(57)【要約】【課題】  滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができ、細胞親和性が高く、生分解性に優れた創傷治癒剤を提供する。【解決手段】  ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求められる（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、（Ａ）の全アミノ酸数に対する全ての（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての（Ｘ’）のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であり、かさ密度が１〜３０ｍｇ／ｃｍ3であり、水分含有率が０〜２０重量％である創傷治癒剤。アミノ酸配列（Ｘ）：３種の特定の配列からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。アミノ酸配列（Ｘ’）：（Ｘ）中の特定数のアミノ酸がリシン及び又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であり、創傷治癒剤のかさ密度が１〜３０ｍｇ／ｃｍ3であり、創傷治癒剤中の水分含有率が０〜２０重量％である創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【請求項２】
前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数と前記アミノ酸配列（Ｘ）及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）の合計個数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計｝］が１：２〜１：６である請求項１に記載の創傷治癒剤。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ）が、前記アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有し、
前記タンパク質（Ａ）中の前記ポリペプチド鎖（Ｙ）と前記ポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数が１〜１００個である請求項１又は２に記載の創傷治癒剤。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：前記ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）が、前記ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の創傷治癒剤。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１〜４のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【請求項６】
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合が５〜５０％である請求項１〜５のいずれか１項に記載の創傷治癒剤。
【請求項７】
前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）を有するタンパク質（Ａ１１−１−１）である請求項１〜６のいずれか１項に記載の創傷治癒剤。
【請求項８】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）であって、円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であるタンパク質（Ａ）を含有する水溶液を凍結乾燥する工程を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の創傷治癒剤の製造方法。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒するためには、創傷部を適度な湿潤環境に保ち、細胞増殖を促す環境を作り出す必要がある（非特許文献１）。そのために患部に適応される創傷被覆材として、従来、ガーゼ及び脱脂綿等が用いられている。これらは、滲出液の吸収が早い反面、細菌に感染しやすく、創面が乾燥してしまうと取り外す際に痛みや出血等を伴うという問題がある。また、創面を乾燥させないために、創傷被覆材と軟膏等を併用することも行われているが、滲出液の吸収が不充分となり、創面が過度に湿った状態になってしまう問題がある。
このように、滲出液のコントロールが創傷治癒にとって非常に重要な因子である。また、滲出液に含まれる種々の成長・増殖因子（ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−β等）を創部に留まらせ、治癒を早めることができるため、滲出液を創傷部に留まらせ、かつ適度な湿潤環境を作り出すような創傷治癒剤が求められている。
【０００３】
そこで、創傷面の滲出液を吸収してゲル化するポリビニルアルコール重合体からなる創傷治癒剤が知られている。（例えば特許文献１）しかしながら、創傷面をゲル化したポリビニルアルコール重合体が覆うことで湿潤環境は維持できるが、肉芽形成や上皮化形成に必要な線維芽細胞等との細胞親和性に乏しく、期待できる効果は得られていない。また、ポリビニルアルコール重合体の生体内での分解性はコラーゲン等の天然物と比較して低く、物理的に除去する必要が生じる場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】古田勝経著、「褥瘡外用療法のヒミツ−事例で学ぶ極意−」、南山堂、２００６年、ｐ２５
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−２６２６０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができ、細胞親和性が高く、生分解性に優れた創傷治癒剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であり、創傷治癒剤のかさ密度が１〜３０ｍｇ／ｃｍ3であり、創傷治癒剤中の水分含有率が０〜２０重量％である創傷治癒剤；ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）であって、円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であるタンパク質（Ａ）を含有する水溶液を凍結乾燥する工程を有する創傷治癒剤の製造方法である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の創傷治癒剤は、滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができ、細胞親和性が高く、生分解性に優れている。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の創傷治癒剤は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）を含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であり、前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であり、創傷治癒剤のかさ密度が１〜３０ｍｇ／ｃｍ3であり、創傷治癒剤中の水分含有率が０〜２０重量％である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：前記アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
【００１０】
本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００１１】
本発明において、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合及びタンパク質（Ａ）の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計の割合が上記範囲であることで、滲出液を吸収してゲル化し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせ、適度な湿潤環境を保つことができる。
【００１２】
本発明におけるタンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求められるタンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合が６０〜８５％であるタンパク質である。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は異なる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、通常６０〜８５％であり、好ましくは６５〜８０％、さらに好ましくは７０〜７５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）をリフォールディングすることによって増加させることができる。また、変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合は、下記測定法によって求める。
【００１３】
＜タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらの合計をβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合とする。
【００１４】
本発明においてタンパク質（Ａ）は、下記アミノ酸配列（Ｘ）を少なくとも１個及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を少なくとも１個有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列又はアミノ酸配列（Ｘ）中の２個のアミノ酸がリシン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）をそれぞれ複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、アミノ酸配列（Ｘ）とアミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。
【００１５】
アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性及び創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。
【００１６】
アミノ酸配列（Ｘ’）として、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
【００１７】
タンパク質（Ａ）は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）中のの全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）及び／又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
【００１８】
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列である。なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、ポリペプチド鎖（Ｙ）は同一でも異なっていても良く、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、（ＶＰＧＶＧ）b配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）c配列が好ましい。
【００１９】
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、アミノ酸配列（Ｘ）が連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。
【００２０】
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数に対するリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸数の合計数の割合は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
【００２１】
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を、他のアミノ酸［グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）又はヒスチジン（Ｈ）］に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
【００２２】
タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。
【００２３】
タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）についても同様である。
【００２４】
本発明におけるタンパク質（Ａ）は、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合が５０〜７０％であるものであるが、細胞親和性の観点から、５２．５〜６７．５％が好ましく、さらに好ましくは５５〜６５％である。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸配列の合計数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
【００２５】
＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）中の全てのアミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数及び全てのアミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数の合計数の割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
【００２６】
なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。その全種類についての合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）中のアミノ酸数｝」を求める。
【００２７】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、細胞親和性の観点から、５〜５０％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４７．５％であり、特に好ましくは２０〜４５％である。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
【００２８】
＜タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
【００２９】
タンパク質（Ａ）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合を適度にする観点、細胞親和性の観点及び創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
【００３０】
タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列を合計２個以上有する場合は、これらの間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）ではないペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸数の割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数｝×１００］は、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
【００３１】
タンパク質（Ａ）は、生体内での分解性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）及び介在アミノ酸配列（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。タンパク質（Ａ）の両末端の構造が、ポリペプチド鎖（Ｙ）に末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）ではないペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、生体内での分解性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。
【００３２】
タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数の割合は、生体内での分解性の観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
【００３３】
タンパク質（Ａ）は、生物工学的手法により細菌を用いて製造することがある。このような場合、発現させたタンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）は末端アミノ酸配列（Ｔ）の他に、Ｎ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００３４】
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列（Ｚ）、全ての末端アミノ酸配列（Ｔ）及び精製タグのアミノ酸数の合計数の割合は、生体内での分解性の観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
【００３５】
タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、創傷面を適度な湿潤環境を保つ観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。
【００３６】
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）｝］は、タンパク質（Ａ）中のβターン構造とランダムコイル構造との合計の割合を適度にする観点から、１：２〜１：６が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：５である。
【００３７】
タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、生体内での分解性の観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは３０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０〜１２０ｋＤａである。
【００３８】
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続した（ＧＶＧＶＰ）8配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）が化学結合した分子質量が約８０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
【００３９】
（Ａ１１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１２個連続したポリペプチド鎖の１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）6ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）5配列（２６）（Ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）6ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）5配列（２６）とを有するタンパク質
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）6ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）5配列（２６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）が化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２４）のタンパク質
【００４０】
（Ａ１２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）40配列（２７）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）
【００４１】
（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、（ＶＰＧＶＧ）4配列（２０）及び（ＶＰＧＶＧ）8配列（２１）をそれぞれ４０個有し、これらが配列（２０）、配列（１）、配列（２１）の順に結合したブロックが４０個化学結合してなる構造を有する分子質量約２００ｋＤａの配列（２２）のタンパク質（ＥＬＰ１．１）
【００４２】
本発明の創傷治癒剤は、上記のようなアミノ酸配列からなるタンパク質（Ａ）を含むものであることから、ポリビニルアルコール等に比べて生分解性に優れている。
【００４３】
本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。
【００４４】
無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書においてリン酸（塩）は無機塩に含まない。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量は、細胞親和性の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０〜３重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜１重量％、特に好ましくは０〜０．５重量％である。
【００４５】
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸塩としては、リン酸のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量は、細胞親和性の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０〜２重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜０．５重量％、特に好ましくは０．００１〜０．０５重量％である。
【００４６】
本発明の創傷治癒剤は、糖及び／又は抗菌剤を含んでいてもよい。
糖としては、公知の糖を用いることができ、例えば、単糖（トリオース、テトロース、ペプトース、ヘキソース及びヘプトース等）、オリゴ糖及び多糖（デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン及びキサンタンガム等）等が挙げられる。
抗菌剤としては、公知の抗菌剤を用いることができ、例えば、銀イオン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等が挙げられる。
【００４７】
創傷治癒剤中の糖の含有量は、創傷治癒剤の重量を基準として、創傷治癒の観点から、０．１〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５重量％である。
抗菌剤の含有量は、創傷治癒剤の重量を基準として、創傷治癒の観点から、０．００１〜１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．１重量％である。
【００４８】
本発明の創傷治癒剤は、多孔質形態を有する。
本発明の創傷治癒剤のかさ密度は、通常１〜３０ｍｇ／ｃｍ3であり、創傷治癒剤のかさ密度を本範囲にすることで、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができる。滲出液吸収の観点から、好ましくは５〜３０ｍｇ／ｃｍ3である。
尚、本発明の創傷治癒剤のかさ密度は、後述の方法により測定することができる。
【００４９】
本発明の創傷治癒剤は、創傷治癒剤中の水分含有率が０〜２０重量％であり、滲出液吸収の観点から、０．５〜１０重量％が好ましい。
創傷治癒剤中の水分含有率は、下記測定方法によって求めることができる。
＜創傷治癒剤中の水分含有率の測定方法＞
創傷治癒剤０．１ｇの水分含有率を微量水分測定装置（平沼産業社製、「ＡＱ−２２００」）にて測定する。
【００５０】
本発明の創傷治癒剤の製造方法は、上記タンパク質（Ａ）を含有するタンパク質水溶液を凍結乾燥する工程を有する創傷治癒剤の製造方法である。
本発明の創傷治癒剤のかさ密度は、タンパク質水溶液中のタンパク質（Ａ）の含有量を調整することで所望の値にすることができる。
タンパク質水溶液中のタンパク質（Ａ）の含有量は、細胞親和性の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．１〜３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜３重量％である。
【００５１】
タンパク質水溶液中には、糖及び／又は抗菌剤を含んでもよい。
タンパク質水溶液中の糖の含有量は、滲出液吸収の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．０１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１重量％である。
タンパク質水溶液中の抗菌剤の含有量は、創傷治癒の観点から、タンパク質水溶液の重量を基準として、０．００００１〜１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００１〜０．１重量％である。
【００５２】
本発明における凍結乾燥としては、公知の凍結乾燥方法を用いることができる。
凍結乾燥には、一次乾燥と二次乾燥がある。一次乾燥とは、試料表面から氷を昇華させるものである。二次乾燥とは、分子間に結合している水を除くものである。
凍結乾燥において、一次乾燥の温度は、タンパク質の立体構造維持の観点から、０℃以下が好ましく、さらに好ましくは−１０℃以下である。また、二次乾燥の温度は、タンパク質の立体構造維持の観点から、１０〜３０℃が好ましく、さらに好ましくは、１０〜２０℃である。
凍結乾燥時間は、タンパク質の立体構造維持の観点から、一次乾燥と二次乾燥との合計で、１２〜４８０時間が好ましく、さらに好ましくは１８〜４２０時間である。
【００５３】
本発明の創傷治癒剤を患部に適用する方法としては、従来用いられている脱脂綿と同様の方法で用いることができ、例えば、患部の壊死組織を除去した後、患部に合わせた形に加工した創傷治癒剤を乗せて、ポリウレタンフィルム等で覆う等が挙げられる。
【００５４】
本発明の創傷治癒剤は、滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせ、菌に感染しにくく、生分解性に優れているため、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒する創傷治癒剤として用いることができる。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
＜製造例１＞
［ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、タンパク質（Ａ）の１種である配列（２３）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。
【００５７】
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
【００５８】
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（Ａ１）の精製物であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【００５９】
１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
【００６０】
２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
【００６１】
３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
【００６２】
４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【００６３】
５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ  ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ  １０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
【００６４】
６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
【００６５】
７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、１６時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を得た。
【００６６】
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８０ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。
また、アミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所製）を用いたアミノ酸組成分析より得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）のアミノ酸の組成比率（実測値）と、合成遺伝子配列から推測されるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）のアミノ酸の組成比率（理論値）を表１に示す。
これらから、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリン（Ｖ）のうち１個がリシン（Ｋ）に置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２３）のタンパク質であることを確認した。
【００６７】
【表１】
2015063517.tif 000002
【００６８】
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ  ジチオスレイトール、６％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％  ブロモフェノールブルー、及び３０％  グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレンにトランスファー（以下、「メンブレン」と略記）し、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％  スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及び抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）が分解吸収され、無くなったと判断した。
【００６９】
○βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定
得られたＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。
＜βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を算出した。結果を表２に示す。
【００７０】
＜製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
【００７１】
＜製造例３＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−３：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５−３：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の３倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。溶出画分の３倍容量の脱イオン水による透析を残り５回繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
【００７２】
＜製造例４＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−４）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社製、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）にて精製し、溶出画分を回収した。
【００７３】
＜比較製造例１＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１’−１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｅｐ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
【００７４】
＜比較製造例２＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」行う以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１’−２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７５】
＜比較製造例３＞
製造例１の「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１’−３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表２に示す。
【００７６】
＜比較製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．２をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−２」を用いる以外は同様にして、分子質量が約３７ｋＤａの配列（２５）のＥＬＰ１．２タンパク質（Ａ’−１）を得た。βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した結果を表２に示す。
【００７７】
＜比較製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、分子質量が約９３ｋＤａの配列（１９）のＳＬＰ４．１タンパク質（Ａ’−２）を得た。βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2015063517.tif 000003
【００７９】
＜実施例１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１）を得た。タンパク質水溶液（１）を２４穴プレート（ＩＷＡＫＩ社製）に入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、１６時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥し、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、創傷治癒剤（１）を得た。
【００８０】
＜実施例２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（２）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（２）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（２）を得た。
【００８１】
＜実施例３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１０ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（３）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（３）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（３）を得た。
【００８２】
＜実施例４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（４）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（４）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（４）を得た。
【００８３】
＜実施例５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（５）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（５）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（５）を得た。
【００８４】
＜実施例６＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１０ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（６）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（６）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（６）を得た。
【００８５】
＜実施例７＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（７）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（７）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（７）を得た。
【００８６】
＜実施例８＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（８）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（８）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（８）を得た。
【００８７】
＜実施例９＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１０ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（９）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（９）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（９）を得た。
【００８８】
＜実施例１０＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（２５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１０）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１０）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１０）を得た。
【００８９】
＜実施例１１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１２．５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１１）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１１）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１１）を得た。
【００９０】
＜実施例１２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（３０ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１２）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１２）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１２）を得た。
【００９１】
＜実施例１３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１３）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１３）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１３）を得た。
【００９２】
＜実施例１４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１４）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１４）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１４）を得た。
【００９３】
＜実施例１５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１５）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１５）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１５）を得た。
【００９４】
＜比較例１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１’）を得た。
【００９５】
＜比較例２＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１５０ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（２’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（２’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（２’）を得た。
【００９６】
＜比較例３＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（３’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（３’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（３’）を得た。
【００９７】
＜比較例４＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（４’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（４’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（４’）を得た。
【００９８】
＜比較例５＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５０ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（５’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（５’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（５’）を得た。
【００９９】
＜比較例６＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（１００ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（６’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（６’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（６’）を得た。
【０１００】
＜比較例７＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１’−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（７’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（７’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（７’）を得た。
【０１０１】
＜比較例８＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１’−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（８’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（８’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（８’）を得た。
【０１０２】
＜比較例９＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１’−３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（９’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（９’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（９’）を得た。
【０１０３】
＜比較例１０＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ’−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１０’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１０’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１０’）を得た。
【０１０４】
＜比較例１１＞
ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ’−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解し（５ｍｇ／ｍｌ）、タンパク質水溶液（１１’）を得た。
実施例１において、「タンパク質水溶液（１）」に代えて「タンパク質水溶液（１１’）」を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤（１１’）を得た。
【０１０５】
＜評価１＞
○かさ密度の測定
予め重量［（Ｇ１）、単位：ｇ］を小数点以下１桁まで測定した５０ｍＬ容量の遠沈管［アズワン（株）製］に、タンパク質水溶液（１）〜（１５）及び（１’）〜（１１’）をそれぞれ１０ｍｌ入れ、実施例１〜１２及び比較例１〜９の条件で凍結乾燥させた。
凍結乾燥後の遠沈管の重さ（Ｇ２）（単位：ｇ）をそれぞれ小数点以下１桁まで測定した。また、遠沈管中の創傷治癒剤の体積（Ｖｏｌ）（ｍｌ）を、遠沈管の目盛りから読み取った。
得られた重量（Ｇ１）、（Ｇ２）及び体積（Ｖ）から、下記式によりかさ密度を算出し、結果を表３に示す。
かさ密度（ｇ／ｍｌ）＝｛（Ｇ２）−（Ｇ１）｝／（Ｖｏｌ）
【０１０６】
＜評価２＞
○創傷治癒剤中の水分含有率の測定
創傷治癒剤（１）〜（１５）及び（１’）〜（１１’）をそれぞれ０．１ｇ用いて、微量水分測定装置（平沼産業社製、「ＡＱ−２２００」）にて創傷治癒剤中の水分含有率を測定した。評価結果を表３に示す。
【０１０７】
＜評価３＞
○肉芽組織高及び上皮化長の測定
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀  ｓｔｄ  Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０ｍｍ×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷面に創傷治癒剤（１）〜（１５）及び（１’）〜（１１’）を各々置き、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
【０１０８】
＜評価４＞
○水分保持率の測定
（湿潤環境維持評価）
１０ｍｍ角の創傷治癒剤（１）〜（１５）及び（１’）〜（１１’）に１００μＬの生理食塩水をたらし、３７℃、湿度５０％の環境下にて５日間静置した。その後、創傷治癒剤中に含まれている水分量［（Ｊ）、単位：μＬ］について、微量水分測定装置を用いて測定した。測定した水分量（Ｊ）から、水分保持率（％）を算出した。結果を表３に示す。
水分保持率（％）＝創傷治癒剤中に含まれている水分量（Ｊ）／１００（μＬ）×１００
【０１０９】
【表３】
2015063517.tif 000004
【０１１０】
表３の結果から、本発明の創傷治癒剤（１）〜（１５）を用いた場合、肉芽組織高及び上皮化長が大きく、細胞親和性が高く、創傷治癒に優れていることが分かる。また、本発明の創傷治癒剤（１）〜（１５）は、水分保持率が１２．３〜２６．７％と適度であることから、吸収した生理食塩水を蒸散させる割合と、保持する割合とが適度であり、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の創傷治癒剤は、滲出液を吸収し、吸収した滲出液を適度に創傷部に留まらせることができ、細胞親和性が高く、生分解性に優れている。したがって、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を治癒する創傷治癒剤として有効である。
【配列表】
2015063517000001.app