(57)【要約】【課題】尿中のα１−ＡＴ５２量に基づいて、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することができる、ＥＬＩＳＡを利用した癌の検査方法の提供。【解決手段】被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、処理尿中のα１−ＡＴ５２量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する判定工程と、を備え、前処理が、α１−ＡＴ５２と、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、尿を分子量分画するステップと、α１−ＡＴ５２が分画される画分を処理尿として回収するステップと、を含む、癌の検査方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、
前記処理尿中の分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、
得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、前記被験者が癌に罹患している、又は前記被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する判定工程と、を備え、
前記前処理が、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記尿を分子量分画するステップと、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、
癌の検査方法。
【請求項２】
前記前処理が、
前記尿にタンパク質変性処理を施し、変性尿を得るステップと、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記変性尿を分子量分画するステップと、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記分子量分画が、限外ろ過又は逆浸透である、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量が、１０ＫＤａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項５】
前記予め設定された閾値が、ＲＯＣ曲線に基づいて設定された閾値である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項６】
前記癌が、固形癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項７】
被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、
前記処理尿中の分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、を備え、
前記前処理が、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記尿を分子量分画するステップと、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、
前記被験者が癌に罹患している、又は前記被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定するためのデータを収集する方法。
【請求項８】
前記前処理が、
前記尿にタンパク質変性処理を施し、変性尿を得るステップと、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記変性尿を分子量分画するステップと、
分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分子量分画が、限外ろ過又は逆浸透である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量が、１０ＫＤａである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、固形癌である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌疾患に関連するタンパク質は古くから研究されており、腫瘍マーカーと称される多くのタンパク質が見出されている。腫瘍マーカーとは、癌の進行に伴って増加する生体因子のことであり、癌の補助診断、治療効果判定、進行度の予測、予後の推定及び特異症状の原因究明等の指標に使用されている。
【０００３】
被験者の尿を使用した固形癌の検査方法として、特許文献１には、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが尿中に検出された場合に固形癌に罹患していると判定する、固形癌の検査方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−８５７５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１には、ウェスタンブロッティング法により分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン（以下、「α１−ＡＴ５２」ともいう。）を検出する固形癌の検査方法が具体的な実施例として記載されている。
【０００６】
ウェスタンブロッティング法は、操作が煩雑であること、１検体あたりの検査コストが高いこと、多検体を並行して検査するのが困難であることから、例えば、定期健康診断のような大規模な検査への適用が困難である。また、ウェスタンブロッティング法は、定性的な評価であることから、癌に罹患している被験者と健常な被験者との判別にカットオフ値（閾値）を設定して客観的に評価することが難しい。
【０００７】
ウェスタンブロッティング法による上述の問題を解決する方法として、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ。以下、「ＥＬＩＳＡ」ともいう。）の利用が考えられる。しかしながら、本発明者らは、尿中のα１−ＡＴ５２をＥＬＩＳＡで定量した場合、その定量値に基づいて、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することができないという新たな課題を見出した。
【０００８】
そこで、本発明は、尿中のα１−ＡＴ５２量に基づいて、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することができる、ＥＬＩＳＡを利用した癌の検査方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、尿中のα１−ＡＴ５２をＥＬＩＳＡで定量する際に、尿に所定の前処理を施すことによって、その定量値に基づいて、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、上記処理尿中の分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、上記被験者が癌に罹患している、又は上記被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する判定工程と、を備え、上記前処理が、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、上記尿を分子量分画するステップと、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を上記処理尿として回収するステップと、を含む、癌の検査方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、上記処理尿中の分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、を備え、上記前処理が、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、上記尿を分子量分画するステップと、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を上記処理尿として回収するステップと、を含む、上記被験者が癌に罹患している、又は上記被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定するためのデータを収集する方法にも関する。
【００１２】
上記前処理工程を備えることにより、尿中のα１−ＡＴ５２のＥＬＩＳＡ定量値に基づいて、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することができる。
【００１３】
上記前処理は、上記尿にタンパク質変性処理を施し、変性尿を得るステップと、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンと、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、上記変性尿を分子量分画するステップと、分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシンが分画される画分を上記処理尿として回収するステップと、を含むものであってもよい。
【００１４】
前処理工程において、タンパク質変性処理を施すことにより、被験者が癌に罹患しているのか否かをより精度よく判別することができる。
【００１５】
上記分子量分画は、限外ろ過又は逆浸透であってもよい。上記分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量は、１０ＫＤａであってもよい。上記予め設定された閾値は、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線に基づいて設定された閾値であってもよい。上記癌は、固形癌であってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、尿中のα１−ＡＴ５２量に基づいて、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することができる、ＥＬＩＳＡを利用した癌の検査方法の提供が可能となる。したがって、定期健康診断のような大規模な検査への適用に適している。また、癌治療後の被験者を対象として本発明を実施することにより、癌治療の治療効果を判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】構築したα１−アンチトリプシン検出系（ＥＬＩＳＡ）の検量線を示すグラフである。
【図２】実施例１〜２及び比較例１に係る癌の検査方法のＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１９】
〔癌の検査方法〕
本実施形態に係る癌の検査方法は、被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、処理尿中のα１−ＡＴ５２量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する判定工程と、を備える。
【００２０】
（前処理工程）
一実施形態において、前処理は、α１−ＡＴ５２と、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量（以下、「設定分子量」ともいう。）以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、被験者から採取された尿を分子量分画するステップと、α１−ＡＴ５２が分画される画分を処理尿として回収するステップと、を含む。
【００２１】
この前処理では、設定分子量以下の分子量を有する溶質が分画される画分が除去された処理尿が得られる。この前処理を施すことによって、ＲＯＣ曲線下面積が顕著に増加する。すなわち、被験者が癌に罹患しているのか否かを精度よく判別することが可能となる。
【００２２】
設定分子量は、５２ＫＤａ未満であればよく、例えば、５０ＫＤａ、４０ＫＤａ、３０ＫＤａ、２０ＫＤａ、１０ＫＤａ、５ＫＤａであってよい。ＲＯＣ曲線下面積が充分に増加することから、設定分子量を５２ＫＤａ未満かつ１０ＫＤａ以上の範囲内で設定し、前処理によって、少なくとも１０ＫＤａ以下の分子量を有する溶質が分画される画分が除去された処理尿を得ることが好ましい。設定分子量を１０ＫＤａとし、前処理によって、１０ＫＤａ以下の分子量を有する溶質が分画される画分が除去された処理尿を得ることがより好ましい。
【００２３】
分子量分画は、公知の方法により行うことができる。分子量分画する方法としては、例えば、ゲルろ過による方法、電気泳動とゲルからの切り出しとを組み合わせた方法、サイズ排除クロマトグラフィーによる方法、限外ろ過による方法、逆浸透による方法、遠心分離による方法、等を挙げることができる。
【００２４】
なお、分子量分画する方法の原理から明らかではあるが、前処理では、設定分子量以下の分子量を有する溶質が１００％完全に除去された処理尿を得ることを意図しているわけではない。
【００２５】
限外ろ過を例にとり、分子量分画する方法についてより具体的に説明する。被験者から採取された尿を、必要に応じて遠心分離し不溶物を除去する。限外ろ過膜を備えた装置に尿試料を添加する。限外ろ過膜は、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０（ミリポア社製）、ビバスピン５００（ザルトリウス社製）等の市販されているものを用いてよい。限外ろ過膜は、公称分画分子量（ＮＭＷＬ）が上述の設定分子量と同じになるものを用いる。例えば、設定分子量を１０ＫＤａとした場合、ＮＭＷＬが１０ＫＤａの限外ろ過膜を用いればよい。限外ろ過は、例えば、尿試料の液流が膜表面に対して垂直方向に生じるノーマルフローろ過、尿試料の液流が膜表面に対して水平方向に生じるタンジェンシャルフローろ過であってもよい。ポンプ等によって加圧してもよいし、遠心分離することで加圧してもよい。
【００２６】
ＮＭＷＬが１０ＫＤａの限外ろ過膜を用いた場合、１０ＫＤａ以下の分子量を有する溶質はろ液画分に分画され、α１−ＡＴ５２を含む１０ＫＤａを超える分子量を有する溶質は、限外ろ過膜に保持される。必要に応じて緩衝液等を追加して分画を繰り返した後、限外ろ過膜に保持された画分を回収して処理尿を得ることができる。
【００２７】
他の実施形態において、前処理は、被験者から採取された尿にタンパク質変性処理を施し、変性尿を得るステップと、α１−ＡＴ５２と、分子量５２ＫＤａよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、変性尿を分子量分画するステップと、α１−ＡＴ５２が分画される画分を処理尿として回収するステップと、を含む。
【００２８】
この前処理では、設定分子量以下の分子量を有する溶質が分画される画分が除去され、かつタンパク質変性処理が施された処理尿が得られる。分子量分画に加え、タンパク質変性処理を施すことによって、ＲＯＣ曲線下面積がより増加する。すなわち、被験者が癌に罹患しているのか否かをより精度よく判別することが可能となる。
【００２９】
タンパク質変性処理とは、タンパク質の高次構造を破壊することでタンパク質を変性させる処理をいう。タンパク質変性処理としては、例えば、熱変性処理、低温変性処理、酸変性処理、アルカリ変性処理、圧力変性処理、超音波処理、変性剤による変性処理、有機溶媒処理を挙げることができる。タンパク質変性処理は、１種を単独で行ってもよく、また２種以上を組み合わせて行ってもよい。
【００３０】
変性剤としては、例えば、尿素及びグアニジン塩酸塩（又は塩酸グアニジン）等の水素結合を破壊する変性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、コール酸ナトリウム等の疎水結合を破壊する変性剤、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等のジスルフィド結合を還元する変性剤を挙げることができる。変性剤は、１種を単独で用いてもよく、また２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
得られた変性尿を分子量分画するステップ、処理尿を回収するステップは、上記で説明したとおりに行うことができる。
【００３２】
熱変性処理及び変性剤による変性処理を組み合わせる場合を例にとり、タンパク質変性処理についてより具体的に説明する。被験者から採取された尿に、変性剤としてＳＤＳ（通常、終濃度０．１〜１０％ｗ／ｖ）と２−メルカプトエタノール（通常、終濃度５〜２０％ｗ／ｖ）を添加する。変性剤は直接尿に添加してもよいし、変性剤を溶解させた緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）を尿に添加するのでもよい。続いて、変性剤を添加した尿を、例えば、５〜３０分間、２５〜１００℃で加熱することにより、熱変性処理及び変性剤による変性処理を行うことができる。
【００３３】
（定量工程）
定量工程では、処理尿中のα１−ＡＴ５２量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する。
【００３４】
ＥＬＩＳＡは、α１−ＡＴ５２が抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片に結合する性質を利用して、処理尿中のα１−ＡＴ５２量を定量するものであればよく、例えば、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法のいずれであってもよい。
【００３５】
直接吸着法は、例えば、処理尿を固相に接触させて吸着させるステップと、必要に応じて固相をブロッキングするステップと、一次抗体（抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片）を固相に接触させて抗原抗体反応させるステップと、必要に応じて未反応の一次抗体を洗浄するステップと、一次抗体が標識されている場合は、当該標識を利用して定量するステップとを含む。一次抗体が標識されていない場合は、標識された二次抗体（一次抗体と特異的に反応する抗体）と反応させるステップを更に含んでいてもよい。
【００３６】
サンドイッチ法は、例えば、固相化抗体（抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片）を固相に吸着させるステップと、必要に応じて固相をブロッキングするステップと、一次抗体（固相化抗体とは異なるエピトープを認識する抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片）及び処理尿を固相に接触させて抗原抗体反応させるステップと、必要に応じて未反応の一次抗体及びα１−アンチトリプシンを洗浄するステップと、一次抗体が標識されている場合は、当該標識を利用して定量するステップとを含む。一次抗体が標識されていない場合は、標識された二次抗体（一次抗体と特異的に反応する抗体）と反応させるステップを更に含んでいてもよい。
【００３７】
競合法は、例えば、一定量のα１−ＡＴ５２標準品を固相に接触させて吸着させるステップと、必要に応じて固相をブロッキングするステップと、一次抗体（抗α１−アンチトリプシン抗体又はその機能的断片）及び処理尿を固相に接触させて抗原抗体反応させるステップと、必要に応じて未反応の一次抗体及びα１−アンチトリプシンを洗浄するステップと、一次抗体が標識されている場合は、当該標識を利用して定量するステップとを含む。一次抗体が標識されていない場合は、標識された二次抗体（一次抗体と特異的に反応する抗体）と反応させるステップを更に含んでいてもよい。
【００３８】
ＥＬＩＳＡは本技術分野においてよく知られた技術であり、当業者であれば、抗体及び標識等の試薬の選定、ブロッキング、抗原抗体反応及び各種洗浄等の諸条件（例えば、試薬の種類、温度、時間、回数等）、並びに標識の検出条件等の各種条件を適宜設定することができる。なお、標識は、存在量に依存して基質を発色又は発光させることができる酵素であることが一般的であるが、存在量に依存したシグナルが得られる標識（例えば、蛍光標識等）であれば酵素でなくてもよい。
【００３９】
定量工程は、ＥＬＩＳＡで定量したα１−ＡＴ５２の値を規格化するステップを更に含んでいてもよい。規格化は、被験者間のバラつきが少ない指標に基づいて、α１−ＡＴ５２を定量する各種操作に起因する誤差を補正するものである。当該指標としては、例えば、尿中のクレアチニン量（単位：ｍｇ／ｍＬ）を挙げることができる。例えば、ＥＬＩＳＡで定量したα１−ＡＴ５２の値を上記指標で除することで規格化することができる。
【００４０】
（判定工程）
判定工程では、定量工程で得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する。
【００４１】
閾値は、予め設定されたものである。定量工程で得られた定量値を閾値と比較して、閾値を上回る場合は、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると機械的に判定され、一方、閾値以下の場合は、被験者が癌に罹患していない、又は被験者が癌に罹患しているおそれがないと機械的に判定される。
【００４２】
閾値は、例えば、以下のようにして設定することができる。予め癌に罹患しているか否かを診断された被験者から採取された尿をサンプルとし、上述の前処理工程及び定量工程を実施してα１−ＡＴ５２の定量値を得る。複数の被験者（例えば、５０人）から得た「癌の罹患の有無」のデータ及び「α１−ＡＴ５２の定量値」のデータを統計的に処理することにより、両データ間の相関を解析する。解析された結果から、例えば、陽性率の高さ（感度の高さ）を重視するか、偽陽性率の低さ（特異度の高さ）を重視するか、又は陽性率と偽陽性率をどの程度でバランスさせるか等の目的に応じて、閾値を設定することができる。
【００４３】
閾値は、ＲＯＣ曲線に基づいて設定してもよい。ＲＯＣ曲線（例えば、図２参照）に基づく閾値の設定方法としては、例えば、左上隅からの距離が最小となる点を閾値としてもよく、ＲＯＣ曲線下面積が０．５００となる斜点線から最も離れた点を閾値としてもよく、任意の特異度や感度になるような閾値を設定してもよい。
【００４４】
左上隅からの距離が最小となる点を閾値とする場合、例えば、図２の実施例１では、閾値は２１９５００（感度：０．８６、特異度：０．６８）である。ＲＯＣ曲線下面積が０．５００となる斜点線から最も離れた点を閾値とする場合、例えば、図２の実施例１では、閾値は２１９５００（感度：０．８６、特異度：０．６８）、９１２５４（感度：０．９６、特異度：０．５７）である。
【００４５】
本実施形態に係る検査方法の対象となる癌としては、特に制限されるものではないが、例えば、肺癌、甲状腺癌、咽頭癌、食道癌、乳癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、腺癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣（睾丸）癌及び子宮癌等の固形癌、並びに白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の造血器癌が挙げられる。本実施形態に係る検査方法の対象となる癌としては、肺癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、腺癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、尿管癌、膀胱癌、腎臓癌及び前立腺癌等の固形癌が好ましい。
【００４６】
被験者から採取された尿は、採尿後８時間以内であれば、そのまま本実施形態に係る検査方法に使用できるが、採尿後８時間以降に固形癌の検査を実施する場合は、尿を凍結保存したり、凍結乾燥したり、あるいは尿にプロテアーゼインヒビターを添加しておくことが好ましい。なお、採尿後の尿は、冷蔵又は氷冷しておくことが好ましい。
【００４７】
〔データを収集する方法〕
本実施形態に係るデータを収集する方法（以下、「データ収集方法」ともいう。）は、被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、処理尿中の分子量５２ＫＤａのα１−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量する定量工程と、を備える。前処理工程及び定量工程は、上述したとおりである。
【００４８】
本実施形態に係るデータ収集方法によれば、被験者が癌に罹患していると判定するためのデータ、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定するためのデータを収集することができる。判定は、収集したデータのみに基づいて行ってもよい。また判定は、収集したデータに加えて、例えば、他の腫瘍マーカーに関するデータ、医師による問診、触診等の結果を組み合わせて総合的に行うものであってもよい。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明について、実施例を挙げてより具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５０】
〔ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン検出系の構築〕
ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン検出系（以下、「ＥＬＩＳＡ検出系」ともいう。）を構築した。
【００５１】
抗α１−アンチトリプシンポリクローナル抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１２５ｎｇ／１００μｌとなるよう０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、Ｎｕｎｃ社製イムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）の各ウェルへ１００μｌずつ添加し、４℃にて一昼夜反応（固相化反応）させた。固相化反応後、ダルベッコりん酸緩衝液（以下、「Ｄ−ＰＢＳ（−）」）で各ウェルを２回洗浄し、超純水で５倍希釈したポリマー系ブロッキング溶液（Ｎ１０２，日油社製）を各ウェルへ２００μｌずつ添加し、４℃にて一昼夜反応（ブロッキング反応）させた。ブロッキング反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で各ウェルを５回洗浄し、抗α１−アンチトリプシン抗体固相化プレートを得た。抗α１−アンチトリプシン抗体固相化プレートは、測定に用いるまで乾燥状態で−８０℃にて保存した。なお、測定に用いる際には、室温に戻してから使用した。
【００５２】
血漿由来のヒトα１−アンチトリプシンの標品タンパク質（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）に溶解して様々な濃度の希釈系列を調製し、同一濃度につき２つのウェルを使用して各ウェルへ１００μｌずつ添加し、４℃にて一昼夜反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で各ウェルを５回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で１０ｎｇ／１００μｌに調製したＨＲＰ標識抗α１−アンチトリプシンポリクローナル抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、遮光下で、室温にて１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で各ウェルを５回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、遮光下で、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ硫酸を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、室温にて１５分間反応させた。反応後、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
その結果、７５ｐｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で直線性に優れた（相関係数：０．９９８）定量性を有するＥＬＩＳＡ検出系が構築された（図１）。なお、同一濃度の２つのウェルの測定値（平均値±標準偏差）におけるＣＶ値はいずれも５％以下であった。
【００５４】
〔α１−アンチトリプシンの定量による癌の検査方法〕
予め癌に罹患しているか否かを診断された被験者から採取された尿をサンプルとし、構築したＥＬＩＳＡ検出系による尿中のα１−アンチトリプシンの定量によって、癌の検査が可能か否かを検証した。ＥＬＩＳＡに供する尿サンプルの前処理について、実施例１では限外ろ過処理のみを行い、実施例２ではタンパク質変性処理及び限外ろ過処理を行い、比較例１では前処理を行わなかった。
【００５５】
被験者の年齢、性別（男性：Ｍ、女性：Ｆ）、癌の種類及び癌の進行度（ステージ）を表１〜３に示した。各表中、「診断」の項目において、「１」は尿採取当時癌に罹患していると診断された被験者を示し、「０」は尿採取当時癌に罹患していないと診断された被験者を示す。癌の進行度（ステージ）の０〜ＩＶは、国際対がん連合（ＵＩＣＣ：Ｕｎｉｏｎ  Ｔｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１ｅ  Ｃｏｎｔｒｅ  ｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ）が採用している悪性腫蕩の病期分類（ＴＮＭ分類）における進行度（ステージ）分類である。数字が大きいほど癌が進行し、０及びＩは初期段階の癌であることを意味している。表２は、癌の病巣を切除した被験者のリストである。表２中、癌の種類及び癌の進行度（ステージ）は治療前の癌について記載されている。
【００５６】
（実施例１：限外ろ過処理）
＜測定試料調製＞
被験者より尿を採取し、採尿後直ちに遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、その上清を小分けして、−８０℃の冷凍庫で保存した。ＥＬＩＳＡ法による測定を実施する当日に解凍し、直ちに遠心分離（２，８００×ｇ，４℃、１０分間）した。得られた上清のうち５０μｌを分取し、等量の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を混和後、限外ろ過装置（ミリポア社製、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０）のメンブレン上に添加して遠心分離（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）した。遠心分離後、メンブレン上に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１００μｌを添加して更に遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）する工程を計４回繰り返した。最終的に限外ろ過装置のメンブレンを逆転させ、メンブレン上に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を５０μｌ添加して遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、得られた溶液を測定試料とし、ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン量の測定に供した。
【００５７】
＜クレアチニン量の測定＞
−８０℃の冷凍庫で保存した尿を、クレアチニン量を測定する当日に解凍し、直ちに遠心分離（２，８００×ｇ，４℃、１０分間）した。得られた上清を用い、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ社製、カタログＮｏ．５００７０１）によってクレアチニン量を測定した。
【００５８】
＜ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン量の測定＞
測定試料に０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）を添加して様々な濃度の希釈系列を調製し、構築したＥＬＩＳＡ法による検出系で測定を行った。同一濃度につき２つのウェルを使用して各ウェルへ１００μ１ずつ添加し（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ添加）、４℃にて一昼夜反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で各ウェルを５回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で１０ｎｇ／１００μｌに調製したＨＲＰ標識抗α１−アンチトリプシンポリクローナル抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、遮光下で、室温にて１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＤ−ＰＢＳ（−）で各ウェルを５回洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、遮光下で、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ硫酸を各ウェルへ１００μｌずつ添加し、室温にて１５分間反応させた。反応後、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５９】
得られた測定値（平均値±標準偏差でＣＶ値は５％以内）と、同一のプレート上の別のウェルで同時に測定して得られたヒトα１−アンチトリプシンの標品タンパク質の検量線とから、α１−アンチトリプシン量（単位：ｐｇ／ｍｌ）を求め、同じ試料中のクレアチニン量（単位：ｍｇ／ｍ１）で補正することで、尿中のα１−アンチトリプシン量（単位：（ｐｇ／ｍｌ）／（ｍｇ／ｍ１））を求めた。測定結果を表１〜３に示した。
【００６０】
（実施例２：タンパク質変性処理及び限外ろ過処理）
被験者より尿を採取し、採尿後直ちに遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、その上清を小分けして、−８０℃の冷凍庫で保存した。ＥＬＩＳＡ法による測定を実施する当日に解凍し、直ちに遠心分離（２，８００×ｇ，４℃、１０分間）した。得られた上清のうち５０μｌを分取し、４．３％ＳＤＳ及び１０％２−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を含有する１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）５０μ１を添加して混和後、１００℃、５分間煮沸してタンパク質変性処理を行った。タンパク質変性処理を行った尿試料に等量の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を混和後、限外ろ過装置（ミリポア社製、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １０）のメンブレン上に添加して遠心分離（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）した。遠心分離後、メンブレン上に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）１００μｌを添加して更に遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、６０分間）する工程を計４回繰り返した。最終的に限外ろ過装置のメンブレンを逆転させ、メンブレン上に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）を５０μｌ添加して遠心分離操作（１３，２００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、得られた溶液を測定試料とし、ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定に供した。ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定は、実施例１と同手順で行った。測定結果を表１〜３に示した。
【００６１】
（比較例１：未処理）
被験者より尿を採取し、採尿後直ちに遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、１０分間）を行い、その上清を小分けして、−８０℃の冷凍庫で保存した。ＥＬＩＳＡ法による測定を実施する当日に解凍し、直ちに遠心分離（２，８００×ｇ，４℃、１０分間）した。得られた溶液を測定試料とし、ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定に供した。ＥＬＩＳＡによるα１−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定は、実施例１と同手順で行った。測定結果を表１〜３に示した。
【００６２】
【表１】
2015169608.tif 000003
【００６３】
【表２】
2015169608.tif 000004
【００６４】
【表３】
2015169608.tif 000005
【００６５】
〔ＲＯＣ曲線の作成〕
表１〜３に示した結果からＲＯＣ曲線を作成した。図２は、実施例１〜２及び比較例１に係る癌の検査方法のＲＯＣ曲線を示すグラフである。また、ＲＯＣ曲線下面積の値を表４に示した。
【００６６】
【表４】
2015169608.tif 000006
【００６７】
実施例１及び実施例２に係る検査方法では、ＲＯＣ曲線下面積で、癌に罹患している被験者（２８検体）と、癌に罹患していない被験者（癌の病巣を切除した被験者、及び癌に罹患したことのない被験者を含む）（２８検体）は、それぞれ０．７６０及び０．７８８の値となり、癌に罹患している被験者を判別することが可能であることがわかる。さらに、癌に罹患していない被験者（２８検体）のうち、癌の病巣を切除した被験者が８検体含まれており、癌の治療効果を判定することも可能であることがわかる。
【００６８】
一方、比較例１に係る検査方法では、ＲＯＣ曲線下面積で、癌に罹患している被験者（２８検体）と、癌に罹患していない被験者（癌の病巣を切除した被験者、及び癌に罹患したことのない被験者を含む）（２８検体）は、０．６２９の値となり、癌に罹患している被験者を判別することが困難であることがわかる。さらに、癌に罹患していない被験者（２８検体）のうち、癌の病巣を切除した被験者が８検体含まれており、癌の治療効果を判定することも困難であることがわかる。
【００６９】
さらに、実施例及び比較例のＲＯＣ曲線下面積について、統計的学的に差があるか検定を行ったところ、有意差が確認された（ｐ＝０．０４８８５（実施例１対比較例１）、ｐ＝０．０２０９９（実施例２対比較例１）、統計解析ソフトＲを使用）。なお、検定を２回実施したため、ＦＤＲ（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ）を制御することとし、ＢＨ（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）法を使用して判定を行った。ＦＤＲで有意水準に該当する基準値として５％を採用した。
【図１】
2015169608.tif 000007
【図２】
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