(57)【要約】【課題】ポリ−γ−グルタミン酸を高生産することができる枯草菌変異株の提供。【解決手段】ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が強化されており、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が強化されており、
かつ、
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、
枯草菌変異株。
【請求項２】
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が欠失又は不活性化されている、請求項１記載の枯草菌変異株。
【請求項３】
さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子が欠失又は不活性化されている、請求項２記載の枯草菌変異株。
【請求項４】
さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化されている、請求項２記載の枯草菌変異株。
【請求項５】
少なくとも前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子とが組み合わせて発現強化されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【請求項６】
前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、及び前記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【請求項７】
前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ'）〜（ｆ'）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ''）〜（ｆ''）からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ'''）〜（ｆ'''）からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号１、１３、１６、２０、２４及び２７のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号３、１４、１７、２１、２５及び２８のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ前記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号５、１５、１８、２２、２６及び２９のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ前記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号７、１９、２３及び３０のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【請求項１２】
さらに枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている、請求項１〜１１のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【請求項１３】
前記枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、請求項１２記載の枯草菌変異株：
（ｇ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号９に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号９、３１及び３２のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、請求項１２記載の枯草菌変異株。
【請求項１５】
さらに枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている、請求項１〜１４のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【請求項１６】
前記枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ｍ）〜（ｒ）からなる群より選択される、請求項１５記載の枯草菌変異株：
（ｍ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列と少なくとも５８％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも５６％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号１１及び３３〜３６のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、請求項１５記載の枯草菌変異株。
【請求項１８】
枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を強化し、かつ
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する、
ことを含む、方法。
【請求項１９】
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子を欠失又は不活性化する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子を欠失又は不活性化する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも前記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子と、前記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子とを組み合わせて発現強化する、請求項１８〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ又はそれに相当する遺伝子、前記ｐｇｓＣ又はそれに相当する遺伝子、前記ｐｇｓＡ又はそれに相当する遺伝子、及び前記ｐｇｓＥ又はそれに相当する遺伝子の発現を強化する、請求項１８〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
さらに枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化することを含む、請求項１８〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
さらに枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化することを含む、請求項１８〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の枯草菌変異株を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸生産能を有する枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いたポリ−γ−グルタミン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−γ−グルタミン酸（ＰＧＡ）は、グルタミン酸のγ−位のカルボキシル基とα−位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。また、ポリ−γ−グルタミン酸はγ-ポリグルタミン酸と呼称される場合もある。ポリ−γ−グルタミン酸は、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から有用な高分子素材として近年注目されている。
【０００３】
ＰＧＡを生産する微生物としては、納豆菌を含む一部のバチルス（Bacillus）属細菌（Bacillus subtilis var.chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる。一方、納豆菌は分類学上では枯草菌に含まれるが、枯草菌の中には、Bacillus subtilis 168株のようにＰＧＡ生産が検出されないものもある。
【０００４】
納豆菌を含む多くのBacillus属細菌において、ＰＧＡ合成酵素をコードする遺伝子は、ｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、及びｐｇｓＥ遺伝子である。これらの遺伝子は、同一の転写開始制御領域の下流に存在し、クラスター構造（オペロン）を構成している（例えば、非特許文献１〜４参照）。ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子群にコードされる酵素ＰｇｓＢＣＡＥそれぞれのＰＧＡ合成機構における機能が報告又は推定されている（非特許文献１、４〜９）。
【０００５】
非特許文献１では、ＰＧＡ生産能を有する納豆菌（ＩＦＯ１６４４９株）において、ｐｇｓＢ遺伝子（ｙｗｓＣ遺伝子と別称）欠損株、ｐｇｓＣ遺伝子（ｙｗｔＡ遺伝子と別称）欠損株及びｐｇｓＡ遺伝子（ｙｗｔＢ遺伝子と別称）欠損株を構築し、それぞれの欠損株におけるＰＧＡ生産能を検証している。この非特許文献１では、ＰＧＡ生産能を有する納豆菌において、ＰＧＡ生産にはｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子が必須であり、さらに最大のＰＧＡ高生産を得るためにはｐｇｓＡ遺伝子が必要であると推論されている。非特許文献１０には、染色体上のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子及びｐｇｓＡ遺伝子を欠損した枯草菌に、ｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子及びｐｇｓＡ遺伝子から選ばれる遺伝子を単独で若しくは複数組み合わせて発現するベクターを導入した変異株においてＰＧＡの生産性を調べた結果が報告されている。この非特許文献１０では、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ遺伝子及びｐｇｓＡの全ての遺伝子が発現しなければＰＧＡが生産されないと結論されている。
【０００６】
他方、特許文献１には、枯草菌野生株にｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株が高いＰＧＡ生産性を有すること、一方で、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡの全ての遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株ではＰＧＡ生産性が低いことが記載されている。さらに特許文献１には、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子に相当する、枯草菌以外の微生物に由来するｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子を枯草菌株に導入した場合にも同様の効果が得られることが示されている。また特許文献２には、ａｃｋＡ遺伝子、ａｃｏＡ遺伝子、ａｃｏＢ遺伝子等から選ばれる１以上の遺伝子が欠失又は不活性化されている宿主枯草菌株にｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株は、同じ宿主株にｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡの全ての遺伝子が連結されたベクターを導入して得られた組換え株と比べて、ＰＧＡ生産性が高いことが記載されている。
【０００７】
特許文献３には、ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌変異株が、プロテアーゼ等の酵素の生産性に優れていることが記載されている。特許文献４には、特許文献３記載のゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌変異株において、ＰＧＡ合成に関与する枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子を導入し、ただしｐｇｓＡ遺伝子は導入しないことにより、該枯草菌のＰＧＡ生産性が向上することが記載されている。
【０００８】
特許文献５には、コリネバクテリウム属微生物において、ピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子の発現を高めて当該酵素の活性を増加させることにより、グルタミン酸産生が向上することが記載されている。特許文献６には、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌の細胞内のピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強することによる、効率のよいＬ−グルタミン酸の製造方法が記載されている。特許文献７には、グルタメートシンターゼ及び／又はグルタミンシンセターゼ活性、ならびにグルタメートデヒドロゲナーゼ活性が低減化され、さらにラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減化されているか又はピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強されているコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属細菌において、コハク酸等の非アミノ有機酸の生成が増加することが記載されている。しかし、この変異微生物は、コハク酸等の非アミノ有機酸の生産のために開発された株である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−０８９７０８号公報
【特許文献２】特開２０１０−２１３６６４号公報
【特許文献３】特開２００７−１３００１３号公報
【特許文献４】特開２０１３−２５２１１５号公報
【特許文献５】特表２００２−５０８９２１号公報
【特許文献６】特開２０００−２０１６９２号公報
【特許文献７】特開２００５−１６８４０１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Bacteriol., 2002, 184:337-343
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 263:6-12
【非特許文献３】Microbiology, 1997, 143:3313-3328
【非特許文献４】Molecular Microbiology, 2006, 65:1091-1098
【非特許文献５】Eur. J. Biochem., 2001, 268:5321-5328
【非特許文献６】未来材料, 2003, 3:44-50
【非特許文献７】Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63:2034-2037
【非特許文献８】微生物利用の大展開, 第１章４節, 2002, pp.657-663
【非特許文献９】Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108:226-223
【非特許文献１０】Biosci. Biotechnol. Biochem., 2006, 70:1794-1797
【非特許文献１１】J. Biosience and Bioengineering, 2006, 102:60-65
【非特許文献１２】J Chem Technol Biotechnol., 2013 Published online in Wiley Online Library
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸（以下の本明細書においてＰＧＡとも称する）を高生産することができる枯草菌変異株、当該枯草菌変異株の製造方法、及び当該枯草菌変異株を用いたＰＧＡの製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ＰＧＡを効率良く生産することができる微生物株の開発を進めた。その結果、本発明者は、野生株に比べてゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株において、枯草菌ポリ−γ-グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化し、さらにアルファ−アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ遺伝子）及びアルファ−アセトラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｌｓＤ遺伝子）からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化することにより、得られた枯草菌変異株が顕著に高いＰＧＡ生産能を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、一態様において、以下を提供する：
枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が強化されており、
かつ
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、
枯草菌変異株。
【００１４】
別の態様において、本発明は以下を提供する：
枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を強化し、かつ
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する、
ことを含む、方法。
【００１５】
また別の態様において、本発明は、上記枯草菌変異株を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の枯草菌変異株は高いＰＧＡ生産能を有する。本発明の枯草菌変異株を用いることによりＰＧＡを効率良く製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。
【図２】枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。
【図３】ｍａｚＦ遺伝子融合カセットを使用したマーカーフリー欠失法の手順を示す模式図。
【図４】枯草菌変異株へのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の導入手順及び導入位置に関する一実施形態を示す模式図。
【図５】ＰＧＡ組換え生産用ベクターの構築手順の例示的実施形態。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（１．定義）
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２０】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
【００２１】
本明細書において、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上若しくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２２】
本明細書において、遺伝子の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点からの上流領域及び下流領域には限定されない。
【００２３】
本明細書において、遺伝子の制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。本明細書において、遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域を含む。転写開始制御領域は制御領域及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。
【００２４】
本明細書において、目的遺伝子の発現強化とは、改変前に比較して目的遺伝子の発現量を増加させることである。目的遺伝子の発現量を増加させる手段としては、例えば、ゲノム上の目的遺伝子に、野生型に比較して該遺伝子の発現を強化できる制御領域（強制御領域）を作動可能に連結すること、強発現制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に導入すること、又は複数の目的遺伝子を細胞内に発現可能に存在させる改変などが挙げられる。複数の目的遺伝子を細胞内に発現可能に存在させる改変としては、複数個の目的遺伝子を、必要に応じて作動可能に連結した制御領域と共に、細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって細胞内で発現する目的遺伝子の数を増加させる改変を挙げることができる。
【００２５】
本明細書において、目的遺伝子と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
【００２６】
本明細書において、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子とは、ＰＧＡ合成に関与する枯草菌遺伝子群を構成するｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子及びｐｇｓＥ遺伝子のうちのいずれか１つ以上をいう。ｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子及びｐｇｓＥ遺伝子は、同一の転写開始制御領域の下流に存在し、クラスター構造（オペロン）を構成している（例えば、非特許文献１〜４参照）。例えば、納豆菌においては、ＰＧＡは、ＰｇｓＢＣＡＥと称される膜結合型酵素系によってリボソーム非依存的に生産される。
【００２７】
枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子は、ｙｗｓＣ遺伝子とも称され、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＰｇｓＢ（ＹｗｓＣと別称）をコードする。ＰｇｓＢ（ＹｗｓＣと別称）はグルタミン酸におけるγ−位のカルボキシル基に作用するアミドリガーゼ反応に関与することが知られている（例えば、非特許文献１及び５参照）。
【００２８】
枯草菌ｐｇｓＣ遺伝は、ｙｗｔＡ遺伝子とも称され、配列番号３に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＰｇｓＣ（ＹｗｔＡと別称）をコードする。ＰｇｓＣ（ＹｗｔＡと別称）は膜結合型タンパク質で、ＰＧＡの細胞外への排出に関与すること（非特許文献１）、ＰｇｓＢと共存してグルタミン酸の連結反応に関わっていること（非特許文献５及び６）が推定されている。
【００２９】
枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子は、ｙｗｔＢ遺伝子とも称され、配列番号５に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＰｇｓＡ（ＹｗｔＢと別称）をコードする。ＰｇｓＡ（ＹｗｔＢと別称）は、ＰＧＡの排出に関わると推定されている（非特許文献５及び６）。
【００３０】
枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子は、配列番号７に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＰｇｓＥ（ＹｗｔＣと別称）をコードする。ＰｇｓＥ（ＹｗｔＣと別称）は、ＰＧＡ生産菌であるBacillus anthracisの膜結合タンパク質ＣａｐＥと同様な機能を有することが推定されている（非特許文献４）。亜鉛存在条件でのＰｇｓＥ発現誘導により、Bacillus subtilis subsp. chungkookjang株においてＰＧＡ生産性が向上することが報告されている（非特許文献９）。
【００３１】
本明細書におけるタンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸、及びＡＴＰ又はＧＴＰを基質とし、これに塩化マンガンを加えた反応溶液中におけるＰＧＡの生成を検出することにより測定することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００２，１８４：３３７−３４３）。また本明細書における、上述の枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子を、上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とともに枯草菌又はその変異株に導入した際に、当該株におけるＰＧＡの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。所定の微生物におけるＰＧＡ生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するＰＧＡ生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＧＡを検出する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，６０：２５５−２５８）；酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：１６８４−１６８７）；培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２６３：６−１２）；ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７：１２１２−１２１３）等によって行うことができる。
【００３２】
本明細書において、上述のｐｇｓＣ又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能」とは、枯草菌又はその変異株にて上記ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子とともに当該ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子を発現させた際に、当該株にＰＧＡを生産させる能力であり得る。このことは、ｐｇｓＢ遺伝子を単独で発現させた株ではＰＧＡが生産されず、ｐｇｓＢ遺伝子とともにｐｇｓＣ遺伝子を発現させた株ではＰＧＡが生産されるという本発明者らが見出した知見に基づいている。
【００３３】
本明細書において、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子とは、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子をいう。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子は、配列番号９に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質ＰｇｄＳ（ＹｗｔＤと別称）をコードする。ＰｇｄＳ（ＹｗｔＤと別称）は、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群の下流に存在し、γアミド結合を切断するエンド型ペプチダーゼとして知られている（非特許文献１１）。また近年の報告では、Bacillus licheniformis  ＷＸ−０２株においてｐｇｄＳ遺伝子の発現を強化することにより、生産されるＰＧＡを低分子量体となり、またＰＧＡ生産性が向上することが報告されている（非特許文献１２）。
【００３４】
本明細書において、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性とは、下記式（１）に示すピルビン酸からオキサロ酢酸への転換反応を触媒する活性であり、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子とは、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子である。
【化１】
2015213467.tif 000002
【００３５】
本明細書において、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子とは、枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子をいう。枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子は、配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする。
【００３６】
（２．本発明の枯草菌変異株の製造）
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、枯草菌ポリ−γ-グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されており、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、枯草菌ポリ−γ-グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化する改変と、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化させる改変とを加えることによって作製することができる。
【００３７】
（２−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株）
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（例えば、Bacillus subtilis Marburg No.168；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失している。好ましくは、当該枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している。このような枯草菌変異株の例としては、特開２００７−１３００１３号公報に記載の枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる。
【００３８】
上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、例えば、１６８株等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌１６８株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ  ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（[www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。
【００３９】
あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。
【００４０】
【表１】
2015213467.tif 000003
【００４１】
ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。
【００４２】
まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ'の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ'の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。
【００４３】
次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ'、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ'を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。
【００４４】
上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。
【００４５】
上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。
【００４６】
次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。
【００４７】
次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。
【００４８】
ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてｃｈｐＡ遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報を参照）。
【００４９】
以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。
【００５０】
（２−２．遺伝子の欠失又は不活性化）
本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が欠失又は不活性化されている。
【００５１】
より好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されており、かつａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子が欠失又は不活性化されている。より好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されており、かつａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化されている。
【００５２】
さらに好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が欠失又は不活性化されており、かつａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子が欠失又は不活性化されている。さらに好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が欠失又は不活性化されており、かつａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化されている。
【００５３】
ａｌｓＳ遺伝子、ａｌｓＤ遺伝子、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子はいずれも、有機酸合成に関わる枯草菌遺伝子である。ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子は、ａｌｓＳＤ遺伝子群として１つのオペロンを形成している。本発明の枯草菌変異株において欠失又は不活性化され得る遺伝子のＢＳＯＲＦ  ＤＢにおける登録番号及びコードするタンパク質を以下の表２に示す。当業者は、当該ＢＳＯＲＦ  ＤＢの情報に基づいて、親株における上記遺伝子を同定することができる。
【００５４】
【表２】
2015213467.tif 000004
【００５５】
上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記（２−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株）にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したＢＳＯＲＦ  ＤＢにて確認することができる。
【００５６】
（２−３．遺伝子発現強化）
（２−３−１．ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子）
本発明の枯草菌変異株においては、さらに、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている。本発明で発現強化される枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、好ましくは、少なくとも枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。
【００５７】
枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％、例えば、５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５８】
枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％、例えば、５９％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５９】
枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％、例えば、４８％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００６０】
枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％、例えば、３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００６１】
また、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ、及びｐｇｓＥの各遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ合成に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、ＰＧＡ生産性微生物であってもＰＧＡ非生産性微生物であってもよく、例えば、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus pumilus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis等のバチルス属微生物、およびNatrialba aegyptiaca、Hydra、Oceanobacillus iheyensisなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１、３、５又は７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１、３、５又は７で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子を同定することができる。
【００６２】
例えば、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＢ遺伝子、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＢ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens ＦＺＢ４２株のｙｗｓＣ遺伝子、及びOceanobacillus iheyensis ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０１遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＢ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９９．９％、７８％、８１％及び６２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９９．７％、８９％、９３％及び５５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
【００６３】
また例えば、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＣ遺伝子、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＣ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens ＦＺＢ４２株のｙｗｔＡ遺伝子、及びOceanobacillus iheyensis ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０２遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＣ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ１００％、７８％、８３％及び５９％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ１００％、８９％、９３％及び５１％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
【００６４】
また例えば、Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＡ遺伝子、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＡ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens ＦＺＢ４２株のｙｗｔＢ遺伝子、及びOceanobacillus iheyensis ＨＴＥ８３１株のＯＢ２９１７遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＡ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ１００％、６８％、７５％及び４８％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ１００％、６７％、７８％及び３０％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。
【００６５】
また例えば、Bacillus licheniformis ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＥ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens ＦＺＢ４２株のｐｇｓＥ遺伝子、及びBacillsu anthracis Ｈ９４０１株のｃａｐＥ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＥ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ６３％、７６％及び５１％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ４７％、７２％及び３５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。
【００６６】
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢＣＡＥに相当するバチルス属または他の属に属する微生物の遺伝子の具体的な例としては、下記表３に示す遺伝子が挙げられる。
【００６７】
【表３】
2015213467.tif 000005
【００６８】
好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）、（ａ'）〜（ｆ'）、（ａ''）〜（ｆ''）及び（ａ'''）〜（ｆ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、少なくとも上記（ａ）〜（ｆ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ａ'）〜（ｆ'）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせを含む。また好ましくは、発現強化される遺伝子は、上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、少なくとも上記（ａ）で表した遺伝子と、（ａ'）で表した遺伝子との組み合わせを含む。さらに好ましくは、発現強化される遺伝子は、上記（ａ）及び（ａ'）で表した遺伝子の組み合わせであるか、又は上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子の組み合わせである。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ポリ−γ-グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、配列番号１、３、５、７及び１３〜３０のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つであり、好ましくは、少なくとも配列番号１、１３、１６、２０、２４及び２７のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号３、１４、１７、２１、２５及び２８のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせを含む。より好ましくは、発現強化される遺伝子は、配列番号１、１３、１６、２０、２４及び２７のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号３、１４、１７、２１、２５及び２８のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号５、１５、１８、２２、２６及び２９のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号７、１９、２３及び３０のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせである。
【００７０】
（２−３−２．ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子）
本発明の好ましい実施形態において、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化された本発明の枯草菌変異株においては、さらに枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている。本発明で発現強化される枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である。従来の微生物を用いたＰＧＡ生産法では、微生物がＰＧＡを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やＰＧＡの生産性に悪影響が及ぶ場合があった。一方、本発明によれば、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化することで、低分子化されたＰＧＡが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、ＰＧＡを高生産に伴う上記課題を解決することができる。
【００７１】
枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ｇ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号９に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％、例えば、５７％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７２】
枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ分解に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号９で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Bacillus licheniformis  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号３１）及びBacillus amyloliquefaciens ＦＺＢ４２株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号３２）が挙げられる。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、上記（ｇ）〜（ｌ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、上記（ｇ）で表した遺伝子である。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、配列番号９、３１及び３２のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つである。
【００７５】
（２−３−３．ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子）
本発明の別の好ましい実施形態において、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化された本発明の枯草菌変異株においては、さらに枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている。本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株においては、上記枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子と、上記枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はそれに相当する遺伝子と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現がいずれも強化されている。本発明で発現強化される枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である。
【００７６】
枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ｍ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列と少なくとも５８％、例えば、５８％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも５６％、例えば、５６％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７７】
枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子に相当する遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号１１で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Bacillus licheniformis  ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｙｃＡ（配列番号３３）、Bacillus clausii由来のｐｙｃＡ（配列番号３４）、Bacillus amyloliquefaciens  ＤＭＳ７株のｐｙｃＡ（配列番号３５）、及びClostridium acetobutylicum  ＤＳＭ１７３１株のｐｙｃ（配列番号３６）を挙げることができる。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、上記（ｍ）〜（ｒ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、上記（ｍ）で表した遺伝子である。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子は、配列番号１１及び３３〜３６のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つである。
【００８０】
（２−３−４．目的遺伝子発現の強化）
上述したゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株（親株）において、目的とする枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、又はそれらに相当する遺伝子（以下、目的遺伝子）の発現を強化する手段としては、例えば、親株のゲノム上で、野生型に比較し発現を強化できる制御領域（強制御領域）と目的遺伝子とを作動可能に連結して配置すること；及び、制御領域、好ましくは強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を、親株細胞のゲノム中若しくはプラスミド中に導入すること、などが挙げられる。
【００８１】
例えば、親株のゲノム上の目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の制御領域配列を強制御領域に置換することによって、該目的遺伝子の発現を強化することができる。あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって該目的遺伝子の発現を強化することができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により、該目的遺伝子の発現を強化することもできる。
【００８２】
目的遺伝子の発現強化のための手順の一例を以下に記載する。まず、目的遺伝子が制御領域と作動可能に連結され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片を構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ｒｒｎＯオペロン制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。次いで、このＤＮＡ断片を親株に導入すれば、親株ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。
【００８３】
目的遺伝子の発現強化のための手順の別の例を以下に記載する。まず、制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子）の順で配置したＤＮＡを含むベクターを調製する。次いで、このベクターを親株に導入すれば、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。
【００８４】
本発明において目的遺伝子の発現強化に使用され得る制御領域は、好ましくは、宿主内において下流の目的遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流の目的遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域である。また好ましくは、目的遺伝子の野生型の制御領域と比較して、目的遺伝子の発現を強化することができる制御領域（強制御領域）である。
【００８５】
本発明において枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子、又はそれらの相当遺伝子の発現強化に使用され得る制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域、ｔｕｆＡ遺伝子制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が例示されるが、これらに限定されない。
【００８６】
あるいは、本発明において枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子、又はそれらの相当遺伝子の発現強化に使用され得る制御領域の好ましい例として、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流０．４〜１．０ｋｂ領域（配列番号３７）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が挙げられる。
【００８７】
好ましくは、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子（ｐｇｓＢＣ遺伝子）又はその相当遺伝子に対しては上記ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子の制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群全て（ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）又はその相当遺伝子群全てに対してはｒｒｎＯオペロン制御領域が、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子又はその相当遺伝子に対してはｔｕｆＡ遺伝子制御領域が使用される。
【００８８】
本発明においてピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はその相当遺伝子の発現強化に使用され得る制御領域の例としては、バシラス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｌＳ遺伝子等）の制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が例示されるが、特に限定されない。
【００８９】
目的遺伝子又は制御領域の親株への導入に使用されるベクターは、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターであればよい。ベクターの種類は、適宜選択することができるが、親株内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が親株のゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下であれば良く、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下であれば良い。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００９０】
目的遺伝子又は制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的遺伝子及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、目的遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、目的遺伝子の断片の順で連結されているようにする。
【００９１】
発現を強化するポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子がｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子とｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせの場合は、親株に導入するＤＮＡ断片やベクター上において、上流から制御領域断片、ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子の断片、次いでｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにするとよい。
【００９２】
親株へのＤＮＡ断片又はベクターの導入は、例えばプロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）やコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６３，８６：３９２−４００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）などの通常の手法に従って行うことができる。
【００９３】
以上の手順で、ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有し、枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されており、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、本発明の枯草菌変異株を作製することができる。本発明の枯草菌変異株の製造方法においては、最終的に得られた微生物において、上述したゲノムの大領域の欠失、所定の遺伝子の欠失又は不活性化、及び目的遺伝子の発現強化が達成されていればよく、ゲノムや遺伝子の欠失又は不活性化、及び遺伝子の発現強化を行う順序は特に限定されない。例えば、本発明の枯草菌変異株は、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で目的遺伝子を発現強化し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化して製造されてもよく、あるいは、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化し、次いで上述した手順で目的遺伝子を発現強化して製造されてもよい。
【００９４】
（３．本発明の枯草菌変異株を用いたＰＧＡ生産）
本発明の枯草菌変異株は、親株となるゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株、又は該親株に対し枯草菌ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子の発現を強化した枯草菌変異株と比べて、高いＰＧＡ生産能を有している。本発明の枯草菌変異株を培養することによって当該菌外に効率よくＰＧＡが生産されるため、ＰＧＡを効率よく生産することが可能になる。したがって、本発明の別の態様は、上述した本発明の枯草菌変異株を用いるＰＧＡの製造方法に関する。
【００９５】
本発明のＰＧＡの製造方法においては、先ず、適切な培地において上記本発明の組換え枯草菌を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。当該培地は、合成培地であっても天然培地であってもよい。
【００９６】
本発明のＰＧＡの製造方法において、必ずしも培地にグルタミン酸を添加する必要はないが、ＰＧＡの生産性をより向上させるために、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養することができる。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、ＰＧＡの生産性向上の点から、０．００５ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度６００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００９７】
培養条件として、至適温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、より好ましくは５〜８である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは１〜１０日間であり、より好ましくは１〜５日間である。培養は、特に限定されないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。
【００９８】
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた菌体と分離する必要がある。ＰＧＡを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。
【００９９】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【０１００】
＜１＞枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が強化されており、
かつ、
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、
枯草菌変異株。
【０１０１】
＜２＞好ましくは、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が欠失又は不活性化されている、＜１＞記載の枯草菌変異株。
【０１０２】
＜３＞好ましくは、さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子が欠失又は不活性化されている、＜２＞記載の枯草菌変異株。
【０１０３】
＜４＞好ましくは、さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失又は不活性化されている、＜２＞記載の枯草菌変異株。
【０１０４】
＜５＞好ましくは、少なくとも上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子とが組み合わせて発現強化されている、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【０１０５】
＜６＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【０１０６】
＜７＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と６２％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１０７】
＜８＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ'）〜（ｆ'）からなる群より選択される、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％以上、より好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１０８】
＜９＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ''）〜（ｆ''）からなる群より選択される、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１０９】
＜１０＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ'''）〜（ｆ'''）からなる群より選択される、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株：
（ａ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％以上、より好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１１０】
＜１１＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号１、１３、１６、２０、２４及び２７のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号３、１４、１７、２１、２５及び２８のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号５、１５、１８、２２、２６及び２９のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号７、１９、２３及び３０のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【０１１１】
＜１２＞好ましくは、さらに枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている、＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【０１１２】
＜１３＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、＜１２＞記載の枯草菌変異株：
（ｇ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号９に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１１３】
＜１４＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号９、３１及び３２のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、＜１２＞記載の枯草菌変異株。
【０１１４】
＜１５＞さらに枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現が強化されている、＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
【０１１５】
＜１６＞好ましくは、上記枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ｍ）〜（ｒ）からなる群より選択される、＜１５＞記載の枯草菌変異株：
（ｍ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１１６】
＜１７＞好ましくは、上記枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号１１及び３３〜３６のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、＜１５＞記載の枯草菌変異株。
【０１１７】
＜１８＞枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において
枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ及びｐｇｓＥ、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を強化し、かつ
ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する、
ことを含む、方法。
【０１１８】
＜１９＞好ましくは、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子を欠失又は不活性化する、＜１８＞記載の方法。
【０１１９】
＜２０＞好ましくは、さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子を欠失又は不活性化する、＜１９＞記載の方法。
【０１２０】
＜２１＞好ましくは、さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化する、＜１９＞記載の方法。
【０１２１】
＜２２＞好ましくは、少なくとも上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子とを組み合わせて発現強化する、＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
【０１２２】
＜２３＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子、及び上記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化する、＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。
【０１２３】
＜２４＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と６２％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１２４】
＜２５＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ'）〜（ｆ'）からなる群より選択される、＜１８＞〜＜２４＞のいずれか１項記載の方法：
（ａ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％以上、より好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でポリ−γ−グルタミン酸を生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１２５】
＜２６＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ''）〜（ｆ''）からなる群より選択される、＜１８＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の方法：
（ａ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１２６】
＜２７＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ａ'''）〜（ｆ'''）からなる群より選択される、＜１８＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の方法：
（ａ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％以上、より好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１２７】
＜２８＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号１、１３、１６、２０、２４及び２７のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号３、１４、１７、２１、２５及び２８のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号５、１５、１８、２２、２６及び２９のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子であり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号７、１９、２３及び３０のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１項記載の方法。
【０１２８】
＜２９＞好ましくは、さらに枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化することを含む、＜１８＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の方法。
【０１２９】
＜３０＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、＜２９＞記載の方法：
（ｇ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号９に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつポリ−γ−グルタミン酸分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１３０】
＜３１＞好ましくは、上記枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号９、３１及び３２のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、＜２９＞記載の方法。
【０１３１】
＜３２＞好ましくは、さらに枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子の発現を強化することを含む、＜１８＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の方法。
【０１３２】
＜３３＞好ましくは、上記枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記（ｍ）〜（ｒ）からなる群より選択される、＜３２＞記載の方法：
（ｍ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１３３】
＜３４＞好ましくは、上記枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、配列番号１１及び３３〜３６のいずれかに示すヌクレオチド配列からなる遺伝子である、＜３２＞記載の方法。
【０１３４】
＜３５＞＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の枯草菌変異株、又は＜１８＞〜＜３４＞のいずれか１項記載の方法で製造された枯草菌変異株を用いるポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
【０１３５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３６】
（実施例１）菌株の構築
（１−１）トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特開２００７−１３００１３号公報）におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の元株である枯草菌１６８株は、遺伝子型としてｔｒｐＣ２を所持している。つまり１６８株はトリプトファン合成に関与するインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードするｔｒｐＣ遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株はトリプトファン非要求性であることが知られている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９,１４５（Ｐｔ１２）：３３１９−３３２０）。枯草菌１６８株とＡＴＣＣ６０５１Ｔ株のｔｒｐＣ遺伝子を比較したところ、３２８番目から３３０番目のヌクレオチドＡＴＴが枯草菌１６８株では存在しないことがわかった。そこで、ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株ゲノムを鋳型とし、表４記載のｔｒｐＣ＿Ｆ１及びｔｒｐＣ＿Ｒ１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を構築した。このＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株をコンピテント法で形質転換し、トリプトファン非添加のＳＭＡ寒天培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素２カリウム、０．６％リン酸２水素カリウム、０．１％クエン酸３ナトリウム-２水和物、０．５％グルコース、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性ＭＧＢ８７４Ｔ株を得た。
【０１３７】
（１−２）ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築
上記（１−１）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ株を宿主として、ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
【０１３８】
始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１及びａｌｓＳＤ−ＤＲ１を用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群の開始コドン上流に隣接する領域である断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ２及びａｌｓＳＤ−ＤＲ２を用いて、ａｌｓＤ遺伝子遺伝子の停止コドン下流の領域である断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＩＦ及びａｌｓＳＤ−ＩＲを用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群ＯＲＦ内と相同領域である断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）を鋳型とし、表４記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。
【０１３９】
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｃ）をこの順となる様に表４記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１及びａｌｓＳＤ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ株の形質転換を行い、ＩＰＴＧを含まずスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１４０】
最後に、ｍａｚＦ遺伝子カセットを除くため、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上で培養し、生育したコロニーを選択した。得られた変異株は、断片（Ｂ）において細胞内相同組換えによりｍａｚＦカセットが除去された変異株となる（以下、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株と称する）。ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株はゲノム上のａｌｓＳ遺伝子開始コドンからａｌｓＤ遺伝子停止コドン領域が欠失し、更に薬剤選択マーカーが除去された変異を有する枯草菌変異株である。本実施例でのｍａｚＦ遺伝子カセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築したａｌｓＳＤ遺伝子群欠失方法を図３に示した。
【０１４１】
得られた形質転換体ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７４：５４６３）によるシークエンシングによって、ゲノム上のａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失が生じていることを確認した。
【０１４２】
（１−３）ａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築
上記（１−２）で構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株を宿主として、上述の手法と同様に、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失された変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築を行った。
【０１４３】
ａｃｋＡ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表４記載のプライマーａｃｋＡ−ＤＦ１及びａｃｋＡ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表４記載のプライマーａｃｋＡ−ＤＦ２及びａｃｋＡ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表４記載のプライマーａｃｋＡ−ＩＦ及びａｃｋＡ−ＩＲを、それぞれ使用した。
【０１４４】
ｐｔａ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表４記載のプライマーｐｔａ−ＤＦ１及びｐｔａ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表４記載のプライマーｐｔａ−ＤＦ２及びｐｔａ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表４記載のプライマーｐｔａ−ＩＦ及びｐｔａ−ＩＲを、それぞれ使用した。
【０１４５】
ｙｄａＰ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表４記載のプライマーｙｄａＰ−ＤＦ１及びｙｄａＰ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表４記載のプライマーｙｄａＰ−ＤＦ２及びｙｄａＰ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表４記載のプライマーｙｄａＰ−ＩＦ及びｙｄａＰ−ＩＲを、それぞれ使用した。
【０１４６】
ｌｄｈ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表４記載のプライマーｌｄｈ−ＤＦ１及びｌｄｈ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表４記載のプライマーｌｄｈ−ＤＦ２及びｌｄｈ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表４記載のプライマーｌｄｈ−ＩＦ及びｌｄｈ−ＩＲを、それぞれ使用した。
【０１４７】
順次、欠失変異を集積させ、最終的にＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。得られた形質転換体ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。
【０１４８】
（１−４）ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が導入された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｐｙｃＡ株）の構築
ゲノム上のαアミラーゼをコードするａｍｙＥ遺伝子を分断する形で、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子ｐｙｃＡを導入するためのコンストラクトを構築した。ｐｙｃＡ遺伝子発現の制御領域として、恒常的発現制御である胞子形成に関与するｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域を用いた。
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーｎｅｗ−ａｍｙＥ−ＵＦ及びａｍｙＥ−ＵＲを用いて、ａｍｙＥ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。ｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）で枯草菌野生株１６８を形質転換した変異株を鋳型とし、表５記載のプライマーｃａｔ−Ｆ及びｎｅｗ−ａｍｙＥ−ＤＲを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｍｙＥ下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーａｍｙＥ／ＰＶＧ−Ｆ及びＰｓｐｏＶＧ−Ｒを用いて、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域の断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５記載のプライマーＰＶＧ／ｐｙｃＡ−Ｆ−２及びｐｙｃＡ／ｃａｔ−Ｒ−２を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｐｙｃＡ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【０１４９】
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｃ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｂ）をこの順となる様に表５記載のプライマーｎｅｗ−ａｍｙＥ−ＵＦ及びｎｅｗ−ａｍｙＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｐｙｃＡ株を得た。
【０１５０】
得られた形質転換体ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｐｙｃＡ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１５１】
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｐｙｃＡ株は、ゲノム上に生来のｐｙｃＡ遺伝子と、導入したＰｓｐｏＶＧ制御下の枯草菌ｐｙｃＡ遺伝子との両方を有する枯草菌変異株である。本実施例のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の導入手順及び導入位置を図４に示した。
【０１５２】
【表４】
2015213467.tif 000006
【０１５３】
【表５】
2015213467.tif 000007
【０１５４】
（１−５）ＰＧＡ組換え生産用ベクター（ｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣ）の構築
Bacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーＰ−Ｓ２３７／ＢＳｐｇｓＢ  ａｔｇ  ＦＷ及びＨｉｎｄＩＩＩ＿ＢＳｐｇｓＢＣ  ＲＶを用いて、ｐｇｓＢＣ遺伝子を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片（ＢＣ）をそれぞれ調製した。さらに、Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーＣｍ＿Ｓ２３７  ＦＷとＰ＿Ｓ２３７−ＲＶのプライマーセットを用いて、ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）プロモーター領域０．６ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＿Ｓ２３７）（配列番号３７）を調製した。
【０１５５】
次に、断片（Ｐ＿Ｓ２３７）及び（ＢＣ）を鋳型とし、Ｃｍ＿Ｓ２３７  ＦＷとＨｉｎｄＩＩＩ＿ＢＳｐｇｓＢＣ  ＲＶとのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法にて（Ｐ＿Ｓ２３７）及び（ＢＣ）を１断片化した２．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）を得た。続いて、このＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理し、それぞれを同様の制限酵素処理を施したプラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）とＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いてライゲーション反応（結合化）を行った。
【０１５６】
上記ライゲーション試料を用いて、大腸菌（ＨＢ１０１株）をコンピテントセル法にて形質転換し、選択培地で選択し、得られた菌体から組換えプラスミドを抽出した。これらを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位に目的とする上記ＤＮＡ断片（Ｐ＿ＢＣ）が挿入していることを確認した。（Ｐ＿ＢＣ）の挿入が確認された組換えプラスミドを、ＰＧＡ組換え生産用ベクターｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣとした。本実施例におけるＰＧＡ組換え生産用ベクター構築手順を図５に示す。
【０１５７】
【表６】
2015213467.tif 000008
【０１５８】
（１−６）ＰＧＡ組換え生産用ベクター（ｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣ）が導入された組換え枯草菌変異株の作製
上記（１−２）〜（１−４）で作製した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株及び枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｐｙｃＡ株を宿主とした。
上記（１−５）で作製したＰＧＡ組換え生産用ベクターｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣ（特開２００９−８９７０８）を用いて、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）により各宿主を形質転換した。テトラサイクリン−塩酸塩５０ｐｐｍを添加したＤＭ３プロトプラスト再生培地（０．５Ｍコハク酸ナトリウム（ｐＨ７．３）、０．５％カザミノ酸（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、０．３５％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１５％ ＫＨ2ＰＯ4、０．５％グルコース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ社製）、１％バクト寒天（ディフコ社製））上に生育したコロニーを目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。以上の手順により、各宿主にBacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１）のプロモーター領域及びBacillus sp．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２６２）由来のｐｇｓＢ及びｐｇｓＣ遺伝子を導入した株を得た。
【０１５９】
（１−７）ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株）の構築
始めに、先述したマーカーフリーの欠失法を用いて、枯草菌が本来ゲノム上に有するＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。
【０１６０】
実施例（１−１）にて構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、断片（Ａ）増幅には表７記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表７記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ２及びｐｇｓ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表７記載のプライマーｐｇｓ−ＩＦ及びｐｇｓ−ＩＲを、それぞれ使用した。構築した最終ＰＣＲ産物を枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株で形質転換した。得られた形質転換体（枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株）のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。
【０１６１】
次いで、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−１ｒを用いて、ｔｕｆＡ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、表７記載のプライマーｔｕｆＡ−２ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いて、ｔｕｆＡ下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーＢＳｐｇｄＳ−Ｆ及びＢＳｐｇｄＳ−Ｒを用いて、ｐｇｄＳ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣ２１３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｓｐｃ−Ｆ及びｓｐｃ−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【０１６２】
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｃ）及び断片（Ｄ）をこの順となるように表７記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて上述した枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を得た。
【０１６３】
得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株のゲノムを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１６４】
次いで、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及び表５記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＲを用いて、ａｍｙＥ上流領域の断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。ｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）で枯草菌野生株１６８を形質転換した変異株を鋳型とし、表５記載のプライマーｃａｔ−Ｆ及び表７記載のプライマーａｍｙＥ−ＤＲを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｍｙＥ下流領域の断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＲＩＫ３５６株（Ｎａｔｏｒｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００９，１９１：４５５５−４５６１）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーａｍｙＥ／ＰｒｒｎＯ−Ｆ及びＰｒｒｎＯ／ｂｓ−ｐｇｓＲを用いて、ｒｒｎＯオペロンの制御領域の断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｂｓ−ｐｇｓＦ及びｂｓ−ｐｇｓ／ｃａｔＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子群の断片（Ｄ）をＰＣＲ増幅した。
【０１６５】
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｃ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｂ）をこの順となる様に表７記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及びａｍｙＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いてＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株で形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株を得た。
【０１６６】
得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株のゲノムを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。
【０１６７】
（１−８）ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築
先述したマーカーフリーの欠失法を用いて、上記（１−７）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株を宿主として、ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失された枯草菌変異株枯草菌の構築を行った。
【０１６８】
始めに、枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株を宿主として、先述した（１−２）と同様の手法でａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失を行った。
【０１６９】
次に、（１−７）と同様の手法で、ゲノム上にＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化する変異を導入し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株を構築した。
【０１７０】
【表７】
2015213467.tif 000009
【０１７１】
（実施例２）ＰＧＡ生産性評価
実施例１にて得られた形質転換体を１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ、１５ｐｐｍテトラサイクリン）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に０．６ｍＬ（２％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。ＰＧＡ生産量は、プラスミドｐＨＹ＿ＰＳ２３７／ｐｇｓＢＣを導入した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株におけるＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。
【０１７２】
結果を表８に示す。ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株は、培養１日目で、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔと比較してＰＧＡ生産量が高かった。ａｌｓＳＤ遺伝子群に加えてａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａＡ遺伝子、ｙｄａＰＡ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株では、ＰＧＡ生産量がさらに高かった。さらに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株にピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を導入した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｐｙｃＡ株では、ＰＧＡ生産量がさらに高かった。
【０１７３】
【表８】
2015213467.tif 000010
【０１７４】
（実施例３）ＰＧＡ生産性評価２
実施例１にて得られた枯草菌変異株を５ｍＬのＬＢ培地（１．０％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ＮａＣｌ）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）に０．６ｍＬ（２％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。ＰＧＡ生産量は、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株におけるＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。
【０１７５】
結果を表９に示す。ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株は、培養１日目で、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡと比較してＰＧＡ生産量が高かった。
【０１７６】
【表９】
2015213467.tif 000011
【０１７７】
（測定例）ＰＧＡの定量分析及び分子量分析
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＰＧＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０7）及びＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０6）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムＴＳＫ  ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ  ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。溶離液には０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度は５０℃、溶出ピークの検出波長は２１０ｎｍを用いた。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり５０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ  ＳＣＲＥＥＮ  ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量８０万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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