(57)【要約】【課題】新規リパーゼ、同酵素をコードするポリヌクレオチド、同ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、同ベクターが導入された形質転換体、同酵素の製造法、および同酵素の利用法を提供する。【解決手段】クロレラ・ケスレリ（Chlorella kessleri）等のクロレラ属藻類から新規リパーゼを取得する。【選択図】図２
2015216863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の性質を有するリパーゼ：
（１）グリセロ脂質のカルボキシルエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を有する；
（２）分子量が50,000から60,000である；
（３）クロレラ（Chlorella）属藻類に由来する。
【請求項２】
前記グリセロ脂質が、グリセロ糖脂質である、請求項１に記載のリパーゼ。
【請求項３】
前記クロレラ属藻類が、クロレラ・ケスレリ（Chlorella kessleri）である、請求項１または２に記載のリパーゼ。
【請求項４】
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、リパーゼ：
（ａ）配列番号８または１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号８または１１に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グリセロ糖脂質のカルボキシルエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号７または１０に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号７または１０に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、グリセロ糖脂質のカルボキシルエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５または６に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【請求項９】
請求項７に記載の形質転換体を培地で培養し、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリパーゼを生成させること、および培養物より前記リパーゼを採取すること、を含む、リパーゼの製造法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリパーゼをグリセロ脂質に作用させることを含む、グリセロ脂質を加水分解する方法。
【請求項１１】
前記グリセロ脂質が、グリセロ脂質を含有する飲食品又はその原料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリパーゼをグリセロ脂質を含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリパーゼをグリセロ糖脂質に作用させることを含む、糖グリセロールを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規リパーゼ、同酵素をコードするポリヌクレオチド、同ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、同ベクターが導入された形質転換体、同酵素の製造法、および同酵素の利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「リパーゼ」とは、グリセロ脂質を加水分解する酵素の総称である。
【０００３】
「グリセロ脂質」とは、グリセロール骨格を有する脂質をいう。グリセロ脂質としては、グリセロ糖脂質、グリセロリン脂質、中性脂肪が挙げられる。
【０００４】
「グリセロ糖脂質」とは、ジアシルグリセロールのフリーの水酸基に糖鎖が共有結合した化合物をいう。グリセロ糖脂質としては、モノガラクトシルジアシルグリセロールやジガラクトシルジアシルグリセロール等のガラクト脂質が挙げられる。ガラクト脂質等のグリセロ糖脂質は、シアノバクテリアの細胞膜や葉緑体のチラコイド膜における構成脂質として存在する（非特許文献１）。
【０００５】
グリセロ糖脂質に対してリパーゼ活性を示す酵素を、特に、ガラクトリパーゼともいう。ガラクトリパーゼは、例えば、葉緑体を有するホウレンソウ等の高等植物においてその存在が知られている（非特許文献２）。また、ガラクトリパーゼとしては、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）由来のガラクトリパーゼ（特許文献１）や
クラミドモナス・レインハルティ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のガラクトリパー
ゼ（非特許文献３）も知られている。
【０００６】
ガラクトリパーゼは、例えば、製パン用の品質改良剤として利用されている。また、ガラクトリパーゼは、例えば、クロロフィターゼと組み合わせて、洗剤の成分として利用されている。
【０００７】
しかしながら、公知のガラクトリパーゼには、例えば、その生産量が低く、産業応用するのが困難であるという問題があった。また、特許文献１に記載のガラクトリパーゼはレシチンに対するリパーゼ活性を有するため、レシチンを含有する素材の加工に利用する場合、副産物が生じる点が問題となり得る。さらに、特許文献１に記載のガラクトリパーゼはカビ由来であることから、食品分野で利用するためには抗生物質やアレルゲンなどの除去が必要になるため、食品素材の加工に適するとはいえない。また、特許文献１に記載のガラクトリパーゼには、遺伝子組換え法による発現法が確立されていないため、大量製造法がないという欠点もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2008-206515
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】小林康一 光合成研究 2009 19: 52-58
【非特許文献２】Sakaki T, et al., Plant Physiol. 1990 Oct;94(2):773-80.
【非特許文献３】Li X, et al., Plant Cell 11, 4670 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規リパーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ガラクトリパーゼをクロレラ・ケスレリ（Chlorella kessleri）から見出し、本願発明を完成させた。本酵素と既知のガラクトリパーゼとのアミノ酸配列の相同性は極めて低く、本酵素は既知のガラクトリパーゼとは全く異なる新規なガラクトリパーゼであった。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］
以下の（１）〜（３）の性質を有するリパーゼ：
（１）グリセロ脂質のカルボキシルエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を有する；
（２）分子量が50,000から60,000である；
（３）クロレラ（Chlorella）属藻類に由来する。
［２］
前記グリセロ脂質が、グリセロ糖脂質である、前記リパーゼ。
［３］
前記クロレラ属藻類が、クロレラ・ケスレリ（Chlorella kessleri）である、前記リパーゼ。
［４］
下記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質である、リパーゼ：
（ａ）配列番号８または１１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号８または１１に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グリセロ糖脂質のカルボキシルエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
［５］
前記リパーゼをコードするポリヌクレオチド。
［６］
下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号７または１０に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号７または１０に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、グリセロ糖脂質のカルボキシルエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［７］
前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［８］
前記組換えベクターを導入した形質転換体。
［９］
前記形質転換体を培地で培養し、前記リパーゼを生成させること、および培養物より前記リパーゼを採取すること、を含む、リパーゼの製造法。
［１０］
前記リパーゼをグリセロ脂質に作用させることを含む、グリセロ脂質を加水分解する方法。
［１１］
前記グリセロ脂質が、グリセロ脂質を含有する飲食品又はその原料である、前記方法。［１２］
前記リパーゼをグリセロ脂質を含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法。
［１３］
前記リパーゼをグリセロ糖脂質に作用させることを含む、糖グリセロールを製造する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、新規リパーゼが提供される。一態様においては、同酵素を利用して、食品素材の機能性を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Chlorella kessleri 11h株（UTEX 263）由来ガラクトリパーゼ（chGLと記載）のSDS-PAGEによる解析結果を示す写真。レーンＭ：マーカー、レーン１：精製酵素。
【図２】ChGLの基質特異性を示す図。
【図３】ChGLの活性の温度依存性を示す図。
【図４】ChGLの温度安定性を示す図。
【図５】ChGLの活性のpH依存性を示す図。
【図６】ChGLのpH安定性を示す図。
【図７】ChGLの活性のCa2+イオン濃度依存性を示す図。
【図８】ChGLの活性のTritonX-100濃度依存性を示す図。
【図９】TF-chGL融合タンパク質をEscherichia coliで発現させた結果を示すSDS-PAGE分析の写真。
【図１０】TF-chGL融合タンパク質をFactor-Xaで処理した結果を示すSDS-PAGE分析の写真。
【図１１】ChGLとAspergillus japonicus由来ガラクトリパーゼとの相同性比較の結果を示す図。
【図１２】ChGLとChlamydomonas reinhardtii由来ガラクトリパーゼとの相同性比較の結果を示す図。
【図１３】ChGLとリポパンＦの温度安定性を比較した図。
【図１４】ChGLによる小麦粉の物性変化効果を示す図。
【図１５】ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）を、FactorXaで処理したTF-chGL融合タンパク質で処理した結果を示すHPLC分析の図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜１＞本発明のリパーゼ
本発明は、新規リパーゼを提供する。本発明において提供されるリパーゼを「本発明のリパーゼ」ともいう。
【００１６】
本発明において、「リパーゼ」とは、グリセロ脂質のエステル結合（カルボキシルエスエル結合）を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。ここでいう「エステル結合（カルボキシルエスエル結合）」とは、より具体的には、グリセロ脂質を構成するグリセロール骨格の水酸基と脂肪酸との間のエステル結合である。エステル結合の加水分解により、カルボン酸（脂肪酸）が遊離する。同活性を、「リパーゼ活性」ともいう。
【００１７】
「グリセロ脂質」とは、グリセロール骨格を有する脂質をいう。グリセロ脂質としては、グリセロ糖脂質、グリセロリン脂質、中性脂質が挙げられる。
【００１８】
「中性脂質」とは、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールの総称である。「モノアシルグリセロール」とは、グリセロールの３つの水酸基の内、１つの水酸基に脂肪酸がエステル結合した化合物をいう。「ジアシルグリセロール」とは、グリセロールの３つの水酸基の内、２つの水酸基に脂肪酸がエステル結合した化
合物をいう。「トリアシルグリセロール」とは、グリセロールの３つの水酸基全てに脂肪酸がエステル結合した化合物をいう。脂肪酸が結合する水酸基の位置は、特に制限されない。脂肪酸が結合する水酸基は、モノアシルグリセロールの場合、グリセロール骨格の１位、２位、または３位の水酸基であってよい。脂肪酸が結合する水酸基は、ジアシルグリセロールの場合、グリセロール骨格の１位と２位、１位と３位、または２位と３位の水酸基であってよい。
【００１９】
「グリセロ糖脂質」とは、ジアシルグリセロールのフリーの水酸基に糖鎖が共有結合した化合物をいう。「フリーの水酸基」とは、脂肪酸とエステル結合していない水酸基をいう。例えば、ジアシルグリセロールが１，２−ジアシルグリセロールである場合、グリセロール骨格の３位の水酸基がフリーの水酸基である。糖鎖の種類や長さは特に制限されない。グリセロ糖脂質としては、ガラクト脂質が挙げられる。「ガラクト脂質」とは、ジアシルグリセロールのフリーの水酸基にガラクトース鎖（例えば、ガラクトースの１分子や２分子）が共有結合した化合物をいう。ガラクト脂質としては、モノガラクトシルジアシルグリセロールやジガラクトシルジアシルグリセロールが挙げられる。また、その他のグリセロ糖脂質としては、スルホキノボシルジアシルグリセロールが挙げられる。モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラクトシルジアシルグリセロール、およびスルホキノボシルジアシルグリセロールは、それぞれ、糖鎖が１分子のガラクトース、２分子のガラクトース、および１分子のスルホキノボースである場合のグリセロ糖脂質である。
【００２０】
「グリセロリン脂質」とは、ジアシルグリセロールのフリーの水酸基にホスホリル塩基が共有結合した化合物をいう。塩基としては、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン、グリセロールが挙げられる。グリセロリン脂質としては、レシチンが挙げられる。
【００２１】
加水分解されるエステル結合の位置および数は特に制限されない。グリセロ糖脂質の場合、２つのエステル結合のいずれか一方または両方が加水分解されてよい。グリセロリン脂質の場合、２つのエステル結合のいずれか一方または両方が加水分解されてよい。中性脂質の場合、１〜３つのエステル結合の内、１〜３つのエステル結合が加水分解されてよい。
【００２２】
リパーゼは、１種のグリセロ脂質に対してのみリパーゼ活性を示してもよく、２種またはそれ以上のグリセロ脂質に対してリパーゼ活性を示してもよい。リパーゼは、少なくともグリセロ糖脂質に対してリパーゼ活性を示すのが好ましく、少なくともガラクト脂質に対してリパーゼ活性を示すのがより好ましい。グリセロ糖脂質に対するリパーゼ活性を「ガラクトリパーゼ活性」、同活性を有するリパーゼを「ガラクトリパーゼ」ともいう。
【００２３】
リパーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が、50,000〜60,000であってよい。
【００２４】
リパーゼとしては、例えば、クロレラ（Chlorella）属藻類のガラクトリパーゼが挙げ
られる。クロレラ（Chlorella）属藻類としては、クロレラ・ケスレリ（Chlorella kessleri）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）が挙げられる。Chlorella kessleriとしては、Chlorella kessleri
11h株（UTEX 263）が挙げられる。Chlorella kessleri 11h株は、テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The University of Texas at Austin, The Culture Collection of
Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA）から入手
できる。すなわち、リパーゼは、例えば、このような藻類に由来するタンパク質であってよい。
【００２５】
Chlorella kessleri 11h株（UTEX 263）のガラクトリパーゼのアミノ酸配列、およびそ
れをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列を、それぞれ、配列番号８および７に示す。すなわち、リパーゼは、例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、リパーゼは、例えば、配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００２６】
また、配列番号８に示すアミノ酸配列はプロ領域を含む。リパーゼは、例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列の内、プロ領域を除いた部分のアミノ酸配列（すなわち成熟タンパク質のアミノ酸配列）を有するタンパク質であってもよい。また、リパーゼは、例えば、配列番号７に示す塩基配列の内、成熟タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。Chlorella kessleri 11h株（UTEX 263）のガラクトリパーゼの成熟タンパク質のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列を、それぞれ、配列番号１１および１０に示す。
【００２７】
リパーゼは、元の機能が維持されている限り、上記例示したリパーゼ（例えば、配列番号８または１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、リパーゼをコードする遺伝子（「リパーゼ遺伝子」ともいう）は、元の機能が維持されている限り、すなわち元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したリパーゼ遺伝子（例えば、配列番号７または１０に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したリパーゼやそれをコードする遺伝子のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００２８】
「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、元のタンパク質の活性（または性質）に対応する活性（または性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、リパーゼにあっては、タンパク質のバリアントが、リパーゼ活性を有することをいう。
【００２９】
リパーゼのホモログとしては、例えば、上記アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、上記リパーゼ遺伝子のホモログは、例えば、各種微生物（原核生物）の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。一方、真核微生物の場合は、cDNAラ
イブラリーを鋳型として、同様にPCRにより上記リパーゼ遺伝子のホモログを取得するこ
とができる。
【００３０】
リパーゼは、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号８または１１に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００３２】
また、リパーゼは、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００３３】
また、リパーゼは、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号７または１０に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコ
ードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、上記塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を
鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわ
ゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より
好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げ
ることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる
場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが
挙げられる。
【００３４】
リパーゼは、上記のようなリパーゼの内、そのアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列が本発明の出願時に公知であるものを除いたものであってもよい。
【００３５】
リパーゼ遺伝子は、元の機能が維持されている限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、リパーゼ遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００３６】
なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「リパーゼ遺伝子」とは、リパーゼをコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。リパーゼ遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。リパーゼ遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。リパーゼ遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。リパーゼ遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハ
イブリッド鎖であってもよい。リパーゼ遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。リパーゼ遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。リパーゼ遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
【００３７】
＜２＞リパーゼの製造
リパーゼは、リパーゼを生産する能力を有する宿主を利用して製造することができる。すなわち、本発明は、リパーゼを生産する能力を有する宿主を培地で培養し、リパーゼを生成させること、および培養物よりリパーゼを採取すること、を含む、リパーゼの製造法を提供する。なお、リパーゼは、リパーゼ遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
【００３８】
リパーゼを生産する能力を有する宿主は、本来的にリパーゼを生産する能力を有するものであってもよく、リパーゼを生産する能力を有するように改変されたものであってもよい。
【００３９】
リパーゼを生産する能力を有する宿主としては、上記のようなクロレラ属藻類、例えばChlorella kessleri 11h株（UTEX 263）、が挙げられる。
【００４０】
リパーゼを生産する能力を有する宿主としては、リパーゼ遺伝子が導入された宿主も挙げられる。
【００４１】
リパーゼ遺伝子を導入する宿主は、機能するリパーゼを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。より好ましい宿主としては、細菌が挙げられる。細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等
のコリネ型細菌が挙げられる。また、放線菌としては、ストレプトマイセス（Streptmyces）属細菌などが挙げられる。なお、宿主としては、中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を好適に用いることができる。
【００４２】
リパーゼ遺伝子は、リパーゼ遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ等の核酸を利用できる。また、リパーゼ遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)
）。
【００４３】
また、取得したリパーゼ遺伝子を適宜改変してそのバリアントを取得することもできる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的
変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
【００４４】
リパーゼ遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、リパーゼ遺
伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、リパーゼ遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、リパーゼ遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類のリパーゼ遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類のリパーゼ遺伝子を有していてもよい。
【００４５】
リパーゼ遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、リパーゼ遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとして、具体的には、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、cspAプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられ
る。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【００４６】
リパーゼ遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、リパーゼ遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、
およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００４７】
リパーゼ遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。リパーゼ遺伝子を含むベクターを、リパーゼ遺伝子の発現ベクターまたは組換えベクターともいう。リパーゼ遺伝子の発現ベクターは、例えば、リパーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。リパーゼ遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するために好適なプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（い
ずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A
（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF DNA（TaKaRa）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤
耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。放線菌で自律複製可能なベクターとして、具
体的には、例えば、エシェリヒア・コリと放線菌のシャトルベクターであるpUC702（Molnar et al., J. Ferment. Bioeng., vol.72, 368-372 (1991)）が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むリパーゼ遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、リパーゼのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流にリパーゼのコード領域を組み込んでもよい。
【００４８】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」などに、特に放線菌において利用可能なものに関しては、「PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS（Kieserら、John Innes Foundation、2000年）」などに、詳細に記述されており、それらを利用することが可能である。
【００４９】
また、リパーゼ遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体上への遺伝子の導入は、例えば、相同的組み換えを利用して行うことができる。相同組換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）、P1ファージ等のファージを用いたトランスダクション（transduction）、接合伝達ベクターを用いた方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いた方法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、例えば、反復ＤＮＡ配列（repetitive
DNA）や、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、例えば、トランスポゾンやMini-Muを用いた方法により、遺伝子を染色体上にランダ
ムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色
体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むリパーゼ遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、リパーゼのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流にリパーゼのコード領域を組み込んでもよい。
【００５０】
染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
【００５１】
リパーゼは、他のアミノ酸配列（タンパク質やペプチド）との融合タンパク質として発現することもできる。他のアミノ酸配列の種類は特に制限されない。他のアミノ酸配列は、宿主の種類やリパーゼの使用目的等の諸条件に応じて適宜選択することができる。他のアミノ酸配列として、具体的には、トリガーファクター（TF）やＨｉｓタグ等のタグ配列、プロ配列、シグナル配列が挙げられる。例えば、プロ配列を利用することで、リパーゼを効率的に活性型酵素として生産することができる。また、例えば、シグナル配列を利用することで、リパーゼを効率的に細胞外に分泌生産することができる。プロ配列としては、例えば、Chlorella kessleri 11h株（UTEX 263）等のクロレラ属藻類のガラクトリパーゼのプロ配列が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、ホスホリパーゼのシグナル配列が挙げられる。また、リパーゼと他のアミノ酸配列との間にプロテアーゼの認識配列
をデザインすることにより、必要に応じて、プロテアーゼを用いて融合タンパク質からリパーゼを切り出し取得することもできる。プロテアーゼとしては、Factor Xaプロテアー
ゼやproTEVプロテアーゼが挙げられる。これらプロテアーゼの認識配列は公知である。
【００５２】
形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞
を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol.
Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ
型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。また、特に放線菌に関しては、「PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS（Kieserら、John Innes Foundation、2000年）」を参照して形質転換を行うことができる。
【００５３】
上記のようなリパーゼを生産する能力を有する宿主を培地で培養することにより、リパーゼを発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行ってよい。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、リパーゼを発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
【００５４】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
【００５５】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
【００５６】
イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
【００５７】
無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
【００５８】
その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
【００５９】
培養法は、液体培養であってもよく、固体培養であってもよいが、液体培養が好ましい。培養は、好気的に行うのが好ましい。好気的な培養法としては、振盪培養法や、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が挙げられる。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5〜50％に、好ましくは10％程度に調節してもよい。培養温度は、例えば
、10〜50℃、好ましくは20℃〜45℃、より好ましくは25℃〜40℃であってよい。培地のpH
は、例えば、3〜9、好ましくは5〜8に調整されてもよい。pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。培養期間は、例えば、12時間〜20日間、好ましくは1日間〜7日間であってよい。
【００６０】
また、クロレラ属藻類等の微細藻類の培養方法について以下に例示する。微細藻類の培養については多くの知見があり、例えば、Chlorella属藻類、Arthrospira属藻類（Spirulina）、およびDunaliella salina等の藻類は、食用として、工業的に大規模な培養が行われている（Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci. Bioeng. 101: 87-96）。微細藻類の
培養は、例えば、このような知見を参照して実施してよい。
【００６１】
微細藻類の培養は、光合成を利用し有機化合物を利用しない独立栄養培養（autotrophic culture）、光合成を利用せず有機化合物を利用する従属栄養培養（heterotrophic culture）、または光合成と有機化合物の両方を利用する混合栄養培養（mixotrophic culture）により実施することができる。微細藻類の培養は、通常は、独立栄養培養（autotrophic culture）により実施してよい。
【００６２】
微細藻類の培養は、解放系で行われてもよく、閉鎖系で行われてもよい。例えば、オープンポンドと呼ばれる解放培養系で培養を行うことができる。また、例えば、クローズドフォトバイオリアクターと呼ばれる閉鎖培養系で培養を行うことができる。
【００６３】
微細藻類の培養に用いる培地は、微細藻類が増殖でき、且つ、リパーゼを発現できるものであれば特に制限されない。培地は、例えば、窒素源や各種無機塩を含有していてよい。また、培地は、例えば、必要に応じて炭素源等の他の成分を含有していてもよい。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定することができる。培地としては、例えば、微細藻類の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。そのような培地として、具体的には、例えば、0.3×HSM培地（Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224: 646-654）、0.2
×ガンボーグ培地（Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147）、modified NORO培地（Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6: 44-48; Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117）、Bold's Basal Medium（Tornabene, T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440; Archibald, P.
A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology 20: 383-389）、F/2培地（Lie, C.-P. and
Lin, L.-P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214）、TAP培地が挙げられる。
【００６４】
微細藻類の培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養温度は、例えば、20〜40℃、好ましくは25℃〜35℃、より好ましくは30℃付近であってよい。培地の初発pHは、例えば、中性付近であってよい。中性付近とは、例えば、pH 7〜9であってよい。培養中はpH調整を行ってもよく、行わなくともよい。pH調整には、適当な無機あるいは有機の酸性
あるいはアルカリ性物質を使用することができる。培養は、通気しながら行ってよい。通気量は、例えば、培養液単位体積当たりの1分間の通気量として、0.1〜2 vvm（volume per volume per minute）であってよい。培養液には、さらにCO2を供給してもよい。CO2の
供給量は、例えば、通気量に対して、0.5〜5％（v/v）であってよい。CO2と空気は、別個に培養液に供給してもよく、混合して培養液に供給してもよい。光合成を利用する場合、培養系に光を供給する。光は、適当な光源を利用して供給することができる。光源としては、例えば、白色蛍光灯、白色発光ダイオード、高圧ナトリウムランプ、太陽光が挙げられる。これらの光源は、適宜組み合わせて利用してもよい。光の照度は、例えば、1,000
〜10,000 luxであってよい。培養液は、適宜、撹拌または循環させてよい。光の供給、空気の供給、CO2の供給、撹拌、循環等の各種操作は、連続的に行われてもよく、間欠的に
行われてもよい。各種操作の条件は、培養を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。培養期間は、例えば、1〜40日間であってよい。
【００６５】
上記のような条件下で培養を行うことにより、リパーゼを含む培養物が得られる。リパーゼは、例えば、宿主の菌体内および／または培地中に蓄積する。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」または「藻体」と読み替えてよい。
【００６６】
リパーゼは、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。
【００６７】
すなわち、例えば、宿主の菌体内にリパーゼが蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、リパーゼを回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地にリパーゼが蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清からリパーゼを回収することができる。
【００６８】
リパーゼの精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。リパーゼの精製は、所望の程度に行うことができる。
【００６９】
精製されたリパーゼは、「リパーゼ」としてグリセロ脂質の加水分解に利用できる。リパーゼは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
【００７０】
また、精製されたリパーゼに限られず、リパーゼを含有する任意の画分を「リパーゼ」としてグリセロ脂質の加水分解に利用してもよい。リパーゼを含有する画分は、リパーゼがグリセロ脂質に作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、リパーゼを生産する能力を有する宿主の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製されたリパーゼと共に利用されてもよい。
【００７１】
回収したリパーゼは、適宜、製剤化してもよい。剤形は特に制限されず、リパーゼの使用用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。
【００７２】
＜３＞リパーゼの利用
本発明においては、リパーゼを利用して、グリセロ脂質を加水分解することができる。すなわち、本発明は、リパーゼをグリセロ脂質に作用させることを含む、グリセロ脂質を加水分解する方法を提供する。同方法を、「本発明の方法」ともいう。また、同方法の一態様は、リパーゼをグリセロ脂質に作用させることを含む、グリセロ脂質の加水分解物の製造法である。
【００７３】
グリセロ脂質の加水分解により、脂肪酸と、脂肪酸が遊離した（すなわちエステル結合が加水分解されて水酸基を生じた）グリセロ脂質が生成する。これらの成分は、まとめてグリセロ脂質の加水分解物として取得し、利用してよい。また、これらの成分の内、所望の成分を分離回収し、利用してもよい。成分の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法や膜処理法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【００７４】
例えば、グリセロ脂質がグリセロ糖脂質である場合、グリセロ糖脂質の加水分解により、糖グリセロールが生成し得る。すなわち、本発明の方法の一態様は、リパーゼをグリセロ糖脂質に作用させることを含む、糖グリセロールを製造する方法であってもよい。
【００７５】
「糖グリセロール」とは、グリセロールのいずれかの水酸基に糖鎖がグリコシド結合した化合物をいう。糖グリセロールとして、具体的には、例えば、ガラクトシルグリセロール、ジガラクトシルグリセロール、およびスルホキノボシルグリセロールが挙げられる。ガラクトシルグリセロールは、グリセロールのいずれか１つの炭素の水酸基にガラクトースが結合した糖グリセロールである。ジガラクトシルグリセロールは、グリセロールのいずれか１つの炭素の水酸基にジガラクトースが結合した糖グリセロールである。スルホキノボシルグリセロールは、グリセロールのいずれか１つの炭素の水酸基にスルホキノボースが結合した糖グリセロールである。ガラクトシルグリセロール、ジガラクトシルグリセロール、およびスルホキノボシルグリセロールは、特記しない限り、いずれも、グリセロールの１位の炭素の水酸基に糖鎖が結合したもの、グリセロールの２位の炭素の水酸基に糖鎖が結合したもの、グリセロールの３位の炭素の水酸基に糖鎖が結合したもの、またはそれらの混合物であってよい。
【００７６】
生成する糖グリセロールの種類は、加水分解されるグリセロ糖脂質の種類に対応する。すなわち、例えば、モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラクトシルジアシルグリセロール、およびスルホキノボシルジアシルグリセロールの加水分解により、それぞれ、ガラクトシルグリセロール、ジガラクトシルグリセロール、およびスルホキノボシルグリセロールが生成し得る。また、生成する糖グリセロールにおける糖鎖の位置は、加水分解されるグリセロ糖脂質における糖鎖の位置に対応する。すなわち、例えば、グリセロール骨格の３位に糖鎖が結合したグリセロ糖脂質の加水分解により、グリセロール骨格の３位に糖鎖が結合した糖グリセロールが生成し得る。本発明においては、１種の糖グリセロールのみが製造されてもよく、２種またはそれ以上の糖グリセロールが製造されてもよい。
【００７７】
グリセロ脂質は、グリセロ脂質そのものであってもよく、グリセロ脂質を含有する素材であってもよい。言い換えると、グリセロ脂質は、単独で（すなわち単離された状態で）リパーゼによる加水分解に供されてもよく、任意の素材に含有された状態でリパーゼによる加水分解に供されてもよい。すなわち、「リパーゼをグリセロ脂質に作用させること」には、特記しない限り、グリセロ脂質そのものにリパーゼを作用させる場合に限られず、グリセロ脂質を含有する素材にリパーゼを作用させる場合が包含される。同様に、例えば、「リパーゼをグリセロ糖脂質に作用させること」には、特記しない限り、グリセロ糖脂質そのものにリパーゼを作用させる場合に限られず、グリセロ糖脂質を含有する素材にリパーゼを作用させる場合が包含される。グリセロ脂質は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。すなわち、グリセロ脂質としては、例えば、グリセロ脂質を含有する農水畜産物、それらの加工品、それらから分離したグリセロ脂質、人工的に合成したグリセロ脂質が挙げられる。グリセロ脂質を含有する素材としては、小麦粉が挙げられる。グリセロ脂質を含有する素材は、１種のグリセロ脂質を含有していてもよく、２種またはそれ以上のグリセロ脂質を含有していてもよい。グリセロ脂質としては、１種のグリセロ脂質を用いてもよく、２種またはそれ以上のグリセロ脂質を用いてもよい。
【００７８】
グリセロ脂質は、例えば、グリセロ脂質を含有する飲食品であってもよく、グリセロ脂質を含有する飲食品の原料であってもよい。言い換えると、グリセロ脂質は、例えば、飲食品またはその原料に含有された状態でリパーゼによる加水分解に供されてもよい。飲食品またはその原料の種類や形態は、飲食品またはその原料がグリセロ脂質を含有する限り、特に制限されない。例えば、上述したようなグリセロ脂質やそれを含有する素材を、いずれも単独で飲食品またはその原料として利用してもよく、それらの２またはそれ以上を適宜組み合わせて飲食品またはその原料として利用してもよく、それらの１またはそれ以上と他の成分とを適宜組み合わせて飲食品またはその原料として利用してもよい。グリセロ脂質を含有する飲食品またはその原料をリパーゼにより加水分解することにより、グリセロ脂質の加水分解物を含有する飲食品またはその原料が得られる。さらに、グリセロ脂質の加水分解物を含有する飲食品の原料を用いて、グリセロ脂質の加水分解物を含有する飲食品を製造することができる。飲食品には調味料も含まれる。グリセロ脂質を含有する飲食品としては、例えば、小麦加工食品（うどん等の麺帯、パン、クッキー、ケーキ、ドーナツ等）や大豆加工食品（豆乳、豆腐類、おから、味噌、大豆煮豆等）等が挙げられる。
【００７９】
グリセロ脂質は、例えば、溶液、懸濁液、スラリー、またはペースト等の形態でリパーゼによる加水分解に供することができる。溶媒または分散媒としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体を用いることができる。また、グリセロ脂質は、適宜、乳化等の前処理に供してから、リパーゼによる加水分解に供してもよい。反応系におけるグリセロ脂質の濃度は、所望の程度に加水分解が達成される限り、特に制限されない。反応系におけるグリセロ脂質の濃度は、グリセロ脂質の種類や形態、所望の加水分解率等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応系（反応液等）は、グリセロ脂質と溶媒からなるものであってもよく、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、飲食品や医薬品に配合して使用される成分が挙げられる。他の成分としては、例えば、塩類、糖類、タンパク質、香料、保湿剤、着色料、界面活性剤が挙げられる。塩類としては、Ｃａ2+イオンが挙げられる。界面活性剤としては、Triton X-100が挙げられる。
【００８０】
反応条件（酵素量、反応時間、反応温度、反応ｐＨ等）は、所望の程度に加水分解が達成される限り、特に制限されない。反応条件は、リパーゼの種類や純度、グリセロ脂質の種類や純度、所望の加水分解率等の諸条件に応じて適宜設定できる。酵素量は、グリセロ脂質1 gに対し、例えば、0.01〜100 U、好ましくは0.1〜10 Uであってよい。反応温度は
、例えば、20〜60℃、好ましくは30〜40℃、より好ましくは35〜40℃であってよい。反応溶液のpHは、例えば、4〜8、好ましくは5〜7.5、より好ましくは6〜7であってよい。反応時間は、例えば、10秒〜48時間、好ましくは10分〜24時間であってよい。
【００８１】
加水分解は、所望の程度に行うことができる。加水分解率（グリセロ脂質中の加水分解されたエステル結合数／グリセロ脂質中の加水分解前のエステル結合数）は、例えば、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、または２０％以上であってもよく、１００％以下、７０％以下、または５０％以下であってもよい。
【００８２】
加水分解により、グリセロ脂質の物性や機能を改変することができる。よって、例えば、グリセロ脂質を含有する飲食品またはその原料をリパーゼにより加水分解することにより、飲食品またはその原料の物性や機能を改変することができる。これら物性や機能の改変を総称して「改質」ともいう。すなわち、本発明の方法は、言い換えると、リパーゼをグリセロ脂質に作用させることを含む、グリセロ脂質を改質する方法であってよい。また、同方法の一態様は、例えば、リパーゼをグリセロ脂質を含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法であってよい。よって、リパーゼは、グリセロ脂質の改質剤（物性改変剤や機能改変剤）として提供されてよく、例え
ば、飲食品またはその原料の改質剤（物性改変剤や機能改変剤）として提供されてもよい。改質としては、例えば、食感の改善が挙げられる。リパーゼは、具体的には、例えば、小麦加工食品用や大豆加工食品用の品質改良剤として提供されてよい。
【００８３】
また、リパーゼは、グリセロ脂質の加水分解用試薬等の、試験研究用試薬として提供されてもよい。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８５】
実施例１：クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）の培養
テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The University of Texas at Austin, The
Culture Collection of Algae (UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA）より、クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）を入手した。クロレラ・ケスレリ11h株を、0.2×Gamborg's B5培地で前培養した。なお、0.2×Gamborg's B5培地は、Gamborg's B5培地（下記に組成を記す）を5倍希釈後、オートクレーブ滅菌（120℃, 15 min）して調製した。得られた前培養液16 mlを0.2×Gamborg’s B5培地800 mlを入れた１L
容メディウムビンに添加し、ポータブルガス混合装置PMG-1（コフロック）を使用して空
気とCO2を混合し3%CO2濃度に調整したガスを500 ml/minで吹き込みながら、14日間30℃にて攪拌培養した。培養は全て植物インキュベータCL-301（（株）トミー精工）内で実施し、光照射条件は白色蛍光灯を光源とした約5,000 luxの照度での連続照射とした。
【００８６】
＜Gamborg's B5培地（日本製薬）の組成＞
KNO3           2500 mg
MgSO4・7H2O     250 mg
NaH2PO4・H2O    150 mg
CaCl2・2H2O     150 mg
(NH4)2SO4       134 mg
Na2・EDTA        37.3 mg
FeSO4・7H2O      27.8 mg
MnSO4・H2O       10 mg 
H3BO3             3 mg
ZnSO4・7H2O       2 mg
KI                0.75 mg
Na2MoO4・2H2O     0.25 mg
CuSO4・5H2O       0.025 mg
CoCl2・6H2O       0.025 mg
脱イオン水で1 Lに調製。
【００８７】
実施例２：クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）由来ガラクトリパーゼの精製
実施例１で得られたクロレラ・ケスレリ11h株の培養液（2 L分）を遠心し上清を除去して藻体を得た。得られた藻体を20 mM Tris-HCl (pH8.0)緩衝液 200 mlで懸濁後、ビーズ
破砕機（ハミルトンビーチ社製）を用い冷却条件で「1分間ON−1分間OFF」のサイクルを10回繰り返し、藻体の破砕液を調製した。その後、その破砕液を遠心分離（2,400xg, 4℃
で5分間）して、上清を無細胞抽出液として回収した。続いて、その無細胞抽出液にTritonX-100溶液を終濃度1%で添加し、4℃で2時間撹拌し、無細胞抽出液中のタンパク質を可溶化した。次に、その可溶化液を超遠心分離（210,000ｘｇ、4℃で1時間）した後、上清に
対して、その容量の3倍量のアセトンを添加した後、-20℃で終夜静置することでタンパク質をアセトン沈殿させた。続いて、アセトン沈殿溶液を遠心分離（12,000xg, 4℃で5分間
）し、沈殿画分に対して、バッファーＡ（1% TritonX-100を含む20 mM Tris-HCl (pH8.0)）150 mlを添加してタンパク質を可溶化した後、DTT（ジチオトレイトール、終濃度1 mM
）とKCl（終濃度2 M）を加え、これを粗酵素液とした。
【００８８】
粗酵素液を、2M KClを含むバッファーＡにて平衡化した疎水性相互作用カラムToyopearl Butyl-650M（東ソー）に供し、酵素を吸着させた。その後、同緩衝液にてカラムを洗浄した。次に、溶出液としてバッファーＡを用いて酵素を2 Mから0 M KClのリニアグラジエントにて溶出させ、ガラクトリパーゼ活性を有する画分を回収した。ガラクトリパーゼ活性は、DGDG（ジガラクトシルジアシルグリセロール）を基質として、実施例４に記載のガラクトリパーゼ活性の標準測定方法に従って測定した（特記しない限り、以下同じ）。
【００８９】
続いて、その活性画分をVivaspin 20-10K（GEヘルスケア社製）により脱塩およびバッ
ファーＡに置換した。脱塩およびバッファー交換後の酵素液を、バッファーＡで平衡化した陰イオン交換カラム（Hitrap DEAE FF）に供し、酵素を吸着させた。その後、同緩衝液によりカラムを洗浄した。次に、溶出液として1 M NaClを含むバッファーＡを用いて0 M
から1 M NaClのリニアグラジエントにて酵素を溶出させ、ガラクトリパーゼ活性を有する画分を回収した。次に、得られた活性画分に対して終濃度2 Mとなるように塩化カリウム
を添加した後、その酵素液を疎水性相互作用カラムHitrap Butyl HP（2M KClを含むバッ
ファーＡにて平衡化済み）に供し、酵素を吸着させた。その後、同緩衝液にてカラムを洗浄した。次に、溶出液としてバッファーＡを用いて、目的酵素を2Mから0M KClでのリニアグラジエントにて溶出させ、ガラクトリパーゼ活性を有する画分を回収し、精製酵素とした。
【００９０】
得られた精製酵素を12%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGE（Laemmli, U.K., Nature, 227, 680(1970)）に供して分子量を測定したところ、精製酵素は分子量約55,000での単一バンドを示した（図１）。
【００９１】
実施例３：クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）由来ガラクトリパーゼのアミノ酸配列
決定
精製酵素のN末端アミノ酸配列を以下のようにして決定した。すなわち、精製酵素を実
施例２に示した方法でSDS-PAGEに供したのち、泳動したタンパク質をPVDF膜に転写した。次に、転写したタンパク質をアミノ酸配列解析装置Procise 494 HT(Applied Biosystem社製）で解析し、そのN末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号1に示すN末端ア
ミノ酸配列が得られた。
【００９２】
次に、精製酵素の内部アミノ酸配列を以下のようにして決定した。すなわち、精製酵素を実施例２に示した方法でSDS-PAGEに供したのち、精製酵素に対応するバンドを切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。次に、得られた消化物（ペプチド）を質量分析計（ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により解析し、精製酵素の内部アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号2および配列番号3に示す内部アミノ酸配列が得られた。
【００９３】
実施例４：クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）由来ガラクトリパーゼの特性解析
まず、クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）由来ガラクトリパーゼの基質特異性を解
析した。なお、本発明において、クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）由来ガラクトリ
パーゼを「chGL」ともいう。
【００９４】
ガラクトリパーゼ活性の標準測定方法は以下の通りである。すなわち、1%(w/v) Triton
X-100を含む1%(w/v) 基質（DGDG；ジガラクトシルジアシルグリセロール, Larodan Fine
Chemicals, #59-1210）2.5μL、1%(w/v) Triton X-100を含む200mM MES-NaOH（pH 6.5）15μL、20mMCaCl2 2.5μL、1%(w/v) Triton X-100 2.5μLを混合し、1%(w/v) Triton X-1
00を含む酵素溶液（ここでは精製酵素）2.5μLを加え、合計量25μLとなる反応液を調製
した。この反応液を37℃にて5分間保温して酵素反応させた後、100℃で5分間加熱し反応
を停止させた。そして反応液5μL中に含まれる遊離脂肪酸を、遊離脂肪酸測定キット「NEFA C-テストワコー」（和光純薬）を用いて、キットに添付の指示書に記載のとおりに測
定した。本条件で、１分間に１μmolの遊離脂肪酸を生成する酵素活性を１単位(U)のガラクトリパーゼ活性とした。
【００９５】
また、DGDG以外の基質として、MGDG（モノガラクトシルジアシルグリセロール）、SQDG（スルホキノボシルジアシルグリセロール）、POPG（1-パルミトイル-2-オレイル-sn-グ
リセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)）、POPC（1-パルミトイル-2-オレイル-sn-グリ
セロ-3-ホスホコリン）、POPE（1-パルミトイル-2-オレイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタ
ノールアミン）、POPS（1-パルミトイル-2-オレイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン）、DMPA（1,2-ジミリストイルホスファチジン酸）、tristearate（トリステアリン）、dipalmitate（ジパルミチン）、オリーブ油を用いた。DGDG以外の各基質に対するリパーゼ活性は、DGDGに代えて同量（(w/v)％）の各基質を用いたこと以外は、ガラクトリパーゼ活性の
標準測定方法に従って測定した。本条件で、１分間に１μmolの遊離脂肪酸を生成する酵
素活性を１単位(U)の各基質に対するリパーゼ活性とした。なお、オリーブ油に対するリ
パーゼ活性は、特許第5179208号に記載の方法に従って測定した。具体的には、オリーブ
油（ナカライテスク（株）製）200mgとアラビアガム（和光純薬工業（株）製）100mgに水10mlを加え、超音波発生装置(Fine, Ultra sonic cleaner, 100W)で超音波処理１分、ボ
ルテックスでの攪拌１分を合計２回の条件で乳化させ、これを基質液として用いた。
【００９６】
なお、実施例で用いたDGDG、MGDG、SQDGは、いずれも、１，２−ジアシルグリセロールの３位の水酸基に糖鎖が結合したグリセロ糖脂質である。
【００９７】
図２は、各基質に対する活性を、DGDGに対する活性を基準（100%）とする相対活性として示したグラフである。この結果から、本酵素（クロレラ・ケスレリ由来ガラクトリパーゼ）は、主にDGDGに対して作用するガラクトリパーゼであることが明らかとなった。
【００９８】
なお、精製酵素のガラクトリパーゼ活性は、27.6 U/mLであり、2.5μL当たりの活性は69 mUであった。また、精製酵素のガラクトリパーゼ比活性は531 U/mgであった。
【００９９】
次に、本酵素の活性の温度依存性を以下のようにして検定した。終濃度として0.1(w/v)％ 基質（DGDG）、0.3(w/v)％ Triton X-100、2mM CaCl2、120mM MES-NaOH（pH6.5、各設定温度時）、精製酵素69 mUを混合し、合計量25μLとなる反応液を調製した。この反応液を各設定温度条件にて5分間保温し、酵素反応を行った。その後に、ガラクトリパーゼ活
性の標準測定方法に従ってガラクトリパーゼ活性を測定した。図３は、各反応温度でのガラクトリパーゼ活性を、反応温度が37℃である場合のガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とする相対活性として示したグラフである。図３に示すように、本酵素は、25℃〜55℃でガラクトリパーゼ活性を示し、反応の至適温度は37℃付近（例えば35〜40℃）であった。
【０１００】
次に、本酵素の温度安定性を以下のように検定した。0.2 M MES-NaOH（pH6.5、各設定
温度時）で、精製酵素を５倍希釈した後、各温度で30分間静置し処理した。その後、ガラクトリパーゼ活性の標準測定方法に従って酵素反応を行い、ガラクトリパーゼ活性を測定した。図４は、各温度での処理後の残存ガラクトリパーゼ活性を、処理を行わずに酵素反応したときのガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とした相対活性として示したグラフである。図４に示すように、本酵素は、4℃から60℃までの温度での処理後において、残存
ガラクトリパーゼ活性が確認された。特に40℃以下の温度での処理後では、処理前の80%
以上のガラクトリパーゼ活性が維持された。
【０１０１】
次に、本酵素の活性のpH依存性を以下のように検定した。0.1(w/v)% 基質（DGDG）および0.3(w/v)% Triton X-100を含む、酢酸-酢酸Na（黒丸）、MES-NaOH（黒三角）、HEPES-NaOH（白丸）、Bis-Tris（黒四角）、Tris-HCl（白三角）、およびGlycine-NaOH（白四角
）から選ばれる緩衝液（140mM、各pH、温度37℃）に、精製酵素を69 mU加え、合計量25μLとなる反応液を調製した。この反応液を各pH条件にて5分間、酵素反応させた。その後に、ガラクトリパーゼ活性の標準測定方法に従ってガラクトリパーゼ活性を測定した。図５は、各反応pHでのガラクトリパーゼ活性を、反応pHが6.5（MES-NaOH）である場合のガラ
クトリパーゼ活性を基準（100%）とする相対活性として示したグラフである。図５に示すように、この酵素は、pH4からpH8という広い範囲で活性を示し、反応の至適pHは6.5付近
（例えば6〜7）であった。
【０１０２】
次に、本酵素のpH安定性を以下のように検定した。酢酸-酢酸Na（白丸）、MES-NaOH（
黒丸）、HEPES-NaOH（黒三角）、Bis-Tris（白三角）、Tris-HCl（白四角）、およびGlycine-NaOH（黒四角）から選ばれる緩衝液（50mM、各pH、温度37℃）で、精製酵素を５倍希釈した後、各pHで4℃、3時間処理した。その後、ガラクトリパーゼ活性の標準測定方法に従って酵素反応を行い、ガラクトリパーゼ活性を測定した。図６は、各pHでの処理後の残存ガラクトリパーゼ活性を、処理を行わずに酵素反応したときのガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とした相対活性として示したグラフである。図６に示すように、本酵素は、少なくともpH4から10までのpHでの処理後において、残存ガラクトリパーゼ活性が確認さ
れた。
【０１０３】
次に、本酵素の活性に必要な金属イオンを以下のようにして検定した。終濃度として0.1(w/v)％ 基質（DGDG）、0.3(w/v)％ Triton X-100、2mM CaCl2、120mM MES-NaOH（pH6.5、各設定温度時）、さらに、各種金属イオンを含む試薬を終濃度で10mMとなるように、あるいは阻害剤等を終濃度で2mMとなるように添加し、精製酵素69 mUを添加し、合計量25μLとなる反応液を調製した。別途、終濃度として0.1%(w/v) 基質（DGDG）および0.3%(w/v)
Triton X-100を含む120mM MES-NaOH（pH 6.5）に、精製酵素69 mUを添加し、合計量25μLとなる反応液（Ca2+フリー）を調製した。この反応液を、ガラクトリパーゼ活性の標準
測定方法に従って、pH6.5、37℃の条件で5分間、酵素反応させた後に、ガラクトリパーゼ活性を測定した。表１は、各種添加物を添加した条件のガラクトリパーゼ活性を、10 mM Ca2+を添加した条件でのガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とする相対活性として示す。本酵素は、Mn2+の存在下あるいは阻害剤存在下で若干活性が低下した。また、本酵素は、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、またはEDTAの存在下、および何も添加しない条件（Ca2+フリー）では、活性が大きく低下した。よって、本酵素はCa2+要求性であることがわかった。そこで、次に、Ca2+イオン濃度とガラクトリパーゼ活性との関係を調べた。終濃度として0.1%(w/v) 基質（DGDG）、0.3%(w/v) Triton X-100、120mM MES-NaOH（pH 6.5）に、Ca2+イオンを所定の終濃度となるように添加し、精製酵素69 mUを添加し、合計量25μLとなる反応液を調製した。この反応液を、ガラクトリパーゼ活性の標準測定方法に従って、pH6.5、37℃にて5分間、酵素反応させた後に、ガラクトリパーゼ活性を測定した。図７は、各濃度のCa2+を添加した条件でのガラクトリパーゼ活性を、2mM Ca2+を添加した条件でのガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とする相対活性として示したグラフである。図７に示すように、本酵素は、この反応条件下では、2mM程度のCa2+イオンが存在する条件が最適
であることがわかった。また、IAA(ヨードアセタミド)、2-ME（2-メルカプトエタノール
）、DTT（ジチオトレイトール）により活性が低下したことから、本酵素はシステイン残
基あるいはシスチン構造が酵素の立体構造の維持や活性発現に関与していることが示唆される。また、PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）により活性が低下したことから、本酵素はセリン残基が活性発現に関与していることが示唆される。
【０１０４】
【表１】
2015216863.tif 000003
【０１０５】
続いて、本酵素の活性の界面活性剤Triton X-100濃度依存性を以下のように検定した。0.1%(w/v) 基質（DGDG）および2mM CaCl2を含む120mM MES-NaOH（pH 6.5）に、Triton X-100を所定の終濃度となるように添加し、精製酵素69 mUを添加し、合計量25μLとなる反
応液を調製した。この反応液を、ガラクトリパーゼ活性の標準測定方法に従って、pH6.5
、37℃にて5分間、酵素反応させた後に、ガラクトリパーゼ活性を測定した。図８は、各
濃度のTriton X-100を添加した条件でのガラクトリパーゼ活性を、0.3%(w/v) Triton X-100を添加した条件でのガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とする相対活性として示したグラフである。このように、本酵素は、この反応条件下では0.3%(w/v)程度のTriton X-100が存在する条件が最適であることがわかった。
【０１０６】
実施例５：クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）のゲノムDNA配列解析
クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）を、実施例１と同様の手順で7日間培養し、湿藻体重量で約20 mgの藻体を回収した。藻体を液体窒素で-80℃に冷却した乳鉢（オートクレーブ滅菌済）に入れ、液体窒素を加えながら、乳棒で藻体を破砕し粉末状にした。完全に粉末状になった藻体からNucleoSpinPlantII（MACHEREY-NAGEL製）を用いてDNAの抽出及び精製を行い、約10μgのDNAを得た。
【０１０７】
次に、取得したDNAを、Nextera DNA Sample Preparation Kit（illumina製）、Nextera
Index Kit（illumina製）、Agencourt AMPure XP（BECKMAN COULTER製）及びDNA Clean & Concentration Kit-5（ZYMO RESEARCH製）を用いてメーカー推奨プロトコル通りに処理し、DNAサンプルを調製した。次いで、DNAサンプルをMiseq Reagent Kit v2 500-cycles
（illumina製）にロードし、MiSeq（illumina製）DNAシーケンサーによりゲノムDNAの塩
基配列情報を得た。取得した塩基配列から作成したゲノムDNAのコンティグ配列に対して
、N末端アミノ酸配列である配列番号1に対応するDNA配列の検索を行ったところ、配列番
号4の塩基配列を取得した。
【０１０８】
実施例６：クロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）のガラクトリパーゼをコードするcDNA
の取得
実施例５で得たクロレラ・ケスレリ11h株（UTEX 263）の藻体からRNeasy mini (QIAGEN)を用いて全RNAの抽出及び精製を行い、約8μgの全RNAを得た。
【０１０９】
得られた全RNAを鋳型として、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）を用いて、「3'RACE用および5'RACE用1st strand cDNA」を作製した。
【０１１０】
次いで、「3'RACE用および5'RACE用1st strand cDNA」を鋳型として、3'RACE法及び5'RACE法にて遺伝子断片を増幅した。3'RACE用プライマーとしては、配列番号4を元にゲノムDNA配列情報を用いて設計した配列番号5のプライマーを用いた。一方、5'RACE用プライマーとしては、配列番号2を元にゲノムDNA情報を用いて設計した配列番号6のプライマーを
用いた。ポリメラーゼとしてはKOD FX Neo（TOYOBO）を使用した。PCRは、94℃-2分での
熱変性後、「98℃-10秒、68℃-2分」のサイクルを40回実施した。その結果、3'RACE法に
より約2 kbpのDNA断片が、5'RACE法により約800 bpのDNA断片が、それぞれ得られた。
【０１１１】
3'RACE法及び5'RACE法で得られたDNA断片を各々シーケンス解析し、配列を重ね合わせ
ることにより、完全長cDNA配列を取得した。当該cDNAには、１５３０塩基からなるオープンリーディングフレーム（ORF）が見出された。当該ORFは、５１０アミノ酸残基をコードしうるものであった。当該ORFの塩基配列を含む、当該cDNAの開始コドンから終始コドン
までの塩基配列を配列番号7に示す。また、当該ORFがコードしうるアミノ酸配列（すなわち当該cDNAがコードしうるアミノ酸配列）を配列番号8に示す。配列番号7の中に、chGLの内部アミノ酸配列である配列番号3に対応する配列番号9の塩基配列が確認されたことから、当該cDNAがchGLをコードしうると確認できた。なお、当該cDNAがコードしうるアミノ酸配列（配列番号8）は、プロ領域を含むchGLのアミノ酸配列である。成熟型chGLのアミノ
酸配列と、当該cDNA中の成熟型chGLをコードしうる部分の塩基配列を、それぞれ配列番号10および11に示す。
【０１１２】
次に、再度chGLをコードし得るcDNAの塩基配列が配列番号7であることを確認するため
に、配列番号12及び配列番号13のプライマーを用い、「3'RACE用および5'RACE用1st strand cDNA」を鋳型として、ポリメラーゼとしてKOD FX Neoを使用して、94℃-2分での熱変
性後、「98℃-10秒、68℃-3分」のサイクルを35回実施するPCRを行い、DNA断片を増幅さ
せた。そして、その増幅したDNA断片を、Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) (TaKaRa製)を使用して付属のpUC118ベクターにライゲーションし、そのDNA断片の塩基配列を
決定したところ、配列番号7の塩基配列を有するDNA断片であることを確認した。
【０１１３】
実施例７：エシェリヒア・コリによるchGLの発現
成熟型chGLをエシェリヒア・コリ（Escherichi coli）にて発現させることを検討した
。発現プラスミドとしてpCold TF DNA（TaKaRa）を選択した。pCold TF DNAは、シャペロンであるトリガーファクター（TF）を可溶化タグとして目的タンパク質に融合した形態で
目的遺伝子が発現するようにデザインされた、目的タンパク質の転写が低温で誘発されるコールドショック発現ベクターである。
【０１１４】
成熟型chGLをコードしうるcDNA（配列番号10）を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いて発現プラスミドへクローニングした。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF
DNAを鋳型として、配列番号14および配列番号15のプライマーを用いたPCRにより行った
。成熟型chGLをコードしうるcDNA断片の増幅は、「3'RACE用および5'RACE用1st strand cDNA」を鋳型として、配列番号16および配列番号17のプライマーを用いたPCRにより行った。ポリメラーゼとしてはKOD FX Neo(TOYOBO)を使用した。PCRは、94℃-2分での熱変性後
、「98℃-10秒、55℃-5秒、68℃-6分」のサイクルを35回実施した。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体か
ら、TFをコードするDNAの下流に正しく成熟型chGLをコードしうるcDNAが連結した発現プ
ラスミド（pCTF-chGL1と命名）を有する株を取得することができた。
【０１１５】
次に、得られた株から、プラスミド抽出キットQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を
用いてpCTF-chGL1を抽出した。pCTF-chGL1を用いてE. coli Rosetta2株（Novagen）を形
質転換し、成熟型chGLの発現株E. coli pCTF-chGL1/Rosetta2を作製した。本発現株を、
終濃度100μg/mlとなるようアンピシリン添加したLB培地（Trypton（Difco製）10g、Yeast Extract（Difco製）5g、NaCl 10gに脱イオン水を添加して1 Lに合わせた後pH7.0に調整しオートクレーブ（121℃、15分）した培地）で、37℃にて1晩振とう培養し前培養液を作製した。終濃度100μg/mlとなるようアンピシリン添加した新たなLB培地へ、1/100容量分の前培養液を添加し、37℃で3時間程度振とう培養を行った後、終濃度1 mMとなるようイ
ソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、培養温度を15℃へ下げて、pCTF-chGL1のcspAプロモーターからの転写を誘導した（低温誘導）。15℃で24時間培養を行った後、菌体を遠心分離にて回収した。また、コントロールとして、低温誘導直前の菌体も同様にして回収した。
【０１１６】
次に、培養液1 ml分の菌体を、緩衝液S（20 mM Tris-HCl (pH8.0)）350μlに懸濁した
のち、超音波破砕機UCD-250（コスモバイオ製）を用いて冷却条件下で「30秒ON−30秒OFF」のサイクルを10回繰り返すことで破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離（21,600xg, 4℃で10分間）に供して不溶性画分を除き、上清画分を粗抽出液とした。
【０１１７】
続いて、粗抽出液4μlに、NuPAGE LDSサンプルバッファー（Novex製）2.5μl、NuPAGE
サンプル還元試薬（Novex製）1μl、脱イオン水2.5μlを加え、70℃で10分間熱処理後、NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel（Novex製）を用いて電気泳動を行った。その結果、図９に示
すように、発現プラスミドでの低温誘導前に比べて低温誘導後のサンプルにおいて、目的とする分子量105 x 103付近に顕著なタンパク質のバンドが観察された。なお、TFの理論
分子量は52,100、chGLの理論分子量は52,800であるので、今回の発現実験における目的タンパク質であるTF-chGL融合タンパク質の分子量は約105 x 103と推定される。
【０１１８】
pCTF-chGL1/Roseeta2株を低温誘導した後の粗抽出液中にガラクトリパーゼ活性が確認
できるかどうかを検討した。上記のようにして得られた粗抽出液2.5μlを、酵素反応液（200 mM Tris-HCl溶液(pH7.1) 17.5μl、「1% DGDG、1% TritonX-100混合液」2.5μl、100
mM CaCl2溶液 2.5μl）22.5μlに加え混合後、37℃で5分間保温した。その後、100℃で10分間処理して酵素を熱失活させ、続いて、遠心分離（21,600xg, 4℃で5分間）にて上清
を回収し、その中の脂肪酸を定量した。なお、コントロールサンプルとして、粗抽出液を予め100℃で10分間処理し熱失活させたものを準備し、同様に酵素反応した後に脂肪酸を
定量した。脂肪酸の定量にはLabAssay NEFA（和光純薬）を使用し、生成した脂肪酸量を
オレイン酸換算で算出した。測定サンプルで定量した脂肪酸量から、予め熱処理したコントロールサンプルの脂肪酸量を差し引いた値を生成脂肪酸量とみなし、1分間に1μmolの
脂肪酸を生成する酵素活性を1 unitのガラクトリパーゼ活性と定義した。吸光度測定には吸光プレートリーダーSPECTRAMAX190（モレキュラーデバイス製）を使用した。酵素活性
測定の結果、粗抽出液中のガラクトリパーゼ比活性は1.2 unit/mg proteinであった。以
上の結果から、実施例６で取得したcDNAがchGLをコードしうるものであることが示された。
【０１１９】
なお、本融合タンパク質（TF-chGL融合タンパク質）はN末端側にHisタグを有している
。そこで、Amicon Pro Affinity Concentration Kit Ni-NTA（Millipore）のNi-NTA樹脂
により本融合タンパク質を精製した。さらに、本融合タンパク質は、TFとchGLの連結部にプロテアーゼFactor Xaの切断認識部位（Ile-Glu-Gly-Arg）を有しているため、本融合タンパク質をFactor Xa（Novagen）で切断することで、chGL部分のみを取得することができる。そこで、次に、chGL部分のみを取得し、chGL部分のみでのガラクトリパーゼ活性を確認した。
【０１２０】
精製したTF-chGL融合タンパク質をFactorXaを用いて1時間処理した。処理サンプルを、NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel（Novex製）を用いたSDS-PAGEに供した。FactorXa処理前のサンプルと比較して、FactorXaにて処理した場合、TF-chGLの分子量バンドは消失して、代
わってTFとchGLに相当する約53,000 のタンパク質バンドが生成した（図１０）。また、
この処理サンプルのガラクトリパーゼ活性を確認したところ、ガラクトリパーゼ比活性は約8 units/mg proteinであった。以上の結果から、実施例６で取得したcDNAがchGLをコードするcDNAであることが判明した。
【０１２１】
実施例８：放線菌によるchGLの発現
放線菌ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）によるchGLの発現
を以下のようにして実施した。
【０１２２】
プロ配列を含むchGLの全長（配列番号８）をコードするDNAの上流側断片と下流側断片
を、実施例６に記載の「3'RACE用および5'RACE用1st strand cDNA」を鋳型として、配列
番号２０と２１のプライマーペアおよび配列番号２２と２３のプライマーペアをそれぞれ用いて、PCRにより増幅した。次に、増幅した両DNA断片を混合して鋳型とし、配列番号２１と２２のプライマーを用いて、PCRを実施した。これにより、chGL遺伝子内のSphIサイ
トをつぶした、プロ配列を含むchGLの全長（配列番号８）をコードするDNA断片を得た。
このDNA断片中、chGLのプロ配列をコードする部分の5'末端にはSphIサイトが、成熟型chGLをコードする部分の3'末端にはBglIIサイトが、それぞれ付加されている。このDNA断片
をSphIおよびBglIIで消化して、公知のエシェリヒア・コリと放線菌のシャトルベクターpUC702（Molnar et al., J. Ferment. Bioeng., vol.72, 368-372 (1991)）に導入されたPLDプロモーターとPLDターミネーター（Ogino et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.64, 823-828 (2004)）間に挿入し、chGLの発現プラスミドpUC702/chGLを構築した。
【０１２３】
pUC702/chGLを、公知の方法にて放線菌ストレプトマイセス・リビダンス1326株（NBRC15675）へ導入した。こうして得られた形質転換体を、試験管に入れた50μg/mlチオストレプトンを含むPG培地（組成：2% glucose, 0.5% yeast extract, 0.5% ペプトン, 0.8% K2HPO4, 0.05% MgSO4・７水和物, pH 調整なし）および50μg/mlチオストレプトンを含むISP2培地（組成：10 g malt extract, 4 g yeast extract, and 4 g glucose per liter, pH 7.2）に植菌し、23℃にて培養した。
【０１２４】
次に、培養液1mL分の菌体を、緩衝液（1% Triton X-100を含む20 mM Tris-HCl (pH8.0)）1mLに懸濁したのち、超音波破砕機を用いて冷却条件下で菌体を破砕した。得られた菌
体破砕液を遠心分離（21,600xg, 4℃で10分間）に供して不溶性画分を除き、上清画分を
粗抽出液とした。粗抽出液を用いて酵素活性を測定した結果、培養６日目には培養液1mL
あたり約1.5Uの酵素が得られた。このように、放線菌をホストとして、酵素活性を発揮できる形でchGLを菌体内に発現させることができた。
【０１２５】
実施例９：chGLと既知のガラクトリパーゼとのアミノ酸配列の相同性比較
chGLと既知のガラクトリパーゼとのアミノ酸配列の相同性を解析した。相同性の解析には、配列多重整列ソフトClustalWを用いた。chGLとアスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）由来のガラクトリパーゼ（配列番号１８；特開2008-206515）との比較結果を図１１に、chGLとクラミドモナス・レインハルティ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のガラクトリパーゼ（配列番号１９；Li X, et al., Plant Cell 11, 4670 (2012)）との比較結果を図１２に、それぞれ示す。アミノ酸レベルでの相同性は、chGLとアス
ペルギルス・ジャポニクス由来のガラクトリパーゼ間では12％、chGLとクラミドモナス・レインハルティ由来のガラクトリパーゼ間では20%であり、いずれも極めて低いものと判
明した。従って、本実施例で取得したchGLは、新規なガラクトリパーゼであることが示された。なお。アスペルギルス・ジャポニクス由来のガラクトリパーゼは２９４アミノ酸残基から、クラミドモナス・レインハルティ由来のガラクトリパーゼは１１１７アミノ酸残基からなり、chGLとはタンパク質の分子量も大きく異なる。
【０１２６】
実施例１０：リポパンFとchGLの酵素特性比較
製パン用のリパーゼとして市販されているリポパンF（ノボザイム社）とchGLとで温度
安定性を比較した。
【０１２７】
リポパンFは、反応調製液（20 mM Tris-HCl (pH7.1)、1% Triton X-100）に1 mg/ml（
本酵素活性測定系にて約150U/mg-proteinに相当）となるよう添加し、酵素液として使用
した。一方、chGLは、実施例２で調製した精製酵素（酵素濃度66U/mg-protein）を酵素液として用いた。まず、酵素溶液を30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃の各温度で30分間保持した後に、それぞれ2.5μlの酵素溶液を、反応液（200 mM Tris-HCl(pH7.1) 17.5μl、「1% DGDG、1% TritonX-100」混合液 2.5μl、100 mM CaCl2溶液 2.5μl）22.5
μlに加え混合後、37℃、10分間保温した。その後、100℃、10分間で熱失活させた後、遠心分離（21,600xg, 4℃で5分間）し、上清を取得した。次いで、上清中の脂肪酸を定量し、ガラクトリパーゼ活性を算出した。酵素反応は、全て検体数n=3で実施した。図１３は
、各温度での処理後の残存ガラクトリパーゼ活性を、40℃での処理後の残存ガラクトリパーゼ活性を基準（100%）とした相対活性として示したグラフである。図１３に示すように、50℃での温度安定性は、リポパンFよりもchGLの方が優れていることが示され、chGLは
保存安定性が高いことが判明した。
【０１２８】
実施例１１：食品素材へのchGLの応用
chGLによる食品素材の物性改変効果を、小麦粉を用いて検定した。薄力粉3 g (日清製
粉製)に対し、終濃度 20 mM Tris-HCl(pH7.1)、0.2% Triton X-100、30 mM NaClになるよう調製した10 units分のchGL溶液25 mlを加え作用させ、結果物の破断特性をテクスチャ
ーアナライザー（TA XTplus、StableMicroSystems製）を用いて評価した。具体的には、25℃で30分間撹拌しながら小麦粉とchGLを反応させた後、7分間かけて95℃まで昇温させ、その後、95℃で110秒撹拌反応させて糊化を行った。糊化したサンプルを1.5ml容のエッペンドルフチューブに詰め、老化処理（「冷凍−解凍」を3回繰り返す）を行い、模擬的な
生地サンプルを作製した。得られた生地サンプルを破断試験に供した。結果を図１４に示す。図１４において試験力の変化が二つのピークになっているのは、治具の圧縮により一旦壊れた生地を再度圧縮していることに起因する。破断試験の結果、chGLで処理した生地サンプルにおいては「硬さ」が低下する傾向があることが分かり（表２）、すなわち、古くなった糊化サンプルに対して生地の柔らかさを維持する効果がある可能性が示唆された。一方で、「粘着性」に関しては、chGLで処理した生地サンプルとchGL無添加のコントロールとでほぼ同等の結果であった（表２）。なお、ここでは、「硬さ」とは、生地サンプ
ルを圧縮した時に受ける最大試験力（アナライザーの治具にかかる力の大きさ）として定義し、「粘着性」とは、生地サンプルを圧縮後に治具を引き離すのに要する力と距離をかけた値として定義した。
【０１２９】
【表２】
2015216863.tif 000004
【０１３０】
実施例１２：chGLを用いた糖グリセロール製造
実施例７に記載した、精製TF-chGL融合タンパク質をFactorXaを用いて1時間処理したサンプルを酵素溶液とした。酵素溶液25μlを、酵素反応液（200 mM Tris-HCl溶液(pH7.1) 175μl、「1% DGDG、1% TritonX-100混合液」25μl、100 mM CaCl2溶液 25μl）225μlに加え混合後、37℃で1時間保温した。その後、日立製のオートサンプラー L-7200、ポンプ
L-7100、および示差屈折率検出器 L-2490に糖分析用カラム SH-1011(昭和電工)を備え付けたHPLC分析装置を使用して、反応サンプルのHPLC分析を行った。移動相には水を用いた。結果、図１５に示すように、保持時間7.01分に、糖グリセロールの一種であるジガラクトシルグリセロールのピークが検出された。
【０１３１】
＜配列表の説明＞
配列番号１：成熟型chGLのN末端アミノ酸配列
配列番号２：chGLの内部アミノ酸配列
配列番号３：chGLの内部アミノ酸配列
配列番号４：成熟型chGLのN末端アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列
配列番号５：3'-RACE用プライマーの塩基配列
配列番号６：5'-RACE用プライマーの塩基配列
配列番号７：chGLをコードするcDNAの塩基配列
配列番号８：chGLのアミノ酸配列
配列番号９：chGLの内部アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列
配列番号１０：成熟型chGLをコードするcDNAの塩基配列
配列番号１１：成熟型chGLのアミノ酸配列
配列番号１２：chGLをコードするcDNAをクローニングするためのプライマーの塩基配列
配列番号１３：chGLをコードするcDNAをクローニングするためのプライマーの塩基配列
配列番号１４：pCold TF DNAのDNA断片増幅用のプライマーの塩基配列
配列番号１５：pCold TF DNAのDNA断片増幅用のプライマーの塩基配列
配列番号１６：成熟型chGLをコードするcDNA断片増幅用のプライマーの塩基配列
配列番号１７：成熟型chGLをコードするcDNA断片増幅用のプライマーの塩基配列
配列番号１８：Aspergillus japonicus由来のガラクトリパーゼのアミノ酸配列
配列番号１９：Chlamydomonas reinhardtii由来のガラクトリパーゼのアミノ酸配列
配列番号２０：chGLの一部をコードするDNA断片の増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２１：chGLの一部をコードするDNA断片の増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２２：chGLの一部をコードするDNA断片の増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２３：chGLの一部をコードするDNA断片の増幅用プライマーの塩基配列
【図２】
2015216863.tif 000005
【図３】
2015216863.tif 000006
【図４】
2015216863.tif 000007
【図５】
2015216863.tif 000008
【図６】
2015216863.tif 000009
【図７】
2015216863.tif 000010
【図８】
2015216863.tif 000011
【図１３】
2015216863.tif 000012
【図１５】
2015216863.tif 000013
【図１】
2015216863.tif 000014
【図９】
2015216863.tif 000015
【図１０】
2015216863.tif 000016
【図１１】
2015216863.tif 000017
【図１２】
2015216863.tif 000018
【図１４】
2015216863.tif 000019
【配列表】
2015216863000001.app