(57)【要約】【課題】多発性骨髄腫の治療のための新規な薬剤の提供。【解決手段】パルミチン酸を含有する骨髄腫細胞死誘導剤と、これを有効成分として含有する骨髄腫治療用医薬組成物と、を提供する。本発明に係る医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤、ＳＣＤ−１阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、免疫調節薬、抗体医薬、ステロイド剤及び抗癌剤からなる群から選択される一以上を有効成分として含有していてもよい。本発明に係る骨髄腫細胞死誘導剤及び骨髄腫治療用医薬組成物は、多発性骨髄腫の治療の選択肢を広げ、多剤併用による治療効果の向上をもたらす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パルミチン酸を含有する骨髄腫細胞死誘導剤。
【請求項２】
請求項１記載の骨髄腫細胞死誘導剤を有効成分として含有する骨髄腫治療用医薬組成物。
【請求項３】
さらに、プロテアソーム阻害剤、ＳＣＤ−１阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、免疫調節薬、抗体医薬、ステロイド剤及び抗癌剤からなる群から選択される一以上を有効成分として含有する請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブ、カーフィルゾミブ及びマリゾミブからなる群より選択される一以上である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
プロテアソーム阻害剤を含有する医薬、ＳＣＤ−１阻害剤を含有する医薬、ＨＤＡＣ阻害剤を含有する医薬、免疫調節薬を含有する医薬、抗体を含有する医薬、ステロイド剤を含有する医薬及び抗癌剤を含有する医薬からなる群から選択される一以上の医薬と、請求項１記載の骨髄腫細胞死誘導剤を含有する医薬と、を組み合わせてなる髄腫治療用医薬。
【請求項６】
分離された細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率に基づいて骨髄腫細胞を検出する方法。
【請求項７】
前記比率が、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）とパルミチン酸（Ｃ１６：０）との比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）である請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）が所定値よりも高い場合に、前記細胞を骨髄腫細胞として検出する請求項７記載の方法。
【請求項９】
骨髄腫患者から分離された骨髄腫細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率に基づいて、前記骨髄腫患者に対するパルミチン酸の治療効果の有無を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄腫細胞に対する細胞死誘導剤及びこれを含有する骨髄腫治療用の医薬組成物に関する。より詳しくは、パルミチン酸を含有する骨髄腫細胞死誘導剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）は血液がんの一種であり、骨髄で腫瘍性形質細胞が増殖し、骨融解や腎障害などの多様な症状が引き起こされる疾患である。多発性骨髄腫の全生存率は、プロテアソーム阻害剤や免疫調節薬などの新規薬剤の登場により改善しつつある。しかし、再発症例も多く、高齢者では合併症や副作用のため治療が継続できない症例もみられる。
【０００３】
腫瘍性形質細胞では、異常免疫グロブリンであるＭ蛋白が産生され、産生された変性蛋白が小胞体に蓄積することによる小胞体ストレスが存在している。この恒常的に存在する小胞体ストレスに加えてさらに小胞体ストレスが加わると、腫瘍性形質細胞は細胞死すると考えられている。上述のプロテアソーム阻害剤は、プロテアソームの機能を阻害し、過剰な蛋白の蓄積による小胞体ストレスを介して腫瘍性形質細胞の細胞死を誘導する機序が知られている。特許文献１には、プロテアソーム阻害剤としてボルテゾミブを用いる多発性骨髄腫の治療方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５３９２７３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブによる治療の効果は、従来の治療と比較して優れるもののいまだ十分ではない。また、末梢神経障害などの副作用のため、ボルテゾミブによる治療の継続が困難な症例も多い。多発性骨髄腫の治療では、再発や副作用のために次々と薬剤を変更せざるを得ない場合が多く、治療の選択肢を広げるため、新規薬剤の開発や多剤併用による治療効果の向上が望まれている。
【０００６】
そこで、本発明は、多発性骨髄腫の治療のための新規な薬剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、骨髄腫細胞の脂肪酸組成においてパルミチン酸が減少していること、パルミチン酸が骨髄腫細胞の細胞死を誘導することを見出した。この知見に基づき、本発明は、パルミチン酸を含有する骨髄腫細胞死誘導剤と、これを有効成分として含有する骨髄腫治療用医薬組成物と、を提供する。
本発明に係る医薬組成物は、プロテアソーム阻害剤、ＳＣＤ−１阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、免疫調節薬、抗体医薬、ステロイド剤及び抗癌剤からなる群から選択される一以上を有効成分として含有していてもよい。前記プロテアソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、マリゾミブが挙げられる。
また、本発明はプロテアソーム阻害剤を含有する医薬、ＳＣＤ−１阻害剤を含有する医薬、ＨＤＡＣ阻害剤を含有する医薬、免疫調節薬を含有する医薬、抗体を含有する医薬、ステロイド剤を含有する医薬及び抗癌剤を含有する医薬からなる群から選択される一以上の医薬と、前記骨髄腫細胞死誘導剤を含有する医薬と、を組み合わせてなる骨髄腫治療用医薬をも提供する。
【０００８】
また、本発明は、分離された細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率に基づいて骨髄腫細胞を検出する方法も提供する。この方法において、前記比率は、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）とパルミチン酸（Ｃ１６：０）との比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）とすることができる。この場合、前記比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）が所定値よりも高い場合に、前記細胞を骨髄腫細胞として検出する。
【０００９】
さらに、本発明は、骨髄腫患者から分離された骨髄腫細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率に基づいて、前記骨髄腫患者に対するパルミチン酸の治療効果の有無を検出する方法をも提供する。
【００１０】
なお、脂肪酸の名称の後に付した（ＣＭ：Ｎ）において、Ｍは脂肪酸の炭素数、Ｎは脂肪酸の不飽和結合数を示す。例えば、（Ｃ１６：０）なる表記は、炭素数１６、不飽和結合数０のパルミチン酸を示し、（Ｃ１６：１）なる表記は、炭素数１６、不飽和結合数１のパルミトレイン酸を示す。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、多発性骨髄腫の治療のための新規な薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】骨髄腫細胞の脂肪酸組成の分析結果を示すグラフである（実施例２）。
【図２】骨髄腫細胞の脂肪酸組成の分析結果を示すグラフである（実施例２）。
【図３】パルミチン酸添加後の骨髄腫細胞（Ｕ２６６）の生存率の変化を示すグラフである（実施例３）。
【図４】パルミチン酸又はボルテゾミブの添加７２時間後の骨髄腫細胞（Ｕ２６６）の生存率を示すグラフである（実施例３）。
【図５】パルミトレイン酸、リノール酸、ステアリン酸又はオレイン酸の添加７２時間後の骨髄腫細胞（Ｕ２６６）の生存率を示すグラフである（実施例３）。
【図６】パルミチン酸添加７２時間後の骨髄腫細胞の生存率の変化を示すグラフである（実施例３）。ＡはＲＰＭＩ８２２６、ＢはＫＭＳ−２１ＢＭの結果を示す。
【図７】パルミチン酸添加７２時間後の正常血液細胞の生存率を示すグラフである（実施例３）。Ａは正常Ｂ細胞、Ｂは正常末梢血単核球の結果を示す。
【図８】パルミチン酸の骨髄腫細胞に対するアポトーシス誘導作用を評価した結果を示すグラフである（実施例４）。
【図９】多発性骨髄腫モデルマウスにおけるパルミチン酸の抗腫瘍活性を評価した結果を示すグラフである（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１４】
１．骨髄腫細胞死誘導剤
本発明に係る骨髄腫細胞死誘導剤は、パルミチン酸を含有する。本発明者らは、パルミチン酸が骨髄腫細胞（腫瘍性形質細胞）の細胞死を誘導する作用を有し、骨髄腫治療のために有効であることを明らかにした（実施例参照）。
【００１５】
パルミチン酸による骨髄腫細胞の細胞死を誘導する作用は、パルミチン酸処理により骨髄腫細胞において飽和脂肪酸が過剰な状態が作出され、生体膜リン脂質組成の変化を通じて小胞体ストレスが生じることによるものと考えられる。すなわち、Ｍ蛋白の蓄積による恒常的な小胞体ストレスに加えて、生体膜リン脂質組成の変化による小胞体ストレスが加わることで、骨髄腫細胞の細胞死が誘導されるものと推察される。
【００１６】
本発明に係る骨髄腫細胞死誘導剤は、このように腫瘍細胞に恒常的に存在する小胞体ストレスを増強することにより効果を発現するものであるため、正常細胞に対する副作用が少ないと考えられる。また、本発明に係る骨髄腫細胞死誘導剤は、骨髄腫治療に用いられる既存のプロテアソーム阻害剤、ＳＣＤ−１阻害剤及びＨＤＡＣ阻害剤とは作用機序が異なるものであるため、既存薬剤との併用により腫瘍細胞に対する細胞死誘導作用の増強が期待できる。従って、本発明に係る骨髄腫細胞死誘導剤及びこれを有効成分とする骨髄腫治療法医薬組成物は、従来の治療では効果が不十分な症例や副作用のために治療継続が困難な症例に対して、従来の治療に代替して又は組み合わせて適用し得るものである。
【００１７】
２．骨髄腫治療用医薬組成物
本発明に係る骨髄腫治療用医薬組成物は、上記骨髄腫細胞死誘導剤単独で又は溶解剤、増量剤、賦形剤あるいは担体と混合して、注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、溶液剤、徐放剤等の製剤として用いることができる。溶解剤、増量剤、賦形剤あるいは担体などの添加剤は、薬剤学的に許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって適宜決定され得る。例えば注射剤の場合、一般に食塩、グルコ−ス、マンニト−ル等の糖類が望ましい。経口剤の場合、でんぷん、乳糖、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム等が望ましい。
【００１８】
本発明に係る骨髄腫治療用医薬組成物の投与経路は、経口的又は注射剤により非経口的に全身性に投与される。また、カテーテル等により遠隔的に投与してもよく、ステントやグラフトあるいは一体化させたステントグラフトに薬剤を結合させてもよい。さらに、体内に留置することにより徐放性に投与してもよい。特に経口投与が好ましい。
【００１９】
本発明に係る骨髄腫治療用医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、投与対象（動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものであるが、患者の骨髄腫の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量とされる。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００２０】
本発明に係る骨髄腫治療用医薬組成物は、上記骨髄腫細胞死誘導剤に加えて、骨髄腫治療のために既に臨床応用されている薬剤や研究段階にある薬剤を有効成分として含有していてもよい。臨床応用されている薬剤としては、プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬、ステロイド剤及び抗癌剤が挙げられる。また、前臨床段階の薬剤としては、ＳＣＤ−１阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤及び抗体医薬が挙げられる。
【００２１】
プロテアソーム阻害剤としては、特に限定されないが、ボルテゾミブ、カーフィルゾミブ、マリゾミブなどが挙げられる。
ＳＣＤ−１は、炭素鎖の長さが１６および１８の飽和脂肪酸に対しΔ９位に不飽和結合を導入し，一価不飽和脂肪酸を合成する機能を有する酵素である。ＳＣＤ−１阻害剤は、特に限定されないが、4-(2-Chlorophenoxy)-N-(3-(3-methylcarbamoyl)phenyl)piperidine-1-carboxamideなどであってよい。
ＨＤＡＣは、ヒストンの脱アセチル化酵素である。ＨＤＡＣ阻害剤としては、特に限定されないが、ボリノスタット、パノビノスタットなどを用いることができる。
また、抗体医薬とは、生体内で免疫反応にかかわる抗体タンパク質を主成分とした医薬品である。抗体医薬としては、特に限定されないが、エロツズマブ、ダラツムマブなどを用いることができる。
【００２２】
免疫調節薬としては、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイドが例示される。
ステロイド剤としては、デキサメタゾンなどの汎用の薬剤を用いることができる。
また、抗癌剤は、特に限定されないが、メルファランなどであってよい。
【００２３】
本発明に係る骨髄腫治療用医薬組成物の他の態様としては、プロテアソーム阻害剤を含有する医薬、ＳＣＤ−１阻害剤を含有する医薬、ＨＤＡＣ阻害剤を含有する医薬、免疫調節薬を含有する医薬、抗体医薬を含有する医薬、ステロイド剤を含有する医薬及び抗癌剤を含有する医薬からなる群から選択される一以上の医薬と、上記骨髄腫細胞死誘導剤を含有する医薬と、を組み合わせてなる骨髄腫治療用医薬も挙げられる。各医薬は、前述の各薬剤を含有する医薬であってよい。
【００２４】
ここで、「組み合わせてなる」とは、２以上の医薬のそれぞれを異なる時間に投与する場合、それぞれの医薬組成物を同時に投与する場合、２以上の医薬を含んで成る１種類の医薬組成物を投与する場合、を意味する。前二者の場合、２以上の医薬のそれぞれを同一の投与経路で投与してもよく、又は別の投与経路で投与してもよい。各医薬は、患者に対して骨髄腫の症状を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。また、投与期間は患者の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００２５】
３．骨髄細胞の検出方法
本発明者らは、骨髄腫細胞の脂肪酸組成においてパルミチン酸が正常細胞に比べて減少していることを明らかにした（実施例参照）。従って、細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率に基づけば当該細胞が骨髄腫細胞であるか否かを判定することができる。より具体的には、骨髄細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸の比率に基づけば当該骨髄細胞が腫瘍性細胞であるか正常な形質細胞であるかを判定でき、患者から分離された骨髄細胞中の腫瘍性細胞を検出したり、骨髄細胞を腫瘍性細胞と正常細胞とに分離したりすることが可能となる。
【００２６】
パルミチン酸の比率としては、特に限定されないが、例えば、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）とパルミチン酸（Ｃ１６：０）との比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）を用いることができる。細胞の前記比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）が基準値よりも高い場合、前記細胞は骨髄腫細胞として判定、検出される。一方、基準値よりも低い場合、前記細胞を非腫瘍性細胞として判定、検出される。
【００２７】
骨髄細胞の採取は、局所麻酔下に骨髄穿刺針を用い、腸骨ないし胸骨等を穿刺し、シリンジにて骨髄液を吸引することにより行うことができる。
【００２８】
また、骨髄細胞からの骨髄腫細胞又は正常な形質細胞の分離は、骨髄腫細胞又は形質細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原と該抗原に対する標識抗体とフローサイトメータ（セルソータ）を用いた従来公知の手法により行うことができる。また、磁気細胞分離法などの慣用の手法を用いて分離を行うことも可能である。
【００２９】
細胞の脂肪酸組成及びパルミチン酸の比率は、二次イオン質量分析装置を用いて分析、測定することができる。具体的には、目的の細胞を酸化インジウムスズ（ITO）コートしたスライドガラスなど、導電性のガラス上に接着し、一次イオンビームを細胞に照射することで二次イオンをスパッタリングし、飛行時間型質量分析計などにより２次イオンを分析して脂肪酸を測定することができる。また、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法などの手法でも細胞の脂肪酸組成の分析は可能である。
【００３０】
基準値は、骨髄腫細胞及び正常な形質細胞について予め取得されたパルミチン酸の比率（比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０））に基づいて決定すればよい。判定は、基準値を超えた値を示す細胞を骨髄腫細胞とすることにより行う。このような判定は装置又はソフトウェアにより自動で行ってもよく、あるいは試験者が自身で行ってもよい。基準値は装置又はソフトウェアに保持記憶させておくこともできる。
【００３１】
比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）の基準値としては、一例として、正常形質細胞で得られた同比の「平均値±２標準偏差」とできる。具体的な基準値は、単なる例示に過ぎないが、例えば０．１０５〜０．１３０の範囲の数値とできる。
【００３２】
４．骨髄腫患者に対するパルミチン酸の治療効果の判定方法
脂肪酸組成においてパルミチン酸が正常細胞に比べて低くなっている骨髄腫細胞にパルチミン酸を処理すると細胞死（アポトーシス）が誘導された（実施例参照）。このことから、骨髄腫細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率は、パルミチン酸によるアポトーシスに対する感受性を示す指標となり得るものであり、骨髄腫患者に対するパルミチン酸あるいはこれを含有する骨髄腫治療用医薬の治療効果を判定するために有用な指標となり得る。
【００３３】
具体的には、上述の方法により骨髄腫患者からの骨髄腫細胞を分離し、骨髄腫細胞の脂肪酸組成に占めるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の比率（例えば比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０））を測定する。そして、測定値が基準値よりも高い場合、前記骨髄腫患者に対するパルミチン酸あるいはこれを含有する骨髄腫治療用医薬の有効性が高いと判定する。一方、測定値が基準値よりも低い場合、有効性が低いと判断する。有効性が高いとされた場合にのみ、本発明に係る骨髄腫治療用医薬組成物又は組み合わせ医薬を投与することで効果的な治療が可能となる。換言すると、例えば比（Ｃ１６：１／Ｃ１６：０）が基準値より高い場合に治療の有効性が高いと検出することができ、基準値より低い場合には治療の有効性が低いと検出することができる。
【実施例】
【００３４】
＜実施例１：骨髄腫細胞の分離＞
骨髄腫患者から以下の手順により骨髄腫細胞を分離した。MP療法（メルファランとプレドニゾロン）抵抗性の患者(IgA-κ型、D&S分類：StageIIIB、ISS：Stage3）から、局所麻酔下で骨髄穿刺を施行し、腸骨から骨髄液を採取した。骨髄液を溶血処理後、細胞表面抗原に対する蛍光標識抗体（Alexa Floura488-CD38、APC-CD45、PE-CD19、PE-Cy7-CD56）で処理した。セルソータ（FACSAria, BD）によりCD38++/CD45dim/CD19-/CD56-〜+の細胞（骨髄腫細胞）を分離した。
【００３５】
また、同様の手順により、健常者から採取した骨髄液を細胞表面抗原に対する蛍光標識抗体（Alexa Floura488-CD38、PerCP-Cy5.5-CD138）で処理し、CD38++/CD138++の細胞（正常形質細胞）を分離した。
【００３６】
＜実施例２：骨髄腫細胞の脂肪酸組成の分析＞
骨髄腫細胞の脂肪酸組成を以下の手順により分析した。ITOコートしたスライドガラスにサイトスピンで骨髄腫細胞および正常形質細胞を接着した。0.25％グルタールアルデヒドで固定後、酢酸アンモニウムで3回洗浄し、測定まで-80℃で保管した。二次イオン質量分析装置（PHI TRIFT V（アルバック・ファイ株式会社））を用いて、negative ion mode、m/z 0-1850の範囲で測定を行った。
【００３７】
また、同様の手順により正常な形質細胞の脂肪酸組成を分析した。
【００３８】
結果を図１及び図２に示す。図中、「Ｃｏｎｔ」は正常形質細胞、「ＭＭ」は骨髄腫細胞の分析値を示す。図１中、グラフ縦軸は、細胞膜リン脂質の主成分であるリン酸で補正したイオンのカウント数を示す。
【００３９】
骨髄腫細胞では、正常形質細胞に比して、パルミチン酸量が有意に減少し（図１Ｂ参照）、一方で、オレイン酸とステアリン酸の量が有意に増加していた（図１Ｄ，Ｅ参照）。また、骨髄腫細胞では、正常形質細胞に比して、パルミチン酸に対するパルミトレイン酸の比（パルミトレイン酸／パルミチン酸）が有意に増加していた（図２Ａ参照）。
【００４０】
＜実施例３：パルミチン酸による骨髄腫細胞の細胞死誘導実験＞
パルミチン酸添加が骨髄腫細胞の生存率に及ぼす影響を以下の手順により評価した。骨髄腫細胞株（Ｕ２６６）を脂肪酸フリー培地（RPMI1640、0.5%脂肪酸フリーBSA）中で培養した。培地中にパルミチン酸を終濃度10、25、50、100、500、1000μMで添加し、添加後24、48、72時間後の細胞の生存率を測定した。比較物質には、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸をそれぞれ終濃度10、25、50、100、500、1000μM、ボルテゾミブを終濃度1、10、100、1000nMで用いた。
【００４１】
結果を図３〜５に示す。パルミチン酸を50μM及び100μM以上の終濃度で添加した細胞では、生存率の低下を認めた（図３参照）。パルミチン酸による細胞生存率の低下は、ボルテゾミブと同様に認められた（図４参照）。一方、パルミチン酸以外の脂肪酸を添加した場合には、500μM以上の高用量を添加した場合には細胞死が顕著であったが、50μM及び100μMの終濃度ではパルミチン酸添加でみられたような細胞生存率の低下はみられなかった（図５参照）。
【００４２】
さらに、骨髄腫細胞株としてＵ２６６に替えてＲＰＭＩ８２２６又はＫＭＳ−２１ＢＭを用いて同様に細胞生存率を評価した結果を図６に示す。ＲＰＭＩ８２２６では、パルミチン酸を終濃度50μM及び100μMで添加した細胞で生存率の低下を認めた（図６Ａ参照）。また、ＫＭＳ−２１ＢＭでも、終濃度250μMで細胞生存率の低下がみられた（図６Ｂ参照）。
【００４３】
パルミチン酸の正常血液細胞に対する影響を確認するため、健常者の末梢血より分離した正常Ｂ細胞および正常末梢血単核球の培地中にパルミチン酸を終濃度10、25、50、100、500、1000μMで添加し、72時間後の生存率を測定した。
骨髄腫細胞の場合と異なり、正常細胞では、終濃度10〜500μMにおいて生存率の低下はみられなかった（図７）。
【００４４】
これらの結果から、パルミチン酸が骨髄腫細胞の細胞死を誘導する作用を有し、骨髄腫治療のために有効であることが明らかとなった。
【００４５】
＜実施例４：アポトーシスの確認＞
パルミチン酸が骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導することを以下の手順により評価した。骨髄腫細胞株（U266）を脂肪酸フリー培地（RPMI1640、0.5%脂肪酸フリーBSA）中で培養した。培地中にパルミチン酸を終濃度100μMで添加し、添加後10、18、24、34、48時間後の細胞を回収してフローサイトメータ（EPICS XL, BC）でFITC-AnnexinVとPI（ヨウ化プロピディウム）を用いてアポトーシス細胞を検出した。比較には、脂肪酸フリー培地のみで培養した細胞（コントロール）及びパルミチン酸に替えてパルミトレイン酸又はオレイン酸を終濃度100μMで添加して培養した細胞を用いた。
【００４６】
結果を図８に示す。図中、横軸はPIの蛍光強度、縦軸はFITC-AnnexinVの蛍光強度を表す。パルミチン酸を添加したものでは、24時間後からAnnexinV陽性／PI陰性で示されるアポトーシスが確認でき、時間の経過とともに増加した。AnnexinV陽性／PI陽性で示されるネクローシスおよびAnnexinxV陰性／PI陰性の生細胞の減少もみられた。このような変化はコントロールでは認められなかった。また、このような変化は、パルミチン酸に替えてパルミトレイン酸又はオレイン酸を添加した場合にもみられなかった（不図示）。この結果から、パルミチン酸が骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導することが明らかとなった。
【００４７】
＜実施例５：多発性骨髄腫モデルマウスにおけるパルミチン酸の抗腫瘍活性の評価＞
以下の手順により、多発性骨髄腫モデルマウスにおけるパルミチン酸投与の有効性を検証した。
１．モデル動物：7週齢NOGマウスにU266ヒト骨髄腫細胞株（2×106細胞）を尾静脈経由で移植した多発性骨髄腫モデルマウスを、薬剤投与群及び陰性対照群に割り振り、10週齢となったところで実験に用いた。
２．薬剤： 終濃度1.27%DMSO、5%脂肪酸フリーBSAを含むRPMI1640にパルミチン酸を溶解し、50mMパルミチン酸溶液を作成した。吸入麻酔下でマウスの脛骨を経由して骨髄内に50mMパルミチン酸溶液を30分毎に14時間、10μLずつ投与した。対照群には同量のPBSを投与した。
３．抗腫瘍効果の評価： 最終投与の8時間後に過剰の麻酔薬投与により安楽死させた後、大腿骨及び脛骨中の骨髄液を回収し、フローサイトメータ（FACSaria）によりFITC-anti-mouse CD45抗体（mCD45）、PerCP-Cy5.5-anti-human-CD138抗体（hCD138）、APC-anti-human CD45抗体（hCD45）、FITC-anti-human-HLA-A,B,C抗体（hHLA-ABC）を用いて骨髄腫細胞の割合を測定した。薬剤を投与しない群についても同様の評価を行った。
【００４８】
結果を図９に示す。mCD45陰性/hCD138陽性（図９Ａ参照）、mCD45陰性/hCD45陽性（図９Ｂ参照）、又はhHLA-ABC陽性（図９Ｃ参照）で示される骨髄腫細胞の割合は、パルミチン酸非投与群と比較してパルミチン酸投与群で減少していた。この結果から、パルミチン酸がin vivoにおいて骨髄腫に対する抗腫瘍活性を示し、骨髄腫治療のために有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に係る骨髄腫細胞死誘導剤及びこれを有効成分として含有する骨髄腫治療用医薬組成物は、多発性骨髄腫の治療の選択肢を広げ、多剤併用による治療効果の向上をもたらす。
【図１】
2015063505.tif 000002
【図２】
2015063505.tif 000003
【図３】
2015063505.tif 000004
【図４】
2015063505.tif 000005
【図５】
2015063505.tif 000006
【図６】
2015063505.tif 000007
【図７】
2015063505.tif 000008
【図８】
2015063505.tif 000009
【図９】
2015063505.tif 000010