(57)【要約】【課題】乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化する能力を有する新規なプロモーターを提供すること。【解決手段】乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するコムギ由来のプロモーター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するコムギ由来のプロモーター。
【請求項２】
Triticum monococcum由来である、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと比較して１〜１５０倍である、請求項１又は２に記載のプロモーター。
【請求項４】
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において０．７倍以上であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．２倍以上であり、根において２０倍以上であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において１０倍以上である、請求項１から３の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項５】
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４．０〜６３．１倍であり、根において１０．９〜４１．８倍であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．５〜３３．５倍であり、根において３０．１〜１９０．５倍以下であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．８〜４３．３倍であり、根において１４．１〜８８１．５倍以下である、請求項１から４の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項６】
MYCATRD22（塩基配列はCACATG）、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）、ABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）からなる群から選択される少なくとも１種以上のモチーフを少なくとも１個以上有する、請求項１から５の何れか１項に記載のプロモーター。
【請求項７】
以下の（ａ）〜(ｄ）の何れかである、請求項１から６の何れか１項に記載のプロモーター。
（ａ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列を含むプロモーター；
（ｂ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；
（ｃ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；又は
（ｄ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター。
【請求項８】
請求項１から７の何れか１項に記載のプロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された遺伝子とを含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む微生物又はウイルス。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクター及び／あるいは請求項９に記載の微生物又はウイルスにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１１】
前記宿主細胞が単子葉植物由来の細胞である、請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
前記宿主細胞がコムギ（Triticum aestivum）由来の細胞である請求項１０又は１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項８に記載のベクター及び／あるいは請求項９に記載の微生物又はウイルスを植物細胞内に導入する工程を含む、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物の製造方法。
【請求項１４】
請求項８に記載のベクター及び／あるいは請求項９に記載の微生物又はウイルスを植物細胞内に導入する工程を含む、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を植物に付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化するコムギ由来のプロモーターに関する。さらに本発明は、本発明のプロモーターを用いた、ベクター、微生物又はウイルス、形質転換体、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物の製造方法、並びに乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を植物に付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレスなど様々な環境ストレスに対応するための耐性機構を有している。近年、このようなストレスに対する耐性を有する植物が作製されている。例えば、特許文献１には、渇水、高塩分または極端な温度から農産物を保護することを目的としたトレハロース産生トランスジェニック植物が記載されている。また、特許文献２には、高等植物の光合成関連タンパク質の生産を促進することを特徴とする植物の環境ストレスに耐性を高める方法が記載されている。さらに特許文献３には、少なくとも１種のポリアミン合成酵素酵素遺伝子を植物中で機能し得る誘導性プロモーターの制御下で安定に保持し、且つ該外因性のポリアミン合成酵素酵素遺伝子を有していない比較対照植物に比べて少なくとも1種のストレス耐性が改良された植物及びその子孫が記載されている。
【０００３】
また、ストレス誘導性プロモーターを用いて環境ストレス耐性を植物に付与することも報告されている。例えば、特許文献４及び５には、所定の塩基配列を有するイネ由来のストレス誘導性プロモーターが記載されている。また、特許文献６には、耐塩植物として知られているシロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  Ｌ．）におけるコリンモノオキシゲナーゼ遺伝子の上流に位置する環境ストレス応答性プロモーターが記載されている。さらに特許文献７及び８には、シロイヌナズナ由来の環境ストレス応答性プロモーターが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５０１９７８号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／０５８９７５号公報
【特許文献３】特開２００７−２１号公報
【特許文献４】特開２００４−２４８６３８号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００４／０８５６４１号公報
【特許文献６】特開２００４−３３０２６号公報
【特許文献７】特開２００５−８０６１３号公報
【特許文献８】特開２００７−２０２４６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の通り、イネ、シロザおよびシロイヌナズナに由来する環境ストレス応答性プロモーターについての報告はあるが、コムギについての環境ストレス応答性プロモーターの報告はほとんどない。また、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーターについての報告もない。本発明は、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化する能力を有する新規なプロモーターを提供すること解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化する能力を有する、コムギに由来する新規プロモーターをクローニングすることに成功し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するコムギ由来のプロモーター。
（２）  Triticum monococcum由来である、（１）に記載のプロモーター。
（３）  乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと比較して１〜１５０倍である、（１）又は（２）に記載のプロモーター。
（４）乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において０．７倍以上であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．２倍以上であり、根において２０倍以上であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において１０倍以上である、（１）から（３）の何れかに記載のプロモーター。
（５）乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４．０〜６３．１倍であり、根において１０．９〜４１．８倍であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．５〜３３．５倍であり、根において３０．１〜１９０．５倍以下であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．８〜４３．３倍であり、根において１４．１〜８８１．５倍以下である、（１）から（４）の何れかに記載のプロモーター。
（６）  MYCATRD22（塩基配列はCACATG）、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）、ABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）からなる群から選択される少なくとも１種以上のモチーフを少なくとも１個以上有する、（１）から（５）の何れかに記載のプロモーター。
（７）  以下の（ａ）〜(ｄ）の何れかである、（１）から（６）の何れかに記載のプロモーター。
（ａ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列を含むプロモーター；
（ｂ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；
（ｃ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；又は
（ｄ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター。
（８）  （１）から（７）の何れかに記載のプロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された遺伝子とを含むベクター。
（９）  （８）に記載のベクターを含む微生物又はウイルス。
（１０）  （８）に記載のベクター及び／あるいは（９）に記載の微生物又はウイルスにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（１１）  前記宿主細胞が単子葉植物由来の細胞である、（１０）に記載の形質転換体。
（１２）  前記宿主細胞がコムギ（Triticum aestivum）由来の細胞である（１０）又は（１１）に記載の形質転換体。
（１３）  （８）に記載のベクター及び／あるいは（９）に記載の微生物又はウイルスを植物細胞内に導入する工程を含む、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物の製造方法。
（１４）  （８）に記載のベクター及び／あるいは（９）に記載の微生物又はウイルスを植物細胞内に導入する工程を含む、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を植物に付与する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する。本発明のプロモーターを利用することにより、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、乾燥ストレス処理における葉のGUS遺伝子の発現量を示す、RT-PCRの電気泳動写真である。各cDNAの上段がGUS遺伝子の増幅、下段が内在性遺伝子であるEF-1αの増幅結果を示す。
【図２】図２は、塩ストレス処理における葉及び根のGUS遺伝子の発現量を示す、RT-PCRの電気泳動写真である。各cDNAの上段がGUS遺伝子の増幅、下段が内在性遺伝子であるEF-1αの増幅結果を示す。
【図３】図３は、低温ストレス処理における葉及び根のGUS遺伝子の発現量を示す、RT-PCRの電気泳動写真である。各cDNAの上段がGUS遺伝子の増幅、下段が内在性遺伝子であるEF-1αの増幅結果を示す。
【図４】図４は、乾燥、塩及び低温ストレス処理時におけるGUS染色を行った時の写真を示す。
【図５】図５は、乾燥、塩及び低温ストレス処理時におけるGUS遺伝子の発現量の定量PCRにおいて、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと比較した結果を示す。図５のＡの葉においては、tplb0004l11、Contig1515、tplb0015p04の各欄において左側から、ストレス付与から０時間後、１時間後、３時間後、及び５時間後、それぞれのストレス付与から通常の栽培条件に戻して２日後を示す。図５のＡの根においては、tplb0004l11、Contig1515、tplb0015p04の各欄において左側から、ストレス付与から０時間後、１時間後、３時間後、及び５時間後を示す。図５のＢ及びＣの葉及び根においては、tplb0004l11、Contig1515、tplb0015p04の各欄において左側から、ストレス付与から０時間後、１時間後、５時間後、１０時間後、及び２４時間後、それぞれのストレス付与から通常の栽培条件に戻してから２日後を示す。
【図６】図６は、乾燥、塩及び低温ストレス処理時におけるGUS遺伝子の発現量の定量PCRにおいて、処理開始時と比較した結果を示す。
【図７】図７は、本発明のプロモーターに存在するモチーフの種類の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）プロモーター
本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有することを特徴とする。プロモーターが活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大するとは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、又は低温ストレス条件下にプロモーターを曝した場合に、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、プロモーターの下流に連結した遺伝子の転写を活性化して、当該遺伝子の発現量を増大することを言う。
【００１１】
乾燥ストレス条件とは、水分が欠乏した状態を意味し、例えば、植物体をタオルの上に置くなど水分を吸収できない状態に置くことを言う。塩ストレス条件とは、５０ｍＭ〜６００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭ〜４００ｍＭの濃度のＮａＣｌを継続的に０．５時間〜数週間処理したときの状態を意味する。低温ストレス条件とは、生物種の生活至適温度よりも低い温度にさらされた状態を言い、例えば、コムギの場合には−２０℃〜＋１０℃、好ましくは−１５℃〜＋５℃の温度で継続的に1時間〜数週間処理することを言う。
【００１２】
乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するか否かは、以下のような手法により確認することができる。即ち、種々のレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（ＧＦＰ）等）をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入した後、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の各々の何れにおいても活性化することを特徴とする。
【００１３】
本発明のプロモーターが由来する生物はコムギであり、コムギとしては、1粒系  T. aegilopoides、T. thaoudar、T. monococcum  2粒系 T. dicoccoides、T. dicoccum（2粒コムギ、エンマーコムギ）、T. pyromidale、T. orientale（コーラサンコムギ）、T. durum（デュラムコムギ、マカロニコムギ）、T. turgidum（リベットコムギ）、T. polonicum（ポーランドコムギ）、T. persicum（ペルシャコムギ）、普通系 T. aestivum（普通コムギ、パンコムギ）、T. spelta（スペルトコムギ〔ディンケルコムギ、ファッロコムギ〕）、T. compactum（クラブコムギ、密穂コムギ）T. sphaerococcum（インド矮性コムギ）、T. maha（マカコムギ）、T. vavilovii（バビロビコムギ）  チモフェービ系 T. timopheevi  などが挙げられるが、特に限定されない。上記の中でも特にTriticum monococcum由来のプロモーターが好ましい。
【００１４】
好ましい実施態様においては、本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと比較して１〜１５０倍（好ましくは１．０２倍以上、１４０倍以下、より好ましくは１．０４倍以上、１３８．７倍以下）である。
【００１５】
好ましい実施態様においては、本発明のプロモーターは以下の（条件ｉ）〜（条件ｉｉｉ）の何れかを満たすプロモーターである。
（条件ｉ）
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上（好ましくは３．５倍以上、より好ましくは４．０倍以上）であり、根において０．７倍以上（好ましくは０．７５倍以上、より好ましくは０．８倍以上）であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．２倍以上（好ましくは１．４倍以上、より好ましくは１．５倍以上）であり、根において２０倍以上（好ましくは２５倍以上、より好ましくは３０．１倍以上）であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上（好ましくは３．５倍以上、より好ましくは３．８倍以上）であり、根において１０倍以上（好ましくは１２倍以上、より好ましくは１４．１倍以上）である。
【００１６】
（条件ｉｉ）
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４０倍以上（好ましくは５０倍以上、より好ましくは５５．６倍以上）であり、根において３０倍以上（好ましくは３５倍以上、より好ましくは４１．８倍以上）であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において２０倍以上（好ましくは３０倍以上、より好ましくは３３．５倍以上）であり、根において１００倍以上（好ましくは１５０倍以上、より好ましくは１９０．５倍以上）であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３０倍以上（好ましくは４０倍以上、より好ましくは４１．８倍以上）であり、根において３００倍以上（好ましくは５００倍以上、より好ましくは８８１．５倍以上）である。
【００１７】
（条件ｉｉｉ）
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４０倍以上（好ましくは５０倍以上、より好ましくは６３．１倍以上）であり、根において５倍以上（好ましくは８倍以上、より好ましくは１０．９倍以上）であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において３倍以上（好ましくは４．０倍以上、より好ましくは５．３倍以上）であり、根において１００倍以上（好ましくは１５０倍以上、より好ましくは１８２．６倍以上）であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３０倍以上（好ましくは４０倍以上、より好ましくは４３．３倍以上）であり、根において２００倍以上（好ましくは３００倍以上、より好ましくは４４７．４倍以上）である。
【００１８】
より好ましい実施態様においては、本発明のプロモーターは以下を満たすプロモーターである。
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４．０倍以上、６３．１倍以下であり、より好ましくは５５．６倍以上、６３．１倍以下であり、根において０．８倍以上、４１．８倍以下であり、より好ましくは１０．９倍以上、４１．８倍以下であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．５倍以上、３３．５倍以下であり、より好ましくは５．３倍以上、３３．５倍以下であり、根において３０．１倍以上、１９０．５倍以下であり、より好ましくは、１８２．６倍以上、１９０．５倍以下であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．８倍以上、４３．３倍以下であり、より好ましくは４１．８倍以上、４３．３倍以下であり、根において１４．１倍以上、８８１．５倍以下であり、より好ましくは４４７．４倍以上、８８１．５倍以下である。
【００１９】
本発明のプロモーターの具体例としては、以下の実施例で取得された配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列を含むプロモーターを挙げることができる。
配列番号１７（RFL_Contig1515）、配列番号１８（tplb0004l11）および配列番号２１（tplb0015p04）に記載の塩基配列を含むプロモーターに存在するモチーフの種類の位置を図６に示す。本発明のプロモーターは、MYCATRD22（塩基配列はCACATG）、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）、ABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）からなる群から選択される少なくとも１種以上（好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上）のモチーフを少なくとも１個以上（好ましくは３個以上、より好ましくは５個以上、特に好ましくは８個以上）有することが好ましい。
【００２０】
本発明のプロモーターの具体例としては、以下を挙げることができる。
・MYCATRD22（塩基配列はCACATG）を１個、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）を３個、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）を１個、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）又はABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）を２個、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）を１個、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）を３個有するプロモーター（例えば、配列番号１７のRFL_Contig1515）
・MYCATRD22（塩基配列はCACATG）を３個、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）を１個、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）を５個、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）を１個、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）を１個、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）を１個有するプロモーター（例えば、配列番号１８のtplb0004l11）
・MYCATRD22（塩基配列はCACATG）を１個、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）を２個、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）を４個、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）またはABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）を１個、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）を１個、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）を３個、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）を３個有するプロモーター（例えば、配列番号２１のtplb0015p04）
【００２１】
さらに、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する限りは、配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むプロモーターでもよい。
【００２２】
さらに、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する限りは、配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列において、例えば、１又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含むプロモーターでよく、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含むプロモーターも使用することができる。
【００２３】
さらに、本発明おけるプロモーターは、当該プロモーターが有しているモチーフ以外の塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加させてもよい。
例えば以下のプロモーターを挙げることができる。なお、１〜２００ｂｐとは１〜２００番目までの塩基を意味し、上記以外の記載も同様である。
（i）配列番号１７，１８又は２１に記載の塩基配列における転写開始点（ＡＴＧ）から直近のＴＡＴＡボックスまで、及び／又は１〜２００ｂｐまでの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
（ii）配列番号１７記載の塩基配列における２０１〜３６２ｂｐ、３６９〜４７１ｂｐ、４７７〜４８７ｂｐ、４９３〜７５９ｂｐ、７６５〜８８０ｂｐ、８８７〜１０６１ｂｐ、１０６８〜１０９０ｂｐ、１０９７〜１２１１ｂｐ、１２１８〜１３７４ｂｐ、１３８０〜１４３７ｂｐ、１４４４〜１５０９ｂｐの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
（iii）配列番号１８記載の塩基配列における２０１〜２０５ｂｐ、２１３〜５８３ｂｐ、５９０〜６８９ｂｐ、７０３〜７２１ｂｐ、７２８〜１１５６ｂｐ、１１６３〜１３６５ｂｐ、１３７１〜１４０７ｂｐ、１４１４〜１５４０ｂｐ、１５４９〜１５８８ｂｐ、１５９５〜１６１９ｂｐ、１６２６〜１７５２ｂｐの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
（iv）配列番号２１記載の塩基配列における２０１〜４２７ｂｐ、４３４〜５２５ｂｐ、５３２〜５３８ｂｐ、５４４〜６１２ｂｐ、６１８〜７６３ｂｐ、７６９〜１１９０ｂｐ、１１９７〜１４６２ｂｐ、１４８１〜１５３１ｂｐ、１５３８〜１６０７ｂｐ、１６１４〜１６３４ｂｐの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
【００２４】
さらに、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する限りは、配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むプロモーターでもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃、より好ましくは50〜65℃、特に好ましくは55〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃、50℃、55℃、60℃または65℃である。
【００２５】
本発明のプロモーターは、上記した塩基配列において、これらの３'末端に翻訳効率を向上させる塩基配列を付加したものでもよいし、プロモーター活性を喪失しない限りその５'末端を欠失したものでもよい。
【００２６】
本発明のプロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明のプロモーターを得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明のプロモーターの変異型であって変異前のプロモーターと同等の機能を有するものを合成することもできる。  なお、部位特異的突然変異誘発法としては、変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて行うことができ、またTAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行うこともできる。
【００２７】
２．ベクター
本発明のベクターは、適当なベクターに本発明のプロモーターを連結することにより製造することができる。本発明のプロモーターを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。
【００２８】
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられる。ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２９】
ベクターに本発明のプロモーターを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３０】
本発明においては、所望の遺伝子を発現させるため、上記のベクターに、さらに遺伝子を挿入することができる。遺伝子を挿入する手法は、ベクターにプロモーターを挿入する方法と同様である。遺伝子の種類は特に限定されるものではないが、例えば、植物に対して乾燥ストレス、塩ストレス及び／又は低温ストレスに対する耐性を付与できるタンパク質をコードする遺伝子などが好ましい。
【００３１】
本発明のベクターにおいて、本発明のプロモーターは、上記した所望の遺伝子の機能が発揮されるように、当該遺伝子が発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、遺伝子が導入される宿主生物においてプロモーターの制御下に遺伝子が発現されるように、遺伝子とプロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。即ち、本発明のベクターには、本発明のプロモーター及び所望の遺伝子の他に、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３２】
さらに、本発明のプロモーターに目的の任意遺伝子をセンス又はアンチセンス方向で接続したものを作製し、これをバイナリーベクターと呼ばれるpBI101(Clonetech社)などのベクターに挿入することができる。
【００３３】
３．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プロモーター又は目的遺伝子、環境ストレス応答性転写因子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、植物が好ましい。宿主が植物である場合は、形質転換植物（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。
【００３４】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、アブラナ科（例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)など）、イネ科（例えば、コムギ（Triticum）、トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativa)など）、ナス科（例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）など）、マメ科（例えば、ダイズ(Glycine max)など）に属する植物などが挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００３５】
本発明のベクターは、通常の形質転換方法、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって宿主中に導入することができる。
【００３６】
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入することができる。
【００３７】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。
【００３８】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。
【００３９】
アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。
【００４０】
Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。
【００４１】
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００４２】
本発明のベクターは、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、本発明のプロモーター、リボソーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４３】
細菌への組み換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４４】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００４５】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４６】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４７】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行われる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００４８】
４．植物の製造
本発明においては、上記した形質転換植物細胞等から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。
【００４９】
本発明においては、本発明のプロモーターを挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産することができる。
【００５０】
形質転換植物体から植物種子を得るには、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。このようにして育種された植物においては、特に本発明のプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を誘導することができる。
【００５１】
本発明のプロモーターを導入した形質転換植物体は、その下流に連結した遺伝子の発現量が増大することにより、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有することになる。
【００５２】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
[実施例１]  ストレス応答遺伝子の単離
本発明では、Wheat Oligonucleotide Microarray(Agilent Technologies社製)を用いて、環境ストレス時に特異的発現をしている遺伝子を網羅的に解析した。該マイクロアレイはRefSeq(Release 31), Unigene (Build 53), TIGR Plant Transcript Assemblies (Release 5), TIGR Gene Indices (Release 11) といった最新の公共データベースを基にしたオリゴDNAを搭載しており、43,000個以上の転写産物をカバーしている。
【００５４】
実験に用いたサンプルは、以下のように調製した。コムギ種子（Triticum aestivam Chinese Spring）をシャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことでコムギの葉と根を生育させた。
【００５５】
環境ストレスとして乾燥ストレスに応答性を示す遺伝子を解析した。乾燥ストレス処理は、水耕栽培中の植物体をキムタオルの上に置くことで乾燥ストレス状態にし、処理後1、5、10及び24時間で経時的にサンプルを採取した。各時間乾燥ストレス処理したサンプルは葉と根に切り分けその場で液体窒素によりサンプルを凍結保存した。また比較コントロールとして、水耕栽培を継続しているものからも同様に1、5、10及び24時間で経時的にサンプルを採取した。
【００５６】
凍結保存したサンプルからのtotal RNAの抽出にはRNeasy Plant mini kit(QIAGEN社製)を使用し、NanoDrop ND-2000分光光度計(NanoDrop Technologies社製)を使用して濃度測定を行った。回収したtotal RNAの分解度測定にはAgilent2100バイオアナライザーを使用し、分析キットとしてRNA 6000 Nano kit(Agilent Technologies社製)を用いてRNAの分解度をチェックした。
【００５７】
RNAの標識にはLow Input Quick Amp Labeling Kit(Agilent Technologies社製)を使用し、Cy3標識したcDNAを合成した。
【００５８】
このcDNAとWheat Oligonucleotide MicroarrayをGene Expression Hybridization Kit(Agilent Technologies社製)を使用してハイブリダイズさせた。その後Gene Expression Wash Pack（Wash buffer1とWash buffer2を含む）(Agilent Technologies社製)を使用して、非特異的な標識ターゲットや非特異的吸着を洗い流してマイクロアレイのスライドガラスを乾燥させた。
【００５９】
スライドガラスをDNA Microarray Scanner(Agilent Technologies社製)に読み込み、各スポットの蛍光強度を数値化した。マイクロアレイデータ解析用のソフトウェアGeneSpring(Agilent Technologies社製)を用いて、各スポットの蛍光強度（数値）、各スポットに搭載された２０mer程度のプローブの番号（ID）、元のＣＤＳ番号（contig又はtplbなど）、及びその遺伝子がコードするタンパク質、ＣＤＳと相同性のある他の植物（イネ、アラビ、オオムギなど）の情報を照合することによって解析を行った。その結果、乾燥時に特異的に発現量が増加する遺伝子を、ストレス応答遺伝子として7個選択した。
【００６０】
[実施例２]  プロモーター配列の単離
マイクロアレイ解析の結果選択した遺伝子（CDS）について、コムギCDSデータベース（URL: http://trifldb.psc.riken.jp/index.pl）を検索することで各ストレス応答遺伝子の配列情報を取得した。また、DDBJに登録されているコムギ配列をダウンロードし、アセンブルすることで応答遺伝子の配列情報を取得した。プロモーター配列は遺伝子の開始コドン（ATG）と推測される位置から約1〜2kbの上流付近をプロモーター領域と推定する。
【００６１】
コムギゲノムの配列情報はいまだ完全には解読されていないため、各遺伝子の上流に存在するプロモーター領域の単離には定法である、5’RACE法やTAIL-PCR法などを用いることができる（島本ら  植物細胞工学シリーズ７  新版  植物のPCR実験プロトコール  秀潤社）。また、未知領域のシーケンスに特化したDNA Walking Speedup Premix kit(Seegene社製)なども利用することができる。
【００６２】
本発明者らは、まずコムギ（Triticum aestivam Chinese Spring）からプロモーター配列の単離を試みたが、異質倍数体（AABBDD）であるため単一のプロモーター配列を単離することは困難であった。そのため、コムギの祖先種である一粒コムギ（Triticum monococcum A’A’）からプロモーター配列の単離を実施した。
【００６３】
一粒コムギ（Triticum monococcum DV92）の種子を実施例１記載の方法で水耕栽培し、生育した葉（第1葉〜第2葉）からCTAB法にてゲノムDNAを抽出した（島本ら  植物細胞工学シリーズ７  新版  植物のPCR実験プロトコール  秀潤社）。これを鋳型にDNA Walking Speedup Premix kitを使用して、各ストレス応答遺伝子の上流配列の単離を行った。得られた配列はpGET vectorに組み込み、プロモーター領域を同定した。シーケンス解析はDye terminator法により実施し、Applied Biosystems社製の3130xlジェネティックアナライザを用いた。
【００６４】
解読されたゲノム情報を元に、各cDNAの上流配列を増幅させるプライマーを設計し直した（表１）。forwardプライマーの5’末端側にはCACCの4塩基配列を付加しており、PCRにてDNAを増幅し、gateway用エントリーベクター  pENTR/D-TOPO（invitrogen社製）へクローニングが行える。
【００６５】
【表１】
2015192606.tif 000002
【００６６】
各cDNAのforwardプライマー及びreverseプライマーを用いて以下の条件にてゲノムPCRを行った。PCRの酵素には非常に高い正確性を有するPrimeSTAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa BIO社製)を使用し、50μlの反応系（1X PrimeSTAR GXL バッファー, 0.2mM dNTP 液, 0.2μM PCRプライマー, テンプレート（上記Triticum monococcum DV92ゲノム） 100ng, 1.25U PrimeSTAR GXLポリメラーゼ）で行った。PCRの条件は、最初に94℃で5分反応させた後、98℃で10秒、55℃で15秒及び68℃で2分のサイクルを30サイクル、最後に68℃で5分の条件で行った。PCR産物は、1.0%アガロースゲル電気泳動により、断片のサイズと増幅効率を確認し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TaKaRa BIO社製)を使用して精製をした。
【００６７】
精製したPCR産物をpENTR/D-TOPOに組み込み、プロモーター領域のシーケンス解析を行い、変異がないことを確認した。それぞれのプロモーター配列を配列番号１５〜２１に示す。
【００６８】
ＣＤＳ      プロモーター領域の配列
7AL.Contig16213:  配列番号１５
Scaffold2239:  配列番号１６
RFL_Contig1515:  配列番号１７
tplb0004l11:  配列番号１８
tplb0009k09:  配列番号１９
tplb0010o09:  配列番号２０
tplb0015p04:  配列番号２１
【００６９】
[実施例３]  形質転換用アグロバクテリウムの調製
配列が確認されたプロモーターが導入されたpENTR/D-TOPOはgatewayベクターpMDC164（Curtis et. al. (2003) Plant Physiol. Oct;133(2)462-9）とLR Clonase Enzyme mix（invitrogen社製）を使用することで組み換えられ、プロモーター配列の下流にβ-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）とNosターミネーター（Tnos）を連結した発現ベクターとした。なお、pMDC164ベクターはT-DNA領域にハイグロマイシン耐性遺伝子も有している。
【００７０】
上記プロモーター配列を導入した発現ベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience EHA105）  に、凍結融解法（Hofgen et. al. (1988) Nucleic Acids Res., Oct 25;16(20)9877）を参照にして導入し形質転換した。形質転換アグロバクテリウムを選抜するため、カナマイシン（50μg/L）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、28℃で2日間静置培養を行った。得られたシングルコロニーをＬＢ液体培地に植菌し、28℃で2日間振とう培養を行い、終濃度20%のグリセロールストックとして-80℃保存した。
【００７１】
[実施例４]イネ科モデル植物の形質転換
本発明では、イネ科の一年生草本植物であるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）を用いてプロモーターの活性を評価する。ミナトカモジグサはコムギやオオムギと同じイチゴツナギ亜科に分類される植物で、イネ科のモロコシやイネよりも分類学上コムギに近い、ゲノムサイズが小さい、植物体が比較的小型及び形質転換が可能という点から、モデル植物に適していると考えられている。
【００７２】
ミナトカモジグサの形質転換はAlves et. al.の方法（Nature Protocol 2009;4(5):638-49）に従い、カルスへのアグロバクテリウム感染を行った。自家受粉後のミナトカモジグサ  Bd21の未熟胚を取り出し、2,4-D (2.5μg/ml)を含むBDD培地で25℃暗所、約3週間培養することにより、未熟胚からカルスが形成された。
【００７３】
グリセロールストックのアグロバクテリウムをカナマイシン（50μg/ml）を含むLB液体培地に植菌し、28℃で一晩振とう培養を行った。これをカナマイシン（50μg/ml）を含むBDA培地に塗布し28℃で2日間静置培養した。生育してきた菌体をかき集めてアセトシリンゴン（40μg/ml）を含むアグロバクテリウム感染液に懸濁し、OD600nm=1.0に調整したものを接種懸濁液とした。
【００７４】
胚カルスを接種懸濁液に5分間浸した後、ハイグロマイシンとカルベニシリンを含む培地に移し25℃暗所で約6週間静置培養した。ハイグロマイシン耐性を示して成長を続けたカルスを、カイネチンを含むシュート形成培地に移し、25℃、16時間照明下で2〜5週間培養した。シュート形成が見られた個体についてはアグリポット中のMS培地に移植し、ルート形成を促した。アグリポット内で十分発根した植物を鉢上げし、3〜4ヶ月、22℃、湿度50％、20時間照明下で生育し種子（T1）を採取した。各発現ベクター導入アグロバクテリウムを使用したミナトカモジグサの形質転換の結果、tplb0009k09のプロモーター配列を組み込んだアグロバクテリウムを感染させたカルスだけは形質転換植物が発生しなかった。
【００７５】
[実施例５]  環境ストレス応答の評価
１．乾燥ストレス応答実験
実施例４で採取した形質転換植物のT1種子を、シャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後、ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことで葉と根を生育させた。乾燥ストレス処理は、水耕栽培中の植物体をキムタオルの上に置くことで乾燥ストレス状態にし、5時間処理を行った。
【００７６】
乾燥処理後、葉と根を切り分け凍結乾燥した。同様に無処理（コントロール）として水耕栽培を続けた形質転換体の葉と根も採取した。各サンプルからのRNAの抽出にはRNeasy Plant mini kitを使用し、次いでPrimeScriptII1st strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa BIO社製)を使用することで cDNAを合成した。プロモーター配列の下流に繋いだGUS遺伝子の半定量RT-PCRを行うことで乾燥ストレス応答を確認した。RT-PCR条件は以下に示す。
【００７７】
ポリメラーゼはQuick Taq HS DyeMix(TOYOBO社製)を使用し、50μlの反応系（1X Premix, 0.2μM PCRプライマー, テンプレート（上記cDNA） 25ng）で行った。PCRの条件は、最初に94℃で2分反応させた後、94℃で30秒、60℃で30秒及び68℃で1分のサイクルを30サイクル、最後に68℃で2分の条件で行った。PCR産物は、1.0%アガロースゲル電気泳動により、断片のサイズと増幅効率を確認した。ここで用いたPCRプライマーを以下の表２に示す。
【００７８】
【表２】
2015192606.tif 000003
【００７９】
PCR産物の電気泳動の結果を図１に示した。乾燥処理によって4種類のプロモーターで発現が強く応答されていた（Scaffold2239, Contig1515, tplb0004l11, tplb0015p04）。1種類（7AL.Contig16213）は微弱ながらも応答が見られた。tplb0010o09については乾燥ストレスによるGUS遺伝子の発現応答は見られなかった。
【００８０】
２．塩ストレス応答実験
実施例４で採取した形質転換植物のT1種子を、シャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後、ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことで葉と根を生育させた。塩ストレス処理は、水耕栽培中の植物体を200mM NaClを加えた22℃の水槽に植物体を移すことで塩ストレス状態にし、そのまま24時間処理を行った。
【００８１】
上記手法と同様に、サンプルからRNAを抽出し、cDNAの合成及びRT-PCRを行い、GUS遺伝子の発現を電気泳動にて確認した。PCR産物の電気泳動の結果を図２に示した。塩処理によって3種類のプロモーターで発現が見られ（Contig1515, tplb0004l11, tplb0015p04）、特に葉よりも根で強い応答が見られた。一方、Scaffold2239については塩ストレス応答は見られなかった。
【００８２】
３．低温ストレス応答実験
実施例４で採取した形質転換植物のT1種子を、シャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後、ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことで葉と根を生育させた。低温ストレス処理は、水耕栽培中の植物体を4℃に設定したグロースチャンバー中の4℃の水槽に植物体を移すことで低温ストレス状態にし、そのまま10時間処理を行った。
【００８３】
上記手法と同様に、サンプルからRNAを抽出し、cDNAの合成及びRT-PCRを行い、GUS遺伝子の発現を電気泳動にて確認した。PCR産物の電気泳動の結果を図３に示した。これまで乾燥及び塩ストレス応答を示した3種類のプロモーターは、低温ストレスにおいても応答することが示された。
【００８４】
４．GUS染色法による導入遺伝子の発現の観察
ミナトカモジグサに導入したプロモーターの活性を観察するために、GUS染色を実施した。乾燥、塩及び低温ストレス処理を行った植物体をGUS染色用の反応液（100mM リン酸ナトリムバッファー（pH7.0）, 1mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide(X-Gluc), 0.5mM K3〔Fe(CN)6〕, 0.5mM K4〔Fe(CN)6〕,0.1% Triton-X）に浸漬し、30分間脱気をした。その後、37℃で1晩反応させ、反応液を捨て、70%エタノールで反応液を置換して反応を停止させた。何度か70%エタノールを交換して葉緑素を除去した。
【００８５】
実体顕微鏡で観察した結果を図４に示す。各ストレス処理のサンプルは葉で染色が見られ、特に若い葉で濃い染色が認められた。
【００８６】
[実施例６]  レポーター遺伝子（GUS）の発現量解析
乾燥、塩及び低温で応答することが確認されたプロモーターについて、発現パターンと発現強度を分析するため、各ストレス条件下で経時的（ストレス付与から０時間後、１時間後、３時間後、５時間後、１０時間後、及び２４時間語）にRNAを抽出して、定量PCRを実施した。また各時間ストレス付与後から通常の栽培条件（水耕栽培、真水、22℃）に戻し、２日間栽培した時のプロモーターの応答及び下流遺伝子の発現量変化についても確認した。定量PCRにはFast SYBR Green Mster Mix(life technologies社製)及びStepOnePlus(life technologies社製)を使用した。比較対象のコントロールとして、遺伝子組換え植物に汎用的に用いられているカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、GUS遺伝子及びNosターミネーター（Tnos）を連結したプラスミドを導入した形質転換ミナトカモジグサを使用した。内部標準遺伝子としてUBC18遺伝子を用い（Hong et. al. (2008) BMC Plant Biol., Nov 7;8:112）、プライマーの配列を以下の表３に示す。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
図５はコントロールであるカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに対する相対発現の定量PCRの結果、図６はストレス処理開始時に対する相対発現の定量PCRの結果を示す。発現パターンは、3種類とも異なっており、早い時間で応答するものや継続して応答するものが見られた。また、どのプロモーターにおいても、ストレス条件下から通常の栽培条件に戻すとプロモーターの活性は無処理と同等レベルまで低下していた。発現強度については、3種類のプロモーターのうち、1種類はコントロールである35Sプロモーターと同程度の発現強度を示し、他の2種類は10〜150倍近く発現を誘導するプロモーターであった。3種類のプロモーター配列は、植物体で汎用的なプロモーターと同等以上の発現量を有するものであることが明らかとなった。
【００８９】
tplb0004l11では、乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で４．０倍であり、根において最大で０．８倍であり、塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で１．５倍であり、根において最大で３０．１倍であり、低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で３．８倍であり、根において最大で１４．１倍である。
【００９０】
Contig1515では、乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で５５．６倍であり、根において最大で４１．８倍であり、塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で３３．５倍であり、根において最大で１９０．５倍であり、低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で４１．８倍であり、根において最大で８８１．５倍である。
【００９１】
tplb0015p04では、乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で６３．１倍であり、根において最大で１０．９倍であり、塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で５．３倍であり、根において最大で１８２．６倍であり、低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で４３．３倍であり、根において最大で４４７．４倍である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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