(57)【要約】【課題】セルロースおよびデンプンの糖化ならびにその後のアルコール発酵を、高効率かつ低環境負荷である方法で行うことのできる方法を提供し、高効率、低コストおよび低環境負荷型のバイオマスエタノール製造法を確立することを課題とする。【解決手段】高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有し、さらに、広範な抗菌スペクトルを示す抗菌性物質を産生し、植物生長促進作用を有する、新規のパエニバチルス属の細菌を提供することで上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）セルロース分解能およびデンプン分解能を有し、
（ｂ）細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示し、
（ｃ）ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない、
パエニバチルス属に属する細菌またはその変異体。
【請求項２】
細菌および酵母以外の真菌が、植物病原菌類、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌、エスケリキア属およびフザリウム属のいずれかに属する菌の１種以上である、請求項１に記載の細菌もしくはその変異体。
【請求項３】
パエニバチルス属に属する細菌が、パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＰＵ−３７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０２）である、請求項１または２に記載の細菌またはその変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体の抗菌性抽出物。
【請求項５】
アセトニトリルを抽出溶媒として用いて製造された、請求項４に記載の抗菌性抽出物。
【請求項６】
低級アルコールを抽出溶媒として用いて製造された、請求項４に記載の抗菌性抽出物。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗菌性抽出物を含有する、抗菌組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体を培養することによって得られる、培養物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを含む、組成物。
【請求項１０】
さらに酵母を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体、酵母、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを含む、エタノール製造用キット。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養することを含む、セルロースおよび／またはデンプン分解物の製造方法。
【請求項１３】
セルロースおよび／またはデンプン分解物がグルコースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養することにより、セルロースおよび／またはデンプンをグルコースに変換する工程、
（ｂ）（ａ）で得たグルコースを含む培地中で、酵母を培養することにより、グルコースをエタノールに変換する工程、
を含むエタノールの製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体、および酵母を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養する工程を含む、エタノールの製造方法。
【請求項１６】
アセトニトリルを用いた抽出によって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法。
【請求項１７】
低級アルコールを用いた抽出によって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌もしくはその変異体、請求項８に記載の培養物または請求項４〜７のいずれか一項に記載の抗菌性抽出物を含有する農薬。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌もしくはその変異体、請求項８に記載の培養物または請求項４〜７のいずれか一項に記載の抗菌性抽出物を含有する種子消毒剤。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌または請求項８に記載の培養物を含有する植物生長促進剤。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌、請求項８に記載の培養物または請求項４〜７のいずれか一項に記載の抗菌性抽出物を含有する土壌改良剤。
【請求項２２】
請求項１８に記載の農薬により植物を処理する工程を含む、細菌または酵母以外の真菌による病害の防除方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の種子消毒剤により、種子を処理する工程を含む、種子消毒方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の植物生長促進剤により植物を処理する工程を含む、植物生長促進方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の土壌改良剤により土壌を処理する工程を含む、土壌改良方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに同定されたパエニバチルス属の微生物、該微生物により産生される抗菌性抽出物等、および該微生物を用いるエタノールの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスエタノールは、トウモロコシやサトウキビなどの植物由来バイオマスを原料として製造されたエタノールである。バイオマスに含まれる炭素は大気中のＣＯ２を植物が光合成により固定したものであり、燃焼により排出される量と植物により吸収される量が等しいことから（カーボンニュートラル）、バイオマスエタノールは再生可能なエネルギー資源として期待されている。
【０００３】
しかしながら、バイオマスエタノールの製造原料が食料と競合しうることから、稲藁等のソフトセルロースや廃材木質系バイオマスなどの非食料であるバイオマスを原料とする、バイオマスエタノールの生産技術の開発が強く望まれている。アルコール発酵によるエタノールの生産の前段階である、バイオマス原料の糖化は、現状においては多くの場合強酸による加水分解により行われており、その環境負荷が高いことも問題点として指摘されている。さらに、バイオマスエタノールは、日本国内では製造コストが高く、いまだ試験製造段階にある。よって、食用価値の低い原料等を利用した、低コストおよび低環境負荷型の糖化技術の開発が望まれている。
【０００４】
ところで、種子消毒は、育苗期に発生する多くの病害を防ぐために重要な処理である。種子消毒には農薬が主に使用されているが、消費者の食に対する安全性意識の向上から、最近では農薬や化学肥料を使用しない有機栽培が消費者から歓迎されている。また、生産者にとっても農作物の付加価値が向上するため、その生産量は年々増加している。農薬としてカウントされない有機栽培農法に使用できる種子消毒方法は、温湯消毒と微生物農薬（エコホープ、タフブロック）の２種類に限られている。しかしながら、温湯消毒は温度管理が難しく、正確に熱処理を行うためには特別な装置が必要である。一方、微生物農薬は適用できる作物の範囲が狭く、イネを中心に使用されている。よって、幅広い作物に適用できる微生物農薬の開発が望まれている。
【０００５】
本発明者らは、これまでに、強固な結晶構造を有するキチンを効率良く分解することのできる新規なパエニバチルス属の微生物を同定し、開示した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５４４７７６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、セルロースおよびデンプンの糖化ならびにその後のアルコール発酵を、高効率かつ低環境負荷である方法で行うことのできる技術を開発し、低コストおよび低環境負荷型のバイオマスエタノール製造法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有する新規のパエニバチルス属の細菌を同定した。また、本発明者らは、当該細菌のスクリーニングの過程で、当該細菌が広い抗菌スペクトルを有する抗菌性物質を産生することを見出した。さらに、該抗菌性物質は酵母に対しては抗菌性を示さないことも見出した。当該パエニバチルス属細菌と酵母を共培養するか、あるいは連続的に培養することで、当該パエニバチルス属細菌の産生する抗菌性物質によりコンタミネーションを抑制しつつ、該細菌によるセルロースおよびデンプンの糖化ならびに酵母によるアルコール発酵を効率的に行うことができた。
さらに本発明者らは、当該細菌が、土壌中の難溶性リン化合物の可溶化（植物へのリンの供給）、植物生長ホルモンの産生、シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制（植物もシデロフォアを産生可能）、シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌、植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害、窒素固定などにより、植物に対する生長促進効果を有することを見出した。
また、広い抗菌スペクトルを有する抗菌性物質を産生する当該細菌を、種子消毒剤、農薬、土壌改良剤などとしても使用し得ることを見出した。
【０００９】
以上の知見に基づき本発明が完成された。即ち、本発明は以下の通りである。
［１］  （ａ）セルロース分解能およびデンプン分解能を有し、
（ｂ）細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示し、
（ｃ）ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない、パエニバチルス属に属する細菌またはその変異体。
［２］  細菌および酵母以外の真菌が、植物病原菌類、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌、エスケリキア属およびフザリウム属のいずれかに属する菌の１種以上である、［１］に記載の細菌もしくはその変異体。
［３］  パエニバチルス属に属する細菌が、パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＰＵ−３７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０２）である、［１］または［２］に記載の細菌またはその変異体。
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体の抗菌性抽出物。
［５］  アセトニトリルを抽出溶媒として用いて製造された、［４］に記載の抗菌性抽出物。
［６］  低級アルコールを抽出溶媒として用いて製造された、［４］に記載の抗菌性抽出物。
［７］  ［４］〜［６］のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する、抗菌組成物。
［８］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体を培養することによって得られる、培養物。
［９］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを含む、組成物。
［１０］  さらに酵母を含む、［９］に記載の組成物。
［１１］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体、酵母、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを含む、エタノール製造用キット。
［１２］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養することを含む、セルロースおよび／またはデンプン分解物の製造方法。
［１３］  セルロースおよび／またはデンプン分解物がグルコースである、［１２］に記載の方法。
［１４］  （ａ）［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養することにより、セルロースおよび／またはデンプンをグルコースに変換する工程、
（ｂ）（ａ）で得たグルコースを含む培地中で、酵母を培養することにより、グルコースをエタノールに変換する工程、
を含むエタノールの製造方法。
［１５］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体、および酵母を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養する工程を含む、エタノールの製造方法。
［１６］  アセトニトリルを用いた抽出によって、［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法。
［１７］  低級アルコールを用いた抽出によって、［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法。
［１８］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌もしくはその変異体、［８］に記載の培養物または［４］〜［７］のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する農薬。
［１９］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌もしくはその変異体、［８］に記載の培養物または［４］〜［７］のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する種子消毒剤。
［２０］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌または［８］に記載の培養物を含有する植物生長促進剤。
［２１］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌、［８］に記載の培養物または［４］〜［７］のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する土壌改良剤。
［２２］  ［１８］に記載の農薬により植物を処理する工程を含む、細菌または酵母以外の真菌による病害の防除方法。
［２３］  ［１９］に記載の種子消毒剤により、種子を処理する工程を含む、種子消毒方法。
［２４］  ［２０］に記載の植物生長促進剤により植物を処理する工程を含む、植物生長促進方法。
［２５］  ［２１］に記載の土壌改良剤により土壌を処理する工程を含む、土壌改良方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有し、広範な抗菌スペクトルを有する抗菌性物質を産生する、新規のパエニバチルス属の細菌が提供される。該細菌を用いることで、食用価値の低いセルロース原料またはデンプン原料を含む、多様な原料からグルコースを産生することができ、さらに該グルコースはエタノール製造のための原料とすることができる。また、該細菌は抗菌性物質を産生するため、エタノール製造工程の効率化を図ることが可能となり、さらに、該抗菌性物質はそれ自体農業資材や医薬品としても有用に活用しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、セルロース分解能を有する微生物のスクリーニング方法を示す図である。
【図２】図２は、デンプン分解能を有する微生物のスクリーニング方法を示す図である。
【図３】図３は、新規に同定されたＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物の、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を利用した分子系統解析の結果を示す図である。当該微生物は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＦＰＵ−３７として示される。
【図４】図４は、ＦＰＵ−３７株由来セルラーゼのセルロースによる発現誘導、およびその局在を示した図である。
【図５】図５は、ＦＰＵ−３７株由来アミラーゼのデンプンによる発現誘導、およびその局在を示した図である。
【図６】図６は、様々な植物病原菌類に対するＦＰＵ−３７株の抗菌活性を示す図である。
【図７】図７は、アセトニトリルによるＦＰＵ−３７株の抽出物に抗菌活性があること、および該抗菌活性を示す物質の産生が結晶性セルロースおよび真菌の添加によって誘導されることを示す図である。
【図８】図８は、アセトニトリルまたはブタノールによるＦＰＵ−３７株の抽出物の抗菌スペクトルを示す図である。
【図９】図９は、ＦＰＵ−３７株および酵母を使用した、大麦のアルコール発酵試験の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＦＰＵ−３７株によるイネ（コシヒカリ）の苗に対する生長促進効果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＦＰＵ−３７株によるトマト苗に対する生長促進効果を示す図である。（すでに生長促進効果が確認されていた土壌細菌１０−１株およびＩＫ−５株と効果を比較した）
【図１２】図１２は、ＦＰＵ−３７株の有機酸による難溶性リン酸塩の可溶化能力試験の結果を示す図である。Ｐｉｋｏｖｓｋａｙａ’Ａｇａｒ上に、ＦＰＵ−３７株の菌体周辺に明確な溶解斑が形成され、難溶性リン化合物の可溶化能力が確認された。
【図１３】図１３は、ＦＰＵ−３７株のシデロフォアの産生試験の結果を示す図である。シデロフォア検定培地上で明確な青の消色の消失が確認されたことから、ＦＰＵ−３７株のシデロフォア産生能力が確認された。
【図１４】図１４は、ＦＰＵ−３７株の高いシアン化水素（ＨＣＮ）産生能力を示す図である。
【図１５】図１５は、ＦＰＵ−３７株のキチン分解活性を検証した結果を示す図である。キチン含有培地上においてハローが形成されなかったことから、ＦＰＵ−３７株はキチン分解能力がないと判定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、
（ａ）セルロース分解能およびデンプン分解能を有し、
（ｂ）細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示し、
（ｃ）ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない、
パエニバチルス属に属する細菌またはその変異体を提供する。
【００１３】
本明細書中に記載の化合物は、その全ての異性体をも包含する。
【００１４】
本発明のパエニバチルス属に属する細菌（以下、本発明の細菌と略記する場合がある）またはその変異体は、セルロースおよびデンプンを単糖または少糖類へ分解し得る。すなわち、本発明の細菌またはその変異体は、セルロースおよびデンプンを糖化する活性を有する。本発明の細菌またはその変異体によるセルロースの分解は、セルロース分子内部をランダムに切断するエンド型の分解様式、またはセルロース分子の末端から切断してセロビオースを産生するエキソ型の分解様式であり得る。当該分解反応は細胞内で起きてもよいし、細胞外で起きてもよい。当該分解産物の例として、単糖であるグルコース、二糖であるセロビオース、および３糖〜６糖のオリゴ糖を産生し得る。当該分解産物は、好ましくはグルコース、セロビオースまたは３糖であり、より好ましくはグルコースである。
また、デンプンの分解は、その構成分子であるアミロース分子およびアミロペクチン分子をランダムに切断するエンド型の分解様式、ならびに／またはアミロースおよびアミロペクチン分子の末端から切断してマルトースもしくはグルコースを産生するエキソ型の分解様式であり得る。エンド型の分解活性を示すアミラーゼはα−アミラーゼ、エキソ型の分解活性を示しマルトースを産生するアミラーゼはβ−アミラーゼ、エキソ型の分解活性を示しグルコースを産生するアミラーゼはグルコアミラーゼと呼ばれる。後述するように、本発明の細菌が産生するアミラーゼは、α−アミラーゼの触媒ドメインとβ−アミラーゼの触媒ドメインの両方を有することから、好ましい分解様式としては、エンド型の分解様式、およびエキソ型の分解によりマルトースを産生する分解様式が例示される。さらに、本発明の好ましいデンプン分解様式として、本発明のアミラーゼによりデンプンからマルトースが産生された後、該マルトースをα−グルコシダーゼにより分解しグルコースを産生する分解様式が例示される。これらデンプンの分解反応は、細胞内で起きてもよいし、細胞外で起きてもよい。デンプンの分解産物としては、例えば、単糖であるグルコース、二糖であるマルトース、および３〜６糖のオリゴ糖が挙げられる。当該分解産物は、好ましくはグルコース、マルトースまたは３糖であり、より好ましくはグルコースである。
【００１５】
本発明の細菌またはその変異体が有するセルラーゼの代表例として配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ、それをコードするポリヌクレオチドの例として配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号２のセルラーゼ遺伝子は、パエニバチルス・ポリミクサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）のβ−１．４−グルカナーゼと高い相同性を示し、糖質加水分解酵素のファミリー５に分類される触媒ドメイン（ＧＨ５）、Ｎ末端側に分泌シグナル配列、およびＣ末端側に糖質結合モジュールであるｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ（ＣＢＭ）のファミリー３（ＣＢＭ３）ドメインを有する。本発明の細菌またはその変異体が産生するセルラーゼは、セルロースの添加により発現が誘導され、培養上清中に分泌される、基質誘導型の分泌酵素であり得る。
【００１６】
本発明の細菌またはその変異体が有するアミラーゼの代表例として配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ、それをコードするポリヌクレオチドの例として配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４のアミラーゼ遺伝子は、パエニバチルス・ポリミクサのβ／α−アミラーゼと高い相同性を示し、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有している。さらに、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、Ｎ末端側にβ−アミラーゼの触媒ドメイン（ＧＨ１４）および２つのＣＢＭ２５を有し、Ｃ末端側にはα−アミラーゼの触媒ドメイン（ＧＨ１３）およびＣＢＭの一種であるＡａｍｙ−Ｃモジュールを有するため、α−アミラーゼ活性およびβ−アミラーゼ活性の両方を示すと考えられる。本発明の細菌またはその変異体が有するアミラーゼポリペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対し、１、２、３または４個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失がなされた、α−アミラーゼ活性およびβ−アミラーゼ活性を有するポリペプチド、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明の細菌が産生するアミラーゼは、デンプンの添加により発現が誘導され、培養上清中に分泌される、基質誘導型の分泌酵素であり得る。
【００１７】
本発明の細菌またはその変異体が有するα−グルコシダーゼの代表例として配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ、それをコードするポリヌクレオチドの例として配列番号６で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号６のα−グルコシダーゼ遺伝子は、糖質分解酵素ファミリー３１（ＧＨ３１）に分類される酵素である。本発明の細菌が産生するα−グルコシダーゼは、細胞内に局在する酵素であり得る。
【００１８】
本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明の細菌またはその変異体のマーカーとして有用である。本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼのポリヌクレオチドは、本発明の細菌またはその変異体を検出するための核酸プローブを作製するために用いることができ、また、本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼのポリペプチドは、本発明の細菌またはその変異体を検出するための抗体を作製するために用いることができる。該プローブおよび抗体は、本発明の細菌またはその変異体を同定するために好適に使用し得る。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼまたはα−グルコシダーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに該ベクターにより形質転換された形質転換体も提供し得る。
【００２０】
本発明の細菌またはその変異体は、他の細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示す。当該他の細菌および酵母以外の真菌は、本発明の細菌またはその変異体が示す抗菌活性によって、死滅または増殖が抑制される。具体例としては、植物病原微生物やヒト病原微生物（例えば、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌およびフザリウム属の菌）等が挙げられ、より具体的には、トマト葉かび病菌（Ｆｕｌｖｉａ  ｆｕｌｖｕｍ（Ｃｏｏｋｅ）Ｃｉｆｅｒｒｉ）、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、オオムギ赤かび病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、イチゴ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ）、トマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓｃｈｅｃｈｔｅｎｄａｌ  ｆ．ｓｐ．Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、サトイモ乾腐病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓｃｈｅｃｈｔｅｎｄａｌ  ｆ．ｓｐ．Ｃｏｌｏｃａｓｉａｅ）、キュウリつる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、イネばか苗病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、スイカつる枯病菌（Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ  ｂｒｙｏｎｉａｅ）、スイカ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、ダイズ紫斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ）、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（旧学名Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ））、および軟腐病（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）等の植物病原菌類の菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ等のブドウ球菌属の細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ等の連鎖球菌属の細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ等の腸球菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエスケリキア属の細菌、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ等の白癬菌類、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ等のカンジダ症起因菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のクリプト��ッカス症起因菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ等の淋菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等の髄膜炎菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ等の赤痢菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ等のサルモネラ菌、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ等のコレラ菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等の緑膿菌、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ等の百日咳菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等のインフルエンザ菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の結核菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ等の破傷風菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ等のジフテリア菌、ならびにＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（完全（有性）世代：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）等のフザリウム属の菌が挙げられる。本発明の細菌またはその変異体は、少なくともこれらの菌から選択される１種に対して、好ましくは全てに対して抗菌活性を有する。
【００２１】
本明細書中、「抗菌活性」とは、菌を殺す活性および菌の増殖を抑制する活性を意味する。
【００２２】
本発明の細菌またはその変異体は、近縁種である、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊａｍｉｌａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ、およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓと異なり、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない。ゼラチン分解能は、ゼラチンを含有する培地に細菌を接種したときに、固化していたゼラチンを室温で溶解する能力を意味する。硝酸塩還元能は、硝酸塩を含有する培地で細菌の培養を行い、還元反応により亜硝酸を生成する能力を意味する。当業者であれば、公知の方法によりゼラチン分解能および硝酸塩還元能の試験を容易に行うことができる。あるいは、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を試験するための市販のキット（例えば、ＡＰＩ２０Ｅキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，  Ｌｙｏｎ，  Ｆｒａｎｃｅ））なども好適に使用し得る。本発明の細菌は、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していないことを特徴の一つとする。
【００２３】
その他、本発明の細菌またはその変異体の特徴の例として、以下が挙げられる。
・細胞形態が桿状で周鞭毛を持ち、活発な運動性を有する。
・コロニーが白色に近いクリーム色を呈する（培地により多少異なる）。
【００２４】
更なる局面において、本発明の細菌は、土壌中の難溶性リン化合物の可溶化（植物へのリンの供給）能力、植物生長ホルモンの産生能力、シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制能力（植物もシデロフォアを産生可能）、シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌能力、植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害能力、窒素固定能力を有するという特徴を有する。
【００２５】
（難溶性リン化合物の可溶化能力）
本発明の細菌は、難溶性リン化合物を可溶化できる。
リンは、植物の必須元素の一つであり、核酸、リン脂質、ＮＡＤＰ、ＡＴＰなどの構成元素として重要な役割を担っている。土壌に含まれる細菌の一部は、有機酸により、土壌中に含まれるリン酸カルシウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸鉄などの難溶性リン化合物を可溶化することができる。理論に束縛されないが、本発明の細菌も、難溶性リン化合物の可溶化することができ、可溶化されたリンを植物に供給することができるため、植物生長促進作用を有すると考えられる。
【００２６】
（植物生長ホルモンの産生能力）
本発明の細菌は、植物生長ホルモンであるインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を産生できる。インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）は、植物生長ホルモン（オーキシン）の１つである。理論に束縛されないが、本発明の細菌は、ＩＡＡを産生することにより、植物の生長促進効果を有すると考えられる。
【００２７】
（シデロフォアの産生能力）
シデロフォア（Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ）とは、細菌や菌類が分泌する鉄キレーターである。シデロフォアは、環境中の微量の鉄と結合して機能する。理論に束縛されないが、本発明の細菌は、シデロフォアを産生し、環境中の鉄を奪うことにより植物病原微生物の増殖を抑制することができると考えられる。
【００２８】
（シアン化水素の産生能力）
本発明の細菌は、シアン化水素（ＨＣＮ）を産生する。理論に束縛されないが、シアン化水素（ＨＣＮ）の産生により、植物病原微生物の殺菌が行われるため、植物の生長促進効果を有すると考えられる。
【００２９】
（エチレンの生合成阻害能力）
メチオニン→Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）→１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）→エチレンという経路を通じて、エチレンは合成される。本発明の細菌はＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を有しており、ＡＣＣの添加により増殖速度が増加する。
一般的に、エチレンは、生長を阻害し、花芽形成や萌芽を抑制する。理論に束縛されないが、本発明の細菌はＡＣＣを分解する作用を有するため、植物の生長を促進することができると考えられる。
【００３０】
（窒素固定能力）
窒素固定とは、空気中に多量に存在する安定な窒素分子を、アンモニア、硝酸塩、二酸化窒素などの無機窒素化合物に変換するプロセスをいう。本発明の細菌は、ニトロゲナーゼ（フラボドキシン）遺伝子を有しており、窒素非含有培地で増殖することができる。
従って、理論に束縛されないが、本発明の細菌は、窒素固定能力を有し、土壌中に窒素化合物を供給できるため、植物の生長を促進することができると考えられる。
【００３１】
本発明の細菌の特徴として、キチン分解活性を有さないことも挙げられる。本発明の細菌は、キチン分解酵素（キチナーゼ）遺伝子を有さず、キチン含有培地上で培養した際にハローを形成しない。
【００３２】
好ましい態様において、本発明の細菌は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８０２で表されるパエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＰＵ−３７株である。当該細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成２６年２月２０日）。
【００３３】
本発明の細菌またはその変異体は、好ましくは、単離された細菌である。「単離された」とは、天然材料からの細菌の分離がなされることで、天然に存在する場合よりも高い純度であることを意味する。本発明の細菌またはその変異体が単離されたものである場合、その純度は、含有される菌全体の個数に対して、５０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％である。
【００３４】
本発明の細菌は、本発明の細菌の変異体であり得る。該変異体は、本発明の細菌に由来する菌株である限り特に限定されないが、例えば、形態学的特徴、染色性、増殖性、栄養要求性、遺伝学的特徴、生理学的特徴、および生化学的特徴等において、本発明の細菌と１以上の同様の性質を示し、かつ本発明の細菌の所望の性質を保持している菌株であり得る。該所望の性質としては、セルラーゼ分解能、デンプン分解能、抗菌活性、植物生長促進作用、難溶性リン化合物の可溶化能、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）産生能、シデロフォア産生能、シアン化水素（ＨＣＮ）産生能、エチレン生合成阻害能、窒素固定能が挙げられる。あるいは、該変異体は、該所望の性質を発揮するために必要な本発明の細菌由来の遺伝子（例、本発明の細菌のセルラーゼおよびアミラーゼの遺伝子等）を、他の宿主細胞に導入することによって作製することもできる。
【００３５】
本発明の細菌の変異体は、本発明の細菌に自体公知の変異原処理を行い、親株と同等もしくはそれ以上の所望の効果を有する菌株を選抜することにより得ることができる。セルラーゼ分解能は、例えば後述の実施例に記載される方法を用いて試験することができるが、それらに限定されず、自体公知のいかなる方法を用いてもよい。
本発明の変異体は、例えば、本発明の細菌を改変処理することにより作製できる。このような改変処理としては、例えば、変異原性物質等の存在下での培養、本発明の細菌の有用性を高め得る遺伝子の導入、本発明の細菌の有用性を高め得る遺伝子（例、Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｐｙｒｕｖｉｃ  ａｃｉｄ  （ＩＰＡ）の生合成系遺伝子群、Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  生合成遺伝子、Ｆｅ３＋−ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子、１−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  （ＡＣＣ）  ｄｅａｍｉｎａｓｅ遺伝子、窒素固定遺伝子（ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ  ＝  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ）、抗生物質産生系遺伝子群、酵素などのタンパク質の生合成能力を高めることを目的としたリボソームの高機能化など遺伝子）の機能改変、および本発明の細菌が保有する遺伝子の破壊、ならびにこれらの操作の組合せなどが挙げられる。本発明はまた、このような作製方法を提供する。
ここで変異原としては、例えば、アルキル化剤（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等）、ヌクレオチド塩基類似体（ブロモウラシル等）、ニトロソ化合物、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、放射線、紫外線等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、当該変異体は、所望の効果（例えば、セルラーゼ分解能、デンプン分解能、抗菌活性または生長促進作用）が親株と比較して増大しているか、あるいはそれらの効果については同等であるが、例えば広いｐＨレンジで増殖可能、増殖速度が早い、低温下でも増殖可能などの他の有利な効果を奏する菌株などである。
【００３６】
得られた変異体が抗菌性物質を産生しているか否かは自体公知の方法により検証することができる。
例えば、ＡＭ寒天培地上に変異体の培養液をスポットしたペーパーディスクをおよび何もスポットしていないペーパーディスクを置き、植物病原菌をそれぞれに植菌し、２８℃で培養することにより試験できる。何もスポットしていないペーパーディスクと比較して、変異体の培養液をスポットしたペーパーディスク上での該植物病原菌数が少ない場合、該変異体は該植物病原菌に対して抗菌活性を有する。
【００３７】
得られた変異体が植物生長促進作用を有しているか否かは自体公知の方法により検証することができる。
例えば、変異体が難溶性リン化合物を可溶化することができるか否かは、例えば、リン酸カルシウムを懸濁させたＰｉｋｏｖｓｋａｙａ寒天培地上で培養し、コロニーを形成させ、ハロー（ｈａｌｏ−ｚｏｎｅ）形成の有無を調べることにより試験することができる。難溶性リン化合物の可溶化することができる変異体である場合、変異体のコロニー周囲に、リン酸カルシウムの溶解によりハロー（ｈａｌｏ−ｚｏｎｅ）が形成される。
【００３８】
変異体がインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を産生できるか否かは、例えば、ｓａｌｋｏｗｓｋｉ’ｓ試験によって評価することができる。
変異体がシデロフォアを産生するか否かは、例えば、Ｃｈｒｏｍｅ  Ａｚｕｒｏｌ  Ｓ−鉄錯体を用いた呈色反応によって試験することができる。
変異体がシアン化水素（ＨＣＮ）を産生するか否かは、例えば、ピクリン酸−炭酸ナトリウム試験紙によって試験することができる。
変異体がエチレンの生合成を阻害するか否かは、例えば、ＡＣＣデアミナーゼ活性を測定することによって評価することができる。
変異体が窒素固定するか否かは、例えば、ニトロゲナーゼ活性を測定することによって評価することができる。
【００３９】
本発明の細菌またはその変異体は、パエニバチルス属細菌全般の培養に用いられる自体公知の方法により培養することができる。当業者であれば培養に使用する培地を適宜選択可能であるが、培地の例としては、Ｍ９培地（最少培地）、ＫＬ培地、ＢＨＩ培地、２ＹＴ培地、ＹＰＤ培地、ＡＭ３培地、ＬＢ培地等が挙げられる。本発明の細菌は窒素固定能力を有するため、窒素を含まない培地で培養することもできる。培養時間や培養スケールなどは、当該培養物の用途等に応じて適宜設定することができる。培養温度は、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２８〜３７℃であり、最も好ましくは３７℃である。また、培地は、好ましくは、ｐＨ３〜１０に調節される。
本発明の細菌またはその変異体の培養は、例えば、試験管、培養フラスコ等の培養器に一定量の培地を入れ、本発明の細菌またはその変異体を接種し、試験管振とう機、シンプロカルシェーカー、ロータリーシェーカー等を用い、好気条件下で３０〜４２℃にて振とう培養により行うことができる。より大規模な培養は、数Ｌ規模のジャーファーメンターや数１００Ｌ〜数１００ｔ規模の工業的タンク等の大規模培養槽を用いての通気攪拌培養にて行うことができる。培養時間は特に制限はない。
【００４０】
本発明は、本発明の細菌またはその変異体の抗菌性抽出物を提供する。該抗菌性抽出物は、本発明の細菌またはその変異体に由来するものであれば、どのような方法により抽出されたものであってもよい。当該方法は、例えば、本発明の細菌またはその変異体を含む培養液を遠心分離に供し、該細菌をペレットにし、アセトニトリルまたは低級アルコール等の有機抽出溶媒に該細菌を再懸濁した液を抗菌性抽出物とすることができ、あるいは、アセトニトリルまたは低級アルコール等の有機抽出溶媒に懸濁した後にさらに遠心分離に供し、その上清を抗菌性抽出物とすることもできる。本明細書中、「低級アルコール」とは、炭素数１〜５のアルコールを意味し、好ましい低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびペンタノールが挙げられ、より好ましくはブタノールである。
【００４１】
当該抗菌性抽出物は、抗菌性物質を含むことにより、植物病原微生物やヒト病原微生物（例えば、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌およびフザリウム属の菌）等、より具体的には、トマト葉かび病菌（Ｆｕｌｖｉａ  ｆｕｌｖｕｍ（Ｃｏｏｋｅ）Ｃｉｆｅｒｒｉ）、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）、オオムギ赤かび病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、イチゴ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｃｕｔａｔｕｍ）、トマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓｃｈｅｃｈｔｅｎｄａｌ  ｆ．ｓｐ．Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、サトイモ乾腐病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  Ｓｃｈｅｃｈｔｅｎｄａｌ  ｆ．ｓｐ．Ｃｏｌｏｃａｓｉａｅ）、キュウリつる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、イネばか苗病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、スイカつる枯病菌（Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ  ｂｒｙｏｎｉａｅ）、スイカ炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、ダイズ紫斑病菌（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｋｉｋｕｃｈｉｉ）、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（旧学名Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ））、および軟腐病（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）等の植物病原菌類の菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ等のブドウ球菌属の細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ等の連鎖球菌属の細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ等の腸球菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエスケリキア属の細菌、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ等の白癬菌類、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ等のカンジダ症起因菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のクリプトコッカス症起因菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ等の淋菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等の髄膜炎菌、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅ��ｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ等の赤痢菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ等のサルモネラ菌、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ等のコレラ菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等の緑膿菌、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ等の百日咳菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等のインフルエンザ菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等の結核菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ等の破傷風菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ等のジフテリア菌、ならびにＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（完全（有性）世代：Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）等のフザリウム属の菌から選択される少なくとも１種の菌に対して抗菌活性を有する。
【００４２】
また、当該抗菌性抽出物は、抽出に使用した溶媒の種類に応じて、異なる菌に対して抗菌活性を示し得る。例えば、アセトニトリルを使用して抽出した抗菌性抽出物は、植物病原菌類およびフザリウム属の菌に対して抗菌活性を有し得、低級エタノールを使用して抽出した抗菌性抽出物は、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、およびエスケリキア属の菌に対して抗菌活性を有し得る。
【００４３】
当該抗菌性抽出物は、広範囲の細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示すため、農薬や医薬品、種子消毒剤、土壌改良剤等に好適に使用し得る。
【００４４】
当該抗菌性抽出物が農薬として使用される場合、対象となる農作物としては、例えば、イネ、大麦、トマト、スイカ、キュウリ、イチゴ、サトイモ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイ、テンサイ、サトウキビ、ナス、ピーマン、メロン、カボチャ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、タマネギ、ネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス、ゴボウ、レタス、シュンギク、ニンジン、ホウレンソウ、オクラ、リンゴ、ナシ、ウメ、ブドウ、カキ、イチジク、キウイなどが挙げられる。
【００４５】
当該抗菌性抽出物が医薬品として使用される場合、ヒトおよび他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、経口的または非経口的に安全に投与することができる。該医薬品は、細菌感染症および真菌感染症に対して治療効果を有し得る。当該感染症の具体例として、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌またはフザリウム属の菌に感染したことにより発症する感染症などが挙げられる。
【００４６】
一態様において、本発明は、上記抗菌性抽出物を含有する抗菌組成物を提供する。該抗菌組成物は、上記本発明の抗菌性抽出物を有効成分として含むものであれば、該抗菌性抽出物の効果を損なわないその他の多糖、オリゴ糖、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、無機化合物、有機化合物、およびミネラルなどの成分を含有してもよい。また、該抗菌組成物は、所望の効果を損なわないものであれば、希釈剤、賦形剤、安定化剤、保存剤などの生理学的に許容される担体を更に含んでいてもよい。該抗菌組成物中に含まれる、本発明の抗菌性抽出物の含有量は、抽出方法や用途等に応じて適宜調整できるが、例として、０．１〜１００（ｗ／ｗ）％であり得る。
【００４７】
本発明の抗菌組成物は、広範な抗菌スペクトルを示すことから、殺菌剤等の農薬、抗生物質等の医薬品、種子消毒剤、土壌改良剤等として好適に使用し得る。あるいは、上記抽出操作をせずに本発明の細菌またはその変異体を生物農薬、種子消毒剤、土壌改良剤等として使用することもできる。
【００４８】
本発明の抗菌組成物が農薬として使用される場合、および本発明の細菌またはその変異体を生物農薬として使用する場合、対象となる農作物としては、例えば、イネ、大麦、トマト、スイカ、キュウリ、イチゴ、サトイモ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイ、テンサイ、サトウキビ、ナス、ピーマン、メロン、カボチャ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、タマネギ、ネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス、ゴボウ、レタス、シュンギク、ニンジン、ホウレンソウ、オクラ、リンゴ、ナシ、ウメ、ブドウ、カキ、イチジク、キウイなどが挙げられる。
【００４９】
本発明の抗菌組成物が医薬品として使用される場合、ヒトおよび他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、経口的または非経口的に安全に投与することができる。該医薬品は、細菌感染症および真菌感染症に対して治療効果を有し得る。当該感染症の具体例として、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌またはフザリウム属の菌に感染したことにより発症する感染症などが挙げられる。
【００５０】
別の態様において、本発明は、本発明の細菌またはその変異体を培養することによって得られる培養物を提供する。本明細書中、「培養物」は、培養された菌体および培養上清を意味する。
【００５１】
該培養物は、上記した本発明の抗菌性抽出物および抗菌組成物の製造に有用である。該培養物には、α−グルコシダーゼも含有されると考えられるので、マルトースを分解しグルコースを産生する目的にも好適に使用し得る。また、該培養物は、後述する、本発明のセルロースおよび／またはデンプン分解物の製造方法、本発明のエタノール製造方法、ならびに本発明の抗菌性抽出物の製造方法に用いることができる。本発明の細菌またはその変異体は、長期培養による自己消化（オートリシス）により培養上清中にα−グルコシダーゼを遊離するので、マルトースを分解しグルコースを産生するために、該培養上清を用いることもできる。
【００５２】
また、上記、本発明の培養物は、本発明の細菌またはその変異体により産生されたセルラーゼおよびアミラーゼを含有すると考えられるので、セルロースやデンプンの糖化に好適に使用し得る。
【００５３】
当業者であれば当該培養に使用する培地を適宜選択可能であるが、培地の例としては、Ｍ９培地（最少培地）、ＢＨＩ培地、２ＹＴ培地、ＹＰＤ培地、ＡＭ３培地、ＬＢ培地等が挙げられる。培養時間や培養スケールなどは、当該培養物の用途等に応じて適宜設定することができる。培養温度は、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２８〜３７℃であり、最も好ましくは３７℃である。また、培地は、好ましくは、ｐＨ３〜１０に調節される。
【００５４】
本発明の細菌またはその変異体を培養することによって得られる培養物は、例えば、当該培養物を水もしくは適当な希釈液（例えば、等張緩衝液や培地等）で適切な菌体濃度となるまで希釈することができる。あるいは、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を回収し、適当な分散媒（例えば、等張緩衝液や新鮮培地等）に再懸濁することもできる。さらに、回収した菌体を常法により凍結乾燥することもできる。あるいはまた、培養物に１０〜２０％のグリセロールを添加して−８０℃で凍結保存し、用時融解して培地等に再懸濁して用いることもできる。また、当該細菌は芽胞（内生胞子）を形成するが、芽胞は熱や乾燥などの環境変化に対して耐性を示し長期間安定に保存できるので、芽胞の形態で製品化し、用時発芽させ菌体を増殖させてもよい。
一方、所望の効果をもたらす有効物質が菌体外（培養上清）に分泌される場合は、培養上清をそのままで、あるいは濃縮もしくは希釈して使用することもできる。
【００５５】
（農薬）
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物を含有する農薬（本明細書中、本発明の農薬ともいう）を提供する。本発明の農薬は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物または細菌もしくはその変異体が抗菌活性を有する植物病原微生物に起因する病害に対して、防除効果を有する。
本発明の農薬の対象となる農作物の例としては、上記に記載のとおりであるが、所望の効果を有する限り、上記に限定されるものではない。
【００５６】
所望の効果を有する限り、本発明の農薬により農作物を処理する方法は特に制限されない。例えば、対象とする農作物に、水性溶媒で希釈した本発明の農薬をスプレーヤーにより散布してもよく、対象とする農作物が生育する土壌に本発明の農薬を直接混和するか水等に懸濁した本発明の農薬を用いて潅注処理してもよい。
本発明の農薬を用いて農作物を処理する場合、本発明の農薬で農作物を直接処理してもよく、本発明の農薬で農作物に接触し得る物質（例、農業用水、防根透水シート等）を間接的に処理してもよい。さらには、一実施態様において、農作物に接触し得る物質をあらかじめ本発明の農薬で処理し、続いて本発明の農薬を除去してから、該物質を使用することもできる。
本発明の農薬を散布することにより農作物を処理する場合、農薬の量は、使用土壌約５リットルあたり散布が液体であれば、１００〜５００ｍｌ適用することが好ましく、その菌体濃度は散布液体１ｍｌあたり通常１０３〜１０６ｃｆｕである。
本発明の農薬により農作物を処理するタイミングは、所望の効果を有する限り特に制限されず、任意のタイミングで使用することができる。
本発明の農薬の施用頻度に対しては特に制限はない。本発明の農薬により植物を処理する前および後において、通常の方法で植物を栽培することができる。
【００５７】
本発明の農薬に本発明の細菌の変異体を用いる場合、該変異体は、抗菌性物質を生成する細菌であることが好ましい。
【００５８】
（種子消毒剤）
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物を含有する種子消毒剤（本明細書中、本発明の種子消毒剤ともいう）を提供する。本発明の種子消毒剤は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物または細菌が抗菌活性を有する植物病原微生物に対して、防除効果を有する。
【００５９】
本発明の種子消毒剤は、種子、種もみ、種芋、球根などの消毒に使用することができる。
【００６０】
本発明の種子消毒剤は、所望の効果を損なわない限り、従来公知の種子消毒方法により使用され得る。
種子を消毒する方法としては湿粉衣、浸漬、吹付け、塗沫などの方法があるが、これらに限定されない。一実施態様として、本発明の種子消毒剤は、液状である本発明の種子消毒剤に種子を浸す浸漬法に用いられる。別の実施態様としては、粉末状の本発明の種子消毒剤を種子にまぶす粉衣法に用いられる。浸漬法は種子の浸種前処理、種子の催芽処理時のいずれにおいても、用いることができる。また粉衣法は、乾燥種子に用いることができる。また別の実施形態として、本発明の種子消毒剤は、表面を湿らせた種子に本発明の種子消毒剤を付着させて用いることができる。
【００６１】
種子消毒を行う場合には、種子質量に対して製剤を２〜５０質量％適用することが好ましく、その菌体濃度は種子質量１ｇあたり通常１０３〜１０９ｃｆｕである。
浸漬法により種子消毒を行う場合、例えば、種子を本発明の種子消毒剤０．５時間から４８時間、好ましくは１時間から２４時間、浸潤させることにより種子消毒を行うことができる。
【００６２】
本発明の種子消毒剤に本発明の細菌の変異体を用いる場合、該変異体は、抗菌性物質を生成する細菌であることが好ましい。
【００６３】
（植物生長促進剤）
本発明の一実施形態として、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物を含む植物生長促進剤（本明細書中、本発明の植物生長促進剤ともいう）を提供する。
本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物は、土壌中の難溶性リン化合物の可溶化（植物へのリンの供給）、植物生長ホルモンの産生、シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制（植物もシデロフォアを産生可能）、シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌、植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害、窒素固定などにより、植物に対する生長促進効果を有する。
【００６４】
本発明の植物生長促進剤の対象となる植物としては、ナス科植物（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ等）、マメ科植物（インゲン、ダイズ、ラッカセイ、ササゲ、アズキ等）、アブラナ科植物（ハクサイ、カブ、キャベツ、ダイコン、アブラナ等）、イネ科植物（イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ等）、ウリ科植物（キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ、トウガン等）、ユリ科植物（チューリップ、ユリ、タマネギ、アスパラガス、ネギ、ニラ、ニンニク等）、ミカン科植物（特に柑橘類：ウンシュウミカン、ユズ、レモン、ブンタン、イヨカン、ハッサク、グレープフルーツ等）を挙げることができ、中でも好ましい例としてナス科植物、およびイネ科植物を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６５】
所望の効果を有する限り、本発明の植物生長促進剤により植物を処理する方法は特に制限されない。例えば、対象とする植物に、水性溶媒で希釈した本発明の植物生長促進剤をスプレーヤーにより散布してもよく、対象とする植物が生育する土壌に本発明の植物生長促進剤を直接混和するか水等に懸濁した本発明の植物生長促進剤を用いて潅注処理してもよい。
植物生長促進剤を直接土壌に混和することにより植物生長促進処理を行う場合には、使用土壌約５リットルあたり散布が液体であれば、１００〜５００ｍｌ適用することが好ましく、その菌体濃度は散布液体１ｍｌあたり通常１０３〜１０９ｃｆｕ、好ましくは１０４〜１０８ｃｆｕである。
【００６６】
本発明の植物生長促進剤の施用頻度に対しては特に制限はない。本発明の植物生長促進剤を使用する前および後において、通常の方法で植物を栽培することができる。
【００６７】
本発明の植物生長促進剤に本発明の細菌の変異体を用いる場合、該変異体は、難溶性リン化合物の可溶化能力、植物生長ホルモンの産生能力、シデロフォアの産生能力、シアン化水素の産生能力、エチレンの生合成阻害能力、窒素固定能力および抗菌性物質の産生能力から成る群より選ばれる少なくとも１つ以上の能力を有する細菌であることが好ましく、より好ましくは２つ以上、さらに好ましくは３つ以上、最も好ましくは７つの能力を有する細菌である。
【００６８】
（土壌改良剤）
本発明の一実施形態として、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物を含む、土壌改良剤（本明細書中、本発明の土壌改良剤ともいう）を提供する。
本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物は、植物に対する生長促進効果を有し、抗菌作用を有するため、土壌改良剤として使用することができる。本発明の抗菌性抽出物および抗菌組成物もまた抗菌作用を有するため、土壌改良剤として使用することができる。
本明細書において、土壌は、土耕栽培に用いる土等の固形培地、養液栽培等に用いる液体培地、または半流動培地を含む。本明細書中、土壌改良剤とは、土壌の、物理性または化学性を改良する作用を有する剤を指す。本発明の土壌改良剤は、土耕栽培用土壌、養液土耕栽培用土壌、および養液栽培（水耕栽培、噴霧耕、固形培地耕）用土壌のいずれにも使用され得る。
土壌改良の例としては、病原性の低い土壌への改良、生長促進作用を有する土壌への改良、防腐作用を有する土壌への改良などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
所望の効果を有する限り、本発明の土壌改良剤により土壌を処理する方法は特に制限されない。例えば、本発明の土壌改良剤を土壌に直接混和してもよく、本発明の土壌改良剤を水等に懸濁した後に潅注処理してもよい。養液栽培または水耕栽培の場合、本発明の土壌改良剤を培養液または水耕液へ直接添加してもよい。本発明の一実施形態において、あらかじめ本発明の土壌改良剤により土壌を処理し、その後本発明の土壌改良剤を除去した土壌を、植物の栽培に使用することもできる。土壌改良剤の除去は、例えばろ過膜によるろ過等によって行われ得るが、所望の効果を有する限りこれに限定されない。
本発明の一実施態様において、本発明の土壌改良剤により、養液栽培用の液体培地を処理することにより、細菌および酵母以外の真菌に対する防腐効果を液体培地に与えることができる。
【００７０】
本発明の土壌改良剤を用いて土壌改良を行う場合には使用土壌約５リットルあたり散布が液体であれば、１００〜５００ｍｌ適用することが好ましく、その菌体濃度は散布液体１ｍｌあたり通常１０３〜１０９ｃｆｕ、好ましくは１０４〜１０８ｃｆｕである。
【００７１】
本発明の土壌改良剤を散布するタイミングは、所望の効果を有する限り特に制限されず、植物の播種前、植物の育種中などの任意のタイミングで使用することができる。
本発明の土壌改良剤の施用頻度に対しては特に制限はない。
【００７２】
本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤は、所望の効果を損なわないものであれば、粉剤、粒剤、水和剤、顆粒水和剤（ドライフロアブル）、フロアブル剤（懸濁剤）、乳剤、エマルション、マイクロカプセル剤などの様々な剤形で提供され得る。
【００７３】
本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤は、所望の効果を損なわないものであれば、有効成分に加え、担体を含んでも良い。使用できる担体としては、農薬または種子消毒剤に常用されるものであれば、固体または液体のいずれでも使用でき特定のものに限定されるものではない。
固体担体としては、鉱物系担体（クレー、タルク、炭酸カルシウム、けいそう土、ゼオライト、ベントナイト、酸性白土、活性白土、アタパルガスクレー、バーミキュライト、パーライト、軽石、珪砂、シリカ、ホワイトカーボン、二酸化チタンなど）、植物系担体（木質粉、トウモロコシ茎（穂軸）、クルミ殻（堅果外皮）、果実核、モミガラ、オガクズ、ふすま、大豆粉、粉末セルロース、デンプン、デキストリン、糖類（グルコース、マルトース、ラクトース、シュークロースなど）などの不活性な粉体または粒状物、寒天などの水溶性高分子ゲルなどや塩素化ポリエチレン、塩素化ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体、尿素−アルデビド樹脂などの種々のポリマー粉末）などが挙げられる。
また、液体担体としては、水、アルコール類、多価アルコール類、多価アルコール誘導体類、ケトン類、エステル類、含窒素担体類、油脂類などが挙げられ、具体的には、エタノール、イソプロパノール、シクロヘキサノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレン系グリコールエーテル、シクロヘキサノン、γ―ブチロラクトン、脂肪酸メチルエステル（ヤシ油脂肪酸メチルエステル）、二塩基酸メチルエステル（コハク酸ジメチルエステル，グルタミン酸ジメチルエステル、アジピン酸ジメチルエステル）、Ｎ―アルキルピロリドン、ヤシ油、大豆油、菜種油などが挙げられる。
【００７４】
本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤は、所望の効果を損なわないものであれば、界面活性剤、乳化剤、粉砕助剤、結合助剤、滑助剤、溶解助剤、懸濁分散助剤、粉末化助剤、液性調整剤、増粘剤、崩壊分散剤、酸化防止剤、拡展剤、展着剤、湿潤剤、安定化剤、乾燥剤、紫外線吸収剤、ドリフト防止剤、アジュバント、物理性改良剤、有効成分安定化剤または凍結防止剤などを含んでも良い。
また、本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤には、有効成分に加え、他の殺菌成分、殺虫成分、植物生育調節成分が含まれていてもよい。
【００７５】
さらに、本発明は、本発明の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを含む、組成物を提供する。
【００７６】
本発明の組成物に含まれるセルロースおよび／またはデンプンとしては、セルロースおよび／またはデンプンを含有するものであればいかなるものも使用可能である。食用農作物の価格の高騰を防ぐ観点から、食料供給と競合しないセルロースおよび／またはデンプン原料を使用するのが好ましい。食料供給と競合しない原料としては、農作物の非可食部分（例えば、サトウキビ搾汁後のバガス、稲藁等のソフトセルロース、トウモロコシの茎）や木質廃材が好適な例として挙げられる。また、食用価値の低い農作物（例えば、規格外農産物、資源作物、大麦、および食品廃棄物等）も、原料として好適に用い得る。入手しやすさの観点から、大麦粉末、コーンスターチ等の市販のデンプン原料や、結晶性セルロース等の精製品も好適に使用し得る。本発明の組成物中のセルロースおよび／またはデンプンの含有量は、セルロース原料の種類、デンプン原料の種類、該組成物の使用目的等に応じて適宜設定することができる。
【００７７】
本発明の組成物に含まれる微生物の含有量は、その使用目的等に応じて適宜設定することができる。
【００７８】
本発明の組成物は、本発明の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを有効成分として含むものであれば、さらに、所望の効果を損なわないその他の多糖、オリゴ糖、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、無機化合物、有機化合物、およびミネラルなどの成分を含有してもよい。また、該組成物は、所望の効果を損なわないものであれば、希釈剤、賦形剤、安定化剤、保存剤などの生理学的に許容される担体を更に含んでいてもよい。
【００７９】
本発明の組成物は、後述する、本発明のセルロースおよび／またはデンプン分解物の製造方法、ならびに本発明のエタノール製造方法に好適に用いることができる。
【００８０】
本発明の組成物は、さらに酵母を含有し得る。本明細書中、「酵母」は、アルコール発酵を行うことのできる酵母を意味し、好ましい例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓが挙げられる。当該酵母を含む本発明の組成物は、後述する、本発明のエタノールの製造方法に好適に用いることができる。
【００８１】
本発明の組成物を、細菌が生育可能な適切な条件下でインキュベートすることによって、セルロースおよび／またはデンプンの分解が進み、結果としてグルコース、セロビオース、マルトース、および３糖〜６糖のオリゴ糖等を得ることができ、さらに酵母によるアルコール発酵に供することで、エタノールを製造することができる。本発明の細菌またはその変異体は、広範な微生物に対して抗菌活性を示すため、コンタミネーションを抑制しつつセルロースおよび／またはデンプンの分解を行うことが可能で、かつ、酵母に対しては抗菌活性を示さないので、該分解工程後の糖溶液をそのままアルコール発酵に使用可能である。従って、本発明は、本発明の細菌またはその変異体、酵母、ならびにセルロースおよび／またはデンプンを含む、エタノール製造用キットも提供し、該キットを用いれば、効率的にエタノールを製造することができる。
【００８２】
一態様において、本発明は、本発明の細菌またはその変異体を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養することを含む、セルロースおよび／またはデンプンの分解物の製造方法を提供する。この培養を行うことで、本発明の細菌またはその変異体によってセルロースおよび／またはデンプンが糖化され、培地中にグルコース、セロビオース、マルトース、および３糖〜６糖のオリゴ糖などの分解物が生じる。
【００８３】
当該製造方法における、本発明の細菌またはその変異体の定義、好ましいセルロースおよび／またはデンプン原料については上記に準じる。
【００８４】
当該製造方法における培養の方法は、本発明の細菌またはその変異体によるセルロースおよび／またはデンプンの糖化が可能であれば特に制限されない。使用し得る培地としては、例えば、Ｍ９培地（最少培地）、ＢＨＩ培地、２ＹＴ培地、ＹＰＤ培地、ＡＭ３培地、ＬＢ培地等が挙げられる。培養温度は、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは２８〜３７℃であり、最も好ましくは３７℃であり、培地は、好ましくは、ｐＨ３〜１０に調節される。培養時間や培養スケールなどは、当該培養によって得られる分解物の使用目的等に応じて適宜設定することができる。
【００８５】
「セルロースおよび／またはデンプンの分解物」は、セルロースの分解物、デンプンの分解物、またはこれら分解物の混合物を意味する。当該製造方法によって得られる分解物の糖鎖の大きさは特に限定されないが、例えば、単糖であるグルコース、二糖であるセロビオースおよびマルトース、３〜６糖のオリゴ糖等が挙げられる。該分解物は、好ましくはグルコースである。
【００８６】
さらに、本発明は、
（ａ）本発明の細菌またはその変異体を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養することにより、セルロースおよび／またはデンプンをグルコースに変換する工程、
（ｂ）（ａ）で得たグルコースを含む培地中で、酵母を培養することにより、グルコースをエタノールに変換する工程、
を含むエタノールの製造方法を提供する。
【００８７】
上記（ａ）の工程における、本発明の細菌またはその変異体の定義、好ましいセルロース原料およびデンプン原料、好ましい培地および培養方法は上記に準じる。培養時間については、少なくとも、セルロース原料およびデンプン原料をグルコースにまで分解し、必要量のグルコースを得るのに要する時間であることが好ましい。当該培養時間は、使用するセルロース原料およびデンプン原料の種類や量、培養スケール等に応じて適宜設定可能である。
【００８８】
上記（ｂ）の工程において用いられる酵母は、アルコール発酵を行うことのできる酵母であれば特に制限されないが、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｒｉａｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓである。
【００８９】
該酵母の培養は、アルコール発酵に適した条件で行われるのであれば、特に制限されないが、例えば、酵母を増殖させる必要がある場合の培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２８℃であり、発酵を行う際の温度は１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃、より好ましくは１５℃であり得る。また、培地のｐＨは、好ましくはｐＨ３〜１０、より好ましくはｐＨ４．９に調節し得る。使用し得る培地の種類は上記に準じる。
【００９０】
上記（ａ）および（ｂ）の工程は、同時に行うことも可能である。即ち、本発明は、本発明の細菌またはその変異体、および酵母を、セルロースおよび／またはデンプンを含有する培地中で培養する工程を含む、エタノールの製造方法も提供する。
【００９１】
本発明のエタノールの製造方法においては、デンプン原料のα化をしなくてもデンプン原料の糖化を効率的に行うことができるため、原料の前処理を簡略化することができる。また、本発明の細菌は広範な微生物に対し抗菌活性を示すことから、原料の滅菌処理を省いたとしてもコンタミネーションを抑制しつつ原料の糖化を行うことが可能で、滅菌処理に要する大きなエネルギーを節約することができる。従って、本発明のエタノールの製造方法は、原料の前処理や滅菌処理の工程を省略し、低コストかつ低環境負荷型のエタノール製造方法を提供することができる。一方で、本発明の細菌またはその変異体は、酵母に対しては抗菌活性を示さないので、糖化処理後の培養液をそのまま酵母によるアルコール発酵に使用するか、あるいは本発明の細菌またはその変異体と酵母とを共培養し、原料の糖化処理とアルコール発酵を同時進行で行うことも可能である。
【００９２】
上記方法により製造されたエタノールは、当業者に公知の方法により精製し、燃料等の所望の用途に使用することができる。
【００９３】
他の態様において、本発明は、アセトニトリルを用いた抽出または低級アルコールを用いた抽出によって、本発明の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法を提供する。
【００９４】
当該方法は、例えば、本発明の細菌またはその変異体を含む培養液を遠心分離に供し、該細菌をペレットにし、アセトニトリルまたは低級アルコールに該細菌を再懸濁した液を抗菌性抽出物とすることができ、あるいは、アセトニトリルまたは低級アルコールに懸濁した後にさらに遠心分離に供し、その上清を抗菌性抽出物とすることもできる。アセトニトリルを用いた抽出および低級アルコールを用いた抽出は単独で行ってもよいし、あるいは連続して行ってもよい。連続して行う場合は、アセトニトリル抽出および低級アルコール抽出のいずれを先に行ってもよい。
【００９５】
当該方法により得られた抗菌性抽出物は、広範囲の細菌および酵母以外の真菌に対し抗菌活性を示す。該細菌および酵母以外の真菌については上記に準じる。よって、該抗菌性抽出物は、農薬や医薬品等に好適に使用し得る。
【００９６】
当該抗菌性抽出物が農薬として使用される場合、対象となる農作物としては、例えば、イネ、大麦、トマト、スイカ、キュウリ、イチゴ、サトイモ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイ、テンサイ、サトウキビ、ナス、ピーマン、メロン、カボチャ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、タマネギ、ネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス、ゴボウ、レタス、シュンギク、ニンジン、ホウレンソウ、オクラ、リンゴ、ナシ、ウメ、ブドウ、カキ、イチジク、キウイなどが挙げられる。
【００９７】
当該抗菌性抽出物が医薬品として使用される場合、ヒトおよび他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、経口的または非経口的に安全に投与することができる。該医薬品は、細菌感染症および真菌感染症に対して治療効果を有し得る。当該感染症の具体例として、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌またはフザリウム属の菌に感染したことにより発症する感染症などが挙げられる。
【００９８】
（防除方法）
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物を含有する農薬（本明細書中、本発明の農薬ともいう）により植物を処理する工程を含む、細菌および酵母以外の真菌による病害の防除方法を提供する。使用する本発明の農薬の濃度、対象となる農作物、散布方法、使用頻度などは、本発明の農薬について記載したものに準ずる。
【００９９】
（種子消毒方法）
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物により、種子を処理する工程を含む、種子消毒方法を提供する。種子消毒の方法については、種子消毒剤について記載したものに準ずる。
【０１００】
（植物生長促進方法）
本発明の一実施形態として、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物により植物を処理する工程を含む、植物生長促進方法を提供する。
方法については、植物生長促進剤について記載したものに準ずる。
【０１０１】
（土壌改良方法）
本発明の一実施形態として、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物により土壌を処理する工程を含む、土壌改良方法を提供する。
土壌改良方法については、土壌改良剤について記載したものに準ずる。
【０１０２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【０１０３】
（実施例１）セルロース分解能およびデンプン分解能を有する新規微生物のスクリーニング
１．セルロース分解能を有する微生物の選別（図１）
まず、稲藁の粉末を唯一の炭素源として含む最少培地を作製した。稲藁粉末は、稲藁をハサミで約３〜５ｃｍの長さに切り、７０℃の乾燥機で一週間程乾燥させた後、ミキサーで粉末状になるまで粉砕することで得た。７％稲藁培地は、１００ｍＬのＭ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４；６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４；３ｇ、ＮａＣｌ；０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ；１ｇを蒸留水に溶解し１Ｌとすることで作製した）、および７ｇの稲藁粉末をボトルに入れて、オートクレーブ（１２１℃、２０分）し、冷却後に滅菌済みの１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を１ｍＬおよび１Ｍ  ＭｇＳＯ４を１ｍＬ添加することで作製した。
稲藁培地に、福井県内外の４０箇所よりサンプリングされた土壌を加え、セルロース分解能を有する微生物を同定すべく集積培養を繰り返した。該土壌に含まれる酵母は、セルロースの分解により生成したグルコースを利用して発酵し、二酸化炭素を発生するため、二酸化炭素の発泡を指標に目的とする微生物を濃縮した（図１Ａ）。
さらに、コンゴレッドとカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を添加した寒天培地上に微生物を播種し、溶解斑の大きさを指標に微生物の選抜を行った（図１Ｂ）。
こうして、高いセルロース分解能を有する微生物を選別した。
【０１０４】
２．デンプン分解能を有する微生物の選別（図２）
蒸留水１Ｌと六条大麦粉末（福井大麦倶楽部、石挽、βｇ）５０ｇを混合した溶液にサンプリング土壌約３００ｇを添加して混ぜ、室温（約２３℃）で４日間静置培養した。六条大麦粉末１０ｇと蒸留水２００ｍＬを混合し、乳酸を使用してｐＨを２．５〜３．０に調整した培地を新たに作製し、前記培養液を５ｍＬ添加し、５０℃で３日間静置培養した。培地のｐＨを低くすることによって雑菌の繁殖を抑え、培地の腐敗を防ぐことができる。その後、１００μＬの培養液を、６．２５％（ｗ／ｖ）六条大麦液体培地（０．５ｇの六条大麦と蒸留水８ｍＬを混合し、１２１℃で２０分間オートクレーブすることで作製した）（約ｐＨ５．６）の入った試験管に添加した（図２、１次スクリーニング）。
デンプン分解酵素（アミラーゼ）を産生する微生物は、デンプンの分解産物である二糖（マルトース）の資化性（代謝能力）が高いと考え、マルトースを唯一の炭素源とする最少寒天培地上での増殖速度を指標にし、大きなコロニーを形成する微生物を選抜した（図２、２次スクリーニング）。マルトース含有寒天培地は、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＮａＣｌ、１ｇのＮＨ４Ｃｌ、１５ｇのＡｇａｒを蒸留水５００ｍＬに溶解後、１２１℃で２０分間オートクレーブし、冷却後に別個に滅菌した、２０ｇマルトース水和物を溶解した５００ｍＬの水溶液、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を１ｍＬ、および１Ｍ  ＭｇＳＯ４を１ｍＬ混合し、シャーレに流入することで作製した。
さらに、デンプン質を豊富に含んでいる六条大麦粉を添加した最少寒天培地上で、溶解斑の大きさを指標にし、デンプン糖化能の高い微生物を選抜した（図２、３次スクリーニング）。六条大麦寒天培地への植菌の際は、なるべく形状の異なるコロニーを選択して植菌した。六条大麦寒天培地は、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＮａＣｌ、１ｇのＮＨ４Ｃｌ、２０ｇの六条大麦粉末、１５ｇのＡｇａｒを蒸留水１Ｌに溶解後、１２１℃で２０分間オートクレーブし、冷却後に別個に滅菌した、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２を１ｍＬ、および１Ｍ  ＭｇＳＯ４を１ｍＬ混合し、シャーレに流入することで作製した。
３次スクリーニングで溶解斑を形成したシングルコロニーをそれぞれ２ＹＴ液体培地（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ  １６ｇ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ、およびＮａＣｌ  ５ｇを蒸留水に溶解し、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整後、蒸留水を加え１Ｌとし、１２１℃で２０分間オートクレーブすることで作製した）５ｍＬに植菌し、一晩前培養を行った。１％（ｗ／ｖ）コーンスターチを含有するＭ９液体培地１０ｍＬに、前培養液２０μＬを混合し、２８℃、１５０ｒｐｍで４日間振とう培養した。その後、培養液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、培養上清２０μＬをグルコース迅速比色定量法（Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２９（１１），１０２１−５）に供し、デンプンをグルコースに効率的に分解することができる微生物を同定した（図２、４次スクリーニング）。
【０１０５】
（実施例２）セルロース分解能およびデンプン分解能を有する新規微生物の同定試験
興味深いことに、上記のようにして選別された、高いセルロース分解能を有する微生物、および高いデンプン分解能を有する微生物は同じエリアからサンプリングされたものであった。そこで、両微生物の属（ｇｅｎｕｓ）を決定するために、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（約１．５ｋｂ）の塩基配列を利用して分子系統解析を行ったところ、これら微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は１００％一致した。さらに、両微生物の結晶性セルロース分解能、デンプン分解能、生理学的性質、生化学的性質、および形態学的特徴を比較した結果、これら微生物が同一の微生物であることが判明した。以下に、該微生物の特徴を列記する。
・細胞形態は桿状で周鞭毛を持ち、活発な運動性を有する。
・コロニーは白色に近いクリーム色を呈する（培地により多少異なる）。
・アミラーゼを産生する。
・グルカナーゼを産生する。
・細菌および真菌類に対する抗生物質を産生する。
・ゼラチンを加水分解しない。
・硝酸塩を還元しない。
また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を利用した分子系統解析の結果を図３に示す。分子系統解析の結果、当該微生物はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物であり、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の基準株（ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）であるＡＪ３２０４９３やＡＪ２７１１５７、ＡＢ６８０８９４、ＡＦ３９１１２３と遺伝子クラスターを形成していることが明らかになった（図３）。当該微生物は、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない点で前記近縁種とは異なることから、当該微生物をＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属の新種細菌と同定し、ＦＰＵ−３７株と命名した。
【０１０６】
（実施例３）ＦＰＵ−３７株の糖質分解酵素の同定
次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ）によるゲノムドラフト解析を行った結果、ＦＰＵ−３７株のゲノムサイズは約５．９Ｍｂｐであり、細菌としては比較的大きなゲノムサイズを有することが明らかとなった。すでにＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属で報告されている既知のセルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼの遺伝子配列に基づいて、ＦＰＵ−３７株のゲノム上に存在しているこれら遺伝子配列の相同性検索を行ったところ、それぞれ１種類の遺伝子がヒットした。
ＦＰＵ−３７株のセルラーゼ遺伝子（配列番号１）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａのβ−１．４−グルカナーゼと高い相同性を示し、糖質加水分解酵素（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ；ＧＨ）のファミリー５に分類される触媒ドメイン（ＧＨ５）、Ｎ末端側に分泌シグナル配列、およびＣ末端側に糖質結合モジュールであるｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ（ＣＢＭ）のファミリー３（ＣＢＭ３）ドメインを有することが明らかとなった。
ＦＰＵ−３７株のアミラーゼ遺伝子（配列番号３）は、パエニバチルス・ポリミクサのβ／α−アミラーゼと高い相同性を示し、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有していた。さらに、該アミラーゼ遺伝子は、Ｎ末端側にβ−アミラーゼの触媒ドメイン（ＧＨ１４）および２つのＣＢＭ２５を有し、Ｃ末端側にはα−アミラーゼの触媒ドメイン（ＧＨ１３）およびＣＢＭの一種であるＡａｍｙ−Ｃモジュールを有することが明らかとなった。よって、ＦＰＵ−３７株のアミラーゼ遺伝子は、α−アミラーゼ活性およびβ−アミラーゼ活性の両方を有すると考えられる。
また、ＦＰＵ−３７株のα−グルコシダーゼ遺伝子（配列番号５）は、糖質分解酵素ファミリー３１（ＧＨ３１）に分類される酵素であることが明らかとなった。
【０１０７】
（実施例４）ＦＰＵ−３７株のセルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼの局在と発現誘導
１．ＦＰＵ−３７株のセルラーゼの局在と発現誘導
（１）ＢＨＩ培地（３．７ｇのＢＨＩを蒸留水で溶解し１００ｍＬとした後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分）することで作製した）のみ、および（２）１％（ｗ／ｖ）スターチ、（３）１％（ｗ／ｖ）結晶性セルロース、または（４）１％（ｗ／ｖ）Ｆｕｓａｒｉｕｍ粉末を添加したＢＨＩ培地１００ｍＬをそれぞれ作製した。
ＢＨＩ液体培地２０ｍＬ中、３７℃で１日振とう培養したＦＰＵ−３７の前培養から、上記（１）〜（４）の培地にそれぞれ５ｍＬずつ培養液を添加し、３７℃で３日間旋回培養した。その後、これら培養液から１．５ｍＬずつをチューブに移し、遠心分離（１５０００回転、５分間）を行い、上清を新しいチューブに移した。該上清を以下の酵素反応に使用した。
氷上にて、１．５ｍＬチューブに基質溶液（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＰＮＰ−Ｇｌｕ）またはｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅ（ＰＮＰ−（Ｇｌｕ）２））４０μＬ、緩衝液（クエン酸緩衝液（ｐＨ５．６））３０μＬ、および酵素液（上記で得られた上清）３０μＬを加え、反応液を作製した。ネガティブコントロールとして、反応液を反応させず直ちに反応停止液（０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液）２００μＬ添加したものを作製した。反応液は３７℃で３時間反応させ、反応後直ちに氷上に移し、反応停止液を２００μＬ添加し反応を停止させた。
その後、９６ウェルプレートに反応液を２００μＬ／ｗｅｌｌとなるように移し、吸光プレートリーダーで４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
結果を図４に示す。結晶性セルロースを添加して培養した培養上清でのみセルラーゼ活性が認められたことから、ＦＰＵ−３７株のセルラーゼはセルロースにより発現誘導されることが明らかとなった。また、セルラーゼ活性の局在を調べたところ、該活性は、培養上清のみに認められた（図４Ｂ）。これらの結果より、ＦＰＵ−３７株のセルラーゼは、セルロースにより発現誘導され、細胞外へ分泌されることが明らかとなった。
【０１０８】
２．ＦＰＵ−３７株のアミラーゼの局在と発現誘導
２ＹＴ、２ＹＴ＋３％（ｗ／ｖ）可溶スターチ液体培地それぞれ２０ｍＬ中において、３０℃、１２０ｒｐｍでＦＰＵ−３７株を３日間振とう培養した。その後、それぞれの培養液から２ｍＬずつ分注し、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。沈殿している菌体に対して、懸濁用緩衝液（ＭＥＳ緩衝液（４８ｍＬ，１Ｍ，ｐＨ６．２）、ＥＤＴＡ２Ｎａ（２０ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ，０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む）を蒸留水で５００ｍＬとすることで作製した）をそれぞれ２ｍＬずつ加え、ボルテックスして沈殿を懸濁し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した後、さらに１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄し、懸濁用緩衝液をそれぞれ２ｍＬずつ加えボルテックスで沈殿を懸濁することで、菌体懸濁液を得た。
α−アミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社）を使用して、２ＹＴ培地または２ＹＴ＋３％（ｗ／ｖ）可溶スターチ培地から得られた、上記培養上清と菌体懸濁液のα−アミラーゼ活性を測定した（図５Ａ）。α−アミラーゼ活性は、ＦＰＵ−３７株の培養上清（図５Ａ、培養上清）において認められ、菌体懸濁液（図５Ａ、菌体画分）では活性が低かった。さらに、可溶スターチを添加した培養上清（図５Ａ、培養上清、デンプン＋）において、添加しないもの（図５Ａ、培養上清、デンプン−）と比べ、α−アミラーゼの活性が顕著に高いことから、デンプンの添加によりα−アミラーゼの発現が誘導されたことを確認した。
ＢＥＴＡ−ＡＭＹＬＡＳＥ  ＢＥＴＡＭＹＬ−３  ＡＳＳＡＹ  ＫＩＴ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ）を使用して、２ＹＴ培地または２ＹＴ＋３％（ｗ／ｖ）可溶スターチ培地から得られた、上記培養上清と菌体懸濁液のβ−アミラーゼ活性を測定した（図５Ｂ）。β−アミラーゼ活性は、培地に可溶スターチを添加したＦＰＵ−３７株の培養上清（図５Ｂ、培養上清、デンプン＋）において強く認められ、培地に可溶スターチを添加していないＦＰＵ−３７株の培養上清（図５Ｂ、培養上清、デンプン−）において弱いながらも認められ、菌体懸濁液（図５Ｂ、菌体画分）では活性が低かった。さらに、可溶スターチを添加した培養上清（図５Ｂ、培養上清、デンプン＋）において、添加しないもの（図５Ｂ、培養上清、デンプン−）と比べ、β−アミラーゼの活性が顕著に高いことから、デンプンの添加によりβ−アミラーゼの発現が誘導されたことを確認した。
【０１０９】
３．ＦＰＵ−３７株のα−グルコシダーゼの局在
２ＹＴ＋３％（ｗ／ｖ）可溶スターチ液体培地１０ｍＬ中において、３０℃でＦＰＵ−３７株を３日間振とう培養した。その後、培養液を１５ｍＬ容量のチューブに移し、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。沈殿している菌体に、ＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ  ８ｇ／Ｌ，  ＫＣｌ  ０．２ｇ／Ｌ，  Ｎａ２ＨＰＯ４×１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ／Ｌ，  ＫＨ２ＰＯ４０．２４ｇ／Ｌ）を１０ｍＬ加え、ボルテックスして菌体を洗浄した。この菌体懸濁液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した後、さらに８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を完全に廃棄した後、ＰＢＳ緩衝液を１０ｍＬ加え、ボルテックスで沈殿を懸濁することで、菌体懸濁液を得た。菌体液の１ｍＬを別のチューブに移し、残りの菌体液に１ｍｇ／ｍＬとなるように溶菌酵素リゾチームを添加し、３０℃で３０分間反応後、超音波破砕を行い、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清を細胞溶解液として用いた。
培養前の培地（コントロール）、培養上清（細胞外画分＝分泌酵素）、菌体懸濁液（菌体表層酵素）および細胞溶解液（菌体内酵素）のα−グルコシダーゼ活性は、サンプル０．５ｍＬに対して等量の３％マルトース水溶液を加えて３７℃で１時間反応後、グルコース迅速比色定量法（Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．，２９（１１），１０２１−５）によりグルコースの生成を指標に測定した。その結果、α−グルコシダーゼ活性は、細胞溶解液においてのみ検出された。
以上の結果より、ＦＰＵ−３７株のα−アミラーゼおよびβ−アミラーゼは、ともにデンプンの添加により発現誘導される菌体外酵素であり、α−グルコシダーゼは、細胞内に局在していることを確認した。
【０１１０】
（実施例５）ＦＰＵ−３７株が有する抗菌活性の解析
１．植物病原菌類に対する抗菌活性
本発明者らは、ＦＰＵ−３７株のスクリーニングの過程において、ＦＰＵ−３７株が周囲の微生物を排除する強力な抗菌活性を示すことを見出した。そこで、本発明者らは、農業上重要な植物病原菌類に対するＦＰＵ−３７株の抗菌活性を対峙培養により確認した（図６）。
ＡＭ３寒天培地上に、ＦＰＵ−３７株の培養液を４０μＬスポットしたペーパーディスクおよび何もスポットしていないペーパーディスクを置き、図６に示す植物病原菌をそれぞれ植菌し、２８℃で培養した。
ＦＰＵ−３７株は、いずれの植物病原菌に対しても強い抗菌活性を有することが示された。
２．抗菌性物質の局在と誘導
１％（ｗ／ｖ）結晶性セルロースを含有するＢＨＩ培地中で、ＦＰＵ−３７株を３日間培養した５００ｍＬの培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を１ｍＬ取ってフィルター滅菌し、培養上清サンプルとした。残りの上清は廃棄し、菌体にＰＢＳを２０ｍＬ加えて再懸濁した。該菌体懸濁液を遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分間）し、菌体量の５倍量のアセトニトリル（例：菌体１ｍｇに対してアセトニトリル５μＬ）を加え再懸濁した。その後、懸濁液を撹拌し（１４５ｒｐｍ、３０分間）、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を採取し、さらに該上清を遠心分離（８０００ｒｐｍ、５分間）し、その上清を採取した。当該上清をアセトニトリル抽出画分とした。
キュウリ病原菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）に対する抗菌活性を確認したところ、培養上清、培地のみ、およびコントロール（アセトニトリルのみ）においては、抗菌活性が確認されず、アセトニトリル抽出画分のみが抗菌活性を示した（図７Ａ）。この結果は、ＦＰＵ−３７株が産生する抗菌性物質が培養上清には分泌されず、菌体に付着していることを示している。
また、上記抗菌活性は、結晶性セルロースまたは真菌細胞壁（１％（ｗ／ｖ）Ｆｕｓａｒｉｕｍ粉末）を含有する培地でＦＰＵ−３７株を培養したときに誘導されることが明らかとなった（図７Ｂ）。
３．アセトニトリル抽出画分およびブタノール抽出画分の抗菌活性の解析
上記と同様の方法によりアセトニトリル抽出画分を得た。また、アセトニトリルの代わりにブタノールを使用すること以外は同様の方法によって、ブタノール抽出画分を得た。これら抽出画分の微生物に対する抗菌活性を解析した。
黄色ブドウ球菌、フザリウム属の菌、および酵母（公益財団法人  日本醸造協会、協会９０１号酵母を使用）に対する抗菌活性を確認したところ、アセトニトリル抽出画分はフザリウム属の菌のみに対して、ブタノール抽出画分は黄色ブドウ球菌のみに対して抗菌活性を示した（図８Ａ）。従って、ＦＰＵ−３７株は、少なくとも２種類の抗菌性物質を産生することが示唆された。また、該抗菌性物質は、酵母に対しては抗菌活性を示さないことが明らかとなった。この性質は、ＦＰＵ−３７株と酵母を共培養することを可能とし、セルロース原料および／またはデンプン原料から簡便かつ効率的にエタノールを製造することを可能にする。
さらに、ブタノール抽出画分の抗菌スペクトルを確認したところ、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に広く抗菌活性を示すことが明らかとなった（図８Ｂ）。
【０１１１】
（実施例６）ＦＰＵ−３７および酵母を用いたエタノール製造
ＦＰＵ−３７株はデンプンを効率よく糖化可能であり、酵母以外の広範な微生物に対し抗菌活性を示す強力な抗菌性物質を産生するので、この特徴を利用して、アミラーゼによるデンプン糖化に必要な原料のα化処理と滅菌処理を行わずに、デンプンを豊富に含む六条大麦粉をそのまま唯一の炭素源として用い、ＦＰＵ−３７株および酵母（協会酵母９０１号）による並行複発酵行った（図９）。
六条大麦粉７０ｇとＭ９培地１００ｍＬを混合し、乳酸でｐＨを４．９に調整しオートクレーブによる滅菌をせずに発酵培地として用いた。ＦＰＵ−３７株を２ＹＴ培地４００ｍＬ中で２日間（２８℃）培養し、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を廃棄し、乳酸でｐＨを４．９に調整したＭ９培地１０ｍＬを加え、菌体を懸濁し、該懸濁液１０ｍＬを上記発酵培地へ加えた。その後、２５℃の恒温槽中で２日間糖化処理を行った。ＹＰＤ培地４００ｍＬ中で２日間振とう培養（２８℃）した協会酵母９０１号を、５０００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、上清を廃棄し、乳酸でｐＨを４．９に調整したＭ９培地５ｍＬを加え、菌体を懸濁し、該懸濁液５ｍＬを上記糖化処理後の発酵培地へ加えた。１５℃の恒温槽中で、静置培養発酵を４０日間行った。発酵液を数日おきに採取し、ＭｉｌｌｉＱ水で１００倍希釈し、ガスクロマトグラフィーを使用してエタノール濃度を測定した。
図９に示すように、発酵培地中のエタノール濃度は、発酵開始から１９日間大きく上昇し、１９日目以降は上昇が緩やかとなった。ＦＰＵ−３７株を加えていない発酵培地においてもエタノール濃度の上昇が見られるが、これは六条大麦粉を加熱せずにそのまま使用したため、大麦由来のアミラーゼが失活せずに機能したためと考えられる。尚、オートクレーブ処理でα化した六条大麦粉を使用し、ＦＰＵ−３７株を発酵培地に加えなかった場合は、発酵培地に酵母を加えてもエタノールが検出されないことを確認している。また、ＦＰＵ−３７株が産生するα−グルコシダーゼは細胞内に局在するが、ＦＰＵ−３７株は溶菌しやすい細菌であるため、溶菌により培養液中にα−グルコシダーゼが放出され、ＦＰＵ−３７のアミラーゼにより産生されたマルトースをさらにグルコースに分解し、該グルコースから酵母がエタノールを産生したものと考えられる。
発酵開始４０日目で、ＦＰＵ−３７株を使用した場合の産生されたエタノールの濃度は４．８％で、ＦＰＵ−３７株を使用しなかった場合は、３．８％であった（図９）。よって、ＦＰＵ−３７株を用いることで、原料のα化処理および滅菌処理を行わずとも、効率的にエタノールを製造できることが示された。
【０１１２】
（実施例７）ＦＰＵ−３７株の種子消毒（雑菌抑制）効果
種子消毒は、育苗期に発生する多くの病害を防ぐために重要な処理である。種子消毒には農薬が主に使用されているが、消費者の食に対する安全性意識の向上から、最近では農薬や化学肥料を使用しない有機栽培が消費者から歓迎されている。また、生産者にとっても農作物の付加価値が向上するため、その生産量は年々増加している。農薬としてカウントされない有機栽培農法に使用できる種子消毒方法は、温湯消毒と微生物農薬（エコホープ、タフブロック）の２種類に限られている。しかしながら、温湯消毒は温度管理が難しく、正確に熱処理を行うためには特別な装置が必要である。一方、微生物農薬は適用できる作物の範囲が狭く、イネを中心に使用されている。そこで、広い抗菌スペクトルを持つＦＰＵ−３７株は、イネ以外（トマト、レタス、コマツナ、キャベツ、ホウレンソウ、球根、種芋など）にも使用できる種子消毒剤として使用できるのではないかと考え、トマトの種子を用いて種子消毒試験を行った。
試験は、実際に種子に付着している微生物に対するＦＰＵ−３７株の効果を明確に判定できるように、無菌の寒天培地上で行った。培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（４．６  ｇ／Ｌ、和光純薬  ３９２−００５９１）を用い、植物と微生物の両方が増殖できるように酵母エキス（５ｇ／Ｌ）およびグルコース（５ｇ／Ｌ）、寒天（１５ｇ／Ｌ）をさらに添加した（ＭＳＹＧ培地）。寒天培地は、オートクレーブ滅菌後にシャーレに分注した。雑菌の増殖を抑制するために使用した抗生物質（ストレプトマイシン）は、オートクレーブ滅菌後に５０℃程度にまで温度が下がってから１００μｇ／ｍｌ濃度となるように添加した。トマトの種子は、そのままＭＳＹＧ培地または抗生物質含有ＭＳＹＧ培地の上に各６０個ずつを置いて発芽させた。ＦＰＵ−３７株の種子消毒（雑菌抑制）効果では、ＦＰＵ−３７株の一晩培養液１ｍＬ（２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に種子を含浸させてからＭＳＹＧ培地の上に置いて発芽させた。
【０１１３】
【表１】
2015192665.tif 000002
【０１１４】
種子消毒せずにＭＳＹＧ培地上に置いて発芽させたトマトの種は、その多くが種子の周囲に雑菌が大量に繁殖して出芽しなかった（発芽率１８％）。一方、抗生物質含有ＭＳＹＧ培地では、雑菌の繁殖が抑えられることにより高い発芽率（９２％）となり、種子消毒の重要性が実感できる結果となった。ＦＰＵ−３７株を含浸させた種子においても、雑菌の繁殖が良く抑えられており、８３％という高い発芽率であった。以上の結果から、ＦＰＵ−３７株は雑菌の繁殖を抑えて発芽率を高める効果があると考えられる。また、土壌改良剤（土壌殺菌）としても期待される。
【０１１５】
（実施例８）ＦＰＵ−３７株の生長促進効果
ＦＰＵ−３７株が植物の生長に与える効果を試験した。
ＦＰＵ−３７株がイネの生長に与える効果を試験するため、イネ（コシヒカリ）を２群に分けた。ハウス内において、半分にはＦＰＵ−３７株の一晩培養液（２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を、残りの半分には培地のみを、潅水により育苗箱あたり５０ｍＬを一週間間隔で２回与えた。圃場に移して２０日後の結果を図１０に示す。
ＦＰＵ−３７株を添加したイネは、培地のみを与えられたイネと比較して、生長が促進された。従って、ＦＰＵ−３７株の一晩培養液は、イネに対して生長促進作用を有することが示された。
次にＦＰＵ−３７株がトマトの生長に与える効果を試験した。
トマト苗を４群に分け、それぞれに、ＦＰＵ−３７株の一晩培養液（２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍＬ）、１０−１株の一晩培養液（２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍＬ）、１Ｋ−５株の一晩培養液（２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍＬ）または培地のみを、潅水により根部に１０ｍＬづつ与えた。添加２０日後の結果を図１１に示す。
ＦＰＵ−３７株を添加したトマトは、培地のみを与えられたトマトと比較して、生長が促進された。従って、ＦＰＵ−３７株の一晩培養液は、トマトに対して生長促進作用を有することが示された。その効果は、すでに生長促進作用が確認されている１Ｋ−５株や１０−１株に匹敵するものであった。
ＦＰＵ−３７株は植物病原菌類等に対して強い抗菌活性を有しているが、大変興味深いことにイネやトマトなどの作物に対して生長促進効果を示すことを発見した（図１０および図１１）。そこで、ＦＰＵ−３７株の植物生長促進効果に関する分子機構の解明を目的として、生長促進に係わる各因子を解析した。
植物の生長促進効果に関与することが推定される表２に記載の因子について解析した。
【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
実施例８−１．  有機酸による難溶性リン酸塩の可溶化能力試験
３１．３ｇのＰｉｋｏｖｓｋａｙａ’Ａｇａｒ（ＨＩＭＥＤＩＡ  Ｍ５２０−５００Ｇ）を１Ｌの水に溶解し、１２１℃で２０分オートクレーブ後にシャーレに分注した。この寒天培地上でＦＰＵ−３７株を２８℃で１週間培養し、不溶性リンで白濁した培地に形成される透明な溶解斑を指標に難溶性リン化合物の可溶化能力を検定した。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
ＦＰＵ−３７株の菌体周辺に明確な溶解斑が形成され、難溶性リン化合物の可溶化能力が確認された（図１２）。
【０１２０】
実施例８−２．  シデロフォアの産生試験
（１）  Ｆｅ−ＣＡＳ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（１０ｍＭ  ＨＣｌに溶解した１ｍＭ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ溶液１０ｍＬに対して、５０ｍＬのＣｈｒｏｍｅ  Ａｚｕｒｏｌ  Ｓ（ＴＣＩ  ＴＧ２ＶＭ−ＴＳ）水溶液（１．２１ｍｇ／ｍＬ）と４０ｍｌのＨＤＴＭＡ（ＴＣＩ  ３３Ｈ７Ｂ−ＲＩ）水溶液（１．８２ｍｇ／ｍｌ）を混合して調製）６０ｍＬ、（２）２ＹＴ−ＰＩＰＥＳ寒天培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン１６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＰＩＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ  ＧＢ１５７）３０．２４ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）１Ｌ、および（３）１０％（ｗ／ｖ）カザミノ酸溶液  ５０ｍＬ、をそれぞれオートクレーブ滅菌後に混合し、シャーレに分注してシデロフォア検定培地を作成した。Ｃｈｒｏｍｅ  Ａｚｕｒｏｌ  Ｓ−鉄錯体は青色に呈色するが、シデロフォアにより鉄が奪われると呈色は消失する。寒天培地上でＦＰＵ−３７株を２８℃で１２日間培養して、Ｃｈｒｏｍｅ  Ａｚｕｒｏｌ  Ｓ−鉄錯体に由来する青色の消失を指標にシデロフォアの産生を評価した。
シデロフォア検定培地上で明確な青色の消失が確認されたことから、ＦＰＵ−３７株のシデロフォア産生能力が確認された（図１３）。
【０１２１】
実施例８−３．  シアン化水素（ＨＣＮ）の産生分析
Ｍ９最少培地（表４）に寒天１５ｇ／Ｌおよび酵母エキス５ｇ／Ｌ、グリシン５ｇ／Ｌを添加して寒天培地を作成し、この寒天培地上に形成したコロニーを用いてシアン化水素の酸性能力を検定した。シアン化水素を検定するために検定紙は、０．５％（ｗ／ｖ）Ｐｉｃｒｉｃ  Ａｃｉｄ（２，４，６−Ｔｒｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）（Ｗａｋｏ  ２０７−０８６７１）水溶液に、２％（ｗ／ｖ）になるようにＳｏｄｉｕｍ  Ｃａｒｂｏｎａｔｅを加えてフィルター滅菌し、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ（ｎｏ．１）に含浸・風乾することで作成した（この状態で黄色）。
この検定紙（黄色）を寒天培地上に形成したコロニーの上に置き、黄色から褐色への変化を指標にＨＣＮ産生を評価した。この方法では、検定紙の色が黄色からオレンジ、赤、茶色に変化し、それぞれ低、中、高レベルのＨＣＮ産生を評価可能である。
結果を図１４に示す。検定紙が褐色に変色したことから、高いＨＣＮ産生能力を有していることが確認された。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
実施例８−４．  キチン分解活性
キチンの分解活性は、キチン含有培地（０．５％（ｗ／ｖ）コロイダルキチンと０．５％酵母エキスを含むＭ９寒天培地）上での溶解斑形成を指標に評価した。また、ゲノム解析によりキチン分解酵素（キチナーゼ）遺伝子の存在についても確認した（図１５）。
キチン含有培地上においてハローが形成されなかったことから、ＦＰＵ−３７株はキチン分解能力のないと判定した。この結果は、ゲノム解析によりゲノム上にキチナーゼ遺伝子が存在しないことと一致する。
【０１２４】
実施例８  −５．  インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）の産生試験
【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
ＫＬ培地に最終濃度０．１％となるようにトリプトファンを添加し、ＦＰＵ−３７株を植菌して２８℃で３日間振盪培養した。菌体を遠心分離で除去した培養上清２ｍＬに対して、２滴のオルトリン酸を滴下し、さらに４ｍＬのＳａｌｋｏｗｓｋｉ試薬（３５％過塩素酸５０ｍＬに対して０．５Ｍ  ＦｅＣｌ３を１ｍＬ混合して調製）を加えて室温で３０分間ＩＡＡを赤色に発色させ、５３０ｎｍの吸光度を測定した。培養液の測定と同時にＩＡＡ標品で検量線を作成し、培養液中のＩＡＡ産生量を定量した。
測定の結果、ＦＰＵ−３７株が培養上清中に「８．４１μｇ／ｍＬ」という高濃度のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）を植物成長ホルモンとして産生していることを確認した。
【０１２７】
実施例８−６．  ニトロゲナーゼ（フラボドキシン）の測定
ニトロゲナーゼ（フラボドキシン）は、窒素固定を行う細菌が持っている酵素であり、大気中の窒素をアンモニアに変換する反応を触媒する。ニトロゲナーゼ活性は、窒素源を含まない最少培地（ＫＬ培地から硫酸アンモニウムを除いた培地）での増殖能力を指標に評価した。また、ゲノム解析によりニトロゲナーゼ（フラボドキシン）遺伝子の存在についても確認した。
培養試験の結果、窒素源非含有培地での培養において、培養三日後にＯＤ６６０における吸光度が０．６５にまで達したため、ＦＰＵ−３７株には窒素固定能力があると判断した。さらに、ゲノム上に存在するニトロゲナーゼ（フラボドキシン）遺伝子（配列番号７）も確認した。
【０１２８】
［ＦＰＵ−３７株由来ニトロゲナーゼ（フラボドキシン）の塩基配列（配列番号７）］
ＡＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＣＧＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＧＡＧＧＧＴＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＡＴＧＡＴＴＧＣＡＡＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＡＣＧＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＡＧＡＣＧＡＧＣＴＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＴＴＣＴＧＴＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＧＧＴＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＣＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＴＧＴＣＣＴＧＡ
［ＦＰＵ−３７株由来ニトロゲナーゼ（フラボドキシン）のアミノ酸配列（配列番号８）］
ＭＮＬＧＫＩＭＩＡＹＡＳＭＴＧＮＴＥＥＩＡＥＬＩＡＥＧＶＲＱＡＧＨＥＡＥＬＫＡＳＹＤＣＮＡＱＥＬＬＡＹＤＧＦＬＬＧＶＹＴＷＧＤＧＥＬＰＤＥＦＬＤＦＹＥＥＬＤＥＬＤＬＳＧＫＫＴＡＶＦＧＳＧＤＴＳＹＴＱＦＣＧＡＶＤＬＶＥＧＫＶＫＥＲＧＡＳＶＩＱＥＳＬＫＩＥＦＮＰＬＤＤＥＫＥＮＣＲＡＹＧＲＱＦＡＱＡＧＩＧＶＳ
【０１２９】
実施例８−７．  １−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）デアミナーゼ活性の測定
エチレン生合成における前駆体であるＡＣＣの代謝による資化能力（ＡＣＣデアミナーゼは代謝酵素）を測定することにより、エチレンの合成阻害能力を評価した。具体的には、ＡＣＣを唯一の窒素源として含む最少培地（ＫＬ培地から硫酸アンモニウムを除いた培地）を作成し、その増殖能力を濁度として数値化することにより評価した。上述の試験により、ＦＰＵ−３７株は窒素固定能力を有することが明らかとなったため、実際にはＡＣＣの添加により増殖能力が高くなることでＡＣＣ代謝能力を評価した。また、ゲノム解析により１−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＣＣ代謝酵素）遺伝子の存在についても確認した。
試験の結果、ＦＰＵ−３７株はＡＣＣの添加により増殖速度が増加したことから、ＡＣＣ代謝能力があり、ＡＣＣ代謝酵素を産生していると判断した。さらに、ゲノム上に存在する１−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＣＣ代謝酵素）遺伝子（配列番号９）も確認した。
【０１３０】
【表６】
2015192665.tif 000007
【０１３１】
［ＦＰＵ−３７株由来１−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅの塩基配列（配列番号９）］
ＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡＴＴＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＴＣＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＧＧＴＴＧＣＧＣＡＧＡＣＴＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＧＣＣＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣＧＣＴＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＣＧＡＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＧＴＡＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＣＣＧＣＧＡＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＣＣＡＧＧＴＧＡＣＣＴＡＴＧＴＣＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＣＧＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＣＡＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＣＧＧＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＡＣＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＣＡＧＡＴＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＴＣＧＡＣＴＧＣＧＧＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＡＧＡＴＴＡＡＴＧＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＡＣＧＣＡＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＧＣＣＧＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＡＣＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴＧＣＴＡＡＡＴＡＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＴＣＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＣＧＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＴＡＧＣＴＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＴＡＣＴＡＧＧＴＡＣＴＡＧ
［ＦＰＵ−３７株由来１−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅのアミノ酸配列（配列番号１０）］
ＭＮＲＩＹＬＤＨＡＡＳＴＰＭＨＰＥＶＡＱＴＭＭＤＩＭＴＧＱＦＧＮＡＳＳＶＨＡＦＧＲＤＡＫＲＴＶＳＡＡＲＤＡＶＡＡＳＬＧＣＫＰＥＥＩＩＦＴＳＧＧＴＥＳＤＮＬＡＬＦＧＴＡＴＡＤＧＲＴＳＧＨＩＩＴＴＡＩＥＨＨＡＶＬＨＡＣＤＥＬＥＫＡＧＹＱＶＴＹＶＰＶＮＧＦＧＲＶＮＰＡＤＩＥＡＡＩＲＰＤＴＦＬＩＳＭＭＹＡＮＮＥＶＧＶＩＱＰＶＱＥＶＧＱＩＡＲＥＨＧＩＩＦＨＶＤＡＶＱＡＦＧＨＩＳＩＤＣＧＮＬＰＩＤＬＬＳＶＳＧＨＫＩＮＧＰＱＧＶＧＡＬＹＩＲＱＧＴＲＩＱＰＬＭＨＧＧＬＱＥＫＫＲＲＡＧＴＥＮＩＡＧＩＡＧＬＡＫＡＡＴＬＡＮＡＳＩＥＥＲＧＡＨＤＭＡＬＲＱＴＬＬＫＡＬＥＮＳＬＧＳＨＥＦＩＩＮＧＤＰＥＨＦＶＰＮＶＬＮＩＳＦＰＡＩＧＴＥＴＭＬＭＮＬＤＭＥＧＩＡＡＡＳＧＳＡＣＴＳＧＳＬＥＬＳＨＶＬＱＡＭＤＬＰＥＤＶＬＮＳＡＩＲＦＳＦＧＬＧＮＴＴＥＥＭＥＹＴＡＫＫＩＥＴＩＷＫＲＬＲＴＲＹ
【０１３２】
実施例８−８．  抗生物質
実施例５に記載のとおり、ＦＰＵ−３７株は抗生物質を産生する。
【０１３３】
ＦＰＵ−３７株の生長促進効果に関するまとめ
以上の結果から、ＦＰＵ−３７株が有する植物に対する生長促進効果の分子機構は、「土壌中の難溶性リン化合物の可溶化（植物へのリンの供給）」や「植物生長ホルモンの産生」、「シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制（植物もシデロフォアを産生可能）」、「シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌」、「植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害」、「窒素固定」などによる複数の因子による複合効果であることが示唆された。結果を表７に示す。
ＦＰＵ−３７株の優れた抗菌活性は、種子消毒剤だけでなく、土壌改良剤やバイオ農薬への応用が期待できる。
【０１３４】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明によれば、高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有し、強力な抗菌性物質を産生する新規のパエニバチルス属の細菌が提供される。該細菌を用いることで、多様なセルロース原料およびデンプン原料からグルコースを製造することが可能となり、さらに、該グルコースはエタノールの製造に有用である。また、該細菌が産生する抗菌性物質の効果により、エタノール製造工程の効率化を図ることが可能となる。該抗菌性物質はそれ自体農業資材や医薬品としても有用に活用しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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