(57)【要約】      （修正有）【課題】動物細胞の形態変化を伴う事なく効果的に培養できる細胞培養デバイスの提供。【解決手段】アミノ基（又はイミノ基）含有高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物。2015213446.tif 000007［式中Ａは非置換又は置換Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ，Ｌ１はｍ個とｎ個の反復単位のセグメントを連結するリンカー（ｍ＝２〜１，０００の整数，ｎ＝独立して１〜１，０００の整数），Ｌ２は−Ｃ１〜６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ１〜６アルキレン）ｑ−（ｑ＝０又は１），Ｒは独立して環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表す。］表面にカルボキシル基を有する培養機材の表面へ共有結合を介して固定された、培養中の動物細胞の形態の変化を抑制するための細胞培養デバイス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるアミノ基（またはイミノ基）含有高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、表面にカルボキシル基を有する培養機材の表面へ共有結合を介して固定された、培養中の動物細胞の形態の変化を抑制するための細胞培養デバイス。
【化１】
2015213446.tif 000005
上式中、
Ａは、非置換または置換Ｃ1−Ｃ12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ1Ｒ2ＣＨ−（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＲ1とＲ2は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ1は、ｍ個の反復単位のセグメントとｎ個の反復単位のセグメントを連結するリンカーを表し、
Ｌ2は、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは整数０または１であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、独立して、１〜１，０００の整数である。
【請求項２】
Ｌ1が、単結合、−（ＣＨ2）cＳ−、−ＣＯ（ＣＨ2）cＳ−、からなる群より選ばれ、ここでｃは１〜１２の整数である、請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項３】
Ｒが、独立して、Ｒの総数ｎの、少なくとも７０％である、請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項４】
Ｒが、次式
【化２】
2015213446.tif 000006
式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基から選ばれる、請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面に高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が共有結合を介して固定された細胞培養用デバイスを関する。特に、培養中の動物細胞の形態変化を抑制するための細胞培養デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、生体または生体に由来する物質、特に血液と接触する表面の生体適合性を、高分子化環状ニトロキシドラジカルを使用して高めることにより、材料に血液が接触することで生じる、例えば血小板や白血球の減少を抑制することができることも見出し、当該使用について提案した（特許文献１参照）。
【０００３】
ところで、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の再生医療が注目されているが、これらの細胞を未分化の状態を維持したまま培養することは品質管理の観点から非常に重要である。また、薬剤スクリーニング等において用いられる培養細胞は一般的に細胞の継代数を重ねるごとに細胞の形態が変化することが知られている。これらの例に見られるように、培養細胞は通常の培養環境においてはその形態が変化する傾向にある。細胞の形態を変化させる原因としては様々なものが知れているが、培養液中に発生する活性酸素種（ＲＯＳ）もその一つである。このＲＯＳが細胞を刺激し、細胞の形態を変化させる。特に、ミトコンドリアの還元電位を乱すことで、細胞の形態維持に深く関与しているミトコンドリア内のＲＯＳレベルを変化させているのであろうと報告されている（非特許文献１）。これまで、一般的に、ＲＯＳを消去する物質としてビタミン等種々の抗酸化剤が用いられてきた。しかしながらこれらの小分子の抗酸化剤はＲＯＳを消去する一方で、それ自体が細胞の形態変化を誘発するという側面を持ち合わせる。したがって、これら小分子の抗酸化剤（ＲＯＳ消去剤）に代わる材料設計が将来的には非常に重要となってくるであろう。
【０００４】
本発明者らは、このような観点から、特許文献１で表面処理に使用されている２−メトキシメチルアクリレート／クロロメチルスチレンのランダムコポリマーのスチレン反復単位部分に環状ニトロキドラジカル部分（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ））を担持させたポリマーに代え、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ〔ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（ｐ−４−（２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−１−オキシル）アミノメチルスチレン：当該ポリマーの製造等については、必要があれば特許文献２参照〕で培養機材表面をコートすることにより高等動物細胞を未分化の状態を維持したまま培養できることを報告した（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−７８７０６
【特許文献２】ＷＯ２００９／１３３６４７
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１２，４８，１５８−１７６
【非特許文献２】第６２回  高分子討論会、予稿原稿  ２０１３年８月２８日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の非特許文献１に記載の培養機材によれば、活性酸素種において分化することが報告されている未分化の白血病細胞株ＨＬ６０を、分化誘導を抑制した状態で効果的に培養
することができる。しかしながら、報告されている培養機材表面（カルボキシル基坦持）へのＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴのコーティング法では、必ずしも、当該ポリマーを均一かつ、安定に前記表面へ固定できないことが見出された。したがって、本発明はかような短所を克服ないしは解消し、しかも培養細胞の形態変化を誘導しない細胞培養用デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、このような短所を解消すべく研究したところ、驚くべきことに、当該ポリマーを包含する特定の高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物を培養機材表面（カルボキシル基担持）に一定条件下で共有結合せしめると、かような短所が解消できることが確認できた。
【０００９】
したがって、本発明は、前記課題を解決するための手段として、下記式（Ｉ）で表されるアミノ基（またはイミノ基）含有高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物が、表面にカルボキシル基を有する培養機材の表面へ共有結合を介して固定された、培養中の動物細胞の形態の変化を抑制するための細胞培養デバイスを提供する。
【００１０】
【化１】
2015213446.tif 000002
【００１１】
上式中、
Ａは、非置換または置換Ｃ1−Ｃ12アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ1Ｒ2ＣＨ−（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＲ1とＲ2は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ1は、ｍ個の反復単位のセグメントとｎ個の反復単位のセグメントを連結するリンカーを表し、
Ｌ2は、−Ｃ1-6アルキレン−ＮＨ−（Ｃ1-6アルキレン）q−であり、ここでｑは整数０または１であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも５０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、２〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、独立して、１〜１，０００の整数である。
【００１２】
＜発明の詳細な記述＞
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１３】
式（Ｉ）で表される高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物において、各基、部分、または数値について、具体的なまたは好適な態様は、次のとおりである。
【００１４】
リンカーＬ1は、例えば、単結合、−（ＣＨ2）cＳ−、−ＣＯ（ＣＨ2）cＳ−、からなる群より選ばれ、ここでｃは１〜１２の整数である、ことができる。
【００１５】
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、かような残基の中、好ましいのは、Ｒが、次式
【００１６】
【化２】
2015213446.tif 000003
【００１７】
式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基から選ばれものである。
【００１８】
ｍは、好ましくは２〜５００の整数、より好ましくは１０〜３００の整数であり、ｎは、好ましくは１〜２００の整数、より好ましくは３〜１００の整数、最も好ましくは８〜３０の整数である。
【００１９】
これらの化合物は、前記特許文献２に記載の方法及びそれに準ずる方法により製造できる。
【００２０】
表面にカルボキシル基を有する培養機材は、その表面に水性媒体（水、水混和性有機溶媒、例えば、Ｃ1-3アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、等を含有する水溶液）中で、式（Ｉ）で表される高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物のＬ2中の−ＮＨ−基と反応して共有結合を形成し得る状態のカルボキシル基を有するものであれば、記如何なる形状及び構造を有する如何なる材料製であってもよい。当該カルボキシル基は、前記表面の特定領域または全体に均一に分布しているものであることが、本発明の目的上好ましい。このような表面を有する培養機材として使用できるものは、市販されているものをそのまま、または改良して使用してもよい。本発明にいう、培養機材はそれ自体が培養に役立つ培養デバイスであってもよく、また、かような培養デバイスの部材であってもよい。
【００２１】
市販されている培養機材としては、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＰｕｒｅＣｏａｔ  Ｃａｂｂｏｘｙｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｈｅｓ等を挙げることができる。
【００２２】
共有結合は、前記Ｌ2中の−ＮＨ−基と表面のカルボキシル基の脱水縮合反応によって
形成される結合である。こうして、式（Ｉ）の化合物は、前記両基が静電的に結合することによって、表面に固定されたものより化学的に安定化するものと推測される。上記脱水反応を行うとき、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＥＤＣ）等の縮合剤を８０ｍｇ／ｍｌの濃度でカルボキシル表面を活性化させ、その後高分子化合物（６０ｍｇ／ｍｌ）を加え２５度において１２時間反応させる。このような反応条件下に処理すると、式（Ｉ）の化合物を表面のカルボキシル基に対応するように均一に結合または固定することができる。理論により、拘束されるものでないが、静電相互作用により式（Ｉ）の化合物を表面にコートすると、高分子ポリマー同士の会合により不均一なコーティングや高塩濃度環境下におけるポリマーの剥離が推測されるが、上記のように共有結合形成反応を行うと、機材表面のカルボキシル基とポリマー中のアミノ基により当該結合が形成され、より均一に当該化合物を表面に固定できるものと推測できる。
【００２３】
動物細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞であることができる。また、かような細胞は、天然由来または人工的に操作されたものであることができ、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞、未分化がん細胞であることができる。
【００２４】
本発明にいう、動物細胞の形態の変化には、分化の誘導、アポトーシスの発生、オートファジーの発生等が包含される。
【００２５】
本発明は、動物細胞を形態の変化を実質的に伴うことなく、長期にわたって培養することができるので、再生医療用の細胞培養系、細胞の機能を評価する系、薬剤のスクリーニング系を提供するのに役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】例１による、電子スピン共鳴によるポリマーコートの確認のためのＥＳＲスペクトル。
【図２】例２による、ブチル酸を加えたＨＬ６０の顕微鏡画像。黒い細胞は分化した細胞である。ポリマーをコートすることで細胞の分化が抑制されている。
【図３】例３による、ＨＬ６０分化誘発の結果を示す図面に代わる、写真。
【図４】例４による、ＪＣ−１によるミトコンドリアの膜電位測定の結果を示すグラフ。
【図５】例５による、マウス胎児繊維芽細胞の接着評価の結果を示す図面に代わる写真。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の具体的な態様を挙げながら本発明をより具体的に説明するが、本発明をこれらに限定することを意味するものではない。
【実施例】
【００２８】
以下の具体例では、特許文献１に記載されているような、本発明者らが開発して下記式で表される高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物（以下、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴと略記することもある。なお、式中、ｍ＝１１０、ｎ＝１８（それぞれ、平均値））
【００２９】
【化３】
2015213446.tif 000004
【００３０】
例１：ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの培養機材へのコーティング
表面にカルボキシル基を有する２４ウェルプレート（ＰｕｒｅＣｏａｔ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｄｉｓｈ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＥＤＣ）を４０ｍｇメタノール中で反応させた後、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ（３０ｍｇ）を加え一晩振動させて撹拌した。反応終了後プレートを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液により洗浄した。ポリマーコートの確認はプレートをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ電子スピン共鳴により行った。結果を図１に示す。
【００３１】
図中、（ａ）縮合剤であるＥＤＣ存在下でポリマーを反応させたプレート。（ｂ）ＥＤＣ非存在下でポリマーをコートしたプレート。縮合剤が存在していないとシグナルが検出されなかったことからポリマーが共有結合で結合していることがわかる。
【００３２】
例２：活性酸素種を消去することによる細胞分化抑制例
ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを固定した２４ウエル（ｗｅｌｌ）プレートに活性酸素種により分化が誘導されることが報告されているヒト前骨髄球白血病細胞（ＨＬ６０）を播種し（５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、さらに活性酸素種を発生させることが知られているブチル酸を０．４ｍＭの濃度で加えて３７℃で４８時間培養した。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、新しい２４ｗｅｌｌプレートに播種し、ニトロブルーテトラゾリウム溶液（２００μｌ、４ｍｇ／ｍｌ）と１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセタート溶液（２００μｌ、５μｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１時間培養した。１時間後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００、カールツァイス株式会社）を用いて細胞を撮像し、ホルマザンを形成している細胞を計数した。その結果ポリマーコートすることで細胞の分化を抑制している事が確認できた。結果を図２（＋：ポリマーをコートした例、−未ポリマーコート）に示す。
【００３３】
例３：細胞の分化制御（小分子抗酸化剤との比較）
これまで、活性酸素を消去する物質としてビタミン等の様々な抗酸化物質が使用されてきた。これら小分子の抗酸化剤との比較を行った。２４ウェルカルボキシルプレートにＨＬ６０を播種し（５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、アスコルビン酸（最終濃度２５μＭ），トコフェロール（最終濃度２５μＭ）、Ｎ−アセチルシステイン（（最終濃度５ｍＭ）のいずれかを加え４８時間培養した後に、ニトロブルーテトラゾリウム溶液（２００μｌ、４ｍｇ／ｍｌ）と１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール  １３−アセタート溶液
（２００μｌ、５μｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１時間培養した。１時間後、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００、カールツァイス株式会社）を用いて細胞を撮像し、ホルマザンを形成している細胞を計数した。また比較実験としてＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを固定した２４ｗｅｌｌプレートを用いて同様の実験を行った（図４）。
【００３４】
結果を図３に示す。
【００３５】
図３より、ビタミン等の抗酸化剤はＨＬ６０の分化を誘発（分化率７〜８％）しているのに対し、ポリマーコートしたプレートは細胞の分化を誘発していなかった（分化率１％以下）。図３において、（ａ）アスコルビン酸、（ｂ）トコフェロール、（ｃ）Ｎアセチルシステイン、（ｄ）ポリマーコートをした倍にＨＬ６０分化誘発の結果を示す。
【００３６】
例４：細胞の形態維持（ミトコンドリアの膜電位による評価）
ミトコンドリアの膜電位は細胞の状態を表す事が知られている。例えば細胞にアポトーシスが生じるとミトコンドリアの膜電位が低下する事が知られている。そこでポリマーコートした培養機材のミトコンドリア膜電位に与える効果を解析した。ポリマーコートした２４ウェルプレートに５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの高濃度でＨＬ６０を播種し、４８時間培養した後にＪＣ−１（５，５’，６，６’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−１，１’，３，３’−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ
ｉｏｄｉｄｅ）（フナコシ）によりミトコンドリアの膜電位を解析した。比較実験としてポリマーコートしていないプレート及びアスコルビン酸（最終濃度２５μＭ），トコフェロール（最終濃度２５μＭ）、Ｎ−アセチルシステイン（（最終濃度５ｍＭ）のいずれかを加え４８時間培養した後にもＪＣ−１により膜電位を測定した。結果を図４に示す。図４より、Ｒｅｄ（赤）／Ｇｒｅｅｎ（緑）の蛍光比が高いほどミトコンドリアの膜電位が良好な状態にあるが、ポリマーコートしたプレート（図中（ｂ））はポリマーコートしていないプレート（図中（ａ））及びアスコルビン酸（図中（ｃ）），トコフェロール（図中（ｄ）），Ｎアセチルシステイン（図中（ｅ））と比較して良好な状態を保持していた。
【００３７】
例５：非特許文献２の静電相互作用によるポリマーコートとの比較
非特許文献では、同じポリマー（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）を同じく同様のカルボキシプレートに静電相互作用によりコーティングを行い評価した。今回構築した共有結合を介したコーティング方法とコーティングの均一性及び安定性を比較する為にマウス胎児繊維芽細胞（２Ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を播種し、２４時間後プレートへの接着性を評価した。用いているポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントが存在し、均一にコーティングされていると、接着細胞のプレート表面への接着を阻害する。今回作成した共有結合によるポリマーコーティングでは細胞の接着が全く見られなかった（図５の（ａ））のに対し、静電相互作用によるコーティングでは細胞の接着が確認された（図５（ｂ））。このことは共有結合によるコーティング方法の方が安定性及び均一性の観点から優れていることを示唆している。
【図１】
2015213446.tif 000008
【図２】
2015213446.tif 000009
【図３】
2015213446.tif 000010
【図４】
2015213446.tif 000011
【図５】
2015213446.tif 000012