(57)【要約】      （修正有）【課題】環境への負荷が小さく経済的な方法により、１，５−ペンタンジアミン（１，５−ＰＤ）の製造方法の提供。【解決手段】下記からなる群より選ばれるタンパク質の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ＰＤを生成することを含む、１，５−ＰＤの製造方法：（ａ）特定ののアミノ酸配列を含むタンパク質；（ｂ）特定のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および（ｃ）特定のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選ばれるタンパク質の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタンジアミンを生成することを含む、１，５−ペンタンジアミンの製造方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記反応がｐＨ７．０〜１０．０の条件下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された微生物を用いて、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタンジアミンを生成することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記微生物がエシェリヒア・コリである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
【請求項６】
Ｈ７．０〜１０．０の条件下でリジン脱炭酸活性を有する、請求項５記載のタンパク質。
【請求項７】
下記からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、リジン脱炭酸活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、リジン脱炭酸活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（Ｄ）請求項５または６記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８記載の発現ベクターを含む微生物。
【請求項１０】
請求項９記載の微生物を用いて、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ性条件下で反応を触媒できるリジン脱炭酸酵素を用いる１，５−ペンタンジアミンの製造方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−ペンタンジアミン（カダベリン、またはペンタンメチレンジアミン等とも呼ばれる、分子式Ｃ５Ｈ１４Ｎ２を有する化合物。以下、必要に応じて、「１，５−ＰＤ」と略記する）は、ポリアミド樹脂などの樹脂原料として、あるいは医薬中間体として需要が見込まれる物質である。１，５−ＰＤは、非石油系原料から製造可能であるため、環境負荷の低減という観点からも工業的に注目されている。
【０００３】
１，５−ＰＤの生物学的製造方法では、リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）が利用されている。ＬＤＣは、リジンから１，５−ＰＤおよびＣＯ２を生成する酵素である。ＬＤＣを用いる１，５−ＰＤの製造方法としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｒｉｓｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＬＤＣを用いる方法が報告されている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２２３７７０号公報
【特許文献２】特開２００８−１９３８９９号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１０８８５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リジンにＬＤＣを作用させて１，５−ＰＤを生成する場合、リジンの脱炭酸によりカルボキシル基が脱離して二酸化炭素が発生し、１価のカチオンであるリジンから２価のカチオンである１，５−ＰＤが生成する為、反応液のｐＨが上昇する。したがって、反応液のｐＨ上昇を防ぎ酵素反応を最適ｐＨに維持する為には高濃度の中和剤を含む緩衝液中で反応させるか、または中和剤としての酸を反応系に逐次添加する必要がある。しかしながら、このような場合、中和剤（例、無機酸、有機酸等の酸）に由来する副生塩が発生し、これが環境に対する負荷となる。また、この副生塩を回収・再利用する場合は多大な設備が必要とされ、１，５−ＰＤの製造コストが上昇することから、経済的に不利である。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、環境への負荷が小さく経済的な方法により、１，５−ＰＤを生成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、リジンから１，５−ＰＤを生成する反応において中和剤に由来する副生塩の発生を低減させるためには、アルカリ性条件下で１，５−ＰＤを生成すればよいことを着想した。本発明者は、本着想に基づき、アルカリ性条件下での１，５−ＰＤの生成を実現するため鋭意検討した結果、アルカリ性条件下で１，５−ＰＤを生成できるタンパク質を単離・同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記からなる群より選ばれるタンパク質の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタンジアミンを生成することを含む、１，５−ペンタンジアミンの製造方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
〔２〕前記反応がｐＨ７．０〜１０．０の条件下で行われる、〔１〕の方法。
〔３〕前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された微生物を用いて、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタンジアミンを生成することを含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記微生物がエシェリヒア・コリである、〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
〔６〕Ｈ７．０〜１０．０の条件下でリジン脱炭酸活性を有する、〔５〕のタンパク質。
〔７〕下記からなる群より選ばれるポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、リジン脱炭酸活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、リジン脱炭酸活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（Ｄ）〔５〕または〔６〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔８〕〔７〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔９〕〔８〕の発現ベクターを含む微生物。
〔１０〕〔９〕の微生物を用いて、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、アルカリ性条件下で１，５−ＰＤを生成できるＬＤＣを用いることで、副生塩の発生量を低減できる。したがって、本発明によれば、環境への負荷が小さく経済的な方法により１，５−ＰＤを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のリジン脱炭酸酵素のｐＨプロファイルを示す図である。各ｐＨでの反応において、１００ｍMの下記緩衝液をそれぞれ用いた：◇（Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．０，７．５，８．０，８．５）；□（ＣＨＥＳ緩衝液、ｐＨ８．５，９．０，９．５）；△（ＣＡＰＳ緩衝液）。
【図２】図２は、リジン脱炭酸酵素による経時的なリジン消費量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、所定のタンパク質の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタンジアミンを生成することを含む、１，５−ペンタンジアミンの製造方法を提供する。
【００１２】
具体的には、このようなタンパク質としては、以下を用いることができる：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつリジン脱炭酸活性を有するタンパク質。
本発明において、リジン脱炭酸活性とは、リジンを１，５−ＰＤに転換する活性をいう。
本発明はまた、このようなタンパク質を提供する。
【００１３】
本発明のタンパク質は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物〔例、シュードモナス・オティティディス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）またはその近縁種〕に由来していてもよい。
【００１４】
上記（ｂ）のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個または１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
【００１５】
上記（ｃ）のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００１６】
アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙまたはＩｄｅｎｔｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、アミノ酸配列の同一性として、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値を利用してもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１７】
上記（ｂ）および（ｃ）のタンパク質の調製のため、配列番号２のアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログ（既知のリジン脱炭酸酵素）のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、酵素学的特性（例、リジン脱炭酸活性、ｐＨ安定性）を維持し得る１以上のアミノ酸残基の変異が導入される、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列を決定することができる。
【００１８】
上記（ｂ）および（ｃ）のタンパク質の調製のため、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００１９】
本発明のタンパク質はまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を有していてもよい。本発明のタンパク質に付加され得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）；シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）；他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、所定の条件（例、３０〜３７℃、ｐＨ７．０〜１０．０）下で、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の約５０％以上の活性、好ましくは約８０％以上の活性、より好ましくは約９０％以上の活性、さらにより好ましくは約１００％以上の活性を保持していることが望ましい。
【００２１】
本発明の１，５−ＰＤの製造方法では、上述したようなタンパク質の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ＰＤが生成される。Ｌ−リジンの塩としては、無機酸塩（例、塩酸塩）、無機塩基塩（例、アンモニウム塩）、有機酸塩（例、酢酸塩）、および有機塩基塩（例、トリエチルアミン塩）等の非金属塩、ならびにアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）、およびアルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩）等の金属塩が挙げられる。
【００２２】
所定のタンパク質の作用により、Ｌ−リジンおよび／またはその塩から１，５−ペンタンジアミンを生成することは、例えば、後述するような本発明の形質転換体を用いて、または本発明のタンパク質（例、抽出、粗精製または精製タンパク質）を用いて、行われる。本発明の形質転換体を用いて１，５−ＰＤが生成される場合、１，５−ＰＤ生成のための条件は、後述するような形質転換体の培養条件と同様である。本発明の形質転換体を用いて１，５−ＰＤが生成される場合、本発明のタンパク質を形質転換体外に放出させるように処理（例、破砕処理、熱処理）してもよい。タンパク質を用いて１，５−ＰＤが生成される場合、１，５−ＰＤ生成のための反応条件は、適切な反応液（例、緩衝液）を用いて行われる。また、本発明のタンパク質を本発明の形質転換体で高発現させた後に微生物を上述のとおり処理し、微生物の処理物をＬ−リジンおよび/またはその塩を含む反応系に添加して、１，５−ＰＤを生成してもよい。
【００２３】
本発明の１，５−ＰＤの製造方法は、１，５−ＰＤを生成し得る限り任意のｐＨ条件で行うことができるが、中性またはアルカリ条件下で行われてもよい。本発明のタンパク質は、このような条件下で安定性が高いという特性を有し得る。したがって、本発明の１，５−ＰＤの製造方法は、ｐＨ７．０〜１０．０の条件下で好適に行うことができる。本発明の製造方法はまた、１，５−ＰＤの収量を向上させるため、反応系中にＬ−リジンおよび／またはその塩を追加することをさらに含んでいてもよい。
【００２４】
１，５−ＰＤの回収および精製は、当該分野で知られている任意の方法により行うことができる（例、背景技術で挙げた先行文献、および国際公開第２０１３／１０８８５９号を参照）。例えば、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の慣用手法を利用できる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドは、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれる：
（Ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、リジン脱炭酸活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、リジン脱炭酸活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；および
（Ｄ）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のタンパク質と同様の微生物に由来し得る。
【００２７】
（Ｂ）において、ヌクレオチド配列の「同一性」は、アミノ酸配列について上述した方法と同様に決定することができる。ヌクレオチド配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。（Ｃ）において、「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、高い同一性％を示す実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い同一性％を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。（Ｂ）および（Ｃ）のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、所定の条件（例、３０〜３７℃、ｐＨ７．０〜１０．０）下で、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の約５０％以上の活性、好ましくは約８０％以上の活性、より好ましくは約９０％以上の活性、さらにより好ましくは約１００％以上の活性を保持していることが望ましい。本発明のポリヌクレオチドはまた、５’末端または３’末端に、上述したような他のペプチド成分（例、タグ部分）をコードするポリヌクレオチドを有していてもよい。
【００２８】
本発明のタンパク質は、本発明の形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを微生物（宿主）に導入することにより作製できる。
【００２９】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む。本発明の発現ベクターはまた、本発明のポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含むことができる。本発明の発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはまた、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。本発明の発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明のタンパク質に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、本発明の発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−５１ｂ、ｐＥＴ−４１ａ、ｐＭＡＬ−ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ−５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。本発明のタンパク質とそれに付加された他のペプチド成分との切断をタンパク質発現後に可能にするため、本発明の発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。
【００３０】
本発明のタンパク質を発現させるための微生物としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア属細菌、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。微生物としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００３１】
本発明の形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃〜３７℃であってもよく、ｐＨは６．５〜７．５であってもよく、培養時間は１ｈ〜１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１〜１０％を、好ましくは３％〜８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。
【００３２】
形質転換される微生物は、上述したとおりであるが、エシェリヒア・コリについて詳述すると、エシェリヒア・コリＫ１２株亜種のエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換されたエシェリヒア・コリを作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常エシェリヒア・コリにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
【００３４】
また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドをエシェリヒア・コリに導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
【００３６】
また、形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック社製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック社製）〕。
【００３７】
得られた本発明の発現ベクターを用いてエシェリヒア・コリを形質転換し、このエシェリヒア・コリを培養することにより、本発明のタンパク質を得ることができる。
【００３８】
培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、エシェリヒア・コリを培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、微生物等の種類に応じて適宜選択される。
【００３９】
本発明のタンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明のタンパク質は、本発明の形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）または溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物または溶解物として得ることができる。このような破砕物または溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明のタンパク質を得ることができる。あるいは、本発明のタンパク質の回収は、本発明の形質転換体を、上述したような処理に付した後に行うことができる。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：新規リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）遺伝子の同定
１−１）新規リジン脱炭酸酵素活性を有する菌の自然界からの分離
各種土壌サンプルをＬ−リジン塩酸塩１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム３．５６ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム２ｇ／ｌ、酵母エキス０．２ｇ／ｌ、トリプトン２ｇ／ｌおよび炭酸ナトリウム０．１ｇ／ｌを含む培地（ＬＤＨ培地、ｐＨ９．２）３ｍｌを入れた試験官に添加し、３７℃で２から７日間振盪培養した。菌の生育の認められた培地を新しい培地に植え継ぎ、同じ条件で振盪培養を行った。これらの培養液を同じ組成の平板寒天培地にプレーティングし、ＬＤＨ培地培地にて良好に生育する菌３９７株を単離した。
【００４２】
次に、平板培地にて培養した単離菌をかきとり、リジンＨＣｌ塩  ４ｇ／ｌ、Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＥＳ）２０．７ｇ／ｌ（１００ｍＭ）、Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）  ２６．５ｍｇ／ｌを含む反応液５０μｌ（ｐＨ８．４および９．２）に添加し、３７℃で１６時間反応させ、リジン脱炭酸反応を行った。１，５−ＰＤを生成し、かつｐＨ８．４と９．２での生成量の差が少ない株として日本国内の土壌より単離された一株を選抜した。本株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析よりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓに近縁のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌に帰属されることが判明した。本株をＰＳ２９３６株と命名した。
【００４３】
酵素活性はリジンおよび１，５−ＰＤをポストカラムＯＰＡ法（Ｓ．Ｒ．Ｖａｌｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂ．Ｇｌｏｒｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９７）  ｖｏｌ．８０，ｐ．１００６−１０１２）によりＨＰＬＣで定量する方法、もしくは残存するＬ−リジンをバイオセンサＢＦ−５（王子計測機器株式会社）にて定量する方法で測定した。
【００４４】
１−２）菌株からの新規リジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）遺伝子のクローニング
ＰＳ２９３６株からゲノムを調製し、ＮｅｘｔｅｒａＸＴ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）用いて調製したサンプルを、ＭｉＳｅｑ  ＩＩ  次世代シーケンサ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてゲノム配列を分析した。Ｅ．ｃｏｌｉアミノ酸脱炭酸酵素のホモロジーに基づき、得られたゲノム配列からリジン脱炭酸酵素をコードする候補遺伝子を検索した。その結果、配列表１に示す７５１アミノ酸残基のタンパク質をコードする２，２５３ｂｐのＯＲＦが見出された。配列表２に示すアミノ酸配列のタンパク質はＢｌａｓｔ検索した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＮＢＲＣ  １０６５５３由来のｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｏｒｎ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ脱炭酸酵素と最も高い相同性を示し、本遺伝子配列との相同性は８７％（６４０アミノ酸残基のうち５６２アミノ酸が相同）であった。
【００４５】
本アミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーセット（ＰＳＬＤＣＦおよびＰＳＬＤＣＲ）で、Ｋ２９３６株の染色体を鋳型として、ＰＣＲ法により本候補酵素遺伝子（ＬＤＣ）を含むＤＮＡ断片を増幅した。これをプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトに連結した発現プラスミドを構築し、ｐＳＰ４１０と命名した。
ＰＳＬＤＣＦ：５’−ｃｇｃｇｃｇｇｃａｇｃｃａｔａｔｇｔａｃａａａｇａｃｃｔｇａａｇｔｔｃｃ（配列番号３）
ＰＳＬＤＣＲ：５’−ｇｃａｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｔｃａｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｃａａｔｃａａｃ（配列番号４）
【００４６】
実施例２：新規リジン脱炭酸酵素遺伝子の活性確認と性質検討
実施例１にて構築した発現プラスミドｐＳＰ４１０でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株を形質転換し、本形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとＩＰＴＧ  １ｍＭを含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間培養した。該培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で１回洗浄した後、菌体を５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、４℃で２０分間超音波処理を行い破砕した。処理液を８，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離して不溶性画分を除き、無細胞抽出液を調製した。
【００４７】
リジンベース  ８ｇ／ｌ、Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＬＰ）  ２６．５ｍｇ／ｌ、および各種緩衝液１００ｍＭでｐＨを６から１０までに調整した反応液１ｍｌに菌体処理物０．１ｍｌを添加して３７℃で一時間反応した。緩衝液成分としてＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ）１２．１ｇ／ｌ（ｐＨ７，７．５，８，８．５）、Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＥＳ）２０．７ｇ／ｌ（ｐＨ８．６，９、９．）、Ｎ−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＡＰＳ）２２．１ｇ／ｌ（ｐＨ９．７，１０）を用いた。反応液０．１ｍｌを採取して１ｍｌの１％（ｖ／ｖ）リン酸に添加し、反応を停止し、生成する１，５−ＰＤを定量した。
【００４８】
各ｐＨにて活性を測定した結果を図１に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ由来リジン脱炭酸酵素（ＣａｄＡ）の至適ｐＨは６．２と報告されているが（参考文献：Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９７）１７９，４４８６−９２）、本酵素はｐＨ７．５〜８．０で最大活性を示し、１，５−ＰＤ生産に適した性質であると考えられた。
【００４９】
また、本ＬＤＣはｐＨ８で最大活性を示したため、以降の実験では酵素活性測定はＴｒｉｓ緩衝液を用いて、ｐＨ８．０、３０℃の条件で１分間に１μｍｏｌの１，５−ＰＤを生成する活性を１ｕｎｉｔと定めた。
【００５０】
実施例３：新規リジンの脱炭酸酵素を用いた反応
さらに実施例２で調製した粗酵素液を用い、アルカリ性の反応液でリジンから１，５−ＰＤ生産反応を試みた。リジンベース  ５０ｇ／ｌ（ｐＨ８．５）、ＰＬＰ  ２．６３ｍｇ／ｌに粗酵素液を終濃度で６．３Ｕ／ｍｌとなるように添加し、３０℃で反応中のｐＨは調整せず、反応させた。対照として特開第２００８−１９３８９９号公報の実施例１に記載の方法に従いＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３９９３６）由来リジン脱炭酸酵素（ＣａｄＡ）発現株を構築し、本菌から粗酵素液を調製し、７．０Ｕ／ｍｌ（ＣａｄＡ活性はｐＨ６測定）の活性量を添加して反応を行った。
【００５１】
リジン消費に関する反応の経時的変化を図２に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ由来リジン脱炭酸酵素を用いた反応はこの条件で停止したが、ＰＳ２９３６株由来のリジン脱炭酸酵素を用いた反応ではリジンが消費された。これより、本酵素を高ｐＨの反応で用いることで、酸の添加量を大きく削減できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、ポリアミド樹脂などの樹脂原料として、あるいは医薬中間体として利用できる１，５−ＰＤの製造に有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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