(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、皮膚の健常状態の維持に必要な成分であるセラミドを合成するための酵素の機能亢進を行うための皮膚外用剤原料を提供する。【解決手段】  皮膚の表面に付与することによりセラミドの生合成の鍵酵素であるべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進機能を有する酵母抽出物であって、色素合成する酵母から抽出した色素を含む酵母抽出物を皮膚外用剤または化粧品の成分とする。色素を産生する酵母としては、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母が挙げられる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進活性成分を内在するＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種の酵母の抽出物を含むことを特徴とするベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤。
【請求項２】
前記酵母が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０であることを特徴とする請求項１に記載のベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤を含むことを特徴とする化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、べータ・グルコセレブロシダーゼの亢進効果を有する酵母抽出物を原料とする皮膚外用剤または化粧品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は、体表面側からみて、表皮と真皮により構成されている。真皮と接する表皮の細胞であって、基底細胞と呼ばれる表皮の細胞が有棘細胞、顆粒細胞と順次変化しつつ、皮膚表面側すなわち、体表面側に移動し、最終的には、角質細胞へと変化する。角質細胞で構成される角質部分は、セラミドなど脂質成分と角質細胞とが層状に重なり構成されている。
セラミドは、角質部分の角質細胞間の空間にあって、被膜機能により、体内からの水の損失を防ぐ機能を有し、肌の保湿維持に機能していることが知られている。（非特許文献１）
セラミド分子は、分子内に油分に親和性のある部分と水に親和性がある部分を保持しており、角質部分におけるセラミド分子は、油分に親和性のある部分を内側に配列した層状構造を形成する。その層構造の外側は水に親和するので、その層状構造間に水の層が形成され、油性の層と水の層の繰り返し構造が形成できる。その繰り返し構造内部に水分子を保持して保水機能を果たしていると言われている。故に、セラミドが十分機能している肌は、しっとりとした潤いのある、すべすべした肌であると言われている。
このようにセラミドは、肌の水分保持に重要な機能を果たしていると考えられているので、乾燥肌の治療または対処のために、セラミドを皮膚表面から外用することも考えられている。
しかし、セラミドは、外用剤や化粧品とする場合において、油性成分に対しても、水に対しても、馴染みにくいので、十分量のセラミドを配合することが難しいことや、製剤化しても、保管の経過時間に伴い析出してしまうなど取扱いの難しさがある。
【０００３】
その対策として、特許文献１に開示されているように、α，ε−ビス（γ−Ｎ−（炭素数１０〜３０）アシルグルタミル）リジンを界面活性剤のような機能を期待して、セラミドと混練して製剤化する方法が開示されている。その方法により調製した製剤を、人工的に荒らした肌に塗布し、１０分後に、経皮水分喪失  ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｗａｔｅｒ  ｌｏｓｓ（ＴＥＷＬ）を計測する方法で評価すると、水分の喪失改善の効果があることが開示されている。
一時的に、セラミドを含む膜が形成されて水分喪失を防止できたと考えられるが、界面活性機能のある成分と共存した状態では、本来の表皮で形成されているセラミドのラメラ構造の形成は期待されない。さらに、界面活性剤成分が、長期的には、表皮のセラミドのラメラ構造を乱すことも懸念される。
【０００４】
他の保湿を目的とした方法としては、従来からイーストエキストラクトあるいはイーストエキスあるいは酵母エキスなどと呼ばれていた酵母の水抽出物が肌の保湿効果があることが知られていたことに基づいて、水抽出物である酵母エキスを用いて皮膚に外用することによりセラミドの合成を活発化することが開示されている（特許文献２）。
開示技術では、ヒト正常表皮角化細胞を用いて効果評価を行っており、具体的には、細胞培養培地中に増殖因子としてＢＰＥ（牛脳下垂体）を含む培地に、水溶性の抽出物である酵母エキスを添加して、細胞培養を行い、セラミドの合成促進効果を示しているが、牛脳下垂体などに含まれる既知および未知の生理活性物質が酵母エキスとの複合相互作用で効果が発揮されている可能性があり、酵母エキス単独の効果であることは示されていない。
また、実験に用いているヒト正常表皮角化細胞は、皮膚組織を構成するある段階の細胞状態であって、皮膚組織構成された状態の組織内の細胞の状態や応答特性を必ずしも反映しているわけではないことも、酵母エキスによる効果であるかどうかが明確に示されてない。
【０００５】
脂質代謝を経由し角質層でのセラミドに変換される代謝経路において、最終的にセラミドの合成に関わる酵素が、β―グルコセレブロシダーゼであることに着目し、皮膚組織でのセラミド合成を促進するために、β―グルコセレブロシダーゼの活性化の方法として、β-ガラクトシルセラミドを外用剤として用いることによるβ―グルコセレブロシダーゼの活性化の方法が開示されている（特許文献３）。
【０００６】
しかし、β-ガラクトシルセラミドは、動物の脳試料からの抽出精製が必要であり、外用剤のための成分として製造供給するには、高価な成分となる問題がある。
表皮のセラミドの機能は水分の喪失防止機能だけでなく、皮膚外部から体内への物質の侵入も防止する防御壁の機能も果たしている。
この防御の機能が低下すると、皮膚の外から、種々の物質が体内に侵入して、皮膚組織に存在する免疫系の血球細胞との免疫応答反応を引き起こし、結果として、皮膚のかゆみの発生や、炎症を起こしたり、アレルギー体質であれば、アトピー性皮膚炎を起こす。
皮膚外部から体内への物質の侵入防止機能が低下したアトピー性皮膚炎の患者皮膚において、セラミド量が減少していることが報告されている（非特許文献２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１９２３０号公報
【特許文献２】特開平８−２１７６５８号公報
【特許文献３】特許２８９６３２１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】フレグランスジャーナル Vol.31(7), 60-65, 2003
【非特許文献２】Acta Dermato-Venereologica, vol.78, no.1,pp. 27-30, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、皮膚組織における保湿機能と、外部からの物質の体内への侵入を防止する機能を維持するために重要なセラミドを、皮膚組織における生合成を活発にすることであり、皮膚組織でセラミド合成を促進するための皮膚の外用剤に用いる成分を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、皮膚組織内での細胞におけるセラミド合成を促進させることに関して、鋭意検討した結果、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種の酵母から疎水溶媒を用いて、抽出した色素を含む酵母抽出物に、セラミド合成の鍵酵素であるべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進機能を有する効果を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の構成からなることを特徴とする。
【００１１】
〔１〕  ベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進活性成分を内在するＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種の酵母の抽出物を含むことを特徴とするベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤。
〔２〕  前記酵母が、受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０であることを特徴とする前記〔１〕に記載のベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤。
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載のべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤を含むことを特徴とする皮膚外用剤。
〔４〕  前記〔１〕又は〔２〕に記載のべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤を含むことを特徴とする化粧品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤の皮膚組織内での細胞におけるセラミド合成を促進させる作用により、皮膚の改善のための成分を提供でき、その成分を生かした肌改善作用を有する皮膚外用剤および化粧品を提供できる。
さらに、その肌改善作用を有する皮膚外用剤および化粧品の原料は当該発明の酵母を用いて発酵培養することにより生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例において、ベータ・グルコセレブロニダーゼの亢進効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のべータ・グルコセレブロシダーゼの亢進剤は、ベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進活性成分を内在するＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種の酵母の抽出物を含む。
【００１５】
前記ベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進活性成分を内在するＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種の酵母は、カロチノイド色素を作り出す機能を有することが多く、カロチノイド色素を含む野菜、果物の栽培土壌又はエビ、カニ等の甲殻類の殻を廃棄した土壌等からスクリーニングによって採取することができる。
【００１６】
より具体的には、柑橘樹木の栽培畑土壌から採取したＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種の酵母である、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０の酵母がカロチノイド色素を産生しベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進活性成分を内在する酵母として用いられる。
【００１７】
そして、前記酵母は、培養して増殖させて供給することができる。
前記酵母の培養には、培養液組成として、パン酵母などの一般的な酵母培養培地組成でよく、例示すると、培地１Ｌ中にグルコース１０ｇ、およびポリペプトン５ｇ、および酵母エキス３ｇ、およびモルトエキス３ｇを含んで滅菌処理されたものでよいが、前記酵母が増殖する組成であれば制限されるものではない。
【００１８】
培地組成以外の前記酵母の培養の条件は、特に制限されることはないが、培養対象の酵母株の生育に適した温度域で設定すればよく、また、培養期間、ばっ気の有無、培地の撹拌、培地のＰＨ、培養途中での培地への栄養成分の添加操作などの条件も培養対象の酵母株の生育に適した条件を設定すればよい。
【００１９】
培養後の酵母の回収は、遠心分離操作による回収でもよいし、濾過処理による回収でもよい。
【００２０】
培養後回収した酵母から脂溶性の溶媒を用いて抽出操作を行い、前記酵母の抽出物を得ることができる。前記抽出物を得るには、培養した酵母細胞やその乾燥物や凍結乾燥物や凍結物を用いて抽出操作をしてもよく、より好ましくは、それらの破砕処理物を用いて抽出操作をするのが良い。
【００２１】
破砕処理は、フレンチプレスのような加圧解放処理による破砕処理や超音波付与による破砕処理やボールミル粉砕処理やビーズ粉砕処理や、冷凍粉砕処理などの処理が適用できる。あるいは、酵母細胞壁を溶解する酵素処理を行ってもよい。
【００２２】
培養後回収した酵母から抽出物を抽出するのに用いられる脂溶性の溶媒は、疎水性の有機溶媒が用いられる。疎水性の有機溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルムなどのアルキルハライド、ヘキサンなどの炭化水素類、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類等が挙げられる。これら単独で用いてもよく、あるいは、複数の組み合わせて混合して用いてもよい。
【００２３】
抽出操作後に、減圧濃縮・減圧蒸留操作などを行い、有機溶剤を除去して、抽出物を回収して利用する。エタノールなど食品として利用可能な有機溶剤であれば、有機溶剤中に溶解した抽出物をそのまま利用することも可能である。
【００２４】
前記酵母の抽出物は、着色しており肌改善作用を有するベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進物質を含んでいる。
【００２５】
セラミドの生合成の鍵酵素であるベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進機能の測定は、本発明の色素を皮膚細胞に付与した後に、細胞内のべータ・グルコセレブロシダーゼ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを抽出して、その細胞内発生量を計測することにより行うことができる。
【００２６】
前記抽出物は、肌改善作用を有するベータ・グルコセレブロシダーゼの亢進物質を含有しているので、液状、クリーム状、粉末、顆粒、タブレット、カプセル等の形状に加工して肌改善作用を有する皮膚外用剤原料とすることができる。前記の皮膚外用剤原料は、皮膚外用剤や化粧品やアトピー性皮膚炎予防剤や肌ケアシートや絆創膏の原料として提供できる。
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。
【実施例】
【００２８】
〔実施例１〕
色素産生の微生物は、柑橘樹木の栽培畑土壌を分離源として、特開２００５−１３７２８８号公報に記載の方法により分離操作を行った。
分離源土壌を滅菌蒸留水に懸濁、細孔径５μｍの濾過フィルターでろ過処理して、懸濁液中に浮遊する土壌粒子などを除外した後、ジェットディスペンサーで、予め２％グルコースを含有する無機塩培地（硫酸アンモニウム２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ／ｌ、塩化カルシウム２水和物０．０１５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／ｌ、リン酸水素ナトリウム１２水和物１４．３ｇ／ｌ、リン酸水素カリウム５．４ｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水和物２ｍｇ／ｌ、モリブデン酸アンモニウム４水和物０．１５ｍｇ／ｌ、硫酸銅５水和物０．２ｍｇ／ｌ、塩化コバルト０．４ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン５水和物１．５ｍｇ／ｌ）を分注した分離プレートに、１液滴中１微生物細胞となるように分注した。３０℃に加温し、２４時間インキュベーションを行った。
上記の操作を行い、ピンク色に呈色しながら増殖を示す微生物試料を取り出した。
【００２９】
ピンク色の色素を含有する微生物の種属を同定するために、色素産生微生物の１８ＳリボソームＤＮＡの塩基配列を解析した。２か所の１８ＳリボソームＤＮＡ遺伝子配列のユニバーサル領域を塩基配列としたＤＮＡオリゴマーを用いて、ＰＣＲ増幅法を用いて、色素産生微生物の１８ＳリボソームＤＮＡを得て、そのＤＮＡ試料を鋳型として、ＤＮＡ塩基配列分析を行った。配列表１に１８ＳリボソームＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を示す。
データベースを用いた解析の結果、色素産生微生物は、色素産生酵母でありＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属の酵母であることがわかった。
【００３０】
〔実施例２〕
ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ブドウ糖１０ｇを１Ｌに含むｐＨ６．２のＹＭ培地を用いて、前記ピンク色の呈色を示したＲｈｏｄｏｔｒｕｌａ属酵母を一晩、液体培養して微生物を増殖させ、１ｍＬ培地あたり約１０の９乗細胞の培養液を得た。
得られた培養液１ｍＬの遠心操作を行い、酵母を菌体試料として回収し、細胞に内在する物質の抽出調製を行った。回収した前記酵母菌体試料にクロロホルムメタノール（２：１）混合溶媒１００μＬを添加して、ガラスビーズ存在下で、激しく振盪して、酵母細胞を破砕するとともに、抽出溶媒中にピンク色色素成分を含む物質を抽出した。抽出した色素成分を含む抽出物の濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。
【００３１】
〔実施例３〕
実施例２で抽出し回収した色素成分を含む抽出物を人工皮膚の皮膚表面側に付与することによるセラミド合成の促進効果を評価した。セラミドの合成促進効果は、人工皮膚の細胞内でのべータ・グルコセレブロシダーゼの遺伝子発現量としてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量で評価した。
人工皮膚は、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング（Ｊ−ＴＥＣ）社製のＬａｂ  Ｃｙｔｅ  ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ(２４ｗｅｌｌ)を用いた。
人工皮膚は、内径６．４ミリメートルの培養カップ内に、ヒト皮膚組織としてカップ底面のメンブレンフィルター側から順に基底層・有棘層・顆粒層・角質層の構造が形成されて、最外面が角質層となっている。
濃度が１００μｇ／ｍＬである前記抽出物をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で１μｇ／ｍｌに希釈し、上記人工皮膚のカップ内に５０μＬ添加して、前記抽出物を含むＰＢＳが角質層側から人工皮膚に接するようにした。その試料を３７℃，５％ＣＯ２で１週間インキュベートした。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴｒｙｚｏｌを用いて、インキュベート後の人工皮膚よりＲＮＡを抽出し、次いで逆転写反応を実施した。逆転写反応は、Ｔａｋａｒａ社製のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔを用い逆転写産物を得た。
リアルタイムＰＣＲ装置は、ＢｉｏＲａｄ社製のＣＦＸ９６を使用し、解析ソフトとしてＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒを用い、リアルタイムＰＣＲ反応用の酵素試料としてロシュ社製のＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒを用いて、逆転写産物を鋳型としたリアルタイムＰＣＲ法を実施し、ベータ・グルコセレブロニダーゼのｍＲＮＡ量を測定した。
内部標準遺伝子としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ量を測定し、結果を標準化した。実験試料の繰り返し数Ｎは３とした。
【００３２】
〔比較例１〕
比較対照（コントロール）としては、人工皮膚のカップ内に前記抽出物を含まないＰＢＳを５０μＬ添加する条件とし、その条件以外は、実施例３の実験操作と同様に操作・インキュベートした試料を用い、実施例３と同様のメッセンジャーＲＮＡの発現量を解析した。
【００３３】
測定結果を図１に示したとおり、前記抽出物を与えた人工皮膚は、コントロールに比べて、２倍程度のベータ・グルコセレブロニダーゼのｍＲＮＡ量であり、前記抽出物によるベータ・グルコセレブロニダーゼの亢進効果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
以上のように、本発明の酵母から抽出した色素成分を含む物質は、皮膚組織の細胞において、べータ・グルコセレブロシダーゼのｍＲＮＡ発現の亢進活性を有し、肌におけるセラミド合成を亢進する効果を有する、化粧品またはアトピー皮膚炎の予防および改善剤に利用できる。また、容易に酵母を培養し、かつ、その酵母から色素成分を含む物質を回収することができるので、安定して、本発明の皮膚外用剤原料を供給生産することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００３５】
配列番号１は、色素産生微生物（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６８０の酵母）の１８ＳリボソームＤＮＡのＤＮＡ塩基配列を示す。
【図１】
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【配列表】
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