(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも細胞保護作用を有しかつ抗凝固作用が少ない新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを有効成分として含む医薬を提供する。【解決手段】ポリペプチドは、Ｅ５活性を有するものであれば特に限定されないが、特定の配列で示されるアミノ酸配列からなり、（Ｉ）細胞保護活性を有し、かつ（ＩＩ）プロテインＣの活性化を促進する。ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項３】
細胞障害の予防及び／又は治療のための請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
血管内皮細胞障害の予防及び／又は治療のための請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害の予防及び／又は治療のための請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
表皮細胞障害の予防及び／又は治療のための請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症、虚血／再灌流障害、卒中、虚血性発作、急性心筋梗塞、急性神経変性疾患、アルツハイマー病、ダウン症症候群、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、褥瘡、創傷、閉塞性動脈疾患、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、肥満、臓器移植、化学療法、免疫抑制薬、及び放射線障害等、種々の疾患や処置により細胞は傷害を受ける。これらの疾患や処置による傷害の治療においては抗アポトーシス活性を一つの機序とする細胞保護活性を有する物質が有効である。細胞保護活性を有する蛋白質の一つとして、トロンボモジュリンが知られている。
【０００３】
本来トロンボモジュリンは、トロンビンと特異的に結合しトロンビンの血液凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロテインＣ活性化能を著しく促進する作用を有する物質として知られ、強力な血液凝固阻害作用を有することが知られている。トロンビンによる凝固時間を延長することや、トロンビンによる血小板凝集を抑制することも知られている。プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性化プロテインＣとなる。この活性化プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、及び活性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノゲンアクチベータの産生に関与していることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（Ｄ１、１−２２６番目：シグナルペプチドが１８アミノ酸残基であると考えた場合の位置表示、以下同じ）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（Ｄ２、２２７−４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（Ｄ３、４６３−４９８番目）、膜貫通領域（Ｄ４、４９９−５２１番目）、そして細胞質内領域（Ｄ５、５２２−５５７番目）の５つの領域から構成されている。全長のトロンボモジュリンと同じプロテインＣ活性化促進活性を有する部分は、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、主としてＮ末端側から４、５、６番目のＥＧＦ様構造からなる部分（Ｅ４５６）であることが知られている（非特許文献２）。また、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、Ｎ末端側から４、５番目のＥＧＦ様構造からなる部分（Ｅ４５）では、全長のトロンボモジュリンよりは低下しているが、プロテインＣ活性化促進活性を有していることが知られている（非特許文献３）。
【０００５】
Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域のみからなる可溶性トロンボモジュリン（Ｄ１２３）は、造血器悪性腫瘍ならびに感染症ＤＩＣ患者を対象とした第三相臨床試験が実施され、未分画ヘパリン治療に対して、有効性と安全性の点で勝ることが示され、汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）治療薬として臨床応用されている。Ｄ１２３は細胞保護活性を有することが知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】鈴木宏治、医学のあゆみ  １９８３；１２５：９０１
【非特許文献２】Ｚｕｓｈｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８９；２６４：１０３５１−１０３５３
【非特許文献３】Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９０；２６５：２０１５６−２０１５９
【非特許文献４】Ｉｋｅｚｏｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０１２；３２：２２５９−２２７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、少なくとも細胞保護作用を有しかつ抗凝固作用が少ない新規なポリペプチド及び該ポリペプチドを有効成分として含む医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来、Ｄ１２３やＥ４５は、細胞保護作用を有するとともに、トロンビンと結合しプロテインＣ活性化を促進する抗凝固作用も有することが知られていた。ところが、抗凝固作用を有する物質を生体内へ投与した場合、出血の副作用のリスクがあることが知られている。例えば、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、高い出血リスクを有しており、市場からの撤退を余儀なくされている（Marti-Carvajal AJ et.al Cochrane Database Syst Rev. 2012 ; (12):CD004388）。本発明者らは、出血の副作用のリスクを大きな問題点ととらえ、細胞保護作用を有すると同時に抗凝固作用が少ない、好ましくは抗凝固作用が無い物質を見出すべく鋭意検討を行った結果、配列番号１で示されるポリペプチド（以下、Ｅ５と呼ぶことがある）が、Ｅ４５と同等以上の細胞保護作用を有し、かつ非常に少ないプロテインＣ活性化を促進する作用、すなわち非常に少ない抗凝固作用を有していることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明としては以下のものが挙げられる。
〔１〕配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
〔２〕前記〔１〕に記載のポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
〔３〕細胞障害の予防及び／又は治療のための前記〔２〕に記載の医薬組成物。
〔４〕血管内皮細胞障害の予防及び／又は治療のための前記〔２〕又は〔３〕に記載の医薬組成物。
〔５〕消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害の予防及び／又は治療のための前記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔６〕表皮細胞障害の予防及び／又は治療のための前記〔２〕〜〔５〕に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、優れた細胞保護活性を有しかつ抗凝固作用が少ないポリペプチド及び該ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物が提供される。これにより、医薬としての使用時の出血のリスクの低減が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ポリペプチドの細胞死抑制活性を示す。縦軸はMcl-1発現誘導活性のコントロールに対する強度を示す。
【図２】図２は、Ｅ５ポリペプチドの細胞死抑制活性を示す。縦軸は免疫抑制剤により誘発されたアポトーシス細胞の割合を示す。
【図３】図３ａは、サイクロスポリン（ＣｓＡ）による血管内皮細胞障害に対するＥ５ポリペプチドの血管内皮保護効果を示す。また図３ｂは、ＩＬ−１βによる血管内皮細胞障害に対するＥ５ポリペプチドの血管内皮保護効果を示す。縦軸はＣｓＡ又はIL-1βによる細胞障害活性をコントロールに対する割合（蛍光相対単位：RFU, relative fluorescence units）で示した。
【図４】図４ａ及び図４ｂは、in vitroにおける内皮細胞管腔形成能（管腔構造の長さ）に対する血管新生促進効果を示す。図４ａにおける縦軸は管腔の長さのコントロールに対する割合（Relative tube length）を、図４ｂにおける縦軸は血管新生インデックス示す。図４ｃは、in vivoにおけるマウスマトリゲル皮下移植法での血管新生促進効果を示す。縦軸は、ゲル内のヘモグロビン含量を示す。
【図５】図５ａは、ポリペプチドのＮＯ産生促進活性を示す。縦軸は、コントロールに対するＮＯ産生の相対量を示す。図５ｂは、ポリペプチドのｅＮＯＳリン酸化誘導活性を示す。
【図６】図６は、ポリペプチドの血管内皮細胞増殖促進活性を示す。縦軸はブロモデオキシウリジン（BrdU）取り込み量を示す。
【図７】図７は、血管内皮細胞に対してポリペプチドを作用させた場合の細胞内シグナル伝達にかかわる各種タンパク質のリン酸化の亢進を示す。
【図８】図８は、ポリペプチドの抗凝固活性を示す。合成基質S-2366を用いポリペプチドによって産生された活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）のアミド溶解活性から求めた活性値を蛋白質濃度で除して算出した比活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明をいくつかの好ましい態様（本発明を実施するための好ましい形態：以下、本明細書において「本実施の形態」と略すことがある）について具体的に説明するが、本発明の範囲は下記に説明する特定の態様に限定されることはない。
【００１３】
本実施の形態における単離されたポリペプチド（本明細書において、単に「ポリペプチド」ともいう。）は、（Ｉ）細胞保護活性を有し、かつ（ＩＩ）プロテインＣの活性化を促進する作用、すなわち一定以下の抗凝固作用を有する。これらの作用をＥ５ペプチド活性と呼ぶことがある。Ｅ５ペプチド活性としては、上記（Ｉ）及び（ＩＩ）の作用を有していれば特に限定されない。
【００１４】
Ｅ５ペプチド活性における（Ｉ）細胞保護活性としては、１）細胞死抑制活性、２）細胞透過性亢進抑制活性、３）血管新生促進活性、４）細胞増殖促進活性、又は５）細胞機能維持活性が例示される。（Ｉ）細胞保護活性としては、１）〜５）のうちの少なくとも一つを有していれば特に限定されないが、１）を有していることが好ましく、１）〜５）の全てを有していることが好ましい。
【００１５】
１）細胞死抑制活性は、細胞の抗アポトーシス活性を測定することにより確認することができる。アポトーシスとは生理的、病理的要因により生じた不要な細胞や障害細胞などを積極的に除去する能動的細胞死とされてきたが、種々の病態に伴う細胞死にも関与しており、アポトーシスにより細胞障害が引き起こされることが明らかとなってきている。従ってアポトーシスを抑制することは細胞死を抑制し細胞障害の進展を阻害する治療薬として有効とされる。アポトーシスに関わるシグナル伝達経路は、アポトーシス促進分子や抑制分子等多くの分子からなることから、一度に全てのアポトーシス活性を抑制できるわけではない。抗アポトーシス活性とは、アポトーシスを惹起する物質で細胞等を処理したときに誘導されるアポトーシスを抑制する活性のことであり、アポトーシス促進分子の阻害活性やアポトーシス抑制分子の上昇活性を示す。例えば、後述の実施例（２．）に記載のように、非特許文献４に記載された試験方法によりヒト臍帯静脈内皮に対するアポトーシス抑制分子、すなわち抗アポトーシス蛋白質の一種であるMcl-1の発現誘導の程度を調べることにより、又は後述の実施例（３．）に記載のように、非特許文献４に記載された試験方法によりヒト臍帯静脈内皮細胞における免疫抑制剤誘発性アポトーシスの阻害の程度を調べることにより、抗アポトーシス活性を確認することができる。
【００１６】
抗アポトーシス活性としては、細胞死を妨げる効果を示すものであれば特に限定されないが、Mcl-1の発現誘導が無刺激の状態の細胞での発現に比して２倍以上であることが好ましく、５倍以上であることがより好ましく、８倍以上であることがさらに好ましい。
【００１７】
２）細胞透過性亢進抑制活性は種々の惹起物質にて特定の細胞を刺激することで引き起こされた細胞透過性亢進に対する抑制活性を測定することにより確認することができる。細胞透過性亢進とは、外界からの様々な刺激によって引き起こされる組織障害に対して生体防御反応として炎症が惹起され、機械的原因に加えて組織障害及び炎症反応により誘導されるサイトカインやケミカルメディエーター等によって細胞間のバリア機構が破たんし、細胞同士の接合部が開くことにより物質が細胞間を通過しやすくなることを示す。透過性が亢進すると、細胞成分の一つである白血球が細胞に接着し、その形を扁平化させて細胞の間隙から浸潤する。白血球は、組織内に侵入してきた細菌や異物などを食作用によって細胞内に取り込み、消化分解して無毒化し、さらには壊死した細胞を除去させる。その結果、炎症が終焉に向かうとともに細胞透過性亢進も見られなくなり、同時に細胞修復も始まり元の正常な状態に戻る。しかしながら、組織障害が繰り返して生じる場合や、自己免疫異常による炎症の場合は、組織修復と同時に新たな炎症が始まるため、炎症が恒常的に続き、慢性炎症となり機能障害が引き起こされる。
【００１８】
細胞透過性亢進が特に問題となる細胞は内皮細胞及び上皮細胞である。内皮は内皮細胞の薄層からなる。内皮細胞の層は、とりわけ、静脈や毛細血管などの血管の内部表面、及び血液と血管の外壁の間のバリア(関門)を形成する。内皮細胞は、大血管から最も小さい毛細血管までの全血管系の内側を被う。上皮細胞は、ヒト及び動物器官のすべての内部及び外部体表面を被う単層又は多層の細胞層を形成する。上皮細胞は、互いに近接して、細胞接着に富む。上皮細胞は、外側、外部又は内腔に向かう頂側、及び基底側に区別することができる。さらに、上皮細胞は、閉鎖帯 (密着結合)、接着帯 (接着結合)、及びデスモソーム (接着斑)からなる接着複合体(結合複合体)を有し、これは一方で物理化学的バリアを示し、他方で隣り合った上皮細胞を相互に連結させる。
【００１９】
細胞透過性亢進抑制活性は、例えば、後述の実施例（４．）に記載のように、非特許文献４に記載された試験方法によりヒト臍帯静脈内皮細胞における免疫抑制剤や炎症性サイトカインにより誘導される細胞透過性の亢進の阻害の程度を調べることにより確認することができる。細胞透過性亢進抑制活性としては、透過性亢進を抑制する効果を示すものであれば透過性亢進惹起物質や細胞の種類は特に限定されない。
【００２０】
３）血管新生促進活性は、一般的な血管新生評価方法を用いて確認することができる。近年、心・脳などの血管障害が死因の過半を占めており、血管障害による死亡率の減少及び生存者のQOLの改善が医療の重要なテーマの一つとされている。特に重篤な疾患として閉塞性動脈硬化症(arteriosclerosis obliterans;ASO)などの重症慢性下肢虚血患者に対する血管新生療法が治療モデルとして盛んに行われている。血管新生促進活性は、例えば、後述の実施例（５．）に記載のように、非特許文献４に記載された試験方法によりin vitoやin vivoの両方で確認することができる。in vitroでは、培養血管内皮細胞の管腔形成の促進活性を管腔の長さや分岐点の数で評価できる。in vivoでは、マウスマトリゲル皮下移植法にてゲル内のヘモグロビン含量で評価できる。
【００２１】
４）細胞増殖促進活性は、一般的な細胞増速活性を測定する方法にて確認することができる。評価する細胞としては、特に限定されないが、内皮細胞及び上皮細胞であることが好ましい。細胞増殖促進活性は、例えば、後述の実施例（７．）に記載のように、非特許文献４に記載された試験方法により確認することができる。
【００２２】
５）細胞機能維持活性は、特定の細胞機能が維持されていることを一般的な方法にて確認することができる。例えば、後述の実施例（６．）に記載のように、血管内皮細胞の機能の場合はNO産生促進活性によって評価することができる（非特許文献４）。
【００２３】
Ｅ５ペプチド活性における（ＩＩ）プロテインＣの活性化を促進する作用、すなわち抗凝固作用は、例えば、後述の実施例（９．）に記載のように、特開昭６４−６２１９号公報を初めとする各種の公知文献に明確に記載された試験方法により、プロテインＣの活性化を促進する作用の活性量やその有無を測定することにより容易に確認することができる。（ＩＩ）プロテインＣの活性化を促進する作用、すなわち抗凝固作用としては、Ｄ１２３が有する抗凝固活性の1/10以下であることが好ましく、1/100以下であることがより好ましく、1/1000以下であることがさらに好ましく、検出限界以下であることが特に好ましい。抗凝固作用が全く無いことが好ましい別の態様もある。
【００２４】
本実施の形態におけるポリペプチドは、Ｅ５活性を有するものであれば特に限定されないが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。
【００２５】
本実施の形態におけるポリペプチドは、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ（具体的には、例えば配列番号２の塩基配列）を発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得することができる。発現ベクターとは、プロモーター配列、ｍＲＮＡにリボソーム結合部位を付与する配列、発現したい蛋白をコードするＤＮＡ配列、スプライシングシグナル、転写終結のターミネーター配列、複製起源配列などで構成されるＤＮＡ分子であり、好ましい発現ベクターの例としては、Mulligan RCら[Proc Natl Acad Sci USA 1981;78:2072-2076]が報告しているｐＳＶ２−Ｘや、Howley PMら[Methods in Emzymology 1983;101:387-402、Academic Press]が報告しているｐＢＰ６９Ｔ（６９−６）などが挙げられる。また、精製のし易さの観点から、発現ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（Wang H. and Kazanietz MG. J Biol Chem. 2002;277(6):4541-50）を用いることも好ましい。さらに、微生物において発現可能な発現ベクターに組み込む別の好ましい態様もある。
【００２６】
これらのポリペプチドを製造するに際して用いることのできる宿主細胞としては、動物細胞が挙げられる。動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ−１２−６６４細胞等が、またヒト由来細胞としてＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞が極めて一般的であり好ましく、ＣＨＯ細胞においては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。
【００２７】
また、遺伝子操作の過程やポリペプチドの製造過程において、大腸菌等の微生物も多く使われ、それぞれに適した宿主−ベクター系を使用することが好ましく、上述の宿主細胞においても、適宜のベクター系を選択することができる。
【００２８】
上記の形質転換細胞を培養するにあたっては、通常の細胞培養に用いられる培地を使用することが可能であり、その形質転換細胞を各種の培地にて事前に培養して、最適の培地を選択することが好ましい。例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、１９９培地などの公知の培地を基本培地とし、さらに改良あるいは各種培地用のサプリメントを添加した培地を使用すればよい。培養方法としては、血清を添加した培地で培養する血清培養、又は血清を添加しない培地で培養する無血清培養が挙げられる。培養方法は特に限定されることはないが、無血清培養が好ましい。
【００２９】
上記により取得された培養上清、又は培養物からのポリペプチドの単離精製方法は、公知の手法（例えば、堀尾武一編集、蛋白質・酵素の基礎実験法、１９８１）に準じて行うことができる。例えば、ポリペプチドと逆の電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、ポリペプチドの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーの使用も好ましい。また、ポリペプチドとの特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。
【００３０】
また、Ｈｉｓタグを有する発現ベクターを使用した場合には、Ｈｉｓタグ精製キット（例えばＭＢＬ社製）を用いてポリペプチドを精製することができる。
【００３１】
精製の程度は、使用目的等により選択でき、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精製品のゲル濾過ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣの結果が単一のピークになるまで純粋化することが好ましいが、単一のバンドを得ることを求めるものではない。
【００３２】
本実施の形態におけるポリペプチドは、Ｅ５ペプチド活性を有するものであれば、糖鎖やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が付加していてもよい。また、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部にＤ体アミノ酸が含まれていてもよい。これらは、生体内での安定性が高い点で好ましい場合がある。
【００３３】
ポリペプチドにおける糖鎖付加は、公知の方法により行うことができる（Sato M et.al. J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22）。糖鎖はＮ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個が好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。
【００３４】
ポリペプチドにおけるＰＥＧ鎖付加は、公知の方法により行うことができる（Ulbricht K et.al. Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90）。ＰＥＧ鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のＰＥＧ鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。ＰＥＧ鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。
【００３５】
ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とすることは、公知の方法により行うことができる（Brenneman DE et.al. J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7）。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないようにするため、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい場合がある。
【００３６】
本実施の形態におけるポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法によっても容易に製造することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。
【００３７】
本発明により、Ｅ５ペプチド活性を有するポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物が提供される。本実施の形態における医薬組成物は、細胞保護作用を有しており、低酸素、物理的因子（外傷、熱、放射線等）、感染、毒素、あるいは炎症反等によって惹起される細胞障害を改善するために用いることができる。
【００３８】
細胞障害とは、適応の限界（可逆性）を超えた外的因子あるいは内的因子にさらされ、細胞の死に至るものと定義される。すなわち、外界からの様々な刺激によって引き起こされる組織障害やそれに伴って出てくる自己由来の起炎性因子に対して生体防御反応として炎症が惹起され、組織障害及び炎症反応により誘導されるサイトカインやケミカルメディエーター等によって細胞間のバリア機構が破たんし細胞透過性が亢進し、細胞がアポトーシス等の細胞死が誘導され、細胞機能障害が引き起こされる状態ことを言う。
【００３９】
細胞障害としては、敗血症、虚血／再灌流障害、卒中、虚血性発作、急性心筋梗塞、急性神経変性疾患、アルツハイマー病、ダウン症症候群、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、褥瘡、創傷、閉塞性動脈疾患、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、肥満、臓器移植、化学療法、免疫抑制薬、及び放射線障害等、種々の疾患や処置により細胞が受ける障害が挙げられる。本実施の形態による医薬組成物は、細胞保護作用を有することにより、これらの細胞障害を予防及び／又は治療することができる。なお、本明細書中において、細胞障害の予防及び／又は治療とは、細胞障害に起因する疾患の予防及び／又は治療も含む。
【００４０】
本実施の形態における細胞障害は、低酸素、物理的因子（外傷、熱、放射線等）、感染、毒素、あるいは炎症反等によって惹起される細胞障害であれば特に限定されないが、血管内皮細胞障害、表皮細胞障害、消化管上皮細胞障害、気管上皮細胞障害、又は肺胞上皮細胞障害が例示される。
【００４１】
血管内皮細胞障害は、高血圧、高血糖、脂質異常、喫煙、インスリン抵抗性、炎症性サイトカイン等の因子により血管内皮細胞が活性化され、それにより血管内皮細胞透過性が亢進し、血液中の有害物質が血管中に進入するのを防ぐことができなくなり、また、様々な細胞・組織・器官の情報伝達や免疫応答に関与することで血管の恒常性維持ができなくなる状態をいう。血管透過性が亢進し、血管が拡張するために発赤と浮腫による腫脹が起こり、それに伴い発熱物質や発痛物質による熱や痛みが生じる。
【００４２】
血管内皮細胞障害に起因する疾患としては、敗血症、虚血／再灌流障害、卒中、虚血性発作、急性心筋梗塞、閉塞性動脈疾患、動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、類洞閉塞症候群、溶血性尿毒症症候群、血栓性微小血管障害症、播種性血管内血液凝固症候群、全身性毛細管漏出症候群が例示される。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００４３】
皮膚の表面には主に表皮細胞から形成される表皮があり、体内の水分保持や外界の細菌や刺激からからだを守るバリアの役割を果たしている。表皮細胞障害は、物理的因子（外傷、熱、外力、放射線等）やストレス、神経ペプチド、ヒスタミン、感染等により障害を受け、皮膚の透過性の亢進、感染防御能の低下といったいわゆるバリア機能が障害され、角質層における水分の保持機能が損なわれ、外界からの刺激物や細菌、アレルゲンが入りやすくなりさらに炎症が誘導され、皮膚の機能異常をきたした状態をいう。皮膚組織の微小循環不全から細胞壊死に至る場合もある。
【００４４】
表皮細胞障害に起因する疾患としては、褥瘡、アトピー性皮膚炎が例示される。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００４５】
消化管の場合、消化管の内側は消化管上皮細胞によって覆われており、消化管上皮細胞の内側には、マクロファージや樹状細胞、リンパ球といった免疫担当細胞が多数存在している。消化管上皮細胞障害とは、免疫反応、薬物、毒素、放射線照射により消化管上皮細胞透過性が亢進し消化管バリアが損傷すると、それによって侵入する外来異物や腸内細菌に対して、これらの免疫系細胞が反応し炎症を起こした状態をいう。
【００４６】
消化管上皮細胞障害に起因する疾患としては、放射線障害、炎症性腸疾患が例示される。炎症性腸疾患の患者の消化管上皮において、細胞同士の接合に重要な蛋白質の発現異常が認められており、消化管バリアがルーズになって透過性が亢進することと炎症性腸疾患の重症度と相関することが報告されている。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００４７】
気道上皮細胞は管腔側近傍に存在するタイトジャンクションで相互に結合することにより選択的透過障壁として機能し、気道上皮透過性の恒常性の維持に寄与している。気道上皮透過性の亢進は、多くの肺疾患における組織傷害モデルにおいて見られる。気道上皮細胞障害に起因する疾患としては、気管支喘息等アレルギー疾患が例示される。
【００４８】
喘息は好酸球、マスト細胞、リンパ球などの活性化と気道粘膜障害を伴う気道の慢性炎症とされている。本実施の形態における医薬組成生物はこれらの疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００４９】
肺の場合、肺胞の内側は肺胞上皮細胞によって覆われている。肺胞上皮細胞障害とは、細菌やウィルス感染、化学物質、薬物、高酸素や炎症反応により肺胞上皮細胞がダメージを受け透過性が亢進すると、タンパク成分に富む浮腫液がそのまま肺胞の中に漏出し肺胞の壁を覆って硝子膜を作り、硝子膜に覆われた肺胞は、酸素と炭酸ガスのやりとりをうまくできなくなってしまう状態をいう。肺の広い範囲で肺胞が硝子膜に覆われてしまう状態をびまん性肺胞傷害と呼ぶ。
【００５０】
肺胞上皮細胞障害に起因する疾患としては、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、肺炎が例示される。本実施の形態における医薬組成物はこれら疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。
【００５１】
本実施の形態における医薬組成物は、担体を含有することができる。用いることのできる担体としては、水溶性の担体が好ましく、通常は、医薬品の添加剤として許容できる、等張化剤、緩衝化剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、防腐剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤などが好ましい。例えば、ショ糖、グリセリン等や、その他の無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えて調製することができる。さらに必要に応じて、特開平１−６２１９号公報及び特開平６−３２１８０５号公報に開示される通り、アミノ酸、塩類、糖質、界面活性剤、アルブミン、ゼラチン等を添加してもよい。本実施の形態における医薬組成物は、本実施の形態のポリペプチドに加えて、他の医薬成分を組み合わせて含んでもよい。他の医薬成分としては、例えば、免疫抑制剤、造血器悪性腫瘍治療薬等が挙げられる。
【００５２】
担体及び他の医薬成分の添加方法は特に限定されないが、一態様において、免疫抑制剤及び造血器悪性腫瘍治療薬から選ばれる少なくとも１つを含有する本実施の形態の医薬組成物を、凍結乾燥製剤として製造する方法としては、通常行われるように、例えば、免疫抑制剤及び造血器悪性腫瘍治療薬から選ばれる少なくとも１つを含有する溶液とポリペプチド含有溶液を混合した後、担体等の添加物を添加混合し、凍結乾燥する方法や、あらかじめ担体等の添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解した免疫抑制剤又は造血器悪性腫瘍治療薬から選ばれる少なくとも１つに混合した後、ポリペプチド含有溶液を添加混合にする方法にて溶液を調製し、凍結乾燥する方法が挙げられる。本実施の形態における医薬組成物が各医薬成分を組み合わせてなる場合には、各医薬は、適宜の製造方法により担体を添加して製造することが好ましい。本実施の形態における医薬組成物としては、注射液の形態で提供されても、また凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提供されてもよい。
【００５３】
製剤化工程においては、アンプル又はバイアルに、０．０１〜１０ｍｇの本実施の形態におけるポリペプチド、注射用水、さらには、添加剤を含有する溶液を、例えば０．５〜１０ｍＬ充填して水溶液注射用製剤として調製できる。また、凍結し減圧下のもとで乾燥して凍結乾燥製剤として調製する方法が例示される。
【００５４】
本実施の形態における医薬組成物は、非経口投与法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによって投与することが望ましい。また経口投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与、経肺投与、経皮投与により投与することも可能である。
【００５５】
本実施の形態における医薬組成物が各医薬成分を組み合わせてなる場合には、それぞれの医薬成分は、適宜の投与方法により投与することが好ましい。
【００５６】
静脈内投与の場合、一度に所望の量を投与する方法（静脈内急速投与）又は点滴静脈内投与が挙げられる。一度に所望の量を投与する方法（静脈内急速投与）は投与時間が短い点で好ましい。
【００５７】
本実施の形態における医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度、投与経路などによっても異なるが、一般的には成人１日当たり０．０１〜１００ｍｇを１〜３回に分けて投与することが例示される。投与期間は数日〜２カ月の連日投与が一般的であるが、患者の症状により１日投与量、投与期間共に増減することができる。また、投与間隔は、２日から１４日に１回、好ましくは２日から７日に１回、さらに好ましくは３日から５日に１回にとすることも可能である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例及び試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
【００５９】
１．ポリペプチドの作製
配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号２の塩基配列よりなる）の人工合成をタカラバイオ株式会社に依頼し、Ｃ末にＶ５タグ及びＨｉｓタグが付加するようにｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓプラスミド（インビトロジェン）に挿入した。本プラスミドをサル腎臓（ＣＯＳ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より、Ｈｉｓタグ精製キット（ＭＢＬ社）によりポリペプチド精製品を取得した。精製品はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認し、ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により蛋白質濃度を定量した。ＣＯＳ細胞により作製した蛋白質及びポリペプチドは、Ｅ５（配列番号１、実施例１）及び、Ｅ４５（比較例１：非特許文献４に記載の方法により取得）であった。
【００６０】
なお、各ポリペプチドのＣ末にＶ５タグ及びＨｉｓタグが付加されるが、このタグは細胞保護活性には影響を与えない（非特許文献４）。
【００６１】
Ｄ１２３（比較例２）は、ＷＯ２００８／０４４６３１号公報の製造例１に記載の方法に従い、取得した。
【００６２】
また、別の方法として、株式会社  ペプチド研究所へ依頼することにより、化学合成によってもＥ５を取得した（実施例２）。
【００６３】
２．ポリペプチドの細胞死抑制活性（抗アポトーシス蛋白質誘導活性）
Ｅ４５（比較例１）、Ｄ１２３（比較例２）、及びＥ５（実施例１）の細胞保護活性を細胞死抑制活性にて評価した。細胞死抑制活性は、血管内皮細胞を用いた抗アポトーシス蛋白質Ｍｃｌ−１発現誘導の測定にて評価した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を専用培地（２％ウシ胎児血清含有ＥＧＭ(endothelial cell growth medium)、Ｌｏｎｚａ）で培養し、培地中へ各ポリペプチドを17.45 fmolの濃度になるように添加して培養した。陰性対照として、ブランク（ペプチド無し）を用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて行った。添加後、４８時間後に培地を除き、細胞溶解液にてＨＵＶＥＣを溶解し、細胞抽出液を得た。細胞抽出液を５−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、イモビロン−Ｐメンブレン (Millipore）に転写し、抗Ｍｃｌ−１抗体（Santa Cruz Biotechnology、sc-819）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Abcam）によるウエスタンブロットを実施し、以下の手順に従いＭｃｌ−１量を定量した。
【００６４】
転写したイモビロン−Ｐメンブレンを室温にて１％ｍｉｌｋにて２分ブロッキングした。抗Ｍｃｌ−１抗体を１％ｍｉｌｋ液で１０００倍に希釈し、ナイロン膜と室温にて４℃にて終夜インキュベートした。インキュベート終了後、洗浄液（組成：ＰＢＳ＋０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で計３回洗浄した。
次いで、１％ｍｉｌｋ液で１０００倍に希釈した２次抗体溶液を添加し、室温にて６０分間インキュベートした後、洗浄液で計３回洗浄した。
ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア・ジャパン）の添付のマニュアルに従い、基質溶液ＥＣＬ液２種類を添加し、室温で通常１〜２分間インキュベートした後、ＬＡＳ４０００イメージアナライザー（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ社）にて感光、現像を行った。Ｍｃｌ−１蛋白質のバンドの強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（Wayne Rasband、NIH）にて定量化した。
次いで同じナイロン膜を用いて、抗ＧＡＰＤＨ抗体にて同様の手順で染色後、ＧＡＰＤＨ蛋白質のバンド強度を定量し、内部標準として用いた。
【００６５】
結果を、対照におけるＭｃｌ−１誘導活性を１とした場合の各ポリペプチドの相対Ｍｃｌ−１誘導活性として、図１に示す。図１に示されるように、本発明のポリペプチドＥ５は、Ｍｃｌ−１誘導活性、すなわち細胞保護活性を有しており、Ｅ４５（比較例１）と同等以上、かつＤ１２３（比較例２）よりも高い細胞保護活性を有していた。
【００６６】
３．ポリペプチドの細胞死抑制活性（抗アポトーシス活性）
Ｅ５（実施例１）の細胞保護活性を、抗アポトーシス活性を測定することで調べた。
具体的には、免疫抑制剤であるサイクロスポリン（ＣｓＡ）（Sigma Chemical）により誘発されるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のアポトーシス反応に対して、最終濃度を３ｎg／mLになるようにＥ５を添加し抗アポトーシス活性を測定した。
【００６７】
ＨＵＶＥＣを上記２．と同様の専用培地にて培養後、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、ＰＢＳに懸濁した。細胞懸濁液を２×１０5細胞／ｍLになるように１２ウェル培養プレート（Sumilon社）に１ｍLずつ分注した。ＣｓＡ、あるいはＣｓＡ＋Ｅ５を添加し、２４時間曝露させた。アポトーシス細胞の測定は、アネキシン−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Pharmingen）を用いて、付属のプロトコールに準じて実施した。
【００６８】
アポトーシス細胞は、アネキシンＶとＰＩ（プロピジウムアイオダイド）染色後、ＦＡＣＳにて検出した。アネキシンＶ陽性細胞を初期アポトーシス細胞（early apoptosis）、アネキシンＶとＰＩの両者が陽性である細胞を後期アポトーシス細胞（late apoptosis）と表し、その両方を合わせてアポトーシス細胞とした。
【００６９】
この結果を、図２に示す。図２に示されるように、細胞保護活性を有することが知られているＤ１２３と同様にＥ５ペプチドは、ＣｓＡによって誘導されるアポトーシスに対して抑制作用を有することがわかる。
【００７０】
４．ポリペプチドの血管内皮保護活性
Ｅ５（実施例１）の血管内皮保護活性を血管透過性亢進抑制活性を測定することで調べた。血管透過性亢進に対するポリペプチドの影響は、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Millipore）を用いて、付属のプロトコールに準じて評価した。具体的には、ＨＵＶＥＣをコラーゲンコートされたインサート上にコンフルエントになるまで培養し、２４時間のスタベーション後、ＣｓＡ、あるいはＣｓＡ＋Ｅ５を添加し１２時間培養した。ＦＩＴＣ標識デキストランを上室に添加し、下室に出てきたＦＩＴＣの蛍光強度を測定し血管内皮細胞透過性亢進活性とした。この結果を、図３に示す。
【００７１】
図３ａに示されるように、血管透過性亢進を抑制することが知られているＤ１２３と同様に、Ｅ５はＣｓＡによる血管透過性亢進を抑制した。図３ｂに示されるように、ＣｓＡの代わりにＩＬ−１β（Sigma Chemical）を用いた場合も同様の結果であった。
【００７２】
５．ポリペプチドの血管新生促進活性
Ｄ１２３（比較例２）、及びＥ５（実施例１）の血管新生促進活性を調べた。陽性対照としてＶＥＧＦ（Pepro Tech Inc社）を、陰性対照としてバッファーを用いた。
【００７３】
血管新生促進活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管内皮管腔形成、及びマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏマトリゲル皮下移植法にて評価した。具体的には、２４ウェル培養プレート（Sumilon社）を用いて、ヒト臍帯内皮細胞（２．５×１０4細胞／ｗｅｌｌ）を、増殖因子を減量したマトリゲル（BD Bioscience）に播種した。
【００７４】
Ｄ１２３、Ｅ５、又はポジティブコントロールとしてＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、８時間培養した。何も添加しないものを対照とした。管腔形成は４０倍の倍率で光学倒立顕微鏡にて観察し、ランダムに選んだ５視野の管腔長さをＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Wayne Rasband）にて計測し、コントロールに対する割合として示した。この結果を、図４ａに示す。血管新生インデックスは視野における分岐部の数として計算し、平均値で示した。この結果を、図４ｂに示す。
【００７５】
図４a及び図４ｂに示されるように、管腔の長さ、及び血管新生インデックスの両方で濃度依存的にＥ５による血管新生促進活性が認められた。３０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度のＥ５では、その活性はＤ１２３及び強力な血管新生作用を有するＶＥＧＦより高かった。
【００７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管新生促進活性は、マトリゲル皮下移植法にて評価した。４０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む、増殖因子を低減させたマトリゲル（０．５ｍＬ）に、評価したい検体（Ｄ１２３、Ｅ５又はＶＥＧＦ）を混合し、Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢雌）の背部皮下へ投与した。何も混合しないものを対照とした。４日後、マトリゲルを摘出してヘモグロビン含量を定量した。この結果を図４ｃに示す。
【００７７】
図４ｃに示されるように、Ｅ５を混合した場合、マトリゲルは高いヘモグロビン含量を示し、１００ｎｇ／ｍＬではその活性はＶＥＧＦよりも高く、顕著な血管新生を促進する活性が認められた。また、その活性はＤ１２３より高かった。
【００７８】
６．ポリペプチドのＮＯ産生促進活性及びｅＮＯＳリン酸化促進活性
Ｄ１２３（比較例２）及びＥ５（実施例１）のＮＯ産生促進活性及びｅＮＯＳリン酸化促進活性を調べた。
【００７９】
ＮＯ産生は、Griess Reagent System（Promega）を用いて、添付プロトコールに準じて測定した。具体的には、ＨＵＶＥＣをＤ１２３又はＥ５添加培地にて上記２．と同様の手法を用いて培養後、培地と等量のＧｒｉｅｓｓ試薬を添加し、ＮＯ2-を測定した。この結果を、図５ａに示す。
【００８０】
ｅＮＯＳリン酸化誘導は、Ｄ１２３又はＥ５を添加して培養したＨＵＶＥＣの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ｅＮＯＳ抗体（Cell Signaling Technology）又は抗ｐ−ｅＮＯＳ抗体（Ｓｅｒ１１７７）（Cell Signaling Technology）を用いたウエスタンブロット解析にて検討した。この結果を、図５ｂに示す。
【００８１】
図５ａに示されるように、Ｅ５にはＮＯ産生を促進する活性が認められ、その活性はＤ１２３より高かった。ＣｓＡ添加によるＮＯ産生低下をＥ５は抑制した。
また、図５ｂに示されるように、Ｅ５は未添加のコントロールに比べＣｓＡ添加によるｅＮＯＳ蛋白質のリン酸化（図５ｂのｐ−ｅＮＯＳ）低下を抑制した。その活性はＤ１２３より高かった。
【００８２】
７．ポリペプチドの細胞増殖促進活性
Ｄ１２３（比較例２）及びＥ５（実施例１）のポリペプチドによる細胞増殖促進活性の測定を行った。
具体的には、ＨＵＶＥＣ（５×１０3細胞）を、Ｄ１２３あるいはＥ５存在下で、上記２．と同様の専用培地を用いて９６ウェルプレートにて２４時間培養した。さらに、ブロモデオキシウリジン（１０μｍｏｌ／Ｌ／ｗｅｌｌ）を添加し４時間培養後、細胞内に取り込まれたブロモデオキシウリジンを測定した。測定は、細胞増殖ELISA,BrdU発色キット（Roche）を用いて、添付のプロトコールに準じて実施した。
【００８３】
この結果を、図６に示す。図６に示されるように、Ｅ５はＨＵＶＥＣに対して濃度依存的な増殖促進活性を示した。
【００８４】
８．ポリペプチドによるＥＲＫ、Ａｋｔ、及びＪＮＫのリン酸化促進活性
Ｄ１２３（比較例２）、及びＥ５（実施例１）のＥＲＫ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＳＴＡＴ５、Ｓ６Ｋ、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化に対する作用を評価した。
具体的には、ＨＵＶＥＣを専用培地で培養後、無血清培地で３時間starvationした後、各検体を添加した。
【００８５】
Ｄ１２３は１００ｎｇ／ｍＬ、Ｅ５は１０、３０又は１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間又は４８時間インキュベートした後、２０μlのライシスバッファー（組成：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で細胞溶解液を調製した。この溶解液を５−１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で蛋白を分離し、イモビロン−Ｐメンブレンにトランスファーした後、上記３．と同様の方法にて各蛋白質のリン酸化を特異的抗体にて検出した。用いた抗体を以下に示す：抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Cell Signaling Technology, 9101）；
抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）（Cell Signaling Technology, 9271）；
抗リン酸化ＪＮＫ抗体（Ｔｙｒ１８３／１８５）（Cell Signaling Technology, 9251）；
抗リン酸化ｐ３８抗体（Ｔｙｒ１８０／１８２）（Cell Signaling Technology, 9216）；
抗リン酸化ＳＴＡＴ５抗体（Ｔｙｒ６９４）（Cell Signaling Technology, 9351）；
抗リン酸化Ｓ６Ｋ（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Cell Signaling Technology, 4856）；
抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１抗体（Ｔｈｒ３７／４６）（Cell Signaling Technology, 2855）；
抗ＥＲＫ抗体（Cell Signaling Technology, 9102）；
抗Ａｋｔ抗体（Ｓｅｒ４７３）（Cell Signaling Technology, 9272）；
抗ＪＮＫ抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-474）；
抗ｐ３８抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-535G）；
抗ＳＴＡＴ５抗体（Ｃ−１７）（Santa Cruz Biotechnology）；
抗Ｓ６Ｋ（Cell Signaling Technology, 2217）；
抗４Ｅ−ＢＰ１抗体（Cell Signaling Technology, 9644）；及び
抗Ｂｃｌ−２抗体（Santa Cruz Biotechnology, sc-509）。
結果を図７に示した。
【００８６】
図７に示されるように、Ｅ５添加により２４時間後から顕著なＥＲＫのリン酸化と弱いながらＪＮＫのリン酸化が、４８時間後にはＡｋｔのリン酸化が認められた。Ｅ５によるリン酸化の程度はＤ１２３より強かった。
【００８７】
９．ポリペプチドの抗凝固活性
Ｅ４５（比較例１）及びＥ５（実施例１）の抗凝固活性を調べた。抗凝固活性は、プロテインＣ活性化促進活性によって評価した。具体的には、Ｅ４５又はＥ５をプロテインＣ及びトロンビンと反応後、生成した活性化プロテインＣを合成基質Ｓ−２３６６にて４０５ｎｍの吸光度を測定することにより評価した。
【００８８】
２０ｍＭ塩化カルシウム溶液７５μＬに、検量線用のコントロールＤ１２３、Ｅ４５（１４ｎｇ／μＬ）又はＥ５（１０ｎｇ／μＬ）を２５μＬ添加し混合後、４０ＮＩＨＵ／ｍＬトロンビン溶液２５μＬ、次いで１５μｇ／ｍＬプロテインＣ溶液２５μＬ添加、３７℃１０分インキュベートした。アンチトロンビンＩＩＩを添加し３７℃１０分インキュベートし反応を停止させた後、基質溶液を添加し、３７℃１０分インキュベートした。反応を停止後、４０５ｎｍ吸光度を測定し、Ｄ１２３を用いた検量線から、Ｅ４５及びＥ５のプロテインＣ活性化促進活性すなわち抗凝固活性を求めた。その結果、ポリペプチドＥ５の抗凝固活性は検出限界以下、Ｅ４５の抗凝固活性は２．１１Ｕ／ｍＬであった。それぞれを蛋白質濃度で除して比活性を算出した結果を図８に示す。
【００８９】
図８に示されるように、Ｄ１２３が４０９，６００Ｕ／ｍｏｌに対して、Ｅ４５は１７５８．４Ｕ／ｍｏｌと弱いながらも抗凝固活性が認められたのに対して、本発明のポリペプチドＥ５には抗凝固活性が認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、優れた細胞保護活性を有しかつ抗凝固作用が少ないポリペプチド及び該ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物を提供することができるという産業上の利用可能性を有する。これにより、医薬としての使用時の出血のリスクを低減することが期待できるという産業上の利用可能性も有する。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１：Ｅ５のアミノ酸配列
配列番号２：配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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