(57)【要約】【課題】拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及び培地を提供する。【解決手段】Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のみを遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地で培養することによって上記課題を解決する。このとき、無血清培地はＩＷＰ４をさらに含むことが好ましい。また、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入してから２週間後に、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のみを遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地で２週間培養することが好ましい。【選択図】図２
2015213441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋様細胞を作製する方法であって、
Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のみを遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地で培養する工程を含む方法。
【請求項２】
前記無血清培地がＩＷＰ４をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入してから２週間後に前記線維芽細胞を前記無血清培地で２週間培養する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
心筋様細胞を作製する方法であって、
Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＧａｔａ４を遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦを含む無血清培地で培養する工程を含む方法。
【請求項５】
前記無血清培地がＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ１０を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記無血清培地がＩＷＰ４をさらに含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＧａｔａ４を遺伝子導入してから２週間後に前記線維芽細胞を前記無血清培地で２週間培養する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
心筋様細胞を作製するために使用する培地であって、
ＶＥＧＦを含み、無血清であることを特徴とする培地。
【請求項９】
ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含み、無血清であることを特徴とする培地。
【請求項１０】
心筋様細胞を作製するために使用する培地である、請求項９に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及び培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
少なくとも３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を線維芽細胞に遺伝子導入することにより、ｉＰＳ細胞を介することなく直接心筋様細胞へと分化誘導し、心筋様細胞を作製する方法が提案されている（特許文献１及び非特許文献１〜２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１３−５２４８３７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍ．Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｃｅｌｌ，１４２（３），３７５−３８６，２０１０．
【非特許文献２】Ｒ．Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ‐ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１１０（３１），１２６６７−１２６７２，２０１３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１及び非特許文献１〜２で提案された技術では、少なくとも３つの因子を遺伝子導入した線維芽細胞から拍動する心筋様細胞へと分化誘導する数が少なく効率が悪い。一方で、心筋様細胞のがん化のリスクを低減させるために、線維芽細胞に導入する因子の数を減らして、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる技術の開発が求められている。
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及び培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが鋭意検討を行った結果、ＶＥＧＦを含む無血清培地を用いて、３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を遺伝子導入した線維芽細胞を培養したものは、従来のＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地を用いて培養したものに比べて、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることを見出した。また、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地を用いることにより、線維芽細胞に遺伝子導入する因子を３つから２つに減らしても、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることを見出した。このようにして本発明者らは本発明を完成させた。
【０００８】
（１）上記課題を解決するための本発明に係る方法は、心筋様細胞を作製する方法であって、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のみを遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地で培養する工程を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る方法において、前記無血清培地がＩＷＰ４をさらに含むように構成できる。
【００１０】
本発明に係る方法において、前記Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入してから２週間後に前記線維芽細胞を前記無血清培地で２週間培養するように構成できる。
【００１１】
（２）上記課題を解決するための本発明に係る方法は、心筋様細胞を作製する方法であって、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＧａｔａ４を遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦを含む無血清培地で培養する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る方法において、前記無血清培地がＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ１０を含むように構成できる。
【００１３】
本発明に係る方法において、前記無血清培地がＩＷＰ４をさらに含むように構成できる。
【００１４】
本発明に係る方法において、前記Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＧａｔａ４を遺伝子導入してから２週間後に前記線維芽細胞を前記無血清培地で２週間培養するように構成できる。
【００１５】
（３）上記課題を解決するための本発明に係る培地は、心筋様細胞を作製するために使用する培地であって、ＶＥＧＦを含み、無血清であることを特徴とする。
【００１６】
（４）上記課題を解決するための本発明に係る培地は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含み、無血清であることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る培地において、心筋様細胞を作製するために使用する培地であるように構成できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる方法及び培地を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施例において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地、あるいは、ＪＡＫ阻害剤、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、又はＶＥＧＦを含む無血清培地で４週間培養し、分化誘導した拍動心筋様細胞の数を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地、あるいは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦ、ＦＧＦ１０及びＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０、又は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０及びＶＥＧＦ（ＦＦＶ）を含む無血清培地で４週間培養し、分化誘導した拍動心筋様細胞の数を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地及び／又はＦＦＶを含む無血清培地を用いて、所定期間の間、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞を培養した後、分化誘導した拍動心筋様細胞の数を調べ、同様の実験を３回行って数を合計した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞、あるいは、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＨａｎｄ２を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地又はＦＦＶを含む無血清培地を用いて４週間培養した後、分化誘導した拍動心筋様細胞の数を調べ、同様の実験を３回行って数を合計した結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス新生仔尾端部由来線維芽細胞、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＨａｎｄ２を遺伝子導入したマウス新生仔尾端部由来線維芽細胞、あるいは、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１及びＭｙｏｃｄを遺伝子導入したマウス新生仔尾端部由来線維芽細胞を、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地又はＦＦＶを含む無血清培地を用いて８週間培養した後、分化誘導した拍動心筋様細胞の数を調べ、同様の実験を２回行って数を合計した結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、マウス胎児線維芽細胞、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞、あるいは、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したマウス胎児線維芽細胞を、ＦＦＶを含む無血清培地を用いて４週間培養した後、分化誘導した拍動心筋様細胞の数を調べ、同様の実験を２回行って数を合計した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明に係る心筋様細胞の作製方法、及び培地について、図面を参照しつつ説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実験例に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００２１】
［心筋様細胞の作製方法］
本発明の心筋様細胞の作製方法は、少なくとも２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦを含む無血清培地で培養する工程を含んでいる。
【００２２】
このような心筋様細胞の作製方法によれば、遺伝子導入した線維芽細胞から拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる。より具体的には、３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を遺伝子導入した線維芽細胞を、ＶＥＧＦを含む無血清培地で培養したものは、従来のＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地で培養したものに比べ、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる。また、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地を用いて培養することにより、線維芽細胞に導入する３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）に減らしても、拍動する心筋様細胞へと分化誘導することができるので、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる。
【００２３】
以下、心筋様細胞の作製方法について詳細に説明する。
【００２４】
（線維芽細胞）
線維芽細胞は、少なくとも２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）が遺伝子導入されていれば特に制限されるものではないが、さらにＧａｔａ４が遺伝子導入されていてもよい。その他、Ｈａｎｄ２、又は、Ｍｅｓｐ１及びＭｙｏｃｄ等が遺伝子導入されていてもよい。これらの因子の遺伝子導入、すなわち、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの導入は、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクター等のウイルスベクターを用いた方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法により行うことができる。なお、遺伝子導入する因子の数としては、心筋様細胞のがん化のリスクを低減させるために少ないことが好ましい。また、遺伝子導入した線維芽細胞は、導入した遺伝子を一過性に発現するものであっても、安定に発現するものであってもよい。
【００２５】
なお、線維芽細胞は、一部又は全ての因子のポリペプチドが該線維芽細胞内に導入されたものであってもよい。ポリペプチドの導入は、例えば、上記ポリペプチドに細胞膜透過性ペプチドを融合した融合ペプチドを用いた方法等の公知の方法により行うことができる。細胞膜透過性ペプチドとしては、例えば、ＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチド、そのＴＡＴペプチドのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、そのＰＴＤを全てアルギニンに置換したペプチド等を用いることができる。
【００２６】
各因子の遺伝子及び／又はポリペプチドが導入される線維芽細胞は、ヒト、又はマウス、ラット、ブタ等のヒト以外の脊椎動物から単離されたものであっても、その継代培養細胞であってもよい。線維芽細胞としては、例えば、胎児線維芽細胞、尾先端部由来線維芽細胞、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等を用いることができる。
【００２７】
（培地）
培地は、血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。無血清培地としては、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ３４無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いることができるが、これらに制限されるものではない。
【００２８】
無血清培地は、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）を含むものであれば特に制限されるものではないが、ＶＥＧＦ以外に、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子−１０）、ＪＡＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＪＡＫ阻害剤）、及びＩＷＰ４（Ｗｎｔ阻害剤）から選択される１又は２種の物質をさらに含むものが好ましい。なお、線維芽細胞が、２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）のみが遺伝子導入された線維芽細胞である場合には、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０を含む無血清培地を用いることが好ましく、さらにＩＷＰ４を含むものがより好ましい。また、線維芽細胞が、少なくとも３つの因子（Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＧａｔａ４）が遺伝子導入された線維芽細胞である場合には、ＶＥＧＦを含む無血清培地であればよく、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ１０をさらに含むものが好ましく、加えてＩＷＰ４をさらに含むものがより好ましい。
【００２９】
（線維芽細胞の培養）
少なくとも２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）の遺伝子及び／又はポリペプチドを導入した線維芽細胞の培養は、該線維芽細胞から直接心筋様細胞に分化誘導する工程である。すなわち、２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）のみの遺伝子及び／又はポリペプチドを導入した線維芽細胞、あるは、少なくとも３つの因子（Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＧａｔａ４）の遺伝子及び／又はポリペプチドを導入した線維芽細胞を培養して心筋様細胞を作製する工程である。
【００３０】
少なくとも２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）の遺伝子及び／又はポリペプチドを導入した線維芽細胞の培養は、適した条件であれば特に制限されるものではなく、通常、２５℃〜３７℃の範囲内の温度で、かつ、５％ＣＯ２条件下で行われる。
【００３１】
ＶＥＧＦを含む無血清培地を用いた、少なくとも２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）の遺伝子及び／又はポリペプチドを導入した線維芽細胞の培養は、遺伝子及び／又はポリペプチドを導入してから２週間後に行うことが好ましい。なお、このＶＥＧＦを含む無血清培地を用いた培養は、遺伝子及び／又はポリペプチドを導入してから２週間後から４週間後にかけて（２週間の間）行うことが好ましい。この期間、ＶＥＧＦを含む無血清培地で培養することにより、心筋様細胞への分化誘導が効率よく行われ、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができる。なお、遺伝子導入してから２週間の間は、血清を含む培地で培養することが好ましい。血清としては、特に制限されるものではないが、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、仔牛血清（ＮＣＳ）、ウマ血清等を用いることができる。また、血清を添加する培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地、ＤＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等を用いることができるが、これらに制限されるものではない。
【００３２】
（心筋様細胞の確認方法）
心筋様細胞の確認は、例えば、顕微鏡により拍動するか否かを確認したり、ＦＡＣＳ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、免疫染色法、マイクロアレイアッセイ法等の公知の方法により心筋特異的マーカー遺伝子が発現しているか否かを確認したりすることにより行うことができるが、これらの方法に制限されるものではない。
【００３３】
心筋特異的マーカー遺伝子としては、例えば、Ｍｙｈ６、ｃＴｎＴ、ＲｙＲ２、ＨＣＮ４、Ａｃｔｃ１、Ｇｊａ１、Ｃｏｌ１ａ２等を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。
【００３４】
［培地］
本発明の培地は、心筋様細胞を作製するのに有用である。特に、少なくとも２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を遺伝子導入した線維芽細胞、より具体的には、２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）のみを遺伝子導入した線維芽細胞、あるいは、少なくとも３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を遺伝子導入した線維芽細胞から、心筋様細胞へと分化誘導し、心筋様細胞を作製するのに有用である。その他、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から心筋様細胞へと分化誘導し、心筋様細胞を作製するのにも有用である。なお、本発明の培地の各構成要素は、既述した「心筋様細胞の作製方法」の説明欄で詳しく説明したとおりであるので、ここではその説明を省略する。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例等によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３６】
［実験１］
（マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の単離）
生後７週齢〜１０週齢のメスＩＣＲマウス（日本クレア社）とα−ミオシン重鎖−緑色蛍光蛋白（αＭＨＣ−ＧＦＰ）トランスジェニックマウス（オス）を交配させた。受精を確認した日を妊娠０日として、妊娠確認後１２日目に妊娠したＩＣＲマウスから胎児を摘出した。
【００３７】
胎児から心臓を摘出し、倒立顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７１）にて心臓を蛍光にて投影し、ＧＦＰ蛍光を発する胎児を選択した。選択した胎児から、四肢および、頭部１／２〜２／３、肺、肝臓、腎臓、腸管等の実質臓器を摘出した。残った体幹部の組織をＰＢＳ（−）（ＷＡＫＯ社製、０４５−２９７９５）にて洗浄し、血球成分を十分に取り除いた。その後、滅菌した手術用ハサミにて組織をできるだけ細かく剪断した。剪断した組織片に０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製、２５２００−０７２）とＰＢＳ（−）を１：１に混合した溶液を加えた（１５ｍＬ／６〜７匹胎児）。そして、３７℃で１５分間、ウォーターバスで震盪しながらインキュベートした。
【００３８】
インキュベート後、ＦＢＳ原液（ＨｉＣｌｏｎｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＳＶ３００１４．０３）を１５ｍＬ添加して十分縣濁させ、懸濁液を４℃で遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分間）を行い、上清を除去した。細胞沈殿物を、表１に示すＭＥＦ用培地３０ｍＬに再懸濁し、１０ｃｍ組織培養用ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１７２９５８）に注入した（胎児２〜３匹分で１０ｃｍディッシュ１枚分）。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。翌日、新しいＭＥＦ用培地に交換し、以後、３〜４日ごとに培地交換を行った。
【００３９】
【表１】
2015213441.tif 000003
【００４０】
遊走した細胞を０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製、２５２００−０７２）にて採取し、４０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ社製、ＲＥＦ３５２３４０）を用いて濾過することによりマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離した。
【００４１】
［実験２］
（マウス新生仔尾端部由来線維芽細胞（ＴＴＦ）の単離）
生後７週齢〜１０週齢のメスＩＣＲマウスとαＭＨＣ−ＧＦＰトランスジェニックマウス（オス）を交配させた。受精を確認した日を妊娠０日として、妊娠確認から約２０日目後に妊娠したＩＣＲマウスから新生仔を得た。
【００４２】
新生仔から心臓を摘出し、倒立顕微鏡にて心臓を蛍光にて投影し、ＧＦＰ蛍光を発する新生仔を選択した。選択した新生仔から、尾部の先端より１／２〜２／３の範囲の尾端部を、滅菌済みの手術用ハサミにて切断した。その後、切り出した尾端部を集めて２〜３ｍｍ３の断片に剪断した。剪断した尾端部組織をゼラチンコーティングした１０ｃｍ組織培養用ディッシュに一定間隔に置き、１５分間室温で自然乾燥させた（新生仔尾先端部５〜７匹分で１０ｃｍディッシュ１枚分）。そして表２に示すＴＴＦ用培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。以後、５日〜７日ごとに新しいＴＴＦ用培地に交換し、７日〜１４日間培養した。
【００４３】
【表２】
2015213441.tif 000004
【００４４】
遊走した細胞を０．２５％  トリプシン−ＥＤＴＡにて採取し、４０μｍ細胞ストレーナーを用いて濾過することによりマウス新生仔尾端部由来線維芽細胞（ＴＴＦ）を単離した。
【００４５】
［実験３］
（遺伝子導入細胞の作製）
ゼラチンでコーティングした１０ｃｍ組織培養用ディッシュに、Ｐｌａｔ−Ｅパッケージング細胞（３．６×１０６細胞）をまき、表３に示すＰｌａｔ−Ｅ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩静置培養した。
【００４６】
【表３】
2015213441.tif 000005
【００４７】
一方、３００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製、３１９８５−０７０）に、２７μＬ  ＦｕＧＥＮＥＴＭ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｅ２６９１）を混合して５分間静置し、ｐＭｘ−Ｇａｔａ４、ｐＭｘ−Ｍｅｆ２ｃ、ｐＭｘ−Ｔｂｘ５、ｐＭｘ−Ｈａｎｄ２、ｐＭｘ−Ｍｅｓｐ１、又はｐＭｘ−Ｍｙｏｃｄのレトロウイルスプラスミドを９０００ｎｇ分混合し、強くタッピングし、１５分間室温で静置した。その後、上記一晩培養したＰｌａｔ−Ｅパッケージング細胞に各種レトロウイルスプラスミドを混合し、各遺伝子を形質移入（トランスフェクション）させた。
【００４８】
トランスフェクションしてから２４時間後に、表３に示すＰｌａｔ−Ｅ培地に置換し、更に３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間静置した。その後、上清を回収し、０．４５μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、１７５９８）で濾過し、５０ｍＬチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、４３０８２９）に回収した。回収した上清１０ｍＬに対し、１０ｍｇ／ｍＬのＰｏｌｙｂｒｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、＃ＴＲ−１００３−Ｇ）を４μＬ注入し、各遺伝子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｈａｎｄ２、Ｍｅｓｐ１、Ｍｙｏｃｄ等）のレトロウイルス溶液を調製した。
【００４９】
Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のレトロウイルス溶液、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＨａｎｄ２のレトロウイルス溶液、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１及びＭｙｏｃｄのレトロウイルス溶液、あるいは、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５のレトロウイルス溶液を、同量ずつ混ぜ合わせて各種混合ウイルス溶液を調製した。
【００５０】
実験１で単離したＭＥＦ、又は実験２で単離したＴＴＦを、１２ウェル細胞培養用マルチウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５３０４３）に撒き（０．５×１０５個／ウェル）、一晩静置した。その後、ウェル中の培地を吸引除去して各種混合ウイルス溶液１ｍＬを注入し（感染させた日を０日とした。）、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩静置培養して、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したＭＥＦ又はＴＴＦ（それぞれを「ＧＭＴ−ＭＥＦ」及び「ＧＭＴ−ＴＴＦ」という。）、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５及びＨａｎｄ２を遺伝子導入したＭＥＦ又はＴＴＦ（それぞれを「ＧＨＭＴ−ＭＥＦ」及び「ＧＨＭＴ−ＴＴＦ」という。）、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｍｅｓｐ１及びＭｙｏｃｄを遺伝子導入したＴＴＦ（以下、「ＧＭＴＭＭ−ＴＴＦ」という。）、あるいは、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５を遺伝子導入したＭＥＦ（以下、「ＭＴ−ＭＥＦ」という。）を作製した。
【００５１】
［評価１］
（各種物質を添加した無血清培地による心筋様細胞への分化誘導）
実験３により作製したＧＭＴ−ＭＥＦを、表４又は表５に示す各培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。なお、培養は、３〜４日ごとに培地を交換して行った。また、無血清培地による培養は、最終濃度で、０．５μＭのＪＡＫ阻害剤（ＣＡＬＢＯＣＨＥＭ社製、＃４２００９９）、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（リコンビナントヒトＦＧＦ  ｂａｓｉｃ１４６ａａ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２３３−ＦＢ−０２５）、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０（リコンビナントヒトＦＧＦ１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、３４５−ＦＧ−０２５）、又は５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（リコンビナントヒトＶＥＧＦ１６５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２９３−ＶＥ−０５０）を無血清培地に添加したものを用いて行った。
【００５２】
【表４】
2015213441.tif 000006
【００５３】
【表５】
2015213441.tif 000007
【００５４】
感染させてから２８日後に、ＨＳオールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ９０００）を用いて明視野４倍で各ウェルの全体を撮影した。また、同顕微鏡を用いて位相差２０倍で拍動する心筋様細胞の数を計測し、１２ウェルの合計を算出した。その結果を図１に示す。
【００５５】
図１に示すように、ＪＡＫ阻害剤、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０又はＶＥＧＦを添加した無血清培地を用いてＧＭＴ−ＭＥＦを培養したものは、従来のＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地を用いて培養したものに比べて、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることが確認できた。
【００５６】
［評価２］
（各種物質を組み合わせて添加した無血清培地による心筋様細胞への分化誘導）
次に、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０及びＶＥＧＦをそれぞれ組み合わせて無血清培地に添加することにより、拍動する心筋様細胞を効率よく作製することができるかを調べるため、無血清培地に、ＦＧＦ２及びＶＥＧＦ、ＦＧＦ１０及びＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びＦＧＦ１０、又は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０及びＶＥＧＦ（ＦＦＶ）を添加する以外は、評価１と同様の方法により４週間培養して拍動する心筋様細胞の数を算出した。その結果を図２に示す。
【００５７】
図２に示すように、無血清培地にＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を添加してＧＭＴ−ＭＥＦを培養することにより、拍動する心筋様細胞をより効率よく作製できることが確認できた。また、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２を含む無血清培地にＦＧＦ１０をさらに添加することにより、相乗効果が認められた。
【００５８】
［評価３］
（ＦＦＶを含む無血清培地の培養条件による心筋様細胞への分化誘導）
次に、ＦＦＶを含む無血清培地によるＧＭＴ−ＭＥＦの培養が、どの期間で有効なのかどうかを調べるため、図３に示すように、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地及び／又はＦＦＶを含む無血清培地を用いて、所定期間の間、ＧＭＴ−ＭＥＦを培養する以外は、評価１と同様の方法により培養を行って拍動する心筋様細胞の数を算出した。同様の実験を３回行い、それらの合計を図３に示した。
【００５９】
図３に示すように、感染（遺伝子導入）から２週間後に、ＦＦＶを含む無血清培地でＧＭＴ−ＭＥＦを２週間培養することにより、心筋様細胞への分化誘導が効率よく行われ、心筋様細胞を効率よく作製できることが確認できた。また、ＦＦＶを含む無血清培地でＧＭＴ−ＭＥＦを４週間培養することにより得られた拍動心筋様細胞から総ＲＮＡを単離し、ＡＢＩ７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）とＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地で培養することにより得られた拍動心筋様細胞から単離した総ＲＮＡと同様に、心筋特異的マーカー遺伝子（例えば、Ｍｙｈ６、ｃＴｎＴ、ＲｙＲ２、ＨＣＮ４等）の発現が認められた（図は示さない。）。
【００６０】
［評価４］
（ＦＦＶを含む無血清培地によるＧＨＭＴ−ＭＥＦから心筋様細胞への分化誘導）
次に、ＧＨＭＴ−ＭＥＦにおいてもＦＦＶを含む無血清培地で培養することにより、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できるかを調べるため、ＧＨＭＴ−ＭＥＦ又はＧＭＴ−ＭＥＦをＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地又はＦＦＶを含む無血清培地を用いて培養する以外は、評価１と同様の方法により培養を行って拍動する心筋様細胞の数を算出した。同様の実験を３回行い、それらの合計を図４に示した。
【００６１】
図４に示すように、ＦＦＶを含む無血清培地を用いてＧＨＭＴ−ＭＥＦを培養したものは、従来のＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地を用いて培養したものに比べて、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることが確認できた。また、ＧＨＭＴ−ＭＥＦは、ＧＭＴ−ＭＥＦに比べて、ＦＦＶを含む無血清培地による心筋様細胞への分化誘導が効率よく行われ、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることが確認できた。
【００６２】
［評価５］
（ＦＦＶを含む無血清培地による各種遺伝子導入細胞から心筋様細胞への分化誘導）
次に、ＧＭＴ−ＴＴＦ、ＧＨＭＴ−ＴＴＦ、及びＧＭＴＭＭ−ＴＴＦにおいても、ＦＦＶを含む無血清培地で培養することにより、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できるかを調べるため、これらの細胞をＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地又はＦＦＶを含む無血清培地を用いて８週間培養する以外は、評価１と同様の方法により培養を行って拍動する心筋様細胞の数を算出した。同様の実験を２回行い、それらの合計を図５に示した。
【００６３】
図５に示すように、ＦＦＶを含む無血清培地を用いてＧＨＭＴ−ＴＴＦを培養したものは、従来のＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地を用いて培養したものに比べて、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることが確認できた。また、ＦＦＶを含む無血清培地を用いてＧＭＴＭＭ−ＴＴＦを培養したものは、ＦＦＶを含む無血清培地を用いてＧＨＭＴ−ＴＴＦを培養したものに比べて、拍動する心筋様細胞をより効率よく作製できることが確認できた。
【００６４】
［評価６］
（ＩＷＰ４による効果）
次に、ＧＭＴ−ＭＥＦをＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地で培養し、感染（遺伝子導入）から２週間後に、ＩＷＰ４、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０及びＶＥＧＦ（ＩＦＦＶ）を含む無血清培地に置換して２週間培養する以外は、評価１と同様の方法により４週間培養して拍動する心筋様細胞の数を算出した。なお、ＩＦＦＶを含む無血清培地は、ＦＦＶを含む無血清培地に最終濃度で４．８μＭのＩＷＰ４（ＳＴＥＭＧＥＮＴ社製、０４−００３６）を添加することにより調製した。また、ＧＭＴ−ＭＥＦをＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地又はＦＦＶを含む無血清培地で培養する以外は、評価１と同様の方法により４週間培養して拍動する心筋様細胞の数を算出した。これらの実験を２回行い、それらの結果を表６に示した。
【００６５】
【表６】
2015213441.tif 000008
【００６６】
表６に示すように、ＤＭＥＭ／Ｍ１９９とＩＦＦＶを含む無血清培地を用いてＧＭＴ−ＭＥＦを培養したもの、すなわち、遺伝子導入してから２週間の間は血清を含む培地で培養し、その後２週間の間はＩＦＦＶを含む無血清培地で培養したものは、従来のＤＭＥＭ／Ｍ１９９培地を用いて培養したものに比べて、拍動する心筋様細胞が１００〜２００倍に増加することが確認できた。
【００６７】
［評価７］
（ＭＴから心筋様細胞への誘導）
次に、ＭＥＦ単独、ＧＭＴ−ＭＥＦ、及びＭＴ−ＭＥＦを、ＦＦＶを含む無血清培地で培養する以外は、評価１と同様の方法により４週間培養して拍動する心筋様細胞の数を算出した。同様の実験を２回行い、それらの合計を図６に示した。
【００６８】
図６に示すように、ＦＦＶを含む無血清培地を用いることにより、線維芽細胞に導入する３つの因子（Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）を２つの因子（Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５）に減らしても、拍動する心筋様細胞へと分化誘導することができ、拍動する心筋様細胞を効率よく作製できることが確認できた。
【図１】
2015213441.tif 000009
【図２】
2015213441.tif 000010
【図３】
2015213441.tif 000011
【図４】
2015213441.tif 000012
【図５】
2015213441.tif 000013
【図６】
2015213441.tif 000014