(57)【要約】【課題】化学療法を受けるがん患者向けアジュバント製造の組成物の提供。【解決手段】本発明の化学療法を受けるがん患者向けアジュバントを製造するための組成物は、主に大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物を含み、前記組成物が、大腸ポリープの発生とがん化の阻害、がん患者の生存率、特に、無増悪生存率の向上を含む化学療法の有効性の向上、及び（または）化学療法により引き起こされる副作用の減少効果を提供し、また、本発明の組成物は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）などの炎症性メディエーターの産生減少に有効な消炎活性も提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法による患者のがん治療におけるアジュバント製造のための組成物の使用であって、そのうち、前記組成物が大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物を含むことを特徴とする、化学療法による患者のがん治療におけるアジュバント製造のための組成物の使用。
【請求項２】
前記大豆発酵抽出物が、水性大豆抽出物と少なくとも１種の乳酸菌及び選択的に少なくとも１種の酵母の発酵により作られたことを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項３】
前記大豆発酵抽出物が、（ａ）水性大豆抽出物を少なくとも１種の乳酸菌と、少なくとも１種の酵母と発酵させて発酵液を形成する工程と、（ｂ）前記発酵液を滅菌する工程と、（ｃ）前記滅菌済みの発酵液をろ過してろ液を取得する工程と、（ｄ）前記ろ液を濃縮して濃縮した大豆発酵抽出物を得る工程と、を含むプロセスにより作成されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項４】
前記大豆発酵抽出物、前記緑茶抽出物、前記スピルリナ、前記ウコン抽出物、前記ベニクスノキタケ菌糸体、前記グレープシード抽出物が、前記組成物中に１２〜３０：４：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２の重量比で存在することを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項５】
前記がんが結腸直腸がんであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項６】
前記化学療法が、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン及びそれらの任意の組み合わせから構成される群より選択された化学療法薬剤を投与して実施されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項７】
前記組成物が、大腸ポリープの増殖またはがん化の阻害、化学療法の有効性向上、化学療法へのコンプライアンス向上、または化学療法により引き起こされる副作用の減少に有効な量であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記組成物が生存率を高める効果を備え、特に、無増悪生存率を高めることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項９】
抗炎症剤の製造における、請求項１乃至４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１０】
前記組成物が、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生を減少するために有効な量で存在することを特徴とする、請求項９に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全ての開示内容が参照によって本願に組み込まれる、２０１４年９月６日に出願された台湾特許出願第１０２１３２３１０号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は化学療法のためのアジュバントを製造するための組成物に関し、特に、本発明は大腸ポリープの増殖とがん化の阻害に有効であり、化学療法の有効性と化学療法に対するコンプライアンスを高め、化学療法に起因する副作用を減少する、化学療法を受けているがん患者向けのアジュバントを製造するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
大豆発酵抽出物、緑茶、スピルリナ、ウコン、ベニクスノキタケ、グレープシードはいずれも健康に対する自然の宝物であり、数々の生化学的試験においてこれら素材のそれぞれに体に健康的な効果があることが示されている。ウコンに含まれるクルクミンの主な薬理活性は、腫瘍の成長を阻害することであり、ベニクスノキタケに豊富に含まれる多糖は免疫機能を強化し、腫瘍細胞を殺すことができる。単一成分を製剤化した製品はさまざまなものが市販されているが、がん治療における化学療法による副作用を減少することに対する６成分の複方の効果について、関連の研究はない。
【０００４】
結腸直腸がんを例とすると、結腸直腸がんには結腸がんと直腸がんが含まれ、世界で最も一般的な悪性腫瘍の１つである。何が結腸直腸がんを引き起こすのかは完全に明らかになってはいないが、結腸直腸がんは食生活に高い関連性があると一般的に考えられている。例えば、加工食品や動物性脂肪、たんぱく質が豊富な食品の摂取増加、及び繊維が豊富な食品の摂取不足の両方が、現代世界の疾患である結腸直腸がんの発生の増加につながる。幸い、結腸直腸がんの発生は多いが、病変は比較的容易に見つけることができ、結腸直腸がんの進行には比較的長い時間を要する。ほとんどの早期結腸直腸がんはポリープから約５〜１０年で進行するため、定期検査で大腸ポリープが早期段階で発見されれば、結腸直腸がんは一般に容易に制御できる。しかしながら、結腸直腸がんの早期段階における症状は顕著でなく、特異度が低いため、患者と医師がそれらの症状を看過しやすく、早期の発見と治療の機会を逃しやすい。
【０００５】
通常、結腸直腸がんは手術、放射線治療、化学療法の３種類の治療法が最も一般的である。中でも、腫瘍に対する理解とともに、現在結腸直腸がんの化学療法ではフルオロウラシル（５−ＦＵ）ベースの併用化学療法を主として用い、がんの再発と転移の減少及び生存率の向上が図られている。
【０００６】
ＦＯＬＦＯＸ４はステージＩＩ及びＩＩＩと転移性の結腸直腸がん治療に現在使用されている化学療法レジメンであり、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン、オキサリプラチンを含む薬剤から構成されている。しかしながら、これらの薬剤には発熱、嘔気、嘔吐、下痢、骨髄抑制、手足抹消部のしびれ、血行不良を含む毒性の副作用がある。薬剤に起因する副作用の症状によって、患者は往々にして生活品質の低下と生命を脅かす合併症に苦しんでいる。
【０００７】
したがって、不快感を減少し、生活の質を高めるために、化学療法を受けるがん患者向けのアジュバントを見つけることが必要とされている。
【０００８】
さらに、慢性炎症や免疫系の活性化が腫瘍の進行に関連していることが知られている。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用とがん進行のリスク緩和間の関連性など、慢性的な免疫活性化の関与を示唆する証拠がいくつか示されている。腫瘍形成において炎症反応のメディエーターが重要な役割を果たしており、がんの治療的介入の標的となる。化学療法を受けるときの炎症反応を調節する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述を踏まえ、本発明の目的は、化学療法を受けるがん患者向けのアジュバントを製造するための組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、抗炎症剤を製造するための組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
特に、本発明の組成物は、大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物を含む。
【００１２】
本発明の一実施形態によると、前記組成物は大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物を重量比１２〜３０：４：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２で含む。
【００１３】
本発明の一実施形態によると、前記がん患者は結腸直腸がん患者である。
【００１４】
本発明の一実施形態によると、前記がん患者は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン及びそれらの任意の組み合わせから構成される群より選択された化学療法薬剤を投与する化学療法を受ける。
【００１５】
本発明の一実施形態によると、本発明の前記組成物は、経口投与される。
【００１６】
一部の実施形態において、本発明の前記組成物は、大腸ポリープの増殖とがん化の阻害、及び腫瘍の大きさの縮小または生存期間の延長（特に無増悪生存期間）化学療法へのコンプライアンス向上、化学療法によって引き起こされる副作用の減少を含む化学療法の有効性向上に有効である。
【００１７】
特に、本発明の前記組成物は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生減少において有効である。
【００１８】
これら及びその他の本発明の特徴は、以下の好ましい実施形態と図面による説明からより明らかになるであろう。それでも、本発明で開示される新規的概念の要旨と範囲を逸脱しない変更や修飾が可能であろう。
【００１９】
本発明の前述の概要、及び以下の詳細な説明は、添付の図面を組み合わせるとより理解しやすいであろう。本発明の例示を目的として、図面に現在好ましい実施形態を示す。しかしながら、本発明は示された正確な配置と手段に限定されないことに理解が必要である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ラットの結腸における異常陰窩巣（ＡＣＦ）を示すグラフである。（Ａ）ＭＢ−６（Ｂ１＝１７．３ｍｇ／ラット／日、Ｂ２＝３４．６ｍｇ／ラット／日、Ｂ３＝６９．２ｍｇ／ラット／日）治療ラットはＣ１（１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）対照）ラットと比較してＡＣＦ合計数／結腸（４０．６〜５１．０％、＊Ｐ＜．０５）の大幅な減少を示した。（Ｂ）ＡＣＦ当たりの陰窩数が１〜３陰窩、４〜６陰窩、７陰窩以上に分類された。ＭＢ−６は化学誘発ＡＣＦの形成を大幅に抑制し、７陰窩以上の群において最高の阻害率（８１．７％、＊Ｐ＜．０５対Ｃ１群）が観察された。
【図２】ＭＢ−６とロイコボリン／５−フルオロウラシルの化学療法で治療した結腸腫瘍ＣＴ−２６−ＶＤ保有ＢＡＬＢ／ｃマウスの生存状況を示すグラフである。生存期間の中央値は、２７．５日間（腫瘍のみ）、３０．５日間（ＮＣ）、３４．５日間（ＰＳＫ）、３５日間（ＭＢ−６−Ｌ）、３９日間（ＭＢ−６−Ｍ）、３９日間（ＭＢ−６−Ｈ）であった。ＮＣは陰性対照、ＰＳＫは多糖Ｋ、ＭＢ−６−Ｌは０．６２５ｇ／ｋｇのＭＢ−６、ＭＢ−６−Ｍは１．２５ｇ／ｋｇ、ＭＢ−６−Ｈは２．５ｇ／ｋｇのＭＢ−６を示す。
【図３】全例（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ、ＩＴＴ）数中の無増悪生存（ＰＦＳ）が大幅に延長されたことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
例外が特筆されない限り、ここで使われるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術において通常の技能を有する者に一般的に理解されているものと同じ意味を持つ。
【００２２】
本明細書において使用される単数形には、文脈上明らかに単数である場合を除いて、複数の指示対象も含まれる。即ち、例えば「（ある）部材（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」と言う場合には、こうした部材及び当業者に公知のその等価物が複数ある場合も含まれる。
【００２３】
本発明において、生物学的活性薬剤または組成物の投与に関連して使用される用語「治療有効量」とは、未治療の対照群と比較して、治療対象において意図される生物学的効果を生じるに足る生物学的活性薬剤または組成物の用量を指す。具体的に、本発明の組成物の有効量とは、大腸ポリープの増殖及び（または）がん化を阻害する、生存期間、特に無増悪生存期間の延長を含め化学療法の有効性を高める、化学療法へのコンプライアンスを高める、及び（または）化学療法により生じる副作用を減少する量を指す。量は投与経路と、年齢、体重、症状、治療効果、投与法、治療時間を含む治療の条件に基づいて調整できる。例えば、特定の実施形態において、本発明で使用される組成物の経口用量は１日１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇであり、具体的には１日１０〜８００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には１日１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的には１日１０〜２５０ｍｇ／ｋｇ、より一層具体的には１日１０〜１５０ｍｇ／ｋｇである。
【００２４】
本発明において使用される用語「個体」または「被験者」とは、ヒト及びコンパニオンアニマル（犬、猫など）を含むヒト以外の動物、家畜（牛、羊、豚、馬など）、または実験動物（ラット、マウス、モルモットなど）を含む。
【００２５】
本発明に基づき、本発明の組成物は化学療法向けのアジュバントとして使用することができる。一実施形態において、本発明の組成物の治療有効量は薬学的に許容可能な担体とともに、送達及び吸収の目的に適した形態の医薬組成物に調製することができる。投与モードにより、本発明の医薬組成物は、好ましくは、約１０％〜約１００％、または約２０％〜約１００％、または約４０％〜約１００％、または約６０％〜約１００％の重量の活性成分を含み、そのうち、前記重量％は組成物全体の重量に基づいて算出される。
【００２６】
ここで使用される用語「担体」または「薬学的に許容可能な担体」とは、医薬業界における当業者の知るところにあるものを含む、医薬品用の希釈剤または賦形剤などを指す。
【００２７】
本発明は大豆発酵抽出物、緑茶、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物を主に含む組成物を提供し、前記組成物は、化学療法を受けるがん患者向けのアジュバントの製造に使用することができる。
【００２８】
具体的に、本発明で使用される大豆発酵抽出物は、水性大豆抽出物と少なくとも１種の乳酸菌及び選択的に少なくとも１種の酵母の発酵によって製造された抽出物を指す。一実施形態において、前記少なくとも１種の乳酸菌はラクトバシラス種であり、前記少なくとも１種の酵母はサッカロミケス種である。特定の実施形態において、前記発酵はラクトバシラスの異種培養を用いて実施され、例えば、５または１０、１５、２０、２５、３０株のラクトバシラスの培養と、好ましくは少なくとも１種の酵母が、前記ラクトバシラスの異種培養に添加される。前記発酵に使用可能なラクトバシラスの株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＣＣＲＣ（台湾食品工業発展研究所生物資源保存及び研究センター、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１０６９５及び（または）１４０２６、１４０６４、１４０６５、１４０７９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＣＣＲＣ  １０６９６及び（または）１４００７、１４００９、１４０１０、１４０６９、１４０７１、１４０９８、１６０５４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＣＣＲＣ  １０７９１及び（または）１２２６７、１２３０６、１２３１２、１２３１５、１２３２３、１４０１６、１４０１５、１４１１７、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ  ＣＣＲＣ  １４０１１及び（または）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ＣＣＲＣ  １６０５９を含むがこれらに限らない。前記発酵に使用可能な酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＣＲＣ  ２０５７７及び（または）２０５７８、２０５８１、２１４９４、２１５５０、２１７９７、２１８０５、２２１３８、２２２３４、２２３３７、２２７３１、２２７２８、及び（または）Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ  ＣＣＲＣ  ２１２６９及び（または）２１７４２、２２０５７を含むがこれらに限らない。具体的に、前記発酵の後には滅菌、ろ過、濃縮、凍結乾燥またはこれらの任意の組み合わせなどの工程が続く。好ましくは、前記発酵の後に例えば加熱による滅菌が行われ、さらに選択的にろ過及び濃縮が行われる。より好ましくは、前記大豆発酵抽出物を例えば凍結乾燥により乾燥させて、粉末状の大豆発酵抽出物を得る。特定の実施形態において、本発明の大豆発酵抽出物は、（ａ）水性大豆抽出物を少なくとも１種の乳酸菌及び少なくとも１種の酵母と発酵させて発酵液を形成する工程、（ｂ）前記発酵液を滅菌する工程、（ｃ）滅菌済みの前記発酵液をろ過してろ液を収集する工程、（ｄ）前記ろ液を濃縮し、濃縮大豆発酵抽出物を得る工程を含むプロセスによって製造される。具体的な実施形態において、大豆は蒸留水と混合され（例えば、約１：１０の割合で）、この混合物が約１００℃で約３０分間加熱された後ろ過される。これにより水性大豆抽出物が得られ、さらに少なくとも１種の乳酸菌と少なくとも１種の酵母で適切な培地において発酵され、３６〜４３℃で４５〜５０時間培養される。発酵した抽出物��滅菌、ろ過、（例えばろ液中の約９５％の水含量を除去して）濃縮され、濃縮された形態の大豆発酵抽出物が得られる。特定の実施形態において、前記大豆発酵抽出物の具体的な比重は１．１３６ｇ／ｍｌで、７１．４９％の水分、５．１５％の灰、０．１６％の粗脂肪、５．４５％の粗タンパク質、０．１５％の粗繊維、及び炭水化物を含む。また、０．００４ｍｇ／１００ｇのビタミンＢ１、０．１２ｍｇ／１００ｇのビタミンＢ２、２．１７ｍｇ／１００ｇの鉄、１１３．５５ｍｇ／１００ｇのカルシウム、３７９．１９ｍｇ／１００ｇのリンなど複数のビタミンとミネラルも含むことができる。本発明で使用される大豆発酵抽出物は、米国特許第６８５５３５０号及び第６７３３８０１号に従って調製され、これらの文献はその全体を参照として本明細書に組み入れる。
【００２９】
さらに、前記緑茶抽出物、前記ウコン抽出物、前記グレープシード抽出物は、水とエタノールでの抽出を含む一般的な標準手順で作成される。スピルリナは収穫後乾燥させて粉末または錠剤にすることで得られる。前記ベニクスノキタケ菌糸体は一般的な液体発酵の後、乾燥、濃縮及び（または）粉末に研磨することで得られる。これら成分はすべてメーカーから市販されており、購入可能である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態に基づき、本発明の組成物は、大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物を含み、それらの重量比は１２〜３０：４：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２であり、好ましくは１２〜２０：４：１〜２：１〜２：１〜２：１〜２である。本発明の具体的な実施形態に基づくと、大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物の重量比は１２：４：２：１：１：１である。本発明の別の具体的な実施形態に基づくと、大豆発酵抽出物、緑茶抽出物、スピルリナ、ウコン抽出物、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物の重量比は１２：４：１：１：２：１である。上述の重量比下で、前記組成物の各成分の重量割合は異なる状況に基づいて適切に調整することができる。
【００３１】
本発明の組成物は食品または医薬品として製造することができる。食品タイプの製品は従来の賦形剤または充填剤を用いた任意の従来の技法により調製することができ、必要に応じて添加物を混合することができる。また、医薬品は本発明の組成物の治療有効量と薬学的に許容可能な担体を用い、一般に薬学的技法または方法で調製することができる。本発明の組成物の投与には、経口投与または注射が含まれ、さらに薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び（または）賦形剤を含んでもよい。上述の担体は、溶剤、分散媒質、塗膜、抗菌剤、抗真菌薬、等張剤、吸収遅延剤等とすることができる。前記希釈剤は無菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝液、リンガー溶液、またはグルコース溶液等とすることができる。前記賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、乳糖、でんぷん、ゼラチン、アルギン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム等とすることができる。
【００３２】
一部の特定の実施形態において、本発明の組成物は大腸ポリープの増殖及び（または）がん化を阻害する効果を備えている。具体的に、実施形態に示されるように、本発明の組成物は１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）により誘発される異常陰窩巣（ＡＣＦ）を阻害することができ、かつ大腸ポリープの増殖及び（または）がん化を阻害する効果も備えている。
【００３３】
一部の特定の実施形態において、本発明の組成物は、がん患者の生存、特に無増悪生存期間の延長を含む、化学療法の有効性を向上する効果を備えている。実施形態に示されるように、本発明の組成物と化学療法を受けている被験者は、本発明の組成物なしで化学療法を受けている被験者より寿命が延長され、特に無増悪生存期間が延長された。
【００３４】
一部の特定の実施形態において、本発明の組成物は化学療法へのコンプライアンス向上の効果を備えている。実施形態に示されるように、本発明の組成物と化学療法を受けている被験者は、本発明の組成物なしで化学療法を受けている被験者より、大幅に高い化学療法へのコンプライアンスを示した。
【００３５】
一部の特定の実施形態において、本発明の組成物は化学療法により引き起こされる副作用を減少する効果を備えている。実施形態に示されるように、本発明の組成物をがんの化学療法プロセス中に与えると、前記組成物が化学療法の副作用、特に、腎損傷の減少と好中球減少症の改善が可能であることが分かった。
【００３６】
加えて、本発明に基づき、本明細書で説明する組成物は、抗炎症剤として使用することができる。具体的に、本発明の組成物は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）など、マクロファージ等の炎症細胞中の炎症メディエーター産生を効果的に減少する。
【００３７】
本発明は、前立腺がん、乳がん、子宮がん、血液がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、精巣がん、リンパ腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、肺がん、脳腫瘍、皮膚がん、胃がん、口腔がん、肝臓がん、喉頭がん、胆嚢がん、甲状腺がん、肝臓がん、腎臓がん、上咽頭がんを含む、がんを患う患者に適用できる。本発明の一実施形態によると、前記患者は結腸直腸がん患者である。本発明の実施形態に基づき、前記化学療法は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチンを含む薬剤を使用した治療である。
【００３８】
本発明は以下の実施形態によってさらに明らかになる。以下の実施形態は限定ではなく、例示を目的として提供されている。当業者であれば、本発明の開示を踏まえ、開示された具体的な実施形態において多くの変更が可能であり本発明の要旨と範囲から逸脱することなく、同じまたは類似の結果を得ることができる点に理解が必要である。
【実施例１】
【００３９】
１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）により誘発される異常陰窩巣（ＡＣＦ）形成の阻害
【００４０】
１．１  材料および方法  
【００４１】
動物実験が国立台湾大学動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により許可され、すべての動物が実験動物のケアと使用に関する標準指針に従って処理された。約６週齢のＦ３４４オスラットが国立台湾大学医学部実験動物センター（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）より購入された。
【００４２】
オスＦ３４４ラットは重量別に８匹ずつ無作為にグループ分けされた。ラットは取得１週間後から重量パーセントで１７．７％のたんぱく質、６４．９％の炭水化物、５．２％の脂肪を含むＨａｒｌａｎ  ＡＩＮ−７６齧歯類用精製飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国インディアナ州インディアナポリス）（Ｈａｒｌａｎ  ＡＩＮ−７６Ａ精製飼料データシート、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．参照元：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｒｌａｎ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｘｄ／１１３１ａ６ｅ１６１７３４８ｂ９ａ９９ｃ８ｄ２ａｆ９３３ｆ７９６．ｐｄｆ？ｄ＝１７０４８１）が与えられた。ラットはステンレス製のケージ内に飼料と蒸留水を自由に摂取できる状態で保たれた。動物の部屋は２３±１℃、湿度５０±１０％、１２時間ごとの昼夜サイクルで維持された。飼料の摂取と重量が毎日記録された。
【００４３】
本発明の組成物（ＭＢ−６）には、例えば大豆発酵抽出物（米国特許第６８５５３５０号及び第６７３３８０１号の方法に従って調製）、緑茶抽出物（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｏ．）、スピルリナアルジー（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、ウコン抽出物（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ  Ｌ．）、ベニクスノキタケ菌糸体、グレープシード抽出物（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）の６つの成分が含まれる。表１に特定の実施形態における重量比１２：４：２：１：１：１のＭＢ−６の成分を示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
動物は、１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）注射を受けた対照群Ｃ１、生理食塩水注射を受けた対照群Ｃ２、本発明の６成分製剤の低用量（１７．３ｍｇ／ラット／日）を受けた実験群Ｂ１、本発明の６成分製剤の中用量（３４．６ｍｇ／ラット／日）を受けた実験群Ｂ２、本発明の６成分製剤ＭＢ−６の高用量（６９．２ｍｇ／ラット／日）を受けた実験群Ｂ３にグループ分けされた。ＤＭＨを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）に溶解して２％溶液が作成され、ｐＨ６．７に調整された後等分され、−２０℃で必要時まで保管された。ＤＭＨが腹腔内（ＩＰ）注射で毎週２０ｍｇ／ｋｇの用量で４週間投与された（体重１ｋｇにつき２％溶液１ｍｌの注射に相当）。対照群には生理食塩水の注射が行われた（体重１ｋｇにつき１ｍｌの生理食塩水）。表２と表３に示す。
【００４６】
【表２】
2015051970.tif 000004
【００４７】
【表３】
2015051970.tif 000005
【００４８】
１５週目に動物は１晩絶食され、翌日二酸化炭素吸引により安楽死させられた。その後結腸が取り除かれて長さと重量が測定され、異常陰窩巣（ＡＣＦ）の数と各ＡＣＦを構成する陰窩の数がカウントされた。簡単に言うと、結腸は長手方向の軸に沿って切られ、粘膜内層を上向きに開いて広げられ、手前、中間、後方の３部分に切断された。各部分が１０％の緩衝ホルマリンを入れたペトリ皿内のフィルタ紙２枚の間に置かれ、２４時間以上固定された。ＡＣＦ定量化のため、固定された結腸組織が０．２％メチレンブルー（ＰＢＳを溶剤とする）で染色され、光学顕微鏡４０〜１００倍の拡大率でＡＣＦ数が評価された。陰窩数を判定するため、ＡＣＦ当たりの陰窩数がさらに１〜３陰窩、４〜６陰窩、７陰窩以上に分類された。
【００４９】
ＳＡＳソフトウェアを使用して実験データが一元配置分散分析法（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により分析され、スチューデントのＴ検定で群間の違いの比較が行われた。ｐ＜０．０５の結果は有意差を示している。
【００５０】
１．２  結果
【００５１】
合計５０匹のＦ３４４ラットがＣ１（ＤＭＨ対照群）、Ｃ２（標準対照群）、Ｂ１（ＭＢ−６−Ｌ）、Ｂ２（ＭＢ−６−Ｍ）、Ｂ３（ＭＢ−６−Ｈ）の群に無作為に割り当てられた。経時的に５群の体重の間に大きな差はなかった。結腸当たりのＡＣＦ数を図１Ａに示す。ＭＢ−６治療ラットは、Ｃ１（ＤＭＨ対照群）のラットと比較して、結腸当たりの合計ＡＣＦ数において有意な減少を示した（４０．６〜５１．０％、Ｐ＜．０５）。ＡＣＦ当たりの陰窩数がさらに１〜３陰窩（小）、４〜６陰窩（中）、７陰窩以上（大）に分類された。ＭＢ−６は化学誘発ＡＣＦの形成を有意に抑制し、かつ７陰窩以上の群において最高の阻害率（８１．７％、図１Ｂ）が観察された。表４と表５も併せて参照する。
【００５２】
【表４】
2015051970.tif 000006
【００５３】
【表５】
2015051970.tif 000007
【００５４】
まとめると、動物実験では本発明の６成分の調剤が１，２−ジメチルヒドラジンにより誘発される異常陰窩巣の数を効果的に減少し、特に大きい異常陰窩巣の発生を減少することが示された。
【実施例２】
【００５５】
１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）により誘発される結腸直腸がん形成の阻害
【００５６】
２．１  材料および方法  
【００５７】
購入した６週齢のＦ３４４オスラットが取得１週間後に無作為にグループ分けされた。各群３０匹とした。動物は、１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）注射を受けた対照群Ｃ１、生理食塩水注射を受けた対照群Ｃ２、本発明の６成分製剤の中用量（３４．６ｍｇ／ラット／日）を受けた実験群Ｂ２にグループ分けされた。ＤＭＨを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）に溶解して２％溶液が作成され、ｐＨ６．７に調整された後等分され、−２０℃で必要時まで保管された。ＤＭＨが腹腔内（ＩＰ）注射で毎週３０ｍｇ／ｋｇの用量で８週間投与された（体重１ｋｇにつき２％溶液１．５ｍｌの注射に相当）。対照群には生理食塩水の注射が行われた（体重１ｋｇにつき１．５ｍｌの生理食塩水）。表６と表７に示す。
【００５８】
【表６】
2015051970.tif 000008
【００５９】
【表７】
2015051970.tif 000009
【００６０】
３２週の実験期間の終了時に、実験動物は１晩絶食され、翌日エーテル麻酔により安楽死させられ、解剖された。動物の結腸が取り除かれて長さと重量が測定され、続く腫瘍分析のために保存された。
【００６１】
結腸、盲腸、小腸、胃が取り出され、これら臓器の長手方向の軸に沿って完全に切開された。リン酸緩衝生理食塩水での洗浄後、これら臓器はフィルタ紙上に粘膜を上向きにして平らに置かれた。試料上の腫瘍が検査され、腫瘍の位置、数、大きさが記録された。各腫瘍の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）、深さ（Ｄ）がバーニヤで測定され、各腫瘍の体積（Ｖ）が公式：Ｖ＝（Ｌ＊Ｗ＊Ｄ＊π）／６で算出された。試料の写真が撮影され、保存された。
【００６２】
ＳＡＳソフトウェアを使用して実験データが一元配置分散分析法（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）により分析され、スチューデントのＴ検定で群間の違いの比較が行われた。ｐ＜０．０５の結果は有意差を示している。
【００６３】
２．２  結果
【００６４】
表８に示すように、腫瘍数について、本発明の６成分調剤は１，２−ジメチルヒドラジンにより誘発される腫瘍形成を効果的に阻害し、阻害率は３８．４％で、統計的有意差があった（ｐ＜０．０５）。
【００６５】
【表８】
2015051970.tif 000010
【００６６】
さらに、表９に示すように、腫瘍はその体積に基づいて、０〜１００ｍｍ３（小型）、１００〜５００ｍｍ３（中型）、５００ｍｍ３超（大型）の３つのグループに分類された。本発明の６成分調剤は１，２−ジメチルヒドラジンにより誘発される腫瘍を阻害でき、特に、小型（０〜１００ｍｍ３）の腫瘍を阻害率４９．７％で有意に阻害した（ｐ＜０．００１）。
【００６７】
【表９】
2015051970.tif 000011
【実施例３】
【００６８】
マウスにおける結腸直腸がんの体積減少と生存期間の延長
【００６９】
３．１  材料および方法
【００７０】
オスＢＡＬＢ／ｃマウスが台湾国立実験動物センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）で購入され、２１±２℃、１２時間ごとの昼夜サイクルで維持された。ＡＩＮ−７６精製飼料と蒸留水が不断給与された。
【００７１】
マウスが１２匹ずつ７つの群に無作為に分けられ、１ケージに３匹ずつ入れられた。マウス結腸がん細胞株ＣＴ−２６−ＶＤが５％のＣＯ２を含むインキュベータ内で１０％ウシ胎児血清を含む完全なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ＃１１９９５）で３７℃で培養された。マウス結腸がんモデルの確立については先に説明されている（Ｗｉｔｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ２０１４；８８：１１８８〜９５）。簡潔には、マウスの重量を測定し、体重に基づいた適切な用量のペントバルビタールナトリウム（Ｓｏｍｎｏｔｏｌ、カナダ、１０μＬ／ｇ、６．５ｍｇ／ｍｌ）で麻酔した。１００μＬのＣＴ−２６−ＶＤ細胞懸濁液（２×１０５細胞／ｍＬ、２×１０４細胞／マウス）がマウスの脾臓に注射され（０日目）、動物は回復まで低体温症から保護された。治療されたマウスには３つの異なる用量のＭＢ−６（０．６２５ｇ／ｋｇ（ＭＢ−６−Ｌ）、１．２５ｇ／ｋｇ（ＭＢ−６−Ｍ）、２．５ｇ／ｋｇ（ＭＢ−６−Ｈ））が経口投与された。その後マウスは腫瘍細胞注射後３日目と６日目にＬＶ／５−ＦＵ（ロイコボリン／５−フルオロウラシル）で治療された。陰性対照（ＮＣ）と陽性群マウスには被験物質ＭＢ−６の代わりとしてそれぞれ滅菌ミリＱ水とＰＳＫ（多糖Ｋ、０．３２５ｇ／ｋｇ）が投与された。各群の概要を表１０に示す。
【００７２】
【表１０】
2015051970.tif 000012
ＮＣ、陰性対照；ＰＳＫ、多糖Ｋ；ＭＢ−６−Ｌ、０．６２５ｇ／ｋｇ  ＭＢ−６；ＭＢ−６−Ｍ、１．２５ｇ／ｋｇ；ＭＢ−６−Ｈ、２．５ｇ／ｋｇ  ＭＢ−６；ＬＶ／５−ＦＵ、ロイコボリン／５−フルオロウラシル。
【００７３】
各マウスの体重が週１回監視された。１５日目にマウスにルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ）を注射し、３％イソフルランの吸入により麻酔した後、非侵襲性ＩＶＩＳイメージングシステム１００シリーズ（Ｘｅｎｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を装備した暗い箱の中に入れた。腫瘍成長を判定するためにシステムソフトウェアを使用して生体発光が定量化された。各マウスの寿命が５５日まで記録された。研究終了後、すべての動物が二酸化炭素吸引により安楽死された。
【００７４】
３．２  結果  
【００７５】
ＬＶ／５−ＦＵ化学療法群と比較して、ＭＢ−６はＣＴ−２６−ＶＤ保有ＢＡＬＢ／ｃマウスの飼料摂取及び体重に影響しなかった。生体発光定量化の結果、１．２５または２．５ｇ／ｋｇのＭＢ−６投与はＬＶ／５−ＦＵ化学療法による治療の有効性を有意に高めることが示された（データ未提示）。生存期間の中央値は２７．５日（腫瘍のみ）、３０．５日（ＮＣ）、３４．５日（ＰＳＫ）、３５日（ＭＢ−６−Ｌ）、３９日（ＭＢ−６−Ｍ）、３９日（ＭＢ−６−Ｈ）であった（図２）。０．６２５〜２．５ｇ／ｋｇのＭＢ−６の投与は化学療法を受けた腫瘍保有マウスの寿命を有意に延長したが、そのうちＭＢ−６−ＭはＮＣ群と比較して３０％以上寿命を延長した。
【実施例４】
【００７６】
ヒト臨床試験
【００７７】
４．１  材料および方法
【００７８】
４．１．１  適格患者
【００７９】
この研究は比較群あり、多施設共同、並行群間比較、二重盲検、ランダム化、プラセボ対照臨床研究であり、ＦＯＬＦＯＸ４（５−ＦＵ＋ＬＶ＋オキサリプラチン）との組み合わせで、ｍＣＲＣ患者におけるＭＢ−６の有効性と安全性をプラセボと比較して評価した。この臨床研究は、研究に参加した６病院の治験審査委員会により承認され、すべての患者から書面によるインフォームドコンセントが提供された。
【００８０】
２０歳以上で、組織学的にＣＲＣ及び（または）転移ガンの臨床所見が確認され、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のいずれかにより１つ以上の測定可能な病変を有し、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  群（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスが２以下で、適切な骨髄予備能（ヘモグロビン９ｇ／ｄＬ以上、絶対好中球数が１．５×１０９／Ｌ以上、血小板が１００×１０９／Ｌ以上）、及び肝腎機能（総ビリルビンが１．２５×以下、クレアチニンが１．２５以下、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノ酸転移酵素（ＡＳＴ）が２．５×正常値上限未満）を備えた患者が適格とされた。
【００８１】
妊娠中または授乳中の患者、適切な避妊方法を実施していない患者、中枢神経系転移ガンの所見がある患者、全身性抗微生物治療が必要な活動性感染症を有する患者、現在慢性的下痢及びその他重篤な共存症（例：狭心症、心筋梗塞、鬱血性心不全、てんかん、または治験医師の判断でその他重大な医療条件）がある患者、２つ目の原発性悪性腫瘍の病歴がある患者（適切に治療された皮膚の基底細胞がんまたは子宮頸部上皮内がんを除く）、またはその他抗がん治療を同時に受けている患者、または過去４週間以内に別の新薬で治療を受けた患者は除外された。
【００８２】
４．１．２  治療プロトコル   
【００８３】
患者はＭＢ−６と併用ＦＯＬＦＯＸ４（ｄｅ  Ｇｒａｍｏｎｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００；１８：２９３８〜４７；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；２２：２３〜３０）で治療された。ＭＢ−６の用量は各３２０ｍｇの６カプセルが１日３回食事とともに投与された。プラセボ群は不活性成分のみの同じ数のカプセルを摂取した。ＦＯＬＦＯＸ４化学療法レジメンが、ＬＶ（２００ｍｇ／ｍ２）とオキサリプラチン（８５ｍｇ／ｍ２）の２時間の点滴、続いて４００ｍｇ／ｍ２の５−ＦＵボーラス投与の２２時間の点滴と１日目６００ｍｇ／ｍ２、及び２時間のＬＶ２００ｍｇ／ｍ２点滴、続いて４００ｍｇ／ｍ２５−ＦＵボーラス投与の２２時間の点滴と２日目６００ｍｇ／ｍ２として行われた。ＦＯＬＦＯＸ４レジメンは２週間ごとに合計１６週間繰り返された。
【００８４】
４．１．３  経過観察評価
【００８５】
ランダム化の前に２週間ごとにバイタルサインと体重が測定された。血清がん胎児性抗原（ＣＥＡ）値と血液学的及び生化学的パラメータ（赤血球（ＲＢＣ）数、ヘマトクリット値、白血球（ＷＢＣ）、血小板数、絶対好中球数、白血球百分率、総ビリルビン、クレアチニン、ＡＬＴ及びＡＳＴ）の測定が４週間ごとに実施された。腫瘍評価は８週間ごとに実施された。薬剤コンプライアンスは毎回の検査訪問時に記録された。
【００８６】
４．１．４  主要エンドポイント      
【００８７】
この研究の主要な有効性エンドポイントが、先行研究（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；４５：２２８〜４７）に従い、ＭＢ−６に対する最良総合効果（ＲＥＣＩＳＴ  １．１基準による完全奏効（ＣＲ）＋部分奏効（ＰＲ））の算出とプラセボを受けた患者の結果との比較により評価された。
【００８８】
４．１．５  二次エンドポイント
【００８９】
無増悪生存率（ＰＦＳ）がランダム化の日から疾患の増悪が観察された日までの期間として評価された。あらゆる死因による死亡が増悪事象と見なされた。疾患の増悪または生存経過観察が記録されていない患者は最後の客観的腫瘍評価の日に打ち切られた。事後ベースライン腫瘍評価または生存経過観察が行われていない場合、増悪は治験薬の開始日に打ち切られた。
【００９０】
治験薬の開始時または開始後に生じた有害事象（ＡＥ）は、ＭｅｄＤＲＡコーディング辞典（Ｐｒｏｇｒａｍ  ＣＴＥ．  Ｃｏｍｍｏｎ  ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）．Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ２００６）により器官別大分類と基本語に従って分類された。ＡＥの期間、重篤度、治験薬との関連性、対応措置、結果が記録された。事象が重篤な有害事象（ＳＡＥ）として分類されるか否かも記録された。
【００９１】
４．２  結果
【００９２】
４．２．１  患者層
【００９３】
合計７２名の転移性結腸直腸がんを患う患者が採用された。被験者は二重盲検法でランダム化され、ランダム置換ブロックサイズを使用してＭＢ−６またはプラセボのいずれかを１：１の割合で受けた。３４名の患者がＭＢ−６群に、３８名がプラセボ群に、それぞれランダム化された。合計６０名の患者（ＭＢ−６群２９名とプラセボ群３１名）が１６週間の治験を完了した（８３．３％）。全７２名の患者がＩＴＴ（ｉｎｔｅｎｔ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ）人数に含められた。２群間の患者層とベースライン特性に違いはなかった（ｐ＞．０５）。
【００９４】
４．２．２  主要評価項目
【００９５】
最良総合効果はＭＢ−６群で４１．２％、プラセボ群で３９．５％であり、差は有意でなかった（Ｐ＝１．０００）。ＲＥＣＩＳＴ  １．１の基準による最後の測定での腫瘍縮小効果（ＣＲ＋ＰＲ）は、ＭＢ−６群が６１．８％、プラセボ群が６３．２％であった。
【００９６】
４．２．３  副次評価項目
【００９７】
１６週間の治験期間中にＭＢ−６群の患者で疾患の増悪を示した者はいなかったが、一方プラセボ群では６名の患者が増悪を示した。ＭＢ−６群の患者はプラセボ群の患者よりも有意に低い疾患増悪率を示した（０．０％対１５．８％、Ｐ＝．０２６）。ＭＢ−６群に死亡者はいなかったが、１６週間の治験期間中にプラセボ群では２名が死亡した。さらに、８週間の投薬中止後、本発明の６成分製剤で治療を受けた患者における無増悪生存率は有意に高まった（ｐ＝０．００５６）。表１１に示す。
【００９８】
【表１１】
2015051970.tif 000013
【００９９】
さらに、ＭＢ−６群ではベースラインから有意な体重減少はなかったが、一方でプラセボ群では治験の４週目、６週目、８週目で有意な体重減少が示された（Ｐ＜．０５）。しかし、治験終了時２群間の体重変化の違いは有意ではなかった（Ｐ＝．１１４）。加えて、血清ＣＥＡ値にはＦＯＬＦＯＸ４化学療法で８週目に有意な減少があり、減少はＭＢ−６の存在下でも同様であった。
【０１００】
また、ＭＢ−６のコンプライアンスは９３．８±１１．６％で、プラセボでは９４．１±１１．４％であった（Ｐ＝．９１９）。興味深いことに、ＭＢ−６群はプラセボ群と比較してＦＯＬＦＯＸ４化学療法に有意に高いコンプライアンスを示した（それぞれ９４．４±７．８％対８９．０±１３．２％、Ｐ＝．０３７）。表１２に示す。
【０１０１】
【表１２】
2015051970.tif 000014
【０１０２】
表１２に示すように、本発明の組成物（ＭＢ−６）は被験者の化学療法への許容度を高めた（ｐ＝０．０３７０）。
【０１０３】
４．２．３  安全性と副作用の減少
【０１０４】
ＡＥ（副作用）の重篤度がＣＴＣＡＥ  ３．０にしたがい、１＝軽度、２＝中程度、３＝重篤、４＝生命を脅かす、５＝死亡に分類された。一般に、プラセボ群はＭＢ−６群よりもグレード４以上のＡＥ発生率が有意に高かった（それぞれ２８．９％対２．９％、Ｐ＝．００４）。合計１９名の患者（ＭＢ−６群６名、プラセボ群１３名）から２８の重篤な有害事象（ＳＡＥ）が報告された。特に、プラセボ群はＭＢ−６群よりも血清クレアチニン増加の発生率も有意に高く（２９％対５．９％、Ｐ＝．０１４）、ＭＢ−６群が化学療法により引き起こされる腎臓への副作用を減少したことを示している。表１３に示す。
【０１０５】
【表１３】
2015051970.tif 000015
【０１０６】
さらに、本発明の６成分製剤（ＭＢ−６）は化学療法により引き起こされる好中球減少症、特により重篤なものを高いレベルで改善することができる（レベル４以上、ｐ＝０．０３０２）。表１４に示す。
【０１０７】
【表１４】
2015051970.tif 000016
【実施例５】
【０１０８】
消炎の研究
【０１０９】
マクロファージは炎症反応において中核的な役割を果たす。ＬＰＳによる活性化後、ＮＦ−κＢ経路とＭＡＰキナーゼ経路を含む下流のシグナル伝達経路の活性化を生じる。これらシグナル伝達経路は、ＮＯ、ＰＧ、炎症性サイトカインを含むさまざまな炎症性メディエーターの発現を誘発する。したがって、ＲＡＷ  ２６４．７マウスマクロファージ様細胞は、消炎作用のスクリーニングに優れたモデルを提供する。
【０１１０】
５．１  材料および方法
【０１１１】
５．１．１  細胞培養と試料処理
【０１１２】
ＲＡＷ  ２６４．７細胞が１０％のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地で、加湿された５％ＣＯ２空気中において３７℃で培養された。ＲＡＷ  ２６４．７細胞は０．１〜１×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種された。その後細胞は０．０６２５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で試験試料（ｔｅｓｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ）（ＭＢ−６）と、または陽性対照（デキサメタゾンまたはセレブレックス）とインキュベーションされた後、ＬＰＳ  １００ｎｇ／ｍｌで１８時間活性化された。培養期間の終わりに、細胞生存性が比色定量ＭＴＴアッセイで判定された。細胞培養上清が保存され、−２０℃で亜硝酸塩、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６レベルの分析用に凍結保存された。
【０１１３】
５．１．２  亜硝酸塩の判定
【０１１４】
培地中の亜硝酸塩のレベルがＧｒｉｅｓｓ試薬システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して判定され、ＮＯレベルを反映すると推測された。簡潔には、５０μｌの細胞培養培地が５０μＬのスルファニルアミド溶液と混合され、室温で１０分間インキュベーションされた後、５０μＬのＮＥＤ溶液が添加され、さらに１０分間室温でインキュベーションされた。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、米国バーモント州ウィヌースキ）を使用して５２０ｎｍで吸収度が測定された。すべての実験で新鮮な培地がブランクとして使用された。試料中の亜硝酸塩のレベルが標準亜硝酸ナトリウム曲線から読み取られた。
【０１１５】
５．１．３  ＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６アッセイ
【０１１６】
培地中のＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６のレベルがＥＩＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）を使用して定量化された。
【０１１７】
５．２  結果
【０１１８】
５．２．１  ＬＰＳ誘発ＮＯ及びＰＧＥ２産生と細胞生存に対するＭＢ−６の効果
【０１１９】
ＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるＬＰＳ誘発ＮＯ及びＰＧＥ２産生に対するＭＢ−６の効果を評価するため、培地が採取され、亜硝酸塩とＰＧＥ２のレベルが測定された。ＭＢ−６は用量依存的にＬＰＳ誘発ＮＯ産生を有意に阻害した。さらに、ＭＢ−６での治療はＬＰＳ誘発ＰＧＥ２産生も減少した。セレブレックス、ＣＯＸ−２阻害薬がＰＧＥ２産生の陽性対照として使用された。さらに、ＲＡＷ  ２６４．７細胞でＭＴＴアッセイを使用してＭＢ−６の細胞傷害効果が評価され、ＭＢ−６は使用された濃度（０．０６２５〜１ｍｇ／ｍｌ）では細胞生存性に影響しなかった。
【０１２０】
５．２．２  ＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α及びＩＬ−６放出に対するＭＢ−６の効果
【０１２１】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−６放出などのＬＰＳ誘発サイトカインに対するＭＢ−６の効果がさらに酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって検査された。ＭＢ−６での細胞の事前処理がＩＬ−６とＴＮＦ−αの産生を有意に減少したことが分かった。結果を表１５に示す。
【０１２２】
【表１５】
2015051970.tif 000017
【０１２３】
まとめ
【０１２４】
この研究の結果は、ＭＢ−６が結腸がんを患う患者において化学療法の有効性を高めることを確認した。臨床前の生体内試験ではＭＢ−６がＬＶ／５−ＦＵで治療を受けた結腸がん保有ＢＡＬＢ／ｃマウスの寿命を延長できることが示された。臨床研究の結果によると、ＭＢ−６の投与を受けた患者は１６週間の治験期間にわたりプラセボ群と比較してＰＦＳが有意に高く、８週目にＭＢ−６群とプラセボ群で同様の血清ＣＥＡ値低下が見られたことから、ＭＢ−６の添加はＦＯＬＦＯＸ４の有効性を損なわないことが示された。さらに、ＭＢ−６群では有意に高いＦＯＬＦＯＸ４のコンプライアンスが観察され、より高い許容度が示された。また、ＭＢ−６群はグレード４以上のＡＥ発生が有意に低かった。
【０１２５】
ＭＢ−６群の患者はＰＦＳ中央値が有意に高く、疾患の進行がより遅かったため、ＭＢ−６がＦＯＬＦＯＸ４の治療を受けるｍＣＲＣ患者の全体的生存品質を向上したことが示唆される。これらのデータは、ＭＢ−６が化学療法を受けた腫瘍保有マウスの寿命を３０％以上延長したことを示す臨床前試験と一貫している。
【０１２６】
ＭＢ−６群とプラセボ群間の最良総合効果（ＣＲ＋ＰＲ）において有意な差はなかったが、データはＦＯＬＦＯＸ４の腫瘍縮小効果が５８．５％であることを示した先行研究（Ｔｏｕｒｎｉｇａｎｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４：３９４〜４００）と一貫している。これは、ＭＢ−６がｍＣＲＣ患者におけるＦＯＬＦＯＸ４の有効性を損なわなかったことを示唆している。また、研究終了時、２群間でＣＥＡ値と免疫機能においても有意な差はなく、ＭＢ−６が化学療法レジメンに悪影響を生じないことが確認されている。つまり、ＭＢ−６はこれら転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）患者におけるＦＯＬＦＯＸ４の細胞傷害効果に干渉しなかった。さらに、本研究のデータではＭＢ−６が消炎活性を提供できることも示されており、これはＭＢ−６で治療したがんの進行がより遅いという結果を支持している。
【０１２７】
まとめると、臨床前体内研究ではＭＢ−６がＬＶ／５−ＦＵで治療された結腸がん保有Ｂａｌｂ／ｃマウスの寿命を延長できることが示された。臨床研究の結果によると、ＭＢ−６の投与を受けた患者は１６週間の治験期間中プラセボ群と比較してＰＦＳが有意に高く、かつグレード４以上のＡＥ発生率が有意に低いことが示された。
【０１２８】
本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が、更なる例示の必要なく、ここに開示された説明に基づき本発明を最大範囲まで拡大利用することが可能であろう。したがって、本発明の説明、実施例、請求の範囲は本発明の範囲を制限するものではなく例示的なものであると理解されるべきである。
【符号の説明】
【０１２９】
なし
【図１】
2015051970.tif 000018
【図２】
2015051970.tif 000019
【図３】
2015051970.tif 000020
【外国語明細書】
2015051970000001.pdf
2015051970000002.pdf
2015051970000003.pdf
2015051970000004.pdf