(57)【要約】【課題】様々な癌の予後を確実性が高く、簡便に予測することができる癌の予後を予測するための方法及びキット、優れた癌細胞の増殖抑制能を有する癌細胞増殖抑制剤、前記癌細胞増殖抑制剤を含む癌治療薬、癌治療薬のスクリーニング方法、並びに、ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を確実性が高く、簡便に予測することができるｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法及びキットを提供すること。【解決手段】患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、癌の予後を評価する工程とを含む、癌の予後を予測するための方法、ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、癌の予後を評価する工程とを含むことを特徴とする癌の予後を予測するための方法。
【請求項２】
ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする癌の予後を予測するためのキット。
【請求項３】
細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかに被験物質を投与する工程と、
前記細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、前記被験物質の癌の治療効果を判定する工程とを含むことを特徴とする癌治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
請求項４に記載の癌細胞増殖抑制剤を含有することを特徴とする癌治療薬。
【請求項６】
患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、ｍＴＯＲ阻害剤が有効か否かを評価する工程とを含むことを特徴とするｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法。
【請求項７】
ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とするｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予後を予測するための方法及びキット、癌治療薬のスクリーニング方法、癌細胞増殖抑制剤、癌治療薬、並びにｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の癌において、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）経路は、重要な癌細胞の生存シグナルであることが知られている。現在、ｍＴＯＲ経路の阻害剤であるラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）とその類似化合物は、乳癌骨転移病変等において臨床応用が行われ、有望な結果が得られている。また、コア酵素であるｍＴＯＲのキナーゼ阻害剤が多く開発され、臨床試験が行われている。
【０００３】
一方、これまでに、癌に対する分子標的薬使用により、治療経過中に新規遺伝子変異等による耐性獲得が問題になっている。そのため、ラパマイシンとその類似化合物や、キナーゼ阻害剤に対する耐性獲得も予想される。また、ｍＴＯＲは、代謝経路にも深く影響を及ぼすことから、副作用の問題が臨床試験で顕在化する可能性もある。
したがって、ｍＴＯＲ経路阻害剤の適応症例選択のための診断薬の開発や癌治療薬として使用し得る、疾患に関係した異なる作用機序のｍＴＯＲ経路阻害剤の開発が強く求められている。
【０００４】
また、癌の予後を予測する因子としては、例えば、肺腺癌の予後を良好にする因子として、転写因子ＴＴＦ−１（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−１；別名Ｎｋｘ２−１）が知られている（非特許文献１、２）。
しかしながら、ＴＴＦ−１の発現は現時点で肺癌治療法選択の確立した指標にはなっていない。また肺癌だけでなく様々な癌の予後を確実性が高く、簡便に予測することができる方法としては、一部を除いて未だ十分な方法が提供されておらず、その速やかな開発が求められている。
【０００５】
ＴＵＦＴ１（Ｔｕｆｔｅｌｉｎ  １）は、歯のエナメル質で発現し、石灰化に関わる因子として発見された因子である（非特許文献３、４）。これまでに、ＴＵＦＴ１と癌との関連性に関する報告はされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｎ  Ｄ，  Ｌｉ  Ｑ，  Ｄｅｅｂ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｔｕｄｙ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．  ３４：  ５９７−６０４  （２００３）
【非特許文献２】Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ  ＶＫ，  Ｓｙｒｉｇｏｓ  ＫＮ，  Ｂｅｐｌｅｒ  Ｇ，  Ｈｏｍｅｒ  ＲＪ，  Ｒｉｍｍ  ＤＬ．  Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｇｅ  Ｉ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２７：  ２７１−２７８  （２００９）
【非特許文献３】Ｂａｓｈｉｒ  ＭＭ，  Ａｂｒａｍｓ  ＷＲ，  Ｔｕｃｋｅｒ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｆｔｅｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ．  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．  ３９：  １３−２４  （１９９８）
【非特許文献４】Ｍａｏ  Ｚ，  Ｓｈａｙ  Ｂ，  Ｈｅｋｍａｔｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｆｔｅｌｉｎ  ｇｅｎｅ：  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅ．  ２７９：１８１−１９６  （２００１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、様々な癌の予後を確実性が高く、簡便に予測することができる癌の予後を予測するための方法及びキット、優れた癌細胞の増殖抑制能を有する癌細胞増殖抑制剤、前記癌細胞増殖抑制剤を含む癌治療薬、癌治療薬のスクリーニング方法、並びに、ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を確実性が高く、簡便に予測することができるｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、癌の予後を評価する工程とを含むことを特徴とする癌の予後を予測するための方法である。
＜２＞  ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする癌の予後を予測するためのキットである。
＜３＞  細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかに被験物質を投与する工程と、
前記細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、前記被験物質の癌の治療効果を判定する工程とを含むことを特徴とする癌治療薬のスクリーニング方法である。
＜４＞  ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜５＞  前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を含有することを特徴とする癌治療薬である。
＜６＞  患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、ｍＴＯＲ阻害剤が有効か否かを評価する工程とを含むことを特徴とするｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法である。
＜７＞  ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とするｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するためのキットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、様々な癌の予後を確実性が高く、簡便に予測することができる癌の予後を予測するための方法及びキット、優れた癌細胞の増殖抑制能を有する癌細胞増殖抑制剤、前記癌細胞増殖抑制剤を含む癌治療薬、癌治療薬のスクリーニング方法、並びに、ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を確実性が高く、簡便に予測することができるｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、試験例１の肺腺癌における代表的なＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析の例である（縦軸：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ、横軸：日数）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験例１の乳癌における代表的なＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析の例である（縦軸：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ、横軸：月数）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、試験例１の大腸癌における代表的なＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析の例である（縦軸：Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ、横軸：月数）。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２−１の正常組織でのＴＵＦＴ１の発現を解析した結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２−２のヒト細胞株におけるＴＵＦＴ１の発現を解析した結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３−１のＡ５４９細胞におけるＴＵＦＴ１の発現を解析した結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３−２のＴＵＦＴ１の細胞内局在を検討した結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、試験例３−３のＴＵＦＴ１の細胞内局在を検討した結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例４−１の結果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例４−２の結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例５−１の顕微鏡像を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例５−１の細胞数を計数した結果を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、試験例５−２の顕微鏡像を示す図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、試験例５−２の細胞数を計数した結果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、試験例６−１の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、試験例６−２の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、試験例７−１のＲｈｏＡの結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、試験例７−１のＲａｃ１の結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図８Ａ】図８Ａは、試験例８におけるＲｈｏＡタンパク質の量を測定した結果を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、試験例８におけるＲｈｏＡ  ｍＲＮＡの量を測定した結果を示すグラフである（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、試験例８におけるＲａｃ１タンパク質の量を測定した結果を示す図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、試験例８におけるＲａｃ１  ｍＲＮＡの量を測定した結果を示すグラフである（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図９Ａ】図９Ａは、試験例９におけるタンパク質の量を測定した結果を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、試験例９におけるＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１のｍＲＮＡの量を測定した結果を示すグラフである（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、試験例１０−１の結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、試験例１０−２の結果を示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、試験例１１−１の結果を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、試験例１１−２の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、試験例１２の結果を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、試験例１３−１の結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．、＊はＰ＜０．０５を示す）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、試験例１３−２の結果を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、試験例１４−１の結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、試験例１４−２の結果を示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、試験例１５−１の結果を示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、試験例１５−２の結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、試験例１５−３の結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．）。
【図１６】図１６は、試験例１６の結果を示す図である（エラーバー：Ｓ．Ｄ．、＊はＰ＜０．０５を示す）。
【図１７】図１７は、試験例１７の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、試験例１８の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、試験例１９の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、試験例２０の結果を示す図である。
【図２１】図２１は、試験例２１の結果を示す図である。
【図２２】図２２は、試験例２２の結果を示す図である。
【図２３】図２３は、試験例２３の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（癌の予後を予測するための方法）
本発明の癌の予後を予測するための方法は、測定工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１２】
＜測定工程＞
前記測定工程は、患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程である。
【００１３】
−患者由来の試料−
前記患者由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌組織、末梢血、尿などが挙げられる。
【００１４】
−ＴＵＦＴ１−
前記ＴＵＦＴ１は、歯のエナメル質で発現し、石灰化に関わる因子として発見された因子である。
前記ＴＵＦＴ１遺伝子の塩基配列情報や、タンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができ、例えば、塩基配列はＮＭ_０２０１２７、アミノ酸配列はＮＰ_０６４５１２として登録されている。
【００１５】
−ＴＵＦＴ１の発現量の測定−
前記患者由来の試料中のＴＵＦＴ１の発現量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量を測定する方法、タンパク質の発現量を測定する方法などが挙げられる。
【００１６】
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などが挙げられる。
【００１７】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、ＴＵＦＴ１を増幅できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：５及び配列番号：６のプライマーの組合せが好ましい。
フォワードプライマー：
５’−ＣＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴ−３’（配列番号：５）
リバースプライマー：
５’−ＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：６）
【００１８】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法における内在性コントロールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）などが挙げられる。
前記ＧＡＰＤＨの増幅に用いるプライマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：１３及び配列番号：１４のプライマーの組合せが好ましい。
フォワードプライマー：
５’−ＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＧＡＧ−３’（配列番号：１３）
リバースプライマー：
５’−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣ−３’（配列番号：１４）
【００１９】
前記タンパク質の発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウエスタンブロッティング法、免疫細胞染色法、組織染色法などが挙げられる。
【００２０】
前記ウエスタンブロッティング法に用いるＴＵＦＴ１に対する抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗ＴＵＦＴ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）などが挙げられる。
【００２１】
−ＴＵＦＴ１の活性の測定−
前記患者由来の試料中のＴＵＦＴ１の活性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法でＴＵＦＴ１−ｍＴＯＲシグナルを定量することなどが挙げられる。
前記ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法によるＴＵＦＴ１−ｍＴＯＲシグナルの定量は、例えば、後述する試験例１３に示すように、ＴＵＦＴ−１と、ｍＴＯＲ及びＲａｐｔｏｒの少なくともいずれかとの結合状態に基づくシグナルを定量する。
【００２２】
前記測定工程では、前記ＴＵＦＴ１の発現量のみを測定してもよいし、前記ＴＵＦＴ１の活性のみを測定してもよいし、両者を測定してもよい。
【００２３】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、癌の予後を評価する工程である。
【００２４】
−評価−
前記癌の予後を評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＴＵＦＴ１の発現量が癌患者の中で高い場合、及びＴＵＦＴ１の活性が癌患者の中で高い場合の少なくともいずれかの場合には、予後不良であると評価することができる。
【００２５】
前記ＴＵＦＴ１の発現量が癌患者の中で高い場合とは、例えば、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析によりそれぞれの癌で設定した発現量を上回る場合をいう。
前記Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析によりそれぞれの癌で設定した発現量を上回る場合としては、例えば、肺腺癌では、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの肺腺癌のデータセットにおけるＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが−１．８４以上の場合、乳癌では、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの乳癌のデータセットにおけるＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが７．４４以上の場合、大腸癌では、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの大腸癌のデータセットにおけるＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが１２．３以上の場合などが挙げられる。
【００２６】
前記ＴＵＦＴ１の活性が癌患者の中で高い場合とは、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法で癌組織及び細胞の少なくともいずれかでのＴＵＦＴ１−ｍＴＯＲシグナル値が正常組織及び細胞の少なくともいずれかと比べて２倍以上の場合をいう。
【００２７】
前記癌の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肺腺癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵癌などが挙げられる。
【００２８】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、患者由来の試料を調製する試料調製工程などが挙げられる。
【００２９】
（癌の予後を予測するためのキット）
本発明の癌の予後を予測するためのキットは、ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記癌の予後を予測するためのキットは、前記癌の予後を予測するための方法で好適に用いることができる。
【００３０】
＜ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子＞
前記核酸分子としては、ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得るものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列番号：５及び配列番号：６のプライマーが好ましい。
【００３１】
＜ＴＵＦＴ１に対する抗体＞
前記ＴＵＦＴ１に対する抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、抗ＴＵＦＴ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）が好ましい。
【００３２】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に用いるプライマー、ＲＴ−ＰＣＲに使用する酵素、ウエスタンブロッティングや免疫染色に用いる二次抗体などが挙げられる。
【００３３】
（癌治療薬のスクリーニング方法）
本発明の癌治療薬のスクリーニング方法は、被験物質投与工程と、ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する測定工程と、判定工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００３４】
＜被験物質投与工程＞
前記被験物質投与工程は、細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかに被験物質を投与する工程である。
【００３５】
−被験物質−
前記被験物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化合物、該化合物の誘導体、タンパク質、核酸分子などが挙げられる。
前記被験物質の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
−細胞及び癌モデル動物−
前記細胞及び癌モデル動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販の細胞株や癌モデル動物を用いることができる。
前記細胞は、癌細胞であってもよいし、癌細胞以外の細胞であってもよい。
【００３７】
＜ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する測定工程＞
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する測定工程は、前記細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程である。
【００３８】
−発現量の測定−
前記ＴＵＦＴ１の発現量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−ＴＵＦＴ１の発現量の測定−」の項目に記載の方法と同様に行うことができる。
【００３９】
−活性の測定−
前記ＴＵＦＴ１の活性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−ＴＵＦＴ１の活性の測定−」の項目に記載の方法と同様に行うことができる。
【００４０】
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する測定工程では、前記ＴＵＦＴ１の発現量のみを測定してもよいし、前記ＴＵＦＴ１の活性のみを測定してもよいし、両者を測定してもよい。
【００４１】
＜判定工程＞
前記判定工程は、前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、前記被験物質の癌の治療効果を判定する工程である。
【００４２】
−判定−
前記判定の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、被験物質を投与した細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の発現量が、前記被験物質を投与しなかった細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の発現量よりも低い場合、及び被験物質を投与した細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の活性が、前記被験物質を投与しなかった細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の活性よりも低い場合の少なくともいずれかの場合には、前記被験物質は、癌の治療効果を有すると判定することができる。
【００４３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかから、ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定するための試料を調製する工程などが挙げられる。
【００４４】
後述する試験例で示すように、ＴＵＦＴ１の作用機序の１つとして、ｍＴＯＲやＲａｐｔｏｒなどとの結合があり、ＴＵＦＴ１は、ｍＴＯＲ経路の活性化を行っている。そのため、ＴＵＦＴ１の機能を調節する物質のスクリーニングにより、ｍＴＯＲ経路が関連する癌を含む各種疾患に対する治療薬を開発できる可能性がある。
また、ＴＵＦＴ１を指標とすることにより、ラパマイシンとその派生薬、ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤とは異なる作用機序のｍＴＯＲ経路を阻害、又は調節する癌治療薬のスクリーニングが可能になる。そのため、分子標的薬への耐性獲得の対処や、ｍＴＯＲ阻害物質の副作用を回避できる可能性があり、それにより適応患者・疾患拡大も可能となると考えられる。
【００４５】
（癌細胞増殖抑制剤）
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４６】
＜ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれか＞
−ｓｉＲＮＡ−
前記ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、１８塩基長〜２９塩基長の小分子二本鎖ＲＮＡである。
前記ｓｉＲＮＡの末端構造は、平滑末端であってもよいし、突出末端（オーバーハング）であってもよい。
前記ｓｉＲＮＡとしては、ＴＵＦＴ１の発現を抑制することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：１及び２からなるｓｉＲＮＡ、下記配列番号：３及び４からなるｓｉＲＮＡが好ましい。
５’−ＧＧＡＵＡＵＡＡＧＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＧＡ−３’（配列番号：１）
５’−ＡＡＧＣＵＵＧＣＵＡＣＵＵＡＵＡＵＣＣＵＣ−３’（配列番号：２）
５’−ＧＵＡＧＣＣＵＵＵＵＧＣＧＧＡＡＡＡＡＵＵ−３’（配列番号：３）
５’−ＵＵＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＣＵＡＣＵＣ−３’（配列番号：４）
【００４７】
−ｓｈＲＮＡ−
前記ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は、１８塩基〜２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基〜９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡである。
前記ｓｈＲＮＡの末端構造は、平滑末端であってもよいし、突出末端であってもよい。
前記ｓｈＲＮＡとしては、ＴＵＦＴ１の発現を抑制することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：１５のｓｈＲＮＡ、下記配列番号：１６のｓｈＲＮＡが好ましい。
５’−ＧＣＵＧＧＵＣＡＵＵＣＵＣＵＧＧＣＵＵＡＣＧＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＧＵＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＵＧＡＣＣＡＧＣＵＵ−３’（配列番号：１５）
５’−ＧＧＡＵＡＵＡＡＧＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＡＣＧＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＧＵＡＡＧＣＵＵＧＣＵＡＣＵＵＡＵＡＵＣＣＵＵ−３’（配列番号：１６）
【００４８】
−ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子−
前記ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペリフォシン、エデルフォシンが好ましい。
【００４９】
前記ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の製造方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の方法により製造することができる。
【００５０】
前記ｓｉＲＮＡ及ｓｈＲＮＡは、発現ベクターの態様としてもよい。
【００５１】
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤は、前記ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００５２】
前記ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかには、どのような化学修飾が加えられてもよい。
【００５３】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生理食塩水、培養液、トランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
＜癌細胞＞
前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、肺癌細胞、乳癌細胞が好ましい。
前記癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、癌患者の体内に存在する細胞であってもよい。
【００５５】
前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、癌細胞にトランスフェクトすることにより、細胞に作用させることができる。前記トランスフェクトの方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
癌細胞に対して作用させる前記癌細胞増殖抑制剤の量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
＜癌細胞増殖抑制方法＞
前記癌細胞増殖抑制剤は、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを含むので、癌細胞に作用させることにより、ＴＵＦＴ１遺伝子の発現抑制或いは機能抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを癌細胞に作用させることを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法にも関する。
【００５７】
また、後述する試験例では、癌細胞でＴＵＦＴ１の発現を減少させると、ＴＧＦ−βで癌細胞を刺激した場合のＥＭＴ（上皮間葉転換）様の形態変化が乏しい（試験例４）、癌細胞の運動能が抑制される（試験例５）、アクチンストレスファイバーの形成が抑制される（試験例６）、ＲｈｏＡタンパク質及びＲａｃ１タンパク質の発現が抑制される（試験例７、８）、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現が抑制される（試験例９）、Ｓ６Ｋ１及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化が阻害される（試験例１０）、ｍＴＯＲ−Ｒａｐｔｏｒ間の結合強度が変わる（試験例１４）ことが示された。また、試験例２０では、ＴＵＦＴ１のノックダウンにより、ｍＴＯＲのリソソームへの移行が抑制されることが示され、試験例２２では、ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合がペリフォシン又はエデルフォシンにより阻害されることが示された。
したがって、本発明は、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを含む、癌細胞の形態変化抑制剤、癌細胞の運動能抑制剤、アクチンストレスファイバー形成抑制剤、ＲｈｏＡタンパク質の発現抑制剤、Ｒａｃ１タンパク質の発現抑制剤、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現抑制剤、Ｓ６Ｋ１のリン酸化阻害剤、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化阻害剤、ｍＴＯＲとＲａｐｔｏｒとの結合強度調節剤、ｍＴＯＲＣ１のシグナル活性化阻害剤、ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合阻害剤、又はｍＴＯＲのリソソームへの移行抑制剤にも関する。
【００５８】
（癌治療薬）
本発明の癌治療薬は、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００５９】
＜癌細胞増殖抑制剤＞
前記癌細胞増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の「癌細胞増殖抑制剤」の項目に記載した通りである。
前記癌治療薬中の前記癌細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌治療薬は、前記癌細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。
【００６０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。また、前記癌治療薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６１】
＜剤形＞
前記癌治療薬の剤形としては、特に制限はなく、例えば、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。これらの剤は、常法により製造することができる。
【００６２】
＜投与＞
前記癌治療薬は、癌に罹患した患者に投与することにより好適に使用することができる。
前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、肺癌、乳癌が好ましい。また、前記癌治療薬は、癌の転移を抑制するためにも用いることができる。前記癌の転移としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌の骨転移などが挙げられる。
【００６３】
前記癌治療薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
【００６４】
前記癌治療薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記癌治療薬の剤形、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。
【００６５】
前記癌治療薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
また、前記癌治療薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
【００６６】
前記癌治療薬は、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよいが、前記癌治療薬は、癌細胞の増殖を阻害し、前記癌細胞の増殖による腫瘍の増大を防ぐ効果に優れることから、前記疾患の早期の段階に投与されることが望ましい。
【００６７】
＜予防乃至治療方法＞
前記癌治療薬は、前記癌細胞増殖抑制剤を含むので、癌を患う個体に投与することにより、ＴＵＦＴ１の発現抑制を介して、癌細胞の増殖を効果的に抑制し、癌を予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法にも関する。前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、肺癌、乳癌が好ましい。
【００６８】
また、後述する試験例で示すように、ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲ経路との関係が示唆されたことから、ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標とすることにより、ｍＴＯＲ経路阻害剤の適応症例を選択することが可能となると考えられる。したがって、本発明は、患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、ｍＴＯＲ経路阻害剤の適応症例であるか否かを評価する工程とを含むことを特徴とするｍＴＯＲ経路阻害剤の適応症例の選択方法、及びＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とするｍＴＯＲ経路阻害剤の適応症例を選択するためのキットにも関する。
【００６９】
（ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法）
本発明のｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法は、測定工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００７０】
＜測定工程＞
前記測定工程は、患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程である。
【００７１】
−患者由来の試料−
前記患者由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−患者由来の試料−」の項目に記載のものと同様のものが挙げられる。
【００７２】
−ＴＵＦＴ１−
前記ＴＵＦＴ１は、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−ＴＵＦＴ１−」の項目に記載のものと同様である。
【００７３】
−発現量の測定−
前記ＴＵＦＴ１の発現量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−ＴＵＦＴ１の発現量の測定−」の項目に記載の方法と同様に行うことができる。
【００７４】
−活性の測定−
前記ＴＵＦＴ１の活性の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−ＴＵＦＴ１の活性の測定−」の項目に記載の方法と同様に行うことができる。
【００７５】
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する測定工程では、前記ＴＵＦＴ１の発現量のみを測定してもよいし、前記ＴＵＦＴ１の活性のみを測定してもよいし、両者を測定してもよい。
【００７６】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、ｍＴＯＲ阻害剤が有効か否かを評価する工程である。
【００７７】
−ｍＴＯＲ阻害剤−
前記ｍＴＯＲ阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペリフォシン、エデルフォシン、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＣＣ−２２３、ＡＺＤ２０１４、ＡＺＤ８０５５、ＤＳ−３０７８、ＯＳＩ−０２７、ＣＣ−１１５、ＭＥ−３４４、ＭＬＮ０１２８、ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＳＡＲ２４５４０９、ＧＤＣ−０９８０、ＤＳ−７４２３、ＬＹ３０２３４１４、ＳＦ１１２６、ＰＷＴ３３５９７、ＧＳＫ２１２６４５８などが挙げられる。
前記ペリフォシンは、アルキルリン脂質の１つであり、多発性骨髄腫や結腸直腸癌などの癌の治療薬として、臨床試験が行われてきた。
前記エデルフォシンは、前記ペリフォシンの類縁化合物である。
【００７８】
−評価−
前記ｍＴＯＲ阻害剤が有効か否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＴＵＦＴ１の発現量が癌患者の中で高い場合、及びＴＵＦＴ１の活性が癌患者の中で高い場合の少なくともいずれかの場合には、ｍＴＯＲ阻害剤が有効ではないと評価することができる。また、ＴＵＦＴ１の発現量が癌患者の中で高い場合に該当しない場合、及びＴＵＦＴ１の活性が癌患者の中で高い場合に該当しない場合の少なくともいずれかの場合には、ｍＴＯＲ阻害剤が有効であると評価することができる。
【００７９】
前記ＴＵＦＴ１の発現量が癌患者の中で高い場合とは、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−評価−」の項目に記載のものと同様である。
【００８０】
前記ＴＵＦＴ１の活性が癌患者の中で高い場合とは、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−評価−」の項目に記載のものと同様である。
【００８１】
前記癌の種類としては、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「−評価−」の項目に記載のものと同様のものが挙げられる。
【００８２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、上述の「癌の予後を予測するための方法」における「＜その他の工程＞」の項目に記載のものと同様のものが挙げられる。
【００８３】
（ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するためのキット）
本発明のｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するためのキットは、ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するためのキットは、前記ｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法で好適に用いることができる。
【００８４】
＜ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子＞
前記核酸分子としては、上述の「癌の予後を予測するためのキット」における「＜ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子＞」の項目に記載のものと同様のものが挙げられる。
【００８５】
＜ＴＵＦＴ１に対する抗体＞
前記核酸分子としては、上述の「癌の予後を予測するためのキット」における「＜ＴＵＦＴ１に対する抗体＞」の項目に記載のものと同様のものが挙げられる。
【００８６】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、上述の「癌の予後を予測するためのキット」における「＜その他の構成＞」の項目に記載のものと同様のものが挙げられる。
【実施例】
【００８７】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。
【００８８】
（試験例１：ＴＵＦＴ１の発現と癌の予後との関連）
ＴＵＦＴ１の発現と癌の予後との関連について、付随する臨床情報も含めて公開されている癌マイクロアレイの横断解析データベースであるＰｒｏｇｎｏＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｅｎ．ｎｅｔ／ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎ／）を用いて検討を行った。ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎは、公開されている大量のマイクロアレイデータをメタ解析するために開発された検索サイトである（Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ，  Ｋｉｔａｄａ  Ｋ，  Ｎａｋａｉ  Ｋ，  Ｓａｒａｉ  Ａ．  ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎ：  ａ  ｎｅｗ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ．  ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２：  １８  （２００９））。前記データベースからＴＵＦＴ１の発現及び患者予後の情報データを入手し、統計解析ソフトウェアＲを用いてＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析及びｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を行った。
【００８９】
図１Ａに肺腺癌における代表的なＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析（Ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の例を示す。実線はＴＵＦＴ１の高発現集団（ｎ＝９７）の結果を示し、点線はＴＵＦＴ１の低発現集団（ｎ＝２０）の結果を示す。
なお、ＴＵＦＴ１の高発現集団とは、ＴＵＦＴ１の発現量が、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの該当データセットでのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが−１．８４以上である集団であり、ＴＵＦＴ１の低発現集団とは、ＴＵＦＴ１の発現量が、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの該当データセットでのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが−１．８４未満である集団である。
図１Ａの結果から、ＴＵＦＴ１の発現と肺腺癌の患者の予後不良との間に強い相関が見られた（ｐ＝０．００３８）。
【００９０】
図１Ｂに乳癌における代表的なＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析（Ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の例を示す。実線はＴＵＦＴ１の高発現集団（ｎ＝８０）の結果を示し、点線はＴＵＦＴ１の低発現集団（ｎ＝２０６）の結果を示す。
なお、ＴＵＦＴ１の高発現集団とは、ＴＵＦＴ１の発現量が、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの該当データセットでのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが７．４４以上である集団であり、ＴＵＦＴ１の低発現集団とは、ＴＵＦＴ１の発現量が、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの該当データセットでのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが７．４４未満である集団である。
図１Ｂの結果から、ＴＵＦＴ１の発現と乳癌の患者の予後不良との間に強い相関が見られた（ｐ＝０．０３０１）。
【００９１】
図１Ｃに大腸癌における代表的なＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ解析（Ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の例を示す。実線はＴＵＦＴ１の高発現集団（ｎ＝１１）の結果を示し、点線はＴＵＦＴ１の低発現集団（ｎ＝４０）の結果を示す。
なお、ＴＵＦＴ１の高発現集団とは、ＴＵＦＴ１の発現量が、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの該当データセットでのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが１２．３以上である集団であり、ＴＵＦＴ１の低発現集団とは、ＴＵＦＴ１の発現量が、ＰｒｏｇｎｏＳｃａｎデータベースの該当データセットでのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖａｌｕｅが１２．３未満である集団である。
図１Ｃの結果から、ＴＵＦＴ１の発現と大腸癌の患者の予後不良との間に強い相関が見られた（ｐ＝０．００１３１）。
【００９２】
以上の結果から、複数の癌で、ＴＵＦＴ１の発現の高さと患者の予後不良との間に強い相関が見られ、ＴＵＦＴ１の発現と癌の進行との関連が示唆された。
【００９３】
（材料及び方法）
以下の試験例２〜２３で用いた材料及び方法は、以下の通りである。
＜細胞培養＞
ヒト肺腺癌細胞Ａ５４９、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の高転移性クローンであるＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ、ヒト胎児腎細胞２９３Ａ、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍと、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎとを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃、５％  ＣＯ２条件で培養した。
【００９４】
＜増殖因子及び阻害剤＞
ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、以下、「ＴＧＦ−β」と称することがある）は、１ｍｇ／ｍＬのｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含む４ｍＭ  ＨＣｌにて溶解した。
また、インスリン（株式会社細胞科学研究所製）、ウォルトマニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ペリフォシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、エデルフォシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をそれぞれ用いた。
【００９５】
＜ｓｉＲＮＡ及びトランスフェクション＞
ＴＵＦＴ１に対するｓｉＲＮＡ及びコントロールのｓｉＲＮＡは、株式会社ＲＮＡｉから入手した。ｓｉＲＮＡの哺乳細胞への導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
用いたｓｉＲＮＡは、以下の通りである。
−Ｈｕｍａｎ  ＴＵＦＴ１＃１（以下、「ｓｉＴＵＦＴ１＃１」と称することがある）−
５’−ＧＧＡＵＡＵＡＡＧＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＧＡ−３’（配列番号：１）
５’−ＡＡＧＣＵＵＧＣＵＡＣＵＵＡＵＡＵＣＣＵＣ−３’（配列番号：２）
−Ｈｕｍａｎ  ＴＵＦＴ１＃２（以下、「ｓｉＴＵＦＴ１＃２」と称することがある）−
５’−ＧＵＡＧＣＣＵＵＵＵＧＣＧＧＡＡＡＡＡＵＵ−３’（配列番号：３）
５’−ＵＵＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＣＵＡＣＵＣ−３’（配列番号：４）
−コントロール（以下、「ｓｉＮＣ」と称することがある）−
万能ネガコン（株式会社ＲＮＡｉ製）を用いた（配列非公開）。
【００９６】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング＞
細胞をＰＢＳで洗浄後、ＮＰ−４０  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、  １％  ＮＰ−４０）で溶解させ、４℃で１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し上清を回収した。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）によりタンパク質濃度を測定し、濃度をそろえたサンプルを作製した。３×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）、０．０８％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ、８０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５．２％  ＳＤＳ、１３．２ｍＭ  ＤＴＴ）を加えて９８℃で３分間ボイルし、５％−１２％  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離後、セミドライ法にてＰＶＤＦメンブレン（Ｐａｌｌ社製）に転写した。
メンブレンをＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（５％  スキムミルク（森永乳業株式会社製）、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）−Ｔ）にて室温で１時間インキュベーションした後、各種一次抗体を４℃で一晩、二次抗体を室温で１時間インキュベーションした。
バンドの検出にはＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）法を用い、ＥＣＬ１液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、  ２．５ｍＭ  Ｌｕｍｉｎｏｌ、  ０．４ｍＭ  ｐ−Ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）と、ＥＣＬ２液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、  ０．０１５％  Ｈ２Ｏ２）とを５ｍＬずつ混ぜ合わせてメンブレンを浸し、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ／ＬＡＳ−４０００（富士フイルム株式会社製）を使用して検出した。
【００９７】
使用した抗体を以下に示す。
［一次抗体］
・  抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、「抗ＦＬＡＧ抗体」と称することがある）
・  抗ＴＵＦＴ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・  抗ＨＤＡＣ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ｔｕｂｕｌｉｎ（「αＴｕｂｕｌｉｎ」と称することがある）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
・  抗ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｔ３０８）（「ｐＡｋｔ（Ｔ３０８）」と称することがある）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・  抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔ３８９）（「ｐＳ６Ｋ１（Ｔ３８９）」と称することがある）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗ｐ７０  Ｓ６  Ｋｉｎａｓｅ（「Ｓ６Ｋ１」と称することがある）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗ｐｈｏｓｐｈｏ−４ＥＢＰ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗ＲｈｏＡ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗ｍＴＯＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・  抗Ｒａｐｔｏｒ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ｒｈｅｂ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・  抗Ｒａｃ１抗体（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｌｅｔｏｎ社製）
・  抗Ｍｙｃ抗体（和光純薬工業株式会社製）
［二次抗体］
・  抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）
・  抗Ｇｏａｔ  ＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
【００９８】
＜細胞分画＞
細胞分画には、ＮＥ−ＰＥＲ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、推奨プロトコルに則って行った。
【００９９】
＜細胞数の測定＞
細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。培地でＴＧＦ−β３（１ｎｇ／ｍＬ）刺激あり、なしの条件下でそれぞれ３７℃、５％  ＣＯ２において０時間〜７２時間培養を行い、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理後、細胞数を計測した。
【０１００】
＜ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
細胞のトータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用してプロトコルに従って回収した。Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡｓへの逆転写は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴａＫａＲａ社製）により、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを用いて行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をＳｔｅｐｏｎｅ  ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。
使用したプライマーの配列を以下に示す。
【０１０１】
−ＴＵＦＴ１遺伝子−
フォワードプライマー：
５’−ＣＣＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴ−３’（配列番号：５）
リバースプライマー：
５’−ＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：６）
【０１０２】
−ＲｈｏＡ遺伝子−
フォワードプライマー：
５’−ＴＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：７）
リバースプライマー：
５’−ＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号：８）
【０１０３】
−Ｒａｃ１遺伝子−
フォワードプライマー：
５’−ＡＡＣＣＡＡＴＧＣＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号：９）
リバースプライマー：
５’−ＣＴＧＴＴＴＧＣＧＧＡＴＡＧＧＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１０）
【０１０４】
−Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子−
フォワードプライマー：
５’−ＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣ−３’（配列番号：１１）
リバースプライマー：
５’−ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：１２）
【０１０５】
−ＧＡＰＤＨ遺伝子−
フォワードプライマー：
５’−ＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＣＣＧＡＧ−３’（配列番号：１３）
リバースプライマー：
５’−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣ−３’（配列番号：１４）
【０１０６】
＜Ｒａｃ１及びＲｈｏＡの活性測定＞
Ｒａｃ１及びＲｈｏＡの活性測定は、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製のキット（Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｋｉｔ）を用い、その添付プロトコルに基づき行った。
【０１０７】
＜細胞免疫染色＞
細胞の培養には、８ウェルカルチャースライド（Ｎｕｎｃ社製）を使用した。培養上清を除去してＰＢＳで洗浄後、４％  ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）にて室温で２０分間、又は１５分間固定し、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により室温で１０分間、又は７分間細胞膜透過処理を行った。各一次抗体は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク株式会社製）で希釈し、４℃で一晩インキュベーションした。その後、Ａｌｅｘａ蛍光標識された二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とともに室温で４５分間、又は１時間インキュベーションを行い、最後にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ社製）で封入、核染色を行った。
またＦ−アクチンの蛍光染色には、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて室温で１時間インキュベーションした。
【０１０８】
＜チャンバーマイグレーションアッセイ（Ｃｈａｍｂｅｒ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）＞
細胞をＰＢＳで洗浄後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ／  ＥＤＴＡで処理し、細胞数を計数した。全ての条件において細胞数を一定に揃え、細胞懸濁液を８μｍポアのＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ（ＢＤ社製）に添加した。一定時間３７℃、５％  ＣＯ２条件でインキュベーションした後に、チャンバーを取りだし、１０％ホルマリンで細胞を１５分間室温にて固定した。ＰＢＳで洗浄後、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ液（０．５％  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ、  ２０％  メタノール）に１分間浸けた。チャンバーの内側についた細胞は、最後に綿棒でふき取った。顕微鏡にて細胞数を計数し、視野毎の平均を取って定量した。
【０１０９】
＜プルダウンアッセイ（Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙ）＞
プルダウンアッセイには、ＲｈｏＡ／Ｒａｃ１／Ｃｄｃ４２  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｃｏｍｂｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｋｉｔ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）を用い、推奨プロトコルに則って行った。
【０１１０】
＜免疫沈降＞
細胞をＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで溶解し、遠心後、一部をローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として取り分けて、残りに抗体を添加し、４℃で一晩インキュベーションした。その後、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し、更に４５分間、又は１時間４℃でインキュベーションした。前記ビーズは、ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、サンプルバッファー（Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を加えて９５℃、５分間煮沸した。これらのサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングの手法で検出した。
【０１１１】
＜Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ＞
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡは、Ｏｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の試薬（Ｄｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡ  Ｐｒｏｂｅ、Ｄｕｏｌｉｎｋ  ＰＬＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）を用い、推奨プロトコルに則って行った。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ社製）で封入、核染色を行った。
【０１１２】
＜アデノウイルスベクター調製＞
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１、ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ２、又はコントロールのＬａｃＺを発現させるアデノウイルスを作製するため、２９３Ａ細胞にＰａｃ１処理した発現アデノウイルスベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションした。ほとんどの細胞がｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ（ＣＰＥ）を起こすまで数週間培養した後、培養上清を回収して凍結融解を３度繰り返した後に、４℃、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ウイルス上清を回収した。回収したウイルスの一部を２９３Ａ細胞に感染させることでウイルスの増幅を行った。最終的にはＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｖｉｒａｋｉｔ（ＶＩＲＡＰＵＲ社製）により調製した。
【０１１３】
前記ＴＵＦＴ１  Ｖ１（ｖａｒｉａｎｔ  １）、及びＴＵＦＴ１  Ｖ２（ｖａｒｉａｎｔ  ２）は、ＴＵＦＴ１の転写バリアントであり、分子量は、それぞれ４４ｋＤａ、３９ｋＤａである。前記ＴＵＦＴ１  Ｖ１及びＴＵＦＴ１  Ｖ２の塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができ、例えば、ＴＵＦＴ１  Ｖ１は、ＧｅｎｂａｎｋにＮＭ＿０２０１２７として登録されており、ＴＵＦＴ１  Ｖ２は、ＧｅｎｂａｎｋにＮＭ＿００１１２６３３７として登録されている。
【０１１４】
＜発現ベクター＞
−ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１発現ベクター−
前記アデノウイルスベクター調製の項目におけるＴＵＦＴ１  Ｖ１と同一の配列を、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入した。
【０１１５】
−ｍｙｃ−ＲａｇＡ発現ベクター−
ＲａｇＡをコードする配列を、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入した。前記ＲａｇＡの分子量は３７ｋＤａであり、その塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができ、例えば、ＮＭ＿００６５７０として登録されている。
【０１１６】
−ｍｙｃ−ＲａｇＢ発現ベクター−
ＲａｇＢをコードする配列を、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入した。前記ＲａｇＢの分子量は４３ｋＤａであり、その塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができ、例えば、ＮＭ＿００６０６４として登録されている。
【０１１７】
−ｍｙｃ−ＲａｇＣ発現ベクター−
ＲａｇＣをコードする配列を、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入した。前記ＲａｇＣの分子量は４４ｋＤａであり、その塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができ、例えば、ＮＭ＿０２２１５７として登録されている。
【０１１８】
−ｍｙｃ−ＲａｇＤ発現ベクター−
ＲａｇＤをコードする配列を、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入した。前記ＲａｇＤの分子量は４６ｋＤａであり、その塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができ、例えば、ＮＭ＿０２１２４４として登録されている。
【０１１９】
−ｍｙｃ−Ｒｈｅｂ発現ベクター−
Ｒｈｅｂをコードする配列を、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に挿入した。前記Ｒｈｅｂの分子量は２０ｋＤａであり、その塩基配列情報は、公知のデータベースから取得することができ、例えば、ＮＭ＿００５６１４として登録されている。
【０１２０】
−ｍｙｃ−ＲａｇＤ（野生型（ｗｔ））発現ベクター−
ｍｙｃ−ＲａｇＤ（野生型（ｗｔ））発現ベクターは、上記ｍｙｃ−ＲａｇＤ発現ベクターと同一である。
【０１２１】
−ｍｙｃ−ＲａｇＤ（ＧＤＰ結合型（ＧＤＰ））発現ベクター−
ｍｙｃ−ＲａｇＤ（ＧＤＰ結合型（ＧＤＰ））発現ベクターは、上記ｍｙｃ−ＲａｇＤ発現ベクターの塩基配列を改変し、アミノ酸がＳ７７Ｌとなるように置換したものである。
【０１２２】
−ｍｙｃ−ＲａｇＤ（ＧＴＰ結合型（ＧＴＰ））発現ベクター−
ｍｙｃ−ＲａｇＤ（ＧＴＰ結合型（ＧＴＰ））発現ベクターは、上記ｍｙｃ−ＲａｇＤ発現ベクターの塩基配列を改変し、アミノ酸がＱ１２１Ｌとなるように置換したものである。
【０１２３】
＜ｓｈＲＮＡ発現細胞の作製＞
ＴＵＦＴ１に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＵＦＴ１＃３、ｓｈＴＵＦＴ１＃４）をコードするオリゴヌクレオチド、及びコントロールのｓｈＲＮＡ（ｓｈＮＴＣ）をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、アニールしたものをエントリーベクターにクローニングし、レンチウイルスベクター（ＣＳ−ＲｆＡ−ＥＧ）に挿入し、２９３ＦＴ細胞において目的のｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを作製した。前記ウイルスは、濃縮後にＡ５４９細胞に感染させ、ｓｈＲＮＡを発現するＡ５４９細胞（以下、「ｓｈＲＮＡ発現細胞」と称することがある）を樹立した。
なお、各オリゴヌクレオチドがコードするｓｈＲＮＡの配列は、以下の通りである。
−ｓｈＴＵＦＴ１＃３−
５’−ＧＣＵＧＧＵＣＡＵＵＣＵＣＵＧＧＣＵＵＡＣＧＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＧＵＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＵＧＡＣＣＡＧＣＵＵ−３’（配列番号：１５）
−ｓｈＴＵＦＴ１＃４−
５’−ＧＧＡＵＡＵＡＡＧＵＡＧＣＡＡＧＣＵＵＡＣＧＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＧＵＡＡＧＣＵＵＧＣＵＡＣＵＵＡＵＡＵＣＣＵＵ−３’（配列番号：１６）
−ｓｈＮＴＣ−
５’−ＧＣＧＣＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＵＵＣＧＡＣＧＵＧＵＧＣＵＧＵＣＣＧＵＣＧＡＡＵＣＣＵＡＣＡＡＡＧＣＧＣＧＣＵＵ−３’（配列番号：１７）
【０１２４】
＜ｓｈＲＮＡ発現細胞の皮下移植実験＞
前記ｓｈＲＮＡ発現細胞をＰＢＳで希釈、懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス一個体に対して、１．０×１０６個皮下移植した。
コントロール群（ｓｈＮＴＣ群）、ＴＵＦＴ１ノックダウン群（ｓｈＴＵＦＴ１＃３群、ｓｈＴＵＦＴ１＃４群）の各群に対して８匹ずつ置き、移植後６日目から２４日目まで、３日おきに腫瘍の長径及び短径をノギスで計測し、腫瘍体積を算出した。
前記腫瘍体積は、以下の式により算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）÷２
【０１２５】
（試験例２：ＴＵＦＴ１の発現）
＜試験例２−１：正常組織でのＴＵＦＴ１の発現＞
正常組織でのＴＵＦＴ１の発現について、遺伝子発現データベースＲｅｆＥｘＡ（東京大学先端科学技術センターシステム生物医学ラボラトリー）を用いて検討を行った。
図２Ａに、全脳（Ｗｈｏｌｅ＿ｂｒａｉｎ）、網膜（Ｒｅｔｉｎａ）、小脳（Ｂｒａｉｎ＿ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）、胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ）、肺（Ｌｕｎｇ）、皮膚（ｓｋｉｎ）、胸部（Ｂｒｅａｓｔ）、骨格筋（Ｓｋｅｌｔａｌ＿ｍｕｓｃｌｅ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ１（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｋｉｄｎｅｙ２（手術検体））、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、小腸（Ｓｍａｌｌ＿ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、結腸（Ｃｏｌｏｎ）、精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）、前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、卵巣（Ｏｖａｒｙ）、子宮（Ｕｔｅｒｕｓ）、胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａ）、脂肪（Ａｄｉｐｏｓｅ）におけるＴＵＦＴ１の発現を解析した結果を示す。
図２Ａの結果から、ＴＵＦＴ１は、正常組織においても発現していることが示された。
【０１２６】
＜試験例２−２：ヒト細胞株におけるＴＵＦＴ１の発現＞
以下の様々なヒト細胞株のｃＤＮＡライブラリを作成して、ＴＵＦＴ１遺伝子の発現を定量的ＰＣＲにより検討した。前記ＴＵＦＴ１遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により補正した。結果を図２Ｂに示す。
［ヒト細胞株］
Ａ３７５細胞、Ａ５４９細胞、ＥＢＣ−１細胞、Ｈ４４１細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞、Ｌｕ９９細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＫＮ２８細胞、ＭＫＮ４５細胞、ＭＫＮ７細胞、ＯＣＵＭ−２Ｄ細胞、ＯＣＵＭ−２Ｍ細胞、ＯＣＵＭ−２ＭＤ３細胞、ＯＣＵＭ−２ＭＬＮ細胞、ＰＣ−３ｕ細胞、Ｕ３７３ＭＧ細胞。
【０１２７】
Ａ５４９細胞もＨ４４１細胞もともに肺腺癌細胞株であるが、Ｈ４４１細胞はＴＴＦ−１の発現が高い細胞であり、Ａ５４９細胞はＴＴＦ−１の発現が認められない細胞である。ＴＵＦＴ１はＴＴＦ−１により転写抑制を受ける因子であるから、予想通りＨ４４１細胞で発現が低く、Ａ５４９細胞で高い発現が見られることがわかった（図２Ｂ）。
また、その他には、乳癌細胞株であるＭＫＮ７細胞、ＭＣＦ７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などで高い発現が見られた（図２Ｂ）。
以降の試験例では主に、Ａ５４９細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いているが、いずれの細胞も他の細胞と比べて、比較的ＴＵＦＴ１の発現が高い細胞であると言える。
【０１２８】
（試験例３：ＴＧＦ−βによるＴＵＦＴ１発現制御と、ＴＵＦＴ１の細胞内局在の検討）
＜試験例３−１＞
Ａ５４９細胞を用い、ＴＧＦ−β刺激によるＴＵＦＴ１の発現制御を以下のようにして検討した。
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２をトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後にトータルＲＮＡを回収した。ＴＵＦＴ１のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。前記ＴＵＦＴ１遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により補正した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図３Ａに示す。
図３Ａの結果から、Ａ５４９細胞では、ＴＧＦ−β刺激（＋）によって、ＴＵＦＴ１の転写レベルでの発現誘導が強くかかることが明らかとなった。また、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、及びｓｉＴＵＦＴ１＃２により、ＴＵＦＴ１の発現をノックダウンさせることができることも明らかとなった。
【０１２９】
＜試験例３−２＞
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１、又はＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ２を発現させるアデノウイルスベクターをＡ５４９細胞に導入し、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に、抗ＦＬＡＧ抗体による細胞免疫染色により、ＴＵＦＴ１の細胞内局在を検討した。結果を図３Ｂに示す。
図３Ｂの結果から、ＴＵＦＴ１は、細胞質全体で強く発現が確認された。また、バリアントの違いによる細胞内局在に差は認められなかった。
【０１３０】
＜試験例３−３＞
内因性のＴＵＦＴ１タンパク質の局在を調べるために、Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２をトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を回収し、核画分（Ｎｕｃｒｅｕｓ）と細胞質画分（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）に分画したうえで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行った。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図３Ｃに示す。
図３Ｃの結果から、細胞免疫染色の結果と同様に、ＴＵＦＴ１は主に細胞質で発現するタンパク質であることを示唆する結果が得られた。なお、コントロールのＴｕｂｕｌｉｎは細胞質画分のみ、ＨＤＡＣ１は核画分のみで観察されており、分画が適切に行えていることも確認した。
また、Ａ５４９細胞では、ＴＧＦ−β刺激（＋）によって、タンパク質レベルでもＴＵＦＴ１の発現誘導が強くかかることが明らかとなった。また、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、及びｓｉＴＵＦＴ１＃２により、ＴＵＦＴ１の発現をノックダウンさせることができることも明らかとなった。
【０１３１】
以上の結果から、ＴＵＦＴ１は、ＴＧＦ−β誘導性で、主に細胞質で発現と機能を持つ因子であると予想された。
【０１３２】
（試験例４：ＴＵＦＴ１のノックダウンによる細胞の形態の変化）
＜試験例４−１：Ａ５４９細胞＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞の形態を観察した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図４Ａに示す。
図４Ａの結果から、ｓｉＮＣをトランスフェクションした場合、ＴＧＦ−β刺激を与えると細胞が紡錘形に変化した。一方、ｓｉＴＵＦＴ１＃１をトランスフェクションした場合（ＴＵＦＴ１をノックダウンさせた場合）には、ＴＧＦ−βを加えてもＥＭＴ（上皮間葉転換）様の形態変化が乏しく、またＴＧＦ−β未処置群においても細胞の１つ１つが丸く（もしくは多角形状に）なるような形態を示す上、細胞間相互作用も弱くなっている様子が観察された。
【０１３３】
＜試験例４−２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞＞
前記試験例４−１において、細胞をＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞に代えた以外は同様にして試験した。結果を図４Ｂに示す。
図４Ｂの結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞でも、Ａ５４９細胞と同様の傾向であることが示された。
【０１３４】
以上の結果から、ＴＵＦＴ１のノックダウンは、細胞運動に影響を及ぼす可能性が高いと考えられた。
【０１３５】
（試験例５：ＴＵＦＴ１のノックダウンによる細胞の運動能の変化）
細胞の運動は、血管新生、胚発生、免疫応答、腫瘍細胞の転移、浸潤など様々な過程で中心的な役割を果たすため、癌の悪性化の過程を考える上で重要な指標である。細胞運動性の評価をするにあたりチャンバーマイグレーションアッセイを施行した。
前記チャンバーマイグレーションアッセイは、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒの上部から細胞懸濁液を加え、一定時間培養後にメンブレンの８．０μｍのポアを透過して移動した細胞数を計数するという手法であり、細胞運動性を測定する方法としてよく用いられる。
【０１３６】
＜試験例５−１：Ａ５４９細胞＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）２４時間後の細胞を用いて、チャンバーマイグレーションアッセイ（アッセイ時間は４時間）を行った。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図５Ａ及び５Ｂに示す。
なお、各条件につき８視野を観察した（Ｎ＝８）。図５Ｂは、視野に含まれる細胞数の平均を表す（エラーバー：Ｓ．Ｄ．、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
図５Ａ及び５Ｂの結果から、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２を投与した細胞群では、ｓｉＮＣを投与した群と比較して有意に細胞運動性が低下することが示された。
【０１３７】
＜試験例５−２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞＞
前記試験例５−１において、細胞をＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞に代え、１０視野を観察（Ｎ＝１０）した以外は同様にして試験した。結果を図５Ｃ及び５Ｄに示す。なお、図５Ｄ中、＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す。
図５Ｃ及び５Ｄの結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞でも、Ａ５４９細胞と同様の傾向であることが示された。
【０１３８】
（試験例６：ＴＵＦＴ１のノックダウンがアクチン形態形成に及ぼす影響）
細胞運動は、多段階の機構によって時間的・空間的に厳密に制御されているが、その基盤として重要な仕組みが細胞骨格の再構築である。細胞骨格分子にはアクチン、微小管、中間径繊維の３種類があるが、細胞運動においては細胞先導端におけるアクチン重合が非常に重要であることが知られている。
そこで、細胞の運動性の低下がもたらされる原因を探るため、アクチン骨格の形態に着目した検討を行った。上述の通り、アクチンは細胞内部の繊維状構造を構築する細胞骨格の１つで、細胞の形態形成において大きな役割を担うタンパク質である。今回用いたファロイジンは、アクチン重合体（Ｆ−アクチン）に特異的な結合能を持つため、Ｆ−アクチンのイメージングに適する。
【０１３９】
＜試験例６−１：Ａ５４９細胞＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を固定した。前記細胞について、ファロイジンによりＦ−アクチンを染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図６Ａに示す。
図６Ａの結果から、ｓｉＮＣを投与したコントロールでは、ＴＧＦ−β刺激に伴ってアクチンストレスファイバーが増加した。
一方、ｓｉＴＵＦＴ１＃１を投与したＴＵＦＴ１ノックダウン細胞では、アクチンストレスファイバーがほとんど見られなくなり、その代わりに針状にアクチン繊維が進展するような、フィロポディア（糸状仮足）構造が出現する様子が観察された。また、ｓｉＴＵＦＴ１＃１を投与したＴＵＦＴ１ノックダウン細胞では、白のドットとして観察されるような、Ｆ−アクチンが凝集する形態も見られた。
【０１４０】
＜試験例６−２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞＞
前記試験例６−１において、細胞をＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞に代えた以外は同様にして試験した。結果を図６Ｂに示す。
図６Ｂの結果から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞でも、Ａ５４９細胞と同様の傾向であることが示された。
【０１４１】
（試験例７：ＴＵＦＴ１のＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質に及ぼす効果）
アクチンなどの細胞骨格の形態形成は、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質によって制御されていることが知られている。Ｒｈｏファミリーメンバーには２０種類以上が存在すると言われているが、なかでもＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、及びＣｄｃ４２が特に良く研究されており、ＲｈｏＡはストレスファイバーを、Ｒａｃ１はラメリポディアを、Ｃｄｃ４２はフィロポディアをそれぞれ誘導すると言われている（Ｎｏｂｅｓ  ＣＤ，  Ｈａｌｌ  Ａ．  Ｒｈｏ，  ｒａｃ，  ａｎｄ  ｃｄｃ４２  ＧＴＰａｓｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｃａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｆｉｂｅｒｓ，  ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ，  ａｎｄ  ｆｉｌｏｐｏｄｉａ．  Ｃｅｌｌ．  ８１：  ５３−６２  （１９９５））。これらＲｈｏファミリーＧタンパク質には、他の低分子量Ｇタンパク質と同様にＧＴＰ結合型の活性型と、ＧＤＰ結合型の不活性型が存在し、分子スイッチとして機能することが知られている（Ｈａｌｌ  Ａ．  Ｒｈｏ  ｆａｍｉｌｙ  ＧＴＰａｓｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ４０：  １３７８−１３８２  （２０１２））。
【０１４２】
ファロイジン染色の観察結果から、ＴＵＦＴ１のノックダウンは、ＲｈｏファミリーＧタンパク質の活性に影響を及ぼしているのではないかと考察した。そこで、Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｋｉｔを用いたプルダウンアッセイにより、ＧＴＰ結合の活性型Ｇタンパク質のみ特異的に回収する手法で検討を行った。プルダウンには、Ｒｈｏエフェクタータンパク質であるＲｈｏｔｅｋｉｎのＲＢＤ（Ｒｈｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）、又はＣｄｃ４２／Ｒａｃ１のエフェクタータンパク質であるＰＡＫのＰＢＤ（ｐ２１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を用いた。
【０１４３】
＜試験例７−１：Ａ５４９細胞＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を回収した。前記細胞について、プルダウンアッセイにより、活性型Ｇタンパク質を回収し、抗ＲｈｏＡ抗体、又は抗Ｒａｃ１抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより評価した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に評価した。
【０１４４】
また、Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後にトータルＲＮＡを回収した。ＲｈｏＡ、又はＲａｃ１のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。前記ＲｈｏＡ、又はＲａｃ１のｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により補正した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。
【０１４５】
結果を図７Ａ（ＲｈｏＡ）及び７Ｂ（Ｒａｃ１）に示す。
図７Ａ及び７Ｂの結果から、ＴＵＦＴ１のノックダウンにより、ＲｈｏＡ、及びＲａｃ１のそれぞれにおいて、活性型Ｇタンパク質の量が大きく減少する様子が示された（図７Ａ及び７Ｂの「Ａｃｔｉｖｅ」）。また、それに伴って、ＲｈｏＡ、及びＲａｃ１タンパク質の総量が減少している様子が示された（図７Ａ及び７Ｂの「Ｔｏｔａｌ」）。一方、転写レベルでの変動は、ほとんど差がなかった（図７Ａ及び７Ｂの棒グラフ）。
したがって、ＲｈｏＡ及びＲａｃ１は、ＴＵＦＴ１によるタンパク質レベルでの制御を受けている可能性が示唆された。
【０１４６】
（試験例８：ＴＵＦＴ１のＲｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質に及ぼす効果）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を回収し、核画分（Ｎｕｃｒｅｕｓ）と細胞質画分（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）に分画したうえで、細胞質画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行い、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、ＴＵＦＴ１、又はＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図８Ａ（ＲｈｏＡ）、及び図８Ｃ（Ｒａｃ１）に示す。
【０１４７】
また、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後にトータルＲＮＡを回収した。ＲｈｏＡ、又はＲａｃ１のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。前記ＲｈｏＡ、又はＲａｃ１のｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により補正した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図８Ｂ（ＲｈｏＡ）、及び図８Ｄ（Ｒａｃ１）に示す。
【０１４８】
図８Ａ〜８Ｄの結果から、Ａ５４９細胞と同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ細胞でもＴＵＦＴ１のノックダウンにより、ＲｈｏＡ、及びＲａｃ１のタンパク質の量が減少している様子が示された（図８Ａ及び８Ｃ）。一方、転写レベルでの変動は、ほとんど差がなかった（図８Ｂ及び８Ｄ）。
【０１４９】
（試験例９：ＴＵＦＴ１がｍＴＯＲシグナルに影響を及ぼす可能性）
ＴＵＦＴ１のノックダウンによりＲｈｏＡやＲａｃ１がタンパク質レベルで減少するメカニズムを探るにあたり、我々はｍＴＯＲシグナルに着目した。ｍＴＯＲは、グルコースやアミノ酸、さまざまな増殖因子を感知し、細胞の増殖や代謝・生存における調節因子の役割を果たすセリン／スレオニンキナーゼである。ｍＴＯＲは、ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  １）と、ｍＴＯＲＣ２（ｍＴＯＲ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ２）の２種類の複合体を形成し、それぞれ独立したネットワークを築くことが知られている（Ｗｕｌｌｓｃｈｌｅｇｅｒ  Ｓ，  Ｌｏｅｗｉｔｈ  Ｒ，  Ｏｐｐｌｉｇｅｒ  Ｗ，  Ｈａｌｌ  ＭＮ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ２．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８０：  ３０６９７−３０７０４  （２００５）；Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ．  ｍＴＯＲ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ６：  ７２９−７３４  （２００６））。詳細には、ｍＴＯＲＣ１は、主にｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、ｍＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０、及びＤｅｐｔｏｒから、ｍＴＯＲＣ２は、主にｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、ｍＬＳＴ８、ｍＳｉｎ１、及びＤｅｐｔｏｒから構成されていると考えられている。
【０１５０】
ｍＴＯＲＣ１の代表的な機能は、その下流でＳ６Ｋ１や４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化し、タンパク質の翻訳を司ることである。この翻訳制御を受ける因子には癌と関連したものが多いと言われており、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ｃ−Ｍｙｃ、ＶＥＧＦなどがそれにあたるが（Ｇｅｒａ  ＪＦ，  Ｍｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆ  ＩＫ，  Ｓｈｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ＡＫＴ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  （ｍＴＯＲ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｎｄ  ｃ−ｍｙｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７９：  ２７３７−２７４６  （２００４））、近年Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質もｍＴＯＲＣ１の制御下にあることが報告された（Ｌｉｕ  Ｌ，  Ｌｕｏ  Ｙ，  Ｃｈｅｎ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＲｈｏＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８５：  ３８３６２−３８３７３  （２０１０））。
【０１５１】
そこで、ＴＵＦＴ１がｍＴＯＲシグナルに影響を及ぼす可能性を探る為、ｍＴＯＲＣ１の代表的な翻訳制御因子であるＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現を以下のようにして調べた。
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を回収し、核画分（Ｎｕｃｒｅｕｓ）と細胞質画分（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）に分画したうえで、細胞質画分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行い、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＲｈｏＡ、ＴＵＦＴ１、又はＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図９Ａに示す。
【０１５２】
また、Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後にトータルＲＮＡを回収した。Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。前記Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１のｍＲＮＡの発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により補正した。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図９Ｂに示す。
【０１５３】
図９Ａ及び９Ｂの結果から、ＲｈｏＡやＲａｃ１と同様にＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１でも、ＴＵＦＴ１ノックダウン条件下では、タンパク質レベルは減少するが、転写レベルでは変動がないことが示された。
【０１５４】
（試験例１０：ＴＵＦＴ１のノックダウンがＳ６Ｋ１及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化に影響を及ぼす可能性）
試験例９の結果は、ＴＵＦＴ１がｍＴＯＲＣ１に影響を与えることを示唆する結果であったため、ｍＴＯＲＣ１の下流として代表的な直接的リン酸化標的であるＳ６Ｋ１及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより検討した。
【０１５５】
＜試験例１０−１：インスリン刺激なし＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、ｓｉＴＵＦＴ１＃１、又はｓｉＴＵＦＴ１＃２  １０ｎＭをトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を溶解しタンパク質を回収し、各種ｍＴＯＲ関連因子の抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより、ＲｈｏＡ、ｐＡｋｔ（Ｔ３０８）、Ａｋｔ、ｐＳ６Ｋ１（Ｔ３８９）（「ｐＳ６Ｋ１」と称することがある）、Ｓ６Ｋ１、ｐ４Ｅ−ＢＰ１（「ｐ４ＥＢＰ１」と称することがある）、ＴＵＦＴ１、及びαＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）についても同様に調べた。結果を図１０Ａに示す。
【０１５６】
図１０Ａの結果から、ＴＵＦＴ１のノックダウンはＳ６Ｋ１（Ｔ３８９）のリン酸化レベルを著しく低下させた（図１０Ａ中、「ｐＳ６Ｋ１（Ｔ３８９）」）。一方、ｍＴＯＲＣ１の上流であるＡｋｔ（Ｔ３０８）のリン酸化レベルには影響を与えないことがわかった（図１０Ａ中、「ｐＡｋｔ（Ｔ３０８）」）。
【０１５７】
＜試験例１０−２：インスリン刺激あり＞
ＴＧＦ−βもｍＴＯＲ経路を活性化する因子の１つとして報告があるが（Ｌａｍｏｕｉｌｌｅ  Ｓ，  Ｄｅｒｙｎｃｋ  Ｒ．  Ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １７８：  ４３７−４５１  （２００７））、ｍＴＯＲ経路を活性化させる因子として最もよく用いられているものはインスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）である。そこで、インスリンによる短時間刺激を行った場合について調べた。
【０１５８】
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１  １０ｎＭをトランスフェクションし、無血清培地（ＤＭＥＭ（１１９６５−０９２）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２４時間培養後、インスリン刺激（１７４ｎＭ）を０時間、１時間、又は３時間行った後、細胞を溶解しタンパク質を回収し、各種ｍＴＯＲ関連因子の抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより、ｐＳ６Ｋ１、ｐ４ＥＢＰ１、ＴＵＦＴ１、及びＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。結果を図１０Ｂに示す。
【０１５９】
図１０Ｂの結果から、インスリンによる短時間刺激を行った場合には、ＴＵＦＴ１のノックダウンは、より顕著にＳ６Ｋ１のリン酸化レベルを抑えただけでなく、もう１つの代表的なリン酸化標的である４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化レベルについてもやや低下させることがわかった。
【０１６０】
以上の結果は全て、ＴＵＦＴ１のノックダウンがｍＴＯＲＣ１のシグナル活性を抑制していることを示唆するものであった。
【０１６１】
（試験例１１：ＴＵＦＴ１の過剰発現がＳ６Ｋ１のリン酸化レベルに及ぼす影響）
＜試験例１１−１：インスリン刺激、及びＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ刺激なし＞
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１（「Ｔｕｆｔ  Ｖ１」と称することがある）、又はＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ２（「Ｔｕｆｔ  Ｖ２」と称することがある）を発現させるアデノウイルスベクターをＡ５４９細胞に導入し（ＭＯＩ  １００）、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を溶解しタンパク質を回収し、各種ｍＴＯＲ関連因子の抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより、ｐＳ６Ｋ１、Ｓ６Ｋ１、ＴＵＦＴ１、及びＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。また、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）なし（−）の場合、ＬａｃＺを発現させるアデノウイルスベクター（コントロール）を用いた場合についても同様に調べた。結果を図１１Ａに示す。
【０１６２】
図１１Ａの結果から、ＴＵＦＴ１を過剰発現させた場合には、Ｓ６Ｋ１のリン酸化レベルがやや上昇する傾向にあることがわかった。
【０１６３】
＜試験例１１−２：インスリン刺激、及びＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ刺激あり＞
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１、又はＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ２を発現させるアデノウイルスベクターをＡ５４９細胞に導入し（ＭＯＩ  １００）、無血清培地（ＤＭＥＭ（１１９６５−０９２）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２４時間培養後、インスリン刺激（１７４ｎＭ）を４時間行った後、ＰＩ３Ｋの阻害剤であるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ刺激を１時間行った後、細胞を溶解しタンパク質を回収し、各種ｍＴＯＲ関連因子の抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより、ｐＳ６Ｋ１、Ｓ６Ｋ１、ＴＵＦＴ１、及びＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。結果を図１１Ｂに示す。
【０１６４】
図１１Ｂの結果から、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎを投与した場合には、ＴＵＦＴ１を過剰発現させてもＳ６Ｋ１のリン酸化レベルが回復する様子は認められなかった。そのため、ＴＵＦＴ１単独でｍＴＯＲＣ１を活性化させる能力はないと考えられた。
【０１６５】
（試験例１２：ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲ関連因子との結合の検討）
上記の結果から、ＴＵＦＴ１は、ｍＴＯＲシグナルに関係している可能性が高いことが示唆されたため、ＴＵＦＴ１と、ｍＴＯＲ関連因子との結合の有無を調べた。
なお、前記ｍＴＯＲ関連因子として、ｍＴＯＲＣ１の主要な構成因子であるｍＴＯＲ及びＲａｐｔｏｒ、並びにｍＴＯＲＣ２の主要な構成因子であるＲｉｃｔｏｒについて調べた。Ｒａｐｔｏｒは、分子量約１５０ｋＤａのｍＴＯＲのアダプタータンパク質であり、ｍＴＯＲＣ１の基質であるＳ６Ｋ１や４Ｅ−ＢＰ１とも結合して、リン酸化を補助する役割を担う因子である（Ｎｏｊｉｍａ  Ｈ，  Ｔｏｋｕｎａｇａ  Ｃ，  Ｅｇｕｃｈｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  （ｍＴＯＲ）  ｐａｒｔｎｅｒ，  ｒａｐｔｏｒ，  ｂｉｎｄｓ  ｔｈｅ  ｍＴＯＲ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｐ７０  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ４Ｅ−ＢＰ１  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅｉｒ  ＴＯＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  （ＴＯＳ）  ｍｏｔｉｆ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  １５４６１−１５４６４  （２００３））。一方、Ｒｉｃｔｏｒは、分子量約２００ｋＤａのタンパク質であり、ｍＴＯＲＣ２複合体の形成や基質との結合に必要と言われている（Ｓａｒｂａｓｓｏｖ  ＤＤ，  Ａｌｉ  ＳＭ，  Ｋｉｍ  ＤＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｉｃｔｏｒ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｏｆ  ｍＴＯＲ，  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒａｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．  １４：  １２９６−１３０２  （２００４））。
【０１６６】
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１を発現させるアデノウイルスベクターをＡ５４９細胞に導入し（ＭＯＩ  １００）、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を溶解しタンパク質を回収後、抗ＦＬＡＧ抗体にて免疫沈降を行った。次いで、抗ｍＴＯＲ抗体、抗Ｒａｐｔｏｒ抗体、又は抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより評価した。結果を図１２に示す。
【０１６７】
図１２の結果から、ＴＵＦＴ１は、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、及びＲｉｃｔｏｒの全ての因子と結合能があることが示唆された。
【０１６８】
（試験例１３：内在性のＴＵＦＴ１と、ｍＴＯＲ関連因子との結合）
＜試験例１３−１＞
内在性のタンパク質同士間でも結合が存在することを確認するため、第一の手法としてｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ（ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）法を用いた。Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法では、分子特異的な１次抗体に加えて、核酸配列が結合した２次抗体を用いる。２種類の抗体が十分に近接した状態にある時のみ、ライゲーション反応及びポリメラーゼによるＤＮＡ増幅が起こるため、これを蛍光プローブで検出するという手法である。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡシグナルの定量にはＤｕｏｌｉｎｋ  ＩｍａｇｅＴｏｏｌ（Ｏｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、細胞あたりのドット数を計数した。
【０１６９】
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１をトランスフェクションし、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を固定した。抗ＴＵＦＴ１抗体と、ｍＴＯＲ関連抗体（抗ｍＴＯＲ抗体、抗Ｒａｐｔｏｒ抗体、又は抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体）とを用いてｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡを行った。細胞あたりのドット数を計数し、定量した結果を図１３Ａに示す。
【０１７０】
図１３Ａの結果から、ｍＴＯＲ及びＲａｐｔｏｒについては、ＴＵＦＴ１との結合を示すシグナルが多数検出され（ｓｉＮＣをトランスフェクションした場合）、ｓｉＴＵＦＴ１＃１をトランスフェクションした場合には、前記シグナルが有意に消失することが示された。
一方、Ｒｉｃｔｏｒについては、ｓｉＮＣをトランスフェクションした場合でのシグナル数が少ないことに加え、ｓｉＴＵＦＴ１＃１をトランスフェクションした場合でもシグナル数に大きな変動は見られなかった。これは、Ｒｉｃｔｏｒと、ＴＵＦＴ１とが内在的には結合しないという可能性も考えられるが、抗体の感度の問題や、今回の条件ではｍＴＯＲＣ２のシグナルがあまり誘導されていない、又はＡ５４９細胞ではＲｉｃｔｏｒの発現が低いなどの可能性も存在する。
【０１７１】
＜試験例１３−２＞
内在性のタンパク質同士間でも結合が存在することを確認するため、更に、免疫沈降法により調べた。
Ａ５４９細胞について、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を溶解しタンパク質を回収後、抗ＴＵＦＴ１抗体にて免疫沈降を行った。次いで、抗ｍＴＯＲ抗体、抗Ｒａｐｔｏｒ抗体、抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体、又は抗Ｒｈｅｂ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより評価した。結果を図１３Ｂに示す。
【０１７２】
図１３Ｂの結果から、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡの結果と同様、ｍＴＯＲ及びＲａｐｔｏｒと、ＴＵＦＴ１との間で、結合性があることが示唆された。また、ＴＵＦＴ１は、ｍＴＯＲの活性化に関わるＲｈｅｂとも結合する可能性があることが示唆された。
【０１７３】
これらの結果より、Ａ５４９細胞では、ＴＵＦＴ１は、ｍＴＯＲ、及びＲａｐｔｏｒ（即ち、ｍＴＯＲＣ１の構成因子）と内在的にも結合する可能性が高いと考えられる。
【０１７４】
（試験例１４：ＴＵＦＴ１のｍＴＯＲＣ１活性化機構における重要性）
ＴＵＦＴ１は、ｍＴＯＲＣ１の近傍に存在して、どのような役割を担っているのかを検討した。
ｍＴＯＲＣ１の主要な構成因子であるｍＴＯＲとＲａｐｔｏｒとは、シグナルが入っていない不活性な状態では強固な結合を示すが、何らかの刺激により活性化されるとその結合が減弱することが知られている（Ｋｉｍ  ＤＨ，  Ｓａｒｂａｓｓｏｖ  ＤＤ，  Ａｌｉ  ＳＭ，  ｅｔ  ａｌ．  ｍＴＯＲ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒａｐｔｏｒ  ｔｏ  ｆｏｒｍ  ａ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｈａｔ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．  Ｃｅｌｌ．  １１０：  １６３−１７５  （２００２））。そこで、ＴＵＦＴ１が、ｍＴＯＲ−Ｒａｐｔｏｒ間の結合に影響を与えるか否かについて調べた。
【０１７５】
＜試験例１４−１：ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ法＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１をトランスフェクションし、無血清培地（ＤＭＥＭ（１１９６５−０９２）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２４時間培養後、インスリン刺激（１７４ｎＭ）を１時間行った後に細胞を固定した。抗ｍＴＯＲ抗体と、抗Ｒａｐｔｏｒ抗体とを用いてｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡを行った。細胞あたりのドット数を計数し、定量した結果を図１４Ａに示す（Ｎ＝４）。
【０１７６】
図１４Ａの結果から、ｓｉＮＣを投与した細胞と比較して、ｓｉＴＵＦＴ１＃１を投与した細胞では、ｍＴＯＲ−Ｒａｐｔｏｒ間の結合が多いことがわかった。
【０１７７】
＜試験例１４−２：免疫沈降法＞
Ａ５４９細胞に、ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＮＣ、又はｓｉＴＵＦＴ１＃１をトランスフェクションし、無血清培地（ＤＭＥＭ（１１９６５−０９２）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２４時間培養後、インスリン刺激（１７４ｎＭ）を１時間行った後に細胞を溶解し、タンパク質を回収した。抗ｍＴＯＲ抗体を用いて免疫沈降を行い、抗Ｒａｐｔｏｒ抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより評価した。結果を図１４Ｂに示す。
【０１７８】
図１４Ｂの結果から、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡの結果と同様、ｓｉＮＣを投与した細胞と比較して、ｓｉＴＵＦＴ１＃１を投与した細胞では、ｍＴＯＲ−Ｒａｐｔｏｒ間の結合が強まることがわかった。
【０１７９】
これらの結果は、ＴＵＦＴ１のノックダウンがインスリン刺激により誘導されるｍＴＯＲシグナルの活性化を、ｍＴＯＲ−Ｒａｐｔｏｒ間の結合強度を変えることで抑制している可能性を示唆するものであった。
【０１８０】
（試験例１５：ｓｈＲＮＡ発現細胞）
＜試験例１５−１：ｓｈＲＮＡ発現細胞におけるタンパク質の発現＞
ｓｈＴＵＦＴ１＃３を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、ｓｈＴＵＦＴ１＃４を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、及びｓｈＮＴＣを発現するｓｈＲＮＡ発現細胞のそれぞれについて、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後に細胞を溶解し、タンパク質を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを行い、ＴＵＦＴ１、ｐＳ６Ｋ１、又はＴｕｂｕｌｉｎの発現を調べた。結果を図１５Ａに示す。
【０１８１】
図１５Ａの結果から、ｓｈＴＵＦＴ１＃３を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、及びｓｈＴＵＦＴ１＃４を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞では、ＴＵＦＴ１の発現が抑制されていることが確認された。また、これらの細胞では、Ｓ６Ｋ１のリン酸化レベルが低下していることも示された。
【０１８２】
＜試験例１５−２：ｓｈＲＮＡ発現細胞におけるＴＵＦＴ１  ｍＲＮＡの発現＞
ｓｈＴＵＦＴ１＃３を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、ｓｈＴＵＦＴ１＃４を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、及びｓｈＮＴＣを発現するｓｈＲＮＡ発現細胞のそれぞれについて、ＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）４８時間後にトータルＲＮＡを回収した。ＴＵＦＴ１のｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。前記ＴＵＦＴ１遺伝子の発現量は、ＧＡＰＤＨの発現量により補正した。また、Ａ５４９細胞についても同様に調べた。結果を図１５Ｂに示す。
【０１８３】
図１５Ｂの結果からも、ｓｈＴＵＦＴ１＃３を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、及びｓｈＴＵＦＴ１＃４を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞では、ＴＵＦＴ１の発現が抑制されていることが確認された。
【０１８４】
＜試験例１５−３：ｓｈＲＮＡ発現細胞の増殖＞
ｓｈＴＵＦＴ１＃３を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、ｓｈＴＵＦＴ１＃４を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞、及びｓｈＮＴＣを発現するｓｈＲＮＡ発現細胞をＴＧＦ−β刺激（１ｎｇ／ｍＬ）有りの条件で培養し、２４時間、及び７２時間時点で細胞を回収し、細胞数を計数した（Ｎ＝３）。結果を図１５Ｃに示す。
【０１８５】
図１５Ｃの結果から、ＴＵＦＴ１の機能喪失は、癌細胞の増殖を抑制することが示された。
【０１８６】
（試験例１６：ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍の増殖を以下のようにして調べた。
ｓｈＴＵＦＴ１＃３を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞（Ａ５４９−ｓｈＴＵＦＴ１＃３）ｓｈＴＵＦＴ１＃４を発現するｓｈＲＮＡ発現細胞（Ａ５４９−ｓｈＴＵＦＴ１＃４）、又はｓｈＮＴＣを発現するｓｈＲＮＡ発現細胞（Ａ５４９−ｓｈＮＴＣ）をヌードマウスに皮下移植し、移植後６日目から２４日目まで、３日おきに腫瘍の長径及び短径をノギスで計測し、腫瘍体積を算出した。結果を図１６に示す。
【０１８７】
図１６の結果から、ＴＵＦＴ１のノックダウンは、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍増殖をも著しく抑えることが示され、癌におけるＴＵＦＴ１の重要性が示唆される結果となった。
【０１８８】
（試験例１７：ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲシグナル関連タンパク質因子との相互作用の検討）
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１発現ベクターと、ｍｙｃ−ＲａｇＡ発現ベクター、ｍｙｃ−ＲａｇＢ発現ベクター、ｍｙｃ−ＲａｇＣ発現ベクター、ｍｙｃ−ＲａｇＤ発現ベクター、又はｍｙｃ−Ｒｈｅｂ発現ベクターとをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランフェクションし、一晩培養した。細胞を溶解しタンパク質を回収後、抗Ｍｙｃ抗体にて免疫沈降を行った。次いで、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ＴＵＦＴ１抗体、又は抗Ｍｙｃ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより評価した。結果を図１７に示す。
【０１８９】
図１７の結果から、ＴＵＦＴ１はｍＴＯＲＣ１アミノ酸シグナルにおける重要因子であるＲａｇＧＴＰａｓｅのうち、ＲａｇＤとのみ結合性を示した。一方で、ＲａｇＤと配列相同が高いため、一般的に重複した機能を持つと考えられているＲａｇＣとＴＵＦＴ１との間にはほとんど結合性が見いだせなかった。この結果は、ＴＵＦＴ１がｍＴＯＲＣ１シグナルのうち、アミノ酸経路と関わる可能性を示唆した。
【０１９０】
（試験例１８：ＴＵＦＴ１とＲａｇＤとの相互作用の検討）
試験例１７の結果から、ＴＵＦＴ１は、Ｒａｇ  ＧＴＰａｓｅのうちＲａｇＤとのみ結合性を示した。本試験例では、ＲａｇＤの活性状態とＴＵＦＴ１結合性との間の関係を探るため、既に報告のあるＲａｇＤのＧＴＰ結合型変異体及びＧＤＰ結合型変異体を作製し、試験した。
【０１９１】
ＦＬＡＧ−ＴＵＦＴ１  Ｖ１発現ベクターと、ｍｙｃ−ＲａｇＤ（野生型（ｗｔ））発現ベクター、ｍｙｃ−ＲａｇＤ（ＧＤＰ結合型（ＧＤＰ））発現ベクター、又はｍｙｃ−ＲａｇＤ（ＧＴＰ結合型（ＧＴＰ））発現ベクターとをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランフェクションし、一晩培養した。細胞を溶解しタンパク質を回収後、抗Ｍｙｃ抗体にて免疫沈降を行った。次いで、抗ＦＬＡＧ抗体、又は抗Ｍｙｃ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより評価した。結果を図１８に示す。
【０１９２】
図１８の結果から、ＴＵＦＴ１はいずれの変異体とも結合したが、特に活性型のＧＤＰ結合型ＲａｇＤと強い結合性を示した。
【０１９３】
（試験例１９：ＴＵＦＴ１の発現量と、ペリフォシンへの感受性との相関の検討）
がん細胞株パネルＪＦＣＲ３９におけるＴＵＦＴ１の発現をａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマイクロアレイによって取得した。Ｄａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０に発表されたこの細胞株パネルの薬剤感受性データ（ＧＩ５０値）を用いてＴＵＦＴ１の発現量と、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔインヒビターの１つであるペリフォシン（Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）への感受性との関係をプロットした。結果を図１９に示す。図１９中、ｒは相関係数、ｐはｓｔｕｄｅｎｔのｔ分布の確率を示す。
【０１９４】
図１９の結果から、ペリフォシン（Ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）への感受性とＴＵＦＴ１発現量との間に強い負の相関が見出された。ペリフォシンは、アルキルリン脂質の一種であり、膜の脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ）に作用することでＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路全体を抑制すると考えられている。
【０１９５】
（試験例２０：ＴＵＦＴ１のノックダウンの影響の検討）
８ウェルチャンバースライドにＡ５４９細胞を播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＴＵＦＴ１＃１又はｓｉＮＣを１０ｎＭ導入した。
細胞アミノ酸飢餓培地（＃Ｄ９４４３；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２回リンスした後、３時間培養し、その後アミノ酸と血清を含むＤＭＥＭに替えて３０分間反応させた。
その後、細胞免疫染色を行い、染色画像をＦＶ１０ｉ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で取得した。なお、一次抗体には、抗ＬＡＭＰ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）、又は抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。結果を図２０に示す。
【０１９６】
アミノ酸刺激は、ｍＴＯＲの局在を細胞質からリソソーム領域へと変化させることが知られている。
図２０の結果から、アミノ酸刺激１０分間後、コントロール細胞（ｓｉＮＣを導入した細胞）では確かにｍＴＯＲのシグナルがリソソームマーカーであるＬＡＭＰ２領域と共染色されることがわかった。一方で、ＴＵＦＴ１をノックダウンすると、ｍＴＯＲはリソソーム領域への移行がほとんど見られなくなり、アミノ酸飢餓条件と同様細胞質全体に存在し続けることが分かり、本結果もＴＵＦＴ１がｍＴＯＲのアミノ酸経路に関与する可能性を強く示唆するものとなった。
【０１９７】
（試験例２１：阻害剤のｍＴＯＲのリソソーム移行への影響の検討）
８ウェルチャンバースライドにＡ５４９細胞を播種し、培養した。
細胞アミノ酸飢餓培地（＃Ｄ９４４３；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２回リンスした後、阻害剤として、ウォルトマニンを２０μＭ、ペリフォシンを２０μＭ、又はエデルフォシンを１０μＭ添加し、３時間培養し、その後ウォルトマニンを２０μＭ、ペリフォシンを２０μＭ、又はエデルフォシンを１０μＭ添加したアミノ酸と血清を含むＤＭＥＭに替えて３０分間反応させた。
その後、細胞免疫染色を行い、染色画像をＦＶ１０ｉ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で取得した。なお、一次抗体には、抗ＬＡＭＰ２抗体（Ａｂｃａｍ社製）、又は抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた。結果を図２１に示す。
【０１９８】
図２１の結果から、コントロール、及びＡｋｔ阻害剤であるウォルトマニンで処理した細胞においてはアミノ酸刺激によるｍＴＯＲのリソソーム移行に影響はなかった。一方で、ペリフォシンとその類縁化合物であるエデルフォシンは、ｍＴＯＲの移行を完全に抑え、ｍＴＯＲはアミノ酸非依存的に細胞質領域に広く存在し続けることがわかった。
よって、ペリフォシンがＴＵＦＴ１と同じく、ｍＴＯＲの移行に作用することが示唆された。
【０１９９】
（試験例２２：ｍＴＯＲ阻害剤によるＴＵＦＴ１と、ｍＴＯＲとの結合への影響の検討）
ペリフォシン及びエデルフォシンがＴＵＦＴ１に及ぼす影響を探るため、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡの手法により、ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲの結合に対する効果を試験した
【０２００】
８ウェルチャンバースライドにＡ５４９細胞を播種し、培養した。
細胞アミノ酸飢餓培地（＃Ｄ９４４３；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で２回リンスした後、２時間おき、ペリフォシンを２０μＭ又はエデルフォシンを１０μＭ添加して、更に１時間培養した。
その後ペリフォシンを２０μＭ又はエデルフォシンを１０μＭ添加したアミノ酸と血清を含むＤＭＥＭに替えて３０分間反応させた。細胞を、４％  ＰＦＡにて室温で１５分間固定し、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により室温で７分間細胞膜透過処理を行った。各一次抗体（抗ＴＵＦＴ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ｍＴＯＲ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））は、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ（ナカライテスク株式会社製）で希釈し、４℃で一晩反応させた。
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡシグナルの定量には、Ｄｕｏｌｉｎｋ  ＩｍａｇｅＴｏｏｌ（Ｏｌｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。画像は、ＦＶ１０ｉ（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で取得した。結果を図２２に示す。
【０２０１】
図２２の結果から、ペリフォシン、エデルフォシンともにｍＴＯＲと、ＴＵＦＴ１と間の結合数を著しく減少させることがわかった。一方で、ＴＵＦＴ１とＲａｇＤの結合に対しては効果を及ぼさなかった。
よって、ペリフォシン、エデルフォシンは、ＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害することでアミノ酸によるｍＴＯＲの移行を抑制していることが考えられる。
【０２０２】
（試験例２３：ＴＵＦＴ１のノックダウンによる癌細胞の転移への影響の検討）
ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ−ｌｕｃ細胞に、ＴＵＦＴ１に対するｓｈＲＮＡであるｓｈＴＵＦＴ１＃３、又はコントロールであるｓｈＮＴＣを導入した。前記細胞  １．０×１０５個を雌ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの左心室に注射し、移植５週間後にルシフェラーゼによるｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇにて骨転移の観察を行った。
図２３に、各ｓｈＲＮＡを導入した細胞を注射した場合のマウスあたりの平均転移箇所数を測定した結果を示す。
【０２０３】
図２３の結果から、ＴＵＦＴ１をノックダウンした細胞を移植した群では、平均転移箇所数の優位な低下が見られ、ＴＵＦＴ１は癌細胞の転移能にも大きく影響を及ぼす因子であると示唆された。
【０２０４】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、癌の予後を評価する工程とを含むことを特徴とする癌の予後を予測するための方法である。
＜２＞  ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする癌の予後を予測するためのキットである。
＜３＞  細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかに被験物質を投与する工程と、
前記細胞及び癌モデル動物の少なくともいずれかにおけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、前記被験物質の癌の治療効果を判定する工程とを含むことを特徴とする癌治療薬のスクリーニング方法である。
＜４＞  ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＴＵＦＴ１の発現を抑制するｓｈＲＮＡ、及びＴＵＦＴ１とｍＴＯＲとの結合を阻害する分子の少なくともいずれかを含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
＜５＞  癌細胞に、前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を作用させることを特徴とする癌細胞の増殖抑制方法である。
＜６＞  前記＜４＞に記載の癌細胞増殖抑制剤を含有することを特徴とする癌治療薬である。
＜７＞  個体に、前記＜６＞に記載の癌治療薬を投与することを特徴とする癌の予防乃至治療方法である。
＜８＞  患者由来の試料中におけるＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを測定する工程と、
前記ＴＵＦＴ１の発現量及び活性の少なくともいずれかを指標として、ｍＴＯＲ阻害剤が有効か否かを評価する工程とを含むことを特徴とするｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するための方法である。
＜９＞  ＴＵＦＴ１に対するプローブ及びプライマーの少なくともいずれかとして使用し得る核酸分子、並びにＴＵＦＴ１に対する抗体の少なくともいずれかを含有することを特徴とするｍＴＯＲ阻害剤の薬効を予測するためのキットである。
【図１Ａ】
2015213503.tif 000002
【図１Ｂ】
2015213503.tif 000003
【図１Ｃ】
2015213503.tif 000004
【図２Ａ】
2015213503.tif 000005
【図２Ｂ】
2015213503.tif 000006
【図３Ａ】
2015213503.tif 000007
【図３Ｂ】
2015213503.tif 000008
【図３Ｃ】
2015213503.tif 000009
【図４Ａ】
2015213503.tif 000010
【図４Ｂ】
2015213503.tif 000011
【図５Ａ】
2015213503.tif 000012
【図５Ｂ】
2015213503.tif 000013
【図５Ｃ】
2015213503.tif 000014
【図５Ｄ】
2015213503.tif 000015
【図６Ａ】
2015213503.tif 000016
【図６Ｂ】
2015213503.tif 000017
【図７Ａ】
2015213503.tif 000018
【図７Ｂ】
2015213503.tif 000019
【図８Ａ】
2015213503.tif 000020
【図８Ｂ】
2015213503.tif 000021
【図８Ｃ】
2015213503.tif 000022
【図８Ｄ】
2015213503.tif 000023
【図９Ａ】
2015213503.tif 000024
【図９Ｂ】
2015213503.tif 000025
【図１０Ａ】
2015213503.tif 000026
【図１０Ｂ】
2015213503.tif 000027
【図１１Ａ】
2015213503.tif 000028
【図１１Ｂ】
2015213503.tif 000029
【図１２】
2015213503.tif 000030
【図１３Ａ】
2015213503.tif 000031
【図１３Ｂ】
2015213503.tif 000032
【図１４Ａ】
2015213503.tif 000033
【図１４Ｂ】
2015213503.tif 000034
【図１５Ａ】
2015213503.tif 000035
【図１５Ｂ】
2015213503.tif 000036
【図１５Ｃ】
2015213503.tif 000037
【図１６】
2015213503.tif 000038
【図１７】
2015213503.tif 000039
【図１８】
2015213503.tif 000040
【図１９】
2015213503.tif 000041
【図２０】
2015213503.tif 000042
【図２１】
2015213503.tif 000043
【図２２】
2015213503.tif 000044
【図２３】
2015213503.tif 000045
【配列表】
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