(57)【要約】【課題】空間分解能に優れた細胞の画像を取得することができる細胞画像処理方法、細胞画像処理装置及び細胞画像処理プログラムを提供すること。【解決手段】  細胞の定量位相画像を取得する第１の取得ステップと、  細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得ステップと、  前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定ステップと、  設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算ステップと、を備えることを特徴とする細胞画像処理方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の定量位相画像を取得する第１の取得ステップと、
細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得ステップと、
前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定ステップと、
設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算ステップと、
を備えることを特徴とする細胞画像処理方法。
【請求項２】
前記設定ステップは、定量位相画像及び高周波成分画像の最高輝度及び最低輝度を同じに設定するステップである、請求項１に記載の細胞画像処理方法。
【請求項３】
前記高周波成分画像は、明視野画像又は位相差コントラスト画像である、請求項１又は２に記載の細胞画像処理方法。
【請求項４】
細胞の定量位相画像を取得する第１の取得手段と、
細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得手段と、
前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定手段と、
設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算手段と、
を備えることを特徴とする細胞画像処理装置。
【請求項５】
コンピュータを、
細胞の定量位相画像を取得する第１の取得手段、
細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得手段、
前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定手段、
設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算手段、
として機能させるための細胞画像処理プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞画像処理方法、細胞画像処理装置及び細胞画像処理プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の面積またはコンフルエンスを決定するための方法として、細胞と細胞の周りのバックグラウンドに関する定量的位相データを準備し；定量的位相データから細胞の境界を決定し；そして境界内の面積を決定することにより細胞の面積またはコンフルエンスを決定することを含んでなる方法が知られている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００７−５０９３１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、定量位相画像は干渉像であり、空間分解能が低く、定量位相画像における細胞の内部構造及び境界（輪郭）部分は不明瞭なことが多い。
【０００５】
そこで、本発明は、空間分解能に優れた細胞の画像を取得することができる細胞画像処理方法、細胞画像処理装置及び細胞画像処理プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述の目的を達成する本発明は、細胞の定量位相画像を取得する第１の取得ステップと、細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得ステップと、前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定ステップと、設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算ステップと、を備えることを特徴とする細胞画像処理方法である。
【０００７】
また、本発明は、細胞の定量位相画像を取得する第１の取得手段と、細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得手段と、前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定手段と、設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算手段と、を備えることを特徴とする細胞画像処理装置である。
【０００８】
また、本発明は、コンピュータを、細胞の定量位相画像を取得する第１の取得手段、細胞の高周波成分画像を取得する第２の取得手段、前記定量位相画像及び前記高周波成分画像の輝度を設定する設定手段、設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算して減算画像を取得する減算手段、として機能させるための細胞画像処理プログラムである。
【０００９】
このような本発明により、空間分解能に優れた細胞の画像を取得することができる。
【００１０】
本発明において、「細胞」とは、「単一細胞又は細胞集団」を意味する。
【００１１】
また、「高周波成分画像」は、「定量位相画像の空間周波数成分に含まれない高い空間周波数成分を含む画像」を意味し、高周波成分画像には、明視野画像、位相差コントラスト画像等が含まれる。なお、「明視野画像」は、「明視野顕微鏡で撮影された画像」であり、「位相差コントラスト画像」は、「位相差コントラスト顕微鏡で撮影された画像」である。
【００１２】
本発明の「設定定量位相画像」は、輝度を設定した定量位相画像を意味する。「設定定量位相画像」の輝度が、第１の取得ステップで取得した「定量位相画像」の輝度と同じであることもある。
【００１３】
また、「設定高周波成分画像」は、輝度を設定した高周波成分画像を意味する。「設定高周波成分画像」の輝度が、第２の取得ステップで取得した「高周波成分画像」の輝度と同じであることもある。
【００１４】
また、「減算画像」は、「設定定量位相画像から設定高周波成分画像を減算した画像」を意味する。
【００１５】
本発明の設定ステップは、定量位相画像及び高周波成分画像の最高輝度及び最低輝度を同じに設定するステップでよい。このようなステップを備える本発明の細胞画像処理方法によって、減算画像の空間分解能をさらに向上させ、コントラストをよくすることができる。
【００１６】
本発明の高周波成分画像は明視野画像であってよい。高周波成分画像が明視野画像であると、細胞の内部構造（例えば細胞核）が明瞭な減算画像を取得することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、空間分解能に優れた細胞の画像を取得することができる細胞画像処理方法、細胞画像処理装置及び細胞画像処理プログラムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】細胞観察システム１の構成図である。
【図２】細胞画像処理装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。
【図３】細胞画像処理装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【図４】細胞画像処理方法のフローチャートである。
【図５】定量位相画像（図中（Ａ））から明視野画像（図中（Ｂ））を減算した減算画像（図中（Ｃ））が高い空間周波数成分を含み、空間分解能に優れることを説明するための模式図である。
【図６】細胞観察システム２の構成図である。
【図７】定量位相画像（図中（Ａ））から位相差コントラスト画像（図中（Ｂ））を減算した減算画像（図中（Ｃ））が高い空間周波数成分を含み、空間分解能に優れることを説明するための模式図である。
【図８】実施例１のヒトｉＰＳ細胞の定量位相画像（図中（Ａ））、明視野画像（図中（Ｂ））及び減算画像（図中（Ｃ）である。
【図９】実施例２のヒトｉＰＳ細胞の定量位相画像（図中（Ａ））、設定定量位相画像（図中（Ａ’））明視野画像（図中（Ｂ））及び減算画像（図中（Ｃ）である。
【図１０】実施例３のヒトｉＰＳ細胞の定量位相画像（図中（Ａ））及び減算画像（図中（Ｃ））である。
【図１１】図１０（Ａ）の定量位相画像における白線で囲まれた部分の三次元プロット画像（図中（Ａ））、及び図１０（Ｃ）の減算画像における白線で囲まれた部分の三次元プロット画像（図中（Ｃ））である。
【図１２】実施例４のＥＳ細胞の定量位相画像（図中（Ａ））及び減算画像（図中（Ｃ））である。
【図１３】抗Ｎａｎｏｇ抗体により免疫染色した実施例４のＥＳ細胞の蛍光画像である。
【図１４】実施例５のヒトｉＰＳ細胞の定量位相画像（図中（Ａ））、明視野画像（図中（Ｂ））及び減算画像（図中（Ｃ）である。
【図１５】図１４（Ａ）の定量位相画像の断面図（図中（Ａ））、図１４（Ｂ）の位相差コントラスト画像の断面図（図中（Ｂ））及び図１４（Ｃ）の減算画像の断面図（図中（Ｃ））である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の細胞画像処理方法、細胞画像処理装置及び細胞画像処理プログラムの好適な実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００２０】
（細胞）
本発明の実施にあたっては、まず、細胞を準備する。細胞は「単一細胞又は細胞集団」を意味し、その限りにおいて特に制限はない。細胞はヒトだけでなく、マウス、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等の細胞でもよい。また、細胞は、複数系統の細胞に分化する能力（多分化能）及び細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を有する細胞（幹細胞）でよく、分化細胞でもよい。幹細胞としては、例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞が挙げられる。
【００２１】
（測定試料）
次に、細胞を測定試料とする。測定試料は、例えば細胞を含む溶液をスライドチャンバに注入して準備する。
【００２２】
（細胞観察システム）
次に、使用する細胞観察システム１の構成について説明する。図１は細胞観察システム１の構成図である。
【００２３】
図１に示すように、細胞観察システム１は、主に、定量位相顕微鏡Ａ及び細胞画像処理装置Ｄにより構成される。
【００２４】
（定量位相顕微鏡）
定量位相顕微鏡Ａは、光の入射側に、図示しない光出射部からの照射光を導く光ファイバＢの出射側端面Ｂ１に臨ませたレンズＡ２と、このレンズＡ２を透過する光を反射する反射部Ａ３を具備する。一方、定量位相顕微鏡Ａの光の出射側には、光干渉部Ａ７で生成される干渉縞（図示せず、以下同様）を撮像して定量位相画像とするＣＣＤカメラ等の撮像装置Ｃ１と、部分反射部Ａ８で反射された被測定光を撮像して明視野画像とする撮像装置Ｃ２が設けられる。
【００２５】
定量位相顕微鏡Ａは、測定試料Ｓを支持する試料台Ａ４、対物レンズＡ５、反射部Ａ６、光干渉部Ａ７、部分反射部Ａ８を備える顕微鏡本体Ａ１を具備する。
【００２６】
試料台Ａ４は、例えば、中央に光を透過可能な光透過部Ａ４１を備えるとともに、上向き面に測定試料Ｓを載置可能な載置面Ａ４２を有する略板状のものである。載置面Ａ４２に測定試料Ｓを載置した状態で上方から光を照射することにより、測定試料Ｓを透過した被測定光が光透過部Ａ４１を透過して対物レンズＡ５に向かうようにしている。なお、光透過部Ａ４１は、例えばガラス等の光を透過可能な部材より形成したものであってもよいし、単なる孔であってもよい。対物レンズＡ５は、例えば、操作部（図示しない）の操作に基づいて、入射してくる被測定光をその操作に係る所定の倍率で拡大させて平行光として出射するものである。部分反射部Ａ８は、例えばダイクロイックミラー（二色性ミラー）であり、照射光がレーザ光（例えば８３０ｎｍ）であるときの被測定光を透過するが、照射光が白色光であるときの被測定光を反射するものである。反射部Ａ６は、例えば全反射型のミラーであって、部分反射部Ａ８を透過する被測定光Ｈ１を全反射させて光干渉部Ａ７に導入できるようにしている。光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、この光分離素子Ａ７１が出射する被測定光Ｈ１（Ｈ１ａ、Ｈ１ｂ）を収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５とを具備するものである。ここで、光分離素子Ａ７１は、回折格子を用いて構成したものである。さらには、光分離素子Ａ７１は、偏光方向が互いに異なる２つの光に分離する偏光分離素子であってもよい。その場合、光干渉部Ａ７は、被測定光Ｈ１を、偏光方向が互いに異なる２つの光Ｈ１ａ、Ｈ１ｂに分離する光分離素子Ａ７１と、収束光Ｈ２（Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ）に変換する集光レンズＡ７２と、収束光Ｈ２の収束位置に配した空間フィルタＡ７３と、空間フィルタＡ７３を透過した物体光Ｈ３と参照光Ｈ４と、この空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４と、この半波長板Ａ７４により偏光方向を揃えられた物体光Ｈ３と参照光Ｈ４とを重ね合わせて干渉縞を生成する合成レンズＡ７５と、を具備するものである。もしくは、空間フィルタＡ７３の出射側に配した半波長板Ａ７４に代えて偏光子を配して物体光Ｈ３と参照光Ｈ４の偏光方向を揃えてもよい。
【００２７】
照射光をレーザ光とすると、定量位相顕微鏡Ａの被測定光は部分反射部Ａ８を透過し、Ａ６で反射され、光干渉部Ａ７に導入される。そして、光干渉部Ａ７で生成される干渉縞が撮像装置Ｃ１で撮像されて定量位相画像となる。
【００２８】
一方、照射光を白色光とすると、定量位相顕微鏡Ａの被測定光は、部分反射部Ａ８で反射され、結像レンズＡ１０を経て、撮像装置Ｃ２で撮像されて明視野画像となる。
【００２９】
（細胞画像処理装置）
次に、細胞画像処理装置Ｄの構成について説明する。図２は細胞画像処理装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図であり、図３は細胞画像処理装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【００３０】
図２に示すように、細胞画像処理装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２及びＲＡＭ  Ｄ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、例えば撮像装置Ｃ１及びＣ２等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７等を含む通常のコンピュータとして構成される。後述する細胞画像処理装置Ｄの各機能は、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２、ＲＡＭ  Ｄ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ  Ｄ１１の制御の元で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させると共に、主記憶装置Ｄ１２、Ｄ１３や補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
【００３１】
図３に示すように、細胞画像処理装置Ｄは、機能的構成要素として、第１の取得手段Ｄ１、第２の取得手段Ｄ２、設定手段Ｄ３、減算手段Ｄ４及び表示手段Ｄ５を備える。
【００３２】
第１の取得手段Ｄ１は、撮像装置Ｃ１から細胞の定量位相画像を取得するものである。第２の取得手段Ｄ２は、撮像装置Ｃ２から細胞の明視野画像を取得するものである。設定手段Ｄ３は、取得した定量位相画像又は明視野画像の輝度を設定するものである。減算手段Ｄ４は、設定定量位相画像から設定明視野画像を減算して減算画像を取得するものである。表示手段Ｄ５は、減算画像を表示するものである。
【００３３】
（細胞画像処理プログラム）
細胞画像処理プログラムは、コンピュータを、上述した第１の取得手段Ｄ１、第２の取得手段Ｄ２、設定手段Ｄ３、減算手段Ｄ４及び表示手段Ｄ５として機能させるものである。コンピュータに細胞画像処理プログラムを読み込ませることにより、コンピュータは細胞画像処理装置Ｄとして動作する。細胞画像処理プログラムは、例えば、記録媒体に格納されて提供される。なお、記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、または半導体メモリ等が例示される。
【００３４】
（細胞画像処理方法）
細胞画像処理装置Ｄにより行われる細胞画像処理方法について説明する。図４は細胞画像処理方法のフローチャートである。細胞画像処理装置Ｄにより行われる細胞画像処理方法により、空間分解能に優れた細胞の画像を取得することができる。
【００３５】
［第１の取得ステップＳ１］
第１の取得手段Ｄ１は、撮像装置Ｃ１から定量位相画像を取得する。
【００３６】
［第２の取得ステップＳ２］
第２の取得手段Ｄ２は、撮像装置Ｃ２から明視野画像を取得する。なお、第２の取得ステップＳ２は、第１の取得ステップＳ１よりも前に行ってもよいし、あるいは後で行ってもよい。
【００３７】
［設定ステップＳ３］
設定手段Ｄ３は、取得した定量位相画像及び明視野画像の輝度を設定する。その設定は、減算画像のＤＣ成分が少なくなるように行われるのが通常である。
【００３８】
設定手段Ｄ３は、取得した定量位相画像及び明視野画像の輝度を変更することなく、そのままとすることもあるし、取得した定量位相画像又は明視野画像の輝度を変更して設定することもある。
【００３９】
設定手段Ｄ３による輝度を変更するか否かの判定方法には特に制限はない。定量位相画像又は明視野画像の輝度が、予め決めておいた輝度の数値あるいは数値範囲である場合に変更すると判定するようにしてもよいし、逆に、予め決めておいた輝度の数値あるいは数値範囲にない場合に変更すると判定するようにしてもよい。
【００４０】
また、定量位相画像と明視野画像の輝度を対比して、定量位相画像又は明視野画像の輝度を変更するか否かを判定してもよい。この場合は、輝度のヒストグラムを対比して変更するか否かを判定するようにするのが好ましい。
【００４１】
輝度を変更する場合、設定手段Ｄ３は、輝度を高くあるいは低くする変更を行う。
【００４２】
輝度の変更は１回行ってもよいし、複数回行ってもよい。なお、輝度を複数回変更した結果、設定定量位相画像の輝度が第１の取得ステップで取得した定量位相画像と同じになることもあるし、設定明視野画像の輝度が第２の取得ステップで取得した明視野画像と同じになることもある。
【００４３】
上述のようにして、設定手段Ｄ３により、取得した定量位相画像及び明視野画像の輝度が設定されるが、設定ステップＳ３においては、定量位相画像及び高周波成分画像の最高輝度又は最低輝度を同じに設定するのが好ましい。特に、定量位相画像及び高周波成分画像の最高輝度及び最低輝度を同じに設定することによって、減算画像の空間分解能をさらに向上させ、コントラストをよくすることができる。
【００４４】
［減算ステップＳ４］
減算手段Ｄ４は、設定定量位相画像から設定高周波成分画像である設定明視野画像を減算して減算画像を取得する。取得された減算画像は、空間分解能に優れ、細胞内器官（オルガネラ）等の細胞の内部構造及び境界（輪郭）部分が明瞭である。
【００４５】
特に、細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の細胞集団である場合、染色をせずとも、その減算画像から内部構造を詳細に知ることができる。また、減算画像は、細胞核が強調されるので、減算画像から、細胞の分化度を判定することができる。
【００４６】
減算画像は、定量位相画像にない高い空間周波数成分を含むので、定量位相画像の情報を維持し、さらに定量位相画像にない情報を補うものといえる。
【００４７】
本発明は理論に拘束されるわけではないが、減算画像が空間分解能に優れるのは、以下の原理によるものと本発明者らは推定している。
【００４８】
定量位相画像ＩＱＰＭは、低い空間周波数成分のみを含む画像である。この画像の細胞による位相遅れΔφをΔφＬＦとすると、
ＩＱＰＭ＝ΔφＬＦ
となる。これを模式的に示したのが図５（Ａ）である。
【００４９】
一方、明視野画像ＩＢＦは、高い空間周波数成分を含み、境界が強調された画像である。そして、ＩＢＦと細胞による位相遅れΔφＨＦには、
ＩＢＦ〜１−ΔφＨＦ
の比例関係がある。ΔφＨＦを模式的に示したのが図５（Ｂ）である。
【００５０】
定量位相画像から明視野画像を減算すると、
ＩＱＰＭ−ＩＢＦ＝ΔφＬＦ＋ΔφＨＦ−１
となり、減算画像は高い空間周波数成分を含むものとなる。
【００５１】
したがって、減算画像は、空間分解能に優れたものとなる。これを模式的に示したのが図５（Ｃ）である。図５（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）において、横軸は空間周波数であり、縦軸は各空間周波数における光強度（振幅）である。
【００５２】
［表示ステップＳ５］
表示手段Ｄ５は、減算ステップＳ４で取得された減算画像を表示する。表示に際し、減算画像は適当な画像処理が施されても差支えない。減算画像は、全部表示されるようにしてもよいし、一部だけ表示されるようにしてもよい。
【００５３】
また、表示手段Ｄ５により、減算画像の色、輝度、コントラスト、拡大、縮小等の調整等がされるようにするのも可能である。
【００５４】
以上、本発明の第１の実施形態として、細胞観察システム１を使用する実施形態について詳細に述べたが、さらに、定量位相画像及び位相差コントラスト画像を同時に取得することのできる細胞観察システム２を使用する第２の実施形態について説明する。図６は細胞観察システム２の構成図である。
【００５５】
細胞観察システム２の構成は、細胞観察システム１の構成と概ね同じであるが、細胞観察システム２の定量位相顕微鏡Ａは、さらに、光の入射側に、図示しない光出射部からの照射光Ｈ０’を導く光ファイバＢ’の出射側端面Ｂ１’に臨ませた照射光学系Ａ２’と、照射光学系Ａ２’を透過する光を反射するとともに、反射部Ａ３で反射された光を透過する部分反射部Ａ９とを具備する。部分反射部Ａ９としては、例えばダイクロイックミラー（二色性ミラー）が用いられる。照射光学系Ａ２’は、コレクタレンズＡ２１’、絞り板Ａ２２’及びコンデンサレンズＡ２３’を含む。コレクタレンズＡ２１’は、照射光Ｈ０’をコリメートする。絞り板Ａ２２’は、光ビーム断面のうち光軸からの距離が一定範囲である円環領域を選択的に通過させる。コンデンサレンズＡ２３’は、コレクタレンズＡ２１’によりコリメートされた光を収斂させる。なお、細胞観察システム２における対物レンズＡ５は位相膜及び減光膜を有するものである。
【００５６】
このような細胞観察システム２において、照射光Ｈ０をレーザ光（例えば８３０ｎｍ）とし、照射光Ｈ０’を白色光として同時に照射すると、照射光Ｈ０は、Ａ３で反射され、部分反射部Ａ９及び測定試料Ｓを透過し、細胞観察システム１について述べたのと同様、最終的に撮像装置Ｃ１で撮像されて定量位相画像となる。
【００５７】
そして、同時に照射された照射光Ｈ０’は、照射光学系Ａ２’を通過し、部分反射部Ａ９で反射され、測定試料Ｓを透過し、最終的に撮像装置Ｃ２で撮像されて画像となるが、対物レンズＡ５は位相膜及び減光膜を有するので、その画像は位相差コントラスト画像となる。
【００５８】
したがって、細胞観察システム２により、定量位相画像及び位相差コントラスト画像を同時に取得することが可能である。
【００５９】
高周波成分画像が位相差コントラスト画像である第２の実施形態においても、減算画像が空間分解能力に優れるのは、以下の原理によるものと本発明者らは推定している。
【００６０】
上述のとおり、定量位相画像ＩＱＰＭについては、
ＩＱＰＭ＝ΔφＬＦ
である（図７（Ａ））。
【００６１】
一方、位相差コントラスト画像ＩＰｈＣも、高い空間周波数成分を含み、境界が強調された画像である。そして、細胞による位相遅れをΔφＨＦと定義すれば、画像の電場Ｅは、
Ｅ＝ｅｘｐ［ｉ（φ＋ΔφＨＦ)）＝ｅｘｐ［ｉφ］（１＋ｉΔφＨＦ）
と近似できる。
【００６２】
対物レンズ瞳位置に設けられた位相膜により細胞からの散乱光の位相が９０度ずれることにより、位相遅れΔφＨＦが光強度に変換される結果、
ＩＰｈＣ＝｜ｅｘｐ（ｉπ／２）＋ｉΔφＨＦ｜２＝１−２ΔφＨＦ
が導かれ、位相差コントラスト画像ＩＰｈＣと位相遅れΔφＨＦに比例関係が生じる。
【００６３】
さらに位相差コントラスト顕微鏡では、０次回折光とその近傍（以下、略０次回折光）を減光する光学素子が位相膜と同位置に設置してあるため、略０次回折光が減光される。これを模式的に示したのが図７（Ｂ）である。
【００６４】
定量位相画像から位相差コントラスト画像を減算すると、
ＩＱＰＭ−ＩＰｈＣ＝ΔφＬＦ＋２ΔφＨＦ−１
となり、減算画像は高い空間周波数成分を含むものとなる。
【００６５】
したがって、第２の実施形態においても、減算画像は、空間分解能に優れたものとなる。これを模式的に示したのが図７（Ｃ）である。図６と同様、図７（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）において、横軸は空間周波数であり、縦軸は各空間周波数における光強度（振幅）である。
【００６６】
以上、本発明の第１及び第２の実施形態について説明したが、本発明が上述の実施形態に限定されないことはいうまでもない。例えば、細胞観察システム１の対物レンズＡ５を位相膜及び減光膜を有するものとしてもよいし、細胞観察システム２の対物レンズＡ５を位相膜及び減光膜を有さないものとしてもよい。
【００６７】
また、細胞観察システム１及び細胞観察システム２を、定量位相顕微鏡と明視野顕微鏡又は位相差コントラスト顕微鏡とが別の装置として構成されている細胞観察システムとしてもよい。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
細胞画像処理装置により、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１。Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１、ｐ．１０１−１０６）の定量位相画像（図８（Ａ））及び明視野画像（図８（Ｂ））から、減算画像（図８（Ｃ））を取得した例を示す。この例では、細胞画像処理装置は、定量位相画像及び明視野画像の輝度のヒストグラムを対比し、定量位相画像の輝度を自動変更して明視野画像と同じ最高輝度及び最低輝度に設定し、そして、設定定量位相画像から明視野画像を減算した。
【００６９】
定量位相画像は細胞内器官（オルガネラ）の光学厚さがないように見え、コントラストもあまり明瞭でないが、減算画像では境界及び細胞内器官（オルガネラ）が明瞭であることがわかる。
【００７０】
（実施例２）
細胞画像処理装置により、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）の定量位相画像（図９（Ａ））及び明視野画像（図９（Ｂ））から、減算画像（図９（Ｃ））を取得した例を示す。この例では、細胞画像処理装置は、定量位相画像の輝度を自動変更して明視野画像と同じ最高輝度及び最低輝度の設定定量位相画像（図９（Ａ’））とした後、設定定量位相画像から明視野画像を減算した。
【００７１】
（実施例３）
細胞画像処理装置により、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）の定量位相画像（図１０（Ａ））及び明視野画像から、減算画像（図１０（Ｃ））を取得した例を示す。
【００７２】
定量位相画像（図１０（Ａ））における白線で囲まれた部分の三次元プロット画像が図１１（Ａ）であり、及び減算画像（図１０（Ｃ））における白線で囲まれた部分の三次元プロット画像が図１１（Ｃ）である。図１１（Ａ）及び（Ｃ）の横軸（Ｘ及びＹ方向）はいずれも画素（ピクセル）の個数を表し、そして縦軸（Ｚ方向）は輝度を表す。
【００７３】
図１１（Ａ）と図１１（Ｃ）の対比から、減算画像とするとコントラストが明瞭になることがわかる。
【００７４】
（実施例４）
細胞画像処理装置により、ＥＳ細胞（ｋｈＥＳ３）の定量位相画像（図１２（Ａ））及び明視野画像から、減算画像（図１２（Ｃ））を取得した例を示す。減算画像では、細胞核領域がより明瞭となっている。
【００７５】
図１３は、抗Ｎａｎｏｇ抗体により免疫染色したＥＳ細胞の蛍光画像である。
【００７６】
図１３の略円形の白色部分がＥＳ細胞の細胞核領域である。図１２（Ｃ）と図１３の対比からも、減算画像中の細胞核領域が明瞭であることがわかる。
【００７７】
（実施例５）
細胞画像処理装置により、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）の定量位相画像（図１４の（Ａ））及び位相差コントラスト画像（図１４（Ｂ））から、減算画像（図１４（Ｃ））を取得した例を示す。
【００７８】
図１５（Ａ）は、図１４（Ａ）の定量位相画像の断面図、図１５（Ｂ）は、図１４（Ｂ）の位相差コントラスト画像の断面図、そして、図１５（Ｃ）は、図１４（Ｃ）の減算画像の断面図である。なお、断面は、図１４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に表示した黒線の断面である。
【００７９】
定量位相画像の断面図をみると、左右がなだらかとなっており、これは、像の不鮮明さすなわち空間分解能が低いことを表している。一方、位相差コントラスト画像の断面図では、両端のエッジがアンダーシュート、オーバーシュートしており、空間方向に微分操作された効果が表れている。これは位相膜および減光膜により、０次光とその近傍の空間周波数が遮断されたためである。減算画像の断面図では、左右の両端部が、急峻な強度分布となっており、定量位相画像の解像度が回復している。
【符号の説明】
【００８０】
１、２…細胞観察システム、Ａ…定量位相顕微鏡、Ａ１…顕微鏡本体、Ｂ…光ファイバ、Ｃ１、Ｃ２…撮像装置、Ｄ…細胞画像処理装置、Ｄ１…第１の取得手段、Ｄ２…第２の取得手段、Ｄ３…設定手段、Ｄ４…減算手段、Ｄ５…表示手段。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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