(57)【要約】【課題】メンブレンやマイクロ流路での従来式の読み取りに対して、蛍光イムノクロマトグラフィーの検出感度を改善し、低濃度の試料液であっても高い感度で検出測定を行うことができる蛍光イムノクロマトグラフィーおよびその検出装置を提供する。【解決手段】蛍光標識試薬を含有する試料液をマイクロ流路に流通させ、前記マイクロ流路中に設けられた反応部において、蛍光標識試薬に励起光を照射して当該蛍光標識試薬から発せられる蛍光を検出して行う蛍光イムノクロマトグラフィーであって、方向（ｘ）と方向（ｙ）と方向（ｚ）とを定義し、前記方向（ｙ）と実質的に同じ方向（ｙａ）から励起光を照射し、前記方向（ｚ）と実質的に同じ方向（ｚａ）から前記蛍光を検出する蛍光イムノクロマトグラフィー。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識試薬を含有する試料液をマイクロ流路に流通させ、前記マイクロ流路中に設けられた反応部において、蛍光標識試薬に励起光を照射して当該蛍光標識試薬から発せられる蛍光を検出して行う蛍光イムノクロマトグラフィーであって、
前記試料液を流通させる方向（ｘ）と、当該流通方向（ｘ）と直交する方向（ｙ）と、前記流通方向（ｘ）および直交方向（ｙ）がなす平面（Ｌ）に対して直交する方向（ｚ）とを定義し、前記方向（ｙ）と実質的に同じ方向（ｙａ）から励起光を照射し、前記方向（ｚ）と実質的に同じ方向（ｚａ）から前記蛍光を検出する蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項２】
前記蛍光標識試薬が蛍光色素を含有する蛍光シリカ粒子を含有する請求項１に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項３】
前記蛍光シリカ粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下である請求項２に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項４】
前記励起光照射方向（ｙａ）が、前記流路における反応部を基点にして、前記方向（ｙ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項５】
前記検出方向（ｚａ）が、前記流路における反応部を基点にして、前記方向（ｚ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項６】
前記励起光の照射を光フィルタを介して行う請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項７】
前記蛍光の検出をマイクロ流路を構成する装置の壁面を介して行う請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項８】
前記方向（ｙ）が、前記反応部の投影面積で最大となる方向と一致する請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項９】
前記マイクロ流路の底面および／または側面に被検物質の捕捉物質および／または前記蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された請求項１〜８のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
【請求項１０】
前記マイクロ流路内の反応部に多孔質体が配置され、多孔質の内部に被検物質の捕捉物質および／または蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
【請求項１１】
蛍光標識試薬を含有する試料液をマイクロ流路に流通させ、前記マイクロ流路中に設けられた反応部において、蛍光標識試薬に励起光を照射して当該蛍光標識試薬から発せられる蛍光を検出して行う蛍光イムノクロマトグラフィー用の検出装置であって、
前記試料液を流通させる流路が延びる方向（ｘ）と、当該流通方向（ｘ）と直交する方向（ｙ）と、前記流通方向（ｘ）および直交方向（ｙ）がなす平面（Ｌ）に対して直交する方向（ｚ）とを定義し、前記方向（ｙ）と実質的に同じ方向（ｙａ）から前記励起光を受けるようにされ、前記方向（ｚ）と実質的に同じ方向（ｚａ）から前記蛍光を検出する検出部を具備する検出装置。
【請求項１２】
前記標識試薬が蛍光色素を含有する蛍光シリカ粒子である請求項１１に記載の検出装置。
【請求項１３】
前記蛍光シリカ粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下である請求項１２に記載の検出装置。
【請求項１４】
前記励起光照射方向（ｙａ）が、前記流路における反応部を基点にして、前記方向（ｙ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１５】
前記検出方向（ｚａ）が、前記流路における反応部を基点にして、前記方向（ｚ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１６】
前記励起光を透過する光フィルタを具備する請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１７】
前記検出部が下記のいずれかで構成された請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の検出装置。
（ａ）マイクロ流路から検出方向に沿って延びる光学部材で構成されている
（ｂ）検出部の光透過性が検出装置のその他の部分に対して高められている
（ｃ）検出部の屈折率がその周辺部分に対して高められている
【請求項１８】
前記マイクロ流路の幅が０．０１μｍ以上１０００μｍ以下である請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項１９】
前記マイクロ流路の深さが０．０１μｍ以上１０００μｍ以下である請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項２０】
前記マイクロ流路の底面および／または側面に被検物質の捕捉物質および／または前記蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項２１】
前記マイクロ流路内の反応部に多孔質体が配置され、多孔質の内部に被検物質の捕捉物質および／または蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項２２】
前記方向（ｙ）が前記反応部の投影面積で最大となる方向と一致する請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の検出装置。
【請求項２３】
前記励起光照射方向（ｙａ）の特定の位置に励起光源が設けられた請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光イムノクロマトグラフィーおよびその検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
イムノクロマトグラフィーとは、被検物質を捕捉した部分が発色することによって、その有無を判定する免疫測定法である。その手順は以下のとおりである。まず、被検物質が標識粒子に捕捉される。これが、通常メンブレンで構成される支持体中を、毛細管現象により移動する。さらに、支持体にライン状に固定化された捕捉物質と前記の被検物質とが接触し、ここで被検物質が補足され、次第に濃縮される。その結果、捕捉物質が固定化されたラインが強く発色することによって、被検物質の有無を精度良く判定することができる。
【０００３】
本出願人は、これまで検出感度の向上を目的として、蛍光シリカ粒子を使ったイムノクロマトグラフィー（蛍光イムノクロマトグラフィー）を開発してきた（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１９６８２５号公報
【特許文献２】特開２０１２−１８９３５５号公報
【特許文献３】特開２００８−３０４４０１号公報
【特許文献４】特開２００６−１７０８５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光シリカ粒子を用いたイムノクロマトグラフィーでは、上述のようにその他の粒子を利用した試薬に比べ感度が向上する。しかし、メンブレンを用いた方法では、以下のような課題がある。
（１）測定方向の表面に吸着した粒子しか測定できない
（２）メンブレンの奥に吸着した粒子は測定できないため、個体差が発生しやすい
（３）弱陽性のとき、バックグラウンドが高いとライン発光が埋もれることがある
（４）光分散するため測定部に光が到達するまでに強度が落ちやすい
【０００６】
そこで、本発明者らは、上記の蛍光イムノクロマトグラフィーにおいて、マイクロ流路チップを適用することを検討した。しかしながら、一般的な検出形態により（特許文献１，４）、マイクロ流路の斜め上方（方向（ｙ）に対して斜めの方向）から励起光を照射し、同様に上方（方向（ｙ））から検出を行ったところ、被検物質の濃度の高い条件では一定の改善がみられたものの、低濃度条件では十分な効果がないことを確認した（後記比較例参照）。
【０００７】
以上の技術知見に鑑み、本発明は、メンブレンやマイクロ流路での従来式の読み取りに対して、蛍光イムノクロマトグラフィーの検出感度を改善し、低濃度の試料液であっても高い感度で検出測定を行うことができる蛍光イムノクロマトグラフィーおよびその検出装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題は下記の手段により解決された。
〔１〕蛍光標識試薬を含有する試料液をマイクロ流路に流通させ、上記マイクロ流路中に設けられた反応部において、蛍光標識試薬に励起光を照射して上記蛍光標識試薬から発せられる蛍光を検出して行う蛍光イムノクロマトグラフィーであって、
上記試料液を流通させる方向（ｘ）と、上記流通方向（ｘ）と直交する方向（ｙ）と、上記流通方向（ｘ）および直交方向（ｙ）がなす平面（Ｌ）に対して直交する方向（ｚ）とを定義し、上記方向（ｙ）と実質的に同じ方向（ｙａ）から励起光を照射し、上記方向（ｚ）と実質的に同じ方向（ｚａ）から上記蛍光を検出する蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔２〕上記蛍光標識試薬が蛍光色素を含有する蛍光シリカ粒子を含有する〔１〕に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔３〕上記蛍光シリカ粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下である〔２〕に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔４〕上記励起光照射方向（ｙａ）が、上記流路における反応部を基点にして、上記方向（ｙ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔５〕上記検出方向（ｚａ）が、上記流路における反応部を基点にして、上記方向（ｚ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔６〕上記励起光の照射を光フィルタを介して行う〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔７〕上記蛍光の検出をマイクロ流路を構成する装置の壁面を介して行う〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔８〕上記方向（ｙ）が、上記反応部の投影面積で最大となる方向と一致する〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔９〕上記マイクロ流路の底面および／または側面に被検物質の捕捉物質および／または上記蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
〔１０〕上記マイクロ流路内の反応部に多孔質体が配置され、多孔質の内部に被検物質の捕捉物質および／または蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の蛍光イムノクロマトグラフィー。
〔１１〕蛍光標識試薬を含有する試料液をマイクロ流路に流通させ、上記マイクロ流路中に設けられた反応部において、蛍光標識試薬に励起光を照射して上記蛍光標識試薬から発せられる蛍光を検出して行う蛍光イムノクロマトグラフィー用の検出装置であって、
上記試料液を流通させる流路が延びる方向（ｘ）と、上記流通方向（ｘ）と直交する方向（ｙ）と、上記流通方向（ｘ）および直交方向（ｙ）がなす平面（Ｌ）に対して直交する方向（ｚ）とを定義し、上記方向（ｙ）と実質的に同じ方向（ｙａ）から上記励起光を受けるようにされ、上記方向（ｚ）と実質的に同じ方向（ｚａ）から上記蛍光を検出する検出部を具備する検出装置。
〔１２〕上記標識試薬が蛍光色素を含有する蛍光シリカ粒子である〔１１〕に記載の検出装置。
〔１３〕上記蛍光シリカ粒子の平均粒子径が１０００ｎｍ以下である〔１２〕に記載の検出装置。
〔１４〕上記励起光照射方向（ｙａ）が、上記流路における反応部を基点にして、上記方向（ｙ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される〔１１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔１５〕上記検出方向（ｚａ）が、上記流路における反応部を基点にして、上記方向（ｚ）から４５°ずれた位置の範囲内に配置される〔１１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔１６〕上記励起光を透過する光フィルタを具備する〔１１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔１７〕上記検出部が下記のいずれかで構成された〔１１〕〜〔１６〕のいずれか１項に記載の検出装置。
（ａ）マイクロ流路から検出方向に沿って延びる光学部材で構成されている
（ｂ）検出部の光透過性が検出装置のその他の部分に対して高められている
（ｃ）検出部の屈折率がその周辺部分に対して高められている
〔１８〕上記マイクロ流路の幅が０．０１μｍ以上１０００μｍ以下である〔１１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔１９〕上記マイクロ流路の深さが０．０１μｍ以上１０００μｍ以下である〔１１〕〜〔１８〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔２０〕上記マイクロ流路の底面および／または側面に被検物質の捕捉物質および／または上記蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された〔１１〕〜〔１９〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔２１〕上記マイクロ流路内の反応部に多孔質体が配置され、多孔質の内部に被検物質の捕捉物質および／または蛍光標識試薬の捕捉物質が固定された〔１１〕〜〔１９〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔２２〕上記方向（ｙ）が上記反応部の投影面積で最大となる方向と一致する〔１１〕〜〔２１〕のいずれか１項に記載の検出装置。
〔２３〕上記励起光照射方向（ｙａ）の特定の位置に励起光源が設けられた〔１１〕〜〔２２〕のいずれか１項に記載の検出装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のイムノクロマトグラフィーおよびその検出装置によれば、メンブレンやマイクロ流路での従来式の読み取りに対して、蛍光イムノクロマトグラフィーの検出感度を改善し、低濃度の試料液であっても高い感度で検出測定を行うことができる。また、シンプルな構造で高感度の検出を可能とすることができ、十分な信頼性を維持しつつ、安価で汎用性のある検出装置及びその使用方法を提供し、イムノクロマトグラフィーの生化学分析および臨床検査における一層の拡大に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用の検出装置１０を模式的に示した斜視図（ａ）および断面図（ｂ）である。
【図１−２】図１−１の流路断面を拡大した拡大断面図である。
【図１−３】図１−１の装置の平面図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用の検出装置２０を模式的に示した斜視図である。
【図３】本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用の検出装置３０を模式的に示した斜視図（ａ）および断面図（ｂ）である。
【図４−１】本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用の検出装置４０を模式的に示した斜視図である。
【図４−２】検出装置４０の変形例を示す平面図である。
【図５】本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用の検出装置５０を模式的に示した斜視図である。
【図６】検出装置１０の変形例を示す平面図である。
【図７】検出装置１０の別の変形例を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のイムノクロマトグラフィーは、蛍光標識試薬を含有する試料液をマイクロ流路に流通させ、前記マイクロ流路中の蛍光標識試薬に励起光を照射して当該蛍光標識試薬から発せられる蛍光を検出して行う。このとき、本発明においては、前記試料液を流通させる流通方向（ｘ）と、これに直交する方向（ｙ）と、前記流通方向（ｘ）および直交方向（ｙ）がなす平面（Ｌ）に対して実質的に直交する方向（ｚ）との直交座標を定義する。そして、前記方向（ｙ）と実質的に同じ方向（ｙａ）から励起光を照射する。一方、前記方向（ｚ）と実質的に同じ方向から蛍光を検出する。以下、本発明について、図面を参照しながら、その好ましい実施形態に基づき詳細に説明する。
【００１２】
図１−１は本発明の一実施形態に係るイムノクロマトグラフィー用の検出装置１０を模式的に示している。（ａ）がその斜視図であり、（ｂ）がＡ−Ａ矢視の断面図である。本実施形態の検出装置１０は、平面視において長方形であり（図１−３参照）、その長手方向に向けて流路１が設けられている。流路１は毛細管現象を利用して試料液が移行するように微細であることが好ましく、その幅（Ｗ）および深さ（Ｄ）が、それぞれ、１０００μｍ以下であることが好ましく、７００μｍ以下であることがより好ましく、５００μｍ以下であることが特に好ましい。下限は特になく０．０１μｍ以上が実際的だが、本発明においては、試料液とともに蛍光シリカ粒子を流すので蛍光シリカ粒子の粒径よりも十分大きいことが好ましい。その観点から、１０μｍ以上が実際的である。なお、図示していないが、上記流路の上面には蓋体をかぶせるようにして、測定中に異物等が流路内に混入することのないようにすることが好ましい。
【００１３】
流路の両端には流路幅よりも直径の大きい円筒状の送液部２と排出部３がある。送液部２に試験液Ｓを滴下すると、試験液Ｓが毛細管現象により流路１に吸い込まれ、流路内の反応部８を介して、排出部３に向かって流れる。
【００１４】
流路は断面において矩形とされており（図１−２参照）、本実施形態においては、反応部８の位置で、その底面１ｂに捕捉性物質６が固定されている。この捕捉性物質６は被検物質４との結合性を有し、この被検物質４を介して標識粒子５をこの位置で捕捉する。標識粒子５は、後で詳細に述べるが、蛍光シリカ粒子５１と結合性物質５２とで構成されている。本実施形態では、流路の側面１ａに捕捉性物質６を付与しない例として示しているが、反応部８の側面１ａに捕捉性物質６を付与する形態としてもよい。このようにすることで、３次元的な標識粒子の捕捉を可能とし、より標識粒子の集積度の高い測定が可能となる。
【００１５】
本実施形態においては、励起光が、試験液Ｓが流れる流通方向（ｘ）に対して垂直の方向（方向（ｙ））と同じ方向（ｙａ）から照射される。励起光は、本装置においては、流路のほぼ中央に位置する反応部８に到達するようにされている。本明細書では前記反応部８を励起光の照射の観点から励起光照射部と呼ぶことがある。このとき、この位置には、すでに流路を移行して捕捉性物質６に捕捉された標識粒子５が多数存在する。本実施形態においては、ここで励起光を受け標識粒子５から発せられる蛍光を、装置正面の検出部７１から検出する。すなわち、前記流通方向（ｘ）と垂直方向（励起光照射方向）（ｙ）とがなす平面（Ｌ）に対して垂直の方向（ｚ）と同じ方向（ｚａ）から検出を行う。このようにすることで、励起光の影響を低減することができ、感度の高い蛍光検出を行うことができる。これは、蛍光シリカ粒子を利用した実施態様においてより顕著になる。
試験液の流路１から検出部７１までの距離（ｄ）は特に限定されないが、０．１ｍｍ以上が好ましく、１ｍｍ以上がより好ましく、５ｍｍ以上が特に好ましい。上限としては、２０ｍｍ以下が好ましく、１５ｍｍ以下がより好ましく、１０ｍｍ以下が特に好ましい。装置の好ましい厚さは、後記図３の形態におけるｋ１と同義である。
図１−１（ｂ）の断面図には、照射光源９１および検出器（肉眼）９２を示している。その他の図面ではこれらを省略しているが、本発明の装置においては、照射光源９１および検出器９２をその装置の構成部品として取り込んでいてもよい。
【００１６】
図１−３は図１−１の装置の平面図である。この図で示したように、本実施形態においては、反応部８の中央にテストラインｔが配置されている。このテストラインｔは、前記の捕捉性物質を流路底面に配置した部分に該当する。ただし、本発明はこの例に限定されず、テストラインｔとともにコントロールラインｃを設けてもよい。コントロールラインｃには、テストラインｔとは異なる捕捉性物質が配置され、被検物質４を伴わない標識粒子５を捕捉するようにされている。
【００１７】
本実施形態においては、前記方向（ｙ）が前記反応部の投影面積で最大となる方向と一致する設定とされている。より単純化して説明すると、流路の幅Ｗと深さＤの関係において、幅の方が大きくなるように設定されている場合、その投影面積が最大となる方向は、幅方向と直交し、深さ方向の延長方向となる。本実施形態においては、これが方向（ｙ）と一致する前提とされ、それと実質的に同じ方向が照射方向（ｙａ）とされている。逆に、深さＤが幅Ｗよりも大きい場合、投影面積で最大となる方向は、深さ方向に直交し、幅方向の延長方向となる。この場合は、その向きを方向（ｙ）と定義する。
このように、反応部の投影面積で最大となる方向から励起光を照射することにより、より効率的に試薬の蛍光発光を促し、これと直交する検出方向（ｚａ）からの検出を一層効果的にする。
【００１８】
ここで蛍光シリカ粒子を標識粒子に利用する利点について述べる。シリカ粒子は透明性が高く、励起光および蛍光が高い透過率で透過する。そのため、励起光の光路および蛍光の光路に他の粒子が存在していても、それぞれの光が他の粒子に遮られずに透過する。したがって、励起光であれば、より多くの粒子にその光が到達し蛍光が発せられる。蛍光であれば、他の粒子の透明の部分を透過して、検出部に到達する。これが、例えば金コロイド粒子のような標識粒子であれば、その光は遮られ、励起光であれば、これが到達する表面に露出したもののみが標識として機能する。発色（吸光）を呈したとしても、検出部（観察者）との間に他の粒子が存在すると、その裏側の粒子の発色は確認されず、非効率な検出測定となる。例えば、上述した側面１ａに捕捉性物質６を配した実施形態のような場合に蛍光シリカ粒子を用いる利点が顕著となり、側面１ａで発光する蛍光のみならず、その奥の底面１ｂ上の粒子の蛍光も効果的に検出されることとなる。
【００１９】
本発明において、前記励起光照射方向（ｙａ）は、前記流路における反応部（励起光の照射位置）を基点にした、前記方向（ｙ）であることが好ましいが、そこから所定の程度ずれた位置であってもよい。例えば、励起光源が４５°偏倚した位置の範囲内に配置されていてもよい。この偏倚は小さいほうが好ましく、３０°以下であることがより好ましく、２０°以下であることがさらに好ましく、１０°以下であることがさらに好ましい。偏倚の下限は特に規定されないが、通常は不可避的なずれ量（例えば１°）が発生することがある。本発明においては、このように許容範囲内の偏倚を含む意味として、実質的に同じ方向と言うことがある。上記励起光照射方向（ｙａ）は、反応部との関係では、反応部の投影面積が最大となる方向（投影面に直交する方向）と一致していることが好ましい。この方向は、前述のとおり、例えば、図１−１で言うと、その（ｙ）方向となる。したがって、励起光の照射光源と組み合わせた検出装置とする場合には、当該方向（ｙａ）の所定の位置に照射光源を設置することが好ましい。
【００２０】
また、前記蛍光検出方向（ｚａ）が、（ｚ）方向と一致していることが好ましい。ただし、この点も同様に、その方向から４５°偏倚した位置の範囲内に配置されていてもよい。この偏倚は小さいほうが好ましく、３０°以下であることがより好ましく、２０°以下であることがさらに好ましく、１０°以下であることがさらに好ましい。偏倚の下限は特に規定されないが、通常は不可避的なずれ量（例えば１°）が発生することがある。検出は目視によって行っても、受光器によって行ってもよい。受光器を用いる場合には、当該方向（ｚａ）の所定の位置に受光器を設置することが好ましい。目視観察のための観察窓を設けるような場合にも同様に、方向（ｚａ）の所定の位置に観察窓を設けることが好ましい。
【００２１】
装置を形成する材料は特に限定されないが、検出部の良好な光透過性を考慮すると、透明性の高い材料を用いることが好ましい。無機材料であれば、各種のガラスや、石英などを利用することができる。有機材料であれば、各種の透明プラスチックを用いることができる。材料としては、ポリエステル樹脂（芳香族ポリエステル、非芳香族ポリエステル）、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリオレフィン、セルロースアセテート、耐候性塩化ビニルなどを用いることができる。あるいは、各種のシリコーン（シロキサン樹脂）を用いることもできる。なかでも、本発明においては、シロキサン樹脂を用いることができ、ポリジメチルシロキサンを例示することができる。
【００２２】
装置を構成する材料の屈折率としては、流路で発生した蛍光を可及的に外部に漏らさない設定とすることが望ましい。かかる観点から、装置材料の屈折率は１．１以上であることが好ましく、１．２以上であることがより好ましく、１．４以上であることが特に好ましい。上限としては、２．２以下であることが好ましく、２以下であることがより好ましく、１．８以下であることが特に好ましい。
なお、本発明において、屈折率は特に断らない限り、２３℃、波長５８９．３ｎｍの値を採用する。
【００２３】
本実施形態において、流路内の反応部８に設けるテストラインには捕捉性物質を付与している。捕捉性物質には常用されているものを用いることができるが、後記の結合性物質として挙げたものを好適に利用することができる。テストライン用の捕捉性物質は標的物質との結合性が付与されている。
一方、コントロールラインを反応部８に設けるときには、テストラインとは異なる結合性物質を用いることが好ましい。具体的には標識粒子の結合性物質と直接結合するものを選定することが好ましい。これにより、その部位で未反応の標識粒子を捕捉することができ、コントロールラインとしての機能を果たすことができ好ましい。
【００２４】
図２は別の実施形態に係る検出装置２０を模式的に示した斜視図である。本実施形態においては、図１−１に示した装置と同様に平面視において長方形のチップに、その長手方向に沿って流路１が設けられている。一方、上記とは異なり、検出部（面）の透過率が他の部分（面）に比べて高められている。具体的には、検出部７１のある装置正面１６以外の面、つまり上面１１、右側面１２、左側面１３、裏面１４、下面１５はすべて銀面（反射面）とされている。このようにすることで、反応部（励起光照射部）８で発せられた蛍光を外部に逃がさずに、効果的に検出部７１からの検出測定を行うことができる。構造的に複雑にせずに、検出感度を高めることができることが、本実施形態における利点である。本実施形態の変形例としては、銀面とせずに、黒色の面などにしてもよい。このときにも相応の効果が得られ、コストやその他の事情等を考慮して、表面処理の態様を適宜選定することができる。
【００２５】
図３はさらに別の実施形態に係る検出装置３０を模式的に示した斜視図である。本実施形態も図１−１の装置の応用例であり、検出部を装置外方に延出させた外方延出部７ａが設けられている。この外方延出部は、装置を構成する部材か、もしくはそれよりも高屈折率の材料で構成されており、外部に光が漏れにくくされている。屈折率の差は０．０２以上であることが好ましく、０．１以上であることがより好ましい。上限は特に規定されないが、１以下であることが実際的である。このようにすることで、上下方向への光の拡散を効果的に防ぐことができる。本実施形態の変更形態としては、外方延出部の寸法や形状を適宜に変更する例が挙げられる。あるいは、この部分に図２のような表面の塗膜処理を行ってもよい。
本実施形態において検出部７１までの長さ（ｄ２）は、前記図１−１の装置の長さ（ｄ）の好ましい範囲の１．５倍〜２倍に設定することが好ましい。具体的な延出部の長さ（ｄ２−ｄ）は、１ｍｍ以上がより好ましく、５ｍｍ以上が特に好ましい。上限としては、２０ｍｍ以下が好ましく、１５ｍｍ以下がより好ましい。検出部の厚さｋ２は装置の厚さｋ１より薄いことが好ましい。このようにすることで、光の導波・屈折の関係でより良好な検出が可能となる。かかる観点から、厚さの比率ｋ２／ｋ１は０．０３〜０．７が好ましく、０．０５〜０．３がより好ましい。装置の厚さｋ１は、特に限定されないが、１．４ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好適である。延出部７ａの基部にテーパーθ１、θ２を設けることが好ましい。θ１、θ２はともに、２〜３０°であることが好ましく、２〜１５°であることが好ましい。テーパーθ１、θ２は片側に設けてもよいが、光の導波の観点から下側と上側の両側に設けることが好ましい。
【００２６】
図４−１の装置においては、装置内の流路１の側壁１ａを含む部分で、励起光照射部８から検出部７１につながる部分（光路）７ｂの屈折率を、その他の部分７ｃの屈折率よりも高めている。このように、光路７ｂのみを異なる部材とする方法は特に制限されず、たとえば一度直方体のチップとした後に、この部分をくり貫き、他の部材を埋め込むようにしてもよい。あるいは、２種以上の樹脂を共押出したり、混在させて型付けしたりして成形してもよい。低屈折率の部分７ｃと高屈折率の部分（光路）７ｂとの屈折率の差は０．０２以上であれば、蛍光を外部に逃さずに閉じ込める効果が得られるので好ましく、０．１以上であれば、多少の材料のばらつきがあっても屈折率に差がつけられるのでより好ましい。上限は特に規定されないが、１以下であることが実際的である。また、光路７ｂのサイズは、ｚ方向から見たときに反応部を包含するサイズであることが好ましい。光路７ｂは、反応部の数に応じて複数設けられても良い。
【００２７】
図４−２は図４−１の装置の変更形態であり、複数の検出光路７ｅ、７ｆが設けられたものである。このようにすることで、同図に示したように、テストラインｔとコントロールラインｃを併設したような場合に適合し、それぞれの検出部７２、７３において良好な視認性の検出を可能とすることができる。
【００２８】
図５の装置は、流路内の構成について変更を行ったものであり、流路１の内部で、励起光照射部８に該当する部分に多孔質体９が配置された例である。多孔質体には内部にも捕捉性物質が固定されており、このような装置構成とすることで、反応域により広い表面積を確保することができ、より多くの抗体を反応域に固定することができる。そのため、狭い反応域により多くの標識粒子を被検物質を介して捕捉することができ、蛍光の強度を高めることができる。多孔質体はたとえば透明な材料であり、多孔質シリカで形成することができる。
【００２９】
図６及び７は、図１に示した検出装置１０の変形例を示す平面図である。図６の装置では、送液部２を複数備え、第１の送液部２ａに第１の試験液Ｓ１を、第２の送液部２ｂに第２の試験液Ｓ２を滴下する。途中の合流部においてＳ１とＳ２が混合される。第１の試験液Ｓ１は被検物質を含み、第２の試験液Ｓ２は標識試薬を含んでいても良い。また、図７のように、第１の送液部２ａと第２の送液部２ｂが直列に配置してもよい。
【００３０】
［標的物質］
本発明において、検出、定量の対象としての標的物質４は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。標的物質を含有する試料としては特に制限はないが、尿、血液などの液体試料が挙げられる。
【００３１】
［蛍光標識粒子］
本発明に用いられる蛍光標識粒子５は、蛍光シリカ粒子５１と結合性物質５２とで構成されていることが好ましい（図１−２）。蛍光シリカ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５９，１５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法が挙げられる。本発明においては、国際公開２００７／０７４７２２Ａ１公報に記載された蛍光シリカ粒子の調製方法に準じて得られた、蛍光物質を含有する蛍光シリカ粒子を用いることが特に好ましい。蛍光シリカ粒子に含有させる蛍光物質の具体例としては、蛍光有機色素化合物が好ましい。
【００３２】
具体的には、蛍光シリカ粒子は、前記蛍光有機色素化合物とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなる蛍光シリカ粒子が得られる。
前記蛍光シリカ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光有機色素化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
【００３３】
前記シランカップリング剤としてγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
【００３４】
【化１】
2015152306.tif 000003
【００３５】
・蛍光有機色素化合物
前記活性基を有する又は付加した前記蛍光有機色素化合物の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン−ＮＨＳエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）、下記式でそれぞれ表されるＤＹ５５０−ＮＨＳエステル又はＤＹ６３０−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
【００３６】
【化２】
2015152306.tif 000004
【００３７】
・シランカップリング剤
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
【００３８】
・シラン化合物
前記縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
【００３９】
上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
【００４０】
・結合性物質
前記蛍光シリカ粒子の表面に吸着又は結合させる結合性物質は、標的物質と結合性を有する。この性質を利用して、試料液に標的物質が存在していた場合には、これと結合させて系内で標識することができる。前記の結合性物質は生体分子であることが好ましい。生体分子としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、タンパク質又はペプチドが挙げられる。ここで、リガンドとはタンパク質と特異的に結合する物質をいい、例えば、酵素に結合する基質、補酵素、調節因子、あるいはホルモン、神経伝達物質などをいい、低分子量の分子やイオンばかりでなく、高分子量の物質も含む。
【００４１】
・密度
ラテックス粒子は密度が１ｇ／ｃｍ３であり、密度が小さい。このことから、粒径を小さくすると遠心分離で分離が不可能となり、標識粒子として使用できなくなることがある。これに対し、シリカは相対的に密度が大きいため、粒径を小さくしても沈降しやすい。マイクロ流路を利用する本発明にあっては、粒子が好適に沈降し、底面の捕捉性物質と反応しやすくなるため、密度（比重）の大きいシリカ粒子を適用することが好ましい。この観点でのシリカ粒子の利用については、例えば、特表２０１２−５０３７８０号公報、国際公開第２０１１／０７１２５６号パンフレット等が挙げられる。また、密度が大きくなると遠心分離で分離がしやすく、調製時の手間が軽減されるため、その点からもシリカ粒子を好適に標識粒子として使用することができる。上記の観点から、蛍光シリカ粒子の密度は１．５ｇ／ｃｍ３以上が好ましく、１．７ｇ／ｃｍ３以上がより好ましく、１．８ｇ／ｃｍ３以上が特に好ましい。上限としては、２．５ｇ／ｃｍ３以下が実際的である。またフロー液の比重よりも高いことが望ましい。仮に血液であるとすると、血液の比重は１．０５ｇ／ｍＬ程度であるので、シリカ粒子の密度は１．２ｇ／ｍＬよりも重いことが望まれる。
【００４２】
・屈折率
また、下記のように低屈折率であることも、周囲の水の影響による光の散乱を起こさず、シリカ粒子を用いる利点となる。特に、本願発明においては、後記実施例で示すように、１０ｎｇ／ｍｌというごく微量の被検物質の検出に係る精度向上も見据えており、その観点からもシリカ粒子を用いた標識試薬とすることが好ましい。
［屈折率］    ５８９．３ｎｍ  ２３℃
ポリスチレンビーズ    １．５９
シリカ粒子            １．４０−１．４６
水                    １．３３
（理科年表  国立天文台編）
反射光強度  Ｒ＝（ｎ０−ｎｉ）２
ｎ０  水の屈折率
ｎｉ  粒子の屈折率
Ｒ（ポリスチレンビーズ）＝７．９３×１０−３
Ｒ（シリカ粒子）＝６．５７×１０−４〜２．１７×１０−３
【００４３】
・一次粒子の粒径
蛍光シリカ粒子の平均粒径が１ｎｍ以上であることが好ましく、２０ｎｍ以上であることがより好ましく、５０ｎｍ以上であることが特に好ましい。上限は、１０００ｎｍ以下であることが好ましく、７００ｎｍ以下であることがより好ましく、５００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、４００ｎｍ以下であることが特に好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個のシリカ粒子の合計の投影面積からシリカ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
【００４４】
・二次粒子の粒径
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
【００４５】
シリカ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましく、粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
【００４６】
［蛍光波長］
本発明の好ましい実施形態においては、蛍光の波長（λ）は、４００ｎｍ〜８００ｎｍであることが好ましく、４５０ｎｍ〜７００ｎｍであることがより好ましい。さらに、汎用されている検出器（光センサー）の受光感度特性や、蛍光色素の入手性等を考慮すると、上記蛍光の検出波長領域（λ）は、４００ｎｍ〜６５０ｎｍであることが好ましく、５００ｎｍ〜６５０ｎｍであることがより好ましい。なおここで言うピークとはピークトップないしその近傍全般を指し、狭義にはピークトップ（頂点）を意味するものとする。
【００４７】
［検出方法］
本発明のイムノクロマトグラフィーにおいては、前記検出装置を用い、その検出部を介して標識粒子の蛍光を検出測定する。前記蛍光標識粒子が発する蛍光を好適に検出する観点から、前記励起光源（光照射器）が、波長３００ｎｍ〜５５０ｎｍの励起光を発することが好ましく、波長４００ｎｍ〜５５０ｎｍがより好ましく、波長５００ｎｍ〜５５０ｎｍがさらに好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ及びキセノンランプが挙げられる。特にレーザダイオードまたは発光ダイオードから照射した励起光を用いることが好ましい。また、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましい。さらに、蛍光を的確に検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えていることがさらに好ましい。
【００４８】
前記受光器は、前記蛍光を受光する光電子倍増管、ＣＣＤ検出器、ＣＭＯＳ検出器であることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから標的物質の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。受光器の受光感度における特性としては、高感度の製品の入手性の観点から、波長４００〜７００ｎｍに高感度の受光領域（受光ピーク）があるものを適用することが好ましく、波長５００〜６００ｎｍに高感度の受光領域（受光ピーク）があるものを適用することがより好ましい。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態によれば、以下のような利点が得られる。
［１］測定に使用する粒子およびマイクロ流路チップが透過性を持つため、３６０°どの方向からでも測定できるうえに、粒子が重なっていても測定に影響を与えない
［２］ライン上の粒子どうしは通常密集する。一方、粒子の屈折率は空気よりも大きいため粒子が発光した光は隣接する粒子の中を通りやすい。このため、測定方向から粒子を観察したとき、粒子から発せられた光は集光しながら測定部まで光が到達する。これに対してバックグラウンド（ＢＧ）は、非特異吸着により吸着した粒子の発光を測定する。ＢＧ上の粒子はライン上の粒子に比べ周りに粒子が少ないため発光した光は分散しながら測定部へ到達する。このため、結果としてラインとＢＧのＳＮ比はメンブレンより大きくなる。
［３］ラインよりも狭い面積で同数の粒子を測定することができる。そのため、単位面積当たりの粒子密度が大きくなり感度が向上する。
［４］蛍光シリカ粒子を用いたときには、屈折率が高く水に近いため、光の散乱を抑え、明瞭な蛍光検出が可能となる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、本明細書においては、配合量や濃度は特に断らない限り質量基準である。
【００５１】
（標識シリカナノ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）５．８ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに２．６μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。得られた反応液４００μｌにエタノール１２８ｍｌ、ＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）４００μｌ、蒸留水２８．８ｍｌ、２８質量％アンモニア水４００μｌを加え、室温で２４時間反応を行った。反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径１７２ｎｍのシリカナノ粒子９４．２ｍｇを得た。収率約８８％。
【００５２】
作製した濃度２０ｍｇ／ｍｌローダミン含有シリカ粒子／アルギン酸の複合粒子のコロイド５００μｌに、０．５ＭのＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）を１００μｌ、５０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳを４６１μｌ、１９．２ｍｇ／ｍｌのＥＤＣを１５０μｌ、蒸留水を１．０８９ｍｌ加え、３０分間混合した。反応液を１５，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、蒸留水を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回遠心分離と蒸留水への分散を繰り返して粒子を洗浄し、最後に５０ｍＭのＫＨ  ２ＰＯ  ４緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに分散させた。ここに５０ｍＭのＫＨ  ２ＰＯ  ４緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した１ｍｇ／ｍｌの抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ  マウスＩｇＧ  １、Ｍｅｄｉｘ    Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を１ｍｌ加え、２時間混合した。続いて１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を１００μｌ加え、さらに１時間混合した。反応液を１５，０００×Ｇの重力加速度で３０分遠心分離し、上清を除去後、５０ｍＭのＫＨ  ２ＰＯ  ４緩衝液（ｐＨ８．０）を１ｍｌ加え粒子を分散させた。同様にして更に２回、遠心分離と５０ｍＭのＫＨ  ２ＰＯ  ４緩衝液（ｐＨ８．０）への分散を繰り返して粒子を洗浄し、最後に５０ｍＭのＫＨ  ２ＰＯ  ４緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに分散させ、抗ｈＣＧ抗体で修飾されたローダミン含有シリカ粒子（蛍光標識粒子）のコロイドを得た（収量１０ｍｇ／ｍｌ×１ｍｌ）。
【００５３】
（検出装置の作製）
図１に示した装置を準備した。マイクロ流路用基板、蓋用基板、送液部、ともに透明性の高いポリジメチルシロキサンで作製した（屈折率１．４、２３℃、５８９ｎｍ）。マイクロ流路は、幅（Ｗ）４００μｍ、深さ（Ｄ）４００μｍとした。また反応部の底面の面積は０．１６ｍｍ３とした。下記の手法で抗体を塗布した後にマイクロ流路用基板と蓋用基板を接着した。抗ｈＣＧ抗体で修飾された蛍光シリカ粒子（１０ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍｌと、５０ｍｇ／ｍｌスクロース３ｍｌと、蒸留水１．７ｍｌを混合した。得られた蛍光標識粒子を送液部に０．４ｍＬ滴下し、１０分放置した。
【００５４】
前記の流路のほぼ中央に、抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＦＳＨ（ＬＨ），  ｃｌｏｎｅ  ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を１０μＬ点着した。これを３ｈｒ放置することで基材に抗ｈＣＧ抗体を流路内に固定し、反応部のテストラインを形成した。
【００５５】
（標識粒子の蛍光測定）
１００，２０，２  ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）１００μＬをそれぞれ蛍光シリカ粒子（１０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、送液部に滴下した。また比較用として同様のテストストリップのサンプルパッド部分に滴下し、５分放置した。比較例のテストストリップは特許５１００５４１号明細書に基づき作製した。
【００５６】
励起光源側のフィルタとしてＦＦ０１−４８２（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製、）、検出器側のフィルタとしてＦＦ０１−５３６（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）を用いた。マイクロ流路チップもしくはテストストリップを水銀ランプ（１０３Ｗ）で照射し、検出器としてＣＣＤ検出器（Ｃ２７４１−３５Ａ（商品名、浜松ホトニクス社製））を用いて目視による蛍光の画像化を行った。励起光の波長は５３５ｎｍであり、検出光の波長は５５５ｎｍであった。
【００５７】
従来法としてメンブレンＨＦ１２０、マイクロ流路チップを用いて測定を行った。実施例および比較例のいずれにおいても、励起光は、照射部８に向け、その垂直方向（ｙ方向）から照射した。一方、その検出は、実施例においては検出部７１（ｚ方向）から行った。比較例においては、いずれも励起光と同じ方向（ｙ方向）で、約１５°ほど流通方向に向けて斜めの方向から蛍光を測定した。その結果が表１である。
【００５８】
【表１】
2015152306.tif 000005
【００５９】
上記の結果から分かるとおり、本発明のイムノクロマトグラフィーおよびその検出装置によれば、メンブレンを用いた蛍光イムノクロマトグラフィーの検出感度等を改善し、低濃度の試験液であっても高い感度で検出測定を行うことができることが分かる。また、マイクロ流路を用いたイムノクロマトグラフィーにおいても、励起光の照射方向（ｙ方向）から検出するものに対しても、大きな改善が見られることが分かる。
【符号の説明】
【００６０】
１  流路
１ａ  流路側面
１ｂ  流路底面
１１  上面
１２  右側面
１３  左側面
１４  裏面
１５  下面
１６  正面
２、２ａ、２ｂ  送液部
３  排出部
４  被検物質
５  蛍光標識粒子
５１  蛍光シリカ粒子
５２  結合性物質
６  捕捉性物質
７１  検出部
７２  左検出部
７３  右検出部
８  励起光照射部
９１    照射光源
９２    検出器（肉眼）
【図１−１】
2015152306.tif 000006
【図１−２】
2015152306.tif 000007
【図１−３】
2015152306.tif 000008
【図２】
2015152306.tif 000009
【図３】
2015152306.tif 000010
【図４−１】
2015152306.tif 000011
【図４−２】
2015152306.tif 000012
【図５】
2015152306.tif 000013
【図６】
2015152306.tif 000014
【図７】
2015152306.tif 000015