(57)【要約】【課題】がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法や、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測キットや、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果向上剤を提供すること。【解決手段】被検者の組織又は体液中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とするがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法であって、前記マイクロＲＮＡが、（１）hsa-miR-147b、（２）hsa-miR-486-5p、（３）hsa-miR-125b-1-3p、（４）hsa-miR-196b-3p、（５）hsa-miR-378a-3p、（６）hsa-miR-196b-5p、（７）hsa-miR-224-5p、（８）hsa-miR-20b-5p、（９）hsa-miR-659-3p、（１０）hsa-miR-1184、（１１）hsa-miR-18b-5p、（１２）hsa-miR-135b-5p、（１３）hsa-miR-23cから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の組織又は体液中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とするがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法であって、前記マイクロＲＮＡが、以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることを特徴とする方法。
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
【請求項２】
がん患者が、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ*２４０２を保有する患者であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
がん患者が、大腸がん患者であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ペプチドワクチン療法に用いるエピトープペプチドが、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ*２４０２に対する結合能を有するエピトープペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測キットであって、以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブ又はプライマーを備えたキット。
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
【請求項６】
以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡに対するマイクロＲＮＡインヒビター又はマイクロＲＮＡミミックを含む、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果向上剤。
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の組織又は体液中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とするがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法や、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測キットや、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界中で多くの罹患数がいる疾患であり、その中でも大腸がんは世界中で約１００万人が毎年命を失っている疾患である。この１０年間、標準化学療法（ＦＯＬＦＯＸ）とＶＥＧＦやＥＧＦＲ抗体のようなモノクローナル抗体との併用療法により転移性大腸がん患者の予後は著しく改善してきた。しかしながら、多くの大腸がん患者において化学療法抵抗性により進行が進み、命を失っているのが現状である。
【０００３】
がんは早期の発見がその治療にとって重要であり、そのために様々ながんの診断方法が開発されてきた。そのなかで、近年、マイクロＲＮＡを測定することにより、がんの診断を行う手法が挙げられる。マイクロＲＮＡ（以下、「miR」ともいう）とは、細胞内に存在する長さ２０から２５塩基のＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているノンコーディングＲＮＡの一種である。これまでに、マイクロＲＮＡ分子からなる大腸がんの検査マーカー（特許文献１参照）や、無血清培地中で大腸がん細胞を培養し、培養液中に放出されるマイクロＲＮＡを測定してがん細胞の悪性度を評価する方法（特許文献２参照）が提案されている。また、被検者が大腸がんを有するか又はそれを発生する危険性があるかどうかを診断する方法であって、被検者からの試験試料中のmiR-125b-1のレベルを測定することを含む方法（特許文献３参照）や、前立腺がんを有する患者におけるがんの再発尤度を定量化する方法であって、前記患者から採取された前立腺組織を含む生物学的試料中のmiR-486-5pの発現量を測定する工程を含む方法（特許文献４参照）や、血清中の腫瘍由来miR-486-5pが肺がんと関係していること（非特許文献１参照）や、miR-147bの発現が胃がん組織と正常な胃の組織との間で２倍以上異なっていること（非特許文献２参照）が報告されている。
【０００４】
一方、標準的ながん療法では効果が不十分な患者に対する療法として、標準化学療法と併用するために、作用機序の異なる免疫療法の開発が世界的に進められている。開発初期の単純な腫瘍抗原エピトープペプチドは免疫療法効果が十分でないことが判明した。そこで、現在、抗腫瘍免疫ネットワークの重要なポイントを制御する免疫制御技術の開発が進められており、将来はそれらを組み合わせた複合免疫療法の開発が期待されている。免疫療法には腫瘍抗原エピトープペプチドが用いられ、たとえば、RNF43(ring finger protein 43)、TOMM34（34 kDa translocase of the outer mitochondrial membrane)、KOC1(IMP-3; IGF-II mRNA binding protein 3)等が報告されている（非特許文献３参照）。かかる免疫療法は、患者によって効果に個人差があり、療法を施す前に療法効果を予測することが好ましいため、免疫療法を行う前に、その効果を適切に予測できる方法の開発が重要な課題となっている。
【０００５】
これまでに、被検者から得られた試料に含まれる、miR-660、miR-324-5p、miR-532-5p、及びこれらマイクロＲＮＡと同一のファミリーに属するマイクロＲＮＡからなる群から選ばれる１又は複数を測定する工程を含む、前記被検者における肝線維症の療法の効果予測方法（特許文献５参照）が提案されている。しかしながら、マイクロＲＮＡの発現量とがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果との関係については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再表２０１１−０４０５２５号公報
【特許文献２】再表２０１１−００１９０６号公報
【特許文献３】特開２０１３−０４６６１２号公報
【特許文献４】特表２０１３−５３２４８２号公報
【特許文献５】特開２０１２−１２５２１５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Li Y, Liang L, Zhang CY. Anal Chem. 2013 Dec 3;85(23):11174-9
【非特許文献２】Yao Y, Suo AL, Li ZF, Liu LY, Tian T, Ni L, Zhang WG, Nan KJ, Song TS, Huang C. Mol Med Rep. 2009 Nov-Dec;2(6):963-70
【非特許文献３】硲  彰一、岡  正朗  日外科系連会誌2012 37(1):41-45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
がん免疫療法においては、その効果を適切に予測できる方法やそのためのバイオマーカーの確立が重要であり、さらに複合免疫療法構築のために必要な免疫制御技術を開発することにより、新たな複合免疫療法の治療戦略の構築を目指すことが必要である。そこで、本発明の課題は、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法や、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測キットや、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果向上剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測可能なバイオマーカーを探索するため、標準化学療法が不応となった大腸がん患者に対するペプチドワクチン単独療法を行った症例の探索的解析を行うとともに、進行大腸がんの１次療法として標準化学療法とペプチドワクチン療法を行った症例の探索的解析も合わせて行った。その結果、マイクロＲＮＡの発現量の高低により、ペプチドワクチン療法の効果が異なることを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、［１］被検者の組織又は体液中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とするがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法であって、前記マイクロＲＮＡが、以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることを特徴とする方法；
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
や、［２］がん患者が、ヒト白血球型抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）−Ａ*２４０２（以下、「ＨＬＡ−Ａ*２４０２」ともいう）を保有する患者であることを特徴とする上記［１］記載の方法や、［３］がん患者が、大腸がん患者であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法や、［４］ペプチドワクチン療法に用いるエピトープペプチドが、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）−Ａ*２４０２に対する結合能を有するエピトープペプチドであることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載の方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、［５］がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測キットであって、以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブ又はプライマーを備えたキット；
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、［６］以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡに対するマイクロＲＮＡインヒビター又はマイクロＲＮＡミミックを含む、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果向上剤；
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測が可能となる。そのため、がん患者に対して適切な免疫療法を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１におけるhsa-miR-196b-3p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。Ｌｏｗは相対蛍光強度が２２０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が２２０以上の患者であり、縦軸は全生存率を示し、横軸は投与開始からの経過月を示す。
【図２】実施例１におけるhsa-miR-196b-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。Ｌｏｗは相対蛍光強度が４００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が４００以上の患者であり、縦軸、横軸は図１と同様である。
【図３】実施例１におけるhsa-miR-147b発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。Ｌｏｗは相対蛍光強度が５００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が５００以上の患者であり、縦軸、横軸は図１と同様である。
【図４】実施例１におけるhsa-miR-378a-3p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。Ｌｏｗは相対蛍光強度が６５００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が６５００以上の患者であり、縦軸、横軸は図１と同様である。
【図５】実施例１におけるhsa-miR-486-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。Ｌｏｗは相対蛍光強度が３６５未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が３６５以上の患者であり、縦軸、横軸は図１と同様である。
【図６】実施例１におけるhsa-miR-224-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。Ｌｏｗは相対蛍光強度が２７０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が２７０以上の患者であり、縦軸、横軸は図１と同様である。
【図７】実施例２におけるhsa-miR-1184発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が１０００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が１０００以上の患者である。また、縦軸は全生存率を示し、横軸は投与開始からの経過月を示す。
【図８】実施例２におけるhsa-miR-20b-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が４６０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が４６０以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図９】実施例２におけるhsa-miR-196b-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が４００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が４００以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図１０】実施例２におけるhsa-miR-659-3p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が２１００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が２１００以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図１１】実施例２におけるhsa-miR-18b-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が３２０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が３２０以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図１２】実施例２における135b-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が５４０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が５４０以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図１３】実施例２におけるhsa-miR-224-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が２７０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が２７０以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図１４】実施例２におけるhsa-miR-23c発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が１２００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が１２００以上の患者である。また、縦軸、横軸は図７と同様である。
【図１５】実施例３におけるhsa-miR-147b発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が５００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が５００以上の患者である。また、縦軸は全生存率を示し、横軸は投与開始からの経過月を示す。
【図１６】実施例３におけるhsa-miR-378a-3p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が６５００未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が６５００以上の患者である。縦軸、横軸は図１５と同様である。
【図１７】実施例３におけるhsa-miR-486-5p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が３６５未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が３６５以上の患者である。縦軸、横軸は図１５と同様である。
【図１８】実施例３におけるhsa-miR-125b-1-3p発現量と全生存期間との関係を調べた結果を示す図である。（ａ）は全症例、（ｂ）は試験療法群（HLA-A*2402+）、（ｃ）は対照群（HLA-A*2402-）であり、Ｌｏｗは相対蛍光強度が５５０未満、Ｈｉｇｈは相対蛍光強度が５５０以上の患者である。縦軸、横軸は図１５と同様である。
【図１９】実施例４における血漿中のhsa-miR-486-5p発現量と腫瘍組織中のhsa-miR-486-5p発現量との関係を示す図である。縦軸が腫瘍組織中のhsa-miR-486-5p発現量、横軸が血漿中のhsa-miR-486-5p発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法としては、被検者の組織又は体液中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とするがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測方法であって、前記マイクロＲＮＡが、以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることを特徴とする方法であれば特に制限されないが、被検者としてはヒトを好適に挙げることができる。
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
【００１６】
また、本発明のがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測を補助する方法としては、被検者の組織又は体液中のマイクロＲＮＡの発現量を測定することを特徴とするがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測を補助する方法であって、前記マイクロＲＮＡが、以下の（１）〜（１３）に示すマイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡであることを特徴とする方法あれば特に制限されないが、被検者としてはヒトを好適に挙げることができる。
（１）配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）；
（２）配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）；
（３）配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）；
（４）配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）；
（５）配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）；
（６）配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）；
（７）配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）；
（８）配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）；
（９）配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）；
（１０）配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）；
（１１）配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）；
（１２）配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）；
（１３）配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）；
【００１７】
被検者の組織又は体液としては、被検者のがん組織、血漿又は血清を挙げることができる。
【００１８】
本発明におけるマイクロＲＮＡは、配列番号１に示されるマイクロＲＮＡ−１４７ｂ（hsa-miR-147b）や、配列番号２に示されるマイクロＲＮＡ−４８６−５ｐ（hsa-miR-486-5p）や、配列番号３に示されるマイクロＲＮＡ−１２５ｂ−１−３ｐ（hsa-miR-125b-1-3p）や、配列番号４に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−３ｐ（hsa-miR-196b-3p）や、配列番号５に示されるマイクロＲＮＡ−３７８ａ−３ｐ（hsa-miR-378a-3p）や、配列番号６に示されるマイクロＲＮＡ−１９６ｂ−５ｐ（hsa-miR-196b-5p）や、配列番号７に示されるマイクロＲＮＡ−２２４−５ｐ（hsa-miR-224-5p）や、配列番号８に示されるマイクロＲＮＡ−２０ｂ−５ｐ（hsa-miR-20b-5p）や、配列番号９に示されるマイクロＲＮＡ−６５９−３ｐ（hsa-miR-659-3p）や、配列番号１０に示されるマイクロＲＮＡ−１１８４（hsa-miR-1184）や、配列番号１１に示されるマイクロＲＮＡ−１８ｂ−５ｐ（hsa-miR-18b-5p）や、配列番号１２に示されるマイクロＲＮＡ−１３５ｂ−５ｐ（hsa-miR-135b-5p）や、配列番号１３に示されるマイクロＲＮＡ−２３ｃ（hsa-miR-23c）（以下、総称して「本件マイクロＲＮＡ」ともいう）から選ばれる少なくとも１種、好ましくは、hsa-miR-147bや、hsa-miR-486-5pや、hsa-miR-125b-1-3pや、hsa-miR-196b-3pや、hsa-miR-378a-3pや、hsa-miR-196b-5pや、hsa-miR-224-5pや、hsa-miR-20b-5pや、hsa-miR-1184や、hsa-miR-135b-5pや、hsa-miR-23cから選ばれる少なくとも１種であり、表１に、配列番号１〜１３に示されるマイクロＲＮＡのmicroRNA database（http://www.mirbase.org/）のＩＤ、配列を示す。
【００１９】
【表１】
2015213492.tif 000002
【００２０】
被検者の組織又は体液からマイクロＲＮＡを抽出する方法としては、被検者の組織又は体液から、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡを抽出する方法である限り特に制限されず、例えば、miRNeay Mini Kit（キアゲン社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることによって、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出する方法を好適に例示することができる。
【００２１】
本発明において、マイクロＲＮＡの発現量を測定する方法としては特に制限されないが、マイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法を挙げることができる。
【００２２】
上記マイクロアレイ法としては、組織又は体液から抽出したＲＮＡを蛍光等のラベルで標識し、そのＲＮＡを、本件マイクロＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブが固定されたマイクロアレイに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイを洗浄して、マイクロアレイ上に残ったマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法を例示することができる。
【００２３】
また、上記定量ＰＣＲ法としては、本件マイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、かつ、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されず、アガロース電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法等の通常の定量ＰＣＲ法を用いることができるが、定量の精度や信頼性の点で、蛍光プローブ法が好ましい。
【００２４】
本発明において、ペプチドワクチン療法とは、エピトープペプチドを患者に投与し、がんに対する特異的な獲得免疫を生じさせてがんの治療を行う方法を意味する。
【００２５】
本発明において、エピトープペプチドとは、がん細胞に特異的に存在するタンパク質由来の８〜１０個のアミノ酸からなる、免疫療法に用いるペプチドを意味し、かかるエピトープペプチドとしては、投与する被検者が保有するＨＬＡに結合可能なエピトープペプチドであることが好ましく、例えば被検者がＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有する場合には、ＨＬＡ−Ａ*２４０２に対する結合能を有するエピトープペプチド（ＨＬＡ−Ａ*２４０２拘束性エピトープペプチド）であることが好ましい。ＨＬＡ−Ａ*２４０２拘束性エピトープペプチドとしては、具体的には、腫瘍抗原由来のRNF43-721（配列番号１４：NSQPVWLCL）、TOMM34-299（配列番号１５：KLRQEVKQNL）、KOC1(IMP-3)-508（配列番号１６：KTVNELQNL）、及びＶＥＧＦＲ（vascular endothelial growth factor receptor）１、ＶＥＧＦＲ２をターゲットとする血管新生抑制がんワクチンであるVEGFR1-1084（配列番号１７：SYGVLLWEI）、VEGFR2-169（配列番号１８：RFVPDGNRI）を挙げることができ、上記エピトープペプチドのいずれか１個のみを用いても、２個以上混合して用いてもよく、３個以上混合してもよく、４個以上混合してもよく、５個全て混合してもよい。がん細胞によって表面に有するエピトープペプチドにばらつきがあるため、よりペプチドワクチン療法の効果を高める観点からは、混合するエピトープペプチドの数は、３個以上、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上である。
【００２６】
本発明において、がん患者としては特に制限されないが、ペプチドワクチン療法に用いるエピトープペプチドが結合可能なＨＬＡを保有する患者であることが好ましく、例えばＨＬＡ−Ａ*２４０２拘束性エピトープペプチドを用いる場合には、ＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有する患者であることが好ましい。がん患者がＨＬＡ型を保有するか否かは、例えばＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ法により確認することが可能である。
【００２７】
本発明において、対象となるがんとしては、大腸がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、乳がん、肺がん、子宮がん、卵巣がん等を挙げることができ、大腸がんを好適に挙げることができる。
【００２８】
本発明において、ペプチドワクチン療法の効果予測とは、ペプチドワクチン療法を行った患者において、ペプチドワクチン療法の効果が高いか低いかを予測することを意味し、具体的には、ペプチドワクチン療法を行った患者の全生存期間若しくは全生存率を向上させる効果が高いか低いかを予測することを挙げることができる。なお、全生存率とは、ペプチドワクチン療法を行った患者において、治療から一定期間が経過した後に生存している患者の割合を意味する。
【００２９】
上記がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測は、被検者の組織又は体液中の本件マイクロＲＮＡの発現量から選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量を測定することによって行うことができる。例えば、事前にペプチドワクチン療法の効果有りのがん患者と効果無しのがん患者それぞれ２人以上、好ましくは４人以上、より好ましくは５人以上の組織又は体液中における本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量を測定し、かかる発現量の中央値又は平均値を算出し、前記中央値又は平均値を基にカットオフ値を定める。次いで被検者の前記本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種の発現量を測定し、被検者の発現量と前記カットオフ値とを比較することで、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能である。
【００３０】
ペプチドワクチン療法の効果有りのがん患者と効果無しのがん患者としては、ペプチドワクチン療法の効果有りのがん患者を「無増悪生存期間が１５０日以上、若しくは追加化学療法無しで、全生存期間が３００日以上の患者」とし、ペプチドワクチン療法の効果無しのがん患者を「無増悪生存期間が９０日未満、若しくは全生存期間が２１０日未満の患者」とする方法や、ペプチドワクチン療法の効果有りのがん患者を「ペプチドワクチン療法開始後、３年以上生存した患者」とし、ペプチドワクチン療法の効果無しのがん患者を「ペプチドワクチン療法開始後、２年以内に亡くなった患者」とする方法を挙げることができる。
【００３１】
また、前記本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種の発現量を測定し、被検者の発現量と前記カットオフ値とを比較することで、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測する方法としては、具体的には、hsa-miR-147b、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-659-3p、hsa-miR-1184を測定した場合においては、発現量がカットオフ値未満であれば、ペプチドワクチン療法の効果が高いと予測でき、発現量がカットオフ値以上であれば、ペプチドワクチン療法の効果が低いと予測できる。一方、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-23cを測定した場合においては、発現量がカットオフ値以上であれば、ペプチドワクチン療法の効果が高いと予測でき、発現量がカットオフ値未満であれば、ペプチドワクチン療法の効果が低いと予測できる。
【００３２】
本発明のがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果予測キットとしては、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブ又はプライマーを備えたキットであれば特に制限されず、かかるキットには、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーの他、バッファー、ｄＮＴＰｓ、ＲＮＡのラベル化反応に用いる試薬、ハイブリダイゼーション反応に用いる試薬、説明書等を含んでもよい。
【００３３】
本件マイクロＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーは当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。かかるプローブ又はプライマーを用いてマイクロアレイ法又は定量ＰＣＲ法を行うことにより、本件マイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能となる。
【００３４】
上記ストリンジェントな条件としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００３５】
上記プローブとしては、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡの塩基配列若しくはその一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができ、かかるポリヌクレオチドをプローブとしてマイクロアレイに固定して用いれば、マイクロアレイ法を行うことができる。
【００３６】
また、上記プライマーとしては、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡの塩基配列の５’側の一部の塩基配列からなるポリヌクレオチド（フォワードプライマー）や、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡの塩基配列の３’側の一部と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド（リバースプライマー）を挙げることもできる。かかるポリヌクレオチドをプライマーセットとして用いれば、定量ＰＣＲ法を行うことができる。
【００３７】
本発明のがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果向上剤としては、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡに対するマイクロＲＮＡインヒビター又はマイクロＲＮＡミミックを含んでいれば特に制限されず、前記マイクロＲＮＡインヒビターとは、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡに対して拮抗作用を有する化合物を意味し、前記マイクロＲＮＡミミックとは、本件マイクロＲＮＡから選ばれる少なくとも１種のマイクロＲＮＡに対して機能増強作用を有する化合物を意味する。
【００３８】
上記ペプチドワクチン療法の効果向上剤は、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を含んでいてもよい。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤等の固形製剤であってもよいが、優れたペプチドワクチン療法の効果向上を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤等の液剤とすることが好ましい。
【００３９】
上記ペプチドワクチン療法の効果向上剤の投与方法としては、所望のペプチドワクチン療法の効果向上が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を挙げることができる。また、上記ペプチドワクチン療法の効果向上剤はペプチドワクチン療法に用いるエピトープペプチド等の薬剤と同時に患者に投与しても、いずれか一方を先に患者に投与してもよい。
【実施例１】
【００４０】
［第Ｉ相試験（ＰＩ）を行った症例の探索的解析］
（がん患者に対する療法）
標準化学療法が不応となったＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有する進行大腸がん患者１８例に対してペプチドワクチン単独療法（第Ｉ相試験（ＰＩ））を行った。この試験はヘルシンキ宣言に従っており、国立大学法人山口大学の倫理審査委員会により承認された。また、患者からはインフォームドコンセントを得た。各患者がＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有するか否かはＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ法により調べた。
【００４１】
（ペプチドワクチン療法）
ペプチドワクチン療法としてはＨＬＡ−Ａ*２４０２拘束性の５種類のエピトープペプチドそれぞれ３ｍｇを１．５ｍｌの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）Montanide ISA51（Seppci社製）に混合し、２８日間の療法において、１日、８日、１５日、２２日に皮下投与を行った。５種類のエピトープペプチドとしては、腫瘍抗原由来のRNF43-721（配列番号１４：NSQPVWLCL）、TOMM34-299（配列番号１５：KLRQEVKQNL）、KOC1(IMP-3)-508（配列番号１６：KTVNELQNL）、及びＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２をターゲットとする血管新生抑制がんワクチンであるVEGFR1-1084（配列番号１７：SYGVLLWEI）、VEGFR2-169（配列番号１８：RFVPDGNRI）（American Peptide Company社製）を用いた。上記ぺプチドは標準固相法で合成し、精製してGMP gradeのものを用いた。
【００４２】
上記患者の１８例のうち、腫瘍組織中のマイクロＲＮＡを９例で解析可能であり、マイクロＲＮＡの発現量を以下の方法で調べた。
【００４３】
（トータルＲＮＡの抽出）
患者のがん組織からのトータルＲＮＡを用いて、腫瘍組織における約１４００種類のマイクロＲＮＡの発現量と全生存期間の関係をマイクロＲＮＡマイクロアレイ解析により網羅的に解析した。トータルＲＮＡはmiRNeay Mini Kit（キアゲン社製）を用いて、そのプロトコールに従って抽出した。トータルＲＮＡの濃縮や精製は分光光度計で評価し、ＲＮＡインテグリティはAgilent RNA 6000 Nano Kit(Santa Clara社製)を用いて確認した。それぞれのサンプルのＯＤ２６０／２８０比は２．００から２．１０であり、マイクロアレイに適した精度を有していた。
【００４４】
（マイクロＲＮＡマイクロアレイ解析）
マイクロＲＮＡマイクロアレイ解析はmiRCURY LNATMTM microRNA Array 6th generation（EXIQON社製）及びGenePix（登録商標）4000B（Sunnyvale社製）を用いて行った。それぞれのハイブリダイゼーションシグナルの相対蛍光強度をMicroarray Data Analysis Tool Ver3.2（Filgen社製）により評価し、マイクロＲＮＡの発現量を調べた。
【００４５】
次に、上記９例中８例の進行大腸がん患者を、治療効果有りの患者（無増悪生存期間が１５０日以上、若しくは追加化学療法無しで、全生存期間が３００日以上の患者）と、治療効果無しの患者（無増悪生存期間が９０日未満、若しくは全生存期間が２１０日未満の患者）との二群に分けて、がん組織に発現しているマイクロＲＮＡの発現量（がん部ｍｉＲ発現量）を比較し、Ｆｉｓｈｅｒ比により順位化した。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2015213492.tif 000003
【００４７】
さらに、治療効果有り、無しの患者で発現量に差があったマイクロＲＮＡのうち、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-224-5pの各マイクロＲＮＡの発現量の高低で、上記９例の進行大腸がん患者を二群に分け、Kaplan-Meier法により全生存率を求め、二群の全生存期間の差をlog-rank検定により比較検討した。発現量の高低で患者を二群に分ける際の基準となるカットオフ値は、上記９例の進行大腸がん患者におけるがん組織に発現しているマイクロＲＮＡの発現量のほぼ平均値であり、かつ２群間の症例数のばらつきが少ない数値とした。また、全生存期間は最初にエピトープペプチドを投与した日から患者が亡くなった日で計算した。各マイクロＲＮＡの発現量の平均値、標準偏差、中央値、カットオフ値、log-rank検定結果を表３に、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-224-5pの発現量と全生存期間との関係を図１〜６に示す。
【００４８】
【表３】
2015213492.tif 000004
【００４９】
図１、２、６に示すように、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-224-5pの発現量が多い（相対蛍光強度がカットオフ値以上）症例においては、発現量が少ない（相対蛍光強度がカットオフ値未満）症例と比較して全生存期間が長いことが明らかとなった。また、図３〜５に示すように、hsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5pの発現量が少ない（相対蛍光強度がカットオフ値未満）症例においては、発現量が多い（相対蛍光強度がカットオフ値以上）症例と比較して全生存期間が長いことが明らかとなった。このように上記マイクロＲＮＡにおいては、発現量の高低で予後に差が確認され、マイクロＲＮＡの発現量とがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果との関連が示された。
【００５０】
したがって、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-224-5pはペプチドワクチン療法の効果を予測するバイオマーカーであり、かかるマイクロＲＮＡの発現量を調べることで、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能であることが明らかとなった。また、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-224-5pの発現量が少ない症例、又はhsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5pの発現量が多い症例においてはペプチドワクチン療法の効果が低いことから、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-224-5pに対して増強作用を有する化合物、あるいはhsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5p、に対して拮抗作用を有する化合物を用いることにより、ペプチドワクチン療法の効果が高まると考えられる。
【実施例２】
【００５１】
［第ＩＩ相試験（ＰＩＩ）を行った症例の探索的解析を行った症例の探索的解析］
（がん患者に対する療法）
切除不能進行大腸がん患者に対する１次療法として２００９年２月から２０１２年１１月まで、標準化学療法であるＦＯＬＦＯＸ療法(n=93)（Schmoll HJ, et all, J Clin Oncol(2012) 30:3588-3595)又はＸＥＬＯＸ療法(n=3)（Yagyu R et all, Int J Oncol(2004) 25:1343-8)にペプチドワクチン療法を上乗せする併用療法（第ＩＩ相試験（ＰＩＩ））を合計９６名に行った。この試験はヘルシンキ宣言に従っており、国立大学法人山口大学の倫理審査委員会により承認された。また、患者からはインフォームドコンセントを得た。ペプチドワクチン療法に用いるエピトープペプチドは実施例１と同様の５種類のエピトープペプチドを用い、それぞれ３ｍｇを１．５ｍｌの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）Montanide ISA51（Seppci社製）に混合し、週１回の皮下投与を１３週間、その後２週間に１度の皮下投与を続けた。
【００５２】
（患者におけるＨＬＡ−Ａ*２４０２の有無）
本療法は、患者がＨＬＡ−Ａ*２４０２を有するか否かを患者ならびに主治医に知らせず、生物学的二重盲検試験とした。ＨＬＡ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ法により各患者がＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有するか否かを調べ、５０例が試験療法群（本試験で使用したエピトープペプチドの効果が認められる、ＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有する患者群：HLA-A*2402+）、４６例が対照群（本試験で使用したエピトープペプチドの効果が認められない、ＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有しない患者群：HLA-A*2402-）であったことが後のキーオープンで判明した。これらの患者のうち、腫瘍組織中のマイクロＲＮＡを２６例（試験療法群１６例、対照群１０例）で解析可能であり、マイクロＲＮＡの発現量を実施例１と同様の方法で調べた。
【００５３】
次に、試験療法群(HLA-A*2402+)１６例のうちの１３患者を長期生存患者（ペプチドワクチン療法開始後、３年以上生存した患者）と短期生存患者（ペプチドワクチン療法開始後、２年以内に亡くなった患者）との二群に分けて、がん組織に発現しているマイクロＲＮＡの発現量（がん部ｍｉＲ発現量）を比較し、Ｆｉｓｈｅｒ比により順位化した。結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
2015213492.tif 000005
【００５５】
さらに、試験療法群（HLA-A*2402+:１６例）、対照群（HLA-A*2402-:１０例）、全症例（ALL:２６例）それぞれの患者を、表５に示す各マイクロＲＮＡの発現量の高低で二群に分け、Kaplan-Meier法により全生存率を求め、二群の全生存期間の差をlog-rank検定により比較検討した。発現量の高低で患者を二群に分ける際の基準となるカットオフ値は、全症例（ALL:２６例）におけるがん組織に発現しているマイクロＲＮＡの発現量のほぼ中央値とした。また、全生存期間は最初にエピトープペプチドを投与した日から患者が亡くなった日で計算した。各マイクロＲＮＡの発現量の中央値、カットオフ値、log-rank検定結果を表５に、各マイクロＲＮＡの発現量と全生存期間との関係を図７〜１４に示す。
【００５６】
【表５】
2015213492.tif 000006
【００５７】
図７、１０に示すように、試験療法群(HLA-A*2402+)において、hsa-miR-1184、hsa-miR-659-3pの発現量が少ない（相対蛍光強度がカットオフ値未満）症例においては、発現量が多い（相対蛍光強度がカットオフ値以上）症例と比較して全生存期間が長いことが明らかとなった。また、図８、９、１１〜１４に示すように、試験療法群(HLA-A*2402+)において、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR135b-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23cの発現量が多い（相対蛍光強度がカットオフ値以上）症例においては、発現量が少ない（相対蛍光強度がカットオフ値未満）症例と比較して全生存期間が長いことが明らかとなった。一方、図７〜１４に示すように、対照群（HLA-A*2402-）においては、各マイクロＲＮＡの発現量によって全生存期間への影響はほとんどみられなかった。このように上記マイクロＲＮＡにおいては、ＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有する試験療法群(HLA-A*2402+)にのみ発現量の高低で予後に差が確認され、それぞれのマイクロＲＮＡの発現量と、ペプチドワクチン療法の効果との関連が示された。
【００５８】
したがって、hsa-miR-1184、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-659-3p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR135b-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23cはペプチドワクチン療法の効果を予測するバイオマーカーであり、かかるマイクロＲＮＡの発現量を調べることで、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能であることが明らかとなった。また、hsa-miR-1184、hsa-miR-659-3pの発現量が多い症例、又はhsa-miR-20b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR135b-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23cの発現量が少ない症例においてはペプチドワクチン療法の効果が低いことから、hsa-miR-1184、hsa-miR-659-3pに対して拮抗作用を有する化合物、あるいはhsa-miR-20b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR135b-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23cに対して機能増強作用を有する化合物を用いることにより、ペプチドワクチン療法の効果が高まると考えられる。
【実施例３】
【００５９】
（第Ｉ相試験（ＰＩ）を行った症例の探索的解析によって求めたマイクロＲＮＡの第ＩＩ相試験（ＰＩＩ）を行った症例への応用）
第Ｉ相試験（ＰＩ）を行った９症例の探索的解析によって求めた３０のマイクロＲＮＡの発現量のカットオフ値に基づき、第ＩＩ相試験（ＰＩＩ）を行った試験療法群（HLA-A*2402+:１６例）、対照群（HLA-A*2402-:１０例）、全症例（ALL:２６例）それぞれの患者を二群に分け、Kaplan-Meier法により全生存率を求め、二群の全生存期間の差をlog-rank検定により比較検討した。hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-125b-3pの発現量の平均値、標準偏差、中央値、カットオフ値、log-rank検定結果を表６に、上記各マイクロＲＮＡの発現量と全生存期間との関係を図１５〜１８に示す。なお、hsa-miR-196b-5pとhsa-miR-224-5pの発現量と全生存期間との関係については、図９、１３に示しているため、ここでは示していない。
【００６０】
【表６】
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【００６１】
表６や図１５〜１８に示すように、ＨＬＡ−Ａ*２４０２を保有する試験療法群(HLA-A*2402+)にのみ発現量の高低で予後に差が確認され、それぞれのマイクロＲＮＡの発現量と全生存期間との関係は、表３における第Ｉ相試験（ＰＩ）を行った９症例の解析結果と同じ傾向を示した。したがって、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-147b、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-125b-3pの発現量を調べることで、第Ｉ相試験（ＰＩ）を行った症例だけでなく、第ＩＩ相試験（ＰＩＩ）を行った症例に対しても、ペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能であることが明らかとなった。
【実施例４】
【００６２】
実施例１における第Ｉ相試験（ＰＩ）においてマイクロＲＮＡを解析可能であった９症例において、更に血漿中のマイクロＲＮＡを解析した。
【００６３】
上記９例の患者の血漿から実施例１と同様の方法でトータルＲＮＡの抽出及びマイクロＲＮＡマイクロアレイ解析を行い、血漿中のhsa-miR-486-5pの発現量を調べた。次に、図１９に示すように横軸に血漿中のhsa-miR-486-5pの発現量（相対蛍光強度）、縦軸に腫瘍組織中のhsa-miR-486-5pの発現量（相対蛍光強度）をプロットしたグラフを作成した。その結果、血漿中のhsa-miR-486-5pの発現量と腫瘍組織中のhsa-miR-486-5pの発現量とはきれいな相関があった。したがって、腫瘍組織だけでなく、血漿中のマイクロＲＮＡを測定することによって、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能であることが明らかとなった。血漿中のマイクロＲＮＡを測定すればよいことから、簡便且つ迅速にがん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、がん患者に対するペプチドワクチン療法の効果を予測することが可能であり、がんの治療分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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