(57)【要約】【課題】本発明は、ヒトメラノーマ細胞に高い特異性を有するメラノーマ増殖抑制剤を提供することを課題とする。【解決手段】γリノレン酸を含むヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γリノレン酸を含むヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
【請求項２】
γリノレン酸が遊離型γリノレン酸である、請求項１に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
【請求項３】
γリノレン酸が遊離型γリノレン酸またはその誘導体のいずれかである、請求項１に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
【請求項４】
遊離型γリノレン酸誘導体が水酸化物である、請求項３に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
【請求項５】
γリノレン酸が０．１〜５００μＭの濃度で投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
【請求項６】
ヒトメラノーマがコーカソイド種由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトメラノーマの増殖を抑制するための化学療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ（悪性黒色腫）は、メラノサイトが癌化して生じる悪性腫瘍である。早期から転移を生じやすく、化学療法や放射線療法にも抵抗性で悪性度の高い腫瘍として知られている。
メラノーマをはじめとする分化の段階から異常を生じたと考えられる癌細胞（白血病細胞、大腸がん細胞、乳がん、神経芽細胞腫など）には、正常な細胞に分化誘導することができるものが存在する。正常な細胞に分化すれば、増殖が制御され、その細胞はやがて死滅する（非特許文献１）。
メラノーマ治療に用いられている薬剤としては、タキソールなどが挙げられるが、毒性が強く、副作用も多い（非特許文献２）。γリノレン酸はBL6マウスのメラノーマの増殖
抑制効果を持つことは知られていたが（特許文献１）、γリノレン酸がマウスのメラノーマに効果があったからといって、ヒトのメラノーマの増殖抑制効果があるとは分からなかった。また、γリノレン酸のヒトメラノーマ分化誘導効果についても知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭59-134721号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】中谷一泰、蛋白質核酸酵素、癌細胞に対する新規な分化・アポトーシス誘導剤、Vol.41 No.2, 1996, p119-126
【非特許文献２】岡本芳晴、科学研究費補助金研究成果報告書、悪性黒色腫に対する分化誘導剤の開発(http://kaken.nii.ac.jp/pdf/2010/seika/jsps/15101/20580352seika.pdf)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒトメラノーマ細胞に高い特異性を有するメラノーマ増殖抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、γリノレン酸がヒトメラノーマ細胞の分化誘導能及び増殖抑制能の両方を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）γリノレン酸を含むヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
（２）γリノレン酸が遊離型γリノレン酸である、（１）に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
（３）γリノレン酸が遊離型γリノレン酸またはその誘導体のいずれかである、（１）に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
（４）遊離型γリノレン酸誘導体が水酸化物である、（３）に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
（５）γリノレン酸が０．１〜５００μＭの濃度で投与されることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
（６）ヒトメラノーマがコーカソイド種由来である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤。
（７）（１）〜（６）のいずれか１項に記載のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤を含む医薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、ヒトメラノーマ細胞の分化誘導能及び増殖抑制能の両方を有する。
本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、毒性、催奇原性がないため、副作用の少ない癌化学療法剤として利用できる。
本発明により、メラノーマ治療の選択肢の１つとして「分化誘導による細胞増殖抑制治療法」が加わり、医療従事者及び患者は、患者の状態、進行の度合い等によって、最良な治療法を選択することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒトメラノーマ細胞株（G361）及びマウスメラノーマ細胞株（B16BL6）での本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤（GLA）の分化誘導能を示す。
【図２】ヒトメラノーマ細胞株（G361）及びマウスメラノーマ細胞株（B16BL6）での本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤（GLA）の細胞増殖抑制能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、γリノレン酸を有効成分として含有することを特徴とする。本発明で使用されるγリノレン酸は、遊離型γリノレン酸またはγリノレン酸誘導体のいずれであってもよいが、遊離型γリノレン酸が好ましい。
【００１１】
本発明の「ヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤」とは、ヒトメラノーマ細胞の分化を誘導し、かつ、ヒトメラノーマ細胞の増殖を抑制する薬剤をいう。
メラノーマ細胞における分化の指標としてはチロシナーゼ活性が挙げられる。チロシナーゼ活性の上昇はすなわち分化度の上昇を表す（Chin Med J (Engl). 2012 Nov; 125(22): 4088-92.）。本発明において、ヒトメラノーマ細胞の分化誘導能は、例えば、Chin Med
J (Engl). 2012 Nov; 125(22): 4088-92.のMethods Tyrosinase assayの欄に記載されるような、チロシナーゼアッセイにより測定することができる。本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤により、チロシナーゼ活性（475nmにおける吸光度）は、対照区の値と
比較して３倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、上昇する。
ヒトメラノーマ細胞の増殖抑制能は、細胞増殖試薬（WST-1）、例えば、Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System(TaKaRa製)によって測定することができる。本発明の
ヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤により、増殖能（450nmにおける2時間後の吸光度）は、対照区と比較して、５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは４０％以上減少している。
【００１２】
本発明で使用される「遊離型γリノレン酸」とは、グリセリド体ではなく、グリセリンから遊離しているγリノレン酸を意味する。
本発明で使用される遊離型γリノレン酸は、市販のものを使用することができる。遊離型γリノレン酸は、CAYMAN CHEMICAL社などより販売されている。本発明で使用される遊
離型γリノレン酸は、γリノレン酸トリグリセリドを酵素処理することによってグリセリンから遊離したγリノレン酸を使用してもよいし、月見草の種子などから抽出してもよい。月見草の種子などから抽出したものを酵素処理することによって、遊離したγリノレン
酸を使用しても良い。
【００１３】
本発明で使用される遊離型γリノレン酸の誘導体としては、例えば、γリノレン酸エステル、γリノレン酸の水酸化物、ジホモγリノレン酸が挙げられるが、ヒトメラノーマ細胞の分化誘導能及び増殖抑制能の両方を有する限り、特に限定されない。γリノレン酸エステルの具体例としては、γリノレン酸の末端のカルボン酸と水酸基を有する化合物ＲＯＨ（式中、Ｒはアルキル基またはフェノール基である）とのエステル体が挙げられる。γリノレン酸の水酸化物の具体例としては、γリノレン酸の二重結合をもたない炭素原子に結合する水素が水酸基に置換された水酸化物（末端炭素原子が水酸化される場合を除く）が挙げられ、水酸化は１個の水酸基の水酸化に限定されず、複数個の水酸化でもよい。
【００１４】
メラノーマ細胞の由来としては、ヒト細胞由来、マウス細胞由来、ウサギ細胞由来等様々あるが、本発明のメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、特にヒト細胞由来のメラノーマ細胞に使用することが好ましい。
またメラノーマ細胞の種類としては、口腔、子宮、皮膚、リンパ節、肝臓のメラノーマ細胞が挙げられ、詳細には、ヒト口腔由来悪性黒色腫細胞(例えば、HMG, PMP, MMN9及びMAA)、ヒト子宮由来悪性黒色腫細胞(例えば、MVH-II)、ヒト皮膚由来悪性黒色腫細胞(例えば、G361及びC32)、ヒトリンパ節転移由来悪性黒色腫細胞(例えば、WM-266-4)、ヒト肝臓由来腺癌細胞(例えば、SK-Hep-1)、ヒト由来悪性黒色腫細胞（例えば、HMY-1）、リンパ
節由来ヒト悪性黒色腫（例えば、A2058）、及びヒト上皮由来悪性黒色腫細胞（例えば、G361）が挙げられる。G361は、コーカソイド（白人）種由来であり、ATCCカタログ番号CRL-1424として掲載されている。他にもATCCよりSK-MEL-5、MeWo、RPMI-7951、Hs 934.T、Malme-3M等の悪性黒色腫細胞を購入することが出来る。モンゴロイド（日本人）種由来の悪性黒色腫細胞としてはHMV-II、HOMM、HTMM、MMAc、MMAc・SF株等が挙げられる。
【００１５】
本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、γリノレン酸を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して医薬とすることができる。
【００１６】
薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、添加剤、基剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。溶剤としては、例えば、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロー
ス、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤としては、例えばブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばパラヒドロキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、例えばジブチルヒドロキシトルエン、アスコルビン酸、トコフェロール等が挙げられる。添加剤としては、ビタミンＥ等が挙げられる。基剤としては、ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール）類、グリセリン類等の親水性基剤が挙げられる。
なお、本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、γリノレン酸を単独の有効成分としてもよいし、その他のメラノーマ細胞増殖抑制剤と併用してもよい。
【００１７】
本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、例えば、溶媒としてのメタノール、エタノール、またはジメチルスルホキシドに懸濁して用いることが好ましい。また、媒体中の薬剤の濃度を容量％で１％以下となるように調整することが好ましい。さらに、本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、上記添加剤、抗酸化剤、基剤を含むことが好ましい。製剤中のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤の好ましい含有量は、製剤全量に対して１〜５０質量％であり、より好ましくは１〜２０質量％である。
【００１８】
本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤を含有してなる医薬は、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤、塗布剤等の医薬製剤として、経口的または非経口的（例、局所、静脈内注射、経皮塗布等）に安全に投与することができる。なお、医薬には医薬部外品も含まれる。低濃度で吸収されるため、局所投与される外用剤が好ましい。特に、口腔、子宮、皮膚、リンパ節、肝臓などの部位に対して、塗布によって局所投与される外用剤が好ましい。
【００１９】
好ましい投与量は、投与対象、症状などにより異なり特に制限されないが、例えば、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。
【００２０】
なお、γリノレン酸を液剤として投与する場合、γリノレン酸の濃度は、濃度が低すぎると効果が発現しないとの問題が生じる一方、濃度が高すぎると過酸化脂質による細胞毒性を引き起こすといった問題が生じるため、０．１〜５００μＭで投与されることが好ましく、より好ましくは１〜２５０μＭ、更に好ましくは１０〜１００μＭである。
【００２１】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【実施例】
【００２２】
実施例１：本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤の分化誘導能
＜材料＞
下記に示す2種のメラノーマについて、分化誘導能についての実験を行った。
・G361：ヒトメラノーマ細胞（独立行政法人医薬基盤研究所より入手）
・B16BL6：マウスメラノーマ細胞（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手）
＜方法＞
分化誘導能の測定（チロシナーゼアッセイ）
Chin Med J (Engl). 2012 Nov; 125(22): 4088-92.のMethods Tyrosinase assayの欄を参照して行った。詳細には6 well細胞培養用プレートに上記メラノーマ細胞を播種し、細
胞を接着させるために1晩常法で培養した。その後γリノレン酸（GLA、Cayman Chemical Company製)をエタノールで溶解し、所定の濃度となるように培地に添加した。24時間後、培地を除去しPBSで洗浄した後、0.5% deoxycholate溶液(Appli Chem社製)を600μl/well
加え、細胞を回収した。L-DOPA(SIGMA社製)を0.1%加え、37℃で15分間処理した後、475nm吸光度を測定した。同サンプルを用いてBCA assayにてタンパク質量を測定し、チロシナ
ーゼ活性（吸光度）をタンパク質量（μg/ml）で除することによって、チロシナーゼ活性(475nm吸光度)/タンパク質量(μg/ml)の値を得た。得られた値に1000を乗じた後、それぞれの細胞株の対照区の値を1とし補正計算を行い、チロシナーゼ活性（fold of control）の値を得た。
＜結果＞
分化誘導能の測定（チロシナーゼアッセイ）の結果を図1に示す。図1は対照区を1とし
た時のチロシナーゼ活性の変化である。B16BL6マウスメラノーマにおいてはγリノレン酸（GLA）を処理してもチロシナーゼ活性に殆ど変化は見られなかったが（図1右）、G361ヒトメラノーマ細胞においてはGLA濃度依存的にチロシナーゼ活性の上昇が見られた。これ
はGLAの濃度依存的にメラノーマ細胞が分化していることを表している。
【００２３】
実施例２：本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤の細胞増殖抑制能
＜材料＞
実施例１と同じ細胞株を使用した。
＜方法＞
96well細胞培養用プレートにメラノーマ細胞を播種し、細胞を接着させるために1晩常
法で培養した。その後GLA(Cayman Chemical Company製)をエタノールで溶解し、所定の濃度となるように培地に添加した。GLAを添加してから48時間後、Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara製)を10μl加え、2時間後の吸光度(450nm)を測定することにより、増殖能を評価した。
＜結果＞
細胞増殖抑制能の測定（WST-1アッセイ）の結果を図2に示す。図2は対照区の癌細胞を100%とした時の癌細胞増殖の変化である。B16BL6マウスメラノーマにおいてはγリノレン
酸（GLA）を処理しても癌細胞の増殖能に殆ど変化は見られなかったが（図2右）、G361ヒトメラノーマ細胞においてはGLA濃度依存的に癌細胞の増殖抑制効果が見られた。
【００２４】
本発明のγリノレン酸を含むメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、ヒトメラノーマのみで分化促進効果および増殖抑制効果を発揮した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により、ヒトメラノーマ細胞に選択的な化学療法剤を提供することができる。本発明のヒトメラノーマ分化誘導増殖抑制剤は、癌予防および治療の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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