(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の抗凍結剤であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は副作用を有する問題点があり、ＤＭＳＯを用いずに凍結温度での保存が可能で、且つ、細胞療法の直接投与のためのビヒクルとして使用可能な組成物の提供。【解決手段】（ｉ）トロロックス、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、ショ糖、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシン、及びグルタチオン；並びに（ｉｉ）間葉幹細胞、神経幹細胞又は網膜前駆細胞を含み、且つ、双極性非プロトン性溶媒を含まない、治療用組成物。該細胞は、生分解性高分子ポリマー物質（特に、ＰＬＧＡ）に含まれることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）トロロックス、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、ショ糖、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシン、およびグルタチオン；ならびに
（ｉｉ）幹細胞または前駆細胞
を含み、かつ、双極性非プロトン性溶媒（特にＤＭＳＯ）を含まない、治療用組成物。
【請求項２】
前記細胞は、ヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞は、造血幹細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞は、間葉幹細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞は、神経幹細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞は、網膜前駆細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞は、高分子足場またはマイクロキャリアに含まれる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記高分子足場または前記マイクロキャリアはＰＬＧＡである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１の（ｉ）に記載の組成物中で幹細胞または前駆細胞を懸濁することを含む、患者への投与のために幹細胞または前駆細胞を製剤化する方法。
【請求項１０】
前記細胞は、細胞培養系から回収される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記の初期工程を含む、請求項９に記載の方法:
（ａ）請求項１の（ｉ）に記載の組成物中で前記細胞を懸濁する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の前記細胞懸濁物を凍結温度で保存する工程；および
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記細胞懸濁物を解凍する工程。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）は、−７０℃〜−２００℃（好ましくは−８０℃〜−１９６℃）で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞懸濁物は、前記工程（ｂ）または前記工程（ｃ）の後で低温度で保存される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記低温度での保存は２℃〜８℃で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞はヒト幹細胞またはヒト前駆細胞である、請求項９ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、造血幹細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、間葉幹細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、神経幹細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、網膜前駆細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、高分子足場またはマイクロキャリアに含まれる、請求項９ないし１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記高分子足場または前記マイクロキャリアはＰＬＧＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞はカプセルに包含されている、請求項９ないし１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞は、アルギン酸塩、キトサン、ＰＥＧ、ＰＬＬ、ポリ−Ｌ−オルニチン１４、ポリ（メチレン−ｃｏ−グアジニン）塩酸塩、プルロニクス（登録商標）、グリセリンリン酸、ヒアルロン酸、セルロースリン酸、澱粉、寒天、カラギーナン、絹フィブロイン、ゼラチンおよびジェランガムから選ばれる物質に包含されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記製剤化する工程は、細胞伝達カニューレを介して投与される、請求項９ないし２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の組成物を単位用量の形態で含む、薬剤。
【請求項２６】
前記薬剤は、組織への移植または全身伝達を介して、該薬剤を必要とする患者に直接投与される、請求項２５に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞治療組成物および前記組成物を製剤化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療の開発は、現在未だ満たされていない需要がある数多くの治療の示唆に対する研究の対象である。細胞懸濁物として投与されるこのような療法は、理想的には、前記細胞と混合可能なビヒクルの使用、受容者に対して毒性を有さないこと、ならびに投与前および投与中に十分な時間の療法の保存に適していることを必要とする。
【０００３】
周囲条件または低温条件（２℃〜８℃）にて細胞療法を保存することは、同種療法の初期相の臨床試験で必要である。このことは、患者自身の細胞を出発材料として利用する自己細胞療法でも用いられる可能性がより高い。
【０００４】
凍結保存は、投与前の細胞療法の長期保存に必要である可能性が高い。治療細胞産物は主に製造され、数か月以上流通される可能性が高いため、後期相のマルチセンター（multi-centre）試験は、低温保存を用いて達成され得るよりも実質的により長い保存時間を必要とするだろう。最終的には、細胞治療製剤の承認後の製造は、多数年間の保存が必須となるであろう。
【０００５】
抗凍結剤であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用は、液体窒素冷凍庫（〜−１９５℃）での細胞の保存に多大な実用性を有する。ＤＭＳＯは、ジメチルホルムアミド, Ｎ−メチル−２−ピロリドンおよびヘキサメチルホスフォルアミドをさらに含む、双極性非プロトン性溶媒類の一員であり、細胞療法の製造および取引において最も汎用されている抗凍結剤である。しかしながら、この溶媒は、細胞産物および後に治療される患者に対して毒性を有する（Hubel, 2001；Sauer-Heilborn et al., 2004）。例えば、骨髄移植では、ＤＭＳＯで凍結保存された細胞を移植した患者の殆どが副作用に苦しみ、そして少数が重篤な合併症を経験する。点滴中の直接的な効果および遅発型の副作用は、容量依存的な様式で観察される。細胞製剤が全身に投与されると、記載された効果が生じ、そしていずれの製剤成分も希釈されて広く分散される。一方、組織への直接的な注射を介する投与（例えば、頭蓋内投与、筋肉内投与または心臓内投与）は、局所的な毒性作用を増加させるだろう。凍結保存された細胞からＤＭＳＯ成分を除去する方法は、ＤＭＳＯに関連する合併症および副作用を減少させる（Syme et al., 2004）。しかしながら、回収される細胞産物はたった６０％であり、これらの工程は非効率的である（Calmels et al., 2003）。
【０００６】
グリセリンおよびトレハロースの使用が、凍結保存された精子の保存に効果があることが示されているが（Storey et al., 1998）、しかしながら、この方法は、違う細胞型には効果がないことが判明している。
【０００７】
投与のための従来の細胞製剤は、細胞培地および改良された生理食塩水に依存する。これらの製剤は投与に適しているけれども、細胞製剤の生存能力を数時間より長く保持しない。このことは、従来の細胞製剤を臨床研究から排除し、臨床投与のための製剤を放出するのにかかる時間、続く輸送および移植の潜在的に長いプロセス（全部で最大９時間）が細胞を生存不能にさせるかもしれない。これにより、初期の臨床試験の緊急の障害を克服するために、これらの製剤の品質保持期限が９時間を超えるように延ばす必要がある。加えて、細胞治療製剤を商業的に生存可能にするために、ずっと長い期間にわたる保存の戦略が求められている。
【０００８】
賦形剤であるHypoThermosol（登録商標）-FRS（ＨＴＳ−ＦＲＳ）（BioLife Solutions,Inc）は、虚血性傷害を最小化するために、超低温での心停止の間使用される潅流液として当初開発された低温保存溶液である。ＨＴＳ−ＦＲＳは、長期間低温（２℃−１０℃）保存された細胞における保存後のネクローシスおよびアポトーシスのレベルを調節するために設計された市販の製剤である。
【０００９】
米国特許６９２１６３３号明細書は、アポトーシスを阻害し、かつ、前記溶液をガラス質（vitrify）にさせるのに十分な濃度のガラス固化（vitrification）組成物を含む低温保存溶液に、細胞、組織または臓器を接触させることにより、前記細胞、前記組織または前記臓器を保存する方法を開示する。
【００１０】
米国特許６６３２６６６号明細書は、ナノ熱性（nanothermic）保存、低温保存または凍結保存、ならびに、ＨＴＳ−ＦＲＳおよびゲル化剤を含む細胞試料の輸送に用いられるゲル性組成物を開示する。
【００１１】
国際公開２００５／００９７６６号は、凍結温度で保存可能である、肝臓細胞、ＨＴＳおよびＤＭＳＯを含む薬剤組成物を開示する。
【００１２】
投与前に、毒性を有する抗凍結剤を除去するために、低温度または凍結温度にてこれらの組成物の保存を行い、続いて細胞治療産物を処理することが求められる。これにより、厄介でかつ費用がかかる付加的な放出試験が必要となることがある。
【００１３】
したがって、ＤＭＳＯの代替物を提供し、凍結温度での保存が可能であり、かつ、細胞療法の直接投与のためのビヒクルとして使用可能な組成物および製剤が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様によれば、本発明は治療用組成物を提供し、前記組成物は：
（ｉ）トロロックス、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、ショ糖、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシン、およびグルタチオン；ならびに
（ｉｉ）幹細胞または前駆細胞
を含み、かつ、前記組成物は、双極性非プロトン性溶媒（特にＤＭＳＯ）を含まない。
【００１５】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様にかかる組成物中で、幹細胞または前駆細胞を懸濁することを含む、患者への投与のために幹細胞または前駆細胞を製剤化（formulate）する方法である。この方法はさらに、以下の初期工程を含んでいてもよい：
（ａ）本発明の第１の態様の組成物中で前記細胞を懸濁する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の前記細胞懸濁物を凍結温度（cryothermictemperature）で保存する工程；および
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記細胞懸濁物を解凍する工程。
【００１６】
前記細胞懸濁物はまた、前記工程（ｂ）または前記工程（ｃ）の後で低温度（hypothermic temperature）で保存されていてもよい。すなわち、前記懸濁物を凍結温度から低温度に移管させてもよい。
【００１７】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様にかかる組成物を単位用量の形態で含む薬剤である。
【００１８】
添付の図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、生理食塩水中で製剤化された幹細胞の代謝活性と同程度である、HypoThermosol（登録商標）-FRS中で製剤化された神経肝細胞の代謝活性を示すグラフである。
【図２】図２は、２℃〜８℃にて５時間品質保持試験を行った後、周囲温度にて最大４時間解凍した、神経幹細胞の生存能力の例を示すグラフである。
【図３】図３は、２℃〜８℃にてＨＴＳ−ＦＲＳ中で２４時間保存した後、周囲温度にて４時間保存した、一晩保存した神経幹細胞の例を示すグラフである。
【図４】図４は、２℃〜８℃で９日間の品質保持試験の間の神経幹細胞の生存能力の例を示すグラフである。
【図５】図５は、周囲温度にて２日間の品質保持試験の間の神経幹細胞の生存能力の例を示すグラフである。
【図６】図６は、２℃〜８℃で２４時間の品質保持試験の間の網膜前駆細胞の生存能力を示すグラフであり、解凍された凍結保存細胞は、中間培養工程を経ずにＨＴＳ−ＦＲＳ中で製剤化されたものである。
【図７】図７は、１０％ＤＭＳＯまたはＨＴＳ−ＦＲＳのいずれかを含む培地で−８０℃にて４日間、神経幹細胞の凍結保存した例を示すグラフである。
【図８】図８は、解凍直後および周囲温度で４時間解凍した後の神経幹細胞の生存能力の例を示すグラフであり、前記細胞は、１０％ＤＭＳＯまたはＨＴＳ−ＦＲＳのいずれかを含む培地にて液体窒素ガス中で１か月凍結保存されたものである。
【図９】図９は、解凍直後ならびに周囲温度で４時間および２４時間解凍した後における網膜幹細胞の生存能力の例を示すグラフであり、前記細胞は、１０％ＤＭＳＯまたはＨＴＳ−ＦＲＳのいずれかを含む培地にて液体窒素ガス中で１か月凍結保存されたものである。
【図１０】図１０は、解凍直後および周囲温度で４時間解凍した後における間葉幹細胞の生存能力の例を示すグラフであり、前記細胞は、１０％ＤＭＳＯまたはＨＴＳ−ＦＲＳのいずれかを含む培地にて液体窒素ガス中で１か月凍結保存されたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、細胞組成物、ならびに凍結温度での保存に適する細胞組成物を製剤化する方法に関し、保存された細胞組成物は、解凍後、患者に直接投与することができる。
【００２１】
本明細書において、「患者」という用語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サルおよびヒト）を含む哺乳類を意味し、好ましくはヒトである。
【００２２】
本発明は、低温度保存溶液中で懸濁させた幹細胞および前駆細胞を含む、治療用途に適する組成物を提供し、該組成物は、トロロックス、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、ショ糖、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシン、およびグルタチオンを含み、かつ、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、（ＣＨ３）２ＳＯ）または他のいずれの双極性非プロトン性溶媒を含まない。低温度の保存溶液は、HypoThermosol（登録商標）またはHypoThermosol（登録商標）-FRS（ＨＴＳ−ＦＲＳ）という商品名で市販されており、バイオライフ  ソリューションズ  インク（BioLife Solutions,Inc）によって製造されている。本発明の組成物は、凍結温度での保存およびそれに続く解凍に適しており、さらなる処理または試験を必要とすることなく、組成物の細胞を必要とする患者に直接投与することができる。
【００２３】
本発明の組成物から排除される双極性非プロトン性溶媒類は、ＤＭＳＯ、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンおよびヘキサメチルホスフォルアミドを含む。この種類に属するものは、極性化合物および非極性化合物を溶解する、高い極性を有する有機溶媒である。これらの溶媒は水と同様に、幅広い範囲の有機溶媒と混和性を有し、かつ、相対的に高い沸点を有する。これらの溶媒は、細胞産物に対して毒性を有し、かつ、さらには治療される患者に対しても毒性を有するため、これらの溶媒は本発明の組成物から排除される。
【００２４】
本発明はまた、保存溶液であるＨＴＳ−ＦＲＳ中で幹細胞または前駆細胞を懸濁することにより、臨床投与のための幹細胞または前駆細胞を製剤化する方法を提供する。本発明の方法は、ＤＭＳＯまたは他の双極性非プロトン性溶媒の非存在下で、ＨＴＳ−ＦＲＳに懸濁させた細胞を凍結温度で保存させることができ、かつ、続いて患者への前記細胞の直接投与が可能であるという驚くべき知見に基づく。本発明にしたがって臨床投与のために製剤化された細胞は、細胞培養系から回収させることができる。あるいは、凍結保存された細胞を保存状態から回収してもよい。したがって、本発明の一実施形態において、患者に直接投与するためにＨＴＳ−ＦＲＳ中で細胞を懸濁する前に、以下の初期工程が実行される：
（ａ）ＨＴＳ−ＦＲＳ中で前記細胞を懸濁する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の懸濁させた前記細胞を凍結温度で保存する工程；および
（ｃ）前記工程（ｂ）の懸濁させた前記細胞を解凍する工程。
【００２５】
凍結保存（工程（ｂ））または解凍（工程（ｃ））に続いて、前記細胞懸濁物はまた、低温度にて保存してもよい。
【００２６】
本明細書において、「低温度」という用語は、２℃〜８℃の範囲内の温度を意味する。
【００２７】
本明細書において、「凍結温度」という用語は、−２０℃より低い温度を意味し、好ましくは−７０℃〜−２００℃の範囲内の温度であり、最も好ましくは−８０℃〜−１９６℃の範囲内の温度である。「凍結保存」という用語は、これらの範囲内の温度で細胞を保存することを意味する。
【００２８】
本明細書において、「周囲温度」という用語は、１５℃〜２５℃の範囲内の温度を意味する。
【００２９】
本発明はまた、ＨＴＳ−ＦＲＳ中に懸濁させた幹細胞または前駆細胞を単位用量の形態で含む薬剤を提供する。この薬剤は、いずれかの適切な伝達手段を介して（好ましくは、組織への移植または全身への伝達を介して）、それを必要とする患者への直接投与に適している。
【００３０】
本発明に利用される細胞は幹細胞または前駆細胞である。好ましくは、前記細胞はヒト体性幹細胞またはヒト前駆細胞であり、最も好ましくは、ヒト造血幹細胞、ヒト間葉幹細胞、ヒト神経幹細胞（神経上皮細胞）およびヒト網膜前駆細胞から選択される。
【００３１】
細胞は、２０，０００〜８０，０００細胞／μｌ、好ましくは４０，０００〜６０，０００細胞／μｌの範囲の濃度で本発明の組成物中に存在する。
【００３２】
本発明にかかる細胞組成物、製剤および薬剤は、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与および筋肉内投与を含む、直接的な組織移植または全身投与を介した臨床投与に適している。細胞製剤は、いずれか適切な方法を介して投与されてもよいが、しかしながら、細胞伝達カニューレを介した投与が好ましい。
【００３３】
本発明の組成物の幹細胞または前駆細胞は、生体適合性足場またはマイクロキャリアに含有されていてもよい。細胞と足場またはマイクロキャリアとの結合（association）は、針注射を用いるより良い細胞の生存、ならびに、続く移植、より良い宿主組織への融合を促進するかもしれない。足場またはマイクロキャリアは好ましくは生分解性高分子物質であり、最も好ましくは、Bible et al（2009）により記載されているポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である。あるいは、足場またはマイクロキャリアは、ポリ−Ｌ−ラクチド（ＰＬＬＡ）、コラーゲン、フィブロネクチン、グルコサミノグルカン（ＧＡＧｓ）、フィブリン、澱粉、セルロース  アラビノガラクタン（ラーチガム）、アルギン酸、寒天、カラギーナン、キチン、ヒアルロン酸、デキストラン、ジェランガム、プルラン、ヒドロキシアパタイト、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）、ヒドロゲル、または、ペプチドベースのナノ構造化繊維質足場等の自己集合性材料を含む物質を含有する、滑らかで、マクロ多孔性構造または微小孔性構造であってもよい。
【００３４】
幹細胞または前駆細胞は、アルギン酸塩（Tsang et al., 2007）等の物質を用いてカプセルに包含されていてもよい。加えて、カプセル化は、キトサン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン１４、ポリ（メチレン−ｃｏ−グアジニン）塩酸塩、プルロニクス（登録商標）、グリセリンリン酸、ヒアルロン酸、セルロースリン酸、澱粉、寒天、カラギーナン、絹フィブロイン、ゼラチンおよびジェランガムを含む物質からなるマクロカプセル化（macroencapsulation）を具体化する。これらの細胞カプセル化の組み合わせは、凍結細胞のより良い生存を促進することができ、幹細胞または前駆細胞の一時的または永久的な物理的単離を保証することができ、かつ、次に移植が行われる細胞のあらゆる潜在的な免疫拒絶を避けることができる。
【００３５】
本発明の組成物は、（ｉ）慢性発作障害、急性発作、外傷性脳傷害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症および関連する疾患を含む神経疾患；（ｉｉ）末梢虚血、末梢動脈疾患、心筋梗塞、糖尿病誘発性血管疾患および関連する疾患を含む血管系疾患；（ｉｉｉ）網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および関連する疾患を含む網膜疾患；（ｉｖ）クローン病、関節リウマチ、１型糖尿病および関連する疾患を含む自己免疫疾患；および（ｖ）白血病、リンパ腫、骨髄腫および関連する疾患を含む血液癌の治療を含む療法での使用に適している。
【００３６】
細胞産物は細胞伝達装置に適応性を有し、かつ、臨床投与による毒性を有していないため、本発明にしたがって製剤化された細胞は、ＤＭＳＯまたは他の毒性を有する化合物を保存媒体または調製媒体から除去する処理をさらに行う必要がない。
【００３７】
下記の限定されない実施例を参照して本発明を以下に説明する。
【００３８】
［方法］
（神経幹細胞、網膜前駆細胞および間葉幹細胞の製剤化）
神経幹細胞はヒト胎児脳由来であり、Polock et al（2006）によって記載されているように、組織培地内に保持された。網膜前駆細胞培地は胎児網膜から得られ、Aftab et al（2009）によって記載されているように、組織培地中に保持された。健常志願者の骨盤骨の後腸骨稜から抜き取られた骨髄から単離されたヒト間葉幹細胞をLonza（カタログ番号：ＰＴ−２５０１）から入手し、製造者所有の培地であるＭＳＣＧＭ（間葉成長培地）を用いて製造者が推薦するように培養した。２代培養で供給された細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて３代培養し、上述した製剤化の前の初期捲種密度を５０００〜６０００細胞／ｃｍ２とした。
【００３９】
細胞培地は、７０〜９０％に融合するまでＴ−フラスコで膨張（expand）させた。使用済みの培地は吸引され、次いで細胞単層を、マグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含まないＨＢＳＳ（Invitrogen）を用いて洗浄した。この洗浄物を吸引し、次いで、組み換えウシトリプシン（Lonza TrypZean/EDTA）を用いて３７℃にて５分間前記細胞を解離した。解離された細胞懸濁物を、トリプシン阻害剤溶液（ＤＭＥＭ：Ｆ１２ [Invitrogen]中、０．５５ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤 [Sigma]、１％のＨＳＡ[Grifols]、２５Ｕ／ｍｌのベンゾンヌクレアーゼ [VWR]）と混合し、〜５００×ｇで５分間遠心分離した。この上清を吸引し、前記細胞ペレットを、ＤＭＥＭ：Ｆ１２中の５０％HypoThermosol（登録商標）-FRS（BioLife Solutions,Inc）で洗浄し、次いで、〜５００×ｇで５分間遠心分離した。次に、この細胞ペレットを、４０，０００〜６０，０００細胞／μlの濃度でHypoThermosol（登録商標）-FRS中に懸濁させた。
【００４０】
また、細胞を３７℃の水浴に２分間浸して、凍結保存培地（１０％ＤＭＳＯ[WAK-Chemie Medical]を添加した培地）から細胞を解凍し、次いで洗浄し、上述のようにHypoThermosol（登録商標）-FRS中で製剤化した。
【００４１】
トロロックスを含有する生理食塩水中で製剤化した対照試料を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２中の５０％HypoThermosol（登録商標）-FRSの代わりにＤＭＥＭ：Ｆ１２中で洗浄し、次いで、マグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含有しない、０．５ｍＭのＮ−アセチルシステインおよび０．５〜１μＭのトロロックス（Sigma）を添加したＨＢＳＳ中に懸濁させた。
【００４２】
生理食塩水中で製剤化した対照試料を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２中の５０％HypoThermosol（登録商標）-FRSの代わりにＤＭＥＭ：Ｆ１２中で洗浄し、次いで、マグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含有しない、０．５ｍＭのＮ−アセチルシステイン（Sigma）を添加したＨＢＳＳ中に懸濁させた。
【００４３】
（HypoThermosol（登録商標）-FRSで製剤化された細胞と生理食塩水中で製剤化された細胞との比較）
HypoThermosol（登録商標）-FRS中で製剤化された神経幹細胞の代謝活性は、生理食塩水溶液中で製剤化された神経肝細胞の代謝活性と同程度である。HypoThermosol（登録商標）-FRSまたは生理食塩水中の細胞製剤を１時間保存し、次いで代謝活性アッセイ（Dojindo CCK-8）を培地中で１時間行った。存在する細胞の数を考慮して、細胞定量化アッセイ（Invitrogen CyQUANT）を用いて結果を標準化した。データは、HypoThermosol（登録商標）-FRS中で製剤化された細胞が、生理食塩水中で製剤化された細胞の代謝活性と同程度の代謝活性を有することを示している（図１参照）。
【００４４】
表１に示されるように、生理食塩水およびＨＴＳ−ＦＲＳで製剤化された神経細胞は、表現型マーカーと同程度の免疫反応性を有する培地を生じさせる。HypoThermosol（登録商標）-FRSまたは生理食塩水中の細胞製剤を最大８時間保存した。次に、前記製剤のネスチン免疫反応性を、蛍光抗体およびフローサイトメトリーを用いて測定し、免疫反応性は予め定めされた９３％の下限を超えていた（生理食塩水＝９９．９％；HypoThermosol（登録商標）-FRS＝９９．８％）。次いで、製剤化された細胞試料を拡大培地中に懸濁させ、ラミニンでコーティングされた組織培養皿に蒔いた。両方の培地ともに、正常な外見を有する、付着性（adherent）の健康な細胞を産生した。これらの細胞は次いで、免疫細胞化学によって分析され、かつ、上述の予め定めされた９５％ネスチン免疫反応性の上限を超えるまで測定された。マイトジェンを７日間服用中止にすることで、幹細胞は、予め定めされた制限内にて表現型（phenotype）マーカーに対する免疫反応性を有する神経表現型へと分化した（マーカー特異性: ＧＦＡＰ＝星状細胞；ＧａｌＣ＝オリゴデンドロサイト；ＤＣＸおよびＴＵＢＢ３＝ニューロン）。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
（低温保存）
品質保持期限の試験は、生理食塩水中で製剤化されるかまたはＨＴＳ−ＦＲＳを用いる本発明で記載された方法を用いて、治療用および市販用に製造された神経幹細胞株であるＣＴＸ０Ｅ０３（Pollock et al., 2006）の生存能力を評価している。一般に、前記細胞は投与前に２℃〜８℃で保存されるだろう。しかしながら、前記細胞の保存条件は、投与の間は周囲温度であるだろうし、かつ、品質保持期限アッセイの間、この温度変化が考慮される。２℃〜８℃で５時間保存し次いで周囲温度への温度変化を行ったすべての実験からのデータが図２に示されており、該データは、ＨＴＳ−ＦＲＳによって生じた、生理食塩水製剤を超える、生存可能な品質保持期限の増加を明らかに実証する。同じ培地由来の細胞との処理の比較では、ＨＢＳＳ＋ＮＡＣ処理後のＨＴＳ−ＦＲＳ処理によって生じた、７時間の時点の生存能力における平均増加は２２．７％である（ＨＢＳＳ＋ＮＡＣの生存能力＝５８．９％である；ＨＴＳ−ＦＲＳの生存能力＝８１．６％である）。今までの各場合において、本発明のＨＴＳ−ＦＲＳ製剤の生存能力は、生存可能な細胞産物に対する調節信頼性によって定められているように、上述の７０％を超える許容基準になっている。
【００４７】
加えて、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の一晩の低温保存が行われている。個々の細胞製剤は２℃〜８℃で２４時間生存可能であり、かつ、続く付加的な周囲温度での４時間は臨床投与温度を模している（図３参照）。さらに、ＨＴＳ−ＦＲＳ中で製剤化された細胞は２℃〜８℃で最大７日間生存可能であり、生理食塩水で製剤化された細胞は２日以内に生存不可能になる（図４参照）。ＨＴＳ−ＦＲＳの細胞保存特性の一部は、ビタミンＥ誘導体であるトロロックス（生理食塩水溶液中で周囲温度にて神経幹細胞を２日間保存することができる）に起因する可能性がある（図５参照）。これらのデータは、本発明の方法に続いて行われる、低温条件での細胞療法における短期保存および中期保存の成功を示している。
【００４８】
図６は、低温度で２４時間の品質保持期限試験の間の網膜前駆細胞の生存能力を示す。解凍した凍結保存細胞を、緊急の培養処理を行わずにＨＴＳ−ＦＲＳ中で製剤化した。
【００４９】
（凍結保存）
神経幹細胞、網膜前駆細胞および間葉幹細胞の凍結保存は、本発明の方法を用いて首尾よく達成されている。本発明の方法にしたがって製剤化された細胞は、細胞生存能力が悪化することなく、−８０℃での保存が最大４日間可能である（図７ないし図１０参照）。ＨＴＳ−ＦＲＳ非毒性溶液は、１０％ＤＭＳＯを含む現行の方法を用いて達成されるのと同様に、続いて凍結保存が行われる細胞の生存能力を維持する点で効果的であった（図８ないし図１０）。加えて、解凍した本発明の細胞は、続くＨＴＳ−ＦＲＳ中での解凍においても生存能力を維持している（図８ないし図１０参照）。さらに、これらの解凍した細胞は、組織培地中に配置したときに、１０％ＤＭＳＯを用いて凍結保存された細胞と同等の生物学的活性を示している。
【００５０】
（装置の互換性）
細胞治療製剤の投与に関して許容されうる賦形剤の鍵となる起因のひとつは、クリニックで使用されるであろう外科装置との互換性である。本明細書で記載された方法にしたがって製剤化された細胞療法の粘度および密度の違いならびに生理食塩水溶液は、理論的には、シリンジおよび細胞伝達カニューレを介して細胞を運ぶビヒクルの能力に影響を及ぼすであろう。しかしながら、表２に示されるように、HypoThermosol（登録商標）-FRS中で製剤化された細胞は、生理食塩水中で製剤化された細胞と同じ成功率で、細胞伝達カニューレを通過する。細胞製剤（５０，０００細胞／μｌ）が２５０μlのガラス製シリンジに引き込まれ、２００μl が１μｌ／分または５μｌ／分の速度で１９ｃｍ細胞伝達カニューレを介して放出された。細胞の生存能力をトリパンブルー排除（exclusion）によって評価し、かつ、細胞の濃度を血球計を用いて測定した。加えて、前記細胞のネスチン免疫反応性を、蛍光抗体およびフローサイトメトリーを用いて測定した。生存能力は、各製剤において許容範囲にあった。細胞濃度は一定である。ネスチン免疫反応性は、上述の予め定められた９３％の下限を超えたままであった。これらの結果はさらに、賦形剤としてのＨＴＳ−ＦＲＳの使用を実証している。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
（細胞の生存能力および濃度アッセイ）
細胞試料を０．４％トリパンブルー（Sigma）と１：１で混合し、血球計の上に配置した。生存能力がある細胞は細胞質から染料を排除し、無色である。細胞膜の完全性を失っている生存能力がない細胞は、青に染色される。試料の生存能力および濃度は、１０倍の対象位相差顕微鏡分析を用いて、血球計のマス目内で細胞を計測することにより決定される。
【００５３】
本発明のヒト幹細胞および前駆細胞の製剤は、２℃〜８℃での保存において、産物の生存可能な品質保持期限を、従来の標準である約３時間から少なくとも２４時間に延長する。加えて、細胞は、−７０℃未満の温度にて４日間より長い期間、ならびに液体窒素保存条件（〜−１９５℃）にて少なくとも６ヶ月、この同じ保存培地における凍結保存に耐えことができる。品質保持期限におけるこれらの改善は、保存された産物の特徴に影響を及ぼすことなく、影響されない有効性をもたらす。
【００５４】
（毒性）
本発明における方法によって製剤化された細胞療法の毒性は変化しないだろう。マウスへと移植された場合、HypoThermosol（登録商標）-FRSビヒクルまたは神経幹細胞とともに想定される明らかな毒性は認められなかった。これらの試験は頭蓋内投与および筋肉内投与を含む。加えて、毒性試験はラットについても完了しており、HypoThermosol（登録商標）-FRS溶液または生理食塩水溶液の頭蓋内投与に対する被験者の応答の違いや、いずれかの溶液に対する明らかな反応は示されなかった。
【００５５】
本明細書で記載されたすべての刊行物の内容は、本参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５６】
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Williams SK, Senechal G (2001) Safety of Hypothermosol for Intra-Cardiac Injection. In. Tuscon, AZ, USA: University of Arizona Health Sciences Center.  
【図１】
2015051986.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月30日(2014.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）トロロックス、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオネート、ショ糖、マンニトール、グルコース、デキストラン−４０、アデノシン、およびグルタチオン；ならびに
（ｉｉ）間葉幹細胞、神経幹細胞または網膜前駆細胞
を含み、かつ、双極性非プロトン性溶媒を含まない、治療用組成物。
【請求項２】
前記間葉幹細胞はヒト間葉幹細胞であり、前記神経幹細胞はヒト神経幹細胞であり、前記網膜幹細胞はヒト網膜前駆細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞は、生分解性高分子ポリマー物質に含まれる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記生分解性高分子ポリマー物質はＰＬＧＡである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１の（ｉ）に記載の組成物中で前記間葉幹細胞、前記神経幹細胞または前記網膜前駆細胞を懸濁することを含む、患者への投与のために幹細胞または前駆細胞を製剤化する方法。
【請求項６】
前記細胞は、細胞培養系から回収される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
下記の初期工程を含む、請求項５または６に記載の方法:
（ａ）請求項１の（ｉ）に記載の組成物中で前記間葉幹細胞、前記神経幹細胞または前記網膜前駆細胞を懸濁する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）の前記細胞懸濁物を凍結温度で保存する工程；および
（ｃ）前記工程（ｂ）の前記細胞懸濁物を解凍する工程。
【請求項８】
前記工程（ｂ）は、−７０℃〜−２００℃で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）は、−８０℃〜−１９６℃で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞懸濁物は、前記工程（ｂ）または前記工程（ｃ）の後で低温度で保存される、請求項７ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記低温度での保存は２℃〜８℃で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記間葉幹細胞はヒト間葉幹細胞であり、前記神経幹細胞はヒト神経幹細胞であり、前記網膜幹細胞はヒト網膜前駆細胞である、請求項５ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記間葉幹細胞、前記神経幹細胞または前記網膜前駆細胞は、生分解性高分子ポリマー物質に含まれる、請求項５ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生分解性高分子ポリマー物質はＰＬＧＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記間葉幹細胞、前記神経幹細胞または前記網膜前駆細胞はカプセルに包含されている、請求項５ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記間葉幹細胞、前記神経幹細胞または前記網膜前駆細胞は、アルギン酸塩、キトサン、ＰＥＧ、ＰＬＬ、ポリ−Ｌ−オルニチン１４、ポリ（メチレン−ｃｏ−グアジニン）塩酸塩、プルロニクス（登録商標）、グリセリンリン酸、ヒアルロン酸、セルロースリン酸、澱粉、寒天、カラギーナン、絹フィブロイン、ゼラチンおよびジェランガムから選ばれる物質に包含されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記製剤化する工程は、細胞伝達カニューレを介して投与される、請求項５ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物を単位用量の形態で含む、薬剤。
【請求項１９】
前記薬剤は、組織への移植または全身伝達を介して、該薬剤を必要とする患者に直接投与される、請求項１８に記載の薬剤。
【外国語明細書】
2015051986000001.pdf