(57)【要約】【課題】ＧＬＰ−１分泌促進剤、およびそれを評価または選択する方法の提供。【解決手段】（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定することを含むＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含むＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法。
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含む食欲抑制剤の評価または選択方法。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含む肥満予防および／または改善剤の評価または選択方法。
【請求項４】
前記（Ｂ）において、前記被験物質と共存させていない前記ＴＲＰＶ２または前記カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入がさらに測定される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記（Ｃ）において、前記ＴＲＰＶ２または前記カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入の測定結果が、前記被験物質と共存させた該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルと、該被験物質と共存させていない該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルとの間で比較される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＲＰＶ２または前記カチオンチャネルとして、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルを発現している哺乳動物由来の組織または細胞が使用される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＲＰＶ２または前記カチオンチャネルを発現している前記哺乳動物由来の組織または細胞が、哺乳動物から単離された腸Ｌ細胞を含む組織もしくは細胞またはその培養物である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＲＰＶ２または前記カチオンチャネルを発現している前記哺乳動物由来の組織または細胞が、ＴＲＰＶ２を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織もしくは細胞またはその培養物である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項記載の方法であって、
前記（Ａ）および（Ｂ）は、（ａ）前記ＴＲＰＶ２または前記カチオンチャネルを発現している前記哺乳動物由来の組織または細胞と、被験物質とを共存させ、該組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することを含み、
さらに、該方法は、（ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルを発現していない哺乳動物由来の組織または細胞と、該被験物質とを共存させ、該組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することを含む、方法。
【請求項１０】
ジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールを有効成分とするＧＬＰ−１分泌促進剤。
【請求項１１】
ジフェニルボリン酸無水物を有効成分とする食欲抑制剤。
【請求項１２】
ジフェニルボリン酸無水物を有効成分とする肥満予防および／または改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法、ならびにＧＬＰ−１分泌促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）は、内分泌ホルモンであるグルカゴンと共通の遺伝子および前駆体から産生される消化管ホルモンである。グルカゴンが膵島のα細胞で産生されるのに対し、ＧＬＰ−１は消化管粘膜上皮の内分泌細胞（Ｌ細胞）で産生され、その前駆体からグルカゴンとは異なったプロセシングを経て産生される。ＧＬＰ−１は、糖代謝に重要な役割を果たしているインクレチン（ｉｎｃｒｅｔｉｎ：Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ）作用を備えたホルモンであり、栄養素の摂取によって血中に分泌され、膵臓β細胞に働きかけてインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる。
【０００３】
ＧＬＰ−１はまた、膵臓α細胞からのグルカゴン分泌を抑制することにより、肝からのブドウ糖放出を低下させ、血糖値を低下させる。この作用は低血糖によるグルカゴン分泌と拮抗せず、またインスリン濃度に依存しないことが報告されている。ＧＬＰ−１投与により、１型糖尿病患者および２型糖尿病患者でともに、血糖を一定にするのに必要なインスリン量が減少したことも報告されている。したがって、ＧＬＰ−１は、糖尿病患者の血糖値制御に有用であると考えられている（非特許文献１）。ＧＬＰ−１はまた、グリコーゲン合成を促進させること（非特許文献２）、および心筋における糖取り込みを促進させて心機能を改善させること（非特許文献３）が報告されており、耐糖能の改善に有用であると考えられる。さらにＧＬＰ−１の作用として、胃排泄や胃酸分泌の抑制、および食欲と摂食の抑制が知られている。ＧＬＰ−１による食欲と摂食の抑制作用は、中枢神経系に存在するＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）を介した中枢性の機序が関与していると考えられている（非特許文献４）。
【０００４】
したがって、ＧＬＰ−１により、肥満、糖尿病や、インスリン抵抗性を改善できる可能性がある。近年では、ＧＬＰ−１補充療法やＧＬＰ−１Ｒアゴニストを利用した糖尿病治療法の開発が進められている。既に、ＧＬＰ−１アナログ製剤であるエクセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）やリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）が糖尿病治療薬として使用されており、インスリン抵抗性改善にも効果があることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
さらにＧＬＰ−１は、受容体依存的または非依存的に、心筋細胞内のｃＡＭＰの増加による心筋収縮力の増強、ＮＯ産生による血管弛緩反応の改善、ＧＬＵＴ１を介した糖取込み増加などによって、心機能改善作用を示すことが知られている（非特許文献５）。また、Ｄａｈｌ食塩感受性ラットにＧＬＰ−１アナログを投与することにより、収縮期血圧が有意に低下する（非特許文献６）。したがって、ＧＬＰ−１は、高血圧や心血管疾患の改善にも有用である。
【０００６】
ＧＬＰ−１はポリペプチドであるため、投与しても体内の酵素により消化または分解され易く、その血中濃度を一定に保つのは非常に困難である。したがって、生体内でのＧＬＰ−１濃度を長時間にわたって高めるためには、体外からの投与よりも内因性ＧＬＰ−１の分泌を促進することが望ましい。ＧＬＰ−１の分泌を促進する物質としては、パルミチン酸、オレイン酸、肉加水分解物、ガストリン放出ペプチド、カルバコール、フォルスコリン、イオノマイシン、酢酸ミリスチン酸ホルボール、必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、スキムミルク、カゼイン、レプチン、ムスカリン性受容体Ｍ１およびＭ２、キラヤ、リゾホスファチジルイノシトール、マジョラム、カワラヨモギ、フェルラ酸、ユッカ、糖セラミド、βカロチン、植物ステロール、ビート、菊花、パプリカ、オレンジ、高麗人参、ビワ茶などがこれまでに報告されている（非特許文献７〜１１および特許文献１〜４）。
【０００７】
ＴＲＰＶ２は、ＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネルファミリーに属するＴＲＰＶ（ＴＲＰ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）サブファミリーの一員である。ＴＲＰチャネルファミリーは、一般に６回膜貫通領域を有するカチオンチャネルのファミリーである。哺乳類のＴＲＰチャネルは、ＴＲＰＣ、ＴＲＰＶ、ＴＲＰＭ、ＴＲＰＡ、ＴＲＰＭＬおよびＴＲＰＰの６種類のサブファミリーに分類されている。ＴＲＰチャネルは、熱、浸透圧、膨張などの物理的刺激や種々の化学物質により活性化され、細胞におけるセンサータンパク質として働くほか、自身のイオン流入を細胞内シグナルとして伝えるシグナル複合体形成の足場としても働くと考えられている。ＴＲＰＶ２は、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｎａ+、Ｋ+、Ｃｓ+などのカチオンの透過性が高く、高温、機械刺激、細胞膨張、およびカンナビジオール、テトラヒドロカンナビノール、プロベネシドなどの化学物質により活性化される（非特許文献１２、１３）。
【０００８】
ＴＲＰＶ２の活動は、細胞のシグナル伝達系により修飾を受けることがある。例えば、膵β細胞のＴＲＰＶ２は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼや他のキナーゼシグナル経路、またはインスリンによる刺激を受け、細胞内画分から細胞膜へと移行する（非特許文献１４，１５）。肥満細胞のＴＲＰＶ２は、プロテインキナーゼＡによるリン酸化により活性を制御されている可能性が示唆されている（非特許文献１６）ほか、細胞膜への局在がｃＡＭＰにより制御を受けていることが示唆されている（非特許文献１７）。また、ＴＲＰＶ２は細胞膜におけるホスファチジルイノシトールビスリン酸の枯渇によりＣａ2+依存性脱感作を受ける（非特許文献１８）。
【０００９】
ＴＲＰＶ２は、後根神経節、三叉神経節、脳、肺、腸、脾臓、肥満細胞などの多くの組織に発現する。ＴＲＰＶ２の生理学的機能としては、マクロファージの貪食作用（非特許文献１９）、肥満細胞の脱顆粒（非特許文献１６）、ＮＯを介した腸管運動の制御（非特許文献２０）、胃適応性弛緩と胃排泄の促進（非特許文献２１）、膵β細胞でのグルコース応答性インスリン分泌の促進（非特許文献１５）などが報告されている。さらに、伸展刺激による血管収縮にＴＲＰＶ２が関与すること、およびカンナビジオールによるＴＲＰＶ２刺激により血管拡張物質ＣＧＲＰが放出されることが報告されており、ＴＲＰＶ２が血圧の上昇および低下に関与することが示唆されている（非特許文献２２、２３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０８６４０６号
【特許文献２】特開２０１２−１３１７４２号公報
【特許文献３】特開２０１３−０６３９５７号公報
【特許文献４】特開２０１３−０６３９５６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】医学のあゆみ, 2009, 231(7):755-758
【非特許文献２】FEBS Letters, 1994, 349(2):313-316
【非特許文献３】J Pharmacol Exp Ther, 2006, 317(3):1106-1113
【非特許文献４】Eur J Pharmacol, 2002, 440(2-3):269-279
【非特許文献５】医学のあゆみ, 2012, 241(7):507-516
【非特許文献６】Cardiovascular Diabetology, 2010:9:32
【非特許文献７】Endocrinology, 2001, 142(10):4522-4528
【非特許文献８】Journal of Endocrinology, 2006, 191:159-170
【非特許文献９】Nutrition, 2009, 25(3):340-349
【非特許文献１０】Endocrinology, 2003, 144(7):3244-3250
【非特許文献１１】Diabetes, 2006, 52(2):252-259
【非特許文献１２】生化学, 2009, 第81巻, 第11号:962-983
【非特許文献１３】J Neurosci, 2008, 28(24):6231-6238
【非特許文献１４】Biochem J, 2010, 432:375-386
【非特許文献１５】Diabetes, 2009, 58:174-184.
【非特許文献１６】J Exp Med, 2004, 200(2):137-147
【非特許文献１７】J Cell Biochem, 2005, 94:669-683
【非特許文献１８】J Neurosci, 2010, 30(40):13338-13347
【非特許文献１９】Nat Immunol, 2010, 11(3):232-239.
【非特許文献２０】J Neurosci, 2010, 30(49):16536-16544.
【非特許文献２１】Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2013, 304(3):235-240.
【非特許文献２２】Circ Res, 2003, 93(9):829-838
【非特許文献２３】Translational Research, 2013, 161(6):469-476
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法、ならびにＧＬＰ−１分泌促進剤の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、ＧＬＰ−１分泌能を有する哺乳動物の腸細胞においてＴＲＰＶ２が高発現していること、さらに当該腸細胞におけるＴＲＰＶ２の活性化がＧＬＰ−１分泌を促進することを新たに見出した。したがって、各種物質によるＴＲＰＶ２活性化作用を調べることによって、当該物質のＧＬＰ−１分泌促進作用を評価することができ、かつＧＬＰ−１分泌促進剤の候補物質を探索可能である。ＴＲＰＶ２を活性化させることができる物質は、哺乳動物腸Ｌ細胞によるＧＬＰ−１分泌を促進するＧＬＰ−１分泌促進剤として有用である。
【００１４】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含むＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法を提供する。
【００１５】
また本発明は、上記（Ａ）〜（Ｃ）を含む食欲抑制剤の評価または選択方法を提供する。
【００１６】
また本発明は、上記（Ａ）〜（Ｃ）を含む肥満予防および／または改善剤の評価または選択方法を提供する。
【００１７】
さらに本発明は、ジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールを有効成分とするＧＬＰ−１分泌促進剤を提供する。
【００１８】
さらに本発明は、ジフェニルボリン酸無水物を有効成分とする食欲抑制剤を提供する。
【００１９】
さらに本発明は、ジフェニルボリン酸無水物を有効成分とする肥満予防および／または改善剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、各種物質のＧＬＰ−１分泌促進効果をより簡便かつ正確に評価することができ、優れたＧＬＰ−１分泌促進剤を選択することが可能となる。また、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、肥満等の発症可能性の低下、予防もしくは改善、体重増加の予防もしくは体重の低下、または食欲抑制のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】腸細胞におけるＴＲＰＶ２  ｍＲＮＡ発現：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。
【図２】本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤による腸細胞におけるＧＬＰ−１分泌促進作用、上；カンナビジオール、中；ジフェニルボリン酸無水物、下；プロベネシド：平均値±ＳＥ（ｎ＝４）、＃；ｐ＜０．１、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治治療または診断する方法を含まない、より具体的には医師、または医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療または診断を実施する方法を含まない概念である。
【００２３】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患、症状もしくは状態の発症の防止、抑制または遅延、あるいは個体の疾患、症状もしくは状態の発症の危険性を低下させることをいう。
【００２４】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状もしくは状態の好転、疾患、症状もしくは状態の悪化の防止、抑制または遅延、あるいは疾患、症状もしくは状態の進行の逆転、防止、抑制または遅延をいう。
【００２５】
本明細書において、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２６】
本発明により提供されるＧＬＰ−１分泌促進剤は、哺乳動物に経口摂取されることにより、その消化管内でＧＬＰ−１分泌能を有する腸Ｌ細胞の受容体に作用して、該腸Ｌ細胞からのＧＬＰ−１分泌を高めるか、または食事を摂取することで引き起こされる生体内でのＧＬＰ−１分泌を促進する物質である。本発明により提供されるＧＬＰ−１分泌促進剤は、腸Ｌ細胞のＧＬＰ−１分泌経路自体を活性化させる点において、従来ＧＬＰ−１分泌促進に用いられているＤＰＰ４阻害剤やαグルコシダーゼ阻害剤とは異なる。ＤＰＰ４阻害剤は、ＧＬＰ−１分解酵素であるＤＰＰ４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）を阻害してＧＬＰ−１分解を抑制することで、結果的に血中ＧＬＰ−１濃度の低下を抑制する。またαグルコシダーゼ阻害剤は、多糖類の分解領域を上部小腸から下部小腸へシフトさせ、腸Ｌ細胞が存在する下部小腸におけるグルコースの濃度を高めることによって、ＧＬＰ−１分泌を促進する。いずれも、ＧＬＰ−１分泌経路に直接作用するものではない。
【００２７】
一態様において、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）：（Ａ）ＴＲＰＶ２と被験物質とを共存させること；（Ｂ）該ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、を含むＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法を提供する。ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させるものと同定された被験物質は、ＧＬＰ−１分泌促進剤として選択することができる。
【００２８】
ＴＲＰＶ２は、哺乳動物ＴＲＰチャネルファミリーのＴＲＰＶサブファミリーに属するカチオンチャネルとして知られており、ＶＲＬ−１、ＯＴＲＰＣ２またはＧＲＣとも称される。ＴＲＰＶ２は、６回膜貫通領域を有し、Ｎ末端の細胞内領域には６個のアンキリンリピート（ＡＮＫＲ）ドメインが、Ｃ末端の細胞内領域にはＴＲＰ−ボックス（ＥＷＫＦＡＲ）を含むドメインが存在する構造を有する（非特許文献１２）。ＴＲＰＶ２は一価カチオンまたは二価カチオンを透過させるチャネルであり、Ｃａ2+またはＮａ+をよく透過させる。したがって、ＴＲＰＶ２によるＣａ2+またはＮａ+流入を指標として、ＴＲＰＶ２の活性化レベルを調べることができる。
【００２９】
本発明の方法に使用されるＴＲＰＶ２は、哺乳動物細胞で発現することができるＴＲＰＶ２であればよい。哺乳動物としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サルなどが挙げられる。ＴＲＰＶ２の好ましい例としては、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５７１９７．２（ヒトＴＲＰＶ２：配列番号１）、ＮＰ＿０５８９０３．２（ラットＴＲＰＶ２：配列番号２）もしくはＮＰ＿０３５８３６．２（マウスＴＲＰＶ２：配列番号３）で示されるポリペプチド、およびそれらの天然に存在する変異体が挙げられる。
【００３０】
本発明の方法に使用される被験物質は、ＧＬＰ−１分泌促進剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。被験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的または生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物もしくは混合物であってもよい。
【００３１】
本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。本発明の方法においてＴＲＰＶ２を使用する場合、ＴＲＰＶ２を発現している哺乳動物由来の組織または細胞、例えば、哺乳動物から単離されたＴＲＰＶ２を発現している組織または細胞およびその培養物、ＴＲＰＶ２を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織や細胞およびその培養物などを使用することができる。あるいは、ＴＲＰＶ２を有する哺乳動物細胞の膜、哺乳動物細胞由来のＴＲＰＶ２を担持した人工脂質二重膜なども、本発明の方法においてＴＲＰＶ２として使用することができる。
【００３２】
哺乳動物から単離されたＴＲＰＶ２を発現している組織または細胞およびその培養物としては、好ましくは、哺乳動物から単離された腸Ｌ細胞を含む組織または細胞、およびその培養物が挙げられる。哺乳動物の腸Ｌ細胞は、遠位空腸から回腸、ならびに大腸および直腸の一部を含む腸組織に存在する。したがって、哺乳動物から単離された腸Ｌ細胞を含む組織または細胞およびその培養物としては、哺乳動物の遠位空腸もしくは回腸または大腸および直腸の一部を含む腸組織から単離された組織または細胞、当該単離された組織または細胞の培養物、および哺乳類腸Ｌ細胞モデルとなり得る培養細胞株、例えばＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞、ＳＴＣ−１細胞などが挙げられる。しかしながら、本発明の方法に使用できるＴＲＰＶ２を発現している組織または細胞およびその培養物としては、上記腸Ｌ細胞を含む組織または細胞に限定されるものではなく、腸組織に由来しない内因性ＴＲＰＶ２発現の高い細胞を用いることも可能である。例えば、ＴＲＰＶ２は後根神経節、三叉神経節、脳をはじめ、肺、脾臓、肥満細胞に多く発現することから、当該組織から単離された細胞およびその培養物もまた、本発明で使用することができるＴＲＰＶ２を発現している組織または細胞およびその培養物の例として挙げられる。
【００３３】
ＴＲＰＶ２を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織や細胞は、例えば、任意の哺乳動物の組織または細胞を、ＴＲＰＶ２をコードする遺伝子を導入してＴＲＰＶ２を発現するように形質転換することによって作製することができる。当該ＴＲＰＶ２を発現する形質転換細胞としては、特に限定されないが、発現ベクターを用いた安定発現株化細胞や一過性発現細胞、ＴＲＰＶ２過剰発現マウス由来培養細胞などが挙げられ、ＨｕＴｕ−８０やＣａｃｏ−２などの哺乳動物の腸細胞に由来し、かつ本来ＴＲＰＶ２の発現が低い細胞を、ＴＲＰＶ２を発現するように形質転換したものが好ましい。ＴＲＰＶ２をコードする遺伝子を細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーションやリポフェクションなどによるベクター導入が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子導入に必要な細胞の密度は特に限定されず、得られた形質転換細胞全体として、後述するような手順でのＣａ2+またはＮａ+流入測定を可能にする量のＴＲＰＶ２を発現できればよい。
【００３４】
本発明の方法においては、上記ＴＲＰＶ２と上記被験物質とを共存させる（工程Ａ）。当該共存工程は、例えば、当該被験物質を所定の濃度で含む培地で、上述したＴＲＰＶ２を発現している哺乳動物由来の組織または細胞を培養すること、あるいは、当該組織または細胞を含む培養物に当該被験物質を所定の濃度で添加することを含む。上記組織または細胞を培養する際の細胞の濃度は、特に限定されず、最終的にＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入が測定可能な細胞数が得られればよい。好ましくは、当該組織または細胞は、被験物質と共存させる前に予め約３７℃で一定時間、例えば４８〜９６時間程度培養しておき、ＴＲＰＶ２を充分に発現させておくとよい。あるいは、当該共存工程は、上述したＴＲＰＶ２を有する哺乳動物細胞の膜や、哺乳動物細胞由来のＴＲＰＶ２を担持した人工脂質二重膜を含む反応系に、当該被験物質を所定の濃度で添加することを含む。いずれの場合も、ＴＲＰＶ２と当該被験物質との共存は、当該被験物質の作用によるＴＲＰＶ２の活性の変化が期待される時間、好ましくは５分〜３時間程度、より好ましくは１５〜６０分間程度継続させる。
【００３５】
上記ＴＲＰＶ２を発現している組織や細胞を含む培養物中、またはＴＲＰＶ２を有する細胞膜や人工脂質二重膜を含む反応系中における上記被験物質の濃度は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができ、例えば、０．００００１〜１０質量％（乾燥残分）程度、好ましくは０．０００１〜３質量％（乾燥残分）程度にすればよい。
【００３６】
次いで、上記ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を測定する（工程Ｂ）。本発明の方法においては、上記ＴＲＰＶ２が発現している膜、組織または細胞全体でのＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を測定する。より詳細には、上記ＴＲＰＶ２が発現している膜、組織または細胞の群と、ＴＲＰＶ２を発現していない膜、組織または細胞の群とに、同様に被験物質を共存させた後、それぞれの膜、組織または細胞全体としてのＣａ2+またはＮａ+流入を測定する。ＴＲＰＶ２が発現している群におけるＣａ2+またはＮａ+流入量から、ＴＲＰＶ２を発現していない群におけるＣａ2+またはＮａ+流入量を差し引くことによって、該ＴＲＰＶ２が発現している膜、組織または細胞におけるＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することができる。
【００３７】
本発明の方法に使用されるＴＲＰＶ２を発現していない膜、組織または細胞としては、本発明の方法に使用されるＴＲＰＶ２が発現している膜、組織または細胞からＴＲＰＶ２の発現を抑制した膜、組織または細胞、ＴＲＰＶ２遺伝子を含むベクターを導入する代わりに空ベクターを導入した細胞、内因性のＴＲＰＶ２発現がないもしくはほとんどない組織または細胞などが挙げられる。ＴＲＰＶ２の発現を抑制した膜、組織または細胞としては、ｓｉＲＮＡによるＴＲＰＶ２ノックダウン細胞、ＴＲＰＶ２ノックアウトマウス由来の膜、組織または細胞などが挙げられる。ｓｉＲＮＡノックダウンに用いる細胞としては、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞およびＳＴＣ−１細胞や、神経細胞およびその培養株などの内因性ＴＲＰＶ２発現の高い細胞が好ましいが、これらに限定されるものではない。内因性のＴＲＰＶ２発現がないもしくはほとんどない組織または細胞としては、ＨｕＴｕ−８０やＣａｃｏ−２などのＴＲＰＶ２をほとんど発現しない哺乳動物の腸由来細胞が好ましい。
【００３８】
組織または細胞全体でのＣａ2+流入の測定には、Ｃａ2+指示薬を用いたＣａ2+流入測定を適用できる。より具体的には、Ｃａ2+流入を測定すべき組織または細胞に、Ｃａ2+指示薬を添加して細胞内に該Ｃａ2+指示薬を浸透させ、次いで被験物質を添加し、その後Ｃａ2+指示薬の反応産物を経時的に測定する。細胞内へのＣａ2+指示薬の浸透においては、好ましくは、Ｃａ2+指示薬を添加した培地中で細胞を室温〜３７℃で１０〜６０分間インキュベーションし、次いで、培地を除去し、細胞をリンガー液等にて２回洗浄して、細胞外のＣａ2+指示薬を除去すればよい。Ｃａ2+指示薬としては、例えば、ｆｕｒａ−２−ＡＭ、ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（いずれもドージンドー社）などの蛍光指示薬を使用することができるが、これらに限定されない。これらの蛍光Ｃａ2+指示薬の反応産物は、蛍光イメージングなどの蛍光アッセイによって検出および定量することができる。例えば、蛍光アッセイで測定された蛍光強度の最大値を、細胞へのＣａ2+流入量として取得することができる。蛍光アッセイは、蛍光プレートリーダ（例えば、ＦＤＳＳ３０００；浜松ホトニクス）などを用いて、例えば以下の条件；温度：室温〜３７℃、測定時間：５〜３０分、インターバル：１〜２秒、励起波長および検出波長：指示薬の既定波長、にて行うことができる。
【００３９】
組織または細胞全体でのＮａ+流入の測定には、Ｎａ+指示薬を用いたＮａ+流入測定を適用できる。具体的な手順は、上述したＣａ2+流入測定の手順と同様である。細胞内へのＮａ+指示薬の浸透においては、好ましくは、Ｎａ+指示薬を添加した培地中で細胞を室温〜３７℃で１０〜６０分間インキュベーションし、次いで、培地を除去し、細胞をＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）等にて２回洗浄して、細胞外のＮａ+指示薬を除去すればよい。Ｎａ+指示薬としては、例えば、ＣｏｒｏＮａ  Ｇｒｅｅｎ−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの蛍光指示薬を使用することができるが、これらに限定されない。蛍光Ｎａ+指示薬の反応産物は、Ｃａ2+指示薬の反応産物の測定の場合と同様、蛍光アッセイにより検出および定量することができる。
【００４０】
上述した手順で、ＴＲＰＶ２を発現している組織または細胞（ＴＲＰＶ２発現群）、およびＴＲＰＶ２を発現していない組織または細胞（ＴＲＰＶ２非発現群）における、Ｃａ2+またはＮａ+流入を測定する。ＴＲＰＶ２発現群における測定値から、ＴＲＰＶ２非発現群における測定値を差し引くことによって、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ2+流入を測定することができる。例えば、上述した蛍光アッセイで測定された蛍光強度の最大値について、ＴＲＰＶ２発現群とＴＲＰＶ２非発現群との差を求め、得られた値をＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入量として取得することができる。
【００４１】
またあるいは、ＴＲＰＶ２を有する細胞膜、人工脂質二重膜を含む反応系と、ＴＲＰＶ２を有さない同じ反応系とに、同様に被験物質を共存させた後、それぞれの反応系全体としてのＣａ2+またはＮａ+流入を測定する。ＴＲＰＶ２を有する反応系におけるＣａ2+またはＮａ+流入量から、ＴＲＰＶ２を有さない反応系におけるＣａ2+またはＮａ+流入量を差し引くことによって、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することができる。上記膜におけるＣａ2+またはＮａ+流入の測定には、上述したＣａ2+指示薬またはＮａ+指示薬を用いる方法を適用することができる。
【００４２】
次いで、上記測定結果に基づいて、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定する（工程Ｃ）。例えば、より高濃度の被験物質と共存させた組織もしくは細胞または反応系と、より低濃度の被験物質と共存させた組織もしくは細胞または反応系との間、被験物質と共存させた組織もしくは細胞または反応系と、被験物質と共存させていないかまたは対照物質と共存させた組織もしくは細胞または反応系との間、あるいは同じ組織もしくは細胞または反応系での被験物質との共存前後で、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入の測定結果を比較する。被験物質との共存により、またはより高濃度の被験物質との共存によりＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入が増加する場合、当該被験物質を、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる物質として同定することができる。
【００４３】
Ｃａ2+またはＮａ+流入は、必ずしも定量的に評価する必要はないが、定量的に評価することが好ましい。例えば、被験物質共存群におけるＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入量が、被験物質非共存群と比較して１０５％以上、好ましくは１１０％以下、より好ましくは１２０％以上に増加していれば、当該被験物質を、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる物質として選択することができる。Ｃａ2+またはＮａ+流入量の評価に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的な有意差を検定することが好ましい。
【００４４】
したがって、例えば、被験物質を添加したＴＲＰＶ２発現群とＴＲＰＶ２非発現群との間（被験物質群間）でＣａ2+またはＮａ+流入量の差を求め、同様に、対照物質（例えば、溶媒のみ）を添加したＴＲＰＶ２発現群とＴＲＰＶ２非発現群との間（対照物質群間）でＣａ2+またはＮａ+流入量の差を求め、次いで、被験物質群と対照物質群との間で、求めた差の値についての統計学的有意差検定を行うことによって、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を評価することができる。被験物質群間での差が対照物質群間での差よりも統計学的に有意に大きい場合、当該被験物質を、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる物質として同定することができる。
【００４５】
あるいは、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入は、ＴＲＰＶ２発現群とＴＲＰＶ２非発現群のそれぞれにおいて、被験物質を添加したときのＣａ2+またはＮａ+流入量から対照物質（例えば、溶媒のみ）添加を添加したときのＣａ2+またはＮａ+流入量を引いた差を求め、次いで、求めた差の値について、ＴＲＰＶ２発現群とＴＲＰＶ２非発現群との間での統計学的有意差検定を行うことによって評価することができる。ＴＲＰＶ２発現群での差がＴＲＰＶ２非発現群での差よりも統計学的に有意に大きい場合、当該被験物質を、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる物質として同定することができる。
【００４６】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態においては、上記工程（Ａ）および（Ｂ）が、（ａ）上記ＴＲＰＶ２を発現している哺乳動物由来の組織または細胞と、被験物質とを共存させ、該組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することを含み、より好ましくは、（ａ'）該被験物質と共存させていない該ＴＲＰＶ２を発現している哺乳動物由来の組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することをさらに含み、
さらに当該方法は、（ｂ）上記ＴＲＰＶ２を発現していない哺乳動物由来の組織または細胞と、該被験物質とを共存させ、該組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することを含み、より好ましくは、（ｂ'）該被験物質と共存させていない該ＴＲＰＶ２を発現していない哺乳動物由来の組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することをさらに含み、そして、
上記（Ｃ）は、（i）〔（ａ）の測定値−（ａ'）の測定値〕が〔（ｂ）の測定値−（ｂ'）の測定値〕よりも統計学的に有意に大きい場合、または（ii）〔（ａ）の測定値−（ｂ）の測定値〕が〔（ａ'）の測定値−（ｂ'）の測定値〕よりも統計学的に有意に大きい場合に、該被験物質を、ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる物質として同定することを含む。ＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させるものと同定された被験物質は、ＧＬＰ−１分泌促進剤として選択することができる。
【００４７】
上記本発明の方法においては、ＴＲＰＶ２の代わりに、ＴＲＰＶ２と機能や構造が相同なポリペプチドを利用することができる。例えば、上記ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５７１９７．２（配列番号１）、ＮＰ＿０５８９０３．２（配列番号２）もしくはＮＰ＿０３５８３６．２（配列番号３）で示されるようなＴＲＰＶ２のホモログ、オルソログ、パラログもしくはアナログを、ＴＲＰＶ２の代わりに本発明の方法に用いることができる。また例えば、上記ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５７１９７．２（配列番号１）、ＮＰ＿０５８９０３．２（配列番号２）もしくはＮＰ＿０３５８３６．２（配列番号３）で示されるポリペプチドとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有し、６回膜貫通領域を有し、かつＣａ2+またはＮａ+を透過するカチオンチャネルとして機能するポリペプチドを、ＴＲＰＶ２の代わりに本発明の方法に用いることができる。本明細書において、配列同一性に関する「少なくとも８０％」とは、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上をいう。
【００４８】
後述の実施例に示すとおり、哺乳動物の腸Ｌ細胞においては、ＴＲＰＶ２が高度に発現しており（図１）、しかも当該腸Ｌ細胞におけるＴＲＰＶ２の活性化は、当該細胞のＧＬＰ−１分泌を促進する（図２）。したがって、上記の手順で同定されたＴＲＰＶ２からのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質は、哺乳動物においてＧＬＰ−１分泌を促進することができるＧＬＰ−１分泌促進剤として選択することができる。必要に応じて、選択された物質をさらなるスクリーニングにかけ、例えば、哺乳類腸Ｌ細胞モデルの培養細胞株を用いた分泌刺激試験や実験動物を用いた単回投与実験によって腸Ｌ細胞からのＧＬＰ−１分泌促進能を直接測定することにより、より強力なＧＬＰ−１分泌促進作用を有する物質を選別してもよい。
【００４９】
ＧＬＰ−１分泌を促進することによって、食欲の抑制、体重の減少、または肥満等の疾患の予防および／または改善などの効果を得ることができる。したがって、別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む食欲抑制剤の評価または選択方法を提供する。さらに別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む肥満予防および／または改善剤の評価または選択方法を提供する。
【００５０】
さらなる態様として本発明は、上記本発明の方法により選択されたＧＬＰ−１分泌促進剤を提供する。本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の例としては、ジフェニルボリン酸無水物（ｄｉｐｈｅｎｙｌｂｏｒｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、プロベネシド（Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ）、カンナビジオール（ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ）などが挙げられる。これらの化合物は、いずれもＴＲＰＶ２アゴニストであり、ＴＲＰＶ２からの細胞内へのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる。本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、ジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールを有効成分とする。すなわち、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、ジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールを有効成分として含有し得る。
【００５１】
本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、ＧＬＰ−１の分泌を促進させるための有効成分として使用することができる。あるいは、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、当該ＧＬＰ−１分泌促進作用を介して、食欲を抑制し、体重を減少させ、または肥満等の疾患を予防および／もしくは改善するための有効成分として使用することができる。当該使用は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物における使用であり得る。非ヒト哺乳動物としては、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、サルなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００５２】
上記本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の使用は、治療的使用であっても、非治療的使用であってもよい。非治療的使用としては、例えば、健康の維持もしくは増進、または美容目的で食欲抑制、体重減少等の効果を得るために、医療行為としてではなく、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を投与するかまたは摂取させることが挙げられる。また非治療的使用としては、健康の維持もしくは増進、または美容目的で食欲抑制、体重減少等の効果を求めて本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の投与または摂取を望む者に対して、医療行為としてではなく、当該効果を謳って本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を提供することが挙げられる。
【００５３】
さらに、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、ＧＬＰ−１分泌促進、食欲抑制、体重減少、または肥満等の疾患の予防および／もしくは改善などのための医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料等を製造するために使用することができる。
【００５４】
上記医薬品または医薬部外品は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を有効成分として含有する。当該医薬品または医薬部外品は、経口投与される。また当該医薬品や医薬部外品は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を単独で含有していてもよいが、薬学的に許容される担体や、他の有効成分や薬理成分をさらに含有する組成物であってもよい。上記医薬品または医薬部外品は、好ましくは毎食時または毎食時前に投与され、より好ましくは毎食時の４時間〜直前に投与される。
【００５５】
上記飲食品または飼料は、ＧＬＰ−１分泌促進、食欲抑制、体重減少、または肥満等の疾患の予防および／もしくは改善などの機能を得ることを企図し、かつ当該機能を必要に応じて表示した飲食品、機能性飲食品、保健食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品、飼料、ペットフード等であり得る。なお、当該機能を必要に応じて表示した飲食品、機能性飲食品、保健食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品とは、機能表示が許可された飲食品であって、一般の飲食品とは区別されるものである。
【００５６】
上記飲食品は、あらゆる形態および種類の食品および飲料を含む。例えば、食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態を含む。上記飼料は、上述した非ヒト動物のための飼料またはペットフードであり、あらゆる形態および種類を含む。上記飲食品または飼料は、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を単独で含有していてもよいが、食品に使用される添加物や、他の栄養成分をさらに含有する組成物であってもよい。
【００５７】
上記本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤を含有する医薬品、医薬部外品、飲食品または飼料は、上述した原料から、公知の医薬品、医薬部外品、飲食品または飼料の製造方法に従って製造することができる。上記医薬品または医薬部外品における本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の含有量は、好ましくは０．０１質量％以上１００質量％以下、より好ましくは０．１質量％以上７０質量％以下、さらに好ましくは１質量％以上５０質量％以下であり得る。上記飲食品または飼料における本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の含有量は、好ましくは０．００１質量％以上１０質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以上５質量％以下、さらに好ましくは０．０１質量％以上１質量％以下であり得る。
【００５８】
あるいは、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、ＧＬＰ−１分泌促進のため、あるいは食欲抑制、体重減少、または肥満等の疾患を予防および／もしくは改善するために、それらを必要とする対象に有効量で投与されるかまたは摂取され得る。当該対象としては、ＧＬＰ−１分泌促進、食欲抑制、体重減少、または肥満等の疾患を予防および／もしくは改善することを必要とするヒトまたは非ヒト哺乳動物が挙げられる。あるいは、当該対象は、健康の維持もしくは増進、または美容目的で食欲抑制、体重減少等の効果を求める者が挙げられる。したがって、当該対象への本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の投与または摂取は、治療的または非治療的に行われ得る。
【００５９】
上記対象に対する本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の好ましい投与または摂取の有効量は、当該対象の種、体重、性別、年齢、状態またはその他の要因に従って変動し得るが、投与経路は経口投与である。投与および摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、好ましくは毎食時または毎食時前に、より好ましくは毎食時の４時間〜直前に、経口投与または摂取される。経口投与または摂取のための本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の用量は、乾燥物換算で、成人（６０ｋｇ）当たりに換算して、０．００１〜１ｇ／日、好ましくは０．００５〜５００ｍｇであり得る。
【００６０】
あるいは、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、そのＧＬＰ−１分泌促進効果を研究する目的で、または他のＧＬＰ−１分泌促進剤を開発する際のポジティブコントロールとして、哺乳動物由来の組織、器官、細胞等に投与されてもよい。当該組織、器官、細胞は、好ましくは、ＧＬＰ−１を分泌する能力を有する天然由来または生物学的もしくは生物工学的に改変された組織、器官、細胞である。
【００６１】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、製造方法、用途あるいは方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００６２】
〔１〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含むＧＬＰ−１分泌促進剤の評価または選択方法。
【００６３】
〔２〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含む食欲抑制剤の評価または選択方法。
【００６４】
〔３〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルと、被験物質とを共存させること；
（Ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；および、
（Ｃ）該測定の結果に基づいて、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質を同定すること、
を含む肥満予防および／または改善剤の評価または選択方法。
【００６５】
〔４〕好ましくは、上記（Ｂ）において、上記被験物質と共存させていない上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入がさらに測定される、〔１〕〜〔３〕のいずれか１に記載の方法。
【００６６】
〔５〕好ましくは、上記（Ｃ）において、上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入の測定結果が、上記被験物質と共存させた該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルと、該被験物質と共存させていない該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルとの間で比較される、〔４〕記載の方法。
【００６７】
〔６〕好ましくは、上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルとして、該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルを発現している哺乳動物由来の組織または細胞が使用される、〔１〕〜〔５〕のいずれか１に記載の方法。
【００６８】
〔７〕上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルを発現している上記哺乳動物由来の組織または細胞が、好ましくは、哺乳動物から単離された腸Ｌ細胞を含む組織もしくは細胞またはその培養物であり、より好ましくは、遠位空腸または回腸を含む単離された腸組織、小腸初代培養細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞およびＳＴＣ−１細胞からなる群より選択される、〔６〕記載の方法。
【００６９】
〔８〕好ましくは、上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルを発現している上記哺乳動物由来の組織または細胞が、ＴＲＰＶ２を発現するように遺伝的に改変された哺乳動物の組織もしくは細胞またはその培養物である、〔６〕記載の方法。
【００７０】
〔９〕〔６〕〜〔８〕のいずれか１に記載の方法であって、好ましくは、
上記（Ａ）および（Ｂ）は、（ａ）上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルを発現している上記哺乳動物由来の組織または細胞と、被験物質とを共存させ、該組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することを含み、
さらに、該方法は、（ｂ）該ＴＲＰＶ２または該カチオンチャネルを発現していない哺乳動物由来の組織または細胞と、該被験物質とを共存させ、該組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定することを含む、方法。
【００７１】
〔１０〕好ましくは、さらに以下：
（ａ'）：上記被験物質と共存させていない上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルを発現している上記哺乳動物由来の組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること；
（ｂ'）：該被験物質と共存させていない上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルを発現していない上記哺乳動物由来の組織または細胞へのＣａ2+またはＮａ+流入を測定すること、
を含む〔９〕記載の方法。
【００７２】
〔１１〕好ましくは、上記（Ｃ）が、以下の場合に、上記被験物質を、上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質として同定することを含む、〔１０〕記載の方法：
〔（ａ）の測定値−（ａ'）の測定値〕が、〔（ｂ）の測定値−（ｂ'）の測定値〕よりも統計学的に有意に大きい場合、または
〔（ａ）の測定値−（ｂ）の測定値〕が、〔（ａ'）の測定値−（ｂ'）の測定値〕よりも統計学的に有意に大きい場合。
【００７３】
〔１２〕好ましくは、上記ＴＲＰＶ２または上記カチオンチャネルからのＣａ2+またはＮａ+流入を増加させる被験物質をＧＬＰ−１分泌促進剤として選択することをさらに含む、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１に記載の方法。
【００７４】
〔１３〕好ましくは、上記ＴＲＰＶ２またはこれとアミノ酸配列において少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなるカチオンチャネルが、以下からなる群より選択される、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１に記載の方法：
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、６回膜貫通領域を有し、かつＣａ2+またはＮａ+を透過するカチオンチャネルとして機能するポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、６回膜貫通領域を有し、かつＣａ2+またはＮａ+を透過するカチオンチャネルとして機能するポリペプチド；および、
配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、６回膜貫通領域を有し、かつＣａ2+またはＮａ+を透過するカチオンチャネルとして機能するポリペプチド。
【００７５】
〔１４〕好ましくは、上記Ｃａ2+またはＮａ+流入の測定が、Ｃａ2+指示薬またはＮａ+指示薬の反応産物を測定することである、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１に記載の方法．
【００７６】
〔１５〕好ましくは、上記ＧＬＰ−１分泌促進剤、食欲抑制剤および肥満予防および／または改善剤が、哺乳動物の消化管内で腸Ｌ細胞の受容体に直接作用して該腸Ｌ細胞からのＧＬＰ−１分泌を高める物質である、〔１〕〜〔１４〕のいずれか１に記載の剤。
【００７７】
〔１７〕ジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールを有効成分とするＧＬＰ−１分泌促進剤。
【００７８】
〔１８〕ジフェニルボリン酸無水物を有効成分とする食欲抑制剤。
【００７９】
〔１９〕ジフェニルボリン酸無水物を有効成分とする肥満予防および／または改善剤。
【００８０】
〔２０〕ＧＬＰ−１分泌促進剤の製造のためのジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールの使用。
【００８１】
〔２１〕食欲抑制剤の製造のためのジフェニルボリン酸無水物の使用。
【００８２】
〔２２〕肥満予防および／または改善剤の製造のためのジフェニルボリン酸無水物の使用。
【００８３】
〔２３〕ＧＬＰ−１分泌促進のためのジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールの使用。
【００８４】
〔２４〕食欲抑制のためのジフェニルボリン酸無水物の使用。
【００８５】
〔２５〕肥満予防および／または改善のためのジフェニルボリン酸無水物の使用。
【００８６】
〔２６〕好ましくは非治療的に使用される、〔２３〕〜〔２５〕のいずれか１に記載の使用。
【００８７】
〔２７〕ＧＬＰ−１分泌促進に使用されるジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオール。
【００８８】
〔２８〕食欲抑制に使用されるジフェニルボリン酸無水物。
【００８９】
〔２９〕肥満予防および／または改善に使用されるジフェニルボリン酸無水物。
【００９０】
〔３０〕ジフェニルボリン酸無水物、プロベネシドまたはカンナビジオールを有効量で対象に投与するかまたは摂取させることを含む、ＧＬＰ−１分泌促進方法。
【００９１】
〔３１〕ジフェニルボリン酸無水物を有効量で対象に投与するかまたは摂取させることを含む、食欲抑制方法。
【００９２】
〔３２〕ジフェニルボリン酸無水物を有効量で対象に投与するかまたは摂取させることを含む、肥満予防および／または改善方法。
【００９３】
〔３３〕好ましくは非治療的方法である、〔３０〕〜〔３２〕のいずれか１に記載の方法。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００９５】
実施例１  腸細胞におけるＴＲＰＶ２  ｍＲＮＡ発現の定量
ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞（ヒト盲腸腺癌由来上皮細胞；ＡＴＣＣ社）は、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ウシ胎児血清含有、高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養して増殖させたのち、マトリゲル（１００μＬ／ｗｅｌｌ；ＢＤ社）をコーティングした２４ウエルプレートに５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播き、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清含有、高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３日間培養した。
ＨｕＴｕ−８０細胞（ヒト十二指腸腺癌由来細胞；ＡＴＣＣ社）は、２４ウエルプレートに５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播き、ＤＭＥＭ：Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ１２・１０％ＦＢＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３日間培養した。
Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト結腸腺癌由来上皮細胞；ＡＴＣＣ社）は、１２ウエルプレートに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播き、ＤＭＥＭ・１０％ＦＢＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３日間培養した。
【００９６】
各細胞から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを精製した。熱変性（６５℃、５分間）させた精製ＲＮＡ  ２μｇを、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。続いて、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）２×ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、ｐｒｉｍｅｒおよびｐｒｏｂｅ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００で遺伝子発現量を解析した。内部標準として３６Ｂ４発現量を測定した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｐｒｏｂｅは、ＴＲＰＶ２にはＨｓ００９０１６４０＿ｍ１、３６Ｂ４にはＨｓ９９９９９９０２＿ｍ１を用いた。
【００９７】
結果を図１に示す。Ｌ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルであるＮＣＩ−Ｈ７１６細胞においてＴＲＰＶ２が顕著に発現していた。
【００９８】
実施例２  本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤によるＧＬＰ−１分泌促進作用
試験物質としてＴＲＰＶ２アゴニストであるカンナビジオール、ジフェニルボリン酸無水物およびプロベネシドを用いた。カンナビジオール（Ｓｉｇｍａ社）は、１００％エタノールに濃度０．１、０．３または１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。ジフェニルボリン酸無水物（Ｓｉｇｍａ社）は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；和光純薬工業）に濃度１０、３０または１００ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。プロベネシド（Ｓｉｇｍａ社）は、ＤＭＳＯに濃度３０、１００、３００ｍＭとなるように希釈した。これらの希釈液をＫＲＢ（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）バッファー（Ｓｉｇｍａ社）に１／１０００量添加し、試験物質溶液を調製した。コントロールとしては、カンナビジオールには１００％エタノールを、ジフェニルボリン酸無水物およびプロベネシドにはＤＭＳＯを用いた。
【００９９】
ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞は、実施例１と同様の方法で培養し、マトリゲル（６０μＬ／ｗｅｌｌ；ＢＤ社）をコーティングした４８ウエルプレートに２．５×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（Ｎ＝４）となるように播き、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清含有、高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した。３日後に培地を試験物質溶液に交換し、２時間培養した後、上清を回収した。上清はＤｉｐｒｏｔｉｎ−Ａ（ＤＰＰ４阻害剤、Ｓｉｇｍａ社）およびアプロチニン溶液（プロテアーゼインヒビター、和光純薬工業）を加えた微量遠心管に回収し、浮遊細胞を除去した後、ＧＬＰ−１定量まで−８０℃で保存した。ＧＬＰ−１の定量は、ＧＬＵＣＡＧＯＮ−ＬＩＫＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ−１（ＡＣＴＩＶＥ）ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（ミリポア社）により、キットに添付のＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで１０倍希釈した上清を用いて行った。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて実施した。
【０１００】
結果を図２に示す。カンナビジオールは１μｇ／ｍＬ以上、ジフェニルボリン酸無水物は１０μｇ／ｍＬ以上、プロベネシドは３００μＭ以上の濃度で、コントロールと比べて統計学的に有意（ｐ＜０．０５）に細胞のＧＬＰ−１分泌を促進した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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