(57)【要約】【課題】  生体内においてコラーゲンの産生を有効に促進し、家畜の肉量を増加したり鶏卵の品質を向上し得るコラーゲン産生促進剤を提供すること。【解決手段】  樹皮を乾留して得られる木酢液および樹皮を炭化して得られる樹皮炭粉末を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹皮を乾留して得られる木酢液および樹皮を炭化して得られる樹皮炭粉末を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
樹皮が、カシ、シイ、タブ、キハダおよびカシワよりなる群から選ばれる１種または２種以上の広葉樹である請求項１記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
乾留の温度が３８０〜４２０℃である請求項１または２記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
炭化の温度が３８０〜４２０℃である請求項１〜３のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
樹皮炭粉末が、粒径１ｍｍ以下の粒子を９６質量％以上含有するものである請求項１〜４のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項６】
木酢液と樹皮炭粉末の質量比が１７：３〜１５：５である請求項１〜５のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項７】
家禽類の卵の貯蔵安定性を向上するものである請求項１〜６のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項８】
家畜の肉量を増加するものである請求項１〜６のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤を家禽類に投与することを特徴とする家禽類の卵の貯蔵安定性向上方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤を家畜に投与することを特徴とする肉量増加方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤を家畜に投与することを特徴とする肉質改善方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかの項記載のコラーゲン産生促進剤を家畜に投与することを特徴とする卵質改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進剤に関し、さらに詳細には、摂取することにより、卵殻膜や筋肉の結合組織などの生体内に存在するコラーゲン含量を増加することが可能なコラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、動物の結合組織を構成している主要なタンパク質で、例えば、筋繊維骨、軟骨、腱、皮膚などに存在する。コラーゲンは、多数の分子種からなるスーパーファミリーを構成しており、繊維束形成型グループ（I型、II型、III型、V型、XI型）、シート形成型グループ（IV型、VII型、IX型）などに分類されている。従来コラーゲンは、組織を支持する構造タンパク質であると考えられていたが、現在では、細胞の正常な機能を発揮するのに重要な働きをし、例えば、細胞の代謝、形態、増殖、分化などのさまざまな活動に影響を与えることが明らかにされている。  
【０００３】
コラーゲンは、皮膚では、基底膜、真皮に存在し、皮膚に保湿機能や柔軟性、弾力性を与え、張りやつやのあるみずみずしい肌の状態が維持されるが、紫外線照射や乾燥等の外的因子の影響、あるいは加齢によってコラーゲンが減少すると、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、肌荒れやしわ等が生じる。このため、コラーゲン産生を促進する成分を配合したしわ改善等を目的とした皮膚外用剤の開発が進められてきた。  
【０００４】
一方、コラーゲンは、動物の筋肉組織や卵にも存在する。畜産業においては、畜肉や鶏卵の品質または生産量を向上させることを目的として、様々な方法が提案されてきた。例えば、特定の乳酸菌を摂取させることにより、鶏の肉質を改善し、肉量を増加させる技術が開示されている（特許文献１）。また、鶏卵内部の濃厚卵白の水様化や卵黄の高さの減少など貯蔵中の卵質の低下を防止することを目的として、特定条件で鶏卵を加熱処理する方法が提案されている（特許文献２）。しかし、これまで畜肉や卵の生産量または品質を向上させるために生体内のコラーゲン産生に着目した技術は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２１９８９９号公報
【特許文献２】特開２００２−２３８４４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体内においてコラーゲンの産生を有効に促進し、家畜の肉量を増加したり、鶏卵の貯蔵安定性を向上し得るコラーゲン産生促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、樹皮を乾留して得られる木酢液および樹皮を炭化して得られる樹皮炭粉末とを摂取することにより、生体内のコラーゲン産生が促進され、例えば、鶏卵の卵殻膜中及び卵黄中のコラーゲン含量が増加するため卵質が向上するとともに、貯蔵中の卵質低下を防止し得ること、また筋繊維が増大して肉量が増加することを見出し本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、樹皮を乾留して得られる木酢液および樹皮を炭化して得られる樹皮炭粉末を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤である。
【０００９】
また本発明は、上記コラーゲン産生促進剤を鶏に投与することを特徴とする鶏卵の貯蔵安定性向上方法である。
【００１０】
さらに本発明は、上記コラーゲン産生促進剤を家畜に投与することを特徴とする肉量の増加方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、摂取することにより、生体内の様々な組織においてコラーゲン産生を有効に促進することが可能である。例えば、鶏に摂取させることにより、卵黄中及び卵殻膜中のコラーゲン含量が増加するため、卵質が向上するとともに、貯蔵中の卵質の低下を防止することができる。また筋繊維が増大するため肉量を増加させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１における各試験区の卵殻膜中のコラーゲン含量を示す図である。
【図２】試験例１における対照区（Ａ）とネッカリッチ１質量％添加区（Ｂ）の卵殻膜表面の位相差顕微鏡による微分干渉撮影画像である。
【図３】試験例２における各試験区の卵殻膜中のコラーゲン含量を示す図である。
【図４】試験例２における各試験区の卵殻膜厚を示す図である。
【図５】試験例２における対照区（Ａ）とネッカリッチ１．１質量％添加区（Ｂ）のＨＥ染色した卵殻膜断面の光学顕微鏡写真である。
【図６】試験例２における対照区（Ａ、Ｃ）とネッカリッチ１．１質量％添加区（Ｂ、Ｄ）のＨＥ染色した卵殻膜断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７】試験例３における各試験区の卵殻膜中のコラーゲン含量を示す図である。
【図８】試験例４における６日間暗室２５℃で保管後の卵殻膜のコラーゲン含量に対するＨＵ値をプロットした図である。
【図９】試験例４における２１日間暗室１２℃で保管後の卵殻膜のコラーゲン含量に対するＨＵ値をプロットした図である。
【図１０】試験例５における各試験区の２１日齢および４９日齢の半膜様筋中の総タンパク量およびコラーゲン含量を示す図である。
【図１１】試験例５における対照区とネッカリッチ1.0質量％添加区のＨＥ染色した半膜様筋の顕微鏡写真である。
【図１２】試験例５における対照区とネッカリッチ1.0および1.2質量％添加区のコラーゲンIおよびIIIを染色した半膜様筋の顕微鏡写真である。
【図１３】試験例６における腿肉中の脂肪含量（ａ）及び脂肪酸組成（ｂ）を示すグラフである。
【図１４】試験例６におけるクッキングロス（ａ）及び官能テスト（ｂ）の結果を示すグラフである。
【図１５】試験例８における対照区とネッカリッチ1.0質量％添加区のＨＥ染色した筋束、筋周膜、筋内膜の顕微鏡写真である。
【図１６】試験例９におけるコラーゲン含量の測定結果である。
【図１７】試験例９における対照区とネッカリッチ0.8質量％添加区のＨＥ染色した半膜様の顕微鏡写真である（上段；従来の固定化方法、下段；冷凍屠体）。
【図１８】試験例９における対照区とネッカリッチ0.8質量％添加区のコラーゲンIIIを染色した、大腿筋膜張筋（M.tensor fasciae latae）、半膜様筋（M.semimembranous）、外側広筋（M.vastus intermedius）、長内転筋（M.adductor longus）、浅胸筋（M.pectoralis superficialis）の顕微鏡写真である。
【図１９】試験例１０におけるネッカリッチ1質量％添加区の卵黄中のコラーゲンの顕微鏡写真である。Ａは卵黄の抽出コラーゲンであり、Ｂはポジティブコントロールの手羽先の抽出コラーゲンである。
【図２０】試験例１０におけるコラーゲン分子の顕微鏡写真である。Ａは卵黄からの抽出コラーゲン、Ｂは手羽先からの抽出コラーゲンである。
【図２１】試験例１０における脱脂・乾燥後の卵黄乾燥物の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、樹皮を乾留して得られる木酢液および樹皮を炭化して得られる樹皮炭粉末を有効成分する。
【００１４】
上記木酢液の原料となる樹皮としては、樹木であれば特に限定されるものではないが、広葉樹が好ましく、例えば、カシ、タブ、サクラ、カエデ、シイ、クス、イス、ナラ、キハダ、ヤマモモ、カシワ、ケヤキ、クワ、キリ、ミズキ、ソヤが挙げられ、これらの１種または２種以上を用いることができ、これらの中でもカシ、シイ、タブ、キハダおよびカシワよりなる群から選ばれる１種または２種以上を用いることが好ましい。これらの樹皮を乾留するにあたって、乾留温度は、比較的低温が好ましく、具体的には３５０〜４５０℃が好ましく、３８０〜４２０℃がより好ましい。このような温度で２０〜３０日程度乾留すればよい。加熱手段は特に限定されず、直火、ヒーター等を利用できる。乾留によって発生した気体状の蒸留物を公知の手段によって捕集する。捕集された蒸留物を冷却して液体とし、静置しておくと上層、中間層、下層の３層に分離する。本発明の木酢液としては、このうちの中間層を公知方法により分取して用いる。
【００１５】
一方、上記樹皮炭粉末の原料となる樹皮も木酢液と同様のものを使用することができる。この樹皮を炭化処理するにあたって、炭化温度は３５０〜４５０℃が好ましく、３８０〜４２０℃がより好ましい。このような温度で２０〜３０日間程度炭化処理すればよい。上記木酢液の調製において、乾留を３５０〜４５０℃、好ましくは３８０〜４２０℃で２０〜３０日間程度加熱処理することにより、樹皮の乾留と炭化処理を同時に行うことができ、工程を簡略化することができる。このようにして得られた樹皮炭は、公知の粉砕方法によって粉砕処理し、１ｍｍ以下の粒径のものが、好ましくは９６質量％以上、より好ましくは９９質量％以上含有するように調整する。このような粒径の範囲にあると、飼料等と混合しやすい点で好適である。粒度の調整は、目開き１ｍｍの篩を用いて篩分け等することにより行うことができる。
【００１６】
本発明のコラーゲン産生促進剤において、上記木酢液と樹皮炭粉末の含有質量比は、１８：２〜１４：６が好ましく、１７：３〜１５：５がより好ましい。木酢液と樹皮炭粉末をこのような比率で個別に投与してもよいが、例えば、樹皮炭粉末に所定量の木酢液を噴霧するなどして予め均一に混合して粉末状にしておくことが、取り扱いが容易となるため好ましい。このような木酢液と樹皮炭粉末の粉末状混合物として、ネッカリッチ（宮崎みどり製薬株式会社製）が市販されており、これを利用することができる。
【００１７】
かくして得られた本発明のコラーゲン産生促進剤は、そのまま、あるいは公知の担体と組み合わせて製剤化することができ、例えば、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができる。本発明のコラーゲン産生促進剤の投与対象である家畜としては、鶏、ウズラ、七面鳥、ダチョウなどの家禽類の他、牛、豚、馬（競走馬を含む）などが例示できる。これらの家畜に本発明のコラーゲン産生促進剤を投与する場合には、直接経口投与してもよく、飼料等に混ぜて摂取させてもよい。その他、魚類等にも投与できる。また本発明のコラーゲン産生促進剤は、ヒトが摂取することもでき、それによって皮膚のコラーゲン産生が促進され、保湿効果や肌荒れ、しわ等の改善効果、骨格筋・骨膜の増強による怪我の予防、関節機能の強化による健康増進効果が得られる。経口摂取する場合には、適当な飲食品原料と組み合わせて、食品、飲料、サプリメント等の飲食品の形態とすることができる。
【００１８】
本発明のコラーゲン産生促進剤の用量は特に限定されるものではないが、コラーゲン産生促進効果の観点から、例えば、家畜に投与する場合、上記含有質量比における木酢液および樹皮炭粉末の合計で、１個体１日あたり体重の0.01〜10質量%程度投与すればよい。飼料に混合して投与する場合には、飼料１kgに対し10g(質量1％)程度混合すればよい。また、ヒトが摂取する場合には、成人１日当たりの上記含有質量比における木酢液および樹皮炭粉末の合計の摂取量が、５〜１０ｇとなるようにすればよい。
【００１９】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、摂取することにより、生体内の種々の組織におけるコラーゲンの産生を促進することができる。例えば鶏などの家禽類に摂取させると、卵の卵黄及び卵殻膜中のコラーゲン含量が増加するため、卵質が向上するとともに、貯蔵安定性が向上し、貯蔵中の卵質の低下が抑制される。また、調理した際の肉汁の漏出などによるクッキングロスの低減、風味及び食感の改善、冷凍耐性など肉質を顕著に改善することができる。さらに、骨膜は幹細胞性(STEMNESS)を有すことから、骨形成過程における疾病や感染症を含む環境要因の影響が強く表れ、骨膜に含まれる多量の膜基質(Extra Celler Matrix:以下ECM)のうち、本発明はコラーゲン等の発現を誘導できる。コラーゲン等のECM発現の増大効果は、骨間の靭帯量増大を誘導し、関節の連結強度につながり、骨と筋肉の連結への効果は、筋周膜強化による骨格筋全体の機能向上を行える。遺伝的にコラーゲン産生に問題を有するヒト(骨形成不全、エーラー・ダンロス症候群、アルポート症候群、ノブロフ症候群)や家畜（ダブルマッスル等）では、正常から逸脱した骨形成機構を有している。本発明によるコラーゲン等のECM誘導は、コラーゲン産生遺伝子ならびにその転写障害を有する対象でも骨形成機能の改善に応用できる。家畜や家禽を対象とした遺伝資源の保存は、動物園や水族館で重要な課題である。特に、卵膜および卵殻膜形成におけるコラーゲン産生促進効果は、人工授精等で用いる良質な卵子を確保することができる。さらに、ヒトにおける人工授精においても、良質な卵子の確保へ応用することができる。また鶏の他、種々の家畜に摂取させることにより、筋組織中の筋繊維を増大させることができるため、肉量を増加することが可能であり、畜産業における生産性を向上させることができる。競走馬においては、筋力増加により怪我の防止になるとともに強い馬の育成につながる。またヒトが摂取すると、皮膚のコラーゲン産生が促進され、保湿効果や肌荒れ、しわ等の改善効果が得られる。また筋繊維が増強されるため、高齢者やスポーツ選手の怪我防止にも有効である。
【実施例】
【００２０】
以下、発明を製造例等に基づき説明する。なお本発明は、製造例等により何ら限定されるものではない。
【００２１】
製造例１
南九州産のカシ、シイなどを主とする広葉樹をローリングバーガーにより剥皮して樹皮を得た。樹皮を縦5m×横5m×深さ1.1mの平窯に重ねて入れ、約390℃で炭化処理した。発生した蒸留物をファンで吸引し、平窯の側面に設けられた２個の穴から煙道を通って冷却水層まで移送して、冷却水層内に配管されたステンレス管を通過させて冷却し、貯留タンクに粗木酢液として貯留した。粗木酢液を貯留タンク内に約3ヶ月静置して、上層（油分）、中間層、下層（タール分等）に分離させてから、中間層を分取して精製木酢液を得た。一方、樹皮炭は粉砕機により、目開き１ｍｍの篩で篩分けしたときに篩を通過する粒度１ｍｍ以下の粒子が９６質量％以上となるように粉砕した。この樹皮炭粉末１６ｋｇに対し精製木酢液４ｋｇを噴霧、混合して樹皮炭粉末と木酢液の混合物を調製した。
【００２２】
試験例１
79週齢（554日齢）のソニア鶏種を用いて、基礎飼料（CP15%、ME2,800kcal/kg）にネッカリッチ（宮崎みどり製薬株式会社製）を0（対照区），0.5，1質量％の割合で混合した餌を８４日間与えた後、卵殻膜中のコラーゲン含量を測定した。飼養はウインドレス三段高床式で行った。試験は各区16羽からなる3区に分け、2羽ずつの8反復で行った。採取した卵についてコラーゲン測定キット（Semi-Quantitative Collagen Assay Kit,Chondrex社製）を用いて卵殻膜のコラーゲン含量を測定した。結果を表１および図１に示す。また対照区とネッカリッチ１質量％添加区の卵殻膜表面の位相差顕微鏡を用いた微分干渉撮影画像を図２に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
ネッカリッチ1.0%添加区の卵殻膜コラーゲン含量は対照区と比べて有意に増加した（表１および図１）。また対照区の卵殻膜表面は繊維の間隙が大きく粗いのに対し、ネッカリッチ1.0%添加区は間隙が小さく緻密であった（図２）。
【００２５】
試験例２
18週齢（127週齢）のジュリア鶏種を10羽ずつ3区に分け、基礎飼料（CP15%、ME280kcal/kg；対照区）、基礎飼料に飼料米の含有量が20質量％となるように配合した混合飼料（20%WPR）、混合飼料にネッカリッチの含有量が1.1質量％となるように添加したネッカリッチ添加飼料（20%WPR+1.1%WVC）をそれぞれ与え、ウインドレス三段高床式で112日間飼養した。飼養91日後に採取した卵について試験例１と同様にして卵殻膜のコラーゲン含量を測定した。結果を図３に示す。またマイクロゲージを用いて卵殻膜厚を測定した。その結果を図４に示す。さらに飼養84日後に採取した卵の卵殻膜をヘマトキシリン・エオジン（HE）染色し、光学顕微鏡で観察した。その顕微鏡写真を図５に示す。また飼養112日後に採取した卵の卵殻膜断面を走査型電子顕微鏡を用いて撮影した（図６）。
【００２６】
対照区と比べ、ネッカリッチ添加飼料区は卵殻膜のコラーゲン含量が増加するとともに、その厚みも約10μm大きいものであった（図３および４中、20%WPR+1.1%WVC）。また対照区の卵殻膜表面は繊維の間隙が大きく粗いのに対し、ネッカリッチ添加飼料区は間隙が小さく緻密であった（図５および６）。
【００２７】
試験例３
96.5週齢（676週齢）のボリス・ブラウン鶏種を5羽ずつ4区に分け、基礎飼料（CP15%、ME280kcal/kg）にネッカリッチ0（対照区），0.5，1.0，2.0質量％の割合で混合した餌を84日間与えた後、試験例１と同様にして卵の卵殻膜中のコラーゲン含量を測定した。飼養はウインドレス三段高床式で行った。結果を図７に示す。また位相差顕微鏡を用いて卵殻膜厚を測定し、各試験区につき5個の卵の平均値を求めた。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
対照区と比べ、ネッカリッチ添加区は卵殻膜のコラーゲン含量が増加するとともに、その厚みも約10μm程度厚くなった（表２および図７）。
【００３０】
試験例４
試験例２で試験開始から８９日目に採取した卵を平均気温25℃で6日間暗室保管後、卵質検査としてEGGマルチテスタEMT-5000（ロボットメーション社、東北リズム社製）を用いてHU値を測定した。HU値は、卵を割ったときの卵黄端部分と水溶性卵白端部分との中間地点の濃厚卵白の高さで定義され、ＨＵ値が大きいほど卵の鮮度は高いとされる。次に試験例１と同様にして卵殻膜のコラーゲン含量を測定し、コラーゲン含量に対するHU量をプロットして相関関係を調べた（図８）。同様に試験開始から１２４日目に採取した卵を12℃で21日間保管後、コラーゲン含量とHU値を測定し、相関関係を調べた（図９）。
【００３１】
卵殻膜のコラーゲン含量とHU値間に相関関係が見られ、例えば２５℃暗室保管の場合、コラーゲン含量が1μg/mm2増加することでHU値が5.92高くなり、コラーゲン含量が卵の貯蔵能力に大きな役割を果たしていることが示された。
【００３２】
試験例５
１週齢のブロイラー（チャンキー）を各区10羽からなる4区に分け、基礎飼料（21日までCP22%、ME3,050kcal/kg、22日以降CP18%、ME3,250kcal/kg）にネッカリッチを0（対照区），0.8，1.0，1.2％添加した飼料を42日間給餌した。試験は各区4羽ずつの4反復で行った。21日齢、49日齢の鶏を屠殺後速やかに腿肉を採取しブアン液で固定した。後日半膜様筋を採取してパラフィン包埋した。ミクロトームで切片を作成し、コラーゲン測定キット（Semi-Quantitative Collagen Assay Kit,Chondrex社製）により総タンパク量およびコラーゲン含量を測定した。結果を図１０に示す。またヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行い、顕微鏡観察を行った（図１１）。さらに包埋した切片をキシレンで脱パラフィン処理した後、アルコールに置換しコラーゲンI(ラビット抗体)及びIII(マウス抗体)を用いて免疫染色した（図１２）。また屠殺した検体から腸管を採取し、走査型電子顕微鏡（SEM）用固定液を浸透させた後、パラフィン包埋し、HEで染色して顕微鏡観察を行った。
【００３３】
ネッカリッチ添加区は対照区と比べ、腿肉（半膜様筋）中の総タンパク量及びコラーゲン含量が増加した（図１０）。また対照区は筋繊維の間隙が大きく筋束が小さいのに対し、ネッカリッチ添加区は筋繊維の間隙が小さく筋束が大きくなり、またネッカリッチ添加区は筋繊維がコラーゲンIIIにより染まることから、筋繊維芽細胞からのコラーゲン分泌が促進され、筋繊維が増大することが示唆された（図１１および１２）。
【００３４】
試験例６
ソニア鶏種産卵鶏に、育成期に合わせた養分要求量を満たした基礎飼料にネッカリッチ（WVC）を1.1％添加した飼料を120〜762日間給餌した。この廃鶏雌10羽から腿肉を採取し、脂質含量や脂肪酸組成の測定、腿肉全体のクッキングロスの測定や官能テストに供した。これらのデータを標準的な基礎飼料で飼養したソニア鶏種廃鶏雌と比較した。
各腿肉試料から半膜様筋を取り除き、クロロホルムとメタノールの混液（2:1,v/v）中でホモジナイズし、脂質を抽出した。抽出した脂質試料の一部を用い、有機溶媒を除去した後、抽出した脂質の重量を測定した。残った試料を用いて脂肪酸組成の測定を行った。脂肪酸組成は、メチルエステル化してキャピラリーカラムガスクロマトグラフィーにて測定した。結果を図１３（（ａ）脂質含量、（ｂ）脂肪酸組成）に示す。この結果より、ネッカリッチ添加区で統計上有意に脂質量が増え、脂肪酸組成ではリノール酸、リノレイン酸が有意に増加することが明らかになった。
【００３５】
残った生の腿肉試料は真空パックして８０℃の湯中で１５分間加熱した。肉の重量に対する漏出した肉汁の重量の割合をクッキングロスとして評価した。
次に、腿肉をホットプレートで１分間焼き、官能テストに供した。官能テストは訓練された１２名のパネラーにより行われた。香りの強さの評価や、硬さ、ジューシーさ、油っぽさなどの味の評価や好ましい肉か好ましくない肉かなどの総合評価は、paired-testによりスコア化し、統計処理した（Sugawara T,Yasuo A , 2002 , Book on Experiments in Food Science P1-226）。これらの結果を図１４（（ａ）クッキングロス、（ｂ）官能テスト）に示す。グラフ中、ａ，ｂについて、異なる上付き文字は統計的有意差を意味する（P<0.05）
【００３６】
ネッカリッチ添加区の方が、統計上有意にクッキングロスが少ないことが示された。また官能テストでは、ネッカリッチ添加区の方が、臭いが少なく、柔らかくジューシーで、肉々しくおいしい肉であると評価された。
【００３７】
試験例７
試験例６の廃鶏雌の胸肉を用いて肉のテクスチャーを評価した。物性評価の標準的な方法に従って胸肉を４℃で２日間冷蔵保存した後、浅胸筋の皮を除去し、肉の柔らかさを評価した。筋繊維方向に沿って筋肉内面に平行して4cm辺にカットし、筋繊維に直角に2.5cm辺にカットした。この肉片を、200Nロードセルと0.3mm厚ステンレス鋼プレートを備えたレオメーター（株式会社山電、RE2-33005B）の試料台（直径4cm）に置いた。破断方向は、肉片の表面と垂直方向とした。肉のテクスチャーは、一定速度による圧縮破断テスト（圧縮速度1mm/sにて100%圧縮または崩壊するまで、２５℃）により、破断強度、破断ひずみ、破断エネルギーなどの物性により評価した。結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
ネッカリッチ添加区の方が、３項目とも統計上有意に柔らかい肉であることが示された。産卵を終えた採卵鶏の胸肉は、固くて食用には向かないとされているが、ネッカリッチの給餌により、食用としての利用が可能になる。
【００４０】
試験例８
雄のブロイラーに、基礎飼料（スタータ飼料CP22%、ME12.8MJ/kg、後期飼料CP18%、ME13.6MJ/kg）にネッカリッチを0（対照区）又は1.2％添加した飼料を１週から７週間給餌した。49日齢の鶏を屠殺後、その腿肉の７μｍの厚みで横断面にカットし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、筋束、筋周膜、筋内膜を蛍光顕微鏡で観察した（図１５）。ネッカリッチ添加区では筋束(図中、白三角の部分)や筋周膜(PM)が太くなっていることがわかる。
【００４１】
試験例９
育成期に合わせた養分要求量を満たした基礎飼料にネッカリッチを0（対照区）又は0.8％添加した餌を給餌した５１日齢のオスのブロイラー屠体を−20℃で２〜３ヵ月冷凍保存した。各区４羽の屠体を解凍し、腿肉から、大腿筋膜張筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋、縫工筋、薄筋、大腿直筋、外側広筋、中間広筋、内側広筋、恥骨筋、長内転筋、大内転筋の筋肉部位を取り出した。また胸肉から浅胸筋も採取した。各部位の中央部から2×2×2ｍｍのブロックを調製し、切片を作成した後、コラーゲン測定キット（Semi-Quantitative Collagen Assay Kit,Chondrex社製）により半膜様筋について、非コラーゲンタンパク量（NC）およびコラーゲン含量（TC)を測定した。コラーゲン含量は、筋肉の面積当たりの量とした。３つの連続した切片は、コラーゲン測定キットを用いたコラーゲン含量測定に使用し、４番目の切片は、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、筋肉の面積の測定及び従来の形態学的診断に使用された。この測定において、25ｍｍ２当たりのコラーゲン含量を鶏１羽あたりに換算した。４羽の平均値を各区の各筋肉の面積当たりのコラーゲン含量とした。
大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋の単位面積当たりのコラーゲン含量データを屈筋群（Flexor）のコラーゲン含量として包括した。縫工筋、薄筋、大腿直筋、外側広筋、中間広筋、内側広筋のデータは伸筋群（Extensor）とし、恥骨筋、長内転筋、大内転筋のデータは、内転筋群（Adductor）とした。大腿筋膜張筋の全てのデータの平均および、屈筋群、伸筋群、内転筋群の全てのデータの平均を、１つの腿肉試料の平均とした（Mean of all thigh meats）。大腿筋膜張筋（M.Tensor fasciae latae）、浅胸筋（M.pectoralis superficialis）と併せてコラーゲン含量の測定結果を図１６に示す。図中、斜線棒グラフはネッカリッチ添加区、白色棒グラフは対照区を示す。
【００４２】
この結果から、腿肉膝上の全筋腫でみると、ネッカリッチ添加区では、大腿筋膜張筋、屈筋群、浅胸筋でコラーゲン量が多かった。一方、内転筋群、伸筋群ではコントロールの方が多かった。筋肉には赤色筋と白色筋があり、ネッカリッチを給与すると、白色筋で、中でも負荷の大きな筋肉でコラーゲンが増えることが示唆された。つまりは筋繊維の分化活性箇所でコラーゲンが増えるという筋肉増強効果が得られると考えられる。
【００４３】
またヘマトキシリン・エオジン染色した半膜様筋の顕微鏡写真を図１７（上段；従来の固定化方法、下段；冷凍屠体）に示す。ネッカリッチ添加区では、コラーゲンの接着力により、冷凍時の水分の膨張による筋束や間隙の壊れ具合が少ない。旨味をよく保持していると思われる。
【００４４】
コラーゲンI及びIIIの免疫蛍光分析のために、すべての半膜様筋の組織を0.1Ｍクエン酸緩衝液にｐＨ6.0,95℃で10分間浸漬することにより抗原賦活した。染色方法は公知の染色方法（Jassasa et al.,2012）を用いた。抗体は、コラーゲンI(ラビット抗体（1:1000;ab34710,Abcam,Cambridge,MA,USA）、マウス抗体{FH-7A} （1:1000;ab6310,Abcam)及びコラーゲンIII(鶏抗体（1:1000;CO20331,Biolog Inc.,Haburg,Germany）)を用いた。Alexa赤及び緑複合二次抗体（Molecular Probes,Sunnyvale,CA,USA）は2000倍に希釈して用いた。蛍光培地（Vectashield;Vector Labs.Burlingame,CA,USA）に設置する前に原子対比染色をHoechst33258（Molecular Probes）1μg/mlを用いて行った。各区分は落射蛍光顕微鏡で観察した。
【００４５】
結果を図１８に示す。筋種別にみると、ネッカリッチ添加区では、大腿筋膜張筋で特にCOLIIIがよく染まっていた。他には、屈筋群(半膜様筋)、浅胸筋でCOLIIIがよく染まっていた。一方、内転筋群(中間広筋)、伸筋群(長内転筋)では違いが見られないか、もしくはコントロールの方がよく染まっていた。
【００４６】
試験例１０
99週齢のソニア鶏種を用いて、基礎飼料（JA西日本くみあい飼料株式会社製くみあい配合飼料試験用IP旭マツシュ前期）にネッカリッチ（宮崎みどり製薬株式会社製）を0（対照区）又は1質量％の割合で混合した餌を８４日間与えた後、以下の方法で卵黄中のコラーゲンを抽出し、その量を測定した。その結果、ネッカリッチ１質量％添加区の卵黄中のコラーゲン含量は、対照区と比べ約３０倍であった。卵黄中の抽出コラーゲンの顕微鏡写真を図１９に示す。コラーゲンＩは青色励起光に対し緑色の自家蛍光を持つことから、コラーゲンＩが認められた。また卵黄からのコラーゲン分子の顕微鏡写真を図２０に示す。コラーゲン分子は３０ｎｍの大きさで、共有結合したコラーゲン繊維は６５ｎｍごとに凹凸があることが知られているが、このようなコラーゲン分子に相当する部分が認められた。
【００４７】
（コラーゲン抽出方法）
（１）卵を割り、カラザを切り卵黄と卵白を丁寧に取り除く(カラザも取り除く、卵黄3個で1検体とする)。
（２）卵黄を10倍量(1L)の10倍希釈塩酸に24時間漬け込む。これにより卵黄中カルシウムなどミネラル分を除去する。
（３）10倍量(1L)の10倍希釈水酸化ナトリウムに24時間漬け込む。
（４）10%過酸化水素水に24時間漬け込む。これによりコラーゲンタンパク質を酸化する。
（５）10倍量(1L)の10倍希釈酢酸に48時間漬け込む。
（６）吸引濾過により不純物を除去する。
（７）食塩(250g)を溶かし48時間かけて塩析する。
【００４８】
（コラーゲン定量方法）
淵なしのシャーレにあらかじめ重量を計測したパラフィルムをのせ、塩ビ管の筒をのせる。液を入れ、内容物をこしとると、コラーゲンはパラフィルムに吸着される性質をもつことから濃縮される。吸着したコラーゲンを37℃の恒温室で3日間乾燥させることで結晶化する。パラフィルムに吸着させた状態で重量を測定し、あらかじめ計測していたパラフィルム重量を差し引くことで定量化ができる。
【００４９】
なお、上記コラーゲン抽出方法において、さらに下記（８）〜（１１）の脱脂・乾燥処理を行うことにより高分子コラーゲンの乾燥物を得て、その重量を測定することによってもコラーゲンの定量が可能である。このような脱脂・乾燥処理後の乾燥物の顕微鏡写真を図２１に示す。緑色の自家蛍光が認められる。
（８）浮遊物を集め100000rpm,5min,4℃で遠心する。
（９）上清を取り除き沈殿物を集める。
（１０）100%エタノールにてさらに脱脂する。
（１１）乾燥物(高分子コラーゲン)の重量を測定する。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、家畜に投与することにより、卵の貯蔵能力を向上させたり、肉量を増加する効果を有するものであるため、特に畜産業において生産性向上に有用なものである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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