(57)【要約】【課題】血液サンプル中のＲＡＳのステイタスを指標として、被験者のＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する方法の提供。【解決手段】被験者の腫瘍に対するＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する方法であって、（ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＲＡＳ遺伝子由来核酸等が存在するか否か、及び当該血液サンプル中のＲＡＳが、野生型か変異型かを決定する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において、前記血液サンプル中に、野生型のＲＡＳ遺伝子由来核酸等が検出され、かつ変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸等が検出されなかった場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が高いと判定し、前記血液サンプル中に、変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸等が検出された場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が低いと判定する工程とを有する、ＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の腫瘍に対するＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する方法であって、
（ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が存在するか否か、及び当該血液サンプル中のＲＡＳが、野生型か変異型かを決定する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において、
前記血液サンプル中に、野生型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が高いと判定し、
前記血液サンプル中に、変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が低いと判定する工程と、
を有することを特徴とする、ＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項２】
前記被験者が、過去に、腫瘍部分の外科的切除処置又はＶＥＧＦ阻害剤投与処置を受けたことがあることを特徴とする、請求項１に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項３】
前記ＲＡＳが、ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、又はＮＲＡＳである、請求項１又は２に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項４】
前記被験者が、ＶＥＧＦ阻害剤以外の薬剤の投与処置を受けたことがある、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項５】
前記被験者が、ＶＥＧＦ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＶＥＧＦ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けた腫瘍患者であり、
前記血液サンプルが、前記腫瘍患者が再びＶＥＧＦ阻害剤投薬処置を受けようとする前に採取されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項６】
前記他の抗腫瘍療法が化学療法剤の投薬治療である、請求項５に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項７】
前記化学療法剤が、フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタモキシフェンからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項６に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項８】
前記他の抗腫瘍療法が放射線治療である、請求項５に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項９】
前記他の抗腫瘍療法が、前記被験者に既に投薬されたＶＥＧＦ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療である、請求項５に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１０】
前記分子標的薬剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブからなる群より選択される１種又は２種以上である、請求項９に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１１】
前記他の抗腫瘍療法が、前記分子標的薬剤の投薬治療と、化学療法剤の投薬治療との併用療法である、請求項９又は１０に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が、再発性腫瘍である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、転移巣である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が、原発巣である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上である、１〜１４のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が、前記被験者の体内の複数個所に存在している、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１７】
前記変異型が、ＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｓ２、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、及びＡ１４６Ｖからなる群より選択される１又は２以上である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１８】
前記血液サンプル中のＲＡＳの存在の有無、及び野生型か変異型かの決定を、当該血液サンプル中の循環ＤＮＡから、野生型のＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否か、及び変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べることにより行う、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【請求項１９】
前記血液サンプルが、末梢血液、血清、血漿である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者から低侵襲的に採取された生体サンプル中のＲＡＳ蛋白質の遺伝子型を調べることにより、当該被験者のＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成（胚形成期に、血管がないところに新たに血管がつくられること）及び血管新生（既存の血管から分枝伸長して血管を形成すること）に関与する一群の糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞成長因子、血管内皮増殖因子、血管内皮成長因子などと呼ばれることもある。ＶＥＧＦは主に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体 （ＶＥＧＦＲ） にリガンドとして結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させたりする働きを有しており、単球・マクロファージの活性化にも関与する。ＶＥＧＦは、正常な体の血管新生に関わる他、腫瘍の血管形成や転移など、悪性化の過程にも関与している。
【０００３】
脈管形成や血管新生、リンパ管新生に関与する増殖因子には、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰｌＧＦ（胎盤増殖因子、ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−１、ＰｌＧＦ−２の７つがあり、これらはまとめて「ＶＥＧＦファミリー」と呼ばれる。単にＶＥＧＦという場合、ＶＥＧＦ−Ａを指すこともある。さらに、いくつかのＶＥＧＦファミリーメンバーは、オルタナティブスプライシングによりいくつかの亜型が存在する。例えばＶＥＧＦ−Ａは、ヒトでは通常アミノ酸数が１２１個 (ＶＥＧＦ−Ａ１２１)、１６５個 (ＶＥＧＦ−Ａ１６５)、１８９個 (ＶＥＧＦ−Ａ１８９)、２０６個 （ＶＥＧＦ−Ａ２０６）の４種類が存在する（非特許文献１）他、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ-Ａ１８３といった稀な亜型も報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
ＶＥＧＦは、血管新生の中心的な促進因子であり、ＶＥＧＦシグナル伝達系が血管新生制御の分子標的として注目されている。ＶＥＧＦは、癌を含む様々な細胞において、主に低酸素条件下に転写因子ＨＩＦ−１（ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １）によって発現が誘導される。ｍＲＮＡのスプライシングの違いによって、いくつかのサイズのホモ二量体としてとして産生、分泌された後、主に受容体型チロシンキナーゼのＶＥＧＦ２型受容体を介して血管内皮細胞の遊走・増殖を促進するばかりか、血管透過性も亢進させる。
【０００５】
これまで、いくつかの研究グループがＶＥＧＦの奏効性予測マーカーを挙げているが、決定的な候補となるものは未だ報告されていない。Ｉｎｃｅ ＷＬらは、臨床第III相試験によって、転移性結腸・直腸癌患者のｆｉｒｓｔ ｌｉｎｅ治療において、ＬＶ／５−ＦＵ＋ＣＰＴ−１１併用療法（ＩＦＬ ｒｅｇｉｍｅｎ）に抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体ベバシツマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）を追加すると、ＯＳ中央値が延長することを報告した（ＩＦＬ＋ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ群 とＩＦＬ／プラセボ群との比較試験、非特許文献３参照。）。また、彼らは、本試験の参加者を対象として、ＫＲＡＳ、ｂ−ＲＡＦ、ｐ５３の変異状況、又は核内ｐ５３過剰発現が、ベバシツマブの治療効果を予測するバイオマーカーとなりうるかを評価するために、後ろ向き解析を行った。
【０００６】
また、ヨハンセンらは、癌関連遺伝子の変異とＶＥＧＦ阻害剤の感受性や長期奏功性の関連を調べ、腫瘍組織中の癌関連遺伝子変異が、消化癌におけるＶＥＧＦ阻害剤の感受性や長期奏功性を予測するマーカーとして機能することを報告している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５０２２８５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tischer E, et al.，Journal of Biological Chemistry，vol.266，1991，p.11947−11954.
【非特許文献２】Neufeid G, et al.，FASEB Journal，vol.13，1999，p.9−22.
【非特許文献３】Ince WL，et al.，Journal of the National Cancer Institute，vol. 97(13)，2005，p.981−989.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腫瘍（癌）の患者における血管新生阻害剤として機能するＶＥＧＦ阻害剤の奏効性を、当該患者の腫瘍組織におけるＲＡＳのステイタスにかかわらず、当該患者の末梢血中のＲＡＳのステイタスを指標として予測する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、癌患者において、ＶＥＧＦ阻害剤を投与した時、腫瘍組織中のＲＡＳのステイタスが変異型で、末梢血中のＲＡＳのステイタスが野生型の場合、ＶＥＧＦ阻害剤が顕著に長期奏効すること、及びＶＥＧＦの腫瘍組織中においてＲＡＳの変異型が検出されないにもかかわらず、末梢血中に変異型のＲＡＳが検出された患者では、ＶＥＧＦ阻害剤の奏効性が低いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明に係るＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法は、下記（１）〜（１９）である。
（１）  被験者の腫瘍に対するＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する方法であって、
（ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が存在するか否か、及び当該血液サンプル中のＲＡＳが、野生型か変異型かを決定する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において、前記血液サンプル中に、野生型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が高いと判定し、前記血液サンプル中に、変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が低いと判定する工程と、
を有することを特徴とする、ＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（２）  前記被験者が、過去に、腫瘍部分の外科的切除処置又はＶＥＧＦ阻害剤投与処置を受けたことがある、前記（１）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（３）  前記ＲＡＳが、ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、又はＮＲＡＳである、前記（１）又は（２）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（４）  前記被験者が、ＶＥＧＦ阻害剤以外の薬剤の投与処置を受けたことがある、前記（１）〜（３）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（５）  前記被験者が、ＶＥＧＦ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＶＥＧＦ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けた腫瘍患者であり、
前記血液サンプルが、前記腫瘍患者が再びＶＥＧＦ阻害剤投薬処置を受けようとする前に採取されたものである、前記（１）〜（３）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（６）  前記他の抗腫瘍療法が化学療法剤の投薬治療である、前記（５）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（７）  前記化学療法剤が、フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタモキシフェンからなる群より選択される１種又は２種以上である、前記（６）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（８）  前記他の抗腫瘍療法が放射線治療である、前記（５）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（９）  前記他の抗腫瘍療法が、前記被験者に既に投薬されたＶＥＧＦ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療である、前記（５）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１０）  前記分子標的薬剤が、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブからなる群より選択される１種又は２種以上である、前記（９）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１１）  前記他の抗腫瘍療法が、前記分子標的薬剤の投薬治療と、化学療法剤の投薬治療との併用療法である、前記（９）又は（１０）のＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１２）  前記腫瘍が、再発性腫瘍である、前記（１）〜（１１）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１３）  前記腫瘍が、転移巣である、前記（１）〜（１１）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１４）  前記腫瘍が、原発巣である、前記（１）〜（１１）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１５）  前記腫瘍が、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上である、前記（１）〜（１４）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１６）  前記腫瘍が、前記被験者の体内の複数個所に存在している、前記（１）〜（１５）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１７）  前記変異型が、ＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｓ２、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、及びＡ１４６Ｖからなる群より選択される１又は２以上である、前記（１）〜（１６）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１８）  前記血液サンプル中のＲＡＳの存在の有無、及び野生型か変異型かの決定を、当該血液サンプル中の循環ＤＮＡから、野生型のＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否か、及び変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べることにより行う、前記（１）〜（１７）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
（１９）  前記血液サンプルが、末梢血液、血清、血漿である、前記（１）〜（１８）のいずれかのＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法により、被験者に対する侵襲性が低い生体サンプルから、被験者においてＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功するか否かを精度よく予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において行った、ＶＥＧＦ阻害剤（ベバシズマブ）＋ＦＯＬＦＯＸ治療のレジメンを示した図である。
【図２】実施例１において、ＩＤ番号４の患者の腹部ＣＴ撮像図である。
【図３】実施例１において、ＩＤ番号２２の患者胸部のＣＴ撮像図である。
【図４】実施例１において、ＩＤ番号９の患者の腹部ＣＴ撮像図である。
【図５】実施例１において、ＩＤ番号９の患者の胸部ＣＴ撮像図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
従来は、血中のＲＡＳ遺伝子又はそのタンパク質は、腫瘍組織から血管浸潤等により遊離したものであり、血中のＲＡＳのステイタス（遺伝子型）は、腫瘍組織のＲＡＳのステイタスと一致すると考えられていた。しかしながら、この従来の知見に反して、血中のＫＲＡＳのステイタスと腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスは一致しない場合があり、この場合には意外にも、腫瘍組織におけるＶＥＧＦ阻害剤の長期奏効性は、腫瘍組織中のＫＲＡＳのステイタスよりも、血中のＫＲＡＳのステイタスに依存する。当該知見は、本発明者等が初めて見出したものである。
【００１５】
本発明に係るＶＥＧＦ阻害剤長期奏功性予測方法（以下、「本発明に係る長期奏功性予測方法」ということがある。）は、腫瘍組織中のＲＡＳのステイタスにかかわらず、血中のＲＡＳのステイタスを指標として、ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測することを特徴とする。血中のＲＡＳが野生型であり、変異型が検出されなかった被験者は、腫瘍組織中のＲＡＳが野生型か変異型かにかかわらず、ＶＥＧＦ阻害剤投与による抗腫瘍作用が長期間、例えば１年６カ月以上も奏功する可能性が高いと予測される。逆に、血中から変異型のＲＡＳが検出された被験者は、ＶＥＧＦ阻害剤に対する長期奏効性は低く、ＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用は比較的短期間しか奏功しない可能性が高いと予測される。
【００１６】
実際に後記実施例１に示すように、原発巣又は転移巣におけるＫＲＡＳ遺伝子が変異型であったにもかかわらず、血清中のＫＲＡＳステイタスは野生型を示した症例が３例存在し、そのうち２例は、ベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ化学併用療法が一年半以上、長期奏効した。当該３例のうち、ベバシズマブ、ＦＯＬＦＯＸ治療が長期奏効しなかった１例は、原発巣切除処置から４ヶ月後に再発したが、当該患者では、原発巣切除前はＫＲＡＳのＧ１２Ａの変異型が検出され、切除後、血清ＫＲＡＳは野生型となったが、その後の定期的検査で血清中からＧ１２Ａが再度検出された。
【００１７】
つまり、腫瘍組織中に突然変異したＲＡＳ遺伝子の存在が認められている場合、末梢血中の循環ＤＮＡから突然変異したＲＡＳ遺伝子が検出された被験者では、ＶＥＧＦ阻害剤に対する長期奏効性が低い、と予測することができる。逆に、末梢血中の循環ＤＮＡから突然変異したＲＡＳ遺伝子の存在が確認されなかった場合には、当該被験者の腫瘍はＶＥＧＦ阻害剤が長期奏効性を示す腫瘍であると予測できる。このように、腫瘍組織中のＲＡＳのステイタスではなく、血中のＲＡＳのステイタスを指標とするほうが、ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏効性を精度よく予測できることは、本発明者らによってはじめて見出された知見である。
【００１８】
すなわち、本発明に係る長期奏功性予測方法は、被験者の腫瘍に対するＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する方法であって、下記工程（ａ）と工程（ｂ）とを有することを特徴とする。
（ａ）被験者から採取された血液サンプル中に、ＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が存在するか否か、及び当該血液サンプル中のＲＡＳが、野生型か変異型かを決定する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において、
前記血液サンプル中に、野生型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出され、かつ変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が高いと判定し、
前記血液サンプル中に、変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、前記被験者はＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が低いと判定する工程。
【００１９】
本発明に係る長期奏功性予測方法において検出するＲＡＳは、ＨＲａｓであってもよく、ＮＲａｓであってもよく、ＫＲＡＳであってもよい。本発明に係る長期奏功性予測方法においては、ＫＲＡＳの遺伝子型を判断の指標とすることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る長期奏功性予測方法において検出する変異型のＲＡＳは、例えば挿入、逆位、欠失、及び／又は点突然変異のような全ての形態の突然変異を包含する。これらの突然変異したＲＡＳ遺伝子は、一つの対立遺伝子（ヘテロ接合性）又は双方の対立遺伝子（ホモ接合性）にそれぞれ見出される野生型ＲＡＳとは異なり、体細胞性又は生殖系列で見出され得る変異型ＲＡＳである。体細胞突然変異は、ある種の組織、例えば腫瘍組織でのみ生じるものであり、生殖細胞系列で遺伝するものではない。生殖系列突然変異は、体組織の任意のもので見出すことができる。
【００２１】
本発明に係る長期奏功性予測方法において検出する変異型のＲＡＳとしては、ＲＡＳ遺伝子のエクソン２〜４上のコドン１２、１３、６１、及び１４６のうちの１又は２以上のアミノ酸置換を伴う突然変異したＲＡＳが好ましい。具体的には、例えば、ＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ２、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｃ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ａ１４６Ｇ、Ａ１４６Ｔ、及びＡ１４６Ｖからなる群より選択される１又は２以上の変異を有する変異型ＲＡＳが挙げられる。各変異型の核酸（遺伝子）突然変異の態様を表１に示す。また、ＫＲＡＳのアミノ酸配列を配列番号１に、ＫＲＡＳのエクソン２上のコドン１２を含む遺伝子配列を配列番号２に、ＫＲＡＳのエクソン３上のコドン６１を含む遺伝子配列を配列番号３に、ＫＲＡＳのエクソン４上のコドン１４６を含む遺伝子配列を配列番号４に、それぞれ示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
本発明に係る長期奏功性予測方法においては、工程（ａ）において、腫瘍組織中のＲＡＳのステイタスではなく、血液サンプル中のＲＡＳのステイタスを調べる。血液サンプルとしては、末梢血液自体であってもよく、血清や血漿であってもよい。血液サンプルは、腫瘍組織よりも低侵襲的に被験者から採取することができるため、再発腫瘍患者のように、腫瘍組織の生体サンプルの採取が困難な被験者についても、ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測することができる。また、血液サンプルは被験者から経時的に採取することもできるため、本発明に係る長期奏功性予測方法は、腫瘍が再発したかどうかのモニタリングにも好適である。
【００２４】
なお、前記血液サンプルは、原発性腫瘍、転移性腫瘍、再発性腫瘍にかかわらず、腫瘍が初期の段階に被験者から採取されたものが好ましい。具体的には、本発明に係る長期奏功性予測方法において用いられる血液サンプルは、ＣＥＡが５ｎｇ／ｍＬ以下である、又はＣＡ１９−９の値が３７．０Ｕ／ｍＬ以下であるものが好ましい。
【００２５】
本発明に係る長期奏功性予測方法において、長期奏功性が予測されるＶＥＧＦ阻害剤は、ヒトをはじめとする動物において、ＶＥＧＦ阻害作用を有する物質であれば特に限定されるものではなく、抗ＶＥＧＦ抗体であってもよく、ＴＫＩであってもよい。具体的には、抗ＶＥＧＦ抗体としては、ベバシズマブ（製品名：アバスティン（Ａｖａｓｔｉｎｅ）（登録商標）などが挙げられる。本発明に係る長期奏功性予測方法においては、これらのＶＥＧＦ阻害剤のうち、１種又は２種以上に対する長期奏功性を予測することが好ましい。中でも、ベバシズマブに対する長期奏功性を予測することが好ましい。
【００２６】
本発明に係る長期奏功性予測方法において、ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する対象となる腫瘍は、ＶＥＧＦ仲介性腫瘍（癌）すなわち、腫瘍形成にＶＥＧＦがある役割を担っている腫瘍であれば特に限定されるものではない。当該腫瘍には、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰部、甲状腺、結腸直腸、食道、肝臓の癌、肉腫、膠芽細胞腫、頭頸部、白血病及びリンパ性悪性疾患が含まれる。より詳細には、神経芽細胞腫、腸癌（例えば、直腸癌、大腸癌、家族性大腸ポリポーシス癌及び遺伝性非ポリポーシス大腸癌）、食道癌、口唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺動脈乳頭癌、腎臓癌、腎実質癌、卵巣癌、頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、尿管癌、メラノーマ、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫及び末梢神経外胚葉性腫瘍）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病骨（ＡＭＬ）、慢性髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｅｏｍａ）、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫及び形質細胞腫が含まれ得る。本発明に係る長期奏功性予測方法において予測対象となる腫瘍としては、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上であることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る長期奏功性予測方法において、ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測する対象となる腫瘍は、原発巣（原発性腫瘍）であってもよく、転移巣（転移性腫瘍）であってもよい。また、再発性腫瘍であってもよい。さらに、腫瘍が、被験者の体内の複数個所に存在していてもよい。
【００２８】
本発明に係る長期奏功性予測方法においては、再発性腫瘍についてのＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測することが好ましい。例えば、過去に腫瘍部分の外科的切除処置を受けたことがある被験者や、過去にＶＥＧＦ阻害剤投与処置を受けたことがある被験者から採取された血液サンプルを用いることにより、再発性腫瘍や転移巣のＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測することができる。なお、被験者が過去にＶＥＧＦ阻害剤を投与されたことがある場合には、ＶＥＧＦ阻害剤を投薬された後６０日間が経過した後に採取された血液サンプルを用いることが好ましい。ＶＥＧＦ阻害剤治療においては、治療期間中にも、当該ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測しながら治療を行うためには、本発明に係る長期奏功性予測方法を継続的に実施することが好ましい。通常、腫瘍マーカー検査のための採血は月に１回程度であり、ＣＴ検査は３カ月に１回程度であることとのバランスから、本発明に係る長期奏功性予測方法は６０日間程度ごとの実施が好ましいと考えられるためである。
【００２９】
また、本発明に係る長期奏功性予測方法において用いられる血液サンプルは、過去にＶＥＧＦ阻害剤に対して薬剤耐性を示していた被験者から採取されたものであってもよい。過去にＶＥＧＦ阻害剤に対して薬剤耐性を示していた被験者であっても、血液サンプルから変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、当該被験者はその血液サンプルが採取された時点において、ＶＥＧＦ阻害剤による抗腫瘍作用が長期間奏功する可能性が高く、ＶＥＧＦ阻害剤を服用することにより、腫瘍縮小効果が長期間（例えば、投与開始時点から１年６ケ月以上の間）得られる可能性が高いと判定できる。逆に、血液サンプルから変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、当該被験者はその血液サンプルが採取された時点において、ＶＥＧＦ阻害剤に対する感受性が低く、ＶＥＧＦ阻害剤を服用しても持続的な腫瘍縮小効果が得られない可能性が高いと判定できる。
【００３０】
本発明に係る長期奏功性予測方法は、ＶＥＧＦ阻害剤をリチャレンジする被験者から採取された血液サンプルに対して行うことも好ましい。ここで、「ＶＥＧＦ阻害剤をリチャレンジする被験者」とは、ＶＥＧＦ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＶＥＧＦ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けており、その後に再度のＶＥＧＦ阻害剤の投薬処置を受けようとする被験者を意味する。ＶＥＧＦ阻害剤投与により耐性を獲得する場合があるが、リチャレンジ前に予め血中のＲＡＳのステイタスを調べることにより、リチャレンジにおけるＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を予測することができる。すなわち、リチャレンジ前に被験者から採取された血液サンプルから変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出されなかった場合には、当該被験者はＶＥＧＦ阻害剤が長期間奏功する可能性が高く、ＶＥＧＦ阻害剤をリチャレンジすることにより腫瘍縮小効果が長期間得られる可能性が高いと判定できる。逆に、血液サンプルから変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸又はそのタンパク質が検出された場合には、当該被験者はＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性が低く、ＶＥＧＦ阻害剤をリチャレンジしても持続的な腫瘍縮小効果は得られない可能性が高いと判定できる。
【００３１】
なお、ＶＥＧＦ阻害剤をリチャレンジする前に受ける他の抗腫瘍療法としては、公知の抗腫瘍療法の中から、被験者の病態等に応じて適宜選択して用いることができる。当該他の抗腫瘍療法としては、具体的には、放射線治療、化学療法剤の投薬治療、既に投薬されたＶＥＧＦ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療等が挙げられる。当該他の抗腫瘍療法としては、１又は２以上の抗腫瘍療法の併用療法であってもよい。例えば、本発明に係る長期奏功性予測方法としては、分子標的薬剤の投薬治療と、化学療法剤の投薬治療との併用療法が好ましい。
【００３２】
前記化学療法剤としては限定されるものではなく、細胞毒性又は細胞分裂阻害性を有する化合物であり得る。具体的には、（ｉ）代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、又はメトトレキセート；（ｉｉ）ＤＮＡ断片化剤、例えば、ブレオマイシン；（ｉｉｉ）ＤＮＡ架橋剤、例えば、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、又はナイトロジェンマスタード；（ｉｖ）インターカレート剤、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシン）、又はミトキサントロン；（ｖ）タンパク合成阻害剤、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、又はジフテリア毒素；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ毒、例えばカンプトセシン、又はトポテカン；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ毒、例えばエトポシド（ＶＰ−１６）、又はテニポシド；（ｖｉｉｉ）微小管関連剤、例えばコルセミド、コルヒチン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔｅｘｅｌ）、ビンブラスチン、又はビンクリスチン；（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、例えば、フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）、又はＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；（ｘ）様々な治験薬、例えばチオプラチン（ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）、ＰＳ−３４１、フェニルブチレート、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９、Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール類、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセタノール、エピガロカテキン没食子酸塩、テアフラビン類、フラバノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸及びその誘導体；（ｘｉ）ホルモン、例えばグルココルチコイド又はフェンレチニド；（ｘｉｉ）抗ホルモン、例えばタモキシフェン、フィナステライド、又はＬＨＲＨアンタゴニストが含まれる。また、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、ダウナルビシン、タキソテール、及びマイトマイシンＣも含まれる。前記他の抗腫瘍療法においては、これらの化学療法剤のうち１種のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００３３】
本発明に係る長期奏功性予測方法を、ＶＥＧＦ阻害剤投与処置後に化学療法剤の投薬治療を行い、その後さらにＶＥＧＦ阻害剤のリチャレンジを予定している被験者から採取された血液サンプルに対して行う場合、当該化学療法剤としては、フルオロウラシル、フォリン酸、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキセート、ブレオマイシン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトセシン、トポテカン、テニポシド、コルセミド、コルヒチン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタモキシフェンからなる群より選択される１種又は２種以上であることが好ましい。
【００３４】
前記分子標的薬剤としては、具体的には、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブからなる群より選択される１種又は２種以上が挙げられる。
【００３５】
本発明に係る長期奏功性予測方法は、過去に、ＥＧＦＲ阻害剤投与処置を受けた被験者から採取された血液サンプルに対して行うことも好ましい。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体薬に体制が観察され、別療法として、ＶＥＧＦ阻害剤治療を行う場合である。ＥＧＦＲ阻害剤の投薬処置を受けた後に、当該ＥＧＦＲ阻害剤投薬処置とは異なる他の抗腫瘍療法を受けており、その後にＶＥＧＦ阻害剤治療の投薬処置を受けようとする被験者であってもよい。
当該他の抗腫瘍療法としては、被験者の病態等に応じて適宜選択して用いることができ、具体的には、放射線治療、化学療法剤の投薬治療、既に投薬されたＥＧＦＲ阻害剤とは異なる種類の分子標的薬剤の投薬治療等が挙げられる。化学療法剤や分子標的薬剤としては、前記のものが挙げられる。
【００３６】
前記工程（ａ）においては、血液サンプル中のＲＡＳのステイタスは、タンパク質レベルで決定してもよく、核酸レベル（ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）で決定してもよい。本発明に係る長期奏功性予測方法においては、高感度に検出可能であることから、ＲＡＳ遺伝子由来核酸を測定対象とすることが好ましい。具体的には、前記血液サンプル中のＲＡＳの存在の有無、及び野生型か変異型かの決定を、当該血液サンプル中の循環ＤＮＡから、野生型及び変異型のＲＡＳ遺伝子由来核酸が検出されるか否かを調べることにより行うことが好ましい。ＲＡＳ遺伝子由来核酸とは、ＲＡＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの全長若しくはその部分、ＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの全長若しくはその部分、前記ｍＲＮＡの全長若しくはその部分を鋳型として得たｃＤＮＡ、又はこれらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等によって人工的に増幅させた増幅産物等が挙げられる。
【００３７】
血液サンプル中のＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出や、検出されたＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定は、常法により行うことができる。本発明においては、予測精度の点から、０．１％の変異型を検出できる測定条件で行うことが好ましい。
【００３８】
例えば、血液サンプル中のＲＡＳの存在やそのステイタスは、血液サンプル中に含まれているＲＡＳ遺伝子由来核酸を、デジタルＰＣＲを用いて検出することによって決定できる。特にバイオラッド社のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の技術（Hindson，et.al.，Analytical  Chemistry，2011，vol.83（22），pp. 8604−8610）を利用することにより、高感度に検出することができる。ドロップレットの数が多ければ多いほど、解析精度が高くなる。０．０１％の突然変異を検出する性能を担保するためには、一つの突然変異を検出するために１０，０００ドロップレットが必要である。そのために、ＰＣＲのマスターミックス中の界面活性剤濃度を規定することが好ましい。例えば、ＤＮＡ伸長酵素などの保存液として用いられるエチレングリコール又はグリセロールは、終濃度で０．１５％以下に、又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘは、終濃度０．０００３％以下であることが好ましい。上記界面活性剤が、前記終濃度以上になるとドロップレットによるエマルジョン数が激減し、高感度に突然変異を検出することが困難になる。
【００３９】
また、血液サンプルから得られた核酸及び核酸断片を、第１ＰＣＲを１５〜５０サイクル行うことにより、当該核酸中に含まれるであろう変異型ＲＡＳのアリルコピー数の絶対量を増加させた後、１０６コピー数程度に希釈してから、公知の突然変異検出方法を行うことも好ましい。当該方法によれば、反応系に存在する変異型の全体数を増加させるため、突然変異の種類が増えても、変異型のアリルが物理的に存在せずに検出不能となる可能性を下げることができる。さらに、当該方法を、前記のデジタルＰＣＲと組み合わせてもよい。
【００４０】
その他の方法としては、例えば、血液サンプル中の核酸を鋳型としたＰＣＲ等により、ＲＡＳ遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅した後、この増幅産物に対して、ＫＲＡＳの特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブを接触させて会合体が形成されたか否かを高感度に検出する方法が挙げられる。ハイブリダイゼーションを行う前に、前記増幅産物の希釈物に対してエマルジョンＰＣＲを行うことも好ましい。
【００４１】
前記プローブは、例えば放射性同位元素（３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセン等）又は発色剤で検出可能に標識される。また、当該プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ−ホスホロアミデート類、又はＬＮＡであってもよい。なお、当該プローブの塩基長さは、約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、又は約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、又は約２０から約３０でありうる。
【００４２】
血液サンプル中のＲＡＳの存在やそのステイタスは、インベーダー法（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｏｌｉｖｉｅｒ，  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７３：１０３−１１０，  ２００５）を使用して分析することができる。インベーダー法とは、ＰＣＲなどによって調製された二本鎖ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡに対して、部分的に三重塩基を形成するように、アレルプローブとインベーダーオリゴがハイブリダイゼーションを行う。ここで、アレルプローブの５’末端の一部は、前記二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡと非相補的な配列（フラップ部）を有するように設計されているが、インベーダーオリゴは完全にそれらに対して相補的な配列を有している。２種のアレルプローブは、それぞれ野生型、変異型に対して相補的になるように設計されており、上記二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡに対し競合的にハイブリダイゼ−ションを行い、完全相補でハイブリダイゼーションした際に、フラップエンドヌクレアーゼが一部三重塩基になっている部分を認識し、アレルプローブのフラップ部が、同反応系に存在する自己相補型ＦＲＥＴカセットにハイブリダイゼーションする。この時に、前記の一部三重塩基になる部分ができ、目的の突然変異をフラップエンドヌクレアーゼが切断し、ＦＲＥＴカセット内の蛍光修飾されたＤＮＡ断片が遊離して、ＦＲＥＴ内の消光物質と乖離するために蛍光を発する。理論上、一度切断されたアレルプローブのフラップ部は、別のＦＲＥＴカセットに再度ハイブリダイゼーションすることができ、シグナルが増幅される非常に高感度に突然変異を検出できる手法である。
【００４３】
当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、ＲＡＳ遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅させるために使用することができる（例えば、Wu，et.al.，Genomics，1989，vol.4，pp.560−569を参照。）。また、アレル特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することもできる（例えば、Ruano  and  Kidd，Nucleic  Acids  Research，1989，vol.17，pp.8392を参照。）。当該技術によれば、特定のＲＡＳ突然変異にその３’末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定のＲＡＳ突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。また、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）（例えば、欧州特許出願公開第０３３２４３５号、及びNewton  et.al.，Nucleic  Acids  Research，1989，vol.17，pp.7参照。）も使用することができる。
【００４４】
血液サンプル中のＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出や、検出されたＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定には、遺伝子変異を検出する場合や、遺伝子の挿入及び欠失を検出する場合に使用されるその他の方法も利用することができる。当該方法としては、具体的には、例えば、サンガー法を基礎とするシークエンス解析法を利用し、血液サンプル中のＲＡＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はこれらの増幅産物等の塩基配列を直接決定する方法が挙げられる。また、塩基配列の決定は、ＰＣＲを介して行うこともできる。その他、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、多型断片におけるアレルの改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析もまた、アレルの塩基変化変異体を検出するために使用することができる（Orita  et.al.，Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences，USA，1989，vol.86，p.2766−2770、及びGenomics，1989，vol.5，p.874−879）。
【００４５】
なお、血液サンプル中のＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出や、検出されたＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定に用いられる試薬等をキット化することにより、本発明に係る長期奏功性予測方法をより簡便に行うことができる。当該試薬としては、例えば、血液サンプルから核酸を抽出するための試薬、ポリメラーゼやリガーゼ等の酵素、ＲＡＳの特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブやプライマー（ＲＡＳ遺伝子の突然変異の部位又はその隣接部位に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）等が挙げられる。また、当該キットには、血液サンプル中のＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出やその遺伝子型の決定方法についてのプロトコルや、得られたＲＡＳの遺伝子型（ステイタス）の結果からのＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性の判定基準についての指示が記載された書面等が含まれていてもよい。
【００４６】
本発明に係る長期奏功性予測方法は、ＶＥＧＦ阻害剤の投与処置の適用の有無を判断する際に重要な情報を提供し得る。つまり、本発明に係る長期奏功性予測方法は、臨床医に有用な情報を提供でき、当該方法より得られた情報に基づき、臨床医らは適切な治療方法を決定することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４８】
［実施例１］
原発巣を外科的切除した再発性大腸癌患者２３名について、原発巣、転移巣、及び転移巣確認後に採取された血液から調製された血清に含まれるＫＲＡＳについて、ノンシノニマスなアミノ酸置換を伴う突然変異を調べた。
【００４９】
(臨床サンプル)
原発巣の外科的切除手術の術前又は術後に、再発性大腸癌患者の末梢血６ｍＬを採血後、遠心分離処理（３，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、血清成分を得た。さらに、ＩＤ番号９の患者については、転移巣の外科的切除手術の術後にも、末梢血６ｍＬを採血し、同様にして血清成分を得た（サンプル番号１６）。また、一部の患者の原発巣、転移巣のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片も実験サンプルとした。なお、本試験は、日本医科大学付属病院内の倫理審査委員会で承認されており、全ての患者からは本研究を包含するインフォームドコンセントを得て行った。本試験における患者情報について表２に示す。表２中、「転移巣」の欄の「−」は、転移巣が確認される前の患者であることを意味する。また、表２中、「分子標的薬」の欄は、転移巣の外科的切除手術後（但し、サンプル番号８とサンプル番号１５は、原発巣の外科的切除手術前）に行った分子標的薬とＦＯＬＦＯＸ併用療法において投与された分子標的薬を示す。すなわち、同欄中、「ｂ−ｍａｂ」は、ベバシズマブ＋ＦＯＬＦＯＸ併用療法を、「Ｃ−Ｍａｂ」は、セツキシマブ＋ＦＯＬＦＯＸ併用療法を、それぞれ表している。表２中、「化学療法」の欄は、転移巣の外科的切除手術後の分子標的薬投与処置時点（但し、サンプル番号２０と２１では、原発巣の外科的切除手術後の分子標的薬投与処置時点、サンプル番号１６では血液サンプル採取時点）における、化学療法の施行状況を示す。より詳細には、「なし」は投与未定であり、今後投与の可能性がある患者を意味し、「施行前」は施行が予定されていることを意味し、「施行中」は化学療法が奏効しており、投与を続けている状態を意味し、「施行後」は化学療法が奏効していたが、当該時点では投与を終了していることを意味し、「終了後」は化学療法が効かなくなった状態（すなわち、緩和ケアに入っている状態）を意味する。
【００５０】
原発巣がＫＲＡＳ変異型であるＩＤ番号１〜５、９〜１１、１６、１７、１９〜２３の患者に対して、抗ＶＥＧＦ阻害剤であるベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）を行った。ベバシズマブ２週間間隔投与法で行い、５ｍｇ／ｋｇを投与速度０．５ｍｇ／ｋｇ／分（５ｍｇ／ｋｇでは１０分）にて点滴静脈内投与を行った。また、初回投与時間は９０分間とした。忍容性により、投与時間は、２回目６０分間、３回目以降３０分間投与とした。ＦＯＬＦＯＸ化学療法は、４００ｍｇ／ｂｏｄｙのフォリン酸（ロイコボリン）と、１４５又は１４０ｍｇ／ｂｏｄｙのオキサリプラチンを、２時間かけて点滴静脈内投与し、フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、６７５又は６５０ｍｇ／ｂｏｄｙを急速点滴静脈内投与した後、さらに４１００ｍｇ／ｂｏｄｙを２２時間持続点滴静脈内投与した。投与レジメンを図１に示す。
【００５１】
【表２】
2015096049.tif 000003
【００５２】
（血清中のＣＥＡ及びＣＡ−１９−９の測定）
血清中のＣＥＡ及びＣＡ−１９−９を、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）により測定した。測定結果を表３に示す。
【００５３】
(血清からのセルフリー（ｃｆ）ＤＮＡの単離精製)
血清からのｃｆＤＮＡの単離精製は、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて行った。本キットに供した血清サンプルの量は、患者によって異なり、２ｍＬ〜４ｍＬであった。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液５０μＬにて行った。
【００５４】
（ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡの単離精製)
ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡ単離精製は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて行った。１サンプルにつき、ＦＦＰＥ切片は１０μｍにスライスされたものを３枚用いた。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液１００μＬにて行った。
【００５５】
(ＤＮＡの定量)
ｃｆＤＮＡ及びＦＦＰＥ切片から単離精製したＤＮＡの定量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。測定するサンプルは全て、単離したＤＮＡをＴＥ緩衝液で２０倍に希釈したものを用いた。蛍光測定装置は、ＳＡＦＩＲＡ（ＴＥＣＡＮ社）を用いた。
【００５６】
(ダイレクトシークエンシング)
原発巣や転移巣の手術標本、並びに血清中のＫＲＡＳ塩基配列解析は、ダイレクトシークエンシングにて行った。ＫＲＡＳのダイレクトシークエンス用のプライマー配列はＫＲＡＳ（フォワード）：５’−ＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡ−３’（配列番号５）、ＫＲＡＳ（リバース）：５’−ＧＴＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡ−３’（配列番号６）を用いた。各ＰＣＲ産物の長さは２１４ｂｐであり、ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の前変性後、９４℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとして４０サイクル行い、その後７２℃で１０分間の伸長反応を行った。シークエンス解析はＡＢＩ３７３０（アプライドバイオシステムズ、Foster  City、CA)を用いて、ビッグダイターミネーター法によるサイクルシークエンシングを行った。結果を表３に示す。表３の「血清」欄中、遺伝子型の語尾の「（術前）」と「（術後）」は、それぞれ原発巣の外科的切除手術の術前又は術後に採取された血清中の遺伝子型であることを意味する。また、表３の「転移巣」の欄中、「−」は、転移巣中のＫＲＡＳの遺伝子型を解析していないことを意味する。
【００５７】
【表３】
2015096049.tif 000004
【００５８】
原発巣の手術標本のＫＲＡＳ遺伝子変異とｃｆＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子変異の一致率は、８１．８％であった。また、原発巣とｃｆＤＮＡにおけるＫＲＡＳ遺伝子変異の相関表を表４に示す。表４中、「ｐＤＮＡ」は、原発巣から抽出したＤＮＡを意味する。ＣｏｈｅｎのＫａｐｐａ係数κの算出は、Ｐ(一致率)、Ｐｅ(２つのサンプルの間で結果が偶然に一致した場合の一致率)から、
κ＝（Ｐ−Ｐe）／（１−Ｐｅ）
に当てはめたところ、κ値は０．５８となった。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
特筆すべき点は、原発巣のＫＲＡＳステイタスが変異型で、血清中のＫＲＡＳステイタスが野生型であるＩＤ番号４、９（サンプル番号１５）、２２（サンプル番号２４）の３例のうち、ＩＤ番号４と２２は顕著なベバシズマブ＋ＦＯＬＦＯＸ併用療法が長期に奏効した症例であった。この２例は、一年半以上、ＳＤ（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；腫瘍縮小率が３０％未満、又は腫瘍増大率が２０％未満）の状態を維持した。なお、腫瘍縮小率（縮小効果）は、ＣＴ画像の腫瘍の直径から算出した。腫瘍が多点的に存在する場合は、それらの直径を合計して算出した。ＩＤ番号４の患者の治療検査履歴を表５に、ＣＴ撮像図（平成２５年１月９日、同年４月１８日、及び同年９月６日撮像）を図２に、それぞれ示す。また、ＩＤ番号２２の患者の治療検査履歴を表６に、ＣＴ撮像図（平成２５年２月１日、及び同年５月２５日撮像）を図３に、それぞれ示す。図２中の矢印は、縮小効果が観察された腫瘍部位を示し、図３中の矢印は、消失した腫瘍部位を示す。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
【表６】
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【００６３】
また、ＩＤ番号９の患者の原発巣切除手術前の循環ＤＮＡからは、結果的に原発巣と同様のＫＲＡＳ遺伝子変異(Ｇ１２Ａ)が観察されたが、原発巣切除手術後の循環ＤＮＡ中からは、Ｇ１２Ａは検出されなかった。しかし、その後、血清ＫＲＡＳからＧ１２Ａが検出され、４ヶ月後に再発した。すなわち、ベバシズマブによる奏効性が著しく悪い結果となった。ＩＤ番号９の患者の治療検査履歴を表７に、ＣＴ撮像図（腹部：平成２５年３月２３日撮像、胸部：同年６月１０日撮像）を図４及び５に、それぞれ示す。図４及び５中の矢印は、再発が確認された腫瘍部位を示す。これらの結果から、血清又は血漿中のｃｆＤＮＡからＫＲＡＳ遺伝子変異を検出することにより、癌患者の予後、あるいは、再発診断に応用できることが示唆される。また、癌マーカーであるＣＥＡやＣＡ−１９−９が応答する前に、末梢血中のｃｆＤＮＡを観察することで早期診断にもつながる。
【００６４】
【表７】
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【００６５】
その他、原発巣及び転移巣が野生型であったＩＤ番号８及びＩＤ番号１５の患者のｃｆＤＮＡ中からＧ１３Ｄが検出されたことである。さらにＩＤ番号８の患者にＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブを投与しても、腫瘍縮小効果は見られなかった。当該結果は、腫瘍組織のＫＲＡＳの遺伝子変異ステイタスは、必ずしもＥＧＦＲ阻害剤の治療効果予測因子にならないことを示すものである。一方で、ＩＤ番号１５の患者は、ＣＴ撮像結果から、腫瘍が２０％以上縮小した。
【００６６】
なお、後記実施例１における再発大腸癌患者の臨床分析においては、原発巣に突然変異したＫＲＡＳ遺伝子が観察された全患者において、再発診断時に採取された血清中からも突然変異したＫＲＡＳ遺伝子が観察された。当該結果から、原発巣切除後の再発診断において、循環中の突然変異したＫＲＡＳ遺伝子を同定することは有用であること、原発巣に対する治療を受けたことがある被験者について、経時的に血液中のＫＲＡＳのステイタスを調べることにより、再発腫瘍の存在を早期に（患者によっては、ＣＥＡやＣＡ１９−９等の既存のバイオマーカーよりも早期に）確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明に係る長期奏功性予測方法は、末梢血サンプルを用いる。このため、原発巣切除したり、バイオプシなどの生検採取することなく、低侵襲に、ＶＥＧＦ阻害剤の長期奏功性を高精度に予測することができる。この低侵襲性と良好な精度の点から、本発明に係る長期奏功性予測方法は、癌検診などで、便潜血などに変わる検査方法として広く普及すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月5日(2014.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
その他、原発巣及び転移巣が野生型であったＩＤ番号８及びＩＤ番号１４の患者のｃｆＤＮＡ中からＧ１３Ｄが検出されたことである。さらにＩＤ番号８の患者にＥＧＦＲ阻害剤であるセツキシマブを投与しても、腫瘍縮小効果は見られなかった。当該結果は、腫瘍組織のＫＲＡＳの遺伝子変異ステイタスは、必ずしもＥＧＦＲ阻害剤の治療効果予測因子にならないことを示すものである。一方で、ＩＤ番号４及び２２の患者は、ＣＴ撮像結果から、腫瘍が２０％以上縮小した。