(57)【要約】      （修正有）【課題】治療標的用の宿主遺伝子及びコードされるタンパク質を短期間で同定する方法。【解決手段】レンチウイルス又はＭＭＬＶベースのいずれかである遺伝子探索ベクターを細胞ゲノムにランダムに挿入するランダムホモ接合性遺伝子摂動（ＲＵＧＰ）技術と、そのベクター挿入部位を熱非対称インターレース（ＴＡＩＬ）ＰＣＲを組み合わせ、有望な標的の同定のための期間を、数ヶ月から数週間又はそれ以下に低下させる。インフルエンザ、ＨＩＶ、及び他のウイルス感染の潜在的な宿主標的を同定するために使用し、特定の標的（ＰＴＣＨ１、Ｒｏｂｏ１、及びＮｅｄｄ４を含む）を詳細に再検討する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患状態に対処するための治療用薬物の開発のための標的を同定する方法であって、以下：
活性化因子を発現する哺乳動物細胞の集団（該細胞が宿主ゲノムを含む）を、誘導薬剤の非存在において不活性化される誘導可能プロモーターを含む遺伝子探索ベクターを含むウイルス粒子を用いて形質導入し、それにおいて該遺伝子探索ベクターが、該宿主ゲノム中の宿主遺伝子に、宿主遺伝子に対してセンス又は反対の方向で挿入され、該誘導薬剤の存在においてセンス又はアンチセンスＲＮＡを生成し、それにより、該宿主遺伝子の発現が両方の対立遺伝子で抑制される又は該挿入により増強され、それにおいて十分な数の挿入事象が該集団において生じ、該ゲノムの実質的に全ての遺伝子座における該遺伝子探索ベクターの挿入を確実にすること；
哺乳動物細胞の形質導入集団を検証し、該疾患状態に固有の表現型を示す細胞を同定すること；
該遺伝子探索ベクター（ＧＳＶ）の挿入点での各遺伝子配列を、該疾患状態に固有の表現型を示す細胞において同定すること；及び
該ＧＳＶの挿入点での各々の該遺伝子配列を特徴付け、該挿入により該ゲノムの摂動が、該遺伝子配列の過剰発現又は低下発現を起こしているか否かを決定し、それにおいて該配列が、該疾患状態に対処するための治療用薬物の開発のための標的として同定されること
を含む、方法。
【請求項２】
ＧＳＶの挿入点での遺伝子配列が、熱非対称インターレースポリメラーゼ連鎖反応（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）の使用により特徴付けられる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
疾患状態に固有の表現型を示す摂動細胞の同定に続き、該細胞を誘導薬剤の非存在において増殖させ、該誘導薬剤の非存在において該疾患状態に固有の該表現型を示さない細胞だけを、標的を同定する目的のためにさらに考慮する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ウイルス粒子が、ＧＳＶを用いてトランスフェクションされたレンチウイルス又はＧＳＶを用いてトランスフェクションされたサルマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）のいずれかに基づく、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ウイルスが、自己不活性化しており、ＧＳＶが、その挿入点から脱することができない、請求項４記載の方法。
【請求項６】
疾患状態に固有の表現型が、ウイルスにより攻撃された場合での生存であり、細胞を誘導薬剤の非存在において増殖させ、該ウイルスにより攻撃された場合、それらが生き残らない、請求項３記載の方法。
【請求項７】
ウイルスが、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、又はパラインフルエンザウイルスである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
疾患状態に固有の表現型が、腫瘍細胞による転移特徴の獲得である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
疾患状態に固有の表現型が、有毒化学療法薬物に対する耐性である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
疾患状態に固有の表現型を示す摂動細胞の同定に続き、該細胞を誘導薬剤の非存在において及び有毒化学療法薬物の存在において増殖させ、該誘導薬剤の非存在において該有毒化学療法薬物に対して耐性である細胞を、治療用薬物の開発のための標的を反映しないとしてさらに特徴付けない、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
形質導入が、低い感染効率（ＭＯＩ）を使用して行われ、形質導入された実質的に全ての細胞が、単一のＧＳＶ挿入事象を用いて形質導入されることを確実にする、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＭＯＩが０．２未満である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＧＳＶが、少なくとも１つの遺伝子モチーフ又は検出可能な標識を含み、形質導入に続くＧＳＶの挿入遺伝子座の同定を容易にする、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
細胞に、ＰＴＣＨ１遺伝子の発現を阻害する薬剤、又はＰＴＣＨ１によりコードされるタンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害する方法。
【請求項１５】
薬剤が、ＰＴＣＨ１タンパク質に対する抗体又はＰＴＣＨ１タンパク質に結合する小分子を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
医薬的に許容可能な担体中に懸濁されたＰＴＣＨ１タンパク質に結合する抗体を含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害するための組成物。
【請求項１７】
哺乳動物細胞において、ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、又はＳＬＣＡ２５の少なくとも１つの発現レベルを低下させることを含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害する方法。
【請求項１８】
発現が、ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、又はＳＣＬＡ２５遺伝子の発現を阻害することにより低下される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
方法が、細胞に、ＭＲＰＬ４２タンパク質、ＣＯＸ５Ａタンパク質、ＴＡＰＴ１タンパク質、又はＳＣＬＡ２５タンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が、抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞においてＲｏｂｏ１の発現レベルを低下させることを含む、哺乳動物細胞においてＨＩＶの感染性を阻害する方法。
【請求項２２】
発現が、Ｒｏｂｏ１遺伝子の発現を阻害することにより低下される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
方法が、細胞に、Ｒｏｂｏ１タンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
薬剤が、抗体である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
医薬的に許容可能な担体中に懸濁されたＲｏｂｏ１に対する抗体を含む、哺乳動物細胞においてＨＩＶの感染性を低下させる際に効果的な組成物。
【請求項２６】
哺乳動物細胞においてＮｅｄｄ４の発現レベルを低下させることを含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害する方法。
【請求項２７】
発現が、Ｎｅｄｄ４をコードする遺伝子の発現を阻害することにより低下される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
方法が、細胞に、Ｎｅｄｄ４タンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が抗体である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Ｎｅｄｄ４に対する抗体を医薬的に許容可能な担体中に含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザ感染性を低下させる際に効果的な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先データ及び参照による組み入れ
本願は、以下に対する優先権の利益を主張する：米国特許仮出願第６１／１４２，６６４号（２００９年１月６日出願）；米国特許仮出願第６１／１５３，０１２号（２００９年２月１７日出願）；米国特許仮出願第６１／１５８，０１５号（２００９年３月６日出願）；米国特許仮出願第６１／１６０，７３７号（２００９年３月１７日出願）；米国特許仮出願第６１／１７８，１１２号（２００９年５月１４日出願）；及び米国特許仮出願第６１／１８０，４５７号（２００９年５月２２日出願）；それらの全てが参照によりその全体が組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、熱非対称インターレースＰＣＲ、又はＴＡＩＬ−ＰＣＲといわれるプロセスを通じてスポットされた標的の同定と合わせた、ランダムホモ接合性遺伝子摂動（ＲＨＧＰ）による治療用宿主標的を同定するための遺伝子探索ベクターシステム（ＧＳＶ）の使用に関する。ＲＨＧＰとＴＡＩＬ  ＰＣＲとの組み合わせは、本願を通して、ＲＨＧＰといわれる。
【０００３】
ヒトゲノムの配列決定は、即時に、かつて期待された処置のための治療標的のカスケードをもたらしてこなかった。遺伝子配列の存在を知ることによって、１人（それ以上はない）が、遺伝子又は遺伝子システムが関与する表現型、又は遺伝子が細胞の進行中の進化をどのように媒介するかを特徴付けることはできない。それにもかかわらず、宿主標的の同定は、多くの研究者にとって重要性の増加する分野となっている。ウイルス疾患は、特に、ウイルス侵入者によって攻撃された哺乳動物、及び特にヒトを予防及び処置する方法を開発する人の独創性に挑戦してきた。本発明は広い適用性を有するが、本願におけ焦点は、治療介入のための宿主標的を同定するためのデバイスとしてのＲＨＧＰの有用性である。
【０００４】
ウイルスは、効果的な治療法を開発する能力を妨げてきた。部分的には、突然変異してウイルスを標的化する薬物の有効性から離れるそれらの能力のためである。ウイルスは、また、それらに対して利用可能な広いパレットの差動的な作用を有する。それらは迅速な侵入者（インフルエンザなど）である。又は、感染細胞の機構のウイルスによる乗っ取りは緩徐で、経時的に遅延されうる（ＨＩＶなど）。侵入者の標的化に対する代替物として、Functional Genetics, Inc.（本願の譲受人）は、ウイルスを標的化する治療法の設計から離れたパラダイムシフトに導いており、宿主タンパク質（例えばＴＳＧ１０１及び他の宿主タンパク質など）を標的化する抗体及び小分子治療の両方を開発している。宿主タンパク質を標的化することにより、ウイルスが突然変異して離れる圧力が低下する。ウイルスは所与の細胞に感染することができるが、しかし、そのライフサイクルのために必須の宿主タンパク質へのウイルスの接近を拒むことにより、細胞から細胞へのウイルスの伝播が予防される。
【０００５】
潜在的な宿主の治療タンパク質及び遺伝子の同定を推進するために、ある種の先端サーチエンジンが要求される：
質問は基本的なものである。問題の遺伝子、及び／又はそれがコードする産物は、ウイルス侵入者に対してある種の耐性を付与するか。質問は、本質的に、イエス／ノーの質問でありうる。他の状況において（他の疾患を伴う）、質問は異なりうる。このように、ＲＨＧＰを使用し、ヒト遺伝子（その発現がアルツハイマー患者において見出されるプラーク形成表現型と相関する）を同定してもよい。それらの結果は、米国特許出願シリアル番号１２／５６６，９５１（２００９年９月２５日出願）において報告される。種々の技術が長年にわたり開発されており、種々の疾患に関与する宿主標的を同定してきた。例示的な技術は、競合ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。例えば、Nature, Revealing the World of iRNA, 431, pp.338-342 (September, 2004)を参照のこと（参照により本明細書において組み入れられる）。低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）は、標的発見において補助するためのゲノム規模のｓｉＲＮＡライブラリーの生成のために多大な注目を受けてきた。Becket et al, Cancer Research, 69(2), (2009)。これらの方法は、同定される標的、及び関連するゲノムのある程度の事前の知識を要求する。過去十年間に、多くの生命を脅かす癌の診断及び処置における著しい進歩が目撃されてきた。進展の大部分は、癌細胞の挙動を制御する基本的機構の理解の上に築かれる。そのような知識によって、癌細胞により選択的に利用される分子変化及び調節機構に対する標的治療の合理的設計のための基礎が形成された。顕著な成功は、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））を用いた乳癌細胞上のＨＥＲ２、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））を用いた多発性骨髄腫におけるプロテオソーム、及びゲフィチニブ（Iressa（登録商標））を用いた非小細胞肺癌細胞上のＥＧＦＲの標的化を含む（Ataergin et al., 2009; Campos, 2008; Madarnas et al., 2008; Pytel et al., 2009; Yang et al., 2009）。しかし、今日開発中の合理的に設計された治療の大半では、相対的に狭い一連の標的に焦点が合わされている。この強調は、論理的には、これらの標的についての知識の増加及び同じ又は類似の分子を標的化する早い模倣薬物を刺激する既存の薬物を用いた商業的成功に続く。それにもかかわらず、これらの傾向は、本来なら、過小評価される又は未知の標的もしくは機構から生じうる飛躍的進歩の邪魔をしうる。鍵は、従って、癌細胞の薬物感受性、転移能力、及び疾患の病態生理の他の特徴を決定的に制御する標的を同定する新規手段を開発することである。
【０００６】
過去十年間に、多くの生命を脅かす癌の診断及び処置における著しい進歩が目撃されてきた。進展の大部分は、癌細胞の挙動を制御する基本的機構の理解の上に築かれる。そのような知識によって、癌細胞により選択的に利用される分子変化及び調節機構に対する標的治療の合理的設計のための基礎が形成された。顕著な成功は、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））を用いた乳癌細胞上のＨＥＲ２、ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））を用いた多発性骨髄腫におけるプロテオソーム、及びゲフィチニブ（Iressa（登録商標））を用いた非小細胞肺癌細胞上のＥＧＦＲの標的化を含む（Ataergin et al., 2009; Campos, 2008; Madarnas et al., 2008; Pytel et al., 2009; Yang et al., 2009）。しかし、今日開発中の合理的に設計された治療の大半では、相対的に狭い一連の標的に焦点が合わされている。この強調は、論理的には、これらの標的についての知識の増加及び同じ又は類似の分子を標的化する早い模倣薬物を刺激する既存の薬物を用いた商業的成功に続く。それにもかかわらず、これらの傾向は、本来なら、過小評価される又は未知の標的もしくは機構から生じうる飛躍的進歩の邪魔をしうる。鍵は、従って、癌細胞の薬物感受性、転移能力、及び疾患の病態生理の他の特徴を決定的に制御する標的を同定する新規手段を開発することである。
【０００７】
相対的に単純な生物（例えば細菌など）のゲノムでの初期の調査において、単一コピーのＤＮＡだけ、従って、標的遺伝子の単一対立遺伝子の存在が、標的遺伝子の迅速同定に役立った。標的組換え（相同組換え）により遺伝子を「ノックアウト」することによって、問題の遺伝子の機能を削除することができた。対照的に、二倍体生物（哺乳動物を含む）は、２コピーの各遺伝子を提示する。細胞中に存在する１本のＤＮＡ上の単一コピーだけを破壊することによって、遺伝子、又はそれに関連する表現型は除去されない。この問題に対する解決が、米国特許第５，６７９，５２３号（Li et al.）に提示されており、参照により本明細書において組み入れられる。それはランダムホモ接合性ノックアウト又は「ＲＨＫＯ」技術に向けられる。この方法において、遺伝子探索ベクターがゲノム中に挿入され、アンチセンス鎖の生成を起こすトランス活性化因子を保有する。このように、１本鎖中へのベクターの挿入によって１つの対立遺伝子が発現停止され、アンチセンス鎖の生成は、反対の対立遺伝子に結合し、それを不活性化又は発現停止する。
【０００８】
ＲＨＫＯに対するいくつかの限定がある。最初に、それはノックアウト効果に限定される。発現のアップレギュレーションの効果を決定し、アップレギュレーションの標的として貴重でありうる潜在的な標的を同定することができない。遺伝子（その増強された発現が重要な表現型を付与する）の発現を増強する方法については米国特許第５，２７２，０７１号を参照のこと。ＲＨＫＯ技術により提示される追加の課題は、改変細胞の複数ラウンドの培養についての必要性である。培養のために要求される時間と、変化した表現型（ここでベクターが挿入された）に関与する摂動の同定のために要求される時間の間に、多大な「ダウンタイム」がシステム中に導入される。
【０００９】
米国特許出願シリアル番号１１／９２８，３９３（Duan et al.）（参照により本明細書において組み入れられる）において、抗体を低レベルで発現する細胞において抗体の発現レベルを増強するための方法が開示され、ランダムホモ接合性遺伝子摂動、又はＲＨＧＰといわれる。この方法において、遺伝子探索ベクター、又はＧＳＶは、アンチセンスＲＮＡを生成し、それは挿入ベクターと組み合わされ、摂動されるいずれの遺伝子の発現も低下又は除去し、細胞集団にトランスフェクションするために使用される。本願の実施例は、特定の遺伝子の標的摂動を含み、再び、大部分がノックアウト技術に向けられ、増強された抗体産生（所望の表現型）という結果の検証のために特定の細胞の発現を抑制する。この技術は、また、摂動に起因する細胞を増大及び培養する必要性、及び結果として生じる遅延を含む。
【００１０】
標的サーチエンジンは、任意の特定の疾患又は表現型の型に限定されるべきではない。このように、ウイルス疾患に加えて、種々の状況（抗体発現に加えて）を想像することができ、そこでは、個人、例えばヒトなど（宿主細胞だけではない）は、改善された表現型から利益を得うる。腫瘍学での薬物開発の歴史は、癌細胞の挙動の増加する理解と共に進化してきた。薬物開発の最初の期間において、化合物ライブラリーが、腫瘍細胞の増殖又は生存の阻害について分析された。これらのアプローチは、実験室での腫瘍細胞の培養における進歩の結果として可能になった。そのような改善によって、培養された腫瘍細胞の増殖を殺す又は予防する化合物を同定するための実験的スクリーニングを開発することが可能になった。これらの評価は機能第１（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ｆｉｒｓｔ）アプローチを含み、そこでは、最終的な結果に最大の価値を、抗腫瘍活性の標的又は機構的基礎の同一性にはより少ない強調を置いた。これらのアプローチは、ハイスループットスクリーニング手順における改善を要求及び刺激し、化学構造のアレイを、新規天然産物の単離を介して、新規化学ライブラリー及び／又はその２つの組み合わせを作製することにより多様化させるための努力を促進した。結果として得られる細胞傷害性治療は、今日の本発明者らの抗腫瘍薬の武器庫の大半を含み、アルキル化剤（プラチナ化合物）、抗生物質（ドキソルビシン）、抗代謝剤（メトトレキセート、５−フルオロウラシル）、アルカロイド（ビンクリスチン）、及びタキサン（タキソル）を含む。しばしば、治療法のための標的の同一性は未知である、又は機構的基礎は後に同定された。効果的であるが、これらの細胞傷害性の抗腫瘍薬剤は、しばしば、不要な副作用を伴った。それによって長期間にわたる化合物の使用が限定されうる。これを複雑化することとして、Ｐ糖タンパク質の発現増加が、腫瘍細胞の迅速な突然変異速度と合わさって、薬物耐性腫瘍の選択を支持する傾向がある（Gottesman and Ling, 2006）。
【００１１】
実験室において腫瘍細胞を培養する能力によって、また、研究者が良性細胞と悪性細胞を区別する変化を理解し始めることができるようになり、それは標的介入の時代を予告した。悪性形質転換に寄与するがん遺伝子の理解における基本的な進歩は、次に、癌細胞の挙動（増殖、生存、及び浸潤）を支配するシグナル伝達経路の同定を促進した。この理解の改善によって、公知の標的に基づく化学療法剤の新たな生成が促進された。結果として得られる化合物は、公知の標的、例えばトポイソメラーゼ（ポドフィロトキシン）及び増殖因子又はそれらの受容体などに影響を与えた。腫瘍細胞についての改善された選択性は、より効果的で選択的な抗腫瘍薬物をもたらした。標的薬物をスクリーニング又は操作し、特定の標的を選択的に阻害したため、新たな分子医薬は、しばしば、関連する診断用薬剤を伴ったが、それは患者の適格性又は処置結果を予測したであろう。我々は標的介入のこの時代の真っ最中に依然としているが、同じ歴史的な障害（不要な副作用及び薬物耐性の獲得を含む）の多くが残存する。これを複雑化することとして、結果として得られる薬物の多くが、相対的に狭い一連の標的（例、チューブリン、増殖因子、及びキナーゼ）に焦点を合わせている。この優先順位付けは、検証された標的を集中的に研究するための必要性の論理的結果であった。しかし、意図していない結果は、研究下にある標的の着実に狭まる型であった。標的同定への種々のアプローチの開発を図１に示す。
【００１２】
疾患に対する遺伝的関連の理解の改善に伴い、癌の遺伝的基礎の増加する認識によって、腫瘍細胞のゲノム及び次にプロテオミクスサンプリングにおける興味が促された。癌細胞についての潜在的な標的を同定するための「−オミクス」の成長は、ＤＮＡ配列決定における劇的な技術的進歩と同時期に起こり、多くの注目を集め、学界及び医薬業界を、その技術への相当なインフラの投資に導いた。ゲノミクス、プロテオミクス、及び関連する戦略によって、標的の数及び幅が増加した。このように、この分野では、それ自体が、幅広い標的にあふれていることが見出され、継続的な標的発見についての認知された必要性は底に達した。しかし、「−オミクス」を使用して同定された相関関連によって、しばしば、疾患病理を起こす又はそれに寄与する標的が、疾患プロセスの副作用として生じる標的から区別されないことがますます理解された。このあいまい性は、原因と結果の周辺の問題を解決するための相当な投資を要求し、このように、新規の腫瘍学標的についての一般的な欲求を減少させてきた。なぜなら、多くの機関が、「−オミクス」研究及びその結果として得られる標的を研究するために必要とされる技術に、相当なインフラを投資していたからである。
【００１３】
したがって、潜在的な治療候補の迅速な検出のための方法を開発することが依然として当業者の目標であり、それは、同定された場合、それらの治療的な潜在力を開発する（発現低下（例、遺伝子治療）又はそれによりコードされるタンパク質のサイレンシング（リガンド結合治療）のいずれかを通じて）又は単に診断の対象とすべき遺伝子（それらの存在、又は複数コピーでの存在が、個人が、問題の遺伝子と相関する全ての表現型についての可能性の高い候補であることを示す）を同定するためのさらなる実験の対象となりうる。理想的には、この技術は、アップレギュレーションならびにダウンレギュレーションに起因する表現型を同定することが可能であるはずであり、ゲノム、又は標的遺伝子の知識は要求しない。不必要な多額のお金及び人的資源の出費を避けるために、この技術は、検証可能な潜在的標的（即ち、新たな表現型が、ゲノム自体の変化に起因し、それ自体の改変、又は攻撃状態に対する暴露のいずれかの結果ではない）を得る必要がある。それは、潜在的な候補のクローニング及び増大に起因する時間遅延を低下させる基礎に関する結果を得る必要がある。
【００１４】
発明の概要
ランダムホモ接合性遺伝子摂動（ＲＨＧＰ）は、所与の細胞集団において遺伝子をランダムに破壊するための方法であり、任意の所望の表現型のスクリーニング及びその関連遺伝子の同定を可能にする。ＲＨＧＰの能力に対して役立つのは、そのアンチセンス技術であり、それによって遺伝子の全コピーの同時不活性化が可能になる（所与の細胞において全てのコピーを無効にする反復標的化を要求する従来のノックアウトアプローチとは異なる）。さらに、ＲＨＧＰは、競合ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術よりも強力である。なぜなら、それは以下の利点を与えるからである：標的又は経路の事前の知識なしに、偏りのない方法で任意の遺伝子座に影響を与える能力；そのエピジェネティック状態（サイレンスされているか又はサイレンスされていないか）にかかわらず、任意の標的（マイクロＲＮＡを含む）又はタンパク質ドメインを過剰発現又はノックダウンする能力；表現型の即時検証のための組み込み可逆性；及び同じベクターシステムを用いてインビボで表現型を試験する能力。また、ＲＨＧＰは、ＲＮＡｉのオフターゲットの影響を受けない。なぜなら、ＲＨＧＰベクターがゲノム中に組込まれ、その活性のための基礎として相同性を使用しないからである。ＲＨＧＰは、その現在の具体化において、しかし、ＲＮＡｉと比較し、遺伝子標的を同定するために実質的により長い時間が必要である。なぜなら、それは、目的の全ての標的化された遺伝子座が細菌中にクローン化され、配列決定を通じて個々に同定されることを要求するからである。本発明において、本発明者らは、全てのＲＨＧＰ挿入標的を、ＰＣＲを使用して迅速に同定するための方法の適応について記載しており、それによりＲＮＡｉ方法論に沿った標的遺伝子発見のスピードをもたらす。この強力な技術は、ウイルス疾患又は細菌疾患と戦うための潜在的な宿主タンパク質の同定に限定されない。宿主タンパク質が関与する任意の症候群、例えば癌などを、ＲＨＧＰの強力なプロセスに供することができる。
【００１５】
ＲＨＫＯの技術の上に構築し、そこでは最初のアプローチが開発され、真核細胞が一般的に２組の染色体を有するとの事実に起因するバリアを克服した（Li and Cohen, 1996）。ＲＨＧＰでは同じ基本的アプローチを用いる。真核細胞の二倍体の性質によって、細菌経路の本発明者らの理解において非常に強力であることが証明されている標的遺伝子の単純なノックアウトベースの評価が妨げられた。ｓｉＲＮＡ（公知の標的のノックアウトに限定される）とは異なり、ＲＨＧＰベースのアプローチは、任意の標的遺伝子の両方のコピーを同時にノックダウンする能力を含み、その遺伝子の任意の事前の知識又はアノテーションに非依存的である。強力な阻害が可能である。なぜなら、組込み事象自体が、遺伝子の第１コピーをノックアウトするために十分であり、標的遺伝子のアンチセンス発現が、第２の対立遺伝子をノックダウンするためである（図２）。ＲＨＧＰが、また、遺伝子発現（全遺伝子又は個々のドメインを含む）をアップレギュレーションすることができる（図３Ａ）。今日まで、今日までにＲＨＧＰを使用して同定された標的の約半分が、センス方向での組込みを示し、残りの半分がアンチセンス組込み事象を示している。結果的に、ＲＨＧＰは、研究下にある表現型の原因となる任意の遺伝子変化についてゲノム全体を照合する手段を提供する。
【００１６】
ＲＨＧＰの中心となる特性は、固有のレンチウイルスベースの（又はサルマウス白血病ウイルスベースの）遺伝子エレメントであり、遺伝子探索ベクター（ＧＳＶ）として公知であり、それは、ゲノム全体を照合し、目的の表現型を起こす標的遺伝子を同定するように設計された。ＧＳＶはゲノム内の単一部位に組込まれ、そこで、それは誘導プロモーターを介して標的遺伝子の発現を調節する（図４）。１個の細胞当たり単一の組込みが、相対的に低い感染効率（ＭＯＩ）でＧＳＶを用いた細胞の形質導入により制御される。ベクター自体が、自己不活性化レンチウイルスＬＴＲをコードし、それは、ＧＳＶが形質導入細胞から再出現することを予防する。
【００１７】
ＧＳＶは、ゲノム中に、センス又はアンチセンスのいずれかの方向で組込まれうる。アンチセンス配置において、組込み事象自体が１つの対立遺伝子を不活性化し、アンチセンスコンストラクトの発現を促進し、それによって他の対立遺伝子上でコードされる遺伝子がノックダウンされる（図３Ａ）。反対（センス）方向に組込まれた場合、ＲＨＧＰは、標的遺伝子の過剰発現又は非発現停止を促進することができる。この結果は、遺伝子全体の単純な過剰発現を超えて拡大しうる（例、開始部位の上流での挿入）、又は、開始部位の下流に組込まれた場合、特定のドメインの過剰発現を引き起こし、それは、野生型遺伝子の機能のドミナントネガティブな阻害剤を産生しうる。そのようなものとして、ＲＨＧＰによって細胞ゲノム全体の照合ができるようになり、異なる型の標的事象を同定する。
【００１８】
ＲＨＧＰは、ＧＳＶ形質導入細胞の「ライブラリー」の構築を要求する（図３Ｂ）。このライブラリーは、ゲノム全体をカバーするＧＳＶ組込み事象（過剰発現及びアンチセンス発現の両方に関する）を含む。ＲＨＧＰは、柔軟で、分析される細胞型（リンパ系もしくは付着性）、種（ヒトもしくは非ヒト）、又は形質転換特徴（初代もしくは不死化もしくは形質転換）により偏らない。ＲＨＧＰ戦略では、内因的に有毒であるＧＳＶ形質導入事象が除かれる。例えば、重要遺伝子の発現を破壊するＲＨＧＰ形質導入事象は、宿主細胞に対して有毒でありうる。このように、これらのクローンは、ＲＨＧＰライブラリーから除去されうる。一旦形質導入されると、同じライブラリーが記録され、他のスクリーニングのために使用することができる。
【００１９】
ＲＨＧＰ−ＴＡＩＬを使用し、疾患又は不全状態に応答性でありうる種々の現象及び表現型が試験されてきた。本明細書において考察されるのは、インフルエンザに対する耐性、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び関連するＡＩＤＳ、ならびに癌に対する耐性に関与する表現型を試験するためのＲＨＧＰの使用からの種々の結果である。これらのＲＨＧＰ試験により生成された標的も追跡調査される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、標的発見方法における最近の開発を反映するチャートである。
【図２】図２は、本願の本発明の遺伝子探索ベクター（ＧＳＶ）の使用を実証する概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のＧＳＶのセンス及びアンチセンス挿入を実証する概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のＧＳＶのセンス及びアンチセンス挿入を実証する概略図である。
【図４】図４は、インフルエンザ関連標的についての完全なＲＨＧＰ研究の実施に関与する段階を描写するフローチャートである。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明において使用されるＧＳＶ  ｐＲＨＧＰ−１２ＲＳＮについての遺伝子地図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明において使用されるＧＳＶ  ｐＲＨＧＰ−１２ＲＳＮについての遺伝子地図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＴＣＨ１の同定を、ＲＨＧＰ技術によるインフルエンザの治療的阻害のための可能な標的として描写する概略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＴＣＨ１の同定を、ＲＨＧＰ技術によるインフルエンザの治療的阻害のための可能な標的として描写する概略図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＰＴＣＨ１の同定を、ＲＨＧＰ技術によるインフルエンザの治療的阻害のための可能な標的として描写する概略図である。
【図７】図７は、コントロールと比較した、ＰＴＣＨ１の阻害により起こされたウイルス産生における相対的な阻害を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、異なるＭＯＩでのＰＴＣＨ１の阻害効果のグラフ同定である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、異なるＭＯＩでのＰＴＣＨ１の阻害効果のグラフ同定である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、異なるＭＯＩでのＰＴＣＨ１の阻害効果のグラフ同定である。
【図９Ａ】図９Ａは、生物学的プロセス及び分子機能によるＲＨＧＰ同定されたインフルエンザ標的の分類を示すチャートである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、生物学的プロセス及び分子機能によるＲＨＧＰ同定されたインフルエンザ標的の分類を示すチャートである。
【図１０】図１０は、ＲＨＧＰにより同定された治療標的の阻害により起こされたウイルス産生における低下を反映するグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＨＩＶ感染を制御するための標的としてのＲｏｂｏ１の同定を例示する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＨＩＶ感染を制御するための標的としてのＲｏｂｏ１の同定を例示する。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＨＩＶ感染を制御するための標的としてのＲｏｂｏ１の同定を例示する。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＨＩＶ感染性に対する、ＲＨＧＰ同定されたＲｏｂｏ１を阻害する効果を反映する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＨＩＶ感染性に対する、ＲＨＧＰ同定されたＲｏｂｏ１を阻害する効果を反映する。
【図１３】図１３は、Ｎｅｄｄ４（抗体が産生されるエピトープ）に対する種々の抗体の生成及び感染ＭＤＣＫ細胞の表面上でのＮｅｄｄ４の同定を描写する。
【図１４】図１４は、Ｎｅｄｄ４抗体により起こされたウイルス複製の低下を実証するグラフである。
【図１５】図１５は、ＲＨＧＰを使用して癌転移を阻害するための標的の同定において取るべき段階を例示するフローチャートである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、転移癌の形成を阻害するために使用されうるＲＨＧＰにより同定された標的の重要な特徴を特定するチャートである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、転移癌の形成を阻害するために使用されうるＲＨＧＰにより同定された標的の重要な特徴を特定するチャートである。
【００２１】
発明の詳細な説明
遺伝子探索ベクター
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターは、２つの特色で来る：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）バージョン及びレンチウイルスバージョン。探索ベクターがどのようにコンストラクションされ、使用されるかを理解することが、本発明の詳細な実施を理解する際での重要な第一段階である。
【００２２】
ＭＭＬＶベクターは、それらが、遺伝子のプロモーター領域中への挿入を好むという利点を有し、それにより遺伝子全体がアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされることを確実にする。さらに、ＭＭＬＶは活性遺伝子に向かって偏っておらず、それらを相対的にランダムにゲノム全体に挿入することができる。レンチウイルスベクターは、ＭＭＬＶと比較して感染の広い宿主範囲を有しており（それらが水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質、すなわちＶＳＶ−Ｇを用いてシュードタイピングされているとの理由で）、それらは分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。しかし、それらは、それらが活発に転写された遺伝子を好む点で、それらが相対的に非ランダムに挿入されるという事実に悩まされる。レンチウイルスバージョンは、ＭＭＬＶバージョン（プロモーター領域を好む傾向がある）と異なり、遺伝子自体の内に挿入の偏りを有さない。レンチウイルスバージョンは、未知の理由で、ＭＭＬＶベクターと比較してより高い力価を一貫して産出している。
【００２３】
ＭＭＬＶベクターは、それらがいずれかの末端にＭＭＬＶ  ５’及び３’ＬＴＲ（末端反復配列）を有する点で、同じ一般構造を有し、組込み後にウイルスの非重要エレメントを自動的に切り出すために使用されるＣｒｅ遺伝子が隣接する（ＬｏｘＰエレメントがあり、Ｃｒｅ及び不要なエレメントが自動的に除去される）。
【００２４】
特定のベクターの特性
ＲＨＧＰ４８：このベクターは、１４コピーのテトラサイクリン応答エレメント（１４×ＴＲＥ）を伴うプロモーターを含み、転写ターミネーターなしにピューロマイシン耐性遺伝子の発現を促進させ、アンチセンス転写物を作製する（このアンチセンスは、ＲＨＧＰベースの遺伝子不活性化の基礎である）。ＴＲＥは、テトラサイクリンの非存在において、プロモーターが活性であり、アンチセンス発現を促す点でＴｅｔ−Ｏｆｆプロモーターである。一旦テトラサイクリンが培地に加えられると、プロモーターが遮断され、アンチセンス転写物も遮断され、それはＲＨＧＰの可逆特性の基礎である。
【００２５】
ＲＨＧＰ４８−ＲＳＢ：このベクターはＲＨＧＰ４８の構造と類似であるが、しかし、ＴＲＥがアンチセンス発現を促す代わりに、それはNew England BioLabsのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターを使用し、それはＲＳＬ１リガンドにより活性化される。５コピーのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈエレメントがあり、それらにＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈアクチベーターが結合する。このプロモーターは、ブラストサイジン耐性遺伝子の発現を促し、それも転写ターミネーターなしであり、アンチセンス産物を作ることができる。
【００２６】
ＲＨＧＰ４８−ＲＳＮ：このＭＭＬＶベクターはＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ調節プロモーターを含み、アンチセンス転写物を促すが、しかし、アンチセンスから転写される耐性遺伝子はない。この「ネイキッド」プロモーターは、標的遺伝子のダウンレギュレーション及びアップレギュレーションの両方を促進すると考えられる。なぜなら、理論的に、プロモーターの下流に遺伝子を有することによって、下流の標的を翻訳する能力が損なわれうるからである（なぜなら、遺伝子、例えばブラストサイジン又はピューロマイシンなど翻訳終止コドンを有する）。挿入事象の選択を可能にするために、常時発現性のホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが存在し、ブラストサイジン耐性遺伝子を促す（これはセンス方向の正常遺伝子であり、アンチセンス転写物を産生しない）。
【００２７】
レンチウイルスベクターは５’及び３’ＬＴＲの両方を含むが、しかし、３’ＬＴＲは自己不活性化し（３’ＳＩＮ−ＬＴＲと呼ばれる）、ゲノム中への挿入後、ベクターはウイルスを複製し、産生することができない。これによって安全性プロファイルが劇的に増加する。これらのベクターはＣｒｅ遺伝子を含まず、しかし、それらは全てがＬｏｘＰ部位を有し、それらは、ゲノムにおいて、Ｃｒｅを外因的に加えることにより除去（逆転）することができる。これらのベクターは、また、ＲＳＶエンハンサーエレメントを５’ＬＴＲ中に含み、レンチウイルスのより高い転写、故に、産生を可能にする。
【００２８】
ＲＨＧＰ１１：このベクターはＥＧＦＰを駆動する１４×ＴＲＥを有し、調節されたアンチセンス産物、ならびに緑色蛍光タンパク質を産生することを促す。これによって、細胞を蛍光顕微鏡下で見ることが可能になり、必要な場合、ＦＡＣＳにより選別される。また、このベクターはゼオシン耐性遺伝子を有し、ＰＧＫプロモーターを促し、薬物選択を可能にする。
【００２９】
ＲＨＧＰ１１−ＣＭＶＥ：このベクターはＲＨＧＰ１１と類似であるが、しかし、ＥＧＦＰを伴うアンチセンス発現を促す調節されたＴＲＥの代わりに、アンチセンスは常時発現性である。なぜなら、ＣＭＶプロモーターがＥＧＦＰアンチセンスコンストラクトを駆動するからである。これは、表現型を簡単に逆転させることができない場合（例えばインビボ試験など）において重要でありうる。
【００３０】
ＲＨＧＰ２２：このベクターは、典型的なＴＲＥの代わりに、ｐＴｉｇｈｔ  ＴＲＥを有する。５コピーのｐＴｉｇｈｔ応答エレメントがある。ｐＴｉｇｈｔは、また、アンチセンスのためのテトラサイクリン調節プロモーターであるが、しかし、本来のＴＲＥほどリーキーではない。このｐＴｉｇｈｔは、ブラストサイジン耐性遺伝子を通じてアンチセンス発現を駆動している。
【００３１】
ＲＨＧＰ１２−ＲＳＮ：このベクターはＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターを使用し、「ネイキッド」アンチセンス転写物を促す。また、ベクターを、ＰＧＫプロモーターがブラストサイジン遺伝子の発現を駆動しているという事実により、薬物により選択することができる。また、ＥＧＦＰ遺伝子をブラストサイジン遺伝子の下流にＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）エレメントを介して置き、ＰＧＫプロモーターが両方のタンパク質の産生を駆動することができる。このベクターについての遺伝子地図を図５に示す。
【００３２】
ＲＨＧＰ１３−ＣＭＶＮ：このベクターもアンチセンス転写物を生成する「ネイキッド」プロモーターを有するが、しかし、このプロモーターは常時発現性であり（ＣＭＶプロモーター）、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ又はＴＲＥ／ｐＴｉｇｈｔプロモーターように調節されない。これは、再び、インビボ試験のために有用であり、そこでは安定な非調節アンチセンス産生が意味をなす。このベクターは、ＲＨＧＰ１２−ＲＳＮベクターと同じＰＧＫ−ＢＳ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰコンストラクトを有する。
【００３３】
ＲＨＧＰ−ＴＡＩＬプロトコール
ＲＨＧＰの成功スクリーニングは、表現型をスクリーニングするために使用されるアッセイに依存的である。他のスクリーニング手順と同様に、所望の表現型は明確であり、頑健でなければならない。一旦それらの最小限の基準が満たされると、ＲＨＧＰを実質的に任意の用途に適用することができ、それにおいて、所望の表現型によって細胞を物理的に単離することが可能になる。一例として、本発明者らの実験室及びその他ではＲＨＧＰを利用し、腫瘍細胞が、細胞傷害性薬剤を用いた化学療法攻撃（Lih, Wei, and Cohen, 2006; Reiske et al., 2009）又はホルモン療法に対して耐性となる標的を同定してきた。これらの条件下で、薬物感受性細胞が消滅し、ＲＨＧＰ摂動細胞のサブセットが生き残った。「オミクス」ベースのアプローチを典型的に表わす相関する知見とは異なり、薬物攻撃に直面した生存は、ＲＨＧＰ形質導入事象により直接的に起こされた。所望の表現型の選択は、細胞ベースのアッセイに限定されず、ＲＨＧＰを同様にインビボでの適用のために使用することができる。例えば、動物モデルにおいて腫瘍形成能力又は転移能力を獲得する細胞を単離することができる。結果としての生存を超えて、ＲＨＧＰは、また、他の特性（例えば特定のマーカーを発現する細胞の親和性ベースの単離など）について選択することができる。そのような結果は、特定のマーカー（所望の表現型として）の発現を使用し、フローサイトメトリー又はパニング手順を使用して細胞を物理的に単離することができる場合に可能である。
【００３４】
相当な努力が投資され、ＲＨＧＰの頑健性及び効率が最適化されてきた。ＧＳＶからの発現を促す可逆的プロモーターは、目的の標的を迅速に検証する効率的な手段を提供する。所望の表現型が得られた後、実験を、サイレンシングさせたＧＳＶプロモーターを用いて繰り返し、表現型を逆転させることができる。表現型が、サイレンシングされたＧＳＶを使用して持続する場合、そのクローンは優先順位から外されるであろう。なぜなら、表現型が、無関係のアーチファクトの結果として生じたかもしれないからである。そのようなものとして、一旦ＲＨＧＰライブラリーが構築されると、目的の表現型について選択し、表現型の可逆性を検証することが可能になる（全て単一の試験において）。
【００３５】
一旦表現型が、可逆的プロモーターを使用して検証されると、ＧＳＶは、標的遺伝子を同定し、ＧＳＶ組込みの方向（例、センス又はアンチセンス）を決定するためのモチーフをコードする。ＲＨＧＰの初期バージョンでは、宿主ゲノムＤＮＡの物理的単離、それに続く従来の配列決定が要求された。この手順では、細菌形質転換のために十分なゲノムＤＮＡを単離するための十分な数のクローンの増殖が要求された。個々の細菌クローンを次に単離し、プラスミドを、ＧＳＶ組込み事象の配列決定のために単離した。このプロセスでは数週間の努力が要求され、限定されたスループットを伴った。標的同定は、熱非対称インターレース（ＴＡＩＬ）ＰＣＲの改変を使用して認められている。ＴＡＩＬ−ＰＣＲは、本来は、植物における遺伝子挿入を同定するために開発された（Liu et al., 1995）。より最近では、それを使用し、マウスゲノム中の遺伝子挿入が同定されている（Pillai et al., 2008）。本発明者らはＴＡＩＬ−ＰＣＲを組み入れ、ＧＳＶ挿入部位のハイスループット同定を実施した。なぜなら、少数の細胞が、ゲノムＤＮＡを単離するために必要とされるからである。これらの改善によって、ハイスループットスクリーニングが促進され、ＧＳＶ挿入部位についての情報が数週間ではなく数日以内に産生される。
【００３６】
これは、トランスジーン挿入部位のハイスループットゲノム規模同定のためのＴＡＩＬ−ＰＣＲの最初の適用、ならびにヒト細胞におけるトランスジーン挿入部位同定のためのＴＡＩＬ−ＰＣＲの最初の適用である。
【００３７】
本来のＲＨＧＰクローニング技術は、制限消化及び自己連結のための実質的な量のゲノムＤＮＡを単離するために十分な数まで（例えば、６ウェルプレート密度まで）の哺乳動物細胞の増殖を含む。その後、自己連結プラスミドを細菌中に形質転換し、多くのクローンを個々に選び、一晩増殖させ、プラスミドをこれらの培養物から次の日に単離する。これらのプラスミドを、次に、トランスジーン挿入の部位を同定するための配列決定のために送る。
【００３８】
ＴＡＩＬ−ＰＣＲを用いて、哺乳動物細胞を、９６ウェルプレート中でのゲノム抽出のために直接的に処理することができ、それにより手順がハイスループットスクリーニングのために受け入れられるようになる。ＤＮＡを、次に、９６ウェルプレートフォーマット中での、公知の及びランダムなプライマーの混合物を使用した３サイクルのＴＡＩＬ−ＰＣＲに供し、次にプレートを、第３ＰＣＲラウンド後の配列決定のために直接提出し、挿入部位情報をわずか３日間で産出する。以下の表では種々の技術及びそれらの相対速度の推定を比較する（最適効率で）：
【００３９】
【表１】
2015096067.tif 000003
【００４０】
約５０〜１００ngのゲノムＤＮＡ／ウェルをＰＣＲ反応において使用する。より少ないＤＮＡを、ＤＮＡが限定している場合に、確実に使用することができる。例えば、通常のゲノムＤＮＡ調製物は、０．２〜０．８μg/μlの範囲の産出量を有し、そのため、ＰＣＲ反応のためのＴＥ又はＨ２Ｏ中での１：１０希釈で十分に作用する。各ＤＮＡサンプルを、１つのフォワード及び６つのリバースＰＣＲプライマーの１つを有する６つの反応中に分けるため（全てが独立したウェル中）、１ゲノムＤＮＡサンプル当たり８反応のプレミックスを、Ｉｍｍｏｍｉｘ  Ｒｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Biolineから）を使用して調製する。フォワードプライマーの原液濃度は１μMであり、リバースプライマーは各々１０μMである（それぞれ最終濃度０．１５μM及び２μMについて）。
【００４１】
【表２】
2015096067.tif 000004
【００４２】
一次ＴＡＩＬ−ＰＣＲサイクリング条件（約６時間）：
【表３】
2015096067.tif 000005
【００４３】
レンチウイルスＲＨＧＰベクターについて、以下のプライマーを１ＤＮＡサンプル当たりに使用する（各々６反応）：
一次ＴＡＩＬ−ＰＣＲ：ＩＳＰ１（フォワード）＋ＡＤ１〜ＡＤ６（リバース）
二次ＴＡＩＬ−ＰＣＲ：ＧＳＰ３ｎｅｗ（フォワード）＋ＡＤ１〜ＡＤ６（リバース）
三次ＴＡＩＬ−ＰＣＲ：ＩＳＰ２（フォワード）＋ＡＤ１〜ＡＤ６（リバース）
【００４４】
フォワードプライマー：
【表４】
2015096067.tif 000006
【００４５】
リバースプライマー：
【表５】
2015096067.tif 000007
【００４６】
ＭＭＬＶ  ＲＨＧＰベクターについて、以下のプライマーを使用する：
【００４７】
フォワードプライマー：
【表６】
2015096067.tif 000008
【００４８】
リバースプライマー（上と同じ）
【００４９】
＃１のサンプルを１%アガロースゲル上で流し、バンドを可視化することができる。その後、各サンプルの１：２００希釈を行う。これは、最初に、各サンプルの水中への１：２０希釈を行い、次に、この１μlを、二次ＴＡＩＬ−ＰＣＲのための続く１０μlのＰＣＲ反応（１：２００最終希釈比を達成するために）において使用することにより行う。時折、ＰＣＲサンプルにおける容積喪失があり、そのため、５μlの水を、各ウェルに（所望の場合）希釈前に加えることができる（同じことを三次ＴＡＩＬ−ＰＣＲの前に行うことができる）。二次ＴＡＩＬ−ＰＣＲ用の１反応当たりのプレミックスは以下の通りである：
【００５０】
【表７】
2015096067.tif 000009
【００５１】
リバースプライマー及び鋳型ＤＮＡを、マルチチャネルピペットを使用して分注することができる。二次ＴＡＩＬ−ＰＣＲサイクリング条件（約４時間）：
【表８】
2015096067.tif 000010
【００５２】
＃２のサンプルをゲル上で流し（所望の場合）、＃２に示す通りに１：２００希釈を行い、＃２の同じプレミックスを使用し、三次ＴＡＩＬ−ＰＣＲを、以下のサイクリング条件を用いて行う（約２時間）：
【表９】
2015096067.tif 000011
【００５３】
＃３のサンプルを１%アガロースゲル上で流すことができる（所望の場合）。プレートを、次に、最終的な特異的プライマー（例えばレンチウイルス用のＩＳＰ２、又はＭＭＬＶ用の４８ＲＳ３など）を使用した配列決定のために直接送ることができる。低容積についての懸念がある場合、１５μlの水をより簡単な取り扱いのために各ウェルに加えることができる。
【００５４】
この手順によって、クローンにおいてウイルス組込みの同じ部位が成功裏に同定されており、そこで、組込み部位が、本来のＲＨＧＰクローニングアプローチを使用し、ＲＨＧＰレンチウイルス及びＭＭＬＶベクターの両方をヒト細胞株及び非ヒト細胞株において使用して同定されてきた。
【００５５】
実施例１−インフルエンザ因子の研究及びＰＴＣＨ１の同定
インフルエンザ感染は、感染性疾患媒介性の罹患及び死亡の主な原因のままである。蓄積する証拠は、季節性及び汎発性インフルエンザの大半のバリアントが、従来の治療に対する耐性を発生していることを示す。そのような情報は、インフルエンザを標的化するための新規アプローチの特定において新たな興味を生じている。本発明者らの実験室では、宿主志向性の治療法の新たな戦略を開発しており、それによって、ウイルスが疾患を起こすことを予防する安全で効果的な様式で宿主分子を標的化することを追求する。改善された発見技術（ＲＨＧＰ）を使用し、本発明者らは、ＰＴＣＨ１を、インフルエンザウイルス感染を決定的に制御する必須の宿主標的として同定する。本発明者らは、さらに、抗体又はｓｉＲＮＡを使用したＰＴＣＨ１に対する標的介入によってインフルエンザ感染が減少することを実証する。最終的に、本発明者らは、実験室の外部でのインフルエンザ感染におけるＰＴＣＨ１の関与を、ＰＴＣＨ１の遺伝的変異が野外における減少した疾患の罹患率に関連することを示すことにより実証する。全体で、これらの知見は、インフルエンザ疾患の管理を改善するための新規の宿主指向の治療法の開発についての重要な意味を有する。
【００５６】
インフルエンザは、感染性疾患媒介性の苦痛及び死亡の最も大きな原因の１つのままである。平均的な年において、インフルエンザは２０〜３０，０００の生命を奪い、経済的な損害は何十億ドルにもなる。その広範囲の流行にもかかわらず、ワクチン接種は散発性のままである。最近の試験では、ワクチンが、処置された人々の半分未満において有効でありうることが示されている。これを複雑化することとして、わずか一握りの治療法が、インフルエンザ感染を処置するために開発されてきた。増加する証拠は、多くの季節性株及び汎発性（トリ）株がこれらの化合物に対して耐性になっており、このようにそれらの適用を取り除いていることを示す。薬物耐性株の不可避の増殖は、インフルエンザに固有ではない。インフルエンザ、ＨＩＶ、ヘルペス、及び他のウイルスの耐性株の出現は、医学界が抗ウイルス治療のための戦略を再考することを強いてきた。
【００５７】
従来の抗体ウイルス剤では、ウイルスによりコードされる経路が標的化されてきた。基本的な理論的根拠では、ウイルス経路の標的化によって正常宿主細胞に対する毒性が最小限になりうることが想定されてきた。しかし、結果として得られる化合物の多くが、実際に非常に有毒であり、依然として悪く、ウイルス標的への焦点は、病原体に対して選択圧力を置き、治療に耐性であるバリアントを引き出す。代替物についてのこの必要性は、本明細書において実施されるアプローチを促してきたが、それは、薬剤耐性に対して非感受性である新たな治療法を開発することを追求し、それは、広域スペクトルの異なるウイルス型に適用することができる。
【００５８】
本発明者らの実験室では、感染性疾患のための宿主志向性の治療法の概念が開発されてきた。このアプローチでは、ウイルス感染細胞において誤発現される又は機能的に変化している宿主由来標的を同定することを追求する。そのように行う際、本発明者らは、変化した発現又は機能が、ウイルス疾患を処置する際に安全で効果的である新規治療法のための機会を提供しうると仮定してきた。異なる型のインフルエンザに必須である経路を同定、そして次に標的化することにより、本発明者らは、広域スペクトルの適用を伴う十分に必要とされる抗ウイルス剤を開発するであろう。知識における明らかなギャップは、安全で効果的な宿主標的及び、理想的には、それらの標的を遂行する手段を同定する必要性である。その目的のために、本発明者らは、本発明者らの中核技術（ＲＨＧＰ）を成功裏に利用した。本発明者らの実験戦略では、ゲノム中の単一部位でのＧＳＶの組込みを中心とした。そこでは、それは標的遺伝子の過剰発現又は発現の喪失のいずれかを起こしうる。そのようなものとして、ＲＨＧＰによって、本発明者らは、細胞ゲノム全体を照合し、宿主細胞がインフルエンザ感染に耐性となる又は生き残ることを可能にする異なる型の事象を同定することが可能になる。ＲＨＧＰを使用し、ＰＴＣＨ１を、インフルエンザ感染における必須の宿主標的として同定した。ＰＴＣＨ１に対する標的介入によってインフルエンザ感染を遮断することができる。最終的に、ＳＮＰ分析によって、ＰＴＣＨ１が、ブタ集団におけるインフルエンザの自然大流行の間での疾患転帰に関連することが実証される。
【００５９】
材料及び方法
細胞培養。ヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入した。Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａ細胞株はNolan博士（Stanford University）からの寄贈であり、マウスＮ２ａ細胞株はXu博士（Rockefeller University）からの寄贈であった。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をＤＭＥＭ（１０%  ＦＢＳを含む）中で培養し、Ｎ２ａ細胞を５０%  ＤＭＥＭ培地及び５０%  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５%  ＦＢＳを含む）中で培養した。
【００６０】
ＲＨＧＰライブラリーの生成及びスクリーニング。ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターを適用し、ＭＤＣＫ細胞においてＲＨＧＰライブラリーを生成した。ＲＨＧＰライブラリーを、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２を用いて、感染効率（ＭＯＩ）０．１又は０．００１で示された通りに感染させた。第２ラウンドの感染から２週間後、ゲノムＤＮＡを、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＡｑｕａＰｕｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して得た。自己連結ゲノムＤＮＡを濃縮し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に電気穿孔し、クロラムフェニコールを使用して選択した。
【００６１】
ｓｉＲＮＡを用いた宿主標的遺伝子の検証。ＰＴＣＨ１についてのヒト二本鎖ｓｉＲＮＡホモログを、製造者により推奨される通りに調製した。ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６配列（ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＵ）は、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシド（ＮＰ）遺伝子を標的化し、ポジティブコントロールを提供した（Ge et al., 2003）。非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ１）は、ネガティブコントロールを提供した。ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレート中に、１×１０５個細胞／ウェルでそれぞれプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞を、２０nMのｓｉＲＮＡ及びＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯを用いて、製造者の指示（Mirus）に従ってトランスフェクションした。第２ラウンドのトランスフェクションから２４時間後、サンプルを、ＭＥＭを用いて洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（ＭＯＩ  １）を用いた感染が続く。細胞を、１時間にわたり、１５分毎に穏やかに揺らしながらインキュベーションした。各ウェルからの培養培地を感染後４８時間目に回収し、培地中の子孫ウイルスを、標準的なプラークアッセイを使用して滴定した。
【００６２】
フローサイトメトリー。フローサイトメトリー分析のために、ＭＤＣＫ細胞を、トリプシンを使用して浮遊させ、１×１０５個細胞を氷上で１０mg/mL抗体を用いて３０分間にわたりインキュベーションした。細胞をＰＢＳ（ＰＢＳ中１%  ＢＳＡ（Sigma, St. Louis, MO）を含む）を用いて氷上で３回洗浄し、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗ウサギ（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて３０分間にわたり氷上でインキュベーションした。洗浄後、細胞を、１%パラホルムアルデヒドを伴うＰＢＳ中で固定した。データは、ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Guava Technologies, Hayward, CA）において取得され、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを使用して分析した。
【００６３】
ＳＮＰ及びデータセット。ＰＴＣＨ１  ＳＮＰを選択し、２つの基準を満たした：（ａ）許容可能な対立遺伝子の頻度；及び（ｂ）外部ジェノタイピングプロバイダー（Sequenom）による成功裏のフォーマッティング。
【００６４】
インフルエンザデータセットを、商業用ブタ産生システムにおいて、ＰＩＣ遺伝学を使用して収集した。試験期間の間に、農場は、ブタインフルエンザウイルスの大流行を経験した。４つの成長形質を測定した：（１）成長：これは、高及び低成長動物を比較した０／１形質である；（２）生命ＤＧ：生涯１日増体量（ｇ／日）；（３）ＬＤＧ死体増体量：（グラム／日）及び（４）離乳：終点１日増体量（ｇ／日）。
【００６５】
ＬＳＭの好ましい遺伝子型−ＬＳＭの好ましくない遺伝子型／２
【００６６】
結果
宿主細胞をインフルエンザに耐性にする標的を同定するために、ＲＨＧＰライブラリーを、上に記載する通りにＭＤＣＫ細胞において生成し、インフルエンザ攻撃を示した通りに実施した（図６Ａ）。ライブラリーを、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２を用いた感染により攻撃し、インフルエンザ耐性細胞について選択した。本発明者らは、以前に、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２（ＭＯＩ１０−１）を用いた感染によって全てのＭＤＣＫ細胞が４８時間以内に再現性よく殺されることを確証していた（示さず）。コントロールとして、偽形質導入細胞の並行培養物を同じように処理し、生存体は４８時間後に観察されなかった。
【００６７】
複数ラウンドのインフルエンザ攻撃を生き残ったＲＨＧＰ形質導入細胞についての選択後、本発明者らは、１つの特定の培養物（Ｒ２６−７）に焦点を合わせ、それはインフルエンザ感染を生き残った。ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターによって、本発明者らは、標的遺伝子を効率的に位置付け、組込み事象の方向（センス又はアンチセンス）を決定することができた。ゲノムＤＮＡをＲ２６−７細胞から単離した。ＲＨＧＰベクター挿入部位に隣接するゲノムＤＮＡ配列を配列決定し、イヌゲノムに対して、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを使用してマッピングした（図６Ｂ）。Ｒ２６−７における組込み事象が、イヌ染色体において、アンチセンス方向で、ＰＴＣＨ１遺伝子中で生じた（図６Ｃ）。そのようなものとして、組込みは、ＰＴＣＨ１の第１のコピーを物理的に破壊した。結果として得られるアンチセンスは、第２の対立遺伝子の発現をノックダウンした。
【００６８】
天然細胞を使用したＰＴＣＨ１の検証
本発明者らは、次に、ＰＴＣＨ１を、インフルエンザ媒介性の宿主細胞の殺傷を予防する候補標的として検証することを追求した。これらの試験は、ＲＨＧＰ又はＭＤＣＫ細胞の使用から生じうるアーチファクトを除くことを意味した。ＰＴＣＨ１は、イヌ由来ＭＤＣＫ細胞から単離されていたため、本発明者らは、そのヒトホモログを同定し、ヒトＨＥＫ−２９３細胞においてこれらの標的について選択的なｓｉＲＮＡを発現させた。二本鎖ｓｉＲＮＡを生成し、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした非標的ｓｉＲＮＡは、トランスフェクションのための一致させたコントロール及び参照基準を提供した。ＮＰ−１４９６二本鎖ｓｉＲＮＡは、決定的なインフルエンザ遺伝子を標的化し、インフルエンザ感染を阻害することが実証されており、ポジティブコントロールを提供した（Ge et al., 2003）。インフルエンザ感染はＨＥＫ２９３細胞を効率的に殺さないため、本発明者らは、本発明者らの実験プロトコールを改変し、ウイルス力価（宿主細胞の生存の代わりに）を、効率についての主要エンドポイントとして測定した。ｓｉＲＮＡ処理したＨＥＫ２９３細胞を、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２を用いて４８時間にわたり感染させ、ウイルス力価をプラークアッセイにより測定した。ＰＴＣＨ１二本鎖ｓｉＲＮＡは、インフルエンザウイルス産生を、ポジティブコントロール（ＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡ）と同程度のレベルで減少させた。（図７）。
【００６９】
追加の標的
同様の細胞において同じ手順を使用し、同様の攻撃を用いて、ＲＨＧＰ技術を使用し、追加の標的を同定した。これらの内で、ＳＬＣ２５Ａ２５（以前に、膜を横断するミトコンドリア転移及び恐らくはＭｇ−ＡＴＰ交換に関与するタンパク質として特徴付けられた）、Ｒｇｎｅｆ（細胞付着、細胞運動性、及びＢリンパ球活性化、ならびに恐らくは細胞アポトーシスにおいて役割を有することが観察された）、Ｎｅｄｄ４及びＨｅｒｃ６（両方ともユビキチンリガーゼ）（全てがインフルエンザのための潜在的な標的として）、ならびにＲｏｂｏ１（細胞運動性及び軸索ガイダンスに関与する受容体）（ＨＩＶのための潜在的な標的として）がある。これらの一部が以下で考察される。これらのタンパク質は、ウイルス感染様式で細胞表面上に現れるため、各々は、モノクローナル抗体、ペプチド、アンチセンス、ｓｉＲＮＡなどを使用して標的化されうる。
【００７０】
ＰＴＣＨ１の抗体標的化によってインフルエンザ感染が減少する。
ＰＴＣＨ１は、複数回貫通型膜タンパク質である。そのようなものとして、本発明者らは、それが、抗体ベースの介入のために標的を提供しうると考えた。この可能性を評価するために、親和性精製された抗血清を得て、インフルエンザ感染細胞の表面上のＰＴＣＨ１を認識するそれらの能力についてテストした。ＭＤＣＫ細胞を、Ａ／Ｕｄｏｒｎインフルエンザを用いて、インタクトな細胞の染色の前に１８時間にわたり感染させた。この実験計画を利用し、ウイルスを用いた長期のインキュベーション又は固定化（それらのいずれかによって膜の完全性が破壊されうる）の結果として生じうるアーチファクトについての潜在力を最小限にした。ウイルスによりコードされる赤血球凝集素及び一致させたコントロール（ＰＴＣＨ１を認識しない）について特異的な抗体は、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールをそれぞれ提供した。ＰＴＣＨ１抗体はインフルエンザ感染細胞に結合し、かなり多くの染色が、非感染コントロールよりも、感染細胞を用いて観察された（図８Ａ及び８Ｂ）。この結果は、膜の完全性の喪失を表わさなかった。なぜなら、細胞は、トリパンブルー及び他の生体染色色素を、利用された条件下で排除し続けたからである。
【００７１】
ＰＴＣＨ１抗体がインフルエンザ感染細胞に結合する能力に基づき、本発明者らは、次に、これらの抗体を用いた処理がインフルエンザ感染性を変化させうるか否かを問うた。ＭＤＣＫ細胞を、インフルエンザを用いて、ＰＴＣＨ１抗体の存在又は非存在において感染させた。培養上清を次に収集し、感染性インフルエンザ粒子の数を、標準的なプラークアッセイを使用して定量化した。これらの試験によって、ＰＴＣＨ１抗体が、インフルエンザ増殖を、未処理細胞又は非特異的抗血清を用いて処理されていたコントロールと比較し、２〜３対数（１００〜１０００倍）だけ減少させることが実証された。本発明者らは、次に、この結果が、最初の感染又はウイルスライフサイクルの後の段階の抗体阻害を表わしうるか否かを問うた。この疑問は、より高い感染効率（ＭＯＩ）０．１（０．００１よりむしろ）で感染を繰り返すことにより対処した。本発明者らは、ＰＴＣＨ１抗体が、相対的に高いＭＯＩでインフルエンザを比較的阻害する場合、それらは、最初の付着又は感染細胞中への侵入を遮断しているであろうと推論した。他方で、抗体がライフサイクルの後の段階（例、出芽又は放出）に影響を与えた場合、阻害活性はより高いＭＯＩで減少しうる。後者の考え方と一致して、ＰＴＣＨ１抗体処理の抗ウイルス効果は、より高いＭＯＩで減少し、インフルエンザにおける１対数（１０倍）の減少を与えた。（図８Ｃ）これらの結果は、ＰＴＣＨ１が抗体治療のための適した標的を提供しうること、及び、抗体がウイルスライフサイクルの相対的に後の段階を遮断するように見えることを示唆する。
【００７２】
ＰＴＣＨ１を、実験室から、野外におけるインフルエンザ感染に翻訳する。
細胞ベースのアッセイを用いた興味をそそる知見に基づき、本発明者らは、ＰＴＣＨ１が、実験室の外部でのインフルエンザ感受性に関連しうるか否かを問うた。このために、本発明者らは、ブタ集団における頑健形質の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）評価を、ブタインフルエンザウイルス大流行の間に利用した。具体的には、本発明者らは、ＰＴＣＨ１  ＳＮＰがブタ体重増加における変化（ブタにおけるインフルエンザ感染の理解された結果である）に関連するか否かを問うた。
【００７３】
ＰＴＣＨ１内又はその近くの一連の異なるＳＮＰ（６１９、６６１、６６２、及び６６３として公知）を、いくつかの基準（有意水準、対立遺伝子頻度、相加対優性効果、効果の大きさ（表現型の標準偏差））に基づいて選択した。本発明者らは、次に、ＳＮＰが野外においてインフルエンザ耐性に関連するか否かを問うた。このために、野外においてウイルス感染に暴露されたブタからのＤＮＡを抽出し、各ＳＮＰについて遺伝子型を同定し、ＳＮＰ遺伝子型と性能形質の間での統計的な関連性を決定した。試験では、データセット回収の期間中にブタインフルエンザ大流行を受けていた大農場からのデータセットを利用した。本発明者らの分析では、２つの異なるＰＴＣＨ１  ＳＮＰ（６１９及び６６０）を、離乳の時期以降での増加した平均１日体重増加及び体重増加と関連付けた（表Ｉ）。これらの結果は統計的に有意であり、ＰＴＣＨ１が体重増加（ブタ集団におけるインフルエンザ罹患の有意な指標である）と関連しうることを示唆する。
【００７４】
このように、ＲＨＧＰ技術を使用し、主要な知見は、ＰＴＣＨ１細胞表面受容体がインフルエンザウイルスによる感染のために必須であること、及び、ＰＴＣＨ１に対する標的介入（ｓｉＲＮＡ又は抗体のいずれかを使用）によってインフルエンザ感染が減少しうることの実証である。本発明者らは、また、ＰＴＣＨ１が、多くの異なる種（ヒト、イヌ、及びブタを含む）からの細胞の感染の間にインフルエンザにより広く利用されることを示している。最終的に、本発明者らは、これらの基本的な知見の重要性を野外における状況に翻訳する（ＰＴＣＨ１が、ブタ集団の自然感染の間に疾患転帰に関連することを実証することによる）。
【００７５】
本発明者らの試験の１つの新規局面は、ＰＴＣＨ１が宿主細胞のインフルエンザ感染を調節することの実証である。ＰＴＣＨ１は、ソニックヘッジホッグ（胚発生の間での細胞の組織化、増殖、及び生存を支配する分泌分子）のための細胞受容体のヒトホモログである。ＰＴＣＨ１は、また、腫瘍抑制因子としての役割に関与しており、種々の上皮性悪性腫瘍と関連付けられる。機構的な観点から、インフルエンザの基礎は未知であるが、しかし、異なるＭＯＩでの抗体処理の差動的な効果は、ウイルスライフサイクルの相対的に後の段階におけるＰＴＣＨ１についての役割を示唆しうる。
【００７６】
本発明者らの本報告での別の重要な局面は、抗ウイルス疾患のための新規の宿主指向の標的を同定するためのＲＨＧＰの利用である。ＲＨＧＰは、研究下にある表現型を調節する細胞中の任意の標的を同定するための機会を提供する（過剰発現又は発現の喪失を介して）。ＲＨＧＰの中心となる特性は、疾患プロセスにおけるその関与を決定するための標的の事前の知識を有する必要がないことである。本発明者らの結果は、この概念をさらに支持する。なぜなら、ＰＴＣＨは、以前に、インフルエンザに関連付けられていなかったからである。
【００７７】
疾患管理の観点から、本発明者らの本知見についての興味深く重要な潜在的な意味がある。第１に、ＰＴＣＨ１は、ＰＴＣＨ１発現又は機能を標的化する抗体又は他のアプローチを使用して、インフルエンザによる感染に対して介入するための機会を提供しうる。比較可能な知見が、複数の種（ヒト、イヌ、ブタ）を使用して得られたとの事実は、ＰＴＣＨ１が、インフルエンザ感染のために使用される重要な中核機構を表わすことを示しうる。感染性疾患を標的化するための本発明者らの宿主指向のアプローチの中心となる教義は、基本的な経路の同定が、複数のウイルス株を標的化するための手段を提供しうるとの考え方に焦点を合わせている。今後の研究によって、異なる季節性及び汎発性形態のウイルス病原体におけるＰＴＣＨ１の役割がさらに詳述されるはずである。宿主指向の治療から生じる第２の機会は、ウイルスが、重要な宿主機構に対する代替物を発生しなかったであろうという概念である。正しい場合、ＰＴＣＨ１の効果的な標的化は、インフルエンザの処置を長く悩ませてきた薬物耐性の獲得に関連する問題を克服する機会を提供しうる。
【００７８】
表Ｉ。ＰＴＣＨ１多型は、ブタインフルエンザ大流行の状況におけるブタ集団の増加した体重増加と関連する−（好ましい対立遺伝子（主要対立遺伝子と比べて）の１コピーでの成長（グラム／日）に対するＰＴＣＨ１多型の効果。全ての結果が、主要対立遺伝子と比べた、体重増加における相対的な増加として示される（ｐ値）。生涯１日増体量＝最終的な体重−出生時体重離乳終了時の１日増体量＝最終的な体重−離乳時の体重）
【００７９】
【表１０】
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【００８０】
実施例２−他のインフルエンザ因子を同定するために使用されるＲＨＧＰ
ウイルス病原体の治療的標的化のための従来のアプローチでは、耐性株の発生及び広域スペクトル用途の欠如から生じる障害に一貫して直面してきた。インフルエンザは特に問題となる治療課題を表わす。なぜなら、季節性抗原シフト及びドリフトは、高いウイルス突然変異率と合わせて、多くの従来の抗ウイルス剤を混乱させてきたからである。新たに出現する又は操作されたインフルエンザ株は、インフルエンザのトリ亜型における最近の興味により典型的に表わされる通り、さらにより大きな脅威を表わす。ウイルスによりコードされる分子の標的化に関連する限定に基づき、本発明者らは、ウイルス増殖を予防する又は宿主をウイルス媒介性の病原性から回避させる様式で、宿主経路を標的化する直交アプローチを取ってきた。この目的に対して、ランダムホモ接合性遺伝子摂動（ＲＨＧＰ）を使用し、正常細胞において十分に耐容されるが、しかし、インフルエンザを阻害する宿主志向性の標的が同定された。ＲＨＧＰを用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲの使用によって、ゲノム全体の徹底的なスクリーニングが促進され（過剰発現又は発現の喪失の両方について）、宿主細胞をインフルエンザ感染に対して耐性にする標的が同定された。本発明者らは、インフルエンザが宿主細胞を殺すことを予防する一連の宿主志向性の標的を同定し、複数のアプローチを使用してこれらの標的を検証する。これらの試験では、ウイルス疾患と戦うための新たなパラダイムが支持され、新規の標的及び機構を同定するためのＲＨＧＰの能力が実証される。
【００８１】
ウイルス感染に対処するための１つの新たなアプローチは、ウイルス疾患の病原性に必須である宿主因子を標的化することである。ＨＩＶ／ＡＩＤＳでの戦争からの顕著な例は、ＣＣＲ５のアンタゴニストの開発である。これらのアンタゴニストは、結合及び内在化のために必要である表面暴露された共受容体の機能を予防することを追求する。初期の知見では、これらの薬剤が、ＣＣＲ５栄養性ウイルスを用いて感染された患者のサブセットの処置のための十分に必要とされる選択肢を提供しうることを示唆する。
【００８２】
実施例２において、哺乳動物（ヒトを含む）におけるインフルエンザに関する治療介入のための可能な標的の異なる研究を調べる。上で注目した通り、本発明は、改善された形態のＲＨＧＰの適用を含み、それは、また、細胞において任意の標的（全遺伝子又は個々のドメインを含む）のアップレギュレーションを起こすことができる。結果的に、ＲＨＧＰは、研究下にある表現型の原因となる任意の遺伝子変化についてゲノム全体を照合する手段を提供する。本発明者らはＲＨＧＰを適用し、インフルエンザ感染について要求される一連の宿主志向性の標的を同定し、検証した。
【００８３】
材料及び方法
化学物質及び細胞培養。ＭＤＣＫ細胞、ヒト２９３ＨＥＫ細胞、及びＭＥＭ培地を、American Type Culture Collection（ATCC）から購入した。Ｆｕｇｅｎｅ  ６をRocheから購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞、及びViraPower PackagingキットをInvitrogenから購入した。ベクターｐＩＲＥＳｈｙｇ３及びｐＴＲＥ−ｌｕｃをClontechから得た。ＲＮａｓｅ  Ａ及びプロテイナーゼＫをSigmaから購入した。インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２はCharles River Labにより提供された。全ての制限酵素をNew England BioLabから購入した。細胞培養培地及び補助剤は、Invitrogen又はHycloneのいずれかからであった。全ての短鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをDharmacon Researchにより合成した。ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬）をMirusから購入した。ＭＤＣＫ細胞をＭＥＭ（１０%  ＦＢＳを含む）中で培養した。全ての細胞培養物を５%  ＣＯ２を用いて３７℃でインキュベーションした。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｄｏｘ誘導アッセイのために使用される）をPromegaから購入した。
【００８４】
ｐＴｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーター−ベクターのコンストラクション及びＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−ｏｆｆ安定細胞株。ｐＴｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーターベクターを、ｐＩＲＥＳｈｙｇ３ベクターを骨格として使用してコンストラクションした。ＰＣＲ生成されたｔＴＡフラグメントを、ｐＩＲＥＳｈｙｇ３ベクターのＢａｍＨＩ及びＳｏｆＩ部位中に挿入し、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーターベクター（ｐＩＲＥＳｈｙｇ３−ｔＴＡ）を生成した。
【００８５】
ＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞株を作製するために、１０cmプレート中の１〜２×１０６個のＭＤＣＫ細胞を、１０μgのｐＩＲＥＳｈｙｇ３−ｔＴＡベクター及び３０μlのｆｕｇｅｎｅ  ６を用いて、製造者の指示に従いトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ＭＤＣＫ細胞を１：１０希釈により分割し、２００μg/mlのハイグロマイシンを用いて培養した。培地を、３日毎に、非トランスフェクト細胞が殺され、トランスフェクトされた安定な細胞コロニーが形成されるまで交換した。目に見える個々のコロニーを選び、２４ウェルプレート中で継代培養した。ハイグロマイシン耐性クローンを、Ｄｏｘ誘導活性について、ｐＴＲＥ−ｌｕｃベクター及びＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキットを使用し、製造者の指示に従いスクリーニングした。４０倍を上回る誘導性を伴う安定クローンを、ＲＨＧＰライブラリーを作製するための標的細胞として使用した。
【００８６】
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクター（ｐＲＨＧＰ２２）のコンストラクション。ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクター（ｐＲＨＧＰ２２）を、ｐＬＥＳＴベクターをCohen実験室（17, Lu, 2004）からの骨格として使用して構築した。ｐＬＥＳＴ中のＮｅｏＲ−ＴＲＥ−ＣＭＶのＤＮＡ配列を、最初に、ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ−ＣＭＶ−ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＲの発現カセットを用いて置換した。３’ＵＴＲ  ＷＰＲＥエレメントを除去し、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）耐性遺伝子を同じ部位に挿入した。２つのＬｏｘＰ部位を、ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＲ遺伝子の下流及びｐ１５Ａ  ｏｒｉ−ＣＡＴの上流にそれぞれ挿入した。Ｃｒｅレコンビナーゼを伴うＬｏｘＰ部位によって、本発明者らは、ＴＲＥ−ＣＭＶプロモーターを染色体から切り出すことにより表現型を可逆的に検証することができるようになるであろう。
【００８７】
ＲＨＧＰウイルスの産生及びＲＨＧＰライブラリーの構築。ＲＨＧＰレンチウイルスを、InvitrogenのＶｉｒｏＰｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して産生した。２９３ＦＴの細胞を、１０cmプレート中に、約１〜２×１０６個細胞／プレートでそれぞれプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞を、３μgのＲＨＧＰ２２ベクター及び９μgのＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ  ２０００を使用してトランスフェクトした。培地を、新鮮なトランスフェクション培地を用いて、３７℃での５時間のインキュベーション後に交換した。４８時間のインキュベーション後、培地中のウイルスを回収し、０．４５μmフィルターを通じてろ過した。レンチウイルスを、製造者の指示に従い滴定した。
【００８８】
ＲＨＧＰライブラリーを構築するために、ＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞を、１５０mmプレート中に、２×１０６個細胞／プレートで、それぞれＲＨＧＰウイルスの収集の１日前にプレーティングした。次の日、細胞（４．６×１０６個細胞／プレート）を、１０mlのＰＢＳを用いて洗浄し、１０mlの新鮮に収集されたＲＨＧＰウイルスを、６μg/mlのポリブレンを用いて形質導入した。細胞を３７℃で２時間にわたりインキュベーションし、２０分毎に揺らすことにより混合した。２時間のインキュベーション後、培地を、１０mlの形質導入培地を用いて補充した。形質導入から２４時間後、細胞を１０mlのＰＢＳを用いて洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（ＭＯＩ０．１）を用いた２時間にわたる５mlの感染ＤＭＥＭ培地（０．２%のＢＳＡ、２００μg/mlのハイグロマイシン、及び６μg/mlのブラストサイジンを含む）中での感染が続く。細胞を、穏やかに１５分毎に揺らすことにより混合した。２時間の感染後、細胞を１５mlの感染培地に加えた。２４時間の感染後、細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２を用いて再び同じＭＯＩで感染させた。第２ラウンドの感染から２日後、細胞を、１０mlのＰＢＳを用いて洗浄し、２０mlの５０%条件培地（２００μg/mlのハイグロマイシン及び６μg/mlのブラストサイジンを含む）に加えた。培地を、３日毎に、非形質導入細胞が殺され、ウイルス耐性コロニーが形成されるまで交換した。第２ラウンドの感染から２週間後、目に見える個々のコロニーを選び、２４ウェルプレート中で継代培養した。
【００８９】
インフルエンザウイルス耐性細胞クローンについての可逆性アッセイ。インフルエンザウイルス耐性クローンの可逆性を検証するために、表現型及び親ＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞を、Ｄｏｘの非存在又は存在において３日間にわたり培養した。細胞を、１００mmプレート中で、２×１０６個細胞／プレートでプレーティングし、Ｄｏｘを用いて又は用いずに培養した。２４時間後、細胞を、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（それぞれＭＯＩが１×１０−２及び１×１０−５）を用いて感染させた。３日間のインキュベーション後、細胞を、クリスタルバイオレット染色に供した。
【００９０】
インフルエンザウイルス耐性クローンからの候補遺伝子の同定。典型的には、各クローンの１〜１０×１０６個細胞を回収し、ＰＢＳ溶液を用いて１回洗浄した。細胞ペレットを、１０mlの溶解緩衝液（０．３２Mスクロース、１０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５mM  ＭｇＣｌ２、及び１%  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中に再浮遊させた。ライセートを１５００×ｇで１５分間にわたり遠心分離した。ペレットを、０．５mlのプロテイナーゼＫ緩衝液（２５mM  ＥＤＴＡ、１５０mM  ＮａＣｌ、及び４０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５を含む）中の１００μgのプロテイナーゼＫを用いて処理し、０．５%  ＳＤＳの添加が続いた。混合物を一晩３７℃でインキュベーションした。プロテイナーゼＫ処理されたライセートに５０μgのＲＮａｓｅ  Ａを加え、３７℃で２〜４時間にわたりインキュベーションした。ゲノムＤＮＡを、フェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムを用いて２回抽出し、等容積のイソプロパノールを用いた沈殿が続いた。ＤＮＡペレットを、７０%エタノールを用いて洗浄し、２００μlのＴＥ（ｐＨ７．５）緩衝液中に溶解した。
【００９１】
２５０μl中のゲノムＤＮＡ（１０μg）を、制限酵素ＢａｍＨＩ又はＸｂａＩを用いて２〜４時間にわたり消化した。消化されたＤＮＡをフェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールを用いて沈殿し、３０μlのＴＥ緩衝液中に溶解した。２５０μl中の消化されたＤＮＡ（２．５μg）を、２０単位のＴ４リガーゼを用いて１６℃で一晩自己連結させた。連結されたＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させ、７０%エタノールを用いて洗浄した。ＤＮＡペレットを２０μlのＴＥ緩衝液中に溶解させ、DH10B ElectroMaxコンピテント細胞中に電気穿孔した。各々の連結ＤＮＡからのコロニー（８〜１６）を、プラスミドＤＮＡ調製及びサイズ分析のための制限酵素を用いた消化のために選んだ。候補プラスミドＤＮＡをさらに使用し、表現型に関与する標的遺伝子をＤＮＡ配列決定及びゲノムマッピングにより同定した。
【００９２】
ｓｉＲＮＡを用いた宿主標的遺伝子の検証。候補遺伝子ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＳＬＣ２５Ａ２５、及びＴＡＰＴ１についてのヒト二本鎖ｓｉＲＮＡホモログを、製造者によるｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌとして調製した。インフルエンザウイルスのヌクレオカプシド（ＮＰ）遺伝子に対するｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６配列（ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＵ）を、ポジティブコントロールとして使用した（18, Ge, 2003）。非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ  １）をネガティブコントロールとして使用した。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレート中に１×１０５個細胞／ウェルでそれぞれプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞を、２０nMのｓｉＲＮＡ及び１．５μlのTransIT-TKOを用いて、製造者の指示に従いトランスフェクトした。細胞を、２４時間のインキュベーション後、ｓｉＲＮＡを用いて再トランスフェクトした。第２ラウンドのトランスフェクションから２４時間後、細胞を０．５mlのＭＥＭを用いて洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（ＭＯＩ１．０）を用いた３００μlのＤＭＥＭ培地及び０．０５%  ＦＢＳ中での感染が続く。細胞を、１５分毎に穏やかに揺らしながら１時間にわたりインキュベーションした。細胞を、ＭＥＭを用いて２回洗浄し、ウイルス産生のために０．５mlの感染培地に加えた。各ウェルからの培地を、トランスフェクションから２４又は４８時間後に回収した。培地中の子孫ウイルスを、プラークアッセイにより滴定した。
【００９３】
結果
ＲＨＧＰ細胞ライブラリーの構築
ＲＨＧＰによって、細胞ゲノム全体を照合し、過剰発現及びノックアウト事象の両方を評価することを追求する。この課題では、宿主の全ゲノムのカバーを確実にするための十分な組込み事象を伴うＲＨＧＰライブラリーの作製が要求される。また、ライブラリーは、細胞当たり単一のＲＨＧＰ組込み事象に限定され、同じ細胞での複数の摂動から生じる複雑さを防止することが重要である。ヒトゲノム中での平均遺伝子サイズが２７ｋｂと推定されるため（１９）、本発明者らは、１０５の独立した組込み事象が、全ゲノムのランダムなカバーを確実にするために要求されると計算した（１遺伝子当たり１ベクター挿入）。ＲＨＫＯを用いた先行する試験では、ＭＭＬＶベースの組込みベクターに焦点を合わせていた（１６）。しかし、これらのベクターの力価は、一般的に、１０３形質導入単位(TU)/mLに限定される。アプローチの効率を改善するために、レンチウイルスシステムを開発した。材料及び方法に概説されている通りに、ｐＲＨＧＰ２２を、ブラストサイジン耐性遺伝子を促すｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ−ＣＭＶプロモーターからなる改善された発現カセットを使用して構築し、厳密な誘導制御下で選択可能マーカーを提供した。ｏｒｉ−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）耐性遺伝子は、独立したレポーターを提供し、宿主ゲノムＤＮＡをレスキューし、標的遺伝子及びベクター組込みの部位を同定した。
【００９４】
インフルエンザウイルス耐性表現型のスクリーニング
宿主細胞をインフルエンザに対して耐性にする標的を同定するために、ＲＨＧＰライブラリーをＭＤＣＫ細胞において生成した。この特定の細胞モデルを、インフルエンザ感染に対するその十分に確証された応答性に基づいて選択した。ｐＲＨＧＰ２２ベクターを用いた形質導入を介したライブラリー構築に続き、ＲＨＧＰ細胞ライブラリーを作製し、ヒトゲノムの１００倍のカバーを確実にした。単一細胞内での複数の挿入についての潜在力を最小限にするために、低ＭＯＩ（０．１５）を、ＲＨＧＰライブラリー調製のための標的細胞の形質導入の間に用いた。
【００９５】
ＭＤＣＫ細胞ライブラリーを、本来なら致死濃度のブラストサイジン（感染から２４時間後に投与）を使用して選択し、ベクター組込みを確実にした。ライブラリーを、また、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２を（相対的に高いＭＯＩ０．１で）用いた感染により攻撃し、インフルエンザ耐性細胞について選択した。インフルエンザ感受性細胞の徹底的な除去を確実にするために、培養物を複数ラウンドのインフルエンザ感染に供した。コントロールとして、一致させたコントロールを含めた。それは、ＲＨＧＰ形質導入を欠くが、しかし、その他の点では同様に処理された。一般的に、第２ラウンドのインフルエンザ攻撃後、生存細胞は、一致させたコントロールにおいて検出されなかった。その後、ＲＨＧＰ形質導入群中の生存細胞をクローン化し、増大させ、約３，０００クローン／試験を産出した（表２）。これらから、合計１９４の個々のコロニーを、さらなる分析のために、単一ライブラリーから単離した。個々のクローンがインフルエンザ耐性表現型を保持したことを問うために、これらを、インフルエンザを用いて再攻撃した。再攻撃試験によって、本発明者らは、インフルエンザ攻撃に対していくらか感受性であるクローンを優先順位から外すことができた。１４の高度に耐性のクローンのサブセットが、さらなる特徴付けのために選択された。
【００９６】
ウイルス耐性クローンの可逆性アッセイ
ＲＨＧＰ技術の重要な特性は、誘導プロモーターによる調節を介して候補標的を検証する能力である。これによって、本発明者らは、自然突然変異又は感染アッセイでの他のアーチファクトの結果としてインフルエンザに対して耐性になったであろう任意の候補クローンを除去することができた。具体的には、インフルエンザ耐性クローン中に取り込まれたＲＨＧＰベクター用のプロモーターは、Ｔｅｔ−ｏｆｆシステムの制御下にあった。従って、外因的に加えられたテトラサイクリン（Ｔｅｔ）又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在において、ＲＨＧＰベクターを「オフにする」ことができる。この特性によって、本発明者らは、外因的に加えられたＤｏｘの存在において攻撃された場合にインフルエンザに対して耐性のままであるそれらの候補を優先順位から外すことができた。これらの試験の経過において、本発明者らは、高い感染効率（ＭＯＩ）でのインフルエンザ耐性が、インフルエンザライフサイクルの初期段階に関連する標的又は経路を好みうるのに対し、低ＭＯＩが、インフルエンザライフサイクルの後期段階のために要求される機構を好みうると考えた。このように、インフルエンザ攻撃を、２つの広く異なる感染効率（１０−５又は１０−２）で行い、アッセイシステムが、ウイルス耐性の初期又は後期のいずれかの段階の機構について偏りうる可能性を除いた。細胞生存を、クリスタルバイオレットを用いた感染から７２時間後の染色により決定した。ＲＨＧＰ組込み事象を欠くコントロール細胞は、宿主細胞のウイルス媒介性の殺傷についてのポジティブコントロールを提供した。分析された１４クローンの内、１２（８６%）がＤｏｘの存在においてインフルエンザに対する感受性を再獲得し、残りの２つがさらなる研究のために優先順位から外された。
【００９７】
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターを設計し、標的遺伝子を効率的に位置付け、組込み事象の方向（センス又はアンチセンス）を決定した。具体的には、遺伝子探索ベクターはＣＡＴレポーター遺伝子をコードし、それは、制限酵素ベースのゲノムＤＮＡクローニングによりレスキューすることができる。ゲノムＤＮＡを、検証され、インフルエンザ耐性のＤｏｘ媒介性の可逆性が実証されたそれらのクローンから単離した。ゲノムＤＮＡを、適した制限酵素を用いて消化し、自己連結させ、環状ベクターゲノムＤＮＡを得た。これらの構築物を使用し、Ｅ．  ｃｏｌｉを形質転換させ、クロラムフェニコール耐性サブクローンを単離し、配列決定した。ベクター組込みのゲノム部位を確認するために、少なくとも８〜１６の異なるクロラムフェニコール耐性コロニーを単離し、各ＭＤＣＫクローンから配列決定した。ＲＨＧＰベクター挿入部位に隣接する結果として得られるゲノムＤＮＡ配列を、イヌゲノムに対する、標準的な探索アルゴリズムを使用したゲノムマッピングに供した。実験計画と一致して、大半の標的が、ＭＤＣＫ細胞当たり単一の組込み部位からなった。しかし、一部のクローンは複数の組込み事象を含み、それらは、複数のＲＨＧＰ組込み部位の結果として又はその特定の候補が複数のクローンからなっていた場合に生じたであろう。また、本発明者らは、技術的な限定に起因して、他の候補の小さなサブセットから候補遺伝子を単離することができなかった。全体で、ゲノムＤＮＡクローニングによって、インフルエンザ耐性に関連する合計７０の異なる標的遺伝子が同定された。
【００９８】
ナイーブな細胞を使用した標的遺伝子の検証
ＲＨＧＰによって、インフルエンザ感染に対して耐性を付与する一連の標的が同定された。表現型の可逆性によって、実験システム内での標的の適用性が検証された。本発明者らは、また、独立した実験システムを使用してこれらの候補の検証を追求し、ＲＨＧＰ、宿主細胞システム（ＭＤＣＫ）の選択、又はインフルエンザバリアント（Ｕｄｏｒｎウイルス）に固有でありうる予想外の結果についての潜在力を除いた。
【００９９】
ＲＨＧＰを使用して同定された標的の独立した確認として、これらの標的のサブセットを選択し、より従来のアプローチを使用してテストした。具体的には、本発明者らは標的を強調しており、そこでは減少した発現がインフルエンザ耐性に関連した。なぜなら、部分的には、ノックダウン標的が、将来の標的戦略に受け入れられ、小分子又は生物製剤ベースの治療を使用して発現又は機能を同程度にノックダウンしうるからである。重要なことには、ＭＤＣＫ細胞からの結果によってイヌ標的が同定され、ｓｉＲＮＡを、標的遺伝子のヒトホモログに対して設計した。二本鎖ｓｉＲＮＡを、４つのそのような標的（ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、及びＳＬＣ２５Ａ２５）について生成し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために使用した。インフルエンザは一般的にＨＥＫ２９３に対して毒性がないため、ウイルス力価の測定は、効力を評価するためのエンドポイントとしての役割を果たした。本発明者らの最初の一連の試験のために、ｓｉＲＮＡ処理した２９３細胞を、ＲＨＧＰ試験のために使用した同じインフルエンザ株（Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２）を用いて感染させた。Ｕｄｏｒｎを用いた攻撃に続き、ウイルス力価を評価し、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞においてより低いレベルのウイルスを実証した。サイトカインの同化に対するｓｉＲＮＡのアーチファクトベースの効果についての最近の証拠に照らして、並行試験を、無関係のｓｉＲＮＡコンストラクトを用いて行い、このように、目的の標的についての抗ウイルス効果の特異性を検証した。
【０１００】
Ｕｄｏｒｎを使用した知見の検証後、本発明者らは、次に、結果を他のインフルエンザバリアントに拡大した。例えば、ｓｉＲＮＡは、また、異なるインフルエンザ株（Ａ／ＷＳＮ／３３）に対する耐性を付与した。比較可能な知見が、異なる感染効率で得られた。全体で、これらの知見は、新規の宿主ベースの標的を同定するためのＲＨＧＰの適用を検証し、異なる形態のインフルエンザに対する広域スペクトルの適用のための潜在力を示唆する。
【０１０１】
この実施例において、ＲＨＧＰが、インフルエンザウイルス感染のために要求される任意の宿主因子（過剰発現又はノックダウンされている標的を含む）のゲノム規模のスクリーニングを行い、ＲＨＧＰベクター内の内部エレメントを使用してこれらの標的を検証するための効率的な手段を提供することができることが示されている。このゲノム規模のスクリーニングでは、インフルエンザについての効果的な宿主志向性の標的としてＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、及びＳＬＣ２５Ａ２５タンパク質に優先順位が付けられた。これらの標的の効率は、独立した試験において従来のｓｉＲＮＡアプローチを使用してさらに検証された。
【０１０２】
本発明者らの本試験の１つの固有の局面は、改善された形態のＲＨＧＰの使用である。以前の試験では、ＭＭＬＶベースのベクターが用いられ、二倍体細胞において遺伝子の両方のコピーが阻害された。しかし、ＭＭＬＶベクターは、内因的に限定された低力価の産生であった。本発明者らは、レンチウイルスシステムによって以前の限定が克服されることを実証する。結果として得られるシステムは、ヒトゲノム全体の１００倍のカバーを確実とするために十分であった。それは、過剰発現された標的及びノックダウンされた標的の両方の徹底的な評価を行うために重要である。さらに、レンチウイルスベクターの使用は、活性な遺伝子転写の部位中への単一部位挿入を強く好む。それはスクリーニング手順の効率を増加させる。
【０１０３】
１つの異なる利点は、ＲＨＧＰが標的の事前の知識により偏らず、同定された標的遺伝子がしばしばまだアノテートされていないことである。しかしながら、本発明者らは、ＰＡＮＴＨＥＲ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Mi, 2005）を用いてＲＨＧＰインフルエンザ遺伝子のヒトホモログを分析し、推定上の生物学的経路を同定した。これらの標的は、生物学的プロセス及び分子機能のカテゴリーに広く分類された（図９）。７０の標的の内、６１（８７%）を分類することができ、９（１３%）はできなかった。それらの６１の遺伝子によって、７つの主要な生物学的プロセス及び８つの主要な分子機能が同定された。生物学的プロセスの内で顕著なのは、核酸及びタンパク質代謝、シグナル伝達、及び細胞内タンパク質輸送に関連する経路であった。具体的には、標的機能は、核酸結合に関連する内因活性、酵素活性（キナーゼ、リガーゼ、ヒドロラーゼ、レドックス）、細胞シグナル伝達、及び細胞内トランスポートを含んだ。初期の指標は、これらの標的クラスがランダムではないことを示唆する。なぜなら、本明細書において同定されたキナーゼ、膜輸送タンパク質、リガーゼ、ヒドロラーゼ、及びトランスファー／キャリアタンパク質の頻度は、公知の標的クラスのランダム検索を行う場合に予測されうるものより少なくとも３倍高かったからである。
【０１０４】
増加する証拠は、ウイルス疾患のための宿主志向性の治療法の概念を支持してきた。特に、一連の最近のｓｉＲＮＡベースの試験が行われ、インフルエンザ、ＨＩＶ、又はウエストナイルウイルスによる感染と関連する宿主標的が同定されている。ｓｉＲＮＡは、標的発見のためにますます利用されているが、しかし、ｓｉＲＮＡの頑健で持続的な過剰発現の必要性により内因的に。一部のｓｉＲＮＡ知見の結果は、技術自体が、本来なら、細胞挙動をどのように変化させうるかについての懸念により曇らされてきた。特に、ｓｉＲＮＡがサイトカイン発現を変化させうるとの最近の報告は、感染性疾患への適用について特に問題である。本発明者らは、ＲＨＧＰが改善された代替物を提供しうると考える。なぜなら、それは、これらの同じ制約により限定されないからである。実際に、本明細書において同定された標的及び経路の大半（７３%）が新規である。この結果は、ＲＨＧＰが、また、まだアノテートされていない標的ならびに過剰発現されるタンパク質又はドメインを同定する能力を有することを反映する可能性が高い。対照的に、ｓｉＲＮＡアプローチは、一般的に、公知の又はアノテートされた標的のノックダウンに限定される。興味深いことに、ＭＤＣＫ細胞のＲＨＧＰ照合を使用して本明細書において同定された標的又は経路の２７%が、ヒト細胞のＨＩＶ又はウエストナイル感染と関連する遺伝子とある程度の関係（配列、タンパク質ファミリー、又は機構的経路に関して）を有する（表３）。この観察は、異なるウイルス病原体が収束的に進化し、特定の決定的な宿主経路を共有することを示唆する。これらの経路は、しばしば、異なる哺乳動物種（例、イヌ及びヒト）の間で保存される。とりわけ、本明細書において同定された遺伝子は、最近のインフルエンザ試験とはあまり似てない。本発明者らは、この外見上の矛盾が、インフルエンザを用いた以前の試験でＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株が利用されたとの事実を表わしていると仮定する。それは重要である。なぜなら、ショウジョウバエは、哺乳動物細胞とは遺伝的に異なるからであり、なぜなら、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノムは、約１４，０００遺伝子（ヒト又はイヌのゲノムより少ない）に限定されるからである。
【０１０５】
さらなる研究によって、ＲＨＧＰを使用して同定された標的の一部をウイルス感染と関連付ける潜在的な機構情報が明らかになる。例えば、減少したＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、及びＳＬＣ２５Ａ２５発現が、インフルエンザ感染に対する感受性を減少させる（図１０）。ＭＲＰＬ４２は、ミトコンドリアリボソームタンパク質（核遺伝子によりコードされる）であり、ミトコンドリアのタンパク質合成に関与する。最近の報告では、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＩＶ−Ｎｅｆの導入が、関連する宿主ミトコンドリアタンパク質（ＭＲＰＬ１、ＭＲＰＬ１４、及びＭＲＰＬ１９）の発現を刺激することが実証された。この報告では、これらの因子のアップレギュレーションが、ウイルスライフサイクルの後期段階で要求されるウイルスメッセージの産生を促進しうることが示唆された。正しい場合、本発明者らの結果は、この知見をＭＲＰＬ４２まで拡大させ、インフルエンザが同様の機構を利用しうることを示す。同様の知見によって、本明細書において同定された別の標的（ＣＯＸ５Ａ）がウイルス感染と関連付けられる。ＣＯＸ５Ａは、チトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）複合体の１成分である。異なるサブユニット（ＣＯＸ６Ａ１）が、報告によると、インフルエンザウイルス複製のために要求される。興味深いことに、膜貫通タンパク質ＴＡＰＴ１（膜貫通前後形質転換１）は、脊椎動物胚における発生の間での軸骨格パターン形成のために要求され、遺伝子の一部が、ＨＣＭＶ  ｇＨ受容体（ｇＨ受容体に対するモノクローナル抗体を用いたｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングにより同定された）をコードすることが明らかにされた。ＴＡＰＴ１が病原性に関与する機構は不明のままであるが、ＴＡＰＴ１が、また、インフルエンザウイルス感染に関与しうることも可能である。ＳＬＣ２５Ａ２５（可溶性キャリアファミリー２５、メンバー２５）タンパク質は、ミトコンドリア及びリン酸キャリアのスーパーファミリーのメンバーである。スーパーファミリーにおける多数の同様のタンパク質が、報告によると、ＨＩＶ及びＷＮＶ感染に関与してきた。
【０１０６】
遺伝子不活性化に加えて、他の遺伝子のＲＨＧＰ誘導によってインフルエンザ感受性が減少する。これらの内で顕著なのは、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２）及びプラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼ（ｕｒａｋｉｎａｓｅ）（ＰＬＡＵ）遺伝子である。プロトがん遺伝子ＢＣＬ２が、細胞生存の十分に特徴付けられた調節因子である。最近の報告では、ＢＣＬ２は、シンドビス、インフルエンザウイルス、又はＨＩＶ−１により起こされたアポトーシスに続く細胞生存の調節と関連付けられている。同様に、ＲＨＰＧは、また、ＰＬＡＵセリンプロテアーゼの過剰発現をインフルエンザと関連付けた。とりわけ、ＰＬＡＵのアミノ末端フラグメントが、最近、感染細胞からのＨＩＶ−１の組み立て及び出芽を抑制することが示された（Wada, 2001）。ゲノム相関によって、また、ＰＬＡＵ及びその受容体（ＰＬＡＵＲ）が、ヒト呼吸器合胞体ウイルスによる感染と関連付けられている。
【０１０７】
実施例３−ＲＨＧＰを使用した潜在的なインフルエンザ標的のさらなる同定
上の実施例２に示すものと非常に類似の技術を使用し、インフルエンザウイルス感染を予防又は処置するための治療介入のための追加の潜在的な標的が同定された。
【０１０８】
材料及び方法
化学物質及び細胞培養。ＭＤＣＫ細胞、ヒト２９３ＨＥＫ細胞、及びＭＥＭ培地をAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入した。インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２をCharles River Labから購入した。全てのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドはDharmacon Researchにより合成された。
【０１０９】
ｐＴｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーターベクターの構築及びＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−ｏｆｆ安定細胞株。ｐＴｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーターベクターを、ｐＩＲＥＳｈｙｇ３（Clontech）を骨格として使用して構築した。ＰＣＲ生成されたｔＴＡフラグメントを、ｐＩＲＥＳｈｙｇ３ベクターのＢａｍＨＩ及びＳｏｆＩ部位中に挿入し、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーターベクター（ｐＩＲＥＳｈｙｇ３−ｔＴＡ）を生成した。
【０１１０】
ＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞株を作製するために、２×１０６個のＭＤＣＫ細胞を１０cmプレート中で培養し、１０μgのｐＩＲＥＳｈｙｇ３−ｔＴＡベクターを用いて、ｆｕｇｅｎｅ  ６（Roche）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、ＭＤＣＫ細胞の対数期の培養物を、２００μg/mlハイグロマイシンを使用して選択し、培地を、３日毎に、全てのコントロール細胞が殺されるまで交換した。ハイグロマイシン耐性クローンを、ｐＴＲＥ−ｌｕｃ（Clontech）ベクター及びＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を使用し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｌｃｉｎｅ）（Ｄｏｘ；Invitrogen）誘導活性についてスクリーニングした。少なくとも４０倍の誘導を伴う安定クローンを使用し、ＲＨＧＰライブラリーを作製した。
【０１１１】
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクター（ｐＲＨＧＰ２２）のコンストラクション。ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクター（ｐＲＨＧＰ２２）を、ｐＬＥＳＴベクター（Stanley Cohen博士（Stanford）により提供）（Lu et al., 2004）を骨格として使用してコンストラクションした。ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ−ＣＭＶ−ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＲを、プロモーターとして置換した。３’ＵＴＲ  ＷＰＲＥエレメントを除去し、ｐ１５Ａ  ｏｒｉ−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）耐性遺伝子を同じ部位に挿入した。２つのＬｏｘＰ部位を、ＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎＲ遺伝子から下流及びｐ１５Ａ  ｏｒｉ−ＣＡＴから上流にそれぞれ挿入した。
【０１１２】
ＲＨＧＰウイルスの産生及びＲＨＧＰライブラリーの構築。ＲＨＧＰレンチウイルスを、ＶｉｒｏＰｏｗｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を使用して産生した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、１０cmプレート中に１０６個細胞／プレートでプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞を、３μgのＲＨＧＰ２２及び９μgのViroPower Packaging Mixを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を使用してトランスフェクトした。培地を、３７℃で５時間のインキュベーション後に交換した。４８時間後、培養培地中のウイルスを、０．４５μmフィルターを通じてろ過し、製造者の指示に従い滴定した。
【０１１３】
ＲＨＧＰライブラリーを構築するために、ＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞を、１５cmプレート中に、２×１０６個細胞／プレートでプレーティングした。次の日に、サンプルを、ＰＢＳを用いて洗浄し、６μg/mlポリブレン中のＲＨＧＰウイルスを用いて形質導入した。サンプルを、新鮮培地を用いた補充の前に混合しながら３７℃で２時間にわたりインキュベーションした。形質導入から４８時間後、細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２を用いて、感染効率（ＭＯＩ）０．１で２時間にわたり、ＤＭＥＭ培地（０．２%  ＢＳＡ、２００μg/mlハイグロマイシン、２μg/mlウシトリプシン、及び６μg/mlブラストサイジンを含む）中で、１５分毎に穏やかに混合しながら感染させた。培地を、次に、ＭＥＭを用いて補充した。２日後、細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、上に示すとおりに、インフルエンザウイルスを用いて再び感染させた。第２ラウンドの感染後、サンプルを、ＰＢＳを用いて洗浄し、条件培地（２００μg/mlのハイグロマイシン及び６μg/mlのブラストサイジンを含む）中でインキュベーションした。培地を、３日毎に、全ての非トランスフェクト細胞が殺され、ウイルス耐性コロニーが形成されるまで交換した。第２ラウンドの感染から２週間後、目に見える個々のコロニーを単離し、２４ウェルプレート中で継代培養した。
【０１１４】
インフルエンザウイルス耐性細胞クローンについての可逆性アッセイ。ＲＨＧＰ事象の可逆性を検証するために、ＭＤＣＫ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞を、Ｄｏｘの非存在又は存在において３日間にわたり培養した。細胞を、１０cmプレート中で、２×１０６個細胞／プレートでプレーティングし、Ｄｏｘを用いて又は用いずに培養した。２４時間後、サンプルを、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（それぞれＭＯＩが１×１０−２及び１×１０−５）を用いて感染させた。３日後、生存細胞を、クリスタルバイオレットを用いて染色し、残りの細胞を可視化した。
【０１１５】
インフルエンザウイルス耐性クローンからの候補遺伝子の同定各クローンからの１×１０６個細胞を、溶解緩衝液（０．３２Mスクロース、１０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５mM  ＭｇＣｌ２、及び１%  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中に浮遊させた。ライセートを１５００×ｇで１５分間にわたり遠心分離した。ペレットを、プロテイナーゼＫ緩衝液（２５mM  ＥＤＴＡ、１５０mM  ＮａＣｌ及び４０mM  Ｔｒｉｓ、０．５%  ＳＤＳ、ｐＨ７．５を含む）中の１００μgのプロテイナーゼＫ（Sigma）を用いて処理した。混合物を一晩３７℃でインキュベーションし、５０μgのＲＮａｓｅ  Ａ（Sigma）を用いて処理し、３７℃で２時間にわたりインキュベーションした。ゲノムＤＮＡを、フェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムを用いて抽出し、イソプロパノールを用いた沈殿が続いた。ＤＮＡペレットを、７０%エタノールを用いて洗浄し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解した。
【０１１６】
ゲノムＤＮＡ（１０μg）を、制限酵素ＢａｍＨＩ又はＸｂａＩを用いて消化し、フェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノールを用いて沈殿し、ＴＥ緩衝液中に溶解した。消化されたＤＮＡ（２．５μg）を、Ｔ４リガーゼ（Invitrogen）を使用して１６℃で一晩自己連結させた。連結されたＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させ、７０%エタノールを用いて洗浄した。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液中に溶解させ、ＤＨ１０Ｂ  ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘコンピテント細胞（Invitrogen）中に電気穿孔した。複数のコロニーを、プラスミドＤＮＡ調製及び制限酵素消化のために単離した。プラスミドＤＮＡをさらに使用し、標的遺伝子をＤＮＡ配列決定及びゲノムマッピングにより同定した。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡを用いた宿主標的遺伝子の検証。候補遺伝子ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＳＬＣ２５Ａ２５、及びＴＡＰＴ１についてのヒト二本鎖ｓｉＲＮＡホモログを、製造者により推奨される通りに調製した。ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６配列（ＧＧＡＵＣＵＵＡＵＵＵＣＵＵＣＧＧＡＧＵＵ）は、インフルエンザウイルスのヌクレオカプシド（ＮＰ）遺伝子を標的化し、ポジティブコントロールを提供した（18, Ge, 2003）。非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ１）がネガティブコントロールを提供した。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレート中に１×１０５個細胞／ウェルでそれぞれプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞を、２０nMのｓｉＲＮＡ及びTransIT-TKOを用いて、製造者の指示（Mirus）に従いトランスフェクトした。細胞を、２４時間のインキュベーション後、ｓｉＲＮＡを用いて再トランスフェクトした。第２ラウンドのトランスフェクションから２４時間後、サンプルを、ＭＥＭを用いて洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（ＭＯＩ１）を用いた感染が続く。細胞を、１５分毎に穏やかに揺らしながら１時間にわたりインキュベーションした。各ウェルからの培養培地を、トランスフェクションから４８時間後に回収した。培地中の子孫ウイルスを、標準的なプラークアッセイを使用して滴定した。
【０１１８】
結果
ＲＨＧＰ細胞ライブラリーの構築
ＲＨＧＰの中心となる特性は、固有のレンチウイルスベースの遺伝子エレメントであり、遺伝子探索ベクター（ＧＳＶ）として公知であり、それは、ゲノム全体を照合し、宿主細胞がインフルエンザ感染に耐性となる又は生き残ることを可能にする標的を同定するように設計された。本発明者らの実験戦略では、ゲノム中の単一部位でのＧＳＶの組込みを中心とした。そこで、それは誘導プロモーターを介して標的遺伝子の発現を調節した。ベクターは自己不活性化レンチウイルスＬＴＲをコードし、それは、ＧＳＶが形質導入細胞から再出現することを予防した。ＲＳＶ  Ｅ／Ｐプロモーターは、ＧＳＶの産生のためだけに使用され、宿主ゲノム中へのＧＳＶの組込みにより除去された。
【０１１９】
ＧＳＶは、センス又はアンチセンスのいずれかの方向で組込まれうる。アンチセンス配置において、組込み事象自体が１つの対立遺伝子を不活性化し、アンチセンス構築物の発現を促進し、それによって他の対立遺伝子上でコードされる遺伝子がノックダウンされた。この方法において、ＲＨＧＰは、二倍体細胞における両方の遺伝子コピーのホモ接合性摂動を促進した。反対（センス）方向では、ＲＨＧＰは、標的遺伝子の過剰発現を促進した。この結果は、遺伝子全体の単純な過剰発現を超えて拡大しうる（例、開始部位の上流での挿入）。なぜなら、開始部位の下流への組込みはドメインの過剰発現を引き起こし、野生型遺伝子の機能のドミナントネガティブな阻害剤を産生しうる。そのようなものとして、ＲＨＧＰによって、本発明者らは、細胞ゲノム全体を照合し、宿主細胞がインフルエンザ感染に耐性となる又は生き残ることを可能にする異なる型の事象を同定することができた。
【０１２０】
ＲＨＧＰを促進するために、ＭＤＣＫ細胞のライブラリーを、レンチウイルスベースのＧＳＶを使用して形質導入する。ゲノム中での平均遺伝子サイズが２７kbと推定されるため（Gupta and Varshney, 2004）、本発明者らは、１０５の独立した組込み事象が、ゲノム全体のランダムなカバーを確実にしうると計算した（Li and Cohen, 1996）。材料及び方法に概説されている通り、ｐＲＨＧＰ２２を、ブラストサイジン耐性遺伝子を促すｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔ−ＣＭＶプロモーターからなる発現カセットを使用して構築し、厳密な誘導制御下で選択可能マーカーを提供した。形質導入された宿主細胞のライブラリーを、次に、ブラストサイジンを使用して選択し、生存細胞を、以下で詳述する通りに、インフルエンザ耐性についてスクリーニングした。
【０１２１】
インフルエンザウイルス耐性表現型のスクリーニング
宿主細胞をインフルエンザに対して耐性にする標的を同定するために、ＲＨＧＰライブラリーをＭＤＣＫ細胞において生成し、インフルエンザ攻撃を実施した。この特定の細胞モデルを、インフルエンザ感染に対するその十分に確証された応答性に基づいて選択した。なぜなら、イヌゲノムがアノテートされており、ヒトホモログと比較することができるからである。本発明者らは予備試験を行い、ＭＤＣＫ細胞が、選択のために利用される条件下でＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２により効率的かつ完全に殺されることを確実にした。この結果は、生存細胞が、ＲＨＧＰ摂動の結果として（インフルエンザに対する自然耐性のアーチファクトとしてではなく）生じることを確実にするために必須であった。ｐＲＨＧＰ２２  ＧＳＶを用いたライブラリー構築に続き、少なくとも１０７の独立したＭＤＣＫクローンからなるライブラリーを作製し、ゲノムの１００倍のカバーを確実にした。低ＭＯＩ（０．１）をライブラリー作製の間に用いて、１を上回る異なるＧＳＶによる任意の細胞の形質導入を最小限にした。ＧＳＶ組込みを確認する追加の手段として、ＭＤＣＫライブラリーを、致死濃度のブラストサイジン（感染から４８時間後に投与）を用いてインキュベーションした。
【０１２２】
ライブラリーを、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２を用いた感染により攻撃し、インフルエンザ耐性細胞について選択した。本発明者らは、以前に、Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２（ＭＯＩ１０−１）を用いた感染によって全てのＭＤＣＫ細胞が４８時間以内に再現性よく殺されることを確証していた。コントロールとして、偽形質導入細胞の並行培養物を同じように処理し、生存体は４８時間後に観察されなかった。本発明者らは、さらに、生存細胞を複数ラウンドの致死攻撃に供することによりアーチファクトを最小限にすることを追求した。このように、サンプルを少なくとも３ラウンドのインフルエンザ攻撃に供し、その時に、生存細胞は、一致させたコントロールのいずれにおいても検出されなかった。
【０１２３】
これらの試験の経過において、本発明者らは、高い相対的ＭＯＩのインフルエンザでの攻撃が特定の型の標的について偏りうると考えた。例えば、高いＭＯＩでの生存が、意図的にではなく、感染の初期段階に関連する標的を好みうる、又は、後の段階での事象に関連する標的に対して偏りうる。そのような偏りを予防するために、並行した一連の試験を行い、低い力価でのウイルス攻撃に関連する生存を比較した。このために、クローンを、低い最初のＭＯＩ（ＭＯＩ１０−５）での感染に供した。培養物を、次に、経時的に、複数ラウンドの感染を使用して評価し、コントロールサンプル中の全ての細胞がインフルエンザにより殺されていたことを確実にする。
【０１２４】
インフルエンザを用いた攻撃を生き残ったＲＨＧＰ形質導入細胞についての選択後、クローンを、単一細胞クローニングにより単離し、そして増大し、平均３，０００クローン／実験を産出した。豊富なクローンを仮定し、３０３の異なるインフルエンザ耐性クローンのサブセット（全集団の１０%）をランダムに選択し、第２ラウンドの単一細胞クローニングに供し、クローン性を確実にした（表２）。これらのサブクローンを、次に、一連の試験に供し、表現型を確認し、標的遺伝子を同定した。各サブクローンを、再び、インフルエンザを用いた致死攻撃を生き残る能力についてテストした。不活性Ｔｅｔ−ｏｆｆ  ＧＳＶを用いて形質導入されていた親ＭＤＣＫ宿主細胞は、一致させたネガティブコントロールを提供した。１２９の異なるサブクローン（最初の集団の４３%）が、インフルエンザを用いた致死攻撃を生き残るそれらの能力に基づいて単離された。この段階での下方選択の大半が、単一細胞クローニングプロセスを生き残ることができなかったコロニーに起因した。
【０１２５】
ウイルス耐性細胞クローンの可逆性アッセイ
ＲＨＧＰ技術の重要な特性は、誘導プロモーターによる調節を介して候補標的を検証する能力である。これによって、本発明者らは、自然突然変異又はＲＨＧＰに関連しない他のアーチファクトの結果としてインフルエンザに対して耐性になったであろう候補を除去することができた。ＲＨＧＰベクター用のプロモーターはＴｅｔ−ｏｆｆシステムの制御下にあったため、本発明者らは、ドキシサイクリンの存在又は非存在において候補のインフルエンザ媒介性の殺傷を比較した。この試験によって、１２９の生存クローン中１１１（８６%）でインフルエンザ攻撃に対する可逆性の耐性が実証された。残りの１８クローン（１４%）が優先順位から外され、ＲＨＧＰ、及び無関係ではないアーチファクトがインフルエンザ耐性表現型に関与することを確実にした。
【０１２６】
ゲノムＤＮＡクローニングによる宿主遺伝子の同定
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターを設計し、標的遺伝子を効率的に位置付け、組込み事象の方向（センス又はアンチセンス）を決定した。具体的には、遺伝子探索ベクターはＯｒｉ−ＣＡＴレポーター遺伝子をコードし、それは、制限酵素ベースのゲノムＤＮＡクローニングによりレスキューすることができる。ゲノムＤＮＡを、インフルエンザに対する実証された可逆的な耐性を有する１１１のクローンから単離し、合計１１０の標的遺伝子を産出した（表Ｉ）。ＲＨＧＰベクター挿入部位に隣接する結果として得られるゲノムＤＮＡ配列を、イヌゲノムに対する、UCSC Genome Browserを使用したゲノムマッピングに供した。実験計画と一致して、大半の標的が、１クローン当たり単一の組込み部位からなった。本発明者らは、技術的な限定に起因して、候補の小さなサブセットから候補遺伝子を単離することができなかった。また、少数のサンプルが複数の組込み事象を含んだ。それらは、複数のＲＨＧＰ組込み部位の結果として又はサブクローンがクローン性ではなかった場合に生じたであろう。このあいまい性に起因し、複数の組込み事象に関連する遺伝子を、さらなる検証のために優先順位から外した。
【０１２７】
ＲＨＧＰにより提供される組込みの部位及び方向は、宿主細胞がインフルエンザを用いた攻撃を生き残ることを可能にする摂動の型に関する洞察を提供した（図４）。具体的には、ＲＨＧＰ摂動は広く３群に分けられた：（１）「アンチセンス」：１つの対立遺伝子の破壊及び他の対立遺伝子のアンチセンス阻害を促進させたアンチセンス組込み事象；（２）「センス下流」：センス方向での組込み（１つ又は複数のドメインの産生を促進すると予測されうる。全長遺伝子産物のドミナントネガティブ阻害剤として作用しうる）；及び（３）「センス上流」：開始部位の上流のセンス方向での組込み（標的遺伝子全体の過剰発現を促進しうる）。ＲＨＧＰを使用して同定された９９の公知の標的の内、５６の標的（全標的の５６%）が標的発現の「アンチセンス」ノックダウンを表わした。標的の別の３５%が「センス下流」事象を表わし、野生型遺伝子発現のドミナントネガティブ阻害剤の過剰発現を伝える可能性が高い。この解釈と一致して、本発明者らは、特定の標的ＰＴＢＰ１が２つの別々のクローン中の標的として独立して同定されることに注目した；１つのクローンは「アンチセンス」方向及び別は「センス下流」方向。残りの９%は「センス上流」挿入を表わした。１１の標的遺伝子（本明細書において配列決定した１１０の標的の１０%）の方向が確認されないであろう。なぜなら、遺伝子自体が、以前に、記載されておらず、従って、方向の割り当てが可能ではなかったからである。
【０１２８】
別々の評価において、本発明者らは、これらの１１０の標的遺伝子が以前にウイルス感染と関連付けられていたかを問うた。本明細書において同定される１１０の標的の内わずか４つ（ＭＤＮ１、ＧＲＫ６、ＡＫＴ１、及びＳＴＸＢＰ１）がウイルス感染に直接的に関連付けられており（表ＩＩ）、ＲＨＧＰを使用して同定された１０６の標的（９６%）についての新規情報を示唆している。本発明者らの分析を関連タンパク質に拡大することにより、本発明者らは、本明細書において同定される１１０の標的の内２３（２１%）が、以前にウイルス感染と関連付けられていた宿主標的と相同性を共有している又はそれらとスーパーファミリーの共通メンバーであることを見出した。これらの知見は、ＲＨＧＰによって宿主標的の圧倒的多数（７５%）についての新規機能が同定されたことを示唆する。本明細書において同定された２つの標的（Ｃ４ｏｒｆ３２及びＣ２１ｏｒｆ３３）が、オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）として簡単に記載されており、帰する機能を伴わない。全体で、これらの知見は、宿主ゲノムのＲＨＧＰベースの照合によって両方の新規標的が同定され及び／又は新規機能が公知の遺伝子に帰されたことを示唆する。
【０１２９】
ナイーブな細胞を使用した標的遺伝子の検証
ＲＨＧＰによってＭＤＣＫ細胞中の一連の標的が同定され、それらはインフルエンザ感染に対して耐性を付与する。表現型の可逆性は、これらの標的についての最初の検証を提供した。本発明者らは、次に、独立した実験システムを使用してこれらの候補を検証することを追求し、ＭＤＣＫ細胞又はＲＨＧＰ技術のアーチファクトとして生じうる結果を除いた。標的遺伝子がイヌ由来ＭＤＣＫ細胞から単離されていたため、本発明者らはそれらのヒトホモログを同定し、ヒトＨＥＫ−２９３細胞においてこれらの標的について選択的であるｓｉＲＮＡを発現させた。
【０１３０】
ＲＨＧＰによって、宿主細胞（過剰発現又はノックダウンされている標的を含む）のインフルエンザ媒介性の殺傷を予防する改変が同定された。本発明者らは、ＲＨＧＰベクター内で誘導プロモーターを使用してこれらの標的を検証し、表現型を逆転させ、それにより、ＲＨＧＰ戦略に起因しない自然アーチファクトについての潜在力を最小限にできた。このゲノム規模のスクリーニングによって、本発明者らは、宿主細胞を、インフルエンザウイルスを用いた本来なら致死的な攻撃に対して耐性にする１１０の新規標的を同定することができた。これらの標的の内、大半（１１０中１０６）が、以前に、インフルエンザと関連付けられていた。また、本発明者らは、新規機能を、以前に未知である遺伝子及びｏｒｆに帰する。概念の証拠として、標的のサブセットを、従来のｓｉＲＮＡアプローチを使用した独立した試験においてさらに検証した。
【０１３１】
最近の一連のｓｉＲＮＡベースの試験によって、インフルエンザ、ＨＩＶ、又はウエストナイルウイルスによる感染と関連する宿主標的が同定された（概要については表３を参照のこと）（Brass et al., 2008; Hao et al., 2008; Konig et al., 2008; Krishnan et al., 2008）。これらの初期の試験では、異なる種に由来する宿主細胞が利用された。それらは、本発明者らの本知見との比較の複雑さを増加させる。これを複雑化することとして、ｓｉＲＮＡは、標的発見のためにますます利用されるが、しかし、ｓｉＲＮＡの頑健で持続的な過剰発現の必要性により内因的に限定される。一部のｓｉＲＮＡの知見での結果は、また、ｓｉＲＮＡが宿主防御機構を非特異的に変化させるか否かの疑問により曇らされてきたが（Kleinman et al., 2008）、それは、抗ウイルス疾患へのｓｉＲＮＡ技術の適用について特に問題になりうる。ＲＨＧＰは、また、潜在的な抗ウイルス宿主防御機構を誘導しうる。例えば、ＧＳＶのアンチセンス方向は、二本鎖ＲＮＡを誘導することが予測され、それ自体が宿主の抗ウイルス応答を引き起こすことができる。
【０１３２】
表
【表１１】
2015096067.tif 000013
【０１３３】
表２。示しているのは、宿主細胞を、本来なら致死的であるインフルエンザ感染に耐性にすることができる宿主標的のＲＨＧＰ媒介性の同定と関連する事象の進行の概観である。ＲＨＧＰを使用して同定された特定の標的（９６%）及び標的ファミリー（７５%）の大部分が固有であったことに注目して下さい。ＲＨＧＰは、また、アノテートされていなかった標的の同定を促進した。
【０１３４】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０１３５】
表３。示しているのは、ＲＨＧＰ（本報告）又はｓｉＲＮＡを使用して同定された標的及び標的ファミリーの評価である。この表は、本試験及び発表された知見（示す通り）の両方に共通である標的ファミリーに限定される。４つの標的（ＭＤＮ１、ＧＲＫ６、ＡＫＴ１、及びＳＴＸＢＰ１、太字）が共有され、残りは固有であったが、一部の関連するスーパーファミリーメンバーは、異なるウイルスによる感染と関連付けられている。示されていないのは、以前に発表された情報と共通性を有さない、本明細書において同定された８７の追加の標的である。
【０１３６】
実施例４−ＲＨＧＰを使用し、ＨＩＶ感染性を制御するための潜在的な標的を同定する。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）は、公衆衛生に対する世界的な脅威である。ウイルスを直接的に標的化する現在の医薬は、しばしば、薬物耐性ウイルスバリアントにおいて無効になりうる。薬物耐性と戦うための出現する概念は、ウイルスの機能、生存、及び増殖のために（しかし、宿主自体に対してではない）必須である宿主機構を標的化する考え方である。本明細書において、ヒトＭＴ４  Ｔ細胞に対するランダムホモ接合摂動（ＲＨＧＰ）を使用し、本発明者らは、これらの細胞がＨＩＶ−１ＮＬ４−３を用いた致死感染に生き残るために必須である、安全で効果的な一連の宿主標的を同定した。ＲＨＧＰは、細胞中の全ての標的をサンプリングすることができる新たな技術である。これは、遺伝子探索ベクター（ＧＳＶ）の操作を通じて可能であり、それは、宿主染色体中にランダムに組込むことができる。ＧＳＶは、細胞において、誘導因子により調節される不可逆的な様式で、任意の標的をアップレギュレーション又はダウンレギュレーションすることができる。誘導因子の除去によるＲＨＧＰ効果の逆転によって、操作された細胞は、ＨＩＶ感染に再び感受性になる。ｓｉＲＮＡアプローチを使用し、同定され、定義された遺伝子標的が検証され、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５のいずれかに向性のウイルスを用いた感染のために必要であることが示された。これらの試験では、標的介入のための新規の遺伝子候補（機能の事前の知識を伴わない遺伝子配列（ＥＳＴ）を含む）を同定するためのＲＨＧＰの能力が実証される。これらの候補は、広域スペクトルの薬物開発のために直接的に適する。なぜなら、それらの発見の間での遺伝子破壊は、無視できる細胞傷害性を示すだけであるからである。
【０１３７】
三種混合薬物治療（すなわちＨＡＡＲＴ、高活性抗レトロウイルス治療）は、ＨＩＶ−１複製を効果的に制御することができるが、ＨＡＡＲＴ耐性ＨＩＶ−１株が、エラープローンＨＩＶウイルス逆転写酵素と頑健なウイルス複製及び不完全な患者のコンプライアンスとの組み合わせとして容赦なく出現している。一部の地域において、ＨＡＲＲＴにおいて使用される三種薬物に対して耐性であるウイルスが、ＡＩＤＳ患者の２０%近くから単離された（Grant, Hecht et al. 2002; Richman, Morton et al. 2004）。そのような知見によって、ＨＩＶ−１疾患の処置のための新たなパラダイム（特に、耐性の発生に対して比較的非感受性である作用機構を伴うもの）を同定する緊急性が増加する。ＨＩＶ−１感染（しかし、宿主自体ではない）に必須である宿主遺伝子産物を標的化する治療法は、処置のそのような新たなモダリティを提供しうる。なぜなら、十分に設計された宿主標的は、病原体に対して直接的な選択圧力を置かないかもしれないからである。
【０１３８】
ウイルスと宿主細胞の間での相互作用によってウイルス病原性の結果（ウイルスの除去から潜在的及び致死的な感染に及ぶ）が決定されることが十分に確証されている。ＨＩＶ−１は、宿主細胞タンパク質と相互作用し、それらの複製を助け、免疫攻撃を回避することが公知である。この相互作用の例は、欠損した細胞表面受容体（ＣＣＲ５）を保有し、従って、ＨＩＶ−１感染に対して耐性である個人により実証される（Liu, Paxton et al. 1996）。同様の型の相互作用が、文献において報告されており、ＨＩＶ−１ライフサイクルのほぼ全ての段階を包含する：細胞受容体ＣＤ４及び共受容体ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５へのＥｎｖ結合を要求するウイルス侵入から、Ｇａｇ  ｐ６によりＴＳＧ１０１をハイジャックする必要性のあるウイルス放出まで（Garrus, von Schwedler et al. 2001）。ＨＩＶ−１タンパク質と宿主細胞のものとの相互作用の完全な文書化は、このように、ＨＩＶ−１複製及び病原性のプロセスを理解するために重大である。より重要なことには、そのような理解は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳと戦うための治療法及び予防戦略を改善するための礎石を提供しうる。
【０１３９】
ＨＩＶ−１感染における宿主因子の理解された重要性に照らして、増加する研究で、抗ウイルス治療のための宿主標的が考えられ始めている。宿主指向の治療法が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ処置において、ＨＩＶ結合及び内在化のために必要である受容体に影響を及ぼすための生物製剤及び小分子を用いてウイルス受容体ＣＤ４及び／共受容体ＣＣＲ５（Reeves and Piefer 2005; Wheeler, McHale et al. 2007）を標的化することにより成功裏に使用されてきた。実験室での研究及び初期の臨床試験では、これらの薬剤がＨＩＶ／ＡＩＤＳの処置のための選択肢を提供しうることが示唆される。
【０１４０】
発見された全ての宿主遺伝子が、治療標的として適するわけではない（特に、宿主自体に必須であるもの）。これらの標的の間で区別するために、本発明者らの実験室では新規技術であるランダムホモ接合性遺伝子摂動（ＲＨＧＰ）を用いて、ＨＩＶ感染のために必須であるが、しかし、非感染細胞の増殖、生存、又は機能のためには必要ではない標的について選択している。ＲＨＧＰは、真核細胞中の任意の遺伝子をアップレギュレーション又はダウンレギュレーションし、細胞挙動の客観的な測定を使用して結果を評価するように設計した。
【０１４１】
本明細書において、本発明者らは、ＲＨＧＰを適用し、宿主細胞が致死的ＨＩＶ感染に耐性になることを可能にする一連の宿主志向性の標的を同定した。これらの新規標的は、その機能が公知の生物学的経路に関連する遺伝子及び機能が割り当てられていないＥＳＴを含む。同定された遺伝子を、他の遺伝的アプローチ（ｓｉＲＮＡを含む）を使用して検証した。従って、この研究では、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する将来の薬物開発のための潜在的な新たな安全な標的が明らかになった。
【０１４２】
材料及び方法
細胞株及びウイルス
細胞（ＭＴ４、ＰＭ１細胞、及びＴＺＭ−ｂｌを含む）及びウイルス（薬物耐性突然変異体ウイルス及びＲ５向性バリアント）を、NIH AIDS Research及びReference Reagent Programから得た。ＨＩＶ−１ＮＬ４−３を、ＨＥＫ２９３から、プロウイルスＤＮＡ（NIH AIDSプログラム）のトランスフェクション後に作製し、ＭＴ４細胞中で増幅させた。
【０１４３】
ＨＩＶ−１感染ならびに感染性及びｐ２４産生の決定
ＭＴ４又はＰＭ１細胞を、ＨＩＶ−１（ＭＯＩ０．００１）を用いて、１時間にわたる低速遠心分離（１，２００g）により感染させた。感染後に回収された上清を、次に、感染性の検査のために、ＴＺＭ−ｂｌ指標細胞株（Wei, Decker et al. 2002）に移した。相対発光単位（ＲＬＵ）を、ＴＺＭ−ｂｌ細胞で、それらをＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて３日後に処理した後に得た。
【０１４４】
回収された上清中のＰ２４量を、また、ＨＩＶ−１  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット（Xpressbio, Thurmont, MD）を使用し、製造者の指示に従い測定した。
【０１４５】
ＭＴ−４  Ｒ１細胞株の構築
ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍをNew England Biolabs（NEB）から購入した。トランスアクチベーターＲ１をコードするプラスミドｐＮＥＢ−Ｒ１を、最初に、制限酵素ＳｃａＩ（NEB）を使用して線状化した。ＭＴ４細胞を、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Eppendorf, AG 22331, Huammburg）を使用し、３６０v（電圧）及び１００ms（時間）の条件下での電気穿孔によりトランスフェクションした。ＭＴ４細胞を、Ｇ−４１８（４００μg/ml）を使用して選択し、Ｇ−４１８耐性細胞を連続限界希釈によりクローン化した。増大後、クローンを、Ｒ１応答性ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＧｌｕｃ）を用いたトランスフェクション後、Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（NEB）を使用して発光（相対発光単位（ＲＬＵ））について少なくとも２回検討した。本発明者らは、これらの細胞クローンからの発光のＲＳＬ１誘導（倍）を以下の通りに決定した：誘導因子での処理なしのサンプルからのＲＬＵにより除した、誘導因子の存在においてサンプルから得られたＲＬＵ。これらのクローンからの倍は２〜６０倍に及んだ。最も高い誘導を伴う安定なクローン（＃２−１４）を使用し、ＲＨＧＰライブラリーを作製した。
【０１４６】
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターｐＲＨＧＰ１２−ＲＳＮのコンストラクション
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターｐＲＨＧＰ１２−ＲＳＮは、企業において、レンチウイルスベースのｐＬＥＳＴベクター（寛大に、Stanley Cohen博士（Stanford）により提供された）を骨格として使用してコンストラクションされた一連のＦＧＩのＲＨＧＰベクターの１つである（Lu, Wei et al. 2004）。このベクターは、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（NEB）を用いてコンストラクションされた。ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステムは、ＴＡＴＡボックスの上流に５コピーのＧＡＬ４応答エレメント（５×ＲＥ）を含み、ＲＳＬ１リガンドの存在において低い基礎発現を伴う転写の高い誘導をもたらす。ベクターを構築するために、ｐＬＥＳＴ中のＮｅｏＲ−ＴＲＥ−ＣＭＶのＤＮＡ配列を、最初に、５’ＬＴＲ部位の反対のＯｒｉ−ＣＡＴ−ＲＳのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（ＲＳ）誘導性発現カセットを用いて置換した。選択マーカー及びブラストサイジン（ＢＳ）耐性遺伝子を含むレポーターカセットならびにＰＫＧプロモーターにより制御されるＥＧＦＰ遺伝子を、ＲＳ発現カセットの反対方向でＮｈｅＩ部位中に挿入した。２つのＬｏｘＰ部位を、ＲＳプロモーターの下流及びｐ１５Ａ  ｏｒｉ−ＣＡＴの上流にそれぞれ挿入した。
【０１４７】
ＧＳＶを保有するレンチウイルスの産生及びＲＨＧＰライブラリーの構築
ＲＨＧＰレンチウイルスを、ＶｉｒｏＰｏｗｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を使用して産生した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、１０cmプレート中に１０６個細胞／プレートでプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、細胞を、３μgのＲＨＧＰ２２−ＲＳＮ及び９μgのＶｉｒｏＰｏｗｅｒ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen）を使用してトランスフェクトした。培地を、３７℃で５時間のインキュベーション後に交換した。４８時間後、培養培地中のウイルスを、０．４５μmフィルターを通じてろ過し、製造者の指示に従い滴定した。
【０１４８】
ＲＨＧＰライブラリーを構築するために、ＭＴ４−Ｒ１細胞を、ＲＨＧＰウイルスを用いて、ポリブレン（６μg/ml）の存在において、１時間にわたる低速遠心分離（１，２００g）により形質導入した。単一細胞内での複数の挿入についての潜在力を最小限にするために、低ＭＯＩ（０．１）をライブラリー作製の間に用い、細胞が、１を上回る異なるＧＳＶにより形質導入されうる可能性を最小限にする。ＧＳＶ組込み細胞を、ＧＢＬ培地（完全ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｇ４１８（４００μg/ml）、ブラストサイジン（４μg/ml）、及びＲＳＬ１リガンド（０．５μM）を含む）を使用して選択した。
【０１４９】
ＨＩＶ−１攻撃から生き残ったＲＨＧＰ細胞クローンの選択
ＨＩＶ−１ＮＬ４−３を用いた感染後、ＭＴ４−Ｒ１  ＲＨＧＰライブラリーを、同じＧＢＬ培地中で培養した。個々の生存クローンを、連続限界希釈により確立し、ＧＢＬ培地中で継続的に増大させた。細胞クローンを、さらに、ＨＩＶ−１を用いて攻撃し、それらの耐性を確認した。
【０１５０】
可逆性
ＲＨＧＰ事象の可逆性を検証するために、ウイルス耐性ＭＴ４細胞クローンを、ＧＢＬ培地又はＲＳＬ１を伴わないＧＢＬ培地中で少なくとも３日間にわたり培養した。ＨＩＶ−１感染後、上清中でのウイルス産生（感染性及びｐ２４）を上に記載する通りに検討した。
【０１５１】
ウイルス耐性クローンからの候補遺伝子の同定
ＲＨＧＰ遺伝子探索ベクターを設計し、標的遺伝子を効率的に発見し、組込み事象の方向（センス又はアンチセンス）を決定した。遺伝子探索ベクターはＯｒｉ−ＣＡＴレポーター遺伝子を含み（図１）、それは、制限酵素ベースのゲノムＤＮＡクローニングによりレスキューすることができる。
【０１５２】
各クローンからの細胞（１×１０６）を、溶解緩衝液（０．３２Mスクロース、１０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５mM  ＭｇＣｌ２、及び１%  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む）中に浮遊させた。遠心分離後、ペレットを、プロテイナーゼＫ緩衝液（２５mM  ＥＤＴＡ、１５０mM  ＮａＣｌ及び４０mM  Ｔｒｉｓ、０．５%  ＳＤＳ、ｐＨ７．５を含む）中のプロテイナーゼＫ（Sigma）及びＲＮａｓｅ  Ａ（Sigma）を用いて処理した。ゲノムＤＮＡを、フェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムを用いて抽出し、イソプロパノールを用いた沈殿が続いた。ＤＮＡペレットを、７０%エタノールを用いて洗浄し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解した。
【０１５３】
ＢａｍＨＩ又はＸｂａＩを用いた消化及びフェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムを用いた抽出後、ゲノムＤＮＡ（１０μg）を、エタノールを用いて沈殿し、ＴＥ緩衝液中に溶解した。消化されたＤＮＡ（２．５μg）を、Ｔ４リガーゼ（Invitrogen）を使用して１６℃で一晩自己連結させた。連結されたＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させ、７０%エタノールを用いて洗浄した。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液中に溶解させ、ＤＨ１０Ｂ  ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘコンピテント細胞（Invitrogen）中に電気穿孔した。複数のコロニーを、プラスミドＤＮＡ調製及び制限酵素消化のために単離した。プラスミドＤＮＡをさらに使用し、標的遺伝子をＤＮＡ配列決定及びゲノムマッピングにより同定した。ＲＨＧＰベクター挿入部位に隣接する結果として得られるゲノムＤＮＡ配列を、ヒトゲノムに対する、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを使用したゲノムマッピングに供した。
【０１５４】
ｓｉＲＮＡを用いた宿主標的遺伝子の検証
ＲＨＧＰ同定遺伝子についてのヒト二本鎖ｓｉＲＮＡホモログ（ｓｉＧＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ）を、製造者（Dharmacon）により推奨される通りに調製した。ｓｉＲＮＡ  Ｒａｂ  ６Ａ及びＨＩＶ−１  ｔａｔをポジティブコントロールとして用いた（Brass, Dykxhoorn et al. 2008）。非標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ１）をネガティブコントロールとして使用した。ＭＴ４又はＰＭ１細胞を、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で一晩培養した。対数期増殖中のＭＴ４細胞を、１．２μMのｓｉＲＮＡを用いて、電気穿孔プロトコールにより、製造者（Eppendorf）の指示に従いトランスフェクトした。ＰＭ１細胞を、同じプロトコール下で（パルス条件２００v（電圧）及び２００ms（時間）の使用を除く）、電気穿孔した。細胞を、ＨＩＶ−１バリアントを用いて、トランスフェクションから２４時間後に感染させた。培養培地を毎日新しくした。細胞生存をトリパンブルー色素排除アッセイにより毎日検討した。上清中でのウイルス産生（感染性及びｐ２４）を上に記載する通りに検討した。
【０１５５】
結果
ＲＨＧＰ標的遺伝子の発見の概観
材料及び方法に概説されている通り、ｐＲＨＧＰ１２を、ブラストサイジン耐性遺伝子を促す常時発現性プロモーターからなる発現カセットを使用してコンストラクションした。ＧＳＶは、また、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターを含み、それはリガンドにより活性化することができる。リガンドの存在（プロモーターオン）は、このように、宿主転写物を産生し、ＲＨＧＰ効果の上方又は下方のいずれかの調節を誘発することができる。ＲＨＧＰにより起こされる遺伝子摂動効果は、前に詳細に記載された（Sui, Bamba et al. 2009）。本発明者らはこの供給源を利用し、ヒトＴリンパ球のゲノム全体を照合し、標的（アップレギュレーション又はダウンレギュレーションを問わず、これらの細胞を本来なら致死的なＨＩＶ−１感染に生き残ることを可能にする）を同定した。
【０１５６】
ＭＴ４  Ｔ細胞を操作し、トランスアクチベーターＲ１を安定的に発現させ、それはＲＨＧＰ中の組込みプロモーターを活性化し、誘導因子ＲＳＬ１の存在において転写物を産生することができる。遺伝子摂動の「ＲＨＧＰライブラリー」を確立するためのＲＨＧＰベクターを用いた形質導入及び抗生物質選択に続き、宿主細胞を、ＨＩＶ−１の致死感染を用いて攻撃した。
【０１５７】
生存細胞は、限界希釈によりクローン化された単一細胞であった。ＲＨＧＰと無関係の事象の結果として生じたであろうそれらの生存体を除去するために、表現型を、ＲＳＬ１の非存在においてＨＩＶ−１攻撃を繰り返すことにより確認した。この試験では、ＲＨＧＰ自体が（他のアーチファクト又は自然突然変異ではなく）、ＨＩＶ−１感染に直面した細胞生存に直接的に関与することが確認された。生存クローンからのゲノムＤＮＡを次に単離し、配列決定し、標的遺伝子ならびにＧＳＶ組込みの方向を特定した（結果が標的のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを表わすか否かを決定するために）。
【０１５８】
ＲＨＧＰ細胞ライブラリーの構築
１０５の組込み事象を伴うＭＴ４−Ｒ１細胞のライブラリーを、レンチウイルスベースのｐＲＨＧＰ１２  ＧＳＶを使用して形質導入し、宿主ゲノムのカバーを確実にした。ゲノム中での平均遺伝子サイズが２７kbと推定されるため（Gupta and Varshney, 2004）、本発明者らは、これらの１０５の独立した組込み事象が、ゲノム全体のランダムなカバーを確実にしうると計算した。形質導入された宿主細胞のライブラリーを、次に、ブラストサイジンを使用して選択した。特定のブラストサイジン耐性細胞クローンから、本発明者らは、ＧＳＶが実際に宿主染色体中に組込まれ、アンチセンス転写物が誘導因子ＲＳＬ１の処置時にだけ産生されることを見出した（データ示さず）。Ｒ１発現及びＧＳＶ組込みを確認及び維持する追加の手段として、ＭＴ４ライブラリーが、続く実験において、致死濃度のＧ４１８及びブラストサイジンと一緒に持続的にインキュベーションされた。
【０１５９】
ＨＩＶ−１耐性細胞は、ウイルス誘導性細胞殺傷から生き残った。
ＭＴ４−Ｒ１細胞は、親ＭＴ４細胞と同様に、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３（ＭＯＩ１０−４）により、５日以内に効率的かつ完全に殺された。ＲＳＬ１の添加はこの殺傷に影響を及ぼさなかった（図１１Ａ、左パネル）。これらの条件は、「プロモーターオン」を保つためのＲＳＬ１の存在において、生存細胞クローンについての続く選択のために厳密に利用された。追加のコントロールとして、偽形質導入細胞の並行培養物を同じように処理し、生存体は５日後に観察されなかった。この結果は、生存細胞が、ＲＨＧＰ摂動の結果として（ＨＩＶ−１に対する自然耐性のアーチファクトとしてではなく）生じることを確実にするために必須であった。クローニング及び増大後、生存細胞を複数ラウンドの感染に供し、感受性細胞を除去した。最後に、本発明者らは、ウイルス誘導性殺傷に耐性である２５のＲＨＧＰ細胞クローンを得た。図１１Ａ（右パネル）は、ＨＩＶ−１攻撃後でのそのような１つの耐性クローンの生存を示す。
【０１６０】
ゲノム配列決定と並行して、本発明者らは、これらの耐性細胞クローンが、ＨＩＶ感染時に感染性ウイルス粒子を産生し続けるか否かを問うた。ＲＳＬ１の存在におけるＨＩＶ−１ＮＬ４−３を用いたこれらの耐性細胞クローンの再攻撃後、上清を４dpiで回収し、ＴＺＭ細胞に移し、それによって感染性の読み出しが提供される。図１１Ｂは、得られたウイルス耐性ＲＨＧＰ細胞クローンが子孫ウイルスを産生及び放出しないとの代表的な実験を示す。これらの知見は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおけるｐ２４の決定により独立して確認された。
【０１６１】
野生型ＨＩＶ−１ＮＬ４−３を用いた結果が励みとなるが、本発明者らは、治療法についての大きな満たされない必要性は、従来の医薬に耐性であるウイルスバリアントへの新たな標的の適用であると考えた。従って、本発明者らは、プロテアーゼ阻害剤に対する確立された耐性を伴うＨＩＶ−１バリアントを用いた並行した一連の試験を実施した。野生型ＨＩＶを用いた攻撃に耐性であるＲＨＧＰ形質導入クローンは、また、プロテアーゼ耐性バリアントに直面した攻撃に生き残った。この結果は、宿主細胞の生存に固有ではなかった。なぜなら、感染性アッセイならびにｐ２４  ＥＬＩＳＡによって、耐性細胞における突然変異体ＨＩＶ−１による欠損した感染が確認された（図１１Ｃ）。一緒に、これらの結果によって、本発明者らが得た細胞クローンが、ＷＴ及び薬物耐性ＨＩＶ−１バリアントの両方による感染に耐性であることが確認された。
【０１６２】
ウイルス耐性細胞クローンの可逆性アッセイ
ＲＨＧＰ技術の重要な特性は、誘導プロモーターによる調節を介して候補標的を検証する能力である。本発明者らは、最初に、ＲＨＧＰライブラリーを構築するために使用されているＭＴ４−Ｒ１細胞においてトランスアクチベーターＲ１の誘導活性を検討した。ＭＴ４−Ｒ１細胞は、最初に、Ｒ１応答性ルシフェラーゼレポート遺伝子（NEB）を用いてトランスフェクトし、誘導因子ＲＳＬ１の存在又は非存在において培養した。発光（ＲＬＵ）を次に検討した。ＭＴ４−Ｒ１は、ＲＳＬ１の存在において高く安定したレベルの発光を示したが、しかし、ＲＳＬ１が存在しない場合には背景レベルだけであった（図１２Ａ）。この結果は、Ｒ１の活性化能力がＲＳＬ１により強固に制御されることを示した。  
【０１６３】
これらのクローンでのＨＩＶ−１耐性の獲得が、本当にＲＨＧＰの組込みに起因することを確認するために、本発明者らは、次に、これらのクローンにおいてウイルス産生の可逆性を検討した。ＲＨＧＰベクター用のプロモーターは、リガンド制御されたＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ誘導性トランスアクチベーターＲ１の制御下にあったため、本発明者らは、リガンドＲＳＬ１の存在又は非存在において候補のＨＩＶ媒介性殺傷を比較することができた。本発明者らの試験では、これらの生存クローンがＨＩＶ−１攻撃に対して可逆的な耐性を示すことが確認された。図１２Ｂは、この一連の実験からの代表的な細胞クローンの結果を示す。リガンドが、ＨＩＶ−１攻撃の間に、細胞培養中に存在しない場合、頑健なウイルス産生（親ＭＴ４細胞から産生されるものと同程度）がこの細胞クローンについて観察された。高レベルのウイルス放出が、細胞がウイルス媒介性殺傷で死ぬまでの多くの日数にわたり持続した。
【０１６４】
ゲノムＤＮＡクローニングによる宿主遺伝子の同定
ゲノムＤＮＡを、ＨＩＶ−１に対して可逆的な耐性を示していたウイルス耐性クローンから単離した。ＧＳＶ組込み部位を伴う２５のＨＩＶ非感受性宿主細胞クローンが、２１の異なる宿主細胞標的の同定をもたらした。これらのＧＳＶ組込みは、１２の以前に記載された遺伝子及び２の非アノテートＥＳＴを含んだ。クローンの一部は、同じ親からの子孫に思われた。なぜなら、ＧＳＶは、同じ方向を伴う同じ遺伝子中に組込まれていたからである。３つのクローンが、遺伝子又はＥＳＴを伴わない領域中にＲＨＧＰ挿入を有した。本発明者らは、Ｏｒｉ−ＣＡＴレポーター遺伝子の部分的喪失に起因する４つの候補から候補遺伝子を単離することはできなかった。
【０１６５】
これらの遺伝子及びＥＳＴの特性を表４に列挙する。ＲＨＧＰにより提供される組込みの部位及び方向は、宿主細胞がＨＩＶ−１攻撃を生き残ることを可能にする摂動の型に関する洞察を提供した。具体的には、ＲＨＧＰ摂動は広く３群に分けることができた：（１）「アンチセンス」：１つの対立遺伝子の破壊を促進させたアンチセンス組込み事象及び他の対立遺伝子のアンチセンス阻害；（２）「センス下流」：センス方向での組込み（内因性の遺伝子産物のドミナントネガティブ阻害剤の産生を促進すると予測されうる）；及び（３）「センス上流」：開始部位の上流のセンス方向での組込み（標的遺伝子の過剰発現を促進すると予測されうる）。ＲＨＧＰを使用して同定された１２の遺伝子標的の内、８の標的が標的発現の「アンチセンス」ノックダウンを表わした。標的の他の６つが「センス下流」事象を表わし、野生型遺伝子発現のドミナントネガティブ阻害剤の過剰発現を表わす可能性が高い。「センス上流」挿入は、本試験において同定されなかった。これらの予測に基づき、候補遺伝子の全てがＧＳＶ組込み事象によりダウンレギュレーションされる可能性が高い。これによって、本発明者らは、ナイーブなＭＴ４細胞でのｓｉＲＮＡノックダウンアプローチを直接的に使用し、ウイルス耐性表現型を再現することができた。全体で、これらの知見は、宿主ゲノムのＲＨＧＰベースの照合によって両方の新規標的が同定され及び／又は新規機能が公知の遺伝子に帰されたことを示唆する。
【０１６６】
ナイーブな細胞を使用した標的遺伝子の検証
ＲＨＧＰによってＭＴ４細胞中の一連の標的が同定され、それらはＨＩＶ−１感染に対して耐性を付与する。表現型の可逆性は、これらの標的についての最初の検証を提供した。本発明者らは、次に、独立した実験システムを使用してこれらの候補を検証することを追求し、自然突然変異又は本発明者らのＲＨＧＰ技術のアーチファクトとして生じうる結果を除いた。
【０１６７】
これらの耐性遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡをDharmaconから購入した（４つの個々のｓｉＲＮＡを含むＳｍａｒｔｐｏｏｌ）。非標的ｓｉＲＮＡは、トランスフェクション及び参照基準のための一致されたコントロールを提供した。ウイルスｔａｔ及び細胞標的Ｒａｂ６Ａに特異的であるｓｉＲＮＡ構築物を、これらのｓｉＲＮＡがＨＩＶ−１感染を効率的に阻害できるとの最近の報告に基づいて、ポジティブコントロールとして選択した（Brass, Dykxhoorn et al. 2008）。
【０１６８】
ｓｉＲＮＡを、天然ＭＴ４細胞中に、電気穿孔を介して、ＨＩＶ−１ＮＬ４−３感染の１日前にトランスフェクトした。上清を、感染から２日後に回収した。処理した細胞から産生された感染性ウイルス粒子を、ＴＺＭ細胞ベースの読み出しを使用して検討した。図６Ａに示す通り、１２の選ばれた標的遺伝子に対する二本鎖ｓｉＲＮＡによって、ＨＩＶ−１ウイルス産生が、ポジティブコントロール（Ｔａｔ及びＲａｂ６Ａ）において観察されるものと同程度のレベルまで低下した。生存も検討し、ｓｉＲＮＡ処理からの可能な細胞傷害性効果を除いた。非常に同様のパーセンテージの生存細胞が、処理されたサンプルの全てについて観察された。これらの結果によって、ＲＨＧＰにより同定されたこれらの遺伝子がウイルス複製において重要であるとの本発明者らの知見が確認され、新規の宿主ベースの標的を同定するためのＲＨＧＰの適用が検証された。
【０１６９】
ＨＩＶ−１ＮＬ４−３（ＣＸＣＲ４向性ウイルス）誘導性殺傷から生き残った細胞から同定されたこれらの宿主遺伝子候補が、また、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ−１ウイルスのウイルス複製に重要であるか否かを検討するために、同じｓｉＲＮＡアプローチを、次に、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５二重発現Ｔ細胞株ＰＭ１で使用し、Ｒ５向性ＨＩＶ−１ＭＥ１を用いた感染が続いた。ＨＩＶ−１ＭＥ１株のウイルス産生は、これらの１２の遺伝子標的を標的化する特異的ｓｉＲＮＡを用いて処理された細胞において有意に阻害された（図６Ｂ）。これらの結果によって、ＲＨＧＰにより同定されたこれらの遺伝子がＨＩＶ−１ウイルス（Ｘ４及びＲ５向性バリアントの両方を含む）の複製において重要であるとの本発明者らの知見が確認され、新規の宿主ベースの標的を同定するためのＲＨＧＰの適用が検証された。
【０１７０】
本発明者らの本試験において、本発明者らはＲＨＧＰ技術を適用し、ＨＩＶ−１ウイルス感染のために要求される宿主因子についてのゲノム規模のスクリーニングを行った。本発明者らは、細胞を、ＨＩＶ−１ウイルスを用いた本来なら致死的な攻撃に対して耐性にする新規の宿主ベースの標的を同定した。また、本発明者らは、新規の抗ＨＩＶ−１機能を、以前に公知の遺伝子及びアノテートされていないＥＳＴに帰する。これらの標的を、最初に、表現型を逆転させるためのＲＨＧＰベクター内に組込まれた誘導プロモーターを使用し、次に、天然細胞において、従来のｓｉＲＮＡアプローチを使用して検証した。本発明者らは、さらに、結果として得られる標的を、異なるＨＩＶバリアント（薬物感受性及び耐性分離株ならびにＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４向性ウイルスを含む）に広く適用可能であることを見出した。
【０１７１】
本来なら致死的なインフルエンザ感染に直面した際の生存のために必須の宿主標的のパネルを同定した初期の試験において使用されたＲＨＧＰと同様に（Sui, Bamba et al. 2009）、本発明者らはレンチウイルスシステムを使用し、ＭＭＬＶベースのＲＨＫＯにより起こされる低力価のＧＳＶ産生での先の限定を克服した（Li and Cohen 1996）。これらの改善によって、本発明者らは、宿主ゲノム全体をサンプリングし、改善されたＧＳＶにより引き起こされる１０５の組込み事象から１２の遺伝子標的を同定することができた。レンチウイルスベクターが、活性な遺伝子転写の部位中への単一部位挿入を支持するとの予測と一致して（Mitchell, Beitzel et al. 2004）、全ての組込みが活性な遺伝子領域において生じた。
【０１７２】
ＲＨＧＰの１つの固有の特性は、標的発現が誘導可能なプロモーターの制御下にあることである。このように、表現型（ＨＩＶ−１耐性）と摂動遺伝子の間での因果関係は、誘導因子の取り除きにより確認することができる。同じ実験設定内でこれらの標的を検証することにより、この特性は、治療候補の本発明者らの発見効率を増加させる。実際に、耐性クローンからの全てのＲＨＧＰ標的が、天然細胞を用いた続くｓｉＲＮＡ試験において成功裏に確認された。候補遺伝子と比べたＧＳＶ挿入の位置及び方向に依存して、ＲＨＧＰは、また、哺乳動物細胞において遺伝子の活性化、しばしば過剰発現を生成することができる。本発明者らの本試験において観察されなかったが、標的のサブセット（Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２））の過剰発現によって、ＭＤＣＫ細胞が、インフルエンザウイルス感染に対する宿主遺伝子の発見の間にインフルエンザ感染に生き残ることができた（Sui, Bamba et al. 2009）。従来のアプローチ（例、ｓｉＲＮＡ）により生成される一過性のノックダウンの代わりに、ＲＨＧＰ表現型は高度に安定であり、それによって機構試験が促進され、ＨＩＶ−１複製におけるこれらの摂動遺伝子の役割を特徴付けることができる。
【０１７３】
ＲＨＧＰは、標的の事前の知識により偏らなかった。実際に、ＨＩＶ−１耐性ＲＨＧＰ細胞クローンから、本発明者らは、２つのアノテートされていないＥＳＴがＧＳＶにより標的化されることを発見した（表１）。さらに、本発明者らが、ＰＡＮＴＨＥＲ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Mi, Lazareva-Ulitsky et al. 2005）を使用して遺伝子標的を分析した場合、それらの多くの推定分子機能が依然として分類されていなかった（ＣＡＳＤ１、ＧＤＡＰ２、ＴＮＲＣ６Ａ、及びＴＴＣ２１Ｂ）、又は未知であった（ＣＡＭＰＳＡＰ１Ｌ１及びＧＳＴＣＤ１）。それらの２つはユビキチン−タンパク質リガーゼに属する（ＨＥＣＷ２及びＤＺＩＰ３）。残りの標的において、各標的の１つが以下のファミリーにおいて見出される：免疫グロブリン受容体又は防御／免疫タンパク質（Ｒｏｂｏ１）、シグナル伝達分子（ＮＬＧＮ１）、ｍＲＮＡポリアデニル化因子（ＣＰＳＦ１）、及びトランスポーター又はヒドロラーゼ（ＡＴＰ８Ａ１）。
【０１７４】
候補遺伝子の内、Ｒｏｂｏ１が非常に良好な治療標的としての役割を果たしうる。Ｉ型膜貫通タンパク質として、それは、本来は、神経発生の間に軸索ガイダンス受容体として同定された（Wong, Park et al. 2002）。Ｒｏｂｏ１は、また、ＣＸＣＲ４との相互作用（ＨＩＶ感染との潜在的な連関）を通じてＴ細胞の化学走性において役割を果たすことが見出された（Wu, Feng et al. 2001; Prasad, Qamri et al. 2007）。それがＣＣＲ５にも結合するか否かを検討する価値がある。ウエスタンブロットを使用し、本発明者らは、Ｒｏｂｏ１発現がＲＨＧＰ耐性クローン及びｓｉＲＮＡ処理細胞において低下されることを確認した（未発表データ）。さらなる研究が、Ｒｏｂｏ１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ウイルス複製が、恐らくは細胞膜のビリオン融合の間にウイルス侵入段階において遮断されることを明らかにするために必要とされる。Ｒｏｂｏ１は、ＨＩＶ−１複製においてＨＩＶ−１共受容体ＣＣＸＲ４及びＣＣＲ５の活性を支持する潜在的な新たな役割を持ちうる。ＣＣＲ５の治療標的と同様に、Ｒｏｂｏ１に対するアンタゴニスト及び／又はモノクローナル抗体が、従って、ＡＩＤＳを処置するための新たな一連の治療計画を提供しうる。
【０１７５】
同定されたＨＩＶ−１耐性遺伝子のリストは、また、２つのＥユビキチンリガーゼ（ＨＥＣＷ２及びＤＺＩＰ３）を含む。このファミリーからのタンパク質は、タンパク質分別経路及び小胞輸送プロセスに関与することが見出されており、それらは、また、ウイルス出芽及び放出の間にＨＩＶ−１及び他のウイルスにより使用される。１つの良好な例はＴＳＧ１０１（ウイルス脱出のためにＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ６によりハイジャックされるユビキチン様リガーゼ）である（Garrus, von Schwedler et al. 2001）。ＨＥＣＷ２は、別のＥ３ユビキチンリガーゼＮＥＤＤ４と高度に相同である。ＨＩＶ−１ウイルスがＮＥＤＤ４を使用するとの直接的な証拠はないが、ＰＰＸＹの後ドメインを伴う多くの他のエンベロープウイルスは、宿主細胞からのそれらの放出のためにＮＥＤＤ４を要求しない。これら２つの遺伝子産物（ＨＥＣＷ２及びｂＺＩＰ３）は、また、ＨＩＶ−１成熟及び脱出のために重要でありうることを推測することが興味をそそられる。
【０１７６】
【表１３】
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【０１７７】
実施例５−同定された潜在的な標的のさらなる研究
上で考察した試験によって、増殖性ＨＩＶ感染のために必須である新規の宿主標的が同定された（Ｒｏｂｏ１）。Ｒｏｂｏ１は、可溶性リガンドのための膜貫通受容体であり、ＳＬＩＴとして公知である。Ｒｏｂｏ１は神経系の発生において主に発現され、軸索ガイダンスを調節する。Ｒｏｂｏ１は、また、リンパ系細胞で発現され、それは細胞間相互作用の調節において同様に役割を果たしうる。
【０１７８】
Ｒｏｂｏ１の細胞外構造は、それが５つの積み重なった免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインからなる点で顕著であり、それは３つのタンデムフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ−ＩＩＩ）ドメインにより支持される。そのようなものとして、Ｒｏｂｏ１は、細胞膜から比較的遠くに伸展すると予測される。そのような特性は、しばしば、細胞間接着を伴い観察される。なぜなら、グリコシル化タンパク質上の負の電荷を持つ糖（糖タンパク質及びプロテオグリカン）の静電反発力が、細胞を分離するバリアとしての役割を果たし、密接な相互作用（例えば膜融合など）を予防する。実際に、本発明者らは、この機構が進化し、部分的に、ウイルスが宿主細胞に侵入することを予防しうると推測する。
【０１７９】
本発明者らは、細胞膜からのＲｏｂｏ１の伸展突起が、ウイルス感染におけるその必須の役割についてのＲＨＧＰの証拠と組み合わせて、Ｒｏｂｏ１がウイルスの取り込みに関与し、恐らくはウイルス−宿主結合の初期部位又は共受容体として機能しうることを示唆すると仮定する。
【０１８０】
この考え方を支持し、Ｒｏｂｏ１が、文献において、ケモカイン受容体ＣＣＲ５と相互作用することが報告されている。ＣＣＲ５は、次に、ＨＩＶ感染のための重要な共受容体として機能することが公知である。実際に、ＣＣＲ５（ならびに別のケモカイン受容体ＣＸＣＲ４）は、ＨＩＶ感染を処置するための一連の最近承認された又は治験中である新たな薬物の標的である。
【０１８１】
RJ Shattock and JP Moore, Nature Reviews Microbiology, 1, 25; 2003に示されている通り、ＣＣＲ５は細胞膜から遠くに突出せず、ＨＩＶによりコードされるｇｐ１２０へのＣＤ４結合が安定性を提供し、十分に理解された静電反発力（本来であればＨＩＶがＴ細胞と密接に接触することを予防しうる）を克服することが仮定される。この安定性は、次に、ＣＣＲ５とウイルスタンパク質との続く相互作用を支持し、膜融合及び内在化を媒介しうる。
【０１８２】
このモデルは興味深いが、しかし、ＣＤ４細胞外ドメインが４つのＩｇドメインからなり、このように、ＣＤ４がＲｏｂｏ１よりもかなり短いことを認識することが重要である。本発明者らは、従って、既存のモデル上に拡大し、Ｒｏｂｏ１が追加の共受容体として機能しうると仮定し、それは、ＣＤ４により媒介される段階よりもウイルス相互作用のより初期段階を安定化するために必要である。
【０１８３】
この仮定は、ウイルス出芽を予防するための治療介入についての重要な潜在的な意味を保有する。例えば、Ｒｏｂｏ１又はそのウイルス結合パートナーの特異的阻害剤は、初期結合を予防する及び／又は感染の細胞間伝播を予防する役割を果たしうる。ＨＩＶウイルス産生をノックダウンするためのｓｉＲＮＡトランスフェクションを含む実験において、Ｒｏｂｏ１がノックダウンし、又は、非常に低いウイルス産生値を与え、コントロール値の９%という低さを残した。このように、Ｒｏｂｏ１の阻害剤は、一旦、細胞の初期細胞感染が生じると、ＨＩＶ−１の伝播を効果的に遮断しうる。これらの阻害剤は、必ずしも限定はされないが、小分子、アプタマー、及び生物製剤（抗体、ペプチド、及びそれらの派生物を含む）からなりうる。
【０１８４】
現在、Ｒｏｂｏ１についてのウイルス結合パートナーは公知ではないが、しかし、本発明者らは異なる可能性を仮定する。
【０１８５】
最初に、感染細胞から出芽する際にＨＩＶ粒子の外部エンベロープ中に取り込まれるＳＬＩＴタンパク質（又はＲｏｂｏ１についての他の生理学的リガンド）及びこれらの残存タンパク質が、Ｒｏｂｏ１との最初の相互作用を促進するために十分でありうる。
【０１８６】
加えて又は代わりに、Ｒｏｂｏ１は、そのＳＬＩＴリガンド上でコードされるロイシンリッチモチーフ（ＬＲＲモチーフ）を認識すると理解される。これを念頭に置き、ＨＩＶによりコードされるｇｐ４１が、比較的顕著にロイシン残基（１２３残基中１６；１３%）を含むことに注目すべきである；これらの残基中で特に豊富である局在化領域を伴う。ｇｐ４１の親分子（ｇｐ１６０）は８１のロイシンを含む（８４９の全残基中；９．５%）。ｇｐ１６０内でコードされる他の主要タンパク質はｇｐ１２０であり、それは３２のロイシン残基（合計４５５残基から；７．０%）を含むが、この分子中にはロイシンの顕著なクラスターもあり、その少なくとも１つがＬＲＲモチーフと似うる。ＨＩＶによりコードされるｎｅｆは、また、ビリオンの表面上で暴露されうるが、１７のロイシン残基（合計１９６アミノ酸から；８．８%）を含む。ロイシン（及びクラスター）についてのこの相対的な濃縮は、ＨＩＶの一般的な形質を表わさないように思われる。なぜなら、非膜暴露タンパク質（例えば逆転写酵素など）は、少数のロイシン（５６０中４８；８．５%）を利用するためであり、それらは顕著にはクラスター形成しない。同様に、ＨＩＶ−１  Ｇａｇは４１のロイシン（５０８の全残基中；８．０%）を含む。
【０１８７】
ウイルス付着の直接的な阻害に加えて、フローサイトメトリーデータは、Ｒｏｂｏ１の特定のエピトープが、ＨＩＶ感染細胞の表面上に優先的に暴露されることを示す。この知見は、宿主防御機構（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を介した除去のための感染細胞の抗体ベースの標的化についての可能性を生じる。また、これらの抗体は、毒素、放射性核種、又は感染細胞を標的化するための他の致死薬剤を用いて標識されうる。これらの型の活性は、必ずしも抗体に限定されないであろう。なぜなら、他の抗体、ペプチド、融合タンパク質、及びこれらのエピトープを標的化する生物製剤又は小分子も、感染細胞を標的化するための活性を有しうるからである。
【０１８８】
ＨＩＶを越えて、Fuctional Genetics, Inc.からの最近のデータは、Ｒｏｂｏ１上の特定のエピトープが、インフルエンザ感染細胞の表面上に優先的に暴露されることを示唆する。このデータは、Ｒｏｂｏ１ベースの治療法の広域適用についての意味を有しうる。Ｒｏｂｏ１が、ＨＩＶを越えたウイルスに関連する機構的基礎は公知ではなく、本研究の課題である。
【０１８９】
ＲＨＧＰの実用的な能力を実証するために、上の実施例において同定された特定の標的が、ウイルス疾患の治療的な予防又は処置のための潜在的な宿主標的として、さらなる研究の対象であった。直ぐ上で考察したＲｏｂｏ１、及び上のインフルエンザに関連して考察されたＰＴＣＨ１に加えて、Ｎｅｄｄ４を、インフルエンザの処置のための可能な候補として上の通りに同定した。Ｎｅｄｄ４は、また、共同所有される米国特許出願シリアル番号１１／９３９，１２２（２００７年１１月１３日出願）において考察され、その全体が参照により本明細書において組み入れられる。
【０１９０】
Ｎｅｄｄ４は、ＥＳＣＲＴタンパク質と一般的にいわれるタンパク質のクラスのメンバーであり、典型的には細胞内で見出され、そこで、それは、ＥＳＣＲＴタンパク質ファミリーの他のメンバーと相互作用し、細胞内の１点から別の点にタンパク質を向ける又は運ぶ。Ｎｅｄｄ４に対する抗体を、標準的な手段により調製した。ヒト身体の特定組織がＮｅｄｄ４について弱く染色されるが（例、結腸、小腸、肝臓の幹細胞）、一般的に、このタンパク質は表面で弱く発現される（仮にあっても）。産生された抗体の内、ヒトＮｅｄｄ４抗体Ａｂ２７９７９及びＡｂ１０１ＡＰは、両方がFunctional Geneticsから利用可能であり、従来の方法を使用して調製されたが、しかし、任意の抗体産生方法を用いることができる。これら及び無関係の標的に対して産生されたコントロール抗体を用いて実施されたＦＡＣＳによって、Ｎｅｄｄ４は、感染されていないＭＤＣＫ細胞の表面上で全く染色されず、インフルエンザ（Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２）を用いて感染されたＭＤＣＫ細胞は、表面上に多量のタンパク質を呈することが実証された。ＴＳＧ１０１と同様に、ウイルス装置は感染細胞の細胞機能を乗っ取るため、Ｎｅｄｄ４は、その通常の役割から「ハイジャック」され、使用されて、ビリオン、又は必須のビリオンタンパク質を細胞表面に輸送すると思われる。図１３。
【０１９１】
Ａｂ２７９７９（Ｎｅｄｄ４配列の中央、アミノ酸３１３−３３４から取られたエピトープに対して産生された）及びＡｂ１０１ＡＰ（タンパク質のＣ末端、Ｎｅｄｄ４アミノ酸８６０−９００に対して産生された）（図１３を参照のこと）は、インフルエンザ複製の強いＡＤＣＣ媒介性阻害を示した。濃度０．０１μg/ml及びそれ以上で、これらの抗体は、反復インビトロ実験においてウイルス複製の８０%より良好な阻害を示した。（図１４）。
【０１９２】
上で考察された実験結果を、種々のインフルエンザ株に対して繰り返した。なぜなら、従来の治療からのインフルエンザについての「回避」の１つの主な手段が、処置での事前のワクチンによる中和を避けるための十分な違いである小さな突然変異、又は新たな株の導入であるからである。実験では、抗体結合が、比較されたインフルエンザ株、及び関連ウイルス（パラインフルエンザ、ＲＳＶ）を通して持続的であることが実証された。抗体を使用し、ＭＤＣＫ細胞を使用したＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）、ＭＤＣＫ細胞を使用したＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡ／Ｊａｐａｎ／３０５／５７（Ｈ２Ｎ２）、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、ＨＥＫ２０３細胞におけるＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、ＭＤＣＫ細胞におけるＢ／Ｌｅｅ／４０、ＨＥｐ−２細胞におけるＨＰＩＣ−３（ヒトパラインフルエンザウイルス３）、ＭＲＣ−５細胞におけるＣＭＶ／ＡＤ−１９６、及びＨＥｐ−２細胞におけるＲＳＶ／Ａ２に対するこれらの抗体による表面上での大量の染色が実証された。これらのウイルス全般での結果は、ヒト又は哺乳動物（他の哺乳動物は、ペット及び家畜、例えばイヌ、ネコ、ならびに関連する哺乳動物及び農業用動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどを含む）を標的化することが、広く効果的でありうることを示唆しており、そこでは従来のウイルス標的処置は共通して株及び宿主に特異的である。明らかに、ＲＨＧＰ−ＴＡＩＬ技術は、種々の状況における介入のための標的としての開発のために遺伝子及びそれらのコードされるタンパク質を迅速に同定する能力を提供する。
【０１９３】
実施例６−転移関連遺伝子のＲＨＧＰ同定
上で注目した通り、ＲＨＧＰは、ウイルス感染性の阻害のための潜在的な標的の同定に限定されない。考えられている特定の条件について固有である表現型が特定できる限り、ＲＨＧＰの使用は予測可能な結果を与え、そこでは同定された遺伝子はその表現型を促進又は阻害する。治療用薬剤が、遺伝子によりコードされるタンパク質に標的化される場合、遺伝子自体とは対照的に、薬剤は対応する効果を与えるはずである。
【０１９４】
このように、癌処置を改善させるための１つのアプローチは、化学療法に対する耐性を促進する薬剤を同定することである。多くの強力な化学療法剤が宿主に対して有毒であり、治癒の症例は疾患と同じくらい悪い。ＲＨＧＰライブラリーを化学療法剤に暴露させる。薬物処置を生き残るものを同定し、摂動が変化した生存条件を起こした遺伝子を選択し、挿入されたＲＨＧＰ挿入物の報告を決定し、上の通りに、過剰発現又は低下発現が所望の表現型に関与するか否かを決定する。
【０１９５】
生存は、しかし、ＲＨＧＰ探索において表現型として使用することができる唯一の特徴ではない。多くの癌において、それは、特に危険である転移状態の発生である。腫瘍の転移癌への形質転換を抑制しうる薬剤は、寿命を延長し、支持処置を助ける際に価値がありうる。腫瘍は、塞栓が解離し、血中に入ることにより転移する。効果的な転移が形成するために、腫瘍塞栓が、それらが移動している血管の内皮壁に結合しなければならない。図１５におけるフローチャートにより示される通り、ＲＨＧＰを使用して、付着を阻害又は促進するその能力について摂動細胞を照合することができる。付着を促進する候補標的の能力を予防する治療産物（例えば、候補に結合しうる抗体など）、又は付着の低下を増強する産物（例えば付着を阻害する候補の過剰発現又は投与など）は、同様に、転移の形成を遅延又は抑制しうる。
【０１９６】
図１５のフローチャートに従った付着表現型のこのＲＨＧＰ研究の適用は、研究のための複数の候補を産生している。主な候補を図１６に同定しており、それらは、同定された候補だけでなく、付着、任意の同定された有用性又は機能などを促進又は低下させるか否かを反映する。これらの標的の各々での実行は、次に、効果的な癌処置薬剤である、追加の十分に耐容される薬剤を産生しうる。
【０１９７】
本特許出願を通して引用された参考文献、及び列挙された研究を、より良好な情報のために以下に列挙する。
【０１９８】
【表１４−１】
2015096067.tif 000017
【表１４−２】
2015096067.tif 000018
【表１４−３】
2015096067.tif 000019
【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１４−８】
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【表１４−９】
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【表１４−１０】
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【表１４−１１】
2015096067.tif 000027
【０１９９】
本願において開示する発明を、複数の具体的な実施例により例示し、ならびに、総称的に考察してきた。実施例（特定のベクターフラグメント、標的、及び手順を含む）は、限定することを意図しない。請求項において見出される具体的な列挙の非存在において、請求項は、任意の例示された実施態様に限定されるとは考えるべきではなく、開示の全ての局面と一致して読まれるべきである。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  疾患状態に対処するための治療用薬物の開発のための標的を同定する方法であって、以下：
活性化因子を発現する哺乳動物細胞の集団（該細胞が宿主ゲノムを含む）を、誘導薬剤の非存在において不活性化される誘導可能プロモーターを含む遺伝子探索ベクターを含むウイルス粒子を用いて形質導入し、それにおいて該遺伝子探索ベクターが、該宿主ゲノム中の宿主遺伝子に、宿主遺伝子に対してセンス又は反対の方向で挿入され、該誘導薬剤の存在においてセンス又はアンチセンスＲＮＡを生成し、それにより、該宿主遺伝子の発現が両方の対立遺伝子で抑制される又は該挿入により増強され、それにおいて十分な数の挿入事象が該集団において生じ、該ゲノムの実質的に全ての遺伝子座における該遺伝子探索ベクターの挿入を確実にすること；
哺乳動物細胞の形質導入集団を検証し、該疾患状態に固有の表現型を示す細胞を同定すること；
該遺伝子探索ベクター（ＧＳＶ）の挿入点での各遺伝子配列を、該疾患状態に固有の表現型を示す細胞において同定すること；及び
該ＧＳＶの挿入点での各々の該遺伝子配列を特徴付け、該挿入により該ゲノムの摂動が、該遺伝子配列の過剰発現又は低下発現を起こしているか否かを決定し、それにおいて該配列が、該疾患状態に対処するための治療用薬物の開発のための標的として同定されること
を含む、方法。
［２］  ＧＳＶの挿入点での遺伝子配列が、熱非対称インターレースポリメラーゼ連鎖反応（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）の使用により特徴付けられる、［１］記載の方法。
［３］  疾患状態に固有の表現型を示す摂動細胞の同定に続き、該細胞を誘導薬剤の非存在において増殖させ、該誘導薬剤の非存在において該疾患状態に固有の該表現型を示さない細胞だけを、標的を同定する目的のためにさらに考慮する、［１］記載の方法。
［４］  ウイルス粒子が、ＧＳＶを用いてトランスフェクションされたレンチウイルス又はＧＳＶを用いてトランスフェクションされたサルマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）のいずれかに基づく、［１］記載の方法。
［５］  ウイルスが、自己不活性化しており、ＧＳＶが、その挿入点から脱することができない、［４］記載の方法。
［６］  疾患状態に固有の表現型が、ウイルスにより攻撃された場合での生存であり、細胞を誘導薬剤の非存在において増殖させ、該ウイルスにより攻撃された場合、それらが生き残らない、［３］記載の方法。
［７］  ウイルスが、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、又はパラインフルエンザウイルスである、［６］記載の方法。
［８］  疾患状態に固有の表現型が、腫瘍細胞による転移特徴の獲得である、［１］記載の方法。
［９］  疾患状態に固有の表現型が、有毒化学療法薬物に対する耐性である、［１］記載の方法。
［１０］  疾患状態に固有の表現型を示す摂動細胞の同定に続き、該細胞を誘導薬剤の非存在において及び有毒化学療法薬物の存在において増殖させ、該誘導薬剤の非存在において該有毒化学療法薬物に対して耐性である細胞を、治療用薬物の開発のための標的を反映しないとしてさらに特徴付けない、［３］記載の方法。
［１１］  形質導入が、低い感染効率（ＭＯＩ）を使用して行われ、形質導入された実質的に全ての細胞が、単一のＧＳＶ挿入事象を用いて形質導入されることを確実にする、［１］記載の方法。
［１２］  ＭＯＩが０．２未満である、［１１］記載の方法。
［１３］  ＧＳＶが、少なくとも１つの遺伝子モチーフ又は検出可能な標識を含み、形質導入に続くＧＳＶの挿入遺伝子座の同定を容易にする、［１］記載の方法。
［１４］  細胞に、ＰＴＣＨ１遺伝子の発現を阻害する薬剤、又はＰＴＣＨ１によりコードされるタンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害する方法。
［１５］  薬剤が、ＰＴＣＨ１タンパク質に対する抗体又はＰＴＣＨ１タンパク質に結合する小分子を含む、［１４］記載の方法。
［１６］  医薬的に許容可能な担体中に懸濁されたＰＴＣＨ１タンパク質に結合する抗体を含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害するための組成物。
［１７］  哺乳動物細胞において、ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、又はＳＬＣＡ２５の少なくとも１つの発現レベルを低下させることを含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害する方法。
［１８］  発現が、ＭＲＰＬ４２、ＣＯＸ５Ａ、ＴＡＰＴ１、又はＳＣＬＡ２５遺伝子の発現を阻害することにより低下される、［１７］記載の方法。
［１９］  方法が、細胞に、ＭＲＰＬ４２タンパク質、ＣＯＸ５Ａタンパク質、ＴＡＰＴ１タンパク質、又はＳＣＬＡ２５タンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、［１７］記載の方法。
［２０］  薬剤が、抗体である、［１９］記載の方法。
［２１］  哺乳動物細胞においてＲｏｂｏ１の発現レベルを低下させることを含む、哺乳動物細胞においてＨＩＶの感染性を阻害する方法。
［２２］  発現が、Ｒｏｂｏ１遺伝子の発現を阻害することにより低下される、［２１］記載の方法。
［２３］  方法が、細胞に、Ｒｏｂｏ１タンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、［２１］記載の方法。
［２４］  薬剤が、抗体である、［２３］記載の方法。
［２５］  医薬的に許容可能な担体中に懸濁されたＲｏｂｏ１に対する抗体を含む、哺乳動物細胞においてＨＩＶの感染性を低下させる際に効果的な組成物。
［２６］  哺乳動物細胞においてＮｅｄｄ４の発現レベルを低下させることを含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザの感染性を阻害する方法。
［２７］  発現が、Ｎｅｄｄ４をコードする遺伝子の発現を阻害することにより低下される、［２６］記載の方法。
［２８］  方法が、細胞に、Ｎｅｄｄ４タンパク質に結合する薬剤を投与することを含む、［２６］記載の方法。
［２９］  薬剤が抗体である、［２８］記載の方法。
［３０］  Ｎｅｄｄ４に対する抗体を医薬的に許容可能な担体中に含む、哺乳動物細胞においてインフルエンザ感染性を低下させる際に効果的な組成物。
【図１】
2015096067.tif 000028
【図２】
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【図３Ａ】
2015096067.tif 000030
【図３Ｂ】
2015096067.tif 000031
【図４】
2015096067.tif 000032
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2015096067.tif 000034
【図６Ａ】
2015096067.tif 000035
【図６Ｂ】
2015096067.tif 000036
【図６Ｃ】
2015096067.tif 000037
【図７】
2015096067.tif 000038
【図８Ａ】
2015096067.tif 000039
【図８Ｂ】
2015096067.tif 000040
【図８Ｃ】
2015096067.tif 000041
【図９Ａ】
2015096067.tif 000042
【図９Ｂ】
2015096067.tif 000043
【図１０】
2015096067.tif 000044
【図１１Ａ】
2015096067.tif 000045
【図１１Ｂ】
2015096067.tif 000046
【図１１Ｃ】
2015096067.tif 000047
【図１２Ａ】
2015096067.tif 000048
【図１２Ｂ】
2015096067.tif 000049
【図１３】
2015096067.tif 000050
【図１４】
2015096067.tif 000051
【図１５】
2015096067.tif 000052
【図１６Ａ】
2015096067.tif 000053
【図１６Ｂ】
2015096067.tif 000054
【配列表】
2015096067000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月24日(2014.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞においてＲｏｂｏ１の発現レベルを低下させることを含む、ヒト細胞においてＨＩＶ−１の複製を低下させる方法。
【請求項２】
前記発現が、Ｒｏｂｏ１をコードする遺伝子の発現を阻害することにより低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｒｏｂｏ１をコードする遺伝子の発現の阻害は、アンチセンス構築物によって達成される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｒｏｂｏ１をコードする遺伝子の発現の阻害は、Ｒｏｂｏ１をコードする遺伝子の破壊によって達成される請求項２に記載の方法。