(57)【要約】【課題】腎癌の再発に特異的な因子であって、腎癌の再発リスクの予測結果を治療に結びつけることが可能な因子を用いた、腎癌の再発予測手段としての有用性が高い、腎癌の再発リスクの予測診断薬及びキット、並びに予測方法を提供する。【解決手段】腎癌再発リスク予測用診断薬:ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５からなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する。この診断薬を含む腎癌再発リスク予測用キット。腎癌の再発リスク予測方法:（Ａ）腎癌の治療を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること；並びに（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の腎癌の再発リスクを予測することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、
ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５からなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬。
【請求項２】
上記タンパク質及び／又はポリペプチドが、抗体及び／又はその断片である、請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
腎癌の再発リスクの予測に用いるためのキットであって、請求項１又は２に記載の診断薬を含む、キット。
【請求項４】
（Ａ）腎癌の治療を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の腎癌の再発リスクを予測すること、
を含む、腎癌の再発リスクを予測する方法。
【請求項５】
工程（Ａ）において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記生体試料が腎組織である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
工程（Ａ）において、上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、それら遺伝子の翻訳産物をそれぞれ特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを用いた免疫組織化学法により決定される、請求項４から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記タンパク質及び／又はポリペプチドが抗体及び／又はその断片である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（Ａ）において、上記患者の非癌性腎組織における上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物それぞれの発現レベルを対照として上記生体試料における上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定し、かつ工程（Ｂ）において、以下の判断基準により上記患者の腎癌の再発リスクを予測する、請求項４から８の何れか１項に記載の方法：
（ｉ）工程（Ａ）において決定した上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、対応する対照の発現レベルよりも高い場合には、上記患者は腎癌の再発リスクが高いと予測する；又は
（ii）工程（Ａ）において決定した上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが、対応する対照の発現レベルよりも低いか、若しくは同等である場合には、上記患者は腎癌の再発リスクが低いと予測する。
【請求項１０】
工程（Ａ）において、上記患者の非癌性腎組織における上記全ての遺伝子の翻訳産物それぞれの発現レベルを対照として上記生体試料における上記全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定し、かつ工程（Ｂ）において、以下の判断基準により上記患者の腎癌の再発リスクを予測する、請求項４から８の何れか１項に記載の方法：
（ｉ）工程（Ａ）において決定した上記全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルが、対応する対照の発現レベルよりも高い場合には、上記患者は腎癌の再発リスクが高いと予測する；又は
（ii）工程（Ａ）において決定した上記全ての遺伝子の翻訳産物発現レベルが、対応する対照の発現レベルよりも低いか、若しくは同等である場合には、上記患者は腎癌の再発リスクが低いと予測する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬及びキット、並びに腎癌の再発リスクを予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓に限局した（転移のない）腎癌の治療法としては、腎温存手術（腎部分切除術）及び根治的腎摘出術の外科的療法が主体である。しかし、根治的腎切除術を行った症例でも約３０％の症例において経過観察中に転移が認められる。転移性腎細胞癌では、抗癌化学療法および放射線治療が無効であると考えられているので、インターフェロン又はインターロイキン２等の免疫療法が行われてきたものの、その奏効率は約１０％と低い。近年、vascular endothelial growth factor: VEGFおよびその受容体を標的とした薬剤であるソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブやmammalian target of rapamycin (mTOR)阻害剤であるエベロリムス、テムシロリムスによる分子標的治療が導入され、一定の成果が得られているものの、最終的には治療に対して耐性となることが知られている。腎癌の確定診断の後、遠隔転移の有無、病期、及び腫瘤の大きさ等を調べ、その結果に基づいて、これらの治療法から適切なものが選択され実施される。これら治療法に基づく腎癌の治療後においては、再発や転移に対処するために、ＣＴ検査等の画像検査による予後の経過観察が必須とされており、腎癌の治療においては具体的な治療後に腎癌の再発や転移の有無を含めた予後予測が重要になっている。
【０００３】
腎癌の再発予測因子としては、赤沈、ＣＲＰ（Ｃ−reactive protein）及びＩＡＰ(Immunosuppressive  Acidic Protein)などの炎症反応に関わる因子が注目されている。赤沈及びＣＲＰ値については腎癌特異的生存率と有意な相関を有することが示されており（非特許文献１〜７）、これら因子は治療前検査の対象として推奨されている。一方、ＩＡＰについては、臨床症例に基づいた調査から腎癌再発予測因子としての有用性が示唆されているものの（非特許文献８〜１１）、調査に用いた症例数が必ずしも十分な数とは言えず、腎癌再発予測因子としての有用性は不明である。
【０００４】
さらに、近年、腎癌の再発予測因子として、血中ピルビン酸キナーゼＭ２及びチミジンキナーゼ１が腎摘出術の後の腎細胞癌の再発予測因子になり得る可能性が示唆されている（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sengupta S, Lohse CM, Cheville JC, Leibovich BC, Thompson RH, Webster WS, Frank I, Zincke H, Blute ML, Kwon ED. The preoperative erythrocyte sedimentation rate is an independent prognostic factor in renal cell carcinoma. Cancer. 2006;106(2):304-12.
【非特許文献２】Ljungberg B, Grankvist K, Rasmuson T. Serum acute phase reactants and prognosis in renal cell carcinoma. Cancer. 1995;76(8):1435-9.
【非特許文献３】Lamb GW, McMillan DC, Ramsey S, Aitchison M. The relationship between the preoperative systemic inflammatory response and cancer-specific survival in patients undergoing potentially curative resection for renal clear cell cancer. Br J Cancer. 2006;94(6):781-4.
【非特許文献４】Masuda H, Kurita Y, Fukuta K, Mugiya S, Suzuki K, Fujita K. Significant prognostic factors for 5-year survival after curative resection of renal cell carcinoma. Int J Urol. 1998;5(5):418-22.
【非特許文献５】Fujikawa K, Matsui Y, Oka H, Fukuzawa S, Takeuchi H. Serum C-reactive protein level and the impact of cytoreductive surgery in patients with metastatic renal cell carcinoma. J Urol. 1999;162(6):1934-7.
【非特許文献６】Atzpodien J, Royston P, Wandert T, Reitz M; DGCIN -- German Cooperative Renal Carcinoma Chemo-Immunotherapy Trials Group. Metastatic renal carcinoma comprehensive prognostic system. Br J Cancer. 2003;88(3):348-53.
【非特許文献７】Michela de Martino, Tobias Klatte, Christoph Seemann, Matthias Waldert, Andrea Haitel, Georg Schatzl, Mesut Remzi† and Peter Weibl. Validation of serum C-reactive protein (CRP) as an independent prognostic factor for disease-free survival in patients with localized renal cell carcinoma (RCC). BJU InternationalEarly View, Article first published online: 15 MAR 2013
【非特許文献８】Masuda H, Kurita Y, Suzuki K, Fujita K, Aso Y. Predictive value of serum immunosuppressive acidic protein for staging renal cell carcinoma: comparison with other tumour markers. Br J Urol. 1997;80(1):25-9.
【非特許文献９】Igarashi T, Tobe T, Kuramochi H, Akakura K, Ichikawa T, Hamano S, Suzuki N, Furuya Y, Ito H. Serum immunosuppressive acidic protein as a potent prognostic factor for patients with metastatic renal cell carcinoma. Jpn J Clin Oncol. 2001;31(1):13-7.
【非特許文献１０】Matsumoto K, Iwamura M, Muramoto M, Suyama K, Tabata K, Minei S, Hirai S, Baba S. [Prognostic value of serum immunosuppressive acidic protein in renal cell carcinoma] Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi. 2002;93(4):548-54.
【非特許文献１１】Kawata N, Yamaguchi K, Hirakata H, Hachiya T, Yoshida T, Takimoto Y. Immunosuppressive acidic protein detects high nuclear grade localized renal cell carcinoma. Urology. 2005;66(4):736-40.
【非特許文献１２】Benjamin Nisman, Vladimir Yutkin, Hovav Nechushtan, Ofer N. Gofrit, Tamar Peretz, Simon Gronowitz, and Dov PodeOBJECTIVES Pyruvate kinase type M2 Circulating Tumor M2 Pyruvate Kinase and Thymidine Kinase 1 Are Potential Predictors for Disease Recurrence in Renal Cell Carcinoma After Nephrectomy. Urology. 2010 Aug;76(2):513.e1-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の通り、赤沈及びＣＲＰ値は腎癌特異的生存率と有意な相関を有することが示されているものの、これら因子は治療前検査の対象として推奨されるに留まることおよび上記因子は炎症の程度を示す一般的なマーカーであり、腎癌の再発を予測し得る特異的な因子としての有用性は決定的なものではない。ＩＡＰについては、上述の通り、ＩＡＰの腎癌再発予測因子としての有用性は不明のままである。
【０００７】
さらに、血中ピルビン酸キナーゼＭ２及びチミジンキナーゼ１についても、腎摘出術の後の腎細胞癌の再発予測因子として有用性は示唆されているものの、実際の臨床現場において腎癌の再発予測因子として応用可能な技術には至っていない。
【０００８】
加えて、上記バイオマーカー(ＣＲＰ)は、当該蛋白質がどのようにして癌の悪性度や再発に関係しているのか、に関する分子メカニズムが明確に示されていない。従って、これらのバイオマーカー陽性患者をどのように治療すべきであるかに関する知見が欠けており、当該バイオマーカー陽性であることが判明しても、患者、医師共に戸惑うばかりである。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、腎癌の再発に特異的な因子を用いた、腎癌の再発予測手段としての有用性が高い、腎癌の再発リスクの予測診断薬及びキット、並びに予測方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、腎癌の再発リスクの予測結果を治療に結びつけることが可能な因子を用いた予測診断薬及びキット、並びに予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ａｒｆ６経路に属する特定の遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子の発現が腎癌の再発に有意に相関することを見出した。本発明は、係る知見により完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は以下の（１）〜（３）に関する。
（１）腎癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、
ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５からなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬。
（２）腎癌の再発リスクの予測に用いるためのキットであって、上記本発明の診断薬を含む、キット。
（３）（Ａ）腎癌の治療を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定すること；並びに
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の腎癌の再発リスクを予測すること、を含む、腎癌の再発リスクを予測する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、腎癌の再発に特異的な因子を用いた、腎癌の再発予測手段としての有用性が高い、腎癌の再発リスクの予測診断薬及びキット、並びに予測方法を提供することができる。本発明で用いる因子であるバイオマーカーは、癌の浸潤転移や治療抵抗性に関与するシグナル経路を形成する一群の蛋白質からなるものである。このシグナル経路を阻害すると、癌の浸潤転移などを著しく減じる事も本発明者は見いだしている。従って、本発明の予測診断薬及びキット、並びに予測方法を用いて、腎癌の再発が予測される患者について治療方針を提供することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例において取得した免疫組織化学染色（例として抗ＥＰＢ４１Ｌ５抗体を使用）の顕微鏡写真を示す。
【図２】各遺伝子の翻訳産物発現と腎癌の治療完了から再発までの期間(図２Ａ〜２Ｄ)、及び生存期間(図２Ｅ)との相関関係を調べた結果を示す。
【図３】EPB41L5のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_020909.3）を示す。
【図４】EPB41L5のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_065960.2) を示す。
【図５】EPB41L5とEPB41L4bの一次構造比較を示す。
【図６】EPB41L4b isoform1とisoform2のゲノムの比較を示す。
【図７】EPB41L4b isoform1とisoform2のアミノ酸の比較を示す。
【図８】EPB41L5(NP_065960.2)とEPB41L4b(NP_061987.3061987.3)についてアラインメント解析を示す。
【図９】AMAP1のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_018482.3）を示す。
【図１０】AMAP1のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_060952.2) を示す。
【図１１】AMAP1と相同性がある遺伝子（ArfGAP family）の情報を示す。
【図１２】AMAP1と相同性があるAMAP2遺伝子のcds領域塩基配列(NCBI Reference Sequence: NM_003887.2)を示す。
【図１３】AMAP1と相同性があるAMAP2のアミノ酸配列(NCBI Reference Sequence: NP_003878.1)を示す。
【図１４】AMAP1と相同性があるAMAP2のアライメント解析のデータを示す。
【図１５】GEP100のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_014869.3）を示す。
【図１６】GEP100のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_055684.3）を示す。
【図１７】ヒトゲノムにおいてGEP100と類似性があるタンパク質群を示す。
【図１８】GEP100と相同性がある遺伝子群を示す。
【図１９】GEP100と相同性があるBRAG1遺伝子のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_015075.1）を示す。
【図２０】GEP100と相同性があるBRAG1のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_055890.1）を示す。
【図２１】GEP100と相同性があるBRAG1のアライメント解析のデータを示す。
【図２２】GEP100と相同性があるBRAG3遺伝子のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_015232.1）を示す。
【図２３】GEP100と相同性があるBRAG3のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_056047.1）を示す。
【図２４】GEP100と相同性があるBRAG3のアライメント解析のデータを示す。
【図２５】EPB41L5に対するポククローナル抗体の抗原部位（アミノ酸541番目から733番目までを含むペプチド(193アミノ酸)）を図示する。
【図２６】抗原をウサギに免疫し、抗血清を採取、抗体の精製を行う一連の操作のスキームを示す。
【図２７】EPB41L5抗体のアフィニティー精製の結果を示す。
【図２８】EPB41L5抗体のアフィニティー精製の結果を示す。
【図２９】AMAP1に対する抗体の抗原部位の情報、抗原部位のクローニング手順、抗原の調製、ウサギへの免疫、抗血清の採取、及びに抗体の精製等に関する情報をまとめて示す。
【図３０】GEP100に対する抗体の抗原部位の情報、抗原部位のクローニング手順、抗原の調製、ウサギへの免疫、抗血清の採取、及びに抗体の精製等に関する情報をまとめて示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
診断薬
本発明の一の態様によれば、腎癌の再発リスクの予測に用いるための診断薬であって、
ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５からなる群から選択されるいずれか1つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有する、診断薬が提供される。
【００１５】
本発明において、「腎癌」とは、腎臓原発の悪性新生物の最も多くを占める腎細胞癌を指す。また、腎細胞癌の大部分は淡明細胞型腎細胞癌である。
【００１６】
本発明において、「再発リスク」とは、腎癌の治療を受けた患者が、当該治療の完了後に癌を再発するリスクを意味する。再発する癌は、腎癌及び転移性腎細胞癌のいずれか一方または両方を包含する。再発リスクは、腎癌の治療を受けた後、例えば、５年以内の早期再発リスクを主に意味する。但し、再発リスクは、腎癌の治療を受けた後５年を超え、１０年以内の中期再発リスク、あるいは１０年を超える後期再発リスクを含み得る。さらに、腎癌の治療法は、特に限定されるものでは無い。例えば、抗癌剤投与を含む化学療法、インターフェロン及び／又はインターロイキン２および近年転移性腎癌に導入されている分子標的薬の投与、或いは病巣部を含めて腎臓を部分的に切除して腎臓を温存する腎部分切除術等が挙げられる。
【００１７】
「再発リスクの予測」の方法については、「予測方法」において後述する。
本発明の診断薬は、腎癌の再発リスクの予測に用いることができる。このことは、腎癌の治療を受け、かつその後腎癌が再発した患者群における以下の結果から理解できる。腎組織で特定遺伝子の翻訳産物の高発現が見られる患者は、腎組織で当該特定遺伝子の翻訳産物の高発現が見られない患者と比較して、統計的に腎癌の治療後、比較的早期（例えば、５年以内）に腎癌を再発する事が統計的有意差を持って示される。この点は、後述する実施例で具体的に示される。特定遺伝子とは、具体的には、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子である。これら遺伝子の何れか１つの翻訳産物の高発現が見られる患者は統計的有意差を持って再発するリスクが高い。さらに、上記遺伝子の何れか２つの翻訳産物の高発現が見られる患者は、統計的有意差を持って再発するリスクがさらに高くなり、上記遺伝子の３つの翻訳産物の高発現が見られる患者は、統計的有意差を持って再発するリスクが最も高くなる。即ち、腎癌組織において上記遺伝子の翻訳産物の高発現が認められる場合、当該患者は腎癌の治療後に早期に癌を再発するリスクが高いと予測される。詳細は、後述する、腎癌の再発リスクを予測する方法において説明する。このように、本発明において「腎癌の再発リスクの予測」とは、腎組織における上記特定遺伝子の翻訳産物の高発現を検出することを前提としている。そのため、当該予測に用いるための本発明の診断薬は、具体的にはそれら遺伝子翻訳産物の検出に用いるための試薬であって、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５からなる群から選択されるいずれか１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドを含有するものである。
【００１８】
＜遺伝子ＥＰＢ４１Ｌ５＞
遺伝子ＥＰＢ４１Ｌ５（略称ＥＢＬ５）（ＧｅｎｅＩＤ：５７６６９）は、癌浸潤におけるＡＭＡＰ１の結合パートナーであり、浸潤仮足形成に必須である。
2015021800.tif 000002
【００１９】
2 EPB41L5ファミリーの中でもEPB41L5に最も相同性があるのはEPB41L4bである。EPB41L4bには、band 4.1-like protein 4B isoform 1 [Homo sapiens](NP_060894.2)（配列番号3）とband 4.1-like protein 4B isoform 2 [Homo sapiens](NP_061987.3)（配列番号4）がある。isoform1は、short formである。図５にEPB41L5とEPB41L4bの一次構造比較を示す。図６にEPB41L4b isoform1とisoform2のゲノムの比較を示す。図７にEPB41L4b isoform1のアミノ酸配列とisoform2のアミノ酸配列の比較を示す。図８にEPB41L5(NP_065960.2)（配列番号2）とEPB41L4b(NP_061987.3)（配列番号4）についてアラインメント解析を示す。
【００２０】
図８に示すように、EPB41L5(NP_065960.2)（配列番号2）とEPB41L4b(NP_061987.3)（配列番号4）についてアラインメント解析の結果、C末端側(EPB41L5 基準で541番目以降の配列)において両者配列は大きく異なっており、EPB41L5のC末端配列は当該タンパク 質に対する特異的な抗体を作製する上で有効な抗原になる。本発明においては、EPB41L5タンパク 質に対する特異的な抗体またはその断片は、EPB41L5（配列番号2）の541番目から733番目付近のアミノ酸配列領域にエピトープとなるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であることが適当である。
【００２１】
＜遺伝子ＡＭＡＰ１＞
遺伝子ＡＭＡＰ１（ＧｅｎｅＩＤ：５０８０７）は、癌浸潤におけるＡｒｆ６の下流エフェクターである。図９にAMAP1のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_018482.3）（配列番号5）を示す。図１０にAMAP1のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_060952.2)（配列番号6）を示す。図１１にAMAP1と相同性がある遺伝子（ArfGAP family）の情報を示す。図１２にAMAP1と相同性があるAMAP2遺伝子のcds領域塩基配列(NCBI Reference Sequence: NM_003887.2)（配列番号7）を示す。図１３にAMAP1と相同性があるAMAP2のアミノ酸配列(NCBI Reference Sequence: NP_003878.1)（配列番号8）を示す。図１４にAMAP1と相同性があるAMAP2のアライメント解析のデータを示す。
【００２２】
図１４に示すように、AMAP1（NCBI Reference Sequence: NP_060952.2)（配列番号6）とAMAP2 (NCBI Reference Sequence: NP_003878.1)（配列番号8）についてのアラインメント解析の結果、両者配列に大きく異なる領域がある。AMAP1のこの領域は、当該タンパク 質に対する特異的な抗体を作製する上で有効な抗原になる。本発明においては、AMAP1タンパク 質に対する特異的な抗体またはその断片は、AMAP1（配列番号6）の935番目から1002番目付近のアミノ酸配列領域にエピトープとなるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であることが適当である。
【００２３】
＜遺伝子ＧＥＰ１００＞
遺伝子ＧＥＰ１００（ＧｅｎｅＩＤ：９９２２）は、癌浸潤におけるＡｒｆ６活性化因子である。
図１５にGEP100のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_014869.3）（配列番号9）を示す。図１６にGEP100のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_055684.3）（配列番号10）を示す。図１７にヒトゲノムにおいてGEP100と相同性があるタンパク質群を示す。図１８にGEP100と相同性がある遺伝子群を示す。GEP100はBRAG familyと相同性が高いことが分かる。図１９にGEP100と相同性が高いBRAG1遺伝子のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_015075.1）（配列番号11）を示す。図２０にGEP100と相同性が高いBRAG1のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_055890.1）（配列番号12）を示す。図２１にGEP100とBRAG1のアライメント解析のデータを示す。図２２にGEP100と相同性が高いBRAG3遺伝子のcds領域塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_015232.1）（配列番号13）を示す。図２３にGEP100と相同性が高いBRAG3のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_056047.1）（配列番号14）を示す。図２４にGEP100とBRAG3のアライメント解析のデータを示す。
【００２４】
図２１に示すGEP100（NCBI Reference Sequence: NP_055684.3）（配列番号10）とBRAG1（NCBI Reference Sequence: NP_055890.1）（配列番号12）についてのアラインメント解析の結果、図２４に示すGEP100（NCBI Reference Sequence: NP_055684.3）（配列番号10）とBRAG3のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_056047.1）（配列番号14）についてのアラインメント解析の結果から、それぞれ両者配列には大きく異なる配列領域が存在し、これらの配列領域のタンパク 質に対する特異的な抗体を作製する上で有効な抗原になる。本発明においては、GEP100タンパク 質に対する特異的な抗体またはその断片は、GEP100 （配列番号10）の139番目から248番目付近のアミノ酸配列領域にエピトープとなるアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であることが適当である。
【００２５】
上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチドとは、上記遺伝子のうち一の遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得るものであれば特に限定されるものでは無い。例えば、当該翻訳産物に対する抗体及び／又はその断片が挙げられる。抗体及び／又はその断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドの調製方法については、遺伝子翻訳産物に対する特異的結合を保持し得る限り、どのような方法も採用し得る。例えば、当該遺伝子翻訳産物となるタンパク質及び／又はその断片を抗原として、公知の手法により所望のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等を調製することが出来る。
【００２６】
尚、上記遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドが有する遺伝子翻訳産物に対する特異的結合性は、当該遺伝子の翻訳産物を、当該遺伝子の翻訳産物と共存可能性がある他の遺伝子の翻訳産物と識別できる程度であれば良い。従って、例えば、上記遺伝子に一部改変（置換、欠失、付加等）が加わっている遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及びポリペプチドであっても、上記遺伝子の翻訳産物を、当該遺伝子の翻訳産物と共存可能性がある他の遺伝子の翻訳産物と識別できる程度の遺伝子翻訳産物に対する特異的結合性を有するものであれば、本発明の「遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質及び／又はポリペプチド」に含めることができる。
【００２７】
さらに、本発明の診断薬においては、単一の診断薬に、上記遺伝子のうち１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド１種のみが含まれていてもよいし、或いは上記遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２種以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれていてもよい。加えて、上記タンパク質及び／又はポリペプチドは、遺伝子翻訳産物の検出のために、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例えば、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、並びにフルオロセイン等の蛍光低分子化合物を含む）等が挙げられる。但し、これら標識物質による標識を有する物に限定される意図ではない。本発明の診断薬において上記タンパク質及び／又はポリペプチドが標識されていない場合には、当該遺伝子の翻訳産物を公知の方法により検出することができる。そのような検出には、例えば、それらタンパク質及び／又はポリペプチド（一次抗体）に結合する二次抗体を用いたシステムを用いることができる。二次抗体を用いたシステムには市販の検出キットがある。このシステムでは、例えば、一次抗体に対する二次抗体がペルオキシダーゼで標識されており、試料中で目的遺伝子翻訳産物に特異的に結合した一次抗体にさらに上記二次抗体を特異的に結合させ、ペルオキシダーゼの発色基質（例えば、3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）を当該試料に添加して発色を観察することにより遺伝子翻訳産物の検出することが出来る。さらに、本発明において、１つの診断薬に、上記遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれていている場合には、例えば、それら２以上のタンパク質及び／又はポリペプチドをそれぞれ異なる波長の蛍光を発する異種の蛍光物質で標識することができる。これにより、同一試料において目的の遺伝子翻訳産物それぞれを検出することが出来る。
【００２８】
診断薬は、任意に、緩衝剤、防腐剤、凍結防止剤等を含み得る。緩衝剤としては、例えば、トリス塩酸塩、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等を挙げることかできる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム等を挙げることができる。凍結防止剤としては、例えば、グリセロール等を挙げることができる。
【００２９】
本発明の診断薬は、後述する腎癌の再発リスクを予測する方法の工程（Ａ）において、所定の遺伝子翻訳産物の発現レベルを決定するために当該遺伝子の翻訳産物検出に用いることができる。
【００３０】
キット
本発明の別の態様によれば、腎癌の再発リスクの予測に用いるためのキットであって、上述の診断薬を含む、キットが提供される。
【００３１】
本発明のキットは、後述する腎癌の再発リスクを予測する方法を実施する上で用い得る試薬及び部材等の要素をキットとして提供するものであり、上記診断薬を含むことを特徴とする。
【００３２】
本発明のキットにおいては、本発明の診断薬は、（１）単一の診断薬において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５のうち１つの遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド１種のみが含まれることにより１つの遺伝子の翻訳産物の検出が可能である診断薬であることができる。あるいは、本発明の診断薬は、（２）単一の診断薬においてそれら遺伝子の翻訳産物それぞれをそれぞれ特異的に認識可能な２種以上のタンパク質及び／又はポリペプチドが含まれることにより当該単一の診断薬が複数の上記遺伝子翻訳産物を検出可能である単一の診断薬であってもよい。さらに、本発明のキットにおいては、上記（１）の１つの遺伝子の翻訳産物の検出が可能である診断薬、及び／又は上記（２）の複数の遺伝子翻訳産物の検出が可能である単一の診断薬が含まれ得る。
【００３３】
本発明のキットには、上記診断薬に加えて、ブロッキング試薬、診断薬に含まれるタンパク質及び／又はポリペプチド（抗体）の検出に用いるための標識化二次抗体、発色試薬、腎癌の再発リスクを予測する方法に関する実験プロトコルを記述した指示書等が任意に含まれ得る。ブロッキング試薬としては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等を挙げることができる。
【００３４】
予測方法
本発明の別の態様によれば、以下工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、腎癌の再発リスクを予測する方法が提供される。
（Ａ）腎癌の治療を受けた患者から採取した生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の腎癌の再発リスクを予測する工程、
【００３５】
本発明の方法において、「腎癌」、並びに「腎癌の治療」については、前記の通りである。本発明の方法において、患者とは、腎癌の治療を受けた患者である。
【００３６】
本発明の方法において、「生体試料」とは、腎癌の治療を受けた患者から採取された任意の生体試料である。生体試料は、腎組織であることが再発リスクを精度良く予測し得るというという観点で好ましい。さらに、腎組織としては、例えば、腎癌の治療において腫瘍摘出術の際に患者から摘出した腎臓病変部位の組織、又は、病変部位が存在していた近傍の腎組織であって腫瘍摘出術の後に、摘出術とは別に採取した腎組織を挙げることができる。但し、患者への負担を極力軽減し、かつ再発リスクを精度良く予測し得るという観点から、腎組織は、腫瘍摘出術の際に患者から摘出した腎癌病変部位の組織であることが好ましい。尚、本発明では病理診断のために腎臓原発巣および転移巣の外科切除検体から作製されたパラフィン包埋組織を用いて上述の予測因子を検出可能であるため、病理診断が行われたすべて症例について検索が可能である。
【００３７】
本発明の方法の工程（Ａ）においては、前記生体試料において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する。これら遺伝子は、Ａｒｆ６経路に属する遺伝子である。実施例で示すように、腎癌患者の腎組織においてＡｒｆ６経路に属する遺伝子が組織レベルで発現し、Ａｒｆ６経路の稼働が推定される場合には、当該患者は相対的に腎癌の治療後に早期再発するリスクが高い。従って、Ａｒｆ６経路に属する遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子の高発現が確認された場合、腎癌の治療後の再発を促進するものと考えられるＡｒｆ経路の稼働が推定され、当該患者は早期に腎癌を再発する蓋然性が高いと判断し得る。
【００３８】
本発明方法の工程（Ａ）において、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、及びＥＰＢ４１Ｌ５から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの決定は、上記生体試料に対して実施される限り、その方法については特に限定されるものでは無い。上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの決定は、例えば、上記生体試料全体に対して実施してもよいし、或いは生体試料において特定種の細胞に対して実施してもよいし、或いは生体試料に存在する細胞において細胞質及び細胞核それぞれ別々に実施してもよい。上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルの決定が、生体試料に存在する細胞において細胞質及び細胞核それぞれ別々に実施された場合、決定した翻訳産物発現レベルの結果は、細胞質についての結果と細胞核についての結果の２種類が得られる。それら２種類の結果は、後述の工程（Ｂ）にそれぞれ用いることが出来る。
【００３９】
本発明方法の工程（Ａ）において使用される、生体試料における上記所定の遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する方法は、特に限定されない。具体的には、本発明の診断薬について上記した如く、検出の対象となる遺伝子の翻訳産物を特異的に認識可能なタンパク質又はポリペプチド（診断薬）を用いて当該遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定する方法を利用可能である。具体的には、生体試料である組織切片において遺伝子翻訳産物の発現強度及び発現分布を正確に把握して発現レベルを決定することが好ましい。特に、それらタンパク質及び／又はポリペプチド（診断薬）を用いた免疫組織化学法により当該遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することが、遺伝子翻訳産物の発現強度及び発現分布をより正確に把握できるという観点から好ましい。なお、免疫組織化学法については、各種公知の手法を用いることができる。本発明においては、それら公知の手法を用いても良いし、或いは新たに開発された手法を用いてもよい。免疫組織化学法等の翻訳産物発現レベル決定方法は、対象となる遺伝子翻訳産物の発現レベルを決定できるものである限り、特に限定されるものではない。
【００４０】
さらに、本発明においては、遺伝子翻訳産物の特異的な検出を確保するために、上記タンパク質及び／又はポリペプチドは、検出の対象となる遺伝子翻訳産物に対する抗体及び／又はその断片であることが好ましい。この点は、本発明の診断薬についての説明で既述の通りである。
【００４１】
本発明方法の工程（Ａ）において、本発明所定の遺伝子の翻訳産物の発現レベル決定には、生体試料において任意のタンパク質検出法で検出されたシグナル強度を基準とし、この基準との比較を用いることが出来る。基準に用いる生体試料の例としては、同一患者から採取した非癌性組織（特に、非癌性腎組織）を挙げることができ、この組織における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現レベルを対照とすることができる。この場合、同一患者から採取した非癌性組織（特に、非癌性腎組織）における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現シグナル強度と、対象生体試料における本発明所定の遺伝子翻訳産物発現シグナル強度を、同一のタンパク質検出法で検出し、比較するそれにより、本発明所定の少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルを決定することができる。さらに、「翻訳産物発現レベルの決定」においては、上記基準との比較において、対象生体試料における本発明所定の少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現のシグナル強度が、例えば、「高い」、「同等」又は「低い」等のランク付けをすることもできる。或いは、例えば上記基準として用いるシグナル強度を基準として対象生体試料における本発明所定の少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現のシグナル強度をスコア化することもできる。シグナル強度のスコア化は、例えば、基準として用いた試料における遺伝子翻訳産物のシグナル強度を０とし、そのシグナル強度と対象生体試料における遺伝子翻訳産物のシグナル強度を比較して、例えば、−１から３等の整数でスコア化することが出来る。遺伝子翻訳産物のシグナル強度のランク付けやスコア化は、適宜決定できる。
【００４２】
本発明方法の工程（Ｂ）においては、工程（Ａ）において決定した翻訳産物発現レベルに基づいて、上記患者の腎癌の再発リスクを予測する。
【００４３】
工程（Ｂ）において腎癌の再発リスクを予測するには、具体的には、工程（Ａ）に関し上記に説明した通り、上記基準との比較により決定した「高い」、「同等」又は「低い」等のランク、或いはスコア化した値に基づいて、腎癌治療後の再発リスクを予測することが出来る。より具体的には、対象生体試料における上記少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「高い」とのランク付けが得られた場合には、当該患者については、腎癌の再発リスクが相対的に高いと理解することができる。さらに、対象生体試料における上記いずれか２つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「高い」とのランク付けが得られた場合には、当該患者については、腎癌の再発リスクが相対的により高いと理解することができ、３つの遺伝子の翻訳産物発現レベルが「高い」とのランク付けが得られた場合には、当該患者については、腎癌の再発リスクが相対的に最も高いと理解することができる。
それに対して、対象生体試料における上記３つの遺伝子全ての翻訳産物発現レベルが「同等」又は「低い」とのランク付けが得られたされた場合には、当該患者については、腎癌の再発リスクが相対的に低いと理解することができる。翻訳産物発現レベルをスコア化した場合には、スコア自体から腎癌の再発リスクを理解することができる。或いは、予めスコアに再発リスクが「高い」、「低い」又は「中程度」等の判定を割り振っておき、得られたスコアから腎癌の再発リスクを「高い」、「低い」又は「中程度」等と理解することもできる。腎癌の再発リスクの予測は、「高い」、「低い」又は「中程度」のような結果を得るだけでなく、腎癌の治療後から腎癌を発症するリスクが５０〜９０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％等）である期間がどの程度であるかを示す指標を含むこともできる。
【００４４】
治療又は予防方法
さらに、本発明の別の態様によれば、腎癌の再発を治療又は予防する方法が提供される。具体的には、腎癌の再発を治療又は予防する方法とは、上記腎癌の再発リスクを予測する方法により得られた予測結果に基づいて、腎癌の再発を治療又は予防する方法である。
【００４５】
具体的には、本方法は、抗癌剤を用いた化学療法、ホルモン療法、放射線療法、外科的処置、食事療法、生活指導等、任意の腎癌の再発を治療又は予防し得る手段を含む。本発明で用いる遺伝子の翻訳産物（バイオマーカー）は、癌の浸潤転移や治療抵抗性に関与するシグナル経路を形成する一群の蛋白質からなるものである。このシグナル経路を阻害すると、癌の浸潤転移などを著しく減じる事も本発明者は見いだしている。従って、本発明の予測方法を用いて、腎癌の再発が予測される患者について、上記シグナル経路を阻害することを含む治療方法を施して、腎癌の再発を治療又は予防し得る。
【００４６】
本方法は、上記腎癌の再発リスクを予測する方法により得られた予測結果に基づいて、腎癌の再発を治療又は予防する限り特に限定されるものではなく、上記腎癌の再発リスクを予測する方法の方法工程を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
＜材料及び方法＞
（材料及び方法）
（１）患者集団
尚、今回の検討は腎細胞癌の分子標的治療の耐性機構を調べる研究プロジェクトとして慶應義塾大学倫理委員会の許可を得て行われた研究の一環として行われた。具体的には過去に慶應義塾大学病院（日本国、東京）にて腎癌摘出手術を受けた１１２人の患者を対象にし、解析を行った。
【００４９】
（２）免疫組織化学（Immunohistochemistry；ＩＨＣ）
ＥＰＢ４１Ｌ５抗体は、以下に具体的に説明するように、ヒト蛋白質のアミノ酸558番目から733番目までを含むペプチドを抗原としウサギに免疫した後、標準的手法によって抗血清を採取、抗原にてアフィニティ精製したものを用いた。
【００５０】
図２５にEPB41L5に対するポククローナル抗体の抗原部位（アミノ酸541番目から733番目までを含むペプチド(193アミノ酸)）を図示する。
EPB41L5抗原部位のクローニング手順
HUVEC cDNAをtemplateにし、抗原領域の両端に作製したプライマーを用いて抗原部位のクロ-ニングを行い、GST融合蛋白質発現用ベクターpGEX-4Tに挿入した。
EPB41L5抗原の調製
GST融合蛋白質発現用ベクターpGEX-4T-2にEPB41L5抗原部位の遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて、Eschericha coli BL21株の形質転換を行う。形質転換した大腸菌をLB培地中で37℃で振とう培養しOD600が0.7に達した時に終濃度0.2mMになるようにIPTGを添加し発現の誘導を行う。25℃で2時間培養後、集菌を行った。
【００５１】
抗原蛋白質を大量発現させた大腸菌をPBS緩衝液で懸濁後、超音波破砕機により氷上で破砕し、遠心操作にて煩雑物の除去を行った後、上清を回収する。抗原蛋白質はGST融合蛋白質として発現するので、GSTタグを特異的に認識し吸着するGlutathione Sepharose 4Bをカラムに充鎮し、カラムを平衡後サンプル溶液を添加する。カラムを洗浄し煩雑蛋白質を除去した後、glutathione含有の緩衝液により、GST融合蛋白質の溶出を行った。
得られた抗原を常法によりウサギに免疫し、抗血清を採取、抗体の精製を行った。一連の操作は図２６に示すスキームに基づいて実施した。EPB41L5抗体のアフィニティー精製の結果を図２７及び２８に示す。
【００５２】
＜AMAP1に対する抗体＞
AMAP1に対する抗体の抗原部位の情報、抗原部位のクローニング手順、抗原の調製、ウサギへの免疫、抗血清の採取、及びに抗体の精製等に関する情報をまとめて図２９に示す。
【００５３】
＜GEP100に対する抗体＞
GEP100に対する抗体の抗原部位の情報、抗原部位のクローニング手順、抗原の調製、ウサギへの免疫、抗血清の採取、及びに抗体の精製等に関する情報をまとめて図３０に示す。
【００５４】
尚、ＡＭＡＰ１及びＧＥＰ１００に対する抗体については過去に報告がある（Onodera et al., 2006; Morishige et al., 2008）。
【００５５】
免疫組織化学染色は、以下の通り、厚さ４μｍのホルマリン固定パラフィン包埋連続切片を用いて実施した。全てのスライドは、最初にキシレンにおいて脱パラフィン処理を行い、段階的なアルコールにおいて脱水処理を実施し、次いで、切片をトリス緩衝食塩水(TBS: 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)でリンスした。
【００５６】
その後、以下の条件により、各抗原について切片の抗原賦活化処理を行った。
（ｉ）ＥＰＢ４１Ｌ５（ＥＢＬ５）：クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で９５℃、４０分インキュベート；
（ｉｉ）ＡＭＡＰ１又はＧＥＰ１００：抗原賦活化液（EDTA solution、ｐＨ９、Nichireiから購入）で９５℃、４０分インキュベート；
【００５７】
次いで、室温で０．３％Ｈ2Ｏ2／メタノールにインキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。切片をＴＢＳで洗浄した後、ＡＭＡＰ１（１：５００）、ＧＥＰ１００（１：１００）、又はＥＰＢ４１Ｌ５（ＥＢＬ５；１：１０００に対する一次抗体（括弧内の比率は希釈倍率）と共に、室温で３０分間、インキュベートした。さらにＴＢＳで洗浄した後、二次抗体としてEnVision（商標）(DAKO、日本国)を用いて各一次抗体の検出を行い、ジアミノベンジジンを用いて発色させた。各切片は、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、水洗した後、定常法に従い透徹処理・封入処理を行った。
【００５８】
（３）評価
全ての試料は、それぞれ独立に、盲検下で、腎臓腫瘍を専門とする病理学会認定医とArf6経路の研究に精通した研究者がその染色度合いに応じて「高い」（非癌性腎組織の染色度合いと比較して染色が濃い場合）又は「低い」（非癌性腎組織の染色度合いと比較して染色が同程度又は薄い場合）の２段階評価をした。
【００５９】
（４）統計分析
今回の解析では、Kaplan-Meier法により生存率を算定し、Log-rank法により有意差の検定を行った。分析の候補となった予測因子変数は、ＡＭＡＰ１、ＧＥＰ１００、ＥＰＢ４ＩＬ５（ＥＢＬ５）、０．０５未満のｐ値は、統計的に有意な相関があると判断した。これらの解析は、Stat View ver.5 for WINDOWSを用いて実施した。
【００６０】
＜結果＞
（１）患者におけるＡＭＡＰ１、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＧＥＰ１００の翻訳産物発現と臨床病理学的特徴との関係
患者における各遺伝子の翻訳産物発現と臨床病理学的特徴との関係を以下の表１に示す。
【００６１】
【表１】
2015021800.tif 000003
【００６２】
（解析結果）
図２Ａ〜ＣはＡＭＡＰ１、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＧＥＰ１００の各遺伝子の翻訳産物が高発現の患者と低発現の患者について、再発を免れた期間とその割合を示すカプラン・マイヤー曲線である。ＡＭＡＰ１、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＧＥＰ１００のいずれにおいても、それが高発現の患者は低発現の患者と比べて有意（それぞれＰ＜０．０００１、＜０．０００１、＝０．０００３）に早期再発していることがわかった。
【００６３】
また図２Ｄに示すように、ＡＭＡＰ１、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＧＥＰ１００の３つ全てが高発現の場合は、３つ全てが低発現又は３つのうち１〜２つが低発現（図中「Others」と表記）の場合と比べてより顕著に早期再発の傾向が見られた。
【００６４】
さらに、ＡＭＡＰ１、ＥＰＢ４１Ｌ５、ＧＥＰ１００の３つ全てが高発現の場合は有意（Ｐ＝０．０００２）な生存期間短縮傾向も見られた（図２Ｅ）。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、癌の診断および治療に関連する分野に有用である。
【図１】
2015021800.tif 000004
【図２】
2015021800.tif 000005
【図３】
2015021800.tif 000006
【図４】
2015021800.tif 000007
【図５】
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【図６】
2015021800.tif 000009
【図７】
2015021800.tif 000010
【図８】
2015021800.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2015021800.tif 000013
【図１１】
2015021800.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2015021800.tif 000020
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2015021800.tif 000023
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2015021800.tif 000029
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2015021800.tif 000032
【図３０】
2015021800.tif 000033
【配列表】
2015021800000001.app