(57)【要約】      （修正有）【課題】融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株、及び組み換えリステリア株と薬学的に許容される担体とを含むワクチンまたは免疫原性組成物の提供。【解決手段】腫瘍特異性抗現ポリペプチド，および任意で，血管新生ポリペプチドを発現する組み換えリステリア株であって，ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子に変異を含む弱毒化リステリアであり，前記ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子の変異を補完する代謝酵素を含み，内因性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含む組み換えリステリア株。前記リステリア株は，Ｎ末端ＬＬＯ（リステリオシン−Ｏ）に融合された融合タンパク質を発現する免疫原性組成物。【選択図】図１
2015213500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸分子と第２の核酸分子とを含む組み換えリステリア株であって、それぞれの前記核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、前記第１の核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに組み込まれる、組み換えリステリア株。
【請求項２】
前記組み換えリステリア株は、ファゴリソソームから抜け出ることが可能である、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項３】
前記第２の核酸分子は、前記内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいて、前記第１の核酸分子と共にリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項４】
前記組み換えリステリア株は、異種抗原をコードする前記第２の核酸分子を含むエピソーム発現ベクターを含む、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項５】
異種抗原をコードする前記第２の核酸分子は、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームにおける前記エピソーム発現ベクターに存在する、請求項４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６】
前記ＰＥＳＴ含有遺伝子は、ＬＬＯである、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７】
前記ＰＥＳＴ含有遺伝子は、ＡｃｔＡである、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項８】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、腫瘍細胞によって発現されるポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項９】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、血管新生ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１０】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１１】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をコードする、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１２】
前記第１の核酸分子は、リステリアゲノムへの部位特異的相同的組み換えのために設計されるベクターである、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１３】
前記断片は、免疫原性断片である、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１４】
前記組み換えリステリア株は、栄養要求性リステリア株である、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１５】
前記栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ変異体である、請求項１４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１６】
前記栄養要求性リステリア株は、前記栄養要求性リステリア株の栄養要求性を補完する代謝酵素を含むエピソーム発現ベクターを含む、請求項１４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１７】
前記代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である、請求項１６に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１８】
前記代謝酵素は、前記組み換えリステリア株における細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する、請求項１６に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１９】
前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である、請求項１６に記載の組み換えリステリア株。
【請求項２０】
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項１６に記載の組み換えリステリア株。
【請求項２１】
前記組み換えリステリア株は、動物宿主に継代されている、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項２２】
前記組み換えリステリア株は、組み換えリステリアモノサイトゲネス株である、請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項２３】
請求項１に記載の組み換えリステリア株と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせとを含む、ワクチン。
【請求項２４】
組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、前記対象における抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記組み換えリステリア株は、第１の核酸分子と第２の核酸分子とを含み、それぞれの前記核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、前記第１の核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる、方法。
【請求項２５】
前記組み換えリステリア株は、ファゴリソソームから抜け出ることが可能である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の核酸分子は、前記内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいて、前記第１の核酸分子と共にリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組み換えリステリア株は、異種抗原をコードする前記第２の核酸分子を含むエピソーム発現ベクターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
異種抗原をコードする前記第２の核酸分子は、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームにおける前記エピソーム発現ベクターに存在する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＥＳＴ含有遺伝子は、ＬＬＯである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＥＳＴ含有遺伝子は、ＡｃｔＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、腫瘍細胞によって発現されるポリペプチドをコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、血管新生ポリペプチドをコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の核酸分子は、リステリアゲノムへの部位特異的相同的組み換えのために設計されるベクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記断片は、免疫原性断片である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換えリステリア株は、栄養要求性リステリア株である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ変異体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記栄養要求性リステリア株は、前記栄養要求性リステリア株の栄養要求性を補完する代謝酵素を含むエピソーム発現ベクターを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記代謝酵素は、前記組み換えリステリア株における細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記組み換えリステリア株は、動物宿主に継代されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項４５】
前記組み換えリステリア株は、組み換えリステリアモノサイトゲネス株である、．請求項２４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組み換えリステリア株は、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせと共に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４７】
前記組み換えリステリア株は、経口または非経口で投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、前記対象における癌を治療、抑制、または阻害する方法。
【請求項４９】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌は、前立腺癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌は、卵巣癌、乳癌、またはそれらの組み合わせである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記癌は、メラノーマである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌は、乳癌、脳癌、肺癌、消化管癌、肉腫、膵臓癌、またはそれらの組み合わせである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１に記載の組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、前記対象における少なくとも１つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法。
【請求項５６】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍は、前立腺腫瘍である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記腫瘍は、卵巣腫瘍、乳房腫瘍、またはそれらの組み合わせである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１の核酸分子または前記第２の核酸分子は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をコードする、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
腫瘍は、乳房腫瘍である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記腫瘍は、脳腫瘍、肺腫瘍、消化管腫瘍、膵臓腫瘍、またはそれらの組み合わせである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株であって、前記核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる、組み換えリステリア株。
【請求項６３】
前記組み換えリステリア株は、ファゴリソソームから抜け出ることが可能である、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６４】
前記ＰＥＳＴ含有遺伝子は、ＬＬＯである、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６５】
前記ＰＥＳＴ含有遺伝子は、ＡｃｔＡである、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６６】
前記核酸分子は、腫瘍細胞によって発現されるポリペプチドをコードする、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６７】
前記核酸分子は、血管新生ポリペプチドをコードする、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６８】
前記核酸分子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６９】
前記核酸分子は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をコードする、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７０】
前記核酸分子は、リステリアゲノムへの部位特異的相同的組み換えのために設計されるベクターである、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７１】
前記断片は、免疫原性断片である、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７２】
前記組み換えリステリア株は、栄養要求性リステリア株である、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７３】
前記栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ変異体である、請求項６２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７４】
前記栄養要求性リステリア株は、前記栄養要求性リステリア株の栄養要求性を補完する代謝酵素を含むエピソーム発現ベクターを含む、請求項７２に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７５】
前記代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である、請求項７４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７６】
前記代謝酵素は、前記組み換えリステリア株における細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する、請求項７４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７７】
前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である、請求項７４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７８】
前記代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である、請求項７６に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７９】
前記組み換えリステリア株は、動物宿主に継代されている、請求項６２に記載の組み換えリステリア。
【請求項８０】
前記組み換えリステリア株は、組み換えリステリアモノサイトゲネス株である、請求項６２に記載の組み換えリステリア。
【請求項８１】
２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法であって、
（ａ）第１の抗原をコードする第１の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、
（ｂ）第２の抗原をコードする第２の核酸を含むエピソーム発現ベクターで、前記組み換えリステリアを形質転換すること、および
（ｃ）前記組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で前記第１の抗原および前記第２の抗原を発現すること、
を含む、方法。
【請求項８２】
２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法であって、
（ａ）第１の抗原をコードする第１の核酸および第２の抗原をコードする第２の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、および
（ｂ）前記組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で前記第１の抗体および前記第２の抗原を発現すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腫瘍特異性抗原ポリペプチド、および任意で、血管新生ポリペプチドを発現する組み換えリステリア株であって、これらのポリペプチドのうちの少なくとも１つをコードする核酸分子は、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる、組み換えリステリア株、それを調製する方法、ならびにそれを投与することを含む、免疫応答を誘導し、癌または腫瘍を治療、阻害、または抑制する方法を本明細書において提供する。
【背景技術】
【０００２】
多くの前臨床エビデンスおよび早期臨床試験データにより、免疫系の抗腫瘍能力を利用して、確立された癌を有する患者を治療することができることが示唆されている。ワクチン戦略では、様々な種類の癌に関連する腫瘍抗体を活用する。腫瘍関連抗原を発現するウイルスまたは細菌ベクター等の生ワクチンでの免疫付与は、腫瘍に対する強力なＣＴＬ応答を誘発するための１つの戦略である。
【０００３】
リステリアモノサイトゲネス（Ｌｍ）は、主にリステリオリシン−Ｏ（ＬＬＯ）の孔形成活性によってマクロファージおよび樹枝状細胞等の抗原提示細胞の細胞質への直接アクセスを有する、グラム陽性の通性細胞内細菌である。ＬＬＯは、細胞による貪食後にＬｍによって分泌され、ファゴリソソーム膜に穴を開け、細菌が空胞から抜け出て、細胞質に進入することを可能にする。ＬＬＯは、ＭＨＣクラスＩ分子を介して免疫系に非常に効率的に提示される。さらに、Ｌｍ由来のペプチドも、ファゴリソソームを介してＭＨＣクラスＩＩ提示へのアクセスを有する。
【０００４】
癌は、複雑な疾病であり、併用療法アプローチが成功する可能性が高い。腫瘍細胞だけでなく、腫瘍成長を支持する微環境も、治療効果を最大限にするために標的とされなければならない。ほとんどの免疫療法は、腫瘍細胞を標的とする単一の抗原に焦点を当てているので、ヒトの癌に対して限られた成功しか収めていない。腫瘍細胞および腫瘍微環境を同時に標的とすることが可能な単一の治療薬は、特に相乗的抗腫瘍効果をもたらす場合、他の免疫療法アプローチを超える利点を有するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組み換えリステリア株が本明細書において提供され、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、該第１の核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。別の実施形態では、本発明は、そのような組み換えリステリア株を含むワクチンを提供する。
【０００６】
別の実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における抗原に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書において提供され、該組み換えリステリア株は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含み、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、該第１の核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０００７】
別の実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組み換えリステリア株を投与することを含む、対象における癌を治療、抑制、または阻害する方法が本明細書において提供され、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、該第１の核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０００８】
別の実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組み換えリステリア株を投与することを含む、対象における少なくとも１つ腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法が本明細書において提供され、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、該第１の核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０００９】
別の実施形態では、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株が本明細書において提供され、それぞれの該核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【００１０】
別の実施形態では、２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法が本明細書において提供され、方法は、第１の抗原をコードする第１の核酸および第２の抗原をコードする第２の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、および該組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で該第１の抗原および該第２の抗原を発現することを含む。
【００１１】
別の実施形態では、２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法が本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、第１の抗原をコードする第１の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、第２の抗原をコードする第２の核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換すること、および該組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で該第１の抗原および該第２の抗原を発現することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（Ａ）ｋｌｋ３組み込みおよびＡｃｔＡ欠失後のＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の略図。（Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子は、ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれる。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用する各コンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製からのＰＣＲは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４ｂｐのバンドを増幅し、野生型タンパク質の分泌信号配列を欠く。
【図２】（Ａ）ｐＡＤＶ１３４プラスミドの地図。（Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質は、沈殿し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離され、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質は、抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用してウエスタンブロット法によって検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータ、短縮ＬＬＯのためのＯＲＦ、およびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）から成る。（Ｃ）ｐＡＤＶ１４２プラスミドの地図。（Ｄ）ウエスタンブロット法は、抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用するＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示した。
【図３】（Ａ）選択圧（Ｄ−アラニン）の有無で培養した場合のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの体外でのプラスミド安定性。株および培養条件が最初に掲載され、ＣＦＵ決定のために使用されたプレートは、その後に掲載される。（Ｂ）体内でのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのクリアランスおよびこの期間中の潜在的なプラスミド損失の評価。細菌は、示される時点で静脈内に注入され、脾臓から単離された。ＣＦＵは、ＢＨＩおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンプレートに対して決定された。
【図４】（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける１０８ＣＦＵの投与後の株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの体内クリアランス。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上に播種することによって決定された。この方法の検出の限界は、１００ＣＦＵであった。（Ｂ）１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ、およびＸＦＬ７株でのＪ７７４細胞の細胞感染検定。
【図５】（Ａ）追加抗原投与６日後の未感作およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの脾細胞におけるＰＳＡ四量体特異的細胞。（Ｂ）未感作およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの脾細胞におけるＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色は、ＰＳＡペプチドで５時間刺激された。ＥＬ４細胞の特異的溶解は、カスパーゼに基づく検定（Ｃ）およびユーロピウムに基づく検定（Ｄ）を使用して、異なるエフェクター／標的比率で、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスおよび未感作マウスからの体外で刺激されたエフェクターＴ細胞を伴うＰＳＡペプチドでパルスを発した。ＰＳＡペプチドの存在下またペプチドの非存在下での２４時間の刺激後に得られた未感作および免疫された脾細胞におけるＩＦＮγスポットの数（Ｅ）。
【図６】ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫付与は、Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行を誘導する。マウスは、未処置のままか（ｎ＝８）（Ａ）、または７、１４、および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（Ｃ）で腹腔内で免疫付与された。腫瘍サイズは、それぞれの個々の腫瘍に対して測定され、値は、ミリメートルで平均直径として表された。各線は、個々のマウスを表す。
【図７】（Ａ）脾臓におけるＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析、ならびに未処理マウスおよびＬｍ対照菌株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫されたマウスのＴ−ＰＳＡ−２３腫瘍の浸潤。（Ｂ）脾臓における、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の分析、および未処理マウスおよびＬｍ対照菌株またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫されたマウスのＴ−ＰＳＡ−２３腫瘍の浸潤。
【図８】（Ａ）ｋｌｋ３組み込みおよびＡｃｔＡ欠失後のＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の略図。（Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子は、ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれる。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用する各コンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製からのＰＣＲは、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０ｂｐのバンドを増幅する。
【図９】（Ａ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌する。細菌性培養上清からのタンパク質は、沈殿し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離され、ＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロット法によって検出された。（Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によって産生されたＬＬＯは、溶血活性を保持する。ヒツジ赤血球は、細菌性培養上清の連続希釈法で培養され、溶血活性は、５９０ｎｍの吸光度によって測定された。（Ｃ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、マクロファージ様Ｊ７７４細胞の内部で成長する。Ｊ７７４細胞は、細菌とともに１時間培養し、続いて、細胞外細菌を死滅させるためにゲンタマイシンにより処置した。細胞内成長は、示される時点で得られた、連続希釈のＪ７７４溶解物を播種することによって測定した。Ｌｍ１０４０３Ｓは、これらの実験において対照として使用された。
【図１０】マウスのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３での免疫付与は、ＰＳＡ特異的免疫応答を誘導する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｌｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、またはＬｍｄｄＡ−１４２の１×１０８ＣＦＵで１週間間隔で２回免疫付与され、７日後に脾臓を採取した。脾細胞は、１μＭのＰＳＡ６５−７４ペプチドと共に、モネンシンの存在下で５時間刺激された。細胞は、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌ、および細胞内ＩＦＮ−γに対して染色され、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器において分析された。
【図１１】事前にマップされ、予測されたＨＬＡ−Ａ２エピトープの位置に基づいて区別できるＨＭＷ−ＭＡＡ断片を発現する３つのＬｍベースのワクチンが設計された（Ａ）。Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＭＡ２１６０−２２５８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃとも称される）株は、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質に対応する約６２ｋＤａのバンドを分泌する（Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１５）は、Ｂ１６Ｆ１０細胞を皮下に接種され、Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８（ｎ＝８）で、３、１０、および１７日目に腹腔内に免疫付与されるか、または未処置のままにされた（ｎ＝７）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１６）は、ＲＥＮＣＡ細胞を皮下に接種され、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ｎ＝８）または同等の投与量の対照Ｌｍワクチンのいずれかで、３、１０、および１７日目に腹腔内に免疫付与された。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫付与されたマウスは、確立された腫瘍の成長を妨げた（Ｃ）。ＦＶＢ／Ｎマウス（ｎ＝１３）は、ＮＴ−２腫瘍細胞を皮下に接種され、Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ（ｎ＝５）または同等の投与量の対照Ｌｍワクチン（ｎ＝８）のいずれかで、７、１４、および２１日目に腹腔内に免疫付与された。マウスのＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでの免疫付与は、Ｂ１６Ｆ１０、ＲＥＮＣＡ、およびＮＴ−２等のＨＭＷ−ＭＡＡを発現するように操作されていない腫瘍の成長を有意に弱めた（Ｄ）。腫瘍サイズは、それぞれの個々の腫瘍に対して測定され、値は、ミリメートル単位で、平均直径±標準誤差として表される。＊：Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定。
【図１２】Ｌｍ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでの免疫付与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍浸潤を促進し、血管内の周皮細胞の数を低下させる。（Ａ）ＮＴ−２腫瘍は、除去され、免疫蛍光のために薄片にされた。染色群は、番号を付け（１〜３）、各株を右側に示す。連続した組織は、可能なＴＩＬのための抗ＣＤ８αと併せて、パン血管マーカ抗ＣＤ３１、またはＨＭＷ−ＭＡＡのマウス相同体であるＡＮ２のための抗ＮＧ２抗体のいずれかで染色された。群３は、上記の抗体に対するアイソタイプ対照および核マーカとして使用されたＤＡＰＩ染色を示す。計５つの腫瘍が分析され、各群からの単一の代表的画像が示される。血管の周囲のＣＤ８＋細胞は、矢印によって示される。（Ｂ）連続した切片は、抗ＮＧ２および抗アルファ平滑筋細胞アクチン（α−ＳＭＡ）抗体を使用して周皮細胞に対して染色された。これらの２つの抗体（マージ画像における黄色）の二重染色／共局在化は、周皮細胞染色を示す（上）。周皮細胞共局在化は、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量化され、共局在化された物体の数が、グラフに示される（下）。計３つの腫瘍が分析され、各郡からの単一の代表的画像が示される。＊：Ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定。グラフは、平均±標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、一実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸が、一実施形態ではＬＬＯである、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる、抗原ポリペプチドを発現する組み換えリステリア株に関する。一実施形態では、リステリアは、２つのポリペプチドを発現し、１つは腫瘍関連抗原であり、１つは血管新生ポリペプチドである。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組み換えリステリア株を提供し、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、第１の核酸分子は、内因性ＬＬＯ遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれ、第２の核酸分子は、組み換えリステリア株内のエピソーム発現ベクターに存在する。一実施形態では、第１の核酸分子は、ＫＬＫ３タンパク質をコードし、第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドをコードし、一実施形態では、非溶血性ＬＬＯ、短縮ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ配列をコードする核酸を伴うオープンリーディングフレームにある。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む組み換えリステリア株を提供し、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドをコードする。
【００１６】
一実施形態では、第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドをコードする内因性核酸配列を伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。一実施形態では、第１の核酸分子は、ＬＬＯをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。別の実施形態では、第１の核酸分子は、ＡｃｔＡをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【００１７】
一実施形態では、第１の核酸分子は、ＬＬＯをコードする内因性核酸配列を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。一実施形態では、組み込みは、ＬＬＯの機能性を排除しない。別の実施形態では、組み込みは、ＡｃｔＡの機能性を排除しない。一実施形態では、ＬＬＯまたはＡｃｔＡの機能性は、その天然の機能性である。一実施形態では、ＬＬＯ機能性は、生物がファゴリソソームから抜け出ることを可能にしているが、別の実施形態では、ＬＬＯ機能性は、それが融合するポリペプチドの免疫原性を強化している。一実施形態では、本発明の組み換えリステリアは、ＬＬＯ機能を保持し、それは、一実施形態では溶血機能であり、別の実施形態では抗原機能である。ＬＬＯの他の機能は当技術分野で知られており、ＬＬＯ機能性を評価する方法およびそのための検定も同様である。一実施形態では、本発明の組み換えリステリアは、野生型病原性を有するが、別の実施形態では、本発明の組み換えリステリアは、弱毒化病原性を有する。別の実施形態では、本発明の組み換えリステリアは、非病原性である。一実施形態では、本発明の組み換えリステリアは、ファゴリソソームから抜け出て、サイトゾルに進入するのに十分な病原性を有する。一実施形態では、本発明の組み換えリステリアは、融合された抗原−ＬＬＯタンパク質を発現する。したがって、一実施形態では、第１の核酸分子のリステリアゲノムへの組み込みは、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子の構造を乱さず、別の実施形態では、それは、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子の機能を乱さない。一実施形態では、第１の核酸分子のリステリアゲノムへの組み込みは、該リステリアのファゴリソソームから抜け出る能力を乱さない。
【００１８】
別の実施形態では、第２の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいて、該第１の核酸分子と共にリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。したがって、一実施形態では、第１の核酸分子および第２の核酸分子は、ＬＬＯをコードする核酸配列を伴うフレームにおいて組み込まれるが、別の実施形態では、それらは、ＡｃｔＡをコードする核酸配列を伴うフレームにおいて組み込まれる。別の実施形態では、第２の核酸分子は、第１の核酸分子の組み込み部位と区別できる部位においてＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムへ機能可能に組み込まれる。一実施形態では、第１の核酸分子は、ＬＬＯをコードする核酸配列を伴うフレームにおいて組み込まれるが、第２の核酸分子は、ＡｃｔＡコードする核酸配列を伴うフレームにおいて組み込まれ、別の実施形態では、第１の核酸分子は、ＡｃｔＡコードする核酸配列を伴うフレームにおいて組み込まれるが、第２の核酸分子は、ＬＬＯをコードする核酸配列を伴うフレームにおいて組み込まれる。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、第１の異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする第１の核酸分子、および第２の異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする第２の核酸分子を含む組み換えリステリア株を提供し、該第１の核酸分子は、異種抗原ポリペプチドおよび内因性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドが融合タンパク質として発現されるように、リステリアゲノムに組み込まれる。一実施形態では、第１の異種抗原ポリペプチドおよび内因性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレームにおいて翻訳されるが、別の実施形態では、第１の異種抗原ポリペプチドおよび内因性ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、別々に翻訳された後に融合される。
【００２０】
一実施形態では、リステリアゲノムは、内因性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含み、一実施形態では、その内因性ＡｃｔＡ遺伝子は毒性因子である。一実施形態では、そのような欠失は、より弱毒化した、そのため、ヒトの使用に対してより安全なリステリア株を提供する。この実施形態によると、抗原ポリペプチドは、リステリア染色体におけるＬＬＯを伴うフレームにおいて組み込まれる。別の実施形態では、組み込まれた核酸分子は、ＡｃｔＡ遺伝子座に組み込まれる。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする染色体核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置換される。
【００２１】
別の実施形態では、組み込まれた核酸分子は、リステリア染色体に組み込まれる。
【００２２】
一実施形態では、該第１の核酸分子は、リステリアゲノムへの部位特異的相同的組み換えのために設計されるベクターである。別の実施形態では、コンストラクトまたは異種遺伝子は、相同的組み換えを使用してリステリア染色体に組み込まれる。
【００２３】
相同的組み換えのための技術は、当技術分野で知られており、例えば、Ｆｒａｎｋｅｌ，ＦＲ，Ｈｅｇｄｅ，Ｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ，ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｇａｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４７６６−４７７４．１９９５、Ｍａｔａ，Ｍ，Ｙａｏ，Ｚ，Ｚｕｂａｉｒ，Ａ，Ｓｙｒｅｓ，Ｋ  ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１４３５−４５，２００１、Ｂｏｙｅｒ，ＪＤ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＴＭ，Ｍａｃｉａｇ，ＰＣ，Ｐｅｎｇ，Ｘ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＳ，Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｇ，Ｌｅｗｉｓ，ＭＧ，Ｓｈｅｎ，Ａ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ，Ｒ，Ｂｒｏｗｎ，ＣＲ，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ，ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ．ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｂｏｏｓｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＳＩＶ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｄｅｌ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＩＶ２３９  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３３３：８８−１０１，２００５に記載される。別の実施形態では、相同的組み換えは、米国特許第６，８５５，３２０号に記載されるように行われる。別の実施形態では、温度感受性プラスミドを使用して、組み換え体を選択する。各技術は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００２４】
別の実施形態では、コンストラクトまたは異種遺伝子は、トランスポゾン挿入を使用してリステリア染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入のための技術は、当技術分野で知られており、ＤＰ−Ｌ９６７の構造物において、とりわけ、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０、５８：３７７０−３７７８）によって記載される。トランスポゾン突然変異生成は、一実施形態では、安定したゲノム挿入変異体を形成することができるという利点を有する。別の実施形態では、外来遺伝子がトランスポゾン突然変異生成によって挿入されたゲノムにおける位置は、不明である。
【００２５】
別の実施形態では、コンストラクトまたは異種遺伝子は、ファージ組み込み部位を使用してリステリア染色体に組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ＬＭ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）の付着部位を使用して、ゲノムにおける任意の適切な部位であり得る（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３´末端）、対応する付着部位に異種遺伝子を挿入する。別の実施形態では、内因性プロファージは、コンストラクトまたは異種遺伝子の組み込み前に利用される付着部位から欠失させられる。別の実施形態では、この方法は、単一配列成分を引き起こす。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の第１の核酸配列は、プロモータ／調節配列に機能的に連結される。別の実施形態では、第２の核酸配列は、プロモータ／調節配列に機能的に連結される。別の実施形態では、核酸配列のそれぞれは、プロモータ／調節配列に機能的に連結される。一実施形態では、プロモータ／調節配列は、該核酸配列を含むエピソームプラスミド上に存在する。一実施形態では、内因性リステリアプロモータ／調節配列は、本発明の方法および組成物の核酸配列の発現を制御する。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書において提供される核酸配列は、リステリア株におけるコードされたペプチドの発現を駆動するプロモータ、調節配列、またはそれらの組み合わせに機能的に連結される。遺伝子の構成的発現を駆動するために有用なプロモータ、調節配列、およびそれらの組み合わせは、当技術分野で知られており、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡ、ＰＡｃｔＡ、ｈｌｙ、ＡｃｔＡ、およびｐ６０プロモータ、ストレプトコッカスｂａｃプロモータ、ストレプトマイセスグリセウスｓｇｉＡプロモータ、およびＢ．チューリンゲンシスｐｈａＺプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドをコードする核酸の誘導性かつ組織特異的発現は、ペプチドをコードする核酸を、誘導性または組織特異的プロモータ／調節配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用である、組織特異的または誘導性調節配列、プロモータ、およびそれらの組み合わせの例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導性プロモータ、およびＳＶ４０後期エンハンサ／プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド等の誘発剤に応答して誘導されるプロモータが利用される。したがって、本発明が、知られているまたは知られていない、それに機能的に連結される所望のタンパク質の発現を駆動することが可能である、任意のプロモータまたは調節配列の使用を含むことが理解される。一実施形態では、調節配列は、プロモータであり、別の実施形態では、調節配列は、エンハンサであり、別の実施形態では、調節配列は、サプレッサであり、別の実施形態では、調節配列は、リプレッサであり、別の実施形態では、調節配列は、サイレンサである。
【００２８】
一実施形態では、リステリアゲノムへの組み込みのために使用される核酸コンストラクトは、組み込み部位を含有する。一実施形態では、部位は、ＰｈＳＡ（Ｓｃｏｔｔ  Ａからのファージ）ａｔｔＰＰ´組み込み部位である。ＰｈＳＡは、別の実施形態では、Ｌ．モノサイトゲネス株ＳｃｏｔｔＡのプロファージ（参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｉ．Ｂ．Ｋｒａｕｓｅ，Ｔ．Ｈｅｎｌｅ，ａｎｄ  Ｓ．Ｓｃｈｅｒｅｒ．１９９４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  １４  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｔｙｐｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７０１-７１０）、ヒトリステリア症の蔓延中に単離された血清型４ｂ株である。別の実施形態では、部位は、当技術分野で知られている任意の別の組み込み部位である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００２９】
別の実施形態では、核酸コンストラクトは、インテグラーゼ遺伝子を含有する。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は、ＰｈＳＡインテグラーゼ遺伝子である。別の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子は、当技術分野で知られている任意の他のインテグラーゼ遺伝子である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００３０】
一実施形態では、核酸コンストラクトは、プラスミドである。別の実施形態では、核酸コンストラクトは、シャトルプラスミドである。別の実施形態では、核酸コンストラクトは、組み込みベクターである。別の実施形態では、核酸コンストラクトは、部位特異的組み込みベクターである。別の実施形態では、核酸コンストラクトは、当技術分野で知られている任意の他の種類の核酸コンストラクトである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００３１】
本明細書において提供される方法よび組成物の組み込みベクターは、別の実施形態では、ファージベクターである。別の実施形態では、組み込みベクターは、部位特異的組み込みベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ａｔｔＰＰ´部位をさらに含む。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００３２】
別の実施形態では、組み込みベクターは、Ｕ１５３ベクターである。別の実施形態では、組み込みベクターは、Ａ１１８ベクターである。別の実施形態では、組み込みベクターは、ＰｈＳＡベクターである。
【００３３】
別の実施形態では、ベクターは、Ａ５１１ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｘ９１０６９）である。別の実施形態では、ベクターは、Ａ００６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ５４５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ０２０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５００ベクター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｘ８５００９）である。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０５１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０５４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０５５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０５６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ１０１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ１１０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ１１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ１５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｄ４４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５３８ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ６５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５１３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５０２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５０５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５１９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ６０４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｃ７０３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０２５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ５２８ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０２４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０１２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０３５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｃ７０７ベクターである。
【００３４】
別の実施形態では、ベクターは、Ａ００５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ６２０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ａ６４０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｂ０２１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ＨＳＯ４７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ１０Ｇベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ８／７３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ１９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ２１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ４３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ４６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ１０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ１０８ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ１１０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ１６３／８４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ３１２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ３４０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ３８７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ３９１／７３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ６８４／７４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｈ９２４Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ｆＭＬＵＰ５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ｓｙｎ（＝Ｐ３５）ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、００２４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、００６１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、０２９７１Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは、０２９７１Ｃベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５／４７６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５／９１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５／９３９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５／１１３０２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５／１１６０５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５／１１７０４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１８４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５７５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、６３３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、６９９／６９４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、７４４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、９００ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１０９０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１３１７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１４４４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１６５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１８０６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１８０７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９２１／９５９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９２１／１１３６７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９２１／１１５００ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９２１／１１５６６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９２１／１２４６０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９２１／１２５８２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１９６７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、２３８９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、２４２５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、２６７１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、２６８５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、３２７４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、３５５０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、３５５１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、３５５２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、４２７６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、４２７７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、４２９２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、４４７７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５３３７ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５３４８／１１３６３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５３４８／１１６４６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５３４８／１２４３０ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、５３４８／１２４３４ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１００７２ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１１３５５Ｃベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１１７１１Ａベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１２０２９ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１２９８１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、１３４４１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、９０６６６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、９０８１６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、９３２５３ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、９０７５１５ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、９１０７１６ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、ＮＮ−リステリアベクターである。別の実施形態では、ベクターは、Ｏ１７６１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、４２１１ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、４２８６ベクターである。
【００３５】
別の実施形態では、組み込みベクターは、リステリアを感染させることが可能である、当技術分野で知られている任意の他の部位特異的組み込みベクターである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の組み込みベクターまたはプラスミドは、抗生物質耐性をリステリアワクチン株に与えない。別の実施形態では、組み込みベクターまたはプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含有しない。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、組み換えポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。一実施形態では、単離核酸は、本明細書において提供される組み換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離核酸は、本明細書において提供される組み換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離核酸は、本明細書において提供される組み換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離核酸は、本明細書において提供される組み換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９７％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離核酸は、本明細書において提供される組み換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。
【００３７】
一実施形態では、２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、組み換えリステリアは、少なくとも３つ以上の区別できる異種抗原を発現する。別の実施形態では、組み換えリステリアは、４つ以上の区別できる異種抗原を発現する。別の実施形態では、組み換えリステリアは、５つ以上の区別できる異種抗原を発現する。
【００３８】
別の実施形態では、方法は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいて、第１の抗原をコードする第１の核酸をリステリアゲノムに遺伝子的に融合することを含む。別の実施形態では、方法は、２つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも２つの核酸を、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合することを含む。別の実施形態では、方法は、２つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも３つの核酸を、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合することを含む。別の実施形態では、方法は、２つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも４つの核酸を、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合することを含む。別の実施形態では、方法は、２つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも５つの核酸を、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合することを含む。
【００３９】
別の実施形態では、方法は、第２の抗原をコードする第２の核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも２つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも２つの核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも３つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも３つの核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも４つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも４つの核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも５つの区別できる異種抗原をコードする少なくとも５つの核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。
【００４０】
さらに別の実施形態では、方法は、該組み換えリステリア株における、当技術分野で知られている、抗原発現を促す条件下で該第１の抗原および該第２の抗原を発現することを含む。
【００４１】
別の実施形態では、方法は、上記の異種抗原を含む少なくとも１つのエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、上記の異種抗原を含む少なくとも２つのエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、上記の異種抗原を含む少なくとも３つのエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。別の実施形態では、方法は、上記の異種抗原を含む少なくとも４つのエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換することを含む。
【００４２】
別の実施形態では、組み換えリステリア株は、３つ以上の抗原を発現してもよく、そのうちのいくつかは、リステリア染色体に組み込まれる１つ以上の核酸分子から発現され、そのうちのいくつかは、組み換えリステリア株に存在する１つ以上のエピソーム発現ベクターを介して発現される。したがって、上記のように、一実施形態では、本明細書において提供される組み換えリステリア株は、２つ以上のエピソーム発現ベクターを含み、一実施形態では、別々の抗原ポリペプチドをそれぞれ発現する。一実施形態では、抗原のうちの１つ以上は、ＬＬＯを伴う融合タンパク質として発現され、一実施形態では、それは非溶血性ＬＬＯであり、別の実施形態では短縮ＬＬＯである。一実施形態では、本明細書において提供される組み換えリステリア株は、一実施形態では細胞表面抗原および抗血管新生ポリペプチドである、２つの異なる細胞型によって発現される、２つの別々の抗原に対する免疫応答を誘発することによって腫瘍を標的とするが、別の実施形態では、本明細書において提供される組み換えリステリア株は、同じ細胞型によって発現される２つの異なる抗原に対する免疫応答を誘発することによって腫瘍を標的とし、一実施形態では、それらの異なる抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）であり、一実施形態ではＦＯＬＨ１である。別の実施形態では、本明細書において提供される組み換えリステリア株は、後述の、または当技術分野で知られている２つの異なる抗原に対する免疫応答を誘発することによって腫瘍を標的とする。
【００４３】
一実施形態では、本発明の組成物および方法の第１の抗原は、特定の細胞表面抗原または腫瘍標的に対して向けられ、第２の抗原は、血管新生抗原または腫瘍微環境に対して向けられる。別の実施形態では、本発明の組成物および方法の第１の抗原および第２の抗原は、腫瘍細胞によって発現されるポリペプチドであるか、または別の実施形態では、腫瘍微環境において発現されるポリペプチドである。別の実施形態では、本発明の組成物および方法の第１の抗原は、腫瘍によって発現されるポリペプチドであり、本発明の組成物および方法の第２の抗原は、受容体標的、ＮＯシンテターゼ、Ａｒｇ−１、または当技術分野で知られている他の酵素である。
【００４４】
一実施形態では、２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法が本明細書において提供され、方法は、一実施形態では、第１の抗原をコードする第１の核酸および第２の抗原をコードする第２の核酸を、ＰＥＳＴ配列を含む天然ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合することを含む。別の実施形態では、該第１の抗原および該第２の抗原の発現は、該組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で産生される。
【００４５】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリア株は、異種抗原をコードする第２の核酸分子を含むエピソーム発現ベクターを含む。別の実施形態では、異種抗原をコードする第２の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームにおける該エピソーム発現ベクターに存在する。
【００４６】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のエピソーム発現ベクターは、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列をコードする核酸配列にフレームにおいて融合される抗原を含む。一実施形態では、抗原は、ＨＭＷ−ＭＡＡであり、別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号２）である。別の実施形態では、本明細書において列挙されるＰＥＳＴ様ＡＡ配列のうちの１つを含む任意のＬＬＯ配列への抗原の融合は、ＨＭＷ−ＭＡＡに対する細胞媒介性免疫を強化することができる。
【００４７】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、リステリアＡｃｔＡタンパク質からのＰＥＳＴ様配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号３）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号４）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号５）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号６）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされる、リステリアシリゲリ細胞溶解素からのものである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号７）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質からのものである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカスピオゲネスストレプトリジンＯからのものであり、例えば、ＡＡ３５−５１でのＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号８）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカスエクイシミリスストレプトリジンＯからのものであり、例えば、ＡＡ３８−５４でのＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号９）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、配列番号３−９から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、配列番号１−９から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物由来の別のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。
【００４８】
ＰＥＳＴ様配列の特定は、当技術分野で知られており、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（参照することにより本明細書に組み込まれる、Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ  ＰＥＳＴ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（参照することにより本明細書に組み込まれる、ＰＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６；２１（７）：２６７−７１）に記載される。「ＰＥＳＴ様配列」とは、別の実施形態では、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）残基に富む領域を指す。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、いくつかの正荷電アミノ酸を含有する１つ以上のクラスタを側面に有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、それを含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌにおいて開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌにおいて開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、１つ以上の内部リン酸化部位を含有し、これらの部位でのリン酸化は、タンパク質分解に先行する。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列として本明細書において称される配列は、ＰＥＳＴ配列である。
【００４９】
一実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ様配列は、例えば、ＬＭに対するＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）によって、およびＲｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）等において記載される方法に従って特定される。代替として、他の原核生物からのＰＥＳＴ様ＡＡ配列も、この方法に基づいて特定することができる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が、これらに限定されないが、他のリステリア種を含むことが予期される、他の原核生物。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌにおいて開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌにおいて開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴ発見プログラムを使用して特定される。
【００５０】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの特定は、特定されたタンパク質配列内の正荷電アミノ酸Ｒ、Ｈ、およびＫに対する初期スキャンによって達成される。正荷電側面の間にある全てのアミノ酸は、数えられ、ウィンドウサイズパラメータと同等か、またはそれ以上の多数のアミノ酸を含有する、それらのモチーフのみがさらに考慮される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有しなければならない。
【００５１】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質は、重大なアミノ酸の局所濃縮およびモチーフの疎水性に基づく得点パラメータを用いて精緻化される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、ＤまたはＥの１等量、Ｐの１等量、およびＳまたはＴの１等量に対して補正される。別の実施形態では、疎水性の計算は、原則として、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ，Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｏｔｌｉｔｔｌｅ，ＲＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５（１９８２）の方法に従う。簡易計算のために、本来、アルギニンに対する−４．５からイソロイシンに対する＋４．５の範囲であった、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性度指標は、以下の線形変換を使用して正整数に変換され、アルギニンに対する０からイソロイシンに対する９０の値となる。
【００５２】
疎水性度指標＝１０＊Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性度指標＋４５
【００５３】
別の実施形態では、可能性のあるＰＥＳＴモチーフの疎水性は、各アミノ酸種に対するモルパーセントおよび疎水性指標の積の合計として計算される。所望のＰＥＳＴ得点は、局所濃縮の項および以下の式によって表される疎水性の項の組み合わせとして得られる。
【００５４】
ＰＥＳＴ得点＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指標
【００５５】
別の実施形態では、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ様配列」、または「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」とは、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも＋５の得点を有するペプチドを指す。別の実施形態では、用語は、少なくとも６の得点を有するペプチドを指す。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも７の得点を有する。別の実施形態では、得点は、少なくとも８である。別の実施形態では、得点は、少なくとも９である、別の実施形態では、得点は、少なくとも１０である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１１である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１２である。別の実施形態では、得点は。少なくとも１３である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１４である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１５である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１６である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１７である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１８である。別の実施形態では、得点は、少なくとも１９である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２０である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２１である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２２である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２２である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２４である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２４である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２５である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２６である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２７である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２８である。別の実施形態では、得点は、少なくとも２９である。別の実施形態では、得点は、少なくとも３０である。別の実施形態では、得点は、少なくとも３２である。別の実施形態では、得点は、少なくとも３５である。別の実施形態では、得点は、少なくとも３８である。別の実施形態では、得点は、少なくとも４０である。別の実施形態では、得点は、少なくとも４５である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００５６】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当技術分野で知られている任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，Ａｌｖｅｓ  Ｊ，Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を使用して特定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【００５７】
ＰＥＳＴ指標は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって適切な長さの各広がり（例えば、３０−３５のアミノ酸広がり）に対して計算される。ＰＥＳＴ残基のそれぞれに対する係数値（ＣＶ）は、１であり、他のアミノ酸（非ＰＥＳＴ）のそれぞれに対しては、０である。
【００５８】
ＰＥＳＴ様配列を特定するための各方法は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【００５９】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当技術分野で知られている任意の他のＰＥＳＴ様配列である。各ＰＥＳＴ様配列およびその種類は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、融合タンパク質を提供し、一実施形態では、それはリステリアによって発現される。一実施形態では、そのような融合タンパク質は、ＰＥＳＴ様配列に融合され、それは、一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むタンパク質断片への融合を指す。別の実施形態では、この用語は、タンパク質断片がＰＥＳＴ様配列以外の周囲配列を含む場合を含む。別の実施形態では、タンパク質断片は、ＰＥＳＴ様配列から成る。そのため、別の実施形態では、「融合」とは、それらのそれぞれの端部で互いに連結されるか、または一方が他方に包含されるかのいずれかの２つのペプチドまたはタンパク質断片を指す。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００６１】
別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリア株は、完全長ＬＬＯポリペプチドを含み、一実施形態ではそれは溶血性である。
【００６２】
別の実施形態では、組み換えリステリア株は、非溶血性ＬＬＯポリペプチドを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＬＬＯ断片である。別の実施形態では、オリゴペプチドは、完全ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で知られている任意のＬＬＯタンパク質またはその断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００６３】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片は、本明細書において提供される組成物および方法において利用される。一実施形態では、短縮ＬＬＯタンパク質は、ポリペプチド、すなわち、一実施形態では抗原、別の実施形態では血管新生因子、または別の実施形態では抗原および血管新生因子の両方を発現する本明細書において提供されるエピソーム発現ベクターによってコードされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、Ｎ末端断片である。
【００６４】
別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する。
【００６５】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号１０）。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１０に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１０の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１０の変異形である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１０の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１０のイソ型である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００６６】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する。
【００６７】
ｍｋｋｉｍｌｖｆｉｔｌｉｌｖｓｌｐｉａｑｑｔｅａｋｄａｓａｆｎｋｅｎｓｉｓｓｖａｐｐａｓｐｐａｓｐｋｔｐｉｅｋｋｈａｄｅｉｄｋｙｉｑｇｌｄｙｎｋｎｎｖｌｖｙｈｇｄａｖｔｎｖｐｐｒｋｇｙｋｄｇｎｅｙｉｖｖｅｋｋｋｋｓｉｎｑｎｎａｄｉｑｖｖｎａｉｓｓｌｔｙｐｇａｌｖｋａｎｓｅｌｖｅｎｑｐｄｖｌｐｖｋｒｄｓｌｔｌｓｉｄｌｐｇｍｔｎｑｄｎｋｉｖｖｋｎａｔｋｓｎｖｎｎａｖｎｔｌｖｅｒｗｎｅｋｙａｑａｙｓｎｖｓａｋｉｄｙｄｄｅｍａｙｓｅｓｑｌｉａｋｆｇｔａｆｋａｖｎｎｓｌｎｖｎｆｇａｉｓｅｇｋｍｑｅｅｖｉｓｆｋｑｉｙｙｎｖｎｖｎｅｐｔｒｐｓｒｆｆｇｋａｖｔｋｅｑｌｑａｌｇｖｎａｅｎｐｐａｙｉｓｓｖａｙｇｒｑｖｙｌｋｌｓｔｎｓｈｓｔｋｖｋａａｆｄａａｖｓｇｋｓｖｓｇｄｖｅｌｔｎｉｉｋｎｓｓｆｋａｖｉｙｇｇｓａｋｄｅｖｑｉｉｄｇｎｌｇｄｌｒｄｉｌｋｋｇａｔｆｎｒｅｔｐｇｖｐｉａｙｔｔｎｆｌｋｄｎｅｌａｖｉｋｎｎｓｅｙｉｅｔｔｓｋａｙｔｄ（配列番号１１）。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１１に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１１の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１１の変異形である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１１の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１１のイソ型である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００６８】
本明細書において提供される組成物および方法において使用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する。
【００６９】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１３１２８；配列番号１２、核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７に記載される）。この配列に対応する前駆タンパク質の最初の２５のＡＡは、信号配列であり、ＬＬＯが細菌によって分泌される場合にＬＬＯから開裂される。したがって、本実施形態では、完全長活性ＬＬＯタンパク質は、５０４の残基の長さである。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は、本明細書において提供されるワクチンに取り込まれるＬＬＯ断片源として使用される。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１２に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１２の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１２の変異形である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１２の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１２のイソ型である。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【００７０】
本明細書において提供される組成物および方法において使用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する。
【００７１】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号１３）。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１３に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１３の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１３の変異形である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１３の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ  ＡＡ配列は、配列番号１３のイソ型である。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【００７２】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法のＬＬＯポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＺＰ＿０１９４２３３０、ＥＢＡ２１８３３に記載されるリステリアモノサイトゲネス１０４０３Ｓ株からのものであるか、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載される核酸配列によってコードされる。別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法で使用するためのＬＬＯ配列は、リステリアモノサイトゲネスからのものであり、一実施形態では、それは４ｂ  Ｆ２３６５株（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＹＰ＿０１２８２３）、ＥＧＤ−ｅ株（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ＿４６３７３３）、または当技術分野で知られているリステリアモノサイトゲネスの任意の他の株である。
【００７３】
別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法で使用するためのＬＬＯ配列は、フラボバクテリア細菌ＨＴＣＣ２１７０（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＺＰ＿０１１０６７４７またはＥＡＲ０１４３３、一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によってコードされる）からのものである。一実施形態では、一実施形態では、パエニバチルスアルベイ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｐ２３５６４またはＡＡＡ２２２２４、一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ６２７０９によってコードされる）で見られる、アルベオリシン等の他の種におけるＬＬＯと相同であるタンパク質は、本明細書において提供される組成物および方法において使用されてもよい。他のそのような相同タンパク質は、当技術分野において知られている。
【００７４】
各ＬＬＯタンパク質およびＬＬＯ断片は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００７５】
別の実施形態では、既知のリシン、またはその断片を含む、他の種からのＬＬＯの相同体を使用して、本明細書において提供される組成物および方法の抗原を伴うＬＬＯの融合タンパク質を作製することができ、一実施形態ではそれはＨＭＷ−ＭＡＡであり、別の実施形態ではＨＭＷ−ＭＡＡの断片である。
【００７６】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様ドメインである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片は、本明細書において提供される組成物の一部としてか、または方法において利用される。
【００７７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、カルボキシ末端に活性化ドメインを含有しない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、非溶血性断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ配列は、別の場所での欠失または突然変異によって非溶血性にされる。
【００７８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の約４４１のＡＡから成る。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、５２９のＡＡ完全長ＬＬＯタンパク質の最初の約４００−４４１のＡＡを含む。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質のＡＡ１−４４１に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの最初の約４２０のＡＡから成る。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質のＡＡ１−４２０に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの約ＡＡ２０−４４２から成る。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質のＡＡ２０−４４２に対応する。別の実施形態では、システイン４８４を含む活性化ドメインを伴わず、および特にシステイン４８４を伴わない任意のΔＬＬＯは、本明細書において提供される方法および組成物に好適である。
【００７９】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４００のＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の３００のＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の２００のＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の１００のＡＡに対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の５０のＡＡに対応し、一実施形態では、１つ以上のＰＥＳＴ様配列を含む。
【００８０】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。残基番号は、別の実施形態では、上に列挙される残基番号と正確に一致する必要はない。例えば、相同ＬＬＯタンパク質が、本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合ではそうである。
【００８１】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の組み換えリステリア株は、内因性ＡｃｔＡ配列を伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる核酸分子を含む。別の実施形態では、本明細書において提供されるエピソーム発現ベクターは、ＡｃｔＡまたは短縮ＡｃｔＡに融合される抗原を含む融合タンパク質を含む。一実施形態では、抗原は、ＨＭＷ−ＭＡＡであるが、別の実施形態では、それは、ＨＭＷ−ＭＡＡの免疫原性断片である。
【００８２】
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の抗原は、ＡｃｔＡタンパク質に融合されるが、それは、一実施形態ではＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片であり、一実施形態ではＡｃｔＡの最初の３９０のＡＡを、別の実施形態ではＡｃｔＡの最初の４１８のＡＡを、別の実施形態ではＡｃｔＡの最初の５０のＡＡを、別の実施形態ではＡｃｔＡの最初の１００のＡＡを含むか、またはそれから成り、一実施形態では、配列番号２において提供されるもの等のＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物において利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、ＡｃｔＡの最初の１５０のＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の約２００のＡＡを含むか、またはそれから成り、それは、一実施形態では本明細書において記載される２つのＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物において利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、ＡｃｔＡの最初の２５０のＡＡ、別の実施形態では、ＡｃｔＡの最初の３００のＡＡを含むか、またはそれから成る。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。残基番号は、上に列挙される残基番号と正確に一致する必要はない。例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書において利用されるＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号は、当業者にとっては通常の作業であろう、当技術分野で知られているＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ等の配列整合ツールを使用して、適宜に調整することができる。
【００８３】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端部分は、１つ、２つ、３つ、または４つのＰＥＳＴ様配列を含み、一実施形態では、それは、本明細書において特に記述されるＰＥＳＴ様配列、もしくは本明細書において記載されるそれらの相同体、または本明細書において記載される方法およびアルゴリズムを使用してか、または当技術分野で知られている代替の方法を使用することによって決定することができる他のＰＥＳＴ様配列である。
【００８４】
本明細書において提供される方法および組成物において利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号１４に記載される配列を有する。
【００８５】
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号１４）。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、配列番号１４に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当技術分野で知られている任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４の変異形である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４のイソ型である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４の相同体の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４の変異形の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１４のイソ型の断片である。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【００８６】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換えヌクレオチドは、配列番号１５に記載される配列を含む。ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号１５）。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、配列番号１５に記載される配列を有する。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００８７】
本明細書において提供される方法および組成物において利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号１６：ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号１６）に記載される配列を有し、それは、一実施形態では、リステリアモノサイトゲネス、株１０４０３ＳからのＡｃｔＡの最初の３９０のＡＡである。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、配列番号１６に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当技術分野で知られている任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６の変異形である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６のイソ型である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６の相同体の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６の変異形の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１６のイソ型の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００８８】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換えヌクレオチドは、配列番号１７：ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔａｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｃｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａｇｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔｇａｇｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａａａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇｃａａａａｇｃａｇａｇａａａｇｇｔｃｃｇａａｔａａｃａａｔａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇａｇｃａａａｃａｇｇａａａｔｇｔｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｔｃｇａｃｃｇａｃｃａａｃｔｃｔｇｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａａａｇｃｃａｔａｇｃｇｔｃｇｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃａｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｃａａａｔａａｇａｇａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｃｇａｇｔｃｔａｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｔｃａａａａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃｇａｔｇｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔａｃｔｃｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｔａｔｇｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇｃｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａｇｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｃｇａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｔａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号１７）に記載される配列を含み、それは、一実施形態では、リステリアモノサイトゲネス１０４０３Ｓ株におけるＡｃｔＡをコードする最初の１１７０のヌクレオチドである。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、配列番号１７に記載される配列を有する。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００８９】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当技術分野で知られている別のＡｃｔＡ断片であり、一実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む任意の断片である。したがって、一実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、ＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−１００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、ＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−２００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、ＡｃｔＡ配列のアミノ酸２００−３００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３００−４００である。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、ＡｃｔＡ配列のアミノ酸１−３００である。別の実施形態では、本明細書において提供される組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。別の実施形態では、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質全体をコードする任意の他の配列を含む。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【００９０】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法で使用するためのＡｃｔＡ配列は、リステリアモノサイトゲネスからのものであり、一実施形態では、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ５４００２株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ５３４８株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ５４００６株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＥＵ３９４９６４）、または当技術分野で知られているリステリアモノサイトゲネスの任意の他の株である。
【００９１】
一実施形態では、株、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡにおける欠失ＡｃｔＡ領域の配列は、以下の通りである。
【００９２】
ｇｃｇｃｃａａａｔｃａｔｔｇｇｔｔｇａｔｔｇｇｔｇａｇｇａｔｇｔｃｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｔｃｇｃｇａｇａｔｇｇｇｃｇａａｔａａｇａａｇｃａｔｔａａａｇａｔｃｃｔｇａｃａａａｔａｔａａｔｃａａｇｃｇｇｃｔｃａｔａｔｇａａａｇａｔｔａｃｇａａｔｃｇｃｔｔｃｃａｃｔｃａｃａｇａｇｇａａｇｇｃｇａｃｔｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｔｃａｔｔａｔａａｔａｇｔｇｇｔａｔｃｃｃｇａａｔａａａｇｃａｇｃｃｔａｔａａｔａｃｔａｔｃａｃｔａａａｃｔｔｇｇａａａａｇａａａａａａｃａｇａａｃａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃｇｃｇｃｃｔｔａａａｇｔａｃｔａｔｔｔａａｃｇａａａａａａｔｃｃｃａｇｔｔｔａｃｃｇａｔｇｃｇａａａａａａｇｃｇｃｔｔｃａａｃａａｇｃａｇｃｇａａａｇａｔｔｔａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔｇｃｔｔｃｔａａａａａａｇｔｔｇｃｔｇａａｇｃｔｔｇｇｇａａｇｃａｇｔｔｇｇｇｇｔｔａａｃｔｇａｔｔａａｃａａａｔｇｔｔａｇａｇａａａａａｔｔａａｔｔｃｔｃｃａａｇｔｇａｔａｔｔｃｔｔａａａａｔａａｔｔｃａｔｇａａｔａｔｔｔｔｔｔｃｔｔａｔａｔｔａｇｃｔａａｔｔａａｇａａｇａｔａａｃｔａａｃｔｇｃｔａａｔｃｃａａｔｔｔｔｔａａｃｇｇａａｃａａａｔｔａｇｔｇａａａａｔｇａａｇｇｃｃｇａａｔｔｔｔｃｃｔｔｇｔｔｃｔａａａａａｇｇｔｔｇｔａｔｔａｇｃｇｔａｔｃａｃｇａｇｇａｇｇｇａｇｔａｔａａｇｔｇｇｇａｔｔａａａｃａｇａｔｔｔａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃｇｔｃｇａｃｃｃａｔａｃｇａｃｇｔｔａａｔｔｃｔｔｇｃａａｔｇｔｔａｇｃｔａｔｔｇｇｃｇｔｇｔｔｃｔｃｔｔｔａｇｇｇｇｃｇｔｔｔａｔｃａａａａｔｔａｔｔｃａａｔｔａａｇａａａａａａｔａａｔｔａａａａａｃａｃａｇａａｃｇａａａｇａａａａａｇｔｇａｇｇｔｇａａｔｇａｔａｔｇａａａｔｔｃａａａａａｇｇｔｇｇｔｔｃｔａｇｇｔａｔｇｔｇｃｔｔｇａｔｃｇｃａａｇｔｇｔｔｃｔａｇｔｃｔｔｔｃｃｇｇｔａａｃｇａｔａａａａｇｃａａａｔｇｃｃｔｇｔｔｇｔｇａｔｇａａｔａｃｔｔａｃａａａｃａｃｃｃｇｃａｇｃｔｃｃｇｃａｔｇａｔａｔｔｇａｃａｇｃａａａｔｔａｃｃａｃａｔａａａｃｔｔａｇｔｔｇｇｔｃｃｇｃｇｇａｔａａｃｃｃｇａｃａａａｔａｃｔｇａｃｇｔａａａｔａｃｇｃａｃｔａｔｔｇｇｃｔｔｔｔｔａａａｃａａｇｃｇｇａａａａａａｔａｃｔａｇｃｔａａａｇａｔｇｔａａａｔｃａｔａｔｇｃｇａｇｃｔａａｔｔｔａａｔｇａａｔｇａａｃｔｔａａａａａａｔｔｃｇａｔａａａｃａａａｔａｇｃｔｃａａｇｇａａｔａｔａｔｇａｔｇｃｇｇａｔｃａｔａａａａａｔｃｃａｔａｔｔａｔｇａｔａｃｔａｇｔａｃａｔｔｔｔｔａｔｃｔｃａｔｔｔｔｔａｔａａｔｃｃｔｇａｔａｇａｇａｔａａｔａｃｔｔａｔｔｔｇｃｃｇｇｇｔｔｔｔｇｃｔａａｔｇｃｇａａａａｔａａｃａｇｇａｇｃａａａｇｔａｔｔｔｃａａｔｃａａｔｃｇｇｔｇａｃｔｇａｔｔａｃｃｇａｇａａｇｇｇａａ（配列番号１８）。一実施形態では、下線を引いた領域は、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡ株に存在するａｃｔＡ配列要素を含有する。一実施形態では、太字の配列ｇｔｃｇａｃは、Ｎ−ＴおよびＣ−Ｔ配列の接合の部位を表す。
【００９３】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリア株は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、または、別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片をコードする第１の核酸分子または第２の核酸分子を含む。
【００９４】
一実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡは、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）としても知られており、別の実施形態では、２３２２の残基の膜結合タンパク質である。一実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡは、外科的に除去された良性母斑およびメラノーマ病変の９０％以上に対して発現され、基底細胞癌、神経堤起原腫瘍（例えば、星状細胞腫、グリオーマ、神経芽細胞腫、および肉腫）、小児白血病、および小葉乳癌病巣においても発現される。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡは、別の実施形態では、体内での新血管形成に関連する、腫瘍血管新生血管系における活性周皮細胞および周皮細胞の両方に対して高度に発現される。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片（残基２１６０−２２５８）を発現する、本明細書において提供される、組み換えリステリアでのマウスの免疫付与は、ＨＭＷ−ＭＡＡを発現するように操作されていない腫瘍の成長を弱める（図９Ｄ）。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片（残基２１６０−２２５８）を発現する組み換えリステリアでのマウスの免疫付与は、腫瘍血管系における周皮細胞の数を低下させる。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡの断片（残基２１６０−２２５８）を発現する組み換えリステリアでのマウスの免疫付与は、血管の周囲および腫瘍へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を引き起こす。
【００９５】
一実施形態では、ＮＧ２またはＡＮ２として知られるＨＭＷ−ＭＡＡのマウス相同体は、ＨＭＷ−ＭＡＡとの８０％の相同性、および同様の発現パターンおよび機能を有する。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡは、活性周皮細胞および腫瘍血管新生血管系における周皮細胞の両方で高度に発現される。一実施形態では、活性周皮細胞は、体内での新血管形成に関連する。一実施形態では、活性周皮細胞は、血管新生に関与する。別の実施形態では、血管新生は、腫瘍の生存のために重要である。別の実施形態では、腫瘍血管新生血管系における周皮細胞は、体内での新血管形成に関連する。別の実施形態では、活性周皮細胞は、血管発生、安定化、成熟、および再構築における重要な細胞である。したがって、一実施形態では、腫瘍関連抗原としてその役割の他に、ＨＭＷ−ＭＡＡは、免疫療法アプローチを使用する抗血管新生のための潜在的な普遍的標的でもある。本明細書において記載されるように（実施例８）、この抗原に対するＬｍベースのワクチンを使用し得えられた結果は、この可能性を裏付けている。
【００９６】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の抗原のうちの１つは、活性周皮細胞において発現される。別の実施形態では、抗原のうちの少なくとも１つは、活性周皮細胞において発現される。
【００９７】
本明細書において提供されるＨＭＷ−ＭＡＡ断片が由来するＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、別の実施形態では、ヒトＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、マウスタンパク質である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、ラットタンパク質である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、霊長類タンパク質である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他の種からのものである。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）である。別の実施形態では、ＡＮ２タンパク質が、本明細書において提供される方法および組成物において使用される。別の実施形態では、ＮＧ２タンパク質が、本明細書において提供される方法および組成物において使用される。
【００９８】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、以下の配列を有する。
【００９９】
ＭＱＳＧＲＧＰＰＬＰＡＰＧＬＡＬＡＬＴＬＴＭＬＡＲＬＡＳＡＡＳＦＦＧＥＮＨＬＥＶＰＶＡＴＡＬＴＤＩＤＬＱＬＱＦＳＴＳＱＰＥＡＬＬＬＬＡＡＧＰＡＤＨＬＬＬＱＬＹＳＧＲＬＱＶＲＬＶＬＧＱＥＥＬＲＬＱＴＰＡＥＴＬＬＳＤＳＩＰＨＴＶＶＬＴＶＶＥＧＷＡＴＬＳＶＤＧＦＬＮＡＳＳＡＶＰＧＡＰＬＥＶＰＹＧＬＦＶＧＧＴＧＴＬＧＬＰＹＬＲＧＴＳＲＰＬＲＧＣＬＨＡＡＴＬＮＧＲＳＬＬＲＰＬＴＰＤＶＨＥＧＣＡＥＥＦＳＡＳＤＤＶＡＬＧＦＳＧＰＨＳＬＡＡＦＰＡＷＧＴＱＤＥＧＴＬＥＦＴＬＴＴＱＳＲＱＡＰＬＡＦＱＡＧＧＲＲＧＤＦＩＹＶＤＩＦＥＧＨＬＲＡＶＶＥＫＧＱＧＴＶＬＬＨＮＳＶＰＶＡＤＧＱＰＨＥＶＳＶＨＩＮＡＨＲＬＥＩＳＶＤＱＹＰＴＨＴＳＮＲＧＶＬＳＹＬＥＰＲＧＳＬＬＬＧＧＬＤＡＥＡＳＲＨＬＱＥＨＲＬＧＬＴＰＥＡＴＮＡＳＬＬＧＣＭＥＤＬＳＶＮＧＱＲＲＧＬＲＥＡＬＬＴＲＮＭＡＡＧＣＲＬＥＥＥＥＹＥＤＤＡＹＧＨＹＥＡＦＳＴＬＡＰＥＡＷＰＡＭＥＬＰＥＰＣＶＰＥＰＧＬＰＰＶＦＡＮＦＴＱＬＬＴＩＳＰＬＶＶＡＥＧＧＴＡＷＬＥＷＲＨＶＱＰＴＬＤＬＭＥＡＥＬＲＫＳＱＶＬＦＳＶＴＲＧＡＲＨＧＥＬＥＬＤＩＰＧＡＱＡＲＫＭＦＴＬＬＤＶＶＮＲＫＡＲＦＩＨＤＧＳＥＤＴＳＤＱＬＶＬＥＶＳＶＴＡＲＶＰＭＰＳＣＬＲＲＧＱＴＹＬＬＰＩＱＶＮＰＶＮＤＰＰＨＩＩＦＰＨＧＳＬＭＶＩＬＥＨＴＱＫＰＬＧＰＥＶＦＱＡＹＤＰＤＳＡＣＥＧＬＴＦＱＶＬＧＴＳＳＧＬＰＶＥＲＲＤＱＰＧＥＰＡＴＥＦＳＣＲＥＬＥＡＧＳＬＶＹＶＨＲＧＧＰＡＱＤＬＴＦＲＶＳＤＧＬＱＡＳＰＰＡＴＬＫＶＶＡＩＲＰＡＩＱＩＨＲＳＴＧＬＲＬＡＱＧＳＡＭＰＩＬＰＡＮＬＳＶＥＴＮＡＶＧＱＤＶＳＶＬＦＲＶＴＧＡＬＱＦＧＥＬＱＫＱＧＡＧＧＶＥＧＡＥＷＷＡＴＱＡＦＨＱＲＤＶＥＱＧＲＶＲＹＬＳＴＤＰＱＨＨＡＹＤＴＶＥＮＬＡＬＥＶＱＶＧＱＥＩＬＳＮＬＳＦＰＶＴＩＱＲＡＴＶＷＭＬＲＬＥＰＬＨＴＱＮＴＱＱＥＴＬＴＴＡＨＬＥＡＴＬＥＥＡＧＰＳＰＰＴＦＨＹＥＶＶＱＡＰＲＫＧＮＬＱＬＱＧＴＲＬＳＤＧＱＧＦＴＱＤＤＩＱＡＧＲＶＴＹＧＡＴＡＲＡＳＥＡＶＥＤＴＦＲＦＲＶＴＡＰＰＹＦＳＰＬＹＴＦＰＩＨＩＧＧＤＰＤＡＰＶＬＴＮＶＬＬＶＶＰＥＧＧＥＧＶＬＳＡＤＨＬＦＶＫＳＬＮＳＡＳＹＬＹＥＶＭＥＲＰＲＨＧＲＬＡＷＲＧＴＱＤＫＴＴＭＶＴＳＦＴＮＥＤＬＬＲＧＲＬＶＹＱＨＤＤＳＥＴＴＥＤＤＩＰＦＶＡＴＲＱＧＥＳＳＧＤＭＡＷＥＥＶＲＧＶＦＲＶＡＩＱＰＶＮＤＨＡＰＶＱＴＩＳＲＩＦＨＶＡＲＧＧＲＲＬＬＴＴＤＤＶＡＦＳＤＡＤＳＧＦＡＤＡＱＬＶＬＴＲＫＤＬＬＦＧＳＩＶＡＶＤＥＰＴＲＰＩＹＲＦＴＱＥＤＬＲＫＲＲＶＬＦＶＨＳＧＡＤＲＧＷＩＱＬＱＶＳＤＧＱＨＱＡＴＡＬＬＥＶＱＡＳＥＰＹＬＲＶＡＮＧＳＳＬＶＶＰＱＧＧＱＧＴＩＤＴＡＶＬＨＬＤＴＮＬＤＩＲＳＧＤＥＶＨＹＨＶＴＡＧＰＲＷＧＱＬＶＲＡＧＱＰＡＴＡＦＳＱＱＤＬＬＤＧＡＶＬＹＳＨＮＧＳＬＳＰＲＤＴＭＡＦＳＶＥＡＧＰＶＨＴＤＡＴＬＱＶＴＩＡＬＥＧＰＬＡＰＬＫＬＶＲＨＫＫＩＹＶＦＱＧＥＡＡＥＩＲＲＤＱＬＥＡＡＱＥＡＶＰＰＡＤＩＶＦＳＶＫＳＰＰＳＡＧＹＬＶＭＶＳＲＧＡＬＡＤＥＰＰＳＬＤＰＶＱＳＦＳＱＥＡＶＤＴＧＲＶＬＹＬＨＳＲＰＥＡＷＳＤＡＦＳＬＤＶＡＳＧＬＧＡＰＬＥＧＶＬＶＥＬＥＶＬＰＡＡＩＰＬＥＡＱＮＦＳＶＰＥＧＧＳＬＴＬＡＰＰＬＬＲＶＳＧＰＹＦＰＴＬＬＧＬＳＬＱＶＬＥＰＰＱＨＧＡＬＱＫＥＤＧＰＱＡＲＴＬＳＡＦＳＷＲＭＶＥＥＱＬＩＲＹＶＨＤＧＳＥＴＬＴＤＳＦＶＬＭＡＮＡＳＥＭＤＲＱＳＨＰＶＡＦＴＶＴＶＬＰＶＮＤＱＰＰＩＬＴＴＮＴＧＬＱＭＷＥＧＡＴＡＰＩＰＡＥＡＬＲＳＴＤＧＤＳＧＳＥＤＬＶＹＴＩＥＱＰＳＮＧＲＶＶＬＲＧＡＰＧＴＥＶＲＳＦＴＱＡＱＬＤＧＧＬＶＬＦＳＨＲＧＴＬＤＧＧＦＲＦＲＬＳＤＧＥＨＴＳＰＧＨＦＦＲＶＴＡＱＫＱＶＬＬＳＬＫＧＳＱＴＬＴＶＣＰＧＳＶＱＰＬＳＳＱＴＬＲＡＳＳＳＡＧＴＤＰＱＬＬＬＹＲＶＶＲＧＰＱＬＧＲＬＦＨＡＱＱＤＳＴＧＥＡＬＶＮＦＴＱＡＥＶＹＡＧＮＩＬＹＥＨＥＭＰＰＥＰＦＷＥＡＨＤＴＬＥＬＱＬＳＳＰＰＡＲＤＶＡＡＴＬＡＶＡＶＳＦＥＡＡＣＰＱＲＰＳＨＬＷＫＮＫＧＬＷＶＰＥＧＱＲＡＲＩＴＶＡＡＬＤＡＳＮＬＬＡＳＶＰＳＰＱＲＳＥＨＤＶＬＦＱＶＴＱＦＰＳＲＧＱＬＬＶＳＥＥＰＬＨＡＧＱＰＨＦＬＱＳＱＬＡＡＧＱＬＶＹＡＨＧＧＧＧＴＱＱＤＧＦＨＦＲＡＨＬＱＧＰＡＧＡＳＶＡＧＰＱＴＳＥＡＦＡＩＴＶＲＤＶＮＥＲＰＰＱＰＱＡＳＶＰＬＲＬＴＲＧＳＲＡＰＩＳＲＡＱＬＳＶＶＤＰＤＳＡＰＧＥＩＥＹＥＶＱＲＡＰＨＮＧＦＬＳＬＶＧＧＧＬＧＰＶＴＲＦＴＱＡＤＶＤＳＧＲＬＡＦＶＡＮＧＳＳＶＡＧＩＦＱＬＳＭＳＤＧＡＳＰＰＬＰＭＳＬＡＶＤＩＬＰＳＡＩＥＶＱＬＲＡＰＬＥＶＰＱＡＬＧＲＳＳＬＳＱＱＱＬＲＶＶＳＤＲＥＥＰＥＡＡＹＲＬＩＱＧＰＱＹＧＨＬＬＶＧＧＲＰＴＳＡＦＳＱＦＱＩＤＱＧＥＶＶＦＡＦＴＮＦＳＳＳＨＤＨＦＲＶＬＡＬＡＲＧＶＮＡＳＡＶＶＮＶＴＶＲＡＬＬＨＶＷＡＧＧＰＷＰＱＧＡＴＬＲＬＤＰＴＶＬＤＡＧＥＬＡＮＲＴＧＳＶＰＲＦＲＬＬＥＧＰＲＨＧＲＶＶＲＶＰＲＡＲＴＥＰＧＧＳＱＬＶＥＱＦＴＱＱＤＬＥＤＧＲＬＧＬＥＶＧＲＰＥＧＲＡＰＧＰＡＧＤＳＬＴＬＥＬＷＡＱＧＶＰＰＡＶＡＳＬＤＦＡＴＥＰＹＮＡＡＲＰＹＳＶＡＬＬＳＶＰＥＡＡＲＴＥＡＧＫＰＥＳＳＴＰＴＧＥＰＧＰＭＡＳＳＰＥＰＡＶＡＫＧＧＦＬＳＦＬＥＡＮＭＦＳＶＩＩＰＭＣＬＶＬＬＬＬＡＬＩＬＰＬＬＦＹＬＲＫＲＮＫＴＧＫＨＤＶＱＶＬＴＡＫＰＲＮＧＬＡＧＤＴＥＴＦＲＫＶＥＰＧＱＡＩＰＬＴＡＶＰＧＱＧＰＰＰＧＧＱＰＤＰＥＬＬＱＦＣＲＴＰＮＰＡＬＫＮＧＱＹＷＶ（配列番号１９）。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列は、配列番号１９に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列は、配列番号１９の相同体である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列は、配列番号１９の変異形である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列は、配列番号１９の断片である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列は、配列番号１９のイソ型である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１００】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、以下の配列によってコードされる。
【０１０１】
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【０１０２】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、ＮＭ＿００１８９７およびＸ９６７５３から選択される受入番号を有するＧｅｎＢａｎｋエントリに記載されるＡＡ配列を有する。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される配列を含む。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される配列の相同体である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される配列の変異形である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される配列の断片である。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡタンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される配列のイソ型である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１０３】
本発明において利用されるＨＭＷ−ＭＡＡ断片は、別の実施形態では、ＡＡ３６０−５５４を含む。別の実施形態では、断片は、本質的にＡＡ３６０−５５４から成る。別の実施形態では、断片は、ＡＡ３６０−５５４から成る。別の実施形態では、断片は、ＡＡ７０１−１１３０から成る。別の実施形態では、断片は、本質的にＡＡ７０１−１１３０から成る。別の実施形態では、断片は、ＡＡ７０１−１１３０から成る。別の実施形態では、断片は、ＡＡ２１６０−２２５８を含む。別の実施形態では、断片は、本質的に２１６０−２２５８から成る。別の実施形態では、断片は、２１６０−２２５８から成る。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１０４】
別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリアは、一実施形態では、血管新生であり、別の実施形態では、抗原性である組み換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、ＨＭＷ−ＭＡＡであり、別の実施形態では、ポリペプチドは、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片である。別の実施形態では、プラスミドは、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドをさらにコードする。一実施形態では、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、ポリペプチドの免疫原性を強化する。一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＨＭＷ−ＭＡＡ断片は、非ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列に融合する。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片は、非ＨＭＷ−ＭＡＡ  ＡＡ配列内に包含される。別の実施形態では、ＨＭＷ−ＭＡＡ由来のペプチドは、ＬＬＯ断片、ＡｃｔＡタンパク質もしくは断片、またはＰＥＳＴ様配列に取り込まれる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１０５】
非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、一実施形態では、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチドである。別の実施形態では、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、ＡｃｔＡオリゴペプチドである。別の実施形態では、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、ＰＥＳＴ様オリゴペプチドである。一実施形態では、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列、およびそれらの断片への融合は、抗原の細胞媒介性免疫原性を強化する。一実施形態では、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列、およびそれらの断片への融合は、多様な発現系における抗原の細胞媒介性免疫原性を強化する。別の実施形態では、非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドは、当技術分野で知られている任意の他の免疫原性非ＨＭＷ−ＭＡＡペプチドである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリア株は、腫瘍細胞によって発現される異種抗原ポリペプチドを発現する。一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリア株は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードする第１の核酸分子または第２の核酸分子を含み、一実施形態では、ＰＳＡは、前立腺腫瘍によって高度に発現される前立腺癌に対するマーカであり、一実施形態では、前立腺癌は、アメリカ人男性において最も頻繁に見られる種類の癌であり、別の実施形態では、アメリカ人男性における癌に関連した死亡の第２の原因である。一実施形態では、ＰＳＡは、前立腺上皮細胞によって分泌されるカリクレインセリンプロテアーゼ（ＫＬＫ３）であり、一実施形態では、それは、前立腺癌に対するマーカとして広く使用される。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書において提供される組み換えリステリア株は、ＫＬＫ３タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１０８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。
【０１０９】
ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号２１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３２９１５）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２１の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２１の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２１の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。
【０１１１】
ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＹＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号２２）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２２の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２２の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２２の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２２の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号２３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５９９９５．１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２３の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２３の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２３の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２３の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ｇｇｔｇｔｃｔｔａｇｇｃａｃａｃｔｇｇｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｃａａａｇｇａｔｃｔａｇｇｃａｃｇｔｇａｇｇｃｔｔｔｇｔａｔｇａａｇａａｔｃｇｇｇｇａｔｃｇｔａｃｃｃａｃｃｃｃｃｔｇｔｔｔｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃｃｔａｇａｔｇａａｇｔｃｔｃｃａｔｇａｇｃｔａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｔｃｃａｇｇｇｔｇａｔｃｔａｇｔａａｔｔｇｃａｇａａｃａｇｃａａｇｔｇｃｔａｇｃｔｃｔｃｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｃａｃａｇｃｔｃｔｇｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｇｇｇｔｔｇｔｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃａｔｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｇｇｔｃａｇｃｃｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔｇａａｇｇｔｔｔｔａｔａｇｇｇｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇａｇａｇｇｇｇｃｃａｔｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｔｇｃａｇｇａｇａｇｇｇａｇｃｃａｇｃｃｃｔｇａｃｔｇｔｃａａｇｃｔｇａｇｇｃｔｃｔｔｔｃｃｃｃｃｃｃａａｃｃｃａｇｃａｃｃｃｃａｇｃｃｃａｇａｃａｇｇｇａｇｃｔｇｇｇｃｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃａｃｔｔｃａａｇｃｃｃａｔａｃｃｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｔａｔｔｇｃａａｃａｇｔｃｃｔｃａｃｔｃｃｃａｃａｃｃａｇｇｔｃｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｃｔｔａｃｃｃｃａｇａａｃｔｔｔｃｔｔｃｃｃａｔｔｔｇｃｃｃａｇｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃａｇｃｔｇｃｔｔｔａｃｔａａａｇｇｇｇａａｇｔｔｃｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｃｃｇｔｇｔｔｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｇｇｇｃｔｃａａａａｃｃｔｃｃａａｇｇａｃｃｔｃｔｃｔｃａａｔｇｃｃａｔｔｇｇｔｔｃｃｔｔｇｇａｃｃｇｔａｔｃａｃｔｇｇｔｃｃａｔｃｔｃｃｔｇａｇｃｃｃｃｔｃａａｔｃｃｔａｔｃａｃａｇｔｃｔａｃｔｇａｃｔｔｔｔｃｃｃａｔｔｃａｇｃｔｇｔｇａｇｔｇｔｃｃａａｃｃｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｃｃｔｔｇａｔｇｃｔｔｇｇｃｃｔｃｃｃａａｔｃｔｔｇｃｃｃｔａｇｇａｔａｃｃｃａｇａｔｇｃｃａａｃｃａｇａｃａｃｃｔｃｃｔｔｃｔｔｔｃｃｔａｇｃｃａｇｇｃｔａｔｃｔｇｇｃｃｔｇａｇａｃａａｃａａａｔｇｇｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｇｇｃａａｔｇｇｇａｃｔｃｔｇａｇａａｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｇａｃｔｃｔｔａｇｃｃｃｃａｇａｃｔｃｔｔｃａｔｔｃａｇｔｇｇｃｃｃａｃａｔｔｔｔｃｃｔｔａｇｇａａａａａｃａｔｇａｇｃａｔｃｃｃｃａｇｃｃａｃａａｃｔｇｃｃａｇｃｔｃｔｃｔｇａｇｔｃｃｃｃａａａｔｃｔｇｃａｔｃｃｔｔｔｔｃａａａａｃｃｔａａａａａｃａａａａａｇａａａａａｃａａａｔａａａａｃａａａａｃｃａａｃｔｃａｇａｃｃａｇａａｃｔｇｔｔｔｔｃｔｃａａｃｃｔｇｇｇａｃｔｔｃｃｔａａａｃｔｔｔｃｃａａａａｃｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃａｇｃａａｃｔｇａａｃｃｔｃｇｃｃａｔａａｇｇｃａｃｔｔａｔｃｃｃｔｇｇｔｔｃｃｔａｇｃａｃｃｃｃｔｔａｔｃｃｃｃｔｃａｇａａｔｃｃａｃａａｃｔｔｇｔａｃｃａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｃｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｃｇｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｔｇａｇｔａｇｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃａｇａｇｇａａｔａａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｃａｇｇａｔａａｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇａｇａｇｇｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃａｃａｔｇｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｇａｃｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｃｃａｔａｔｃｔｃｃｃｃｃｔｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔｃｔｇｇｔｃｃｃｔｃｔｃｔａｇｃｃａｇｔｇｔｇｔｃｔｃａｃｃｃｔｇｔａｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｇｔｃｔｃｔｃｇｇｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃａｃｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔａｃｔｇａａｃａｃａｃｇｃａｃｇｇｇａｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａａａａｇｇａａｇｇｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃａｃａｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｃａｇｇｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇａｇｔｔｃｇａｇａｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａａｃｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃａｔｃｔｃｔａｃｔａａａａａｔａｃａａａａａａｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｃｇｃａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｃｃｃａｇｃｔａｃｔｃａｇｇａｇｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇａａｔｔｇｃａｔｔｇａａｃｃｔｇｇａｇｇｔｔｇａｇｇｔｔｇｃａｇｔｇａｇｃｃｇａｇａｃｃｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｔｇａｃａｇａｇｔｇａｇａｃｔｃｃｇｃｃｔｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇａａａａｇｇａａｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｃｃｔｇａｔｇｔｇｔｇｔｇｇｇｔａｔｇａｇｇｇｔａｔｇａｇａｇｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃａｃｔｃｃａｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃａｇｇａｃａｔｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｔｔｇｇｇａｇａｃａｃａｇａｇａａｇｇｇｃｔｇｇｔｔｃｃａｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇａｇｇｇｇｃａａｔｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇａａｇｇａｇａａｇｇｇｇｇａａｇｇａａａａｃａｇｇｇｔａｔｇｇｇｇｇａａａｇｇａｃｃｃｔｇｇｇｇａｇｃｇａａｇｔｇｇａｇｇａｔａｃａａｃｃｔｔｇｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃａｇｇｃｔａｃｃｔａｃｃｃａｃｔｔｇｇａａａｃｃｃａｃｇｃｃａａａｇｃｃｇｃａｔｃｔａｃａｇｃｔｇａｇｃｃａｃｔｃｔｇａｇｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｃａｃｔｃａｇｃｔｃｃａａａｇｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｔｔｔｃｔｃｔｃｃｃａｃａｃｔｔｔａｔｃａｔｃｃｃｃｃｇｇａｔｔｃｃｔｃｔｃｔａｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇａｃｔｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃｃｔｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃａｃｔｔｔｃｔｇｃｃｔｇｇｔｔｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔｇｇｃｃｃａｔｇｔｃｔｇｔｔｔｃｔｃｔａｔｇｔｔｔｃｔｇｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｇｔａｔｔｔｔｃｇｇｃｔｃａｃｃｔｔｇｔｔｔｇｔｃａｃｔｇｔｔｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｇｃｃｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｃｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｔｔｃｔｇｔａｔｃｔｇｃｃｃｔｔｃａｃｃｃｔｃｔｃａｃａｃｔｇｃｔｇｔｔｔｃｃｃａａｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｇｔａｔｔｔｔｇｇｃｃｔｇａａｃｔｇｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｔｔｃｔｃａｃｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｔｃｔｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｔｇｃｔｃｃｔｃｔｇｔｃｃｃｔｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｔａｔｃａｔｃｃｔｃｇｃｔｃｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｃｇｔｃｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｇｔａｃｇｃｃｔｇｇｇｃｃａｇａｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇａｇｃｃｃａｇａｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇａｃａｇｇａｃｔｃｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｇｇａｇｇａｇｇｇｃｃａａｇｇａａｃｃａｇｇｔｇｇｇｇｔｃｃａｇｃｃｃａｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｔｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｇｔａｇｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｔｇａｇｔｃａｔｃｃｃｔａｃｔｃｃｃａａｇａｔｃｔｔｇａｇｇｇａａａｇｇｔｇａｇｔｇｇｇａｃｃｔｔａａｔｔｃｔｇｇｇｃｔｇｇｇｇｔｃｔａｇａａｇｃｃａａｃａａｇｇｃｇｔｃｔｇｃｃｔｃｃｃｃｔｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｔｇｔａｇｃｃａｔｇｃｃａｃｃｔｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｃａｔｃｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｃｃｃｔｃｔｔｃｔｔｔｇａｃｔｃｃｃｔｃａａｇｇｃａａｔａｇｇｔｔａｔｔｃｔｔａｃａｇｃａｃａａｃｔｃａｔｃｔｇｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔｃａｇｃａｃａｃｇｇｔｔａｃｔａｇｇｃａｃｃｔｇｃｔａｔｇｃａｃｃｃａｇｃａｃｔｇｃｃｃｔａｇａｇｃｃｔｇｇｇａｃａｔａｇｃａｇｔｇａａｃａｇａｃａｇａｇａｇｃａｇｃｃｃｃｔｃｃｃｔｔｃｔｇｔａｇｃｃｃｃｃａａｇｃｃａｇｔｇａｇｇｇｇｃａｃａｇｇｃａｇｇａａｃａｇｇｇａｃｃａｃａａｃａｃａｇａａａａｇｃｔｇｇａｇｇｇｔｇｔｃａｇｇａｇｇｔｇａｔｃａｇｇｃｔｃｔｃｇｇｇｇａｇｇｇａｇａａｇｇｇｇｔｇｇｇｇａｇｔｇｔｇａｃｔｇｇｇａｇｇａｇａｃａｔｃｃｔｇｃａｇａａｇｇｔｇｇｇａｇｔｇａｇｃａａａｃａｃｃｔｇｃｇｃａｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｇｃｇｇｃａｃｃｔｇｇｇｇｇａｇｃａｇａｇｇｇａａｃａｇｃａｔｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｇｇａｇｇｇｇｃｃｔａｇａｇｇｇｃｇｔｃａｇｇａｇｃａｇａｇａｇｇａｇｇｔｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｇａｇｔｇａａｇｇａｔｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇａａｃａａａｇｇａｃｃｃｃｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｔｃａｃｃｔｇｇｇｃｃａｃａｇｇａｇｇａｃａｃｔｇｃｔｔｔｔｃｃｔｃｔｇａｇｇａｇｔｃａｇｇａａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃａｇａａｇｃａｇｇａｃａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｔｃａｇｇｔｇｔｃｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔａｔｇｇｇａｔｃａｇａｃｔｇｃａｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｃａｇｃａｇｇｇａｔｇｔｇｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｔｇｇｇｇｃｔｇａｃｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇｃａｔｔｇｔｃｃｃｃａｃｃｔｇｇｇｃｃｃｔｔａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃｃｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｇｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｔｃｃ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ｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｔａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｇｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇｔｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇａｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃ（配列番号２２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１４８１０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２４の残基４０１．．４４６、１６８８．．１８４７、３４７７．．３７６３、３９０７．．４０４３、および５４１３．．５５６８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２４の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２４の変異体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２４の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２４の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＷＶＩＬＩＴＥＬＴＭＰＡＬＰＭＶＬＨＧＳＬＶＰＷＲＧＧＶ（配列番号２５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２１８）別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２５の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２５の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２５の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２５の断片である。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【０１１５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｔｇｇｇｔｃａｔｔｃｔｇａｔｃａｃｃｇａａｃｔｇａｃｃａｔｇｃｃａｇｃｃｃｔｇｃｃｇａｔｇｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｇｔｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｇａｇｇｔｇｔｃｔａｇｔｃａｇａｇａｇｔａｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔｇａｇｇａｇｃｃａｃｇｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｔｇｇｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｔｃｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇｔｃｔａｃａａｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｃｇｔｇｇａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｃａｇｇａｇｃｔｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｃｃａｃｃｇｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇａｇｃｃｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇａａｇｔｃｇｇｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔｃｔｔｃｃａａａｇｃｔｇｇｇａａｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｔｔａｔｃｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｇｔｃｔｇａａａｇａｔａｇｇａｔｔｇｃｃｃａｇｇｃａｇａａａｃｔｇｇｇａｃｔｇａｃｃｔａｔｃｔｃａｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｇｃｔｔｔｔａｃｃｃｔｔａｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号２６；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００４７）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２６の残基４２−７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２６の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２６の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２６の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２６の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫ（配列番号２７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２２１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２７の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は、配列番号２７を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２７の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｔｇａｇｔａｇｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｇｇｇｇａｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｃｃｃａｇａｇｇａａｔａａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｃａｇｇａｔａａｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｇａｃｔｇｇｇｇｇａｇａｇａｇｇｇａａａｇｔｔｃｔｇｇｔｔｃａｇｇｔｃａｃａｔｇｇｇｇａｇｇｃａｇｇｇｔｔｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｇｔｔｃｃｔｃｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｔｇｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｔｔａｔｇｔｃｔｃｔｔｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃｇｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃｃｇｔｇｔｇａｃｔａｔｔｔｔｇｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｇｔ（配列番号２８；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００５０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２８の残基４２−７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２８の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２８の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２８の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２８の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチド源であるＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号２９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２２０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２９の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２９の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号２９の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１１９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号３０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００４９）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３０の残基４２−７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３０の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３０の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３０の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３０の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＫＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号３１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２５２１９）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３１の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３１の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３１の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３１の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号３２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０３００４８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３２の残基４２−７５８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３２の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３２の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３２の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３２の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号３３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１６３９）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３３の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３３の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３３の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３３の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｃｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａａｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇ（配列番号３４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１６４８）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３４の残基４２−８２７によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３４の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３４の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３４の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３４の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号３５ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＸ２９４０７．１）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３５の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３５の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３５の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は、配列番号３５を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３５の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ｇｇｇｇｇａｇｃｃｃｃａａｇｃｔｔａｃｃａｃｃｔｇｃａｃｃｃｇｇａｇａｇｃｔｇｔｇｔｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｔｇａｃｇｔｇｇａｔｔｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔｇｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａｇｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｃｇａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号３６；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ０５６６６５）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３６の残基４７−８３２によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３６の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３６の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３６の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３６の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２６】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡ（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８２）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３７の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３７の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３７の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３７の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２７】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＶＳＨＰＹＳＱＤＬＥＧＫＧＥＷＧＰ（配列番号３８、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ５１２３４６）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３８の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３８の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３８の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は、配列番号３８を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３８の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＥＲＧＨＧＷＧＤＡＧＥＧＡＳＰＤＣＱＡＥＡＬＳＰＰＴＱＨＰＳＰＤＲＥＬＧＳＦＬＳＬＰＡＰＬＱＡＨＴＰＳＰＳＩＬＱＱＳＳＬＰＨＱＶＰＡＰＳＨＬＰＱＮＦＬＰＩＡＱＰＡＰＣＳＱＬＬＹ（配列番号３９ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８４）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３９の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３９の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質の配列は、配列番号３９を含む。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３９の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号３９の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１２９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有する。ＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲＧＲＡＶＣＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶＬＴＡＡＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬＬＧＲＨＳＬＦＨＰＥＤＴＧＱＶＦＱＶＳＨＳＦＰＨＰＬＹＤＭＳＬＬＫＮＲＦＬＲＰＧＤＤＳＳＨＤＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡＥＬＴＤＡＶＫＶＭＤＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶＤＬＨＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶＨＰＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＲＷＴＧＧＫＳＴＣＳＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧＳＥＰＣＡＬＰＥＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ（配列番号４０ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＪ４５９７８３）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４０の相同体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４０の変異形である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４０の異性体である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４０の断片である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３０】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下の配列を有するヌクレオチド分子によってコードされる。ａａｇｔｔｔｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃａｇｔｃｃａａｇａｃｃｃｃａａａｔｃａｃｃａｃａａａｇｇａｃｃｃａａｔｃｃｃｃａｇａｃｔｃａａｇａｔａｔｇｇｔｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｇａｔｃｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｃｔｃｔｇｃｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｇａａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａａａｃｃｔａｇｇｇａａｇａｔｔｇａｃａｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｔｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｃｃｔｇｃｃｃａｔｇｔｃｃｃａｇｇａｃｔｃｃｃａｇｃｃｔｔｇｇｔｔｃｔｃｔｇｃｃｃｃｃｇｔｇｔｃｔｔｔｔｃａａａｃｃｃａｃａｔｃｃｔａａａｔｃｃａｔｃｔｃｃｔａｔｃｃｇａｇｔｃｃｃｃｃａｇｔｔｃｃｔｃｃｔｇｔｃａａｃｃｃｔｇａｔｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｔａｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔｇｃａｇｇｔｇｃｔｇｃａｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｇｇａｔｔｇｔｇｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇｃｇａｇａａｇｃａｔｔｃｃｃａａｃｃｃｔｇｇｃａｇｇｔｇｃｔｔｇｔａｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｇｃａｇｇｇｃａｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｔｇｔｔｃｔｇｇｔｇｃａｃｃｃｃｃａｇｔｇｇｇｔｃｃｔｃａｃａｇｃｔａｃｃｃａｃｔｇｃａｔｃａｇｇａａｃａａａａｇｃｇｔｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｃｇｇｃａｃａｇｃｃｔｇｔｔｔｃａｔｃｃｔｇａａｇａｃａｃａｇｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｃａｇｇｔｃａｇｃｃａｃａｇｃｔｔｃｃｃａｃａｃｃｃｇｃｔｃｔａｃｇａｔａｔｇａｇｃｃｔｃｃｔｇａａｇａａｔｃｇａｔｔｃｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｇａｔｇａｃｔｃｃａｇｃｃａｃｇａｃｃｔｃａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｃｃｇａｇｃｔｃａｃｇｇａｔｇｃｔａｔｇａａｇｇｔｃａｔｇｇａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃａｇｇａｇｃｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇａｃｃａｃｃｔｇｃｔａｃｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｃａｔｔｇａａｃｃａｇａｇｇａｇｔｔｃｔｔｇａｃｃｃｃａａａｇａａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇｔｇｇａｃｃｔｃｃａｔｇｔｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｃａａｇｔｔｃａｃｃｃｔｃａｇａａｇｇｔｇａｃｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｔｇｇａｃａｇｇｇｇｇｃａａａａｇｃａｃｃｔｇｃｔｃｇｇｇｔｇａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｃｃｃａｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｔｇｇｔｇｔｇｃｔｔｃａａｇｇｔａｔｃａｃｇｔｃａｔｇｇｇｇｃａｇｔｇａａｃｃａｔｇｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｇａａａｇｇｃｃｔｔｃｃｃｔｇｔａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇｔｇｃａｔｔａｃｃｇｇａａｇｔｇｇａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａｔｃｇｔｇｇｃｃａａｃｃｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃｃｔａｔｃａａｃｔｃｃｃｔａｔｔｇｔａｇｔａａａｃｔｔｇｇａａｃｃｔｔｇｇａａａｔｇａｃｃａｇｇｃｃａａｇａｃｔｃａｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｔｔｃｔａｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｔｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｇａｇｇｔｃｃａｇｇｇｔｔｇｃｔａｇｇａａａａｇａａａｔｃａｇｃａｇａｃａｃａｇｇｔｇｔａｇａｃｃａｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔａａａｔｇｇｔｇｔａａｔｔｔｔｇｔｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇｇａａｔａｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｃｔｇｇａｇａｃａｔａｔｃａｃｔｃａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｇｇａｃａｃａｇａｔａｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｇｇｇｇｔａｃａｇａｇａｔｇａａａｇａｇｇｇｇｔｇｇｇａｔｃｃａｃａｃｔｇａｇａｇａｇｔｇｇａｇａｇｔｇａｃａｔｇｔｇｃｔｇｇａｃａｃｔｇｔｃｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｃａｃａａｃｇｃａｃｃａｇａｃａｃｔｃａｃａｇｃａａｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇａａａａｃａｔａａｃｃｃａｃｔｃｔｇｔｃｃｔｇｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇａａｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｃｔｇｔｇａａｃｃａａｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｇｇａｔｇｇｇｇａｔｇａａｇｔａａｇｇａｇａｇｇｇａｃｔｇａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔｇａｔｔｃａｃｔａｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔａｔｔｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｇａｃａａｃｃｃｔｃａｇａｔｔｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｔａｇｔａｇａａｃｔｃａｃａｇａａａｔａａａｇａｇｃｔｇｔｔａｔａｃｔｇｔｇａａ（配列番号４１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０７７３０）。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４１の残基６７−１０８８によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４１の相同体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４１の変異形によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４１の異性体によってコードされる。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列番号４１の断片によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３１】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに記載される配列によってコードされる。ＢＣ００５３０７、ＡＪ３１０９３８、ＡＪ３１０９３７、ＡＦ３３５４７８、ＡＦ３３５４７７、Ｍ２７２７４、およびＭ２６６６３。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに記載される配列によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３２】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに記載される配列によってコードされる。ＮＭ＿００１０３００５０、ＮＭ＿００１０３００４９、ＮＭ＿００１０３００４８、ＮＭ＿００１０３００４７、ＮＭ＿００１６４８、ＡＪ４５９７８２、ＡＪ５１２３４６、またはＡＪ４５９７８４。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。一実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、配列がＭＷＶＰＶＶＦＬＴＬＳＶＴＷＩＧＡＡＰＬＩＬＳＲ（配列番号４２）を欠く、本明細書に記載される任意の配列の変形によってコードされる。
【０１３３】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋ受入番号のうちの１つに記載される配列を含む配列を有する。Ｘ１３９４３、Ｘ１３９４２、Ｘ１３９４０、Ｘ１３９４１、およびＸ１３９４４。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３４】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のＫＬＫ３タンパク質である。各ＫＬＫ３タンパク質は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３５】
別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは、当技術分野で知られている任意の他のＫＬＫ３ペプチドである。別の実施形態では、ＫＬＫ３ペプチドは、当技術分野で知られている任意の他のＫＬＫ３ペプチドの断片である。各種のＫＬＫ３ペプチドは、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３６】
「ＫＬＫ３ペプチド」とは、別の実施形態では、完全長ＫＬＫ３タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３信号ペプチドを欠くＫＬＫ３タンパク質の断片を指す。別の実施形態では、この用語は、ＫＬＫ３信号ペプチドを除くＫＬＫ３配列全体を含有するＫＬＫ３タンパク質を指す。「ＫＬＫ３信号配列」とは、別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質上で天然に見られる任意の信号配列を指す。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＫＬＫ３タンパク質は、いかなる信号配列も含有しない。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３７】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物で使用するためのＫＬＫ３ペプチド源であるカリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３タンパク質）は、ＰＳＡタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、Ｐ−３０抗原タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、γ−セミノプロテインタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、カリクレイン３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、セミノゲラーゼタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、セミニンタンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、当技術分野で知られている任意の他の種類のＫＬＫ３タンパク質である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３８】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、スプライス変異形１ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、スプライス変異形２ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、スプライス変異形３ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、転写変異形１ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、転写変異形２ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、転写変異形３ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、転写変異形４ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、転写変異形５ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、転写変異形６ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、スプライス変異形ＲＰ５ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、当技術分野で任意の他のスプライス変異形ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、当技術分野で知られている任意の他の転写変異形ＫＬＫ３タンパク質である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１３９】
別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、成熟ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、プロＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、リーダー配列は、本明細書において提供される方法および組成物の成熟ＫＬＫ３タンパク質から除去されている。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１４０】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のＫＬＫ３ペプチド源であるＫＬＫ３タンパク質は、ヒトＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、霊長類ＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、ＫＬＫ３タンパク質は、当技術分野で知られている任意の他の種のＫＬＫ３タンパク質である。別の実施形態では、上記のＫＬＫ３タンパク質のうちの１つは、「ＫＬＫ３タンパク質」と当技術分野で称される。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１４１】
別の実施形態では、対象の抗原は、ＫＬＫ９ポリペプチドである。
【０１４２】
別の実施形態では、対象の抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態では、抗原は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕである。別の実施形態では、抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、抗原は、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原は、ＳＣＣＥである。別の実施形態では、抗原は、ＣＥＡである。別の実施形態では、抗原は、ＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原は、ｐ５３である。別の実施形態では、抗原は、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原は、ＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態では、抗原は、ＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原は、ＷＴ−１である。別の実施形態では、抗原は、ＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原は、プロテイナーゼ３である。別の実施形態では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態では、抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、又はそれらの組み合わせから選択される。
【０１４３】
別の実施形態では、抗原は、腫瘍関連抗原であり、一実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの１つである。ＭＡＧＥ（メラノーマ−関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、チロシナーゼ、変異体ｒａｓタンパク質、変異体ｐ５３タンパク質、進行癌に関連するｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチド、またはｐ５３ペプチド、子宮頸癌に関連するＨＰＶ１６／１８抗原、乳癌に関連するＫＬＨ抗原、結腸直腸癌に関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｇｐ１００、メラノーマに関連するＭＡＲＴ１抗原、または前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原。別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法のための抗原は、メラノーマ関連抗原であり、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、ベータ−ＨＣＧ、またはそれらの組み合わせである。
【０１４４】
一実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、腫瘍標的として機能する２つの別々の抗原をコードし得、一実施形態では、その抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）および前立腺癌幹細胞（ＰＳＣＡ）抗原である。一実施形態では、第２の核酸によってコードされるポリペプチドは、抗原ポリペプチドをコードする第１の核酸に対する免疫応答を補完するか、または相乗作用を与え得る。別の実施形態では、第２の核酸によってコードされるポリペプチドは、血管成長に影響を与える。一実施形態では、第１の核酸および第２の核酸は、血管成長に影響を与える２つのポリペプチドをコードし得、一実施形態では、それらは、区別できる別の機構を介して作用して、血管成長に影響を与える。一実施形態では、そのようなポリペプチドは、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、ポリペプチドは、腫瘍抗体および血管新生因子の両方として機能し得る。一実施形態では、第１の核酸は、腫瘍抗体をコードし得、第２の核酸は、ＡＲＧ−１もしくはＮＯＳ、または組み合わせの機能または発現の阻害因子であるポリペプチドをコードし得る。一実施形態では、ＮＯＳの阻害因子は、ＮＧ−モノ−メチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）、ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、７−ＮＩ、Ｌ−ＮＩＬ、またはＬ−ＮＩＯである。一実施形態では、酸化窒素シンターゼ阻害因子およびＬ−アルギニン競合阻害因子である、Ｎ−オメガ−ニトロ−Ｌ−アルギニンは、核酸によってコードされ得る。一実施形態では、第２の核酸は、ＡＲＧ−１またはＮＯＳの機能または発現を阻害するｍＲＮＡをコードし得る。
【０１４５】
一実施形態では、本発明のリステリアによって発現されるポリペプチドは、神経ペプチド成長因子アンタゴニストであり得、一実施形態では、［Ｄ−Ａｒｇ１、Ｄ−Ｐｈｅ５、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］物質Ｐ、［Ａｒｇ６、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰｈｅ８］物質Ｐ（６−１１）である。これら、および関連する実施形態実施形態は、当業者によって理解される。
【０１４６】
別の実施形態では、抗原は、感染症抗原である。一実施形態では、抗原は、自己抗原または自己抗原である。
【０１４７】
他の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生生物、寄生蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ、ジャガイモ粉状そうか病菌抗原、ビブリオ抗原、サルモネラ菌抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクターピロリウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、もしくは−４５型ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１４８】
他の実施形態では、抗原は、以下の疾病のうちの１つに関連する。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス属、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、はしか、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病からの免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液感染性腫瘍を含む癌、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植等の移植拒絶反応、バセドウ病、多腺性自己免疫疾患疾病、肝炎、顕微鏡的多発動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗原介在性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節炎、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化、脳脊髄炎、ギランバレー症候群、重症筋無力症、ランバートイートン症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんま疹、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ヴィスコットアルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイドーシス、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアスポロゾイト周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。各抗原は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１４９】
本明細書において提供される方法および組成物によって誘導される免疫応答は、別の実施形態では、Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法の組み換えリステリアは、血管新生ポリペプチドを含む。別の実施形態では、癌療法に対する抗血管新生のアプローチは、非常に有望であり、一実施形態では、そのような抗脈管形成療法の１つの種類は、周皮細胞を標的とする。別の実施形態では、血管内皮細胞および周皮細胞に対する分子標的は、抗腫瘍療法のための重要な標的である。別の実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）信号伝達は、周皮細胞を新規に形成された血管に動員するために重要である。したがって、一実施形態では、本明細書において提供される血管新生ポリペプチドは、一実施形態では、ＰＤＧＦＲ−βである、周皮細胞信号伝達に関与する分子を阻害する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明の組成物は、血管新生因子、またはその免疫原性断片を含み、一実施形態では、免疫原性断片は、宿主免疫系によって認識される１つ以上のエピトープを含む。一実施形態では、血管新生因子は、新規血管の形成に関与する分子である。一実施形態では、血管新生因子は、ＶＥＧＦＲ２である。別の実施形態では、本発明の血管新生因子は、アンギオジェニン、アンジオポイエチン−１、Ｄｅｌ−１、酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）の線維芽細胞成長因子、ホリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過因子（ＶＰＦ）である。別の実施形態では、血管新生因子は、血管新生のタンパク質である。一実施形態では、成長因子は、血管新生のタンパク質である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用するための血管新生のタンパク質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、およびニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、アンジオポイエチン１（Ａｎｇ１）およびＴｉｅ２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、ＢＢ−ホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、エンドグリンおよびＴＧＦ−β受容体、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インテグリンαＶβ３、αＶβ５、およびα５β１、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１、エフリン、プラスミノゲン活性化因子、プラスミノゲン活性化因子阻害剤−１、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、またはＩｄ１／Ｉｄ３である。一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用するための血管新生のタンパク質は、アンジオポイエチンであり、一実施形態では、アンジオポイエチン１、アンジオポイエチン３、アンジオポイエチン４、またはアンジオポイエチン６である。一実施形態では、エンドグリンは、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、またはＯＲＷ１としても知られている。一実施形態では、エンドグリンは、ＴＧＦ−β共受容体である。
【０１５２】
一実施形態では、本明細書において提供される癌ワクチンは、腫瘍を浸潤し、腫瘍細胞を破壊し、疾病を根絶することが可能なエフェクターＴ細胞を生成する。一実施形態では、リンパ球（ＴＩＬ）に浸潤する自然発生の腫瘍は、結腸、卵巣、およびメラノーマ等のいくつかの腫瘍においてより良い予後に関連する。直腸癌では、微小転移の兆候を伴わない腫瘍は、免疫細胞の浸潤の増加およびＴｈ１発現プロファイルを有し、それは、患者の生存の改善と相関する。また、Ｔ細胞による腫瘍の浸潤は、前臨床および臨床試験の両方における免疫療法アプローチの成功に関連している。一実施形態では、腫瘍部位へのリンパ球の浸潤は、概して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１等の炎症性サイトカインによる、腫瘍血管系の内皮細胞における接着分子の上方調節に依存する。細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管内皮細胞接着分子１（Ｖ−ＣＡＭ−１）、血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）、およびＥ−セレクチンを含む、いくつかの接着分子は、腫瘍へのリンパ球浸潤の過程に関連付けられている。しかしながら、これらの細胞接着分子は、腫瘍血管系において頻繁に下方調節されている。したがって、一実施形態では、本明細書において提供される癌ワクチンは、ＴＩＬを増加させるか、接着分子（一実施形態では、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、またはそれらの組み合わせ）を上方調節するか、炎症性サイトカイン（一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、またはそれらの組み合わせ）を上方調節するか、またはそれらの組み合わせである。
【０１５３】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法は、抗血管新生療法を提供し、一実施形態では、免疫療法戦略を改善し得る。一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法は、腫瘍血管における接着分子を上方調節し、白血球血管相互作用を強化することによって、体内の内皮細胞アネルギーを回避し、ＣＤ８＋Ｔ細胞等の、腫瘍に浸潤する白血球の数を増加させる。興味深いことに、強化された抗腫瘍保護は、活性化された腫瘍に浸潤するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加およびＶＥＧＦ遮断後の腫瘍における調節性Ｔ細胞の数の顕著な低下と相関する。
【０１５４】
一実施形態では、本明細書において記載される腫瘍を患っている宿主への腫瘍関連抗原と同時の抗血管新生抗原の送達は、腫瘍成長に影響を与える上で、相乗効果、およびより強力な治療効果を有する。
【０１５５】
別の実施形態では、ワクチン接種を通して周皮細胞を標的とすることは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）浸潤、周皮細胞の破壊、血管不安定化、および血管炎症につながり、別の実施形態では、リンパ球接着および移行にとって重要である内皮細胞における接着分子の上方調節に関連し、最終的に、腫瘍組織に浸潤するリンパ球の能力を改善する。別の実施形態では、腫瘍特異性抗原の同時送達は、腫瘍部位に侵入し、腫瘍細胞を死滅させることが可能なリンパ球を生成する。
【０１５６】
一実施形態では、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲ−β）信号伝達は、周皮細胞を新規に形成された血管に動員するために重要である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２およびＰＤＧＦＲ−βの同時阻害は、内皮細胞アポトーシスおよび腫瘍血管の退行を誘導し、一実施形態では、腫瘍血管の約４０％となる。
【０１５７】
別の実施形態では、該組み換えリステリア株は、栄養要求性リステリア株である。別の実施形態では、該栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ変異体である。別の実施形態では、核酸分子は、抗生物質選択の非存在下で組み換え細菌株において安定して維持される。
【０１５８】
一実施形態では、ワクチンベクターとして有用な栄養要求性変異体は、多数の方法で生成され得る。別の実施形態では、Ｄ−アラニン栄養要求性変異体は、一実施形態では、成長のための外から加えられたＤ−アラニンを必要とするリステリアの弱毒化した栄養要求性株を生成するためのｄａｌ遺伝子およびｄａｔ遺伝子の両方の妨害を介して生成することができる。
【０１５９】
一実施形態では、Ｄ−アラニンに欠乏しているリステリアのＡＡ株の生成は、例えば、当業者に知られている多数の方法で達成することができ、その方法には、欠失突然変異生成、挿入突然変異生成、およびフレームシフト突然変異の生成を引き起こす突然変異生成、タンパク質の未完熟終了を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異が含まれる。別の実施形態では、突然変異生成は、組み換えＤＮＡ技術を使用してか、または変異原性化学物質もしくは放射および変異体のその後の選択を使用する伝統的な突然変異生成技術を使用して達成することができる。別の実施形態では、欠失変異体は、栄養要求性表現型の復帰変異の付随する低い可能性のために好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異体は、簡易培養検定において、Ｄ−アラニンの非存在下で成長する能力に対して試験することができる。別の実施形態では、この化合物の非存在下で成長することができないそれらの変異体は、さらなる研究のための選択される。
【０１６０】
別の実施形態では、前述のＤ−アラニン関連遺伝子に加えて、本明細書において提供される、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子を、リステリアの突然変異生成のための標的として使用することができる。
【０１６１】
一実施形態では、該栄養要求性リステリア株は、該栄養要求性リステリア株の栄養要求性を補完する代謝酵素を含むエピソーム発現ベクターを含む。別の実施形態では、コンストラクトは、エピソームの型でリステリア株に含有される。別の実施形態では、外来抗原は、組み換えリステリア株に宿るベクターから発現される。別の実施形態では、該エピソーム発現ベクターは、抗生物質耐性マーカを欠く。一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の抗原は、ＰＥＳＴ配列を含むオリゴペプチドに遺伝子的に融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む該内因性ポリペプチドは、ＬＬＯである。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む該内因性ポリペプチドは、ＡｃｔＡである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１６２】
別の実施形態では、代謝酵素は、組み換え細菌株の染色体の残余に欠けている内因性代謝関連遺伝子を補完する。一実施形態では、内因性代謝関連遺伝子は、染色体において突然変異している。別の実施形態では、内因性代謝関連遺伝子は、染色体から欠失している。別の実施形態では、該代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、該代謝酵素は、該組み換えリステリア株における細胞壁合成のために使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態では、該代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態では、該代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１６３】
別の実施形態では、代謝酵素は、細胞壁合成において使用されるアミノ酸（ＡＡ）の形成を触媒する。別の実施形態では、代謝酵素は、細胞壁合成において使用されるＡＡの合成を触媒する。別の実施形態では、代謝酵素は、細胞壁合成において使用されるＡＡの合成に関与する。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１６４】
別の実施形態では、代謝酵素は、細胞壁の構成要素であるＤ−グルタミン酸の合成酵素である。
【０１６５】
別の実施形態では、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、ｄａｌ遺伝子は、反応Ｌ−アラニン⇔Ｄ−アラニンを触媒する、アラニンラセマーゼをコードする。
【０１６６】
本明細書において提供される方法および組成物の方法および組成物のｄａｌ遺伝子は、別の実施形態では、以下の配列によってコードされる。
【０１６７】
ａｔｇｇｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｃａｔｃｇｔｃｃａａｃａｔｇｇａｔｔｇａａａｔａｇａｃｃｇｃｇｃａｇｃａａｔｔｃｇｃｇａａａａｔａｔａａａａａａｔｇａａｃａａａａｔａａａｃｔｃｃｃｇｇａａａｇｔｇｔｃｇａｃｔｔａｔｇｇｇｃａｇｔａｇｔｃａａａｇｃｔａａｔｇｃａｔａｔｇｇｔｃａｃｇｇａａｔｔａｔｃｇａａｇｔｔｇｃｔａｇｇａｃｇｇｃｇａａａｇａａｇｃｔｇｇａｇｃａａａａｇｇｔｔｔｃｔｇｃｇｔａｇｃｃａｔｔｔｔａｇａｔｇａｇｇｃａｃｔｇｇｃｔｃｔｔａｇａｇａａｇｃｔｇｇａｔｔｔｃａａｇａｔｇａｃｔｔｔａｔｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔｇｇｔｇｃａａｃｃａｇａａａａｇａａｇａｔｇｃｔａａｔｃｔｇｇｃａｇｃｃａａａａａｃｃａｃａｔｔｔｃａｃｔｔａｃｔｇｔｔｔｔｔａｇａｇａａｇａｔｔｇｇｃｔａｇａｇａａｔｃｔａａｃｇｃｔａｇａａｇｃａａｃａｃｔｔｃｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａａｇｔａｇａｔａｇｃｇｇｔａｔｇｇｇｇｃｇｔｃｔｃｇｇｔａｔｔｃｇｔａｃｇａｃｔｇａａｇａａｇｃａｃｇｇｃｇａａｔｔｇａａｇｃａａｃｃａｇｔａｃｔａａｔｇａｔｃａｃｃａａｔｔａｃａａｃｔｇｇａａｇｇｔａｔｔｔａｃａｃｇｃａｔｔｔｔｇｃａａｃａｇｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｇａａａｃｔａｇｔｔａｔｔｔｔｇａａｃａａｃａａｔｔａｇｃｔａａｇｔｔｃｃａａａｃｇａｔｔｔｔａａｃｇａｇｔｔｔａａａａａａａｃｇａｃｃａａｃｔｔａｔｇｔｔｃａｔａｃａｇｃｃａａｔｔｃａｇｃｔｇｃｔｔｃａｔｔｇｔｔａｃａｇｃｃａｃａａａｔｃｇｇｇｔｔｔｇａｔｇｃｇａｔｔｃｇｃｔｔｔｇｇｔａｔｔｔｃｇａｔｇｔａｔｇｇａｔｔａａｃｔｃｃｃｔｃｃａｃａｇａａａｔｃａａａａｃｔａｇｃｔｔｇｃｃｇｔｔｔｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｇｃａｃｔｔｇｃａｃｔｃｔａｔａｃｃｇａｇａｔｇｇｔｔｃａｔｇｔｇａａａｇａａｃｔｔｇｃａｃｃａｇｇｃｇａｔａｇｃｇｔｔａｇｃｔａｃｇｇａｇｃａａｃｔｔａｔａｃａｇｃａａｃａｇａｇｃｇａｇａａｔｇｇｇｔｔｇｃｇａｃａｔｔａｃｃａａｔｔｇｇｃｔａｔｇｃｇｇａｔｇｇａｔｔｇａｔｔｃｇｔｃａｔｔａｃａｇｔｇｇｔｔｔｃｃａｔｇｔｔｔｔａｇｔａｇａｃｇｇｔｇａａｃｃａｇｃｔｃｃａａｔｃａｔｔｇｇｔｃｇａｇｔｔｔｇｔａｔｇｇａｔｃａａａｃｃａｔｃａｔａａａａｃｔａｃｃａｃｇｔｇａａｔｔｔｃａａａｃｔｇｇｔｔｃａａａａｇｔａａｃｇａｔａａｔｔｇｇｃａａａｇａｔｃａｔｇｇｔａａｃａｃｇｇｔａａｃａｇｃａｇａｔｇａｔｇｃｃｇｃｔｃａａｔａｔｔｔａｇａｔａｃａａｔｔａａｔｔａｔｇａｇｇｔａａｃｔｔｇｔｔｔｇｔｔａａａｔｇａｇｃｇｃａｔａｃｃｔａｇａａａａｔａｃａｔｃｃａｔｔａｇ（配列番号４２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０３８４３８）。別の実施形態では、ｄａｌをコードするヌクレオチドは、配列番号４２と相同である。別の実施形態では、ｄａｌをコードするヌクレオチドは、配列番号４２の変異形である。ｄａｌをコードするヌクレオチドは、配列番号４２の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のｄａｌ遺伝子によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１６８】
別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、以下の配列を有する。
【０１６９】
ＭＶＴＧＷＨＲＰＴＷＩＥＩＤＲＡＡＩＲＥＮＩＫＮＥＱＮＫＬＰＥＳＶＤＬＷＡＶＶＫＡＮＡＹＧＨＧＩＩＥＶＡＲＴＡＫＥＡＧＡＫＧＦＣＶＡＩＬＤＥＡＬＡＬＲＥＡＧＦＱＤＤＦＩＬＶＬＧＡＴＲＫＥＤＡＮＬＡＡＫＮＨＩＳＬＴＶＦＲＥＤＷＬＥＮＬＴＬＥＡＴＬＲＩＨＬＫＶＤＳＧＭＧＲＬＧＩＲＴＴＥＥＡＲＲＩＥＡＴＳＴＮＤＨＱＬＱＬＥＧＩＹＴＨＦＡＴＡＤＱＬＥＴＳＹＦＥＱＱＬＡＫＦＱＴＩＬＴＳＬＫＫＲＰＴＹＶＨＴＡＮＳＡＡＳＬＬＱＰＱＩＧＦＤＡＩＲＦＧＩＳＭＹＧＬＴＰＳＴＥＩＫＴＳＬＰＦＥＬＫＰＡＬＡＬＹＴＥＭＶＨＶＫＥＬＡＰＧＤＳＶＳＹＧＡＴＹＴＡＴＥＲＥＷＶＡＴＬＰＩＧＹＡＤＧＬＩＲＨＹＳＧＦＨＶＬＶＤＧＥＰＡＰＩＩＧＲＶＣＭＤＱＴＩＩＫＬＰＲＥＦＱＴＧＳＫＶＴＩＩＧＫＤＨＧＮＴＶＴＡＤＤＡＡＱＹＬＤＴＩＮＹＥＶＴＣＬＬＮＥＲＩＰＲＫＹＩＨ（配列番号４３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０３８４２８）。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３と相同である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３の変異形である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３の異性体である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３の相同体の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３の変異形の断片である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、配列番号４３の異性体の断片である。
【０１７０】
別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のリステリアｄａｌタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のグラム陽性のｄａｌタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のｄａｌタンパク質である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１７１】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のｄａｌタンパク質は、その酵素活性を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の９０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の８０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の７０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の６０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の５０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の４０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の３０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の２０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の１０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｌタンパク質は、野生型活性の５％を保持する。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１７２】
別の実施形態では、代謝酵素は、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）によってコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのアルファ−ケトグルタル酸＋Ｄ−ａｌａへの変換、および逆反応に関与するｄａｔ遺伝子によって、部分的に制御される。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明において利用されるｄａｔ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０３８４３９に記載される配列を有する。別の実施形態では、ｄａｔ遺伝子は、当技術分野で知られる任意の別のｄａｔ遺伝子である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１７４】
本明細書において提供される方法および組成物の方法および組成物のｄａｔ遺伝子は、別の実施形態では、以下の配列によってコードされる。
【０１７５】
ａｔｇａａａｇｔａｔｔａｇｔａａａｔａａｃｃａｔｔｔａｇｔｔｇａａａｇａｇａａｇａｔｇｃｃａｃａｇｔｔｇａｃａｔｔｇａａｇａｃｃｇｃｇｇａｔａｔｃａｇｔｔｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇｔａｔａｔｇａａｇｔａｇｔｔｃｇｔｃｔａｔａｔａａｔｇｇａａａａｔｔｃｔｔｔａｃｔｔａｔａａｔｇａａｃａｃａｔｔｇａｔｃｇｃｔｔａｔａｔｇｃｔａｇｔｇｃａｇｃａａａａａｔｔｇａｃｔｔａｇｔｔａｔｔｃｃｔｔａｔｔｃｃａａａｇａａｇａｇｃｔａｃｇｔｇａａｔｔａｃｔｔｇａａａａａｔｔａｇｔｔｇｃｃｇａａａａｔａａｔａｔｃａａｔａｃａｇｇｇａａｔｇｔｃｔａｔｔｔａｃａａｇｔｇａｃｔｃｇｔｇｇｔｇｔｔｃａａａａｃｃｃａｃｇｔａａｔｃａｔｇｔａａｔｃｃｃｔｇａｔｇａｔｔｔｃｃｃｔｃｔａｇａａｇｇｃｇｔｔｔｔａａｃａｇｃａｇｃａｇｃｔｃｇｔｇａａｇｔａｃｃｔａｇａａａｃｇａｇｃｇｔｃａａｔｔｃｇｔｔｇａａｇｇｔｇｇａａｃｇｇｃｇａｔｔａｃａｇａａｇａａｇａｔｇｔｇｃｇｃｔｇｇｔｔａｃｇｃｔｇｔｇａｔａｔｔａａｇａｇｃｔｔａａａｃｃｔｔｔｔａｇｇａａａｔａｔｔｃｔａｇｃａａａａａａｔａａａｇｃａｃａｔｃａａｃａａａａｔｇｃｔｔｔｇｇａａｇｃｔａｔｔｔｔａｃａｔｃｇｃｇｇｇｇａａｃａａｇｔａａｃａｇａａｔｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａａａｃｇｔｔｔｃｔａｔｔａｔｔａａａｇａｔｇｇｔｇｔａｔｔａｔｇｇａｃｇｃａｔｇｃｇｇｃａｇａｔａａｃｔｔａａｔｃｔｔａａａｔｇｇｔａｔｃａｃｔｃｇｔｃａａｇｔｔａｔｃａｔｔｇａｔｇｔｔｇｃｇａａａａａｇａａｔｇｇｃａｔｔｃｃｔｇｔｔａａａｇａａｇｃｇｇａｔｔｔｃａｃｔｔｔａａｃａｇａｃｃｔｔｃｇｔｇａａｇｃｇｇａｔｇａａｇｔｇｔｔｃａｔｔｔｃａａｇｔａｃａａｃｔａｔｔｇａａａｔｔａｃａｃｃｔａｔｔａｃｇｃａｔａｔｔｇａｃｇｇａｇｔｔｃａａｇｔａｇｃｔｇａｃｇｇａａａａｃｇｔｇｇａｃｃａａｔｔａｃａｇｃｇｃａａｃｔｔｃａｔｃａａｔａｔｔｔｔｇｔａｇａａｇａａａｔｃａｃｔｃｇｔｇｃａｔｇｔｇｇｃｇａａｔｔａｇａｇｔｔｔｇｃａａａａｔａａ（配列番号４４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０３８４３９）。別の実施形態では、ｄａｔをコードするヌクレオチドは、配列番号４４と相同である。別の実施形態では、ｄａｔをコードするヌクレオチドは、配列番号４４の変異形である。別の実施形態では、ｄａｔをコードするヌクレオチドは、配列番号４４の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のｄａｔ遺伝子によってコードされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１７６】
別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、以下の配列を有する。
【０１７７】
ＭＫＶＬＶＮＮＨＬＶＥＲＥＤＡＴＶＤＩＥＤＲＧＹＱＦＧＤＧＶＹＥＶＶＲＬＹＮＧＫＦＦＴＹＮＥＨＩＤＲＬＹＡＳＡＡＫＩＤＬＶＩＰＹＳＫＥＥＬＲＥＬＬＥＫＬＶＡＥＮＮＩＮＴＧＮＶＹＬＱＶＴＲＧＶＱＮＰＲＮＨＶＩＰＤＤＦＰＬＥＧＶＬＴＡＡＡＲＥＶＰＲＮＥＲＱＦＶＥＧＧＴＡＩＴＥＥＤＶＲＷＬＲＣＤＩＫＳＬＮＬＬＧＮＩＬＡＫＮＫＡＨＱＱＮＡＬＥＡＩＬＨＲＧＥＱＶＴＥＣＳＡＳＮＶＳＩＩＫＤＧＶＬＷＴＨＡＡＤＮＬＩＬＮＧＩＴＲＱＶＩＩＤＶＡＫＫＮＧＩＰＶＫＥＡＤＦＴＬＴＤＬＲＥＡＤＥＶＦＩＳＳＴＴＩＥＩＴＰＩＴＨＩＤＧＶＱＶＡＤＧＫＲＧＰＩＴＡＱＬＨＱＹＦＶＥＥＩＴＲＡＣＧＥＬＥＦＡＫ（配列番号４５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０３８４３９）。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５と相同である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５の変異形である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５の異性体である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５の相同体の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５の変異形の断片である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、配列番号４５の異性体の断片である。
【０１７８】
別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のリステリアｄａｔタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のグラム陽性のｄａｔタンパク質である。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のｄａｔタンパク質である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１７９】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の方法および組成物のｄａｔタンパク質は、その酵素活性を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の９０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の８０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の７０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の６０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の５０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の４０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の３０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の２０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の１０％を保持する。別の実施形態では、ｄａｔタンパク質は、野生型活性の５％を保持する。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１８０】
別の実施形態では、代謝酵素は、ｄｇａによってコードされる。Ｄ−グルタミン酸合成も、ｄｇａ遺伝子によって、部分的に制御され、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性変異体は、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で成長しない（Ｐｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３３６−３４２）。別の実施形態では、組み換えリステリアは、Ｄ−グルタミン酸に対して栄養要求性である。さらなる例は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子を含む。そのような合成遺伝子は、β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードし、不活性化されると、変異体を、この合成経路に対して栄養要求性とする（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２９９−３０２）。別の実施形態では、ｄｇａタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のリステリアｄｇａタンパク質である。別の実施形態では、ｄｇａタンパク質は、当技術分野で知られている任意の他のグラム陽性のｄｇａタンパク質である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１８１】
別の実施形態では、代謝酵素は、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アラニン合成に関与する、当技術分野で知られている任意の他の酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｌ−アラニン合成に関与する、当技術分野で知られている任意の他の酵素である。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｄ−アラニン合成に関与する、当技術分野で知られている任意の他の酵素である。別の実施形態では、組み換えリステリアは、Ｄ−アラニンに対して栄養要求性である。アラニン合成に対して栄養要求性である細菌は、当技術分野で知られており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４３２１−４３２５），Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｔａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：７９−９１）、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第６，０９９，８４８号））、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ，（Ｂｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６８：５６６３−７０）に記載される。別の実施形態では、当技術分野で知られている任意のＤ−アラニン合成遺伝子は、不活性化されている。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１８２】
別の実施形態では、代謝酵素は、アミノ酸アミノトランスフェラーゼである。
【０１８３】
別の実施形態では、代謝酵素は、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼであるｓｅｒＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、細胞壁成分ジアミノピメリン酸の合成に関与するａｓｄ（アスパラギン酸ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノアートからの５−アミノレブリン酸の形成を触媒する、ｇｓａＢ−グルタミン酸塩−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノアートからの５−アミノレブリン酸の形成を触媒する、ＨｅｍＬによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、Ｌ−アスパラギン酸および２−オキソグルタル酸からのオキサロ酢酸およびＬ−グルタミン酸の形成を触媒する、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼであるａｓｐＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アルギニン生合成に関与するａｒｇＦ−１によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アミノ酸生合成に関与するａｒｏＥによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、３−デヒドロキナ酸生合成に関与するａｒｏＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アミノ酸生合成に関与するａｒｏＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アミノ酸生合成に関与するａｒｏＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、ヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、ヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、ヒスチジン生合成に関与するｈｉｓＧによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、メチオニン生合成に関与するｍｅｔＸによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、プロリン生合成に関与するｐｒｏＢによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アルギニン生合成に関与するａｒｇＲによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、アルギニン生合に関与するａｒｇＪによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、チアミン生合成に関与するｔｈｉＩによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、トリプトファン生合成に関与するＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、トリプトファン生合成に関与するａｒｏＡによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、バリンおよびイソロイシン生合成に関与するｉｌｖＤによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、バリンおよびイソロイシン生合成に関与するｉｌｖＣによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、ロイシン生合成に関与するｌｅｕＡによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、リジン生合に関与するｄａｐＦによってコードされる。別の実施形態では、代謝酵素は、トレオニン生合成に関与するｔｈｒＢによってコードされる（全てのＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２９７３）。
【０１８４】
別の実施形態では、代謝酵素は、ｔＲＮＡシンテターゼである。別の実施形態では、代謝酵素は、ｔｒｐＳ遺伝子によってコードされ、トリプトファンｔＲＮＡシンテターゼをコードする。別の実施形態では、代謝酵素は、当技術分野で知られているの任意の他のｔＲＮＡシンテターゼである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１８５】
別の実施形態では、本明細書において提供される組み換えリステリア株は、動物宿主に継代されている。別の実施形態では、継代は、ワクチンベクターとしての株の有効性を最大にする。別の実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を安定させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の病原性を安定させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を増加させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の病原性を増加させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の不安定な亜株の率を低下させる。別の実施形態では、継代は、株を弱化させるか、または別の実施形態では、株の病原性を弱める。動物宿主を通して組み換えリステリア株を継代するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許出願第１０／５４１，６１４号に記載される。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１８６】
本明細書において提供される方法および組成物の組み換えリステリア株は、別の実施形態では、組み換えリステリアモノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は、組み換えリステリアシリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、組み換えリステリアグライ株である。別の実施形態では、リステリア株は、組み換えリステリアイバノビイ株である。別の実施形態では、リステリア株は、組み換えリステリアムレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は、組み換えリステリアウェルシュメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当技術分野で知られている任意の他のリステリア種の組み換え株である。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物で使用するためのリステリアタンパク質の配列は、上述される株のうちのいずれかからのものである。
【０１８７】
一実施形態では、本明細書において提供されるリステリアモノサイトゲネス株は、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株、ＮＩＣＰＢＰ５４００２株、Ｓ３株、ＮＣＴＣ５３４８株、ＮＩＣＰＢＰ５４００６株、Ｍ７株、Ｓ１９株、または当技術分野で知られている、リステリアモノサイトゲネスの別の株である。
【０１８８】
別の実施形態では、組み換えリステリア株は、ワクチン株であり、一実施形態では、細菌ワクチン株である。
【０１８９】
一実施形態では、ワクチンは、組成物であり、組成物への暴露の結果として、組成物における抗原またはポリペプチドに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、ワクチンは、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを付加的に含む。別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を付加的に含み、一実施形態では、それは自己であるが、別の実施形態では対象と同種である。
【０１９０】
一実施形態では、「ワクチン」は、組成物であり、組成物への暴露の結果として、組成物における抗原またはポリペプチドに対する宿主における免疫応答を誘発する。一実施形態では、免疫応答は、特異抗原に対するか、または抗原上の特異的エピトープに対する。一実施形態では、ワクチンは、ペプチドワクチンであり得、別の実施形態では、ＤＮＡワクチンであり得る。別の実施形態では、ワクチンは、細胞内に含有され、別の実施形態では、それによって送達され得、その細胞は、一実施形態では細菌細胞であり、一実施形態ではリステリアである。一実施形態では、ワクチンは、対象が疾病または病気にかかるか、または発症することを防止することができ、別の実施形態では、ワクチンは、疾病または病気を有する対象に対して治療的であり得る。一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明の組成物およびアジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組み換えリステリアを含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、本発明の組み換えワクチンベクターを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、本発明のプラスミドを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ワクチン組成物の一部として投与され得る。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明のワクチンは、アジュバントと共に送達される。一実施形態では、アジュバントは、大部分がＴｈ１媒介性である免疫応答を好む。別の実施形態では、アジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答を好む。別の実施形態では、アジュバントは、Ｔｈ１媒介性免疫応答を好む。別の実施形態では、アジュバントは、抗体媒介性応答より細胞媒介性免疫応答を好む。別の実施形態では、アジュバントは、任意の他の種類の当技術分野で知られているアジュバントである。別の実施形態では、免疫原性組成物は、標的タンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘導する。
【０１９３】
別の実施形態では、アジュバントは、ＭＰＬである。別の実施形態では、アジュバントは、ＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲアゴニストである。別の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストである。別の実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲ９アゴニストである。別の実施形態では、アジュバントは、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）である。別の実施形態では、アジュバントは、イミキモドである。別の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントは、サイトカインであるか、またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントは、ケモカインであるか、またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２であるか、またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−６であるか、またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントは、リポ多糖体である。別の実施形態では、アジュバントは、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌに記載される通りである。別の実施形態では、アジュバントは、当技術分野で知られている任意の他のアジュバントである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１９４】
一実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における抗原に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書において提供される。一実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における抗原に対する抗血管新生の免疫応答を誘導する方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、該組み換えリステリア株は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの該核酸分子は、異種抗原をコードする。さらに別の実施形態では、該第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０１９５】
一実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における少なくとも１つの癌を治療、抑制、または阻害する方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、該組み換えリステリア株は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの該核酸分子は、異種抗原をコードする。さらに別の実施形態では、該第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドをコードする核酸配列を伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。別の実施形態では、該抗原のうちの少なくとも１つは、該癌細胞のうちの少なくとも１つによって発現される。
【０１９６】
一実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における癌に対する発症を遅延させる方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における癌に対する進行を遅延させる方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における癌に対する寛解を延長させる方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における既存の腫瘍のサイズを減少させる方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における既存の腫瘍の成長を防止する方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における新規または付加的な腫瘍の成長を防止する方法が本明細書において提供される。
【０１９７】
一実施形態では、癌または腫瘍は、特定の癌または腫瘍にかかりやすいことが知られている特定の集団において防止されることができる。一実施形態では、そのような感受性は、一実施形態では、集団を肺癌にかからせる可能性がある、喫煙等の環境因子による場合があるが、別の実施形態では、そのような感受性は、遺伝因子による場合があり、例えば、ＢＲＣＡ１／２突然変異を伴う集団は、一実施形態では乳癌に、別の実施形態では卵巣癌にかかりやすい可能性がある。別の実施形態では、染色体８ｑ２４、染色体１７ｑ１２、および染色体１７ｑ２４．３上にある１つ以上の突然変異は、当技術分野で知られているように、前立腺癌への感受性を増加させる場合がある。癌の感受性の一因となる他の遺伝および環境因子は、当技術分野で知られている。
【０１９８】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書において提供される組み換えリステリア株を接種してヒト対象の免疫強化をするステップをさらに含む。別の実施形態では、追加接種において使用される組み換えリステリア株は、初期の「プライミング」接種において使用される株と同じである。別の実施形態では、追加免疫株は、プライミング株と異なる。別の実施形態では、同じ投与量がプライミングおよび追加接種において使用される。別の実施形態では、より多い投与量が追加免疫において使用される。別の実施形態では、より少ない投与量が追加免疫において使用される。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０１９９】
一実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードし、この方法は、前立腺癌を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＰＳＡをコードし、この方法は、卵巣癌を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＰＳＡをコードし、この方法は、前立腺癌の転移を治療、阻害、または抑制することであり、転移は、一実施形態では、骨への転移を含み、別の実施形態では、他の臓器への転移を含む。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＰＳＡをコードし、この方法は、前立腺癌の骨への転移を治療、阻害、または抑制するためのものである。さらに別の実施形態では、方法は、前立腺癌の他の内臓への転移を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＰＳＡをコードし、この方法は、乳癌を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＰＳＡをコードし、この方法は、卵巣および乳癌の両方を治療、阻害、または抑制するためのものである。
【０２００】
一実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をコードし、この方法は、メラノーマを治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、乳癌を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、卵巣癌を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、良性母斑病変を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、基底細胞癌を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、を治療、阻害、または抑制するためのものであり、神経堤起原の腫瘍は、一実施形態では、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、小児白血病を治療、阻害、または抑制するためのものであり、それは、一実施形態では、小児急性リンパ性白血病であり、別の実施形態では、小児急性骨髄白血病（一実施形態では、急性骨髄性白血病、急性骨髄系白血病、急性骨髄球性白血病、または急性非リンパ性白血病）であり、別の実施形態では、急性リンパ性白血病（一実施形態では、急性リンパ性白血病と称される）であり、別の実施形態では、急性骨髄性白血病（急性骨髄白血病、急性骨髄球性白血病、または急性非リンパ性白血病とも称される）であり、別の実施形態では、ハイブリッドまたは混合系統白血病である。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、慢性骨髄性白血病または若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）を治療、阻害、または抑制するためのものである。別の実施形態では、第１の核酸分子または第２の核酸分子は、ＨＭＷ−ＭＡＡをコードし、この方法は、小葉乳癌病巣を治療、阻害、または抑制するためのものである。
【０２０１】
本明細書において提供される方法および組成物の標的である癌は、別の実施形態では、メラノーマである。別の実施形態では、癌は、肉腫である。別の実施形態では、癌は、癌腫である。別の実施形態では、癌は、中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。別の実施形態では、癌は、神経膠腫である。別の実施形態では、癌は、胚細胞腫瘍である。別の実施形態では、癌は、絨毛癌である。
【０２０２】
別の実施形態では、癌は、膵臓癌である。別の実施形態では、癌は、卵巣癌である。別の実施形態では、癌は、胃癌である。別の実施形態では、癌は、膵臓の癌の病巣である。別の実施形態では、癌は、肺腺癌である。別の実施形態では、癌は、結腸直腸腺癌である。別の実施形態では、癌は、肺扁平腺癌である。別の実施形態では、癌は、胃腺癌である。別の実施形態では、癌は、卵巣表面上皮新生物（例えば、良性、増殖性、またはそれらの悪性種）である。別の実施形態では、癌は、口腔扁平上皮癌である。別の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態では、癌は、子宮内膜癌である。別の実施形態では、癌は、膀胱癌である。別の実施形態では、癌は、頭頸部癌癌である。別の実施形態では、癌は、前立腺癌である。
【０２０３】
別の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、癌は、結腸癌である。別の実施形態では、癌は、肺癌である。別の実施形態では、癌は、卵巣癌である。別の実施形態では、癌は、子宮癌である。別の実施形態では、癌は、甲状腺癌である。別の実施形態では、癌は、肝細胞癌である。別の実施形態では、癌は、甲状腺癌である。別の実施形態では、癌は、肝癌である。別の実施形態では、癌は、腎癌である。別の実施形態では、癌は、カポジである。別の実施形態では、癌は、肉腫である。別の実施形態では、癌は、別の癌または肉腫である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２０４】
一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法は、上述される癌のいずれに関連するか、またはそれから生じる固形腫瘍を治療するために使用することができる。別の実施形態では、腫瘍は、ウィルムス腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は、線維形成性小円形細胞腫瘍である。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原をコードする組み換えリステリアを含む組成物を対象に投与することを含む、対象における固形腫瘍の血管新生を妨げる方法を提供する。別の実施形態では、抗原は、ＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である。別の実施形態では、抗原は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。別の実施形態では、抗原は、血管新生に関与することが当技術分野で知られている任意の他の抗原である。別の実施形態では、本明細書において提供される、対象における固形腫瘍の血管新生を妨げる方法および組成物は、２つの異種抗原をコードする組み換えリステリアを含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、２つの異種抗原の１つは、ＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原は、血管新生に関与することが当技術分野で知られている任意の他の抗原である。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２０６】
前立腺癌ワクチンの有効性を評価するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｄｚｏｊｉｃ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＴＲＡＭＰ−Ｃ２  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００６  Ｊｕｎ  １；６６（８）：８３１−８），Ｎａｒｕｉｓｈｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＴＶＰ−１  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  Ｊｕｌ；１３（７）：６５８−６３），Ｓｅｈｇａｌ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．２００６  Ａｕｇ  ２３；６：２１）、およびＨｅｉｎｒｉｃｈ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｎ  Ｌｏｂｕｎｄ−Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００７；５６（５）：７２５−３０）に記載される。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【０２０７】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物を試験するために使用される前立腺癌モデルは、ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡを安定的に発現するＴＲＡＭＰ−Ｃ１由来）マウスモデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、１７８−２ＢＭＡ細胞モデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、ＰＡＩＩＩ腺癌細胞モデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、ＰＣ−３Ｍモデルである。別の実施形態では、前立腺癌モデルは、当技術分野で知られている任意の他の前立腺癌モデルである。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２０８】
別の実施形態では、ワクチンは、ヒト対象において試験され、有効性は、当技術分野で知られている方法、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接測定するか、または例えば、腫瘍転移の数もしくはサイズを判断するか、または病徴（咳、胸痛、体重減少等）を監視することによって疾病の進行を測定することを使用して監視される。ヒト対象における前立腺癌ワクチンの有効性を評価するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｕｅｎａｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｚｅｄ  ｐｕｌｌｕｌａｎ（ＣＨＰ）ａｎｄ  ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．２００７  Ａｐｒ  １９；７：９）およびＴｈｏｍａｓ−Ｋａｓｋｅｌ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＰＳＣＡ  ａｎｄ  ＰＳＡ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＤＴＨ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００６  Ｎｏｖ  １５；１１９（１０）：２４２８−３４）に記載される。各方法は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明は、対象における良性前立腺肥大（ＢＰＨ）を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象における前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を治療する方法を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、リステリアゲノムに機能可能に組み込まれる核酸分子を含む組み換えリステリア株が本明細書において提供される。別の実施形態では、該核酸分子は、（ａ）ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチド、および（ｂ）オープンリーディングフレームにおいて抗原を含むポリペプチドをコードする。
【０２１１】
一実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における少なくとも１つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、該組み換えリステリア株は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む。別の実施形態では、それぞれの該核酸分子は、異種抗原をコードする。別の実施形態では、該第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む天然ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれ、該抗原は、該腫瘍の少なくとも１つの細胞によって発現される。
【０２１２】
一実施形態では、「抗原」は、本明細書において、生物と接触させられる場合、生物から検出可能な免疫応答を引き起こす物質を指すために使用される。抗原は、脂質、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、またはそれらの組み合わせおよび変形であり得る。
【０２１３】
一実施形態では、「変異形」とは、集団の大部分と異なるが、それらの１つ、例えば、スプライス変異形として考慮されるように、一般的な様態と十分に同様である、アミノ酸または核酸配列（もしくは他の実施形態では、生物または組織）を指す。
【０２１４】
一実施形態では、「イソ型」とは、同じタンパク質の別のイソ型、または型と比較されるわずかな差異を伴う分子、例えば、タンパク質の型を指す。一実施形態では、イソ型は、異なるが関連する遺伝子から産生され得るか、または別の実施形態では、代替のプライシングによって同じ遺伝子から発生し得る。別の実施形態では、イソ型は、単一ヌクレオチド多型によって引き起こされる。
【０２１５】
一実施形態では、「断片」とは、完全長タンパク質またはポリペプチドより短いか、またはより少ないアミノ酸を含むタンパク質またはポリペプチドを指す。別の実施形態では、断片とは、完全長核酸より短いか、またはより少ないヌクレオチドを含む核酸を指す。別の実施形態では、断片は、Ｎ末端断片である。別の実施形態では、断片は、Ｃ末端断片である。一実施形態では、断片は、タンパク質、ペプチド、または核酸の配列内（ｉｎｔｒａｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）区分である。一実施形態では、断片は、機能的断片である。別の実施形態では、断片は、免疫原性断片である。一実施形態では、断片は、１０〜２０の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態では、断片は、５つ以上の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態では、断片は、１００〜２００の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態では、断片は、１００〜５００の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態では、断片は、５０〜２００の核酸またはアミノ酸を有し、別の実施形態では、断片は、１０〜２５０の核酸またはアミノ酸を有する。
【０２１６】
一実施形態では、「免疫原性」または「免疫原性の」は、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物が動物に投与される場合、動物における免疫応答を誘発する、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物の先天的能力を指すために本明細書において使用される。そのため、「免疫原性の強化」とは、一実施形態では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物が動物に投与される場合、動物における免疫応答を誘発する、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物の能力を増加させることを指す。タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物の免疫応答を誘発する能力の増加は、一実施形態では、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物に対するより多くの抗体、抗原または生物に対するより多様な抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物に特異的なより多くのＴ細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原、または生物に対するより多い細胞毒性またはヘルパーＴ細胞応答等によって測定することができる。
【０２１７】
一実施形態では、「相同体」とは、特定の核酸またはアミノ酸配列と配列同一性のある割合を共有する核酸またはアミノ酸配列を指す。一実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法において有用な配列は、特定のＬＬＯ配列の相同体またはそのＮ末端断片、ＡｃｔＡ配列またはそのＮ末端断片、または本明細書において記載されるか、もしくは当技術分野で知られているＰＥＳＴ様配列であり得る。一実施形態では、そのような相同体は、維持する。別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法において有用な配列は、抗原性ペプチドの相同体であり得、一実施形態では、ＫＬＫ３またはＨＭＷ−ＭＡＡもしくはその機能的断片である。一実施形態では、本発明のポリペプチドの相同体、および一実施形態では、そのような相同体をコードする核酸は、親ポリペプチドの機能的特徴を維持する。例えば、一実施形態では、本発明の抗原ポリペプチドの相同体は、親ポリペプチドの抗原性特徴を維持する。別の実施形態では、本明細書において提供される組成物および方法において有用な配列は、本明細書において記載される任意の配列の相同体であり得る。一実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７０％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７２％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも７５％の同一性を共有する。別の実施形態では相同体は、特定の配列と少なくとも７８％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８０％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８２％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８３％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８５％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８７％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも８８％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９０％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９２％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９３％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９６％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９７％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９８％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と少なくとも９９％の同一性を共有する。別の実施形態では、相同体は、特定の配列と１００％の同一性を共有する。各可能性は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【０２１８】
一実施形態では、本明細書において提供され、および／または本明細書において記載される任意の配列の相同体は、本発明の一部であると考えられることが理解される。
【０２１９】
一実施形態では、本発明の意味範囲内の「機能的」は、タンパク質、ペプチド、核酸、断片またはそれらの変異形の、生物活性または機能を提示する先天的能力を指すために本明細書において使用される。一実施形態では、そのような生物学的機能は、相互作用パートナー、例えば、膜関連受容体へのその結合特性であり、別の実施形態では、その三量化特性である。本発明の機能的断片および機能的変異形の場合、これらの生物学的機能は、実際は、例えば、それらの特異性または選択性に対して変化され得るが、基礎的な生物学的機能は保持される。
【０２２０】
一実施形態では、「治療」とは、治療療法および予防的または防止的対策の両方を指し、目的は、本明細書において記載される標的とされる病態または疾患を予防するか、または軽減することである。したがって、一実施形態では、治療は、疾病、疾患、もしくは病気、またはそれらの組み合わせに直接影響を与えるか治癒する、抑制する、阻害する、予防する、その重症度を低下させる、その発症を遅延させる、それに関連する症状を軽減することを含み得る。、一実施形態では、「治療」とは、とりわけ、進行の遅延、寛解の促進、寛解の誘導、寛解の増加、回復の促進、代替の治療法の有効性の増加もしくはそれに対する抵抗の低下、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「予防」または「妨げる」とは、とりわけ、症状の発症の遅延、疾病の再発の予防、再発エピソードの回数または頻度の低下、症候性エピソードの間の潜伏の増加、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「抑制」または「阻害」は、とりわけ、症状の重症度の低下、急性エピソードの重症度の低下、症状の回数の低下、疾病関連症状の発生率の低下、症状の潜伏の低下、症状の改善、二次的症状の低下、二次感染の低下、患者生存の延長、またはそれらの組み合わせを指す。
【０２２１】
一実施形態では、症状は一次的であるが、別の実施形態では、症状は二次的である。一実施形態では、「一次的」とは、特定の疾病または疾患の直接的結果である症状を指すが、一実施形態では、「二次的」とは、第一要因に由来するか、またはその結果生じる症状を指す。一実施形態では、本発明で使用するための化合物は、一次的もしくは二次的症状、または二次的合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は、疾病または病態の任意の兆候であり得る。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、「含む」という用語は、他の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列の包含、および当技術分野で知られ得る他のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列の包含を指し、それは、一実施形態では、抗原もしくはリステリアポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、「から本質的に成る」という用語は、特定の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列、またはそれらの断片を有する、本明細書において提供される方法で使用するための組成物を指す。しかしながら、組み換えポリペプチドの有用性に直接関与しない他のポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、「成る」という用語は、任意の形態か、または本明細書において記載される実施形態における、特定の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列、または断片、または本明細書において提供される組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、または核酸配列もしくは断片の組み合わせを有する、本明細書において提供される方法で使用するための組成物を指す。
【０２２３】
一実施形態では、本明細書において提供される方法で使用するための組成物は、静脈内投与される。別の実施形態では、ワクチンは、経口で投与されるが、別の実施形態では、ワクチンは、非経口（例えば、皮下、筋肉内等）で投与される。
【０２２４】
さらに、別の実施形態では、組成物またはワクチンは、座薬、例えば、肛門座薬または尿道座薬として投与される。さらに、別の実施形態では、医薬組成物は、ペレットの皮下移植によって投与される。さらなる実施形態では、ペレットは、長期にわたる薬剤の制御放出を提供する。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、カプセルの形態で投与される。
【０２２５】
一実施形態では、投与経路は、非経口であってもよい。別の実施形態では、経路は、眼球内、結膜、局所、経皮、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、膣内、直腸内、腫瘍内、経癌、経粘膜、筋肉内、血管内、心室内、頭蓋内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、鼻腔内（点滴剤）、舌下、経口、エアロゾル、もしくは座薬、またはそれらの組み合わせであってもよい。鼻腔内投与または吸入による適用のためには、混合され、適切な担体の存在下でエアロゾル化されるか、または霧状にされる化合物の溶液または懸濁液が好適である。そのようなエアロゾルは、本明細書において記載される任意の薬剤を含むことができる。一実施形態では、本明細書に記載される組成物は、一実施形態では、くも膜下および脳室内投与である、頭蓋内投与のために好適な形態であってもよい。一実施形態では、投与計画は、治療される房木の正確な性質、病気の重症度、患者の年齢および全身的な身体状態、体重、個々の患者の応答等に基づいて熟練した臨床医によって決定される。
【０２２６】
一実施形態では、非経口適用で、特に好適なものは、注入可能な滅菌溶液、好ましくは、油性または水性溶液、および懸濁液、乳液、または座薬およびかん腸を含むインプラントである。アンプルは、便利な投与単位である。そのような座薬は、本明細書において記載される任意の薬剤を含むことができる。
【０２２７】
一実施形態では、持続または指定放出型組成物を調剤することができ、例えば、リポソーム、または活性化合物が、例えば、マイクロカプセル化による差動分解性コーティング、複数のコーティング等で保護されるものがある。そのような組成物は、即時放出または徐放のために調剤することができる。新規化合物を凍結乾燥させ、例えば、注入のための生成物の調製のために得られる結乾燥品を使用することも可能である。
【０２２８】
一実施形態では、液剤のために、薬学的に許容される担体は、水または非水溶液、懸濁液、乳液、または油であってもよい。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳液、または懸濁液が挙げられる。油の例としては、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、オリーブ油、ひまわり油、および魚肝油がある。
【０２２９】
一実施形態では、本発明の組成物は、薬学的に許容される。一実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、安全であり、本発明で使用するための少なくとも１つ化合物の有効量の所望の投与経路のための適切な送達を提供する任意の製剤を指す。この用語は、ｐＨが、化合物の安定性および投与経路に従って、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲にある特定の所望の値で維持される、緩衝製剤の使用も指す。
【０２３０】
一実施形態では、本発明の組成物またはその方法において使用される組成物は、単独または組成物内で投与されてもよい。別の実施形態では、従来の賦形剤、すなわち、活性化合物と有害に反応しない非経口、腸内（例えば、経口）、または局所適用に好適な薬学的に許容される有機または無機担体物質との本発明の組成物混合剤を使用することができる。一実施形態では、好適な薬学的に許容される担体としては、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、またはでんぷん等の炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、白パラフィン、グリセロール、アルギン酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、医薬品は、滅菌することができ、所望であれば、活性化合物と有害に反応しない助剤、例えば、滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味料および／または芳香剤等と混合することができる。別の実施形態では、それらは、所望であれば、他の活性薬剤、例えば、ビタミンと組み合わせることもできる。
【０２３１】
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の使用のための組成物は、担体／希釈剤と共に投与されてもよい。固体担体／希釈剤としては、ゴム、でんぷん（例えば、トウモロコシでんぷん、アルファ化でんぷん）、糖類（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリル酸（例えば、ポリアクリル酸メチル）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物の組成物は、本発明の組成物および癌を予防するか、または治療する際に効果的な１つ以上の付加的化合物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、付加的化合物は、化学療法に有用な化合物を含むことがで、一実施形態では、それはシスプラチンである。別の実施形態では、イホスファミド、フルオロウラシルまたは５−ＦＵ、イリノテカン、パクリタキセル（タクソール）、ドセタキセル、ゲムシタビン、トポテカン、またはそれらの組み合わせ、本明細書において提供される方法で使用するための本明細書において提供される組成物と共に投与することができる。別の実施形態では、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルマスティン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グリアデルインプラントｓ、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフールウラシル、テモゾロマイド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビン、またはそれらの組み合わせを、本明細書において提供される方法で使用するための本明細書において提供される組成物と共に投与することができる。
【０２３３】
別の実施形態では、本明細書において提供される融合タンパク質は、適切な配列のサブクローニング、その後の得られたヌクレオチドの発現を含む過程によって調製される。別の実施形態では、部分列は、クローンされ、適切な部分列は、適切な制限酵素を使用して開裂される。その後、断片は、別の実施形態では、所望のＤＮＡ配列を産生するために結紮される。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して産生される。まず、新規の末端の両側上の天然ＤＮＡの切片は、別々に増幅される。１つの増幅配列の５´末端は、ペプチドリンカーをコードするが、他の増幅配列の３´末端も、ペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５´末端は、第２の断片の３´末端に相補的であるため、２つの断片（例えば、ＬＭＰアガロース上の部分的精製後）を第３のＰＣＲ反応における重複鋳型として使用することができる。増幅配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上の切片（ここでアミノ配列を形成する）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここでカルボキシ配列を形成する）を含有する。その後、挿入物は、プラスミドに結紮される。別の実施形態では、同様の戦略を使用して、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片が異種ペプチド内に包含されるタンパク質を産生する。
【０２３４】
一実施形態では、本発明は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリアも提供し、該核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２３５】
一実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含む第１のポリペプチドまたはその断片を伴うオープンリーディングフレームとしてゲノムに機能可能に組み込まれる第１の抗原、およびＰＥＳＴ配列を含む第２のポリペプチドまたはその断片を伴うオープンリーディングフレームとしてゲノムに機能可能に組み込まれる第２の抗原を含む２つの区別できる異種抗原を発現し、分泌することが可能な組み換えリステリアが本明細書において提供される。別の実施形態では、該第１のポリペプチドもしくは該第２のポリペプチドまたはそれらの断片は、ＡｃｔＡ、またはＬＬＯである。別の実施形態では、該第１の抗原または該第２の抗原は、前立腺腫瘍関連抗原（ＰＳＡ）、または高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）である。別の実施形態では、該断片は、免疫原性断片である。さらに別の実施形態では、該エピソーム発現ベクターは、抗生物質耐性マーカを欠く。
【０２３６】
別の実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、区別できる。別の実施形態では、該第１の抗原および該第２の抗原は、同時に発現される。別の実施形態では、該第１の抗原または該第２の抗原は、同レベルで発現される。別の実施形態では、該第１の抗原または該第２の抗原は、異なって発現される。別の実施形態では、遺伝子またはタンパク質は、別の実施形態では、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、免疫ブロット法等を含む、当技術分野で知られている方法によって決定される。別の実施形態では、該第１の抗原または該第２の抗原の発現は、誘導系によって制御されるが、別の実施形態では、該第１の抗原または該第２の抗原の発現は、構成プロモータによって制御される。別の実施形態では、誘導性発現系は、当技術分野で知られている。
【０２３７】
一実施形態では、腫瘍細胞および血管新生を同時に標的とする２つの区別できる異種抗原を発現し、分泌することが可能な組み換えリステリアを調製する方法が本明細書において提供される。別の実施形態では、該組み換えリステリアを調製する該方法は、ＰＥＳＴ配列を含む第１のポリペプチドまたはその断片をコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結されるゲノムに第１の抗原を遺伝子的に融合するステップ、およびＰＥＳＴ配列を含む第２のポリペプチドまたはその断片をコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結される第２の抗原をコードするエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換するステップを含む。別の実施形態では、該組み換えリステリアを調製する方法は、ＰＥＳＴ配列を含む第１のポリペプチドまたはその断片をコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結されるゲノムに第１の抗原を遺伝子的に融合するステップ、およびＰＥＳＴ配列を含む第２のポリペプチドまたはその断片をコードするオープンリーディングフレームに機能的に連結される第２の抗原を遺伝子的に融合するステップを含む。
【０２３８】
細菌を形質転換するための方法は、当技術分野で知られており、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、エレクトロポレーション法、バクテリオファージ媒介媒介性形質導入、化学的かつ物理的形質転換技術が挙げられる（ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９：１９０−１９９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。別の実施形態では、本明細書において提供されるリステリアワクチン株は、エレクトロポレーションによって形質転換される。各方法は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２３９】
一実施形態では、組み換えリステリア株を対象に投与することを含む、該対象における抗原に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書において提供され、該組み換えリステリア株は、第１の核酸分子および第２の核酸分子を含み、それぞれの該核酸分子は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードし、該第１の核酸分子は、ＰＥＳＴ配列を含む内因性ポリペプチドをコードする核酸を伴うオープンリーディングフレームとしてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２４０】
別の実施形態では、癌の発症を阻害する方法が本明細書において提供され、該方法は、該癌において特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。
【０２４１】
一実施形態では、対象における第１および第２の腫瘍を治療する方法が本明細書において提供され、該方法は、第１および第２の腫瘍上に特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。
【０２４２】
別の実施形態では、対象における癌に関連する症状を改善する方法が本明細書において提供され、該方法は、該癌において特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。
【０２４３】
一実施形態では、癌から対象を保護する方法が本明細書において提供され、該方法は、該癌において特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。
【０２４４】
別の実施形態では、癌の発症を遅延させる方法が本明細書において提供され、該方法は、該癌において特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、転移癌を治療する方法が本明細書において提供され、該方法は、該癌において特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、転移癌または微小転移を予防する方法が本明細書において提供され、該方法は、該癌において特異的に発現される２つの区別できる異種抗原を発現する組み換えリステリア組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、組み換えリステリア組成物は、経口または非経口で投与される。
【０２４５】
一実施形態では、本発明は、２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の抗原をコードする第１の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、（ｂ）第２の抗原をコードする第２の核酸を含むエピソーム発現ベクターで、該組み換えリステリアを形質転換すること、および（ｃ）該組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で該第１の抗原および該第２の抗原を発現すること、を含む。別の実施形態では、本発明は、２つの抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の抗原をコードする第１の核酸および第２の抗原をコードする第２の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、および（ｂ）該組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で該第１の抗原および該第２の抗原を発現すること、を含む。一実施形態では、遺伝子融合は、本明細書において記載されるように、相同的組み換えを介する。一実施形態では、抗原発現を促す条件は、当技術分野で知られている。
【０２４６】
本明細書において提供される方法および組成物の別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」とは、少なくとも２つの塩基−糖類−リン酸の組み合わせの列を指す。この用語は、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」とは、一実施形態では、核酸ポリマーのモノマー単位を指す。ＲＮＡは、一実施形態では、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態であり得る。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記載されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６およびその中に挙げられる参考文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体の形態であり得る。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、一本、二本、三本、または四本鎖であり得る。この用語は、別の実施形態では、他の種類の骨格であるが同じ塩基を含有する場合がある人工核酸も含む。一実施形態では、人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態では、ヌクレオチドは、オキセタン修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは、１つ以上のリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合で置換することによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は、当技術分野で知られている天然の核酸のリン酸骨格の任意の他の変異形を含有する。ホスホチオレート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に知られており、例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７、およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載される。核酸の産出および使用は、当業者に知られており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載される。各核酸誘導体は、本明細書において提供される個別の実施形態を表す。
【０２４７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「組み換えペプチド」という用語は、別の実施形態では、任意の長さのペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドまたは組み換えペプチドは、ＨＭＷ−ＭＡＡ断片に関して上記に列挙される長さのうちの１つを有する。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。一実施形態では、「ペプチド」という用語は、天然ペプチド（分解生成物、合成的に合成されたペプチド、または組み換えペプチドのいずれか）および／または例えば、ペプチドを体内にある間により安定させるか、細胞に侵入することをより可能にする修飾を有する場合がある、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイド等のペプチド模倣薬（典型的に、合成的に合成されたペプチド）を指す。そのような修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない、ペプチド結合修飾、骨格修飾、および残基修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、本明細書に完全に記載されるかのように参照することによって組み込まれる、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）において特定される。この点におけるさらなる詳細は、以下に提供される。
【０２４８】
一実施形態では、「抗原ポリペプチド」は、宿主にとって異物であり、宿主に存在するか、または別の実施形態では、それによって検出される際、免疫応答の上昇につながる、上述されるポリペプチド、ペプチド、または組み換えペプチドを指すために本明細書において使用される。
【０２４９】
ペプチド内でのペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、＊−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）によって置換されてもよく、Ｒは、任意のアルキル、例えば、炭素原子上に自然に提示される、メチル、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）であり、Ｒは、「通常の」側鎖である。
【０２５０】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った任意の結合で、および同時にいくつか（２−３）においてでも生じることができる。天然芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルアラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環上メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒ等の合成非天然酸に対して置換されてもよい。
【０２５１】
上記に加えて、本明細書において提供されるペプチドは、１つ以上の修飾アミノ酸または１つ以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合炭水化物等）も含んでもよい。
【０２５２】
一実施形態では、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と代替可能であり、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない、分子を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の知られている類似体を含む配列も指す。
【０２５３】
「安定的に維持される」とは、別の実施形態では、検出可能な損失を伴わずに、１０世代、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下での核酸分子またはプラスミドの維持を指す。別の実施形態では、期間は、１５世代である。別の実施形態では、期間は、２０世代である。別の実施形態では、期間は、２５世代である。別の実施形態では、期間は、３０世代である。別の実施形態では、期間は、４０世代である。別の実施形態では、期間は、５０世代である。別の実施形態では、期間は、６０世代である。別の実施形態では、期間は、８０世代である。別の実施形態では、期間は、１００世代である。別の実施形態では、期間は、１５０世代である。別の実施形態では、期間は、２００世代である。別の実施形態では、期間は、３００世代である。別の実施形態では、期間は、５００世代である。別の実施形態では、期間は、５００世代より多い。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、体外（例えば、培養内）で安定的に維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、体内で安定的に維持される。別の実施形態では、核酸分子またはプラスミドは、体外および体外の両方で安定的に維持される。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２５４】
一実施形態では、「アミノ酸」または「アミノ酸」という用語は、２０の自然発生のアミノ酸を含むことが理解され、それらのアミノ酸は、しばしば体内で翻訳後に修飾され、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホトレオニン、ならびに２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよび／またはニチンを含むが、これらに限定されない他の異常アミノ酸を含む。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の両方を含み得る。
【０２５５】
「核酸」または「核酸配列」という用語は、一本または二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを指す。この用語は、参照核酸として、所望の目的のために、同様または改善された結合特性を有する天然ヌクレオチドの知られている類似体を含有する核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを包含する。用語は、自然発生のヌクレオチドと同様の方法か、または所望の目的のためにそれより改善される割合で代謝する核酸も含む。この用語は、合成骨格を伴う核酸様構造も包含する。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格類似体としては、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホン酸、ホスホロアミダート、アルキルホスホトリエステル、スルファミン酸、３´−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３´−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられ、例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６００，Ｅｄｓ．Ｂａｓｅｒｇａ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ＮＹＡＳ  １９９２）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位等の非イオン性骨格を含有する。ホスホロチオエート結合は、例えば、国際公開第ＷＯ９７／０３２１１号、同第ＷＯ９６／３９１５４号、Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載される。この用語によって包含される他の合成骨格は、メチル−ホスホン酸結合または交互のメチルホスホン酸およびホスホジエステル結合（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８６９２−８６９８）、ならびにベンジルホスホン酸結合（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．６：１５３−１５６）を含む。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、および増幅生成物と代替可能に使用される。
【０２５６】
本明細書において提供される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的組み換え部位」という用語は、組み換え部位の側面にある核酸切片の交換または切除を媒介するリコンビナーゼ（場合によっては、関連タンパク質と共に）によって認識される核酸分子における塩基の配列を指す。リコンビナーゼおよび関連タンパク質は、「組み換えタンパク質」と総称され、例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：６９９−７０７；１９９３）を参照されたい。
【０２５７】
「ファージ発現ベクター」または「ファージミド」とは、原核、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類細胞を含む任意の細胞における、構造的または誘導的に、体外または体内で、本明細書において提供される方法および組成物の核酸配列を発現する目的のための任意のファージベースの組み換え発現系を指す。ファージ発現ベクターは、典型的に、細菌細胞において再生すること、および適切な条件下でファージ粒子を産生することの両方ができる。この用語は、線状または環状発現系を含み、エピソームのままでいるか、または宿主細胞ゲノムに組み込む、両方のファージベースの発現ベクターを包含する。
【０２５８】
一実施形態では、本明細書において使用される「機能的に連結される」という用語は、転写および翻訳調節核酸が、転写が始動される方法で、任意のコード配列に対して位置付けられることを意味する。概して、これは、プロモータおよび転写始動または開始配列は、コード領域まで５´の場所に位置付けられることを意味する。
【０２５９】
一実施形態では、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質をコードすることができる可能性のある塩基の配列を含有する生物のゲノムの一部である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始および終止端部は、ｍＲＮＡの端部と同等ではないが、それらは、通常、ｍＲＮＡ内に含有される。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（始動コドン）と終止コドン配列（終端コドン）との間に位置する。、一実施形態では、内因性ポリペプチドを伴うオープンリーディングフレームとしてゲノムに機能可能に組み込まれる核酸分子は、内因性ポリペプチドを伴う同じオープンリーディングフレームにおいてゲノムに組み込まれた核酸分子である。
【０２６０】
一実施形態では、本発明は、リンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。一実施形態では、「リンカー配列」は、２つの異種ポリペプチドまたはその断片もしくはドメインを接合するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書において使用される場合、リンカーは、融合ポリペプチドを形成するように、ポリペプチドに共有結合するアミノ酸配列である。リンカーは、典型的に、オープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列および表示タンパク質を含む融合タンパク質を作製するための表示ベクターからのレポーター遺伝子の除去後に残りの組み換え信号から翻訳されるアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、リンカーは、グリシンおよび他の小さい中性アミノ酸等の付加的なアミノ酸を含むことができる。
【０２６１】
一実施形態では、本明細書において使用される「内因性」は、参照生物内で発生もしくは由来したか、または参照生物内の原因から生じた事項を説明する。別の実施形態では、内因性は、天然を指す。
【０２６２】
一実施形態では、本明細書において使用される「異種の」は、参照種と異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を説明する。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は、一実施形態では、リステリア株に対して天然または内因性ではないポリペプチド、または別の実施形態では、リステリア株によって通常発現されないポリペプチド、または別の実施形態では、リステリア株以外の源からのポリペプチドを発現する。別の実施形態では、異種は、同種内の異なる生物に由来するものを説明するために使用されてもよい。別の実施形態では、異種抗原は、リステリアの組み換え株によって発現され、組み換え株によって、哺乳類細胞の感染後、処理され、細胞毒性Ｔ細胞に提示される。別の実施形態では、リステリア種によって発現される異種抗原は、それが、哺乳類において自然に発現される未修飾抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答を引き起こす限り、腫瘍細胞または感染性病原体における対応する未修飾抗原またはタンパク質に正確に一致する必要はない。
【０２６３】
一実施形態では、本明細書において記載される「エピソーム発現ベクター」とは、線状または環状であってもよく、通常二重鎖の形態である核酸ベクターを指す。一実施形態では、エピソーム発現ベクターは、対象の遺伝子を含む。別の実施形態では、対象の挿入された遺伝子は、中断されないか、またはしばしば細胞ＤＮＡへの組み込みから生じる調節拘束に供されない。別の実施形態では、挿入された異種遺伝子の存在は、細胞自体の重要な領域の再配列または中断につながらない。別の実施形態では、エピソームベクターは、細菌細胞質における複数の複製物に存続し、対象の遺伝子の増幅を引き起こし、別の実施形態では、ウイルス性トランス作用因子が、必要である場合に供給される。別の実施形態では、安定したトランスフェクション手順では、エピソームベクターの使用は、しばしば、染色体を組み込むプラスミドの使用より高いトランスフェクション効率を引き起こす（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４８６１−４８６６、Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のエピソーム発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される任意の多様な方法によって、体内、生体外、または体外で細胞に送達されてもよい。ベクターは、単独、または対象の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態で送達されてもよい。
【０２６４】
一実施形態では、「融合された」とは、共有結合による結合を指す。
【０２６５】
「形質転換」とは、一実施形態では、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り込むように細菌細胞を操作することを指す。別の実施形態では、「形質転換する」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するように細菌細胞を操作することを指す。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２６６】
別の実施形態では、接合は、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入するために使用される。接合のための方法は、当技術分野で知られており、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ（Ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６  Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００５  Ａｕｇ  ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記載される。各方法は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２６７】
「代謝酵素」とは、別の実施形態では、宿主細菌によって必要とされる栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌によって必要とされる栄養素の合成に必要とされる酵素を指す。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、この用語は、宿主細菌の持続的成長のために必要とされる栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態では、酵素は、栄養素の合成のために必要とされる。各可能性は、本明細書において提供される方法および組成物の個別の実施形態を表す。
【０２６８】
一実施形態では、本明細書において使用される「弱化」という用語は、細菌の動物における疾病を引き起こす能力の減少を意味する。すなわち、弱毒化リステリア株の病因的特徴は、野生型リステリアと比較して低下しているが、弱毒化リステリアは、培養における成長および維持が可能である。例として、弱毒化リステリアによるＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内接種を使用して、接種された動物の５０％が生存する（ＬＤ５０）致死量は、好ましくは、少なくとも約１０倍、より好ましくは、少なくとも約１００倍、より好ましくは、少なくとも約１，０００倍、さらにより好ましくは、少なくとも約１０，０００倍、最も好ましくは、少なくとも約１００，０００倍で、野生型リステリアのＬＤ５０を超えて増加する。したがって、リステリアの弱毒化株は、それが投与される動物を死亡させないものであるか、または投与される細菌の数が、同じ動物を死亡させるために必要とされる野生型非弱毒化細菌の数より大幅に多い場合にのみ動物を死亡させるものである。弱毒化細菌は、その成長のために必要とされる栄養素がその中に存在しないため、一般環境における複製が可能であるものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は、必要とされる栄養素が提供される制御環境における複製に限定される。したがって、本発明の弱毒化株は、それらが、無制御複製が可能であるという点において、環境的に安全である。
【０２６９】
本明細書において使用される「約」という用語は、量に関する用語において、プラスマイナス５％、または別の実施形態では、プラスマイナス１０％、または別の実施形態では、プラスマイナス１５％、または別の実施形態では、プラスマイナス２０％を意味する。
【０２７０】
「対象」という用語は、一実施形態では、病気またはその続発症のための療法を必要とするか、またはそれらにかかりやすい、ヒトを含む、哺乳類を指す。対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス、ならびにヒトを含み得る。一実施形態では、「対象」という用語は、全ての点で健康であり、疾病もしくは疾患の兆候を有さないか、または示さない個人を除外しない。
【０２７１】
一実施形態では、本明細書において提供されるリステリアは、本明細書において記載されるように、異種ポリペプチドを発現し、別の実施形態では、本明細書において提供されるリステリアは、本明細書において記載されるように、異種ポリペプチドを分泌し、別の実施形態では、本明細書において提供されるリステリアは、本明細書において記載されるように、異種ポリペプチドを発現し、分泌する。別の実施形態では、本明細書において提供されるリステリアは、異種ポリペプチドを含み、別の実施形態では、異種ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２７２】
一実施形態では、本明細書において提供されるリステリア株を、ワクチンの調製において使用することができる。一実施形態では、本明細書において提供されるリステリア株は、ペプチドワクチンの調製において使用することができる。ペプチドワクチンを調製するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、ＥＰ１４０８０４８，米国特許第２００７０１５４９５３号、およびＯＧＡＳＡＷＡＲＡ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．８９９５−８９９９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９２）に記載される。一実施形態では、ペプチド進化技術を使用して、より高い免疫原性を伴う抗原を作製する。ペプチド進化のための技術は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第６７７３９００号に記載される。
【０２７３】
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物のワクチンは、宿主脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトに、単独、または薬学的に許容される担体と組み合わせてのいずれかで投与することができる。別の実施形態では、ワクチンは、リステリア株自体か、またはリステリア種が発現するように修飾された異種抗原への免疫応答を誘導するために有効な量で投与される。別の実施形態では、投与されるワクチンの量は、本開示を保有している場合、当業者によって日常的に決定され得る。別の実施形態では、薬学的に許容される担体としては、滅菌蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝液、または重炭酸塩緩衝液を挙げ得るが、これらに限定されない。別の実施形態では、選択される薬学的に許容される担体および使用される担体の量は、投与方法、リステリアの株、およびワクチンの年齢および病状を含むいくつかの要因に依存する。別の実施形態では、ワクチンの投与は、経口経路によるか、またはそれは、非経口、鼻腔内、筋肉内、血管内、直腸内、腹腔内、または投与の多様な知られている経路の任意の１つであり得る。別の実施形態では、投与経路は、感染性病原体または治療される腫瘍の種類に従って選択することができる。
【０２７４】
一実施形態では、本発明は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株を提供し、該核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２７５】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株を投与することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、該核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２７６】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株を投与することを含む、対象における癌を治療、抑制、または阻害する方法を提供し、該核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２７７】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株を投与することを含む、対象における少なくとも１つの腫瘍を治療、抑制、または阻害する方法を提供し、該核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２７８】
別の実施形態では、本発明は、抗原を発現する組み換えリステリア株を産生する方法を提供し、方法は、抗原をコードする第１の核酸を、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに遺伝子的に融合すること、および該組み換えリステリア株における抗原発現を促す条件下で該抗原を発現することを含む。
【０２７９】
別の実施形態では、本発明は、異種抗原ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株を使用して上記に記載される任意の方法を提供し、該核酸分子は、内因性ＰＥＳＴ含有遺伝子を伴うオープンリーディングフレームにおいてリステリアゲノムに機能可能に組み込まれる。
【０２８０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書において提供される１つ以上のリステリア株、アプリケータ、および本明細書において提供される方法を履行する際のキットの構成要素の使用法を説明する説明資料を含む、本明細書において提供される方法を便利に履行するためのキットを提供する。
【０２８１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に示すために提示される。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２８２】
我々は、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍の退行に関連する強力なＰＳＡ特異的免疫応答を誘発する、ｔＬＬＯに融合されるＰＳＡを分泌する組み換えＬｍ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）を開発し、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現は、ベクターに対する抗生物質耐性を与える、ｐＧＧ５５（表１）に基づくプラスミドに由来する。我々は、近年、抗生物質耐性マーカを有さない、ｐＡＤＶ１４２プラスミドに基づくＰＳＡワクチンのための新規の株を開発し、ＬｍｄｄＡ−１４２（表１）と称した。この新規の株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡより、１０倍弱毒化されている。さらに、ＬｍｄｄＡ−１４２は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりわずかに免疫原性であり、腫瘍を発現するＰＳＡを退行させる際に有意により有効であった。
【０２８３】
表１．プラスミドおよび株
【０２８４】
【表１】
2015213500.tif 000003
【０２８５】
プラスミドｐＡＤＶ１４２（６５２３ｂｐ）の配列は、以下の通りである。
【０２８６】
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【０２８７】
実施例１：弱毒化リステリア株−ＬｍｄｄΔＡｃｔＡの構造物、ならびにＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ株におけるｋｌｋ遺伝子へのフレームにおけるヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入
【０２８８】
株Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）を、病原性因子、ＡｃｔＡの不可逆的欠失によって弱毒化した。Ｌｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）背景におけるＡｃｔＡのインフレーム欠失は、下流遺伝子の発現に対する任意の極性効果を回避するために構築した。Ｌｍ  ｄａｌ  ｄａｔ  ΔＡｃｔＡは、ＡｃｔＡのＮ末端にある最初の１９のアミノ酸およびＣ末端にある２８のアミノ酸残基を含有し、５９１のアミノ酸が欠失する。
【０２８９】
ＡｃｔＡ欠失変異体は、ＡｃｔＡの上流（６５７ｂｐ−オリゴのＡｄｖ２７１／２７２）および下流（６２５ｂｐ−オリゴのＡｄｖ２７３／２７４）部分に対応する染色体領域を増殖し、ＰＣＲによって結合することによって産生した。この増幅のために使用されたプライマーの配列を表２に示す。ＡｃｔＡの上流および下流ＤＮＡ領域は、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位にあるｐＮＥＢ１９３において、このプラスミドからクローンし、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩは、温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７においてさらにクローンし、ΔＡｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡＤＶ１２０）を得た。
【０２９０】
表２：ＡｃｔＡの上流および下流のＤＮＡ配列の増幅のために使用されたプライマーの配列
【０２９１】
【表２】
2015213500.tif 000004
【０２９２】
遺伝子のその染色体場所からの欠失は、プライマー３（Ａｄｖ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号５１）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ；配列番号５２）として図１に示される、ＡｃｔＡ欠失領域に外部で結合するプライマーを使用して検証した。ＰＣＲ分析は、ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔＡｃｔＡから単離された染色体ＤＮＡに対して行った。Ｌｍｄｄ染色体ＤＮＡにおける２つの異なるセットのプライマー対１／２および３／４での増幅後のＤＮＡ断片のサイズは、３．０Ｋｂおよび３。４Ｋｂと予想した。一方、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡのためのプライマー対１／２および３／４を使用したＰＣＲの予想されたサイズは、１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂであった。このように、図１のＰＣＲ分析は、ＡｃｔＡの１．８ｋｂ領域が、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡ株において欠失されたことを確認する。ＤＮＡ配列決定も、株、ＬｍｄｄΔＡｃｔＡ．に領域を含有するＡｃｔＡの欠失を確認するために、ＰＣＲ生成物に対して行った。
【０２９３】
実施例２：Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質依存性エピソーム発現系の構築
【０２９４】
Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質依存性エピソーム発現系（ｐＡＤＶ１４２）は、抗生物質を有さないプラスミドｐＴＶ３の次の世代である（参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｖｅｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２００４．７２（１１）：６４１８−２５）。病原性遺伝子転写活性化剤のための遺伝子であるｐｒｆＡは、リステリア株Ｌｍｄｄが、染色体におけるｐｒｆＡ遺伝子の複製物を含有するため、ｐＴＶ３から欠失された。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位にあるｐ６０−リステリアｄａｌのためのカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌによって置換し、プラスミドｐＡＤＶ１３４（図２Ａ）を得た。リステリアおよびバチルスｄａｌ遺伝子の類似性は、約３０％であり、プラスミドと、Ｌｍｄｄ染色体におけるｄａｌ遺伝子の残りの断片との間の組み換えの機会を実質上排除する。プラスミドｐＡＤＶ１３４は、抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含有した。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡＤＶ１３４プラスミドで形質転換し、選択されたクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現は、ウエスタンブロット法によって確認された（図２Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン抵抗を除いて、抗生物質耐性マーカを欠く。
【０２９５】
さらに、ｐＡＤＶ１３４は、ヒトＰＳＡ、ｋｌｋ３をクローン化するためにＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限し、プラスミド、ｐＡＤＶ１４２を得た。新規のプラスミド、ｐＡＤＶ１４２（図２Ｃ、表１）は、リステリアｐ６０プロモータの制御下でバチルスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含有する。シャトルプラスミド、ｐＡＤＶ１４２は、外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａ  ｄｒｘ  ＭＢ２１５９およびリステリアモノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の成長を補完した。プラスミドｐＡＤＶ１４２の抗原発現カセットは、ｋｌｋプロモータおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から成る（図２Ｃ）。
【０２９６】
プラスミドｐＡＤＶ１４２は、リステリア背景株、ＬｍｄｄＡｃｔＡ株に形質転換し、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡを得た。株、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロット法によって確認した（図２Ｄ）。２つの体内継代後、株、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌があった。
【０２９７】
実施例３：株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの体外および体内安定性
【０２９８】
プラスミドの体外安定性は、８日間、選択圧の存在または非存在下でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を培養することによって検査した。株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのための選択圧は、Ｄ−アラニンである。したがって、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）およびＢＨＩ＋１００μｇ／ｍｌのＤ−アラニンにおいて継代した。ＣＦＵは、選択的（ＢＨＩ）および非選択的（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地上に播種した後、毎日決定した。プラスミドの損失は、非選択的培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）上に播種した後、より高いＣＦＵをもたらすことが予想された。図３Ａに示すように、選択的および非選択的培地におけるＣＦＵの数に差異はなかった。これは、プラスミドｐＡＤＶ１４２は、実験が終了する少なくとも５０世代の間、安定していることを示唆する。
【０２９９】
体内でのプラスミド維持は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、５×１０７ＣＦＵ  ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの静脈内注入によって決定した。生菌は、２４時間および４８時間でＰＢＳ内で均質化された脾臓から単離した。各資料のＣＦＵは、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋１００μｇ／ｍｌのＤ−アラニン上で、各時点で決定した。脾細胞を選択的および非選択的培地上に播種した後、コロニーを２４時間後に回収した。この株は、高度に弱毒化しているため、細菌負荷は、２４時間で体内で除去される。ＣＦＵの有意な差異は、選択的および非選択的プレート上で検出されず、全ての単離された最近における組み換えプラスミドの安定した存在を示唆する（図３Ｂ）。
【０３００】
実施例４：株ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）の体内継代、病原性、およびクリアランス
【０３０１】
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソームに発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組み換えリステリア株である。安全な投与量を決定するために、マウス様々な投与量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫付与し、毒作用を決定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒作用を引き起こした（データは示されず）。結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの１０８ＣＦＵの投与量は、マウスによる良好な耐容性を示したことを示唆した。病原性の研究では、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、高度に弱毒化されていたことが示される。
【０３０２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、安全量１０８ＣＦＵの腹腔内投与後のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの体内クリアランスを決定した。２日目後のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫付与されたマウスの肝臓および脾臓において検出可能なコロニーは存在しなかった。この株は、高度に弱毒化しているため、４８時間で体内で完全に除去された（図４Ａ）。
【０３０３】
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱化が、マクロファージを感染させ、細胞内で成長する、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの能力を弱化させたかを判断するために、我々は、細胞感染検定を行った。Ｊ７７４Ａ．１等のマウスマクロファージ様細胞株は、リステリアコンストラクトに体外で感染させ、細胞内成長を定量化した。陽性対照菌株野生型リステリア株１０４０３Ｓは、細胞内で成長し、陰性対照ＸＦＬ７であるｐｒｆＡ変異体は、ファゴリソソームを回避することができないため、Ｊ７７４細胞において成長しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内成長は、細胞から細胞へ広がる、この株の能力の損失のため、１０４０３Ｓより遅かった（図４Ｂ）。結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡが、マクロファージを感染させ、細胞質内で成長する能力を有することを示す。
【０３０４】
実施例５：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける株−ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの免疫原性
【０３０５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるコンストラクトＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによって誘発されたＰＳＡ特異的免疫応答は、ＰＳＡ四量体染色を使用して決定した。マウスは、１週間間隔でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫付与し、脾細胞は、追加接種後６日目にＰＳＡ四量体に対して染色した。ＰＳＡ特異的四量体での脾細胞の染色は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡが、ＰＳＡ四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞の２３％を誘発したことを示した（図５Ａ）。
【０３０６】
５ｈのＰＳＡペプチドでの刺激の後のＩＦＮ−γを分泌するＰＳＡ特異的Ｔ細胞の機能的能力を、細胞内サイトカイン染色を使用して検査した。未感作マウスと比較して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群において、ＰＳＡペプチドで刺激されたＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＩＦＮ−γ分泌細胞の割合（％）が２００倍し（図５Ｂ）、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株が、非常に免疫原性であり、脾臓におけるＰＳＡに対する高レベルの機能的に活性なＰＳＡ  ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の原因となることを示唆する。
【０３０７】
マウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫付与した後にＰＳＡに対して生成された細胞毒性Ｔ細胞の機能活性を決定するために、我々は、体外検定において、ＰＳＡ特異的ＣＴＬのＨ−２Ｄｂペプチドでパルスされた細胞ＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳに基づくカスパーゼ検定（図５Ｃ）およびユウロピウム放出（図５Ｄ）を使用して、細胞溶解を測定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫付与されたマウスの脾細胞は、標的抗原としてＰＳＡペプチドを提示する細胞のための高い細胞溶解活性を伴うＣＴＬを含有した。
【０３０８】
Ｅｌｉｓｐｏｔは、抗原での２４時間の刺激の後のエフェクターＴ細胞のＩＦＮ−γを分泌する機能的能力を決定するために行った。ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、我々は、未感作マウスの脾細胞と比較して、特異ペプチドで刺激されたＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫付与されたマウスからの脾細胞において、ＩＦＮ−γのスポットの数が２０倍の増加したことを確認した（図５Ｅ）。
【０３０９】
実施例６：ＬｍｄｄＡ−１４２株での免疫付与は、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的ＣＴＬによる腫瘍の浸潤を誘導する
【０３１０】
コンストラクトＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）の治療効果を、ＰＳＡ（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）、Ｓｈａｈａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を発現するように操作された前立腺腺癌細胞株を使用して決定した。マウスに、２×１０６ＴＰＳＡ細胞を皮下的に埋め込んだ。腫瘍が、６日目に４−６ｍｍの触診可能なサイズに到達すると、マウスは、１０８ＣＦＵ  ＬｍｄｄＡ−１４２、１０７ＣＦＵ  Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（陽性対照）で１週間間隔で３回免疫付与するか、未処理のままとした。未感作マウスは、徐々に腫瘍を発症した（図６Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫付与されたマウスは、３５日目まで全て腫瘍を有さず、８匹中３匹のマウスが、徐々に、腫瘍を発症し、腫瘍は、未感作マウスと比較してかなり遅い速度で成長した（図６Ｂ）。８匹中５匹のマウスは、７０日目まで腫瘍を有さないままであった。予想した通り、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ接種マウスは、未感作対照より少ない腫瘍を有し、腫瘍は、対照よりゆっくりと発症した（図６Ｃ）。このように、コンストラクトＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＴＰＳＡ細胞株によって確立された腫瘍の６０％を退行させ、他のマウスにおける腫瘍の成長を遅くすることができる。腫瘍を有さない状態であった治癒されたマウスは、６８日目にＴＰＳＡ腫瘍で再免疫試験した。
【０３１１】
ＬｍｄｄＡ−１４２でのマウスの免疫付与は、未処理群における０％と比較して（図６Ａ）、実験動物の６０％以上において、ＰＳＡを発現するように操作された７日間確立Ｔｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の成長および退行を制御することができる（図６Ｂ）。ＬｍｄｄＡ−１４２は、高度に弱化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびプラスミドｐＡＤＶ１４２を使用して構築した（表１）。
【０３１２】
さらに、腫瘍に浸潤する、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトによって生成されたＰＳＡ特異的ＣＤ８リンパ球の能力を調査した。マウスは、腫瘍の混合物およびマトリゲルを皮下的に埋め込み、未感作または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアか、またはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによる７日間隔での２つの免疫付与を続けた。腫瘍は、２１日目に切除し、腫瘍に浸潤するＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞の集団に対して分析した。
【０３１３】
未感作およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対象免疫付与マウスの両方には、非常に低い数のＰＳＡに特異的なＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。しかしながら、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫付与されたマウスにおいて、ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋ＴＩＬの割合は１０−３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓におけるＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏｗＰＳＡ四量体＋細胞の集団は、腫瘍におけるものより７．５倍少なかった（図７Ａ）。
【０３１４】
さらに、未処理マウスおよびリステリア免疫付与マウスの腫瘍におけるＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ調節細胞（ｒｅｇ）の存在を決定した。興味深いことに、リステリアでの免疫付与は、腫瘍におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇの数の相当な減少を引き起こしたが、脾臓においては減少はなかった（図７Ｂ）。しかしながら、コンストラクトＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、未感作およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫付与群と比較して、腫瘍におけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ−ｒｅｇの頻度の減少に強い影響を有した（図７Ｂ）。
【０３１５】
このように、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位に浸潤することが可能なＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができる（図７Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫付与は、腫瘍における調節性Ｔ細胞の数の減少を伴い（図７Ｂ）、恐らく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性に対するより好ましい環境を作る。
【０３１６】
実施例７：Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず機能的ＬＬＯを分泌する
【０３１７】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、下流で、完全長ヒトｋｌｋ３遺伝子を含有し、これは、ＰＳＡタンパク質をコードし、染色体におけるｋｌｋ遺伝子を伴うフレームにおいて相同的組み換えによって挿入される。これらのコンストラクトは、ｋｌｋ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組み換えカセットを携持し、温度感受性レプリコンを有するｐＫＳＶ７プラスミドを使用して相同的組み換えによって作製した（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２；７４（７−８）ｐ７０５−７１１）。第２の組み換えイベント後のプラスミド切除のために、組み込み選択のために使用される抗生物質耐性マーカは、損失される。さらに、ＡｃｔＡ遺伝子は、ＬｍｄｄＡ−１４３株において欠失される（図８Ａ）。染色体へのｋｌｋを伴うフレームにおけるｋｌｋ３の挿入は、両コンストラクトにおいて、ＰＣＲ（図８Ｂ）および配列決定（データは示されず）によって検証した。
【０３１８】
これらの染色体コンストラクトの重要な一態様は、ＬＬＯ−ＰＳＡの産生は、リステリアのファゴソームからの回避、サイトゾル侵入、およびＬ．モノサイトゲネスによって生成される効率的な免疫のために必要とされる、ＬＬＯの機能を完全に消失しないということである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清からの分泌されたタンパク質のウエスタンブロット分析は、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する約８１ｋＤａのバンド、およびＬＬＯの予想されたサイズである約６０ｋＤａのバンドを明らかにし（図９Ａ）、ＬＬＯが、染色体における融合遺伝子にもかかわらず、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合から開裂されるか、またはＬ．モノサイトゲネスによって単一のタンパク質として未だに産生されているかのいずれかを示す。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によって分泌されるＬＬＯは、野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、５０％の溶血活性を保持した（図９Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の両方は、マクロファージ様Ｊ７７４細胞株において細胞内で複製することが可能であった（図９Ｃ）。
【０３１９】
実施例８：Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の両方は、ＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する
【０３２０】
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の両方が、ＬＬＯに融合されるＰＳＡを分泌することが可能であることを示した後、我々は、これらの株が、体内でＰＳＡ特異的免疫応答を誘発することができるかどうかを調査した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、未処理のままか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、もしくはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫付与した。ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＰＳＡ６５−７４ペプチドで脾細胞を刺激すること、およびＩＦＮ−γに対する細胞内染色によって測定した。図１０に示されるように、染色体およびプラスミドベースのベクターによって誘発された免疫応答は、同様である。
【０３２１】
実施例９：ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ融合タンパク質を分泌する組み換えＬｍ株は、広範な抗腫瘍応答を引き起こす
【０３２２】
事前にマップされ、予測されたＨＬＡ−Ａ２エピトープの位置に基づいて、区別できるＨＭＷ−ＭＡＡ断片を発現する３つのＬｍベースのワクチンを設計した（図１１Ａ）。Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＭＡ２１６０−２２５８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃとも称される）は、非病原性Ｌｍ  ＸＦＬ−７株およびｐＧＧ５５ベースのプラスミドに基づく。この株は、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質に対応する約６２ｋＤａのバンドを分泌する（図１１Ｂ）。ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８の分泌は、恐らくＨＭＷ−ＭＡＡ膜貫通ドメインに対応、この断片の高い疎水性のために比較的弱い。完全長ＨＭＷ−ＭＡＡ遺伝子でトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を使用して、我々は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫付与されたマウスの６２．５％までが、確立された腫瘍の成長を妨げることができたことを確認した（図１１Ｃ）。この結果は、ＨＭＷ−ＭＡＡが、ワクチン接種戦略において標的抗原として使用することができることを示す。興味深いことに、我々は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでのマウスの免疫付与は、区別できるマウス株に由来した、Ｂ１６Ｆ１０、ＲＥＮＣＡ、およびＮＴ−２（図１１Ｄ）等のＨＭＷ−ＭＡＡを発現するように操作されていない腫瘍の成長を有意に弱めたことも確認した。ラットＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質を発現する哺乳類癌細胞株であり、ＦＶＢ／Ｎトランスジェニックマウスに由来するＮＴ−２腫瘍モデルでは、腫瘍接種後７日目のＬｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでの免疫付与は、腫瘍成長を弱めただけではなく、５匹中１匹のマウスにおける腫瘍の退行も誘導した（図１１Ｄ）。
【０３２３】
実施例１０：Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃでのマウスの免疫付与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍間質の浸潤および腫瘍血管系における周皮細胞範囲の有意な低下を誘導する
【０３２４】
ＮＴ−２細胞は、ＨＭＷ−ＭＡＡ相同体ＮＧ２を発現しないが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−ＣでのＦＶＢ／Ｎマウスの免疫付与は、ＮＴ−２腫瘍の成長を有意に弱め、最終的には、腫瘍退行をもたらした（図１１Ｄ）。この腫瘍モデルを使用して、免疫蛍光によって腫瘍部位におけるＣＤ８＋Ｔ細胞および周皮細胞を評価した。ＣＤ８に対するＮＴ−２腫瘍区分の染色は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃワクチンで免疫付与されたマウスにおける腫瘍への、および血管の周囲のＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を示し、これは対照ワクチンで免疫付与されたマウスにおいては観察されなかった（図１２Ａ）。ＮＴ−２腫瘍における周皮細胞も、αＳＭＡおよびＮＧ２（ＨＭＷ−ＭＡＡのマウス相同体）抗体での二重染色によって分析した。３つの独立したＮＴ−２腫瘍からのデータ分析は、対照と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃで免疫付与されたマウスにおける周皮細胞の数において有意な低下を示した（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｂ）。分析が、ワクチンによって標的とされないαＳＭＡに対して染色された細胞に制限された場合、同様の結果が得られた（データは示されず）。このように、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃワクチン接種は、周皮細胞を標的とすることによって腫瘍部位における血管形成に影響を与える。
【０３２５】
実施例１１：ＬＬＯ−ＰＳＡおよびｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８融合タンパク質の同時発現および分泌による強化された抗腫瘍活性を有する組み換えＬ．モノサイトゲネスベクターの開発、および双方の異種抗原に対する免疫応答の誘発
【０３２６】
材料および方法：
【０３２７】
ｐＡＤＶ１６８プラスミドの構築  ＨＭＷ−ＭＡＡ−Ｃ断片は、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼでの二重消化によってＰＣＲ２．１−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８プラスミドから切除する。この断片は、既にＸｈｏＩおよびＸｍａＩで消化されたｐＡＤＶ１３４プラスミドにおいてクローン化して、Ｅ７遺伝子を切除する。ｐＡＤＶ１６８プラスミドは、エレクトロコンピテントｄａｌ（−）ｄａｔ（−）大腸菌株ＭＢ２１５９に電気穿孔し、陽性クローンは、ＲＦＬＰおよび配列分析のためにスクリーニングする。
【０３２８】
対照菌株ＬｍｄｄＡ−１６８、ならびにＬｍｄｄ−１４３／１３４およびＬｍｄｄＡ−１４３／１３４の構築  Ｌｍｄｄ、Ｌｍｄｄ−１４３、およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ｐＡＤＶ１６８またはｐＡＤＶ１３４プラスミドのいずれかで形質転換する。形質転換細胞は、Ｄ−アラニン（ＢＨＩ培地）を含有しないストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）で補給されたブレインハートインフュージョンアガープレート上で選択する。個々のクローンは、抗ＬＬＯ、抗ＰＳＡ、または抗Ｅ７抗体を使用して、ウエスタンブロット法によって、細菌性培養上清におけるＬＬＯ−ＰＳＡ、ｔＬＬＯ−ＨＭＷ−ＭＡＡ２１６０−２２５８、およびｔＬＬＯ−Ｅ７分泌に対してスクリーニングする。各株からの選択されたクローンは、体外および体内病原性に対して評価する。各株は、最も安定した組み換えクローンを選択するために体内で２回継代する。簡潔に述べると、各コンストラクトからの選択されたクローンは、成長させ、１×１０８ＣＦＵ／マウスで４匹のマウスの群に腹腔内注入する。脾臓は、１日目および３日目に採取し、均質化し、ＢＨＩアガープレート上に播種する。最初の継代後、各株からの１つのコロニーを選択し、体内で２回目の継代を行う。ベクターのさらなる弱化を防止するために、その生存能力を弱めるレベルにまで、区別できる弱化レベル（Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８）の２つのベクターにおけるコンストラクトを生成する。
【０３２９】
Ｊ７７４細胞における細胞内複製による体外病原性決定  マクロファージによるＬｍの取り込み、その後のサイトゾル侵入および細胞内増殖は、Ｌｍベースのワクチンによる抗原送達および提示の成功のために必要とされる。マクロファージ様Ｊ７７４細胞株を使用する体外侵入検定を使用して、新規の組み換えＬｍ株におけるこれらの特性を試験する。簡潔に述べると、Ｊ７７４細胞は、対照野生型Ｌｍ株１０４０３Ｓまたは試験される新規のＬｍ株のいずれかにより、１：１のＭＯＩで抗生物質を伴わない培地において１時間感染させる。細胞外細菌は、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの培地における１時間の培養により死滅させる。サンプルは、一定間隔で収穫し、細胞は、水で溶解する。１０倍の連続希釈の溶解物を、ＢＨＩプレート上に二重播種し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を各サンプルにおいて数える。
【０３３０】
体内病原性の研究  ４匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）の群に、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４、またはＬｍｄｄＡ−１４３／１３４株の２つの異なる投与量（１×１０８および１×１０９ＣＦＵ／投与量）を腹腔内で注入する。マウスは、生存およびＬＤ５０推定に対して２週間観察した。１×１０８より高いＬＤ５０が、他のＬｍベースのワクチンでの過去の経験に基づき、許容できる値を成す。
【０３３１】
結果
【０３３２】
ｐＡＤＶ１６８プラスミドの構築に成功すると、それは、正確なＨＭＷ−ＭＡＡ配列の存在に対して配列決定される。これらの新規の株におけるこのプラスミドは、各コンストラクトに特異的なＬＬＯ融合タンパク質を発現し、分泌する。これらの株は、高度に弱化され、少なくとも１×１０８ＣＦＵのＬＤ５０を有し、ＡｃｔＡ遺伝子に欠け、その結果として細胞間伝播の能力に欠ける、ＡｃｔＡ欠損（ＬｍｄｄＡ）株に対しては、１×１０９ＣＦＵより高い可能性が高い。コンストラクトを試験し、弱化と治療効果との間のより良いバランスを有するものを選択する。
【０３３３】
実施例１２：Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８での免疫付与後に誘発される免疫応答および抗腫瘍効果の検出
【０３３４】
ＰＳＡおよびＨＭＷ−ＭＡＡに対する免疫応答は、ＩＦＮ−γ産生、およびこれらの抗原に対する特異的ＣＴＬ活性の検出等の標準的な方法を使用して、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８株での免疫付与後のマウスにおいて研究した。二重発現ベクターの治療効果は、ＴＰＳＡ２３腫瘍モデルにおいて試験する。
【０３３５】
ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１つの治療群につき３匹のマウス）は、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８株により１週間間隔で２回免疫付与する。この実験のための対照として、マウスは、Ｌｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４２、ＬｍｄｄＡ−１６８、Ｌｍｄｄ−１４３／１３４、ＬｍｄｄＡ−１４３／１３４で免疫付与するか、または未処理のままにする（未感作群）。脾臓は、７日後に採取し、脾細胞の単細胞懸濁液を調製する。これらの脾細胞は、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を有する新しく調製された完全ＲＰＭＩ培地において、丸底９６ウェルプレートにける２×１０６細胞／ウェルで播種し、１μＭの最終濃度の、ＰＳＡ  Ｈ−２Ｄｂペプチド、ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ（配列番号５３）、またはＨＰＶ１６Ｅ７Ｈ−２Ｄｂ対照ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号５４）のいずれかで刺激する。ＨＭＷ−ＭＡＡ−エピトープは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいてマップされていないため、ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的免疫応答は、２×１０６脾細胞を２×１０５ＥＬ４−ＨＭＷ−ＭＡＡ細胞とともに培養することによって検出する。細胞は、細胞における細胞内ＩＦＮ−γを保持するために、モネンシンの存在下で５時間培養する。培養後、細胞は、抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体で染色する。その後、それらは、ＩＦＮγ−ＰＥに対して透過処理し、染色し、４色ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析する。
【０３３６】
細胞毒性検定  ワクチン接種の際に生成されるＰＳＡおよびＨＭＷ−ＭＡＡ特異的Ｔ細胞のエフェクター活性を調査するために、単離脾細胞を、刺激細胞（ＰＳＡまたはＨＭＷ−ＭＡＡ牛痘のいずれかに感染したマイトマイシンＣ処理されたＭＣ５７Ｇ細胞）の存在下で、２０Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地において５日間培養する。細胞毒性検定のために、ＥＬ４標的細胞は、ＤＤＡＯ−ＳＥ（０．６μＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で１５分標識化し、完全培地で２回洗浄する。標識化標的細胞は、５μＭの最終濃度のＰＳＡ  Ｈ−２ＤｂペプチドまたはＨＰＶ１６Ｅ７Ｈ−２Ｄｂ対照ペプチドのいずれかを１時間適用する。ＨＭＷ−ＭＡＡ特異的細胞毒性応答のために、ＥＬ４−ＨＭＷ−ＭＡＡ細胞を、標的として使用する。細胞毒性検定は、標的細胞（Ｔ）をエフェクター細胞（Ｅ）と共に、異なるＥ：Ｔ比率で２−３時間培養することによって２時間行う。細胞は、ホルマリンで固定し、透過処理し、標的Ｔ細胞におけるアポトーシスの誘導を検出するために、開裂カスパーゼ−３に大して染色する。
【０３３７】
抗腫瘍有効性  Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８株の抗腫瘍有効性を、Ｔ−ＰＳＡ２３腫瘍モデル（ＴｒａｍｐＣ−１／ＰＳＡ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−１４２およびＬｍｄｄＡ−１６８の抗腫瘍有効性と比較する。８匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６−８週齢）の群は、２×１０６Ｔ−ＰＳＡ２３細胞を皮下に接種し、７日後、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４３／１６８、ＬｍｄｄＡ−１４２、およびＬｍｄｄＡ−１６８の０．１×ＬＤ５０投与量を腹腔内に免疫付与する。対照として、マウスは、未処理のままか、またはＬｍ対照菌株（ＬｍｄｄＡ−１３４）で免疫付与するかのいずれかである。各群は、７日間隔でワクチンの２つの付加的投与量を受ける。腫瘍は、６０日間か、またはそれらが、２ｃｍのサイズに到達するまで監視し、この時点でマウスを殺す。
【０３３８】
結果
【０３３９】
ＬｍｄｄＡ−１６８でのマウスの免疫付与は、ＨＭＷ−ＭＡＡに対する特異的応答の誘導を引き起こす。同様に、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８は、ＰＳＡおよびＨＭＷ−ＭＡＡに対する免疫応答を誘発し、その誘導は、個々に各抗原を発現するＬ．モノサイトゲネスベクターによって生成される免疫応答と同程度である。Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８でのＴ−ＰＳＡ−２３によるマウスの免疫付与は、ＬｍｄｄＡ−１４２またはＬｍｄｄＡ−１６８のいずれかでの免疫付与より良い抗腫瘍治療効果を引き起こす。
【０３４０】
実施例１３：Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８のいずれかでの免疫付与は、周皮細胞破壊、内皮細胞における接着分子の上方調節、およびＰＳＡに特異的なＴＩＬの強化された浸潤を引き起こす
【０３４１】
Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８での免疫付与後に誘導される腫瘍浸潤リンパ球および内皮細胞接着分子の特徴付け  Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８のいずれかで免疫付与されたマウスからの腫瘍は、免疫蛍光によって分析し、内皮細胞による接着分子の発現、腫瘍血管系における血管密度および周皮細胞範囲、ならびにＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞を含む免疫細胞による腫瘍の浸潤を研究する。ＰＳＡ抗原に特異的なＴＩＬは、四量体分析および機能試験によって特徴付ける。
【０３４２】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の分析  マトリゲルに包含されるＴＰＳＡ２３細胞をマウス（ｎ＝１群につき３匹）に皮下注射で接種し、抗腫瘍研究において得られた結果に従い、どちらがより効果的であるかによって、Ｌｍｄｄ−１４３／１６８またはＬｍｄｄＡ−１４３／１６８を７日目および１４日目に免疫付与する。比較のために、マウスは、対照ＬｍワクチンであるＬｍｄｄＡ−１４２、ＬｍｄｄＡ−１６８で免疫付与するか、または未処理のままにする。２１日目に、腫瘍は、外科的に切除し、氷冷ＰＳＢで洗浄し、外科用メスで細分化する。腫瘍は、ディスパーゼで処理し、マトリゲルを可溶化にし、分析のために単一細胞を放出する。ＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＳＡ６５−７４Ｈ−２Ｄｂ四量体−ＰＥおよび抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５およびＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ抗体で染色する。腫瘍における調節性Ｔ細胞を分析するために、ＴＩＬは、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、およびＣＤ２５−ＡＰＣで染色し、続いて、ＦｏｘＰ３染色（抗ＦｏｘＰ３−ＰＥ、Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）のために透過処理する。細胞は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析する。
【０３４３】
免疫蛍光  腫瘍接種後２１日目に、マトリゲルに埋め込まれたＴＰＳＡ２３腫瘍は、外科的に切除し、断片は、ＯＣＴ凍結培地において即座に凍結保存する。腫瘍断片は、８−１０μｍ厚の凍結切片にする。免疫蛍光のために、サンプルは、解凍し、４％ホルマリンを使用して固定する。ブロッキング後、切片は、３７℃の加湿チャンバ内のブロッキング溶液における抗体で１時間染色する。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色は、メーカーの使用説明書に従って行う。細胞内染色（αＳＭＡ）のために、培養は、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡ溶液において行う。スライドは、フェージング防止剤を伴う封入溶液（Ｂｉｏｍｅｄａ）を使用してカバースリップし、２４時間固定して、４℃に保った後、Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（２００６）およびＢＸ５１シリーズのオリンパス蛍光顕微鏡を使用して画像化する。ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、αＳＭＡ、ＮＧ２、ＣＤ３１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＶＡＰ−１は、免疫蛍光によって評価する。
【０３４４】
統計分析：ノンパラメトリックのマンホイットニーおよびクラスカルワリス検定を、異なる処置群の間の腫瘍サイズを比較するために適用する。腫瘍サイズは、各群におけるマウスの最大数（８匹のマウス）で、最新の時点で比較する。０．０５未満のｐ値を、これらの分析において統計的に有意であると見なす。
【０３４５】
結果
【０３４６】
Ｌｍｄｄ−１４３／１６８およびＬｍｄｄＡ−１４３／１６８でのＴＰＳＡ２３によるマウスの免疫付与は、より多数のＰＳＡに特異的なエフェクターＴＩＬをもたらし、腫瘍血管系の周皮細胞範囲も減少させる。さらに、細胞接着マーカは、免疫付与されたマウスにおいて有意に上方調節される。
【０３４７】
付随図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明は、それらの実施形態のみに限定されず、様々な変更および修飾が、添付請求項において定義される本発明の範囲または趣旨から逸脱せずに当業者によってその中で達成されてもよいことが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月30日(2015.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質をコードする核酸分子を含む組み換えリステリア株であって、
前記融合タンパク質は、Ｎ末端ＬＬＯに融合された異種抗原を含み、
前記組み換えリステリア株は、ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子に変異を含む弱毒化リステリアであり、
前記リステリアは、前記ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子の変異を補完する代謝酵素を含み、
前記リステリアは、内因性ＡｃｔＡ遺伝子の欠失を含むことを特徴とする組み換えリステリア株。
【請求項２】
前記変異は、欠失変異であることを特徴とする請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項３】
前記核酸分子は、前記リステリアのゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項１に記載の組み換えリステリア株。
【請求項４】
前記核酸分子は、前記組み換えリステリア株におけるプラスミド上に存在することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株。
【請求項５】
前記プラスミドは、抗生物質選択の非存在下で前記組み換えリステリアワクチン株において安定して維持されることを特徴とする請求項４に記載の組み換えリステリア株。
【請求項６】
前記プラスミドは、前記組み換えリステリアに抗生物質耐性を与えないことを特徴とする請求項５に記載の組み換えリステリア株。
【請求項７】
前記代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素またはＤアミノ酸トランスフェラーゼ酵素であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株。
【請求項８】
前記異種抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）またはその断片、若しくはヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ−Ｅ７）またはその断片であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株。
【請求項９】
前記リステリア株が、リステリアモノサイトゲネス株であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株と、薬学的に許容される担体とを含むワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１１】
アジュバントを更に含むことを特徴とする請求項１０に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１１に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１３】
対象における免疫応答を誘導する薬剤を製造するための、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株、または請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物の使用。
【請求項１４】
前記免疫応答が、腫瘍または癌から前記対象を保護することを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
対象における腫瘍または癌を治療する薬剤を製造するための、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株、または請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物の使用。
【請求項１６】
対象における腫瘍または癌の発症を防止または遅延させる薬剤を製造するための、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組み換えリステリア株、または請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物の使用。
【請求項１７】
前記腫瘍が、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、子宮頸腫瘍、または卵巣腫瘍であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、または卵巣癌であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか一項に記載の使用。