(57)【要約】      （修正有）【課題】日常の食生活において容易に入手及び摂取でき、副作用の少ない天然由来の脂肪細胞への分化抑制剤、及び脂肪細胞への分化を抑制する方法等を提供する。【解決手段】脂肪細胞形成抑制方法であって、前記対象に、治療有効量の脂肪細胞への分化抑制剤を投与することを含み、分化抑制剤がアカモク又はその処理物であることを特徴とする脂肪細胞形成抑制方法。アカモクの処理物が、アカモクの抽出物である脂肪細胞形成抑制方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象における脂肪細胞形成抑制方法であって、前記対象に、治療有効量の脂肪細胞への分化抑制剤を投与することを含み、分化抑制剤がアカモク（Sargassum horneri）又はその処理物であることを特徴とする脂肪細胞形成抑制方法。
【請求項２】
アカモクの処理物が、アカモクの抽出物であることを特徴とする請求項１記載の脂肪細胞形成抑制方法。
【請求項３】
アカモクの抽出物が、アカモクの水抽出物であることを特徴とする請求項２に記載の脂肪細胞形成抑制方法。
【請求項４】
アカモクの水抽出物が、３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物であることを特徴とする請求項３に記載の脂肪細胞形成抑制方法。
【請求項５】
脂肪細胞への分化抑制剤が、骨髄細胞から前駆脂肪細胞への分化抑制剤であることを特徴とする請求項１記載の脂肪細胞形成抑制方法。
【請求項６】
脂肪細胞への分化抑制剤が、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制剤であることを特徴とする請求項１記載の脂肪細胞形成抑制方法。
【請求項７】
対象が、マウス、ラット、トリ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒトから選ばれる一種又は二種以上であることを特徴とする請求項１記載の脂肪細胞形成抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、必要とする対象における脂肪細胞形成抑制方法であって、前記対象に、治療有効量の骨髄細胞から脂肪細胞への分化抑制剤を投与することを含み、分化抑制剤がアカモク（Sargassum horneri）又はその処理物である脂肪細胞形成抑制方法や、アカモク又はその処理物を有効成分として含有する脂肪細胞への分化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代謝の恒常性は、破骨細胞、骨芽細胞及び骨細胞によって調節されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。骨芽細胞は骨髄間葉系幹細胞から分化、形成され、骨形成及び石灰化を増進する。破骨細胞は、血液幹細胞から分化、形成され、骨の破壊をもたらす。骨組織は、これらの細胞の働きにより、その構築と再構築とよばれる生理的機構によって新陳代謝されており、その柔軟性と弾力性が維持されている。それらの過程には骨髄環境とともに多くのホルモン及びサイトカインが関与し、巧妙に調節されている。これらの調節機構の破綻は骨量の減少を伴って骨粗鬆症を含む、多種の骨疾患をもたらすことが知られている。
【０００３】
骨髄の間葉系幹細胞は、多能性の間質細胞（stromal cell）であり、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、脂肪細胞（adipocyte）等に分化することが知られている（例えば、非特許文献３〜５参照）。この分化の過程は複雑なシグナルシステムによって調節されており、かかるシグナルシステムに関与する因子としては、骨形態タンパク（bone morphogenic proteins; BMPs）、Ｗｎｔ ＭＭＴＶ統合部位（wingless type MMTV integration site）タンパク質、ヘッジホッグスdelta/jagged タンパク質、繊維芽細胞成長因子（fibroblastic growth factors）、インスリン（insulin）、インスリン様成長因子（insulin-like growth factors）、脂肪細胞と骨芽細胞の転写因子（peroxisome proliferators-activated receptor gamma;PPAγ及びrunt-related transcription factor 2; Runx2）（例えば、非特許文献６〜９参照）などのタンパク質調節因子が公知である。
【０００４】
骨髄間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化する際には、デキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン等の特異的ホルモン関連調節因子が関与して特異的に前駆脂肪細胞へと分化することが知られているが、骨髄の間葉系幹細胞が、脂肪細胞に分化するのか又は脂肪細胞以外の細胞に分化するのかということや、脂肪細胞への分化を抑制することができるのかということについては、昨今の高齢化社会において、肥満の予防又は治療に対する要請との関係で近年ますます注目されている。
【０００５】
脂肪細胞への分化を抑制する成分としては、シフォナキサンチンを有効成分とする脂肪前駆細胞分化抑制剤（例えば、特許文献１参照）や、エビスグサ、キキョウ、キハダ、クララ、ゴシュユ、スイカズラ、ハブソウ、ハマボウフウ、ビンロウから選ばれる植物の抽出物の１種又は２種以上を含有する前駆脂肪細胞分化抑制剤（例えば、特許文献２参照）や、環状ペプチドを有効成分とする前駆脂肪細胞の分化抑制剤（例えば、特許文献３参照）や、プロラクチン阻害剤を有効成分とする、脂肪細胞分化阻害剤（例えば、特許文献４参照）やＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ及び／又はＶａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕからなる脂肪細胞分化抑制能を有するペプチド（例えば、特許文献５参照）が提案されているが、十分な効果を有するとはいえず、脂肪細胞への分化を抑制する新規成分の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−００１５２４号公報
【特許文献２】特開２００５−２３９６５９号公報
【特許文献３】特開２００５−２２００７４号公報
【特許文献４】特開２０００−２１７５７６号公報
【特許文献５】特開平０６−２９３７９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Raggatt L.J., Partridge N.C. (2010) Cellular and molecular mechanisms of bone remodeling. J Biol Chem. 285:25103-25108.
【非特許文献２】Chambers T.J., Fuller K. (2011) How are osteoclasts induced to resorb bone? Ann. N. Y. Acad. Sci. 1240:1-6.
【非特許文献３】Chen G., Deng C., Li Y.P. (2012) TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation. Int. J. Biol. Sci. 8:272-288.
【非特許文献４】Minguel J.J., Erices A., Conget P. (2001) Mesenchymal stem cells. Exp. Biol. Med. 226:507-520.
【非特許文献５】Muruganandan S., Roman A.A., Sinal C.J. (2009) Adipocyte differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: cross talk with the osteoblastogenesis program. Cell. Mol. Life Sci. 66:236-253.
【非特許文献６】Laudes M. (2011) Role of WNT signalling in the determination of human mesenchymal stem cells into preadipocytes. J. Mol. Endocrinol. 46:R65-72.
【非特許文献７】Gharibi B., Abraham A.A., Ham J., Evans B.A. (2011) Adenosine receptor subtype expression and activation influence the differentiation of mesenchymal stem cells to osteoblasts and adipocytes. J. Bone Miner Res. 26:2112-2124.
【非特許文献８】Kawai M., Rosen C.J. (2010) PPARγ: a circadian transcription factor in adipogenesis and osteogenesis. Nat. Rev. Endocrinol. 6:629-636.
【非特許文献９】Wu L., Cai X., Dong H., Jing W., Huang Y., Yang X., Wu Y., Lin Y. (2010) Serum regulates adipogenesis of mesenchymal stem cells via MEK/ERK-dependent PPARγ expression and phosphorylation. J. Cell. Mol. Med. 14:922-932.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、日常の食生活において容易に入手及び摂取でき、副作用の少ない天然由来の脂肪細胞への分化抑制剤や、必要とする対象において脂肪細胞への分化を抑制する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ワカメ（Undaria pinnatifida）、アラメ（Eisenia bicyclis）、テングサ（Gelidium amansii）、アナアオサ（Ulva pertusa Kjellman）等の種々の食用海藻について研究を進めてきたが、浅海に多産する褐藻類ヒバマタ目ホンダワラ属の海藻として知られているアカモクについて、その処理物を有効成分とする抗骨粗鬆症作用を発揮する骨量増進組成物（特開２００３−０２６５９７）や、アカモク又はその処理物を有効成分として含有する糖尿病態の予防・改善剤（特開２００４−２１７５５９）や、アカモク又はその処理物を有効成分として含有するＮＦ−κＢ阻害剤（特開２０１３−２１３００７）を提案してきた。本発明者らは、さらに検討を続け、アカモクの水抽出物が、骨髄間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を抑制する作用を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）必要とする対象における脂肪細胞形成抑制方法であって、前記対象に、治療有効量の脂肪細胞への分化抑制剤を投与することを含み、分化抑制剤がアカモク又はその処理物であることを特徴とする脂肪細胞形成抑制方法；
（２）アカモクの処理物が、アカモクの抽出物であることを特徴とする上記（１）記載の脂肪細胞形成抑制方法；
（３）アカモクの抽出物が、アカモクの水抽出物であることを特徴とする上記（２）に記載の脂肪細胞形成抑制方法；
（４）アカモクの水抽出物が、３０００以下の分子量からなるアカモク水抽出物であることを特徴とする上記（３）に記載の脂肪細胞形成抑制方法；
（５）脂肪細胞への分化抑制剤が、骨髄細胞から前駆脂肪細胞への分化抑制剤であることを特徴とする上記（１）記載の脂肪細胞形成抑制方法；
（６）脂肪細胞への分化抑制剤が、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制剤であることを特徴とする上記（１）記載の脂肪細胞形成抑制方法；
（７）対象が、マウス、ラット、トリ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒトから選ばれる一種又は二種以上であることを特徴とする上記（１）記載の脂肪細胞形成抑制方法；
【００１１】
また、本発明は以下に関する。
１）アカモク又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞への分化抑制剤； 
２）アカモクの処理物が、アカモクの抽出物であることを特徴とする上記１）に記載の分化抑制剤；
３）アカモクの抽出物が、アカモクの水抽出物であることを特徴とする上記２）に記載の分化抑制剤；
４）アカモクの抽出物が、３０００以下の分子量からなるアカモク抽出物であることを特徴とする上記２）又は３）に記載の分化抑制剤；
５）上記１）〜４）のいずれかに記載の脂肪細胞への分化抑制剤を含有することを特徴とする脂肪細胞形成抑制剤；
６）上記１）〜４）のいずれかに記載の脂肪細胞への分化抑制剤を含有することを特徴とする抗肥満剤；
７）アカモク又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞過形成による病態の予防・改善用機能性食品又は食品素材；
８）アカモクの処理物が、アカモクの抽出物であることを特徴とする上記７）記載の脂肪細胞過形成による病態の予防・改善用機能性食品又は食品素材；
９）アカモク又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とする脂肪細胞過形成による病態の予防・改善用飼料；
１０）アカモクの処理物が、アカモクの抽出物であることを特徴とする上記９）記載の脂肪細胞過形成による病態の予防・改善用飼料；
１１）アカモク又はその処理物の、脂肪細胞への分化抑制剤を製造するための使用。
１２）アカモク又はその処理物の、脂肪細胞形成抑制剤を製造するための使用。
１３）脂肪細胞への分化抑制剤に使用するためのアカモク又はその処理物。
１４）脂肪細胞形成抑制剤に使用するためのアカモク又はその処理物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤は、長年食用とされてきた天然物から抽出、精製することによって得ることができるため、安全性が高く、内臓組織や皮下組織において脂肪の蓄積を抑制する脂肪蓄積抑制作用や、肥満防止作用、セルライト生成抑制作用、高脂血症抑制作用を奏し、また、経口投与することができるという優れた効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アカモクの水抽出物が０、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された前駆脂肪細胞への分化用培養液中で、前駆脂肪細胞への分化形成期の培養を行い、次いで、アカモクの水抽出物が０、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された脂肪細胞への分化用培養液中で、脂肪細胞への分化形成期の培養を行った場合に形成される脂肪細胞数を示すグラフである。
【図２】アカモクの水抽出物が０、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された前駆脂肪細胞への分化用培養液中で、前駆脂肪細胞への分化形成期の培養を行い、次いで、アカモクの水抽出物が０、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された脂肪細胞への分化用培養液中で、脂肪細胞への分化形成期の培養を行った場合の細胞試料の吸光度を示すグラフである。
【図３】アカモクの水抽出物が０、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された前駆脂肪細胞への分化用培養液中で、前駆脂肪細胞への分化形成期の培養を行い、次いで、アカモク水抽出物を添加しない脂肪細胞への分化用培養液中で、脂肪細胞への分化形成期の培養を行った場合の細胞の吸光度を示すグラフである。
【図４】アカモク水抽出物を添加しない前駆脂肪細胞への分化用培養液中で、前駆脂肪細胞への分化形成期の培養を行い、次いで、アカモクの水抽出物が０、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された脂肪細胞への分化用培養液中で、脂肪細胞への分化形成期の培養を行った場合の細胞の吸光度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の脂肪細胞形成抑制方法としては、必要とする対象に治療有効量の脂肪細胞への分化抑制剤を投与することを含み、分化抑制剤がアカモク又はその処理物であることを特徴とする、前記対象における脂肪細胞形成抑制方法であれば特に制限されるものではなく、アカモク又はその処理物としては、常温水、熱水、脱イオン水等の水を用いて可溶性成分を分離することにより得られたアカモク水抽出物や、アルコール水、ヘキサン等の有機溶媒を用いて可溶性成分を分離することにより得られたアカモク有機溶媒抽出物や、アカモク全体を乾燥させて得られたアカモク乾燥物や、乾燥させたアカモクを粉末化処理して得られたアカモク乾燥粉末や、セルラーゼなどの酵素を用いてアカモクを処理することにより得られたアカモク酵素処理物などを挙げることができ、これらの中でもアカモク水抽出物やアカモク有機溶媒抽出物が好ましく、中でもアカモクの水抽出物を好適に例示することができる。
【００１５】
本発明の脂肪細胞（成熟脂肪細胞を含む）への分化抑制剤としては、アカモク又はその処理物を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、上記アカモク水抽出物やアカモク有機溶媒抽出物は、そのままで脂肪細胞への分化抑制剤の有効成分として用いることができるが、当該抽出物を、更に適当な精製手段、例えばシリカゲルカラムクロマト法、逆相カラムクロマト法、ゲル濾過クロマトグラフ法、膜ろ過法などにより脂肪細胞への分化抑制活性の高い画分を分画して用いることもできる。脂肪細胞への分化抑制活性の高い画分としては、３００００以下の分子量、好ましくは１００００以下の分子量、より好ましくは５０００以下の分子量、さらに好ましくは３０００以下の分子量からなるものを好適に例示することができる。
【００１６】
アカモク又はその処理物の調製方法としては、例えば、生アカモクを水で洗浄後、ホモジナイザー等で破砕処理したものに１〜５倍量、好ましくは２〜４倍量、特に好ましくは３倍量程度の常温水、熱水、脱イオン水等の水や、５〜８０％、好ましくは１０〜４０％、より好ましくは２０％程度のメタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール水、ヘキサンなどの各種有機溶媒を加えて抽出処理し、４０００〜７０００ｇ、好ましくは５０００〜６０００ｇで５〜１５分間、好ましくは１０分間程度遠心処理して、可溶性画分を分離することにより、アカモク有機溶媒抽出物やアカモク水抽出物を調製する方法や、生アカモクを水で洗浄後、凍結真空乾燥、天日乾燥、風乾、熱風乾燥、加熱乾燥、マイクロ波乾燥等により乾燥する方法を挙げることができるが、破砕処理したアカモクに３倍量程度の水を加えて抽出処理し、５０００〜６０００ｇで１０分間程度遠心処理して、可溶性画分を分離する方法を好適に例示することができる。また、抽出処理するアカモクとしては、破砕処理しないインタクトなアカモクを用いることもでき、その場合は、抽出処理後にホモジナイザー等で破砕処理することが好ましい。また、採取したアカモクをすぐに加工処理しない場合は、１０℃以下の低温、例えば４〜５℃にて保存することが好ましい。
【００１７】
脂肪細胞への分化抑制剤が、脂肪細胞への分化を抑制する作用を有するか否かを確認する方法としては、骨髄間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させるための培養液に被検分化抑制剤を添加又は添加することなく骨髄間葉系幹細胞を培養したのち、形成された脂肪細胞数を計測し、被検分化抑制剤を添加しない場合と比較して、被検分化抑制剤を添加した場合に脂肪細胞へ分化した細胞が有意に少ないときに、当該被検分化抑制剤は、骨髄間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化抑制作用を有すると決定することができる（方法１）。
【００１８】
脂肪細胞への分化抑制剤が、脂肪細胞への分化を抑制する作用を有するか否かを確認する別法としては、（ａ）被検分化抑制剤を添加又は添加しない前駆脂肪細胞への分化用培養液中で、骨髄間葉系幹細胞を培養したのち、脂肪細胞への分化用培養液中で培養し、形成された脂肪細胞数を計測し、前駆脂肪細胞への分化形成期に、被検分化抑制剤を添加しない場合と比較して被検分化抑制剤を添加した場合に、形成された脂肪細胞が有意に少ないときに、当該被検分化抑制剤が骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への分化抑制作用を有すると決定することができ（方法２）、（ｂ）前駆脂肪細胞への分化用培養液中で、骨髄間葉系幹細胞を培養したのち、上記脂肪細胞への分化用培養液に被検分化抑制剤を添加又は添加しない培養液中で、前駆脂肪細胞を培養して脂肪細胞へ分化させる培養後、形成された脂肪細胞数を計測し、脂肪細胞への分化形成期に被検分化抑制剤を添加しない場合と比較して、被検分化抑制剤を添加した場合に形成された脂肪細胞が有意に少ないときに、当該被検分化抑制剤は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制作用を有すると決定することができる（方法３）。
【００１９】
上記前駆脂肪細胞へ分化させる培養方法としては、牛胎児血清を含有する培養液にデキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン等の細胞分化促進因子を添加した前駆脂肪細胞への分化用培養液中で骨髄間葉系幹細胞を培養する方法を具体的に例示することができ、上記脂肪細胞へ分化させる培養方法としては、牛胎児血清を含有する培養液にインスリン等の細胞分化促進因子を添加した脂肪細胞への分化用培養液に培地交換後、前駆脂肪細胞を培養する方法を具体的に例示することができる。
【００２０】
上記前駆脂肪細胞への分化の培養期間としては、６〜９０時間、好ましくは２４〜７２時間、より好ましくは３６〜６０時間、さらに好ましくは４２〜５４時間、特に好ましくは４５〜５１時間を挙げることができる。また、上記脂肪細胞への分化の培養期間としては、１〜７日間、好ましくは２〜６日間、より好ましくは３〜５日間、さらに好ましくは３．５〜５．５日間を挙げることができる。
【００２１】
前記形成された脂肪細胞数は、常法により計測・確認することができるが、例えば、培養液を除去した細胞をホルマリン溶液で固定した後、オイルレッド試薬を添加して、染色された細胞数を計測することにより確認する方法や、オイルレッド試薬を添加することにより染色された細胞を、さらに、イソブチルアルコールに溶解して細胞内に取り込まれた染色色素を抽出し、得られた抽出液をオイルレッド色素の吸収波長である４９０ｎｍにおける吸光度を測定した場合の吸光度の多寡により、形成された脂肪細胞数を計測・確認する方法を挙げることができる。
【００２２】
本発明の脂肪細胞形成抑制方法において、必要とする対象とは、脂肪細胞形成抑制をすることが必要とされる対象、脂肪細胞過形成が関与する病態を治療する必要がある対象、かかる病態が生じることを予防する必要がある対象等を挙げることができる。脂肪細胞過形成が関与する病態としては、脂肪蓄積、肥満、セルライト生成、高脂血症等を例示することができ、とりわけ骨髄間葉系幹細胞から脂肪細胞への過剰な分化によって脂肪細胞が過形成されたことにより引き起こされる病態を挙げることができる。
【００２３】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤は、脂肪細胞形成抑制作用、脂肪蓄積抑制作用や、肥満防止作用、セルライト生成抑制作用、高脂血症抑制作用等を有することから、これらの作用を有する医薬品として、また、脂肪細胞過形成が関与する病態の予防剤や症状改善剤として、さらに食品に添加配合することにより該食品を脂肪細胞過形成が関与する病態の予防・改善作用を有する機能性食品とするための薬理組成物素材として、有利に用いることができる
【００２４】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤の治療有効量としては、必要とする対象において脂肪細胞形成抑制作用を付与することができる量であれば特に制限されず、例えば、アカモク水抽出物（乾燥重量）は１日あたり、０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で摂取することにより、また、アカモク乾燥物は１日あたり１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で摂取することにより、脂肪細胞過形成による病態の予防・改善作用をもたらすが、症状、性別、年齢等に応じて、摂取量は適宜調整することができ、上記治療有効量としては、上記脂肪細胞過形成が関与する病態を治療するための量を挙げることができるが、上記脂肪細胞過形成が関与する病態を予防するための有効量を便宜上含めることができる。
【００２５】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤の投与形態としては、経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液等の剤型を注射する形態を挙げることができる。また、本発明の脂肪細胞への分化抑制剤は、脂肪細胞の過形成が関与する疾患の治療、予防に有用な医薬品、サプリメント、機能性食品として用いることができる。
【００２６】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤を脂肪細胞形成抑制剤等の医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することにより、抗肥満剤、内臓脂肪や皮下脂肪の脂肪蓄積予防剤、抗セルライト生成剤、高脂血症剤等を調製することができ、これらの他の肥満、高脂血症等の脂肪細胞過形成が関与する病態の他の治療薬と併用することもできる。
【００２７】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤は、脂肪細胞過形成の病態の予防・改善用の機能性食品又は食品素材の製造に用いることができる。かかる分化抑制剤は、機能性食品又は食品素材の製造工程又は製造後に添加・配合することができる。
【００２８】
上記食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料などを具体的に例示することができる。
【００２９】
本発明における脂肪細胞への分化抑制剤は、脂肪細胞過形成の病態の予防・改善用飼料の製造に用いることができる。かかる予防・改善用飼料は、マウス、ラット、トリ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類等の飼料、より詳細には、ブタ、ヒツジ、ウシ等の家畜用の飼料や、ニワトリ等の家禽用の飼料やネコ、イヌ等のダイエット用飼料や、マウス、ラット等の実験用飼料に、アカモク又はその処理物を配合することにより調製することができ、かかるアカモク又はその処理物が有効成分として配合された飼料は、家畜や家禽やペットや実験動物の脂肪細胞過形成の病態の予防・改善に有用である。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］
（アカモク水抽出物の調製）
海藻アカモクは静岡県下田市及び岩手県宮古市の沿岸から採取した。水洗されたアカモクは、精製蒸留水中でホモジナイズ（粉砕）後、５５００ｇにて１０分間遠心分離し、その上清液をアカモク水溶性抽出物として凍結乾燥した。凍結乾燥したアカモク水溶性抽出物は、精製蒸留水に溶解され、膜分画法で分子量３０００以下の画分を分離することにより、アカモク水抽出物を調製した。かかるアカモク水抽出物を凍結乾燥し、実験に使用するときには精製蒸留水に溶解して用いた。
【００３２】
（骨髄間葉系幹細胞の調製）
マウス骨髄間葉系幹細胞を以下のとおり採取した。マウス（ＣＤ１−Ｅｌｉｔｅ野生型、雌２か月齢）は、チャールスリバー社（ＵＳＡ）から購入し、病原菌のない動物飼育室で飼育した。該マウスから得られた大腿骨及び頸骨は、ダルベッコ改良イーグル培養液（Invitrogen Corporation社製 (Carlsbad, CA, USA)）中において、無菌的に筋肉組織を除去し、それぞれの骨幹部を卓上遠心分離（１００００ｒｐｍにて１分間）することによって無菌的に骨髄細胞を分離し、ダルベッコ改良イーグル培養液に懸濁して骨髄細胞懸濁液を調製した。かかる骨髄細胞懸濁液は、さらに１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離後洗浄した。さらに赤血球の除去処理を行い、マウス骨髄間葉系幹細胞を得た。
【００３３】
［アカモク水抽出物の骨髄間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化抑制作用についての検討］
上記アカモク水抽出物が、マウス骨髄間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を抑制するか否かを検討した。
【００３４】
（骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への培養１）
上記マウス骨髄間葉系幹細胞（１×１０６細胞数／培養穴／ｍＬ、１２穴プレート）は、１０％の牛胎児血清（Hyclone社製、USA）と、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ/ｍＬ）（Invitrogen Corporation社製 (Carlsbad, CA, USA)）とを含有するダルベッコ改良イーグル培養液（Invitrogen Corporation社製 (Carlsbad, CA, USA)）中に、１μＭ／ｍＬのデキサメタゾン（Sigma-Aldrich社製）と、０．５ｍＭ／ｍＬの３−イソブチル−１−メチルキサンチンとを細胞分化促進因子として添加した前駆脂肪細胞への分化用培養液を調製した。この培養液に、０（対照１）、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの上記アカモク水抽出物を添加した各培養液中で、３７℃にて４８時間培養した。また、対照２として、アカモクを添加せず、かつ、デキサメタゾンと３−イソブチル−１−メチルキサンチンとを添加しない培養液を用いて上記マウス骨髄間葉系幹細胞を同様に培養した。
【００３５】
（前駆脂肪細胞から脂肪細胞への培養１）
上記４８時間培養した細胞について、１０％牛胎児血清と１％ペニシリン−ストレプトマイシンとを含有するダルベッコ改良イーグル培養液に、１０μｇ／ｍＬのインスリンを添加した脂肪細胞への分化用培養液を調製した。この培養液に、０（対照１）、５、１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの上記アカモクの水抽出物を添加した各培養液中で、さらに３７℃にて４日間培養した。また、対照２については、アカモクを添加せず、かつ、インスリンを添加しない培養液を用いて前駆脂肪細胞を培養した。
【００３６】
培養液を除去後、細胞を１０％ホルマリン溶液で固定した後、オイルレッド試薬を添加して、脂肪細胞を染色し、脂肪細胞数を計測した。結果を図１に示す。その後、オイルレッド染色した細胞に０．２ｍＬのイソブチルアルコールを添加して１０分間振とう溶解し、Spectra Count microplate photometerにより、４９０ｎｍの波長で測定した吸光度を示す。データは、それぞれのグループ毎に、８検体の平均値とその標準偏差で示した。*ｐ＜０.００１は、アカモクを添加せず、細胞分化促進因子類も添加しなかった対照２（白バー）と比較して有意差がある場合を示し、**ｐ＜０.００１は、アカモクを添加せず細胞分化促進因子類を添加した対照１（グレーバー）と比較して有意差がある場合を示す。結果を図２に示す。
【００３７】
（結果）
図１から明らかなとおり、アカモクの水抽出物を添加した培養液においては、形成される脂肪細胞数が、濃度依存的に有意に減少することが確認され、特に１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された場合、対照１と比較して脂肪細胞の形成が有意に抑制された。また、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加された場合、細胞分化促進因子類を添加しない場合と同程度、又はそれ以下の脂肪細胞数となった。また、図２から明らかなとおり、アカモクの水抽出物を添加した培養液においては、濃度依存的にオイルレッドが特異的に吸収する４９０ｎｍにおける吸光度が対照１と比較して減少し、特に１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加した場合に、対照１と比較して有意に減少することが確認された。これらの結果により、アカモク水抽出物が、骨髄間葉系幹細胞からの脂肪細胞への分化や脂肪細胞の形成を有意に抑制することが確認された。
【００３８】
［実施例２］
［アカモク水抽出物の骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への分化抑制作用についての検討］
実施例１において調製されたアカモク水抽出物が、骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への分化を抑制するか否かを検証した。
【００３９】
（骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への培養２）
実施例１において調製されたマウス骨髄間葉系幹細胞は、上記「骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への培養１」と同様の手順で、各培養液において、４８時間の培養がされた。対照２についても同様に調製した。
【００４０】
（前駆脂肪細胞から脂肪細胞への培養２）
上記各培養液において４８時間培養した細胞について、アカモク水抽出物が添加されていない脂肪細胞分化用培養液に交換したことの他は、上記「前駆脂肪細胞から脂肪細胞への培養１」と同様の手順で、４日間の培養がされた。
【００４１】
培養液を除去後、細胞を１０％ホルマリン溶液で固定し、オイルレッド試薬を添加して、脂肪細胞を染色し、オイルレッド染色した細胞に０．２ｍＬのイソブチルアルコールを添加して１０分間振とう溶解し、４９０ｎｍの波長で測定した吸光度を示す。データは、それぞれのグループ毎に、８検体の平均値とその標準偏差で示した。*ｐ＜０.００１は、アカモクを添加せず、細胞分化促進因子類も添加しなかった対照２（白バー）と比較して有意差がある場合を示し、**ｐ＜０.００１は、アカモクを添加せず細胞分化促進因子類を添加した対照１（グレーバー）と比較して有意差がある場合を示す。結果を図３に示す。
【００４２】
（結果）
図３から明らかなとおり、前駆脂肪細胞へ分化させるために、アカモクの水抽出物を添加した培養液においては、濃度依存的にオイルレッドが特異的に吸収する４９０ｎｍにおける吸光度が対照１と比較して減少し、特に１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加した場合に、対照１と比較して有意に減少することが確認された。これらの結果により、アカモク水抽出物が、骨髄間葉系幹細胞からの前駆脂肪細胞への分化や脂肪細胞の形成を有意に抑制することが確認された。
【００４３】
［実施例３］
［アカモク水抽出物の前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制作用についての検討］
実施例１において調製されたアカモク水抽出物が、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を抑制するか否かを検証した。
【００４４】
（骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への培養３）
実施例１において調製されたマウス骨髄間葉系幹細胞は、アカモク水抽出物が添加されていない前駆脂肪細胞分化用培養液中で培養されたことの他は、上記「骨髄間葉系幹細胞から前駆脂肪細胞への培養１」と同様の手順で、各培養液において４８時間の培養がされた。
【００４５】
（前駆脂肪細胞から脂肪細胞への培養３）
上記４８時間培養した細胞について、実施例１の「前駆脂肪細胞から脂肪細胞への培養１」と同様の手順で、細胞を４日間培養した。
【００４６】
培養液を除去後、細胞を１０％ホルマリン溶液で固定し、オイルレッド試薬を添加して、脂肪細胞を染色し、オイルレッド染色した細胞に０．２ｍＬのイソブチルアルコールを添加して１０分間振とう溶解し、４９０ｎｍの波長で測定した吸光度を示す。データは、それぞれのグループ毎に、８検体の平均値とその標準偏差で示した。*ｐ＜０.００１は、アカモクを添加せず、細胞分化促進因子類も添加しなかった対照２（白バー）と比較して有意差がある場合を示し、**ｐ＜０.００１は、アカモクを添加せず細胞分化促進因子類を添加した対照１（グレーバー）と比較して有意差がある場合を示す。結果を図４に示す。
【００４７】
（結果）
図４から明らかなとおり、脂肪細胞分化形成期に、アカモクの水抽出物を添加した培養液においては、濃度依存的に、特に１０、２５、５０μｇ／培養液ｍＬの各濃度で添加した場合に、オイルレッドが特異的に吸収する４９０ｎｍにおける吸光度が対照と比較して有意に減少することが確認された。これらの結果により、アカモク水抽出物が、前駆脂肪細胞からの脂肪細胞への分化や脂肪細胞の形成を有意に抑制することが確認された。
【００４８】
（考察）
以上の結果より、アカモク抽出物は、骨髄間葉系幹細胞からの前駆脂肪細胞への分化の過程と、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化の過程との両方に作用し、脂肪細胞の形成を抑制する作用、脂肪蓄積抑制作用、肥満防止作用、セルライト抑制作用、脂肪合成抑制作用を発揮する可能性を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、海藻アカモク又はその処理物、特に３０００以下の分子量からなるアカモク抽出物を有効成分として用いることにより、骨髄間葉系幹細胞からの前駆脂肪細胞さらには脂肪細胞への分化を抑制することができるため、脂肪細胞過形成の病態の予防や治療をすることができる。また、食経歴の長い海藻であるアカモクからの調製物であるため安全性が高く、若い時期から日常的に予防目的で摂取することができるので、個人の老後の健康的な生活に資するばかりでなく、高齢化社会の医療費削減への貢献が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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