(57)【要約】【課題】神経芽腫高リスク群患者は、外科的切除・化学療法・放射線療法などを用いた強度な治療にも関わらず、高頻度に転移・再燃を起こすことからその予後は悪い。再燃症例に対しては、シスプラチンなどの従来神経芽腫の治療に用いられている化学療法剤は効果がなく、現在のところ有効な治療法は確立されていない。【解決手段】本発明者らは、先行研究により神経芽腫において腫瘍促進的に機能することが明らかとされている転写因子LMO1が発現調節を行う遺伝子（LMO1標的遺伝子）を同定することにより、神経芽腫において腫瘍促進的に機能する複数の分子経路（LMO1分子経路）を推定した。これらの分子経路を阻害する分子阻害剤を神経芽腫培養細胞に投与し、これらが神経芽腫細胞の増殖を抑制することを明らかにした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
LOM1シグナル伝達に係わるSrc、RASA1、ILKのいずれかの機能を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする神経芽腫治療剤。
【請求項２】
Srcを阻害する物質がKX2-391である請求項１記載の神経芽腫治療剤。
【請求項３】
RASA1を阻害する物質がPluripotinである請求項１記載の神経芽腫治療剤。
【請求項４】
ILKを阻害する物質がCpd22である請求項１記載の神経芽腫治療剤。
【請求項５】
被検化合物の存在下と非存在下で、Srcの活性を比較し、Ｓｒｃ阻害活性の有無を分析する工程を含む、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
被検化合物の存在下と非存在下で、RASA1の活性を比較し、ＲＡＳＡ１阻害活性の有無を分析する工程を含む、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
被検化合物の存在下と非存在下で、ILKの活性を比較し、ＩＬＫ阻害活性を有する化合物を選択する工程を含む、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
LOM1シグナル伝達に係わるSrc、RASA1、ILKのいずれかの機能を阻害することを特徴とする神経芽腫細胞増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経芽腫に対する治療剤および細胞増殖抑制方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は白血病、脳腫瘍についで頻度の高い小児がんである。近年、神経芽腫に対する治療は格段に進歩し、低リスク群及び中リスク群の患者の5年生存率は95％を超えるまでになった。しかしながら高リスク群患者においては、外科的切除・化学療法・放射線療法などを用いた強度な治療にも関わらず、高頻度に転移・再燃（手術・化学療法などにより治癒に向かったが再度悪化すること）を起こすことからその予後は悪く、5年生存率は未だに50％以下となっている（非特許文献１）。再燃症例に対しては、シスプラチンなどの従来神経芽腫の治療に用いられている化学療法剤は効果がなく、現在のところ有効な治療法は確立されていない。そのため、再燃症例に有効な薬剤を開発するための、新たな治療標的分子の発見が重要な課題となっており、様々な分子がその候補として提唱されている（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００３】
最近、本発明者らが参加した最新のゲノム解析により、転写因子 Lim domain only 1 （LMO1）が神経芽腫、その中の特に高リスク群の発症に関わっていることが示され、さらに、神経芽腫の発生においてLMO1ががん遺伝子として腫瘍促進的に機能していることが明らかとなった（非特許文献４）。
【０００４】
このため、LMO1が神経芽腫細胞内で発現を制御している遺伝子（LMO1標的遺伝子）をゲノム網羅的に同定することにより、神経芽腫において機能する重要な腫瘍促進分子経路が解明され、その分子経路に対する阻害剤の開発あるいは既存の阻害剤の適用によって、現在治療法のない高リスク群の再発症例に対して有効な治療法が確立されると考え、本発明に導くに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Maris, J.M. Recent advances in neuroblastoma. N. Engl. J. Med. 362, 22022211 (2010)
【非特許文献２】Cole KA, et al. New strategies in refractory and recurrent neuroblastoma: translational opportunities to impact patient outcome. Clin. Cancer Res. 18, 2423-2428 (2012)
【非特許文献３】Verissimo CS, et al. Neuroblastoma therapy: what is in the pipeline? Endocr. Relat. Cancer 18, R213-231(2011)
【非特許文献４】Wang K, et al. Integrative genomics identifies LMO1 as a neuroblastoma oncogene. Nature 469, 216220 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
神経芽腫は白血病、脳腫瘍についで頻度の高い小児がんである。近年、神経芽腫に対する治療は格段に進歩し、低リスク群及び中リスク群の患者の5年生存率は95％を超えるまでになったが、高リスク群については未だに50％以下となっている。これは高リスク群患者においては転移・再燃が高頻度に起こることと再燃症例に対する有効な治療法が確立されていないことによる。そのため、再燃症例に有効な薬剤を開発するための、新たな治療標的分子の発見が重要な課題となっている。本発明は、神経芽腫に対する新規の治療標的分子とこれを阻害することによる新規の治療剤および細胞増殖抑制方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、クロマチン免疫沈降−シークエンス法(ChIP-Seq)と呼ばれる最新の解析手法を用いて、神経芽腫細胞においてLMO1が発現を調節している遺伝子（LMO1標的遺伝子）を同定し、これを基に神経芽腫細胞における腫瘍促進分子経路（LMO1分子経路）を複数明らかにした。これらのLMO1分子経路に係わるSrc、RAS p21 protein activator 1 (RASA1)、integrin-linked kinase (ILK)の３つの分子に注目した。
【０００８】
これらのLMO1分子経路に係わるSrc、RASA1、ILKにおいて、Ｓｒｃ分子阻害剤KX2-391（N-Benzyl-2-[5-[4-[2-(4-morpholinyl)ethoxy]phenyl]pyridin-2-yl]acetamide）、RASA1 分子阻害剤Pluripotin （N-(3-(7-(1,3-dimethyl-1H-pyrazol-5-ylamino)-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidin-3(4H)-yl)-4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)benzamide）、およびILK 分子阻害剤Cpd 22 (N-methyl-3-(1-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)-5-(4'-(trifluoromethyl)biphenyl-4-yl)-1H-pyrazol-3-yl)propanamide)を神経芽腫培養細胞に添加することで、その細胞増殖が抑制されることを見出した。
【０００９】
KX2-391およびCpd 22は、前立腺がんの動物モデルでの効果が確認され、Pluripotinは培養条件下で胎児幹細胞（ＥＳ細胞）などの多分化能を維持する際の有用性が提唱されているが、神経芽腫治療においてこれらの分子に対する阻害剤を用いることは、知られていない。この知見は神経芽腫に対する新規の治療分子標的とその阻害剤を提示するものであり、新規の治療方法を提唱するものである。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下と非存在下で、Ｓｒｃの活性を比較し、Ｓｒｃ阻害活性の有無を分析する工程を備えることを特徴とする。上記構成によって得られるＳｒｃ阻害活性を有する化合物は神経芽腫治療薬の開発に用いることができる。
【００１１】
また、本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下と非存在下で、RASA1の活性を比較し、RASA1阻害活性の有無を分析する工程を備えることを特徴とする。上記構成によって得られるRASA1阻害活性を有する化合物は神経芽腫治療薬の開発に用いることができる。
【００１２】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下と非存在下で、ILKの活性を比較し、ILK阻害活性の有無を分析する工程を備えることを特徴とする。上記構成によって得られるILK阻害活性を有する化合物は神経芽腫治療薬の開発に用いることができる。
【００１３】
LMO1標的遺伝子のひとつであるＫＨＤＲＢＳ２遺伝子がコードするタンパクは、細胞分裂促進的に機能する分子であり、Src分子はこのタンパクをリン酸化することによってその機能を活性化することが知られている。Src分子阻害剤はSrc分子によるＫＨＤＲＢＳ２タンパクの活性化を阻害することやSrc分子による他のタンパクのリン酸化を阻害することによりがん細胞の増殖を抑制することができる。
【００１４】
LMO1標的遺伝子のひとつであるRASA1遺伝子がコードするタンパクは、がん細胞の増殖能等について抑制的に機能するDLC1分子（がん抑制遺伝子として知られている）の機能を阻害する働きがある。RASA1分子阻害剤はRASA1によるこのがん抑制遺伝子に対する阻害作用を抑えることや他のリン酸化酵素の機能を阻害することによりがん細胞の増殖を抑制することができる。
【００１５】
LMO1標的遺伝子のひとつであるＬＩＭＳ１遺伝子がコードするタンパクは、ILK分子と複合体を形成し、がん細胞内で細胞分裂促進的に機能している分子である。したがって、ILK分子阻害剤はLIMS1-ILK複合体の機能を阻害することによりがん細胞の増殖を抑制することができる。
【発明の効果】
【００１６】
神経芽腫高リスク群患者においては、再燃が高頻度に起こるにも関わらず再燃症例に対する有効な治療法は確立されていないことから、その予後は悪く５年生存率は５０％以下となっている。LMO1は、高リスク群神経芽腫で機能している分子であり、この分子が調節している分子経路の阻害剤は再燃症例の治療に有効な可能性が高く、これらの分子阻害剤を治療に用いることにより高リスク群患者の予後を改善することが可能となる。本発明の神経芽腫の細胞増殖抑制法は、神経芽腫治療について、既存の製剤の新たな適用や新規分子阻害剤の創薬及びそれらの臨床研究を促進する効果を持つ。
【００１７】
本発明の3種の分子阻害剤は神経芽腫培養細胞の細胞増殖を抑制することから、生体内でも神経芽腫の細胞増殖を抑制することが期待できる。Src分子阻害剤KX2-391は、成人のがんである前立腺がんを対象に動物モデルでの評価が確認され、現在ヒトでの臨床試験（Phase II）が行われている。ヒトに対する投与が可能であることが確認されており、神経芽腫治療への適用についても臨床試験が可能である。
【００１８】
ILK分子阻害剤Cpd 22は経口投与で有効性があることが確認されており、前立腺がん培養細胞を移植したマウスモデルにおいて腫瘍縮小効果があること及びこのとき大きな有害事象が見られなかったことが報告されていることから、ヒトへの投与の可能性が考えられ、神経芽腫その他のがんについて臨床研究の実施を検討できる。
【００１９】
RASA1分子阻害剤Pluripotinは培養条件下で胎児幹細胞（ＥＳ細胞）やその他の細胞の多分化能を維持する際の有用性が確認されているのみで、がん細胞の細胞増殖抑制作用については知られておらず、本発明で初めてがんへの有効性が明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】３種の分子阻害剤による神経芽腫細胞増殖の抑制。KX2-391（Src分子阻害剤）、Pluripotin（RASA1分子阻害剤）、Cpd 22（ILK分子阻害剤）を培養液中に異なる濃度で加え、3種の神経芽腫培養細胞（SK-N-BE(2)、SK-N-SH、LA-N-5）を72時間 培養したところ、溶媒であるDMSO (dimethyl sulfoxide)のみを加えたコントロールと比較して、濃度依存的に細胞増殖が抑制された。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
本発明の神経芽腫治療剤は、LOM1シグナル伝達に係わるSrc、RASA1、ILKのいずれか機能を阻害する物質を有効成分として含有する。Src、RASA1、ILKのいずれか機能を阻害することは、その物質の存在により、Src、RASA1、ILKの特徴であるリン酸化が抑制され、がん化の方向に進むシグナル伝達を阻害することができる。
【００２３】
Sｒｃ阻害剤として、KX2-391、PP1（CAS # 172889-26-8 ：4-amino-5-(4-methylphenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo-d-3,4-pyrimidine）、Src Kinase Inhibitor I（CAS # 179248-59-0： 4-(4′-Phenoxyanilino)-6,7-dimethoxyquinazoline）、TX-1123  （CAS # 157397-06-3：  2-((3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxyphenyl)-methylene)-4-cyclopentene-1,3-dione）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
RASA1阻害剤として、Pluripotinなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
ILK阻害剤として、Cpd 22、DRM02、QLT0267、KP-392、T315などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の薬剤は、Src、RASA1、ILKの機能を阻害する物質をそのままの形態でもよく、又は薬学的に許容される添加剤を配合した医薬組成物の形態であってもよい。
【００２７】
本発明の薬剤を含む医薬組成物は、その形態は特に制限されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状などの固体状；溶液状、乳液状、分散液状等の液状；又はペースト状等の半固体状等の、任意の形態に調整することができる。経口製剤としては、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤を含む）、チュアブル剤、溶液剤などの剤形とすることができる。また、非経口製剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤、又は座剤などの剤形とすることができる。
【００２８】
本発明の薬剤の投与量や投与形態は、対象、病態やその進行状況、投与経路、剤型その他の条件によって適宜選択すればよいが、通常、１日あたり０．００１−１００ ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは１日あたり０．０１−１０ ｍｇ／ｋｇである。
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
（実験材料）
３種の神経芽培養細胞を用意し投与実験を行った。SK-N-BE(2)細胞はEuropean Collection of Cell Cultures (ECACC)より購入し、ウシ胎児血清（15％）及び非必須アミノ酸（0.5％、ライフテクノロジー）を添加したEMEM (和光純薬) とHam’s F12 (和光純薬) の１：１混合液中にて培養した。SK-N-SH細胞はECACCより購入し、ウシ胎児血清（10％）を添加したDMEM (和光純薬)培養液中にて培養した。LA-N-５細胞は理化学研究所バイオリソースセンターより譲渡を受けウシ胎児血清（10％）を添加したRPMI1640 (ライフテクノロジー)培養液中にて培養した。相対的細胞数の計測にはCell Counting Kit-8（同仁化学）を用いMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)法にて行った。Src分子阻害剤KX2-391（Selleckchem社）、ILK分子阻害剤Cpd 22（Calbiochem社）、RASA1分子阻害剤Pluripotin （Sigma社）の3種の分子阻害剤をdimethyl sulfoxide（ＤＭＳＯ、Merck社）に溶解して培養液中に添加した。
【００３１】
（実験方法）
細胞増殖抑制実験はCell Counting Kit-8（同仁化学）の添付文書に記載されている方法に準じて行なった。
３種の神経芽培養細胞をそれぞれ９６ウェルプレートにまき（2000細胞/ウェル）、翌日段階的に希釈して作成した3種の濃度の分子阻害剤を各ウェルに加えた。72時間培養ののち、Cell Counting Kit-8試薬を加え2時間反応させたあと、450nmの吸光度を計測した。それぞれの分子阻害剤のそれぞれの濃度について５ウェル一組として実験を行い平均値や標準偏差を求めた。
【００３２】
（結果）
3種のそれぞれ分子阻害剤は、SK-N-BE(2)細胞、SK-N-SH細胞およびLA-N-５細胞について、濃度依存的にその細胞増殖を抑制した（図１）。
【図１】
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