(57)【要約】      （修正有）【課題】中性脂質を含有する両性リポソームの改良された配合物の提供。【解決手段】中性脂質を含有する両性リポソームであって、該中性脂質が、コレステロールまたはコレステロールと少なくとも１つの中性若しくは双性イオン性脂質の混合物から選択され、該混合物のκ(中性)が０.３又はそれ未満である両性リポソーム。該両性リポソームを活性物質又は成分の供給或いは標的化供給のための担体として含有する医薬組成物。活性物質、例えば核酸治療物質を封入することができる両性リポソーム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性脂質を含有する両性リポソームであって、該中性脂質が、コレステロールまたはコレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物からなる群から選択され、該混合物のκ(中性)が０.３またはそれ未満である両性リポソーム。
【請求項２】
コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物のκ(中性)が、０.２５未満、好ましくは０.２未満、最も好ましくは０.１５未満である請求項１に記載の両性リポソーム。
【請求項３】
コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物が、
(ｉ)コレステロール／ホスファチジルコリン、
(ii)コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン、
(iii)コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルコリン、
(iv)コレステリン／スフィンゴミエリン、
(ｖ)コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン／スフィンゴミエリン、
からなる群から選択される請求項１または２に記載の両性リポソーム。
【請求項４】
ホスファチジルエタノールアミンがＤＯＰＥである請求項３に記載の両性リポソーム。
【請求項５】
ホスファチジルコリンが、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、大豆ＰＣまたは卵ＰＣから選択される請求項３に記載の両性リポソーム。
【請求項６】
コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物のモル比が４〜０.２５である請求項１〜５のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項７】
両性リポソームが、１つまたはそれ以上または複数の荷電した両親媒性物質を含有し、該物質が互いと組合せて両性の性質を有する請求項１〜６のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項８】
荷電した両親媒性物質が両性脂質である請求項７に記載の両性リポソーム。
【請求項９】
両性脂質が、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣＨｏｌからなる群から選択される請求項８に記載の両性リポソーム。
【請求項１０】
両性リポソームが両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有し、該脂質成分の混合物が少なくとも１つのｐＨ応答性成分を含有する請求項７に記載の両性リポソーム。
【請求項１１】
脂質成分の混合物が、
(ｉ)安定なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質(Amphoter I混合物と称する)、
(ii)荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質(Amphoter II混合物と称する)、または
(iii)安定なアニオン性脂質および荷電可能なカチオン性脂質(Amphoter III混合物と称する)、
を含有する請求項１０に記載の両性リポソーム。
【請求項１２】
両性リポソームの等電点が４.５〜６.５である請求項１〜１１のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１３】
アニオン性脂質が、以下からなる群から選択される請求項１〜１２のいずれかに記載の両性リポソーム：
ジアシルグリセロールヘミスクシネート、例えば、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、ＰＯＧＳ、ＤＰＧＳ、ＤＳＧＳ；ジアシルグリセロールヘミマロネート、例えば、ＤＯＧＭまたはＤＭＧＭ；ジアシルグリセロールヘミグルタレート、例えば、ＤＯＧＧ、ＤＭＧＧ；ジアシルグリセロールヘミアジペート、例えば、ＤＯＧＡ、ＤＭＧＡ；ジアシルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸、例えば、ＤＯ-ｃＨＡ、ＤＭ-ｃＨＡ；(２,３-ジアシル-プロピル)アミノ}-オキソアルカン酸、例えば、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ；ジアシル-アルカン酸、例えば、ＤＯＰ、ＤＯＢ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、ＤＭＰ、ＤＯＢ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ；Ｃｈｅｍｓおよびその誘導体、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ５、Ｃｈｏｌ-Ｃ６、Ｃｈｏｌ-Ｃ７またはＣｈｏｌ-Ｃ８；Ｃｈｏｌ-Ｃ１、ＣｈｏｌＣ３Ｎまたはコレステロールヘミジカルボン酸およびコレステリルオキシカルボニルアミノカルボン酸、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ１２またはＣｈｏｌＣ１３Ｎ、脂肪酸、例えば、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ネルボン酸、ベヘン酸；ＤＯＰＡ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＰＯＰＡ、ＤＳＰＡ、Ｃｈｏｌ-ＳＯ４、ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＳＰＧまたはＤＯＰＳ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＳＰＳまたはセチル-ホスフェート。
【請求項１４】
カチオン性脂質が、以下からなる群から選択される請求項１〜１３のいずれかに記載の両性リポソーム：
ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＰＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＰＯＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＰＤＡＰ、ＤＳＤＡＰ、ＤＯＤＭＨＥＡＰまたはＤＯＲＩ、ＰＯＤＭＨＥＡＰまたはＰＯＲＩ、ＤＭＤＭＨＥＡＰまたはＤＭＲＩ、ＤＰＤＭＨＥＡＰまたはＤＰＲＩ、ＤＳＤＭＨＥＡＰまたはＤＳＲＩ、ＤＯＭＤＨＥＡＰ、ＰＯＭＤＨＥＡＰ、ＤＭＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＭＤＨＥＡＰ、ＤＳＭＤＨＥＡＰ、ＤＯＭＨＥＡＰ、ＰＯＭＨＥＡＰ、ＤＭＭＨＥＡＰ、ＤＰＭＨＥＡＰ、ＤＳＭＨＥＡＰ、ＤＯＤＨＥＡＰ、ＰＯＤＨＥＡＰ、ＤＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＤＨＥＡＰ、ＤＳＤＨＥＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＰＯＥＰＣ、ＤＯＲＩＥ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＭＣＡＰ、ＤＯＭＧＭＥ、ＤＯＰ５Ｐ、ＤＯＰ６Ｐ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＴＣ-Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ-Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-ベタイン、Ｎ-メチル-ＰｉｐＣｈｏｌ、ＣＴＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ４Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-ＤＭＣ３Ｎ-Ｍｏ２、ＣｈｏｌＣ４Ｈｅｘ-Ｍｏ２、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＰｉｐＣ２-Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＤＯ、ＭｏＤＰ、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭ。
【請求項１５】
両性リポソームがAmphoter I混合物であり、該混合物のκ(min)が０.０７〜０.２２である請求項１〜１４のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１６】
両性リポソームが以下から選択されるAmphoter I混合物である請求項１〜１５のいずれかに記載の両性リポソーム：
クレーム
【表１−１】
2015110625.tif 000163
【表１−２】
2015110625.tif 000164
【表１−３】
2015110625.tif 000165
【表１−４】
2015110625.tif 000166
【表１−５】
2015110625.tif 000167
【表１−６】
2015110625.tif 000168
【請求項１７】
両性リポソームがAmphoter II混合物であり、該混合物のκ(min)が０.２３未満である請求項１〜１４のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１８】
両性リポソームが以下から選択されるAmphoter II混合物である請求項１〜１４および１７のいずれかに記載の両性リポソーム：
【表２−１】
2015110625.tif 000169
【表２−２】
2015110625.tif 000170
【表２−３】
2015110625.tif 000171
【表２−４】
2015110625.tif 000172
【請求項１９】
リポソームが、５０〜１０００ｎｍの範囲内のサイズを有する請求項１〜１８のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項２０】
リポソームが、細胞標的化リガンドおよび／または粒子を立体的に安定化する膜形成分子または膜配置分子を含有する請求項１〜１９のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項２１】
リポソームが少なくとも１つの活性物質を封入している請求項１〜２０のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項２２】
活性物質が、脊椎動物細胞において１つまたはそれ以上のＲＮＡに転写されうる核酸を含有し、該ＲＮＡがｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり、該ｍＲＮＡが１つまたはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードしている請求項２１に記載の両性リポソーム。
【請求項２３】
核酸が、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ構築物またはｍＲＮＡである請求項２２に記載の両性リポソーム。
【請求項２４】
活性物質がオリゴヌクレオチドである請求項２１に記載の両性リポソーム。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、転写に影響を与える物質、スプライシングに影響を与える物質、リボザイム、ＤＮＡザイムまたはアプタマーである請求項２４に記載の両性リポソーム。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドが、ホスフェートまたはホスホチオエート形態にあるＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックされた核酸(ＬＮＡ)、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、２'Ｏ-メチルＲＮＡ(２'Ｏｍｅ)、２'Ｏ-メトキシエチルＲＮＡ(２'ＭＯＥ)などの修飾ヌクレオチドを含有する請求項２４または２５のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項２７】
少なくとも８０重量％の活性物質がリポソーム内部に配置されている請求項２１〜２６のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項２８】
リポソームが未封入の活性物質を含有する請求項２１〜２４のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項２９】
請求項２１〜２８のいずれかに記載の活性物質を装填した両性リポソームおよびそのための医薬的に許容しうるビヒクルを含有する医薬組成物。
【請求項３０】
細胞の試験管内、生体内または生体外トランスフェクションのための、請求項１〜２８のいずれかに記載の両性リポソームの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中性脂質を含有する両性リポソームの改良または該両性リポソームに関連する改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
両性リポソームは、動物において優れた生体内分布を示し、十分に許容されることがわかった。これらは、活性物質(核酸分子を含む)を高効率で封入することができる。
【０００３】
双性イオン性の構造とは対照的に、両性リポソームは有利な等電点を有し、比較的高いｐＨ値において負に荷電し、比較的低いｐＨ値において正に荷電している。両性リポソームは、Straubingerら(非特許文献１)によって導入されたｐＨ感受性リポソームの比較的大きい群に属する。ｐＨ感受性リポソームにおける典型的なｐＨ応答性要素は、コレステロールヘミスクシネート(ＣＨＥＭＳ)、パルミトイルホモシステイン、ジオレオイルグリセロールヘミスクシネート(ＤＯＧ-Ｓｕｃｃ)などである。ＣＨＥＭＳは、１０℃を超える温度において逆六角形相を優先的に採る脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を、ｐＨ７.４においてラメラ相に安定化することができる。ラメラＣＨＥＭＳ／ＤＯＰＥ系は、中性またはわずかにアルカリ性のｐＨにおいて調製することができるが、これらの系は、酸性ｐＨにおいて不安定になり、溶解する(非特許文献２)。
【０００４】
融合性リポソームは、医薬用途において、特に、薬物(例えば核酸、例えばプラスミドおよびオリゴヌクレオチドなど)の細胞内供給のために非常に重要である。エンドサイトーシスによる細胞へのリポソームの取込みの後、エンドソームからの薬物の放出が、細胞サイトゾルへの薬物の供給のための重要な工程である。エンドソーム内のｐＨはわずかに酸性であり、従って、ｐＨ感受性リポソームはエンドソーム膜と融合することができ、これにより、エンドソームからの薬物の放出を可能にする。このことは、脂質相の不安定化(例えば、高い融合性による)が、エンドソーム脱出および細胞内供給を容易にすることを意味する。また、他の低ｐＨ環境(例えば、腫瘍または炎症部位において見られる低ｐＨ)が、そのようなリポソームの融合を開始させることができる。
【０００５】
Hafezら(非特許文献３)は、そのような融合が起こるｐＨの制限された制御に満足せず、カチオン性脂質の添加によって融合点を微調整するための合理的アプローチを示した。
このような混合物は、真の両性特性を有し、低ｐＨにおいてはカチオン状態で存在し、比較的高いｐＨ(典型的には生理学的ｐＨ)においてはアニオン粒子として存在する。Hafezらによれば、融合は、粒子の正味電荷がゼロであるｐＨ値(該粒子の等電点)において始まり、一旦、該等電点を交差する(ｐＨがある程度低下する)と、融合は連続過程である。この見解は、数学モデルを用いて両性脂質混合物の融合傾向を分析しているLiおよびSchick(非特許文献４)と同見解である。
【０００６】
１９７５年にIsraelachviliおよびMitchell(非特許文献５)は、脂質分子の全体の形が水和した脂質膜の構造を決定すると仮定する分子形状コンセプトを導入した。これは、脂質の幾何、より具体的には、極性頭部基と疎水性膜アンカーの間のサイズ比が、脂質相を決定する重要なパラメーターであることを意味する(非特許文献６)。しかし、最初の理論は、極性頭部基の立体部分である対イオンを考慮しておらず、これがLiおよびSchick(非特許文献４)により提供された。彼等のＤＯＤＡＣ／ＣＨＥＭＳ系の記載において、ナトリウムイオンは、中性ｐＨにおいてＣＨＥＭＳの頭部基を大きくするが、ｐＨ低下につれて解離し、こうして頭部基体積を最小化し、六角形相を促進する(強カチオンとしてのＤＯＤＡＣは、ｐＨとは無関係にそのそれぞれの対イオンと一定の関係にあると仮定される。このモデルは、あるｐＨおよびそれ以下のｐＨにおける融合を予測する。
【０００７】
分子形状コンセプトに従う脂質相(非特許文献７)：
【表１】
2015110625.tif 000002
【０００８】
両性脂質混合物への中性脂質の添加は、両性リポソームの等電点にわずかの影響しか持たないことがわかっている。特許文献１(Panznerら)は、低ｐＨおよび中性ｐＨの両方において安定なサイズを有する、中性脂質を含有するある種の両性リポソームを開示している。また、特許文献１は、低ｐＨから出発して、そのような粒子に核酸を装填する方法を記載している。
【０００９】
特許文献２(Endertら)は、中性脂質としてホスファチジルコリンとコレステロールの混合物を含有し、コレステロールのモル量が３５〜４０モル％である両性リポソーム配合物を開示している。
特許文献３(Panznerら)は、中性脂質としてホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含有する両性リポソームを開示している。
【００１０】
両性リポソームは、複雑な構造であり、少なくとも相補的な一対の荷電した脂質を含有する。１つまたはそれ以上のそのような中性もしくは双性イオン性脂質の含有は、特に、成分の個々の量が変化することができるので、混合物の複雑性を大きく増加させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０５／０９４７８３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０７／０３１３３３号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Straubingerら、FEBS Lett.、1985、179(1)、148-154
【非特許文献２】HafezおよびCullis、Biochim. Biophys. Acta、2000、1463、107-114
【非特許文献３】Hafezら、Biophys. J.、2000、79(3)、1438-1446
【非特許文献４】LiおよびSchick、Biophys. J.、2001、80、1703-1711
【非特許文献５】IsraelachviliおよびMitchell、Biochim. Biophys. Acta、1975、389、13-19
【非特許文献６】Israelachviliら、Biochim Biophys Acta、1977、17; 470(2): 185-201
【非特許文献７】Israelachviliら、1980、Q. Rev. Biophys.、13(2)、121-200
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、中性脂質を含有する両性リポソームの改良された配合物を提供することである。
本発明の別の目的は、細胞のトランスフェクションを可能にする両性リポソームの改良された配合物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、そのようなリポソームを、活性物質または成分(薬物、例えば核酸薬物、例えばオリゴヌクレオチドおよびプラスミドを含む)を細胞または組織に供給するための担体として含有する医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、本発明の１つの側面によれば、中性脂質を含有する両性リポソームであって、該中性脂質が、コレステロールまたはコレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物からなる群から選択され、該混合物のκ(中性)が０.３またはそれ未満である両性リポソームが提供される。
【００１６】
好ましくは、コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物のκ(中性)は、０.２５未満、好ましくは０.２未満、最も好ましくは０.１５未満である。
【００１７】
ある種の態様において、コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物は、以下からなる群から選択される：
ａ．コレステロール／ホスファチジルコリン、
ｂ．コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン、
ｃ．コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルコリン、
ｄ．コレステリン／スフィンゴミエリン、
ｅ．コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン／スフィンゴミエリン。
【００１８】
適するホスファチジルエタノールアミンは、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＰｈｙＰＥ、ＤＬｉｎＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥまたはこれらの天然等価物からなる群から選択することができ、ここで、ＤＯＰＥが最も好ましい。
【００１９】
ホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣまたはこれらの天然等価物、例えば大豆ＰＣまたは卵ＰＣからなる群から選択することができ、ここで、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣが好ましい。
【００２０】
本発明の両性リポソームは、１つまたはそれ以上または複数の荷電した両親媒性物質を含有し、該物質は互いと組合せて両性の性質を有する。
【００２１】
本発明の１つの側面において、荷電した両親媒性物質は両性脂質である。
適する両性脂質は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣＨｏｌからなる群から選択することができる。
【００２２】
別法によれば、本発明の両性リポソームは、両性の特性を有する脂質成分の混合物を含有し、該脂質成分の混合物は、少なくとも１つのｐＨ応答性成分を含有する。
【００２３】
該脂質成分の混合物は、
(ｉ)安定なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質(Amphoter I混合物と称する)、
(ii)荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質(Amphoter II混合物と称する)、または
(iii)安定なアニオン性脂質および荷電可能なカチオン性脂質(Amphoter III混合物と称する)、
を含有することができる。
【００２４】
本発明の１つの態様において、両性リポソームの等電点は、４〜７、好ましくは４.５〜６.５、最も好ましくは５〜６である。
【００２５】
アニオン性脂質は、以下からなる群から選択することができるが、これらに限定はされない：ジアシルグリセロールヘミスクシネート、例えば、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、ＰＯＧＳ、ＤＰＧＳ、ＤＳＧＳ；ジアシルグリセロールヘミマロネート、例えば、ＤＯＧＭまたはＤＭＧＭ；ジアシルグリセロールヘミグルタレート、例えば、ＤＯＧＧ、ＤＭＧＧ；ジアシルグリセロールヘミアジペート、例えば、ＤＯＧＡ、ＤＭＧＡ；ジアシルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸、例えば、ＤＯ-ｃＨＡ、ＤＭ-ｃＨＡ；(２,３-ジアシル-プロピル)アミノ}-オキソアルカン酸、例えば、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ；ジアシル-アルカン酸、例えば、ＤＯＰ、ＤＯＢ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、ＤＭＰ、ＤＯＢ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ；Ｃｈｅｍｓおよびその誘導体、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ５、Ｃｈｏｌ-Ｃ６、Ｃｈｏｌ-Ｃ７またはＣｈｏｌ-Ｃ８；Ｃｈｏｌ-Ｃ１、ＣｈｏｌＣ３Ｎまたはコレステロールヘミジカルボン酸およびコレステリルオキシカルボニルアミノカルボン酸、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ１２またはＣｈｏｌＣ１３Ｎ、脂肪酸、例えば、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ネルボン酸、ベヘン酸；ＤＯＰＡ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＰＯＰＡ、ＤＳＰＡ、Ｃｈｏｌ-ＳＯ４、ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＳＰＧまたはＤＯＰＳ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＳＰＳまたはセチル-ホスフェート。
【００２６】
カチオン性脂質は、以下からなる群から選択することができるが、これらに限定はされない：ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＰＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＰＯＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＰＤＡＰ、ＤＳＤＡＰ、ＤＯＤＭＨＥＡＰまたはＤＯＲＩ、ＰＯＤＭＨＥＡＰまたはＰＯＲＩ、ＤＭＤＭＨＥＡＰまたはＤＭＲＩ、ＤＰＤＭＨＥＡＰまたはＤＰＲＩ、ＤＳＤＭＨＥＡＰまたはＤＳＲＩ、ＤＯＭＤＨＥＡＰ、ＰＯＭＤＨＥＡＰ、ＤＭＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＭＤＨＥＡＰ、ＤＳＭＤＨＥＡＰ、ＤＯＭＨＥＡＰ、ＰＯＭＨＥＡＰ、ＤＭＭＨＥＡＰ、ＤＰＭＨＥＡＰ、ＤＳＭＨＥＡＰ、ＤＯＤＨＥＡＰ、ＰＯＤＨＥＡＰ、ＤＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＤＨＥＡＰ、ＤＳＤＨＥＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＰＯＥＰＣ、ＤＯＲＩＥ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＭＣＡＰ、ＤＯＭＧＭＥ、ＤＯＰ５Ｐ、ＤＯＰ６Ｐ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＴＣ-Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ-Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-ベタイン、Ｎ-メチル-ＰｉｐＣｈｏｌ、ＣＴＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ４Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-ＤＭＣ３Ｎ-Ｍｏ２、ＣｈｏｌＣ４Ｈｅｘ-Ｍｏ２、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＰｉｐＣ２-Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＤＯ、ＭｏＤＰ、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭ。
【００２７】
さらに、または別法として、本発明の両性リポソームは、本明細書の表６０および表６１に挙げた化合物番号１〜９７を有する１つまたはそれ以上の化合物を含有することができる。
【００２８】
本発明の１つの態様において、両性リポソームはAmphoter I混合物であり、該混合物のκ(min)が０.０７〜０.２２、好ましくは０.０９〜０.１５である。
【００２９】
本発明の別の態様において、両性リポソームはAmphoter II混合物であり、該混合物のκ(min)が０.２３未満、好ましくは０.１８未満である。
【００３０】
本発明の別の側面において、本リポソームは、両親媒性物質の以下の特定の組合せを有するもの以外の脂質混合物を含有することができる：ＤＣ-Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＡ／Ｃｈｏｌが４０：２０：４０(モル比)。
【００３１】
本発明のさらに他の側面において、両性リポソームは、５０モル％またはそれ以上のモル量でコレステロールとホスファチジルコリンの混合物を含有するもの以外であることができる。
【００３２】
本発明の別の特定の側面において、両性リポソームは、少なくとも１つの活性物質を封入している。該活性物質は薬物を含有することができる。ある種の態様において、該活性物質は核酸を含有することができる。
【００３３】
そのような使用に限定されるものではないが、本発明において記載される両性リポソームは、核酸に基づく薬物、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミドなどのための担体として使用するのに非常に適している。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡのための１つまたはそれ以上の特定の配列をコードする核酸、ならびに、タンパク質発現レベルを特異的に調節しうるか、または特にスプライシングおよび人工切断への介入によってタンパク質構造に影響を与えうるオリゴヌクレオチドに分類される。
【００３４】
即ち、本発明のある種の態様において、核酸に基づく治療物質は、脊椎動物細胞において１つまたはそれ以上のＲＮＡに転写されうる核酸を含有することができ、該ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであってよく、該ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードしている。このような核酸治療物質は、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ構築物、例えば、ＭＩＤＧＥベクター(Minimalistic Immunogenically Defined Gene Expression)(国際公開第９８／２１３２２号または独国特許第１９７５３１８２号に開示)、または翻訳準備ができたｍＲＮＡ(例えば、欧州特許第１３９２３４１号)であってよい。
【００３５】
本発明の別の態様において、既存の細胞内核酸またはタンパク質を標的化しうるオリゴヌクレオチドを使用することができる。このような核酸は、特定の遺伝子をコードすることができ、該オリゴヌクレオチドを、転写を弱めるかまたは調節するように、転写体のプロセッシングを修飾するように、あるいはタンパク質の発現に介入するように適合させる。用語「標的核酸」は、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、ならびに、該ＤＮＡに由来する全てのＲＮＡ、プレ-ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを包含する。標的核酸と該配列に指向する１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの間の特異的なハイブリダイゼーションは、タンパク質発現を阻害または調節する結果になるであろう。このような特異的な標的化を達成するために、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列に実質的に相補性であるヌクレオチドの連続ストレッチを適切に含有しているはずである。
【００３６】
上記した基準を満たすオリゴヌクレオチドは、多数の異なる化学およびトポロジーを用いて構築することができる。オリゴヌクレオチドは、天然または修飾ヌクレオシドを含有することができ、これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックされた核酸(ＬＮＡ)、２'Ｏ-メチルＲＮＡ(２'Ｏｍｅ)、２'Ｏ-メトキシエチルＲＮＡ(２'ＭＯＥ)(そのホスフェートまたはホスホチオエート形態にある)あるいはモルホリノまたはペプチド核酸(ＰＮＡ)が含まれるが、これらに限定はされない。
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であることができる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、８〜６０の電荷を有するポリアニオン性構造体である。ほとんどの場合、これらの構造体は、ヌクレオチドを含有するポリマーである。本発明は、オリゴヌクレオチドの特定の作用メカニズムに限定されず、該メカニズムの理解は、本発明の実施に必要ではない。
オリゴヌクレオチドの作用メカニズムは、変化することができ、特に、スプライシング、転写、核-細胞質輸送および翻訳に対する効果を含むであろう。
【００３８】
本発明の好ましい態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドを使用することができ、これには、ＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、ロックされた核酸、２'-修飾オリゴヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとして普通に知られるその他のものが含まれるが、これらに限定はされない。骨格または塩基または糖の修飾には、ホスホチオエートＤＮＡ(ＰＴＯ)、２'Ｏ-メチルＲＮＡ(２'Ｏｍｅ)、２'フルオロＲＮＡ(２'Ｆ)、２'Ｏ-メトキシエチル-ＲＮＡ(２'ＭＯＥ)、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、Ｎ３'-Ｐ５'ホスホアミデート(ＮＰ)、２'フルオロアラビノ核酸(ＦＡＮＡ)、ロックされた核酸(ＬＮＡ)、モルホリンホスホアミデート(モルホリノ)、シクロヘキセン核酸(ＣｅＮＡ)、トリシクロ-ＤＮＡ(ｔｃＤＮＡ)などが含まれるが、これらに限定はされない。さらに、混合化学が当分野で知られており、コポリマー、ブロック-コポリマーまたはギャップマー(gapmer)として、あるいは他の配置で、単一ヌクレオチド種を超える種から構築される。
【００３９】
上記したオリゴヌクレオチドに加えて、相補性配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を用いて、タンパク質発現を阻害することもできる。このようなＲＮＡ分子は、当分野においてｓｉＲＮＡ分子として知られている(例えば、国際公開第９９／３２６１９号または国際公開第０２／０５５６９３号)。他のｓｉＲＮＡは、一本鎖ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡ(１つの不連続鎖を有する)を含有する。ここでも、この群のオリゴヌクレオチドに様々な化学を適合させる。また、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系も当分野で知られている。
【００４０】
本発明の別の態様において、デコイオリゴヌクレオチドを使用することができる。これらの二本鎖ＤＮＡ分子およびその化学的修飾体は、核酸を標的とせず、転写因子を標的とする。これは、デコイオリゴヌクレオチドが配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質に結合し、転写に介入することを意味する(例えば、Cho-Chungら、Curr. Opin. Mol. Ther.、1999)。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、生理学的条件下で遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズすることによって転写に影響を与えうるオリゴヌクレオチドを使用することができる。ここでも、この群のオリゴヌクレオチドに様々な化学を適合させることができる。
【００４２】
本発明のなおさらなる態様において、ＤＮＡザイムを使用することができる。ＤＮＡザイムは、酵素活性を有する一本鎖オリゴヌクレオチドおよびその化学的修飾体である。典型的なＤＮＡザイム(「１０−２３」モデルとして知られる)は、生理学的条件で特定部位において一本鎖ＲＮＡを切断することができる。ＤＮＡザイムの「１０−２３」モデルは、ＲＮＡ上の標的配列に相補的な２つの基質認識ドメインによって挟まれた１５個の高保存性デオキシリボヌクレオチドからなる触媒ドメインを有する。標的ｍＲＮＡの切断は、その破壊およびＤＮＡザイムのリサイクルの結果になり、複数の基質を切断することができる。
【００４３】
本発明のさらに別の態様において、リボザイムを使用することができる。リボザイムは、酵素活性を有する一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびその化学的修飾体である。これらは、機能的に次の２つの成分に分けることができる：保存性の幹−触媒コアおよび隣接配列(所与のＲＮＡ転写体中の標的部位を囲む配列に逆相補性である)を形成するループ構造。隣接配列は、特異性を付与することができ、通常は合計して１４〜１６ヌクレオチドからなることができ、選択した標的部位の両側に伸びている。
【００４４】
本発明のなおさらなる態様において、アプタマーを用いてタンパク質を標的にすることができる。アプタマーは、通常は１５〜６０ヌクレオチド長さであり、特定の分子標的に緊密に結合する核酸(例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ)およびその化学的修飾体からなる巨大分子である。そのヌクレオチド鎖は、分子を複雑な３次元形状に折り畳む分子内相互作用を生じることができる。アプタマーの形状は、その標的分子(酸性タンパク質、塩基性タンパク質、膜タンパク質、転写因子および酵素を含むが、これらに限定はされない)の表面に緊密に結合することを可能にする。アプタマー分子の結合は、標的分子の機能に影響を与えることができる。
【００４５】
上記したオリゴヌクレオチドの全ては、鎖あたりに、少なければ５または１０、好ましくは１５、より好ましくは１８ヌクレオチドと、５０、好ましくは３０、より好ましくは２５ヌクレオチドの間の長さで変化することができる。より具体的には、オリゴヌクレオチドは、その標的配列のＲＮＡｓｅＨ媒介分解を触媒するか、または翻訳をブロックするか、またはスプライシングを再指向するか、またはアントゴミアー(antogomirs)として働く８〜５０ヌクレオチド長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであることができる。これらは、１５〜３０塩基対長さのｓｉＲＮＡであることができ、さらに１５〜３０塩基対長さのデコイオリゴヌクレオチドであることができ、１５〜３０ヌクレオチド長さのゲノムＤＮＡの転写に影響を与える相補性オリゴヌクレオチドであることができる。さらにこれらは、２５〜５０ヌクレオチド長さのＤＮＡザイム、または２５〜５０ヌクレオチド長さのリボザイム、または１５〜６０ヌクレオチド長さのアプタマーであることもできる。
【００４６】
このような下位群のオリゴヌクレオチドは、機能的に規定されることが多く、同一または異なることができるか、またはその化学的性質または構造の一部の(全てではない)特徴を、本発明の教示に実質的に影響することなく共有することができる。オリゴヌクレオチドと標的配列の間の適合は、好ましくは完全であり、オリゴヌクレオチドの各塩基は、標的核酸上の相補性塩基と、上記した数のオリゴヌクレオチドの連続ストレッチにわたって塩基対を形成する。配列の対は、塩基対の連続ストレッチ中に１つまたはそれ以上のミスマッチを含むことができるが、これは好ましさが低い。一般に、そのような核酸の種類および化学的組成は、生体内または試験管内でビヒクルとして本発明のリポソームの性能にわずかの影響しか持たず、当業者は、本発明の両性リポソームと組合せるのに適する他の種類のオリゴヌクレオチドまたは核酸を見つけることができる。
【００４７】
１つの側面において、本発明の両性リポソームは、試験管内、生体内または生体外で細胞をトランスフェクトするのに有用である。
【００４８】
本発明の別の側面において、本発明の両性リポソームは、その表面に、細胞表面の標的受容体に結合する細胞標的化リガンドを含有することができる。リガンドには、抗体またはそのフラグメント、糖、ホルモン、ビタミン、ペプチド、例えばａｒｇ-ｇｌｙ-ａｓｐ(ＲＧＤ)、成長因子、ビリルビン、トランスフェリン、葉酸塩あるいは他の成分が含まれるが、これらに限定はされない。
【００４９】
本発明のさらに他の側面において、両性リポソームは、膜形成する分子または膜配置分子(これは粒子を立体的に安定化する)を含有することができる。このような分子は当分野で知られており、これには、両親媒性デキストラン、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコール、ツイーン(Tween)８０またはＧＭ１ガングリオシドが含まれるが[例えば、Woodleら、Biochim. Biophys. Acta、1113(2)、171-179、(1992)；Allenら、Biochim. Biophys. Acta、981(1)、27-35、(1989)]、これらの物質に限定はされない。上記した分子は、両親媒性の性質を有し、上記した部分から選択することができる少なくとも１つの親水性ドメインを含有し、少なくとも１つの疎水性ドメイン(これは脂質であることが非常に多い)、１２個またはそれ以上の炭素原子を含む１つまたはそれ以上のアルキル鎖あるいは１２個またはそれ以上の炭素原子を含む１つまたはそれ以上のアシル鎖をさらに含有する。最も多く使用される両親媒性分子には、ＤＳＰＥ-ｍＰＥＧ、ＤＭＰＥ-ｍＰＥＧおよび８〜２４個の炭素原子のＮ-アシル鎖長を有するセラミドに結合したポリエチレングリコールが含まれる。
【００５０】
疎水性部分のサイズが、これらの立体的シールド部分の拡散時間に関係していることが当業者に知られている[例えば、Mok,K.W.ら、(1999)、Biochim. Biophys. Acta 1419、137-150；Silvius,J.R.およびZuckermann,M.J.、(1993)、Biochemistry 32、3153-3161；Webb,M.S.ら、(1998)、Biochim. Biophys. Acta 1372、272-282；Wheeler,J.J.ら、(1999)、Gene Ther. 6、271-281；Zhang,Y.P.ら、(1999)、Gene Ther. 6、1438-1447に示されている]。即ち、立体シールドは、脊椎動物または哺乳動物におけるそのような粒子の循環時間の範囲内で、一定または一時的な性質であろう。また、立体的安定化ポリマーを、脂質二重層の外表面および内表面の両側にグラフト化することができるか、または外表面側のみに限定することもできる。これを、該部分挿入の異なる方法によって達成することができる[例えば、Shi Fら、(2002)、Biochemical Journal 366、333-341に示されている]。
【００５１】
他の効果の中で、立体安定剤は、血流中に粒子を注入したときに、ＲＥＳ(細網内皮系)による粒子の取込みを最小にする。
【００５２】
また、細胞標的化リガンドおよび粒子を立体的に安定化する分子を含有する両性リポソームも、本発明の範囲内である。リガンドおよび立体的に安定化する分子の両方を含有する薬物供給系が当分野で知られている[例えば、Hu-Lieskovanら、Cancer Res.、65(19)、8984-8992、(2005)またはSchiffelersら、Nucleic Acid Research、32(19)、(2004)]。
【００５３】
本発明のさらなる側面は、活性物質または成分(薬物、例えば核酸薬物、例えばオリゴヌクレオチドおよびプラスミドを含む)の供給または標的化供給のための担体として、本発明の両性リポソームを含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、適当な薬理学的に許容しうるビヒクル中に配合することができる。この目的のために、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水などのビヒクルが当業者によく知られている。
【００５４】
ある種の態様において、該医薬組成物を、ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫性または自己免疫性疾患、癌および／または代謝性疾患の治療または予防に使用することができる。
【００５５】
本発明のなおさらなる側面は、ヒトまたは非ヒト動物を治療するための方法であって、活性物質または成分のための担体として本発明の両性リポソームを含有する医薬組成物を、特定の器官もしくは複数の器官、腫瘍、または感染もしくは炎症部位に標的化する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、Amphoter I系におけるアニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比率について、κを計算した結果をグラフで示すものである。左パネル：ｐＨおよびアニオン性脂質の割合(％)に応答したκの表面プロット。右パネル：選択した量のアニオン性脂質に対するｐＨ応答の詳細分析。
【００５７】
【図２】図２は、Amphoter II系におけるアニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比率について、κを計算した結果をグラフで示すものである。左パネル：ｐＨおよびアニオン性脂質の割合(％)に応答したκの表面プロット。右パネル：選択した量のアニオン性脂質に対するｐＨ応答の詳細分析。
【００５８】
【図３】図３は、Amphoter III系におけるアニオン性およびカチオン性モデル脂質の間の異なる比率について、κを計算した結果をグラフで示すものである。左パネル：ｐＨおよびアニオン性脂質の割合(％)に応答したκの表面プロット。右パネル：選択した量のアニオン性脂質に対するｐＨ応答の詳細分析。
【００５９】
【図４】図４は、様々な対イオンサイズによるAmphoter II混合物のアニオン性またはカチオン性状態の安定化を示す。左パネル：等しい対イオンサイズの分析。右パネル：比較的大きいカチオン性対イオンによるアニオン性状態の排他的な安定化。ＣＡ：対アニオン；ＣＣ：対カチオン；記号説明中の数字は分子体積をÅ3で示す。
【００６０】
【図５】図５は、様々な対アニオンによるカチオン性Amphoter II脂質相の非対称安定化を示す。製造中に、カチオン性脂質相を比較的大きいアニオン(ＣＡ１２０)で安定化する。リポソームを中性ｐＨに調整し、緩衝組成物を比較的小さい対アニオン(ＣＡ２１)と交換する。ここで酸性ｐＨに遭遇したリポソームは、脂質相がさらに低いκ値を有するので、融合しがちになる。ＣＡ：対アニオン；ＣＣ：対カチオン；記号説明中の数字は分子体積をÅ3で示す。
【００６１】
【図６】図６は、中性脂質をさらに含有するAmphoter II系における外部ｐＨに応答したκの計算をグラフで示すものである。５０％の中性脂質を、図の記号説明中に示したκ値を有する系に添加した。
【００６２】
【図７】図７は、ＣｉＰ緩衝液におけるｐＨジャンプ後のＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳリポソームのサイズを示す。６６モル％ＣＨＥＭＳ(クロス)、７５モル％ＣＨＥＭＳ(アステリスク)または１００モル％ＣＨＥＭＳ(ドット)を含有するＤＯＴＡＰリポソームを、ｐＨ８において製造し、表示したｐＨにジャンプさせ、比較的低いｐＨにおける１時間インキュベートの後に中和した。サイズを、サイクルの終点で測定した。
【００６３】
【図８】図８は、ＭｏＣＨｏｌおよびＣＨＥＭＳを含有するAmphoter II系の融合挙動を示す。左：系のκ値の計算。右：ＣｉＰ緩衝液中のＣＨＥＭＳおよびＭｏＣｈｏｌの異なる混合物のｐＨジャンプ後の実験融合結果。記号説明中の割合(％)は混合物中のＣＨＥＭＳの量を表す。
【００６４】
【図９】図９は、モノアルキル脂質を含有するAmphoter II系の融合挙動を示す。左：系のκ値の計算。右：ＣｉＰ緩衝液中のオレイン酸およびＭｏＣｈｏｌの異なる混合物のｐＨジャンプ後の実験融合結果。記号説明中の割合(％)は、混合物中のオレイン酸の量を表す。
【００６５】
【図１０】図１０ａおよび１０ｂは、０％〜５０％のＰＯＰＣを含む混合物のκ(min)に対するＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳからのリポソームの融合強度[マトリックスＣ／Ａ＝０.１７〜０.７５(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)；Ｃ／Ａ＝０.３３〜３(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)-対-ｐＨにおける％ΣＦＲＥＴとして表す]のプロットを示す。参照κ(min)は、Ｃ／Ａ＝０.６６(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)またはＣ／Ａ＝１(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)についてモデル化した。０％ＰＯＰＣの％ΣＦＲＥＴを１００に設定した。
【００６６】
【図１１】図１１ａおよび１１ｂは、０％〜５０％のＤＯＰＥを含む混合物のκ(min)に対するＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳからのリポソームの融合強度[マトリックスＣ／Ａ＝０.１７〜０.７５(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)；Ｃ／Ａ＝０.３３〜３(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)-対-ｐＨにおける％ΣＦＲＥＴとして表す]のプロットを示す。参照κ(min)は、Ｃ／Ａ＝０.６６(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)またはＣ／Ａ＝１(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)についてモデル化した。０％ＤＯＰＥの％ΣＦＲＥＴを１００に設定した。
【００６７】
【図１２】図１２ａおよび１２ｂは、０％〜５０％のコレステロールを含む混合物のκ(min)に対するＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳからのリポソームの融合強度[マトリックスＣ／Ａ＝０.１７〜０.７５(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)；Ｃ／Ａ＝０.３３〜３(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)-対-ｐＨにおける％ΣＦＲＥＴとして表す]のプロットを示す。参照κ(min)は、Ｃ／Ａ＝０.６６(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)またはＣ／Ａ＝１(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)についてモデル化した。０％コレステロールの％ΣＦＲＥＴを１００に設定した。
【００６８】
【図１３】図１３ａおよび１３ｂは、０％〜５０％のＰＯＰＣ／コレステロール混合物(１：１)を含む混合物のκ(min)に対するＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳからのリポソームの融合強度[マトリックスＣ／Ａ＝０.１７〜０.７５(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)；Ｃ／Ａ＝０.３３〜３(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)-対-ｐＨにおける％ΣＦＲＥＴとして表す]のプロットを示す。参照κ(min)は、Ｃ／Ａ＝０.６６(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)またはＣ／Ａ＝１(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)についてモデル化した。０％ＰＯＰＣ／コレステロールの％ΣＦＲＥＴを１００に設定した。
【００６９】
【図１４】図１４は、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳおよび１０％〜５０％の異なる中性もしくは双性イオン性脂質を含有するリポソームの融合強度(マトリックスＣ／Ａ＝０.３３〜３-対-ｐＨにおけるΣＦＲＥＴとして表す)を示す。点線は、０％の中性もしくは双性イオン性脂質を含むリポソームの融合強度を示す。
【００７０】
【図１５】図１５は、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳおよび１０％〜５０％の異なるＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ混合物を含有するリポソームの融合強度(マトリックスＣ／Ａ＝０.３３〜３-対-ｐＨにおけるΣＦＲＥＴとして表す)を示す。点線は、０％の中性もしくは双性イオン性脂質を含むリポソームの融合強度を示す。
【００７１】
【図１６】図１６は、ＤＣ-Ｃｈｏｌ／Ｃｈｅｍｓを含有するリポソームの融合ゾーンと等電点の間の相関を示す。ｄ(ｐＨ-ＩＰ)は、ＦＲＥＴを測定したｐＨと、適切なＣ／Ａ比に対する等電点の間の差である。
【００７２】
【図１７】図１７は、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１を封入した、表７７からの中性および／または双性イオン性脂質を含有する全てのAmphoter IリポソームのＩＣ50値-対-κ(min)値のプロットを示す(ＩＣ50値は、実施例８に記載したＨｅｌａ細胞の試験管内トランスフェクションから導いた)。
【００７３】
【図１８】図１８は、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１を封入した、表７８からの中性および／または双性イオン性脂質を含有する全てのAmphoter IIリポソームのＩＣ50値-対-κ(min)値のプロットを示す(ＩＣ50値は、実施例８に記載したＨｅｌａ細胞の試験管内トランスフェクションから導いた)。
【００７４】
【図１９】図１９は、表７７および表７８からの中性および／または双性イオン性脂質を含有する全ての両性リポソームのサイズ-対-ｄκ(ｐＨ８)のプロットを示す。
【００７５】
【図２０】図２０は、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１(黒棒)または非標的化スクランブルｓｉＲＮＡ(白棒)を封入し、かつ、中性および／または双性イオン性脂質を含有しないか、または異なる中性および／または双性イオン性脂質を表示したモル量で含有する、異なるＤＯＤＡＰ／ＤＭＧＳ(Ｃ／Ａ＝０.５)両性リポソームでトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞の％細胞生存性(偽処理細胞に対して正規化した)を示す。
【００７６】
【図２１】図２１は、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１(黒棒)または非標的化スクランブルｓｉＲＮＡ(白棒)を封入し、かつ、中性および／または双性イオン性脂質を含有しないか、または異なる中性および／または双性イオン性脂質を表示したモル量で含有する、異なるＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧＳ(Ｃ／Ａ＝０.５)両性リポソームでトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞の％細胞生存性(偽処理細胞に対して正規化した)を示す。
【００７７】
【図２２】図２２は、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１(黒棒)または非標的化スクランブルｓｉＲＮＡ(白棒)を封入し、かつ、中性もしくは双性イオン性脂質として漸増モル量のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ混合物(モル比０.５)を含有する、異なるＣｈｉｍ／ＤＭＧＳ(Ｃ／Ａ＝０.５)両性リポソームでトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞の％細胞生存性(偽処理細胞に対して正規化した)を示す。
【００７８】
【図２３】図２３は、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１(黒棒)または非標的化スクランブルｓｉＲＮＡ(白棒)を封入し、かつ、中性もしくは双性イオン性脂質として漸増モル量のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ混合物(モル比０.５)を含有する、異なるＤＣ-Ｃｈｏｌ／ＤＭＧＳ(Ｃ／Ａ＝０.５)両性リポソームでトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞の％細胞生存性(偽処理細胞に対して正規化した)を示す。
【００７９】
【図２４】図２４は、異なる中性および／または双性イオン性脂質を表示したモル量で含有し、かつ、ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１を封入した、異なるＩＰを有する２種類の異なる両性脂質混合物(ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧＳおよびＤＯＤＡＰ／ＤＭＧＳ)からの異なるＩＣ50値-対-ＩＰ値のプロットを示す。
【００８０】
【図２５】図２５は、ｓｉＲＮＡ標的化ＡｐｏＢ１００または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡをそれぞれ封入したＤＯＴＡＰ／ＤＯＧＳ／Ｃｈｏｌ(１５：４５：４０)両性リポソーム配合物でトランスフェクションした初代マウス肝細胞の相対的ＡｐｏＢ発現を％で示す(未処理細胞と比較)。
【００８１】
【図２６】図２６は、ｓｉＲＮＡ標的化ＡｐｏＢ１００または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡをそれぞれ封入したＤＯＤＡＰ／ＤＭＧＳ／Ｃｈｏｌ(２４：３６：４０)両性リポソーム配合物でトランスフェクションした初代マウス肝細胞の相対的ＡｐｏＢ発現を％で示す(未処理細胞と比較)。
【００８２】
【図２７】図２７は、リポソーム配合物Ｆ５、Ｆ７およびＦ８の尾静脈注射の２時間後の、マウスの肝臓および脾臓からの低温切開片のＣｙ５.５ラベル化ｓｉＲＮＡのシグナルを示す(平均強度として)。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
「荷電可能」とは、両親媒性物質が、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲内のｐＫを有することを意味する。従って、荷電可能な両親媒性物質は、弱い酸または塩基であることができる。「安定」な両親媒性物質は、強い酸または塩基であり、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で実質的に安定な電荷を有する。
【００８４】
本明細書中で「両性」とは、アニオン性およびカチオン性の両方の荷電した基を含有する物質、物質混合物または超分子複合体(例えば、リポソーム)を意味し、ここで、
(１)少なくとも１つの、所望により両方の、カチオン性およびアニオン性両親媒性物質は荷電可能であり、ｐＫ４〜８の少なくとも１つの荷電した基を有し、
(２)ｐＨ４においてカチオン電荷が主であり、そして
(３)ｐＨ８においてアニオン電荷が主である。
【００８５】
結果として、該物質または物質混合物は、ｐＨ４〜ｐＨ８の間で中性正味電荷の等電点を有する。この定義により、両性の性質は双性イオン性の性質とは異なる(双性イオンは、上記した範囲のｐＫを持たないため)。その結果、双性イオンは、広範なｐＨ値にわたり本質的に中性に荷電している(ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、双性イオン性の性質を有する中性脂質である)。
【００８６】
本明細書において、「Ｃ／Ａ」または「Ｃ／Ａ比」または「Ｃ／Ａモル比」とは、両親媒性物質の混合物中のカチオン性両親媒性物質／アニオン性両親媒性物質のモル比を意味する。
【００８７】
本明細書において、「κ(min)」とは、関数κｔｏｔａｌ(ｐＨ)の最小値を意味する。
本明細書において、「κ(中性)」とは、中性もしくは双性イオン性脂質またはその混合物のκ値を意味する。
【００８８】
本明細書において、「ＩＣ５０」とは、標的ｍＲＮＡの５０％ノックダウンまたは増殖アッセイの場合には細胞生存性の５０％阻害を導くオリゴヌクレオチドの阻害濃度を意味する。
【００８９】
以下に挙げる脂質のリストには、中性、双性イオン性、アニオン性、カチオン性または両性の脂質の具体例が含まれる。この脂質リストは、決して本開示の範囲を限定するものではない。
脂質の省略形を本明細書中で使用する。これら省略形の多くは、文献において標準的に使用されているものである。
【００９０】
中性もしくは双性イオン性脂質：
ＰＣ：ホスファチジルコリン(未特定の膜アンカー)；
ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン(未特定の膜アンカー)；
ＳＭ：スフィンゴミエリン(未特定の膜アンカー)；
ＤＭＰＣ：ジミリストイルホスファチジルコリン；
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン；
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン；
ＰＯＰＣ：１-パルミトイル-２-オレオイルホスファチジルコリン；
ＤＯＰＣ：ジオレオイルホスファチジルコリン；
ＤＯＰＥ：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；
ＤＭＰＥ：ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン；
ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン；
ＤｐｈｙＰＥ：ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン；
ＤｌｉｎＰＥ：ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン；
Ｃｈｏｌ：コレステロール。
【００９１】
また、上に挙げたジアシル基を含む中性もしくは双性イオン性脂質のあらゆるジアルキル誘導体も、本発明の範囲内である。
【００９２】
アニオン性脂質：
ＣＨＥＭＳ：コレステロールヘミスクシネート；
Ｃｈｏｌ-ＣＯＯＨまたはＣｈｏｌ-Ｃ１：コレステリル-３-カルボン酸；
Ｃｈｏｌ-Ｃ２：コレステロールヘミオキサレート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ３：コレステロールヘミマロネート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ：Ｎ-(コレステリル-オキシカルボニル)グリシン；
Ｃｈｏｌ-Ｃ５：コレステロールヘミグルタレート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ６：コレステロールヘミアジペート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ７：コレステロールヘミピメレート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ８：コレステロールヘミスベレート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ１２：コレステロールヘミドデカンジカルボン酸；
Ｃｈｏｌ-Ｃ１３Ｎ：１２-コレステリルオキシカルボニルアミノドデカン酸；
【００９３】
以下の一般式で示されるコレステロールヘミジカルボン酸およびコレステリルオキシカルボニルアミノカルボン酸：
【化１】
2015110625.tif 000003
[式中、ＺはＣまたは-ＮＨ-であり、ｎは１〜２９のいずれかである]；
【００９４】
ＤＧＳまたはＤＧ-Ｓｕｃｃ：ジアシルグリセロールヘミスクシネート(未特定の膜アンカー)；
ＤＯＧＳまたはＤＯＧ-Ｓｕｃｃ：ジオレオイルグリセロールヘミスクシネート；
ＤＭＧＳまたはＤＭＧ-Ｓｕｃｃ：ジミリストイルグリセロールヘミスクシネート；
ＤＰＧＳまたはＤＰＧ-Ｓｕｃｃ：ジパルミトイルグリセロールヘミスクシネート；
ＤＳＧＳまたはＤＳＧ-Ｓｕｃｃ：ジステアロイルグリセロールヘミスクシネート；
ＰＯＧＳまたはＰＯＧ-Ｓｕｃｃ：１-パルミトイル-２-オレオイルグリセロール-ヘミスクシネート；
ＤＯＧＭ：ジオレオイルグリセロールヘミマロネート；
ＤＯＧＧ：ジオレオイルグリセロールヘミグルタレート；
ＤＯＧＡ：ジオレオイルグリセロールヘミアジペート；
ＤＭＧＭ：ジミリストイルグリセロールヘミマロネート；
ＤＭＧＧ：ジミリストイルグリセロールヘミグルタレート；
ＤＭＧＡ：ジミリストイルグリセロールヘミアジペート；
ＤＯＡＳ：４-{(２,３-ジオレオイル-プロピル)アミノ}-４-オキソブタン酸；
ＤＯＡＭ：３-{(２,３-ジオレオイル-プロピル)アミノ}-３-オキソプロパン酸；
ＤＯＡＧ：５-{(２,３-ジオレオイル-プロピル)アミノ}-５-オキソペンタン酸；
ＤＯＡＡ：６-{(２,３-ジオレオイル-プロピル)アミノ}-６-オキソヘキサン酸；
ＤＭＡＳ：４-{(２,３-ジミリストイル-プロピル)アミノ}-４-オキソブタン酸；
ＤＭＡＭ：３-{(２,３-ジミリストイル-プロピル)アミノ}-３-オキソプロパン酸；
ＤＭＡＧ：５-{(２,３-ジミリストイル-プロピル)アミノ}-５-オキソペンタン酸；
ＤＭＡＡ：６-{(２,３-ジミリストイル-プロピル)アミノ}-６-オキソヘキサン酸；
ＤＯＰ：２,３-ジオレオイル-プロパン酸；
ＤＯＢ：３,４-ジオレオイル-ブタン酸；
ＤＯＳ：５,６-ジオレオイル-ヘキサン酸；
ＤＯＭ：４,５-ジオレオイル-ペンタン酸；
ＤＯＧ：６,７-ジオレオイル-ヘプタン酸；
ＤＯＡ：７,８-ジオレオイル-オクタン酸；
ＤＭＰ：２,３-ジミリストイル-プロパン酸；
ＤＭＢ：３,４-ジミリストイル-ブタン酸；
ＤＭＳ：５,６-ジミリストイル-ヘキサン酸；
ＤＭＭ：４,５-ジミリストイル-ペンタン酸；
ＤＭＧ：６,７-ジミリストイル-ヘプタン酸；
ＤＭＡ：７,８-ジミリストイル-オクタン酸；
【００９５】
ＤＯＧ-ＧｌｕＡ：ジオレオイルグリセロール-グルコロン酸(１-または４-結合)；
ＤＭＧ-ＧｌｕＡ：ジミリストイルグリセロール-グルコロン酸(１-または４-結合)；
ＤＯ-ｃＨＡ：ジオレオイルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸；
ＤＭ-ｃＨＡ：ジミリストイルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸；  ＰＳ：ホスファチジルセリン(未特定の膜アンカー)；
ＤＯＰＳ：ジオレオイルホスファチジルセリン；
ＤＰＰＳ：ジパルミトイルホスファチジルセリン；
ＰＧ：ホスファチジルグリセロール(未特定の膜アンカー)；
ＤＯＰＧ：ジオレオイルホスファチジルグリセロール；
ＤＰＰＧ：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール；
Ｃｈｏｌ-ＳＯ４：コレステロールスルフェート；
ＰＡ：ホスファチジン酸(未特定の膜アンカー)；
ＤＯＰＡ：ジオレオイルホスファチジン酸；
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム；
Ｃｅｔ-Ｐ：セチルホスフェート；
ＭＡ：ミリスチン酸；
ＰＡ：パルミチン酸；
ＯＡ：オレイン酸；
ＬＡ：リノール酸；
ＳＡ：ステアリン酸；
ＮＡ：ネルボン酸；
ＢＡ：ベヘン酸。
【００９６】
また、上に挙げたジアシル基を含むアニオン性脂質のあらゆるジアルキル誘導体も、本発明の範囲内である。
【００９７】
カチオン性脂質：
ＭｏＣｈｏｌ：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロールヘミスクシネート；  ＨｉｓＣｈｏｌ：ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシネート；
ＣＨＩＭ：コレステロール-(３-イミダゾール-１-イルプロピル)カルバメート；
ＤｍＣ４Ｍｏ２：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-２,３-ジメチルヘミスクシネート；
ＤｍＣ３Ｍｏ２：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-２,２-ジメチルヘミマロネート；
Ｃ３Ｍｏ２：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミマロネート；
Ｃ３Ｍｏ３：４-(２-アミノプロピル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミマロネート；  Ｃ４Ｍｏ４：４-(２-アミノブチル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミスクシネート；  Ｃ５Ｍｏ２：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミグルタレート；  Ｃ６Ｍｏ２：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミアジペート；
Ｃ８Ｍｏ２：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロール-ヘミアジペート；
Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ３：[(３-モルホリン-４-イル-プロピルカルバモイル)-メチル]-カルバミン酸コレステリルエステル；
Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ２：[(２-モルホリン-４-イル-エチルカルバモイル)メチル]-カルバミン酸コレステリルエステル；
Ｃｈｏｌ-Ｃ４Ｎ-Ｍｏ２：[(２-モルホリン-４-イル-エチルカルバモイル)エチル]-カルバミン酸コレステリルエステル；
Ｃｈｏｌ-ＤＭＣ３Ｎ-Ｍｏ２：[１-メチル-２-(２-モルホリン-４-イル-エチルカルバモイル)プロピル]-カルバミン酸コレステリルエステル；
Ｃｈｏｌ-Ｃ４Ｈｅｘ-Ｍｏ２：２-(２-モルホリン-４-イル-エチルカルバモイル)-シクロヘキサンカルボン酸コレステリルエステル；
Ｃｈｏｌ-ベタイン：コレステリル-オキシカルボニル-メチル-トリメチルアンモニウムクロリド；
ＤＤＡＢ：ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；
【００９８】
１,２-ジアシル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン、例えば、
ＤＯＴＡＰ：１,２-ジオレオイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン；
ＤＭＴＡＰ：１,２-ジミリストイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン；
ＤＰＴＡＰ：１,２-ジパルミトイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン；
ＤＳＴＡＰ：１,２-ジステアロイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン；
ＰＯＴＡＰ：パルミトイルオレオイル-３-トリメチルアンモニウム-プロパン；
【００９９】
１,２-ジアシル-３-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン、例えば、
ＤＯＤＭＨＥＡＰまたはＤＯＲＩ：１,２-ジオレオイル-３-ジメチルヒドロキシエチル-アンモニウム-プロパン；
ＤＭＤＭＨＥＡＰまたはＤＭＲＩ：１,２-ジミリストイル-３-ジメチルヒドロキシエチル-アンモニウム-プロパン；
ＤＰＤＭＨＥＡＰまたはＤＰＲＩ：１,２-ジパルミトイル-３-ジメチルヒドロキシエチル-アンモニウム-プロパン；
ＤＳＤＭＨＥＡＰまたはＤＳＲＩ：１,２-ジステアロイル-３-ジメチルヒドロキシエチル-アンモニウム-プロパン；
ＰＯＤＭＨＥＡＰまたはＰＯＲＩ：パルミトイルオレオイル-３-ジメチルヒドロキシエチル-アンモニウム-プロパン；
【０１００】
１,２-ジアシル-３-メチルジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン、例えば、
ＤＯＭＤＨＥＡＰ：１,２-ジオレオイル-３-メチルジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＭＭＤＨＥＡＰ：１,２-ジミリストイル-３-メチルジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＰＭＤＨＥＡＰ：１,２-ジパルミトイル-３-メチルジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＳＭＤＨＥＡＰ：１,２-ジステアロイル-３-メチルジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＰＯＭＤＨＥＡＰ：パルミトイルオレオイル-３-メチルジヒドロキシエチル-アンモニウム-プロパン；
【０１０１】
１,２-ジアシル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン、例えば、
ＤＯＤＡＰ：１,２-ジオレオイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン；
ＤＭＤＡＰ：１,２-ジミリストイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン；
ＤＰＤＡＰ：１,２-ジパルミトイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン；
ＤＳＤＡＰ：１,２-ジステアロイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン；
ＰＯＤＡＰ：パルミトイルオレオイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン；
【０１０２】
１,２-ジアシル-３-メチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン、例えば、
ＤＯＭＨＥＡＰ：１,２-ジオレオイル-３-メチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＭＭＨＥＡＰ：１,２-ジミリストイル-３-メチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＰＭＨＥＡＰ：１,２-ジパルミトイル-３-メチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＳＭＨＥＡＰ：１,２-ジステアロイル-３-メチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＰＯＭＨＥＡＰ：パルミトイルオレオイル-３-メチルヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
【０１０３】
１,２-ジアシル-３-ジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン、例えば、
ＤＯＤＨＥＡＰ：１,２-ジオレオイル-３-ジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＭＤＨＥＡＰ：１,２-ジミリストイル-３-ジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＰＤＨＥＡＰ：１,２-ジパルミトイル-３-ジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＤＳＤＨＥＡＰ：１,２-ジステアロイル-３-ジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
ＰＯＤＨＥＡＰ：パルミトイルオレオイル-３-ジヒドロキシエチルアンモニウム-プロパン；
【０１０４】
１,２-ジアシル-sn-グリセロ-３-エチルホスホコリン、例えば、
ＤＯＥＰＣ：１,２-ジオレオイル-sn-グリセロ-３-エチルホスホコリン；
ＤＭＥＰＣ：１,２-ジミリストイル-sn-グリセロ-３-エチルホスホコリン；
ＤＰＥＰＣ：１,２-ジパルミトイル-sn-グリセロ-３-エチルホスホコリン；
ＤＳＥＰＣ：１,２-ジステアロイル-sn-グリセロ-３-エチルホスホコリン；
ＰＯＥＰＣ：パルミトイルオレオイル-sn-グリセロ-３-エチルホスホコリン；
【０１０５】
ＤＯＴＭＡ：Ｎ-[１-(２,３-ジオレイルオキシ)プロピル]-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウムクロリド；
ＤＯＴＩＭ：１-[２-(オレオイルオキシ)エチル]-２-オレイル-３-(２-ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド；
ＴＭＡＧ：Ｎ-(ａ-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-Ｄ−グルタミン酸クロリド；
ＢＣＡＴ：Ｏ-(２Ｒ-１,２-ジ-Ｏ-(１９Ｚ,９９Ｚ-オクタデカジエニル)-グリセロール)-Ｎ-(ビス-２-アミノエチル)カルバメート；
ＤＯＤＡＣ：ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド；
ＤＯＲＩＥ：１,２-ジオレイル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムプロパン；
ＤＭＲＩＥ：１,２-ジミリスチル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムプロパン；
ＤＯＳＣ：１,２-ジオレオイル-３-スクシニル-sn-グリセロールコリンエステル；
ＤＨＭＨＡＣ：Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；
ＤＨＤＥＡＢ：Ｎ,Ｎ-ジ-ｎ-ヘキサデシル-Ｎ-メチル,Ｎ-(２-ヒドロキシエチル)アンモニウムクロリド；
ＤＭＨＭＡＣ：Ｎ,Ｎ-ミリスチル-Ｎ-(１-ヒドロキシプロパ-２-イル)-Ｎ-メチルアンモニウムクロリド；
ＤＯＴＢ：１,２-ジオレオイル-３-(４'-トリメチルアンモニオ)ブタノイル-sn-グリセロール；
ＤＯＳＰＡ：２,３-ジオレイルオキシ-Ｎ-[２-(スペルミンカルボキサミド)エチル]-Ｎ,Ｎ-ジメチル-１-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；
ＤＯＧＳ*：ジオクタデシルアミド-グリシルスペルミン；
ＤＯＧＳＤＳＯ：１,２-ジオレオイル-sn-グリセロ-３-スクシニル-２-ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン；
【０１０６】
ＳＡＩＮＴ脂質：合成両親媒性物質(学際的)；
ＤＰＩＭ、ＤＯＩＭ：４,(２,３-ビス-アシルオキシ-プロピル)-１-メチル-１Ｈ-イミダゾール(未特定の膜アンカー)；
ＭｏＤＰ：１,２-ジパルミトイル-３-Ｎ-モルホリン-プロパン；
ＭｏＤＯ：１,２-ジオレオイル-３-Ｎ-モルホリン-プロパン；
ＤＰＡＰｙ：２,３-ビス-パルミトイル-プロピル-ピリジン-４-イル-アミン；
ＤＣ-Ｃｈｏｌ：３ｂ-[Ｎ-(Ｎ９,Ｎ９-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール；
ＴＣ-Ｃｈｏｌ：３ｂ-[Ｎ-(Ｎ９,Ｎ９-トリメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール；
ＤＡＣ-Ｃｈｏｌ：３ｂ-(Ｎ-(Ｎ,Ｎ'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール；
ＰｉｐＣ２Ｃｈｏｌ：４{Ｎ-２-エチルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}ピペラジン；
ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ：{Ｎ-２-エチルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}モルホリン；
ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ：{Ｎ-２-プロピルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}モルホリン；
Ｎ-メチル-ＰｉｐＣｈｏｌ：Ｎ-メチル{４-Ｎ-アミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}ピペラジン；
ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ：{Ｎ-２-エチルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}ピロリジン；
ＰｉｐｅＣ２Ｃｈｏｌ：{Ｎ-２-エチルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}ピペリジン；
ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ：{Ｎ-２-プロピルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}イミダゾール；
ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ：{Ｎ-２-エチルアミノ[(３'-β-コレステリル)カルバモイル]}ピリジン；
ＣＴＡＢ：セチルトリメチルアンモニウムブロミド；
ＮｅｏＰｈｅｃｔｉｎＴＭ：カチオン性カルジオリピン、例えば、[１,３-ビス-(１,２-ビス-テトラデシルオキシ-プロピル-３-ジメチル-エトキシアンモニウムブロミド)-プロパン-２-オール]。
【０１０７】
また、上に挙げたジアシル基を含むカチオン性脂質のあらゆるジアルキル誘導体も、本発明の範囲内である。
【０１０８】
両性脂質：
ＨｉｓｔＣｈｏｌ：Ｎα-ヒスチジニル-コレステロール-ヘミスクシネート；
ＨｉｓｔＤＧ：１,２-ジパルミトイルグリセロール-ヘミスクシネート-Ｎ-ヒスチジニル-ヘミスクシネート、およびジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体；
ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ：１,２-ジパルミトイルグリセロール-Ｏ-ヒスチジニル-Ｎα-ヘミスクシネート、およびジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体；
ＡＣ：アシルカルノシン、ステアリル-およびパルミトイルカルノシン；
ＨＣＣｈｏｌ：Ｎα-ヒスチジニル-コレステロールカルバメート。
【０１０９】
また、上に挙げたジアシル基を含む両性脂質のあらゆるジアルキル誘導体も、本発明の範囲内である。
【０１１０】
ＭｏＣｈｏｌ：４-(２-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロールヘミスクシネート：    
【化２】
2015110625.tif 000004
ＨｉｓＣｈｏｌ：ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシネート：
【化３】
2015110625.tif 000005
【０１１１】
本発明の１つの側面は、リポソーム、特に両性リポソームの製造に有用な脂質に関する。この側面の１つの態様において、該脂質は、以下の一般式で示される：
【化４】
2015110625.tif 000006
[式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して、０、１または２個のエチレン性不飽和結合を有するＣ8〜Ｃ30アルキルまたはアシル鎖であるか、あるいはＲ1またはＲ2の一方はＨであってよく、
Ｒ3は、１〜８個のＣ原子を有する、所望により-ＯＨで置換されていてもよい非分岐、分岐または環式のアルキル、アルケニル、アルキレンまたはアルキニルまたはアリール基であり、
Ｒ4は、以下の構造のいずれかから選択される：
【化５】
2015110625.tif 000007
または
【化６】
2015110625.tif 000008
(式中、ＸおよびＹ1およびＹ2は、独立して、１〜８個のＣ原子を有する、所望により-ＯＨで置換されていてもよい非分岐、分岐または環式のアルキル、アルケニル；アルキレンまたはアルキニルまたはアリール基であるか、あるいはＹ2はＨであってよい)]。
【０１１２】
この群の脂質の化学的代表例には、以下のものが含まれるが、これらに限定はされない：
１,２-ジアシル-３-エチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパン：
【化７】
2015110625.tif 000009
１,２-ジアシル-３-メチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパン：
【化８】
2015110625.tif 000010
２-[(２,３-ジアシルオキシプロピル)(メチル)アミノ]エチルアセテート：
【化９】
2015110625.tif 000011
[式中、Ｒ1およびＲ2は、独立して、０、１または２個のエチレン性不飽和結合を有するＣ8〜Ｃ30アシル鎖であるか、あるいはＲ1またはＲ2の一方はＨであってよい]。
【０１１３】
この群の脂質の具体的な脂質には、例えば、１,２-ジオレオイル-３-メチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパン(ＤＯＭＣＡＰ)または１,２-ジオレオイル-３-メチル-(メトキシカルボニル-メチル)アンモニウム-プロパン(ＤＯＭＧＭＥ)が含まれる。
【０１１４】
この側面の別の態様において、脂質は、以下の一般式のいずれかを有することができる：
【化１０】
2015110625.tif 000012
または
【化１１】
2015110625.tif 000013
[式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、０、１または２個のエチレン性不飽和結合を有するＣ８〜Ｃ３０アルキルまたはアシル鎖であるか、あるいはＲ１またはＲ２の一方はＨであってよい]。
【０１１５】
この群の脂質の具体的な脂質は、例えば、１,２-ジオレオイル-３-Ｎ-ピロリジン-プロパン(ＤＯＰ５Ｐ)または１,２-ジオレオイル-３-Ｎ-ピリジニウム-プロパン ブロミド塩(ＤＯＰ６Ｐ)である。
【０１１６】
分子体積
脂質形状理論は、所与の両親媒性物質の疎水性部分と極性頭部基の間の形状バランスに基づいており、これら２つの分子部分の絶対値に基づいていない。本発明によれば、κは、脂質の極性部分と非極性部分の間の体積比である。
【数１】
2015110625.tif 000014
【０１１７】
分子体積を算出するために様々な異なる方法が、当業者にとって利用可能であり、選択可能な方法および出典が、例えば、Connolly,M.J.の論文[Am. Chem. Soc. (1985) 107、1118-1124]およびその中の参照文献において議論されているか、または、http://www.ccl.net/cca/documents/molecular-modeling/node5.htmlに示されている。
【０１１８】
通常、分子体積は、ファンデルワールス半径(ｒivdW)と称される値を各原子種に、所与の原子対(ｉおよびｊ)に対するこれらの量の合計が、これらの最も近い可能な距離(ｄij)に等しくなるように割り当てることによって算出される：
【数２】
2015110625.tif 000015
【０１１９】
「最良」のファンデルワールス半径の多くの異なる表が存在するが、異なる著者に由来する対応する原子の値は同様である。幾何的に言うと、ファンデルワールス半径は、原子を囲む球状「シールド」としてイメージすることができ、２つの非結合原子間の最も近い距離は、各シールドが触れるときである。しかし、共有結合原子のシールドは、結合長さが原子のファンデルワールス半径の合計よりも短いので、交差している。分子のファンデルワールス表面(ファンデルワールス外皮とも称される)は、個々の原子の球からなり、その交差部分が除かれている。
【０１２０】
単一分子(即ち、共有結合に沿う任意の２つの原子の間に通路が存在する分子)については、ファンデルワールス外皮は閉じた表面であり、従って、それは体積を有する。この体積が分子体積またはファンデルワールス体積と称され、通常はÅ3で表される。コンピューターで分子体積を算出する直接的な方法は、数値積分法による。
【０１２１】
ある種の態様において、脂質分子ならびにそれぞれの頭部および尾部フラグメントの分子体積を、DS Viewer Pro 5.0 (Accelrys Inc.、San Diego、CA)を用いて算出することができ、それぞれのファンデルワールス半径内の体積を算出した。
【０１２２】
典型的な膜フラグメントは、通常のリン脂質の疎水性部分である１,２-ジアシル-エチレングリコールであり、元のグリセロールの３’炭素原子はホスホコリン頭部基に託す。
また、同じフラグメントが、通常のカチオン性脂質ＤＯＴＡＰおよびその誘導体にも見られ、他の極性頭部基を有するジアシルグリセロール(例えばジミリストイルグリセロールヘミスクシネートなど)にも見られる。
【０１２３】
コレステロール誘導体については、全ステロール(３'酸素ではない)が疎水性部分と定義され、頭部基はそれに補完的である。
【０１２４】
同様に、カチオン性またはアニオン性アルキル誘導体については、極性頭部基は、アルキル鎖のＣ１炭素を含む極性フラグメントと定義される。従って、(ｎ−１)炭素原子を含む残りの鎖が、疎水性の非極性部分を表す。
【０１２５】
分子体積は、算出に使用する定数に依存し、分子の立体配座によって影響を受ける。疎水性非極性フラグメントに対して得られる典型的な値は、以下の通りであり、これをさらなる算出のために使用した：
【表２】
2015110625.tif 000016
【０１２６】
多くの対アニオンの分子体積が同じように導かれたが、Ｎａ＋またはＫ＋については、強く結合した水和層を考慮する。以下に挙げる値を、さらなる算出のために使用した：
【表３】
2015110625.tif 000017
【０１２７】
荷電した極性頭部基は異なる代表例を有しており、この群のいくつかの個々の構成員について、分子体積を、以下に、本明細書中の表６０、表６１および表６２に示す。
【表４】
2015110625.tif 000018
【０１２８】
脂質の分子体積を決定するために、他の方法を使用することができる。また、いくつかのパラメーター(例えば、膜尾部と極性頭部の間の正確な分離点；水和ケージ中の水分子の数またはファンデルワールス半径)を、モデルの全般的適用性に影響を与えることなく変化させることもできる。同じ理解で、分子体積における比較的微妙な変化、特に、プロトンの解離または立体配座の変化に由来する微妙な変化を無視することができる。ある種の態様において、表２、３、４、６０、６１および６２に示した分子体積を、本発明において使用することができる。
【０１２９】
対イオンは、実際の極性頭部基と比べると、同じカテゴリーのサイズに分類される。即ち、脂質極性領域からの対イオンの離脱または付加は、全頭部基サイズに、従って頭部／尾部バランスκに大きな効果を有することがわかっている。１つの例として、ＣＨＥＭＳナトリウム塩は頭部基サイズ１４１Ａ３を有するが、これがｐＨ４における未解離形態で７６Ａ３に低下する。κは、それぞれ０.４２および０.２３の間で変化する。ＣＨＥＭＳはｐＨ７.５およびそれ以上においてラメラ相を形成するが、低ｐＨにおいては六角形相を採る。
【０１３０】
既知の相挙動を有する他の脂質を用いて、ラメラ相と六角形相の間の識別のためのκ値を選択することができる(１つの例を以下の表５に示す)。ＰＥ頭部基は、末端アミノ基とホスホエステル基中の酸素の間で水素結合により分子内環構造を形成することができる(ベタイン構造)[例えば、Pohleら、J. Mol. Struct. 408/409、(1997)、273-277]。ＰＣ頭部基は、立体的に遮蔽されており、代わりに、そのそれぞれの荷電した基に対イオンを採用する。
【表５】
2015110625.tif 000019
【０１３１】
両性脂質混合物における分子体積のｐＨ誘導変化
第１のモデルにおいては、荷電したアニオン性およびカチオン性脂質の間で脂質塩形成は起こらない。これは、LiおよびSchick[Biophys. J.、2001、80、1703-1711]の仮定を反映しており、脂質塩を形成するのには立体的に遮蔽されている脂質の場合であろう(独立イオンモデル)。
【０１３２】
膜における脂質種は、未解離のアニオンおよびカチオンならびに解離したアニオンおよびカチオンを含有し、この後者は、そのそれぞれの対イオンと複合している。このような混合物のκ値は、その成分の加重和であると仮定される：
【数３】
2015110625.tif 000020
[式中、アニオン0またはカチオン0は、未荷電の種を示し、アニオン-またはカチオン+は、それぞれの荷電した種を示し、ｃは濃度を示す]。
【０１３３】
このような仮定のもとで存在する個々の種の量は、酸または塩基解離の既知の平衡定数Ｋから算出することができる：
【数４】
2015110625.tif 000021
【数５】
2015110625.tif 000022
【数６】
2015110625.tif 000023
【数７】
2015110625.tif 000024
[式中、アニオン0は未解離のアニオンであり、アニオン-は負に荷電した分子であり、アニオンtotは、それぞれのアニオンの合計濃度である；カチオンは同じ体系に従い、ｃ(Ｈ＋)およびＫは、それぞれ酸または塩基のプロトン濃度および平衡定数である]。
【０１３４】
しかし、カチオン性およびアニオン性の両親媒性物質の間の可能な相互作用を考慮に入れると、混合物中に脂質塩が第５の種として生じる：
【数８】
2015110625.tif 000025
【０１３５】
脂質塩において、カチオン性両親媒性物質は、アニオン性両親媒性物質の対イオンとして働き(逆も同様)、こうして、小さい対イオン(ナトリウムまたはホスフェートなど)を頭部基から移動させる。脂質塩は正味で荷電しておらず、その幾何は、両部分(小さい対イオンを含まない)の合計であると仮定しなければならない。従って：
【数９】
2015110625.tif 000026
【０１３６】
塩形成は、最低濃度で存在する荷電した両親媒性物質によって制限される：
【数１０】
2015110625.tif 000027
【０１３７】
２つの荷電した両親媒性物質の間の塩形成は、このモデル内で完全であると仮定されるが、勿論、不完全な塩形成も仮定することができる。以下に挙げる計算は、塩が２つの脂質分子を含有することをさらに反映する。勿論、脂質塩形成時のさらなるある種の膜収縮を仮定すること、およびκ(塩)の寄与に異なる加重を置くことも可能である。
【０１３８】
モデル計算
脂質混合物の両性の性質を達成するために、脂質イオンの少なくとも１つは、ｐＨ感受性の弱い酸または塩基(「荷電可能」)であることが必要である。詳細な開示が国際公開第０２／０６６０１２号に見られ、その内容は、参照することにより本明細書に援用される。性質が異なって、３種類の基本系が可能であり、ここで分析する：
「Amphoter I」：強カチオンおよび弱アニオン；
「Amphoter II」：弱カチオンおよび弱アニオン；
「Amphoter III」：弱カチオンおよび強アニオン。
【０１３９】
ａ．Amphoter I系
Amphoter I系は、両性の性質を達成するために過剰のｐＨ感受性アニオンを必要とする。ｐＨ７から８において、アニオン性脂質は完全に荷電しており、全てのカチオン性脂質が消費されるまで塩形成が起こる。７０モル％のアニオン性脂質と３０モル％のカチオン性脂質を含む例においては、全てのカチオン性脂質および対応する３０モル％のアニオン性脂質が脂質塩として存在し、一方、４０モル％のアニオン性脂質が未結合であり、頭部基にその対イオンを採用する。
【０１４０】
中性条件から出発すると、ｐＨの低下はアニオン性脂質を放電させ、対イオンの喪失のゆえにκ値がより小さくなり、なお荷電したアニオン性脂質の部分がカチオン性脂質の量に等しくなったときに最小に到達する。従って、κは、両性脂質混合物の等電点において最小である。ｐＨがさらに低下すると、アニオン性脂質のますます少ない部分が荷電したままである。これは、脂質塩の解離および対イオンの採用を意味し、ここでは、脂質塩から遊離したカチオン性脂質を意味する。
【０１４１】
添付した図面の図１の左パネルは、混合物中のアニオン性脂質の量およびｐＨに依存するκの複雑な挙動を示す。「融合性の谷間」が現れ、５５モル％を超え８５モル％未満のアニオン性脂質を含むあらゆる両性混合物は、わずかに酸性の条件下で融合するが、より酸性の条件下および中性の両方において安定であることが予測される。
【０１４２】
５０モル％未満のアニオン性脂質を含むAmphoter I混合物は、もはや両性ではない。これは、アニオンが、カチオン性脂質上の電荷を調節することはできるが、過補償することはできないためである。このような混合物は、ｐＨ依存性の融合を経るであろうが、低ｐＨにおいて第２の安定相を提供しない。１：１複合体は、低ｐＨにおいてのみラメラ相を採り、中性において融合を経る。
【０１４３】
図１に示した計算のために使用したパラメーターを、以下の表６に示す(体積はÅ3)：    
【表６】
2015110625.tif 000028
【０１４４】
ｂ．Amphoter II系
Amphoter II系は、アニオン：カチオン比の全範囲にわたり両性であることの明らかな利点を有しており、Amphoter IまたはAmphoter III系におけるような強イオンに対する電荷過補償を必要としない。モデル系の計算を図２に示す。
【０１４５】
計算のために使用したパラメーターを、以下の表７に示す(全ての体積はÅ3)：
【表７】
2015110625.tif 000029
【０１４６】
ここでも、脂質塩モデルは、中性ないしわずかにアルカリ性のｐＨにおいて、さらにわずかに酸性のｐＨにおいて安定な状態を予測し、その間に不安定性または融合性の顕著な谷間を予測する。
【０１４７】
Amphoter I系とは対照的に、融合状態は、アニオン性およびカチオン性の成分間の広範囲の異なる脂質比を横切って到達することができる。即ち、融合性の谷間は、比較的広い範囲のアニオン／カチオン比を横切って伸び、所与の系が融合性であるｐＨにわたって比較的大きい制御の程度を可能にする。
【０１４８】
ｃ．Amphoter III混合物
安定なアニオンとｐＨ感受性カチオンを含有するAmphoter III混合物は、中性ｐＨにおいて脂質塩を形成することができない。これは、このｐＨにおいて荷電したカチオン性脂質が存在しないか、またはわずかしか存在しないためである。それは、初めにカチオンを創製するために酸性化の進行を必要とし、次いで塩形成を経ることができる。モデル系の計算を図３に示す。
【０１４９】
計算のために使用したパラメーターを、以下の表８に示す(全ての体積はÅ3)：
【表８】
2015110625.tif 000030
【０１５０】
図１および図３からわかるように、Amphoter III系は、Amphoter I系の鏡像のように挙動する。これらは、弱い脂質イオンが過剰に存在し、逆イオンの一定電荷を過補償する限り、融合性の谷間を提供する。Amphoter I系とは対照的に、融合のためのｐＨは、ｐＨ感受性脂質イオンのｐＫよりも高いところに位置する。
【０１５１】
融合の谷間の実験的証拠は、実施例１〜４に示されており、両性リポソームにおける脂質塩形成の中心仮説のための確認を提供する。
【０１５２】
本明細書中に記載するアルゴリズムは、広範囲の両性脂質混合物の融合挙動の予測を可能にする。予測のルールは、相互作用する脂質の単純な幾何的記述から誘導され、分子の実際の化学的表現からは独立している。即ち、既存および新規の脂質の組合せを、当業者は容易に試験することができ、意図した融合挙動を、合理的な方法で予測することができる。以下に挙げる鍵となるパラメーターは、そのような選択方法を示すことができるが、他の優先事項を、適用のそれぞれの目的に依存して設定することもできる。
【０１５３】
脂質塩のκ
脂質塩のκは、上記した式(7)で算出され、融合性六角形相を合理的に予測するためには適切には０.３４または０.３５より低いであろう。ある種の態様において、κは、０.３より低く、好ましくは０.２５より低くてもよい。κ(塩)は、一緒にした極性頭部基が小さく、かつ一緒にした疎水性部分が大きいときに低くなる。好ましい頭部基体積の合計は、約３００Å3またはそれより小さく、より好ましい態様において、この体積は２２０Å3より小さく、さらに好ましい値は１７０Å3より小さい。上で行った選択によれば、尾部基体積の好ましい合計は、６５０Å3より大きく、約１０００Å3程度に大きくてよく、ここで、適当な頭部および尾部基の組合せは、好ましいκ(塩)値によって支配される。
【０１５４】
変化の振幅[ｄ(κ)／ｄ(ｐＨ)]
κに対して低い値を有する脂質塩は、対イオンの採用によってその等電点の上または下で安定化することができる。本発明の好ましい態様において、比較的大きい対イオンを用いて、両性脂質混合物のカチオン性またはアニオン性状態のいずれかを安定化する。図４は、Amphoter II系について、このような対イオンサイズからの依存性を示す。図４の計算のために使用したパラメーターを、以下の表９に示す：
【表９】
2015110625.tif 000031
【０１５５】
図４の右パネルから、そのような安定化が非対称性でありうること、例えば、両性脂質混合物のカチオン性相のやや限定された安定化およびアニオン性相のより高い安定化を与えることが明らかになる。また、生理学的体液中に天然に存在しない対イオンを用いて、貯蔵中の安定性を改善することができる(このような貯蔵イオンを体液中に存在するナトリウムイオンと交換することは、生体内でのリポソームからの積荷の放出に有利であることもある)。脂質相の個々のまたは共通の安定化のための適切なイオン体積を選択することができる。このような安定化は、両性リポソームの製造および貯蔵に特に有用である。
【０１５６】
本発明のある種の態様において、比較的大きい対カチオンを用いて、中性条件において両性リポソームを安定化させる。好ましい態様において、このような対カチオンは、分子体積が５０Å３またはそれ以上であり、より好ましい態様において、この体積は７５Å３を超え、該中性ｐＨは、ｐＨ７〜８、より好ましくはおよそ生理学的ｐＨ７.４である。
【０１５７】
両性リポソームを医薬目的のために製造するときには、使用するイオンと適用経路との適合性を満たす必要がある。適する対カチオンは、イオンサイズを記載する上記の表３から選択することができる。医薬組成物に好ましい対カチオンは、ナトリウムまたはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、トリス-ヒドロキシエチルアミノメタン、トリエチルアミン、アルギニン(特にＬ−アルギニン)などのそれぞれのイオン化された形態である。
【０１５８】
本発明の１つの態様において、両性リポソームを、低ｐＨにおいてそのカチオン性状態で製造することができる。このような条件下で、リポソームは、ポリアニオン、例えば、タンパク質、ペプチドまたは核酸(大きいプラスミドまたは比較的小さいオリゴヌクレオチドを問わない)に結合することができる。このような結合は、両性リポソームへの該物質の封入効率の改善に有用である。
【０１５９】
酸性ｐＨにおいて低κを有する脂質相を使用するのが有利である。大きい対アニオンの選択は、例えば、これらの条件下でのリポソームの製造および積荷の封入に対して、脂質相の安定化を容易にする。
【０１６０】
適する大きい対アニオンは、５０Å３より大きい分子体積を有し、好ましい大きい対イオンは、７５Å３より大きい分子体積を有する。適する対アニオンは、上記の表３から選択することができる。好ましい対アニオンは、シトレート、ピロホスフェート、バルビツレート、メチルスルフェートなどである。
【０１６１】
酸性条件下で封入すべき積荷と脂質相とを接触させた後、リポソームを中和し、未封入の積荷を所望により除去することができる。通常、未封入の積荷は脂質膜から分離する(両者が中性条件下で同じ電荷を保持するため)。両性リポソームは、その等電点より上で、例えば、ｐＨ７〜８において負に荷電しており、積荷分子は、そのようなｐＨにおいてポリアニオンとして存在する。これは、特に、１核酸塩基あたりに１つの負電荷を保持する核酸の場合である。このようなリポソームは、比較的小さい対アニオンと組合せて低ｐＨに暴露したときに、効果的な不安定化を経ることができる。これは、例えば、そのようなリポソームの全身投与および細胞取込みおよびエンドサイトーシスの後の場合である。
クロリドまたはホスフェートが、動物(あらゆる動物)、哺乳動物またはヒトの体液において最も普通の対アニオンである。ホスフェート、なおさらにクロリドは、水和殻を持たないか、またはほとんど持たない小さい対イオンであり、分子体積は＜６０Å３である。
【０１６２】
図５は、リポソーム生成および使用のサイクルを示し、非対称性の対イオン使用による酸性条件下での脂質相の選択的な安定化および不安定化を示す。図５の計算に使用したパラメーターを、以下の表１０に示す(体積はÅ３)：
【表１０】
2015110625.tif 000032
【０１６３】
等電点
両性リポソームの等電点の数学的説明が、国際公開第０２／０６６０１２号に記載されている。両性リポソームの等電点を、広範囲の条件に調整することができ、異なるｐＫ解離定数を有する個々の脂質の十分な化学的代表例が存在し、これが、当業者による両性リポソームを製造するために有用な成分および組合せの選択を可能にする。さらに、所与の両性脂質組成物の等電点を、Hafezら[Biophys. J.、79、(2000)、1438−1446]が記載しているように、アニオン性およびカチオン性脂質の間のモル比によって容易に調整することができる。
【０１６４】
本発明の両性リポソームのトランスフェクション効率は、両性脂質混合物の等電点に依存することがわかった。これを図２４に示すが、驚くべきことに、コレステロールまたはコレステロールとＰＥもしくはＰＣの混合物を含有する本発明の両性リポソームは、特定範囲の等電点において細胞をより効率的にトランスフェクトすることを示す。
【０１６５】
本発明の１つの態様において、本発明の両性リポソームの等電点は、４〜７、好ましくは４.５〜６.５、最も好ましくは５〜６である。
【０１６６】
上記したアルゴリズムは、特に環境のｐＨに応答する脂質化学と得られる膜の安定性の間の構造-活性の関係を提供する。実験データは、さらにこの関係を示し、モデル予測を正当化する(例えば、実施例２、３、４ならびに対応する図７、図８および図９)。さらに、このモデルは、脂質混合物の等電点付近の融合を予測する。このような相互関係を実験において示すことができ、図１６において分析する。
【０１６７】
上に示したデータは、モデル計算からの高度の予測可能性を示す。分子体積の考慮および電気的荷電のやや長期の相互作用から出発するアルゴリズムは、成分の立体的適合または不適合を反映せず、また、相転移温度および関連の分子移動を考慮しない(これは特殊な場合に生じるであろう)。
【０１６８】
両性系のコンピューター内スクリーニング
上記したアルゴリズムによって教示される定量的な構造-活性の関係は、コンピューター内スクリーニングを容易にし、合理的な選択および最適化を助ける。このようなスクリーニングを、それ自体で、または経験的検証と組合せて、例えば、実験パラメーターの使用または一連の脂質同族体中の選択したデータポイントの包含によって、使用することができる。
【０１６９】
アルゴリズムは、多くの技術的目的のための両性リポソームの選択を可能にする。より詳細な分析を、医薬用途における該両性リポソームの使用について以下に挙げる。このような医薬用途の中で、ヒトまたは非ヒト動物(好ましくは哺乳動物)の血流中への直接投与および非経口投与が特に重要である。両性リポソームは、特に、積荷分子の細胞内供給において、特別の適用可能性を有する。上記したように、細胞内への取込み中に、リポソームは、細胞のリポソームまたはエンドソーム中の酸性環境にさらされる。脂質相の不安定化(例えば、高い融合性による)は、エンドソーム脱出および細胞内供給を容易にすることが知られている。また、他の低ｐＨ環境が該融合を開始させることもできる(例えば、腫瘍または炎症部位において見られる低ｐＨ条件)。
【０１７０】
κ(塩)の好ましい低い値を有する両性リポソームは、意図したような融合相の形成または不安定化によって酸性化に有利に応答することがわかった。
【０１７１】
酸性条件に対するκ(塩)とκ(合計)の間の相違は、重要性が低い。これは、酸性条件下で不安定な脂質相は、細胞取込みに介入しないためである。さらに、製造のために該脂質相を安定化する方法は、上に記載されている。
【０１７２】
分析は、対カチオンサイズおよび混合物中のアニオン性脂質の割合に敏感である。上記したように、比較的大きい対カチオンは、選択を厳格性の低いものにする。これは、このパラメーターがｄκ(ｐＨ８)を直接改善し、これが、低振幅を有する系がより機能的になることを意味するためである。多かれ少なかれ厳格な選択になるが、対カチオンサイズは、選択した系の観察される全体パターンを変化させない。このことは、文献において見ることができる対カチオンサイズの変動性を効果的に補償する。
【０１７３】
本発明は、中性脂質を含有する両性リポソームの別の配合物を提供することを目的とする。
中性脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質またはコレステロールなどの構造を含んでなる。これらの脂質は、ｐＨ３〜８で反応するｐＨ応答性要素を有していないので、この範囲で分子幾何の変化は起こらない。中性脂質の個々のκ値に依存して、両性脂質対の双安定性挙動の希釈が起こり、ｄ(κ)／ｄ(ｐＨ)の険しさが比較的小さくなる(図６に示すように)。さらに、相ダイアグラム中の曲線が、荷電した脂質の希釈のために使用した中性脂質に依存して、より低いかまたはより高いκ値に向かってシフトする。図６の計算に使用したパラメーターを、以下の表１１に示す(体積はÅ３)：
【表１１】
2015110625.tif 000033
【０１７４】
図６は、上記したAmphoter IIモデル系と組合せた、κ値がそれぞれ０.５、０.３または０.１９である異なる中性脂質の添加に対する挙動を示す。この系の振幅は、Δκ＝０.０８９から０.０４４に低下するが、最小値は、個々の中性成分のκに従う。
【０１７５】
中性脂質の添加は、融合挙動のゾーンを広げることができ、この目的のために、低いκ値を有する中性脂質を使用することができる。このような好ましい脂質は、κ値が０.３またはそれ未満であり、より好ましい脂質は、κ値が約０.２である。このような脂質の代表例は、ホスファチジルエタノールアミンである。ホスファチジルエタノールアミンは、末端アミノ基とホスフェートの間で内部塩架橋(ベタイン構造)を形成するものと考えられ、従って、対イオンは頭部基に採用されない。
【０１７６】
Ｃ14〜Ｃ18アルキル鎖を有するホスファチジルエタノールアミンは、両性リポソームの融合性を調節するための好ましい脂質である。
コレステロールが、低κを有する脂質の別の例であり、従って、両性脂質系の融合挙動を広げるであろう。
勿論、異なる中性脂質の混合物を用いて、そのような系の融合性と安定性の間のバランスを最適化することもできる。
【０１７７】
上記したアルゴリズムは、両性脂質系に対する中性脂質混合物の効果について定量的予測を行うことを容易にする。このような混合物は、リポソームの改善された安定性を与えることになり、さらに、血清タンパク質に対するさらに良好な耐性あるいは細胞への増強された取込みを与えることになるであろう。両性系の最適化は、多数の有用成分のゆえに、それ自体が骨の折れる作業である。この作業は、さらなる成分の追加によりさらに複雑になり、合理的なアプローチが至急に必要とされている。
【０１７８】
コンピューター内スクリーニングのために、脂質頭部基サイズが４０〜１９０Å３および脂質疎水性尾部サイズが３４０、４１０または５００Å３である両性脂質系を、対カチオン、具体的にはナトリウム(６５Å３)の存在下に分析した。対アニオンは、提供したスクリーニングにとって関連性が低い。これは次の理由による：即ち、イオンが、(i)脂質塩に関与しない、および(ｉｉ)ｐＨ８において本質的に膜に結合しない。
【０１７９】
このコンピューター内分析の目的のために、パラメーターκ(塩)をその機能的等価物κ(塩)nに置換する。同様に、パラメーターｄκ(ｐＨ８)を、ｄκ(ｐＨ８)ｎに置換して、中性脂質を含有する系の分析のための使用を示す。
【０１８０】
貯蔵条件下で、または血流中でしばらく安定であるためには、中性ｐＨにおけるκ(合計)とκ(塩)nの間にある程度の相違が必要である。好ましい態様において、このような相違[本明細書においてｄκ(ｐＨ８)ｎと称する]は、０.０８に等しいかまたはそれより大きくてよい。上記したように、κ(塩) ｎは、融合性の有力な予測であり、一方、ｄκ(ｐＨ８)n≧０.０８が必要であるが、十分な条件ではない。選択した系の採点は、基準として１／κ(塩)nを用いて行った。高い値は、良好な融合および十分な安定性振幅を有する系を示す。
【０１８１】
以下に挙げるAmphoter ＩおよびAmphoter ＩＩおよびＩＩＩ系のコンピューター内スクリーニングは、低κを有する中性脂質をさらに含有する融合性両性リポソームのより一般的かつ実験的に無作為の選択を提供する。この計算は、当業者が、好ましい頭部および尾部サイズを有する両親媒性物質を推測し、次いで、改良された両性脂質混合物を確認することを可能にする。
【０１８２】
中性脂質をさらに含有するAmphoter I系
Amphoter Ｉ系について、アニオン性両親媒性物質の完全解離をｐＨ８において仮定した。Ｃ／Ａ＝０.３３３を有する３２４のAmphoter Ｉ脂質系のライブラリーを構築し、κ(塩)n＜０.３４およびｄκ(ｐＨ８)ｎ≧０.０８を有する好ましい脂質系を、全集団から選択した。選択した系の適合度を、ライブラリーへの３０％コレステロールの添加について、以下の表１２に１／κ(塩)ｎとして示す。
【０１８３】
【表１２】
2015110625.tif 000034
表１２：３０％コレステロールを含有する高機能性Amphoter I系；Ｃ／Ａ＝０.３３３、κ(塩)n＜０.３４およびｄκ(ｐＨ８)n＞０.０８、値は１／κ(塩)nを表す。
【０１８４】
最良の適合を有する系は、脂質アニオンおよび脂質カチオンに対して小さい頭部基を有する。大きい脂質アニオン尾部はｄκ(ｐＨ８)nによって制限され、一方、カチオン尾部サイズは影響が少ない。
強ラメラ脂質(例えば、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣ)の添加は、上に示した選択ルールに質的に影響することなく、より厳格な選択になる。
【０１８５】
ｂ．中性脂質をさらに含有するAmphoter II系
Amphoter II系について、アニオン性両親媒性物質の完全解離をｐＨ８において仮定し、本質的にカチオン性両親媒性物質の解離をこのｐＨにおいて仮定しなかった。また、このような選択をAmphoter III系にも適用する(それが、５０％またはそれ未満のアニオン性両親媒性物質を含有する限りにおいて)。
【０１８６】
カチオンに富むAmphoter IIまたはAmphoter III系のライブラリー(Ｃ／Ａ＝３)を、上記したように構築し、κ(塩)n＜０.３４およびｄκ(ｐＨ８)n＞０.０８を基準として用いて高機能性の系を選択した。選択した系の適合度を、ライブラリーへの３０％コレステロールの添加について、以下の表１３に１／κ(塩)nとして示す。
【０１８７】
【表１３】
2015110625.tif 000035
表１３：３０％コレステロールを含有する高機能性Amphoter II系；Ｃ／Ａ＝３、κ(塩)n＜０.３４およびｄκ(ｐＨ８)n＞０.０８、値は１／κ(塩)nを表す。
【０１８８】
コレステロールの添加は、大きい頭部基を有するカチオン性脂質に向かって大きく偏った選択になり、この特徴は、κ(塩)nに対して敏感であり、比較的小さい値のκ(塩)nが、この最適を比較的小さい頭部基の方へシフトさせる。好ましい脂質アニオンは小さい頭部基を有する。
ここでも、ラメラ脂質(例えば、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣ)の添加は、上に示した選択ルールに質的に影響することなく、厳格な選択になる。
【０１８９】
また、平衡化したAmphoter II系のライブラリー(Ｃ／Ａ＝１)を構築し、このライブラリーにおいて３０％コレステロールの存在下に選択スキームに導入した(表１４)。
【０１９０】
【表１４】
2015110625.tif 000036
表１４：３０％コレステロールを含有する高機能性Amphoter II系；Ｃ／Ａ＝１、κ(塩)n＜０.３４およびｄκ(ｐＨ８)n＞０.０８、値は１／κ(塩)nを表す。
【０１９１】
中性脂質を含まない混合物からの対応するAmphoter IIライブラリー(Ｃ／Ａ＝１)は、多数の陽性の系を有するが、３０％コレステロールの添加は、非常に厳格な選択になった。これは、融合を促進する脂質の添加に対する直観に反し、選択基準としてのｄκ(ｐＨ８)nの影響を示す。敏感性分析は、非常に厳格な変数としてｄκ(ｐＨ８)nを明らかにし、この値の低下は、選択圧を急速に排除する。
この群において、ラメラ脂質(例えば、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣ)の添加は、コレステロールの添加と同様の影響を有していた。
【０１９２】
また、アニオンに富むAmphoter II系のライブラリー(Ｃ／Ａ＝０.３３)を構築し、このライブラリーにおいて３０％コレステロールの存在下に選択スキームに導入した(表１５)。
【０１９３】
【表１５】
2015110625.tif 000037
表１５：３０％コレステロールを含有する高機能性Amphoter II系；Ｃ／Ａ＝０.３３３、κ(塩)n＜０.３４およびｄκ(ｐＨ８)n＞０.０８、値は１／κ(塩)nを表す。
【０１９４】
ここで、比較的大きいアニオン頭部基に向かって陽性候補のある種の偏りを観察することができる。しかし、これは、小さいアニオン性頭部基の存在下に融合活性が常に改善しているので、注意深く解釈する必要がある。
ラメラ脂質(例えば、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣ)の添加は、より厳格な選択基準を示唆するが、陽性候補のパターンを質的に変化させない。
【０１９５】
中性もしくは双性イオン性脂質を含有する両性リポソームの選択
荷電した両親媒性物質を含有する異なる両性リポソーム混合物の融合性を、脂質融合アッセイ、粒子成長または当分野で既知の他の方法を用いて調べることができ、これによって、好ましい混合物の確認が可能になる。脂質の混合を、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)を用いて試験することができ、実験詳細を実施例５に記載する(該実施例において、両性脂質混合物の融合をｐＨ２.５〜７.５の範囲内でモニターする)。
【０１９６】
両性リポソーム配合物の好ましい混合物の確認のためのさらなる実験アプローチには、実施例８、９および１０に記載するように、供給ビヒクルとして異なる両性リポソーム配合物を用いる細胞のトランスフェクションが含まれる。試験管内および生体内での細胞または組織への活性物質(例えば核酸活性物質)の供給はなお課題であり、当分野において、トランスフェクションが効率的であり、医薬用途に安全であり、かつ製造が容易である改善された供給ビヒクルが必要とされている。
【０１９７】
また、上記したアルゴリズムは、中性脂質をさらに含有する両性脂質混合物にも当てはまり、このような混合物の量的影響が、実施例６および対応する図１０〜１３に示されている。簡潔に言うと、中性脂質の含有は、κ(中性)が荷電した脂質のみの混合物のκ(min)よりも高いときには常に、所与の両性系の融合強度を低下させることができる。図１０ａ、ｂおよび図１３ａ、ｂは、このことを実験的に示す。また、図１２ａ、ｂに示すように、逆の場合も見られる。最終的に、図１１ａ、ｂに示すように、ある種の系は、中性脂質の導入による影響が少ない。より多くの成分を用いる系の実験的最適化は、ますます困難かつ面倒になるので、様々な構成成分の影響の分析および数値予測が、ますます重要になり、迅速かつ効率的な予測を可能にする。
【０１９８】
実際的に言うと、両性リポソーム膜における中性脂質の存在は、リポソームの融合性に効果を有しており、リポソームの融合または機能(例えば、細胞および組織への活性物質の供給)を改善するか、または損なうことができる。このような効果の性質が、両性系のκ(塩)とκ(中性)の間の関係、中性脂質または中性脂質混合物の膜定数によって大きく影響されることがアルゴリズムから明らかである。例えば、κ(塩)がκ(中性)よりも高いときには、そのような中性脂質の添加は、融合を刺激するか、または融合ゾーンの幅を広げることができる。勿論、このためにκ(合計)はある種の最小値に到達しなければならない。ある種の態様において、このような最小値は、０.３４または０.３５より小さく、より好ましくは０.３より小さく、さらに好ましくは０.２５より小さい。
【０１９９】
実験的証拠が実施例６および図１４に示されている。そこでは、異なる量の異なる中性脂質が、Amphoter II系(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)の膜に混合されている。さらに、他の両性系の融合性に対する中性脂質の影響を、実施例６において試験し、結果を表７３および表７４にまとめた。
【０２００】
中性脂質としてのコレステロールは、両性脂質系の融合性に効果を持たないか、または融合性の改善を導くことができる。同様の挙動が、脂質ＤＯＰＥに対して観察された。コレステロールおよびホスファチジルエタノールアミンは、κ値が０.３より低く、六角形相を採る中性もしくは双性イオン性脂質であり、コレステロールのκ値は、ホスファチジルエタノールアミンのκ値よりも低い。
【０２０１】
融合性と安定性の間のバランスを最適化するために、両性リポソームにおいて中性成分として中性もしくは双性イオン性脂質の混合物を使用するのが有利であることもある。
【０２０２】
また、中性脂質は、荷電した両親媒性物質のみの混合物と比較して、融合性をさらなるＣ／Ａ比に広げうることがわかった。例えば、４０モル％コレステロールの添加は、融合が起こるためのＤＯＴＡＰ／ＣｈｅｍｓのＣ／Ａ比を、Ｃ／Ａ≧０〜０.４からＣ／Ａ≧０〜０.６７に広げる。さらなるデータを、実施例６の表７３および表７４中に見ることができる。
【０２０３】
また、中性脂質は、両性リポソームの他の性質、例えば、コロイド安定性または体液中の安定性にも影響を与えることができる。例えば、医薬用途における両性リポソームの使用は、貯蔵中および血流移動中のリポソームの安定性を必要とする。
【０２０４】
実施例７は、中性脂質が両性リポソームを安定化しうることを示す。例えば、両性脂質混合物ＤＯＴＡＰ／オレイン酸は、生理学的ｐＨおよび高Ｃ／Ａ比においてコロイド状であり、不安定であり、凝集体を形成する。ある量の例えばコレステロールを中性脂質として添加すると、これらの混合物を生理学的ｐＨにおいて安定化することができる。
【０２０５】
本発明の１つの態様は、中性脂質として、コレステロールまたはコレステロールと１つまたはそれ以上の中性もしくは双性イオン性脂質との混合物を含有する両性リポソームに関する。
【０２０６】
この側面の１つの態様において、コレステロールと１つまたはそれ以上の中性もしくは双性イオン性脂質との混合物のκ(中性)は、０.３またはそれ未満、好ましくは０.２５未満、より好ましくは０.２未満、最も好ましくは０.１５未満である。
【０２０７】
この側面のある種の態様において、両性リポソームは、５０モル％またはそれ以上のモル量でコレステロールとホスファチジルコリンの混合物を含有するもの以外である。
【０２０８】
κ(中性)は、以下の式によって算出することができる：
【数１１】
2015110625.tif 000038
[式中、κ(脂質)は、適当な中性もしくは双性イオン性脂質のκ値であり、ｃ(脂質)は、中性脂質混合物中の該脂質の濃度であり、ｉは実行中の変数である]。
【０２０９】
例えば、コレステロールと双性イオン性脂質の異なる混合物のκ(中性)値を、表１６〜１８に示す。
【０２１０】
【表１６】
2015110625.tif 000039
【０２１１】
【表１７】
2015110625.tif 000040
【０２１２】
【表１８】
2015110625.tif 000041
【０２１３】
コレステロールと１つまたはそれ以上の中性もしくは双性イオン性脂質との混合物は、以下からなる群から選択することができるが、これらに限定はされない：
ａ．コレステロール／ホスファチジルコリン、
ｂ．コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン、
ｃ．コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルコリン、
ｄ．コレステリン／スフィンゴミエリン、
ｅ．コレステロール／ホスファチジルエタノールアミン／スフィンゴミエリン。
【０２１４】
本発明の好ましい態様において、コレステロールまたはコレステロールとホスファチジルエタノールアミンの混合物が、唯一の中性脂質として両性リポソーム中に存在し、これは、κ(中性)＞０.２５である中性脂質(ホスファチジルコリンなど)が本質的に存在しないことを意味する。好ましくは８０モル％以下、より好ましくは６５モル％以下、最も好ましくは５０モル％以下のこれら脂質を、両性リポソーム中の唯一の中性脂質として使用する。
【０２１５】
コレステロールまたはコレステロールとホスファチジルエタノールアミンの混合物は、実施例８および９に示すように、両性脂質混合物のトランスフェクション効率を改善しうることがわかった。
【０２１６】
本発明の１つの態様において、コレステロールとホスファチジルエタノールアミンの混合物のモル比は、４またはそれ未満、好ましくは４〜０.２５、より好ましくは３〜０.５、最も好ましくは２〜１である。
【０２１７】
ホスファチジルエタノールアミンの膜尾部は、限定されることなく、Ｃ14〜Ｃ20の直鎖飽和または不飽和のアシルまたはアルキル(これらは、フィタン酸におけるようにメチル側鎖をさらに含有することができる)の群から選択することができ、これにより、脂質、例えば、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＰｈｙＰＥ、ＤＬｉｎＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥまたはこれらの天然等価物を形成する。また、異なるホスファチジルエタノールアミンの混合物も本発明の範囲内である。本発明の好ましい態様において、ホスファチジルエタノールアミンはＤＯＰＥである。
【０２１８】
本発明のさらなる態様において、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンの混合物が、中性脂質として両性リポソーム中に存在することができる。好ましくは、上記の表１８に示すように、該混合物は、４０モル％以下のホスファチジルコリン、κ(中性)＞０.２５である双性イオン性脂質成分を含有する。
【０２１９】
本発明のなおさらなる態様において、中性脂質、例えばホスファチジルコリン(ＰＣ)、スフィンゴミエリンまたはセラミドおよびコレステロール(Ｃｈｏｌ)の混合物を、中性脂質成分として両性リポソームにおいて使用することができる。
【０２２０】
好ましいのは、ホスファチジルコリンとコレステロールの混合物である。ＰＣ／Ｃｈｏｌのモル比は、４〜０.２５または３〜０.３３であってよい。好ましいのは、ＰＣ／Ｃｈｏｌのモル比が１.５〜０.２５、より好ましくは１〜０.２５である。これらの中性脂質混合物を、塩形成性の荷電した脂質に、８０モル％またはそれ未満、あるいは６５モル％またはそれ未満、好ましくは５０モル％またはそれ未満の量で添加することができる。
【０２２１】
ある種の態様において、５０モル％未満、好ましくは４０モル％未満のモル量でのＰＣ／Ｃｈｏｌの添加が好ましいこともある。
【０２２２】
対照的に、Endertらの国際公開第０５／０９４７８３号に開示されている両性リポソーム配合物は、コレステロールとＰＣの混合物を、５０モル％を超える合計量あるいは２またはそれ以上のＰＣ／Ｃｈｏｌのモル比およびκ(中性)＞０.３で含有する。
【０２２３】
図２２および２３は、漸増する量のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ(モル比 ０.５)の混合物が、両性リポソーム配合物のトランスフェクション効率を低下させることを示す。同様に、図１５に示すように、漸増するモル比のＰＣ／Ｃｈｏｌは、両性リポソーム配合物の融合性を低下させる。
【０２２４】
ホスファチジルコリンは、限定されることなく、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣまたはこれらの天然等価物(例えば、大豆ＰＣまたは卵ＰＣ)の群から選択することができる。また、異なるホスファチジルコリンの混合物も本発明の範囲内である。本発明の好ましい態様において、ホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣから選択する。
【０２２５】
κ(中性)＜０.２５である中性脂質の他の化学的代表例を見つけることもできる。グリセロール骨格に未置換のヒドロキシルを保持するジアシルグリセロールを、中性脂質として使用するために考慮することができる。しかし、これら化合物の一部は、タンパク質キナーゼＣ経路への第２のメッセンジャーおよびシグナルとして機能し[Albertsら；Molecular Biology of the Cell、第3版、1994、第747頁以降、Garland Publishing、ロンドン]、これがその使用を制限する。
【０２２６】
長鎖アルコールについては、そのような制限は当てはまらず、例えば、１４〜３０個のＣ原子を有する直鎖の飽和または不飽和アルコールを、本発明の実施に使用することができる。他の中性脂質には、トコフェロール、他のステロール、中性もしくは双性イオン性リゾ脂質、モノアシルもしくはモノアルキルグリセロールまたはジアルキルグリセロールが含まれる
【０２２７】
本発明の中性脂質を含有する両性リポソームは、１つまたはそれ以上または複数の荷電した両親媒性物質(これらは、互いと組合せて両性の性質を有し、ｐＨ７.４において負に荷電または中性であり、ｐＨ４またはそれ未満において正に荷電している)を含有することができる。
【０２２８】
本発明の１つの態様において、両性リポソームは、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣ-Ｃｈｏｌの群から選択することができるが、これらに限定はされない両性脂質を含有する。
【０２２９】
本発明の別の態様において、両性リポソームは、荷電した脂質の混合物を含有し、該荷電した脂質の少なくとも１つはｐＨ応答性である。
【０２３０】
この荷電した脂質成分の混合物は、
(ｉ)安定なカチオン性脂質およびｐＨ応答性の荷電可能なアニオン性脂質(Amphoter I混合物と称する)、
(ii)荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質(Amphoter II混合物と称する)、または
(iii)安定なアニオン性脂質および荷電可能なカチオン性脂質(Amphoter III混合物と称する)、
を含有することができる。
【０２３１】
本発明の両性リポソームは、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含有することができ、該カチオン性脂質は、以下からなる群から選択することができるが、これらに限定はされない：ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＰＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＰＯＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＰＤＡＰ、ＤＳＤＡＰ、ＤＯＤＭＨＥＡＰまたはＤＯＲＩ、ＰＯＤＭＨＥＡＰまたはＰＯＲＩ、ＤＭＤＭＨＥＡＰまたはＤＭＲＩ、ＤＰＤＭＨＥＡＰまたはＤＰＲＩ、ＤＳＤＭＨＥＡＰまたはＤＳＲＩ、ＤＯＭＤＨＥＡＰ、ＰＯＭＤＨＥＡＰ、ＤＭＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＭＤＨＥＡＰ、ＤＳＭＤＨＥＡＰ、ＤＯＭＨＥＡＰ、ＰＯＭＨＥＡＰ、ＤＭＭＨＥＡＰ、ＤＰＭＨＥＡＰ、ＤＳＭＨＥＡＰ、ＤＯＤＨＥＡＰ、ＰＯＤＨＥＡＰ、ＤＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＤＨＥＡＰ、ＤＳＤＨＥＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＰＯＥＰＣ、ＤＯＲＩＥ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＭＣＡＰ、ＤＯＭＧＭＥ、ＤＯＰ５Ｐ、ＤＯＰ６Ｐ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＴＣ-Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ-Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-ベタイン、Ｎ-メチル-ＰｉｐＣｈｏｌ、ＣＴＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ４-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-ＤＭＣ３Ｎ-Ｍｏ２、ＣｈｏｌＣ４Ｈｅｘ-Ｍｏ２、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＰｉｐＣ２-Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＤＯ、ＭｏＤＰ、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭ。
【０２３２】
ある種の態様において、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＨＥＡＰまたはＤＯＲＩ、ＤＤＡＢ、ＤＯＥＰＣ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ４Ｎ-Ｍｏ２、ＭｏＤＯ、ＤＯＭＣＡＰ、ＤＯＰ５Ｐ、ＤＯＰ６Ｐ、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭからなる群から選択することができる。
【０２３３】
本発明の両性リポソームは、１つまたはそれ以上のアニオン性脂質を含有することができ、該アニオン性脂質は、以下からなる群から選択することができるが、これらに限定はされない：ジアシルグリセロールヘミスクシネート、例えば、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、ＰＯＧＳ、ＤＰＧＳ、ＤＳＧＳ；ジアシルグリセロールヘミマロネート、例えば、ＤＯＧＭまたはＤＭＧＭ；ジアシルグリセロールヘミグルタレート、例えば、ＤＯＧＧ、ＤＭＧＧ；ジアシルグリセロールヘミアジペート、例えば、ＤＯＧＡ、ＤＭＧＡ；ジアシルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸、例えば、ＤＯ-ｃＨＡ、ＤＭ-ｃＨＡ；(２,３-ジアシル-プロピル)アミノ}-オキソアルカン酸、例えば、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ；ジアシル-アルカン酸、例えば、ＤＯＰ、ＤＯＢ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、ＤＭＰ、ＤＯＢ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ；Ｃｈｅｍｓおよびその誘導体、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ５、Ｃｈｏｌ-Ｃ６、Ｃｈｏｌ-Ｃ７またはＣｈｏｌ-Ｃ８；Ｃｈｏｌ-Ｃ１、ＣｈｏｌＣ３Ｎまたはコレステロールヘミジカルボン酸およびコレステリルオキシカルボニルアミノカルボン酸、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ１２またはＣｈｏｌＣ１３Ｎ、脂肪酸、例えば、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ネルボン酸、ベヘン酸；ＤＯＰＡ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＰＯＰＡ、ＤＳＰＡ、Ｃｈｏｌ-ＳＯ４、ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＳＰＧまたはＤＯＰＳ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＳＰＳまたはセチル-ホスフェート。
【０２３４】
ある種の態様において、１つまたはそれ以上のアニオン性脂質は、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、Ｃｈｅｍｓ、Ｃｈｏｌ-Ｃ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ５、Ｃｈｏｌ-Ｃ６、Ｃｈｏｌ-Ｃ７、Ｃｈｏｌ-Ｃ８、Ｃｈｏｌ-Ｃ１、ＣｈｏｌＣ３Ｎ、Ｃｈｏｌ-Ｃ１２、ＣｈｏｌＣ１３Ｎまたは他のコレステロールヘミジカルボン酸またはコレステリルオキシカルボニルアミノカルボン酸からなる群から選択することができる。
【０２３５】
さらに、または別法として、本発明の両性リポソームは、表６０および表６１に挙げた化合物番号１〜９７を有する１つまたはそれ以上の化合物を含有することもできる。
【０２３６】
上記したように、中性脂質を含有する両性脂質混合物のκ(合計)は、リポソームの融合を可能にするために、ある種の最小値 κ(min)に到達しなければならない。
【０２３７】
本発明の１つの態様において、両性リポソーム配合物はAmphoter I混合物であり、中性脂質は、コレステロールまたはコレステロールと中性もしくは双性イオン性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン)の混合物であり、これら混合物のκ(min)は０.０７〜０.２２、好ましくは０.０９〜０.１５である。この発見は驚くべきことであり、これは、本発明のAmphoter Iリポソーム配合物のトランスフェクション効率が、特定範囲のκ(min)値において最適を示すことを意味する。
【０２３８】
図１７は、異なるAmphoter I系のトランスフェクション効率のそのような関係を示す[ＩＣ50-対-κ(min)として表す]。
【０２３９】
本発明のさらなる態様において、中性脂質成分としてコレステロールまたはコレステロールと中性もしくは双性イオン性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン)の混合物を含有するAmphoter Iリポソーム配合物を、以下に挙げる混合物から選択することができる：
【０２４０】
【表１９−１】
2015110625.tif 000042
【０２４１】
【表１９−２】
2015110625.tif 000043
【０２４２】
【表１９−３】
2015110625.tif 000044
【０２４３】
【表１９−４】
2015110625.tif 000045
【０２４４】
【表１９−５】
2015110625.tif 000046
【０２４５】
【表１９−６】
2015110625.tif 000047
【０２４６】
本発明の別の態様において、両性リポソーム配合物は、Amphoter II混合物であり、中性脂質が、コレステロールまたはコレステロールと中性もしくは双性イオン性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン)の混合物であり、これら混合物のκ(min)が０.２３未満、好ましくは０.１８未満である。図１８は、異なるAmphoter II系のトランスフェクション効率の相関を示す[ＩＣ50-対-κ(min)として表す]。
【０２４７】
本発明のさらなる態様において、中性脂質成分としてコレステロールまたはコレステロールと中性もしくは双性イオン性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン)の混合物を含有するAmphoter IIリポソーム配合物を、以下に挙げる混合物から選択することができる：
【０２４８】
【表２０−１】
2015110625.tif 000048
【０２４９】
【表２０−２】
2015110625.tif 000049
【０２５０】
【表２０−３】
2015110625.tif 000050
【０２５１】
【表２０−４】
2015110625.tif 000051
【０２５２】
本発明の両性リポソームは、当業者に知られる適する方法を用いて製造することができる。このような方法には、規定の孔サイズを有する膜からの押出、封入すべき積荷を含有する水相へのアルコール性脂質溶液の射出、または高圧ホモジナイゼーションが含まれるが、これらに限定はされない。
【０２５３】
薬物(例えばオリゴヌクレオチド)の溶液を、中性ｐＨにおいて脂質相と接触させ、これにより、一定割合(％)の溶液を体積含有させることができる。約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲の高濃度の脂質が、活性物質の実質的な封入を達成するために好ましい。
【０２５４】
両性リポソームは、その等電点またはそれ以下において核酸を結合する明らかな利点を提供し、これにより、これらの活性物質をリポソーム膜に集中させる。この方法(改良装填法と称される)は、国際公開第０２／０６６０１２号により詳しく記載されており、その内容は、参照することにより本明細書に援用される。
【０２５５】
本発明の１つの態様において、両性リポソームを、脂質フィルム押出法と組合せて該改良装填法を用いることによって製造することができる。
本発明の別の態様において、両性リポソームを、例えば核酸を含有する水相へのアルコール性脂質溶液の射出と組合せて該改良装填法を用いることによって製造することができる。この方法は、国際公開第０７／１０７３０４号(Panznerら)により詳しく記載されており、その内容は、参照することにより本明細書に援用される。
【０２５６】
本発明の両性リポソームの製造に使用した実際の製造方法とは関係なく、ある種の態様において、未封入の薬物を、リポソームの最初の製造後にリポソームから除去することができる。ここでも、本明細書中に含まれる技術文献および参照文献が、そのような方法を詳しく記載しており、適する工程には、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限外濾過および透析濾過が含まれるが、これらに限定はされない。
【０２５７】
しかし、あらゆる未封入薬物の除去は、本発明の効果にとって必要ではなく、ある種の態様においては、リポソーム配合物は、遊離ならびに捕捉薬物を含有していてよい。
【０２５８】
本発明の１つの側面において、リポソームのサイズは、５０〜１０００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは７０〜２５０ｎｍの間で変化することができる。
他の側面において、リポソームのサイズは７０〜１５０ｎｍの間で変化することができ、さらに他の側面において、リポソームのサイズは１３０〜２５０ｎｍの間で変化することができる。
【０２５９】
中性ｐＨにおいて安定な膜相の形成を達成するためにはｄκ(ｐＨ)８のある種の最小値が必要であることを、本発明において記載した。実施例８で得られた実験データの分析により、ｄκ(ｐＨ８)が０.０８より高いときに、非常に小さい粒子のより高い頻度が得られることが明らかになった(これは安定なリポソームの形成を示す)。この実験の多くの例において、驚くほど小さいｄκ(ｐＨ８)である０.０４が、小さい粒子の形成になお十分であった。しかし、小さい粒子の形成の頻度は、より低い値のｄκ(ｐＨ８)については低い。これは、これらの粒子が融合ゾーンを脱出しなかったためである。この分析を図１９に示す。
【０２６０】
本明細書中に挙げた実験データは、Amphoter I系に対してκ(min)＝０.０９〜０.１５およびAmphoter II系に対してκ(min)＜０.２をｄκ(ｐＨ８)＞０.０４と組合せて用いて、両性脂質のライブラリーをコンピューター内でスクリーニングすることによって、成功裏の担体のより一般的な記載を可能にする。容易に入手できるパラメーターκ(塩)またはκ(塩)nを、上で行ったスクリーニングに使用したが、κ(min)の関数を以下のように書くことができる。Amphoter I系については、次の通りである：
【数１２】
2015110625.tif 000052
【数１３】
2015110625.tif 000053
【数１４】
2015110625.tif 000054
【０２６１】
Amphoter II系については、それぞれの式は次の通りである：
【数１５】
2015110625.tif 000055
【数１６】
2015110625.tif 000056
(アニオン過剰の系について)、しかし
【数１７】
2015110625.tif 000057
(カチオン過剰の系について)、そして
【数１８】
2015110625.tif 000058
【０２６２】
Amphoter III系については、以下の式が当てはまる：
【数１９】
2015110625.tif 000059
【数２０】
2015110625.tif 000060
【数２１】
2015110625.tif 000061
【０２６３】
これらの式において、ＶAH、ＶCH、ＶATおよびＶCTは、それぞれアニオン性およびカチオン性の頭部および尾部基の体積であり、ｘanおよびｘcatは、アニオン性およびカチオン性成分の分画である。Ｖccは対イオンの体積である。
【０２６４】
中性ｐＨのAmphoter I系においては、全てのカチオン性脂質および同じ量のアニオン性脂質が脂質塩を形成し、残りのアニオン性脂質は、(1a)におけるように荷電している。ｐＨの低下は、荷電した脂質アニオンの利用可能性が脂質塩形成を制限するまで、脂質アニオンのプロトン化およびその対イオンの喪失の結果を与えることになる。そのとき、全ての脂質アニオンは、脂質塩におけるその結合またはプロトン化の進行のいずれかにより、本質的に対イオンを欠いており、これが(2a)に反映される。同じ制約がアニオンに富むAmphoter II系に当てはまり、κ(min)は、脂質アニオンのｐＫからそう離れていないｐＨにおいて脂質塩ゾーンの左側に見られ、従って、式(5a)は、(2a)と同一である。
【０２６５】
カチオンに富むAmphoter IIまたは真のAmphoter III系は、これらの特徴を逆にし、κ(min)は、脂質塩ゾーンの上端に見られる。これは、限定量のアニオン性脂質が、カチオン性脂質のイオン化した部分と脂質塩を形成し、残りのカチオン性脂質が、式(6a)および(9a)におけるように未荷電である場合である。ｐＨの低下は、膜への対アニオンの採用およびカチオン性脂質のさらなるイオン化により、κを高くするであろう。いくらかより高いｐＨにおいて、イオン化脂質カチオンは、脂質塩を維持するのに十分ではなく、そのとき遊離した脂質アニオンは、その対イオンを二重層に採用するであろう。
【０２６６】
ｐＨ８において、荷電した脂質アニオンおよび未荷電の脂質カチオンの両方が共存し、ここでも、カチオンに富むAmphoter II系とAmphoter IIIの間に差はない。
【０２６７】
アニオン性およびカチオン性脂質の均等な分布を有するAmphoter II系は、ｐＨ８において、他のAmphoter II系のように挙動する。κ(min)に関する限り、完全塩形成が可能であり、どちらの化合物によっても限定されない。従って、それは次の通りである：
【数２２】
2015110625.tif 000062
【０２６８】
個々のｐＫ値は、融合ゾーンの実際の場所を決定するが、κ(min)およびκ(ｐＨ８)に関する限り重要ではなく、脂質アニオンのｐＫは、脂質カチオンのｐＫよりも２単位またはそれ以上低く、ほぼ完全な脂質塩形成を容易にする。それぞれのｐＫ値の間の比較的小さい相違は、不完全な脂質塩形成の結果になり、そのとき膜のκ(合計)は、非パートナー脂質種の比較的大きい部分を含み、こうしてκ(min)を高め、系振幅ｄκ(ｐＨ８)を低下させる。この効果は、Amphoter II系に対して限定され、両脂質がほぼ等モル量で存在する状況において最も顕著である。具体的な計算は、以下のAmphoter IIセクションのもとで行う。
【０２６９】
残る唯一の非脂質変数は、対カチオンの体積であり、これを、ほとんどの目的のためにナトリウム(６５Å３)に設定する。スクリーニングライブラリーにおける中性脂質の添加は、両性および中性脂質部分の線形混合を用いて行った。
【０２７０】
ライブラリー
上記からのパラメーターおよび計算を用いて、配合物空間の包括的分析のためのツールとして、組合せライブラリーを創製した。このために、４種類の最も典型的な脂質尾部体積(Ｃ24アルキル＝２８０Å３、コレステロール＝３４０Å３、ジミリストイルグリセロール＝４１０Å３およびジオレオイルグリセロール＝５００Å３)を、体積が４０Å３〜２００Å３である８種類の異なる頭部基と体系的に組合せた。得られた３２種類の脂質に、全１０２４種類の可能な組合せを採らせて、荷電した脂質対を形成し、さらなる複雑性の層を加えた(アニオン性およびカチオン性脂質の間のモル比を柔軟に保ち、そのときに得られた荷電した両親媒性物質の組を、所望によりκ(中性)＜０.２５である可変量の中性脂質とブレンドした)。４種類のこのようなライブラリーを構築して、Amphoter I、アニオンに富むAmphoter II、平衡化したAmphoter IIおよびカチオンに富むAmphoter II／Amphoter III系の相違に対応した。
【０２７１】
κ(min)＞０.０９、κ(min)＜０.１５、およびｄκ(ｐＨ８)＞０.０４を有する好ましいAmphoter I系の一般的説明
脂質のライブラリーを、記載したように構築した。脂質アニオンおよびカチオン間の相互作用がAmphoter I明細に続く。以下に挙げる表２１〜２５は、０、２０、３０、４０または５０％コレステロールを含有する陽性にスクリーニングされた種を確認する。表中に挙げた値はκ(min)であり、ＡＨ、ＡＴ、ＣＨおよびＣＴは、それぞれ、アニオンおよびカチオンの頭部および尾部基を示す。
【０２７２】
【表２１】
2015110625.tif 000063
【０２７３】
【表２２】
2015110625.tif 000064
【０２７４】
【表２３】
2015110625.tif 000065
【０２７５】
【表２４】
2015110625.tif 000066
【０２７６】
【表２５】
2015110625.tif 000067
【０２７７】
陽性のAmphoter I種は、６０％コレステロールまたはそれ以上で見られなかった。
κ(中性)の増加は、κ(min)に向かって追加の選択圧を生じる。κ(中性)＝０.１５、０.２または０.２５である中性脂質に対して陽性の系を、以下の表２６〜２８に示す(これらは、３０％の中性脂質含量に対するそのような分析を提供する)。
【０２７８】
【表２６】
2015110625.tif 000068
【０２７９】
【表２７】
2015110625.tif 000069
【０２８０】
【表２８】
2015110625.tif 000070
【０２８１】
また、選択圧は、より高い量の脂質カチオンにより増加する[脂質塩のより広範囲の形成が系振幅ｄκ(ｐＨ８)を低下させるため]。以下の表２９は、Ｃ／Ａ＝０.５および３０％コレステロールのAmphoter I系について、陽性種の頻度の減少を示し、約０.６６のＣ／Ａがこの設定の限界を示す。
【０２８２】
【表２９】
2015110625.tif 000071
【０２８３】
κ(min)＜０.１８およびｄκ(ｐＨ８)＞０.０８を有する、好ましいアニオンに富むおよび平衡化したAmphoter II系の一般的説明
脂質のライブラリーを、記載したように構築した。脂質アニオンおよびカチオン間の相互作用が、過剰の脂質アニオンまたは等量脂質アニオンおよび脂質カチオンを有するAmphoterＩＩ明細に続く。中性ｐＨにおいて脂質塩形成が系振幅を制限しないので、ｄκ(ｐＨ８)を用いるより厳密なスクリーニングがここで示される。勿論、Amphoter Ｉ系に対して行ったように、より低い選択圧を用いてライブラリーをスクリーニングすることもできる。
【０２８４】
以下に挙げる表３０〜３５は、０、２０、３０、４０、５０または６０％コレステロールを含有する陽性にスクリーニングされた種を確認する。表中に挙げた値はκ(min)であり、ＡＨ、ＡＴ、ＣＨおよびＣＴは、それぞれ、アニオンおよびカチオンの頭部および尾部基を示す。
【０２８５】
【表３０】
2015110625.tif 000072
【０２８６】
【表３１】
2015110625.tif 000073
【０２８７】
【表３２】
2015110625.tif 000074
【０２８８】
【表３３】
2015110625.tif 000075
【０２８９】
【表３４】
2015110625.tif 000076
【０２９０】
【表３５】
2015110625.tif 000077
【０２９１】
やや高いκ(中性)を有する中性脂質の使用が実行可能であり、κ(中性)＝０.１５、０.２または０.２５である中性脂質成分を３０％含有するそのような混合物の結果を、以下の表３６〜３８に示す。
【０２９２】
【表３６】
2015110625.tif 000078
【０２９３】
【表３７】
2015110625.tif 000079
【０２９４】
【表３８】
2015110625.tif 000080
【０２９５】
Amphoter Ｉ系とは対照的に、カチオン性脂質成分の量のさらなる増加は、系振幅ｄκ(ｐＨ８)を低下させない(中性ｐＨにおいて脂質塩形成が起こらないため)。従って、系はより寛容になり、６５、６０または５０％脂質アニオンおよび３０％コレステロールを含有するアニオンに富むAmphoter ＩＩ系について以下の表３９〜４１に示すように、陽性にスクリーニングされた種の頻度がより高くなる。
【０２９６】
【表３９】
2015110625.tif 000081
【０２９７】
【表４０】
2015110625.tif 000082
【０２９８】
【表４１】
2015110625.tif 000083
【０２９９】
Amphoter ＩＩ系について、ｐＫ値の差に関する規定を上記で行った。この制限の程度を以下の表４２に示す。
【表４２】
2015110625.tif 000084
【０３００】
この効果は、等量の脂質アニオンおよび脂質カチオンを含む系に対して最も顕著であり、ｐＫ値において制限差を有する平衡化したAmphoter II系のκ(min)のための式は次の通りである：
【数２３】
2015110625.tif 000085
[式中、ｓｆは、表４２に示す塩形成の程度である]。
【０３０１】
脂質塩形成の減少は、より高いκ(min)を導き、結果としてｄκ(ｐＨ８)の低下を導く[κ(ｐＨ８)が影響を受けないため]。従って、脂質塩形成能力の小さな低下は、以下の表４３−Ａ〜Ｆに示すように、このような系の適合度のむしろ大きな低下につながる：表４３において、
(Ａ)ｓｆ＝８３％、および３０％のコレステロール；
(Ｂ)ｓｆ＝７６％、および３０％のコレステロール；
(Ｃ)ｓｆ＝８３％、および３０％のκ(中性)が０.２である中性脂質；
(Ｄ)ｓｆ＝７６％、および３０％のκ(中性)が０.２である中性脂質；
(Ｅ)ｓｆ＝７６％、および１５％のコレステロール；
(Ｆ)ｓｆ＝８３％、および１５％のコレステロール。
【０３０２】
【表４３−１】
2015110625.tif 000086
【０３０３】
【表４３−２】
2015110625.tif 000087
【０３０４】
【表４３−３】
2015110625.tif 000088
【０３０５】
【表４３−４】
2015110625.tif 000089
【０３０６】
【表４３−５】
2015110625.tif 000090
【０３０７】
【表４３−６】
2015110625.tif 000091
【０３０８】
κ(min)＜０.１８およびｄκ(ｐＨ８)＞０.０８を有する、好ましいカチオンに富むAmphoter ＩＩおよびAmphoter ＩＩＩ系の一般的説明
脂質のライブラリーを、記載したように構築した。脂質アニオンおよびカチオン間の相互作用が、過剰の脂質カチオンを有するAmphoter ＩＩ明細に続く。他のAmphoter ＩＩ系を用いたときのように、系振幅ｄκ(ｐＨ８)を制限する脂質塩形成が存在せず、より厳格な値０.０８をスクリーニングに使用した。Amphoter ＩＩＩ系は同じ処方によって導かれ、それに応じて結果が当てはまる。
【０３０９】
以下に挙げる表４４〜４９は、０、２０、３０、４０、５０または６０％コレステロールを含有する陽性にスクリーニングされた種を確認する。表中に挙げた値はκ(min)であり、ＡＨ、ＡＴ、ＣＨおよびＣＴは、それぞれ、アニオンおよびカチオンの頭部および尾部基を示す。
【０３１０】
【表４４】
2015110625.tif 000092
【０３１１】
【表４５】
2015110625.tif 000093
【０３１２】
【表４６】
2015110625.tif 000094
【０３１３】
【表４７】
2015110625.tif 000095
【０３１４】
【表４８】
2015110625.tif 000096
【０３１５】
【表４９】
2015110625.tif 000097
【０３１６】
やや高いκ(中性)を有する中性脂質の使用が実行可能であり、κ(中性)＝０.１５、０.２または０.２５である中性脂質成分を３０％含有するそのような混合物の結果を、以下の表５０〜５２に示す。
【０３１７】
【表５０】
2015110625.tif 000098
【０３１８】
【表５１】
2015110625.tif 000099
【０３１９】
【表５２】
2015110625.tif 000100
【０３２０】
AmphoterＩ系とは対照的に、カチオン性脂質成分の量の変動は、系振幅ｄκ(ｐＨ８)に挑戦しない(中性ｐＨにおいて脂質塩形成が起こらないため)。この系はより寛容になり、４０または４５％脂質アニオンおよび３０％コレステロールを含有するアニオンに富むAmphoter ＩＩ系について以下の表５３〜５４に示すように、陽性にスクリーニングされた種の頻度がより高くなる。
【０３２１】
【表５３】
2015110625.tif 000101
【０３２２】
【表５４】
2015110625.tif 000102
【０３２３】
本発明の別の側面において、驚くべきことに、ある等電点(ＩＰ)５〜６を有する粒子が細胞トランスフェクションにおいて最も効率的であることがわかった。両性リポソームの融合ゾーンは、所与の粒子の等電点付近に局在化されるが、これら融合性担体に対する細胞応答は、上記した領域において融合性になるものに限定される。これは、本発明のアルゴリズムを用いて予測することができない細胞の側面である。
【０３２４】
この発見は、ＩＰが５〜６である好ましい担体を製造するために使用しうる脂質アニオンおよび脂質カチオン間のモル比に制限を加える。電解質の所与の混合物のＩＰは、以下のように算出することができる：
【数２４】
2015110625.tif 000103
[式中、ＫaおよびＫcは、それぞれ脂質アニオンおよびカチオンの解離定数であり、ｘanおよびｘcatは、これら２つのそれぞれのモル分率であり、ＳＱＲは平方根を表し、ｌｏｇは１０を底とする対数を表す]。
【０３２５】
ＩＰの好ましい範囲の式の解を、Amphoter Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ系について、脂質のｐＫ値に対して以下の表５５〜５９に挙げる。
ｐＫ１５は、多くの第一および第二アミンの高ｐＫを表すが、多くの脂質カチオン中のアンモニウム基の非既存ｐＫをも表す。
【０３２６】
【表５５】
2015110625.tif 000104
【０３２７】
【表５６】
2015110625.tif 000105
【０３２８】
【表５７】
2015110625.tif 000106
【０３２９】
【表５８】
2015110625.tif 000107
【０３３０】
【表５９】
2015110625.tif 000108
【０３３１】
ここで、機能的な両性リポソームを形成する好ましい脂質種をさらに記載することができる。コンピューター内スクリーニングデータは、荷電および中性脂質の有用な組合せの詳細な記述を与え、そのそれぞれの頭部および尾部基サイズに関する詳細な情報を包含する。また、このデータは、膜における脂質アニオン、脂質カチオンと１つまたはそれ以上の中性脂質種の間のモル比を確認および選択する方法をも示す。また、問題の脂質アニオンおよび脂質カチオンのｐＫに対して、さらなる特定が行われ、上記の表は、荷電した種のｐＫと、得られる混合物の好ましいＩＰを達成するための得られるモル比の間の関係を提供する。
【０３３２】
最新技術は、脂質のｐＫを決定する方法およびデータを提供している[例えば、Hafezら、(2000)、Biochim Biophys Acta 1463、107-114、またはBudkerら、(1996)、Nature Biotechnology 14、760-764、またはHeyesら、(2005)、J. Control. Release 107(2)、276-287]。所与の構造のｐＫを決定する別の方法には、定量的な構造-活性の関係およびそれに供されているデータベース、例えば、ACD／pka DB(Version 7.06)(Advanced Chemistry Development Inc.)、ｐＫ分析および計算を提供するソフトウエアプログラムの使用が含まれる。実験的ｐＫ値は、計算値とはある程度異なることがあり、このような差異は、使用した異なる実験方法または膜背景中に置いたときの荷電した基の制限された化学的活性に帰することができる。実のところ、膜結合した基の局所濃度は、同じ材料について自由溶液におけるよりも高く、解離の減少、従って化学的活性の低下は、電解質の濃溶液に対して知られた現象である。これは、脂質アニオンについてはより高い実際のｐＫ値および脂質カチオンについてはより低い値にシフトする結果になる。このような差異は、本発明の多くの側面において、脂質アニオンについては＋１であり、脂質カチオンについては−０.５である。
【０３３３】
好ましい脂質系の化学的代表例
本明細書は、膜混合および細胞トランスフェクションからの実験データを、数学的記述(脂質形状および脂質相互作用に基づく機構的洞察を、好ましい系の分子体積、相互作用の種類およびｐＫ値の詳細な記述を可能にする系に変換する)と一体化する。この数学的記述は連続的であるが、該連続体中でいずれかの脂質が明らかな代表例を与える。以下に挙げる表は、上記したコンピューター内スクリーニングおよび実験データによって記述される化学的空間内に入るある種の脂質頭部および尾部基の上記のような明らかな代表例を示す。表６０、表６１および表６２の全ての分子体積および全てのｐＫ値は、それぞれ、DS Viewer Pro 5.0 (Accelrys Inc.、San Diego、CA)およびACD／pka DB (Version 7.06)(Advanced Chemistry Development Inc.)を用いて計算した。ｐＫ値は、溶液中の分子について示し、上で行った膜環境におけるｐＫシフトの考慮を、ケースバイケースで相応に当てはめることができる。
【０３３４】
当業者に周知である他のツールを用いて分子体積を算出することができる。体積の代わりに分子断面を用いたとしても、質的予測は変化しないであろう。勿論、そのような場合には、結果を再較正しなければならないであろう。
【０３３５】
本明細書中に開示した分子体積の計算は、疎水性部分の鎖飽和に対して沈黙している。
不飽和脂質の使用は、そのような脂質を含有する脂質膜が周囲温度で比較的高い流動性を有し、これが融合挙動を改善することもあるので、特定の利点を有することもある。また、不飽和脂質が膜において側圧をかけ、従って、これら成分の見掛け体積を反映するために補正因子を挿入しうることも知られている。このような補正因子は１よりも高い。
【０３３６】
脂質尾部基
最も多く使用される脂質尾部基のリストを、本明細書の表２に挙げる。
【０３３７】
脂質頭部基：中性頭部基
コレステロールおよび双性イオン性リン脂質ＰＣおよびＰＥが、このカテゴリーにおいて最も典型的な成分である。これらの頭部基体積は、それぞれ、３０Ａ３、１３６Ａ３および９８Ａ３である。コレステロールおよびＰＥは、対イオンを欠いている(第１のものはその中性の性質により、第２のものは双性イオン性構造の形成による)。ＰＣ頭部基は、１つの対アニオンおよび１つの対カチオンの両方を引き付け、それぞれの分子体積を、本明細書の表３に挙げる。
【０３３８】
脂質頭部基：アニオン性頭部基
Amphoter ＩおよびＩＩ中の脂質アニオンのための標準の荷電要素は、カルボキシル基である。膜アンカーとの直接会合は、多くの配合物において好ましい最小の頭部基を生じる。種のリストを、以下の表６０に挙げる。
【０３３９】
【表６０】
2015110625.tif 000109
【０３４０】
本発明の好ましい態様において、ジアシルグリセロールは、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジオレオイル−、ジステアロイル−およびパルミトイルオレオイル−グリセロールであり、上記した表中のＲには、この群からの任意の選択が含まれる。
【０３４１】
ジアシルグリセロールおよびコレステロール化合物に加えて、長鎖脂肪酸を用いて両性リポソームを構築することができる。その尾部体積は変化するが、頭部基は、カルボニル原子およびＣ2として規定される。このフラグメントの体積は４１.９Å３であり、これら酸のｐＫは４.７８である。
【０３４２】
リン脂質において２種類の関連する酸性頭部基が存在する：即ち、フラグメント体積が１１５.９Å３であるホスホグリセロール、およびフラグメントサイズが１２１.７Å３であるホスホセリン。それぞれのｐＫ値は、ホスホグリセロールについては１.３４および８.４(ホスファチジルセリン中のアミノ官能)、１.９６(ホスファチジルセリン中のカルボキシル官能)およびそのリン酸エステルについては１.２６である。
【０３４３】
脂質頭部基：カチオン性脂質頭部基
カチオン性脂質頭部基は、そのアニオン性対応物と比較して化学的により多様である。
ｐＨ感受性窒素が荷電中心として機能するが、この元素を様々な脂肪族、複素環式または芳香族構造中に組込むことができる。以下のリストは、小さいカチオン性頭部基の例を挙げるものである。
【０３４４】
【表６１−１】
2015110625.tif 000110
【０３４５】
【表６１−２】
2015110625.tif 000111
【０３４６】
【表６１−３】
2015110625.tif 000112
【０３４７】
本発明の好ましい態様において、ジアシルグリセロールは、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジオレオイル−、ジステアロイル−およびパルミトイルオレオイル−グリセロールであり、ジアルキルは、ジミリスチル−、ジパルミチル−、ジオレイル−、ジステアリル−およびパルミチルオレイル−であり、上記した表中のＲには、この群からの任意の選択が含まれる。
【０３４８】
多数のカチオン性脂質化合物が、膜アンカーとしてコレステロールを使用している。通常、リンカー基を挿入して、荷電した基をこの骨格上に組込むが、この群の化合物には、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＣＨＩＭなどが含まれる。フラグメント体積およびｐＫ値を、以下の表６２に挙げる。
【０３４９】
【表６２】
2015110625.tif 000113
【０３５０】
上に挙げた記載は、全ての必要なパラメーター(例えば、脂質頭部基サイズおよびｐＫならびに脂質尾部基サイズ)に関して、有用な脂質種を確認することを可能にする。
【０３５１】
以下の開示は、本発明の特定の態様のために上記した知見を一体化する。そこでは、κ(min)、ｄκ(ｐＨ８)およびＩＰに対する制限を特定の脂質化学に適用し、特定の配合物を記載する。
【０３５２】
このような態様のある種の好ましい側面において、ＣＨＥＭＳ、ＤＭＧＳ、ＤＯＧＳまたはＣｈｏｌ-Ｃ１をアニオン性脂質種として使用する。以下の表６３は、Amphoter I系におけるこれら脂質の分析を供するものであり、そこで、脂質カチオンは、ｐＫが８.５より大きい強カチオンであり、該脂質カチオンは、それぞれＶCH＝５０Å３または１００Å３、およびＶCT＝５００Å３を有し、中性脂質はコレステロールであり、κ(min)＜０.１３および＞０.０９；ｄκ(ｐＨ８)＞０.０４およびＩＰ５〜６である。
【０３５３】
【表６３−１】
2015110625.tif 000114
【０３５４】
【表６３−２】
2015110625.tif 000115
【０３５５】
【表６３−３】
2015110625.tif 000116
【０３５６】
表６４は、κ(中性)＝０.２である中性脂質の分析を供するものである。
【表６４−１】
2015110625.tif 000117
【０３５７】
【表６４−２】
2015110625.tif 000118
【０３５８】
【表６４−３】
2015110625.tif 000119
【０３５９】
脂質カチオンのｐＫが７.５または８に向かって低下すると、系振幅の最初の改善につながる。これは、比較的少ない脂質アニオンが、ｐＨ８において脂質塩中に隔離されるためである。以下の表６５は、このような系の分析を供するものであり、そこでは、ＣＨＥＭＳ、ＤＭＧＳ、ＤＯＧＳまたはＣｈｏｌ-Ｃ１をアニオン性脂質種として使用し、脂質カチオンはｐＫ７.７を有し、また脂質カチオンはそれぞれＶCH＝５０Å3または１００Å3、およびＶCT＝５００Å3を有し、中性脂質はコレステロールであり、κ(min)＜０.１３および＞０.０９；ｄκ(ｐＨ８)＞０.０４およびＩＰ５〜６である。
【０３６０】
【表６５−１】
2015110625.tif 000120
【０３６１】
【表６５−２】
2015110625.tif 000121
【０３６２】
【表６５−３】
2015110625.tif 000122
【０３６３】
以下の表６６は、６５について記載した系であってκ(中性)＝０.２である系の分析を供するものである。
【表６６−１】
2015110625.tif 000123
【０３６４】
【表６６−２】
2015110625.tif 000124
【０３６５】
【表６６−３】
2015110625.tif 000125
【０３６６】
脂質カチオンのｐＫが７に向かってさらに低下すると、ｄκ(ｐＨ８)から選択圧が解放される。これは、実質的な脂質塩形成が、中性ｐＨにおいてもはや起こらないためである。以下の表６７は、このようなAmphoter II系の分析を供するものであり、そこでは、ＣＨＥＭＳ、ＤＭＧＳ、ＤＯＧＳまたはＣｈｏｌ-Ｃ１をアニオン性脂質種として使用し、脂質カチオンはｐＫ７.０を有し、また脂質カチオンはそれぞれＶCH＝５０Å3または１００Å3、およびＶCT＝５００Å3を有し、中性脂質はコレステロールであり、κ(min)＜０.１８および＞０.０９；ｄκ(ｐＨ８)＞０.０８およびＩＰ５〜６である。
【０３６７】
【表６７−１】
2015110625.tif 000126
【０３６８】
【表６７−２】
2015110625.tif 000127
【０３６９】
【表６７−３】
2015110625.tif 000128
【０３７０】
表６７で使用した中性脂質を比較的大きいκ(中性)＝０.２の種に置換すると、以下の表６８に示すようになる。
【表６８−１】
2015110625.tif 000129
【０３７１】
【表６８−２】
2015110625.tif 000130
【０３７２】
【表６８−３】
2015110625.tif 000131
【０３７３】
上に記載したように、脂質カチオンのｐＫを６.３に向かってさらに低下させると、混合物の等電点において脂質塩形成を最大化する脂質アニオンおよび脂質カチオンの能力に制限を創出し、それと同時に該制限は、κ(min)を上昇させ、ｄκ(ｐＨ８)を低下させる。以下の表６９は、このようなAmphoter II系の分析を供するものであり、そこでは、ＣＨＥＭＳ、ＤＭＧＳ、ＤＯＧＳまたはＣｈｏｌ-Ｃ１をアニオン性脂質種として使用し、脂質カチオンはｐＫ６.３を有し、また脂質カチオンはそれぞれＶCH＝５０Å3または１００Å3、およびＶCT＝５００Å3を有し、中性脂質はコレステロールであり、κ(min)＜０.１８および＞０.０９；dκ(ｐＨ８)＞０.０８およびＩＰ５〜６である。
【０３７４】
【表６９−１】
2015110625.tif 000132
【０３７５】
【表６９−２】
2015110625.tif 000133
【０３７６】
【表６９−３】
2015110625.tif 000134
【０３７７】
また最後に、表６９に記載の脂質系を、κ(中性)＝０.２の中性脂質系の存在下で分析し、結果を以下の表７０に示す。
【表７０−１】
2015110625.tif 000135
【０３７８】
【表７０−２】
2015110625.tif 000136
【０３７９】
【表７０−３】
2015110625.tif 000137
【０３８０】
要約すると、本発明の両性リポソームは、コレステロールまたはコレステロールと１つまたはそれ以上の中性もしくは双性イオン性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン)の混合物から選択される中性脂質を含有し、細胞または組織に活性物質を供給するのによく適している。多数の活性配合物の具体例が、本明細書および本発明の実施例に開示されている。高頻度の成功裏の組成物を与える化学的空間が、アルゴリズムならびに本明細書中に記載するパラメーターκ(min)およびｄκ(ｐＨ８)を用いて記載されている。特に好ましい配合物は、
・Amphoter I相互作用タイプ；κ(min)＝０.０９〜０.１５およびｄκ(ｐＨ８)＞０.０４および等電点５〜６；
・Amphoter II相互作用タイプ；κ(min)＜０.１８およびｄκ(ｐＨ８)＞０.０８および等電点５〜６；
を有しており、
上記の両性配合物の全てが、コレステロールまたはコレステロールと１つまたはそれ以上の中性もしくは双性イオン性脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン)の混合物からなる群から選択される中性脂質をさらに含有し、該混合物のκ(中性)が０.３またはそれ未満である。
【実施例】
【０３８１】
本発明を実施するある種の側面のさらなる細部の理解のために、以下に実施例を挙げる。これら実施例は、いかなる意味においても本開示の範囲を限定するものではない。
【０３８２】
実施例１：リポソームの製造およびｐＨ依存性の融合実験
緩衝系
１００ｍＭクエン酸ナトリウムおよび２００ｍＭリン酸水素ナトリウムをストック溶液として調製し、変化量の両溶液を混合して必要なｐＨに調整した。１つの例としてＣｉＰ７.０は、ｐＨ７.０の該系列からの緩衝液を特定し、クエン酸塩およびリン酸塩から調製される。
【０３８３】
リポソームの製造
リポソームを乾燥した脂質フィルムから生成させた。簡潔に言うと、各脂質組成物(２０μモル)を、クロロホルム／メタノール ３：１(１ｍｌ)に溶解し、真空中で回転蒸発器を用いて乾燥した。得られたフィルムを、ＣｉＰ８.０(１ｍｌ)中で穏やかに撹拌しながら４５分間水和させた。得られたリポソーム懸濁液を凍結させ、解凍後に超音波処理し、最終的に２００ｎｍポリカーボネートフィルターから押出した。
【０３８４】
ｐＨジャンプ実験
ＣｉＰ８.０中のリポソーム(１０μｌ)を、ガラス管中に入れ、必要なｐＨのＣｉＰ緩衝液(１ｍｌ)と急速混合した。試料を室温で１時間放置し、２００ｍＭリン酸水素ナトリウム(３ｍｌ)を試料と急速混合した。リポソームのサイズをMALVERN Zetasizer 3000HSを用いて分析し、サイズをＺ-平均として記録した。
【０３８５】
実施例２：Amphoter I脂質混合物の融合
リポソームを、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウムｐＨ８.０(ＣｉＰ８.０)中のＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳから調製し、少量を、比較的低いｐＨを有するＣｉＰ緩衝液に注入した(詳細については実施例１を参照)。比較的低いｐＨにおいて観察されるいずれかの比較的大きい構造は、凝集体形成および多中心ハチの巣構造の生成のいずれかによるものか、あるいはそのような構造は、真の融合に起因するものであろう。これら２つの結果物の間で分離するために、２００ｍＭリン酸水素ナトリウムを用いてｐＨを中性に再調整した。静電反発が、多中心小胞を解離したが、融合生成物は解離しなかった。この結果を図７に示す。
【０３８６】
数学的な塩架橋モデルにおいて予測されるように、不安定性の谷間がわずかに酸性の条件において存在し、比較的大きい粒子への融合が、ｐＨ６.５から始まって観察された。
しかし、低ｐＨへのリポソームの速い添加は、いくらかのＤＯＴＡＰが混合物中に存在している限り、粒子の安定化を与えた。１００モル％ＣＨＥＭＳからのリポソームは、ｐＨ４.５より下で融合状態に入り、比較的低いｐＨにおいて安定化が得られなかった。
【０３８７】
注目すべきことに、ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳの１：１混合物は、ＣｉＰ８.０においてリポソームを形成することができず、これは、これらのパラメーターに対して非ラメラ相を予測する数学的モデルと良く一致する。
【０３８８】
実施例３：Amphoter II系の融合
リポソームを、クエン酸ナトリウム／リン酸ナトリウムｐＨ８.０(ＣｉＰ８.０)中のＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳから調製し、少量を、比較的低いｐＨを有するＣｉＰ緩衝液に注入した(詳細については実施例１を参照)。比較的低いｐＨにおいて観察されるいずれかの比較的大きい構造は、凝集体形成および多中心ハチの巣構造の生成のいずれかによるものか、あるいはそのような構造は、真の融合に起因するものであろう。これら２つの結果物の間で分離するために、２００ｍＭリン酸水素ナトリウムを用いてｐＨを中性に再調整した。静電反発が、多中心小胞を解離したが、融合生成物は解離しなかった。
【０３８９】
実験的証拠は、塩架橋モデルを支持する(図８を参照)。融合ゾーンは、ＭｏＣＨｏｌの大きい頭部基サイズのゆえに、高アニオン含量に向かって傾斜する。従って、混合物中の３３モル％または５０モル％ＣＨＥＭＳを用いて融合は起こらず、一方、６６モル％または７５モル％ＣＨＥＭＳを含有する混合物は、ｐＨ４〜６に暴露したときに融合を経る。
予測されるように、融合の開始は、比較的高い量のＣＨＥＭＳを用いて比較的低いｐＨ値にシフトする。ここでも、１００モル％ＣＨＥＭＳは、低ｐＨで融合性であり、低ｐＨにおいて安定な状態を持たない。
【０３９０】
計算に使用したパラメーターを、以下の表７１に示す。Ｎａ／Ｈ2ＰＯ4中のＣＨＥＭＳおよびＭｏＣｈｏｌをモデル化合物として使用した(全ての体積はÅ3)：
【表７１】
2015110625.tif 000138
【０３９１】
実施例４：モノアルキル脂質との脂質塩形成
オレイン酸を、既知の普通のｐＨ感受性膜成分として選択した。脂質尾部は体積が比較的小さいので、頭部基におけるいずれかの変化は、膜安定性に対してより顕著な結果を有する。図９に示すように、モデル化は、オレイン酸が、ＭｏＣｈｏｌを含むAmphoter II系における融合の強力な推進体であることを予測する。これを実験的に確認する。オレイン酸の混合物は、ＭｏＣｈｏｌとリポソームを形成し、粒子は、異なる条件に暴露したときに急速に融合を経る。アルゴリズムから予測されるように、融合の程度は、混合物中の比較的少ない量のＯＡに対して制限されるが、５０モル％のアニオンは、古典的な谷間タイプの融合パターンの結果を与える。融合傾向はＯＡでより強いので、混合物中の該アニオンのより大きい部分が、広範囲のｐＨ値にわたって大きな融合の結果を与える。それでも、低ｐＨにおいて混合物を常に安定化させることができる。詳細は実施例１の通りである。
【０３９２】
【表７２】
2015110625.tif 000139
【０３９３】
実施例５：蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)に基づく融合アッセイ
異なる両性脂質混合物の融合性を調べるために、ＦＲＥＴに基づく脂質混合アッセイを用いた。それぞれ０.６モル％のＮＢＤ-ＰＥ[Ｎ-(７-ニトロベンズ-２-オキサ-１,３-ジアゾール-４-イル)-１,２-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩]またはRhodamine-PE [LissamineTM ローダミンＢ １,２-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩]で単一ラベルしたリポソームを調製して、ＦＲＥＴシグナルの出現により脂質融合をモニターした。
【０３９４】
脂質をイソプロパノールに溶解し(最終脂質濃度１６ｍＭ)、混合した。緩衝液(酢酸１０ｍＭ、リン酸１０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７.５)をアルコール性脂質混合物に加えることによってリポソームを調製し、最終脂質濃度１.９５ｍＭおよび最終イソプロパノール濃度１２.２％を得た。リポソームの調製のために、液体取扱いロボット(Perkin Elmer、Multiprobe ＩＩ Ex)を使用した。ＮＢＤ-ラベルおよびＲｈ-ラベルした両性リポソームを１：１の比で混合し、次いで上記した緩衝液を用いて１：１で希釈した。最後に、この混合試料の少量を、漸減特定ｐＨ(ＨＡｃ５０ｍＭ、リン酸５０ｍＭ、ＮａＯＨ、ｐＨ７.５〜２.５)にし、３７℃で２時間インキュベートした。この工程において、リポソームを再び１：１で希釈した。
【０３９５】
試料の蛍光を、２組のフィルター(ＮＢＤ／ローダミン：４６０／５９０ｎｍおよびＮＢＤ／ＮＢＤ：４６０／５３０ｎｍ)を用いて測定した。膜融合のシグナルとしてのＦＲＥＴを、発光(５９０ｎｍ)／発光(５３０ｎｍ)の比として表した。バックグラウンド０.４はバックグラウンド蛍光を示し、従って、ＦＲＥＴシグナルから差し引いた。
【０３９６】
融合と単なる凝集を識別するために、懸濁液をｐＨ７.５に中和し、再びＦＲＥＴシグナルを測定した。リポソームの融合に対する残存アルコール含量３％の可能な介入を、予備実験によって排除した。
【０３９７】
実施例６：両性脂質混合物の融合に対する中性もしくは双性イオン性脂質の影響
漸増量の中性もしくは双性イオン性脂質を含む両性リポソームを、実施例５の記載のように調製した。最初に、Amphoter Ｉ系(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)およびAmphoter II(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)を、１０〜５０％の異なる中性もしくは双性イオン性脂質またはこれらの混合物の添加によって調製した。一連の異なるＣ／Ａ比を有するリポソームについて融合を測定した。全マトリックス中の全てのこのような測定の合計を用いて、系を特徴付けることができる。次いで、中性もしくは双性イオン性脂質の効果を、この全体的パラメーター(Σ ＦＲＥＴ)を用いて分析した。
【０３９８】
図１４は、両性脂質混合物ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳの融合性に対する、異なる中性もしくは双性イオン性脂質の影響を示す。高κを有する中性脂質(例えば、ＰＯＰＣまたはＤＯＰＣ)が両性リポソームの融合性を低下させ、一方、比較的低いκを有する脂質(例えば、ＤＯＰＥまたはコレステロール)が、融合性にわずかの影響しか持たないか、または融合を改善することすらあることが明らかである。ＰＯＰＣとＤＯＰＥの混合物およびＰＯＰＣまたはＤＯＰＣとコレステロールの混合物は、２つの脂質の比に依存して、融合能力にわずかの影響しか持たないか、またはそれを減少させる。これを、図１５にさらに示す。モル比ＰＣ／Ｃｈｏｌが高くなるにつれて、両性リポソームの融合性が低くなる。これらの発見は、中性脂質ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝１の混合物について図１０〜１３に示したモデルと非常によく関連する。これらの図において、ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ(Ｃ／Ａ＝０.１７〜０.７５)またはＭｏＣＨｏｌ／ＤＯＧＳ(Ｃ／Ａ＝０.３３〜３)からのリポソームのΣＦＲＥＴを、０％〜５０％の中性脂質を含む混合物のκ(min)に対してプロットした。参照κ(min)は、Ｃ／Ａ＝０.６６(ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ)またはＣ／Ａ＝１(ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＧＳ)についてモデル化した。
【０３９９】
さらなる実験において、他の両性脂質系の融合性に対するＰＯＰＣまたはコレステロールの効果を測定した。表７３および表７４は、これらのデータをまとめ、実験の第１部分の結果を確認するものである。表７３および表７４は、Σ ＦＲＥＴ、ならびに、両性リポソームがｐＨ７〜ｐＨ８において安定であり、ｐＨ３〜ｐＨ６、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ６において融合するＣ／Ａ比の範囲を示す。
【０４００】
低融合性を有する両性脂質系を、コレステロールの添加によって明瞭に改善しうることが明らかになった。さらに、結果は、コレステロールが、融合性の範囲に影響を有しうることを示す。これは、Ｃ／Ａ比の範囲を広くしうることを意味する。
【０４０１】
【表７３】
2015110625.tif 000140
【０４０２】
【表７４】
2015110625.tif 000141
【０４０３】
実施例７：中性脂質による両性リポソームのコロイド安定化
融合アッセイを、実施例５に記載したように行った。０または２０モル％コレステロールを含むＤＯＴＡＰ／オレイン酸配合物について、カチオン／アニオンのモル比(Ｃ／Ａ比)＝０.１７、０.３３、０.４０、０.５０、０.６７、０.７５での融合を試験し、純粋なアニオン性リポソームを対照として調製した。
【０４０４】
以下に挙げる表７５および表７６は、２つのＤＯＴＡＰ／オレイン酸Amphoter系の融合プロフィールを、マトリックスＣ／Ａ-対-ｐＨとして示す。さらに、純粋なアニオン性脂質のリポソームの融合をも示す(Ｃ／Ａ＝０)。
【０４０５】
これらの表は、コレステロールの添加が、ｐＨ７.５およびＣ／Ａ比＝０.６７および０.７５において両性リポソームのコロイド安定化を導くことを示す。
【表７５】
2015110625.tif 000142
【表７６】
2015110625.tif 000143
【０４０６】
実施例８：ｓｉＲＮＡ標的化Ｐｌｋ-１または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡを封入した両性リポソームによるＨｅｌａ細胞の試験管内トランスフェクション
リポソームの調製：
リポソームを、イソプロパノール注入法によって製造した。脂質をイソプロパノールに溶解し(３０ｍＭ脂質濃度)、混合した。ＮａＡｃ２０ｍＭ、スクロース３００ｍＭ、ｐＨ４.０中のｓｉＲＮＡ溶液(ｐＨをＨＡｃで調整する)を、アルコール性脂質混合物に加えることによってリポソームを調製し、最終アルコール濃度３０％を得た。生成したリポソーム懸濁液を、体積の２倍の１３６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭのＮａＣｌ(ｐＨ９)を用いてｐＨ７.５にシフトさせ、最終脂質濃度３ｍＭおよび最終イソプロパノール濃度１０％を得た。
【０４０７】
一部の配合物は、出発濃度として２０ｍＭ脂質を用いて調製し、２ｍＭを最終脂質濃度とした。このような配合物は、表７７および表７８においてアステリスク(＊)を付けた。
Ｎ／Ｐ＝製造中の脂質からのカチオン性電荷／ｓｉＲＮＡからのアニオン性電荷の比。
リポソーム配合物のサイズを、動的光散乱(Zetasizer 3000、Malvern)を用いて特徴付けた。
【０４０８】
以下に挙げるｓｉＲＮＡ標的化ＰＬＫ-１または非標的化スクランブルｓｉＲＮＡを封入したリポソームAmphoter I配合物を調製した。
ＰＬＫ-１ ｓｉＲＮＡは、Haupenthalら、Int J Cancer、121、206-210 (2007)に記載される通りである。
【０４０９】
【表７７−１】
2015110625.tif 000144
【０４１０】
【表７７−２】
2015110625.tif 000145
【０４１１】
【表７７−３】
2015110625.tif 000146
【０４１２】
【表７７−４】
2015110625.tif 000147
【０４１３】
【表７７−５】
2015110625.tif 000148
【０４１４】
以下に挙げるｓｉＲＮＡ標的化ＰＬＫ-１または非標的化スクランブルｓｉＲＮＡを封入したリポソームAmphoter II配合物を調製した。
【０４１５】
【表７８−１】
2015110625.tif 000149
【０４１６】
【表７８−２】
2015110625.tif 000150
【０４１７】
【表７８−３】
2015110625.tif 000151
【０４１８】
トランスフェクションプロトコール：
Ｈｅｌａ細胞を、ＤＳＭＺ(German Collection of Micro Organism and Cell Cultures)から入手し、ＤＭＥＭ中で維持した。培地をGibco-Invitrogenから購入し、１０％ＦＣＳを追加した。細胞を、２.５＊１０4細胞／ｍｌの密度でプレーティングし、培地(１００μｌ)中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。１６時間後に、ｓｉＲＮＡを含有するリポソームを、所望により血清中でのプレインキュベート後に、製造用緩衝系(上記を参照)において、またはＰＢＳにおいて、またはOptimemI(Gibco-Invitrogen)において希釈した。
次いで、１０μｌを細胞に加えた(ウエルあたり１１０μｌの最終体積および９.１％ＦＣＳ)(用量は、０.４〜１５０ｎＭのＰｌｋ-１またはスクランブルｓｉＲＮＡで変化し、最大試験用量は、Amphoter I配合物については１２.５〜１５０ｎＭで、Amphoter IIについては４０〜１５０ｎＭで変化した)。また、希釈緩衝液(１０μｌ)を、未処理細胞および細胞を含まないウエルに加えた。さらに、対照として、遊離のｓｉＲＮＡを細胞に加えた(１０〜８０ｎＭのＰｌｋ-１またはスクランブルｓｉＲＮＡ)。細胞培養皿を、５％ＣＯ２下に３７℃で７２時間インキュベートした。トランスフェクション効率を、細胞増殖／生存性アッセイを用いて分析した。
【０４１９】
細胞増殖／生存性アッセイ：
細胞増殖／生存性を、CellTiter-Blue 細胞生存性アッセイ(Promega、米国)を用いて測定した。簡潔に言うと、トランスフェクションの７２時間後に、Medium/CellTiter-Blue 試薬(８０μｌのMediumと２０μｌのCellTiter-Blue試薬のプレミックス)(１００μｌ)をウエルに加えた。３７℃で２.５時間のインキュベートに続いて、培地(８０μｌ)を、黒色微量滴定プレート(NUNC、デンマーク)のウエルに移した。蛍光を、蛍光プレートリーダー(Ｅｘ．５５０ｎｍ／Ｅｍ．５９０ｎｍ)を用いて記録した。各プレート上に、以下の対照を含ませた：(ｉ)細胞を含まず培地を含むウエル(培養培地バックグラウンド蛍光のための対照)および(ii)細胞を含むウエル(未処理細胞＝偽トランスフェクション細胞)。計算のために、培養培地バックグラウンドの平均蛍光値を、実験ウエル(トランスフェクションおよび偽トランスフェクション細胞)の全ての平均(３回)値から差し引いた。各トランスフェクションからの蛍光値を、偽トランスフェクション細胞からの平均蛍光値(これを１００％とした)に対して正規化した。
【０４２０】
結果：
図１７は、表７７の中性リポソームを含む全てのAmphoter IリポソームのＩＣ50値-対-κ(min)値のプロットを示す。
低ＩＣ50値は、リポソーム供給系の高トランスフェクション効率を示す。配合物を異なる用量範囲で試験すると、「ＩＣ50＞１２.５ｎＭ」としてマークしたプロット中の一部の配合物は、これらの配合物が適切な試験用量範囲において効率的ではないことを示す。
このプロットは、特定範囲のκ(min)値におけるAmphoter Iリポソームのトランスフェクション効率の最適値を明瞭に示す。
【０４２１】
同様に、図１８において、表７８の中性脂質を含む全てのAmphoter IIリポソームのＩＣ50値-対-κ(min)値が示されている。配合物を異なる用量範囲でのみ試験すると、「ＩＣ50＞４０ｎＭ」としてマークしたプロット中の一部の配合物は、これらの配合物が適切な試験用量範囲において効率的ではないことを示す。
この図から、細胞トランスフェクションのためには、両性リポソームはκ(min)のある種の最小値に到達しなければならないことが明らかになった。
【０４２２】
図１９中のプロットは、表７７および表７８からの中性脂質を含有する全てのリポソームのサイズ-対-配合物のｄκ(ｐＨ８)を示し、非常に小さい粒子が、好ましくはｄκ(ｐＨ８)＞０.０４で得られることを示す。ｄκ(ｐＨ８)は、κ(ｐＨ８)とκ(min)の差である。
【０４２３】
２つの選択した両性脂質混合物のトランスフェクション効率に対する中性脂質の添加の影響を、図２０および図２１に示す。両ケースにおいて、中性脂質の添加は、両性リポソームのトランスフェクション効率を明瞭に改善し、両ケースにおいて、用量応答が見られたが、その一方で、適当な両性リポソーム中に封入された対照スクランブルｓｉＲＮＡは効果を示さなかった。
【０４２４】
図２２および図２３は、Amphoter I(ＤＣ-ＣＨＯＬ／ＤＭＧＳ)系およびAmphoter II(Ｃｈｉｍ／ＤＭＧＳ)系について、６０モル％のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ混合物(モル比０.５)の添加が、細胞トランスフェクションをほぼ完全に阻害したことを示す。対照的に、２０モル％または４０モル％のＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ混合物の添加は、細胞トランスフェクションを阻害しなかった。
【０４２５】
さらに、本発明の両性リポソームのトランスフェクション効率に対する両性脂質混合物の等電点(ＩＰ)の影響を、本発明の異なる両性リポソームについて、図２４に示す。
【０４２６】
実施例９：ｓｉＲＮＡ標的化ＡｐｏＢ１００または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡを封入した両性リポソームによる初代肝細胞の試験管内トランスフェクション
ｓｉＲＮＡ標的化ＡｐｏＢ１００または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡを封入したリポソームの調製：
リポソームを、イソプロパノール注入法によって製造した。脂質混合物をイソプロパノールに溶解した。活性ＡｐｏＢ１００または非活性スクランブルｓｉＲＮＡのストック溶液を緩衝液で希釈して適当な濃度にし、丸底フラスコに移した。両溶液を、ｐＨ４において、ポンプ付き注入デバイスを用いて１０：２３.３(溶媒中の脂質：水性緩衝液中のｓｉＲＮＡ)の比で混合して、イソプロパノール濃度３０％にした。得られたリポソーム懸濁液を、ｐＨ７.５および最終アルコール濃度１０％にシフトさせた。最終リポソームを透析して、未封入のｓｉＲＮＡおよびアルコールを除去した。次いで、このリポソーム懸濁液を、所望のｓｉＲＮＡ濃度に濃縮した。
【０４２７】
ＡｐｏＢ１００ ｓｉＲＮＡは、Soutschekら、Nature、432、173-178 (2004)に記載される通りであり、ガイド鎖上に５'ホスホリル化をさらに含む。
【表７９】
2015110625.tif 000152
【０４２８】
トランスフェクションプロトコール：
初代マウス肝細胞を、Seglen[Seglen, P.O.、「単離したラット肝細胞の調製」、Methods Cell Biol. 13:29-83; 1976]のプロトコールに従って単離し、マウス細胞調製のために修飾した。マウス肝細胞を、最終的にＤＭＥ-培地(Gibco-Invitrogen)に再懸濁させた。この細胞を、６ウエルのプレートに４×１０5細胞／ウエルの密度でプレーティングし、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥ-培地(２０００μｌ)中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。
【０４２９】
トランスフェクションのために、ｓｉＲＮＡを含有するリポソームを、Optimem I (Gibco-Invitrogen、Karlsruhe、独国)で希釈して、所望の用量にした。２００μｌ量を細胞に添加した(ウエルあたり２２００μｌ最終体積および９.１％ＦＣＳ)。Optimem Iまたは透析緩衝液で処理した細胞を、未処理対照とした。細胞培養皿を、５％ＣＯ2下に３７℃で７０時間インキュベートした。
標的ｍＲＮＡ(ＡｐｏＢ)の減少を、Quantigeneアッセイ(Panomics、Fremint、CA、米国)を用いて定量した。
【０４３０】
結果：
両方の両性リポソーム配合物が、未処理細胞と比較して、用量依存的に５または２０％下まで、標的ＡｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを示した(図２５および２６を参照)。対照的に、非標的化スクランブルｓｉＲＮＡを封入した配合物は、細胞のＡｐｏＢ ｍＲＮＡレベルに対してほとんど効果を有さず、リポソーム配合物が毒性を示さないことを示した。
【０４３１】
実施例１０：ｓｉＲＮＡ標的化ＰＬＫ-１または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡを封入した両性リポソームによるＲＡＷ２６４.７細胞(マウス白血病単球マクロファージセルライン)の試験管内トランスフェクション
ｓｉＲＮＡ標的化ＰＬＫ-１または非標的化スクランブル(ｓｃｒ)ｓｉＲＮＡを封入したリポソームの調製：
リポソームＦ１〜Ｆ４を、イソプロパノール注入法によって製造した。脂質混合物をイソプロパノールに溶解した。活性ＰＬＫ-１または非活性スクランブルｓｉＲＮＡのストック溶液を緩衝させて適当な濃度にし、丸底フラスコに移した。両溶液を、ｐＨ４において、ポンプ付き注入デバイスを用いて１０：２３.３(溶媒中の脂質：水性緩衝液中のｓｉＲＮＡ)の比で混合して、イソプロパノール濃度３０％にした。得られたリポソーム懸濁液を、ｐＨ７.５および最終アルコール濃度１０％にシフトさせた。次いで、このリポソーム懸濁液を、所望のｓｉＲＮＡ濃度に濃縮した。
【０４３２】
ＰＬＫ-１ ｓｉＲＮＡは、Haupenthalら、Int J Cancer、121、206-210 (2007)に記載される通りである。
Ｆ１：ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ  ２４：２６：４０(モル％)
Ｆ２：ＤＯＴＡＰ／ＤＯＧＳ／Ｃｈｏｌ  １５：４５：４０(モル％)
Ｆ３：ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ／Ｃｈｏｌ  １５：４５：４０(モル％)
Ｆ４：ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ／Ｃｈｏｌ  １７：５３：３０(モル％)
【表８０】
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【０４３３】
トランスフェクションプロトコール：
ＲＡＷ２６４.７細胞を、ＡＴＣＣから入手し、ＤＭＥＭ中で維持した。培地をGibco-Invitrogenから購入し、１０％ＦＣＳを追加した。細胞を、４＊１０4細胞／ｍｌの密度でプレーティングし、培地(１００μｌ)中、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。ｓｉＲＮＡを含有するリポソームを、製造用緩衝系で希釈した。次いで、１０μｌを細胞に加えた(ウエルあたり１１０μｌの最終体積および９.１％ＦＣＳ)(１９〜６００ｎＭのＰｌｋ-１またはスクランブルｓｉＲＮＡ)。また、希釈緩衝液(１０μｌ)を、未処理細胞および細胞を含まないウエルに加えた。細胞培養皿を、５％ＣＯ2下に３７℃で７２時間インキュベートした。トランスフェクション効率を、実施例８に記載した細胞増殖／生存性アッセイを用いて分析した。
【０４３４】
結果：
ＰＬＫ-１ ｓｉＲＮＡを封入した両性リポソーム配合物Ｆ１〜Ｆ４は、ＲＡＷ２６４.７細胞、即ち、マウス白血病単球マクロファージセルラインのトランスフェクションに有効であった。ＩＣ50値を以下の表８１に示す。
【表８１】
2015110625.tif 000154
【０４３５】
実施例１１：両性リポソームの血清安定性
ｓｉＲＮＡ封入リポソームの調製：
Ｐｌｋ-１ ｓｉＲＮＡ／ｓｃｒ ｓｉＲＮＡ-Ｃｙ５.５ラベル化(９：１ ｗ／ｗ)の混合物を封入した両性リポソームを、実施例１０に記載したように調製した。製造過程の後、リポソームを濃縮および透析して、未封入のｓｉＲＮＡおよびアルコールを除去した。
Ｆ５：ＤＯＴＡＰ／Ｃｈｅｍｓ／Ｃｈｏｌ  ３１：３９：３０(モル％)
Ｆ６：ＤＯＴＡＰ／ＤＭＧＳ／Ｃｈｏｌ  １５：４５：４０(モル％)
Ｆ７：ＣｈｏｌＣ４Ｎ-Ｍｏ２／ＤＭＧＳ／Ｃｈｏｌ  ２３：４７：３０(モル％)
Ｆ８：ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＨｉｓＣｈｏｌ／ＤＭＧＳ／Ｃｈｏｌ  ７：２８：２５：３０：１０(モル％)
【表８２】
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【０４３６】
血清安定性を測定するために、リポソームを、２ｍＭの脂質濃度に希釈し、次いで、７５％マウス血清中、３７℃で２時間インキュベートした(最終脂質濃度０.５ｍＭ)。血清インキュベート中のｓｉＲＮＡの放出を、ＴＢＥ緩衝液中、１５％ポリアクリルアミドゲル(Biorad)でのゲル電気泳動によってモニターした。遊離のｓｉＲＮＡだけがゲルに入るので、血清インキュベート中にリポソームから放出されたｓｉＲＮＡを、ゲルにおいて、Ｃｙ５.５ラベル化ｓｉＲＮＡを検出するODYSSEY赤外結像系(LI-COR Biosciences)を用いて検出することができる。
【０４３７】
結果：
【表８３】
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【０４３８】
実施例１２：マウスにおける両性リポソームの生体内分布および許容性
実施例１１の両性リポソームＦ５、Ｆ７およびＦ８を、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に、８ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量で静脈内注射した。２時間後にマウスを犠牲にし、肝臓と脾臓の低温切開片を調製し、Ｃｙ５.５ラベル化ｓｉＲＮＡを検出するODYSSEY赤外結像系(LI-COR Biosciences)を用いて分析した。低温切開片の平均強度を、合計強度／面積によって算出した。
【０４３９】
結果：
マウスは、副作用(例えば、みすぼらしい毛、呼吸困難または無気力)の徴候を示さなかった。
肝臓および脾臓における２時間後の両性リポソームの生体内分布を図２７に示す。全ての両性リポソーム配合物が肝臓において見られ、幾分低い濃度で脾臓において見られた。
【０４４０】
実施例１３：ｓｉＲＮＡを封入した両性リポソーム
ｓｉＲＮＡを装填した両性リポソームを、非標的化スクランブルｓｉＲＮＡを用いて製造した。脂質混合物Ａ(ＤＣ-Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｃｈｏｌ、２６：３９：３５モル％)またはＢ(ＤＣ-Ｃｈｏｌ：ＤＭＧＳ：Ｃｈｏｌ、２０：４０：４０モル％)を、両混合物について濃度３０ｍＭまたは６０ｍＭ(最終脂質濃度)でエタノールに溶解した。適切な体積のｓｉＲＮＡストックを、２０ｍＭのＮａＡｃ、３００ｍＭのスクロース／ＮａＯＨ、ｐＨ４.０で希釈した。有機および水溶液を、３：７の比で混合し、直ちにリポソーム懸濁液を、１３６ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１００ｍＭのＮａＣｌによってｐＨ＞７.５にシフトさせた。
【０４４１】
未封入のｓｉＲＮＡの量を、Centrisart[分子量排除３００ｋＤ(Sartorius、Goettingen、独国)]を用いる限外濾過によって測定した。濾液のｓｉＲＮＡ濃度を分光学的に測定した(ＯＤ２６０ｎｍ)。封入されたオリゴヌクレオチドの量は、ｓｉＲＮＡの全体量から未封入のｓｉＲＮＡ量を差し引くことによって決定した。
【０４４２】
製造後の粒子特性：
【表８４】
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【０４４３】
実施例１４：１,２-ジオレオイル-３-メチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパン(ＤＯＭＣＡＰ)の合成
工程Ａ：１,２-ジヒドロキシ-３-メチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパンの合成
【化１２】
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この化合物は、Xuら、Synlett 2003、2425-2427に従って合成した。簡潔には、３-メチルアミノ-１,２-プロパンジオール(５.２６ｇ)をアセトニトリル(８０ｍｌ)に加え、混合物を２.５時間撹拌した。次いで、アクリル酸メチルエステル(４.３１ｇ)および酢酸銅(II)一水和物(０.５ｇ)を加え、反応液を室温で一晩撹拌した。溶媒を回転蒸発によって除去し、粗生成物(青色油)を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液：酢酸エチルエステル)。生成物(無色油)を1Ｈ-ＮＭＲによって特徴付けた。
【０４４４】
工程Ｂ：１,２-ジオレオイル-３-メチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパンの合成
【化１３】
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１,２-ジヒドロキシ-３-メチル-(メトキシカルボニル-エチル)アンモニウム-プロパン(１.９ｇ)を乾燥ジクロロメタン(４０ｍｌ)に溶解した。次いで、トリエチルアミン(２.２３ｇ)および４-ジメチルアミノピリジン(０.３１８ｍｇ)を加え、混合物を氷浴で５〜１０℃まで冷却した。次いで、ジクロロメタン(１０ｍｌ)中のオレイン酸クロリド(６.６２ｇ)の溶液を、反応混合物に滴下し、温度を１５℃未満であるように制御した。添加の後、氷浴を除去し、混合物を２０℃で２時間撹拌した。最後に、反応混合物を濾過し、残留物をジクロロメタン(５０ｍｌ)で洗浄した。濾液の溶媒を回転蒸発によって除去し、粗生成物(黄色油)を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液：酢酸エチルエステル：石油エーテル １：９)。生成物(黄色油)を、1Ｈ-ＮＭＲおよびＬＣ-ＭＳによって特徴付けた。
【０４４５】
実施例１５：１,２-ジオレオイル-３-Ｎ-ピロリジン-プロパン(ＤＯＰ５Ｐ)の合成
【化１４】
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Ｎ2雰囲気下に、ピロリジノ-１,２-プロパンジオール(２ｇ)をジクロロメタン(２５ｍｌ)と混合した。次いで、トリエチルアミン(２.７９ｇ)および４-ジメチルアミノピリジン(０.０１ｇ)を加え、反応混合物を撹拌し、氷浴中で冷却した。次いで、ジクロロメタン(２５ｍｌ)中のオレイン酸クロリド(８.２９ｇ)を、４５分間で滴下した。反応混合物を、室温で２日間撹拌した。粗生成物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液：酢酸エチルエステル：石油エーテル １：１)。生成物(黄色油)を、1Ｈ-ＮＭＲ、13Ｃ-ＮＭＲおよびＬＣ-ＭＳによって特徴付けた。
【０４４６】
実施例１６：１,２-ジオレオイル-３-Ｎ-ピリジニウム-プロパンブロミド塩(ＤＯＰ６Ｐ)の合成
工程Ａ：１,２-ジオレオイル-３-ブロモ-プロパンの合成
【化１５】
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Ｎ2雰囲気下に、３-ブロモ-１,２-プロパンジオール(７.７５ｇ)をジクロロメタン(３００ｍｌ)に溶解した。反応混合物を氷浴で冷却し、次いで、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(１９.３９ｇ)およびオレイン酸クロリド(３６.１１ｇ)を加えた。反応液を一晩撹拌した。次いで、溶媒を回転蒸発によって除去した。石油エーテル(３００ｍｌ)を加えた後に白色固体が沈殿し、これを除去した。粗生成物を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液：石油エーテル)。生成物(黄色油)を1Ｈ-ＮＭＲによって特徴付けた。
【０４４７】
工程Ｂ：１,２-ジオレオイル-３-Ｎ-ピリジニウム-プロパンブロミド塩の合成
【化１６】
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１,２-ジオレオイル-３-ブロモ-プロパン(５.５６ｇ)をピリジン(８０ｍｌ)に溶解し、反応混合物を８５℃で一晩撹拌した。溶媒を回転蒸発によって除去し、粗生成物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製した(溶離液：クロロホルム；クロロホルム：メタノール ４：１)。生成物(褐色油)を1H-ＮＭＲによって特徴付けた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年2月6日(2015.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性脂質を含有し、該中性脂質はコレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物であり、該混合物のκ(中性)が０.３またはそれ未満であり；
１つまたはそれ以上または複数の荷電した両親媒性物質を含有し、該物質は互いと組合せて両性の性質を有し、該荷電した両親媒性物質は荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質（Ａｍｐｈｏｔｅｒ  ＩＩと称する）を含み；
０．１３〜０．２３のκ（ｍｉｎ）を有し；
該少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質がＰＯＰＣおよびＤＯＰＥである；
両性リポソーム。
【請求項２】
コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物のκ(中性)が、０.２５未満、好ましくは０.２未満、最も好ましくは０.１５未満である請求項１に記載の両性リポソーム。
【請求項３】
コレステロールと少なくとも１つの中性もしくは双性イオン性脂質の混合物のモル比が４〜０.２５である請求項１または２に記載の両性リポソーム。
【請求項４】
該荷電した両親媒性物質が両性脂質である請求項１に記載の両性リポソーム。
【請求項５】
該両性脂質が、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣＨｏｌからなる群から選択される請求項４に記載の両性リポソーム。
【請求項６】
該アニオン性脂質が、以下からなる群から選択される請求項１〜５のいずれかに記載の両性リポソーム：
ジアシルグリセロールヘミスクシネート、例えば、ＤＯＧＳ、ＤＭＧＳ、ＰＯＧＳ、ＤＰＧＳ、ＤＳＧＳ；ジアシルグリセロールヘミマロネート、例えば、ＤＯＧＭまたはＤＭＧＭ；ジアシルグリセロールヘミグルタレート、例えば、ＤＯＧＧ、ＤＭＧＧ；ジアシルグリセロールヘミアジペート、例えば、ＤＯＧＡ、ＤＭＧＡ；ジアシルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸、例えば、ＤＯ-ｃＨＡ、ＤＭ-ｃＨＡ；(２,３-ジアシル-プロピル)アミノ}-オキソアルカン酸、例えば、ＤＯＡＳ、ＤＯＡＭ、ＤＯＡＧ、ＤＯＡＡ、ＤＭＡＳ、ＤＭＡＭ、ＤＭＡＧ、ＤＭＡＡ；ジアシル-アルカン酸、例えば、ＤＯＰ、ＤＯＢ、ＤＯＳ、ＤＯＭ、ＤＯＧ、ＤＯＡ、ＤＭＰ、ＤＯＢ、ＤＭＳ、ＤＭＭ、ＤＭＧ、ＤＭＡ；Ｃｈｅｍｓおよびその誘導体、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ５、Ｃｈｏｌ-Ｃ６、Ｃｈｏｌ-Ｃ７またはＣｈｏｌ-Ｃ８；Ｃｈｏｌ-Ｃ１、ＣｈｏｌＣ３Ｎまたはコレステロールヘミジカルボン酸およびコレステリルオキシカルボニルアミノカルボン酸、例えば、Ｃｈｏｌ-Ｃ１２またはＣｈｏｌＣ１３Ｎ、脂肪酸、例えば、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ネルボン酸、ベヘン酸；ＤＯＰＡ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＰＯＰＡ、ＤＳＰＡ、Ｃｈｏｌ-ＳＯ４、ＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＳＰＧまたはＤＯＰＳ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＳＰＳまたはセチル-ホスフェート。
【請求項７】
該カチオン性脂質が、以下からなる群から選択される請求項１〜６のいずれかに記載の両性リポソーム：
ＤＯＴＡＰ、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＳＴＡＰ、ＰＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ、ＰＯＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＰＤＡＰ、ＤＳＤＡＰ、ＤＯＤＭＨＥＡＰまたはＤＯＲＩ、ＰＯＤＭＨＥＡＰまたはＰＯＲＩ、ＤＭＤＭＨＥＡＰまたはＤＭＲＩ、ＤＰＤＭＨＥＡＰまたはＤＰＲＩ、ＤＳＤＭＨＥＡＰまたはＤＳＲＩ、ＤＯＭＤＨＥＡＰ、ＰＯＭＤＨＥＡＰ、ＤＭＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＭＤＨＥＡＰ、ＤＳＭＤＨＥＡＰ、ＤＯＭＨＥＡＰ、ＰＯＭＨＥＡＰ、ＤＭＭＨＥＡＰ、ＤＰＭＨＥＡＰ、ＤＳＭＨＥＡＰ、ＤＯＤＨＥＡＰ、ＰＯＤＨＥＡＰ、ＤＭＤＨＥＡＰ、ＤＰＤＨＥＡＰ、ＤＳＤＨＥＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＥＰＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＰＥＰＣ、ＤＳＥＰＣ、ＰＯＥＰＣ、ＤＯＲＩＥ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＭＣＡＰ、ＤＯＭＧＭＥ、ＤＯＰ５Ｐ、ＤＯＰ６Ｐ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＴＣ-Ｃｈｏｌ、ＤＡＣ-Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-ベタイン、Ｎ-メチル-ＰｉｐＣｈｏｌ、ＣＴＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、Ｃｈｉｍ、ＭｏＣ３Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ３、Ｃｈｏｌ-Ｃ３Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-Ｃ４Ｎ-Ｍｏ２、Ｃｈｏｌ-ＤＭＣ３Ｎ-Ｍｏ２、ＣｈｏｌＣ４Ｈｅｘ-Ｍｏ２、ＤｍＣ４Ｍｏ２、ＤｍＣ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ２、Ｃ３Ｍｏ３、Ｃ５Ｍｏ２、Ｃ６Ｍｏ２、Ｃ８Ｍｏ２、Ｃ４Ｍｏ４、ＰｉｐＣ２-Ｃｈｏｌ、ＭｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＰｙｒｒｏＣ２Ｃｈｏｌ、ＩｍＣ３Ｃｈｏｌ、ＰｙＣ２Ｃｈｏｌ、ＭｏＤＯ、ＭｏＤＰ、ＤＯＩＭまたはＤＰＩＭ。
【請求項８】
両性リポソームがＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＭｏＣｈｏｌ、ＣＨＥＭＳおよびＣｈｏｌを含む混合物である、請求項１〜７のいずれかに記載の両性リポソーム：
【請求項９】
該リポソームが、５０〜１０００ｎｍの範囲内のサイズを有する請求項１〜８のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１０】
該リポソームが、細胞標的化リガンドおよび／または粒子を立体的に安定化する膜形成分子または膜配置分子を含有する請求項１〜９のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１１】
該リポソームが少なくとも１つの活性物質を封入している請求項１〜１０のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１２】
該活性物質が、脊椎動物細胞において１つまたはそれ以上のＲＮＡに転写されうる核酸を含有し、該ＲＮＡがｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミアーまたはリボザイムであり、該ｍＲＮＡが１つまたはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードしている請求項１１に記載の両性リポソーム。
【請求項１３】
該核酸が、環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ構築物またはｍＲＮＡである請求項１２に記載の両性リポソーム。
【請求項１４】
該活性物質がオリゴヌクレオチドである請求項１１に記載の両性リポソーム。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、転写に影響を与える物質、スプライシングに影響を与える物質、リボザイム、ＤＮＡザイム、アプタマーまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである請求項１４に記載の両性リポソーム。
【請求項１６】
該オリゴヌクレオチドが、ホスフェートまたはホスホチオエート形態にあるＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックされた核酸(ＬＮＡ)、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、２'Ｏ-メチルＲＮＡ(２'Ｏｍｅ)、２'Ｏ-メトキシエチルＲＮＡ(２'ＭＯＥ)などの修飾ヌクレオチドを含有する請求項１４または１５のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１７】
少なくとも８０重量％の該活性物質が該リポソーム内部に配置されている請求項１１〜１６のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１８】
該リポソームが未封入の活性物質を含有する請求項１１〜１４のいずれかに記載の両性リポソーム。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれかに記載の活性物質を装填した両性リポソームおよびそのための医薬的に許容しうるビヒクルを含有する医薬組成物。
【請求項２０】
細胞のインビトロ、生体外トランスフェクションのための、請求項１〜１８のいずれかに記載の両性リポソームの使用。
【外国語明細書】
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