(57)【要約】【課題】本発明は、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用を有するポリクローナル抗体を提供することを目的とする。【解決手段】鳥類の卵から調製されたポリクローナル抗体であって、苦味受容体（Ｔ２Ｒ）活性化作用を有することを特徴とするポリクローナル抗体。当該抗体は、Ｔ２Ｒの全長タンパク質を抗原として、鳥類に免疫して得られることが好ましい。当該抗体は苦味刺激自体が及ぼす生理機能のさらなる解明やリガンド結合部位の解明に繋がるツールとして利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類由来のポリクローナル抗体であって、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用を有することを特徴とするポリクローナル抗体。
【請求項２】
苦味受容体Ｔ２Ｒの全長タンパク質を抗原として、鳥類に免疫して得られるポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載のポリクローナル抗体。
【請求項３】
抗原が、苦味受容体Ｔ２Ｒの立体構造を維持している全長タンパク質であることを特徴とする請求項２に記載のポリクローナル抗体。
【請求項４】
抗原が、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ及びＣ末端にＨｉｓタグを付加した苦味受容体Ｔ２Ｒの全長タンパク質であることを特徴とする請求項２又は３に記載のポリクローナル抗体。
【請求項５】
苦味受容体Ｔ２Ｒが、ヒト苦味受容体ｈＴ２Ｒ１６であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリクローナル抗体。
【請求項６】
前記抗原を免疫されたニワトリの卵から調製されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のポリクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とする苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化用組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリクローナル抗体と、苦味受容体Ｔ２Ｒ発現細胞とを接触させることを特徴とする苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用を有するポリクローナル抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物は、少なくとも５つの基本的味覚、すなわち、甘味、苦味、酸味、塩味、及び旨味を認識する感覚を持つと考えられている。苦味、甘味、及び旨味の感知は、舌の表面にある味覚受容体細胞で発現するＧタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）を介して行なわれ、酸味、塩味の感知は、イオンチャネルを介して行なわれると考えられている。
【０００３】
味覚は、生物にとって食物の種類や質に関する情報を得るための重要な役割を持っている。例えば、甘味（糖のシグナル）、旨味（タンパク質や核酸のシグナル）、塩味（ミネラルのシグナル）は、生きていくために必要な栄養素を含む食物であることを知らせ、酸味（腐敗物のシグナル）や苦味（毒物のシグナル）は、有毒な物質や有害な物質を含むことを知らせる。
【０００４】
しかし、ヒトにとって苦味や酸味はその強さの程度によってはおいしさの重要な要素となり得るものである。特に嗜好性の強い食品においては苦味や酸味は重要な要素となっている。
【０００５】
苦味物質は味蕾の味細胞膜上に特異的に発現する苦味受容体Ｔ２Ｒによって受容される。Ｔ２Ｒは細胞膜を貫通する領域を７つ持った「７回膜貫通型タンパク質」と呼ばれる膜タンパク質であり、細胞内に位置する部分でＧタンパク質と共役して苦味刺激を伝達する。Ｔ２Ｒファミリーには多くの種類があることが知られている。
【０００６】
これまで、苦味受容体Ｔ２Ｒに対するアンタゴニスト活性を有する抗体は報告されているが（特許文献１）、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用（苦味受容体Ｔ２Ｒに対するアゴニスト活性）を有するポリクローナル抗体は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−５１８６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用を有するポリクローナル抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］鳥類由来のポリクローナル抗体であって、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用を有することを特徴とするポリクローナル抗体。
［２］苦味受容体Ｔ２Ｒの全長タンパク質を抗原として、鳥類に免疫して得られるポリクローナル抗体であることを特徴とする前記［１］に記載のポリクローナル抗体。
［３］抗原が、苦味受容体Ｔ２Ｒの立体構造を維持している全長タンパク質であることを特徴とする前記［２］に記載のポリクローナル抗体。
［４］抗原が、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ及びＣ末端にＨｉｓタグを付加した苦味受容体Ｔ２Ｒの全長タンパク質であることを特徴とする前記［２］又は［３］に記載のポリクローナル抗体。
［５］苦味受容体Ｔ２Ｒが、ヒト苦味受容体ｈＴ２Ｒ１６であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載のポリクローナル抗体。
［６］前記抗原を免疫されたニワトリの卵から調製されることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載のポリクローナル抗体。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載のポリクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とする苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化用組成物。
［８］前記［１］〜［６］のいずれかに記載のポリクローナル抗体と、苦味受容体Ｔ２Ｒ発現細胞とを接触させることを特徴とする苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、苦味受容体Ｔ２Ｒ活性化作用を有するポリクローナル抗体を提供することができる。この抗体は苦味刺激自体が及ぼす生理機能のさらなる解明やリガンド結合部位の解明に繋がるツールとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−ＨｉｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２】精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−ＨｉｓのＣＤスペクトル（円偏光２色性）測定の結果を示した図である。
【図３】精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓの二次構造を示す図である。
【図４】調製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓを抗原とし、一次免疫後、二次免疫後及び三次免疫後にそれぞれ卵黄中の抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図５】精製した鶏卵抗体の力価をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図６】ｈＴ２Ｒ１６発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、サリシン添加後の細胞内カルシウム濃度の推移を調べた結果を示す図である。
【図７】ｈＴ２Ｒ１６発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、本発明のポリクローナル抗体添加後の細胞内カルシウム濃度の推移を調べた結果を示す図である。
【図８】各種サンプルについて、ｈＴ２Ｒ１６発現ＨＥＫ２９３細胞の細胞内カルシウム濃度の変化を比較した結果を示す図である。
【図９】抗体（抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ）及びサリシンの苦味強度及び味質を評価した結果を示す図であり、（ａ）は苦味強度の評価結果、（ｂ）は味質の評価結果である。
【図１０】抗体を事前摂取した場合のサリシンの苦味強度の官能評価の結果を示す図であり、（ａ）は抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹを事前摂取した場合の結果、（ｂ）はコントロール抗体を事前摂取した場合の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、鳥類由来のポリクローナル抗体であって、苦味受容体Ｔ２Ｒ（以下、単にＴ２Ｒという。）活性化作用を有することを特徴とするポリクローナル抗体（以下、本発明のポリクローナル抗体という。）を提供する。Ｔ２Ｒ活性化作用を有するポリクローナル抗体は、Ｔ２Ｒに対するアゴニスト活性を有するポリクローナル抗体と換言することができる。
【００１３】
抗原が受容体である場合、当該受容体を抗原として得られる抗体は、抗原と結合することにより本来のリガンドの結合を阻害し、アンタゴニストとして作用することが予想される。しかし、本願発明者らが取得した鳥類由来のポリクローナル抗体は、予想に反して抗原受容体を活性化させる（アゴニストとして作用する）ものであった。しかも、多種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体中には、抗原受容体に対するアンタゴニスト活性を奏する抗体が含まれることが予想されるところ、全体として抗原受容体の活性化作用を奏するポリクローナル抗体が得られたことは、全く予期できないことであった。
【００１４】
本発明のポリクローナル抗体は、鳥類由来のポリクローナル抗体であり、以下に説明する抗原を鳥類に免疫することにより取得することができる。
抗原は、Ｔ２Ｒの全長タンパク質又はその一部を含むものであればよいが、Ｔ２Ｒの全長タンパク質を含むことが好ましく、Ｔ２Ｒの全長タンパク質以外のタンパク質（例えばＧＦＰなど）を含まないことがより好ましい。すなわち、抗原は、Ｔ２Ｒの全長タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質でなく、単独のＴ２Ｒの全長タンパク質であることが好ましい。
【００１５】
抗原に用いるＴ２Ｒの全長タンパク質は、Ｔ２Ｒの立体構造を維持していることが好ましい。抗原に用いるＴ２Ｒの全長タンパク質が立体構造を維持していることは、ＣＤスペクトル測定やリガンド結合能の有無により確認することができる。また、抗原に用いるＴ２Ｒの全長タンパク質は、精製のためのアフィニティータグを有していてもよい。アフィニティータグは公知のアフィニティータグから適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグなどが挙げられる。抗原に用いるＴ２Ｒの全長タンパク質として、好ましくは、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ及びＣ末端にＨｉｓタグを付加したＴ２Ｒの全長タンパク質である。
【００１６】
Ｔ２Ｒファミリーには多くの種類があり、ヒトでは２５種類（ｈＴ２Ｒ１、ｈＴ２Ｒ３、ｈＴ２Ｒ４、ｈＴ２Ｒ５、ｈＴ２Ｒ７、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ９、ｈＴ２Ｒ１０、ｈＴ２Ｒ１３、ｈＴ２Ｒ１４、ｈＴ２Ｒ１６、ｈＴ２Ｒ３８、ｈＴ２Ｒ３９、ｈＴ２Ｒ４０、ｈＴ２Ｒ４１、ｈＴ２Ｒ４２、ｈＴ２Ｒ４３、ｈＴ２Ｒ４４、ｈＴ２Ｒ４５、ｈＴ２Ｒ４６、ｈＴ２Ｒ４７、ｈＴ２Ｒ４８、ｈＴ２Ｒ４９、ｈＴ２Ｒ５０、ｈＴ２Ｒ６０）が存在し、マウスでは３５種類（Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１１、Ｔ２Ｒ１２、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１５、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ１７、Ｔ２Ｒ１８、Ｔ２Ｒ２０、Ｔ２Ｒ２１、Ｔ２Ｒ２２、Ｔ２Ｒ２３、Ｔ２Ｒ２４、Ｔ２Ｒ２６、Ｔ２Ｒ２７、Ｔ２Ｒ２９、Ｔ２Ｒ３０、Ｔ２Ｒ３１、Ｔ２Ｒ３４、Ｔ２Ｒ３５、Ｔ２Ｒ３６、Ｔ２Ｒ３７、Ｔ２Ｒ３８、Ｔ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３，Ｔ２Ｒ１０４、Ｔ２Ｒ１０６、Ｔ２Ｒ１０８、Ｔ２Ｒ１０９、Ｔ２Ｒ１１９、Ｔ２Ｒ１２２、Ｔ２Ｒ１３９）が存在する（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  Ｊ．，Ｈｏｏｎ  Ｍ．Ａ．  Ｒｙｂａ  Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ：Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｓｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６；４４４；２８８−２９４）。
【００１７】
苦味受容体Ｔ２Ｒは、リガンドが判明しているものが好ましく、例えばＴ２Ｒ４，４４（リガンド：デナトニウム）、マウスＴ２Ｒ５（リガンド：シクロヘキシミド）、Ｔ２Ｒ１０（リガンド：ストリキニーネ）、Ｔ２Ｒ１６（リガンド：サリシン）、Ｔ２Ｒ３８（リガンド：フェニルチオカルバミド）、Ｔ２Ｒ４３，４４（リガンド：サッカリン）等が挙げられる。好ましくは、ヒト苦味受容体ｈＴ２Ｒ１６である。ｈＴ２Ｒ１６のアミノ酸配列（配列番号１）及びコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）は、それぞれアクセッション番号：ＡＡＨ９５５２４及びＢＣ０９５５２４として、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬに登録されている。
【００１８】
公知の方法でＴ２Ｒ遺伝子をクローニングして、種々の発現系において発現させることで得ることができる。上記各Ｔ２Ｒ遺伝子の塩基配列は、公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬなど）から取得することができる。取得した塩基配列に基づいてＰＣＲプライマーを作製し、常法に従ってクローニングすることができる。
【００１９】
クローニングしたＴ２Ｒ遺伝子を導入する発現ベクターは、宿主に応じて適宜選択すればよく、例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合はｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＢ００９８６４）等、大腸菌の場合はｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等、酵母の場合はｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）、ｐＲＳ４２６（Ａｄｄｇｅｎｅ社製）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等、昆虫細胞の場合はＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。
【００２０】
本発明においては、宿主は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞（例えば、大腸菌等の細菌、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）など）を用いることができるが、中でも酵母が好ましく用いられる。
【００２１】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を用いることができる。得られた形質転換体を培養し、発現誘導した後、培養物などから、濾過、遠心分離、破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの慣用的な手法を組み合わせて、Ｔ２Ｒタンパクを回収、精製することができる。
【００２２】
抗原を免役する鳥類は特に限定されないが、例えばニワトリ、ウズラ、アヒル等の家禽類、ダチョウ等が挙げられる。好ましくはニワトリである。本発明においては、抗体の量産性などの点から、鳥類に免疫して、その卵から抗体を調製することが好ましい。
【００２３】
免疫の方法は特に限定されず、例えば、Ｍａｋｏｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（２）：２７０−２７４，１９９２に記載された方法、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅｎ’ｓ  Ｅｇｇ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（８）．２１４１−２１４３．１９９１）に記載された方法等が挙げられる。免疫は抗原を免疫増強剤（アジュバント）と共に接種（皮下注射、筋肉注射など）することにより行うことが好ましい。アジュバントとしては、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマーなどの沈降性アジュバンドや、流動パラフィン、ラノリン、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）などの油性アジュバントが例示できる。
【００２４】
抗原の接種量は、目的とする抗体が体内に適当量形成され、かつ動物に対して過度の毒性が発揮されないように適宜決定すればよい。また、抗原の接種は数回に分けて行い、高力価が持続するように追加接種することが好ましい。
【００２５】
抗原を免疫された鳥類が生産した卵からポリクローナル抗体を調製する方法は、公知の方法で行うことができる。例えば、免疫したニワトリの卵中に抗体が適当量生成したことを確認した後、卵を採取し、卵から卵黄液を分離し、得られた卵黄液を粉末化した後、その粉末をエタノール等を用いて脱脂した粉末中から緩衝液を用いて抽出する方法、カラギーナンを使用した方法（Ｈ．Ｈａｔｔａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，５４（１０），２５３１−２５３５，１９９０）などによってポリクローナル抗体を調製することができる。
上記で得られたポリクローナル抗体は、適宜、塩析やカラムを用いた方法などにより更に精製することもできる。
【００２６】
得られたポリクローナル抗体がＴ２Ｒ活性化作用を有することは、例えばＴ２Ｒ発現細胞に得られたポリクローナル抗体を接触させ、カルシウム応答の推移を調べることにより確認することができる。ポリクローナル抗体をＴ２Ｒ発現細胞に接触させた後、Ｔ２Ｒリガンドとして知られるサリシン等と同様のカルシウム応答の推移を示した場合には、ポリクローナル抗体はＴ２Ｒ活性化作用を有すると判断することができる。
【００２７】
本発明のポリクローナル抗体は、Ｔ２Ｒを活性化することにより、本来のリガンドによる苦味強度を増大させる効果を奏する。本発明のポリクローナル抗体とリガンドとを同時にＴ２Ｒと接触させてもよく、本発明のポリクローナル抗体とＴ２Ｒとを接触させた後にリガンドとＴ２Ｒとを接触させてもよいが、本発明のポリクローナル抗体とＴ２Ｒとを接触させた後にリガンドとＴ２Ｒとを接触させると効果を増大させることができる。
【００２８】
本発明は、上記本発明のポリクローナル抗体を有効成分として含有するＴ２Ｒ活性化用組成物（以下、本発明の組成物という。）を提供する。本発明の組成物は、上記本発明のポリクローナル抗体を有効成分として含有していればよく、Ｔ２Ｒ活性化作用を損なわない限り、さらに他の成分を含有していてもよい。本発明の組成物における本発明のポリクローナル抗体の含有量はＴ２Ｒ活性化作用を有する範囲内で適宜設定することができる。本発明の組成物の形態は特に限定されず、固体、液体等の何れであってもよい。
【００２９】
本発明は、上記本発明のポリクローナル抗体と、Ｔ２Ｒ発現細胞とを接触させることを特徴とするＴ２Ｒ活性化方法（以下、本発明の方法という。）を提供する。本発明の方法において、Ｔ２Ｒ発現細胞は、細胞膜上にＴ２Ｒを発現している細胞であればよく、生体に存在するＴ２Ｒ発現細胞、及び組換えＴ２Ｒを強制発現させた細胞のいずれであってもよい。生体に存在するＴ２Ｒ発現細胞としては、例えば、味蕾の味細胞などが挙げられる。接触の方法は特に限定されないが、例えば、本発明のポリクローナル抗体を舌上に載せる方法、組換えＴ２Ｒ強制発現細胞の培地に本発明のポリクローナル抗体を添加する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
〔実施例１：抗原の調製〕
（１）ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ発現酵母株の作製
（１−１）ヒトＴ２Ｒ１６（ｈＴ２Ｒ１６）遺伝子のクローニング
ｈＴ２Ｒ１６遺伝子は、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型に用いて表１に示すＦ１及びＲ１プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅しクローニングした。
【００３２】
マウス・ロドプシンのＮ末端３８残基配列遺伝子（ｍＲｈｏ）は、Ｄｒ．ＬｉｑｕａｎＨｕａｎｇ（モネル研究所、ＵＳＡ）から供与された遺伝子を鋳型にして表１のＦ２及びＲ２プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。表１のＦ３及びＲ３プライマーを用いて再度ＰＣＲ法により増幅したｈＴ２Ｒ１６とｍＲｈｏを混合し、これを鋳型として表１のＦ２及びＲ３プライマーを用いてＰＣＲ法にてｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６融合遺伝子を増幅した後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６を得た。
【００３３】
【表１】
2015063499.tif 000002
【００３４】
（１−２）ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ融合遺伝子の増幅
表２に示すＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ及び８×Ｈｉｓ−ｈＴ２Ｒ１６ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒを用い、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６を鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動により目的のサイズであることを確認した。
【００３５】
【表２】
2015063499.tif 000003
（１−３）形質転換酵母の作製
ＹＰＤ培地で前日から培養しておいた酵母(Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ＢＪ３５０１株)を、ＹＰＤ培地３０ｍＬでＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．４になるように調製し、３０℃で４時間培養した。培養後、培養液を遠心分離して菌体を回収し、１Ｍソルビトールで３回洗浄後、１Ｍソルビトール：５００μＬに再懸濁した。
ＰＣＲ産物（ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ融合遺伝子）とＳｍａIで直線化したｐＰｒＧＳ−ＤＤＧＦＰ（京都大学水谷博士より供与）と酵母懸濁液とを混合させて４０℃で４０分間インキュベートし、リチウムアセテート法（酢酸リチウム法）により形質転換を行った。その後、ＳＤ−ＵＨプレートに散布し、約３日後まで３０℃でインキュベートしてコロニーが複数できていることを確認した。
【００３６】
（２）ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓの精製
（２−１）ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ発現酵母の培養及び膜画分の回収
プレートのコロニーから、２％グルコース含ＳＣ−Ｕ培地中で３０℃で２〜３日間前々培養を行った後、２％グルコース含ＳＤ−ＣＡＡ培地を含む２Ｌフラスコに植菌し、３０℃で４８時間培養した（前培養）。培養後遠心分離し、上清を捨て、酵母をＳＤ−ＣＡＡ培地に移し、ガラクトース（終濃度２％）を加えて２０℃で７２時間誘導培養した。培養後遠心分離し上清を捨て、ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。ファルコンチューブにｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓと懸濁液を入れ、高速振盪機（ＣＭ１０００）に直接固定する方法により、１時間低温室で攪拌して細胞壁を破砕した。遠心分離し、上清を集めた。ペレットをｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、さらに２回遠心分離して上清を集めた。集めた上清を４℃、３０，０００ｒｐｍ、１時間、遠心分離機(ＨＩＴＡＣＨＩ社)にかけ沈殿画分をｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。上記操作はクリーンベンチ内で行った。保存する場合は液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００３７】
（２−２）アフィニティーカラム（Ｎｉカラム）による精製
膜画分をｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、界面活性剤（Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、最終濃度１％）を加え、４℃で１時間処理して可溶化した後、遠心分離して上清を集めた。集めた上清をＮｉ−ＮＴＡミニカラムにアプライし、２時間吸着させた。次にｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒでミニカラムを洗浄した後、ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒをミニカラムにアプライし、溶出フラクション（目的タンパク質）を１ｍｌずつ４本のチューブに分取した。
【００３８】
（３）精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓの確認
精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。結果を図１に示した。精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓのバンドの位置を矢印で示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロッティングのいずれにおいても同じ位置にバンドが現れ、高純度のＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓが得られたことが確認できた。
【００３９】
次に、精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓの二次構造を調べるために、ＣＤスペクトル（円偏光２色性）測定（円二色性分散計「Ｊ−８２０」、日本分光社製）を行った。結果を図２に示した。タンパク質のαへリックスのスペクトルは２０８ｎｍと２２２ｎｍ付近に二つの負の極大を持つという特性を持つが、精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓについても同様のスペクトルが得られ（図中、Ｔ２Ｒ１６（２５℃））、また２２２ｎｍの値から算出したαへリックス含量が予測値と近い値を示した。以上より、ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓは二次構造を保持していることが明らかとなった。精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓの二次構造のイメージを図３に示した。
【００４０】
また、ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓのリガンド結合能を調べるために、リガンドの存在下及び非存在下において温度を変化させてＣＤスペクトルを測定した。温度２５℃においては、リガンドであるサリシンを加えてもスペクトルに変化はなかった（図中、Ｔ２Ｒ１６＋ｓａｌｉｃｉｎ（２５℃））。温度を９０℃に上昇させると、２０８ｎｍ及び２２２ｎｍにおける負の値が小さくなり、タンパク質中のα−ヘリックスが減少することが示されたが（図中、Ｔ２Ｒ１６（９０℃））、サリシン存在下ではα−ヘリックスの減少が抑制されるという結果が得られた（図中、Ｔ２Ｒ１６＋ｓａｌｉｃｉｎ（９０℃））。このα−ヘリックスの減少抑制は、サリシンがＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓに結合したことにより、変性が抑制されたと考えられた。つまり、精製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓはリガンド結合能を有していることから、二次構造を保持していると考えられた。
【００４１】
〔実施例２：抗体の調製〕
（１）免疫
実施例１で調製したＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓを抗原とし、以下の条件で産卵鶏（２羽）のももの筋肉に注射して免疫を行った。
・一次免疫（０週とする）
ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ：０．２ｍｇ／羽
アジュバント：ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）
・二次免疫（２週間後）
ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ：０．５ｍｇ／羽
アジュバント：ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）
・三次免疫（４週間後）
ＦＬＡＧ−ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ：０．２ｍｇ／羽
アジュバント：ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）
抗原を接種したニワトリの卵黄中の抗体力価の推移をＥＬＩＳＡによって調べた。結果を図４に示した。図４より、三次免疫後の卵黄で抗体力価が上昇することが確認された。
【００４２】
（２）鶏卵からの抗体精製
十分に抗体力価が上昇した６週間後及び７週間後（三次免疫から２及び３週間後）の卵から卵黄を分離し、得られた卵黄を均質化した後、抗体精製時まで−２０℃に凍結保存した。解凍した卵黄液２２５ｇを用い、３倍量の０．５％食塩水（６７５ｍＬ）を加え、均質になるよう撹拌した。更に、２倍量の０．４％のλ−カラギーナン水溶液４５０ｍＬを加え、撹拌後、１時間静置した。静置後、８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、その上清を回収した。回収した上清を、セライト−５４５、ろ紙、ヌッチェ型ロート、ろ過びんを用いてろ過した。ろ液に硫酸ナトリウムを加え、塩析を行った。塩析は３回実施した。その後、１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム溶液を透析外液として用いて４℃で一晩透析を行った。その後、０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は凍結乾燥した。
【００４３】
（３）抗体の評価
精製した抗体のｈＴ２Ｒ１６に対する抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡは、ｈＴ２Ｒ１６を固相化した９６ウェルプレートを用い、一次抗体に抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ又はコントロールＩｇＹを１０，０００ｎｇ／ｍＬから２倍段階希釈した抗体液、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体、発色液にはｐＮＰＰを用いた。コントロールＩｇＹは未免疫鶏卵から上記と同様な方法で精製したものを使用した。ＥＬＩＳＡの結果を図５に示した。精製した抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹは濃度依存的に抗体力価が上昇した。一方、コントロールＩｇＹは、いずれの濃度でも抗体力価は上昇しなかった。この結果から、得られた鶏卵抗体は、ｈＴ２Ｒ１６に特異的な抗体であることが明らかとなった。
【００４４】
（４）カルシウムイメージング法による評価
カルシウムイメージング法とは細胞にカルシウム感受性の試薬を負荷し、細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する方法であり、苦味物質によって苦味受容体が活性化すると細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇する。
【００４５】
（4-1）実験１
ｈＴ２Ｒ１６を発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、サリシン又はｈＴ２Ｒ１６抗体添加後の細胞内カルシウム濃度の推移を調べた。細胞数が５×１０４／ウェルになるよう９６ウェルプレートに播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターに入れ、１日培養したのち、Ｃａ２＋感受性蛍光色素Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（終濃度２μＭ）を含むＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地で、室温で３０分間、続いて３７℃で３０分間インキュベートした。ウェル中の液を取り除き、ＤＰＢＳ（＋）中、室温で３０分間インキュベートしＡＭ基の切断を促した。その後、マイクロプレートリーダーＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＨＴ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いてウェルに試料液をインジェクションして細胞の蛍光変化を1分間測定（励起４８５ｎｍ／測定５２８ｎｍ）した。結果を図６及び図７に示した。図６はサリシン添加後の細胞内カルシウム濃度の推移を示した図であり、図７は得られた抗体を添加した後の細胞内カルシウム濃度の推移を示した図である。図６より、サリシン添加により細胞内のカルシウム濃度が上昇したこと、つまり、サリシンによりｈＴ２Ｒ１６発現細胞が活性化されたことが示された。また、図８より、得られた抗体の添加により、濃度依存的に細胞内のカルシウム濃度が上昇したことが明らかとなった。この結果から、得られた抗体（鶏卵ポリクローナル抗体）は、ｈＴ２Ｒ１６を濃度依存的に活性化させることが明らかになった。
【００４６】
（4-2）実験２
ｈＴ２Ｒ１６発現ＨＥＫ２９３細胞を用いたカルシウムイメージング法により、各種サンプル添加時の細胞内カルシウム濃度の推移を比較した。サンプルには、ＤＰＢＳ（溶媒対照）、陽性対照として１ｍＭ  Ｓａｌｉｃｉｎ（図中：Ｓａｌ）及び２５μＭ  Ｉｓｏｐｒoｔｅｒｅｎｏｌ（図中：Ｉｓｏ）、０．０５％抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ（上記により得られた鶏卵ポリクローナル抗体）（図中：Ａｎｔｉ−Ｔ２Ｒ１６ＩｇＹ）、陰性対照として未免疫鶏卵より精製した０．０５％コントロールＩｇＹ（図中：ＩｇＹ）を用いた。いずれのサンプルも、２０個の細胞について細胞内カルシウム濃度の推移を測定し、サンプル添加前と添加後の細胞内カルシウム濃度の差を求めた。
結果を図８に示した。図８に示されるように、陰性対照として用いた０．０５％ＩｇＹではＤＰＢＳ（溶媒対照）と同程度の細胞内カルシウム濃度の上昇であったが、０．０５％抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹを添加した場合は、１ｍＭ  Ｓａｌｉｃｉｎを添加した場合よりも強く、もっとも強いカルシウム濃度の上昇が認められた。
【００４７】
〔実施例３：抗体が苦味受容に及ぼす影響〕
抗体が苦味受容にどのような影響を及ぼすのかを詳しく分析するため、２０〜２６歳の健康な成人男女を被験者として官能試験を行った。具体的には、感じた苦味強度をＶＡＳ（ヴィジュアルアナログスケール）を用いて評価した。また、抗体単独については、味質（苦味、甘味、塩味、うま味、酸味、その他）についても評価した。
【００４８】
（１）抗体（抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ）の苦味強度及び味質の評価
抗体溶液（２５０μｇ／ｍＬ）及びサリシン溶液（３ｍＭ）をそれぞれ被験者（ｎ＝３０）に摂取させ、苦味強度及び味質について回答を得た。結果を図９（ａ）、（ｂ）に示した。（ａ）は苦味強度の評価結果、（ｂ）は味質の評価結果である。図９（ａ）及び（ｂ）より、得られた抗体（抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ）は、サリシン程強い苦味強度はないが、抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ単体でも３０％の人が苦味を感じることが明らかとなった。
【００４９】
（２）抗体（抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹ）摂取後のサリシンの苦味強度の評価
抗体溶液（２５０μｇ／ｍＬ）を摂取した後にサリシン溶液（１ｍＭ）を摂取した時の苦味強度を、水を摂取した後にサリシン溶液（１ｍＭ）を摂取した時の苦味強度と比較した。また、抗体を抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹからコントロールＩｇＹに代えて同様にサリシン溶液の苦味強度を比較した。結果を図１０（ａ）、（ｂ）に示した。（ａ）は抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹの結果、（ｂ）はコントロールＩｇＹの結果である。図１０（ａ）、（ｂ）から明らかなように、抗ｈＴ２Ｒ１６−ＩｇＹを事前に摂取する（予め口に含む）ことにより、サリシンの苦味が有意に強く感じられるが、コントロールＩｇＹを事前に摂取してもサリシンの苦味強度に有意な変化はないことが示された。この結果から、今回得られたｈＴ２Ｒ１６活性化作用を有する鶏卵ポリクローナル抗体は、事前摂取することによってｈＴ２Ｒ１６のリガンドであるサリシンの苦味強度を増大させる特性を持つことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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