(57)【要約】【課題】本発明の目的は、メタロエクトペプチダーゼの新規阻害因子としての、改変オピオルフィンペプチドを提供することである。【解決手段】本発明は、改変されたオピオルフィンペプチドを提供するものであって、オピオルフィンペプチドを構成するアミノ酸の各残基又は組み合わせが１つ以上の官能基で改変されている。【選択図】図５
2015110651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのペプチド誘導体：
ζ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＯＨ  （Ｉ）
［式中、
ζは、水素原子、チロシン、Ｙ−［リンカー］−又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡ１は、Ｑ又はＧｌｐであり、
ＡＡ２は、Ｋ、Ｒ又はＨ、好ましくはＲであり、
ＡＡ３は、Ｙ、Ｇ、Ｎ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡ４は、Ｐ、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）、好ましくはＳ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡ５は、Ｋ又はＲ、好ましくはＲであり、
Ｃ−［リンカー］−は、Ｃｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ］−を意味し、ｎは１〜２０の整数であり、
Ｙ−［リンカー］−は、Ｔｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ’−ＣＯ］−を意味し、ｎ’は１〜２０の整数であり、
Ｆ（Ｘ）は、フェニル基が１つ以上のハロゲン原子で置換されたフェニルアラニンを意味し、
Ｓ（ＯＡｌｋ）は、ヒドロキシル基がリンカー又は１〜２０個の炭素原子を有する分岐アルキル基で置換されたセリンを意味し、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５のいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
であり、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ、ＱＨＮＰＲ、ＱＲＧＰＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＧｌｐＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド誘導体であり、式（ＩＩ）：
ζａ−Ｑ−ＡＡａ２−ＡＡａ３−Ｐ−Ｒ−ＯＨ  （ＩＩ）
［式中、
ζａは、水素原子、又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡａ２はＲ又はＨ、好ましくはＲであり、
ＡＡａ３はＧ、Ｎ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦであり、
Ｃ−［リンカー］−、Ｆ（Ｘ）及びＳ（ＯＡｌｋ）は請求項１において定義され、Ｑ、ＡＡ２、ＡＡ３、Ｐ、及びＲは、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＱ、ＡＡ２、ＡＡ３、Ｐ、及びＲのいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＨＮＰＲ又はＱＲＧＰＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド誘導体であり、式（ＩＩＩ）：
ζｎ−ＡＡ１−ＡＡｎ２−ＡＡｎ３−ＡＡｎ４−ＡＡｎ５−ＯＨ  （ＩＩＩ）
［式中、
ζｎは、水素原子、チロシン又はＹ−［リンカー］−であり、
ＡＡ１は、Ｑ又はＧｌｐ、好ましくはＱであり、
ＡＡｎ２は、Ｋ又はＲ、好ましくはＲであり、
ＡＡｎ３は、Ｙ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡａ４は、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡｎ５はＫ又はＲ、好ましくはＲであり、
Ｙ−［リンカー］−、Ｆ（Ｘ）及びＳ（ＯＡｌｋ）は請求項１において定義され、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＡＡ５のいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、但し該ペプチドがＱＲＦＳＲ、ＱＨＮＰＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＧｌｐＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチド誘導体であり、式（ＩＶ）：
ζｍ−Ｑ−Ｒ−ＡＡｍ３−ＡＡｍ４−Ｒ−ＯＨ  （ＩＶ）
［式中、
ζｍは、水素原子、又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡｎ３は、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ（Ｘ）であり、
ＡＡｍ４は、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）、好ましくはＳ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
Ｃ−［リンカー］−、Ｆ（Ｘ）及びＳ（ＯＡｌｋ）は請求項１において定義され、Ｑ、Ｒ、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＲは、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＱ、Ｒ、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＲのいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ又はＹＱＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチド誘導体の内、
ＱＲＦＳＲ−ＮＨ２；
ＱＲ−Ｆ［４Ｂｒ］−ＳＲであり、−Ｆ［４Ｂｒ］−が、フェニル基のパラ位が臭素原子で置換されたフェニルアラニンであるもの；
ＱＲＦＰＲ；
（アセチル）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ビオチン−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ｄＲ−ｄＳ−ｄＦ−ｄＲ−ｄＱ；
Ｙ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｙ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＣＱＲＦＳＲ；
ＣＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＣＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−ドデカノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
［Ｃβ２］ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−［β３Ｒ］；
Ｃ−［ｄＱ］−ＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［ｄＲ］；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−［ｄＲ］；
［ｄＣ］−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［ｄＲ］；
［Ｃβ２］−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［β３Ｒ］；
［ＣＱＲＦＳＲ］２；
ＱＲＹＳＲ；
ＱＲ−Ｆ［４Ｆ］−ＳＲであり、−Ｆ［４Ｆ］−が、フェニル基のパラ位が臭素原子で置換されたフェニルアラニンであるもの；
ＱＫＦＳＲ；
ＱＲＦＳＫ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−ｄＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−β３Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）β３Ｒ；
であり、ここで：
Ｃβ２がＨ２ＮＯＣＨ２−ＳＨ）−ＣＨ２−ＣＯ−であり；
β３Ｒが−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）］−ＣＯＯＨであり；
−Ｓ（−Ｏ−オクタノイル）が、ヒドロキシル基がドデカノイル基で置換されたセリンを意味し；
−Ｓ（−Ｏ−ドデカノイル）が、ヒドロキシル基がドデカノイル基で置換されたセリンを意味する；
前記ペプチド誘導体。
【請求項６】
中性エンドペプチダーゼＮＥＰ及び／又はアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対して阻害活性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド誘導体。
【請求項７】
ヒトＡＰ−Ｎに対して阻害活性を有する、請求項２に記載のペプチド誘導体。
【請求項８】
ヒトＮＥＰに対して阻害活性を有する、請求項３に記載のペプチド誘導体。
【請求項９】
中性エンドペプチダーゼＮＥＰ及び／又はアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対する二機能性阻害因子である、請求項４に記載のペプチド誘導体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチド誘導体、及び医薬として許容される担体を含む組成物。
【請求項１１】
処置を要する対象の疾患又は障害を処置する方法であり、膜メタロエクトペプチダーゼの活性の調節を意図して、疾患又は障害を処置するための量の、請求項１〜９のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチド誘導体を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記膜メタロエクトペプチダーゼが膜−亜鉛メタロペプチダーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜メタロペプチダーゼがＮＥＰ及び／又はＡＰ−Ｎである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
疼痛、抑鬱障害（ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、セクシャリティと関連する社会活動の障害、及び性行動の障害からなる群から選択される疾患又は障害を処置するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
膜メタロエクトペプチダーゼの活性の調節を意図して、疾患又は障害の治療において使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に定義されるペプチド誘導体。
【請求項１６】
前記膜メタロエクトペプチダーゼが膜亜鉛メタロペプチダーゼである、請求項１５に記載のペプチド誘導体。
【請求項１７】
前記膜メタロエクトペプチダーゼがＮＥＰ及び／又はＡＰ−Ｎである、請求項１５又は１６に記載のペプチド誘導体。
【請求項１８】
疼痛、抑鬱障害、セクシャリティと関連する社会活動の障害、及び性行動の障害からなる群から選択される疾患又は障害の処置において使用するための、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のペプチド誘導体。
【請求項１９】
前記ペプチド誘導体が天然アミノ酸からなる請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド誘導体をコードする配列を含む核酸。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項で定義されるペプチド誘導体に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年４月７日に出願された米国仮出願第６１／０４２，９２２号の利益を主張する。該出願は、参照により援用される。
【０００２】
本発明は、メタロエクトペプチダーゼの新規阻害因子としての、改変オピオルフィンペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
亜鉛金属エクトペプチダーゼは、哺乳類の重要な生理機能の制御に関与する、神経伝達物質及びホルモン性伝達物質の受容体依存的な活性を調節する。それらは神経及び全身の組織の細胞表面に存在し、神経ペプチド及び制御ペプチドの分泌後プロセシング又は代謝を触媒する（Ｒｏｑｕｅｓ，  ＢＰ，  Ｎｏｂｌｅ，  Ｆ，  Ｄａｕｇｅ，  Ｖ，  Ｆｏｕｒｎｉｅ−Ｚａｌｕｓｋｉ，  ＭＣ  ＆  Ｂｅａｕｍｏｎｔ，  Ａ．  （１９９３）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ４５，  ８７−１４６．  Ｔｕｒｎｅｒ，  ＡＪ，  Ｉｓａａｃ，  ＲＥ  ＆  Ｃｏａｔｅｓ，  Ｄ．  （２００１）  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２３，  ２６１−２６９）。
【０００４】
神経及び／又はホルモン性ペプチドシグナルの中で最も重要なものは、物質Ｐ（Ｓ）及びエンケファリンであり、これらは、ストレスとなる、又は脅迫的な環境刺激に対する行動的な適応応答（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の、受容体依存的な調節に関与する。それらは、侵害受容情報の脊髄処理（ｓｐｉｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び鎮痛のメカニズム、感情及び／又は意欲の応答、不安、攻撃性、及び神経免疫炎症現象を顕著に制御する（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，  ＡＨ．  （１９９５）  Ｂｒ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ  ７５，  １９３−２００．  Ｓｏｒａ，  Ｉ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｎ，  Ｆｕｎａｄａ，  Ｍ，  Ｕｊｉｋｅ，  Ｈ，  Ｒｅｖａｙ，  ＲＳ，  Ｄｏｎｏｖａｎ，  ＤＭ，  Ｍｉｎｅｒ，  ＬＬ  ＆  Ｕｈｌ，  ＧＲ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，  １５４４−１５４９；  Ｋｏｎｉｇ，  Ｍ，  Ｚｉｍｍｅｒ，  ＡＭ，  Ｓｔｅｉｎｅｒ，  Ｈ，  Ｈｏｌｍｅｓ，  ＰＶ，  Ｃｒａｗｌｅｙ，  ＪＮ，  Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，  ＭＪ  ＆  Ｚｉｍｍｅｒ，  Ａ．  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８３，  ５３５−５３８；  Ｆｉｌｌｉｏｌ，  Ｄ，  Ｇｈｏｚｌａｎｄ，  Ｓ，  Ｃｈｌｕｂａ，  Ｊ，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍ，  Ｍａｔｔｈｅｓ，  ＨＷ，  Ｓｉｍｏｎｉｎ，  Ｆ，  Ｂｅｆｏｒｔ，  Ｋ，  Ｇａｖｅｒｉａｕｘ−Ｒｕｆｆ，  Ｃ，  Ｄｉｅｒｉｃｈ，  Ａ  ＆  ＬｅＭｅｕｒ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５，  １９５−２００）。
【０００５】
亜鉛エクトペプチダーゼは、下流の神経及びホルモンシグナルの機能的機能的能力の調節において生理的に重要で、かつ重要な役割を果たすことから、何がそれらの活性を調節しているのかという問題に重点を置き、結果的にその全体の制御カスケードを明らかにすることは重要である。また、エクトペプチダーゼ活性の上流の制御因子を発見することも、生体病理的及び医療的観点から有意義である。なぜなら、新しい薬物候補開発の可能性が生じるからである。
【０００６】
スピノルフィンという脳特異的ヘプタペプチドは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ；ＥＣ３．４．２４．１１［ＥＣ］）及びアミノペプチダーゼＮ（ＡＰ−Ｎ；ＥＣ３．４．１１．２［ＥＣ］）等のエンケファリン分解エクトエンザイムに対する阻害的活性に基づき、ウシ脊髄から単離及び特定された（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｋ  ＆  Ｈａｚａｔｏ，  Ｔ．  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９４，  ７１３−７１９；  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｙ，  Ｏｎｏ，  Ｈ，  Ｕｅｄａ，  Ａ，  Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，  Ｍ，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｋ  ＆  Ｈａｚａｔｏ，  Ｔ．  （２００２）  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  ３，  ５８７−５９９）。加えて、発明者らは、ラットにおいて、環境の変化への適応に関与するペプチド伝達物質として、ラットシアロルフィン（ｓｉａｌｏｒｐｈｉｎ）を特定した。ラットシアロルフィンは内分泌ペプチドシグナルであり、雄ラットにおいては、アンドロゲン制御により発現が活性化され、環境ストレスに対するアドレナリン誘導性応答の下で分泌が刺激される。これは、ラットにおいて、膜結合性ラットＮＥＰ活性の生理的阻害因子であり、そして痛覚の有力な阻害因子である（Ｒｏｕｇｅｏｔ，  Ｃ，  Ｒｏｓｉｎｓｋｉ−  Ｃｈｕｐｉｎ，  Ｉ，  Ｎｊａｍｋｅｐｏ，  Ｅ  ＆  Ｒｏｕｇｅｏｎ，  Ｆ．  （１９９４）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１９，  ７６５−７７３；  Ｒｏｕｇｅｏｔ，  Ｃ，  Ｖｉｅｎｅｔ，  Ｒ，  Ｃａｒｄｏｎａ，  Ａ，  Ｌｅ  Ｄｏｌｅｄｅｃ，  Ｌ，  Ｇｒｏｇｎｅｔ，  ＪＭ  ＆  Ｒｏｕｇｅｏｎ，  Ｆ．  （１９９７）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７３，  Ｒ１３０９−Ｒ１３２０．；  Ｒｏｕｇｅｏｔ，  Ｃ，  Ｒｏｓｉｎｓｋｉ−Ｃｈｕｐｉｎ，  Ｉ  ＆  Ｒｏｕｇｅｏｎ，  Ｆ．  （１９９８）  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｅｄｓ．  Ｃｈａｌｄａｋｏｖ，  ＧＮ  ＆  Ｍａｔｈｉｓｏｎ，  Ｒ．  （Ｂｕｌｇａｒｉａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｖａｒｎａ，  Ｂｕｌｇａｒｉａ，）  Ｖｏｌ  ９，  ｐｐ．  １７−３２；  Ｒｏｓｉｎｓｋｉ−Ｃｈｕｐｉｎ，  Ｉ，  Ｈｕａｕｌｍｅ，  ＪＦ，  Ｒｏｕｇｅｏｔ，  Ｃ  ＆  Ｒｏｕｇｅｏｎ，  Ｆ．  （２００１）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２，  ４５５０−４５５９；  Ｒｏｕｇｅｏｔ，  Ｃ，  Ｍｅｓｓａｏｕｄｉ，  Ｍ，  Ｈｅｒｍｉｔｔｅ，  Ｖ，  Ｒｉｇａｕｌｔ，  ＡＧ，  Ｂｌｉｓｎｉｃｋ，  Ｔ，  Ｄｕｇａｖｅ，  Ｃ，  Ｄｅｓｏｒ，  Ｄ  ＆  Ｒｏｕｇｅｏｎ，  Ｆ．  （２００３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，  ８５４９−８５５４）。
【０００７】
以前、発明者らは、ヒトオピオルフィン野生型ペプチド（ＱＲＦＳＲ−ペプチド）（目下ヒトにおいて最初に性状解析された）が、２つのエンケファリン不活性化エクトペプチダーゼである中性エンドペプチダーゼＮＥＰ（ＥＣ  ３．４．２４．１１）及びアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎ（ＥＣ  ３．４．１１．２）の効果的な二機能性阻害因子であることを示した（Ｗｉｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  Ｎｏｖ．  ２００６，  １０３（４７）：  １７９７９−８４）。
【０００８】
オピオルフィンペプチド誘導体は以前から記載されており（例えばＷｉｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  Ｎｏｖ．  ２００６，  １０３（４７）：  １７９７９−８４）、基本的なペプチド配列はＱＲＦＳＲである。
【０００９】
よって、この配列及び下記の式により定義される配列は、変更される場合があり：例えばＸｌ−Ｘ２−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇであり、ここでＸｌはＨ原子又はＴｙｒアミノ酸を表し、ＸｌがＨのときＸ２はＧｌｎ若しくはＧｌｐを表し、又はＸ１がＴｙｒ若しくはＣｙｓのとき、Ｘ２はＧｌｎを表す。好ましくはＱＲＦＳＲ、ＹＱＲＦＳＲ、及び／又はＣＱＲＦＳＲであり、ＱＲＦＳＲが最も好ましい。Ｇｌｐはピログルタミン、Ｔｙｒ又はＹはチロシン、Ｇｌｎ又はＱはグルタミン、Ｐｈｅ又はＦはフェニルアラニン、Ｓｅｒ又はＳはセリン、及びＣｙｓ又はＣはシステインを表すものと理解されたい。これらのペプチドは、国際特許出願ＷＯ２００５０９０３８６として公開されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規オピオルフィン誘導体、及び高度に選択的な生化学アッセイを使用するインビトロでの機能的特性化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】ビヒクル又は５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【００１２】
【図５】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＱＲＦＳＲ−ペプチド類似体による阻害を表す。各バーは回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われた。
【００１３】
【図６】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＱＲＦＳＲ−ペプチド類似体による阻害を表す。各バーは回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われた。
【００１４】
【図７】
【図８】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＱＲＦＳＲ−ペプチド類似体による阻害を表す。各バーは回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われた。
【００１５】
【図９】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＣＱＲＦＳＲペプチドによる濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＣＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００１６】
【図１０】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチドによる濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００１７】
【図１１】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、Ｙ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ（即ちＹ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ）ペプチドによる濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＹ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われ、Ｌｏｇ  μＭでプロットされた。
【００１８】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【００１９】
【図１８】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＣＱＲＦＳＲペプチドによる濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＣＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００２０】
【図１９】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、Ｙ［ＰＥ１２］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチド（即ちＹ−（−ＦＴＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ）による濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＹ［ＰＥ１２］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドの存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００２１】
【図２０】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチド（即ちＣ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ）による濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＣ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドの存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００２２】
【図２１】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、Ｃ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチド（即ちＣ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ）による濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＣ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドの存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００２３】
【図２２】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチド（即ちＣ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ）による濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＣ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチドの存在下又は非存在下で行われ、μＭでプロットされた（ログスケール）。
【００２４】
【図２３】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチド（即ちＣ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ）による濃度依存的阻害を表す。各点は、回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、様々な濃度のＣ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチドの存在下又は非存在下で行われ、ｎＭでプロットされた（ログスケール）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書中で、本発明は、オピオルフィンペプチドを構成するアミノ酸の各残基又は組み合わせが１つ以上の官能基で改変された、ペプチドの改変バージョンを提供する。
【００２６】
そのような改変オピオルフィンペプチドの非限定的な例として：
ＮＨ２−ＱＲＦＳＲ−ＣＯＮＨ２；
ＮＨ２−ＱＲＧＰＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＱＨＮＰＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＱＲ（４ブロモＦ）ＳＲ−ＣＯＯＨ（即ちＮＨ２−ＱＲ−Ｆ［４Ｂｒ］−ＳＲ−ＣＯＯＨ（ここで−Ｆ［４Ｂｒ］−が、フェニル基のパラ位が臭素原子で置換されたフェニルアラニンであることにより、−Ｆ［４Ｂｒ］−は以下の式；
【化１】
2015110651.tif 000003
で表される）；
Ｎ−（アセチル）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
Ｎ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
Ｎ−（ビオチン−Ｃ６）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ｄＲｄＳｄＦｄＲｄＱ−ＣＯＯＨ（レトロインバーション（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）Ｄ−エナンチオマー）；
ＮＨ２−ＹＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｙ−（Ｃ６−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｙ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＣＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＣＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ１２−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［Ｃβ２］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳ［β３Ｒ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ［ｄＱ］ＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］［ｄＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳ［ｄＲ］；
ＮＨ２−［ｄＣ］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］［ｄＲ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［Ｃβ２］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］［β３Ｒ］−ＣＯＯＨ；
［ＣＱＲＦＳＲ］２（システインジペプチドのジスルフィド結合を介して連結される）；
Ｇｌｐ−ＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＱＲＹＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＱＲＦ［４Ｆ］ＳＲ−ＣＯＯＨ（ここで−Ｆ［４Ｆ］−が、フェニル基のパラ位がフッ素原子で置換されたフェニルアラニンであることにより、−Ｆ［４Ｆ］−は以下の式；
【化２】
2015110651.tif 000004
で表される）；
ＮＨ２−ＱＫＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−ＱＲＦＳＫ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ６−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ６−ポリエチレン）−ＱＲＦＳ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ［ＰＥ１２］ＱＲＦＳ−ｄＲ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ１２−ポリエチレン）−ＱＲＦＳ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］−β３Ｒ−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）−ＱＲＦＳ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］−β３Ｒ−ＣＯＯＨ；
が挙げられ、ここで
Ｃβ２は、天然のシステイン残基を、システインのαカルボニル基に近いＣα炭素の隣にメチレン残基を含むβ２−システインで置き換えたものであり（Ｈ２Ｎ（−ＣＨ２−ＳＨ）−ＣＨ２−ＣＯ−）；
β３Ｒは、天然のアルギニン残基を、アルギニンのαアミン基に近いＣα炭素の隣にメチレン残基を含むβ３−アルギニンで置き換えたものであり（−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）］−ＣＯＯＨ）；
［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］及び［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］は、ヒドロキシル基がオクタノイル基で置換されたセリンを意味し；
［Ｓ−Ｏ−Ｃ１２−ポリエチレン］は、ヒドロキシル基がドデカノイル基で置換されたセリンを意味し；
Ｃ６、Ｃ８又はＣ１２−ポリエチレンは、炭素が６、８又は１２個のエチレン基のスペーサーに対応する（それぞれ、（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−、−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−及び（−ＨＮ−（ＣＨ２）Ｉ２−ＣＯ−）。
【００２７】
上記ペプチドにおいて、ＮＨ２−は、ペプチドの末端アミンを表し、ＣＯＯＨは末端カルボン酸を表す（末端基がアミドの時は−ＣＯ−ＮＨ２）。また、上記リストは、
Ｔｈｅ  ｌｉｓｔ  ａｂｏｖｅ  ｃａｎ  ａｌｓｏ  ｂｅ  ｒｅａｄ  ａｓ：
ＱＲＦＳＲ−ＮＨ２；
ＱＲＧＰＲ；
ＱＨＮＰＲ；
（アセチル）ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ビオチン−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ｄＲ−ｄＳ−ｄＦ−ｄＲ−ｄＱ；
ＹＱＲＦＳＲ；
Ｙ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｙ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＣＱＲＦＳＲ；
ＣＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＣＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−ドデカノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
［Ｃβ２］ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−［β３Ｒ］；
Ｃ−［ｄＱ］−ＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［ｄＲ］；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−［ｄＲ］；
［ｄＣ］−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［ｄＲ］；
［Ｃβ２］−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［β３Ｒ］；
［ＣＱＲＦＳＲ］２；
Ｇｌｐ−ＲＦＳＲ；
ＱＲＹＳＲ；
ＱＲ−Ｆ［４Ｆ］−ＳＲであり、−Ｆ［４Ｆ］−が、フェニル基のパラ位がフッ素原子で置換されたフェニルアラニンであるもの；
ＱＲ−Ｆ［４Ｂｒ］−ＳＲ，  ｗｈｅｒｅｉｎ  −Ｆ［４Ｂｒ］−が、フェニル基のパラ位が臭素原子で置換されたフェニルアラニンであるもの；
ＱＫＦＳＲ；
ＱＲＦＳＫ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−ｄＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−β３Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）β３Ｒ，
と読まれることもあり、ここで：
Ｃβ２はＨ２Ｎ（−ＣＨ２−ＳＨ）−ＣＨ２−ＣＯ−であり；
Ｂ３Ｒは−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ［−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）］−ＣＯＯＨであり；
−Ｓ（−Ｏ−オクタノイル）は、ヒドロキシル基がオクタノイル基で置換されたセリンを意味する。
【００２８】
−Ｓ（−Ｏ−ドデカノイル）は、ヒドロキシル基がドデカノイル基で置換されたセリンを意味する。以下の定義は、本願全体で使用される。
【００２９】
「ペプチド」は、アミノ酸残基の線形配列（ｌｉｎｅａｒ  ａｒｒａｙ）が互いにペプチド結合で連結して構成される分子である。そのような線形配列は、任意で環状、即ち線形ペプチドの両端あるいはペプチド中のアミノ酸の側鎖が、化学結合で連結されたものであり得る。更に、そのようなペプチドは、二次、三次、又は四次構造や、他のペプチド又は他の非ペプチド分子との分子間結合を有し得る。そのような分子間結合は、限定されないが、共有結合（ジスルフィド結合等）、又はキレーション、静電気相互作用、疎水性相互作用、水素結合、イオン−双極子（ｉｏｎ−ｄｉｐｏｌｅ）相互作用、双極子−双極子相互作用、若しくはそれらの任意の組み合わせを介するものであり得る。
【００３０】
下記ペプチドの任意のアミノ酸がＬ型又はＤ型であり得る。特に、全てのペプチドがＬ型又はＤ型のいずれかであり得る。前記炭化水素鎖は、任意で天然のアミノ酸よりも多くのメチレン基を含むため、該アミノ酸はβアミノ酸、より正確にはβ２又はβ３アミノ酸である場合がある。例えば、Ｒは、以下：ＩＲ（即ちＬ−Ａｒｇ）、ｄＲ（即ちＤ−Ａｒｇ）、β３Ｒ又はβ２Ｒのいずれか１つを表し得る。また、下記ペプチドの任意のアミノ酸は、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸の場合もある。
【００３１】
「Ｆ（Ｘ）」は、フェニル基が１つ以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素で置換されたフェニルアラニンであり、好ましいＦ（Ｘ）は、以下の式：
【化３】
2015110651.tif 000005
で表される。
【００３２】
「Ｓ（ＯＡｌｋ）」は、１〜２０個の炭素原子を有するヒドロキシル基が直鎖又は分岐鎖アルキル基（即ちＡｌｋ）、好ましくはオクタノイル又はドデカノイル基で置換されたセリンを意味する。本願において、Ｓ（Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン）又はＳ（Ｏ−Ｃ８）は、ヒドロキシル基がオクタノイル基で置換されたセリンを意味する。
【００３３】
「Ｃ−［リンカー］−」はＣｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ］−を意味し、ここでｎは１〜２０、好ましくは４〜１５の整数であり、６，８又は１２が特に好ましい。本願において、「Ｃ−（Ｃ６−ポリエチレン）」又は「Ｃ［ＰＥＯ］」はＣｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＣＯ］−を意味し；「Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）」又は「Ｃ［ＰＥ８］」はＣｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）８−ＣＯ］−を意味し；そして「Ｃ−（Ｃ１２−ポリエチレン）」又はＣ［ＰＥ１２］」はＣｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−を意味する。
【００３４】
「Ｙ−［リンカー］−」はＴｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ］−を意味し、ここでｎ’は１〜２０、好ましくは４〜１５の整数であり、６，８又は１２が特に好ましい。本願において、本願において、「Ｙ−（Ｃ６−ポリエチレン）」又は「Ｙ［ＰＥｏ］」はＴｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＣＯ］−を意味し；「Ｙ−（Ｃ８−ポリエチレン）」又は「Ｙ［ＰＥ８］」はＴｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）８−ＣＯ］−を意味し；そして「Ｙ−（Ｃ１２−ポリエチレン）」又は「Ｙ［ＰＥ１２］」はＴｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−を意味する。
【００３５】
本発明のペプチド誘導体の特定のペプチダーゼに対する「阻害能力」は、Ｋｉ値又はＩＣ５０値のいずれかの測定等により、当業者により容易に評価され得る。特に、ＩＣ５０値が測定される場合、所定の実験条件下（同一の緩衝剤、同一のペプチダーゼ及び基質濃度）、所定のペプチダーゼに対する、２つの改変オピオルフィンペプチドの相対的な阻害能力は、各改変オピオルフィンペプチドのＩＣ５０値を測定し、そして該改変オピオルフィンペプチドのＩＣ５０値と、同一の実験条件下でのオピオルフィンのＩＣ５０値とを比較することにより比較され得る。
【００３６】
本発明は、ペプチド誘導体であり、式（Ｉ）：
ζ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＯＨ  （Ｉ）
［式中、
ζは、水素原子、チロシン、Ｙ−［リンカー］−又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡ１は、Ｑ又はＧｌｐであり、
ＡＡ２は、Ｋ、Ｒ又はＨ、好ましくはＲであり、
ＡＡ３は、Ｙ、Ｇ、Ｎ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡ４は、Ｐ、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）、好ましくはＳ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡ５は、Ｋ又はＲ、好ましくはＲであり、
Ｃ−［リンカー］−は、Ｃｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ］−を意味し、ｎは１〜２０の整数、好ましくは６，８又は１２であり、
Ｙ−［リンカー］−は、Ｔｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ’−ＣＯ］−を意味し、ｎ’は１〜２０の整数、好ましくは６，８又は１２であり、
Ｆ（Ｘ）は、フェニル基が１つ以上のハロゲン原子で置換されたフェニルアラニンを意味し、
Ｓ（ＯＡｌｋ）は、ヒドロキシル基がリンカー又は１〜２０個の炭素原子を有する分岐アルキル基で置換されたセリンを意味し、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５のいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ、ＱＨＮＰＲ、ＱＲＧＰＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＧｌｐＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体に関する。
【００３７】
一般に、本発明のペプチド誘導体において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５のいずれか１つは、βアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸である。
【００３８】
一つの態様において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５の１つ以上は、βアミノ酸である。他の態様において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５の全てが、βアミノ酸である。
【００３９】
一つの態様において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５の１つ以上は、アザ−アミノ酸である。他の態様において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５の全てが、アザ−アミノ酸である。
【００４０】
一つの態様において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５の１つ以上は、β−アザ−アミノ酸である。他の態様において、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５の全てが、β−アザ−アミノ酸である。
【００４１】
一つの態様において、前記ペプチド誘導体はシステインを含み、そしてダイマーであり、ここで２つのシステインの２つの硫黄原子がジスルフィド結合で結合している。例えば、［ＣＱＲＦＳＲ］２は、ペプチド誘導体ＣＱＲＦＳＲのダイマーで、システインアミノ酸がジスルフィド結合で結合している。
【００４２】
好ましい態様において、がヒドロキシキノリンであるとき、ペプチド誘導体は、以下の式で表される：
【化４】
2015110651.tif 000006
【００４３】
式（Ｉ）のペプチド誘導体は、中性エンドペプチダーゼＮＥＰ及び／又はアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対する阻害能力に優れる改変オピオルフィンペプチドである。
【００４４】
式（Ｉ）の好ましいペプチド誘導体は：
ＣＱＲＦＳＲ、
ＱＲＦ（Ｘ）ＳＲ、
ＱＲＧＰＲ、
ＱＨＮＰＲ、
ＱＲＦＰＲ、
ＱＲＦＳ（ＯＡｌｋ）Ｒ、好ましくはＱＲＦＳ（Ｏ−オクタノイル）Ｒ、
Ｃ−［リンカー］−ＱＲＦＳＲ、好ましくはＣ−［ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ、Ｃ−［ＮＨ−（ＣＨ２）８−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ、又はＣ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ、
ＱＲＹＳＲ、
ＱＫＦＳＲ、
ＱＲＦＳＫ、
Ｃ−［リンカー］−ＱＲＦＳＲ、好ましくはＣ−［ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ、Ｃ−［ＮＨ−（ＣＨ２）８−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ、又はＣ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ、
［ＣＱＲＦＳＲ］２、
Ｃ−［ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＣＯ］−ＱＲＦＳ（ＯＡｌｋ）Ｒ、好ましくはＣ−［ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＣＯ］−ＱＲＦＳ（Ｏ−オクタノイル）Ｒ及びＹ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ
である。
【００４５】
一つの態様において、本発明は、ペプチド誘導体であり、式（ＩＩ）：
ζａ−Ｑ−ＡＡａ２−ＡＡａ３−Ｐ−Ｒ−ＯＨ  （ＩＩ）
［式中、
ζａは、水素原子、又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡａ２はＲ又はＨ、好ましくはＲであり、
ＡＡａ３はＧ、Ｎ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦであり、
好ましくは、Ｑ、ＡＡ２、ＡＡ３、Ｐ、及びＲは、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＱ、ＡＡ２、ＡＡ３、Ｐ、及びＲのいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＨＮＰＲ又はＱＲＧＰＲではない、前記ペプチド誘導体に関する。
【００４６】
前記式（ＩＩ）のペプチド誘導体は、改変オピオルフィンペプチドであり、そしてヒトＡＰ−Ｎ阻害因子であるのが有利である。特に、該ペプチド誘導体は、ＡＰ−Ｎに対する阻害能力が、ＮＥＰエンドペプチダーゼ及び／又はカルボキシジペプチダーゼ活性に対する阻害能力よりも強い（好ましくは１０倍、８倍又は１０倍）。
【００４７】
好ましい式（ＩＩ）のペプチド誘導体は、
ＱＲＧＰＲ、
ＱＨＮＰＲ、及び
ＱＲＦＰＲ
である。
【００４８】
一つの態様において、本発明は、ペプチド誘導体であり、式（ＩＩＩ）
ζｎ−ＡＡ１−ＡＡｎ２−ＡＡｎ３−ＡＡｎ４−ＡＡｎ５−ＯＨ  （ＩＩＩ）
［式中、
ζｎは、水素原子、チロシン又はＹ−［リンカー］−であり、
ＡＡ１は、Ｑ又はＧｌｐ、好ましくはＱであり、
ＡＡｎ２は、Ｋ又はＲ、好ましくはＲであり、
ＡＡｎ３は、Ｙ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡａ４は、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡｎ５はＫ又はＲ、好ましくはＲであり、
該ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＡＡ５のいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、但し該ペプチドがＱＲＦＳＲ、ＱＨＮＰＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＧｌｐＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体に関する。
【００４９】
前記式（ＩＩＩ）のペプチド誘導体は、改変オピオルフィンペプチドであり、そしてヒトＮＥＰ阻害因子であるのが有利である。特に、該ペプチド誘導体は、ＮＥＰエンドペプチダーゼ及び／又はカルボキシジペプチダーゼ活性に対する阻害能力が、ＡＰ−Ｎに対する阻害能力よりも強い（好ましくは１０倍、８倍又は１０倍）。
【００５０】
一つの態様において、本発明は、ペプチド誘導体であり、式（ＩＩＩａ）：
ＡＡ１−Ｒ−ＡＡｎ３−Ｓ（ＯＡｌｋ）−ＡＡｎ５−ＯＨ  （ＩＩＩａ）
［式中、
ＡＡ１はＱ又はＧｌｐであり、
ＡＡｎ３はＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡｎ５はＫ又はＲ、好ましくはＲである］
で表され、但し該ペプチドがＱＲＦＳＲ、ＱＨＮＰＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＧｌｐＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体に関する。
【００５１】
式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩａ）で表される好ましいペプチド誘導体は：
ＱＲＹＳＲ、
ＱＲＦ（Ｘ）ＳＲ、
ＱＫＦＳＲ、
ＱＲＦＳＫ、
ＱＲＦＳ（ＯＡｌｋ）Ｒ、好ましくはＱＲＦＳ（Ｏ−オクタノイル）Ｒ、及び
Ｙ−［ＮＨ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ］−ＱＲＦＳＲ
である。
【００５２】
一つの態様において、本発明は、ペプチド誘導体であり、式（ＩＶ）：
ζｍ−Ｑ−Ｒ−ＡＡｍ３−ＡＡｍ４−Ｒ−ＯＨ  （ＩＶ）
［式中、
ζｍは、水素原子、又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡｎ３は、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ（Ｘ）であり、
ＡＡｍ４は、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）、好ましくはＳ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
該Ｑ、Ｒ、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＲは、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＱ、Ｒ、ＡＡ３、ＡＡ４、及びＲのいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ又はＹＱＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体に関する。
【００５３】
前記式（ＩＶ）のペプチド誘導体は、ヒトＮＥＰ及び／又はヒトＡＰ−Ｎに対する二機能性阻害因子であるのが有利な改変オピオルフィンペプチドであり、ヒトＮＥＰ及びヒトＡＰ−Ｎの両方に対して顕著な阻害能力を示す。
【００５４】
式（ＩＶ）の好ましいペプチド誘導体は：
ＣＱＲＦＳＲ、
［ＣＱＲＦＳＲ］２、
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−［リンカー］−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ、好ましくはＣ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ、Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ又はＣ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＱＲＦ（Ｘ）ＳＲ並びに
ＱＲＦＳ（ＯＡｌｋ）Ｒ、好ましくはＱＲＦＳ（Ｏ−オクタノイル）Ｒ
である。
【００５５】
好ましくは、本発明のペプチド誘導体は、改変オピオルフィン誘導体であり、中性エンドペプチダーゼＮＥＰ及び／又はアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対する阻害能力を有する。最も好ましくは、本発明の改変オピオルフィンペプチドは、エンドペプチダーゼＮＥＰ及びアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対する阻害能力を有する。
【００５６】
本発明のペプチド誘導体は、組み込まれるべき異なるアミノ酸残基の連続的な結合により、液相又は固相中での既知のペプチド合成手段により調製され得て（液相中ではＮ末端からＣ末端へ、又は固相中ではＣ末端からＮ末端へ合成される）、該Ｎ末端及び反応性側鎖は、既知の基により予めブロックされている。
【００５７】
固相合成において、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより記載された技術が特に使用され得る。あるいは、１９７４年にＨｏｕｂｅｎｗｅｙｌにより記載された技術も使用され得る。
【００５８】
本発明のペプチド誘導体は、遺伝子組換え手段を使用して得ることもあるが、但し、得られたペプチド誘導体は、天然のアミノ酸のみで構成されることとなる。
【００５９】
前記オピオルフィンペプチドに対する改変として、ケミカル（例えば追加の化学部分、メチル、ポリエチレンＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２及びそれらのポリエチレングリコール、並びに／又はグリコシル化形態等を付加する）、及びペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）（例えば構造及び／又は機能においてペプチドを模倣する態分子量化合物（例えばＡｂｅｌｌ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ：  ＪＡＩ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９７）；Ｇａｎｔｅ，  Ｐｅｐｔｉｄｍｉｍｅｔｉｃａ  −  ｍａｓｓｇｅｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔｅ  Ｅｎｚｙｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｎ  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  １０６：  １７８０−１８０２  （１９９４）；及びＯｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３６：  ３０３９−３０４９  （１９９３）等を参照されたい））が挙げられる。
【００６０】
本発明のペプチド誘導体に導入され得る他の改変として、Ｌアミノ酸に代えての非天然アミノ酸、Ｄアミノ酸、β２アミノ酸、β３アミノ酸、アザアミノ酸、又はβ−アザアミノ酸の使用、立体構造的拘束（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）、等価性変形（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、環化、又は他の改変が挙げられる。他の例として、１つ以上のアミド結合が非アミノ結合に置き換えられること、並びに／又は１つ以上のアミノ酸側鎖が異なる化学部分に置き換えられること、又は１つ以上のＮ末端、Ｃ末端若しくは１つ以上の側鎖が保護基により保護されること、並びに／又は二重結合及び／若しくは環化及び／若しくは立体特異性（ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）がアミノ酸鎖中に導入されることにより剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）及び／若しくは結合親和性を増大させることを含む。
【００６１】
本発明のペプチド誘導体の標的となるメタロエクトペプチダーゼの結合ドメインの結晶構造に基づき、コンピューターを利用したドラッグデザイン開発により、模倣体を得ることも出来る（Ｏｅｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （２０００）２９６（２）：３４１−９；  Ｇｏｍｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  （２００１）  １３（３）：２６１−７０；  Ｋａｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  （２００２），  ２（３）：２４７−６９）。
【００６２】
更なる他の改変として、以下のものが挙げられる。
【００６３】
脂肪族アルコールとのエステル化による（ＣＯＯＨ）、又はアミド化によりによる、及び／又はアセチル化による（ＮＨ２）、又はＮＨ２末端にカルボキシアルキル若しくは芳香族疎水鎖を付加することによる、ＮＨ２及びＣＯＯＨ親水基の保護。
【００６４】
ＣＯ−ＮＨアミド結合のレトロインバーション（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）異性体、又はアミド基のメチル化（又はケトメチレン、メチレンオキシ、ヒドロキシエチレン）。
【００６５】
２つのアミノ酸間への−［ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−］−部分の挿入。Ｎは１〜２０の整数で、好ましくは６、８又は１２である。
【００６６】
上記で定義した天然アミノ酸を含むペプチド誘導体を含むペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸あるいはポリヌクレオチドも本発明の一部であるが、遺伝情報の退化（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）も考慮される。好ましくは、該核酸は、天然アミノ酸からなるペプチド誘導体をコードする配列を含む。
【００６７】
本発明の核酸として、上記配列のいずれか又はそれらの相補配列と、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、即ち０．２ｘＳＳＣ中６８℃、５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣ中４２℃、又はこれらの２つの条件のいずれかにおいて観察されるのと同レベルのハイブリダイゼーションを可能とするハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件下でハイブリダイズする配列が挙げられる。
【００６８】
更に、本発明は、本発明の核酸配列を含むクローニング及び／又は発現ベクター、並びに前記核酸又は該ベクターを含む宿主細胞、即ちこれらのベクターの１つ以上が導入された宿主細胞に関する。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチド誘導体を含むペプチド、又はタンパク質をコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、その発現を可能とするエレメントと操作可能な形で連結している。該ベクターは、プロモーター配列、転写開始及び終結シグナル、及び転写制御に適切な領域を含むのが有利である。宿主細胞への導入は、トランジエントであってもステーブルであってもよい。また、前記ベクターは、転写したタンパク質を分泌するための特異的なシグナルを含み得る。
【００６９】
宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、限定されないが、細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞であってもよく、市販の細胞株であってもよい。宿主細胞の好ましい例として、ＣＯＳ−Ｉ、ＨＥＫ細胞、２９３細胞、又はＣＨＯ細胞が挙げられる。
【００７０】
更に、本発明は、本明細書中に記載の改変オピオルフィンに指向する（即ち特異的に認識する）、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、又はそれらのフラグメントを提供する。そのような抗体は、例えば、本発明のペプチド誘導体の薬物動態的特性の研究等に有用であり得る。
【００７１】
様々な文法形式の「抗体」という用語は、本明細書中で、イムノグロブリン分子、及びイムノグロブリン分子の免疫的に活性な部分、即ち、抗体結合部位あるいはパラトープを含む分子を指す。抗体分子の例として、無傷のイムノグロブリン分子、実質的に無傷のイムノグロブリン分子、並びにイムノグロブリン分子の部分、例えば当該技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）として知られる部分等が挙げられる。
【００７２】
ポリクローナル抗体を樹立する手順も、周知である。典型的には、そのような抗体は、免疫前血清（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を得るために最初に出血させられたニュージーランド白ウサギに、本発明のコンジュゲートペプチド誘導体等のペプチド誘導体を皮下投与して樹立し得る。該抗原は、部位あたり合計５０μｌの体積で、１０箇所又は５箇所以上注入され得る。前記ウサギは、最初の注入から５週間後に出血させられ、そして、６週間ごとに３回、免疫応答の程度に依存して、最初の注入に対して最大で５分の１の濃度の同一の抗原を皮下注射することで、定期的にブーストさせられる。各ブーストの１０日後、血清の試料を回収する。抗体を捕捉するための対応する抗原を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより、血清からポリクローナル抗体を回収する。ポリクローナル抗体を樹立するためのこの及び他の手法は、Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）に記載されている。
【００７３】
様々な文法形式の「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープと免疫反応することが可能な１種類の抗体結合部位のみを有する抗体分子の集団を指す。故に、典型的には、モノクローナル抗体は、免疫応答する任意のエピトープとの単一の結合親和性を示す。故に、モノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位を有し、それぞれが異なるエピトープに対して免疫特異的である、二機能性モノクローナル抗体等の抗体分子であってもよい。
【００７４】
モノクローナル抗体を調製する実験室的方法は、当該技術分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  （上掲）を参照されたい）。モノクローナル抗体（Ｍｂｓ）は、コンジュゲートペプチド誘導体等の本発明のペプチド誘導体に対して免疫化した哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト等により調製され得る。該免疫化哺乳類中の抗体産生細胞を単離し、そしてミエローマ又はヘテロミエローマ細胞と融合して、ハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）を生産する。モノクローナル抗体を産生する該ハイブリドーマ細胞を、所望のモノクローナル抗体の供給源として使用する。
【００７５】
Ｍａｂはハイブリドーマの培養により生産できるが、本発明はこれに限定されない。ハイブリドーマからクローニングした核酸を発現することにより生産されたＭａｂの使用も意図される。即ち、ハイブリドーマにより分泌される分子を発現する核酸を他の細胞株に導入して、形質転換体を作製するのである。該形質転換体は、元のハイブリドーマとは遺伝型か異なるが、該ハイブリドーマにより分泌される抗体分子に対応する、本発明の抗体分子（全抗体分子の免疫活性フラグメントを含む）の生産は同様に可能である。加えて、本明細書は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単一鎖抗体、及びそれらに類する免疫応答性抗体フラグメントを形成する方法を提供する。これらは全て、抗体のクラス及び特異性が開示され、そして請求されている限りは、当業者が構築し得る正確な変異体の構造にかかわらず、本発明の範囲内である。
【００７６】
前記改変オピオルフィンペプチドは、医薬として許容される担体と組み合わせて、医薬組成物として製剤化され得る。例えば、医薬組成物は局所、経口、舌下、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、経皮又は眼球内投与等に適したものであり得る。
【００７７】
上記改変オピオルフィンペプチドは、疾患又は障害に処置に有用であり、ここでは膜メタロエクトペプチダーゼ、更に具体的には、膜亜鉛メタロペプチダーゼ、ＮＥＰ及びＡＰ−Ｎ等の活性の調整が想定される。
【００７８】
天然のＮＥＰの基質は、主にペプチドホルモン：中枢及び末梢の疼痛知覚、炎症現象、無機イオン交換及び／又は動脈緊張の調節に中心的な役割を果たす、エンケファリン、物質Ｐ、ブラジキニン、アンジオテンシンＩＩ及び心房性ナトリウム利尿ペプチドである（Ｒｏｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．  １９９３；４５（１）：８７−１４６）。
【００７９】
より具体的には、中性エンドペプチダーゼ、ＮＥＰ２４−１１は、哺乳類の神経及び末梢組織の両方に分布し、末梢においては、特に肝臓及び胎盤に豊富である。これらの組織において、細胞表面メタロペプチダーゼＮＥＰは、神経ペプチド、全身性免疫制御ペプチド及びペプチドホルモンの分泌後プロセシング及び代謝に関与する。循環し、又は分泌される制御ペプチドの活性レベルを調節することにより、ＮＥＰは、それらの生理的な受容体誘導性の活性を調整する。故に、膜結合ＮＥＰは：強力な血管作動性ペプチド、例えば物質Ｐ、ブラジキニン（ＢＫ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）及びアンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）；強力な炎症／免疫ペプチド、例えば物質Ｐ及びＢＫ及びｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）；強力なオピオイド神経ペプチド、例えばＭｅｔ及びＬｅｕ−エンケファリン（Ｅｎｋ）並びに強力な無機イオン交換及び体液ホメオスタシス制御ペプチド、例えばＡＮＰ、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）並びにＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）等の活性の制御に関与する。
【００８０】
総合的な観点から、ＮＥＰの生物的活性は、疼痛の処理の調節の他に、動脈緊張制御、炎症現象、情動状態及び水−電解質ホメオスタシスに関与する、ペプチド作動性シグナルの活性レベルの調節である。臨床的な観点から、これは、ＮＥＰが様々な疾患状態の重要な薬物標的であることを実証する。例えば、ＮＥＰ及びＡＰＮを阻害することにより、中枢又は末梢の内性的オピオイドのレベルの増大及び活性の遅延、鎮痛作用、又は抗鬱若しくは神経刺激作用等が得られる。ＮＥＰ及び／又はＡＰ−Ｎ阻害因子の使用により内在性制御ペプチドの濃度を変化させることの主要な利点は、薬理作用が、本来のリガンドにより活性化される受容体部位のみで誘導されること、そして特定の環境、行動及び生理病理学的ストレスのある状況で起る、緊張又は刺激作動性のそれらの放出に大いに依存することである（Ｒｏｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３）。
【００８１】
哺乳類膜メタロペプチダーゼのＮＥＰ以外の例として、ＮＥＰ２、ＥＣＥ（エンドセリン変換酵素）、特にＥＣＥ１及びＥＣＥ２、赤血球表面抗原ＫＥＬＬ及びＸ連鎖低リン血症性くる病に関与するＰＥＸ遺伝子産物及びＡＰ−Ｎ（アミノペプチダーゼＮ）等が挙げられる。
【００８２】
ＮＥＰ２は、神経系及び生殖組織に特異的に分布している。
【００８３】
ＡＰ−Ｎは、広範な種類のヒトの器官、組織及び細胞（内皮、上皮、線維芽細胞、白血球）に存在する偏在的酵素であり、特に腎臓及び中枢神経系において豊富である。同定された基質として、アンジオテンシンＩＩＩ（ＡｎｇＩＩＩ）；エンケファリン及びエンドルフィン等の神経ペプチド；並びにカリダン（ｋａｌｌｉｄａｎ）及びソマトスタチン等のホルモン等が挙げられる。ＡＰ−Ｎは多機能性の酵素で、癌形成、免疫系、疼痛、動脈圧等に関与する。また、ＡＰ−Ｎは、抗原のトリミング及び抗原提示のプロセスにも関与する。これらの機能は、生物活性ペプチドの応答を調整し（疼痛の制御、バソプレシン遊離）、そして免疫機能及び主要な生物イベント（細胞増殖、分泌、浸潤、血管形成）に影響し、故に多くの種類の疾患における処置の選択枝を提供する。
【００８４】
ＥＣＥの阻害は、高血圧の治療並びに動脈硬化の予防及び処置において顕著な用途を有する。
【００８５】
ＮＥＰと共にするＡＰ−Ｎの阻害は、疼痛、並びに欝、不安、鎮静及び社会的−性的感情的障害の治療において顕著な用途を有する。
【００８６】
関連する膜メタロペプチダーゼの阻害は、腫瘍即ち卵巣、直腸結腸、脳、肺、膵臓、消化管及び色素細胞の癌の処置、並びに転移、アテローム性動脈硬化、及び／又は高血圧の発生の低下において治療効果を有する。
【００８７】
関連する膜メタロペプチダーゼの阻害は、疼痛の緩和に効果がある。そのような急性の疼痛に対する抗侵害受容作用は鎮痛に効果があるが、関節炎又は炎症性大腸疾患、手術後創傷、及び癌及び／又は癌治療に関連する又は関連しない神経性の激痛等の、慢性の炎症性疼痛にも効果がある。
【００８８】
更に、細菌又はウイルスメタロペプチダーゼの阻害は、抗感染効果を有することが期待される。
【００８９】
メタロペプチダーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ポルフィロモナス・ギンギワリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、及びレギオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）等の病原体の宿主組織への侵入、並びに免疫的及び炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【００９０】
更に、細菌メタロペプチダーゼ、特に亜鉛メタロペプチダーゼは、Ｂ．アンスラキス（Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の毒素等のタンパク質溶解毒素、並びにＣ．テタヌム（Ｃ．  ｔｅｔａｎｕｍ）及びボツリヌム（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の神経毒素により引き起こされる疾患において重要な役割を果たす。
【００９１】
他のメタロペプチダーゼも、例えばＨＩＶにより引き起こされる感染等、様々な感染において重要な役割を果たす（ＦＲ  ２  ７０７  １６９）。
【００９２】
細菌又はウイルスによる疾患の処置におけるプロテイナーゼ阻害因子の重要性は、Ｊ．  Ｐｏｔｅｍｐａ及びＪ．  Ｔｒａｖｉｓにより見出されている。
【００９３】
メタロペプチダーゼの様々な機能は、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１；  Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９７７  ；  Ｋｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９８７  ；  Ｂｅａｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６に開示されている。
【００９４】
本発明の１つの目的は、末梢、脊髄及び／又は脊柱上のＮＥＰ及びＡＰ−Ｎを阻害することにより、中枢又は末梢の内在性オピオイド（エンケファリンであり得る）のレベルを増大し、及び活性を持続させるように働く改変オピオルフィンペプチドを用いる、鎮痛又は抗鬱治療を提供することである。
【００９５】
疼痛、特に急性及び慢性の疼痛、内臓の（ｖｉｓｃｅｒａｌ）炎症性及び神経性の疼痛の治療が意図される。
【００９６】
また、任意の水−電解質のインバランスの治療も、本発明の目的である。標的となる障害として、水−電解質のインバランスにより引き起こされる、骨、歯、腎臓、副甲状腺、膵臓、精巣、胃粘膜、前立腺及び唾液腺の障害等が挙げられる。
【００９７】
特に、前記障害は、副甲状腺亢進症若しくは低下症、骨粗鬆症、膵炎、顎下腺結石症、腎石症及び骨形成異常症（ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）から選択され得る。
【００９８】
対人障害及び行動障害の治療も、更に想定される。ＷＯ０２／０５１４３４に、様々な精神障害が記載されている。
【００９９】
特に、本発明は、忌避障害（ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、認知低下障害（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ａｗａｒｅｎｅｓｓ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、自閉性障害、注意欠陥多動性障害、覚醒障害、ホスピタリズム（ｈｏｓｐｉｔａｌｉｓｍ）、対人機能（ｉｎｔｅｒｐｅｒｓｏｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）及び外界との交流（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｗｏｒｌｄ）の障害、分裂病質人格障害、統合失調症、抑鬱障害、周囲への関心の低下（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ｉｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、並びに不時の射精（ｕｎｔｉｍｅｌｙ  ｅｊａｃｕｌａｔｉｏｎ）、多淫症及び勃起不全等のセクシャリティと関連する社会活動の障害からなる群から選択される任意の障害に対して利用される。
【０１００】
また、本発明は、本発明のペプチド又はペプチド誘導体の、精神刺激剤（ｐｓｙｃｈｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）としての使用にも関する。故に、ナルコレプシー、睡眠過剰、脅迫神経障害（ｏｂｓｅｓｓｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ  ｔｒｏｕｂｌｅ）、情動障害、例えば抑鬱障害若しくは主要抑鬱障害（ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、主要抑鬱障害単一エピソード（ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｐｉｓｏｄｅ）若しくは再発性主要抑鬱障害（ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）、Ｉ型若しくはＩＩ型双極性障害、気分変調性障害、並びに気分循環性障害の予防又は処置に利用される。
【０１０１】
また、膜メタロペプチダーゼの変調が想定される疾患として、高血圧、アテローム性動脈硬化、腫瘍、炎症性関節炎及び腸疾患等が挙げられる。
【０１０２】
感染の治療も包含される。特に、細菌又はウイルス疾患の処置におけるプロテイナーゼの重要性は、Ｊ．  Ｐｏｔｅｍｐａ及びＴｒａｖｉｓが言及している。
【０１０３】
上記改変オピオルフィンペプチダーゼは、免疫−炎症応答の調節にも有用である。
【０１０４】
上記で定義した改変オピオルフィンペプチダーゼは、ナトリウム利尿剤又は利尿剤としても有用である。
【０１０５】
故に、本発明は、上記で定義したペプチド誘導体の、疼痛、抑鬱障害、セクシャリティと関連する社会活動の障害、及び性行動の障害からなる群から選択される疾患又は障害の処置における使用を提供する点で有利である。
【０１０６】
本発明の他の目的は、上記ペプチド誘導体又は核酸の、薬物乱用、特にモルヒネの薬物乱用の治療における代替物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）としての使用である。
【０１０７】
実際に、研究によると、薬物乱用及び報酬の発達（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｗａｒｄ）及び薬物依存性に対する脆弱性は、少なくとも部分的に、内在性のオピオイド系の、既存の又は誘導された改変及び／又は欠損に基づく。この関連で、内在性のオピオルフィンの効果を強化するための改変オピオルフィンペプチド又は核酸の使用は、慢性的なモルヒネ又はヘロインの投与の中断によって引き起こされる様々な副作用（離脱の身体的兆候）を減少させ得る。
【０１０８】
本発明のペプチド誘導体を用いて処置され得る好ましい疾患若しくは症状として、疼痛、抑鬱障害、セクシャリティと関連する社会活動の障害、及び性行動の障害等が挙げられる。
【０１０９】
更に、本発明は、内在性のＢＰＬＰタンパク質若しくは成熟生産物、例えば天然オピオルフィンＱＲＦＳＲと、膜メタロペプチダーゼとの間の相互作用を調整する薬剤の使用による、疾患の予防又は処置用の治療組成物の調製に関し、ここで、該膜メタロペプチダーゼの活性の調整が想定される。
【０１１０】
本発明は、ＢＰＬＰタンパク質又はＱＲＦＳＲペプチドにおけるＮＥＰ及び／又はＡＰＮ結合部位に対する結合能力で、化合物をスクリーニングするインビトロでの方法を提供する。この方法の詳細は、例えば２００６年９月１５日に出願された米国特許出願第１０／５９３，０７１号等に記載され、またＷＯ  ２００５／０９０３８６として、その他にも国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０５６７にも記載され、それらの内容は、本明細書中に参照により援用される。
【０１１１】
本発明の他の目的は、ＢＰＬＰタンパク質又はその成熟生産物（又はＢＰＬＰタンパク質又はその成熟生産物の結合特異性又は生理活性を保持するペプチド）のＮＥＰ及び／又はＡＰ−Ｎ結合部位に特異的に結合する改変オピオルフィンペプチドの相対的親和性を判定するプロセスであり、例えば２００６年９月１５日に出願された米国出願第１０／５９３，０７１号等に記載されており、それらの内容は、本明細書中に参照により援用される。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：生化学アッセイの方法
【０１１３】
特定の基質の加水分解のリアルタイム蛍光モニタリングを使用する各アッセイのために、形式的な動態解析を行った。
【０１１４】
蛍光測定用の９６ウェルにおいて、ヒトＮＥＰ及びヒトＡＰ−Ｎ酵素活性の解析を可能とする全てのパラメーターを、初期速度の測定の条件下で規定した。
【０１１５】
１−ヒトエクトペプチダーゼ、ｈＮＥＰ、及びｈＡＰ−Ｎの供給源
【０１１６】
ペプチダーゼの純粋な供給源として、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した、組換えヒトＮＥＰ及び組換えヒトＡＰ−Ｎ（それぞれＮ末端の細胞質セグメント及び膜貫通セグメントを欠く）を使用した。
【０１１７】
２−基質及び合成阻害因子
【０１１８】
インビトロで、以下の合成選択基質の分解を測定することにより、アミノ、カルボキシジ、及びエンドペプチダーゼの活性を試験した。
【０１１９】
ＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性に特異的な、内部的に消光した蛍光基質である−Ａｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ  ＦＲＥＴ−ペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。
【０１２０】
ＮＥＰ−カルボキシジペプチダーゼ活性に特異的な、内部的に消光した蛍光基質である−Ａｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ  ＦＲＥＴ−ペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。
【０１２１】
分子内部的に消光した、構造的にブラジキニンに関連している蛍光発生ペプチドである−  Ｍｃａ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｆ−Ｋ−（Ｄｎｐ）−ＯＨ  ＦＲＥＴ−ペプチドは、ＮＥＰ及びＥＣＥ活性を測定するための選択的基質であり、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０１２２】
ＦＲＥＴは、供与蛍光粒子（Ａｂｚ＝オルト−アミノベンゾイル又はＭｃａ＝７−メトキシクマリン−４−イル−アセチル）から受容蛍光粒子（ＤｎｐＯＨ＝２，４−ジニトロフェニル又はＥＤＤｎｐ＝２，４−ジニトロフェニルエチレンジアミン）への、距離依存的なエネルギーの移動である。
【０１２３】
−Ｌ−アラニン−Ｍｃａ、Ａｌａ−Ｍｃａ、アミノペプチダーゼ活性を測定するための蛍光発生基質は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【０１２４】
様々な利用可能な選択的合成ペプチダーゼ阻害因子の存在下及び非存在下での、可溶性エクトペプチダーゼによるこれらの基質の加水分解速度を測定して、各酵素アッセイの特異性を評価した：−チオルファン（ＮＥＰ阻害因子）（Ｂａｃｈｅｍ）、−ベスタチン（ＡＰ阻害因子）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。
【０１２５】
３−９６ウェル蛍光アッセイを使用した、ペプチダーゼ活性の測定
【０１２６】
各アッセイのインキュベーションの時間、ｐＨ及び温度、並びに酵素及び基質濃度は、初期速度の測定の条件に従った。試験阻害化合物の存在下及び非存在下（１〜５０μＭの濃度範囲）での、２つのペプチダーゼによる器質の加水分解を、代謝速度をリアルタイムでモニタリングすることにより測定した。これらは、予めインキュベートしておいた培地に添加された。酵素の非存在下で得られる蛍光シグナルを表す基質の自然分解のバックグラウンド速度を差し引いて、初期速度をＲＦＵ（相対蛍光単位）／分で計算した。
【０１２７】
ＦＲＥＴ特異的ペプチド基質Ａｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐを用いたＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性の測定
ブラックハーフエリア９６ウェルマイクロプレートを使用して、２００ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７（最終体積１００μｌ）中での酵素（１２．５ｎｇ）を標準反応とした。１０分間２８℃でプレインキュベーションした後、基質（１５μＭ最終濃度）を添加し、４０分間２８℃で（２．３分間隔の連続測定）、励起及び放出の波長がそれぞれ３２０ｎｍ及び４２０ｎｍの蛍光測定マイクロプレートリーダー（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｒ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００−Ｔｅｃａｎ）を使用して、蛍光シグナル（ＲＦＵ）の出現の動態を、直接解析した。
【０１２８】
初期速度の測定の条件下で、シグナルの強度は、反応時間２０〜４０分の間、形成された代謝物の量に正比例していた。故に、阻害因子非存在下では、ｒｈＮＥＰに誘導されたＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐの特異的なエンドプロテオリシスの初期速度は、８２１８±２８７８ＲＦＵ／分／μｇ  ｒｈＮＥＰ、ｎ＝３独立測定として、線形回帰（傾き＝ビヒクル存在下でのＮＥＰ活性／インキュベーション時間）から計算された。
【０１２９】
ＦＲＥＴ特異的ペプチド基質Ａｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨを使用するＮＥＰ−カルボキシジペプチダーゼ活性の測定
ブラックハーフエリア９６ウェルマイクロプレートを使用して、５０ｍＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．５（最終体積１００μｌ）中での酵素（２．５ｎｇ）を標準反応とした。１０分間プレインキュベーションした後、基質（４μＭ最終濃度）を添加し、４０分間２８℃で（２．３分間隔の連続測定）、励起及び放出の波長がそれぞれ３２０ｎｍ及び４２０ｎｍの蛍光測定マイクロプレートリーダーを使用して、蛍光シグナル（ＲＦＵ）の出現の動態を、直接解析した。これらの初期速度の測定の条件下で、ヒトＮＥＰに誘導されたＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨの特異的な加水分解は、５９７９６±１８６８５ＲＦＵ／分／μｇ  ｒｈＮＥＰ、ｎ＝４独立測定で評価された。基質Ａｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨを用いて試験されたＮＥＰ−カルボキシジペプチダーゼ活性は、図５〜８で「ＮＥＰ−ＣＤＰ１活性」と表記されている。
【０１３０】
加えて、分子内で消光している蛍光ペプチドのＭｃａ−ＢＫ２（１０μＭ）を、上述と同じ実験条件下で、５ｎｇのｒｈＮＥＰにより加水分解した。これらの条件下で、ｈＮＥＰ酵素は、Ｍｃａ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｆ−Ｋ−（Ｄｎｐ）−ＯＨに対して、主にカルボキシジペプチダーゼとして働き、Ａ−Ｆ結合を選択的に開裂するが、エンドペプチダーゼとしてＧ−Ｆ結合の開裂も行う。初期速度測定の条件下で、ヒトＮＥＰに誘導されたＭｃａ−ＢＫ２の特異的な加水分解は、１２１９１０±２４７５５ＲＦＵ／分／μｇ  ｒｈＮＥＰ、ｎ＝３独立測定で評価された。基質Ａｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨを用いて試験されたＮＥＰ−カルボキシジペプチダーゼ活性は、図５〜８で「ＮＥＰ−ＣＤＰ２活性」と表記されている。
【０１３１】
Ａｌａ−Ｍｃａ基質を使用したＡＰ−Ｎエクトペプチダーゼの測定
ブラックハーフエリア９６ウェルマイクロプレートを使用して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０（最終体積１００μｌ）中での酵素（４ｎｇ）を標準反応とした。１０分間２８℃でプレインキュベーションした後、Ａｌａ−Ｍｃａ基質（２５μＭ最終濃度）を添加し、４０分間２８℃で、励起及び放出の波長がそれぞれ３８０ｎｍ及び４６０ｎｍの蛍光測定リーダーを使用して、シグナルの出現の動態を直接解析した。初期速度の測定の条件下で、シグナルの強度は、反応時間１０〜４０分の間、形成された代謝物の量に正比例していた。これらの初期速度測定の条件下で、ヒトＡＰ−Ｎに誘導されたＡｌａ−Ｍｃａのアミノプロテオリシスは、１４７０４２±４４６５７  ＲＦＵ／分／μｇ  ｒｈＡＰ−Ｎ、ｎ＝３独立測定として（傾きから：インキュベーション時間に対する阻害因子非存在下のＡＰ−Ｎ活性）から計算された。ＮＥＰカルボキシジペプチダーゼ活性をアッセイする他のＦＲＥＴ−ペプチド基質は、Ｂａｒｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００７，  ３８８：４４７−４５５に記載されている。
【０１３２】
実施例２：生化学アッセイの結果
【０１３３】
１−ｈＮＥＰ及びｈＡＰ−Ｎに対するオピオルフィンペプチド誘導体のスクリーニング
【０１３４】
化合物は、最終濃度５０μＭで３回試験された。
【０１３５】
図１〜９は、本発明の様々なペプチド誘導体を用いた場合の、ＮＥＰエンドペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼの活性並びにＡＰ−Ｎ活性に対する生化学アッセイの結果を示す。
【０１３６】
様々なオピオルフィンペプチド類似体について、前記２つの膜結合外酵素（ｅｃｔｏｅｎｚｙｍｅ）、ＮＥＰ（特異的エンドペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼ活性）及びＡＰＮに対する阻害能力を、選択的蛍光ベース酵素アッセイ：過去に研究室内で開発及び確認された（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／出願日２００９年１月１８日、本願で参照により援用される）ＦＲＥＴ−ｂａｓｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｏｄｅｌｓを使用することにより試験した。
【０１３７】
以下の化合物を解析した。以下の化合物中、ＮＨ２−は、ペプチドの末端アミンを意味し、そしてＣＯＯＨは、ペプチドの末端カルボン酸を意味する。
【０１３８】
−ＮＨ２−ＱＲＦＳＲ−ＣＯＮＨ２（オピオルフィン）；ＮＨ２−ＱＲＧＰＲ−ＣＯＯＨ；ＮＨ２−ＱＨＮＰＲ−ＣＯＯＨ；ＮＨ２−ＱＲ（４ブロモＦ）ＳＲ−ＣＯＯＨ（即ちＱＲＦ（４Ｂｒ）ＳＲ）；ＮＨ２−ＱＲＦＰＲ−ＣＯＯＨ：これらは、ヒトＡＰ−Ｎで優勢な阻害を示し、ヒトＮＥＰにおいて弱い阻害能力を示した。
【０１３９】
−Ｎ−（アセチル）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；Ｎ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；Ｎ−（ビオチン−Ｃ６−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ：これらは、ヒトＡＰ−Ｎ及びＮＥＰにおいて弱い阻害能力を示し、ＮＥＰエンドペプチダーゼ活性が優勢であった。
【０１４０】
−ＮＨ２−ｄＲｄＳｄＦｄＲｄＱ−ＣＯＯＨ（レトロインバーションＤ−エナンチオマー）：ヒトＡＰ−Ｎ及びＮＥＰにおいて顕著な阻害活性を示さず、ＡＰ−Ｎ活性が優勢であった。
【０１４１】
−ＮＨ２−ＹＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；ＮＨ２−Ｙ−（Ｃ６−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ；ＮＨ２−Ｙ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ：これらは、ヒトＮＥＰエンドペプチダーゼ活性において優勢な阻害を示し、特にＹ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲが有効であった。
【０１４２】
−ＮＨ２−ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；ＮＨ２−ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ：これらは、ヒトＮＥＰ（特異的エンドペプチダーゼ及びカルボキシジペプチダーゼ活性）及びＡＰ−Ｎの強力な二機能性阻害因子であった。
【０１４３】
他の改変オピオルフィンペプチドとして、以下のものが挙げられる。
【０１４４】
ＮＨ２−ＣＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ；
【０１４５】
ＮＨ２−ＣＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ１２−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ
【０１４６】
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ
【０１４７】
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ
【０１４８】
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ
【０１４９】
ＮＨ２−［ＣΒ２］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］Ｒ−ＣＯＯＨ
【０１５０】
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳ［Β３Ｒ］−ＣＯＯＨ
【０１５１】
ＮＨ２−Ｃ［ｄＱ］ＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］［ｄＲ］−ＣＯＯＨ
【０１５２】
ＮＨ２−Ｃ−（Ｃ８−ポリエチレン）ＱＲＦＳ［ｄＲ］
【０１５３】
ＮＨ２−［ｄＣ］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］［ｄＲ］−ＣＯＯＨ
【０１５４】
ＮＨ２−［Ｃβ２］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン］［β３Ｒ］−ＣＯＯＨ
【０１５５】
ジスルフィド結合によるシステインジペプチドである、［ＣＱＲＦＳＲ］２
【０１５６】
２−ｈＮＥＰ及びｈＡＰ−Ｎに対する、選択的なオピオルフィンペプチド誘導体の濃度依存的な阻害
【０１５７】
ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチド（図９及び１３）
【０１５８】
前記ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９７、ｎ＝１８決定点（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）、７±３μＭでＩＣ５０。
【０１５９】
ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、６±１μＭでＩＣ５０。
【０１６０】
ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝３０決定点、０．８±０．１μＭでＩＣ５０。
【０１６１】
ＣＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＭｃａ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｆ−Ｋ−（Ｄｎｐ）−ＯＨ  ＦＲＥＴ−ペプチド（Ｍｃａ−ＢＫ２）開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１６決定点、１７±２μＭでＩＣ５０。
【０１６２】
故に、システインアミノ酸とのアミド結合の形成によるＮＨ２−ＱＲＦＳＲペプチドのＮ−末端の修飾（チオール官能基は亜鉛を強力にキレートする）により、化合物（ＣＱＲＦＳＲペプチド）のｈＡＰ−Ｎ（元のＱＲＦＳＲペプチドの１０倍）及びｈＮＥＰ（５倍）に対する阻害能力が強化された。
【０１６３】
ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチド（図１０）
【０１６４】
ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８］Ｒペプチドは、ｒｈＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９８、ｎ＝１８決定点、２．８±０．２μＭでＩＣ５０。
【０１６５】
ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８］Ｒペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、１２±５μＭでＩＣ５０。
【０１６６】
ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８］Ｒペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２０決定点、１０±１μＭでＩＣ５０。
【０１６７】
ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−Ｃ８］Ｒペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＭｃａ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｆ−Ｋ−（Ｄｎｐ）−ＯＨ  ＦＲＥＴ−ペプチド（Ｍｃａ−ＢＫ２）開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、１４±４μＭでＩＣ５０。
【０１６８】
Ｙ−［アミノドデカン酸スペーサー］−ＱＲＦＳＲペプチド（図１１及び１９）
【０１６９】
Ｙ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９８、ｎ＝１８決定点、１０±１μＭでＩＣ５０。
【０１７０】
Ｙ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、２４±２μＭでＩＣ５０。
【０１７１】
Ｙ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２０決定点、１２２±２０μＭでＩＣ５０。
【０１７２】
Ｙ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＭｃａ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｆ−Ｋ−（Ｄｎｐ）−ＯＨ  ＦＲＥＴ−ペプチド（Ｍｃａ−ＢＫ２）開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、３１±２μＭでＩＣ５０。よって、Ｙ−（Ｃ１２−ポリエチレン）ＱＲＦＳＲが、ヒトＮＥＰエンドペプチダーゼ活性阻害において優勢であることが確認された。
【０１７３】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲペプチド（ＰＥ６＝アミノヘキサン酸）（図２０）
【０１７４】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９８、ｎ＝１８決定点、４０±５μＭでＩＣ５０。
【０１７５】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、２１７でＩＣ５０。
【０１７６】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２０決定点、０．８±０．１μＭでＩＣ５０。
【０１７７】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるｔｈｅ  Ｍｃａ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｆ−Ｋ−（Ｄｎｐ）−ＯＨ  ＦＲＥＴ−ペプチド（Ｍｃａ−ＢＫ２）開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝１８決定点、２２７μＭでＩＣ５０。
【０１７８】
Ｃ−［アミノドデカン酸スペーサー］−ＱＲＦＳＲペプチド（図２１）
【０１７９】
Ｃ［ＰＥ１２］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９６、ｎ＝２４決定点、５．７±０．５μＭでＩＣ５０。
【０１８０】
Ｃ［ＰＥ１２］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９７、ｎ＝３０決定点、１９±２μＭでＩＣ５０。
【０１８１】
Ｃ［ＰＥ１２］ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９８、ｎ＝２１決定点、０．８±０．１μＭでＩＣ５０。
【０１８２】
Ｃ−［アミノヘキサン酸スペーサー］−ＱＲＦＳ［０−オクタノイル］Ｒペプチド（図２２）
【０１８３】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチドは、ｒｈＮＥＰ−エンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２７決定点、７５９±５６μＭでＩＣ５０。
【０１８４】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２７決定点、８４８±５８μＭでＩＣ５０。
【０１８５】
Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２４決定点、１．７±０．１μＭでＩＣ５０。
【０１８６】
生理的なＮＥＰの基質である物質Ｐを使用し、細胞膜をｈＮＥＰの供給源とする、生物学的に関連するインビトロのアッセイにおいて、Ｃ［ＰＥ６］ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒ誘導体ペプチドは、膜結合ｈＮＥＰエンドペプチダーゼ活性により誘導される物質Ｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９５、ｎ＝１３決定点、１．６±０．４μＭでＩＣ５０（元のオピオルフィンペプチドの同一の試験結果の５倍以上）（図２３）。
【０１８７】
［ＣＱＲＦＳＲ］ジペプチド（［ＣＱＲＦＳＲ］２）
【０１８８】
［ＣＱＲＦＳＲ］ジペプチドは、ｒｈＮＥＰエンドペプチダーゼ活性により誘導されるＡｂｚ−ｄＲ−Ｇ−Ｌ−ＥＤＤｎｐ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．８７、ｎ＝２４決定点、１．４±０．５μＭでＩＣ５０。
【０１８９】
［ＣＱＲＦＳＲ］ジペプチドは、ｒｈＮＥＰ活性により誘導されるＡｂｚ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｋ−ＤｎｐＯＨ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２７決定点、３．３±０．２μＭでＩＣ５０。
【０１９０】
［ＣＱＲＦＳＲ］ジペプチドは、ｒｈＡＰ−Ｎ活性により誘導されるＡｌａ−ＡＭＣ開裂を、濃度依存的に阻害した：ｒ２＝０．９９、ｎ＝２４決定点、０．８±０．１μＭでＩＣ５０。
【０１９１】
表１：ＮＥＰ及びＡＰ−Ｎ活性に対する様々なペプチド及びペプチド誘導体のＩＣ５０値のまとめ
【表１】
2015110651.tif 000007
【０１９２】
データ全体で、ＮＨ２−ＱＲＦＳＲのＮ末端のαアミン基の、ヒトＡＰ−Ｎに対するオピオルフィンの阻害能力における重要性が示された。
【０１９３】
実際に、元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、それをアセチル化したもの、又は環化したもの、それをオクタノイル化したもの又はビオチン化したもののｈＡＰ−Ｎに対する阻害能力は低下した。
【０１９４】
しかしながら、元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、２つの化合物：ｐＧｌｕ−ＲＦＳＲ及びＣ８−ＱＲＦＳＲは、ヒトｈＮＥＰにおける阻害能力は、それ以上とはいかないまでも、少なくとも同等であった。
【０１９５】
これらのデータから、更に、ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨペプチドの遊離カルボキシル末端の、ｈＮＥＰの、特にＮＥＰのカルボキシジペプチダーゼ活性に対する阻害能力における重要性が示され、元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、アミド化により（ＱＲＦＳＲ−ＣＯＮＨ２）、ｈＮＥＰ活性に対する阻害能力が低下することが示された。
【０１９６】
ＱＲＦＳＲペプチドのＰｈｅ残基は、ｈＮＥＰ及びｈＡＰ−Ｎペプチダーゼ活性に対するオピオルフィンの阻害能力に重要である。実際に、元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、ＰｈｅをＴｙｒ残基に置換すると（ＱＲＹＳＲ）、ｈＡＰ−Ｎの阻害能力が６倍低下し、そしてヒトＮＥＰに対する阻害能力が僅かに低下した。
【０１９７】
しかしながら、興味深いことに、Ｐｈｅを４−フルオロ−Ｐｈｅ残基に置換すると（ＱＲ［４Ｆ］ＦＳＲ）、元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、ヒトＮＥＰに対する阻害能力が２倍低下し、そしてｈＡＰ−Ｎに対する阻害能力は同程度であった。逆に、Ｐｈｅを（４ブロモ−Ｐｈｅ）残基に置換すると、ヒトＮＥＰに対する阻害能力が低下した。
【０１９８】
ＱＲＦＳＲペプチドの中央のＲＦＳの改変は、ｈＮＥＰに対するオピオルフィンの阻害能力に影響する。元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、ＱＲＧＰＲ、ＱＨＮＰＲ、及びＱＲＦＰＲは、ヒトＡＰ−Ｎの阻害能力は同等で、ヒトＮＥＰに対する阻害能力は低下した。
【０１９９】
これらの結果は、更に、ＱＲＦＳＲペプチドの位置２のＡｒｇのグアニジウムイオンの、ｈＡＰＮに対するオピオルフィンの阻害能力における重要性を示す。元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、Ａｒｇ２をＬｙｓ残基のε−アミンに置換すると（ＱＫＦＳＲ）、ｈＡＰ−Ｎに対する阻害能力は１０倍低下し、そしてヒトＮＥＰに対する阻害能力は僅かに低下した。
【０２００】
同様に、ＱＲＦＳＲペプチドの位置５のＡｒｇ残基のグアニジウムイオンは、ｈＡＰＮに対するオピオルフィンの阻害能力において重要である。元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、Ａｒｇ５をＬｙｓ残基のε−アミンに置換すると（ＱＲＦＳＫ）、ｈＡＰ−Ｎに対する阻害能力は１０倍低下し、そしてヒトＮＥＰに対する阻害能力は同等であった。
【０２０１】
興味深いことに、ＱＲＦＳＲペプチドのセリン残基のヒドロキシル基をオクタン酸でエステル化すると（ＱＲＦ［オクタノイル−セリン］Ｒ）、元のペプチドであるオピオルフィン（ＱＲＦＳＲ）と比較して、ｈＡＰ−Ｎに対する阻害能力は同等で、そしてｈＮＥＰエンドペプチダーゼ活性及びカルボキシジペプチダーゼ活性に対する阻害能力は強化された（元のペプチドであるオピオルフィンの１０倍以上の阻害能力）（図１９を参照されたい）。
【０２０２】
実施例３：潜在的に元のペプチドを上回るインビボ生体利用可能性を示し得る、生物学的に活性な強力なオピオルフィンのペプチド模倣体の、インビトロでの同定
【０２０３】
１．生物学的吸収の潜在的利益：膜透過輸送（上皮及び内皮細胞膜の通過）
【０２０４】
ポリエチレンＣ６、Ｃ８、ＣｌＯ又はＣ１２スペーサー等の化学疎水性部分を付加してオピオルフィンペプチドの改変することより、膜を通じての生物学的インビボ吸収効率が増大し得る。試験された全ての化合物の中で、ＮＨ２−ＱＲＦ［Ｓ−Ｏ−オクタノイル］Ｒ−ＣＯＯＨ−ＮＨ２−Ｙ（ＰＥ１２）ＱＲＦＳＲ−ＣＯＯＨ（ＰＥ＝［ＣＨ２］ｎ；ＰＥ１２＝アミノ−ドデカン酸）は、ヒトＮＥＰ（特異的エンドペプチダーゼ及びカルボキシジペプチダーゼ活性）及びＡＰ−Ｎ活性の強力な二機能性阻害因子であることが示された。
【０２０５】
２−代謝安定性の潜在的利益：システイン−ジペプチド：［ＣＱＲＦＳＲ］２
【０２０６】
［ＣＱＲＦＲ］ジペプチドは、ＣＱＲＦＳＲモノマーペプチドと比較して、ｈＮＥＰエンドペプチダーゼ活性及びカルボキシジペプチダーゼ活性に対する阻害能力が２倍以上増大した。該ジペプチドの配列は、循環しているアミノペプチダーゼによる分解から、該誘導体化合物を保護すると考えられる。
【０２０７】
明らかに、上記教示を考慮して、本発明の様々な改変及び変法を想到することが可能である。故に、添付の請求項の範囲内で、本発明は、本明細書中に特に記載した以外の態様で実施され得ると理解され得る。
【図１】
2015110651.tif 000008
【図２】
2015110651.tif 000009
【図３】
2015110651.tif 000010
【図４】
2015110651.tif 000011
【図５】
2015110651.tif 000012
【図６】
2015110651.tif 000013
【図７】
2015110651.tif 000014
【図８】
2015110651.tif 000015
【図９】
2015110651.tif 000016
【図１０】
2015110651.tif 000017
【図１１】
2015110651.tif 000018
【図１２】
2015110651.tif 000019
【図１３】
2015110651.tif 000020
【図１４】
2015110651.tif 000021
【図１５】
2015110651.tif 000022
【図１６】
2015110651.tif 000023
【図１７】
2015110651.tif 000024
【図１８】
2015110651.tif 000025
【図１９】
2015110651.tif 000026
【図２０】
2015110651.tif 000027
【図２１】
2015110651.tif 000028
【図２２】
2015110651.tif 000029
【図２３】
2015110651.tif 000030
【配列表】
2015110651000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月13日(2015.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
「Ｓ（ＯＡｌｋ）」は、ヒドロキシル基の水素原子が１〜２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルカノイル基（即ちＡｌｋ）、好ましくはオクタノイル又はドデカノイル基で置換されたセリンを意味する。本願において、Ｓ（Ｏ−Ｃ８−ポリエチレン）又はＳ（Ｏ−Ｃ８）は、ヒドロキシル基の水素原子がオクタノイル基で置換されたセリンを意味する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明は、ペプチド誘導体であり、式（Ｉ）：
ζ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＯＨ  （Ｉ）
［式中、
ζは、水素原子、チロシン、Ｙ−［リンカー］−又はＺｎキレート基、例えばシステイン、Ｃ−［リンカー］−、Ｎ−アセチル−システイン、Ｎ−メルカプトアセチル（ＨＳ−ＣＨ２−ＣＯ−）、ヒドロキサム酸（ＨＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、又は任意で置換されるヒドロキシキノリンであり、
ＡＡ１は、Ｑ又はＧｌｐであり、
ＡＡ２は、Ｋ、Ｒ又はＨ、好ましくはＲであり、
ＡＡ３は、Ｙ、Ｇ、Ｎ、Ｆ又はＦ（Ｘ）、好ましくはＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡ４は、Ｐ、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）、好ましくはＳ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡ５は、Ｋ又はＲ、好ましくはＲであり、
Ｃ−［リンカー］−は、Ｃｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ］−を意味し、ｎは１〜２０の整数、好ましくは６，８又は１２であり、
Ｙ−［リンカー］−は、Ｔｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ’−ＣＯ］−を意味し、ｎ’は１〜２０の整数、好ましくは６，８又は１２であり、
Ｆ（Ｘ）は、フェニル基が１つ以上のハロゲン原子で置換されたフェニルアラニンを意味し、
Ｓ（ＯＡｌｋ）は、ヒドロキシル基の水素原子が１〜２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルカノイル基で置換されたセリンを意味し、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかであり、そして任意のＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４及びＡＡ５のいずれか１つがβアミノ酸、アザ−アミノ酸又はβ−アザ−アミノ酸であってもよい］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ、ＱＨＮＰＲ、ＱＲＧＰＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＧｌｐＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのペプチド誘導体：
ζ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＯＨ （Ｉ）
［式中、
ζは、水素原子、チロシン、Ｙ−［リンカー］−、システイン、又はＣ−［リンカー］−であり、
ＡＡ１はＱであり、
ＡＡ２はＲであり、
ＡＡ３はＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡ４はＳ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡ５はＲであり、
Ｃ−［リンカー］−は、Ｃｙｓ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ］−を意味し、ｎは１〜２０の整数であり、
Ｙ−［リンカー］−は、Ｔｙｒ−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ’−ＣＯ］−を意味し、ｎ’は１〜２０の整数であり、
Ｆ（Ｘ）は、フェニル基が１つ以上のハロゲン原子で置換されたフェニルアラニンを意味し、
Ｓ（ＯＡｌｋ）は、ヒドロキシル基の水素原子が１〜２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルカノイル基で置換されたセリンを意味し、
システインである場合のζ及びＡＡ５は、独立してＬ型又はＤ型のいずれかである］
であり、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ、ＹＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド誘導体であり、式（ＩＩＩ）：
ζｎ−ＡＡ１−ＡＡｎ２−ＡＡｎ３−ＡＡｎ４−ＡＡｎ５−ＯＨ （ＩＩＩ）
［式中、
ζｎは、水素原子、チロシン又はＹ−［リンカー］−であり、
ＡＡ１はＱであり、
ＡＡｎ２はＲであり、
ＡＡｎ３はＦ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡｎ４は、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
ＡＡｎ５はＲであり、
Ｙ−［リンカー］−、Ｆ（Ｘ）及びＳ（ＯＡｌｋ）は請求項１において定義され、
ＡＡｎ５は、Ｌ型又はＤ型のいずれかである］
で表され、但し該ペプチドがＱＲＦＳＲ、ＹＱＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド誘導体であり、式（ＩＶ）：
ζｍ−Ｑ−Ｒ−ＡＡｍ３−ＡＡｍ４−Ｒ−ＯＨ （ＩＶ）
［式中、
ζｍは、水素原子、システイン、又はＣ−［リンカー］−であり、
ＡＡｍ３は、Ｆ又はＦ（Ｘ）であり、
ＡＡｍ４は、Ｓ又はＳ（ＯＡｌｋ）であり、
Ｃ−［リンカー］−、Ｆ（Ｘ）及びＳ（ＯＡｌｋ）は請求項１において定義され、
システインである場合のζｍ及びＡＡ５の位置のＲは、Ｌ型又はＤ型のいずれかである］
で表され、該ペプチド誘導体がシステインを含む場合、該ペプチド誘導体は任意でダイマーであり、但し該ペプチドは、ＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳＲではない、前記ペプチド誘導体。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチド誘導体の内、
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｙ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｙ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＣＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
ＣＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−ドデカノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）８−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−［ｄＲ］；
［ｄＣ］−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−［ｄＲ］；
［ＣＱＲＦＳＲ］２；
ＱＲ−Ｆ［４Ｆ］−ＳＲであり、−Ｆ［４Ｆ］−が、フェニル基のパラ位がフッ素原子で置換されたフェニルアラニンであるもの；
ＱＲ−Ｆ［４Ｂｒ］−ＳＲであり、−Ｆ［４Ｂｒ］−が、フェニル基のパラ位が臭素原子で置換されたフェニルアラニンであるもの；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦＳＲ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）６−ＣＯ−）−ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）ＱＲＦ−Ｓ（Ｏ−オクタノイル）−Ｒ；
Ｃ−（−ＨＮ−（ＣＨ２）１２−ＣＯ−）−ＱＲＦＳ−ｄＲ；
であり、ここで：
−Ｓ（−Ｏ−オクタノイル）が、ヒドロキシル基の水素原子がオクタノイル基で置換されたセリンを意味し；
−Ｓ（−Ｏ−ドデカノイル）が、ヒドロキシル基の水素原子がドデカノイル基で置換されたセリンを意味する；
前記ペプチド誘導体。
【請求項５】
中性エンドペプチダーゼＮＥＰ及び／又はアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対して阻害活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド誘導体。
【請求項６】
ヒトＮＥＰに対して阻害活性を有する、請求項２に記載のペプチド誘導体。
【請求項７】
中性エンドペプチダーゼＮＥＰ及び／又はアミノペプチダーゼＡＰ−Ｎに対する二機能性阻害因子である、請求項３に記載のペプチド誘導体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチド誘導体、及び医薬として許容される担体を含む組成物。
【請求項９】
膜メタロエクトペプチダーゼの活性の調節に関連する疾患又は障害を治療するための医薬組成物であって、疾患又は障害を治療するための量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の１つ以上のペプチド誘導体を含有する、医薬組成物。
【請求項１０】
前記膜メタロエクトペプチダーゼが膜−亜鉛メタロペプチダーゼである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記膜メタロペプチダーゼがＮＥＰ及び／又はＡＰ−Ｎである、請求項９又は１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
疼痛、抑鬱障害（ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、セクシャリティと関連する社会活動の障害、及び性行動の障害からなる群から選択される疾患又は障害を処置するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
膜メタロエクトペプチダーゼの活性の調節を意図して、疾患又は障害の治療において使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に定義されるペプチド誘導体。
【請求項１４】
前記膜メタロエクトペプチダーゼが膜亜鉛メタロペプチダーゼである、請求項１３に記載のペプチド誘導体。
【請求項１５】
前記膜メタロエクトペプチダーゼがＮＥＰ及び／又はＡＰ−Ｎである、請求項１３又は１４に記載のペプチド誘導体。
【請求項１６】
疼痛、抑鬱障害、セクシャリティと関連する社会活動の障害、及び性行動の障害からなる群から選択される疾患又は障害の処置において使用するための、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のペプチド誘導体。
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月14日(2015.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】ビヒクル又は５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図２】ビヒクル又は５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図３】ビヒクル又は５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図４】ビヒクル又は５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図７】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＱＲＦＳＲ−ペプチド類似体による阻害を表す。各バーは回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われた。
【図８】精製組換えヒトｈＮＥＰ又はＡＰ−Ｎによる対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解の、ＱＲＦＳＲ−ペプチド類似体による阻害を表す。各バーは回収された無傷の基質のパーセンテージを表し、「阻害因子無しの速度−阻害因子存在下の速度／阻害因子無しの速度」のパーセンテージとして計算され、測定は、５０μＭのＱＲＦＳＲペプチド類似体の存在下又は非存在下で行われた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
【図１２】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図１３】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図１４】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図１５】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図１６】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【図１７】ビヒクル又は１〜５０μＭのＣＱＲＦＳＲ又はＣＱＲＦＳ［Ｏ−オクタノイル］Ｒオピオルフィンペプチド類似体の存在下での、組換えｈＮＥＰ又はｈＡＰ−Ｎによる、対応するＦＲＥＴ−ペプチド基質の加水分解のキネティクスを示す。各点は、ＲＦＵ（相対蛍光単位）で表されるシグナルの強さを表しており、これらは形成される代謝物の量に比例しており、反応時間（分）との関数として表された。
【外国語明細書】
2015110651000001.pdf