(57)【要約】【課題】医療用インプラントの抗菌コーティングを実現する、商業的に実現可能な手段が求められている。本発明は、一般にコーティングプロセスに関し、より詳細には、鉱質化した身体部分用の埋込み型プロテーゼのコーティングプロセスに関する。【解決手段】本発明は、医療用インプラントのためのコーティングであって、前記コーティングの少なくとも一部が骨結合剤を含有し、コーティングの同じおよび／または異なる部分が抗菌金属剤を含有するコーティングを開示する。【選択図】図１
2015110019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用インプラントのためのコーティングであって、前記コーティングの少なくとも一部が骨結合剤を含有し、前記コーティングの同じおよび／または異なる部分が抗菌金属剤を含有するコーティング。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にコーティングプロセスに関し、より詳細には、鉱質化した身体部分用の埋込み型プロテーゼのコーティングプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトおよび動物の身体で使用される医療用インプラントは、短期および長期の両方にわたり、数多くの目的で役割を果たすことが当技術分野で知られている。医療用インプラントに関するある一般的な合併症は、埋込み部位での感染である。インプラント関連の感染は、埋込み手術の前および後の設定期間中に患者に投与される予防的な全身性抗生物質の使用を含めた、いくつかの異なる手段によって管理される。しかし、宿主部位の感染は共通の課題のままであり、ほとんどの場合、インプラントを除去する２回目の手術が必要になる。インプラントを除去する理由は、感染が生じると、そのインプラントが、コロニー形成する侵入細菌によって好まれる部位として働くからである。細菌フローラがこのようにインプラントにコロニー形成すると、フローラは、全身的手段（経口または静脈内など）による抗生物質の送達を介した根絶に対し、耐性が極めて高くなる。そのような感染を管理する唯一の手段は、コロニー形成したインプラントを除去して別のインプラントシステムと置換する、修正手術である。修正手術は、感染を含めた任意の手術の合併症の全てと関連がある。さらに今度は、患者の身体は、２つの手術による病的状態に対処しなければならない。修正手術のその他の望ましくない態様には、失血および血栓症が含まれる。修正手術には、インプラント不全というより大きな危険性も伴い、修正手術の医学的予後は、１回目の手術ほど決して良好ではない。修正手術は、１回目の手術よりも費用がかかり、患者が完全に動けるようになるにはさらにより長い回復時間を要し、その結果、生産性に損失が生じる可能性がある。前述の内容からわかるように、インプラント部位感染に起因する修正手術は、患者にとって大きな医学的課題であり、治療コストがかさむ。インプラント関連の感染を低減させまたは無くす技術は、患者の快適な状態および医療ケアを実行する経済性に、重要な積極的貢献をすることになる。
【０００３】
金属である銀およびその化合物が良好な抗菌剤であることは、医薬分野では周知である。したがって、銀およびその化合物は、表皮感染を治療するため日常的に使用されている。銀化合物は、典型的には、潜在的な感染を防ぐために新生児の眼に投与される。伝統的な抗生物質に勝る銀化合物の１つの主な利点は、感染性細菌が、銀に対して耐性を形成しないことである。薬剤耐性細菌は、感染治療の分野における課題の主な原因である。したがって銀化合物は、細菌の耐性株を発症する危険性無しに、医療用インプラントでの細菌感染を予防する潜在能力を有している。
【０００４】
これまで、金属性の銀および／またはその化合物を医療用インプラントの外面に組み込むための、数多くの試みがなされてきた。これらの試みおよびそれらの制約について、以下にまとめる。
【０００５】
銀は、有機ポリマー担体を用いた電気メッキ、電着、および塗装を含む当技術分野で公知の任意の数の手段によって、医療用インプラントにメッキ（コーティング）することができる。コーティングするその他の技法には、化学気相成長法（ＣＶＤ）および物理気相成長法（ＰＶＤ）が含まれる。ＣＶＤおよびＰＶＤ技法は、非常に高価であり、高度に洗練され制御された製造プロセスを必要とする。これらコーティング技法の全ては、インプラントでの使用が限られるが、その理由は、生物学的界面、即ちインプラントと宿主組織との間の界面が、コーティングされたインプラントとコーティングされていないインプラントでは全く異なるからである。この制約は、その生物学的界面が宿主組織との一体化に合わせて通常は設計製作される医療用インプラントの成功に、甚だしい影響を及ぼす可能性がある。インプラントの生物学的界面が、組織との一体化性と同時に抗菌性を有するというこの必要性は、後で示されるように本発明の重要な態様を形成する。
【０００６】
医療用インプラントの表面に銀のイオンを「注入する」試みがなされてきた。この技法は、インプラントの表面に衝突するイオン化銀のエネルギービーム（高速）を利用する。この技法を、「イオン注入」と呼ぶ。銀イオン注入は、非常に薄い表面層（典型的には、ナノメートルの厚さの範囲）にのみ影響を及ぼし、したがって、感染性物質に対する長期有効性に関してはその使用が限定される。「注入された」銀イオンは、医療用インプラントの表面に十分に組み込むことができるので、細菌を効果的に死滅させるために周囲組織内に浸出することはほとんどない。同様の制約が、「イオンビーム支援蒸着」（ＩＢＡＤ）と呼ばれる技法に存在する。イオン注入技法も非常に高価であり、洗練され制御された製造プロセスを必要とする。
【０００７】
インプラントの生物学的界面、効果的には宿主組織に接触しているインプラントの表面は、典型的には宿主組織と一体化するよう設計製作されることが、先に論じられていた。医療用インプラント、特に骨接触整形、脊髄、および歯科インプラントで使用される一般的な表面設計製作技術は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）コーティングである。
【０００８】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）コーティングは、プラズマ溶射、電着、溶液沈殿、およびゾルゲル法を含めたいくつかの異なる方法を使用して、医療用インプラントに付着される。ＨＡに銀を組み込む試みもなされている。主に、従来技術は、銀ドープ型ＨＡコーティングを提供するために、以下の２つの異なる方法を使用した。
【０００９】
ＨＡに銀誘導体を組み込む１つの方法は、安定な酸化銀およびＨＡ粉末の層をインプラントに順次付着させるステップを含む。しかし、この方法は、均質な銀ドープ型ＨＡコーティングを形成しない。その結果、被覆範囲は均一でなく、イオン放出は注入後に安定的に維持されない。プラズマ溶射前に酸化銀をＨＡ粉末と混合した場合であっても、その酸化物は、従来のＨＡ粉末と化学的に反応し化合して均質な配合物を形成することができない。
【００１０】
第２の方法は、ヒドロキシアパタイトコーティングを有するインプラントを硝酸銀溶液に約２４時間浸漬し、次いでインプラントを空気または不活性環境下で乾燥することである。この方法は、ＨＡで既にコーティングされたインプラントに銀を付着させることに依拠する。この後の方法は、既存のＨＡコーティングの物理的および機械的特徴を乱す可能性があり、したがって基材である医療用インプラントにＨＡを取着する観点から望ましくない場合がある。さらに、この技法は、十分な硝酸銀をＨＡコーティング内に深く浸漬することができない。医療用インプラントのＨＡコーティングは、数百から何百ミクロンもの厚さに及ぶ可能性がある。この方法による銀の組込みは、硝酸銀とＨＡコーティングとの間のイオン交換反応を必要とする。このイオン交換反応は、外面でのみ生じ、ＨＡがコーティングされたインプラントは硝酸銀溶液と接触する。したがって、銀はＨＡマトリックスを通して表面に組み込まれるが、銀は、ＨＡコーティングの全厚にわたりＨＡマトリックスに組み込まれない。銀は、ＨＡコーティングの表面および表面付近領域にのみ（厚さ全体を通してではない。）組み込まれるので、宿主組織への銀イオンの放出は長続きしない傾向があり、即ち銀イオンの放出は、注入から数カ月後に感染を防ぐのに必要とされる非常に長い期間にわたって持続されない。さらに、イオン交換反応は、硝酸銀溶液のｐＨの慎重な制御を必要とする。硝酸銀溶液の理想的なｐＨは、インプラントに既にコーティングされたＨＡ構造を保存するのに適していない。そのような方法では、基材である医療用インプラントへのＨＡコーティングの取着は、銀塩溶液のｐＨが制御されない場合、浸漬プロセス中に損なわれる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｃｈｅら（２００４）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ、１９：  １９〜２９
【非特許文献２】Ｇａｎら（２００４）、Ｐａｒｔ  ＩＩ：  Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２５：  ５３１３〜５３２１
【非特許文献３】Ｓｉｍｍｍｏｎｓら（１９９９）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、４７：  １２７〜１３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
先の考察は、銀およびその化合物を医療用インプラントの生物学的界面に組み込む従来技術の方法の制約を示している。医療用インプラントの抗菌コーティングを実現する、商業的に実現可能な手段が求められている。抗菌特性を有する理想的な医療用インプラントは、その製造が、プラズマ溶射などの現在実施されている製造プロセスから逸脱しないようなものと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一実施形態では、医療用インプラントに適したコーティングが提供される。そのようなインプラントは、骨結合を促進させかつ／または同時に埋込み部位での感染の危険性を低減させ、または無くすことができるような、有益な効果を発揮することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、前記コーティングの少なくとも一部が骨結合剤を含有し、かつコーティングの同じおよび／または異なる部分が抗菌金属剤を含有する、医療用インプラントのコーティングが提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、医療用インプラントは、宿主生物環境と繋がるコーティングを有する。そのようなコーティングは、好ましくは、カルシウム誘導体などの骨結合または骨伝導を促進させる物質を含む。本明細書で使用される「骨結合剤（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、インプラントと骨との一体化を後押しする能力を有する任意の物質を指す。「骨伝導」という用語は、インプラントが新しい骨芽細胞と骨肝細胞との取着を支持することができ、新しい細胞を移動させ新しい血管を形成することができる構造が提供される状況を指す。
【００１６】
この記述の全体を通して使用される「カルシウム誘導体」という用語は、骨結合または骨伝導を促進し得る物質の代表的な用語として使用され、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）としばしば呼ばれるが、任意の適切な誘導体であってもよく、その例は当業者が十分承知していることを理解されたい。一例はＨＡであるが、リン酸カルシウム、オルトリン酸カルシウム、リン酸３カルシウム、セラミックバイオグラスなどのその他の誘導体の全ては本発明の機能を果たすことができ、制約無く本明細書に組み込まれる。インプラントと宿主組織との一体化を高める表面設計製作のその他の形には、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、β型リン酸３カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよびβ型リン酸３カルシウムの混合物、吸収性ポリマー、バイオグラス、誘導体化リン酸ベース化合物、オルトホスフェート、リン酸１カルシウム、リン酸８カルシウム、リン酸２カルシウム水和物（ブルシャイト）、リン酸２カルシウム無水物（モネタイト）、無水リン酸３カルシウム、フィトロッカイト、リン酸４カルシウム、非晶質リン酸カルシウム、フルオロアパタイト、クロロアパタイト、非化学量論的アパタイト、カーボネートアパタイト、生物由来のアパタイト、リン酸水素カルシウム、カルシウム水素アパタイト、水不溶性セラミックス、ホスフェート、ポリホスフェート、カーボネート、シリケート、アルミネート、ボレート、ゼオライト、ベントナイト、カオリン、およびこれらの組合せなどの、コーティングであるアパタイトが含まれる。これらの表面設計製作技法は、制約無く本明細書に組み込まれる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、カルシウム誘導体は、ヒドロキシアパタイトおよび／またはβ型リン酸３カルシウムの１種または組合せである。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未変性のカルシウム誘導体（例えば、ＨＡ）コーティングの抗菌効力は、銀の添加によって改善される。
【００１９】
銀は、銀置換カルシウム誘導体（ＨＡなど）および／または個々の金属銀粒子の１つまたは複数として存在し得る。
【００２０】
好ましくは、抗菌金属剤は、個々の粒子として前記コーティングの少なくとも一部に存在する。抗菌金属は、銀、銅、および／または亜鉛の１種または複数を含んでいてもよい。個々の粒子（例えば、銀粒子）は、好ましくはコーティングの厚さ全体にわたって分布していてもよい。
【００２１】
本発明は、個々の銀化合物（酸化銀など）ではなく、医療用インプラントに組み込まれた金属銀を有することが好ましいことを見出した。
【００２２】
銀（または、銅などのその他の抗菌金属種）の使用は、いくつかの方法で設計製作することができる。金属性抗菌剤は、宿主動物（ヒトを含む。）組織で使用されることになるので、その性質は、以下の非限定的な重要な機能を果たすべきである：
（ａ）抗菌処理された医療用インプラントは、細菌コロニー形成に耐えるべきである。コーティング内に存在する銀の化学形態は、これに影響を及ぼす可能性がある。例えば銀は、リン酸銀、酸化銀、硝酸銀、およびその他の化合物など、化合物としてインプラント表面のコーティング内に存在することができる。銀は、金属銀形態で存在することもできる。さらに、銀化合物および／または金属銀の混合物が存在することができる。まさにその組成は、埋め込んだ後および抗菌コーティングが宿主組織環境で反応する時間と共に、インプラントが微生物コロニー形成に耐える能力に影響を与えることになる。
（ｂ）抗菌処理された医療用インプラントは、その抗菌特性に影響を与えるように、抗菌金属を宿主組織内に放出すべきである。抗菌金属は、銀のイオンとしてまたは金属銀として、または銀化合物（例えば、リン酸銀または酸化銀）として、宿主組織に放出することができる。抗菌剤放出の化学的性質は、コーティングの組成に依存することになる。好ましいタイプの放出（イオン性、金属性、または化合物）は、抗菌コーティングの組成によって制御できることが理解される。
（ｃ）宿主環境内への銀の放出動態は、バースト放出（ボーラス）の形をとってもよく、または長時間にわたって持続させてもよく、またはバーストと持続放出との組合せであってもよい。放出動態および放出持続時間は、上記にて論じたように、コーティング内の銀およびその化合物の化学的性質を選択することによって、設計製作することができる。
（ｄ）上記にて論じた形の銀の放出は、宿主の生体組織、器官、および有機体が十分耐えることのできる用量であるべきである。放出は、インプラントおよびコーティングのその他の生物学的および機械的機能を、目に見える程度まで妨げないものであるべきである。コーティングおよび銀の放出は、生体適合性であるべきであり、宿主環境に細胞傷害的課題を提示しないものであるべきである。これは、上述のように制御することができる。
【００２３】
抗菌コーティング中に存在する銀およびその化合物のタイプおよび濃度は、任意の数の手段によって制御することができる。銀は、当技術分野で知られているように、硝酸銀またはその他の銀化合物とのイオン交換反応によって、コーティング微粒子（ＨＡなど）に組み込むことができる。イオン交換反応の後、過剰な銀化合物は、ＨＡ粉末から完全に濯ぎ落とすことができ、または部分的にのみ濯ぐことができる。したがってＨＡ粉末は、未反応の銀化合物を含有することがなく、または未反応の過剰な銀化合物の全てを保持することができ、または未反応の銀の部分量を保持することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、個々の金属粒子（例えば、金属銀粒子）が、それ自体では抗菌金属剤とは置換されない骨結合剤を含むコーティング内に存在する。任意選択で、金属粒子は、やはり抗菌金属剤で置換された骨結合剤を含むコーティング内に分布される。好ましくは、金属剤は銀であり、骨結合剤に置換された銀としてコーティング内に存在する。
【００２５】
任意選択で、医療用インプラントにコーティングを提供する１つの方法は、「プラズマ溶射」と呼ばれる技法による。医療用インプラントにプラズマ溶射されたコーティングの厚さは、典型的には約１ミクロンからにすることができ、典型的には１０または数十から数百ミクロンの範囲である。数千ミクロンを超える（１ミリメートル以上）コーティングの厚さも可能である。カルシウム誘導体コーティングを医療用インプラントに付着させるその他の方法には、ゾルゲル法、電着、溶液沈殿、およびバイオミメティックコーティングが含まれる。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、インプラントは、骨結合剤の粉末（例えば、ＨＡなどのカルシウム誘導体）を用いてプラズマ溶射される。好ましくは、骨結合剤は、プラズマ溶射前に、抗菌金属剤（例えば、銀）で少なくとも部分的に置換される。
【００２７】
プラズマ溶射コーティングは、大気条件下または還元条件下または真空中で付着させることができる。さらに、プラズマ溶射装置は、制御された環境条件下に置くことができる。例えば環境は、アルゴンまたはその他の不活性ガスを含有していてもよい。または環境は、反応性ガスを含有していてもよい。プラズマ溶射装置を作動させる環境は、ＨＡコーティングに組み込まれる銀（またはその化合物）のタイプを決定することができる。例えば大気中の（制御されていない環境）ＨＡコーティングは、プラズマから出て行くときかつインプラント表面にコーティングされる前に、イオン交換反応を介して、ＨＡ粒子中に既に存在する銀（およびその化合物）の酸化をもたらす可能性がある。真空プラズマ溶射は、この酸化反応を回復させることができる。特定の銀化合物が望ましい場合、プラズマ溶射装置の環境は、そのような化合物の生成に影響があるように制御することができる。例えば、ＨＡコーティング中に銀化合物としてフッ化銀を有することが望ましい場合、その環境は、当技術分野で知られている任意の数の手段によって、フッ素を豊富にすることができる。
【００２８】
一実施形態では、さらにコーティングを強固にしまたは基材に結合するために、後工程の熱処理を必要としない。
【００２９】
プラズマ溶射を本発明で利用する場合、抗菌剤（銀など）を含有するコーティングの少なくとも１つの層の好ましいプラズマ溶射は、還元環境下で実施する。
【００３０】
したがって、本発明の一実施形態では、前記コーティングの少なくとも一部が骨結合剤を含有し、かつコーティングの同じおよび／または異なる部分が抗菌剤を含有する、医療用インプラントのプラズマ溶射コーティングが提供される。
【００３１】
好ましくは、骨結合剤がカルシウム誘導体である。
【００３２】
好ましくは、抗菌剤を含有するコーティングの少なくとも一部は、還元条件下でプラズマ溶射され、好ましくはプラズマ溶射は、真空中で実施される。
【００３３】
理論に拘泥するものではないが、ＨＡなどの粉末が未反応の銀化合物を含有する場合、これらの化合物は、プラズマの高度還元環境（水素および不活性ガスの混合物）下で金属（元素）銀に解離すると考えられる。したがって、プラズマ溶射が真空条件下で実施される場合、還元金属銀は、ＨＡおよび銀含有ＨＡと共に個々の金属粒子として医療用インプラントにコーティングされることになる。一方、プラズマ溶射プロセスを大気条件下で実施した場合、プラズマの還元雰囲気中で形成された金属銀は、酸素と反応して酸化物を形成することになる。次いでこれらの酸化物を、ＨＡおよび銀含有ＨＡと共に医療用インプラントにコーティングする。先の考察から、医療用インプラント上に存在する銀のタイプは、コーティングを医療用インプラントに付着させるプロセスによって制御できることを、理解することができる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態では、前記コーティングの少なくとも一部が、抗菌金属の個々の粒子を含有する。いくつかの実施形態では、前記抗菌金属は、金属である銀、銅、および／または亜鉛の１種または複数を含む。
【００３５】
好ましくは、抗菌金属には、金属である銀が含まれる。いくつかの実施形態では、金属銀粒子は、その形状が球または不規則である。さらに、金属銀粒子の直径は、そのサイズが約１５ｎｍから約１０μｍに及ぶ。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態では、銀濃度は、約０．１から約１０重量％の濃度を有するなど、抗菌効果を発揮するのに十分である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、カルシウム誘導体を含有する前記コーティングの少なくとも一部に含有される前記カルシウム誘導体は、銀置換されており、好ましくは銀置換カルシウム誘導体は、コーティングの厚さ全体を通して均質に分布される銀濃度を有する。銀置換カルシウム誘導体は、銀を約０．１から約１０重量％、好ましくは銀を約０．５から約３．０重量％含有していてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、抗菌剤を含有する前記コーティングの少なくとも一部は、コーティングのその部分の全厚にわたり分布された薬剤を有する。
【００３９】
次いで製造プロセスの慎重な制御により、ＨＡコーティング中に下記のタイプの銀のいずれか１種または２種以上の組合せを含有する、プラズマ溶射ＨＡコーティング医療用インプラントを生成することが可能になる。
（１）銀は、ＨＡコーティングの外面から固定深さまで存在させることができ、またはＨＡコーティングの全厚に存在させることができる。
（２）銀は、ＨＡと完全に反応しＨＡコーティングの全体にわたり均質に分布する銀化合物（例えば、リン酸銀、酸化銀）の形をとることができる。あるいは、銀化合物は、ＨＡコーティングのマトリックス中に離散的に分布させることができる。
（３）銀は、銀変性ＨＡとして未変性のＨＡ結晶構造に完全に組み込むことができ、ＨＡコーティングの全体にわたり均質に分布することができる。
（４）銀は、プラズマの還元雰囲気中で形成される、金属である銀の形をとることができる。そのような銀は、ＨＡコーティングのマトリックス中に銀の個々の粒子として分布される。金属である銀は、ＨＡコーティングの外面から固定深さまで存在することができ、またはＨＡコーティングの全厚に存在することができる。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態では、コーティングは、その厚さが好ましくは約１μｍより大きく、好ましくは約１０μｍから約２００μｍであり、最も好ましくは約３０μｍから約１００μｍである。前記コーティングは、好ましくは基材材料（例えば、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ、ｃｐ−Ｔｉ、ＣｏＣｒＭｏ、Ｔａ、およびその他の生物医学的材料）に十分接着され、例えば少なくとも１５ＭＰａの引張り接着強さを有する。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未変性カルシウム誘導体（例えば、ＨＡ）コーティングの骨結合は、銀の添加によって損なわれない。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、コーティングは、１つまたは複数の骨伝導、骨促進、および／または抗菌特性を有する。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、コーティングは、銀を含有するカルシウム誘導体（例えば、ＨＡ）粉末の均質な配合物から形成される。いくつかの実施形態では、銀含有カルシウム誘導体粉末とその他の銀含有粉末とのブレンドは、銀をコーティングに組み込むのに必要とされない。例えば、一実施形態では、ＨＡ粉末とその他の粉末（例えば、酸化銀粉末）とのブレンドは、銀をＨＡコーティングに組み込むのに必要ではない。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、骨結合剤（例えば、ＨＡ）粉末は、表面に吸着される少なくとも部分的に過剰な銀反応体を含有する。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＨＡ粉末は、銀置換および過剰な銀反応体の両方を含有する。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、骨結合剤（例えば、ＨＡ）粉末において置換するための銀反応体は、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）および／またはフッ化銀（ＡｇＦ）など、銀塩の１種または複数である。あるいは、またはさらに、銀反応体を、ヨウ化銀などの銀ハロゲン化物の１種または複数にすることができる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、銀の他にカルシウム誘導体も、下記の物質、即ちカーボネート、フッ化物、ケイ素、マグネシウム、ストロンチウム、バナジウム、リチウム、銅、および／または亜鉛の１種または複数で置換される。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、銀含有カルシウム誘導体（例えば、ＨＡ）粉末は、最初に従来のＨＡ粉末を、硝酸銀含有および／またはフッ化銀含有水性または有機溶液に、ある期間にわたり浸漬することによって形成される。いくつかの実施形態では、水性または有機溶液は、フッ化銀および硝酸銀の両方を含んでいてもよい。
【００４９】
カルシウム誘導体（例えば、ＨＡ）粉末は、ＨＡ粉末とＡｇ塩溶液との十分なイオン交換反応を行うのに適切な時間、溶液に浸漬し撹拌することが好ましい。そのような時間は、約１日から３日間など、数時間（例えば１０時間）から１週間に及んでよい。反応は、より好ましくは約２日間である。最良の結果のためには、混合物を光に過剰に曝露することを避ける必要があることがある。
【００５０】
骨結合剤（例えば、ＨＡ）粉末は、室温で浸漬させてもよいが、わずかに高い温度が、ＨＡへの溶液の溶解度を増大させるには好ましい。温度は、組成物が分解するほど高く上昇させるべきではない。
【００５１】
一般に、水性または有機溶液中でＨＡ粉末をＡｇ塩と反応させる間、溶液の適正なｐＨレベルを維持することも重要である。ｐＨは一般に、最小限に抑えられたＨＡ溶解があるが、同時に硝酸銀がＯＨと反応し沈殿して水酸化銀を形成し最終的には酸化銀になる可能性が低下するレベルで維持すべきである。ｐＨレベルは、６．５〜８．５の範囲に維持してもよいが、ＨＡが溶解するのを防ぐには、好ましくは６．７よりも高い。より好ましくは、混合物のｐＨレベルは６．８〜７．２の範囲にあるが、その他のレベルも許容可能である。
【００５２】
イオン交換反応後、混合物を空気乾燥したままにしてもよく、または脱イオン水および蒸留水（ＤＤＨ２Ｏ）で濯ぎかつ／または洗浄し、次いで空気乾燥してもよい。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態では、銀含有カルシウム誘導体粉末をイオン交換またはゾルゲル法により生成し、その後、基材材料にプラズマ溶射を行う、抗菌コーティングを調製するための方法が提供される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、銀含有カルシウム誘導体粉末は：
ａ．カルシウム誘導体粉末を、カルシウムイオンを銀イオンに交換するのに十分な時間および温度で、銀塩溶液中に懸濁するステップ、および
ｂ．前記イオン交換され洗浄したカルシウム誘導体を乾燥するステップ
によって生成される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、前記イオン交換されたカルシウム誘導体粉末を洗浄する追加のステップを、ステップ（ａ）と（ｂ）との間で行う。
【００５６】
いくつかの実施形態では、カルシウム誘導体粉末と銀塩溶液との間のイオン交換反応は、約２０℃から９５℃の温度で約２４から１６８時間行われる。いくつかの実施形態では、銀塩溶液が１０−２〜１０−４Ｍの濃度を有する硝酸銀またはフッ化銀であり、硝酸銀とＨＡ粉末との質量比は０．０１〜０．１の範囲内にある。
【００５７】
さらに、いくつかの実施形態では、銀含有カルシウム誘導体粉末は：
（ａ）カルシウム、銀、および／またはリン前駆体の組合せを混合して、均質なゾルゲル溶液を得るステップ、
（ｂ）ゾルゲル溶液を、２０〜９５℃の温度で適切な時間にわたりエイジングさせるステップ、
（ｃ）ゾルゲル溶液を、室温を超える温度で適切な時間、乾燥し焼成するステップ、
（ｄ）焼成した粉末を、後で行われるプラズマ溶射プロセスに合わせて所望の粒度分布に加工するステップ
によるゾルゲル法によって生成される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、カルシウム前駆体が硝酸カルシウムである。いくつかの実施形態では、銀前駆体が硝酸銀である。いくつかの実施形態では、リン前駆体がリン酸２水素アンモニウムである。いくつかの実施形態では、銀前駆体の濃度範囲は約０．１重量％から１０重量％であり、好ましくは０．５重量％から３．０重量％である。
【００５９】
ある実施形態では、フッ素およびカーボネート前駆体を、カルシウム、銀、およびリン前駆体と混合して、均質なゾルゲル溶液を得る。いくつかの実施形態では、フッ素前駆体がフッ化アンモニウムである。いくつかの実施形態では、カーボネート前駆体が炭酸アンモニウムである。いくつかの実施形態では、Ｆおよび／またはカーボネート前駆体の濃度が約１０−２〜１０−３Ｍである。
【００６０】
ある実施形態では、カーボネート、フッ化物、ケイ素、マグネシウム、ストロンチウム、バナジウム、リチウム、銅、または亜鉛前駆体、またはこれらの組合せを、カルシウム、銀、およびリン前駆体と混合して、均質なゾルゲル溶液を得る。
【００６１】
残りの固体混合物は、内部に銀および／またはフッ化物を有する均質なＨＡ粉末配合物を含む。均質なＨＡ粉末配合物は、摩砕してもしなくてもよく、次いで従来のプラズマ溶射プロセスに使用して、通常のＨＡ粉末のように生物医学的インプラントまたは医療用機器をコーティングしてもよい。本発明の浸漬および摩砕プロセスは、一般に、ＨＡ粉末の平均粒度を取るに足らない程度にしか増大させず、それによって、従来の装置に依存する可能性のある後続のプラズマ溶射プロセスを妨げない。
【００６２】
いくつかの実施形態では、溶射前の銀含有カルシウム誘導体粉末配合物のサイズ分布は、未変性の純粋なカルシウム誘導体粉末と実質的に均等である。
【００６３】
濯ぐことなく前述の空気乾燥プロセスを使用する、１つの可能性のある利点は、濯ぎをしないことによって、水性／有機溶液が蒸発した後に、均質なＨＡ／銀粉末配合物の他に少量の過剰な硝酸銀またはフッ化銀が存在し得ることである。これは、極めて高い温度がプラズマ溶射プロセス中に示された後、均質なＨＡ粉末中の銀の一部が気化した場合であっても、いくらかの残留する（即ち、「余分な」）銀がコーティング内に存在することを確実にする可能性がある。最終的なプラズマ溶射コーティング中の銀の含量および分解プロファイルは、種々の濃度の銀塩を使用して調整することができる。
【００６４】
本発明の一実施形態では、外科的インプラントが必要な患者を処置する方法であって、前記患者を手術するステップ、前記手術部位に請求項１から２０のいずれかに記載のコーティングを含む医療用インプラントを挿入するステップ、および手術後にそのままインプラントを残すステップを含み、そのインプラントがインプラント部位の術後感染の危険性を低減させまたは無くす方法が提供される。
【００６５】
本明細書で使用される「銀」という用語は、実質的に純粋な銀、銀ベースの成分を有する組成物、銀ベースの成分を有する前駆体、銀化合物、または銀を有する合金を含んでいてもよい。先の考察から、銀および／または銀化合物を、表面が同時に抗菌機能を果たすような手法で、医療用インプラントの生物学的界面（ＨＡコーティングなど）に組み込むことが可能である。
【００６６】
その他の金属種も、同様の抗菌効果を有することが知られている。これらの種には、銅、亜鉛、水銀、鉛、およびその他の金属が含まれるが、これらに限定するものではない。これらの金属種は、送達される用量に応じて広範にわたる有効性を発揮する。さらに、これら金属種のいくつかは、やはり使用される用量および金属種が付着される組織部位に応じて、宿主組織に対して毒性を有する可能性がある。本発明は、好ましい抗菌金属種としての銀に関するが、銀のみに限定するものではない。種々の金属種の混合物も使用することができる。
【００６７】
本発明の適用可能性に関するその他の領域は、以下に示される詳細な記述から明らかにされよう。詳細な記述および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すが、単なる例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。
【００６８】
本明細書に組み込まれかつ本明細書の一部を形成する添付図面は、本発明の実施形態を例示し、かつ記述された説明と共に、本発明の原理、特性、および特徴を説明する働きをする。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＨＡ（ａ）、Ａｇ−ＨＡ−Ｌ（ｂ）、Ａｇ−ＨＡ−Ｍ（ｃ）、およびＡｇ−ＨＡ−Ｈ（ｄ）でコーティングされたＴｉ６Ａｌ４Ｖディスクを示す走査電子顕微鏡写真である。
【図２】ＨＡ（左）およびＡｇ−ＨＡ−Ｈ（右）でコーティングされたＴｉ６Ａｌ４Ｖディスクの断面図を示す走査電子顕微鏡写真である。銀濃度は、「ｘ」のマーカーによって示されるように、Ａｇ−ＨＡ−Ｈサンプルのコーティング全体にわたり異なる部位で測定した。
【図３】種々のコーティングクーポンの引張り接着強さを示す図である。
【図４】ＨＡがコーティングされた、およびＡｇ−ＨＡ−Ｈがコーティングされたサンプルの、破断面を示す図である。
【図５】サンプルのＰＢＳにおける銀放出プロファイルを示す図である。
【図６】図６ａ（ＨＡ）６ｂ（Ａｇ−ＨＡ１）および６ｃ（Ａｇ−ＨＡ２）は、低倍率での種々のサンプルそれぞれの２次電子画像を示す図であり、各サンプルタイプの概観を示している。
【図７】図７ａ（ＨＡ）、７ｂ（Ａｇ−ＨＡ１）、および７ｃ（Ａｇ−ＨＡ２）は、図６のサンプルの表面形態の、より高い倍率での２次電子画像を示す図である。
【図８】図８ａ（ＨＡ）、８ｂ（Ａｇ−ＨＡ１）、および８ｃ（Ａｇ−ＨＡ２）は、低倍率での種々のサンプルの後方散乱電子画像を示す図であり、各サンプルタイプの概観を示している。
【図９】図９ａ（ＨＡ）、９ｂ（Ａｇ−ＨＡ１）、および９ｃ（Ａｇ−ＨＡ２）は、図８のサンプルのそれぞれから示される、より高い倍率での後方散乱画像を示す図である。
【図１０】図１０ａ（Ａｇ−ＨＡ１）および１０ｂ（Ａｇ−ＨＡ２）は、図８および９のサンプルの、より高い倍率での検査を示す図である。
【図１１】図１１ａ（Ａｇ−ＨＡ１）および１１ｂ（Ａｇ−ＨＡ２）は、図８および９のサンプルの、より高い倍率での検査を示す図である。
【図１２】本発明のサンプルの後方散乱ＥＭを示す図である。
【図１３】図１３ａは、ＥＤＸ微量分析によって得られた元素ドットマップを示すのに対し、図１３ｂには、サンプルＡｇ−ＨＡ２の対応領域の後方散乱画像が示されている。
【図１４】図１４ａ（Ａｇ−ＨＡ１）および１４ｂ（Ａｇ−ＨＡ２）は、Ａｇ−ＨＡ１サンプルおよびＡｇ−ＨＡ２サンプルからのＥＤＳスペクトルを示す図である。
【図１５】ＨＡ２サンプル上の個々の明るい粒子（画像中、「ｘ」が付されたスポット）のＥＤＸスペクトルを示す図である。
【図１６】図１６ａ〜ｃは、ＨＡ２サンプル上のＥＤＸＡも介して評価された、個々の明るい粒子から離れたコーティング領域の画像を示す。
【図１７】３つのサンプルＨＡ、Ａｇ−ＨＡ１、およびＡｇ−ＨＡ２のＸ線回折パターンを示す図である。
【図１８】３つの異なるサンプルの引張り接着強さを示す図である。
【図１９】本発明のコーティングの実施形態の概略を示す図である。
【図２０】銀変性β−ＴＣＰおよびブピバカインを含有する上部ＰＬＧＡコーティングを低倍率で示す図である。
【図２１】銀変性β−ＴＣＰおよびブピバカインを含有する上部ＰＬＧＡコーティングを高倍率で示す図である。
【図２２】本発明の別の実施形態の概略を示す図である。
【図２３】ＰＬＧＡコーティング上のＰＬＧＡビーズの上面図を、低倍率で示す図である。
【図２４】ＰＬＧＡコーティング上のＰＬＧＡビーズの上面図を、高倍率で示す図である。
【図２５】ＰＬＧＡコーティングを高倍率で示す図である。
【図２６】図２６（ａ）および（ｂ）は、９日で引き外したインプラント：  Ｒａｂｂｉｔ＃１Ａからの低Ａｇ変性リン酸カルシウムコーティングインプラントから得たＳＥＭ画像である。
【図２７】図２７（ａ）および（ｂ）は、９日で引き外したインプラント：  Ｒａｂｂｉｔ＃１Ａからの非リン酸カルシウムコーティングインプラントから得たＳＥＭ画像である。
【図２８】図２８（ａ）および（ｂ）は、９日で引き外したインプラント：  Ｒａｂｂｉｔ＃１Ｂからの高Ａｇ変性リン酸カルシウムコーティングインプラントから得たＳＥＭ画像である。
【図２９】図２９（ａ）および（ｂ）は、９日で引き外したインプラント：  Ｒａｂｂｉｔ＃１Ｂからの非リン酸カルシウムコーティングインプラントから得たＳＥＭ画像である。
【図３０】「低」Ｓ−ＣＰ、９日の後方散乱ＳＥＭを示す図である（サンプル４Ａ  右）。多孔質コート領域内の、鉱質化組織（骨）（矢印）の小領域。破線は、部位穿孔後の宿主骨の位置を示す。
【図３１】「高」Ｓ−ＣＰ、９日の後方散乱ＳＥＭを示す図である（サンプル５Ｂ  左）。多孔質コート領域内の、鉱質化組織（骨）（矢印）の小領域。破線は、部位穿孔後の宿主骨の位置を示す。
【図３２】「対照」（ＣＰ無し）、９日の後方散乱ＳＥＭを示す図である（サンプル５Ｂ  右）。多孔質コート領域内の、鉱質化組織（骨）（矢印）の小領域。
【図３３】「低」Ｓ−ＣＰ、１６日の後方散乱ＳＥＭを示す図である（サンプル９Ｃ  右）。全多孔質コート深さの全体を通した、広範な骨内殖。破線は、初期穿孔骨境界を示す。
【図３４】「高」Ｓ−ＣＰ、１６日の後方散乱ＳＥＭを示す図である（サンプル８Ｄ  右）。全多孔質コート深さの全体を通した、広範な骨内殖。破線は、可能性のある初期穿孔骨境界を示す。
【図３５】「対象」（ＣＰ無し）、１６日の後方散乱ＳＥＭを示す図である（サンプル２Ｃ  左）。多孔質コーティングの深さ全体を通した骨内殖。初期穿孔骨境界の特定は困難である。
【図３６】図３６（ａ）および（ｂ）は、９日間焼結した多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖ「対照」インプラントを示す−（ａ）および（ｂ）サンプル５Ｂ右−青緑色に染色した領域は骨である（古い、および新たに形成された。）。断面の厚さにより、一部の骨は染色効果を示さず、灰色に見える。少量の繊維状組織が、一部の領域の界面付近に存在する（矢印）。
【図３７】図３７（ａ）および（ｂ）は、「低」Ｓ−ＣＰオーバー層を有する、９日間焼結した多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖインプラントを示す−（ａ）サンプル８Ａ左、（ｂ）サンプル４Ａ右−（ｂ）では、穿孔による当初の骨損失の程度（おそらくは、いくらかの骨ダイバック）は、切断された小柱によって明らかである。
【図３８】図３８（ａ）および（ｂ）は、「高」Ｓ−ＣＰオーバー層を有する、９日間焼結した多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖインプラントを示す−（ａ）および（ｂ）サンプル８Ｂ左−高および低倍率の両方の画像は、部位処置（穿孔）による骨損失の程度、およびおそらくはその後の骨ダイバックを示す（（ｂ）の点線）。それにも関わらず、適切な圧入が実現され、界面ゾーン内でのおよび多孔質コート内への早期の骨形成が可能になる（矢印）。
【図３９】図３９（ａ）および（ｂ）は、１６日間焼結した多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖインプラント「対照」インプラントを示す−（ａ）および（ｂ）サンプル２Ｃ左−多孔質コート全体を通した広範な新たな骨形成および内殖（青緑色の染色領域）。
【図４０】図４０（ａ）および（ｂ）は、「低」Ｓ−ＣＰオーバー層を有する、１６日間焼結した多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖインプラントを示す−（ａ）および（ｂ）サンプル９Ｃ右−広範な新たな骨形成および内殖［サンプルを埋め込んだアーチファクト（気泡）が（ａ）に見られる。］。
【図４１】図４１（ａ）および（ｂ）は、「高」Ｓ−ＣＰオーバー層を有する、１６日間焼結した多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖインプラントを示す−（ａ）および（ｂ）サンプル８Ｄ右−インプラントの長さに沿った良好な骨内殖。
【図４２】微生物学的活性の超音波カウントの結果を示す図である。
【図４３】微生物学的活性の超音波カウントの結果を示す図である。
【図４４】微生物学的活性の懸濁液カウントの結果を示す図である。
【図４５】微生物学的活性の懸濁液カウントの結果を示す図である。
【図４６】Ａｇ／ＨＡ培地で培養したＭＣ３Ｔ３細胞の、Ａ４５０ｎｍ〜Ａ６５５ｎｍでの平均吸光度を示す図である。誤差棒は、データの標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
示される実施形態に関する以下の記述は、実際には単なる例示であり、本発明、その適用、または使用をいかなる方法によっても限定するものではない。
【００７１】
抗菌ＨＡ粉末配合物は、まず、従来のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粉末（約４５から約１２５ミクロンの平均粒度を有する市販されているＨＡ粉末など）を、硝酸銀含有および／またはフッ化銀含有水性または有機溶液にある時間浸漬することによって形成される。いくつかの実施形態では、水性または有機溶液は、フッ化銀および硝酸銀の両方を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、β型リン酸３カルシウムを使用してもよく、またはＨＡをβ型リン酸３カルシウムと組み合わせてもよい。リン酸カルシウム混合物は、銀を約０．１重量％から約１０重量％、約０．１重量％から約７重量％、または約０．１重量％から約５重量％含む。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム混合物は、銀を約０．５重量％から約３重量％、または約０．５重量％から約２重量％含む。
【００７２】
「重量％」または「重量パーセント」という用語は、コーティングまたはコーティング内の層の重量の％を指し、インプラントそのものの重量は含まない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、カーボネート、フッ化物、ケイ素、マグネシウム、ストロンチウム、バナジウム、リチウム、銅、および亜鉛の１種または複数を、リン酸カルシウム混合物に添加してもよい。
【００７４】
ＨＡ粉末を、溶液中に約１日から約７日間浸漬し、撹拌する。ＨＡ粉末は、ＨＡ粉末とＡｇ塩溶液との間で十分なイオン交換反応が可能になるように、約１日から約３日間にわたり溶液に浸漬し撹拌することが好ましい。反応は、より好ましくは約２日間である。さらに、最良の結果を得るには、光に対する混合物の過剰な曝露を避ける必要があることがある。
【００７５】
ＨＡ粉末は、室温で浸漬してもよいが、ＨＡへの溶液の溶解度を増大させるには、わずかに温かい温度が好ましい。温度は、組成物を分解するほど上昇させるべきではない。いくつかの実施形態では、約２０℃から約９５℃の温度範囲を使用してもよい。その他の実施形態では、約６０℃から約８０℃の温度範囲を使用してもよい。
【００７６】
一般に、ＨＡ粉末が水性または有機溶液中でＡｇ塩と反応させる間、溶液の適正なｐＨレベルを維持することが重要である。ｐＨは一般に、ＨＡ溶解が最小限に抑えられるように、しかし同時に、硝酸銀がＯＨと反応し沈殿して水酸化銀を形成し最終的には酸化銀になる可能性が低下するようなレベルで維持すべきである。ｐＨレベルは、ＨＡが溶解しないように、６．５〜８．５の範囲に維持してもよいが、好ましくは６．７よりも高い。より好ましくは、混合物のｐＨレベルは６．８〜７．２の範囲であるが、その他のレベルも許容可能である。
【００７７】
イオン交換反応後、混合物をそのまま空気乾燥してもよく、または脱イオン水および蒸留水（ＤＤＨ２Ｏ）で濯ぎかつ／または洗浄し、次いで空気乾燥してもよい。
【００７８】
残りの固体混合物は、銀および／またはフッ化物を内部に有する均質なＨＡ粉末配合物を含む。均質なＨＡ粉末配合物は、摩砕し、次いで従来のプラズマ溶射プロセスで使用して、通常のＨＡ粉末のように生物医学的インプラントまたは医療機器をコーティングしてもよい。本発明の浸漬プロセスは、一般に、ＨＡ粉末の平均粒度を取るに足らない程度にしか増大させず、それによって、従来の装置に依存し得る後続のプラズマ溶射プロセスを妨げない。
【００７９】
第１の方法では、ＨＡ粉末をＡｇＦ溶液と組み合わせる。混合物を浸漬し、１から３日間撹拌する。混合物を乾燥する。得られた配合物を、医療用インプラントにプラズマ溶射してもよい。例として、フッ化銀は、約１×１０−２から約１×１０−４Ｍの濃度を有していてもよい。例として、フッ化銀とＨＡ粉末との質量比は、約０．０１から約０．１の範囲内にある。一実施形態では、混合物を約１日から約３日間、約５０℃から約９５℃の間の温度で空気乾燥する。さらに別の実施形態では、銀溶液は、１×１０−３から約１×１０−４Ｍの範囲の濃度を有する。
【００８０】
第２の方法では、ＨＡ粉末をＡｇＮＯ３溶液と組み合わせる。混合物を浸漬し１から３日間撹拌する。混合物を乾燥する。得られた配合物を、医療用インプラントにプラズマ溶射する。例として、硝酸銀は、約１×１０−２から約１×１０−４Ｍの濃度を有していてもよい。例として、硝酸銀とＨＡ粉末との質量比は、約０．０１から約０．１の範囲内である。一実施形態では、混合物を約１日から約３日間、約５０℃から約９５℃の間の温度で空気乾燥する。
【００８１】
第３の方法では、ＨＡ粉末をＡｇＦおよびＡｇＮＯ３溶液と組み合わせる。混合物を浸漬し、１から３日間撹拌する。混合物を乾燥する。得られた配合物は、医療用インプラントにプラズマ溶射してもよい。
【００８２】
第４の方法では、ＨＡ粉末をＡｇＦ溶液と組み合わせる。混合物を浸漬し、１から３日間撹拌する。混合物を濯ぐ。次いで混合物を乾燥する。得られた配合物を、医療用インプラントにプラズマ溶射してもよい。
【００８３】
第５の方法では、ＨＡ粉末をＡｇＮＯ３溶液と組み合わせる。混合物を浸漬し、１から３日間撹拌する。混合物を濯ぐ。次いで混合物を乾燥する。得られた配合物を、医療用インプラントにプラズマ溶射してもよい。
【００８４】
第６の方法では、ＨＡ粉末をＡｇＦおよびＡｇＮＯ３溶液と組み合わせる。混合物を浸漬し、１から３日間撹拌する。混合物を濯ぐ。次いで混合物を乾燥する。得られた配合物を、医療用インプラントにプラズマ溶射してもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、銀含有ＨＡ粉末は、（ａ）カルシウム、銀、および／またはリン前駆体を混合して、均質なゾルゲル溶液を得るステップ、（ｂ）ゾルゲル溶液を、約２０℃から約９５℃の温度で約７から約９日間、エイジングさせるステップ、（ｃ）ゾルゲル溶液を、約５００から約８００℃に及ぶ高温で約２から約４時間乾燥し焼成するステップ、および（ｄ）焼成した粉末を、後で行われるプラズマ溶射プロセスに合わせて所望の粒度分布に摩砕し篩にかけるステップによるゾルゲル法によって、生成される。いくつかの実施形態では、平均粒度が約４５から約１５０ミクロンである。例として、カルシウム前駆体は硝酸カルシウムであってもよく、銀前駆体は硝酸銀であってもよく、リン前駆体はリン酸２水素アンモニウムであってもよい。銀前駆体の濃度は、約０．１重量％から約１０重量％、約０．１重量％から約７重量％、または約０．１重量％から約５重量％、より好ましくは約０．５重量％から約３重量％、または約０．５重量％から約２重量％の範囲であってもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、リン酸カルシウムコーティングを付着する前に、基材にベース層またはプライマー層を付着させてもよい。ベース層は、基材とコーティングとの間の反応を回避しまたは減じるのに使用してもよい。あるいはベース層は、コーティング−基材の界面で、引張り接着強さを改善することができる。ベース層は、真空プラズマ溶射プロセスを使用して、付着させてもよい。あるいはベース層は、大気プラズマ溶射、イオンスパッタリング、ゾルゲルディップコーティング法、溶液沈殿、バイオミメティック法、または電着を使用して付着させてもよい。ベース層は、任意の数の化合物であってもよい。例としてベース層は、金属コーティング、セラミックコーティング、または生分解性バイオセラミックコーティングであってもよい。特にベース層は、リン酸カルシウム、バイオグラス、ポリリン酸カルシウム、リン酸４カルシウム（ＴＴＣＰ）、β型リン酸３カルシウム（ＴＣＰ）、β型ピロリン酸カルシウム（ＣＰＰ）、β型メタリン酸カルシウム（ＣＭＰ）、または実質的に純粋なＨＡを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ベース層の厚さは約１から約５０ミクロンであり、より好ましくは約１０から約２０ミクロンである。ある特定の実施形態では、ベース層および抗菌コーティングの全厚は、約３０から約３００ミクロンであり、より好ましくは約５０から約１００ミクロンである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、フッ素およびカーボネート前駆体を、カルシウム、銀、およびリン前駆体と混合して、均質なゾルゲル溶液を得ることができる。例として、フッ素前駆体はフッ化アンモニウムであってもよく、カーボネート前駆体は炭酸アンモニウムであってもよい。フッ素前駆体の濃度は、約１０−２から約１０−３Ｍの範囲であってもよい。カーボネート前駆体の濃度は、約０．１から約１０−３Ｍの範囲であってもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、骨刺激材料を、カルシウム、銀、およびリン前駆体と混合して、均質なゾルゲル溶液を得ることができる。例として、塩、鉱物、金属、金属酸化物、カーボネート、フッ化物、ケイ素、マグネシウム、ストロンチウム、バナジウム、リチウム、銅、または亜鉛前駆体、またはこれらの組合せを、カルシウム、銀、およびリン前駆体と混合して、均質なゾルゲル溶液を得ることができる。
【００８９】
当業者なら、溶液中の硝酸銀および／またはフッ化銀の正確な量または濃度を変えてよいことを、容易に理解することができる。ごく少量の硝酸銀および／またはフッ化銀しかＨＡ粉末に吸収されず、したがって溶液の濃度は、硝酸銀またはフッ化銀の廃棄物を削減するために最適化することができる。あるいは余分なフッ化銀および／または硝酸銀を溶液に添加して、プラズマ溶射中の銀および／またはフッ素のいくらかの蒸発／気化を補償することができる。
【００９０】
さらに、ストロンチウムおよび／またはバナジウムを単独で、または本発明の銀および／またはフッ化物、ならびに銅や亜鉛などのその他の金属と組み合わせて使用してもよい。
【００９１】
少量の銀および／またはフッ化物を従来のＨＡ粉末に添加することにより、本発明は、改善された抗菌／抗感染／骨結合特性を生物医学的インプラントにもたらす。さらに、従来技術は、本発明で行われるようにプラズマ溶射することが可能な均質な配合物であるＨＡ粉末を、もたらすことができない。本発明の均質なＨＡ／銀粉末配合物は、銀およびＨＡが別々の不均質な付着よりも、プラズマ溶射後にさらになお均一で分解が制御されたコーティングを提供することができる。
【００９２】
上述の例には、ヒドロキシアパタイトが含まれるが、当業者なら、リン酸カルシウムのその他の形態を使用してよいことが理解されよう。例として、アパタイト、即ち非化学量論的アパタイト、リン酸カルシウム、オルトホスフェート、リン酸１カルシウム、リン酸２カルシウム、リン酸３カルシウム、フィトロッカイト、リン酸４カルシウム、非晶質リン酸カルシウムを、ＨＡの代わりに用いてもよい。
【００９３】
本発明は、好ましくは本明細書に記述される方法および技法のいずれかを使用してコーティングされた、様々な医療用インプラントも提供する。医療用インプラントのコーティングは、１つまたは複数の層を含むことができ、各層は、別の層と同じまたは異なる組成を含んでいてもよい。各層は、好ましくは還元環境下（例えば、真空中）でプラズマ溶射される。
【００９４】
任意選択で、医療用インプラントは、いくつかの層を含むコーティングを有し、その抗菌剤の濃度は、少なくとも２つのコーティング層で異なるものである。
【００９５】
本発明のインプラントは、好ましくは、宿主環境に首尾よく一体化する機会を高めるように製造され、一方それと同時に、感染の危険性を低減させまたは防止する抗菌環境を提供する。
【００９６】
本発明の範囲から逸脱することなく、対応する図を参照しながら、上述のように様々な修正を例示的な実施形態に行うことができるので、前述の記述に含まれ添付図面に図示される全ての内容は、限定ではなく例示として解釈すべきとする。したがって、本発明の外延および範囲は、上述の例示的な実施形態をいかようにも限定すべきではなく、本明細書に添付された以下の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ定義すべきである。
【００９７】
（実施例）
（実施例１）
方法
３つの異なる濃度の硝酸銀溶液を、硝酸銀溶液とＨＡ粉末との間のイオン交換反応のために、蒸留および脱イオン水（ＤＤＨ２Ｏ）で調製した。硝酸銀溶液からのいくらかのＡｇイオンを、ＨＡ構造からのＣａイオンの代わりに用いることになり、一方、いくらかの銀化合物は、ＨＡ表面に物理的に吸着されることになる。ＨＡ粉末中の目標とされる銀含量は、それぞれ０．３重量％、１重量％、および３重量であった。硝酸銀およびＨＡ粉末の質量を、Ｔａｂｌｅ  １（表１）に列挙した。
【００９８】
【表１】
2015110019.tif 000003
【００９９】
硝酸銀（ＢＤＨ、カタログ＃ＢＤＨ０２７６−１２５Ｇ）を、まず、３リットルのガラスビーカー中のＤＤＨ２Ｏに溶解し、次いでＨＡ粉末（ＭＥＤＩＰＵＲＥ（登録商標）、ＭＥＤＩＣＯＡＴ  ＡＧ、粒度：  −１２５μｍ＋４５μｍ）を、Ｔａｂｌｅ  １（表１）に従って、調製した硝酸銀溶液に添加した。ＨＡおよび硝酸銀溶液を、室温のオービタルシェーカ内で、１８０ＲＰＭで３日間撹拌することにより、均質なイオン交換反応を可能にした。
【０１００】
イオン交換反応後、溶液を、炉内で８０℃で乾燥したままにして、水を蒸発させた。次いで乾燥し変性させたＨＡ粉末を、乳棒および乳鉢を使用して手作業で軽く摩砕して、乾燥プロセス中に形成された凝集塊を破砕した。次いで摩砕し変性したＨＡ粉末を、１００〜３２５メッシュシーブ（Ｗ．Ｓ．Ｔｙｌｅｒ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に通して篩にかけた。１５０μｍよりも大きくまたは４５μｍよりも小さい全てのＨＡ粉末を廃棄した。少なくとも９８％のＨＡ粉末を、１００〜３２５メッシュシーブの間で収集した。
【０１０１】
銀変性ＨＡ粉末を、レーザ回折粒度分析器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＳ１３  ３２０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）を使用してさらに特徴付けた。全ての測定値を、Ｔａｂｌｅ  ２（表２）に列挙した。平均粒度は、ＨＡ粉末中の銀含量の増加と共にわずかに増大した。低および中度の銀ＨＡ粉末の粒度分布は、対照の純粋なＨＡ粉末に類似していた。
【０１０２】
【表２】
2015110019.tif 000004
【０１０３】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を利用して、粉末の構造、相組成、および粒度を特徴付けた（事前噴霧）。この分析は、Ｈ＆Ｍ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）で行った。コーティングされたサンプルを、標準サンプルホルダに配置し、４０ｋＶ／３０ｍＡのＣｕ放射線を使用してＰｈｉｌｉｐｓ  ＰＷ３０２０回折装置に入れた。スキャンを、１０°から７０°の範囲にわたりステップサイズ０．０２°で、それぞれカウント時間８時間で実行した。エネルギー分散型Ｘ線分析を備えた走査電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ−６４６０ＬＶ、日本）を使用して、表面形態、Ｃａ／Ｐ比、コーティングのＡｇ含量、およびコーティングの厚さを検査した。
【０１０４】
銀変性粉末を、１０％硝酸溶液にこの粉末（事前噴霧）を完全に溶解することによって、組成に関してさらに分析した。一定分量を硝酸溶液から引き出し、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）質量分析を使用して銀イオン濃度分析を行った。
【０１０５】
次いでこれらの銀変性ＨＡ粉末を、銀含有ＨＡコーティングに関して、Ｍｅｄｉｃｏａｔ（Ｍａｇｅｎｗｉｌ、スイス）の従来の真空プラズマ溶射プロセスで使用した。粉末が溶射された全ての基材は、ミルアニールされたＴｉ６Ａｌ４Ｖ合金から作製された。平らな表面のディスクサンプルは、直径１２．６ｍｍおよび厚さ３．１ｍｍであった。これらのクーポンをグリットブラストにかけて、清浄化し、その後、プラズマ溶射した。溶射パラメータの全ては、純粋なＨＡ粉末と銀変性ＨＡ粉末とで共に同じであった。Φ１２．６ｍｍホールのステンレス鋼板を使用して、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖクーポンを取り付けた。コーティングプロセス後、溶射したままのコーティングをイソプロパノールで濯いだ。
【０１０６】
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を利用して、粉末に関して使用したものと同じ手法で、コーティングの構造、相組成、および粒度を特徴付けた。
【０１０７】
４つの群のそれぞれから得た、３つの直径１インチのＴｉ６Ａｌ４Ｖクーポンを、基材として使用して、ＨＡまたはＡｇドープ済みＨＡコーティングを堆積し、それによって、ＡＳＴＭ  Ｆｌ１４７に記述されたものと同様の手法でコーティングの引張り接着強さを評価した。
【０１０８】
各クーポンの裏面および試験スタブの端部を、８０グリッド紙で全て軽く挟んで、エポキシ接着強さを高めた。クーポンの裏面（即ち、コーティングされていない面）をアセトンで清浄化し、２〜３分間空気乾燥させた。
【０１０９】
引張り試験スタブを、１層のＦＭ１０００接着剤を裏面にかつ１層をコーティング面に使用して、各クーポンの対向面に貼り付けた。これは、硬化フィクスチャで構造をアセンブルし、このフィクスチャを３３８°Ｆ（１７０℃）の温度の対流式炉内に１３０分間（または、２個のフィクスチャが同時に炉内に置かれる場合は１３５分間）、死荷重２．３ｌｂｆ（１０Ｎ）の下に置いて、接着剤を熱硬化することによって行った。フィクスチャを炉から除去し、室温まで冷却した後、死荷重を取り除き、構造体をフィクスチャから取り出した。
【０１１０】
各構造体を、破損するまで０．１０インチ／分（２．５ｍｍ／分）の変位速度で引張り荷重の下に置き、試験をした。各構造体のピーク荷重および破断モードを記録した。引張り接着強さは、ピーク荷重をクーポンの断面積で割ることによって、決定した。試験後、各クーポンについて、無効な試験であることを示し得る基材への接着剤の浸透が無いことを確実するために、検査をした。
【０１１１】
１つのサンプルを、コーティングからの銀放出を評価するために各条件で使用した。コーティングされたディスクサンプルを、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）２ｍＬに２４、７２、および１６８時間浸漬した。各時点で、１ｍＬ溶液を引き出し、４℃の冷蔵庫でエッペンドルフ管内に保存し、その後、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ＆  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．  Ｍｅｎｐｈｉｓ、ＴＮで誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）銀分析を行った。濃硝酸１５μＬをこの管に添加して、溶液から銀が堆積しないようにした。
【０１１２】
結果
銀変性ＨＡ粉末のＸＲＤおよびＩＣＰの結果を、以下のＴａｂｌｅ  ３（表３）に列挙する。全Ａｇ（ＸＲＤ）は、粉末ＸＲＤ相組成分析の結果である。ＸＲＤの結果は、銀が、金属の銀、硝酸銀（即ち、銀を含有する当初の銀イオン交換反応媒体）、または酸化銀として存在することを実証した。ＸＲＤは、金属銀または銀化合物の結晶質層を決定するだけであることに留意すべきである。ＨＡ結晶に中間された銀は検出されない。ＩＣＰは、銀変性ＨＡ粉末中のＡｇの総量を決定するのに使用した。ＩＣＰ分析は、存在する全ての銀−ＨＡ結晶中に置換されたものとして存在する銀およびＨＡ結晶から分離された個々の化合物として存在する銀（例えば、硝酸銀、酸化銀、および金属銀）を測定する。ＨＡ結晶中に含有される銀の量は、ＩＣＰの結果からＸＲＤの結果を差し引くことによって決定することができる。例えば、１重量％のＡｇ−ＨＡ粉末の場合、ＸＲＤの結果は、銀変性ＨＡ粉末中に銀が０．４５重量％あることを示し；しかし同じ粉末のＩＣＰの結果は、この変性粉末中の全Ａｇ含量が０．９８重量％であることを示したが、これは設計された全銀濃度に近いものであった。したがって、これは、約５４％の銀がＨＡ構造内に組み込まれたことを示す。硝酸銀イオン交換溶液からの過剰な銀は、ＶＰＳプロセス後にＸＲＤによって特定されたようにその他のＡｇ相に変換された。
【０１１３】
【表３】
2015110019.tif 000005
【０１１４】
図１は、コーティングの表面外観を示す、純粋なＨＡ（ａ）、Ａｇ−ＨＡ−Ｌ（ｂ）、Ａｇ−ＨＡ−Ｍ（ｃ）、およびＡｇ−ＨＡ−Ｈ（ｄ）でコーティングされたＴｉ６Ａｌ４Ｖディスクサンプルの走査電子顕微鏡写真を示す。概して、全てのコーティングは均一に見え、かつＴｉ６Ａｌ４Ｖ基材を覆っていた。銀含有ＨＡコーティングと純粋なＨＡコーティングとの間に、明らかな相違は無かった。ＨＡおよびＡｇ−ＨＡ−Ｈのサンプルの断面は、コーティングの厚さが約８０μｍであることを示す（図２）。銀濃度を、「ｘ」のマーカーによって示されるように、Ａｇ−ＨＡ−Ｈサンプルのコーティング全体にわたり異なる部位で測定した。
【０１１５】
定量的エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸＡ）は、Ｔａｂｌｅ  ４（表４）において、コーティングのＣａ／Ｐ比およびＡｇ含量を示す。少なくとも１０〜１５のランダムに選択された領域を、サンプルごとに使用して、この定量分析用にスペクトルを収集した。Ｃａ／Ｐ比は、銀含量の増加と共に低下したが、これは、コーティング中のＡｇが増加すると共にＨＡ格子中のＡｇの置換が増加することを示している。さらに、Ａｇを、Ａｇドープコーティングの厚さを通して特定した（図２；  Ｔａｂｌｅ  ５（表５））。
【０１１６】
ドープ済みＨＡコーティングのＡｇ含量は、ＩＣＰにより測定された値よりも高く（Ｔａｂｌｅ  ３（表３））、これはＥＤＸＡ分析に関連した表面粗さのアーチファクトに起因するようである。
【０１１７】
【表４】
2015110019.tif 000006
【０１１８】
【表５】
2015110019.tif 000007
【０１１９】
ＸＲＤの結果をＴａｂｌｅ  ６（表６）に示す。定量分析を、Ｒｉｅｔｖｅｌｄ精製を使用して行った。ＨＡ相の他に、Ｃａ３（ＰＯ４）２ＣａＯ（リン酸４カルシウム、ＴＴＣＰ）の不純物相を、全てのコーティングサンプルで特定した。対照の純粋なＨＡコーティングサンプル中に、Ａｇは検出されなかった。ドープ済みＨＡコーティング中のＡｇ含量は、Ｔａｂｌｅ  １（表１）に示される設計されたＡｇ含量に近いものであった。ＶＰＳプロセス中のＡｇの損失および蒸発は、最小限に抑えられた。さらに、ＨＡコーティングへのＡｇの添加は、Ａｇ−ＨＡ−ＬおよびＡｇ−ＨＡ−Ｍでコーティングされたサンプルの相組成を著しく変化させず、しかし、多量のＡｇドープ型ＨＡコーティング（即ち、Ａｇ−ＨＡ−Ｈ）は、対照の純粋はＨＡコーティングサンプルよりも、わずかに増大したＨＡ相および減少したＴＴＣＰ相を示した。
【０１２０】
【表６】
2015110019.tif 000008
【０１２１】
さらに、ＨＡ相およびＡｇ相の格子パラメータおよび粒度を、Ｓｃｈｅｒｒｅｒの式を使用して計算した。これらの結果をＴａｂｌｅ  ７（表７）に示す。半値全幅（ＦＷＨＭ）データをＳｃｈｅｒｒｅｒの式と共に使用して、平均ＨＡおよびＡｇ粒度を決定した。Ｓｃｈｅｒｒｅｒの式は、
【０１２２】
［数１］
ｔ＝０．９λ／βｃｏｓθ
【０１２３】
によって与えられ、但しλはＸ線波長であり、βはＦＷＨＭであり、θはブラッグの回折角である。
【０１２４】
【表７】
2015110019.tif 000009
【０１２５】
全てのコーティングサンプル（Ａｇドープ済みＨＡコーティングを含む。）が、化学量論的に標準的なＨＡに比べて著しく高いｃ／ａ比を有したことは、何の価値も無い（Ｔａｂｌｅ  ７（表７））。これは、ＨＡおよびＡｇ−ＨＡコーティングサンプルが、Ｔａｂｌｅ  ４（表４）に示されるＣａ／Ｐ比によって明らかにされたように、非化学量論的であることを示している。
【０１２６】
Ｓｃｈｅｒｒｅｒの式を使用すると、ＶＰＳコーティング中の平均ＨＡ粒度は４０．８ｎｍから５７．０ｎｍに及んだ。コーティング中の粒度とＡｇの含量との間には、相関が無かった。コーティングの平均Ａｇ粒度もナノスケール上にあり、３７．６ｎｍから５６．４ｎｍに及んだ。ＶＰＳプロセス後、Ａｇまたは銀化合物をナノ結晶質金属Ａｇに変換した。このナノ結晶質ＨＡ相および金属Ａｇ相は、溶融または部分溶融ＨＡまたはＡｇ−ＨＡ粉末をプラズマに通しかつ基材上に素早く堆積した後の、高速冷却から得られた。したがって、粒の成長が引き起こされる時間は無かった。
【０１２７】
引張り接着強さの結果を、図３に報告する。Ａｇ−ＨＡ−Ｈコーティングサンプルに関する引張り接着強さは、試験サンプルの全ての中で最も低く、最小でも１５ＭＰａの接着強さを必要とするＩＳＯの要件を満たさなかった。１重量％以下のＡｇの添加（即ち、Ａｇ−ＨＡ−ＬおよびＡｇ−ＨＡ−Ｍ）は、コーティングの引張り接着強さに著しい影響を及ぼさなかった。欠陥の全ては、コーティング内に生じた。銀含有ＨＡコーティングと純粋なＨＡコーティングとの破断面の外観に、明らかな相違は無かった（純粋なＨＡおよびＡｇ−ＨＡ−Ｈは図４に示される。）。
【０１２８】
ＰＢＳの銀放出プロファイルを、図５に示す。全てのコーティングサンプルは、２４時間ほどの早い時間で３７℃のＰＢＳ中にＡｇを放出したことを示す。ＰＢＳ中に放出されたＡｇ濃度は、７日まで、経時的に徐々に増大した。ＰＢＳ中に放出されたＡｇの量は、Ａｇ用量に依存的である。Ａｇ−ＨＡ−Ｈコーティングサンプルは、最大量のＡｇをＰＢＳに放出し、Ａｇ−ＨＡ−Ｌコーティングサンプルは、最少量のＡｇを放出した。
【０１２９】
（実施例２）
硝酸銀溶液を使用したヒドロキシアパタイト粉末変性
２つの異なる濃度の硝酸銀溶液を、硝酸銀溶液とＨＡ粉末との間のイオン交換反応用に蒸留水および脱イオン水（ＤＤＨ２Ｏ）で調製した。理論的には、硝酸銀溶液からのいくらかのＡｇイオンが、ＨＡ構造からのＣａイオンと置換されることになり、一方、いくらかのＡｇイオンは、ＨＡ表面に物理的に吸着されることになる。ＨＡ粉末中の目標とする銀含量は、それぞれ１重量％および２重量％であった。硝酸銀およびＨＡ粉末の質量を、Ｔａｂｌｅ  ８（表８）に列挙した。
【０１３０】
【表８】
2015110019.tif 000010
【０１３１】
硝酸銀（ＢＤＨ、カタログ＃  ＢＤＨ０２７６−１２５Ｇ）を、まず、３リットルのガラスビーカー中のＤＤＨ２Ｏに溶解し、次いでＨＡ粉末（ＭＥＤＩＰＵＲＥ（登録商標）、ＭＥＤＩＣＯＡＴ  ＡＧ、粒度：  −１３０μｍ＋４５μｍ）を、Ｔａｂｌｅ  ８（表８）により調製された硝酸銀溶液に添加した。ＨＡおよび硝酸銀溶液を、室温のオービタルシェーカ内で、１８０ＲＰＭで３日間撹拌することにより、均質なイオン交換反応を可能にした。
【０１３２】
イオン交換反応後、溶液を、炉内で８０℃で乾燥したままにして、水を蒸発させた。次いで乾燥し変性させたＨＡ粉末を、自動化された乳棒および乳鉢を使用して軽く摩砕して（Ｒｅｔｓｃｈ、Ｍｏｒｔａｒ  Ｇｒｉｎｄｅｒ  ＲＭ２００、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＰＡ）、乾燥プロセス中に形成された凝集塊を破砕した。次いで摩砕した変性ＨＡ粉末を、１００〜３２５メッシュシーブ（Ｗ．Ｓ．Ｔｙｌｅｒ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に通して篩にかけた。１５０μｍよりも大きくまたは４５μｍよりも小さい全てのＨＡ粉末を廃棄した。少なくとも９８％のＨＡ粉末を、１００〜３２５メッシュシーブの間で収集した。
【０１３３】
銀変性ＨＡ粉末を、レーザ回折粒度分析器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＳ１３  ３２０、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）を使用してさらに特徴付けた。全ての測定値を、Ｔａｂｌｅ  ９（表９）に列挙した。平均粒度は、ＨＡ粉末中の銀含量の増加と共にわずかに増大した。低および中度の銀ＨＡ粉末の粒度分布は、対照の純粋なＨＡ粉末に類似していた。
【０１３４】
【表９】
2015110019.tif 000011
【０１３５】
次いでこれらの銀変性ＨＡ粉末を、銀含有ＨＡコーティングに対してＭｅｄｉｃｏａｔ（Ｍａｇｅｎｗｉｌ、スイス）で従来の真空プラズマ溶射プロセスで使用した。
【０１３６】
基材の調製
全ての基材を、ミルアニールされたＴｉ６Ａｌ４Ｖ合金から作製した。平らな表面のディスクサンプルは、直径１２．６ｍｍおよび厚さ３．１ｍｍであった。これらのクーポンを、Ｓ＆Ｎ、Ａａｒａｕ、スイスでグリットブラストにかけて清浄化した。
【０１３７】
コーティングの堆積
コーティングを、Ｍｅｄｉｃｏａｔ、Ｍａｇｅｎｗｉｌ、スイスで従来の真空プラズマ溶射システムを使用して付着させた。全ての溶射パラメータは、純粋なＨＡ粉末および銀変性ＨＡ粉末の両方に関して同じであった。Φ１２．６ｍｍの穴を有するステンレス鋼板を、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖクーポンを取り付けるのに使用した。コーティングプロセス後、溶射したままのコーティングをイソプロパノールで濯いだ。
【０１３８】
コーティングの特徴付け技法
電界放射型走査電子顕微鏡法
サンプルを、２重後方散乱検出器（Ｄｕａｌ  ＢＳＤ）とＳＯＰ／ＭＳ／１３１によるＥＤＡＸ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４０００エネルギー分散型Ｘ線微量分析（ＥＤＸ）システムとを備えたＦＥＩ  Ｎｏｖａ  ＮａｎｏＳＥＭ  ２００走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して検査した。各サンプルクーポンの３つの例全てを、自己接着カーボンリッチディスクを用いて、２５ｍｍの直径のアルミニウムピンスタブに取り付けた。サンプルを、表面電荷が最小限に抑えられかつ表面情報が最大限になるように（最小限に抑えられた電子ビーム透過）、コーティングしないまま（スパッタコーティング無し）中加速電圧１０ＫＶの低真空条件下（０．６〜１．０Ｔｏｒｒ、水蒸気）で検査した。
【０１３９】
ＥＤＸデータを得るのに使用した分析条件は、１０ＫＶ加速電圧、スポットサイズ５．５、および位置３での最終アパーチャ、Ｘ線カウント速度は、２０％から３９％の検出システム不感時間で秒当たり約１５００から４０００カウントの間であった（ほぼ最適な条件）。ＥＤＸ微量分析は、この研究において問題とされる化学元素からｘ線を励起するのに必要な最小限に抑えられた電子ビームエネルギーを提供し、一方、材料表面を通過するサンプルの浸透を最小限に抑えようとするという理由で、１０ＫＶ加速電圧で実施した。高分解能撮像は、２次電子に関しては低真空検出器（ＬＶＤ）で、また後方散乱電子に関しては気状分析検出器（ＧＡＤ）実現した。代表的な領域のデジタル画像を、非圧縮ＴＩＦＦフォーマットで記録した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して、サンプルＨＡ１−Ａｇ／ＨＡ（ＴＯ０３５Ｂ）およびＨＡ２−Ａｇ／ＨＡ（ＴＯ０３５Ｃ）中の銀に富む材料のサイズを評価し、このとき空間較正を行うためにＳＥＭ画像スケールバーを使用した。
【０１４０】
Ｘ線回折
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を利用して、構造および相組成を特徴付けた。この分析は、スイスのＳｗｉｓｓ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで行った。ＸＲＤパターンを、２０°から６０°の間で、０．０２°のステップサイズで、銅ｘ線源を用いて測定した。シグナルを、各ステップで３秒間測定し、その強度を秒当たりのカウント数（ｃｐｓ）で示す。以下のスリットおよびフィルタを、以下の順序で、即ち１ｍｍ、０．５ｍｍ、Ｎｉフィルタ、および０．２ｍｍで使用した。ＸＲＤは、表面から廃棄された粉末ではなく（ＩＳＯ  １３７７９−３に記述されるように）溶射したままのコーティング上で測定した。ヒドロキシアパタイトコーティングのＸＲＤパターンを、ＡＳＴＭ  Ｆ  ２０２４−００およびＩＳＯ  １３７７９−３規格の修正版で分析した。両方の標準的な試験法の直接の適用は、銀の存在によって結果が不明瞭になったので、可能ではなかった。コーティングの分析に使用された規格および方法を修正する理由は、結果のセクションで論じた。参照材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｒｅｆ７６／８００／７ｈ）、Ａｌ２Ｏ３（Ａｌｐｈａ  Ａｅｓａｒ  ９９．９９％）、および銀板（９９．９５％）であった。
【０１４１】
Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ基材に対するコーティングの引張り接着強さ
３つのグループそれぞれから得た、５つの直径１インチのＴｉ６Ａｌ４Ｖクーポンを、基材として使用して、ＨＡまたはＡｇドープ済みＨＡコーティングを堆積し、これらコーティングの引張り接着強さを、ＡＳＴＭ  Ｆ１１４７で記述されたものと同様の手法で評価した。
【０１４２】
各クーポンの裏面および試験スタブの端部を、８０グリット紙で全て軽く挟んで、エポキシ接着強さを高めた。クーポンの裏面（即ち、コーティングされていない面）をアセトンで清浄化し、２〜３分間空気乾燥させた。
【０１４３】
引張り試験スタブを、１層のＦＭ１０００接着剤を裏面に使用しかつ１層をコーティング面に使用して、各クーポンの対向面に貼り付けた。これは、構造体を硬化フィクスチャにアセンブルし、このフィクスチャを変換炉内に１３０分間（または、２個のフィクスチャが同時に炉内に置かれる場合は１３５分間）、３３８°Ｆ（１７０℃）の温度で、死荷重２．３ｌｂｆ（１０Ｎ）の下に置いて、接着剤を熱硬化することによって行った。炉からフィクスチャを取り出し、室温に冷却した後、死荷重を取り除き、構造体をフィクスチャから取り外した。
【０１４４】
各構造体を、破損するまで０．１０インチ／分（２．５ｍｍ／分）の変位速度で引張り荷重の下に置くことにより、試験をした。各構造体のピーク荷重および破断モードを記録した。引張り接着強さは、ピーク荷重をクーポンの断面積で割ることによって、決定した。試験後、各クーポンについて、無効な試験であることを示し得る基材への接着剤の浸透が無いことを確実するために、検査をした。
【０１４５】
結果および考察
ＳＥＭ／ＥＤＸ
図６ａから図６ｃは、低倍率での異なるサンプルそれぞれの２次電子画像を示し、各サンプルタイプの外観を示している。各サンプルタイプの表面外観に、定性的な相違は見られない。表面は、丸味の付いた非晶質形態と、凝集した角度の付いた微粒子のいくらかの領域との混合物を有しており、コーティングプロセスで使用された粉末ストックの溶融が不完全であることを示唆していた。これは、金属クーポンをコーティングするための、真空プラズマ溶射などの溶融噴霧堆積プロセスの使用と矛盾しないものである。
【０１４６】
図７ａから図７ｃは、各サンプルの表面形態の、より高い倍率の２次電子画像を示す。形態の混合物は、各サンプルで見られず、非晶質上の材料といくらかの微細な角度の付いた微粒子との両方が存在している。微視的な亀裂がＨＡ層の表面に存在した（図７ｃで明らかである。）。同様の微粒子材料が、サンプルの全てで観察され、サンプルタイプまたは倍率に関係無くそれらの表面外観に明らかな定性的相違は無かったが、２次および後方検出画像の両方の後方電子シグナルは、サンプルＡｇ−ＨＡ１およびＡｇ−ＨＡ２中にミクロおよびナノスケールの銀粒子がさらに存在することを明らかにした。
【０１４７】
図８ａから図８ｃは、低倍率での異なるサンプルそれぞれの後方散乱電子画像を示し、各サンプルタイプの外観を示している。いくつかの明るい斑点／粒子が、銀含有サンプル上に見られる。多くの電子が、より高い平均原子数（Ｚ）からなる材料から後方散乱され、後方散乱画像上に明るい領域を生成している。図８ｂおよび８ｃでのより明るい、また非常に明るい領域は、銀に富む材料の部位に対応する（銀化合物は、後方散乱電子画像においてより暗い領域として現されるカルシウムＨＡよりも、高い平均Ｚを有している。）。より高い倍率の後方散乱画像が、図９ａから９ｃの各サンプルから示され、銀含有サンプル中の銀に富む材料の空間分布に細かな詳細が明らかにされている。
【０１４８】
ＨＡ対照サンプルの組成は、後方散乱電子によって視覚化されるように均質である（図９ａ）。銀を含有するサンプルＡｇ−ＨＡ１およびＡｇ−ＨＡ２は、図９ｂおよび９ｃにおいて組成が均質であることが示される。銀に富む材料の異なるサイズの範囲がわかるが、より多くの銀に富む材料は、サンプルＡｇ−ＨＡ２に示される。銀に富む材料のサイズに関する画像分析評価は、銀含有サンプルに関して約１５ｎｍから１０μｍに及んでいた。より高い倍率の検査は、図１０ａおよび１０と図１１ａおよび１１ｂで、銀ベースの微粒子の異なる形状を強調している。各サンプルに関する薄い灰色領域（図９ｃのオレンジの円および図１２の明らかに見える部分など）は、高倍率で見たときに、カルシウムＨＡの表面にまたは表面下に分散した多くのナノスケールの銀微粒子からなることが示されている。
【０１４９】
図１３ａは、ＥＤＸ微量分析によって得られた元素ドットマップを示し、一方、サンプルＡｇ−ＨＡ２の対応する領域の後方散乱画像を、図１３ｂに示す。ドットマップは、銀ドープ済みサンプルの後方散乱画像に示される明るいフィーチャおよび薄い灰色のフィーチャが、銀に富む材料に対応する（ＥＤＸマップの青い領域）という確認を行う。
【０１５０】
図１４ａ〜ｂは、Ａｇ−ＨＡ１サンプルおよびＡｇ−ＨＡ２サンプルからのＥＤＳスペクトル示す。矢印は、銀のピークエネルギーを示す。Ａｇ−ＨＡ２は、コーティング中により高いＡｇ含量を有することを示した。
【０１５１】
図１５は、ＨＡ２サンプル上の個々の明るい粒子のスペクトルを示す（画像中、「ｘ」がマークされたスポット）。これらの領域の銀濃度は、以下の画像に示されるように、個々の明るい粒子が無い領域の場合よりも非常に高かった。これらの明るい領域および付随するＥＤＸＡスペクトルは、ＸＲＤ分析を介して先に発見された金属粒子の存在を、確かなものにしている。
【０１５２】
個々の明るい粒子から離れたコーティング領域も、図１６ａ〜ｃに示されるように、ＨＡ２サンプルに関するＥＤＸＡを介して評価した。これらの領域は、明るい個々の粒子に欠けているが、非常に低い濃度であっても銀の存在を示していた。これは、ＸＲＤおよびＩＣＰ分析によって先に実証されたように、ＨＡマトリックス内の銀置換の存在があることを確かなものにしている。
【０１５３】
Ｘ線回折
定性分析
３つのサンプルのＸＲＤパターンを、図１７に示す。サンプルＨＡは、ヒドロキシアパタイトに関する全ての予測されるピークを示す。Ａｇ−ＨＡ１およびＡｇ−ＨＡ２サンプルは、同じＨＡピークを示すが、金属銀に一致する３８．１５°にピークが付加されている（図１７のピークを示す矢印）。広いピークが３１．１°に観察される。このピークは、非晶質相またはα型リン酸３カルシウム（α−ＴＣＰ）またはβ型リン酸３カルシウム（β−ＴＣＰ）に起因する可能性がある。３８．１５°のピークは、銀（Ａｇ）からの回折であり、挿入図は、このピークの画像を拡大したものを示す。
【０１５４】
３．３．２  結晶化度分析
結晶化度を、ＡＳＴＭ  Ｆ  ２０２４−００およびＩＳＯ  １３７７９−３の両方の規格により測定した。両方の方法の結果を、Ｔａｂｌｅ  １０（表１０）に示す。ＡＳＴＭ  Ｆ  ２０２４−００は、外部標準（α−Ａｌ２Ｏ３）と比較した、３８．５°から５９°の間のピークの相対強度を測定する。これらのピークは、ヒドロキシアパタイトに見られる一般的な不純物に乱されていないが、これらのピークの相対強度は主ピークよりも低く、したがってこの方法はそれほど感度がよくない。ＩＳＯ  １３７７９−３規格は、１００％ヒドロキシアパタイト参照物と比較した、１０個の最も強いピークの相対強度を測定する。これらの測定は、表面から擦り取った粉末とは対照的に（ＩＳＯ  １３７７９−３に指定されるように）、「溶射したままの」サンプルに関して実施した。
【０１５５】
３．３．３  銀分析
２つのサンプルＡｇ−ＨＡ１およびＡｇ−ＨＡ２の銀含量を、純粋な銀サンプルと比較した相対強度によって測定した。銀含量の結果を、Ｔａｂｌｅ  １０（表１０）に示す。Ａｇ−ＨＡ１サンプルは、２．０±０．５％の銀含量を有し、Ａｇ−ＨＡ２サンプルは、２．５±０．５％の銀顔料を有する。
【０１５６】
【表１０】
2015110019.tif 000012
【０１５７】
３．５  Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ基材に対するコーティングの引張り接着強さ
引張り接着強さの結果を、図１８に報告する。Ａｇ−ＨＡ１コーティングサンプルに関する引張り接着強さは、全ての試験サンプルの中で最も低くかったが、この群の最低値であっても、最小の接着強さが１５ＭＰａであることを必要とするＩＳＯ要件を依然として満たしていた。全ての欠陥は、コーティング内に生じた。銀含有ＨＡコーティングと純粋なＨＡコーティングとの破断面の外観に、明らか相違は無かった。
【０１５８】
（実施例３）
生物医学的適用例に関する勾配コーティング
図１９は、下記の方法によって調製された本発明の実施形態の一例を示す（ＶＰＳ  ＨＡ（１５１２）およびＶＰＳ  ＡｇＨＡ（１５１４）を含有する勾配コーティングと、β−ＴＣＰ、Ａｇ、およびブピバカインを含有するＰＬＧＡコーティングの上層（１５１６）とを備えたインプラント基材（１５１０）［例えば、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ］）。
【０１５９】
１．  ＨＡ／Ａｇ−ＨＡコーティングの調製：
Ａｇ−ＨＡ粉末（４５〜１２５μｍ）を、イオン交換反応を使用して変性させた。コーティングプロセスのパラメータは、医療用インプラント用の本発明者らの製造設備で生成された、標準的な真空プラズマ溶射ＨＡコーティングと同じであった。ＶＰＳ  ＨＡコーティングを最初に付着させ、次いでＶＰＳ  Ａｇ−ＨＡコーティングを付着させた。コーティングしたサンプルは、ＰＬＧＡコーティングに供する準備ができた。
【０１６０】
２．  銀変性β−ＴＣＰ粉末の調製：
１）．  ０．５ｇのβ−ＴＣＰ粉末（Ｄ５０  約３μｍ）および１４５．８ｍｇの硝酸銀を、５５ｍＬの脱イオン水および蒸留水に溶解し、６０℃で１時間撹拌した。
２）．  水を、６０℃で一晩蒸発させた。
３）．  次いで乾燥粉末を摩砕した。あるいは、銀変性β−ＴＣＰを凍結乾燥して水を除去することもでき、摩砕ステップを必要としない。
４）．  銀変性粉末を、引き続き４００℃で２時間焼結した。
【０１６１】
３．  ＰＬＧＡ溶液の調製：
１）．  ０．７５ｇのＰＬＧＡペレット（８５：１５）を、ジクロロメタン１５ｍＬ中に溶解し、一晩撹拌した。
２）．  ０．２５ｇの銀変性β−ＴＣＰおよび１００ｍｇのブピバカイン粉末を、ＰＬＧＡ溶液中に溶解し、一晩撹拌した。Ａｓｄａｓｄ
【０１６２】
４．  ＰＬＧＡコーティングの付着：
ＶＰＳ  ＨＡ／ＶＰＳ  Ａｇ−ＨＡコーティングしたＴｉ６Ａｌ４Ｖ基材を、ＰＬＧＡ溶液に浸漬し、垂直に引き出し、次いで一晩空気乾燥した。
【０１６３】
結果：
上部ＰＬＧＡ層の表面形態を、図２０および２１に示す。ＥＤＸＡスペクトルから得られた定量分析を、Ｔａｂｌｅ  １１（表１１）に示す。
【０１６４】
【表１１】
2015110019.tif 000013
【０１６５】
（実施例４）
図２２は、本発明の別の実施形態を示す（ＶＰＳ  ＨＡ（１８１２）およびＶＰＳ  ＡｇＨＡ（１８１４）を含有する勾配コーティングと、β−ＴＣＰ、Ａｇ、およびブピバカインを含有するＰＬＧＡコーティングの層（１８１６）と、β−ＴＣＰ、Ａｇ、およびブピバカインを含有するＰＬＧＡビーズ層（１８１８）とを備えたインプラント基材（１８１０）［例えば、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ］）。
【０１６６】
これは、Ａｇおよびブピバカインの量および放出所要時間を、ＰＬＧＡコーティングの上面へのＰＬＧＡビーズの添加を通して全コーティング表面積を増大させることにより、制御できることを実証する一例である。ブピバカインは、身体環境で死素早い放出プロファイルを有することが知られていた。連続した長期にわたる放出をもたらすために、ブピバカインをＰＬＧＡビーズに組み込んで、身体環境におけるその分解速度を遅くした。
【０１６７】
方法
１．  ＰＬＧＡビーズの調製：
１）  銀変性β−ＴＣＰ粉末を、実施例３の場合と同じ方法で調製した。
２）  ０．２５ｇの銀変性β−ＴＣＰおよび１００ｍｇのブピバカイン粉末を、ＰＬＧＡ溶液（０．７５ｇのＰＬＧＡを１５ｍＬのジクロロメタンに溶かしたもの）に溶解し、一晩撹拌した。
３）  ５ｇのドデシル硫酸ナトリウムを５００ｍＬの脱イオン水および蒸留水に溶解した。
４）  銀変性β−ＴＣＰおよびブピバカイン粉末を含有するＰＬＧＡ溶液を、激しく撹拌しながらＳＤＳ溶液に１滴ずつ添加した。水中油中水２重乳化から形成されたビーズを洗浄し、２４時間撹拌した後に１％ＳＤＳ中に収集した。
５）  収集したＰＬＧＡビーズを、やはり銀変性β−ＴＣＰおよびブピバカインを含有する上部ＰＬＧＡコーティングに付着させた。
６）  ＰＬＧＡビーズをまとめてかつＰＬＧＡコーティングに、７０℃で１２時間焼結した。
【０１６８】
結果：
表面形態を、図２３、２４、および２５に示す。表面組成を、ＥＤＸＡを使用して分析し、その結果をＴａｂｌｅ  １２（表１２）に示した。
【０１６９】
【表１２】
2015110019.tif 000014
【０１７０】
（実施例５）
放出プロファイル
調製されたコーティングからの、Ａｇ、Ｃａ、およびブピバカインの放出を、ＩＣＰ分析およびＵＶ分光分析によってそれぞれ確認した。
【０１７１】
コーティングサンプルを３ｍＬのＰＢＳに、３７℃で２４および４８時間浸漬した。各時点で、ブピバカインの放出を、２６５ｎｍで分光測光法により測定した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ）。ブピバカイン標準物質は、適切な量の薬物をＰＢＳ中に溶解することによって調製した。ＰＢＳは、ブランクとして使用した。ブピバカイン濃度を、Ｔａｂｌｅ  １３（表１３）に示す。
【０１７２】
【表１３】
2015110019.tif 000015
【０１７３】
２４および４８時間でのＰＢＳ中のＡｇ、Ｃａ、およびＰの濃度を、Ｔａｂｌｅ  １４（表１４）に示した。
【０１７４】
【表１４】
2015110019.tif 000016
【０１７５】
分解に関する研究は、コーティングが、鎮痛作用としてブピバカインを、抗菌作用としてＡｇイオンを、また骨伝導作用としてＣａを放出できることを確認した。
【０１７６】
（実施例６）
合成および特徴付けの方法の例
合成
１）．  ＶＰＳ勾配コーティング：  Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ基材＋純粋なＶＰＳ  ＨＡ層＋３％ＶＰＳ  ＡｇＨＡ層
２）．  ＰＬＧＡ（８５：１５）ペレットをジクロロメタンに溶解し、一晩撹拌する。
３）．  β−ＴＣＰを硝酸銀溶液に２時間浸漬し撹拌して、イオン交換反応を行う。
３）．  ブピバカインを上記ＴＣＰ＋硝酸銀溶液に添加する。
４）．  ブピバカイン＋ＴＣＰ＋硝酸銀溶液を一晩乾燥する。
５）．  ブピバカイン＋ＴＣＰ＋硝酸銀の乾燥粉末を、溶解したＰＬＧＡ溶液に添加し、一晩撹拌する。
６）．  上記ＰＬＧＡ溶液をブピバカイン＋ＴＣＰ＋硝酸銀と共に使用して、ＶＰＳ勾配コーティングを浸漬コーティングする。
【０１７７】
特徴付け
１）．  ＳＥＭ上面図および断面図
２）．  ＥＤＡＸ−上層および断面の元素組成（Ｃａ、Ｐ、Ａｇ）
３）．  ＸＲＤ−上層の相組成（主にブピバカインを検出するため）
４）．  ＸＲＤの代替例：  上層をＰＢＳに溶解し（３日）、その後、ブピバカインを分光分析する。
【０１７８】
（実施例７）
合成および特徴付けの方法のその他の例
合成
１）．  ゾルゲル浸漬コーティングプロセスを行って、Ａｇ勾配コーティング、即ちＴｉ６Ａｌ４Ｖ基材＋純粋なＣａ−Ｐ層＋２％Ａｇ−Ｃａ−Ｐ層を作製する。
２）．  ＰＬＧＡ（８５：１５）ペレットをクロロホルムに溶解する。
３）．  鎮痛剤（例えば、店頭のＴｙｌｅｎｏｌ）およびＡｇ−ＣａＰ（２重量％Ａｇ）粉末をＰＬＧＡに添加する。
４）．  調製したＰＬＧＡポリマー溶液を使用して、ゾルゲルＡｇ−Ｃａ−Ｐサンプルを浸漬コーティングする。
【０１７９】
特徴付け
１）．  ＰＢＳおよびＳＢＦでの分解前後のＳＥＭ上面図
２）．  深さ情報を得るためのＴｏＦ−ＳＩＭＳ
３）．  ＸＲＤ−相組成
４）．  ＳＢＦでの（３日）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性評価
５）．  ＰＢＳに溶解して（２４時間、４８時間、７２時間）、Ａｇ濃度を測定する。
【０１８０】
（実施例８）
変性抗菌リン酸カルシウムコーティングによる多孔質表面インプラントの骨結合
ゾルゲル形成されたＡｇ変性リン酸カルシウム薄膜オーバー層（厚さ約１ミクロン）を用いてまたは用いないで調製された、Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ合金多孔質表面インプラントの機械的引出し試験の結果を、本明細書に報告する。簡単にまとめると、この研究は、内大腿顆に横方向に埋め込まれた多孔質表面インプラント（Ｉｎｎｏｖａ−Ｓｙｂｒｏｎ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから獲得したＥｎｄｏｐｏｒｅ（登録商標）歯科インプラント）を有する、１グループ１０匹のウサギの４グループを使用した（多孔質領域は、海綿骨質に面している。）。インプラントの位置決めおよび埋込み手順は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれているＴａｃｈｅら（２００４）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ、１９：  １９〜２９、Ｇａｎら（２００４）、Ｐａｒｔ  ＩＩ：  Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２５：  ５３１３〜５３２１、Ｓｉｍｍｍｏｎｓら（１９９９）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、４７：  １２７〜１３８に記載されているものと同様であった。「試験」インプラント（動物当たり１つ、右足または左足−ランダムに位置決め）は、Ｔｉ合金インプラントの焼結多孔質面上に重なるＡｇ変性リン酸カルシウムコーティングで調製した。Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ合金粉末（４４から１５０ミクロンの粒度）約３層からなる多孔質表面領域を焼結して、厚さ約３００ミクロンであり多孔率３５体積％（近似値）でありかつ平均粒度が７５から１００ミクロン範囲の多孔質層が形成されるようにした。相互接続した独立開口構造は、阻害されない骨内殖によってインプラント固定を実現するのに適切であった。この粒子および孔径は、整形外科用インプラントに従来使用されてきたものよりいくらか小さいが、許容されることが証明され、実際に寸法上の制約が生じる歯科用インプラントの適用例に好ましいことは、注目に値する。
【０１８１】
ゾルゲル形成リン酸カルシウムオーバー層については、先に研究がなされており（しかし、Ａｇ＋変性を差し引く。）、未変性形態では、より速い骨内殖を促進させることが観察された（即ち、骨結合が高められた。）。これら初期の研究に基づいて、Ａｇ変性リン酸カルシウムコーティングが、多孔質表面インプラントへの骨内殖を増大させると共に初期の埋込み後の期間中のインプラント部位での感染の可能性を低下させる、抗菌および骨伝導コーティングとして、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗにより提案され開発された。極めて重大な初期の埋込み後の治癒期間中の、この増大した感染抵抗力は、局所感染および炎症応答をもたらす微生物の進入が骨内殖を阻害しかつインプラントの不全をもたらす可能性があるので、望ましい。したがって、この初期期間中の細菌感染の可能性を低下させることは、骨内殖を通した固定に合わせて設計された整形外科用インプラントの信頼性を改善するのに、極めて有益と考えられる。
【０１８２】
材料および方法
２つの異なるＡｇ＋含有リン酸カルシウム配合物について、調査した。これらの配合物は、この報告において、「低」および「高」Ａｇレベルと示される（以下に示される結果では、ＬＣ＝低Ａｇ＋（０．９重量％）リン酸カルシウムおよびＨＣ＝高Ａｇ＋（２．５重量％）リン酸カルシウムコーティング）。動物研究は、ＬＣインプラントが２０匹のウサギの大腿顆に、また「対照」インプラント（即ち、リン酸カルシムが無い（ＮＣ）ゾルゲルコーティング）がその他の大腿骨に配置されるように、一方、ＨＣインプラントは残りの２０匹のウサギに、「対照」インプラントと同様に配置されるように設計された。各グループからの１０匹のウサギを、インプラントの配置後９日間そのままにし、次いで安楽死させ、一方、別の１０匹のウサギは、１６日間そのままにした後、犠牲にした。これは、１０個のＮＣの９日間インプラントと比較するための、９日間の埋込み後の１０個のＬＣインプラントと、１６日間のＮＣインプラントと比較するための、同様の数のＬＣインプラントを提供した。同様に、２つのグループの１０個のＨＣインプラントについて、９および１６日間のインプラント滞留期間後に研究を行い、ＮＣインプラントと比較した。
【０１８３】
確実なインプラントの固定をもたらすための、効果的な骨内殖に関するインプラントの性能を、機械的引出し試験（上記にて論じた、先に報告された研究のように）、ならびに動物を犠牲にした後のインプラント−組織サンプルの一部の組織学的検査および評価によって、評価した。さらに、引き出されたインプラントのいくつかを、走査電子顕微鏡での２次電子撮像によって検査して、インプラント−組織界面領域を特徴付け、存在し得る任意の骨状または繊維組織フィーチャを特定した。機械的引出し試験の利点は、この試験によって、顕微鏡検査を通して観察される選択領域ではなく完全な界面に関する情報が得られることである。機械的試験用の全ての試験片は、動物を安楽死させ大腿顆領域を切開した後に、生理食塩液中に保存し、犠牲後２時間以内に試験をした。
【０１８４】
上述のグループ当たり１０個のサンプルのうち８個を、機械的試験を行い、残りの２個のサンプルを、組織サンプル調製物に使用した。引出し試験では、インプラントの適正な位置合わせを確実にするオーダーメードのフィクスチャに骨インプラントサンプルを取り付け、１ｍｍ／分の速度の変位制御下で引出し力を加える。多孔質表面インプラントのテーパ付き形状および慎重なサンプルの位置合わせによって、測定された引出し力および界面剛性に寄与し得る骨インプラント接合部で作用する摩擦力が、確実に回避された。最大引出し力および荷重変位曲線の最大正接勾配を使用して、引出し抵抗および界面ゾーン剛性を決定した。
【０１８５】
上述のグループ当たり１０個のサンプルのうち２個を、ウサギを犠牲にした後に収集し、１０％緩衝ホルマリンに固定し、メタクリル酸メチル中に包埋するよう処理した。得られたブロックを、ダイヤモンドウエハ形成ブレードを使用して切断し、その中央平面でインプラントの長軸に沿って、厚さ約２００マイクロメートルの切片を生成した。次いでこれらのサンプルをスライドガラスに載せ、慎重に摩砕し、研磨して、厚さ約３０から４０ミクロンの、石灰質除去がなされていない切片を得た。「薄い」切片を、０．３％トルイジンブルーと２％ホウ酸ナトリウムとの１：１混合物で、５０℃で１５分間染色し、次いで０．３％のライトグリーンを２％酢酸に溶かした溶液で、室温で３分間染色した。切片を、光学顕微鏡により検査し、下記のように外観を記録した。
【０１８６】
種々の対のインプラントに関し、リン酸カルシウムでコーティングされた「試験」インプラント対コーティングされていない「対照」インプラントの、最大引出し力および測定された界面ゾーン剛性値の、統計分析（１つの変数パラメータとしての、インプラント設計による分散分析）を行った。したがって、９日間のＬＣインプラントを、反対側のウサギ大腿顆に配置された対応する９日間のＮＣインプラントと比較し、９日間のＨＣインプラントを、対応する９日間のＮＣインプラントと比較し、１６日間の対になったインプラントを同じ方法で比較した。さらに、９日間のＮＣインプラントを、１６日間のＮＣインプラントと比較し、９日間のＨＣインプラントおよび１６日間のＨＣインプラントを同様に比較した。
【０１８７】
結果および考察
本発明の研究から得た機械的試験結果を、Ｔａｂｌｅ  １５（表１５）に示す。
【０１８８】
【表１５】
2015110019.tif 000017
【０１８９】
統計的試験は、サンプルの全ての対に関し、「試験」インプラントと「対照」インプラントとの間で最大引出し力と界面剛性の両方に有意差が無いことを示した（有意差はｐ＜０．０５に対応する。）。しかし、ＬＣインプラントおよびＨＣインプラントの両方に関しては、９日間のサンプルに比べて１６日間のインプラントの引出し力に、非常に有意な増大があった（ｐ＜０．００１）。界面ゾーン剛性は、９日間から１６日間までで増大も示し、この増大は有意であったが（ｐ＝０．０４８）、その差は、引出し抵抗で観察された値ほど大きくなかった。この興味ある結果は、９から１６日でより広範な組織および骨内殖が生じるので（即ち、「より強靭な」界面ゾーンが生じる。）、亀裂の伝播および破断に対して界面ゾーンがより強い抵抗をもたらすことを示唆している。９から１６日間の埋込み期間の増大は、このウサギ大腿顆埋込みモデルで先に報告された結果と一致している。
【０１９０】
興味深いことに、Ａｇ＋変性リン酸カルシウムオーバー層は、１６日間の埋込み期間後に界面剛性値をもたらし、これは９日間のインプラントでの値よりも平均して高いが、著しく異なるものではなかった。焼結したままのもの、リン酸カルシウムでコーティングされていないもの、およびＡｇ＋変性リン酸カルシウムコーティング（低および高Ａｇ＋）の９日間によるインプラント除去に対する抵抗力は、組織（骨）内殖がコーティングインプラントで生じたことを示した。
【０１９１】
引出しインプラントのＳＥＭ検査
機械的試験を行った９日間のインプラントのいくつかを、２次電子放出走査顕微鏡によって検査した。
【０１９２】
図２６から２９までは、収集された画像の８つを示す。図２６ａおよびｂは、９日間埋め込んだウサギ＃１Ａから得られた、リン酸カルシウムでコーティングされた低Ａｇ＋インプラント（ＣＬ−９）の画像を示す。このインプラントは、より低い界面剛性および引出し力を示したが、それにも関わらず２次電子画像は、鉱質化組織の特徴を示す領域で広範な組織接着および内殖を示す。図２７ａおよびｂは、同じ動物の他方の膝から得られた、コーティングされていない「対照」インプラント（ＮＣＬ−９）の画像である。このインプラントは、反対側の足からのコーティングされたインプラント（ＣＬ）に比べ、より高い剛性および引出し値を示し、９日間の埋込み期間によって、予測された広範な組織接着および鉱質化組織の内殖を示した。図２８ａおよびｂと２９ａおよびｂは、抽出された高Ａｇ＋含有リン酸カルシウムコーティングインプラント（図２８ａおよびｂ）と、対応するコーティングされていない「対照」インプラント（図２９ａおよびｂ）との画像である；（ウサギ＃１Ｂ、即ち、それぞれインプラントＣＨ−９およびＮＣＨ−９を含有する。）。
【０１９３】
非機械的試験インプラントのＢＳ−ＳＥＭ検査
ＢＳ−ＳＥＭを使用して、組織−インプラント界面ゾーンの画像を収集し、定量的画像分析を、検査セクションで行った。定量的評価（Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラム）では、その多孔質コーティング領域の長さに沿ったインプラント基材からの、幅約２２０マイクロメートルのエンベロープを選択した（即ち、インプラントの長さに沿った多孔質コーティングの末端に到達するが、より周辺領域は除外される、エンベロープの幅；インプラントの端部も除外した。）。この領域を、Ｑｕａｎｔｉｍａｔｅ画像分析ソフトウェアを使用して分析した。孔内の骨の領域％を決定した（即ち、％［骨面積／孔面積］）。プログラムは、名目的には３５から４０体積％と設計される、多孔質コーティングの多孔率％の決定も可能にした。
【０１９４】
図３０から３５は、全てのサンプルタイプの典型的なＢＳ−ＳＥＭ画像を示す。ＢＳ−ＳＥＭ画像は、「対照」インプラントと同様に、ＣＰオーバー層を有するインプラントでは２つの期間で、鉱質化組織（骨）内殖（薄い灰色領域）を明らかに示す。利用可能な多孔度内での骨％に関する定量的画像分析の結果を、Ｔａｂｌｅ  １６（表１６）に示す。分析したセクションでは、インプラントの長さを４つのセクションに分割して分析に供し、それによって、分析用により高い倍率の画像が得られる。次いで４つの測定値を平均して、各インプラントごとの骨内殖％（および多孔率％）を得た。全てのセクションからのデータがＴａｂｌｅ  １６（表１６）に含まれ、インプラントの長さに沿って観察されたばらつきが示されている。これは、インプラントが配置される海綿骨質の構造から見ると、意外なことではない。各インプラントごとに、平均および標準偏差を決定した。１元配置ＡＮＯＶＡを行って、それぞれのウサギごとに、相対する足のインプラント同士で統計的な差があるかどうか決定した。統計的有意性を、ｐ＜０．０５と見なした。異なる領域（骨、Ｔｉ合金粒子、および充填されていない孔、または骨で少なくとも充填されていないもの）は、Ｑｕａｎｔｉｍａｔｅ撮像ソフトウェアによって容易に区別され、利用可能な孔内に骨充填％の目標決定が可能になった。動物内での比較のみを行った（即ち、各動物での左足および右足）。これは、全ての異なる条件（低Ｓ−ＣＰ、高Ｓ−ＣＰ、対照、９日および１６日で）を含め比較用に７組を提供し、２匹の動物については各条件を評価し、１つを例外とした。残念なことに、１つの失われたインプラント（ウサギ２Ｃ）は、含めることができなかった。
【０１９５】
【表１６】
2015110019.tif 000018
【０１９６】
分析されたサンプルが少数にも関わらず、定量的画像分析は、いくつかの興味深い追加の知見を示唆している。
【０１９７】
９日間のデータは、２匹のウサギ（８Ａおよび８Ｂ）において、骨内殖％がＳ−ＣＰ変性インプラント（８Ａ、低Ｓ−ＣＰおよび８Ｂ高Ｓ−ＣＰ）の場合にそれぞれの「対照」インプラント（ＣＰオーバー層無し）よりも著しく高かったことを示す。分析を行ったその他２匹の９日間のウサギは、著しい相違を示さなかった。
【０１９８】
１６日間のＣＰ変性インプラントと「対照」インプラントとの骨内殖に、著しい相違は無かった。
【０１９９】
前述のように、これらの知見は、Ｓ−ＣＰオーバー層が骨内殖を阻害しないことを示す。事実、ＢＳ−ＳＥＭ画像および定量的画像分析は、Ｓ−ＣＰオーバー層の付加によって骨内殖のより速い速度が促進され得ることを示唆している。
【０２００】
定量的画像分析は、インプラントの多孔率％を確認するのにも使用した。分析された１７個の切片の、Ｑｕａｎｔｉｍｅｔソフトウェアを使用して決定された多孔率％は、４３．１±２．７％に等しかった。
【０２０１】
ウサギ用インプラントの組織学的評価
検査した切片は、４０匹のウサギから選択された８匹のウサギから回収された、１６個の組織−インプラントブロックから調製し、これらを研究に使用した。組織切片調製物用のこれら１６個のサンプルの中で、インプラントは１個のブロックに存在しなかった。そのインプラント（サンプル２Ｃ、１６日間「低」Ａｇ＋）は、おそらく骨結合がなされておらず、配置後にインプラント部位から移動していると考えられる。残りの６４個のインプラントを機械的試験（引出し試験）にかけて、上記にて論じたようにインプラント−骨界面ゾーンの剪断強度および界面剛性を決定した。
【０２０２】
高量または低量で処理されたインプラントと対照のインプラント（処理されていない）との間に、明らかな相違は無かった。経時的な骨内殖の成熟は、全ての動物で同じであった。処理されたインプラントに反応は観察されず、周囲を取り囲む骨に明らかな細胞死は無かった。図３６から４１は、全てのインプラントに関する骨内殖の領域を示す、各条件の代表的な顕微鏡写真を示す。この知見は、上記にて報告された機械的引出し試験結果に一致している。
【０２０３】
まとめおよび結論
１．  引出し試験結果および引出しインプラントのＳＥＭ画像は、確実なインプラント固定をもたらす組織内殖が、Ａｇ＋変性リン酸カルシウムゾルゲル形成コーティングのオーバー層を備えた多孔質表面インプラントの場合に９日間で生じることを裏付けている。
【０２０４】
２．  引出し試験は、より低いまたはより高いＡｇ＋添加を行った変性コーティングが、同様に機能することを示唆している。
【０２０５】
３．  予測されるように、インプラント除去のための引出し力は、埋込み期間の増大と共に増大し、９日間のサンプルに比べて１６日間の埋込みサンプルのほうが著しく高い引出し力を記録した。しかし、界面ゾーン剛性値は、９日間と１６日間の埋込みサンプルに関して著しく異なっていなかったが、平均値は、１６日間のインプラントのほうが高かった。
【０２０６】
４．  本発明の研究から得た、変性リン酸カルシウムコーティングインプラントに関して記録された引出し力は、先の研究（Ｔａｃｈｅら）で報告されたものと著しく異なっておらず、著しく高い界面ゾーン剛性値が観察された。より高い界面剛性は、先の研究で使用されたより長いインプラント（９ｍｍ対７ｍｍの長さ）に起因していたと考えられる。
【０２０７】
５．  多孔質コーティングＴｉ６Ａｌ４Ｖインプラント上に堆積されたゾルゲルリン酸カルシウム被膜へのＡｇ＋の添加は、骨内殖を阻害しない。試験をした銀の２つの濃度は、同様の結果をもたらすように見えた。
【０２０８】
（実施例９）
ＨＡ−Ａｇコーティングの抗菌活性
方法
実施例２から得たコーティングを、その抗菌活性について評価した。さらに、負の対照（コーティングされていないＴｉ６Ａｌ４Ｖ基材）および正の対照（Ａｃｔｉｃｏａｔ  ７（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｎｅｐｈｅｗ）−抗菌特性を有することが知られているナノ結晶質銀含有創傷包帯）も評価した。
【０２０９】
サンプル培養法
約１０４ｃｆｕ／ｍｌを含有する試験生物の懸濁液を、一晩勾配培養物を回収することによって調製した。試験クーポンを、ＡＳＴＭ規格Ｅ２１４９−０１（動的接触条件下で固定化抗菌剤の抗菌活性を決定するための標準試験法）に基づく方法で試験した。
【０２１０】
サンプルを、低蒸発性の蓋を備えた２４ウェル滅菌組織培養プレートの平底に入れ、各サンプルタイプごとに４種類を、試験がなされる各時点ごとに調製した。さらに、Ａｃｔｉｃｏａｔ  ７の正の対照サンプルおよび負の培養対照を、設定した（時点当たりそれぞれ３複製物）。各サンプルに、試験生物懸濁液２ｍｌを接種し、プレートをパラフィンで密封して、培養物の蒸発を最小限に抑えた。サンプルを、３７℃で、１５０ｒｐｍで撹拌しながら適切な時間インキュベートし、超音波カウントを２４、４８、および７２時間で行った。超音波カウントは、正および負の方法の対照サンプルに適切ではなかった。時間０のサンプルは、コロニー化が引き起こされる時間が無く、関連ある情報を全くもたらさないので、超音波カウントで採取しなかった。
【０２１１】
表面から離れて示される任意の活性を示す、追加の支持情報では、０、２４、４８、および７２時間で試験接種材料からカウントを得て、懸濁液中のカウントのｌｏｇ減少を計算した。３つの複製物を、全ての時点でサンプル採取したが、それはいつでも制約があり得るからである。
【０２１２】
超音波カウント
洗浄溶液中の超音波処理は、金属表面から接着細胞を除去してその数を評価する、認められている方法である。本明細書では、その処理を、種々のレベルの細菌増殖が銀含有ＨＡコーティングおよび非銀含有ＨＡ対照のサンプルで見られるか否か決定するのに使用した。
【０２１３】
クーポンをＰＢＳで洗浄し、次いで過剰な量を吸引除去し、このプロセスをさらに５回繰り返して、全体で６回の洗浄を行った。クーポンを、９ｍｌのＳＴＳ（０．８５％塩および１％Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．４％チオグリコール酸ナトリウム）を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ管に入れたものの中に置き、ポリスチレンフロートを使用して超音波処理水浴中に浮かべた。次いでサンプルを、６０Ｈｚで１０分間超音波処理した。
【０２１４】
得られた超音波処理物を、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＭＲＤ）で１０−５まで希釈し、全ての希釈溶液を、重複Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（３Ｍ）にプレートアウトした。次いで得られた被膜を少なくとも４８時間、３２℃でインキュベートし、その後、ペトリフィルム読取器を使用して数えあげた。
【０２１５】
超音波処理カウント結果
図４２および４３は、超音波処理カウントの結果を示す。表面カウントのより大きな減少は、ｅＭＲＳＡ  １５（表皮ＭＲＳＡ  １５、ＵＫ病院分離株）ではなく表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）で見られたが、グローバックが７２時間の時点で、初期接種および均等な対照に等しいレベルまで見られた。
【０２１６】
懸濁液からのカウント
適切な期間の後、接種材料１ｍｌを、複製物１から３よりサンプル処理した（全てのサンプルの中で、ＳＴＳ  ９ｍｌに添加）。次いでこの１ｍｌを２重に播き、１ｍｌを連続希釈して、ＭＲＤにおいて、負の対照に関しては時間０で１０−４に、２４時間で１０−５に、その後１０−６にし、コーティングサンプルおよび正の対照に関しては、全ての時点で１０−５にした。
【０２１７】
コーティングされていないサンプルおよび培養対照の場合、０および２４時間では、それぞれ１０−２以下および１０−３以下の希釈溶液を、重複Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（３Ｍ）にプレートアウトした。コーティングサンプルの場合、全ての希釈溶液を、Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ（３Ｍ）に２重に置いた。得られたプレートを、３２℃で少なくとも４８時間インキュベートし、その後カウントした。
【０２１８】
懸濁液カウント結果
図４４および４５は、懸濁液カウントの結果を示す。懸濁液からのカウントは、時間０からのカウントの減少を、したがってｌｏｇ減少を計算するのに使用することができる。ｅＭＲＳＡ  １５に対し、より低い用量の銀は、死滅をほとんど示さなかったが、懸濁液中の数を固定的に保持した。より高い銀用量は、検出限界まで死滅させ、そこでの数を維持した。両方の用量の銀ＨＡは、最初に表皮ブドウ球菌を低レベルにまで死滅させるが、７２時間で初期生物に匹敵するレベルにまで、生物のグローバックがあった。
【０２１９】
（実施例１０）
ＶＰＳ  Ａｇ／ＨＡサンプルの細胞傷害性試験
実施例２からのコーティングを、細胞傷害性に関して評価した。さらに、コーティングされていないＴｉ６Ａｌ４Ｖクーポン（非細胞傷害性であることが知られている負の対照）も評価した。
【０２２０】
方法
材料
コーティングされていないＴｉ６Ａｌ４Ｖクーポン
ＶＰＳ−ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クーポン−バッチＴＯ０３５Ａ
低用量銀（１％）を有するＶＰＳ−ＨＡ（ＨＡ１）−バッチＴＯ０３５Ｂ
中用量銀（２％）を有するＶＰＳ−ＨＡ（ＨＡ２）−バッチＴＯ０３５Ｃ
ポリ塩化ビニルディスク−バッチＴＯ０２４−９０−０２−０１
高密度ポリエチレンディスク−バッチＴＯ０２４−９０−０２−０２
α−最小必須培地イーグル（α−ＭＥＭ）および１０％ウシ胎児血清−＃９６９６、＃９６６２、＃９７０７
トリプシン−ＥＤＴＡ−Ｌｏｔ  ０５８Ｋ２３７３
トリパンブルー−Ｓｉｇｍａ  Ｔ８１５４  Ｌｏｔ  ０８８ｋ２３７９およびＬｏｔ  ０４７ｋ２３４９
ＤＡＰＩを有する蛍光用Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤−Ｖｅｃｔｏｒ  Ｈ−１２００  Ｌｏｔ  ＵＯ４０３
ＷＳＴ−１試薬−Ｒｏｃｈｅ  １１６４４８０７００１  Ｌｏｔ  １４４７３２００
【０２２１】
条件培地の調製
ＩＳＯ  １０９９３指針を使用して、表面積と体積との比を、全ての試験および対照サンプルに関して計算して、サンプルの液体抽出物を生成するのにサンプル当たり必要とされる培地の体積を決定した（条件培地と呼ぶ。）。ＨＡ、ＨＡ１、ＨＡ２、およびチタンクーポンの場合、必要とされる培地の体積は、１．２３ｍｌ／クーポンであり、４つのクーポンが、６ウェルプレートの１つのウェルに置かれ（ｎ＝４）、合計体積は４．９２ｍｌであった。ＰＶＣおよびＨＤＰＥディスクに必要とされる培地の体積は、１．３３ｍｌ／ディスクであり、４つのディスクが６ウェルプレートの１つのウェルに置かれ（ｎ＝４）、合計体積は５．３２ｍｌであった。６ウェルプレート内のこれらグループのレイアウトは、プレートのレイアウトの効果を減じるのを助けるために、ランダムにした。これらのプレートと平行に、６ウェルプレートは、添加される培地を５．３２ｍｌ／ウェル有し、このグループがアッセイ対照として使用されるだけのときに組織培養プラスチック群（ＴＣＰ）として作用し、したがって、必ずしもランダム化に含める必要は無い。試験材料と共にインキュベートされた培地は、α−ＭＥＭであり、これら５つのプレートを、３７℃で、５％のＣＯ２中７日間インキュベートした。
【０２２２】
細胞播種
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、ＳＯＰ／ＣＢ／００６に従いカウントするために継代した。細胞は、５×１０４／ｃｍ２で播くのに必要とされた。この密度で、２×９６ウェルプレート上の１６８ウェルに播き、細胞は、Ｐ１３であった。細胞を、４８時間、３７℃の５％ＣＯ２中で培養した。
【０２２３】
条件培地の適用
培地を、９６ウェルプレートから取り出し、適切な条件培地１００μｌに置き換えたが、これは、ｎ＝６／サンプル群／処理／対照群であった。２×９６ウェルプレートを、３７℃で、５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした。
【０２２４】
ＷＳＴ−１アッセイ
ＷＳＴ−１試薬を使用して、条件培地に曝された細胞の代謝活性を定量した。ＷＳＴ−１試薬１０μｌ／ウェルを、９６ウェルプレートのそれぞれに添加した。プレートを、３７℃で１時間、５％ＣＯ２中でインキュベートし、１分間振盪させ、次いでＭｕｌｔｉｓｋａｎプレートリーダー（ａｓｓｅｔ番号００００５２４７）で、それぞれ試験波長および参照波長の４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで読み取った。参照波長を、各ウェルごとに試験波長から差し引き、各群ごとの平均を計算し、プロットすることによって、細胞の代謝活性を実証した（図４６）。
【０２２５】
結果および考察
マイコプラズマ試験
ＤＡＰＩ染色によるマイコプラズマ試験を、ＳＯＰ／ＣＢ／０６９に従い実施した。この実験で使用した細胞は、マイコプラズマ陰性と見なした。
【０２２６】
ＷＳＴ−１アッセイ
刺激を与えたＨＡ１およびＨＡ２の群は、正の細胞傷害性対照群ＰＣＶおよび負の対照群ＨＤＰＥに比べ、この実験でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の代謝活性を増大させた。しかし、ＨＡのみに曝された細胞の代謝活性は、２つのＡｇ含有群のどちらよりも高かった。Ｔｉ６Ａｌ４Ｖ群に曝された細胞の代謝活性は、全てのＨＡ含有群および負の対照ＨＤＰＥの場合よりも低かった。しかしＴｉ６Ａｌ４Ｖは、正の対照の２倍のレベルまで、細胞の鉱質化を刺激した。ＴＣＰ群は、細胞対照群として使用し、この群の細胞は、負の対照ＨＤＰＥと同様のレベルで代謝した。チタン群の細胞の代謝活性は、２つの負の対照よりも低かったが、誤差棒で示されるように、このデータ集合から得たデータは大きな広がりがあったことに留意されたい。
【０２２７】
結論
銀が１および２％のＶＰＳ  Ａｇ／ＨＡサンプルは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の代謝活性を、正および負の対照よりも高いレベルまで増大させた。しかし、これらの群から得た細胞の代謝活性は、ＨＡだけの群の細胞よりも低かった。
【０２２８】
当業者なら、本発明の広がりおよび範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきでなく、本明細書に添付される任意の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるべきことが理解されよう。
【符号の説明】
【０２２９】
１８１０  インプラント基材
１８１２  ＶＰＳ  ＨＡ
１８１４  ＶＰＳ  ＡｇＨＡ
１８１６  コーティング層
１８１８  ビーズ層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【外国語明細書】
2015110019000001.pdf