(57)【要約】      （修正有）【課題】クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）蔓から抽出された機能性成分エストロゲン用作用物質を含有する抽出物を安定的に抽出する方法、並びにその抽出物を含有する生活習慣病改善剤組成物および食品組成物の提供。【解決手段】葛蔓を効率よく処理抽出し、女性ホルモン（エストロゲン）様作用更には抗酸化能を有する機能性成分を多く含有することを特徴とし、それを用いた生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。前記抽出物にはプエラリン、ダイゼイン、ゲニステインの様なイソフラボノイド又は、その配糖体やマロニルダイジン等のマロニルイソフラボン配糖体が含まれている。【効果】前記抽出物は、体重増加抑制、摂食抑制、血圧上昇抑制、高血圧コレステロール血症抑制等の予防・治療効果がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
葛（Pueraria
lobata、英名kudzu）蔓から抽出されたエストロゲン様作用物質を含有することを特徴とする葛蔓抽出物、その製造方法、それを含有する生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【請求項２】
葛種としてプエラリア・ロバータ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）を用いたことを特徴とする請求項１記載の生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【請求項３】
葛蔓は葛蔓乾燥物であることを特徴とする請求項１または２記載の生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【請求項４】
葛蔓を乾燥して、粉末状とし、超音波撹拌を伴うアルコール抽出後、濃縮、凍結乾燥したことを特徴とする請求項１記載の生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【請求項５】
葛蔓からエストロゲン作用物質を抽出するために低級アルコール例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールの単独又はこれと水との混合物を用いたことを特徴とする請求項１から３記載の生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【請求項６】
葛蔓抽出物から抽出されたエストロゲン作用物質には、プエラリン、ダイゼイン、ゲニステインのようなイソフラボノイド又はその配糖体や、マロニルダイジンなどのマロニルイソフラボン配糖体が含まれていることを特徴とする請求項１から３記載の生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【請求項７】
葛蔓からエストロゲン作用物質を抽出するための溶剤は３０％〜７０％エタノールで、水とエタノールとの混合物であることを特徴とする請求項４記載の生活習慣病改善剤組成物又は食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は女性ホルモン（エストロゲン）様作用さらには抗酸化能を有する葛蔓処理物、及びこの処理物の製造方法さらには、この処理物を含有する各種薬剤又は食品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲンは女性ホルモンの一種であり、発情作用を示すホルモン及び類似の作用を持つ物質の総称である。天然に存在するステロイド系のエストロゲンとしては、エストラジオールが主要なものであるが、その他のステロイド系のエストロゲンとしては、例えばエストロン、エストリオール、エリキン、ホモエストロン、エチニルエストラジオール等が知られている。また、非ステロイド系のエストロゲンとしては、例えばジエチルスチルベストロール、ヘキセストロール等が知られている。
【０００３】
一方、植物にもエストロゲン作用物質が含まれていることが知られており、これらは植物エストロゲンと総称されている。このような植物エストロゲンとしては、例えばゲニステイン、ダイゼイン、ミロエストロール等のイソフラボン類が比較的強いエストロゲン様活性を示すことが報告されている（非特許文献１、特許文献1）。特許文献1は菊の花エキス含有植物油、松の葉エキス含有植物油を含有する子宮内膜症治療薬について記述されているが葛蔓抽出物あるいは生活習慣病治療薬とは異なる製造方法であり、本特許範囲に入るものではない。更に最近、これらの植物エストロゲンを含む植物を日常的に摂取することが、骨粗鬆症や婦人科疾患、乳癌、子宮癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の疾患の発現の減少、さらには血中コレステロール量の減少など生活習慣病に寄与する可能性が指摘されている（非特許文献２、３、特許文献2、3）。特許文献2、3については、熟地黄のエストロゲン様作用による生活習慣病治療薬の製造方法であるが、本特許範囲とは異なる製造方法である。
【０００４】
現在使用されているエストロゲン作用剤は、副作用を有することが知られており、長期間使用すると乳ガンや子宮ガンなどを発現する危険性がある（非特許文献４）。
【０００５】
また、好気的呼吸を行う生物は、呼吸により大気もしくは水中の酸素を生体内に取り込み、糖類や脂質、タンパク質等の栄養素を酸素を用いて代謝させることで、必要とするエネルギーを生産及び利用している。この呼吸に利用される酸素は比較的安定な物質であるが、生体内外における様々な反応を介して、反応性の高いスーパーオキシド、ヒドロキシラジカル又は過酸化水素等の活性酸素へ日常的に変化する。これら活性酸素は強力な殺菌作用を有し、生体の自己防衛に関与する重要な物質でもある。しかし、活性酸素は生体保護を司る物質である反面、その反応性の高さから、生体内の脂質、タンパク質、ＤＮＡ等に傷害を与え、動脈硬化による血管障害や血栓等による血流障害、悪性腫瘍等の誘発の要因となっている。また老化・ガン化・女性特有の病気に関しても、活性酸素との関連性が研究されてきている。
【０００６】
このように生体に対し傷害を与える原因となる活性酸素だが、ヒトにおいては一応活性酸素による生体内組織や器官の損傷を防ぐ機構を保有している。例えばSOD(Super Oxide Dismutase)やカタラーゼ等の酵素による活性酸素自体の消去作用がその機構に該当する。しかし、これらの酵素は加齢と共にその発現量も急激に低下する為、活性酸素による損傷の増加及びそれに伴う疾病や障害の発生が顕著化してくる。また現代の生活環境における増大した紫外線曝露量や排気ガスやタバコ等による大気中での化学物質の蔓延化等の状況から、若年層においても過剰な活性酸素の発生の為に、通常の生体内での自己防衛機構では充足できず、前記障害や疾病の発生率が上昇している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１５１５
【特許文献２】特開２００４−１５５７７９
【特許文献３】特開２００４−１５５７８０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅ．Ｃｈｅｎｇら「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１２０、ｐ．５７５、１９５４年
【非特許文献２】S t e p h a n i e C . B l u m e t a l. 「J . N u t r.」 1 3 3 : 1 2 4 4 - 1 2 4 9 , 2 0 0 3年
【非特許文献３】S u z a n n e C . H o e t a l.「O s t e o p o r o s I n t」  1 4 : 8 3 5 - 8 4 2, 2 0 0 3 年
【非特許文献４】鈴木秋悦ら編「エストロゲン−新しい視点から見た作用−」メジカルビュー社、ｐ．６８、１９９９年、
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の課題は、生体内組織の障害や疾病を防止する上で、活性酸素を消去する抗酸化成分の摂取や適用が非常に重要であり、食品業界においては、従来より例えばカロチン類、グルタチオン、フェルラ酸、エラグ酸、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェエロール及びその誘導体、ユビキノン類等の抗酸化剤が利用されてきている。そして更に高い効果や高い安全性等の有益性の高い新規抗酸化剤の開発が望まれている。さらに、女性特有の更年期障害等に対しては、エストロゲン作用あるいはエストロゲン拮抗作用の認められる副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
【００１０】
本発明は、葛蔓に含まれる成分を効率よく利用し得、かつ機能性が付与された組成物を提供することにある。
【００１１】
さらに、解決しようとする課題点としては、エストロゲン作用、エストロゲン拮抗作用、抗酸化作用を有する化合物の開発、及びこれを用いた抗酸化剤、医薬品並びに食品組成物への応用である。
【００１２】
葛根、葛花は、乾燥物自体または抽出物の乾燥粉末を漢方薬の原料などとして用いられている。しかし、葛蔓処理物には、有用と思われる様々な成分が含まれているにもかかわらず、葛蔓処理物を食品および皮膚外用剤として利用することについては、ほとんど検討されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このため、葛蔓よりエストロゲン様作用を有するゲニステイン、ダイゼインなどのイソフラボン類を高濃度に抽出する製造方法を確立し、さらにその抽出物が体重増加抑制、摂食抑制、血圧上昇抑制、高コレステロール血症抑制などに効果を有することを見出し、本発明を完成するに到った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の体重増加抑制、摂食抑制、血圧上昇抑制、高コレステロール血症抑制などの予防、治療剤（以下単に本発明治療剤という）は、葛蔓を乾燥したものを原料として用いて得られるが、このクズは、マメ科の大形蔓性の多年草であって、東アジアや東南アジアを中心にして広く分布している。
【００１５】
本発明の原料としては、クズの中のどのような種のものを用いてもよく、制限はないが、特にプエラリア・ロバータ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）が好適である。
【００１６】
本発明の治療剤は、原料の葛蔓乾燥物から、以下に示す（イ）（ロ）の工程を経て調製することができる。
（イ-1）葛蔓乾燥物を水と低級アルコールのいずれか一方又は両方からなる溶剤で抽出する工程、及び
（イ-2）この抽出工程において、超音波攪拌を伴う工程、
（ロ）この回収した画分を濃縮乾燥する工程。
【００１７】
上記の(イ)工程の際に用いる溶剤としては水のみでもよいが、薬理作用の大きい抽出エキスを得るには低級アルコール例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールの単独又はこれと水との混合物を用いるのがよい。
【００１８】
例えば、多年生葛蔓乾燥粉砕物(約１ｇ)を水、30％エタノール、50％エタノール、95％エタノール、99.5％エタノール、各25ｍL、液比25倍にて24時間抽出をし、上清の濾過回収、減圧濃縮を行った後、凍結真空乾燥、粉末化した葛蔓抽出物のイソフラボン含有量は図1となった。
【００１９】
（イ）工程では、茶褐色の抽出液が得られるが、これは所望に応じ、ろ紙でろ過して固形物を除去したのち、次工程に付する。
【００２０】
上記(イ-2)工程において、超音波攪拌を伴い、抽出を行ってもよい。
例えば、1年物葛蔓粉砕物より、液比25倍量、99.5％エタノールにて、横ふり振とうにより24時間抽出をした場合、葛蔓抽出物100ｇあたりのイソフラボノイド量は13.598gとなり、一方、15分間の超音波攪拌を伴う、24時間攪拌により抽出した場合、イソフラボノイド量は26.635ｇとなる。すなわち、超音波攪拌を用いた抽出法がより好ましいが、本製造方法において、超音波攪拌を伴うことは必須ではない。
【００２１】
葛蔓抽出物は、葛蔓、葛蔓破砕物、葛蔓乾燥物、または葛蔓粉末から抽出処理を行って得られる抽出物が含まれる。葛蔓抽出物の形状は問わず、液状、ペースト状、および粉状(葛蔓エキス末という場合もある)のいずれであってもよい。好ましくは葛蔓搾汁、葛蔓抽出物、またはこれらの乾燥粉末（搾汁粉末、抽出エキス末など）である。
この抽出エキスは、所望ならばその溶液状のものをそのまま用いることができるが、抽出エキスを濃縮、乾燥して茶色粉末状にしたものが、製剤しやすい点で好ましい。
【００２２】
このようにして得られる葛蔓抽出物には、プエラリン、ダイゼイン、ゲニステインのようなイソフラボノイド又はその配糖体や、マロニルダイジンなどのマロニルイソフラボン配糖体が含まれている。
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
乾燥し、粉砕した葛蔓100ｇに25倍量の50％エタノールを加え、超音波攪拌機で15分間抽出したのち、かき混ぜながらさらに一昼夜抽出し、ろ紙にてろ過した。そのろ液を減圧下で濃縮し、凍結乾燥器にて、乾燥することにより、茶色粉末状葛蔓抽出物を約9.85ｇ得た。
【００２５】
このエタノール抽出物をイソフラボン分析条件にてLCMS（（株）島津製作所  LCMS-2010EV、カラムSymmetryC18 3.5μm (2.1×150mm)、グラジエント溶出0.1％ギ酸入り超純水・０．１％ギ酸入りアセトニトリル、流速0.25mL/min、波長260nm）にて解析した結果、各種イソフラボノイドが確認された  (表1)。
【表１】
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イソフラボノイド含有量
【００２６】
さらに、この抽出物の栄養成分を分析した結果を下記表2に示す。
【表２】
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クズ蔓抽出物栄養成分
※１：エネルギー換算計数：たんぱく質  4  脂質  9  炭水化物  4
※２：窒素・たんぱく質換算係数：6.25
※３：計算式：１００−（水分＋たんぱく質＋脂質＋灰分）
【実施例２】
【００２７】
実施例1で得られた葛蔓抽出物について、生体内の代表的な活性酸素種のひとつであるペルオキシラジカルに対する抗酸化力を測定する試験であるORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity)値を測定した。各抽出物0.1ｇをAWA（アセトン：蒸留水：酢酸＝70：29.5：0.5）にて抽出後、アッセイバッファーで200、400、800倍希釈した試料25μlに37度恒温槽で蛍光物質1５０μL添加し、そこへラジカル供給剤を２５μL添加し、３７度恒温状態で蛍光強度を分析した。結果を下記表3に示す。水溶性ビタミンE誘導体であるTroloxを標準物質として用い、ORAC値はグラム当たりのマイクロモルTrolox等量（Trolox Equivalent）で表示している。
【表３】
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ORAC値；抗酸化能分析
【００２８】
この結果、本発明の葛蔓抽出物は抗酸化力を有することを示した。
【実施例３】
【００２９】
次に、実施例1で得られた葛蔓抽出物のエストロゲンレセプター（ER）βとの親和性を検討した。以下に詳述する。
ERβはアゴニストと結合することで立体構造が変化し、コアクチベーター（SRC1）と結合して複合体を形成する。そこで、実際にはEnBio RCAS for ERβ（藤倉化成株式会社、茨城）キットを用い測定した。サンプルとして17βエストラジオール、葛蔓５０％エタノール抽出物、ゲニステインを用い、濃度依存的に複合体の形成を検出した。結果は、ネガティブコントロールの活性を０％、ポジティブコントロール（250ｎM  17βエストラジオール）の活性を100％とした相対活性値、B/Bmax(%)で算出した。
【００３０】
以上より、本発明の葛蔓抽出物は植物性エストロゲンであるゲニステインより弱い活性で、エストロゲン様作用を有することを示した。
【実施例４】
【００３１】
過食による肥満を呈し、重篤な高血圧、脂質代謝異常を発症するメタボリックシンドロームモデル動物である6週齢雌性SHRSP.Z-Leprfa/IzmDmcrに実施例1で回収した葛蔓抽出物(0.27g／kg・BW／日)混合AIN93M餌を6週間負荷した。その間、摂食量、体重の変化について観察を行った。得られた結果を図２、３に示す。
【００３２】
この図より、実施例1で回収した抽出物により過食による体重増加の抑制効果が認められた。
【実施例５】
【００３３】
実施例1で回収した抽出物を用いて、肥満に対する治療効果を以下の通り試験した。
実施例4と同様に6週齢雌性メタボリックシンドロームモデル動物にコントロール食もしくは葛蔓抽出物混合餌を6週間負荷した。その後、と殺し、摘出した腸間膜脂肪は10%ホルマリン10mLで固定した後、切り出し、ヘマトキシリン・エオジン染色 (H・E染色)を行い、顕微鏡下で脂肪細胞サイズを計測し、対照群と比較した（図5）。
【００３４】
抽出物を与えたラットの脂肪細胞のサイズが小さくなっていることが認められた。
【実施例６】
【００３５】
実施例1で回収した抽出物を用いて、脂肪組織に対する治療効果を以下の通り試験した。
脂肪細胞に分化するマウス繊維芽細胞3T3-L1にプエラリン(30μg/ml)、ゲニステイン(30μg/ml)、葛蔓水抽出物(437μg/ml)、葛蔓50%エタノール抽出物(162μg/ml)、葛蔓99.5%エタノール抽出物(152μg/ml)、ピオグリタゾン(5μM)負荷およびコントロールの7群に分け、脂肪細胞への分化誘導を開始した。なお、葛蔓抽出物濃度は総イソフラボン量が30μｇ/ｍLとなるよう調整した。分化誘導開始7日目に細胞を回収し、氷上で細胞を超音波破砕し氷上で15分間放置後、1200rpmで10分間、4℃で遠心分離を行い、上清を回収した。以上をサンプルとしてトリグリセライド(TG)含量を測定した（図７）。
【００３６】
この結果より、ポジティブコントロールである脂肪細胞分化促進作用を有するチアゾリジン誘導体、ピオグリタゾンと同様に、実施例1で回収した抽出物において前駆脂肪細胞を分化誘導する作用があることが認められた。
【００３７】
実施例5および実施例6より、前駆脂肪細胞の分化が促進され、脂肪細胞の肥大化を抑制し、脂肪細胞が小型化することが確認された。
【実施例７】
【００３８】
実施例1で回収した抽出物を用いて、高コレステロール血症に対する治療効果を以下の通り試験した。
実施例４と同様に6週齢雌性メタボリックシンドロームモデルラットにコントロール食もしくは葛蔓抽出物混合餌を6週間負荷した。その後、ペントバルビタールナトリウムにて麻酔し、採血を行った。採血した血液は遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．×１０分）後血清を分離し、コレステロールE-テストワコーにて血清中の総コレステロールを定量し対照群と比較した。
【００３９】
血清総コレステロール量は対照群115.05±7.34mg／dl、実施例1で回収した抽出物負荷群86.57±6.48mg／dlとなり、有意に抽出物負荷群が低値を示した（ｐ＜0.05）。
【００４０】
このことより、実施例1で回収した抽出物により血清コレステロール上昇の抑制効果が認められた。
【実施例８】
【００４１】
実施例1で回収した抽出物を用いて、脂肪肝に対する治療効果を以下の通り試験した。
実施例４と同様に6週齢雌性メタボリックシンドロームモデルラットにコントロール食もしくは葛蔓抽出物混合餌を6週間負荷した。その後、と殺し、摘出した肝臓は湿重量を測定し、２％ホルマリン１０ｍｌで固定した後、切り出し、ヘマトキシリン・エオジン染色 (H・E染色)を行い、顕微鏡下で肝細胞の形態を観察し、対照群と比較した（図８）。
【００４２】
対象群の肝臓で認められた肝細胞肥大、大脂肪滴が実施例１で回収した抽出物により、改善されることが認められた。
【実施例９】
【００４３】
実施例1で回収した抽出物を用いて、高血圧に対する治療効果を以下の通り試験した。
実施例４と同様に6週齢雌性メタボリックシンドロームモデルラットにコントロール食もしくは葛蔓抽出物混合餌を6週間負荷した。その間、血圧の変化について観察を行った（図９）。
【００４４】
この図より、実施例1で回収した抽出物により、実施例4、5、7、8の効果とともに血圧の上昇が抑制されたことが認められた。
【実施例１０】
【００４５】
実施例1で回収した抽出物を用いて、腎疾患に対する治療効果を以下の通り試験した。
実施例４と同様に6週齢雌性メタボリックシンドロームモデルラットにコントロール食もしくは葛蔓抽出物混合餌を6週間負荷した。
実験終了時、24時間採尿を行い、尿中アルブミン排泄量を測定した。
尿中アルブミンは腎症の早期発見マーカーとして頻用される。健常人においても、アルブミンは尿中に排泄されているが、糸球体のろ過サイズバリアが損傷されると尿中にアルブミンがさらに漏れ出す。アルブミンの測定には免疫比濁法を用いた。免疫比濁法とは、抗原に抗体を反応させ、免疫複合体の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰（吸光度）を自動分析器で計測して検体に含まれる抗原量を測定する方法である。
結果を下記表4に示す。
【表４】
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24時間尿中アルブミン排泄量
【００４６】
また、解剖時腎臓湿重量において、葛蔓負荷群が有意に低値を示した（コントロール群0.76±0.01ｇ、葛蔓群0.66±0.01ｇ、ｐ＜0.05）。
【００４７】
この結果より、葛蔓により尿中へのアルブミン漏出が抑制され、腎湿重量が低値を示し、腎疾患の予防効果が確認された。
【実施例１１】
【００４８】
重篤な高血圧を呈し、全例が脳卒中を発症し死に至る脳卒中易発症高血圧自然発症ラットである5週齢雌性SHRSPに卵巣摘出術（OVX）または偽手術(Sham)を施し、6週齢より実施例1で回収した葛蔓抽出物(0.27g／kg・BW／日)混合AIN93M餌を8週間負荷した。負荷前後の血圧を測定し、高血圧に対する治療効果を実験した（図１１）。
【００４９】
この図より、実施例1で回収した抽出物により、葛蔓負荷後血圧の上昇が抑制されたことが認められ、特に卵巣摘出術群で顕著であったことが観察された。以上より、体重増加抑制を伴わない、血圧上昇抑制効果が確認された。
【実施例１２】
【００５０】
以下の成分を含む錠剤の形の製薬組成物を調整した。
実施例1の抽出物                            0.1ｇ
ラクトース                                       0.06ｇ
ステアリン酸マグネシウム              0.02ｇ
スターチ                                          0.15ｇ
リン酸カルシウム                            0.20ｇ
【実施例１３】
【００５１】
以下の成分を含むクッキーを製造した（重量%）。全体を攪拌して混合し、180℃〜220℃にて20分から30分オーブンで焼き上げた。
実施例1の抽出物                            1.8％
小麦粉                                              70％
無塩バター                                       8％
ショ糖                                              12％
卵・水                                              8.2％
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の抽出物は抗酸化作用を有するため、種々の組成物としての実現化が可能であり、産業上の利用可能性を有する。また、本発明の抽出物はエストロゲン様作用により生活習慣病改善等の効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】粉末化した葛蔓抽出物のイソフラボン含有量エタノール濃度および抽出温度による葛蔓抽出物のイソフラボン含有量の変化を示す図である。
【図２】エストロゲンレセプターβ結合能の評価１７βエストラジオールのエストロゲンレセプターβとの結合能を100％として、実施例1で得られた抽出物のエストロゲンレセプターβとの結合性を示す図である。
【図３】摂食量（g）の変化実施例1で得られた抽出物負荷によるメタボリックシンドロームモデル動物の摂食量の変化を示す図である。
【図４】体重（g）の変化実施例1で得られた抽出物負荷によるメタボリックシンドロームモデル動物の体重の変化を示す図である。
【図５】脂肪組織写真（１）実施例1で得られた抽出物負荷によるメタボリックシンドロームモデル動物の脂肪組織図である。
【図６】脂肪組織写真（２）
【図７】3T3培養細胞におけるタンパク1mgあたりTG含量実施例1で得られた抽出物負荷による3T3細胞におけるトリグリセリド含量を示す図である。
【図８】肝臓組織写真実施例1で得られた抽出物負荷によるメタボリックシンドロームモデル動物の肝臓組織図である。
【図９】血圧（ｍｍHg）の変化（１）実施例1で得られた抽出物負荷によるメタボリックシンドロームモデル動物の血圧の変化を示す図である。
【図１０】血圧（ｍｍHg）の変化（２）
【図１１】血圧上昇抑制（１）実施例1で得られた抽出物負荷による脳卒中易発症高血圧自然発症ラットの血圧を示す図である。
【図１２】血圧上昇抑制（２）
【図１３】血圧上昇抑制（３）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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