(57)【要約】【課題】スダチ成分として、生体細胞のサーチュイン活性をより強く促進し得る物質を解明し、各種疾患の予防や、アディポネクチンの血中濃度の低下、インスリン抵抗性の亢進等に起因する種々の疾患の予防又は治療用の医薬製剤や食品、飼料を提供すること。【解決手段】スダチ成分の一つである（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールにＳｉｒｔ１活性が顕著であることを見出した。これにより、上記（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールを含有する組成物が、サーチュイン活性化促進剤として、メタボリックシンドローム、例えば糖尿病や脂質異常症等の種々の疾患の予防・治療に活用できることが明らかとなった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、Ｓｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤。
【請求項２】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを含有することを特徴とする、メタボリックシンドロームの治療・予防用の健康食品またはサプリメント。
【請求項３】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを含有することを特徴とする、Ｓｉｒｔ１活性化とＰＧＣ１ａ活性化の２つの作用を有することを特徴とする、請求項１に記載のＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤。
【請求項４】
上記Ｓｉｒｔ１活性化とＰＧＣ１α活性化が、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの添加量５０μＭより高い濃度で顕在化することを特徴とする、請求項３に記載のＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤。
【請求項５】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、中性脂肪濃度の低下促進剤。
【請求項６】
上記中性脂肪濃度が、肝細胞の中性脂肪濃度である、請求項５に記載の中性脂肪濃度の低下促進剤。
【請求項７】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの添加量５０μＭより高い濃度で顕在化することを特徴とする、請求項５に記載の中性脂肪濃度の低下促進剤。
【請求項８】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、脂質異常症の予防又は治療剤。
【請求項９】
上記脂質異常症が脂肪肝である、請求項８に記載の脂質異常症の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ−ｔｒａｎｓ−１，２−ｄｉｏｌ）を有効成分とするサーチュイン１（Ｓｉｒｔ１）の活性促進剤に関する。本発明は食品、医薬製剤、飼料等に好適に適用される。
【背景技術】
【０００２】  サーチュイン（ｓｉｒｔｕｉｎ）は、ＮＡＤ＋依存型の脱アセチルか酵素群の総称であり、酵母（Ｓｉｒ２など５種類）、線虫（４種類）、ショウジョウバエ（５種類）及びヒト（ＳＩＲＴ１〜ＳＩＲＴ７）など、多様なサーチュインが同定されている。ヒト・サーチュインは、いずれも、約２７５アミノ酸残基から構成されており、進化的な保存性の高い、触媒反応を担う領域を一次構造内に含んでいる。Ｓｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ２、Ｓｉｒｔ３、Ｓｉｒｔ５は、タンパク質基質中の−アミノ基がアセチル化されたリジン残基から、ＮＡＤ＋依存的に脱アセチル化を触媒する。Ｓｉｒｔ４とＳｉｒｔ６は、ＮＡＤ＋を供与体として、タンパク質基質中のＡＤＰ−リボシル化を触媒する。
サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）（サープロテイン（Ｓｉｒｐｒｏｔｅｉｎ）ともいう）を活性化することにより、細胞死の予防、老化の予防、細胞死の治療、延命、寿命延長、癌発生の予防ができると報告されている（特許文献１）。このようなサーチュイン活性化試剤としては、植物の感染抵抗性に関与する成分であるレスベラトロールが知られており、動物実験によってコレステロールの減少、心臓病のリスク予防、早期ガンの予防及び進行抑制、血小板凝集予防などの効果が報告されている（非特許文献１，２）。また、近年、サーチュイン活性が上昇すると、アディポネクチンの産生が促進されることが明らかとなっている（特許文献２）。
上記の知見に刺激を受け、生体のサーチュイン活性を促進させる物質の探索が盛んに行われており、前述のレスベラートルより、更に強いサーチュイン活性促進物質が探索されている（特許文献３）。【０００３】  植物には多くの成分（例えばポリフェノール類等）が存在し、多くの機能を担っている。レスベラトロールも、その一つであり、レスベラトロール以外にも、生体のサーチュイン活性を促進させる物質が存在することが想像された。そこで、植物成分（例えばポリフェノール類等）が検討され、報告される中で、スダチ果皮粉末を経口投与されたマウスに関して、生存率が向上していることが報告されている。このことから、スダチの成分には、サーチュイン活性を促進する物質があると考えられ、これまで３５種類の化合物がスダチ果皮から単離され、その活性が評価されてきた（特許文献４）。
しかしながら、これらスダチ成分の３５種の化合物は、非常に微量であり、サーチュイン活性の評価も充分実施できず、どのような作用メカニズムでのサーチュイン活性の発現であるのかも全く解明されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５３０４１７号公報
【特許文献２】特開２００８−２５５０４０号公報
【特許文献３】特開２０１１−５７５８０号公報
【特許文献４】特開２００９−１２６７９９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】中畑泰和、「時間生物学」Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，６９−７４（２０１１）
【非特許文献２】山盛徹、「北獣会誌」Ｖｏｌ．５５，４５−４９（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の目的は、スダチ抽出成分の３５種の中で、Ｓｉｒｔ１タンパク質の産生を促進し、生体のサーチュイン活性を促進させる物質を特定し、それを有効成分とするサプリメントや医薬組成物を作製することにより、各種疾患の予防を行うことである。特に、アディポネクチンの血中濃度の低下、及びインスリン抵抗性の亢進等に起因する種々の疾患の予防、更にはメタボリックシンドローム、糖尿病やその合併症、動脈硬化、消化器疾患等の種々の病態の予防を行うことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、上記課題を解決するためにスダチ成分から３５種の化合物を単離し、その内、７種にサーチュイン（Ｓｉｒｔ１／Ｓｉｒ２）活性を認め、特にその内の２種にはレスベラトロールと同等の活性があることを見出している（特許文献４）。本発明者らは、更に検討を進め、サーチュイン活性が認められなかったスダチ成分の中で、以下の構造式の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ−ｔｒａｎｓ−１，２−ｄｉｏｌ）（１）が、図１（化合物番号３０）に示されるように、標準物質であるレスベラトロールと同程度以上のＳｉｒｔ１活性化作用があることを見出した。また、上記化合物（１）を用いて検討したところ、肝細胞の中性脂肪（トリグリセリド）濃度の低下を起こすことが分かり、本発明の化合物が、これまでスダチ果皮粉末の効果として報告されていた血中トリグリセリド濃度を低下させる有効成分の一つであることが明らかとなった。本発明者らは、以上の知見により本発明を完成した。【０００８】
【化１】
2015074653.tif 000002
【０００９】  本発明の要旨は以下の通りである。
（１）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、Ｓｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤。
（２）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを含有することを特徴とする、メタボリック・シンドロームの治療・予防用の健康食品またはサプリメント。
（３）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを含有することを特徴とする、Ｓｉｒｔ１活性化とＰＧＣ１ａ活性化の２つの作用を有することを特徴とする、上記（１）に記載のＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤。
（４）上記Ｓｉｒｔ１活性化とＰＧＣ１α活性化が、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの添加量５０μＭより高い濃度で顕在化することを特徴とする、上記（３）に記載のＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤。
（５）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、中性脂肪濃度の低下促進剤。
（６）上記中性脂肪濃度が、肝細胞の中性脂肪濃度である、上記（５）に記載の中性脂肪濃度の低下促進剤。
（７）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの添加量５０μＭより高い濃度で顕在化することを特徴とする、上記（５）に記載の中性脂肪濃度の低下促進剤。
（８）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、脂質異常症の予防又は治療剤。
（９）上記脂質異常症が脂肪肝である、上記（８）に記載の脂質異常症の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１０】  本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール（１）は、Ｓｉｒｔ１活性がレスベラトロールと同程度以上であり、更に、肝細胞のトリグリセリドの濃度を有意に低下させることができるため、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール（１）を利用した脂質異常症の予防又は治療剤や健康食品を提供することができる。更に、本発明の１，２‐ジオール（１）を含有する健康食品またはサプリメントを摂食することによって、サーチュイン活性の低下が関与するメタボリックメタボリックシンドローム、糖尿病やその合併症、消化器疾患等の種々の病態の治療・予防に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】すだち果皮由来化合物３１種のＳｉｒｔ１活性を、レスベラトロールと対比して表わした図である。
【図２】（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールによる、Ｓｉｒｔ１活性化の濃度依存（用量相関）を表わした図である。５００μＭの投与量で顕著な有意差が見られる。
【図３】（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールによる、Ｓｉｒｔ１活性化の時間依存（経時変化）を表わした図である。化合粒の添加、８時間後に有意な活性が見られ、２４時間後になると顕著な有意差が示された。このように、化合物の投与から効果発現までは、８時間以上のタイムラグがあることが見出された。
【図４】（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールによる、ＰＧＣ１α活性化の時間依存（経時変化）を表わした図である。上記図３に示されたＳｉｒｔ１活性化の挙動と同様に、きれいに相関していることが示された。
【図５】（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールを投与することにより、肝細胞の中性脂肪（ＴＧ）含量が低下したことを表わした図である。上記図３に示されたＳｉｒｔ１活性化の挙動と同様にきれいに相関していることが示された。即ち、化合物を５μＭ投与することにより、ＴＧ含量が低下し始め、５０μＭになると有意差が付き始めることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】  本発明の「（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール」とは、上記構造式（１）の化合物であり、Ｒ（＋）−リモネン（ｌｉｍｏｎｅｎｅ）の酸化代謝体と考えられる。なお、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの有効投与量としては、Ｓｉｒｔ１を活性化するに充分な量であれば特に問題はない。例えば、５０μＭの濃度が担保できれば、筋肉細胞や肝細胞で効果が発揮できることが示されている。
本発明の「Ｓｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤」とは、Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現増強を通じて、Ｓｉｒｔ１タンパク質の産生促進効果を示す化合物のことであり、更には、Ｓｉｒｔ１タンパク質の阻害物質を排除する効果を示す化合物のことを言う。
本発明のＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤は、メタボリックシンドロームの予防や治療用の医薬品やサプリメントの有効成分としてヒトおよび動物に投与することができる。更には、各種飲食品、飼料（ペットフード等）に配合しても摂取させることができる。本発明のＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤を医薬品として使用する場合には、経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの製剤や各種飲食品には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
【００１３】  本発明の飲食品やサプリメントの中に含まれる有効成分である（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの含有量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができ、例えば、１〜１０質量％程度とすることができる。特に、保健用飲食品やサプリメント等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。
本発明の医薬品において、有効成分である（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの投与量は、その種類、その剤型、また患者の年令、体重、状況などによって異なるが、例えば経口的に服用される場合には、成人１日１回〜数回投与され、１日あたり１回約１ｍｇ〜２００ｍｇ、好ましくは３ｍｇ〜２０ｍｇ／人程度投与するのがよい。
【００１４】  本発明の「ＰＧＣ１α活性化」とは、Ｓｉｒｔ１の作用により、ＰＧＣ−１αが脱アセチル化して活性化することをいう。なお、ＰＧＣ−１α（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−  １α）とは、ミトコンドリアを構成する分子、あるいはその機能発揮に重要な分子の発現の制御を行う主調節因子である。そのため、ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア合成やエネルギー産生を促進している。即ち、ＰＧＣ−１は筋機能とインスリン感受性に影響を与えている。従って、ＰＧＣ１α活性化により、インスリン感受性が改善されることになる。
本発明の「中性脂肪」とは、トリグリセリド（ＴＧ）のことであり、砂糖などの糖質、炭水化物、動物性脂肪などを主な原料として、肝臓で作製される。糖質、炭水化物、動物性脂肪を多く取りすぎると、皮下脂肪の主成分として蓄積される。中性脂肪が血液中に増加してくると、動脈硬化を進める一因になる。そのため、中性脂肪の血中濃度の測定は、動脈硬化性疾患（狭心症、心筋梗塞、脳卒中など）を予防するために重要な数値となっている。例えば、中性脂肪の値が高い場合には動脈硬化の危険度が高く、低い場合には栄養障害やそれを引き起こす病気の可能性が考えられる。中性脂肪濃度は、血中の基準値では３０〜１４９ｍｇ／ｄｌである。中性脂肪値は食後３０分ぐらいから上昇し始め、４〜６時間後に最も高くなる。測定する時間によっても変動が大きいため、検査は早朝空腹時に行なうこととされている。メタボリックシンドロームなどの患者の場合、中性脂肪の濃度が、血中の基準値を大きく超えているため、動脈硬化が加速されることになる。それ故、血中のＴＧ濃度を低下させることにより、動脈硬化が予防又は治療できることになる。また、肝臓の細胞中での中性脂肪濃度が高くなると、肝細胞への中性脂肪の蓄積が進み、肝臓が脂肪肝になり、これが重症化すると、肝硬変、肝臓ガンへと移行して行くことになる。それ故、血中や肝細胞内での中性脂肪濃度の低下はメタボリックシンドロームの予防又は治療に欠かせないものであり、脂質異常症や脂肪肝の予防や治療に有効な方法である。
【００１５】
【実施例】
【００１６】  以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００００】３１種のスダチ成分のＳｉｒｔ１活性の評価
（１）試剤
１）使用細胞：Ｃ２Ｃ１２（未分化）
２）使用培地：１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭ
３）サンプル：生薬研究室提供の紅花抽出物およびスダチ抽出物
４）キット：Ｃｙｃｌｅｘ社製品「Ｃｙｃｌｅｘ  ＳＩＲＴ１／Ｓｉｒ２  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」
５）サイトゾル回収用緩衝液（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５％  ＮＰ−４０、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ
（２）方法
１）細胞培養：
細胞培養用の３５ｍｍディッシュあるいは６穴プレートに細胞を播種し、１０％ＦＢＳＤ−ＭＥＭでコンフルエントになるまで培養する。
２）細胞刺激：
上記培地を吸引し、コントロールのグループは通常培地と、サンプルのグループは任意の濃度でサンプルを溶解した培地と交換する。本実験ではサンプルの最終濃度は５０ｕＭとした。Ｎ数は１グループにつき最低でも３，５〜６用意するとより望ましい。３７℃インキュベーターで２４時間刺激を行う。
３）細胞収穫（Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）：
以下の手順で細胞を刺激を終了し、サイトゾルを回収する。
サイトゾルの回収は以下の通りである。
ます、培地を吸引Ｉ、氷冷したＰＢＳで２回洗った。次に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて（コンフルの場合は２５０〜３００μｌ程度に増やしても良く、一見して細胞密度が低い場合は５０〜１００μｌ程度に減量しても良い。）、氷上で１５分放置する。顕微鏡で、細胞質が溶解していることを確認し、セルスクレーパーで掻きとり、エッペンチューブに移した。その後、５秒×３回超音波破砕を行った。次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を他のエッペンチューブに移し、使用するまで−８０℃で保存した。【００００】（３）評価
１）Ｓｉｒｔ１活性評価：
Ｃｙｃｌｅｘ社製品「Ｃｙｃｌｅｘ  ＳＩＲＴ１／Ｓｉｒ２  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」を用い、マイクロプレートリーダーで蛍光強度測定する。
以下の手順で白色９６穴プレートに試薬を供給し、測定する。
ａ）水：
任意の量を各ウェルに添加する。
ｂ）ＮＡＤ溶液：
各ウェルに５μＬずつ添加する。
ｃ）評価サンプル：
タンパク１５μｇ相当のＬｙｓａｔｅを各ウェルに添加する。
ｄ）反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）：
各ウェルに３０μＬずつ添加する。
ｅ）試薬類を注入後、プレートシェイカーでサンプルと試薬をよく混合する。その後、蛍光強度を測定する。測定時間は本実験では通常「Ｒｅａｄｉｎｇｓ：１０」「Ｉｎｔｅｒｖａｌ：１ｍｉｎ」に設定している。
［注記］
通常、白色９６穴マイクロプレートの１穴に１５μｇのタンパクを供給して測定しているので、タンパク量１５μｇに相当するＬｙｓａｔｅの量を秤量する。さらにウェル内の液量を一律にするため添加する水の量も秤量する。
反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）の組成（１穴）５０穴分を作製する場合には、次の表１の組成を採取し、単純に５０倍して調製した。
ＮＡＤ溶液は、▲５▼のＮＡＤ原液を▲１▼ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍希釈して作製する。得られたＮＡＤ溶液と反応緩衝液は−２０℃で保存した。【００００】
【表１】
2015074653.tif 000003
なお、表１の▲１▼とか▲２▼の番号は、Ｋｉｔに附属の試薬チューブに記載されている番号である。また、▲１▼ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒとは、▲１▼Ｓｉｒｔ１  ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを蒸留水で１０倍希釈したもの。【００００】（４）評価結果
各ウェルでの経時的な蛍光強度推移（測定開始時〜測定終了時まで）を求め、「散布図」でグラフにする。さらに近似直線を出し、その傾きを「Ｋ」とする。それぞれＮ＝６での測定を行い、Ｋ１〜Ｋ６を平均した値を「Ｋ  Ａｖｅｒａｇｅ」とする。「Ｋ  Ａｖｅｒａｇｅ」はＳｉｒｔ１活性と相似できる。コントロール（無添加）の「Ｋ  Ａｖｅｒａｇｅ」を１００％として、各グループの「Ｋ  Ａｖｅｒａｇｅ」と比較する。その結果を、図１に示す。
コントロール（無添加）と比較して「Ｋ  Ａｖｅｒａｇｅ」の割合が１００％を上回り、統計的に有意であるグループは、Ｓｉｒｔ１の活性化促進剤と考えられる。図１に示されるように、スダチ成分の中で、これまで有効でないと考えられて来たスダチ・サンプル番号３０の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールに、レスベラトロールと同等以上の明確なＳｉｒｔ１の活性化促進効果が認められた。
【実施例２】
【００００】（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールによるＳｉｒｔ１活性化の評価検討
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールがＳｉｒｔ１活性化に及ぼす影響を、以下の点について検討した。
ａ）Ｓｉｒｔ１活性化に及ぼす上記ジオールの添加濃度の影響
ｂ）Ｓｉｒｔ１活性化に及ぼす上記ジオールの添加後の時間の影響
ｃ）Ｓｉｒｔ１活性化とＰＧＣ１α活性化の相関性
ＰＧＣ１α活性化に及ぼす上記ジオールの添加後の時間の影響【００００】（１）試剤
１）使用細胞：Ｃ２Ｃ１２細胞（筋管細胞）
２）使用培地：１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭ
（２）方法
１）細胞培養：
細胞培養用の３５ｍｍディッシュあるいは６穴プレートに上記細胞を播種し、１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭでコンフルエントになるまで培養する。
２）細胞刺激：
上記培地を吸引し、コントロールのグループは通常培地と、サンプルのグループは任意の濃度でサンプルを溶解した培地と交換する。本実験ではサンプルの最終濃度は５０μＭとした。Ｎ数は１グループにつき最低でも３，５〜６を用意するとより望ましい。３７℃インキュベーターで２４時間刺激を行う。
３）細胞収穫（Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）：
以下の手順で細胞の刺激を終了し、サイトゾルを回収する。サイトゾルの回収は以下の通りである。まず、培地を吸引Ｉ、氷冷したＰＢＳで２回洗った。次に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて（コンフルの場合は２５０〜３００μｌ程度に増やしても良く、一見して細胞密度が低い場合は５０〜１００μｌ程度に減量しても良い。）、氷上で１５分放置する。顕微鏡で、細胞質が溶解していることを確認し、セルスクレーパーで掻きとり、エッペンチューブに移した。その後、５秒×３回超音波破砕を行った。次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を他のエッペンチューブに移し、使用するまで−８０℃で保存した。【００００】（３）評価
サイトゾルを融解し、レムリのサンプルバッファーを添加して９８℃で５分間加熱処理後、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動による展開を行った。展開したゲルは常法に従い、ウエスタンブロットによるＰＶＤＦ膜へ転写し、市販の抗Ｓｉｒｔ１抗体、抗ＰＧＣ１α抗体による検出を行った。また、２次抗体として、抗β−ａｃｔｉｎ抗体、抗ｃ２ｃ１２抗体による検出を行った。
その結果を、図２〜４に示した。図２に示されるように、本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールは、添加量が５００μＭになれば、有意にＳｉｒｔ１活性化が認められた。また、図３に示されるように、本発明の１，２‐ジオールは、添加しても直ぐにはＳｉｒｔ１活性化の反応が起きることはなく、添加後８時間経つと、Ｓｉｒｔ１の活性化が現れ始め、２４時間後にはＳｉｒｔ１の活性化が顕著になってくる。
更に、図４に示されるように、Ｓｉｒｔ１の活性化と相関して、ＰＧＣ１ａの活性化が経時的に顕著になってくることが明らかになった。
【実施例３】
【００００】（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの薬効確認について
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールがＳｉｒｔ１の活性化を促進することから、アディポネクチンの産生を増大させる等のメタボリックシンドロームに対する予防又は治療効果のあることが期待される。そこで、Ｆａｏ細胞を用いて、細胞内の中性脂肪（ＴＧ）含量に対する影響を検討評価した。
（１）試剤
１）使用細胞：Ｆａｏ細胞（ラット肝癌由来細胞株）
２）使用培地：１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭ
（２）方法
１）細胞培養：
細胞培養用の３５ｍｍディッシュあるいは６穴プレートにＦａｏ細胞を播種し、１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭでコンフルエントになるまで培養した。
２）細胞刺激：
上記培地を吸引し、コントロールのグループは通常培地と、サンプルのグループは任意の濃度でサンプルを溶解した培地と交換した。本実験ではサンプルの最終濃度は５０ｕＭとした。Ｎ数は１グループにつき最低でも３，５〜６を用意するとより望ましい。３７℃インキュベーターで２４時間刺激を行った。
３）細胞収穫（Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）：
以下の手順で細胞を刺激を終了し、サイトゾルを回収する。サイトゾルの回収は以下の通りである。まず、培地を吸引し、氷冷したＰＢＳで２回洗った。次に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて（コンフルの場合は２５０〜３００μｌ程度に増やしても良く、一見して細胞密度が低い場合は５０〜１００μｌ程度に減量しても良い。）、氷上で１５分放置する。顕微鏡で、細胞質が溶解していることを確認し、セルスクレーパーで掻きとり、エッペンチューブに移した。その後、５秒×３回超音波破砕を行った。次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を他のエッペンチューブに移し、使用するまで−８０℃で保存した。【００００】（３）評価
上記細胞内の中性脂肪の測定には、刺激後の細胞を氷冷ＰＢＳにて洗浄したのち、１０％メタノール、９０％クロロホルム中にて超音波破砕を行うことにより脂質を抽出した。抽出した脂質は減圧遠心により乾固し、少量の２−プロパノールにて再懸濁した。その２−プロパノール中に溶解している中性脂肪をＴＧワコー（和光純薬）試薬を用いて定量した。
その結果を、図５に示す。図５に示されるように、本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールが、５０μＭの濃度の添加量の場合に、ＴＧの低下効果が出始め、５００μＭになれば、有意差が明確に出る結果であった。本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの効果は、図１に示されるＳｉｒｔ１の活性化に対する上記ジオールの添加効果と相関していることが示された。
即ち、Ｓｉｒｔ１活性化が強くなればなるほど、ＴＧの低下効果が有意に顕著な差として現れてくることが示され、本発明のジオールの添加量が５０μＭになれば肝細胞の中性脂肪（ＴＧ）が減少し始め、５００μＭになれば、肝細胞のＴＧは顕著に減少、低下することが明らかになった。
この結果、本発明のジオールは、脂肪肝の治療に有効であることが示された。また、スダチ果皮粉末には、血中のＴＧ濃度を低下させる効果が知られているが、上記結果から、本願発明のジオールが、血中のＴＧ濃度を低下させる有効成分の一つであることが明確になった。
【実施例４】
【００００】（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの調製
スダチの凍結乾燥果皮より抽出したメタノールエキスを、酢酸エチル−水で分配し、酢酸エチル抽出物をさらにシリカゲルカラム（ヘキサン−酢酸エチル）で分離した。この取得された画分についてＨＰＬＣ（クロロホルム−メタノール）、そしてＧＰＣカラム（メタノール）にて分分離することにより、本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを得ることができる。なお、本発明の上記ジオールは市販もされている。
【産業上の利用可能性】
【００００】  本発明の（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールを有効成分とするＳｉｒｔ１タンパクの産生促進剤及び／又はＳｉｒｔ１活性化促進剤は、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールの効果によってＳｉｒｔ１のタンパク産生増強と活性化の促進を図ることができた。更に、本発明の（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールの薬理学的な効果として、細胞内のトリグリセリドの効果を低下させることが見出された。
これらの結果から、本発明の（＋）‐リモネン‐ｔｒａｎｓ‐１，２‐ジオールは、メタボリックメタボリックシンドロームに関連する疾患の予防と治療、例えば糖尿病や脂質異常症の治療・予防、またＳｉｒｔ１活性調節により大腸癌などの腫瘍性疾患にも効果が期待でき、これらの病態の治療・予防に有効である。
【図１】
2015074653.tif 000004
【図２】
2015074653.tif 000005
【図３】
2015074653.tif 000006
【図４】
2015074653.tif 000007
【図５】
2015074653.tif 000008