(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍溶解ウイルスベクター及びがん治療剤の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列の少なくとも一つ以上のペプチドを発現する腫瘍溶解ウイルスベクターは、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｎｏｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）を発現している細胞に特異的に感染することから、ＣＥＡを発現しているがん、又は、胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん若しくは子宮がん等の治療に有用である。なお、前記腫瘍溶解ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであることが好ましい。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（ＶＬＴＧＮＣＧ）、配列番号２（ＡＧＬＷＰＴＲ）、配列番号３（ＧＦＣＬＴＧＦ）、配列番号４（ＲＣＬＷＧＬＬ）及び配列番号５（ＲＳＳＡＣＧＧ）の少なくとも一つ以上のペプチドを発現する腫瘍溶解ウイルスベクター。
【請求項２】
前記腫瘍溶解ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍溶解ウイルスベクター。
【請求項３】
前記アデノウイルスベクターにおいて、ファイバーノブ領域のＨＩループ部の配列番号６（ＡＣＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＡＡ）と配列番号７（ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡＧＣＡ ＴＡＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＴＣＡ ＴＴＴ）との間に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸が挿入されていることを特徴とする請求項２に記載の腫瘍溶解ウイルスベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の腫瘍溶解ウイルスベクターを含有するがん治療剤であって、
前記がんが、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｎｏｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）を発現しているがんであることを特徴とするがん治療剤。
【請求項５】
前記がんが、胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん又は子宮がんであることを特徴とする請求項４に記載のがん治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解ウイルスベクター及びがん治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子治療の臨床試験において、アデノウイルス、レトロウイルス、プラスミドＤＮＡ等のベクターが用いられている（非特許文献１）。特に、アデノウイルスベクターは、感染域が広いことや細胞への感染効率が高い等の理由により、遺伝子治療のベクターとして汎用されている。また、腫瘍溶解アデノウイルス療法は、正常細胞内では増殖できず腫瘍細胞内だけで増殖するように遺伝子工学的に改変したアデノウイルスを用いた、新たながん治療方法である（非特許文献２及び非特許文献３）。
しかし、腫瘍溶解アデノウイルス療法は、腫瘍溶解能力を格段に増強する必要があること、及びアデノウイルスの正常臓器への感染を防ぐ等の安全性を強化する必要があることの２つの課題がある。現在までに、腫瘍溶解アデノウイルス療法として、特許文献１に記載の技術が知られている（特許文献１）。
また、アデノウイルス５型の細胞へ感染は、キャプシドのファイバーノブがコクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）に吸着し、ペントンベースのＲＧＤ配列が細胞表面のインテグリンと結合して細胞内に取り込まれるという２段階の感染様式をとる。理論的には、アデノウイルスベクターのゲノムを改変し、ＣＡＲやインテグリンとの結合を抑制して標的リガンドを挿入することにより、細胞特異的に感染する標的アデノウイルスベクターを構築することが可能である。
しかし、多くのがん細胞において特異的なリガンドとレセプターの組み合わせは明らかでなく、同じがん種でも個人によって感染に利用できる細胞表面の受容体は大きく異なっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−０４８６２１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gene Therapy Clinical Traials Worldwide Provided by the Journal of Gene Medicine、インターネット（URL:http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical）
【非特許文献２】Oncolytic adenoviruses for the treatment of human cancer: focus on translational and clinical data. Pesonen S, Kangasniemi L, Hemminki A. Mol Pharm. 2011 Feb 7;8(1):12-28.
【非特許文献３】Oncolytic virus therapy for pancreatic cancer using the adenovirus library displaying random peptides on the fiber knob. Nishimoto T, Yoshida K, Miura Y, Kobayashi A, Hara H, Ohnami S, Kurisu K, Yoshida T, Aoki K. Gene Ther. 2009 May;16(5):669-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腫瘍溶解ウイルスベクター及びがん治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、膵がん等の消化器がんにおいて発現が亢進しているがん胎児抗原（ＣＥＡ：Carcinoembrionic antigen、以下ＣＥＡともいう。）を標的とするペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
[１]配列番号１（ＶＬＴＧＮＣＧ）、配列番号２（ＡＧＬＷＰＴＲ）、配列番号３（ＧＦＣＬＴＧＦ）、配列番号４（ＲＣＬＷＧＬＬ）及び配列番号５（ＲＳＳＡＣＧＧ）の少なくとも一つ以上のペプチドを発現する腫瘍溶解ウイルスベクター；
[２]前記腫瘍溶解ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とする[１]に記載の腫瘍溶解ウイルスベクター；
[３]前記アデノウイルスベクターにおいて、ファイバーノブ領域のＨＩループ部の配列番号６（ＡＣＡ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＧＡＡ）と配列番号７（ＡＣＴ ＡＧＴ ＣＣＡ ＡＧＴ ＧＣＡＧＣＡ ＴＡＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＴＣＡ ＴＴＴ）との間に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸が挿入されていることを特徴とする[２]に記載の腫瘍溶解ウイルスベクター;
[４][１]〜[３]のいずれかに記載の腫瘍溶解ウイルスベクターを含有するがん治療剤であって、前記がんが、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｎｏｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）を発現しているがんであることを特徴とするがん治療剤；
[５]前記がんが、胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん又は子宮がんであることを特徴とする[４]に記載のがん治療剤； 
[６][４]又は[５]に記載のがん治療剤を用いたがんの治療方法等である。
【０００８】
なお、本発明において「がん」とは、上皮細胞からなる癌（ｃａｎｃｅｒ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、非上皮性細胞からなる肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）又は血液悪性腫瘍を含む悪性腫瘍のことをいい、がんの由来は問わない。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、腫瘍溶解ウイルスベクター及びがん治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施例において、アデノウイルスベクターの開発の概要を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ＣＥＡを発現する膵がん細胞におけるアデノウイルスライブラリーのスクリーニング方法を示した図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞におけるアデノウイルスの感染効率を検討した結果を示した図である。
【図４】本発明の一実施例において、ＭＩＡＰａＣａ−ＣＥＡ細胞におけるアデノウイルスの感染効率を検討した結果を示した図である。
【図５】本発明の一実施例において、ＰＣ３細胞におけるアデノウイルスの感染効率を検討した結果を示した図である。
【図６】本発明の一実施例において、ＢｘＰＣ−３細胞におけるアデノウイルスの感染効率を検討した結果を示した図である。
【図７】本発明の一実施例において、アデノウイルスにおけるファイバーノブ領域のＨＩループ部を示した図である。
【図８】本発明の一実施例において、腫瘍溶解ウイルスの概要を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、前記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施例において特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、それを修飾・改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置はそれらに添付のプロトコールを用いる。
【００１２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図及び範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変及び修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
＝＝ＣＥＡとの結合性が高いペプチドのスクリーニング＝＝
本発明者は、アデノウイルスベクター（ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＭ７３２６０）において、ファイバーノブ領域のＨＩループ部に多種多様なリガンドを提示するペプチド・ディスプレイ・アデノウイルスライブラリーを構築して、細胞ごとに標的ベクターを探索・同定する方法を開発している（Oncolytic virus therapy for pancreatic cancer using the adenovirus library displaying random peptides on the fiber knob.
Nishimoto T, Yoshida K, Miura Y, Kobayashi A, Hara H, Ohnami S, Kurisu K, Yoshida T, Aoki K. Gene Ther. 2009 May;16(5):669-80.）。
そこで、本発明者は、前記方法を用いて、ＣＥＡとの結合性が高い７アミノ酸残基のペプチド配列を特定した。表１に、前記方法によって特定したペプチド配列の例を示す。なお、表１に示すＣＥＡとの結合性については、以下の実施例に示す非増殖型アデノウイルスベクターをＭＩＡＰａＣａ-２細胞とＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞に、ＭＯＩ＝３０，１００，３００で感染させて、２４時間後にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイを行い、その比の範囲を数値化したものである。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
＝＝腫瘍溶解ウイルスベクター＝＝
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるペプチドを発現するウイルスベクターは、ＣＥＡを発現する細胞に対して特異的に感染する。
一方、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるペプチドを発現するウイルスベクターは、ＣＥＡを発現しない細胞に対して、感染しないか、あまり感染しない。
【００１６】
ここで、腫瘍溶解ウイルスは、がんだけで増殖するウイルスであり、がん細胞に感染して増殖し、前記癌細胞を死滅させることが知られている（Clinical trial results with oncolytic virotherapy: a century of promise, a decade of progress. Liu TC1, Galanis E, Kirn D. Nat Clin Pract Oncol. 2007 Feb;4(2):101-17.）（図８）。一方、腫瘍溶解ウイルスは、正常細胞に感染してもウイルスが増殖できないような仕組みになっているため、正常細胞を死滅させることはない。
従って、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の少なくとも一つ以上のペプチドを発現するウイルスベクターは、ＣＥＡを発現しているがんに対する腫瘍溶解ウイルスベクターとして有用である。
【００１７】
なお、腫瘍溶解ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター等のベクターが挙げられ、アデノウイルスベクターを用いることが好ましい。
【００１８】
＝＝腫瘍溶解ウイルスベクターの作製＝＝
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５のペプチドの取得方法は、特に制限されない。例えば、本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５のペプチドは、前記ペプチドを発現する細胞から単離・精製してもよいし、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えペプチドであってもよいし、当業者において公知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。
【００１９】
本発明に係る腫瘍溶解ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター（ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＭ７３２６０）において、ファイバーノブ領域のＨＩループ部（図７）の配列番号６（ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＡ）と配列番号７（ＡＣＴＡＧＴＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴ）との間に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸を、当業者に公知の技術を用いて挿入することによって作製することができる。
【００２０】
あるいは、本発明に係る腫瘍溶解ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター（ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＭ７３２６０）において、ファイバーノブ領域のＣ末端に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸を、当業者に公知の技術を用いて挿入することによって作製することもできる。
【００２１】
なお、本発明に係る腫瘍溶解ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター（ＮＣＢＩのａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＭ７３２６０）において、ファイバーノブ領域のＨＩループ部の配列番号６と配列番号７との間に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸が挿入されていることが好ましい。
【００２２】
また、本発明に係る腫瘍溶解ウイルスベクターがアデノウイルス以外のベクター（例えば、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター等）である場合、本発明に係る腫瘍溶解ウイルスベクターは、ファイバーノブ領域のＨＩループ部又はファイバーノブ領域のＣ末端に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸を、当業者に公知の技術を用いて挿入することによって作製することができる。
【００２３】
＝＝腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤＝＝
前記の通り、本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の少なくとも一つ以上のペプチドを発現するウイルスベクターは、ＣＥＡを発現しているがんに対する腫瘍溶解ウイルスベクターとして有用である。従って、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５の少なくとも一つ以上のペプチドを発現する腫瘍溶解ウイルスベクターは、ＣＥＡを発現しているがんの治療剤等として使用することができる。
【００２４】
ここで、ＣＥＡは、細胞接着因子に関係する糖タンパク質の一つで、正常細胞には発現していないが、胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん若しくは子宮がん等のがんにおいて発現していることが知られている（The carcinoembryonic antigen (CEA) family: structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues.Hammarstrom S. Semin Cancer Biol. 1999 Apr;9(2):67-81.）。
従って、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の少なくとも一つ以上のペプチドを発現する腫瘍溶解ウイルスベクターは、胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん若しくは子宮がん等のがんの治療剤等として有用である。
【００２５】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の少なくとも一つ以上のペプチドを発現する腫瘍溶解ウイルスベクターを含有するがん治療剤を用いれば、ＣＥＡを発現しているがん、又は胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん若しくは子宮がん等のがんを治療することができる。
特に、本発明に係るがん治療剤は、がんに発現しているＣＥＡを標的とするため、遺伝子治療や腫瘍溶解ウイルス療法を行う際に、有効でかつ安全な治療を行うことができる。アデノウイルスの腫瘍溶解効果は、主に腫瘍への感染力に依存し、本来ウイルスがもつ自然感染域を制限することができるからである。
【００２６】
＝＝腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤の利用＝＝
本発明の腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤は、ヒト又はヒト以外の動物における医薬や、実験用の試薬等、どのようなものに用いてもよい。
【００２７】
本発明の腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、液剤、散布剤、スプレー剤、塗布剤、貼付剤、噴霧剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらの薬剤は、固形、液状、ゲル状、粉末状、ゼリー状、油状、ペースト状、泡状、クリーム状等の形状にしてもよい。
【００２８】
例えば、本発明の腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤を医薬として用いる場合、その製剤化は、従来使用されている添加物を用いて、既存の方法で行うことができる。なお、前記添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、溶剤、安定剤、基剤、湿潤剤、保存剤等の既存の添加物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤を医薬として用いる場合は、それらの投与方法としては、ヒト又はヒト以外の動物に、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の腫瘍溶解ウイルスベクターを含有するがん治療剤は、単独で投与してもよいし、他のがん治療剤と併用して投与してもよい。
【００３０】
本発明の腫瘍溶解ウイルスベクター含有するがん治療剤を実験用の試薬として用いる場合は、それらの投与方法としては、ヒト以外の動物に、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腹腔内投与等が挙げられるが特に限定されるものではない。
また、本発明の腫瘍溶解ウイルスベクターを含有するがん治療剤は、単独で投与してもよいし、他のがん治療剤と併用して投与してもよい。
【００３１】
前記ヒト以外の動物としては、例えば、サル、チンパンジー、イヌ、ウサギ、モルモット、マウス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例及び図を用いてより具体的に説明する。
＜実施例１＞
（１）ｐＢＨＩ-ｌｉｂ、ｃＷＴ及びｃＡｄＬｕｃＥＧＦＰの作製
まず、Ａｇｉｌｅｎｔ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに、ｃＳｕｂ３６０ｌｏｘからＥｃｏＲＩとＣｌａＩの制限酵素を用いて切断した断片約８Ｋｂ(ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ７３２６０において２７３３３１-３５９３に相当する)を挿入したｐＢｌｕｅＥｃｏＲＩ-ＣｌａＩを作製した。このｐＢｌｕｅＥｃｏＲＩ-ＣｌａＩのＥ３領域(ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ７３２６０において２７５９７-３０４７１に相当する)を欠失させ、そこにｌｏｘＰ配列(ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号８）)と、さらにその３’側にサイトメガロウイルスプロモーター領域とＥｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＥＧＦＰ-Ｎ１)を挿入した。
【００３３】
次に、ファイバーノブ領域のＨＩループ部(ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ７３２６０において３２６７９に相当する)に、Ｃｓｐ４５Ｉ配列とＳｐｅＩ配列を挿入したｐＢＨＩｄｅｌｔａＣＡＲを作製した。このｐＢＨＩｄｅｌｔａＣＡＲは、ＣＡＲとの結合を抑制するようにＣＡＲ結合領域（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ７３２６０の３１０４２-３２７８７に相当する）に４か所の点突然変異を挿入してある。プラスミドライブラリーを構築するために、このｐＢＨＩｄｅｌｔａＣＡＲをＣｓｐ４５ＩとＳｐｅＩで切断し、そこに２１ｂｐのランダムなＤＮＡ配列を挿入したｐＢＨＩ-ｌｉｂを作製した。
【００３４】
次に、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ７３２６０において１-２８５９１に相当するアデノウイルスゲノム断片を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｐｅｒｃｏｓ１に挿入し、その３’側にｌｏｘＰ配列を挿入したｃＷＴを作製した。また、非自己増殖型アデノウイルスを作製するために、ｃＷＴのＥ１領域(ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ７３２６０において３４１-３５０９に相当する)を欠損させ、そこにサイトメガロウイルスプロモーター領域とＦｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ(Ｐｒｏｍｅｇａ社ｐＧＬ３ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ)とＥｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＥＧＦＰ-Ｎ１)の融合遺伝子(ＬｕｃＥＧＦＰ)を挿入したｃＡｄＬｕｃＥＧＦＰを作製した。 
【００３５】
（２）ペプチド・ディスプレイ・アデノウイルスライブラリーの作製
次に、ペプチド・ディスプレイ・アデノウイルスライブラリーの作製を行った。
ｐＢＨＩ-ｌｉｂとｃＷＴを同じモル比で混合し、Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅを添加してｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣｒｅ-ｌｏｘ反応により、全長のアデノウイルスゲノムライブラリーを作製した。
このＤＮＡを、ヘルパー細胞であるＨＥＫ２９３細胞から単離したアデノウイルスの産生効率の高いクローン３８（２９３-３８）細胞に遺伝子導入することにより、７-１４日後にペプチド・ディスプレイ・アデノウイルスライブラリーを産生させた。
【００３６】
その結果、６ｃｍ-ｄｉｓｈ １枚当たり１×１０４レベル以上の多様性を持ったアデノウイルスライブラリーが産生されることを確認した。また、計２０枚の６ｃｍ-ｄｉｓｈを用いてライブラリーを産生し、２×１０５以上の多様性を持ったペプチド・ディスプレイ・アデノウイルスライブラリーを構築した。なお、このアデノウイルスライブラリーは、野生型のＥ１領域を有するために自己増殖型である。
【００３７】
＜実施例２＞
次に、ＣＥＡ発現ＭＩＡＰａＣａ-２細胞を作製した。
まず、ヒト膵がん細胞ＭＩＡＰａＣａ-２をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入し、ＣＥＡの発現が無いことを、ＲＴ-ＰＣＲ法および細胞培養液中のＣＥＡの濃度測定(０．５ｎｇ/ｍｌ以下)により確認した。
【００３８】
このＭＩＡＰａＣａ-２細胞に、レトロウイルスベクターを用いて、ヒトＣＥＡ ｃＤＮＡを遺伝子導入し、Ｇ４１８セレクションによって、ＣＥＡを発現するＭＩＡＰａＣａ-２細胞を作製し、ＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡと名付けた。
ＲＴ-ＰＣＲ法及び細胞培養液中のＣＥＡの濃度を測定することにより、ＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞がＣＥＡ（１１３ｎｇ/ｍｌ)を発現していることを確認できた。
【００３９】
＜実施例３＞
次に、ＣＥＡ標的アデノウイルスベクターの探索を行った。
まず、６ｃｍ-ｄｉｓｈにまいたＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞に、ペプチド・ディスプレイ・アデノウイルスライブラリーをＭＯＩ＝１で感染させた。アデノウイルスは自己増殖型なので、感染後増殖して次第に感染を拡大させていった。７日後に細胞を回収して凍結融解を３回行い、粗ウイルス液を抽出した。この粗ウイルス液を、再びＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞にＭＯＩ＝１で感染させ、７日後に粗ウイルス液を回収した。この過程をもう一度行い、得られた粗ウイルス液からＤＮＡを抽出した。
【００４０】
このＤＮＡをランダムなＤＮＡ配列が挿入されているＨＩループ部周辺を認識するプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＣｓｐ４５ＩとＳｐｅＩで切断して、ｐＢＨＩｄｅｌｔａＣＡＲのＣｓｐ４５ＩとＳｐｅＩ部位に挿入した。得られたＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５αにトラスフォームさせ、クローンから抽出したＤＮＡからＨＩループ部に挿入されている配列をシークエンスした。
その結果、ペプチド配列で配列番号１（ＶＬＴＧＮＣＧ）、配列番号２（ＡＧＬＷＰＴＲ）、配列番号３（ＧＦＣＬＴＧＦ）、配列番号４（ＲＣＬＷＧＬＬ）及び配列番号５（ＲＳＳＡＣＧＧ）の５つが認められた（表１と同様）。
【００４１】
＜実施例４＞
次に、ＣＥＡ標的アデノウイルスベクターのＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞への感染性の確認を行った。
まず、ｐＢＨＩｄｅｌｔａＣＡＲをＣＳＰ４５ Ｉ及びＳｐｅＩで切断し、実施例３に記載の５つのペプチド配列を挿入した。これらを、ｐＡｄＬｕｃＥＧＦＰとｉｎ ｖｉｔｒｏのＣｒｅ-ｌｏｘ反応を用いて結合させ、全長のアデノウイルスゲノムＤＮＡを作製して２９３-３８細胞に遺伝子導入し、非増殖型アデノウイルスベクターを産生させた。これらのウイルスは適切なプライマーを使用したＰＣＲによって、それぞれ目的のウイルスであり、他のウイルスが混在していないことを確認した。また、精製したウイルスは２６０ｎｍの吸光度を測定し、ウイルス量をＯＰＵ/ｍｌ （ｏｐｔｉｃａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｕｎｉｔ）＝ＯＤ２６０×ウイルス希釈×１．１×１０１２で算出した。
【００４２】
次に、これらのウイルスを、９６-ｗｅｌｌ ｄｉｓｈを用いて、ＭＩＡＰａＣａ-２細胞とＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞にＭＯＩ＝１０-３００で感染させ、２４時間後に、Ｅｎｖｉｓｉｏｎを用いてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを行った。
その結果、特に、ＶＴＬＧＮＣＧ（配列番号１）を挿入したアデノウイルス(Ａｄ-ＶＴＬ)が、ＭＩＡＰａＣａ細胞に比べて、ＭＩＡＰａＣａ-ＣＥＡ細胞では、感染効率が４-７倍に上昇していた（図３及び図４）。また、このＡｄ-ＶＴＬは、ＣＥＡを発現していないＰＣ-３細胞においては、ＶＴＬＧＮＣＧ（配列番号１）を挿入していないコントロールベクターと比べて感染効率は上がらなかった（図５）。一方、ＣＥＡを発現しているＢｘＰＣ−３細胞においては、感染効率が非常に上昇していた（図６）。
【００４３】
以上の結果より、本発明のアデノウイルスベクターは、ＣＥＡを標的とすることが明らかとなった。
これより、本発明のアデノウイルスベクターは、ＣＥＡを発現しているがん、又は、胃がん、膵がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん若しくは子宮がん等の治療に効果的であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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