(57)【要約】      （修正有）【課題】胞子を形成する菌類を、前処理なしに、マルディトフ質量分析器（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−Ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）に直接的に導入して同定するためのバチルス菌の同定方法を提供する。【解決手段】胞子を形成するバチルス菌類を含む試料を、何らかの前処理なしに、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）上に直接点滴する。前記試料の点滴後、マトリックス溶液を前記ターゲットプレートに処理した後乾燥させることをさらに含む。【選択図】図３
2015021960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルディトフ質量分析器（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌類の同定方法において、胞子を形成するバチルス菌類を含む試料を、何らかの前処理なしに、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）上に直接点滴することを特徴とする、バチルス菌類の同定方法。
【請求項２】
前記試料の点滴後、マトリックス溶液を前記ターゲットプレートに処理した後乾燥させることをさらに含むことを特徴とする、請求項１記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項３】
前記マトリックス溶液は、ジヒドロキシ安息香酸（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トリヒドロキシアセトフェノン（Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）、ヒドロキシフェニルアゾ安息香酸（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｚｏ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ジトラノール（Ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）、シアノ−ヒドロキシ桂皮酸（Ｃｙａｎｏ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、全トランス型レチノイン酸（Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）およびインドールアクリル酸（Ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなるグループより選択された１種以上であることを特徴とする、請求項２記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項４】
前記マトリックス溶液は、シアノ−ヒドロキシ桂皮酸（Ｃｙａｎｏ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）であることを特徴とする、請求項３記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項５】
前記マルディトフ質量分析器は、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社のオートフレックススピードＬＲＦ質量分析器（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ  ＬＲＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）であることを特徴とする、請求項１記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項６】
前記マルディトフ質量分析器のＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度が５０％以上であることを特徴とする、請求項５記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項７】
前記マルディトフ質量分析器のＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を対象として測定する強度に比べて１．６倍以上であることを特徴とする、請求項５記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項８】
前記マルディトフ質量分析器のＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度が７０％〜８０％であることを特徴とする、請求項６記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項９】
前記マルディトフ質量分析器のＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を対象として測定する強度に比べて２．５〜２．７倍であることを特徴とする、請求項７記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１０】
前記バチルス菌類は、バチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスグロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなるグループより選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１１】
２０回を繰り返して求めた標準偏差値を合わせた試料の質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を、バチルス菌類のバイオマーカーの質量電荷比率（ｍ／ｚ）値と互いに比較することを特徴とする、請求項１記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１２】
前記バチルス菌類のバイオマーカーの質量電荷比率（ｍ／ｚ）値が、下記（１）ないし（５）からなるグループより選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１１記載のバチルス菌類の同定方法。
（１）２１９６、２４７３、２５０３、２７８６、３０８９、３３７６、３５９４、６６８４、６７５３、６８４０および９７４６；
（２）３３５７、３４１９、３７０９、４８３６、４９５３、６７１４、６８３９および７０８５；
（３）２３２４、２８７０、２８８６、２９９２、３１２３、４４４７、７９０７、８０５３、８１９９、８３４５、８４９２および８８９５；
（４）２３２４、２７２０、２８７１、２８８７、２９３５、３１１６、５２９９、５９４８、７３３８、８２０１、８３４７、８４９４、８８９６および１１８９８；あるいは、
（５）２１０９、２１２７、３３５７、３４１９、３７０９、６７１５、６８４０および７０８６
【請求項１３】
前記バチルス菌類のバイオマーカーの質量電荷比率（ｍ／ｚ）値が、下記（１）ないし（５）からなるグループより選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１１記載のバチルス菌類の同定方法。
（１）２０８０、２０９７、２１９６、２４４６、２４７３、２５０３、２５１８、２５２３、２５７９、２７８６、３０７５、３０８９、３１５０、３３４１、３３７６、３５７６、３５９４、３６５３、４０３１、４１９６、４３２８、４３８３、４５５４、４９５６、５２６３、５５４１、６６８４、６６９９、６７５３、６８４０および９７４６；
（２）２１０９、２１２３、３０７９、３１９３、３３５７、３４１９、３５４２、３７０９、３８０７、４０３１、４３３５、４４２５、４８３６、４９５３、５１７３、６７１４、６８３９および７０８５；
（３）２３２４、２８７０、２８８６、２９１８、２９３４、２９９２、３１２３、３４３０、３７６０、４４１８、４４４７、４６８２、５０４７、７０７２、７３３６、７９０７、８０５３、８１９９、８３４５、８４９２および８８９５；
（４）２３２４、２７２０、２８７１、２８８７、２９１９、２９３５、２９９１、３１１６、３５２８、４４４８、５０４８、５２９９、５９４８、７０７３、７３３８、８２０１、８３４７、８４９４、８８９６、１１０５６および１１８９８；あるいは、
（５）２１０９、２１２７、２２６６、２３８０、２５２９、３０９５、３３５７、３４１９、３５４２、３７０９、４０３１、４３３５、４４２５、４８３７、４９７１、５１７３、６３５２、６７１５、６８４０および７０８６
【請求項１４】
前記（１）グループのような質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有する試料は、バチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）で判定することを特徴とする、請求項１２または１３記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１５】
前記（２）グループのような質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有する試料は、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）で判定することを特徴とする、請求項１２または１３記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１６】
前記（３）グループのような質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有する試料は、バチルスグロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）で判定することを特徴とする、請求項１２または１３記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１７】
前記（４）グループのような質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有する試料は、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で判定することを特徴とする、請求項１２または１３記載のバチルス菌類の同定方法。
【請求項１８】
前記（５）グループのような質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有する試料は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）で判定することを特徴とする、請求項１２または１３記載のバチルス菌類の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子を形成する菌類を、前処理なしに、マルディトフ質量分析器（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−Ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）に直接的に導入して同定するためのバチルス菌の同定方法および胞子の識別のための分析システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物は、棒状の形態を有しており、カタラーゼ活性を示す。また、これらは、胞子を形成して極限状況に対処し、通性嫌気性微生物の特性を示す。このようなバチルス属微生物は、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のグループに分けられる。
【０００３】
バチルスサブティリスグループは、遺伝体研究のためのモデル生命体として用いられる。
【０００４】
一方、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスチューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルスアトロファエウス（Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などを含むバチルスセレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）グループは、それらの表現型および進化的な関係において非常に高い類似度を示し、そのため、それらの間の区別が非常に難しい。
【０００５】
バチルスアントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は、胞子を形成するグラム陽性バクテリアであって、炭疽菌を引き起こし、ヒトや動物に非常に深刻な影響を及ぼし得るため、生物学戦やバイオテロに使用可能である。
【０００６】
前記菌は、純粋培養された細菌の生化学的特性を利用した伝統的な方法、または化学毒性学的、生理学的、遺伝学的な方法などの多様な方法を利用して分類してきた。しかし、従来技術のような方法では、迅速かつ正確な分類および同定が不可能であるため、より便利で迅速かつ正確なバチルス菌の同定方法の開発に対する要求があった。
【０００７】
マルディトフ質量分析器（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いた質量分析法は、検体をイオン化して、真空管から検出器に到達する時間に基づいて特定の構成物質の質量を測定する方法であって、早い時間内に物質を分析することができる。
【０００８】
ドイツのブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社で最近開発されたマルディバイオタイパー（ＭＡＬＤＩ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ）は、マルディトフ質量分析法を利用して取得した細菌の蛋白質情報を、すでに構築された各菌叢の蛋白質情報と比較分析して識別する超高速分析方法であって、種単位の多様な菌叢を同定する。
【０００９】
マルディトフ質量分析の同定時間は、菌株あたり平均６分以内であり、算出された同定費用は、商品化キットを含む伝統的同定方法の２２〜３２％に過ぎない。すなわち、微生物の同定に利用するのに簡便で所要時間が非常に短く、消耗費用が少ない。
【００１０】
様々なマルディトフ質量分析法を利用した微生物の同定研究において、特別な処理なしに、細胞サンプル自体を直接的に質量分析する方法（ｄｉｒｅｃｔ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ｉｎ−ｓｉｔｕ  ａｎａｌｙｓｉｓ）が栄養細胞やコロニーの分析に適用された。しかし、堅い胞子の特性によって、従来の方法は、抽出などを含む多様な前処理工程を適用した後でなければ同定が不可能である限界があった。
【００１１】
このような問題を解決するために、他の研究では、胞子の同定のために、高分解能のマルディトフ−トフ質量分析器を利用したりした。しかし、マルディトフ−トフ質量分析法は、装備の大きさが巨大で、高価であるため、産業的利用には困難があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Barbuddhe, S. B.; Maier, T.; Schwarz, G.; Kostrzewa, M.; Hof, H.; Domann, E.; Chakraborty, T.; Hain, T. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 5402-5407.
【非特許文献２】Fenselau, C.; Demirev, P. A. Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 157-171.
【非特許文献３】He, Y.; Chang, T. C.; Li, H.; Shi, G.; Tang, Y. -W. Can. J. Microbiol. 2011, 57, 533-538.
【非特許文献４】Moura, H.; Woolfitt, A. R.; Carvalho, M. G.; Pavlopoulos, A.; Teixeira, L. M.; Satten, G. A.; Barr, J. R. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008, 53, 333-342.
【非特許文献５】Lasch, P.; Beyer, W.; Nattermann, H.; Stammler, M.; Siegbrecht, E.; Grunow, R.; Naumann, D. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75, 7229-7242.
【非特許文献６】Aemirev, P. A.; Feldman, A. B.; Kowalski, P.; Lin, J. S. Anal. Chem. 2005, 77, 7455-7461.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、マルディトフ質量分析器（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、以下、マルディトフ質量分析器という）を用いて、胞子を形成するバチルス菌類を迅速かつ容易に検出する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、バチルス菌類の胞子の分析システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明は、マルディトフ質量分析器を用いたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌類の同定方法において、胞子を形成するバチルス菌類を含む試料を、何らかの前処理なしに、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）上に直接点滴することを特徴とする、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌類の同定方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、特定の質量電荷比率（ｍ／ｚ）を用いた特定のバチルス胞子の分析システムを提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明にかかるバチルス菌類の同定方法、胞子の分析システムにより、バチルス菌類を迅速かつ容易に検出、探知および識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のバチルス胞子の質量分析のための直接的な（ｉｎ−ｓｉｔｕ）分析の概略的な過程を示す図である。
【図２】実施例の試料準備方法による炭疽胞子のマルディトフ質量分析スペクトルを比較して示す図である。
【図３】５種類のバチルス胞子の質量分析スペクトルを比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００２０】
本発明は、マルディトフ質量分析器を用いた菌類の同定方法において、胞子を形成するバチルス菌類を含む試料を、何らかの前処理なしに、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）上に直接点滴する簡単な工程を適用してバチルス菌類を同定する方法を提供する。
【００２１】
前記方法において、試料の点滴後、マトリックス溶液を前記ターゲットプレートに処理した後乾燥させることをさらに含むことができる。
【００２２】
前記マルディトフ質量分析器は、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社のオートフレックススピードＬＲＦ質量分析器（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ  ＬＲＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
前記質量分析器は、最大１ｋＨｚのパルス繰返し数（ｐｕｌｓｅ  ｒａｔｅ）を有している３５５ｎｍのＮｄ／ＹＡＧレーザを装着している。
【００２４】
前記マルディトフ質量分析器の適用に対する概略的な様子は図１に示した。
【００２５】
マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）とは、分析しようとする試料および試料のイオン化を補助するマトリックス溶液を点滴してマルディトフ質量分析器に適用するための部品の１つであって、当該分野における通常の知識を有する者であれば誰でも容易に理解することができ、詳細な事項はブルカー社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｕｋｅｒ．ｃｏｍ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）で確認することができる。
【００２６】
本願発明で使用されるマトリックス溶液は、好ましくは、ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））、シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ（Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ））、ヒドロキシフェニルアゾ安息香酸（ＨＡＢＡ（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｚｏ  ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））、ジトラノール（Ｄｉｔｈｒａｎｏｌ）、シアノ−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ（Ｃｙａｎｏ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ））、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ（Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））、インドールアクリル酸（ＩＡＡ（Ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））が良いが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
胞子の同定のための従来のマルディトフ質量分析法では、一般的な微生物より非常に堅い構造によって、細胞の破砕および抽出のための複雑なステップが伴う。これによって、試料の前処理過程で多くの時間および手間がかかるという欠点がある。
【００２８】
本発明は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌類の同定時、従来技術のような前処理を省略し、バチルス胞子試料を、特別な前処理なしに、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）上に直接点滴することを特徴とする。
【００２９】
前記点滴後、乾燥した試料を含むマルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）をマルディトフ質量分析器に適用してバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌類を同定する。
【００３０】
本願発明のバチルス菌類の同定方法では、一般的な微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの分析に利用されるレーザ強度に比べて高い強度のレーザ強度を加える方法を提供する。
【００３１】
前記高い強度は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を対象として測定する強度に比べて約１．６倍以上、より好ましくは２．５〜２．７倍に相当する。前記強度が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を対象として測定する強度に比べて１．６倍以上でなければ、堅い胞子によって直接的な（ｉｎ−ｓｉｔｕ）質量分析が不可能であり、２．７倍を超えると、スペクトルの取得時にノイズが大きくなるという欠点がある。
【００３２】
前記高い強度はまた、本願発明で使用したブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社のオートフレックススピードＬＲＦ質量分析器（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ  ＬＲＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）マルディトフ質量分析器のＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において５０％以上が好ましく、７０〜８０％のレーザ強度がより好ましい。従来技術のような前処理を経て得られたバチルス菌類を同定する場合、ＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度は３０％に相当する。
【００３３】
前記強度がＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において５０％より低い場合、堅い胞子によって直接的な（ｉｎ−ｓｉｔｕ）質量分析が不可能であり、８０％を超えると、スペクトルの取得時にノイズが大きくなるという欠点がある。
【００３４】
本発明のバチルス菌類は、一般的に、バチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスグロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を指すが、胞子を形成するバチルス属の菌類であればこれらに限定されない。
【００３５】
本発明のバチルス菌類の同定方法は、胞子が形成されたバチルス菌自体を試料として使用するため、試料の質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を、バチルス菌類のバイオマーカーの質量電荷比率（ｍ／ｚ）値と互いに比較し、特定のバチルス菌類を同定することができる。
【００３６】
本発明にかかる一実施形態によれば、バチルス胞子ごとに再現性があり有意に検出されるバイオマーカーを確認することができる（図３および表１）。
【００３７】
すなわち、５種類のバチルス菌類の胞子はいずれも、２，０００から２０，０００Ｄａの間の質量範囲内で互いに異なるパターンの質量スペクトルと互いに区別可能な特異的バイオマーカーが検出されることが分かる（図３）。本願発明では、このようなバイオマーカーによってバチルス胞子の分析システムを完成した。
【００３８】
前記バイオマーカーの質量電荷比率（ｍ／ｚ）およびそれに応じた標準偏差と、各バイオマーカーの相対的な検出強度および各検出強度に対する標準偏差は、表１から具体的に確認することができる。バイオマーカーの間でも検出強度が高くて重要なものは太字で表した。
【００３９】
興味深いことに、バチルスグロビギ（Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ）胞子の場合、７．９ｋＤａから８．５ｋＤａの間で非常に広くて独特なパターンの質量スペクトルが確認され、これは、バチルスグロビギ（Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ）胞子の識別に大きく役立つものと期待される。バチルスグロビギ（Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ）の非常に特異的なパターンは、表１において破線で囲んでいる。
【００４０】
また、生物学作用剤として使用可能なバチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子の場合、非常に類似する種のバチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）とも区別されやすいことを確認した。
【００４１】
より具体的に説明すれば、本発明のバチルス菌類のうち、バチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子のバイオマーカーは、好ましくは２１９６、２４７３、２５０３、２７８６、３０８９、３３７６、３５９４、６６８４、６７５３、６８４０、９７４６の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができ、より好ましくは２０８０、２０９７、２１９６、２４４６、２４７３、２５０３、２５１８、２５２３、２５７９、２７８６、３０７５、３０８９、３１５０、３３４１、３３７６、３５７６、３５９４、３６５３、４０３１、４１９６、４３２８、４３８３、４５５４、４９５６、５２６３、５５４１、６６８４、６６９９、６７５３、６８４０、９７４６の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができる。
【００４２】
また、本発明のバチルス菌類のうち、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）胞子のバイオマーカーは、好ましくは３３５７、３４１９、３７０９、４８３６、４９５３、６７１４、６８３９、７０８５の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができ、より好ましくは２１０９、２１２３、３０７９、３１９３、３３５７、３４１９、３５４２、３７０９、３８０７、４０３１、４３３５、４４２５、４８３６、４９５３、５１７３、６７１４、６８３９、７０８５の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができる。
【００４３】
さらに、本発明のバチルス菌類のうち、バチルスグロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）胞子のバイオマーカーは、好ましくは２３２４、２８７０、２８８６、２９９２、３１２３、４４４７、７９０７、８０５３、８１９９、８３４５、８４９２、８８９５の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができ、より好ましくは２３２４、２８７０、２８８６、２９１８、２９３４、２９９２、３１２３、３４３０、３７６０、４４１８、４４４７、４６８２、５０４７、７０７２、７３３６、７９０７、８０５３、８１９９、８３４５、８４９２、８８９５の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができる。
【００４４】
また、本発明のバチルス菌類のうち、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）胞子のバイオマーカーは、好ましくは２３２４、２７２０、２８７１、２８８７、２９３５、３１１６、５２９９、５９４８、７３３８、８２０１、８３４７、８４９４、８８９６、１１８９８の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができ、より好ましくは２３２４、２７２０、２８７１、２８８７、２９１９、２９３５、２９９１、３１１６、３５２８、４４４８、５０４８、５２９９、５９４８、７０７３、７３３８、８２０１、８３４７、８４９４、８８９６、１１０５６、１１８９８の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができる。
【００４５】
さらに、本発明のバチルス菌類のうち、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子のバイオマーカーは、好ましくは２１０９、２１２７、３３５７、３４１９、３７０９、６７１５、６８４０、７０８６の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができ、より好ましくは２１０９、２１２７、２２６６、２３８０、２５２９、３０９５、３３５７、３４１９、３５４２、３７０９、４０３１、４３３５、４４２５、４８３７、４９７１、５１７３、６３５２、６７１５、６８４０、７０８６の特徴的な質量電荷比率（ｍ／ｚ）値を有することができる。
【００４６】
本発明にかかるバチルス菌類の同定方法およびバチルス胞子の分析システムは、従来技術に比べて顕著に少ない努力および時間にもかかわらず、特定のバチルス菌類を簡便かつ正確に同定することができる。
【００４７】
以下、本発明は、下記の実施例によってより具体的に説明するが、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：バチルス菌類の培養
本発明では、韓国疾病管理本部から提供されたバチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスグロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を使用した。各菌株の単一コロニーを、胞子化のために、ＮＢ培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）に接種した後、３２℃で２〜４日間振とう培養した。培養は、光学顕微鏡で９９％以上胞子化が行われるまで進行した。この過程によって培養された胞子は、遠心分離を通じて上澄液および細胞残骸を除去した精製された胞子を回収した。胞子の形成および胞子の純粋精製は４００倍の光学顕微鏡で観察して確認し、この時、胞子の純度は８０〜９０％であった。収集された胞子は、蒸留水に１×１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度で懸濁し、実験に使用する前まで４℃に保管した。
【００４９】
実施例２
マルディトフ質量分析法による胞子の分類のために、図１のように、１×１０８〜９ＣＦＵ／ｍｌで用意された１ｕｌのバチルスアントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子を、何らかの前処理過程も経ずに、ＭＴＰ  ３８４  ターゲットグランドスチール  ＴＦ（ＭＴＰ  ３８４  ｔａｒｇｅｔ  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔｅｅｌ  ＴＦ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ））に直接的に点滴し、常温で約５分間乾燥させた。以後、１００％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ；ＡＣＮ、Ｓｉｇｍａ、米国）と０．３％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ、米国）を２：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で混合したＴＡ２に、１２ｍｇ／ｍｌで用意されたマトリックス溶液（α―シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＨＣＡ）））１ｕｌを、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）上で乾燥した各胞子上に点滴した後、常温で５分間乾燥させた。
【００５０】
胞子の質量スペクトルは、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）社のオートフレックススピードＬＲＦ質量分析器（Ａｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ  ＬＲＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。パルスイオン抽出（Ｐｕｌｓｅ  ｉｏｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）時間は２００ｎｓであった。スペクトルの測定は、イオン源（ｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）１および２で１９．５１ｋＶおよび１８．２６ｋＶの加速電圧を利用するＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）の一般モード（ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅ）を用いた。ＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度を７７％に設定した。
【００５１】
胞子分析の場合、ＭＢＴ＿ＦＣパラメータ（ＭＢＴ＿ＦＣ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）において、レーザ強度を５０％以下に設定すると、質量スペクトルを得ることができなかった。
【００５２】
レンズ電圧は７．００ｋＶであった。胞子の質量スペクトルは、低い質量範囲の０．５から２ｋＤａ、そして、中間質量範囲の２から２０ｋＤａで測定して格納した。質量スペクトルを補正するための基準菌株として、大腸菌ＤＨ５ａ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ドイツ））を用いた。ピークアサインメント許容差（ｐｅａｋ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を１０００ｐｐｍ以内で行った。それぞれの胞子スペクトルのために、最低２００レーザショットを合算した。各胞子の質量スペクトルデータは、ブルカー社製フレックスコントロールソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ’ｓ  Ｆｌｅｘ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（ｖ．３．３；Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ））を用いて取得した。各質量スペクトルは、サビツキーゴーレイ（Ｓａｖｉｔｚｋｙ  Ｇｏｌａｙ）方法によるスムージングトップハット（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ、ＴｏｐＨａｔ）方法によるベースライン差分（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、そして、強度ノーマライゼーション（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を利用して加工した。胞子バイオマーカーの比較分析のために、質量電荷比率（ｍ／ｚ）に各ピークの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）情報を重心（Ｃｅｎｔｒｏｉｄ）アルゴリズムを利用して確認した。バイオマーカー分析は、ピークパターンの再現性を確認するために、バチルス胞子ごとに計２０回以上の実験を行った。
【００５３】
比較例１
本願発明の実施例２による処理を、他の試料準備方法と比較するために、非活性化方法およびビーズ粉砕（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｉｎｇ）とトリフルオロアセテート（ＴＦＡ）抽出を組み合わせた方法を導入して試料をマルディプレートに処理したことを除いては、実施例２と同様の方法で行った。
【００５４】
非活性化方法は、Ｐ．Ｌａｓｃｈ，ｅｔ．ａｌ．，２００９に記載されているように、修正されたＴＦＡ非活性化方法を導入した。ビーズ粉砕（Ｂｅａｄ  ｂｅａｔｉｎｇ）とトリフルオロアセテート（ＴＦＡ）抽出を組み合わせた方法は、まず、３０ｕｌの純粋なエタノール（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）と５ｕｌの胞子サンプルを５分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して混合後、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。以後、上澄液を除去し、常温で２分間エタノールを蒸発させた。機械的な力によって胞子を破砕し、効率的な抽出のために、少量のビーズ（ｂｅａｄｓ）（７ｕｌ）と７ｕｌのアセトニトリル（ＡＣＮ）を沈殿した胞子サンプルに添加し、５分間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。その後、７ｕｌの７０％蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ、米国））を添加した後、１０分間ボルテックス（ｖｏｌｔｅｘｉｎｇ）を行った。このように、３つの方法（直接的な（ｉｎ−ｓｉｔｕ）質量分析方法、非活性化方法、抽出方法）で用意された胞子サンプルは、最低３回ずつ、マルディターゲットプレート（ＭＡＬＤＩ  ｔａｒｇｅｔ  ｐｌａｔｅ）に点滴して比較分析した。
【００５５】
実施例２および比較例１に該当する結果は図２に示される通りである。すなわち、本願発明にかかる、前処理なしに、胞子を形成するバチルス菌類を直接マルディターゲットプレートに点滴する方法は、従来の前処理過程を経た方法と比較した時、より豊富な特異的ピークを有することが分かる。
【００５６】
実施例３
バチルス菌類の胞子間の識別を確認するために、５種類のバチルス胞子、すなわち、バチルスアントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスグロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を、マルディトフ質量分析器を用いて、前記発明方法で質量分析を行ってピークを分析した。実験方法は実施例２と同様であった。
【００５７】
前記結果を下記表１に示した。
【００５８】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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