(57)【要約】【課題】抗酸化組成物の抗酸化活性について、より人体に近い中性域にて評価することのできる抗酸化活性の検査方法を提供する。【解決手段】活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定することとした。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定する抗酸化活性の検査方法。
【請求項２】
前記検体の異なる複数の測定サンプル液を調製し、各測定サンプル液からの化学発光の強度を比較して、前記複数の測定サンプル液のうち所定の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性の、他の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性に対する強弱を判定する請求項１に記載の抗酸化活性の検査方法。
【請求項３】
前記活性酸素含有水は、励起させた光触媒体に水を接触させることにより、この水に前記光触媒体の表面にて生成した活性酸素種を分散させて調製したものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗酸化活性の検査方法。
【請求項４】
前記光触媒体に接触させる水は、同水に所定の物質を添加する供給水処理部を介して供給されたものであり、
前記所定の物質は、酸素ガス、オゾンガス、塩素ガス、一酸化窒素ガス、アンモニアガス、金属塩から選ばれる少なくともいずれか１種であることを特徴とする請求項３に記載の抗酸化活性の検査方法。
【請求項５】
前記金属塩はNaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、CuSO4より選ばれる少なくともいずれか１種であって、
前記水中における濃度は、NaCl及びCaCl2にあっては0.05mM〜50mMの濃度であり、
KCl、MgCl2にあっては0.05mM〜5mMの濃度であり、
CuSO4にあっては50μM〜200μMであることを特徴とする請求項４に記載の抗酸化活性の検査方法。
【請求項６】
前記ルシフェリン類は、ウミホタルルシフェリン類縁体(Cypridina Luciferin Analog)であることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項に記載の抗酸化活性の検査方法。
【請求項７】
シトシン及びグアニンの繰り返し配列を有するオリゴDNAと銅との複合体をスーパーオキシドアニオンラジカルの消去物質の指標物質として用いることを特徴とする請求項１〜６いずれか１項に記載の抗酸化活性の検査方法。
【請求項８】
活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した測定サンプル液の、前記検体を含まない前記発光基液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記検体における抗酸化活性の有無を判定するためのデータが記録された媒体。
【請求項９】
活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した前記検体がそれぞれ異なる複数の測定サンプル液のうち所定のサンプル液の、他のサンプル液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのデータが記録された媒体。
【請求項１０】
生体内において実質的に有効な投与量が未知の第１の抗酸化活性薬剤の、生体内において実質的に有効な投与量が既知の第２の抗酸化活性薬剤と同等の薬効を生起させる指標となる投与量の決定方法であって、
活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に、前記第１の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第１の測定サンプル液と前記発光基液中に前記第２の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第２の測定サンプル液とを調製し、各測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ経時的に計測し、前記発光基液の発光強度の経時変化曲線下面積に対する前記第２の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積の割合の±25％の誤差範囲内に含まれる前記第１の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積となる濃度を前記第１の抗酸化活性薬剤の指標投与量とすることを特徴とする指標投与量の決定方法。
【請求項１１】
シトシン及びグアニンの繰り返し配列を有するオリゴDNAと銅との複合体であり、請求項１〜６いずれか１項に記載の抗酸化活性の検査方法によりスーパーオキシドアニオンラジカルの消去物質として評価可能な抗酸化物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝や外的ストレス等によって発生する活性酸素は極めて高い反応性を有しており、ヒトの体内においてタンパク質や脂質、ＤＮＡ等と反応し、生活習慣病の発症や老化の促進、虚血再灌流後の組織障害、ＤＮＡ障害によるガン細胞の発現をもたらすと考えられている。
【０００３】
そこで従来、これらの酸化傷害を防ぐべく、活性酸素を消去する食品や化粧品、医薬品等（以下、総称して抗酸化組成物ともいう。）が種々提案されている。
【０００４】
そして、これらの抗酸化組成物によれば、体内や皮膚表面などで抗酸化能を生起させることができ、体内環境や皮膚の健全化を図ることができるとされている。
【０００５】
ところで、これらの抗酸化組成物における抗酸化能は、具体的に数値や比率として評価できることが望ましい。
【０００６】
そこで、抗酸化組成物の抗酸化能を評価する方法がこれまでにいくつか提案されている。
【０００７】
例えば、DPPHラジカル消去活性測定として知られる方法は、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylラジカルと抗酸化物質を一定時間反応させた後、520nmの吸光度を測定し、吸光値の減少を濃度既知のTroloxの吸光度に対する相対値として算出するというものである。
【０００８】
また、活性酸素吸収能力(ORAC法)として知られる方法は、AAPH(2,2’-azo-bis(2-amidinopropane) dihydrochloride)を用いてペルオキシラジカル(ROO・)を発生させ、このラジカルにより分解されるFluoresceinの蛍光強度を経時的に測定し、その現象曲線下の面積(AUC:Area Under the Curve)を求める。そして、抗酸化物質の存在下で測定したAUCからBlanｋのAUCを引いた差(net AUC)を計算して、濃度既知のTroloxにおけるnet AUCに対する相対値を求め、Trolox当量に換算して表示するものである（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】沖  智之：ORAC法, 食品機能性評価マニュアル集第II集, p79-86 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述したDPPHラジカル消去活性測定では、アントシアニンを含有する場合などは吸光度が重なり測定できずHPLCでの分離後測定する必要があるという問題がある。
【００１１】
また、上述したORAC法では、親水性H-ORACと親油性L-ORACがあるが、いずれも有機溶媒への溶解を必要とし、カロチノイドなどの抗酸化剤などの測定はできないという問題がある。
【００１２】
そして、いずれの方法にも共通する問題点として、ラジカルの分解測定を行うため、ｐＨを14付近として測定を行わなければならないという点が挙げられる。
【００１３】
現在、ORAC法においてフルオロセインが標準プローブとして利用されているが、この方法では、血漿中の尿酸が主たる抗酸化物質として測定されてしまい。高尿素血症患者の血漿におけるORAC値が健常者よりも高く評価されるなどの問題が指摘されている（参照文献１：二木鋭雄「抗酸化物質の活性、効能に関する話題：USDAによるORACデータベースの撤回」ビタミン 86巻(9号), pp. 519-520. Etsuo Niki (2012) Topics on capacity and benefitial effects of antioxidants: Removal of ORAC data base by USDA. VITAMINS 86(9), 519-520.）。
【００１４】
上記のように特定の抗酸化物のORAC値がヒトの健康と直接関連しないことから、米国農務省（USDA）の栄養データラボラトリー（NDL）は2012年5月16日にORACデータベースを撤回すると発表している（参照文献２：http://www.ars.usda.gov/Services/docs.htm?docid=15866）。
【００１５】
またORAC法では、抗酸化物によるラジカルを捕捉する速度と量（濃度）を区別できない点も問題点として指摘されている（参照文献３：Niki E. (2010) Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free Radical Biology and Medicine 49(4):503-515.）。
【００１６】
さらに経口的に摂取する食品や医薬品および血管内へ投与される医薬品は、体内において抗酸化活性を生起するものであり、その抗酸化活性が発揮される環境のｐＨは中性〜酸性領域である。また、皮膚表面にて使用する化粧品類についても、その抗酸化活性が発揮される環境のｐＨは中性〜弱酸性領域である。
【００１７】
すなわち、上述した抗酸化活性の評価方法はいずれも強アルカリ環境下における抗酸化活性を測定するものであり、これら抗酸化組成物が実際に体内や皮膚表面においてどの程度の抗酸化活性を発揮するのかについて評価する方法としては馴染まないものであった。
【００１８】
本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、抗酸化組成物の抗酸化活性について、より人体に近い中性域にて評価をすることができ、しかもラジカル捕捉因子の反応速度と濃度を検出可能な抗酸化活性の検査方法を提供する。また本発明では、この検査方法によって得られたデータが記録された媒体や、生体内において実質的に有効な投与量が未知の抗酸化活性薬剤の指標投与量の決定方法についても提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記従来の課題を解決するために、本願請求項１に係る発明では、抗酸化活性の検査方法において、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定することとした。
【００２０】
また、本願請求項２に係る発明では、請求項１に記載の抗酸化活性の検査方法において、前記検体の異なる複数の測定サンプル液を調製し、各測定サンプル液からの化学発光の強度を比較して、前記複数の測定サンプル液のうち所定の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性の、他の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性に対する強弱を判定することとした。
【００２１】
また、本願請求項３に係る発明では、請求項１又は請求項２に記載の抗酸化活性の検査方法において、前記活性酸素含有水は、励起させた光触媒体に水を接触させることにより、この水に前記光触媒体の表面にて生成した活性酸素種を分散させて調製したものであることを特徴とすることとした。
【００２２】
また、本願請求項４に係る発明では、請求項３に記載の抗酸化活性の検査方法において、前記光触媒体に接触させる水は、同水に所定の物質を添加する供給水処理部を介して供給されたものであり、前記所定の物質は、酸素ガス、オゾンガス、塩素ガス、一酸化窒素ガス、アンモニアガス、金属塩から選ばれる少なくともいずれか１種であることを特徴とすることとした。
【００２３】
また、本願請求項５に係る発明では、請求項４に記載の抗酸化活性の検査方法において、前記金属塩はNaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、CuSO4より選ばれる少なくともいずれか１種であって、前記水中における濃度は、NaCl及びCaCl2にあっては0.05mM〜50mMの濃度であり、KCl及びMgCl2にあっては0.05mM〜5mMの濃度であり、CuSO4にあっては50μM〜200μMであることを特徴とすることとした。
【００２４】
また、本願請求項６に係る発明では、請求項１〜５いずれか１項に記載の抗酸化活性の検査方法において、前記ルシフェリン類は、ウミホタルルシフェリン類縁体(Cypridina Luciferin Analog)であることを特徴とすることとした。
【００２５】
また、本願請求項７に係る発明では、シトシン及びグアニンの繰り返し配列を有するオリゴDNAと銅との複合体をスーパーオキシドアニオンラジカルの消去物質の指標物質として用いることを特徴とすることとした。
【００２６】
また、本願請求項８に係る発明では、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した測定サンプル液の、前記検体を含まない前記発光基液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記検体における抗酸化活性の有無を判定するためのデータが記録された媒体とした。
【００２７】
また、本願請求項９に係る発明では、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した前記検体がそれぞれ異なる複数の測定サンプル液のうち所定のサンプル液の、他のサンプル液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのデータが記録された媒体とした。
【００２８】
また、本願請求項１０に係る発明では、生体内において実質的に有効な投与量が未知の第１の抗酸化活性薬剤の、生体内において実質的に有効な投与量が既知の第２の抗酸化活性薬剤と同等の薬効を生起させる指標となる投与量の決定方法であって、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に、前記第１の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第１の測定サンプル液と前記発光基液中に前記第２の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第２の測定サンプル液とを調製し、各測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ経時的に計測し、前記発光基液の発光強度の経時変化曲線下面積に対する前記第２の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積の割合の±25％の誤差範囲内に含まれる前記第１の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積となる濃度を前記第１の抗酸化活性薬剤の指標投与量とすることを特徴とする指標投与量の決定方法とした。
【００２９】
また、本願請求項１１に係る発明では、シトシン及びグアニンの繰り返し配列を有するオリゴDNAと銅との複合体であり、請求項１〜６いずれか１項に記載の抗酸化活性の検査方法によりスーパーオキシドアニオンラジカルの消去物質として評価可能な抗酸化物質とした。
【発明の効果】
【００３０】
本願請求項１に係る発明によれば、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定することとしたため、抗酸化組成物の抗酸化活性について、より人体に近い中性域にて評価することのできる抗酸化活性の検査方法を提供することができる。
【００３１】
また、本願請求項２に係る発明によれば、前記検体の異なる複数の測定サンプル液を調製し、各測定サンプル液からの化学発光の強度を比較して、前記複数の測定サンプル液のうち所定の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性の、他の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性に対する強弱を判定することとしたため、複数の測定サンプル液のうち、所定の測定サンプル液中の検体について、他の測定サンプル液中の検体と抗酸化活性の比較を行うことができる。
【００３２】
また、本願請求項３に係る発明によれば、前記活性酸素含有水は、励起させた光触媒体に水を接触させることにより、この水に前記光触媒体の表面にて生成した活性酸素種を分散させて調製したものであることとしたため、高濃度の活性酸素種を含有させて検査を行うことができる。
【００３３】
また、本願請求項４に係る発明によれば、前記光触媒体に接触させる水は、同水に所定の物質を添加する供給水処理部を介して供給されたものであり、前記所定の物質は、酸素ガス、オゾンガス、塩素ガス、一酸化窒素ガス、アンモニアガス、金属塩から選ばれる少なくともいずれか１種であることとしたため、さらに高濃度の活性酸素種を含有させて検査を行うことができる。
【００３４】
また、本願請求項５に係る発明によれば、前記金属塩はNaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、CuSO4より選ばれる少なくともいずれか１種であって、前記水中における濃度は、NaCl及びCaCl2にあっては0.05mM〜50mMの濃度であり、KCl及びMgCl2にあっては0.05mM〜5mMの濃度であり、CuSO4にあっては50μM〜200μMであることとしたため、効率よく高濃度の活性酸素種を含有させて検査を行うことができる。
【００３５】
また、本願請求項６に係る発明によれば、前記ルシフェリン類は、ウミホタルルシフェリン類縁体(Cypridina Luciferin Analog)であることとしたため、発光基液中における検体の存在／非存在や、複数の検体間の抗酸化活性の強弱について、感度良く検出を行うことができる。
【００３６】
また、本願請求項７に係る発明によれば、シトシン及びグアニンの繰り返し配列を有するオリゴDNAと銅との複合体をスーパーオキシドアニオンラジカルの消去物質の指標物質として用いることとしたため、堅実な検査を行うことができる。
【００３７】
また、本願請求項８に係る発明によれば、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した測定サンプル液の、前記検体を含まない前記発光基液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記検体における抗酸化活性の有無や強弱を判定するためのデータが記録された媒体としたため、比較的速やかに検体が抗酸化活性を有するか否かやその強弱ついて検討を行うことができる。
【００３８】
また、本願請求項９に係る発明によれば、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した前記検体がそれぞれ異なる複数の測定サンプル液のうち所定のサンプル液の、他のサンプル液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのデータが記録された媒体としたため、比較的速やかに所定の検体が他の検体に比してどの程度の抗酸化活性を有するのかを検討することができる。
【００３９】
また、本願請求項１０に係る発明によれば、生体内において実質的に有効な投与量が未知の第１の抗酸化活性薬剤の、生体内において実質的に有効な投与量が既知の第２の抗酸化活性薬剤と同等の薬効を生起させる指標となる投与量の決定方法であって、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に、前記第１の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第１の測定サンプル液と前記発光基液中に前記第２の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第２の測定サンプル液とを調製し、各測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ経時的に計測し、前記発光基液の発光強度の経時変化曲線下面積に対する前記第２の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積の割合の±25％の誤差範囲内に含まれる前記第１の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積となる濃度を前記第１の抗酸化活性薬剤の指標投与量とすることとしたため、生体内において実質的に有効な投与量が未知の第１の抗酸化活性薬剤の指標投与量を容易に決定することができる。
【００４０】
また、本願請求項１１に係る発明によれば、シトシン及びグアニンの繰り返し配列を有するオリゴDNAと銅との複合体であり、請求項１〜６いずれか１項に記載の抗酸化活性の検査方法によりスーパーオキシドアニオンラジカルの消去物質として評価可能な抗酸化物質としたため、抗酸化活性の検査方法において正確な検査結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】金属塩を添加した際の活性酸素含有水中の活性酸素種濃度を示した説明図である。
【図２】活性酸素含有水の抗酸化活性評価における有効性の検証結果を示した説明図である。
【図３】グルタチオンの抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図４】アスコルビン酸の抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図５】Z型オリゴDNA・Cu2+複合体による濃度依存的抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図６】Z型オリゴDNAとCu2による複合体形成により発揮される抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図７】エダラボン製剤の抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図８】レモン等の抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図９】トマト等の抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【図１０】清涼飲料水の抗酸化活性の評価結果を示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、活性酸素種を少なくとも1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定する抗酸化活性の検査方法を提供するものである。
【００４３】
前述のように、従来、薬品・化粧品・食物・飲料の有する抗酸化能の評価には、有機化合物の反応過程に発生するラジカル種に対する消去能を用いて評価を行ってきた。代表的な抗酸化能評価方法は、キサンチンオキシダーゼをピポキサンチンに反応させた時に生じるスーパーオキシドアニオンラジカルとテトラゾリウム塩WST-1との還元反応において生成する水溶性のホルマザンWST-1を吸光度により測定することで、スーパーオキシドアニオンラジカルを基質とする酵素活性（スーパーオキシドディスムターゼ活性）を評価する方法ならびにORAC法、DPPHラジカル消去活性(SET)法などの化学反応を用いたラジカル捕捉型の抗酸化物質の評価方法などがある。
【００４４】
しかしながら、DPPHラジカル消去活性(SET)法では、有機ラジカルを利用することにより、含水状態では試料全体評価は出来ず凍結乾燥等の条件にて評価する事となる。そのためポリフェノール活性やアントシアニン含有試料等は、その分析量を別途測定せねばならず、接種および投与する状態での評価が不可能である。(そのものでの評価は出来ない)
【００４５】
ORAC法では、本来、健常者の生体内や食品中に含まれるべきでない高濃度尿酸などの活性が高く評価される問題があり、またキサンチンオキシダーゼとホルマザン生成反応を利用したスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性およびＳＯＤ様活性の評価方法では、スーパーオキシドアニオンラジカル（O2-）に対する消去能を有する抗酸化物質とO2-生成酵素であるキサンチンオキシダーゼに対する阻害物質の効果を識別することが出来ない。
【００４６】
またスーパーオキシドアニオンラジカル（O2-）の消去能に関して、何れの手法においてもアスコルビン酸のように直接的にO2-をはじめとした活性酸素と非選択的に反応する低分子型抗酸化物質群とスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）のように選択的なO2-の分解反応を触媒する高分子型抗酸化物質群の活性を識別することは困難である。
【００４７】
また、評価時のｐＨは強アルカリ性での評価となり、試料の変成を生じる可能性がある。さらに有機ラジカルを使用することにより、試料との直接反応を生じるため正確な評価が出来ないことがある。
【００４８】
また、キットなどで販売されているが、安定性再現性に問題が生じる事がある。
【００４９】
さらに、総合的な評価ではないため、抗酸化能を有すると言われている物質の総量表示で、食品の抗酸化活性が表現されており、対象試料の総合評価としての抗酸化活性の強度を示すことが出来ない。(例えばビタミンC1000mg、クエン酸3000mg、ポリフェノール10mg等)
【００５０】
そこで、本発明者らは鋭意研究を重ね、これまで光触媒反応水生成装置およびレドックス活性を有する水の生成装置等で、定常的に生成する事が可能となった長時間活性酸素を検出する事が可能な水を用い、試料の抗酸化能を評価するという着想を得た。
【００５１】
評価方法は、ウミホタルルシフェリンアナログ(CLA)を用いた化学発光法にて行う。飽和CLA溶液 5μLに、試料5μLを加えた後、定常状態に達した活性酸素含有水490μLを添加し5分間蛍光発光を計測する。スパイク強度1μmol/L(KO2 concentration)以上の発光強度が、5分以上連続して検出できる状態を定常状態に達したと規定する。
【００５２】
試料を添加していないサンプルとの発光強度を比較して、対象となる試料の抗酸化能と評価する。
【００５３】
本法で主として評価可能な活性酸素種は、一重項酸素またはかつスーパーオキシドアニオンラジカルである。相対する2種の活性酸素種を用いて評価できるため、カチオン系抗酸化物質およびアニオン系抗酸化物質の両者の評価を行う事が可能である。
【００５４】
また、活性酸素種を除去する抗酸化物質には、スーパーオキシドアニオンラジカル（O2-）の消去活性が知られるものと、過酸化水素（H2O2）、ヒドロキシラジカル（HO-）、一重項酸素（1O-）などそれ以外の活性酸素種に対してのみ作用することが知られるものとに大別することが出来る。O2-に対する消去能を有することが知られる抗酸化物質としては、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アスコルビン酸、ビリルビンなどが知られる。
【００５５】
一方、ORAC法で高い抗酸化活性を有する物質として評価される尿酸はスーパーオキシドアニオンラジカル（O2-）消去能をもたない。従って、ORAC法の問題点として指摘されている、高尿素血症患者の血漿におけるORAC値が健常者よりも高く評価されるなどの問題（前述の参照文献１）は、スーパーオキシドアニオンラジカル（O2-）に対する消去能をより高く反映した評価を行うことによっても回避できる。
【００５６】
評価指標として対象となるコントロール曲線(area under curve)と試料添加群の呈する曲線との差による減少曲線下領域の面積比により数値化する事も可能であるが、曲線の図表による直接的視覚的評価が最も説得力が高い。
【００５７】
活性酸素種は、元来、ウイルスや細菌の感染時におけるマクロファージの病原体排除機構をはじめとする生体防御に関わるなど、健康維持に重要な役割を担っている。しかし反応性が非常に高いため、ひとたび過剰となると生体中の蛋白質や脂質、あるいはDNAなどの高分子と反応して蛋白質の変成や過酸化脂質の生成や遺伝子障害などを起こし、生活習慣病の発症や老化の促進、発癌作用などを招来するとされている。また脳梗塞や心筋梗塞など臓器の虚血再灌流障害時には、活性酸素種による組織障害が増強され、組織の浮腫や不可逆的変性を生じるとされる。
【００５８】
そのため抗酸化能評価を適切に行い、試料の効能予測および動態予測を含め、濃度効果を簡便に評価する事が必要とされている。本法では親水性の物質であれば対象試料の事前処置を必要とせず、大量の検体を比較評価する事が可能である。例えば、品種ごとの抗酸化活性比較や飲料水の抗酸化活性などが、容易に再現性を持ち可能である。
【００５９】
本法の利用により適切に評価された飲料や薬剤、食品の開発が進む事で、超高齢化社会の健康増進への寄与を行う事が可能となると考えられる。
【００６０】
ここで本明細書における活性酸素種としては、例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル(O2-)、ヒドロキシラジカル(・OH)、脂質過酸化物(LOOH, LOO・)、ハロゲン化酸素(ClO-)、一酸化窒素ラジカル(NO・)、含酸素有機ラジカル種(例としてフェノキシラジカル)などいわゆるフリーラジカルと呼ばれるものに、一重項酸素(1O2)および一重項酸素より生成された環状ペルオキシドやヒドロペルオキシドを加えたものとし、過酸化水素は含まないものとする。
【００６１】
また、本実施形態に係る検査方法にて使用する活性酸素含有水は、これらのような活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して１μＭ以上の濃度で含有するものである。超酸化カリウム(KO2)に換算して１μＭ未満の濃度であると例えば水道水に含有する微量のオゾン代謝物によって発現する発光と類似するため好ましくない。超酸化カリウム(KO2)に換算して１μＭ以上の濃度で活性酸素種を含有する事は、Tiron添加によりスーパーオキシドアニオンラジカルを主体とした活性酸素種である事が確認され、またDABCO添加により一重項酸素を含有する活性酸素種である事を確認することができる。
【００６２】
また、活性酸素含有水は特に限定されるものではないが、励起させた光触媒体に水を接触させることにより、この水に前記光触媒体の表面にて生成した活性酸素種を分散させて調製したものであるのが望ましい。
【００６３】
活性酸素含有水を調製するに際しこのような方法とした場合には、超酸化カリウム(KO2)に換算して１μＭ以上の活性酸素種を比較的容易に水中に存在させることができるため、極めて効率的に検査を行うことができる。また、長時間持続的に検出が可能な活性酸素含有水とすることができる。
【００６４】
また、本実施形態に係る検査方法にて使用するルシフェリン類は、活性酸素種の存在下で発光を示すものであり、例えば、前述のスーパーオキシドアニオンラジカル(O2-)、ヒドロキシラジカル(・OH)、脂質過酸化物(LOOH, LOO・)、ハロゲン化酸素(ClO-)、一酸化窒素ラジカル(NO・)、含酸素有機ラジカル種(例としてフェノキシラジカル)などいわゆるフリーラジカルと呼ばれるもの、一重項酸素(1O2)、一重項酸素より生成された環状ペルオキシドやヒドロペルオキシドの少なくともいずれか１つによって発光を示すものであれば良い。
【００６５】
このようなルシフェリン類の具体例としては、例えばウミホタルルシフェリン類縁体(Cypridina Luciferin Analog)を用いることができる。ルシフェリン類をウミホタルルシフェリン類類縁体とすることにより、発光基液中における検体の存在／非存在や、複数の検体間の抗酸化活性の強弱について、感度良く検出を行うことができる。尚、ウミホタルルシフェリン類縁体は、O2-および1O2に特異的に反応し発光する化学発光プローブであり、O2-および1O2に特化した活性酸素消去能の評価に有効である。
【００６６】
そして本実施形態に係る検査方法では、このルシフェリン類と前述の活性酸素含有水とが混合された液を発光基液として使用する。発光基液は、検体の抗酸化活性を測定するための測定サンプル液のベースとなる液であると共に、測定サンプル液との比較を行うためのコントロール液ともなる液である。
【００６７】
すなわち、抗酸化活性の測定を行う検体を発光基液中に存在させることで測定サンプル液が調製される。なお、測定サンプル液の調製における活性酸素含有水とルシフェリン類と検体との混合順は特に限定されるものではなく、検体の性状に応じて適宜決定することができる。例えば、検体が液体状であれば、発光測定用キュベット等にまず検体を分注し、次いでルシフェリン類を添加して、最後に活性酸素含有水を添加するようにして測定サンプル液を調製しても良い。このような方法によれば、ルシフェリン類による発光開始を測定直前まで抑制することができ、また、測定サンプル液中における検体の攪拌を省略することもできる場合がある。特に検体量や測定サンプル液の総量が少ない場合は、このような手順が有効である。
【００６８】
このようにして調製した測定サンプル液は、直ちに化学発光測定に供する。化学発光の測定に用いる機器は、活性酸素種によってルシフェリン類より発せられた光の波長の強度を検出可能な装置であれば特に限定されるものではなく、例えば、アトー株式会社製のルミノメータやルミネッセンサー等を用いることができる。
【００６９】
発光強度の測定は、発光開始後所定のタイミングにおける強度を測定しても良く、また、発光開始後所定時間までの強度の経時変化を計測するようにしても良い。
【００７０】
そして、検体を含まない発光基液をコントロール（ポジティブコントロール）として、測定サンプル液の発光強度と比較し、測定サンプル液の発光強度がコントロールに比してどのような挙動を示すかにより検体が抗酸化活性を有するか否かを判断することができる。
【００７１】
具体的には、コントロールに比して、測定サンプル液の発光強度が低下していたならば、活性酸素水由来の活性酸素種の働きが検体により抑制されていることとなり、検体は抗酸化活性を有すると判定することができる。なお、必要に応じてネガティブコントロールを設けても良いのは勿論である。ネガティブコントロールは、例えば水道水、リン酸バッファー液、蒸留水、活性酸素含有水のみとしても良い。
【００７２】
ところで、上述の検査方法では、コントロールと測定サンプル液との比較について言及したが、測定サンプル液は、他の測定サンプル液との比較を行うこともできる。
【００７３】
すなわち、検体の異なる複数の測定サンプル液を調製し、各測定サンプル液からの化学発光の強度を比較して、複数の測定サンプル液のうち所定の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性の、他の測定サンプル液に添加した検体における抗酸化活性に対する強弱を判定するようにしても良い。
【００７４】
このような方法とすることにより、例えば市販の健康食品Ｘと健康食品Ｙとについて、いずれの健康食品の方が高い抗酸化活性を呈するかを比較検討することが可能となる。例えば、抗酸化活性の極めて高い野菜ジュースを提供としようとした場合、配合する成分比率の変化や組成品種の違いにより、最も味覚が優れ、食品栄養学的にも高く、しかも抗酸化活性を示す野菜ジュースを配合調整することが可能となる。
【００７５】
また、前述の発光測定により得られたデータは、所定の媒体に記録することで、検体における抗酸化活性の有無を判定するためのデータや、所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのデータとして利用することもでき、アプリケーションとして情報提供することができる。
【００７６】
すなわち、活性酸素種を少なくとも1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した測定サンプル液の、前記検体を含まない前記発光基液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記検体における抗酸化活性の有無を判定するためのデータが記録された媒体としても良い。
【００７７】
また、活性酸素種を少なくとも1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて調製した前記検体がそれぞれ異なる複数の測定サンプル液のうち所定のサンプル液の、他のサンプル液に対するルシフェリン類由来の化学発光の強度の比が分かる、前記所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのデータが記録された媒体としても良い。
【００７８】
ここで媒体としては、例えば、紙媒体であったり、電気的や磁気的、光学的に記録する媒体であっても良い。このようなデータが記録された媒体によれば、検体がどの程度の抗酸化活性を有するのかについて、容易に確認を行うことができる。
【００７９】
また、本実施形態では、生体内において実質的に有効な投与量が未知の抗酸化活性薬剤（以下、第１の抗酸化活性薬剤ともいう。）の指標投与量の決定方法についても提供する。
【００８０】
例えば、生体内において実質的に有効な投与量が既知の抗酸化活性薬剤（以下、第２の抗酸化活性薬剤ともいう。）があり、有効成分が同じか又は異なる後発医薬品として第１の抗酸化活性薬剤の投与試験を行うとき、第２の抗酸化活性薬剤と略同等の効果を生起するために必要な投与量を決定するために、第１の抗酸化性薬剤の濃度が異なる数多くの製剤を調製し、それをそれぞれ投与して効果効能を観察し適切な投与量を推定するという作業が行われる場合がある。
【００８１】
しかしながら、この作業は多くの被験者や労力を要するものであり、極めて煩雑なものである。
【００８２】
そこで、本実施形態では、生体内において実質的に有効な投与量が未知の第１の抗酸化活性薬剤の、生体内において実質的に有効な投与量が既知の第２の抗酸化活性薬剤と同等の薬効を生起させる指標となる投与量の決定方法であって、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に前記第１の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第１の測定サンプル液と前記発光基液中に前記第２の抗酸化活性薬剤を検体として存在させた第２の測定サンプル液とを調製し、各測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ経時的に計測し、前記発光基液の発光強度の経時変化曲線下面積に対する前記第２の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積の割合の±25％の誤差範囲内に含まれる前記第１の抗酸化活性薬剤の発光強度の経時変化曲線下面積となる濃度を前記第１の抗酸化活性薬剤の指標投与量とすることとしている。
【００８３】
そして、本実施形態に係る指標投与量の決定方法によれば、第２の抗酸化活性薬剤と略同等の効果を生起するために必要な目安となる第１の抗酸化性薬剤の投与量を決定することができ、投与試験を極めて効率化することができ、上述の作業の省力化を図ることができる。
【００８４】
以下、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法や媒体について、図面を参照しながら更に具体的に説明する。
【００８５】
〔１．活性酸素含有水の調製〕
（１−１．活性酸素含有水の生成装置について）
本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法にて用いる活性酸素含有水は、励起させた光触媒体に水を接触させ、この水に前記光触媒体の表面にて生成した活性酸素種を分散させて調製することができる。
【００８６】
このような活性酸素含有水の最も単純な製造方法、すなわち最も単純な活性酸素含有水生成装置としては、所定の容器に貯留した水中に光触媒体を浸漬し、同光触媒体が励起するために必要な紫外線やマイクロ波等の電磁波を光触媒体に照射する構成を備えたものを挙げることができる。このような活性酸素含有水生成装置によれば、光触媒体表面から水中に活性酸素種を分散させて、活性酸素含有水を調製することができる。
【００８７】
また、容器内には、100kHz〜500kHz、又は500kHz以上の超音波を光触媒体に対して照射できる超音波発生源を配設して、光触媒体表面から水中への活性酸素種の分散効率を向上させるようにしても良い。特に、光触媒体を後述の（１−２．触媒体の構成）にて言及する繊維状の光触媒体とした場合には、さらに効率よく水中に活性酸素種を高濃度で含ませることができる。
【００８８】
また、光触媒体に接触させる水は、溜水に限らず流水であっても良い。流水とした場合には、光触媒体が収容された容器内を供給した水が一度だけ通過するように構成したワンパス方式や、循環経路を形成して容器内を複数回通過するよう構成した循環方式とすることもできる。
【００８９】
具体的には、光触媒体を収容した容器に水を供給する給水口と容器内の水を吐出する出水口とを形成し、ワンパス方式の場合は、給水口から流水を供給し、出水口から吐出される水を活性酸素含有水として得る。
【００９０】
また、循環方式の場合は、給水口と出水口とを連結する連結流路を形成し、出水口から吐出された水を再度給水口より容器内へポンプ等を介して供給する。連結流路の中途には例えば三方弁のような流水分岐機構を設けておき、循環する水の一部を流水分岐機構より吐出させて活性酸素含有水として得ることもできる。
【００９１】
なお、このような活性酸素含有水生成装置については、本発明者が先に出願した
国際公開WO2010/032765等に詳しく記載されており、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法にて使用する活性酸素含有水の製造装置として好適に用いることができる。
【００９２】
付言するならば、国際公開WO2010/032765の図１及び図２に記載された活性酸素含有水生成装置Ａや、図３に記載された活性酸素含有水生成装置Ｂを好適に用いることもできる。
【００９３】
（１−２．触媒体の構成）
活性酸素含有水を生成するために用いられる触媒体は、同触媒体に接触させた水中に活性酸素種を含有させることのできるものであれば特に限定されるものではない。しかしながら、より好適には、繊維集合体状に形成した触媒体を用いることもできる。
【００９４】
例えば、直径50〜200μm程度（本実施形態では、100μm）とした金属繊維体の集合体であり、同繊維体は、アルミニウム繊維の表面にアルミナ被膜を焼結させて形成したアルミナ繊維に酸化チタンを被覆させた繊維体を用いることができる。
【００９５】
具体的には、アルミニウムで形成した5mm〜20cmの繊維長を有する複数のアルミニウム繊維を絡み合わせた状態で所定の型枠内に収納して押圧し、前記アルミニウム繊維が単位体積あたり0.5g/cm3〜3g/cm3の密度で集合する所望の形状に整えられたアルミニウム繊維集合体を形成し、同アルミニウム繊維集合体を、その融点温度の約２分の１の温度まで、毎分あたり約５℃以下の温度勾配を維持しながら加熱した後に、融点温度の約２分の１の温度を30分〜3時間維持することにより酸化膜の膜厚を5nm以上とし、その後アルミニウム繊維集合体の融点温度に近い温度まで加熱した後に、その温度近傍で30分〜12時間維持することにより酸化膜の膜厚を50nm以上としてアルミナ繊維集合体を生成し、チタニア化合物を含有するゾル液に前記アルミナ繊維集合体を浸漬して引き上げ、アルミナ繊維集合体を構成するアルミナ繊維の表面に付着したゾル液を乾燥させた後に焼成することにより、アルミナ繊維の表面にチタニア薄膜を形成してチタニア繊維集合体を製造することができる。
【００９６】
また、乾燥前に、ゾル液から引き上げられたアルミナ繊維集合体に対して気体を吹き付けて、アルミナ繊維集合体を構成するアルミナ繊維同士の接点に気体を通気させるようにしても良い。これにより、繊維表面にゾル液乾燥物の結晶（ダマ）ができるのを防止することができ、また、接点近傍においても均一な塗液状態とすることができる。また、ゾル液は、15〜25重量％のチタンジイソプロポキシビスアセチルアセトネートと、5〜10重量％のイソプロパノールと、55〜75重量％のエタノールと、5〜10重量％の水とを含有するようにしても良い。このような組成のゾル液にてチタニアコーティングを行うことにより、均一で剥離し難いチタニアコーティングを行うことができる。また、ゾル液において、チタンジイソプロポキシビスアセチルアセトネートと、エタノールと、水との混合割合を3.5:9:1としても良い。これにより更に強固なチタニア薄膜を形成することができる。また、アルミナ繊維集合体のゾル液への浸漬は、収容するゾル液の体積よりも大きな容積を有する密閉容器内で35℃〜60℃としたゾル液を用いて行うものであり、ゾル液に含有されるアルコールを揮発させながら密閉容器内の気相の圧力を高めつつ浸漬することとしても良い。このようにして行うことにより、ゾル液中でのチタニアの析出を防止しつつ、繊維表面でのきめ細やかな析出を行わせることができ、均一なチタニア薄膜の形成を行わせることができる。
【００９７】
（１−３．活性酸素含有水生成装置に供給する水について）
触媒体に接触させる水は純水や水道水、井戸水、オゾン水などであっても良いが、水中の添加物、溶存酸素濃度、溶存オゾン濃度、温度、pH、粘度等を調整することにより、活性酸素種の活性を制御することが可能である。
【００９８】
具体的には、給水口の上流側に、水に所定の物質等を添加する供給水処理部を設けて水に種々の成分を添加するように構成しても良い。
【００９９】
添加する成分としては、例えば、酸素ガス、オゾンガス、塩素ガス、一酸化窒素ガス、アンモニアガス、金属塩（NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2、CuSO4などの銅およびその化合物,鉄およびその化合物、亜鉛およびその化合物、アルミニウムおよびその化合物等より選ばれる少なくともいずれか１つ）を挙げることができる。
【０１００】
図１に、水に金属塩類を添加した場合における活性酸素種の含有量について検討した結果の例を示す。縦軸は金属塩類を添加した前後のルシフェリン類由来の発光強度の差を示し、横軸は各金属塩を示している。なお、各金属塩の濃度は、活性酸素含有水生成装置に供給する水における終濃度を示している。
【０１０１】
図１からも分かるように、金属塩としてNaClを用いた場合には、NaClを添加しない場合に比して、0.05mMの添加で約4000程発光強度が増強し、0.5mMの添加で約9000程度の発光強度の増強がみられた。また、5mM添加時には、発光強度の増強度合いは減少に転じ約2000程度となり、50mM添加時には約800程度となった。これらのことから、金属塩としてNaClを用いる場合には、0.05mM〜50mM、より望ましくは0.05mM〜5mMの濃度で添加するのが良いことが示された。
【０１０２】
また、金属塩としてCaCl2を用いた場合には、CaCl2を添加しない場合に比して、0.05mMの添加で約5000程発光強度が増強し、0.5mMの添加で発光強度の増強度合いは一度減少に転じ約3000程度の発光強度の増強となった。また、5mM添加時には、再び増加傾向が見られ約6000程度となり、50mM添加時には約10000程度となった。これらのことから、金属塩としてCaCl2を用いる場合には、0.05mM〜50mM、より望ましくは5mM〜50mMの濃度で添加するのが良いことが示された。
【０１０３】
また、金属塩としてKClを用いた場合には、KClを添加しない場合に比して、0.05mMの添加で約4000程発光強度が増強し、0.5mMの添加で約7000程度の発光強度の増強がみられた。また、5mM添加時には、発光強度の増強度合いは減少に転じ約3000程度となり、50mM添加時にはKClを添加しない場合に比して発光が抑制されることとなり約-3000程度となった。これらのことから、金属塩としてKClを用いる場合には、0.05mM〜5mMの濃度で添加するのが良いことが示された。
【０１０４】
また、金属塩としてMgCl2を用いた場合には、MgCl2を添加しない場合に比して、0.05mMの添加で約100程発光強度が増強し、0.5mMの添加で約300程度の発光強度の増強がみられた。また、5mM添加時には約1500程度となり、50mM添加時にはMgCl2を添加しない場合に比して発光が抑制されることとなり約-2000程度となった。これらのことから、金属塩としてKClを用いる場合には、0.05mM〜5mMの濃度で添加するのが良いことが示された。
【０１０５】
（１−４．活性酸素含有水の調製）
活性酸素含有水生成装置に水を供給し、励起させた光触媒に水を接触させることで、この水に光触媒体の表面にて生成した活性酸素種を分散させて活性酸素含有水を調製した。このようにして調製した活性酸素含有水の活性酸素種の濃度は１〜５μＭであった。
【０１０６】
（１−５．活性酸素含有水の抗酸化活性評価における有効性）
前述の（１−４．活性酸素含有水の調製）にて調製した活性酸素含有水が、抗酸化活性を評価可能であるかを、ウシ赤血球由来抗酸化物質スーパーオキシドディスムターゼ（Bovin RBC SOD）を用いて検討を行った。
【０１０７】
具体的には、1.5ml容量の遠沈管に、ウミホタルルシフェリン類縁体(Cypridina Luciferin Analog)で飽和させた25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を５μl分注し、次いで検体液としてのウシ赤血球由来抗酸化物質水溶液5μlを分注した後に、活性酸素含有水490μlを加えて混合させて測定サンプル液を調製した。なお、以下本明細書において、検体が何であるかに関わらず、同様の方法にて測定サンプル液を調製する方法を単に「測定サンプル調製法」と称する。また、本試験においてウシ赤血球由来抗酸化物質スーパーオキシドディスムターゼ水溶液は、最終濃度が0.045U、0.45U、4.5U、45U、450U、830Uとなるように、検体の異なる合計６種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１０８】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図２にその結果を示す。
【０１０９】
図２中縦軸はルシフェリン類由来の発光の強度であり、横軸は時間（秒）である。図２からも分かるように、抗酸化活性を有するウシ赤血球由来抗酸化物質スーパーオキシドディスムターゼの濃度に応じて発光強度が変化しており、具体的には、ウシ赤血球由来抗酸化物質スーパーオキシドディスムターゼの濃度が高く抗酸化活性が高いほど、発光強度が低くなる傾向が見られた。
【０１１０】
この結果から、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法によれば、抗酸化組成物の抗酸化活性を評価できることが示された。
【０１１１】
〔２．抗酸化活性の評価〕
（２−１．薬品の評価−グルタチオン）
前述の〔１．活性酸素含有水の調製〕にて調製した活性酸素含有水を用いて本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法の系におけるグルタチオンの濃度を変化させた際の発光強度について検討を行った。グルタチオンは通常還元型グルタチオンとして細胞内に存在し、酸化ストレス時には電子供与体として作用することにより酸化型グルタチオンに変換されることにより、細胞障害を軽減させるとされているアミノ酸である。
【０１１２】
まず、検体液としてグルタチオン水溶液を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。なお、本試験においてグルタチオン水溶液は、最終濃度が1mM、100μM、10μM、1μM、100nMとなるように添加し、検体の異なる合計５種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１１３】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図３にその結果を示す。
【０１１４】
図３からも分かるように、抗酸化活性を有するグルタチオンの濃度に応じて発光強度が変化しており、具体的には、グルタチオンの濃度が高く抗酸化活性が高いほど、発光強度が低くなる傾向が見られた。
【０１１５】
この結果から、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法によれば、抗酸化組成物の抗酸化活性を評価できることが示された。また、測定サンプル液はいずれも中性であり、より人体に近い中性域での抗酸化活性測定が可能であることが示された。
【０１１６】
（２−２．薬品の評価−アスコルビン酸）
次に、アスコルビン酸の濃度を変化させた際の発光強度について検討を行った。アスコルビン酸は栄養素ビタミンCとして広く抗酸化物質と知られ、食品添加物の酸化防止剤としても利用されている。しかしその活性時間は短い。
【０１１７】
まず、検体液としてアスコルビン酸水溶液を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。なお、本試験においてアスコルビン酸水溶液は、最終濃度が1mM、100μM、10μM、3μM、1μMとなるように添加し、検体の異なる合計５種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１１８】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図４にその結果を示す。
【０１１９】
図４からも分かるように、抗酸化活性を有するアスコルビン酸の濃度に応じて発光強度が変化しており、具体的には、アスコルビン酸の濃度が高く抗酸化活性が高いほど、発光強度が低くなる傾向が見られた。特に、グルタチオン同様に10μＭ以上の高濃度のアスコルビン酸も濃度依存性に発光強度が低くなる傾向が見られ、高い抗酸化活性を呈する。
【０１２０】
また注目すべきは、1μMと3μMとを比較した場合、約50秒まではほぼ同等の発光強度を示したが、その後100秒までに間に1μMの方は急激に抗酸化活性が失われコントロール曲線に近似した高い発光強度を示す一方、3μMの方は抗酸化活性を維持しつつ100秒辺りで抗酸化活性が失われるという挙動を示している。このように、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法によれば、経時的な発光強度を観察することにより、抗酸化活性が時間的にどのような変化を示すかを知ることができる。
【０１２１】
併せて、この結果から、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法によれば、抗酸化組成物の抗酸化活性を評価できることが示された。また、試料の効能予測および動態予測を含め、濃度効果を簡便に予測する事が可能である事が示された。
【０１２２】
さらに、スーパーオキシドアニオンラジカル（O2-）の消去能に関して、アスコルビン酸は直接的にO2-をはじめとした活性酸素と非選択的に反応する低分子型抗酸化物質と判断できる。一方、グルタチオンやスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、選択的なO2-の分解反応を触媒する高分子型抗酸化物質であると識別できる。
【０１２３】
（２−３．薬品の評価−Z型DNA・Cu2+複合体の抗酸化活性の評価）
新規の高分子型生体触媒として、2本鎖を形成しZ型構造をとる6塩基対からなる２本鎖オリゴDNAである5’-CGCGCG-3’を作製した。対照として、非Z型の２本鎖ＤＮＡ構造を形成する5’-ATATAT-3’および１本鎖のオリゴDNAである5’-CCCCCC-3’および5’-GGGGGG-3’も作製した。
【０１２４】
まず、検体液としてZ型DNA・Cu2+複合体溶液を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。Z型DNA・Cu2+複合体溶液は、所定最終濃度の硫酸銅(CuSO4)水溶液に図５（ａ）にて示す塩基配列を有する6塩基対の二本鎖DNAを１：１濃度で添加して調製した。なお、本試験においてZ型DNA・Cu2+複合体溶液は、最終濃度が30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μMとなるように添加し、検体の異なる合計５種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１２５】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図５（ｂ）にその結果を示す。
【０１２６】
図５（ｂ）からも分かるように、調製したいずれの測定サンプル液についても、ルシフェリン由来の発光強度はポジティブコントロールよりも顕著に低く、抗酸化活性を有することが示された。
【０１２７】
また、抗酸化活性を有するZ型DNA・Cu2+複合体の濃度に応じて発光強度が変化しており、具体的には、Z型DNA・Cu2+複合体の濃度が高く抗酸化活性が高いほど、発光強度が低くなる傾向が見られた。
【０１２８】
さらに、検体液としてZ型DNAおよび硫酸銅(CuSO4)溶液を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。それぞれの溶液は、最終濃度が100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μMとなるように添加し、検体の異なる各合計７種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１２９】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン由来の発光の強度及び経時変化について測定を行い、その測定結果において最も高い値を示した発光強度数値とコントロールとなる活性酸素含有水の発光強度の最高数値の割合を算出した。図６（ａ）にその結果を示す。
【０１３０】
この結果から、硫酸銅水溶液およびZ型DNA単独での、抗酸化活性は強くなく、両者が酵素＋補酵素的に結合することにより、強い抗酸化活性を呈する事が示された。一方、提示してはいないが、非Ｚ型のオリゴＤＮＡや1本鎖のオリゴＤＮＡでは活性が認められなかった。
【０１３１】
さらに、本試験方法が、他の抗酸化活性法と同様の結果が得られるかの評価を目的として、WST-１ホルマザン試薬との反応を、最も強い抗酸化活性を示した100μM濃度溶液の３サンプルについて、吸光度測定を用いた本実施形態に係る抗酸化活性の検査を行った。図６（ｂ）にその結果（対象区と比較した差スペクトル）を示す。
【０１３２】
この結果にて、前述と同様に、硫酸銅水溶液およびZ型DNA単独では、抗酸化活性を示さず、両者が酵素＋補酵素的に結合することにより、Z型DNA・Cu2+複合体として抗酸化能を示すことが明らかにされた。このように本方法によれば、抗酸化組成物の抗酸化活性を時間・濃度評価できることが示された。
【０１３３】
（２−４．薬品の評価−Edaravone製剤の抗酸化活性の評価）
次に、Edaravone製剤における抗酸化活性の評価を行った。Edaravone (エダラボン)は脳梗塞などによって生じた虚血再灌流障害時に発生する活性酸素種(フリーラジカルと表現されることが多い)に対して、本剤を主として含有する点滴薬が、脳浮腫や組織障害を軽減するとして利用されている。しかし本剤はアニオン系活性酸素種に対する除去作用が強く、ヒドロキシラジカルを代表とするカチオン系活性酸素種による抗酸化活性検出による方法ではスピントラップ法を用いても検出不能であることがある。
【０１３４】
Edaravoneは人体へ投与される際には、経静脈的に血管内へ0.3mg/ml溶液として30分以上の時間をかけ、緩徐に30mg全身投与される。さらに本剤はしばしば、同様の抗酸化作用を有するL-システイン塩酸塩水和物が0.1mg/mlの濃度で混和されている事がある。
【０１３５】
まず、1.5ml容量の遠沈管に、ウミホタルルシフェリン類縁体(Cypridina Luciferin Analog)で飽和させた25mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を５μl分注し、次いで検体液としての検体液として容器より開封し取り出したEdaravone点滴液５〜100μlを分注した後に、活性酸素含有水を加えて混合させつつ500μlにメスアップして測定サンプル液を調製した。なお、本試験においてEdaravone製剤は、最終濃度が60μg/ml、30μg/ml、9μg/ml、6μg/ml、3μg/ml、1.8μg/ml、0.6μg/mlとなるように添加し、検体の異なる合計７種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１３６】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図７にその結果を示す。
【０１３７】
図７からも分かるように、Edaravoneの濃度に応じて発光強度が減弱し、コントロール曲線のArea under curveの50％減弱を示すものは、Edaravone最終濃度3μg/ml濃度が相当する事がわかる。具体的には、最終濃度3μg/ml以上の高濃度のEdaravoneは濃度依存性に発光強度が低くなり、高い抗酸化活性を呈する。しかしEdaravone最終濃度3μg/ml以下のEdaravoneは100秒経過した時点より、その抗酸化活性が急激に減弱し、コントロール曲線に近似していく。
【０１３８】
このことは、今後、抗酸化活性を目的とした薬剤の開発の上で、本法による評価にてArea under curveの50％減弱を示すものを基準として、投与効果の判定を行うのが妥当であることが示された。もちろんこの基準は全身投与にて薬剤を投与する際の基準であり、急性心筋梗塞の治療の際に、カテーテルを通じ局所へ投与する際は、更なる低濃度での投与が可能となり、腎排出性薬剤であることによる全身投与時の副作用発現を軽減することができる。
【０１３９】
また付言すると、本試験にて使用したEdaravone製剤は、リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を５μl、Edaravone点滴液５μl、活性酸素含有水を加えて混合させつつ500μlにメスアップした際に、図７において3μg/mlとして示すカーブを描く濃度、すなわち、0.3mg/mlに調製されている。
【０１４０】
このEdaravone製剤を第２の抗酸化性薬剤と見立てた場合、生体内において実質的に有効な（第２の抗酸化性薬剤と略同等の効果を生起する）投与量が未知の第１の抗酸化活性薬剤の指標投与量の決定するためには、ポジティブコントロールのエリアアンダーザカーブに対するEdaravoneの3μg/mlのエリアアンダーザカーブの割合である約50％と同程度のエリアアンダーザカーブとなる濃度とすれば良い。
【０１４１】
すなわち、ポジティブコントロールのエリアアンダーザカーブに対するEdaravoneの3μg/mlのエリアアンダーザカーブの割合と略同等の割合を示すエリアアンダーザカーブを描く第１の抗酸化性薬剤の測定サンプル中の濃度が同じ実験条件にてＸμg/mlであった場合、Edaravone製剤中のEdaravone濃度である0.3mg/mlと略同等の効果を生起させるための第１の抗酸化性薬剤の濃度は0.1×Ｘmg/mlであるものと指標投与量や指標製剤濃度、指標投与濃度等をin vitro系において容易に決定することができる。
【０１４２】
なお、第２の抗酸化性薬剤と略同等の効果を生起する第１の抗酸化性薬剤の指標投与量を決定するにあたり、ポジティブコントロールのエリアアンダーザカーブに対する第１の抗酸化活性薬剤のエリアアンダーザカーブの割合（以下、第１の割合ともいう。）は、必ずしもポジティブコントロールのエリアアンダーザカーブに対する第２の抗酸化活性薬剤のエリアアンダーザカーブの割合（以下、第２の割合ともいう。）と全く同じである必要はない。本願発明者の経験上、第２の割合の±25％の範囲内に第１の割合が含まれていれば、大凡同様の抗酸化活性や薬効を示すことが分かっており、指標投与量として十分機能するものと考えている。
【０１４３】
また、本試験結果から、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法によれば、抗酸化組成物の抗酸化活性を評価できることが示された。また、測定サンプル液はいずれも中性であり、より人体に近い中性域での抗酸化活性測定が可能であることが示された。
【０１４４】
前述のグルタチオン、アスコルビン酸、エダラボンの結果とスーパーオキシドディスムターゼ、DNA・Cu2+複合体の結果（カーブのパターン）を比較して、試料の希釈系を適切に調整することで活性酸素消去のメカニズムが、活性酸素と非選択的に反応する低分子型抗酸化物質群であるか、選択的なO2-の分解反応を触媒する高分子型抗酸化物質群であるかを、容易に識別することが可能である。
【０１４５】
（２−５．食品の評価−レモン等の抗酸化活性の評価）
次に、市販のレモン及び市販のレモン飲料における抗酸化活性の評価を行った。
【０１４６】
まず、検体液としてレモン汁又はレモン飲料を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。なお、本試験においてレモン飲料は、ビタミンＣを2mg/mlの濃度で含有するものと、7.14mg/mlの濃度で含有するものの２種類を使用し、検体の異なる合計３種類の測定サンプル液の調製を行った。３μＭのアスコルビン酸は大凡0.5mg/mlのビタミンCに相当するため、本サンプルは、途中減弱せず高い抗酸化活性を呈する事が予想できる。
【０１４７】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図８にその結果を示す。
【０１４８】
図８からも分かるように、レモン汁、２種のレモン飲料のいずれについても、ルシフェリン類由来の発光強度はポジティブコントロールよりも顕著に低く、抗酸化活性を有することが示された。
【０１４９】
また、それぞれの測定サンプル液同士を比較すると、ビタミンＣを7.14mg/mlの濃度で含有するレモンジュースは、レモン汁とほぼ同等の抗酸化活性を有することが示唆された。
【０１５０】
また、ビタミンＣを2mg/mlの濃度で含有するレモンジュースは、ビタミンＣを7.14mg/mlの濃度で含有するレモンジュースやレモン汁と比較して、抗酸化活性が低いということが示された。図示していないが、ビタミンＣ 2mg/ml、クエン酸2mg/ml、ポリフェノール20μg/mlを溶解した清涼飲料水は、抗酸化活性成分の相加効果により、レモン汁同等の高い、抗酸化活性を示した。
【０１５１】
本法と同様に、野菜における抗酸化活性の評価として、例えばカイワレ大根、ブロッコリースプラウト、レタスやハーブ類などの葉物野菜等で、野菜の汁を用い直接抗酸化能の評価が可能である。また根菜類などの水分含有量の少ない食品群においては、リン酸バッファー液に対して、試料重量を規定し、ストマッカーにより圧搾した溶液を用いて、比較評価する事が可能である。さらにこの手法によれば、調理方法の違い、例えば湯煎と電子レンジでの加熱等による抗酸化活性の違いなどの評価が容易に出来る。
【０１５２】
加えて冷凍凍結法や凍結乾燥法を代表とする保存方法による抗酸化活性の低下は、ビタミンやポリフェノール類による抗酸化活性ではなく、酵素の凍結障害による失活であることは、本法の評価サンプルに対して、測定直前に凍結操作を加えることで容易に検出する事が出来る。
【０１５３】
（２−６．食品の評価−トマト等の抗酸化活性の評価）
次に、市販のプチトマト及び市販のトマト飲料における抗酸化活性の評価を行った。
【０１５４】
まず、検体液としてプチトマト汁又はトマト飲料を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。なお、本試験においてトマト飲料は２種類を使用し、検体の異なる合計３種類の測定サンプル液の調製を行った。
【０１５５】
調製した測定サンプル液は活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図９にその結果を示す。
【０１５６】
図９中縦軸はルシフェリン類由来の発光の強度であり、横軸は時間（秒）である。図９からも分かるように、プチトマト汁、２種のトマト飲料のいずれについても、ルシフェリン類由来の発光強度はポジティブコントロールよりも顕著に低く、抗酸化活性を有することが示された。
【０１５７】
また興味深いことに、それぞれの測定サンプル液同士を比較すると、未加工のプチトマトの抗酸化活性が最も高く、２種のトマト飲料の比較では、ストレートトマト飲料の方が、濃縮還元トマト飲料に比して抗酸化活性が高いということが示唆された。提示したサンプルにおいて、濃縮還元法による抗酸化活性の失活を思わせる結果となったが、提示していない他のサンプルにおいては、濃縮還元法においても優れた抗酸化活性を呈するサンプルもあり、製法や素材により抗酸化活性を高く維持しうることが示唆された。
【０１５８】
（２−７．食品の評価−清涼飲料水の抗酸化活性の評価）
ジュース等の清涼飲料水においても、ポリフェノールやアントシアニンによる抗酸化活性を謳うものがある。しかし清涼飲料水の中には、還元糖とアミノ酸の反応によりMeillard様反応が惹起され、活性酸素種の生成反応が生じる可能性があるとされている。
【０１５９】
まず、検体液として容器より開封し取り出した清涼飲料を用い、前述の測定サンプル調製法に準じて測定サンプル液を調製した。なお、本試験において使用した清涼飲料水は、2種類の果物を用いてポリフェノール210mg、アントシアニン60mgを含有するとされたものである。
【０１６０】
測定サンプルは同様に活性酸素含有水の添加後直ちに測定装置(ATTO社製ルミネッセンサー）にセットし、ルシフェリン類由来の発光の強度及び経時変化について測定を行った。図１０にその結果を示す。
【０１６１】
図１０からも分かるように、測定開始直後よりルシフェリン類由来の発光強度はポジティブコントロールよりも顕著に高い値を示し、あたかも高濃度の活性酸素を生成するかのように強い発光を呈する。その後含有するポリフェノールやアントシアニンによる抗酸化活性により発光強度は低下する。
【０１６２】
このことは、特筆する抗酸化活性があるとされる果物の中には、輸送中の保存状態により果糖と果物中のアミノ酸が反応しMaillard様反応が生じた可能性があることが示された。
【０１６３】
〔３．記録媒体の作成〕
前述の抗酸化活性の検査方法を行って得られた結果を、紙面上に文字及び数字にて記載し、ポジティブコントロールの発光強度と、各測定サンプル液の発光強度との比が分かるデータが記録された検体における抗酸化活性の有無を判定するための、又は、所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのデータが記録された紙媒体を作成した。
【０１６４】
また、同様に、上記データをコンピュータ上にて入力することによりデータファイルを作成し、このデータファイルをＣＤ−Ｒに記録することで、ポジティブコントロールの発光強度と、各測定サンプル液の発光強度との比が分かるデータが記録された検体における抗酸化活性の有無を判定するための、又は、所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の前記他のサンプル液中の検体に対する強弱を判定するためのＣＤ−Ｒを作成した。
【０１６５】
そして、これらの紙媒体やＣＤ−Ｒによれば、検体が抗酸化活性を有するか否かや、所定のサンプル液中の検体における抗酸化活性の他のサンプル液中の検体に対する強弱について容易に知ることができる。
【０１６６】
また、これらのデータが記録された媒体には、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法、すなわち、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定する抗酸化活性の検査方法にて評価を行った結果である旨を表示する検査方法表示部を紙面上に付記したり、デジタル媒体であれば所定のソフトウェア等を介して視認可能な状態にデジタルデータとして設けても良い。このような検査方法表示部を設けることにより、検査方法を明確に認識させることができる。なお、検査方法表示部に記載する内容は、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法にて検査されたことが分かる記載であれば必ずしも上記文言でなくとも良く、通称などの簡略的な表示であっても良い。
【０１６７】
上述してきたように、本実施形態に係る抗酸化活性の検査方法によれば、活性酸素種を少なくとも超酸化カリウム(KO2)に換算して1μM以上の濃度で含有する活性酸素含有水と前記活性酸素種の存在下で発光を示すルシフェリン類とが混合された発光基液中に抗酸化活性の評価対象となる検体を存在させて測定サンプル液を調製し、同測定サンプル液と、前記検体を含まない前記発光基液とより発せられる前記ルシフェリン類由来の化学発光の強度をそれぞれ計測することにより、前記測定サンプル液からの化学発光の強度が前記発光基液からの化学発光の強度を下回った場合、前記検体は抗酸化活性を有すると判定することとしたため、抗酸化組成物の抗酸化活性について、より人体に近い中性域にて評価することのできる抗酸化活性の検査方法を提供することができる。
【０１６８】
最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。
【図１】
2015161635.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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