(57)【要約】      （修正有）【課題】赤血球凝集剤としてポリブレン、検出試薬として金コロイドコンジュゲートを用いた場合に、全血中の赤血球を凝集させて分離除去しつつ、金コロイドの凝集を起こさないようなイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法の提供。【解決手段】特定の添加剤、（Ａ）２価金属の塩、（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩、（Ｃ）亜硫酸と金属の塩、（Ｄ）カルボン酸キレーター、（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸、に属する化合物からなる群より選ばれる１種または２種以上の化合物を用いることで、金コロイドの凝集を抑制した検出方法。【選択図】図１
2015072181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、以下の構成を有するテストストリップ。
（１）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、
展開部の一部には、金コロイドで標識された抗検出対象物抗体コンジュゲートが溶出可能に保持されたコンジュゲート保持部を有し、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、固定化抗体が固定化されている検出部を有する
（２）サンプル供給部から、展開部のコンジュゲート保持部の上流側まで、のすくなくとも一部に赤血球凝集剤であるポリブレンによる前記コンジュゲートの凝集を抑制するための添加剤が、サンプル供給部を通過して提供されるポリブレンと接触可能に含まれている
【請求項２】
ポリブレンが、サンプル供給部に含まれている請求項１に記載のテストストリップ。
【請求項３】
前記添加剤が、コンジュゲート保持部に含まれている請求項１または２に記載のテストストリップ。
【請求項４】
赤血球凝集剤としてのポリブレンのカチオンを中和するための、中和剤としてのポリアニオンを含まない請求項１〜３のいずれかに記載のテストストリップ。
【請求項５】
前記添加剤が、（Ａ）２価金属の塩、（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩、（Ｃ）亜硫酸と金属の塩、（Ｄ）カルボン酸キレーター、（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸、に属する化合物からなる群より選ばれる１種または２種以上の化合物である請求項１〜４のいずれかに記載のテストストリップ。
【請求項６】
イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、
（Ａ）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、
展開部の一部には、対象物に対する抗体が固定化された金コロイドを含むコンジュゲートが溶出可能に保持されたコンジュゲート保持部を有し、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に、固定化抗体が固定化されている検出部を有する、テストストリップ、
のサンプル供給部にサンプルを供給する工程
（Ｂ）サンプル供給部において、または、サンプル供給部の上流において、ポリブレンとサンプルを接触させて、サンプル中の血液由来成分を凝集させる工程
（Ｃ）（Ｂ）の工程により得られた、凝集物をサンプルより分離除去する工程
（Ｄ）（Ｃ）の工程により得られた、凝集物が分離除去されたサンプル成分、を金コロイドを含むコンジュゲートと接触させる工程であって、ポリブレンによる前記コンジュゲートの凝集を抑制する能力を有する添加剤の存在下に行う工程
（Ｅ）（Ｄ）の工程により得られた、サンプル成分中の対象物とコンジュゲートの複合体、を検出部において検出する工程
【請求項７】
ポリブレンがサンプル供給部に含まれている請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記添加剤が、コンジュゲート保持部に含まれている請求項６または７に記載の検出方法。
【請求項９】
赤血球凝集剤としてのポリブレンのカチオンを中和するための、中和剤としてのポリアニオンを含まない請求項６〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
サンプルが、ヘパリン採血検体またはＥＤＴＡ採血検体である請求項６〜９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
前記添加剤が、（Ａ）２価金属の塩、（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩、（Ｃ）亜硫酸と金属の塩、（Ｄ）カルボン酸キレーター、（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸、に属する化合物からなる群より選ばれる１種または２種以上の化合物である請求項６〜１０のいずれかに記載のテストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィーに関する。さらに詳しくは、ポリカチオンを有効成分とする赤血球凝集剤が測定系中に共存した場合であっても、当該赤血球凝集剤の存在に起因して検出試薬である金コロイドコンジュゲートが非特異的に凝集しないように特定の添加剤で処理されたテストスリップ、および当該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、診療所や小規模病院において、「患者を診察している間に検査結果を知りたい」、というニーズが増加し、従来の院外への外注検査から、Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＰＯＣＴ）への切り替えが行われている。ＰＯＣＴの普及に伴いラテラルフロー式のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを格納したデバイスが体外診断薬として使用されている。イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、検査の際に試薬の調製を必要とせず、血液や尿などの被験試料（以下、「サンプル」ということがある）を当該テストストリップ上に直接滴下するなどの簡単な操作のみで、サンプル中の対象物を検出することが可能なものであり、検出対象物を簡便かつ迅速に分析するのに非常に有用である。
【０００３】
イムノクロマトグラフィー用テストストリップ（以下、「テストストリップ」ということがある）は、一般に、サンプル供給部、展開部、検出部とを備えた多孔性のメンブレンであって、検出対象物に対する標識抗体などの検出試薬（以下、「コンジュゲート」ということがある）が、サンプルとの接触後に展開部を通過して検出部に到達できるよう、展開部の展開開始部位に溶出、展開可能に保持され、さらに固定化抗体が展開部の一部に固定化され検出部を構成する構造となっている。ここで、サンプルがサンプル供給部に滴下されると、サンプル中の検出対象物が標識抗体と特異的に結合して複合体を形成し、該複合体は、展開部を下流方向に向かって展開して行き、さらに固定化抗体に結合する。したがって、抗体固定化部分において、標識抗体、検出対象物及び固定化抗体によるサンドイッチ型複合体を検出することで、検出対象物を定性または定量分析することが可能である。コンジュゲートを構成する標識物の一例は金コロイド粒子であり、金コロイド粒子による呈色反応によって定性的な検出が可能となる。さらに、その呈色度合いに基づいて、サンプル中における検出対象物を定量的に検出することも可能である。
【０００４】
ところで、前記サンプルが全血の場合、全血中の赤血球が多孔性のメンブレン中を移動することができずに、メンブレンの孔を詰まらせ、サンプルの展開を妨害してしまうという問題がある。そこで、全血をサンプルとする場合には、全血から赤血球をあらかじめ分離除去する必要があり、そのような方法としては、測定に先立ち遠心分離によって赤血球を沈降させて取り除く方法や、測定に先立ちあるいは測定開始時に赤血球分離剤により赤血球を凝集させて濾過することにより除去する方法が知られている。
【０００５】
前記赤血球分離剤として、たとえば臭化ヘキサジメトリン（ポリブレンの商品名で流通している。以下、単にポリブレンということがある）が知られている（特許文献１，２，３）。
特許文献１には、合成の水溶性ポリマーからなる赤血球凝集剤の一例としてポリブレンが挙げられている。
特許文献２には、赤血球凝集化物質としてポリブレンを含むクロマトグラフィー用のガラス繊維製血球分離膜が記載されている。そして、ポリブレン単独では血液が血球分離膜を通過する際に溶血を伴うために、該溶血を避けるため前記血球分離膜をＰＶＡで被覆する技術が開示されている。
このように赤血球凝集剤としてポリブレンが一般的に知られているものの、ポリブレンを金属コンジュゲートを検出試薬として採用しているイムノクロマトグラフィーに使用した場合には、全血中の赤血球を凝集させるだけではなく、金属コンジュゲートをも凝集させてしまうという問題があった（特許文献３）。
特許文献３には、そのような金属コンジュゲートの凝集を防止するための技術が開示されている。すなわち、赤血球分離剤としてポリブレンなどのポリカチオンをクロマトグラフィー担体の上流に結合させ、その下流にポリカチオンを中和するためのポリアニオンを結合させたイムノクロマトグラフィーアッセイデバイスが開示されている。本技術によれば、ポリカチオンの正電荷がポリアニオンの負電荷により中和されるため、セレンからなる金属コンジュゲートの凝集を防止することができたというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−２０５５６３号公報
【特許文献２】特開平５−０９９９１８号公報
【特許文献３】特表２００２−５０９２５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、全血をサンプルとし、赤血球凝集剤としてポリブレン、検出試薬として金コロイドコンジュゲートを採用して、イムノクロマトグラフィーを実施する場合において、上記特許文献３の開示に従い、金コロイドコンジュゲートの凝集を防止すべくポリアニオン添加によりポリブレンの正電荷の中和を試みた。しかし、全血中の赤血球の凝集および分離除去は出来たが、金コロイドコンジュゲートの凝集を防止することはできなかった。この理由は定かではないが、特許文献３のセレンコンジュゲートと金コロイドコンジュゲートの違いや、ポリアニオンの種類などに起因するのかもしれない。
本発明は、ポリアニオンを有効成分とする赤血球凝集剤としてポリブレン、検出試薬として金コロイドコンジュゲートを用いた場合に、血液中の赤血球を凝集させて分離除去しつつ、金コロイドコンジュゲートの凝集を起こさない、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの提供、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィーの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するための方法を検討するにあたり、課題の原因物質たるポリカチオンの種類や量の選定ではなく、全く異なる観点から、これまでの試薬構成そのものを見直し、それぞれの構成要素について鋭意検討を加えた結果、おどろくべきことに、ポリブレンによる金コロイドコンジュゲートの凝集を抑制する能力を有する添加剤が存在することを見出し、該添加剤を用いることでポリアニオンによるポリカチオンの中和によることなく、金コロイドコンジュゲートの凝集を抑制することができることを見出し本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。
［１］  イムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、以下の構成を有するテストストリップ。
（１）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、
展開部の一部には、金コロイドで標識された抗検出対象物抗体コンジュゲートが溶出可能に保持されたコンジュゲート保持部を有し、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、固定化抗体が固定化されている検出部を有する
（２）サンプル供給部から、展開部のコンジュゲート保持部の上流側まで、のすくなくとも一部に赤血球凝集剤であるポリブレンによる前記コンジュゲートの凝集を抑制するための添加剤が、サンプル供給部を通過して提供されるポリブレンと接触可能に含まれている
［２］  ポリブレンが、サンプル供給部に含まれている［１］に記載のテストストリップ。
［３］  前記添加剤が、コンジュゲート保持部に含まれている［１］または［２］に記載のテストストリップ。
［４］  赤血球凝集剤としてのポリブレンのカチオンを中和するための、中和剤としてのポリアニオンを含まない［１］〜［３］のいずれかに記載のテストストリップ。
［５］  前記添加剤が、（Ａ）２価金属の塩、（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩、（Ｃ）亜硫酸と金属の塩、（Ｄ）カルボン酸キレーター、（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸、に属する化合物からなる群より選ばれる１種または２種以上の化合物である［１］〜［４］のいずれかに記載のテストストリップ。
［６］  イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法であって、
（Ａ）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、
展開部の一部には、対象物に対する抗体が固定化された金コロイドを含むコンジュゲートが溶出可能に保持されたコンジュゲート保持部を有し、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に、固定化抗体が固定化されている検出部を有する、テストストリップ、
のサンプル供給部にサンプルを供給する工程
（Ｂ）サンプル供給部において、または、サンプル供給部の上流において、ポリブレンとサンプルを接触させて、サンプル中の血液由来成分を凝集させる工程
（Ｃ）（Ｂ）の工程により得られた、凝集物をサンプルより分離除去する工程
（Ｄ）（Ｃ）の工程により得られた、凝集物が分離除去されたサンプル成分、を金コロイドを含むコンジュゲートと接触させる工程であって、ポリブレンによる前記コンジュゲートの凝集を抑制する能力を有する添加剤の存在下に行う工程
（Ｅ）（Ｄ）の工程により得られた、サンプル成分中の対象物とコンジュゲートの複合体、を検出部において検出する工程
［７］  ポリブレンがサンプル供給部に含まれている［６］に記載の検出方法。
［８］  前記添加剤が、コンジュゲート保持部に含まれている［６］または［７］に記載の検出方法。
［９］  赤血球凝集剤としてのポリブレンのカチオンを中和するための、中和剤としてのポリアニオンを含まない［６］〜［８］のいずれかに記載の検出方法。
「１０」  サンプルが、ヘパリン採血検体またはＥＤＴＡ採血検体である［６］〜［９］のいずれかに記載の検出方法。
［１１］  前記添加剤が、（Ａ）２価金属の塩、（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩、（Ｃ）亜硫酸と金属の塩、（Ｄ）カルボン酸キレーター、（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸、に属する化合物からなる群より選ばれる１種または２種以上の化合物である［６］〜［１０］のいずれかに記載のテストストリップ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ポリブレンを赤血球凝集剤とし、検出試薬として金コロイドコンジュゲートを使用したイムノクロマトグラフィーにおいて、ポリブレンによる金コロイドコンジュゲート凝集を抑制する能力を有する添加剤を使用することにより、金コロイドコンジュゲートを凝集させることなく、赤血球のみを凝集させてサンプル中から分離除去することができ、金コロイドコンジュゲートは本来の検出試薬としての役割を果たすことができるため、サンプル中の検出対象物を正確に検出および測定することが可能となった。そしてポリカチオン中和剤としてのポリアニオンの添加を必須条件としないことから試薬構成を極めてシンプルなものとすることができ、また、免疫反応やストリップ上の検出対象物の展開などに対して予測不能な作用をもたらす要因を低減することにもつながるというメリットを有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ポリブレン溶液と本発明の添加剤候補物質を添加したコンジュゲート液との混合液における極大吸収波長の測定結果（実施例１）
【図２】本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構造図である。
【図３】本発明の添加剤を使用したイムノクロマト法とＬＴＩＡ法との比較（実施例２）
【図４】本発明の添加剤処方と従来処方の検出感度の比較（実施例３）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（イムノクロマトグラフィー用テストストリップ）
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、少なくとも「サンプル供給部」、「展開部」、「検出部」とを備えた多孔性のメンブレンであって、検出対象物に対する標識抗体が、サンプルとの接触後に展開部を通過して検出部に到達できるよう、展開部の展開開始部位に溶出可能に保持され、さらに固定化抗体が展開部の一部に固定化され検出部を構成する構造を有している。
これらを具現化する一例として、サンプル供給部を担うサンプルパッド、検出対象物に対する標識抗体が溶出可能に保持され、展開部の一部を担うコンジュゲートパッド、固定化抗体が一部に固定化され、展開部および検出部を担う多孔性のメンブレン、を含むテストストリップが挙げられる。すなわち、本発明の典型的なイムノクロマトグラフィー用テストストリップは以下の構成を有する。
（１）サンプルが供給されるサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流に配置され、金コロイド表面に第一の抗体が感作されたコンジュゲートが溶出可能に保持されたコンジュゲートパッド
（３）コンジュゲートパッドの下流に配置され、コンジュゲートと検出対象物との複合体と結合する第二の抗体が固定化された多孔性のメンブレン
ここで、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、多孔性のメンブレンはそれぞれが別々の担体を構成する場合、あるいは２つが１つの担体を構成する場合もあり、上流から下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、多孔性のメンブレンの順序で構成されるものであればいずれの態様も含まれる。
イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、上記構成のほかに、吸収パッド、３ｒｄパッドのいずれか一以上をさらに配置装着されたものも含む。該テストストリップは、通常、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配列させる。該固相支持体を、サンプルの毛管流を妨げない物質で構成することはもとより、接着剤の成分をサンプルの毛管流を妨げない物質とすることは当然である。なお、抗体が固定化された多孔性のメンブレンの機械的強度を上げ、かつアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルムなどをテストストリップにラミネート加工することも可能である。
【００１２】
（赤血球凝集剤）
本発明に用いられる赤血球凝集剤としては、公知のポリカチオン性の赤血球凝集剤が使用できる。なかでもポリブレンが好ましい。ポリブレンは、その化学名を臭化ヘキサジメトリンといい、ＣＡＳ番号２８７２８−５５−４が付与されたカチオン性ポリマーの１種である。
本発明において、ポリブレンは、サンプルである全血中の赤血球を凝集させるために使用される。ポリブレンの使用態様としては、サンプルを希釈する希釈液にポリブレンを添加したり、サンプルに直接ポリブレンを添加する態様のほか、イムノクロマトストリップのサンプル供給部（サンプルパッド）にポリブレンを含ませておくことができる。このような使用態様により、ポリブレンは全血と接触し、全血中の赤血球が凝集される。赤血球凝集物は、何らかの濾過によりサンプルより除去されるが、イムノクロマトストリップにおいては、サンプル供給部を構成するフィルターをサンプルが通過する際にサンプル供給部上に大部分が残留することで除去される。本発明において、赤血球凝集物がサンプル供給部で除去され、展開部への供給をより確実に低減するためには、後述する３ｒｄ  ｐａｄ（血球分離膜）を併用することが望ましい。
ポリブレンの添加量は、全血サンプル中の検出対象物が所望の展開をできるよう、全血中の赤血球を凝集させて分離除去できる量であればよく、例えば、サンプルパッドに含ませておく場合には、サンプルが滴下された際のサンプルの液量に対して０．２５％以上の濃度となることが好ましく、０．２５〜２％がさらに好適である。サンプルパッドを製造する場合の観点からは、パッドに浸み込ませる溶液中の濃度として０．５％以上が好ましく、０．５〜４％がさらに好適である。
また、本発明においては、特許文献３のように、赤血球凝集剤としてのポリブレンのカチオンを中和するための、中和剤としてのポリアニオンは含まれないが、本発明の目的を逸脱せず、反応系に影響のない範囲において、必要に応じ通常使用されるポリアニオンの存在を排除するものではない。
【００１３】
（添加剤）
本発明において、全血サンプル中の赤血球を凝集する目的で赤血球凝集剤（ポリブレン）を使用するがポリブレンは、赤血球だけではなく、金コロイドコンジュゲートまで凝集してしまうという問題がある。本発明では、このような金コロイドコンジュゲートが凝集しないよう添加剤を用いる必要がある。
本発明に用いられる添加剤としては、ポリブレンによる金コロイドコンジュゲート凝集を抑制する能力を有するものであればいずれでもよい。
このような能力を有する添加剤は、たとえば、金コロイドコンジュゲートおよびポリブレンを含む溶液中に添加し、コンジュゲートの凝集抑制軽減効果を観測することにより、本発明の添加剤を選定することができる。この選定方法は、さらに具体的には、金コロイドコンジュゲートに選定対象の添加剤溶液を加えておき、これにポリブレン溶液を添加し、極大吸収波長を測定し、添加剤無しの場合よりも極大吸収波長が小さいものを選定するという方法である。
特に金コロイドコンジュゲートと赤血球という２種類のポリアニオンが共存する状態で、一方のみを選択的に凝集させ、もう一方の凝集を抑制しうるという事実は、おどろくべきものである。
【００１４】
上記のような選定方法により選択された添加剤としては、（Ａ）２価金属の塩、（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩、（Ｃ）亜硫酸と金属の塩、（Ｄ）カルボン酸キレーター、（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸、に属する化合物からなる群より選ばれる１種または２種以上の化合物を挙げることができる。
【００１５】
（Ａ）２価金属の塩
２価金属の塩は、さらに（Ａ１）２価金属と酸との塩、（Ａ２）２価金属とハロゲン元素との塩に分類することができる。ここで、２価の金属としてはマグネシウム、カルシウム、ニッケル、亜鉛などを例示することができ、酸としては、硫酸、硝酸などの無機酸、酢酸などの有機酸を例示することができ、ハロゲン元素としては、塩素、臭素などを例示することができる。これらのうち（Ａ１）の具体的な化合物としては、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウムが好適であり、（Ａ２）の具体的な化合物としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、塩化マンガン、塩化ニッケルが好適である。
（Ｂ）硫酸と金属又はオニウムとの塩
（Ｂ１）硫酸と金属の塩としては、硫酸と１価金属との塩または硫酸と２価金属との塩を挙げることができ、なかでも硫酸カリウム、硫酸マグネシウム（Ａ１と重複）が好適である。（Ｂ２）硫酸とオニウムとの塩としては、硫酸アンモニウムが好適である。
（Ｃ）亜硫酸と金属の塩
亜硫酸と金属の塩としては、亜硫酸ナトリウムが好適である。
（Ｄ）カルボン酸キレーターおよびその塩
カルボン酸キレーターは、さらに（Ｄ１）ジカルボン酸キレーター、（Ｄ２）トリカルボン酸キレーター、（Ｄ３）テトラカルボン酸キレーター、（Ｄ４）ペンタカルボン酸キレーターに分類することができる。（Ｄ１）ジカルボン酸キレーターとしては、しゅう酸、コハク酸、酒石酸が好適であり、（Ｄ２）トリカルボン酸キレーターとしては、くえん酸が好適であり、（Ｄ３）テトラカルボン酸キレーターとしては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が好適であり、（Ｄ４）ペンタカルボン酸キレーターとしては、ジエチルトリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が好適である。これらのキレーターは、遊離酸あるいは金属塩として使用することができる。金属塩として使用する場合の具体例としては、くえん酸３ナトリウム、ＥＤＴＡ・２ナトリウムなどを挙げることができる。また前記した以外にも、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）など、前記化合物の構造の一部を修飾・改変したものでも差し支えない。
（Ｅ）ポリ塩基性アミノ酸
ポリ塩基性アミノ酸としては、ポリ−Ｌ−アルギニンを挙げることができ、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩として使用するのが好適である。ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩は、特許文献３において、ポリブレンと同様、正電荷を有する赤血球分離剤に区分されている化合物であり、ポリブレンと組み合わせた場合に、ポリブレンによる金コロイドコンジュゲートの凝集効果を増強するのではなく、低下させることは全く意外なことである。
【００１６】
この添加剤の添加量は、ポリブレンによる金コロイドコンジュゲートの凝集を抑えることのできる量であればよく、例えばサンプルパッドおよび／またはコンジュゲートパッドに浸み込ませる溶液中の濃度としては１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられ、２〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが好適な場合もある。添加剤の種類、および添加量・濃度は、目的とする対象物質、必要な感度等に応じて適宜設定することができる。
【００１７】
本発明の特定添加剤の使用態様としては、赤血球凝集剤であるポリブレンによる金コロイドコンジュゲートの凝集を抑制できる態様であればいずれでもよく、イムノクロマトグラフィー用のテストストリップにおいてサンプル供給部から、展開部であってコンジュゲート固定化部位まで、の少なくとも一部にポリブレン成分と接触可能に含浸されていればよい。したがって、サンプル供給部のみでもよく、またサンプル供給部から展開部までの全ての部位であってもよい。
添加剤をサンプル供給および／またはコンジュゲートパッドに含ませた態様には、液状の添加剤がパッドに含まれている態様のほかに、添加剤をパッドに含浸させた後、乾燥させて添加剤が乾燥状態でパッドに付着している態様も含まれる。
また、本発明の特定の添加剤はサンプル希釈液に添加して使用することもできる。
本発明において、上述のとおり、添加剤を特定の使用態様で使用することが必要であるが、その他の目的で上記以外の他の添加剤または上記以外の他の使用態様にて使用することを妨げるものではない。例えば、サンプル供給部から展開部のコンジュゲート固定化部位まで本発明の特定添加剤を含浸させ、展開部の抗体固定化部位は上記以外の添加剤を含浸させる態様とすることも本発明の範囲内に含まれることは言うまでもない。
【００１８】
（金コロイド）
本発明に用いる標識体としての金コロイドは、抗体を感作（固定化）させてコンジュゲートを構成することができ、サンプルと接触させてサンプル中の対象物（抗原）を検出する方法において標識体としての役割を担うことができるような金コロイドであればいずれでもよい。
金コロイドとしては、金コロイドのほかに白金コロイドも本発明の金コロイドに含まれるものとする。
金コロイド粒子の粒径は、検出感度に大きく影響することが知られているが、たとえば、イムノクロマトグラフィー用テストストリップに保持させて使用する場合、金コロイド粒子の粒径としては、２０〜６０ｎｍが好ましく、より好ましくは３０〜５０ｎｍであり、特に４０ｎｍが好ましい。上記の金コロイドは一般に知られている方法、例えば、加熱したテトラクロロ金（III）酸水溶液にクエン酸三ナトリウム水溶液やクエン酸三アンモニウム水溶液を滴下攪拌することによって製造することができる。本明細書では金コロイドを金コロイド粒子と呼ぶこともあるが、同義である。
【００１９】
（金コロイドへの抗体の感作）
検出対象物に対する抗体の金コロイドへの固定化は、通常、物理吸着によって行う。この際、抗体濃度は１〜５μｇ／ｍＬ緩衝液の濃度に調製されるのが好ましい。緩衝液の種類とｐＨは、２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５〜８）または２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）が好ましく、さらに好ましくは２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜７．５）であるが、他の緩衝液の使用も含め、これに限定されるものではない。本明細書では、上記のような金コロイドに検出対象物に対する抗体、コントロール用抗体（あるいは抗原）が固定化されたものを「コンジュゲート」という。
【００２０】
（ブロッキング）
本発明のコンジュゲートは、金コロイド表面において抗体が結合していない領域をブロッキング剤によりブロッキングすることもできる。
金コロイドコンジュゲートのブロッキング剤としては、生物由来成分が一般に用いられ、生物由来成分としては、生物に由来する成分であってブロッキング作用を有する成分であればいずれでもよく、たとえば動物性タンパクおよび動物性タンパク由来のペプチドが挙げられる。具体的には、牛血清アルブミンであるＢＳＡ、微生物由来であるＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴＯＹＯＢＯ製）、絹タンパク質由来（セリシンの加水分解物）であるＮＥＯ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＡＶＥＲ（ＴＯＹＯＢＯ製）、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ製）、Ｓｔａｂｉｌ  ＣｏａｔTM（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社製）、Ｃａｓｅｉｎが挙げられる。
生物由来成分の濃度としては、使用する成分により適宜決定すれば良い。例えば、１ＯＤ／ｍＬに調整した金コロイド溶液に抗体液を加えて混合した後、該混合液に前記の生物由来成分を、終濃度が０．１〜１０％の範囲で添加することによりブロッキングするものであり、より好ましくは０．２〜５％の範囲で使用する。
このほかに、非生物由来成分と生物由来成分の両者を混合したものを金コロイドのブロッキング剤として用いることもできる。
【００２１】
（検出試薬）
本発明において、「検出試薬」とは具体的には少なくともコンジュゲートを含有する溶液である。
検出試薬は、コンジュゲートを安定な状態に保ち、サンプルと混合されたときにコンジュゲートに固定化された抗体が検出対象物と特異的に反応するのを促進する、あるいはコンジュゲートを迅速かつ効果的に溶解、流動化する目的で、例えば１種類以上の安定化剤、溶解補助剤等を含み得る。該安定化剤、溶解補助剤等としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スクロース、カゼイン、アミノ酸類などをあげることができる。
また、検出試薬は、検出感度の向上を目的とし必要に応じて、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等の公知の増感剤を含み得る。
更に検出試薬は、必要に応じてＣａ2+イオンのキレート剤であるＥＤＴＡやＥＧＴＡなども含み得る。
なお、本明細書において、「検出」又は「測定」という用語は、検出対象の存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００２２】
（希釈液）
本発明において、サンプル中の検出対象物の濃度に応じて、サンプルの希釈が必要な場合は、希釈液を用いることがある。希釈液は、抗原抗体反応を著しく阻害したり、または反対に著しく反応を促進して標識体が過凝集するために毛細管現象における展開不良を起こしたり、抗原濃度に応じた抗原抗体反応のシグナル検出が不可能にさえならなければ、いずれの組成の希釈液を用いても良い。
このような作用を有する希釈液としては、例えば、精製水、生理食塩水、ｐＨ６．０〜１０．０の低濃度の緩衝液、例えば１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液や１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液が挙げられる。また、サンプルのストリップでの展開速度を制御する目的で、これらの希釈液に界面活性剤を添加することも可能である。
本発明の希釈液には、前述のとおり、赤血球凝集剤としてのポリブレンを含ませておくことができる。
また、本発明の希釈液には、前述のとおり、ポリブレンの金コロイドコンジュゲートに対する凝集抑制能力を有する添加剤を含ませておくこともできる。
【００２３】
（サンプルパッド）
本発明において、「サンプルパッド」とは、サンプルを受け入れるサンプル供給部を担う部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物の成分とが通り抜けることができる物質及び形態であればいずれのものをも含む。
本発明のサンプルパッドには、前述のとおり、赤血球凝集剤を含ませておくことができる。その場合、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませておくこともできる。
また、本発明のサンプルパッドには、前述のとおり、特定の添加剤を含ませておくこともできる。その場合、サンプルパッドの少なくとも一部に含まれていればよく、全部に含ませることもできる。ここで、本発明のサンプルパッドに赤血球凝集剤および特定の添加剤の両方を含ませておく場合には、両者をサンプルパッドの同じ部位に含ませておくこともできるし、共存しないようにそれぞれ異なる部位に含ませておくこともできる。また、サンプルパッドの全体に両者を含ませておくこともできる。
サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、本発明の目的を逸脱せず、反応系に影響のない範囲において、必要に応じ通常使用されるブロッキング試薬を含ませることもできる。
【００２４】
（コンジュゲートパッド）
本発明において、「コンジュゲートパッド」とは、検出対象物と特異的に反応する検出試薬を後述のコンジュゲートパッドに適した材料に含浸させて乾燥させたものである。コンジュゲートパッドは、サンプルが該コンジュゲートパッドを通過する際、検出試薬と検出対象物とが複合体を形成する機能を有する。該コンジュゲートパッドは、それ単独で抗体固定化メンブレンに接するように配置されていてもよい。あるいは、前記サンプルパッドと接触して配置され、毛細管流によってサンプルパッドを通過したサンプルを受入れ、引き続き該サンプルを毛細管流によって前記サンプルパッドとの接触面とは異なる面で接触する別のパッド（以下、「３ｒｄ Ｐａｄ」ということがある）に移送するように配置してもよい。なお、サンプルパッド、コンジュゲートパッドの一種以上の部位の選択や、選択された部位を抗体固定化メンブレンにどのように配置するかは、適宜に変更可能である。
また、本発明のコンジュゲートパッドには、前述のとおり、特定の添加剤を含ませておくこともできる。その場合、コンジュゲートパッドの少なくともコンジュゲートが固定化されている部位の上流を含む一部に含まれていればよく、全部に含ませることもできる。
該コンジュゲートパッドに適した材料として、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維またはレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。
該コンジュゲートパッドには、必要に応じて、イムノクロマトグラフィーの信頼性を担保するための「コントロール試薬」、例えば、標識体で標識されたサンプル成分とは反応しない抗体や標識体で標識されたＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）などの高抗原性タンパク質などを含み得る。これらのコントロール試薬は、サンプル中に存在する可能性が考えられない成分（物質）であり、適宜に選択可能である。
【００２５】
（３ｒｄ Ｐａｄ）
本発明において、３ｒｄ Ｐａｄとは、サンプルと検出試薬との反応成分のうち、検出対象物の検出に不要な成分を除去し、反応に必要な成分が、抗体が固定化された不溶性メンブレンをスムーズに展開できるようにすることを目的として配置させることができる。例えば、血球や不溶性の血球破砕物などは、検出に不要な成分として除去されることが望ましい。また、この３ｒｄ  Ｐａｄには、抗原抗体反応により生成する凝集体のうち、抗体固定化メンブレンに移動し、スムーズに展開できない位に大きくなった凝集体をあらかじめ除去するという付加的な効果を併せ持たせることも可能である。３ｒｄ Ｐａｄとしては、液体と検出対象の成分とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。
本発明において、前述の赤血球凝集剤とサンプルパッドのみでは除去しきれなかった血球をより確実に分離除去するため、血球分離膜を用いることが望ましい。
【００２６】
（抗体の不溶性メンブレンへの固定化）
本発明のイムノクロマト試薬における検出対象物に対する抗体の不溶性メンブレンへの固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、フロースルー式の場合、上記の抗体を所定の濃度に調製し、その液を一定量、点あるいは＋など特定のシンボル状に、不溶性メンブレンに塗布する。またこの際、イムノクロマトグラフィーの信頼性を担保するため、コンジュゲートと結合できるタンパク質あるいは化合物を、検出対象物に対する抗体とは異なる位置に固定化して「コントロールライン」とすることが一般的である。また、前記のコントロール試薬に対する抗体を検出対象物に対する抗体とは異なる位置に固定化して「コントロールライン」とすることもできる。
【００２７】
ラテラルフロー式の場合には、上記の抗体を所定の濃度に調製しその液をノズルから一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状に不溶性メンブレンに塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は０．１〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５〜３ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体の不溶性メンブレンの固定化量は、フロースルー式の場合には不溶性メンブレンに滴下する塗付量を調節することによって最適化でき、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化できる。特に、ラテラルフロー式の場合、０．５〜２μＬ／ｃｍが好適である。なお、本発明において、「フロースルー式メンブレンアッセイ」という場合は、サンプル液等が不溶性メンブレンに対して垂直に通過するように展開する方式を指し、「ラテラルフロー式メンブレンアッセイ」という場合は、サンプル液等が不溶性メンブレンに対して並行方向に移動するように展開する方式を指す。
【００２８】
また、本発明において、対象物に対する抗体の不溶性メンブレンへの塗付位置については、ラテラルフロー式の場合、コンジュゲートパッドから、上記検出試薬が毛細管現象によって展開し、それぞれの抗体が塗付されたラインを順に通過するように配置されれば良い。好ましくは検出対象物に対する抗体の塗付されたラインが上流にあり、コントロール抗体の塗付されたラインはその下流に位置するように配置するのが好ましい。この際、それぞれのライン間の距離は標識体のシグナル検出が可能であるように十分の距離をとることが望ましい。フロースルー式の場合にも、対象物に対する抗体の塗付位置は標識体のシグナル検出が可能であるように配置されていれば良い。
【００２９】
上記の不溶性メンブレンへ塗付する抗体液は、通常所定の緩衝液を用いて調製することができる。その緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液を挙げることができる。緩衝液のｐＨは、６．０〜９．５の範囲が好ましく、使用する抗体の性質に応じ適宜設定すれば良い。例えば、後述の抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体ではｐＨ７．２の緩衝液が使用できる。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で添加するようになるものも含まれる。不溶性メンブレンに抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体固定化部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。本明細書では、上記のように抗体が固定化された不溶性メンブレンを「抗体固定化メンブレン」ということがある。
【００３０】
（不溶性メンブレン）
本発明において、不溶性メンブレン（以下、単にメンブレンと記載することがある）としては、任意の材質のものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類あるいはセラミックス等が挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、メルク社、東洋濾紙社、ワットマン社などより販売されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などをあげることができる。また、この不溶性メンブレンの孔径と構造を適宜選択することにより、金コロイド標識抗体と対象物との免疫複合体がメンブレン中を流れる速度を制御することが可能である。メンブレン中を流れる速度の制御により、メンブレンに固定化された上記抗体に結合する標識抗体量を調節することができるため、メンブレンの孔径と構造は、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップのほかの構成材料との組み合わせを考慮して最適化することが望ましい。
【００３１】
（吸収パッド）
本発明において、吸収パッドとは、不溶性メンブレンを移動・通過したサンプルを吸収することにより、サンプルの展開を制御する液体吸収性を有する部位である。ラテラルフロー式においては、ストリップ構成の最下流に設ければよく、フロースルー式においては、例えば抗体固定化メンブレンの下部に設ければよい。該吸収パッドとしては、例えば、ろ紙を用いることができるが、これに限定されない。好適には、Ｗｈａｔｍａｎ社の７４０−Ｅ等が用いられる。
【００３２】
（検出デバイス）
本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、ストリップの大きさや、サンプルの添加方法・位置、抗体固定化メンブレンにおける抗体の固定化位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
【００３３】
（その他）
本明細書において、「不溶性メンブレン」を「固相」、抗原や抗体を不溶性メンブレンに物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。
【００３４】
（サンプル）
本発明の検出方法において検出対象物を含む「サンプル」とは、陰性荷電を表面に多数有する粒子状の成分が含まれる液体であり、生物サンプルとしては赤血球が含まれるものを挙げることができ、特に全血、遠心分離等により分離された赤血球、血漿等が挙げられる。
また、血液検体には、採血時にＥＤＴＡやヘパリンなどの抗凝固剤を添加した採血管により採血した血漿検体（以下単にＥＤＴＡ検体、ヘパリン検体などということがある）も含まれる。
本発明によれば  イムノクロマト法においてＥＤＴＡ検体の測定値がヘパリンよりも低値化するという問題も解消され検体の種類を問わずに正確な測定ができるという効果も奏する。また、さらに、本発明の添加剤により、検出感度も上昇するという効果も得られた。したがって、添加剤の濃度や種類を所望のものに選定することでイムノクロマトデバイスの検出感度をコントロールすることも可能である。
【００３５】
（検出対象物）
本発明の検出対象物としては、血液（全血）、赤血球、血清、血漿、尿、唾液又は喀痰などの生物サンプル中に存在する物質で、例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク）、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの炎症関係マーカー、フィブリン分解産物（例えばＤダイマー）、可溶性フィブリン、ＴＡＴ（トロンビン−アンチトロンビン複合体）、ＰＩＣ（プラスミン−プラスミンインヒビター複合体）などの凝固・線溶マーカー、酸化ＬＤＬ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、Ｈ−ＦＡＢＰ（心臓型脂肪酸結合タンパク）などの循環関連マーカー、アディポネクチンなどの代謝関連マーカー、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）などの腫瘍マーカー、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、クラミジアトラコマティス、淋菌などの感染症関連マーカー、アレルゲン特異ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、ホルモン、薬物などが例示される。これらの中でも、サンプルとして全血を使用したいとする要望が高い、Ｄダイマー、ＣＲＰ、ＢＮＰ、Ｈ−ＦＡＢＰなどがより好ましい。
【００３６】
（本発明で用いられる抗体）
本発明に用いられる検出対象物に対する抗体は、検出対象物に対して特異的に反応する抗体であれば、作製する方法によって何ら限定されるものではなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。一般的に当該抗体を産生するハイブリドーマは、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照）に準じ、検出対象物を免疫原として免疫した動物の脾臓細胞と同種のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを細胞融合して作製することができる。
ここで、いわゆるサンドイッチの形成により検出対象物を検出する測定法において用いられる抗体がモノクローナル抗体の場合、標識体固定化用抗体（第一の抗体）と不溶性メンブレン固定化用抗体（第二の抗体）の関係は、第一の抗体のエピトープが一価の場合は第二の抗体のエピトープは第一の抗体と異なるものが用いられ、第一の抗体のエピトープが多価の場合は第二の抗体のエピトープは第一の抗体と同じであってもよいし、異なるものであってもよい。
後述する実施例１では抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体を使用している。本発明で使用した抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体の調製方法は次項に示すとおりであるが、本発明はこれに限らず、市販の抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体を用いてもよい。市販の抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体の例としては、Ｈｙｔｅｓｔ社のｃｌｏｎｅ＃５Ｂ５、＃１０Ｅ１等や、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社のｃｌｏｎｅ＃Ｍ７９１８８、＃７９１８９などが挙げられる（尚、モノクローナル抗体は便宜上それぞれを産生するハイブリドーマのクローン名で表すことがある。以下同じ）。
【００３７】
（抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体の調製例）
（１）ハイブリドーマの調製
ＰＢＳに溶解したヒト精製Ｈ−ＦＡＢＰ（Ｈｙｔｅｓｔ社製）を免疫原とした。この免疫原を完全フロイントアジュバンド（和光純薬工業社製）と１対１の液量で混和乳化してＨ−ＦＡＢＰ濃度０．５ｍｇ／ｍＬのエマルションを調製し、これを６週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に１００μＬ投与した。その後２ケ月半の間にＨ−ＦＡＢＰ濃度０．２ｍg／ｍＬのエマルション１００μＬを３回追加投与し、３回目の追加投与から１０日後にＰＢＳで溶解した０．２ｍｇ／ｍＬのヒト精製Ｈ−ＦＡＢＰ１００μＬを皮下に投与した。その３日後に脾臓、鼠頸部リンパ節および腸骨リンパ節を摘出し、得られた脾臓およびリンパ節細胞と骨髄腫細胞ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４とを６対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０（和光純薬工業社製）存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として２．５×１０6／ｍＬになるようにＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて培養し、およそ１週間後に、ハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡ法を用いてＨ−ＦＡＢＰに反応する抗体を産生する株を選択した。具体的には、まずマイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）にヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）を介し、各培養上清中のＩｇＧを固相化した後、Ｈ−ＦＡＢＰを反応させた。続いて、ビオチン標識抗Ｈ−ＦＡＢＰウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ社製）を反応させ、さらにペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を反応性させた。その後、オルトフェニレンジアミン（東京化成社製）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発色させ、１．５Ｎ硫酸を加え発色を停止した後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定し、Ｈ−ＦＡＢＰに対して高い反応性を示すハイブリドーマを選択した。選択されたハイブリドーマについて限界希釈法によるクローン化を行い、抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０種類を確立した。
【００３８】
（２）モノクローナル抗体の調製
２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、上記（１）で得られたハイブリドーマを細胞数０．２×１０5個の量で腹腔内に投与した。約１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ−１．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．５）と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社製）に通して濾液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でカラムより抗体を溶出させ、抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ＃８７２０３、及びＣｌｏｎｅ＃８７２１２）を精製した。
【００３９】
（測定）
金コロイドに由来するシグナルを定量する方法としては、公知の方法に従って行えばよく、吸光度あるいは反射光強度を測定すればよい。この吸光度もしくは反射光強度の変化量を既知濃度のサンプルの検量線に外挿して、対象物の濃度を測定することもできる。
【００４０】
（イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法）
本発明のイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法は、少なくとも以下の（Ａ）〜（Ｅ）の工程を有する方法であるが、典型的には、上述のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを使用した検出方法である。
（Ａ）少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、
展開部の一部には、金コロイドで標識された検出対象物に対する抗体（コンジュゲート）が溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に、固定化抗体が固定化されている検出部を有する、テストストリップ、のサンプル供給部にサンプルを供給する工程
（Ｂ）サンプル供給部において、または、サンプル供給部の上流において、ポリブレンとサンプルを接触させて、サンプル中の血液由来成分を凝集させる工程
（Ｃ）（Ｂ）の工程により得られた、凝集物をサンプルより分離除去する工程
（Ｄ）（Ｃ）の工程により得られた、凝集物が分離除去されたサンプル成分、を金コロイドを含むコンジュゲートと接触させる工程であって、ポリブレンによる前記コンジュゲートの凝集を抑制する能力を有する添加剤の存在下に行う工程
（Ｅ）（Ｄ）の工程により得られた、サンプル成分中の対象物とコンジュゲートの複合体、を検出部において検出する工程
【実施例】
【００４１】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕本発明の添加剤の選定方法
ポリブレン溶液と、本発明の添加剤候補物質を添加したコンジュゲート液との混合液における吸収波長の測定を行い、本発明の添加剤の選定を行った。
１．各種溶液、コンジュゲートの調製
１）金コロイド標識抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲート）の調製
（i）金コロイド溶液の調製
７３℃に加温した５００ｍＬの精製水に対し、５％（ｗ／ｖ）クエン酸三アンモニウム水溶液を１ｍＬ添加して攪拌混合した。続いて、５％（ｗ／ｖ）テトラクロロ金（III）水溶液を１ｍＬ添加し、攪拌しながら１０分間反応させた後、反応液を沸騰させた。この後、氷水中で冷却し、平均粒子径が４０ｎｍの金コロイドの溶液を調製した。この平均粒子径が４０ｎｍの金コロイドの溶液を、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて、金コロイドの極大吸収波長での吸光度で１ＯＤ／ｍＬに調整した。
（ii）抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲートの調製
上記１ＯＤ／ｍＬの金コロイド溶液（ｐＨ７．０）２０ｍＬに対し、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で４６．２μＬ／ｍＬに希釈した抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ＃８７２１２のＦ（ａｂ‘）2断片）を１ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。当該金コロイドと抗体との混合液に対し、０．１％（ｗ／ｖ）ブロッキング剤（ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ：東洋紡バイオケミカル社、Ｎｏ．ＮＰＳ−３０１）を含む２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍＬ添加し、室温で５分間攪拌した。その後、１０℃にて、１１９００×ｇで４５分間遠心した。上清を除去した後、得られた沈渣に、コンジュゲート希釈液（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ：ＳＣＲＩＰＰＳ社、Ｎｏ．Ｂ０２２１）を１ｍＬ添加してコンジュゲートを懸濁し、抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲートを得た。
(iii) 添加剤水溶液の調製
表１に記載の各添加剤を水に溶解させた。各々の水への溶解性に従って１ｍｏｌ／Ｌもしくは０．５ｍｏｌ／Ｌに調整した。
(iv)試験用懸濁液の調製
上記で調製した添加剤水溶液を（ii）で調製した抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲートに加えて、添加剤が種々濃度になるように調整し、この懸濁液を試験用懸濁液とした。尚、各試験用懸濁液中での添加剤の濃度の組み合わせを表１に示す。
(v)ポリブレンの水溶液
ポリブレン（シグマ−アルドリッチ）を水に溶かし０．５％の濃度の水溶液に調製した。      
【００４２】
【表１】
2015072181.tif 000003
【００４３】
２．試験方法
試験用懸濁液にポリブレン水溶液を加えた際の吸収波長の測定を行った。
上記で調製した試験用懸濁液に等量の０.５％ポリブレン水溶液を加えた。次に、ポリブレン水溶液を加えた直後から１.５分後に分光光度計で４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲で吸収波長を測定し、測定された吸収波長のスペクトルから極大吸収波長を算出した。得られた極大吸収波長が、添加剤無添加の場合（すなわち、金コロイドコンジュゲートの凝集あり）の極大吸収波長よりも小さければ、各添加剤により、ポリブレン存在下における凝集反応の軽減効果があると判定することができる。さらに、ポリブレン無しの場合（すなわち、金コロイドコンジュゲートの凝集なし）の極大吸収波長に近づけばより好ましい添加剤であると判定することができる。
【００４４】
３．試験結果
各々の極大吸収波長を図１に示す。図１に記載の添加剤の濃度は表１に示す試験用懸濁液中の濃度である。以下、この濃度で各サンプルを識別、評価する。
ポリブレン存在下で添加剤無しのサンプルの極大吸収波長は５５２ｎｍであった。これに対し、ポリブレン存在下で実施例の添加剤を加えた各サンプルは、すべての場合において、添加剤無しのサンプルよりも極大吸収波長が低波長側にあり、ポリブレンが存在しないサンプルの極大吸収波長付近の波長であった。
一方、比較例の化合物では、極大吸収波長がポリブレン存在下で添加剤無しのサンプルの極大吸収波長より低波長であるものもあったが、その程度はわずかであり、極大吸収波長がポリブレン存在下で添加剤無しのサンプルの極大吸収波長より長波長であるものも存在した。
【００４５】
〔実施例２〕本発明の添加剤を使用したイムノクロマト法とＬＴＩＡ法との比較
１．本発明のイムノクロマトデバイスの作製
１）金コロイド標識抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲート）の調製
（i）金コロイド溶液の調製
上記実施例１の（i）と同様に調製したものを使用した。
（ii）抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲートの調製
上記実施例１の（ii）と同様に調製したものを使用した。
（iii）コントロールライン用金コロイド標識ＫＬＨ（ＫＬＨコンジュゲート）の調製
上記１ＯＤ／ｍＬの金コロイド溶液（ｐＨ６．１）２０ｍＬに対し、２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．１）で６２０μg／ｍＬとなるよう溶解したＫＬＨ（シグマ社製）を１ｍＬ添加し、室温で１０分間撹拌した。当該金コロイドとＫＬＨとの混合液に対し、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を１ｍＬ添加し、室温で５分間攪拌した。その後、１０℃にて、１１９００×ｇで４５分間遠心した。上清を除去した後、得られた沈渣に、上記コンジュゲート希釈液を１ｍＬ添加してコンジュゲートを懸濁し、ＫＬＨコンジュゲートを得た。
【００４６】
２）コンジュゲートパッドの作製
上記１）で調製した抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲートに添加剤として、硫酸マグネシウム（３０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、酢酸マグネシウム（３０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、硫酸アンモニウム（３０ｍｍｏｌ／Ｌ）になるように溶解させた（Ａ）。なお、各添加剤の濃度は終濃度である。
これら添加剤を含む抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体コンジュゲートを３ＯＤ／ｍＬ、ＫＬＨコンジュゲートを０．７５ＯＤ／ｍＬとなるように、それぞれ２．５％ＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ、２．４％ラクトースを含むＴｒｉｓ−塩酸緩衝液と混合してコンジュゲート溶液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド（日本ポール社、Ｎｏ．８９６４）に該パッド体積の１．２倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で７０℃、４５分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。また、必要に応じ、増感剤などの添加剤を添加する場合には、前記コンジュゲート溶液に必要量を添加した後、同様の操作を行えばよい。
また、上記（Ａ）試験とは別途、添加剤として硫酸マグネシウムを１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように変更した以外は上記と同様の方法を用いてコンジュゲートパッド作製した。また、添加剤無しのコンジュゲートパッド（従来処方）も作製した（Ｂ）。
【００４７】
３）抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体固定化メンブレン（抗体固定化メンブレン）の作製
抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ＃８７２０３）を３ｍｇ／ｍＬとなるように、２．５％スクロースを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈調製し、また、コントロールラインの発色を目的として、ウサギ抗ＫＬＨポリクローナル抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬとなるように、２．５％スクロースを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて希釈調製し、ニトロセルロースメンブレン（メルク社、ＨＦ１８０、２６０ｍｍｘ２５ｍｍ）の短辺の一端の内側の位置に上記抗Ｈ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体、そこの位置から約５ｍｍの間隔をあけて抗ＫＬＨポリクローナル抗体をイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯ  ＤＯＴ社）を用いて１μＬ／ｃｍとなるよう設定し、ライン状に塗布した。ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００４８】
４）サンプルパッドの作製
グラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）を適宜必要な大きさにカットして１％ポリブレンを含むコンジュゲートパッドと同一の緩衝液（又は精製水）を該パッド体積の１．１５倍容量浸み込ませ、ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥したものをサンプルパッドとして用いた。
【００４９】
５）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート（ａ）に上記抗体固定化メンブレン（ｂ）を貼り、展開上流部側に抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体（ｃ）、次いで抗ＫＬＨ抗体（ｄ）の順に塗布部を配置し、さらに血球分離膜（３ｒｄ Ｐａｄ）（ｅ）を装着した。次いで、上記２）で作製したコンジュゲートパッド（ｆ）を配置装着し、さらにこのコンジュゲートパッドに重なるように上記４）で作製したサンプルパッド（ｇ）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｈ）を配置装着した。このように各構成要素を重ね合わせた構造物に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。該テストストリップは、アッセイの際、プラスチック性の専用のハウジング（サンプル添加窓部及び検出窓部を有する、図２中図示せず）に格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイスの形態にした。図２にイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
【００５０】
６）イムノクロマト法による測定
検体１２０μＬを上記で作成したイムノクロマトテストデバイスのサンプルパッド窓部に添加し、１０分後にテストデバイスをイムノクロマトリーダーラピッドピア（浜松ホトニクス社）を用いての抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体塗布部（検出部）の反射光強度を測定した。反射強度から、Ｈ−ＦＡＢＰの濃度を算出した。
【００５１】
２．ＬＴＩＡ法による測定
ＬＴＩＡ法による測定はＬＴＩＡ法測定用試薬リブリア(登録商標) Ｈ−ＦＡＢＰ  (ＤＳファーマバイオメディカル  Ｌｏｔ．Ｓ１ＫＨ０６)を用いて自動分析装置、日立７１７０（日立製作所）で行った。尚、操作はリブリアR Ｈ−ＦＡＢＰの添付文書および日立７１７０の取扱説明書に従って行われた。前記自動分析装置によって定量された各検体のＨ−ＦＡＢＰ 濃度を得た。
【００５２】
３．検体
ヘパリン採血血漿を（Ａ）の試験には２４サンプル、（Ｂ）の試験には１７サンプル、またＥＤＴＡ採血血漿を（Ａ）の試験には２２サンプル、（Ｂ）の試験には２９サンプル用いた。
【００５３】
４.試験結果
検体ごとに、Ｙ軸にイムノクロマトで得られたＨ−ＦＡＢＰ濃度、Ｘ軸にＬＴＩＡ法で得られたＨ−ＦＡＢＰ濃度でプロットして、各添加剤による２つの測定法の相関性に与える影響を示した。結果を図３に示す。
従来法、即ち添加剤無添加の場合、ＥＤＴＡ採血検体がヘパリン採血検体に対して低値化するのに対し、添加剤を添加した際はいずれの場合もＥＤＴＡ含有検体がヘパリン含有検体の相関性は従来法のそれと比べて近い相関性を示した。
イムノクロマト法における従来処方、即ち添加剤無しの場合、ＥＤＴＡ採血検体がヘパリン採血検体に対して低値化するのに対し、本発明の添加剤を添加した処方はいずれの場合も、そのようＥＤＴＡ採血検体の低値化の問題は解消され、ＥＤＴＡ採血検体、ヘパリン採血検体ともにＬＴＩＡ法との相関は同様の相関性を示した。
【００５４】
〔実施例３〕本発明の添加剤処方と従来処方の検出感度の比較
１. イムノクロマトデバイスの作製
上記実施例２の１．の２）コンジュゲートパッドの作製方法の（Ａ）にある添加剤について、同様の方法で、硫酸マグネシウムを３０ｍｍｏｌ／Ｌもしくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ、酢酸マグネシウムを３０ｍｍｏｌ／Ｌもしくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸アンモニウムを３０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように、それぞれの添加剤を含むコンジュゲートパッド、及び添加剤無しのコンジュゲートパッド作製（従来処方）を作成した（Ａ）。
また、硫酸マグネシウムを１０ｍｍｏｌ／Ｌもしくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化マグネシウム５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように変更した以外は上記の方法と同様にして、それぞれの添加剤を含むコンジュゲートパッド、及び添加剤無しのコンジュゲートパッド（従来処方）作製を作成した（Ｂ）。
（Ａ）、（Ｂ）いずれの場合もコンジュゲートパッドの作製方法以外は実施例２と同様にしてイムノクロマトデバイスを作製した。ただし（Ｂ）の場合は、添加剤もポリブレンも含まないデバイスも作製した。
【００５５】
２．検体
ヘパリン採血血漿を（Ａ）の試験には２４サンプル、（Ｂ）の試験には１７サンプル（ただし硫酸マグネシウム５０ｍｍｏｌ／Ｌと塩化マグネシウム５０ｍｍｏｌ／Ｌは１０サンプルのみ）、またＥＤＴＡ採血血漿を（Ａ）の試験には２２サンプル、（Ｂ）の試験には２９サンプル用いた。
【００５６】
３．試験方法
実施例２と同様に検体１２０μＬを上記で作成したイムノクロマトテストデバイスのサンプルパッド窓部に添加し、１０分後にテストデバイスをイムノクロマトリーダーラピッドピア（浜松ホトニクス社）を用いての抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体塗布部（検出部）の反射光強度を測定した。各検体における添加剤無添加のデバイスの反射光強度も１００％とし、各添加剤を加えたデバイスの反射光強度との比を算出し、その比の平均値を求めた。
【００５７】
４．試験結果
結果を図５に示す。
いずれの添加剤を添加したデバイスでもＥＤＴＡ含有検体を測定した場合、添加剤無しのデバイスと比べて反射光強度が増幅した（（Ａ）：１２２.１％〜１２８.５％、（Ｂ）：１１８.６％〜１２６.９％）。また、ヘパリン含有検体でも硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸アンモニウムを添加したデバイスにおいて一定の反射光強度の増幅が確認された（（Ａ）：１０２.６％〜１１０.４％、（Ｂ）：硫酸マグネシウム１０ｍｍｏｌ／Ｌは１００.５％、硫酸マグネシウム５０ｍｍｏｌ／Ｌ は１０２.９％）。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明によれば、ポリブレンを赤血球凝集剤として、検出試薬として金コロイドコンジュゲートを使用したイムノクロマトグラフィーにおいて、特定の添加剤を使用することにより、金コロイドを凝集させることなく、かつ、赤血球を凝集させてサンプル中から分離除去することができるため、サンプル中の対象物を正確に検出および測定することが可能となった。また、ポリブレンの中和剤としてのポリアニオンの添加を必須としないため、試薬構成を極めてシンプルなものとすることが可能となった。
【符号の説明】
【００５９】
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）抗体固定化メンブレン
（ｃ）抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体
（ｄ）抗ＫＬＨ抗体
（ｅ）血球分離膜（３ｒｄ Ｐａｄ）
（ｆ）コンジュゲートパッド
（ｇ）サンプルパッド
（ｈ）吸収パッド
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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