(57)【要約】【課題】標識する検出対象の検出精度を向上できる粒子を提供する。【解決手段】粒子は、磁性材料１１と、磁性材料１１を内包する球状の非磁性材料１２と、を備え、磁性材料１１の重心Ｇ１と非磁性材料１２の重心Ｇ２とが互いにずれていることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性材料と、
前記磁性材料を内包する球状の非磁性材料と、
を備え、
前記磁性材料の重心と前記非磁性材料の重心とが互いにずれていることを特徴する粒子。
【請求項２】
加熱された状態で前記磁性材料に磁力を作用させることにより、前記磁性材料の重心と前記非磁性材料の重心とが互いにずらされ、前記重心がずれた状態で冷却されたことを特徴する請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記非磁性材料は、樹脂材料であり、
前記樹脂材料のガラス転位点以上の温度に加熱された状態で、前記磁性材料の重心と前記非磁性材料の重心とがずらされたことを特徴とする請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
前記非磁性材料の表面に固定され、所定の生体物質と特異的に結合する特異性生体物質を更に備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項５】
直径が２０〜２５０ｎｍであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項６】
磁性材料及び前記磁性材料を内包する球状の非磁性材料を加熱するステップと、
前記磁性材料及び前記非磁性材料が加熱された状態で、前記磁性材料に磁力を作用させることにより、前記磁性材料の重心と前記非磁性材料の重心とを互いをずらすステップと、
前記重心がずれた状態で冷却するステップと
を含むことを特徴する粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、抗原等の生体物質を分析するための粒子及び粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見や治療の効果等を定量的に分析する免疫学的検定（immunoassay）が知られている。免疫検定法の一つとして、容器の内壁面に固定された第１抗体と試料液中の抗原とを反応させ、反応しなかった物質を除去した後、反応した抗原と磁気ビーズで標識された第２抗体との反応量を定量する方法が提案されている（特許文献１参照）。反応量は、磁気ビーズに含有させた蛍光物質が発する光や磁気ビーズの反射光を光学的に検出することにより定量される。また、目的の抗原が流体内に存在する磁気粒子を捕捉し、磁性粒子が膜に結合されている側とは反対側の膜上を走査される磁気検出装置によって、磁性粒子で標識された抗原が検出される（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平５−５７４１号公報
【特許文献２】特表２０１３−５３９８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、磁気ビーズを用いた検出において、磁気ビーズの一部は、バイオマーカーと結合しないまま基板に到達したとき、基板上に固定された第１抗体と磁気ビーズで標識された第２抗体とは基本的に結合しないが、バイオマーカーと反応しないまま基板上に固定された第１抗体と磁気ビーズの第２抗体とが非特異吸着してしまう。一般に、投入したバイオマーカーが基板上に捕捉される確率は、０．１〜１％程度となる。すると、バイオマーカーの濃度によっては、検出信号に含まれる非特異吸着によるノイズも影響し、バイオマーカーの検出が困難になる。
【０００５】
また、磁性体粒子を含んだ磁気ビーズを用いて第１抗体が形成されている容器の内壁面に磁石を配置して、磁気ビーズを引き寄せる方式では、反応時間の短縮は可能となるが、反応収率を上げることはない。更に、磁石により磁気ビーズを含む溶液を攪拌したとしても、磁気ビーズの溶液中の振る舞いから、基板においてバイオマーカーに特異的に結合する磁気ビーズの顕著な増加は見込めない。
【０００６】
上記問題点を鑑み、本発明は、標識する検出対象の検出精度を向上できる粒子及び粒子の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、磁性材料（１１）と、磁性材料（１１）を内包する球状の非磁性材料（１２）と、を備え、磁性材料（１１）の重心（Ｇ１）と非磁性材料（１２）の重心（Ｇ２）とが互いにずれていることを特徴とする粒子である。
【０００８】
本発明の第２の態様は、磁性材料及び磁性材料を内包する球状の磁性材料を加熱するステップと、磁性材料及び非磁性材料が加熱された状態で、磁性材料に磁力を作用させることにより、磁性材料の重心と非磁性材料の重心とを互いをずらすステップと、重心がずれた状態で冷却するステップとを含む粒子の製造方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、磁性材料を偏心させることにより、標識する検出対象の検出精度を向上できる粒子及び粒子の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施の形態に係る粒子の基本的な構成を説明する模式的な図である。
【図２】（ａ）〜（ｆ）は、本発明の実施の形態に係る粒子により生体物質を標識する方法の一例を説明する模式的な基板の拡大断面図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る粒子の溶液中の振る舞いを説明する図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る粒子の溶液中の振る舞いを説明する図である。
【図５】一般的な磁気ビーズの溶液中の振る舞いを説明する図である。
【図６】一般的な磁気ビーズの溶液中の振る舞いを説明する図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る粒子におけるバイオマーカー濃度とビーズ計数結果との特性を、一般的な磁気ビーズとの場合と比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
次に、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付し、重複する説明を省略している。
【００１２】
（粒子）
本発明の実施の形態に粒子１は、図１に示すように、磁性材料１１と、磁性材料１１を内包する球状の非磁性材料１２と、非磁性材料１２の表面に固定された抗体１３とを備える。非磁性材料１２の重心Ｇ２と、磁性材料１１の重心Ｇ１とは、互いに位置がずれている。粒子１は、免疫学的検定において、抗原、抗体等のバイオマーカーを標識する磁気ビーズである。
【００１３】
磁性材料１１は、例えばフェライト、酸化鉄等の強磁性体からなる。磁性材料１１は、単一の粒子であってもよく、複数の粒子であってもよく、非磁性材料１２に被覆される。非磁性材料１２は、例えばポリスチレン等の合成樹脂からなり、略球形に形成される。非磁性材料１２または粒子１の直径は、数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度であり、例えば約２０〜２５０ｎｍである。抗体１３は、粒子１を用いた分析における検出対象となる抗原等の生体物質と、抗原抗体反応により特異的に結合する特異性生体物質である。
【００１４】
以下、図２（ａ）〜図２（ｄ）を参照して、粒子１を用いた分析方法の一例を説明する。図２（ａ）に示すように、基板２０の上面は、予め、表面に抗体３が固定される。抗体３は、疎水結合や共有結合により基板２０の上面に結合される。抗体３は、アビジン等の物質を介して基板２０の表面に固定されてもよい。
【００１５】
次に、図２（ｂ）に示すように、表面に所定の抗原が発現しているエキソソーム４等の生体物質を含む試料液が、基板２０と貫通孔を有するウェル２１により構成される容器に注入される。エキソソーム４は、ブラウン運動により試料液中を移動することにより抗体３と接触し、抗原抗体反応により、抗体３と特異的に結合する。
【００１６】
次に、図２（ｃ）に示すように、粒子１を含む緩衝液が容器に注入される。粒子１の表面に固定された抗体１３は、試料液及び緩衝液を含む溶液中において、抗原抗体反応により、エキソソーム４の抗原と特異的に結合する。粒子１は、エキソソーム４の抗原と結合することにより、エキソソーム４を標識する。
【００１７】
粒子１は、緩衝液が注入される際に基板２０の上方及び下方に磁石が配置され、上方及び下方に移動されることにより、溶液中での移動距離が長くなり、エキソソーム４との反応を促進することができる。
【００１８】
なお、抗体３及び抗体１３とは、エキソソーム４に発現する抗原と特異的に結合する特異性生体物質であればよく、それぞれが別の部位と結合する組み合わせを選択する。例えば、抗体３及び抗体１３は、異なる種類とされることにより、エキソソーム４の２種類の抗原を検出することができる。これに限らず、エキソソーム４は通常の抗原とは異なり、表面に同種のたんぱく質である抗原が複数存在していることから、抗体３及び抗体１３は、同じ種類とされてもよい。
【００１９】
図２（ｄ）に示すように、基板２０に注入された溶液を、洗浄バッファー及び純水等を用いて洗浄することにより、抗体３と結合しない余剰のエキソソーム４と、エキソソーム４と結合しない余剰の粒子１とを含む溶液が除去される。そして、ウェル２１を基板２０から分離して、光ピックアップにより基板２０が光学的に走査され、粒子１が検出されることにより、粒子１に標識されたエキソソーム４を分析することができる。
【００２０】
粒子１は、図３に示すように、磁石により上方及び下方に交互に磁力を作用されることによって、溶液中を上方及び下方に交互に移動する。例えば、粒子１は、位置Ａから磁石の磁力により上方に移動していたとする。このとき、磁性材料１１が位置する側の粒子１の半球面は、磁性材料１１に磁力が上方に作用することにより、上方（移動方向）を向く。また、粒子１が上方に移動する間、移動方向を向く半球面とエキソソーム４とが接触して結合したとする。
【００２１】
粒子１は、エキソソーム４と結合した後、下方に移動する間の位置Ｂにおいて、磁性材料１１に磁力が下方に作用することにより、上方を向いていた半球面が、下方を向くことになる。よって、エキソソーム４は、粒子１の下方を向く半球面に位置し、下方の抗体３と接触して結合する可能性が高くなる。
【００２２】
また、図４に示すように、粒子１は、位置Ａにおいて下方に移動するとする。この後、粒子１は、位置Ｂにおいて、下方を向く半球面がエキソソーム４と接触し、エキソソーム４の抗原と粒子１の表面に固定された抗体１３とが特異的に結合する。粒子１は、位置Ｃに示すように、更に下方に移動したとしても、エキソソーム４と結合した半球面を下側にしてまま移動を続ける。このように、粒子１は、磁性材料１１が偏心されていることにより、エキソソーム４等を介して基板２０に固定される確率を高くすることができる。
【００２３】
一方、図５に示すように、磁性材料と非磁性材料との重心が一致する一般的な磁気ビーズ１Ｐは、上方に作用する磁力により位置Ａから上方に移動する。このとき、磁気ビーズ１Ｐの上側の半球面とエキソソーム４とが接触して結合したとする。その後、磁気ビーズ１Ｐは、下方に作用する磁力により下方に移動する。このとき、磁気ビーズ１Ｐは、位置Ｂに示すように、エキソソーム４と結合した半球面が上方を向いたまま下方に移動する。よって、エキソソーム４は、磁気ビーズ１Ｐにおいて抗体３が固定される基板と反対側の半球面に位置してしまう。
【００２４】
また、図６に示すように、磁気ビーズ１Ｐは、位置Ａにおいて下方に移動するとする。この後、磁気ビーズ１Ｐは、位置Ｂにおいて、下方を向く半球面がエキソソーム４と接触して結合する。磁気ビーズ１Ｐは、位置Ｃに示すように、更に下方に移動する際、溶液の粘性抵抗により、エキソソーム４と結合した半球面が、移動方向と反対方向を向く。よって、エキソソーム４は、磁気ビーズ１Ｐにおいて抗体３が固定される基板と反対側の半球面に位置してしまう。
【００２５】
以上のように、一般的な磁気ビーズ１Ｐは、抗体３が固定された基板方向に移動する際、溶液の粘性抵抗の影響により、結合したエキソソーム４を基板と反対側に向けてしまい、抗体３とエキソソーム４との反応確率が悪化する可能性がある。
【００２６】
なお、磁気ビーズ１Ｐに下方を向く磁力が作用すれば、磁力は粘性抵抗に打ち勝ち、磁気ビーズ１Ｐの方向を変えること無く基板の抗体３まで到達するかに思われる。ところが、免疫反応における標識用の磁気ビーズ１Ｐは上述のように、直径が数十〜２００ｎｍ程度であり、内包される磁性材料の直径は数十ｎｍとなる。よって、磁気ビーズ１Ｐの室温における振る舞いは、一般的な強磁性体と異なり、スピン軌道相互作用に起因する分子内での磁気モーメントの異方性を保つエネルギー、すなわち交換エネルギーと比して熱擾乱による影響が上回る「超常磁性」状態となる。そのため、磁気ビーズ１Ｐに異方性は無く、容易に磁化が回転してしまう。すなわち、溶液の粘性抵抗により容易に磁気ビーズは回転してしまい、結果的にエキソソーム４等のバイオマーカーを捕獲した磁気ビーズ１Ｐは基板上の抗体３との反応確率は向上しない。
【００２７】
（製造方法）
以下、本発明の実施の形態に係る粒子１の製造方法の一例を説明する。
先ず、それぞれ、フェライト等の磁性材料１１を内包し、球状に形成されたポリスチレン等の複数の非磁性材料１２を、窒素中において、ガラス転位点である１００℃以上（例えば１３０℃）まで加熱する。磁性材料１１及び非磁性材料１２を加熱した状態で、磁性材料１１及び非磁性材料１２に５００ｍＴ程度の磁界を印加することにより、磁性材料１１に磁力が作用される。
【００２８】
次いで、磁性材料１１及び非磁性材料１２に磁界を印加した状態で、磁性材料１１及び非磁性材料１２が３０分程度放置される。放置の後、印加した電界を維持したまま磁性材料１１及び非磁性材料１２が室温まで冷却される。
【００２９】
以上のように、磁性材料１１の重心Ｇ１と非磁性材料１２の重心Ｇ２とが互いにずらされた粒子１を製造することができる。なお、フェライト等の酸化鉄は、キュリー点が４００℃以上であり、キュリー点より十分低い加熱温度まで加熱されても何ら影響を受けない。
【００３０】
（比較例）
図７を用いて、本発明の実施の形態に係る粒子１によりバイオマーカーを標識して粒子１を計数した結果と、従来の磁気ビーズ１Ｐを用いた場合の計数結果との比較例を説明する。横軸は、検出対象となるバイオマーカー（エキソソーム４）の濃度であり、縦軸は粒子１及び磁気ビーズ１Ｐの計数結果である。粒子１による計数結果を曲線Ｐ１に、磁気ビーズ１Ｐによる計数結果を曲線Ｐ２に示す。
【００３１】
曲線Ｐ１は、曲線Ｐ２に対してバイオマーカーの濃度に関わらず計数結果が多く、最大で４倍近い差が生じた。粒子１が吸引される際に非磁性材料１２に対して偏心された磁性材料１１に磁力が生じ、溶液の粘性抵抗により、磁性材料１１が偏心された方向に移動するためと考えられる。
【００３２】
曲線Ｐ１及び曲線Ｐ２に沿う破線のように、理想的にはバイオマーカー含有量が０であれば計数結果も０となるべきである。しかしながら、抗原抗体反応を用いた検出方法では、基板２０上に、抗原抗体反応による結合の他に非特異吸着が生じる。このため、バイオマーカーの濃度が０であっても、非特異吸着により基板２０の表面に固定された粒子１及び磁気ビーズ１Ｐが計数されてしまう。
【００３３】
曲線Ｐ１，Ｐ２において、誤差下限と曲線Ｐ１，Ｐ２のバックグラウンドノイズレベルＱとの接点（交点）をそれぞれ最小検出感度Ｒ１，Ｒ２という。本発明の実施の形態に係る粒子１の最小検出感度Ｒ１は、磁気ビーズ１Ｐの最小検出感度Ｒ２に比べて向上しており、バイオマーカー検出の感度が向上していることが分かる。よって、本発明の実施の形態に係る粒子１によれば、生体物質等の分析において疾病等の検出感度を向上することができる。
【００３４】
本発明の実施の形態に係る粒子１によれば、内包される磁性材料１１が偏心されているため、液体中を磁力により移動する際、表面が常に同じ方向を向く。よって、粒子１は、常に同じ半球面において結合する対象との衝突が起き、抗体、抗原等のバイオマーカーとの反応確率を大幅に向上することができる。よって、粒子１は、生体物質の分析を行う時間を短縮でき、検出対象の定量性を向上できるため、分析の精度を向上することができる。
【００３５】
また、本発明の実施の形態に係る粒子１によれば、検出感度を向上できるため、従来より濃度の低いバイオマーカーであっても、検出対象を検出できる。よって、血液等を試料とする場合、被検者のＱＯＬ（quality of life）を向上することができる。
【００３６】
（その他の実施の形態）
上記のように、本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【００３７】
例えば、既に述べた実施の形態において、検出対象である生体物質と、検出対象と特異的に結合する特異性生体物質との組み合わせは、エキソソーム４の抗原と、抗体３及び抗体１３との組み合わせに限るものでない。特異的に結合する組み合わせは、例えば、リガンドと受容体（酵素タンパク質、レクチン、ホルモン等）との組み合わせ、互いに相補的な塩基配列を有する核酸の組み合わせ等であってもよい。
【００３８】
その他、上述の構成を相互に応用した構成等、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
【符号の説明】
【００３９】
Ｇ１  重心
Ｇ２  重心
１  粒子
１Ｐ  磁気ビーズ
３，１３  抗体（特異性生体物質）
４  エキソソーム（生体物質）
１１  磁性材料
１２  非磁性材料
２０  基板
２１  ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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