(57)【要約】      （修正有）【課題】半減期が長く、薬物動態（ＰＫ）及び薬効（ＰＤ）が向上した、血液凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ分子）の提供。【解決手段】下記構造等の１以上のシステイン残基（適切にはＦＶＩＩａの還元ジスルフィド結合のリンカー）を介し、ＦＶＩＩａに共役する生体適合性ポリマー、およびこのような共役形態のＦＶＩＩａを含む薬剤組成物。2015110636.tif 000024［Ｒ１は直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、又は置換／未置換のアリール基若しくはヘテロアリール基；前記アリール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基；適当なヘテロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合、または安定な結合］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のシステイン残基を介してＦＶＩＩａに共役する生体適合性ポリマー。
【請求項２】
前記生体適合性ポリマーは、１以上の還元システインジスルフィド結合を介してＦＶＩ
Ｉａに共役する、請求項１に記載の生体適合性ポリマー。
【請求項３】
前記生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩａでジスルフィド結合を形成した２つのシステイ
ン残基の硫黄残基を架橋するリンカー基によってＦＶＩＩａに共役する、請求項２に記載
の生体適合性ポリマー。
【請求項４】
前記リンカー基は、基Ｒ１（Ｒ１は、直接結合、Ｃ１−１０のアルキレン基、または必
要であれば置換されてもよいアリール若しくはヘテロアリール基である）を介して前記生
体適合性ポリマーに共役する、請求項３に記載の生体適合性ポリマー。
【請求項５】
Ｒ１は、フェニル、ベンゾイル、ナフチル、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イ
ミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジンまたはプリンから選択
される、請求項４に記載の生体適合性ポリマー。
【請求項６】
ＦＶＩＩａのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合の２つの硫黄原子間のリンカ
ー基は、３−炭素架橋を有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマ
ー。
【請求項７】
ＦＶＩＩａのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合の２つの硫黄原子間のリンカ
ー基は、（ＣＨ２）２ＣＨＣ（Ｏ）−である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の生体
適合性ポリマー。
【請求項８】
前記共役体は、下記構造：
【化１】
2015110636.tif 000021
ただし、Ｒ１は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、ま
たは置換されてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である置換基であり；前記ア
リール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基があり；適当なヘテロアリ
ール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オ
キサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水分解
に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである、
を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体適合性ポリマー。
【請求項９】
前記生体適合性ポリマーは約５〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜８のいず
れか１項に記載の生体適合性ポリマー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の１以上のシステイン残基を介してＦＶＩＩａに共
役する生体適合性ポリマーを含む薬剤組成物。
【請求項１１】
前記組成物は製薬上許容できる希釈剤、アジュバントまたは担体を含む、請求項１０に
記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
さらに他の薬剤活性のある物質(pharmaceutically active agent)を含む、請求項１０
または１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
非経口投与に適する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
皮内、皮下、及び筋肉内注射、ならびに静脈内または骨内注入に適する、請求項１０〜
１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態を有する、請求項１０〜１４のいずれか１項に
記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記ＦＶＩＩａ共役体は、未修飾のＦＶＩＩａに比べて半減期がより長い、請求項１０
〜１５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
前記ＦＶＩＩａ共役体は、未修飾のＦＶＩＩａに比べてＡＵＣがより高い、請求項１０
〜１６のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
前記ＦＶＩＩａ共役体は、未修飾のＦＶＩＩａに比べてバイオアベイラビリティがより
高い、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記ＦＶＩＩａ共役体は、未修飾のＦＶＩＩａに比べて免疫原性がより低い、請求項１
０〜１７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の薬剤組成物を血液凝固疾患(blood clotting 
disease)または外傷(trauma)を治療する必要のある患者に投与することを有する血液凝固
疾患または外傷の治療方法。
【請求項２１】
前記血液凝固疾患(blood clotting disease)が、血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求
項２０に記載の治療方法。
【請求項２２】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載のＦＶＩＩａ共役体を含む薬剤組成物を、関節
血症、出血、胃腸出血及び月経過多症の危険性を低減する必要のある患者に投与すること
を有する、血友病Ａ、血友病Ｂまたは外傷を有する哺乳動物の関節血症、出血、胃腸出血
及び月経過多症の危険性の低減方法。
【請求項２３】
前記組成物は、皮下に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物は、静脈内に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物は、１〜１４日毎に一度投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＦＶＩＩａの機能の欠損の特徴を有する血液凝固疾患(blood clotting disease)の治療
に使用される、または外傷の治療に使用される１以上のシステイン残基を介してＦＶＩＩ
ａに共役する生体適合性ポリマー。
【請求項２７】
下記：
【化２】
2015110636.tif 000022
ただし、Ｒ１は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、ま
たは置換されてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である置換基であり；前記ア
リール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基があり；適当なヘテロアリ
ール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オ
キサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水分解
により不安定になる結合(hydrolytically labile bond)による、または安定な結合(nonla
bile bond)によるものである、
の生体適合性ポリマー及びＦＶＩＩａの共役体の調製方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩａの２つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、２
つの遊離チオール基を生成し；
（ｂ）共役２重結合及び脱離基を有する共役試薬間の第一のチオレート導入付加反応(t
hiolate addition reaction)を行い；
（ｃ）前記脱離基を除去して、共役２重結合を生成し；さらに
（ｄ）第二のチオレート導入付加反応(thiolate addition reaction)を行い、２個の硫
黄原子間に３−炭素架橋を形成する
ことを有する方法。
【請求項２８】
前記共役試薬は、下記式：
【化３】
2015110636.tif 000023
ただし、Ｒ１は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、ま
たは置換されてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である置換基であり；前記ア
リール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基があり；適当なヘテロアリ
ール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オ
キサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水分解
に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものであり、およびＬ
は、脱離基である、
を有する、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共役形態の(conjugated forms of)ヒト血液凝固第ＶＩＩａ因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固第ＶＩＩ因子（本明細書中では、ＦＶＩＩとも称する）は、１２個の天然のジ
スルフィド結合を有する、５３，０００ダルトン（Ｄａ）の、グリコシル化されたビタミ
ンＫ依存性の、１本鎖チモーゲンである(O’Hara et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
, 84: 5158-5162 (1987))。このタンパク質は、主に肝臓で生産される。ＦＶＩＩは、外
因性の血液凝固カスケードに関与する（図１）。このタンパク質は、４つの別のドメイン
で構成されている：Ｎ−末端γ−カルボキシグルタミン酸(Gla)ドメイン、２つの上皮成
長因子様(EGF)ドメインおよびＣ−末端セリンプロテアーゼドメイン。循環しているチモ
ーゲンは、血管内皮下層に見つかっているコファクター組織因子(cofactor tissue facto
r)（ＴＦ）の不存在下では非常にプロテアーゼ活性が低い。血管損傷を受けた後、ＦＶＩ
Ｉは高い親和性でＴＦに結合し、１５２番目のアルギニン及び１５３番目のイソロイシン
の間のペプチド結合の特異的な切断によって活性のある、２本鎖の酵素ＦＶＩＩａに変換
する。ＦＶＩＩａ軽鎖は、Ｎ−末端Ｇｌａ及びＥＧＦ様ドメインから構成され、重鎖は、
セリンプロテアーゼドメインから構成される。重鎖及び軽鎖は、１３５番目のシステイン
及び２６２番目のシステインの間の１つのジスルフィド結合によって一緒に維持される。
活性化されると、ＦＶＩＩａは、すばやく、ＦＸからＦＸａへの及びＦＩＸからＦＩＸａ
への変換を触媒する。次に、ＦＸａがＦＶと複合体を形成し、プロトロンビンを切断し、
これにより、少量のトロンビンが生成する(Aitken, M. G. EMA, 16: 446-455 (2004))。
このトロンビンの生成が血小板及び血小板表面のコファクターＶ、ＶＩＩＩ及びＸＩを活
性化する。活性化によって、トロンビンバースト(thrombin burst)が形成され、これによ
りフィブリンの重合及び止血血栓の形成が起こる。
【０００３】
ヒトの組換ＦＶＩＩａが開発され、Novo NordiskによってNovoSeven（登録商標）(epta
cog alfa [activated], ATC code B02BD08)として市販されている。NovoSeven（登録商標
）は、それぞれ、ＦＶＩＩＩまたはＩＸに対する阻害抗体を発現した血友病ＡまたはＢ患
者の出血症状の治療のために認可されている (Jurlander et al., Seminars in Thrombos
is and Hemostasis, 27: 373-383 (2001); Roberts et al., Blood, 15: 3858-3864 (200
4))。この治療は、１９９６年に開始されてから安全で有効であることが分かっている。
しかしながら、タンパク質のインビボでの半減期が比較的短い（２．３時間；Summary Ba
sis for Approval NovoSeven（登録商標）, FDA reference number 96-0597）ため、高投
与量の製品（９０μｇ／ｋｇ）を複数回輸注することが、止血するためには１回の出血症
状の間長持間かけて必要である。製品の短い半減期及び所望の治療効果を得るために必要
とされる高投与量は、阻害剤で血友病患者を予防的に処置するためのNovoSeven（登録商
標）の一般的な使用を妨げる。したがって、明らかに、半減期の長く、薬物動態（ＰＫ）
及び薬効（ＰＤ）が向上した、ＦＶＩＩａ分子を開発する必要がある。
【０００４】
従来、バイオ医薬品の生体適合性ポリマーへの共役(conjugation)を用いて、製品の物
理化学的特性を改良するのに成功してきた。共役により改良された治療用タンパク質の特
性としては、ＰＫ、ＰＤ及び免疫原性がある。化学的部分のタンパク質への結合は、その
循環中の半減期を有意に増加できる(Jevsevar et al., Biotechnol. J., 5: 113-128 (20
10))。糸球体濾過限界より下の分子量を有する分子では、分子量の大きな部分の共役は、
製品の腎クリアランスを妨げる。また、化学的部分の薬剤製品への付加は、立体障害によ
り分子のレセプターによる除去を妨げてしまう。
【０００５】
幾つかの市販されている生物薬剤製品に使用されている生体適合性ポリマーの例として
は、ポリエチレングリコール（本明細書中ではＰＥＧとも称する）がある。ＰＥＧ分子を
他の分子に共有結合させるプロセスは、ＰＥＧ化(PEGylation)と称する。今日まで、９個
のＰＥＧ化製品がＦＤＡでマーケット認可がおり、４つがブロックバスター薬剤(blockbu
ster drug)：PegIntron（登録商標）(Schering-Plough)、Pegasys（登録商標）(Hoffman-
La Roche)、Neulasta（登録商標）(Amgen)及びMicera（登録商標）(Hoffman-La Roche)で
ある。多くの異なる化学物質が、タンパク質治療剤を活性化ＰＥＧ分子に共役するのに使
用されてきた。ランダムＰＥＧ化を用いて、タンパク質のアミノ基を介してタンパク質に
ＰＥＧ部分を共有結合するのに成功した。結合部位は、もっとも頻繁に（ただし、これに
限られない）、リジン残基の側鎖のε−アミノ基であった。このようなランダムな反応に
より、ＰＥＧ分子の結合数や部位が様々である共役体の非常に複雑な混合物が生産できる
。ランダムな共役反応物の精製後であっても、位置異性体が存在してしまい、これにより
、非常に異なる物理化学的及び薬剤特性を示す。多くの部位特異的ＰＥＧ化技術が開発さ
れ、現在、より良好に規定されたバイオ医薬品を生産するのに利用されている。部位特異
的ＰＥＧ化を行うのに使用されるアプローチとしては、Ｎ−末端、システイン、グリカン
、ジスルフィド及びポリヒスチジン標的ＰＥＧ化(N-terminal, cysteine, glycan, disul
phide and poly-histidine targeted PEGylation)がある。
【０００６】
組換ＦＶＩＩａのＰＥＧ化における状況は、様々な特許や特許出願に記載される。
【０００７】
ＷＯ  ９８／３２４６６には、ＦＶＩＩがＰＥＧ化される可能性が示唆されているが、
さらなる情報はない。
【０００８】
ＵＳ  ２００８／０２００６５１には、人工的に導入されたシステイン残基を介して共
役したＰＥＧ分子を有する野生型の、または活性の増加したＦＶＩＩポリペプチドがイン
ビボでの半減期が増加したことが示唆される。
【０００９】
ＵＳ  ２００８／０２２１０３２には、インビボでの半減期が有意に増加した分子を生
じるＦＶＩＩａ−ポリシアル酸共役体の生産が記載される。
【００１０】
ＵＳ  ２００９／０１７６９６７には、酵素がＰＥＧ等の生体適合性ポリマーが共役す
るＦＶＩＩポリペプチドのＣ末端に特定の官能基を導入するのに使用できることが示唆さ
れる。
【００１１】
ＵＳ  ２００９／０２２７５０４には、血清中の半減期が改善した１以上のアスパラギ
ン−および／またはセリン−連結オリゴ糖鎖が少なくとも１つの重合性基で共有結合によ
り修飾される(covalently modified)ＦＶＩＩａ（またはＦＶＩＩａ様分子）の調製が記
載される。
【００１２】
ＵＳ  ２０１０／００２８９３９には、天然の糖タンパク質を、酵素であるガラクトー
スオキシダーゼを用いて修飾して、グリカンの末端に反応性アルデヒド機能性を生成させ
る方法が記載される。この反応性アルデヒドを、さらに用いて、重合性部分をタンパク質
に共役させて、薬理学的特性が向上した製品を製造できる。
【００１３】
ＵＳ  ２０１０／００５６４２８には、グリコシル基でのＰＥＧ等の重合性部分のオキ
シムによる糖タンパク質の誘導化によって、ＦＶＩＩａで薬物動態特性の向上が達成でき
ることが示唆される。
【００１４】
ＵＳ  ２０１０／００９３９３４には、重合性分子の血液凝固因子への共役が、まず凝
固因子をタンパク質への親和性を有する１つのモノクローナル抗体、または複数のモノク
ローナル抗体に結合させた後、活性化ポリマーと反応させることによって標的化できるこ
とが指摘される。
【００１５】
ＵＳ  ２０１０／００９９６１６には、ＦＶＩＩａ等の、血液因子が、これに共役する
少数（１〜９個）の水溶性ポリマーを用いて製造できる方法が記載される。しかしながら
、著者は、この方法によって製造されるＰＥＧ化ＦＶＩＩａの薬理的な特性を具体的に記
載していない。
【００１６】
タンパク質のＰＥＧ化の他のアプローチは、Polythericsによって開発され、ＰＥＧポ
リマーをタンパク質の１対のシステイン残基の還元ジスルフィド結合を介して有用なタン
パク質に結合したTheraPEG（商標）として知られている（ＷＯ  ２００５／００７１９７
）。この技術を用いることにより、第ＦＩＸａ因子の混入のない第ＩＸ因子のＰＥＧ化形
態を調製した（ＷＯ  ２００９／１３０６０２）。
【発明の概要】
【００１７】
しかしながら、ＦＶＩＩａのＰＥＧ化にこれと同じ技術を使用することに関しては、さ
さいであるまたは自明である(trivial or routine)とは考えられなかった。
【００１８】
血液凝固系のタンパク質は止血の点で共通目的を有するものの、上記は全て、TheraPEG
（商標）技術がこれらのすべての半減期や免疫原性プロフィールを向上するのに自明な経
路を提供すると考えることは適切でないという点で、非常に異なるように作用する。
【００１９】
ＦＩＸに関するＦＶＩＩａの活性の点からは、タンパク質と生体適合性ポリマーとの共
役が容易な工程ではない特定のカギとなる相違が存在する。
【００２０】
例えば、ＦＩＸ及びＦＩＸａは内因性の凝固カスケードに関与するが、ＦＶＩＩａは外
因性のカスケードに主に関与する。ＦＩＸは、活性化されると、凝固カスケードに参加す
るために、コファクター、ＦＶＩＩＩと会合を形成するのを必要とするのみである。これ
に対して、ＦＶＩＩａは、組織因子（Ｔｆ）の存在下で凝固を誘発するのみであり、ＦＶ
ＩＩａが凝固で活性であっても、Ｔｆへの結合能を有する必要があり、また、ペプチド切
断を行うのに使用できる活性部位を有する必要がある。TheraPEG（商標）を用いたＦＶＩ
Ｉａの理論的なＰＥＧ化は、タンパク質がＴｆに結合し、活性部位を立体的に妨げる能力
に影響を与えるであろうと考えられた。生物活性に関する他の相違としては、ＦＩＸａが
もともと免疫原性であるのに対して、ＦＶＩＩａはそうではないことがある。
【００２１】
ＦＶＩＩａは、活性化血小板と直接相互作用することによって、凝固を誘発できる。こ
の特定のプロセスは、あまり理解されていないが、さらなるレセプター部位の会合(furth
er receptor site association)を含む。この効果に対して、ＦＶＩＩａは、原則、その
標的部位との相互作用の３つの部位を必要とし、これらはすべてＰＥＧ化によって破壊さ
れうる。したがって、第ＶＩＩａ因子のＰＥＧ化は、ＦＩＸとは異なる様々な独特な異な
るチャレンジを提示する。
【００２２】
にもかかわらず、非修飾のＦＶＩＩａまたは当該分野において既知の他の修飾されたＦ
ＶＩＩａ治療剤と比較して、機能活性は維持しつつ、インビボでのＦＶＩＩａの半減期が
のびるように、生体適合性ポリマーが部位特異的にポリペプチドに共役してなる改良され
たＦＶＩＩａ分子に対して必要性が依然としてある。
【００２３】
組換ＦＶＩＩａの薬理学的な特性を、ＦＶＩＩａを１以上の生体適合性ポリマーに共役
することによって促進することを発見した。薬理学的な特性の向上としては、非共役ＦＶ
ＩＩａに比べて、インビボでの循環中の半減期の増加がある。
【００２４】
本発明の第一の態様によると、１以上のシステイン残基を介してＦＶＩＩａに共役した
生体適合性ポリマーが提供される。
【００２５】
生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコール及びプロピレ
ングリコールの共重合体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリオキシエチル化ポリオ
ール、ポリオレフィンアルコール(polyolefinic alcohol)、ポリヒドロキシアルキルメタ
クリレート、ポリサッカライド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポ
リホスホスファスファゼン(polyphosphosphasphazene)、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルフ
ォリン）、ポリアルキレンオキシドポリマー(polyalkyene oxide polymers)、ポリマレイ
ン酸、ポリ（ＤＬ−アラニン）、カルボキシメチルセルロール、デキストラン、デンプン
またはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン、ポリメタクリレート、ポリシアル酸（Ｐ
ＳＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxy alkanoates)、ポリアミノ酸および
これらの組み合わせからなる群より選択されうる。生体適合性ポリマーは、直鎖または分
岐鎖の構造を有していてもよい。
【００２６】
さらなる実施形態においては、生体適合性ポリマーは、以下に制限されないが、ＦＶＩ
Ｉ、アルブミン、トランスフェリン、モノクローナル抗体、抗体断片、例えば、単一ドメ
イン抗体、ＶＬ、ＶＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｄｉ
−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆｃ及びこれらの組み合わせ等の免疫グロブリンからなる群より
選択されるタンパク質である。
【００２７】
１以上の生体適合性ポリマーが、必要であれば１以上のシステイン残基を介して各ＦＶ
ＩＩａ分子に共役してもよい。遊離システイン残基は、システインジスルフィド結合の結
果である。本発明の生体適合性ポリマーは、１以上の還元システインジスルフィド結合を
介してＦＶＩＩａに共役してもよい。共役は、ＦＶＩＩａでジスルフィド結合を形成した
２個のシステイン残基の硫黄残基を架橋するリンカー基によるものであってもよい。ゆえ
に、ジスルフィド結合は、天然のジスルフィド結合であってもまたは組換により導入され
たジスルフィド結合であってもよい。
【００２８】
生体適合性ポリマーがＰＥＧ分子である場合には、これは、適当な分子量、例えば、５
〜１００ｋＤａ、１０〜５００ｋＤａ、好ましくは５〜３０ｋＤａまたは１０〜３０ｋＤ
ａを有していてもよい。適当な分子量としては、１０、２０、または３０ｋＤａがある。
【００２９】
ＦＶＩＩａとの共役体を形成するであろうポリエチレングリコールポリマーはいくつか
の異なるタイプがある。単一ポリエチレングリコール鎖を有する直鎖のＰＥＧポリマーが
あり、分岐鎖のまたは分岐した(multi-arm)ＰＥＧポリマーがある。分岐鎖のポリエチレ
ングリコールは、統一基(unifying group)を介して一緒に結合する２以上の別の直鎖のＰ
ＥＧ鎖を含む。例えば、２個のＰＥＧポリマーがリジン残基によって一緒に結合してもよ
い。一方の直鎖のＰＥＧ鎖がα−アミノ基に結合し、他方のＰＥＧ鎖がε−アミノ基に結
合する。リジンコアの残りのカルボキシル基は、タンパク質に共有結合するために利用可
能な状態で残っている。双方の直鎖及び分岐鎖のポリエチレングリコールポリマーはある
範囲の分子量で市販されている。
【００３０】
本発明の一態様では、ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は、ＦＶＩＩａに結合した１以上の直
鎖のポリエチレングリコールポリマーを含み、この際、各ＰＥＧは、約２ｋＤａ〜約１０
０ｋＤａの分子量を有する。本発明の他の態様では、ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は、ＦＶ
ＩＩａに結合した１以上の直鎖のポリエチレングリコールポリマーを含み、この際、各直
鎖のＰＥＧは、約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては
、各直鎖のＰＥＧは、約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態に
おいては、各直鎖のＰＥＧは、約２０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態において
は、各直鎖のＰＥＧは、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。特定の実施形態においては
、ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体が１超のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩａに結合してなる場合に
は、例えば、２、３、または８個までの直鎖のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩａに結合する。
実施形態によっては、ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は複数の直鎖のＰＥＧポリマーを含み、
この際、各直鎖のＰＥＧは約１０〜３０ｋＤａの分子量を有する。
【００３１】
本発明のＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は１以上の分岐鎖のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩａに
結合してなっていてもよく、この際、各分岐鎖のＰＥＧは約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの
分子量を有する。本発明の他の態様では、ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は１以上の分岐鎖の
ＰＥＧポリマーがＦＶＩＩａに結合してなっていてもよく、この際、各分岐鎖のＰＥＧは
約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のＰ
ＥＧは、約５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分
岐鎖のＰＥＧは、約２０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖
のＰＥＧは、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する。特定の実施形態においては、ＦＶＩＩ
ａ−ＰＥＧ共役体が１超のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩａに結合してなる場合には、例えば
、２、３、または８個までの分岐鎖のＰＥＧポリマーがＦＶＩＩａに結合する。実施形態
によっては、ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は８個以下の直鎖のＰＥＧポリマーを含み、この
際、各分岐鎖のＰＥＧは約１０〜３０ｋＤａの分子量を有する。
【００３２】
ＦＶＩＩａ−ＰＥＧ共役体は、以下に制限されないが、イオン交換クロマトグラフィー
及びサイズ排除クロマトグラフィー等の当該分野において既知のクロマトグラフィー方法
、アフィニティクロマトグラフィー、沈殿および膜を用いた分離 (membrane-based separ
ation)によって精製されてもよい。
【００３３】
好ましくは、ＦＶＩＩａ共役体生体適合性ポリマー部分は、２個のシステイン残基に結
合してもよく、これによりＦＶＩＩａにジスルフィド結合を形成する。ゆえに、リンカー
を含むＰＥＧはジスルフィド結合を架橋する。このような共役方法の例は、ＷＯ  ２００
５／００７１９７、ＷＯ  ２００９／０４７５００及びＷＯ  ２０１０／０１０３２４に
記載される。
【００３４】
本発明の一実施形態においては、生体適合性ポリマーは、図２に示されるスキームに従
ってＦＶＩＩａに共役できる。図２では、基Ｒ１が生体適合性ポリマー及びＦＶＩＩａ分
子のジスルフィド結合の硫黄原子を結ぶリンカー基の間に示される。
【００３５】
Ｒ１は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、または置換
されてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基でありうる置換基であり；この際、ア
リール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基があり；適当なヘテロアリ
ール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オ
キサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加水分解
により不安定になる結合(hydrolytically labile bond)による、または安定な結合(nonla
bile bond)によるものである。
【００３６】
置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基として
は、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−Ｏ
Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲ
ＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ
＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２
、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び
１３Ｃ＝ＣＨＲ（この際、ＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、水素原子またはアルキル基
（好ましくはＣ１−６）またはアリール（好ましくはフェニル）基を表わす）から選択さ
れる１以上の同一または異なる置換基が挙げられる。電子求引性置換基の存在が特に好ま
しい。一実施形態においては、Ｒ１の置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール
基としては、Ｒ１ユニットを生体適合性ポリマーに連結するアミド（ＮＨＣＯ）基で置換
されたアリール基またはヘテロアリール基がある。
【００３７】
ゆえに、ＦＶＩＩａのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合の２個の硫黄原子間
のリンカー基は、３−炭素架橋を有していてもよい。一実施形態においては、ＦＶＩＩａ
のシステイン残基間のもとのジスルフィド結合の２個の硫黄原子間のリンカー基は、（Ｃ
Ｈ２）２ＣＨＣ（Ｏ）−である。
【００３８】
本発明の一実施形態においては、生体適合性ポリマーは上記したようにして共役しても
よく、この際、ＦＶＩＩａが生体適合性ポリマーに共役してなる組成物は下記構造を有す
る：
【００３９】
【化１】
2015110636.tif 000002
【００４０】
本発明の最も広義な意味では、試薬は下記のように表されうる：
【００４１】
【化２】
2015110636.tif 000003
【００４２】
ただし、Ｒ１は、上記したのと同様の定義であり、およびＬは、脱離基である。
【００４３】
Ｌは、−ＳＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＯＳＯ２Ｒ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ
、ハロゲン（例えば、フッ素または塩素）、または−ＯＷを表わしてもよく、この際、各
Ｒは独立して水素原子またはアルキル基（例えば、Ｃ１−６アルキル基）またはアリール
基（例えば、フェニル基）を表わし、Ｗは、少なくとも１個の電子求引性置換基、例えば
、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−ＯＲ、−ＯＣ
ＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲＣＯＲ、−
ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ
ＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２、−Ｎ＋Ｈ
２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び１３Ｃ＝Ｃ
ＨＲ（この際、ＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、水素原子またはアルキル基（好ましく
はＣ１−６）を表わす）から選択される１以上の同一または異なる置換基を含む置換され
たアリール基（例えば、フェニル基）を表わす。
【００４４】
一実施形態においては、脱離基ＬがＳＯ２Ｒ２（この際、各Ｒ２は独立して水素原子ま
たはアルキル基（例えば、Ｃ１−６アルキル基）またはアリール基（例えば、フェニル基
）を表わす）であり、Ｒ１は、上記したのと同様の定義である場合には、共役試薬は、下
記式を有する。
【００４５】
【化３】
2015110636.tif 000004
【００４６】
一実施形態においては、生体適合性ポリマーはＰＥＧであってもよく、脱離基は−ＳＯ２
Ｒ２であってもよく、この際、Ｒ１及びＲ２は上記と同様の定義であり、試薬は下記のと
おりである：
【００４７】
【化４】
2015110636.tif 000005
【００４８】
本発明の他の実施形態においては、共役試薬は、生体適合性ポリマーがアミド部分（Ｃ
ＯＮＨ）を介して連結する特定の配列から形成されてもよく、この際、Ｌは上記と同様の
定義の脱離基である。換言すると、Ｒ１はＲ３−ＣＯＮＨであり、試薬は下記式を有する
：
【００４９】
【化５】
2015110636.tif 000006
【００５０】
Ｒ３は、直接結合、アルキレン基（好ましくはＣ１−１０アルキレン基）、または置換
されてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基であってもよい置換基を表わし；この
際、アリール基としては、フェニル基、ベンゾイル基及びナフチル基があり；適当なヘテ
ロアリール基としては、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾー
ル、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンがあり；ポリマーへの連結は、加
水分解により不安定になる結合(hydrolytically labile bond)による、または安定な結合
(nonlabile bond)によるものである。
【００５１】
置換されてもよいアリール基またはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基として
は、例えば、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＲ、−Ｏ
Ｒ、−ＯＣＯＲ、−ＯＣＯ２Ｒ、−ＳＲ、−ＳＯＲ、−ＳＯ２Ｒ、−ＮＨＣＯＲ、−ＮＲ
ＣＯＲ、−ＮＨＣＯ２Ｒ、−ＮＲ’ＣＯ２Ｒ、−ＮＯ、−ＮＨＯＨ、−ＮＲ’ＯＨ、−Ｃ
＝Ｎ−ＮＨＣＯＲ、−Ｃ＝Ｎ−−ＮＲ’ＣＯＲ、−Ｎ＋Ｒ３、−Ｎ＋Ｈ３、−Ｎ＋ＨＲ２
、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、−Ｃ≡ＣＲ、−Ｃ＝ＣＲ２及び
１３Ｃ＝ＣＨＲ（この際、ＲまたはＲ’はそれぞれ独立して、水素原子またはアルキル基
（好ましくはＣ１−６）またはアリール（好ましくはフェニル）基を表わす）から選択さ
れる１以上の同一または異なる置換基が挙げられる。電子求引性置換基の存在が特に好ま
しい。
【００５２】
部分ＣＯＮＨが存在し、Ｒ２及びＲ３が上記と同様の定義であり、脱離基が−ＳＯ２Ｒ
２である一実施形態においては、試薬は下記のとおりである。
【００５３】
【化６】
2015110636.tif 000007
【００５４】
共役試薬の上記と同様の定義のＲ１における置換されてもよいアリールまたはヘテロア
リール基がアミド（ＮＨＣＯ）基によってアリールまたはヘテロアリール基を含むこのよ
うな実施形態においては、Ｒ３が上記と同様の定義である共役タンパク質の構造は下記の
とおりになりうる：
【００５５】
【化７】
2015110636.tif 000008
【００５６】
生体適合性ポリマーがＰＥＧである場合には、ＰＥＧがポリエチレン部分であり、Ｌが
上記した定義と同様の脱離基である、本発明の本実施形態における共役試薬は、下記のと
おりである：
【００５７】
【化８】
2015110636.tif 000009
【００５８】
反応条件が中性または若干塩基性である場合には、下記試薬が使用されうる：
【００５９】
【化９】
2015110636.tif 000010
【００６０】
より酸性な条件下では、上記試薬は下記に示される下記分子、ＰＥＧモノ−スルホンを
形成してもよく、これはまた本明細書に記載されるような共役反応に使用されるのに適す
る。
【００６１】
【化１０】
2015110636.tif 000011
【００６２】
本明細書中で使用される、「第ＶＩＩａ因子共役体」または「ＦＶＩＩａ共役体」とい
うことばは、未修飾の第ＶＩＩａ因子に比して薬物動態特性を向上できる生体適合性ポリ
マー部分を含むように修飾された第ＶＩＩａ因子を意味する。薬物動態特性の向上は、下
記パラメーターの１以上の向上として観察されうる：活性、安定性、濃度曲線下面積(are
a under the curve)および循環半減期(circulating half-life)。
【００６３】
第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）及び第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）はまた、特記しない限り
同義で使用される。加えて、本発明は、具体的には、ＦＶＩＩへの生体適合性ポリマーの
共役、次にＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化を包含する。
【００６４】
第ＶＩＩａ因子は、いずれの源由来であってもよい。第ＶＩＩａ因子は、組換ＤＮＡ技
術を用いて生産されても、または血漿から精製されてもよい。第ＶＩＩａ因子は、その活
性断片または突然変異タンパク質を包含する。
【００６５】
本明細書中で使用される、「突然変異タンパク質(mutein)」ということばは、もとのＦ
ＶＩＩａと比較して得られた産物の活性を顕著に変化させることなく、ＦＶＩＩａの天然
成分の１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換される、または欠失する、ある
いは１以上のアミノ酸残基がＦＶＩＩａのもとの配列に付加する、ＦＶＩＩａタンパク質
の類似体を意味する。これらの突然変異タンパク質は、既知の合成法によっておよび／ま
たは部位特異的突然変異誘発技術によって、または上記に適切な他の既知の技術によって
調製される。
【００６６】
本発明に係る突然変異タンパク質は、ストリンジェントな条件下で、本発明に係る、Ｆ
ＶＩＩａをコード化する、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ等の、核酸によってコード化されるタンパク質を包含する。「ストリンジェントな条件
」ということばは、ハイブリッド形成及び次の洗浄条件を意味し、当業者はこれを従来「
ストリンジェント」と称する(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biolog
y, Interscience, N.Y., sections 63 and 6.4 (1987, 1992); Sambrook et al. (Sambro
ok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989))。
【００６７】
下記に制限されるものではないが、ストリンジェントな条件としては、研究対象のハイ
ブリッドの計算上のＴｍ未満より１２〜２０℃低い洗浄条件、例えば、５分間、２×ＳＳ
Ｃ及び０．５％ＳＤＳ、１５分間、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ；３７℃で３０〜６０
分間、０．１倍ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳおよびその後６８℃で３０〜６０分間、０．１
×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中での洗浄条件がある。当業者は、ストリンジェントな条件
は、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基等）またはオリゴヌクレ
オチドプローブ混合物の長さによっても異なることは理解している。プローブ混合物を使
用する場合には、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使
用することが好ましい。
【００６８】
このような突然変異タンパク質は、ＦＶＩＩａと実質的に同様の活性、またはＦＶＩＩ
ａより高い活性を有するように、ＦＶＩＩａの配列と十分重複したアミノ酸配列を有する
ことが好ましい。
【００６９】
ＦＶＩＩａの特徴的な活性の一つとしては、血液凝固カスケードへの参加能があり、Ｆ
ＶＩＩａ活性を検出するためのアッセイは本明細書に記載される。突然変異タンパク質が
かなりのＦＶＩＩａ活性を有する限り、これはＦＶＩＩａと実質的に同様の活性を有する
と考えられうる。ゆえに、このような突然変異タンパク質を本明細書に記載されるアッセ
イにかけることを有する定常的な実験によって、所定の突然変異タンパク質が少なくとも
実質的にＦＶＩＩａと同じ活性を有するかどうかを決定できる。
【００７０】
好ましい実施形態においては、このような突然変異タンパク質は、ＦＶＩＩａのアミノ
酸配列と少なくとも４０％の同一性(identity)または相同性(homology)を有する。より好
ましくは、ＦＶＩＩａのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくと
も７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％、９５％若しくは
９９％の同一性(identity)または相同性(homology)を有する。
【００７１】
同一性(identity)は、配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド
配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。通常、同一性は、比較す
る配列の長さにわたって、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド
配列の精密なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸の対応(exact nucle
otide to nucleotide or amino acid to amino acid correspondence)を意味する。
【００７２】
正確な対応が存在しない配列では、「同一性（％）」が測定される。通常、比較される
２つの配列を、配列間にの最大の相関性があるように並べる。これは、アライメントの度
合いを上げるために、１つまたは２つの配列中に「ギャップ」を挿入することを含んでも
よい。同一性（％）は、比較されるそれぞれの配列の全長にわたって測定されてもよく（
いわゆる、グローバルアライメント）、これは同じまたは非常に同様の長さの配列に特に
適切である、またはより短い所定の長さにわたって測定されてもよく（いわゆる、ローカ
ルアライメント）、これは長さが異なる配列により適切である。
【００７３】
２以上の配列の同一性または相同性を比較する方法は当該分野において既知である。ゆ
えに、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux, et al.
, Nucleic acids Research, 12: 387 (1984))で利用できるプログラム、例えば、プログ
ラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の同一性（％）なら
びに２つのポリペプチド配列間の同一性（％）及び相同性（％）を測定してもよい。ＢＥ
ＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2; 482-489 (1
981))の「ローカルホモロジー(local homology)」アルゴリズムを使用し、２つの配列間
で類似する最も良好な単一の領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性(simil
arity)を測定する他のプログラムもまた当該分野において既知であり、例えば、プログラ
ム(Atschul et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990), www.ncbi.nlm.nih.govのNCBI
のホームページでアクセス可能)のＢＬＡＳＴファミリーやＦＡＳＴＡ(Pearson W R, Met
hods in Enzymology, 183: 63-98 (1990))がある。
【００７４】
本発明に従って使用できるＦＶＩＩａの突然変異タンパク質としては、本明細書に提示
される示唆や助言に基づいて、過度の実験を必要とすることなく、当業者によって定常的
に得られる置換ペプチドとして実質的に相当する配列の有限なセットがある。
【００７５】
本発明に係る突然変異タンパク質の好ましい変更は、「同類」置換("conservative" su
bstitution)として知られているものがある。ＦＶＩＩａの同類アミノ酸置換は、グルー
プのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するような十分に同様の生化学的特性
を有するグループ内の同義的アミノ酸を含む。アミノ酸の挿入及び欠失はまた、特に挿入
または欠失が数個のアミノ酸、例えば、３０個以下、好ましくは１０個以下を含み、機能
的な立体配置(functional conformation)に重要なアミノ酸、例えば、システイン残基を
除去または置換(displace)しない場合には、その機能を変えることなく上記配列中でなさ
れてもよいことは明らかである。このような欠失および／または挿入によって生産された
タンパク質及び突然変異タンパク質は本発明の範囲に含まれる。
【００７６】
ゆえに、アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、
しばしば他のアミノ酸（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）に置換されてもよい。これらの可
能性のある置換のうち、（比較的短い側鎖を有するので）グリシン及びアラニンを相互に
置換しあって使用すること、および（疎水性のより大きな脂肪族側鎖を有するため）バリ
ン、ロイシン及びイソロイシンを相互に置換しあって使用することが好ましい。しばしば
相互に置換しあうことができる他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン及び
トリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニン及びヒスチジン（
塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩（酸性側鎖を有す
るアミノ酸）；アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）ならびにシ
ステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）がある。このような置換は、
しばしば、「同類」または「半同類」アミノ酸置換と称する。
【００７７】
本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸変更は、適当な技術を用いることによ
って、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いることによって、なされる。
【００７８】
本発明の範囲に含まれるアミノ酸置換または挿入が天然のまたは非天然のアミノ酸を用
いてできることは理解されるべきである。天然のまたは合成アミノ酸を使用するか否かに
かかわらず、Ｌ−アミノ酸のみが存在することが好ましい。
【００７９】
加えて、ＦＶＩＩａ及び他のペプチドまたはタンパク質断片を有する融合タンパク質は
また、融合タンパク質がＦＶＩＩａの活性を保持する場合には使用されてもよい。本明細
書における「融合タンパク質」ということばは、一般的な意味では、水素結合または塩架
橋(salt bridge)等の化学的な手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチド結
合によってまたは双方によって、１以上のタンパク質が一緒に結合していることを意味す
る。
【００８０】
本明細書中で使用される「機能的誘導体(functional derivative)」ということばは、
ＦＶＩＩａの誘導体、及びこれらの突然変異タンパク質を包含し、これらは、当該分野に
おいて既知の手段によって、残基の側鎖として生じるまたはＮ−若しくはＣ−末端基への
付加である官能基から調製されてもよく、製薬上許容できる限り、即ち、ＦＶＩＩａの活
性と実質的に同等であるタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を付与し
ない限り、本発明に包含される。
【００８１】
これらの誘導体としては、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとの
または第１級若しくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分
（例えば、アルカノイル基またはカルボキシルアロイル(carboxylic aroyl)基）を用いて
形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または例えば、使用できるヒ
ドロキシル基のグリコシル化等の、アシル部分を用いて形成される遊離ヒドロキシル基の
Ｏ−アシル誘導体（例えば、セリルまたはトレオニル残基の誘導体）がある。
【００８２】
本発明に係る「ＦＶＩＩａの活性断片」は、本明細書に記載されるようなＦＶＩＩａの
断片または突然変異タンパク質であってもよい。「断片」ということばは、分子のサブセ
ット、即ち、所望の生物学的活性を保持するより短いペプチドを意味する。断片は、ＦＶ
ＩＩａ分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片について本明細書に記
載される性質を試験することによって容易に調製されうる。ポリペプチドのＮ−末端また
はＣ−末端のいずれかから一度に１個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは知られ
ており、所望の生物学的活性を保持する、断片を決定することは、定常的な実験を含むの
みである。
【００８３】
ＦＶＩＩａの活性画分、その突然変異タンパク質及び活性断片として、本発明は当該画
分がＦＶＩＩａと実質的に同等の活性を有する場合には、タンパク質分子のポリペプチド
鎖の断片若しくは前駆体単独、または前記タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片若しく
は前駆体がこれに連結した分子若しくは残基、例えば、糖またはホスフェート残基と会合
したもの、またはタンパク質分子の凝集体若しくは糖残基それ自体をさらに包含する。
【００８４】
本明細書における「塩」ということばは、ＦＶＩＩａ分子またはその類似体のカルボキ
シル基の塩およびアミノ基の酸付加塩双方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該分野
において既知の手段によって形成され、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アン
モニウム、鉄または亜鉛塩など、および例えば、トリエタノールアミン等のアミン、アル
ギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカイン等により形成される塩等の有機塩基との塩
が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、鉱酸、例えば、塩酸または硫酸との塩、およ
び有機酸、例えば、酢酸またはシュウ酸との塩が挙げられる。いうまでもなく、このよう
な塩は、本明細書に記載されるＦＶＩＩａの生物学的活性を保持している必要がある。
【００８５】
ＦＶＩＩａ共役体は、非共役ＦＶＩＩａに比べて、例えば、治療上の利点を提供しうる
。このような治療上の利点としては、以下に制限されないが、循環半減期の増加、免疫原
性の減少、活性の上昇、安定性の向上、濃度曲線下面積(area under the curve)の増加、
必要投与量の低減、および別の投与経路の可能性（例えば、皮下）が挙げられる。
【００８６】
未修飾ＦＶＩＩａに比べて、本発明のＦＶＩＩａ共役体は、未修飾ＦＶＩＩａに比べた
場合の、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ、クリアランス（ＣＬ）、半減期、血漿滞
留時間(plasma residence time)及びバイオアベイラビリティ等の、薬物動態特性の１以
上のパラメーターの向上を示しうる。
【００８７】
患者にペプチド薬剤を投与する際の本明細書で使用される「濃度曲線下面積(area unde
r the curve)」または「ＡＵＣ」は、０から無限大の時間の関数としての患者の体循環で
の薬剤の濃度を記載する濃度曲線下の全面積として規定される。本明細書中で使用される
、「クリアランス」または「腎クリアランス」ということばは、１分あたりに排出される
一定量の薬剤を含む血漿の容積として規定される。
【００８８】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される、「半減期」または「ｔ
１／２」ということばは、患者の薬剤の血漿濃度が半分に減少するのに必要な時間として
規定される。複数のクリアランスメカニズム、再分配、及び当該分野において既知の他の
メカニズムによってペプチド薬剤と関連する１つの半減期より大きくなる場合がある。一
般的に、アルファ相(alpha half-life)及びベータ相半減期(beta half-life)は、アルフ
ァ相が再分配に関連し、ベータ相がクリアランスに関連するように規定される。しかしな
がら、ほとんどで、血流に限定されるタンパク質薬剤では、少なくとも２種のクリアラン
ス半減期が存在しうる。アルファ相及びベータ相半減期へのＰＥＧ化の正確な影響は、当
該分野において既知であるように、大きさ及び他のパラメーターによって変化するであろ
う。「半減期」のさらなる説明は、Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommeli
n and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120)に見出される
。
【００８９】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される、「滞留時間(residence
time)」ということばは、薬剤が投薬後に患者の体内にとどまる平均時間として規定され
る。
【００９０】
患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される、「免疫原性」というこ
とばは、投薬後、または繰り返し投薬後の、薬剤の患者の免疫応答の誘発(illicit)しや
すさ(propensity)として規定される。
【００９１】
本発明によると、生体適合性ポリマーとのＦＶＩＩａの共役体は、薬剤組成物における
ＦＶＩＩａの利用可能性を促進する。さらに、生体適合性部分は、ＦＶＩＩａを分解及び
抗体反応から保護しうる。ＦＶＩＩａ共役体は、循環半減期を延ばし、これにより、投与
量の節約効果が得られ、投与回数を減少できる。
【００９２】
上述したように、ＰｏｌｙＴｈｅｒｉｃｓは、部位特異的ＰＥＧ化を目的としてタンパ
ク質中の天然の硫黄原子の選択的化学を利用できるTheraPEGTMとして知られる、技術を開
発した。この技術はまた、新規な硫黄含有基が予め組換または他の手段によって導入され
たタンパク質及びペプチドに適用できる。ＰｏｌｙＴｈｅｒｉｃは、ジスルフィド結合が
ＰＥＧ連結炭素架橋の付加によってより安定にできること、および３次元構造を保持しか
つタンパク質の機能を維持しつつタンパク質中のジスルフィド結合へのこのような修飾を
行うことが可能であることを示した。これにより、初めて、ジスルフィド結合を形成して
、天然のまたは選択的に操作されたタンパク質において部位特異的に有益なタンパク質に
生体適合性ポリマーを共役する２個の硫黄原子の共役チオール選択性を利用できるように
なった。一例としては、ＰＥＧ部分をＦＶＩＩａタンパク質に付加する（またはＦＶＩＩ
ａを「ＰＥＧ化する」）技術を使用することがこのアプローチのものである。
【００９３】
ジスルフィド架橋共役試薬は、相互作用ミカエル及びレトロミカエル反応(interactive
Michael and retro-Michael reaction)されることが可能である潜在的に交差共役する系
(latently cross-conjugated system)である。これにより、天然のジスルフィド基の還元
によって生成した２個の遊離チオールが、もとのジスルフィド結合の２個の硫黄基を連結
する３−炭素架橋を介して再アニールすることができる（例えば、ＰＥＧ部分を付加する
共役反応の概略図に関する図２を参照）。共役試薬は、ＦＶＩＩａタンパク質をＰＥＧ化
するのに使用される生体適合性ポリマーとしてＰＥＧを含む場合には、「ＰＥＧ化」試薬
として記載されてもよい。
【００９４】
機構的に、共役試薬の共役二重結合は、特定の配列の付加反応を開始する必要がある。
チオレート付加(thiolate addition)が起こると、残っているスルフィン酸部分が除去で
きる。これにより、第二のチオレートアニオンの付加及び２個の硫黄原子間の３−炭素架
橋の形成のための別の共役二重結合が生成する。最終産物は、炭素架橋のいずれかの側に
２個の非常に安定なチオール−エーテル結合である。
【００９５】
TheraPEGTM技術を用いるＦＩＸのＰＥＧ化が成功したという事実は、構造的及び機能的
に異なるタンパク質であるため、同様のアプローチを用いてＰＥＧ化したＦＶＩＩａを調
製するのを成功するあるいはその反対の指針にはならない。したがって、TheraPEGTM技術
を用いて調製されたＰＥＧ化ＦＶＩＩａがインビボ実験で非常にうまくいくことは非常に
驚くべきことである。
【００９６】
さらに、最初のインビトロ終点凝結アッセイ(initial in vitroend-point coagulation
assay)の実施から、ＦＶＩＩａの複数の会合要件に関する上記問題は活性が低いために
見つかったことが示唆された。本発明者らに、驚くべきことに、「標準」ＦＶＩＩａ活性
アッセイが活性の過小評価を生じさせ、ゆえに研究がインビボ実験で進行したという自信
を与えたのは異なるレートによるアッセイの使用によるのみであった。
【００９７】
本発明の第二の態様によると、本発明の第一の態様に関連して規定された１以上のシス
テイン残基を介して生体適合性ポリマーがＦＶＩＩａに共役してなる薬剤組成物が提供さ
れる。
【００９８】
本発明の薬剤組成物は、さらに製薬上許容できる希釈剤、アジュバントまたは担体を含
んでもよい。
【００９９】
経口投与に適用される薬剤組成物は、カプセル等の不連続単位として、溶液、シロップ
または懸濁液（水性若しくは非水性液体における；または食用発泡体若しくはホイップと
して；またはエマルジョンとして）提示されてもよい。錠剤または硬質ゼラチンカプセル
に適する賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステア
リン酸またはその塩などが挙げられる。軟質ゼラチンカプセルと一緒に使用するのに適す
る賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液状ポリオールな
どが挙げられる。溶液及びシロップの調製では、使用されうる賦形剤としては、例えば、
水、ポリオール及び糖が挙げられる。懸濁液の調製では、油（例えば、植物油）を使用し
て、水中油型または油中水型懸濁液を形成してもよい。
【０１００】
担体が固体である鼻腔内投与に使用される薬剤組成物は、鼻から吸い込むように、即ち
、鼻のそばに近づけた粉末の容器から鼻腔を介して急速吸入することによって、投与され
る例えば２０〜５００ミクロンの粒径を有する粗粉末を含む。鼻腔用スプレーとしてまた
は点鼻薬として投与されるための、担体が液体である適当な組成物は、活性成分の水性ま
たは油性溶液を含む。吸入用によって投与されるのに使用される薬剤組成物は、様々なタ
イプの定量加圧型のエアロゾル(metered dose pressurised aerosol)、ネブライザーまた
は吸入器によって生成する微粒子ダストまたはミストを含む。
【０１０１】
非経口投与に使用される薬剤組成物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び製剤を対
象となるレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含んでもよい水性及び非水性滅
菌注射溶液；ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含んでもよい水性及び非水性滅菌懸濁液が挙
げられる。注射溶液に使用されうる賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオー
ル、グリセリン及び植物油が挙げられる。本組成物は、１回投与用(unit-dose)または複
数回投与用(multi-dose)容器、例えば、密閉アンプル及びバイアル瓶に入れらえてもよく
、また、使用する直前に、滅菌液、例えば、注射用水を添加するだけでよいフリーズドラ
イ(凍結乾燥)状態で貯蔵されてもよい。即席の注射溶液及び懸濁液を滅菌粉末、顆粒及び
錠剤から調製してもよい。
【０１０２】
通常、薬剤組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤
、着臭剤、塩（本発明の物質はそれ自体が製薬上許容できる塩の形態で提供されてもよい
）、緩衝液、被覆剤または抗酸化剤を含んでもよい。本組成物はまた、本発明の物質に加
えて治療上活性のある薬剤を含んでもよい。本発明の薬剤組成物は、製薬上許容できる希
釈剤、アジュバント、または担体と組み合わせて使用されてもよい。このような賦形剤と
しては、以下に制限されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水）
、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせ
が挙げられる。
【０１０３】
本薬剤組成物は、例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、骨内、鼻腔内または他の経路
などによって、患者の病気を治療するのに有効な効果的な公知の方法で投与されてもよい
。治療でまたは予防として、活性剤を、注射可能な組成物として、例えば、滅菌水性分散
液、好ましくは等張液として患者に投与してもよい。
【０１０４】
哺乳動物、特にヒトに投与する場合には、活性剤の１日あたりの投与量は０．０１ｍｇ
／ｋｇ体重以上であり、具体的には約１ｍｇ／ｋｇ程度であると予想される。ともかく、
主治医が患者に最も適切であろう実際の投与量を決定するであろうし、これは患者の年齢
、体重、性別及び応答性等の因子によって異なるであろう。上記投与量は、平均的な症例
の具体例である。いうまでもなく、より高いまたはより低い投与量が好ましい場合もあり
、このような場合も本発明の範囲に含まれる。
【０１０５】
本発明の物質の投与量は、処置すべき病気または疾患、処置すべき患者の年齢や状態な
どに応じて、広範な上限下限で変化し、最終的には、主治医が使用するのに適切な量を決
定するであろう。
【０１０６】
この投与量は、必要に応じて頻繁に繰り返されてもよい。副作用が発症する場合には、
一般的な臨床でのプラクティスに従って、投与の量および／または頻度を減らしてもよい
。一実施形態においては、薬剤組成物を１〜１４日毎に１回投与してもよい。
【０１０７】
本発明の第三の態様によると、第二の態様の薬剤組成物及び他の薬剤活性のある物質が
提供される。上記他の薬剤活性のある物質は、ＦＶＩＩａの活性を促進するまたは向上さ
せるものであってもよく、例えば、他の血液凝固因子がある。
【０１０８】
本発明の薬剤組成物は、単独で、または治療用化合物若しくは分子、例えば、抗炎症剤
、鎮痛剤または抗生剤等の、他の化合物と組み合わせて使用されてもよい。このような他
の化合物との投与は、同時であっても、別個であってもまたは順次であってもよい。化合
物は、必要であれば指示書を含んでもよいキットの形態で調製されてもよい。
【０１０９】
好ましくは、本発明の薬剤組成物及び他の治療用化合物は、必要とする患者に直接投与
される。
【０１１０】
本発明はまた、本発明の薬剤組成物、および以下に制限されないが、経口投与用のカプ
セル、肺への投与用の吸入器及び静脈内投与用の注射溶液等の投与ベヒクルを含む部分の
キットを提供する。
【０１１１】
本発明の第四の態様によると、本発明の薬剤組成物を血液凝固疾患(blood clotting di
sease)または外傷(trauma)を治療する必要のある患者に投与することを有する血液凝固疾
患または外傷の治療方法が提供される。したがって、本発明の上記態様はまた、当該方法
におけるこのような組成物の使用を包含する。
【０１１２】
血液凝固疾患は、血液凝固因子の機能の欠損または自己抗体の生成によって生じる可能
性がある。血液凝固疾患の例としては、血友病Ａ、血友病Ｂがある。
【０１１３】
本明細書中で使用される、「治療(treatment)」ということばは、ヒトまたは非ヒト動
物に有益でありうるいずれのレジメをも包含する。「非ヒト動物」の治療は、ウマ及びコ
ンパニオンアニマル（例えば、ネコやイヌ）ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマ
科の動物等の農場／農業動物(agricultural animal)などの、家畜の治療にまで拡張され
る。治療は、現存の症状または疾患について行われても、または予防（予防的治療）を目
的としてもよい。治療は、遺伝病または後天的な疾患に対してであってよい。治療は、急
性または慢性の症状に対してであってよい。
【０１１４】
本発明の第五の態様によると、上記したような生体適合性ポリマー及びＦＶＩＩａの下
記の共役体の調製方法であって、
【０１１５】
【化１１】
2015110636.tif 000012
【０１１６】
（ａ）ＦＶＩＩａの２つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、２
つの遊離チオール基を生成し；
（ｂ）共役２重結合及び脱離基を有する共役試薬間の第一のチオレート導入付加反応(t
hiolate addition reaction)を行い；
（ｃ）脱離基を除去して、共役２重結合を生成し；さらに
（ｄ）第二のチオレート導入付加反応(thiolate addition reaction)を行い、２個の硫
黄原子間に３−炭素架橋を形成する
ただし、Ｒ１は、上記と同様の定義である、
ことを有する方法を提供する。
【０１１７】
このような方法において、共役試薬は、下記式を有していてもよい。
【０１１８】
【化１２】
2015110636.tif 000013
【０１１９】
ただし、Ｒ１は、上記と同様の定義であり、およびＬは、上記規定と同様の脱離基であ
る。
【０１２０】
本発明の上記実施形態のさらなる態様は、共役試薬の様々な構造に関して、上記したの
と同様である。
【０１２１】
上記と同様の定義である置換基Ｒ１及びＲ２を有する、使用できる共役試薬の一例とし
ては、下記がある。
【０１２２】
【化１３】
2015110636.tif 000014
【０１２３】
この際、脱離基は、上記定義と同様、ＳＯ２Ｒ２によって表されるスルフィニル基であ
る。
【０１２４】
生体適合性ポリマーがＰＥＧである際には、共役試薬は下記のとおりであってもよい（
上記と同様）。
【０１２５】
【化１４】
2015110636.tif 000015
【０１２６】
本発明の第二以降の好ましい態様は、必要であれば適宜修飾して、第一の態様と同様で
ある。
【０１２７】
ここで、本発明を下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は参考を目
的とし、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
本明細書及び実施例において、下記多くの図面を参照する。この際、
【図１】図１は、血液凝固カスケードを示す。略称：ＨＭＷＫ−高分子量キニノゲン(High Molecular Weight Kininogen)；ＰＫ−プレカリクレイン；ＰＬ−リン脂質。
【図２】図２は、共役試薬の一例としてＰＥＧ化試薬を使用するジスルフィドに特異的なバイオポリマー共役化学(disulphide-specific biopolymer conjugation chemistry)に係る工程を示す(Shaunak et al. in Nat Chem Biol. 2006; 2(6):312-313から)。
【図３（ａ）】図３は、ＤＴＴ（パネルＡ）またはＴＣＥＰ／ＳｅＣｙｓ（パネルＢ）による還元後のＦＶＩＩａを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３（ｂ）】図３は、ＤＴＴ（パネルＡ）またはＴＣＥＰ／ＳｅＣｙｓ（パネルＢ）による還元後のＦＶＩＩａを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】図４は、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａの精製ＰＥＧ化反応混合物（レーン３〜５）を示すクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＦＶＩＩａはレーン１に示され、還元ＦＶＩＩａはレーン２に示される。
【図５】図５は、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ及び３０ｋＤａの精製モノ−ＰＥＧ化ＦＶＩＩａを示す銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６】図６は、ＰＴ凝固アッセイに係る工程の概略図を示す。矢印は、トロンビンによる増幅事象を示す。略称：ＨＭＷＫ−高分子量キニノゲン(High Molecular Weight Kininogen)；ＰＫ−プレカリクレイン；ＰＬ−リン脂質。
【図７】図７は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ（小スケール）の凝固時間の濃度依存性減少を示す。緩衝液（キット）は１１３秒で凝固した。
【図８】図８は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ（大スケール）の凝固時間の濃度依存性減少を示す。緩衝液（キット）は１１５秒で凝固した。
【図９】図９は、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ（大スケール、凍結乾燥バッチ）の凝固時間の濃度依存性減少を示す。緩衝液（キット）は１１４秒で凝固した。
【図１０】図１０は、発色アッセイに係る工程の概略図を示す。矢印は、トロンビンによる増幅事象を示し、阻害効果を示す。
【図１１】図１１は、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＦＶＩＩａ及び２０ｍＭ  ベンズアミジンを含むＦＶＩＩａの用量依存性活性を示す代表的な結果を示す。
【図１２】図１２は、ＦＶＩＩａの反応混合物のＴｈｅｒａＰＥＧＴＭ  ＰＥＧ化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）の分子量マーカー；レーン２〜５、ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａバッチ  それぞれ、２ｍｇＦＶＩＩａ、３ｍｇＦＶＩＩａ、２ｍｇＦＶＩＩａ及び３ｍｇＦＶＩＩａの反応混合物。
【図１３（ａ）】図１３は、ラットのＰＫ研究のために作製されたＰＥＧ化ＦＶＩＩａのの凝固時間の濃度依存性減少を示す（４バッチ  ａ〜ｄ）。
【図１３（ｂ）】図１３は、ラットのＰＫ研究のために作製されたＰＥＧ化ＦＶＩＩａのの凝固時間の濃度依存性減少を示す（４バッチ  ａ〜ｄ）。
【図１３（ｃ）】図１３は、ラットのＰＫ研究のために作製されたＰＥＧ化ＦＶＩＩａのの凝固時間の濃度依存性減少を示す（４バッチ  ａ〜ｄ）。
【図１３（ｄ）】図１３は、ラットのＰＫ研究のために作製されたＰＥＧ化ＦＶＩＩａのの凝固時間の濃度依存性減少を示す（４バッチ  ａ〜ｄ）。
【図１４】図１４は、時間（時間）に対して測定されたヒトＦＶＩＩａの濃度（μｇ／ｍｌ）についてＥＬＩＳＡによってｅｘ−ｖｉｖｏで測定されたＦＶＩＩａ及びＰＥＧ  ＦＶＩＩａの薬物動態プロフィールを示す。
【図１５】図１５は、ＶＩＩａ及びＰＥＧ  ＦＶＩＩａに関する凝固反応速度の比較を示す。
【図１６】図１６は、本発明の共役体の２つの別の概略構造を示し、この際、ＦＶＩＩａは黒色の曲線で表され、（Ｃ）はＦＶＩＩａのシステイン残基を表わし、ＦＶＩＩａは本明細書に記載されるようなリンカーによって生体適合性ポリマーに共役して示される。
【実施例】
【０１２９】
ここで、本発明を下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は詳細に説
明するのみのために存在する。
【０１３０】
実施例１：ＦＶＩＩａのジスルフィドＰＥＧ化
組換ヒトＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））のジスルフィドＰＥＧ化を、
Shaunak et al. in Nat Chem Biol. 2006; 2(6):312-313及びBrocchini et al in Nature
Protocols, 2006; 1(5): 2241-2252に記載される方法を改変した方法に従って行った。
【０１３１】
実施例２：ジスルフィド結合の還元
ＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）ＰＥＧ化方法は、ジスルフィド結合の還元が必要である。Ｆ
ＶＩＩａは単一のジスルフィド結合によって結合して重鎖及び軽鎖から形成した４量体で
あるので、還元条件の調査を最初に行い、還元が鎖間ジスルフィドを切断せずに行われる
か否かを決定した。０．５〜５ｍＭの範囲のＤＴＴによる還元によって鎖間ジスルフィド
が還元して重鎖及び軽鎖を生成することが分かった（図３Ａ）。しかしながら、セレノシ
スタミン(selenocystamine)（ＳｅＣｙｓ）の存在または不存在下のいずれかにおいて、
若干過剰なモル濃度または還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ｔ
ＣＥＰ）を使用すると、鎖間ジスルフィドが少ししか切断しなかったまたは鎖間ジスルフ
ィドが切断しなかった（図３Ｂ）。これらの条件下での還元鎖間ジスルフィドの存在は、
システインチオールと反応してＰＥＧ化物質を生成するＰＥＧ試薬を添加することによっ
て確認した。
【０１３２】
実施例３：ＦＶＩＩａのＰＥＧ化
ＦＶＩＩａのＰＥＧ化のためにＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）を使用する最初の評価を小ス
ケール反応（１０〜２０μｇ  ＦＶＩＩａ）で行った。これにより、２モル当量のＰＥＧ
試薬を用いてモノＰＥＧ化ＦＶＩＩａを再現性良く調製するのに使用される条件を同定で
きた。タンパク質分解を防止するためのベンズアミジンの添加効果を初期実験で調べた。
これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ではＰＥＧ化に影響がないことが分かったので、以降のすべ
ての反応物に添加した。
【０１３３】
反応をスケールアップ（０．２〜０．３ｍｇ  ＦＶＩＩａ）して、初期のインビトロ評
価用のＰＥＧ化ＦＶＩＩａを作製した。ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの複数サンプ
ル及びＰＥＧ（１０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの１サンプルをインビトロ分析用に作製した（
表１参照）。ＰＥＧ化反応の温度を上げると、ヘパリン親和性精製用のクロマトグラムで
のピークの積分によって見積もる際のＦＶＩＩａのＰＥＧ−ＦＶＩＩａへの変換率が上昇
することが分かった。しかしながら、初期のインビトロ評価から、温度の上昇はＰＥＧ化
産物の活性にマイナス効果があることが示されたため、以降の反応を低温で行った（実施
例５）。
【０１３４】
【表１】
2015110636.tif 000016
【０１３５】
様々な精製条件をＰＥＧ化材料の単離について調べた。ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩ
Ｉａの最初のサンプルをヘパリンアフィニティによって精製し、２番目のサンプルをヘパ
リンアフィニティによって精製した後ＤＥＡＥアニオン交換によって精製した。ベンズア
ミジンはこれらのバッチの精製には緩衝液に含めなかった。すべての他のバッチでは、精
製は緩衝液にベンズアミジンを用いたヘパリン親和性によって、その後サイズ排除クロマ
トグラフィー（ＳＥＣ）によって行った。ベンズアミジンを最初ＳＥＣでは緩衝液に含ま
せていたが、これにより、２８０ｎｍでの吸光度が非常に強くなるため、ピークの同定が
困難であった。このため、ベンズアミジンをＳＥＣ緩衝液から除いたが、溶出直後にサン
プルに添加した。
【０１３６】
インビトロ評価用の材料を作製するために、反応をさらに１ｍｇ  ＦＶＩＩａにスケー
ルアップした。小スケールの反応で決定した条件下で、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ及び３０
ｋＤａのＦＶＩＩａのＰＥＧ化体(PEGylated variant)を調製した（図４）。
【０１３７】
上記したように、ヘパリンアフィニティ、さらにＳＥＣによって精製した後、ＰＥＧ化
産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、純度を示し（図５）、ＢＣＡアッセイによって
定量化した。
【０１３８】
実施例４：ＰＴアッセイによるＰＥＧ化ＦＶＩＩａのインビトロ活性の評価
ＦＶＩＩａ及びＰＥＧ化ＦＶＩＩａの活性を修飾プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ
を用いて測定した(STACLOT VIIa-rTF, Diagnostica Stago, Paris, catalogue no. 00281
)。キットに供給された組換可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）は、ＦＶＩＩａに特異的である
。凝固に必要な塩化カルシウムはキットに供給されていないので、２５ｍＭ  塩化カルシ
ウム(Diagnostica Stago, catalogue no. 00367)を、アッセイに使用するために購入した
。図６は、提供された成分及び凝固カスケード内のアッセイに係る工程（オレンジ）を示
す。
【０１３９】
すべてのアッセイは、手動の凝固方法を用いて行った。ＦＶＩＩａまたはＰＥＧ化ＦＶ
ＩＩａ（５０μＬ）をピペットで反応容器（プラスチックキャップを有するガラス製のバ
イアルビン）に入れた。次に、ＦＶＩＩ欠損血漿（５０μＬ）を反応容器に添加した後、
５０μＬのｒｓＴＦを添加し、さらに、リン脂質を反応管に添加し、３７℃で１８０秒間
インキュベートした。こののち、５０μＬの２５ｍＭ  塩化カルシウム（予め３７℃に加
温した）をこの反応混合物に添加すると同時にタイマーを開始した。反応管を緩やかに後
ろに揺り動かし、３７℃の水浴につけ、注意深く観察して、凝固の形成を決定した。フィ
ブリン塊が形成したらすぐに、凝固時間を記録した。
【０１４０】
このアッセイでＦＶＩＩａ活性を測定するのに適当な濃度範囲は、０．０１〜１０ｎｇ
／ｍＬであることが確立され、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａの濃度範囲は、０．１０〜１００ｎｇ
／ｍＬであることが確立された。したがって、非ＰＥＧ化タンパク質で観察された凝固時
間が早く、１００ｎｇ／ｍＬの濃度により即座に凝固するであろうため、アッセイに使用
されるＰＥＧ化ＦＶＩＩａの初期濃度は、ＰＴアッセイではＦＶＩＩａより１オーダー低
かった。
【０１４１】
実施例５：ＰＴアッセイによるＰＥＧ化ＦＶＩＩａ活性の評価
０．２〜０．３ｍｇ  ＦＶＩＩａを用いて開始したＰＥＧ化反応から得られたサンプル
を用いて、ＰＥＧ化ＦＶＩＩａの初期評価を行った。１０ｋＤａ  ＰＥＧｙ化ＦＶＩＩａ
及び２０ｋＤａ  ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ双方のサンプルを試験した。最初の実験はクエン酸
緩衝液中に供給されたＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａのバッチを用いて行ったが、低
い活性を示した。次のサンプルは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に供給した。ＨＥＰＥＳ緩衝液に
供給されたバッチのＰＴアッセイの結果を表２に示す。ベンズアミジン濃度は、試験され
たＦＶＩＩａの最も高い濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）に希釈した後のこれらのＰＥＧ−ＦＶ
ＩＩａサンプル中で４ｍＭであった。
【０１４２】
【表２】
2015110636.tif 000017
【０１４３】
２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのＰＥＧ化ＦＶＩＩａに関する凝固時間の濃度依存性変化を
、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で調べた（図７）。これらのサンプルは、いずれ
の調査でも、濃度の増加に伴って凝固時間が同様に変化した。異なるＰＥＧの大きさでの
曲線が平行であるので、ＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＦＶＩＩａと比較した際の凝固時間の
変化はＰＥＧ化によると考えられる。最もフィットしたラインによると、１０ｋＤａ及び
２０ｋＤａのＰＥＧ化ＦＶＩＩａの活性範囲は、１．３％〜２．５％であった。
【０１４４】
次に、より大きなスケールでの反応（１ｍｇ  ＦＶＩＩａ）から得られた１０ｋＤａ及
び２０ｋＤａのＰＥＧ化ＦＶＩＩａのサンプルを試験した。これらのＰＥＧ化サンプルの
凝固時間はすべて同程度であり、よりスケールの小さい反応から得られたサンプルで観察
されたのより早かった（表３）。これらの反応でのＰＥＧ化サンプルをより高い濃度で供
給したので、ＰＴアッセイでの最も高い濃度として使用される１００ｎｇ／ｍＬの濃度に
するためにより高い希釈が必要であった。これらのサンプルに関する凝固時間の濃度依存
性変化を、ＦＶＩＩａのと比較した（図８）。これらのサンプルの活性範囲（％）を、ベ
ストフィットしたラインから算出したところ、５〜７．５％であることが分かった。
【０１４５】
より大きなスケールの１０ｋＤａ及び２０ｋＤａのＰＥＧ化ＦＶＩＩａサンプルからの
アリコートサンプルを、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（入手できなかったため、マン
ニトールをスクロースに置換）で見出される賦形剤を含むように緩衝液交換した(buffer 
exchange)後、凍結乾燥した。得られた粉末を水に再懸濁し、ＰＴアッセイを用いて分析
した（図９）。同時に、下記サンプルを分析した：（１）１ｍｇスケールの反応から調製
されたＰＥＧ（３０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａのサンプル、（２）ＰＥＧを添加せずにＰＥＧ
化プロセスを行ったＦＶＩＩａ。
【０１４６】
ＰＥＧは添加しない以外はＰＥＧ化ＦＶＩＩａと同様にして処理したＦＶＩＩａは、Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液で緩衝液交換したＦＶＩＩａと同様の凝固時間の変化を示した（図８）。
これから、観察された活性の減少はプロセスではなくＰＥＧの結合によるものであること
が示される。また、ＦＶＩＩａの３０ｋＤａのＰＥＧ化体は、ＰＥＧサイズがより小さい
ものと同様の活性を示した。１０ｋＤａ及び２０ｋＤａのＰＥＧ化ＦＶＩＩａの凍結乾燥
物は、より高い濃度で活性に影響を与えないように見えた。より低い濃度では、凍結乾燥
した１０ｋＤａのＰＥＧ化体は非ＰＥＧ化ＦＶＩＩａと同様の活性を示すように見えた。
しかしながら、このデータは１回の実験で得られたものなので、この値を解釈する際には
注意が必要であり、この結果を確認するには繰り返しの分析が必要である。これらのサン
プルの活性（％）の範囲をベストフィットしたラインから測定し、表３に要約する。
【０１４７】
【表３】
2015110636.tif 000018
【０１４８】
実施例６：発色アッセイ
発色アッセイ(Hyphen Biomed, catalogue no. 221304)により、着色基質の形成によっ
てＦＶＩＩａの活性を測定するが、これは血栓形成を伴わない。これは、カルシウム及び
トロンボプラスチンの存在下でＦＶＩＩａによるＦＸからＦＸａへの活性化によってなさ
れる。ＦＸａは、ＦＸａに特異的な、発色基質を切断する。これにより、ＦＶＩＩａの定
量的な測定が可能になる（図１０）。
【０１４９】
このアッセイを、９６ウェルのマイクロタイタープレートで行った。すべての予め加温
及びインキュベーション工程は３７℃で行った。サンプル（３０μＬ）をマイクロタイタ
ープレートに添加し、３７℃で２分間予め加温した。予め加温したＲ２試薬（３０μＬ）
を各ウェルに添加した後、予め加温したＲ１試薬（６０μＬ）を添加し、これらを混合し
、７分間インキュベートした。次に、発色試薬（Ｒ３、予め加温）を、１ウェル当たり６
０μＬ添加し、５分間インキュベートした。６０μＬの２０％酢酸を添加することによっ
て反応を終了させ、４０５ｎｍでの吸光度を記録した。
【０１５０】
この発色アッセイの結果から、ＨＥＰＥＳ緩衝液でのＦＶＩＩａは上記アッセイと同等
であり、これから２０ｍＭのベンズアミジンを用いたＦＶＩＩａと同様の結果が得られる
ことが示された。発色アッセイの結果の一例を図１１に示す。２０ｍＭ  ベンズアミジン
を含むＨＥＰＥＳ緩衝液におけるＦＶＩＩａのＥＤ５０値は３０７．６±９．０ｐｇ／ｍ
Ｌ（１５．４±０．５ｍＵ／ｍＬ）であり、２０ｍＭ  ベンズアミジンを含むＦＶＩＩａ
では３５１．４±１０．８ｐｇ／ｍＬ（１７．６±０．５ｍＵ／ｍＬ）である。
【０１５１】
ＦＶＩＩａでの発色アッセイ範囲は、０．１０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で
確立された。ｍｇ範囲でのＰＥＧ化ＦＶＩＩａの濃度が発色アッセイでは必要である。こ
れは実現可能ではなく、このため、発色アッセイはＰＥＧ化サンプルには使用しなかった
。
【０１５２】
実施例７：ラットのＰＫ研究のための２０ｋＤａのＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）−ＦＶＩ
Ｉａの製造
ＰＥＧ化反応のスケールを、１ｍｇから２〜３ｍｇ  ＦＶＩＩａにまで増加した。ラッ
トのＰＫ研究のための２０ｋＤａのＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）  ＦＶＩＩａの製造を、２
ｍｇまたは３ｍｇのＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を含む４つのサブロ
ット(sub lot)で行った。前記した条件を用いてＰＥＧ化を行い、ヘパリンアフィニティ
クロマトグラフィーを用いて精製を行い、未反応ＰＥＧ試薬を除去した後、ＳＥＣを行い
、残っている未処理の非ＰＥＧ化ＦＶＩＩａ及びジＰＥＧ化 (diPEGylated)タンパク質を
除去した。モノＰＥＧ化(monoPEGylated)ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａを含む画分
を溜め、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）  ＲＴ緩衝液成分に緩衝液交換した(buffer ex
change)後凍結乾燥した。
【０１５３】
モノＰＥＧ化(monoPEGylated)産物の形成を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって各ＰＥＧ
反応毎に確認した（図１２）。ＦＶＩＩａからＰＥＧ化ＦＶＩＩａへの平均変換率（％）
は、ヘパリンアフィニティ精製のクロマトグラムでのピークの積分によって近似したとこ
ろ、４４．５±７．５％であった。ＰＥＧ化ＦＶＩＩａの最終収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ
全タンパク質アッセイ(Bradford total protein assay)によって測定したところ、１．０
９ｍｇのＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａであった。この量は、１１．２±３．８％の
平均収率となる。
【０１５４】
ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａのインビトロ活性を、修飾プロトロンビン時間(mod
ified prothrombin time)（ＰＴ）アッセイを用いて測定した。半対数グラフにデータを
プロットすることによって、初期研究（実施例５）中の凝固時間の分析を行ったが、キッ
トの製造社が推薦する方法であるので、これを一般的な研究でのｌｏｇ−ｌｏｇグラフに
変更した（図１３）。活性維持率（％）を凍結乾燥前後のサンプルで算出した。凍結乾燥
前のＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの（１００ｎｇ／ｍｌでの）平均凝固時間及び活
性維持率（％）は、それぞれ、３３．０±４．５秒及び０．６±０．４％であった。凍結
乾燥後のＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの（１００ｎｇ／ｍｌでの）平均凝固時間及
び活性維持率（％）は、それぞれ、３４．８±４．７秒及び０．８±０．４％であった。
【０１５５】
ラットの研究で調製されたバッチ及び初期の実現可能性研究（実施例３〜５）中に調製
されたバッチ間の活性維持率で相違がみられた。初期の実現可能性研究でのデータを再検
討したところ、ＦＶＩＩａ標準物質が、ラットの研究でのバッチの分析に使用された標準
物質に比べて同じ濃度での凝固時間がより長いことが分かった。実現可能性でのバッチの
分析に使用されたＦＶＩＩａ標準物質を１５日間シリコン処理されていない微小遠心管中
に保存した。この実験を行ったため、上記条件下でのＦＶＩＩａの保存により、タンパク
質によっては管に付着することが明らかになった。ゆえに、この標準物質を使用する場合
には、実際のＦＶＩＩａ濃度が予想より低くなり、これにより計算値より少ない量がアッ
セイに添加された。これにより凝固時間が長くなり、標準物質の見かけの活性が低くなり
、その結果ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの活性維持率がより高く見えた。ラットの
ＰＫ研究では、保存中にＦＶＩＩａが管に付着するのを防止し、これによりＰＴアッセイ
でより正確な結果が得られるように、ＦＶＩＩａ標準物質を再構築直後にＥｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ  ＬｏＢｉｎｄ（登録商標）管中で−８０℃に凍結した。
【０１５６】
実施例８：ラットでの２０ＫＤのＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）−ＦＶＩＩａ及びＮｏｖｏ
Ｓｅｖｅｎ（登録商標）の薬物動態
ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの薬物動態特性をオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌ
ｅｙラットで評価し、このモデルでのＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の
薬物動態と直接比較した。１群あたり９匹の動物に、２．５ｍｌ／ｋｇの容積で０．３ｍ
ｇ／ｋｇを尾静脈に静脈内（ＩＶ）ボーラス投与によって投与した。０．０３３、０．２
５、０．５、０．７５、１．０、２．０、３．０、６．０及び２４時間に、血液サンプル
を採取した。血漿サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡによってＦＶＩＩａ濃度を分析した。図
１４は、時間に対するＦＶＩＩａ濃度のプロットを示す。アルファ相、ベータ相及び全血
漿の半減期を算出し、表４に示す。結果から、ＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）（２０ｋＤａ）
−ＦＶＩＩａの血漿半減期はＦＶＩＩａのに比べて有意に長いことが示される。
【０１５７】
【表４】
2015110636.tif 000019
【０１５８】
実施例９：イヌのＰＫ研究のための２０ｋＤのＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）−ＦＶＩＩａ
の製造
ＰＥＧ化反応のスケールは、５及び１０ｍｇのスケールで行った中間反応を介して、３
ｍｇから２５ｍｇにまで増加した。イヌのＰＫ研究のためのＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶ
ＩＩａの製造を、２種の源のＦＶＩＩａを用いて行った。
【０１５９】
第１の源のＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））を用いたＰＥＧ（２０ｋＤ
ａ）−ＦＶＩＩａの調製を、１０〜２５ｍｇの反応スケールでのＦＶＩＩａのＰＥＧ化に
よって５つのロットで行った。反応条件は各バッチで同じであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分析から、ＰＥＧ化は一致することが示された。ＦＶＩＩａからＰＥＧ化ＦＶＩＩａへ
の平均変換率（％）は、ヘパリンアフィニティ精製のクロマトグラムでのピークの積分に
よって近似したところ、４１．８±１１．７％であった。ＰＥＧ化ＦＶＩＩａの合計最終
収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ全タンパク質アッセイ(Bradford total protein assay)によっ
て測定したところ、１５．３ｍｇのＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａであった。この量
は、１４．７±３．６％の平均収率となる。
【０１６０】
凍結乾燥前後のサンプルについてインビトロ活性を算出した。凍結乾燥前のＰＥＧ（２
０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの（１００ｎｇ／ｍｌでの）平均凝固時間及びＦＶＩＩａに対す
る活性維持率は、それぞれ、２８．５±３．５秒及び１．８±０．６％であった。凍結乾
燥後のＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの（１００ｎｇ／ｍｌでの）平均凝固時間及び
ＦＶＩＩａに対する活性維持率（％）は、それぞれ、３２．２±４．１秒及び２．２±２
．５％であった。
【０１６１】
第２の源のＦＶＩＩａを用いたＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの調製を、２５ｍｇ
の反応スケールでのＦＶＩＩａのＰＥＧ化によって３つのロットで行った。反応条件は各
バッチで同じであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析から、ＰＥＧ化は一致することが示さ
れた。ＦＶＩＩａからＰＥＧ化ＦＶＩＩａへの平均変換率（％）は、ヘパリンアフィニテ
ィ精製のクロマトグラムでのピークの積分によって近似したところ、４０．３±２．９％
であった。ＰＥＧ化ＦＶＩＩａの合計最終収率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ全タンパク質アッセ
イ(Bradford total protein assay)によって測定したところ、１３．１ｍｇのＰＥＧ（２
０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａであった。この量は、１７．５±６．９％の平均収率となる。
【０１６２】
凍結乾燥前後のサンプルについてインビトロ活性を算出した。凍結乾燥前のＰＥＧ（２
０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの（１００ｎｇ／ｍｌでの）平均凝固時間及びＦＶＩＩａに対す
る活性維持率は、それぞれ、３７．０±３．５秒及び１．５±０．６％であった。凍結乾
燥後のＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの（１００ｎｇ／ｍｌでの）平均凝固時間及び
ＦＶＩＩａに対する活性維持率（％）は、それぞれ、３５．７±１．１秒及び１．３±０
．３％であった。
【０１６３】
実施例１０：凝固反応速度の測定によるＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａのインビト
ロ分析
ＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａがＦＶＩＩａと同じ速度で凝固するか否かを確立す
るために、修飾ＰＴアッセイをＳｙｓｍｅｘ  ＣＡ５０凝固分析器(Sysmex CA50 coagula
tion analyser)で行った。凝固形態として、分析者は２〜８０％の散乱光の変化を記録す
る。凝固検出率（％）に対する凝固時間をプロットすることによって、凝固速度を曲線の
傾斜から算出でき、サンプル間で比較できる。反応速度に対する濃度依存性効果があるた
め、同じ濃度でサンプルを比較することが重要である。
【０１６４】
ＦＶＩＩａ及びＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａの反応速度を下記４種の異なる濃度
で測定した；７．５、１０、１２．５及び２０ｎｇ／ｍｌ（図１５）。ＰＥＧ化ＦＶＩＩ
ａの平均反応速度が、試験した４種の濃度でＦＶＩＩａの２２％であることが分かった（
表５）。
【０１６５】
【表５】
2015110636.tif 000020
【０１６６】
実施例１１：血友病Ａのイヌの２０ＫＤのＴｈｅｒａＰＥＧ（商標）−ＦＶＩＩａ産物
の薬物動態および血液凝固
本研究の目的は、２つの異なるＰＥＧ（２０ｋＤａ）−ＦＶＩＩａ産物（実施例９）が
好ましい薬物動態特性を有し、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）や他の源のＦＶＩＩａに
比べて血友病Ａの犬の阻害剤傾向(inhibitor prone)に有効であるかどうかを決定するこ
とである。これらの２種のＰＥＧ化産物は、その調製に使用されるＦＶＩＩａの源が異な
る。
【０１６７】
前処置ＣＢＣ(pretreatment CBC)、血清生化学検査プロフィールフィブリノーゲン(ser
um chemistry profile fibrinogen)、ＦＤＰ、トロンビン時間（ＴＴ）及びＵＡを各イヌ
で行い、正常な健康状態を及び基準の比較のために確認した。追加の血清及び血漿アリコ
ートを将来行う凝固因子及び阻害抗体アッセイのために−７０℃に凍結する。最初は１回
の試験で１匹のイヌを用い、生物学的半減期及び安全性が満足することが分かった場合に
は、試験を拡張することを計画する。
【０１６８】
各試験項目(test artcle)のイヌをインビトロの反応速度アッセイ（実施例１０）に基
づいて投与量が等しくなるように選択し、橈側皮静脈への静脈内（ＩＶ）輸注によって投
与を行う。
【０１６９】
０．１０９Ｍ  クエン酸三ナトリウムの抗凝固剤中に血液を集めた後、遠心し、−７０
℃に凍結することによって、３０分、１、２、４、８、１６、２４、３６、４８、９６、
及び１２０時間で、血漿サンプルを得る。血漿サンプルについて以下の試験を行う：ａＰ
ＴＴ、Ｓｔａｃｌｏｔ  ＦＶＩＩａ(Staclot FVIIa)活性、ＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩａ
抗原レベルおよびトロンボエラストグラム凝固特性(thromboelastogram clot quality)。
静脈穿刺時に、全血の凝固時間（ＷＢＣＴ）を即座に行う。ａＰＴＴ、Ｓｔａｃｌｏｔア
ッセイ及びＷＢＣＴを用いて、生物学的半減期を評価し、また、ＦＶＩＩａ  ＥＬＩＳＡ
を用いてタンパク質抗原レベルに基づく半減期を測定する。
【０１７０】
産物を投与してから４８時間及び５日目にＣＢＣ及び血清生化学検査を行うことによっ
て、予想できない毒性についてスクリーニングする。フィブリノーゲン、ＦＤＰ及びトロ
ンビン時間（ＴＴ）を評価して血栓症の危険性の増加について試験する。ベテスダアッセ
イ(Bethesda assay)を用いて、中和抗体の存在についてスクリーニングする。
【図１】
2015110636.tif 000025
【図２】
2015110636.tif 000026
【図３（ａ）】
2015110636.tif 000027
【図３（ｂ）】
2015110636.tif 000028
【図４】
2015110636.tif 000029
【図５】
2015110636.tif 000030
【図６】
2015110636.tif 000031
【図７】
2015110636.tif 000032
【図８】
2015110636.tif 000033
【図９】
2015110636.tif 000034
【図１０】
2015110636.tif 000035
【図１１】
2015110636.tif 000036
【図１２】
2015110636.tif 000037
【図１３（ａ）】
2015110636.tif 000038
【図１３（ｂ）】
2015110636.tif 000039
【図１３（ｃ）】
2015110636.tif 000040
【図１３（ｄ）】
2015110636.tif 000041
【図１４】
2015110636.tif 000042
【図１５】
2015110636.tif 000043
【図１６】
2015110636.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月3日(2015.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のポリエチレングリコールが血液凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）でジスルフィド結合を形成した２つのシステイン残基の硫黄原子を架橋するリンカー基によってＦＶＩＩａに共役し、下記構造：
【化１】
2015110636.tif 000045
ただし、Ｒ３は、フェニレン基であり；ポリエチレングリコールへの連結は、加水分解に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである、
を有する、ＦＶＩＩａ−ポリエチレングリコール共役体。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールは５〜１００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のＦＶＩＩａ−ポリエチレングリコール共役体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＦＶＩＩａ−ポリエチレングリコール共役体を含む薬剤組成物。
【請求項４】
前記組成物は製薬上許容できる希釈剤、アジュバントまたは担体を含む、請求項３に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
さらに他の薬剤活性のある物質(pharmaceutically active agent)を含む、請求項３または４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
非経口投与に適する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
皮内、皮下、及び筋肉内注射、ならびに静脈内または骨内注入に適する、請求項３〜６のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態を有する、請求項３〜７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
血液凝固疾患(blood clotting disease)または外傷(trauma)を治療するための請求項３〜８のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記血液凝固疾患(blood clotting disease)が、血友病Ａまたは血友病Ｂである、請求項９に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
血友病Ａ、血友病Ｂまたは外傷を有する哺乳動物の関節血症、出血、胃腸出血及び月経過多症の危険性を低減するための請求項３〜１０のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、皮下に投与される、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、静脈内に投与される、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記組成物は、１〜１４日毎に一度投与される、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
ＦＶＩＩａの機能の欠損の特徴を有する血液凝固疾患(blood clotting disease)の治療、または外傷の治療のための請求項３〜１３のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
請求項１または２に記載のＦＶＩＩａ−ポリエチレングリコール共役体の調製方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩａの２つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、２つの遊離チオール基を生成し；
（ｂ）共役２重結合及び脱離基を有する共役試薬間の第一のチオレート導入付加反応(thiolate addition reaction)を行い；
（ｃ）前記脱離基を除去して、共役２重結合を生成し；さらに
（ｄ）第二のチオレート導入付加反応(thiolate addition reaction)を行い、２個の硫黄原子間に３−炭素架橋を形成する
ことを有する方法。
【請求項１７】
前記共役試薬は、下記式：
【化２】
2015110636.tif 000046
ただし、Ｒ３は、フェニレン基であり；Ｒ２は、水素原子またはＣ１−６アルキル基またはフェニル基であり；ポリエチレングリコールへの連結は、加水分解に不安定な結合による、または安定な結合(nonlabile bond)によるものである、
を有する、請求項１６に記載の方法。
【外国語明細書】
2015110636000001.pdf
2015110636000002.pdf
2015110636000003.pdf
2015110636000004.pdf