(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ３ｂとの結合親和性を増加させて、Ｃ３よりもＣ３ｂとの選択的結合力を保持しているＣＲＩｇ変異体の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列のＥ８−Ｋ１５、Ｒ４１−Ｔ４７、Ｓ５４−Ｑ６４、Ｅ８５−Ｑ９９、及びＱ１０５−Ｋ１１１から選択される領域のアミノ酸置換を含むＣＲＩｇ変異体。ＣＲＩｇをコードしているＤＮＡ断片をファージミドベクター（ｐ３ＤｖｌｚＰＤＺ−ｇＤ）に、野生型コントロール及びＣＲＩｇ変異体を設計するためのテンプレートとしてライゲーションされ、ランダム化の対象となる各残基にＴＡＡ終止コドンを有するテンプレートが、ＣＪ２３９大腸菌細胞から調製され、ソフトランダムストラテジーをＣＲＩｇ変異体の選択のために用い、ライブラリーを設計する。結合親和性を推定するために、修飾された競合ファージＥＬＩＳＡを用いるＣＲＩｇ変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列のＥ８−Ｋ１５、Ｒ４１−Ｔ４７、Ｓ５４−Ｑ６４、Ｅ８５−Ｑ９９、及びＱ１０５−Ｋ１１１からなる群から選択される領域のアミノ酸置換を含むＣＲＩｇ変異体。
【請求項２】
Ｃ３よりもＣ３ｂに対して選択的に結合する、請求項１に記載の変異体、又はその断片。
【請求項３】
配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇよりもＣ３ｂに対して増加した結合親和性を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
結合親和性が少なくとも２倍増加した、請求項３に記載の変異体。
【請求項５】
結合親和性が少なくとも５倍増加した、請求項３に記載の変異体。
【請求項６】
結合親和性が少なくとも１０倍増加した、請求項３に記載の変異体。
【請求項７】
結合親和性が少なくとも９０倍増加した、請求項３に記載の変異体。
【請求項８】
配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇよりも強力な補体第二経路の阻害剤である、請求項１に記載の変異体。
【請求項９】
配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇよりも少なくとも２倍強力である、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇよりも少なくとも５倍強力である、請求項８に記載の変異体。
【請求項１１】
配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇよりも少なくとも１０倍強力である、請求項８に記載の変異体。
【請求項１２】
配列番号：２のアミノ酸配列の位置８、１４、１８、４２、４４、４５、６０、６４、８６、９９、１０５及び１１０からなる群から選択されるアミノ酸の位置に一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１３】
配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸位６０、６４、８６、９９、１０５および１１０における一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１４】
Ｅ８Ｗ、Ｗ１４Ｆ、Ｅ８４Ｙ／Ｗ１４Ｆ；Ｐ４５Ｆ；Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ；Ｑ６４Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ；Ｍ８６Ｙ；Ｍ８６Ｗ、Ｍ８６Ｆ、Ｍ８６Ｗ／Ｑ９Ｒ；Ｍ８６Ｆ／Ｑ９９Ｒ；Ｋ１１０Ｄ、Ｋ１１Ｎ；Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｑ；及びＱ１０５Ｋ／Ｋ１１０Ｄからなる群から選択される一又は複数の置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１５】
Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｅ８Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｋ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｍ８６Ｙ／Ｅ８Ｙ；Ｍ８６Ｙ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ/Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；及びＭ８６Ｙ／Ｑ９９Ｋ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ９９Ｒ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｒ/Ｍ８６Ｙ/Ｑ１０５Ｋ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎからなる群から選択される一又は複数の置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１６】
Ｑ６０Ｉ；Ｑ６４Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ；Ｍ８６Ｙ；Ｑ９９Ｌ；Ｑ１０５Ｋ／Ｋ１１０Ｄ；Ｅ８Ｗ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｅ８Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｋ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｍ８６Ｙ/Ｐ４５Ｆ；及びＭ８６Ｙ/Ｑ１０５Ｋからなる群から選択される一又は複数の置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１７】
Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ又はＱ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆの置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の変異体を含むキメラ分子。
【請求項１９】
イムノアドヘシンである請求項１８に記載のキメラ分子。
【請求項２０】
前記ＣＲＩｇ変異体が配列番号：２の全長ＣＲＩｇよりも短い、請求項１９に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
ＣＲＩｇ細胞外ドメインを含む、請求項２０に記載のキメラ分子。
【請求項２２】
薬学的に許容可能な賦形剤と混合して、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＲＩｇ変異体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容可能な賦形剤と混合して、請求項１９に記載のイムノアドヘシンを含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＲＩｇ変異体又は上記変異体を含むイムノアドヘシンの予防的又は治療的な有効量を、上記治療を必要とする対象に投与することを含む、補体関連疾患又は状態の予防又は治療のための方法。
【請求項２５】
前記補体関連疾患が、炎症性疾病または自己免疫疾病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記補体関連疾患が、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再灌流後の遠隔組織損傷、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、狼瘡腎炎及び結果として生じる糸球体腎炎及び脈管炎、心肺バイパス、心臓麻痺によって誘発された冠状動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎障害、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、年齢関連性黄斑変性、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、同種移植、超急性拒否反応、血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、吸収性肺炎、蕁麻疹、慢性特発性蕁麻疹、溶血性尿毒症症候群、子宮内膜症、心臓性ショック、虚血再かん流障害及び多発性硬化症（ＭＳ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記補体関連疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（硬皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、類肉腫症、自己免疫溶血性貧血（免疫性の汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性の血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患、（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発硬化症、特発性多発性神経障害等の中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、伝染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及びその他の非肝向性ウイルス）、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎等の胆道胆嚢疾患、炎症性及び線維性肺疾患（例えば嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚病、多形性紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫又は免疫介在性皮膚病、乾癬、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎等の肺のアレルギー性疾患、移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連の疾病、アルツハイマー病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、遺伝性血管性浮腫、アテローム性動脈硬化症、及び膜性増殖性ＩＩ型糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記補体関連疾患が慢性関節リウマチ（ＲＡ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記補体関連疾患が補体が関連している目の症状である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
補体が関連している目の症状が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、糖尿病性及びその他の虚血関連の網膜症、眼内炎及び他の眼内新生血管病の全ての段階からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
眼内新生血管病が、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜新血管形成及び網膜新血管形成からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記補体が関連している目の症状が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び眼内炎からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡＭＤが滲出型ＡＭＤである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡＭＤが乾性又は萎縮性ＡＭＤである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が哺乳類である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳類がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＲＩｇ変異体、又は上記変異体を含むイムノアドヘシンの有効量を前記哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるＣ３ｂ補体断片の生産を阻害する方法。
【請求項３８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＲＩｇ変異体、又は上記変異体を含むイムノアドヘシンの有効量を前記哺乳類に投与することを含む、哺乳類の補体第二経路の選択的阻害のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親和性成熟ＣＲＩｇ変異体に関するものである。特に、本発明は、Ｃ３ｂとの結合親和性を増加させて、Ｃ３よりもＣ３ｂとの選択的結合力を保持しているＣＲＩｇ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
補体系
補体系は、通常、不活性なプロ酵素の形態で存在する一連の血清糖タンパク質から構成される複雑な酵素のカスケードである。３つの主要な経路、古典経路、第二経路、及びマンノース結合レクチン経路は、２つの類似しているＣ３コンベルターゼによって、Ｃ３が切断されＣ３ａ及びＣ３ｂとなるＣ３のレベルで結合する補体を活性化させることができる。
【０００３】
マクロファージは、細胞表面発現認識タグ、いわゆる分子パターンの構造の微妙な違いを認識する先天的な能力を高めた専門細胞である(Taylor, et al., Eur J Immunol 33, 2090-1097 (2003); Taylor, et al., Annu Rev Immunol 23, 901-944 (2005))。これらの表面構造の直接的な認識が先天性免疫の基本的態様である一方、オプソニン作用によって一般的なマクロファージレセプタが貪食を仲介することが可能になり、効率が上がって食細胞の認識レパートリが多様化する(Stuart and Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005))。ファゴサイトーシスのプロセスは複数のリガンド-レセプタ相互作用を含み、免疫グロブリン、コレクチン、及び補体構成要素を含むさまざまなオプソニンがマクロファージ細胞表面レセプタとの相互作用によって病原体インターナリゼーションに必要な細胞活性を誘導することが現在明らかである(reviewed by Aderem and Underhill, Annu Rev Immunol 17, 593-623 (1999); Underhill and Ozinsky, Annu Rev Immunol 20, 825-852 (2002))。生殖細胞系遺伝子によってコード化される天然免疫グロブリンが多種多様な病原体を認識することができる一方、大多数のオプソニンＩｇＧは適応免疫によって発生するため、Ｆｃレセプタによる有効なクリアランスは即時ではない(Carroll, Nat Immunol 5, 981-986 (2004))。補体は、その一方で、高速に病原体表面分子を認識して補体レセプタによる取り込みのために粒子の下準備をする(Brown, Infect Agents Dis 1, 63-70 (1991))。
【０００４】
補体は、補体レセプタによる認識のために多種多様な病原体をオプソニン化する３０以上の血清タンパク質から成る。カスケードの最初のトリガーに従って、３つの経路を区別することができる(reviewed by (Walport, N Engl J Med 344, 1058-1066 (2001))。３つの経路は全て、中心構成要素Ｃ３を活性化させる共通のステップを共有するが、それらは認識の性質及びＣ３の活性化につながる最初の生化学ステップによって異なる。標準的な経路は病原体表面に結合した抗体によって活性化され、次にＣ１ｑ補体構成要素を結合し、最終的にＣ３をその活性型Ｃ３ｂに切断するセリン・プロテアーゼ・カスケードを引き起こす。レクチン経路は、レクチン・タンパク質によって炭水化物モティーフが認識された後に活性化される。現在までに、この経路の３部材が同定されている：マンノース結合性レクチン（ＭＢＬ）、レクチンおよびフィコリンのＳＩＧＮ-Ｒ１ファミリー(Pyz et al., Ann Med 38, 242-251 (2006))。ＭＢＬ及びフィコリンはいずれもセリン・プロテアーゼと関係しており、セリン・プロテアーゼは古典経路のＣ１のような働きをし、構成要素Ｃ２及びＣ４を活性化して中心Ｃ３ステップに至る。第二経路は古典経路及びレクチン経路のいずれとも対照的に、病原体表面上の認識モチーフとの内部Ｃ３エステルの直接反応により活性化される。活性化されている表面への最初のＣ３の結合は、第二経路プロテアーゼファクターＢ及びファクターＤの作用によってＣ３ｂ沈着の急速な増幅につながる。重要なことに、古典経路又はレクチン経路のいずれかによって沈着されたＣ３ｂは、ファクターＢ及びＤの作用によってＣ３ｂ沈着の増幅につながる可能性がある。補体活性化の３つの全ての経路において、オプソニン化の重要なステップは、構成要素Ｃ３のＣ３ｂへの変換である。補体カスケード酵素によるＣ３の切断はチオ・エステルを求核攻撃にさらし、チオ・エステル領域を介した抗原面上へのＣ３ｂの共有結合を可能にする。これは、補体のオプソニン化の最初のステップである。結合したＣ３ｂのそれに続くタンパク質加水分解は、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ及びＣ３ｄｇ、異なるレセプタによって認識される切断片を生じる(Ross and Medof, Adv Immunol 37, 217-267 (1985))。この切断により、Ｃ３ｂ沈着をさらに増幅して、直接的な膜損傷が可能な膜攻撃複合体を含む補体カスケードの遅発性構成要素を活性化させるＣ３ｂの能力が無効になる。しかしながら、マクロファージ食細胞のレセプタは優先的にＣ３ｂ及びその切断片を認識する;これは、エステル-結合形成の可転性のために、Ｃ３によって媒介されるオプソニン化が病原体認識の中心であるためであり(Holers et al., Immunol Today 13, 231-236 (1992))、様々なＣ３分解産物のレセプタは従って、ホスト免疫応答において重要な役割を果たす。
【０００５】
Ｃ３自体は、１３の異なったドメインからなる複合体可撓性タンパク質である。分子の核は、密集したＣ３のα及びβ鎖を構成する８つのいわゆるマクログロブリン（ＭＧ）ドメインでできている。ＣＵＢ（Ｃ１ｒ/Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ及びＢｏｎｅ形態形成タンパク質−１）及びＴＥＤドメインはこの構造に挿入され、後者はＣ３ｂの病原体表面との共有結合関連性を可能にするチオ・エステル結合を含んでいる。残りのドメインは、Ｃ３ａを含むか又は中核ドメインのリンカーおよびスペーサとして作用する。Ｃ３ｂ及びＣ３ｃ構造のＣ３との比較は、分子が各タンパク質分解において立体配座の再配列を経て、これによりＴＥＤだけでなく、細胞レセプタと相互作用することができる分子の新しい付加表面も露出させることを実証している(Janssen and Gros, Mol Immunol 44, 3-10 (2007))。
【０００６】
食細胞上の補体Ｃ３レセプタ
補体レセプタの３つの遺伝子上科が知られている：ＣＲ１及びＣＲ２をコードする短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）モジュール、ベータ-２インテグリンファミリーのメンバーであるＣＲ３及びＣＲ４、 及び免疫グロブリンＩｇスーパーファミリーであるＣＲＩｇ。
【０００７】
ＣＲ１は、３０の短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）からなる１８０-２１０ｋＤａのグリコプロテインであって、免疫複合体クリアランスにおいて主要な役割を果たす。ＳＣＲは約６０のアミノ酸のモジュラ構造であり、各々２対のジスルフィド結合を有し構造的剛性を提供している。Ｃ３ｂ及びＣ４ｂの両方との高親和性結合は、各々３つのＳＣＲから成る２つの異なる部位で起きる(reviewed by (Krych-Goldberg and Atkinson, Immunol Rev 180, 112-122 (2001))。ＣＲ１（部位２）のＳＣＲ１５-１７の範囲内に含まれるＣ３ｂ結合部位の構造はＭＲＩ(Smith et al., Cell 108, 769-780 (2002))で測定され、３つのモジュールが１６-１７の接合部において柔軟性を有する拡張した頭−尾配置にあることが明らかとなった。構造誘導突然変異生成により、Ｃ４ｂ結合に欠かせないモジュール１５上のプラスに荷電した表面領域が識別された。このパッチは、ＣＲ１の同一面に曝露されるモジュール１６の塩基性側鎖と共に、Ｃ３ｂ結合に必要である。免疫付着レセプタ(Rothman et al., J Immunol 115, 1312-1315 (1975))として最初に記載されているＣＲ１の主な機能は、肝臓による輸送及びクリアランスのために赤血球上のＩＣを捕えることである(Taylor et al., Clin Immunol Immunopathol 82, 49-59 (1997))。好中球上のＣＲ１にはファゴサイトーシスにおいて役割があるが、組織マクロファージにおいてはない(Sengelov et al., J Immunol 153, 804-810 (1994))。免疫複合体のクリアランスにおける役割に加えて、ＣＲ１は、それぞれのコンベルターゼとの相互作用により、古典経路及び第二経路両方の活性化の強力阻害剤である(Krych-Goldberg and Atkinson, 2001, supra; Krych-Goldberg et al., J Biol Chem 274, 31160-31168 (1999))。マウスにおいて、ＣＲ１及びＣＲ２は、選択的スプライシングによって形成された同じ遺伝子の２つの生成物であり、主にＢ-リンパ球及び小胞樹枝細胞と関係し、Ｂ細胞反応の調整に主に機能する(Molina et al., 1996)。マウスにおいて機能的にＣＲ１と等しいＣｒｒｙは、古典経路及び第二経路酵素を不活化させ、食細胞レセプタとしてよりも補体活性化の内在調整因子として作用する(Molina et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 3357-3361 (1992))。
【０００８】
ＣＲ２（ＣＤ２１）は、ｉＣ３ｂ及びＣ３ｄｇを結合し、Ｂ細胞免疫を強化する主要な補体レセプタである(Carroll, Nat Immunol 5, 981-986 (2004); Weis et al., Proc Natl Acad Sci USA 81, 881-885 (1984))。関連Ｂ細胞によるＣ３ｄ被覆抗原の取り込みにより、Ｂ細胞抗原レセプタを介したシグナルの増強が生じる。このように、ＣＤ２１-ＣＤ１９-ＣＤ８１共レセプタのＢ細胞抗原レセプタとの共会合は、Ｂ細胞活性化の閾値を低下させ、重要な生存シグナルを提供する(Matsumoto et al., J Exp Med 173, 55-64 (1991))。ｉＣ３ｂ上のＣＲ２結合部位は、ＴＥＤとＭＧ１ドメインの間の界面に部分的にマッピングされた(Clemenza and Isenman, J Immunol 165, 3839-3848 (2000))。
【０００９】
ＣＲ３及びＣＲ４は、αサブユニット（それぞれＣＤ１１ｂ又はαＭ、そしてＣＤ１１ｃ又はαＸ）と、共通のベータ鎖（ＣＤ１８又はβ２）から構成される膜貫通型ヘテロ二量体であって、細胞外マトリックス及び他の細胞への接着だけでなく、ｉＣ３ｂの認識に関連している。これらはインテグリンファミリーに属し、ファゴサイトーシスだけでなく、白血球輸送及び遊走シナプス形成、及び共刺激においても機能する（(Ross, Adv Immunol 37, 217-267 (2000)によりレビューされる）。インテグリンの接着性は、インサイドアウトシグナルと呼ばれる、インテグリンを低親和性結合状態から高親和性結合状態に変換するプロセスによって調節される(Liddington and Ginsberg, J Cell Biol 158, 833-839 (2002))。加えて、リガンド結合は、細胞外ドメインから細胞質までシグナルを伝達する。ｉＣ３ｂの結合部位はＣＲ３及びＣＲ４のα鎖上のいくつかのドメインにマッピングされている(Diamond et al., J Cell Biol 120, 1031-1043 (1993); Li and Zhang, J Biol Chem 278, 34395-34402 (2003); Xiong and Zhang, J Biol Chem 278, 34395-34402 (2001))。ＣＲ３の複数のリガンド：ｉＣ３ｂ、ベータ-グルカン及びＩＣＡＭ-１はＣＤ１１ｂのＩドメインの中に含まれる部分的に重なり合う部位と結合するようである(Balsam et al., 1998; Diamond et al., 1990; Zhang and Plow, 1996)。Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂの蛋白質加水分解で不活性化された形態の特異的認識は、構造研究に基づいて予測され、構造研究によって、補体調節プロテアーゼであるファクターＩによってα’鎖の切断時に起きるＣ３ｂ(Nishida et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 19737-19742 (2006))のＣＵＢドメインのアンフォールディングの際に曝露される残基にＣＲ３結合部位が位置づけられる。
【００１０】
ＣＲＩｇは、血流からの病原体のクリアランスに必要なＡ３３抗原およびＪＡＭ１に対する相同性を有するマクロファージに関連するレセプタである。ヒトＣＲＩｇタンパク質は、ヒトＪＡＭ１の保存Ｉｇドメインを認識している縮重プライマを使用して人間の胎児のｃＤＮＡライブラリーから最初にクローニングされた。いくつかのクローンのシークエンシングにより、４００のアミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかとなった。ブラスト検索により、Ｚ３９Ｉｇ、タイプ１膜貫通型タンパク質との類似性が確認された(Langnaese et al., Biochim Biophys Acta 1492 (2000) 522-525)。この分子の細胞外領域は、Ｎ末端Ｖ-セットドメイン及びＣ末端Ｃ２-セットドメインを含む２つのＩｇに類似のドメインから成ることがわかった。新規ヒトタンパク質は、最初は「１回膜貫通型Ｉｇスーパーファミリーマクロファージ関連」（ｈｕＳＴＩｇＭＡ）として指定された。(ｈｕＳＴＩｇＭＡ)。その後、３’及び５’プライマを使用して、ｈｕＳＴＩｇＭＡのスプライス変異体がクローニングされ、このクローンは膜近位ＩｇＣドメインがなく、５０のアミノ酸が不足している。したがって、このヒトタンパク質のより短いスプライス変異体は、ｈｕＳＴＩｇＭＡｓｈｏｒｔと指定された。ｈｕＳＴＩｇＭＡ（ＰＲＯ３６２と称する）のアミノ酸配列及び符号化ポリヌクレオチド配列は、２００２年６月２５日に交付された米国特許第６４１０７０８号明細書に開示されている。加えて、ｈｕＳＴＩｇＭＡ及びｈｕＳＴＩｇＭＡｓｈｏｒｔは、ネズミのＳＴＩｇＭＡ（ｍｕＳＴＩｇＭＡ）タンパク質及び核酸配列とともに、２００４年４月１５日に発行された国際公開番号第 ＷＯ２００４／０３１１０５号明細書に開示されている。
【００１１】
ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ：ＣＲＩｇ複合体の結晶構造は、２００８年２月２１日に発行された米国出願公開番号第２００８／００４５６９７号明細書に開示されている。
【００１２】
肝洞様毛細血管のルーメン中に滞留するクッパー細胞（ＫＣ）は、体内のマクロファージで最も大きな個体群を形成する。ＫＣは他の組織常在性マクロファージと共通のマーカーを有するが、これらは消化管の微小血管システムから排出される門脈血液に存在する腸由来のバクテリア、微生物破片、細菌内毒素、免疫複合体及び死細胞の効果的なクリアランスを対象とする特殊化した機能を果す(Bilzer et al., Liver Int 26, 1175-1186 (2006))。ＫＣ表面への病原体の十分な結合は、病原体に対する第一線の免疫防御における重要なステップである(Benacerraf et al., J Exp Med 110, 27-48 (1959))。循環からの病原体の迅速なクリアランスにおけるＫＣの中心的役割は、ＫＣが欠乏したマウスの死亡率がかなり増加したことによって例証される(Hirakata et al., Infect Immun 59, 289-294 (1991))。ＣＲＩｇの特定はさらに、循環している病原体に対する第一線の免疫防御における補体及びＫＣの重要な役割にさらに重きを置く。
【００１３】
マウスＫＣで特定された唯一の補体Ｃ３レセプタはＣＲＩｇ及びＣＲ３である(Helmy et al., Cell 124, 915-927 (2006))が、その一方で、人間のＫＣはＣＲ１及びＣＲ４の更なる発現を示す(Hinglais et al., 1989)。ＫＣ上のＣＲＩｇ及びＣＲ３は、インビトロのｉＣ３ｂオプソニン化された粒子の結合に貢献する(Helmy et al., Lab Invest 61, 509-514 (2006))。インビボで、ｉＣ３ｂ被覆病原体への結合におけるＫＣ発現ＣＲ３の役割は、より不明確である。ＣＲ３は、好中球の補充と好中球発現ＩＣＡＭ１との相互作用を経て間接的に病原体のクリアランスに貢献すると提案されてきた(Conlan and North,  Exp Med 179, 259-268 (1994); Ebe et al., Pathol Int 49, 519-532 (1999); Gregory et al., J Immunol 157, 2514-2520 (1996); Gregory and Wing, J Leukoc Biol 72, 239-248 (2002); Rogers and Unanue, Infect Immun 61, 5090-5096 (1993))。対照的に、ＣＲＩｇは、肝洞様毛細血管のルーメンを通過する病原体を捕獲することによって、直接的な役割を果たす(Helmy et al., 2006, supra)。ＣＲＩｇ対ＣＲ３の生物学における違いは、これら２つのレセプタの結合特性の違いに部分的に反映される。ＫＣに発現されるＣＲＩｇが単量体Ｃ３断片に構造的に結合するのに対して、ＣＲ３はｉＣ３ｂオプソニン化粒子とのみ結合する(Helmy et al., 2006, supra)。単量体Ｃ３ｂ及びｉＣ３ｂだけでなくＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ被覆粒子を効果的に捕獲するＣＲＩｇの能力は、マクロファージ(Helmy et al., 2006, supra)の膜伸展の先端に集中したＣＲＩｇ分子と、病原体面に存在するＣ３ｂ及びｉＣ３ｂの多量体との間の多効果の相互作用によって発生する結合力の増大を反映する。ＣＲ３がｉＣ３ｂ被覆粒子のみを結合する一方、ＣＲＩｇはさらにＣ３ｂと結合し、最初のＣ３切断生成物が血清オプソニン化病原体に形成される(Croize et al., Infect Immun 61, 5134-5139 (1993))。病原体面に結合した多数のＣ３ｂ分子は、因子Ｈ及びＩによって切断から保護されるため(Gordon et al., J Infect Dis 157, 697-704 (1988))、ＣＲＩｇによるＣ３ｂリガンドの認識により迅速な結合及びクリアランスが確実になる。したがって、ＣＲＩｇ及びＣＲ３はＫＣに発現されるが、これらは病原体クリアランスの異なるリガンド特異性、独特の結合特性及び異なった動力学を示す。
【００１４】
細胞表面レセプタを細胞侵入に利用する病原体の例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなウイルス、及び結核菌、ライ菌、偽結核エルシニア菌、ネズミチフス菌およびリステリア菌のような細胞内バクテリア及びprostigmatoid大形リーシュマニアのような寄生虫である(Cossart and Sansonetti, Science 304:242-248 (2004); Galan, Cell 103:363-366 (2000); Hornef et al., Nat. Immunol. 3:1033-1040 (2002); Stoiber et al., Mol. Immunol. 42:153-160 (2005))
【００１５】
上記のように、ＣＲＩｇは、組織常在性マクロファージの亜集団に発現される最近発見された補体Ｃ３レセプタである。ＣＲＩｇの細胞外ＩｇＶドメインは、Ｃ３タンパク質の補体レセプタとして機能することとは別に、Ｃ３ｂと結合すること、及びＣ３及びＣ５のタンパク質分解活性化を抑制することによって補体の第二経路を選択的に阻害する。しかしながら、転換酵素Ｃ３ｂのＣＲＩｇ結合親和性は低く（ＩＣ５０ >１Ｍ）、ほぼ完全な阻害に到達するにはタンパク質の濃度が比較的高いことが要求される。したがって、改善された治療有効性を有するＣＲＩｇポリペプチドが必要である。本発明は、このようなポリペプチドを提供する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、少なくとも一つには、増強された結合親和性を有するＣＲＩｇ変異体の構造に基づく。組み合わせアミノ酸置換Ｑ６４Ｒ及びＭ８６Ｙを有するＣＲＩｇ−ＥＣＤタンパク質は、野生型ＣＲＩｇ変異体よりも３０倍増加した結合親和性及び７倍改善された補体阻害活性を示した。加えて、関節炎のマウスモデルの、親和性が改善されたＣＲＩｇ融合タンパク質による治療は、野生型ＣＲＩｇタンパク質による治療と比較して、臨床スコアが大幅に減少する結果になった。
【００１７】
したがって本発明は、ＣＲＩｇ変異体に関する。
【００１８】
一つの態様では、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列のＥ８−Ｋ１５、Ｒ４１−Ｔ４７、Ｓ５４−Ｑ６４、Ｅ８５−Ｑ９９及びＱ１０５−Ｋ１１１からなる群から選択される領域のアミノ酸置換を含むＣＲＩｇ変異体に関する。
【００１９】
ある実施形態では、変異体は、Ｃ３よりもＣ３ｂ、又はその断片と選択的に結合する。
【００２０】
他の実施形態では、変異体は、配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇよりもＣ３ｂとの結合親和性を増加させており、この結合親和性は例えば、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも７０倍、又は少なくとも８０倍、又は少なくとも９０倍、又は少なくとも１００倍増加させることが可能である。
【００２１】
さらに別の実施形態では、変異体は、配列番号：２の天然配列ヒトＣＲＩｇより強力な補体第二経路の阻害剤である。
【００２２】
さらなる実施形態では、変異体は、配列番号：２のアミノ酸配列の位置８、１４、１８、４２、４４、４５、６０、６４、８６、９９、１０５及び１１０からなる群から選択される単数又は複数のアミノ酸位置のアミノ酸置換を含む。
【００２３】
さらに別の実施形態では、変異体は、配列番号：２のアミノ酸配列の単数又は複数のアミノ酸位置６０、６４、８６、９９、１０５及び１１０のアミノ酸置換を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、変異体は、Ｅ８Ｗ、Ｗ１４Ｆ、Ｅ８４Ｙ／Ｗ１４Ｆ；Ｐ４５Ｆ；Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ；Ｑ６４Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ；Ｍ８６Ｙ；Ｍ８６Ｗ、Ｍ８６Ｆ、Ｍ８６Ｗ／Ｑ９Ｒ；Ｍ８６Ｆ／Ｑ９９Ｒ；Ｋ１１０Ｄ、Ｋ１１Ｎ；Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｑ；及びＱ１０５Ｋ／Ｋ１１０Ｄからなる群から選択される単数又は複数の置換を含む。
【００２５】
他の実施形態では、変異体は、Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｅ８Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｋ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｍ８６Ｙ／Ｅ８Ｙ；Ｍ８６Ｙ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；及びＭ８６Ｙ／Ｑ９９Ｋ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ９９Ｒ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｒ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｋ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎからなる群から選択される単数又は複数の置換を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態では、変異体は、Ｑ６０Ｉ；Ｑ６４Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ；Ｍ８６Ｙ；Ｑ９９Ｌ；Ｑ１０５Ｋ／Ｋ１１０Ｄ；Ｅ８Ｗ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｅ８Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｋ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｍ８６Ｙ／Ｐ４５Ｆ；及びＭ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｋからなる群から選択される単数又は複数の置換を含む。
【００２７】
さらに特定の実施形態では、変異体は、Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ又はＱ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ置換を含む。
【００２８】
別の態様においては、本発明は、本明細書で定義されるようにＣＲＩｇ変異体を含むキメラに関する。
【００２９】
ある実施形態では、キメラ分子はイムノアドヘシンである。
【００３０】
他の実施形態では、イムノアドヘシンは、配列番号：２の完全長ＣＲＩｇより短いＣＲＩｇ変異体を含む。
【００３１】
さらに別の実施形態では、キメラ分子は、ＣＲＩｇ細胞外ドメインを含む。
【００３２】
更なる態様において、本発明は、ＣＲＩｇ変異体又はキメラ分子（例えば本発明のイムノアドヘシン）を、薬学的な条件を満たした賦形剤との混合物中に含む医薬組成物に関する。
【００３３】
更に別の態様において、本発明は、補体が関係している疾病又は状態の予防又は治療の方法に関し、この方法は上記の治療を必要とする対象に、予防的又は治療的有効量のＣＲＩｇ変異体又は上記変異体を含むキメラ分子（例えばイムノアドヘシン）を投与することを含む。
【００３４】
ある実施形態では、補体が関係している疾病は、炎症性疾病又は自己免疫疾病である。
【００３５】
他の実施形態では、補体が関係している疾病は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血及び再灌流後の遠隔組織損傷、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、狼瘡腎炎及び結果として生じる糸球体腎炎及び脈管炎、心肺バイパス、心臓麻痺によって誘発された冠状動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎障害、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、年齢関連性黄斑変性、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、同種移植、超急性拒否反応、血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、吸収性肺炎、蕁麻疹、慢性特発性蕁麻疹、溶血性尿毒症症候群、子宮内膜症、心臓性ショック、虚血再かん流障害及び多発性硬化症（ＭＳ）からなる群から選択される。
【００３６】
さらに別の実施形態では、補体が関係している疾病は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（硬皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎（多発性筋炎））、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、類肉腫症、自己免疫溶血性貧血（免疫性の汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性の血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫介在性腎疾患、（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発硬化症、特発性多発性神経障害等の中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、伝染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及びその他の非肝向性ウイルス）、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎等の胆道胆嚢疾患、炎症性及び線維性肺疾患（例えば嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚病、多形性紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫又は免疫介在性皮膚病、乾癬、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎等の肺のアレルギー性疾患、移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連の疾病、アルツハイマー病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、遺伝性血管性浮腫、アテローム性動脈硬化症、及び膜性増殖性２型糸球体腎炎からなる群から選択される。
【００３７】
好ましい実施形態では、補体が関係している疾病は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）である。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、補体が関係している疾病は、補体が関係している目の症状である。
【００３９】
さらなる実施形態では、補体が関係している目の症状は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ブドウ膜炎、糖尿病性及びその他の虚血関連の網膜症、眼内炎及び他の眼内新生血管病の全ての段階からなる群から選択される。
【００４０】
さらに別の実施形態では、眼内新生血管病は、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜新血管形成及び網膜新血管形成からなる群から選択される。
【００４１】
さらに別の実施形態では、補体が関係している目の症状は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）及び眼内炎からなる群から選択され、ここでＡＭＤは、乾性及び湿性、又は萎縮性ＡＭＤを含む。
【００４２】
ある実施形態では、患者は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４３】
別の態様において、本発明は、哺乳類におけるＣ３ｂ補体断片の生産の阻害のための方法に関し、これには、前記哺乳類に本発明のＣＲＩｇ変異体又は上記変異体を含むイムノアドヘシンの有効量を投与することが含まれる。
【００４４】
さらに別の態様では、本発明は、哺乳類の補体第二経路の選択的阻害のための方法に関し、これには、前記哺乳類に本発明のＣＲＩｇ変異体又は上記変異体を含むイムノアドヘシンの有効量を投与することが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、天然ヒトＣＲＩｇの３９９アミノ酸の全長形態（ｈｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、天然ヒトＣＲＩｇの３９９アミノ酸の全長形態（ｈｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、天然ヒトＣＲＩｇの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、天然ヒトＣＲＩｇの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、２８０アミノ酸の天然マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、２８０アミノ酸の天然マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、２８０アミノ酸の天然マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８）を示す。
【図４】図４は、結合アッセイ及び阻害アッセイでのＣＲＩｇマウスの活性である。ＣＲＩｇの結合親和性は、Ｃ３ｂの競争的置換として測定され（Ａ）、生物活性は溶血阻害アッセイによって測定された。ＰＵＲ１０６８０は野生型制御（赤）、ＲＩＬ  ４１（青）及びＲＬ４１（緑）は２つの突然変異体であった（Ｂ）。（Ｃ）ＣＲＩｇ結合界面の段階的最適化である。
【図５】競合ＥＬＩＳＡと溶血性アッセイとの相関。
【図６】ＣＲＩｇ突然変異体Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって改善された結合親和性を示している。（Ａ）被覆ＣＲＩｇ ｗｔ及びＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙタンパク質上へのＣ３ｂの増加している濃度の注入によって生成されるＳＰＲ ｓｅｎｓｏｇｒａｍ。Ｂ．結合データの定常状態の分析は、Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ突然変異体に対して０．２ミクロモルのＫｄ及び野生型ＣＲＩｇに対して１．１マイクロモルのＫｄを示している。
【図７】親和性が改善されたＣＲＩｇは、Ｃ３ｂに対して選択性を保持する。精製Ｃ３及びＣ３ｂにはアルファ・スクリーン競合分析が用いられた。
【図８】野生型ＣＲＩｇと比較したＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの改善された補体阻害活性。（Ａ） 野生型ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇ Ｑ４６Ｒ Ｍ８６Ｙによる補体阻害を、ウサギの赤血球及びＣ１ｑ劣化ヒト血清を使用して第二経路選択性溶血性アッセイを使用して比較した。（Ｂ）野生型ＣＲＩｇ及びＣＲＩｇ Ｑ４６Ｒ Ｍ８６Ｙによる補体阻害を、マイクロ・ウエルプレート被覆ＬＰＳ及びＣ１ｑ劣化ヒト血清を使用するＥＬＩＳＡベースの第二経路アッセイを使用して比較した。
【図９】ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙは、ＣＲＩｇ ＷＴよりも改善されたインビボでの有効性を示す。（Ａ）ＫＲＮ血清が注入され、様々な濃度及び型の野生型及び親和性成熟の組換型ヒト及びマウスＣＲＩｇタンパク質で処置されたマウスの臨床スコア。データは、グループにつき４〜７匹のマウスの平均値を表す。（Ｂ）血清移植６日後に、個々のマウスからの臨床スコアの分散プロット線。（Ｃ）血清移植６日後の、ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６ＹのＣＲＩｇ ｗｔで処置されたマウスのヘマトキシリン及びエオシンで染色した部分。（Ｄ）血清移植６日後の、ＣＲＩｇ ｗｔ又はＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙで処置されたマウスからの組織学的評価の分散プロット線。
【表１】
2015145369.tif 000002
ファージ・ライブラリー。５つのソフトランダム化されたライブラリーは、ＣＲＩｇ及びＣ３ｂ間の接触領域をカバーするように設計された。
【表２】
2015145369.tif 000003
より高い親和性ＣＲＩｇマイファージの段階的な生成の表示。
５つのソフトランダム化されたライブラリーから選択されたＣＲＩｇ抗Ｃ３ｂ突然変異体。各パネルは、Ｃ３ｂに対する結合親和性に基づいて各ライブラリーから選ばれたクローンを示す。シークエンスは、一文字のアミノ酸コードによって示される。各パネルは、個々の突然変異体をコンセンサス及び親野生型（ＷＴ）シークエンスと比較する。残基は適宜色がつけられている：青−ソフトランダム化された位置；灰色−ランダム化されてない；黄色−野生型（ＷＴ）とは異なる、選択された残基。表２は、それぞれ出現順に配列番号２１〜６３及び６３〜６７を開示する。
【表３】
2015145369.tif 000004
選択された突然変異体の、競合ＥＬＩＳＡによって測定された、結合親和性、及び生体内の溶血阻害の比較。結合親和性又は生体内有効性が５倍以上増加した突然変異体は、黄色で陰影がつけられている。
【表４】
2015145369.tif 000005
第二世代突然変異体（親シークエンスが灰色で示されている）の結合親和性及び生体内溶血阻害の比較。結合親和性が親突然変異体の５倍以上増加した突然変異体は青で表示され、結合親和性が９０倍以上増加した突然変異体は黄色で表示されている。同様に、親シークエンスよりも大きい生体内有効性を有する突然変異体は、オレンジで表示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
Ｉ．定義
用語「ＣＲＩｇ」、「ＰＲＯ３６２」、「ＪＡＭ４」、および「ＳＴＩｇＭＡ」は同じ意味で使用され、天然配列と変異体ＣＲＩｇポリペプチドとを意味する。
【００４７】
「天然配列」のＣＲＩｇは、その調製の形式とは無関係に、自然界に由来するＣＲＩｇポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドである。したがって、自然界に存在している配列のＣＲＩｇは、自然界から単離することができ、また、組換え手段および／または合成の手段によって生産することもできる。用語「天然配列のＣＲＩｇ」には、具体的に、自然界に存在している短縮型のＣＲＩｇまたは分泌型のＣＲＩｇ（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然界に存在している変異体形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）、ならびにＣＲＩｇの自然界に存在している対立遺伝子変異体が含まれる。自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドには、具体的には、配列番号２の全長の３９９アミノ酸の長いヒトＣＲＩｇポリペプチド（図１Ａ及び１Ｂに示されるｈｕＣＲＩｇ）が含まれ、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号２の約２７７位から３０７位のアミノ酸位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。さらなる実施形態においては、天然配列のＣＲＩｇポリペプチドは、ヒトＣＲＩｇの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ、配列番号４、図２Ａ及び２Ｂに示される）であり、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号４の約１８３位から２１３位の位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。異なる実施形態においては、天然配列のＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号６の２８０アミノ酸の長い全長のマウスＣＲＩｇポリペプチド（ｍｕＣＲＩｇ、図３Ａ〜３Ｃに示される）であり、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号６の約１８１位から２１１位のアミノ酸位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。高等霊長類および哺乳動物を含むヒト以外の他の動物のＣＲＩｇポリペプチドが、具体的にこの定義に含まれる。
【００４８】
ＣＲＩｇ「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、ＣＲＩｇポリペプチドの１つの形態を意味する。これには、それぞれの全長分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは原則として含まれない。通常、ＣＲＩｇ ＥＣＤには、このような膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインの１％未満が含まれており、このようなドメインの０．５％未満しか含まれないことが好ましい。場合により、ＣＲＩｇ ＥＣＤには、配列番号２、４、もしくは６の１位または約２１位からＸ位のアミノ酸残基が含まれる。ここでは、Ｘは、配列番号２の約２７１位から２８１位までの任意のアミノ酸、配列番号４の約１７８位から１８６位までの任意のアミノ酸、配列番号６の約１７６位から１８４位までの任意のアミノ酸である。
【００４９】
「ＣＲＩｇ変異体」は、本明細書で使用される場合には、天然配列のＣＲＩｇポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有している、以下に定義される活性なＣＲＩｇポリペプチドを意味する。これには、ｈｕＣＲＩｇ（配列番号２）、全長のｈｕＣＲＩｇ（配列番号２）、ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ（配列番号４）、およびｍｕＣＲＩｇ（配列番号６）が含まれるが、これらに限定はされない。これらのそれぞれには、Ｎ末端の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、膜貫通ドメインの全体もしくは一部が含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、細胞内ドメインが含まれる場合もまた含まれない場合もある。特定の実施形態においては、ＣＲＩｇ変異体は、配列番号２の配列の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。別の実施形態においては、ＣＲＩｇ変異体は、配列番号４の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。なお別の実施形態においては、ＣＲＩｇ変異体は、配列番号６の配列の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。通常、ＣＲＩｇ変異体は、配列番号２、４、又は６の配列の成熟型のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性、もしくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列相同性、もしくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列相同性、もしくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列相同性、もしくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列相同性、もしくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列相同性を有する。実施例を含む本明細書全体において、「野生型」又は「ＷＴ」はヒトＣＲＩｇ（ＣＲＩｇ（Ｓ））（配列番号４）の成熟型の全長の短い形態を指し、ＣＲＩｇ変異体のアミノ酸残基の付番方式は配列番号４の配列を指す。
【００５０】
本明細書のＣＲＩｇ変異体は、この後に定義されているようにＣＲＩｇアゴニストである。具体的には、本明細書のＣＲＩｇ変異体はＣ３よりもＣ３ｂに対する選択的結合力を保持し、ここで「選択的結合」は、Ｃ３ｂへの結合及びＣ３への非結合を指すのに使用されている。加えて、好ましい実施形態では、本明細書のＣＲＩｇ変異体は、天然配列ＣＲＩｇポリペプチド、例えばＣＲＩｇのヒトの長い形態（配列番号２）と比べて、Ｃ３ｂに対する結合親和性が増加している。様々な実施形態では、結合親和性の増加は配列番号２の天然配列ヒトＣＲＩｇポリペプチドと比べて少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約６倍、もしくは少なくとも約７倍、もしくは少なくとも約８倍、もしくは少なくとも約９倍、もしくは少なくとも約１０倍、もしくは少なくとも約１５倍、もしくは少なくとも約２０倍、もしくは少なくとも約２５倍、もしくは少なくとも約３０倍、もしくは少なくとも約３５倍、もしくは少なくとも約４０倍、もしくは少なくとも約４５倍、もしくは少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約５５倍、もしくは少なくとも約６０倍、もしくは少なくとも約６５倍、もしくは少なくとも約７０倍、もしくは少なくとも約７５倍、もしくは少なくとも約８０倍、もしくは少なくとも約８５倍、もしくは少なくとも約９０倍、もしくは少なくとも約９５倍、もしくは少なくとも約１００倍である。他の実施形態では、配列番号２の天然配列ヒトＣＲＩｇポリペプチドに対するＣ３ｂへの結合親和性の増加は、約５〜１０倍、もしくは約５〜１５倍、もしくは約５〜２０倍、もしくは約５〜２５倍、もしくは約５〜３０倍、もしくは約５〜３５倍、もしくは約５〜４０倍、もしくは約５〜４５倍、もしくは約５〜５０倍、もしくは約５〜５５倍、もしくは約５〜６０倍、もしくは約５〜６５倍、もしくは約５〜７０倍、もしくは約５〜７５倍、もしくは約５〜８０倍、もしくは約５〜８５倍、もしくは約５〜９０倍、もしくは約５〜９５倍、もしくは約５〜１００倍である。
【００５１】
「アミノ酸配列同一性の割合（％）」は、本明細書中のＣＲＩｇ変異体に関しては、配列のアラインメント、および必要に応じた最大配列同一性の割合（％）を得るためのギャップの導入の後の、配列同一性の一部としての保存的置換を全く考慮しない、これらの比較対象である天然ＣＲＩｇ配列中のアミノ酸残基と同一であるＣＲＩｇ変異体配列中のアミノ酸残基の割合（％）として定義される。異なる長さの配列については、配列同一性の割合は、より長い配列の全長とともに、より長い配列に対して決定される。アミノ酸配列同一性の割合を決定するためのアラインメントは、当業者の能力の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータープログラムを使用して行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。その後、配列同一性は、より長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部と１００％の配列同一性を示した場合にもなお、全体的な配列同一性は１００％未満である場合がある。
【００５２】
「核酸配列同一性の割合（％）」は、本明細書中で同定されたＣＲＩｇ変異体をコードする配列に関しては、配列のアラインメント、および必要に応じた最大配列同一性の割合（％）を得るためのギャップの導入の後の、ＣＲＩｇ変異体をコードする配列中のヌクレオチドと同一である候補の配列中のヌクレオチドの割合（％）として、それぞれ定義される。核酸配列同一性の割合（％）を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の能力の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手することができるコンピュータープログラムを使用して行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。その後、配列同一性は、より長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部と１００％の配列同一性を示した場合にもなお、全体的な配列同一性は１００％未満である場合がある。
【００５３】
ＣＲＩｇ変異体の定義には、同定又は調製形式に関わらず、上文に定義されたように、全てのアミノ酸配列変異体が含まれる。本明細書では特に、天然配列ＣＲＩｇの定性的生物学的特性を保つ限りにおいて、置換修飾によって、化学的修飾、酵素処理的修飾、又は自然発生的なアミノ酸以外の部分による他の適切な手段によって修飾された変異体が含まれる。例示の非自然発生的なアミノ酸置換には、本明細書の下記に記載されたものが含まれる。
【００５４】
アミノ酸残基は主に４つのグループに分類される：
酸性：残基は生理学的ｐＨにおけるＨイオンの喪失によって負の電荷を帯びており、この残基は水溶液によって、ペプチドが水溶液中にある際に含まれているペプチドの立体配置における表面位置を求めるように誘引される。
塩基性：残基は生理学的ｐＨにおけるＨイオンとの結合により正の電荷を帯びており、この残基は水溶液によって、ペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中にある際に含まれているペプチドの立体配置における表面位置を求めるように誘引される。
中性／非極性：残基は生理学的ｐＨで荷電せず、この残基は水溶液に反発して、ペプチドが水性媒体中にある際に含まれているペプチドの立体配置における内部位置を求める。これらの残基は「疎水性残基」とも呼ばれる。
中性／極性：残基は生理学的ｐＨで荷電していないが、この残基は水溶液によって、ペプチドが水性媒体中にある際に含まれているペプチドの立体配置における外部位置を求めるように誘引される。
【００５５】
アミノ酸残基は、それらの側鎖基について環状又は非環状、芳香族又は非芳香族として更に分類することができ、これらの名称は当業者の常識である。
【００５６】
遺伝子コードにコードされない共通に見られるアミノ酸には、Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキシリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３-(及び４-)ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについての．ｒｈｏ．-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ＰｈｅについてのＮ-メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ-(Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、又はＩ-)フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニンが含まれる。
【００５７】
用語「イムノアドヘシン」は、本明細書中で使用される場合には抗体様分子を示し、これは、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とともに異種タンパク質（「アドへシン」）の結合特異性を兼ね備えている。構造的には、イムノアドヘシンには、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望の結合特異性を有しているアミノ酸配列（すなわち、これは「異種」である）と、免疫グロブリン定常ドメインの配列との融合体が含まれる。イムノアドヘシン分子の接着部は、通常、受容体またはリガンドの結合部位を少なくとも含む連続しているアミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得ることができる。
【００５８】
「処置」は、障害の発症の予防、または障害の病状を変化させる目的で行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置と、予防的または防止的措置の両方を意味する。処置が必要なものとしては、すでに障害を有しているもの、ならびに障害を予防したいものが含まれる。
【００５９】
「緩和する」は、本明細書中で使用される場合には良くする又は改善すると本明細書において定義される。
【００６０】
用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用される場合は、哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。これには、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜動物、および動物園の動物、競技用動物、またはペット動物、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびフェレットなどが含まれるが、これらに限定はされない。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳動物は高等霊長類であり、最も好ましくは、ヒトである。
【００６１】
用語「補体関連疾患」は、本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、その発症に、例えば、補体欠損などの補体系の活性化の異常が関係している全ての疾患および病理学的症状が含まれる。この用語には、具体的に、Ｃ３転換酵素の阻害が有効である疾患および病理学的症状が含まれる。この用語には、さらに、補体第二経路の阻害（選択的阻害を含む）が有効である疾患および病理学的症状が含まれる。補体関連疾患としては、炎症性疾患および自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再潅流後の離れた組織の傷害、心肺バイパス手術の間の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎および結果として生じる糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、加齢性黄斑変性、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および同種移植、超急性拒絶、血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、および吸引性肺炎が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態では、「補体関連疾患」は、補体の代替経路が重要な役割を果たす疾患であり、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、補体が関連している目の症状、例えば加齢性黄斑変性、抗リン脂質症候群、腸及び腎臓虚血再潅流障害、及びＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎が挙げられる。
【００６２】
用語「補体が関連している眼の症状」は、本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、その発症に、古典経路および第二経路を含み、特に、第二経路が関連している全ての眼の症状および疾患が含まれる。具体的には、このグループには、その発現、発症、または進行を第二経路の阻害によって制御することができる、第二経路に関連している全ての眼の症状および疾患が含まれる。補体が関連している眼の症状としては、黄斑変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階（乾式および湿式（非滲出形態と滲出形態）を含む）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および他の虚血が関係している網膜症、眼内炎、および他の眼内新生血管障害、例えば、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに、網膜血管新生が挙げられるが、これらに限定はされない。補体が関連している眼の症状の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（滲出型（湿式）ＡＭＤおよび非滲出型（乾式または萎縮性）ＡＭＤを含む）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、および眼内炎が含まれる。
【００６３】
用語「炎症性疾患」および「炎症性障害」はほとんど同じ意味で使用され、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の罹患率に寄与している炎症応答を引き起こす、媒介する、または別の方法でこれに寄与している疾患または障害を意味する。炎症応答の減少によって疾患の進行に対して緩和作用を有する疾患もまた含まれる。この用語には、免疫性の炎症性疾患が含まれ、これには自己免疫疾患が含まれる。
【００６４】
用語「Ｔ細胞によって媒介される」疾患は、Ｔ細胞が哺乳動物の罹患率を直接もしくは間接的に媒介する、またはＴ細胞が別の方法で寄与している疾患を意味する。Ｔ細胞によって媒介される疾患は、細胞によって媒介される効果、リンホカインによって媒介される効果などに関連している場合があり、そして、Ｂ細胞が、例えば、Ｔ細胞によって分泌されるリンホカインによって刺激される場合にはＢ細胞に関連している効果に関連している場合がある。
【００６５】
免疫関連疾患および炎症性疾患の例（そのいくつかはＴ細胞によって媒介される）としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴス病、橋本病甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性多発性神経障害）、肝胆汁性疾患（例えば、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、および他の非肝臓向性ウイルス））、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、ならびに硬化性胆管炎、炎症性および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性または免疫性皮膚疾患（水胞性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎が含まれる）、乾癬、肺のアレルギー性疾患（例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎）、移植に伴う疾患（移植拒絶および移植片対宿主病が含まれる）、アルツハイマー病、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００６６】
１つ以上のさらなる治療薬との「組み合わせ」投与には、同時（併用）投与と任意の順序での連続投与とが含まれる。
【００６７】
「活性な」または「活性」は、本発明のＣＲＩｇポリペプチドの変異体について、天然の、または自然界に存在している本発明のポリペプチドの生物学的活性および／または免疫学的活性を保持しているそのようなポリペプチドの形態（単数または複数）を意味する。好ましい生物学的活性は、Ｃ３ｂに結合する能力、および／または補体もしくは補体の活性化に影響を与える能力であり、具体的には、補体第二経路および／またはＣ３転換酵素を阻害する能力である。Ｃ３転換酵素の阻害は、例えば、コラーゲン誘導関節炎または抗体誘導関節炎の間の正常な血清でのＣ３の代謝回転の阻害を測定することによって測定することができるか、あるいは、Ｃ３の蓄積の阻害は関節炎の関節である。
【００６８】
「生物学的活性」は、ＣＲＩｇの生物学的活性を模倣するポリペプチドについて、Ｃ３ｂに結合する能力、および／または補体もしくは補体の活性化に影響を与えるそのような分子の能力を一部意味し、具体的には、補体第二経路および／またはＣ３転換酵素を阻害するそのような分子の能力を意味する。
【００６９】
用語ＣＲＩｇ「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、これには、天然配列のＣＲＩｇポリペプチドの質的な生物学的活性（本明細書中で上記で定義されたような）を模倣する任意の分子が含まれる。
【００７０】
「作動可能に連結されている」は、成分の正常機能が実行可能な接合を指す。このため、制御配列に「作動可能に連結されている」コード配列は、コード配列がこれらの配列の制御下で発現可能であり、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しており、リーディングフレームの中にある配置を意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結されている。あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結されている。連結は、便利な制限部位での連結によって行われる。このような部位が存在しない場合には、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、通常の実施方法に従って使用される。
【００７１】
「コントロール配列」は、特定の宿主生物の中での、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適しているコントロール配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００７２】
「発現系」は、作動可能な連結において所望のコード配列及びコントロール配列を含むＤＮＡ配列を指し、これにより、これらの配列で形質転換された宿主がコードされる蛋白質を生産できる。形質転換を実行するために、発現系がベクター上に含まれ得るが、関連ＤＮＡもその後に宿主クロモソームに組み込まれ得る。
【００７３】
本明細書に使用される場合には、「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養」は同じ意味で使用され、このような名称は全て後代を含む。したがって、「形質転換体」又は「形質転換された細胞」は、形質転換数に関わらず、これらから派生した主要な対象細胞及び培養物を含む。また当然ながら、意図的な又は故意でない突然変異が起こり得るために、全ての後代のＤＮＡ含有量は精密に同一でなくてよい。本来の形質転換された細胞において選択されたものと同じ機能性を有する突然変異後代が含まれる。明らかな区別が意図されるところでは、状況から明確となる。
【００７４】
「プラスミド」は、小文字「ｐ」とその先の及び／又は後に続く大文字及び／又は数字によって表される。本明細書の開始プラスミドは市販されている、基本的に無制限で公的に入手可能である、又は公の手順にしたがって上記の入手可能なプラスミドから作成することができる。さらに、他の当量のプラスミドは従来技術において既知であり、普通の職人にとって明らかである。
【００７５】
「ファージディスプレーライブラリー」は、ファージコートタンパク質との融合物としてクローニングされたタンパク質配列の集合体を発現するタンパク質発現ライブラリーである。したがって、「ファージディスプレーライブラリー」という表現は本明細書において、ファージが外部（通常非相同の）タンパク質を発現するファージ（例えば糸状性ファージ）の集合体を指す。外部タンパク質は、ファージが接触される他の部分と自由に相互作用（結合）する。外部タンパク質を表示する各ファージはファージディスプレーライブラリーの「一部」である。
【００７６】
用語「糸状性ファージ」は、異種ポリペプチドをその表面上に表示できるウイルス粒子を指しており、ｆｌ、ｆｄ、ＰｆＩ、及びＭ１３を非限定的に含む。糸状性ファージは、テトラサイクリン（例えば「ｆｄ−ｔｅｔ」）等の選択可能なマーカーを含むことができる。様々な糸状性ファージの表示系は当業者に周知である(see, e.g., Zacher et al., Gene, 9:127-140 (1980), Smith et al., Science, 228:1315-1317 (1985); and Parmley and Smith, Gene, 73:305-318 (1988))。
【００７７】
用語「パニング」は、目的物に対する高い親和性と特異性を持つ抗体等の化合物を運ぶファージの同定及び単離における複数ラウンドのスクリーニングプロセスを指すのに使用される。
【００７８】
表現「保存されているアミノ酸残基」は、互いに並んだ２つ以上のアミノ酸配列の間で同一であるアミノ酸残基を指すのに使用される。
【００７９】
ＩＩ．詳細説明
補体は、先天性及び適応性免疫応答の重要な成分であるが、３つの補体経路（古典、第二、及びレクチン）それぞれの活性化を通して生成された補体分解産物は炎症及び組織破壊の原因になり得る。したがって、適切な補体調節機能の欠落による制御されていない補体活性化は種々の慢性炎症性疾患に関連してきた。この炎症性カスケードにおける優性遺伝子は、補対分解産物Ｃ３ａ及びＣ５ａであり、これらはＣ３ａ及びＣ５ａレセプタを介した好中球及び炎症性マクロファージの化学誘引物質及び活性化因子として機能する(Mollnes, T.E., W.C. Song, and J.D. Lambris. 2002. Complement in inflammatory tissue damage and disease. Trends Immunol. 23:61〜64)。
【００８０】
ＣＲＩｇは、組織常在性マクロファージの亜集団上に発現される、最近発見された補体レセプタである。機能性レセプタとして、ＣＲＩｇの細胞外ＩｇＶドメインは、補体の第二経路の選択的阻害剤である(Wiesmann et al., Nature, 444(7116):217-20, 2006)。ＣＲＩｇの可溶形態は、間接部の補体の第二経路を阻害することによって、関節炎の実験モデルの炎症及び骨量減少を逆転させることが示されてきた。また、補体第二経路は疾病の誘発だけでなく、疾病の進行にも必要であることも示されてきた。したがって、ＣＲＩｇの第二経路の阻害は、病因が補体第二経路に関与する疾病及び障害に対する見込みある治療手段である。さらなる詳細は、Helmy et al., Cell, 125(1):29-32 2006) and Katschke et al., J. Exp Med 204(6):1319-1325 (2007)を参照のこと。
【００８１】
しかしながら、コンベルターゼサブユニットＣ３ｂに対するＣＲＩｇの親和性は低い（ミクロモル範囲）。さらに効能のある阻害剤を生成して治療試薬を開発するために、Ｃ３ｂと複合したＣＲＩｇの結晶構造を基準として使用し、Ｃ３ｂに対して結合親和性が改善されたＣＲＩｇ変異体を生成するためにファージディスプレー技術を用いた。
したがって、本発明はＣ３ｂに対する改善された結合親和性及び増加した阻害効果等の改善された特性を有するＣＲＩｇ変異体に関する。
【００８２】
親和性成熟ＣＲＩｇ変異体の同定
実施例にさらに詳しく記載されているように、タンパク質又はペプチドライブラリーのファージディスプレーは、Ｃ３ｂに対する改善された結合親和性及び／又は増加した生物活性等のほかの改善された特性を有するＣＲＩｇ変異体を選択するための有用な方法論を提供する(Smith, G. P., (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2:668-673)。Ｍ１３遺伝子ＩＩＩコートタンパク質との融合として一価の形で表示される高親和性タンパク質(Clackson, T., (1994) et al., Trends Biotechnol. 12:173-183)は、複数ラウンドの結合選択後にファージミド粒子にパッケージ化された対応するＤＮＡのクローン化及び塩基配列決定によって同定することが可能である。
【００８３】
ファージディスプレーを使用している親和性成熟は、例えば、Lowman et al., Biochemistry 30(45): 10832-10838 (1991)に記載されており、Hawkins et al, J. Mol Biol.254: 889-896 (1992)、及び下記の実施例も参照のこと。以下の説明に厳密に限られるわけではないが、この過程は簡単に以下のように説明することができる：所定領域内のいくつかの部位が変異して、各部位で全ての可能なアミノ酸置換が生成される。このようにして生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージ化されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生産物に対する融合として、糸状性ファージ粒子から一価の形で表示される。さまざまな変異体を発現しているファージは、複数ラウンドの結合選択によって循環させることができ、その後高い親和性を示すそれらの変異体の単離及び塩基配列決定が行われる。
この方法はまた、米国特許第５７５０３７３号明細書（１９９８年５月１２日出願）に記載されている。
【００８４】
Cunningham, B. C. et al, EMBO J. 13(11), 2508-2515 (1994)には、プール親和性ディスプレーを伴う修正された手順が記載されている。この方法は、新規結合ポリペプチドを選択する方法を提供し：ａ）ポリペプチドをコードする第１遺伝子、天然型又は野生型ファージコードタンパク質の少なくとも一部をコードする第２遺伝子を含む複製可能な発現ベクターが作成され、ここで第１及び第２遺伝子は異種であり、転写調整要素が第１及び第２遺伝子に作動可能に連結されていることにより、融合タンパク質をコードする遺伝子融合が形成され；ｂ）第１遺伝子内の単数又は複数の選択位置においてベクターが突然変異することにより、近縁プラスミドのファミリーが形成され；ｃ）適切な宿主細胞がプラスミドで形質変換され；ｄ）形質変換された宿主細胞に、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を持つヘルパーファージを感染させ；ｅ）形質変換され感染した宿主細胞を、プラスミドの少なくとも一部を含み、宿主を形質変換できる組換え型ファージミド粒子を形成するのに好適な条件下で培養し、この条件は、少量以上のファージミド粒子が、粒子表面上に二以上の融合タンパク質の複製を表示しないように調節され；ｆ）ファージミド粒子に標的分子を接触させることにより、ファージミド粒子の少なくとも一部が標的分子に結合され；そしてｇ）結合するファージミド粒子が結合しないファージミド粒子から分離されることを含む。好ましくは、本方法はさらに、適切な宿主細胞を組換え型ファージミド粒子で形質変換して、ステップｄ）からｇ）を一又は複数回繰り返すことを含む。
【００８５】
本発明のＣＲＩｇ変異体はファージディスプレーを使用して同定されたが、他の技術及び他の表示技術を使用して、親和性成熟ＣＲＩｇ変異体を含む、改善された特性を有するＣＲＩｇ変異体を同定することもできる。
【００８６】
本発明の親和性成熟ＣＲＩｇ変異体は、ＣＲＩｇとＣ３ｂの間の接触領域をカバーするように設計され、ＣＲＩｇ及びＣ３ｂの結晶構造を使用して同定された：米国特許出願公開第２００８／００４５６９７号明細書に開示されたＣＲＩｇ複合体。具体的には、表１に示すように、ライブラリー１〜５は配列番号：２の天然配列全長ＣＲＩｇ分子の各々の残基Ｅ８−Ｋ１５、Ｒ４１−Ｔ４７、Ｓ５４−Ｑ６４、Ｅ８５−Ｑ９９及びＱ１０５−Ｋ１１１をカバーするように設計された。
【００８７】
一実施形態において、本明細書のＣＲＩｇ変異体は、配列番号：２のアミノ酸配列の位置８、１４、１８、４２、４４、４５、６０、６４、８６、９９、１０５及び１１０からなる群から選択される一つ以上のアミノ酸位のアミノ酸置換を含む。
【００８８】
本明細書における代表種のＣＲＩｇ変異体は、表３に記載されている。
【００８９】
好ましくは、置換は、配列番号：２の全長天然ＣＲＩｇのアミノ酸配列のうちの一つ以上のアミノ酸位６０、６４、８６、９９、１０５及び１１０である。
【００９０】
非限定的に、親和性成熟ＣＲＩｇ変異体は、特に配列番号：２の範囲内の一つ以上の以下の置換を含む：Ｅ８Ｗ、Ｗ１４Ｆ、Ｅ８４Ｙ／Ｗ１４Ｆ；Ｐ４５Ｆ；Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ；Ｑ６４Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ；Ｍ８６Ｙ；Ｍ８６Ｗ、Ｍ８６Ｆ、Ｍ８６Ｗ／Ｑ９Ｒ；Ｍ８６Ｆ／Ｑ９９Ｒ；Ｋ１１０Ｄ、Ｋ１１Ｎ；Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｑ；Ｑ１０５Ｋ／Ｋ１１０Ｄ。
【００９１】
２つ以上のアミノ酸置換を有する配列番号：２の天然配列ＣＲＩｇの更なる変異体は表３に示されている。このグループ内に特に含まれるのは、Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｅ８Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｋ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｍ８６Ｙ／Ｅ８Ｙ；Ｍ８６Ｙ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｑ９９Ｋ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ９９Ｒ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｒ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｋ／Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎである。
【００９２】
本明細書の好適なＣＲＩｇ変異体は、以下からなる群から選択される突然変異を含む：Ｑ６０Ｉ；Ｑ６４Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ；Ｍ８６Ｙ；Ｑ９９Ｌ；Ｑ１０５Ｋ／Ｋ１１０Ｄ；Ｅ８Ｗ／Ｑ１０５Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｅ８Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｒ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｑ１０５Ｋ；Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｋ１１０Ｎ；Ｍ８６Ｙ／Ｐ４５Ｆ；Ｍ８６Ｙ／Ｑ１０５Ｋ。
【００９３】
特に好適な変異体は、突然変異Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ又はＱ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｇ４２Ｄ／Ｄ４４Ｈ／Ｐ４５Ｆを含む。
【００９４】
上記又は表３及び４に記載される一つ以上の突然変異を含むが、そうでない場合に配列番号：２の天然ＣＲＩｇ配列を保持する変異体は、本明細書に具体的に含まれている。この種の変異体は、「ＣＲＩｇ」があとに続く特定の突然変異の一覧を示すことによって、本明細書において指定される。したがって例えば、配列番号：２の天然配列ＣＲＩｇとは突然変異Ｅ８Ｗだけが異なる変異体は、「Ｅ８Ｗ ＣＲＩｇ」と指定され、配列番号：２の天然配列ＣＲＩｇとは突然変異Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙだけが異なる変異体は「Ｑ６０Ｉ／Ｑ６４Ｒ／Ｍ８６Ｙ ＣＲＩｇ」等として指定される。
【００９５】
ＣＲＩｇ変異体の調製
本発明のＣＲＩｇ変異体の組換え合成のためにタンパク質をコード化できるＤＮＡを生産するために用いることができる様々な技術が利用可能である。例えば、生成されたタンパク質のアミノ酸配列の変化をコードする自然発生的なＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡを誘導することが可能である。これらの突然変異ＤＮＡを使用して、本発明のＣＲＩｇ変異体を得ることができる。これらの技術は、簡略化された形で、天然ＣＲＩｇポリペプチドをコードする遺伝子を得、下記に述べる組換え技術によって遺伝子を修飾し、適切な発現ベクターに遺伝子を挿入し、適切な宿主細胞にベクターを挿入し、宿主細胞を培養して、所望のＣＲＩｇ変異体の発現を引き起こし、そしてこれにより生産された分子を精製することを含む。
【００９６】
より少し具体的には、本発明のＣＲＩｇ変異体をコードするＤＮＡ配列は、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (1989)等の標準的な教科書に記載されているように、ＤＮＡ配列の合成によって得られる。
【００９７】
ａ．オリゴヌクレオチド媒介突然変異生成は、天然ＣＲＩｇポリペプチド又はその断片の置換、欠失、及び挿入変異体を調製する好適な方法である。Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987)によって説明されているように、この技術は公知技術である。簡潔には、開始ポリペプチド配列をコードする核酸は、ＤＮＡテンプレートに所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドのハイブリダイズによって変異し、ここでテンプレートは、核酸をコードする、変異していない、又は天然ＤＮＡ配列を含むプラスミドの単鎖の形態である。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマを組み込んで、開始核酸の選択された変異をコードするテンプレートの完全な第２相補鎖を合成するために用いられる。
【００９８】
通常、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが用いられる。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコード化するヌクレオチドの両側において、テンプレートに対して完全に相補的な１２〜１５のヌクレオチドを有する。これにより、オリゴヌクレオチドが単鎖ＤＮＡテンプレート分子に適切にハイブリダイズすることが確実となる。オリゴヌクレオチドは、Crea et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 75: 5765 (1978)に記載されているような公知技術を使用して、簡単に合成される。
【００９９】
ファージディスプレーが使用された場合、ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクター（一般に利用できるＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐｌ９ベクターが適切である）由来のそれらのベクターか、又はViera et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987)に記載されている単鎖ファージ起源又は複製を含むそれらのベクターによってのみ生成可能である。したがって、変異すべきＤＮＡは、単鎖テンプレートを生成するために、これらのベクターのうちの1つに挿入されなければならない。単鎖テンプレートの製造はSambrook et al.（上掲）の項4.21-4.41に記載されている。
【０１００】
天然ＤＮＡ配列を変異させるためには、オリゴヌクレオチドを適切なハイブリダイゼーション条件下で単鎖テンプレートにハイブリダイズさせる。ＤＮＡ重合酵素、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を加えて、オリゴヌクレオチドを合成用プライマとして使用して、テンプレートの相補鎖を合成する。これにより、ＤＮＡの１つの鎖がＣＲＩｇの変異する形態をコードし、他の鎖（原型テンプレート）がＣＲＩｇの天然の、変異していない配列をコードするように、ヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、適切な宿主細胞、通常、例えば大腸菌ＪＭ−１０１などの原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後に、それらの細胞をアガロース・プレートに塗布して、３２リン酸塩で放射性同位体でラベル付けされたオリゴヌクレオチドプライマを使用して識別し、変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定する。
【０１０１】
直上で説明した方法を、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作られるように変更することができる。変更は下記のように行う：単鎖オリゴノヌクレオチドを上述したように単鎖テンプレートにアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）（アマシャム）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシンと結合させる。この混合物を、テンプレート-オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼのこの混合物への追加に応じて、突然変異した塩基以外はテンプレートと同一のＤＮＡの鎖が生成される。加えて、この新規なＤＮＡの鎖はｄＣＴＰの代わりに、制限エンドヌクレアーゼ消化からそのＤＮＡの鎖を保護する機能を持つｄＣＴＰ−（ａＳ）を含む。二本鎖ヘテロ二重鎖のテンプレート鎖に適切な制限酵素によって切れ目を与えた後に、テンプレート鎖は突然変異すべき部位を含む領域を越えて、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは他の適切なヌクレアーゼによって消化されることができる。その後、部分的に単鎖である分子を残すために反応を停止させる。完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖が、次に、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの４つ全ての存在でＤＮＡポリメラーゼを使用して形成される。このホモ二本鎖分子は、その後大腸菌ＪＭ１０１等の適切な宿主細胞に形質転換されることができる。
【０１０２】
置換される複数のアミノ酸を有する突然変異体は、いくつかある方法のうちの１つの方法で生成することができる。アミノ酸がポリペプチド鎖においてすぐ近くに位置する場合、それらは、全ての所望のアミノ酸置換のためにコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して同時に突然変異することができる。しかしながら、アミノ酸が互いにある距離を隔てて位置する（約１０以上のアミノ酸によって離れている）場合、全ての所望の変化をコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することはより難しい。その代わりに、１つあるいは２つの代替方法を用いることができる。
【０１０３】
第１の方法では、置換されるべき各アミノ酸に対して別々のオリゴヌクレオチドが生成される。オリゴヌクレオチドはそれから同時に単鎖テンプレートＤＮＡにアニールされ、そして、テンプレートから合成されるＤＮＡの第２鎖が所望のアミノ酸置換の全てをコードする。別の方法は、所望の突然変異体を生産するため、２ラウンド以上の突然変異生成を含む。ラウンド１は、単一の突然変異体について記載されている通りである：野生型ＤＮＡがテンプレートのために用いられ、第１の所望のアミノ酸置換（単数又は複数）をコードするオリゴヌクレオチドがこのテンプレートにアニールされ、そして、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子がその後生成される。ラウンド２の突然変異生成では、ラウンド１の突然変異生成で生産された突然変異ＤＮＡをテンプレートとして利用する。したがって、このテンプレートはすでに、一つ以上の突然変異を含む。追加の所望のアミノ酸置換（単数又は複数）をコードするオリゴヌクレオチドがその後、このテンプレートにアニールされ、結果として生じるＤＮＡの鎖がここでラウンド１及びラウンド２の突然変異生成の両方の突然変異をコードする。この結果として生じたＤＮＡを、ラウンド３、そしてその後の突然変異生成においてテンプレートとして用いることができる。
【０１０４】
ｂ．  カセット突然変異生成
この方法はまた、ＣＲＩｇの置換、欠失、及び挿入変異体を調製するための好適な方法でもある。この方法は、Wells et al. Gene 34: 315 (1985)に記載されている方法に基づいている。開始材料は、遺伝子１、突然変異させるべき遺伝子を含むプラスミド（又は他のベクター）である。開始ＣＲＩｇをコードする核酸において突然変異させるべきコドン（単数又は複数）を同定する。同定した（単数又は複数の）突然変異点の両側にユニーク制限エンドヌクレアーゼがなければならない。このような制限部位が存在しない場合、上述したオリゴヌクレオチド媒介突然変異生成方法を使用して制限部位を生成し、遺伝子１の適切な位置に導入することができる。制限部位がプラスミドに導入された後に、プラスミドをこれらの部位で切断して線形化する。制限部位の間でＤＮＡの配列をコードするが、所望の（単数又は複数の）突然変異作用を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準の手順を用いて合成する。二本の鎖は別々に合成し、その後標準の技術を用いて一緒に混成させる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、線形化プラスミドの端と混合可能である３’及び５’端を有するように設計され、これにより、プラスミドに直接結紮することができる。このプラスミドはここで、ＣＲＩｇの突然変異したＤＮＡ配列を含む。
【０１０５】
ｃ．  ＣＲＩｇ変異体の組換え生産
変異体をコードするＤＮＡを次に適切なプラスミド又はベクターに挿入する。ベクターは宿主細胞を形質変換させるのに使用される。一般には、宿主細胞と混合可能な生物種から生じた複製及び制御配列を含むプラスミドベクターが、それらの宿主に関連して使用される。ベクターは通常、形質変換された細胞に表現型選択を提供できるタンパク質をコードする配列だけでなく、複製部位を保有する。
【０１０６】
例えば、大腸菌は、ｐＢＲ３２２、大腸菌の種由来のプラスミドを使用して形質転換させることができる(Mandel, M. et al., (1970) J. Mol. Biol. 53:154)。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含むため、容易な選択手段となる。他のベクターは、しばしば発現において重要である、異なるプロモータ等の異なる特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０およびpPL−λは、現在利用可能なｔａｃ、ｔｒｐ、またはＰＬプロモータを有する発現ベクターを表す（ファーマシアバイオテクノロジー社）。
【０１０７】
他の好適なベクターは、本明細書において記載されているベクターの関連した形質を結合させることによって標準の技術を使用して作製することができる。ベクターの関連した形質は、プロモータ、リボソーム結合部位、変種遺伝子または遺伝子融合、信号配列、抗生耐性マーカー、コピー番号、および複製の適切な起源を含む。
【０１０８】
本明細書のベクターにおいてＤＮＡのクローン化または発現に好適な宿主細胞は、原核生物、イーストまたは高級真核生物細胞を含む。このための好適な原核生物は、例えばグラム陰性の又はグラム陽性の有機体等の真正細菌、例えばエシェリヒア属、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌、、Ｓｅｒｒａｆｉａ、例えば、セラチア菌およびＳｈｉｇｅｉｌａ等の腸内細菌科だけでなく、例えば枯草菌およびリケニホルミス菌等の桿菌(e.g., B. licheniformis 41P disclosed in DD 266,710 published Apr. 12, 1989)、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属等のシュードモナス属が挙げられる。大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）および大腸菌Ｗ３１１０（ATCC 27,325）等の他の菌種が適切であるが、ある好適な大腸菌をクローン化する宿主は大腸菌２９４(ATCC 31,446)である。これらの実施例は、限定するものではなく事例である。
【０１０９】
原核生物に加えて、糸状菌またはイースト等の真核微生物は、抗体コード化ベクターのための好適なクローン化または発現宿主である。酵母または一般のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で、最も一般的に使用されている。しかしながら、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ；例えば、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・フラギリス（ATCC 12,424）、クリベロマイセス・ブルガリカス（ATCC 16,045）、クリベロマイセス・ウィケラミイ（ATCC 24,178）、クリベロマイセス・ワルチ（ATCC 56,500）、クリベロマイセス・ドロソフィラルム（ATCC 36,906）、クリベロマイセス・サーモトレランス、及びクリベロマイセス・マルシアヌス等のクリベロマイセス宿主；ヤロウイア属（EP 402,226）；メタノール資化酵母（EP 183,070）；カンジダ属；トリコレルマ・リージア（EP 244,234）；アカパンカビ；例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス等のシュワニオマイセス；及び例えばアカパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム等の糸状菌、及び例えばアスペルギルスニドゥランス及びアルペルギルスニガー等のアスペルギルス属宿主等の、多くの他の属、種及び菌株が一般に利用可能であり、本明細書において使用されている。
【０１１０】
グリコシル化抗体の発現のための好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎細胞の実施例は、植物及び昆虫細胞を含む。多数のスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ミバエ）及びカイコガ等の宿主からの多数のバクロウイルス菌種及び変異体及び対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入に対する様々なウイルス菌種、例えば、キンウワバ科ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコガＮＰＶのＢｍ−５菌種は公的に利用可能であり、この種のウイルスは特にヨウトガ細胞の形質移入のために、本発明による本明細書のウイルスとして使用可能である。綿、穀物、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０１１１】
しかし、最も関心を集めたのは脊椎動物の細胞であり、脊椎動物の細胞の培養株（組織培養）での増殖は日常の手順になった。有用な哺乳類宿主細胞系の実施例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサルの腎臓ＣＶ１系である（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎性腎臓系（懸濁培養において成長のためにサブクローン化された２９３ 又は２９３細胞, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977))；乳児ハムスターの腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 10)；チャイニーズハムスターの卵巣／−ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サルの腎臓細胞（CV1 ATCC CCL 70）；アフリカのミドリザルの腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL-1587）；ヒトの子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌの腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファロ・ネズミの肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒトの肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒトの肝細胞(Hep G2, HB 8065)；マウスの乳房腫瘍（MMT 060562（ATCC CCL51））；ＴＲＩ細胞(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトの肝癌系 (Hep G2)である。
【０１１２】
宿主細胞は、本明細書のＣＲＩｇ変異体の生産用に上述した発言又はクローン化ベクターで形質転換され、プロモータを誘発する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに応じて適切に、従来の栄養培地で培養される。
【０１１３】
本発明のＣＲＩｇ変異体を生産するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養することができる。Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０（シグマ）、最小必須培地((ＭＥＭ)、 シグマ)、ＲＰＭＩ−１６４０ (シグマ)、 及びダルベッコ変法イーグル培地((ＤＭＥＭ)、 シグマ) 等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号；4,657,866号；4,927,762号；4,560,655号；又は5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；又は米国特許番号Re．30,985号明細書に記載されている全ての培地が、宿主細胞の培地として使用することができる。これらの培地は全て、必要に応じてホルモン類及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファ（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度に通常存在する無機化合物として定義される）、及びブドウ糖又は等価のエネルギー源で補足してもよい。他の全ての必要な付加物もまた、当業者に公知である適切な濃度で含むことができる。培養条件（例えば温度、 ｐＨなど）は、以前発現用に選択された宿主細胞に使用したものであり、通常熟練した職人にとって明らかである。
【０１１４】
組換え技術を使用するときは、ＣＲＩｇ変異体を細胞内に、細胞周辺腔において、又は媒体に直接分泌させて生産することができる。ＣＲＩｇ変異体が細胞内に生産された場合、第1のステップとして、微粒子状破片（宿主細胞、又は溶解細胞）が、例えば遠心沈殿法又は限外濾過法によって除去される。ＣＲＩｇ変異体が媒体に分泌される場合には、この種の発現系からの上澄みを最初に、例えばＡｍｉｃｏｎ又はミリポアのＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置等の市販のタンパク質濃度フィルタを使用して、おおむね濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのいずれかに含むことができ、抗生物質を偶発の汚染物質の成長を防止するために含むことができる。
【０１１５】
細胞から調製されるＣＲＩｇ変異体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析及び／又は親和性クロマトグラフィを用いて周知の技術によって、浄化することができる。
【０１１６】
ＣＲＩｇ変異体の更なる修飾
本発明のＣＲＩｇ変異体はまた、ある程度修飾して、別の、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合するＣＲＩｇの断片を含めた、ＣＲＩｇ変異体を含むキメラ分子を形成することもできる。ある実施形態では、この種のキメラ分子は、ＣＲＩｇ変異体又はＣＲＩｇの断片の、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供するタグ・ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは通常、変異体ＣＲＩｇポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に配置される。この種のエピトープにタグを付けられた形態のＣＲＩｇ変異体の存在は、タグ・ポリペプチドに対して抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供により、ＣＲＩｇポリペプチドを抗タグ抗体を使用して親和性浄化又はエピトープタグと結合する他の種類の親和性マトリックスによって容易に浄化することを可能にする。様々なタグ・ポリペプチド及びそれらの各抗体は、公知技術である。実施例は、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ・ヒスチジン・グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグ・ポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５[Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、 Ｂ７及び９Ｅ１０抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985))；及び、単純ヘルペスウイルス・グリコプロテインＤ（ｇＤ）タグ及びその抗体(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))を含む。他のタグ・ポリペプチドは、フラグ-ペプチド(Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988))；ＫＴ３エピトープ・ペプチド(Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)；クァドラチュア-チューブリン・エピトープ・ペプチド[Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及び、Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチド・タグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)を含む。
【０１１７】
他の実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域を有するＣＲＩｇ変異体又はその断片の融合を含むことができる。キメラ分子の二価の形態については、この種の融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域との融合であり得る。これらの融合ポリペプチドは、異種タンパク質（「アドへシン」）の結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と結合させる抗体様分子であり、しばしばイムノアドヘシンと呼称される。構造的には、イムノアドヘシンは、抗原認識および抗体の（すなわち、「異種の」）結合部位以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列の融合と、免疫グロブリン定常ドメイン配列を含む。イムノアドヘシン分子の接着部分は通常、少なくともレセプタ又はリガンドの結合部位を含む連続的なアミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４亜型、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等のいかなる免疫グロブリンからも得ることができる。
【０１１８】
最も単純であり、最も直接的なイムノアドヘシンの構造では、「アドへシン」タンパク質の結合領域（単数または複数）が、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域およびＦｃ領域と組み合わされる。通常、本発明のＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラを調製する場合には、ＣＲＩｇの細胞外ドメインをコードする核酸が、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に対して、Ｃ末端で融合される。しかし、Ｎ末端での融合も可能である。
【０１１９】
通常、このような融合体においては、コードされるキメラポリペプチドは、少なくとも免疫グロブリン重鎖の機能的に活性なヒンジ領域、ならびに定常領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対して、また、重鎖のＣＨ１に対してすぐＮ末端に、もしくは軽鎖の対応する領域に対して行うこともできる。
【０１２０】
融合が行われる正確な部位は重要ではない。特定の部位が周知であり、ＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するように選択することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラは、単量体として、またはヘテロ二量体もしくはホモ多量体として、特に二量体または四量体として、ＷＯ９１／０８２９８に本質的に記載されているように作られる。
【０１２２】
好ましい実施形態において、ＣＲＩｇ細胞外ドメインの配列が、免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンＧ．ｓｕｂ．１（ＩｇＧ１））のエフェクター機能を含む抗体（具体的には、Ｆｃドメイン）のＣ末端部分のＮ末端に融合される。ＣＲＩｇ細胞外ドメイン配列に対して重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、パパイン切断部位（これによってＩｇＧ Ｆｃが化学的に定義される；２１６位の残基、重鎖定常領域の最初の残基を１１４または他の免疫グロブリンの同様の部位とする）のすぐ上流にあるヒンジ領域で始まる配列が融合に使用される。特に好ましい実施形態において、ＣＲＩｇのアミノ酸配列が、ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３に、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。融合が行われる正確な部位は重要ではなく、最適な部位は日常的に行われる実験によって決定することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラは、多量体として、そして具体的には、ホモ二量体またはホモ四量体として作られる。一般的には、これらの作られた免疫グロブリンは公知の単位構造を有するであろう。基本的な４つの鎖の構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥに存在している形態である。４単位はより大きな分子量の免疫グロブリンで繰り返される。ＩｇＭは、一般的には、ジスルフィド結合によって共に保たれる基本的な４単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン（および場合によってはＩｇＧグロブリン）もまた血清中では多量体形態で存在し得る。多量体の場合には、個々の４単位が同じである場合も、異なる場合もある。
【０１２４】
あるいは、ＣＲＩｇ細胞外ドメインの配列を、免疫グロブリン重鎖配列と軽鎖配列との間に挿入することができ、その結果、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られる。この実施形態において、ＣＲＩｇ配列は、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとの間、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のいずれかに、免疫グロブリンのそれぞれのアームの免疫グロブリン重鎖の３’末端に融合される。同様の構造が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。
【０１２５】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいては必要ないが、免疫グロブリン軽鎖は、ＣＲＩｇ免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合されて、またはＣＲＩｇ細胞外ドメインに直接融合されて存在する場合がある。前者の場合には、通常は、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、ＣＲＩｇ−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと一緒に発現する。分泌されると、ハイブリッドの重鎖と軽鎖とが共有結合して、２つのジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造が提供される。このような構造の調製に適している方法は、例えば、１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０１２６】
医薬組成物
本発明のＣＲＩｇ変異体を、病状が補体第二経路を含む疾患の治療のために投与することができる。
【０１２７】
治療用形態は、所望の純度の活性のある分子を最適な薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と凍結乾燥処方物または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｏｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して毒性はなく、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンズトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール：３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、ニ糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）：ならびに／あるいは、非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０１２８】
リポフェクションまたはリポソームもまた、細胞にポリペプチド、抗体、または抗体断片を送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができ、そして／または組換えＤＮＡ技術によって生産することもできる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと）。
【０１２９】
本明細書中の処方物にはまた、処置される特定の適応症について不可欠な１つ以上の活性化合物が含まれる場合もあり、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼすことのない相補活性を有しているものである。このような分子は、意図される目的において有効である量での組み合わせで適切に存在する。
【０１３０】
活性分子は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、コロイド状の薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）またはマイクロエマルジョン中の、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に捕捉させることもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編，（１９８０）に開示されている。
【０１３１】
インビボでの投与に使用される処方物は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に行うことができる。
【０１３２】
徐放調製物が調製される場合がある。徐放調製物の適切な例として、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、成形された物質（例えば、膜またはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチルＬ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸）は１００日間を超えて分子を放出できるが、特定のヒドロゲルは、より短い時間の間しかタンパク質を放出できない。カプセル化された抗体が長時間体内にとどまる場合には、これらは、３７℃の水分に曝された結果として変性または凝集する場合があり、これによって、生物学的活性の消失、および免疫原性の変化の可能性が生じる。関与しているメカニズムに応じた安定化のための合理的方法を考えることができる。例えば、凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されると、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸溶液からの凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の開発によって行うことができる。
【０１３３】
治療方法
補体活性化、特に補体第二経路を阻害する能力を受けて、本発明のＣＲＩｇ変異体は補体が関連している疾患及び病的な状態の防止及び／又は治療に有用性があることが分かる。このような疾患及び状態は、非限定的に、補体が関連している炎症性及び自己免疫性疾患を含む。
【０１３４】
本明細書においてＣＲＩｇ変異体の標的になり得る補体が関連している炎症性及び免疫関連の疾患及び障害の特定の例が、先にリストに挙げられた。
【０１３５】
本発明のさらなる詳細は、下記の非限定的な実施例によって説明される。
【０１３６】
実施例１
親和性成熟ＣＲＩｇ変異体の調製
材料及び方法
材料：
材料−酵素およびＭ１３−Ｋ０７ヘルパー・ファージ(New England Biolabs)；Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート・プレート(Nunc.  Roskilde, Denmark)； ９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレート（ＣＯＳＴＡＲ；Ｃａｔ．#3365）；９６ウェル平底、非結合型プレート（ＮＵＮＣ；Ｃａｔ．#２６９６２０）；セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体結合体(Pharmacia)；３，３’、５，５’-テトラメチル-ベンジジン、Ｈ２Ｏ２ペルオキシダーゼ基体（ＴＥＢ）(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc)；大腸菌ＸＬ１-ｂｌｕｅおよび大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）(Stratagene)；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびトゥイーン２０(Sigma)；Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）；ラビットＲＢＣ(Colorado Serum Company; Cat. #CS1081)；ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ）［100mlのベロナール緩衝液］ (BioWhittaker; Cat. #12-624E)；ゼラチン(Bovine Skin Type B; SIGMA; Cat. #G9391-100G)；Ｃ１ｑ欠損血清(CompTech; Cat. #A300)；ｆＨタンパク質(Complement Technology; Cat. #A137)；抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ、５０％のグリセロール中のｍＡｂ、Sigma Cat#A-8592 1.1mg/mL
【０１３７】
ファージディスプレーＣＲＩｇライブラリーの構成
ＣＲＩｇをコードしているＤＮＡ断片は、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ消化されたファージミドベクター（ｐ３ＤｖｌｚＰＤＺ−ｇＤ）(Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987))に、野生型コントロール及びＣＲＩｇ変異体を設計するためのテンプレートとしてライゲーションされた。その後、ランダム化の対象となる各残基にＴＡＡ終止コドンを有するテンプレートが、ＣＪ２３９大腸菌細胞(Kunkel et al., 1987, supra)から調製された。ソフトランダムストラテジーがＣＲＩｇ変異体の選択のために用いられ、ここではほぼ５０％の突然変異率が、野生型ヌクレオチドに適切なベースの７０−１０−１０−１０混合物を有する毒入りのオリゴヌクレオチドストラテジーを用いて、選択された位置に導入された。ライブラリー設計では：５＝５０％ Ａ、１０％  Ｇ、１０％  Ｃ及び１０％  Ｔ；６＝５０％ Ｇ、１０％  Ａ、１０％  Ｃ及び１０％  Ｔ；７＝５０％ Ｃ、１０％  Ａ、１０％  Ｇ及び１０％  Ｔ；８＝５０％ Ｔ、１０％  Ａ、１０％  Ｇ及び１０％  Ｃである。
【０１３８】
５つのライブラリーが設計された。
ライブラリー１は、ＢＣＲ１、ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ６５６（配列番号：７） ＡＧＴ ＧＴＡ ＡＣＡ ＧＧＡ ＣＣＴ ８６６（配列番号：８） ５５５ＧＧＧ ＧＡＴ ＧＴＧ ＡＡＴ ＣＴＴ（配列番号：９）；
ライブラリー２は、ＢＣＲ２、ＡＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＡＡ ７６８（配列番号：１０） ６６８ ＴＣＡ ６５７ ７７５ ６８８ ５７７ ＡＴＣ ＴＴＴ（配列番号１１） ７８６ ＣＧＴ ６５７ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＣＡＴ（配列番号：１２）； 
ライブラリー３は、ＢＣＲ３、ＴＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＧＡＣ ＴＣＴ（配列番号：１３） ８７７ ６６８ ６５７ ７５７ ５８８ ７５６ ７５６ ６７８ ５５５ ＴＡＣ ７５６ ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＧＴＶＧ（配列番号：１４）；
ライブラリー４は、ＢＣＲ４、ＣＡＡ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＣＴＧ（配列番号：１５） ６５６ ５８６ ６５７ ＧＡＣ ７６８ ＡＧＣ ＣＡＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＴＧＴ ６５６ （配列番号：１６） ＧＴＣ ＡＣＣ ＴＧＧ ７５６（配列番号：１７） ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ（配列番号：１８）；
ライブラリー５は、ＢＣＲ５、ＣＣＴ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ７５６（配列番号：１９） ＧＴＣ ６８８ ７６８ ６５７ ５５５ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＧＴ（配列番号：２０）。
【０１３９】
点突発変異のための部位特異的変異導入は、それぞれの突然変異を生じさせるのに適切なコドンを用いて上述したように行われ、正確なクローンは配列によって確認された。
【０１４０】
ＣＲＩｇ変異体を選択するためのライブラリーソーティング及びスクリーニング：
Ｍａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートを、Ｃ３ｂ（５μｇ/ｍｌ）で４℃において一晩中コーティングして、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）及び０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温において１時間ブロッキングした。ファージライブラリーをＣ３ｂコートプレートに加えて、３時間室温において培養した。プレートを１０回洗浄し、結合したファージを５０ｍＭのＨＣｌで溶離して、等量の１．０Ｍのトリス・ベース（ｐＨ７．５）で中和した。回収されたファージを大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの継代により増幅させ、結合選択の追加のラウンドに使用した。５ラウンドの後、各ライブラリーから１２の個別のクローンを選択し、カルベニシリンおよびＭ１３−ＫＯ７ヘルパー・ファージで補足された５００μｌの２ＹＴブロスの９６ウェルフォーマットにおいてそれらを増殖させた。二倍の連続希培養液上清を、計画された位置としてＣ３ｂ、抗ｇＤ、ＢＳＡ及び非同族タンパク質でコーティングすることによって、３８４のウェルプレートに直接加えた。ファージ濃度を推定するために結合親和性を測定したところ、Ｃ３ｂはＢＳＡ及び非同族タンパク質に対しては高くないが抗ｇＤよりも著しく高かった。同じフォーマットの各ライブラリーから約２００のクローンを選別してファージ濃度を調節し、各ライブラリーから抗ｇＤよりもＣ３ｂに著しく結合することを示した２４〜４８のクローンを選択して、それらを分析のために配列した。
【０１４１】
競合ファージＥＬＩＳＡ
結合親和性を推定するために、修飾されたファージＥＬＩＳＡを用いた。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃で一晩５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）の２μｇ／ｍｌの ３Ｃｂでコーティングした。プレートを次に、室温で１時間、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡでブロッキングした。ファージが提示するＣＲＩｇ変異体を連続的にＰＢＴ緩衝液で希釈し、ファージ濃度を推定するために結合を測定したところ、飽和シグナルが５０％であった。ファージの非飽和濃度を調節し、Ｃ３ｂの連続的な希釈によって２時間プレインキュベートした後、混合物をＣ３ｂでコーティングしたアッセイプレートに移した。１５分インキュベートした後に、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ワサビペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体複合体（ＰＢＴ緩衝液で１：５０００の希釈）で３０分インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基体で現像して、１．０ＭのＨ３ＰＯ４で急冷し、４５０ｎｍにおいて分光光度法で読み取った。親和性（Ｉｃ５０）は、競合Ｃ３ｂの濃度として計算し、この結果最大半限のファージミド結合が得られた。
【０１４２】
タンパク質の浄化
発現プラスミドを有している大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の単一コロニーを、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ＬＢ／ｃａｒｂ媒体）で補足される３０ｍＬのＬＢ媒体に植菌し、３７℃で一晩増殖させた。バクテリアを回収し洗浄し再懸濁させて、５００ｍＬのＬＢ／ｃａｒｂ媒体に植菌した。培養菌は３７℃で対数増殖中期（Ａ６００ =０．８）まで増殖させた。タンパク質発現を０．４ｍＭのイソプロピル  １−チオ−−Ｄ−ガラクトピラノシドによって誘発し、培養菌を３０℃で２４時間増殖させた。バクテリアを４０００ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で二回洗浄して、−８０℃で８時間凍らせた。ペレットを５０ｍＬのＰＢＳで再懸濁させ、そしてバクテリアをマイクロフルイダイザープロセッサー又は超音波分解機器を通過させることによって溶解させる。ＣＲＩｇ変異体タンパク質を、２ｍｌのＮＩ−ＮＴＡアガロース及びゲル濾過によって精製した。
【０１４３】
ｍｕｔＣＲＩｇ−ｈｕＦｃ流体相競合結合ＥＬＩＳＡ：
ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−ＬＦＨを２ｕｇ／ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で希釈し、４℃（２５ｕｌ／ウェル）で一晩中（１６〜１８時間）インキュベートすることによって、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ３８４ウェル平底プレート(Nunc, Neptune, NJ)にコーティングした。プレートをＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、５０ｕｌ／ウェルのＢｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ （ＰＢＳ、ｐＨ ７．４、０．５％ＢＳＡ）を各ウェルに加えた。プレートを、１〜３時間ブロックした；この培養及びそれに続く全ての培養は、室温及び軌道シェーカで実行した。ブロッキング・ステップの間、（ジェネンテックで精製された）Ｃ３ｂを２０ｎＭのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈し、ｍｕｔＣＲＩｇ−ｈｕＦｃ分子を２００００〜０．３４ｎＭの濃度範囲で連続的に希釈した。次にＣ３ｂ及びｍｕｔＣＲＩｇ−ｈｕＦｃ分子を１：１で混合し、０．５〜１時間プレインキュベートした。ブロックされたプレートを（上述したように）３回洗浄し、Ｃ３ｂ：ｍｕｔＣＲＩｇ−ｈｕＦｃ複合体を点滴板に加えた（２５ｕｌ／ウェル）。１〜２時間インキュベートした後で（上述したように）ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、プレート結合Ｃ３ｂを抗ヒトＣ３ｂ抗体(clone 5F202, US Biological, Swampscott, MA; 600ng/mL, 25ul/well)を添加することにより検出した。プレートは、上述したように１〜２時間インキュベートし洗浄した。１：２０００に希釈されたＨＲＰ抱合型抗ネズミＦｃ ＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を次に加えて（２５ｕｌ／ウェル）、プレートを１〜２時間インキュベートした。最終洗浄の後、２５ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基体（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）をＥＬＩＳＡプレートに加えた。顕色は、２５ｕｌ ／ウェル１．０Ｍリン酸を加えることによって約８分後に停止させた。４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸収度を、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ ２５０マイクロタイタプレートリーダ（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して測定した。
【０１４４】
補体活性化アッセイ：
ｍｕｔＣＲＩｇ−Ｆｃの補体活性化を阻害する能力を、Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）補体系第二経路キット（Alpco Diagnostics, Salem, NH)を使用して評価した。連続的に希釈されたｍｕｔＣＲＩｇ−Ｆｃ（４００〜０．２ｎＭ）およびＣ１ｑ欠損ヒト血清（５％）(Complement Technology, Tyler, TX)を所望の最終濃度の２倍の濃度で調製して１：１で混合し、ＬＰＳコートＥＬＩＳＡプレート（１００ｕｌ／ウェル）に加える前に３００ＲＰＭで軌道シェーカ上で５分間プレインキュベートした。残りのアッセイは、製造業者の指示に従った。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレートのサンプルを ３７℃で６０〜７０分間インキュベートし、次にＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。１００ｕｌ／ウェルの抗Ｃ５ｂ−９抱合体をＥＬＩＳＡプレートに加えた。室温で３０分間インキュベートした後、上述したようにＥＬＩＳＡプレートを洗浄して、１００ｕｌの基体を各ウェルに加え、プレートをさらに３０分間の室温でインキュベートした。発色現像は、５０ｕｌ／ウェルの５ｍＭＥＤＴＡを加えることによって停止させた。４０５ｎｍでの吸収度を、ＭｕｌｔｉＳｋａｎ Ａｓｃｅｎｔマイクロタイタプレートリーダ(Thermo Fisher Scientific, Milford, MA )を使用して測定した。
【０１４５】
溶血阻害アッセイ：
ウサギの赤血球(Colorado Serum Company, Denver, CO)を、０．１％のウシの皮膚ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）（ＧＶＢ）を含むベロナール緩衝液(Sigma, St. Louis, MO)で３回洗浄し、各洗浄に対し１０分間１５００ｒｐｍで４℃において遠心分離させた。最終的な遠心分離ステップの後、細胞を最終濃度２×１０９セル／ｍＬでＧＶＢの中に再懸濁した。ＧＶＢに連続的に希釈した補体阻害剤を、５０μＬ／ウェルで９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレート(Costar, Cambridge, MA)に加え、続いて０．１ＭＭｇＣｌ２／０．１ＭＥＧＴＡ／ＧＶＢに１：２で希釈したウサギの赤血球を２０μＬ／ウェル加えた。プレート内補体カスケードを、ＧＶＢに予め１：３で希釈したＣ１ｑ欠損血清(Complement Technology, Tyler, TX)を３０μＬ／ウェルで加えることによって誘発した。１００μＬ／ウェルの１０ｍＭＥＤＴＡ／ＧＶＢで反応を停止させる前に、プレート（単数又は複数）を、室温において３０分間穏やかに攪拌することによってインキュベートした。プレートを５分間１５００ｒｐｍで遠心分離させた後に、上澄みを透明な平底で非結合型の９６ウェルプレート（単数又は複数）(Nunc, Neptune, NJ)に移し、マイクロプレートリーダ(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用して、４１２ｎｍにおける光学密度を読み取った。
【０１４６】
アルファスクリーン競合アッセイ：
Ｃ３に対する変異体ＣＲＩｇ分子の交差反応性を、アルファスクリーン（登録商標）ヒスチジン（ニッケルキレート）検出キット(PerkinElmer, Waltham, MA)を使用して評価した。連続的に希釈したヒトのＣ３及びＣ３ｂ（３０００〜０．７ｎＭ）のほかに、ビオチン化ｉＣ３ｂ（３０ｎＭ）、および変異体ＣＲＩｇ（ｍｕｔＣＲＩｇ）と野生型ＣＲＩｇ分子（１５〜６０ｎＭ）を、所望の最終濃度の３倍の濃度に調製して１：１：１で混合し、そして、３０００ＴＰＭにおいて軌道シェーカ上で３０分間、外気温でプレインキュベートした。（各０．１ｍｇ／ｍＬ）ストレプトアビジンドナービーズとニッケルキレートアクセプタービーズの１：１の混合物を所望の最終濃度の４倍の濃度で調製し、反応に加えた。反応プレートを光から保護しながら３０００ｒｐｍで軌道シェーカ上で６０分間、外気温でインキュベートした。プレートを、ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（登録商標）-ＨＴＳマイクロプレート・アナライザー(PerkinElmer, Waltham, MA)で分析した。
【０１４７】
表面プラズモン共鳴
突然変異体および野生型ＣＲＩｇに対するＣ３ｂの親和性を、 Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ａ１００計測器(GE healthcare)の表面プラズモン共鳴測定値を用いて測定した。抗Ｆｃ捕獲フォーマットを採用し、ＫＤを平衡結合測定値から算出した。センサチップは、製造業者によって供給された指示に従って、抗ｍｕＦｃ捕獲キット（BR-1008〜38）を使用して準備した。突然変異体または野生型ＣＲＩｇを、流れている緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ-２０）で１μｇ／ｍＬに希釈し、〜１００ ＲＵの融合タンパク質がチップ表面の一点に捕獲されるように、６０μＬの注入を行った。ＣＲＩｇ以外の捕捉抗体を含む参照スポットに対する信号の減算を有する、ＣＲＩｇスポット上の様々なＣ３ｂ濃度の溶液の１０分注入についてのセンサーグラムを記録した。１０μＬ／分の流量及び２５℃の温度で、４μＭ〜１５．６ｎＭの濃度範囲のＣ３ｂの２倍希釈系列についてのデータが得られた。表面は、１０ｍＭＧｌｙ-ＨＣｌ ｐＨ １．７の３０秒間の注入によって、結合サイクル間で再生させた。各Ｃ３ｂ注射終了後に得られたプラトー値を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００ 評価ソフトウェア ｖ１．１の親和性アルゴリズムを利用しＫＤを算出した(Safsten et al. (2006) Anal. Biochem. 353:181)。
【０１４８】
結果
ファージライブラリーの設計
目的のライブラリーを設計するために、Ｃ３ｂを複合したＣＲＩｇの結晶構造を使用した。５つのライブラリーは、ＣＲＩｇおよびＣ３ｂ間の接触領域をカバーするように設計された（図４）。ＣＲＩｇライブラリーは、一価のファージディスプレーベクターのｇ３ｐマイナーコートタンパク質に対する融合物として構築された(Zhang et al., J Biol Chem 281(31): 22299-311 (2006))。ランダム化されるべき各残基において、ファージプラスミドのＣＲＩｇコード部分に突然変異生成によって停止コドンを導入した。停止コドンを含む各構築物を次に、ファージディスプレーライブラリー（材料および方法を参照）を生成するために用いた。ある「ソフトランダム化」ストラテジーを使用してバインダを選択し、野生型配列バイアスを維持することにより、選択位置が５０％の確率で変異した。平均的多様性が一ライブラリーにつき＞１０１０の独立配列である５つのライブラリー全てが得られた。（表１）。
【０１４９】
ＣＲＩｇファージライブラリーでの選択
結合選択４ラウンド後に、５つのライブラリーから３８のユニーククローンが得られた。（表２）。ライブラリー１には、位置１５のリジンが保存された。位置８においてグルタミン酸が芳香族残基（チロシンおよびトリプトファン）に置き換えられた。位置１４は、親トリプトファン又は同種のフェニルアラニンによって占有された。ライブラリー２において、２４のクローンを配列し、その全部がコンセンサスを明示した。位置４２、４６および４７は、野生型として保存された。アスパラギン、ヒスチジンおよびフェニルアラニンにより、野生型配列が位置４３、４４および４５において置き換えられた。ライブラリー３において１０の位置をランダム化し、そして、配列は位置５４、５５、５６、５７、５８、６１、６２および６３において完全に保存された。イソロイシンまたはリジンは、位置６０で占有された。位置６４において、グルタミンはアルギニンと置き換えられるか、保存された。ライブラリー４では、芳香族残基が位置８６を占有し、同種の塩基性残基（アルギニンおよびリジン）が位置９９を占有した。位置８５、８７および９５もまたソフトランダム化されたが、高度に保存されているようであった。ライブラリー５では、２つの重要な同種の塩基性残基であるリジンおよびアルギニンが位置１０５においてグルタミンよりも優先された。負に帯電しているアスパラギン酸または酸性残基、アスパラギンは位置１１０で優先された。
【０１５０】
競合ファージＥＬＩＳＡ（データ図示せず）によっていくつかの突然変異体の親和性を推定し、ライブラリー３に、野生型ＣＲＩｇよりも約８倍優れたＣ３ｂバインダのクローンがあることを発見した。
【０１５１】
インビトロ結合親和性およびインビボでの生物学的有効性の判定
溶血阻害アッセイにおいてＣ３ｂに対する結合親和性及び有効性を増加させる必須残基を同定するための次の方法は、優位な単一の突然変異を組み込み、他の位置を野生型として保つことによって、又はファージＥＬＩＳＡによって判定された第１世代ファージライブラリーから２〜３の高親和性クローンを選択することによって第２世代のＣＲＩｇ変異体の第２世代を設計することであった。正確にこれらの突然変異体の親和性および有効性を測定するために、全ての変異体を単離タンパク質として発現させた。溶血阻害アッセイからの結果（表３）は、ライブラリー１からのＬ１２、ライブラリー３からのＬ３３が、溶血アッセイでの野生型に比べて４〜１０倍有効性を大幅に増加させることを示した。ライブラリー３からのＬ３２は、野生型ＣＲＩｇと比較して１０倍改良されたＩＣ５０を示した。データはまた、細胞ベースアッセイからの結合親和性及び有効性が相関していないことを証明した。
【０１５２】
突然変異体の組合せ
第２世代ライブラリーからの結果に基づいて、更に溶血アッセイにおける有効性及び結合親和性を高めるために、突然変異体の第３世代を設計した。生物学上最も有力な突然変異体（Ｌ１２−８Ｗ、Ｌ３３−Ｑ６０Ｉ／Ｌ３２−Ｑ６４Ｒ及びＬ４１−Ｍ８６Ｙ）のうちの３つ、およびテンプレートとして最も高い結合親和性を有する突然変異体（Ｌ３２−Ｑ６４Ｒ）のうちの1つを選択した。次に、溶血アッセイにおける有効性及び結合親和性を高める最適な一連の突然変異体を判定するために、これらの突然変異体をライブラリーの第２世代において得られた他の生物学的に有力なクローンと結合させた。詳細な分析のために、ＣＲＩｇ変異体を発現させ精製した。データは、ＷＬ４１及びＷＬ５９突然変異体の結合親和性よりも３〜６倍高かったにも関わらず、Ｌ１２からの組合せ突然変異体の阻害活性が上がらず、親突然変異体と比較してより低い活性さえ示した（表４）。Ｌ３２からの突然変異体の中では、ＲＬ４１は、野生型よりも１．８倍優れた結合親和性と、６倍優れた溶血アッセイにおける有効性を示した。Ｌ３３グループからの全ての突然変異体は、溶血アッセイにおける有効性が有意に上がらなかったにもかかわらず、野生型と比較して約２７〜２２６倍の大幅に増加した結合親和性を示した。また、我々は親和性が改善された組合せクローンの大部分には、６０Ｉ−６４Ｒおよび８６Ｙが関係していることに気づいた。
【０１５３】
ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙ突然変異体の改善された結合親和性及び補体阻害活性
競合ＥＬＩＳＡ（図４及び表３）において最も高い親和性を有する突然変異体Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙを、更なる分析のために選択した。Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇ  ｗｔ及びＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの結合親和性を判定するために、ＣＲＩｇ  ｗｔおよびＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６ＹのＢｉａｃｏｒｅ分析を実施した。ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの親和性は、野生型ＣＲＩｇ（図６）よりも５倍改善された。以前の研究において、ＣＲＩｇ  ｗｔはＣ３ｂに選択的に結合するが天然Ｃ３には結合しないことを示した(Wiesman et al., Nature, 444(7116):217-20, 2006)。突然変異生成によりこの選択性が変わる可能性があるため、アルファスクリーン流体相競合アッセイにおいてＣ３と対比したＣ３ｂに対するＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの親和性を比較した。ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙは可溶性Ｃ３とではなく可溶性C３ｂと競合し、これにより突然変異生成が活性成分Ｃ３ｂ（図７）に対するＣＲＩｇの選択性に影響を及ぼさなかったことを示した。この選択性は、Ｃ３ｂと複合するＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの構造のこれらの残基の分析によって更に確認された（データ図示せず）。
【０１５４】
改善された親和性とＣ３ｂに対する保存された選択性が有効性の改善に繋がっているかどうかを試すために、補体第二経路に対して選択的な、赤血球ベースの溶血アッセイでＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙ対ＣＲＩｇ  ｗｔを試験した。ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙは、ＣＲＩｇ  ｗｔと比較して、４倍改善されたＩＣ５０を示した（図８Ａ）。第二経路補体阻害に対する改善された有効性をさらに立証するために、補体第二経路に対して選択的な、ＬＰＳベースアッセイでＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの阻害活性をＣＲＩｇ  ｗｔと比較した。ここで、ＣＲＩｇは、野生型組換えタンパク質と比較して、１８０倍改善されたＩＣ５０を示した。ＣＲＩｇ  ｗｔおよびＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙは、古典経路による補体活性に影響を与えなかった。このように、ＣＲＩｇ−Ｃ３ｂ結合界面の２つのアミノ酸置換により、補体第二経路に対する選択性を有する、２つの異なるアッセイにおいて改善された結合親和性と、優れた補体阻害活性を有する分子が得られた。
【０１５５】
増加した結合親和性および有効性が、治療有効性の改善と解釈されるかどうかを更に判定するために、ＣＲＩｇのｗｔ及びＱ６４Ｒ Ｍ８６Ｙバージョンの保護効果を関節炎の血清移植モデルで比較した。以前の研究ではＣＲＩｇが強力にコラーゲンおよび抗体によって誘発された関節炎の炎症および骨破壊を阻害することを示した(Katschke et al., J. Exp Med 204(6):1319-1325 (2007))。
【０１５６】
ここで、ＣＲＩｇの有効性を、免疫複合体によって媒介される関節炎の第３前臨床モデルにおいて試験した。慢性関節リウマチの自然発症マウスモデル（Ｋ／ＢｘＮ）は、関節炎によるヒトの疾病の多数の臨床及び組織学的特徴を模倣する。マウスに、第０日にＫ／ＢｘＮマウスから得られた５０マイクロリットルの血清を注射した。マウスを毎日検査し、疾患の範囲を目視観察によって記録した。第６日に全てのマウスを屠殺した。
【０１５７】
マウスには、１００μｌの無菌食塩水に混ぜた、示した量のアイソタイプコントロール又はｈＣＲＩｇ−ｍＩｇＧ１又はｈＣＲＩｇ−ＲＬ４１−ｍＩｇＧ１組換え型タンパク質のいずれかの皮下注射を第１日より開始した。
モニタリング及び評価：
各足のスコア
０＝ 紅斑および腫張なし
１＝足の中央（足根骨）又は足首に限定された紅斑および軽度の腫張
２＝足首から足の中央まで拡がった紅斑および軽度の腫張
３＝足首から中足骨の関節まで拡がった紅斑および中程度の腫張
４＝足首、足及び指を含む紅斑および重症の腫張
平均スコア＝４つの足のスコアの合計
疾病段階、軽度（平均スコア１〜３）、中程度（平均スコア４〜８）及び重度の疾病（平均スコア９以上）。平均スコアは、関連する関節の数を反映する。
第６日に、血液サンプルを屠殺前に麻酔をして心臓穿刺によって収集した。ｈＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質の量は、血清を使用して測定した。関節は、組織学評価のために収集した。
【０１５８】
Ｂａｌｂ／ｃ受容体へのＫＲＮマウスからの血清の接種により、関節の対称的な炎症によって特徴づけられる急速で強い免疫反応が起こる。関節炎の誘発は、関節に炎症性免疫複合体を形成する抗グルコース−６−リン酸イソメラーゼ自己抗体によって仲介される(Kouskoff, V., Korganow, A.S., Duchatelle, V., Degott, C., Benoist, C., and Mathis, D. (1996). Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell 87, 811-822.)。関節炎の発生は、補体第二経路成分が欠損しているマウス、及び共通のｆｃ-レセプタガンマ鎖が欠損しているマウスに疾病がないことから分かるように、無傷の補体第二経路及びＦｃレセプタ機能に全く依存している(Ji, H., Ohmura, K., Mahmood, U., Lee, D.M., Hofhuis, F.M., Boackle, S.A., Takahashi, K., Holers, V.M., Walport, M., Gerard, C., et al. (2002). Arthritis critically dependent on innate immune system players. Immunity 16, 157-168.)。疾病の急速な発症及び重症度のために、ＣＲＩｇ  ｗｔ−Ｆｃ融合タンパク質による治療では、関節炎の評価値は２２％しか減少しなかった（図９Ａ、Ｂ）。ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙによる治療では、関節炎のスコアは６６％減少した。組織学的検査は、ＣＲＩｇ  ｗｔ又はコントロール融合タンパク質治療をうけているマウスに対して、ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙによる治療を受けているマウスにおいて、主に好中球及びマクロファージから成る免疫細胞の溶浸がかなり減少することを示した（図９Ｃ、Ｄ）。ＣＲＩｇ  ｗｔ及びＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙの血清濃度は同程度であり、これは関節炎のスコアの違いがＣＲＩｇ  ｗｔ対ＣＲＩｇ Ｑ６４Ｒ Ｍ８６Ｙタンパク質の半減期の違いによるものでなかったことを示す。このように、標的のＣ３ｂに対するＣＲＩｇの結合親和性の増加が、大幅に改善された治療有効性と解釈されることが示される。
【０１５９】
本明細書に引用された全ての特許および参考文献は、参照することにより本明細書にそれら全体が明確に引用されたものとする。
【０１６０】
本発明は、特定の実施形態として考慮されることに関して記載されているが、本発明が上記実施形態に限定されないことを理解すべきである。それとは反対に、本発明は、添付の請求項の精神及び範囲内に含まれるさまざまな変更態様および等価物をカバーする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2015145369000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月10日(2015.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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