(57)【要約】【課題】  本発明は、生体組織から核酸を抽出するにあたって、組織溶解のための酵素処理を必要とすることなく、簡易且つ短時間で効率よく核酸を回収できる、核酸増幅方法および核酸増幅用の核酸試料の製造方法を提供する。【解決手段】  単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、前記加熱処理工程後の前記混合物を核酸試料とし、前記核酸試料を含む反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、前記増幅工程において、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料であり、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わないことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、
前記加熱処理工程後の前記混合物を核酸試料とし、前記核酸試料を含む反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、
前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、
前記増幅工程において、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料であり、
前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わないことを特徴とする、核酸増幅方法。
【請求項２】
前記加熱処理工程において、前記混合物中の前記生体組織が、組織検体から切り出した組織切片である、請求項１記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記加熱処理工程において、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織を加熱し、
前記増幅工程において、前記加熱処理工程における加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する、請求項１または２記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記増幅工程において、加熱処理後の前記混合物から、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する、請求項１または２記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物から、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物を加熱処理し、
前記増幅工程において、加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する、請求項１または２記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記増幅工程において、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料である、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記増幅工程において、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０４〜０．６４ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料である、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物における、前記水性溶媒と前記生体組織との体積割合が、前記水性溶媒２０μＬに対し、前記生体組織０．０１〜１ｍｍ３である、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合液における、前記水性溶媒と前記生体組織との体積割合が、前記生体組織１ｍｍ３に対し、前記水性溶媒２０〜１００μＬである、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記加熱処理工程において、前記加熱処理後の前記水性溶媒の量が２〜２０μＬとなる加熱時間および加熱温度で処理する、請求項１から３、および５から９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
前記加熱処理工程において、加熱温度が、９０〜９８℃である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１２】
前記水性溶媒が、水、緩衝液および生理食塩水からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１３】
前記生体組織が、包埋組織、包埋組織から包埋試薬を除去した組織、固定化組織、固定組織から固定化試薬を除去した組織および生組織からなる群から選択された少なくとも一つの組織である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１４】
前記生体組織が、パラフィン包埋組織であり、
前記加熱処理工程に先立って、前記パラフィン包埋組織を脱パラフィン処理する工程を含み、
前記加熱処理工程において、前記脱パラフィン処理した前記組織について、加熱処理を行う、請求項１から１３のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１５】
単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程を含み、
前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、
前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わず、
前記加熱処理工程後の前記混合物のうち、核酸増幅の反応液５０μＬ当たり総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を、１回の核酸増幅のための核酸試料とすることを特徴とする、核酸増幅用の核酸試料の製造方法。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸増幅方法に使用する核酸試料の製造方法である、請求項１５記載の核酸試料の製造方法。
【請求項１７】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程、および、
前記増幅工程により得られた増幅物を用いて、ターゲット配列の検出を行う検出工程を含むことを特徴とする、核酸解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法、核酸増幅用の核酸試料の製造方法および核酸解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌の発症と遺伝子との関連性について、様々な報告がなされており、例えば、特定遺伝子における特定の変異の検出によって、癌を予備的に診断するという方法が広がっている。このため、癌の診断においては、病理診断および細胞診断に加えて、遺伝子解析による診断の併用が一般的となってきている。病理診断および細胞診断は、患者から組織を採取して、これを固定または包埋した組織検体を作製する必要がある。このため、通常、遺伝子解析に供する核酸試料は、前記組織検体から切り出した組織切片から抽出されている。
【０００３】
前記切片からの核酸抽出に関しては、種々の市販キットが汎用されているが、一般的に、酵素処理による組織の溶解を行った後、物理的または化学的吸着により核酸を抽出する方法がとられている（非特許文献１）。具体例として、パラフィン包埋組織切片からの核酸回収について、以下に示す。まず、前記パラフィン包埋組織切片について脱パラフィン処理を行う。続いて、脱パラフィン処理後の組織にプロテアーゼ等の組織溶解用の酵素を添加して、約１時間以上の組織の溶解処理を行う。そして、溶解処理によって前記組織から放出された核酸を、カラムまたは磁性ビーズ等の担体に物理的または化学的に吸着させた後、不純物の除去のために前記担体を洗浄し、前記吸着した核酸を前記担体から遊離させることで、核酸の精製と回収を行っている。
【０００４】
しかしながら、このような方法では、脱パラフィン後のプロテアーゼ処理に最低１時間以上を要し、また、精製工程に約３０〜９０分もの時間を要するため、作業時間が長いという問題がある。また、工程が煩雑なため、同じ処理を行っても回収率が不安定であり、例えば、熟練者か否かによって、回収できる核酸の量が異なるという問題がある。
【０００５】
このような問題は、例示したパラフィン包埋組織からの核酸回収には限られず、その他の包埋組織、固定組織および生組織等においても同様である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Clin. Chem. Lab. Med. 2011 50(2), 267-272
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、生体組織から核酸を抽出するにあたって、組織溶解のための酵素処理を必要とすることなく、簡易且つ短時間で効率よく核酸を回収できる、核酸増幅方法および核酸増幅用の核酸試料の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の核酸増幅方法は、単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、
前記加熱処理工程後の前記混合物を核酸試料とし、前記核酸試料を含む反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、
前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、
前記増幅工程において、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料であり、
前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わないことを特徴とする。
【０００９】
本発明の核酸増幅用の核酸試料の製造方法は、
単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程を含み、
前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、
前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わず、
前記加熱処理工程後の前記混合物のうち、核酸増幅の反応液５０μＬ当たり総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を、１回の核酸増幅のための核酸試料とすることを特徴とする。
【００１０】
本発明の核酸解析方法は、前記本発明の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程、および、
前記増幅工程により得られた増幅物を用いて、ターゲット配列の検出を行う検出工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、生体組織から切り出した組織切片に水性溶媒を添加し、前記水性溶媒中で加熱処理するのみで、プロテアーゼ等の酵素処理を施すことなく、前記生体組織中のＤＮＡ等の核酸を放出させ、迅速に優れた収率で、前記核酸を含む核酸試料を得ることができることを見出した。また、本発明によれば、煩雑な工程を不要とするため、例えば、作業者が熟練者か否かにかかわらず、安定した回収率を実現できる。したがって、本発明は、医療分野や生化学等の分野における組織からの核酸回収において、極めて有用であるといえる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜核酸増幅方法＞
本発明の核酸増幅方法は、前述のように、単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程、および、
前記加熱処理工程後の前記混合物を核酸試料とし、前記核酸試料を含む反応液中で、前記核酸試料中の核酸を鋳型として、核酸増幅を行う増幅工程を含み、
前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、
前記増幅工程において、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料であり、
前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わないことを特徴とする。
【００１３】
本発明は、前記加熱処理工程において、単離した生体組織の前処理によって、前記単離した生体組織より核酸を放出できる。このため、前記加熱処理工程は、例えば、核酸試料の製造方法または組織検体の前処理方法ということもできる。すなわち、本発明の核酸増幅方法は、単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程を含み、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わないことを特徴とする。以下、本発明の核酸増幅方法について説明するが、本発明の核酸増幅方法における前記加熱処理工程（以下、「前処理方法」ともいう。）は、本発明の核酸試料の製造方法と読み替え可能である。
【００１４】
本発明において、「組織溶解用の酵素が未添加」とは、前記単離した生体組織に対して前記酵素を添加しないことを意味し、本発明は、従来法とは異なり、前記加熱処理工程の前後にかかわらず、前記酵素による細胞溶解処理を行わない方法といえる。前記組織溶解用の酵素とは、例えば、プロテアーゼ、リプシン、ペプシン等があげられる。
【００１５】
前記前処理方法により前記生体組織を前処理することで、例えば、前記生体組織から放出された核酸を含む核酸試料を調製できる。前記核酸とは、例えば、ＤＮＡである。そして、前記核酸試料は、例えば、後述するように、核酸増幅の試料として使用できる。前記前処理方法は、前述のように、単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱処理するのみで、前記生体組織から核酸試料を調製できるため、例えば、前記生体組織からの核酸試料の調製と、前記核酸試料を用いた核酸増幅反応とを、一連の処理で行うことができる。このため、本発明の核酸増幅方法によれば、例えば、核酸試料の調製と核酸増幅反応とを、自動化することもできる。
【００１６】
本発明において、前記加熱処理工程および前記増幅工程は、特に制限されないが、例えば、下記（１）の実施形態１、下記（２）の実施形態２、および下記（３）の実施形態３があげられる。以下、実施形態１、実施形態２および実施形態３について、それぞれ例をあげて説明する。なお、特に示さない限り、実施形態１、実施形態２および実施形態３の説明は、互いに援用できる。
（１）前記加熱処理工程において、所定体積の前記生体組織を加熱し、
前記増幅工程において、前記加熱処理工程における加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する
（２）前記加熱処理工程において、任意の体積の前記生体組織を加熱し、
前記増幅工程において、加熱後の前記混合物から、所定体積の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する
（３）前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物から、所定体積の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物を加熱処理し、
前記増幅工程において、加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する
【００１７】
（実施形態１）
実施形態１は、前記（１）の実施形態、すなわち、前記加熱処理工程において、所定体積の前記生体組織を加熱し、前記増幅工程において、前記加熱処理工程における加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する形態である。
【００１８】
前記非特許文献１に記載の方法では、さらに、工程が煩雑であるため、工程ごとでロスが生じ、核酸の回収率が十分ではないという問題がある。そして、低い回収率を補う方法として、例えば、核酸回収に使用する切片の体積を大きくするということが考えられるが、これには以下のような問題がある。すなわち、癌の発症に特定遺伝子の変異が関連している場合、組織には、正常遺伝子を有する正常細胞と変異遺伝子を有する変異細胞との両方が含まれる。このため、遺伝子解析においては、前記正常細胞に対して前記変異細胞の割合が極めて低い場合であっても、前記変異遺伝子を検出できることが重要となる。そこで、解析の感度を向上させるため、前記組織診断および前記細胞診断の結果に基づき、前記切片から、前記変異細胞の割合が高いと推測される特定の領域を断片として切り出し、これから核酸回収を行うことが望ましい。しかしながら、前述のように、前記切片から切り出す断片を大きくすると、核酸自体は十分量を回収できても、目的の変異遺伝子の割合が低下し、結果的に、前記変異遺伝子を検出できないおそれがある。
【００１９】
また、前記核酸試料の調製と、前記核酸試料を用いた核酸増幅とを行う場合、簡便性の点から、例えば、前記組織切片から得られた前記核酸試料の全量を、そのまま１回の核酸増幅反応に使用することが好ましい。病理診断で採取した組織検体等の単離した生体組織を用いて遺伝子解析を行う場合、１回の核酸増幅反応用の核酸試料の調製に使用される生体組織の大きさは、例えば、約０．０１〜１ｍｍ３程度である。このため、実施形態１によれば、例えば、病理診断の組織検体から切り出したこのような大きさの生体組織を用いて、核酸試料を調製する場合に、非常に適しているといえる。また、実施形態１によれば、前記生体組織を大きく切り出す必要がないため、例えば、得られた核酸試料に含まれる核酸中の目的の変異遺伝子の割合が低下しない。このため、実施形態１の核酸増幅方法によれば、例えば、前記変異遺伝子を効率良く検出できる。
【００２０】
実施形態１において、前記生体組織の加熱処理は、前記水性溶媒の存在下で行えばよく、その他の条件は特に制限されない。前記加熱処理において、前記生体組織に前記水性溶媒を添加し、前記混合物としてもよいし、前記水性溶媒に前記生体組織を添加し、前記混合物としてもよい。
【００２１】
前記加熱処理工程に供する前記生体組織の大きさは、例えば、０．０１〜１ｍｍ３であり、好ましくは、０．０４〜１ｍｍ３、より好ましくは、０．０４〜０．６４ｍｍ３である。
【００２２】
前記生体組織の形状は、特に制限されない。前記生体組織の厚みは、例えば、２〜２０μｍであり、好ましくは、５〜１５μｍであり、より好ましくは、８〜１２μｍである。また、前記生体組織の最も広い平面の面積は、例えば、例えば、１〜４００ｍｍ２であり、好ましくは、１〜１００ｍｍ２であり、より好ましくは、４〜６４ｍｍ２である。
【００２３】
前記加熱処理工程において、加熱時間は、前述のように、５〜６０分であり、好ましくは、５〜２０分であり、より好ましくは、８〜１２分である。前記加熱時間は、例えば、前記生体組織の大きさに応じて、適宜決定できる。前記生体組織の大きさと前記加熱時間との関係は、特に制限されず、例えば、相対的に大きな生体組織は、相対的に長い加熱時間に設定してもよい。具体例として、生体組織の大きさが１ｍｍ３以下の場合、例えば、５〜２０分であり、好ましくは、５〜１５分、より好ましくは５〜１０分である。
【００２４】
前記加熱処理工程において、前記水性溶媒の量は、特に制限されない。前記水性溶媒の量は、例えば、前記加熱時間の長さ、または、前記生体組織の大きさ等に応じて、適宜決定できる。実施形態１の前処理方法により得られる核酸試料は、前述のように、核酸増幅の試料として使用できる。このため、例えば、後の核酸増幅に供する際、取扱い易いように、前記加熱処理工程の完了時において、適当量の水性溶媒が残存していることが好ましい。前記加熱処理工程の完了時における前記水性溶媒の量は、特に制限されず、例えば、２〜２０μＬ、好ましくは３〜１５μＬ、より好ましくは４〜１０μＬである。
【００２５】
前記加熱処理工程の開始時における前記水性溶媒の量は、特に制限されず、前述のように、前記加熱処理工程の完了時において適当量の水性溶媒が残存するような条件が好ましく、例えば、前記加熱時間等から適宜設定可能であり、例えば、５〜１００μＬであり、好ましくは、８〜８０μＬであり、より好ましくは、１０〜５０μＬである。前記加熱処理工程においては、例えば、前記加熱処理工程の完了時における前記水性溶媒の量が、前述のような範囲となるような加熱時間および加熱温度で処理されることが好ましい。
【００２６】
前記加熱処理工程において、前記加熱時間と前記水性溶媒の量は、前述のように、特に制限されない。具体例として、加熱時間が２０分以下の場合、例えば、１０〜４０μＬであり、好ましくは、１０〜３０μＬ、より好ましくは、２０〜３０μＬであり、加熱時間が２０分を超える場合、例えば、２０〜１００μＬであり、好ましくは、４０〜８０μＬ、より好ましくは、４０〜５０μＬである。
【００２７】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物における、前記生体組織に対する水性溶媒の体積割合は、特に制限されず、例えば、前記生体組織の大きさまたは前記加熱時間の長さに応じて適宜設定できる。具体例として、前記水性溶媒と前記生体組織との体積割合は、前記生体組織１ｍｍ３に対し、例えば、１０〜１００μＬであり、好ましくは、１０〜８０μＬであり、より好ましくは、２０〜５０μＬである。
【００２８】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物における、前記水性溶媒に対する前記生体組織の体積割合は、特に制限されず、前記生体組織の大きさまたは前記加熱時間の大きさに応じて適宜決定できる。具体例として、前記水性溶媒と前記生体組織との体積割合は、前記水性溶媒２０μＬに対し、例えば、０．０１〜１ｍｍ３であり、好ましくは、０．０４〜１ｍｍ３、さらに好ましくは、０．０４〜０．６４ｍｍ３である。ここで、前記生体組織の添加量は、前記加熱処理前の前記水性溶媒の割合に応じて調整でき、例えば、前記加熱処理前の前記水性溶媒が１００μＬであれば、前記生体組織の添加量は、０．０５〜５ｍｍ３の比率で添加してもよい。
【００２９】
前記加熱処理工程において、加熱温度は、特に制限されず、例えば、９０〜９８℃であり、好ましくは、９２〜９６℃であり、より好ましくは、９４〜９５℃である。
【００３０】
下記表１に、前記生体組織の大きさと水性溶媒（例えば、水）の量との割合、および加熱処理後の前記水性溶媒の量、加熱温度、加熱時間を例示するが、これらは例示であって、実施形態１の前処理方法は、これらの例示に制限されない。
【００３１】
【表１】
2015096061.tif 000002
【００３２】
また、具体例として、以下のような条件も例示できるが、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００３３】
【表２】
2015096061.tif 000003
【００３４】
前記水性溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液、生理食塩水等があげられ、これらのいずれかでもよいし、これらの少なくとも２種類の混合液でもよい。前記加熱処理において、前記生体組織と共存させる溶媒は、水性溶媒のみからなることが好ましく、例えば、有機溶媒が混在する場合、溶媒全量における前記有機溶媒の割合は、１ｗ／ｗ％以下が好ましく、より好ましくは、０．１ｗ／ｗ％以下であり、さらに好ましくは、検出限界未満であり、特に好ましくは、０ｗ／ｗ％である。
【００３５】
実施形態１の前処理方法は、例えば、ホモジネート処理した生体組織を加熱処理してもよいが、ホモジネート処理していない生体組織を加熱処理することが好ましい。実施形態１の前処理方法によれば、前記生体組織をホモジネート処理することなく、前記加熱処理を施すのみで、効率良く核酸を回収できる。前記ホモジネート処理の方法は、特に制限されず、例えば、スパチュラ等での押潰、ピペット等での吸排等があげられる。
【００３６】
前記生体組織の種類は、特に制限されず、例えば、組織検体などがあげられる。前記組織検体の種類は、特に制限されず、例えば、包埋組織、固定組織、生組織等があげられる。
【００３７】
前記包埋組織は、特に制限されず、包埋試薬で包埋処理された組織があげられる。前記包埋試薬は、例えば、パラフィン等があげられ、前記包埋組織は、例えば、パラフィン包埋組織等があげられる。
【００３８】
前記加熱処理に供する生体組織は、前記包埋組織から前記包埋試薬を除去した生体組織から切り出した切片が好ましい。前記包埋組織からの前記包埋試薬の除去方法は、特に制限されず、例えば、前記包埋試薬の種類によって、適宜選択できる。前記除去方法は、例えば、前記包埋組織に含まれる前記包埋試薬を溶解する除去試薬を使用することが好ましく、前記除去試薬は、例えば、キシレン、前記キシレンの代替品等が使用でき、前記代替品としては、例えば、商品名Hemo-De（株式会社ファルマ）、商品名Neo-Clear（登録商標、メルク社）、商品名Clear  Advantage（ポリサイエンス）、商品名ティシュークリア（サクラファインテックジャパン）等が使用できる。
【００３９】
具体例として、前記パラフィン包埋組織に対する脱パラフィン処理の一例を以下に示すが、本発明は、これには限定されない。まず、前記パラフィン包埋組織をキシレンに浸漬する。浸漬の条件は、特に制限されず、浸漬回数は、例えば、１〜１００回であり、好ましくは５〜５０回であり、浸漬時間は、１回の浸漬あたり、例えば、１〜６０分であり、好ましくは１０〜３０分である。そして、前記浸漬後の前記組織の中和処理を行う。前記中和処理は、例えば、アルコールへの浸漬と水への浸漬により行える。アルコール濃度は、高濃度から低濃度に段階的に変化させることが好ましく、最終的に水を使用することが好ましい。具体例としては、まず、１００％アルコールへの浸漬を行い、続いて、７０〜９５％アルコールへの浸漬、３０〜７０％アルコールへの浸漬を行い、最終的に水に浸漬する。
【００４０】
前記固定組織は、特に制限されず、固定化試薬で固定処理された組織があげられる。前記固定化試薬は、例えば、ホルマリン等があげられ、前記包埋組織は、例えば、ホルマリン固定組織等があげられる。
【００４１】
前記加熱処理に供する生体組織は、前記固定組織から前記固定化試薬を除去した生体組織から切り出した切片が好ましい。前記固定組織からの前記固定化試薬の除去方法は、特に制限されず、例えば、前記固定化試薬の種類によって、適宜選択できる。前記除去方法は、例えば、前記固定組織に含まれる前記固定化試薬を溶解する除去試薬を使用することが好ましく、前記除去試薬は、例えば、アルコール、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、ドライゾール等が使用できる。
【００４２】
具体例として、前記ホルマリン固定生体組織に対する脱ホルマリン処理の一例を以下に示すが、本発明は、これには限定されない。まず、前記ホルマリン固定生体組織をアルコールに浸漬する。浸漬の条件は、特に制限されず、浸漬回数は、例えば、１〜１００回であり、好ましくは５〜５０回であり、浸漬時間は、１回の浸漬あたり、例えば、０．５〜６０分であり、好ましくは１〜３０分である。そして、前記浸漬後の前記生体組織の中和処理を行う。前記中和処理は、例えば、前述の脱パラフィン処理と同様である。
【００４３】
前記生組織は、例えば、生体から採取した未処理の組織である。
【００４４】
本発明において、組織を採取する生体の部位や、生体の種類は、特に制限されない。前記生体の部位は、肝臓、腎臓、肺、胃および腸等の消化器官等、様々な部位があげられる。また、生体の由来は、例えば、ヒト、または、ヒト以外の非ヒト動物等があげられる。前記生体組織は、例えば、前記生体組織から、変異細胞の割合が高いと推測される特定の領域を切り出して、使用することが好ましい。
【００４５】
前記生体組織と前記水性溶媒との混合物の加熱処理を行った後、前記加熱処理後の前記混合物は、そのまま核酸試料として使用することができる。すなわち、実施形態１の前処理方法は、例えば、前記加熱処理工程の後において、さらに、前記加熱処理物からの核酸の精製処理工程を含まなくてもよい。前記加熱処理によって調製された核酸試料、すなわち、前記生体組織と前記水性溶媒との加熱処理物によれば、例えば、そのままＰＣＲ等の核酸増幅方法に供することができる。
【００４６】
つぎに、前記増幅工程において、前記加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する。前記増幅工程において、使用する前記核酸試料の量は、特に制限されず、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、例えば、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料であり、好ましくは、総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料であり、より好ましくは、総体積０．０４〜０．６４ｍｍ３の前記生体組織から得られた試料である。
【００４７】
実施形態１においては、前記実施形態１の前処理方法により調製した前記混合物を核酸試料とし、前記核酸試料中の核酸を、鋳型として使用できる。実施形態１の増幅工程において、核酸増幅の手法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用でき、具体例として、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  acid  sequence  based  amplification）法、ＴＭ（Transcription−mediated  amplification）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、SMart  Amplification  Process法、ＬＡＭＰ（Loop−Mediated  Isothermal  Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal  and  Chimeric  primer−initiated  Amplification  of  Nucleic  acids）法等があげられる。また、各種核酸増幅の手法における工程や反応条件等は、制限されず、例えば、従来公知の条件に従って行うことができる。
【００４８】
（実施形態２）
実施形態２は、前記（２）の実施形態、すなわち、前記加熱処理工程において、任意の体積の前記生体組織を加熱し、前記増幅工程において、加熱後の前記混合物から、所定体積の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する形態である。
【００４９】
前記加熱処理工程に供する前記生体組織の大きさは、特に制限されず、例えば、０．０１〜１８ｍｍ３であり、好ましくは、０．０４〜９ｍｍ３、より好ましくは、０．０４〜１ｍｍ３である。
【００５０】
前記生体組織の形状は、特に制限されない。前記生体組織の厚みは、例えば、２〜２０μｍであり、好ましくは、２〜１０μｍであり、より好ましくは、５〜１０μｍである。また、前記生体組織の最も広い平面の面積は、例えば、例えば、１〜９００ｍｍ２であり、好ましくは、４〜４００ｍｍ２であり、より好ましくは、４〜１００ｍｍ２である。
【００５１】
前記加熱処理工程において、加熱時間は、前述のように、５〜６０分であり、好ましくは、５〜２０分であり、より好ましくは、８〜１２分である。前記加熱時間は、例えば、前記生体組織の大きさに応じて、適宜決定できる。前記生体組織の大きさと前記加熱時間との関係は、特に制限されず、例えば、相対的に大きな生体組織は、相対的に長い加熱時間に設定してもよい。具体例として、生体組織の大きさが１ｍｍ３以下の場合、例えば、５〜２０分であり、好ましくは、５〜１５分、より好ましくは、５〜１０分であり、前記生体組織の大きさが１ｍｍ３を超える場合、例えば、５〜６０分であり、好ましくは、１０〜３０分、より好ましくは、１０〜２０分である。
【００５２】
前記加熱処理工程において、前記水性溶媒の量は、特に制限されない。前記水性溶媒の量は、例えば、前記加熱時間の長さ、または、前記生体組織の大きさ等に応じて、適宜決定できる。実施形態２の前処理方法により得られる核酸試料は、前述のように、核酸増幅の試料として使用できる。このため、例えば、後の核酸増幅に供する際、取扱い易いように、前記加熱処理工程の完了時において、適当量の水性溶媒が残存していることが好ましい。前記加熱処理工程の完了時における前記水性溶媒の量は、特に制限されない。
【００５３】
前記加熱処理工程の開始時における前記水性溶媒の量は、特に制限されず、前述のように、前記加熱処理工程の完了時において適当量の水性溶媒が残存するような条件が好ましい。
【００５４】
前記加熱処理工程において、前記加熱時間と前記水性溶媒の量は、前述のように、特に制限されない。
【００５５】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物における、前記生体組織に対する水性溶媒の体積割合は、特に制限されず、例えば、前記生体組織の大きさまたは前記加熱時間の長さに応じて適宜設定できる。
【００５６】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物における、前記水性溶媒に対する前記生体組織の体積割合は、特に制限されず、前記生体組織の大きさまたは前記加熱時間の大きさに応じて適宜決定できる。具体例として、前記水性溶媒と前記生体組織との体積割合は、前記水性溶媒２０μＬに対し、例えば、０．０１〜１ｍｍ３であり、好ましくは、０．０４〜１ｍｍ３、さらに好ましくは、０．０４〜０．６４ｍｍ３である。ここで、前記生体組織の添加量は、前記加熱処理前の前記水性溶媒の割合に応じて調整でき、例えば、前記加熱処理前の前記水性溶媒が１００μＬであれば、前記組織切片の添加量は、０．０５〜５ｍｍ３の比率で添加してもよい。
【００５７】
前記加熱処理工程において、加熱温度は、特に制限されず、例えば、９０〜９８℃であり、好ましくは、９２〜９６℃であり、より好ましくは、９４〜９５℃である。
【００５８】
前記生体組織の体積、前記水性溶媒の量および前記加熱時間を例示するが、本発明は、これらの例示には制限されない。
【００５９】
【表３】
2015096061.tif 000004
【００６０】
実施形態２の前処理方法は、例えば、ホモジネート処理していない生体組織を加熱処理してもよいが、ホモジネート処理している生体組織を加熱処理することが好ましい。実施形態２の前処理方法は、前記生体組織をホモジネート処理することで、より効率良く核酸を回収できる。前記ホモジネート処理の方法は、例えば、前述の通りである。
【００６１】
前記生体組織と前記水性溶媒との混合物の加熱処理を行った後、前記加熱処理後の前記混合物は、そのまま核酸試料として使用することができる。すなわち、実施形態２の前処理方法は、例えば、前記加熱処理工程の後において、さらに、前記加熱処理物からの核酸の精製処理工程を含まなくてもよい。前記加熱処理によって調製された核酸試料、すなわち、前記生体組織と前記水性溶媒との加熱処理物によれば、例えば、そのままＰＣＲ等の核酸増幅方法に供することができる。
【００６２】
つぎに、前記増幅工程において、前記加熱処理後の前記混合物から加熱後の前記混合物から、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する。前記増幅工程において、採取する前記生体組織の量は、好ましくは、総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量であり、より好ましくは、総体積０．０４〜０．６４ｍｍ３の前記生体組織に相当する量である。この点を除き、実施形態２の増幅工程は、実施形態１の増幅工程と同じであり、実施形態１の説明を援用できる。
【００６３】
（実施形態３）
実施形態３は、前記（３）の実施形態、すなわち、前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物から、所定体積の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物を加熱処理し、前記増幅工程において、加熱処理後の前記混合物の全量を、前記核酸試料として１回の核酸増幅に使用する形態である。
【００６４】
前記加熱処理工程において、前記加熱処理前の前記生体組織の大きさ、形状、厚みおよび最も広い面積は、特に制限されず、例えば、実施形態２の前記加熱処理工程に供する前記生体組織の説明を援用できる。
【００６５】
前記加熱処理工程において、加熱処理前の前記混合物から、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を採取し、採取した前記混合物の全量を、加熱処理する。採取する前記生体組織の量は、好ましくは総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量であり、より好ましくは、総体積０．０４〜０．６４ｍｍ３の前記生体組織に相当する量である。
【００６６】
実施形態３の前処理方法は、例えば、ホモジネート処理していない生体組織を含む混合物から、加熱処理する混合物を採取してもよいが、ホモジネート処理している生体組織を含む混合物から、加熱処理する混合物を採取することが好ましい。実施形態３の前処理方法は、前記生体組織をホモジネート処理することで、より効率良く核酸を回収できる。前記ホモジネート処理の方法は、例えば、前述の通りである。
【００６７】
この点を除き、実施形態３の前記加熱処理工程および前記増幅工程は、実施形態１の前記加熱処理工程および前記増幅工程と同じであり、実施形態１の説明を援用できる。
【００６８】
＜核酸増幅用の核酸試料の製造方法＞
本発明の核酸増幅用の核酸試料の製造方法は、前述のように、単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程を含み、前記加熱処理工程において、前記加熱処理時間が、５〜６０分であり、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わず、前記加熱処理工程後の前記混合物のうち、核酸増幅の反応液５０μＬ当たり総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記生体組織に相当する量を、１回の核酸増幅のための核酸試料とすることを特徴とする。
【００６９】
本発明の核酸増幅用の核酸試料の製造方法は、前記加熱処理工程において、単離した生体組織の前処理によって、前記単離した生体組織より核酸を放出できる。すなわち、本発明の核酸増幅用の核酸試料の製造方法は、単離した生体組織と水性溶媒との混合物を加熱することにより、前記生体組織から核酸を放出させる加熱処理工程を含み、前記加熱処理工程の前後において、組織溶解用の酵素による酵素処理を行わないことを特徴とする。本発明の核酸増幅用の核酸試料の製造方法において、前記加熱処理工程は、前記本発明の核酸増幅方法の説明を援用できる。
【００７０】
本発明の製造方法により得られた核酸試料は、例えば、前記本発明の核酸増幅方法の核酸試料として使用することができる。このため、本発明の製造方法は、例えば、前記本発明の核酸増幅方法に使用する核酸試料の製造方法としてもよい。
【００７１】
＜核酸解析方法＞
本発明の核酸解析方法は、前述のように、前記本発明の核酸増幅方法により、核酸増幅を行う増幅工程、および、前記増幅工程により得られた増幅物を用いて、ターゲット配列の検出を行う検出工程を含むことを特徴とする。
【００７２】
本発明の核酸解析方法は、前記本発明の核酸増幅方法により核酸増幅を行うことが特徴であって、その他の工程および条件等は、何ら制限されない。本発明において、核酸増幅は、前記本発明の核酸増幅方法の説明を援用できる。
【００７３】
前記検出工程において、前記ターゲット配列の検出は、例えば、前記ターゲット配列の有無を検出する定性分析でもよいし、前記ターゲット配列の量を検出する定量分析でもよい。
【００７４】
前記検出工程において、前記ターゲット配列の検出方法は、特に制限されず、従来公知の方法が援用できる。具体例として、前記検出工程は、例えば、前記増幅工程により得られる前記増幅産物の有無または量によって、ターゲット配列の有無または量を検出できる。また、前記検出工程は、例えば、前記増幅工程により得られる前記増幅産物と、前記ターゲット配列を検出できる検出用プローブとを用いた融解曲線解析（いわゆるＴｍ解析）による検出でもよい。また、前記検出工程は、例えば、Sybr（登録商標）Green等の検出試薬を用いた検出でもよい。
【実施例】
【００７５】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されない。
【００７６】
［実施例１］
パラフィン包埋組織切片を脱パラフィン処理し、加熱処理を施すことによって、核酸試料の調製を行った。
【００７７】
肺腺癌患者（ｎ＝５）の肺から採取した腫瘍組織のパラフィン包埋切片を使用した。前記癌患者は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソンの１９番目に欠損変異（エクソン１９欠損変異）が存在し、同遺伝子のエクソン２１番目のコドン８５８におけるロイシンからアルギニンに置換した点突然変異（Ｌ８５８Ｒ）が存在しないことを確認済みである。
【００７８】
前記パラフィン包埋切片について、腫瘍部をマーキングし、種々の大きさの断片を切り出し、チューブに入れた。前記断片の大きさは、縦２ｍｍ×横２ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル１）、縦５ｍｍ×横５ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル２）、縦８ｍｍ×横８ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル３）、縦１０ｍｍ×横１０ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル４）とした。
【００７９】
これらの断片について、脱パラフィン処理を行った。すなわち、まず、前記断片をいれた前記チューブにキシレンを添加し、混和、遠心後、キシレンを除去し、１００％エタノールを添加して、前記断片の親水処理を行った。そして、前記エタノールを除去し、前記チューブ内の前記断片を乾燥した。これを、核酸試料を調製するための組織検体とした。
【００８０】
つぎに、前記チューブに精製水を添加し、加熱処理を行った。精製水の添加量は、２０μＬとし、９５℃で１０分間加熱処理した。
【００８１】
そして、加熱処理後の処理物全量（９μＬ）を核酸試料とし、遺伝子解析を行った。具体的には、下記表４の組成の反応液を調製して、ＰＣＲとＴｍ解析とを行い、前記ＥＧＦＲ遺伝子の前記変異の検出を行った。
【００８２】
【表４】
2015096061.tif 000005
【００８３】
フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブは、特開２０１２−１０５６４６（特願２０１１−２３７８８０）に開示された下記配列を使用した。
フォワードプライマー(1)  配列番号１
5’-aggaacgtactggtgaaaacaccgc-3’
フォワードプライマー(2)  配列番号２
5’-tctctctgtcatagggactc-3’
リバースプライマー(1)  配列番号３
5’-gcctccttctgcatggtattctttctc-3’
リバースプライマー(2)  配列番号４
5’-gaaactcacatcgaggatttc-3’
プローブ(1)  配列番号５
5’-ttggccCgcccaaaatc-(蛍光)-3’
プローブ(2)  配列番号６
5’-(蛍光)-cccgtcgctatcaaggaattaagagaagc-P-3’
【００８４】
前記反応液について、遺伝子解析装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒の後、９５℃５秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃１秒および４０℃６０秒で処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から９５℃に加熱していき、検出波長４４５〜５５５ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。
【００８５】
そして、前記Ｔｍ解析において、６７℃と５０℃前後におけるピークの有無でエクソン１９欠損変異の有無を確認した。６７℃のピークは、前記ＥＧＦＲ遺伝子の目的部位が正常型であることを意味し、５０℃前後のピークは、前記ＥＧＦＲ遺伝子の目的部位が変異型であることを意味する。したがって、前記５０℃前後においてピークが確認された場合、前記核酸試料において、前記変異を有するＥＧＦＲ遺伝子が回収されたと判断できる。なお、Ｌ８５８Ｒ変異については、５２℃のピークは、前記ＥＧＦＲ遺伝子の目的部位が正常型であることを意味し、６２℃のピークは、前記ＥＧＦＲ遺伝子の目的部位が変異型であることを意味する。したがって、前記５２℃においてピークが確認された場合、前記核酸試料において、Ｌ８５８Ｒ変異を有さないＥＧＦＲ遺伝子が正確に回収されたと判断できる。これらの結果を下記表５に示す。
【００８６】
【表５】
2015096061.tif 000006
【００８７】
前記表５に示すように、精製水とともに脱パラフィン処理後の組織検体を加熱処理して得られた核酸試料（サンプル１−３）は、いずれも、検体全て（ｎ＝５）について、ＰＣＲ後のＴｍ解析において、目的部位が変異型であるＥＧＦＲ遺伝子の存在が確認された。また、前記加熱処理前の前記水性溶媒の量を増やすことで、前記加熱処理後の水性溶媒を所望の量とすることができる。また、加熱温度を調整することでも、前記加熱処理後の水性溶媒を、所望の量とすることができる。これらの結果は、前記核酸試料に、前記組織検体中の変異遺伝子が確実に回収されていることを意味する。このように、本発明によれば、加熱処理を行うのみで、目的の遺伝子が回収された核酸試料を得ることができることがわかった。
【００８８】
［実施例２Ａ］
異なる大きさの組織切片に加熱処理を施すことによって、核酸試料の調製を行った。
【００８９】
肺腺癌患者（ｎ＝５、検体１〜４）の肺から採取した腫瘍組織のパラフィン包埋切片を使用した。前記癌患者は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソンの１９番目に欠損変異（エクソン１９欠損変異）が存在し、同遺伝子のエクソン２１番目のコドン８５８におけるロイシンからアルギニンに置換した点突然変異（Ｌ８５８Ｒ）が存在しないことを確認済みである。
【００９０】
前記パラフィン包埋切片について、腫瘍部をマーキングし、種々の大きさの断片を切り出し、チューブに入れた。前記断片の大きさは、縦２ｍｍ×横２ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル５）、縦５ｍｍ×横５ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル６）、縦８ｍｍ×横８ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル７）、縦１０ｍｍ×横１０ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル８）、縦１５ｍｍ×横１５ｍｍ×厚み１０μｍ（比較例１）、縦２０ｍｍ×横２０ｍｍ×厚み１０μｍ（比較例２）とした。
【００９１】
サンプル５〜８の断片について、前記実施例１と同様にして、前記ＥＧＦＲ遺伝子の前記変異の検出を行った。また、比較例１および２は、９５℃で２０分間加熱処理した以外は、同様にして、前記ＥＧＦＲ遺伝子の前記変異の検出を行った。この結果を、下記表６に示す。
【００９２】
【表６】
2015096061.tif 000007
【００９３】
前記表６に示すように、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記組織切片から得られた試料（サンプル５〜８）である場合、全ての検体で変異が確認できた。一方、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積２．２５ｍｍ３以上の前記組織切片から得られた試料（比較例１および２）である場合、全ての検体で変異が確認できなかった。これらの結果から、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料を、総体積０．０１〜１ｍｍ３の前記組織切片から得られた試料とすることで、前記生体組織から得られた前記核酸試料中の変異遺伝子を増幅できることがわかった。
【００９４】
［実施例２Ｂ］
組織切片に加熱処理を施すことによって、調製した核酸試料を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。
【００９５】
（１）ＥＧＦＲの変異の検出
肺腺癌患者（ｎ＝１）の肺から採取した腫瘍組織のパラフィン包埋切片を使用した。前記癌患者は、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソンの１９番目に欠損変異（エクソン１９欠損変異）が存在し、同遺伝子のエクソン２１番目のコドン８５８におけるロイシンからアルギニンに置換した点突然変異（Ｌ８５８Ｒ）が存在しないことを確認済みである。
【００９６】
前記パラフィン包埋切片について、腫瘍部をマーキングし、種々の大きさの断片を切り出し、チューブに入れた。前記断片の大きさは、縦２ｍｍ×横２ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル９）、縦５ｍｍ×横５ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル１０）、縦８ｍｍ×横８ｍｍ×厚み１０μｍ（サンプル１１）、縦１５ｍｍ×横１５ｍｍ×厚み１０μｍ（比較例３）、縦２０ｍｍ×横２０ｍｍ×厚み１０μｍ（比較例４）とした。
【００９７】
サンプル９〜１１の断片について、前記実施例１と同様にして、前記ＥＧＦＲ遺伝子の前記変異の検出を行った。また、比較例３および４は、９５℃で２０分間加熱処理した以外は、同様にして、前記ＥＧＦＲ遺伝子の前記変異の検出を行った。
【００９８】
この結果、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記組織切片から得られた試料（サンプル９〜１１）である場合、全ての検体で変異が確認できた。一方、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料が、総体積２．２５ｍｍ３を超える前記組織切片から得られた試料（比較例３および４）である場合、全ての検体で変異が確認できなかった。これらの結果から、前記反応液５０μＬ当たりに含まれる前記核酸試料を、総体積０．０４〜１ｍｍ３の前記組織切片から得られた試料とすることで、前記生体組織から得られた前記核酸試料中の変異遺伝子を増幅できることが確認できた。
【００９９】
（２）リアルタイムＰＣＲ
前記（１）でサンプル１０から調製した核酸試料を用いたリアルタイムＰＣＲは、以下の手順で行った。具体的には、まず、下記表７〜９の組成の試薬キット１〜３を調製した。
【０１００】
【表７】
2015096061.tif 000008
【０１０１】
【表８】
2015096061.tif 000009
【０１０２】
【表９】
2015096061.tif 000010
【０１０３】
つぎに、下記表１０の組成の反応準備液を調製した。
【０１０４】
【表１０】
2015096061.tif 000011
【０１０５】
さらに、下記表１１の組成の反応液を調製した。
【０１０６】
【表１１】
2015096061.tif 000012
【０１０７】
前記反応液（ｎ＝３）について、遺伝子発現解析装置（Rotor gene、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。前記リアルタイムＰＣＲは、９５℃で１分の後、９５℃１分および６０℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、サイクル毎に蛍光強度を測定した。また、標準試料は、前記核酸試料に代えて、１００、１０００、または１０００コピー／μＬのヒトゲノムＤＮＡ（Roche社製）を用いた以外は同様にして、蛍光強度を測定した。つぎに、前記標準試料の蛍光強度から標準曲線を作製した。そして、前記標準曲線に基づき、前記核酸試料中のゲノムのコピー数を算出した。この結果、前記核酸試料には、３５８．２０コピーが含まれていることがわかった。これらのことから、前記核酸試料が、リアルタイムＰＣＲに使用できることがわかった。
【０１０８】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【０１０９】
この出願は、２０１３年１０月８日に出願された日本出願特願２０１３−２１０９８３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
以上のように、本発明によれば、前述した関連技術のようなプロテアーゼ等の酵素処理が不要であり、生体組織を水性溶媒中で加熱処理するのみで、優れた収率で核酸を含む核酸試料を得ることができる。また、本発明によれば、煩雑な工程を不要とするため、例えば、作業者が熟練者か否かにかかわらず、安定した回収率を実現できる。したがって、本発明は、医療分野や生化学等の分野における組織からの核酸回収において、極めて有用であるといえる。
【配列表】
2015096061000001.app