(57)【要約】【課題】基材から三次元組織を簡便に回収可能な細胞培養用基材及び細胞培養用基材のコーティングキットを提供する。【解決手段】一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた細胞培養用基材に関する。また。一又は複数の実施形態において、細胞培養用基材をコートするためのキットであって、水溶性ポリマーとジスルフィド結合を有する化合物とを含むコーティングキットに関する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた、細胞培養用基材。
【請求項２】
前記コートの膨潤時の厚みは、５０μｍ以下である、請求項１記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
細胞培養面となる部分が前記架橋された水溶性ポリマーでコートされている、請求項１又は２に記載の細胞培養用基材。
【請求項４】
前記水溶性ポリマーが、水溶性ポリアミノ酸、糖、水溶性ポリエステル及び水溶性ポリアミド並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養用基材。
【請求項５】
前記水溶性ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸)、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）及びポリ（チロシン）並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４記載の細胞培養用基材。
【請求項６】
前記架橋が、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、及びそれらの誘導体並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるジスルフィド結合を有する化合物による架橋である、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養用基材。
【請求項７】
細胞培養用基材をコートするためのキットであって、
水溶性ポリマーと、
ジスルフィド結合を有する化合物とを含む、コーティングキット。
【請求項８】
さらに、縮合剤を含む、請求項７記載のコーティングキット。
【請求項９】
細胞培養用基材のコート剤であって、
水溶性ポリマーと、
ジスルフィド結合を有する化合物とを含む、コート剤。
【請求項１０】
さらに、縮合剤を含む、請求項９記載のコート剤。
【請求項１１】
細胞が三次元に配置された三次元組織の製造のためのキットであって、
請求項１から６のいずれかに記載の細胞培養用基材、請求項７又は８に記載のコーティングキット、及び請求項９又は１０に記載のコート剤からなる群から選択される少なくとも一つと、
三次元組織を回収するための剥離剤とを含む、三次元組織の製造キット。
【請求項１２】
前記剥離剤は、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤である、請求項１１記載の三次元組織の製造キット。
【請求項１３】
前記剥離剤は、システイン、グルタチオン、ジヒドロリポ酸、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン及びジチオスレイトール並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の三次元組織の製造キット。
【請求項１４】
細胞が三次元に配置された三次元組織の製造方法であって、
前記三次元組織を、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた基材上で形成すること、及び
剥離剤を用いて前記三次元組織を前記基材から回収することを含む、三次元組織の製造方法。
【請求項１５】
前記剥離剤は、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤を含む、請求項１４記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞培養用基材、コーティングキット、及び三次元組織の製造キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体外で細胞の三次元組織を構築する技術が開発されている（例えば、特許文献１及び２）。特許文献１には、細胞表面全体が細胞外マトリックス（ECM）膜で被覆された被覆細胞を基材上で培養することによって細胞の三次元組織を製造する方法が開示されている。特許文献２には、三次元細胞組織体を形成するための足場材料として刺激応答性ハイドロゲルを使用し、刺激応答性ハイドロゲル内の空隙に細胞を配置することでハイドロゲル内で三次元細胞組織体を形成させる方法が開示されている。
【０００３】
一方、形成した三次元組織を移植材料等に利用することが試みられ、そのために三次元組織を基材から回収するための様々な方法が検討されている。しかしながら、三次元組織は、通常、細胞を基材上で培養することによって形成されるため、形成された三次元組織は基材に強固に接着しており、細胞にダメージを与えることなく簡便に三次元組織を基材から回収することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２５４号公報
【特許文献２】再公表２００７−０６１０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、細胞へのダメージを低減しつつ、基材から三次元組織を簡便に回収可能な細胞培養用基材、細胞培養用基材のコーティングキット、コート剤、三次元組織の製造キット及び三次元組織の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた細胞培養用基材に関する。
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞培養用基材をコートするためのキットであって、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを含むコーティングキットに関する。
【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞培養用基材のコート剤であって、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを含むコート剤に関する。
【０００９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞が三次元に配置された三次元組織の製造のためのキットであって、上記の細胞培養用基材、上記のコーティングキット及び上記のコート剤からなる群から選択される少なくとも一つと、三次元組織を回収するための剥離剤とを含む三次元組織の製造キットに関する。
【００１０】
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞が三次元に配置された三次元組織の製造方法であって、前記三次元組織を、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた基材上で形成すること、及び剥離剤を用いて前記三次元組織を前記基材から回収することを含む、三次元組織の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本開示は、細胞に与えるダメージを低減しつつ、基材から三次元組織を簡便に回収可能な細胞培養用基材、細胞培養用基材のコーティングキット、三次元組織の製造キット及び三次元組織の製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜Ｃは実験例における顕微鏡写真であって、図１Ａは細胞播種２４時間後（システイン添加前）の画像であり、図１Ｂはシステイン添加２時間後の画像であり、図１Ｃはシステイン添加１０時間後の画像である。図１Ｄは比較実験例におけるシステイン添加１０時間後の顕微鏡写真である。図１Ｅは参考実験例における細胞播種の２４時間後の顕微鏡写真である。
【図２】図２Ａは実施例１（システイン添加３０分後）の顕微鏡写真であって、図２Ｂは比較例１（システイン添加３０分後）の顕微鏡写真である。
【図３】図３Ａ〜Ｄは回収したNHDF積層体の位相差画像（ヘマトキシリン・エオジン染色）である。図３Ａは実施例２の画像であり、図３Ｂは実施例３の画像であり、図３Ｃは比較例２の画像であり、図３Ｄは比較例３の画像である。
【図４】図４Ａは図３Ｂの部分拡大図であり、図４Ｂは図３Ｄの部分拡大図である。
【図５】図５は、実施例３及び比較例３で回収したNHDF積層体の細胞数を示すグラフである。
【図６】図６Ａ及びＢは、実施例３で回収したNHDF積層体の共焦点顕微鏡画像（ヒトFN染色）であって、図６Ｂは図６Ａの部分拡大図である。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、NHDF積層体の回収後のインサート底面の蛍光画像である。図７Ａは比較例３の蛍光画像であり、図７Ｂは実施例３の蛍光画像であり、図７Ｃは図７Ａの部分拡大図であり、図７Ｄは図７Ｂの部分拡大図である。
【図８】図８は、NHDF積層体の回収後のインサート底面にNHDFが残存していた面積の割合（％）を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例４で回収したNHDF積層体の位相差画像（ヘマトキシリン・エオジン染色）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーで形成されたコート上で細胞の培養を行った後、所定の剥離剤を接触させることによって、細胞へのダメージを低減しつつ培養された細胞を容易に回収できる、との知見に基づく。また、本開示は、上記コート上で細胞を三次元に培養することによって細胞の三次元組織が形成できること、さらには、形成された三次元組織に所定の剥離剤を接触させることによって、細胞へのダメージを低減しつつ三次元組織を容易に回収できる、との知見に基づく。
【００１４】
ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーで形成されたコート上で細胞を培養することによって三次元組織を形成でき、また形成された三次元組織を容易に回収できるメカニズムは明らかではないが以下のように推察できる。ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーで形成されたコートは、細胞積層のための十分な強度と細胞接着性とを有するため、そのコート上での細胞の三次元組織化（細胞の積層）が可能となる。また、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーで形成されたコートに、システイン等のジスルフィド結合を切断可能な還元剤を接触させることによって、細胞へのダメージを抑制しつつ、コートの強度と細胞接着性が弱めることができる。このため、細胞へのダメージを低減しつつ基材から三次元組織を容易に剥離して回収できると考えられる。但し、本開示はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１５】
［細胞培養用基材］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた細胞培養用基材（以下、「本開示の細胞培養用基材」ともいう）に関する。本開示の細胞培養用基材によれば、一又は複数の実施形態において、細胞が三次元に配置された三次元組織を形成できるとともに、形成した三次元組織を基材から容易に回収できる。また、本開示の細胞培養用基材によれば、一又は複数の実施形態において、細胞へのダメージを低減しつつ三次元組織を回収することができる。本開示の細胞培養用基材は、一又は複数の実施形態において、三次元組織のみならず単層の細胞シートを形成でき、そのシートを回収することができる。
【００１６】
架橋された水溶性ポリマーによるコートは、一又は複数の実施形態において、基材の細胞培養面となりうる部分の少なくとも一部に形成されている。本開示の細胞培養用基材は、一又は複数の実施形態において、細胞培養面となる部分の一部又は全部が、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされている。本開示において「細胞培養面」とは、細胞と直接接する部分であって、細胞及び／又は三次元組織の培養が可能となる部分をいう。細胞培養面としては、一又は複数の実施形態において、細胞の配置、播種及び積層の少なくとも一つを行う部分であって、基材の主面及び底面等が挙げられる。
【００１７】
コートは、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーで形成される。コートは、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーを含み、好ましくはジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーを主成分とする。また、前記コートは、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーを、ジスルフィド結合を有する化合物で架橋することによって形成されうる。
【００１８】
水溶性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリアミノ酸、糖、水溶性ポリエステル、水溶性ポリアミド及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。水溶性ポリマーは、安全性の観点から、天然由来の水溶性ポリマーが好ましい。水溶性ポリマーは、回収した三次元組織を移植材料等の医療分野への利用を可能とする点から、生体適合性を有する水溶性ポリマーが好ましく、生体内での安全性の高い水溶性ポリマーがより好ましい。水溶性ポリマーは、有機溶媒等を用いることなく溶解できる点から、水溶性ポリアミノ酸及び糖が好ましい。
【００１９】
水溶性ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸)、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）、ポリ（チロシン）、これらの共重合体及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。糖としては、一又は複数の実施形態において、グルコース、セルロース、アルギン酸、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、これらの共重合体、及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。水溶性ポリエステルとしては、一又は複数の実施形態において、ポリリンゴ酸、低分子量ポリ乳酸、低分子量ポリグリコール酸、低分子量ポリε−カプロラクトン、ポリβ−ヒドロキシ酪酸及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。水溶性ポリアミドとしては、一又は複数の実施形態において、水溶性ナイロン等が挙げられる。
【００２０】
前記水溶性ポリマーの架橋は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を有する化合物による架橋である。ジスルフィド結合を有する化合物は、一又は複数の実施形態において、分子内にジスルフィド結合を有する化合物である。ジスルフィド結合を有する化合物としては、一又は複数の実施形態において、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、これらの誘導体及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。
【００２１】
コートは、一又は複数の実施形態において、膨潤状態であってもよいし、乾燥状態であってもよい。
【００２２】
コートの膨潤時の厚みは、細胞積層のための十分な強度と良好な細胞接着性が得られる点から、一又は複数の実施形態において、５０μｍ以下であり、好ましくは２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下又は１μｍ以下である。コートの膨潤時の厚みは、一又は複数の実施形態において、１ｎｍ以上、１０ｎｍ以上又は５０ｎｍ以上である。本開示において「コートの膨潤時の厚み」とは、milliQ（コート１ｃｍ2あたり３０００〜７０００μＬ）で一晩（室温）膨潤させた後の厚みをいう。コートの膨潤時の厚みは、形状測定レーザマイクロスコープ（キーエンス社製、VK-X100）を用いて測定できる。
【００２３】
コートの乾燥時の厚みは、細胞積層のための十分な強度と良好な細胞接着性が得られる点から、一又は複数の実施形態において、５μｍ以下、１μｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、又は１００ｎｍ以下である。コートの乾燥時の厚みは、一又は複数の実施形態において、１ｎｍ以上又は１０ｎｍ以上である。本開示において「コートの乾燥時の厚み」とは、コート剤による被膜を形成し、風乾後の厚みをいう。コートの乾燥時の厚みは、ＱＣＭ測定法によって求めることができる。
【００２４】
基材の材質としては、一又は複数の実施形態において、ガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート及びポリカーボネート等の高分子化合物、セラミックス並びに金属等が挙げられる。基材としては、一又は複数の実施形態において、細胞培養容器として使用されている容器が挙げられる。基材の形状としては、一又は複数の実施形態において、ペトリ皿、ウェルプレート、シャーレ、ディッシュ、インサート、プレート（板状）、チューブ状及びフィルム状の基材等が挙げられる。
【００２５】
本開示の細胞培養用基材は、コート上に細胞を配置し培養することによって、細胞シート及び／又は細胞の三次元組織を製造できる。本開示の細胞培養用基材は、一又は複数の実施形態において、細胞シート及び／又は細胞の三次元組織の製造に用いることができる。本開示において「細胞シート」とは、細胞同士が少なくとも単層で細胞間結合したシート状の細胞集合体をいう。
【００２６】
本開示の細胞培養用基材は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分（ECM）でコートされていてもよい。架橋された水溶性ポリマーによるコートは、一又は複数の実施形態において、その表面がECMでコートされていてもよい。ECMとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有するタンパク質又は高分子や、特許49419464号及び特開2012-115254号に開示のものが挙げられる。ECMの具体例としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリジン及びゼラチン等が挙げられる。
【００２７】
［細胞培養用基材の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の細胞培養用基材の製造方法に関する。本開示の細胞培養用基材の製造方法は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを含む溶液で、基材の表面をコートすることを含む。これにより、水溶性ポリマーの架橋反応により、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーで形成されたコートが基材上に形成される。水溶性ポリマー、ジスルフィド結合を有する化合物及び基材は上述の通りである。
【００２８】
前記溶液は、一又は複数の実施形態において、縮合剤を含むことが好ましい。本開示の細胞培養用基材の製造方法は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物と、縮合剤とを含む溶液で、基材の表面をコートすることを含む。
【００２９】
縮合剤は、一又は複数の実施形態において、脱水縮合剤が挙げられ、カルボジイミド基を含む化合物（カルボジイミド系縮合剤）、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。カルボジイミド系縮合剤としては、一又は複数の実施形態において、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トリエンスルホン酸塩及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。
【００３０】
溶液の調製及び／又は基材のコートは、一又は複数の実施形態において、４〜３７℃で行うことができる。縮合剤の副生成物を抑制する点から、４〜２５℃又は略４℃で行うことが好ましい。水溶性ポリマーの濃度、及び水溶性ポリマーとジスルフィド結合を有する化合物とのモル比（官能基のモル比）は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマー及びジスルフィド結合を有する化合物の種類、培養する三次元組織の種類等に応じて適宜決定できる。水溶性ポリマーの濃度は、一又は複数の実施形態において、３ｗｔ％以上、４ｗｔ％以上又は５ｗｔ％以上であり、又１０ｗｔ％以下、９ｗｔ％以下、又は８ｗｔ％以下である。縮合剤の量は、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を有する化合物の種類に応じて適宜決定できる。縮合剤の量は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を有する化合物に対して等モル〜１０倍モル等が挙げられる。
【００３１】
基材のコートは、一又は複数の実施形態において、上記溶液を基材に塗布若しくは滴下又は溶液に基材を浸漬することによって行うことができる。上記溶液の塗布又は滴下は、一又は複数の実施形態において、基材の細胞培養面となる部分を少なくとも覆うように行えばよい。基材のコートは、より薄膜なコートを形成する点から、一又は複数の実施形態において、上記溶液の塗布又は滴下後、不要な溶液を回収することを含んでいてもよい。細胞培養面の強度をより強くする点から、基材のコートは、一又は複数の実施形態において、コート直後の厚みが５μｍ以下、１μｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下又は１００ｎｍ以下となるよう行うことが好ましい。形成されるコートの厚みは、一又は複数の実施形態において、溶液の塗布又は滴下量、及び浸漬時間等に応じて調製できる。溶液の塗布又は滴下量は、一又は複数の実施形態において、３００μＬ／ｃｍ2以下又は３０μＬ／ｃｍ2以下である。溶液の塗布又は滴下量の下限は、少なくとも細胞培養面となる部分を覆う量であればよく、一又は複数の実施形態において、０．１μＬ／ｃｍ2以上である。
【００３２】
［コーティングキット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞培養用基材をコートするためのキットであって、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを含むコーティングキットに関する。本開示のコーティングキットは、一又は複数の実施形態において、さらに縮合剤を含むことが好ましい。水溶性ポリマー、ジスルフィド結合を有する化合物、及び縮合剤は上述の通りである。
【００３３】
［コート剤］
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞培養用基材をコートするためのコート剤及びその製造方法に関する。本開示のコート剤は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを含む。本開示のコート剤は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物と、縮合剤とを含む。本開示のコート剤は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーを含む。
【００３４】
本開示のコート剤は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを混合することによって得られ、好ましくは水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物と、縮合剤とを混合することによって得られる。本開示のコート剤の製造方法は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを混合することを含む。また、本開示のコート剤の製造方法は、一又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物と、縮合剤とを混合することを含む。水溶性ポリマー、ジスルフィド結合を有する化合物、縮合剤及び混合条件等は上述の通りである。本開示のコート剤は、一又は複数の実施形態において、本開示の細胞培養用基材の製造方法に使用できる。
【００３５】
［三次元組織の製造キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞が三次元に配置された三次元組織の製造のためのキットであって、本開示の細胞培養用基材、本開示のコーティングキット及び本開示のコート剤からなる群から選択される少なくとも一つと、前記三次元組織を回収するための剥離剤とを含む三次元組織の製造キット（以下、「本開示の製造キット」ともいう）に関する。
【００３６】
剥離剤としては、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤が挙げられる。剥離剤としては、一又は複数の実施形態において、システイン、グルタチオン、ジヒドロリポ酸、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール及びこれらの組み合わせ等が挙げられ、細胞への安全性の点から、システイン、グルタチオン及びジヒドロリポ酸が好ましい。
【００３７】
［三次元組織の製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の細胞培養用基材を用いた三次元組織の製造方法に関する。本開示の三次元組織の製造方法は、三次元組織を、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた基材上で形成すること、及び剥離剤を用いて前記三次元組織を前記基材から回収することを含む。本開示の三次元組織の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞へのダメージを低減しつつ、容易に三次元組織を回収することができる。
【００３８】
三次元組織の形成は、一又は複数の実施形態において、架橋された水溶性ポリマーのコート上に細胞を三次元に配置することを含む。三次元組織の形成は、一又は複数の実施形態において、細胞と細胞外マトリックス成分とを用いて行うことが好ましい。したがって、三次元組織は、一又は複数の実施形態において、細胞と細胞外マトリックス成分とを含むことが好ましい。三次元組織の形成は、一又は複数の実施形態において、実施例、特許49419464号及び特開2012-115254号等に開示された方法、その他の公知の方法、今後開発されうる方法を用いて行うことができる。
【００３９】
三次元組織の形成に用いる細胞としては、特に限定されず、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、肝ガン細胞等のがん細胞、上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、組織幹細胞及び免疫細胞等の接着性細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞等が挙げられる。細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、胚性幹細胞、及び人工多能性幹細胞等の由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、培養細胞であってもよい。培養細胞としては、一又は複数の実施形態において、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。
【００４０】
三次元組織の形成は、一又は複数の実施形態において、培地を用いて行う。培地は、一又は複数の実施形態において、Eagle's MEM培地、Dulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RDMI、及びGlutaMax培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培養温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃又は３０〜３７℃である。培養時間は、一又は複数の実施形態において、１〜２４時間又は６〜２４時間である。
【００４１】
三次元組織の回収は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤を用いて行うことができる。三次元組織の回収は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤を基材に導入することを含む。ジスルフィド結合を切断可能な還元剤としては、上述の剥離剤が挙げられる。
【００４２】
三次元組織の回収は、一又は複数の実施形態において、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤を基材に導入することを含む。還元剤による処理時間は、特に限定されるものではなく、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤の濃度等に応じて適宜決定できる。処理時間は、一又は複数の実施形態において、０．５時間以上、１時間以上、１．５時間以上、又は２時間以上である。処理時間は、回収効率等の点から、一又は複数の実施形態において、１０時間以下又は９時間以下である。
【００４３】
［細胞シートの製造キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の細胞培養用基材、本開示のコーティングキット及び本開示のコート剤からなる群から選択される少なくとも一つと、剥離剤とを含む細胞シートの製造キットに関する。
【００４４】
［細胞シートの製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の細胞培養用基材を用いた細胞シートの製造方法に関する。細胞シートの製造方法は、細胞シートを、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた基材上で形成すること、及び剥離剤を用いて前記細胞シートを前記基材から回収することを含む。本開示の細胞シートの製造方法は、三次元組織に替えて基材上で細胞シートを形成する以外は、本開示の三次元組織の製造方法と同様に行うことができる。
【００４５】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔Ａ１〕  ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた、細胞培養用基材。
〔Ａ２〕  前記コートの膨潤時の厚みは、５０μｍ以下であり、好ましくは２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下又は１μｍ以下であり、及び／又は、１ｎｍ以上、１０ｎｍ以上又は５０ｎｍ以上である、〔Ａ１〕記載の細胞培養用基材。
〔Ａ３〕前記コートの乾燥時の厚みは、５μｍ以下、１μｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、又は１００ｎｍ以下であり、及び／又は、１ｎｍ以上又は１０ｎｍ以上である、〔Ａ１〕又は〔Ａ２〕に記載の細胞培養用基材。
〔Ａ４〕  細胞培養面となる部分が前記架橋された水溶性ポリマーでコートされている、〔Ａ１〕から〔Ａ３〕のいずれかに記載の細胞培養用基材。
〔Ａ５〕  前記水溶性ポリマーが、水溶性ポリアミノ酸、糖、水溶性ポリエステル及び水溶性ポリアミド並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ａ１〕から〔Ａ４〕のいずれかに記載の細胞培養用基材。
〔Ａ６〕  前記水溶性ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸)、ポリ(アスパラギン酸)、ポリ（リシン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）及びポリ（チロシン）並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ａ５〕記載の細胞培養用基材。
〔Ａ７〕  前記架橋が、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、及びそれらの誘導体並びにこれらの組み合わせからなる群から選択されるジスルフィド結合を有する化合物による架橋である、〔Ａ１〕から〔Ａ６〕のいずれかに記載の細胞培養用基材。
〔Ａ８〕  前記基材の材質は、ガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、セラミックス及び金属からなる群から選択される、〔Ａ１〕から〔Ａ７〕のいずれかに記載の細胞培養用基材。
〔Ａ９〕  前記基材の形状は、ペトリ皿、ウェルプレート、シャーレ、ディッシュ、インサート、プレート（板状）、チューブ状及びフィルム状からなる群から選択される、〔Ａ１〕から〔Ａ８〕のいずれかに記載の細胞培養用基材。
〔Ｂ１〕  水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物とを含む溶液で、基材の表面をコートすることを含む、細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ２〕  前記水溶性ポリマーが、水溶性ポリアミノ酸、糖、水溶性ポリエステル及び水溶性ポリアミド並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｂ１〕記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ３〕  前記水溶性ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸)、ポリ(アスパラギン酸)、ポリ（リシン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）及びポリ（チロシン）並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ４〕  前記ジスルフィド結合を有する化合物は、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、及びそれらの誘導体並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｂ１〕から〔Ｂ３〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ５〕  前記溶液は、縮合剤を含む、〔Ｂ１〕から〔Ｂ４〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ６〕  水溶性ポリマーと、ジスルフィド結合を有する化合物と、縮合剤とを含む溶液で、基材の表面をコートすることを含む、〔Ｂ１〕から〔Ｂ５〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ７〕  前記縮合剤は、脱水縮合剤であり、好ましくはカルボジイミド基を含む化合物（カルボジイミド系縮合剤）、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｂ５〕又は〔Ｂ６〕に記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ８〕  前記カルボジイミド系縮合剤は、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トリエンスルホン酸塩及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｂ７〕記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ９〕  前記溶液の調製及び／又は基材のコートを、４〜３７℃で行うことを含み、好ましくは４〜２５℃又は略４℃で行うことを含む、〔Ｂ１〕から〔Ｂ８〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ１０〕  前記水溶性ポリマーの濃度は、３ｗｔ％以上、４ｗｔ％以上又は５ｗｔ％以上であり、及び／又は１０ｗｔ％以下、９ｗｔ％以下、又は８ｗｔ％以下である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ９〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ１１〕  前記縮合剤の量は、前記ジスルフィド結合を有する化合物に対して等モル〜１０倍モル、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１０〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ１２〕  前記溶液の塗布又は滴下量は、３００μＬ／ｃｍ2以下又は３０μＬ／ｃｍ2以下であり、及び／又は０．１μＬ／ｃｍ2以上である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１１〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｂ１３〕前記細胞培養用基材は、〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれかに記載の細胞培養用基材である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ１２〕のいずれかに記載の細胞培養用基材の製造方法。
〔Ｃ１〕  細胞培養用基材をコートするためのキットであって、
水溶性ポリマーと、
ジスルフィド結合を有する化合物とを含む、コーティングキット。
〔Ｃ２〕  前記水溶性ポリマーが、水溶性ポリアミノ酸、糖、水溶性ポリエステル及び水溶性ポリアミド並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｃ１〕記載のコーティングキット。
〔Ｃ３〕  前記水溶性ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸)、ポリ(アスパラギン酸)、ポリ（リシン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）及びポリ（チロシン）並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｃ２〕記載のコーティングキット。
〔Ｃ４〕  前記ジスルフィド結合を有する化合物が、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、及びそれらの誘導体並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｃ１〕から〔Ｃ３〕のいずれかに記載のコーティングキット。
〔Ｃ５〕  さらに、縮合剤を含む、〔Ｃ１〕から〔Ｃ４〕のいずれか記載のコーティングキット。
〔Ｃ６〕  前記縮合剤は、脱水縮合剤であり、好ましくはカルボジイミド基を含む化合物（カルボジイミド系縮合剤）、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｃ５〕記載のコーティングキット。
〔Ｃ７〕  前記カルボジイミド系縮合剤は、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トリエンスルホン酸塩及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｃ６〕記載のコーティングキット。
〔Ｄ１〕  細胞培養用基材のコート剤であって、
水溶性ポリマーと、
ジスルフィド結合を有する化合物とを含む、コート剤。
〔Ｄ２〕  前記水溶性ポリマーが、水溶性ポリアミノ酸、糖、水溶性ポリエステル及び水溶性ポリアミド並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｄ１〕記載のコート剤。
〔Ｄ３〕  前記水溶性ポリアミノ酸が、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリ（α−グルタミン酸)、ポリ(アスパラギン酸)、ポリ（リシン）、ポリ（グルタミン）、ポリ（セリン）、ポリ（トレオニン）及びポリ（チロシン）並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｄ２〕記載のコート剤。
〔Ｄ４〕  前記ジスルフィド結合を有する化合物が、シスタミン、シスチン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド、３，３’−ジチオジプロピオン酸、グルタチオンジスルフィド、３，３’−ジチオプロピオヒドラジド、及びそれらの誘導体並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｄ１〕から〔Ｄ３〕のいずれかに記載のコート剤。
〔Ｄ５〕  さらに、縮合剤を含む、〔Ｄ１〕から〔Ｄ４〕のいずれか記載のコート剤。
〔Ｄ６〕  前記縮合剤は、脱水縮合剤であり、好ましくはカルボジイミド基を含む化合物（カルボジイミド系縮合剤）、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｄ５〕記載のコート剤。
〔Ｄ７〕  前記カルボジイミド系縮合剤は、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トリエンスルホン酸塩及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｄ６〕記載のコート剤。
〔Ｅ１〕  細胞が三次元に配置された三次元組織の製造のためのキットであって、
〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれかに記載の細胞培養用基材、〔Ｃ１〕から〔Ｃ７〕のいずれかに記載のコーティングキット、及び〔Ｄ１〕から〔Ｄ７〕のいずれかに記載のコート剤からなる群から選択される少なくとも一つと、
三次元組織を回収するための剥離剤とを含む、三次元組織の製造キット。
〔Ｅ２〕  前記剥離剤は、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤である、〔Ｅ１〕記載の三次元組織の製造キット。
〔Ｅ３〕  前記剥離剤は、システイン、グルタチオン、ジヒドロリポ酸、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン及びジチオスレイトール並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｅ１〕又は〔Ｅ２〕に記載の三次元組織の製造キット。
〔Ｆ１〕  細胞が三次元に配置された三次元組織の製造方法であって、
前記三次元組織を、ジスルフィド結合で架橋された水溶性ポリマーでコートされた基材上で形成すること、及び
剥離剤を用いて前記三次元組織を前記基材から回収することを含む、三次元組織の製造方法。
〔Ｆ２〕  前記基材は、〔Ａ１〕から〔Ａ９〕のいずれかに記載の細胞培養用基材、〔Ｃ１〕から〔Ｃ７〕のいずれかに記載のコーティングキットを用いて作製されたコートを含む基材、及び〔Ｄ１〕から〔Ｄ７〕のいずれかに記載のコート剤を用いて作製されたコートを含む基材からなる群から選択される少なくとも一つである、〔Ｆ１〕記載の三次元組織の製造方法。
〔Ｆ３〕  前記剥離剤は、ジスルフィド結合を切断可能な還元剤を含む、〔Ｆ１〕又は〔Ｆ２〕に記載の三次元組織の製造方法。
〔Ｆ４〕  前記剥離剤は、システイン、グルタチオン、ジヒドロリポ酸、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン及びジチオスレイトール並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔Ｆ１〕から〔Ｆ３〕のいずれかに記載の三次元組織の製造方法。
【００４６】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【００４７】
なお、本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
γ-PGA：poly(γ-glutamic acid)
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
NHDF：正常ヒト皮膚線維芽細胞（CAMBREX社製）
50mM Tris-HCl(pH7.4)：HCl（Nacalai Tesque社製）でpH7.4に調整した50mM Trisを、0.2μm γ-ray sterile filter（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
BFN：Fibronectin from bovine plasma（SIGMA製）
BFN溶液：0.04mg BFN/1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)
Gelatin溶液：0.04mg Gelatin/1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)を、0.2μm γ-ray sterile filter（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
DMEM培地：10wt% FBS（GIBCO社製）を含むDulbecco's eagle's medium（SIGMA社製）
【実施例】
【００４８】
［コート剤の調製］
（調製例１〜５）
10mLの5mM Tris緩衝液(pH7.4)を４℃の氷浴で冷却し、γ-PGAナトリウム塩（Mw＝60〜150×104）を攪拌しながら溶解させた。そこにEDCを溶解し10分間攪拌した。次いでシスタミン塩酸塩を溶解させ2分間攪拌してコート剤を調製した。γ-PGA、EDC及びシスタミンは下記表１に示す濃度となるようにした。
調製したコート剤１００μＬを培養管（商品名：Transwel、コーニング社製）に入れ、２５℃で静置し、ゲル化までの時間を計測した（3，5，10，20及び60分）。その結果を下記表１に示す。
【化１】
2015213450.tif 000003
【００４９】
【表１】
2015213450.tif 000004
【００５０】
［被覆細胞の作製］
NHDFを培地（DMEM、Invitrogen社製）で培養し、トリプシン処理(0.25％トリプシン、0.02%EDTA)(37℃、20分間)して細胞を回収した。回収したNHDFを1×106cell/mlの濃度でBFN溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散させた後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（FN浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散させた後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、Gelatin溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散させた後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い（G浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、G浸漬操作及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってNHDF被覆細胞を作製した（ECM被膜の厚み：６nm）。
【００５１】
（実験例）
［細胞の接着及び剥離の確認］
調製例４のコート剤100μL/wellを24ウェルに配置したインサート（面積：0.33cm2、孔径：8μm）にすみやかに注入し、約10秒後に取り除き、25℃で10分間静置して風乾させた。これによりインサートの底面にコート（厚み：60-80nm）を形成した。コートの厚みは、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定法より求めた。
Milli-Q水（ミリポア社製）を3000-7000μL/cm2加えて一晩放置することによってコートの洗浄を行った。洗浄（膨潤）後のコートの厚みは約5μｍであった。コート（膨潤）の厚みは、形状測定レーザマイクロスコープ（キーエンス社製、VK-X100）を用いて測定した。
ついで、BFN溶液を添加し１５分インキュベートすることでコート上にFNをコーティングした。ついで、NHDF被覆細胞を1×104cells/wellとなるように配置し、24時間培養した後、5mMシステインをインサートの内側に300μL、20mMシステインをインサートの外側に1mL加えた。培地はDMEM培地を使用した。その結果を図１Ａ〜Ｃに示す。
【００５２】
図１Ａは細胞播種の２４時間後（システイン添加前）の顕微鏡写真であり、図１Ｂはシステイン添加２時間後の顕微鏡写真であり、図１Ｃはシステイン添加１０時間後の顕微鏡写真である。図１Ａに示すように、細胞播種の２４時間後には細胞が伸展し、コートとNHDFとの良好な接着が確認された（図１Ａ）。一方、システイン添加２時間後及び１０時間後には、細胞の形態が丸くなり、一部の細胞の脱離が確認された（図１Ｂ及びＣ）。つまり、システインの添加によって、細胞をコートから剥離させて回収できることが確認できた。
【００５３】
（比較実験例）
比較実験例として、NHDF被覆細胞をインサートに直接配置した以外は同様に培養及びシステインの添加を行った。その結果を図１Ｄに示す。図１Ｄはシステイン添加１０時間後の顕微鏡写真である。図１Ｄに示すように、細胞をインサートに直接配置した本比較実験例では、システインの添加から１０時間経過後も細胞が伸展しており、細胞の形態に変化は全く見られなかった。
【００５４】
（参考実験例）
コート剤50μLを注入し取り除くことなくそのまま10分間ゲル化させてゲル層（厚み：約1.5ｍｍ）を形成した以外は実験例と同様にして細胞の培養を行った。その結果を図１Ｅに示す。図１Ｅに示すように、本参考実験例では、24時間培養後も細胞の形状は丸く、細胞がゲル層に十分接着していないことが確認できた。
【００５５】
（実施例１）
インサートに配置する細胞の数を1×105cells/wellとし、細胞の播種から30分後にシステインを添加した以外は、実験例と同様にして細胞の培養を行い、NHDFの単層組織を作製した。ついで、実験例と同様にしてシステインの添加を行った。システイン添加から３０分後の画像を図２Ａに示す。
【００５６】
（比較例１）
NHDF被覆細胞をインサートに直接配置した以外は実施例１と同様にして細胞の培養及びシステインの添加を行った。その結果を図２Ｂに示す。
【００５７】
細胞をインサートに直接配置した比較例１では、単層組織がインサート（基材）に接着したままであったのに対し（図２Ｂ）、実施例１では、コートの端から単層組織がはがれ始めている様子が確認された（図２Ａ）。つまり、システインの添加によって、細胞の単層組織（細胞シート）をコートから回収できることが確認できた。
【００５８】
（実施例２）
インサートに配置するNHDF被覆細胞の数を5×105cells/wellとした以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行い、NHDFが５層積層されたNHDF積層体を作製した。ついで、5mMシステインを、インサートの内側に300μL、外側に1mLそれぞれ添加し、添加から120分後にインサートからNHDF積層体を回収した。その結果を図３〜５に示す。
【００５９】
（実施例３）
インサートに添加するシステインの濃度を20mMとした以外は、実施例２と同様にしてNHDF積層体の作製及び回収を行った。その結果を図３〜５に示す。
【００６０】
（比較例２）
NHDF被覆細胞をインサートに直接配置した以外は実施例２と同様にしてNHDF積層体の作製及び回収を行った。その結果を図３〜５に示す。
【００６１】
（比較例３）
NHDF被覆細胞をインサートに直接配置した以外は実施例３と同様にしてNHDF積層体の作製及び回収を行った。その結果を図３〜５に示す。
【００６２】
図３及び４は回収したNHDF積層体の位相差画像（ヘマトキシリン・エオジン染色）である。図３Ａは実施例２の画像、図３Ｂは実施例３の画像、図３Ｃは比較例２の画像、図３Ｄは比較例３の画像をそれぞれ示す。図４Ａは図３Ｂの部分拡大図、図４Ｂは図３Ｄの部分拡大図を示す。図５は、実施例３及び比較例３で回収したNHDF積層体の細胞数を示すグラフである。図６Ａ及びＢは、実施例３で回収したNHDF積層体の共焦点顕微鏡画像（ヒトFN染色）である。図６Ｂは図６Ａの部分拡大図である。図７Ａ〜ＤはNHDF積層体の回収後のインサート底面の蛍光画像（Phalloidin染色）である。図７Ａは比較例３の画像、図７Ｂは実施例３の画像をそれぞれ示し、図７Ｃは図７Ａの部分拡大図、図７Ｄは図７Ｂの部分拡大図をそれぞれ示す。図８は、NHDF積層体の回収後のインサート底面にNHDFが残存していた面積の割合（％）を示すグラフである。なお、細胞数は、トリパンブルー染色法により求めた。
【００６３】
図３及び４に示すように、被覆細胞をインサートに直接配置した比較例２及び３では、回収時にNHDF積層体が破損したり、インサート（基材）との接着面の細胞にダメージが生じていた。これに対し、培養面がコートされたインサートを用いた実施例２及び３では、細胞が積層された三次元組織が保持された状態で、インサート（基材）との接着面の細胞へのダメージを抑制しつつNHDF積層体を回収できた。また、図６に示すように、実施例２で回収したNHDF積層体には、ECM成分が十分保持されていた。図５に示すように、比較例２及び３と比較して実施例２及び３では高収率で細胞が回収できた。また、図７Ａ〜Ｄ及び図８に示すように、比較例２及び３では細胞層回収後のインサート（基材）の細胞培養面に細胞が多数付着していたのに対し、実施例２及び３では細胞の付着は殆ど見られなかった。つまり、γ−ＰＧA−シスタミンコートを培養面として三次元組織の形成を行い、ついでシステインを添加することによって、細胞へのダメージを抑制しつつ細胞の三次元組織を容易に回収できた。
【００６４】
（実施例４）
インサートに配置するNHDF被覆細胞の数を5×105cells/well、10×105cells/well又は20×105cells/wellとし、システイン添加から60分後に回収した以外は、実施例１と同様にして細胞の培養及び回収を行い、NHDFが5、10又は20層積層されたNHDF積層体を作製した。回収したNHDF積層体の位相差画像（ヘマトキシリン・エオジン染色）を図９に示す。図９に示すように、層の厚みに関わらず、いずれの積層体も細胞へのダメージを抑制しつつインサートから回収できた。
【００６５】
（実施例５）
NHDF被覆細胞に替えてヒト肝癌細胞（HepG2）被覆細胞を用い、インサートに配置する細胞数を5×105cells/wellとし、システイン添加から60分後に回収した以外は、実施例１と同様にして細胞の培養及び回収を行い、肝様組織を作製した。HepG2の場合もNHDFと同様に、細胞へのダメージを抑制しつつインサートから回収できた。
【００６６】
（実施例６）
実施例１と同じインサートを使用し、その上に4×105cells/wellのNHDF被覆細胞を播種し、DMEM培地を添加して37℃で12〜24時間培養した。その上にBFN溶液とGelatin溶液とを交互に1回ずつ加えてNHDF層上にFN-G膜を形成した後、5×104cells/wellのHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Lonza社製）の播種及び培養（37℃12〜24時間）、及び4×105cells/wellのNHDF被覆細胞の播種及び培養（37℃、2日間）を行った。次いで、実施例１と同様にしてインサートから積層体を回収したところ、細胞へのダメージを抑制しつつ積層体をインサートから回収できた。また、内部に形成された血管網も回収前と同様の状態が保持されていた。
【００６７】
（実施例７）
調製例４のコート剤300μL/wellを12ウェルに配置したインサート（面積：1.12cm2、孔径：8μm）に注入し、約10秒後に取り除き、25℃で10分間静置して風乾させた。これによりインサートの底面にコート（厚み：50〜100nm）を形成した。Milli-Q水（ミリポア社製）を3500μL加えて一晩放置することによってコートの洗浄を行った。洗浄（膨潤）後のコートの厚みは約5〜10μｍであった。
インサートに配置するNHDF被覆細胞の数を1×106cells/wellとした以外は、実施例１と同様にして細胞の培養を行い、NHDFが4層積層されたNHDF積層体を作製した。実施例１と同様にしてインサートから積層体を回収したところ、細胞へのダメージを抑制しつつ積層体を回収できた。
【図１】
2015213450.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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