(57)【要約】【課題】変異Ｈ因子結合タンパク質を含むワクチン組成物の提供。【解決手段】本発明は、ヒトまたは非ヒト動物に投与された場合に免疫応答を惹起することができる少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む免疫原性組成物；ならびに関連する組成物、使用およびキットに関する。第１の態様によれば、本発明は、少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む免疫原性組成物であって、ヒトまたは非ヒト動物に投与された場合、免疫応答を惹起することができる組成物を提供する。本発明の１つの目的は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する防御免疫応答を惹起するのに使用できる１種または複数種の組成物を提供することである。【選択図】図３
2015063558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原生物に対する免疫応答の惹起に使用する免疫原性組成物に関し、特に防御免疫応答を惹起できる免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）は莢膜を有するグラム陰性双球菌でヒトの鼻咽頭に存在する。一般集団における保菌率は通常１０％程度である。宿主・病原体関係は複雑であるが、通常共生的なものである。しかしながら、頻度は低いものの、髄膜炎菌の保有により侵襲性疾患を起こす場合もある。この現象は通常、高病原性の少数の近縁種に属する菌株と関連している（非特許文献１）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは世界の化膿性髄膜炎の主要な原因であり、髄膜炎および敗血症を発生させ得る唯一の細菌である。発病率は、地域ごとに風土病の有病率かあるいは流行病の有病率かにもよるが、人口１０万当たり１〜３人の間である。したがって、侵襲性髄膜炎菌性疾患の罹患率、死亡率および罹病率を低下させる予防および治療戦略の開発が求められている。
【０００３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ生体はいくつかの最新の抗生物質に感受性があるものの、それにもかかわらず、髄膜炎菌性感染症と診断される患者の多くが劇症で死亡したり、あるいは重篤な合併症を発症したりする。死亡率は、合併症のない髄膜炎の場合に２〜３％、敗血症性ショックの場合には５０％またはそれ以上に至る（非特許文献２）。
【０００４】
現在承認されているワクチンはその細菌外膜の外側にある莢膜多糖体をベースにしており、したがって対応する莢膜を発現する一部の菌株しか予防できない。加えて、富裕国における髄膜炎菌性疾患の最も多い原因である血清型Ｂ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対しては広く効果があるワクチンが存在しない。これは、血清型Ｂの莢膜が、乳児期および胚発生期に発現するヒト神経細胞接着分子の変異と構造的に関連しているシアル酸のポリマーからなるためである。この抗原を接種すると自己免疫応答を引き起こすことが懸念される。
【０００５】
本発明は、新規な組成物、特に改変されたＨ因子結合タンパク質を含む新規な免疫原性組成物、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を惹起するための、こうした組成物の使用に関する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｕｇａｎｔ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：２７８１−２７９２
【非特許文献２】Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ａｌａ’Ａｌｄｅｅｎ（１９９７）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  ３４：１５−１９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの目的は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する防御免疫応答を惹起するのに使用できる１種または複数種の組成物を提供することである。
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む免疫原性組成物であって、ヒトまたは非ヒト動物に投与された場合、免疫応答を惹起することができる組成物を提供する。
【０００９】
好ましくは、本明細書でＨ因子結合タンパク質という場合、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＨ因子結合タンパク質をいう。
【００１０】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、宿主に擬態することにより宿主生物の免疫応答を破綻させる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、荷電炭水化物化学の代わりにＨ因子結合タンパク質としてタンパク質を使用して宿主の補体制御因子、Ｈ因子を動員する。
【００１１】
健常人の場合、補体の活性化は、膜結合タンパク質とＨ因子（ｆＨ）などの可溶性の血漿制御タンパク質とにより正確に制御されている。Ｈ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）は、２０個のドメイン（リピートまたはＣＣＰ（：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ補体調節タンパク質）と呼ばれる）からなる１５５ｋＤａのタンパク質である。病原体の中にはＨ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）をその表面に隔離することにより補体による殺傷を逃れるように変化しているものもある。
【００１２】
上記で論じたようにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは細菌性髄膜炎および敗血症性ショックの主要な原因として世界的に重要なヒトに適応した病原体である（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｌａｎｃｅｔ  ３６９，２１９６−２１０）。ナイセリア株の多様性のため、髄膜炎菌性疾患に現在使用できるワクチンには広い予防効果がなく、したがって有用性は限定的である。１つのアプローチとして、ワクチン組成物中の抗原としてＨ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ、ＧＮＡ１８７０またはＲ２０８６と呼ばれる）を使用している。Ｈ因子結合タンパク質はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの表面に広く存在する２７ｋＤａの表面リポタンパク質で、保護作用を持つ殺菌抗体を惹起する（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２，２０８８−１００；  Ｍａｓｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７，７８９−９９）。Ｈ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）結合タンパク質は、補体、Ｈ因子の負の制御因子を細菌表面に動員し、ヒト血漿中の補体による溶解を阻害して髄膜炎菌が自然免疫応答から逃れる能力を促進する働きをする（Ｍａｄｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７，５０１−１０；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６，７５６６−７５）。
【００１３】
本発明では、少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質を抗原として使用する。このタンパク質は、このタンパク質へのＨ因子の結合を阻止または抑制するように改変されている。ワクチン製剤のＨ因子結合タンパク質を被検体に投与した後、Ｈ因子結合タンパク質へＨ因子が結合するとワクチンの効果が得られなくなると考えられる。第１に、Ｈ因子結合タンパク質にＨ因子が存在すると宿主免疫系によるＨ因子結合タンパク質の重要なエピトープの認識が損なわれる可能性がある。このエピトープに対して産生される抗体は殺菌抗体でも、細菌へのＨ因子の結合を阻害して補体による溶解に対する細菌の感受性を高める抗体でもよい。第２に、Ｈ因子結合タンパク質に対する免疫応答はハプテンと同様に、結合したＨ因子に対する応答をも惹起することがある。これは、望ましくない自己免疫応答を起こし得る恐れがある。最後に、補体タンパク質はアジュバント活性を有しているため、補体活性化は免疫応答に関与している。Ｈ因子の動員により免疫部位での補体の活性化が低下すればワクチン接種後に得られる免疫レベルを低下させる可能性がある。
【００１４】
好ましくは、本発明に使用される改変されたＨ因子結合タンパク質はタンパク質の１つまたは複数の位置で改変される。
【００１５】
好ましくは、改変されたＨ因子結合タンパク質は、野生型タンパク質のアミノ酸と比較して少なくとも１個のアミノ酸が変えられている。
【００１６】
好ましくは、変えられた（ｃｈａｎｇｅｄ）１個または複数個のアミノ酸は、Ｈ因子結合タンパク質がＨ因子と複合体を形成した場合、単離されたＨ因子結合タンパク質と比較して表面露出が減少するアミノ酸残基である、
Ｈ因子結合タンパク質の変えられる１個または複数個のアミノ酸は、図６（配列番号１）に示す位置番号１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、１４５、１４７、１４９、１５０、１５４、１５６、１５７、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２６２、２６４、２６６、２６７、２６８、２７２、２７４、２８３、２８５、２８６、２８８、２８９、３０２、３０４  ３０６、３１１および３１３のアミノ酸を含む群から選択すればよい。
【００１７】
Ｈ因子結合タンパク質の変えられる１個または複数個のアミノ酸は、野生型タンパク質においてＨ因子と水素結合を形成する１個または複数個のアミノ酸であってもよい。
【００１８】
Ｈ因子結合タンパク質の変えられる１個または複数個のアミノ酸は、図６（配列番号１）に示すアミノ酸番号１０３、１０６、１０７、１０８、１８０、１８１、１８３、１８４、１８５、１９１、１９３、１９５、２６２、２６４、２６６、２７２、２７４、２８３、２８６、３０４および３０６群から選択すればよい。
【００１９】
本発明に使用される改変されたＨ因子結合タンパク質は、前述のアミノ酸の２個以上、３個以上、４個以上または５個以上が変えられていてもよい。好ましくはＨ因子結合タンパク質の１個または複数個のアミノ酸を変えることにより、Ｈ因子との結合を阻止または著しく抑制することができる。
【００２０】
一実施形態では、グルタミン酸の代わりにアラニンになるようにアミノ酸番号２８３および２０４の少なくとも１個を変異する／変える。好ましくはこの変異の結果、Ｈ因子との結合がほぼ完全に消失する。
【００２１】
好ましくは、改変されたＨ因子結合タンパク質へのＨ因子の結合は、野生型Ｈ因子結合タンパク質へのＨ因子の結合よりも少なくとも５倍少なく、好ましくは少なくとも１０倍少なく、好ましくは少なくとも２桁少ない。好ましくは結合の減少は、約５０ｎＭの濃度のアナライトを用いて測定する。こうした水準の結合の減少は、著しい減少と考えられる。
【００２２】
Ｈ因子結合タンパク質は、Ｈ因子との結合を防止または阻害するための改変以外に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染症の免疫原として機能するタンパク質の能力に影響を与えない他の変異をさらに含んでいてもよい。たとえば、タンパク質の他の保存的アミノ酸を変えてもよい。同様にタンパク質には、タンパク質の免疫原性に影響を与えない挿入または欠失を施してもよい。
【００２３】
好ましくは、改変されたＨ因子結合タンパク質は、図６の配列との配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上であるが、Ｈ因子との結合が起こらないか、あるいは著しく減少する少なくとも１つの位置で改変されており、好ましくは別のアミノ酸を有する。
【００２４】
配列同一性の割合は、ある配列中のアミノ酸と、配列を整列させ必要に応じてギャップを入れ、パーセント配列同一性が最大になるようにした後に得られる配列のアミノ酸とが同一である割合と定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアライメントは、当業者によく知られた多くのやり方で行うことができ、たとえば、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）の使用が挙げられる。
【００２５】
パーセント同一性の変化は、たとえばアミノ酸の置換、挿入または欠失によるものでもよい。アミノ酸置換は置換されるアミノ酸の構造的および／または化学的性質が類似しているという点でその性質上保存的であってもよく、たとえばロイシンとイソロイシンとの置換は保存的置換である。
【００２６】
免疫原性組成物は、この組成物が被検体に投与されたとき、少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質に対して免疫応答を惹起することができる組成物である。好ましくは、この被検体はヒトまたは非ヒト動物、一層好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
【００２７】
好ましくは、本発明の組成物により惹起される免疫応答は、免疫したヒトに感染するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの能力に影響を与える。好ましくは、本発明の組成物で免疫したヒトに感染するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの能力は、妨害または防止される。これは、多くの方法で達成することができる。惹起される免疫応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを認識し破壊してもよい。あるいは、または加えて、惹起される免疫応答はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの複製を妨害または防止してもよい。あるいは、または加えて、惹起される免疫応答はヒトまたは非ヒト動物に疾患を引き起こすＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを妨害または防止しても構わない。
【００２８】
改変されたＨ因子結合タンパク質は組換え技術によって（たとえば遺伝子操作された発現系から）作製しても、あるいは、たとえばインビトロでのペプチド合成またはインビトロでの翻訳により作製される合成産物であってもよい。
【００２９】
本発明の組成物は、１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質だけでなく別の１種または複数種の抗原をさらに含んでいてもよい。また、別の抗原はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来であってもよく。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を惹起できてもよい。
【００３０】
本組成物は、被検体に投与されたときに防御免疫応答を惹起／誘発するために使用してもよい。防御免疫応答は、被検体への感染時にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを死滅させてもよいし、あるいはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが複製する、および／または疾患を引き起こすのを防止または阻害してもよい。
【００３１】
本組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する予防ワクチンとして使用しても、または治療ワクチンとして使用してもよい。
【００３２】
さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
好ましくは、医薬組成物は本発明の第１の態様による組成物を含む。
【００３４】
好ましくは、医薬組成物はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する防御免疫応答を誘発できる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「防御免疫応答を誘発する」という用語は、組成物を投与したヒトまたは非ヒト哺乳動物などの宿主生物において組成物が防御応答を引き起こすことができることをいう。好ましくは、防御免疫応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによるそれ以降の感染症を防止する。防御免疫応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの複製を抑制するか、あるいは疾患を軽減するようにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染機構に作用することにより感染を除去するか、あるいは感染の程度を軽減してもよい。
【００３６】
好適な許容可能な賦形剤およびキャリアは当業者によく知られている。これらは、固体キャリアを含んでも、または液体キャリアを含んでもよい。好適な液体キャリアとして、水および食塩水がある。組成物のタンパク質はエマルジョンとして製剤化してもよいし、あるいは生分解性ミクロスフェアまたはリポソームとして製剤化してもよい。
【００３７】
本組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。好適なアジュバントは当業者よく知られており、フロイント不完全アジュバン（動物に使用）およびアルミニウム塩またはカルシウム塩などの金属塩を挙げることができる。
【００３８】
本組成物は、組成物の稠度および／または組成物からの抗原／分泌タンパク質の放出を制御するポリマーまたは他の作用物質をさらに含んでもよい。
【００３９】
本組成物は、水、食塩水、グリセロールまたは他の好適なアルコールなど；湿潤剤または乳化剤；緩衝剤；たとえばセルロースまたはセルロース誘導体などの粘度付与剤；防腐剤；界面活性剤、抗菌剤；および同種のものを含み得る希釈液などの他の作用物質をさらに含んでもよい。
【００４０】
好ましくは、組成物中の活性成分の純度は５０％超、通常８０％超、多くの場合９０％超、一層好ましくは９５％超、９８％超または９９％超である。活性成分の純度は１００％に近く、ほとんどの場合、たとえば純度約９９．５％または純度約９９．９％で使用される。
【００４１】
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因の感染症に対するワクチンとして使用することができる。本組成物は、髄膜炎または敗血症または敗血症性ショックなど他の侵襲性髄膜炎菌性疾患に対するワクチンとして使用してもよい。ワクチンは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓへの曝露のリスクがある人に予防的に、および／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに既に曝露した人に治療的に投与してもよい。
【００４２】
好ましくは、本組成物をワクチンとして使用する場合、組成物は免疫学的に有効な量の抗原を含み、この場合、本組成物は少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む。抗原の「免疫学的に有効な量」は、単回投与あるいは複数回投与で個体に投与した場合にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染症の処置または予防に有効な量である。この量は、処置される個体の健康状態および抗原によって異なる。生体に投与する免疫原性組成物またはワクチン組成物の有効量は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【００４３】
本発明による組成物は、経口投与用でも、全身投与用でも、非経口投与用でも、局所投与用でも、粘膜投与用でも、筋肉内投与用でも、静脈内投与用でも、腹腔内投与用でも、皮内投与用でも、皮下投与用でも、鼻腔内投与用でも、膣内投与用でも、直腸内投与用でも、経皮投与用でも、舌下投与用でも、吸入投与用でも、あるいはエアロゾル投与用でもよい。
【００４４】
本組成物は、単回投与スケジュールで投与するように形成しても、または反復投与スケジュールとして投与するように形成してもよい。反復投与は初回免疫として投与し、その後１回または複数回の追加免疫として投与してもよい。初回免疫と追加免疫との好適なタイミングは常法により決定することができる。
【００４５】
本発明による組成物は、単独で投与しても、あるいは１種または複数種の他の免疫原性組成物またはワクチン組成物、および／または１つまたは複数の他の治療法と組み合わせて投与してもよい。
【００４６】
本発明の組成物は被検体への投与後に血清殺菌抗体応答を誘発し、オプソニン貪食作用（ｏｐｓｏｎｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）に関与する抗体を惹起することができてもよい。こうした応答はマウスを用いて測定すると都合がよく、その結果はワクチンの有効性の標準的な指標となる。
【００４７】
本発明の組成物はさらに、または、あるいは、細菌タンパク質または他の分子を中和することにより、通常の機能を持つことを防ぎ、必ずしも病原生物／細菌を破壊せずに疾患の進行を防止または抑制する、この場合にはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を惹起することができてもよい。
【００４８】
さらなる態様によれば、本発明は、免疫応答を惹起する薬物の調製における、１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質の使用を提供する。薬物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する被検体への予防のためのワクチン接種に使用しても、または治療のためのワクチン接種を使用してもよい。薬物は、予防ワクチンでも、または治療ワクチンでもよい。ワクチンは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因の髄膜炎ワクチン、敗血症ワクチンおよび／または敗血症性ショックワクチンでもよい。
【００４９】
なおさらなる態様によれば、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答を起こすのに使用される１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む組成物を提供する。免疫応答は予防的なものでも、または治療的なものでもよい。組成物は、ワクチンとして使用される組成物であってもよい。
【００５０】
なおさらなる態様によれば、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物をＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染の影響から保護する方法であって、本発明の任意の他の態様による組成物をヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む、方法を提供する。組成物は、ワクチンであってもよい。
【００５１】
別の態様によれば、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物に免疫応答を引き起こす方法であって、本発明による医薬組成物をヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む、方法を提供する。免疫応答は、好ましくは防御免疫応答である。この方法は、既に初回免疫した患者に追加免疫応答を引き起こしてもよい。免疫応答は、予防的なものでも、または治療的なものでもよい。
【００５２】
本発明による組成物の投与を含む治療処置の有効性を確認する１つの方法では、組成物の投与後にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染症のモニタリングを行う。本発明による組成物の投与を含む予防処置の有効性を確認する１つの方法では、組成物の投与後にＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫応答のモニタリングを行う。
【００５３】
別の態様によれば、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染症に対するヒトまたは非ヒト哺乳動物の免疫に使用する薬物の調製における、１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質の使用を提供する。
【００５４】
さらなる態様によれば、本発明は、生体に免疫応答を誘発するのに使用するキットであって、本発明による免疫原性組成物またはワクチン組成物、および投与に関する説明書を含むキットを提供する。
【００５５】
本発明による組成物は、ワクチンとして使用し得るだけでなく、ワクチン被接種者の診断試薬および免疫能の指標としても有用である場合がある。
【００５６】
上記で論じた発明および好ましい特徴の記載はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに関するものであるが、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにも等しく当てはまることを当業者であれば理解するであろう。
【００５７】
当業者であれば、上記で論じた任意の好ましい特徴が本発明の任意の態様に適用できることを理解するであろう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む免疫原性組成物であって、ヒトまたは非ヒト動物に投与された場合に免疫応答を惹起することができる、組成物。
（項目２）
前記Ｈ因子結合タンパク質はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのどちらか一方あるいは両方に対して免疫応答を惹起する、項目１または項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記免疫応答はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染を妨害または防止するのに十分である、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記Ｈ因子結合タンパク質は前記Ｈ因子結合タンパク質に対するＨ因子の結合を防止するかまたは低減するために改変される、項目１から４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記改変されたＨ因子結合タンパク質はその野生型タンパク質と比較して前記改変されたＨ因子結合タンパク質の１つまたは複数の位置で改変されている、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記改変されたＨ因子結合タンパク質はその野生型タンパク質のアミノ酸と比較して少なくとも１個のアミノ酸が変えられている、項目１から６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記変えられている１個または複数個のアミノ酸は、前記Ｈ因子結合タンパク質がＨ因子と複合体で存在する場合、前記単離された野生型Ｈ因子結合タンパク質と比較して表面露出が減少するアミノ酸残基である、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記Ｈ因子結合タンパク質において変えられている前記１個または複数個のアミノ酸は図６に定義される位置番号１０３、１０６、１０７、１０８、１０９、１４５、１４７、１４９、１５０、１５４、１５６、１５７、１８０、１８１、１８２、１８３，１８４、１８５、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９９、２６２、２６４、２６６、２６７、２６８、２７２、２７４、２８３、２８５、２８６、２８８、２８９、３０２、３０４  ３０６、３１１および３１３のアミノ酸残基を含む群から選択される、項目７または８に記載の組成物。
（項目１０）
前記改変されたＨ因子結合タンパク質は図６の配列との配列同一性が少なくとも６０％であり、かつ少なくとも１つの位置でアミノ酸が変えられているため、Ｈ因子との結合が起こらないかあるいは著しく減少する、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記組成物が惹起することができる／引き起こすことができる前記免疫応答は防御免疫応答である、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する予防または治療ワクチンとして使用するためのものである、項目１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
少なくとも１種の改変されたＨ因子結合タンパク質、および薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目１４）
項目１から１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、項目１３に記載の医薬組成物。
（項目１５）
免疫応答を惹起するための薬物の調製における、１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質の使用。
（項目１６）
前記薬物はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する予防のためのワクチン接種または治療のためのワクチン接種に使用される、項目１５に記載の使用。
（項目１７）
前記ワクチンはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが原因の髄膜炎、敗血症および／または敗血症性ショックを防止するかまたは妨げるためのものである、項目１６に記載の使用。
（項目１８）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する免疫応答を引き起こすことにおいて使用するための、１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質を含む組成物。
（項目１９）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染の影響からヒトまたは非ヒト動物を保護する方法であって、前記ヒトまたは非ヒト動物に項目１から１２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
（項目２０）
ヒトまたは非ヒト動物に免疫応答を引き起こす方法であって、項目１３または１４に記載の医薬組成物を前記ヒトまたは非ヒト動物に投与することを含む、方法。
（項目２１）
前記免疫応答は防御免疫応答である、項目１２に記載の方法。
（項目２２）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染に対するヒトまたは非ヒト哺乳動物の免疫に使用するための薬物の調製における、１種または複数種の改変されたＨ因子結合タンパク質の使用。
（項目２３）
生体における免疫応答の誘導に使用するためのキットであって、項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物および投与に関する説明書を含む、キット。
【００５８】
次に、あくまで例示に過ぎないが、以下の図および例を参照しながら本発明の好ましい実施形態について記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１−１】図１ａは、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位がＨ因子のＣＣＰ６に決定され、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位にはＨ因子結合タンパク質の細胞外部分全体が不可欠であることを示す。インタクトなＨ因子結合タンパク質およびその切断型（図示したとおり）に結合するＨ因子のファーウエスタン解析を示す。精製されたＨ因子と膜をインキュベートし、α−ｆＨ  ｐＡｂで検出した。結合が観察されたのは２７ｋＤａのインタクトなＨ因子結合タンパク質（矢印で示す）のみであった。図１ｂは、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位がＨ因子のＣＣＰ６に決定され、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位にはＨ因子結合タンパク質の細胞外部分全体が不可欠であることを示す。α−ｆＨ  ｐＡｂを用いてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓとＨ因子との結合を検出したＦＡＣＳ分析の結果を示す。図１ｃは、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位がＨ因子のＣＣＰ６に決定され、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位にはＨ因子結合タンパク質の細胞外部分全体が不可欠であることを示す。ＳＰＲの結果を用いてＨ因子結合タンパク質がＣＣＰ６を含むＨ因子コンストラクトにしか結合できないことを示す。挿入図は、速度論的パラメータを判定するため、Ｈ因子結合タンパク質表面上に注入した一連のｆＨ６７希釈液を１：１ラングミュアモデルにフッティングしたものを示す。
【図１−２】図１ｄは、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位がＨ因子のＣＣＰ６に決定され、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位にはＨ因子結合タンパク質の細胞外部分全体が不可欠であることを示す。ＦＡＣＳ競合試験の結果を示す（ＣＣＰ５に対するα−ｆＨ  ｍＡｂを使用したため、ｆＨ６７コンストラクトを認識できなかった）。短いｆＨ６７コンストラクト（約０．３〜３０μＭ）は全長Ｈ因子の結合を阻害することができ、このコンストラクトはＨ因子結合タンパク質結合部位全体を含むことが明らかにされる。示した値は、３回の実験平均の蛍光強度±標準偏差である。図１ｅは、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位がＨ因子のＣＣＰ６に決定され、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位にはＨ因子結合タンパク質の細胞外部分全体が不可欠であることを示す。ＳＰＲによる定量化から、Ｈ因子結合タンパク質への高親和結合にはＣＣＰ６が存在すれば必要にして十分であり、かつＣＣＰ７によく見られるＨ因子多型（４０２Ｈｉｓ／Ｔｙｒ）がｆＨｂｐ結合の親和性を著しく変化させないことが確認されたことを示す。
【図１−３】図１ｆは、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位がＨ因子のＣＣＰ６に決定され、Ｈ因子結合タンパク質の結合部位にはＨ因子結合タンパク質の細胞外部分全体が不可欠であることを示す。チップの表面にＨ因子結合タンパク質、流体相にＨ因子コンストラクトを用いた表面プラズモン共鳴により得られた結合定数を示す表である。フィッティングは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０ソフトウェアおよび１：１ラングミュアモデルを用いて行った。示した値は平均±標準偏差であり、Ｃｈｉ２はＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０に与えられるフィッティング指標の質である。
【図２−１】図２ａは、Ｈ因子結合タンパク質およびそれとｆＨ６７との複合体の構造を図示する。Ｈ因子結合タンパク質（残基８０〜３２０）の２枚のｃａｒｔｏｏｎを示す。Ａ、ＢおよびＣ領域を示してある。図２ｂは、Ｈ因子結合タンパク質およびそのｆＨ６７との複合体の構造を図示する。Ｈ因子結合タンパク質とＨ因子のＣＣＰ６および７とのｆＨｂｐ：ｆＨ６７複合体のｃａｒｔｏｏｎを示す。相互作用表面における塩橋の形成に関与する２つのタンパク質側鎖をボールアンドスティックモデルで示す（挿入図に拡大して配置し直してある）。
【図２−２】図２ｃは、Ｈ因子結合タンパク質およびそのｆＨ６７との複合体の構造を図示する。Ｈ因子結合タンパク質およびｆｈ６７のトポロジーを図示し、タンパク質間のＨ結合あるいは塩橋の相互作用のどちらかに関与する残基を示す。黒塗りの丸は、パートーナーと水素結合を形成する残基を示す。黒塗りの星は、パートーナーと塩橋を形成する残基を示す。アスタリスク（ａｓｔｅｒｉｘ）は、複合体構造の独立したコピーの一部のみに認められる相互作用を示す、
【図３】図３は、Ｈ因子結合タンパク質とＨ因子との界面に関し、Ｈ因子とＨ因子結合タンパク質との荷電した側鎖を共にアラニンで置換する部位特異的変異誘発を行うと、野生型ＫＤの濃度前後で各々その野生型パートーナーへの結合が消滅することが明らかにされる。黒いバーは、Ｈ因子結合タンパク質表面にＨ因子のアナライトを注入した時間（５０ｎＭ、４０μｌ．ｍｉｎ−１）を示す。
【図４】図４は、２つの結晶型から得られるｆＨ６７／ｆＨｂｐ複合体の結晶学的に独立した７つのコピーを重ねてｆＨ６７／ｆＨｂｐ複合体の柔軟性を検討する（Ｐ１型の複合体４コピーおよびＣ２型３コピー）。パッキング環境が多岐にわたるにもかかわらず、高度の類似性が認められることから、複合体は生物学的に意味があることが示される。複合体内のタンパク質の再構成はＣＣＰ６およびＨ因子結合タンパク質に比べて、ｆＨ６７のＣＣＰ７の位置のわずかな移動に限定される。より高温の温度因子で表示すると（ここでは「より厚い」ｐｕｔｔｙにして表示）、Ｈ因子結合タンパク質もループのＣＣＰ７の最も近くでパックするものは比較的移動可能である。
【図５】図５は、Ｈ因子結合タンパク質の表面にマップした抗体エピトープの位置を示す。１２、２０、２１でｄｅＣＣＰｉｂｅｄされた防御エピトープの残基を元素別に色づけして（Ｃ緑、Ｎ青、Ｏ赤）ＣＰＫ表示で示す（Ｇｌｕ２１１、Ａｒｇ２１４およびＡｒｇ２６９）。Ｈ因子との結合を阻止する抗体のエピトープを、Ｈ因子結合タンパク質の色に従って色づけしたＣＰＫで示す（領域「Ａ」黄色、「Ｂ」領域緑色、「Ｃ」領域シアン）。これらのエピトープでＨ因子認識部位に直接マップしたものはないが、十分に近くに位置しているため、大きな抗体が結合するとＨ因子の認識が妨害される可能性が高い。さらにＨ因子の多型残基４０２のヒスチジン側鎖をＣＰＫ表示で示す。この残基はＨ因子結合タンパク質（残基１０３〜１０８前後−図２を参照）との二次的接点に近接して位置するものの、２つの多型のＳＰＲの証拠からこれが重要な接点ではないことが示唆される。このことはさらに、複合体のこの領域（２つのＧＮＡループとＨ因子ドメイン）は最も可動性がある領域で著しい変化が認められ、結晶学的に独立した複合体のコピーの間でも２つのタンパク質が相互に接触するのがこの地点であるということによっても裏付けられる（図４）。
【図６】図６は、Ｈ因子結合タンパク質（配列番号６）のアミノ酸配列である。このタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＡＦ４２２０４である。
【図７】図７Ａは、ｆＨｂｐ：ｆＨ６７複合体の構造を示す。ｆＨｂｐをｃａｒｔｏｏｎで示し（緑色の残基はファミリーの中で保存された残基、赤色は保存されていない残基）、ｆＨ６７をサーフェスモデルで示す。図７Ｂは、ｆＨｂｐ：ｆＨ６７複合体の構造を示す。マウスｆＨとヒトｆＨとで異なる残基を赤色で示す。我々の研究は黄色の残基がｆＨ結合に作用することを示す。
【図８】図８は、ＳＰＲにより測定した変異体１、２および３のｆＨｂｐとｆＨ６７８との結合を示す。さらに淋菌性ホモログ、ＮＧＯ００３３との相互作用も調査した。
【図９】図９Ａは、等温滴定カロリメトリーによりｆＨｂｐ／ｆＨ相互作用が溶液におけるｎＭ  ＫＤを特徴とすることが明らかにされることを示す。図９Ｂでは、二重のＧｌｕ→ＡｌａミュータントｆＨｂｐの構造から構造的に変化したのは変異した側鎖内のみであることが確認される（ＦＯ−ＦＣ、αＣマップの赤色の電子密度差で表示。図９Ｃは、ＷＴおよびミュータントｆＨｂｐに流動させた５ｎＭのＨ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）ドメイン５、６および７からの応答を示す（上のデータライン＝ｆＨｂｐ変異体１、下のデータライン＝ｆＨｂｐ変異体１  ＤＭ）。図９Ｄは、ＷＴおよびミュータントｆＨｂｐに流動させた２０ｎＭのインタクトなＨ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）からの応答を示す（上のデータライン＝ｆＨｂｐ変異体１、下のデータライン＝ｆＨｂｐ変異体１  ＤＭ）。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
図１に配列を示したＨ因子結合タンパク質の機能については、このタンパク質を、細胞外ドメイン全体をカバーする「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と呼ばれる一連の領域に細分して以前研究されている（Ｇｉｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３，１１５１−６０）。ウエスタンブロット解析から、Ｈ因子とＨ因子結合タンパク質（図１ａ）との高親和性の相互作用には３つの領域がすべて必要であることが明らかになっており、Ｈ因子結合タンパク質のＨ因子認識部位がその表面全体に広がっていることが示唆される。
【００６１】
Ｈ因子の２０個のＣＣＰドメインのどれがＨ因子結合タンパク質との相互作用に関与しているかを特定するため、以下の技法を使用した：ファーウエスタン解析；ＦＡＣＳ分析（図１ｂ）；および表面プラズモン共鳴（図１ｃ）。得られた結果から、Ｈ因子結合タンパク質により認識されるＨ因子の重要領域は６番目のドメイン、ＣＣＰ６であり、ＣＣＰ６を含むコンストラクトがＨ因子とＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓとの間のＨ因子結合タンパク質依存性相互作用を阻害できたことが明らかになっている（図１ｄ）。相互作用を定量化したところ、ＣＣＰ６を含むいずれのコンストラクトも解離定数が約５ｎＭであることが示される（図１ｃ、１ｅおよび１ｆ）。この相互作用は高濃度塩（１ＭのＮａＣｌ、図示せず）または４〜８の範囲のｐＨ（図示せず）により解離されなかったため、結合イベントの高親和性がさらに裏付けられた。
【００６２】
図９Ａ〜Ｄを参照すると、表面プラズモン共鳴により、ｆＨｂｐの二重変異体がＨ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）ドメイン６および７に２桁大きいＫＤで結合することが示される。この変異体はさらに、より長いコンストラクト（ドメイン５、６および７からなる）および全長Ｈ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）（血清から精製）に対して野生型ｆＨｂｐよりも非常に弱く結合する。
【００６３】
Ｈ因子のＣＣＰ６７間の複合体（以下、ｆＨ６７という）および領域Ａ、ＢおよびＣを含むＨ因子結合タンパク質の細胞外部分の結晶構造を得て、Ｈ因子結合タンパク質およびｆＨ６７のモデルを構築し、２つの結晶型の分解能を２．３５Åまで上げて合計７つの独立した複合体のコピーを得た（図２ａ、ｂおよびｃ）。図２ａに見られるように、Ｈ因子結合タンパク質の細胞外部分は折りたたまれて２つのβバレルを形成しており、Ｎ末端バレルは「Ａ」領域および「Ｂ」領域の一部からなり、Ｃ末端バレルは「Ｂ」領域の残りおよび「Ｃ」領域からなる。Ｎ末端バレルについて構造データベースを検索したところ、構造が似たホモログは認められず、βバレルの特徴的なトポロジー（図２ｃ）は、遺伝子重複イベントにより生じたものでないことが示唆される。
【００６４】
ｆＨ６７：ｆＨＢＰ（Ｈ因子：Ｈ因子結合タンパク質）複合体は、Ｈ因子結合タンパク質のβバレルとＨ因子ＣＣＰ６のβバレルとの間の広範囲に及ぶ相互作用によって結合しており（図２ｂ）、これは、結合試験と整合している。特に、ＣＣＰ６の第２のβストランドへのヘリックスの挿入（このＣＣＰドメインの際だった特徴）は、複合体の中心に位置する。ＰＩＳＡサーバーによる解析によれば、独立した７つの複合体はすべて重要性スコアが１．０で（すなわち生物学的に重要である可能性が極めて高い）、複合体に埋もれたＨ因子結合タンパク質の平均表面積（２８６０±１７７Å２）は大部分の抗体：抗原複合体に埋もれた表面積よりも大きい。さらに、複合体を形成する構造に基づき予測されるΔＧ（−６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）も結合試験から得られた親和性（−１１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、図１ｅに示すＫＤから算出）とよく一致しており、結晶化複合体の生理的意義がさらに裏付けられる。相互作用面は、複数の水素結合および塩橋など多くの静電的相互作用を形状によりよく補完されている（図２ｃ）。これは、加齢黄斑変性症に関連するＨ因子４０２Ｈｉｓ／Ｔｙｒアイソフォーム間の結合に相違がまったく検出されなかったｆＨｂｐ：ｆＨ相互作用試験と整合する（図１ｅ、図４および図５）。Ｈｉｓ４０２は、Ｈ因子結合タンパク質との相互作用に補助的に関与しているに過ぎず、Ｈ因子結合タンパク質のＮ末端βバレルのストランド１と２との間のフレキシブルループに接触している（図４）。
【００６５】
相互作用面をさらに調査するため、荷電した側鎖を小さな疎水性残基アラニン（Ａ）で置換した二重変異／置換型を両方のタンパク質で作製した。ｆＨ６７で作製した変異はＲ３４１ＡおよびＨ３３７Ａであり、Ｈ因子結合タンパク質で作製した変異はＥ２８３ＡおよびＥ３０４Ａであった。この変異タンパク質とその野生型パートーナーとの相互作用をＳＰＲを用いて調査したところ、２つのミュータント型の親和性は２桁を超えて低下したため、野生型ＫＤの約１０倍のアナライト濃度（約５０ｎＭ）で相互作用がほとんど認められないことが明らかになった（図３ａ）。１０００倍高いアナライト濃度（μＭ範囲）であれば、ミュータント型のタンパク質はどちらも野生型パートーナーと相互作用し：ｆＨｂｐＥ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａは野生型に対して定性的に類似した結合速度を保持したものの、解離速度が上昇したのに対し、ｆＨ６７Ｒ３４１Ａ，Ｈ３３７Ａは解離速度が野生型の相互作用とより類似していたが、結合速度が大きく低下した（図１ｅ）。
【００６６】
異なるファミリーのｆＨｂｐは共通の結合特性を持っている
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は変異体１、変異体２および変異体３の３つの変異体ファミリーの１つに属する１種のｆＨｂｐを発現する。我々の研究は、変異体１のｆＨｂｐが疾患分離株に最も多く見られるファミリーであるためこれに着目した。図（Ｆｉｇ）７は、複合体の構造にマップした３つのファミリー間の配列の変化を示しており、配列保存のレベルは高いものの（＞６０％同一）、ｆＨ−結合部位付近に大きな変化がある。このため、異なるｆＨｂｐファミリー間でｆＨ認識モードが保存されているかどうか、さらに結合にとって同一のｆＨｂｐ残基およびｆＨ残基が重要であるかどうかを判定した。これは、ｆＨｂｐの結合を抑制した変異体を作製し、ワクチンとして評価するために必要不可欠な情報である。
【００６７】
そこで我々は、変異体２および変異体３のｆＨｂｐのクローニング、発現および精製を行い、ｆＨとの相互作用の特徴付けを開始した（図８）。我々のこれまでのＳＰＲ試験からは、認識モードが似ており、親和性が同程度であり、ｆＨの同一残基の変異が全ファミリーのｆＨｂｐの結合に著しい影響を与えることが示されている（図示せず）。特記される点として、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのｆＨｂｐホモログ（ＮＧＯ００３３）は変異体３に非常に近い（９１％アミノ酸同一性）にもかかわらず、その精製されたタンパク質はｆＨと強く相互作用できない（図８）。
【００６８】
ｆＨｂｐ  Ｅ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａミュータントはその原子構造を保持している
ｆＨｂｐ  Ｅ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａミュータント（二重変異体、ＤＭ）がナノモル（ｎＭ）範囲の解離定数（ＫＤ）でｆＨ６７と結合できない理由として、アミノ酸の変化によりタンパク質の全体構造が破壊されていることが考えられる。それを明らかにするため、ｆＨｂｐ  Ｅ２８３Ａ，Ｅ３０４ＡミュータントとｆＨ６７との複合体の結晶構造を決定した。
【００６９】
その結果からは、ｆＨｂｐの構造が変化したのは変異した側鎖のみであったことが確認される（図９Ｂ）。さらに我々はｆＨ５、６、７および全長ｆＨへの結合におけるこうした変異の意義を判定した（図９ＣおよびＤ）。ｆＨは１０ｎＭ範囲の濃度で野生型タンパク質と相互作用し得ることから、全長ｆＨに対する親和性はより小さいフラグメント（たとえばｆＨ５、６、７）に対する親和性と同じ範囲であることが示唆される。しかしながら、野生型タンパク質に比べてｆＨｂｐ  Ｅ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａタンパク質の結合親和性は劇的に低下する。
【００７０】
殺菌抗体を惹起するＨ因子結合タンパク質の公表されているエピトープ（Ｇｉｕｌｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３，１１５１−６０；  Ｃａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１，７２２０−７）を構造にマップしたところ、これまでに特徴付けを行ったエピトープ部位でＨ因子認識部位そのものに存在するものはないことが明らかにされている。しかしながら、因子の結合に影響を与え抗体により認識されるエピトープは認識部位の周辺にあるため、立体障害によりＨ因子との結合を阻害する可能性が高い（図５）。
【００７１】
ｆＨｂｐの一重および二重変異体はその免疫原性を保持している
Ｅ２８３ＡおよびＥ３０４Ａのアミノ酸変化の影響を調べるため、これらの置換を別々に含むｆＨｂｐ変異体１のタンパク質（すなわちｆＨｂｐＥ２８３ＡおよびｆＨｂｐＥ３０４Ａ）、あるいは組み合わせて含むｆＨｂｐ変異体１のタンパク質（ｆＨｂｐＥ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａ）を発現させ、精製した。野生型ｆＨｂｐおよびこれらのタンパク質を使用してマウス群（５／群）を免疫し、免疫血清中の殺菌抗体の存在を測定した。結果（表１）を、野生型の血清型Ｂ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（株Ｈ４４／７６）を５０％またはそれ以上殺傷する血清の最大希釈倍数の逆数で表す。免疫前血清に殺傷作用はなかった。
【００７２】
【表１】
2015063558.tif 000003
この結果から、ミュータントタンパク質は血清型Ｂ  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対するＳＢＡ価を惹起する能力が野生型タンパク質と少なくとも同等であることが示される。
【００７３】
方法
ウエスタンブロット解析：タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いで１５Ｖで６０分間ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。膜を、５％ミルクを加えたＰＢＳで４℃にて一晩ブロッキングし、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％スキムミルク）で１回リンスしてから、一次抗体またはｆＨの供給源と１〜２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳＴＭで３回洗浄後、ＰＢＳ中、膜をヤギα−ヒトｆＨ  ｐＡｂ（最終希釈倍率１：１０００）またはマウスのα−ｆＨｂｐ  ｐＡｂ（最終希釈倍率１：１０，０００）とインキュベートした。結合をα−ウサギペルオキシダーゼコンジュゲートＩｇＧ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で検出し、１：５００に希釈して使用した。
【００７４】
フローサイトメトリー解析：合計１０８のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを１０μｌの精製されたｆＨ（２μＭ）または各ＣＣＰ（最終濃度、３ｍＭ）と３０分間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄後、ＰＢＳ中、細菌をｍＡｂ  ＭＲＣ  ０Ｘ２４１またはα−ヒトＨ因子ｐＡｂと３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体と３０分間暗所にて４℃でインキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、髄膜炎菌に結合したＨ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）をフローサイトメトリーにより検出した。阻害アッセイでは、前述のＣＣＰ６７の濃度を上げながら全長Ｈ因子を細菌とインキュベートした。
【００７５】
各タンパク質の発現および複合体の精製：Ｈ因子結合タンパク質およびその切断型を、Ｃ末端にポリヒスチジンタグを付加した融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞に発現させた（Ｍａｓｉｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｖｏｌ  １９７，Ｎｏ  ６，７８９−９７）。菌株の培養液を対数増殖中期まで増殖させ、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ、１ｍＭの最終濃度）で発現を誘導した。製造者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の指示に従いＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりタンパク質を精製し、２５０ｍＭのイミダゾールでカラムから溶出した。Ｈ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）コンストラクトを以前に記載されている（２つのＣＣＰフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）内の４つのジスルフィド結合が正しく形成できるようにリフォールディングする）ようにＥ．ｃｏｌｉに発現させ、ヘパリンカラムを用いたアフィニティー精製あるいはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ｆＨｂｐとｆＨ６７（大過剰モル量）との混合後、複合体をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、緩衝液トリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）により精製したところ、複合体を形成していないｆＨ６７とカラムマトリックスとの間に見られる強い相互作用により、複合体を含むピークおよび過剰ｆＨ６７を含むピークが十分に分離されていることが確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法により推定複合体ピークに両方のタンパク質が存在することが確認された（データ示さず）。
【００７６】
部位特異的変異導入：ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて二重変異体を連続的に作製した。ｆＨ６７のＲ３４１Ａ，Ｈ３３７Ａ二重変異体型は以下のプライマーを用いて作製した：
【００７７】
【化１】
2015063558.tif 000004
突然変異の導入はシーケンシングにより確認した。以前に記載されているように組換えミュータントｆＨ６７フラグメントを封入体に発現させ、封入体からリフォールディングした（Ｐｒｏｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｓｅｃｔ  Ｆ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｊｕｎ  ｌ：６３（ＰＴ６）：４８０−３）。
【００７８】
Ｅ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａ  Ｈ因子結合タンパク質の作製には下記プライマーを使用し、そのタンパク質を発現させ、上記のように精製した：
【００７９】
【化２】
2015063558.tif 000005
表面プラズモン共鳴：標準的なアミンカップリングプロトコルを使用してＨ因子結合タンパク質あるいはＨ因子コンストラクトをセンサー表面（ＣＭ５チップ）に結合した。次いで適切なリガンドを流速４０μｌ／ｍｉｎで流体相中に流動させた。高／低濃度塩（０〜３ＭのＮａＣｌ）あるいは極端なｐＨ（４〜８の範囲を試験）を用いても強い相互作用が破壊されなかったため、各注入間に長い解離時間（６０分）を使用した。より大きいＨ因子結合タンパク質を含む流体相から得られたデータは単純な１：１モデルを用いてうまくフィッティングできなかった（チップマトリックス内／外へのより大きなタンパク質の移動、またはより小さなタンパク質のチップ表面へのカップリングにより起こるＨ因子との結合部位における立体障害の問題に起因すると考えられる）が、平衡近傍の値の粗分析によれば、ＫＤは数十から数百ｎＭの範囲（使用したＨ因子コンストラクトによる）であることが示唆された。（チップ上のｆＨとの）相互作用を除去すると、データはχ２が約３の１：１ラングミュアモデルを用いてうまくフィッティングできることから（図１ｆ）、ＣＣＰ６を含むコンストラクトの真のＫＤは５ｎＭ程度であることが明らかになった（図１ｆを参照）。さらにチップ表面に結合したｆＨｂｐパートーナー（チャネル１に結合したｆＨｂｐＷＴは約８００ＲＵ、チャネル２に結合したｆＨｂｐＥ２８３Ａ，Ｅ３０４Ａは約１５００ＲＵ）を用いて、ｆＨ６７およびＨ因子結合タンパク質二重変異体を解析した。そこでｆＨ６７（ＷＴおよびミュータント）を５０μＭの濃度（約１０×ネイティブＫＤ）で流動させた（ｆｌｏｗｎ）ところ、ＷＴの対合で見られる相互作用の大きさに比べてミュータントとそのＷＴパートーナーではほとんど相互作用がないか、まったく相互作用がないことが明らかになった。ｆＨｂｐＷＴに対するｆＨ６７Ｒ３４１Ａ，Ｈ３３７Ａの親和性の算出には、濃度範囲２５０ｎＭ〜２０μＭにわたる一連の注入（２回ずつ）を使用して、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてフィッティングさせて図１ｆに示す値を得た。
【００８０】
結晶化およびＸ線データの収集：結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して０．２μｌの複合体＋０．２μｌの母液のドロップ（吸光係数を２．２と想定して計算した４．５ｍｇ／ｍｌの複合体、ＪＣＳＧ−ｐｌｕｓの条件１５、２０％ポリエチレングリコール６０００ＭＷ、０．１Ｍのビシン  ｐＨ９．０前後で最適化した母液）から成長させた。結晶を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりｆＨ６７およびＨ因子結合タンパク質が共に存在することが確認された（データ示さず）。結晶（通常５０×１０×５μｍ）を１５％エチレングリコールで凍結保護してから液体窒素で急速凍結した。データは、ＥＳＲＦとＤｉａｍｏｎｄのどちらかを利用して回転法にてＥＳＲＦとＤｉａｍｏｎｄとで収集した。振動角は０．５または１°の範囲、結晶は１２０Ｋに保った。ネイティブＰ１データはビームラインＩＤ１４ｅｈ４（ＥＳＲＦ）、λ＝０．９５２３Åで収集、ネイティブＣ２およびＰｔセットはビームラインＩ０３（Ｄｉａｍｏｎｄ）、λ＝０．９８１４Åで収集、ＨｇセットはビームラインＢＭ１４（ＥＳＲＦ）、λ＝１．００３Åで、Ｓ−ＳＡＤはビームラインＩＤ２９（ＥＳＲＦ）λ＝１．８Åで収集した。データは、ｘｉａ２の−３ｄオプションを用い、統合にはプログラムＸＤＳ４、フレーム間のスケーリングにはプログラムＳｃａｌａ５を強制使用して統合およびスケーリングを行った。
【００８１】
構造決定および精密化：ｆｈ６７／ｆＨｂｐ複合体の構造は、ｆｈ６７の構造（ｆＨ６７８とスクロースオクタスルファート、ＳＯＳ（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｏｃｔａｓｕｌｐｈａｔｅ）との複合体の初期構造、ＰＤＢＩＤ：２ＵＷＮから取得）の分子置換と、Ｐｔ、Ｈｇ誘導体、およびＣ２非対称単位中に存在する３３個のイオウのうち３１個の異常散乱を用いたＭＩＲＡＳ法とを組み合わせてＣ２結晶型で決定した。ＭｏｌＲｅｐ７（ＣＣＰ４
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｕｉｔｅ）を用いてｆＨ６７の３つのコピーを確認し、この２つのＣＣＰドメインの剛体を、Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴを使用して位置を特定できない原子をモデルリングせずに精密化した。次いでこれらの位相をＳＨＡＲＰの位相計算ジョブに組み込み、これを用いて他の結晶の重原子位置（６個のＰｔ、１個のＨｇおよび３１個のＳ）を特定した。３．２Åまでのデータを用いてこの重原子モデルをＳＨＡＲＰ（結晶ごとにＷｉｌｓｏｎ値に固定されたＢ因子）で精密化し、得られた位相をＳＨＡＲＰ内で分子置換による位相と組み合わせてフィギャーオブメリットが０．５４（最も高い分解能のシェル３．３〜３．２Åでは０．３５）の位相を得た。各誘導体の位相決定能は、Ｐｔが（アノマラス（ａｎｏｍａｌｏｕｓ）／アイソモルファス（ｉｓｏｍｏｒｐｈｏｕｓ））０．７／２．４、Ｈｇが０．２／０．３、イオウの異常なシグナルが０．３／０．０であった。これらの位相を使用して得たマップをＳＨＡＲＰ内で溶媒平坦化し、Ｈ因子結合タンパク質、Ｈ因子（Ｆａｃｔｏｒ  Ｈ）ＣＣＰ６およびＨ因子ＣＣＰ７の領域の３種のオペレーターを用いてＤＭで平均化した。Ｈ因子結合タンパク質のＣ末端バレルのＮＭＲモデル（Ｃａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｍａｒ  １７：２８１（ｌｌ）：７２２０−７）がこの密度図に当てはめられなかった（ストランドが変形したと見られる）ため、プログラムＣｏｏｔを用いて手作業でモデルを構築した。４０〜２．３５Åの範囲のデータを使用して修正および精密化を進め、非結晶学的対称性（ｎｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を用いてＣｏｏｔおよびＢｕｓｔｅｒ−ＴＮＴで各ドメインのコアを制限する一方、ループ領域の間ではＲ／Ｒｆｒｅｅが２５．５／２７．１になるまで変化の増加を許容したが、ラマチャンドランプロットの非許容領域に残基は存在しなかった（最適領域をＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙで測定すると９４．６％）。このモデルはｆＨ６７の全残基、およびＨ因子結合タンパク質のＮ末端の５残基を除く全残基、および分子の全コピーにおいて無秩序状態にある親和性タグの６個のヒスチジンを含む。プログラムＭｏｌＲｅｐを用いて個々のドメイン（Ｈ因子ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ならびにＨ因子結合タンパク質）の分子置換を行い、Ｐ１結晶型を決定した（パッキング構造が異なる複合体の独立した４つのコピー）。Ｃｏｏｔ／Ｂｕｓｔｅｒ−ＴＮＴを用いてループ領域のわずかな修正および精密化（９０〜２．３５Å）を行ったところＲ／Ｒｆｒｅｅは２３．２／２６．３となり、やはりラマチャンドランプロットの非許容領域に残基は存在しなかった（最適領域で９５．３％）。構造図はプログラムＰｙＭｏｌを使用して描画する。
【００８２】
免疫化プロトコル
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに０日目および１０日目に、フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｓ’  ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に精製ｆＨｂｐを皮下経路により、あるいはミュータントｆＨｂｐを皮下に免疫した。各動物には、ＰＢＳに溶かした２５マイクログラムのタンパク質を等量のアジュバントと共に全量２００マイクロリットルとして投与した。１４日目に動物を屠殺し、マウスから血清を採取しプールしてから、小分けにして−８０℃で保存した。
【００８３】
血清殺菌活性（ＳＢＡ）
血清型Ｂ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｄｉｓ株Ｈ４４／７６を固体培地で一晩増殖させ、ＰＢＳに回収し、コロニー形成単位の数を定量した。血清の希釈系列を細菌（ＳＢＡ緩衝液中に１０４ＣＦＵ）および幼令ウサギ補体（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ、最終希釈率１：８）に１時間加え、固体培地に蒔いて生存細菌数を判定した。
【図４】
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【図６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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