(57)【要約】      （修正有）【課題】II型糖尿病に関する遺伝病の治療薬、治療方法の提供。【解決手段】ホストの完全なゲノムを供給する遺伝的に正常な少量の培養筋芽細胞及びホストの血清を含有する組成物。培養筋芽細胞は、ホストと組織適合性があり、筋障害前にホストから取得されたドナー筋肉生検であるか、培養筋芽細胞が、ホストと組織不適合であり、特に限定されないがホストの父又は男兄弟を含む遺伝的に正常な群から選択されるドナーに由来する培養筋芽細胞からなる組成物。培養筋芽細胞の用量が、筋ジストロフィー治療用で約５００億細胞、心筋症治療用で約１０億細胞、およびＩＩ型糖尿病治療用で約５００億細胞であって、当該用量がホスト血清の約１億細胞／ｍｌ溶液で投与される組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホストの遺伝病の治療に用いられる、ホストの完全なゲノムを供給する遺伝的に正常な少量の培養筋芽細胞からなる組成物。
【請求項２】
遺伝病がII型糖尿病である請求項１の組成物。
【請求項３】
さらにホストの血清からなる請求項１又は２の組成物。
【請求項４】
ホストの血清は凝固した血清である請求項３の組成物。
【請求項５】
細胞の平均直径が７〜１０μｍである請求項１の組成物。
【請求項６】
培養筋芽細胞の用量が、筋ジストロフィー治療用で約500億細胞、心筋症治療用で約10億細胞、およびII型糖尿病治療用で約500億細胞であって、当該用量がホスト血清の約1億細胞/ml溶液で投与される、請求項１の組成物。
【請求項７】
培養筋芽細胞が、ホストと組織不適合であり、特に限定されないがホストの父または男兄弟を含む遺伝的に正常な群から選択されるドナーに由来する、請求項１の組成物。
【請求項８】
培養筋芽細胞は、ホストと組織適合性があり、筋障害前にホストから取得されたドナー筋肉生検である、請求項１の組成物。
【請求項９】
遺伝子転写産物の活性の検出が、より良い細胞又は細胞培養物の選択に用いられる、請求項１〜８のいずれかである組成物の調製方法。
【請求項１０】
遺伝子が、Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、及びTomm40からなる群から選択される一以上である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が、Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARgamma、Ptpn1 及びUCP1からなる群から選択される一以上である、請求項９の方法。
【請求項１２】
治療を要する患者のII型糖尿病を治療する方法であって、
患者のII型糖尿病の症状を判定または確認し、
ａ．インスリン感受性に関して遺伝的に正常なドナーの筋生検から筋芽細胞を培養し、
ｂ．治療的に有効な用量の免疫抑制剤を患者へ投与し、
ｃ．その後選別し、治療的に有効な用量の筋芽細胞を患者の少なくとも一筋肉へ投与し、
ｄ．ドナー筋芽細胞により、正常な遺伝子の完全な補完を含むそれぞれの核を、患者の遺伝的に異常な筋肉細胞へ挿入させて、遺伝的な補完修復をもたらし、
e.ドナー筋芽細胞を、互いに融合させて、遺伝的に正常な筋繊維を形成する工程からなる、筋芽細胞核の移入を介して患者へ完全なヒトゲノムを供給し、
これにより筋肉を介したグルコース恒常性が改善され、患者のII型糖尿病の症状改善を測定することにより検出される、方法。
【請求項１３】
筋芽細胞の核の移行を介して、ホストの完全なゲノムを供給することによりホストの遺伝病を治療する方法であって、
遺伝的に正常なドナーの筋生検に由来する遺伝的に正常な筋芽細胞を培養し、
治療的に有効な量の免疫抑制剤をホストへ投与し、
その後選択し、治療的に有効な用量の筋芽細胞をホストの少なくとも一筋肉へ投与し、
ドナー筋芽細胞により、正常な遺伝子の完全な補完を含むそれぞれの核を、患者の遺伝的に異常な筋肉細胞へ挿入させて、遺伝的な補完修復をもたらし、
ドナー筋芽細胞を、互いに融合させて、遺伝的に正常な筋繊維を形成する工程からなり、
これにより、少なくとも筋肉機能の改善、可動性の上昇、血液排出／血管形成、及び筋肉細胞膜を介した生化学物質又はイオンの移動、の少なくとも一つの計測を含む、ホストにおける改善の検出が行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施態様は、心筋芽細胞移入治療を用いた疾患のヒトゲノム治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピーター，ケー．ロウは、以前、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）筋肉への筋芽細胞の移入によりジストロフィン（タンパク質）を産生し、心筋への筋芽細胞の移入によりミオシン重鎖（他のタンパク質）を産生することを明らかにした。Yeら2009年の報告（Diabetologia（2009）52:1925-1934 Skeletal myoblast transplantation for attenuation of hyperglycaemia、hyperinsulinaemia and glucose intolerance in a mouse model of type 2 diabetes mellitus）を含む関連特許及び学術論文は、筋ジストロフィー、心筋変性、及び糖尿病の治療に対する安全性と有効性を判断することを重視していた。
【０００３】
これらの研究は、エンドポイントのモニタリングとして、筋肉強度の増大、筋繊維の増加、細胞構造の改善、及びタンパク質の補充を利用していた。しかし、治療法の改善に利用されたり、細胞移植薬やリード化合物などの、予防又は治療薬の同定及び選択用のツールとして利用されることができるための、根底にある遺伝的／生化学的なメカニズムは、いずれも明らかにしていなかった。これに対し、本研究は、その効果が、ドナー細胞の生存、発生及びそれ自体が機能することによりもたらされることを示している。遺伝的な修復につながる遺伝子の転写産物及び翻訳は、疾患の臨床的予防及び治療において真剣に取り組まれてこなかった。
【０００４】
重要な疾患の一つは糖尿病である。糖尿病は、世界中の成人の腎不全及び非外傷性下腿切断の主要原因である。2010年、米国は、糖尿病治療に1980億ドルを費やしたと算定した1。推定2.85億人の成人が、糖尿病症例の約90%を占めるII型糖尿病であった2。糖尿病は、西洋の人口の25%程度に影響を与え、徐々に上昇しており3、重要な心臓血管疾患の危険因子である4。疫学的な双生児研究は、II型糖尿病の重要な特徴である、インシュリン抵抗性の発症における重要な多遺伝子因子を明確に示しており、それらは、環境因子にも影響される5、6。
【０００５】
これまでの研究は、インシュリン抵抗性の発症における骨格筋の重要性を示すものであった。筋肉特異的Glut4ノックアウトマウスは、若年齢からインシュリン抵抗性であり、耐糖能異常であった7。筋肉中のプロテインキナーゼC-γの孤発欠損は、腹部肥満その他の代謝異常を誘発した8。一方、筋特異的LKB1(インシュリン感受性の負の調節因子であるセリン/スレオニンキナーゼ)ノックアウトは、インシュリン感受性を向上し、グルコース恒常性を改善した9。これらの研究は、骨格筋グルコース輸送における異常が、インシュリン抵抗性発症の重要な要因となり得ることを示唆している。
【０００６】
高血糖と高インスリン血症の軽減、及びKKマウスの耐糖能改善は、ヒト骨格筋芽細胞（hSkMs）の異種移植により生じた10。骨格筋芽細胞は、単核であり、異なる型の筋繊維と融合してホスト表現系へ発生できる筋前駆細胞である11。KKマウス骨格筋線維との自然融合によって、移植されたヒト筋芽細胞は、KKマウスにおいて複合筋線維を形成する。
【０００７】
このような糖尿病研究にもかかわらず、基本的な遺伝子転写産物の変化も同義遺伝子について誰も明らかにしていなかった。つまり、これらの研究の教示および結論は、認められた改善は全て、ドナー細胞の生存、発生及び遺伝子修復なしに機能することの結果であったことを示していた。従って、この基礎的な知識を越える、この分野における新たな情報及び治療法は、疾患の臨床的な予防及び治療に計り知れぬほどの恩恵をもたらすことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−１４７８２９号公報
【発明の概要】
【０００９】
ピーター，ケー．ロウの精力的な研究で始まった筋移植治療は、長年にわたって進歩を遂げてきた。しかし、様々な疾患の症状が、同義遺伝子の直接転写産物の質と量の変化によって緩和しうることについて、具体的な認識も理解もなかった。ここに記載される一実施態様においては、遺伝的に異常なII型糖尿病動物モデルを用いて、同義遺伝子の直接転写産物の質と量の変化が、疾患を軽減しうることを、初めて思いの外示された。
【００１０】
II型糖尿病の筋肉に移入した筋芽細胞は、インシュリン抵抗性に関連した複数の経路において、遺伝子転写産物の変化（タンパク質でない）をもたらすことが、驚くべき事に見いだされた。DMD、心筋症及びII型糖尿病からの筋芽細胞移行技術開発に関連して、筋芽細胞の移入が、欠失遺伝子又は異常遺伝子を単に補充するだけでなく、完全なヒトゲノムを供給する正常な筋芽細胞の核の移入を通じて、その効果を媒介するということを、この発見は予想外にも明らかにした。そして置換遺伝子は、遺伝子修復に必要なタンパク質又は因子を産生するために転写する。疾患治療、疾患予防、創薬及び治療用の優れた細胞及びクローンの選択などを含む、この発明の多様な用途が見いだされた。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、空腹状態のKK hSkM、KKコントロール、及びKK線維芽細胞群における、インシュリンシグナル経路遺伝子の転写産物量の比較を示す。
【図２】図２は、空腹状態のKK hSkM、KKコントロール、及びKK線維芽細胞群における、ミトコンドリア遺伝子の転写産物量の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
疾患の治療及び予防
一実施形態は、DMDの症状を予防又は軽減する。他の実施形態は、心筋症の症状を予防又は軽減する。さらに他の実施形態は、II型糖尿病の症状を予防又は軽減する。
【００１３】
好ましい態様によれば、治療を要する患者のII型糖尿病の治療方法であって、患者のII型糖尿病の状態を判断又は確認し；a.インシュリン感受性について遺伝的に正常なドナーの筋生検から筋芽細胞を培養し、b.治療に有効な用量の免疫抑制剤を患者へ投与し、c.その後選択し、治療に有効な量の筋芽細胞を患者の少なくとも一筋肉へ投与し、d.ドナー筋芽細胞により、正常遺伝子の完全な補完をそれぞれ含むドナー筋芽細胞の核を、患者の遺伝的に異常な筋肉細胞へ挿入させて、遺伝的な補完修復をもたらし、e.ドナー筋芽細胞と互いに融合させて、遺伝的に正常な筋繊維を形成する工程からなる、筋芽細胞核の移入を介して患者へ完全なヒトゲノムを供給し；これにより筋肉を介したグルコース恒常性が改善され、患者のII型糖尿病の症状改善を測定することにより検出される方法、を提供する。
【００１４】
一実施態様では、培養筋芽細胞は、患者と組織学的に不適合であり、遺伝的に正常なドナーに由来する。他の態様では、ドナーは、特に限定されないが、父またはホストの男兄弟を含む、遺伝的に正常な群から選択される。
【００１５】
さらに他の態様においては、培養筋芽細胞は、患者がII型糖尿病発症前に患者の筋生検から取得される。また他の態様においては、患者のII型糖尿病の症状改善の測定は、病気の症状を軽減させる同義遺伝子の直接転写産物の量又は質の変化を検出することにより行われる。
【００１６】
また、さらに他の態様においては、培養筋芽細胞の治療的に有効な用量は、II型糖尿病においては約５００億細胞であり、この用量は、約１億細胞／ｍＬで投与される。他の態様においては、免疫抑制剤は、一日当たり５〜７ｍｇ／Ｋｇ、筋芽細胞移植5日前から開始して、術後3週間で完全に離乳するまで経口投与されるサイクロスポリンである。全血中のサイクロスポリン量を毎週監視し、離乳が始まる最後の週まで、血中濃度が約２５０ｎｇ／ｍＬを維持するよう、必要に応じてサイクロスポリンの用量を再調整する。
【００１７】
一実施態様は、患者のII型糖尿病を予防する方法であって、患者のII型糖尿病の潜在的な状態を確認し；a.インシュリン感受性について遺伝的に正常なドナーの筋生検から筋芽細胞を培養し、b.治療に有効な用量の免疫抑制剤を患者に投与し、c.その後選別し、治療に有効な量の筋芽細胞を患者の少なくとも一筋肉へ投与し、d.ドナー筋芽細胞により、正常遺伝子の完全な補完をそれぞれ含むドナー筋芽細胞の核を、患者の遺伝的に異常な筋肉細胞へ挿入させて、遺伝的な補完予防をもたらし、e.ドナー筋芽細胞を互いに融合させて、遺伝的に性異常な筋繊維を形成する工程からなる、筋芽細胞核の移入を介して患者へ完全なヒトゲノムを供給し；これにより筋肉を介したグルコース恒常性が改善され、患者のII型糖尿病の症状改善を測定することにより検出される方法、を提供する。また他の態様は、患者のII型糖尿病の状態の改善を測定することを提供する。
【００１８】
さらにほかの態様は、ホストにおける遺伝病の治療方法であって、a.遺伝的に正常なドナーの筋生検から筋芽細胞を培養し、b.治療に有効な用量の免疫抑制剤をホストに投与し、c.その後選別し、治療に有効な量の筋芽細胞をホストの少なくとも一筋肉へ投与し、d.ドナー筋芽細胞により、正常遺伝子の完全な補完を含むドナー筋芽細胞の核を、患者の遺伝的に異常な筋肉細胞へ挿入させて、遺伝的な補完修復をもたらし、e.ドナー筋芽細胞を互いに融合させて、遺伝的に正常な筋繊維を形成する工程からなる、筋芽細胞核の移入を介してホストの完全なヒトゲノムを供給し；これにより、少なくとも筋肉機能の改善、可動性の上昇、血液排出／血管形成、及び筋肉細胞膜を介した生化学物質又はイオンの移動、の少なくとも一つの計測を含む、ホストにおける改善の検出が行われる方法、を提供する。
【００１９】
創薬における使用
また、他の態様は、インシュリンシグナル経路に関わる２２遺伝子群の1以上の遺伝子転写産物の増加の検出からなる創薬アッセイを提供する。一態様においては、RNA転写産物が分析され、RNA転写産物の存在又は量が、臨床的な可能性、又は（糖尿病などの）疾患の予防又は症状緩和に利用するためのリード化合物の選択に利用される。他の態様においては、遺伝子転写産物の活性のバイオアッセイが、リード化合物の選択に利用される。好ましい態様においては、前記遺伝子は、Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARgamma、Ptpn1及びUCP1からなる群から選択される一以上である。
【００２０】
これらの遺伝子、遺伝子産物及びこれらから産生されるタンパク質は、当業者が容易に理解しうる多種多様な方法により検出できる。インシュリンシグナル経路には、多様な遺伝子の関与が知られているが、本態様は、筋芽細胞治療の文脈において一層有益であることが驚くべき事に見いだされ、且つ好ましいより有用な遺伝子群を提供する。上記の遺伝子の選択的な発現は、II型糖尿病、及びムコ多糖症等の他の遺伝子疾患の予防又は治療用の創薬におけるリード化合物の選別用途として特に好ましい。
【００２１】
さらにほかの態様は、ミトコンドリアの発生と機能に関わる２７遺伝子群の１以上の遺伝子産物の増加の検出からなる、創薬アッセイを提供する。一態様においては、RNA転写産物が分析され、RNA転写産物の存在又は量が、臨床的な可能性、又は（糖尿病などの）疾患の予防又は症状緩和に利用するためのリード化合物を選択するために利用される。他の態様においては、遺伝子転写産物の活性のバイオアッセイは、リード化合物の選択に利用される。好ましい態様においては、前記遺伝子は、Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、及びTomm40からなる群から選択される一以上である。
【００２２】
これらの遺伝子、遺伝子産物及びこれらから産生されるタンパク質は、当業者が容易に理解しうる多種多様な方法により検出することができる。医薬の発見及び開発は、重要なマーカーの同定及び選択を伴う。多様な遺伝子は、ミトコンドリアの発生と機能への関与が知られているが、本態様は、驚筋芽細胞治療の文脈において一層有益であることが驚くべき事に見いだされ、且つ好ましいより有用な遺伝子群を提供する。上記の遺伝子の選択的な発現は、II型糖尿病、肥満、及び異常なミトコンドリア発生と機能に起因する他の遺伝子疾患の予防又は治療用の創薬におけるリード化合物の選別用途として特に好ましい。
【００２３】
他の態様は、糖尿病治療に有用な薬剤化合物又は細胞治療候補を発見する方法であって、試験化合物をin vitro、ex vitro、又はin vivoの細胞群にさらし、Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、及びTomm40からなる群から選択される一以上の遺伝子の遺伝子活性をアッセイし、陽性の遺伝子活性を、糖尿病治療用検査化合物の価値を決定するために利用することからなる方法を提供する。一態様においては、前記方法は、遺伝子転写産物の検出からなる。一態様においては、前記方法は、転写された遺伝子から翻訳されたタンパク質の活性の検出からなる。一態様においては、転写された遺伝子から翻訳されたタンパク質の免疫学的検出からなる。一態様においては、前記方法は、試験化合物をin vitro、ex vitro、又はin vivoの細胞群にさらし、Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1、及びUCP1からなる群から選択される一以上の遺伝子の遺伝子活性をアッセイし、陽性の遺伝子活性を、糖尿病治療用検査化合物の価値を決定するために利用することからなる。
【００２４】
細胞注入によるゲノムの供給
これまで、本分野の研究者は、常に、食塩水、及びその他の、担体溶液として特定され又は部分的に特定された溶媒を用いて、患者へ細胞を注入していた。発明者は、驚くべきことに、ホストの血清を用いて筋芽細胞を注入すると、細胞の生存及び発生を促すことを見出した。細胞注入用の溶媒として、血管形成因子が添加された血清、及び患者血漿の利用もまた検討されるが、調製が容易なため凝固血清が好ましかった。
【００２５】
１億細胞／ｍＬという高い細胞濃度の注入液は、注入後の細胞の融合と発生を促進することがわかった。好ましい技術は、５歳から１２歳のDMD罹患少年などの若い患者の下半身治療、及び１２歳から１８歳のDMD罹患少年などのより年長の患者の上半身治療である。最も好ましくは、５歳から１８歳の患者に対する全身治療（whole body treatment「WBT」）である。WBTは、すべての年齢のII型糖尿病患者に最も好ましい。WBTは、５００億筋芽細胞を患者の８０の大きな筋肉群へ注入することも含む。
【００２６】
一態様においては、より少量の細胞を注入に用い、細胞量当たりより多くのＤＮＡを供給する。ある態様では、好ましい平均細胞直径は、７〜１０μｍである。ある態様においては、平均細胞サイズは１２μｍ以下であり、わずか７μｍでもよい。ある態様においては、治療を要するII型糖尿病患者の治療方法用途として、血清や血漿などの患者血液タンパク質溶媒の細胞懸濁液が供給される。前記治療方法は、患者のII型糖尿病の状態を判断又は確認し、筋芽細胞の核の移行を介して完全なヒトゲノムを患者へ供給することからなり；前記方法は、a.インシュリン感受性について遺伝的に正常なドナーの筋生検から筋芽細胞を培養し、b.治療的に有効な用量の免疫抑制剤を患者へ投与し、c.その後選択し、患者の少なくとも一筋肉へ、治療的に有効な量の筋芽細胞を投与し、d.ドナー筋芽細胞により、正常な遺伝子の完全な補完を含むそれぞれの核を、患者の遺伝的に異常な筋芽細胞へ挿入させて、遺伝的な補完修復をもたらし、e.ドナー筋芽細胞を、互いに融合させて、遺伝的に正常な筋繊維を形成する工程からなる方法であって、これにより筋肉を介したグルコース恒常性が改善され、患者のII型糖尿病の状態改善を測定することにより検出される。他の態様においては、このような細胞懸濁液は、ここに詳しく述べたように他の方法のために供給される。
【００２７】
移植治療に用いられる細胞選択用マーカー
その他の態様において、驚くべき事に、ある遺伝子に対して非常に高い転写活性を示す細胞が、糖尿病などの疾患の細胞治療に優れた効果をもたらすことが見いだされた。特に、このような遺伝子発現は、クローニング用の細胞選択や、治療用の細胞拡大調製に供する培養のために利用できる。ある態様においては、遺伝子転写産物活性の検出は、より良い細胞や細胞培養物の選択に用いられる。好ましい態様においては、遺伝子は、Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、及びTomm40からなる群から選択される一以上である。他の好ましい態様においては、遺伝子は、Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARgamma、Ptpn1及びUCP1からなる群から選択させる一以上である。これらの遺伝子、遺伝子転写産物、及びこれらから産生されるタンパク質は、当業者が容易に理解しうる多種多様な方法により検出することができる。
【００２８】
組成物及び組成物の調整
特に、本発明は、ホストの遺伝的な疾患を治療する用途で、ホストの完全なゲノムを供給する、遺伝的に正常な少量の培養筋芽細胞からなる組成物に関連する。好ましい態様においては、遺伝的な疾患はII型糖尿病である。
【００２９】
好ましくは、組成物は、さらにホストの血清からなり、ホスト血清が凝固した血清であると特に好ましい。
【００３０】
細胞の平均直径は、好ましくは１２μｍ以下であり、特に好ましくは７〜１０μｍである。より好ましくは、培養筋芽細胞の用量は、筋ジストロフィー治療には約５００億細胞、心筋症治療には約１０億細胞、II型糖尿病治療には約５００億細胞であり、前記用量はホスト血清の約１億細胞／ｍＬ溶液で投与される。
【００３１】
好ましくは、培養筋芽細胞は、ホストと組織非適合性であり、特に限定されないが、ホストの父又は男兄弟を含む遺伝的に正常な群から選択されるドナーに由来する。他の好ましい態様においては、培養筋芽細胞は、ホストと組織適合性があり、筋障害を受ける前にホストから取得したドナー筋生検と組織適合性がある。
【００３２】
本発明は、また、上記組成物の調製方法に関し、前記方法において、遺伝子転写産物の活性の検出は、より良い細胞又は細胞培養物を選択するために用いられる。
【００３３】
この方法の好ましい態様において、遺伝子は、Bcl211、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、及びTomm40からなる群から選択される一以上である。この方法のその他の好ましい態様においては、遺伝子は、Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARgamma、Ptpn1及びUCP1からなる群から選択される一以上である。
【実施例】
【００３４】
実施例  ヒト骨格筋芽細胞（hSkM）の筋肉内移植
本実施例は、インシュリンシグナル経路、ミトコンドリア発生と機能の基本的な遺伝子発現プロファイルを示し、この実施態様において主張される移植の効果を明らかにする。
【００３５】
糖尿病KKマウスは、３群：基本培地（M199）注入によるKKコントロール群；ヒト線維芽細胞移植によるKK線維芽細胞群；hSkM移植によるKK筋芽細胞群；に分けた。C57BLマウスは、正常コントロールとしてhSkM移植を受けた。細胞は、後肢の筋肉へ移植した。全ての動物は、６週間だけサイクロスポリンで処置された。ブドウ糖負荷試験を実施した。細胞移植後１２週に空腹状態でマウスを屠殺した。移植筋肉を取り除き、遺伝子発現プロファイリングの研究用に処理した。
【００３６】
動物と食事  KKマウスは、Jax Lab, Maine, USAから購入した。これは、遺伝的に肥満のII型糖尿病動物モデルであり、高血糖、高インスリン血症及びグルコース不耐症を特徴とする12。これらは、１４〜１６週齢のC57BLマウスより約３４％重い。マウスは、個別にプラスチックのゲージに入れ、２５度の空調付きの部屋で１２時間明・１２時間暗サイクル（明：午前９時〜午後９時）、自由にアクセスできる餌（5K52 PMI Nutrition International LLC、USA）と水（水道水）で飼育した。１４〜１６週齢のマウスは、高血糖の検査を受け、実験に用いられた。次の基準に適合するKKマウスを用いた。（１）空腹時血糖値>6.5 mmol/L、及び（２）GTT間、30分又は60分で血糖値>20mmol/L、2時間で>11mmol/L10。
【００３７】
ブドウ糖負荷試験（GTT）  本研究に用いた全てのマウスはGTTを受けた。一晩（約１６時間）空腹状態の後、マウスに、1g／kg体重のグルコースを蒸留水で希釈して（100mg/ml）腹腔内（i.p.）注入した。0分（グルコース注入前）、グルコース注入後30分、60分、120分に、尾静脈から血液サンプルを集めた。血中グルコース濃度は、Accu-Chek Advantage glucometer (Roche、Germany)により判定した。
【００３８】
hSkM及びヒト線維芽細胞の培養  ヒト骨格筋芽細胞を、225 mm2組織培養フラスコ中で培養して増やし、10%FBS、10ng/ml FGF (10% M199)を加えたM199と共に、37℃、５％ＣＯ２のインキュベータ中で、コンフルエントになるまで維持した。hSkMの純度及び均質性を、前述のように、デスミンとCD56の発現により評価した10、13。ヒト線維芽細胞は、シンガポールのNUS外科、Toan Thang Phan准教授の研究室から入手した。
【００３９】
細胞のラベルと移植  細胞は、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Sigma、USA)により、細胞移植前一晩ラベルした10。
【００４０】
糖尿病基準に合致するKKマウスは、ランダムに３群、1.5ml M199のみ投与されたKKコントロール群（n=8）：3x107ヒト線維芽細胞を含む1.5ml M199を投与されたKK線維芽細胞群（n=8）：3x107hSkMを含む1.5ml M199を投与された、KK筋芽細胞群（n=8）：に割り当てた。C57BLマウスは、hSkM移植に関連する副作用を判定するための正常コントロールとして用い、3x107hSkMを含む1.5ｍｌのM199を投与された。全２０回の注入は、麻酔下で、マウスの大腿部の前内側の左右筋肉、後脚の筋肉、及び臀部領域の筋肉に注入した。注入後、回復のため、マウスを各ケージに戻した。全ての動物は、治療前３日から治療後６週までサイクロスポリン（10mg/kg/日）を投与した。血液サンプリング後、動物は１２週に屠殺した。
【００４１】
免疫組織学的試験  細胞移植後１２週に外植されたマウスの骨格筋のDAPI陽性凍結切片を、ジストロフィンの発現用に免疫染色し、hSkM核のマウス骨格筋線維への進入を判定した10。つまり、組織切片を、100％メタノール中で-20℃、20分間固定し、0.1％トリトン-100と共に4℃、10分間インキュベートした。ブロッキング後、ウサギ抗ジストロフィン（Sc-15376、Santa Cruz、USA）抗体を1:50で希釈した一次抗体溶液をサンプルに加え、１時間室温でインキュベートした。その後、フルオレセイン  イソシアネート(FITC) (F-4890、Sigma、USA)が結合したヤギ抗ウサギIgGの1:200希釈を１時間加えた。洗浄後、サンプルをヨウ化プロピジウム（PI）で対比染色し、Olympus BX41 (Olympus、Japan)蛍光向顕微鏡で観察し、Olympic Micro Image (Olympus、Japan)とデジタルカメラを用いて記録した。
【００４２】
筋肉組織の単離とトータルRNAの調製
屠殺後、前内側の大腿部のマウス骨格筋を速やかに分離し、収集して液体窒素中に貯蔵した。メーカーのマニュアルに従い、凍結筋サンプルからTrizol試薬(Invitrogen、USA)で、トータルRNAを抽出した。RNAの濃度及び純度は、Nanodropにより判定した。DNaseI (Fermentas、USA)を用いてトータルRNAから混在するDNAを除去した。Maxima（商標） First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas、USA)を用いて、１μｇのトータルRNAからcDNAを合成した。1枚のアレイプレートに１μＬ（〜１μｇ）のcDNAを用いた。RT２ ProfilerTM PCR Array User Manualの指示通りに、リアルタイムPCRを実施した。遺伝子発現レベルが２倍以上変化した場合は群の間で著しく上昇したと考え、遺伝子発現レベルが０．５倍以下の変化だった場合は群の間で著しく減少したと考えた。遺伝子発現レベルは、さらにcDNAを用いた定量PCR(QPCR)により確認し定量した。遺伝子発現レベルを確認するため、Maxima（商標） SYBR Green qPCR Master Mix (2X) (Fermentas、USA)を用いた。プライマーは、Primer Premier 5 software (Premier Biosoft、USA)を用いて設計した。配列は、要請に応じて入手することができた。ＱＰＣＲの40サイクルの温度サイクルプロトコルは、次のようにプログラムされた：最初の変性の1サイクルは10分間、そして95℃、15秒間変性、30秒間アニーリング、72℃、30秒間伸長。
【００４３】
マウスインシュリン経路及びミトコンドリア発生及び機能の骨格筋における遺伝子発現プロファイルのためのPCRアレイキットは、米国SABiosciences社から購入した。  マウスインシュリンシグナル経路RT2 ProfilerTM PCR Array(Cat PAMM-030、QIAGEN-SAbiosciences、USA)は、インシュリン応答遺伝子の役割に関連する８４遺伝子の発現をプロファイルする。インシュリンは、グルコースの取り込み、グリコーゲン、脂質、及びタンパク質合成、転写活性、細胞増殖及び分化に関係する生化学的応答の広範な領域を調節する。
【００４４】
マウスミトコンドリアRT2 ProfilerTM PCR Array (PAMM-087、QIAGEN-SAbiosciences、USA)は、細胞の強力なオルガネラの生合成及び機能に関連する84遺伝子の発現をプロファイルする。このアレイにモニターされる遺伝子は、電子伝達系及び酸化的リン酸化に必要な代謝産物だけでなく、ミトコンドリアの膜極性及びATP合成に重要な電位の維持に必要なイオンのミトコンドリアの分子輸送のレギュレーター及びメディエーターを含む。代謝産物及びエネルギー産物はミトコンドリアの機能のみではない。細胞間の損傷シグナルにより活性化させる内在性のアポトーシス経路遺伝子もまた、このアレイに含まれる。
【００４５】
統計解析  統計解析は、SPSS 20を用いて行った。すべてのデータは、平均±標準誤差として示されている。４点のグルコース測定の濃度曲線下面積は、ANOVAによる３群間の違いを比較するために用いた。p<0.05の確率値は、グループ間の有意差と見なした。
【００４６】
結果  hSkMは、細胞移植後12週において、ホスト筋肉に広く生存していた。ブドウ糖負荷試験は、KKコントロールと比較して、KK筋芽細胞群のマウスにおいて血中グルコースの著しい現象がみられた。インシュリンシグナル経路の転写パターンは、KKコントロール群（２３遺伝子）、KK繊維芽細胞群（８遺伝子）及びC57BL群（８遺伝子）と比べてKK筋芽細胞群において変化が見られた。ミトコンドリア発生及び機能の転写パターンは、、KKコントロール群（２７遺伝子）、KK繊維芽細胞群（９遺伝子）及びC57BL群（６遺伝子）と比べてKK筋芽細胞群において変化が見られた。
【００４７】
hSkM移植が、インシュリン経路及びミトコンドリア発生と機能に関わる同義遺伝子の遺伝子転写産物の変化をもたらすことは、驚くべきことに且つ初めて見出された。これは、耐糖性の改善を伴い、糖尿病KKマウスの高血糖を減少させた。
【００４８】
体重  治療後12週における４動物群の平均体重は、KKコントロール群で32.3±1.3グラム、KK繊維芽細胞で33.1±1.7グラム、及びKK筋芽細胞群で30.4±1.2グラム、並びにC57BL群で22.9±0.5グラムであった。KKマウスの体重は、C57BL群より著しく重かった（すべてp<0.05）。KK筋芽細胞群において体重減少の傾向がみられたが、２つのKK群には大きな差は見られなかった。
【００４９】
グルコース恒常性及び細胞集積試験  治療後12週におけるマウスのグルコース恒常性の結果：KK筋芽細胞群のHbA1は、KKコントロール及びKK繊維芽細胞と比較して著しく減少していた。しかし、正常コントロールとして供されたC57BL群よりは明らかに高かった。GTTが示すところによると、KK筋芽細胞群は、GTT間の血漿グルコース濃度は著しく減少し、C57BL群と同程度であった（対KKコントロール及び線維芽細胞p<0.05、及び対KK群p<0.05）。
【００５０】
hSkM核は、ホスト筋肉繊維に組み込まれた。：hSkM核のDAPIラベルは100％のラベル効率を示した。ジストロフィンタンパク質の発現用に免疫染色したマウス骨格筋においてDAPI陽性hSkMの生存が確認された。同様の組織を、すべての核を示すヨウ化プロピジウム（PI）で対比染色した。これらの2つの条件のイメージを重ねてhSkM核のマウス骨格筋への組み込みを示した。
【００５１】
HbA1cとブドウ糖負荷試験の改善  グリコシル化ヘモグロビンアッセイを実施した。KK筋芽細胞群のマウスは、hSkM移植後に著しく良好なグルコース制御を実現した。治療後12週には、KK筋芽細胞群のHbA1cは、KKコントロール及び線維芽群より明らかに低くかった（両方p<0.05）。C57BL群のHbA1cは、どのKK群よりも明らかに低かった（すべてp<0.05）
【００５２】
KK筋芽細胞群において、血中グルコース濃度の著しい低下がみられた。移植後１２週には、KKコントロールと繊維芽細胞群の動物は、重篤な高血糖及び耐糖能異常を保有していた。これに対し、KK筋芽細胞群マウスは、KKコントロール及び繊維芽細胞群と比較して血中グルコースの明らかな減少を示し（ともにp<0.05）、C57BL群と同レベルに達していた（p<0.05）。
【００５３】
ホストマウスの骨格筋におけるhSkMsの生存及び集積  hSkMのDAPIラベル効率は100％であった。細胞移植後１２週のマウス骨格筋において、DAPI陽性核として示されるhSkMの広範囲の生存が認められた。
【００５４】
ジストロフィン発現に対するDAPI陽性組織の免疫染色によると、hSkM核は、同じ筋肉繊維中でホストの核と共局在していたことから、hSkMは、ホスト骨格筋繊維に組み込まれ、骨格筋繊維の境界線にあるジストロフィンとして複合筋肉繊維を形成することを示唆している。
【００５５】
大腿部の前内側筋におけるインシュリンシグナル経路の遺伝子発現のアレイ試験
KK筋芽細胞群対KKコントロール群
KK筋芽細胞群のマウスは、KKコントロール群と比較して２２遺伝子の転写産物が増加し、１遺伝子が減少しており、これは、調べた84遺伝子の２７．４％であった（図１）。２２の増加した遺伝子のほとんどは、タンパク質の代謝（１３）、細胞増殖及び分化（９）、MAPK経路（６）、及びインシュリン受容体関連タンパク質（６）、転写因子及び制御因子（４）、炭水化物代謝（４）機能群に属していた。減少した転写産物を示した唯一の遺伝子は、peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ)の標的遺伝子であった。これは、新規であり、興味深い発見である
【００５６】
KK筋芽細胞群対KK線維芽細胞群
KK筋芽細胞群は、KK繊維芽細胞群と比較して８（８４の９．５％）遺伝子の転写産物上昇を示した（図１）。８遺伝子は、タンパク質の代謝（３）、細胞増殖及び分化（２）、M、インシュリン受容体関連タンパク質（１）、転写因子及び制御因子（３）、及びPPARγの標的遺伝子（３）機能群に属していた。
【００５７】
KK筋芽細胞群対C57BL群
C57BL群と比較して、KK筋芽細胞群のマウスは、８遺伝子転写産物の変化を有していた（図１）。このうち、７遺伝子産物が増加し、１つが減少した。７つの上昇した遺伝子のほとんどは、タンパク質の代謝（４）、MAPK経路（２）、炭水化物代謝（３）、PI-3リン酸化経路（２）機能群に属していた。減少した転写産物を有する唯一の遺伝子はGlut-1であった。PPARγ遺伝子転写産物においては変化がなかった。
【００５８】
大腿部の前内側筋におけるミトコンドリア発生及び機能の遺伝子発現のアレイ試験
KK筋芽細胞群対KKコントロール群
KKコントロール群と比較して、KK筋芽細胞群のマウスは、２７（８４の３２．１％）遺伝子の転写産物が増加した（図２）。２７遺伝子のほとんどは、低分子輸送（７）、ミトコンドリア輸送（７）、膜内転移（５）、ミトコンドリアへの標的タンパク質（４）、ミトコンドリアタンパク質輸入（４）、ミトコンドリアの分裂及び融合（４）、ミトコンドリアの局在（３上昇）、及び膜外転移（２）、及び膜極性及び電位（２）機能群に属していた。
【００５９】
KK筋芽細胞群対KK線維芽細胞群
KK繊維芽細胞群と比較して、KK筋芽細胞群は、９（８４の１０．７％）遺伝子転写産物の上昇のみであった（図２）。９遺伝子のほとんどは、低分子輸送（２）、ミトコンドリア輸送（４）、膜内転移（１）、ミトコンドリアへの標的タンパク質（１）、ミトコンドリアタンパク質輸入（２）、ミトコンドリアの分裂及び融合（１）、及び膜外転移（１）、及び膜極性及び電位（２）機能群に属していた。ミトコンドリア局在機能群に属する遺伝子がなく、KK筋芽細胞とKK繊維芽細胞群の大きな違いを示した。
【００６０】
KK筋芽細胞群対C57BL群
C57BL群と比較して、KK筋芽細胞群のマウスは、ミトコンドリア遺伝子転写産物の変化が少ない（図２）。５遺伝子転写産物が増加し、1遺伝子転写産物が減少した。５遺伝子は、低分子輸送（１）、ミトコンドリア輸送（２）、膜内転移（１）、ミトコンドリアへの標的タンパク質（４）、ミトコンドリアタンパク質輸入（４）、ミトコンドリアの分裂及び融合（１）、ミトコンドリアの局在（１上昇）、及び膜外転移（２）、及び膜極性及び電位（２）機能群に属していた。転写産物が減少した唯一の遺伝子はSlc25a25であり、これは低分子輸送遺伝子である。
【００６１】
ミトコンドリア標的タンパク質、ミトコンドリアタンパク質輸入、及び膜外転移などの機能群に属する遺伝子が無く、KK筋芽細胞とC57BL群の大きな違いを示した。
【００６２】
本実施例は、驚くべきことに、hSkM移植後のKKマウスの骨格筋において、遺伝子転写産物の変化で実証されているように、インシュリンシグナル経路及びミトコンドリア発生と機能の遺伝子プロファイルが変化することを示した。インシュリンシグナル経路、及びミトコンドリア発生と機能それぞれ２３（２７．４％）及び２７（３２．１％）の遺伝子転写産物が、KKコントロールマウスと比較して、hSkM移植後のKKマウスの骨格筋において変化した。しかし、KK繊維芽細胞群と比較して、減少した遺伝子の数は８（９．５％）及び９（１０．７％）、C57BL群と比較して８（９．５％）及び６（７．１％）、これらは、KKマウス骨格筋へのhSkM移植は、インシュリンシグナル経路及びミトコンドリア発生と機能に関与する遺伝子の発現レベルを変化させることを示した。いかなる理論にも本実施態様の「要点」にも拘束されることを望むものではないが、これらの変化は、直接的又は間接的に高血糖の低下や耐糖性の改善に寄与すると考えられる。
【００６３】
これらの結果は、hSkM移植が、より良いグルコース恒常性を達成し、耐糖性を改善すし、一時的な免疫抑制処理を用いた細胞移植後12週にKKマウス骨格筋におけるhSkMの広範な生存を伴うことを示している。hSkM核はホスト骨格筋繊維へ組み込まれた。ドナー筋芽細胞の融合がホスト骨格筋細胞繊維と共に混成筋肉繊維を形成した。いかなる理論にも本実施態様の「要点」にも拘束されることを望むものではないが、これは、主要組織適合性遺伝子複合体クラスI抗原を発現しない成熟した骨格筋繊維として、サイクロスポリン処理の中止後、ドナーhSkMが、ホストの免疫拒絶を逃れるのを助けると考えられる14。ドナーの核は、また、混成筋肉繊維中で外来遺伝子がホスト遺伝子と一緒に共発現しうる。実施例の結果は、さらに、正常hSkMの組み込みは、インシュリンシグナル経路に関与する２２遺伝子、及びミトコンドリア発生と機能に関連する２７遺伝子の発現を増加させたことを明らかにしている。
【００６４】
KKコントロール群と比較して、KK筋芽細胞群においてインシュリンシグナル経路の２３遺伝子が変化：２２が増加し、１が減少：したことを見出した。インシュリンシグナル昨日群の第2エフェクター標的遺伝子を除き、すべての他の機能群は明らかに変化した遺伝子を有している。これらの遺伝子の半分（２３遺伝子の５６．５５％）は、タンパク質代謝に深く関与している。ほとんどは、多機能であり、ほかの機能群に関与している。例えば、Cebpa、Frs2、Hras1、Jun、Leptin、Raf、及びShc1は、細胞増殖と分化だけでなく、タンパク質代謝にも関与している。
【００６５】
KK繊維芽細胞群と比較して、KK筋芽細胞群においては、８遺伝子：Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1、及びUCP1：の転写産物が増加した。C57BL群と比較して、KK筋芽細胞群においては7遺伝子の転写産物が増加し、１つが減少した：Braf、Frap1、Gpd-1、Igf2、Leptin、Ppp1ca、及びUCP1が増加した一方、Glut-1は減少した。KKコントロールマウスのみならず、ヒト繊維芽細胞移植を受けたKKマウスと比べても、hSkM移植を受けたKKマウスのみが、高血糖、耐糖性、インシュリン耐性を明らかに改善したことを見出した。しかし、KK筋芽細胞群はC57BL群と同様のグルコース恒常性は生じなかった。そのため、驚くべきことに、Acaca、Aebp1、Cfd、Gpd-1、Jun、PPARγ、Ptpn1、及びUCP1は、特に細胞移植治療の文脈において、グルコース恒常性に寄与するほかの残りの１５遺伝子より一層重要であることが示された。残る１５遺伝子すべての転写産物のレベルは、KK筋芽細胞とKK繊維芽細胞群の間で同様であった。
【００６６】
KK線維芽細胞群と比較して、KK筋芽細胞群において、ミトコンドリア発生と機能の２７遺伝子が増加した。すべての機能群は、KK筋芽細胞群において明らかに変化を示す遺伝子を有していた。半分の遺伝子（２７の５１．９％）は、低分子輸送（７）及びミトコンドリア輸送（７）に関与していた。低分子輸送、膜内及び膜外転移の遺伝子を除き、ほかのほとんどは、また多機能であり、ほかの機能群に関与している。例えば、Aip、Cpt1b、及びGrpel1は、ミトコンドリア輸送だけでなく、ミトコンドリアタンパク質輸入及びミトコンドリア標的タンパク質に関与する。
【００６７】
KK繊維芽細胞群と比較して、KK筋芽細胞群は、９遺伝子：Bcl2l1、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、Tomm40、及びUCP1において遺伝子転写産物の上昇を示した。C57BL群と比較して、KK筋芽細胞群は、５遺伝子：Bcl2l1、Opa1、Sfn、Slc25a22、及びUCP1において遺伝子転写産物の上昇を、１遺伝子：Slc25a25において遺伝子転写産物の減少を示した。KKコントロール及びKk繊維芽細胞マウスと比較して、hSkM移植を受けたKKマウスのみが、高血糖、耐糖性及びインシュリン抵抗性を著しく改善した。それにもかかわらず、それらは、C57BLマウスと同程度のグルコース恒常性を生じない。そのため、驚くべきことに、Bcl2l1、Cox10、Cpt1b、Slc25a22、Slc25a25、Stard3、Timm17b、Tomm40は、グルコース恒常性に寄与する残る１９遺伝子の転写産物レベルがKK筋芽細胞とKK繊維芽細胞群で同様であるように、残る１９遺伝子より重要であることが見出された。
【００６８】
この結果は、SkM移植が、グルコース輸送及び代謝に関与する欠失遺伝子を供給することを示す。インシュリンシグナル経路及びミトコンドリア発生と機能に関与する服す遺伝子の発現レベルは、明らかに上昇した。これらの変化は、直接的又は間接的に、骨格筋におけるグルコース輸送及び代謝の促進に寄与した。これは、同様に、高血糖及び高インスリン血症の軽減、及びKKマウスの糖尿病表現計の改善を引き起こした。
【００６９】
従って、驚くべき事に、正常hSkMをKKマウスの肢骨格筋に対する異種移植が、インシュリンシグナル経路及びミトコンドリア発生と機能に関与する複数因子の発現を上昇させることが示された。これは、KKマウスにおける耐糖性の改善と高血糖の低下を伴う。この文脈において見いだされた特別な遺伝子は、疾患（特に糖尿病）の発症、進行及び細胞の増強による有望な実際の治療のモニタリングのための有用なツールである。これらの一以上の遺伝子の検出は、ここで記載されたような細胞の増加などの疾患緩和剤による治療の前、間、後に特に有用である。これらの遺伝子及びその産物は、細胞治療の新たな領域に用いられる優れた細胞クローンの選択にも有用である。当業者は、ここに記載された特別な遺伝子の一以上を用いて、疾患の治療及び予防のために培養する細胞を選択する方法を容易に理解することができる。
【００７０】
本クレームは、例示であり、限定されない。当業者は、ここの開示に基づき追加の関連形態を判断することができ、紙面を考慮して、本開示から解釈され、容易に感知される態様の徹底的な列挙は排除される。以下の参考文献は、全体として参照することにより特に取り込まれる。特に取り込まれるものは、細胞の取得及び増殖、生化学的（タンパク質、DNA／RNAを含む）及び細胞マーカーのアッセイのために開示された方法や物質である。最も具体的には、参考文献１０及び１３に記載される筋肉細胞の生検、培養、同定及び利用のための各臨床的な手段、手順、及び物質は、参照により取り込まれる。
【００７１】
参考文献
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【図１】
2015051969.tif 000002
【図２】
2015051969.tif 000003
【外国語明細書】
2015051969000001.pdf