(57)【要約】【課題】本発明は、簡便かつ効率的に、飲食品中の食物アレルゲンについて陽性／陰性判定を行うことができる、定性リアルタイムＰＣＲ検査法を提供することを目的とする。【解決手段】食品試料から抽出したＤＮＡと、ポジティブコントロールである予め設定されたコピー数の食物アレルゲンのＤＮＡについて、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、得られた増幅シグナルのＣｔ値を比較することによって、食品試料中の食物アレルゲンの有無について判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無を判定する方法であって、
（ａ）飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、増幅シグナルのＣｔ値を得る工程；
（ｂ）前記食物アレルゲン由来のＤＮＡを鋳型として、工程（ａ）と同じ条件のリアルタイムＰＣＲを行い、増幅シグナルのＣｔ値を得る工程であって、
（ｂ−１）該ＤＮＡが、前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、かつ該ＤＮＡの量（コピー数）と工程（ａ）にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの量（ｎｇ）が２４コピー数を上回る量：５０ｎｇとなる量比にてリアルタイムＰＣＲに用いられる、あるいは
（ｂ−２）該ＤＮＡが、前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、かつ該ＤＮＡの量（コピー数）と工程（ａ）にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの量（ｎｇ）が６コピー数を上回る量：５０ｎｇとなる量比にてリアルタイムＰＣＲに用いられる、工程；
（ｃ）工程（ａ）で得られたＣｔ値と工程（ｂ）で得られたＣｔ値を比較する工程であって、工程（ａ）で得られたＣｔ値が、工程（ｂ）で得られたＣｔ値以下である場合に、該飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、工程。
【請求項２】
飲食品又は飲食品原材料中にタンパク質濃度として１０μｇ／ｇ以上の量にて食物アレルゲンが含まれるものを陽性と判定する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において５０ｎｇ量の飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、かつ工程（ｂ）において、２４コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の環状のＤＮＡ又は６コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の直鎖状のＤＮＡを鋳型として、それぞれリアルタイムＰＣＲに用いられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、食物アレルゲン由来のＤＮＡが環状のＤＮＡである場合５０コピー数又はそれ以上の量にて、又は食物アレルゲン由来のＤＮＡが直鎖状のＤＮＡである場合１２．５コピー数又はそれ以上の量にて、リアルタイムＰＣＲに用いられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）において、工程（ａ）で得られたＣｔ値が、工程（ｂ）で得られたＣｔ値未満である場合に、前記飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
食物アレルゲンが小麦、そば及び落花生からなる群から選択される一以上の食物アレルゲンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
食物アレルゲンが小麦であり、使用するプライマーセットが以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｉｉ）−（ｉｖ）より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、請求項６に記載の方法。
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
【請求項８】
食物アレルゲンがそばであり、使用するプライマーセットが以下の（ｖ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、請求項６に記載の方法。
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｖｉ）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
【請求項９】
食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の（ｖｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むか、あるいは以下の（ｉｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、請求項６に記載の方法。
（ｖｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｖｉｉｉ）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
（ｉｘ）配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｘ）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
リアルタイムＰＣＲによる増幅産物の検出を、蛍光標識されたプローブを用いて行う、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無をリアルタイムＰＣＲ法により判定する方法に用いられるキットであって、
食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及び
食物アレルゲン由来のＤＮＡであって、該ＤＮＡが前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、２４コピー数を上回る量にて存在するか、もしくは該ＤＮＡが前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、６コピー数を上回る量にて存在する、
を含む、上記キット。
【請求項１２】
さらに、リアルタイムＰＣＲによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
食物アレルゲンが小麦であり、プライマーセットが以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｉｉ）−（ｉｖ）より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
【請求項１４】
さらに、配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
食物アレルゲン由来のＤＮＡが、配列番号１９の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体を含む、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
食物アレルゲンがそばであり、プライマーセットが以下の（ｖ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｖｉ）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
【請求項１７】
さらに、配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
食物アレルゲン由来のＤＮＡが、配列番号２０の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体を含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の（ｖｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、あるいは、以下の（ｉｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
（ｖｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｖｉｉｉ）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
（ｉｘ）配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｘ）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
【請求項２０】
さらに、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体、あるいは配列番号２４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
食物アレルゲン由来のＤＮＡが、配列番号２１の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体、あるいは配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体を含む、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
食物アレルゲン由来のＤＮＡを環状の形態にて５０コピー数又はそれ以上の量にて含むか、あるいは、食物アレルゲン由来のＤＮＡを直鎖状の形態にて１２．５コピー数又はそれ以上の量にて含む、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲食品中の食物アレルゲンについて陽性／陰性判定を行うことができるリアルタイムＰＣＲ法を用いた検査法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルゲン（例えば、小麦、そば、落花生等）は、摂取によりアレルギー反応を引き起こし得るものであり、患者によっては極微量の摂取によっても重篤なアナフィラキシーショックを引き起こし得る。また、食物アレルギー患者の数は近年増加の一途をたどっており、世界的に大きな社会問題の一つとなっている。この様な背景のもと、日本をはじめとする諸外国において、食物アレルギー表示制度が施行されている。この表示制度は、特定の食物アレルゲンが含まれない食品を選択するために必要な情報を患者に提供することを目的としたものである。
【０００３】
食物アレルギー表示制度の施行に当たっては、表示の妥当性を検証するための検査方法が必要とされる。日本では、食物アレルゲンのうち、義務表示となる特定原材料７品目（えび、かに、小麦、そば、卵、乳、落花生）、ならびに推奨表示となる、特定原材料に準ずる２０品目（あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン）が対象として指定されており（非特許文献１）、そのうち小麦、そば、落花生などの特定原材料については検査方法が通知されている（非特許文献２）。これら通知によると、特定原材料がタンパク質の量にして一定量以上含まれている飲食品には表示が必要となり、すなわち、食品採取重量１ｇあたりの食物アレルゲンに由来するタンパク質含量がＥＬＩＳＡによる定量のスクリーニング検査で１０μｇ以上となる場合、食物アレルゲンについて陽性と判断され表示が必要とされる。また、ＥＬＩＳＡによる定量スクリーニング検査で陽性と判断された飲食品については、必要に応じて特異性の高いＰＣＲやウェスタンブロットによる定性の確認検査が行われる。
【０００４】
ここで、特定原材料の確認検査に用いられている定性ＰＣＲ検査では、特定原材料由来のＤＮＡを鋳型とする増幅産物の有／無を電気泳動で確認して、特定原材料について陽性／陰性を判定する。その為、定性ＰＣＲ検査には、電気泳動を行う煩雑さと、増幅産物による検査環境の汚染リスクが問題となる。これらの問題を解決するものとしてＰＣＲ反応液中の増幅産物に由来する蛍光シグナル強度をモニタリング検出するリアルタイムＰＣＲ法があり、当該手法を用いた検査法には、食物アレルゲンである小麦、そば、落花生の検査法（特許文献１、２）、遺伝子組換え作物の検査法（非特許文献３）、病原菌の検査法（非特許文献４）、カビの検査法（非特許文献５）などが報告されている。
【０００５】
しかし、従来のリアルタイムＰＣＲ法を用いた確認検査の判定基準は、各種リアルタイムＰＣＲ装置の機種間差や同一装置の個体間差（シリアルＮｏ．の違いによる差）までを考慮することはできておらず、実際に異なる機種のリアルタイムＰＣＲ装置を用いて同一条件でＰＣＲを行った場合には、ＰＣＲ反応液の温度・反応時間・蛍光シグナルの検出感度・解析方法などの違いによりＣｔ値の変動を生じ異なる結果／判定が得られることがある。特に微量レベルの検出が求められる検査では、この変動は全く別の結果／判定を生じ得る。そのため、非特許文献３では、使用するリアルタイムＰＣＲ装置の機種を指定するか、あるいは当該指定の機種と同等の結果が得られる機種の使用が推奨されている。この機種間で生じる問題については、陽性／陰性の判定基準を「被検試料に由来する蛍光シグナルのＣｔ値がポジティブコントロールとした一定量のＤＮＡに由来する蛍光シグナルのＣｔ値未満か／以上か」とすることによって解消することができる（非特許文献４，５）。しかし、ここでポジティブコントロールとして用いられているＤＮＡの量は、標的ＤＮＡ配列として数コピーレベル、つまりＰＣＲの検出下限付近の量であり、増幅する／しないを含めた、Ｃｔ値のバラツキを抑えるためには、バラツキの少ない高濃度側の数点のＣｔ値を測定し、当該値に基づいて作成した検量線を用いて判断基準となるＣｔ値を推定しなければならず、操作が煩雑となる。特に、非特許文献５では、検出限界である５コピーを、直鎖状ＤＮＡより増幅しにくい、環状プラスミドを用いて見積もっている。この様に、非特許文献４、５に示されている定性リアルタイムＰＣＲ法の何れもが、ＰＣＲの理論上の検出下限に近いレベルで陽性／陰性を判定する方法となっており、特に検出感度の高いＰＣＲ法において、環境由来コンタミネーションに起因する蛍光シグナルと陽性被検試料に起因する蛍光シグナルとの明確な区別が難しく、正しく判定できないといった問題があった。
【０００６】
そこで、当該分野においては、リアルタイムＰＣＲ装置の機種を特定せず、また検量線の作成を要することなく、飲食品中の食物アレルゲンについて陽性／陰性の判定を正確に行うことができる、リアルタイムＰＣＲ法を用いた検査法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１３−１８８１６４号公報
【特許文献２】特許第４３９９４１７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】アレルギー物質を含む食品に関する表示指導要領（消費者庁ホームページ）
【非特許文献２】アレルギー物質を含む食品の検査方法について（平成２２年９月１０日付け消食表第２８６号）
【非特許文献３】安全性未審査の組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（平成２４年１１月１６日食安発１１１６第４号）
【非特許文献４】ヨーネ病検査マニュアル（２０１３年３月２９日版）
【非特許文献５】ＦｕｎｇｉＱｕａｎｔ：Ａ  ｂｒｏａｄ−ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｆｕｎｇａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０．１１８６／１４７１−２１８０−１２−２５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置の機種を特定せず、また検量線の作成を要することなく、飲食品中の食物アレルゲンについて陽性／陰性の判定を正確に行うことができる、リアルタイムＰＣＲ法を用いた検査法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の食物アレルゲンが添加されたＰＣＲ検査が難しい飲食品（すなわち、より高い感度のＰＣＲ検査が求められる飲食品）を、食物アレルゲンのＤＮＡに関するリアルタイムＰＣＲ法を用いたＣｔ値の比較により陽性と判定できるＣｔ値を与えるポジティブコントロールとなる食物アレルゲンのＤＮＡのコピー数を設定し、当該コピー数の食物アレルゲンのＤＮＡを、検査対象飲食品から抽出した鋳型ＤＮＡと、食物アレルゲンのＤＮＡを増幅する同一条件のリアルタイムＰＣＲに付すことによって、検査対象飲食品について得られたＣｔ値が、ポジティブコントロールについて得られたＣｔ値以下、好ましくは未満である場合に、当該検査対象飲食品は食物アレルゲンについて陽性であると判断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、検査対象飲食品から抽出した鋳型ＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ法により食物アレルゲンのＤＮＡ増幅産物について得られたＣｔ値を、ポジティブコントロールである予め設定されたコピー数の食物アレルゲンのＤＮＡを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行い得られたＣｔ値と比較するだけで、リアルタイムＰＣＲ装置の機種を指定せずに、また検量線の作成を要することなく、検査対象飲食品中の食物アレルゲンについて陽性／陰性の判定を行うことができる。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無を判定する方法であって、
（ａ）飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、増幅シグナルのＣｔ値を得る工程；
（ｂ）前記食物アレルゲン由来のＤＮＡを鋳型として、工程（ａ）と同じ条件のリアルタイムＰＣＲを行い、増幅シグナルのＣｔ値を得る工程であって、
（ｂ−１）該ＤＮＡが、前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、かつ該ＤＮＡの量（コピー数）と工程（ａ）にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの量（ｎｇ）が２４コピー数を上回る量：５０ｎｇとなる量比にてリアルタイムＰＣＲに用いられる、あるいは
（ｂ−２）該ＤＮＡが、前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、かつ該ＤＮＡの量（コピー数）と工程（ａ）にて用いられる飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの量（ｎｇ）が６コピー数を上回る量：５０ｎｇとなる量比にてリアルタイムＰＣＲに用いられる、工程；
（ｃ）工程（ａ）で得られたＣｔ値と工程（ｂ）で得られたＣｔ値を比較する工程であって、工程（ａ）で得られたＣｔ値が、工程（ｂ）で得られたＣｔ値以下である場合に、該飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、工程。
［２］飲食品又は飲食品原材料中にタンパク質濃度として１０μｇ／ｇ以上の量にて食物アレルゲンが含まれるものを陽性と判定する方法である、［１］の方法。
［３］工程（ａ）において５０ｎｇ量の飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、かつ工程（ｂ）において、２４コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の環状のＤＮＡ又は６コピー数を上回る量の食物アレルゲン由来の直鎖状のＤＮＡを鋳型として、それぞれリアルタイムＰＣＲに用いられる、［１］又は［２］の方法。
［４］工程（ｂ）において、食物アレルゲン由来のＤＮＡが環状のＤＮＡである場合５０コピー数又はそれ以上の量にて、又は食物アレルゲン由来のＤＮＡが直鎖状のＤＮＡである場合１２．５コピー数又はそれ以上の量にて、リアルタイムＰＣＲに用いられる、［３］の方法。
［５］工程（ｃ）において、工程（ａ）で得られたＣｔ値が、工程（ｂ）で得られたＣｔ値未満である場合に、前記飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］食物アレルゲンが小麦、そば及び落花生からなる群から選択される一以上の食物アレルゲンである、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］食物アレルゲンが小麦であり、使用するプライマーセットが以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｉｉ）−（ｉｖ）より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、［６］の方法。
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
［８］食物アレルゲンがそばであり、使用するプライマーセットが以下の（ｖ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、［６］の方法。
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｖｉ）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
［９］食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の（ｖｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むか、あるいは以下の（ｉｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、［６］の方法。
（ｖｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｖｉｉｉ）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
（ｉｘ）配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｘ）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
［１０］リアルタイムＰＣＲによる増幅産物の検出を、蛍光標識されたプローブを用いて行う、［１］〜［９］のいずれかの方法。
【００１３】
［１１］飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無をリアルタイムＰＣＲ法により判定する方法に用いられるキットであって、
食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及び
食物アレルゲン由来のＤＮＡであって、該ＤＮＡが前記プライマーセットの標的配列を含む環状の形態であり、２４コピー数を上回る量にて存在するか、もしくは該ＤＮＡが前記プライマーセットの標的配列を含む直鎖状の形態であり、６コピー数を上回る量にて存在する、
を含む、上記キット。
［１２］さらに、リアルタイムＰＣＲによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む、［１１］のキット。
［１３］食物アレルゲンが小麦であり、プライマーセットが以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｉｉ）−（ｉｖ）より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、［１１］又は［１２］のキット。
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
［１４］さらに、配列番号５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、［１３］のキット。
［１５］食物アレルゲン由来のＤＮＡが、配列番号１９の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体を含む、［１３］又は［１４］のキット。
［１６］食物アレルゲンがそばであり、プライマーセットが以下の（ｖ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、［１１］又は［１２］のキット。
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
（ｖｉ）配列番号７に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
［１７］さらに、配列番号８に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、［１６］のキット。
［１８］食物アレルゲン由来のＤＮＡが、配列番号２０の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体を含む、［１６］又は［１７］のキット。
［１９］食物アレルゲンが落花生であり、使用するプライマーセットが以下の（ｖｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｖｉｉｉ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、あるいは、以下の（ｉｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体と、（ｘ）のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含む、［１１］又は［１２］のキット。
（ｖｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｖｉｉｉ）配列番号１０に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいは
（ｉｘ）配列番号２２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、および
（ｘ）配列番号２３に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
［２０］さらに、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体、あるいは配列番号２４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む蛍光標識されたプローブ又はその変異体を含む、［１９］のキット。
［２１］食物アレルゲン由来のＤＮＡが、配列番号２１の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体、あるいは配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ又はその変異体を含む、［１９］又は［２０］のキット。
［２２］食物アレルゲン由来のＤＮＡを環状の形態にて５０コピー数又はそれ以上の量にて含むか、あるいは、食物アレルゲン由来のＤＮＡを直鎖状の形態にて１２．５コピー数又はそれ以上の量にて含む、［１１］〜［２１］のいずれかのキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、リアルタイムＰＣＲ装置の機種を特定せず、また検量線の作成を要することなく、飲食品中の食物アレルゲンについて陽性／陰性の判定を正確に行うことができる、リアルタイムＰＣＲ法を用いた検査法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、缶詰食品のあさり水煮を用いた、ＤＮＡ分解度の分析結果を示す。
【図２】図２は、市販の加工食品のＤＮＡ抽出量とＤＮＡ分解度の分析結果を示す。Ｘ軸は抽出ＤＮＡ量、Ｙ軸はＤＮＡ断片長をそれぞれ示す。
【図３】図３は、あさり水煮モデル加工食品と市販のあさり水煮加工食品のＤＮＡ抽出量とＤＮＡ分解度の分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無を判定する方法に関し、当該方法は以下の工程（ａ）−（ｃ）を含む：
（ａ）飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡを鋳型として、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、増幅シグナルのＣｔ値を得る工程；
（ｂ）前記食物アレルゲン由来のＤＮＡを鋳型として、工程（ａ）と同じ条件のリアルタイムＰＣＲを行い、増幅シグナルのＣｔ値を得る工程であって、該ＤＮＡが前記プライマーセットの標的配列を含み、かつ工程（ａ）における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの使用量（ｎｇ）に基づいて決定することができる特定の量（コピー数）にてリアルタイムＰＣＲに用いられる、工程；
（ｃ）工程（ａ）で得られたＣｔ値と工程（ｂ）で得られたＣｔ値を比較する工程であって、工程（ａ）で得られたＣｔ値が、工程（ｂ）で得られたＣｔ値以下または未満である場合に、該飲食品又は飲食品原材料中に食物アレルゲンが含まれることを示す、工程。
【００１７】
本発明において「食物アレルゲン」とは、えび、かに、小麦、そば、卵、乳、落花生、あわび、いか、いくら、オレンジ、カシューナッツ、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、ごま、さけ、さば、大豆、鶏肉、バナナ、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン等が挙げられるが、好ましくはえび、かに、小麦、そば、落花生、大豆であり、特に好ましくは重篤なアナフィラキシーショックを引き起こしやすい小麦、そば、又は落花生である。
【００１８】
本発明によれば、飲食品又は飲食品原材料中にタンパク質濃度として１０μｇ／ｇ以上の量にて食物アレルゲンが含まれるものをリアルタイムＰＣＲ法を用いて、簡便かつ迅速に陽性と判定することができる。本発明にて得られた結果は、アレルギー表示の正しさの確認や、アレルギー表示をするべきか否かの判断材料に用いることができる。
【００１９】
「飲食品又は飲食品原材料」とは、食物アレルゲンが含まれる又は含まれる可能性のある飲食品、及びそれらの原料や、加工過程にある飲食品原料などを意味する。
【００２０】
飲食品又は飲食品原材料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、及びそれらの組合せを用いて行うことができる。また、市販のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ＫｉｔやＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ２０／Ｇ、ＤＮｅａｓｙ  Ｍｅｒｉｃｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ｋｉｔ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）等の各種ＤＮＡ抽出キットを用いても良い。
【００２１】
抽出されたＤＮＡの濃度および精製度は、分光光度計を用いて波長２３０、２６０、及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより評価することができる。すなわち、抽出されたＤＮＡの濃度は、下記式（１）を用いて算出することができる。
【００２２】
2015192666.tif 000002
【００２３】
また、ＤＮＡの精製度は、ＰＣＲ反応が良好に行われるべく２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２．０以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８〜２．０であることが好ましい。
【００２４】
さらに、抽出されたＤＮＡについて、植物又は動物が共通に持つ内在性遺伝子に対するプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅産物が得られることを確認してもよい。
【００２５】
抽出されたＤＮＡは、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（上記非特許文献２）に記載されるＤＮＡの調製方法に基づいて２０ｎｇ／μＬ程度に調整することができる。抽出されたＤＮＡは、５〜５００ｎｇとなる量にて鋳型ＤＮＡとして利用することができる。好ましくは抽出されたＤＮＡは、５０ｎｇとなる量にて鋳型ＤＮＡとして利用する（この量は、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（上記非特許文献２）にて特定される量である）。
【００２６】
本発明において、ＰＣＲ反応により増幅されたＤＮＡは、常法に基づいて、蛍光を発する化合物又は蛍光物質で標識されたプローブを用いて検出・定量することができる。「蛍光を発する化合物」としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等を利用することができ、これらはインターカレーターとしてＰＣＲ反応系に加えることにより、増幅されたＤＮＡに結合する。これに励起光を照射することにより蛍光を発し、この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。一方、「蛍光物質で標識されたプローブ」（以下、単に「プローブ」と記載する場合がある。）は、増幅されたＤＮＡ中の標的配列に特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブである。一例としては、ＰＣＲ反応系に加えるとアニーリングステップで増幅されたＤＮＡ中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたプローブが分解され、蛍光物質がプローブから遊離することにより蛍光を発するプローブがある。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができ、このようなプローブはＴａｑＭａｎプローブとも称される。
本発明において好ましくは、プローブを用いて、増幅されたＤＮＡを検出・定量する。
【００２７】
「食物アレルゲン検出用のプライマーセット」は、食物アレルゲン由来のＤＮＡ上の標的配列に特異的又は選択的に結合（ハイブリダイズ）し、リアルタイムＰＣＲ反応により目的の配列を有するＤＮＡ断片を増幅できるものであれば特に限定はされない。
【００２８】
「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」とは、食物アレルゲンが存在することの指標となるＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ等）又はその一部であればよく、特定のタンパク質をコードする領域に由来するものであってもよいし、スペーサー領域（ＩＴＳ配列等）に由来するものであってもよい。このようなＤＮＡの塩基配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに開示されており、これらの遺伝子情報に基づいて、プライマーやプローブを設計することができる。例えば、小麦のＩＴＳ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＡＦ４３８１８６として登録されており、そばのＩＴＳ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＡＢ０００３３１として登録されており、落花生のＩＴＳ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＦＪ２１２３１９として登録されており、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。
【００２９】
プライマーは、食物アレルゲン由来ＤＮＡの塩基配列に基づいて設計することが可能であり、以下の一又は複数の特徴を有するように設計することができる。
・ＰＣＲによる増幅産物のサイズを８０〜３００ｂｐ、より典型的には８０〜１５０ｂｐとする。
・各プライマーのサイズは１７〜２５塩基程度とする。
・各プライマーのＧＣ含量は４０〜６０％とし、部分的にＧＣリッチ又はＡＴリッチでないものとする。
・各プライマーが同程度のＴｍ値を有する。
・目的遺伝子に特異的／比較的特定性の高い配列に設計する。配列の特異性等については、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ検索などを用いて確認することができる。
・プライマー内部又はプライマー間で３塩基以上の相補的配列を有さない。
・３’末端の塩基がＴになるプライマーは避ける。
・３’末端の塩基がＧになるプライマーは避ける。
【００３０】
また、増幅されたＤＮＡを検出・定量する際に用いるプローブは、食物アレルゲン由来のＤＮＡの塩基配列に基づいて設計することが可能であり、以下の一又は複数の特徴を有するように設計することができる。
・プローブのサイズは１０〜３０塩基程度とする。
・プローブのＧＣ含量は２０〜８０％とし、配列内に４塩基以上Ｇの連続を有さない。
・プライマーよりも高い（例えば８〜１０℃程度高い）Ｔｍ値を有する。
・標的配列に特異的／比較的特定性の高い配列に設計する。配列の特異性等については、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ検索などを用いて確認することができる。
・５’末端が蛍光物質（例えば、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ＨＥＸＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＰＥＴ等）で標識されていている。
・３’末端が消光物質（クエンチャー）（例えば、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ等）で標識されていている。
【００３１】
プライマー及びプローブは公知のプライマー／プローブ設計ソフトウェアを用いて設計しても良い。このようなソフトウェアとしては例えば、ＯＬＩＧＯ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社）、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ社）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ライフテクノロジーズ社）等を利用することができる。
【００３２】
プライマー又はプローブとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することができる。
【００３３】
本発明においてプライマーセット及びプローブは、食物アレルゲン由来のＤＮＡを増幅／検出することが可能な公知のプライマーセット及びプローブを利用することができる（例えば、特開２０１３−１８８１６４号公報、特許第４３９９４１７号公報、特許第４６５８８１６号公報）。
【００３４】
本発明においては、下記実施例に具体的に示すとおり、各食物アレルゲンの検出に以下のプライマーセット及びプローブを利用することができる。
【００３５】
食物アレルゲンが小麦である場合、プライマーセットは以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）−（ｉｖ）より選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを利用することができ：
（ｉ）配列番号１に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）配列番号２に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）配列番号３に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｉｖ）配列番号４に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号５に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
【００３６】
食物アレルゲンがそばである場合、プライマーセットは以下の（ｖ）のオリゴヌクレオチドと、（ｖｉ）のオリゴヌクレオチドを含み：
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｖｉ）配列番号７に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号８に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
【００３７】
食物アレルゲンが落花生である場合、プライマーセットは以下の（ｖｉｉ）のオリゴヌクレオチドと、（ｖｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドを含み：
（ｖｉｉ）配列番号９に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｖｉｉｉ）配列番号１０に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号１１に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
または、食物アレルゲンが落花生である場合、プライマーセットは以下の（ｉｘ）のオリゴヌクレオチドと、（ｘ）のオリゴヌクレオチドを含み：
（ｉｘ）配列番号２２に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｘ）配列番号２３に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
プローブは配列番号２４に示す塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むものを利用することができる。
【００３８】
また、本発明においては、上記配列番号１〜１１及び２２〜２４に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、同様にプライマー又はプローブとしての機能を有するオリゴヌクレオチドも、上記プライマー及びプローブとして利用することができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記配列番号１〜１１及び２２〜２４に示す塩基配列を有するプライマー及びプローブを用いたＰＣＲ反応と同じ条件、特にアニーリングステップと同じ条件を指す。本明細書においては、このようなプライマー又はプローブのことを上記配列番号１〜１１及び２２〜２４に示す塩基配列を有するプライマー及びプローブの「変異体」と記載する場合があるが、特に記載しない限り、上記配列番号１〜１１及び２２〜２４に示す塩基配列を有するプライマー及びプローブには当該「変異体」も含まれる。このような変異体には、上記配列番号１〜１１及び２２〜２４に示す塩基配列において数塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや（ここで「数塩基」とは、４塩基以内、３塩基以内、又は２塩基以内の塩基数を意味する）、上記配列番号１〜１１及び２２〜２４に示す塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が含まれ得る。
【００３９】
工程（ａ）においては、上記抽出されたＤＮＡを鋳型として、上記プライマーセットを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行い増幅シグナルのＣｔ値を得る。リアルタイムＰＣＲ反応は常法に従って行うことができ、ＰＣＲ条件（変性、アニーリング、及び伸長の各ステップの温度や長さ）、反応液の組成（ｄＮＴＰ濃度、プライマーの濃度、プローブ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類や濃度、塩化マグネシウムの濃度等）は、食物アレルゲン由来のＤＮＡの検出に必要な特異性や感度を確保できるものであれば、特に限定はされない。リアルタイムＰＣＲ反応を行う装置は特に限定されず、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ（ライフテクノロジーズ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等、リアルタイムＰＣＲ反応を可能とする様々な機種を用いることができ、特に限定はされない。
【００４０】
「Ｃｔ値」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、増幅曲線と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）が交差するサイクル数を意味し、ＰＣＲ増幅産物の生成に由来する蛍光量がある所定量（閾値）に達するときのサイクル数を表す。試料中に最初に含まれる標的ＤＮＡ量が多い程小さく、逆に試料中に含まれる標的ＤＮＡ量が少ない程大きくなる。
【００４１】
Ｃｔ値は、リアルタイムＰＣＲ反応を行う装置に付属の解析ソフトを、デフォルトの解析条件で用いて得ることができる。閾値を手動で設定する必要がある場合は、公知の安全性未審査の組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（平成２４年１１月１６日食安発１１１６第４号）のように任意の相対蛍光量を指定することができる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ等の機種において、ＰＣＲ増幅産物の生成に由来する蛍光量がある一定の基準以上変動したときのサイクル数を「Ｃｑ値」等と呼んでいるが、本技術ではこれらをＣｔ値と読み替えても良い。
【００４２】
本発明において「Ｃｔ値」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いて得られた増幅シグナルのＣｔ値である。
【００４３】
工程（ｂ）においては、上記抽出されたＤＮＡに代えて、前記食物アレルゲン由来のＤＮＡを鋳型として用いる以外は、上記と同じ条件にてリアルタイムＰＣＲ反応を行い、Ｃｔ値を得る。なお、工程（ａ）と工程（ｂ）は、工程（ａ）次いで工程（ｂ）の順序であってもよいし、工程（ｂ）次いで工程（ａ）の順序であってもよく、あるいは、工程（ａ）と工程（ｂ）は同時に実施されてもよい。好ましくは工程（ａ）と工程（ｂ）は同時に実施される。
【００４４】
工程（ｂ）にて鋳型として用いられる「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」としては、上記プライマーやプローブが結合する標的配列を含み得る限り、上記定義のものを用いることができる。その大きさは特に限定されず、プライマーセットの標的配列とそれらに挟まれる領域からなるものであってもよいし、その両端に任意の配列が付加されていてもよい。
【００４５】
また、当該「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」としては、上記プライマーやプローブがストリンジェントな条件下で結合し得て、かつ、同一条件で行ったリアルタイムＰＣＲにおいて食物アレルゲンから抽出されたＤＮＡ中の標的配列と同じＤＮＡ配列を用いた場合と同等のＣｔ値が得られる限り、プライマーセットの標的配列とそれらに挟まれる領域（すなわち、ＰＣＲ反応により増幅される領域）の塩基配列が元の塩基配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録された配列）と比べて、１０個以内、５個以内、３個以内の塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有していても良い。さらに、当該「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」としては、上記プライマーやプローブがストリンジェントな条件下で結合し得る限り、プライマーセットの標的配列とそれらに挟まれる領域（すなわち、ＰＣＲ反応により増幅される領域）の塩基配列が元の塩基配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録された配列）と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するものであってもよい。なお、本明細書においては、これらの元の塩基配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録された配列）とは異なる塩基配列を有する「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」を、当該ＤＮＡの「変異体」と記載する場合があるが、特に記載しない限り、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」には当該「変異体」も含まれる。
【００４６】
本発明において当該「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」はポジティブコントロールとして使用される。本明細書において、当該「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」を「ポジティブコントロール」と呼ぶ場合があるが、これらの用語は相互互換的に使用される。
【００４７】
食物アレルゲン由来のＤＮＡは、工程（ａ）のリアルタイムＰＣＲ反応と同じ条件にて反応を行った場合に、上記抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合と同様に増幅産物及び蛍光シグナルを与えるものであればよい。工程（ａ）で得られる増幅産物の塩基配列は、工程（ｂ）で得られる増幅産物の塩基配列と異なっていてもよく、両者は数塩基の付加、置換、欠失又は挿入に基づく相違を有していてもよい。ここで「数塩基」とは、１０塩基以内、８塩基以内、６塩基以内、４塩基以内、３塩基以内、又は２塩基以内を意味する。
【００４８】
食物アレルゲンが小麦である場合、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」としては、以下の塩基配列を含むＤＮＡ又は以下の塩基配列からなるＤＮＡ、あるいはその変異体を利用することができる。
５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＴＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＴＴＴ−３’（配列番号１９）
【００４９】
食物アレルゲンがそばである場合、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」としては、以下の塩基配列を含むＤＮＡ又は以下の塩基配列からなるＤＮＡ、あるいはその変異体を利用することができる。
５’−ＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣＧ−３’（配列番号２０）
【００５０】
食物アレルゲンが落花生である場合、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」としては、以下の配列番号２１又は配列番号２５に示される塩基配列を含むＤＮＡ又は以下の塩基配列からなるＤＮＡ、あるいはその変異体を利用することができる。
５’−ＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＣＡＴＣＣＧＧＴＣＧＧＧＧＣＧＡＣ−３’（配列番号２１）；
５’−ＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＴＣＧＴＧ−３’（配列番号２５）
【００５１】
好ましくは、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」は、プライマーやプローブが結合する標的配列とは異なる領域において少なくとも１塩基が、元の塩基配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録された配列）の塩基と異なる塩基に置換されている。この置換を指標とすることによって、ＰＣＲ反応により得られた増幅産物が、当該「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」を鋳型として得られたものであるか否かを判断することができる。このような置換（変異）は、所定の位置に変異を導入したクローニング用プライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、クローニングされた食物アレルゲン由来のＤＮＡの所定の位置に変異を導入することができる。あるいは、ＤＮＡ合成により所定の位置に変異を導入することもできる。
【００５２】
「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」は、食物アレルゲンより抽出して得られたＤＮＡを鋳型として目的の配列を含むプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を行いクローニングすることによって調製することができる。あるいは、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」は、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる一本鎖ＤＮＡ合成装置や、二本鎖ＤＮＡ（人工遺伝子）合成装置を利用して合成することができる。
【００５３】
「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」は、直鎖状の形態であってもよいし、環状の形態であってもよい。例えば、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」はプラスミド又はベクターに挿入された環状の形態、またはその後、制限酵素等で切断された直鎖状の形態とすることができる。これにより食物アレルゲン由来のＤＮＡの安定性を高めることができ、また当該プラスミド又はベクターを用いて宿主生物を形質転換することによって、当該プラスミド又はベクターを宿主生物中で生産することができ、有利である。「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」を含むプラスミド又はベクターは、当業者に公知である一般的な分子生物学的手法を用いて行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ／ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）参照）。
【００５４】
「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」は、個々の食物アレルゲンに由来するＤＮＡごと別々のＤＮＡの形態としてもよいが、複数種の食物アレルゲンに由来するＤＮＡを連結して一つのＤＮＡの形態としてもよいし、個々のＤＮＡまたは連結された一つのＤＮＡがプラスミド又はベクターに挿入された形態を有していてもよい。複数種の食物アレルゲンに由来するＤＮＡを連結する場合、各ＤＮＡは直接連結されていてもよいし、一又は複数の塩基を介して間接的に連結されていてもよい。
【００５５】
判定基準に用いる「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」の使用量は、工程（ａ）における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの使用量（ｎｇ）に基づいて決定することができる。すなわち、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」が環状の形態である場合、工程（ａ）における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの使用量（ｎｇ）：工程（ｂ）における食物アレルゲン由来のＤＮＡの使用量（コピー数）の比が、５０（ｎｇ）：２４コピー数を上回る量、好ましくは、当該ＤＮＡを２５コピー若しくはそれ以上、５０コピー若しくはそれ以上、又は１００コピー若しくはそれ以上の量となる量にて用いることができる。例えば、工程（ａ）における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの使用量が５０ｎｇである場合、工程（ｂ）における食物アレルゲン由来のＤＮＡを２４コピー数を上回る量にて鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ反応系に加えることができ、好ましくは、当該ＤＮＡを２５コピー若しくはそれ以上、５０コピー若しくはそれ以上、又は１００コピー若しくはそれ以上の量にて用いる。当該ＤＮＡを２４コピー以下で用いた場合には、Ｃｔ値のバラツキが大きいことに加え、環境由来コンタミネーションに起因する蛍光シグナルを明確に区別することが困難であり、飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無を正しく判断できない場合がある。コピー数の上限は特に限定されないが、飲食品又は飲食品原材料中に微量を超える食物アレルゲンが含まれていた場合に誤って陰性としないために、例えば、１０００コピー以下、５００コピー以下、又は３００コピー以下とすることができる。一方、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」が直鎖状の形態である場合、その使用量は環状の形態の使用量（コピー数）の１／４量とすることができる。すなわち、「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」が直鎖状の形態である場合、工程（ａ）における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの使用量（ｎｇ）：工程（ｂ）における食物アレルゲン由来のＤＮＡの使用量（コピー数）の比が、５０（ｎｇ）：６コピー数を上回る量、好ましくは、当該ＤＮＡを６．２５コピー若しくはそれ以上、１２．５コピー若しくはそれ以上、又は２５コピー若しくはそれ以上の量となる量にて用いることができる。例えば、工程（ａ）における飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡの使用量が５０ｎｇである場合、工程（ｂ）における食物アレルゲン由来のＤＮＡを６コピー数を上回る量にて鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ反応系に加えることができ、好ましくは、当該ＤＮＡを６．２５コピー若しくはそれ以上、１２．５コピー若しくはそれ以上、又は２５コピー若しくはそれ以上の量にて用いることができる。また、その上限は例えば、２５０コピー以下、１２５コピー以下、又は７５コピー以下とすることができる。なお、工程（ｂ）で直鎖状の形態である「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」の使用量（コピー数）１量から得られたＣｔ値は、環状の形態である「食物アレルゲン由来のＤＮＡ」の使用量（コピー数）１／４量から得られたＣｔ値とほぼ同等であることを確認している。
【００５６】
当該ＤＮＡのコピー数は以下の式（２）より算出することができる。
2015192666.tif 000003
式中、「Ａ２６０値」は分光光度計によって得られた波長２６０ｎｍにおける吸光値、「Ｌ」はＤＮＡ（あるいは当該ＤＮＡを含むプラスミド又はベクター）のサイズ（ｂｐ）、「Ｖ」は溶液量（μＬ）を示す。
【００５７】
また、当該ＤＮＡのコピー数はＤｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲを用いて測定することもできる。Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲを用いることの利点は、以下２点である：
１．吸光度測定では区別できない標的配列以外の夾雑ＤＮＡや標的配列の分解ＤＮＡなどを測定しないため、ＰＣＲ増幅可能な標的配列のコピー数のみを測定可能であること；
２．吸光度測定よりも低いコピー数で測定可能であること。
従って、測定原理の違いや１．に記載の利点から、吸光度測定とＤｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ測定とでは、同一試料であっても異なるコピー数として算出され得る。
また、２．に記載の利点から、判定基準とする食物アレルゲン由来のＤＮＡのコピー数に近い濃度（例えば２００−２０００コピー／μＬ）での定量が可能であり、濃度測定後の希釈によるばらつきを抑え得る。
【００５８】
本コピー数は、下記実施例にて詳述されるとおり、食物アレルゲンの定性リアルタイムＰＣＲ検査が難しい（検査法に高い感度が求められる）加工食品の調製において、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の食物アレルゲンを加えて製造された、食物アレルゲン含有モデル加工食品より抽出された、食物アレルゲン由来のＤＮＡ量に基づいて設定されたものである。
【００５９】
すなわち、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の食物アレルゲンを含むモデル加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いて得られる増幅シグナルのＣｔ値が、鋳型ＤＮＡを一定量の食物アレルゲン由来のＤＮＡ（ポジティブコントロール）に代えて得られるＣｔ値以下となるように、当該食物アレルゲン由来のＤＮＡの量（コピー数）は設定されている。食物アレルゲン由来のＤＮＡ（ポジティブコントロール）のコピー数は、バラツキの少ないＣｔ値を与えるように、また、検査環境由来コンタミネーションに起因する蛍光シグナルを誤って陽性としないように、可能な限り大きい方が望ましい。
【００６０】
なお、「Ｃｔ値以下」とは、上記モデル加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いて得られる増幅シグナルのＣｔ値が、鋳型ＤＮＡをポジティブコントロールに代えて得られる増幅シグナルのＣｔ値以下となることである。具体的には、コピー数が既知である複数濃度のポジティブコントロールによって得られた検量線から上記モデル加工食品から抽出したＤＮＡ中のコピー数を推定し、推定されたコピー数以下となるようにポジティブコントロールを設定すればよい。
【００６１】
より好ましくは、上記モデル加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして食物アレルゲン検出用のプライマーセットを用いて得られる増幅シグナルのＣｔ値が、鋳型ＤＮＡをポジティブコントロールに代えて得られる増幅シグナルのＣｔ値未満となるように、すなわち、上記モデル加工食品から抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして得られる増幅シグナルのＣｔ値が、ポジティブコントロールより得られる増幅シグナルのＣｔ値より有意に小さくなると統計的に判断されるようにポジティブコントロール濃度を設定してもよい。なお「有意に小さくなる」とは、それぞれの試料のＣｔ値の平均値と標準偏差より、下記式（３）が成立することを意味する。
【００６２】
2015192666.tif 000004
【００６３】
式中、Ｘ１、σ１はそれぞれモデル加工食品抽出ＤＮＡの平均Ｃｔ値、標準偏差であり、Ｘ２、σ２はそれぞれポジティブコントロールの平均Ｃｔ値、標準偏差である。
【００６４】
また、何点か測定した平均値を用いてもよくその場合には、下記式（４）が成立することを意味する。
【００６５】
2015192666.tif 000005
式中、標準偏差はσ１／√Ｎ１及びσ２／√Ｎ２で表わされ、Ｎ１及びＮ２はそれぞれモデル加工食品抽出ＤＮＡ及びポジティブコントロールの測定数である。
【００６６】
さらに、式（４）が成立する確率ｆ（ｚ）は、下記式（５）より求めることができ、その確率が試験方法の必要とする確率であればよい。
【００６７】
2015192666.tif 000006
【００６８】
上記飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡ、及びポジティブコントロールを所定のコピー数にて、それぞれ鋳型ＤＮＡとして用いて、同一のＰＣＲ条件及び反応液の組成を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を実施し、それぞれについてＣｔ値を得る。次いで、得られたＣｔ値を比較し、飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして得られるＣｔ値が、食物アレルゲン由来のＤＮＡ（ポジティブコントロール）を鋳型ＤＮＡとして得られるＣｔ値以下または未満である場合には、飲食品又は飲食品原材料より抽出されたＤＮＡ試料中に、ポジティブコントロールのコピー数以上またはポジティブコントロールのコピー数を上回るコピー数にて食物アレルゲン由来のＤＮＡが含まれることを示す。これにより当該飲食品又は飲食品原材料中に、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ以上の食物アレルゲンが含まれるものを陽性と判定できる。
【００６９】
本発明はまた、飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの有無をリアルタイムＰＣＲ法により判定する方法に用いられるキットに関し、当該キットは食物アレルゲン検出用のプライマーセット、及びポジティブコントロールとしての食物アレルゲン由来のＤＮＡを含む。
【００７０】
食物アレルゲン検出用のプライマーセットとしては、上記プライマーセットを挙げることができ、その一又は複数種を組み合わせて含めることができる。各プライマー又は各プライマーセットはそれぞれ別個の容器に収容することができる。各プライマー又は各プライマーセットは一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。各プライマー又は各プライマーセットは乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
【００７１】
食物アレルゲン由来のＤＮＡ（ポジティブコントロール）としては、上記食物アレルゲン由来のＤＮＡを挙げることができ、その一又は複数種を組み合わせて含めることができる。食物アレルゲン由来のＤＮＡはそれぞれ別個の容器に収容することができる。食物アレルゲン由来のＤＮＡは一回の使用量（すなわち、環状形態のものであれば２４コピー数を上回る量、好ましくは、２５コピー若しくはそれ以上、５０コピー若しくはそれ以上、又は１００コピー若しくはそれ以上、直鎖状形態のものであれば６コピー数を上回る量、好ましくは、６．２５コピー若しくはそれ以上、１２．５コピー若しくはそれ以上、又は２５コピー若しくはそれ以上）ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。食物アレルゲン由来のＤＮＡは乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
【００７２】
本発明のキットはさらに、リアルタイムＰＣＲによる増幅産物の検出を行うための蛍光標識されたプローブを含む。当該プローブとしては、上記プローブを挙げることができ、その一又は複数種を組み合わせて含めることができる。プローブはそれぞれ別個の容器に収容することができる。プローブは一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。プローブは乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
【００７３】
本発明のキットはさらに、ｄＮＴＰミックス、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、塩化マグネシウム、及び使用説明書より選択される一以上の要素を含めることができる。
【００７４】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１：リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品の選定
１）ＤＮＡ抽出量とＤＮＡ分解度の分析
リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品を選定する指標として、（１）ＤＮＡ抽出量と（２）ＤＮＡ分解度を用いることができる。加工食品はそれぞれ異なる原材料を含んでおり、食品毎に１ｇ（又は単位重量）あたりから抽出されてくるＤＮＡ量は異なる。そのため、同量のアレルゲンを含む食品であっても、抽出されたＤＮＡ量が多いもの程、希釈率が高くなるため、２０ｎｇ／μＬに調整した鋳型ＤＮＡ試料液中に含まれる食物アレルゲンのＤＮＡ濃度は低くなる。よって、ＤＮＡが多く抽出されるもの程、検査が難しい食品であるといえる。また、多くの加工食品では、食品自体のｐＨや加工による加熱などによりＤＮＡが短く分解されており、その程度も異なる。そのため、同量のアレルゲンを含む食品であっても、抽出されたＤＮＡの分解が進んでいるもの程、食物アレルゲンのＤＮＡ由来の標的配列を含むＤＮＡ分子の残存量は少なくなる。よって、ＤＮＡが短く断片化されているもの程、リアルタイムＰＣＲ検査が難しい食品であるといえる。
市販されているさまざまな種類の加工食品について、下記方法により抽出ＤＮＡ量とＤＮＡ分解度を求めた。
【００７６】
＜ＤＮＡ抽出量の算出＞
ＤＮＡ抽出はＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ２０／Ｇを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料約２ｇを５０ｍＬ容チューブに入れ、７．５ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｇ２、２０μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍＬ）、２００μＬのプロテイナーゼＫ溶液を加え混合後、５０℃にて２時間保温した。遠心分離により水層を回収し、予め１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、６ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＱＣでカラムを洗浄し、１ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＱＦでＤＮＡを溶出させてイソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ濃度を求め、食品２ｇから抽出されるＤＮＡ量（μｇ）を算出した。
【００７７】
＜ＤＮＡ分解度の分析＞
上記方法で抽出したＤＮＡ試料をＤＮＡ濃度２０ｎｇ／μＬとなるようにＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて適宜希釈した。それらＤＮＡ試料をＤＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）に負荷し、ＤＮＡ断片長によってそれぞれのＤＮＡを分離した。ＤＮＡ二重らせんにインターカレートする化合物を利用して得られた蛍光強度の極大値、および極大値に対応するＤＮＡ断片長（ｂｐ）を求めた。分析例を図１に示す。極大値に対応するＤＮＡ断片長は、ＤＮＡ分解が激しいほど短くなる。
【００７８】
２）市販の加工食品評価
市販の加工食品３８品の抽出ＤＮＡ量とＤＮＡ断片長を上記方法により分析した（表１）。
【００７９】
【表１】
2015192666.tif 000007
【００８０】
Ｘ軸に抽出ＤＮＡ量、Ｙ軸にＤＮＡ断片長としたグラフを用いて加工食品の評価を行い、検査の難しい加工食品を選定することとした。分析した各加工食品の結果（図２）から、グラフの一番右下にプロットされたあさり水煮（缶詰食品）を検査が難しい加工食品として見出した。あさり水煮の殺菌条件は、黒変リスクへの対応として１２０℃でＦ０値３５程度（日本缶詰協会発行「缶・びん詰・レトルト食品・飲料製造講義II（各論編）」平成１４年５月２０日）と設定されており、一般的な水産缶詰食品の殺菌条件とされるＦ０値５〜８程度と比べて非常に厳しいものとなっている。そのため、缶詰食品のあさり水煮は、他の食品に比べてＤＮＡ分解が進んでおり、リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品となっていると考えられる。
【００８１】
実施例２：食物アレルゲンを含むモデル加工食品の作製
リアルタイムＰＣＲ検査が難しいものとして選定された加工食品に含まれる食物アレルゲンを検出できる感度を持つＰＣＲ法であれば、それ以外の殆どの加工食品に含まれる食物アレルゲンも検出できると考えられる。そこで、上記で選定されたあさり水煮を模して作製した「一定量の食物アレルゲンを含むモデル加工食品」は、後述の陽性／陰性判定基準の設定に用いることができる。
【００８２】
消費者庁の『アレルギー物質を含む加工食品の表示ハンドブック（事業者向け）』には、食物アレルゲンのうち、重篤度・症例数の多い７品目（特定原材料）については省令で表示を義務付けし、飲食品又は飲食品原材料中に含まれる食物アレルゲンの総タンパク含量が一定量以上含まれている場合には表示が必要となる。なお、スクリーニング検査における食物アレルゲン陽性とは、食品採取重量１ｇあたりの食物アレルゲン由来のタンパク質含量が１０μｇ以上のものをいう。実施例１でリアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品として選定したあさり水煮について、食物アレルゲンタンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の特定原材料が含まれるものを確実に陽性と判定できれば、食物アレルゲン検査に必要な感度を十分確保しているといえる。
【００８３】
そこで、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の小麦、そば、落花生を添加して加工したあさり水煮加工食品を、食物アレルゲンを含むモデル加工食品（陽性モデル）として作製し、各定性リアルタイムＰＣＲ検査で確実に陽性と判定されるかを確認した。
【００８４】
＜小麦、そば、落花生粉末の作製と添加量＞
・小麦
添加する小麦は、農林６１号の全粒を用い、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に従って小麦粉末を作製した。あさり水煮モデル加工食品１５０ｇ相当の原料に添加する小麦粉末量は、１５．４５ｍｇとした。
【００８５】
・そば
添加するそばは、ダッタンそば又は普通そばを用いた。日本国内で食されているそば粉の主な種類に、更科そば粉、やぶそば粉、ダッタンそば粉がある。これら３種のそば粉を、実施例１と同様の操作により抽出した単位重量あたりのＤＮＡ抽出量は、ほぼ同等であったが、リアルタイムＰＣＲの検出感度を比較した結果、同量のＤＮＡからの増幅シグナルの立上がり（Ｃｔ値）はダッタンそば粉が遅かったため、一番検査が難しいと判断した。そこで、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に従ってダッタンそば粉末を添加試料の一つとして作製した。また、普通そばは更科そば粉、やぶそば粉の原料であり、最も流通量が多いことから、普通そば粉末も添加試料の一つとして作製した。あさり水煮モデル加工食品１５０ｇ相当の原料に添加するダッタンそば又は普通そばの粉末量は、いずれも２０．１６ｍｇとした。
【００８６】
・落花生
添加する落花生は、千葉県産落花生を用い、消費者庁が情報提供する「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」に従って落花生粉末を作製した。あさり水煮モデル加工食品１５０ｇ相当の原料に添加する落花生粉末量は、６．７５ｍｇとした。
【００８７】
＜食物アレルゲンを含むモデル加工食品の作製＞
あさり水煮加工食品は、日本缶詰協会発行の『缶・びん詰・レトルト食品・飲料製造講義II（各論編）』を参考とし、原料に上記量にて小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を添加して、アレルギー物質を含むモデル加工食品の作製を行った。すなわち、２Ｌ容ビーカーにクエン酸３ナトリウム４０ｇ、リン酸水素２ナトリウム２０ｇを量り入れ、２Ｌの蒸留水で攪拌溶解した液をあさり浸透液（ｐＨ８．８）とした。５００ｍＬ容ビーカーに塩化ナトリウム３．５６ｇ、クエン酸２．４ｇ、クエン酸３ナトリウム２．４ｇを量り入れ、４００ｍＬの蒸留水で攪拌溶解した液を調味液（ｐＨ３．９８）とした。寸胴鍋にたっぷりの水を沸騰させ、５００ｇ冷凍生あさりむき身を入れ３分間ボイルした。湯切り後のあさり重量を量り、あさり重量の２倍以上の浸透液に３０分以上浸漬させた。レトルトパウチに浸透液を軽く切ったあさり１００ｇ、調味料５０ｇ、上述の量の小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を入れ、密閉して混合した。蒸気式レトルト殺菌釜にて１２２℃にて３３分（Ｆ０値＝３５）殺菌後、１０分間の水冷却を行った。レトルトパウチから内容物を取り出し、ミルサーで粉砕均一化し、２ｇずつに分けて冷凍保存した。
以下、これをあさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）とする。なお、別途、小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を添加しない陰性モデルも作製した。
【００８８】
実施例３：あさり水煮モデル加工食品の評価
実施例２で得られたあさり水煮モデル加工食品が適切に作製されたことを確認するために、以下の評価を行った。
【００８９】
＜ＥＬＩＳＡ測定＞
作製したあさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）に各食物アレルゲンタンパク質が１０μｇ／ｇ含まれていることを確認するため、小麦、そば、落花生のＥＬＩＳＡ測定を行った。チューブに分注したうちの任意の２試料を２回反復で市販ＥＬＩＳＡキット（モリナガＦＡＳＰＥＫ特定原材料測定キット、森永生科学研究所社製）を用いてマニュアルに従って定量した。
【００９０】
その結果、そば粉末にダッタンそばを使用したモデルでは、小麦全タンパク質濃度は７．９μｇ／ｇ、８．５μｇ／ｇ、そば全タンパク質濃度は５．４μｇ／ｇ、５．９μｇ／ｇ、落花生全タンパク質濃度は７．０μｇ／ｇ、６．２μｇ／ｇとなり、おおよそ１０μｇ／ｇ量レベルの各食物アレルゲンタンパク質が含まれていることが確認できた。また、そば粉末に普通そばを使用したモデルでは、小麦全タンパク質濃度は９．９μｇ／ｇ、１１．２μｇ／ｇ、そば全タンパク質濃度は８．７μｇ／ｇ、９．５μｇ／ｇ、落花生全タンパク質濃度は６．８μｇ／ｇ、７．２μｇ／ｇとなり、このモデルでも、おおよそ１０μｇ／ｇ量レベルの各食物アレルゲンタンパク質が含まれていることが確認できた。なお、添加した食物アレルゲンはいずれも微量であり、正確な量を添加することが難しいこと、加工や食品中のマトリクスの食物アレルゲンタンパク質濃度の測定への影響が考えられることから、タンパク質濃度として各１０μｇ／ｇ相当量の食物アレルゲンを添加した場合でも必ずしも１０μｇ／ｇとはならなかった。一方、陰性モデルには小麦、そば、落花生タンパク質が含まれていないことを確認した。
【００９１】
＜市販品との比較＞
食品メーカー３社から販売されている市販品あさり水煮缶と作製したあさり水煮モデル加工食品（小麦、ダッタンそば、落花生を添加した陽性モデル、および陰性モデル）を、実施例１の方法により、抽出ＤＮＡ量と分解程度を分析し、加工食品の検査の難しさ評価グラフにプロットした結果（図３）、モデル加工食品は市販品と近い位置にプロットされることが確認された。また、モデル加工食品と市販品とで、あさり重量割合、粉砕して測定したｐＨに大差ないことが確認できた（表２）。これらの結果より、作製したあさり水煮モデル加工食品は、市販品と同様に、リアルタイムＰＣＲ検査が難しい加工食品の一つとして妥当と判断した。
【００９２】
【表２】
2015192666.tif 000008
【００９３】
＜動物ＰＣＲ測定＞
作製したあさり水煮モデル加工食品からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅によるＤＮＡ品質の確認を行った。ＤＮＡ抽出は実施例１のＤＮＡ抽出法と同様の操作で行った。ＰＣＲ増幅確認は消費者庁通知の『アレルギー物質を含む食品の検査方法』に記載されている動物検出用ＰＣＲプライマー及び反応条件を用いて、ＤＮＡが増幅されることを確認した。
【００９４】
＜定性リアルタイムＰＣＲ検査＞
上記で抽出したＤＮＡを小麦検出、そば検出、落花生検出（配列番号９、１０、１１または配列番号２２、２３、２４に示されるプライマー、プローブ)のリアルタイムＰＣＲ検査に供し、作製したあさり水煮モデル加工食品への小麦、そば、落花生粉末の添加の有無によって、Ｃｔ値が得られる／得られないことを確認した。
【００９５】
リアルタイムＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用い、二機種のリアルタイムＰＣＲ装置（ライフテクノロジーズ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ及びロシュ・ダイアグノスティクス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏ）により、以下の方法で行った。
【００９６】
鋳型ＤＮＡは５０ｎｇ  ＤＮＡとなるように加えた。また、各鋳型ＤＮＡ濃度において、２点併行で測定した。
【００９７】
ＰＣＲ装置はライフテクノロジーズ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴを用い、ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用の９６穴ＰＣＲプレートを用いた。ＰＣＲ反応液を入れた容器をリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９５℃，３０秒（変性）に続いて６８℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４５回繰り返して反応させた。ただし、配列番号２２、２３、２４のプライマー・プローブセットの場合はサイクル数を４０回とした。反応終了後、伸長ステップ後に取得した蛍光データを解析した。解析条件は装置に付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。
【００９８】
・小麦
小麦検出の定性リアルタイムＰＣＲでは、１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、配列番号１のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号２のプライマーを終濃度で０．１μＭと、配列番号３と配列番号４のプライマーを終濃度でそれぞれ０．０５μＭと、配列番号５のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。
【００９９】
＜小麦検出用のプライマー及びプローブ＞
配列番号１：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＣ−３’
配列番号２：５’−ＡＡＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＣＴＧ−３’
配列番号３：５’−ＴＧＡＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＣＣＧＧＣＴＧ−３’
配列番号４：５’−ＴＧＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＣＴＧ−３’
配列番号５：５’−ＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＣＩＴＴＧＡＴＡＡＡＧ−３’
【０１００】
・そば
そば検出の定性リアルタイムＰＣＲでは、１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、配列番号６のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号７のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号８のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。
【０１０１】
＜そば検出用のプライマー及びプローブ＞
配列番号６：５’−ＣＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＴ−３’
配列番号７：５’−ＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧ−３’
配列番号８：５’−ＣＧＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣ−３’
【０１０２】
・落花生
落花生検出の定性リアルタイムＰＣＲでは、１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、配列番号９のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号１０のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号１１のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。あるいは、１２．５μＬの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、配列番号２２のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号２３のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号２４のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした。
【０１０３】
＜落花生検出用のプライマー及びプローブ＞
配列番号９：５’−ＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡ−３’
配列番号１０：５’−ＧＴＣＧＣＣＣＣＧＡＣＣＧＧＡＴＧＣ−３’
配列番号１１：５’−ＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣ−３’
配列番号２２：５’−ＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＧＣＴＣ−３’
配列番号２３：５’−ＣＡＣＧＡＧＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＧＡＣＣ−３’
配列番号２４：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧ−３’
【０１０４】
結果、小麦、ダッタンそば又は普通そば、落花生粉末を添加した陽性モデルは蛍光シグナルの上昇によりＣｔ値が認められ、一方、小麦、そば、落花生粉末を添加しなかった陰性モデルは蛍光シグナルが上昇せず、Ｃｔ値が認められなかった。
以上の評価結果から、小麦、そば、落花生粉末を添加したあさり水煮モデル加工食品が適切に作製されたと判断した。
【０１０５】
実施例４：陽性／陰性判定基準とするポジティブコントロールプラスミドＡの作製
小麦ＰＣＲ、そばＰＣＲ、落花生ＰＣＲ(配列番号９、１０、１１に示されるプライマー、プローブ)の標的ＤＮＡ配列をそれぞれ含む３つの増幅産物をＰＣＲにより１つに連結して、それをＴＡクローニングベクターに導入して、大腸菌に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミドを精製して、導入した塩基配列を確認した。
【０１０６】
１）小麦、そば、落花生のＰＣＲ標的ＤＮＡ配列をそれぞれ含む増幅産物の作製
小麦のＰＣＲ標的ＤＮＡ配列を含む増幅産物を得るためのＰＣＲは、１２．５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、プライマーセットとして配列番号１（上記小麦フォワードプライマー）と配列番号１２（制限酵素消化部位＋小麦リバースプライマー）をそれぞれ終濃度で０．２μＭと、鋳型ＤＮＡとして普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来ＤＮＡを用い、最終的に滅菌超純水で２５μＬとしてＰＣＲ反応液を入れた容器をＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９４℃，３０秒（変性）に続いて６６℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４５回繰り返して反応させた。
【０１０７】
そばのＰＣＲ標的ＤＮＡ配列を含む増幅産物を得るためのＰＣＲは、１２．５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、プライマーセットとして配列番号１３（制限酵素消化部位＋そばフォワードプライマー）と配列番号１４（制限酵素消化部位＋そばリバースプライマー）をそれぞれ終濃度で０．２μＭと、鋳型ＤＮＡに普通そば（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）由来ＤＮＡを用い、最終的に滅菌超純水で２５μＬとしてＰＣＲ反応液を入れた容器をＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９４℃，３０秒（変性）に続いて６６℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４５回繰り返して反応させた。
【０１０８】
落花生のＰＣＲ標的ＤＮＡ配列を含む増幅産物を得るためのＰＣＲは、１２．５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、プライマーセットとして配列番号１５（制限酵素消化部位＋配列番号９の落花生フォワードプライマーを含む）と配列番号１０（上記落花生リバースプライマー）をそれぞれ終濃度で０．２μＭと、鋳型ＤＮＡに落花生（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）由来ＤＮＡを用い、最終的に滅菌超純水で２５μＬとしてＰＣＲ反応液を入れた容器をＰＣＲ装置にセットし、９５℃，１５分の後、９４℃，３０秒（変性）に続いて６４℃，１分（アニーリングおよび伸長ステップ）を行うサイクルを４５回繰り返して反応させた。
以下に、本実施例にて新たに合成・使用したプライマー配列を記す。
【０１０９】
配列番号１２：５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＧ−３’
配列番号１３：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧ−３’
配列番号１４：５’−ＡＡＧＣＴＴＣＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＴＧＧ−３’
配列番号１５：５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣ−３’
【０１１０】
２）小麦、そば、落花生ＰＣＲ増幅産物の連結
上記で得られた３つのＰＣＲ産物を、Ｊａｙａｒａｍａｎ  Ｋら（１９９２．Ａ  ＰＣＲ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｏｎｌｙ  Ｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｎｄｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２―３９８）の方法を参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ  Ｋｉｔを用いて以下の方法により連結し、連結ＤＮＡを作製した。
【０１１１】
まず、小麦ＰＣＲ産物とそばＰＣＲ産物を連結するためのＰＣＲは、１２．５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘにさらにｄＮＴＰを終濃度で５００μＭとなるように加えたものに、配列番号１２（制限酵素消化部位＋小麦リバースプライマー）と配列番号１３（制限酵素消化部位＋そばフォワードプライマー）をアウタープライマーとしてそれぞれ終濃度で１μＭずつ、配列番号１６をブリッジプライマーとして終濃度で２５ｎＭずつ加え、鋳型ＤＮＡとして上記小麦ＰＣＲの増幅産物１μＬと上記そばＰＣＲの増幅産物１μＬを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした反応用溶液を作製して、０．２ｍＬマイクロチューブでＰＣＲを行なった。ＰＣＲはライフテクノロジーズ社製のサーマルサイクラーＶｅｒｉｔｉにより、９５℃，１５分（酵素活性化）の後、９５℃，１分（変性）、４０℃，１分（アニーリング）、７２℃，１分（伸長）のサイクルを１５回繰り返し、さらに９５℃，１分（変性）、６６℃，１分（アニーリング）、７２℃，１分（伸長）のサイクルを３０回繰り返して反応させた。得られたＰＣＲ反応液を島津製作所製のＭｕｌｔｉＮＡ  ＭＣＥ−２０２により電気泳動し解析した。
【０１１２】
次に、上記で作製した小麦ＰＣＲ産物とそばＰＣＲ産物の連結された産物と、落花生ＰＣＲ産物を連結するためのＰＣＲは、１２．５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘにさらにｄＮＴＰを終濃度で５００μＭとなるように加えたものに、配列番号１２（制限酵素消化部位＋小麦リバースプライマー）と配列番号１７（制限酵素消化部位＋配列番号９の落花生フォワードプライマーを含む）をアウタープライマーとしてそれぞれ終濃度で１μＭ、配列番号１８をブリッジプライマーとして終濃度で２５ｎＭとなるように加え、鋳型ＤＮＡとして上記小麦ＰＣＲ産物とそばＰＣＲ産物の連結された増幅産物１μＬと落花生ＰＣＲの増幅産物１μＬを加え、最終的に滅菌超純水で２５μＬとした反応用溶液を作製して、０．２ｍＬマイクロチューブでＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、上記小麦ＰＣＲ産物とそばＰＣＲ産物の連結と同じ条件で行なった。得られたＰＣＲ反応液を島津製作所製のＭｕｌｔｉＮＡ  ＭＣＥ−２０２により電気泳動し解析した。
結果、予想された約２７５ｂｐ付近のＰＣＲ増幅産物が得られた（データ省略）。
以下に、本実施例にて新たに合成・使用したプライマー配列を記す。
【０１１３】
配列番号１６：５’−ＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＣ−３’
配列番号１７：５’−ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＧＧＡＡＡＣ−３’
配列番号１８：５’−ＴＣＣＧＧＴＣＧＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧ−３’
【０１１４】
３）連結ＰＣＲ産物のプラスミドへの導入と塩基配列解析
上記で得られた連結ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒにＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）に形質転換した。コロニーＰＣＲにより小麦、そば、落花生ＰＣＲの標的ＤＮＡ配列を含む約２７７ｂｐの挿入断片が含まれていることを確認できた。導入断片を持つ形質転換体をＬＢ培地で液体培養して、菌体からＱＩＡＧＥＮ社製のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出、精製した。なお、精製したプラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列は、プラスミド上にある配列のプライマーを用いた両鎖シークエンスにより解析した結果、意図した通り、形質転換体のプラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列には、小麦ＰＣＲ、そばＰＣＲ、落花生ＰＣＲ（配列番号９、１０、１１に示されるプライマー、プローブ)の標的ＤＮＡ配列がそれぞれ含まれていることが確認できた。
【０１１５】
４）ポジティブコントロールプラスミドのコピー数の算出と濃度調整
プラスミド溶液のコピー数ベースでの濃度は、分光光度計で測定された２６０ｎｍの吸光度「Ａ２６０値」、一般的な吸光度とＤＮＡ濃度の関係式「２６０ｎｍの吸光度１におけるＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μＬ」、プラスミドの長さ「３，２９２ｂｐ」、ＤＮＡの平均分子量「６６０／塩基対」から下記式（２’）により算出した。ＰＣＲ反応の鋳型とするプラスミド溶液の濃度調整は、サケ精子ＤＮＡ  ２０ｎｇ／μＬ含有ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて希釈した。
【０１１６】
2015192666.tif 000009
【０１１７】
実施例５：陽性／陰性判定基準とする、ポジティブコントロールプラスミドＢの作製
小麦ＰＣＲ、そばＰＣＲ、及び落花生ＰＣＲ(配列番号２２、２３、２４に示されるプライマー、プローブ)の標的ＤＮＡ配列をそれぞれ含む配列を人工遺伝子合成装置にて直列に合成し、クローニングベクターに導入して、大腸菌に形質転換した。形質転換した大腸菌からプラスミドを精製して、導入した塩基配列を確認した。
【０１１８】
１）小麦、そば、落花生のＰＣＲ標的ＤＮＡ配列をそれぞれ含む配列の作製
人工遺伝子作製サービス（ファスマック社）に委託して、下記配列をｐＵＣ１９のＳｍａＩサイトに含む環状プラスミドを作製した。
配列番号２６：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＴＴＡＴＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＴＣＴＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣＧＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＴＣＧＴＧ−３’
【０１１９】
なお、作製したプラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列には、プラスミド上にある配列のプライマーを用いた両鎖シークエンスにより解析した結果、意図した通り、小麦ＰＣＲ、そばＰＣＲ、及び落花生ＰＣＲ(配列番号２２、２３、２４に示されるプライマー、プローブ)の標的ＤＮＡ配列がそれぞれ含まれていることが確認できた。
【０１２０】
２）ポジティブコントロールプラスミドＢの制限酵素消化による、直鎖状プラスミドの作製
プラスミドに組込まれた配列の増幅は、直鎖状プラスミドの方が、環状プラスミドよりも早いサイクル数で増幅することが知られている。そこで、制限酵素消化によって直鎖状プラスミドを作製した。
【０１２１】
上記で得られたポジティブコントロールプラスミドの溶液２０μＬに対して、１μＬのＢａｍＨＩ  ３―２０Ｕ／μＬ（東洋紡ライフサイエンス社製）、２．４５μＬの１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、最終的に滅菌水で２４．５μＬとし、３７℃にて、１時間の反応を行った。反応後のプラスミドはＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【０１２２】
３）ポジティブコントロールプラスミドの吸光度によるコピー数の算出と濃度調整
プラスミド溶液のコピー数ベースでの濃度は、分光光度計で測定された２６０ｎｍの吸光度「Ａ２６０値」、一般的な吸光度とＤＮＡ濃度の関係式「２６０ｎｍの吸光度１におけるＤＮＡ濃度５０ｎｇ／μＬ」、プラスミドの長さ「２,９２２ｂｐ」、ＤＮＡの平均分子量「６６０／塩基対」から下記式（２’’）により算出した。ＰＣＲ反応の鋳型とするプラスミド溶液の濃度調整は、サケ精子ＤＮＡ  ２０ｎｇ／μＬ含有ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて希釈した。
【０１２３】
2015192666.tif 000010
【０１２４】
４）ポジティブコントロールプラスミドＢのＤｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲによるコピー数の算出
ＰＣＲ反応液は、１５μＬのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ  ３Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，２Ｘ（ライフテクノロジーズジャパン社製）に、そば検出用である、配列番号６のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号７のプライマーを終濃度で０．２μＭと、配列番号８のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．１μＭ、鋳型ＤＮＡは直鎖状ポジティブコントロールプラスミドを用い、量は吸光度から計算された量で１０００コピー／μＬとなる濃度をＰＣＲ反応液に１２μＬ（２／５量）加え、最終的に滅菌超純水で３０μＬとした。
【０１２５】
ＰＣＲ反応液を入れる容器は専用のチップ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ  ３Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ２０Ｋ  Ｃｈｉｐ、ライフテクノロジーズジャパン社製）を用いた。上記のＰＣＲ反応液を２つのチップに等量入れ、容器をＤｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ装置（ＰｒｏＦｌｅｘＴＭ  ２ｘ  Ｆｌａｔ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ライフテクノロジーズジャパン社製）にセットし、９６℃，１０分（酵素活性化）の後、６０℃，２分（アニーリング）、９８℃，０．５分（変性）のサイクルを３９回繰り返したのち、６０℃，２分（アニーリング）を行って反応させた。反応終了後、専用の装置（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ  ３Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ライフテクノロジーズジャパン社製）で蛍光データを取得し解析した。
結果、吸光度から計算された量が１０００コピー／μＬとなるＤＮＡ溶液は、Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲで検出された標的配列の濃度は５９８コピー／μＬと算出された。
【０１２６】
実施例６：モデル加工食品中における小麦、そば、落花生の定性リアルタイムＰＣＲの陽性／陰性判定
１）小麦、そば、落花生の定性リアルタイムＰＣＲ反応
実施例３で得られたあさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）ＤＮＡと、実施例４又は実施例５で得られたポジティブコントロールプラスミドＡ又はＢをそれぞれ鋳型として、小麦ＰＣＲ、そばＰＣＲ、落花生ＰＣＲ（ポジティブコントロールプラスミドＡの時は配列番号９、１０、１１のプライマー、プローブ；ポジティブコントロールプラスミドＢの時は配列番号２２、２３、２４のプライマー、プローブ）の定性リアルタイムＰＣＲを行ない、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の食物アレルゲンを含むあさり水煮モデルを陽性と判定するポジティブコントロールプラスミドのコピー数を決定した。リアルタイムＰＣＲは、実施例３に示した方法で行い、ポジティブコントロールＢを用いる場合のみサイクル数を４０とした。
【０１２７】
鋳型ＤＮＡには、あさり水煮モデル加工食品抽出ＤＮＡの場合は５０ｎｇ  ＤＮＡとなるように、プラスミドの場合は反応液中のコピー数が２４，２５，５０，６０，１００，１２０コピーとなるように加えた。また、各鋳型ＤＮＡ濃度において、１６点併行で測定した。
【０１２８】
ＰＣＲ反応液を入れる容器は、ライフテクノロジーズ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴでは専用の９６穴ＰＣＲプレートを用い、ロシュ・ダイアグノスティクス社製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏでは専用の８連ＰＣＲチューブを用いた。ＰＣＲ反応液を入れた容器をリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、実施例３に示したＰＣＲ温度条件（ポジティブコントロールＢを用いる場合のみサイクル数を４０）で反応させた。反応終了後、伸長ステップ後に取得した蛍光データを解析した。解析条件はそれぞれの装置に付属する解析ソフトのデフォルト条件で行った。なお、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＮａｎｏでＣｑ値と呼ばれる値は、Ｃｔ値と読み替えた。
【０１２９】
２）ＰＣＲ結果の統計解析と陽性／陰性判定基準の設定
＜ＰＣＲ結果の解析方法＞
まず、あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）ＤＮＡ  ５０ｎｇとポジティブコントロールプラスミド２４，２５，５０，６０，１００，１２０コピーそれぞれの試料について「１６回併行測定したＣｔ値」から平均値（Ｘ）、標準偏差（σ）を算出した。次に、実際の食物アレルゲン検査において同一試料を２回併行測定することを想定して、これらの値から「２回併行測定したＣｔ値の平均」の平均値Ｘ、標準偏差σ／√２を求めた。最後に、あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）の下限Ｃｔ値とプラスミド上限Ｃｔ値が重ならない標準偏差の最大の係数ｚを下記式（４’）で求め、式（４’）が成立する確率ｆ（ｚ）を下記式（５）で求めた。なお、Ｃｔ値の解析条件はそれぞれの装置に付属する解析ソフトのデフォルト条件で行ない、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＮａｎｏでＣｑ値と呼ばれる値は、Ｃｔ値と読み替えた。
【０１３０】
2015192666.tif 000011
2015192666.tif 000012
【０１３１】
・Ｘ１、σ１：あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）抽出ＤＮＡの平均Ｃｔ値、標準偏差
あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）は、実施例４のポジティブコントロールプラスミドＡと比較した場合はそば粉末にダッタンそばを使用したモデルを用い、実施例５のポジティブコントロールプラスミドＢと比較した場合はそば粉末に普通そばを使用したモデルを用いた。
・Ｘ２、σ２：ポジティブコントロールプラスミドの平均Ｃｔ値、標準偏差
【０１３２】
＜解析結果に基づく陽性／陰性判定基準の設定＞
ポジティブコントロールプラスミド２４，２５，５０，６０，１００，１２０コピー／反応液、あさり水煮モデル加工食品抽出ＤＮＡをそれぞれ１６点併行測定し、得られたＣｔ値から、式（５）により式（４’）が成立する確率を算出した結果を下記表３に示す。
【０１３３】
【表３】
2015192666.tif 000013
【０１３４】
また、実施例５のポジティブコントロールプラスミドＢについて、直鎖状の形態にある２５コピー／反応液と、環状の形態にある１００コピー／反応液のＣｔ値、標準偏差を比較した結果を下記表４に示す。
【０１３５】
【表４】
2015192666.tif 000014
【０１３６】
７９００ＨＴ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏで試験したポジティブコントロールプラスミドＡ（環状）２４，５０，６０，１００，１２０コピー／反応液の何れでも、ならびに、ポジティブコントロールプラスミドＢ（直鎖状）２５コピー／反応液及び（環状）１００コピー／反応液の何れでも、あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）抽出ＤＮＡを高い確率（例えば９９．７％以上、３σ）で陽性と判定できることが示された。ポジティブコントロールプラスミドＡ（環状）の場合の一部、そばＰＣＲ／７９００ＨＴと小麦ＰＣＲ／ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｎａｎｏで９９．７％、３σを下回る確率となったが、他の結果から標準偏差のバラツキの範囲と考えられた。
【０１３７】
ポジティブコントロールプラスミドＢ（直鎖状）の２５コピー／反応液は、ポジティブコントロールプラスミドＢ（環状）の１００コピー／反応液と同等のＣｔ値、標準偏差であり、この結果より、直鎖状の形態とすることで、環状の形態の１／４量のコピー数でも同等の結果が得られることが示された。
【０１３８】
プラスミドＡ（環状）の２４コピー／反応液は、３種のリアルタイムＰＣＲともに９９．７％、３σを達成できたものの、バラツキが大きく、１０コピー以下に相当するＣｔ値が得られる場合もあったことから、環境由来コンタミネーションに起因する蛍光シグナルを偽陽性とする可能性が高いと考えた。
【０１３９】
以上の結果より、ポジティブコントロールプラスミドが環状の場合は、２４コピーを上回るコピー、より詳細には５０コピー以上で得られるＣｔ値を陽性／陰性判定基準とすることで、あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）抽出ＤＮＡを二機種のリアルタイムＰＣＲ装置において高い確率で陽性と判定できることを示せた。このことから、検査の難しいモデル加工食品（陽性モデル）を陽性と判定できる量のポジティブコントロールプラスミドから得られるＣｔ値以下または未満となる加工食品を陽性と判定することで、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ以上の小麦、そば、落花生を含む様々な加工食品を見落としなく陽性と判定することができることが示された。
【０１４０】
なお、ポジティブコントロールプラスミドが直鎖状の場合は、１／４量のコピー数でも環状の１量のコピー数と同等の結果が得られることから、上記環状での「２４コピーを上回るコピー」、「５０コピー以上」は、それぞれ直鎖状では「６コピーを上回るコピー」、「１２．５コピー以上」と読み替えることができる。
【０１４１】
実施例７：モデル加工食品中における小麦、そば、落花生のコピー数測定
１）小麦、そば、落花生の定性リアルタイムＰＣＲ反応
実施例３で得られたあさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）ＤＮＡ、実施例４で得られたポジティブコントロールプラスミドＡ、実施例５で得られた直鎖状のポジティブコントロールプラスミドＢをそれぞれ鋳型として、小麦、そば、落花生のリアルタイムＰＣＲを行ない、タンパク質濃度として１０μｇ／ｇ相当量の食物アレルゲンを含むあさり水煮モデルに含まれる標的配列のコピー数をそれぞれ測定した。リアルタイムＰＣＲは、機種はライフテクノロジーズ社製ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴを用い、実施例３に示した方法で行い、ポジティブコントロールＢを用いる場合のみサイクル数を４０とした。
【０１４２】
鋳型ＤＮＡには、あさり水煮モデル加工食品抽出ＤＮＡの場合は５０ｎｇ  ＤＮＡとなるように、実施例４で得られたポジティブコントロールプラスミドＡの場合は反応液中のコピー数が２０，５０，１００，１０００，１００００，１０００００コピーとなるように、実施例５で得られた直鎖状のポジティブコントロールプラスミドＢの場合は反応液中のコピー数が２５，３２００，６４００，１００００コピーとなるように加えた。また、あさり水煮ＤＮＡは１６点併行で未知試料として測定し、プラスミドの各鋳型ＤＮＡは、実施例４で得られたポジティブコントロールプラスミドＡの場合はいずれのコピー数の試料も２点併行で、実施例５で得られた直鎖状のポジティブコントロールプラスミドＢの場合は２５コピーについては１６点併行、３２００，６４００，１００００コピーについてはいずれも２点併行で標準試料として測定した。
また、あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）は、実施例４のポジティブコントロールプラスミドＡと比較した場合は、そば粉末にダッタンそばを使用したモデルを用い、実施例５の直鎖状のポジティブコントロールプラスミドＢと比較した場合は、そば粉末に普通そばを使用したモデルを用いた。
【０１４３】
２）ＰＣＲ結果
まず、あさり水煮モデル加工食品（陽性モデル）ＤＮＡ  ５０ｎｇについて「１６回併行測定したＣｔ値」から平均Ｃｔ値を算出した。解析結果から得られた検量線を用いて平均Ｃｔ値からコピー数を算出した結果、あさり水煮ＤＮＡ  ５０ｎｇ中の小麦、そば、落花生標的配列のコピー数は、実施例４で得られたポジティブコントロールプラスミドＡから計算した場合でそれぞれ４２７，１９９，４８５コピーであり、実施例５で得られた直鎖状のポジティブコントロールプラスミドＢから計算した場合でそれぞれ１４０，１４６，６３コピーと算出された。
【図１】
2015192666.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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