(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内に常在し、細胞情報伝達系に影響する化合物を利用することにより、正常な細胞、組織及び器官への影響が小さく、腫瘍細胞のみを増殖抑制又は死滅可能であり、副作用がなく安全性の高い、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物の提供。【解決手段】下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の有効量を含む、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物。2015051946.tif 000013Ｘは、Ｏ又はＳ、ｎは０、１又は２、ｍは０ないし５の整数、ｌは０、１又は２、Ｒ、Ｒ１はＨ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、ＲとＲ１のリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、Ｒ２はＨ、−ＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＨ、Ｒ３はＦ、−ＮＨ２又はＮ３、及び、Ｗは複素環及びその誘導体を表す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物。
【化１】
2015051946.tif 000010
前記式１において、
Ｘは、Ｏ又はＳ、
ｎは０、１又は２、
ｍは０ないし５の整数、
ｌは０、１又は２
ＲはＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又はＲ1のリン酸基と共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ2はＨ、−ＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ3はＦ、−ＮＨ2又はＮ3、及び、
Ｗは複素環及びその誘導体を表す。
【請求項２】
前記Ｗは、ピリミジン基又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｗは、下記式２で表されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物。
【化２】
2015051946.tif 000011
前記式２において、Ｒ4及びＲ5は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨＣＯＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＣＯＣＨ3を表す。
【請求項４】
前記式２において、Ｒ4はアミノ基であることを特徴とする、請求項１ないし３に記載の化合物。
【請求項５】
前記式１において、
ＸはＯ、
ｎは１、
ｍは１、
ｌは０、
ＲはＨ、
Ｒ1は−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、及び、
Ｒ2はＨであることを特徴とする、請求項１ないし４に記載の化合物。
【請求項６】
前記式１において、２−デオキシ−Ｄ−リボース及び２−ヒドロキシ−Ｄ−リボース、又は、その５’−１リン酸エステル体がＷに結合することを特徴とする、請求項１ないし５に記載の化合物。
【請求項７】
前記式１で表される化合物は、腫瘍細胞の細胞膜上の、又は細胞外に分泌されたヌクレオチダーゼによりチミジンに代謝され、細胞に取り込まれることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１ないし７に記載の化合物及び／又は薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含有することを特徴とする、医薬。
【請求項９】
請求項１ないし７に記載の化合物及び／又は薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含有することを特徴とする、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項１０】
前記式１で表される化合物に、さらに、細胞増殖抑制活性を有する他の化合物を含有することを特徴とする、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗腫瘍活性を有する他の化合物は、パクリタキセル、タキサジエン、バッカチンＩＩＩ、ドセタキセル、タクスチニンＡ、ブレビフォリオール、タキサスパインＤ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シスプラチン、ムスチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ミトラマイシン、ブレオマイシン、プロカルバジン、メトトレキサート、エトポシド、イリノテカン、タモキシフェン、イマチニブ、アフィディコリン、オファツムマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トラスツズマブ、パニツムマブ、モガムリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、及び、リツキシマブからなる群から選択される１種以上の化合物であることを特徴とする、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
培養細胞の細胞膜上に存在する酵素及び／又は培養細胞から細胞外に分泌される酵素により代謝されることにより、細胞内に取り込まれ、細胞増殖抑制作用を発揮することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記培養細胞は、腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素は、ヌクレオチダーゼであることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物は、下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、請求項１２ないし１４に記載の方法。
【化３】
2015051946.tif 000012
前記式１において、
Ｘは、Ｏ又はＳ、
ｎは０、１又は２、
ｍは０ないし５の整数、
ｌは０、１又は２
ＲはＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又はＲ1のリン酸基と共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ2はＨ、−ＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ3はＦ、−ＮＨ2又はＮ3、及び、
Ｗは複素環及びその誘導体を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞への細胞増殖抑制活性の選択性の高いヌクレオシド誘導体化合物、及び該化合物を有効成分として含有する腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。また、本発明は、腫瘍細胞の細胞膜上に存在する酵素及び／又は腫瘍細胞から細胞外に分泌される酵素により代謝されることにより、細胞内に取り込まれ、細胞増殖抑制作用を発現する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、我が国における死因の第一位は、悪性腫瘍であり、悪性腫瘍に対する治療及び／又は予防のために多くの抗腫瘍剤が開発されている。そして、これらの抗腫瘍剤として、多くのヌクレオシド誘導体が開発されている。
【０００３】
ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、及び、シチジン）のリン酸化エステル誘導体であるヌクレオチドは、遺伝情報の保存や発現をつかさどるＤＮＡやＲＮＡの構成成分として生体内に豊富に存在し、種々の生命現象で重要な役割を果たしていることが知られている。例えば、アデノシン５’−３リン酸は、高エネルギー物質として生体内のエネルギー代謝に関与している。また、環状リン酸エステル誘導体であるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは細胞内でセカンドメッセンジャーとして細胞内情報伝達に関与している。
【０００４】
また、ヌクレオシドのプリン塩基やピリミジン塩基の構造の一部を修飾した誘導体、糖部分の水酸基を置換又は修飾した誘導体、及び、糖部分を伴わないプリン塩基やピリミジン塩基自体の誘導体が、前記ヌクレオチドの疑似化合物として生体内で作用する特性を利用して、抗腫瘍剤として使用されている。具体的には、前記抗腫瘍剤としてシタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等をはじめとした多くの化合物が腫瘍治療の化学療法で使用されている（特許文献１〜３）。
【０００５】
しかし、一般的にこれらの薬剤を用いる化学療法では、副作用が深刻な問題となる。例えば、シタラビンはＤＮＡポリメラーゼを阻害し（非特許文献１）、ゲムシタビンはＤＮＡ合成を直接的及び間接的に阻害し（非特許文献２）、５−フルオロウラシルは、チミジル酸合成を阻害して腫瘍細胞の増殖を抑制することを目的とする（非特許文献３）が、これらの薬物は生体内の腫瘍細胞以外の細胞に作用し、副作用を発現するとの問題を有する。
【０００６】
一方、細胞には、ＤＮＡ損傷修復に代表される自己修復・自己治癒機能が存在し、個々の細胞が生きていくために必要とされる能力である。これにより、細胞内で問題が生じた場合でも、ある程度までは自己修復・自己治癒することが可能である。これは組織や器官レベルにおいても同様であり、外傷が治癒したり、手術で一部摘出された肝臓が元の大きさに回復したりする現象がよく知られている。
【０００７】
このような自己修復・自己治癒機能は、腫瘍形成に対しても発揮されると考えられ、正常細胞から腫瘍細胞への何らかの情報伝達が存在すると予想された。そして、５’−ヌクレオチダーゼは、腫瘍患者の血清濃度の上昇が認められるところから（非特許文献４）、この情報伝達を担う化合物として、遺伝情報の保存や発現に関与し、生体内に常在するヌクレオシド誘導体が利用されると予想された。すなわち、ヌクレオシド誘導体は、腫瘍化した細胞に対してその活動を停止させる何らかの特性を有すると考えられた。また、この特性を有する化合物を利用することにより、腫瘍細胞への選択的作用の向上との従来の抗腫瘍剤にない優れた特性を有する抗腫瘍剤又は腫瘍治療用医薬組成物の創製が期待された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭５５−００２６０１号公報
【特許文献２】特開昭６１−１４８１９３号公報
【特許文献３】特開昭５２−０７８８８７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｉｇａｓｈｉｇａｗａ  Ｍ．ら、Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．  ＆  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．、７、２２３（１９９０）
【非特許文献２】Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，Ｗ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１、６１１０（１９９１）
【非特許文献３】Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｋ．Ｕ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３６、３００６（１９６１）
【非特許文献４】Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＭＫら、Ｃａｎｃｅｒ、１８：８８６（１９６５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、生体内に常在し、正常な細胞、組織及び器官への影響が小さく、腫瘍細胞のみを増殖抑制又は死滅可能な、副作用がなく安全性の高い化合物を有効成分として含有する腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物、及び、前記化合物のスクリーニング方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、正常細胞が腫瘍細胞に対して細胞増殖候補化合物として、生体内に常在する化合物であり、かつ、腫瘍患者でその代謝系酵素の活性が亢進している化合物であるヌクレオシド誘導体、特にヌクレオチド誘導体を選択した。そして、本発明者らは、生体内常在性化合物の腫瘍細胞に対する抑制効果を評価し、チミジン誘導体が、正常細胞に影響しない濃度で腫瘍細胞に選択的に細胞増殖抑制作用及び細胞死惹起作用を有することを見出し、その構造活性相関を明らかにすることにより本発明を完成させた。
【００１２】
具体的には、本発明は、下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を提供する。
【化１】
2015051946.tif 000002
前記式１において、
Ｘは、Ｏ又はＳ、
ｎは０、１又は２、
ｍは０ないし５の整数、
ｌは０、１又は２
ＲはＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又はＲ1のリン酸基と共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ2はＨ、−ＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ3はＦ、−ＮＨ2又はＮ3、及び、
Ｗは複素環及びその誘導体を表す。
【００１３】
本発明の前記化合物において、前記Ｗは、ピリミジン基又はその誘導体の場合がある。
【００１４】
本発明の前記化合物において、前記Ｗは、下記式２で表される場合がある。
【化２】
2015051946.tif 000003
前記式２において、Ｒ4及びＲ5は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨＣＯＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＣＯＣＨ3を表す。
【００１５】
本発明の前記化合物において、前記式２のＲ4はアミノ基の場合がある。
【００１６】
本発明の前記化合物において、
前記式１の、
ＸはＯ、
ｎは１、
ｍは１、
ｌは０、
ＲはＨ、
Ｒ1は−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、及び、
Ｒ2はＨの場合がある。
【００１７】
本発明の前記化合物において、前記式１では、２−デオキシ−Ｄ−リボース及び２−ヒドロキシ−Ｄ−リボース、又は、その５’−１リン酸エステル体がＷに結合する場合がある。
【００１８】
本発明の前記化合物において、前記式１で表される化合物は、腫瘍細胞の細胞膜上の又は細胞外へ分泌されたヌクレオチダーゼでチミジンに代謝され、細胞に取り込まれる場合がある。
【００１９】
本発明は、本発明の前記化合物及び／又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物を含有する医薬を提供する。
【００２０】
本発明は、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための前記式１若しくは前記式２の化合物を提供する。
【００２１】
本発明は、前記式１若しくは前記式２の化合物又はそれらの薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の有効量を含有することを特徴とする、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、前記式１で表される化合物に、さらに、細胞増殖抑制活性を有する他の化合物を含有する、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明の前記医薬組成物において、前記抗腫瘍活性を有する他の化合物は、パクリタキセル、タキサジエン、バッカチンＩＩＩ、ドセタキセル、タクスチニンＡ、ブレビフォリオール、タキサスパインＤ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シスプラチン、ムスチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ミトラマイシン、ブレオマイシン、プロカルバジン、メトトレキサート、エトポシド、イリノテカン、タモキシフェン、イマチニブ、アフィディコリン、オファツムマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トラスツズマブ、パニツムマブ、モガムリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、及び、リツキシマブからなる群から選択される１種以上の化合物の場合がある。
【００２４】
本発明は、培養細胞の細胞膜上に存在する酵素及び／又は培養細胞から細胞外に分泌される酵素により代謝されることにより、細胞内に取り込まれ、細胞増殖抑制作用を発揮する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００２５】
本発明の前記スクリーニング方法において、前記培養細胞は、腫瘍細胞の場合がある。
【００２６】
本発明の前記スクリーニング方法において、前記酵素は、ヌクレオチダーゼの場合がある。
【００２７】
本発明の前記スクリーニング方法において、前記化合物は、下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の場合がある。
【化３】
2015051946.tif 000004
前記式１において、
Ｘは、Ｏ又はＳ、
ｎは０、１又は２、
ｍは０ないし５の整数、
ｌは０、１又は２
ＲはＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又はＲ1のリン酸基と共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ2はＨ、−ＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ3はＦ、−ＮＨ2又はＮ3、及び、
Ｗは複素環及びその誘導体を表す。
【００２８】
本発明は、本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物の有効量を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、悪性腫瘍の治療、進行予防及び／又は予防方法を提供する。
【００２９】
本発明の治療、進行予防及び／又は予防方法において、前記医薬組成物は、下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の有効量を含む場合がある。
【化４】
2015051946.tif 000005
前記式１において、
Ｘは、Ｏ又はＳ、
ｎは０、１又は２、
ｍは０ないし５の整数、
ｌは０、１又は２
ＲはＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又はＲ1のリン酸基と共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ2はＨ、−ＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ3はＦ、−ＮＨ2又はＮ3、及び、
Ｗは複素環及びその誘導体を表す。
【００３０】
本発明の前記方法において、前記Ｗは、ピリミジン基又はその誘導体の場合がある。
【００３１】
本発明の前記方法において、前記Ｗは、下記式２で表される場合がある。
【化５】
2015051946.tif 000006
前記式２において、Ｒ4及びＲ5は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨＣＯＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＣＯＣＨ3を表す。
【００３２】
本発明の前記方法において、前記式２のＲ4はアミノ基の場合がある。
【００３３】
本発明の前記方法において、前記式１において、
ＸはＯ、
ｎは１、
ｍは１、
ｌは０、
ＲはＨ、
Ｒ1は−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、及び、
Ｒ2はＨの場合がある。
【００３４】
本発明の前記方法において、前記式１では、２−デオキシ−Ｄ−リボース及び２−ヒドロキシ−Ｄ−リボース、又は、その５’−１リン酸エステル体がＷに結合する場合がある。
【００３５】
本発明の前記方法において、前記式１で表される化合物は、腫瘍細胞の細胞膜上又は腫瘍細胞から分泌されたヌクレオチダーゼでチミジンに代謝され、細胞に取り込まれる場合がある。
【００３６】
本発明は、前記式１で表される化合物に、さらに、抗腫瘍活性を有する他の化合物及び薬学的に許容可能な添加物を併せて、悪性腫瘍の治療、進行予防及び／又は予防のためにその有効量を、これらを必要とする患者に投与するステップを含む、悪性腫瘍の治療、進行予防及び／又は予防方法を提供する。
【００３７】
本発明の治療、進行予防及び／又は予防方法において、前記抗腫瘍活性を有する他の化合物は、パクリタキセル、タキサジエン、バッカチンＩＩＩ、ドセタキセル、タクスチニンＡ、ブレビフォリオール、タキサスパインＤ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シスプラチン、ムスチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ミトラマイシン、ブレオマイシン、プロカルバジン、メトトレキサート、エトポシド、イリノテカン、タモキシフェン、イマチニブ、アフィディコリン、オファツムマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トラスツズマブ、パニツムマブ、モガムリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、及び、リツキシマブからなる群から選択される１種以上の化合物の場合がある。
【００３８】
本発明は、悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬を製造するための下記式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、及び、それらの溶媒和物の使用を提供する。
【化６】
2015051946.tif 000007
前記式１において、
Ｘは、Ｏ又はＳ、
ｎは０、１又は２、
ｍは０ないし５の整数、
ｌは０、１又は２
ＲはＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又はＲ1のリン酸基と共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ1はＨ、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、
Ｒ2はＨ、−ＣＨ3、又は、−ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ3はＦ、−ＮＨ2又はＮ3、及び、
Ｗは複素環及びその誘導体を表す。
【００３９】
本発明の前記使用において、前記Ｗは、ピリミジン基又はその誘導体の場合がある。
【００４０】
前記Ｗは、下記式２で表される場合がある。
【化７】
2015051946.tif 000008
前記式２において、Ｒ4及びＲ5は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＨ、−ＮＨＣＯＣＨ3、−ＯＣＯＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＣＯＣＨ3を表す。
【００４１】
本発明の前記使用において、前記式２のＲ4はアミノ基の場合がある。
【００４２】
本発明の前記使用における前記式１において、
ＸはＯ、
ｎは１、
ｍは１、
ｌは０、
ＲはＨ、
Ｒ1は−ＣＨ2ＯＨ、リン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、又は、前記Ｒのリン酸基を共有するリン酸基でエステル化されたヒドロキシメチル基、及び、
Ｒ2はＨの場合がある。
【００４３】
本発明の前記使用における前記式１において、２−デオキシ−Ｄ−リボース及び２−ヒドロキシ−Ｄ−リボース、又は、その５’−１リン酸エステル体がＷに結合する場合がある。
【００４４】
本発明の前記使用において、前記式１で表される化合物は、腫瘍細胞の細胞膜上の、又は腫瘍細胞から分泌されたヌクレオチダーゼでチミジンに代謝され、細胞に取り込まれる場合がある。
【００４５】
本発明は、さらに、細胞増殖抑制活性を有する他の化合物を含有する悪性腫瘍の治療及び／又は予防のための医薬を製造するための下記式１で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、及び、それらの溶媒和物の使用を提供する。
【００４６】
本発明の前記使用において、前記抗腫瘍活性を有する他の化合物は、パクリタキセル、タキサジエン、バッカチンＩＩＩ、ドセタキセル、タクスチニンＡ、ブレビフォリオール、タキサスパインＤ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シスプラチン、ムスチン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ミトラマイシン、ブレオマイシン、プロカルバジン、メトトレキサート、エトポシド、イリノテカン、タモキシフェン、イマチニブ、アフィディコリン、オファツムマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トラスツズマブ、パニツムマブ、モガムリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、及び、リツキシマブからなる群から選択される１種以上の化合物の場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件で７日間培養したＮＨＤＦ細胞の顕微鏡写真。図１のＡないしＩは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：対照、Ｂ：１ｍＭ  ＡＭＰ、Ｃ：１ｍＭ  ＧＭＰ、Ｄ：１ｍＭ  ＴＭＰ、Ｅ：１ｍＭ  ＣＭＰ、Ｆ：１０ｍＭ  ＡＭＰ、Ｇ：１０ｍＭ  ＧＭＰ、Ｈ：１０ｍＭ  ＴＭＰ、Ｉ：１０ｍＭ  ＣＭＰ。
【図２Ａ】１ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＮＨＤＦ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図２Ａのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、△：１ｍＭ  ＡＭＰ、▽：１ｍＭ  ＧＭＰ、□：１ｍＭ  ＴＭＰ、◇：１ｍＭ  ＣＭＰ。
【図２Ｂ】１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＮＨＤＦ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図２Ｂのプロットは、それぞれ、以下の培養条件の実験群を示す。○：対照、△：１０ｍＭ  ＡＭＰ、▽：１０ｍＭ  ＧＭＰ、□：１０ｍＭ  ＴＭＰ、◇：１０ｍＭ  ＣＭＰ。
【図３】１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件で９日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真。図３のＡないしＪは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：対照、Ｂ：１ｍＭ  ＡＭＰ、Ｃ：１ｍＭ  ＧＭＰ、Ｄ：１ｍＭ  ＴＭＰ、Ｅ：１ｍＭ  ＣＭＰ、Ｆ：１０ｍＭ  ＡＭＰ、Ｇ：１０ｍＭ  ＧＭＰ、Ｈ：１０ｍＭ  ＴＭＰ、Ｉ：１０ｍＭ  ＣＭＰ、Ｊ：対照。
【図４Ａ】１ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図４Ａのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、△：１ｍＭ  ＡＭＰ、▽：１ｍＭ  ＧＭＰ、□：１ｍＭ  ＴＭＰ、◇：１ｍＭ  ＣＭＰ。
【図４Ｂ】１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図２Ｂのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、△：１０ｍＭ  ＡＭＰ、▽：１０ｍＭ  ＧＭＰ、□：１０ｍＭ  ＴＭＰ、◇：１０ｍＭ  ＣＭＰ。
【図５】１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＨＬ６０細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図５のプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、△：１０ｍＭ  ＡＭＰ、▽：１０ｍＭ  ＧＭＰ、□：１０ｍＭ  ＴＭＰ、◇：１０ｍＭ  ＣＭＰ。
【図６】１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件で７日間培養したＮＨＤＦ細胞の顕微鏡写真。図６のＡないしＪは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：対照（非培地交換）、Ｂ：１ｍＭ  ＡＭＰ、Ｃ：１ｍＭ  ＧＭＰ、Ｄ：１ｍＭ  ＴＭＰ、Ｅ：１ｍＭ  ＣＭＰ、Ｆ：１０ｍＭ  ＡＭＰ、Ｇ：１０ｍＭ  ＧＭＰ、Ｈ：１０ｍＭ  ＴＭＰ、Ｉ：１０ｍＭ  ＣＭＰ、Ｊ：対照（培地交換）。
【図７Ａ】１ｍＭのＴＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、チミジン又はチミンが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図７Ａのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、□：１ｍＭ  ＴＭＰ、△：１ｍＭ  ＴＴＰ、▽：１ｍＭ  ＴＤＰ、◇：１ｍＭ  チミジン、×：１ｍＭ  チミン。
【図７Ｂ】１ｍＭのチミン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、チミン＋２−デオキシ−Ｄ−リボース、ＴＭＰ、又は、チミジンが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図７Ｂのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、×：１ｍＭ  チミン、●：１ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−リボース、▲：１ｍＭ  チミン＋１ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−リボース、□：１ｍＭ  ＴＭＰ、◇：１ｍＭ  チミジン。
【図８Ａ】１ｍＭのＴＭＰ、ｃＴＭＰ、ＵＭＰ、３’−ＴＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図８Ａのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、□：１ｍＭ  ＴＭＰ、△：１ｍＭ  ｃＴＭＰ、◇：１ｍＭ  ＵＭＰ、▽：１ｍＭ  ３’−ＴＭＰ、×：１ｍＭ  ｒＴＭＰ。
【図８Ｂ】１ｍＭのＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフ。図８Ｂのプロットは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。○：対照、□：１ｍＭ  ＴＭＰ、●：１ｍＭ  ｄＵＭＰ、◇：１ｍＭ  ＵＭＰ、×：１ｍＭ  ｒＴＭＰ。
【図９】１ｍＭ又は１０ｍＭのＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件で７日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真。図９のＡないしＩは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：対照、Ｂ：１ｍＭ  ＴＭＰ、Ｃ：１ｍＭ  ｄＵＭＰ、Ｄ：１ｍＭ  ＵＭＰ、Ｅ：１ｍＭ  ｒＴＭＰ、Ｆ：１０ｍＭ  ＴＭＰ、Ｇ：１０ｍＭ  ｄＵＭＰ、Ｈ：１０ｍＭ  ＵＭＰ、Ｉ：１０ｍＭ  ｒＴＭＰ。
【図１０】１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ又は１０ｍＭのＴＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件で７日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真。図１０のＡないしＨは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：１０ｍＭ  ＴＭＰ、Ｂ：５ｍＭ  ＴＭＰ、Ｃ：２ｍＭ  ＴＭＰ、Ｄ：１ｍＭ  ＴＭＰ、Ｅ：１０ｍＭ  ｒＴＭＰ、Ｆ：５ｍＭ  ｒＴＭＰ、Ｇ：２ｍＭ  ｒＴＭＰ、Ｈ：１ｍＭ  ｒＴＭＰ。
【図１１】培地交換して７日間培養したＨｅＬａ細胞、及び、培地交換せずに７日培養したＨｅＬａ細胞に対するＴＭＰの影響を示す顕微鏡写真。図１７のＡないしＦは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：対照（非培地交換）、Ｂ：１ｍＭ  ＴＭＰ（非培地交換）、Ｃ：１０ｍＭ  ＴＭＰ（非培地交換）、Ｄ：対照（培地交換）、Ｅ：１ｍＭ  ＴＭＰ（培地交換）、Ｆ：１０ｍＭ  ＴＭＰ（培地交換）。
【図１２】培地交換して７日間培養したＨｅＬａ細胞、及び、培地交換せずに７日培養したＨｅＬａ細胞に対するチミジン又はＴＭＰの影響を示す顕微鏡写真。図１７のＡないしＨは、それぞれ、以下の被験化合物を含む培養条件の実験群を示す。Ａ：対照（非培地交換）、Ｂ：１ｍＭ  チミジン（非培地交換）、Ｃ：１０ｍＭ  チミジン（非培地交換）、Ｄ：１ｍＭ  ＴＭＰ（非培地交換）、Ｅ：対照（培地交換）、Ｆ：１ｍＭ  チミジン（培地交換）、Ｇ：１０ｍＭ  チミジン（培地交換）、Ｈ：１ｍＭ  ＴＭＰ（培地交換）。
【図１３】種々の濃度のＴＭＰ及び／又は抗腫瘍剤が添加された培養条件で３日間又は７日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真。図１９のＡないしＪは、それぞれ、以下の培養条件の実験群を示す。Ａ：１μＭ  シスプラチン（３日間）、Ｂ：１０μＭ  シスプラチン（３日間）、Ｃ：対照（３日間）、Ｄ：０．０１μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣ（３日間）、Ｅ：０．１μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣ（３日間）、Ｆ：１ｍＭ  ＴＭＰ（３日間）、Ｇ：１０ｎＭ  パクリタキセル（３日間）、Ｈ：１００ｎＭ  パクリタキセル（３日間）、Ｉ：１ｍＭ  ＴＭＰ（７日間）、Ｊ：対照（７日間）。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本明細書において、ヌクレオシド誘導体とは、ヌクレオシドが化学的に修飾された化合物であって、生体内で代謝され、細胞増殖抑制作用及び／又は細胞死惹起作用を発揮する化合物及びその塩をいう。前記ヌクレオシドは、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン及びビタミンＢ２を含むが、これらに限定されない。前記ヌクレオシド誘導体は、リン酸エステル誘導体を含む。前記ヌクレオシド誘導体は、アデノシン５’−１リン酸、アデノシン５’−２リン酸、アデノシン５’−３リン酸、グアノシン５’−１リン酸、グアノシン５’−２リン酸、グアノシン５’−３リン酸、チミジン５’−１リン酸、チミジン５’−２リン酸、チミジン５’−３リン酸、ウリジン５’−１リン酸、ウリジン５’−２リン酸、ウリジン５’−３リン酸、シチジン５’−１リン酸、シチジン５’−２リン酸、シチジン５’−３リン酸、デオキシアデノシン５’−１リン酸、デオキシアデノシン５’−２リン酸、デオキシアデノシン５’−３リン酸、デオキシグアノシン５’−１リン酸、デオキシグアノシン５’−２リン酸、デオキシグアノシン５’−３リン酸、２’−ヒドロキシチミジン５’−１リン酸、２’−ヒドロキシチミジン５’−２リン酸、２’−ヒドロキシチミジン５’−３リン酸、デオキシウリジン５’−１リン酸、デオキシウリジン５’−２リン酸、デオキシウリジン５’−３リン酸、デオキシシチジン５’−１リン酸、デオキシシチジン５’−２リン酸、デオキシシチジン５’−３リン酸、２’−デオキシチミジン３’−１リン酸、チミジン３’，５’−環状１リン酸、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、ゲムシタビン、２’３’−ジデオキシチミジン５’−３リン酸、ブチルフェニルデオキシグアノシン３リン酸、カペシタビン、塩酸アンシタビン、ネララビン、ペントスタチン、及び、ブロクスウリジンを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書において、ヌクレオシド誘導体は、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び／又は、それらの混合物を含む。
【００５０】
本明細書において、リン酸エステル誘導体は脱リン酸化され、腫瘍細胞に対して特異的な抗腫瘍活性を発揮する場合がある。前記リン酸エステル誘導体は、ヌクレオチダーゼによって脱リン酸化される場合がある。前記ヌクレオチダーゼはホスホジエステル結合を加水分解できる。
【００５１】
前記リン酸エステル誘導体に誘導化されることにより、腫瘍細胞膜上の、又は腫瘍細胞から分泌されたヌクレオチダーゼで脱リン酸化され、腫瘍細胞に特異的な増殖抑制活性を発揮するヌクレオチド誘導体として、チミジン、シタラビン、カペシタビン、塩酸アンシタビン、ネララビン、ペントスタチン及びブロクスウリジンのリン酸化エステル誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
これらのヌクレオチド誘導体は、例えば、特開昭５５−００２６０１号公報等に記載の方法や定法に基づき、チミジン、シタラビン、ジドブジン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、カペシタビン、塩酸アンシタビン、ゲムシタビン、ネララビン、クロファラビン、ペントスタチン及びブロクスウリジンをリン酸エステル化又はその誘導体とすることにより、合成することができるが、これらに限定されない。
【００５３】
好ましくは、前記ヌクレオチド誘導体は、下記式３で表される化合物、その薬学的に許容可能な塩、及び、それらの溶媒和物である。
【化８】
2015051946.tif 000009
式３において、Ｒ6は−Ｈもしくは−ＣＯＲ8（Ｒ8は、置換基を有していてもよいＣ1〜Ｃ3のアルキル基）、Ｒ7は−（ＰＯ2−Ｏ）nＲ9（ｎは、１ないし３の整数、Ｒ9は−Ｈもしくは−ＣＯＲ10、Ｒ10は置換基を有していてもよいＣ1〜Ｃ3のアルキル基）を表し、又は、Ｒ6とＲ7はこれらが結合する原子と一緒になってＰを含むヘテロ環を形成してもよい。
【００５４】
好ましくは、前記ヌクレオシド誘導体はチミジン誘導体であり、該チミジン誘導体は、チミジン５’−１リン酸、チミジン５’−２リン酸、チミジン５’−３リン酸、チミジン３’，５’−リン酸及びその薬学的に許容可能な塩を含むが、これらに限定されない。チミジン５’−２リン酸、チミジン５’−３リン酸、及び、チミジン３’，５’−リン酸は、腫瘍細胞膜上の、又は腫瘍細胞から分泌されたヌクレオチダーゼにより速やかにリン酸エステルが加水分解され、チミジン５’−１リン酸に代謝される。好ましくは、前記チミジン誘導体はチミジン５’−１リン酸である。チミジン５’−１リン酸は、チミジンに代謝される場合がある。
【００５５】
前記式１の化合物は定法により薬学的に許容可能な塩にすることができる。薬学的に許容可能な塩は、酢酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
また、リン酸基を有するヌクレオシド誘導体は定法により種々のアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアミノ酸との塩にすることができる。具体的には、式１の化合物の塩は薬学的に許容可能な塩であり、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アスパラギン塩、グルタミン塩等の場合があるが、これらに限定されない。
【００５７】
さらに、式１の化合物は、水和物又は薬学的に許容可能な各種溶媒和物も形成でき、本発明に含まれる。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤若しくは内用液剤等の経口製剤、又は、注射剤（静脈内、筋肉内等）、坐剤、軟膏剤、経皮用貼付剤等の非経口投与製剤のいずれの形態であってもよいが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、製剤として、当分野において通常用いられている薬剤用担体、賦形剤等を含む。
【００５９】
前記経口製剤において、有効成分は、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、デンプン、軽質無水ケイ酸、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の少なくとも１つの希釈剤と混合されてもよい。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、前記希釈剤以外の添加剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒプロメロース若しくはマクロゴール６０００のような結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム若しくはタルクのような滑沢剤、クロスポピドンのような崩壊剤、ラクトースのような安定化剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤、ツイーン８０のような可塑剤、酸化チタン若しくはカルナウバロウのような光沢剤、マクロゴール６０００のような被覆剤、又は、三二酸化鉄のような着色剤を含有してもよい。
【００６１】
錠剤又は丸剤は、必要により、ショ糖、ゼラチン若しくは寒天などの糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜されてもよい。
【００６２】
経口投与のための内用液剤は、薬学的に許容可能なシロップ剤、懸濁シロップ剤、ドライシロップ、乳剤、懸濁剤、リモナーデ剤又はエリキシル剤等を含む。また、前記内用液剤は、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水及びエタノールを含むが、これらに限定されない溶剤で調整できる。さらに、前記内用液剤は、不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤又は防腐剤等を含有してもよい。
【００６３】
非経口投与製剤としての注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液性注射剤、懸濁性注射剤又は乳濁性注射剤を含むが、これらに限定されない。水性の溶液剤又は懸濁剤には、例えば注射用蒸留水及び生理食塩液等が含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０（局方名）、トロメタモール等が含まれる。これらの注射剤は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらの注射剤は、例えば定法の濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらの注射剤は、予め製造された無菌の固体組成物を、使用時に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用されてもよい。
【００６４】
前記医薬品添加剤は、前記例示された医薬品添加剤以外の公知の化合物を、公知の用法及び用量（例えば、医薬品添加物辞典２００７（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、東京、２００７）に記載）で使用できる。本発明の医薬組成物の製造は、好ましくは、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規範に適合した条件（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ基準）で実施される。
【００６５】
本発明の経口用製剤及び非経口用製剤の好ましい処方例は、以下の処方例を含むが、これらに限定されない。例えば、前記経口用製剤の好ましい処方例は、１錠（重量０．６ｇ）中、チミジン５’−１リン酸３００ｍｇに、カルナウバロウ、クロスカルメロースナトリウム、軽質無水ケイ酸、酸化チタン、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース（置換度タイプ：２９１０）、マクロゴール６０００、Ｄ−マンニトールなどを添加し、打錠した後に、フィルムコーティングした錠剤である。例えば、前記非経口用製剤の好ましい処方例は、トロメタモール１６９４ｍｇを含む精製水２０ｍＬにチミジン５’−１リン酸１ｇを溶解し、ｐＨ調整剤と等張化剤で、ｐＨ８．２〜８．６、浸透圧比：約４に調整した注射剤である。
【００６６】
本明細書において「増殖抑制」とは、細胞増殖を抑制する作用をいい、腫瘍細胞の増殖を抑制すること、及び、腫瘍細胞の細胞死を惹起又は腫瘍細胞を死滅すること、腫瘍形成を抑制すること、腫瘍の成長を抑制すること、並びに、腫瘍、悪性腫瘍、がん又は癌の治療又は予防を行うことを含む。治療は、根治的治療及び予防的治療を含み、予防は、発症予防、進行予防、転移予防及び再発予防を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書における「腫瘍」は、エイズ関連カポジ肉腫、悪性リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病）、悪性骨・軟部腫瘍、肝臓がん、急性白血病、結腸・直腸がん、骨肉腫、子宮頸がん、小細胞肺がん、白血病（急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、及び悪性リンパ腫等）、小児悪性固形腫瘍（ユーイング肉腫ファミリー腫瘍，横紋筋肉腫，神経芽腫，網膜芽腫，肝芽腫その他肝原発悪性腫瘍，腎芽腫その他腎原発悪性腫瘍等）、消化器がん（胃がん、胆のう・胆管がん、膵臓がん、肝がん、結腸がん、直腸がん等）、食道がん、腎腫瘍、成人急性非リンパ性白血病骨髄異形成症候群（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前立腺がん、多発性骨髄腫、胆管がん・胆道がん、乳がん、尿路上皮がん、肺がん、肺小細胞がん、非小細胞肺がん、有棘細胞がん、卵黄嚢腫瘍、卵管がん、卵巣がん、睾丸腫瘍、絨毛がん、胚細胞腫瘍（精巣腫瘍，卵巣腫瘍，性腺外腫瘍）、膀胱がん、膵がん、顆粒膜細胞腫、脳腫瘍を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記腫瘍は、子宮頸がん、ならびに、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病及び悪性リンパ腫などの白血病を含む。
【００６８】
本明細書における「患者」は、前記腫瘍を有する動物である。前記動物は、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ウシ、ネコ及びイヌ等、特に限定されないが、好ましくはヒトである。
【００６９】
本明細書における「有効量」は、前記患者体内で本発明の効果を発揮するために必要な下記式１で表される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の投与量であって、薬物作用を生じる最小有効量から、薬物作用を生じ、かつ、中毒作用を生じない最大有効量までの間をいう。
【００７０】
前記ヌクレオシド誘導体又はその薬学的に許容可能な塩及び／又はその溶媒和物の投与量（１日量）は、疾患の症状、投与対象の年齢、人種、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定され、単回投与（１日１回投与）又は１日複数回投与される。
【００７１】
前記ヌクレオシド誘導体は又はその薬学的に許容可能な塩及び／又はその溶媒和物の投与量は、通常、成人１人あたり約１日量０．０１〜２０ｇ、好ましくは１日量０．１〜１０．０ｇである。そして、前記投与量が１日１〜４回に分けて経口又は非経口投与される。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法において、ヌクレオシド誘導体として、微生物、菌類、植物及び動物から調製される化合物、化学的に合成される化合物等が評価できる。これらの化合物は、定法に従い調製又は合成できる。例えば、特開昭５５−００２６０１号公報等に記載の方法により市販の原料より合成できるが、これらに記載の方法に限定されない。本発明のスクリーニング方法において、培養細胞は、当業者に標準的な方法で調製し、培養できる。培養方法及び培養条件は、培養する細胞の種類によって適切に選択される。前記培養細胞は、ヒト、実験動物から採取され、培養された細胞、及び、細胞株を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記培養細胞は、腫瘍細胞である。前記培養細胞の由来は、サル、マウス及びラット等、特に限定されないが、好ましくはヒトである。ヒトの腫瘍細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）や理化学研究所バイオリソースセンターの細胞バンクから入手可能であり、例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞を含むが、これらに限定されない。本発明のスクリーニング方法において、細胞増殖抑制作用は、被験化合物（ヌクレオシド誘導体）を添加した実験群の細胞数、ＤＮＡ量、ｍＲＮＡ量又はタンパク質量を、被験化合物を添加していない対照群の細胞数、ＤＮＡ量、ｍＲＮＡ量又はタンパク質量と比較して評価される場合がある。前記実験群及び対照群の細胞数、ＤＮＡ量、ｍＲＮＡ量及びタンパク質量の測定値は、定法により標準化した後に比較される場合がある。細胞数、ＤＮＡ量、ｍＲＮＡ量又はタンパク質量は、定法により測定できる。例えば、細胞数は、顕微鏡観察、セルソーター、ＦＡＣＳ等によって測定できる。例えば、ＤＮＡ量は、ＰＣＲ、サザンブロット等によって測定できる。例えば、ｍＲＮＡ量は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット等によって測定できる。例えば、タンパク質量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法、免疫比濁法等によって測定できる。本発明のスクリーニング方法において、スクリーニング条件（例えば、被験化合物以外の化合物の種類、濃度や、培養の温度、時間や、エンドポイント等）が変更される場合がある。なお、本発明のスクリーニング方法において、培養細胞の代わりに、実験動物個体（例えば、ノックアウトマウス、トランスジェニックマウス、腫瘍細胞を移植されたヌードマウス等）、又はこれらの動物から摘出した腫瘍組織を用いて、ヌクレオシド誘導体の細胞増殖抑制作用、細胞死惹起作用、副作用等が評価されてもよい。
【００７３】
以下に説明する本発明を実施するための形態及び実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の主旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００７４】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００７５】
ＮＨＤＦ細胞の増殖に対するヌクレオシド誘導体（ヌクレオチド）の影響
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製
被験化合物として、市販のアデノシン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ＡＭＰと記載）（３０６−５０７４１、和光純薬工業株式会社）、グアノシン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ＧＭＰと記載）（０７８−０４３６１、和光純薬工業株式会社）、チミジン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ＴＭＰと記載）（Ｔ７００４、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、及び、シチジン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ＣＭＰと記載）（０３０−０５３６３、和光純薬工業株式会社）が使用された。基本培地として、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を含むＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、及び、１１０ｍｇ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が使用された。前記ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ及びＣＭＰは、それぞれ、１ｍＭ又は１０ｍＭとなるように前記基本培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、抗生物質不含）に添加され、被験化合物含有培地が調製された。
【００７６】
細胞培養
市販のＮＨＤＦ細胞（ヒト正常皮膚線維芽細胞：Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，  ＵＳＡ）が、６５００細胞個／ｃｍ2となるように１２穴プレート（旭硝子、東京）に播種された（各群ｎ＝６）。その後、前記ＮＨＤＦ細胞は、前記被験化合物含有培地（１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰ）で培養された。対照として、前記ＮＨＤＦ細胞は、前記被験化合物を含まない基本培地で培養された。
【００７７】
観察
前記ＮＨＤＦ細胞の変化が、ヌクレオチド存在下０、１、３、５、７及び９日後に倒立位相差顕微鏡(ライカマイクロシステムズ株式会社  ＤＭ  ＩＬ  ＬＥＤ)で経時的に観察された。
【００７８】
細胞数の測定
観察後、各ウェルの細胞が０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で剥離され、生存細胞数が血球計算盤を用いて細胞数を測定することにより求められた。
【００７９】
統計解析
各実験群と対照群とについて、ポストホックな双方向性の繰り返しのある分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が行われた。ポストホック分析には、Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤ  ｔｅｓｔが使用された。
【００８０】
結果
図１は、１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件で７日間培養したＮＨＤＦ細胞の顕微鏡写真である。図２Ａは、１ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが存在する培養条件におけるＮＨＤＦ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。１ｍＭのＡＭＰ実験群及び１ｍＭのＣＭＰ実験群では、細胞は対照群と変わらずに増殖した。１ｍＭのＧＭＰ実験群では、細胞は、対照群、１ｍＭのＡＭＰ実験群、及び、１ｍＭのＣＭＰ実験群よりも底面に広がって接着し、細胞数の増加は少なかった。１ｍＭのＴＭＰ実験群では、細胞形態は、対照群、１ｍＭのＡＭＰ実験群、及び、１ｍＭのＣＭＰ実験群と変わらないが、全体的に密度が低いままコンフルエントになった。また、１ｍＭのＴＭＰ実験群の細胞数は、対照群、１ｍＭのＡＭＰ実験群、及び、１ｍＭのＣＭＰ実験群に比べて少なかった（図１、図２Ａ）。細胞数について、対照群と比較して、１ｍＭのＡＭＰ実験群及び１ｍＭのＣＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められなかったが、１ｍＭのＧＭＰ実験群及び１ｍＭのＴＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。すなわち、１ｍＭのＡＭＰ及びＣＭＰはＮＨＤＦ細胞に作用しなかった。また、１ｍＭのＧＭＰ及びＴＭＰは細胞増殖を抑制したが、細胞死を惹起しなかった。
【００８１】
図２Ｂは、１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＮＨＤＦ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。１０ｍＭのＡＭＰ実験群では、細胞は培養開始後５日まで対照群と比較すると低速に増殖したが、細胞死が培養後７日に惹起された。１０ｍＭのＧＭＰ実験群では、細胞は培養後３日まで殆ど増殖せず、細胞死が培養後５日に惹起された。１０ｍＭのＴＭＰ実験群では、細胞は培養後７日までは対照群より密度が低い状態で増殖し、培養後９日で全体的に網状の形態であった。細胞数は培養後９日まで緩やかに増加した（図１、図２Ｂ）。１０ｍＭのＣＭＰ実験群では、細胞は培養後５日まで低速で増加したが、細胞死が培養後７日に惹起された。細胞数について、対照群と比較して、１０ｍＭの４群全は統計学的な有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【００８２】
以上の結果から、１ｍＭのＡＭＰ実験群及び１ｍＭのＣＭＰ実験群では正常細胞の増殖への影響が認められなかった。ｌｍＭのＧＭＰ実験群では、対照群を含む他群と相違して、細胞は底面に大きく広がって接着したため、一定面積あたりの細胞数は減少した。しかし、細胞密度の増加は認められず、細胞間隙を認めた。本結果は、細胞同士のコンタクトインヒビションによる増殖阻害の可能性を示すものである。
【００８３】
一方、１ｍＭのＴＭＰ実験群では、ＮＨＤＦ細胞は細胞密度が低い状態でコンフルエントになった。本結果は、細胞がお互いにより強固に接着し、細胞そのものが他群よりも大きくなった可能性、若しくはコンタクトインヒビションにより細胞数が少なくなった可能性を示すものである。
【００８４】
１０ｍＭのＡＭＰ実験群、１０ｍＭのＧＭＰ実験群及び１０ｍＭのＣＭＰ実験群それぞれで細胞が死滅した。一方、１０ｍＭのＴＭＰ実験群では観察期間中に細胞死が惹起されなかった。また、培養後９日では細胞密度が不均一になったが、細胞死は惹起されなかった。ＴＭＰは他のヌクレオチド（ＡＭＰ、ＧＭＰ及びＣＭＰ）と比較して高濃度においてもＮＨＤＦ細胞に対して細胞死を惹起しなかった。すなわち、１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ及びＣＭＰはＮＨＤＦ細胞を死滅するため、ＡＭＰ、ＧＭＰ及びＣＭＰは、腫瘍細胞以外の正常細胞に細胞死を惹起することが認められた。１０ｍＭのＴＭＰは、ＮＨＤＦ細胞を死滅しないため、正常細胞に対して細胞死を惹起しないことが認められた。
【実施例２】
【００８５】
ＨｅＬａ細胞の増殖に対するヌクレオシド誘導体（ヌクレオチド）の影響
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製、細胞培養、観察、細胞数の測定、及び、統計解析は、原則として実施例１と同様に行われた。前記細胞培養では、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）（ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪）が７０００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレート（旭硝子、東京）に播種された（各群ｎ＝６）。
【００８６】
結果
図３は、１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件で９日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。図４Ａは、１ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが存在する培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。１ｍＭのＡＭＰ実験群、１ｍＭのＧＭＰ実験群、及び、１ｍＭのＣＭＰ実験群では、細胞は対照群と同様に増殖した。１ｍＭのＴＭＰ実験群では他の実験群に比べて細胞増殖が抑制された。細胞数について、対照群と比較して、１ｍＭのＡＭＰ実験群、１ｍＭのＧＭＰ実験群、及び、１ｍＭのＣＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められなかったが、１ｍＭのＴＭＰ実験群のみは統計学的な有意差が認められた（Ｐ＜０．０００１）（図３、図４Ａ）。すなわち、１ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ及びＣＭＰはＨｅＬａ細胞に作用せず、１ｍＭのＴＭＰのみが細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。
【００８７】
図４Ｂは、１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。対照群では細胞は培養後９日まで急速に増殖した。ＡＭＰ実験群では細胞増殖が抑制され、細胞は、対照群と比較して培養後９日まで低速で増殖した。ＧＭＰ実験群では細胞は殆ど増殖しなかったが、細胞形状の変化が培養後３日に現れ、細胞死が培養後５日に惹起された。ＴＭＰ実験群では細胞は培養後５日までＡＭＰ実験群とほぼ同じ速度で増殖したが、細胞死が培養後７日に惹起された。ＣＭＰ実験群では細胞の増殖速度は培養後５日まで対照群とほぼ同じであったが、それ以降は対照群に比べて遅かった。細胞数について、対照群と比較して、ＡＭＰ実験群（ｐ＜０．０００１）、ＧＭＰ実験群（ｐ＜０．０００１）、ＴＭＰ実験群（ｐ＜０．０００１）、及び、ＣＭＰ群（ｐ＝０．００１）は統計学的な有意差が認められた（図３及び図４Ｂ）。すなわち、１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ及びＴＭＰは腫瘍細胞のＨｅＬａ細胞を死滅し、ＣＭＰは増殖をわずかに抑制することが明らかとなった。
【００８８】
実施例１及び２の結果から、ＴＭＰ及びＣＭＰに対する感受性が、正常細胞と、腫瘍細胞とでは異なることが明らかとなった。ここで、ＴＭＰは、生体に常在する化合物である。したがって、これらの結果は、正常細胞を死滅させず、腫瘍細胞を死滅させるＴＭＰは、副作用の少ない抗腫瘍剤として有用であることを示すものである。
【実施例３】
【００８９】
ＨＬ６０細胞の増殖に対するヌクレオシド誘導体（ヌクレオチド）の影響
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製
被験化合物として、市販のＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ及びＣＭＰが使用された。浮遊培養用基本培地として、市販のＰＲＭＩ１６４０（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）が使用された。前記ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ及びＣＭＰは、それぞれ、１０ｍＭとなるように浮遊培養用基本培地（ＰＲＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、抗生物質不含）に添加され、被験化合物含有培地が調製された。
【００９０】
細胞培養
ＨＬ６０細胞（ヒト前骨髄性白血病細胞）（ＪＣＲＢ細胞バンク、大阪）が、１６００００細胞個／ｍｌで浮遊培養用１２穴プレート（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に播種された（各群ｎ＝６）。その後、前記ＨＬ６０細胞は、前記被験化合物含有培地（１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰ）で培養された。対照として、前記ＨＬ６０細胞は、前記被験化合物を含まない基本培地で培養された。
【００９１】
観察
前記ＨＬ６０細胞の変化が、０、１、３、５、７、９及び１４日後に経時的に観察された。
【００９２】
細胞数の測定
培地中に浮遊している細胞が培地中に均一に分布するように懸濁された後、細胞数が血球計算盤を用いて測定することにより求められた。
【００９３】
統計解析
各実験群と対照群とについて、ポストホックな双方向性の繰り返しのある分散分析（Ｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が行われた。ポストホック分析には、Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤ  ｔｅｓｔが使用された。
【００９４】
結果
図５は、１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰが添加された培養条件におけるＨＬ６０細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。細胞数について、対照群と比較して、ＣＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められ、ＡＭＰ実験群、ＧＭＰ実験群及びＴＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められなかった（３群ともにｐ＜０．０００１）。つまり、ＡＭＰ、ＧＭＰ及びＴＭＰは、ＨｅＬａ細胞に対してと同様に、ＨＬ６０細胞に対して増殖抑制効果を有するが、ＣＭＰは増殖抑制効果を有さなかった。
【００９５】
以上の結果から、生体内常在性のヌクレオチド化合物による影響が、細胞の種類で、特に正常細胞と腫瘍細胞との間で異なること、及び、１０ｍＭのＴＭＰは、腫瘍細胞を死滅し、１ｍＭのＴＭＰは、腫瘍細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。また、ＴＭＰの細胞増殖抑制効果は、ＨｅＬａ細胞及びＨＬ６０細胞で類似することが示された。
【実施例４】
【００９６】
コンフルエント状態の正常細胞に対するヌクレオシド誘導体（ヌクレオチド）の影響
本実施例では、ＮＨＤＦ細胞のコンフルエント状態を正常組織のモデルとした。そして、ＮＨＤＦ細胞が密集している状態で高濃度ヌクレオシド誘導体（ヌクレオチド）の影響が評価された。
【００９７】
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製、細胞培養、観察、細胞数の測定、及び、統計解析は、原則として実施例１と同様に行われた。ＮＨＤＦ細胞（ヒト正常皮膚線維芽細胞）は６５００細胞個／ｃｍ2となるように１２穴プレート（旭硝子、東京）に播種され、コンフルエントになるまで基本培地で培養された（各群ｎ＝６）。その後、前記ＮＨＤＦ細胞はＰＢＳ（カルシウム／マグネシウム  フリー、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）で２回洗浄され、細胞培養培地が、培養後７日に基本培地から被験化合物含有培地に切り換えられた。前記ＮＨＤＦ細胞は、前記被験化合物含有培地（１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰ）で培養され、ＮＨＤＦ細胞の変化が、培地交換０、１、３、５、７、９及び１４日後に経時的に観察された。
【００９８】
結果
図６は、１ｍＭ又は１０ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ又はＣＭＰの培養条件で７日間培養したＮＨＤＦ細胞の顕微鏡写真である。１ｍＭのＡＭＰ実験群、１ｍＭのＧＭＰ実験群、１ｍＭのＴＭＰ実験群、１ｍＭのＣＭＰ実験群、非培地交換対照群、及び、培地交換対照群では、明確な変化はなく、線維芽細胞に典型的なコンフルエント状態が維持された。
【００９９】
１０ｍＭのＡＭＰ実験群の細胞の状態は、培地交換後１日まで非培地交換対照群と培地交換対照群と同様であった。しかし、培地交換後３日から接着が弱化し、培地交換後５日以降は徐々に接着細胞数が減少し、細胞間が疎密になった。培地交換後１４日では細胞が配向性を持たない網状に並んだ。
【０１００】
１０ｍＭのＧＭＰ実験群では、コンフルエント状態から、培地交換３日後に細胞が存在しない空白エリアが出現した。同エリアは徐々に大きくなり、細胞がやがて死滅した（培地交換１４日後）。
【０１０１】
１０ｍＭのＴＭＰ実験群の細胞の状態は両対照群と同様であったが、培地交換７日後から細胞間間隙が認められた。
【０１０２】
１０ｍＭのＣＭＰ実験群では細胞が存在しない空白エリアは培地交換７日後には認めなかった。しかし、前記空白エリアは培地交換９日後に出現し、培地交換１４日後までに拡大した。
【０１０３】
以上の結果から、１ｍＭのヌクレオチドのいずれも細胞の形態の変化を認めず、本濃度では密集した正常細胞、すなわち正常組織には影響しないことが示された。１０ｍＭの４種のヌクレオチドの全てで、コンフルエント状態から何らかの形態変化があった。ヌクレオチドの種類によって形態は異なったが、１０ｍＭのヌクレオチドは正常組織に影響を与える可能性があることが示された。また、細胞間に十分な間隔がある状態で被験化合物含有培地で培養を開始した場合と、コンフルエント状態から被験化合物含有培地で培養を開始した場合とで、ヌクレオチドの細胞への影響が異なることが明らかとなった。
【実施例５】
【０１０４】
腫瘍細胞の増殖に対するチミジン関連分子の影響
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製
被験化合物として、市販のＴＭＰ、チミジン５’−３リン酸ナトリウム塩（以下ＴＴＰと記載）（Ｔ０２５１、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、チミジン５’−２リン酸３ナトリウム塩（以下ＴＤＰと記載）（１５２１３９、和光純薬工業株式会社）、チミジン（２０５−０８０９１、和光純薬工業株式会社）、チミン（２０５−０１３９１、和光純薬工業株式会社）、２−デオキシ−Ｄ−リボース（０４５−００４７３、和光純薬工業株式会社）、５−メチル−ウリジン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ｒＴＭＰと記載）（Ｈｏｎｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、上海）、２’−デオキシチミジン３’−１リン酸２ナトリウム塩（以下３’−ＴＭＰと記載）（Ｈｏｎｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、上海）、ウリジン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ＵＭＰと記載）（２１４−００２８４、和光純薬工業株式会社）、チミジン３’，５’−環状１リン酸ナトリウム塩（以下ｃＴＭＰと記載）（Ｔ６７５４、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、及び、２’−デオキシウリジン５’−１リン酸２ナトリウム塩（以下ｄＵＭＰと記載）（Ｄ３８７６、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）が使用された。基本培地として、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を含むＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、及び、１１０ｍｇ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム）（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が使用された。前記ＴＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、チミジン、チミン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、ｒＴＭＰ、３’−ＴＭＰ、ＵＭＰ、ｃＴＭＰ及び／又はｄＵＭＰは、それぞれ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ又は１０ｍＭとなるように前記基本培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、抗生物質不含）に添加され、被験化合物含有培地が調製された。
【０１０５】
細胞培養
細胞培養は、原則として実施例２と同様に行われた。ＴＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、チミジン及びチミンの曝露実験（図７Ａ）の細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が７８００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。ＴＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、チミジン及びチミンは、それぞれ、１ｍＭの最終濃度で使用された。チミン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、チミン＋２−デオキシ−Ｄ−リボース、ＴＭＰ、及び、チミジンの曝露実験（図７Ｂ）の細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が９０００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。チミン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、チミン（１ｍＭ）＋２−デオキシ−Ｄ−リボース（１ｍＭ）、ＴＭＰ、及び、チミジンは、それぞれ、１ｍＭの最終濃度で使用された。ＴＭＰ、ｃＴＭＰ、ＵＭＰ、３’−ＴＭＰ及びｒＴＭＰの曝露実験（図８Ａ）の細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が１３０００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。ＴＭＰ、ｃＴＭＰ、ＵＭＰ、３’−ＴＭＰ及びｒＴＭＰは、それぞれ、１ｍＭの最終濃度で使用された。ＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ及びｒＴＭＰの曝露実験（図８Ｂ、図９）の細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が７０００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。ＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ及びｒＴＭＰは、それぞれ、１ｍＭ又は１０ｍＭの最終濃度で使用された。ＴＭＰ及びｒＴＭＰの曝露実験（図１０）の細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が６５００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。ＴＭＰ及びｒＴＭＰは、それぞれ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ及び１０ｍＭの最終濃度で使用された。
【０１０６】
観察、細胞数の測定、及び、統計解析は、実施例２と同様に行われた。
【０１０７】
結果
ＴＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、チミジン及びチミンの曝露実験
図７Ａは、１ｍＭのＴＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、チミジン又はチミンが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。細胞数について、対照群と比較して、ＴＭＰ実験群、ＴＤＰ実験群、ＴＴＰ実験群、及び、チミジン実験群は統計学的有意な細胞増殖抑制作用が認められ（４実験群ともにｐ＜０．０００１）、チミジン実験群は統計学的な有意差が認められなかった。また、ＴＭＰ実験群と比較して、ＴＴＰ実験群、ＴＤＰ実験群、及び、チミジン実験群は統計学的有意な作用が認められなかった。
【０１０８】
チミン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、チミン＋２−デオキシ−Ｄ−リボース、ＴＭＰ、及び、チミジンの曝露実験
図７Ｂは、１ｍＭのチミン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、チミン＋２−デオキシ−Ｄ−リボース、ＴＭＰ、又は、チミジンが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。細胞数について、対照群と比較して、ＴＭＰ実験群、及び、チミジン実験群は統計学的な有意差が認められ（２実験群ともにｐ＜０．０００１）、チミン実験群、２−デオキシ−Ｄ−リボース実験群、チミン＋２−デオキシ−Ｄ−リボース実験群は統計学的有意な作用が認められなかった。
【０１０９】
ＴＭＰ、ｃＴＭＰ、ＵＭＰ、３’−ＴＭＰ及びｒＴＭＰの曝露実験
図８Ａは、１ｍＭのＴＭＰ、ｃＴＭＰ、ＵＭＰ、３’−ＴＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。細胞数について、対照群と比較して、ＴＭＰ実験群（ｐ＜０．０００１）、３’−ＴＭＰ実験群（ｐ＜０．０００１）、及び、ｃＴＭＰ実験群（ｐ＝０．０００４）は統計学的有意な細胞増殖抑制作用が認められた。ｃＴＭＰ実験群では細胞増殖は、培養開始後５日まで対照群と同様であった。その後、細胞数が減少し、細胞数は培養開始後９日でＴＭＰ実験群と同程度になった。ｒＴＭＰ実験群及びＵＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められなかった。ＴＭＰ実験群と比較して、３’−ＴＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められずＴＭＰ実験群と同様の細胞増殖抑制作用が認められたが、その他の実験群全て統計学的有意に弱い細胞増殖抑制作用しか認められなかった（４実験群ともにｐ＜０．０００１）。
【０１１０】
ＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ及びｒＴＭＰの曝露実験
図８Ｂは、１ｍＭのＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件におけるＨｅＬａ細胞の生存細胞数（平均値±標準誤差、各ｎ＝６）の経時変化を表すグラフである。細胞数について、対照群と比較して、ＴＭＰ実験群（ｐ＜０．０００１）のみは統計学的有意な細胞増殖抑制作用が認められた。ｄＵＭＰ実験群では細胞増殖が培養開始後５日からわずかに抑制されたが、対照群と比較して統計学的な有意差は認められなかった。対照群と比較して、ＵＭＰ実験群及びｒＴＭＰ実験群は統計学的な有意差が認められなかった。
【０１１１】
図９は、１ｍＭ又は１０ｍＭのＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ＵＭＰ又はｒＴＭＰが添加された培養条件で７日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。１０ｍＭのｒＴＭＰ実験群及びＴＭＰ実験群では、細胞が死滅した。１０ｍＭのｄＵＭＰ実験群では、細胞は１ｍＭのｄＵＭＰ実験群と同程度に増殖抑制されたが、死滅しなかった。１０ｍＭのＵＭＰ実験群では、細胞は対照群と同程度に増殖した。
【０１１２】
ＴＭＰ及びｒＴＭＰの曝露実験
図１０は、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ又は１０ｍＭのＴＭＰ又はｒＴＭＰの培養条件で７日間培養したＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。５ｍＭ及び１０ｍＭのＴＭＰ実験群では細胞が培養開始後７日に死滅し始めた。１ｍＭ及び２ｍＭのＴＭＰ実験群では、細胞は増殖抑制されたが、死滅しなかった。５ｍＭ及び１０ｍＭのｒＴＭＰ実験群では、細胞が培養開始後５日に死滅し始め、培養開始後７日にほぼ死滅した。２ｍＭのｒＴＭＰ実験群では、細胞は増殖抑制されたが、死滅しなかった。１ｍＭのｒＴＭＰ実験群では、細胞は増殖抑制されず、対照群と同程度に増殖した。
【０１１３】
以上の結果から、細胞増殖は、チミン実験群及び対照群で相違が認められず、チミンは細胞増殖抑制作用を有しないことが示された。したがって、細胞増殖抑制作用の発現には、チミジン型のヌクレオチド構造が必要であり、糖部分に結合したリン酸基の数は細胞増殖抑制効果に関係しないことが明らかとなった。１ｍＭのｃＴＭＰ実験群では、ＨｅＬａ細胞は培養開始後５日まで対照群と同様に増加した後、細胞数が減少した。この結果は、ｃＴＭＰはＴＭＰと比較して細胞内への取込又は活性型への変換に時間を要するためである。また、ｒＴＭＰも同様の理由により、細胞増殖抑制効果を発揮するまでに時間を要するため、培養開始後７日において、１ｍＭのｒＴＭＰ実験群では細胞増殖が抑制されず、１０ｍＭのｒＴＭＰ実験群では細胞増殖が抑制された。そして、これらの結果は、ｃＴＭＰ及びｒＴＭＰはプロドラッグとして使用できることを示すものである。
【実施例６】
【０１１４】
腫瘍細胞の増殖に対する培地交換の影響（１）
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製、細胞培養、及び、観察は、原則として実施例２と同様に行われた。細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が６５００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。その後、前記ＨｅＬａ細胞は、前記被験化合物含有培地（１ｍＭ又は１０ｍＭのＴＭＰ）で培養された。１つの実験群は２４時間ごとに新鮮な被験化合物含有培地に交換された（培地交換実験群）。別の実験群は２４時間ごとに新鮮な被験化合物含有培地に交換せずに、同一の培地で培養した（非培地交換実験群）。また、前記細胞培養では、２４時間ごとに新鮮な基本培地に交換された対照群（培地交換対照群）と、２４時間ごとに新鮮な基本培地に交換されなかった対照群（非培地交換対照群）とが使用された。
【０１１５】
結果
図１１は、培地交換して７日間培養したＨｅＬａ細胞、及び、培地交換せずに７日間培養したＨｅＬａ細胞に対するＴＭＰの影響を示す顕微鏡写真である。培地交換実験群では、実施例２の結果と同様に、細胞死が１０ｍＭのＴＭＰで培養後７日に惹起された。また、１ｍＭのＴＭＰは細胞増殖を抑制した。非培地交換実験群では、細胞死は１ｍＭ及び１０ｍＭのいずれの濃度のＴＭＰにおいても培養後７日に惹起されず、細胞は非培地交換対照群と同程度に増殖した。
【実施例７】
【０１１６】
腫瘍細胞の増殖に対する培地交換の影響（２）
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製、細胞培養、及び、観察は、原則として実施例６と同様に行われた。細胞培養では、ＨｅＬａ細胞が６５００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。その後、前記ＨｅＬａ細胞は、前記被験化合物含有培地（１ｍＭ又は１０ｍＭのチミジン、又は、１ｍＭのＴＭＰ）で培養された。１つの実験群は２４時間ごとに新鮮な被験化合物含有培地に交換された（培地交換実験群）。別の実験群は２４時間ごとに新鮮な被験化合物含有培地に交換せずに、同一の培地で培養した（非培地交換実験群）。また、前記細胞培養では、２４時間ごとに新鮮な基本培地に交換された対照群（培地交換対照群）と、２４時間ごとに新鮮な基本培地に交換されなかった対照群（非培地交換対照群）とが使用された。
【０１１７】
結果
図１２は、培地交換して７日間培養したＨｅＬａ細胞、及び、培地交換せずに７日間培養したＨｅＬａ細胞に対するチミジン又はＴＭＰの影響を示す顕微鏡写真である。チミジン培地交換実験群（１ｍＭ及び１０ｍＭ）では、チミジン非培地交換実験群（１ｍＭ及び１０ｍＭ）の結果と同様に、腫瘍細胞の増殖が抑制され、チミジンの腫瘍細胞抑制効果は濃度依存的であった。チミジン非培地交換実験群では、細胞死が１０ｍＭのチミジンで培養後５日に惹起された。また、チミジン培地交換実験群（１ｍＭ）、チミジン非培地交換実験群（１ｍＭ）、及び、ＴＭＰ培地交換実験群（１ｍＭ）では、腫瘍細胞の増殖抑制効果は、ほぼ同一であった。さらに、培地交換対照群、非培地交換対照群、及び、ＴＭＰ非培地交換実験群（１ｍＭ）では、細胞死は惹起されなかった。
【０１１８】
前記のとおり、悪性腫瘍患者では、健常者と比較して、血中のヌクレオチダーゼ濃度が高いことが知られている。そこで、腫瘍細胞であるＨｅＬａ細胞もヌクレオチダーゼを細胞外に放出しており、ヌクレオシド誘導体、特にＴＭＰ、ＴＤＰ及びＴＴＰは、前記ヌクレオチダーゼによってチミジンに代謝（例えば、脱リン酸化）されるために、チミジン、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰはいずれも腫瘍細胞を死滅及び／又は増殖抑制を示したものと考えられる（図７参照）。そして、培地交換実験群では、ヌクレオチダーゼ自体及び／又はチミジンが除去されるために、腫瘍細胞の死滅及び／又は増殖抑制が惹起されない（図１１及び１２参照）。したがって、ヌクレオシドを化学的に修飾し（例えば、リン酸化）、腫瘍組織でその上昇を認めるヌクレオチダーゼにより代謝されることによって、腫瘍細胞に対する高い選択毒性を有するヌクレオシド誘導体の抗腫瘍剤を開発することができる。
【実施例８】
【０１１９】
腫瘍細胞の形態に対する抗腫瘍剤及びＴＭＰの影響
材料及び方法
被験化合物含有培地の調製、細胞培養、及び、観察は、原則として実施例２と同様に行われた。前記被験化合物として、ＴＭＰ（１ｍＭ）、シス−ジアンミン白金（ＩＩ）ジクロリド（以下シスプラチンと記載）（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）（１μＭ及び１０μＭ）、マイトマイシンＣ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）（０．０１μｇ／ｍＬ及び０．１μｇ／ｍＬ）、又は、パクリタキセル（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）（１０ｎＭ及び１００ｎＭ）が培養培地に添加された。前記細胞培養において、ＴＭＰ実験群、シスプラチン実験群及びマイトマイシンＣ実験群では、ＨｅＬａ細胞が７８００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。また、パクリタキセル実験群ではＨｅＬａ細胞が７０００細胞個／ｃｍ2で１２穴プレートに播種された。
【０１２０】
結果
図１３は、種々の濃度のＴＭＰ及び／又は抗腫瘍剤が添加された培養条件で３日間又は７日間培養されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真である。対照群と比較して、１０μＭのシスプラチン実験群及び０．１μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ実験群では、扁平で大きく広がった形態の細胞が培養後３日に出現した。同様に、１ｍＭのＴＭＰ実験群では、扁平で大きく広がった形態の細胞が培養後７日に出現した。
【０１２１】
シスプラチン実験群、マイトマイシンＣ実験群では、これらの化合物を添加して増殖抑制した細胞で典型的に見られる、扁平で大きく広がった形態の細胞が出現した。したがって、ＴＭＰ実験群では、ヌクレオチダーゼにより代謝された後、シスプラチンやマイトマイシンＣと同様の作用機序（ＤＮＡの複製及び／又は転写の阻害）で、腫瘍細胞の増殖が抑制されることを示すものである。
【０１２２】
まとめ
以上の結果より、以下の点が明らかとなった。
（１）高濃度ヌクレオチド処理による細胞への影響は、細胞増殖及び細胞死惹起作用を指標とした場合、正常細胞と腫瘍細胞とで異なる。
（２）これらの細胞への影響に対して、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＴＭＰ、及び、ＣＭＰとで各々影響が異なる。
（３）ＴＭＰ及びその誘導体は、他のヌクレオチドと相違し、正常細胞に影響しない濃度で、腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制作用、及び、細胞死惹起作用が認められる。
（４）さらに、ＴＭＰ及びその誘導体は、正常組織モデルである密集正常細胞には１ｍＭの濃度では作用しない。
（５）ＴＭＰ及びその誘導体（ＴＤＰ、ＴＴＰ、ｃＴＭＰ、ｒＴＭＰ等）による腫瘍細胞に選択性の高い増殖抑制作用の発現には、リボース又はデオキシリボースの糖とチミンとを有するヌクレオシドであることが必要であり、リン酸エステルのリン酸基の数は影響しない。
（６）ＴＭＰ及びその誘導体による腫瘍細胞の増殖抑制作用の発現には、ＴＭＰ等が代謝される必要があり、この代謝酵素は、腫瘍組織で濃度が上昇しているヌクレオチダーゼであることが示された。
（７）ＴＭＰ及びその誘導体による正常細胞と比較した場合の腫瘍細胞への増殖抑制作用の発現は、腫瘍組織で上昇したヌクレオチダーゼによる活性発現体への代謝が関与する。
【０１２３】
これらの結果から、腫瘍治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分としてのＴＭＰの有用性が明らかとなった。即ち、正常組織には作用せず腫瘍細胞のみに細胞死を惹起出来れば、患者に負荷をかけずに治療することが可能である。
【０１２４】
生体内、特に細胞内に豊富に存在するヌクレオチドは、副作用がなく安全性が高い。前記結果は、生体内常在性のＴＭＰ、もしくは、腫瘍細胞膜上の、又は細胞外でヌクレオチダーゼにより代謝されるＴＤＰ、ＴＴＰ、ｃＴＭＰ、又は、これらの塩及び／又は溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物を用いれば、正常な細胞、組織及び器官には影響を与えずに腫瘍細胞のみを死滅させることができることを示すものである。
【０１２５】
また、本結果は、腫瘍細胞の細胞膜上の、又は腫瘍細胞から分泌されたヌクレオチダーゼによる脱リン酸化により活性体に代謝され、抗腫瘍活性を発現するヌクレオシド類似構造を有する抗腫瘍剤のリン酸エステル誘導体、又は、これら化合物の塩及び／又は溶媒和物も、プロドラッグとして、正常な細胞、組織及び器官には影響を与えずに腫瘍細胞のみを死滅させることができることを示すものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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