、初期シグナルを生成する。
【０００３】
ＥＧＦＲは、頭頸部、結腸直腸、肺、卵巣、腎臓、膵臓、皮膚、および他の固形腫瘍等、上皮細胞起源の多数の悪性腫瘍型において過剰発現する。ＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達経路は、腫瘍成長および転移の進行に重要な役割を果たし、ＥＧＦＲを、腫瘍治療に適した標的としている（非特許文献１、非特許文献２）。現在では、２つの小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）（エルロチニブ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＯＳＩ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＴａｒｃｅｖａ）およびゲフィチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａおよびＴｅｖａ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＩｒｅｓｓａ））、ならびに２つの裸のモノクローナル抗体であるセツキシマブ（ＩｍＣｌｏｎｅおよびＢＭＳからのＥｒｂｉｔｕｘ）およびパニツムマブ（ＡｍｇｅｎからのＶｅｃｔｉｂｉｘ））を含む、４つのＥＧＦＲ標的剤が、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療用に承認されている。これらの抗ＥＧＦＲ剤は、ＥＧＦＲの活性化および下流シグナル伝達を強く阻害する。ＴＫＩは、ＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインへの結合について、ＡＴＰと競合し（非特許文献３）、一方で、２つのモノクローナル抗体は、受容体への結合について、ＥＧＦＲリガンドと競合する（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【０００４】
抗ＥＧＦＲ療法は完璧ではない。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、特定の腫瘍型においてのみ効果的である。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の効果は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＰＴＥＮ突然変異を有する結腸直腸癌患者において、著しく減少する（非特許文献７，非特許文献８）。さらに、小分子ＥＧＦ阻害剤の活性は、ＥＧＦＲ突然変異の活性化を伴うＮＳＣＬＣ患者に限定される（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。ＥＧＦＲ療法はまた、皮膚毒性をもたらす。皮膚の正常な上皮基底細胞におけるＥＧＦＲ発現は、表皮の正常な発達および生理学に重要な役割を果たし、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、座瘡様皮膚発疹、皮膚の乾燥、掻痒症、爪周囲炎、髪の異常症、粘膜炎、および睫毛または顔の毛の成長の増加を含む、種々の皮膚毒性をもたらす（非特許文献１２において検討される）。生死に関わることは滅多にないが、皮膚毒性は、患者の生活の質を低下させる著しい身体的および精神社会的不快感をもたらす。さらに、患者の約１０％において、皮膚毒性が非常に重度であるため、ＥＧＦＲ阻害剤の臨床転帰を損なう、治療の中断または中止を必要とする。
したがって、正常組織には無害でありながらも、依然としてＥＧＦＲを過剰発現する悪性腫瘍、特に、現在のＥＧＦＲ療法に耐性である腫瘍の治療に非常に効果的である、改善された抗ＥＧＦＲ療法に対する必要性が存在する。この具体的な必要性に取り組むために、本発明は、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の殺傷に非常に効力があるが、正常な上皮細胞の成長には影響を与えないか、またはほとんど与えない、固有の新規なクラスのＥＧＦＲ抗体に焦点をあてる。さらに、本発明のＥＧＦＲ抗体と細胞毒性剤との抱合は、これらの抗体の抗腫瘍活性を強化するが、正常な上皮細胞にさらなる毒性をもたらさない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，７：２−８（２００２）
【非特許文献２】Ｙａｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２：１２７−１３７（２００１）
【非特許文献３】Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２３：２４４５−２４５９（２０００５）
【非特許文献４】Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５−７７６０（１９８４）
【非特許文献５】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１：１３１１−１３１８（１９９５）
【非特許文献６】Ｐｒｅｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４：２９５７−２９６６（１９９８）
【非特許文献７】Ｄｅ  Ｒｏｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ，１１：７５３−７６２（２０１０）
【非特許文献８】Ｂａｒｄｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｓｉｅｎｎａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２８：１２５４−１２６１（２０１０）
【非特許文献９】Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，６：３５２−３６６（２００９）
【非特許文献１０】Ｐａｚ−Ａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，１４：５１−６９（２００９）
【非特許文献１１】Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ，８：２２７−２３１（２００９）
【非特許文献１２】Ｌｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ４：１０７−１１９（２００９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、概して、ＥＧＦＲに結合する、抗体、その抗原結合フラグメント、ポリペプチド、および免疫抱合体に関する。本発明はまた、悪性腫瘍等の疾患の診断および治療のための、このようなＥＧＦＲ結合分子の使用方法に関する。
【０００７】
したがって、一実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％の上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦα）を阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、ならびに（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも１つの特徴を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、抗体は、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％のＥＧＦおよびＴＧＦαを阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、ならびに（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも２つの特徴を有する。別の実施形態において、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％のＥＧＦおよびＴＧＦαを阻害し、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらし、（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【０００８】
一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１９〜２３および６９〜７３からなる群から選択される参照ＶＨ配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択される参照ＶＬ配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列と、を含む、抗体を提供する。別の実施形態において、ＶＨおよびＶＬ配列は、参照ＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも９５％同一である。別の実施形態において、ＶＨおよびＶＬ配列は、参照ＶＨおよびＶＬ配列と、少なくとも９９％同一である。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１９〜２３および６９〜７３からなる群から選択されるＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択されるＶＬ配列と、を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１９および配列番号２４を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２０および配列番号２５を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２１および配列番号２６を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２１および配列番号２７を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２２および配列番号２８を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２３および配列番号２９を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２３および配列番号３０を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６９および配列番号７０を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７１および配列番号２６を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７１および配列番号２７を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７２および配列番号２６を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７２および配列番号２７を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７３および配列番号２６を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７３および配列番号２７を含む。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される、ハイブリドーマによって生成される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本発明は、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される抗体と同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｂ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２５のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｃ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｄ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｅ）配列番号２２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２８のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｆ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２９のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｇ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号３０のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｈ）配列番号６９のＶＨポリペプチドおよび配列番号７０のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｉ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｊ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｋ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｌ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｍ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに（ｎ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される抗体と、同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、（ａ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｂ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２５のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｃ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｄ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｅ）配列番号２２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２８のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｆ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２９のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｇ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号３０のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｈ）配列番号６９のＶＨポリペプチドおよび配列番号７０のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｉ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｊ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｋ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｌ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｍ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに（ｎ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ａ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２、４、６、６３、または６４の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３または５の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１０、１３、または１４の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本抗体は、（ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２、４、６、６３、または６４の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３または５の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１０、１３、または１４の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、本抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ａ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７、８、または９の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１５または１６の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１７の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１８の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本抗体は、（ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７、８、または９の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、ｂ）配列番号１５または１６の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１７の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１８の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、本抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ａ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６５、６６、または６７の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、（ｂ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号６８または１３の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本抗体は、（ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６５、６６、または６７の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、ｂ）配列番号６８または１３の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む。
【００１６】
一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、表面再構成、またはヒトのものである。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、全長抗体である。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原結合フラグメントである。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合型Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に記載のＶＨおよびＶＬ配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、実質的に同様の結合親和性で、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲの両方に結合する、抗体またはポリペプチドを提供する。一実施形態において、抗体またはポリペプチドは、約１．０〜約１０ｎＭのＫｄで、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲに結合する。別の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、約１．０ｎＭまたはそれよりも優れたＫｄで、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲに結合する。別の実施形態において、結合親和性は、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、または放射免疫測定によって測定される。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを生成する、単離細胞を提供する。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを発現する細胞を培養することと、（ｂ）前記抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを、前記培養された細胞から単離することと、を含む、方法を提供する。一実施形態において、細胞は真核細胞である。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫抱合体であって、式中、（Ａ）は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、（Ｌ）は、リンカーであり、（Ｃ）は、細胞毒性剤であり、前記リンカー（Ｌ）は、（Ａ）を（Ｃ）に結合する、免疫抱合対を提供する。別の実施形態において、リンカーは、開裂可能リンカー、非開裂可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群から選択される。別の実施形態において、リンカーは、非開裂可能リンカーである。別の実施形態において、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群から選択される。さらなる実施形態において、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である。
【００２２】
別の実施形態において、免疫抱合体は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、またはこの薬剤のプロドラッグからなる群から選択される、細胞毒性剤を含む。別の実施形態において、細胞毒性剤は、マイタンシノイドである。さらなる実施形態において、細胞毒性剤は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは本明細書に記載の免疫抱合体、ならびに薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、薬学的組成物は、第２の抗癌剤を含む。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、標識化された、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ポリペプチド、または免疫抱合体を含む、診断試薬を提供する。一実施形態において、標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、および金属イオンからなる群から選択される。
【００２５】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ポリペプチド、または免疫抱合体を含む、キットを提供する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲを発現する細胞の成長を阻害するための方法であって、その細胞を、本明細書に記載の免疫抱合体または薬学的組成物と、接触させることを含む、方法を提供する。別の実施形態において、細胞は、腫瘍細胞である。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、新生物を有する患者を治療する方法であって、本明細書に記載の免疫抱合体または薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法を提供する。別の実施形態において、新生物は、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、眼、頭頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系からなる群から選択される。別の実施形態において、本方法は、第２の抗癌剤を対象に投与することを含む。さらなる実施形態において、第２の抗癌剤は、化学療法剤である。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、患者における細胞増殖性障害を治療するための方法であって、本明細書に記載の免疫抱合体または薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法を提供する。別の実施形態において、細胞増殖性障害は、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患からなる群から選択される。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９０％同一のポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、配列は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％同一である。別の実施形態において、配列は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９９％同一である。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、配列番号４４〜５０および８１と、少なくとも９０％同一の配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５０および８１と、少なくとも９５％同一である配列を含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５０および８１と、少なくとも９９％同一である配列を含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号３９〜５８および７７〜８４からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む、宿主細胞を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
前記抗体は、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％のＥＧＦおよびＴＧＦαを阻害するか、または（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３）
前記抗体が、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％のＥＧＦおよびＴＧＦαを阻害し、かつ（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４）
前記抗体は、（ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７３からなる群から選択される参照ＶＨ配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択される参照ＶＬ配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列と、を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目５）
前記ＶＨおよびＶＬ配列は、前記参照ＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも９５％同一である、項目４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目６）
前記ＶＨおよびＶＬ配列は、前記参照ＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも９９％同一である、項目５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目７）
（ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７３からなる群から選択されるＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択されるＶＬ配列と、を含む、項目６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目８）
配列番号１９および配列番号２４を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目９）
配列番号２０および配列番号２５を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１０）
配列番号２１および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
配列番号２１および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１２）
配列番号２２および配列番号２８を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１３）
配列番号２３および配列番号２９を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１４）
配列番号２３および配列番号３０を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１５）
配列番号６９および配列番号７０を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１６）
配列番号７１および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１７）
配列番号７１および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１８）
配列番号７２および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１９）
配列番号７２および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２０）
配列番号７３および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２１）
配列番号７３および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２２）
ヒトＥＧＦＲへの第２の抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記第２の抗体が、配列番号２１の重鎖可変領域と、配列番号２６もしくは２７の軽鎖可変領域と、を含み、第１の抗体または抗原結合フラグメントが、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％の上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦα）を阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、または（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２３）
２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される、ハイブリドーマによって生成される、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２４）
２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される抗体と、同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２５）
ヒトＥＧＦＲへの参照抗体の結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％の上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦα）を阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、または（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２６）
ａ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｂ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２５のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｃ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｄ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｅ）配列番号２２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２８のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｆ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２９のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｇ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号３０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｈ）配列番号６９のＶＨポリペプチドおよび配列番号７０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｉ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｊ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｋ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｌ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｍ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに
ｎ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される抗体と、同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２７）
ヒトＥＧＦＲへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、
ａ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｂ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２５のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｃ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｄ）配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｅ）配列番号２２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２８のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｆ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２９のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｇ）配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号３０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｈ）配列番号６９のＶＨポリペプチドおよび配列番号７０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｉ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｊ）配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｋ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｌ）配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｍ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに
ｎ）配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２８）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ａ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２、４、６、６３、または６４の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３または５の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１０、１３、または１４の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２９）
ａ）（ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２、４、６、６３、または６４の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３または５の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号１０、１３、または１４の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３０）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ａ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７、８、または９の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１５または配列番号１６の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１７の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１８の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３１）
ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７、８、または９の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号１５または１６の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１７の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１８の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目３０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３２）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ａ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６５、６６、または６７の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号６８または１３の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３３）
ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６５、６６、または６７の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号６８または１３の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３４）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、表面再構成、またはヒトのものである、項目１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３５）
全長抗体である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３６）
抗原結合フラグメントである、項目１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３７）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合型Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、項目１〜３６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３８）
項目１〜３７のいずれか一項に記載のＶＨおよびＶＬ配列を含む、ポリペプチド。
（項目３９）
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、実質的に同様の結合親和性で、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲの両方に結合する、項目１〜３８のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４０）
約１．０〜約１０ｎＭのＫｄで、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲに結合する、項目３９に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４１）
約１．０ｎＭまたはそれよりも優れたＫｄで、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲに結合する、項目４０に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４２）
前記結合親和性は、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、または放射免疫測定によって測定される、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４３）
項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを生成する、単離細胞。
（項目４４）
項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）項目４３に記載の細胞を培養することと、（ｂ）前記抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを、前記培養された細胞から単離することと、を含む、方法。
（項目４５）
前記細胞は、真核細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫抱合体であって、式中、
（Ａ）は、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、
（Ｌ）は、リンカーであり、
（Ｃ）は、細胞毒性剤であり、
前記リンカー（Ｌ）が、（Ａ）を（Ｃ）に結合する、免疫抱合体。
（項目４７）
前記リンカーは、開裂可能リンカー、非開裂可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群から選択される、項目４６に記載の免疫抱合体。
（項目４８）
前記リンカーは、非開裂可能リンカーである、項目４７に記載の免疫抱合体。
（項目４９）
前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群から選択される、項目４８に記載の免疫抱合体。
（項目５０）
前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である、項目４９に記載の免疫抱合体。
（項目５１）
前記細胞毒性剤は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、または前記剤のプロドラッグからなる群から選択される、項目４６〜５０のいずれか一項に記載の免疫抱合体。
（項目５２）
前記細胞毒性剤は、マイタンシノイドである、項目５１に記載の免疫抱合体。
（項目５３）
前記細胞毒性剤は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、項目５２に記載の免疫抱合体。
（項目５４）
項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目５５）
第２の抗癌剤をさらに含む、項目５４に記載の薬学的組成物。
（項目５６）
標識化された、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、診断試薬。
（項目５７）
前記標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、および金属イオンからなる群から選択される、項目５６に記載の診断試薬。
（項目５８）
項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、を含む、キット。
（項目５９）
ＥＧＦＲを発現する細胞の成長を阻害する方法であって、対象に、前記細胞を、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目５４または５５に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
（項目６０）
前記細胞は、腫瘍細胞である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
癌を有する患者を治療するための方法であって、対象に、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目５４または５５に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。
（項目６２）
前記対象に第２の抗癌剤を投与することをさらに含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記第２の抗癌剤は、化学療法剤である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
細胞増殖性障害を治療するための方法であって、前記対象に、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目５４または５５に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。
（項目６５）
前記細胞増殖性障害は、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患からなる群から選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９０％同一のポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。（項目６７）
前記配列は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％同一である、項目６６に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目６８）
前記配列は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９９％同一である、項目６７に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目６９）
配列番号４４〜５０および８１と少なくとも９０％同一である配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド。
（項目７０）
前記ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５０および８１と少なくとも９５％同一である配列を含む、項目６９に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目７１）
前記ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５０および８１と少なくとも９９％同一である配列を含む、項目７０に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目７２）
配列番号３９〜５８および７７〜８４からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
（項目７３）
項目６６〜７２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目７４）
項目７３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目７５）
前記免疫抱合体は、ＥＧＦＲ陽性の腫瘍細胞を排除することができるが、３．３ｎＭの濃度で、ヒト初代ケラチノサイトの成長を４０％以下阻害するのみである、項目４６に記載の免疫抱合体。
（項目７６）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫抱合体であって、式中、
（Ａ）は、配列番号２１の重鎖可変領域と、配列番号２６もしくは２７の軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
（Ｌ）は、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーであり、
（Ｃ）は、細胞毒性剤Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、免疫抱合体。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】表示される抗ＥＧＦＲ抗体の、ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）およびサルＥＧＦＲ（ｍｏＥＧＦＲ）抗原に対する結合親和性を示す表である。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞（Ａ）およびヒト初代ケラチノサイト（Ｂ）内のリガンド誘発型ＥＧＦＲリン酸化における、表示される抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す、ウェスタンブロットデータである。
【図３】外因性ＥＧＦＲリガンドの非存在下における、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞内のＥＧＦＲリン酸化に対する表示される抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す、ウェスタンブロットデータである。
【図４】表示される抗体の存在下での、Ａ４３１細胞へのビオチン化ＴＧＦα（Ａ）およびＥＧＦ（Ｂ）の結合を示す線グラフである。
【図５】種々の濃度での表示の抗体の存在下における、ヒト初代ケラチノサイトの成長を示す線グラフである。
【図６】１０μｇ／ｍｌの表示される抗体の存在下における、ＭＣＦ１０Ａ細胞の成長を示すグラフである。
【図７】表示の抗体の存在下における、ＨＣＣ８２７細胞（Ａ）およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（Ｂ）の成長を示す線グラフである。
【図８】表示の濃度で、表示の競合する抗体の存在下における、ビオチン化５２８抗体（Ａ）、ビオチン化セツキシマブ（Ｂ）、およびビオチン化ＥＧＦＲ−７抗体（Ｃ）の、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞への結合を示す線グラフである。
【図９】マウスＥＧＦＲ−７変異体の軽鎖および重鎖可変領域配列の配列比較である。
【図１０】ＥＧＦＲ−７のＶＬ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）の表面再構成における、特定のフレームワーク表面残基の変化を示す表である。
【図１１】ＥＧＦＲ−１２のＶＬ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）の表面再構成における、特定のフレームワーク表面残基の変化を示す表である。
【図１２】表面再構成したＥＧＦＲ−７  ＶＬ（Ａ）、ＥＧＦＲ−７  ＶＨ（Ｂ）、ＥＧＦＲ−１２  ＶＬ（Ｃ）、およびＥＧＦＲ−１２  ＶＨ（Ｄ）の配列と、マウスの対応物との配列比較である。
【図１３】ＥＧＦＲ−７  ＶＬ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）のＣＤＲ移植における、特定のフレームワーク表面残基の変化を示す表である。
【図１４】ＥＧＦＲ−７  ＶＬ（Ａ）およびＥＧＦＲ−７  ＶＨ（Ｂ）のＣＤＲ移植配列と、マウスの対応物との配列比較である。
【図１５】ＥＧＦＲ−６（Ａ）およびＥＧＦＲ−７（Ｂ）について、マウス抗体とその対応するヒト化抗体との間の結合競合を示す線グラフを示す。
【図１６】腫瘍細胞成長の阻害における、マウス抗体とその対応するヒト化抗体の能力を示す、線グラフを示す。
【図１７】Ａ４３１細胞に対する、ヒト化ＥＧＦＲ−６およびＥＧＦＲ−７ＲのＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ活性を示す線グラフを示す。
【図１８】ＥＧＦＲ−６（Ａ）およびＥＧＦＲ−７（Ｂ）に対する、表示の抗体および対応する抗体−マイタンシノイド抱合体の結合曲線を示す。
【図１９】ＦａＤｕ（Ａ）およびＨ２９２（Ｂ）細胞系における、表示の抗体および対応する抗体−マイタンシノイドの細胞毒活性を示す線グラフを示す。
【図２０】Ｈ２２６（Ａ）およびＳＣＣ−４（Ｂ）細胞系における、表示の抗体および対応する抗体−マイタンシノイド抱合体の細胞毒活性を示す線グラフを示す。
【図２１】抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体の単回投与で治療したマウスにおけるＨ２９２腫瘍異種移植片の成長を示す、線グラフを示す。
【図２２】表示の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体の単回投与で治療した、ＦａＤｕ腫瘍異種移植片の成長を示す線グラフを示す。
【図２３】ヒト初代ケラチノサイト（Ａ）およびＨ２９２腫瘍細胞（Ｂ）の成長の阻害における、表示の抗体および抱合体の能力を示す線グラフを示す。
【図２４】表示の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体の存在下において、ヒト初代ケラチノサイトによって生成される、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５の量を表す棒グラフを示す。
【図２５】ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、またはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１もしくはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１抗体−マイタンシノイド抱合体のいずれかの単回３ｍｇ／ｋｇ投与で治療したマウスにおける、Ｈ２９２腫瘍異種移植片の成長を表す線グラフを示す。
【図２６】ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、またはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１もしくはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１抗体−マイタンシノイド抱合体のいずれかの単回５ｍｇ／ｋｇ投与で治療したＨＳＣ２腫瘍異種移植片の成長を表す線グラフを示す。
【図２７】ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、またはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１もしくはｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１抗体−マイタンシノイド抱合体のいずれかの単回５ｍｇ／ｋｇ投与で治療したＦａＤｕ腫瘍異種移植片の成長を表す線グラフを示す。
【図２８】ヒトおよびマウスのＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列の配列比較を示す。
【図２９】ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩの配列の配列比較を示す。
【図３０】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体の結合を表す線グラフを示す。
【図３１】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのｈｕＥＧＦＲ−６抗体の結合を表す線グラフを示す。
【図３２】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのｍｕＥＧＦＲ−７抗体の結合を表す線グラフを示す。
【図３３】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのｍｕＥＧＦＲ−６抗体の結合を表す線グラフを示す。
【図３４】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのｍｕＥＧＦＲ−１２抗体の結合を表す線グラフを示す。
【図３５】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのｍｕＥＧＦＲ−１３抗体の結合を表す線グラフを示す。
【図３６】ｈｕＥＧＦＲ、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ、およびｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩへのセツキシマブの結合を表す線グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ＥＧＦＲシグナル伝達を部分的に阻害し、初代ケラチノサイトを含む、ＥＧＦＲ陽性正常上皮細胞には影響を及ぼさないが、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞には高く細胞毒性である、新しいクラスのＥＧＦＲ結合分子を提供する。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体の免疫抱合体は、抗体の抗腫瘍効果を強化する。
Ｉ．  定義
【００３３】
本発明の理解を促すために、多数の用語および語句を以下に定義する。
【００３４】
本明細書に使用される際、「上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲ」とは、成熟チロシンキナーゼ細胞表面受容体を指す。用語「可溶性ＥＧＦＲ」または「ｓＥＧＦＲ」は、ＥＧＦＲの細胞外のリガンド結合ドメインを含む、ＥＧＦＲの部分を指す。より具体的には、ｓＥＧＦＲは、成熟ＥＧＦＲのアミノ酸１〜６１９を含む（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａ−４３１  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−２５（１９８６））。
【００３５】
語句「ＥＧＦＲ媒介性癌」は、ＥＧＦＲが正常な対応する上皮組織内よりも高いレベルまで異常に活性化される、上皮腫瘍によって特徴付けられる癌を指す。これらのより高いレベルのＥＧＦＲ活性は、多数の種類の癌において、腫瘍成長を促進する。このような癌には、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲの異常活性化は、受容体の過剰発現、遺伝子増幅、突然変異の活性化、受容体リガンドの過剰発現、および／またはＥＧＦＲ活性の調節因子の損失によって生じる可能性がある。
【００３６】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせを認識し、それに特異的に結合する、免疫グロブリン分子を意味する。本明細書に使用される際、用語「抗体」は、抗体が、所望の生物学的活性を呈する限り、抗体の抗原決定部分を含む、少なくとも２つの無傷の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む、任意の他の修飾された免疫グロブリンから生成される、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、その抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、二重特異性抗体等の多特異性抗体を包含する。抗体は、いずれの５つの主要なクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのもの、または、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される、それらの重−軽鎖定常ドメインの同一性に基づいて、それらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のものであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なった周知のサブユニット構造、および３次元構造を有する。抗体は、裸であるか、または毒素、放射性同位体等の他の分子に抱合されてもよい。
【００３７】
「遮断」抗体または「拮抗」抗体は、ＥＧＦＲ等、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または減少させるものである。いくつかの実施形態において、遮断抗体または拮抗抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。生物学的活性は、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％さえも減少される。
【００３８】
抗体に関して本明細書に使用される際、語句「ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力」は、ＥＧＦＲへの結合が、ヒトＥＧＦＲ活性化および受容体の活性化の際に生じるヒトＥＧＦＲの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ、またはマウス腫瘍モデル（実施例を参照されたい）のいずれかを使用して判定される、ＥＧＦＲの生物学的活性の１つ以上の指標を測定することにより、ＥＧＦＲの活性化を阻害する、抗体の能力を評価することができる。
【００３９】
用語「抗ＥＧＦＲ抗体」または「ＥＧＦＲに結合する抗体」は、ＥＧＦＲを標的とすることにおいて、診断および／または治療剤として有用であるために十分な親和性で、ＥＧＦＲに結合する能力を有する抗体を指す。いくつかの抗ＥＧＦＲ抗体が、当該技術分野で既知である。例えば、セツキシマブ（抗体２２５）および５２８抗体は、米国特許第４，９４３，５３３号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
無関係の非ＥＧＦＲタンパク質への抗ＥＧＦＲ抗体の結合範囲は、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）によって測定した場合、ＥＧＦＲへの抗体の結合の約１０％未満であり得る。特定の実施形態において、ＥＧＦＲに結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００４１】
本明細書に使用される際、用語「上皮毒性」は、上皮の異常性または機能障害を指し、ＥＧＦＲ阻害剤の投与によって癌の治療を施される患者において、他の症状の中でもとりわけ、皮膚発疹、下痢、角膜菲薄化、毛髪萎縮もしくは脱毛、毛包の異形成、変性、壊死、もしくは炎症、毛包間の表皮異形成、または損傷後の治癒の失敗もしくは治癒の遅れから選択される、１つ以上の症状または病状によって現れ得る。一実施形態において、上皮毒性は、座瘡様または大型丘疹等の皮膚毒性として現れる。
【００４２】
用語「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部分を指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、抗体フラグメントから形成される、線形抗体、単鎖抗体、および多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの高く特異的な認識および結合に関与する、均一性の抗体集団を指す。これは、典型的に、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、無傷および全長の両方であるモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに、抗原認識部位を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、およびトランスジェニック動物を含む、任意の多数の手段で作製されたこのような抗体を指す。
【００４４】
用語「ヒト化抗体」は、特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、または最小非ヒト（例えば、マウス）配列を含むそれらのフラグメントである、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。典型的に、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲの残基で置き換えられた、ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、および／または能力を精錬および最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域および／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかにおけるさらなる残基の置換によって、さらに修飾されてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域のうち全てまたは実質的に全てを含む、少なくとも１つ、典型的には２つ、または３つの可変ドメインのうち、実質的に全てを含むことになるが、一方で、実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号に記載される。
【００４５】
抗体の「可変領域」は、単独または組み合わせのいずれかの、抗体の軽鎖の可変領域または抗体の重鎖の可変領域を指す。重鎖または軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても既知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続される、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。各鎖内のＣＤＲは、もう一方の鎖のＣＤＲとともに、ＦＲによって近接して結合され、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。ＣＤＲの決定には、少なくとも２つの技法が存在する：（１）種間の配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．））、および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。さらに、ＣＤＲを決定するために、これらの２つのアプローチの組み合わせが、しばしば、当該技術分野において使用される。
【００４６】
Ｋａｂａｔの番号付けシステムは、一般的に、可変ドメイン（おおよそ軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）内の残基を参照する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
【００４７】
Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置の番号付けとは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における、抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用することにより、実際の直線アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮化、またはそこへの挿入に対応する、少数または追加のアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによると残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによると残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ等）を含んでもよい。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所定の抗体に対して、抗体の配列の相同性領域における、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付けを行った配列との配列比較によって、決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置について言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ番号付け慣例を使用して番号付けした場合、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４間で変化する（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を行うためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終了し、３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の中間を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。
【表１Ａ】
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【００４８】
用語「ヒト抗体」は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して製造される、ヒトによって生成される抗体、またはヒトによって生成される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、無傷もしくは全長抗体、そのフラグメント、ならびに／またはマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体等、少なくとも１つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
【００４９】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、２つ以上の種に由来する、抗体を指す。典型的に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）の１つの種に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で、定常領域は、その種での免疫反応を誘発することを避けるために、別のもの（通常、ヒト）に由来する抗体における配列と相同である。
【００５０】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、本明細書に互換的に使用され、特定の抗体によって認識および特異的に結合される能力のある抗原の部分を指す。抗原が、ポリペプチドの場合、エピトープは、連続するアミノ酸、およびタンパク質の３次折り畳みによって並置される、不連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質の変性時に保持されるが、一方で３次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質の変性時に失われる。エピトープは、典型的に、固有の空間配座に、少なくとも３個、より一般的には少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００５１】
「結合親和性」とは、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総合計の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書において使用される際、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する、内在性の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、概して、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向にあるが、一方で、高親和性抗体は、一般的に、より速く抗原に結合し、より長く結合された状態に留まる傾向にある。結合親和性を測定する種々の方法が、当該技術分野で既知であり、そのうちの任意のものを、本発明の目的に使用することができる。特定の例示的な実施形態を、以下に記載する。
【００５２】
結合親和性に関して本明細書に使用される際の「またはそれよりも優れた」とは、分子とその結合パートナーとの間のより強い結合を指す。本明細書に使用される際の「またはそれよりも優れた」とは、より小さい数のＫｄ値によって表される、より強い結合を指す。例えば、抗原に対する親和性が、「０．６ｎＭまたはそれよりも優れた」である抗体は、その抗原に対する抗体の親和性が、０．６ｎＭ未満、すなわち、０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭ等、または０．６ｎＭ未満の任意の数値である。
【００５３】
「特異的に結合する」とは、一般的に、抗体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、およびその結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間にいくらかの相補性をもたらすこと、を意味する。この定義に従って、抗体は、それが、その抗原結合ドメインを介して、あるエピトープに、無作為の無関係なエピトープに結合する場合よりも容易に結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、ある抗体があるエピトープに結合する相対的な親和性を規定して、本明細書に使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所定のエピトープに対して、抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有すると見なすことができるか、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対して有するものよりも、高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
【００５４】
「優先的に結合する」とは、抗体が、関連、類似、相同、または相似エピトープへの結合よりも容易に、あるエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所定のエピトープに「優先的に結合」する抗体は、このような抗体が、関連エピトープと交差反応し得る場合であっても、関連エピトープよりも、そのエピトープに結合する可能性が高い。
【００５５】
抗体は、それが、ある程度エピトープへの参照抗体の結合を妨害する程度まで、そのエピトープに優先的に結合する場合、所定のエピトープへの参照抗体の結合を、「競合的に阻害する」と言われる。競合的阻害は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって判定することができる。抗体は、所定のエピトープへの参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害すると言われ得る。
【００５６】
本明細書に使用される際、語句「実質的に類似」または「実質的に同じ」とは、当業者が、２つの値の間の差異を、前記値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の範囲内に、生物学的および／または統計学的有意性がほとんどないか、またはないと見なすような、２つの数値（一般的に、一方は本発明の抗体と関連し、もう一方は、参照／比較抗体と関連する）間の十分に高い程度の類似性を意味する。前記２つの値の間の差異は、参照／比較抗体の値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満であってもよい。２つの「実質的に」類似する結合親和性の間の差異は、概して、参照／比較抗体の値の関数として約１０％未満である。
【００５７】
本明細書に使用される際、「リガンド非依存的結合」は、ＥＧＦＲとのリガンド相互作用の非存在下で、ヒトＥＧＦＲ上のエピトープに結合する、ＥＧＦＲ結合剤の能力を表す。
【００５８】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然に見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、もはや天然に見られる形態ではない程度まで精製されているものが含まれる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
【００５９】
本明細書に使用される際、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋な物質を指す。
【００６０】
本明細書に使用される用語「免疫抱合体」または「抱合体」は、細胞結合剤（すなわち、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント）に結合され、一般式、Ｃ−Ｌ−Ａによって定義され、式中、Ｃ＝細胞毒素、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合剤または抗ＥＧＦＲ抗体もしくは抗体フラグメントである、化合物またはその誘導体を指す。免疫抱合体はまた、逆の順序の一般式、Ａ−Ｌ−Ｃによって定義されてもよい。
【００６１】
「リンカー」は、安定した共有結合方式で、通常、マイタンシノイド等の薬物である、化合物を、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメント等の細胞結合剤に、結合する能力のある任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が、活性に留まる条件下において、酸誘発性開裂、光誘発性開裂、ペプチダーゼ誘発性開裂、エステラーゼ誘発性開裂、およびジスルフィド結合開裂の影響を受けやすいか、または実質的に抵抗性であり得る。好適なリンカーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。リンカーにはまた、本明細書に記載、および当該技術分野で既知の、荷電リンカーおよびその親水性形態が含まれる。
【００６２】
用語「癌」および「癌性」は、細胞の集団が、制御されない細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。「腫瘍」および「新生物」は、前癌性病変を含む、良性（非癌性）または悪性（癌性）のいずれかの過剰な細胞の成長または増殖からもたらされる、１つ以上の細胞を指す。治療および／または予防可能な「癌」または「腫瘍原性」疾患には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに泌尿生殖器系の新生物が挙げられる。
【００６３】
用語「癌細胞」、「腫瘍細胞」、および文法上の同等物は、腫瘍細胞集団の大部分を構成する非腫瘍原性細胞および腫瘍原性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、腫瘍または前癌性病変に由来する細胞の全集団を指す。本明細書に使用される際、単に、再生および分化する能力を欠くような腫瘍細胞を指している場合の用語「腫瘍細胞」は、そのような腫瘍細胞を癌幹細胞から区別するために、用語「非腫瘍原性」によって修飾されるであろう。
【００６４】
用語「対象」は、具体的な治療の受容者となる、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類等を含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的に、「対象」および「患者」は、ヒト対象を指して、本明細書に互換的に使用される。
【００６５】
１つ以上のさらなる治療剤との「組み合わせ」投与には、同時（併用）および任意の順序での連続投与が含まれる。
【００６６】
用語「薬学的製剤」は、活性成分の生物学的活性を有効にすることができるような形態にあり、製剤が投与されるであろう対象に対して許容できないほど毒性である追加の構成成分を含有しない、調製物を指す。製剤は、滅菌であり得る。
【００６７】
本明細書に開示される、抗体の「有効量」は、具体的に提示される目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、提示される目的に関して、経験に基づいて、通常の方法で、決定することができる。
【００６８】
用語「治療有効量」は、対象または哺乳動物において、疾患または障害を「治療」するのに有効な抗体または他の薬物の量を指す。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞数の減少、腫瘍寸法の縮小、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害（すなわち、ある程度までの遅延、もしくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度までの遅延、もしくは停止）、腫瘍成長のある程度までの阻害、ならびに／または１つ以上の癌関連症状のある程度までの緩和を行うことができる。本明細書における「治療」の定義を参照されたい。その薬物が、既存の癌細胞の成長の予防および／または殺傷を行うことができる限り、それは、細胞増殖抑制および／または細胞毒性であってもよい。「予防的有効量」は、必要な容量および期間で、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。必ずしもそうではないが、典型的には、予防的投与は、疾患の初期段階の前またはその時点で使用されるため、予防的有効量は、治療有効量を下回ることになる。
【００６９】
本明細書に使用される際の用語「標識」は、「標識化」抗体を生成するために、抗体に直接的または間接的に抱合される、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であり得る（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）か、あるいは酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。
【００７０】
「化学療法剤」は、作用機構に関わらず、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤には、例えば、ＣＤ２０の拮抗薬、例えば、リツキシマブおよびシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレジニソン（ｐｒｅｄｉｎｉｓｏｎｅ）、フルダラビン、エトポシド、メトトレキサート、レナリドマイド、クロラムブシル、ベンタムスチン（ｂｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）、および／またはこのような化学療法剤の修飾版が含まれる。
【００７１】
「治療する」または「治療」または「治療すること」または「軽減」または「軽減すること」等の用語は、１）診断される病態または障害の症状の治癒、遅延、緩和、および／または進行の停止を行う治療的処置、ならびに２）標的とされる診断される病態または障害の発達を予防および／または遅延する予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方を指す。したがって、治療を必要とするものには、既に障害を有するもの、障害を有する傾向にあるもの、および障害が予防されるであろうもの、が含まれる。特定の実施形態において、対象は、患者が、癌細胞の数の減少もしくは完全な不在、腫瘍寸法の縮小、癌細胞の末梢器官への浸潤の阻害もしくは不在、例えば、軟組織および骨内への癌の拡散、腫瘍転移の阻害もしくは不在、腫瘍成長の阻害もしくは不在、特定の癌に関連する１つ以上の症状の緩和、罹患率および死亡率の減少、生活の質の向上、腫瘍の腫瘍原性、腫瘍原性頻度、もしくは腫瘍原性能力の減少、腫瘍内の癌幹細胞の数もしくは頻度の減少、腫瘍原性細胞から非腫瘍原性状態への分化、または何らかの効果の組み合わせのうち、１つ以上を示す場合、本発明の方法による癌の「治療」に成功する。
【００７２】
本明細書に互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体等の、修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマー構築の前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分との抱合等、重合後にさらに修飾されてもよい。他の種類の修飾には、例えば、「ｃａｐ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドと類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合でのもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバメート等）、および荷電結合でのもの（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸等）、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）等のペンダント部分を含むもの、インターカレーターでのもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤でのもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸等）、ならびにポリヌクレオチド（複数を含む）の非修飾形態が含まれる。さらに、通常、糖に存在するヒドロキシル基のうちの任意のものを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基で置き換えるか、標準的な保護基で保護するか、または活性化してさらなるヌクレオチドへのさらなる結合を調製することができ、あるいは固体支持体に抱合することができる。５’および３’末端ＯＨを、リン酸化するか、または１〜２０個の炭素原子のアミンもしくは有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース、もしくはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシド等の無塩基ヌクレオシド類似体を含む、一般的に当該技術分野で既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含んでもよい。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置き換えられてもよい。これらの代替の結合基には、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、“（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられる実施形態が含まれるが、これらに限定されず、式中、ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、あるいは任意でエーテル（−−Ｏ−−）結合を含む置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニ��、またはアラルジルである。ポリヌクレオチドにおける全ての結合が、同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書に参照される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００７３】
用語「ベクター」は、宿主細胞中の目的の１つ以上の遺伝子（複数を含む）または配列（複数を含む）を、送達および場合によっては発現する能力のある構築物を意味する。ベクターの例には、限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、もしくはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームおよび生成細胞等の真核細胞内に封入されるＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。
【００７４】
用語「ポリペプチド」「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して、本明細書に互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分との抱合等の任意の他の操作もしくは修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、１つ以上のアミノ酸の類似体（例えば、非天然のアミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾を含む、ポリペプチドもこの定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているため、特定の実施形態において、ポリペプチドが、単鎖または連鎖として生じ得ることが理解される。
【００７５】
２つ以上の核酸またはポリペプチドとの関連において、用語「同一」またはパーセント「同一性」は、いずれのアミノ酸置換も配列同一性の一部とは見なさずに、最大一致について比較および配列比較（必要であればギャップを導入する）した際、同じであるか、または特定の割合の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列の配列比較を得るために使用可能な種々のアルゴリズムおよびソフトウェアが、当該技術分野で既知である。配列比較アルゴリズムの１つのこのような非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３−５８７７において修正され、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）に組み込まれるアルゴリズムである。特定の実施形態において、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列を配列比較するために使用可能な、公的に利用可能な追加のソフトウェアプログラムである。特定の実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＧＣＧソフトウェアのＧＡＰプログラムを使用して、判定することができる（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、およびギャップ加重４０、５０、６０、７０、または９０、および長さ加重１、２、３、４、５、または６を使用して）。特定の代替的な実施形態において、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み込むＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を判定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、およびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６、または４、および長さ加重１、２、３、４、５を使用して）。あるいは、特定の実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して判定される。例えば、パーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用して、ならびに残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４でＰＡＭ１２０を使用して、判定することができる。特定のソフトウェアによる最大配列比較に適切なパラメーターは、当業者によって決定することができる。特定の実施形態においては、配列比較ソフトウェアの初期設定パラメーターを使用する。特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列の、第２の配列アミノ酸に対するパーセント同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算し、式中、Ｙは、第１の配列と第２の配列の配列比較において、完全な一致としてスコアされた（目視検査または特定の配列比較プログラムによって配列比較した場合）アミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列の総残基数である。第１の配列の長さが、第２の配列よりも長い場合、第１の配列の第２の配列に対するパーセント同一性は、第２の配列の第１の配列に対するパーセント同一性よりも長くなる。
【００７６】
非限定的な例として、任意の具体的なポリヌクレオチドが、参照配列に対して特定の割合の配列同一性（例えば、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、およびいくつかの実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）を有するかどうかは、特定の実施形態において、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して、判定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ
２：４８２  ４８９（１９８１）の部分相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の最良の相同性セグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列比較プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に９５％同一であるかどうかを判定する場合、パラメーターは、同一性が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、相同性におけるギャップが参照配列におけるヌクレオチドの総数の最大５％まで許容されるように、設定する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明の２つの核酸またはポリペプチドは、実質的に同一である、すなわち、それらは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定される、最大一致について比較および配列比較した際、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびいくつかの実施形態においては、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する。同一性は、少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０個、またはその間の任意の整数値の残基長の配列の領域にわたって存在し得、６０〜８０個の残基よりも長い領域、例えば、少なくとも約９０〜１００個の残基にわたってもよく、いくつかの実施形態においては、配列は、例えば、ヌクレオチド配列のコード領域等、比較される配列の全長にわたって、実質的に同一である。
【００７８】
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するもう１つのアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アルパラギン、グルタミン、セリン、テオロニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、抗原（複数を含む）、すなわち、ポリペプチドまたは抗体が結合するＥＧＦＲへの、アミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体の結合を無効にするわけではない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を識別する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１  １８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）、およびＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
【００７９】
本開示および特許請求の範囲で使用される際、単数形の「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ」には、内容によりそうでない旨が明確に示されない限り、複数形が含まれる。
【００８０】
実施形態が、「含む」という言葉を伴って本明細書に記載される、いかなる場合も、別の「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」に関して記載される類似の実施形態もまた、提供される。
【００８１】
本明細書において「Ａおよび／またはＢ」等の語句に使用される、用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、ならびに「Ｂ」のいずれをも含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」等の語句に使用される、用語「および／または」は、次の実施形態のそれぞれを包含するように意図する：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
ＩＩ．  ＥＧＦＲ結合剤
【００８２】
腫瘍は、しばしば、種々のリガンドリガンドに結合する成長因子受容体を過剰発現し、無制限の腫瘍成長を促進する。このような成長因子受容体の１つの例は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーである。
【００８３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーを通じたシグナル伝達は、リガンドの結合によって誘発される、ホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に依存する。この受容体ファミリーは、４つの膜結合タンパク質ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４から構成される。これらのタンパク質の過剰発現は、乳房、結腸、卵巣、子宮内膜、胃、膵臓、前立腺、および唾液腺の癌を含むがこれらに限定されない、多数の種類の癌における予後の不良と関連している。多数の団体が、腫瘍成長を阻害するために、ＥＧＦＲタンパク質ファミリー（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＥＧＦＲ）の個々のメンバーを標的とする戦略を開発してきたが、これらの形態の癌を最終的に治療することが証明された治療法はない。
【００８４】
本発明によって、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する新規薬剤（例えば、抗体）を提供する。これらの新規薬剤は、ＥＧＦＲのシグナル伝達を部分的に阻害し、初代ケラチノサイトを含む、ＥＧＦＲ陽性正常上皮細胞に影響を及ぼさない。しかしながら、これらの薬剤は、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞に、高く細胞毒性である。
【００８５】
したがって、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する薬剤を提供する。これらの薬剤は、本明細書に「ＥＧＦＲ結合剤」として称される。特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、抗体、免疫抱合体、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、ヒト化抗体である。
【００８６】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、次の効果の１つ以上を有する。腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させることによる腫瘍の腫瘍原性の減少、腫瘍成長の阻害、生存率の増加、腫瘍細胞の細胞死の誘発、非腫瘍原性状態への腫瘍原性細胞の分化、または腫瘍細胞の転移の予防。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、腫瘍体積を縮小する能力がある。ＥＧＦＲ結合剤が、腫瘍体積を縮小させる能力は、例えば、対照対象の平均腫瘍体積で除した治療対象の平均腫瘍体積である、Ｔ／Ｃ％値を測定することによって評価することができる。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤での治療は、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満のＴ／Ｃ％値をもたらす。
【００８８】
特定の実施形態において、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する免疫抱合体または他の薬剤は、細胞毒性剤を介して、細胞死を誘発する。例えば、特定の実施形態において、ヒトＥＧＦＲ抗体に対する抗体を、タンパク質内部移行によって、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞において活性化されたマイタンシノイドと抱合する。特定の代替的な実施形態において、薬剤または抗体は、抱合されない。
【００８９】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、腫瘍成長を阻害する能力がある。特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、インビボで（例えば、異種移植片マウスモデルにおいて、および／または癌を有するヒトにおいて）腫瘍の成長を阻害する能力がある。
【００９０】
ＥＧＦＲ結合剤には、ＥＧＦＲ抗体であるＥＧＦＲ−６、ＥＧＦＲ−７、およびＥＧＦＲ−１２、ならびにそれらのフラグメント、変異体、および誘導体が含まれる。ＥＧＦＲ結合剤はまた、抗体ＥＧＦＲ−６、ＥＧＦＲ−７、およびＥＧＦＲ−１２と同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合するＥＧＦＲ結合剤を含む。ＥＧＦＲ結合剤はまた、抗体ＥＧＦＲ−６、ＥＧＦＲ−７、およびＥＧＦＲ−１２を競合的に阻害するＥＧＦＲ結合剤を含む。
【００９１】
ＥＧＦＲ結合剤はまた、ＥＧＦＲ−６、ＥＧＦＲ−７、およびＥＧＦＲ−１２の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む、ＥＧＦＲ結合剤を含む。マウスおよびヒト化両方のＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２のＣＤＲ配列を、以下の表１および２に記載する。
【表１】
2015143271.tif 000003
【表２】
2015143271.tif 000004
【００９２】
ＥＧＦＲ結合分子は、ＣＤＲあたり最大４つ（すなわち、０、１、２、３、または４つの）保存的アミノ酸置換を有する、ＥＧＦＲ−６、ＥＧＦＲ−７、およびＥＧＦＲ−１２のＣＤＲを含む、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントであってもよい。
【００９３】
ポリペプチドは、本明細書に記載の個々の可変軽鎖または可変重鎖の１つ以上を含み得る。抗体およびポリペプチドはまた、可変軽鎖および可変重鎖の両方を含んでもよい。マウスおよびヒト化ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体の可変軽鎖および可変重鎖の配列を、以下の表３および４に提供する。
【表３】
2015143271.tif 000005
【表４】
2015143271.tif 000006
【００９４】
さらに、（ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７６と、少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに／または（ｂ）配列番号２４〜３０および７０と、少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドもまた提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１９〜３０および６９〜７６と、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに／または（ｂ）配列番号２４〜３０、および７０の配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７６、のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに／または（ｂ）配列番号２４〜３０および７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドもまた、提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体であり、および／またはポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する、マウス、キメラ、またはヒト化抗体である。特定の実施形態において、配列番号１９〜３０および６９〜７６と、ある割合の配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみが配列番号１９〜３０および６９〜７６とは異なる。
【表５−１】
2015143271.tif 000007
【表５−２】
2015143271.tif 000008
【表５−３】
2015143271.tif 000009
【表５−４】
2015143271.tif 000010
【００９５】
（ａ）配列番号３１、３２、および３６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに／または（ｂ）配列番号３３〜３５、３７、および３８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドもまた、提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３１〜３８と、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３１、３２、および３６と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドならびに／または（ｂ）配列番号３３〜３５、３７、および３８と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３１〜３２、および３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに／または（ｂ）配列番号３３〜３５、３７、および３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体であり、および／またはポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合するヒト化抗体である。特定の実施形態において、配列番号３１〜３８と特定の割合の配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみが配列番号３１〜３８とは異なる。
【００９６】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ抗体は、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１（ＥＧＦＲ−６）、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２（ＥＧＦＲ−７）、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３（ＥＧＦＲ−１２）からなる群から選択される、ハイブリドーマから生成される抗体である。特定の実施形態において、抗体は、ＰＴＡ−１１３３１、ＰＴＡ−１１３３２、およびＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される、ハイブリドーマから生成される抗体のＶＨ−ＣＤＲおよびＶＬ−ＣＤＲを含む。
【００９７】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５に記載のもの等、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用してマウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物に、上述のように免疫付与し、リンパ球による抗体の生成を誘発し、それが免疫抗原に特異的に結合することになる。リンパ球はまた、インビトロで免疫付与することもできる。免疫付与の後に、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、好適な骨髄腫細胞系と融合して、次に未融合のリンパ球および骨髄腫細胞とは別に選択されるハイブリドーマ細胞を形成する。免疫沈降、免疫ブロット、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））によって測定される、選択された抗原に特異的に向けられるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、次いで、標準的な方法を使用したインビトロ培養（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、または動物における腹水腫瘍としてインビボでのいずれかで、繁殖させることができる。モノクローナル抗体は、次いで、ポリクローナル抗体について上述のように、培養培地または腹水から精製することができる。
【００９８】
あるいは、モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載のように、組み換えＤＮＡ方法を使用して製造することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅する、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって単離し、それらの配列を、従来の手順を使用して判定する。重鎖および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを、次に、好適な発現ベクターにクローニングし、それを、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない、例えば、大腸菌細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトすると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。また、所望の種の組み換えモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）に記載のように、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することもできる。
【００９９】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（複数を含む）を、組み換えＤＮＡ技術を使用する多数の異なる方法でさらに修飾し、代替の抗体を生成してもよい。いくつかの実施形態において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインは、１）キメラ抗体を生成するために、例えば、ヒト抗体の領域で、または２）融合抗体を生成するために、非免疫グロブリンポリペプチドで、置換することができる。いくつかの実施形態において、定常領域を切断または除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを生成する。可変領域の部位特異的または高密度な突然変異生成を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ヒトＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特定の実施形態において、このような抗体は、ヒト対象に投与する場合、抗原性およびＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を減少させるために、治療的に使用される。ヒト化抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して生成することができる。特定の代替的な実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体は、ヒト抗体である。
【０１０１】
ヒト抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して、直接的に調製することができる。標的抗原に対する抗体を生成する、インビトロで免疫付与したか、または免疫付与した個体から単離した不死化ヒトＢリンパ球を生成することができる（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい）。また、ヒト抗体は、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９−３１４、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：６１５７−６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）に記載のように、ファージライブラリーがヒト抗体を発現する場合、ファージライブラリーから選択されてもよい。抗体ファージライブラリーの生成および使用の技術はまた、米国特許第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号、同第６，３００，０６４号、同第６，６５３，０６８号、同第６，７０６，４８４号、および同第７，２６４，９６３号、ならびにＲｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。親和性成熟戦略および鎖シャッフリング戦略（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３、参照によりその全体が組み込まれる）が、当該技術分野で既知であり、高い親和性のヒト抗体を生成するために採用することができる。
【０１０２】
ヒト化抗体はまた、内因性免疫グロブリン生成の非存在下において、免疫付与時にヒト抗体の全範囲を生成する能力がある、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座を含む、トランスジェニックマウスにおいて製造することができる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、および同第５，６６１，０１６号に記載される。
【０１０３】
本発明はまた、ＥＧＦＲを特異的に認識する、二重特異性抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを、特異的に認識および結合する能力のある抗体である。異なるエピトープは、例えば、両方の抗体が、ＥＧＦＲ、ならびに例えば、１）Ｔ細胞受容体（例えばＣＤ３）もしくはＦｃ受容体（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６）等の白血球上のエフェクター分子、または２）以下に詳細に記載される細胞毒性剤、を特異的に認識し、それに結合することができるように、同じ分子（例えば、同じＥＧＦＲ）内、または異なる分子上にあってもよい。
【０１０４】
例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも１つは、本発明のポリペプチドに由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原アームは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に焦点をあてるために、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＢ７）、またはＩｇＧのＦｃ受容体等、白血球上の誘発分子に結合するアームと結合される。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する、直接的な細胞毒性剤として使用することもできる。これらの抗体は、抗原結合アーム、およびＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、もしくはＴＥＴＡ等の細胞毒性剤または放射性核種キレート剤に結合するアームを有する。二重特性抗体を製造する技術は、当該技術分野において一般的である（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：１２０、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９、Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８、および米国特許第５，７３１，１６８号）。二価以上を有する抗体もまた想定される。例えば、三重特異性抗体が調製可能である（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。したがって、特定の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体は、多重特異性である。
【０１０５】
特定の実施形態において、例えば、腫瘍浸潤を増加させるための抗体フラグメントを提供する。抗体フラグメントの生成のための種々の技術が、既知である。従来的には、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク分解を介してもたらされる（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）。特定の実施形態において、抗体フラグメントは、組み換えで生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ抗体フラグメントは、全て、大腸菌または他の宿主細胞内に発現し、そこから分泌し得、したがって、これらのフラグメントの大量生成を可能にする。このような抗体フラグメントはまた、上述の抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載のような線形抗体であってもよく、単一特異性または二重特異性であり得る。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者には明らかであろう。
【０１０６】
本発明に従って、技術は、ＥＧＦＲに特異的な単鎖抗体の生成に適合させることができる（米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）。さらに、方法は、所望のＥＧＦＲ特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメント、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体の迅速で効果的な識別を可能にするように、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合させることができる（Ｈｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。抗体フラグメントは、（ａ）抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂフラグメント、（ｃ）パパインおよび還元剤での抗体分子の処理によって生成されるＦａｂフラグメント、ならびに（ｄ）Ｆｖフラグメントを含むがこれらに限定されない、当該技術分野における技術によって生成することができる。
【０１０７】
特に抗体フラグメントの場合においては、抗体を、その血清半減期を増加させるために修飾することが、さらに望ましい可能性がある。これは、例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みによって、抗体フラグメント内の適切な領域の突然変異によって、または末端もしくは中央のいずれかにおいて抗体フラグメントに融合されるペプチドタグに、エピトープを組み込むこと（例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成）によって、達成することができる。
【０１０８】
ヘテロ抱合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫細胞を不要な細胞に標的化するために提案された（米国特許第４，６７６，９８０号）。抗体は、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学において既知の方法を使用して、インビトロで調製可能であることが、企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築することができる。この目的に好適な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチリミデートが挙げられる。
【０１０９】
本発明の目的のために、修飾された抗体が、抗体とヒトＥＧＦＲのポリペプチドとの会合を提供する、任意の種類の可変領域を含み得ることを理解されたい。この点において、可変領域は、所望の腫瘍関連抗原に対する体液性応答の増加および免疫グロブリンの生成を誘発し得る、任意の種類の哺乳動物を含むか、またはそれに由来し得る。このようにして、修飾された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカク等）、またはオオカミ由来のものであり得る。いくつかの実施形態において、修飾された免疫グロブリンの可変領域および定常領域の両方は、ヒトのものである。他の実施形態において、（通常、非ヒト源に由来する）適合性抗体の可変領域は、分子の結合特性の改善または免疫原性の減少のために、操作または特別に調整することができる。この点に関して、本発明に有用な可変領域は、ヒト化され得るか、またはそうでなければ、取り込まれたアミノ酸配列の包含を通じて、改変され得る。
【０１１０】
特定の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置き換えによって、ならびに必要であれば部分的なフレームワーク領域の置き換えおよび配列変更によって、改変される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはサブクラスでさえある抗体に由来してもよいが、ＣＤＲが、異なるクラスの抗体に由来し、場合によっては、異なる種の抗体に由来するであろうことが想定される。一方の可変ドメインの抗原結合能力をもう一方へ移行するために、必ずしも全てのＣＤＲを、ドナーの可変領域由来の全ＣＤＲで置き換える必要はない。むしろ、いくつかの場合においては、抗原結合部位の活性を維持するために必要な残基を移行するだけでよい。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、および同第５，６９３，７６２号に記載の説明を考慮すると、日常的な実験を行うことによって、または試行錯誤による実験によってのいずれかで、免疫原性が減少した機能的抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内にあるであろう。
【０１１１】
可変領域の改変に関わらず、当業者は、本発明の修飾された抗体が、定常領域ドメインのうちの１つ以上の少なくともごく一部が、削除されているか、またはそうでなければ、生来または未改変の定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、増加した腫瘍局在または減少した血清半減期等、所望の生化学的特徴を提供するために改変されている、抗体（例えば、全長抗体またはその免疫反応性フラグメント）を含むであろうことを理解するであろう。いくつかの実施形態において、修飾された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含むであろう。本発明に適合性のある定常領域に対する修飾は、１つ以上のドメインにおける、１つ以上のアミノ酸の追加、削除、または置換を含む。すなわち、本明細書に開示される、修飾された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３）の１つ以上、および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）への改変または修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のドメインが、部分的または完全に削除されている、修飾された定常領域が企図される。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されている、ドメイン削除構築物または変異体を含む（ΔＣＨ２構築物）。いくつかの実施形態において、削除された定常領域ドメインは、通常、定常領域の不在によってもたらされる、何らかの分子の柔軟性を与える短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０個の残基）によって置き換えられる。
【０１１２】
それらの構造に加えて、定常領域が、いくつかのエフェクター機能を媒介することは、当該技術分野で既知である。例えば、抗体への補体のＣ１構成成分の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解に重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症にも関与する可能性がある。さらに、抗体は、抗体のＦｃ領域上のＦｃ受容体部位が、細胞のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した状態で、Ｆｃ領域を介して細胞に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）、およびＩｇＭ（μ受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的な、多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体コーティング粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、またはＡＤＣＣと称される）、炎症性媒介物質の放出、胎盤通過、ならびに免疫グロブリン生成の制御を含む、多数の重要かつ多様な生物学的反応を引き起こす。
【０１１３】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合抗体は、次に、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼす、改変されたエフェクター機能を提供する。例えば、定常領域ドメインの削除または不活性化（点突然変異もしくは他の手段を通じて）は、循環している修飾された抗体のＦｃ受容体結合を減少させ、それによって、腫瘍局在化を増加させ得る。他の事例において、本発明と一致する定常領域の修飾は、補体結合を緩和し、したがって、血清半減期および抱合された細胞毒素の非特異的な会合を減少させ得る。定常領域のさらなる他の修飾を使用して、抗原特異性または抗体の柔軟性の増加のために、局在化の強化を可能にする、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を排除することができる。同様に、本発明による定常領域への修飾は、十分に当業者の範囲内にある周知の生化学または分子工学技術を使用して、容易に行うことができる。
【０１１４】
特定の実施形態において、抗体であるＥＧＦＲ結合剤は、１つ以上のエフェクター機能を有しない。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性、および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を有しない。特定の実施形態において、抗体は、Ｆｃ受容体および／または補体因子に結合しない。特定の実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有しない。
【０１１５】
特定の実施形態において、修飾された抗体を、それぞれの修飾された抗体のヒンジ領域に、ＣＨ３ドメインを直接的に融合するように操作することができることに留意されたい。他の構造においては、ヒンジ領域と修飾されたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインとの間に、ペプチドスペーサーを提供することが望ましい場合がある。例えば、適合性構築物は、ＣＨ２ドメインが、削除され、残りのＣＨ３ドメイン（修飾または非修飾）が、５〜２０個のアミノ酸スペーサーでヒンジ領域に結合される場合に、発現され得る。例えば、定常ドメインの調節エレメントが開放およびアクセス可能なままであり、ヒンジ領域が、柔軟なままであることを確保するために、このようなスペーサーを追加することができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、いくつかの事例において、免疫原性であり、構築物に対する不要な免疫反応をもたらすことを証明し得ることに留意されたい。したがって、特定の実施形態において、構築物に追加されるいずれのスペーサーも、修飾された抗体の所望の生物学的品質を維持するために、比較的非免疫原性であり得るか、または纏めて削除することさえ可能である。
【０１１６】
全定常領域ドメインの削除に加えて、本発明の抗体が数個または単一のみのアミノ酸の部分的な削除または置換によって提供され得ることが、理解されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された範囲内の単一のアミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に減少させ、それによって腫瘍局在化を増加させるのに十分であり得る。同様に、エフェクター機能（例えば、補体ＣＬＱ結合）が調節されるように制御する、１つ以上の定常領域ドメインの一部を、単純に削除することが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的な削除は、抗体の選択された特徴（血清半減期）を改善しながら、対象の定常領域ドメインと関連する他の所望の機能を、無傷に保つことができる。さらに、上に示されるように、開示される抗体の定常領域は、結果として得られる構築物のプロファイルを強化する、１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換を通じて、修飾されてもよい。この点において、修飾された抗体の構造および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を破壊することが可能な場合がある。特定の実施形態は、エフェクター機能の減少もしくは増加等、所望の特徴を強化するか、または、さらなる細胞毒素もしくは炭水化物の結合を提供するために、１つ以上のアミノ酸を定常領域に追加することを含んでもよい。このような実施形態において、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。
【０１１７】
本発明は、本明細書に記載のキメラ、ヒト化、およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントに実質的に相同である、変異体および同等物を、さらに包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、すなわち、類似のアミノ酸による１つ以上アミノ酸の置換アミノ酸を含み得る。例えば、保存的置換は、１つのアミノ酸と、同じ一般クラス内の別のアミノ酸との置換、例えば、１つの酸性アミノ酸と別の酸性アミノ酸、１つの塩基性アミノ酸と別の１つの塩基性アミノ酸、または１つの中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による、置換を指す。保存的アミノ酸置換により意図されるものは、当該技術分野で周知である。
【０１１８】
本発明のポリペプチドは、ヒトＥＧＦＲに対する抗体、またはそのフラグメントを含む、組み換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得る。本発明のいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能の著しい影響なしに、変更され得ることは、当該技術分野において理解されるであろう。したがって、本発明は、実質的な活性を示すか、またはＥＧＦＲタンパク質に対する抗体もしくはそのフラグメントの領域を含む、ポリペプチドの変異体をさらに含む。このような突然変異には、削除、挿入、反転、反復、および型置換が含まれる。
【０１１９】
ポリペプチドおよび類似体は、通常はタンパク質の一部ではない、追加の化学部分を含むように、さらに修飾されてもよい。その誘導された部分は、タンパク質の可溶性、生物学的半減期、または吸収を改善することができる。この部分はまた、タンパク質等のいずれの望ましい副作用も減少または排除し得る。この部分についての概要は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ（２０００）に見出すことができる。
【０１２０】
本明細書に記載の単離されたポリペプチドは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって。生成することができる。このような方法は、直接的タンパク質合成方法から、単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築すること、および好適な形質転換宿主に、これらの配列を発現することまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、目的の野生型タンパク質をコードする、ＤＮＡ配列を単離または合成することよって、組み換え技術を使用して構築される。任意で、配列は、その機能的類似体を提供するために、部位特異的な突然変異生成によって、突然変異生成され得る。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−５０６６（１９８４）および米国特許第４，５８８，５８５号を参照されたい。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を使用して、化学合成によって構築されるであろう。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列、および目的の組み換えポリペプチドが中で生成されるであろう宿主細胞に好ましいコドンを選択することに基づいて、設計され得る。目的の単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列の合成に、標準的な方法を適用することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで連結させることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的構築のために、５’または３’のオーバーハングを含む。
【０１２２】
いったん構築されると（合成、部位特異的な突然変異生成、または別の方法によって）、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクター内に挿入され、所望の宿主細胞内でのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に操作可能に接続され得る。適正な構築は、ヌクレオチドの配列決定、制限酵素マッピング、および好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって、確認することができる。当該技術分野で周知のように、宿主において、高い発現レベルのトランスフェクト遺伝子を得るためには、その遺伝子は、選択された発現宿主において機能的である、転写および翻訳発現制御配列に、操作可能に結合される必要がある。
【０１２３】
特定の実施形態において、組み換え発現ベクターを使用して、ヒトＥＧＦＲに対する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを増幅および発現させる。組み換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する、好適な転写または翻訳調節エレメントに操作可能に結合された、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントのポリペプチド鎖をコードする、合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントを有する、複製可能なＤＮＡ構築物である。転写単位は、一般的に、以下に詳細に記載されるように、（１）遺伝子発現に調節的な役割を有する遺伝エレメント（１つまたは複数）例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、ならびに（３）適切な転写および翻訳の開始および終了配列の集合を含む。このような調節エレメントは、転写を制御するために、操作者の配列を含む。通常、複製の起点によって与えられる宿主内での複製能力、および形質転換細胞の認識を促進するための選択遺伝子が、さらに組み込まれてもよい。ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に関連する場合、操作可能に結合されている。例えば、シグナルペプチドのＤＮＡ（分泌リーダー）は、それが、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に結合される、プロモーターは、それが、配列の転写を制御する場合、コード配列に操作可能に結合される、または、リボソーム結合部位は、それが、翻訳を可能にするように位置付けられる場合、コーディング配列の操作可能に結合される。酵母発現系における使用を対象とした構造エレメントには、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にする、リーダー配列を含まれる。あるいは、組み換えタンパク質が、リーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、それは、Ｎ末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は、任意で、続いて発現された組み換えタンパク質から実質的に開裂されて、最終生成物を提供することができる。
【０１２４】
発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存することになる。幅広い種類の発現宿主／ベクターの組み合わせが採用可能である。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、既知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド、より広宿主域のプラスミド、例えば、Ｍ１３および繊維状単鎖ＤＮＡファージ等、が含まれる。
【０１２５】
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは抗体（もしくは抗原として使用するためのＥＧＦＲタンパク質）の発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下における、原核生物、酵母、昆虫またはより高度な真核細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または桿菌が挙げられる。より高度な真核細胞には、以下に記載の哺乳動物由来の樹立細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系もまた、採用可能である。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）によって記載され、その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体生成を含む、タンパク質生成の方法に関する追加の情報は、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号および同第６，６６０，５０１号、ならびに国際公開第ＷＯ０４００９８２３号に見出すことができ、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組み換えタンパク質の発現に有利に採用される。哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質が、概して、正しく折り畳まれ、適切に修飾され、完全に機能的であるため、実行可能である。好適な哺乳動物宿主細胞系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）によって記載されるサル腎臓細胞のＣＯＳ−７系、ならびに、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞系を含む、適切なベクターを発現する能力のある他の細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製の原型、発現される遺伝子に結合した好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の５’または３’が両側に隣接する非転写配列、ならびに５’または３’翻訳配列、例えば、必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容部位、ならびに転写集結配列を含むことができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生成のためのバキュロウイルス系を、Ｌｕｃｋｏｗ
ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）によって検討した。
【０１２７】
形質転換宿主によって生成されるタンパク質は、任意の好適な方法に従って精製することができる。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によるものが含まれる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコーティング配列、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の親和性標識をタンパク質に結合させ、適切な親和性カラムの通過による容易な精製を可能にすることができる。単離タンパク質はまた、タンパク分解、核磁気共鳴およびｘ線結晶学等の技術を使用して、物理的に特徴付けることができる。
【０１２８】
例えば、培養培地内に組み換えタンパク質を分泌する系からの上清は、まず、市販で利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を使用して、濃縮することができる。濃縮ステップに続いて、濃縮物を、好適な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダント型ジエチルアミノメチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質を採用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に広く採用される、他の種類のものであってもよい。あるいは、カチオン交換ステップが採用されてもよい。好適なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む、種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、ＥＧＦＲ結合剤をさらに精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを採用する、１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを採用することができる。前述の精製ステップのいくつかまたは全てはまた、均一性の組み換えタンパク質を提供するために、種々の組み合わせで採用されてもよい。
【０１２９】
細菌培地で生成された組み換えタンパク質を、細胞ペレットからの初期抽出、続いて、１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって、単離することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップに採用することができる。組み換えタンパク質の発現に採用された微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来方法によって破壊することができる。
【０１３０】
抗体または他のタンパク質の精製のための、当該技術分野で既知の方法にはまた、例えば、米国特許公開第２００８／０３１２４２５号、同第２００８／０１７７０４８号、同第２００９／０１８７００５号に記載されるものであり、そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤は、抗体ではないポリペプチドである。タンパク質標的に高い親和性で結合する、非抗体ポリペプチドの識別および生成のための種々の方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：２９５−３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：１４−２７（２００６）、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：６５３−６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７５：２６６８−７６（２００８）、およびＳｋｅｒｒａ，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７５：２６７７−８３（２００８）を参照されたく、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、ファージディスプレイ技術が、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドの識別／生成に使用されている。特定の実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質Ａ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、およびチオレドキシンからなる群から選択される種類のタンパク質の足場を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本薬剤は、非タンパク質分子である。特定の実施形態において、本薬剤は、小分子である。非タンパク質ＥＧＦＲ結合剤の識別に有用なコンビナトリアルケミストリーライブラリーおよび技術は、当業者に既知である。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ，１０：３４５−３５４（２００８）、Ｄｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，９：８５５−９０２（２００７）、およびＢｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８：１３８３−４０４（２００１）を参照されたく、そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる特定の実施形態において、本薬剤は、炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、またはプロテオグリカンである。
【０１３３】
特定の実施形態において、本薬剤は、核酸アプタマーである。アプタマーは、別の分子に結合するそれらの能力に基づいて（例えば、無作為または突然変異したプールから）選択された、ポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＤＮＡポリヌクレオチドを含む。特定の代替的な実施形態において、アプタマーは、ＲＮＡポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、アプタマーは、１つ以上の修飾された核酸残基を含む。タンパク質への結合のために核酸アプタマーを生成およびスクリーニングする方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，２７０，１６３号、同第５，６８３，８６７号、同第５，７６３，５９５号、同第６，３４４，３２１号、同第７，３６８，２３６号、同第５，５８２，９８１号、同第５，７５６，２９１号、同第５，８４０，８６７号、同第７，３１２，３２５号、同第７，３２９，７４２号、国際特許公開第ＷＯ０２／０７７２６２号、同第ＷＯ０３／０７０９８４号、米国特許出願第２００５／０２３９１３４号、同第２００５／０１２４５６５号、同第２００８／０２２７７３５号を参照されたく、そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．  免疫抱合体
【０１３４】
本発明はまた、薬物またはプロドラッグに結合または抱合された、本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体、抗体フラグメント、およびそれらの機能的同等物を含む、抱合体（本明細書において、免疫抱合体とも称される）を対象とする。好適な薬物またはプロドラッグは、当該技術分野で既知である。薬物またはプロドラッグは、細胞毒性剤であってもよい。本発明の細胞毒性抱合体において使用される細胞毒性剤は、細胞死をもたらす、細胞死を誘発する、または何らかの方法で細胞の生存率を減少させる、任意の化合物であり得、例えば、マイタンシノイドおよびマイタンシノイド類似体が含まれる。他の好適な細胞毒性剤は、例えば、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、エンジイン、例えば、カリケアマイシン、アウリスタチンを含むドラスタチンおよびドラスタチン類似体、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ならびにモルホリノドキソルビシンである。
【０１３５】
このような抱合体は、抗体または機能的同等物への薬物またはプロドラッグの結合のために、結合基を使用して、調製することができる。好適な結合基は、当該技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸性不安定性基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。
【０１３６】
薬物またはプロドラッグは、例えば、ジスルフィド結合を通じて、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントに結合され得る。リンカー分子または架橋剤は、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントと反応し得る、反応化学基を含む。細胞結合剤との反応のための反応化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルであり得る。さらに、リンカー分子は、反応性化学基を備え、それは、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得る、ジチオピリジル基であってもよい。リンカー分子には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）を参照されたい）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）（米国公開第２００９０２７４７１３号を参照されたい）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６号を参照されたい）、２−イミノチオラン、またはアセチルスクシン無水物が挙げられる。例えば、抗体または細胞結合剤は、架橋試薬で修飾することができ、このようにしてもたらされる遊離または保護チオール基を含む抗体または細胞結合剤は、次に、ジスルフィドまたはチオールを含むマイタンシノイドと反応して、抱合体を生成する。抱合体は、ＨＰＬＣ、サイズ排除、吸収、イオン交換および親和性捕捉、透析、または接線流濾過を含むが、これらに限定されない、クロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１３７】
本発明の別の態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、免疫抱合体の有効性、可溶性、または効果を強化する際、ジスルフィド結合およびポリエチレングリコールスペーサーを介して細胞毒性薬物に結合する。このような開裂可能親水性リンカーは、国際公開第ＷＯ２００９／０１３４９７６号に記載される。このリンカー設計の追加の利点は、抗体−薬物抱合体の、所望の高モノマー比および最小凝集である。この態様において、２〜８の狭い範囲の薬物負荷で、ポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を有するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を介して結合された、細胞結合剤と薬物との抱合体が、特に企図され、癌細胞に対して比較的極めて強力な生物学的活性を示し、所望の生化学的特性である、高い抱合収率および高いモノマー比を、最小のタンパク質凝集とともに有することが示される。
【０１３８】
この態様において、式（Ｉ）の抗ＥＧＦＲ抗体薬物抱合体または式（Ｉ’）の抱合体が、特に企図される。
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ］ｍ      （Ｉ）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ    （Ｉ’）
式中、
【０１３９】
ＣＢは、抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントを表し、
【０１４０】
Ｄは、薬物を表し、
【０１４１】
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し、
【０１４２】
Ｙは、ジスルフィド結合を介して薬物に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し、
【０１４３】
ｌは、０または１であり、
【０１４４】
ｍは、２〜８の整数であり、
【０１４５】
ｎは、１〜２４の整数である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、ｍは、２〜６の整数である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ｍは、３〜５の整数である。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ｎは、２〜８の整数である。あるいは、例えば、米国特許第６，４４１，１６３号および同第７，３６８，５６５号に開示されるように、薬物を、まず、修飾して、細胞結合剤との反応に好適な反応性エステルを導入してもよい。活性化されたリンカー部分を含むこれらの薬物と、細胞結合剤との反応は、細胞結合剤薬物抱合体を生成する別の方法を提供する。マイタンシノイドはまた、例えば、米国特許第６，７１６，８２１号に記載のように、ＰＥＧ結合基を使用して、抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントに結合されてもよい。これらのＰＥＧ非開裂可能結合基は、水および非水性溶媒の両方に可溶性であり、１つ以上の細胞毒性剤を、細胞結合剤に結合するために使用することができる。例示的なＰＥＧ結合基には、リンカーの両末端で、１つの末端でスルフヒドリルまたはジスルフィド基、もう１つの末端で活性エステルを通じて、細胞毒性剤および細胞結合剤と反応する、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが挙げられる。ＰＥＧ結合基を使用する、細胞毒性抱合体の合成の一般的な例として、再度、米国特許第６，７１６，８２１号へ参照がなされ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。合成は、反応性ＰＥＧ部分を有する１つ以上の細胞毒性剤と、細胞結合剤との反応で壊死し、結果として、細胞結合剤のアミノ酸残基による、各反応性ＰＥＧ部分の末端の活性エステルの変位をもたらし、ＰＥＧ結合基を通じて細胞結合剤に共有結合された、１つ以上の細胞毒性剤を含む細胞毒性抱合体を生成する。あるいは、細胞結合は、二官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾し、反応性ジスルフィド部分（ピリジルジスルフィド等）を導入してもよく、それを、次にチオール含有マイタンシノイドで処理して抱合体を得ることができる。別の方法において、細胞結合は、二官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾して、チオール部分を導入してもよく、それを、次に反応性ジスルフィド含有マイタンシノイド（ピリジルスルフィド等）で処理して、抱合体を得ることができる。
【０１４９】
非開裂型結合を有する抗体−マイタンシノイド抱合体もまた、調製可能である。このような架橋剤は、当該技術分野において記載され（例えば、米国公開第２００５０１６９９３３号を参照されたい）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体を、文献に記載のように、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳ、またはスクシンイミジル−ヨード酢酸等の架橋試薬で修飾し、１〜１０個の反応基を導入する（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１：３９５−３９９（１９７９）、Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６−６３（１９８４）、およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８：６９０−６９７（１９７９））。修飾された抗体を、次に、チオール含有マイタンシノイド誘導体と反応させ、抱合体を生成する。抱合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを通じたゲル濾過、または透析もしくは接線流濾過によって、精製することができる。修飾された抗体を、チオール含有マイタンシノイド（１〜２モル当量／マレイミド基）で処理し、抗体−マイタンシノイド抱合体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを通じたゲル濾過、セラミックヒドロキシアパタイトカラム上のクロマトグラフィー、透析もしくは接線流濾過、またはそれらの方法の組み合わせによって、精製する。典型的に、１個の抗体につき１〜１０個のマイタンシノイドが、結合される。１つの方法は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で抗体を修飾してマレイミド基を導入し、続いて、修飾された抗体をチオール含有マイタンシノイドと反応させて、チオエーテル結合抱合体を得ることである。また、１個の抗体分子につき、１〜１０個の薬物分子を有する抱合体が生じる。抗体、抗体フラグメント、および他のタンパク質のマイタンシノイド抱合体は、同じ方法で作製される。
【０１５０】
本発明の別の態様において、ＥＧＦＲ抗体は、ＰＥＧスペーサーの仲介を通じた非開裂可能結合を介して、薬物に結合される。薬物と抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントとの間のリンカーを形成する、親水性ＰＥＧ鎖を有する好適な架橋試薬もまた、当該技術分野で周知であるか、または市販入手可能である（例えば、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，パウエル，オハイオ州から）。好適なＰＥＧ含有架橋剤はまた、当業者に既知の標準的な合成化学技術を使用して、市販入手可能なＰＥＧ自体から合成することができる。薬物を、米国特許公開第２００９０２７４７１３号およびＷＯ２００９／０１３４９７６に詳細に記載される方法によって、二官能性ＰＥＧ含有架橋剤と反応させて、次の式、Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄの化合物を得ることができ、それを、次に細胞結合剤と反応させて、抱合体を得ることができる。あるいは、細胞結合は、二官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾して、チオール反応基（マレイミドまたはハロアセトアミド等）を導入してもよく、それを、次にチオール含有マイタンシノイドで処理して、抱合体を得ることができる。別の方法において、細胞結合は、二官能性ＰＥＧ架橋剤で修飾して、チオール部分を導入してもよく、それを、次にチオール反応性マイタンシノイド（マレイミドまたはハロアセトアミドを有するマイタンシノイド等）で処理して、抱合体を得ることができる。
【０１５１】
したがって、本発明の別の態様は、式（ＩＩ）または式（ＩＩ’）の抗ＥＧＦＲ抗体薬物抱合体であり、
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ    （ＩＩ）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ    （ＩＩ’）
式中、ＣＢは、抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントを表し、
【０１５２】
Ｄは、薬物を表し、
【０１５３】
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し、
【０１５４】
Ｙは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して、薬物に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し、
【０１５５】
ｌは、０または１であり、
【０１５６】
ｐは、０または１であり、
【０１５７】
ｍは、２〜１５の整数であり、
【０１５８】
ｎは、１〜２０００の整数である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ｍは、２〜８の整数である。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ｎは、１〜２４の整数である。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ｍは、２〜６の整数である。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ｍは、３〜５の整数である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ｎは、２〜８の整数である。好適なＰＥＧ含有リンカーの例には、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントとの反応のためのＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分、ならびに化合物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチル系部分を有するリンカーが挙げられる。ＰＥＧスペーサーは、本明細書に記載の方法によって、当業者に既知の任意の架橋剤に組み込むことができる。
【０１６４】
本明細書に開示される多数のリンカーは、米国特許公開第２００５０１６９９３３号および同第２００９０２７４７１３号、ならびにＷＯ２００９／０１３４９７６号に詳細に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
本発明は、約２〜約８個の薬物分子（「薬物負荷」）、例えば、マイタンシノイドが、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントに結合され、抱合体の抗腫瘍効果が、同じ細胞結合剤に結合した、より少数またはより多数の薬物と比較した際、より一層有効である、態様を含む。「薬物負荷」とは、本明細書に使用される際、細胞結合剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメント）に結合し得る薬物分子（例えば、マイタンシノイド）の数を指す。一態様において、細胞結合剤に結合し得る薬物分子の数は、平均して約２〜約８個（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１）である。Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）マイタンシン（ＤＭ４）もまた、使用可能である。
【０１６６】
抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントを、二官能性架橋試薬を抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントと反応させ、それによって、リンカー分子の抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントへの共有結合をもたらすことにより、修飾することができる。本明細書に使用される際、「二官能性架橋試薬」は、細胞結合剤を、本明細書に記載の薬物等の薬物に共有結合する、任意の化学部分である。別の方法において、結合部分の一部は、薬物によって提供される。この態様において、薬物は、細胞結合剤を薬物に結合するために使用される、より大きなリンカー分子の一部である、結合部分を含む。例えば、マイタンシノイドＤＭ１を形成するために、マイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基の側鎖は、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾される。このマイタンシンのチオール化形態は、修飾された細胞結合剤と反応して、抱合体を形成することができる。したがって、最後のリンカーは、２つの構成成分から構築され、１つは架橋試薬によって提供されるが、もう１つはＤＭ１由来の側鎖によって提供される。
【０１６７】
薬物分子はまた、血清アルブミン等の中間担体分子を通じて、抗体分子に結合されてもよい。
【０１６８】
本明細書に使用される際、「細胞結合剤に結合した」または「抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントに結合した」という表現は、好適な結合基またはその前駆体を介して、細胞結合剤である抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントに結合した少なくとも１つの薬物誘導体を含む、抱合体分子を指す。１つの結合基は、ＳＭＣＣである。
【０１６９】
特定の実施形態において、本発明において有用な細胞毒性剤は、マイタンシノイドおよびマイタンシノイド類似体である。好適なマイタンシノイドの例には、マイタンシノールのエステルおよびマイタンシノール類似体が挙げられる。マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体のように、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に高く毒性である、あらゆる薬物が含まれる。
【０１７０】
好適なマイタンシノールエステルの例には、修飾された芳香環を有するもの、および他の位置に修飾を有するものが挙げられる。このような好適なマイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６２，６６３号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３７１，５３３号、同第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、同第６，３３３，４１０号、同第７，２７６，４９７号、および同第７，４７３，７９６号に開示される。
【０１７１】
ある実施形態において、本発明の免疫抱合体は、チオール含有マイタンシノイド（ＤＭ１）、正式名称Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンを、細胞毒性剤として利用する。ＤＭ１は、次の構造式（ＩＩＩ）によって表される。
【化１】
2015143271.tif 000011
【０１７２】
別の実施形態において、本発明の抱合体は、チオール含有マイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（例えば、ＤＭ４）を、細胞毒性剤として利用する。ＤＭ４は、次の構造式（ＩＶ）によって表される。
【化２】
2015143271.tif 000012
【０１７３】
立体障害チオール結合を含む、別のマイタンシノイドは、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ−２’（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３と称される）は、次の構造式（Ｖ）によって表される。
【化３】
2015143271.tif 000013
【０１７４】
米国特許第５，２０８，０２０号および同第７，２７６，４９７号に教示されるマイタンシノイドのそれぞれもまた、本発明の抱合体に使用することができる。この点に関して、米国特許第５，２０８，０２０号および同第７，２７６，６９７号の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
マイタンシノイド上の多くの位置が、結合部分に化学的に結合するための位置として機能する。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位は、全て有用であることが予想される。いくつかの実施形態において、Ｃ−３位は、結合部分に化学的に結合するための位置として機能し、いくつかの具体的な実施形態においては、マイタンシノールのＣ−３位は、結合部分に化学的に結合するための位置として機能する。
【０１７６】
いくつかの抱合体の構造的表示を、以下に示す。
【化４−１】
2015143271.tif 000014
【化４−２】
2015143271.tif 000015
【化４−３】
2015143271.tif 000016
【化４−４】
2015143271.tif 000017
【０１７７】
このような抗体−マイタンシノイド抱合体の生成のための複数の記述は、米国特許第６，３３３，４１０号、同第６，４４１，１６３号、同第６，７１６，８２１号、および同第７，３６８，５６５号に提供され、そのそれぞれが、全体として本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
一般的に、水性緩衝液中の抗体の溶液は、反応基を保有するジスルフィド部分を有する、モル過剰マイタンシノイドとともにインキュベートすることができる。反応混合物を、過剰アミン（エタノールアミンタウリン等）の添加によって、反応停止させることができる。マイタンシノイド−抗体抱合体は、次に、ゲル濾過によって精製することができる。
【０１７９】
１個の抗体分子あたりのマイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度比を、分光光度的に測定することによって、判定することができる。平均のマイタンシノイド分子／抗体数は、例えば、１〜１０個または２〜５個であり得る。
【０１８０】
アントラサイクリン化合物、ならびにその誘導体、中間体、または修飾形態もまた、抗ＥＧＦＲ免疫抱合体の調製に使用することができる。例えば、ドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、ドキソルビシン中間体、および修飾ドキソルビシンを、抗ＥＧＦＲ抱合体に使用することができる。例示的な化合物は、ＷＯ２０１０／００９１２４号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような化合物には、例えば、次の式の化合物が含まれ、
【化５】
2015143271.tif 000018
【０１８１】
式中、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシ、またはメトキシ基であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃｓアルコキシ基、またはその薬学的に許容される塩である。
【０１８２】
抗体とマイタンシノイドまたは他の薬物との抱合体を、インビトロで種々の望ましくない細胞系の増殖を抑制するそれらの能力について、評価することができる。例えば、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９２、およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ等の細胞系は、これらの化合物の細胞毒性の評価に、容易に使用可能である。評価する細胞を化合物に４〜５日間曝露し、細胞の生存率を、既知の方法による直接アッセイで測定することができる。ＩＣ５０値は、次に、アッセイの結果から計算することができる。
【０１８３】
免疫抱合体は、本明細書に記載のいくつかの実施形態によると、細胞内に内部移行され得る。免疫抱合体は、したがって、それが、ＥＧＦＲ発現細胞によって、取り込まれるか、または内部移行される際に、治療効果を発揮することができる。いくつかの具体的な実施形態において、免疫抱合体は、開裂可能リンカーによって細胞毒性剤に結合された、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを含み、細胞毒性剤は、ＥＧＦＲ発現細胞によって内部移行される際に、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドから開裂される。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、免疫抱合体は、腫瘍体積を縮小する能力がある。例えば、いくつかの実施形態において、免疫抱合体での治療は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満のＴ／Ｃ％値をもたらす。
【０１８５】
別の態様において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、薬物の代わりに本発明の抗体に結合し得る。ｓｉＲＮＡは、オリゴヌクレオチドの修飾に広く使用される方法によって、本発明の抗体に結合され得る（例えば、米国特許公開第２００５０１０７３２５号および同第２００７０２１３２９２号を参照されたい）。したがって、その３’または５’−ホスホラミダイト形態にあるｓｉＲＮＡを、ヒドロキシ官能性を有する架橋剤の１つの末端と反応させて、ｓｉＲＮＡと架橋剤との間にエステル結合をもたらすことができる。ｓｉＲＮＡホスホラミダイトと、末端アミノ基を有する架橋剤との類似反応により、アミンを通じて、ｓｉＲＮＡへの架橋剤の結合をもたらす。あるいは、ｓｉＲＮＡを、標準的な化学的方法によって、誘導し、チオール基を導入してもよい。修飾して活性ジスルフィドまたはマレイミド部分を導入した抗体と、このチオール含有ｓｉＲＮＡを反応させ、開裂可能または非開裂可能抱合体を生成することができる。この方法によって、１〜２０個のｓｉＲＮＡ分子を、抗体に結合することができる。
ＩＩＩ．  ポリヌクレオチド
【０１８６】
特定の実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチド、またはこのようなポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明は、ヒトＥＧＦＲに対する抗体をコードするか、またはこのような抗体のフラグメントをコードする、核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれ、二本鎖または単鎖であり得、単鎖の場合は、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
【０１８７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されている。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。
【０１８８】
本発明は、配列番号１〜３８および６９〜７６からなる群から選択される配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０１８９】
本発明は、以下の表７〜９に示されるものから選択される配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【表７−１】
2015143271.tif 000019
【表７−２】
2015143271.tif 000020
【表８】
2015143271.tif 000021
【表９−１】
2015143271.tif 000022
【表９−２】
2015143271.tif 000023
【表９−３】
2015143271.tif 000024
【表９−４】
2015143271.tif 000025
【表９−５】
2015143271.tif 000026
【０１９０】
さらに、配列番号３９〜５８、７７〜８４と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドもまた提供する。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３９〜４３、５１、５４、５６、７７〜８０、もしくは８２〜８４と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに／または（ｂ）配列番号４４〜５０、５２、５３、５５、５７、５８、８１と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３９〜４３、５１、５４、５６、７７〜８０、もしくは８２〜８４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号４４〜５０、５２、５３、５５、５７、５８、８１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【０１９１】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に融合された成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そのリーダー配列が、宿主細胞によって開裂されて、ポリペプチドの成熟形態を形成し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質にさらなる５’アミノ酸残基を加えたプロタンパク質をコードすることが可能である。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、タンパク質の不活性形態である。いったんプロ配列が開裂されると、活性な成熟タンパク質が残る。
【０１９２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、コードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に融合された、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得るか、またはマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。
【０１９３】
本発明は、さらに、例えば、フラグメント、類似体、および誘導体をコードする、本明細書に上述のポリヌクレオチドの変異体に関する。
【０１９４】
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、または両方における改変を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、静的置換、追加、または削除をもたらす改変を含むが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド変異体は、遺伝子コードの縮退のため、‘静的置換によって生成される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンを、大腸菌等の細菌宿主に好ましいものに変更する）ために、生成される。
【０１９５】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクターおよび細胞もまた、提供する。
ＩＶ．  使用方法および薬学的組成物
【０１９６】
本発明のＥＧＦＲ結合剤（抗体、免疫抱合体、およびポリペプチドを含む）は、癌の治療等、治療的な治療法を含むが、これに限定されない、種々の適用に有用である。特定の実施形態において、本薬剤は、腫瘍成長の阻害、分化の誘発、腫瘍体積の縮小、および／または腫瘍の腫瘍原性の減少に有用である。使用方法は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボ法であってもよい。特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤もしくは抗体もしくは免疫抱合体、またはポリペプチドは、それが結合するヒトＥＧＦＲに拮抗性ではない。
【０１９７】
一態様において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体および免疫抱合体は、生物学的試料中のＥＧＦＲの存在を検出することに有用である。本明細書に使用される際、用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織を含む。
【０１９８】
一態様において、本発明は、生物学的試料中のＥＧＦＲの存在を検出する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を可能にする条件下で、生物学的試料を抗ＥＧＦＲ抗体と接触させること、および抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。
【０１９９】
一態様において、本発明は、ＥＧＦＲの発現の増加と関連する障害の診断方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、試験細胞を抗ＥＧＦＲ抗体と接触させること、ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出することによって、試験細胞によるＥＧＦＲの発現レベルを判定すること（定量的または定性的のいずれかで）、ならびに、試験細胞によるＥＧＦＲの発現レベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織に由来する正常細胞、またはこのような正常細胞に匹敵するレベルでＥＧＦＲを発現する細胞）によるＥＧＦＲの発現レベルと比較することを含み、対照細胞と比較した際、試験細胞によるＥＧＦＲの高い発現レベルは、ＥＧＦＲの発現の増加と関連する障害の存在を示す。特定の実施形態において、試験細胞は、ＥＧＦＲの発現の増加と関連する障害を有する疑いのある個体から得られる。特定の実施形態において、障害は、癌または腫瘍等、細胞増殖性障害である。
【０２００】
特定の実施形態において、上述のもの等、診断または検出の方法は、細胞表面上、またはその表面上にＥＧＦＲを発現する細胞から得られた膜標本内に、発現されるＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出することを含む。特定の実施形態において、本方法は、ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を可能にする条件下で、細胞を抗ＥＧＦＲ抗体と接触させること、および細胞表面上で、抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。細胞の表面上に発現されるＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出するための例示的なアッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
【０２０１】
特定の他の方法が、ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出するために使用可能である。このような方法には、当該技術分野で周知の抗原結合アッセイ、例えば、ウェスタンブロット、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫測定、タンパク質Ａ免疫測定、および免疫組織化学（ＩＨＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
特定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、標識化される。標識には、直接的に検出される標識または部分（蛍光、発色団、電子密度、および放射性標識等）、ならびに例えば、酵素反応または分子間相互作用を通じて、間接的に検出される、酵素またはリガンド等の部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０３】
特定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、不溶性マトリックス上に固定化される。固定化は、溶液中で遊離したままである任意のＥＧＦＲから抗ＥＧＦＲ抗体を分離することを伴う。これは、通常、アッセイ手順の前に、不水溶性マトリックスもしくは表面への吸着により抗ＥＧＦＲ抗体を不溶性にすること（Ｂｅｎｎｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第３，７２０，７６０号）、または共有結合（例えば、グルタルアルデヒド架橋）、または例えば免疫沈降によって抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲとの複合体の形成後に抗ＥＧＦＲ抗体を不溶性にすること、のいずれかによって、達成される。
【０２０４】
診断または検出のいずれの上述の実施形態も、抗ＥＧＦＲ抗体の代わりにか、またはそれに加えて、本発明の免疫抱合体を使用して実行することができる。
【０２０５】
特定の実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤または拮抗薬（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）で治療される疾患は、癌である。特定の実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ結合剤（例えば、抗体）が結合する、ＥＧＦＲを発現する細胞によって特徴付けられる。
【０２０６】
さらなる態様において、本発明は、ＥＧＦＲが発現される、特に、ＥＧＦＲが、異常発現（例えば、過剰発現）される、膀胱、脳、頭頸部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺、皮膚、および腎臓の癌を含む、細胞増殖疾患を治療するための改善された方法であって、本発明の抗ＥＧＦＲ結合剤の治療有効量を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法を対象とする。別の実施形態において、抗体は、ヒト化される。本発明の抗ＥＧＦＲ結合剤によって治療することができる細胞増殖障害の例には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系内に位置する新生物が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
同様に、他の細胞増殖障害もまた、本発明の抗ＥＧＦＲ結合剤によって治療することができる。このような細胞増殖障害の例には、上記の器官系に位置する、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
本発明は、さらに、本明細書に記載の抗体または他の薬剤を使用して、腫瘍成長を阻害するための方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、細胞を、インビトロで、ＥＧＦＲ結合剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。例えば、ＥＧＦＲを発現する不死化細胞系または癌細胞系を、抗体または他の薬剤を添加した培地中で培養し、腫瘍成長を阻害する。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞を、例えば、組織生検、胸水、または血液試料等の患者試料から単離し、ＥＧＦＲ結合剤を添加した培地中で培養し、腫瘍成長を阻害する。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、腫瘍または腫瘍細胞を、インビボで、ＥＧＦＲ結合剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。特定の実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞をＥＧＦＲ結合剤と接触させることは、動物モデルにおいて行われる。例えば、ＥＧＦＲ結合剤を、免疫無防備状態のマウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）において成長させた１つ以上のＥＧＦＲを発現する異種移植片に投与して、腫瘍成長を阻害する。いくつかの実施形態において、癌幹細胞を、例えば、組織生検、胸水、または血液試料等の患者試料から単離し、免疫無防備状態のマウスに注射し、次いで、それにＥＧＦＲ結合剤を投与して、腫瘍細胞成長を阻害する。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤を、同時、または腫瘍原性細胞の導入直後に動物に投与し、腫瘍成長を防止する。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合剤を、腫瘍原性細胞が、指定寸法まで成長した後に、治療として投与する。
【０２１０】
特定の実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、ＥＧＦＲ結合剤の治療有効量を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、対象はヒトである。特定の実施形態において、対象は、腫瘍を有するか、腫瘍を除去されている。
【０２１１】
特定の実施形態において、腫瘍は、ＥＧＦＲ結合剤または抗体が結合する、ＥＧＦＲを発現する。
【０２１２】
さらに、本発明は、対象における腫瘍の腫瘍原性を減少させる方法であって、ＥＧＦＲ結合剤の治療有効量を、対象に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、癌幹細胞を含む。特定の実施形態において、腫瘍中の癌幹細胞の頻度は、本薬剤の投与によって減少する。
【０２１３】
本発明は、さらに、腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞に分化させる方法であって、腫瘍原性細胞を、ＥＧＦＲ結合剤と接触させること（例えば、ＥＧＦＲ結合剤を、腫瘍原性細胞を含む腫瘍を有するか、またはそのような腫瘍を除去した対象に、投与することによって）を含む、方法を提供する。
【０２１４】
腫瘍細胞を含むがこれに限定されない細胞の分化を誘発するための、本明細書に記載のＥＧＦＲ結合剤、ポリペプチド、または抗体の使用もまた、提供する。例えば、細胞を、本明細書に記載のＥＧＦＲ結合剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）の有効量と接触させることを含む、細胞の分化を誘発させる方法が、想定される。ＥＧＦＲ結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍内の細胞に分化を誘発させる方法もまた、提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、膵臓腫瘍である。特定の他の実施形態において、腫瘍は、結腸腫瘍である。いくつかの実施形態において、治療方法は、ＥＧＦＲ結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を、対象に投与することを含む。
【０２１５】
本発明は、さらに、本明細書に記載のＥＧＦＲ結合剤のうち１つ以上を含む、薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの薬学的組成物は、ヒト患者において腫瘍成長の阻害および癌の治療における使用を見出す。
【０２１６】
特定の実施形態において、保管および使用のために、製剤を、精製された本発明の抗体または薬剤と、薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、賦形剤）とを合わせることによって調製する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００）。好適な薬学的に許容されるビヒクルには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等の非毒性緩衝剤；塩化ナトリウム等の塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、酸化防止剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０個未満のアミノ酸残基）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アルパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリン等の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに、ＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
本発明の薬学的組成物は、局所または全身治療のいずれかのためのあらゆる手段で、投与することができる。投与は、経皮貼付、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐薬、液体、および粉末等の、局所（例えば、膣および直腸送達を含む、粘膜へ）、肺（例えば、噴霧器によるものを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入または吹送によって、すなわち、気管内、鼻腔内、表皮、および経皮）；経口；または静脈内、心房内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射または注入を含む、非経口；または頭蓋内（例えば、髄腔内もしくは脳室内）の投与であり得る。
【０２１８】
本発明の抗体または免疫抱合体は、薬学的複合製剤中、または併用療法としての投与レジメンにおいて、抗癌特性を有する第２の化合物と合わせることができる。薬学的複合製剤または投与レジメンの第２の化合物は、互いに悪影響を与えることのないように、ＡＤＣの組み合わせに対して相補的な活性を有し得る。ＥＧＦＲ結合剤および第２の抗癌剤を含む薬学的組成物もまた、提供される。
【０２１９】
疾患の治療について、本発明の抗体または薬剤の適切な用量は、全てが治療する医師の判断で、治療される疾患の種類、疾患の重症度および過程、疾患の反応性、抗体または薬剤が治療的もしくは予防的目的で投与されるのか、以前の治療法、患者の病歴等に依存する。抗体または薬剤は、１回または数日から数ヶ月続く一連の治療にわたって、あるいは治癒がもたらされるか、または疾患状態の減少（例えば、腫瘍寸法の縮小）が達成されるまで、投与され得る。最適な投与スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定から計算することができ、個々の抗体または薬剤の相対的な強度によって変化することになる。投与する医師は、最適な投与量、投与方法、および反復率を、容易に決定することができる。特定の実施形態において、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｍｇであり、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、または年１回以上で与えることができる。特定の実施形態において、抗体または他のＥＧＦＲ結合剤を、２週間に１回、または３週間に１回与える。特定の実施形態において、抗体または他のＥＧＦＲ結合剤の投与量は、体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇである。治療する医師は、投与の反復率を、測定された体液および組織中の薬物の滞留時間および濃度に基づいて、推定することができる。
【０２２０】
併用療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であることを証明し得る、すなわち、活性成分が一緒に使用された場合に達成される効果が、化合物を別々に使用することからもたらされる効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）組み合わせた単位用量形態で、同時に共製剤化および投与もしくは送達される、（２）別個の製剤として、交互または並行して送達される、または（３）何らかの他のレジメンによる場合に、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば、別個の注射器で別々の注射によって、連続的に投与または送達される場合に、達成され得る。一般的に、交互療法の際、各活性成分の有効用量は、連続的に、すなわち、順に投与されるが、一方で、併用療法においては、２つ以上の活性成分の有効量は、一緒に投与される。
ＶＩ．  ＥＧＦＲ結合剤を含むキット
【０２２１】
本発明は、本明細書に記載の抗体、免疫抱合体、または他の薬剤を含み、本明細書に記載の方法を実行するために使用可能である、キットを提供する。特定の実施形態において、キットは、１つ以上の容器中に、少なくとも１つの精製されたＥＧＦＲに対する抗体を含む。いくつかの実施形態において、キットは、対照、アッセイを行うための指示書、ならびに結果の分析および提示に必要な任意のソフトウェアを全て含む、検出アッセイの実行に必要および／または十分な構成要素の全てを含む。当業者は、開示される本発明の抗体、免疫抱合体、または他の薬剤を、当該技術分野で周知の確立されたキット形式に、容易に組み込むことができることを、容易に認識するであろう。
【０２２２】
ＥＧＦＲ結合剤（例えば、ＥＧＦＲ結合抗体）、ならびに第２の抗癌剤を含むキットを、さらに提供する。特定の実施形態において、第２の抗癌剤は、化学療法剤（例えば、リツキシマブ）である。
【実施例】
【０２２３】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示目的のみであり、それを踏まえた種々の修正または変更が当業者に提示され、本出願の精神および範囲内に含まれるであろうことを、理解されたい。
実施例１
マウスＥＧＦＲ抗体の生成
【０２２４】
マウス抗ＥＧＦＲ抗体を生成するために、ＣＡ９２２（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ），新宿区，日本）およびＨＳＣ４（ＪＣＲＢ，新宿区，日本）等の頭頸部扁平上皮癌細胞系を、Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ウィルミントン，マサチューセッツ州）に、マウス１匹あたり５×１０６個の細胞の用量で、２週間に１回で５回皮下注射した。ハイブリドーマ生成のために屠殺する３日前に、免疫付与したマウスに、もう一用量の抗原を腹腔内注射で与えた。マウスの脾臓を、標準的な動物プロトコルに従って収集し、２つの滅菌したフロスト付き顕微鏡用スライド間で潰し、ＲＰＭＩ−１６４０培地において単一細胞懸濁液を得た。赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解した後、脾臓細胞を、続いて、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｐ３細胞）（Ｊ．Ｆ．Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９７９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２３：１５４８−１５５０）と、Ｐ３細胞１：脾臓細胞３の比率で混合した。脾臓細胞とＰ３細胞の混合物を洗浄し、融合培地（０．３Ｍ  マンニトール／Ｄ−ソルビトール、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中において、室温で３分間、プロナーゼで処理した。反応を、ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加によって停止し、続いて細胞を洗浄し、２ｍｌの低温融合培地に再懸濁し、ＢＴＸ  ＥＣＭ  ２００１電気融合機（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で融合した。融合細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地に穏やかに添加し、３７℃で２０分間インキュベートし、続いて平底９６ウェルプレートに、２００μｌ／ウェルで播種した。次に、プレートを、５％ＣＯ２インキュベーターで、ハイブリドーマのクローンが抗体スクリーニングの準備が整うまで、３７℃でインキュベートした。Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｖｕｎａｋｉｓ（Ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２１，“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ
Ｉ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ）、およびＥ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”；１９８８；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に記載のもの等を含む、免疫付与およびハイブリドーマの他の技術もまた使用可能である。
マウスハイブリドーマのスクリーニングおよび選択
【０２２５】
ハイブリドーマのスクリーニングは、未処理またはＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理済みのいずれかの免疫付与細胞を用いて、フローサイトメトリー結合アッセイを使用して行った。ＥＧＦとのインキュベーションは、細胞表面上のＥＧＦＲのレベルを下方調節するため、ＥＧＦＲ特異的ハイブリドーマ上清は、未処理細胞にのみ反応し、ＥＧＦ処理した細胞には反応しないであろう。スクリーニングのための細胞は、まず、無血清培地で一晩培養し、２つの部分に分割した。一方の部分の細胞を未処理のまま残し、もう一方の部分を３７℃で、３時間ＥＧＦで処理した。ＥＧＦ処理細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）近赤外ＤＤＡＯ−ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化し、１：１の比率で未処理細胞と混合し、ハイブリドーマ上清とともに、氷上で２時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ−標識化抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、洗浄し、ホルマリンで固定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して分析した。ＥＧＦＲ特異的ハイブリドーマを拡大し、上清を、可溶性組み換えヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ）を抗原として使用して、ＥＬＩＳＡによって再スクリーニングした。陽性ハイブリドーマを、ヒトＥＧＦＲ発現Ａ４３１表皮癌腫細胞系（ＡＴＣＣ）およびサルＥＧＦＲ発現Ｖｅｒｏ細胞系（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞系）（ＡＴＣＣ）を用いて、フローサイトメトリー結合アッセイを使用して再スクリーニングした。手短に述べれば、ハイブリドーマ上清を、Ａ４３１細胞およびＤＤＡＯ標識化Ｖｅｒｏ細胞とともに、氷上で１時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＰＥ抱合型ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに、氷上で１時間インキュベートした。細胞を、続いてＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ホルマリン中に固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【０２２６】
ヒトおよびサル両方の抗原に反応する陽性ハイブリドーマのクローンを、ＥＧＦＲ過剰発現ＨＣＣ８２７細胞（ＡＴＣＣ）の基底増殖を阻害する能力について試験した。手短に述べれば、指数成長期のＨＣＣ８２７細胞を、１０％ＦＢＳを含有する１００μｌの完全培地において、２０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。１００μｌのハイブリドーマ上清を、細胞に添加し、混合物を、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で５日間インキュベートした。細胞増殖のレベルを、比色分析ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して判定した。ＷＳＴ−８は、生存細胞中の脱水素酵素によって、組織培養培地中に可溶である橙色のホルマザン生成物に還元され、生成されたホルマザンの量は、生存細胞数に直接的に正比例する。ＷＳＴ−８の最終体積の１０％を、各ウェルに添加し、プレートを、３７℃でさらに２〜４時間インキュベートした。プレートを、次に、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーヴェール，カリフォルニア州）で、４５０ｎｍ（Ａ４５０）における吸光度を測定することによって分析した培地を伴うウェルおよびＷＳＴ−８のみの、バックグラウンドＡ４５０吸光度を、全ての値から差し引いた。各処理済み試料の値を、未処理細胞を有するウェルの平均値で除すことによって、生存率を計算した（生存率＝（Ａ４５０処理済み試料−Ａ４５０バックグラウンド）／（Ａ４５０未処理試料−Ａ４５０バックグラウンド））。結果を、生存率０が細胞を有さないウェルの値を示し、１が、いずれの抗ＥＧＦＲ抗体も有さない、血清含有培地における細胞増殖のレベルを示すように、正規化した。少なくとも５０％のＨＣＣ８２７細胞成長を阻害したハイブリドーマのクローンを、限界希釈法によって、サブクローニングした。フローサイトメトリーにより親細胞と同じ反応性を示した、各ハイブリドーマから１つのサブクローンを、その後の分析のために選択した。安定したサブクローンを培養し、抗体を、市販のアイソタイプ化試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、アイソタイプ化した。
抗体の精製
【０２２７】
抗体を、例えば、タンパク質ＡまたはＧクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡまたはＧ  ＨＰ、１ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の標準的な方法を使用して、ハイブリドーマのサブクローン上清から精製した。手短に述べれば、上清を、１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０の添加によって、クロマトグラフィー用に調製した。ｐＨ調節した上清を、０．２２μｍのフィルター膜を通じて濾過し、結合緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したカラムに充填した。カラムを、２８０ｎｍで吸光を伴わずに安定したベースラインが得られるまで、結合緩衝液で洗浄した。抗体を、ｐＨ２．８の０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有０．１Ｍ酢酸緩衝液で、０．５ｍＬ／分の流速を使用して溶出した。おおよそ０．２５ｍＬの分画を収集し、１／１０体積の１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０の添加によって中和した。ピーク分画（複数を含む）を、１倍ＰＢＳに対して一晩で２回透析し、０．２μｍのフィルター膜を通じた濾過によって、滅菌した。精製した抗体を、Ａ２８０での吸光度により定量化した。
【０２２８】
タンパク質Ａ精製分画を、マウス抗体に対する第四級アンモニウム（Ｑ）クロマトグラフィーとともに、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を使用して、さらに洗練した。手短に述べれば、タンパク質Ａ精製由来の試料を、結合緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）に、緩衝液交換し、０．２２μｍのフィルターを通じて濾過した。調製した試料を、次に、１２０ｃｍ／時間の流速で、結合緩衝液で平衡化したＱ高速樹脂（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に充填した。カラム寸法は、試料中、全てのＭＡｂに結合するのに十分な能力を有するように選択した。続いて、カラムを、２８０ｎｍで吸光を伴わずに安定したベースラインが得られるまで、結合緩衝液で洗浄した。勾配を２０カラム体積（ＣＶ）中１０ｍＭから開始し、５００ｍＭまでの塩化ナトリウムによって、抗体を溶出した。ピーク分画を、２８０ｎｍ（Ａ２８０）での吸光度測定に基づいて収集した。モノマーの割合を、ＳＷＸＬガードカラム６．０×４０ｍｍを有するＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ７．８×３００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，モンゴメリービレ，ペンシルバニア州）上で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ，サンタクララ，カリフォルニア州）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で評価した。９５％を超えるモノマー含量を有する分画をプールし、ＴＦＦシステムを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換し、０．２μｍのフィルター膜を通じて濾過することにより滅菌した。精製した抗体のＩｇＧ濃度を、１．４７の減衰係数を使用して、Ａ２８０によって判定した。セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）等の代替方法もまた、良好な選択性を有する抗体の洗練に使用可能である。ＩＥＸクロマトグラフィーに対して記載されるものと類似のプロトコルを用いて、４０μｍの粒子寸法を有するＣＨＴタイプＩＩ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ＣＨＴに対する結合緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に相当し、抗体を、２０〜１６０ｍＭの勾配のリン酸ナトリウムで、２０ＣＶにわたって溶出した。
実施例２
ヒトおよびサルのＥＧＦＲ抗原に対する結合親和性
【０２２９】
ヒトおよびサルの抗原に対するＥＧＦＲ抗体の結合親和性を判定するために、ＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ）およびＡ４３１（ＡＴＣＣ）、ならびにＶｅｒｏサル腎臓細胞系（ＡＴＣＣ）等のＥＧＦＲ発現ヒト腫瘍細胞系を、フローサイトメトリー結合アッセイに使用した。手短に述べれば、細胞を、４℃で１時間、種々の濃度のＥＧＦＲ抗体とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、４℃で１時間、ＰＥ抱合型二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ホルマリン中に固定し、ＦＡＣＳａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。これらの抗体の結合親和性を判定するために、幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットした。用量反応曲線を、非線形回帰によって生成し、各抗体の見掛けの解離定数（Ｋｄ）に対応する、曲線のＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して計算した。本発明のＥＧＦＲ抗体、ならびに陽性対照抗体であるセツキシマブおよびパニツムマブは、ヒト腫瘍細胞およびサルＶｅｒｏ細胞の両方に、強く特異的な結合を示した。図１に示される表は、ヒトＥＧＦＲおよびサルＥＧＦＲに対する各抗体のＫｄを記載する。本発明のＥＧＦＲ抗体は、ヒトおよびサルの両方の抗原に対して、同様に強力な結合親和性を示した。
実施例３
リガンド誘発ＥＧＦＲ活性化の阻害
【０２３０】
ＥＧＦＲのリガンド結合は、ＥＧＦＲのリン酸化に続いて、下流シグナル伝達経路の活性化を誘発する。リガンド誘発ＥＧＦＲ活性化における抗ＥＧＦＲ抗体の効果を調査するために、ＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍細胞系およびヒト初代成熟ケラチノサイトを使用して、ウェスタンブロット分析を行った。手短に述べれば、細胞を、１ｅ６細胞／ウェルで、６ウェルプレートに播種し、通常培地で一晩培養した。細胞を洗浄し、３７℃で２時間、０．１％ＢＳＡを含有する無血清培地で飢餓状態にした。１０μｇ／ｍｌの抗体を細胞に添加し、混合物を、３７℃で３時間インキュベートした。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を混合物に添加し、１５分間、３７℃でインキュベートした。次に、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液中に溶解した。タンパク質溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を５％ＢＳＡでブロッキングし、抗ホスホチロシン抗体（クローン４Ｇ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、ＨＲＰ抱合型抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに、室温で１時間インキュベートし、再度洗浄した。ＥＣＬ（化学発光強化）システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、シグナルを検出した。各列に等量のタンパク質が充填されることを確実にするために、膜を剥がし、抗−β−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で再プローブした。
【０２３１】
図２に示されるように、ＥＧＦ刺激は、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞およびヒト初代ケラチノサイトの両方において、強いＥＧＦＲのリン酸化をもたらした。セツキシマブおよびパニツムマブでの細胞の処理は、ＥＧＦ誘発ＥＧＦＲリン酸化を強く阻害したが、一方で、本発明のＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲの活性化を完全には阻害しなかった。抗ＫＴＩ（Ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害剤）抗体（ＡＴＣＣから入手したハイブリドーマにより生成）を、陰性対照として使用した。
実施例４
ＥＧＦＲ抗体の作動活性
【０２３２】
ＥＧＦＲリガンドの非存在下におけるＥＧＦＲシグナル伝達に対する本発明のＥＧＦＲ抗体の効果を調査するために、ＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍細胞を、実施例５に記載の無血清培地において飢餓状態にした。細胞を、続いて、１０μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ抗体とともに、３７℃で３時間インキュベートした。陽性対照である未処理細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦとともに、３７℃で１５分間インキュベートした。タンパク質溶解物を調製し、実施例５に記載のように、ウェスタンブロットを使用して分析した。代表的な結果を、図３に示す。ＥＧＦ処理は、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞において、強いＥＧＦＲのリン酸化を明らかに誘発したが、一方で、本発明のＥＧＦＲ抗体は、リガンドの非存在下において、ＥＧＦＲシグナル伝達に影響を及ぼさなかった。
実施例５
リガンド結合の競合
【０２３３】
ＥＧＦＲシグナル伝達阻害の１つの機構は、リガンド結合の封鎖である。ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲへのリガンド結合を阻害するかどうかを試験するために、Ａ４３１細胞へのビオチン化ＥＧＦＲリガンドの結合を、抗ＥＧＦＲ抗体の存在下において、フローサイトメトリーによって測定した。ＴＧＦαのビオチン化は、製造業者の説明書に従って、ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ）を使用して、行った。ビオチン化ＥＧＦは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。競合アッセイの前に、ビオチン化リガンドの結合曲線を確立した。種々の濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＣ５０濃度（ＥＧＦおよびＴＧＦａに対して、それぞれ１．８ｎＭおよび１０ｎＭ）で、ビオチン化リガンドと事前に混合し、混合物を、細胞とともに、氷上で３０分間インキュベートした。続いて、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰＣ抱合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦｌｏｗＪｏプログラム（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットした。図４に示されるように、陰性対照抗体である抗ＫＴＩ抗体は、リガンド結合に影響を及ぼさなかったが、一方で、全ての抗ＥＧＦＲ抗体は、次のＥＣ５０（表１０）で、リガンド結合に競合した。
【表１０】
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【０２３４】
本発明のＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブと類似のＥＣ５０で、ＴＧＦａおよびＥＧＦ結合を妨害した（図４および表１０）。この結果は、リガンド誘発ＥＧＦＲシグナル伝達（実施例３）、およびヒト初代ケラチノサイトを含む、正常上皮細胞の成長（実施例６）に対する、セツキシマブおよび本発明のＥＧＦＲ抗体の差動的な効果を説明することはできない。
実施例６
ヒト初代ケラチノサイトおよび正常上皮細胞系の成長阻害アッセイ
【０２３５】
ヒトの皮膚の正常上皮基底細胞、消化管、および他の器官は、生理的にＥＧＦＲを発現する。これらの組織におけるＥＧＦＲシグナル伝達は、上皮細胞の成長に重要である。セツキシマブおよびパニツムマブ、ならびにエルロチニブおよびゲフィチニブ等の小型チロシンキナーゼ阻害剤によるＥＧＦＲシグナル伝達経路の破壊は、著しい皮膚毒性をもたらす。皮膚および他の上皮細胞における潜在毒性を模倣するために、ヒト初代ケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および非腫瘍原性乳房上皮細胞系であるＭＣＦ１０Ａ（ＡＴＣＣ）を使用する増殖アッセイを確立した。このアッセイにおいて、細胞を、製造業者により推奨される、１ウェルあたり１，５００〜２，０００細胞でＥＧＦＲリガンド含有培地に播種し、抗ＥＧＦＲ抗体とともに、３７℃で５日間インキュベートした。ケラチノサイトアッセイ（図５）において、細胞を、１ｎＭ  ＥＧＦの存在下で、種々の濃度の抗体とともに成長させた。一方で、ＭＣＦ１０Ａ細胞アッセイ（図６）においては、細胞を、１０ｎＭ  ＥＧＦの存在下で、固定濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗体とともに成長させた。細胞増殖のレベルを、実施例１に記載のように、比色分析ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ロックビル，メリーランド州）を使用して判定した。生存率を計算した。各処理済み試料の値を、未処理細胞を有するウェルの平均値で除すことによって、生存率を計算した（生存率＝（Ａ４５０処理済み試料−Ａ４５０バックグラウンド）／（Ａ４５０未処理試料−Ａ４５０バックグラウンド））。結果を、０が、ＥＧＦの非存在下における細胞増殖のレベルを示し、１が、いずれの抗ＥＧＦＲ抗体処理も有さない、ＥＧＦの存在下における細胞増殖のレベルを示すように、正規化した。
【０２３６】
ヒト初代ケラチノサイト、ならびにＭＣＦ１０Ａ細胞への抗ＥＧＦＲ抗体の結合を、増殖アッセイを行う前に確認した。ケラチノサイト増殖アッセイの代表的な結果を、図５に示す。毒性プロファイルから予想されるように、セツキシマブおよびパニツムマブは、セツキシマブについては４０％、パニツムマブについては７８％の最大阻害を伴って、用量依存的様式でケラチノサイトの増殖を強く阻害した。驚くべきことに、本発明のＥＧＦＲ抗体は、陰性対照であるキメラＫＴＩ抗体と同様に、ケラチノサイトに対する影響をほとんど有さなかったか、または全く有さなかった。この結果は、ＭＣＦ１０Ａ増殖アッセイにおいて確認した（図６）。セツキシマブおよびパニツムマブは、ＭＣＦ１０Ａ細胞増殖を強く阻害したが、一方で本発明のＥＧＦＲ抗体は、ＭＣＦ１０Ａ細胞成長に対する影響をほとんど有さなかったか、または全く有さなかった。これらのデータは、本発明のＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲを発現する正常上皮細胞に対して、セツキシマブおよびパニツムマブよりも毒性が低いことを示唆する。
実施例７
ＨＣＣ８２７およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞系の基底増殖の阻害
【０２３７】
腫瘍細胞の基底増殖の阻害における、抗ＥＧＦＲ抗体の能力を判定するために、ＥＧＦＲを発現するＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣ）およびＮＣＩ−Ｈ２９２（ＡＴＣＣ）肺腫瘍細胞系を用いた増殖アッセイを確立した。細胞を、１０％ＦＢＳを含有する通常成長培地に１ウェルあたり２，０００細胞で播種し、３７℃で５日間、種々の濃度の抗ＥＧＦＲ抗体の存在下において、成長させた。細胞増殖のレベルを、比色分析ＷＳＴ−８アッセイを使用して判定した。ＯＤ結果を、生存率１が、抗ＥＧＦＲ抗体なしの通常成長培地で成長した細胞を表し、０が、細胞なしのウェルの値を表すように、正規化した。
【０２３８】
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、ＨＣＣ８２７およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を用いた、代表的な増殖アッセイ結果を示す。ＨＣＣ８２７細胞系（図７Ａ）においては、セツキシマブは、用量依存的様式で、腫瘍細胞の成長を強く阻害した。ＥＧＦＲを発現する正常上皮細胞には無害であるにも関わらず、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブと同様か、またはそれよりも優れた阻害活性を示した。表１１は、各抗体のＥＣ５０および最大阻害％を示す。
【表１１】
2015143271.tif 000028
【０２３９】
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞系（図７Ｂ）においては、セツキシマブおよびパニツムマブは、用量依存的様式で、基底細胞増殖を強く阻害した。本発明のＥＧＦＲ抗体もまた、最大増殖阻害が、セツキシマブおよびパニツムマブであり、この細胞系において著しく活性であった。表１２は、各抗体のＥＣ５０および最大阻害％を示す。
【表１２】
2015143271.tif 000029
【０２４０】
これらのデータは、本発明のＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲ過剰発現細胞において、セツキシマブおよびパニツムマブと同様に活性でありながらも、正常上皮細胞の成長には影響を及ぼさないことを強く主張する。
実施例８
抗ＥＧＦＲ抗体結合競合
【０２４１】
抗ＥＧＦＲ抗体の結合エピトープを区別するために、フローサイトメトリーを使用して、抗体結合競合アッセイを行った。この実験において、０．３ｎＭビオチン化５２８（図８Ａ）、０．２ｎＭビオチン化セツキシマブ（図８Ｂ）、および０．２ｎＭビオチン化ＥＧＦＲ−７抗体（図８Ｃ）のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞への結合を、種々の濃度の「競合する」抗体の存在下において、測定した。手短に述べれば、ビオチン化抗体を、種々の濃度の「競合する」抗体と、事前混合した。抗体混合物を、次に、細胞とともに、氷上で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン−アレクサ４８８抱合体とともに、氷上で１時間インキュベートした。洗浄後、細胞を固定し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットし、１００％が、他の抗体の非存在下におけるビオチン化抗体の最大結合を表し、０％が、ビオチン化抗体の非存在下におけるバックグラウンド染色を表すように、正規化した。図８に示されるように、全てのＥＧＦＲ抗体は、互いに競合する。セツキシマブおよびパニツムマブは、裸の５２８抗体と同程度の強さで５２８抗体結合と競合したが、一方で本発明のＥＧＦＲ抗体は、５２８抗体と競合する能力が、わずかに低かった（図８Ａ）。全てのＥＧＦＲ抗体は、類似の様式で、セツキシマブおよびＥＧＦＲ−７ビオチン化抗体の結合と、競合した（図８Ｂおよび８Ｃ）。
実施例９
ＥＧＦＲ抗体のＶＬおよびＶＨ領域のクローニングおよび配列決定ＥＧＦＲ抗体
【０２４２】
全細胞ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡｇｅｎ）を使用して、５×１０６細胞のＥＧＦＲハイブリドーマから調製した。ｃＤＮＡを、続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡから合成した。
【０２４３】
ハイブリドーマ細胞由来のｃＤＮＡにおける、１回目の縮重ＰＣＲ反応のための手順は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３３：１６７−７７）およびＣｏ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−５４）に記載の方法に基づいたものであった。ＶＨ配列を、次の縮重プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。ＥｃｏＭＨ１  ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ（配列番号５９）、ＥｃｏＭＨ２  ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号６０）、およびＢａｍＩｇＧ１  ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号６１）。ＶＬ配列を、次の縮重プライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した。ＳａｃＩＭＫ  ＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号６２）およびＨｉｎｄＫＬ  ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号８５）。（混合基は、次のように定義する。Ｎ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ）。ＰＣＲ反応混合物を、次に、１％低融点アガロース上に流し、３００〜４００ｂｐのバンドを切除し、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡミニカラムを使用して精製し、配列決定のため、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送った。それぞれの５’および３’ＰＣＲプライマーを配列決定プライマーとして使用して、両方向から可変領域ｃＤＮＡを生成した。ＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列決定の結果から、予想した。
【０２４４】
ＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用した縮重プライマーは、５’末端配列を変化させるため、完全な配列を検証するために、さらなる配列決定の努力が必要であった。抗体配列が由来する、マウスの生殖細胞系配列について、ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を検索するために、予備ｃＤＮＡ配列を使用した。ＰＣＲプライマーを、次いで、この新しいＰＣＲ反応が、ＰＣＲプライマーによって変化されていない完全な可変領域ｃＤＮＡ配列をもたらすように、マウス抗体の生殖細胞系結合型リーダー配列とアニーリングするように設計した。ＰＣＲ反応、バンド精製、および配列決定を、上述のように行った。
配列確認のための質量決定
【０２４５】
可変領域のｃＤＮＡ配列情報を、生殖細胞系の定常領域配列と合わせ、全長抗体ｃＤＮＡ配列を得た。次に、重鎖および軽鎖の分子量を計算し、マウスＥＧＦＲ抗体のＬＣ／ＭＳ分析によって得られた分子量と比較した。分子量測定値は、ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２両方の軽鎖および重鎖のｃＤＮＡ配列と一致する。
ＥＧＦＲ−７変異体の複合ＣＤＲ配列
【０２４６】
多数のマウス抗ＥＧＦＲハイブリドーマに配列決定を行い、ＥＧＦＲ−７とほぼ同一の軽鎖および重鎖可変領域配列を有する抗体を発現するが、いくつかのＣＤＲアミノ酸置換を、特に重鎖ＣＤＲ２に有することが見出された（図９）。マウスＥＧＦＲ−７のこれらのＣＤＲ変異体は、機能的に同一であることが見出されたため、それらは、ＥＧＦＲ−７のＣＤＲのものの配列の柔軟性に、いくらかの構造的見識を提供する。軽鎖ＣＤＲ２および３、ならびに重鎖ＣＤＲ１は、変異体のそれぞれにおいて同一であるが、一方で単一の残基置換が、軽鎖ＣＤＲ１および重鎖ＣＤＲ３において低頻度で見られた。明らかに緊密な配列保存を有するＣＤＲのものとは対照的に、ＥＧＦＲ−７の変異体は、重鎖ＣＤＲ２に、４つ程度のアミノ酸置換を頻繁に含んだ。ＥＧＦＲ−７のこれらの配列変異体は、５つの緊密に保存されたＣＤＲのものは、ＥＧＦＲ結合の構造的基礎を提供し得るが、一方で重鎖ＣＤＲ２は、親和性成熟の際に体細胞突然変異ホットスポットをもたらす、いくらかの配列柔軟性を有することを示唆する。表４は、ヒト化について上述のＣＤＲ変異体とともに、ＥＧＦＲ−７変異体に基づいて列挙される、複合ＣＤＲ配列を提供する。これらの複合ＣＤＲのものに由来するヒト化抗体は、ＥＧＦＲ−７の機能的特性を維持することが予想される。
【表１３】
2015143271.tif 000030
実施例１０
抗体のヒト化
【０２４７】
ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体を、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９−９７３（１９９４）およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５−９０４（１９９６）等、前述の表面再構成方法に従って、ヒト化した。表面再構成は、一般的に、軽鎖および重鎖両方における可変領域フレームワーク表面残基の識別、ならびにそれらをヒトの同等物で置き換えることを伴う。マウスＣＤＲのものは、表面再構成した抗体において保持される。ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体の例示的なＣＤＲは、表１３に示されるように定義される。ＣＤＲのものに分類されるリジンを抱合する影響についての懸念を最小化するために、マウスＥＧＦＲ−７抗体の軽鎖ＣＤＲ１中のリジン２４を、軽鎖ＣＤＲ１の両形態が得られるように、アルギニンでヒト化形態１．０（斜体で示される）に置き換えた。同様に、マウスＥＧＦＲ−１２抗体の軽鎖ＣＤＲ１中のリジン２７および３１を、それぞれ、グルタミンおよびアルギニンで、ヒト化形態１．０（斜体で示される）に置き換えた。アルギニンの代わりにグルタミンでのリジン２７を置き換えるのは、グルタミンが、この位置で、ヒト生殖細胞系配列に確保されるためである。表面再構成に採用されるＡｂＭ重鎖ＣＤＲ２の定義に加えて、この表は、ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体のマウスおよびヒトの両方の形態に対する、例示的なＫａｂａｔ定義された重鎖ＣＤＲ２のものを提供する。下線の配列は、表面再構成のためのＣＤＲと見なされなかったＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ２の位置を示す。
【０２４８】
表面残基位置を、３０％以上の相対的なアクセス可能性を有する任意の位置として定義した（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  Ｊ．Ｔ．ｅｔ．Ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４；２３５：９５９−９７３）。計算した表面残基を、次に、ヒト生殖細胞系表面配列と配列比較し、最も相同であるヒト表面配列を識別した。ＥＧＦＲ−７抗体の軽鎖可変ドメインの置き換え表面として使用したヒト生殖細胞系配列は、ＩＧＫＶ１−１２＊０１であったが、一方でＩＧＫＶ１−１６＊０１を、ＥＧＦＲ−１２抗体のＶＬの置き換え表面として使用した。ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体の重鎖可変ドメインの置き換え表面として使用したヒト生殖細胞系配列は、それぞれ、ＩＧＨＶ１−６９＊０２およびＩＧＨＶ１−６９＊０８であった。ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体の特定のフレームワーク表面残基の変化を、それぞれ、図１０および１１に提供する。両方の抗体の表面再構成した軽鎖は、好ましい形態にＣＤＲ１リジン置換（複数を含む）を含んだため、表面再構成形態（ｖ１．０１）はまた、マウスのリジン（複数を含む）がＣＤＲ−Ｌ１に保持された状態で得られた。最後に、マウスＥＧＦＲ−７およびその変異体の重鎖フレームワーク２は、不対システイン残基をもたらす体細胞Ｗ４７Ｃ突然変異を含んだ。この理由のために、ＥＧＦＲ−７重鎖Ｗ４７生殖細胞系の復帰突然変異体形態（ｖ１．１１）もまた、試験した。図１２は、ＥＧＦＲ−７およびＥＧＦＲ−１２抗体の軽鎖および重鎖両方の可変ドメインの表面再構成した配列の、それらのマウス対応物との配列比較を示す。
【表１４】
2015143271.tif 000031
【０２４９】
可変ドメインの表面再構成によるヒト化に加えて、ＥＧＦＲ−７抗体はまた、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：６０４−６０８（１９８６）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）等に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）移植技術に従って、ヒト化した。ＣＤＲ移植方法は、自然に進化したマウス抗体由来のＣＤＲを、ヒト抗体のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することから構成される。プロセスの主要なステップは、適切なヒトアクセプターフレームワークを選択することであった。Ｋａｂａｔの番号付けスキームおよびＫａｂａｔのＣＤＲ定義を、ＥＧＦＲ−７抗体のＣＤＲ移植に使用した。ＣＤＲ移植のためのＥＧＦＲ−７抗体の例示的なＣＤＲは、表１５に示されるように定義される。マウスＥＧＦＲ−７抗体と最も高い相同性を有するヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列を、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２０７−２０９（２００１）に記載のように、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）の相互作用ツールＶ−ＱＵＥＳＴを通じて、識別した。ＥＧＦＲ−７抗体のＶＬおよびＶＨドメインのアクセプターフレームワークとして使用したヒト生殖細胞系配列は、それぞれ、ＩＧＫＶ１−３３＊０１およびＩＧＨＶ１−４６＊０３であった。ＣＤＲのものに分類されるリジンを抱合する影響についての懸念を最小化するために、マウスＥＧＦＲ−７抗体の軽鎖ＣＤＲ１におけるリジン２４を、ＣＤＲ移植の際に、アルギニンで置き換えた（表６）。特定のフレームワーク残基の変化、ならびにＥＧＦＲ−７抗体のＣＤＲ移植におけるＣＤＲ−Ｌ１の置換を、図１３に提供し、ＥＧＦＲ−７抗体の可変ドメインのＣＤＲ移植した配列と、そのマウスの対応物との配列比較を、図１４に図示する。
【表１５】
2015143271.tif 000032
ヒト化ＥＧＦＲ抗体の組み換え発現
【０２５０】
ｈｕＥＧＦＲ−７およびｈｕＥＧＦＲ−１２の可変領域配列を、コドン最適化し、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって合成した。配列は、単鎖の哺乳動物発現プラスミド内のそれぞれの定常配列とのインフレームクローニングのために、制限酵素部位が両側に隣接している。軽鎖可変領域を、ｐＡｂＫＺｅｏプラスミド中のＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩ部位にクローニングした。重鎖可変領域を、ｐＡｂＧ１Ｎｅｏプラスミド中のＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａ１部位にクローニングした。これらのプラスミドは、一過的または安定いずれかの哺乳動物細胞のトランスフェクションにおいて、組み換え抗体を発現するために使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において組み換え抗体を発現するための一過的トランスフェクションを、修正したＰＥＩ手順を使用して行った（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：Ｅ９（２００２））。上清を、マウス抗体について上述した標準的な手順を使用して、タンパク質Ａおよびポリッシングクロマトグラフィーステップによって精製した。
実施例１１
マウス抗ＥＧＦＲ抗体とヒト化抗ＥＧＦＲ抗体との間の結合競合
ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体の結合を試験するために、抗体競合アッセイを、実施例８に記載のように行った。ｍｕＥＧＦＲ−６およびｍｕＥＧＦＲ−７抗体は、互いに競合し合うため（図８Ｃ）、この実験は、ＥＧＦＲ−６（図１５Ａ）またはＥＧＦＲ−７（図１５Ｂ）のマウスまたはヒト化抗体が、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞へのビオチン化ｍｕＥＧＦＲ−７抗体の結合と競合する能力を試験する。手短に述べれば、１ｎＭのビオチン化ｍｕＥＧＦＲ−７抗体を、種々の濃度の「競合する」抗体と事前混合した。抗体混合物を、次に、標的細胞とともに、氷上で１時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰＣ抱合体とともに、氷上でさらに１時間インキュベートし、洗浄し、固定して、フローサイトメーターを使用して分析した。幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットし、１００％が、他の抗体の非存在下におけるビオチン化抗体の最大結合を表し、０％が、ビオチン化抗体の非存在下におけるバックグラウンド染色を表すように、正規化した。図１５Ａに示されるように、ｍｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−６両方の抗体は、類似のＥＣ５０（ｍｕＥＧＦＲ−６について８．１３ｎＭおよびｈｕＥＧＦＲ−６について１１．０９ｎＭ）で、ｍｕＥＧＦＲ７の結合と競合する。図１５Ｂは、ｍｕＥＧＦＲ−７、ｈｕ−ＥＧＦＲ−７、およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体もまた、類似のＥＣ５０（ｍｕＥＧＦＲ７について３．５４ｎＭ、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒについて３．３５ｎＭ、およびｈｕＥＧＦＲ−７について４．１２ｎＭ）で、ｍｕＥＧＦＲ−７抗体結合と競合することを示す）。これらの結果は、ヒト化が、本発明の抗体の結合に影響を及ぼさないことを示す。
ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性
【０２５１】
本発明のヒト化抗体の抗腫瘍活性を試験するために、Ｈ２９２腫瘍細胞成長阻害アッセイを、実施例７に記載のように行った。図１６に示されるように、ＥＧＦＲ−６およびＥＧＦＲ−７のマウスおよびヒト化抗体は、表１６に含まれるＥＣ５０で、Ｈ２９２腫瘍細胞成長に効力を有した。全てのヒト化抗体が、マウス対応物の抗腫瘍活性を維持し、これらの抗体の生物学的活性に影響を及ぼさないことは明らかである。
【表１６】
2015143271.tif 000033
実施例１２
ｈｕＥＧＦＲ抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性
【０２５２】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイを使用して、新たに単離したヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として用いて、腫瘍細胞系の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を測定した（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  ２７６（９）：６５９１−６０４）。ＮＫ細胞を、まず、ＮＫ細胞単離キットＩＩ（＃１３０−０９１−１５２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，オーバーン，カリフォルニア州）の修正したプロトコルを使用して、正常ドナーのヒト末梢血から単離した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ブライトン，マサチューセッツ州）。末梢血を、１倍ＰＢＳで２倍希釈した。２５ｍＬの希釈した血液を、５０ｍＬの円錐管中で、２５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ上に注意深く重ね、４００ｇで４５分間、室温で遠心分離した。末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）を、界面から収集し、新しい５０ｍＬの円錐管に移し、１倍ＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＭＣを計数し、２．５×１０７細胞／１００μｌの濃度において、ＭＡＣＳ緩衝液（１倍ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で再懸濁し、続いて、１／４倍体積のＮＫ細胞ビオチン−抗体カクテルを、細胞懸濁液に添加した。ＮＫ細胞ビオチン−抗体カクテルは、ＮＫ細胞を除いてリンパ球に結合し、ＮＫ細胞の陰性選択をもたらす、ビオチン化した抗体を含有する。混合物を、４℃で１０分間インキュベートし、次いで、３／５倍体積のＭＡＣＳ緩衝液および２／５体積のビオチン化抗体に結合するであろうＮＫ細胞ＭｉｃｒｏＢｅａｄカクテルを、添加した。細胞−抗体混合物を、４℃でさらに１５分間インキュベートした。次に、細胞を５０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。ＮＫ細胞を、自動ＭＡＣＳ分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、陰性分画として分離した。結果として得られたＮＫ細胞を、一晩、３０ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１％１００Ｘ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を補充したＲＰＭＩ−１６４０）に蒔いた。後続のアッセイおよび全ての希釈は、ＲＨＢＰ培地（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地）において行った。
【０２５３】
ＲＨＢＰ培地中の種々の濃度の抗体を、５０μＬ／ウェルで、丸底９６ウェルプレート中に２通りにアリコートした。標的細胞（この実験においては、Ａ４３１細胞系）を、１０６細胞／ｍＬで、ＲＨＢＰ培地に再懸濁し、１００μＬ／ウェルで、抗体希釈物を有する各ウェルに添加した。標的細胞および抗体希釈物を含有するプレートを、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＮＫ細胞を、５０μＬ／ウェルで、標的細胞を含有するウェルに添加した。典型的な比率は、１個の標的細胞対３〜４個のＮＫ細胞であった。次の対照を、各実験のために準備した。ＮＫ細胞単独、標的細胞単独（自発的ＬＤＨ放出）、ＮＫ細胞と標的細胞（抗体非依存性ＬＤＨ放出）、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する標的細胞（最大ＬＤＨ放出）。混合物を、細胞溶解を可能にするために、３７℃で４時間インキュベートした。プレートを、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００μＬの上清を、新しい平底９６ウェルプレートに注意深く移した。細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ  １  ６４４  ７９３）からのＬＤＨ反応混合物（１００μＬ／ウェル）を、各ウェルに添加し、室温で５〜３０分間インキュベートした。試料の光学密度（ＯＤ）を、４９０ｎｍ（ＯＤ４９０）で測定した。各試料の特異的溶解パーセントを、次の式を使用して判定した。特異的溶解パーセント＝（試験値−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）×１００。
【０２５４】
図１７は、ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体の代表的なＡＤＣＣ活性を、ｃｈＫＴＩ抗体のものと比較して示す。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、最大特異的殺滅がおおよそ２０％、ならびにｈｕＥＧＦＲ６およびｈｕＥＧＦＲ−７ＲのＥＣ５０が、それぞれ２２ｎｇ／ｍｌおよび１７ｎｇ／ｍｌに達し、用量依存的に、ＮＫ細胞媒介性の標的細胞殺滅を誘発した。対照的に、標的細胞に結合しなかったｃｈＫＴＩ抗体は、ＡＤＣＣの媒介に失敗した。
実施例１３
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の調製
【０２５５】
（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）リンカーを、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に溶解した。ｈｕＥＧＦＲ抗体を、５ｍｇ／ｍＬの抗体を、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中において、１０モル過剰のＳＭＣＣとともに、インキュベートすることによって、ＳＭＣＣで修飾して、抗体にマレイミドを導入した。周辺温度でおおよそ１００分後、反応混合物を、同じリン酸カリウム緩衝液で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。分画を有する抗体をプールし、後続のステップに使用した。
【０２５６】
ＳＭＣＣ修飾した抗体を、マレイミドリンカーに対して、１．７のモル過剰で、１０ｍＭのＤＭ１溶液と反応させた。反応物を、周辺温度下で、おおよそ１８時間攪拌した。抱合反応混合物を、ｐＨ６．５の１倍ＰＢＳで平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５ゲル濾過カラムを通じて濾過した。ｈｕＥＧＦＲ抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体を、次いで、１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロース、ｐＨ５．５を含有する緩衝液中に、透析した。１個の抗体分子あたりの結合したＤＭ１分子の数を、既に報告された抗体およびＤＭ１の減衰係数を使用して、判定した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，８６１８−８６２３（１９９６））。抱合反応後に存在する遊離マイタンシノイドの割合は、２０〜５０μｇの抱合体を、１００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０中、２５％アセトニトリル中で平衡化したＨｉＳｅｐカラムに注入し、アセトニトリル中に溶出することによって判定した。全遊離マイタンシノイド種のピーク面積（勾配において溶出し、既知の標準物との溶出時間の比較によって識別）を、波長２５２ｎｍに設定した吸光度検出器を使用して測定し、結合マイタンシノイド（カラムのフロースルー分画における抱合体ピーク中に溶出）に関連するピーク面積と比較して、全遊離マイタンシノイド種の割合を計算した。１個のｈｕＥＧＦＲ抗体につき３．５〜４個のＤＭ１分子を有する抱合体を、１％未満が未抱合マイタンシノイドとして存在する状態で、得た。
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
【０２５７】
例示的なＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカーを、エタノール中に溶解した。ｈｕＥＧＦＲ抗体を、８ｍｇ／ｍＬで、５．５〜５倍のモル過剰ＳＰＤＢリンカーとともに、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および３％エタノールを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で、おおよそ２時間室温でインキュベートした。ＳＰＤＢ修飾した抗体を、ｐＨ６．５のＰＢＳ中で２倍に希釈し、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中のＤＭ４の濃溶液（１５〜３０ｍＭ）の添加によって、１．５倍のモル過剰マイタンシノイドＤＭ４で修飾した。室温で一晩インキュベートした後、抱合した抗体を、１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％スクロース、ｐＨ５．５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆ上のクロマトグラフィーによって精製した。１個の抗体分子あたりの結合したＤＭ４分子の数を、既に報告した、抗体およびマイタンシノイドの減衰係数を使用して判定した（Ｗｉｄｄｉｓｏｎ
ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，４９：４３９２−４４０８（２００６））。全遊離マイタンシノイド種の割合を、上述のように判定した。１個のｈｕＥＧＦＲ抗体につき３．５〜４個のＤＭ４分子を有する抱合体を、１％未満が未抱合マイタンシノイドとして存在する状態で、得た。
実施例１４
マイタンシノイド抱合体の結合親和性
【０２５８】
ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体のマイタンシノイド抱合体の結合親和性を、実施例２に記載のように、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞を使用して、裸の抗体のものと比較した。ｈｕＥＧＦＲ−６抗体および抱合体の結合曲線から計算したＫｄ（図１８Ａ）は、裸のｈｕＥＧＦＲ−６抗体については０．８１ｎＭであり、ｈｕＥＧＦＲ−６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体については１．１８ｎＭであった。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体および抱合体の結合曲線から計算したＫｄ（図１８Ｂ）は、裸のｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体については０．６７ｎＭであり、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体については０．８３ｎＭであった。このデータは、ＤＭ抱合が、ｈｕＥＧＦＲ抗原に対するｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体の結合親和性を著しく改変しないことを示す。
実施例１５
腫瘍細胞に対するインビトロ細胞毒性アッセイ
【０２５９】
ＥＧＦＲ抗体マイタンシノイド抱合体が腫瘍細胞成長を阻害する能力を、インビトロ細胞毒性アッセイを使用して測定した。手短に述べれば、標的細胞を、１ウェルあたり１，５００〜３，０００個の細胞で、１０％ＦＢＳを含有する１００μＬの完全ＲＰＭＩ培地に蒔いた。抱合体を、５倍連続希釈を使用して、完全ＲＰＭＩ培地中に希釈し、１ウェルあたり１００μＬを添加した。最終濃度は、典型的に、３×１０−８Ｍ〜８×１０−１４Ｍの範囲であった。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で５日間インキュベートした。残存細胞の生存率を、比色分析ＷＳＴ−８アッセイを使用して判定し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を、多重ウェルプレートリーダーにおいて測定した。各処理試料の値を、未処理対照の平均値で除すことによって、生存率を計算した。生存率を、各処理について、片対数プロットで、抗体−抱合体の濃度に対してプロットした。
【０２６０】
本発明の裸の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体のインビトロ細胞毒性を、ｃｈＫＴＩおよびｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１等の非特異性抗体およびその対応するマイタンシノイド抱合体の活性と比較した。典型的な細胞毒性アッセイから得られた結果を、図１９および２０に示す。
【０２６１】
図１９Ａにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイドの抱合体の活性を、ＦａＤｕ細胞系において試験した。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体は、それぞれ、４０％および５５％のＨ２９２細胞成長を阻害したが、一方で、ｃｈＫＴＩ抗体は活性を有さなかった。マイタンシノイド抱合は、本発明のＥＧＦＲ抗体の活性を、さらに強化した。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの両方のＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体が、それぞれ、０．２２ｎＭおよび０．０６ｎＭのＥＣ５０で、標的細胞を完全に破壊した。対照ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体もまた、標的細胞を殺滅したが、ＥＣ５０はかなり低かった０．５９μＭ）。
【０２６２】
図１９Ｂにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイド抱合体の活性を、Ｈ２９２細胞系において試験した。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体は、６０〜７０％のＨ２９２細胞成長を阻害したが、一方で、ｃｈＫＴＩ抗体は、活性を有さなかった。マイタンシノイド抱合は、本発明のＥＧＦＲ抗体の活性を、さらに強化した。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの両方のＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体が、それぞれ、０．１６ｎＭおよび０．０３ｎＭのＥＣ５０で、標的細胞を完全に破壊した。対照ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体もまた、標的細胞を殺滅したが、ＥＣ５０はかなり低かった（３８．５１ｎＭ）。
【０２６３】
図２０Ａにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイド抱合体の活性を、Ｈ２２６細胞系において、セツキシマブと比較した。セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−６、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体、ならびにｃｈＫＴＩ対照抗体は、抗増殖活性を有さなかった。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの両方の抗体のマイタンシノイド抱合体は、それぞれ、０．６８ｎＭおよび０．１４ｎＭのＥＣ５０で、標的細胞を完全に排除したが、一方で、対照ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体は、標的細胞の殺滅に失敗した。
【０２６４】
図２０Ｂにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイド抱合体の活性を、ＳＣＣ−４細胞系において、セツキシマブと比較した。セツキシマブ、ｈｕＥＧＦＲ−６、およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体は、最大阻害がおおよそ３０％で、用量依存性の成長阻害を示したが、一方で、ｃｈＫＴＩ抗体は、活性を有さなかった。マイタンシノイド抱合は、本発明のＥＧＦＲ抗体の活性を、さらに強化する。ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの両方のＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体は、それぞれ、０．０７ｎＭおよび０．０３ｎＭのＥＣ５０で、標的細胞を完全に排除した。対照ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体もまた、標的細胞を殺滅したが、ＥＣ５０はかなり低かった（１７．６２ｎＭ）。要約すると、これらの結果は、マイタンシノイド抱合が、本発明のＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性を、劇的に強化することを示す。
実施例１６
ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、ならびにマイタンシノイド抱合体を比較したインビボ効果研究
ｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体の、裸の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体の活性を、ＥＧＦＲ発現Ｈ２９２ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）（図２１）およびＦａＤｕ  ＳＣＣＨＮ（頭頸部の扁平上皮細胞癌腫）（図２２）の腫瘍異種移植片モデルにおいて試験した。１×１０７個の腫瘍細胞を、ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍がおおよそ１００ｍｍ３の平均体積に達したときに、動物を、腫瘍体積によって治療群に無作為化し、指定用量の裸の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体を１回注入した。各治療群の平均腫瘍体積を、腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする（図２１および２２）。表１７および１８は、完全寛解（ＣＲ）（触知可能な腫瘍がない）を有するマウスの数、および対照群の腫瘍体積が、所定の寸法に達した際に、各治療群の腫瘍体積の平均を対照群の平均腫瘍体積で除したものに相当する、腫瘍成長阻害率（Ｔ／Ｃ％）を示す。４２％未満のＴ／Ｃ％値を有する治療を、活性であると見なし、一方で、１２％未満のＴ／Ｃ％値を有する治療を、高く活性であると見なす。
【０２６５】
本発明の裸の抗体および抗体マイタンシノイド抱合体は、非常に活性であり、それらは、Ｈ２９２およびＦａＤｕの両方の腫瘍異種移植片の成長を、有意に遅延させた（図２１および２２）。Ｈ２９２腫瘍異種移植片研究（図２１および表１７）において、３ｍｇ／ｋｇ程度のｈｕＥＧＦＲ−６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体で治療した全てのマウスは、完全寛解を示した。１０ｍｇ／ｋｇでのｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体でさえも、高く活性であった。ＦａＤｕ腫瘍異種移植片研究においては（図２２および表１８）、１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＥＧＦＲ−６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、高く活性であり、抗体−マイタンシノイド抱合体は、いくつかのマウスにおいて、完全寛解を伴って、なおもさらに活性であった。
【表１７】
2015143271.tif 000034
【表１８】
2015143271.tif 000035
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１を比較したインビボ効果研究
【０２６６】
裸の抗体、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体、およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１抱合体の活性を、ＥＧＦＲ発現Ｈ２９２ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）（図２５）、ＨＳＣ２  ＳＣＣＨＮ（頭頸部の扁平上皮細胞癌腫）（図２６）およびＦａＤｕ  ＳＣＣＨＮ（図２７）腫瘍異種移植片モデルにおいて、試験した。実験およびデータ分析は、上述のように行った。
【０２６７】
Ｈ２９２  ＮＳＣＬＣ腫瘍異種移植片研究（図２５および表１９）において、試験品目の全てが、３ｍｇ／ｋｇの単回投与で、高く活性であった。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１の両方の抱合体で治療した全てのマウスが、完全寛解を示したが、一方で、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体で治療したマウスは、一匹も完全寛解を有さなかった。ＨＳＣ２  ＳＣＣＨＮ腫瘍異種移植片研究においては（図２６および表２０）、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１の両方の抱合体が、８％のＴ／Ｃを有して高く活性であったが、一方で、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、５ｍｇ／ｋｇの単回投与で、ほとんど活性ではなかった。ＦａＤｕ  ＳＣＣＨＮ腫瘍異種移植片研究においては（図２７および表２１）、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＰＥＧ−ＭＡＬ−ＤＭ１の両方の抱合体は、それぞれ、１５％および２８％のＴ／Ｃを有して、活性であった。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体治療は、いくらかの腫瘍成長阻害を示したが、それは、著しく活性ではなかった。結論として、これらの結果は、本発明の裸の抗体は、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＣＨＮ腫瘍の成長の阻害に効力を有し、マイタンシノイドとの抱合が、抗腫瘍活性をさらに強化することを示す。
【表１９】
2015143271.tif 000036
【表２０】
2015143271.tif 000037
【表２１】
2015143271.tif 000038
実施例１７
ヒト初代ケラチノサイトにおけるインビトロ細胞毒性アッセイ
【０２６８】
ＥＧＦＲシグナル伝達は、ヒト初代ケラチノサイト増殖に重要な役割を果たす。小分子チロシンキナーゼ阻害剤またはセツキシマブ等の拮抗性抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、ケラチノサイト培養において、成長の停止およびアポトーシスをもたらす（Ｓｔｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６，１４９３−１４９９（１９９８））。ケラチノサイトのアポトーシスは、診療施設において抗ＥＧＦＲ療法によりもたらされる皮膚毒性の原因となる機構の１つであると考えられる。皮膚毒性の可能性を試験するために、本発明のＥＧＦＲ抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体を、ヒト初代ケラチノサイトを使用して、インビトロ細胞毒性アッセイにおいて試験した。手短に述べれば、ヒト初代ケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１ウェルあたり１，５００〜３，０００個の細胞で、製造業者に推奨される、１００μＬのＥＧＦを含有する培地に蒔いた。試験品目を、５倍連続希釈を使用して、ＥＧＦ含有培地中で希釈し、１ウェルにつき１００μＬを添加した。最終濃度は、典型的に、３×１０−８Ｍ〜８×１０−１４Ｍの範囲であった。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で５日間インキュベートした。残存細胞の生存率を、比色分析ＷＳＴ−８アッセイを使用して判定し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を、多重ウェルプレートリーダーにおいて測定した。各処理試料の値を、未処理対照の平均値で除すことによって、生存率を計算した。生存率を、各処理について、片対数プロットで、抗体−抱合体の濃度に対してプロットした。
【０２６９】
同じ実験において、ヒト初代ケラチノサイト（図２３Ａ）ならびにＨ２９２腫瘍細胞（図２３Ｂ）に対する、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体のインビトロ細胞毒性を、非特異性抗体（ｃｈＫＴＩ）、ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体、非拮抗性抗体（ｈｕＭＬ６６）、およびその対応するマイタンシノイド抱合体の活性と比較した。Ｈ２９２細胞系（図２３Ｂ）においては、ｈｕＭＬ６６抗体は活性を有さなかったが、一方で、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、細胞成長を最大５５％まで阻害した。ｈｕＭＬ６６およびｈｕＥＧＦＲ−７Ｒのマイタンシノイド抱合体が、最良の活性を有し、それらは、０．０５〜０．０７ｎＭのＥＣ５０で、腫瘍細胞成長を完全に阻害した。ヒト初代ケラチノサイト（図２３Ａ）において、ｃｈＫＴＩおよびｈｕＭＬ６６抗体は、ケラチノサイト増殖に対して影響を有さなかった。しかしながら、ｈｕＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、０．５５ｎＭのＥＣ５０で、ケラチノサイトの殺滅に非常に効力があった。ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体は、ケラチノサイトにほとんど影響を有さなかった。驚くべきことに、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体は、ｈｕＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１抱合体と比較して、ケラチノサイトに対して、毒性がはるかに低かった。３．３ｎＭの濃度で、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒの裸の抗体およびその対応する抱合体は、ケラチノサイトの成長を４０％未満で阻害しただけであった。要約すると、本発明の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体は、腫瘍細胞の排除には非常に効力がありながらも、ヒト初代ケラチノサイト細胞の成長にはほとんど影響を有しない。
実施例１８
ヒト初代ケラチノサイトによるケモカイン／サイトカイン生成
【０２７０】
主にケラチノサイトから構成される皮膚上皮は、樹枝状細胞、メラニン細胞、およびＴリンパ球、ならびに単球が散在しており、宿主防御に高く関与している。身体的、化学的、または免疫特異的損傷は、異なる白血球の亜集団を引き付けて活性化し、炎症反応を誘発する、ケモカインおよびサイトカインの発現の増加によって特徴付けられる、表皮反応を容易に引き起こす。ＴＮＦαは、ヒトケラチノサイトに、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ１０／ＩＦＮγ誘発性タンパク質１０、およびＣＸＣＬ８／ＩＬ−８を含む、多数のケモカインおよびサイトカインを発現させる。ＣＣＬ５は、Ｔ細胞、単球、ならびに好中球を引き付ける。ＣＸＣＬ１０は、１型Ｔ細胞の移動を誘発する。ＣＸＣＬ８は、好中球動員ならびに上皮および内皮細胞の増殖に活性な化学誘引物質である。
【０２７１】
ＥＧＦＲシグナル伝達は、恒常性の維持および上皮組織の修復を支配する。ＥＧＦＲの活性化は、ケラチノサイトの増殖、移動、および制御された分化をもたらす。ＴＮＦαに反応して、ケラチノサイトは、ＥＧＦＲシグナル伝達を活性化するＥＧＦＲリガンドを生成する。ケラチノサイトにおける強化されたＥＧＦＲ活性化は、ＣＸＣＬ８発現を増加させ、ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０の発現を減少させる。対照的に、ＥＧＦＲシグナル伝達の障害は、逆のパターンをもたらす。選択的ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の皮膚への適用は、表皮ＣＣＬ５およびＣＸＣＬ１０レベルの増加、ならびに皮膚中により多くの単球／マクロファージおよびＴ細胞を伴う、より重度の接触過敏性反応をもたらす。これらの発見は、ＥＧＦＲシグナル伝達が、ケラチノサイトにおけるケモカインの発現に影響を及ぼすことにより、皮膚炎症を調節することを示唆する（Ｐａｓｔｏｒｅ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：５０４７−５０５６（２００５））。現在では、ＥＧＦＲ療法の際に診療施設おいて現れた皮膚毒性は、皮膚におけるアポトーシスおよび持続した炎症によってもたらされると見られている。
【０２７２】
ヒト初代ケラチノサイトによるケモカイン／サイトカイン生成を調節することにおける、本発明の抗体および抗体−マイタンシノイド抱合体の効果を、次のインビトロアッセイにおいて試験した。１×１０５個のヒト初代ケラチノサイト／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、まず、６ウェルプレートに蒔いた。細胞を、一晩飢餓状態にし、次いで、ＥＧＦ含有培地において、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１０μｇ／ｍｌの試験抗体で、１４時間培養した。培養上清中のＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ８を、製造業者のプロトコルに従って、Ｒ＆ＤシステムのＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。図２４に示されるように、セツキシマブは、ＣＸＣＬ８の発現を減少させ、ＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５の生成を増加させた。対照的に、本発明の裸の抗体は、ｃｈＫＴＩ対照と比較すると、これらのケモカイン／サイトカインの発現に、影響を有さないか、またはほとんど有さなかった。驚くべきことに、本発明のＥＧＦＲ抗体のマイタンシノイド抱合体もまた、ケラチノサイトに対して影響を有さないか、またはほとんど有さなかった。要約すると、実施例１７および１８に示された結果は、本発明の抗体および抗体マイタンシノイド抱合体の両方が、インビトロにおいて、ヒト初代ケラチノサイトに対して最小の影響を有し、したがって、ヒトの皮膚に対する毒性がより低い傾向にあることを強く示唆する。ケラチノサイトへの影響とは対照的に、本発明の抗体および抗体マイタンシノイド抱合体は、実施例７、１２、１５、および１６に示されるように、インビトロおよびインビボにおいて、ＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞の殺滅には非常に効力が高い。要約すると、本発明の抗体および抗体細胞毒性剤抱合体は、正常細胞に対して、腫瘍細胞に対するものとは異なる効果を有する、独自のクラスの抗ＥＧＦＲ分子である。
実施例１９
エピトープのマッピング
【０２７３】
ヒトＥＧＦＲは、細胞外リガンド結合領域、単一の膜貫通領域、および非触媒調節領域が両側に隣接した細胞質チロシンキナーゼドメインを有する、大型（１１８６個の残基）のモノマー糖タンパク質である。ヒトＥＧＦＲ（残基１〜６１８）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、本明細書においてドメインＩ（アミノ酸１〜１６５）、ドメインＩＩ（アミノ酸１６６〜３０９）、ドメインＩＩＩ（アミノ酸３１０〜４８１）、およびドメインＩＶ（アミノ酸４８２〜６１８）と称される、４つのサブドメイン（図２８）を含む。これらのドメインはまた、Ｌ１、ＣＲ１、Ｌ２、およびＣＲ２とも称され、ＬおよびＣＲは、それぞれ、大型（Ｌａｒｇｅ）およびシステインリッチ（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ）の頭字語である。本発明のｈｕＥＧＦＲ−７Ｒのエピトープを、切断型およびキメラのヒト／マウスＥＧＦＲ分子を操作することによって、ヒトＥＧＦＲ  ＥＣＤドメインＩＩＩにおいて、主に、アミノ酸４６０〜４８０を含む規定領域にマッピングする。
ＥＧＦＲ変異体のクローニングおよび発現
【０２７４】
全長ヒトＥＧＦＲ  ＥＣＤ（アミノ酸１〜６１８）は、Ｆｃ融合タンパク質（ｈｕＥＧＦＲ−Ｆｃ）として発現される。タンパク質配列を、コドン最適化し、合成し、ｐｍｕＦｃ２ＡＮＬ哺乳動物発現ベクターにおいて、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって、マウスＩｇＧ２Ａヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を用いて、インフレームでクローニングした。本発明の抗体は、ＥＧＦＲに結合するセツキシマブと競合し（図８Ｂ）、セツキシマブがドメインＩＩＩに排他的に結合するため、本発明の抗体のエピトープもまた、ドメインＩＩＩ内に位置し、セツキシマブのものと重なり得る。エピトープをさらに識別するために、全ドメインＩＩＩ（アミノ酸３１０〜４８１）に加えて、ドメインＩＶ（アミノ酸４８２〜５０１）からの２０個の余剰残基を含む、セツキシマブの結合に必要とされることが示唆される、切断したヒトＥＧＦＲのＦｃ融合（ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）を、ｈｕＥＧＦＲ−Ｆｃと同様に構築した。さらに、アミノ酸３１０〜５０１を含む切断したマウスＥＧＦＲ（ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）、およびアミノ酸４６０〜４８１をコードするヌクレオチド配列が、ヒトＥＧＦＲの配列で置き換えられたマウスＥＧＦＲアミノ酸３１０〜５０１を含むキメラ形態のｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃもまた、同様に、Ｆｃ融合タンパク質として発現されるように構築した（図２９）。ｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ構築物は、残基４６０、４６１、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、および４７８〜４８０を含む、１０個のアミノ酸のそれらのヒト対応物への突然変異から構成される。ＥＧＦＲ  ＥＣＤ  Ｆｃタグ化タンパク質の全ては、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを解して発現され、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して、トランスフェクトされた細胞の上清から精製される。
種々のＥＧＦＲ  ＥＣＤ−Ｆｃ構築物への抗体結合  
【０２７５】
ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒを、上述の種々のＥＧＦＲ−Ｆｃ構築物への結合について、ＥＬＩＳＡフォーマットで試験した。図３０に示されるように、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ−Ｆｃ）およびヒトＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）の両方に、類似の親和性で結合する。図３０はまた、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体が、ヒト受容体との高い配列相同性にも関わらず（ドメインＩＩＩにおいて８８％の配列同一性）、事実上マウスＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）を認識しないことを示す。さらに、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体は、位置４６０、４６１、４６７、４６８、４７１、４７３、４７４、および４７８〜４８０における１０個のアミノ酸がそれらのヒト対応物に突然変異された、主としてマウスＥＧＦＲドメインＩＩＩ配列を含む、ヒト／マウスＥＧＦＲキメラ（ｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）に結合する（図３０）。これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体が、ヒトＥＧＦＲのドメインＩＩＩに排他的に結合し、結合エピトープは、大部分がアミノ酸位置４６０〜４８０内に限定されることを示す。ｈｕＥＧＦＲの別の切断形態への結合親和性を比較すると、ｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩ−ＦｃへのｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体の結合親和性に、ｈｕＥＧＦＲおよびｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩと比較して、おおよそ２倍の減少が存在することが明らかであり、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体のエピトープが、位置４６０〜４８０以外のさらなるアミノ酸残基から構成されることを示唆する。このデータは、ｍｕＥＧＦＲ−７抗体の結合結果で確認した（図３２）。
【０２７６】
同時に、ｈｕＥＧＦＲ−６（図３１）、ｍｕＥＧＦＲ−６（図３３）、ｍｕＥＧＦＲ−１２（図３４）、およびｍｕＥＧＦＲ−１３（図３５）抗体等、独自の生物学的活性をＥＧＦＲ−７抗体と共有する、本発明の他の抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ−７抗体と同様の結合特性を示す。それらは、ヒトＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）に結合するが、マウスＥＧＦＲドメインＩＩＩ（ｍｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃ）には結合せず、重要なことに、それらは、全て、ｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃよりも低い親和性でｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩ−Ｆｃに結合する。これらのデータは、本発明の抗体によって認識されるエピトープが、位置４６０〜４８０のアミノ酸残基に加えて、ドメインＩＩＩ内の他の残基を構成することを示唆する。対照的に、セツキシマブは、ｃｈＥＧＦＲｄＩＩＩ、ならびに野生型ヒトＥＧＦＲおよびｈｕＥＧＦＲｄＩＩＩに、類似の親和性で結合し（図３６）、セツキシマブ結合エピトープが、位置４６０〜４８０のアミノ酸残基に限定されることを示唆する。要約すると、本発明のｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体、ならびに他の抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＥＧＦＲ細胞外ドメインのドメインＩＩＩに排他的に結合する。さらに、キメラＥＧＦＲの構築を通じて、本発明の抗体によって認識されるエピトープが、ｈｕＥＧＦＲドメインＩＩＩのＣ末端に向かって移動され、大部分がセツキシマブ結合部位と重なるが同一ではなく、さらなる重要アミノ酸から構成される可能性が高いことが確認された。
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【０２７７】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を十分に明らかにするため、当業者の範囲内の知識を適用することによって、必要以上の実験を伴わずに、様々な適用のためにこのような特定の実施形態を、本発明の一般概念を逸脱することなく、容易に修正および／または適合することができるであろう。したがって、このような適合および修正は、本明細書に提示される教示および指導に基づき、開示される実施形態の同等物の意義および範囲の中に含まれることが意図される。本明細書における表現または用語は、限定ではなく説明を目的とするものであり、したがって、本明細書の用語または表現は、当業者によって、教示および指導を考慮して解釈されることを理解されたい。
【０２７８】
本発明の幅および範囲は、上述の例示的な実施形態のいかなるものによっても制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるものとする。
（項目１）  ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％の上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦα）を阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、ならびに（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも１つの特徴を有する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）  前記抗体は、前記抗体は、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％のＥＧＦおよびＴＧＦαを阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、ならびに（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも２つの特徴を有する、項目１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３）ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％のＥＧＦおよびＴＧＦαを阻害し、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらし、（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目４）  前記抗体は、（ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７３からなる群から選択される参照ＶＨ配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択される参照ＶＬ配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列と、を含む、項目１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目５）  前記ＶＨおよびＶＬ配列は、前記参照ＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも９５％同一である、項目４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目６）  前記ＶＨおよびＶＬ配列は、前記参照ＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも９９％同一である、項目５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目７）  （ａ）配列番号１９〜２３、６９、および７１〜７３からなる群から選択されるＶＨ配列と、（ｂ）配列番号２４〜３０および７０からなる群から選択されるＶＬ配列と、を含む、項目６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目８）  配列番号１９および配列番号２４を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目９）  配列番号２０および配列番号２５を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１０）  配列番号２１および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１１）  配列番号２１および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１２）  配列番号２２および配列番号２８を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１３）  配列番号２３および配列番号２９を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１４）  配列番号２３および配列番号３０を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１５）  配列番号６９および配列番号７０を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１６）  配列番号７１および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１７）  配列番号７１および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１８）  配列番号７２および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１９）  配列番号７２および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２０）  配列番号７３および配列番号２６を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２１）  配列番号７３および配列番号２７を含む、項目７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２２）  ヒトＥＧＦＲへの第２の抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記第２の抗体が、配列番号２１の重鎖可変領域と、配列番号２６もしくは２７の軽鎖可変領域と、を含み、第１の抗体または抗原結合フラグメントが、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％の上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦα）を阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、または（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２３）  ２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される、ハイブリドーマによって生成される、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２４）  ２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択される抗体と、同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２５）  ヒトＥＧＦＲへの参照抗体の結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３１、２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３２、および２０１０年１０月６日にＡＴＣＣに寄託された寄託指定番号ＰＴＡ−１１３３３からなる群から選択され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ａ）１０ｎＭ以上の濃度で、Ａ４３１細胞に結合する少なくとも８０％の上皮成長因子（ＥＧＦ）および形質転換成長因子（ＴＧＦα）を阻害する、（ｂ）３０ｎＭ以上で、Ｈ２９２およびＨＣＣ８２７腫瘍細胞増殖の少なくとも５０％の阻害をもたらす、または（ｃ）６０ｎＭ以下で、２０％を上回ってケラチノサイトおよびＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２６）  
ａ）  配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｂ）  配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２５のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｃ）  配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｄ）  配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｅ）  配列番号２２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２８のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｆ）  配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２９のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｇ）  配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号３０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｈ）  配列番号６９のＶＨポリペプチドおよび配列番号７０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｉ）  配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｊ）  配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｋ）  配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｌ）  配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｍ）  配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｎ）  配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される抗体と、同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２７）  ヒトＥＧＦＲへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、
ａ）  配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｂ）  配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２５のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｃ）  配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｄ）  配列番号２１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｅ）  配列番号２２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２８のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｆ）  配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２９のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｇ）  配列番号２３のＶＨポリペプチドおよび配列番号３０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｈ）  配列番号６９のＶＨポリペプチドおよび配列番号７０のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｉ）  配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｊ）  配列番号７１のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｋ）  配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｌ）  配列番号７２のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、
ｍ）  配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２６のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに
ｎ）  配列番号７３のＶＨポリペプチドおよび配列番号２７のＶＬポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２８）  ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ａ）  １、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２、４、６、６３、または６４の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３または５の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）  １、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１０、１３、または１４の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２９）  
ａ）  （ａ）配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２、４、６、６３、または６４の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３または５の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）  配列番号１０、１３、または１４の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目２７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３０）  ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ａ）  １、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７、８、または９の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）  １、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１５または配列番号１６の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１７の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１８の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３１）  
ａ）  配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７、８、または９の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）  配列番号１５または１６の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１７の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１８の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目３０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３２）  ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、
ａ）  １、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６５、６６、または６７の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）  １、２、または３つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号６８または１３の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３３）  
ａ）  配列番号１の参照重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号６５、６６、または６７の参照重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の参照重鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、
ｂ）  配列番号６８または１３の参照軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１１の参照軽鎖配列ＣＤＲ２、および配列番号１２の参照軽鎖ＣＤＲ３配列とそれぞれ同一である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３４）  前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、表面再構成、またはヒトのものである、項目１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３５）  全長抗体である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３６）  抗原結合フラグメントである、項目１〜３３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３７）  前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖもしくはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合型Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、項目１〜３６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目３８）  項目１〜３７のいずれか一項に記載のＶＨおよびＶＬ配列を含む、ポリペプチド。
（項目３９）  前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、実質的に同様の結合親和性で、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲの両方に結合する、項目１〜３８のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４０）  約１．０〜約１０ｎＭのＫｄで、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲに結合する、項目３９に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４１）  約１．０ｎＭまたはそれよりも優れたＫｄで、ヒトＥＧＦＲおよびマカクＥＧＦＲに結合する、項目４０に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４２）  前記結合親和性は、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、または放射免疫測定によって測定される、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４３）  項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを生成する、単離細胞。
（項目４４）  項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）項目４３に記載の細胞を培養することと、（ｂ）前記抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを、前記培養された細胞から単離することと、を含む、方法。
（項目４５）  前記細胞は、真核細胞である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫抱合体であって、式中、
（Ａ）は、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、
（Ｌ）は、リンカーであり、
（Ｃ）は、細胞毒性剤であり、
前記リンカー（Ｌ）が、（Ａ）を（Ｃ）に結合する、免疫抱合体。
（項目４７）  前記リンカーは、開裂可能リンカー、非開裂可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群から選択される、項目４６に記載の免疫抱合体。
（項目４８）  前記リンカーは、非開裂可能リンカーである、項目４７に記載の免疫抱合体。
（項目４９）  前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群から選択される、項目４８に記載の免疫抱合体。
（項目５０）前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である、項目４９に記載の免疫抱合体。
（項目５１）  前記細胞毒性剤は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、または前記剤のプロドラッグからなる群から選択される、項目４６〜５０のいずれか一項に記載の免疫抱合体。
（項目５２）  前記細胞毒性剤は、マイタンシノイドである、項目５１に記載の免疫抱合体。
（項目５３）  前記細胞毒性剤は、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、項目５２に記載の免疫抱合体。
（項目５４）  項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目５５）  第２の抗癌剤をさらに含む、項目５４に記載の薬学的組成物。
（項目５６）  標識化された、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、診断試薬。
（項目５７）  前記標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、および金属イオンからなる群から選択される、項目５６に記載の診断試薬。
（項目５８）  項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、を含む、キット。
（項目５９）  ＥＧＦＲを発現する細胞の成長を阻害する方法であって、対象に、前記細胞を、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目５４または５５に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
（項目６０）  前記細胞は、腫瘍細胞である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）  癌を有する患者を治療するための方法であって、対象に、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目５４または５５に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。
（項目６２）  前記対象に第２の抗癌剤を投与することをさらに含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）  前記第２の抗癌剤は、化学療法剤である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）  細胞増殖性障害を治療するための方法であって、前記対象に、項目１〜４２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目４６〜５３のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目５４または５５に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。
（項目６５）  前記細胞増殖性障害は、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患からなる群から選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）  配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９０％同一のポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
（項目６７）  前記配列は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％同一である、項目６６に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目６８）  前記配列は、配列番号３９〜４３、７７〜８０、および８２〜８４からなる群から選択される配列と、少なくとも９９％同一である、項目６７に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目６９）  配列番号４４〜５０および８１と少なくとも９０％同一である配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド。
（項目７０）  前記ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５０および８１と少なくとも９５％同一である配列を含む、項目６９に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目７１）  前記ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５０および８１と少なくとも９９％同一である配列を含む、項目７０に記載の単離ポリヌクレオチド。
（項目７２）  配列番号３９〜５８および７７〜８４からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
（項目７３）  項目６６〜７２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目７４）  項目７３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目７５）  前記免疫抱合体は、ＥＧＦＲ陽性の腫瘍細胞を排除することができるが、３．３ｎＭの濃度で、ヒト初代ケラチノサイトの成長を４０％以下阻害するのみである、項目４６に記載の免疫抱合体。
（項目７６）  式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫抱合体であって、式中、
（Ａ）は、配列番号２１の重鎖可変領域と、配列番号２６もしくは２７の軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
（Ｌ）は、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーであり、
（Ｃ）は、細胞毒性剤Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、免疫抱合体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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