(57)【要約】      （修正有）【課題】対象生成物を発現する真核宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞を選択する方法の提供。【解決手段】前記真核宿主細胞が少なくとも対象生成物をコードする導入ポリヌクレオチド、及びＤＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドを含む複数の真核宿主細胞を提供するステップであって、前記宿主細胞の細胞生存度は葉酸塩の取込みに依存し、前記複数の真核宿主細胞を、少なくともＤＨＦＲの阻害剤および制限濃度の葉酸塩を含む選択培地で培養するステップと、対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するステップとを含む、対象生成物を発現する真核宿主細胞の選択方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するための方法であって、
少なくとも
（ａ）複数の真核宿主細胞を提供するステップであって、前記宿主細胞の細胞生存度は
葉酸塩の取込みに依存し、前記真核宿主細胞が少なくとも
（ｉ）対象生成物をコードする導入ポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）ＤＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドを含むステップと、
（ｂ）前記複数の真核宿主細胞を、少なくともＤＨＦＲの阻害剤および制限濃度の葉酸
塩を含む選択培地で培養するステップと、
（ｃ）対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するステップと、を
含む方法。
【請求項２】
前記選択培地が５００ｎＭ以下の濃度のＤＨＦＲ阻害剤および５００ｎＭ以下の濃度の
葉酸塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択培地が２００ｎＭ以下の濃度のＤＨＦＲ阻害剤を含み、および／または２．５
ｎＭ〜１００ｎＭの濃度の葉酸塩を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択培地が、１０ｎＭ〜１００ｎＭのＭＴＸ濃度と組み合わせた１２．５ｎＭ〜５
０ｎＭの濃度の葉酸を含む、請求項１から３の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＨＦＲ酵素が、ＤＨＦＲ阻害剤に対して、宿主細胞によって内因的に発現される
ＤＨＦＲ酵素よりも低い感受性を有するＤＨＦＲ酵素である、請求項１から４の少なくと
も一項に記載の方法。
【請求項６】
前記真核宿主細胞がＣＨＯ宿主細胞、好ましくはＤＨＦＲ＋（プラス）細胞である、請
求項１から５の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるＤＨＦＲ
酵素よりも、ＭＴＸに対する感受性がより低い導入ＤＨＦＲ酵素と一緒に用いられる、請
求項１から６の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項８】
対象生成物をコードする前記ポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素をコードする前記ポ
リヌクレオチドが、少なくとも１つの発現ベクターによって導入されている、請求項１か
ら７の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が対象生成物をコードする少なくとも２つの導入ポリヌクレオチドを含み
、好ましくは少なくとも１つのポリヌクレオチドは免疫グロブリン分子の重鎖をコードし
、他のポリヌクレオチドは免疫グロブリン分子の軽鎖をコードする、請求項１から８の少
なくとも一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象生成物をコードする（１つまたは複数の）導入ポリヌクレオチドおよび前記Ｄ
ＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドが異なる発現カセットに含まれ、前記対象
生成物をコードする（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドの発現を促進するための発現
カセットは、前記ＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレオチドの発現を促進するための発
現カセットよりも強いプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む、請求項１から９
の少なくとも一項に記載の方法。
【請求項１１】
対象生成物を生成するための方法であって、以下の、
（ａ）前記対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するための、請
求項１から１０のいずれかに記載の選択方法を実施するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの選択される真核宿主細胞を、前記対象生成物の発現を可能にす
る条件下で培養するステップと、を少なくとも含む方法。
【請求項１２】
以下の、
（ｃ）前記細胞培養培地および／もしくは前記真核宿主細胞から前記対象生成物を単離
するステップ、ならびに／または
（ｄ）単離された対象生成物をさらに処理するステップ、の少なくとも１つを含む、請
求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象生成物が免疫グロブリン分子またはその機能的断片である、請求項１１または
１２に記載の方法。
【請求項１４】
５００ｎＭ以下の濃度のＤＨＦＲ阻害剤、および５００ｎＭ以下の制限濃度の葉酸塩を
含む選択培地。
【請求項１５】
２．５ｎＭ〜１００ｎＭの制限濃度の葉酸塩および／または２００ｎＭ以下の濃度のＤ
ＨＦＲ阻害剤を含む、請求項１４に記載の選択培地。
【請求項１６】
１０ｎＭ〜１００ｎＭのＭＴＸの濃度と組み合わせた１２．５ｎＭ〜５０ｎＭの濃度の
葉酸を含む、請求項１４または１５に記載の選択培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象生成物を発現する真核宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞を選択する新規
方法に関する。さらに、本発明は、対象生成物を高収率で効率的に生成する方法に関する
。
【背景技術】
【０００２】
多量の対象生成物、例えば組換えペプチドおよびタンパク質をクローニングして発現さ
せる能力は、ますます重要になっている。高レベルのタンパク質を精製する能力は、ヒト
の医薬および生物工学分野で、例えばタンパク質医薬を生成するために、ならびに例えば
タンパク質の三次元構造の決定を可能にするためにタンパク質を結晶化させるための基礎
研究において重要である。さもなければ多量に得るのが困難であるタンパク質は、宿主細
胞で過剰発現させ、その後に単離および精製することができる。
【０００３】
組換えタンパク質の生成のための発現系の選択は、細胞増殖特性、対象タンパク質の発
現レベル、細胞内および細胞外での発現、翻訳後改変ならびに生物活性だけでなく、治療
タンパク質の生産における規制問題および経済事項を含む、多くの因子によって決まる。
細菌または酵母などの他の発現系に勝る哺乳動物細胞の重要な利点は、適切なタンパク質
折畳み、複合Ｎ結合グリコシル化および真正Ｏ結合グリコシル化、ならびに他の広範な翻
訳後改変を実行する能力である。記載した利点のために、真核細胞、特に哺乳動物細胞は
、現在、モノクローナル抗体などの複合治療タンパク質を生成するための最適な発現系で
ある。
【０００４】
高発現宿主細胞（高生産者とも呼ばれる）を得る最も一般的な手法は、第一段階として
対象生成物を発現するのに適当な発現ベクターを生成する。発現ベクターは、対象生成物
をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞での発現を誘起し、組換え細胞系を生成するた
めの少なくとも１つの選択マーカーを提供する。哺乳動物発現ベクターの重要なエレメン
トには、頑健な転写活性が可能である構成的または誘導可能なプロモーター；安定細胞系
の調製および遺伝子増幅のための、Ｋｏｚａｋ配列、翻訳終結コドン、ｍＲＮＡ切断およ
びポリアデニル化シグナル、転写終結区ならびに選択マーカーを通常含む、最適化された
ｍＲＮＡプロセシングおよび翻訳シグナルが通常含まれ、さらに、細菌でのベクター増殖
のための原核生物の複製起点および選択マーカーが発現ベクターによって提供されてもよ
い。
【０００５】
近年では、開発は、宿主細胞での遺伝子発現のための改良されたベクターの設計を重視
していた。しかし、利用可能なベクターがあり余る程あるにもかかわらず、哺乳動物細胞
で高収率を有する頑健なポリペプチド／タンパク質の生成は、まだ難題である。
【０００６】
高収率で対象生成物を発現する高生産性細胞系を得るための１つの確立された方法は、
宿主細胞の安定したトランスフェクションである。しかし、ゲノムへの安定した組込みは
稀な事象であり、安定してトランスフェクトされた細胞の小さいサブセットだけが高生産
者である。したがって、それらの選択が難題である。
【０００７】
選択マーカーおよび選択系は、対象生成物を高収率で発現する宿主細胞を得るために、
遺伝子操作、組換えＤＮＡ技術および組換え生成物の生成において広く使われている。そ
れぞれの系は、安定してトランスフェクトされたクローンを生成および同定するためにも
有用である。それぞれの選択マーカーおよび選択系を用いる主要な目標は、選択的増殖条
件へ曝露させると、導入された選択マーカー、したがって対象組換え生成物の高レベルの
生成が可能な細胞の同定を可能にする、選択可能な遺伝子を導入することである。生成物
発現の収率を増加させることは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）または
グルタミン合成酵素（ＧＳ）などの酵素が例えば欠損している細胞系を、これらの選択マ
ーカー酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ならびにＤＨＦＲを阻害するメトト
レキセート（ＭＴＸ）、およびＧＳを阻害するメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）など
の剤と一緒に用いて、遺伝子増幅によって達成することができる。
【０００８】
先行技術で通常用いられる１つの卓越した選択系は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ／ＭＴ
Ｘ選択系である。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ
）へのジヒドロ葉酸のＮＡＤＰ依存的還元を触媒する。ＴＨＦは、１０−ホルミル−ＤＨ
Ｆおよび５，１０−メチレン−ＤＨＦに次に内変換され、それぞれプリンおよびチミジレ
ートの新規生合成で用いられる。ＤＨＦは、５，１０−メチレン−ＴＨＦ依存的反応にお
けるｄＴＭＰへのｄＵＭＰの変換を触媒するチミジレート合成酵素（ＴＳ）の触媒活性の
副産物である。したがって、ＤＨＦＲは、ＤＮＡ複製のために必要であるプリンおよびピ
リミジンヌクレオチドの生合成のために必須である、ＴＨＦコファクターの再利用のため
に重要である。したがって、ＤＨＦＲ遺伝子欠損（すなわち標的ゲノム欠失によって）細
胞（例えばＣＨＯ細胞）を、ヌクレオチドが含まれない培地でのＤＨＦＲ遺伝子のトラン
スフェクションのためのレシピエントとして用いることができる。トランスフェクション
の後、最も強力なＤＨＦＲ阻害剤（Ｋｄ＝１ｐＭ）である抗葉酸剤ＭＴＸの漸増濃度に細
胞を曝露させ、それによって、細胞により高いレベルのＤＨＦＲを生成させることができ
る。複数回の選択の後、選択マーカーＤＨＦＲは、しばしばかなりの増幅を経る。また、
それぞれの選択マーカーのより感受性である変異形を、野生型の宿主細胞と併用してもよ
い。あるいは、ＭＴＸへの大きな抵抗性、すなわちより低い感受性を有する突然変異体マ
ウスＤＨＦＲ、またはＤＨＦＲの他の変異形は、トランスフェクトされた細胞での高レベ
ルのＭＴＸ抵抗性の獲得を著しく増強した優性の選択マーカーとしても、広範に用いられ
ている。しかし、先行技術で用いられるＤＨＦＲ／ＭＴＸ選択系の主要な欠点は、この技
術が、変異原性細胞傷害剤ＭＴＸを利用するということである。ＭＴＸは、レシピエント
細胞の遺伝子型を、特により高い濃度において、変化させることができる。この結果、例
えば還元型葉酸担体（ＲＦＣ）における機能欠失型突然変異／またはＲＦＣ遺伝子発現の
喪失（これらは共に、ＭＴＸ取込みを消滅させる）による、対象標的遺伝子の発現が存在
しないＭＴＸ抵抗性細胞集団がしばしば生じる。しかし、対象生成物を十分な収率で生成
する宿主細胞を単離するために、十分にストリンジェントな選択条件を達成するために、
増加する／高い濃度のＭＴＸが必要である。
【０００９】
明らかになるように、トランスフェクトされた集団から高生産性細胞を濃縮するために
、高ストリンジェンシー選択系が重要である。選択系のストリンジェンシーが高いほど、
選択工程後の低生産者の数は少なく、トランスフェクトされた細胞集団で非常に稀な超高
生産性クローンを見出す可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、対象生成物を高収率で生成する宿主細胞を選択するため
のストリンジェントな選択系、ならびに対象生成物を十分な収率で生成するための方法を
提供することである。詳細には、本発明の目的は、必要とする有毒な剤、特にＭＴＸの量
がより少ないストリンジェントな選択系を提供することである。さらに、本発明の目的は
、対象生成物を高収率で生成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、対象生成物を高収率で発現する宿主細胞を選択するための選択系、およびそ
れぞれの生成物、特に抗体などのポリペプチドの生成に関する。
【００１２】
一態様によると、本発明は、対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選
択するための方法であって、少なくとも以下の
（ａ）複数の真核宿主細胞を提供するステップであって、前記宿主細胞の細胞生存度は
葉酸塩の取込みに依存し、前記真核宿主細胞が少なくとも
（ｉ）対象生成物をコードする導入ポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）ＤＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドを含むステップと、
（ｂ）前記複数の真核宿主細胞を、少なくともＤＨＦＲの阻害剤および制限濃度の葉酸
塩を含む選択培地で培養するステップと、
（ｃ）対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するステップと、を
含む方法に関する。
【００１３】
本発明は、対象生成物の発現を可能にする条件下で本発明によって選択される宿主細胞
を培養することを含む、対象生成物を生成する方法にも関する。
【００１４】
本発明による選択方法で用いることができる、少なくともＤＨＦＲの阻害剤および葉酸
塩を制限濃度で含む選択培地も提供される。「選択培地」とは、宿主細胞の選択に有用で
ある細胞培養培地である。
【００１５】
本出願の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の請求項から当分
野の技術者に明らかになる。しかし、以下の説明、添付の請求項および具体的実施例は、
本出願の好ましい実施形態を示しているものの、例示だけのためであることを理解された
い。開示される発明の精神および範囲内の様々な変更および改変は、以下のものを読むこ
とによって当分野の技術者に容易に明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、抗葉酸剤ＭＴＸなどの有毒な剤をより低い濃度でのみ必要とするが、高生産
性宿主細胞を同定するのに十分なストリンジェントな選択条件をなお提供する、選択マー
カーとしてＤＨＦＲを用いる選択系に関する。
【００１７】
本発明の一態様によると、対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択
するための方法であって、少なくとも以下の
（ａ）複数の真核宿主細胞を提供するステップであって、前記宿主細胞の細胞生存度は
葉酸塩の取込みに依存し、前記真核宿主細胞が少なくとも
（ｉ）対象生成物をコードする導入ポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）ＤＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドを含むステップと、
（ｂ）前記複数の真核宿主細胞を、少なくともＤＨＦＲの阻害剤および葉酸塩を制限濃
度で含む選択培地で培養するステップと、
（ｃ）対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するステップと、を
含む方法が提供される。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」とは、通常１つのデオキシリボースまたはリボースから別の１つ
に連結するヌクレオチドのポリマーであり、文脈次第でＤＮＡならびにＲＮＡを指す。用
語「ポリヌクレオチド」は、いかなるサイズ制限も含まず、特定の改変ヌクレオチドでは
、改変を含むポリヌクレオチドも包含する。
【００１９】
「対象生成物」は、前記宿主細胞から発現される生成物を指す。対象生成物は、例えば
ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えばＲＮＡであってよい。好ましくは、対象生
成物は、ポリペプチド、特に免疫グロブリン分子である。対象生成物のさらなる例を、以
下に詳述する。
【００２０】
「導入ポリヌクレオチド」とは、例えばトランスフェクションなどの組換え技術を用い
て、宿主細胞に導入されたポリヌクレオチド配列を指す。宿主細胞は、導入ポリヌクレオ
チドに同一であるそれぞれ対応する内因性ポリヌクレオチドを含んでもよく、含まなくて
もよい。導入は、例えば、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる、適するベクターを
トランスフェクトすること（安定トランスフェクション）によって達成することができる
。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入を可能にする、適する発現ベクターを以下に詳述
する。異種核酸がゲノムに挿入されない場合は、異種核酸は、後期段階で、例えば細胞が
有糸分裂を経るときに失われる可能性がある（一時的トランスフェクション）。適するベ
クターは、例えばエピソーム複製によって、ゲノムに組み込まれることなく宿主細胞で維
持されることもあるかもしれない。しかし、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するため
の他の技術も先行技術で公知であり、それらは下でさらに詳細に記載される。
【００２１】
「ＤＨＦＲの阻害剤」とは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の活性を阻害する
化合物である。それぞれの阻害剤は、例えば、ＤＨＦＲとの結合をめぐってＤＨＦＲ基質
と競合することができる。適するＤＨＦＲ阻害剤は、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）
などの抗葉酸剤である。さらなる例には、それらに限定されないが、グルクロン酸トリメ
トレキセート（ニュートレキシン）、トリメトプリム、ピリメタミンおよびペメトレキセ
ドが含まれる。
【００２２】
本明細書で用いる用語「選択すること」または「選択」は、本発明によるベクターまた
はベクター組合せを組み込んだ宿主細胞を選択し、それに応じて得るために、選択マーカ
ーおよび選択的培養条件を用いる過程を特に指す。それによって、トランスフェクトされ
た宿主細胞の集団から、首尾よくトランスフェクトされた宿主細胞を単離および／または
濃縮することができる。
【００２３】
本発明によるベクターまたはベクター組合せを首尾よく組み込んだ宿主細胞と比較して
、本発明によるベクターまたはベクター組合せを首尾よく組み込まなかった宿主細胞は、
選択的培養条件下で好ましくは死に至るかまたは増殖が損なわれる。選択の間、本発明に
よるベクターまたはベクター組合せを首尾よく組み込んだ宿主細胞は、トランスフェクト
された宿主細胞の集団からプールとして濃縮することができる。また、選択の間（例えば
クローン選択によって）、トランスフェクトされた宿主細胞の集団から個々の宿主細胞を
単離することができる。首尾よくトランスフェクトされた宿主細胞を（例えばＦＡＣＳ選
別または限界希釈によって）得るための選択方法の適する実施形態は、先行技術で周知で
あり、したがって詳細な説明を必要としない。
【００２４】
「葉酸塩の制限濃度」とは、宿主細胞に選択圧を提供する、選択培地中の葉酸塩の濃度
を指す。したがって、葉酸塩は選択培地に豊富には含まれず、それによって宿主細胞に選
択圧を提供する。制限濃度で選択培地に含まれる葉酸塩は、宿主細胞によって取り込まれ
、処理されることが可能である。宿主細胞によって処理されないであろう葉酸塩、特に葉
酸塩誘導体は、選択圧に寄与しないであろうし、したがって制限濃度に寄与しないであろ
う。適する濃度域を、下に記載する。
【００２５】
「ポリペプチド」とは、（１つまたは複数の）ペプチド結合によって連結されるアミノ
酸のポリマーを含む分子を指す。ポリペプチドには、タンパク質（例えば、５０個を超え
るアミノ酸を有する）およびペプチド（例えば、２〜４９個のアミノ酸を有する）を含む
、任意の長さのポリペプチドが含まれる。ポリペプチドには、任意の活性または生物活性
のタンパク質および／またはペプチドが含まれる。適する例を、下に概説する。
【００２６】
対象生成物を生成することができる組換え真核生物細胞を提供するための選択系は、選
択マーカーとしてのＤＨＦＲの使用と組み合わせた選択培地中の葉酸塩の限定的利用度に
基づくことができることが、予想外にも見出された。この系は広く適用でき、すなわち、
細胞生存度が葉酸塩の取込みに依存する真核宿主細胞に適用可能である。上記のように、
遺伝子増幅のために十分な選択圧を達成するために、したがって対象生成物の生成の増加
を達成するために、先行技術はかなり高い抗葉酸剤／ＭＴＸ濃度を用いなければならない
。ＭＴＸなどの抗葉酸剤は有毒であり、宿主細胞を遺伝的に変化させることがあるので、
これは欠点である。選択培地でのＤＨＦＲ選択マーカーと制限濃度の葉酸塩との併用に基
づく本発明の手法は、低いＤＨＦＲ阻害剤濃度でも選択ストリンジェンシーがかなり増加
する利点を有する。したがって、本発明の選択系を用いる場合、低い濃度のＤＨＦＲ阻害
剤（例えばＭＴＸ）を選択培地で用いる場合でも、高生産者が得られる。したがって、高
生産性の細胞クローンの同定を可能にするストリンジェントな選択条件を提供するための
先行技術手法と比較して、本発明の教示を用いる場合、より少ないＤＨＦＲ阻害剤、した
がってより低い濃度の有毒な剤しか必要としない。その特異な設計のために、トランスフ
ェクトされた宿主細胞集団からの高生産性細胞の濃縮を可能にする、非常にストリンジェ
ントな選択系が提供される。本発明による選択系のこの高いストリンジェンシーは、集団
での選択の後の集団内の低生産者数を低下させ、非常に稀な超高生産性クローンを見出す
可能性を高くする。
【００２７】
選択培地は、１つまたは複数種の葉酸塩を含むことができる。本発明による葉酸塩は、
例えば酸化型葉酸塩（すなわち葉酸）または還元型葉酸塩またはその誘導体であってよい
。一般に、そのような葉酸塩が好ましくは機能的膜結合葉酸受容体によって真核生物の細
胞に取り込まれることが可能である限り、葉酸塩は本発明の範囲内で有用であることがで
きる。酸化型葉酸塩、すなわち葉酸、ならびに還元型葉酸塩またはテトラヒドロ葉酸（Ｔ
ＨＦ）として知られる葉酸の還元型誘導体は、真核生物、特に哺乳動物の細胞におけるプ
リン、チミジレートおよび特定のアミノ酸の生合成のための必要不可欠なコファクターお
よび／またはコエンザイムであるビタミンＢ９群である。ＴＨＦコファクターは、ＤＮＡ
複製、したがって細胞増殖のために特に重要である。具体的には、ＴＨＦコファクターは
、プリンおよびチミジレート、アミノ酸の新規の生合成、ならびにＤＮＡのＣｐＧ島メチ
ル化を含むメチル基代謝を含む、一連の相互接続代謝経路の１炭素単位の供与体として機
能する。具体的には、１０−ホルミル−ＴＨＦ（１０−ＣＨＯ−ＴＨＦ）を含むＴＨＦコ
ファクターは、プリンの新規生合成に関与する２つの重要な新規ホルミルトランスフェラ
ーゼ反応で、１炭素単位を供与する。酸化型葉酸塩の好ましい例は、葉酸である。還元型
葉酸塩の好ましい例は、５−メチル−テトラヒドロ葉酸、５−ホルミル−テトラヒドロ葉
酸、１０−ホルミル−テトラヒドロ葉酸および５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸で
ある。
【００２８】
選択培地中の葉酸塩の濃度は、用いる真核生物宿主細胞に特に依存する。５００ｎＭ以
下、２５０ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、
２５ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、さらに１０ｎＭ以下、例えば７．５ｎＭ以下の葉酸塩濃度
が適する。適する範囲には、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、０．１ｎＭ〜２５０ｎＭ、５また
は１０ｎＭ〜２５０ｎＭ、好ましくは１ｎＭ〜１５０ｎＭ、５または１０ｎＭ〜１５０ｎ
Ｍ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、５または１０ｎＭ〜１００ｎＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０
ｎＭ、２．５ｎＭ〜５０ｎＭ、１０ｎＭ〜５０ｎＭまたは１２．５ｎＭ〜５０ｎＭが含ま
れる。これらの濃度は、葉酸を葉酸塩として用いるときに特に適する。
【００２９】
それぞれの濃度は、本発明の意味において制限的であり、したがって宿主細胞に選択圧
を提供するのに適する。細胞が生存可能である限り、濃度が低いほど、発揮される選択圧
はより強い。記載の濃度域は、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いるのに特に適する。
【００３０】
選択培地で用いられるＤＨＦＲ阻害剤の濃度も、用いる真核生物宿主細胞に依存する。
選択培地中のＤＨＦＲ阻害剤の濃度が低下されると想定される場合には、５００ｎＭ以下
、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下
のＤＨＦＲ阻害剤濃度が有利である。しかし、好ましくは、選択培地は少なくとも１０ｎ
ＭのＤＨＦＲ阻害剤を含む。好ましくはＭＴＸである抗葉酸剤の好ましい濃度は、１ｎＭ
〜５００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ〜２００ｎＭ、１０ｎＭ〜１５０ｎＭ、より好ましく
は１０ｎＭ〜１００ｎＭである。選択培地中のそれぞれの濃度は、ＣＨＯ細胞のために特
に適する。
【００３１】
上記の葉酸塩および抗葉酸剤の好ましい濃度および濃度域は、互いに組み合わせること
ができる。一実施形態によると、ＤＨＦＲ阻害剤、好ましくはＭＴＸの２００ｎＭ以下、
好ましくは１５０ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下の濃度、および１００ｎＭ未満の
葉酸塩、好ましくは７５ｎＭ未満の葉酸塩、好ましくは葉酸の濃度を含む選択培地が用い
られる。一実施形態では、１２．５ｎＭ〜５０ｎＭの葉酸塩濃度が、１０ｎＭ〜１００ｎ
Ｍの抗葉酸剤濃度と組み合わせて用いられる。好ましくは、葉酸塩および抗葉酸剤として
葉酸およびＭＴＸが用いられる。
【００３２】
葉酸およびＭＴＸの可能な濃度は、お互いに依存してもよい。好ましい組合せは、２．
５ｎＭ〜７５ｎＭ、２．５ｎＭ〜５０ｎＭまたは１２．５ｎＭ〜５０ｎＭの葉酸濃度と、
１０ｎＭ〜５００ｎＭ、好ましくは１０ｎＭ〜１００ｎＭのＭＴＸ濃度との組合せである
。これらの濃度は、ＤＨＦＲ＋（プラス）細胞を用いるときに特に好ましい。
【００３３】
上記の濃度は、成長の早い懸濁細胞に特に適し、それは商業生産細胞系の好ましい表現
型である。しかし、異なる細胞系が異なる葉酸消費特性を有することがある。さらに、制
限的／選択的な濃度は、用いる葉酸塩、抗葉酸剤それぞれによって異なってよい。したが
って、葉酸塩、特に葉酸および抗葉酸剤、特にＭＴＸの制限濃度、ならびに適する葉酸対
ＭＴＸの比は、異なる細胞系で異なってよい。しかし、適する濃度は、当業技術者が実験
的に容易に決定することができる。
【００３４】
一実施形態によると、トランスフェクションおよび／または選択の前に、宿主細胞は無
葉酸塩培地、または制限濃度の葉酸塩を含む培地で前培養される。葉酸塩の適する制限濃
度は、上に記載されている。好ましくは、宿主細胞を前培養するための前記培地は、葉酸
塩、特に葉酸を５０ｎＭ以下の濃度で含む。
【００３５】
組み込まれた選択マーカーＤＨＦＲの発現は、選択的培養条件下で宿主細胞に選択有利
性を提供する。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子欠損宿主細胞（例えば標的ゲノム欠失によって、
ＤＨＦＲ−宿主細胞とも呼ばれる）（例えばＣＨＯ細胞）を、ヌクレオチドが含まれない
培地での選択マーカー遺伝子としてのＤＨＦＲ遺伝子のトランスフェクションのためのレ
シピエントとして用いることができる。しかし、適当な選択的培養条件を用いる場合には
、ＤＨＦＲ選択を実施するときに、ＤＨＦＲを内因的に発現する宿主細胞（ＤＨＦＲ＋（
プラス）宿主細胞）を用いることも可能である。本発明によるポリヌクレオチドによるト
ランスフェクションの後、細胞をＤＨＦＲ阻害剤の漸増濃度に曝露させることができる。
ＤＨＦＲ阻害剤の１つの例は、強力なＤＨＦＲ阻害剤（Ｋｄ＝１ｐＭ）であるＭＴＸなど
の抗葉酸剤である。培地中のＭＴＸなどの抗葉酸剤の存在は、生存するためにＤＨＦＲの
増加するレベルを細胞に生成させる。複数回の選択の後に、選択マーカーＤＨＦＲは、そ
れを達成するためにかなりの遺伝子増幅をしばしば経る。
【００３６】
本発明と併用することができるいくつかの適するＤＨＦＲ遺伝子が、先行技術で公知で
ある。ＤＨＦＲは、野生型ＤＨＦＲまたはその機能的変形体もしくは誘導体であってよい
。用語「変形体」または「誘導体」には、それぞれのＤＨＦＲ酵素のアミノ酸配列に関し
て１つまたは複数のアミノ酸配列変換（例えば欠失、置換または付加）を有するＤＨＦＲ
酵素、ＤＨＦＲ酵素またはその機能的断片およびさらなる構造および／または機能を提供
するように改変されているＤＨＦＲ酵素、ならびにＤＨＦＲ酵素の少なくとも１つの機能
を保持する上記の機能的断片を含む融合タンパク質が含まれる。ＤＨＦＲ酵素／変形体は
、ＭＴＸに対して野生型ＤＨＦＲ酵素よりも多少感受性である、選択マーカーとして用い
ることができる。一実施形態によると、用いるＤＨＦＲ酵素は、ＭＴＸなどの抗葉酸剤に
対して、対応する野生型ＤＨＦＲ酵素および／または発現されるならば宿主細胞によって
内因的に発現されるＤＨＦＲ酵素よりも感受性である。ＤＨＦＲ酵素は、それが本発明の
中で機能的である限り、すなわち用いる宿主細胞に適合する限り、任意の種に由来しても
よい。例えば、ＭＴＸへの大きな抵抗性を有する突然変異体マウスＤＨＦＲは、トランス
フェクトされた細胞での高レベルのＭＴＸ抵抗性の獲得を著しく増強する優性の選択マー
カーとして広範に用いられている。好ましくは、ＭＴＸなどのＤＨＦＲ阻害剤に対して、
ＤＨＦＲ＋（プラス）宿主細胞で内因的に発現されるＤＨＦＲ酵素よりも影響を受けにく
く、したがって感受性がより低いＤＨＦＲ酵素が用いられる。
【００３７】
一実施形態によると、イントロンまたはその断片は、ＤＨＦＲ遺伝子の読み取り枠の３
’末端に置かれる。これは、構築物の発現／増幅率に有益な影響を及ぼす。ＤＨＦＲ発現
カセットで用いられるイントロンは、ＤＨＦＲ遺伝子のより小さい、非機能的変形体をも
たらしている（Ｇｒｉｌｌａｒｉら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８７巻、５
９〜６５ページ）。それによって、ＤＨＦＲ遺伝子の発現レベルは低下し、したがって選
択系のストリンジェンシーをさらに高くすることができる。したがって、宿主細胞は、Ｄ
ＨＦＲ酵素をコードする導入ポリヌクレオチドを含むことができ、前記ポリヌクレオチド
は、ＤＨＦＲコード配列の３’に位置するイントロンを含む。ＤＨＦＲ遺伝子の発現レベ
ルを低下させるためにイントロンを利用する代替法がＥＰ０７２４６３９に記載され、そ
れらを用いることもできた。
【００３８】
ほとんどの原核生物と対照的に、それら自身の葉酸塩を合成する植物および真菌類、哺
乳動物ならびに他の真核生物種はＴＨＦコファクター生合成を欠き、したがってそれらを
外来源、通常培地から得なければならない。３つの独立輸送系、すなわち還元葉酸塩担体
（ＲＦＣ）、プロトン結合葉酸塩輸送体（ＰＣＦＴ、別名ＳＬＣ４６Ａ）および葉酸塩受
容体（ＦＲ）が、哺乳動物の細胞で葉酸塩および抗葉酸剤の取込みを媒介することが現在
知られている。
【００３９】
真核宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞および真菌細胞から
なる群から選択される。真菌細胞および植物細胞は、葉酸塩について原栄養体性であって
よい（すなわち、そのような細胞は、それらの細胞生存、すなわち細胞の成長および増殖
のために必要なそれら自身の葉酸塩を自律的に合成することができる）。本発明は、葉酸
塩について栄養要求性であるかまたはなることができる、そのような真菌および植物の細
胞を特に包含する。これは、例えば遺伝子操作によることができ、すなわち細胞は、それ
らの細胞生存に必要な十分量の葉酸塩を今や合成することができない。例えば、そのよう
な真菌または植物の細胞の、例えば適当な代謝経路を通して葉酸塩を内因的に生合成する
能力は、例えば適当な標的遺伝子の遺伝子破壊もしくは遺伝子サイレンシング、または鍵
酵素の阻害などによって不活性化することができる。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物
細胞である。前記哺乳動物細胞は、齧歯動物細胞、ヒト細胞およびサル細胞からなる群か
ら選択することができる。齧歯動物細胞が特に好ましく、それは、好ましくは、ＣＨＯ細
胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、マウス３Ｔ３線維芽細胞およびＳＰ２／０細胞からなる群
から選択される。最も特に好ましい齧歯動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。ヒト細胞も好ま
しく、それは、好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰｅｒＣ６細胞および
ＨｅＬａ細胞からなる群から選択される。サル細胞もさらに好ましく、それは、好ましく
は、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される。宿主細
胞は、好ましくはＤＨＦＲ＋（プラス）細胞、特にＤＨＦＲ＋（プラス）ＣＨＯ細胞であ
る。
【００４０】
一実施形態によると、対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素を
コードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの発現ベクターによって導入された。そ
れぞれのベクターを導入するのに適する技術は下に記載され、例えばトランスフェクショ
ンが含まれる。
【００４１】
本発明による「発現ベクター」は、少なくとも１つの外来核酸断片を運ぶことができる
ポリヌクレオチドである。ベクターは分子担体のように機能し、核酸の断片それぞれポリ
ヌクレオチドを宿主細胞へ送達する。それは、その中に組み込まれるポリヌクレオチドを
正しく発現させるための調節配列を含む、少なくとも１つの発現カセットを含む。ポリヌ
クレオチド（例えば、対象生成物または選択マーカーをコードする）は、そこから発現さ
せるために、発現ベクターの（１つまたは複数の）発現カセットに挿入されてもよい。本
発明による発現ベクターは、環状または線状の形で存在することができる。用語「発現ベ
クター」は、外来核酸断片の導入を可能にする人工染色体または類似したそれぞれのポリ
ヌクレオチドも含む。
【００４２】
対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレ
オチドは、同じであるか異なる発現ベクターの上に位置してもよい。両方のポリヌクレオ
チドを運ぶ発現ベクターを用いることは、１つの発現ベクターを宿主細胞に導入するだけ
でよいという利点を有する。さらに、特に安定した発現系を確立する場合、ポリヌクレオ
チドがゲノムに一緒に組み込まれ、したがって類似した収率で発現される可能性がより高
い。しかし、トランスフェクションのために少なくとも２つの発現ベクターの組合せを用
いることが可能でもあり、本発明の範囲内でもあり、そこにおいて、それぞれのポリヌク
レオチドは異なる発現ベクターの上に位置する。発現ベクターの前記組合せは、宿主細胞
に次にトランスフェクトされる。
【００４３】
真核宿主細胞は、さらなる対象生成物をコードする少なくとも１つのさらなる導入ポリ
ヌクレオチドを含むことができる。この実施形態は、免疫グロブリン分子を発現させるた
めに特に適する。好ましい実施形態によると、宿主細胞は、各々対象生成物をコードする
少なくとも２つの導入ポリヌクレオチドを含み、そこで、少なくとも１つのポリヌクレオ
チドは免疫グロブリン分子の重鎖またはその機能的断片をコードし、他のポリヌクレオチ
ドは免疫グロブリン分子の軽鎖またはその機能的断片をコードする。それぞれのポリヌク
レオチドは、適当な発現ベクターを用いることにより導入することができる。少なくとも
２つの発現ベクターの組合せが用いられる場合、免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖（
またはその機能的断片）をコードする前記ポリヌクレオチドは、同じであるかまたは異な
る発現ベクターの上に位置することができる。
【００４４】
宿主細胞、したがってポリヌクレオチドを前記宿主細胞に導入するための発現ベクター
は、１つまたは複数のさらなる選択マーカーをコードする１つまたは複数のさらなるポリ
ヌクレオチドをさらに含むことができる。したがって、本発明の一実施形態では、性能を
さらに向上させるために、本発明の系を１つまたは複数の異なる選択系（例えばｎｅｏ／
Ｇ４１８などの抗生物質抵抗性選択系）と一緒に利用する共選択を適用することができる
。真核宿主細胞の選択を可能にするさらなる真核生物の選択マーカーの他に、真核宿主細
胞で選択を可能にする原核生物の選択マーカーを用いることもできる。それぞれの原核生
物の選択マーカーの例は、抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイク
リンおよび／またはクロラムフェニコールに対する抵抗性を提供するマーカーである。
【００４５】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために用いられるベクターは、転写を促進する
ために適する転写調節エレメント、例えば発現カセットのエレメントとしてのプロモータ
ー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写休止または終止シグナルを通常含む。
所望の生成物がタンパク質である場合、例えばリボソームを動員するのに適する５’キャ
ップ構造をもたらす５’非翻訳領域、および翻訳工程を終了するための終止コドンなど、
適する翻訳調節エレメントは、好ましくはベクターに含まれ、発現されるポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結される。詳細には、選択マーカー遺伝子の役目を果たすポリヌクレオ
チドならびに対象生成物をコードするポリヌクレオチドは、適当なプロモーターに存在す
る転写エレメントの支配下で転写することができる。選択マーカー遺伝子から生じる転写
物および対象生成物のそれは、かなりのレベルのタンパク質発現（すなわち翻訳）および
適切な翻訳終結を促進する機能的翻訳エレメントを有する。組み込まれたポリヌクレオチ
ドの発現を正しく促進することができる機能的発現単位は、本明細書で「発現カセット」
とも呼ばれる。
【００４６】
ポリヌクレオチドを真核宿主細胞に導入するために用いられる本発明による発現ベクタ
ーまたは発現ベクターの組合せは、発現カセットのエレメントとして、少なくとも１つの
プロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーエレメントを含むことができる
。これらの２つの調節エレメントの間の物理的境界は必ずしも明白でないが、用語「プロ
モーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはいかなる関連因子が結合し、そこで転
写が開始される核酸分子上の部位を通常指す。エンハンサーは、プロモーター活性を時間
的に、ならびに空間的に強化する。多くのプロモーターは、広範囲の細胞型で転写活性が
ある。プロモーターは、２つのクラス、すなわち構成的に機能するものおよび誘導または
脱抑制によって調節されるものに分けることができる。両方のクラスは、本発明の教示に
適する。哺乳動物細胞でのポリペプチドの高レベル生成のために用いられるプロモーター
は強くあるべきで、好ましくは広範囲の細胞型で活性であるべきである。
【００４７】
多くの細胞型で発現を促進する強い構成的プロモーターには、それらに限定されないが
、アデノウイルス主後期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーター、
ＳＶ４０およびラウス肉腫ウイルスプロモーターならびにマウスの３−ホスホグリセリン
酸キナーゼプロモーター、ＥＦ１ａが含まれる。プロモーターおよび／またはエンハンサ
ーをＣＭＶおよび／またはＳＶ４０から得る場合、本発明の発現ベクターで良好な結果が
達成される。転写プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１
αプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＢＲＯＡＤ３プロモーター、マウスｒｏｓａ  ２
６プロモーター、ｐＣＥＦＬプロモーターおよびβアクチンプロモーターからなる群から
選択することができる。
【００４８】
好ましくは、対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素をコードす
るポリヌクレオチドは、別々の転写プロモーターの支配下にある。一般に、真核宿主細胞
で、必要不可欠なポリヌクレオチドの発現、特に転写を促進することができるプロモータ
ーが適する。ポリヌクレオチドからの発現を促進する別々の転写プロモーターは、同じで
あっても異なってもよい。
【００４９】
一実施形態によると、対象生成物をコードするポリヌクレオチドの発現を促進するため
には、ＤＨＦＲ酵素および／または存在するならばさらなる選択マーカーをコードするポ
リヌクレオチドの発現を促進するためによりも強いプロモーターおよび／またはエンハン
サーが用いられる。この配置は、対象生成物のために、選択マーカーのためによりも多く
の転写物が生成される効果を有する。異種生成物を生成する個々の細胞の能力が無制限で
なく、したがって対象生成物に集中されるべきであるので、対象生成物の生成が選択マー
カーの生成よりも優位であることが有利である。さらに、選択工程は発現細胞系を確立す
る初期段階だけで起こり、発現細胞系はその後対象生成物を継続的に生成する。したがっ
て、対象生成物の発現／生成に細胞の資源を集中させることが有利である。さらに、１つ
または複数の選択マーカー、特にＤＨＦＲを発現させるためにより強くないプロモーター
を用いることは、選択圧をさらに増加させ、したがって選択培地でより低い濃度のＤＨＦ
Ｒ阻害剤の使用を可能にする。
【００５０】
一実施形態によると、対象生成物をコードするポリヌクレオチドの発現を促進するプロ
モーターはＣＭＶプロモーターであり、ＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレオチドの発
現を促進するプロモーターはＳＶ４０プロモーターである。ＣＭＶプロモーターは、哺乳
動物の発現で利用可能な最も強いプロモーターの１つであることが公知であり、非常に良
好な発現率をもたらす。それは、ＳＶ４０プロモーターよりもかなり多くの転写物を与え
ると考えられている。
【００５１】
さらなる実施形態によると、対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ
酵素をコードするポリヌクレオチドは同じ転写プロモーターの支配下にあり、したがって
１つの発現カセットから発現される。適するプロモーターは上に記載されている。この実
施形態では、前記転写プロモーターの支配下にあるそれぞれの発現カセットから、１つの
長い転写物が得られる。一実施形態によると、対象生成物をコードするポリヌクレオチド
および／またはＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレオチドの間に、少なくとも１つのＩ
ＲＥＳエレメントが機能的に位置する。それによって、別々の翻訳産物が前記転写物から
得られることが保証される。
【００５２】
発現カセットは、適当な転写終結点を含むことができる。これは、上流プロモーターか
ら第二の転写単位にかけての連続した転写として、下流プロモーターの機能を阻害するこ
とができ、これはプロモーター閉塞または転写干渉として知られる現象である。この事象
は、原核生物および真核細胞の両方で記載されている。２つの転写単位間の転写終結シグ
ナルの適切な配置は、プロモーター閉塞を防止することができる。転写終結点はよく特徴
付けられており、発現ベクターへのそれらの組込みは遺伝子発現に対して複数の有益な影
響を及ぼすことがわかっている。
【００５３】
用いた宿主細胞は、真核生物、特に哺乳動物の宿主細胞である。ほとんどの真核生物の
初期ｍＲＮＡは、一次転写物の切断および共役ポリアデニル化反応を含む複雑な過程で加
えられるポリＡテールを、それらの３’末端に有する。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの安定
性および輸送性のために有利である。したがって、対象生成物およびＤＨＦＲ酵素をコー
ドするポリヌクレオチドを発現するための発現カセットは、転写終結およびポリアデニル
化に適するポリアデニル化部位を通常含む。ウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）、マウスβグロ
ビン、ＳＶ４０早期転写単位および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に由来
するものを含む、哺乳動物の発現ベクターで用いることができるいくつかの効率的なポリ
Ａシグナルがある。しかし、合成ポリアデニル化部位も公知である（例えば、Ｌｅｖｉｔ
ｔら、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３巻（７号）：１０１９〜１０２５ページに基づ
くＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ−ｎｅｏ発現ベクターを参照）。ポリアデニル化部位は、ＳＶ
４０ポリＡ部位、例えばＳＶ４０後期および初期ポリＡ部位（例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎ
ｉら、１９８１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８５４〜８６４ページに記載のプラスミ
ドｐＳＶ２−ＤＨＦＲを参照）、合成ポリＡ部位（例えば、Ｌｅｖｉｔｔら、１９８９、
Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３巻（７号）：１０１９〜１０２５ページに基づくＰｒｏｍｅｇａ
のｐＣＩ−ｎｅｏ発現ベクターを参照）およびｂｇｈポリＡ部位（ウシ成長ホルモン）か
らなる群から選択することができる。
【００５４】
さらに、対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素をコードするポ
リヌクレオチドを含む発現カセットは、少なくとも１つのイントロンを含むことができる
。この実施形態は、発現のために哺乳動物の宿主細胞が用いられる場合に特に適する。よ
り高等な真核細胞からのほとんどの遺伝子は、ＲＮＡプロセシングの間に除去されるイン
トロンを含む。それぞれの構築物は、イントロンを欠く同一の構築物よりも遺伝子導入系
でより効率的に発現される。通常、イントロンは読み取り枠の５’末端に置かれるが、３
’末端に置かれることもある。したがって、発現率を増加させるために、イントロンが発
現カセットに含まれてもよい。前記イントロンは、１つまたは複数のプロモーターおよび
またはプロモーター／エンハンサーエレメントと、発現されるポリヌクレオチドの読み取
り枠の５’末端との間に位置することができる。本発明と併用することができるいくつか
の適するイントロンが、最新技術において公知である。
【００５５】
一実施形態によると、対象生成物を発現させるための発現カセットで用いられるイント
ロンは、ＳＩＳまたはＲＫイントロンなどの合成イントロンである。ＲＫイントロンは、
好ましくは対象遺伝子のＡＴＧ開始コドンの前に置かれる、強い合成イントロンである。
ＲＫイントロンは、ＣＭＶプロモーターのイントロン供与スプライス部位およびマウスＩ
ｇＧ重鎖可変領域の受容スプライス部位からなる（例えば、Ｅａｔｏｎら、１９８６、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５巻、８３４３〜８３４７ページ、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、
１９８３、ＥＭＢＯ  Ｊ．２巻（８号）、１３７３〜１３７８ページを参照、それは、ｐ
ＲＫ−５ベクター（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）から得ることができる）。
【００５６】
上に述べたポリヌクレオチドおよび／または発現カセットを含む発現ベクターは、その
円形形態で宿主細胞にトランスフェクトすることができる。スーパーコイルベクター分子
は、エンドおよびエキソヌクレアーゼの活性のために、核内で線状分子に通常変換される
。しかし、トランスフェクションの前の発現ベクターの線状化は、安定したトランスフェ
クションの効率をしばしば向上させる。発現ベクターがトランスフェクションの前に線状
化される場合、これは、線状化の場所として調節することもできる。したがって、本発明
の一実施形態によれば、発現ベクターまたは少なくとも２つの発現ベクターの組合せは、
少なくとも１つの定義済みの制限部位を含み、それはトランスフェクションの前に（１つ
または複数の）ベクターの線状化のために用いることができる。一実施形態によると、線
状化部位は、線状化後に、ＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレオチドが、対象生成物を
コードするポリヌクレオチドの５’に位置するように配置される。この配置は、遺伝子増
幅のために有利である。原核生物の選択マーカーをさらに用いる場合、前記原核生物のマ
ーカーをコードするポリヌクレオチドは、対象生成物をコードするポリヌクレオチドの３
’に位置する。これは、原核生物の選択マーカー遺伝子が線状化ベクター核酸の「哺乳動
物」部分の３’に、したがって「外側」にあるという効果を有する。原核生物の配列は哺
乳動物の細胞で増加するメチル化または他のサイレンシング効果をもたらすことができる
ので、原核生物の遺伝子は哺乳動物の発現におそらく有利でないので、この配置は好まし
い。
【００５７】
対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレ
オチドは、好ましくは前記宿主細胞に安定して導入される。安定した導入、トランスフェ
クションそれぞれは、発現細胞系の確立、特に対象生成物の大規模、したがって工業的生
産のために有利である。
【００５８】
ポリヌクレオチドおよび発現ベクターを、哺乳動物の宿主細胞を含む真核宿主細胞に導
入するために、先行技術で公知であるいくつかの適当な方法がある。それぞれの方法には
、それらに限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレー
ション、リポフェクション、微粒子銃によっておよびポリマーによって媒介される遺伝子
導入が含まれる。対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ酵素をコード
するポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに導入するために、従来のランダムな組込みに基
づく方法の他に、組換えによって媒介される手法も用いることができる。そのような組換
え方法は、導入遺伝子の指定挿入を媒介することができる、Ｃｒｅ、ＦｌｐまたはΦＣ３
１のような部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｏｕｍａｒｄら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（２００６）５０巻：９３〜１０８ページを参照）の使用を含むことができる。
あるいは、前記ポリヌクレオチドを挿入するために、相同組換えの機構を用いてもよいか
もしれない（Ｓｏｒｒｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３
巻（２００５）４３１〜４６９ページにレビューされている）。組換えに基づく遺伝子挿
入は、宿主細胞に移動／導入される異種核酸に含まれるエレメント数の最小化を可能にす
る。例えば、残りのエレメント（例えば、対象生成物をコードするポリヌクレオチドおよ
びＤＨＦＲ酵素をコードするポリヌクレオチド）だけを宿主細胞に導入／トランスフェク
トする必要があるように、プロモーターおよびポリＡ部位（外因性または内因性の）をす
でに提供している挿入遺伝子座を用いてもよいかもしれない。本発明による適する発現ベ
クターまたは発現ベクターの組合せ、ならびに適する宿主細胞の実施形態は、上で詳細に
記載されている。我々は、上の開示を参照する。
【００５９】
ＤＨＦＲ酵素に加えてさらなる選択マーカーを用いる場合、前記選択マーカーの選択条
件は、ＤＨＦＲ酵素の選択条件を適用する前に適用されてもよい。例えばネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）をさらなる選択マーカーとして用いる場合、本
発明による（１つまたは複数の）発現ベクターを組み込んだ細胞を選択するために、細胞
を、例えばＧ４１８を含む培地で先ず増殖させてもよい。
【００６０】
ＤＨＦＲ選択マーカーに加えて制限濃度の葉酸塩を選択培地に用いる本発明の戦略は、
より低いＤＨＦＲ阻害剤濃度を用いる場合でも非常に高いストリンジェンシーが得られる
利点を有する。これらの新規選択条件を生き残る細胞集団の生産性は、著しく増加する。
実施例は、選択方法の後に得られた宿主細胞が対象生成物を高収率で生産することを示し
ている。また、個々の宿主細胞の平均生産性が増加する。したがって、より低いスクリー
ニング努力で高生産クローンを見出す可能性が向上する。したがって、本発明による選択
系は、先行技術で用いられる選択系よりも優れている。詳細には、それぞれの選択マーカ
ー単独の使用と比較してより高い生産性を有する宿主細胞が得られる。したがって、選択
条件のより高いストリンジェンシーのために、選択方法が最適化される。
【００６１】
本発明のストリンジェントなスクリーニング／選択方法の結果として得られる細胞は、
一般に単離され、元の細胞集団の非選択細胞から濃縮することができる。それらを単離し
、個々の細胞として培養することができる。それらは、任意選択でさらなる定性的もしく
は定量的な分析のために、１回または複数回のさらなる選択で用いることもでき、または
、例えばタンパク質生産のための細胞系の開発において用いることができる。一実施形態
によると、上に述べたように選択される生産宿主細胞の濃縮集団は、対象のポリペプチド
の良好な収率での生産のための集団として直接に用いられる。好ましくは、対象生成物を
安定して発現する宿主細胞が選択される。安定したトランスフェクション／発現の利点は
、上で詳述されている。我々は、上の開示を参照する。
【００６２】
対象生成物を生成するための方法であって、以下の、
（ａ）前記対象生成物を発現する少なくとも１つの真核宿主細胞を選択するための、本
発明による選択方法を実施するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの選択される真核宿主細胞を、前記対象生成物の発現を可能にす
る条件下で培養するステップと、を少なくとも含む方法も提供される。
【００６３】
本発明による選択方法は高生産性の細胞クローンの同定を可能にするので、前記選択系
は生産工程の重要で不可欠な一部である。発現された対象生成物は、宿主細胞を破壊する
ことによって得ることができる。ポリペプチドは発現され、例えば培地に分泌され、そこ
から得ることもできる。また、それぞれの方法の組合せも可能である。一実施形態による
と、前記宿主細胞は、無血清条件下で培養される。
【００６４】
それによって、生成物、特にポリペプチドは、高収率で生成すること、および得ること
／単離することができる。得られた生成物は、さらなる処理工程、例えば精製および／ま
たは改変工程にかけることもできる。したがって、対象生成物を生成するための方法は、
以下の工程の少なくとも１つを含むことができる。
・前記細胞培養培地および／または前記宿主細胞から対象生成物を単離すること、およ
び／または
・単離された対象生成物を処理すること。
【００６５】
本発明に従って生成される対象生成物、例えばポリペプチドは、当技術分野で公知であ
る方法によって回収し、任意選択でさらに処理すること、例えば精製、単離および／また
は改変することができる。例えば、生成物は、それらに限定されないが遠心分離、ろ過、
限外ろ過、抽出または沈殿を含む従来の方法によって、栄養培地から回収することができ
る。精製は、それらに限定されないがクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、
疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電集
束法）、差別的溶解性（例えば硫安塩析）または抽出を含む当技術分野で公知である様々
な方法によって実施することができる。
【００６６】
対象生成物は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる遺伝情報の転写、翻訳また
は任意の他の発現事象によって生成することができる任意の生物学的生成物であってよい
。この点に関し、生成物は発現生成物である。対象生成物は、ポリペプチド、核酸、特に
ＲＮＡまたはＤＮＡからなる群から選択することができる。生成物は、薬学的もしくは治
療的に活性な化合物、またはアッセイなどで利用される研究ツールであってよい。特に好
ましい実施形態では、生成物は、ポリペプチド、好ましくは薬学的もしくは治療的に活性
なポリペプチド、または診断アッセイもしくは他のアッセイなどで利用される研究ツール
である。したがってポリペプチドは、任意の特定のタンパク質またはタンパク質の群に限
定されず、逆に、本明細書に記載の方法によって選択および／または発現させることが望
まれる任意のサイズ、機能または起源の任意のタンパク質であってよい。したがって、い
くつかの異なる対象ポリペプチドを発現させ／生成することができる。上で概説されるよ
うに、用語ポリペプチドには、任意の活性または生物活性のタンパク質および／またはペ
プチド、例えば生体活性ポリペプチド、例えば酵素タンパク質またはペプチド（例えばプ
ロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ）、受容体タンパク質またはペプチド、輸送体タ
ンパク質またはペプチド、殺菌性および／またはエンドトキシン結合性タンパク質、構造
タンパク質またはペプチド、免疫性ポリペプチド、毒素、抗生物質、ホルモン、成長因子
、ワクチンなどが含まれる。前記ポリペプチドは、ペプチドホルモン、インターロイキン
、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、免疫グロブリン、特に抗体または機
能的抗体断片またはその変形体からなる群から選択することができる。最も好ましい実施
形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン分子もしくは抗体、またはその機能的変形体
、例えばキメラ、または部分的もしくは完全ヒト化抗体である。そのような抗体は、診断
用抗体、または薬学的もしくは治療的に活性な抗体であってよい。
【００６７】
上でおよび請求項で定義される本発明による方法によって得られる生成物も、提供され
る。前記生成物は、好ましくはポリペプチド、特に免疫グロブリン分子またはその機能的
断片である。
【００６８】
一実施形態によると、本発明は、制限濃度の葉酸塩および少なくとも１つのＤＨＦＲ阻
害剤を含む選択培地も提供する。好ましくは、前記選択培地は、以下の特性の１つまたは
複数を有する。
（ａ）それは、葉酸塩、好ましくは葉酸を以下から選択される濃度で含む。
（ａａ）５００ｎＭ以下、
（ｂｂ）２５０ｎＭ以下、
（ｃｃ）１５０ｎＭ以下、
（ｄｄ）１００ｎＭ以下、
（ｅｅ）７５ｎＭ以下、
（ｆｆ）５０ｎＭ以下、
（ｇｇ）２５ｎＭ以下、および／または
（ｈｈ）１５ｎＭ以下、
ならびに／あるいは
（ｂ）それは、葉酸塩、好ましくは葉酸を以下から選択される濃度域で含む。
（ａａ）０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、
（ｂｂ）０．１ｎＭ〜２５０ｎＭ、好ましくは２．５ｎＭ〜２５０ｎＭまたは５もし
くは１０ｎＭ〜２５０ｎＭ、
（ｃｃ）０．１ｎＭ〜１５０ｎＭ、好ましくは２．５ｎＭ〜１５０ｎＭまたは５もし
くは１０ｎＭ〜１５０ｎＭ、
（ｄｄ）１ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは２．５ｎＭ〜１００ｎＭまたは５もしくは
１０ｎＭ〜１００ｎＭ、
（ｅｅ）１ｎＭ〜７５ｎＭ、好ましくは２．５ｎＭ〜７５ｎＭまたは５もしくは１０
ｎＭ〜７５ｎＭ、
（ｆｆ）１ｎＭ〜５０ｎＭ、
（ｇｇ）２．５ｎＭ〜５０ｎＭ、および／または
（ｈｈ）１２．５ｎＭ〜５０ｎＭ
ならびに／あるいは
（ｃ）それは、好ましくは抗葉酸剤であるＤＨＦＲ阻害剤を、以下から選択される濃度
で含む。
（ａａ）５００ｎＭ以下、
（ｂｂ）４００ｎＭ以下、
（ｃｃ）３００ｎＭ以下、
（ｄｄ）２５０ｎＭ以下、
（ｅｅ）２００ｎＭ以下、
（ｆｆ）１５０ｎＭ以下、および／または
（ｇｇ）１００ｎＭ以下、
ならびに／あるいは
（ｄ）それは、好ましくは抗葉酸剤、より好ましくはＭＴＸであるＤＨＦＲ阻害剤を、
以下から選択される濃度で含む。
（ａａ）１ｎＭ〜５００ｎＭ、
（ｂｂ）１０ｎＭ〜２００ｎＭ、
（ｃｃ）１０ｎＭ〜１５０ｎＭ、および／または
（ｄｄ）１０ｎＭ〜１００ｎＭ。
【００６９】
葉酸塩およびＤＨＦＲ阻害剤の示した濃度および濃度域は、互いに組み合わせることが
できる。選択培地中の葉酸塩および抗葉酸剤の濃度域および適する実施形態の利点および
さらなる好ましい実施形態は、本発明による選択方法と一緒に上で詳細に概説した。それ
は、上の開示を参照する。前記選択培地は、本発明の選択系と一緒に用いることができる
。
【００７０】
本明細書で指摘される本文および文書の全内容は、参照により本明細書に組み込まれ、
したがって本開示の一部を形成する。
【００７１】
以下の実施例は、その範囲を制限することなく、本発明を例示する役目を果たす。詳細
には、実施例は本発明の好ましい実施形態に関する。
【実施例】
【００７２】
一般に、試薬などの適する物質は当業技術者によく知られ、市販されており、製造業者
の指示に従って用いることができる。実験を、記載のように実施した。
【００７３】
ＣＨＯ細胞でのトランスフェクション実験は、対象生成物としてモノクローナル抗体を
発現する発現カセットを含む発現ベクターを用いて実行する。選択マーカーとして、Ｇ４
１８抵抗性遺伝子（ＮＥＯ）およびＤＨＦＲ遺伝子が、別々の発現カセット中の発現ベク
ターの上に存在する。この実験は、低葉酸条件下での減少したＭＴＸ量による選択が、高
生産性細胞集団を生じることを証明する。参照として、ＤＨＦＲの標準の選択条件が用い
られ、それは、より高いＭＴＸ濃度および非制限量の葉酸を用いる。
【００７４】
実施例１：ＤＨＦＲおよび葉酸の制限濃度
１．１．発現ベクター
発現ベクターは、以下の決定的なエレメントを含む哺乳動物の発現ベクターであり、そ
れらのエレメントは発現ベクターの上に同じ配向性で配置される。
【００７５】
【表１】
2015107120.tif 000002
【００７６】
１．２．ＣＨＯ細胞のトランスフェクションおよび選択
細胞培養、トランスフェクションおよびスクリーニングは、振とうフラスコにおいて、
ＦＣＳを含まないＣＨＯ細胞に適当な培地で増殖するＣＨＯ細胞の懸濁液を用いて実施す
る。細胞は、エレクトロポレーションによって発現ベクターでトランスフェクトした。宿
主細胞での細胞内葉酸貯蔵を減少させ、前培養培地から選択培地への葉酸の共転移を防止
するために、トランスフェクションおよび選択の前に無葉酸培地または葉酸含量低下（例
えば５０ｎＭ）培地で細胞を継代培養させる。細胞生存度に従い、トランスフェクション
の２４〜４８時間後に、Ｇ４１８およびＭＴＸ含有選択培地を細胞に加えることによって
第一の選択工程を開始する。第一の選択工程では、３つの異なるＭＴＸ濃度（２．５、５
および１０ｎＭ）および葉酸濃度（１２．５、２５および５０ｎＭ）を試験する。参照と
して、非制限量の葉酸、ここでは培地中の標準濃度に対応する１１．３μＭを含む培地を
用いる。
【００７７】
細胞が８０％を超える生存度に回復次第、第一の選択工程と同じ量の葉酸を含むが、１
０倍多い量のＭＴＸ（すなわち、２５、５０および１００ｎＭ）を含む無Ｇ４１８培地で
細胞を継代培養することによって、第二の選択工程を適用する。参照培養条件の場合には
、５００ｎＭ  ＭＴＸを細胞に加える。
【００７８】
１．３．プール生産性の判定
選択される細胞集団の生産性は、非制限量の葉酸（１１．３μＭ）を含み、Ｇ４１８は
含まないがそれぞれの選択培地と同じ濃度のＭＴＸを含んでいる培地での、過増殖振とう
フラスコバッチ培養を通して、最初および最後の選択工程の後に分析する。
【００７９】
５０ｍＬ有効容積を有する２５０ｍＬ容量の振とうフラスコにバッチ培養物を播種し、
振とうキャビネット（無加湿）内で１５０ｒｐｍおよび１０％ＣＯ２で培養する。アッセ
イを開始するとき、細胞の生存度は＞９０％でなければならない。播種細胞密度は、通常
１ｍＬにつき約２ｘ１０５細胞である。力価判定は１３日目に行う。細胞培養上清中の抗
体力価は、培養開始から１３日後のプロテインＡのＨＰＬＣで測定する。
【００８０】
１．４．結果
葉酸制限濃度の下でｄｈｆｒ／ＭＴＸ選択のストリンジェンシーを評価するために、モ
ノクローナル抗体を発現するためのＤＨＦＲベクター発現のトランスフェクションを、こ
の実施例１で実行する。ベクターは、Ｇ４１８抵抗性遺伝子（上記参照）も含む。先ず、
トランスフェクトされた細胞集団を、Ｇ４１８および異なる濃度のＭＴＸを異なる濃度の
葉酸で加えることによって選択する。この最初の第一の選択工程は、第二の選択工程でよ
り高いストリンジェンシーが適用される前に、トランスフェクトされない細胞を殺滅し、
並行して、細胞に細胞内葉酸貯留を消費させる手助けをするはずである。これらの条件下
で、通常すべてのトランスフェクトされた細胞集団は回復し、上に述べたように生産性が
評価される。
【００８１】
表１は、得られた生産性結果を要約する。
【００８２】
【表２】
2015107120.tif 000003
【００８３】
異なる葉酸濃度を有するＧ４１８およびＭＴＸ含有培地で選択されるトランスフェクト
された細胞を、振とうフラスコバッチ培養で分析する。培養の１３日目に、培地の試料を
とり、プロテインＡのＨＰＬＣによって抗体含量について分析する。
【００８４】
結果は、すべての細胞集団が抗体を生成することを示す。１０ｎＭ未満のＭＴＸの添加
は、低い葉酸濃度でも細胞に対してあまり影響を示さない。生成された抗体の濃度は、Ｍ
ＴＸ不在下の選択に同等である。しかし、第一の選択工程で１０ｎＭ  ＭＴＸを用いる場
合、低い葉酸濃度での細胞の生産性は濃度依存的にかなり増加する。最も低い葉酸濃度（
１２．５ｎＭ）および１０ｎＭ  ＭＴＸによる選択の後、細胞の生産性は、標準の葉酸濃
度の培地と比較して１０倍を超えて高いことが見出される。
【００８５】
選択ストリンジェンシーをさらに高くするために、次の工程ではＧ４１８を除去するが
、培地中のＭＴＸ濃度を１０倍に増加させ、第一の選択工程で用いられる葉酸濃度を維持
する。参照の場合には、先行技術で一般的のようにＭＴＸを高い濃度で、ここでは５００
ｎＭで加える。これらの条件下では、多くのトランスフェクトされた集団の細胞の生存度
は劇的に低下して低いレベルにとどまり、その結果それらのすべてを回復させることがで
きるわけではない。回復させることができた細胞集団はさらに増殖させ、生産性を分析す
る（表２）。
【００８６】
【表３】
2015107120.tif 000004
【００８７】
Ｇ４１８およびＭＴＸ選択細胞集団は、ＭＴＸ濃度を上昇させることによってさらに選
択される。回復した集団は、振とうフラスコバッチ培養で分析する。培養の１３日目に、
培地の試料をとり、プロテインＡのＨＰＬＣによって抗体含量について分析する。
【００８８】
この選択工程の後の参照細胞集団（５００ｎＭ  ＭＴＸ、１１．３μＭ  ＦＡ）の生産
性は、約２５〜３０ｍｇ／Ｌに増加する。１００ｎＭ以下のＭＴＸ濃度では、いかなる利
点も見られない。しかし、１００ｎＭ  ＭＴＸを低い葉酸含有量（１２．５または２５ｎ
Ｍ）と一緒に用いるとき、増幅／選択のために低いＭＴＸ濃度が用いられるが、生産性は
最高２７７ｍｇ／Ｌであり、したがって参照より１０倍高い。
【００８９】
したがって、選択培地において選択マーカーとしてＤＨＦＲを制限葉酸濃度と一緒に用
いることは、低いＤＨＦＲ阻害剤濃度でさえ対象タンパク質を高度に過剰発現する細胞を
生成する。結果は、この組合せが従来の選択系（例えば、選択培地で標準の葉酸濃度を用
いるＤＨＦＲ／Ｇ４１８）より優れていることを示す。
【００９０】
実施例２：トランスフェクトされたＣＨＯ細胞によるポリペプチドの大規模生産
ポリペプチドの大規模生産は、例えばウェーブ、ガラスまたはステンレス鋼バイオリア
クターで実行することができる。その目的のために、通常単一の凍結バイアルから、例え
ばＭａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋからのバイアルから細胞を増殖させる。いくつかの
工程を通して細胞を解凍し、増殖させる。異なる規模のバイオリアクターを、適量の細胞
で接種する。細胞密度は、フィード溶液および添加剤をバイオリアクターに加えることに
よって高くすることができる。細胞は、長期間、高い生存度で維持される。リアクター内
において、１リットルにつき数百ミリグラムから１リットルにつき数グラムの範囲の生成
物濃度が、大規模で達成される。精製は、親和性、イオン交換、疎水性相互作用またはサ
イズ排除クロマトグラフィー方法を含めることができる、標準のクロマトグラフィー方法
によって実行することができる。バイオリアクターのサイズは、最終規模で最高数千リッ
トルの容量が可能である（例えば、Ｆ．Ｗｕｒｍ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ  ２２巻、１１号、２００４、１３９３〜１３９８ページも参照）。
【外国語明細書】
2015107120000001.pdf