(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫を変調することによって感染を治療及び予防することを含む免疫関連障害の治療に有用な新規分子、ＳＴＩＮＧの提供。【解決手段】発現スクリーニングで、約５，５００個のヒト完全長ｃＤＮＡ及び９，０００個のマウス完全長ｃＤＮＡをＩＦＮβのプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子（ＩＦＮβ−Ｌｕｃ）を有する２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ＩＦＮβ−Ｌｕｃの約２５０倍の誘導をもたらす遺伝子の一つとして、単離したＳＴＩＮＧ。ＳＴＩＮＧをコードする核酸配列。【効果】ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦではヒトサイトメガロウイルス又はワクシニアウイルス感染において、ＩＦＮβの誘導が起こらず、ＳＴＩＮＧ欠損マウスではＨＳＶ−１ウイルス感染による致死率が増加した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２に列挙される配列か、それらの活性型断片又はバリアントかを含む、免疫応答を変調するタンパク質又はペプチドをエンコードすることを特徴とする、単離された核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施態様は、被験者の自然及び獲得免疫を変調するための、及び／又は、免疫に関連した疾患、癌、自己免疫の治療、感染の治療及び予防のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本出願は、２００８年８月４日に出願された米国仮特許出願第６１／１２９，９７５号の優先権を主張し、引用により全体として本明細書に取り込まれる。
【０００３】
病原体の侵入への細胞性宿主防御応答は、ウイルスの核酸か、リポ多糖又は鞭毛タンパク質を含む微生物の細胞壁成分かのような病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）を抗病原体遺伝子の誘導をもたらすように検出することを主に含む。例えば、ウイルスのＲＮＡは、小胞体（ＥＲ）及び／又はエンドソームに存在する膜結合型トル様受容体（ＴＬＲ’ｓ）（例えば、ＴＬＲ３及び７／８）か、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）と呼ばれるＴＬＲ非依存性細胞内ＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡヘリカーゼ又はメラノーマ分化関連抗原（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）５（ＭＤＡ５、ＩＦＩＨ１及びヘリカードとも呼ばれる）かによって検出される。これらの事象は、多くが現在未知の下流のシグナル事象を活性化し、Ｉ型ＩＦＮを含む、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３／７に依存性の遺伝子の転写をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
概要
本概要は、本発明の性質及び実体を簡潔に表すための本発明の概要を示すために提供される。本概要は、特許請求の範囲、すなわち、意味を解釈するか、あるいは限定するためには用いられないであろうとの理解のもとに提示される。
【０００５】
ＳＴＩＮＧ分子（インターフェロン遺伝子の促進因子）は、免疫系、特に自然免疫系を変調する。癌、感染、自己免疫疾患又は障害、炎症等のような疾患を治療する、ＳＴＩＮＧ、及び／又は、ＳＴＩＮＧの発現、活性及び／又は機能を変調するその他の薬剤を含む組成物は、かかる疾患の発症の危険性にさらされている患者にか、かかる疾患に罹患した患者かを治療するために投与される。
【０００６】
また、本発明の実施態様は、ＳＴＩＮＧと直接的か、あるいは間接的に相互作用又は会合する分子及び経路に関する。
【０００７】
本発明の別の局面は以下に説明される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
本発明は添付図面に関して説明され、参照番号が類似又は均等の要素を指定するために図面を通して用いられる。前記図面は一定の縮尺で描写されておらず、それらは本発明を例示するためのみに提供される。本発明の多くの局面が、例示のための応用例に関して以下に説明される。多数の具体的な詳細、相互関係及び方法が、本発明の完全な理解を提供するために列挙されると理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明が、１つ又は２つ以上の具体的な詳細なしにか、あるいは別の方法とともに実施される場合があると容易に認識するであろう。本発明は、いくつかの作業が、異なる順番で、及び／又は、別の作業又は事象と同時に起こる場合があるように、作業又は事象の図示された順番によって限定されない。さらに、図示された作業又は事象の全てが、本発明に応じる方法を実行するために必要とされるわけではない。
【０００９】
本明細書で開示される遺伝子全て、遺伝子名及び遺伝子産物は、本明細書で開示される組成物及び方法が適用可能ないずれかの種由来のホモログに対応することが意図される。したがって、前記用語は、ヒト及びマウス由来の遺伝子及び遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。特定の種由来の遺伝子又は遺伝子産物が開示されるとき、本明細書は、仮に明らかにされている内容が明確に示されていない場合には、ただの模範的に説明するだけで、限定することを意図するものではないと理解される。したがって、例えば、哺乳類の核酸及びアミノ酸の配列に関係するいくつかの実施態様で本明細書に開示される前記遺伝子については、その他の哺乳類、魚類、両生類、爬虫類及び鳥類を含むが、これらに限定されないその他の動物由来のホモログ遺伝子及び／又はオルソログ遺伝子と、遺伝子産物とを含むことを意図する。好ましい実施態様では、前記遺伝子又は核酸の配列はヒトである。
【００１０】
別に定義される場合を除いて、本明細書で用いられる（技術用語及び科学用語を含む）用語の全ては、本発明の属する当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。一般的に用いられる辞書で定義されるような用語は、関連技術に関するそれらの意味と一致する意味を有しているとして解釈されるべきであり、本明細書で特に明確に定義される場合を除いて、理想とされるか、あるいは過度に形式ばった意味で解釈されないであろうとさらに理解されるであろう。
【００１１】
定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様をただ説明するだけの目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で用いられるところの単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「前記又は該（ｔｈｅ）」は、状況が別に明示される場合を除いて、複数形も含むことが意図される。さらに、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで用いられる「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」又はそれらの変形（ｖａｒｉａｎｔｓ）の用語である限り、かかる用語は前記用語の「含む」と類似するやり方で含むことが意図される。
【００１２】
「約（ａｂｏｕｔ）」又は「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定されるときの特定の値についての許容可能な誤差範囲を意味し、該誤差範囲は、どのように前記値が測定されるか、決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、本技術分野における実務の上で、標準偏差の１倍以上の範囲内を意味する場合がある。代替的に、「約」は、特定の値の２０％までの範囲を意味する場合があり、１０％までが好ましく、５％までがより好ましく、１％までがさらにより好ましい。代替的に、特に生物学的システム又は過程に関して、前記用語は、１０倍以内（ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を意味する場合があり、値の５倍以内が好ましく、２倍以内がより好ましい。特定の値が、明細書及び特許請求の範囲に記載されるとき、別に記載される場合を除いて、前記特定の値についての許容可能な誤差範囲を意味する「約」という前記用語は推定されるべきである。
【００１３】
「免疫応答を誘導又は増強する」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が投与されなかった対照試料を超える統計学的に測定可能な誘導又は増加を免疫応答に起こすことを意味する。前記免疫応答の誘導又は増強は、予防又は治療の応答を被験者にもたらすことが好ましい。免疫応答の例は、Ｉ型ＩＦＮの産生を増大させ、ウイルスと、代替の病原体によるその他のタイプとの感染に対する抵抗性を増大させる。腫瘍に対する免疫応答（抗腫瘍応答）の増強は、腫瘍を防止するためか、あるいは存在する腫瘍を除去するためのワクチンの開発を含む。
【００１４】
「ＳＴＩＮＧ」という用語は、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、センス及びアンチセンスのポリヌクレオチド鎖、相補的な配列、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ホモログ及び／又はオルソログのＳＴＩＮＧ分子、それらのアイソフォーム、前駆体、変異体、バリアント（ｖａｒｉａｎｔｓ）、誘導体、スプライスバリアント、アレル、異なる種及び活性型断片を含むが、これらに限定されないことを意味する。
【００１５】
「機能的なＳＴＩＮＧ遺伝子の欠失」という用語は、トランスジェニック動物が、ＳＴＩＮＧをエンコードする遺伝子を欠失するか、あるいはＳＴＩＮＧの発現に必要とされるその他の遺伝的構成要素（例えば、プロモーター）を欠失することを意味する。
【００１６】
「活性型断片又はバリアント」という用語は、少なくとも３８０個のアミノ酸残基の長さであり、前記ペプチド、ポリヌクレオチド又はタンパク質の連続的な一部分と１００％同一である断片か、完全長のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質までを含む断片との同一性が少なくとも９０％であり、好ましくは９５％であるバリアントかを意味する。例えば、バリアントは、当業者に定義されるような保存的なアミノ酸置換か、最初のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の活性の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％又は９０％が維持されることを提供する、非保存的な置換かを含む場合がある。ＳＴＩＮＧ分子か、断片か、スモ（ｓｕｍｏ）化、リン酸化、グリコシル化のような翻訳後修飾を有するバリアントか、あるいはスプライスバリアント等も含まれ、これらの全てはＳＴＩＮＧの機能の有効性に影響する場合がある。
【００１７】
別に示される場合を除いて、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、それらは、変化するサイズのペプチド配列を指すことが典型であるけれども、本明細書で互換的に用いられる。
【００１８】
「バリアント」という用語とは、ポリヌクレオチド配列に関して用いられる際には、野生型遺伝子に関するポリヌクレオチド配列を含む場合がある。この定義は、例えば、「アレル」、「スプライシング」、「種」又は「多型」のバリアントも含む。スプライシングバリアントは参照分子と顕著な同一性を有する場合があるが、ｍＲＮＡのプロセッシング中にエキソンのスプライシングが交互に起こるために、より大きいか、あるいはより小さいポリヌクレオチドであることが一般的である。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有するか、あるいはドメインを有しない場合がある。種バリアントは、１種類の種からもう１種類の種に変化するポリヌクレオチド配列である。本発明で特に有用なものは、野生型遺伝子産物のバリアントである。バリアントは核酸配列の少なくとも１個の突然変異から生じる場合があり、構造又は機能が変化されるか、あるいは変化されない場合がある、改変型ｍＲＮＡ又はポリペプチドを生じる場合がある。特定の天然遺伝子又は組換え遺伝子のいずれかは、アレル型を、全く有しないか、１個有するか、あるいは多数有する場合がある。バリアントを生じる通常の突然変異の変化は、ヌクレオチドの天然の欠失、付加又は置換が原因であることが一般的である。これらの変化タイプのそれぞれは、特定の配列において１回又は２回以上、単独か、別の変化タイプとの組み合わせかで生じる場合がある。
【００１９】
生成ポリペプチドは、互いに関連する重要なアミノ酸の同一性を有することが一般的であろう。多型バリアントは、個別の特定の種間における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の変化である。多型バリアントは「一塩基多型」（ＳＮＰｓ）、すなわち、前記ポリヌクレオチド配列が１つの塩基によって変化する一塩基突然変異を含む場合もある。ＳＮＰｓの存在が、例えば、ある疾患になりやすい傾向、すなわち、抵抗性に対して感受性を有する特定の集団を示す場合がある。
【００２０】
「ポリヌクレオチド誘導体」は、化学修飾、例えば、アルキル基、アシル基又はアミノ基による水素の置換を受けた核酸を含む。誘導体、例えば、オリゴヌクレオチド誘導体は、改変型糖原子団か、糖間（ｉｎｔｅｒ−ｓｕｇａｒ）結合かのような非天然の一部分を含む場合がある。これらのうちで模範的なものは、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）と、当業者に知られるその他の硫黄を含む化学種とである。核酸誘導体は、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補因子、阻害剤、磁性粒子等を含む、標識を含む場合もある。
【００２１】
ポリペプチド又はペプチドの「誘導体」は、例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸化、硫酸化、還元／アルキル化、アシル化、化学共役又は軽いホルマリン処理によって改変されたものである。誘導体は、放射性同位元素、蛍光及び酵素の標識を含むがこれらに限られない、直接的又は間接的のいずれかの検出可能な標識を含むために改変される場合もある。
【００２２】
「免疫調節」という用語は、化合物、組成物又は物質が（例えば、免疫応答を刺激又は増大する）免疫原性か、（例えば、免疫応答を低下又は抑制する）免疫抑制性かであることを意味する。
【００２３】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）はＴ細胞を活性化可能な細胞であり、単球／マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣｓ）を含むが、これらに限定されない。「樹状細胞」又は「ＤＣ」という用語は、リンパ性又は非リンパ性の組織で見られる形態学的に類似の細胞タイプの多様な集団のメンバーのいずれかをいう。これらの細胞は、これらの特徴的な形態、高いレベルの表面ＭＨＣクラスＩＩの発現によって特徴付けられる。樹状細胞は、組織供給源の多くから単離される場合がある。樹状細胞は、ＭＨＣで拘束されたＴ細胞を感作する高い能力を有し、ｉｎ  ｓｉｔｕでのＴ細胞への抗原提示で非常に有効である。前記抗原は、Ｔ細胞の発生及び寛容で発現する自己抗原と、正常な免疫過程で提示される外来性の抗原との場合がある。
【００２４】
本明細書で用いられるところの「発現ベクター」という用語は、転写可能な遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含む、ベクターをいう。ある場合には、ＲＮＡ分子が、その後に、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに翻訳される。その他の場合には、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の製造では翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物で効果的に連結されたコーディング配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列を指すさまざまな制御配列を含む場合がある。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターはその他の機能にも役立つ核酸配列を含む場合がある。
【００２５】
特定の核酸に関して、「エンコードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」又は「エンコードされる」、「エンコードする」とは、特定のタンパク質への翻訳の情報を含むことを意味する。タンパク質をエンコードする核酸配列は、前記核酸の翻訳領域に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含む場合があるか、あるいは（例えば、ｃＤＮＡのような）かかる介在性の非翻訳配列を欠失する場合がある。タンパク質がエンコードされる前記情報は、コドンの使用によって明記される。アミノ酸配列は、「一般的な」遺伝暗号を用いる前記核酸によってエンコードされることが典型的である。
【００２６】
本明細書で用いられるところの核酸に関しての「異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、外来種から生じるか、あるいは同一種から生じる場合には、慎重なヒトの介入によって組成物及び／又はゲノム遺伝子座においてその天然型から実質的に改変される核酸である。例えば、異種性構造遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターは、前記構造遺伝子が由来する種と異なる種に由来するか、あるいは同一の種に由来する場合には、１つ又は両方がそれらの原型から実質的に改変される。異種性のタンパク質は、外来種から生じる場合があるか、あるいは同一種から生じる場合には、慎重なヒトの介入によってその原型から実質的に改変される。
【００２７】
「試料」は、その最も広範な意味で本明細書で用いられる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体等を含む試料は、体液と、細胞調製物の可溶性画分又は細胞が増殖された培地と、細胞から単離されるか、あるいは抽出される、染色体、細胞小器官又は膜と、溶液中又は基質に結合される、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡか、あるいはポリペプチド又はペプチドと、細胞と、組織と、組織付着痕（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｉｎｔ）と、指紋、皮膚又は毛髪と、同様のものとを含む場合がある。
【００２８】
「患者」、「被験者」又は「個人」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、治療される哺乳類の被験者を指し、ヒトの患者となることが好ましい。ある場合には、本発明の方法は、マウス、ラット及びハムスターを含むげっ歯類と、霊長類とを含むが、これらに限られない実験動物と、獣医学の用途と、疾患の動物モデルの開発とでの使用がある。
【００２９】
「診断の」又は「診断した」は、病状の存在又は性質を同定することを意味する。診断方法は、感度及び特異度に違いがある。診断アッセイの前記「感度」は、テスト結果が陽性の病人の百分率である（「真の陽性」の百分率）。前記アッセイによって検出されない病人は「偽陰性」である。前記アッセイで、病気ではなく、かつ、テスト結果が陰性である被験者は「真の陰性」と称される。診断アッセイの前記「特異度」は、１から偽陽性度を減算した差であり、前記「偽陽性」度は、テスト結果が陽性であるが、その疾患を有しない被験者の割合として定義される。特別な診断方法が症状の決定的な診断を提供しない場合があるが、前記方法は診断の目的とする陽性指標を提供すれば十分である。
【００３０】
「治療」は、疾患の発生を妨げるか、あるいは疾患の症状又は徴候を変更する意図で実施された介入である。したがって、「治療」は、治療上の処置と、予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段との両方を指す。治療を必要とするものは、前記疾患を既に罹患しているものと、前記疾患が予防されるべきものとを含む。腫瘍（例えば、癌）の治療では、治療剤が腫瘍細胞の症状を直接的に減少するか、あるいは別の治療剤、例えば、放射線及び／又は化学療法によって、前記腫瘍細胞をより治療しやすくする場合がある。本明細書で用いられるところの「改善した」又は「治療」は、ある徴候が正常値（例えば、健康な患者又は個人で得られた値）に近付くことを指し、前記徴候は、例えば、日常的な統計試験を用いて決定されたとき、正常値との違いが５０％未満であり、正常値との違いが約２５％未満であることが好ましく、正常値との違いが１０％未満であることがより好ましく、正常値と有意な差がないことがさらにより好ましい。例えば、腫瘍細胞に関して「治療（ｔｒｅａｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、前記細胞の進行を止めることか、成長を減速することか、退縮を誘導することか、前記細胞の存在下で関係する症状を改善することかを指す。感染性疾患生物に苦しんでいる個人の治療は、個人から前記疾患生物を低下及び除去することを指す。例えば、プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）か、ＥＬＩＳＡ等のような別の自動診断方法かによって測定されるとき、ウイルス粒子が低下する。
【００３１】
「癌の治療」は、（１）（ｉ）増殖速度の低下、（ｉｉ）完全な増殖停止を含む腫瘍の成長のある程度の阻害、（２）腫瘍の細胞数の減少、（３）腫瘍のサイズの現状維持、（４）腫瘍のサイズの低下、（５）末梢器官への腫瘍細胞の浸潤の（ｉ）低下、（ｉｉ）速度の低下又は（ｉｉｉ）完全な予防を含む阻害、（６）転移の（ｉ）低下、（ｉｉ）速度の低下又は（ｉｉ）完全な予防を含む阻害、（７）（ｉ）腫瘍のサイズの現状維持、（ｉｉ）腫瘍のサイズの減少、（ｉｉｉ）腫瘍の成長速度の低下、（ｉｖ）浸潤の減少、速度低下又は予防をもたらす場合がある抗腫瘍免疫応答の増大、及び／又は、（８）疾患に関係する１種類又は２種類以上の徴候の重症度又は数のある程度の軽減のうちの１種類又は２種類の効果を指す。
【００３２】
本明細書で用いられるところの「安全かつ有効な量」という用語は、本発明のやり方で用いられた際に、妥当な利益／リスク割合に相応の（毒性、刺激作用又はアレルギー応答のような）不適切で有害な副作用なしに所望の治療応答を生じさせるのに十分な成分量を指す。「治療上の有効量」とは、所望の治療応答を生じさせるのに有効な本発明の化合物量を意味する。例えば、肉腫又はリンパ腫のいずれかの癌の成長又は発生を遅延させるか、あるいは前記癌の収縮又は転移を妨げるための有効量である。特定の安全かつ有効な量か、治療上の有効量かは、治療されている特定の条件と、患者の身体の状態と、治療されている哺乳類又は動物のタイプと、治療の持続期間と、（存在する場合には）同時療法の性質と、供された特定の製剤かつ化合物又はその誘導体の構造とのようなかかる因子で変わるであろう。
【００３３】
「免疫系の細胞」又は「免疫細胞」は、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球と、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球と、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ）細胞と、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と、単球と、マクロファージと、好中球と、顆粒球と、マスト細胞と、血小板と、ランゲルハンス細胞と、幹細胞と、樹状細胞と、末梢血単核細胞と、腫瘍浸潤性（ＴＩＬ）細胞と、ハイブリドーマを含む遺伝子改変免疫細胞と、薬剤改変免疫細胞と、上記細胞タイプのその誘導細胞（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）又は前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）とを含むが、これらに限定されない、アッセイされる場合がある免疫系の細胞のうちいずれかを含むことを意味する。
【００３４】
「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合可能で、前記抗原を選択する免疫応答を仲介する細胞を指す。これらの細胞は、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）と、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）と、単球と、マクロファージと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）、例えば、ＣＴＬ株、ＣＴＬクローン及び腫瘍、炎症又はその他の浸潤由来のＣＴＬｓとを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
「免疫関連分子」は、静止（「刺激されていない」）状態か、活性化状態かの免疫細胞のいずれかで同定される分子のいずれかを指し、受容体、リガンド、細胞表面分子、核酸分子、ポリペプチド、バリアント及びこれらの断片のいずれかを含む。
【００３６】
「Ｔ細胞」又は「リンパ球」は、胸腺から生じ、ＣＤ３複合体のタンパク質と会合するヘテロ２量体受容体（例えば、再編成Ｔ細胞受容体、細胞の抗原／ＭＨＣ特異性の原因であるＴ細胞表面上のヘテロ２量体タンパク質）を有するリンパ球のサブセットである。Ｔ細胞応答は、別の細胞へのそれらの影響（例えば、標的細胞の死滅、Ｂ細胞のような別の免疫細胞の活性化）か、それらが産生するサイトカインかについてアッセイすることによって検出される場合がある。
【００３７】
「Ｔ細胞応答」という用語は、Ｔ細胞に関係する免疫学的応答を意味する。「活性化される」前記Ｔ細胞は、抗原特異的記憶Ｔ細胞又は抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を作成するために分裂する。前記細胞傷害性Ｔ細胞は前記抗原を含むと認識される細胞に結合し、破壊する。前記記憶Ｔ細胞は前記抗原によって活性化され、結果として、既に遭遇した抗原への応答を提供する。前記抗原へのこの総合的応答は、前記抗原特異的な、例えば腫瘍特異的な、Ｔ細胞応答である。
【００３８】
活性的又は不活性的な場合があり、液性（抗体を利用する）又は細胞性の場合がある「２次免疫応答」又は「獲得免疫応答」は、動物の生涯で確立され、誘導抗原に特異的であり、前記抗原との繰り返しの遭遇での免疫応答の増大によって特徴付けられる。前記獲得免疫系のＴリンパ球の重要な特徴は、細胞表面上のＭＨＣ分子によって提示される病原体由来ペプチドの微量の濃度を検出できることである。
【００３９】
ＳＴＩＮＧ組成物
本発明の実施態様は、本明細書でＳＴＩＮＧと名付けられた分子の核酸配列及びそれらのエンコードされた産物に関する。新規のＳＴＩＮＧの核酸、そのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、変異体、バリアント及び活性型断片は、被験者の自然及び獲得免疫を変調するため、及び／又は、免疫を変調することによって感染を治療及び予防することを含む免疫関連疾患の治療のために用いられる場合がある。また、前記ペプチドと反応する薬剤と、前記ペプチド、単離された核酸分子を含む医薬品組成物と、前記ペプチドをエンコードする単離された核酸分子と、前記核酸分子を含む組み換え核酸コンストラクトと、該組み換え核酸コンストラクトを含む少なくとも１つの細胞と、宿主細胞を用いて前記ペプチドを産生する方法とを提供する。さらに本発明は、被験者に本発明の前記ペプチドを投与し、それによって前記被験者の自然免疫を変調するステップによって前記被験者における感染を治療及び／又は予防するための方法を提供する。さらに、本発明は候補治療剤を同定するための方法を提供する。
【００４０】
以下の実施例では、データは、自然免疫のシグナル伝達過程を調節する新規分子、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）の発現後の同定、クローニング及び特徴付けのために提供される。核酸及びペプチドの配列の両方は、ヒト及びマウスで同定される。仮想の膜貫通（ＴＭ）領域５つを含むＳＴＩＮＧは小胞体（ＥＲ）に主に存在し、Ｉ型ＩＦＮを誘導し、発現後の強力な抗ウイルス状態を発揮するためのＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の転写経路の両方を活性できる。反対に、ＳＴＩＮＧの消失は、Ｉ型ＩＦＮを活性化するためのポリＩＣの能力を低下させ、ターゲッティング相同組み換えによって作成されたＳＴＩＮＧを消失するマウス胎仔線維芽細胞（ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦ）を水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の感染に感受性にする。また、ＳＴＩＮＧの非存在下でのＩ型ＩＦＮ応答を刺激するためのＤＮＡで仲介される能力は大きく阻害され、ＳＴＩＮＧが、ＤＮＡウイルス及び細菌その他の病原体の感染の認識で重要な役割を果たす場合があることを示す。酵母ツーハイブリッド（Ｙｅａｓｔ−ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ）及び同時免疫沈降の研究は、ＳＴＩＮＧが、ＲＩＧ−Ｉ、及び、翻訳後、ＥＲ膜を横切るタンパク質の移行のために必要とされるトランスロコン関連タンパク質（ＴＲＡＰ）複合体のメンバーのＳｓｒ２／ＴＲＡＰβと相互作用することを示す。ＴＲＡＰβのＲＮＡｉ消失は、ＳＴＩＮＧの機能を阻害し、ポリＩＣに応答するＩ型ＩＦＮの産生を阻害することが後に発見された。したがって、自然免疫のシグナル伝達の新規調節因子の同定は別として、このデータは、初めて、哺乳類細胞における細胞内ｄｓＲＮＡ／ウイルスのシグナル伝達と、ＤＮＡ／ウイルス、プラスミドＤＮＡを利用した経路とにおける前記トランスロコンの潜在的な役割をさらに示し、該トランスロコンはＩ型ＩＦＮの産生を含む１次自然免疫応答の活性化の中心だと思われる。
【００４１】
好ましい実施態様では、本明細書で説明されるＳＴＩＮＧ分子と、ＳＴＩＮＧがさまざまな経路で調節する分子とは、免疫系その他の系を調節するための新たなアジュバント、ワクチン及び療法の設計を提供する。前記分子と、それが調節する経路とは、疾患と戦うためのワクチン及び療法で利用されるであろう。ＳＴＩＮＧによって免疫系を変調することが、外来の病原体（ｆｏｒｅｉｇｎ  ａｇｅｎｔｓ）によってもたらされる疾患を含む疾患の治療を提供する。本発明の方法によって治療及び／又は予防される場合がある外来の病原体による模範的な感染は、細菌（例えば、グラム陽性又はグラム陰性の細菌）による感染と、菌類による感染と、寄生生物による感染と、ウイルスによる感染とを含む。本発明の１つの実施態様では、前記感染は細菌感染（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．又はバンコマイシン耐性エンテロコッカスによる感染）である。もう１つの実施態様では、前記感染は菌類感染（例えば、糸状菌、酵母又は高等菌類による感染）である。さらにもう１つの実施態様では、前記感染は寄生生物感染（例えば、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｚを含む、単細胞又は多細胞の寄生生物による感染）である。さらにもう１つの実施態様では、前記感染は、ウイルス感染（例えば、ＡＩＤＳ、トリインフルエンザ、水痘、口唇ヘルペス、風邪、胃腸炎、腺熱、インフルエンザ、嚢尾虫、流行性耳下腺炎、咽頭炎、肺炎、風疹、ＳＡＲＳ、及び、下気道又は上気道の感染（例えば、呼吸合包体ウイルス）と関係するウイルスによる感染）である。
【００４２】
また、ＳＴＩＮＧは、誤って折り畳まれたタンパク質を除去するために必要であるプロテオソーム（ＰＳＭＢ１）の構成成分と会合する。誤って折り畳まれたタンパク質を分泌経路から除去することは、小胞体（ＥＲ）でのそれらの認識に依存する。ＳＴＩＮＧはＥＲに存在し、ＥＲＡＤ−ＥＲ−関連タンパク質の分解で潜在的に役割を果たすためにＰＳＭＢ１と会合する。機能的ユビキチンプロテアソームシステムは必要不可欠であり、消失が、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病）と、心疾患とをもたらす場合がある。プロテアソーム活性の上向き調節は、消耗症（敗血症、悪液質）をもたらす場合がある。脳及び筋肉で生じる免疫プロテアソーム（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ）は持続性の炎症を示し、癌細胞中で下向き調節される。プロテアソーム阻害剤によるアポトーシスを誘導することが（メラノーマのような）癌のための治療である。したがって、ＳＴＩＮＧはこれらの経路で役割を果たし、癌療法及び神経変性疾患のための標的を提供する場合がある。
【００４３】
もう１つの実施態様では、ＳＴＩＮＧは、融合原子団と結合するか、化学原子団を介して連結するかのいずれかによって興味のある分子（例えば、ペプチド、抗原、酵素等）と会合し、該興味のある分子の半減期、細胞内構造体での保持、分解、興味ある前記分子の細胞内又は表面の発現状態の変更等を変調する。
【００４４】
好ましい実施態様では、タンパク質又はペプチドをエンコードする単離された核酸配列は、配列番号１又は２に列挙される配列か、免疫応答を誘導又は増強するそれらの活性型断片又はバリアントかを含む。
【００４５】
もう１つの好ましい実施態様では、活性型断片は少なくとも３８０個の連続するヒトアミノ酸残基の長さであり、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏｎで免疫応答を誘導又は増強する。
【００４６】
もう１つの好ましい実施態様では、配列番号１又は２か、それらの活性型断片かの発現が、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞、組織又は器官のＩ型ＩＦＮを誘導する。
【００４７】
もう１つの好ましい実施態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで配列番号１又は２の発現が抗ウイルス免疫応答を誘導する。
【００４８】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは抗腫瘍応答を誘導する。癌細胞が、例えば、既知又は未知のウイルスの以下のウイルス（ＥＢＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＥＴＣ）感染の多くの方法によって、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）又はその他のレトロエレメント（レトロエレメント由来ＤＮＡ、レトロ転写）か、前記ＳＴＩＮＧ経路を活性化するタンパク質又は核酸（内在性レトロウイルス及び癌、Ｒｕｐｒｅｃｈｔ  Ｋら、Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、２００８  Ｎｏｖ；６５（２１）：３３６６−８２）、Ｇｉｆｆｏｒｄ及びＴｒｉｓｔｅｍ、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、２００３  ２６：３  ２９１−３１５）かの再活性化によってＳＴＩＮＧ経路を活性化する場合がある（Ｄｏｌｅｉ  Ａ、Ｐｅｒｒｏｎ  Ｈ．、Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  ２００９  Ｊａｎ；１５（１）：４−１３）（Ｇｏｏｄｉｅｒ  ＪＬ、Ｋａｚａｚｉａｎ  ＨＨ  Ｊｒ、Ｃｅｌｌ．  ２００８  Ｏｃｔ  ３；１３５（１）：２３−３５）。
【００４９】
もう１つの好ましい実施態様では、癌の治療は、ＳＴＩＮＧか、ＳＴＩＮＧ及びその経路を誘導する薬剤かを投与することを含む。本明細書で示されるデータは、ＳＴＩＮＧによって調節される細胞内ＤＮＡ経路がこれまで調べられた癌細胞全てで消失することを証明する。したがって、前記ＳＴＩＮＧ経路の抑制は、細胞のトランスフォーメーション過程について初期の重要で今のところ新規な要件かもしれない。前記細胞内ＤＮＡ経路は消失し、この事象は、ＳＴＩＮＧか、ＳＴＩＮＧと相互作用する分子か、ＴＲＡＰ複合体、小胞輸送経路（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ）及びエンドソーム経路を含むＳＴＩＮＧの上流又は下流の分子かを含む。
【００５０】
好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧ及び／又はＳＴＩＮＧと相互作用する分子は、癌の治療のために患者に投与される。ＳＴＩＮＧは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＴＩＮＧを発現するベクター、抗体等として投与される場合がある。本明細書のデータは、ＳＴＩＮＧが、バーキットリンパ腫、乳癌、その他の白血病、リンパ腫、メラノーマ等のようなさまざまなリンパ腫で存在しないことを示す。また、本明細書のデータは、正常な細胞では消失しないが、癌細胞では細胞内シグナル伝達が消失することを示す。したがって、ＳＴＩＮＧ及び／又はＳＴＩＮＧ関連分子の再構築は、癌とその他の疾患又は障害との治療で用いられる。例えば、前記データは、２９３Ｔ又はＭＣＦ７のような細胞内ＤＮＡシグナル伝達の消失を前もって示された癌細胞株中にＳＴＩＮＧを再構築することが、前記細胞内経路を回復することを示す。すなわち、ＳＴＩＮＧの再構築は、Ｉ型ＩＦＮと、おそらくその他のシグナル伝達経路とを誘導する。したがって、ＳＴＩＮＧは癌細胞での再構築に、おそらく正常な細胞を殺さないが、癌細胞を殺すのに有用となるであろう。ＳＴＩＮＧか、細胞内ＤＮＡ経路でＳＴＩＮＧと直接的又は間接的に会合するその他の分子かが、治療上の介入のための有用な標的の場合がある。理論に拘束されないが、前記ＳＴＩＮＧ経路は、ＨＰＶに関連する子宮頚癌、ＨＣＶ又はＨＢＶに関連する肝細胞癌、おそらくウイルスが関係する癌（ＥＢＶ陽性のバーキット株（例えば、図２６、２７を参照せよ。）のようなウイルスに感染した腫瘍で調節を解除する／抑制されるであろうことも意図する。ＳＴＩＮＧは、上述のような（ＥＢＶ、ＨＰＶ）と、ＣＭＶ、ＨＩＶ等とのようなものに潜在的に感染した細胞で抑制される場合もある。
【００５１】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは、癌を予防又は治療するために患者に投与される。癌は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、カルシノーマ及びサルコーマを含むがこれらに限定されない哺乳類で見られる癌又は新生物又は悪性腫瘍の全てのタイプを指す。癌の例は、脳と、胸部と、膵臓と、子宮頸部と、大腸と、頭部及び首部と、腎臓と、肺と、非小細胞肺と、メラノーマと、中皮腫と、卵巣と、サルコーマと、胃と、子宮と、髄芽腫との癌である。本明細書で用いられる「癌」、「新生物」及び「腫瘍」は、単数形又は複数形のいずれかで互換的に用いられ、それらを病理学上の宿主生物にする悪性転換を起こした細胞を指す。原発性癌細胞（つまり、悪性転換の部位近くから得られた細胞）は、十分に確立された手法、特に組織学的試験によって非癌性細胞から容易に鑑別される場合がある。本明細書で用いられるところの癌細胞の定義は、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞の祖先から生じた細胞のいずれかも含む。これは、転移した癌細胞と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養と、癌細胞から生じた細胞株とを含む。固形腫瘍として通常は示される癌のタイプを指すとき、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲ画像化法、Ｘ線、超音波又は触診のような手順によって腫瘍の大きさを利用して検出可能であるもの、及び／又は、患者から採取することが可能な試料中で１種類又は２種類以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能なものである。
【００５２】
好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧの投与は、神経障害を予防（神経保護）又は治療する。神経障害とは、神経系及び／又は視覚系の障害のいずれかを指す。「神経障害」は、中枢神経系（脳、脳幹及び小脳）と、（脳神経を含む）末梢神経系と、自律神経系（中枢及び末梢神経系の両方で配置される部分）とに関する障害を含む。神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー病、脳卒中、多発性硬化症等を含む。
【００５３】
以下は本発明の組成物及び方法を用いて治療される場合がある複数の神経学的障害、症状、兆候、症候群のリストである。後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、加齢黄斑変性、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、血管性認知症、筋萎縮性側索硬化症、無脳症、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド−キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自律神経機能不全、背中の痛み（ｂａｃｋ  ｐａｉｎ）、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼けいれん、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内高血圧症、ビンスワンガー病、眼瞼けいれん、ブロッホ−サルズバーガー症候群、腕神経叢損傷、脳膿瘍、脳損傷、（多型性神経膠芽腫を含む）脳腫瘍、脊椎腫瘍、ブラウン−セカール症候群、カナバン病、手根管症候群、灼熱痛、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、頭部の障害（ｃｅｐｈａｌｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、大脳萎縮症、脳性巨人症、脳性麻痺、シャルコー−マリー−トゥース病、化学療法誘発性末梢神経障害及び末梢神経障害性疼痛、キアリ奇形、舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、慢性疼痛、複合性局所疼痛症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｐａｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、コフィン−ローリー症候群、遷延性意識障害を含む昏睡、先天性顔面神経麻痺、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋縫合早期癒合症、クロイツフェルト−ヤコブ病、蓄積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞封入体病、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ−ダンシングフィート症候群（ｄａｎｃｉｎｇ  ｅｙｅｓ−ｄａｎｃｉｎｇ  ｆｅｅｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ダンディ−ウォーカー症候群、ドーソン病、デ・モルシエ症候群（Ｄｅ  Ｍｏｒｓｉｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、デジェリン・クルンプケ麻痺、認知症、皮膚筋炎、糖尿病性神経障害、び漫性硬化症、自律神経失調症、書字障害、読字障害、筋緊張異常、早期乳児てんかん性脳症、空虚トルコ鞍症候群、脳炎、脳瘤、脳三叉神経領域血管腫症、てんかん、エルブ麻痺、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性痙性四肢麻痺、熱性けいれん、フィッシャー症候群、フリードライヒ運動失調、前頭側頭葉型認知症その他「タウオパチー」、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞性動脈炎、巨細胞封入体症（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）、グロボイド細胞白質ジストロフィー、ギラン−バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、ハレルフォルデン−スパッツ病、頭部外傷、頭痛、片側顔面けいれん、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調（ｈｅｒｅｄｏｐａｔｈｉａ  ａｔａｃｔｉｃａ  ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）、耳性帯状疱疹、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）、平山症候群、ＨＩＶ関連認知症及びニューロパチー（ＡＩＤＳの神経学的症状）、全前脳胞症、ハンチントン病その他のポリグルタミン鎖病、水無脳症、水頭症、副腎皮質機能亢進症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎���ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、封入体筋炎、色素失調症、乳児型フィタン酸蓄積症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｐｈｙｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、乳児型レフサム病、乳児けいれん、炎症性筋疾患、頭蓋内のう胞、頭蓋内圧亢進症、ジュベール症候群（Ｊｏｕｂｅｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、カーンズ−セイヤー症候群、ケネディ病、キンスボーン症候群、クリッペル・ファイル症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ−ヴェランダー病、クールー、ラフォラ疾患、ランバート−イートン筋無力症候群、ランドウ−クレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルグ）症候群、学習障害、リー病、レノックス−ガストー症候群、レッシュ−ナイハン症候群、脳白質ジストロフィー、レビー小体型認知症、滑脳症、閉じこめ症候群、ルー−ゲーリッグ病（すなわち、運動ニューロン疾患又は筋萎縮性側索硬化症）、腰椎椎間板症、ライム病の神経学的後遺症、マシャド・ジョセフ病、巨頭症、巨脳症、メルカーソン−ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラー−フィッシャー症候群、一過性脳虚血発作、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、若年性一側性上肢筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコ多糖症、多発梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症その他脱髄疾患、体位性低血圧を伴った多系統萎縮症、ｐ筋ジストロフィー（ｐ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、重症筋無力症、ミエリン分解性びまん性硬化症（ｍｙｅｌｉｎｏｃｌａｓｔｉｃ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、乳児期ミオクローヌス脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、先天性筋緊張症、ナルコレプシー、神経線維腫症、悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的症状、ループスの神経学的後遺症、神経性筋緊張病、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、ニーマン−ピック病、オサリバン−マクロード症候群、後頭神経痛、潜在性脊椎閉鎖不全（ｏｃｃｕｌｔ  ｓｐｉｎａｌ  ｄｙｓｒａｐｈｉｓｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス−ミオクローヌス、視神経炎、起立性低血圧、使いすぎ症候群、感覚異常、パーキンソン病、先天性パラミオトニア、腫瘍随伴性疾患、発作、パリー−ロンベルグ症候群、ペリツェウス−メルツバッヘル病、周期性四肢麻痺、末梢性ニューロパチー、有痛性神経障害及び神経障害疼痛、持続性植物状態、広汎性発達障害、光くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症（ｐｈｙｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病、圧迫神経、下垂体腫瘍、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧、プラダー−ウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面半側萎縮症、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性灰白質ジストロフィー（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｐｏｌｉｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、進行性核上性麻痺、偽脳腫瘍、ラムゼイ・ハント症候群（I型及びII型）、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、反復性動作障害、反復性ストレス傷害、下肢静止不���症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、セント・ヴィトゥス舞踏病、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、中隔視神経形成異常症、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）、シャイ−ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、ソトス症候群、痙縮、二分脊髄、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、スティッフ−パーソン症候群、脳卒中、スタージ・ウェーバ症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、シデナム舞踏病、失神、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジア、テイ−サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムセン病、胸郭出口症候群、三叉神経痛（Ｔｉｃ  Ｄｏｕｌｏｕｒｅｕｘ）、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄症、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛（ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｎｅｕｒａｌｇｉａ）、熱帯性痙性不全対麻痺症、結節性硬化症、血管性認知症  （多発梗塞性認知症）、側頭動脈炎を含む血管炎、フォン  ヒッペル−リンドウ病、ワレンベルグ症候群、ウェルドニッヒ−ホフマン病、ウエスト症候群、むちうち損傷、ウイリアムズ症候群、ウィルソン病、及び、ツェルウエーガー症候群。
【００５４】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧを投与することが、自己免疫疾患に罹患する患者を予防又は治療する。自己免疫疾患の例は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多因子感受性（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の慢性の炎症性症状であるクローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤｓ）を含む。
【００５５】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは、抗癌療法に対する疾患進行又は結果（ｏｕｔｃｏｍｅ）又は応答又は抵抗についての予後指標（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）マーカーである。例えば、ＳＴＩＮＧの消失は、正常な細胞と比較してＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を変え、すなわち、変異体ＳＴＩＮＧ分子の検出が腫瘍細胞に進行している細胞を示すこととなるであろう。
【００５６】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは、薬剤等による癌、自己免疫、感染を含む疾患状態の予後指標である。
【００５７】
好ましい実施態様では、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、配列番号１又は２に列挙される単離された核酸か、それらの活性型断片又はバリアントかによってエンコードされる。ある実施態様では、前記ペプチドは、少なくとも３８０個の連続的なアミノ酸残基の長さである。
【００５８】
もう１つの好ましい実施態様では、バイオマーカーは、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体を含む。
【００５９】
もう１つの好ましい実施態様では、バイオマーカーは、配列番号１又は２に列挙される単離された核酸、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるぺプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含む。
【００６０】
自己免疫の役割
２本鎖ＤＮＡに対する抗体が、全身性エリテマトーデスの患者のおよそ半分に存在し、ＳＬＥの診断に非常に特異的である（Ｓｉｍｏｎ  ＪＡら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  （Ｏｘｆｏｒｄ）．  ２００４  Ｆｅｂ；４３（２）：２２０−４）。さらに、前記抗体は、顕著な予後指標の重要性を有する抗ｄｓＤＮＡ抗体の有するＳＥＬ患者は、ループス腎炎及び脈管炎を含む狼瘡の重篤な所見を発症する可能性がとても高く、予後が実質的に長期間不良である。狼瘡に対するｄｓＤＮＡ抗体の重要性が長く認識されているにもかかわらず、前記抗体と疾患の発症との関連性は謎のままである。標的組織抗原と直接的に相互作用する、単離された抗ｄｓＤＮＡ抗体の特異性（ｄｓＤＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）は一部の患者では知られてきたが、この種の同定された交差反応性を有しない患者でも肝臓がしばしば標的にされ、同様に予後が不良である。狼瘡の患者又は動物モデルのｄｓＤＮＡ抗原へのＢ及びＴ細胞の寛容プロトコルは、成功しなかった（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００６  Ａｕｇ；５４（８）：２５２３−３２；  Ｃａｒｄｉｅｌ  ＭＨら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００８  Ａｕｇ；５８（８）：２４７０−８０；  Ｋａｎｇ  ＨＫら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７  Ｊｕｎ  １５；１７８（１２）：７８４９−５８．）。しかし、ヌクレオソームのＤＮＡと、自然免疫の誘導、特に重篤なｄｓＤＮＡ関連瘢痕との関係性の興味が存在し続けており、免疫反応性を誘導する自己ＤＮＡに対する非ＴＬＲ９の自然免疫認識経路が同定されている。ＳＴＩＮＧが、（ヌクレオソーム又は細胞内ＲＮＡのような）細胞破片の成分を潜在的に含む産物に対する自然免疫応答を誘導／増幅する役割を果たす場合がある可能性がある役割を与えられるとき、ＳＴＩＮＧは、自己免疫及び自己炎症性の症状の広範なアレイの発現で役割を果たす場合もある。したがって、前記ＳＴＩＮＧ遺伝子が、ヒトの５ｑ３１．２、すなわち、クローン病、関節リウマチ、１型糖尿病及びセリアック病を含む疾患リスク及び／又はより重篤な疾患の過程に結び付けられるＩＢＤ５遺伝子座のすぐそばに配置されることは注目すべきことである（７−１０）。また少なくとも１つの報告が、この領域と、狼瘡のリスクとの連鎖を観察した（Ｄｅ  Ｊａｇｅｒ  ＰＬら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００６  Ｊｕｎ；７（４）：３２７−３４）。理論に拘束されないが、ＳＴＩＮＧ関連経路の誘導を増大することが、プロ免疫（ｐｒｏ−ｉｍｍｕｎｅ）シグナル伝達を増大して、抗ｄｓＤＮＡ関連狼瘡の主要器官を標的にし、不良な結果をもたらす傾向を含む、自己免疫疾患の可能性及び重篤性を増大すると仮説が立てられる。前記ＳＴＩＮＧ経路によって調節されるその他の疾患は多発性硬化症を含み、この原因は、ＤＮＡを利用したレトロエレメントを含む場合がある（Ｄｏｌｅｉ  Ａ、Ｐｅｒｒｏｎ  Ｈ、ＪＮｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．  ２００９  Ｊａｎ；１５（ｌ）：４−１３；  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｔ．、Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００５  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１５（３）：１７９−２１１）。
【００６１】
ＳＴＩＮＧと相互作用する分子
ＳＴＩＮＧは、未だに知られていない分子及び経路を含むさまざまなものと相互作用又は会合する。
【００６２】
好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧ、その組成物、その活性型断片、バリアント又は変異体は、ＳＴＩＮＧと直接的又は間接的に相互作用又は会合する分子の発現及び／又は機能を変調する。これは、ＳＴＩＮＧが（直接的又は間接的に）影響を及ぼす経路に関与する全てのそれらの経路及び分子を直接的又は間接的に含む。
【００６３】
例えば、ＳＴＩＮＧに結合するＴＲＡＰ−βは、例えば、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＭＩＮＴ及び／又はＳＴＲＩＮＧを通して同定された）、ＳＳＲ２（ＥＮＳＰ０００００３５７２９５３）、ＳＳＲ４  ＥＮＳＰ０００００３５９１０３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９６）、ＳＳＲ１  ＥＮＳＰ０００００２４４７６３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９５）、ＳＳＲ３  ＥＮＳＰ０００００２６５０４４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９５）、ＳＲＰＲ  ＥＮＳＰ０００００３２８０２３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９６）、ＴＲＡＭ１  ＥＮＳＰ０００００２６２２１３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９５５）ＤＤＯＳＴ  ＥＮＳＰ０００００３６４１８８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９４３）、ＲＰＮ２  ＥＮＳＰ０００００３４５９０４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９３１）、ＳＥＣ６１Ｂ  ＥＮＳＰ０００００２２３６４１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９２５）、ＳＥＣ１１Ａ  ＥＮＳＰ０００００２６８２２０３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１８）、ＳＲＰ１９  ＥＮＳＰ０００００２８２９９９３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１７）、ＳＥＣ６１Ｇ  ＥＮＳＰ０００００３４１５３８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１６）、ＳＲＰ９  ＥＮＳＰ０００００３０５２３０３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１５）、ＤＡＤ１  ＥＮＳＰ０００００２５０４９８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１）、ＳＲＰ６８  ＥＮＳＰ０００００３１２０６６３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１）、ＳＰＣＳ２  ＥＮＳＰ０００００２６３６７２３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０７）、ＳＥＣ１１Ｃ  ＥＮＳＰ０００００２９９７１４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０６）、ＳＴＴ３Ｂ  ＥＮＳＰ０００００２９５７７０３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０５）、ＳＥＣ６１Ａ１  ＥＮＳＰ０００００２４３２５３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０３）、ＳＥＣ６１Ａ２  ＥＮＳＰ０００００３６８３１９３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０３）、ＳＲＰ７２  ＥＮＳＰ０００００３４２１８１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０２）、ＥＲＯ１Ｌ  ＥＮＳＰ０００００３５２０４４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）ＩＮＳ  ＥＮＳＰ０００００３７０７３１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＲＰＮ１  ＥＮＳＰ０００００２９６２５５３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＳＰＣＳ１  ＥＮＳＰ０００００２３３０２５３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＳＰＣＳ３  ＥＮＳＰ０００００２６４５９７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＳＲＰ１４  ＥＮＳＰ０００００２６７８８４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＳＲＰ５４  ＥＮＳＰ０００００２１６７７４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＳＲＰＲＢ  ＥＮＳＰ０００００２７３４０６３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＴＲＡＭ２  ＥＮＳＰ０００００１８２５２７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）、ＥＮＳＰ０００００３５１５６８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０５）と相互作用する。
【００６４】
もう１つの例では、［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＭＩＮＴ及び／又はＳＴＲＩＮＧを通して；相互作用物相互作用詳細ジーンカード外部ＩＤ（ｓ）（Ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔａｉｌｓ  ＧｅｎｅＣａｒｄ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ＩＤ（ｓ））］ＳＥＣ６１Ｂと相互作用するタンパク質（Ｐ６０４６８１、２  ＥＮＳＰ０００００２２３６４１３）は、ＳＳＲ１  Ｐ４３３０７２、ＥＮＳＰ０００００２４４７６３３  ＭＩＮＴ−４５４６７２３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９６）；ＳＥＣ６１Ｇ  ＥＮＳＰ０００００３４１５３８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９８６）；ＳＥＣ６１Ａ１  ＥＮＳＰ０００００２４３２５３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９８１）；ＴＲＡＭ１  ＥＮＳＰ０００００２６２２１３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９６４）；ＳＳＲ３  ＥＮＳＰ０００００２６５０４４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９３４）；ＳＳＲ４  ＥＮＳＰ０００００３５９１０３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９３４）；ＳＳＲ２  ＥＮＳＰ０００００３５７２９５３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９２５）；ＲＰＮ２  ＥＮＳＰ０００００３４５９０４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９２３）；ＳＲＰ９  ＥＮＳＰ０００００３０５２３０３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１２）；ＤＡＤ１  ＥＮＳＰ０００００２５０４９８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９１１）；ＳＰＣＳ２  ＥＮＳＰ０００００２６３６７２３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０８）ＤＤＯＳＴ  ＥＮＳＰ０００００３６４１８８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０６）；ＴＲＡＭ２  ＥＮＳＰ０００００１８２５２７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０４）；ＳＲＰ６８  ＥＮＳＰ０００００３１２０６６３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９０３）；ＳＥＣ６１Ａ２  ＥＮＳＰ０００００３６８３１９３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９）；ＥＲＯ１Ｌ  ＥＮＳＰ０００００３５２０４４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）ＩＮＳ  ＥＮＳＰ０００００３７０７３１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＲＰＮ１  ＥＮＳＰ０００００２９６２５５３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＥＣ１１Ａ  ＥＮＳＰ０００００２６８２２０３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＥＣ１１Ｃ  ＥＮＳＰ０００００２９９７１４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＰＣＳ１  ＥＮＳＰ０００００２３３０２５３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＰＣＳ３  ＥＮＳＰ０００００２６４５９７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＲＰ１４  ＥＮＳＰ０００００２６７８８４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＲＰ  １９  ＥＮＳＰ０００００２８２９９９３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＲＰ５４  ＥＮＳＰ０００００２１６７７４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＲＰ７２  ＥＮＳＰ０００００３４２１８１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＲＰＲ  ＥＮＳＰ０００００３２８０２３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＲＰＲＢ  ＥＮＳＰ０００００２７３４０６３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＳＴＴ３Ｂ  ＥＮＳＰ０００００２９５７７０３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＤＥＲＬ２  ＥＮＳＰ０００００１５８７７１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．７６２）；ＤＥＲＬ��  ＥＮＳＰ０００００３１５３０３３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．７６２）；ＥＤＥＭ１  ＥＮＳＰ０００００２５６４９７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．７４６）；ＳＥＣ６２  ＥＮＳＰ０００００３３７６８８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．７３２）；ＢＣＡＰ３１  Ｐ５１５７２１  ＥＢＩ−１７８８８１９、ＥＢＩ−７７６８３；−−ＥＮＳＰ０００００３５１５６８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）を含む。
【００６５】
［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＭＩＮＴ及び／又はＳＴＲＩＮＧを通して；Ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｄｅｔａｉｌｓ  ＧｅｎｅＣａｒｄ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ＩＤ（ｓ）］ＥＸＯＣ２／Ｓｅｃ  ５  （Ｑ９６ＫＰ１１  ＥＮＳＰ０００００２３０４４９３）と相互作用するタンパク質の例は、ＳＥＲＧＥＦ  Ｑ９ＵＧＫ８１、ＥＮＳＰ０００００２６５９６５３  ＥＢＩ−４６５７１５、ＥＢＩ−４６５３６８  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９８）；ＥＸＯＣ３  ＥＮＳＰ０００００３２３３７７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９７）；ＥＸＯＣ８  ＥＮＳＰ０００００３５３５６４３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９７）；ＲＡＬＡ  ＥＮＳＰ０００００００５２５７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９９７）；ＥＸＯＣ７  ＥＮＳＰ０００００３３４１００３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９８７）；ＥＸＯＣ４  ＥＮＳＰ０００００２５３８６１３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９７３）；ＥＸＯＣ５  ＥＮＳＰ０００００３４２１００３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９７３）；ＲＡＬＢ  ＥＮＳＰ０００００３６５３９８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９７２）；ＥＸＯＣ６  ＥＮＳＰ０００００２６０７６２３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９６９）；ＥＸＯＣ１  ＥＮＳＰ０００００３７０６９５３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９５４）；ＡＲＦ６  ＥＮＳＰ０００００２９８３１６３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９３５）；ＤＰＨ３  ＥＮＳＰ０００００２８５０８２３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．９２８）；ＲＨＯＱ  ＥＮＳＰ０００００２３８７３８３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）；ＴＲＩＰ１０  ＥＮＳＰ０００００３２０１１７３  ＳＴＲＩＮＧ（スコア＝．８９９）を含む。
【００６６】
ＳＴＩＮＧを発現するベクター
もう１つの好ましい実施態様では、ベクターは、配列番号１、２に列挙されるポリヌクレオチド、それらのバリアント、変異体又は活性型断片を含む。
【００６７】
前記ベクターは患者に投与される場合があり、配列番号１、２、それらのバリアント、変異体又は活性型断片は、抗ウイルス活性、免疫応答、免疫シグナル伝達又は細胞内Ｂ型ＤＮＡのうち、少なくとも１つを含む応答を誘導する。
【００６８】
当業者に知られ、本明細書に説明されるような多くのベクターは、哺乳類への遺伝子産物の伝達を仲介することができると知られる。（遺伝子送達又は遺伝子伝達の「運搬体」と時折言及される）「ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む分子の高分子又は複合体を指す。送達されるべき前記ポリヌクレオチドは、遺伝子療法で興味のあるコーディング配列を含む場合がある。ベクターは、例えば、（アデノウイルス（「Ａｄ」）、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びレトロウイルスのような）ウイルスベクター、リポソームその他の脂質含有複合体と、宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を仲介することが可能なその他の高分子複合体とを含む。また、ベクターは、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現をさらに変調するか、あるいは標的とされた細胞に有用な性質を提供する、他の成分又は機能を含む。以下により詳細に説明され、例示されるように、かかるその他の成分は、例えば、（細胞タイプ又は組織特異的な結合を仲介する成分を含む）細胞への結合か、あるいは標的化に影響を及ぼす成分と、前記細胞によるベクターの核酸の取込に影響を及ぼす成分と、取込後の前記細胞内でのポリヌクレオチドの局在に影響を及ぼす（核移行を仲介する薬剤のような）成分と、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分とを含む。また、かかる成分は、検出可能及び／又は選択可能なマーカーのようなマーカーを含む場合があり、該マーカーは、前記ベクターによって送達される核酸を取り込み、かつ、発現している細胞を検出又は選択するのに用いられる。かかる成分は、（結合及び取込を仲介する、成分又は機能を有する特定のウイルスベクターの使用のような）ベクターの天然の特徴として提供される場合があり、すなわち、ベクターはかかる機能を提供するために改変される場合がある。その他のベクターは、Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ３４：  １６７−１７１（２００３）によって説明されるベクターを含む。広範なかかるベクターは、当業者に知られ、一般的に入手可能である。
【００６９】
「組み換えウイルスベクター」は、１種類又は２種類以上の異種性遺伝子産物又は配列を含むウイルスベクターをいう。多くのウイルスベクターはパッケージングと関係するサイズ制限を示すため、前記異種性遺伝子産物又は配列は、ウイルスゲノムの１箇所又は２箇所以上の部分を置換することによって導入されることが典型的である。かかるウイルスは複製欠損となる場合があり、（例えば、複製及びキャプシド形成に必要な遺伝子産物を運ぶヘルパーウイルス又はパッケージング細胞株を用いることによる）ウイルスの複製及びキャプシド形成においてトランスで提供されるための機能の欠損を必要とする。また、送達されるべきポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側で輸送される改変されたウイルスベクターが説明されている（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ  Ｔら、ＰＮＡＳ  ８８：８８５０−８８５４、１９９１を参照せよ。）。
【００７０】
適切な核酸送達システムは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存アデノウイルス、レトロウイルス又はセンダイウイルス（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）リポソーム複合体のうちの少なくとも１つに由来する典型的な配列のウイルスベクターを含む。前記ウイルスベクターは、前記ポリヌクレオチドに操作可能に連結された強力な真核細胞プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むことが好ましい。
【００７１】
さらにベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質及び化学コンジュゲートを含むことが好ましい。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶを利用したウイルスを含む。好ましい１つのＨＩＶを利用したウイルスは少なくとも２つのベクターを含み、ｇａｇ及びｐｏｌの遺伝子がＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルス由来である。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。前記ベクターは、オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）又はアビポックス（ａｖｉｐｏｘ）のベクターのようなｐｏｘベクター、単純ヘルペス１型ベクターのようなヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，  Ｆ．ら、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編、（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ：Ｕ．Ｓ．Ａ．：９０  ７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８７：１１４９  （１９９０）］と、アデノウイルスベクター［ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）］と、アデノ随伴ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）］とを含む。
【００７２】
ポックスウイルスベクターは細胞質に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは核酸の短期間の発現のみを生じる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、いくつかの発明の実施態様のために示される場合がある。前記アデノウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスと比較して（例えば、約１カ月未満の）短期間の発現を生じ、いくつかの実施態様では、より長期間の発現を示す場合がある。選択される特定のベクターは、標的細胞と、治療される症状とに依存するであろう。適切なプロモーターの選択は容易に達成される場合がある。高発現プロモーターを用いることが好ましい。適切なプロモーターの例は、７６３個の塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：１５１（１９９３））及びＭＭＴのプロモーターが用いられる場合もある。特定のタンパク質は、その天然のプロモーターを用いて発現される場合がある。発現を高めるその他のエレメントは、ｔａｔ遺伝子及びｔａｒエレメントのような高い発現レベルを生じるエンハンサー又はシステムを含む場合もある。その後、このカセットは、ベクター、例えばＥ．ｃｏｌｉの複製開始点を含む、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２又はその他の既知のプラスミドベクターのようなプラスミドベクターに挿入される場合がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版（１９８９）を参照せよ。前記プラスミドベクターは、前記マーカーポリペプチドが、処理される生物の代謝に有害な影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性のβ−ラクタマーゼ遺伝子のような選択可能なマーカーを含む場合もある。前記カセットは、国際公開第ＷＯ  ９５／２２６１８号公報明細書で説明されたシステムのような合成送達システムで原子団を核酸結合原子団に結合される場合もある。
【００７３】
所望の場合には、本発明のポリヌクレオチドは、陽イオン性リポソームのような微小送達運搬体及びアデノウイルスベクターとともに用いられる場合もある。リポソーム調製、ターゲッティング及び内容物の送達の手順の参照のために、Ｍａｎｎｉｎｏ及びＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６８２（１９８８）を参照せよ。また、Ｆｅｉｇｎｅｒ及びＨｏｌｍ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．  Ｌａｂ．  Ｆｏｃｕｓ、１１（２）：２１（１９８９）、及び、Ｍａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．  Ｌａｂ．  Ｆｏｃｕｓ、１１（２）：２５（１９８９）を参照せよ。
【００７４】
複製欠損組み換えアデノウイルスベクターは、既知の手法に従って作成される場合がある。Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：６２６−６３０（１９９２）；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３−１５５（１９９２）を参照せよ。
【００７５】
もう１つの送達方法は、細胞内にＳＴＩＮＧを作成することができる１本鎖ＤＮＡ作成ベクターを用いることである。引用により全体として本明細書に取り込まれる、例えば、Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４：１６７−１７１（２００３）を参照せよ。
【００７６】
ＳＴＩＮＧの発現は、当業者に知られたプロモーター／エンハンサーのエレメントのいずれかによって制御される場合があるが、それらの調節エレメントは、発現のために選択される宿主で機能的でなければならない。ＳＴＩＮＧ遺伝子の発現を制御するために用いられる場合があるプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号公報明細書及び第５，１６８，０６２号公報明細書）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウスサルコーマウイルスの３’長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７、１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８：１４４１−１４４５、１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２、１９８２）；ベータ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７５：３７２７−３７３１、１９７８）又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８０：２１−２５、１９８３）のような原核生物発現ベクター；また、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎの「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、２４２：７４−９４、１９８０を参照せよ。；Ｇａｌ４プロモーターのような酵母又はその他の菌類由来のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスフォグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、及び、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用される動物の転写制御領域：膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子の制御領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６、１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５０：３９９−４０９、１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５、１９８７）；膵ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子の制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２、１９８５）、リンパ球細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子の制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８、１９８４；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８、１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：１４２６−１４４４、１９８７）、精巣、胸部、リンパ球及びマスト細胞で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルスの制御領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５、１９８６）、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子の制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １：２６８−２７６、１９８７）、肝臓で活性であるアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５��１６３９−１６４８、１９８５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８、１９８７）、肝臓で活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子の制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  １：１６１−１７１、１９８７）、骨髄の細胞で活性であるベータ−グロビン遺伝子の制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０、１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４、１９８６）、脳のオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２、１９８７）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子の制御領域（Ｓａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６、１９８５）及び視床下部で活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子の制御領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８、１９８６）を含むが、これらに限定されない。
【００７７】
広範な宿主／発現ベクターの組み合わせは、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに供される場合がある。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡの配列のセグメントからなる場合がある。適切なベクターは、ＳＶ４０の誘導体、及び、既知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａ１−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０、１９８８）、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１、例えば、ＮＭ９８９その他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び繊維状１本鎖ファージＤＮＡの多くの誘導体；２μプラスミド又はその誘導体のような酵母プラスミド、昆虫又は哺乳類の細胞で有用なベクターのような真核細胞で有用なベクター；ファージＤＮＡ又はその他の発現制御配列を供するために改変されたプラスミドのようなプラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター等を含む。
【００７８】
酵母発現システムは、ＳＴＩＮＧを発現するために本発明に従って用いられる場合もある。ただ２つに言及すると、例えば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのクローニング部位；インビトロジェン）か、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキーゼで開裂されるＮ末端ペプチド；インビトロジェン）かが本発明に従って供される場合がある。酵母ツーハイブリッド発現システムは本発明に応じて調製される場合がある。
【００７９】
１つの好ましい送達システムは、１種類又は２種類以上のポリヌクレオチド、好ましくは約１種類のポリヌクレオチドを取り込む組み換えウイルスベクターである。本発明の方法で用いられる前記ウイルスベクターは、約１０８から５×１０８ｐｆｕまでのｐｆｕ（プラーク形成単位）を有することが好ましい。前記ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターで投与される実施態様では、約０．１ナノグラムから約４０００ミリグラムまでの間の使用は、例えば、約１ナノグラムから約１００ミリグラムまででたいてい有用であろう。
【００８０】
免疫変調
ＳＴＩＮＧは自然免疫応答を活性化する。したがって、疾患特異的抗原に結合して、免疫応答を変調し、広範な疾患療法で適用可能なアジュバントのようなワクチンで用いられる場合があることを期待される。
【００８１】
免疫系は、「自然」又は「１次」免疫系と、「獲得／適応」又は「２次」免疫系との２つの一般的な系に分類される。自然免疫系は最初に感染を抑え、適切な応答を生じるための獲得免疫系のための時間をとると考えられる。前記自然免疫系のさまざまな構成要素が引金となり、抗原特異的Ｂ及びＴリンパ球を含む、前記獲得免疫系を増大する（Ｋｏｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  １９９８、１７：３０３；Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．  １９９２、１３：  ３７９；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ及びＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ．１９８８、３９２：２４５）。「１次免疫応答」は、抗原との事前接触によって影響されない自然免疫応答を指す。１次免疫の主な防御機構は、（潜在的環境侵入者の付着に対して防御する）皮膚と、（細菌その他の外来物質を捕まえる）粘液と、（飲み込まれた侵入者を破壊する）胃酸と、（ウイルス複製を抑制する）インターフェロン（ＩＦＮ）及び（細菌の破壊を促進する）補体タンパク質のような抗菌性物質と、（インターフェロンの作用を増強し、細菌の成長を阻害し、組織修復を増大する）発熱と、（微生物及び特定の腫瘍細胞を破壊し、特定のウイルスが感染した細胞を攻撃する）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、（侵入者を貪食するためのマクロファージ及び樹状細胞のような白血球を動かす）炎症応答とである。
【００８２】
マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）を含む自然免疫系のいくつかの細胞は、パターン認識受容体を通して外来の抗原を取り込むことによって獲得免疫系の一部分としても機能し、前記抗原のペプチド断片と、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ分子とを組み合し、ナイーブＣＤ８＋及びＣＤ４＋のＴ細胞それぞれを刺激する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ及びＳｔｅｉｎｍａｎ、上記；Ｈｏｌｍｓｋｏｖら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．  １９９４、１５：６７；Ｕｌｅｖｉｔｃｈ及びＴｏｂｉａｓ  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９５、１３：４３７）。プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）はこれらのＴ細胞と連絡し、細胞性及び液性の免疫それぞれを仲介する、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）のリンパ球への分化をもたらす（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９５、１３：２５１；Ｈｏｗａｒｄ及びＯ’Ｇａｒｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．  １９９２、１３：１９８；Ａｂｂａｓら、Ｎａｔｕｒｅ．  １９９６、３８３：７８７；Ｏｋａｍｕｒａら、Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８、７０：２８１；Ｍｏｓｍａｎｎ及びＳａｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．  １９９６、１７：１３８；Ｏ’  Ｇａｒｒａ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  １９９８、８：２７５）。
【００８３】
獲得免疫では、獲得Ｔ及びＢ細胞免疫応答は、自然免疫応答とともに働く。獲得免疫応答の基礎は、クローナル認識及び応答の基礎である。抗原は、それを認識する細胞のクローンを選択し、特異的免疫応答の最初の要素が特定のリンパ球の急速な増殖とならなければならない。これは、前記免疫応答のエフェクター期（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｈａｓｅ）が生じるとき、応答する細胞のさらなる分化の後に起こる。本実施態様に関して、これらのエフェクターＴリンパ球は腫瘍特異的Ｔリンパ球である。
【００８４】
好ましい実施態様では、免疫変調組成物は、ＳＴＩＮＧのポリヌクレオチド、そのペプチド、変異体、バリアント又は断片を含む。
【００８５】
もう１つの好ましい実施態様では、免疫変調組成物はＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を変調する薬剤を含み、つまり、ＳＴＩＮＧが関係する細胞内経路（例えば、細胞内ＤＮＡで仲介される１型インターフェロン誘導の調節）に影響する。免疫変調組成物は、疾患又は障害が一様ではない患者を予防又は治療するのに用いられる。疾患又は障害の例は、免疫障害、自己免疫、癌、炎症、悪液質、神経変性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、心不全、移植、又は、感染を含む。
【００８６】
もう１つの好ましい実施態様では、薬剤は、対照基準線（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較してＳＴＩＮＧの機能を抑制又は増大する。
【００８７】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは、対照基準線と比較して免疫応答を抑制又は増大する。
【００８８】
もう１つの好ましい実施態様では、パートナー分子又は分子は、ＳＴＩＮＧが、直接的、例えば、パートナー分子に結合することか、間接的、例えば、ＳＴＩＮＧが経路の一部分の分子に影響し、それによって、相互作用する全経路の下流に影響することかのいずれかで作用する経路の一部分である。ＳＴＩＮＧが、直接的又は間接的に相互作用する場合があるパートナー分子の例は、ＲＩＧ−Ｉ、Ｓｓｒ２、ＴＲＡＰ、ＳＥＣ６１、ＮＫ−ｋＢ、ＴＢＫ、ＩＰＳ−１、ＭＡＭ成分、エクソシスト（ｅｘｏｃｙｓｔ）成分、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ成分、ＧＡＲＰ成分、トランスロコン成分、エンドソーム成分又はＩＲＦ３、ＩＲＦ７を含む。
【００８９】
もう１つの好ましい実施態様では、１種類又は２種類以上のワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）又はその他の治療剤とともに投与される場合があるアジュバントは、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かを含む。
【００９０】
もう１つの好ましい実施態様では、それを必要とする患者においてＤＮＡで誘導される自然免疫応答を変調する方法は、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かの治療上の有効量を前記患者に投与するステップを含む。
【００９１】
もう１つの好ましい実施態様では、患者においてウイルス感染を治療する方法は、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列（Ｓｔｉｎｇ）、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かの治療上の有効量を前記患者に投与するステップを含む。
【００９２】
好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは抗原の交差提示を調節する。また、ＳＴＩＮＧは、ＭＨＣ−Ｉの成分のベータ−２微小免疫グロブリンと相互作用する。β２微小免疫グロブリンは、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現と、ペプチド結合溝（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅ）の安定とに必要である。β２微小免疫グロブリンの非存在下で、ＭＨＣクラスＩ分子（古典的又は非古典的）の非常に限定された量が前記表面で検出される場合がある。ＭＨＣクラスＩの非存在下で、ＣＤ８  Ｔ細胞は発生することができない。ＩＩ型ＩＦＮは、免疫プロテアソームに取り込まれるプロテアソーム（免疫サブユニット）の成分を上向き調節することができる。これらは、細胞で仲介される免疫を刺激するためにＭＨＣクラスＩ受容体に効率的に結合する、抗原を有するペプチドを生成する。したがって、いくつかの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧはこれらの過程を調節し、免疫を変調する。またこの過程の欠損はＳＴＩＮＧを含み、薬剤のためのスクリーニング及び標的を提供する。
【００９３】
また、ＳＴＩＮＧは、自然免疫応答を刺激することができるＤＮＡを認識することの重要性を示す（前記ＤＮＡは、ベクター、プラスミド、ポリｄＡ−ｄＴ、ポリｄＣ−ｄＧを含むＤＮＡと、インターフェロンを刺激するＤＮＡ［ＩＳＤ］を含む、一様ではない長さ及び配列の組成物のＤＮＡとを含む）。したがって、もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧは、前記自然免疫応答を変調する。
【００９４】
もう１つの好ましい実施態様では、それを必要とする患者においてＤＮＡで誘導される自然免疫応答を変調する方法は、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列（Ｓｔｉｎｇ）、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かの治療上の有効量を前記患者に投与するステップを含む。
【００９５】
全てのＤＮＡワクチンはＴＢＫ１経路を通して機能し、免疫応答に必要であるＴＢＫ１を通してＩＦＮ経路を活性する。プラスミドＤＮＡは、ＳＴＩＮＧの非存在下で完全にＩＦＮを活性化することができないため、ＳＴＩＮＧはこの過程を仲介することを示す。したがって、ＳＴＩＮＧ及び関連分子は、未来のワクチン及び免疫療法の方法で重要な成分となるであろう。ＳＴＩＮＧはＮＦ-ｋＢ経路を活性化するも発見された。
【００９６】
もう１つの好ましい実施態様では、アジュバントは、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列（Ｓｔｉｎｇ）、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かを含む。
【００９７】
ＳＴＩＮＧは、トランスロコン及びプロテアソーム及びゴルジ／エンドソーム／エクソシストの機能を調節し、新しいワクチン及び治療構想の戦略計画のための新しい機構を提供する場合がある。
【００９８】
抗原に取り付けられたか、あるいはカプセルに入れられたＳＴＩＮＧによる経路の調節が、この分子は前記自然免疫経路を強力に刺激するため、新しいワクチン構想を生じると期待される。前記経路は、機能を調節するためのその他の分子によって刺激される場合もある。前記経路は、作用機能の前記トランスロコンをさらに包含する。したがって、これらの分子は、ワクチン及び治療過程のための標的とされる場合もある。これらの経路又はＳＴＩＮＧそれ自身は、癌か、病因に寄与する感染を伴うウイルスかによって調節不全にされる場合がある。
【００９９】
ＳＴＩＮＧは、抑制するためのフラビウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルスのような病原体によって宿主防御応答を避けるための標的とされる場合があり、抗病原体薬剤の標的となる場合がある。
【０１００】
ＳＴＩＮＧは、病原体及び癌に対するワクチンに有用な場合があり、薬剤によって標的とされるか、あるいは免疫系を増大するための治療上の標的として用いられる場合がある。ＳＴＩＮＧ及び細胞内ＤＮＡ経路が癌で調節不全にされる場合に（本明細書のデータは、それが多くの癌細胞では発現しないことを示す。）、それは疾患のバイオマーカー及び／又は疾患の予後結果の診断指標マーカーとして役立つ場合もある。ＳＴＩＮＧは癌で頻繁に調節不全にされ、ウイルス性腫瘍崩壊の機構を提供する場合がある。
【０１０１】
好ましい実施態様では、ワクチンは、配列番号１又は２に列挙される核酸配列か、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かを含む。前記ワクチンは、ベクター又は核酸として投与される場合がある。
【０１０２】
もう１つの好ましい実施態様では、ワクチンは、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含む。
【０１０３】
もう１つの好ましい実施態様では、ｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答を変調する方法は、免疫調節組成物を治療上の有効量でそれを必要とする患者に投与するステップを含む。免疫変調組成物は、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体を含むことが好ましい。
【０１０４】
もう１つの好ましい実施態様では、前記免疫変調組成物は、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含む。
【０１０５】
さらにもう１つの実施態様では、それを必要とする被験者の疾患又は障害を予防又は治療する方法は、治療上の有効量で免疫調節組成物を患者に投与するステップを含み、免疫変調組成物は、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体を含む。もう１つの好ましい実施態様では、前記免疫変調組成物は、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含む。
【０１０６】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧ、その変異体、バリアント及び活性型断片は、例えば、ウイルス性、細菌性、菌類性又は原生動物の病原体のような感染性疾患病原体からの感染を予防又は治療するために患者に投与される。
【０１０７】
また、ヘルペス科（ＨＳＶ−Ｉ−８）のようなウイルスと、ＨＰＶ及びＨＢＶのような癌と関係するその他のＤＮＡウイルスとは、ＩＦＮを誘導するためのＳＴＩＮＧと、自然及び獲得免疫応答とを意図せずに活性化する場合がある。同一の結果が、リステリアのような細菌の感染後に見られる。リステリア由来のＤＮＡは、通常はＩＦＮを活性化するが、ＳＴＩＮＧの非存在下では生じない。合わせて、ＳＴＩＮＧは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスと、見かけ上の（ｐｌａｕｓｉｂｌｅ）プラス鎖ウイルスと、ＤＮＡウイルスと、特定の細菌と、寄生生物及び菌類のようなその他のＤＮＡ病原体との感染後の先天的なシグナル伝達に必要とされる。したがって、ＳＴＩＮＧは、（ＲＮＡウイルスの自然免疫を集合的にただ変調する）ＲＩＧ−Ｉ又はＭＤＡ５又はＩＰＳ−１と比較してより重要であると思われる。
【０１０８】
好ましい実施態様では、患者におけるウイルス感染を治療する方法は、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列（Ｓｔｉｎｇ）、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かの治療上の有効量を前記患者に投与するステップを含む。
【０１０９】
ペプチド
ＳＴＩＮＧペプチドをエンコードする核酸が配列番号１及び２に列挙される。前記「ＳＴＩＮＧ」という用語は、核酸及びペプチドの両方を指すであろう。本発明はこれら２種類に限られず、アレルバリアント、種バリアント、スプライスバリアント、変異体、断片等を含むが、これらに限定されない。これら２つの配列は、明細書を通して例示の目的にのみ用いられるであろうが、限定するようには構成されていない。
【０１１０】
好ましい実施態様では、配列番号１又は２によってエンコードされるペプチドは、それらが「活性型」ペプチドであるということがわかっている、少なくとも５つの連続したアミノ酸残基を含む。「活性型」とは本明細書で説明された周知の機能を含んだＳＴＩＮＧの、１種類又は２種類以上の機能を含むだけでなく、前記ＳＴＩＮＧ分子に先天的なその他の機能か、又は、最終使用者によるいずれかの操作に基づいて組み換えられる場合があるものを含んだその他の機能のいずれかを含む。
【０１１１】
別の好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧペプチドは、該ペプチド自体と、その化学的に同等なものと、その異性体（例えば、同位体か、立体同位体か、レトロ同位体か、レトロ−インベルソ同位体か、全てのＤ型同位体か、全てのＬ型同位体か、それらのＬ型とＤ型の混合型同位体）と、それらの保存的な置換と、それらの前駆体と、例えばＮ又はＣ末端からの１つのアミノ酸の開裂又は本発明のペプチドの免疫学的に活性である代謝物のような、そのタンパク質分解過程の形態と、それらの薬学的に許容される塩及びエステルと、翻訳後修飾の結果によるその他の形態とを含む。また、長さが１０個以下及び１０個か、９個か、８個か、７個か、６個か、５個か、４個のアミノ酸（環状か、線形か、コア親配列から分岐した）を含む、特定の配列が連続するいずれかの親配列が含まれる。当業者は前記ペプチドが、単量体か、２量体か、３量体等の場合がある場所を理解するであろう。本発明のペプチドの使用は、活性断片又は断片が１個又は２個以上の結合パートナーと複合体を形成する場所でのペプチドの使用を含む。本発明のペプチドの活性を保持する、改変されたペプチドは本発明の技術的範囲内に含まれる。
【０１１２】
別の好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧペプチドは、少なくとも１つの非天然のアミノ酸残基又は１つの非アミノ酸分子を含む。１つの「非天然の」アミノ酸残基は前記ＳＴＩＮＧ核酸配列によってエンコードされた１つのアミノ酸へのいずれかの変化を含む。したがって、１つの非天然アミノ酸残基又は非アミノ酸分子は、１つの化学的に同等なもの、ホモログ、合成分子（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、誘導体、バリアント、置換、ペプチド核酸、リンカー分子、無機分子等を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
前記突然変異は、核酸レベル又はアミノ酸レベルで導入される場合がある。特定の核酸配列に関して、遺伝暗号の縮重のために、機能的に同一の核酸の多くは特定のタンパク質のいずれかをエンコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵの全てのコドンは、アミノ酸のアラニンをエンコードする。したがって、コドンによって特定されるアラニンの全ての部位で、前記コドンが、エンコードされたポリペプチドを変更することなく、説明された対応するコドンのいずれかに変更される場合がある。かかる核酸の変化は、保存的に改変された変化の１種である「サイレント変化」である。核酸レベルの突然変異が特定のアミノ酸をエンコードするために導入される場合には、その後、１個又は２個以上の核酸は変化される。例えば、プロリンは、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＵによってエンコードされ、したがって、例えば、ＣＣＣ（プロリン）からＧＣＣへの１塩基の変化は、アラニンを生じさせる。したがって、例として、天然又は非天然のポリペプチドをエンコードする本明細書の天然又は非天然の核酸配列の全ては、天然又は非天然の核酸の候補のサイレント変化全てを説明する。当業者は、（通常、メチオチンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧとを除いて）天然又は非天然の核酸の各コドンは、機能的に同一の分子か、異なる分子かを生成するために改変される場合があると認識するであろう。したがって、天然及び非天然のポリペプチドをエンコードする天然及び非天然の核酸の各サイレント変化は、説明された配列それぞれに暗示される。
【０１１４】
アミノ酸配列については、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列への個別の置換、欠失又は付加が、エンコードされた配列の天然及び非天然のアミノ酸１個か、あるいは天然及び非天然のアミノ酸を低い百分率で変更、付加又は欠失し、前記変化は、アミノ酸の欠失か、アミノ酸の付加か、化学的に類似のアミノ酸での天然及び非天然のアミノ酸の置換かを生じさせる。機能的に類似の天然アミノ酸を提供する保存的な置換表は、当業者に周知である。かかる保存的に改変されたバリアントは、本明細書で説明された方法及び組成物の多型バリアント、種間ホモログ及びアレルに追加され、これらを除外しない。
【０１１５】
「非天然のアミノ酸」とは、２０種類の共通のアミノ酸のうちの１個か、ポリリジンか、セレノシステインかではないアミノ酸を指す。「非天然のアミノ酸」という用語と同義的に用いられる場合がある別の用語は、「非天然的にエンコードされたアミノ酸」と、「非天然のアミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」と、「非天然的に生じるアミノ酸」と、これらのさまざまなハイフンで結ばれた説明及びハイフンで結ばれていない説明とである。「非天然のアミノ酸」という用語は、（前記２０種類の共通アミノ酸か、ピロリジン及びセレノシステインかを含むが、これらに限られない）天然にエンコードされたアミノ酸の改変によって天然に生じるアミノ酸に限られず、使用者の操作なしに、伸長中のポリペプチド鎖に翻訳複合体によって取り込まれないアミノ酸も含む。天然にエンコードされない「天然に生じるアミノ酸」の例は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリンと、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニンと、Ｏ−ホスホチロシンとを含むが、これらに限られない。さらに、「非天然のアミノ酸」という用語は、天然に生じず、かつ、合成的に得られる場合があるか、あるいは非天然のアミノ酸の改変によって得られる場合があるアミノ酸を含むが、これらに限られない。
【０１１６】
ある場合には、前記非天然アミノ酸の置換又は取込は、別の化学的、物理学的、薬理学的及び／又は生物学的な特徴に影響を及ぼすポリペプチド中の別の付加、置換又は欠失と組み合わせられるであろう。ある場合には、前記別の付加、置換又は欠失は、前記ポリペプチドの（タンパク質分解に対する耐性を含むが、これらに限られない）安定性を増大するか、あるいはその適切な受容体、リガンド及び／又は結合タンパク質に関する前記ポリペプチドの親和性を増大する場合がある。ある場合には、別の付加、置換又は欠失は、前記ポリペプチドの可溶性を増大する場合がある。いくつかの実施態様では、部位は、天然にエンコードされたか、あるいは非天然のアミノ酸との置換に加えて、組換え宿主細胞中で発現する前記ポリペプチドの安定性を増大する目的で非天然のアミノ酸の取り込むための別の部位のために選択される場合がある。いくつかの実施態様では、前記ポリペプチドは、関連リガンド、結合タンパク質及び／又は受容体に関する親和性を変調するか、受容体の２量体化を（増加又は低下を含むが、これらに限られない）変調するか、受容体の２量体を安定にするか、循環半減期を変調するか、放出又は生物学的利用能を変調するか、精製を促進するか、特定の投与経路を改善又は変更するかの別の付加、置換又は欠失を含む。同様に、前記非天然のアミノ酸のポリペプチドは、化学的又は酵素の開裂配列か、プロテアーゼ開裂配列か、官能基か、（ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓを含むが、これらに限られない）抗体−結合ドメインその他の（ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ又はＧＳＴ等を含むが、これらに限られない）配列を利用した親和性か、（ＧＦＰを含むが、これらに限られない）同定、精製、組織又は細胞膜を介する輸送、プロドラッグの放出又は活性化、サイズの縮小その他の前記ポリペプチドの特徴を向上する（ビオチンを含むが、これらに限られない）結合された分子かを含む場合がある。
【０１１７】
本明細書で説明された方法及び組成物は、ポリペプチドに１種類又は２種類以上の非天然のアミノ酸を取り込むことを含む。１種類又は２種類以上の非天然のアミノ酸は、前記ポリペプチドの活性を消出しない１箇所又は２箇所以上の特定の部位に取り込まれる場合がある。これは、非天然又は天然の疎水性のアミノ酸で疎水性のアミノ酸を置換すること、非天然又は天然の大きなアミノ酸で大きなアミノ酸を置換すること、非天然又は天然の親水性アミノ酸で親水性アミノ酸を置換すること、及び／又は、活性に必要とされない部位に非天然のアミノ酸を挿入することを含むが、これらに限られない「保存的な」置換を作成することによって達成される場合がある。
【０１１８】
さまざまな生化学的及び構造的なアプローチは、前記ポリペプチドの非天然アミノ酸での置換のための所望の部位を選択するために供される場合がある。前記ポリペプチド鎖のいずれかの部位が非天然アミノ酸を取り込むための選択に適していおり、選択は、合理的な計画か、いずれかの特定の所望の目的のためか、あるいは特定の所望の目的が全くないランダム選択かを利用する場合がある。所望の部位の選択は、（さらに改変されるか、あるいは改変されずに維持される場合がある）非天然アミノ酸のポリペプチドの生成に利用される場合があり、該ポリペプチドが、作動薬か、スーパー作動薬（ｓｕｐｅｒ−ａｇｏｎｉｓｔｓ）か、部分作動薬か、逆作動薬か、拮抗薬か、受容体結合変調因子か、受容体活性変調因子か、結合パートナーに結合する変調因子か、結合パートナー活性変調因子か、結合パートナー構造変調因子か、２量体又は多量体の形成か、天然の分子と比較して活性又は性質に変化が全くないか、可溶性、凝集又は安定性のような前記ポリペプチドの物理学的又は化学的な性質のいずれかの操作かを含むが、これらに限られない所望の性質又は活性のいずれかを有する。例えば、ポリペプチドの生物学的活性に必要とされた前記ポリペプチドの部位は、点突然変異解析、アラニンスキャニング又はホモログスキャニングの方法を含むが、これらに限られない方法を用いて同定される場合がある。アラニン又はホモログのスキャニングミュータジェネシスを含むが、これらに限られない方法によって生物学的活性に重要であるとして同定された残基以外の残基は、前記ポリペプチドについて探索された所望の活性に依存する非天然アミノ酸での置換のための優れた候補である場合がある。代替的に、生物学的活性に重要だとして同定された前記部位は、前記ポリペプチドについて探索された所望の活性に再び依存する非天然アミノ酸での置換のための優れた候補である場合もある。別の代替方法は前記ポリペプチド鎖の各部位で非天然アミノ酸での連続的な置換を作成し、前記ポリペプチドの活性への影響を観察するであろう。いずれかのポリペプチドに非天然アミノ酸での置換のための部位を選択する手段、手法又は方法のいずれかは、本明細書で説明された方法、手法及び組成物の使用に適している。
【０１１９】
欠失を含むポリペプチドの天然の変異体の構造及び活性は、非天然アミノ酸での置換に寛容なタンパク質の領域を決定するために調べられる場合がある。非天然アミノ酸での置換に不寛容な残基が一度調べられた際には、残りの部位それぞれにおける目的とした置換の影響は、関連ポリペプチドと、関係するリガンド又は結合タンパク質のいずれかとの３次元構造を含むが、これらに限られない方法を用いて調べられる場合がある。多くのポリペプチドのＸ線結晶学的構造及びＮＭＲ構造は、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）、タンパク質及び核酸の巨大分子の３次元構造データを含む集中化データベースで利用可能であり、１個が非天然アミノ酸で置換される場合があるアミノ酸の部位を同定するのに用いられる場合がある。さらに、３次元構造のデータが利用できない場合には、モデルが、ポリペプチドの２次及び３次の構造を調査するのに作成される場合がある。したがって、非天然アミノ酸で置換される場合があるアミノ酸部位の同定は、容易に行なわれる場合がある。非天然アミノ酸の模範的な取込部位は、候補の受容体結合領域か、結合タンパク質又はリガンドに結合するための領域かから場外される部位を含むが、これらに限られず、該部分は、完全又は部分的に溶媒に曝露される場合があり、近傍の残基との水素結合相互作用が最小限であるか、あるいは全くない場合があり、近傍の反応性残基に最小限に曝露される場合があり、及び／又は、関係する受容体、リガンド又は結合タンパク質を用いて特定のポリペプチドの３次元結晶構造によって予測されたような高可動性の領域の場合がある。
【０１２０】
広範な非天然アミノ酸は、ポリペプチドの特定の部位で置換されるか、あるいは取り込まれる場合がある。例として、特定の非天然アミノ酸は、それに関連のあるリガンド、受容体及び／又は結合タンパク質を用いるポリペプチドの３次元結晶構造の試験と、保存的な置換の優先度とを利用する取込のために選択される場合がある。
【０１２１】
さらに本明細書で用いられるところの本発明のペプチドの「化学的に同等なもの」は同一の所望の活性、例えば本明細書で説明されるペプチドのような免疫学的活性を有し、僅かな化学的な違いを示す１つの分子、すなわち、温和な条件下で本発明のペプチド（例えば、本発明のペプチドのエステル、エーテル、還元生成物及び複合体）へ変換された分子である。
【０１２２】
さらに、本明細書で用いられる「保存的な置換」は、それらが類似の極性又は立体配置を有するためか、置換された残基と同一のクラス（例えば、疎水性、酸性又は塩基性）に属するためかのいずれかにより、機能的に同等であるようなアミノ酸の置換である。本明細書で定義されているところの「保存的な置換」という用語は、自然免疫を増大する発明のペプチドの能力への重要でない影響を有する置換を含んでいる。保存的な置換の例は、ある極性（親水性）残基を別の残基に置換すること（例えば、アルギニン／リジン、グルタミン／アスパラギン、又は、スレオニン／セリン）、ある非極性（疎水性）残基を別の残基に置換すること（例えば、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン）、ある酸性残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を別の残基に置換すること、又は、ある塩基性残基（例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン又はオルニチン）を別の残基に置換することを含む。
【０１２３】
本明細書で用いられるところの「アナログ」という用語は、本明細書で説明された配列に実質的に同一なアミノ酸配列を有するペプチドのいずれかを含み、前記実質的に同一なアミノ酸残基配列は、少なくとも１種類の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換される。「アナログ」は、機能的なバリアントと、ＳＴＩＮＧペプチドのアミノ酸配列と明確に化学的に同等なものとを含む。さらに本明細書で用いられるところの「機能的なバリアント」という用語は、例えばＩＦＮβを刺激することのような自然免疫を変調する能力と、例えばＲＩＧ−Ｉ、Ｓｓｒ２／ＴＲＡＰβのような１種類又は２種類以上の分子の相互作用と、例えばＮＦ−κＢ、ＩＲＦ３等を活性することのような転写経路の活性とを示す、ペプチドの活性を指す。さらに「アナログ」は本明細書で説明されたアナログの薬学的に許容される塩のいずれかを含む。
【０１２４】
本明細書で用いられるところの「誘導体」とは、機能的な側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１種類又は２種類以上のアミノ酸を有する本発明のペプチドを指す。模範的な誘導体化された分子は遊離のアミノ基が、アセチル基か、アミン塩酸塩か、カルボベンゾキシ基か、クロロアセチル基か、ホルミル基か、ｐ−トルエンスルホニル基か、又はｔ−ブチルオキシカルボニル基を加えることによって、塩又はアミドを形成するために誘導体化されたペプチド分子を含むが、これらに限定されない。遊離のヒドロキシル基は、Ｏ−アシル化又はＯ−アルキル化誘導体を形成するために誘導体化される場合がある。さらに、遊離のカルボキシル基は、塩か、エステル（例えば、メチル及びエチルエステル）か、ヒドラジドかを形成するために誘導体化される場合がある。したがって、「誘導体」は本明細書で説明される誘導体の薬学的に許容される塩のいずれかをさらに含む。
【０１２５】
本発明の１つの実施態様では、本発明の単離されたペプチドが改変されたＣ末端及び／又はＮ末端を有する。例えば、前記単離されたペプチドはアミド化されたＣ末端を有する場合がある。例えば、アミノ末端はアセチル化（Ａｃ）される場合があるか、あるいはカルボキシ末端がアミド化（ＮＨ２）される場合がある。しかし、本発明の１つの実施態様では、本発明のペプチドは、かかる改変が所望の免疫学的活性の消失をもたらす場合には、アセチル化されないことが好ましい。アミノ末端改変は、メチル化（すなわち、−−ＮＨＣＨ３又は−−ＮＨ（ＣＨ３）２）か、アセチル化か、カルボベンゾイル基（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｙｌ  ｇｒｏｕｐ）の付加か、Ｒがナフチル基と、アクリジニル基と、ステロイジル基と、類似の基とからなるグループから選択されるＲＣＯＯ−−で定義されるカルボキシレートの官能性を含む保護基のいずれかを有する前記アミノ末端の保護かを含む。カルボキシ末端改変は、遊離酸をカルボキサミド基で置換すること、又は、構造的な制約を導入するためにカルボキシ末端で環状ラクタムを形成することを含む。
【０１２６】
ある実施形態において、例えば、ＮＨのＮＣＨ３への置換のような骨格の置換がなされる場合がある。単離されたペプチドはまた、改変（例えば、挿入もしくは欠失のような点変異、又は先端の切断）である場合がある。例として、前記ペプチドは、所望のＳＴＩＮＧ活性が保持されるかぎり、Ｄアミノ酸の少なくとも一つの点挿入により改変される残基を含むアミノ酸配列を含む場合がある。特に、プロリン残基の環のサイズが５員から４員、６員又は７員までに変化されるプロリンアナログが供される場合がある。環状基は、飽和又は不飽和の場合があり、不飽和の場合は、芳香性又は非芳香性の場合がある。
【０１２７】
別の好ましい実施態様では、２０種類の遺伝的にエンコードされたアミノ酸（又はＤアミノ酸）の天然に存在する側鎖が、例えば、アルキルと、低級アルキルと、環状４員、５員、６員ないし７員のアルキルアミドと、アミド低級アルキルと、アミドジ（低級アルキル）と、低級アルコキシと、ヒドロキシと、カルボキシと、それらの低級エステル誘導体のような類似の特性を有する他の側鎖、４員、５員、６員ないし７員複素環とで置き換えられる。
【０１２８】
かかる置換は、以下のものを含む場合があるが必ずしも限定されない：（１）非標準の正に荷電したアミノ酸、例えば：オルニチンか、Ｎｌｙｓ；「Ｎ末端」に結合されたリジン側鎖及びグリシンのアミノ基に結合されたアミノプロピル基又はアミノエチル基を有する化合物を有するＮ−（４−アミノブチル）−グリシン。（２）電荷及び側鎖を有さない、アルガニンに類似した非天然のアミノ酸。例えば、Ｃｉｔ；シトルリン及びＨｃｉ；メチレン基を１個又は２個以上有するシトルリン；（３）ＯＨを有する（例えば、セリンのように）、非標準の天然には存在しないアミノ酸。例えば、ｈＳｅｒ；ホモセリン（メチレン基をもう一個有する）、Ｈｙｐ；ヒドロキシプロリン、Ｖａｌ（βＯＨ）；ヒドロキシバリン、Ｐｅｎ；ペニシラミン、Ｖａｌ（βＳＨ）；（４）プロリン誘導体、例えば、Ｄ−Ｐｒｏ。例えば、３，４−デヒドロプロリン、Ｐｙｒ；ピログルタミン（環中にＣ＝Ｏを持つプロリン）、環上にフッ素置換を有するプロリン、１，３−チアゾリジン−＋カルボン酸（環中にＳを有するプロリン）；（５）ヒスチジン誘導体、例えば、Ｔｈｉ；ベータ−（２チエニル）−アラニン；又は（６）アルキル誘導体、例えば、Ａｂｕ；２−アミノ酪酸（Ｃα上にエチル基）、Ｎｖａ；ノルバリン（Ｃα上にプロピル基）、Ｎｌｅ；ノルロイシン（Ｃα上にブチル基）、Ｈｏｌ；ホモロイシン（Ｃα上にプロピル基）、Ａｉｂ、アルファ−アミノイソ酪酸（メチレン基を有さないバリン）。それらの置換が親ペプチド／配列の活性を保持することを当業者は認める場合がある。
【０１２９】
別の代替的な実施形態において、Ｃ末端カルボキシル基又はＣ末端エステルが、環状ペプチドを形成するような、カルボキシル基又はエステルの−−ＯＨ又はエステル（−−ＯＲ）のそれぞれのＮ末端アミノ基による内部置換によって、環化するよう誘導される場合がある。例えば、ペプチド酸を付与する合成及び開裂後、例えば、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）か、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物といった溶液中において、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適切なカルボキシル基のアクチベーターにより、遊離酸は活性化されたエステルに変えられる。その後、活性化されたエステルのＮ末端アミンによる内部置換により、環状ペプチドが形成される。重合と対照的に内部環化は、非常に希薄な溶液の使用により増大される場合がある。かかる方法は、当該分野で周知である。
【０１３０】
末端アミノ基又は末端カルボキシル基が存在しないように、ペプチドのプロテアーゼに対する感受性を減少させるか、又はペプチドの立体配座を制限するために、本発明のペプチドを環化する場合があるか、又はペプチド末端へデスアミノ残基又はデスカルボキシ残基が組み込まれる場合がある。本発明の化合物のＣ末端官能基は、アミドと、アミド低級アルキルと、アミドジ（低級アルキル）と、低級アルコキシと、ヒドロキシと、及びカルボキシと、及びそれらの低級エステル誘導体と、及び薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられる。
【０１３１】
本発明のペプチドは、Ｎ末端システイン及び／又はＣ末端システインを付加すること、及び、ジスルフィド結合又は他の側鎖の相互作用を介してペプチドを環化することによって環化される場合がある。
【０１３２】
末端アミノ基又は末端カルボキシル基が存在しないように、ペプチドのプロテアーゼに対する感受性を減少させるか、又はペプチドの立体配座を制限するために、ペプチド末端へデスアミノ残基又はデスカルボキシ残基が組み込まれる場合がある。
【０１３３】
キメラ分子
好ましい実施態様では、１種類又は２種類以上のＳＴＩＮＧ核酸、タンパク質又はペプチドは、他の原子団に連結又は融合される場合がある。例えば、アプタマー、抗体の配列のような標的化配列と、例えば、サイトカインと、抗生物質と、毒物と、放射性標識のような治療上のエフェクター分子と、シグナル誘導ペプチドと、細胞内標的化原子団等。前記ＳＴＩＮＧ分子はリンカー分子を介して遺伝的に融合又は結合される場合がある。
【０１３４】
例えば、ＳＴＩＮＧ融合分子は、抗体単独か、変調性／細胞溶解性の原子団単独のいずれかの血清半減期（ｔ１／２）を越える有意な血清半減期を有する変調性又は細胞溶解性の原子団である場合がある、治療上の有効なドメインと融合又は連結される場合がある。
【０１３５】
したがって、さらに本発明の実施態様は、変調性及び／又は細胞溶解性の１価又は多価の治療上の活性ドメインと、抗原−結合ドメインとを含むキメラ融合分子と、１本鎖かつ多価の変調性及び細胞溶解性の抗原−結合融合タンパク質等の組成物に関する。別の結合原子団は、インテグリンモチーフ及びＮＧＲモチーフを含む。
【０１３６】
さらに、本明細書で説明される本発明で用いられるための前記キメラＳＴＩＮＧ分子は少なくとも１つの追加のドメイン、特に、例えばヒスチジン伸張のような精製手段を提供するドメインを含む場合がある。追加のドメインは、共有結合又は非共有結合によって結合される場合がある。
【０１３７】
前記結合は、当業者に知られ、かつ、本明細書で説明された方法に従う遺伝的な融合を利用する場合があるか、あるいは例えば、国際公開第ＷＯ９４／０４６８６号公報明細書に説明された、例えば、化学的な架橋によって実施される場合がある。前記コンストラクト中に存在する追加のドメインは、結合部位ドメインの１個に対するポリペプチドリンカーのような可動性のリンカーによって結合される場合があり、前記ポリペプチドリンカーが、前記ドメインの１個のＣ末端と、前記ペプチドの別のＮ末端との距離を補うのに十分な長さの複数か、親水性か、ペプチドかに結合されたアミノ酸を含む場合があり、前記ポリペプチドは、水溶液に溶解された際に結合に適切な構造と推測する。
【０１３８】
別の好ましい実施態様では、前記分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで融合分子を検出し、治療中にキメラ分子の効果を監視するための標識を含む。
【０１３９】
「検出可能な原子団」又は「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫科学的又は化学的な方法によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識は、３２Ｐか、３５Ｓか、蛍光色素か、高電子密度試薬か、（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に用いられるような）酵素か、ビオチン−ストレプトアビジンか、ジゴキシゲニンか、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質か、標識に相補的な配列を有する核酸分子かを含む。検出可能な原子団は、試料中で結合した検出可能な原子団の量を定量するために用いることができる放射性、発色性又は蛍光性のシグナルのような測定可能なシグナルをしばしば生成する。前記シグナルの定量は、例えば、シンチレーション測定、濃度測定又はフローサイトメトリーによって達成される。
【０１４０】
他の実施態様では、前記分子は、いずれかの立体異性体、例えば、鏡像異性体、ジアステレオマー、互変異性体等の場合がある。融合分子又はこの一部分は、それらのバリアント全て、変異体、アレル、置換体、断片及びアナログを含む。
【０１４１】
別の好ましい実施態様では、本発明の実施態様において用いられる場合がある原子団は所望の治療に基づいて決定される場合がある。例えば、疾患が癌であった場合、さまざまな抗癌剤が用いられる場合がある。ある疾患が移植又は自己免疫と関連する場合、免疫抑制分子が用いられる場合がある。疾患が感染症であった場合、抗生物質と、抗ウイルス原子団と、抗炎症原子団が用いられる場合がある。本発明は例えば、抗血管新生原子団及び毒物として用いられる場合があるように、異なった特徴を有する１種類又は２種類以上の原子団の使用を意図する。さまざまな原子団及び組み合わせは使用者の想像力によってのみ限定される。例示的な実施例として、前記原子団は、エンドスタチン、アンジオゲニン、アンジオスタチン、ケモカイン、アンジオアレスチン、アンジオスタチン（プラスミノゲン断片）、抗血管新生因子由来の基底膜コラーゲン（タムスタチン、カンスタチン又はアレスチン）、抗血管新生アンチトロンビンＩＩＩ、シグナル伝達阻害剤、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体断片、フィブロネクチン断片、ｇｒｏ−ベータ、へパリナーゼ、ヘパリン六糖類断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロン・アルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、クリングル５（プラスミノゲン断片）、メタロプロテアーゼ阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、２−メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノゲン活性化因子阻害剤、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、さまざまなレチノイド、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）等を含む１種類又は２種類以上の分子を含む場合がある。これらの分子は、全て形状、それらのバリアント、変異体、アレル、置換体、断片及びアナログを含む。
【０１４２】
もう１つの好ましい実施態様では、標的化ドメインは、抗体、アプタマー、受容体に対するリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ペプチド、リポ多糖類、インテグリン等を含む。
【０１４３】
もう１つの好ましい実施態様では、キメラ融合分子は別の腫瘍抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む。前記結合ドメインは、抗体又はアプタマー、受容体、リガンド等の場合がある。
【０１４４】
１つの好ましい実施態様では、本発明は、Ｆｃ領域、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、１本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）及びＦｖ断片と、所望の標的エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に対する特異性を有する抗体の一部分のいずれかとを含む抗体融合分子を提供する。好ましいものは、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、二重特異性及びヘテロの免疫グロブリン（モノクローナル抗体が好ましい）に属している、抗体又は抗体断片か、１本鎖、２本鎖及び多重鎖のタンパク質及び糖タンパク質かであり、好ましいものは、これらの免疫グロブリンの合成的かつ遺伝的に設計されたバリアントも含む。
【０１４５】
もう１つの好ましい実施態様では、前記抗原結合ドメインはアプタマーである。好ましい実施態様では、前記キメラ分子は、ＳＴＩＮＧ分子、このバリアント、変異体及び断片に融合されたアプタマーを含む。前記アプタマーは、１種類又は２種類以上の腫瘍抗原のいずれかに特異的な場合がある。
【０１４６】
本明細書で用いられるところの「アプタマー」又は「選択された核酸結合種」という用語は、改変されていないか、あるいは化学的に改変されたＲＮＡ又はＤＮＡを含む場合がある。選択方法はアフィニティークロマトグラフィーの場合があるがこれに限られず、増幅方法は、逆転写（ＲＴ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合がある。
【０１４７】
多くの腫瘍抗原は当業者に周知である。例えば、全体として引用により本明細書に取り込まれる、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ＢＪら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；  ９：  ６８４−９３と、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＡＮら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１；  １３：  １３４−１４０と、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２０２；  １８８：  ５１−６４とを参照せよ。代替的に、腫瘍抗原に対する多くの抗体は商業的に入手可能である。
【０１４８】
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも２つの結合原子団が同一の標的上の異なる結合部位に対して特異性を有する複数の結合原子団を有する化合物を特徴とする。好ましい実施態様では、複数の結合原子団はポリペプチドを含む。別の好ましい実施態様では、標的化原子団は、所望の標的上の異なる部位に結合する全ての結合ポリペプチドである。特定の好ましい実施態様では、前記標的は、タンパク質か、受容体か、受容体／リガンド複合体かであり、前記結合ポリペプチドは、前記タンパク質か、前記受容体か、前記受容体／リガンド複合体かの異なるエピトープに結合する。
【０１４９】
もう１つの好ましい実施態様では、前記標的は、血管新生、過剰増殖の疾患又は創傷治癒に関係する受容体である。別の実施態様では、前記標的は、例えば、タンパク質−チロシンキナーゼ受容体のような受容体のファミリーを含む。１つの実施態様では、前記標的は、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲ、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−１、−２又は−３）か、該ＫＤＲ／ＶＥＧＦ及びＦｌｔ−１／ＶＥＧＦの複合体かであり、結合原子団、特に結合ペプチドは、Ｆｌｔ−１及びＫＤＲか、該ＫＤＲ／ＶＥＧＦ及びＦｌｔ−１／ＶＥＧＦの複合体かの異なるエピトープに結合する。例えば、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１及びＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４である。
【０１５０】
固形腫瘍治療に関して、本発明は、外科手術、放射線療法、化学療法等のような古典的アプローチとの組み合わせで用いられる場合がある。したがって、本発明は、治療用組成物が、外科手術又は放射線治療の前又は後に同時に用いられるか、あるいは従来の化学療法剤、放射線療法剤その他の抗血管新生剤か、標的にされた免疫毒素又はコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）かの前又は後に患者に投与される併用療法を提供する。
【０１５１】
もう１つの好ましい実施態様では、前記キメラ分子は、１種類又は２種類以上の細胞溶解性又はその他のエフェクター分子を含む。抗体又はその断片に融合するために用いられる場合がある細胞溶解性分子は、ＴＮＦ−αと、ＴＮＦ−βと、リシン、アブリン、ジフテリア、ゲノニン、シュードモナス・エンドトキシンＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ）、クロタルス・ドゥリッセウス・テリフィカス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ）の毒素、クロタルス・アドメンテウス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍｅｎｔｅｕｓ）の毒素、ナジャ・ナジャ（Ｎａｊａ  ｎａｊａ）の毒素及びナジャ・モカムビク（Ｎａｊａ  ｍｏｃａｍｂｉｑｕｅ）の毒素のようなペプチド毒素をエンコードするもののような適切なエフェクター遺伝子とを含むが、これらに限られない。（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｈｕｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １５：４４３，  １９９６と、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４２：１１５，  １９９６と、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３４：２５９，  １９９８と、Ｍａｕｃｅｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：４３１１；  １９９６とを参照せよ。）。
【０１５２】
ＩＣＥ−ファミリーのシステインプロテアーゼ、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質、Ｂａｘ、ＢｃｌＸｓ及びカスパーゼのようなアポトーシスを誘導又は仲介する遺伝子も適切である（Ｆａｖｒｏｔら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：７２８，  １９９８と、ＭｃＧｉｌｌら、Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２：Ｄ３５３，  １９９７と、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ６：５３，  １９９５とを参照せよ。）。別の潜在的な抗腫瘍剤は、アポプチン（ａｐｏｐｔｉｎ）と、低分子薬剤の化学療法ができないときでさえ、アポトーシスを誘導するタンパク質とである（Ｐｉｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ４６５：１５３，  ２００）。Ｋｏｇａらは、アポトーシス遺伝子Ｃａｓｐａｓｅ−８に結合したｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモーターを用いるテロメラーゼ−特異的遺伝子療法（ＦＬＩＣＥ）を提案する（Ｈｕ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１：  １３９７，  ２００）。
【０１５３】
細胞傷害性Ｔリンパ球又はＬＡＫ細胞がこれらの標的に送達する可溶性パッケージ中に存在する酵素も興味深い。膜孔形成タンパク質のパーフォリンと、Ｆａｓリガンドとは、これらの細胞の主要な細胞可溶性分子である（Ｂｒａｎｄａｕら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６：３７２９，  ２００、Ｃｒｕｚら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：８８１，  １９９９）。またＣＴＬｓは、４種類の１次基質特異性を有するグランザイムと称される少なくとも１１種類のセリンプロテアーゼのファミリーを発現する（Ｋａｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４７７：３０７，  ２０００）。低濃度のストレプトリシン０及びニューモリシンはグランザイムＢ依存性アポトーシスを促進する（Ｂｒｏｗｎｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９：８６０４，  １９９９）。
【０１５４】
別の適切なエフェクターは、細胞に対する毒性そのものではなく、該細胞を代謝的に変えるか、無毒性プロドラッグを致死性薬剤に変化するかのいずれかによって、細胞を別の無毒性化合物に対して感受性にする活性を有するポリペプチドをエンコードする。単純ヘルペスウイルスに由来する場合があるようなチミジンキナーゼ（ｋｔ）と、触媒的に同等なバリアントとが模範的である。ＨＳＶのｔｋは、増殖細胞のＤＮＡ複製を阻害する毒性産物に抗ヘルペス剤ガンシクロビル（ＧＣＶ）を変換する。
【０１５５】
必要ではないが所望の場合には、因子は、ケモカイン、サイトカイン、例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＩＬ−１１と、別のインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、インターフェロン、例えば、γインターフェロン、エリスロポエチンとを含むが、これらに限られない場合もある。
【０１５６】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧキメラ分子はアンチセンス又はｓｉＲＮＡドメインを含む場合もある。
【０１５７】
もう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧ分子と、キメラＳＴＩＮＧ分子等は放射性標識される場合がある。使用は、診断の目的のための治療及び画像処理を含む。標識は、放射性原子、酵素又は発色原子団の場合がある。抗体を標識するための方法は、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ及びＧｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）と、Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４−１０２１（１９７４）とで説明された。抗体を標識するための追加の方法は、米国特許第３，９４０，４７５号公報明細書及び米国特許第３，６４５，０９０号公報明細書で説明された。オリゴヌクレオチドプローブを標識するための方法は、例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８３）  ８０：４０４５と、Ｒｅｎｚ及びＫｕｒｚ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）  １２：３４３５と、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＧｕｍｐｏｒｔ、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８３）  １１：６１６７と、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８５）  １３：２３９９と、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）  １３８：２６７とで説明された。
【０１５８】
前記標識は放射性の場合がある。有用な放射性標識のいくつかの例は、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ及び３Ｈを含む。放射性標識を使用することが、英国第２，０３４，３２３号公報明細書、米国特許第４，３５８，５３５号公報明細書及び米国特許第４，３０２，２０４号明細書で説明された。
【０１５９】
非放射性標識のいくつかの例は、酵素と、発色団と、電子顕微鏡によって検出可能な原子及び分子と、これらの磁性の性質によって検出可能な金属イオンとを含む。
【０１６０】
いくつかの有用な酵素標識は、基質に検出可能な変化をもたらす酵素を含む。いくつかの有用な酵素と、これらの基質とは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピロガロール及びｏ−フェニレンジアミン）と、βグルコシダーゼ（フルオレセイン・βＤ−ガラクトピラノシド）と、アルカリホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム）とを含む。酵素標識を使用することが、英国第２，０１９，４０４号公報明細書と、欧州第６３，８７９号公報明細書と、Ｒｏｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、４７、１９８１−１９９１（１９６１）とで説明された。
【０１６１】
有用な発色団は、例えば、蛍光、化学発光及び生物発光の分子及び色素を含む。本発明で有用なある特異的な発色団は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノールを含む。
【０１６２】
前記標識は、当業者に周知な方法によって、抗体又はヌクレオチドのプローブにコンジュゲート化される場合がある。前記標識は、前記プローブ上の官能基を介して直接的に結合される場合がある。前記プローブは、かかる官能基を含むか、含むように生じさせられる場合があるかのいずれかである。適切な官能基のある例は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基を含む。代替的には、酵素及び発色団のような標識は、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド等のような薬剤と結合することによって、抗体又はヌクレオチドにコンジュゲート化される場合がある。
【０１６３】
前記標識は、上記の方法によって前記プローブに結合したリガンドと、前記標識に結合したリガンドに対する受容体とを介して前記プローブにコンジュゲート化される場合もある。既知のリガンド−受容体の組み合わせのいずれかは適切である。ある適切なリガンド−受容体の対合は、例えば、ビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプトアビジンと、抗体−抗原とを含む。
【０１６４】
もう１つの好ましい実施態様では、本発明のキメラ融合分子は画像処理のために用いられる場合がある。画像処理の使用では、複合体がその本体の外側で検出される場合があるように、複合体は標識化される。典型的な標識は放射性同位体であり、通常は短い半減期を有する放射性同位体である。１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴＣ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３２Ｐのような有用な画像化放射性同位体が用いられる場合がある。ガドリニウム−１５３のような核磁気共鳴（ＮＭＲ）の画像化エンハンサーは、ＮＭＲによる検出のための前記複合体を標識するために用いられる場合がある。ポリヌクレオチド又はタンパク質中の原子団のいずれかの標識を実施するための方法及び試薬は、当業者に既知であると考えられる。
【０１６５】
本発明の使用、組成物及び方法について開示されたＳＴＩＮＧ分子は、免疫変調分子のように機能する場合がある追加のドメインを含むと認識される。前記免疫変調分子は、サイトカイン、リンホカイン、Ｔ細胞共刺激リガンド等を含むがこれらに限られない。好ましくは、前記キメラ融合分子は腫瘍細胞を標的にし、かつ、変調性又は細胞溶解性の分子を、例えば腫瘍細胞か、感染細胞のような標的細胞に輸送し、かつ、免疫細胞及び／又は活性化された免疫細胞を前記標的細胞に補充する。
【０１６６】
免疫調節エフェクター分子は、液性及び／又は細胞性の免疫系、特に、その細胞性及び／又は非細胞性の成分、その機能、及び／又は、別の生理学的システムとのその相互作用に積極的及び／又は消極的に影響を及ぼす。前記免疫調節エフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、マクロファージ遊走阻止因子（特に、Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ（１９９８）、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７６（３−４）；  １５１−６１か、Ｍｅｔｚ  （１９９７）、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６６、１９７−２２３かに説明されたようなＭＩＦ）、Ｔ細胞受容体及び可溶性ＭＨＣ分子を含むグループから選択される場合がある。かかる免疫調節エフェクター分子は当業者に周知であり、特に、Ｐａｕｌ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州（１９８９）で説明される。特に、既知のサイトカイン及びケモカインは、Ｍｅａｇｅｒ、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」（１９９８）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ有限会社、チチェスター、ウェストサセックス州、英国と、（Ｂａｃｏｎ（１９９８）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ９（２）：１６７−７３か、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ（１９９７）、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２、２６８２−６か、Ｔａｕｂ（１９９４）、Ｔｈｅｒ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １（４）、２２９−４６か、Ｍｉｃｈｉｅｌ（１９９２）、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ３（１）、３−１５か）とで説明される。
【０１６７】
測定される場合がある免疫細胞の活性は、（１）ＤＮＡ複製を測定することによる細胞増殖と、（２）ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＴＮＦ−αのようなサイトカインのための特別な測定を含む増大されたサイトカイン生成と、（３）標的によって仲介された細胞の殺傷又は溶解と、（４）細胞分化と、（５）免疫グロブリン生成と、（６）表現型の変化と、（７）走化性を有するケモタクチン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎ）に応答可能なことを意味する走化性因子又は走化性の生成と、（８）ある別の免疫細胞タイプの活性を阻害することによる免疫抑制と、（９）異常な活性の徴候のような特定の環境下で活性化された免疫細胞の断片化を指すアポトーシスとを含むが、これらに限られない。
【０１６８】
トランスジェニック非ヒト動物
さらにもう１つの局面では、本発明はトランスジェニック非ヒト動物、たとえばＳＴＩＮＧを欠如するトランスジェニックマウスを提供する。詳細は以下の実施例で提供される。
【０１６９】
好ましい実施態様では、ゲノムが、配列番号１又は２に列挙された機能的なＳＴＩＮＧ遺伝子か、それらの種バリアントか、変異体かが欠損している非ヒトトランスジェニック哺乳類である。
【０１７０】
トランスジェニック哺乳類が、ＳＴＩＮＧの分子機構と、及び特にヒトＳＴＩＮＧで誘導されるシグナル伝達を評価するために用意される場合がある。かかる哺乳類は薬物の候補をスクリーニング又はテストするための優れたモデルを提供する。例えば、ＳＴＩＮＧ活性の欠損を補う場合がある化合物を同定するために、化合物又は「ノックアウト」動物の疾患を評価することが可能である。代替的に、ヒトＳＴＩＮＧ「ノックイン」哺乳類はヒト被験者での場合より詳細に本システムの分子生物学を評価するために提供される場合がある。両方の手法は、細胞のゲノムにおいて、それらの天然の位置での遺伝情報の一単位を操作し、終末分化した生物のバックグラウンドにおける当該操作の結果を調べることを可能にする。
【０１７１】
「ノックアウト哺乳類」は遺伝子ターゲッティング法により不活性化されている特定の遺伝子をそのゲノム内に含む哺乳類（例えばマウス）である（例えば、米国特許第５，７７７，１９５号公報明細書と、米国特許第５，６１６，４９１号公報明細書とを参照せよ）。ノックアウト哺乳類は、（例えば、ある欠損アレルと、ある野生型アレルとの）ヘテロ接合体ノックアウトと、ホモ接合体変異体との両方を含む。ノックアウト哺乳類の作製は、胚性幹細胞と称する未分化細胞タイプの中の、特定の遺伝子の発現を抑制するために用いられる場合がある核酸コンストラクトの最初の導入を必要とする。その後、この細胞は哺乳類の胚に注射される。その後、統合された細胞を有する哺乳類の胚が妊娠期間中に仮親に移植された。Ｚｈｏｕら（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，９：２６２３−３４，１９９５）はＰＰＣＡノックアウトマウスを説明する。ノックアウトマウスはウイルス感染と、免疫系機能と、ＳＴＩＮＧ調節経路と、新しい治療法の同定と、癌の罹患性等とを研究するために用いられる場合がある。発達した疾患表現系（Ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｖｅｌｏｐ）は、さらなる創薬のためのプラットフォームを提供する場合がある。
【０１７２】
「ノックアウト」という用語は、細胞内の内在性ＤＮＡ配列によってエンコードされたタンパク質の少なくとも一部の発現を部分的か、あるいは完全に抑制することを指す。「ノックアウトコンストラクト」という用語は、細胞内の内在性ＤＮＡ配列によってエンコードされたタンパク質の発現を減少又は抑制するように設計された核酸配列を指す。ノックアウトコンストラクトとして用いられる前記核酸配列は、（１）抑制された遺伝子（エキソン配列、イントロン配列及び／又はプロモーター配列）のいくつかの一部からのＤＮＡと、（２）前記細胞内の前記ノックアウトコンストラクトの存在を検出するために用いられるマーカー配列とを含むことが典型的である。前記ノックアウトコンストラクトは前記細胞内に挿入され、天然のＤＮＡ配列の転写を妨げるか、又は中断するために、かかる位置における前記細胞のゲノムＤＮＡを統合する。かかる挿入は相同組換えによりしばしば生じる（すなわち、内在性ＤＮＡ配列に対して相同である前記ノックアウトコンストラクト領域が、前記ノックアウトコンストラクトが前記細胞内に挿入されたとき、互いをハイブリダイズするか、及び前記ノックアウトコンストラクトが内在性ＤＮＡの対応する位置に取り込まれるように組換える）。前記ノックアウトコンストラクト核酸配列は、１）抑制するための前記遺伝子の１個か、又は２個以上のエキソンと、及び／又はイントロンの完全か、又は部分的な配列か、２）抑制するための前記遺伝子の完全か、又は部分的なプロモーター配列か、又は３）それらの組み合わせを含む場合がある。典型的には、前記ノックアウトコンストラクトはしばしば相同組換えの過程で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に挿入され、該ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡの中に統合される。このＥＳ細胞がその後発達している胚（ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏ）に注射され、統合される。
【０１７３】
「遺伝子の崩壊」及び「崩壊遺伝子」という文言は天然のＤＮＡ配列のある領域（しばしば１つ又は２つ以上のエキソン）と、及び／又は、野生型と又は遺伝子の天然に生じる配列と比較して、前記細胞内の前記遺伝子の発現を減らすか又は妨げるための、遺伝子の前記プロモーター領域への核酸配列の挿入を指す。例として、核酸コンストラクトは、崩壊させるＤＮＡ配列（プロモーター及び／又はコード領域）に対して相補的なＤＮＡ配列に挿入された抗生物質耐性遺伝子をエンコードするＤＮＡ配列を含むように調製される場合がある。この核酸コンストラクトがその後細胞内でトランスフェクションされる際に、前記コンストラクトは前記ゲノムＤＮＡの中へ統合されるであろう。したがって、前記ＤＮＡは現在、抗生物質耐性遺伝子によって破壊されたので、細胞の多くの子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）は少なくともいくつかの細胞ではもはや前記遺伝子を発現しないか、又は遺伝子を低下したレベルで発現するであろう。
【０１７４】
「ノックイン」哺乳類は、内在性遺伝子が異種遺伝子に置換された哺乳類である（Ｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．３：３３１，１９９１）。前記異種遺伝子が興味のある遺伝子座に「ノックインされている」、つまり、発現の評価の対象（この場合は遺伝子がレポーター遺伝子である場合がある；Ｅｌｅｆａｎｔｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１１８９７，１９９８）か、又は相同遺伝子の機能、つまり、前記異種遺伝子発現と適切なプロモーターからの転写を結合することが好ましい。これは相同組換えか、トランスポゾンか（Ｗｅｓｔｐｈａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｄｅｒ，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ７：５３０，１９９７），変異体組換え部位か（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：８６８，１９９７），又はＰＣＲ（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：７８４，１９９８）によって達成される場合がある。
【０１７５】
相同組換えにおいて、前記ＤＮＡは長さが少なくとも約１キロベース（ｋｂ）が一般的であり、長さが３ないし４キロベースであることが好ましく、したがって、前記ノックアウトコンストラクトが前記ＥＳ細胞の前記ゲノムＤＮＡ内に導入される際、組換えに十分な相補的配列を提供するであろう。
【０１７６】
本発明の範囲内に含まれるものは、遺伝子２個又は３個以上がノックアウト又はノックインか、両方かをされた哺乳類である。かかる哺乳類が、各々のノックアウトコンストラクトを作成するために本明細書で列挙された手順を繰り返すことか、各々ノックアウトされた一つの遺伝子を有する哺乳類を互いに繁殖し、ダブルノックアウト遺伝子型を有する哺乳類をスクリーニングすることにより作成される場合がある。
【０１７７】
調節されたノックアウト動物は、例えばｔｅｔ−抑制因子システム（米国特許第５，６５４，１６８号公報明細書を参照せよ）、又は、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステム（米国特許第４，９５９，３１７号公報明細書と、米国特許第５，８０１，０３０号公報明細書とを参照せよ）といったさまざまなシステムを用いて用意される場合がある。
【０１７８】
もう１つの一連の実施態様では、トランスジェニック動物は、（ｉ）ヒトのＳＴＩＮＧが安定に前記トランスジェニック動物の前記ゲノムに挿入されるか、及び／又は、（ｉｉ）前記内在性ＳＴＩＮＧ遺伝子が不活性化され、ヒトの相対物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）と交換されることにより作成される。例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ，ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７：４０４，１９９７；Ｅｓｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：９５３，１９９６；Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｕｐｐｌ．２：３６，１９９６．を参照せよ。かかる動物は候補化合物で処置され、ＳＴＩＮＧ活性へのかかる薬物の効果について監視される場合がある。
【０１７９】
別の好ましい実施態様では、ノックイン、ノックアウト両方の前記トランスジェニック動物及び異種ＳＴＩＮＧ分子からの細胞は、異なるアッセイで用いられる場合があり、前記細胞は、トランスフォーメーション、不死化等される場合がある。
【０１８０】
アンチセンスＳＴＩＮＧオリゴヌクレオチド
もう１つの好ましい実施態様では、細胞又は患者におけるＳＴＩＮＧの機能及び／又は発現がターゲッティングＳＴＩＮＧ分子によって変調されている。ＳＴＩＮＧアンチセンス又はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの例は、配列番号３ないし５を含む。
【０１８１】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２で列挙されるような核酸配列と相補的な少なくとも５個の連続した塩基を含み、前記オリゴヌクレオチドが、特異的にハイブリダイゼーションし、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＳＴＩＮＧの発現及び／機能を変調する。もう１つの好ましい実施態様では、本発明のオリゴマーの化合物は、異なる塩基が前記化合物のヌクレオチド部位に１箇所又は２箇所以上に存在するバリアントも含む。例えば、最初のヌクレオチドがアデノシンの場合には、この位置にチミジン、グアノシン又はシチジンを含むバリアントが生成される場合がある。このことは前記オリゴヌクレオチドの位置のいずれかで行われる場合がある。その後、これらの化合物は、標的核酸の発現を阻害するためにこれらの能力を決定するために本明細書中で説明された方法を用いることがテストされる。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドと標的との間の相同性、配列の同一性又は相補性が、約５０％から約６０％までである。いくつかの実施態様では、相同性、配列の同一性又は相補性が、約６０％から約７０％までである。いくつかの実施態様では、相同性、配列の同一又は相補性が、約７０％から約８０％までである。いくつかの実施態様では、相同性、配列の同一性又は相補性が、約８０％から約９０％までである。いくつかの実施態様では、相同性、配列の同一性又は相補性が、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％である。
【０１８３】
もう１うの好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートのヌクレオチド間の結合と、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミダイト、カルバマート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミダイト、カルボキシメチルエステル及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド間の結合との組み合わせを含む。
【０１８４】
もう１つの好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸、固定核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、アナログ、誘導体及び／又はそれらの組み合わせを含む少なくとも一つの改変された核酸塩基を任意に含む。
【０１８５】
オリゴヌクレオチドは、前記化合物の前記標的核酸への結合が、活性の喪失をもたらす前記標的核酸の正常機能を阻害し、特異的結合が所望される条件で、標的でない核酸配列に対する前記オリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な相補性の程度がある際に特異的にハイブリダイゼーション可能である。かかる条件は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏアッセイか、又は治療的処置の場合における生理的条件と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイの場合における該アッセイが行われる場合の条件を含む。
【０１８６】
ＤＮＡか、ＲＮＡか、キメラか、又は置換されたもの等であろうが、オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への化合物の結合が有用性の喪失をもたらす標的ＤＮＡ又はＲＮＡ正常機能を阻害し、及び、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイか、又は治療的処置の場合における生理的条件と、アッセイが行われる場合の条件でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイのような、特異的結合が所望される条件で、標的でない配列に対する前記オリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な相補性の程度がある際に特異的にハイブリダイゼーション可能である。
【０１８７】
アンチセンスの特異性及び感受性も治療用の当業者に周知の方法で抑制される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物及びヒトの疾病状態の治療における治療原子団として供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に、及び効果的に投与され、多数の臨床治験が現在進行中である。従って、オリゴヌクレオチドは細胞と、組織と、及び動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように形成される場合があるような、有用な治療の態様である場合があることが確立されている。
【０１８８】
本発明の実施態様においてオリゴマーのオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、特にオリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合し、標的遺伝子によってエンコードされた分子の発現及び／又は機能を変調する。阻害されるＤＮＡの前記機能は、例えば、複製及び転写を含む。阻害されるＲＮＡの前記機能は全ての生体機能、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転座か、ＲＮＡからタンパク質への翻訳か、１個又は２個以上のｍＲＮＡ種をもたらすためのＲＮＡのスプライシングか、及び、ＲＮＡによって関与されるか又は促進される場合がある溶媒の活性を含む。前記機能は、所望の機能次第で、上向き調節されるか、又は抑制される場合がある。
【０１８９】
前記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴマー化合物と、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、外部誘導配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチドと、代替スプライサーと、プライマーと、プローブと、及び標的核酸の少なくとも一部に対してハイブリダイゼーションする他のオリゴマー化合物を含む。かかるように、これらの化合物は、１本鎖か、２本鎖か、部分的な一本鎖か、環状オリゴマーかの化合物の形状で導入される場合がある。
【０１９０】
本発明に関して、オリゴヌクレオチドを特定の核酸分子（例えば、配列番号１又は２）にターゲッティングすることは、多段階の過程の場合がある。前記過程は、通常、機能が変調されるべきである標的核酸を同定することで始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の障害又は疾患状態と関連する細胞遺伝子（又は遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）か、又は感染因子からの核酸分子である場合がある。
【０１９１】
前記ターゲッティング過程は通常、例えば、発現の変調のような所望の影響が生じるであろうようなことを生じる前記アンチセンス相互作用のための前記標的核酸中で、少なくとも一つのターゲット領域か、セグメントか、又は部位の決定も含む。本発明に関して、「領域」という用語は少なくとも一つの同定可能な構造、機能又は性質を有する標的核酸の一部分として定義される。標的核酸の領域中がセグメントである。「セグメント」は標的核酸中のより小さい領域、すなわち、領域の一部と定義される。本発明で用いられるところの「部位」とは標的核酸中の位置として定義される。
【０１９２】
したがって、従来技術において、翻訳開始コドンは５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子内；対応するＤＮＡ分子における５’−ＡＴＧ）であることが典型的であるため、前記翻訳開始コドンは「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも呼ばれる。小数の遺伝子が、５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧのＲＮＡ配列を有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧはｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが示されている。従って、各例の開始アミノ酸は主に（真核生物において）メチオニン又は（原核生物において）ホルミルメチオニンであるが、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を含む場合がある。真核細胞遺伝子及び原核細胞遺伝子は、２つ又は３つ以上の代わりの開始コドンを有する場合があり、そのいずれか一つを、特定の細胞タイプ又は組織において、又は特定の条件の組みあわせにおいて、翻訳開始のために用いる場合がある。本発明に関しては、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」は、かかるコドンの配列とは無関係に、ＳＴＩＮＧをエンコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するためにｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる前記コドン又は複数のコドンを指す。同様に、遺伝子の翻訳終止コドン（又は「終止コドン」）は、三つの配列の１つ、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡである）を有する場合がある。
【０１９３】
「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５’又は３’）に約２５個から約５０個までの連続ヌクレオチドを含む、かかるｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を指す。同様に、「終止コドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち５’又は３’）に約２５個から約５０個までの連続ヌクレオチドを含む、かかるｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を指す。その結果、前記「開始コドン領域」（又は「翻訳開始コドン領域」）及び前記「終止コドン領域」（又は「翻訳終止コドン領域」）は、本発明の前記アンチセンス化合物に有効にターゲティングされる場合がある全ての領域である。
【０１９４】
また、前記翻訳開始コドン及び前記翻訳終止コドンの間の領域を指すことが当業者に知られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）すなわち「コード領域」は、有効にターゲティングされる場合がある領域である。本発明に関して、標的領域は、遺伝子の前記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の前記翻訳開始又は終止コドンを含む遺伝子内領域である。
【０１９５】
他の標的領域は、当技術分野において前記翻訳開始コドンから５’の方向のｍＲＮＡの一部を指し、このようにｍＲＮＡ（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）の５’キャップ部位と前記翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含むことが当技術分野において公知である５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。さらに他の標的領域は、翻訳終止コドンから３’の方向のｍＲＮＡの一部を指し、このように、ｍＲＮＡ（又は遺伝子の対応するヌクレオチド）の翻訳終止コドンと３’末端との間のヌクレオチドを含むことが当技術分野において公知である３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡの前記５’キャップ部位は、５’−５’−トリホスフェート結合によってｍＲＮＡの最も５’側の残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの前記５’キャップ領域には、前記５’キャップ構造そのものと共にキャップ部位に隣接する最初のヌクレオチド５個が含まれると考えられる。本発明についての他の標的領域は、前記５’キャップ領域である。
【０１９６】
いくつかの真核生物のｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」として知られる１個又は２個以上の領域を含み、これらは翻訳される前に転写物から切除される。残りの（及びしたがって翻訳された）領域は「エキソン」として知られ、連続的なｍＲＮＡ配列を形成するために共にスプライシングされる。１つの実施態様において、スプライス部位、例えば、イントロン−エキソン接合部又はエキソンイントロン接合部をターゲッティングすることは、異常なスプライシングが疾患に関係する状況か、又は特定のスプライス産物の過剰発現が疾患に関係する状況において特に有用である。再配列又は欠失による異常な融合接合部が標的部位のもう１つの実施態様である。異なる遺伝子起源からの２つ（又はそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシングプロセスを通して生成されたｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として知られる。例えばＤＮＡ又はプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物を用いて、イントロンが有効に標的とされる場合がある。
【０１９７】
もう１つの好ましい実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドのコード及び／又は非コード領域に結合し、標的分子の発現及び／又は機能を変調する。
【０１９８】
もう１つの好ましい実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは天然のアンチセンスポリヌクレオチドに結合し、標的分子の発現及び／又は機能を変調する。
【０１９９】
もう１つの好ましい実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはセンスポリヌクレオチドと結合し、標的分子の発現及び／又は機能を変調する。
【０２００】
もう１つのＲＮＡ転写物はＤＮＡの同じゲノム領域から生成される場合がある。これらのもう１つの転写物又は「プレｍＲＮＡバリアント」は、その開始又は終止位置のいずれかが同じゲノムＤＮＡから生成された他の転写物とは異なり、イントロン及びエキソン配列の双方を含む、同じゲノムＤＮＡから生成された転写物である。
【０２０１】
スプライシングの際に、１つ又は２つ以上のエキソン又はイントロン領域又はその一部の切除により、プレｍＲＮＡバリアントはより小さい「ｍＲＮＡバリアント」を生成する。その結果、ｍＲＮＡバリアントは、プロセッシングされたプレｍＲＮＡバリアントであり、それぞれの唯一のプレｍＲＮＡはスプライシングの結果として常に唯一のｍＲＮＡバリアントを生成しなければならない。これらのｍＲＮＡバリアントはまた、「選択的スプライスバリアント」として知られる。前記プレｍＲＮＡバリアントのスプライシングが起こらない場合、前記プレｍＲＮＡバリアントは前記ｍＲＮＡバリアントと同一である。
【０２０２】
バリアントは、転写を開始又は終止するためのもう１つののシグナルを用いることによって、生成される場合がある。プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡが１つより多い開始コドン又は終止コドンを有する場合がある。プレｍＲＮＡに由来するバリアントか、又はもう１つの開始コドンを用いるｍＲＮＡバリアントは、そのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的開始バリアント」として知られる。選択的終止コドンを用いるそれらの転写物は、そのプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの「選択的終止バリアント」として知られる。選択的終止バリアントの１つの特異的なタイプは、生成された多数の転写物が転写機構によって「ポリＡ終止シグナル」の１つの二者択一的選択に起因し、それによって唯一のポリＡ部位で終止する転写物を生成する「ポリＡバリアント」である。本発明に関して、本明細書において記述した前記バリアントのタイプも同様に標的核酸の実施態様である。
【０２０３】
前記アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、活性なアンチセンス化合物がターゲティングされる標的領域の少なくとも５個のヌクレオチドの部分であると定義される。
【０２０４】
特定の模範的な標的セグメントの特異的配列が本明細書において記述されているが、当業者は、これらが本発明の範囲内の特定の実施態様を説明及び記述するために役立つと認識するであろう。さらに標的セグメントが、この開示を考慮して当業者によって容易に同定されることができる。
【０２０５】
模範的な好ましい標的セグメント内から選択される少なくとも５個の連続する核酸塩基の伸長を含む、長さが５個ないし１００個の核酸塩基の標的セグメントは、同様にターゲティングに適していると考えられる。
【０２０６】
標的セグメントには、例として、好ましい標的セグメントの１つの５’末端からの少なくとも５つ連続した核酸塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列が含まれる（残りの核酸塩基は、前記標的セグメントの５’末端のすぐ上流から始まってＤＮＡ又はＲＮＡが約５個ないし約１００個の核酸塩基を含むまで続く同一ＤＮＡ又はＲＮＡの連続的な伸長である）。同様に好ましい標的セグメントは、例としての好ましい前記標的セグメントの１つの３’末端から少なくとも５つ連続した核酸塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列によって表される（残りの核酸塩基は、標的セグメントの３’末端のすぐ下流から始まって、ＤＮＡ又はＲＮＡが約５個ないし約１００個の核酸塩基を含むまで続く同一のＤＮＡ又はＲＮＡの連続的な伸長である）。本明細書に記述された標的セグメントを有する当業者は、過度の実験を行うことなくさらに好ましい前記標的セグメントを同定することができるであろう。
【０２０７】
一旦、１種類又は２種類以上の領域、セグメント又は部位が同定されると、アンチセンス化合物は、前記標的に十分な相補性、すなわち、所望の効果を与えるために十分な効率で、かつ、十分な特異性を持ってハイブリダイゼーションするように選択される。
【０２０８】
本発明の実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは特定の標的のアンチセンス鎖に結合する。前記オリゴヌクレオチドは少なくとも５個のヌクレオチドの長さであり、各オリゴヌクレオチドが重なる配列を標的とするように合成される場合があるので、前記オリゴヌクレオチドは前記標的ポリヌクレオチドの全長を覆うために合成される。また前記標的は、コーディング領域及び非コーディング領域を含む。
【０２０９】
本発明によると、アンチセンス化合物は、標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイゼーションし、その機能を変調するアンチセンスのオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部誘導配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物のような１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物その他のオリゴマーの化合物を含む。然るに、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様又はそれらの混合物の場合があるか、あるいはそれらの１種類又は２種類以上の模倣物の場合がある。それらの化合物は、１本鎖、２本鎖、環状又はヘアピンのオリゴマー化合物の場合があり、内部又は末端のバルジ（ｂｕｌｇｅｓ）、ミスマッチ又はループのような構造エレメントを含む場合がある。アンチセンス化合物は直線状に日常的に調製されるが、結合されるか、あるいは環状又は分枝状に調製される場合がある。アンチセンス化合物は、例えば、全体的又は部分的な２本鎖化合物を形成するためにハイブリダイゼーションした２本鎖か、完全又は部分的な２本鎖化合物のハイブリダイゼーション及び形成を可能にするための十分な自己相補性を有する１本鎖かのようなコンストラクトを含む場合がある。２本鎖は、遊離の３’又は５’の末端を残したまま内部的に連結される場合があるか、あるいは連続的なヘアピン構造又はループを形成するために連結される場合がある。前記ヘアピン構造は、５’又は３’の末端のいずれかでの突出部分を含む場合があり、１本鎖の性質の拡大を生じる。前記２本鎖化合物は、任意に、末端に突出部分を含む場合がある。さらに改変は、前記末端、核酸塩基部位、糖部位のうちの１つか、ヌクレオシド間の連結のうちの１つかに付けられたコンジュゲート基を含む場合がある。代替的に、２本鎖は、非核酸原子団又はリンカー基を介して連結される場合がある。１本鎖のみから形成されるとき、ｄｓＲＮＡは、２本鎖を形成するためにそれ自体を逆向きに重ねて自己相補性ヘアピン型分子の形状をとる場合がある。したがって、前記ｄｓＲＮＡｓが、完全又は部分的に２本鎖の場合がある。遺伝子発現の特異的変調は、トランスジェニックの細胞株でｄｓＲＮＡヘアピンを安定的に発現することによって達成される場合があるが、いくつかの実施態様では、前記遺伝子発現又は機能は上向き調節される。２本鎖を形成するためにそれ自体を逆向きに重ねられた自己相補性ヘアピン型分子の構造をとる２本鎖又は１本鎖から形成されるとき、前記２本鎖（すなわち、１本鎖の２本鎖形成領域）は、塩基がＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で対合する相補性ＲＮＡ鎖である。
【０２１０】
一旦、システムに導入されると、本発明の化合物は、標的核酸の開裂又はその他の改変に影響するために、１種類又は２種類以上の酵素又は構造タンパク質の作用を引き出す場合があるか、あるいはその場に存在することにもとづく機構（ｏｃｃｕｐａｎｃｙ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を通して働く場合がある。一般的に、（オリゴヌクレオチドを含む）核酸は、（例えば、一般的に１種類又は２種類以上の２’−デオキシ糖で、一般的にＵ塩基よりもむしろＴ塩基を有する）「ＤＮＡ様」か、あるいは（例えば、一般的に１種類又は２種類以上の２’−ヒドロキシル又は２’改変糖で、一般的にＴ塩基よりもむしろＵ塩基を有する）「ＲＮＡ様」として説明される場合がある。核酸螺旋は、１つのタイプの構造よりも多くを採用する場合があり、Ａ型及びＢ型が最も一般的である。一般的に、Ｂ型様の構造を有するオリゴヌクレオチドが「ＤＮＡ様」であり、Ａ型様の構造を有するオリゴヌクレオチドが「ＲＮＡ様」であると考えられている。いくつかの（キメラの）実施態様では、アンチセンス化合物は、Ａ型及びＢ型の領域の両方を含む場合がある。
【０２１１】
もう１つの好ましい実施態様では、所望のオリゴヌクレオチド又はアンチセンス化合物は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、改変された連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖の一過的（ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）又は短鎖のヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ誘導型の遺伝子活性化（ＲＮＡａ）、低分子活性化ＲＮＡｓ（ｓａＲＮＡｓ）又はそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。
【０２１２】
また、ｄｓＲＮＡは、「低分子ＲＮＡ誘導型の遺伝子活性化」すなわち「ＲＮＡａ」と呼ばれる機構の遺伝子発現を活性化することができる。ｄｓＲＮＡのターゲッティング遺伝子プロ―モーターが、関連遺伝子の強力な転写活性化を誘導する。ＲＮＡａは、「低分子活性化ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）と呼ばれる合成ｄｓＲＮＡを用いてヒト細胞で示された。ＲＮＡａはその他の生物で保存されるかどうかは今のところ知られていない。
【０２１３】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のような低分子２本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる進化的に保存された機構の引金であることが発見されている。ＲＮＡｉは、転写を抑制するためにクロマチンを再構築すること、相補的ｍＲＮＡを分解すること、又はタンパク質の翻訳を阻害することによって、遺伝子のサイレンシングをいつももたらす。またｄｓＲＮＡｓは、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）として作用する場合がある。理論に拘束されないが、遺伝子プロモーターの配列を標的にすることによって、ｓａＲＮＡｓは、ｄｓＲＮＡ誘導型の転写活性化（ＲＮＡａ）と呼ばれる現象で標的遺伝子の発現を誘導するであろう。
【０２１４】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、哺乳類又は哺乳類細胞で遺伝子発現を阻害するための力強いツールとなっている。このアプローチは、発現プラスミド又はウイルスと、ｓｉＲＮＡに処理される低分子ヘアピンＲＮＡをコードしている配列とを用いて、ＲＮＡそれ自体又はＤＮＡのいずれかの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達を必要とする。このシステムは、プレｓｉＲＮＡが活性であり、遺伝子発現のために調節型で組織特異的なプロモーターを使用できる細胞質に前記プレｓｉＲＮＡを効率的に輸送できる。
【０２１５】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド又はアンチセンス化合物は、リボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマーか、それらの模倣物、キメラ、アナログ又はホモログかを含む。この用語は、天然の核酸塩基、糖及びヌクレオシド間の共有結合（バックボーン）からなるオリゴヌクレオチドと、同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドとを含む。改変されるか、あるいは置換されるかかるオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞内の取り込みの増加と、標的核酸に対するアフィニティーの増加と、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加とのような所望の特性のために、天然の形状を超えることがしばしば所望される。
【０２１６】
本発明によると、前記オリゴヌクレオチド又は「アンチセンス化合物」は、標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイゼーションし、その機能を変調する、アンチセンスのオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの模倣物、キメラ、アナログ又はホモログ）、リボザイム、外部誘導配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物のような１本鎖又は２本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、ｓａＲＮＡ、ａＲＮＡその他のオリゴマーの化合物を含む。然るに、それらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様又はそれらの混合物の場合があるか、あるいは１種類又は２種類以上のそれらの模倣物の場合がある。これらの化合物は、１本鎖、２本鎖、環状又はヘアピンのオリゴマーの化合物の場合があり、内部又は末端のバルジ、ミスマッチ又はループのような構造エレメントを含む場合がある。アンチセンス化合物は直線状に日常的に調製されるが、結合されるか、あるいは環状又は分枝状に調製される場合がある。アンチセンス化合物は、例えば、全体的又は部分的な２本鎖化合物を形成するためにハイブリダイゼーションした２本鎖か、完全又は部分的な２本鎖化合物のハイブリダイゼーション及び形成を可能にするための十分な自己相補性を有する１本鎖かのようなコンストラクトを含む場合がある。２本鎖は、遊離の３’又は５’の末端を残したまま内部的に連結される場合があるか、あるいは連続的なヘアピン構造又はループを形成するために連結される場合がある。前記ヘアピン構造は、５’又は３’の末端のいずれかでの突出部分を含む場合があり、１本鎖の性質の拡大を生じる。前記２本鎖化合物は、任意に、末端に突出部分を含む場合がある。さらに改変は、前記末端、核酸塩基部位、糖部位のうちの１つか、ヌクレオシド間の連結のうちの１つかに付けられたコンジュゲート基を含む場合がある。代替的に、２本鎖は、非核酸原子団又はリンカー基を介して連結される場合がある。１本鎖のみから形成されるとき、ｄｓＲＮＡは、２本鎖を形成するためにそれ自体を逆向きに重ねて自己相補性ヘアピン型分子の形状をとる場合がある。したがって、前記ｄｓＲＮＡｓが、完全又は部分的に２本鎖の場合がある。遺伝子発現の特異的変調は、トランスジェニックの細胞株でｄｓＲＮＡヘアピンを安定的に発現することによって達成される場合がある（Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．、１９９１、２、１１０−１１９、Ｍａｔｚｋｅら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．、２００１、１１、２２１−２２７、Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２００１、１５、４８５−４９０）。２本鎖を形成するためにそれ自体を逆向きに重ねられた自己相補性ヘアピン型分子の構造をとる２本鎖又は１本鎖から形成されるとき、前記２本鎖（すなわち、１本鎖の２本鎖形成領域）は、塩基がＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で対合する相補性ＲＮＡ鎖である。
【０２１７】
本発明に応じるアンチセンス化合物は、塩基核酸約５個から約８０個まで（例えば、約５個から約８０個までで連結される核酸塩基）の長さのアンチセンス部分を含む場合がある。これは、アンチセンス鎖の長さ又はアンチセンス化合物の部分を言う。言い換えれば、本発明の１本鎖アンチセンス化合物は５個から約８０個までの塩基核酸を含み、（例えば、ｄｓＲＮＡのような）本発明の２本鎖アンチセンス化合物は、塩基核酸５個ないし約８０個の長さのアンチセンス鎖又は部分を含む。当業者は、これが、核酸塩基５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個又は８０個の長さのアンチセンス部分か、あるいはそれらの範囲内のいずれかを含むと認識するであろう。
【０２１８】
１つの実施態様では、本発明の前記アンチセンス化合物は、核酸塩基１０個ないし５０個の長さのアンチセンス部分を有する。当業者は、これが、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個又は５０個の長さのアンチセンス部分か、あるいはそれらの範囲内のいずれかを有するオリゴヌクレオチドを例示すると認識するであろう。いくつかの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、核酸塩基１５個の長さである。
【０２１９】
１つの実施態様では、本発明の前記アンチセンス又はオリゴヌクレオチドは、核酸塩基１２個又は１３個ないし３０個の長さのアンチセンス部分を有する。当業者は、これが、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個又は３０個の長さのアンチセンス部分か、あるいはそれらの範囲内のいずれかを有するアンチセンス化合物を例示すると認識するであろう。
【０２２０】
本発明のある好ましいオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。本発明に関して「キメラオリゴヌクレオチド」又は「キメラ」は、少なくとも１つのヌクレオチドを作成するそれぞれの化学的に別々の領域２種類又は３種類以上を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞への取り込みの増大、標的に対する結合アフィニティーの増大のような）有益な特性１つ又は２つ以上を与える改変されるヌクレオチドの少なくとも１つの領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡのハイブリダイゼーション産物を開裂できる酵素の基質である領域とを含むことが典型的である。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡの２本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化が前記ＲＮＡ標的の開裂を生じ、それによって遺伝子発現のアンチセンス変調の効率を大いに増大する。結果として、比較可能な結果が、キメラオリゴヌクレオチドが用いられるとき、同一の標的領域にハイブリダイゼーションするホスホロチオエートのデオキシオリゴヌクレオチドと比較してより短いオリゴヌクレオチドでしばしば得られる場合がある。前記ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動によって日常的に検出され、必要であれば、当業者に知られる核酸ハイブリダイゼーション手法と関係付けられる場合がある。１つの好ましい実施態様では、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合アフィニティーを増大するために改変された少なくとも１つの領域と、しばしばＲＮアーゼＨの基質として作用する領域とを含む。その標的（この場合には、ｒａｓをエンコードする核酸）に対するオリゴヌクレオチドのアフィニティーは、前記オリゴヌクレオチドと標的とが解離する温度である、オリゴヌクレオチド／標的の対合のＴｍを測定することによって日常的に決定され、解離は分光光度的に検出される。前記Ｔｍが高くなることは、前記標的に対する前記オリゴヌクレオチドのアフィニティーをより高くする。
【０２２１】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記で説明されたようなオリゴヌクレオチド、改変されるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及び／又は、オリゴヌクレオチド模倣物２種類又は３種類の複合構造として形成される場合がある。また、かかる化合物は、ハイブリダイゼーション産物又はギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）として当業者に呼ばれた。かかるハイブリダイゼーション構造の調製を教示する典型的な米国特許は、米国特許第５，０１３，８３０号公報明細書、第５，１４９，７９７号公報明細書、第５，２２０，００７号公報明細書、第５，２５６，７７５号公報明細書、第５，３６６，８７８号公報明細書、第５，４０３，７１１号公報明細書、第５，４９１，１３３号公報明細書、第５，５６５，３５０号公報明細書、第５，６２３，０６５号公報明細書、第５，６５２，３５５号公報明細書、第５，６５２，３５６号公報明細書及び第５，７００，９２２号公報明細書と、引用により本明細書に取り込まれるそれぞれとを含むがこれらに限定されない。
【０２２２】
もう１つの好ましい実施態様では、改変される前記オリゴヌクレオチドの領域は、糖の２’の部位で改変されたヌクレオチドを少なくとも１つ含み、２’−Ｏ−アルカリ、２’−Ｏ−アルカリ−Ｏ−アルカリ又は２’−フルオロで改変されたヌクレオチドが最も好ましい。別の好ましい実施態様では、ＲＮＡの改変は、ピリミジン及び脱塩基残基のリボース上での２’−フルオロ、２’−アミノ及び２’Ｏ−メチルの改変か、前記ＲＮＡの３’末端での逆方向の塩基かを含む。かかる改変はオリゴヌクレオチドに日常的に取り込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、特定の標的に対する２’デオキシオリゴヌクレオチドと比較してより高いＴｍ（例えば、より高い標的結合アフィニティー）となることが示された。かかるアフィニティーの増大の効果は、遺伝子発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害を大いに増大することになる。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡとＤＮＡとの２本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞内エンドヌクレアーゼであり、したがって、この酵素の活性化は前記ＲＮＡの標的の開裂を生じ、よって、ＲＮＡｉ阻害の効率を大いに増大することができる。前記ＲＮＡの標的の開裂は、ゲル電気泳動によって日常的に示される場合がある。もう１つの好ましい実施態様では、キメラオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性を増大するために改変される。細胞は、核酸を分解する場合があるさまざまなエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む。ヌクレオチド及びヌクレオシドの改変の多くが、天然のオリゴデオキシヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ消化に対してより高い耐性のオリゴヌクレオチドにすることが示された。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを、細胞抽出物又は単離されたヌクレアーゼとインキュベーションし、通常、ゲル電気泳動によって正常なオリゴヌクレオチドの残っている程度を経時的に測定することによって日常的に測定される。前記ヌクレアーゼ耐性を増大するために改変されたオリゴヌクレオチドは、改変されていないオリゴヌクレオチドと比較して長い間正常な状態で残存する。さまざまなオリゴヌクレオチドの改変が、ヌクレアーゼ耐性を増大又は付与することが示された。オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホロチオエートの改変を含むことが現在のところより好ましい。ある場合には、標的結合アフィニティーを増大するオリゴヌクレオチドの改変は、ヌクレアーゼ耐性を独立的に増大することもできる。いくつかの所望の改変は、Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ａｃｅ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  １９９５、２８：３６６−３７４で見出される場合がある。
【０２２３】
本発明について予測される好ましいオリゴヌクレオチドのいくつかの具体的な例は、例えば、ホスホロチオエートか、ホスホトリエステラーゼか、メチルホスホネートか、短鎖のアルカリ又はシクロアルキルの糖間結合か、短鎖のヘテロ原子又は複素環の糖間結合かの改変されたバックボーンを含むものを含む。最も好ましいものは、ホスホロチオエートのバックボーンを有するオリゴヌクレオチドと、ヘテロ原子のバックボーン、特に、ＣＨ２−−ＮＨ−−Ｏ−−ＣＨ２、［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩのバックボーンとして知られる］ＣＨ，−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２、ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２及びＯ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２のバックボーンを有するオリゴヌクレオチドとであって、天然のホスジエステルのバックボーンは、Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨとして示される。また、Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ａｃｅ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  １９９５、２８：３６６−３７４によって開示されるアミドのバックボーンが好ましい。また、好ましいものはモルフォリノのバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号公報明細書）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）のバックボーンのような別の好ましい実施態様では、前記オリゴヌクレオチドのホスホジエステルのバックボーンはポリアミドのバックボーンで置換されるので、核酸塩基は前記ポリアミドのバックボーンのアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合されている（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１、２５４、１４９７）。また、オリゴヌクレオチドは、１種類又は２種類以上の置換された糖原子団を含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’の部位に、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３であって、ｎは１個から約１０個までで、Ｃ１ないしＣ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−−、Ｓ−−又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための官能基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させる官能基その他の類似の特性を有する置換基のうちの１つを含む。好ましい改変は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３］（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６）を含む。その他の好ましい改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。また、類似の改変が、前記オリゴヌクレオチドのその他の部位で、特に、３’末端のヌクレオチドの糖の３’部位及び５’���端のヌクレオチドの５’部位で行われる場合がある。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模倣物を有する場合がある。
【０２２４】
追加的又は代替的に、オリゴヌクレオチドは、（当業者にしばしば単に「塩基」と呼ばれる）核酸塩基の改変又は置換を含む場合もある。本明細書で用いられるところの「改変されていない」又は「天然」の核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。改変された核酸塩基は、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅ  ピリミジン、特に、（５−メチル−２’デオキシシトシンとしても呼ばれ、５−Ｍｅ−Ｃとして当業者にしばしば呼ばれる）５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びジェントビオシルＨＭＣの天然の核酸で単に稀に又は一過的に発見される核酸塩基と、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン又はその他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン及び２，６−ジアミノプリンの合成核酸塩基とを含む（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、サンフランシスコ、１９８０、７５−７７頁；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７、１５：４５１３）。当業者に知られる「万能な」塩基、例えば、イノシンが含まれる場合がある。５−Ｍｅ−Ｃの置換は、核酸２本鎖の安定性を０．６−１．２°Ｃ上昇することが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．ら編、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ出版社、ボカラトン、１９９３、２７６−２７８頁）、今のところ好ましい塩基置換である。
【０２２５】
本発明の前記オリゴヌクレオチドのもう１つの改変は、オリゴヌクレオチドの活性又は細胞内の取り込みを増大する１種類又は２種類以上の原子団又はコンジュゲートを前記オリゴヌクレオチドに化学的に連結することを含む。かかる原子団は、コレステロール原子団か、コレステリル原子団（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８９、８６、６５５３）か、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．  １９９４、４、１０５３）か、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．  ＮＹ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １９９２、６６０、３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．  １９９３、３、２７６５）か、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９２、２０、５３３）か、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシルの残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯＪ．  １９９１、１０、１１１；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １９９０、２５９、３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  １９９３、７５、４９）か、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又は１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９９５、３６、３６５１；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９０、１８、３７７７）か、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９５、１４、９６９）か、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９９５、３６、３６５１）かのような脂質原子団を含むがこれらに限定されない。疎水性原子団を含むオリゴヌクレオチドと、かかるオリゴヌクレオチドを調製するための方法とは、例えば、米国特許第５，１３８，０４５号公報明細書、第５，２１８，１０５号公報明細書及び第５，４５９，２５５号公報明細書で当業者に知られる。
【０２２６】
特定のオリゴヌクレオチドの部位全てに、均一に改変することは必要ではなく、実際に、前述の改変のうちの２つ以上が、１つのオリゴヌクレオチドか、あるいはオリゴヌクレオチドの１つのヌクレオシドにでさえ取り込まれる場合がある。また、本発明は、上記で定義されたようなキメラオリゴヌクレオチドを含む。
【０２２７】
もう１つの実施態様では、本発明の核酸分子は、脱塩基のヌクレオチド、ポリエステル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、糖質、脂質又はポリ炭化水素の化合物を含むがこれらに限定されないもう１つの原子でコンジュゲート化される。当業者は、これらの分子が、糖、塩基又はリン酸基のいくつかの部位で前記核酸分子を含む１種類又は２種類以上のヌクレオチドのいずれかに連結される場合があると認識するであろう。
【０２２８】
本発明に従って、作用の効力、特異性及び持続時間を増大し、オリゴヌクレオチドの投与経路を広げるためのＬＮＡ単量体を使用することのような改変を使用することは、ＭＯＥ、ＡＮＡ、ＦＡＮＡ、ＰＳ等のような従来の化学からなる（Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｕｈｌｍａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００、Ｖｏｌ  ３  Ｎｏ  ２を参照せよ。）。これは、ＬＮＡ単量体によって従来のオリゴヌクレオチドの単量体のいくつかを置換することによって達成される場合がある。前記ＬＮＡで改変されたオリゴヌクレオチドは、親の化合物と類似のサイズを有する場合があるか、あるいは大きい場合があり、小さいことが好ましい。かかるＬＮＡで改変されたオリゴヌクレオチドは、約７０％未満のＬＮＡ単量体を含むことが好ましく、約６０％未満がより好ましく、約５０％未満がより好ましく、それらのサイズは約５個から２５個までのヌクレオチドであり、約１２個から２０個までのヌクレオチドであることがより好ましい。
【０２２９】
好ましい改変されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、正常な３’−５’連結を有する、ホスホロチオエート、キラル（ｃｈｉｒａｌ）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチルその他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノリン酸塩と、２’−５’で連結したこれらのアナログと、近傍のヌクレオシド対合の単位が、３’−５’を５’−３’にか、あるいは２’−５’を５’−２’に連結されて逆極性を有するこれらとを含むがこれらに限られない。また、さまざまな塩、混合塩及び遊離酸形状が含まれる。
【０２３０】
それらの中にリン原子を含まない改変されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、短鎖アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間の連結と、混合されたヘテロ原子と、アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間の連結とか、１種類又は２種類以上の短鎖のヘテロ原子又は複素環のヌクレオシド間の連結かによって形成されるバックボーンを有することが好ましい。これらは、（ヌクレオシドの糖部分の一部で形成される）モルフォリノ連結を有するバックボーン；シロキサンのバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンのバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルのバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルのバックボーン；アルケンを含むバックボーン；スルファメートのバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノのバックボーン；スルホナート及びスルホンアミドのバックボーン；アミドのバックボーン：及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２の構成成分部分を有するその他のものを含む。
【０２３１】
その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物では、前記糖及びヌクレオシド間の連結の両方、例えば、前記ヌクレオチド単位のバックボーンは、新規官能基で置換される。前記塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションを維持される。良好なハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣物のかかるオリゴマーの化合物１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖のバックボーンは、アミドを含むバックボーン、特に、アミノエチルグリシンのバックボーンで置換される。前記核酸塩基は維持され、前記バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合される。
【０２３２】
本発明のもう１つの好ましい実施態様では、ホスホロチオエートのバックボーンを有するオリゴヌクレオチドと、ヘテロ原子、特に、メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩのバックボーンとして知られる−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、天然のホスホジエステルのバックボーンの−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を有するオリゴヌクレオチドとは、上記で参照された米国特許第５，４８９，６７７号公報明細書の−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−、及び、上記で参照された米国特許第５，６０２，２４０号公報明細書のアミドのバックボーンとして示される。また、好ましいものは、上記で参照された米国特許第５，０３４，５０６号公報明細書のモルフォリノのバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【０２３３】
また、改変されたオリゴヌクレオチドが、１種類又は２種類以上の置換された糖原子団を含む場合がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’の部位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯアルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、前記アルキル、アルケニル及びアルキニルが、ＣをＣＯアルキルにか、あるいはＣ２をＣＯアルケニル及びアルキニルに置換されるか、あるいは置換されない場合がある。特に好ましいものは、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ、ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２及びＯ（ＣＨ２ｎＯＮ（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ｎ及びｍは１から約１０までの場合がある。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’の部位に、Ｃ１ないしＣ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上するための官能基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させる官能基その他の類似の特性を有する置換基のうちの１つを含む。好ましい改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）すなわち２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４）例えば、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好ましい改変は、以下の本明細書の実施例で説明されるような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）、例えば、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基と、（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、すなわち２’−ＤＭＡＥＯＥとして当業者に知られる）２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）、例えば、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２とを含む。
【０２３４】
その他の好ましい改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。また、類似の改変が、前記オリゴヌクレオチドのその他の部位で、特に、３’末端のヌクレオチド又は２’−５’で連結されたオリゴヌクレオチドの糖の３’部位と、５’末端のヌクレオチドの５’部位とで行われる場合がある。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチルのような糖模倣物を有する場合がある。
【０２３５】
また、オリゴヌクレオチドは、（当業者にしばしば単に「塩基」と呼ばれる）核酸塩基の改変又は置換を含む場合がある。本明細書で用いられるところの「改変されていない」又は「天然」の核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）と、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）とを含む。改変された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチルその他のアルキルの誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピルその他のアルキルの誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏ−ｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルその他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルその他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３―デアザグアニン及び３−デアザアデニンのようなその他の合成及び天然の核酸塩基を含む。
【０２３６】
さらに核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号公報明細書で開示されたものと、「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８−８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０で開示されたものと、Ｅｎｇｌｉｓｃｈらによって「Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」、１９９１、３０、６１３頁で開示されたものと、Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．によって「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１５章、２８９−３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．  それぞれ、ＣＲＣ出版社、１９９３で開示されたものとを含む。これらの特定の核酸塩基は、本発明のオリゴマーの化合物の結合アフィニティーを増加するのに特に有用である。これらは、５−置換ピリミジンと、６−アザピリミジンと、２−アミノプロピルアデニンを含むＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンと、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンとを含む。５−メチルシトシンの置換は、核酸２本鎖の安定性を０．６−１．２°Ｃ上昇することが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．ら編、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ出版社、ボカラトン、１９９３、２７６−２７８頁）、今のところ好ましい塩基置換であり、なお、２’−Ｏ−メトキシエチル糖の改変と組み合されるとき、より好ましい。
【０２３７】
抗ＳＴＩＮＧ分子
抗体及びアプタマー
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてＳＴＩＮＧ遺伝子及び遺伝子発現を検出することに加えて、免疫アッセイは、本発明のＳＴＩＮＧタンパク質を検出するために用いられる場合もある。かかるアッセイは、ＳＴＩＮＧの変調因子をスクリーニングと、治療上及び診断上の用途とのために有用である。免疫アッセイは、定性的又は定量的にＳＴＩＮＧタンパク質を解析するために用いられる場合がある。適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）で見出される場合がある。
【０２３８】
ＳＴＩＮＧ、別の分子と複合体を形成したＳＴＩＮＧ、ＳＴＩＮＧの断片、それらの変異体、バリアント及び相補配列に特異的に結合する抗体が提供される。
【０２３９】
本明細書で用いられるところの「抗体」という用語は、完全で正常な（ｉｎｔａｃｔ）抗体と、そのＦａｂ断片及びＦ（ａｂ）２断片とを指すことを意味する。完全で正常な抗体は、マウスのモノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体のようなモノクローナル抗体を含む。例えば、Ｒａｄ５０上に存在するエピトープに結合する抗体は、アフィニティークロマトグラフィーのような周知の手法を用いて天然の供給源及び組み換え発現システムの両方からＲａｄ５０を単離し、精製するために有用である。細胞が前記タンパク質を発現している場合に、かかる抗体は試料中のかかるタンパク質の存在を検出し、決定するために有用である。
【０２４０】
一度、ＳＴＩＮＧに対する特異的抗体が入手できれば、ＳＴＩＮＧはさまざまな免疫アッセイ方法によって検出される場合がある。さらに、前記抗体は、ＳＴＩＮＧ変調因子として治療上用いられる場合がある。免疫学的及び免疫アッセイの手順の参考のために、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ及びＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照せよ。さらに、本発明の前記免疫アッセイは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  （Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）と、上記のＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅとで広範に参考にされたいくつかの設定のうちのいずれかで実施される場合がある。
【０２４１】
好ましい実施態様では、抗体は、ＳＴＩＮＧ、そのバリアント、変異体及び断片に特異的である。ＳＴＩＮＧ分子はヒトＳＴＩＮＧ分子であることが好ましい。例えば、マウス抗ヒトＳＴＩＮＧ、ウサギ抗ヒトＳＴＩＮＧ、マウス抗ヒトＳＴＩＮＧ、ヤギ抗マウスＳＴＩＮＧ等である。前記抗体の種は、いずれかの種の場合がある。しかし、ヒト又はヒト化抗体が好ましい。前記抗体は、直線状のＳＴＩＮＧペプチドか、天然の立体構造かのエピトープに向けられる場合がある。
【０２４２】
もう１つの好ましい実施態様では、モノクローナル又はポリクローナルの抗体は、配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の１種類又は２種類以上の抗原性エピトープに特異的である。
【０２４３】
またもう１つの好ましい実施態様では、ＳＴＩＮＧに対するアプタマーが考えられる。本明細書で用いられるところの「アプタマー」又は「選択された核酸結合種」という用語は、改変されていないか、あるいは化学的に改変されたＲＮＡ又はＤＮＡを含む。選択方法はアフィニティークロマトグラフィーによる場合があり、増幅方法は、逆転写（ＲＴ）又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による場合があるが、これらに限られない。
【０２４４】
候補治療剤
ハイスループットの機能的ゲノムアッセイが、ＳＴＩＮＧの機能及び／又は発現の変調因子を同定するために用いられる場合がある。例えば、ＳＴＩＮＧで仲介されるインターフェロン誘導のようなＳＴＩＮＧの機能を測定する詳細な方法は、以下の実施例で提供される。細胞は、（核酸によってエンコードされる）ｃＤＮＡ又はランダムペプチドライブラリーと接触されるのが典型である。前記ｃＤＮＡライブラリーは、センス、アンチセンス、完全長及び欠損型のｃＤＮＡを含む場合がある。前記ペプチドライブラリーは核酸によってエンコードされる。その後、ＳＴＩＮＧの前記ｃＤＮＡ又はペプチドライブラリーの影響が監視される。ｃＤＮＡ又はペプチドの影響が確認され、例えば、テトラサイクリンプロモーターからの発現のような核酸の調節可能な発現を用いて体細胞突然変異を鑑別される場合がある。ペプチドをエンコードするｃＤＮＡ及び核酸は、例えば、配列タグを用いて、当業者に知られる手法を用いて回復される場合がある。
【０２４５】
前記ｃＤＮＡ（例えばＳＴＩＮＧ）によってエンコードされるペプチド又はタンパク質と相互作用するタンパク質は、酵母ツーハイブリッドシステム、哺乳類ツーハイブリッドシステム又はファージディスプレイスクリーニング等を用いて単離される場合がある。よく同定された標的が、ＳＴＩＮＧの機能経路の追加のメンバーを同定するために、これらのアッセイでバイト（ｂａｉｔ）としてさらに用いられる場合があり、メンバーは創薬のための標的でもある（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５（１９８９）、Ｖａｓａｖａｄａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：１０６８６  （１９９１）、Ｆｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：７９５８（１９９２）、Ｄａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１：９５４（１９９１）、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５７８（１９９１）、及び、米国特許第５，２８３，１７３号公報明細書、第５，６６７，９７３号公報明細書、第５，４６８，６１４号公報明細書、第５，５２５，４９０号公報明細書及び第５，６３７，４６３号公報明細書を参照せよ。）。
【０２４６】
好ましい実施態様では、治療剤を同定する方法は、（ｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列、それらの活性型断片、バリアント又は変異体によってエンコードされるペプチドか、（ｉｉ）配列番号１又は２に列挙される核酸配列（ＳＴＩＮＧ）、それらの活性型断片、バリアント又は変異体かを候補治療剤と接触するステップと、（ｉ）前記薬剤は、前記ペプチドの機能か、パートナー分子と前記ペプチドとの相互作用かを変調するか、（ｉｉ）前記薬剤は、前記核酸配列（ＳＴＩＮＧ）の発現及び／又は機能を変調するかどうかを決定するステップとを含む。
【０２４７】
もう１つの好ましい実施態様では、疾患を治療するための候補治療剤を同定する方法は、ＳＴＩＮＧを発現する単離された細胞を培養するステップ、培養された細胞に候補治療剤を投与するステップ、候補治療剤の存在下又は非存在下で対照細胞と比較してＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を関係付けるステップを含み、薬剤は、所望の治療上の結果に基づいて同定される。例えば、ＳＴＩＮＧの発現を変調する薬剤；インターフェロン産生、さまざまな分子とのＳＴＩＮＧの会合、経路の変調、β２−ミクログロビンの発現等を変調する薬剤であり、それに関して、ＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を調節する候補治療剤を同定するステップである。
【０２４８】
診断及び候補薬剤送達のもう１つの適切な方法は、ＳＴＩＮＧ、そのアレル又は断片を発現する細胞とテスト試料を接触するステップと、ＳＴＩＮＧ、そのアレル又は断片と前記テスト試料との相互作用か、ＳＴＩＮＧ、そのアレル又は断片の発現産物かを検出するステップとを含む。ＳＴＩＮＧ、そのアレル又は断片か、遺伝子、そのアレル又は断片の発現産物かが、例えば、蛍光又は放射性の成分を用いて適切に検出可能に標識される場合がある。
【０２４９】
もう１つの好ましい実施態様では、患者由来の細胞が単離され、候補治療分子と接触される。前記遺伝子、その発現産物は同定ために監視され、遺伝子又は発現産物は前記薬剤によって調節される。
【０２５０】
核酸マイクロアレイ
ユニークな核酸それぞれは、アレイを形成するために定義された部位で配置されるため、ＳＴＩＮＧに結合可能な核酸配列の同定は、基質表面上に核酸のライブラリーを不動化することによって達成される場合がある。詳細は以下の実施例の段落で提供される。一般的に、核酸の不動化されたライブラリーは、前記核酸に生体分子を結合する好ましい条件下で前記生体分子又は候補薬剤に曝露される。非特異的に結合する生体分子は、所望の結合特異性レベルに依存して穏やかな緩衝条件からストリンジェントな緩衝条件までを用いて洗い流される場合がある。その後、前記核酸アレイは、核酸配列が前記生体分子に結合したものを決定するために解析されるであろう。前記生体分子は、結合した核酸の局在の検出で使用するための蛍光タグを輸送するであろうことが好ましい。
【０２５１】
核酸配列の不動化されたアレイを用いるアッセイは、未知の核酸配列、一塩基多型（ＳＮＰ）解析、特定の種、組織、細胞タイプ等由来の遺伝子発現パターン解析、遺伝子同定等を決定するために用いられる場合がある。
【０２５２】
所望の遺伝子発現産物をエンコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドの追加の診断上の使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。これらのオリゴマーは、化学的に合成されるか、酵素的に生産されるか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作成される場合がある。オリゴマーは、発現産物をエンコードするポリヌクレオチドの断片か、前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの断片かを含むことが好ましいであろうし、特異的遺伝子の同定のための至適条件下で供されるであろう。オリゴマーは、密接に関連したＤＮＡ又はＲＮＡの配列の検出又は定量のためのストリンジェンシーの低い条件下で供される場合もある。
【０２５３】
さらなる実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列のいずれかに由来するオリゴヌクレオチド又はより長い断片が、マイクロアレイの標的として用いられる場合がある。前記マイクロアレイは、多数の遺伝子及び遺伝子転写物の同一性及び／又は発現のレベルを監視するため、同時に、標的遺伝子又はその産物が相互作用する遺伝子を同定するため、及び／又は、例えば、神経障害を仲介する遺伝子の発現産物の調節における候補治療剤の有効性を評価するために用いられる場合がある。この情報は遺伝子機能を決定し、治療剤の活性を開発し、監視するために用いられる場合がある。
【０２５４】
マイクロアレイは、当業者に知られる方法を用いて調製され、使用され、解析される場合がある（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９９５、米国特許第５，４７４，７９６号公報明細書、Ｓｃｈｅｎａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら、１９９５、国際公開第ＷＯ９５／２５１１１６号公報明細書、Ｓｈａｌｏｎら、１９９５、国際公開第ＷＯ９５／３５５０５号公報明細書、Ｈｅｌｌｅｒら、１９９７、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：２１５０−２１５５、及び、Ｈｅｌｌｅｒら、１９９７、米国特許第５，６０５，６６２号公報明細書を参照せよ。）。その他の実施態様では、マイクロアレイは、候補薬剤を同定するためにアッセイされる場合があるペプチド又はその他の所望の分子を含む。
【０２５５】
候補薬剤は、典型的には、それらは、低分子有機化合物を含む有機化合物と、オリゴヌクレオチドを含む核酸と、ペプチドとであるが、多数の化学種を含む。低分子有機化合物は、例えば、約４０又は５０以上で約２，５００未満の分子量を適切に有する場合がある。候補薬剤は、タンパク質及び／又はＤＮＡと相互作用する化学官能基を含む場合がある。
【０２５６】
候補薬剤は、合成化合物又は天然化合物のライブラリーを含む広範な供給源から得られる場合がある。例えば、多くの手段が、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む、広範な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び指向型合成のために利用可能である。代替的に、例えば、細菌、菌類及び動物の抽出物の形状の天然化合物ライブラリーが利用可能であるか、あるいは容易に作成される。
【０２５７】
本発明の治療剤のアッセイは、動物モデルと、細胞を利用するシステムと、細胞を利用しないシステムとを適切に含む。
【０２５８】
同定された遺伝子、そのバリアント、断片又はオリゴペプチドが、例えば、化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって、治療上の利益がある薬剤を同定するか、あるいはその他のさまざまな薬剤スクリーニング手法又は解析手法のいずれかによって興味のある化合物を同定するために用いられることが好ましい。かかるスクリーニングで供された遺伝子、そのアレル、断片又はオリゴペプチドは、溶液中で遊離の状態か、固体支持体に付着されるか、細胞表面上で産生されるか、細胞内に局在されるかの場合がある。
【０２５９】
薬剤スクリーニングのためのもう１つの手法は、興味のあるタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットのスクリーニングを提供する（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、１９８４、国際公開第ＷＯ８４／０３５６４号公報明細書を参照せよ。）。この方法では、多数の異なる低分子のテスト化合物が固体基板上で合成される。前記テスト化合物は、同定された遺伝子又はその断片と反応し、洗浄される。その後、結合した分子は当業者に周知の方法によって検出される。代替的に、非中和抗体が、ペプチドを捕捉し、固体基板上にそれを不動化するために用いられる場合がある。
【０２６０】
本発明のスクリーニング方法は、多様な分子のライブラリーから所望の活性を有する化合物１種類又は２種類以上を同定するためのスクリーニングアッセイを使用するステップを含む。「スクリーニングアッセイ」は、予め選択された活性を有する採取物中の化合物を同定、単離及び／又は構造を決定するために設計された選択的アッセイである。「同定すること」とは、所望の活性を有する化合物が単離され、その化学構造が構造を決定され（核酸及びポリペプチドそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸の配列を決定することを含むが、これらに限られない）、及び、スクリーニングされる活性を有する化合物を追加的又は代替的に精製することを意味する。生化学アッセイ及び生物アッセイは、タンパク質間相互作用、酵素触媒反応、低分子タンパク質の結合から細胞機能までにわたる広範なシステムで活性をテストするために設計される。かかるアッセイは、自動化アッセイ、半自動化アッセイ及びＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）アッセイを含む。
【０２６１】
ＨＴＳ法では、多くの個別の化合物は、多数のテスト化合物が、同時か、ほとんど同時かに所望の活性についてスクリーニングされるため、ロボット、自動又は半自動の方法によって並行してテストされることが好ましい。本発明の一貫生産システムを用いて、１日あたり異なる化合物を約６，０００個ないし２０，０００個まで、約１００，０００個ないし１，０００，０００個でさえもアッセイし、スクリーニングすることが可能である。
【０２６２】
典型的にＨＴＳでは、標的分子が、適切な対照を含む、変調された受容体を有する単離した細胞とともに、投与されるか、あるいは培養される。
【０２６３】
１つの実施態様では、スクリーニングは、標的とリガンドとの複合体が形成される場合がある条件下で、化合物メンバーのいくつかが前記標的のリガンドである、多様なライブラリーの化合物メンバーと各培養細胞を接触するステップと、ライブラリーのメンバーがかかる複合体で存在することを同定するステップとを含む。もう１つの非限定的な態様では、スクリーニングは、酵素によって触媒された反応の生産物又は反応物が検出可能なシグナルを産生する条件下で、化合物メンバーのいくつかが標的の阻害剤（又は活性化剤）である、多様なライブラリーの化合物メンバーと前記標的酵素を接触するステップを含む。後者の態様では、標的酵素の阻害剤は、検出可能な生産物由来のシグナルを低下するか、あるいは検出可能な反応物由来のシグナルを増加する（又は、活性化剤については逆である。）。
【０２６４】
１つの実施態様では、本発明は、天然又は組み換えのいずれかのＳＴＩＮＧタンパク質か、ＳＴＩＮＧタンパク質を発現する細胞又は組織かを用いる可溶性アッセイを提供する。もう１つの実施態様では、本発明は、前記ＳＴＩＮＧタンパク質又はその断片が固相基板上に付着されるハイスループットな形式での固相を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを提供する。本明細書で説明される前記アッセイのいずれか１つは、例えば、リガンド結合、細胞増殖、例えば、ＣＤ−６９の細胞表面マーカーのフラックス（ｆｌｕｘ）、スクリーニング、放射性標識ＧＴＰ結合、例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ又はｃＡＭＰの２次情報伝達物質のフラックス、サイトカイン産生等のハイスループットスクリーニングのために適合される場合がある。１つの実施態様では、β２−ミクログロビンの変調を用いる細胞を利用したシステム及びＦＡＣＳアッセイは、ＳＴＩＮＧタンパク質の変調因子、したがって、Ｔ細胞の活性化の変調因子を同定するためにハイスループットの形式で用いられる場合がある。
【０２６５】
可溶性又は固体の状態のいずれかの本発明のハイスループットアッセイでは、１日に数千の異なる変調因子又はリガンドをスクリーニングできる。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＳＴＩＮＧタンパク質のためか、あるいはＳＴＩＮＧタンパク質を含む、細胞を利用する又は膜を利用するアッセイのために用いられる。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された候補となる変調因子に対して個別のアッセイを実行するために用いられる場合があり、すなわち、濃度又はインキュベーション時間の影響が観察される場合に、ウェル５−１０個全てが単独の変調因子をテストする場合がある。したがって、１つの標準的マイクロタイタープレートは、約１００個（例えば、９６個）の変調因子をアッセイできる。ウェル１５３６個のプレートが用いられる場合には、その後、１つのプレートは、約１００個ないし約１５００個までの異なる化合物を容易にアッセイできる。１日あたり多くのプレートをアッセイでき、約６，０００個、２０，０００個、５０，０００個までか、あるいは１００，０００以上の異なる化合物についてのスクリーニングアッセイは、本発明の一貫生産システムを用いることができる。
【０２６６】
固相反応のために、興味あるタンパク質又はその断片、例えば、融合タンパク質の一部分として前記興味あるタンパク質又はその断片を含む細胞外ドメインか、細胞又は膜かが、共有又は非共有結合を介して、例えば、タグを介して直接的又は間接的に固相成分に結合される場合がある。前記タグはさまざまな成分のいずれかの場合がある。一般的に、前記タグ（タグ結合体）を結合する分子は固体支持体に固定され、興味のあるタグ化された分子は、前記タグ及び前記タグ結合体の相互作用によって前記固体支持体に付着される。
【０２６７】
タグ及びタグ結合体の多くが、文献で十分に説明された既知の分子相互作用にもとづいて用いられる場合がある。例えば、タグが天然の結合体、例えば、ビオチン、プロテインＡ又はプロテインＧを有するとき、適切なタグ結合体（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域等）と組み合わせて用いられる場合がある。ビオチンのような天然の結合体を有する分子に対する抗体が、広範に入手可能であり、タグ結合体に適切であり、ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８  ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＳＩＧＭＡ、ミズーリ州セントルイスを参照せよ。
【０２６８】
同様に、ハプテン性又は抗原性の化合物のいずれかが、タグ／タグ結合体の対合を形成するために適切な抗体との組み合わせで用いられる場合がある。数千の特異的抗体が商業的に入手可能であり、追加の抗体の多くが文献に説明される。例えば、１つの一般的な形状では、前記タグは１次抗体であり、前記タグ結合体は、前記１次抗体を認識する２次抗体である。抗体−抗原の相互作用に加えて、受容体−リガンドの相互作用は、タグ及びタグ結合体の対合として適切である。例えば、細胞膜受容体の作動薬及び拮抗薬（例えば、トランスフェリン、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体及び抗体と、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等とのような細胞受容体−リガンドの相互作用）であり、例えば、Ｐｉｇｏｔｔ及びＰｏｗｅｒ、Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ  （１９９３）を参照せよ。同様に、毒物（ｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｍｓ）、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、鎮痛剤、ステロイド等）、（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンＤと、ペプチドとを含む、さまざまな低分子リガンドの影響を仲介する）細胞内受容体、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖及び環状の両方のポリマー形状）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質及び抗体がさまざまな細胞受容体とただ相互作用する場合がある。
【０２６９】
また、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド（ｐｏｌｙａｒｙｌｅｎｅ  ｓｕｌｆｉｄｅｓ）、ポリシロキサン、ポリイミド及びポリアセテートのような合成ポリマーが、適切なタグ又はタグ結合体を形成する場合がある。また、その他のタグ／タグ結合体の対合の多くが本明細書で説明されるアッセイ系で有用であると、本明細書の参照にもとづいて当業者に明らかになるであろう。
【０２７０】
また、ペプチド、ポリエーテル等のような一般的なリンカーはタグとして役立ち、約５個から２００個までのアミノ酸のポリｇｌｙ配列のようなポリペプチド配列を含む場合がある。かかる可動性リンカーは当業者に知られる。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、シェアウォーターポリマー社、アラバマ州ハンツビルから入手可能である。これらのリンカーは、アミド結合、スルフィドリル結合又は異種官能基結合（ｈｅｔｅｒｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅｓ）を任意に有する。
【０２７１】
タグ結合体は、現在利用可能なさまざまな方法のいずれかを用いて固体基板に固定される。固体基板は、前記タグ結合体の一部分と反応する表面に化学基を固定する化学試薬に前記基板の全部又は一部分を曝露することによって一般的に誘導されるか、あるいは機能化される。例えば、長鎖部分に結合するための適切な官能基は、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基及びカルボキシル基を含むであろう。アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランが、ガラス表面のようなさまざまな表面を機能化するために用いられる場合がある。かかる固相バイオポリマーアレイの構成は、文献に十分に説明される。例えば、（例えば、ペプチドの固相合成を説明する）Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５４（１９６３）、（ピン上で固相成分の合成を説明する）Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｍｅｔｈ．  １０２：２５９−２７４（１９８７）、（セルロースディスク上でさまざまなペプチド配列の合成を説明する）Ｆｒａｎｋ及びＤｏｒｉｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：６０３１−６０４０（１９８８）、（固体基板に固定されたバイオポリマーのアッセイをただ説明する）Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７（１９９１）、Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（４）：７１８−７１９（１９９３）及びＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（７）：７５３７５９（１９９６）を参照せよ。基板にタグ結合体を固定するための非化学的アプローチは、熱、ＵＶ照射による架橋等のようなその他の一般的な方法を含む。
【０２７２】
化学ライブラリー
コンビナトリアルケミストリーの開発は、数百個ないし数千個の個々の化合物の速く、経済的な合成を可能にする。これらの化合物は、有効性のスクリーニングのために設計された低分子の中規模のライブラリーで配置されることが典型的である。コンビナトリアル法は、新規化合物を同定するために適切な偏りのないライブラリーを作成するために用いられる場合がある。さらに、作成される場合がある低分子の多様性のないライブラリーは、以前に決定された生物学的活性を有する片親の化合物に由来する。いずれかの場合には、重要な酵素の阻害剤のようなコンビナトリアルケミストリーによって作成される、治療上の適切な生体分子を特異的に標的化するための有効なスクリーニングシステムを欠くことが、それらの資源を最適に使用することを妨げる。
【０２７３】
コンビナトリアルケミストリーのライブラリーは、化学合成又は生合成のいずれか、試薬のような多数の化学「構成要素」の組み合わせによって作成された多様な化学化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリーのような線形コンビナトリアルケミストリーのライブラリーは、特定の化合物の長さ（例えば、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）について多数の組み合わせと、潜在的に可能な方法全てとにおいて一連の化学構成要素（アミノ酸）を組み合わせることによって形成される。数百万の化学化合物は、化学構成要素のかかるコンビナトリアル混合を通して合成される場合がある。
【０２７４】
「ライブラリー」は、２種類から５０，０００，０００種類までの多様な化合物メンバーを含む場合がある。ライブラリーは少なくとも４８種類の多様な化合物を含むことが好ましく、９６種類又は９７種類以上の多様な化合物であることが好ましく、３８４種類又は３８５種類以上の多様な化合物であることがより好ましく、１０，０００種類又は１０，００１種類以上の多様な化合物であることがより好ましく、１０，０００種類よりも多い多様なメンバーであることが好ましく、１，０００，０００種類よりも多い多様な化合物メンバーであることが最も好ましい。「多様な」とは、ライブラリーの化合物の５０％よりも多くが、前記ライブラリーの別のメンバーと全く同一ではない化学構造を有することを意味する。ライブラリーの化合物の７５％よりも多くが、前記収集物の別のメンバーと全く同一ではない化学構造を有することが好ましく、９０％よりも多いことがより好ましく、約９９％よりも多いことが最も好ましい。
【０２７５】
コンビナトリアルケミストリーのライブラリーの調製は当業者に周知である。総説として、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９６：５５５−６００、１９９６と、Ｋｅｎａｎら、Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｈａｐｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９：５７−６４、１９９４と、Ｊａｎｄａ、Ｔａｇｇｅｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｕｎｔａｇｇｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９１：１０７７９−８５、１９９４と、Ｌｅｂｌら、Ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：１７７−９８、１９９５と、Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅ，  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ，  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  １５：４８１−９６、１９９５と、Ｃｈａｂａｌ、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｌｅａｄｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６：６３２−９、１９９５と、Ｄｏｌｌｅ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ．  ２：２２３−３６、１９９７と、Ｆａｕｃｈｅｒｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅａｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｏｂｏｔｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃａｎ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７５：６８３−９、１９９７と、Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  １：１７４−８０、１９９５と、Ｋａｙら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ４：５３５−４３、２００１とを参照せよ。
【０２７６】
多様な化学ライブラリーを作成するための別の化学法が用いられる場合もある。かかる化学法は、ペプチド（国際公開第ＷＯ  ９１／１９７３５号公報明細書）、エンコードされたペプチド（国際公開第ＷＯ  ９３／２０２４２号公報明細書）、ランダムなバイオオリゴマー（国際公開第ＷＯ  ９２／０００９１号公報明細書）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号公報明細書）、ヒダントイン（ｈｙｄａｎｔｏｉｎｓ）、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４：６５６８（１９９２））、ベータ−Ｄ−グルコースの足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子の化合物ライブラリーの類似体有機合成物（Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバミン酸塩（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１３０３（１９９３））、及び／又は、ぺプチジルホスホン酸塩（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（上述のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＳａｍｂｒｏｏｋを参照せよ。）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号公報明細書を参照せよ。）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４（１９９６）と、国際公開第ＵＳ  ９６／１０２８７号公報明細書とを参照せよ。）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０−１５２２（１９９６）と、米国特許第５，５９３，８５３号公報明細書とを参照せよ。）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１月１８日、３３頁（１９９３）を参照せよ。）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号公報明細書）、チアゾリジノン及びメタチアザノン（米国特許第５，５４９，９７４号公報明細書）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号公報明細書及び米国特許第５，５１９，１３４号公報明細書）、モルフォリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号公報明細書）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号公報明細書）等を含むが、これらに限られない。
【０２７７】
コンビナトリアルライブラリーを調製するためのデバイスが商業的に入手可能である（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ、ケンタッキー州ルイスビルと、シンフォニー、レイニン、マサチューセッツ州ウォバーンと、４３３Ａ  アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー、９０５０と、ミリポア、マサチューセッツ州ベッドフォードとを参照せよ。）。さらに、コンビナトリアルライブラリーの多くは、それ自体を商業的に入手可能である（例えば、コムジェネックス、ニュージャージー州プリンストン、アシネックス、ロシア国モスクワ、トリポス社、ミズーリ州セントルイス、ケムスター社、ロシア国モスクワ、３Ｄファーマシューティカルズ、ペンシルバニア州エクストン、マーテック（Ｍａｒｔｅｋ）バイオサイエンス、メリーランド州コロンビア等を参照せよ。）。
【０２７８】
ハイスループットスクリーニングは、シグナル伝達経路のような複合体分子事象での薬物の効果と、細胞機能、アポトーシス、細胞分裂、細胞接着、遊走、エキソサイトーシス及び細胞間情報伝達を含むが、これらに限られない細胞機能とを測定するために用いられる場合がある。多色の蛍光は、多数の標的及び細胞工程を１回のスクリーニングでアッセイすることを可能にする。細胞応答の相互相関関数は、標的の確認と、リード化合物の最適化とのために必要とされる豊富な情報をもたらすであろう。
【０２７９】
もう１つの局面では、本発明は、細胞が１個又は２個以上の蛍光レポーター分子を含む、複数の細胞を含む部位のアレイを提供するステップと、前記細胞の前記蛍光レポーター分子由来の蛍光シグナルを得るための細胞を含む、前記部位それぞれの複数の細胞を走査するステップと、前記蛍光シグナルをデジタルデータに変換するステップと、前記細胞内の前記蛍光レポーター分子の分布、環境又は活性を決定するために前記デジタルデータを利用するステップとを含む、細胞を解析するための方法を提供する。
【０２８０】
新しい創薬パラダイムの主成分は、細胞内のイオン、代謝物、高分子及び細胞内小器官の時空間分布、含有量及び活性を測定するために用いられる、連続的に増加している蛍光及び発光の試薬のファミリーである。これらの試薬のクラスは、生細胞及び固定細胞の分子の分布及び量を測定する標識試薬と、時空間のシグナル伝達事象を伝えるための環境指標と、生細胞内の標的分子活性を測定するための蛍光タンパク質バイオセンサーとを含む。１種類の細胞で多数の試薬を組み合わせるマルチパラメーターアプローチは、創薬のための新しい強力な手段である。
【０２８１】
この方法は、特定の細胞成分のための蛍光又は発光の分子の高い親和性に依存する。特定成分のための前記親和性は、イオン性相互作用と、（タンパク質を利用するクロモフォア、フルオロフォア及びルミフォア（ｌｕｍｉｐｈｏｒｅｓ）とのキメラ融合を含む）共有結合と、疎水性相互作用と、電位と、場合によっては、細胞成分内への単純な封入とのような物理学的な力によって支配される。発光プローブは、低分子か、標識された高分子か、緑色蛍光キメラタンパク質を含むが、これらに限られない遺伝子工学的に改変されたタンパク質かの場合がある。
【０２８２】
当業者は、タンパク質、リン脂質、ＲＮＡ及びＤＮＡのハイブリダイゼーション用プローブのような蛍光標識された生体分子を含むがこれらに限られない、本発明で用いられる場合がある広範な蛍光レポーター分子を認識するであろう。同様に、結合又は会合のための特定の化学的性質で特異的に合成された蛍光試薬が蛍光レポーター分子として用いられた（Ｂａｒａｋら、（１９９７）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２７４９７−２７５００、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋら、（１９９０）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：４１８−４３０、Ｔｓｉｅｎ（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２９巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１２７−１５６頁）。蛍光標識された抗体は、細胞又は組織と同じくらい複雑な分子混合物で単一の分子標的に結合するための特異性が高い、特に有用なレポーター分子である。
【０２８３】
発光プローブが、生細胞内で合成される場合があるか、あるいは、拡散と、促進型又は活性型の輸送と、シグナル配列で仲介される輸送と、エンドサイトーシス又はピノサイトーシスの取込みとを含む、多数の非機械的機序を介して前記細胞に輸送される場合がある。当業者に周知である機械的大量充填法が、発光プローブを生細胞に充填するために用いられる場合もある（Ｂａｒｂｅｒら、（１９９６）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０７：１７−２０、Ｂｒｉｇｈｔら、（１９９６）、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２４：２２６−２３３、ＭｃＮｅｉｌ（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２９巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１５３−１７３頁）。これらの方法は、電気穿孔法と、スクレープ充填（ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）、ビーズによる充填、衝撃による充填、注射器による充填、高張性及び低張性による充填のようなその他の機械的方法とを含む。さらに、細胞は、以前に説明されたような興味のあるタンパク質に結合した、ＧＦＰのようなレポーター分子を発現するために遺伝子工学的に改変される場合がある（Ｃｈａｌｆｉｅ及びＰｒａｓｈｅｒ、米国特許第５，４９１，０８４号公報明細書、Ｃｕｂｉｔｔら、（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：４４８−４５５）。
【０２８４】
いったん細胞において、前記発光プローブは、それらの標的ドメインとの特異的で高親和性の相互作用か、あるいはシグナル配列で仲介される輸送のような分子ターゲッティングのその他の機序のために前記標的ドメインで蓄積する。蛍光標識されたレポーター分子は、該レポーターの位置、量及び化学環境を決定するために有用である。例えば、前記レポーターが、脂溶性の膜環境か、より水溶性の環境かに存在するかどうかが決定される場合がある（Ｇｉｕｌｉａｎｏら、（１９９５）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４、Ｇｉｕｌｉａｎｏ及びＴａｙｌｏｒ、（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７．１−１６）。前記レポーターのｐＨ環境が決定される場合がある（Ｂｒｉｇｈｔら、（１９８９）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０４：１０１９−１０３３、Ｇｉｕｌｉａｎｏら、（１９８７）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６７：３６２−３７１、Ｔｈｏｍａｓら、（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２１０−２２１８）。キレート基を有するレポーターが、Ｃａ＋＋のようなイオンに結合するか、結合しないかどうかが決定される場合がある（Ｂｒｉｇｈｔら、（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３０巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１５７−１９２頁、Ｓｈｉｍｏｕｒａら、（１９８８）、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（トウキョウ）  ２５１：４０５−４１０、Ｔｓｉｅｎ（１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３０巻、Ｔａｙｌｏｒ及びＷａｎｇ（編）、１２７−１５６頁）。
【０２８５】
さらに生物の特定の細胞タイプは特異的に標識される場合があり、その他の細胞タイプでは標識されない場合がある成分を含む場合がある。例えば、神経細胞は、分極化した膜成分をしばしば含む。つまり、それらの細胞は、それらの細胞膜に沿って高分子を非対照的に分配する。結合組織又は支持組織の細胞は、別の細胞タイプに特異的に分子を閉じ込められる顆粒をしばしば含む（例えば、ヘパリン、ヒスタミン、セロトニン等）。筋肉組織細胞のほとんどは、筋小胞体、機能が細胞質中のカルシウムイオン濃度を調節できる特殊化した細胞内小器官を含む。神経組織細胞の多くは、神経ホルモン又は神経伝達物質が閉じ込められた分泌性の顆粒及び小胞を含む。したがって、蛍光分子は、特定細胞内の特定成分だけでなく、混合された細胞タイプの集団内の特定細胞をも標識するために設計される場合がある。
【０２８６】
当業者は蛍光を測定するための広範な方法を認識するであろう。例えば、蛍光レポーター分子のいくつかが、励起又は放出のスペクトルの変化を示し、いくつかは、１個の蛍光レポーターが蛍光を消失する一方、第２の蛍光レポーターが蛍光を獲得する共鳴エネルギー移動を示し、いくつかは、蛍光の消失（消光）又は発光を示す一方、いくつかは回転運動を伝える（Ｇｉｕｌｉａｎｏら、（１９９５）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２４：４０５−４３４、Ｇｉｕｌｉａｎｏら、（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：１−１６）。
【０２８７】
手順全てが完全に自動化される場合がある。例えば、試料物質の試料採取は、試料容器から試料を取り出すステップと、取り出された試料の少なくとも一部をテスト細胞培養（例えば、遺伝子発現が調節される細胞培養）に送達するステップとを含む、複数のステップで達成される場合がある。試料採取は、追加のステップ、特に好ましくは試料調製のステップを含む場合もある。１つのアプローチでは、たった１種類の試料のみが、ある時にはオート・サンプラー・プローブ（ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ  ｐｒｏｂｅ）に吸い込まれ、たった１種類の試料のみが、ある時には前記プローブに存在する。別の実施態様では、多数の試料が溶媒によって分離されるオート・サンプラー・プローブに吸い込まれる場合がある。さらに別の実施態様では、多数のプローブが自動試料採取のために平行して用いられる場合がある。
【０２８８】
一般的な場合には、試料採取は、手動か、半自動のやり方か、自動のやり方かで達成される場合がある。試料は、例えば、ピペットか、注射器型の手動式プローブかを用いて、手動で試料容器から取り出され、その後、評価システムの充填口又は注射口に手動で送達される場合がある。半自動のプロトコルでは、該プロトコルの局面のいくつかが自動で達成される（例えば、送達される）が、別の局面のいくつかは手動操作（例えば、作業制御工程からの試料の取り出し）を必要とする。しかし、前記試料は、例えば、オート・サンプラーを用いる完全に自動化されたやり方で、試料容器から取り出され、評価システムに送達されることが好ましい。
【０２８９】
標識
アッセイで用いられる特定の標識又は検出可能な原子団又はタグが、それらのリガンドへのＯＲＦファージの特異的な結合を顕著に妨害しない限り、本発明の重大な局面ではない。検出可能なグループは、検出可能な物理的又は化学的な性質を有する物質のいずれかの場合がある。かかる検出可能な標識は、免疫アッセイの分野で十分に開発され、一般的に、かかる方法で有用な多くの標識が本発明に適用される場合がある。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的な手段によって検出可能な組成物のいずれかである。本発明の有用な標識は、磁性ビーズ（例えば、ダイナビーズ（商標））と、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）と、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）と、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般的に用いられるその他のもの）と、コロイド金又は着色ガラス又はプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような比色標識とを含む。
【０２９０】
前記標識は、当業者に周知の方法に応じるアッセイの所望の成分に直接的又は間接的に結合される。上記したように、広範な標識が、必要とされる感度、前記化合物との連結しやすさと、必要な安定性と、利用可能な計測器と、廃棄規定とに依存する標識を選択して用いられる場合がある。
【０２９１】
非放射活性標識は、間接的な手段によってしばしば結合される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。その後、前記リガンドは、検出可能な酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物のようなシグナルシステムに、固有に検出可能にか、共有的にかのいずれかで結合される、もう１つの分子（例えばストレプトアビジン）分子に結合する。
【０２９２】
前記分子は、例えば、酵素又はフルオロフォアと連結することによってシグナルを生じる化合物に直接的に連結される場合もある。標識として興味のある酵素は、主に、特にホスファターゼ、エラスターゼ及びグリコシダーゼの加水分解酵素か、特にペルオキシダーゼのオキシダーゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅｓ）かであろう。蛍光化合物は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等を含む。化学発光化合物は、ルシフェリンと、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールとを含む。用いられる場合があるさまざまな標識又はシグナル産生システムの総説として、米国特許第４，３９１，９０４号公報明細書を参照せよ。
【０２９３】
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、前記標識が放射活性標識である場合には、検出手段は、シンチレーションカウンターか、オートラジオグラフィーのような写真フィルムかを含む。前記標識は蛍光標識である場合には、適切な光波長で蛍光色素を励起し、その結果として生じる蛍光を検出することによって検出される場合がある。前記蛍光は、写真フィルムを用いて、電荷結合素子（ＣＣＤｓ）又は光電子増倍管等のような電子検出器を使用することによって視覚的に検出される場合がある。同様に、酵素標識は、前記酵素に適切な基質を提供し、その結果として生じる反応産物を検出することによって検出される場合がある。最後に、簡便な比色標識は、前記標識と関連する色を単に観察することによって検出される場合がある。したがって、さまざまな試験紙アッセイでは、コンジュゲート化された金がしばしば桃色に見える一方、さまざまなコンジュゲート化されたビーズがビーズの色で見える。
【０２９４】
ＳＴＩＮＧ組成物の剤形及び投与
組成物は、ＳＴＩＮＧが関係する疾患のｉｎ  ｖｉｖｏの治療又は予防に有用である。これらは、ウイルス疾患、細菌感染、原生動物の寄生感染、癌、自己免疫疾患、炎症、移植、神経疾患又は障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、アルツハイマー病、肝疾患又は障害、胃腸疾患又は障害、糖尿病、癌、自己免疫、免疫関連疾患又は障害、神経疾患又は障害、神経変性疾患又は障害、神経の修復及び麻痺、神経内分泌分化、炎症性疾患、筋疾患又は障害、感染性生物に関係する疾患又は障害等を含む。
【０２９５】
本発明の１つの実施態様では、これらは、特に疾患を予防又は治療するための薬剤での使用のための化合物を提供し、前記疾患の症状は、例えば、癌、感染、自己免疫、移植等の免疫応答を変調することによって改変される場合がある。免疫応答を抑制することを所望されるこれらの疾患又は症状（例えば、炎症、自己免疫疾患又は障害、移植等）では、ＳＴＩＮＧは、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、抗体、アプタマー等で下向き調節される場合がある。免疫応答を増大又は増強することを所望されるこれらの症状では、ＳＴＩＮＧは、ＳＴＩＮＧ、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド等を発現するベクターを投与することによって、例えば、癌、ウイルス感染で再構築される場合がある。
【０２９６】
ＳＴＩＮＧ化合物又は同定された薬剤は、さまざまな手段によって評価される場合がある。細胞アッセイは、宿主細胞に対して毒性を示さないが、寄生生物の感染ライフサイクルか、ｅｘ  ｖｉｖｏの癌又は炎症細胞の遊走かを妨害するための化合物の能力を評価する。細胞アッセイは、寄生生物が感染したか、あるいはウイルスが感染した細胞の生存率を培養で測定する。ｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイは、例えば、感染か、癌の浸潤又は成長か、炎症性細胞の遊走と関係する疾患症状のような疾患症状を予防又は改善するための化合物の有効性を評価する。さらに、好ましい化合物は、疾患病原体の前記感染ライフサイクルの完了、癌細胞又は炎症細胞の遊走能等を遅延するか、妨害するか、予防するか、あるいは排除する。追加的に、好ましい化合物は、個人の感染か、あるいは個人の癌細胞又は炎症細胞の遊走を予防又は減少し、それによって、かかる感染又は変異細胞（ｒｏｇｕｅ  ｃｅｌｌ）の遊走に関係する病態を予防又は減少する。
【０２９７】
本発明の組成物及び方法は、異常細胞増殖を生じる疾患と、感染性病原体による疾患とに対する治療又は予防のため、特に、被験者の肺、心臓、肝臓、前立腺、脳、精巣、胃、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、腸（ｂｏｗｅｌ）、脊髄、洞、尿管又は卵巣の組織で起こる場合があるような感染の治療のために供されることが好ましい。また、本発明の方法は、ウイルス血症又は敗血症のような全身性症状の治療のために供される場合がある。また本発明の方法は、ウイルス感染又は細菌感染に関係する疾患及び障害と、感染性病原体によって生じるその他の障害のいずれかとを治療するために供されることが好ましい。
【０２９８】
前記化合物の効果の程度を調べるために、ＳＴＩＮＧを含むか、あるいは欠失する試料、アッセイ、培養又はテスト被験者は潜在的な化合物で処理され、前記テスト化合物なしの陰性対照試料と、前記ＳＴＩＮＧを抑制することが知られている化合物で処理された陽性対照試料とに対して比較される。（試験化合物で処理されていない）陰性対照試料は、相対的ＳＴＩＮＧ活性レベルが１００％であると指定される。ＳＴＩＮＧの発現、活性及び／又は機能の抑制は、前記対照に関しての前記ＳＴＩＮＧの発現、活性及び／又は機能が約９０％であるとき、達成され、７５％又は５０％であることが好ましく、２５−０％であることがより好ましい。
【０２９９】
本発明は、本明細書で言及された又は黙示された前記疾患状態の予防及び／又は処理に有用である。また、本発明は、ＳＴＩＮＧの発現、活性及び／又は機能の調節解除によって生じる疾患を治療又は予防する方法で有用であり、該方法は、本発明の化合物をそれを必要とする動物、特に哺乳類、最も好ましくはヒトに投与することを含む。本発明は、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、口蹄疫ウイルス及びＣｒｉｔｈｉｄｉａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｔｅによる感染を含む疾患と、骨粗鬆症、自己免疫、住血吸虫症、マラリア、腫瘍転移、異染性白質ジストロフィー、筋ジストロフィー及び筋萎縮とを治療する方法を特に提供する。
【０３００】
その他の例は、獣医学上及びヒトの病原寄生虫、アピコンプレックス門又は肉質鞭毛虫門の細胞内活性型寄生虫、トリパノソーマ、マラリア原虫、リーシュマニア、バベシア及びタイレリア、クリプトスポリジウム、サクロシスチダ（Ｓａｃｒｏｃｙｓｔｉｄａ）、アメーバ、コクシジウム及びトリコモナディア（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｄｉａ）を含む。また、これらの化合物は、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍによって生じる熱帯性マラリア、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ又はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅによって生じる三日熱マラリアの治療と、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅによって生じる四日熱マラリアの治療とに適している。前記化合物は、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉによって生じるトキソプラズマ病、例えば、Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉによって生じるコクシジウム病、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓによって生じる腸住肉胞子虫病（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓａｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａによって生じる赤痢、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍによって生じるクリプトスポリジウム症、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉによって生じるシャガス病、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ又はｇａｍｂｉｅｎｓｅによって睡眠病、皮膚及び内臓とその他の形態とのリーシュマニア症の治療に適している。また、前記化合物は、ウシ東海岸熱を生じる病原体のＴｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、アフリカのウシナガナ病（Ｎａｇａｎａ  ｃａｔｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）を生じる病原体のＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ又はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｖｉｖａｘ  ｖｉｖａｘ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｂｒｕｃｅｉ、スラ（Ｓｕｒｒａ）を生じるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｅｖａｎｓｉ、ウシ及びバッファロのテキサス熱を生じる病原体のＢａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ、イヌ、ネコ及びヒツジのヨーロッパウシバベシア症及びバベシア症を生じる病原体のＢａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、ヒツジ、ウシ及びブタのサルコシスチス症を生じる病原体のＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｏｖｉｃａｎｉｓ及びｏｖｉｆｅｌｉｓ、ウシ及びトリのクリプトスポリジウム症を生じる病原体のクリプトスポリジア、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ及びトリ、特にニワトリ及びシチメンチョウのコクシジウム病を生じる病原体のエイメリア及びイソスポラ種のような獣医学上の病原寄生虫によって感染した動物の治療に適している。リケッチアは、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｆｅｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｆｒｉｃａｅのような種を含み、チフス、リケッチア痘、ボタン熱（Ｂｏｕｔｏｎｎｅｕｓｅ  ｆｅｖｅｒ）、アフリカダニ刺熱（Ａｆｒｉｃａｎ  Ｔｉｃｋ  Ｂｉｔｅ  Ｆｅｖｅｒ）、ロッキー山紅斑熱、オーストラリアダニチフス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｔｉｃｋ  Ｔｙｐｈｕｓ）、フリンダース島紅斑熱（Ｆｌｉｎｄｅｒｓ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｆｅｖｅｒ）及びクイーンズランドダニチフス（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｔｉｃｋ  Ｔｙｐｈｕｓ）のような疾患を生じる。これらの疾患の治療では、本発明の前記化合物は、その他の薬剤と組み合わせて用いられる場合がある。
【０３０１】
重篤なヒト疾患を生じる細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのグラム陽性生物と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．のグラム陰性生物とであることが特に好ましい。
【０３０２】
もう１つの好ましい実施態様では、前記細菌はグラム陰性細菌である。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｉａ  ｃｅｐａｃｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．を含む。
【０３０３】
本発明に応じるヒト疾患を生じるか、あるいは関係する菌類は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉを含む（しかしこれらに限られない）ことが特に好ましい。
【０３０４】
ウイルス生物の非限定的な例は、表１に列挙されるものを含むが、これらに限られない。前記ウイルス生物についての情報は、Ｆｉｅｌｄｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、第１巻及び第２巻、ＢＮ  Ｆｉｅｌｄｓら（編）を参照せよ。
【０３０５】
【表１】
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【０３０６】
もう１つの好ましい実施態様では、本発明の化合物は、１種類又は２種類の化合物と、その他の既知の療法とを組み合わせて予防又は治療のために患者に投与される場合がある。例えば、癌の場合には、ＳＴＩＮＧ組成物は、化学療法的又は外科的な治療とともに投与される場合がある。
【０３０７】
また、本発明の前記化合物は、薬剤の濃度が骨吸収を抑制するか、あるいは本明細書で開示されるその他の治療上の指示のいずれかを達成するのに十分なやり方で患者に経口投与される場合がある。前記化合物を含む医薬品組成物は、前記患者の症状と一致するやり方で、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの経口投与量で投与されることが典型的である。前記経口投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまでであろうことが好ましい。
【０３０８】
５％ブドウ糖の水又は通常の生理食塩水か、適切な賦形剤を用いる類似の剤形かで前記化合物の静注が最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。非経口投与量は、システインタンパク質分解酵素を抑制するために有効な濃度で血漿において薬剤の濃度を維持するためのやり方で、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇとなるであろうことが典型的であり、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまでが好ましい。前記化合物は、約０．４ｍｇ／ｋｇ／日ないし約４００ｍｇ／ｋｇ／日の総１日投与量を達成するためのレベルで、１日に１ないし４回投与される場合がある。治療上の有効な本発明の化合物の正確な量と、かかる化合物が投与される最も良い経路とは、治療上の効果を有するために必要とされる濃度と、薬剤の血液レベルとを比較することによって、当業者によって容易に決定される。本発明の化合物のプロドラッグは、適切な方法のいずれかで調製される場合がある。前記プロドラッグの原子団が、機能性ケトン、特異的なケタール及び／又はヘミアセタールである前記化合物について、転換が従来の方法に従ってもたらされる場合がある。
【０３０９】
本発明の化合物、誘導体、塩、組成物等が本発明に従って投与されるとき、許容不可能な毒物学的な影響は全く予定されない。良好な生物学的利用能を有する場合がある本発明の前記化合物は、特定の薬理学的効果を有するために必要とされる化合物の濃度を決定するための多くの生物学的アッセイのうちの１つでテストされる場合がある。
【０３１０】
もう１つの好ましい実施態様では、それらは、ＳＴＩＮＧ化合物と、薬学的又は獣医学的に許容可能な担体とを１種類又は２種類以上含む医薬品又は獣医学上の組成物を提供される。治療又は予防される疾患又は症状に適切又は望ましいと考えられる場合があるとき、その他の活性物質が存在する場合もある。
【０３１１】
前記担体、又は、２種類以上が存在する場合には、前記担体のそれぞれは、処方のその他の成分と適合する意味で許容され、受容者に無害でなければならない。
【０３１２】
本明細書で説明される前記化合物は、上述されたさまざまな薬剤送達システムで用いられるのに適している。さらに、投与される化合物のｉｎ  ｖｉｖｏの血清半減期を増大するために、前記化合物は、カプセルに入れられるか、リポソームの内腔に導入されるか、あるいはコロイドとして調製される場合があるか、あるいは供される場合がある従来の手法が、前記化合物の延長された血清半減期を提供する。さまざまな方法が、例えば、Ｓｚｏｋａらの米国特許第４，２３５，８７１号公報明細書、米国特許第４，５０１，７２８号公報明細書及び米国特許第４，８３７，０２８号公報明細書と、引用により本明細書に取り込まれるもののそれぞれとで説明されるようなリポソームを調製するために利用可能である。さらに、標的化薬剤送達システム、例えば、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームで前記薬剤が投与される場合がある。前記リポソームは標的化され、器官によって選択的に取り込まれるであろう。
【０３１３】
前記剤形は、直腸、経鼻、（頬側及び舌下を含む）局部、膣内又は（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）非経口の投与に適切なものを含むが、前記剤形は経口的に投与される剤形であることが好ましい。前記剤形は、例えば、錠剤及び徐放性カプセルの剤形単位で提供される場合があることが好ましく、薬学の当業者に周知の方法のいずれかによって調製される場合がある。
【０３１４】
かかる方法は、上記の特定の活性剤と、前記担体とを会合するステップを含む。一般的に、前記剤形は、前記活性剤と、液性担体又は細かく分割された固形担体か、両方かとを均一的及び本質的に会合し、その後、必要な場合には、産物の形を整えることによって調製される。本発明は、薬学的又は獣医学的に許容可能な担体又は媒体と組み合わせるか、あるいは会合する、例えば、一般式（Ｉ）の化合物を含む医薬品組成物を調製するための方法に及ぶ。
【０３１５】
これらの方法を用いて同定されたＳＴＩＮＧ又はその他のいずれかの化合物は、薬学的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って処方される場合があり、それによって、前記化合物は薬学的に許容可能な担体媒体との混合物で組み合される。治療用製剤は、凍結乾燥された剤形又は水溶液の形状で、所望の純度を有する活性成分と、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤とを混合することによって保存のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０））。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、供される用量及び濃度で受容者に無毒であり、リン酸、クエン酸その他の有機酸のような緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、（残基約１０個未満の）低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン又はリジンのようなアミノ酸、単糖、二糖、及び、グルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような塩形成対イオン（ｓａｌｔ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎｓ）、及び／又は、ＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩアメイカス社、ニュージャージー州ブリッジウォーター）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州マウントオリーブ）又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０３１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏの投与のために用いられるべき前記製剤は、無菌で、発熱性物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）が不存在でなければならい。これは、凍結乾燥及び再構築の前又は後に、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０３１７】
投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内の経路による注射又は注入、局部投与、又は、徐放性システムに従う。
【０３１８】
本発明の医薬品組成物の用量及び所望の薬剤濃度は、想起された特定の使用に依存して変化する場合がある。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の医師の技術範囲内で十分である。動物実験は、ヒトの療法のための有効投与量を決定するための確かな指針を提供する。有効量の異種間の尺度構成は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，  Ｊ．及びＣｈａｐｐｅｌｌ，  Ｗ．、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔの「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ出版、ニューヨーク州、１９８９、４２−９６頁で規定された原理のとおり実施される場合がある。
【０３１９】
本発明の経口投与のための剤形は、活性剤の予定された量を含むカプセル、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔｓ）又は錠剤のそれぞれのような個別の単位か、粉末又は顆粒か、水溶液又は非水溶液の前記活性剤の溶液又は懸濁液か、水中油型乳剤又は油中水型乳剤か、あるいはボーラス等として提供される場合がある。
【０３２０】
経口投与のための組成物（例えば、錠剤及びカプセル）について、「許容可能な担体」という用語は、一般的な賦形剤、例えば結合剤、例えば、シロップ剤、アカシアゴム（ａｃａｃｉａ）、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース及びデンプンのような媒体と、例えば、トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、スクロース、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸の賦形剤（ｆｉｌｌｅｒｓ）及び担体と、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムその他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロール、シリコーン流体、タルク、ワックス、オイル及びコロイド状シリカのような潤滑剤とを含む。ペパーミント、ウィンターグリーンのオイル、サクランボ風味等のような風味剤が用いられる場合もある。容易に同定可能な投与剤形を作成するために着色剤を添加することが所望される場合がある。錠剤は、当業者に周知な方法によってコーティングされる場合もある。
【０３２１】
錠剤は、任意に１種類又は２種類以上の副成分とともに圧縮又は成形することによって作成される場合がある。圧縮された錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤と任意に混合された、粉末又は顆粒のような流れ易い（ｆｒｅｅ  ｆｌｏｗｉｎｇ）形状の前記活性剤を適切な機械で圧縮することによって調製される場合がある。成形された錠剤は、不活性希釈液で湿らされた粉末状の化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作成される場合がある。前記錠剤は、任意にコーティングされるか、あるいは刻み目を入れられる場合があり、前記活性剤の遅速性か、あるいは制御された放出を提供するために処方される場合がある。
【０３２２】
経口投与に適切なその他の剤形は、たいてはスクロースと、アカシアゴム又はトラガカントゴムとの風味付けされた基剤に前記活性剤を含むロゼンジ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）と、ゼラチン及びグリセリンか、スクロース及びアカシアゴムかのような不活性基剤に前記活性剤を含むパスティール剤（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）と、適切な液性担体に前記活性剤を含む口腔洗浄剤とを含む。
【０３２３】
非経口製剤は無菌であろうことが一般的である。
【０３２４】
キット
本発明に応じるキットは、ＳＴＩＮＧ分子、抗体等のうちの少なくとも１つを含む。また、前記キットは、（液体又は凍結の形状の）緩衝剤及び／又は賦形剤の溶液か、水で再構築されるべき緩衝剤及び／又は賦形剤の粉末調製物かを含む。したがって、ＳＴＩＮＧのペプチドを含むキットは、熱か、水か、前記キットで提供される溶液かの所定量を添加することが、疾患の治療における治療効果について化合物のいずれかを効率的にアッセイするための十分な濃度及びｐＨの剤形を生じるであろう濃度で、凍結されるか、凍結乾燥されるか、事前希釈されるか、あるいは事前混合されることが好ましい。また、かかるキットは、前記アッセイの成分を再構築し、使用するための説明書を含むであろうことが好ましい。前記キットは、再構築された活性組成物のための２種類又は３種類以上の構成部分を含む場合もある。例えば、第２の構成部分は、ユーロピウムクリプテート（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ  ｃｒｙｐｔａｔｅ）及びアロフィコシアニンで標識された抗タグ抗体の場合がある。上記の緩衝剤、賦形剤その他の構成部分は、キットと個別又は一緒に販売される場合がある。
【０３２５】
本発明のさまざまな実施態様が以上に説明されたが、これらは、例示目的のために提供され、限定的に解釈するものではないと理解されるべきである。開示された実施態様についての多くの変更が、本発明の趣旨又は技術的範囲から逸脱することなしに本明細書に応じて行われる場合がある。したがって、本発明の技術的範囲は、上記の実施態様のいずれかによって限定されるべきではない。
【０３２６】
本明細書で言及された文献全てが引用により取り込まれる。本出願で引用された全ての刊行物及び特許文献は、あたかも刊行物又は特許文献の各々が個別に表示されるように、同一の程度に全ての目的のために引用により取り込まれる。本明細書においてさまざまな引用文献を引用することによっては、特定の引用文献が本発明に対して「先行技術」でない旨を本発明の出願人は認める。本発明の組成物及び方法の実施態様は、以下の実施例で例示される。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
【図１Ａ】ヒト及びマウスのＳＴＩＮＧのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１Ｂ】ＴＭ及び富ロイシン領域を示すｈＳＴＩＮＧの概略図。
【図１Ｃ】ヒトＳＴＩＮＧのノーザンブロット解析の結果を示す写真。
【図１Ｄ】ＨＥＫ２９３細胞のＳＴＩＮＧの免疫ブロット解析の結果を示す写真。
【図１Ｅ】カルボキシル末端にＨＡでタグが付されたｈＳＴＩＮＧを用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の共焦点解析の結果を示す写真。
【図１Ｆ】ＳＴＩＮＧがＥＲ中に存在することを確かめる分画実験の結果を示す写真。
【図２Ａ】トランスフェクション３６時間後に行われたＩＦＮβのプロモーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｂ】トランスフェクション３６時間後に行われたＰＲＤＩＩＩ−Ｉのプロモーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｃ】トランスフェクション３６時間後に行われたＮＦ−κＢのプロモーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｄ】トランスフェクション３６時間後に行われたＩＳＲＥのプロモーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｅ】ＩＲＦ３の２量体化を検出するための免疫ブロット解析の結果を示す写真。
【図２Ｆ】ＩＦＮβのｍＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲ解析した結果を示すグラフ。
【図２Ｇ】トランスフェクションしたＭＥＦ由来の培地がＩＦＮβタンパク質についてＥＬＩＳＡによって解析された結果を示すグラフ。
【図２Ｈ】各遺伝子に対するｈＳＴＩＮＧの相対発現量を示す図。
【図２Ｉ】ベクター単独か、ｈＳＴＩＮＧ又はｍＳＴＩＮＧ又はΔＲＩＧ−Ｉ又はＩＰＳ−１を発現するプラスミドかを用いてトランスフェクションされたＭＥＦの写真。
【図２Ｊ】プラークアッセイによって測定されたウイルスのタイターを示すグラフ。
【図２Ｋ】ｈＳＴＩＮＧ、ｍＳＴＩＮＧ又はＴＢＫ−１がトランスフェクションされた正常及びＴＢＫ−１欠損のＭＥＦにおけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｌ】ｈＳＴＩＮＧ又はｍＳＴＩＮＧがトランスフェクションされた正常及びＦＡＤＤ欠損のＭＥＦにおけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｍ】ｈＳＴＩＮＧのバリアントの概念図。
【図２Ｎ】完全長のｈＳＴＩＮＧ及びｈＳＴＩＮＧのバリアントを用いるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図２Ｏ】ｈＳＴＩＮＧ−Ｆｕｌｌ、ｈＳＴＩＮＧ−Ｎ及びｈＳＴＩＮＧ−Ｃのさまざまな濃度におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図３Ａ】ｍＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉを用いるノックダウン実験の結果を示す免疫ブロット写真。
【図３Ｂ】ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）での２４時間感染後に、ｍＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで処理されたＭＥＦの蛍光顕微鏡（ＧＦＰ）の写真。
【図３Ｃ】ＩＦＮβのｍＲＮＡの発現量を示すグラフ。
【図３Ｄ】２４時間後に、ＲＮＡｉで処理されたか、あるいはＲＮＡｉで処理されていないＭＥＦから測定されたウイルスのタイターのグラフ。
【図３Ｅ】ＥＳ細胞におけるＳＴＩＮＧのターゲット相同組換え（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）の計画を表す概念図。
【図３Ｆ】ＳＴＩＮＧ−／−又は対照同腹子のＭＥＦにおけるＳＴＩＮＧのｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示すグラフ。
【図３Ｇ】ＳＴＩＮＧ−／−細胞又は対照のＭＥＦの免疫ブロットの結果を示す写真。
【図３Ｈ】ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  ０．１）での１２時間感染後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦの蛍光顕微鏡（ＧＦＰ）の写真。
【図３Ｉ】ＶＳＶ−ＧＦＰでの感染２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから測定されたウイルスのタイターのグラフ。
【図３Ｊ】ＶＳＶΔＭでの感染２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから測定されたウイルスのタイターのグラフ。
【図３Ｋ】ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）又はセンダイウイルス（ＳｅＶ  ＭＯＩ  １）で感染された２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから測定された内在性ＩＦＮβレベルを示すグラフ。
【図３Ｌ】ｄＡ−ｄＴでの２４時間処理後のＩＦＮβの発現量を示すグラフ。
【図３Ｍ】ＤＮＡがトランスフェクションされたＭＥＦの経時変化（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）解析の結果を示すグラフ。
【図３Ｎ】ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ及びｄＡ−ｄＴでの２４時間処理後のＢＭＤＭにおけるＩＦＮβの発現量を示すグラフ。
【図３Ｏ】ポリＩ：Ｃ、ＬＰＳ及びｄＡ−ｄＴでの２４時間処理後のＧＭ−ＤＣにおけるＩＦＮβの発現量を示すグラフ。
【図４Ａ】抗ＦＬＡＧ抗体で同時免疫沈降された後、抗ＨＡ抗体で免疫ブロット解析した結果を示す写真。
【図４Ｂ】内在性のＲＩＧ−Ｉに対する抗体を用いて免疫ブロット解析した結果を示す写真。
【図４Ｃ】免疫ブロット解析の結果を示す写真。
【図４Ｄ】ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図４Ｅ】染色した細胞の顕微鏡写真。
【図４Ｆ】ＩＦＮβの発現量を示すグラフ。
【図４Ｇ】線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングの結果を示す写真。
【図４Ｈ】免疫ブロットの結果を示す写真。
【図４Ｉ】免疫ブロットの結果を示す写真。
【図４Ｊ】ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図４Ｋ】抗ＦＬＡＧ及び抗ＨＡの抗体で染色された細胞の顕微鏡写真。
【図４Ｌ】免疫ブロットの結果を示す写真。
【図５Ａ】ＩＦＮβ−ルシフェラーゼのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図５Ｂ】ＲＢ−ルシフェラーゼのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図５Ｃ】Ｅ２Ｆ−ルシフェラーゼのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図５Ｄ】ｐ５３−ルシフェラーゼのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図６Ａ】ＩＦＮβのｍＲＮＡが定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された結果を示すグラフ。
【図６Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞における７２時間後のｈＳＴＩＮＧのＲＮＡｉノックダウンの確証を示す免疫ブロットの写真。
【図７Ａ】ＶＳＶ−Ｌｕｃでの感染後２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦで測定されたルシフェラーゼ活性を示すグラフ。
【図７Ｂ】ＶＳＶ−Ｌｕｃでの感染後２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから測定されたウイルスのタイターを示すグラフ。
【図７Ｃ】ＳＴＩＮＧ又はＳＴＩＮＧのカルボキシル領域（１７３−３７８番目のアミノ酸）で２４時間トランスフェクションされたＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦの顕微鏡観察の結果を示す写真。
【図７Ｄ】抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いて再構築されたＳＴＩＮＧの発現を確かめた結果を示す免疫ブロット。
【図７Ｅ】プラークアッセイによって２４時間の感染後に測定されたＶＳＶ−ＧＦＰのタイターを示すグラフ。
【図８Ａ】ポリＩ：Ｃ（リポ２０００  ３μＬ／ｍＬ中で１μｇ／ｍＬ）でトランスフェクションされたＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦにおけるＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図８Ｂ】ウイルスの複製がＢＨＫ細胞を用いて２４時間後にプラークアッセイによって測定した結果を示すグラフ。
【図９Ａ】ＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで７２時間処理されたＨｅＬａ細胞におけるＳＴＩＮＧのｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した結果を示すグラフ。
【図９Ｂ】ＩＦＮβに対するＲＮＡｉで７２時間処理されたＨｅＬａ細胞におけるＩＦＮβのｍＲＮＡレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した結果を示すグラフ。
【図９Ｃ】ＳＴＩＮＧ欠損マウス由来のＢＭＤＭ又はＧＭ−ＤＣが抗ＳＴＩＮＧ血清を用いて免疫ブロットによって解析された結果を示す写真。
【図１０Ａ】ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１及びＨＡ−ＳＴＩＮＧか、対照ベクターかで同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞を示す写真。
【図１０Ｂ】ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１及びＨＡ−ＳＴＩＮＧか、対照ベクター（１μｇ／ｍＬ）かで同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞を示すブロットの写真。
【図１１】ｍＳＴＩＮＧ（１μｇ／ｍＬ）及びＩＦＮβ−Ｌｕｃ（１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間同時トランスフェクションされたＲＩＧ−Ｉ又はＩＰＳ−１の欠損ＭＥＦか、対照ＭＥＦかにおけるルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフ。
【図１２Ａ】ＴＲＡＰβに対するＲＮＡｉ又は対照ＲＮＡｉで７２時間処理された２９３Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフ。
【図１２Ｂ】２９３Ｔ細胞は、Ｓｅｃ６１βに対するＲＮＡｉ又は対照ＲＮＡｉで７２時間処理された結果を示すブロットの写真。
【図１２Ｃ】ＲＮＡｉで７２時間処理された２９３Ｔ細胞の細胞生存率が、トリパンブルー排除解析を用いて測定された結果を示すグラフ。
【図１３Ａ】さまざまなＤＮＡリガンドを用いて１６時間トランスフェクションされたマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるＩＦＮβ又はＩＬ−６の濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１３Ｂ】ＩＳＤ（インターフェロン刺激性ＤＮＡ）で４時間トランスフェクションされたＭＥＦにおけるＩｆｎβ又はＩｆｎａ２のｍＲＮＡを測定したグラフ。
【図１３Ｃ】抗体染色された細胞の写真。
【図１３Ｄ】骨髄由来のマクロファージにおけるＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１３Ｅ】マクロファージにおけるＩＬ−１βの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１３Ｆ】ＧＭ−ＣＳＦで誘導された樹状細胞（ＧＭ−ＤＣ）におけるＩＦＮβ又はＩＦＮαの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１３Ｇ】Ｆｌｔ３で刺激された樹状細胞におけるＩＦＮβ又はＩＦＮαの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ａ】１ｘ１０７個のＨＳＶで感染されたＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は同腹子の対照（＋／＋）における細胞生存率を測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ｂ】ＨＳＶ−１で感染されたＳｔｉｎｇ−／−のマウス又は対照の脳におけるＨＳＶ−１のウイルスタイターを測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ｃ】ＨＳＶ−１で感染された動物におけるＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ｄ】ＨＳＶ−１で感染された動物におけるＩＦＮαの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ｅ】ＨＳＶ−１で感染された動物におけるＲＡＮＴＥＳの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ｆ】ＨＳＶ−１で感染された動物におけるＩＬ−６の濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１４Ｋ】ＩＦＮβプロモーターで駆動されるルシフェラーゼ（ＩＦＮ−β−Ｌｕｃ）を測定した結果を示すグラフ。
【図１５Ａ】オボアルブミンをエンコードするＤＮＡワクチンで免疫されたＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は対照（＋／＋）における抗ＯＶＡ  ＩｇＧのタイターを測定したグラフ。
【図１５Ｂ】オボアルブミンをエンコードするＤＮＡワクチンで免疫されたＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は対照（＋／＋）におけるＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋の陽性細胞率を測定した結果を示すグラフ。
【図１５Ｃ】オボアルブミンをエンコードするＤＮＡワクチンで免疫されたＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は対照（＋／＋）におけるＩＦＮ−γ濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１５Ｄ】オボアルブミンを発現するワクシニア（ＶＶ−ＯＶＡ；ｉ．ｖ．、５ｘ１０６個）を用いて感染されたＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は対照（＋／＋）においてＩＦＮ−γ濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１６Ａ】ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡ）で安定的に再構築されたＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦにおいてＨＡ（緑色）及びカルレティキュリン（赤色）の抗体を用いて染色した結果を示す顕微鏡写真。
【図１６Ｂ】ＨＡ−ＳＴＩＮＧのＭＥＦにおいてＨＡ−Ｓｔｉｎｇ（緑色）と、カルレティキュリン（青色）又はミトトラッカー（赤色）とで染色した結果を示す顕微鏡写真。
【図１６Ｃ】感染されていないか、あるいはＨＳＶ感染されたＨＡ−ＳＴＩＮＧのＭＥＦの分画実験の免疫ブロット解析の結果を示す写真。
【図１６Ｄ】ＩＳＤ、１本鎖ＤＮＡ又はＨＳＶで処理されたｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦにおいてＨＡ（緑色）又はカルレティキュリン（赤色）で染色した結果を示す顕微鏡写真。
【図１６Ｅ】ＩＳＤで処理されたｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦにおいてＨＡ（緑色）及びＴＢＫ−１（赤色）の抗体で染色された結果を示す顕微鏡写真。
【図１６Ｆ】ＩＳＤで処理されたｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦにおいてＨＡ（緑色）及びトランスフェリン受容体（Ｔｆｒ、赤色）の抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真。
【図１６Ｇ】ＩＳＤで処理されたｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦにおいてＨＡ（緑色）及びＳｅｃ５（赤色）の抗体で染色した結果を示す顕微鏡写真。
【図１６Ｈ】ＩＳＤと、ＴＲＡＰβ又はＳＥＣ５に対するＲＮＡｉとで処理されたＭＥＦにおいてＩＦＮβのｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフ。
【図１６Ｉ】ＩＳＤと、ＴＲＡＰβ又はＳＥＣ５に対するＲＮＡｉとで処理されたＭＥＦにおいてＩＦＮβのタンパク質濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１７】ポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）、ＩＳＤ、ＨＳＶ−１又はＣｐＧ  ＯＤＮで処理されたマクロファージにおいてＩＬ−６の濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１８Ａ】ＨＳＶ−１で感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおいて欠損Ｉ型ＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１８Ｂ】ＨＳＶ−１で感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおいて欠損Ｉ型ＩＦＮαの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１８Ｃ】ＶＳＶで感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおいて欠損Ｉ型ＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１８Ｄ】ＶＳＶで感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおいて欠損Ｉ型ＩＦＮαの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１８Ｅ】ＥＭＣＶで感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおいて欠損Ｉ型ＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１８Ｆ】ＥＭＣＶで感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおいて欠損Ｉ型ＩＦＮαの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図１９Ａ】ヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ、１２５−２２２番目のアミノ酸）は、フラビウイルスのＮＳ４Ｂタンパク質に顕著な相同性を有することを示すアライメント図。
【図１９Ｂ】ＳＴＩＮＧに対するＹＦＶのＮＳ４ｂの相同性を示す概略図。
【図１９Ｃ】ＦＬＡＧでタグ化されたＳＴＩＮＧと、ＨＡでタグ化されたＹＦＶ−ＮＳ４Ｂとでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞を共焦点顕微鏡で観察した写真。
【図２０】ＩＳＤに曝露後のエンドソームへのＳＴＩＮＧの移行を観察した結果を示す顕微鏡写真。
【図２１Ａ】Ｓｅｃ５に対するＲＮＡｉで処理された細胞を免疫ブロットによって解析した結果を示す写真。
【図２１Ｂ】Ｔｒａｐβに対するＲＮＡｉで処理された細胞をＲＴ−ＰＣＲによって測定した結果を示すグラフ。
【図２２】正常なヒト細胞及びヒト癌細胞株において、ＩＦＮ−β産生に基づいて細胞内ＤＮＡ経路の有無を調べた結果を示すグラフ。
【図２３】ＳＴＩＮＧは多くの癌細胞株では存在しないが、正常な細胞では存在することを示すウエスタンブロットの写真。
【図２４】さまざまな細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現を示すウエスタンブロットの写真。
【図２５】さまざまな細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現を示すノーザンブロットの写真。
【図２６】さまざまなヒトリンパ腫細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現を示すウエスタンブロットの写真。
【図２７】さまざまなヒトリンパ腫細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現を示すノーザンブロットの写真。
【図２８】正常なヒト細胞のさまざまなタイプにおける内在性のＳＴＩＮＧの発現を示すウエスタンブロットの写真。
【図２９Ａ】正常なヒト細胞（ＰＡＳＭＣ及びＮＨＤＦ−ａｄ）又はヒト癌細胞（２９３Ｔ及びＭＣＦ７）におけるｈＳＴＩＮＧの発現を示す免疫ブロット解析の写真。
【図２９Ｂ】ヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ）、マウスＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ）又はΔＲＩＧ−Ｉで処理された、２９３Ｔ細胞におけるＩＦＮ−β−Ｌｕｃのルシフェラーゼ活性と、ＭＣＦ７細胞におけるＩＦＮβの濃度とを測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ａ】ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７でトランスフェクションされ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−のＭＥＦの顕微鏡写真。
【図３０Ｂ】ＩＳＤで処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−のＭＥＦのＮＦ−κＢ  ｐ６５活性について解析した結果を示すグラフ。
【図３０Ｃ】ＩＳＤ又はポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）で処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−のマクロファージのカスパーゼ−１  ｐ１０断片について解析した結果を示す写真。
【図３０Ｄ】ポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）及びＩＳＤで処理されたマクロファージにおいてＩＬ−６濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ｅ】ＳＴＩＮＧが再構築されたＳｔｉｎｇ−／−のＭＥＦにおけるＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ｆ】ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）又はワクシニアウイルス（ＶＶΔＥ３Ｌ）で処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−のＭＥＦにおけるＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ｇ】ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）又はワクシニアウイルス（ＶＶΔＥ３Ｌ）又はバキュロウイルスで処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−のＧＭ−ＤＣｓにおいてＩＦＮβ産生を測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ｈ】ＦＩＴＣ−ＩＳＤで処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−由来のＧＭ−ＤＣｓを観察した顕微鏡写真。
【図３０Ｉ】ＤＡＩでトランスフェクションされ、ＩＳＤで処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋及び−／−のＭＥＦにおいてＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ｊ】ポリ（ｄＡ：ｄＴ）と、ＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉとで処理されたＬ９２９細胞においてＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３０Ｋ】ＳＴＩＮＧのノックダウンを解析した結果を示す免疫ブロットの写真。
【図３１Ａ】ＣＤ３を指標にして、非刺激条件下のＳＴＩＮＧ＋／＋及び−／−の動物における正常なＴ細胞及びＢ細胞のレパートリーを示すＦＡＣＳ解析の結果図。
【図３１Ｂ】ＣＤ４を指標にして、非刺激条件下のＳＴＩＮＧ＋／＋及び−／−の動物における正常なＴ細胞及びＢ細胞のレパートリーを示すＦＡＣＳ解析の結果図。
【図３１Ｃ】ＣＤ１９を指標にして、非刺激条件下のＳＴＩＮＧ＋／＋及び−／−の動物における正常なＴ細胞及びＢ細胞のレパートリーを示すＦＡＣＳ解析の結果図。
【図３１Ｄ】不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のオボアルブミンで免疫されたＳＴＩＮＧ＋／＋及び−／−のマウス（４匹）において抗ＯＶＡ抗体の産生を評価した結果を示すグラフ。
【図３２Ａ】ＨＡ−ＳＴＩＮＧで安定的にトランスフェクションされたＳｔｉｎｇ−／−のＭＥＦにおけるＳＴＩＮＧの発現を示す免疫ブロット解析の写真。
【図３２Ｂ】ＩＳＤ処理前に、ブレフェルジンＡ又はクロロキンで処理されたＭＥＦを観察した顕微鏡写真。
【図３２Ｃ】ＩＳＤ又はポリＩＣでの処理前に、ブレフェルジンＡで処理されたＭＥＦにおけるＩＦＮβのｍＲＮＡの発現を測定した結果を示すグラフ。
【図３２Ｄ】ブレフェルジンＡで処理されたＭＥＦにおけるｈＳＴＩＮＧの発現を測定した結果を示すウエスタンブロットの写真。
【図３２Ｅ】さまざまな濃度のブレフェルジンＡで処理されたときのＳＴＩＮＧ、ＩＲＦ３又はＩＲＦ７がトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞においてＩＦＮ−ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフ。
【図３２Ｆ】クロロキンと、ＩＳＤ又はポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）とで処理されたＢＭＤＭにおいてＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３２Ｇ】クロロキンと、ＩＳＤ、ポリ（ｄＡＴ−ｄＡＴ）又はＬＰＳとで処理されたマクロファージにおけるＩＬ−６の濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３２Ｈ】ＨＡ−ＳＴＩＮＧ又はＨＡ−ＳＴＩＮＧΔＳＰでトランスフェクションされ、ＩＳＤで処理された細胞を観察した顕微鏡写真。
【図３２Ｉ】ＨＡ−ＳＴＩＮＧ又はＨＡ−ＳＴＩＮＧΔＳＰをトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞においてルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフ。
【図３３Ａ】ＩＳＤで処理されたＳＴＩＮＧ＋／＋又は−／−のＭＥＦを、抗ＴＢＫ抗体又は抗カルレティキュリン抗体（赤色）を用いて免疫蛍光解析した顕微鏡写真。
【図３３Ｂ】ＨＡ−ＳＴＩＮＧでトランスフェクションされたＴＢＫ１＋／＋又は−／−のＭＥＦを、抗ＨＡ抗体又は抗カルレティキュリン抗体を用いて免疫蛍光解析した顕微鏡写真。
【図３４Ａ】Ｓｅｃ５又はＳｅｃ６１βに対するＲＮＡｉで処理された細胞においてＳｅｃ５又はＳｅｃ６１βの発現を解析した結果を示す免疫ブロットの写真。
【図３４Ｂ】Ｔｒａｐβに対するＲＮＡｉで処理された細胞においてＴｒａｐβのｍＲＮＡの発現を測定した結果を示すグラフ。
【図３４Ｃ】Ｓｅｃ５又はＳＴＩＮＧのＲＮＡｉで処理されたＭＥＦにおいて、ＨＳＶ−１感染後のウイルスのタイターを測定した結果を示すグラフ。
【図３４Ｄ】Ｓｅｃ５又はＳＴＩＮＧのＲＮＡｉで処理されたＭＥＦにおいて、ＨＳＶ−１感染後のＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３４Ｅ】Ｔｒａｐβ、Ｓｅｃ６１β又はＳｅｃ５に対するＲＮＡｉで処理されたＭＥＦにおいて、ＩＳＤ処理後のＩｆｎｂのｍＲＮＡの発現を測定した結果を示すグラフ。
【図３４Ｆ】Ｔｒａｐβ、Ｓｅｃ６１β又はＳｅｃ５に対するＲＮＡｉで処理されたＭＥＦにおいて、ＩＳＤ処理後のＩＦＮβの濃度を測定した結果を示すグラフ。
【図３５Ａ】ｈＳＴＩＮＧでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞におけるｈＳＴＩＮＧの発現を免疫染色解析した結果を示す顕微鏡写真。
【図３５Ｂ】ｈＳＴＩＮＧでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞におけるｈＳＴＩＮＧの発現を解析した結果を示す免疫ブロットの写真。
【０３２８】
図１Ａは、ヒト及びマウスのＳＴＩＮＧのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。図１Ｂは、ＴＭ及び富ロイシン領域を示すｈＳＴＩＮＧの概略図を示す。図１Ｃは、ヒトのＳＴＩＮＧのノーザンブロット解析を示す。図１Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞のＳＴＩＮＧの免疫ブロット解析を示す。ＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ）に対するＲＮＡｉ又は対照ＲＮＡｉ（ＮＳ）が抗体の特異性を確かめるために用いられた。図１Ｅは、カルボキシル末端にＨＡでタグ化されたｈＳＴＩＮＧでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の共焦点解析を示す。また、トランスフェクションされた細胞は、ＥＲ−ｄｓＲｅｄ、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）又はゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）−ｄｓＲｅｄを用いて解析された。図１Ｆは、ＳＴＩＮＧがＥＲ中に存在することを確かめる分画実験を示す。対照抗体は分画精度を示す（カルレティキュリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）−ＥＲ、ＣＯＸ  ＩＶ−ミトコンドリア、ベータアクチン−細胞質）。
【０３２９】
図２Ａでは、２９３Ｔ細胞は、ヒトのｈＳＴＩＮＧ、マウスのｍＳＴＩＮＧ又は対照のΔＲＩＧ−Ｉの量（５０ｎｇ、１５０ｎｇ、２５０ｎｇ）を増加しながら５０ｎｇのｐ１１０−Ｌｕｃプラスミド及び１０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ標準化プラスミドを用いてトランスフェクションされた。ＩＦＮβプロモーター活性を示すルシフェラーゼアッセイがトランスフェクション３６時間後に行われた。ＰＲＤＩＩＩ−Ｉ−Ｌｕｃ（図２２Ｂ）、ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ（図２Ｃ）又はＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（図２Ｄ）の応答性プラスミドを用いて、図２Ａでのようにトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞が同様に解析された。図２Ｅでは、２９３Ｔ細胞は、２５０ｎｇのベクター単独か、ＳＴＩＮＧ、ＩＰＳ−１又はＴＢＫ−１を発現するプラスミドかを用いて２４時間トランスフェクションされ、溶解された細胞が、非変性（ｎａｔｉｖｅ）ゲル電気泳動と、その後のＩＲＦ３の２量体化を検出するための抗体を用いる免疫ブロットとによって解析された。図２Ｆでは、ＭＥＦは、ベクター単独か、ｈＳＴＩＮＧ又はｍＳＴＩＮＧ又はＩＰＳ−１を発現するプラスミド（５００ｎｇ）かを用いてトランスフェクションされ、ｍＲＮＡがトランスフェクション２４時間後に回収された。ＩＦＮβのｍＲＮＡがｑＲＴ−ＰＣＲによって解析された。図２Ｇでは、トランスフェクションされたＭＥＦ由来の培地が、ＩＦＮβタンパク質についてＥＬＩＳＡによって解析された。図２Ｈでは、２９３Ｔ細胞は、対照か、あるいはｈＳＴＩＮＧを発現するプラスミド２５０ｎｇを用いてトランスフェクションされ、ｍＲＮＡがＤＮＡマイクロアレイによる解析のために３６時間後に回収された。図２Ｉでは、ＭＥＦは、ベクター単独か、ｈＳＴＩＮＧ又はｍＳＴＩＮＧ又はΔＲＩＧ−Ｉ又はＩＰＳ−１を発現するプラスミド（５００ｎｇ）かを用いてトランスフェクションされ、ＶＳＶ−ＧＦＰを用いてＭＯＩ  １でトランスフェクション３６時間後に感染された。図２Ｊでは、実験（図２Ｈ）由来のウイルスの複製が、プラークアッセイによって測定された。図２Ｋでは、正常又はＴＢＫ−１欠損のＭＥＦが、１０ｎｇのＰＲＬ−ＴＫとともに、ベクター単独か、ｈＳＴＩＮＧ、ｍＳＴＩＮＧ又はＴＢＫ−１を発現するプラスミド（５００ｎｇ）かと、１００ｎｇのマウスＩＦＮβ−Ｌｕｃレポータープラスミドとを用いて２４時間トランスフェクションされ、ルシフェラーゼが測定された。図２Ｌでは、正常又はＦＡＤＤ−／−のＭＥＦが図２Ｋでのように処理され、ルシフェラーゼが測定された。図２Ｍは、ｈＳＴＩＮＧのバリアントの概念図である。図２Ｎでは、２９３Ｔ細胞は、完全長のｈＳＴＩＮＧ又はｈＳＴＩＮＧのバリアントを用いて図２Ａでのようにトランスフェクションされ、ルシフェラーゼが測定された。図２０では、２９３Ｔ細胞は、図２Ａでのようにルシフェラーゼのプラスミドとともに、ｈＳＴＩＮＧ−Ｆｕｌｌ、ｈＳＴＩＮＧ−Ｎ又はｈＳＴＩＮＧ−Ｃ（０ｎｇ、１５０ｎｇ、２５０ｎｇ）の量を増加しながら１００ｎｇの完全長のＳＴＩＮＧを用いてトランスフェクションされた。ルシフェラーゼが３６時間後に測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【０３３０】
図３Ａでは、ＭＥＦ（Ｃ５７／ＢＬ６）は、ｍＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで処理され、ノックダウンが抗ＳＴＩＮＧウサギ抗血清を用いる免疫ブロットによって７２時間後に確かめられた。図３Ｂでは、ｍＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで処理され、その後にＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）で２４時間感染されたＭＥＦが蛍光顕微鏡観察（ＧＦＰ）された。図３Ｃでは、ＲＮＡｉで処理された細胞はＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）で１６時間感染され、ＩＦＮβのｍＲＮＡが定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された。図３Ｄでは、ウイルスのタイターが、２４時間後に、ＲＮＡｉで処理されたか、あるいはＲＮＡｉで処理されていないＭＥＦから得られた。図３Ｅは、ＥＳ細胞におけるＳＴＩＮＧのターゲッティング相同組換えの計画を表す概念図である。図３Ｆでは、ＳＴＩＮＧ−／−又は対照同腹子のＭＥＦにおけるＳＴＩＮＧのｍＲＮＡが定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析された。図３Ｇでは、図３Ａでのような血清を用いてＳＴＩＮＧ−／−細胞又は対照のＭＥＦが免疫ブロットされた。図３Ｈでは、ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  ０．１）での１２時間感染後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦが蛍光顕微鏡観察（ＧＦＰ）された。図３Ｉでは、ウイルスのタイターがＶＳＶ−ＧＦＰでの感染２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから得られた。図３Ｊでは、ウイルスのタイターが、ＶＳＶΔＭでの感染２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから得られた。図３Ｋでは、内在性ＩＦＮβレベルが、ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）又はセンダイウイルス（ＳｅＶ  ＭＯＩ  １）で感染された２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから測定された。図３Ｌでは、ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦ又は対照は、トランスフェクション（Ｌｉｐｏ２０００［３μＬ／ｍＬ］）されるポリｄＡ−ｄＴで２４時間処理され、ＩＦＮβがＥＬＩＳＡによって測定された。図３Ｍは、ＤＮＡでトランスフェクションされたＭＥＦの経時変化解析である。図３Ｎでは、ＢＭＤＭが、外来性のポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）又はＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）か、図３ＬでのようにトランスフェクションされるポリｄＡ−ｄＴ（１０μｇ／ｍＬ）かで処理され、ＩＦＮβがＥＬＩＳＡによって２４時間後に測定された。図３Ｏでは、ＧＭ−ＤＣｓが図３Ｎのように処理された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【０３３１】
図４Ａでは、２９３Ｔ細胞が、ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧと、ＦＬＡＧでタグ化されたＲＩＧ−Ｉ又はＭＤＡ５とを用いて２４時間同時トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）された。細胞は、ＳｅＶ（ＭＯＩ  １）で１２時間感染された。細胞は溶解され、抗ＦＬＡＧ抗体で同時免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ）され、その後、ＨＡに対する抗体を用いて免疫ブロット解析された。図４Ｂでは、ＨＵＶＥＣｓが溶解され、内在性のｈＳＴＩＮＧに対する抗体を用いて免疫沈降された。洗浄された沈殿物は、内在性のＲＩＧ−Ｉに対する抗体を用いて免疫ブロットされた。図４Ｃでは、２９３Ｔ細胞は、ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧと、ＦＬＡＧでタグ化されたＲＩＧ−Ｉ、ΔＲＩＧ−Ｉ（１−２８４番目のアミノ酸）又はＲＩＧ−Ｉ−Ｃ（２１８−９２５番目のアミノ酸）とを用いて２４時間同時トランスフェクションされた。細胞は溶解され、抗ＦＬＡＧ抗体で同時免疫沈降され、その後、ＨＡに対する抗体を用いて免疫ブロット解析された。図４Ｄでは、２９３Ｔ細胞は、１５０ｎｇのΔＲＩＧ−Ｉとともに、対照ベクター（−）か、あるいは完全長か、アミノ（１−２３０番目のアミノ酸）か、カルボキシル（１７３−３７９番目のアミノ酸）かのＳＴＩＮＧ（０、１５０ｎｇ及び２５０ｎｇ）の量を増加しながら同時トランスフェクションされた。ルシフェラーゼは３６時間後に測定された。図４Ｅでは、２９３Ｔ細胞は、ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧと、ＦＬＡＧでタグ化されたＲＩＧ−Ｉとで２４時間同時トランスフェクションされた。材料及び方法で説明されたように、細胞は固定され、抗ＦＬＡＧ及び抗ＨＡの抗体で染色された。図４Ｆでは、対照又はＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦは、ΔＲＩＧ−Ｉ（１−２８４番目のアミノ酸）又はＩＰＳ−１で２４時間トランスフェクションされた。内在性のＩＦＮβがＥＬＩＳＡによって測定された。図４Ｇでは、材料及び方法で説明されたように、シグナルペプチド（３６−３６９番目のアミノ酸；ＢＤ−ｈＳＴＩＮＧΔＳＰ）か、ＳＴＩＮＧのカルボキシル領域（１７３−３７９番目のアミノ酸；ＢＤ−ｈＳＴＩＮＧ−Ｃ）かを含む、最初のアミノ酸３５個を欠失しているＳＴＩＮＧが、酵母のＧＡＬ４転写因子の結合ドメインに融合され、酵母ＧＡＬ４転写因子の活性化ドメインに融合されたヒトＩＦＮ誘導性線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられた。ＢＤ−ｈＳＴＩＮＧ−Ｃは、Ｓｓｒ−２／ＴＲＡＰβ（ＡＤ−ｈＴＲＡＰβ）と相互作用するが、対照ベクター（ＡＤ）又は陰性対照（ＡＤベクター含有）とは相互作用しないことが発見された。ＢＤ（−Ｔｒｐ）及びＡＤ（−Ｌｅｕ）のプラスミドの両方を有する酵母の効率が、左のパネル（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ）で示され、右のパネル（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ、−Ａｄｅ、−Ｈｉｓ）で高いストリンジェンシーの相互作用が示された。図４Ｈでは、ＨＥＫ２９３細胞は、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＡＰβ（＋）で３６時間トランスフェクションされた。細胞溶解物は抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降され、内在性のＳＴＩＮＧ又は内在性のＳｅｃ６１βに対する抗体を用いて免疫ブロットされた。図４Ｉでは、ＨＥＫ２９３細胞は、ＦＬＡＧ���ＴＲＡＰβ及びＨＡ−ＳＴＩＮＧで３６時間トランスフェクションされた。細胞は溶解され、内在性のＳｅｃ６１βか、ＦＬＡＧ又はＨＡかに対する抗体を用いて免疫ブロットされた。図４Ｊでは、２９３Ｔ細胞は、ＴＲＡＰβ、ＳＥＣ６１β又はＳｅｃ５に対するＲＮＡｉで４８時間処理された。その後、細胞は、ＨＡ−ＳＴＩＮＧ及びＩＦＮβ−Ｌｕｃで２４時間同時トランスフェクションされた。ルシフェラーゼ活性は、説明されたように測定された。図４Ｋでは、２９３Ｔ細胞は、ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧと、ＦＬＡＧでタグ化されたＴＲＡＰβとで２４時間同時トランスフェクションされた。材料及び方法で説明されたように、細胞は固定され、抗ＦＬＡＧ及び抗ＨＡの抗体で染色された。図４Ｌでは、ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＡ−ＳＴＩＮＧと、ＧＦＰＴＢＫ−１とで３６時間トランスフェクションされた。同時免疫沈降実験は、ＨＡでタグ化された抗体を用いて実施され、免疫ブロットがＧＦＰ抗体を用いて実施された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【０３３２】
図５Ａ−Ｄは、２９３Ｔ細胞が、ルシフェラーゼレポーターを駆動するＩＦＮβ（ｐ１１０）、ＲＢ、Ｅ２Ｆ又はｐ５３のプロモーターを用いて、図２でのようなＳＴＩＮＧ又はΔＲＩＧ−Ｉで同時トランスフェクションされたことを示すグラフである。３６時間後、ルシフェラーゼ活性が測定された。アスタリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【０３３３】
図６Ａは、材料及び方法で説明されたように、ｈＳＴＩＮＧのＲＮＡｉノックダウンが、抗ＳＴＩＮＧウサギ血清を用いる免疫ブロットによってＨＥＫ２９３細胞において７２時間後に確かめられたことを示すブロットである。図６Ｂは、図６Ａでのように、ＲＮＡｉで処理された細胞がＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）で１６時間感染され、ＩＦＮβのｍＲＮＡが定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定されたことを示すグラフである。アスタリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【０３３４】
図７Ａは、ＶＳＶ−Ｌｕｃでの感染後２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦで測定されたルシフェラーゼ活性を示すグラフである。図７Ｂは、ＶＳＶ−Ｌｕｃでの感染後２４時間後のＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦから得られたウイルスのタイターを示すグラフである。図７Ｃは、ＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦが、ＳＴＩＮＧ又はＳＴＩＮＧのカルボキシル領域（１７３−３７８番目のアミノ酸）で２４時間トランスフェクションされたことを示す写真である。その後、細胞は、ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  ０．１）で２４時間感染された。蛍光は図３Ｂでのように顕微鏡を用いて検出された。図７Ｄは、抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いて再構築されたＳＴＩＮＧの発現を確かめる免疫ブロットである。図７Ｅは、プラークアッセイによって感染後２４時間で測定された図７ＣのＶＳＶ−ＧＦＰのタイターを示すグラフである。
【０３３５】
図８Ａは、ポリＩ：Ｃ（リポ２０００  ３μＬ／ｍＬ中で１μｇ／ｍＬ）でトランスフェクションされたＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦを示すグラフである。材料及び方法で説明されたように、ＩＦＮβはＥＬＩＳＡを用いて測定された。図８Ｂは、ＥＭＣＶがＳＴＩＮＧ−／−又は対照のＭＥＦに接種するために用いられたことを示すグラフである。ウイルスの複製は、ＢＨＫ細胞を用いて２４時間後にプラークアッセイによって測定された。
【０３３６】
図９Ａは、ＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで７２時間処理されたＨｅＬａ細胞を示すグラフである。定量的ＲＴ−ＰＣＲがノックダウンを確かめるために用いられた。図９Ｂは、ＲＮＡｉ処理の７２時間後ＩＳＤ（リポ２０００  ３μＬ／ｍＬで３μｇ／ｍＬ）か、ポリｄＡ−ｄＴ（リポ２０００  ３μＬ／ｍＬで３μｇ／ｍＬ）かが細胞を６時間処理するために用いられたことを示すグラフである。ＩＦＮβのｍＲＮＡ産物は定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定された。図９Ｃは、ＳＴＩＮＧ欠損マウス由来のＢＭＤＭ又はＧＭ−ＤＣｓが抗ＳＴＩＮＧ血清を用いる免疫ブロットによって解析されたことを示す。図９Ｄは、ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）で２４時間感染されたＳＴＩＮＧ欠損マウス由来のＢＭＤＭを示すグラフである。材料及び方法で説明されたように、ウイルスの複製はプラークアッセイによって測定された。図９Ｅは、ＶＳＶ−ＧＦＰ（ＭＯＩ  １）で２４時間感染されたＳＴＩＮＧ欠損マウス由来のＧＭ−ＤＣｓを示すグラフである。材料及び方法で説明されたように、ウイルスの複製はプラークアッセイによって測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【０３３７】
図１０Ａは、ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１と、ＨＡ−ＳＴＩＮＧ又は対照ベクターとで同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞を示す写真である。２４時間後に、材料及び方法で説明されたように、細胞は固定され、材料及び方法で説明されたように、共焦点顕微鏡を用いて調べられた。図１０Ｂは、ＦＬＡＧ−ＩＰＳ−１と、ＨＡ−ＳＴＩＮＧ又は対照ベクター（１μｇ／ｍＬ）とで同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞を示すブロットである。２４時間後、細胞は溶解され、ＨＡ抗体を用いて免疫沈降された。洗浄された免疫沈降物はＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いて分離され、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫ブロットされた。
【０３３８】
図１１は、ｍＳＴＩＮＧ（１μｇ／ｍＬ）及びＩＦＮβ−Ｌｕｃ（１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間同時トランスフェクションされた、ＲＩＧ−Ｉ又はＩＰＳ−１の欠損ＭＥＦか、対照ＭＥＦかを示すグラフである。材料及び方法で説明されたように、ルシフェラーゼ活性が測定された。
【０３３９】
図１２Ａは、ＴＲＡＰβに対するＲＮＡｉ又は対照ＲＮＡｉで７２時間処理された２９３Ｔ細胞を示すグラフである。ノックダウンの確認は定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施された。図１２Ｂは、Ｓｅｃ６１βに対するＲＮＡｉ又は対照ＲＮＡｉで７２時間処理された２９３Ｔ細胞を示すブロットである。ノックダウンの確認はＳｅｃ６１βに対する抗体を用いて実施された。図１２Ｃは、７２時間後、前記ＲＮＡｉで処理された２９３Ｔ細胞の細胞生存率が、トリパンブルー排除解析を用いて測定されたことを示すグラフである。
【０３４０】
図１３Ａ−１３Ｇは、ＳＴＩＮＧが、細胞内ＤＮＡで仲介されるＩＦＮ産生に必要不可欠であることを示す。図１３Ａでは、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）が（リポフェクタミン２０００とともに）１μｇ／ｍＬのＤＮＡリガンドを用いて１６時間トランスフェクションされ、ＩＦＮβ又はＩＬ−６が測定された。図１３Ｂでは、ＭＥＦはＩＳＤ（インターフェロン刺激性ＤＮＡ）で４時間トランスフェクションされ、Ｉｆｎβ又はＩｆｎａ２のｍＲＮＡが測定された。図１３Ｃでは、図１３Ｂでのように処理されたＭＥＦは、ＩＲＦ３の移行のための抗体によって染色された。図１３Ｄでは、骨髄由来のマクロファージは、１６時間、ポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）、ポリ（ＬＣ）又はＩＳＤでトランスフェクションされたか、あるいはＨＳＶ（ｍｏｉ  １０）又はリステリア（ｍｏｉ  １０）で感染され、ＩＦＮβが測定された。図１３Ｅでは、マクロファージがＨＳＶ−１で１６時間感染され、ＩＬ−１βが測定された。図１３Ｆでは、ＧＭ−ＣＳＦで誘導された樹状細胞（ＧＭ−ＤＣ）が図１３Ｄでのように処理され、１６時間後、ＩＦＮβ又はＩＦＮαが測定された。図１３Ｇでは、Ｆｌｔ３で刺激された樹状細胞は図１３Ｆでのように処理された（外来性のＣｐＧ−ＯＤＮ（１μｇ／ｍＬ）がさらに使用された。）。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３４１】
図１４Ａ−１４Ｋは、ＳＴＩＮＧがｉｎ  ｖｉｖｏの有効な宿主防御に必要とされることを示す。図１４Ａは、ＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は同腹子の対照（＋／＋）（７匹、約８週齢）は、１ｘ１０７個のＨＳＶを用いて静注（ｉ．ｖ．）で感染され、生存率が監視された。図１４Ｂでは、Ｓｔｉｎｇ−／−マウス又は対照は図１４ＡでのようにＨＳＶ−１で感染され、ＨＳＶ−１プラークアッセイのために５日後に、脳が取り出された。図１４Ｃ、１４Ｄでは、ＨＳＶ（１ｘ１０７個、ｉ．ｖ．）で感染された動物（３匹）由来の血清が６時間後にＩＦＮβ又はＩＦＮαの産生について解析された。図１４Ｅ、１４Ｆでは、図１４Ｃでのように感染された動物由来の血清がＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６の産生について解析された。図１４Ｇでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物又は対照（６匹）が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、５ｘ１０７個）を用いて静注で感染され、生存率が監視された。図１４Ｈ、１４Ｉでは、マウス（３匹）が図１４Ｇでのように処理され、ＩＦＮβ又はＩＦＮαが６時間後に測定された。図１４Ｊでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物又は対照（６匹）は脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ、１ｘ１０７個）を用いて腹腔内注射（ｉ．ｐ）で感染され、生存率が監視された。図１４Ｋでは、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）ＮＳ４ｂの量を増加しながら、ＳＴＩＮＧ又はＲＩＧ−１のアミノ末端（ΔＲＩＧ−１、１−２８４）とともに２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションされ、トランスフェクションされたＩＦＮβプロモーターで駆動されるルシフェラーゼ（ＩＦＮ−β−Ｌｕｃ）が３６時間後に測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３４２】
図１５Ａ−１５Ｄは、ＳＴＩＮＧは、ＤＮＡで仲介される有効な獲得免疫応答に必要とされることを示す。図１５Ａでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は対照（＋／＋）［４匹、約８週齢］は、オボアルブミンをエンコードするＤＮＡワクチンを電気穿孔法によって２回（１００μｇ、筋注［ｉ．ｍ．］）免疫された。血清が抗ＯＶＡ  ＩｇＧについて測定された。図１５Ｂ、１５Ｃでは、マウスは処理され、脾臓のＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋の細胞がＦＡＣＳによって測定され、抗ＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ産生がＥＬＩＳＡによって測定された。図１５Ｄでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は対照（＋／＋）［４匹、約８週齢］は、オボアルブミンを発現するワクシニア（ＶＶ−ＯＶＡ；ｉ．ｖ．、５ｘ１０６個）を用いて感染され、脾臓の抗ＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ産生がＥＬＩＳＡによって測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３４３】
図１６Ａ−１６Ｉでは、ＳＴＩＮＧがＥＲからＳｅｃ５を含む小胞まで移行することを示す。図１６Ａでは、ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡ）で安定的に再構築されたＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦが、ＨＡ（緑色）及びカルレティキュリン（赤色）の抗体を用いて染色された。図１６Ｂでは、ＨＡ−ＳＴＩＮＧのＭＥＦが、ＨＡ−Ｓｔｉｎｇ（緑色）、カルレティキュリン（青色）又はミトトラッカー（赤色）について染色された。図１６Ｃでは、感染されていないか、あるいはＨＳＶ感染された（ｍｏｉ  １０；４時間）ＨＡ−ＳＴＩＮＧのＭＥＦの分画実験の免疫ブロット解析を示す（ＳＴＩＮＧに対するＨＡ、カルレティキュリン、ＥＲ；シグマ  ＩＲ、ミトコンドリア関連ＥＲ膜［ＭＡＭ］；ＣＯＸＩＶ、ミトコンドリア）。図１６Ｄでは、トランスフェクションされるＩＳＤ（１μｇ／ｍＬ）、トランスフェクションされる１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ、１μｇ／ｍＬ）又は図１６ＣでのようなＨＳＶ感染での処理後、ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦはＨＡ（緑色）又はカルレティキュリン（赤色）で染色された。図１６Ｅでは、ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦは、ＩＳＤでか、あるいはＩＳＤなしにトランスフェクションされ、細胞は、ＨＡ（緑色）及びＴＢＫ−１（赤色）の抗体で染色された。図１６Ｆでは、ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦは図１６Ｅでのようにトランスフェクションされ、ＨＡ（緑色）及びトランスフェリン受容体（Ｔｆｒ、赤色）の抗体で染色された。図１６Ｇでは、ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡのＭＥＦは図１６Ｅでのようにトランスフェクションされ、ＨＡ（緑色）及びＳｅｃ５（赤色）の抗体で染色された。図１６Ｈ、１６Ｉでは、ＭＥＦは、ＴＲＡＰβ又はＳＥＣ５に対するＲＮＡｉで７２時間処理され、ＩＳＤでトランスフェクションされた。ＩＦＮβのｍＲＮＡ及びタンパク質が、４及び１６時間それぞれで測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３４４】
図１７は、ＳＴＩＮＧの非存在下でのＩＬ−６産生はポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）及びＩＳＤに応答しないが、ＨＳＶ−１又はＣｐＧ  ＯＤＮに応答することを示す。マクロファージは、１μｇ／ｍＬのＤＮＡリガンドでトランスフェクションされたか、あるいはＨＳＶ−１（ｍｏｉ  １０）で１６時間感染された。ＩＬ−６はＥＬＩＳＡによって測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３４５】
図１８Ａ−１８Ｆは、ウイルスで感染されたＳＴＩＮＧノックアウトマウスにおける欠損Ｉ型ＩＦＮ産生を示す。図１８Ａ、１８Ｂでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物（−／−）又は同腹子の対照（＋／＋）［３匹；約８週齢］が、１ｘ１０７個のＨＳＶを用いて静注（ｉ．ｖ．）で感染され、生存率が監視された。動物由来の血清が、２４時間後、ＩＦＮβ又はＩＦＮαの産生について解析された。図１８Ｃ、１８Ｄでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物又は対照（３匹）が水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ、５ｘ１０７個）を用いてｉ．ｖ．で感染され、ＩＦＮβ又はＩＦＮαが１２時間後に測定された。図１８Ｅ、１８Ｆでは、ＳＴＩＮＧ欠損動物又は対照（３匹）が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ、１ｘ１０５個）を用いて腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で感染された。動物由来の血清は、６及び２４時間後、ＩＦＮβ又はＩＦＮαの産生について解析された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３４６】
図１９Ａ−１９Ｃでは、ヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ、１２５−２２２番目のアミノ酸）が、フラビウイルスのＮＳ４Ｂタンパク質に顕著な相同性を示すことを示す。図１９Ａでは、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）のＮＳ４ｂと、デングウイルス（ＤＶ）のＮＳ４ｂと、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ４ｂとの間の相同性が示される。図１９Ｂは、ＳＴＩＮＧに対するＹＦＶのＮＳ４ｂの相同性の概略図である。図１９Ｃでは、２９３Ｔ細胞は、ＦＬＡＧでタグ化されたＳＴＩＮＧと、ＨＡでタグ化されたＹＦＶ−ＮＳ４Ｂとで３６時間同時トランスフェクションされ、共焦点顕微鏡によって観察された。
【０３４７】
図２０は、ＳＴＩＮＧがＩＳＤへの曝露後にエンドソームに移行することを示す。ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡ）で安定的に再構築されたＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦが、トランスフェクションされるＩＳＤでか、あるいはトランスフェクションされるＩＳＤなしに処理（４時間）され、ＨＡ抗体（緑色）と、カルレティキュリン、ＥＲ；ミトトラッカー、ミトコンドリア；ＴｆＲ、再循環されたエンドソーム；ＥＥＡ１、早期エンドソーム；ＴＧＮ４６、トランス−ゴルジ；ジアンチン（Ｇｉａｎｔｉｎ）、シス−ゴルジ；ＬＡＭＰ１、リソソーム（赤色）のいずれかとを用いて染色された。
【０３４８】
図２１Ａ、図２１Ｂでは、ＭＥＦにおけるＲＮＡｉノックダウンが確認された。図２１Ａは、（Ｓｅｃ５に対する）ＲＮＡｉで処理された細胞の免疫ブロットであり、Ｓｅｃ５のノックダウンを示す。図２１Ｂは、（Ｔｒａｐβに対する）ＲＮＡｉで処理された細胞のＲＴ−ＰＣＲの測定値であり、Ｔｒａｐβのノックダウンを示す。
【０３４９】
図２２は、細胞内ＤＮＡ経路がヒト癌細胞になく、正常な細胞にあることを示すグラフである。正常なヒト細胞（ＰＡＳＭＣ、ＮＨＤＦ−ａｄ及びＴＦＦ）か、ヒト癌細胞株（Ｈｅｋ２９３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７、Ｈ１２９９及び２９３Ｔ）かが、偽トランスフェクションされたか、あるいはリポフェクタミンと、５μｇ／ｍＬのポリＩＣ、ポリ（ｄＧ−ｄＣ）、ウシ胸腺ＤＮＡ又は大腸菌ＤＮＡとでトランスフェクションされた。培養上清がトランスフェクション後１６時間で採取され、内在性のＩＦＮ−βがＥＬＩＳＡ（インビトロジェン）によって解析された。データが、ＳＴＩＮＧによって調節される、ｄｓＲＮＡ経路（ポリＩＣ）は機能的であるが、細胞内ＤＮＡ（ポリｄＧ−ｄＣ、ウシ胸腺ＤＮＡ又は大腸菌ＤＮＡ）経路は機能的ではないことを示す。
【０３５０】
図２３は、ＳＴＩＮＧが多くの癌細胞株では存在しないが、正常な細胞では存在することを示すブロットである。正常なヒト細胞（ＰＡＳＭＣ、ＮＨＤＦ−ａｄ）と、癌細胞株（２９３Ｔ−Ｈ１２９９）とにおける内在性のＳＴＩＮＧの発現のウエスタンブロットでは、３０μｇの全ての細胞抽出物が１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、その後、ウサギ−抗ヒトＳＴＩＮＧ血清又はマウス−抗βアクチンモノクローナル抗体（シグマ）のいずれかを用いてウエスタンブロットされた。テストされた細胞の名前が画像の上部に標識される。
【０３５１】
図２４は、さまざまなヒト細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現のウエスタンブロットであり、３０μｇの全ての細胞抽出物が１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、その後、ウサギ−抗ヒトＳＴＩＮＧ血清又はマウス−抗βアクチンモノクローナル抗体（シグマ）のいずれかを用いてウエスタンブロットされた。テストされた細胞の名前が画像の上部に標識される。
【０３５２】
図２５は、さまざまなヒト細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現のノーザンブロットであり、ｍＲＮＡがマイクロポリ（Ａ）プリスト（商標）キット（アンビオン）を用いて抽出された。ノーザンブロットはノーザンマックス（登録商標）−Ｇｌｙキット（アンビオン）の手順に従って、実施された。簡潔には、２μｇの各ｍＲＮＡは、１％  アガロースゲルによって分離され、アンビオンブライトスター（登録商標）−プラスメンブレン上に移され、不動化され、３２Ｐで標識されたヒトＳＴＩＮＧ又はβアクチンのＤＮＡプローブで精査され、最後に、オートラジオグラフィーのために感光された。テストされた細胞株の名前が画像の上部に標識される。
【０３５３】
図２６は、さまざまなヒトリンパ腫細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現のウエスタンブロットであり、３０μｇの全ての細胞抽出物が１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、その後、ウサギ−抗ヒトＳＴＩＮＧ血清又はマウス−抗βアクチンモノクローナル抗体（シグマ）のいずれかを用いてウエスタンブロットされた。ヒトバーキットリンパ腫株７種類（ＢＬ−５、ＢＬ−７、ＢＬ−８、ＳＭ１、パターソン、ＢＬ−３０及びカヌート）と、原発性浸出液リンパ腫株２種類（ＢＣ−１及びＢＣ−３）とが、このウエスタンブロットでテストされた。Ｈｕｖｅｃ細胞が陽性対照として用いられた。（＋）はＥＢＶ陽性であり、（−）はＥＢＶ陰性である。
【０３５４】
図２７は、さまざまなヒトリンパ腫細胞株における内在性のＳＴＩＮＧの発現のノーザンブロットであり、ｍＲＮＡがマイクロポリ（Ａ）プリスト（商標）キット（アンビオン）を用いて抽出された。ノーザンブロットはノーザンマックス（登録商標）−Ｇｌｙキット（アンビオン）の手順に従って、実施された。簡潔には、２μｇの各ｍＲＮＡは、１％  アガロースゲルによって分離され、アンビオンブライトスター（登録商標）−プラスメンブレン上に移され、不動化され、３２Ｐで標識されたヒトＳＴＩＮＧ又はβアクチンのＤＮＡプローブで精査され、最後に、オートラジオグラフィーのために感光された。ヒトバーキットリンパ腫株７種類（ＢＬ−５、ＢＬ−７、ＢＬ−８、ＳＭ１、パターソン、ＢＬ−３０及びカヌート）と、原発性浸出液リンパ腫株２種類（ＢＣ−１及びＢＣ−３）とが、このノーザンブロットでテストされた。Ｈｕｖｅｃ細胞が陽性対照として用いられた。（＋）はＥＢＶ陽性であり、（−）はＥＢＶ陰性である。
【０３５５】
図２８は、正常なヒト細胞のさまざまなタイプにおける内在性のＳＴＩＮＧの発現のウエスタンブロットであり、３０μｇの全ての細胞抽出物が１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、その後、ウサギ−抗ヒトＳＴＩＮＧ血清又はマウス−抗βアクチンモノクローナル抗体（シグマ）のいずれかを用いてウエスタンブロットされた。正常なヒト細胞はロンザ（Ｌｏｎｚａ）から購入され、テストされた細胞株の名前が画像の上部に標識される。
【０３５６】
図２９Ａ−２９Ｂでは、ＳＴＩＮＧは多くの癌細胞から消失するが、ＳＴＩＮＧの再構築は、細胞内ＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮに誘導される経路を回復することができることを示す。図２９Ａは、正常なヒト細胞（ＰＡＳＭＣ及びＮＨＤＦ−ａｄ）又はヒト癌細胞（２９３Ｔ及びＭＣＦ７）におけるｈＳＴＩＮＧの発現の免疫ブロット解析である。図２９Ｂでは、２９３Ｔ細胞は、ヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ）、マウスＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ）又は対照ΔＲＩＧ−Ｉの量を増加しながらＩＦＮ−β−Ｌｕｃ（ｐ１１０−Ｌｕｃ）プラスミドとともにトランスフェクションされ、ルシフェラーゼ活性について解析された。ＭＣＦ７細胞はｈＳＴＩＮＧの量を増加しながらトランスフェクションされ、培養上清が採取され、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−βタンパク質について解析された。
【０３５７】
図３０Ａ−３０Ｋは、ＳＴＩＮＧが細胞内ＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮ型の産生に必要とされることを示す。Ｓｔｉｎｇ＋／＋又は−／−のＭＥＦはＦＬＡＧ−ＩＲＦ７で２４時間トランスフェクションされ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色された。プラスミドのトランスフェクションは、ＩＲＦ７及び核局在を活性化するＳＴＩＮＧ経路を刺激する。これはＳＴＩＮＧの非存在下では起こらない。図３０Ｂでは、Ｓｔｉｎｇ＋／＋又は−／−のＭＥＦはＩＳＤで１６時間処理され、細胞溶解物は、ＥＬＩＳＡを用いてＮＦ−κＢ  ｐ６５活性について解析された。図３０Ｃでは、Ｓｔｉｎｇ＋／＋又は−／−のマクロファージは、ＩＳＤ又はポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）で１６時間処理され、溶解物が抗体を用いてカスパーゼ−１  ｐ１０の断片について解析された。図３０Ｄでは、マクロファージは、１μｇ／ｍＬのＤＮＡリガンドでトランスフェクションされるか、あるいはＨＳＶ−１（ｍｏｉ  １０）で１６時間感染された。ＩＬ−６はＥＬＩＳＡによって測定された。ＳＴＩＮＧの非存在下でのＩＬ−６産生はポリ（ｄＡＴ：ｄＡＴ）及びＩＳＤに応答しないが、ＨＳＶ−１又はＣｐＧ  ＯＤＮに応答する。図３０Ｅでは、Ｓｔｉｎｇ−／−のＭＥＦはＳＴＩＮＧで再構築され、ＥＬＩＳＡによって測定されたようにＩＦＮβの産生は回復された。図３０Ｆ及び３０Ｇでは、Ｓｔｉｎｇ＋／＋又は−／−のＭＥＦは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）又はワクシニアウイルス（ＶＶΔＥ３Ｌ）又はバキュロウイルスで感染（ｍｏｉ  １０）され、ＩＦＮβの産生が、１６時間後にＥＬＩＳＡによって測定された。図３０Ｈは、処理なしか、あるいはＦＩＴＣ−ＩＳＤで処理されたＳｔｉｎｇ＋／＋又は−／−由来のＧＭ−ＤＣｓを示す写真である。図３０Ｉでは、Ｓｔｉｎｇ＋／＋又は−／−のＭＥＦは、マウスＤＡＩで１６時間トランスフェクションされ、ＩＳＤで１６時間処理され、内在性のＩＦＮβが測定された。図３０Ｊでは、Ｌ９２９細胞はＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで３日間処理され、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）で処理された。１６時間後、ＩＦＮβの産生がＥＬＩＳＡによって測定された。図３０Ｋでは、図３０ＩでのＳＴＩＮＧのノックダウンが、抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いて免疫ブロットによって確かめられた。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３５８】
図３１Ａ−３１Ｅは、非刺激条件下のＳＴＩＮＧ−／−の動物における正常なＴ細胞及びＢ細胞のレパートリーを示す。図３１Ａ−３１Ｃでは、ＳＴＩＮＧ＋／＋又は−／−のマウス由来の脾臓細胞は、非刺激条件下、（Ｔ細胞のための）抗ＣＤ３、抗ＣＤ４又はＣＤ８か、（Ｂ細胞のための）抗ＣＤ１９かを用いてＦＡＣＳによって解析された。図３１Ｄでは、オボアルブミン（１０μｇ）の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が、ＳＴＩＮＧ＋／＋又は−／−のマウス（４匹）にｉ．ｐ．で接種された。動物は、１４日後に追加免疫された。ＯＶＡに対する抗体産生が、最後の追加免疫後の１４日目に測定された。図３０Ｅでは、図３０Ｄ由来の脾臓細胞が、抗ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）で刺激され、４日後に、ＩＦＮγがＥＬＩＳＡによって測定された。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３５９】
図３２Ａ−３２Ｉは、ブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）ＡがＳＴＩＮＧの輸送を阻害することを示す。図３２Ａは、両方の細胞タイプでのＳＴＩＮＧの比較可能な量を示すために、ＨＡ−ＳＴＩＮＧで安定的にトランスフェクションされたＳｔｉｎｇ−／−のＭＥＦにおけるＳＴＩＮＧの発現の免疫ブロット解析を示す。図３２Ｂでは、ＨＡ−ＳＴＩＮＧで安定的にトランスフェクションされたＭＥＦは、ＩＳＤ刺激（３時間、リポフェクタミン２０００中で１μｇ／ｍＬ）前に、ブレフェルジンＡ（０．１μｇ／ｍＬ）又はクロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）（０．１ｍＭ）で１時間処理された。緑色は抗ＨＡであり、赤色は抗カルレティキュリンである。図３２Ｃでは、野生型のＭＥＦは上記のブレフェルジンＡで処理され、ＩＦＮβのｍＲＮＡが測定された。図３２Ｄ、３２Ｅでは、上記のブレフェルジンＡのさまざまな濃度で処理された２９３Ｔ細胞は、ＳＴＩＮＧと、構成的活性型のＩＲＦ３又はＩＲＦ７と、ＩＦＮ−ルシフェラーゼレポータープラスミドとで同時トランスフェクションされた。ルシフェラーゼが２４時間後に測定された。図３２Ｆ、３２Ｇでは、さまざまなクロロキン量で１時間処理されたマクロファージは、ＩＳＤ（１μｇ／ｍＬ）、ポリ（ｄＡＴ−ｄＡＴ）［１μｇ／ｍＬ］又はＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で処理され、１６時間後、ＩＦＮβ又はＩＬ６がＥＬＩＳＡによって測定された。図３２Ｈでは、ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦは、ＩＳＤ（１μｇ／ｍＬ）での処理前に、ＨＡ−ＳＴＩＮＧ又は（潜在的なシグナルペプチドモチーフを示す最初の３６個のアミノ酸を欠失している）ＨＡ−ＳＴＩＮＧΔＳＰで２４時間トランスフェクションされた。３時間後、ＳＴＩＮＧの局在が、免疫蛍光法と、抗ＨＡ抗体（緑色）又は抗カルレティキュリン抗体（赤色）とを用いて測定された。図３２Ｉでは、２９３Ｔ細胞が、ＨＡ−ＳＴＩＮＧ又はＨＡ−ＳＴＩＮＧΔＳＰと、ＩＦＮ−ルシフェラーゼプラスミドとで同時トランスフェクションされ、２４時間後、ルシフェラーゼが測定された。ＳＴＩＮＧΔＳＰはＩＳＤに応答して輸送せず、Ｉ型ＩＦＮを活性化できない。アステリスクは、スチューデントｔ検定で決定されるときの有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。誤差棒は標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。
【０３６０】
図３３Ａ−３３Ｂは、ＳＴＩＮＧが、細胞内ＤＮＡに応答するＴＢＫ−１の輸送のために必要不可欠であることを示す。図３３Ａでは、ＳＴＩＮＧ＋／＋又は−／−のＭＥＦはＩＳＤ（リポフェクタミン２０００で１μｇ／ｍＬ）で処理され、３時間後、内在性のＴＢＫ１の局在は、抗ＴＢＫ抗体（緑色）又は抗カルレティキュリン抗体（赤色）を用いる免疫蛍光を用いて解析された。図３３Ｂでは、ＴＢＫ１＋／＋又は−／−のＭＥＦはＨＡ−ＳＴＩＮＧでトランスフェクションされ、２４時間後、細胞はＩＳＤで３時間処理され、ＳＴＩＮＧの局在は、抗ＨＡ抗体（緑色）又は抗カルレティキュリン抗体（赤色）を用いる免疫蛍光法によって解析された。ＳＴＩＮＧはＴＢＫ１の非存在下で局在する。
【０３６１】
図３４Ａ−３４Ｆは、Ｓｅｃ５が効率的な細胞内ＤＮＡで仲介されるシグナル伝達のために必要とされることを示す。図３４Ａは、（Ｓｅｃ５又はＳｅｃ６１βに対する）ＲＮＡｉで処理された細胞の免疫ブロットであり、Ｓｅｃ５及びＳｅｃ６１βのノックダウンを示す。図３４Ｂは、ＲＮＡｉ（Ｔｒａｐβ）で処理された細胞のＲＴ−ＰＣＲの測定値であり、Ｔｒａｐβのノックダウンを示す。図３４Ｃでは、Ｓｅｃ５又はＳＴＩＮＧに対するＲＮＡｉで３日間処理されたＭＥＦは、ＨＳＶ１（ｍｏｉ  １）で２４時間感染され、ウイルスのタイターが測定された。図３４Ｄは、内在性のＩＦＮβが測定されたことを除いて、図３４Ｃと同一である。図３４Ｅでは、Ｔｒａｐβ、Ｓｅｃ６１β又はＳｅｃ５に対するＲＮＡｉで３日間処理されたＭＥＦはＩＳＤで３時間処理され、ＩｆｎｂのｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって測定された。図３４Ｆは、内在性のＩＦＮβが測定されたことを除いて、図３４Ｅと同一である。
【０３６２】
図３５Ａ、３５Ｂは、抗ＳＴＩＮＧモノクローナル抗体ＡＳ−１を用いてのｈＳＴＩＮＧで２４時間トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の免疫染色（図３５Ａ）及び免疫ブロット（図３５Ｂ）を示す。前記モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、ヒトＳＴＩＮＧ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡ（１００μｇ）でマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を接種／免疫することによって作成された。免疫された動物由来の脾臓細胞がハイブリドーマを作成するためにミエローマ細胞に融合され、前記ハイブリドーマはクローンを作成するために単離された。分泌された抗体が、対照としての２９３Ｔ細胞か、ヒトＳＴＩＮＧを発現する２９３Ｔ細胞かを用いて免疫蛍光アッセイでスクリーニングされた（図３５Ａ）。前記ＳＴＩＮＧがトランスフェクションされた細胞で蛍光発光し、対照では蛍光発光しない抗体が、ヒトＳＴＩＮＧ又は対照のベクターを発現する溶解物の免疫ブロットをインキュベーションするために用いられた。したがって、（クローン２ｇ９由来の抗ＳＴＩＮＧ１についての）Ｍａｂ  ＡＳ−１は、免疫蛍光研究及び免疫ブロットでＳＴＩＮＧを認識する。
【実施例１】
【０３６３】
以下の非限定的な例は、本発明の選択された実施態様を例示するために役立つ。比率の変化と、示された構成要素の要素の変更とが当業者に明らかとなるであろうし、本発明の実施態様の技術的範囲内であると理解されるであろう。
【０３６４】
ＳＴＩＮＧ、自然免疫シグナル伝達を亢進する小胞体アダプター
病原体の侵入への細胞性宿主防御応答は、ウイルスの核酸か、リポ多糖又は鞭毛タンパク質を含む微生物の細胞壁成分かのような病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）を抗病原体遺伝子の誘導をもたらすように検出することを主に含む。例えば、ウイルスのＲＮＡは、小胞体（ＥＲ）及び／又はエンドソームに存在する膜結合型トル様受容体（ＴＬＲ’ｓ）（例えば、ＴＬＲ３及び７／８）か、レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）と呼ばれるＴＬＲ非依存性細胞内ＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡヘリカーゼ又はメラノーマ分化関連抗原５（ＭＤＡ５、ＩＦＩＨ１及びヘリカードとも呼ばれる）かによって検出される。これらの事象は、多くが知られないままの下流のシグナル事象を活性化し、Ｉ型ＩＦＮを含む、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３／７に依存性の遺伝子の転写をもたらす。
【０３６５】
方法
細胞、ウイルス及び試薬
２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３の細胞がＡＴＣＣから入手され、１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地で維持された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）がＬｏｎｚａ（スイス、バーゼル）から入手され、内皮増殖培地（ＥＧＭ−２）（Ｌｏｎｚａ）で維持された。ＦＡＤＤ＋／＋、ＦＡＤＤ−／−、ＴＢＫ−１＋／＋及びＴＢＫ−１−／−  ＭＥＦ（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｓ．，  Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００４．  ４３２（７０１５）：４０１−５頁）。ＶＳＶ−ＧＦＰが感染に用いられ、以前に説明されたようにタイターが測定された（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｓ．，  Ｅ．ら、２００４）。ＶＳＶ−ΔＭが以前に説明されたように構築された（Ｆａｒｉａ，  Ｐ．  Ａ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，  ２００５．  １７（１）：９３−１０２頁）。マウスＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡキットがＰＢＬ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手された。ＥＭＣＶがＡＴＣＣから購入された。
【０３６６】
プラスミドコンストラクト
ヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ）、マウスＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ）、ｈＳＴＩＮＧ−Ｎ（１−２３０番目のアミノ酸）及びｈＳＴＩＮＧ−Ｃ（１７３−３７９番目のアミノ酸）の配列がＰＣＲによって増幅され、Ｃ末端にＨＡでタグ化された発現コンストラクトを生成するためにｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされた。Ｆｌａｇでタグ化されたＲＩＧ−Ｉ、ΔＲＩＧ−Ｉ（１−２８４番目のアミノ酸）、ＩＰＳ−１及びＴＢＫ−１をエンコードする発現プラスミドが、以前に説明された（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００７．  １７８（４）：２４２９−３９頁）。ＧＦＰでタグ化されたＲＩＧ−Ｉ及びＴＢＫ−１は、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１（クロンテック、カリフォルニア州）にクローニングすることによって生成された。その他のプラスミドが、ｐ１１０−Ｌｕｃ及びＰＲＤ−ＩＩＩ−Ｉ−Ｌｕｃ（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ）、ＩＦＮβ−Ｌｕｃ及びＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｊ．  Ｈｉｓｃｏｔｔ）、ＮＦＫＢ−ＬＵＣ（ストラタジーン、カリフォルニア州）、ＥＲ−ｄｓＲＥＤ及びゴルジ−ｄｓＲＥＤ（クロンテック、カリフォルニア州）から入手された。
【０３６７】
抗体
ヒトＳＴＩＮＧの３２４−３４０番目の残基と一致する合成ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体が、エボクエスト顧客抗体サービス（ＥｖｏＱｕｅｓｔ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）（インビトロジェン、カリフォルニア州）から入手された。その他の抗体は、ＳＥＣ６１β（アップステート、ニューヨーク州）、β−アクチン、ＨＡ、ＦＬＡＧ（シグマ、ミズーリ州）、ＩＲＦ３及びＲＩＧ−Ｉ（アビーム、マサチューセッツ州）の供給源から入手された。
【０３６８】
ノーザンブロット
ヒトの多数の組織ＲＮＡブロット（クロンテック、カリフォルニア州）が、３２Ｐで標識化された完全長ヒトＳＴＩＮＧプローブでハイブリダイゼーションされた。
【０３６９】
リアルタイムＰＣＲ
総ＲＮＡがＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ抽出キット（キアゲン、カリフォルニア州バレンシア）を用いて細胞から単離され、ｃＤＮＡ合成が１μｇの総ＲＮＡを用いて実施された（ロシュ、インディアナ州インディアナポリス）。蛍光リアルタイムＰＣＲ解析が、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０機器（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナ州インディアナポリス）及びＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州）を用いて実施された。ｍＲＮＡの相対量が、各試料の１８ＳリボソームＲＮＡレベルで標準化された。
【０３７０】
ＤＮＡマイクロアレイ解析
総ＲＮＡが、ＳＴＩＮＧ発現ベクターをトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞から抽出された。ｃＤＮＡの調製及びマイクロアレイ解析が、イエール大学のＷ．Ｍ．  Ｋｅｃｋ財団バイオテクノロジー研究所のＤＮＡマイクロアレイ施設（コネチカット州ニューヘイブン）で実施された。ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０アッセイ（アフィメトリクス、カリフォルニア州）が用いられた。データ解析が、ジーンスプリングソフトフェア（シリコンジェネティクス、カリフォルニア州）で実施された。
【０３７１】
共焦点顕微鏡
ＥＲ−ＤｓＲＥＤ及びゴルジ−ＤｓＲＥＤ（クロンテック、カリフォルニア州）が、ＥＲ及びゴルジのマーカーそれぞれに用いられた。ミトコンドリアの染色のために、生細胞が、３００ｎＭのミトトラッカーレッド（インビトロジェン、カリフォルニア州）を用いて３７°Ｃで４５分間インキュベーションされた。
【０３７２】
ミトコンドリア及びＥＲの画分の単離
ミトコンドリア及びＥＲ膜は、以前に説明されたように不連続ショ糖勾配で精製された（Ｂｏｚｉｄｉｓ，  Ｐ．，  ＣＤ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００７．第３章：単元３  ２７頁）。簡潔には、ＭＴＥ緩衝液（０．２７Ｍ  マンニトール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）中のＨＵＶＥＣ細胞が超音波によって溶解された。溶解された細胞が、核及び細胞破片を除去するために７００ｘｇで１０分間遠心分離された。ミトコンドリアは１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって得られ、ポストミトコンドリア上清（ｐｏｓｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）がＥＲ画分の精製に用いられた。ミトコンドリア沈殿はＭＴＥ緩衝液に再懸濁され、１．０Ｍ及び１．７Ｍのショ糖からなる不連続ショ糖勾配で層状にされ、４０，０００ｘｇで２２分間遠心分離することによってバンド形成された。ミトコンドリア画分が１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって採取され、沈殿化された。精製されたミトコンドリアがＰＢＳ中に再懸濁され、ウエスタンブロット解析に用いられた。ＥＲ画分を単離するために、上記のポストミトコンドリア上清が、１．３Ｍ、１．５Ｍ及び２．０Ｍのショ糖からなる不連続ショ糖勾配で層状にされ、１００，０００ｘｇで７０分間遠心分離することによってバンド形成された。１００，０００ｘｇで４５分間遠心分離することによって、上清と１．３Ｍのショ糖との接合面の前記ＥＲ画分が採取され、沈殿化された。前記ＥＲ膜はＰＢＳ中に再懸濁され、ウエスタンブロット解析に用いられた。
【０３７３】
ＲＮＡ干渉
化学合成されたヌクレオチド２１個のｓｉＲＮＡ２本鎖が、ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）社（コロラド州ラファイエット）から入手された。ヒト及びマウスのＳＴＩＮＧに用いられたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｈＳＴＩＮＧ（ａ）、ＧＣＡＵＣＡＡＧＧＡＵＣＧＧＧＵＵＵ（配列番号３）、ｈＳＴＩＮＧ（ｂ）、ＧＧＵＣＡＵＡＵＵＡＣＡＵＣＧＧＡＵ（配列番号３）、ｍＳＴＩＮＧ、ＣＣＡＡＣＡＧＣＧＵＣＵＡＣＧＡＧＡ（配列番号５）である。２９３Ｔ細胞が、ウェル１つあたり５ｘ１０４細胞個で２４ウェルプレートに播種され、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン、カリフォルニア州）を用いて１０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ２本鎖をトランスフェクションされた。ＭＥＦは、製造者の推奨に従ってアマクサヌクレオフェクター装置（Ａｍａｘａ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）（プログラムＡ−０２３）及びアマクサＭＥＦヌクレオフェクターキット１を用いることによってトランスフェクションされた。トランスフェクション後７２時間に、細胞はさらに実験に用いられた。
【０３７４】
同時免疫沈降、非変性（ｎａｔｉｖｅ）ＰＡＧＥ及び免疫ブロット解析
２９３Ｔ細胞が、ディッシュ１枚あたり１ｘ１０６細胞個で１００ｍｍディッシュ上に播種された。細胞が、リポフェクタミン２０００を用いて総量１０μｇの空プラスミドか、さまざまな発現プラスミドかでトランスフェクションされた。トランスフェクション後３６時間に、細胞は、タンパク質分解酵素阻害剤（ロシュ、インディアナ州）を含む、Ｍ−ＰＥＲ緩衝液中（ピアス、イリノイ州）か、１％  ジギトニン（カルビオケム、カリフォルニア州）緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ジギトニン）中かで溶解された。溶解物は、ＨＡアフィニティーマトリクス（コバンス、ウィスコンシン州）か、ＦＬＡＧアフィニティービーズ（シグマ）かと１晩インキュベーションされた。前記ビーズは、０．０５％  ツイーン−２０を含むＴＢＳによって３回洗浄され、免疫沈降物は、非還元試料緩衝液で５分間煮沸することによって溶出された。内在性ＳＴＩＮＧの免疫沈降のために、ＨＵＶＥＣが１％ジギトニン溶解液で溶解された。浄化された上清は、１０μｇの抗ＳＴＩＮＧ抗体とともにインキュベーションされ後、不動化されたプロテインＧ（ピアス）でインキュベーションされた。前記ビーズは１％  ジギトニン溶解液によって４回洗浄され、免疫沈降物がＳＤＳ試料緩衝液で５分間煮沸することによって溶出された。非変性ＰＡＧＥ及び免疫ブロットが以前に説明されたように実施された（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｓ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００７．  １７８（４）：２４２９−３９頁）。
【０３７５】
ＳＴＩＮＧノックアウトマウスの作成
直鎖状のターゲッティングベクターは、１２９ＳｖＥｖ系統由来のＥ１４．１のＥＳ細胞に電気穿孔法で導入された後、Ｇ４１８で選択された。ターゲッティングされたクローンがＰＣＲによってスクリーニングされた。クローン９０個から陽性クローン１個が同定された。このＥＳクローンが、宿主としてＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞を用いて、注入によってキメラマウスの作成に供された。その結果生じるオスのキメラが、生殖細胞系列伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）のためにＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスとさらに交配された。ヘテロ接合体のマウス（Ｆ１マウス）が、野生型、ヘテロ接合体及びホモ接合体の同腹子（Ｆ２）を得るために異種交配された。前記マウスの遺伝子型がＰＣＲによって決定された。動物はマイアミ大学の医学トランスジェニック基盤施設で作成された。マウスは、食物及び水に自由に入手でき、１２時間の明／暗周期で、２３°Ｃの雰囲気温度で飼育された。動物の世話及び取扱は、ＩＡＣＵＣの指針とおり実施された。
【０３７６】
樹状細胞及びマクロファージの調製
骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）及び樹状細胞（ＧＭ−ＤＣｓ）が、野生型及びノックアウトマウス由来の大腿骨及び脛骨から調製された。（マウス１匹あたりの）単細胞懸濁液が調製され、赤血球細胞が溶解された。ＧＭ−ＤＣｓについて、細胞は、１０％  ＦＣＳ、５０Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００ｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン及びＧＭ−ＣＳＦ  （２０ｎｇ／ｍＬ）を補充されたＤＭＥＭで培養された。ＢＭＤＭについて、細胞が、１０％  ＦＢＳ、抗生物質及びＮＩＨ３Ｔ３細胞由来の２０％条件培地を補充されたＲＰＭＩ１６４９で培養され、培地が２日毎に置換された。８日後、細胞が実験に用いられた。
【０３７７】
ＩＦＮで誘導されたライブラリーの構築
ＳＴＩＮＧの興味あるパートナーをスクリーニングするために、我々は、酵母ツーハイブリッドアプローチを用いた。ヒト細胞由来の新規のＩＦＮで誘導されたｃＤＮＡライブラリーが調製された。このライブラリーを構築するために、テロメラーゼで不死化されたヒト線維芽細胞が、インターフェロン依存性遺伝子を誘導するためにヒトＩＦＮ−アルファ及びβそれぞれ１０００単位で１晩処理された。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡが沈殿された細胞から抽出され、高品質であることが確かめられた。確認後、ｃＤＮＡ合成が「ＢＤパワースクリプト（商標）」ＲＴ（クロンテック）を用いて実施された。この手順は、結果として生じる１本鎖の部位それぞれに、直接クローニング用の個別のＳｆｉＩ部位（Ａ及びＢ）を含むアダプターを付けることができる。またこれは、ｃＤＮＡの集団が完全長のクローンを豊富に含むことを同時に保証する。その後、前記ｃＤＮＡはＰＣＲによって増幅され、ＳｆｉＩで消化され、酵母のプレイ（ｐｒｅｙ）ベクターｐＧＡＤＴ７−ＲｅｃＡＢに連結される。連結された混合物が、Ｅ．ｃｏｌｉ株のＤＨ１０Ｂにトランスフォーメーションされた。増幅されていないライブラリー中の独立クローンの数が、３．２ｘ１０６個であると推定され、平均サイズが１．５２ｋｂであり、インサートが０．８ｋｂから３．０ｋｂまでのサイズの範囲である。独立のクローン１５個が単離され、ＤＮＡがＰＣＲによってサイズを調べるために抽出された。
【０３７８】
酵母ツーハイブリッド解析
ｈＳＴＩＮＧ−Ｃ（１７３−３７９番目のアミノ酸）配列がＰＣＲによって増幅され、バイト（ｂａｉｔ）プラスミドｐＧＢＫ−Ｔ７−ｈＳＴＩＮＧ−Ｃを作成するためにｐＧＢＫ−Ｔ７（クロンテック）にクローニングされた。ＩＦＮで誘導されたライブラリーのプラスミドＤＮＡ１００μｇが、酵母Ｙ１８７株のライブラリースケールトランスフォーメーション（ｌｉｂｒａｒｙ−ｓｃａｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を実施するために用いられた。酵母ライブラリースクリーニングが酵母の接合によって実施された。簡潔には、ｐＧＢＫ−Ｔ７−ｈＳＴＩＮＧ−Ｃが酵母ＡＨ１０９株にトランスフォーメーションされ、トリプトファンを欠く５０ｍＬの最小培地で１晩増殖された。Ｙ１８７のプレトランスフォーメーションライブラリーの１ｍＬ分取量が上記のものと混合され、酵母の接合が、播種される前に１晩続けられる。高いストリンジェンシーのプレート由来の陽性コロニーが単離され、プラスミドＤＮＡが「ガラス−ビーズ」プロトコルによって抽出される。簡潔には、酵母コロニーは、ロイシンを欠く最小培地で１晩増殖される。培養液１．５ｍＬは遠心沈殿され、沈殿は、３００μＬの酵母破砕緩衝液（２％  トリトンＸ−１００、１％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と、酸で洗浄された等量のガラスビーズ（シグマ、カタログ番号Ｇ−８７７２）とともに再懸濁される。３００μＬのフェノール：クロロホルム（１：１、ｐＨ  ８．０）が添加され、試験管が少なくとも１５分間攪拌混合（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）される。試料は遠心分離され、水相が新しい試験管に移され、ＤＮＡが２倍量のエタノールで沈殿された。回収された沈殿は７０％エタノールで洗浄され、乾燥され、５０μＬのミリＱ水に溶解された。２−５μＬが細菌のコンピテント細胞をトランスフォーメーションするために用いられ、ＬＢ−アンピシリンプレート上に播種された。個別のコロニーが増殖され、プラスミドＤＮＡが抽出された。抽出されたＤＮＡが、酵母を再度トランスフォーメーションし、相互作用を再確認し、自動活性化している偽陽性を除去するために用いられる。陽性コロニーが同定のために塩基配列を決定された。
【０３７９】
結果及び議論
自然免疫シグナル伝達機構をさらに決定するために、発現スクリーニングシステムが供され、約５，５００個のヒト完全長ｃＤＮＡ及び９，０００個のマウス完全長ｃＤＮＡが、それぞれ、ＩＦＮβのプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子（ＩＦＮβ−Ｌｕｃ）を有する２９３Ｔ細胞にトランスフェクションされた。過剰発現が、対照ベクターでは誘導されないが、ＩＦＮβ−Ｌｕｃの約２５０倍の誘導をもたらす遺伝子５個は、ＩＰＳ−１（ＶＩＳＡ／ＣＡＲＤＩＦ／ＭＡＶＳとも呼ばれる。）と、ＣＡＲＤを含むミトコンドリアの仮想タンパク質と、ＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路を促進する役割を果たすＩ型ＩＦＮの既知の誘導因子とであることがわかった。しかし、以前に特徴付けられていない分子（ｇｉ：３８０９３６５９／ＮＰ＿９３８０２３／２６１０３０７Ｏ０８ＲＩＫ）が、（インターフェロン遺伝子の刺激因子の）ＳＴＩＮＧとして本明細書に言及される本方法によって単離され、該ＳＴＩＮＧは、（ヒトでは）５個の仮想ＴＭモチーフを有し、ヒト細胞では３７９個のアミノ酸のタンパク質及びマウス細胞では３７８個のアミノ酸のタンパク質として存在する（図１Ａ）。仮想シグナル開裂モチーフが１−３５番目の部位に存在することが発見され、富ロイシン領域がアミノ酸２１−１３９番目の間に見られた（図１Ａ、１Ｂ）。ヒトＳＴＩＮＧ（ｈＳＴＩＮＧ）の仮想分子量は、ＳＴＩＮＧペプチドに対して産生されるウサギ抗血清を用いる免疫ブロット解析の後、ヒト２９３細胞で観察された分子量におおよそ一致する４２，１９２Ｄａだった。ＲＮＡｉ研究が、前記の観察された４２ｋＤａのバンドは実際にＳＴＩＮＧだったことを確かめた（図１Ｄ）。ＳＴＩＮＧは、ノーザン解析によって決定されるとき、さまざまな組織で遍在的に発現することが発見され、共焦点顕微鏡及び分画解析によって決定されるとき、細胞のＥＲ領域に主にあることが発見された（図１Ｅ、１Ｆ）。
【０３８０】
【表２】
2015213514.tif 000003
【０３８１】
表２は、「ベクター単独」の対照と比較して１５倍以上ＩＦＮ−βプロモーターを誘導した遺伝子の一覧を示す。誘導倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、２回実施された実験の平均として算出された。哺乳類遺伝子収集物（ＭＧＣ）によって作成されたｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ベクター（インビトロジェン）にクローニングされた約５，５００個のヒト完全長ｃＤＮＡｓ及び９，０００個のマウス完全長ｃＤＮＡが、オープンバイオシステムズ（アラバマ州ハンツビル）から購入された。ＩＦＮβ−ルシフェラーゼレポーター活性を変えるタンパク質をエンコードするｃＤＮＡを同定するために、４０ｎｇの空、ＩＰＳ−１又はＴＲＩＦのｃＤＮＡの陽性対照発現プラスミド又はｃＤＮＡライブラリーが、３８４個のウェルのライブラリースクリーニングプレートのうちの指定された対照ウェルに分取された。３５ｎｇのＩＦＮレポーターが、マルチドロップロボット（タイターテック）で各ウェルに分注された。インキュベーション後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は各ウェルに分注された。２４時間後、４０μＬのブライトライトルシフェリン試薬（パーキンエルマー）が前記マルチドロップで各ウェルに添加され、室温で１分間インキュベーションされ、発光レベルがアナリストＧＴマルチモードリーダー（モレキュラーデバイス）で定量された。全てのスクリーニングが、２回実施された。このアプローチは、ＩＦＮ経路の調節因子として従来知られていない新しい分子を単離することができる。興味深いことに、当たりの上位５つは、ＩＦＮβプロモーターを活性化に重要なＩＰＳ−１だった。当たりのもう１つは、ＩＲＦ１（１５０倍）だった。このデータは、スクリーニングが機能的で、特異性が高いことを示した。興味深いことに、新しい分子が単離され、ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）として本明細書に言及される。
【０３８２】
２９３Ｔ細胞でのＳＴＩＮＧの過剰発現は、ルシフェラーゼを駆動する対照ＴＫプロモーター（ｐＲＬ−ＴＫ）では誘導されないが、４００倍までＩＦＮプロモーター（ＩＦＮβ−Ｌｕｃ）の発現を、１０００倍までインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）応答性プロモーター（ＰＲＤ−ＩＩＩ−Ｉ−Ｌｕｃ）を、１２倍にＮＦ−κＢ応答性プロモーター（ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ）を、及び、８００倍までインターフェロン誘導性プロモーター（インターフェロン感受性応答エレメント−ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ）を強く誘導することがその後に確かめられた（図２Ａ−２Ｄ）。ＳＴＩＮＧは、Ｒｂ、ｐ５３又はＥ２Ｆの遺伝子由来のプロモーターのようなルシフェラーゼレポーターを駆動する対照プロモーターを活性化しなかった（図５Ａ−５Ｄ）。またＩＲＦ３の２量体の増加は、ＳＴＩＮＧが、ＩＲＦ３の活性化、２量体化及び移行を調節することが確かめられている、ＳＴＩＮＧを発現する２９３Ｔ細胞で観察された（図２Ｅ）。このデータは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析及びＥＬＩＳＡそれぞれによって決定されるとき、内在性ＩＦＮβのｍＲＮＡ及びＩＦＮβのタンパク質がＳＴＩＮＧを一過的にトランスフェクションされたＭＥＦで顕著に誘導されることを観察することによって確かめられた（図２Ｆ、２Ｇ）。２９３Ｔ細胞でのＳＴＩＮＧ発現のＤＮＡマイクロアレイ解析が、１次自然免疫応答遺伝子と、ＩＦＮ誘導性遺伝子とを誘導するためのＳＴＩＮＧの能力をさらに強調する（図２Ｈ）。従って、ＳＴＩＮＧ又はＩＰＳ−１を発現するＭＥＦ細胞は、自然免疫応答遺伝子を誘導するＶＳＶ感染に顕著に抵抗性であった（図２Ｉ、２Ｊ）。その後の解析は、ＳＴＩＮＧ活性がＩＲＦ３の活性化に関係し、ＩκＢキナーゼの実際に上流であることが確かめられている、このキナーゼファミリーメンバーのＴＢＫ−１の非存在下でＳＴＩＮＧ機能が除去されたことを示した（図２Ｋ）。最後に、ＳＴＩＮＧが、効率的な自然免疫シグナル伝達過程に重要なＦＡＤＤの非存在下では、強い活性を発揮しなかったことが観察された（図２Ｌ）。また、ＳＴＩＮＧが、ＨＡでカルボキシル領域でタグ化されると、活性を維持する一方、ＳＴＩＮＧが、ＧＦＰでアミノ末端又はカルボキシル末端でタグ化されたとき、この活性は消失することが確かめられた。その後の解析は、５つの仮想ＴＭ領域（１−２３０番目のアミノ酸）を含むＳＴＩＮＧのアミノ末端領域か、ただのＳＴＩＮＧのカルボキシル領域（１７３−３７９番目のアミノ酸）かが、２９３Ｔ細胞で一過的に過剰発現されたとき、ＩＦＮβ−Ｌｕｃプロモーターを誘導するための顕著な能力のみを示さないことを示した（図２Ｍ、２Ｎ）。したがって、完全長で正常なＳＴＩＮＧは有効な機能に必要とされる。しかし、前記ＳＴＩＮＧのカルボキシル領域は優性阻害の抑制効果を発揮し、ｐ１１０−Ｌｕｃを刺激するための完全長のＳＴＩＮＧの能力を阻害する場合があることがさらに観察された（図２０）。合わせて、このデータは、ＳＴＩＮＧの発現は、抗ウイルス状態の誘導をもたらすＩ型ＩＦＮを含む自然免疫応答を活性化することを示した。
【０３８３】
ＳＴＩＮＧの機能をさらに解析するために、ＲＮＡｉアプローチは、多くの細胞タイプでＳＴＩＮＧを除去するために利用される。データは、ＨＥＫ２９３細胞でのＳＴＩＮＧのノックダウンが、抗ＳＴＩＮＧ抗体を用いて免疫ブロット解析によって確かめるとき、おそらくラブドウイルスがＩＦＮβの単に弱い活性化因子であるため、ＩＦＮβを誘導するためのマイナス鎖の前記ウイルスＶＳＶ−ＧＦＰの能力を適度に低下したことを示した（図６Ａ、６Ｂ）。しかし、ＭＥＦでＲＮＡｉによってＳＴＩＮＧを除去することは、ＶＳＶ−ＧＦＰに応答するＩＦＮβのｍＲＮＡ産生のわずかな低下をもたらす一方、かかる細胞は、ウイルス感染及び複製に非常に感受性にされる（図３Ｂ−３Ｄ）。Ｉ型ＩＦＮ誘導及び宿主防御でのＳＴＩＮＧの必要性を確かめるために、ＳＴＩＮＧ欠損（ＳＴＩＮＧ−／−）マウスが、ＥＳ細胞でのターゲッティング相同組み換えによって作成された（図３Ｅ）。ＳＴＩＮＧの欠損は、ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦのサザン及びノーザン解析及びＲＴ−ＰＣＲ解析と、免疫ブロットとによって確かめられた（図３Ｆ、３Ｇ）。ＳＴＩＮＧ−／−の動物が、正常に、メンデル遺伝の割合で生まれ、発育し、繁殖された。したがって、野生型及びＳＴＩＮＧ−／−の動物由来のＭＥＦが、変化するＭＯＦ（０．０１−１）でＶＳＶ−ＧＦＰで感染後３６時間まで感染された。この研究は、ＶＳＶ−ＧＦＰがＳＴＩＮＧを欠損するＭＥＦにおいて対照と比較してより多くの子孫ウイルス（２  ｌｏｇｓ；  ２４−３６時間）を作成したことを確かめた（図３Ｈ、３Ｉ）。このデータはルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＶＳＶ（図７Ａ−７Ｅ）と、通常、細胞内ｍＲＮＡを核からの輸送を抑制する原因となるウイルスマトリクスタンパク質の欠損を示すＶＳＶ−ΔＭとを用いて確かめられた。Ｉ型ＩＦＮの転写増幅及び抗ウイルス活性の増大を生じる結果の感染後にＩＦＮβのｍＲＮＡの核からの搬出を阻害できないために、ＶＳＶΔＭは正常な細胞で非効率的に複製する。ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦにＳＴＩＮＧを再構築することが、ＶＳＶ感染への感受性を回復した（図７Ａ−７Ｅ）。ＳＴＩＮＧの消失が、細胞内受容体ヘリカーゼＲＩＧ−Ｉによって主に支配されるＶＳＶ以外のマイナス鎖ウイルスに応答するＩＦＮβの産生に影響したかどうかを評価するために、対照又はＳＴＩＮＧ−／−ＭＥＦが、パラミクソウイルスファミリーのメンバーのマイナス鎖センダイウイルス（ＳｅＶ）で感染された。この解析は、ＳＴＩＮＧの消失がＩＦＮβを誘導するためのＳｅＶの能力を低下したことを示した（図３Ｋ）。対照的に、細胞内ＲＩＧ−ＩホモログＭＤＡ５によって主に支配されるＩＦＮβ誘導を誘発するためにトランスフェクションされたポリＩ：Ｃの能力を仲介するための強い必要性が、ＳＴＩＮＧについて観察されなかった（図８Ａ−８Ｂ）。ピコルナウイルスファミリーのメンバーのプラス鎖脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）は、ＳＴＩＮＧの有無にかかわらずにＭＥＦにおいてＩＦＮβを効率的に誘導しなかったことも観察された。さらに、感染されたＳＴＩＮＧ＋／＋又は−／−のＭＥＦでのＥＭＣＶ複製を比較するとき、ウイルスタイターの有意差は全く観察されなかった（図８Ａ−８Ｂ）。したがって、ＳＴＩＮＧは、ＭＤＡ５よりもむしろＲＩＧ−Ｉで仲介される自然シグナル伝達の促進でより優勢な役割を果たす場合があると結論付けられた。興味深いことに、顕著な消失（＞５倍）が、対照と比較してＳＴＩＮＧを欠損するＭＥＦでは、ＩＦＮβを誘導するためにトランスフェクションされたＢ型ＤＮＡ（インターフェロン刺激ＤＮＡ［ＩＳＤ］を含むポリｄＡ−ｄＴ又は非ＣｐＧ）の能力において検出されなかった（図３Ｌ、３Ｍ、図９Ａ−９Ｅ）。ＴＬＲ９が、ＭＥＦでは活性ではないが、ＩＦＮβのＣｐＧ  ＤＮＡで仲介される誘導を支配すると考えられる。したがって、ＳＴＩＮＧが、ＴＬＲ９と独立的なＩ型ＩＦＮのＤＮＡで仲介される誘導で機能する場合があるということは十分に考えられることである。この影響は、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて培養されたマウスのＳＴＩＮＧを欠損する骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）又は骨髄由来樹状細胞（ＧＭ−ＤＣ）で同様に観察された（図３Ｎ、３Ｏ）。しかし、違いは、ＴＬＲ３及び４それぞれに依存する事象についてＳＴＩＮＧ−／−のＢＭＤＭ又はＧＭ−ＤＣを対照と比較するとき、ＩＦＮβを誘導するための外来性ポリＩ：Ｃ又はリポ多糖（ＬＰＳ）の能力で全く観察されなかった（図３Ｎ、３Ｏ）。ＳＴＩＮＧの消失は、ＭＥＦをＶＳＶ−ＧＦＰに対する感受性を高めた一方、感受性の低下が、ＳＴＩＮＧ−／−のＧＭ−ＤＣ又はＢＭＤＭへのＶＳＶ−ＧＦＰ感染後に観察され、ＳＴＩＮＧが線維芽細胞におけるマイナス鎖ウイルスで仲介された自然シグナル伝達の促進でより重要である場合があることを示す（図９Ａ−９Ｅ）。合わせて、データは、ＳＴＩＮＧの消失はＴＬＲ経路に影響しないが、ＲＩＧ−Ｉで仲介されるＩ型ＩＦＮ誘導の欠損をもたらすことを示すであろう。さらに、前記経路でのＳＴＩＮＧの機能は、Ｂ型ＤＮＡによるＩＦＮβを誘導するために利用されたと考えられる。
【０３８４】
自然シグナル伝達におけるＳＴＩＮＧの機能の仕組みをさらに調べるために、ＳＴＩＮＧが、マイナス鎖又はプラス鎖のウイルスＲＮＡそれぞれについての仮想自然免疫シグナル伝達受容体であるＲＩＧ−Ｉ及び／又はＭＤＡ５と相互作用するかを決定するために試みされた。言及されたように、最新データは、ＲＩＧ−Ｉが、ＶＳＶのような多くのマイナス鎖ウイルスによって作成された５’三リン酸を有する短いキャップされていないｓｓＲＮＡ種を認識する場合がある一方、ＭＤＡ５が、ＥＭＣＶによって作成されるもの及びポリＩＣのようなより長いＲＮＡを認識する場合があることを示している。２９３Ｔ細胞での同時免疫沈降実験は、ＭＤＡ５ではなく、ＦＬＡＧでタグ化されたＲＩＧ−Ｉが、同時トランスフェクション実験においてＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧと会合する場合があることを主に示した（図４Ａ）。ＳＴＩＮＧへのＲＩＧ−Ｉの結合が、ＳｅＶでの２９３Ｔ細胞の感染を増大させた（図４Ａ）。その後内在性ＲＩＧ−Ｉが、内在性ＳＴＩＮＧと、複合体として直接的又は間接的に会合する場合があることを正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）で確かめられた（図４Ｂ）。このデータは、ＳＴＩＮＧがＭＤＡ５で調節される経路よりもむしろＲＩＧ−Ｉを優先的に変調するらしいことを示す。この解析を拡張するために、ＳＴＩＮＧと会合する場合があるＲＩＧ−Ｉの領域が次に注目された。比較的小さいＲＩＧ−Ｉコンストラクトが構築され、ＦＬＡＧ配列に融合されたＣＡＲＤドメイン（１−２８４番目のアミノ酸）を含む。ＲＩＧ−Ｉのカルボキシル領域（２１８−９２５番目のアミノ酸）ではなく、ＲＩＧ−Ｉの前記ＣＡＲＤドメインがトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞でＨＡ−ＳＴＩＮＧと優先的に会合できるということが特筆された（図４Ｃ）。
【０３８５】
トランスフェクションされたＳＴＩＮＧはＩＦＮβプロモーターを活性化するためのＲＩＧＩの能力を緩やかに増大することができるということが観察された。しかし、ＳＴＩＮＧのカルボキシル領域がＲＩＧ−Ｉの機能を阻害する場合があり、ＳＴＩＮＧのこの領域が優勢阻害効果を示す場合があることを再度示すことが特筆された（図４Ｄ）。その後に、ＲＩＧ−Ｉが同時トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞でＳＴＩＮＧと同時局在することが示された（図４Ｅ）。ＲＩＧ−Ｉとの状況に類似するけれども、ＳＴＩＮＧと、ＲＩＧ−Ｉの下流のアダプターＩＰＳ−Ｉとの会合が特筆され、ＩＰＳ−ＩがＳＴＩＮＧと直接的に相互作用するか、ＲＩＧ−Ｉ／ＳＴＩＮＧの複合体として存在するかどうかは明らかではない（補足図７）。従って、ＳＴＩＮＧがＲＩＧ−Ｉ又はＩＰＳ−１を欠損するＭＥＦにおいてルシフェラーゼコンストラクトを駆動させるＩＦＮβの誘導を誘導することができ、ＳＴＩＮＧがこれらの先の分子の下流で機能することがおそらく確かであることが観察された（補足図８）。明らかにされたＩＦＮβを誘導するためのΔＲＩＧ−Ｉ又はＩＰＳ−１の能力が、ＳＴＩＮＧ−／−のＭＥＦで低下した（図４Ｆ）。しかし、内在性ＤＮＡ自然シグナル伝達経路がおそらく欠損するために、対照ＭＥＦと比較して、ＳＴＩＮＧの非存在下では（ベクター単体を含む）トランスフェクションされたプラスミド全てによって前記ＩＦＮβの誘導を顕著に低下した。合わせて、データは、ＳＴＩＮＧが、ＲＩＧ−Ｉと、おそらくＩＰＳ−Ｉとの機能と、細胞内ＤＮＡで仲介される自然シグナル伝達経路とを促進する重要な下流のアダプター分子の場合があることを示す。
【０３８６】
ＳＴＩＮＧと相互作用する場合があるその他のタンパク質を同定し、ＳＴＩＮＧの作用分子機構をさらに解明するために、酵母ツーハイブリッドアプローチが適用され、この研究所によって開発されたＩＦＮで誘導されたヒト線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーが、バイトとしてＳＴＩＮＧ（１７３−３７９番目のアミノ酸）を用いてスクリーニングされた。このアプローチ後、ＳＴＩＮＧと会合することを繰り返し見出された１つの分子は、翻訳後にＥＲへのタンパク質の移行を促進する、４つのサブユニット（α−Δ）を含むＴＲＡＰ複合体のメンバーのＳｓｒ２／ＴＲＡＰβだったことが決定された（図４Ｇ）。前記ＴＲＡＰ複合体は、３つのサブユニットのＳｅｃ６１α、β及びγを含むトランスロコンと会合する。ＴＲＡＰβは、同時免疫沈降実験のとおり、ＨＥＫ２９３細胞で内在性ＳＴＩＮＧと実際に会合する場合があることが確かめられた（図４Ｈ）。このアプローチを用いて、ＴＲＡＰβが、おそらくＴＲＡＰβとの複合体として内在性Ｓｅｃ６１βと同時免疫沈降したことが確かめられた（図４Ｈ）。ＳＴＩＮＧがＴＲＡＰβだけでなく、Ｓｅｃ６１βとも会合する場合もあることが次に確かめられた（図４Ｉ）。これは、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＰβ及びＨＡ−ＳＴＩＮＧを同時トランスフェクションし、ＨＡ抗体で免疫沈降することによって達成された。ＦＬＡＧに対する抗体を用いる免疫ブロット解析が、ＳＴＩＮＧとＴＲＡＰβとの会合を確かめた。内在性Ｓｅｃ６１βに対する抗体が、ＳＴＩＮＧ／ＴＲＡＰβ複合体との会合を確かめた（図４Ｉ）。ＳＴＩＮＧが細胞のＥＲ領域でＴＲＡＰβと同時局在することを観察された（図４Ｋ）。まとめると、このデータは、前記ＳＴＩＮＧがトランスロコンの機能と関係する場合があり、前記トランスロコンがＩ型ＩＦＮの誘導に影響可能な場合があることを示すであろう。したがって、２９３Ｔ細胞から前記トランスロコン分子を除去するＲＮＡｉアプローチを用いて、ＴＲＡＰβ又はＳｅｃ６１βの消失が、ＳＴＩＮＧの機能を除去、及び／又は、Ｉ型ＩＦＮ産生に影響したかどうかが評価された。ＴＲＡＰβ又はＳＥＣ６１βの消失は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ又は免疫ブロットによって確かめられ、細胞生存能に影響しなかった（図１２Ａ−１２Ｃ）。このデータは、ＴＲＡＰβ又はＳＥＣ６１βの消失が、ルシフェラーゼを駆動するＩＦＮβプロモーターを誘導するためのＳＴＩＮＧの能力を回復したことを示した（図４Ｊ）。合わせてこのデータは、前記トランスロコンが細胞の自然免疫シグナル伝達過程に関係する場合があることを示す新たな情報を提供する。したがって、ＳＴＩＮＧは、ＲＩＧ−Ｉ及びＤＮＡで仲介される細胞内自然シグナル伝達を前記トランスロコンにつなぐ場合がある、主に小胞体タンパク質（ＥＲ  ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である。理論的に、ＲＩＧ−Ｉは、マイナス鎖又はプラス鎖のウイルスＲＮＡ検出のための自然免疫シグナル伝達受容体かもしれないと推測され、翻訳しているウイルスのＲＮＡをリボソーム／ＥＲトランスロコンの会合の交差点で検出され、ＳＴＩＮＧにその機能を発揮するために必要とされる。代替的に、ＳＴＩＮＧは、確かめられるべきままの事象に、ＥＲストレス応答経路の仲介することで関与する場��がある。前記トランスロコンからＩＲＦ−３／ＮＦ−ｋＢまでのシグナル伝達が如何に生じるかは明らかではないが、トランスロコンは、膜融合の準備で、前記ＥＲと会合し、分泌小胞を膜に繋ぎとめ、タンパク質合成及び分泌を促進する、エクソシスト−１０量体Ｓｅｃ６−Ｓｅｃ８複合体と機能的及び物理的に会合する。近年、前記エクソシスト複合体が、ＴＢＫ１を動員し、活性化し、Ｉ型ＩＦＮ−βの誘導で役割を果たすことが発見された。本明細書の予備的な解析が、ＳＴＩＮＧがＴＢＫ１と同時免疫沈降すること、及び、Ｓｅｃ５のＲＮＡｉ除去がＳＴＩＮＧの機能を消失する細胞にすることを示す（図４Ｌ）。したがって、ＳＴＩＮＧは細胞内ウイルスＲＮＡ種と、Ｂ型ＤＮＡとの検出を促進する場合があり、これらのＰＡＭＰ認識経路の収束を示す。これらの機構は明らかにされることが必要である一方、多くの感染性病原体及び毒物が前記ＥＲを標的にすることは明白である。したがって、前記ＥＲは認識するために進化され、感染後の細胞で自然免疫シグナル伝達を仲介することを含むこれらの細胞ストレスに応答した。
【実施例２】
【０３８７】
ＳＴＩＮＧは、細胞内ＤＮＡで仲介される、Ｉ型インターフェロン依存性自然免疫を調節する。
【０３８８】
方法
マウス、細胞及び試薬
１２９ＳｖＥｖとＣ５７ＢＬ／６ＪのバックグラウンドのＳＴＩＮＧ欠損変異体マウスは、以前に説明されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｈ．及びＢａｒｂｅｒ，  Ｇ．Ｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５５、６７４−６７８（２００８））。ＭＥＦ、骨髄由来マクロファージ及びＧＭ−ＣＳＦで誘導された樹状細胞（ＧＭ−ＤＣｓ）は、以前に説明されたように調製された（Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｈ．及びＢａｒｂｅｒ，  Ｇ．Ｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５５、６７４−６７８（２００８））。ＦＬＴ３リガンドで誘導されたＤＣｓ（ＦＬＴ３−ＤＣｓ）を調製するために、骨髄細胞が、１０％  ＦＢＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）及び１００ｎｇ／ｍＬのヒトＦＬＴ３リガンド（ぺプロテック）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で８日間培養された。２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手され、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地で維持された。ＶＳＶ（インディアナ株）及びＥＭＣＶが以前に説明された（Ｉｓｈｉｋａｗａら、２００８））。ＨＳＶ−１（ＫＯＳ株）及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（血清型１０４０３）はＡＴＣＣから入手された。ゲノムＤＮＡは以下の供給源から得られた。ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−２、アデノウイルス５型（ＡＴＣＣ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ウシ胸腺（シグマ）、ポリ（ｄＡ：ｄＴ）及びポリ（ＬＣ）がアマシャムバイオサイエンスから入手された。ポリ（ｄＧ：ｄＣ）及びポリ（ｄＡ）はシグマから入手された。ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＯＤＮ  １５８５）はインビトロジェンから入手された。細胞を刺激するために、ゲノムＤＮＡ、ポリデオキシヌクレオチド又はポリ（ＬＣ）が、１：１（ｖｏｌ／ｗｔ）の割合でリポフェクタミン２０００とともに混合され、その後、最終濃度１μｇ／ｍＬで細胞に添加された。
【０３８９】
プラスミド
黄熱ウイルスＮＳ４Ｂの配列が、鋳型として完全なＹＦＶ−１７Ｄ配列をエンコードするｐＹＦＭ５．２を用いてＰＣＲによって増幅され、Ｃ末端にＨＡでタグ化された発現コンストラクトを作成するためにｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）プラスミドにクローニングされた。ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）のｃＤＮＡを含む前記発現プラスミドが、ＰＣＲで増幅されたＯＶＡのｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３にクローニングによって構築された。ＨＡでタグ化されたマウスＳＴＩＮＧ（ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡ）、ＦＬＡＧでタグ化されたΔＲＩＧ−Ｉ（１−２８４個のアミノ酸）及びΔＭＤＡ５（１−２８４個のアミノ酸）をエンコードする発現プラスミドが以前に説明された（Ｉｓｈｉｋａｗａら、２００８））。ｐ１１０−Ｌｕｃ（ＩＦＮβ−Ｌｕｃ）がＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓから得られた。ｐＵＮＯ−ｈｓａＩＲＦ３（ＩＲＦ３ＳＡ）及びｐＵＮＯ−ｈｓａＩＲＦ７Δ（ＩＲＦ７ＳＡ）がインビトロジェンから得られた。マウスＤＡＩを含むｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６がオープンバイオシステムズから入手された。
【０３９０】
抗体及びＥＬＩＳＡ
ＳＴＩＮＧに対するウサギポリクローナル抗体が以前に説明された（Ｉｓｈｉｋａｗａら、２００８））。その他の抗体は、カルレティキュリン（ａｂｌ４２３４、アビーム）、シグマ１受容体（［ＳｉｇｍａｌＲ］ａｂ５３８５２、アビーム）、ＴＢＫ１（ＥＰ６１１Ｙ、アビーム）、ＣＯＸ  ＩＶ（ａｂ１６０５６、アビーム）、ウサギポリクローナルＨＡ（ａｂ９１１０、アビーム）、トランスフェリン受容体（［ＴｆＲ］Ｈ６８．４、インビトロジェン）、マウスモノクローナルＨＡ（シグマ）、ＦＬＡＧ（Ｍ２、シグマ）、ＩＲＦ３（ＺＭ３、ザイメッド）、ＴＧＮ４６（ａｂｌ６０５９、アビーム）、ジアンチン（ａｂ２４５８６、アビーム）、ＥＥＡ１（＃２４４１、セルシグナリング）、ＬＡＭＰ１（ＮＢ１２０、ノバスバイオロジカルズ）、ＳＥＣ６１β（アップステート）の供給源から入手された。ＥＬＩＳＡキットは、マウスＩＦＮ−β及びＩＦＮ−α（ＰＢＬ）、マウスＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ又はクアンシスバイオサイエンス）、マウスＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄシステムズ）、マウスＲＡＮＴＥＳ（クアンシスバイオサイエンス）の供給源から入手された。
【０３９１】
ＲＴ−ＰＣＲ
蛍光リアルタイムＰＣＲ解析が、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０機器（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナ州インディアナポリス）と、ＩＦＮβ（Ｍｍ００４３９５４６＿ｓ１）、ＩＦＮα２（Ｍｍ００８３３９６１＿ｓ１）及びＴＲＡＰβ（Ｍｍ００４８１３８３＿ｍ１）のＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（アプライドバイオシステムズ）とを用いて実施された。ｍＲＮＡの相対量は、各試料の１８ＳリボソームＲＮＡレベルで標準化された。
【０３９２】
レポーター解析
２４ウェルプレート上に播種された２９３Ｔ細胞は、総量６００ｎｇのさまざまな発現プラスミド又は対照空プラスミドとともに５０ｎｇのルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて一過的にトランスフェクションされた。内部対照として、１０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫが同時にトランスフェクションされた。その後、２４時間後、総細胞溶解物における前記ルシフェラーゼ活性が測定された。
【０３９３】
ＤＮＡワクチン
マウスは、筋肉内（ｉ．ｍ．）への電気穿孔によってＯＶＡをエンコードするプラスミド（マウス１匹あたり１００μｇ）を用いて免疫された。追加免疫が、第１回目の免疫後２又は４週間までに施された。
【０３９４】
ＯＶＡ特異的免疫応答の測定
脾臓は第２回目の免疫後２週間目に抽出され、５ｘ１０５個の脾臓細胞が９６ウェルプレート上に播種され、その後、１０μｇ／ｍＬのＯＶＡの合成ペプチド（Ｈ−２Ｋｂ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、プロイムノ）で刺激された。３日後、前記細胞の培養上清が採取され、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）によってＩＦＮ−γのタイターが解析された。細胞内ＩＦＮ−γの染色のために、刺激された脾臓細胞が、ＦＩＴＣで標識された抗ＣＤ８抗体（ＢＤ）を用いて染色された。洗浄後、細胞は固定され、透過処理された。その後、細胞は、ＰＥで標識された抗ＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ）を用いて染色された。フローサイトメトリー解析がＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ機器（ＢＤ）で行われた。血清抗ＯＶＡ抗体のタイターがＥＬＩＳＡによって測定された。簡潔には、９６ウェルプレートが１μｇ／ｍＬのＯＶＡタンパク質でコーティングされ、その後、５％脱脂乳を含むＰＢＳでブロッキングされた。プレートは洗浄され、系列希釈された血清で室温で１時間覆われた。洗浄後、抗体は、西洋ワサビぺルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ）を用いて検出された。追加の洗浄後、前記プレートは、基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、シグマ）を用いて染色された。反応が１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で止められ、吸光度が測定された。抗体のタイターは、バックグラウンド減算後に希釈限界法の逆数として表された。
【０３９５】
分画法
ＭＡＭ、ミトコンドリア及びミクロソームが、ｍＳＴＩＮＧ−ＨＡプラスミドを安定的にトランスフェクションされたＳｔｉｎｇ  ＭＥＦから単離された。簡潔には、細胞が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、１，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって沈殿された。沈殿はショ糖均質化緩衝液（０．２５Ｍ  ショ糖、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ［ｐＨ  ７．４］）に再懸濁され、細胞がダウンスホモジナイザーを用いることによって溶解された。溶解された細胞は５００ｇで１０分間遠心分離され、上清が採取された。その後、上清は、未精製のミトコンドリア画分（ＭＡＭ及びミトコンドリア）から未精製のミクロソーム画分（ミクロソーム及び細胞質）を分離するために１０，３００ｇで１０分間遠心分離され、前記未精製のミクロソーム画分（上清）は１００，０００ｇで６０分間超遠心分離された。前記未精製のミトコンドリア画分（沈殿）が、氷冷されたマンニトール緩衝液Ａ（０．２５Ｍ  マンニトール、５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁され、３０％  パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）のマンニトール緩衝液Ｂ（０．２２５Ｍ  マンニトール、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）上に層状にされた。ミトコンドリア及びＭＡＭ画分は、９５，０００ｇで６５分間超遠心分離することによって分離された。単離された画分の両方はマンニトール緩衝液Ｂで希釈され、６，３００ｇで１０分間遠心分離された。ＭＡＭの遠心分離の上清は１００，０００ｇで６０分間遠心分離することによってさらに分離され、沈殿はＭＡＭ画分として用いられた一方、前記ミトコンドリアの遠心分離の沈殿はミトコンドリア画分として用いられた。前記画分全ては、マンニトール緩衝液Ｂに再懸濁された。
【０３９６】
共焦点顕微鏡観察
Ｓｅｃ５及びＬＡＭＰ１の局在化のために、カバーガラス上で増殖された細胞は、８０％／２０％  マンニトール／アセトンで−２０°Ｃで５分間固定された。ＥＥＡ１の染色のために、細胞は、４％パラホルムアルデヒドＰＢＳで３７°Ｃで１５分間固定され、０．２％  トリトン−Ｘ１００で透過処理された。その他のタンパク質を染色するために、細胞は、４％ホルムアルデヒドＤＭＥＭによって３７°Ｃで１５分間固定され、０．２％  トリトン−Ｘ１００によって透過処理された。ミトコンドリア染色のために、生細胞が、３００ｎＭのミトトラッカーレッド（インビトロジェン）で３７°Ｃで４５分間インキュベーションされた。固定され、透過処理された細胞が０．１％  ＢＳＡのＰＢＳでプレインキュベーションされ、１次抗体でインキュベーションされた。その後細胞が、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３又はＣｙ５（シグマ）を結合した２次抗体でインキュベーションされた。
【０３９７】
ＲＮＡ干渉
化学的に合成されたヌクレオチド２１個のｓｉＲＮＡ２本鎖が、ダーマコン社（コロラド州ラファイエット）から入手された。この研究で用いられた各ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列は、マウスＴＲＡＰβのｓｉＲＮＡ、５’−ＵＧＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＣＧＧＧＵＵＡＵＵ−３’（配列番号６）、マウスＳｅｃ５のｓｉＲＮＡ、５’−ＡＧＡＡＧＵＡＵＵＡＧＧＵＣＧＧＡＡＡ−３’（配列番号７）、５’−ＵＣＡＡＣＧＵＡＣＵＵＣＡＧＣＧＡＵＵ−３’（配列番号８）、５’−ＣＡＧＣＡＧＡＧＡＵＵＡＣＡＣＧＵＣＡ−３’（配列番号１０）、５’−ＧＵＧＡＧＵＧＧＣＵＵＧＣＧＣＡＧＵＡ−３’（配列番号１１）である。ＭＥＦは、製造者の推奨に従ってアマクサヌクレオフェクター装置（プログラムＡ−０２３）及びアマクサＭＥＦヌクレオフェクターキット１を用いることによってトランスフェクションされた。トランスフェクション後７２時間に、細胞はさらに実験に用いられた。
【０３９８】
統計
スチューデントｔ検定がデータを解析するために用いられた。
【０３９９】
前の実施例では、実施例１は、細胞内Ｂ型ＤＮＡに応答してマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）でＩ型ＩＦＮの産生を促進する、小胞体（ＥＲ）に存在する膜貫通タンパク質のＳＴＩＮＧ（ＭＰＹＳ／ＭＩＴＡとも言われる。）の役割を最初に示した（Ｊｉｎ，  Ｌ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２８、５０１４−５０２６（２００８）、Ｚｈｏｎｇ，  Ｂ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９、５３８−５５０（２００８））。ＤＮＡで誘導される自然免疫応答の仲介でＳＴＩＮＧの重要性の評価に解析を拡張するために、ＷＴ（＋／＋）又はＳｔｉｎｇ（−／−）の継代数が少ないＭＥＦを用いて、さまざまなＤＮＡリガンドに応答するＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮβ）の誘導が比較された。これらの結果は、ＳＴＩＮＧは、トランスフェクションしたウイルスＤＮＡ（アデノウイルス、Ａｄ５；単純ヘルペスウイルス、ＨＳＶ−１及び２）と、精製されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡと、ウシ胸腺ＤＮＡと、ＣＴ  ＤＮＡと、インターフェロン刺激性ＤＮＡのＩＳＤとに応答するＩＦＮβを誘導するのに必要不可欠だったことを示した（図１３Ａ）。ＩＦＮβの産出の完全な停止がＳｔｉｎｇ（−／−）のＭＥＦでのポリｄＧＣ：ｄＧＣのトランスフェクションの後に観察され、わずかなＩＦＮβの産出が、ポリｄＡＴ：ｄＡＴの使用時に、おそらくＳＴＩＮＧ非依存性、ＲＩＧ−Ｉ依存性のシグナル伝達のために観察された。ＳＴＩＮＧの消失は、ＭＤＡ５によって主に支配されるポリ（ＩＣ）で仲介されるＩ型ＩＦＮの産生に顕著に影響しなかった。付随的解析は、類似のＤＮＡトランスフェクション後の対照と比較して、ＳＴＩＮＧを欠損するＭＥＦでのＩＬ−６産生の劇的な減少をさらに示した（図１３Ａ）。ＩＳＤで仲介されたＩｆｎβ及びＩｆｎ２ａのｍＲＮＡ産生は、対照と比較して、ＳＴＩＮＧを欠損するＭＥＦでは検出することができなかった（図１３Ｂ）。したがって、ＩＲＦ３又はＩＲＦ７の移行は、ＩＳＤでトランスフェクションされたＳＴＩＮＧを欠損するＭＥＦでは観察されず、ＳＴＩＮＧが、ＴＢＫ−１の上流の細胞内ＤＮＡで誘因されたＩＦＮ産生を仲介することでおそらく機能することを示す（図１３Ｃ）。また、ＮＦ−κＢのシグナル伝達は、トランスフェクションされたＩＳＤへの曝露後、Ｓｔｉｎｇ−／−のＭＥＦで適度に欠損した。合わせて、これらのデータは、ＳＴＩＮＧが、線維芽細胞タイプの細胞での細胞内ＤＮＡの認識で必要不可欠な役割を果たすことを示す。これを考慮して、マクロファージを含む抗原提示細胞における細胞内ＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮの産生の促進でのＳＴＩＮＧの重要性が調べられた。この解析は、ＩＳＤでトランスフェクションされたか、あるいはＤＮＡ病原体のＨＳＶ−１又はＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染したＳｔｉｎｇ（−／−）のマクロファージは、Ｉ型ＩＦＮの作成するための能力を大いに欠損することを示した（図１３Ｄ）。しかし、ＡＩＭＩＩ依存性であるプロカスパーゼ１の開裂及び活性型ＩＬ−１βの産生は、ＳＴＩＮＧの消失によって影響されない（図１３Ｅ）。したがって、ＳＴＩＮＧは、ＡＩＭＩＩの「ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ（インフラマソーム）」経路に非依存的に機能するが、細胞内ＤＮＡに応答するＩＦＮの���生に必要不可欠である。さらなる解析は、ＳＴＩＮＧがＧＭＤＣｓ及びＤＣｓ由来の形質細胞（Ｆｌｔ３−ＤＣ）での効率的なＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮの産生に必要とされたことを同様に示した（図１３Ｅ、１３Ｆ）。しかし、残存する内在性ＣｐＧ  ＤＮＡは、対照と比較してＳＴＩＮＧを欠損するＦｉｔ−ＤＣｓにおけるＩ型ＩＦＮを誘導することができ、ＴＬＲ９がＳＴＩＮＧ経路に非依存的に機能することを示す（図１３Ｆ）。また、細胞内ＤＮＡに応答するＩＬ−６の誘導が、Ｓｔｉｎｇ（−／−）のマクロファージで調べられた（図１７）。しかし、ＨＳＶ−１及びＣｐＧ  ＤＮＡが、おそらくＴＬＲ９に依存性のやり方でＳＴＩＮＧを欠損するマクロファージにおいてＩＬ−６を誘導することができるが（図１７）、Ｉ型ＩＦＮを誘導できない（図１３Ｄ）。したがって、ＳＴＩＮＧは、線維芽細胞、マクロファージ、従来のＤＣｓ及びｐＤＣでの細胞内ＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮの産生に重要らしい。最後に、ＳＴＩＮＧが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルス（ＶＶΔＥ３Ｌ）及びバキュロウイルスによる効率的なＩ型ＩＦＮの産生に必要とされることがさらに特筆される。したがって、ＳＴＩＮＧは、線維芽細胞、マクロファージ、従来のＤＣｓ及びｐＤＣでの細胞内ＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮの産生に重要らしい。
【０４００】
ＨＳＶ−１を用いる感染後、ＳＴＩＮＧを欠損する細胞でのＩ型ＩＦＮの産生の顕著な消失が観察されたため、ウイルス感染に対する効率的な宿主防御の促進におけるＳＴＩＮＧのｉｎ  ｖｉｖｏでの重要性が評価された。したがって、Ｓｔｉｎｇ（−／−）又は対照のマウスは静脈内にＨＳＶ−Ｉを感染され、生存が観察された。この研究は、ＳＴＩＮＧを欠損する動物がＨＳＶ−１の感染７日間以内に死んだことを示した（図１４Ａ）。対照的に、同様に感染した野生型マウスの８０％が生存した。かなりの量のＨＳＶ−１が、感染後５日目の感染したＳｔｉｎｇ（−／−）マウスの脳で検出されたが、対照では観察されなかった（図１４Ｂ）。前記Ｓｔｉｎｇ（−／−）の感染動物由来の血清解析は、感染対照動物と比較して、感染後６時間でＩ型ＩＦＮの産生の重度の欠損を示し、ＩＦＮが脳を含む中枢神経系の領域にＨＳＶ−１を到達することを阻害するのに重要であることを示唆する（図１４Ｃ、１４Ｄ）。ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６のレベルは、同一の時点でＳＴＩＮＧを欠損する動物において同様に劇的に低下された（図１４Ｅ、１４Ｆ）。また、Ｓｔｉｎｇ（−／−）のマウスは、ＨＳＶ−１の膣内投与後、ＨＳＶ−１により感受性であることが発見された。このデータは、ＳＴＩＮＧが効率的なＩ型ＩＦＮの産生に重要であり、ＨＳＶ−１の感染に対してのｉｎ  ｖｉｖｏ防御に必要不可欠であることを示した。
【０４０１】
ＳＴＩＮＧの非存在下でＩ型ＩＦＮを誘導するためのマイナス鎖ウイルスの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで欠損することが観察されたため、ＶＳＶ関連疾患に対しての防御におけるＳＴＩＮＧのｉｎ  ｖｉｖｏでの重要性が調べられた。また、ＶＳＶで感染されたＳｔｉｎｇ−／−の動物は、対照と比較して致死性感染に非常に感受性だったことが観察された（図１４Ｇ）。Ｉ型ＩＦＮの産生の欠損は、２４時間でかなり欠損するが、早い時点（６時間）においてＳＴＩＮＧを欠損する動物で見られた（図１４Ｈ、１４Ｉ及び図１８Ａ−１８Ｆ）。したがって、ＳＴＩＮＧは、Ｉ型ＩＦＮの産生の効率的な初期誘導に必要とされ、おそらくＲＩＧ−Ｉ／ＩＰＳ−１経路を調節すること通して、マイナス鎖ウイルスのＶＳＶの感染に対する防御に必要とされる。
【０４０２】
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、フラビウイルスファミリーのプラス鎖ウイルス又は合成ポリ（ＩＣ）が、ＭＤＡ５活性を誘因することを通してＩ型ＩＦＮの誘導を誘導する。ＳＴＩＮＧの必要性がポリ（ＩＣ）活性の促進では観察されず、ＳＴＩＮＧがＭＤＡ５の機能に影響しない場合があることを示す（図１３Ａ）。しかし、ＳＴＩＮＧのノックアウトマウスは、対照と比較して致死性ＥＭＣＶ感染にわずかにより感受性であることを確かめられ、ＳＴＩＮＧが、前記ウイルスによって誘因される宿主防御経路にいくつかの影響を及ぼす場合があることを示す（図１４Ｊ）。それでも、顕著な欠損は、ＥＭＣＶの感染後、対照と比較してＳｔｉｎｇ（−／−）のマウスでのＩ型ＩＦＮの産生で観察されなかった（図１８Ａ−１８Ｆ）。しかし、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のようなフラビウイルスのいくつかは、ＳＴＩＮＧによって促進されるシグナル伝達のＲＩＧ−Ｉ経路を活性化する場合があることが知られる。興味深いことに、データバンクの解析は、前記フラビウイルスの黄熱ウイルス（ＹＦＶ）及びデングウイルス（ＤＶ）が、ＳＴＩＮＧのアミノ末端（１２５−２２２番目のアミノ酸）と強い相同性を示したＮＳ４ｂ産物をエンコードしたことを示した（図１９Ａ−１９Ｃ）。１５３−１７３番目のアミノ酸の消失がＳＴＩＮＧの機能を除去したため、ＳＴＩＮＧ活性でのこの領域の重要性が強調された。機構は不明のままだが、さまざまなフラビウイルスのＮＳ４ｂ産物が細胞のＥＲで局在し、Ｉ型ＩＦＮの誘導を抑制することが示された。これらの観察を考慮して、ＹＦＶ  ＮＳ４ｂがＳＴＩＮＧの機能を干渉する場合があるかどうかが次に決定された。これらの実験は、ＮＳ４ｂは、Ｉ型ＩＦＮを誘導するためのＳＴＩＮＧ能力だけでなく、ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５と、ＶＳＶΔＭとの能力も阻害することができたことを示した（図１４Ｋ）。影響は、ＮＳ４ｂが誘導するアポトーシスのためではなかった。ＹＦＶ  ＮＳ４ｂはＳＴＩＮＧと同時局在することが示され、その後、ＳＴＩＮＧと直接的に会合することが発見され、効率的にＳＴＩＮＧの機能を阻害する（図１８Ａ−１８Ｆ）。これらのデータは、ＳＴＩＮＧが、ＤＮＡウイルス及びマイナス鎖ウイルスのＶＳＶに対する応答での効率的なＩ型ＩＦＮの産生に必要不可欠であることを示す。さらに、ＳＴＩＮＧは、抑制のためにフラビウイルスによって標的化される場合がある。
【０４０３】
ＳＴＩＮＧは、Ｉ型ＩＦＮ４のインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）依存性刺激を誘因する非古典的（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）なＩｋＢキナーゼＴＢＫ−１を通して部分的にその機能を発揮する。ＴＢＫ−１は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡワクチンのアジュバント活性の仲介で重要な役割を果たす。プラスミドＤＮＡに応答してのＴＢＫ−１の活性化は、ＴＬＲ９又はＤＡＩ／ＺＢＰ−１のＤＮＡセンサーの非存在下で生じることが発見され、その他の経路がＤＮＡで仲介される免疫を促進するために存在することを示す。ＳＴＩＮＧがこのシグナル伝達経路の役割を果たすかを評価するために、ＳＴＩＮＧ−／−又は対照のマウスは、オボアルブミン遺伝子をエンコードするプラスミドＤＮＡで免疫された。正常なＢ及びＴ細胞のサブセットが、刺激されていないＳＴＩＮＧ−／−動物で認められる一方、免疫後のＳＴＩＮＧ−／−マウスは、血清のオボアルブミン（ＯＶＡ）特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇの顕著な減少を示した（図１５Ａ）。さらに、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度及びＩＦＮ−γの分泌は、免疫後、野生型マウスと比較してＳＴＩＮＧ−／−動物で著しく減少した（図１５Ｂ、１５Ｃ）。ＯＶＡペプチドに応答する免疫グロブリンが正常であるため、これらのデータは、前記ＳＴＩＮＧに支配されるＤＮＡセンサー経路がＤＮＡワクチンで誘導されるＴ細胞の抗原への効率的な応答に必要不可欠であることを強調した。この情報を考慮して、ＳＴＩＮＧはオボアルブミンを発現するＤＮＡウイルスのワクシニア（ＶＶ−ＯＶＡ）に感染後のＴ細胞応答の促進で役割を果たすかが次に評価された。この研究はＳＴＩＮＧ−／−マウスではなく、対照マウスが、ＯＶＡをエンコードしたウイルスへの強いＴ細胞応答を誘発したことを示し、ＤＮＡアジュバント活性に必要とされる自然免疫シグナル伝達過程でのＳＴＩＮＧの重要性を確かにしている。
【０４０４】
主にＥＲに存在するタンパク質であるＳＴＩＮＧは、ＲＩＧ−Ｉ及びミトコンドリアの自然免疫シグナル伝達アダプターのＩＰＳ−１と会合する場合があり、事象はマイナス鎖ウイルスで仲介されるＩ型ＩＦＮの産生の促進でＳＴＩＮＧの重要性を説明する場合がある。ＳＴＩＮＧは、前記ＥＲでトランスロコン関連タンパク質複合体（ＴＲＡＰ）と会合する。ミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭ）として言及される、ミトコンドリアと前記ＥＲとの物理的な会合は、前記ミトコンドリアへのＣａ２＋の移行と、酸化代謝とに重要である。ＳＴＩＮＧが、ＭＡＭの相互作用に関係する場合があるかを調べた次の実験は、ＩＰＳ−１／ＳＴＩＮＧの相互作用を説明する手助けする場合がある。最初に、ＨＡでタグ化されたＳＴＩＮＧが、ＨＡ抗体を用いて内在性ＳＴＩＮＧの局在を追跡するためにＳＴＩＮＧ（−／−）のＭＥＦに再構築された。この解析は、カルレティキュリンマーカーとの共染によって決定されるとき、ＳＴＩＮＧが主に前記ＥＲと会合することを確かめた（図１６Ａ）。また、ミトトラカーとの共染は、ＳＴＩＮＧが、前記ＥＲと会合したミトコンドリアと同時局在する場合があるすることを示した（図１３Ｂ）。その後、分画解析は、ＳＴＩＮＧが、ＥＲ、ゴルジ及び輸送小胞を含む連続的な膜の複合体のミクロソームと会合することを示した。また、内在性ＳＴＩＮＧが、刺激されていない条件下のＭＥＦにおけるＭＡＭ及びミトコンドリアの画分とともに分画することを発見された（図１４Ｃ）。ＥＲ及びミトコンドリアの会合の調節に関係するシャペロニンであることが知られるカルレティキュリンが同様に分画することを発見された。このデータは、ＶＳＶ感染の場合には、ＳＴＩＮＧがＲＩＧ−Ｉのシグナル伝達を促進するためにＭＡＭ相互作用を通してＩＰＳ−１と会合する場合があることを示す場合がある。興味深いことに、ＨＳＶ−１の感染後、ＳＴＩＮＧはミクロソーム画分のみと主に会合だけすることが観察された（図１４Ｃ）。これらの観察を明らかにするために、ＨＡ−ＳＴＩＮＧ  ＭＥＦが、ＨＳＶ−１で感染されたか、あるいは刺激性ＩＳＤ又は陰性対照のｓｓＤＮＡを前記細胞にトランスフェクションされた。これらの結果は、ＨＳＶ−１の感染又はＩＳＤのトランスフェクションに応答して、ＳＴＩＮＧが前記ＥＲから移行し、前記細胞の非ＥＲミクロソームの区画の核周辺に主に集められたことを示した（図１６Ｄ）。前記ＥＲ及びＭＡＭの画分から輸送されたＳＴＩＮＧは、カルレティキュリン及びミトトラッカーのマーカーで細胞を染色することによって確かめられた（図２０）。クロロキンではなく、ブレフェルジンＡはＳＴＩＮＧの輸送を阻害し、ＳＴＩＮＧが、核周辺領域においてゴルジを介するＥＲから小胞まで局在することを示す。細胞内ＤＮＡに応答するこの輸送は、ＳＴＩＮＧと会合するＴＢＫ−１について同様に観察された。ＳＴＩＮＧの非存在下で、顕著に、ＴＢＫ−１はＩＳＤのトランスフェクションに応答して核周辺領域に再配置できない。ＳＴＩＮＧのアミノ酸３６個の仮想アミノ末端シグナルペプチド配列を消失することがＳＴＩＮＧの輸送及び機能を除去し、ＳＴＩＮＧ活性におけるこの領域の重要性を強調する。合わせて、ＳＴＩＮＧは���ＢＫ−１との複合体として移行することはもっともらしく思われる（図１６Ｅ）。
【０４０５】
ＳＴＩＮＧの細胞内局在を評価するために、ＤＮＡで仲介される細胞内刺激後、細胞内小器官と特異的に会合する分子を認識する抗体が用いられた。ＤＮＡの存在下、ＳＴＩＮＧは、初期エンドソームマーカータンパク質ＥＥＡ１と、再循環エンドソームマーカーＴｆＲとともに主に局在したことが観察された（図１６Ｆ及び図２０）。また、同様に細胞内ＤＮＡに応答して輸送されるＴＢＫ−１は、小胞輸送過程を促進するエクソシスト８サブユニット複合体の構成要素のＳｅｃ  ５と会合することを示されている。細胞内ＤＮＡ刺激まで、ＳＴＩＮＧは、核周辺のエンドソーム区画で会合することが示されているＳｅｃ５と強く同時局在することを発見された（図１６Ｇ）。ＲａｌＢ／Ｓｅｃ５経路が、センダイウイルス（ＳＶ）で仲介されるＩ型ＩＦＮの効率的な産生に必要とされる。しかし、本明細書のデータは、ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ−１複合体が、Ｓｅｃ５／エクソシストの構成成分と会合するためにエンドソームの区画に輸送され、細胞内ＤＮＡに応答してＩ型ＩＦＮの産生を促進する場合があることを示す。またＳｅｃ５がＩＳＤに応答してＩＦＮβの産生を変調するかを評価するために、正常なＭＥＦにおけるＳｅｃ５産生がＲＮＡｉを用いて抑制された（図２１Ａ、２１Ｂ）。この研究は、Ｓｅｃ５の非存在下、ＩＳＤで仲介されるＩＦＮの産生が顕著に損なわれたことを示した（図１６Ｇ）。同様の影響が、ＴＲＡＰ複合体の構成成分のＴＲＡＰβ及びＳｅｃ６１βのノックダウンで観察された。したがって、データは、細胞内ＤＮＡが、ＴＢＫ−１との複合体形成をし、エンドソームの区分を含むＳｅｃ５に輸送するためにＳＴＩＮＧを誘導する場合があり、事象はＩ型ＩＦＮの産生を促進することを示す。
【０４０６】
結論として、ＳＴＩＮＧは、細胞内ＤＮＡの認識と、調べられた細胞タイプ全てでＩ型ＩＦＮの効率的な産生とに必要不可欠であることが示された。ＳＴＩＮＧの消失は、致死性ＤＮＡウイルスの感染（ＨＳＶ−１）にマウスを感受性にする。しかし、ＳＴＩＮＧは、おそらくＲＩＧ−Ｉ及びＩＰＳ−１／ＭＡＭ−ＥＲトランスロコンの相互作用を通してＶＳＶのようなマイナス鎖ウイルスに対する宿主防御応答を促進する。ＳＴＩＮＧ非依存性のＶＳＶで仲介されるＩ型ＩＦＮ誘導経路が存在する一方、該経路は、致死性ＶＳＶ感染に対してマウスを該経路自体で防御するのに十分であるとは思えない。細胞内ＤＮＡに応答して、ＳＴＩＮＧ／ＴＢＫ−１複合体は、Ｓｅｃ５を含むエクソシストの構成成分と会合するためにエンドソーム区分に輸送し、結果としてＩ型ＩＦＮの誘導をすると結論された。これらの事象は、ＹＦＶのようなウイルスによって阻害され、宿主防御の新たなウイルス抑制機構を示す。
【０４０７】
本発明は、１つ又は２つ以上の実施態様に関して図示され、説明されたが、均等の変化及び改変は、この明細書及び添付図面を読み、理解することで当業者が想到するであろう。さらに、本発明の特定の特徴が多数の実施態様のうち１つのみに関して開示される場合がある際に、かかる特徴は、特定又は特別な用途のいずれかのために所望され、長所となる場合に、別の実施態様の１つ又は２つ以上の別の特徴と組み合わされる場合がある。
【０４０８】
要約書の意図は、読者に技術的開示内容の性質を素早く確かめることができるようにすることである。要約書は、以下の請求項の範囲又は意味を解釈するか、あるいは限定するために用いられないであろうとの理解のもとに提示される。
【図１Ａ】
2015213514.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2015213514.tif 000028
【図３Ｅ】
2015213514.tif 000029
【図３Ｆ】
2015213514.tif 000030
【図３Ｇ】
2015213514.tif 000031
【図３Ｈ】
2015213514.tif 000032
【図３Ｉ】
2015213514.tif 000033
【図３Ｊ】
2015213514.tif 000034
【図３Ｋ】
2015213514.tif 000035
【図３Ｌ】
2015213514.tif 000036
【図３Ｍ】
2015213514.tif 000037
【図３Ｎ】
2015213514.tif 000038
【図３Ｏ】
2015213514.tif 000039
【図４Ａ】
2015213514.tif 000040
【図４Ｂ】
2015213514.tif 000041
【図４Ｃ】
2015213514.tif 000042
【図４Ｄ】
2015213514.tif 000043
【図４Ｅ】
2015213514.tif 000044
【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
2015213514.tif 000049
【図４Ｋ】
2015213514.tif 000050
【図４Ｌ】
2015213514.tif 000051
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2015213514.tif 000056
【図６Ｂ】
2015213514.tif 000057
【図７Ａ】
2015213514.tif 000058
【図７Ｂ】
2015213514.tif 000059
【図７Ｃ】
2015213514.tif 000060
【図７Ｄ】
2015213514.tif 000061
【図７Ｅ】
2015213514.tif 000062
【図８Ａ】
2015213514.tif 000063
【図８Ｂ】
2015213514.tif 000064
【図９Ａ】
2015213514.tif 000065
【図９Ｂ】
2015213514.tif 000066
【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
2015213514.tif 000068
【図１０Ｂ】
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【図１１】
2015213514.tif 000070
【図１２Ａ】
2015213514.tif 000071
【図１２Ｂ】
2015213514.tif 000072
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
2015213514.tif 000074
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2015213514.tif 000082
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｋ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2015213514.tif 000109
【図１９Ｃ】
2015213514.tif 000110
【図２０】
2015213514.tif 000111
【図２１Ａ】
2015213514.tif 000112
【図２１Ｂ】
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【図２２】
2015213514.tif 000114
【図２３】
2015213514.tif 000115
【図２４】
2015213514.tif 000116
【図２５】
2015213514.tif 000117
【図２６】
2015213514.tif 000118
【図２７】
2015213514.tif 000119
【図２８】
2015213514.tif 000120
【図２９Ａ】
2015213514.tif 000121
【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
2015213514.tif 000124
【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３０Ｇ】
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【図３０Ｈ】
2015213514.tif 000130
【図３０Ｉ】
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【図３０Ｊ】
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【図３０Ｋ】
2015213514.tif 000133
【図３１Ａ】
2015213514.tif 000134
【図３１Ｂ】
2015213514.tif 000135
【図３１Ｃ】
2015213514.tif 000136
【図３１Ｄ】
2015213514.tif 000137
【図３２Ａ】
2015213514.tif 000138
【図３２Ｂ】
2015213514.tif 000139
【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
2015213514.tif 000141
【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
2015213514.tif 000145
【図３２Ｉ】
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【図３３Ａ】
2015213514.tif 000147
【図３３Ｂ】
2015213514.tif 000148
【図３４Ａ】
2015213514.tif 000149
【図３４Ｂ】
2015213514.tif 000150
【図３４Ｃ】
2015213514.tif 000151
【図３４Ｄ】
2015213514.tif 000152
【図３４Ｅ】
2015213514.tif 000153
【図３４Ｆ】
2015213514.tif 000154
【図３５Ａ】
2015213514.tif 000155
【図３５Ｂ】
2015213514.tif 000156
【配列表】
2015213514000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月17日(2015.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫変調組成物であって、
癌、免疫障害、自己免疫、炎症、悪液質、神経変性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、心不全、移植、及び、感染からなる群から選択される疾患又は障害の予防又は治療のためのＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を変調する薬剤を含み、
該薬剤は、細胞内ＤＮＡで仲介されるＩ型ＩＦＮを誘導を調節することを特徴とする、免疫変調組成物。
【請求項２】
前記薬剤が、有機小分子であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫変調組成物。
【請求項３】
前記薬剤が、核酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫変調組成物。
【請求項４】
前記核酸配列が、発現ベクターに含まれることを特徴とする、請求項３に記載の免疫変調組成物。
【請求項５】
前記核酸配列が、配列番号１又は２で記載されるＳＴＩＮＧタンパク質をエンコードする核酸配列、又は、完全長のＳＴＩＮＧタンパク質と少なくとも９０％の配列の同一性を有する活性型バリアントをエンコードする核酸配列であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の免疫変調組成物。
【請求項６】
前記薬剤が、細胞内のＳＴＩＮＧの機能を増大する２本鎖ＤＮＡであることを特徴とする、請求項３に記載の免疫変調組成物。
【請求項７】
前記２本鎖ＤＮＡが、非天然の核酸であることを特徴とする、請求項６に記載の免疫変調組成物。
【請求項８】
前記核酸配列が、細胞内でＳＴＩＮＧの発現を下向き調節する干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをエンコードすることを特徴とする、請求項３又は４に記載の免疫変調組成物。
【請求項９】
前記薬剤が、ＳＴＩＮＧ活性を変調するペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫変調組成物。
【請求項１０】
前記疾患又は障害が、ウイルス感染であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１１】
前記疾患又は障害が、細菌感染であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１２】
前記疾患又は障害が、癌であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１３】
前記疾患又は障害が、自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１４】
前記薬剤が、ＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を増大することを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節組成物。
【請求項１５】
前記薬剤が、ＳＴＩＮＧの発現及び／又は機能を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の免疫調節組成物。