(57)【要約】      （修正有）【課題】信号分解能を多次元において高める方法を有する非線形顕微鏡システムを提供する。【解決手段】レーザ１２２と、シングル・モード・ファイバ１２４、モード変換器１２６、及び高次モード・ファイバ１２８を備える光伝送システムとを備え、光源から光を受けて構造化された自由空間ビームを供給する光伝送システムは、試料の一領域に光を当てて、埋め込みガウス・ビームの幅に相当する幅を有するガウス・ビームに関連する空間領域より小さい空間領域において非線形応答を生成すること。【選択図】図３Ａ
2015072494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源から光を受け、試料の一領域に光を当てて前記試料の空間領域に非線形応答を生成するための構造化された自由空間ビームを供給する光伝送システムと、
を備え、
前記試料の一領域に伝送された前記構造化された自由空間ビームが、高次モードのファイバの端面から高次のＬＰモードの自由空間出力を備え、前記ファイバの出力が、知られている１よりも大きいＭ２パラメータ、及びＭと１に等しいＭ２パラメータを有する埋め込みガウス・ビームの位置依存性ビーム幅ω（ｚ）との積として表現できるビーム幅を伴う非ガウス形状を有するように前記光伝送システムは構成され、
前記構造化された自由空間ビームによって生成された前記非線形応答の前記空間領域が幅を有し、前記幅は、前記試料に前記構造化された自由空間ビームの前記埋め込みガウス・ビームのみによって光が当てられた際に生成される前記非線形応答の空間領域の幅よりも小さくなるように前記非ガウス形状は構造化される、非線形光システム。
【請求項２】
前記構造化されたビームを前記試料の上に合焦する照射組立体をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記照射組立体が、前記構造化されたビームに前記試料の範囲にわたって走査させる、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記光伝送システムが、シングル・モード・ファイバと、モード変換器と、高次モード・ファイバとを備え、
前記構造化された自由空間ビームが、前記高次モード・ファイバの端面における出力として提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記モード変換器が、前記高次モード・ファイバの少なくとも１つの低次の高次モードを励起するよう構成される、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記非線形応答を検出し、前記非線形応答から導き出された信号を使用して、前記試料の顕微鏡画像を生成する画像化組立体をさらに備える、請求項１に記載の光システム。
【請求項７】
共焦点分解能を前記顕微鏡画像に付加する出力ピンホール組立体をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
試料から顕微鏡画像を生成する方法であって、
（ａ）光を光源から受け、
（ｂ）前記光の低次の高次モードを励起し、
（ｃ）構造化された自由空間ビームを供給し、
（ｄ）試料の一領域を前記構造化された自由空間ビームで照射し、そして、
（ｅ）前記試料の空間領域に非線形応答を生成し、
前記試料の一領域に伝送された前記構造化された自由空間ビームが、高次モードのファイバの端面から高次のＬＰモードの自由空間出力を備え、前記ファイバの出力が、知られている１よりも大きいＭ２パラメータ、及びＭと１に等しいＭ２パラメータを有する埋め込みガウス・ビームの位置依存性ビーム幅ω（ｚ）との積として表現できるビーム幅を伴う非ガウス形状を有するように前記光伝送システムは構成され、
前記構造化された自由空間ビームによって生成された前記非線形応答の前記空間領域が幅を有し、前記幅は、前記試料に前記構造化された自由空間ビームの前記埋め込みガウス・ビームのみによって光が当てられた際に生成される前記非線形応答の空間領域の幅よりも小さくなるように前記非ガウス形状は構造化される、方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｄ）は、前記構造化された自由空間ビームに前記試料の範囲にわたって走査させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｆ）前記非線形放出から導き出された非線形信号を使用して前記試料の顕微鏡画像を生成する、ことをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｆ）共焦点分解能を前記顕微鏡画像に付加するために出力ピンホールを使用する、ことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１１月２５日に出願した米国仮出願第６１／２６４，５３８号、及び２００９年１１月３０日に出願した米国仮出願第６１／２６５，２７１号の優先権を主張するものである。これらの出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、一般に、非線形光システムに関し、詳細には、高次モード（ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒｄｅｒ  ｍｏｄｅ）光ファイバを使用する、改良された非線形光システム及び技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
非線形顕微鏡システムなど、非線形光システムでは、パルス・レーザ・ビームが、試料の上に密に合焦され、光出力を試料から生成させる。非線形信号が、光出力から導き出され、この非線形信号が、試料の顕微鏡画像を生成するために使用されうる。複数の異なる高次の光と物質の相互作用（ｌｉｇｈｔ−ｍａｔｔｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が、２光子蛍光（ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、第二高調波発生（ｓｅｃｏｎｄ−ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、第三高調波発生、ラマン散乱、などを含む、非線形光システムで使用されうる。多光子放出（ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）プロセスでは、入射光強度と放出された放射との間の関係は、非線形である。例えば、２光子励起に対して、その関係は二次である。この非線形関係の結果として、従来のガウス・ビームの中央の空間部分だけが、放出された放射の強度に実質的に寄与する。それ故、レーザ・ビームが密に合焦される部分には、レーザ・ビームが、より拡散する部分よりはるかに多くの多光子放射が生成される。事実上、励起は焦点体積（ｆｏｃａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）に限定され、焦点はずれの対象を高度に排除する結果をもたらす。同様の作用が、第二高調波発生、第三高調波発生、ラマン散乱、光誘起化学反応、材料破損（ｍａｔｅｒｉａｌ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）、などを含む、他のタイプの光と物質の相互作用において発生する。
【０００４】
図１Ａは、従来技術による例示的非線形顕微鏡システム２０の動作の基本原理を示す図である。フェムト秒レーザ２２は、パルス・レーザ・ビーム２８を自由空間出力として供給する端面２６を有する、シングル・モード・ファイバ（ＳＭＦ）２４で誘導されるパルス・レーザ出力の形で、入射光を供給する。レーザ・ビーム２８は、走査ミラー組立体３０によって、顕微鏡画像が生成されるべき試料３４の上にビームを合焦させる対物レンズ３２に導かれる。レーザ・ビーム２８は、蛍光色素分子（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の多光子励起を試料の励起体積（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）の中に発生させるのに十分な強度を有する。多光子励起、例えば２光子蛍光、の量を表す強度レベルを有する蛍光３６が、放出される。
【０００５】
励起に必要な光子の数は、蛍光を作り出すために使用される、特定のタイプの光と物質の相互作用によって決まる。本議論では、顕微鏡システム２０は、２光子励起を使用することが仮定されている。しかし、本議論は、第二高調波発生、第三高調波発生、ラマン散乱、などを含む、他のタイプの光と物質の相互作用を使用する非線形顕微鏡に適用されることが理解されよう。
【０００６】
放出された蛍光は、フォトダイオード、光電子増倍管、または類似の素子など、適切な検出器３８によって検出される。合焦されたレーザ・ビーム２８を試料の一領域にわたって走査することで、ポイント毎の強度データを収集することが可能になる。あるいは、ビームの位置が固定されたままで、試料が、ビームに対して適所に走査されてよい。次いで、画像生成器４０が、強度データを使用して、走査された試料の領域の顕微鏡画像を生成する。
【０００７】
図１Ｂは、従来技術による走査型共焦点非線形顕微鏡システム５０の図を示す。図１Ａに示す顕微鏡システムと同様に、システム５０は、フェムト秒レーザ５２及びパルス・レーザ出力５８を供給する端面５６を有するシングル・モード・ファイバ５４を含む。走査ミラー組立体６０は、レーザ出力５８を対物レンズ６２に導き、対物レンズ６２は、レーザ出力５８を試料６４の上に密に合焦し、それにより、励起体積における蛍光色素分子の多光子励起及び蛍光６６の放出を結果としてもたらす。
【０００８】
図１Ｂの顕微鏡は、出力ピンホール組立体６８を含み、出力ピンホール組立体６８は、検出器レンズ（ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｌｅｎｓ）７０を使用して放出された蛍光を合焦し、その蛍光を入力として第２のシングル・モード・ファイバ（ＳＭＦ）７２の中に供給することによってもたらされ、第２のシングル・モード・ファイバ７２は、次いで、合焦された蛍光を検出器７４に誘導し、検出器７４は、蛍光強度データを画像生成器７６に供給する。ピンホール組立体６８を使用することで、深さ分解能（即ち、距離分解能）が顕微鏡システム５０に付加される。というのは、入射光ビームの焦点の中で生成された信号だけが、検出器７２による測定のために、第２のＳＭＦ７０の中に効率的に結合されうるからである。この設定で、試料の３次元非線形画像が、試料を、横方向のほかに軸方向にも走査することによって得られる。
【０００９】
図１Ａ及び図１Ｂに示す顕微鏡システムでは、試料への入射光を供給するために使用されるパルス・レーザ・ビームが、近ガウス（ｎｅａｒ−Ｇａｕｓｓｉａｎ）形状を有する基本的ＬＰ０１横モードを使用して、レーザから対物レンズに誘導される。システム２０、５０の両システムでは、レーザ・ビームを対物レンズに誘導するシングル・モード・ファイバ２４、５４は、非ガウス（ｎｏｎ−Ｇａｕｓｓｉａｎ）形状を明確に有する高次モードにおける伝播をサポートしない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
その近ガウス形状のため、ＬＰ０１モードのレーザ・ビームは、高次モードのレーザ・ビームよりも狭いビーム幅に合焦されうる。このため、最近の非線形顕微鏡システムは、ＬＰ０１モードのレーザ・ビームを使用して、入射励起光を供給してきた。非線形光システムにおける励起の局在性（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、典型的には、線形光システムで達成されるよりはるかに高い空間分解能を、結果としてもたらす。しかし、顕微鏡システムの性能を、より一層改良することが望ましいであろう。特に、信号分解能を多次元において高める方法を見出すことが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の態様は、改良された非線形光システム及び技術に関する。本発明の一実施形態は、レーザなどの光源と、シングル・モード・ファイバ、モード変換器、及び高次モード・ファイバを備える光伝送システムとを備え、光源から光を受けて、構造化された自由空間ビームを供給する光伝送システムが、埋め込みガウス・ビーム（ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｇａｕｓｓｉａｎ  ｂｅａｍ）を有し、埋め込みガウス・ビームが幅を有する、非線形光システムを開示する。光伝送システムは、試料の一領域に光を当て、埋め込みガウス・ビームの幅に相当する幅を有するガウス・ビームで得られるであろう空間領域より小さい空間領域の中に、非線形応答を生成するように機能する。そのような非線形応答は、例えば、第二高調波発生または多光子材料変形（ｍａｔｅｒｉａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことができる。構造化されたビームの性質のため、非線形効果が存在する空間の広がりは、ガウス形状のビームで達成されるであろう空間の広がりより小さい。
【００１２】
本発明の他の実施形態によれば、レーザなどの光源と、光源から光を受けて、構造化された自由空間ビームを供給する光伝送システムとを備え、光伝送システムは、試料の一領域に光を当てて放射の非線形放出を生成する、非線形光システムが叙述される。この実施形態の他の態様は、非線形放出を検出し、検出された放出から導き出された信号を使用して、試料の顕微鏡画像を生成するための画像化組立体（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を含む。
【００１３】
本発明の他の態様によれば、長周期グレーティングが、モード変換器として使用される。本発明の他の態様によれば、高次モードのレーザ光が光導波路内に作り出され、一方、他の態様では、高次モードのレーザ光が、バルク光要素を使用して、導波路の外に作り出される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】従来技術による例示的非線形顕微鏡システムの図である。
【図１Ｂ】従来技術による例示的非線形顕微鏡システムの図である。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードそれぞれの強度特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）を比較したグラフである。
【図３Ａ】本発明の態様による例示的非線形顕微鏡システムの図である。
【図３Ｂ】本発明の態様による例示的非線形顕微鏡システムの図である。
【図４】図４（従来技術）及び図５は、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードを使用する非線形顕微鏡システムによって達成可能な分解能を比較するための試験用設定を示す、一対の図である。
【図５】図４（従来技術）及び図５は、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードを使用する非線形顕微鏡システムによって達成可能な分解能を比較するための試験用設定を示す、一対の図である。
【図６】図６Ａ乃至図６Ｃは、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードに対する、計算された強度特性に基づいて推測された理論的信号を示す、一連のグラフである。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、線形検出器及び二次の非線形検出器に対して実験的に測定された曲線を示すグラフである。
【図８】図８Ａ（従来技術）及び図８Ｂは、ＬＰ０２モードの共焦点分解能を、ＬＰ０１モードの共焦点分解能と比較するための実験用の設定の、一対の図である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、線形検出器及び二次の非線形検出器に対して測定された共焦点信号を示す、一対のグラフである。
【図１０】本発明の態様による非線形顕微鏡システムの一般的な例を示す図である。
【図１１】本発明の態様による非線形顕微鏡技術の一般的な例を示す流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明は、主に非線形顕微鏡を取り巻くシステムを説明しているが、本発明の範囲が、高次モードの光ファイバを使用する他の非線形光システムを包含することは、当業者には理解されよう。
【００１６】
非線形顕微鏡の場合、高次モードの励起光が、基本的なＬＰ０１モードの入射励起光に比べて、より優れた分解能をもたらすことができる。より優れた分解能は、基本モードの特性と比較した、１つまたは複数の高次モードの強度特性のそれぞれの形状から、また、入射光強度と蛍光との間の非線形関係から生じる。
【００１７】
本発明の態様は、２光子非線形顕微鏡に励起光を供給するために使用される、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードを使用することを背景において説明される。しかし、以下の議論が、他の高次モード及び他のタイプの非線形顕微鏡に拡張されうることが、理解されよう。さらに、蛍光の作成及び検出が、レーザ光の高強度領域の、高い空間拘束（ｓｐａｔｉａｌ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）を利用する用途の一例に過ぎないことに、留意されたい。拘束されたレーザ光は、多光子化学反応または材料破損の促進など、任意の数の非線形効果を誘起するために使用されうる。本明細書で使用されるように、そのような用途を実施するために使用されるシステムは、一般に「非線形光システム」と呼ばれる。
【００１８】
本議論は、Ｍ２パラメータ及び「埋め込みガウス」ビームの概念を活用する。Ｍ２パラメータは、ビーム品質、即ち密なスポットに合焦される能力の尺度である。Ｍ２の最低可能値は、ガウス・ビームに対応する１である。所与の光ビームに対して、Ｍ２パラメータは、ビームの広がり角及びその最も狭い点の幅に基づいて求められ、所与のビームが、ガウス・ビームに比べて、回折限界（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｌｉｍｉｔｅｄ）が何倍であるかを数値で表す。
【００１９】
ＬＰ０２モード、ＬＰ０３モード、及びＬＰ０４モードなど、さらなる高次モードは、中央ローブ及び１つまたは複数の外リングを含む非ガウス形状を有する。これらの形状に対するＭ２値を求めることにおいて、ビーム幅は、横方向の強度分布の二次モーメントとして定義される。
【００２０】
「埋め込みガウス」ビームは、非ガウス・ビームが光システムを通していかに伝播するかを理解するために有用な概念である。ある光システムを通って伝播するガウス・ビームが、位置依存性のビーム幅、ω（ｚ）を有する場合、同じ光システムを通って伝播し、知られているＭ２パラメータを有する非ガウス・ビームのビーム幅を、Ｍ・ω（ｚ）として、即ち位置依存性ビーム幅とＭ２値の平方根であるＭとの積として、表現することができる。
【００２１】
この概念を使用して、非ガウス・ビームに対して、その性能を埋め込みガウス・ビームの性能と比較することで、非ガウス・ビームに有効な分解能向上の尺度が与えられることが理解されよう。
【００２２】
図２Ａは、曲線１０１がＬＰ０１モードに対する強度特性を示し、曲線１０２がＬＰ０２モードに対する強度特性を示す、グラフ１００を示す。２つの特性は、２つの特性間の直視による比較を提供するために、同じ埋め込みガウスのビーム幅ω（ｚ）を有するように、拡縮されている。ＬＰ０１モードの強度特性は、単一の中央ローブ１０１ａで、ガウス形状を厳密に近似する。ＬＰ０２曲線は、中央ローブ１０２ａ及び外リング１０２ｂを有する非ガウス形状で特徴づけられる。
【００２３】
ＬＰ０１モードは、その近ガウス形状を反映する、１強のＭ２値を有する。ＬＰ０２モードは、非ガウスのエネルギー分布を有する。ビーム幅の二次モーメントの定義を使用して、図２Ａに示すＬＰ０２モードに対するＭ２の値は約３であり、Ｍ値は約１．７である。
【００２４】
２光子顕微鏡では、入射光強度と蛍光色素分子励起との間の関係は、二次である。従って、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードを使用して、２光子顕微鏡で達成可能なそれぞれの分解能の比較では、それらそれぞれの強度特性を２乗する必要がある。２乗されないＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードの強度特性は、単一の光子が所与の時間に所与の場所に存在するであろう確率を表すとみなされうる。従って、それぞれの強度特性の２乗は、２つの光子が所与の場所に同時に存在するであろう確率を表すとみなされうる。
【００２５】
図２Ｂは、曲線１１１がＬＰ０１モードに対する２乗された強度特性を示し、曲線１１２がＬＰ０２モードに対する２乗された強度特性を示す、グラフ１１０を示す。２乗した後、ＬＰ０２モードの外リング１１２ｂは大幅に抑制され、今や、中央ローブ１１２ａが支配的である。
【００２６】
２乗されたＬＰ０２モードの強度特性１１２の支配的な中央ローブ１１２ａは、２乗されたＬＰ０１モードの強度特性１１１の中央ローブ１１１ａより大幅に狭い。従って、ＬＰ０２モードのビーム幅が、ＬＰ０１モードのビーム幅より大幅に大きいとしても、２乗されたモードの強度特性は、２光子顕微鏡では、ＬＰ０２モードが、より優れた分解能をもたらすことを表す。
【００２７】
図３Ａは、本発明の態様による、例示的２光子非線形顕微鏡システム１２０の図を示し、高次モードのレーザ・ビームが、入射励起光を供給するために使用される。図３Ａでは、顕微鏡システム１２０は、フェムト秒レーザなどのレーザ光源１２２を備え、最初にシングル・モード・ファイバＳＭＦ１２４で誘導されるパルス・レーザ出力を供給する。代替の光源が、より長いパルスを使用してよく、またはさらには連続波放出を生成してよいが、より高いピーク・パワーは、通常、より短いパルスを使用して達成される。長周期グレーティング（ＬＰＧ）１２６が、ＳＭＦ１２４の出力端に接続され、レーザ出力の所望の高次モードの効率的な励起をもたらす。説明された本発明の実施では、ＬＰＧ１２６は、ＨＯＭファイバ１２８の中に直接書き込まれるのが好ましい。一般的に言えば、ＬＰＧ１２６が別個のファイバの中に書き込まれ、次いで、ＬＰＧ１２６がＨＯＭファイバ１２８にスプライスされることも可能であることに留意されたい。本例では、ＬＰＧ１２６が、ＬＰ０２モードの励起を高次モード（ＨＯＭ）ファイバ１２８の中にもたらす。以下に論じるように、例えばＬＰ０３モード及びＬＰ０４モードを含む、他の高次モードを使用することも可能である。通常、さらなるモードは、中心線におけるそれらの局在化されたピーク強度が高い故に、望まれる。
【００２８】
さらに、中央領域の外の光は、非線形相互作用に寄与しないので、低次の高次モードを使用することが有利である。というのは、全パワーに対するより大きな割合が、中央ローブに存在するからである。対照的に、いわゆる「ベッセル・ビーム（Ｂｅｓｓｅｌ  Ｂｅａｍ）」では、光パワーは、多くの同心円リングに分配され、リングに比較して中央に伝えられる相対的なパワーが減じられる。低次モードにおいて、全パワーに対するより大きな割合が中央ローブに伝えられ、そのことは、多くの非線形相互作用にとって望ましい。従って、本明細書で使用されるように、「低次の高次モード」は、ファイバで誘導される、中央ローブを有する高次モードに言及し、そのモードは、一般に、ＬＰ０ｎモードとして特徴づけられ、ここでｎは、５未満である。
【００２９】
ＨＯＭファイバ１２８は、端面１３０を有し、その端面から、高次モードのレーザ光が、構造化された自由空間ビーム出力１３２として放出される。本発明の他の態様では、高次モードは、レーザ光が導波路を出た後、アキシコン（ａｘｉｃｏｎ）、位相板、空間光変調器、他など、バルク光要素を使用して作り出されうる。しかし、導波路ベースのモード変換器の１つの利点は、バルク光要素を使用することに比較して、光が、望ましくないモードの中にほとんど結合しない、固有の１つまたは複数のモードの励起にある。この利点が、光パワーのより効率的な利用を可能にする。本説明のために、ビームがＬＰ０２モードとして伝播する導波路を出るビームは、「ＬＰ０２−構造化ビーム」と呼ばれる。ＬＰ０２−構造化ビームの出力１３２は、走査ミラー組立体１３４によって、レーザ光１３２を試料１３８の上に密に合焦する対物レンズ１３６に導かれる。２つの光子を同時に吸収する、試料１３８の中の蛍光色素分子が、励起状態に入り、励起体積内で生じる２光子励起の量を表す強度を有する蛍光１４０の放出を結果としてもたらす。合焦されたレーザ光が、試料１３８の選択された領域にわたって走査され、それにより、走査領域にわたる、ポイント毎の、放出された蛍光の強度データがもたらされる。放出された蛍光は、フォトダイオード、他など、適切な検出器１４２で検出される。画像生成器１４４は、検出された信号を使用して、走査された試料の領域の顕微鏡画像を生成する。
【００３０】
図３Ｂは、本発明の他の態様による、走査型共焦点２光子顕微鏡システム１５０を示す。図３Ａの顕微鏡システム１２０と同様に、図３Ｂの顕微鏡システム１５０は、フェムト秒レーザ１５２と、シングル・モード・ファイバ（ＳＭＦ）１５４と、長周期グレーティング１５６と、ＬＰ０２モードのパルス・レーザ・ビーム１６２を出力として供給する出力端面１６０を有する高次モード（ＨＯＭ）ファイバ１５８とを含む。レーザ・ビーム１６２は、走査ミラー組立体１６４で誘導され、対物レンズ１６６によって試料１６８の上に合焦され、２光子蛍光１７０の放出を結果としてもたらす。
【００３１】
図３Ｂの顕微鏡システム１５０は、検出器レンズ１７４と、入力端面１７８を有する第２のシングル・モード・ファイバ１７６と、第２のシングル・モード・ファイバ１７６の中に書き込まれた第２の長周期グレーティング１８０とを備える出力ピンホール組立体１７２をさらに含む。検出器レンズ１７４は、放出された蛍光１７０を端面１７８の上に合焦する。次いで、この蛍光は、第２のシングル・モード・ファイバ１７６によって第２の長周期グレーティング１８０に誘導される。次いで、合焦された、放出された蛍光は、検出器１８２に誘導される。次いで、画像生成器１８４は、蛍光データを使用して、走査された試料の領域の顕微鏡画像を生成する。
【００３２】
出力ピンホール組立体１７２は、深さ分解能（即ち、距離分解能）を顕微鏡システム１５０に付加する。というのは、ビームの焦点の中で生成された信号だけが、検出器による測定のための、第２のシングル・モード・ファイバ１７６の中に、効率的に結合することができるからである。この設定により、試料の３次元非線形画像が、試料を、横方向及び軸方向の両方に走査することによって得られる。
【００３３】
非線形励起のもとで、２光子蛍光、または非線形光プロセスによって誘起された任意の放出は、図２Ｂに示すように、中央のピークが非線形信号において強調されるので、高次モードのようには見えず、より基本モードのように見えることに留意されたい。それ故、ＨＯＭファイバに基づいた非線形共焦点顕微鏡に対して、出力ピグテール（ｐｉｇｔａｉｌ）は、ＨＯＭファイバではなく、シングル・モード・ファイバであるべきである。線形共焦点顕微鏡では、出力ファイバは、やはり、ＨＯＭファイバでなければならないであろう。
【００３４】
図３Ａ及び図３Ｂの顕微鏡システムにおいて、ＨＯＭファイバ１２８、１５８を使用することで、非線形顕微鏡における横分解能と共に共焦点の分解能も改良される。ＨＯＭファイバは、この用途において、その全ファイバ設定（ａｌｌ−ｆｉｂｅｒ  ｓｅｔｕｐ）との互換性、及びそのフェムト秒パルス伝送との互換性を含む、複数の理由に対して魅力的である。
【００３５】
ＨＯＭファイバの高分散度が、ＳＭＦファイバより良好なパルス伝送を可能にする。特に、ＨＯＭファイバの分散特性は、パルスを、伝播中に圧縮または伸張するように設計可能であり、試料の上に、より望ましいパルス形状の入射を結果としてもたらす。長周期グレーティング技術は、所望の高次モードの効率的な励起を可能にし、また、モード変換器の共鳴的性質による波長選択性を提供することができる。モード変換器の数多くの例が、長周期グレーティングを使用して導波路の中に作り出されるモード変換器を含めて、当業界に存在する。上述の、２乗されたＬＰ０２モードの強度特性の、スパイク形状の中央ローブが、非線形顕微鏡において、ＬＰ０１モードに比べて高められた横分解能を可能にする。ＬＰ０２モードの高いＭ２値（約３）が、ＬＰ０１モードに比べて高められた共焦点分解能を可能にする。
【００３６】
図４及び図５は、ＬＰ０１モードを使用した非線形顕微鏡システムの分解能を、ＬＰ０２モードを使用した非線形顕微鏡システムの分解能と比較するように設計された試験用設定２４０、２７０を示す、一対の概略図である。
【００３７】
図４の設定２４０では、１５５０ｎｍフェムト秒エルビウム・レーザ２４２からのパルス・レーザ・ビームが、シングル・モード・ファイバ２４４のＬＰ０１モードで伝播する。図５の設定２７０では、１５５０ｎｍフェムト秒エルビウム・レーザ２７２からのパルス・レーザ・ビームが、高次モード・ファイバ２７４のＬＰ０２モードを励起する長周期グレーティング２７３の中に誘導される。
【００３８】
両試験用設定２４０、２７０では、ファイバ・レーザ出力２４６、２７６が、第１のレンズ２４８、２７８でコリメートされる。次いで、コリメート光２５０、２８０が、第２のレンズ２５２、２８２で合焦される。次いで、焦点２５４、２８４が、第３のレンズ２５６、２８６によって、インジウム・ガリウム・ヒ素（ＩｎＧａＡｓ）フォトダイオード、シリコン（Ｓｉ）フォトダイオード、他など、２光子光電流を生み出す、適切な線形または非線形の検出器２５８、２８８上に結像する。
【００３９】
ナイフ・エッジ２６０、２９０が、ビームの焦点２５４、２８４を通して平行移動され、検出器２５８、２８８上の光電流の量が、ナイフ・エッジの位置の関数として測定される。位置に対するこの曲線の斜度が、顕微鏡の分解能の尺度である。
【００４０】
レンズは、両ビームが、集束レンズ２５２、２８２の直前のコリメート領域２５０、２８０の中で、同じ埋め込みガウス幅を有するように選択される。このことで、ビームの焦点２８４において、ＬＰ０２のビームはＬＰ０１より、幅が約Ｍ倍大きいことが確保され、ここでＬＰ０２のビームのＭ２は、約３である。
【００４１】
図６Ａ〜図６Ｃは、ＬＰ０１モード及びＬＰ０２モードに対する計算された強度特性に基づいて推測された理論的信号を示す、一連のグラフ３００、３１０、３２０である。
【００４２】
図６Ａのグラフ３００は、検出器がビームの強度に対して線形に応答する場合の、ＬＰ０１モード（曲線３０１）及びＬＰ０２モード（曲線３０２）に対する、信号対ナイフ・エッジ位置を示す。
【００４３】
図６Ｂのグラフ３１０は、２乗された強度に応答する二次の非線形検出器に対して、ＬＰ０１モード（曲線３１１）及びＬＰ０２モード（曲線３１２）に対する信号を示す。線形検出器の場合、ＬＰ０２の曲線は、縁部において外リングに支配され、従って、曲線の勾配は、ＬＰ０１のビームより小さい。しかし、非線形検出器に対して、ＬＰ０２のビームの外リングは抑制され、ＬＰ０２の曲線の勾配はＬＰ０１より鋭くなり、顕微鏡など、非線形、または多光子の物質との相互作用を利用する装置において、ＬＰ０２のビームにおける向上された分解能に対する潜在力を示す。
【００４４】
図６Ｃのグラフ（３２０）は、三次の非線形検出器における、ＬＰ０１モード（曲線３２１）及びＬＰ０２モード（曲線３２２）に対する信号を示す。さらに大きな、推測された改良が、ウィングのさらなる抑制及びＬＰ０１の分解能のほぼ２倍となるＬＰ０２の分解能によって、示される。
【００４５】
図７Ａは、線形検出器２５８、２８８における、ＬＰ０１モード（曲線３３１）及びＬＰ０２モード（曲線３３２）に対する、実験的に測定された曲線を示すグラフ３３０である。図７Ｂは、非線形検出器２５８、２８８における、ＬＰ０１モード（曲線３４１）及びＬＰ０２モード（曲線３４２）に対する、実験的に測定された曲線を示すグラフ３４０である。三次の測定は、これらの実験においてなされなかった。
【００４６】
図７Ａ及び図７Ｂの実験的曲線３３１、３３２、３４１及び３４２と、図６Ａ及び図６Ｂの理論的曲線３０１、３０２、３１１及び３１２との間の対応関係に留意されたい。線形検出器（曲線３０１、３０２、３３１及び３３２）の場合、ＬＰ０２は、外リングのため、比較的悪い分解能をもたらすが、非線形検出器（曲線３１１、３１２、３４１及び３４２）に対して外リングは抑制され、中央のスパイクが支配し、ＬＰ０２の測定値の勾配が、ＬＰ０１の勾配より大きくなる。高次モードのメリットは、ＬＰ０２の外リングのより良好な抑制をもたらすであろう、第三高調波発生などの高次非線形性に対して、よりいっそう大きいであろう。
【００４７】
これらの測定値は、非線形顕微鏡において、ＬＰ０２の横分解能が、ＬＰ０１の横分解能より良好でありうることを示す。また、ＨＯＭは、大きなＭ２値を持つビームがより速く回折することによって、共焦点の設定において、より大きなメリットを付加する。
【００４８】
図８Ａ及び８Ｂは、ＬＰ０２モードの共焦点分解能をＬＰ０１モードと比較するための実験的設定３６０、３８０を示す。図８Ａの設定３６０では、フェムト秒レーザ３６２からのパルス・レーザ・ビームが、シングル・モード・ファイバ３６４のＬＰ０１モードにおいて伝播する。図８Ｂの設定３８０では、フェムト秒レーザ３８２からのパルス・レーザ・ビームが、シングル・モード・ファイバ３８３によって、高次モード・ファイバ３８５のＬＰ０２モードを励起する長周期グレーティング３８４の中に誘導される。
【００４９】
両試験用設定３６０、３８０では、ファイバ・レーザ出力３６６、３８６が、第１のレンズ３６８、３８８でコリメートされる。次いで、コリメート光３７０、３９０は、第２のレンズ３７２、３９２によって、軸方向に走査されるミラー３７４、３９４上に再合焦される。ビームから反射されたパワーは、光システムを通って戻り方向に伝播し、ファイバ３６４、３８５の中に戻り方向に結合される。反対方向に伝播するパワーが、９５／５スプリッタ３７６、３９６の５％タップを通して検出される。また、有利なことに、サーキュレータが、タップの代わりに使用されうる。反射された光パワーが、ミラー位置の関数としてプロットされる。
【００５０】
図９Ａは、線形検出器に対して測定された共焦点信号を示すグラフ４００である。線形検出器に対してさえも、ＬＰ０２（曲線４０２）は、ＬＰ０２の大きなＭ２値によって、ＬＰ０１（曲線４０１）に比べて、はるかに鋭い応答曲線を有する。
【００５１】
図９Ｂは、非線形検出器の応答が、線形検出器からの信号を２乗することによってシミュレーションされたグラフ４１０である。図９Ｂに見られるように、ＬＰ０２モード（曲線４１２）を有する非線形共焦点顕微鏡は、ＬＰ０１モード（曲線４１１）に比べてずっと鋭い共焦点応答を提示する。
【００５２】
本発明の他の態様によれば、本明細書で説明される高次モード・ファイバは、非線形顕微鏡の個別の用途に対して最適化される。一般的に言えば、高次モード非線形顕微鏡において、ＬＰ０１入射光を使用する非線形顕微鏡に比べて、より良好な分解能を得るために、モード形状を最適化することが可能である。
【００５３】
ファイバの設計を通して、モード形状が、以下の方法で調整されうる。
１．ファイバのＭ２値が調整されうる。より低いＭ２値が、潜在的に、焦点面においてより密な合焦を可能にする。
２．ＬＰ０２モードの、中央ローブ及び外リングにおけるパワーの割合が、調整されうる。外リングにおけるパワーがより少ないと、二次の非線形測定値におけるそのパワーの影響は、小さくなる。
３．外リングの大きさと幅とは、トレードオフされうる。外リングの大きさを減少させながら、同時に幅を増加させることによって、外リングのパワーが一定に保持され、非線形測定値に対する外リングの影響が減少されうる。
４．中央ローブは、潜在的に、より狭くすることができ、分解能が向上する。
５．ＬＰ０３またはＬＰ０４など、異なる次数のモードまたはそれらの組合せが、使用されうる。複数のモードが組み合わされた場合、ビームが、所望の方式で、例えば建設的に、試料の上で組み合わさることを確実にするために、モード間の相対的な位相関係に注意する必要がある。
【００５４】
これらの設計の調整のすべては、相互に関係づけられていることに、留意することが重要である。例えば、外リングにおけるパワーの割合、またはその幅及び大きさ、を調整することで、やはり、ビームのＭ２が変わるであろう。
【００５５】
図１０は、本発明の態様による、一般的な非線形光システム５００の図である。システム５００は、構造化された自由空間ビームを出力５０４として供給する、ＨＯＭ光源５０２を含む。照射組立体５０６が、出力５０４を使用して試料５０８に光を当て、それにより、光出力５１０を試料から生成する。次いで、画像化組立体５１２が、光出力５１０から導き出された非線形信号５１４を使用して、試料５０８の顕微鏡画像５１４を生成する。上で説明した本発明の例では、非線形信号は、多光子蛍光信号を含む。あるいは、非線形信号は、例えば、第二高調波信号、第三高調波信号、ラーマン信号、他を含んでよい。
【００５６】
図１１は、本発明の態様による、一般的な非線形顕微鏡技術６００の流れ図である。方法は、以下のステップを含む。
ステップ６０１：ファイバで誘導されるレーザ光の、低次の高次モードを励起する。
ステップ６０２：構造化された自由空間ビームを出力として供給する。
ステップ６０３：構造化された自由空間ビームを使用して、試料の一領域への照射をもたらし、それにより、光出力を試料から生成する。
ステップ６０４：光出力から導き出された非線形信号を使用して、試料の領域の顕微鏡画像を生成する。
【００５７】
上の説明は、当業者が本発明を実施することを可能にするであろう詳細を含むが、説明は本質的に例示的であり、説明に対する多くの改変及び変形が、これらの教示のメリットを有する当業者にとって明白であることを、理解されたい。従って、本明細書の本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲によってのみ定義され、特許請求の範囲は、従来技術によって許容される限り広く解釈されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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