(57)【要約】【課題】  盲目の処置用医薬の製造のための光感受性イオンチャネルの使用およびそれを細胞特異的形態で、例えばＯＮ−双極細胞、ＯＮ−ガングリオン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞に発現させる方法を提供すること。【解決手段】  盲目の処置用医薬の製造のための光感受性イオンチャネルの使用およびそれを細胞特異的形態で、例えばＯＮ−双極細胞、ＯＮ−ガングリオン細胞、またはＡＩＩアマクリン細胞に発現させる方法を見いだした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
盲目の処置または軽減用医薬の製造のための、光感受性イオンチャネル遺伝子またはそ
の活性フラグメントの使用。
【請求項２】
光感受性イオンチャネル遺伝子がロドプシン遺伝子である、請求項１。
【請求項３】
ロドプシン遺伝子がチャネルロドプシン−２(ＣｈＲ２)である、請求項２。
【請求項４】
光感受性イオンチャネル遺伝子を、ＯＮ−双極細胞、ＯＮ−ガングリオン、またはＡＩ
Ｉアマクリン細胞の少なくとも１つに投与し、発現させる、請求項１〜３のいずれか。
【請求項５】
光感受性イオンチャネル遺伝子をＡＩＩアマクリン細胞に投与し、発現させる、請求項
４。
【請求項６】
該光感受性イオンチャネル遺伝子を細胞特異的プロモーターの方法により制御する、請
求項１〜５のいずれか。
【請求項７】
光感受性イオンチャネル遺伝子を、ｍＧｌｕＲ６プロモーターまたはその機能性フラグ
メントもしくは誘導体により制御する、請求項６。
【請求項８】
ｍＧｌｕＲ６プロモーターの制御下にチャネルロドプシン−２(ＣｈＲ２)を含む；盲目
の処置用医薬の製造において有用な構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、盲目の処置に関する。本発明はまた盲目の処置に使用するための構築物、な
らびに盲目処置用医薬の製造における当該構築物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
盲目は、世界中で数百万人を身体障害者としている大きな健康問題である。盲目の最も
一般的な原因は、網膜の機能不全である。網膜盲目の３つの最も一般的な形態は、網膜色
素変性症(ＲＰ)、黄斑変性症(macular deneneration)(ＭＤ)および緑内障(Ｇ)である。Ｒ
ＰおよびＭＤにおいて、主要な問題は光受容体の変性およびその結果としての光感受性の
喪失である。それ故、このような光受容体変性と関連する問題を避けることを可能とする
必要性が存在する。
【０００３】
一つの試みにより、１,０００個ほどもの小さい電極を眼に埋め込む“義眼(seeing eye
)”チップである人工網膜(retinal prosthesis)が開発されている。これは、視力を失っ
た人が独立して働くのに十分な視力を回復する可能性を高めるであろうが、電極の数は獲
得すべき高い程度または水準の視力を提供するには全く不十分である。さらに、眼に異物
を挿入することに伴う問題がある。
【０００４】
近年、発現されたとき、細胞を光感受性にできる多くの遺伝子が単離および／または操
作されている。ある場合には、さらなる非遺伝的因子もまた細胞を光感受性とするのに必
要である。
【０００５】
２００１年のEliの一つの提案は、失明の処置のための、ホウレンソウ中のクロロフィ
ル含有タンパク質の使用であった。これらのタンパク質は、入来する光の光子のエネルギ
ーを捕捉後、小さい電界を発する。研究により、光化学系Ｉ反応中心をリポソームに取り
込むことができ、光をその上に照射したときに実験的に同等な電圧を生じる点で機能性で
あることが示されたが、今日まで、これは網膜細胞で働くことが示されていない。
【０００６】
UC Berkeleyの神経生物学者Richard Kramerによる他の研究は、通常光に対して非感受
性である脳細胞内への光活性化スイッチの挿入を可能にするために、カリウムチャネルを
、ボルト数よりむしろ光に対して応答するようにリエンジニアリングすることを研究した
。しかしながら、このチャネルが常に開放されたままであり、化学“プラグ”(これは、
長波長ＵＶ光で照射したときに該プラグがチャネルから放出され、カリウムをチャネルか
ら出すように、光に対して感受性である)がチャネルに結合するように変異しなければな
らない。長波長光は、該プラグがチャネル内に戻り、カリウム放出を停止する原因となる
。しかしながら、このようなシステムが非常に複雑であり、チャネルが誤ったタイプの網
膜細胞に送達されたならば、問題が起こるであろうことが認識される。
【０００７】
Bi et al., (Neuron, 50, 2006, p23-33)は、光受容体変性を有するマウスにおける視
覚応答を回復させるための、微生物型ロドプシンの使用を記載する。しかしながら、ロド
プシン遺伝子の発現は、眼内の種々のタイプの細胞で起こる傾向があり、それは望ましく
なくおよび／または問題である。応答を生じるのに必要な域値光強度が正常桿体および錐
体光受容体よりもはるかに高いことも明らかであるが、例えば、微光環境において対応し
得る方法を教示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
とりわけ、前記の欠点を除くおよび／または軽減することが本発明の目的である。
対象における盲目の処置に使用するのに適するシステムを提供することも本発明の目的
である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要約
第一の局面において、盲目の処置または軽減において使用するための医薬の製造のため
の、光感受性(light-gated)イオンチャネル遺伝子またはその活性フラグメントの使用を
提供する。
【００１０】
本医薬は、一般的に治療的に使用されるが、対象が盲目になりそうであるとして同定さ
れているが、実際の失明はまだ起こっていないか、ほんのわずかしか起こっていないとき
、予防の意味で使用してもよいことは理解すべきである。
【００１１】
盲目は、完全なまたは部分的な視覚の損失を意味する。典型的に本医薬は、黄斑変性症
、緑内障および／または網膜色素変性症と関連する盲目の処置に使用し得る。しかしなが
ら、眼の光受容体の変性または非機能性に至る全ての疾患または状態を、本医薬を使用し
て処置し得ることは当然である。
【００１２】
光感受性イオンチャネルの活性フラグメントは、発現されたときに、続いて該チャネル
が位置する細胞内へのまたは細胞外へのイオン流およびその後のボルト数の変化を引き起
こす、光捕捉分子としてまだ機能できるポリペプチドを生じるフラグメントである。
【００１３】
本発明はまた、光感受性イオンチャネル遺伝子配列またはその活性フラグメントを含む
ＤＮＡ構築物を、盲目である、またはその素因のある患者に投与することによる、盲目を
予防的にまたは治療的に処置する方法にまで拡大されることは、当然であり、その遺伝子
配列またはそのフラグメントは、網膜細胞において１コピー以上の光感受性イオンチャネ
ルタンパク質を発現でき、それにより、該１コピー以上の光感受性イオンチャネルタンパ
ク質の発現が、細胞を、盲目の処置または改善が可能であるように光感受性にする。
【００１４】
典型的に、該光感受性イオンチャネル遺伝子配列または活性フラグメントを対象の網膜
細胞に投与したときに、該光感受性イオンチャネルタンパク質の発現を可能にするような
適切な転写／翻訳制御下に含む組み換え分子の形で、光感受性イオンチャネル遺伝子配列
またはそのフラグメントを投与し得る。光感受性イオンチャネル配列またはフラグメント
が、構成的および／または制御可能プロモーターのようなプロモーターの制御下にあって
よいことは当然である。
【００１５】
本発明はまた、それ故、治療に使用するための、光感受性イオンチャネル遺伝子配列ま
たはその活性フラグメントを含む組み換え分子も提供する。本組み換え分子は、プラスミ
ド、ファージミドまたはウイルスベクターの形であり得る。さらに、組み換え的に発現さ
せた、または化学合成した光感受性イオンチャネルタンパク質、または機能的に重要なそ
のフラグメントを製造し、上記疾患の処置のための、処置的または予防的手段として、適
当な軟膏または他の医薬媒体を介して眼に適用し得る。
【００１６】
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レ
ンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ投与
などのような、遺伝子治療に使用するための、多くの種々のウイルスおよび非ウイルスベ
クター、およびそれらの送達が既知である。遺伝子の眼の所望の細胞への転換のための可
能な技術の詳細なレビューは、Wright(Br J Ophthalmol, 1997; 81: 620-622)により教示
され、それを引用により本明細書に包含させる。さらに、例えば、Neurotechにより開発
されたような、被包性細胞技術を使用することも可能である。
【００１７】
望ましくは、光感受性イオンチャネル遺伝子は、単細胞性藻類のような微生物、典型的
にコナミドリムシ属、とりわけコナミドリムシ由来の、ロドプシンのようなロドプシン遺
伝子である。好ましいロドプシンは、コナミドリムシからの光感受性カチオンチャネルで
ある、チャネルロドプシン−２(ＣｈＲ２)であり、例えば、引用により本明細書に包含さ
せるBoyden et al 2005(Nature Neuroscience, 8, 9; 1263-1268)を参照のこと。
【００１８】
好ましくは、医薬またはベクターを投与し、遺伝子を発現させるべき細胞は、ＯＮ−双
極細胞、ＯＮ−ガングリオン、またはＡＩＩアマクリン細胞である。さらに、光感受性を
失っているが、“死滅”していない光受容体細胞自体を、光感受性イオンチャネル遺伝子
発現に使用できるが、応答の極性は正常条件下の逆である。さらに光感受性イオンチャネ
ル遺伝子の光受容体での発現は、変性の予防または遅延(show down)に働き得る。
【００１９】
該光感受性イオンチャネル遺伝子の発現が、細胞特異的プロモーターの方法により制御
されることが好ましいことは理解すべきである。故に、細胞特異的プロモーターを、光感
受性イオンチャネル遺伝子が、特異的細胞型にのみ発現されることを確実にするために使
用し得る。例えば、ｍＧｌｕＲ６プロモーター(Ueda et al, J Neurosci. 1997 May 1;17
(9):3014-23)を、ＯＮ−双極細胞における発現の制御に用い得る。
【００２０】
適切な網膜細胞で発現されると、該光感受性イオンチャネルタンパク質が細胞の原形質
膜内に入り、細胞に光感受性を付与し、光に応答したイオン輸送、カチオンまたはアニオ
ンの誘発を可能にする。それにも関わらず、網膜が、光受容体の順応性特性のために非常
に広範囲の光強度に対して感受性であることが知られているが、光感受性イオンチャネル
は順応できず、それ故、狭い範囲の光強度にしか応答できないかもしれない。この場合、
このような制限は、当分野で既知のイメージ・インテンシファイアおよび／またはイメー
ジ・コンバーターの使用により軽減し得る。例えば、上記の方法で処置した患者は、例え
ば、メガネ(spectacles)などの上にマウントしたイメージ・インテンシファイア／エンハ
ンサーを装着し得る。
【００２１】
一例として、Telesensory(http://www.telesensory.com)から提供されるようなイメー
ジ増感デバイス(image intensifying device)を、Microvision(http://www.microvision.
com/milprod.html)により開発された網膜走査デバイス(ＲＳＤ)と組合せ、視覚が障害さ
れた患者の網膜に直接明るい、増強されたイメージを送達できる、頭部装着型装置を定位
強し得る(http://www.telesensory.com/home8.html)。簡単に言うと、ＲＳＤは、個体が
、付加的なスクリーンまたはモニターを必要とせずに、大きな、フルモーションイメージ
を見ることができるように、網膜上にイメージを投影する。それ故、増強されたイメージ
を、視覚障害個体の網膜上に直接投影することにより、盲目であると考えられている個体
の視覚を改善することが可能であり得る。
【００２２】
光感受性イオンチャネルが網膜双極またはガングリオン細胞に発現する場合、網膜のネ
ットワーク処理能のいくつかの局面が失われる。例えば、光が双極またはガングリオン細
胞を活性化したならば、水平細胞仲介側方抑制が失われる。これらの場合、網膜様プロセ
ッサー(D. Balya and B. Roska: “Retina model with real time implementation”, In
ternational Symposium on Circuits and Systems ISCAS 2005, Kobe, Japan, May, pp. 
5222-5225.、http://www.anafocus.com/およびhttp://www.eutecus.com/もまた参照)を、
Microvisionシステムと組合せることができる。
【００２３】
光感受性イオンチャネルが、上記のように光受容体で発現されるならば、光受容体にお
ける光応答の極性が逆転する。これは、投影されたイメージの極性を逆転することにより
補正できる：暗ピクセルが明となり、明ピクセルが暗となる。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明を、ここで、実施例の方法により、そして図面を参照して記載する：
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１ａ】本発明で使用するための構築物の模式図を示す。
【図１ｂ】本発明で使用するための構築物の模式図を示す。
【実施例】
【００２６】
プラスミド調整
代謝型グルタミン酸受容体６(ｍＧｌｕＲ６)遺伝子を、網膜内層内の、ＯＮ双極細胞と
呼ばれるある種の双極細胞に特異的に発現させる。これらの細胞は、光受容体細胞により
中継される光シグナルに対する反応性を仲介する。ｍＧｌｕＲ６遺伝子の制御配列は、そ
の細胞特異的発現を担う。これらの制御配列またはその機能的フラグメントもしくは誘導
体を、他の遺伝子の産生を指示するのに使用でき、ＯＮ双極細胞が機能性光受容体細胞の
非存在下で、光に感受性とすることができる。プロモーター分析を、プロモーター機能性
フラグメントおよび誘導体の同定に使用できる(McGowen at al. Mol. Vision 1998, 4:2;
Bookstein et al. PNAS 1990, 87(19); 7762-66)。
【００２７】
発現プラスミドは、蛍光タンパク質をコードする配列に融合しているチャネルロドプシ
ン−２タンパク質コード配列に連結したｍＧｌｕＲ６プロモーター配列(Ueda et al)から
成る。この蛍光“タグ”は、どの細胞がチャネルロドプシン−２タンパク質を製造するか
の可視化を可能にする。これらの配列の全てを、哺乳動物細胞内に輸送し、タンパク質を
産生させるためのベクターを含む、さらなるＤＮＡエレメントと組み合わせる。適当な構
築物の例を、図１ａおよび１ｂに示す。
【００２８】
プラスミド送達
プラスミドを、マウスの網膜に、エレクトロポレーションと呼ばれる技術により送達で
きる。最初に、プラスミドの純粋調節物をマウスの眼の網膜下空間に注入する。ついで、
電流を眼に適用して、ＤＮＡの網膜への挿入をもたらし得る。ＤＮＡはそこに残り、数週
間発現され得る。
【００２９】
チャネルロドプシン−２タンパク質の双極細胞内への送達の他の方法は、ウイルスを利
用する方法の使用である。ｍＧｌｕＲ６プロモーター領域に連結したチャネルロドプシン
−２タンパク質をコードする、組み換えアデノ随伴ウイルスを製造できる。本ウイルスを
、マウス眼の硝子体内空間に注入する。ウイルス粒子が網膜の細胞に感染し、遺伝子発現
を数週間後に試験する。
【００３０】
プラスミドおよび組み換えアデノ随伴ウイルスを、網膜変性症を引き起こす遺伝子変異
の結果、盲目であるマウスの網膜に送達できる(Bowes et al., Nature, 1990; 347;667-6
80)。これらのマウスの光受容体細胞は、生後数週間以内に無くなる。これらのマウスは
、ヒトを侵す網膜変性疾患の試験のために、頻繁に使用される実験モデル系である。チャ
ネルロドプシン−２の、これらの動物の双極細胞への導入により、目的は、他の方法では
光不感受性の網膜への光感受性の回復である。それ故に、これらの試験は、網膜疾患のヒ
ト症例の遺伝子治療アプローチの基礎として働き得る。
【００３１】
構築物がＯＮ双極細胞に送達されたら、脳の残りの部分に、情景についての情報を提供
する、網膜のアウトプット細胞であるガングリオン細胞の活性を記録し得る。多数の電極
または単一電極をガングリオン細胞からの活性の記録に使用できる。正常マウスでは、ガ
ングリオン細胞は、光により刺激されたとき、電気的“スパイク”を生じる。網膜を、盲
目マウスの眼からのＯＮ双極細胞において光感受性チャネルロドプシン−２チャネルを発
現するように調製し、光で刺激し得る。光刺激中、ガングリオン細胞からのスパイク活性
が記録され得る。光により惹起されるスパイク活性が測定できるならば、盲目マウスが“
見る”ことができると結論付けることができる。
【図１ａ】
2015110621.tif 000002
【図１ｂ】
2015110621.tif 000003
【外国語明細書】
2015110621000001.pdf