(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも７５℃でセロビオハイドロラーゼ活性を示す新規な耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法の提供。【解決手段】この耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有し、特定な配列のアミノ酸配列からなるポリペプチド、特定な配列のアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は特定な配列のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、２９１位と２９６位のシステインを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、２９１位と２９６位はシステインである。）からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
【請求項２】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、２９１位と２９６位のシステインを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、２９１位と２９６位はシステインである。）からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ) 配列番号２又は４で表される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｈ) 配列番号２又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項５】
真核微生物である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項６に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
【請求項８】
セルロースを含む材料を、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項４又は５に記載の形質転換体、又は請求項６に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロビオハイドロラーゼ酵素の耐熱性に関する。セロビオハイドロラーゼは、セルロース、ヘミセルロース等のリグノセルロースを加水分解し、単糖を生成するプロセスに関わるグリコシド加水分解酵素の一つである。より詳細には、新規の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロース、ヘミセルロース等の多糖類とリグニンである。例えば、多糖類は、セルラーゼ酵素と総称されるグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品原料として利用される。
【０００３】
複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。リグノセルロースの加水分解には、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ  ３．２．１．８）や、他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。一方で、耐熱性酵素を用いてリグノセルロース糖化処理を高温で行うことにより、酵素量と糖化時間が大幅に削減され、酵素コストの大幅低減が可能であると考えられる。このため、各種セルラーゼについて、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
【０００４】
真核生物である好熱性糸状菌は、原核生物の好熱性細菌や超好熱性アーキアと比べ、その生存限界温度は低く、５５℃程度である。このため、好熱性糸状菌が発現、分泌するグリコシド加水分解酵素の耐熱性は、一般的にあまり高くない。これまで報告された中で最も耐熱性が高い糸状菌由来セロビオハイドロラーゼは、好熱性糸状菌Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのセロビオハイドロラーゼＣＢＨI、ＣＢＨIIが、それぞれ至適温度７５℃と７０℃を示し（例えば、非特許文献１参照。）、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのセロビオハイドロラーゼＣＢＨIは至適温度６５℃である（例えば、非特許文献２参照。）。セロビオハイドロラーゼ中の１個又は複数個のアミノ酸を置換することによって、より耐熱性を向上させる方法もあるが（例えば、特許文献１又は２参照。）、こうして得られた変異型セロビオハイドロラーゼの耐熱性は未だ不充分である。
【０００５】
一方、温泉や熱水噴出孔、油田、鉱山などの極限環境から５５℃以上で増殖する好熱菌や８０℃以上で増殖する超好熱菌が分離、培養されている。これらの好熱性細菌や超好熱性アーキアに由来する耐熱性グリコシド加水分解酵素は、その大部分がエンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はグルコシダーゼ活性を持つ酵素である。リグノセルロース加水分解プロセスにおいて最も重要な役割を果たすセロビオハイドロラーゼは、わずか数個が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属に属する３種の好熱性細菌から分離されているにすぎない。例えば、好熱性嫌気性菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、高いリグノセルロース加水分解活性を持つ酵素複合体セルロソームを菌体外に提示する。セルロソームの主要酵素はセロビオハイドロラーゼであり、ＧＨ５ファミリーに属するＣｅｌＯ、ＧＨ９ファミリーに属するＣｂｈＡとＣｅｌＫの３種類が単離され、いずれも至適温度Ｔｏｐｔ＝６０〜６５℃である（例えば、非特許文献３〜５参照。）。好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａからＧＨ６ファミリーに属するＥ３（例えば、非特許文献６参照。）と、ＧＨ４８ファミリーに属するＣｅｌ４８Ａ（例えば、非特許文献７参照。）の２種類のセロビオハイドロラーゼ遺伝子が単離されている。これらのセロビオハイドロラーゼは比較的熱安定性が高く、最大値の５０％活性を示す温度範囲は４０〜６０℃であり、５５℃で少なくとも１６時間安定した活性を有する。但し、これら２種類のセロビオハイドロラーゼは、７０℃以上では活性が不充分であり、これらを用いてセルロースの糖化処理を行う場合には、糖化処理温度は６０〜６５℃が上限となる。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の好熱性細菌由来セロビオハイドロラーゼは最も耐熱性が高く、至適温度Ｔｏｐｔ＝１０５℃、活性半減期Ｔｈａｌｆが１０８℃で７０分と報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。しかし、当該酵素は、エンドグルカナーゼ様の基質特異性を示し、アモルファス構造のセルロースとカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に対してのみ分解活性を示す。さらに、濾紙の加水分解活性が弱いことから、当該酵素によっては、結晶性リグノセルロースの効率的糖化は期待できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００６−５１５５０６号公報
【特許文献２】特開２０１２−３９９６７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ganju et al.，Biochim. Biophys. Acta，1989，vol.993，p.266-274.
【非特許文献２】Hong et al.，Appl Microbiol Biotechnol.，2003，vol.63，p.42-50.
【非特許文献３】Zverlov et al.，Microbiology，2002，vol.148，p.247-255.
【非特許文献４】Zverlov et al.，Microbiology，1998，vol.143，p.3537-3542.
【非特許文献５】Kataeva et al.，Journal of Bacteriology，1995，vol.181，p.5288-5295.
【非特許文献６】Zhang et al.，Biochemistry，1995，vol.34，p.3386-3395.
【非特許文献７】Irwin et al.，Eur J Biochem.，2000，vol.267，p.4988-4997.
【非特許文献８】Ruttersmith and Daniel，Biochemical Journal，1991，vol.277，p.887-890.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも７５℃でセロビオハイドロラーゼ活性を示す新規な耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法、セルラーゼ混合物及びセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、２９１位と２９６位のシステインを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、２９１位と２９６位はシステインである。）からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
［２］（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、２９１位と２９６位のシステインを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、２９１位と２９６位はシステインである。）からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、（ｇ) 配列番号２又は４で表される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は（ｈ) 配列番号２又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［３］前記［２］ポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［４］前記［３］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［５］真核微生物である、前記［４］の形質転換体。
［６］前記［４］又は［５］の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
［７］前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［６］の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
［８］セルロースを含む材料を、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［４］又は［５］の形質転換体、又は前記［６］の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６及びＡＲ１９Ｇ−１２から推定されるアミノ酸配列と、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ のＧＨ６  セロビオハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ： ＡＢＸ０４７７６．１）、及び好熱性土壌放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ のＧＨ６ セロビオハイドロラーゼＴｆＣｅｌ６Ｂ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＡ６２２１１．１）の触媒ドメインのアミノ酸配列アライメント図である。
【図２】メタゲノム解析により得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（及びＯＪ１−２）、ＯＪ１−１、並びに３５種のバクテリア由来ＧＨ６セロビオハイドロラーゼ触媒領域のアミノ酸配列に基づいた有根分子系統樹であり、ＧＨ６エンドグルカナーゼであるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ  Ｃｅｌ６Ａをアウトグループとして描かれている。ＯＪ１−２はアミノ酸配列がＡＲ１９Ｇ−１２と１００％同一であることから、ＡＲ１９Ｇ−１２と同一遺伝子であり、ＡＲ１９Ｇ−１２の部分配列であると推察される。
【図３】オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２の触媒領域（ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子）の２６８位から３１５位までのアミノ酸配列、当該部分配列に対応するオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、及び３５種のバクテリア由来ＧＨ６セロビオハイドロラーゼのアミノ酸配列アライメント図である。
【図４】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質及びそのアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図５】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質の各基質に対するセロビオハイドロラーゼ活性の測定結果を示した図である。
【図６】実施例１において、大腸菌発現させたアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃタンパク質の各基質に対するセロビオハイドロラーゼ活性の測定結果を示した図である。
【図７】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質及びそのアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃタンパク質の各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【図８】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質の各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性（５０℃又は７０℃）を計測した結果を示した図である。
【図９】実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ（図中、「Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ」）、及び好熱性土壌放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来ＧＨ６セロビオハイドロラーゼＴｆＣｅｌ６Ｂの各酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示した図である。
【図１０】実施例２において、放線菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。
【図１１】実施例２において、放線菌発現させたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質の各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発が進まない一因である。
【００１４】
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
【００１５】
本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内５ヶ所から採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知セロビオハイドロラーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）４４個を得た。これらのＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）分解活性及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２から、ＰＣＲクローニングにより、Ａｖｉｃｅｌ及びＰＳＡ加水分解活性を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１を得た。ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、完全長のＧＨ６触媒領域から構成され、そのアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に、それぞれ表す。
【００１６】
後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、水溶性ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナンや結晶性セルロースのアビセルに対しても分解活性を示すが、ＣＭＣ、β−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるラミナリン、及びキシランに対しては、ほとんど分解活性は示さない。この基質特異性から、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１がＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼであることが示唆される。
【００１７】
また、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、既知のクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＧＨ６ファミリーに属するグリコシドハイドロラーゼ（配列番号８）であり、その配列同一性（相同性）はわずか６３％しかなかった。基質特異性及び既知のセロビオハイドロラーゼとのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、ＧＨ６ファミリーに属する新規なセロビオハイドロラーゼであることが明らかとなった。
【００１８】
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１＜１２＞に示すように、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、４０〜９０℃の広い温度範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。より詳細には、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のセロビオハイドロラーゼ活性は、３０〜７０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、７０〜１００℃の範囲内では、温度が高くなるにつれてセロビオハイドロラーゼ活性は低下する傾向にあった。
【００１９】
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１の２９１位（番目）及び２９６位のセリン残基（Ｓ）をシステイン残基（Ｃ）に置換したアミノ酸置換変異体であるＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１−Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ（以下、単に「Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ」ということがある。）も、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１と同様に、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。アミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃのアミノ酸配列を配列番号３に、それがコードされる塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。実際に、後記実施例１＜１２＞に示すように、Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃは、４０〜１００℃の広い温度範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。より詳細には、Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０〜７５℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、７５〜８５℃の範囲内では、温度が高くなるにつれてセロビオハイドロラーゼ活性は低下する傾向にあり、７５〜１００℃の範囲内ではセロビオハイドロラーゼ活性は低下せず、ほぼ同程度であった。つまり、アミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃは、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１よりも耐熱性に非常に優れていた。
【００２０】
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１、又はそのアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃに対しても、セロビオハイドロラーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
【００２１】
すなわち、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列の２９１位のセリン及び２９６位のセリンが共にシステインに置換されているアミノ酸配列）からなるポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、２９１位と２９６位のシステインを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、２９１位と２９６位はシステインである。）からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
【００２２】
前記（Ｂ）及び（Ｅ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００２３】
前記（Ｃ）及び（Ｆ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上であれば特に限定されないが、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
【００２４】
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００２５】
前記（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
【００２６】
前記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
【００２７】
前記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られる。中でも、７０〜１００℃においても非常に高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことから、前記（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域とすることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡを基質とする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡ以外のその他のβグルカンを基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるＬｉｃｈｅｎａｎ、Ａｖｉｃｅｌ、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＣＭＣ）、β−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン、β−１，３結合からなるグルカン、β−１，６結合からなるグルカン、及びキシラン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、ＰＳＡに加えて、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカンと結晶性セルロースの少なくとも一方を基質とするものが好ましく、ＰＳＡ、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン、及び結晶性セルロースを基質とするものがより好ましい。
【００２９】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ４．０〜６．５の範囲内にある。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、少なくともｐＨ５．０〜７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０〜７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましい。
【００３０】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、セロビオハイドロラーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性等が挙げられる。
【００３１】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドのいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のセロビオハイドロラーゼが有する、セロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼには、公知のセロビオハイドロラーゼに対し、セロビオハイドロラーゼ触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｆ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
【００３２】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
【００３３】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
【００３５】
また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
【００３６】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
【００３７】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｈ)のいずれかの塩基配列からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸（ただし、２９１位と２９６位のシステインを除く。）が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、２９１位と２９６位はシステインである。）からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｇ) 配列番号２又は４で表される塩基配列と７５％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｈ) 配列番号２又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００３８】
なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００３９】
前記（ａ）〜（ｆ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。同に、なお、前記（ｄ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号４で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子組換え技術によって行うことができる。
【００４０】
配列番号２又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ−１２をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ−１２遺伝子」ということがある。）の全長若しくはセロビオハイドロラーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１２遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２又は４で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
【００４１】
前記（ｇ）の塩基配列において、配列番号２又は４で表される塩基配列との配列同一性は、７５％以上であれば特に限定されないが、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましい。
【００４２】
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
【００４３】
例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、又は（ｆ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は複数個の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、又は（ｆ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ−１２遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ−１２遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
【００４４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
【００４５】
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００４６】
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
【００４７】
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
【００４８】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
【００４９】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
【００５０】
発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産できる。特に、当該形質転換体がコウジカビ等の糸状菌や酵母等の真核微生物である場合には、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを比較的簡便に大量生産することができる。
【００５１】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする遺伝子はＧＣ含量が多いため、発現させるための宿主としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌等の放線菌も好ましい。特にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属菌は、有用な抗生物質や生理活性物質を生産することで知られており、工業的に広く利用されている有用細菌である。その物質生産能を応用した外来遺伝子の大量発現系が開発され、いくつかの成功例が報告されている（Herai, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p.14031−14035 (2004)；特開2005−237233号公報；特開2007−53994号公報；Ogino, S. et al., Appl Microbiol Biotechnol vol. 64, 823−828 (2004)；特開2008−193953号公報；Tamura, T. et al., J. Enviomental Biotechnol vol.7, 3−10 (2007)）。特に放線菌は高ＧＣ含量のゲノムを持つため、大腸菌では発現が困難なＧＣ含量の高い遺伝子の発現が良い傾向にあり（Tamura, T. et al., J. Enviomental Biotechnol vol.7, 3−10 (2007)）、また異種タンパク質の発現が放線菌無細胞抽出液の４０％にまで及ぶ極めて高いレベルの発現性も報告されている（Herai, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, p.14031−14035 (2004)）。
【００５２】
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
【００５３】
本発明に係る形質転換体が植物である場合、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
【００５４】
［耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させる。
【００５５】
形質転換体によって生産された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
【００５６】
形質転換体から耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出・精製する方法は、耐熱性セロビオハイドロラーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性セロビオハイドロラーゼは、塩析法、限外濾過法、クロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
【００５７】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性セロビオハイドロラーゼを簡便に精製することができる。
【００５８】
［セルラーゼ混合物］
前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含むセルラーゼ混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出・精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
【００５９】
当該セルラーゼ混合物に含まれる前記耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のセルラーゼとしては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るセルラーゼ混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、β−グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
【００６０】
当該セルラーゼ混合物に含まれるその他のセルラーゼは、少なくとも７０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましく、７０〜９０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることがより好ましい。当該セルラーゼ混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該セルラーゼ混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該セルラーゼ混合物が耐熱性セルラーセのみを含む場合、当該セルラーゼ混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
【００６１】
［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
【００６２】
セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、破砕・細断等の物理的処理、酸・アルカリ等の化学処理、適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
【００６３】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、５５〜１００℃、ｐＨ３．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、７０〜１００℃、ｐＨ４．０〜６．０で反応を行うことがより好ましい。反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で行うことができる。
【００６４】
セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを用いることも好ましい。当該その他のセルラーゼとしては、前記セルラーゼ混合物に含められるセルラーゼと同様のものを用いることができ、少なくとも７０℃で、好ましくは少なくとも７０〜１００℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに代えて、前記セルラーゼ混合物を用いてもよい。
【実施例】
【００６５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６６】
［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性セロビオハイドロラーゼのクローニング
＜１＞  温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：５５℃以上）、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：８０℃以上）の遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。
【００６７】
採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ  Ｌａｒｇｅ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ量が１０μｇ以上得られたゲノム試料では、このうち５μｇを使用し、メタゲノムシーケンスを行った。すなわち、抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡ及び１６ｓｒＤＮＡアンプリコンのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、セルラーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。一方、ＤＮＡ量が少なかった試料（１０μｇ以下）では、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてゲノム増幅を行い、得られた増幅産物に対して、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。
各温泉土壌サンプル当たり３〜４回、計１９回、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３９４ｂｐ、総リード数２６，２９５，４６３、総ゲノム解読量１０．３Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
【００６８】
＜２＞  温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
Ｒｏｃｈｅ  ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３又は２．５．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｍａｔｃｈ  （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ  ｕｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
Ｑｕａｌｉｔｙフィルター処理したリードと１００ｂｐ以上のアセンブルコンティグは、合計２．５Ｇｂｐあり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２６，２９４，１９３リードのうち１７，９９１，５６７リードが、平均で１ｋｂ以上のコンティグにアセンブルされ（計５９５，６０２コンティグ）、このうち最大コンティグ長は２７８，１８５ｂｐであった。
【００６９】
アセンブル後の配列は、ＫＥＧＧデータベース（Kanehisa, M. Science & Technology Japan，1996，No.59，p.34-38、http://www.genome.jp/kegg/、2011/5/11（検索））に参照し、全てのコンティグ及びシングルトンを、バクテリア、アーキア（古細菌）、真核生物、ウィルス、いずれにも属さないものの５カテゴリーに系統分類した。アセンブル後の配列長（＝総コンティグ長＋総シングルトン長）２．５Ｇｂｐのうち、バクテリアにヒットした配列長２５８Ｍｂｐ、アーキアにヒットした配列長２７Ｍｂｐ、真核生物にヒットした配列長１９３，５６１ｂｐ（アセンブル後の全配列長の０．００８％）、ウィルスにヒットした配列長６８５，６４０ｂｐ（アセンブル後の全配列長の０．０２７％）であった。真核生物に属する配列が少なかった理由は、温泉土壌メタゲノムの温度が５８〜７０℃の範囲にあり、糸状菌等の真核生物の生存限界温度を超えていることを反映しているため、と考えられた。これらの結果から、このメタゲノムデータベースは、わずか１１．３％の既知ＤＮＡ配列を含んでいるにすぎないことがわかった。いずれにも属さない配列長は２．２Ｇｂｐあり、アセンブル後の配列全体の８８．７％を占めた。これらは、バクテリア、アーキア、又は真核生物のいずれかに由来する新規な配列である。
【００７０】
＜３＞  セロビオハイドロラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルロース）、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース  １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２００９／４／１３）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。メタゲノムＡＲ１５及びＡＲ１９ではアノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105)を使用し、メタゲノムＨ１、Ｎ２、ＯＪ１ではＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｏｒｐｈｅｌｉａ  ｏｐｔｉｏｎ：ｄｅｆａｕｌｔ（ｍｏｄｅｌ＝Ｎｅｔ７００，ｍａｘｏｖｅｒｌａｐ＝６０）、Ｍｅｔａｇｅｎｅ  ｏｐｔｉｏｎ：−ｍ）。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ  ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ  ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ＝−１、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
【００７１】
アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ及びＭｅｔａｇｅｎｅは、読み取りエラー等によって生じるフレームシフトに対応していないため、以下に述べる方法でフレームシフト補正を行った。まず、コンティグを１ｋｂｐずらしながら２ｋｂｐの長さに切断した。このため、切断された配列は前後の配列と１ｋｂｐ配列が重なっていた。切断した各コンティグ配列を、前述したグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースに参照し（Ｅ＜１ｅ−２０）、Ｂｌａｓｔｘによりスクリーングした。ヒットしたコンティグ配列に対してＧｅｎｅｗｉｓｅ（Ｗｉｓｅ２  ｐａｃｋａｇｅ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/Wise2/）を使い、グリコシド加水分解酵素のコーディング領域を取得した。このとき、１００ｂｐ以下のコーディング領域を持つ配列は除去した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅソフトウェアでは、ターゲットコンティグについて、ローカルデータベース上のヒットした酵素配列と参照し、アライメントスコアーが最大になるように空白（ｇａｐ）を挿入又は削除することによって、配列のフレームシフトが補正される。
【００７２】
こうして得られたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ  ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３．０  ａｎｄ  ＨＭＭＥＲ  ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、隠れマルコフモデルを応用した配列相同性検索アルゴリズムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｆｉｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。ＢＬＡＳＴＰによるスクリーニングを行い、ＣＢＨ（セロビオハイドロラーゼ）配列としてヒットした４４個のＯＲＦをＧＨファミリーに分類した。
【００７３】
＜４＞  Ｏｌｐｈｅｒｉａ出力に見られるレア開始コドンの補正
アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａは、ＡＴＧ（メチオニン）の他、レアコドンのＧＴＧ（バリン)、ＴＴＧ（ロイシン）、及びＡＴＡ（イソロイシン)を開始コドンとしてＯＲＦ検出する。このため、アセンブルされたコンティグにＡＴＧを開始コドンとする完全長ＯＲＦが含まれない場合、Ｏｒｐｈｅｌｉａはレアコドンを開始コドンとして認識するエラーが発生する。前記＜３＞においてＯｒｐｈｅｌｉａにより完全長と出力されたＯＲＦのうち、レアコドンＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＡを開始コドンとするＯＲＦは８個あった。ｇｅｎｅｗｉｓｅによるＯＲＦ出力とＯＲＦが含まれるコンティグのアミノ酸配列を参照し、これらのＯＲＦがレアコドンを開始コドンとする完全長配列か、あるいは、出力エラーであるか、確認を行った。その結果、Ｏｒｐｈｅｌｉａが出力したレアコドンを開始コドンとする８個のＯＲＦは、全て出力エラーであること、すなわち不完全長配列であることが判明した。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
セロビオハイドロラーゼ遺伝子と推定されたＯＲＦ４４個のＧＨファミリー分類結果を表１に示す。表１中、括弧内はメチオニンを開始コドンとする完全長ＯＲＦ数を表している。表１に示すように、ＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼＯＲＦがメタゲノムＡＲ１９から２個（ＡＲ１９Ｇ−１６６とＡＲ１９Ｇ−１２）、メタゲノムＯＪ１から２個（ＯＪ１−１とＯＪ１−２）、合計４個得られた。一方、ＧＨ７ファミリーに属するＯＲＦ配列は得られなかった。ＧＨ９、ＧＨ４８ファミリーに属するＯＲＦはそれぞれ、１５個と１２個得られた。その他のＧＨファミリー（ＧＨ１０、ＧＨ１２、ＧＨ２６）に属するセロビオハイドロラーゼ遺伝子ＯＲＦは合計１３個得られた。これら、セロビオハイドロラーゼ遺伝子と推定された、不完全長配列を含むすべてのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。
【００７６】
なお、現在、実用化されているバイオ燃料用のセルラーゼ酵素液は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ２(http://www.bioenergy.novozymes.com/cellulosic-ethanol/)、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＴＲＩＯ（http://www.genencor.com/industries/biofuels/fuel_ethanol_from_biomass_cellulosic_biofuels/）であり、いずれも木材腐朽菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉが分泌する酵素をベースにしている。この糸状菌が分泌するグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）の主要な構成酵素は、セロビオハイドロラーゼＣＢＨI、ＣＢＨIIであり、それぞれ、ＧＨ７ファミリーとＧＨ６ファミリーに属している。
【００７７】
＜５＞  オープンリーディングフレームＯＪ１−１及びＯＪ１−２
オープンリーディングフレームＯＪ１−１は、５４８アミノ酸残基からなり、セルロース結合モジュールＣＢＭ３（１４９ｂｐ）−リンカー（１１１ｂｐ）−ＧＨ６触媒領域を持つマルチドメイン酵素をコードしていた。但し、触媒領域の後半部は終止コドンが欠落し、不完全長であった。
【００７８】
オープンリーディングフレームＯＪ１−２は、２４７アミノ酸残基からなり、ＧＨ６触媒領域だけからなるポリペプチドをコードする塩基配列であった。ＯＪ１−２は開始コドン、終止コドンいずれも欠いていること、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼは、通常、４００以上のアミノ酸残基から構成されていることから、ＯＪ１−２は不完全配列である。ＯＪ１−２のアミノ酸配列はオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２のアミノ酸配列と１００％同一の配列であり、このことから、ＯＪ１−２はＡＲ１９Ｇ−１２と同一遺伝子であり、ＡＲ１９Ｇ−１２の部分配列であると考えられる。
【００７９】
＜６＞  オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６及びＡＲ１９Ｇ−１２
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６は、４７４アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号５）をコードしていたが、開始コドンが失われている不完全長配列であって、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域だけから構成されていた。ＡＲ１９Ｇ−１６６のＧＨ６触媒領域（ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ、配列番号６）は、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のグリコシドハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）と６６％のアミノ酸配列同一性を示した。
【００８０】
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２は、４５９アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号７）をコードしていたが、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６と同様、開始コドンが失われている不完全長配列であり、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域から構成されていた。ＡＲ１９Ｇ−１２のＧＨ６触媒領域（ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１、配列番号１）は、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ ＤＳＭ ７８５のＧＨ６（ファミリー６グリコシドハイドロラーゼ）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＹＰ＿００１５４４９０４．１）のＣＢＨ触媒領域と６３％のアミノ酸配列同一性を示した。
【００８１】
図１に、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６及びＡＲ１９Ｇ−１２の触媒ドメイン、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ のＧＨ６セロビオハイドロラーゼ触媒ドメイン（配列番号８）、及び好熱性土壌放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ のＧＨ６セロビオハイドロラーゼＴｆＣｅｌ６Ｂ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＡＡ６２２１１．１）触媒ドメイン（配列番号９）のアミノ酸配列アライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列においてアミノ酸残基が保存されている領域を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において一部変異はあるものの大部分のアミノ酸配列においてアミノ酸残基が保存されている領域を示す。
【００８２】
＜系統遺伝学解析＞
培養分離された菌体からクローニングされた遺伝子とは違い、メタゲノム解析によりクローニングされた遺伝子の由来は不明である。高温土壌メタゲノムから得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、ＯＪ１−１が、バクテリアやアーキア（古細菌）など原核生物に由来するのか、あるいは、糸状菌やキノコなど真核生物に由来するのか、わからない。そこで、触媒領域アミノ酸配列のマルチプルアライメントと分子系統樹による系統遺伝学解析を行い、これらＯＲＦの由来を推定した。
【００８３】
図２はＧＨ６ファミリーに属するエキソ型グリコシドハイドロラーゼ（セロビオハイドロラーゼ、グリコシドハイドロラーゼ、エキソグルカナーゼ、及びセロビオシダーゼ）の有根分子系統樹である。オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、及びＯＪ１−１から推定されるアミノ酸配列及びセルロース分解能を有する好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  Ｃｅｌ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）の触媒領域アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰによりＧｅｎｂａｎｋに対しホモロジー検索を行い、ファミリー６に属するグリコシドハイドロラーゼ３５種の配列を得た。これらホモロジー検索によりヒットしたバクテリア３５配列、及びオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、及びＯＪ１−１から推定されるアミノ酸配列について、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｐｒｏ  ５．６．５を用いてマルチプルアライメント（Cost Matrix = Blosum80; Gap open penalty = 12; Gap extension penalty = 3; Alignment type = Global alignment with free end gaps）を行った後、近隣接続法により系統樹を作成した。ＧＨ６ファミリーに属するエンドグルカナーゼＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  Ｃｅｌ６Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＣ０６３８８．１）をアウトグループとした。ブートストラップ確率は１，０００レプリカにより算出し、系統樹の各分岐点にパーセントで示した。図２中、下部に示したスケールは遺伝距離（平均アミノ酸置換数／サイト）である。また、括弧内に示した酵素名の「ＣＢＨ」はｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ又は１，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、「ＧＨ」はｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅの省略である。
【００８４】
系統樹のレファレンスに用いたバクテリア及び糸状菌のファミリー６グリコシドハイドロラーゼは以下の通りである（カッコ内は、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｐｒｏｔａｉｎ  Ｄａｔａ  ｂａｎｋ（ＰＤＢ）又はＥＭＢＬ−Ｂａｎｋのアクセッション番号。）。
Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  １１Ｂ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＫ５２３８８．１）；  
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ  Ｕ３２  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＪ４６９５４．１）；  
Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ  ＡＴＣＣ  ４８４  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＥ４６０５５．１）；  
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＨＹ−１３  ｅｘｏ−ｂｅｔａ−１，４−ｘｙｌａｎａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＲ７１２２４．１）；  
Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｕｅｄａ  １０７  Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ｐｕｔａｔｉｖｅ，ｃｅｌ６Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＥ８５９７８．１）；  
Ｈａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ  ＫＣＴＣ  ２３９６  Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＡＢＣ２７００７．１）；  
Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）；
Ｊｏｎｅｓｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  ２０６０３  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＶ０８３９９．１）；  
Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｓｅｔａｅ  ＫＭ−６０５４  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＪ２６１８５．１）；
Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ  ＤＳＭ  ４４９６３  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：  ＥＦＨ８５８６４．１）；  
Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７３７５  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００６５１８９５３．１）；
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ａｕｒｅｎｔｉａｃａ  ＡＴＣＣ  ２７０２９  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＬ４８５７４．１）；
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｌｕｐｉｎｉ  ｓｔｒ．  Ｌｕｐａｃ  ０８  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＨ２０９６９．１）；
Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＨ６７８６９．１）；
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＹＫ９  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＭ０８８８０．１）；
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ  ３０１６  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦＣ３２４５４．１）；
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  Ｐｏ８２  ＣｂｈＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＧ７１０５０．１）；
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ  ２−４０  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＤ８１５３２．１）；
Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ＣＮＳ−２０５  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＶ９９７７３．１）；
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｖｉｏｌａｃｅａ  ＤＳＳ１２  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿００３５５５６２０．１）；
Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ４４７２８  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＤ４２６２２．１）；
Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＤＷ４／３−１  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＡＵ６７０５０．１）；
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＣ６９５６４．１）；
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＷＰ＿００６１４２９１１．１）；
Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０２１  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＹＰ＿００３３４２３３６．１）；
Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｎｅｒａｅ  Ｔ７９０１  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＲ１２７２３．１）；
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｃｅｌ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）；
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｓｐｏｒａ  ｂｉｓｐｏｒａ  ＤＳＭ  ４３８３３  ｆａｍｉｌｙ  ６  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿００３６５３２５０．１）；
ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｅｌ６Ａ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＹ２４８５５．１）；
Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ  ｍａｒｉｓ  ＡＢ−１８−０３２  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＢ４６９４４．１）；
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｒａｐｈａｎｉ  ７５６Ｃ  ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＬ０８３５９．１）；
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｐｖ．  ｏｒｙｚａｅ  ＫＡＣＣ  １０３３１  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＷ７７２８９．１）；
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ  ＡＴＣＣ  ３５９３７  １，４−ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＷＰ＿００５９９３７３２．１）；
Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  ＤＳＭ  １５８９４  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＺ３０１８１．１）；
Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ＥＢ９２．１  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＧＯ８１２０４．１）。
【００８５】
図２に示すように、メタゲノム解析により得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、ＡＲ１９Ｇ−１２（ＯＪ１−２）、及びＯＪ１−１は、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒｅｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＢＸ０４７７６．１）と同一の分岐群を形成していることが分かった。
【００８６】
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２の触媒ドメイン（ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１）は、セロビオハイドロラーゼ活性が確認されたＡＲ１９Ｇ−１６６の触媒ドメイン（ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ）と７９％のアミノ酸配列同一性を示し、同じ分岐群のセロビオハイドロラーゼＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ  ａｕｒｅｎｔｉａｃｕｓ  ＤＳＭ  ７８５のＧＨ６  ＣＢＨと６３％のアミノ酸配列相同性を示す、新規なタンパク質であった。一方、ＡＲ１９Ｇ−１２の触媒ドメインは、バクテリアのＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼの中で、最も詳しく酵素活性、至適温度、至適ｐＨ、セロビオース阻害、Ｘ線三次元立体構造等の解析や特徴付けが行われている好熱性土壌放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＴｆＣｅｌ６Ｂの触媒ドメインと５３％のアミノ酸配列相同性を示すに過ぎなかった。
【００８７】
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１２、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６、及び３４種のバクテリアＧＨ６  ＣＢＨ触媒ドメインの配列アライメントから、この二つのＯＲＦには他のバクテリアＧＨ６ファミリーに属するＣＢＨには存在しない４アミノ酸残基の挿入部位が１ヵ所存在することが判明した。図３にＡＲ１９Ｇ−１２がコードするタンパク質の触媒領域（ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１）のうち２６８位〜３１５位のアミノ酸残基の配列と、この配列に相同（配列同一）であるＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ（オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−１６６がコードするタンパク質のＣＢＨ領域）、及び３４種のバクテリアのＧＨ６  ＣＢＨ触媒領域のアミノ酸残基の配列アライメントを示した。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ以外の種名の後のカッコ内は配列相同性から推定した酵素名を示し、省略は、ＧＨ：ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ、ＣＢＨ：ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅである。
【００８８】
＜７＞  遺伝子クローニング
メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアセンブルにより得られたセロビオハイドロラーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｇ−１２及びＡＲ１９Ｇ−１６６の触媒領域を、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製)で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲにより増幅した。増幅したＰＣＲ産物はＣｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサを用いて配列確認を行った。
【００８９】
＜８＞  アミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃの作製
図３に示すように、バクテリアＧＨ６ ＣＢＨ触媒領域のアミノ酸配列アライメントにより、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１とＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡにのみ存在する４アミノ酸残基の挿入部位において、この２つの遺伝子は２ヵ所アミノ酸残基（ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１における２９１位と２９６位のアミノ酸残基）が異なっていた。いずれも、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのシステインが、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１ではセリンに置換されていた。そこで、このセリンをシステインに置換したＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６ＣをＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により作製した。
【００９０】
＜９＞  遺伝子発現及びセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ  ｐＥＴ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）に付属するＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株、若しくはＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌をＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。この操作により、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ遺伝子は良く発現した。ところが、ＡＲ１９Ｇ−１２の触媒領域（ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子）については、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡに比較的類似したアミノ酸配列（７９％アミノ酸配列同一性）をコードするにもかかわらず、この遺伝子がコードする酵素タンパク質の発現は得られなかった。
【００９１】
クローニングされたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子の触媒ドメインのＧＣ含有率は６３．６％であり、一方、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ遺伝子の触媒ドメインのＧＣ含有率は５７．２％であった。ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子は、ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡ遺伝子よりＧＣ含有率が６．４％高く、このＧＣ含有率の高さが酵素タンパク質の発現を阻害している可能性が考えられた。そこで、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ ｐＬＥＡＤ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）に組み込み、ＪＭ１０９株で形質転換を行った。発現ベクターｐＬＥＡＤは、ＧＣ 含有率の高い遺伝子の発現効率スクリーニングにより開発されたベクターであり、従来の大腸菌発現ベクターでは発現し難いＧＣ含有量の高い遺伝子の発現に有効なことが示されている（Suzuki et al.，J. Biochem.，1997，vol.121，p.1031−1034.; Ishida and Oshima， J. Biochem.，2002，vol.132．，p.63−70）。この結果、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子がコードする酵素タンパク質の発現が確認された。
【００９２】
具体的には、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子をもつプラスミドを保持していた大腸菌クローン、及びＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子のアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃの遺伝子（Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ遺伝子）をもつプラスミドを保持していた大腸菌クローンをそれぞれ、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で２０時間振とう培養した。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製）で、３０秒間破砕した後に３０秒間休止する処理を１０回行い、遠心後の上清（大腸菌粗抽出物）を得た。当該大腸菌粗抽出物の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、想定されるサイズに目的タンパク質の発現を確認した。タンパク質の発現確認後、３７℃で一晩培養した大腸菌液を前培養液とし、その１００倍量の１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを含むＬＢ培地で本培養を行った。前記同様に超音波破砕し、得られた大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を粗酵素サンプル液とした。
【００９３】
粗酵素サンプル液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ  ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｎｅｎｙｌ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を溶出した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素サンプル液を得た。
【００９４】
粗酵素サンプル液と精製酵素サンプル液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。図４に、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子とアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ遺伝子を導入した形質転換大腸菌の粗酵素サンプル液及び精製酵素サンプル液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質分子量指標、レーン２は粗酵素サンプル液、レーン３は精製酵素サンプル液の電気泳動パターンである。この結果、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子を導入した場合（図中、「ＡＲ１９Ｇ−１２」）とＳ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ遺伝子を導入した場合（図中、「Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ」）のいずれにおいても、粗酵素サンプル液において、アミノ酸配列（配列番号１及び３）から予想される分子量４６．５ｋＤａの付近に強いバンドが認められ、精製酵素サンプル液では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
【００９５】
セロビオハイドロラーゼ遺伝子は、一般に、発現性が非常に悪い。例えば、セロビオハイドロラーゼ遺伝子を、大腸菌を宿主として発現させた場合、当該遺伝子が糸状菌由来、あるいはバクテリア由来に関わらずほとんど発現しない。これに対して、ＧＣ含有量の高い遺伝子の発現に有効な発現ベクターを使用するだけで、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子とＳ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ遺伝子の両方とも、形質転換用大腸菌ＪＭ１０９株で良好に発現させることができた。
【００９６】
＜１０＞  セロビオハイドロラーゼ活性（ＰＳＡ加水分解活性）測定
酵素のセロビオハイドロラーゼ活性測定には、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）を基質として用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
【００９７】
前記＜９＞で調製した精製酵素サンプル液（最終濃度：約１ｍｇ／ｍＬ）のＰＳＡ活性測定は、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と４０μＬの精製水と１０μＬの精製酵素からなる混合液と１００μＬの１質量％ＰＳＡ含有水溶液を、３０〜９９℃で２０分間反応させることにより行った。
【００９８】
全ての計測において、精製酵素サンプル液の代わりに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、精製酵素混合液と前記コントロール区の混合液は、反応温度で５分間保温した後に、同様に保温した基質溶液と混合し、反応開始とした。反応中、いずれの混合液も不溶性基質の沈殿を防ぐため、エッペンドルフ社のサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）を用いて攪拌した。反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
【００９９】
＜１１＞  セロビオハイドロラーゼの基質特異性
アミノ酸配列の相同性から、ＡＲ１９Ｇ−１２遺伝子はＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼであると考えられる。そこで、精製酵素サンプル液（最終濃度：約１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、及びリケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）に対する加水分解活性を計測し、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質、及び、アミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃタンパク質の基質特異性を計測した。
【０１００】
５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と４０μＬの精製水と１０μＬの精製酵素からなる混合液を５０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに１００μＬの各基質の１質量％水溶液を添加し、７０℃で２０分間反応させた。アビセル粉末を基質とした場合は、さらに２時間の実験区を設定した。加水分解反応後、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）（１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク量で除した値）を算出した。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準偏差を求めた。
【０１０１】
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１の測定結果を図５に、アミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃの測定結果を図６に、それぞれ示す。この結果、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１、及びアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃは水溶性ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示した。また、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナンや結晶性セルロースのアビセルに対しても分解活性を示した。一方、ＣＭＣ、β−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるラミナリン、及びキシランに対しては、ほとんど分解活性は示さなかった。非常に弱いながらも結晶性セルロースのアビセルに対して加水分解活性を示し、かつＣＭＣとキシランに対し分解活性を示さなかったという酵素基質特異性は、ＡＲ１９Ｇ−１２がＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼであることを示している。
【０１０２】
＜１２＞  セロビオハイドロラーゼ活性の温度及びｐＨ依存性
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１及びアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６ＣによるＰＳＡ加水分解活性の温度依存性及びｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜９＞で得られた精製酵素サンプル液（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
精製酵素のＰＳＡ加水分解活性の温度依存性測定は、１００μＬの１質量％ＰＳＡ水溶液と、５０μＬの酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と、４０μＬの精製水と、１０μＬの精製酵素からなる混合液を、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９９℃で２０分間反応させた以外は、前記＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
精製酵素のＰＳＡ加水分解活性のｐＨ依存性の測定は、１００μＬの１質量％ＰＳＡ水溶液と、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）と、４０μＬの精製水と、１０μＬの精製酵素からなる混合液を、５０℃又は７０℃で２０分間反応させた以外は、前記＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
計測結果を図７及び８に示す。図７は、横軸を温度として、各温度におけるＰＳＡ加水分解活性（ｐＨ５．５）を計測した結果を示した図であり、図８は、横軸をｐＨとして、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１の５０℃又は７０℃における各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
【０１０３】
精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、温度範囲６０〜８０℃において高いＰＳＡ加水分解活性を示した（図７、△）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ５．５において７０℃であった。酵素反応温度を９０℃以上にした時、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のＰＳＡ加水分解活性は急激に減少した。
一方、精製酵素アミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃは、野生型であるＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１よりも、至適温度は高く、最も高い活性を示した至適温度Ｔｏｐｔは、ｐＨ５．５において７５℃であった（図７、▼）。精製酵素Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６ＣのＰＳＡ加水分解活性は、酵素反応温度が９０〜９９℃でも減少することなく、至適温度７５℃の時の６０％以上の活性が保持された。
【０１０４】
精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１は、反応温度６５〜８０℃、ｐＨ４〜６の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示した（図７、８）。最適ｐＨは反応温度に依存して変化し、６０〜６５℃でｐＨ４．６（実測値）、７０〜７５℃でｐＨ５．２〜５．３（実測値）であり、８０℃でｐＨ５．８（実測値）であった。ｐＨ３．２〜４．５、ｐＨ７〜８の範囲においては、低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた。一方、精製酵素Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃは、精製酵素ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１と同様、ｐＨ４〜６の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示し、ｐＨ３．２〜４．５、ｐＨ７〜８の範囲においては、低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた（図７、８）。
【０１０５】
＜１３＞  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるセロビオハイドロラーゼの熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
【０１０６】
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６  Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ  ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬ濃度の酵素タンパク質を１μＬ、２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を５μＬ、精製水を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)で０．５℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから３０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０−４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。熱変性温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ値）は、温度関数である蛍光強度曲線の１階微分（図９の下段グラフのＹ軸に示した「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」の極大値として定義した。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。
【０１０７】
図９には、ＤＳＦ法により計測したＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ（図中、「Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃ」）、好熱性土壌放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来ＧＨ６セロビオハイドロラーゼＴｆＣｅｌ６Ｂの各酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図９の上段グラフは実測データであり、図９の下段グラフには、図９の上段グラフの蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。
【０１０８】
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１の蛍光強度曲線は、７８℃及び９０℃付近に２つのピークを示し、熱変性が２段階で起こることを示唆した。最初の熱変性は、Ｔｍ＝ ７３．０±０．０（ｎ＝３）であり（表２）、ＰＳＡ加水分解活性から求めたこの酵素の至適温度Ｔｏｐｔ＝７０℃に近い値を示した。２つ目の熱変性については不明であった。
【０１０９】
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃも、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１と同様に２つのピークを示し、それらのピーク温度は８３℃及び９７．５℃であった。最初の熱変性は、Ｔｍ＝７８．５±０．０℃（ｎ＝３）であり（表２）、アミノ酸置換により、野生型よりも５．５℃熱安定性が向上した。この酵素のＰＳＡ加水分解活性の至適温度Ｔｏｐｔ＝７５℃であり、おおよそ、ＤＳＦで計測したＴｍ値と一致していた。一方、ＴｆＣｅｌ６Ｂの蛍光強度曲線は、７４℃付近に単一のピークを示し、Ｔｍ値は７０．２±０．２℃（ｎ＝３）であり、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１より２．８℃低かった（表２）。なお、表２には、ＤＳＦ法により、各酵素タンパク質の熱崩壊温度を独立して各３回計測し、その平均値を示した。
【０１１０】
【表２】
2015173603.tif 000003
【０１１１】
ＡＲ１９Ｇ−１６６がコードするセロビオハイドロラーゼ（ＡＲ１９Ｇ−１６６）のＴｍ値は、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１よりも７．５℃高った。また、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１のアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６ＣのＴｍ値も、ＡＲ１９Ｇ−１２よりも５．５℃高った。これらの結果から、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１の２９１位と２９６位のアミノ酸残基（ＡＲ１９Ｇ−１６６ＲＡのＣ２９５とＣ３００に相当。）をシステイン残基に置換することにより、両システイン残基がＳＳ結合を形成し、酵素タンパク質の熱安定性を高めている可能性が示唆された。
【０１１２】
＜１４＞  カルシウムイオン添加による酵素タンパク質の熱安定性向上
一般に二価金属イオンは、タンパク質に結合することでタンパク質の構造を安定させ、耐熱性を向上させることが知られている。そこで、各酵素のＴｍ値に対するカルシウムイオン（濃度２ｍＭ）の効果を調べた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ９６  Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ  ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに、濃度１ｍｇ／ｍＬの酵素タンパク質を１μＬ、２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を５μＬ、精製水若しくは５ｍＭ  塩化カルシウム水溶液を１２μＬ加え、３０℃で３０分間プリインキュベーションした後、１００倍希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ加え、前記＜１３＞と同様にしてＤＳＦ法によりＴｍ値を測定した。測定結果を表２に示す。
【０１１３】
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１及びアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃは、２ｍＭ濃度のカルシウムイオンの投与により、Ｔｍ値が、それぞれ、７９．０±０．０℃（ｎ＝３）と８５．０±０．０（ｎ＝３）℃となった。つまり、Ｔｍ値はカルシウムイオンにより、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１では５．５℃、Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃでは６．５℃上昇した。一方、好熱性土壌放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＧＨ６セロビオハイドロラーゼＴｆＣｅｌ６Ｂは、カルシウムイオンの添加によって熱安定性が向上することはなく、Ｔｍ値は７０．５±０．０ ℃（ｎ＝３）であった（表２）。これは、カルシウムイオンを添加したＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１より８．５℃、カルシウムイオンを添加したアミノ酸置換変異体Ｓ２９１Ｃ／Ｓ２９６Ｃよりも１４．５℃、それぞれＴｍ値が低かった。
【０１１４】
［実施例２］
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼをより安価に大量生産するための手段として、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子を導入した放線菌における当該タンパク質の発現性を検証した。
【０１１５】
＜１＞  ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子導入放線菌の作製
ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（ライフテクノロジーズ社製）にクローニングされたＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子をテンプレートにして、ＰＣＲにより放線菌発現ベクターｐＨＳＡ８１（特開２００７−５３９９４号公報）に乗せ換え、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓＴＫ２４株に形質転換した。形質転換は、“Genetic manipulation of Streptomyces: a laboratory manual.”に記載の方法（プロトプラストポリエチレングリコール融合法）に準じて行った。コロニーＰＣＲによるポジティブクローンの選抜、ＹＥＭＥ培地（酵母エキス０．３％、バクトペプトン０．５％、麦芽エキス０．３％、グルコース１％、スクロース３４％、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、グリシン０．５％）にて振とう培養後、組換えプラスミドを抽出し、３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて配列確認を行った。
【０１１６】
＜２＞  放線菌におけるＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質の発現
得られた形質転換体を５μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＥＭＥ培地に植菌し、２８℃で５日間振とう培養し、遠心分離により集菌した。菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ８．０)で洗浄した後、培養液の１／１０容量の同Ｂｕｆｆｅｒ を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製）で３０秒間破砕した後に３０秒間休止する処理を１０回行い、遠心後の上清（無細胞抽出物）を得た。当該無細胞抽出物の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、想定されるサイズ（４６．５ｋＤａ）に目的タンパク質の強い発現を確認した。
【０１１７】
当該無細胞抽出物と実施例１＜９＞で得た精製酵素サンプル液（大腸菌発現コントロール）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。図１０に、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子を導入した形質転換放線菌の無細胞抽出物（２０μｇ）及び精製酵素サンプル液（０．５μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。この結果、無細胞抽出物ではアミノ酸配列（配列番号１）から予想される分子量４６．５ｋＤａの付近に強いバンドが認められ、精製酵素サンプル液では、当該バンドに対応する単一バンドが認められたことから、ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子は放線菌において発現することが確認された（図中、矢印）。
【０１１８】
＜３＞  放線菌発現ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１タンパク質の酵素活性測定
ＡＲ１９Ｇ−１２Ｌ１遺伝子組換え放線菌の無細胞抽出物を用いてセロビオハイドロラーゼ活性測定を行なった。活性測定は、５０μＬの無細胞抽出物試料、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と１００μＬの１質量％ＰＳＡ水溶液からなる混合液を反応溶液とし、実施例１＜１０＞と同様にして行った。全ての計測において、１００μＬの１質量％ＰＳＡ水溶液のみを各温度で反応させ、反応停止の後に５０μＬの無細胞抽出液試料、５０μＬの２００ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５．５）を加えた混合液をコントロール区とした。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。結果を図１１に示す。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、酵素タンパク質量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から概算）で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした場合、７５℃における比活性は１．０３Ｕ/ｍｇであった。以上のように、ＡＲ１９Ｇ−１２セロビオハイドロラーゼ酵素は放線菌においても良好な発現及び活性を示したことから、放線菌は本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させるための遺伝子導入ホストとして利用できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有しており、７５℃以上の高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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