(57)【要約】【課題】エタノール生産能力が飛躍的に向上したエタノール生産菌の提供。【解決手段】エタノール生産菌において、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群及びＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化された遺伝子欠損エタノール生産菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール生産菌において、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群およびＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化された遺伝子欠損エタノール生産菌。
【請求項２】
ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群が、ＳＩＲ２、ＨＳＴ３及びＨＳＴ４遺伝子である請求項１記載の遺伝子欠損エタノール生産菌。
【請求項３】
エタノール生産菌から、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群およびＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化することを特徴とする遺伝子欠損エタノール生産菌の製造法。
【請求項４】
ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群が、ＳＩＲ２、ＨＳＴ３及びＨＳＴ４遺伝子である請求項３記載の遺伝子欠損エタノール生産菌の製造法。
【請求項５】
糖類の存在下に請求項１又は２記載の遺伝子欠損エタノール生産菌を培養することを特徴とするエタノールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高エタノール生産性遺伝子欠損菌及びエタノールの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノールは、食用だけでなく工業用にも広く利用される。工業用には化学合成したエタノールが用いられるが、食用には酵母を用いた醸造エタノールが用いられる。近年、燃料用エタノールとしてバイオマスの発酵により得られるバイオエタノールが注目され、広く利用されるに至っている。
【０００３】
かかる点から、発酵によるエタノール生産技術の改良が強く望まれており、セルロースからエタノールを生産する技術の改良に加え、エタノールを生産する微生物の改良も行われている。エタノール生産微生物の改良に関しては、耐熱性酵母（特許文献１、２）、炭素源をグルコースだけでなく様々なグルコースより安価な炭素源を利用する出芽酵母、炭素源をセルロースなど食糧として使用不可能な炭素源を利用する糸状菌トリコデルマ・リーセイ（非特許文献１）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−４２６９０号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／０６２５５８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Appl Microbiol Biotechnol (2006) 69: 627-642
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のエタノール生産性酵母やザイモモナス属菌のエタノール生産能力は、醸造用酵母のエタノール生産能力を大きく超えるものではない。
２０１２年において、バイオエタノールの製造コストは１５０〜２００円／Ｌ（資源エネルギー庁  新エネルギー対策課調べ）となっており、資源エネルギー庁は２０２０年までにバイオエタノールの製造コストを４０円／Ｌにまでコストダウンすることを目標としている。
従って、本発明の課題は、エタノール生産能力が飛躍的に向上したエタノール生産菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、酵母等のエタノール生産菌に対する遺伝子操作によってエタノール生産能力が向上した微生物を得るべく検討した結果、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群に加えて、代謝酵素をコードするＦＢＰ１遺伝子を破壊した遺伝子欠損菌を作製したところ、当該菌が親株に対して１０倍を超えるエタノール生産能を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕エタノール生産菌において、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群およびＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化された遺伝子欠損エタノール生産菌。
〔２〕ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群が、ＳＩＲ２、ＨＳＴ３及びＨＳＴ４遺伝子である〔１〕記載の遺伝子欠損エタノール生産菌。
〔３〕エタノール生産菌から、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群およびＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化することを特徴とする遺伝子欠損エタノール生産菌の製造法。
〔４〕ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群が、ＳＩＲ２、ＨＳＴ３及びＨＳＴ４遺伝子である〔３〕記載の遺伝子欠損エタノール生産菌の製造法。
〔５〕糖類の存在下に〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子欠損エタノール生産菌を培養することを特徴とするエタノールの製造法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規微生物を用いれば、従来酒造用に用いられていた出芽酵母の１０倍以上の効率でエタノールを生産することができる。従って、本発明の微生物を用いれば、バイオエタノール生産の大幅コスト削減が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生株（ＢＹ４７４２株）と本発明遺伝子欠損株のエタノール生産能の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の遺伝子欠損エタノール生産菌は、エタノール生産菌において、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群及びＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化された微生物である。
【００１３】
原料となるエタノール生産菌としては、グルコースからエタノールを生産する能力を有する微生物であればよいが、サッカロマイセス属、ザイモモナス属、クルイベロマイセス属、シゾサッカロマイセス属に属する微生物が挙げられるが、サッカロマイセス・セレビシエ、ザイモモナス・モビリスが好ましく、特にサッカロマイセス・セレビシエが好ましい。
【００１４】
欠失又は不活性化させる遺伝子は、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群及び代謝酵素をコードするＦＢＰ１遺伝子である。
【００１５】
ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群としては、ＳＩＲ２、ＨＳＴ３及びＨＳＴ４遺伝子が挙げられる。ＦＢＰ１遺伝子はFructose-1,6-bisphosphataseを合成し、この遺伝子の欠損により糖新生経路の遮断が起こる。
【００１６】
本発明において、欠失又は不活性化とは、目的とする遺伝子が全部欠失している場合の他、一部が欠失することにより活性を示さなくなる場合、他の遺伝子に置換されることにより活性を示さなくなる場合を含む。
【００１７】
ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群及びＦＢＰ１遺伝子を欠損させる方法としては、ゲノムＤＮＡの相同領域を有する直鎖状ＤＮＡ二本鎖を形質転換する方法が挙げられる。酵母染色体内の遺伝子破壊にはエレクトロポレーション法、酢酸リチウム法が用いられる。
【００１８】
より具体的には、（１）国内外のゲノムデータベース（日本：ＤＤＢＪ、海外ＳＧＤ（Saccharomyces cerevisiae genome database）から出芽酵母など宿主細胞の染色体中の遺伝子配列およびその両端７０ｂｐを含む塩基配列情報を取得する。（２）標的遺伝子の両端７０ｂｐの二つの塩基配列でマーカー遺伝子と呼ばれる抗生物質などの薬剤耐性遺伝子もしくはアミノ酸合成遺伝子を挟んだ融合配列を持つ直鎖状二本鎖ＤＮＡを、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法を用いて合成する。（３）（２）にて作成したＤＮＡ配列を出芽酵母などの宿主生物に形質転換する。（４）抗生物質などの薬剤を添加した宿主細胞培養用の培地もしくは特定のアミノ酸を除いた培地を用いて、染色体中に形質転換用のＤＮＡ配列が挿入された形質転換体だけを成育させる。（５）宿主細胞内の染色体中の標的遺伝子が正確にマーカー遺伝子によって置き換わった、つまり標的遺伝子が破壊されたかどうか、ＰＣＲ法を用いて確認する。以上の（１）〜（５）の方法によって標的遺伝子破壊株の作製ができる。
【００１９】
上記工程（２）で用いる薬剤耐性としては、Ｇ４１８耐性、ハイグロマイシンＢ耐性、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性等が用いられる。
上記工程（２）で用いるアミノ酸合成としては、ヒスチジン合成遺伝子等が用いられる。
このような薬剤耐性微生物は、形質転換により作製することができる。
【００２０】
上記工程（２）に用いる薬剤耐性遺伝子としては、抗生物質Ｇ４１８に対してはｋａｎ遺伝子、ハイグロマイシンＢに対してはｈｐｈ遺伝子、Nourseothricinに対してはＮＡＴ遺伝子が挙げられる。アミノ酸合成遺伝子としては、ｈｉｓ５+遺伝子が挙げられる。
【００２１】
かくして得られた、ＮＡＤ+依存性デアセチラーゼ遺伝子群及びＦＢＰ１遺伝子が欠失又は不活性化した微生物は、エタノール生産能が親微生物に比べて１０倍以上に向上している。従って、本発明の遺伝子欠損微生物を、糖類の存在下に培養すれば効率的にエタノールを製造することができる。
【００２２】
基質として用いられる糖類としては、グルコースなど出芽酵母が醗酵に用いることができる炭素源が挙げられる。培養方法は、微生物の種類によって相違するが、通常pH５〜７、温度２５〜３０℃の条件で行なわれる。なお、原料の糖類としてセルロース等のバイオマスを用いる場合には、さとうきび、トウモロコシ等の植物原料を化学的加水分解、セルラーゼ等による分解を行ってグルコースを得、これに本発明遺伝子欠損微生物を作用させるのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
以下の方法でｈｓｔ３  ｈｓｔ４  ｓｉｒ２  ｆｂｐ１四重欠損株ＨＭＹ１３７０を作成した。α型）に標的遺伝子ＨＳＴ３をヒスチジン合成酵素ｈｉｓ５+をマーカー遺伝子として欠損させ、ｈｓｔ３欠損株（ｈｉｓ５+）を作成した。
（２）出芽酵母野生株ＢＹ４７４１（ＭＡＴα型）に標的遺伝子ＨＳＴ４をハイグロマイシンＢ耐性ｈｐｈ遺伝子をマーカー遺伝子として欠損させ、ｈｓｔ４欠損株（ｈｐｈ）を作成した。
（３）（１）および（２）で作成した遺伝子破壊株を掛け合わせ、胞子形成を経てｈｓｔ３（ｈｉｓ５+）ｈｓｔ４（ｈｐｈ）二重遺伝子欠損株を作成した。
（４）出芽酵母野生株ＢＹ４７４２（ＭＡＴα型）に標的遺伝子ＳＩＲ２をＧ４１８耐性ｋａｎ遺伝子をマーカー遺伝子として欠損させ、ｓｉｒ２欠損株（ｋａｎ）を作成した。
（５）（３）および（４）で作成した遺伝子破壊株を掛け合わせ、胞子形成を経てｈｓｔ３（ｈｉｓ５+）  ｈｓｔ４（ｈｐｈ）  ｓｉｒ２（ｋａｎ）三重遺伝子欠損株を作成した。
（５）で作成した遺伝子破壊株に標的遺伝子ＦＢＰ１をNourseothricin耐性ＮＡＴ遺伝子として欠損させ、ｈｓｔ３（ｈｉｓ５+）  ｈｓｔ４（ｈｐｈ）ｓｉｒ２（ｋａｎ）  ｆｂｐ１（ＮＡＴ）四重遺伝子欠損株ＨＭＹ１３７０を作成した。なおこの株には染色体に不必要な変異を導入しないために、マーカー遺伝子ＵＲＡ３及びＨＳＴ３遺伝子およびその遺伝子転写制御配列を持つ出芽酵母プラスミドを持たせている。このプラスミドは薬剤５−フルオロオロチン酸で酵母細胞を処理することで、プラスミドを細胞から排除することができる。
【００２５】
得られたＨＭＹ１３７０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８２７として寄託した。
【００２６】
実施例２
（１）野生株ＢＹ４７４２およびＨＭＹ１３７０株を出芽酵母用培養液ＹＰＤ  （２％ Bacto peptone．１％ Bacto yeast extract，２％ glucose）５mLに接種し、２５℃にて一晩培養した。
（２）増殖した細胞株を新しいＹＰＤ培養液、２０mL、細胞初期濃度１×１０6cells／mLとし、２５℃にて培養を開始した。
（３）２４時間培養後、細胞数を計測した。同時に培養液中のエタノール濃度をエタノール測定キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社  Ethanol Colorimetric/Fluorometric Assay Kit（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ６２０−１００））および蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｆ２００）を用いて測定した。測定サンプルの調製はエタノール測定キット記載の調製方法に従った。また培養前ＹＰＤ液をエタノール濃度測定のためのコントロールとして用いた。
（４）培養開始後２４時間目のサンプルに関して、その時の細胞数（１×１０6cells）当たりの測定された培地中のエタノール濃度を計算した。
【００２７】
培養をはじめて２４時間で産生した１×１０6cellあたりのエタノール量比（野生株を１として）を図１に示す。図１から明らかなように、本発明の遺伝子欠損株は、出芽酵母株に比べて１０倍以上のエタノール生産能を有する。
【図１】
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