(57)【要約】【課題】簡便に電子染色を行うことができる電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液を加えることを含む。【選択図】図３
2015145854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液を加えることを含む、電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法。
【請求項２】
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液と、試料を固定するための固定液と、を加えることを含む電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記酸性溶液は、塩酸である、電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記緩衝液は、カコジル酸ナトリウム水溶液である、電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法。
【請求項５】
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし緩衝液を加えた溶液に試料を浸漬することを含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。
【請求項６】
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし緩衝液と試料を固定するための固定液とを加えた溶液に試料を浸漬することを含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。
【請求項７】
請求項５または６において、
前記酸性溶液は、塩酸である、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。
【請求項８】
請求項５ないし７のいずれか１項において、
前記緩衝液は、カコジル酸ナトリウム水溶液である、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。
【請求項９】
水酸化ランタンと、
酸性溶液と、
を含む、電子顕微鏡観察用染色剤の原液。
【請求項１０】
請求項９において、
前記酸性溶液は、塩酸である、電子顕微鏡観察用染色剤の原液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法、電子顕微鏡観察用試料の染色方法、および電子顕微鏡観察用染色剤の原液に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料の微細な構造等を観察する装置として、光学顕微鏡や電子顕微鏡が知られている。特に、走査電子顕微鏡や透過電子顕微鏡等の電子顕微鏡は光学顕微鏡と比べて分解能が高いため、より微細な構造を観察する際に有効である。しかしながら、生体試料は、炭素、酸素、窒素、水素などの軽元素を含んで構成されているため、電子線を十分に散乱させることができない。したがって、電子顕微鏡で観察しても、電子顕微鏡像に十分なコントラストが得られない場合がある。そのため、電子顕微鏡で生体試料を観察する際には、一般的に、試料を重金属等で電子染色する。試料を電子染色することにより、電子線の散乱を促し、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
水酸化ランタンは、糖タンパク質に結合することにより、生物組織を電子染色することができる。糖タンパク質は主に細胞膜に局在しており、水酸化ランタンを傍細胞領域のバリア機能を果たす蛋白質群のトレーサーとして用いることができる。
【０００４】
有効な電子染色を行うためには、１％程度の濃度の水酸化ランタン水溶液が必要となる。しかしながら、水酸化ランタンは、２５℃における水に対する溶解度は０．３ｍｇ／ｌであり、ほとんど水に溶けない。図９は、２０ｍｌの水に２ｇの水酸化ランタンを加えた様子を示す写真である。図９に示すように、水酸化ランタンは水に溶けずに懸濁している。このように水酸化ランタンはほとんど水に溶けないため、水酸化ランタン水溶液は、一般的に、硝酸ランタン水溶液に水酸化ナトリウムを加えて作製している。
【０００５】
現在、一般的に使われている水酸化ランタン染色液の作製法は以下の通りである。
【０００６】
まず、２％〜４％の硝酸ランタン水溶液（ｐＨ７．６〜ｐＨ７．８）に０．０１Ｎ水酸化ナトリウムを少しずつ反応させて、水酸化ランタンを作製する。水酸化ランタンは、ｐＨ７．６〜７．８において水に不溶のため、沈殿する。この液に同量のＫａｒｎｏｖｓｋｙ固定液（２．５％グルタールアルデヒド、２％パラホルムアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２））、もしくは、０．１Ｍカコジル酸水溶液（ｐＨ７．２）に１％四酸化オスミウム酸水溶液を溶かしたものを加え、染色液とする。
【０００７】
このようにして、最終濃度１％〜２％水酸化ランタン水溶液（ｐＨ７．２）を作製することができる。水酸化ランタンは溶けきらずに濁ることがあるが、沈殿が気になる場合には、アルコールを添加することにより、溶かしきることが可能である。
【０００８】
このようにして作製した染色液を用いると、生物細胞や組織を固定すると同時に糖タンパク質が染色される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−２５５６９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述した硝酸ランタン水溶液に水酸化ナトリウムを反応させて染色剤を作製する方法では、調整に時間がかかるうえに、最終的に得られる量も安定しなかった。さらに、水酸化ランタンの生成をｐＨ７．６〜７．８で生じる沈殿として確認し、その沈殿が生じた水溶液に同量のＫａｒｎｏｖｓｋｙ固定液等を加えて染色剤とするため、水酸化ランタンの最終濃度は安定しない。さらに、このように作製した染色剤は、水酸化ランタンの沈殿物が残っているため、コンタミネーションの原因となる。
【００１１】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、簡便に電子染色を行うことができる電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法、電子顕微鏡観察用試料の染色方法、および電子顕微鏡観察用染色剤の原液を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（１）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法は、
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液を加えることを含む。
【００１３】
このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、簡便に電子染色を行うことができる。例えば、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かした溶液はストックソリューション（原液）として保存が可能であり、このストックソリューションに緩衝液を加えることで、簡便に染色剤として使用が可能である。
【００１４】
さらに、このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、水酸化ランタンの沈殿を抑制できるため、コンタミネーションを抑制することができる。また、このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、正確な濃度で水酸化ランタン水溶液を作製することができるため、再現性も向上できる。
【００１５】
（２）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法は、
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液と、試料を固定するための固定液と、を加えることを含む。
【００１６】
このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、簡便に電子染色を行うことができる。例えば、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かした溶液はストックソリューション（原液）として保存が可能であり、このストックソリューションに緩衝液を加えることで、簡便に染色剤として使用が可能である。
【００１７】
さらに、このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、水酸化ランタンの沈殿を抑制できるため、コンタミネーションを抑制することができる。また、このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、正確な濃度で水酸化ランタン水溶液を作製することができるため、再現性も向上できる。
【００１８】
さらに、このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、試料を固定しつつ、電子染色を行うことができる。
【００１９】
（３）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法において、
前記酸性溶液は、塩酸であってもよい。
【００２０】
このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、簡便に電子染色を行うことができる。
【００２１】
（４）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法において、
前記緩衝液は、カコジル酸ナトリウム水溶液であってもよい。
【００２２】
このような電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、簡便に電子染色を行うことができる。
【００２３】
（５）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし緩衝液を加えた溶液に試料を浸漬することを含む。
【００２４】
このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、簡便に電子染色を行うことができる。例えば、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かした溶液はストックソリューションとして保存が可能であり、このストックソリューションに緩衝液を加えることで、簡便に染色剤として使用が可能である。
【００２５】
さらに、このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、水酸化ランタンの沈殿を抑制できるため、コンタミネーションを抑制することができる。また、このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、正確な濃度で水酸化ランタン水溶液を作製することができるため、再現性も向上できる。
【００２６】
（６）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、
水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし緩衝液と試料を固定するための固定液とを加えた溶液に試料を浸漬することを含む。
【００２７】
このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、簡便に電子染色を行うことができる。例えば、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かした溶液はストックソリューションとして保存が可能であり、このストックソリューションに緩衝液を加えることで、簡便に染色剤として使用が可能である。
【００２８】
さらに、このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、水酸化ランタンの沈殿を抑制できるため、コンタミネーションを抑制することができる。また、このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、正確な濃度で水酸化ランタン水溶液を作製することができるため、再現性も向上できる。
【００２９】
さらに、このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、試料を固定しつつ、電子染色を行うことができる。
【００３０】
（７）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法において、
前記酸性溶液は、塩酸であってもよい。
【００３１】
このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、簡便に電子染色を行うことができる。
【００３２】
（８）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法において、
前記緩衝液は、カコジル酸ナトリウム水溶液であってもよい。
【００３３】
このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法では、簡便に電子染色を行うことができる。
【００３４】
（９）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の原液は、
水酸化ランタンと、
酸性溶液と、
を含む。
【００３５】
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の原液では、例えば、硝酸ランタン水溶液に水酸化ナトリウムを少しずつ反応させて水酸化ランタンを作製する場合と比べて、簡便に染色剤を作製することができる。
【００３６】
（１０）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の原液において、
前記酸性溶液は、塩酸であってもよい。
【００３７】
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤の原液では、簡便に染色剤を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】水酸化ランタンに塩酸を加えて溶かしたときの様子を示す写真。
【図２】５０ｍｌの０．２Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１０ｍｌの１０％水酸化ランタン水溶液（ｐＨ２．２）、４０ｍｌの蒸留水を混ぜて作製した染色剤を示す写真。
【図３】本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラの透過電子顕微鏡像。
【図４】本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラの透過電子顕微鏡像。
【図５】本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラの透過電子顕微鏡像。
【図６】本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラを傾斜軸を中心に−６０°〜＋６０°傾斜したときの透過電子顕微鏡像。
【図７】本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラのボリュームレンダリング像。
【図８】本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラのボリュームレンダリング像を着色した図。
【図９】水に水酸化ランタンを加えた様子を示す写真。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００４０】
１．  電子顕微鏡観察用染色剤の原液
まず、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の原液（以下「ストックソリューション」ともいう）について説明する。
【００４１】
ここで、電子顕微鏡観察用染色剤とは、電子顕微鏡観察の対象となる試料を染色するための染色剤（電子染色剤）をいう。なお、染色とは、いわゆる電子染色をいい、試料の特定の部位や、試料の周囲に電子の散乱を促す物質（重金属等）を吸着または結合させることをいう。電子顕微鏡観察用染色剤を用いて試料を染色することにより、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる。
【００４２】
また、染色された試料の観察に用いられる電子顕微鏡としては、例えば、走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）、走査透過電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＴＥＭ）などが挙げられる。
【００４３】
本実施形態に係るストックソリューションは、水酸化ランタン（Ｌａ（ＯＨ）３）と、酸性溶液と、を含む。本実施形態に係るストックソリューションは、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かしたものである。本実施形態に係るストックソリューションは、例えば、ｐＨ１．０以上３．０以下である。より好ましくは、本実施形態に係るストックソリューションは、ｐＨ２．０である。
【００４４】
本実施形態に係るストックソリューションに用いられる酸性溶液は、水酸化ランタンを溶かすことができる溶液であれば特に限定されない。当該酸性溶液として、例えば、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸（ＨＮＯ３）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）等を用いることができる。
【００４５】
本実施形態に係るストックソリューションは、例えば、水酸化ランタンに酸性溶液を加えて溶かし、さらに、水を加えることで作製される。
【００４６】
本実施形態に係るストックソリューションでは、電子染色を行う際に、緩衝液を加えることで、染色剤を作製することができる。
【００４７】
したがって、本実施形態に係るストックソリューションによれば、例えば、硝酸ランタン水溶液に水酸化ナトリウムを少しずつ反応させて水酸化ランタンを作製する場合と比べて、簡便に染色剤を作製することができる。
【００４８】
２．  電子顕微鏡観察用染色剤
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、上述した本実施形態に係るストックソリューションに、緩衝液を加えることで製造することができる。
【００４９】
緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、酢酸緩衝液、各種グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリセン（Ｔｒｉｃｅｎｅ）、グリシンアミド、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））、Ｍｉｌｌｏｎｉｇのリン酸緩衝液（２．２６％リン酸二水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）と、２．５２％水酸化ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）とを混合した溶液）等を挙げることができる。
【００５０】
また、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、本実施形態に係るストックソリューションに、上記の緩衝液と、試料を固定するための固定液と、を加えることで製造することができる。
【００５１】
ここで、固定とは、組織や細胞などをできるだけ生時の状態のままに保つ処理をいう。
【００５２】
固定液としては、グルタールアルデヒド固定液、パラホルムアルデヒド固定液、グルタールアルデヒドとパラホルムアルデヒドの混合液（Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液）等を挙げることができる。
【００５３】
ここで、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液は、２．５％グルタールアルデヒド、２％パラホルムアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム水溶液からなる。
【００５４】
例えば、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液に対して、その全体量の１／１０となる量の１０ｗｔ％水酸化ランタン水溶液（ストックソリューション）を加えることで、染色剤とすることができる。Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液には、バッファー（カコジル酸ナトリウム）が含まれるため、ｐＨはほぼ中性（ｐＨ７．０）を保つことができる。また、この染色剤はｐＨ７．０であっても水酸化ランタンの沈殿は生じない。
【００５５】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、糖タンパク質を染色することができる。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、水酸化ランタンが糖タンパク質に結合することにより、生物細胞や生物組織を電子染色することができる。
【００５６】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、糖タンパク質を含む試料の電子染色に用いることができる。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、動物または植物の細胞または組織を含む生体試料の電子染色に用いることができる。
【００５７】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、バッファー（カコジル酸ナトリウム）を含むため、ｐＨ７程度にすることができる。そのため、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、例えば、タンパク質を変性させることなく電子染色することができる。したがって、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、生きている生物細胞に適用することができる。
【００５８】
また、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、水酸化ランタンの沈殿が生じないため、試料のコンタミネーションを抑制することができる。
【００５９】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤では、固定液を含むため、生物細胞や生物組織を固定しつつ、染色することができる。
【００６０】
２．  電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法
次に、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法について説明する。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法は、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液を加えることを含む。以下では、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法の一例を説明する。
【００６１】
まず、本実施形態に係るストックソリューションを作製する。具体的には、まず、水酸化ランタンに酸性溶液（例えば塩酸）を加えて溶かす。次に、最終濃度が所望の濃度（例えば１０ｗｔ％）になるように蒸留水を加える。また、例えば、ストックソリューションのｐＨは、２．０程度にする。以上の工程により、本実施形態に係るストックソリューションを作製することができる。
【００６２】
次に、本実施形態に係るストックソリューションに緩衝液（バッファー）と、固定液と、を加える。例えば、本実施形態に係るストックソリューションに、例えば、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液を加える。Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液は、バッファー（カコジル酸ナトリウム）を含む。ここで、ストックソリューションに緩衝液（バッファー）を含む固定液を加えることで、ｐＨ７程度にすることができる。
【００６３】
以上の工程により、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を製造することができる。
【００６４】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、バッファー（緩衝液）を加える。これにより、簡便に電子染色を行うことができる。具体的には、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かした溶液はストックソリューションとして、保存が可能であり、このストックソリューションにバッファーを加えることで、簡便に染色剤として使用が可能である。
【００６５】
さらに、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、水酸化ランタンの沈殿を抑制できるため、コンタミネーションを抑制することができる。また、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、正確な濃度で水酸化ランタン水溶液を作
製することができるため、再現性も向上できる。
【００６６】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法は、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし、緩衝液と、試料を固定するための固定液と、を加える。そのため、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法では、試料を固定しつつ、電子染色を行うことができる。
【００６７】
３．  電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法を含む。
【００６８】
本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、水酸化ランタンを酸性溶液に溶かし緩衝液を加えた溶液に試料を浸漬することを含む。以下では、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法の一例を説明する。ここでは、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法を、生体試料に適用した例について説明する。
【００６９】
まず、上述した本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤の製造方法により、染色剤を作製する。
【００７０】
次に、生体試料を上記の染色剤に浸漬させて電子染色しつつ、前固定を行う。以上の工程により、生体試料を染色することができる。
【００７１】
次に、前固定された生体試料を、例えばカコジル酸緩衝液で洗浄し、四酸化オスミウムで後固定する。次に、後固定された生体試料を上昇エタノール系列で脱水した後、エポキシ樹脂等に包埋する。
【００７２】
次に、エポキシ樹脂に包埋された生体試料を薄片化する。薄片化は、例えば、ミクロトーム（ウルトラミクロトーム）を用いて行われる。
【００７３】
以上の工程により、電子顕微鏡観察用試料を作製することができる。
【００７４】
４．  実施例
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
【００７５】
（１）ストックソリューションの製造
本実施例のストックソリューションは、水酸化ランタンを塩酸に溶かすことで作製した。
【００７６】
具体的には、まず、２ｇの水酸化ランタン（和光純薬工業株式会社製）に５Ｎ塩酸を２０ｍｌ加えて溶かす。そして、最終濃度が１０ｗｔ％となるように蒸留水を加える。このとき、図１に示すように、水酸化ランタンは溶け、溶液のｐＨは２となった。この１０ｗｔ％水酸化ランタン水溶液を、１０倍のストックソリューションとする。
【００７７】
（２）本実施例に係る染色剤の製造
次に、１０ｗｔ％水酸化ランタン水溶液（ストックソリューション）を、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液に対して、その全体量の１／１０となる量の１０ｗｔ％水酸化ランタン水溶液を加え、染色剤とする。
【００７８】
具体的には、５０ｍｌの０．２Ｍカコジル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）、１０ｍｌの２５％グルタールアルデヒド、１２．５ｍｌの１６％パラホルムアルデヒド、１０ｍｌの１０％水酸化ランタン水溶液（ｐＨ２．０）、および２７．５ｍｌの蒸留水を混ぜることで１００ｍｌの染色剤（２．５％グルタールアルデヒド、４％パラホルムアルデヒド、１％水酸化ランタン、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０））を作製した。
【００７９】
Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液には、バッファー（カコジル酸ナトリウム）が含まれるため、全体量の１／１０のｐＨ２の水溶液が加えられても、ｐＨはほぼ中性を保つ。また、調整された染色剤はｐＨ７だが水酸化ランタンの沈殿は生じない。
【００８０】
図２は、５０ｍｌの０．２Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）、１０ｍｌの１０％水酸化ランタン水溶液（ｐＨ２．２）、４０ｍｌの蒸留水を混ぜて作製した染色剤を示す写真である。このときの染色剤のｐＨは７．０であった。図２からわかるように、染色剤はｐＨ７．０であるにも関わらず、水酸化ランタンの沈殿は生じていない。
【００８１】
（３）試料作製
次に、本実施例に係る染色剤を用いて、ヒドラの電子染色を行った。ヒドラの電子染色は、本実施例に係る染色剤にヒドラを浸漬させることで行った。以下、本実施例に係る試料作製について説明する。
【００８２】
まず、ヒドラを、上記の染色剤に浸漬させることにより、糖タンパク質を染色しつつ、前固定を行う。
【００８３】
次に、前固定されたヒドラを、カコジル酸緩衝液で洗浄し、１〜２％四酸化オスミウムで後固定する。次に、後固定された生体試料を上昇エタノール系列で脱水した後、エポキシ樹脂等に包埋する。次に、エポキシ樹脂に包埋されたヒドラを、ミクロトームを用いて薄片化する。
【００８４】
以上の工程により、試料を作製した。
【００８５】
（４）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図３〜図５は、上記染色剤で電子染色したヒドラの透過電子顕微鏡像である。なお、図４および図５に示すスケールバーは、２００ｎｍである。
【００８６】
図３〜図５に示す透過電子顕微鏡像では、水酸化ランタンをトレーサーとして細胞間隙を可視化することができた。図３および図４では、ヒドラのセプテートジャンクションの梯子状の構造が白く浮かび上がって観察された。
【００８７】
また、このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料について、電子線トモグラフィーを行った。具体的には、作製された電子顕微鏡観察用試料を、傾斜軸中心に−６０°〜＋６０°傾斜させて透過電子顕微鏡で観察し、得られた透過電子顕微鏡像について画像処理を行った。
【００８８】
図６は、本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラを傾斜軸を中心に−６０°〜＋６０°傾斜したときの透過電子顕微鏡像である。図７は、本実施例に係る染色剤で電子染色したヒドラのボリュームレンダリング像である。図８は、図７のボリュームレンダリング像を着色した図である。図８では、細胞膜および梯子状構造を着色した。
【００８９】
図７および図８に示す結果から、ヒドラのセプテートジャンクションに特有の梯子状の構造は奥行を持った隔壁状の構造であることがわかった。このように、本実施例では、電子線トモグラフィーにおいて、良好な画像を得ることができた。すなわち、本実施例に係る染色剤は、高い染色効果を有し、電子線トモグラフィーにも用いることができることがわかった。
【００９０】
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【図１】
2015145854.tif 000003
【図２】
2015145854.tif 000004
【図３】
2015145854.tif 000005
【図４】
2015145854.tif 000006
【図５】
2015145854.tif 000007
【図６】
2015145854.tif 000008
【図７】
2015145854.tif 000009
【図８】
2015145854.tif 000010
【図９】
2015145854.tif 000011