(57)【要約】【課題】本発明は、VVDに改変を加え、二量体の形成及び解離をより精密に制御することができるタンパク質のペアを提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセットにおいて、少なくとも一方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、タンパク質のセットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセットにおいて、
少なくとも一方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、タンパク質のセット。
【請求項２】
前記一方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている、請求項１に記載のタンパク質のセット。
【請求項３】
さらに、少なくとも一方のタンパク質において、補因子結合ドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、請求項１又は２に記載のタンパク質のセット。
【請求項４】
前記一方のタンパク質と、他方のタンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する、請求項１から３いずれか１項に記載のタンパク質のセット。
【請求項５】
前記一方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の二量体形成効率を変更するものであり、他方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の解離速度を変更するものである、請求項４のいずれか１項に記載のタンパク質のセット。
【請求項６】
前記一方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の二量体形成効率を向上させるものであり、他方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つの解離速度を増大させるものである、請求項４に記載のタンパク質のセット。
【請求項７】
光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセットにおいて、
前記２つのタンパク質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその変異体であり、
少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、タンパク質のセット。
【請求項８】
前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸及び／又は５５位に対応するアミノ酸が置換されている、請求項７に記載のタンパク質のセット。
【請求項９】
前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項１０】
前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５５位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の５５位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されている、請求項８又は９に記載のタンパク質のセット。
【請求項１１】
前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換されている、請求項１０に記載のタンパク質のセット。
【請求項１２】
前記少なくとも一方のタンパク質において、さらに、フラビン結合ドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、請求項７から１１のいずれか１項に記載のタンパク質のセット。
【請求項１３】
前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の７４位及び／又は８５位に対応するアミノ酸が置換されている、請求項１２に記載のタンパク質のセット。
【請求項１４】
双方のタンパク質において、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている、請求項１３に記載のタンパク質のセット。
【請求項１５】
前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の１３５位及び／又は１６５位に対応するアミノ酸が置換されている、請求項１２から１４のいずれか１項に記載のタンパク質のセット。
【請求項１６】
双方のタンパク質において、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、請求項１５に記載のタンパク質のセット。
【請求項１７】
一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項１８】
一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項１９】
一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項２０】
一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項２１】
一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項２２】
両方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がシステインで置換されている、請求項８に記載のタンパク質のセット。
【請求項２３】
前記２つのタンパク質が、それぞれ別のタンパク質と結合又は融合しており、前記別のタンパク質は、相互作用するタンパク質である、請求項１から２２に記載のタンパク質のセット。
【請求項２４】
請求項１から２３に記載のタンパク質のセットの各タンパク質をコードする核酸。
【請求項２５】
相互作用する２つのタンパク質の距離を制御する方法であって、
請求項１から２３のいずれか１項に記載のタンパク質のセットの一方のタンパク質を、前記相互作用する２つのタンパク質の一方と結合又は融合させる工程と、請求項１から２２のいずれか１項に記載のタンパク質のセットの他方のタンパク質を、前記相互作用する２つのタンパク質の他方と結合又は融合させる工程と、
前記タンパク質のセットに光を照射する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光の照射で二量体の形成と解離を制御することができる、オプトジェネティクスのツールとして有用なタンパク質のセット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質の光活性化を利用する分子制御アプローチが出現し、オプトジェネティクスと呼ばれている（非特許文献１、２）。光は、化学物質に比較して空間的・時間的に制御しやすい。これまでに、いくつかのグループが、光依存的に二量体を形成する光感受性タンパク質や、光受容体とその結合パートナーを利用した、光依存性のタンパク質−タンパク質相互作用システムについて報告している（非特許文献３−８）。これらのシステムは、様々な細胞のシグナリングプロセスを光で制御する先駆的な例であり、光によってタンパク質−タンパク質相互作用のON/OFFを切り替えることができるため、光スイッチと呼ばれている。
【０００３】
しかしながら、天然の光スイッチは、分子量が大きい、非哺乳類補因子を必要とする、二量体化効率が低く解離速度が遅いなど、望ましくない性質を有していることが多い。細胞内タンパク質を光で制御するオプトジェネティクスの分野では、これらの限界を克服した強力で汎用的な光スイッチの開発が不可欠である。
【０００４】
Vivid（VVD）は、Neurospora Crassa由来の光受容体であり、青色光に反応して素早くホモ二量体化する（非特許文献９）。VVDは、いくつかの点で、他の光依存性二量体化システムより優れている。まず、VVD（約150アミノ酸）は、植物由来の光受容体に基づく他の二量体化システム（例えば、フィトクロムB（PhyB）-PIF、クリプトクロム2（CRY2）-CIB1、FKF1-GiGANTEA（GI））より、分子量が小さい。VVDのこの性質は、立体的障害が生じるのを防ぎ、オプトジェネティクスのツールの精密な分子設計を容易にする。2つ目に、VVDの補因子はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）であるところ、これは真核細胞に豊富に存在することから、外因性補因子を加えることなく、哺乳動物細胞で機能させることができる。
【０００５】
しかしながら、このような利点にも関わらず、VVDは、光を照射したときのVVDの結合親和性が低く（Kd=13μM）（非特許文献１１）、そのために二量体形成効率が低いという問題があった。また、VVDの二量体は、長い光反応サイクル（時定数τ＝18,000秒）のために解離するまでの期間が長いという問題もあった。
【０００６】
また、本来VVDは、青色光に反応してホモ二量体化を形成する。この性質はVVDに汎用的な光スイッチとしての優位性を与える。しかしながら、ホモ二量体を形成するペアは相互に相手を区別できないため、2つの異なるタンパク質（例えばタンパク質Aとタンパク質B）を近付けるための光スイッチとして用いると、タンパク質A-タンパク質Bのペアのみならず、タンパク質A-タンパク質Aやタンパク質B-タンパク質Bのペアも誘導してしまうという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Spencer, D. M. et al., Science 262, 1019-1024 (1993).
【非特許文献２】Inoue, T. et al., Nat. Methods 2, 415-418 (2005).
【非特許文献３】Levskaya, A., et al., Nature, 461, 997-1001 (2009).
【非特許文献４】Kennedy, M. J., et al., Nat. methods 7, 12-16 (2010).
【非特許文献５】Bugaj, L. J., et al., Nat. Methods 10, 249-52 (2013).
【非特許文献６】Yazawa, M. et al., Nat. Biotechnol.27, 941-5 (2009).
【非特許文献７】Wang, X. et al., Nat. Methods 9, 266-9 (2012).
【非特許文献８】Crefcoeur, R. P. et al, Nat. Commun. 4, 1779 (2013).
【非特許文献９】Zoltowski, B. D., et al., Science 316, 1054-7 (2007).
【非特許文献１０】Klemm, J. D., et al., Annu. Rev. Immunol. 16, 569-92 (1998).
【非特許文献１１】Zoltowski, B. D., et al., Biochemistry 24, 7012-7019 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、VVDに改変を加え、二量体の形成及び解離をより精密に制御することができる光スイッチとして有用なタンパク質のペアを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、VVDが二量体を形成する際にその界面に位置するN末端αヘリックスのアミノ酸を改変することによって、VVD光スイッチの二量体化の形成効率を制御できることを見出した。
さらに、フラビン結合ドメイン周辺のアミノ酸を改変すると、光照射の停止によるVVD光スイッチの二量体の解離速度を制御できることを見出した。
また、この方法で改変する場合、二量体を形成するペアのそれぞれに異なる改変を加え、異なるタンパク質のペアとしても二量体が形成されることを確認した。例えば、ペアの一方のタンパク質において二量体形成時に界面に位置するアミノ酸の1つを正電荷を有するアミノ酸で置換し、他方のタンパク質において二量体形成時に界面に位置するアミノ酸の1つを負電荷を有するアミノ酸で置換すると、静電相互作用により互いに区別し、ヘテロ二量体のみ形成してホモ二量体を形成しないペアとすることができた。
さらに、二量体化形成効率の高いペアの一方と、解離速度の速いペアの一方を組み合わせることにより、二量体化形成効率が高く、且つ解離速度の速いペアを得ることができることを見出した。
一方、二量体形成時に界面に位置するアミノ酸を、静電相互作用するアミノ酸ではなく、システインに改変することによって、ホモ二量体の親和性が大幅に向上することを確認した。
そして、このように作製したVVD光スイッチのそれぞれに、相互作用するタンパク質を一つずつ融合させると、光の照射によってそれらのタンパク質の相互作用をONにしたりOFFにしたりすることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセットにおいて、
少なくとも一方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、タンパク質のセット；
〔２〕前記一方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも１つのアミノ酸が側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている、上記〔１〕に記載のタンパク質のセット；
〔３〕さらに、少なくとも一方のタンパク質において、補因子結合ドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、上記〔１〕又は〔２〕に記載のタンパク質のセット；
〔４〕前記一方のタンパク質と、他方のタンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する、上記〔１〕から〔３〕いずれか１項に記載のタンパク質のセット；
〔５〕前記一方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の二量体形成効率を変更するものであり、他方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の解離速度を変更するものである、上記〔４〕のいずれか１項に記載のタンパク質のセット；
〔６〕前記一方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の二量体形成効率を向上させるものであり、他方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つの解離速度を増大させるものである、上記〔４〕に記載のタンパク質のセット；
〔７〕光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセットにおいて、
前記２つのタンパク質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその変異体であり、
少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、タンパク質のセット；
〔８〕前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸及び／又は５５位に対応するアミノ酸が置換されている、上記〔７〕に記載のタンパク質のセット；
〔９〕前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔１０〕前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５５位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の５５位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されている、上記〔８〕又は〔９〕に記載のタンパク質のセット；
〔１１〕前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換されている、上記〔１０〕に記載のタンパク質のセット；
〔１２〕前記少なくとも一方のタンパク質において、さらに、フラビン結合ドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、上記〔７〕から〔１１〕のいずれか１項に記載のタンパク質のセット；
〔１３〕前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の７４位及び／又は８５位に対応するアミノ酸が置換されている、上記〔１２〕に記載のタンパク質のセット；
〔１４〕双方のタンパク質において、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている、上記〔１３〕に記載のタンパク質のセット；
〔１５〕前記少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の１３５位及び／又は１６５位に対応するアミノ酸が置換されている、上記〔１２〕から〔１４〕のいずれか１項に記載のタンパク質のセット；
〔１６〕双方のタンパク質において、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、上記〔１５〕に記載のタンパク質のセット；
〔１７〕一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔１８〕一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔１９〕一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔２０〕一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔２１〕一方のタンパク質において、配列番号：１の５２位及び５５位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の７４位及び８５位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、５５位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の１３５位及び１６５位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔２２〕両方のタンパク質において、配列番号：１の５２位に対応するアミノ酸がシステインで置換されている、上記〔８〕に記載のタンパク質のセット；
〔２３〕前記２つのタンパク質が、それぞれ別のタンパク質と結合又は融合しており、前記別のタンパク質は、相互作用するタンパク質である、上記〔１〕から〔２２〕に記載のタンパク質のセット；
〔２４〕上記〔１〕から〔２３〕に記載のタンパク質のセットの各タンパク質をコードする核酸：及び
〔２５〕相互作用する２つのタンパク質の距離を制御する方法であって、
上記〔１〕から〔２３〕のいずれか１項に記載のタンパク質のセットの一方のタンパク質を、前記相互作用する２つのタンパク質の一方と結合又は融合させる工程と、請求項１から２２のいずれか１項に記載のタンパク質のセットの他方のタンパク質を、前記相互作用する２つのタンパク質の他方と結合又は融合させる工程と、
前記タンパク質のセットに光を照射する工程と、を含む方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る光スイッチによれば、光の照射及び遮断という簡単な工程により、タンパク質の二量体化形成及びその解離を精確に制御することができる。したがって、光スイッチを構成するタンパク質のそれぞれに、互いに相互作用するタンパク質を結合又は融合させておくことにより、光の照射及び遮断によって、該タンパク質の相互作用のON/OFFを精確に切り替えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、VVDの二量体界面の改変を説明する。(a)VVDの構造と本研究において鍵となるアミノ酸残基。青色光照射はCys108とFADのイソアロキサジン環の間に光付加物を形成し、VVDの二量体化を誘導する。Ncapは、二量体の界面に位置する。光反応サイクルに関与する残基は青色で示す。(b)光スイッチとして用いる場合、VVD（オレンジの四角）は、青色光に反応して、タンパク質Aとタンパク質Bのペアだけでなく、A-A及びB-Bという望ましくないペアも誘導する。(c)本発明に係る、2つの異なる型のVVD変異体（青及び赤の四角）は、静電相互作用によりホモ二量体化の形成を防ぎ、ヘテロ二量体を選択的に誘導する。(d)VVDの二量体化を検出するバイオ発光アッセイシステムの概略を示す。あるVVDは、ホタルのスプリット・ルシフェラーゼのNflucで標識され、別のVVDは、Cflucで標識される。それぞれの融合タンパク質は、暗条件下では単量体として存在するのでバイオ発光活性は有しない。青色光を照射すると、素早くVVDが二量体化してNflucとCflucを近づけ、バイオ発光シグナルを誘導する。このアッセイシステムはVVDの二量体化と解離の可逆的検出を可能にする。(e)VVD二量体化の測定と評価の概略を示す。暗条件下及び青色光照射後のバイオ発光強度（BLI）は、それぞれBLIDark及びBLILightで表される。ΔBLIは、BLIDarkをBLILightから差し引いて求めた。RLUは相対光ユニット（relative light unit）を示す。
【図２】図２は、静電相互作用に基づくホモ二量体からヘテロ二量体の差別化を示す。(a)47位から56位のアミノ酸残基を、それぞれグルタミン酸で置換したVVD変異体のホモ二量体化。Nfluc-X及びX(Y)-Cfluc（X及びYはVVD変異体を表す）は、COS-7細胞で共発現させた。細胞は、青色光（470 ± 20 nm, 3 mW/cm2）で30秒照射し、生細胞のバイオ発光測定を行った。BLILight/BLIDark比は、それぞれ白いバーで示す。(b)各アルギニン（R）変異体とグルタミン酸（E）変異体のヘテロ二量体化。いずれも47、48、50、51、52、54又は55位のアミノ酸残基に一アミノ酸置換を有する。(c) 47、48、50、51、52、54又は55位のアミノ酸残基に一アミノ酸置換を有するVVD変異体のホモ二量体（黒丸）とヘテロ二量体（白丸）間のBLILight/BLIDark比の比較。(d,f)55(d)又は52(f)のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸で一アミノ酸置換したVVD変異体のホモ二量体化及びヘテロ二量体化。(e,g)図２ｄ、ｆに示されるBLILight/BLIDark比のヒートマップ。(h)52位と55位の2つのアミノ酸残基が電荷を有するアミノ酸で置換されたVVDのホモ二量体化。各VVD変異体のR、K、D及びEを使った2つのコードは、それぞれアルギニン、リシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸で52位及び55位のアミノ酸残基が置換されていることを示す（例えば、RKはVVD-52R/55Kを意味する）。55位のアミノ酸残基が置換されていないVVD-52RとVVD-52Dは、それぞれR_及びD_と表される。(i)52位と55位のアミノ酸残基を2つとも電荷を有するアミノ酸で置換したVVD変異体のヘテロ二量体化。(j)VVD-52R又はVVD-52Dと、VVD-52D又はVVD-52Rの55位のアミノ酸残基を電荷を有するアミノ酸で置換したVVD変異体のそれぞれとのヘテロ二量体化。(k)図２ｉ、ｊに示したBLILight/BLIDark比のヒートマップ。(l)VVD-52R/55Rと、VVD-52Dの55位のアミノ酸残基を非荷電アミノ酸で置換したVVD変異体のそれぞれとのヘテロ二量体化。(m)52位と55位のアミノ酸残基を2つとも非荷電アミノ酸で置換したVVD変異体のホモ二量体化。結果は、3つの独立した実験の平均±S.D.で示す。＊はVVD-52R及びVVD-52Dを示す。＊＊は、VVD-52R/55R及びVVD-52D/52Gを示し、それぞれをpMag、nMagと名付けた。
【図３】図３はマグネットのペアが二量体化効率を大幅に増大させ、解離速度を速めたことを示す。(a)pMag-85VとnMag-85V、pMag-74V/85VとnMag-74V/85V、pMagとnMag、及びpMag-135I/165IとnMag-135I/165Iの複合体の解離定数。Nfluc-pMagXとnMagX-Cfluc（Xは85V、74V/85V又は135I/165I変異体）を発現するCOS-7細胞に、time 0で30秒間、青色光を照射し複合体形成を誘導し、続いて解離を観察した。(b)マグネットの光反応サイクルの変化は、青色光照射時の二量体形成率に大きく影響した。図３ｂに示されるデータと図３ａに示されるデータは、図３ａではΔBLIを正規化し、図３ｂではしていないことを除いて基本的に同じである。(c)nMagHigh1は、二量体化形成率を大幅に増大させる。pMagX及びnMagX(Y)は、マグネット変異体を示す。Fast1、Fast2、n-dash(-)及びHigh1は、p(n)MagFast1、p(n)MagFast2、p(n)Mag及びp(n)MagHigh1をそれぞれ示す。pMag及びnMagと同様に、これらの変異体のホモ二量体の形成は静電斥力によって抑制された。結果は、3つの独立した測定の平均±S.D.で表す。(d) pMagFast1-nMagFast1複合体とpMagFast1-nMagHigh1複合体の解離速度。挿入図は相対ΔBLIを示す。(e) pMagFast2-nMagFast2複合体とpMagFast2-nMagHigh1複合体の解離速度。(f,g) pMagFast1-nMagHigh1(f)と、pMagFast2-nMagHigh1 (g)の可逆的な二量体化と解離特性。矢印は青色光の繰り返し照射のタイミングを示す。(a)、(b)、及び(d)〜(g)の結果は、3つの独立した測定の典型的な代表例を示す。
【図４】図４はマグネットを利用した光活性化可能なアクチュエータを示す。(a)マグネットを利用した光活性化可能なアクチュエータ（活性化ユニット及びPM-アンカーユニット）の概要を示す。活性化ユニットは、青色光を照射されると、細胞膜（PM）につながれたPMアンカーユニットに引き寄せられる。(b)活性化ユニットとPM-アンカーユニットのドメイン構造の概要を示す。(c)TagRFP-Tと、GPR1由来でPI(3,4,5)P3に特異的に結合するプレクストリン相同ドメインとで構成される蛍光PI(3,4,5)P3-バイオセンサを発現する細胞の蛍光イメージ。細胞は、PI3K活性化ユニットとPM-アンカーユニット（Magetを利用した光活性化可能なPI3K）も発現する。青色光（488nm）による細胞の全体的な照射は、PI(3,4,5)P3-バイオセンサの細胞質から細胞膜への移動を誘導した。イメージ中の白線は照射前後のTagRFP-Tの蛍光強度を示す。(d)マグネットを利用した光活性化可能なPI3Kを利用した、細胞を488nmで焦点照射した後の細胞膜の突出部の形成の空間的制御。青色光照射の前後における細胞の縁部分の概要。(e)PI3K阻害剤LY294002（50μM）による細胞の処理は、青色光依存性の膜突出形成を阻害する。自発的には葉状仮足が形成されない休眠している細胞の縁を、空間的時間的にさらに限定的に照射した。下のパネルは、細胞の微小領域（3.0μm）における488nmの焦点照射前後のDICイメージを表す。青色光の照射後に出現した小さな葉状仮足（幅3.7μm、長さ4.8μm）を点曲線で示す。右のパネルは、青色光を遮断してから6分後のDIC像を示す。(g)マグネットを利用した光活性化可能なPI3Kを発現する細胞に488nmの光を繰り返し、少しずつ移動させながら照射して、細胞の移動を誘導した。最初に照射した位置を白丸で表す。青色光照射前と、最初の照射から38分後の細胞の位置が右パネルに示される。矢印は、細胞の前縁の膜の突出と波立ちを示す。アローヘッドは、細胞の後ろ側の膜の陥凹を指す。(h-j)NIH3T3細胞に、Akt1活性化ユニット(h)、Rac1活性化ユニット(i)及びCdc42活性化ユニット(j)を個別に発現させた。これらの細胞のすべては、PM-アンカーユニットを共発現した。細胞は、縁の部分を488nmで焦点照射した。青色光の照射前後の細胞の縁の概略を右パネルのそれぞれ示す。矢印は、糸状仮足の形成を示す。結果(c)〜(j)は、3つの独立した測定の代表例を示す。スケールバーは10μm。
【図５】図５は、真菌の光受容体を改変して、2つの異なるペアで構成され、選択的にヘテロ二量体化する光スイッチを作り出した。かかる光スイッチは、二量体形成率を著しく増大させ、解離速度を速め、細胞内タンパク質の光による精密な空間的及び時間的制御を可能にした。
【図６】VVDの二量体界面の改変。(a) I52X変異体の二量体形成効率。(b)10mMのDTT非存在下（左パネル）又は存在下（右パネル）のVVD及びVVD-52Cの二量体形成効率。(c)VVD-85Vホモ二量体と、VVD-52C85Vホモ二量体の解離速度。(d) Nfluc-VVD-52C及びVVD-52C-Cflucのウェスタンブロッティング。エラーバーは、(a)は3つの独立した実験（n=9）、(b)及び(c)は2つの独立した実験（n=6）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定（両側検定）を行った。***P < 0.001（野生型に対して）。
【図７】VVD-52Cによる光依存性遺伝子発現の増強。(a)2つのトランス活性化因子、GAVP及びGAVP-52のコンストラクト。(b)GAVP-52Cに基づく遺伝子発現システムの概略図。(c)図７ｃで得られたルシフェラーゼ発現の誘導。エラーバーは、3つの独立した実験（n=9）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定（両側検定）を行った。*P < 0.05。**P < 0.01。
【図８】光活性化可能なカスパーゼ9。(a)VVD-52Cを有する光活性化可能なカスパーゼ9（paCasp9-52）の概略。(b)paCasp9-WTとpaCasp9-52Cの光依存性アポトーシス。iCasp9はAP20187誘導性アポトーシスに用いられた。細胞死は、ルシフェラーゼによる生細胞アッセイで評価した。(c)それぞれのカスパーゼ9プローブ及びmCherryを発現するHEK293細胞のアポトーシス。矢印は、アポトーシス小体を示す。スケールバー：20μm。エラーバーは、3つの独立した実験（n=9）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定（両側検定）を行った。***P < 0.001。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る「光依存的に二量体を形成する２つのタンパク質のセット（以下「光スイッチ」という。）は、光を照射することによって二量体を形成する天然のタンパク質のペアを、人工的に改変したものをいう。光スイッチは、光の照射によって二量体を形成する天然のタンパク質のペアである限り特に限定されず、例えば、下表のものを用いることができる。
【表１】
2015165776.tif 000002
【００１３】
本発明に係る光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、二量体形成時に界面に位置する少なくとも1つのアミノ酸が置換されている。本明細書において、二量体形成時の界面とは、光スイッチのそれぞれのタンパク質において二量体形成時に最も近接する部分、又は二量体形成のために相互作用する部分を意味し、例えば二量体の結晶解析などにより、当業者が適宜決定することができる。例えば、VVDであれば、Ncapと呼ばれるN末端αヘリックス（配列番号：１の47位〜56位）が二量体形成時の界面となる。Ncapは、光を照射すると露出した疎水性表面となり、もう一つのVVDのNcapと相互作用して二量体を形成する。
【００１４】
VVDの全長のアミノ酸配列は以下のとおりである。
MSHTVNSSTMNPWEVEAYQQYHYDPRTAPTANPLFFHTLYAPGGYDIMGYLIQIMNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETE（配列番号：１）
【００１５】
本発明に係る光スイッチにおいて、二量体形成時の界面のアミノ酸は、所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、1つ以上何個置換されていてもよい。置換されるアミノ酸の個数は、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個とすることができるがこれらに限定されない。また、二量体形成時の界面のアミノ酸は、所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、どのアミノ酸に置換されていてもよい。2個以上のアミノ酸が置換される場合、同一のアミノ酸でもよいし、異なるアミノ酸であってもよい。
【００１６】
本明細書において、アミノ酸は、「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、その誘導体や人工のアミノ酸を含む。本明細書においてアミノ酸としては、天然タンパク性L-アミノ酸；非天然アミノ酸；アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、主鎖の構造が天然型と異なる、α,α-二置換アミノ酸（α-メチルアラニンなど）、N-アルキル-α-アミノ酸、D-アミノ酸、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられるがこれに限定しない。
本明細書においてアミノ酸は、慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。一文字表記又は三文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれの変異体や誘導体を含む場合もある。
【００１７】
一態様において、本発明に係る光スイッチは、一方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも1つのアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、二量体形成時の界面に位置する少なくとも1つのアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている。かかる構成により、光スイッチのタンパク質ペアの親和性を高め、二量体形成効率を向上させることが可能である。
一方、このようにタンパク質のペアの一方が正電荷を有するアミノ酸を含み、他方が負電荷を有するアミノ酸を含む場合、正電荷を有するアミノ酸を含むタンパク質同士や、負電荷を有するアミノ酸を含むタンパク質同士の二量体化は、静電斥力により抑制される。したがって、光スイッチのペアのそれぞれに別のタンパク質（例えばタンパク質Aとタンパク質B）を融合又は結合させておくと、光照射により、必ずタンパク質Aを結合したタンパク質と、タンパク質Bを結合したタンパク質が二量体を形成し、タンパク質Aを結合したタンパク質同士や、タンパク質Bを結合したタンパク質同士などの望ましくない二量体が形成されるのを防ぐことができる。
【００１８】
側鎖に正電荷を有するアミノ酸は、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよいが、天然のアミノ酸の場合は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。側鎖に負電荷を有するアミノ酸も、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよいが、天然のアミノ酸の場合は、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。
【００１９】
アミノ酸の置換は、当業者が公知の方法によって行うことができ、例えば、置換後の配列をコードする核酸を合成し、通常の手法でこれを発現させればよい。
【００２０】
一態様において、本発明に係る光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、補因子結合ドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。補因子結合ドメインは、タンパク質の結晶解析などにより、当業者が適宜決定することができる。例えば、VVDの場合は、フラビン結合ドメインが補因子結合ドメインである。補因子結合ドメインのアミノ酸は、所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、1つ以上何個置換されていてもよい。置換されるアミノ酸の個数は、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個とすることができるがこれらに限定されない。また、補因子結合ドメインのアミノ酸は、所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、どのアミノ酸に置換されていてもよい。2個以上のアミノ酸が置換される場合、同一のアミノ酸でもよいし、異なるアミノ酸であってもよい。補因子結合ドメインのアミノ酸を置換することにより、光スイッチの解離速度を制御することができる。
【００２１】
一態様において、本発明に係る光スイッチにおいては、一方のタンパク質と、他方のタンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する。一方のタンパク質と他方のタンパク質は、アミノ酸を置換する前からアミノ酸配列が異なっていてもよく、アミノ酸を置換する前は同じアミノ酸配列であって、アミノ酸の置換によって異なる配列になってもよい。上述のとおり、一方のタンパク質と他方のタンパク質が異なるアミノ酸配列を有していれば、望ましくない二量体が形成されるのを抑制することができる。一方のタンパク質と他方のタンパク質が同じアミノ酸配列を有していれば、汎用性の高い光スイッチとして有用である。
【００２２】
一態様において、本発明に係る光スイッチにおいては、一方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の二量体形成効率を変更するものであり、他方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の解離速度を変更するものであってもよい。このようなペアによれば、二量体形成効率と、解離速度の両方を制御することができる。
【００２３】
一態様において、本発明に係る光スイッチにおいては、一方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つのタンパク質の二量体形成効率を向上させるものであり、他方のタンパク質のアミノ酸置換は、２つの解離速度を増大させるものであってもよい。このようなペアによれば、二量体形成効率が高く、解離速度が大きい、制御性に優れた光スイッチとすることができる。
【００２４】
一態様において、本発明に係る光スイッチにおいては、配列番号：１に記載のアミノ酸からなるタンパク質又はその変異体で構成されるペアの少なくとも一方において、少なくとも1つのアミノ酸が置換されている。
配列番号：１に記載のアミノ酸からなるタンパク質は、VVDであり、配列番号：１に記載のアミノ酸からなるタンパク質の変異体は、光依存的に二量体を形成するVVD変異体である。VVD変異体は、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％の配列同一性を有するタンパク質であってもよい。
この場合、光スイッチは、VVDとVVDのペアの少なくとも一方において、少なくとも1つのアミノ酸が置換されたものであってもよいし、VVD変異体とVVD変異体の少なくとも一方において、少なくとも1つのアミノ酸が置換されたものであってもよいし、VVDとVVD変異体の少なくとも一方において、少なくとも1つのアミノ酸が置換されたものであってもよい。
VVD変異体には、N末端を切断したVVD（配列番号：１の37位から186位で構成されるVVD）も含まれる。
以下、VVD又はその変異体で構成されるペアの少なくとも一方において、少なくとも1つのアミノ酸が置換されたものを、「VVD光スイッチ」という。
【００２５】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、N末端αヘリックスに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。N末端αヘリックスに位置するアミノ酸としては、配列番号：１の47位〜56位が挙げられ、特に47位、48位、50位、51位、52位、54位、及び55位が挙げられる。所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、置換されるアミノ酸の個数は特に限定されず、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個とすることができる。所望の二量体形成効率及び解離速度を実現できる限り、どのアミノ酸に置換されていてもよい。2個以上のアミノ酸が置換される場合、同一のアミノ酸でもよいし、異なるアミノ酸であってもよい。
【００２６】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸及び／又は55位に対応するアミノ酸が置換されている。52位に対応するアミノ酸は、一方のタンパク質において置換されていてもよいし、両方のタンパク質において置換されていてもよい。55位に対応するアミノ酸も、一方のタンパク質において置換されていてもよいし、両方のタンパク質において置換されていてもよい。また、一方のタンパク質において、52位と55位に対応するアミノ酸が両方置換されていてもよく、いずれかのみが置換されていてもよい。一方のタンパク質の52位と他方のタンパク質の52位が同じアミノ酸に置換されていてもよいし、異なるアミノ酸に置換されていてもよい。また、一方のタンパク質の55位と他方のタンパク質の55位が同じアミノ酸に置換されていてもよいし、異なるアミノ酸に置換されていてもよい。
【００２７】
本明細書において、「配列番号：１のX位に対応するアミノ酸」とは、VVD光スイッチを構成するタンパク質が、アミノ酸置換前に、配列番号：１と同一のアミノ酸配列を有する場合は、配列番号：１のX位のアミノ酸を意味する。また、VVD光スイッチを構成するタンパク質が、アミノ酸置換前に、配列番号：１とは異なるアミノ酸配列を有するVVD変異体である場合は、配列番号：１のX位に対応するアミノ酸を意味する。変異体において「配列番号：１のX位のアミノ酸」は、配列のアライメント等によって、当業者が適宜決定することができる。
【００２８】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換されている。本態様において、VVD光スイッチの各タンパク質は、52位以外のアミノ酸が置換されていてもよい。
【００２９】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の55位に対応するアミノ酸が、側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の55位に対応するアミノ酸が、側鎖に負電荷を有するアミノ酸又は中性アミノ酸で置換されている。
【００３０】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の52位及び55位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、55位に対応するアミノ酸がグリシンで置換されている。かかるペアは、一方のタンパク質同士による非特異的な結合が生じにくく、一方のタンパク質と他方のタンパク質との意図された結合が生じやすい。
【００３１】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、さらに、フラビン結合ドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。様々な光受容体のフラビン結合ドメインの研究から、フラビン補因子のイソアロキサジン環を囲むアミノ酸残基は、光反応サイクル、すなわち、青色光依存性のフラビンーシステイニル付加形成と、それに続く暗状態での解離の反応サイクルを司ることが示唆されている。フラビン結合ドメイン周辺のアミノ酸を置換すると、二量体の解離速度を制御することができる。
【００３２】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の74位及び／又は85位に対応するアミノ酸が置換されている。74位と85位は、いずれもフラビン結合ドメインである。74位に対応するアミノ酸は、VVD結合スイッチを構成するタンパク質ペアの一方のみで置換されていてもよいし、両方で置換されていてもよい。85位に対応するアミノ酸も、一方のタンパク質のみで置換されていてもよいし、両方のタンパク質で置換されていてもよい。また、一方のタンパク質において、74位と85位の一方のみ置換されていてもよいし、両方置換されていてもよい。一方のタンパク質の74位と他方のタンパク質の74位が同じアミノ酸に置換されていてもよいし、異なるアミノ酸に置換されていてもよい。また、一方のタンパク質の85位と他方のタンパク質の85位が同じアミノ酸に置換されていてもよいし、異なるアミノ酸に置換されていてもよい。
一態様において、74位及び／又は85位に対応するアミノ酸は、バリンで置換されている。
【００３３】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、双方のタンパク質において、配列番号：１の85位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている。
【００３４】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、双方のタンパク質において、配列番号：１の74位及び85位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている。
【００３５】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、少なくとも一方のタンパク質において、配列番号：１の135位及び／又は165位に対応するアミノ酸が置換されている。135位と165位はいずれもフラビン結合ドメインである。
【００３６】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、双方のタンパク質において、配列番号：１の135位及び165位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている。
【００３７】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、一方のタンパク質において、配列番号：１の52位及び55位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の85位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、55位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の85位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている。かかるVVD光スイッチは、解離速度が速い。
【００３８】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、一方のタンパク質において、配列番号：１の52位及び55位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の74位及び85位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、55位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の74位及び85位に対応するアミノ酸がバリンで置換されている。かかるVVD光スイッチは、著しく速い解離速度が得られる。
【００３９】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、一方のタンパク質において、配列番号：１の52位及び55位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の135位及び165位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、55位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の135位及び165位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている。かかるVVD光スイッチは、二量体形成効率が高い。
【００４０】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、一方のタンパク質において、配列番号：１の52位及び55位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の85位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、55位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の135位及び165位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている。かかるVVD光スイッチは、二量体効率が高く、解離速度が速い。
【００４１】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、一方のタンパク質において、配列番号：１の52位及び55位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、配列番号：１の74位及び85位に対応するアミノ酸がバリンで置換され、
他方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸で置換され、55位に対応するアミノ酸がグリシンで置換され、配列番号：１の135位及び165位に対応するアミノ酸がイソロイシンで置換されている。かかるVVD光スイッチは、二量体効率が高く、解離速度が速い。
【００４２】
一態様において、本発明に係るVVD光スイッチは、両方のタンパク質において、配列番号：１の52位に対応するアミノ酸がシステインで置換されている。かかるVVD光スイッチは、高い親和性でホモ二量体を形成する。
【００４３】
本発明に係る光スイッチは、それを構成する２つのタンパク質に、光を照射することにより二量体を形成する。したがって、それぞれに、互いに相互作用するタンパク質を結合又は融合させておけば、光を照射することにより、これらのタンパク質を近付けて相互作用を誘導することができ、光を消すことにより、これらのタンパク質を解離させて相互作用を停止することができる。光スイッチを構成するタンパク質と、互いに相互作用するタンパク質との結合又は融合は、当業者が公知の方法に従って行うことができる。
【００４４】
また、本発明は、相互作用する2つのタンパク質の距離を制御する方法であって、本発明に係る光スイッチの一方のタンパク質を、互いに相互作用する2つのタンパク質の一方と結合又は融合させる工程と、光スイッチの他方のタンパク質を、互いに相互作用する2つのタンパク質の他方と結合又は融合させる工程と、タンパク質のセットに光を照射する工程と、を含む。
【００４５】
相互作用する2つのタンパク質は特に限定されず、当業者が目的とするタンパク質を選択することができる。互いに相互作用する2つのタンパク質の一方と結合又は融合させる工程は、当業者が適宜行うことができる。相互作用するタンパク質と、光スイッチを構成するタンパク質は、リンカー等を介して結合又は融合していてもよく、直接結合又は融合していてもよい。
【００４６】
これまでに、二量体化に基づいて細胞内シグナル伝達を駆動できる多くの化学活性化可能なツール、例えばカスパーゼ・カスケード（Crouch, S. P., et al., (1993) J.
Immunol. Methods 160, 81-8.；Liebert, M. A., et al., (1999) Gene Ther. 10, 2273-2285.；MacCorkle, R. A., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3655-60.）、Fasシグナル伝達（MacCorkle, R. A., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3655-60.）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路（Cheng, J., et al., (2005) J.
Biol. Chem. 280, 13477-82.）及び受容体チロシン・キナーゼシグナル伝達（Muthuswamy, S. K., et al., (2001) Nat. Cell Biol. 3, 785-92.）が開発され、研究及び臨床のためのツールとして用いられてきた。本発明に係る光スイッチは、これらの手法にも用いることができる。
【００４７】
本発明は、本発明に係る光スイッチを構成するタンパク質をコードする核酸も提供する。本発明に係る核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。
【００４８】
本発明の核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたDNAをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
また、細胞から全mRNAを抽出し逆転写酵素によりcDNAを調製しても良い。この場合、プライマーとして、ベクターに挿入するために必要な制限酵素認識配列を含むものを使用することができる。得られたcDNA混合物に対し、目的のcDNAを増幅するプライマーを利用してPCR法を行うことにより、目的のcDNAのみが増幅される。このときもプライマーとして、制限酵素認識部位を含むものを用いれば、両端に制限酵素認識配列を有するcDNAを得ることができる。また、逆転写酵素によって得るcDNA混合物に代えて、既存のcDNAライブラリを用いてもよい。
本発明に係る光スイッチを構成する各タンパク質が、別のタンパク質と融合している場合、かかる融合タンパク質をコードする核酸も、本発明に係る核酸に包含される。
【００４９】
以下、本発明に係る核酸を用いて、光スイッチを製造する方法を概説する。まず、当該核酸を発現ベクターに挿入する。本発明の核酸はそのまま、又は制限酵素で消化し、又はリンカーを付加して、発現ベクターのプロモータの下流に挿入することができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（λファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
【００５０】
プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモータ、CMV（cytomegalovirus）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモータ、T7プロモータ、lacプロモータ等を用いることができる。
発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込むこともできる。
【００５１】
上記発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。
形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするポリペプチドが発現する。培地は、HEK293T細胞の場合、ウシ胎児血清等の血清を添加したDMEM培地を用いることができる。
【００５２】
形質転換体の培養物からのタンパク質の精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS−PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
【００５３】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
［実施例１］
１．方法
プラスミドの構築と突然変異の導入
VVD光スイッチのベースとして、全長VVD（1-186残基、21.3kDa）よりも安定であると報告されている、N末端が切断されたVVD（337-186残基、17.1kDa）を用いた。N末端切断型VVDをコードするcDNAは、哺乳動物細胞における発現を最適化するコドンと共にInvitrogen社（Carlsbad, CA, USA）に合成を委託した。ホタルルシフェラーゼのN末端断片（Nfluc：1-398残基）と、C末端断片（Cfluc：394-550残基）をコードするcDNAは、標準的なPCRアプローチで増幅した。VVDとスプリット・ルシフェラーゼ断片のキメラ融合構築物は、制限酵素の使用とライゲーション法を組み合わせた通常の方法で行った。Nfluc-VVD、VVD-Nfluc、Cfluc-VVD及びVVD-Cflucは、pcDNA3.1 V5/His-A（Invitrogen）のHind III及びXho I部位、又はHind III及びXba I部位にサブクローニングした。VVDへの変異の導入は、オーバーラップ伸長法（Ho, S. N., et al., Gene 77, 51-2659 (1989)）により、Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（MBL, Nagoya, Aichi, Japan）を用い、使用説明書に従って行った。
【００５６】
ヒトAkt1、マウスTiam1及びヒトインターセクチンをコードするcDNAは、Addgene (Cambridge, MA, USA)から入手した。ウシp85alpha-PI3kinase（iSH2: residues 421-623）からのinter SH2ドメイン（Suh, B. C., et al., Science 314, 1454-1457 (2006).）、プレクストリン相同（PH）ドメインを欠失したヒトAkt1（ΔPH-Akt1: residues 131-480）（Li, B., et al., Gene Ther. 9, 233-244 (2002).）、マウスTiam1からのグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）（Tiam: residues 1033-1406）（Inoue, T., et al., Nat. Methods 2, 415-418 (2005).）及びヒトインターセクチン（ITSN: residues 1229-1580）（Inoue, T., et al., Nat. Methods 2, 415-418 (2005).）からのGEFドメインの増幅は、通常のPCR法によって行った。
【００５７】
pMagFast1（VVD-52R/55R/85V）は、通常のPCR法、制限酵素の使用、ライゲーション法を用いて、フレキシブルなポリペプチドリンカーGGSGGSGGSG（配列番号：２）を介して、iSH2、ΔPH-Akt1、Tiam又はITSNに結合させた。iSH2-pMagFast1（PI3K活性化ユニット）、ΔPH-Akt1-pMagFast1（Akt1活性化ユニット）及びTiam-pMagFast1（Rac1活性化ユニット）をコードするcDNAは、それぞれ発現ベクターpcDNA3.1 V5/His-AのHindIII及びXbaI部位にサブクローニングした。ITSN-pMagFast1（Cdc42活性化ユニット）をコードするcDNAは、切断型SV40プロモータを備えた発現ベクターにサブクローニングし、低い発現を得た。
【００５８】
アンカーユニットを構築するために、ヒト化Kikume Green-Red（mKikGR）単量体をコードするcDNAをMBLより入手し、通常のPCR法で増幅した。mKikGRは、フレキシブルなペプチドリンカー（GGSGG（配列番号：３））を介して、N-RasのC末端由来のCAAXボックスモチーフ（QGCMGLPCVVM（配列番号：４））（Sato, M., et al., Nat. Cell Biol. 5, 1016-1022 (2003).；Sato, M., et al., Nat. Methods 3, 797-799 (2006).）でPCR法により標識した。nMagHigh1（VVD-52D/55G/135I/165I）のキメラ融合構築物と、mKikGR-CAAXは、通常の制限酵素法とライゲーション法で作製した。フレキシブルなペプチドリンカー（GGSGGSGG（配列番号：５））を、nMagHigh1と
mKikGR-CAAXの間に挿入した。nMagHigh1-mKikGR-CAAX（PMアンカーユニット）をコードするcDNAは、発現ベクターpcDNA3.1 V5/His-AのHindIII及びXhoI部位にサブクローニングした。TagRFPをコードする遺伝子は、Evrogen（Moscow, Russia）から入手し、通常のPCR法で増幅した。その光に安定な変異体TagRFP-S158T（TagRFP-T）（Shaner, N. C. et al. Nat. Methods 5, 545-551 (2008).）は、部位特異的突然変異法により作製した。
【００５９】
PI(3,4,5)P3バイオセンサを構築するために、ヒトGRP1由来のPHドメイン（261-386残基）を、通常のPCR法、制限酵素法、ライゲーション法により、フレキシブルなペプチドリンカー（GGSGGGGSGGGGSGG（配列番号：６））を介してTagRFP-Tに接続した。PI(3,4,5)P3バイオセンサ（PH-TagRFP-T）をコードするcDNAは、発現ベクターpcDNA3.1 V5/His-AのHindIII及びXhoI部位にサブクローニングした。すべてのクローニング酵素はTakara Biomedical（Tokyo, Japan）から入手し、使用説明書に従って用いた。すべてのPCR断片はABI310 genetic analyzer（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）でシーケンシングした。
【００６０】
細胞培養
COS-7及びHEK293細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM, Sigma Aldrich, St. Lois, MO）に10％FBS（GIBCO, Carlsbad, CA, USA）、100 unit/mlペニシリン、及び100 μg/mlストレプトマイシン（GIBCO）を加え、37℃、5％CO2で培養した。PK15細胞は、最小必須培地（MEM, Invitrogen）に10％FBS、100 unit/mlペニシリン、及び100 μg/mlストレプトマイシンを加え、37℃、5％CO2で培養した。
【００６１】
バイオ発光アッセイ
VVD変異体のスクリーニングのために、96ウェルのブラックウォールプレート（Thermo Fisher Scientific, Walthman, MA, USA）に、約2.0×104細胞/ウェルのCOS-7細胞を播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。細胞に、Nfluc-X及びX(Y)-Cfluc（X及びYはVVD変異体を表す）をコードするcDNAを1：1の割合で、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてそれぞれトランスフェクトした。DNAは全量で0.4μg/ウェルであった。トランスフェクトの24時間後、培地を、基質となるD-ルシフェリンを含む100μLのluciferase assay reagent (Promega, Madison, WI, USA)に交換した。luciferase assay reagentは、5mLのハンクス液（HBSS, Grand Island Biological Co., Grand Island, NY, USA）を、1バイアルの凍結乾燥ルシフェラーゼアッセイ基質（Promega）に加えることによって調製した。
【００６２】
細胞をluciferase assay reagentで処理してから室温で1時間反応させた後、バイオ発光をCentro XS3 LB 960 plate-reading luminometer（Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany）で測定した。バイオ発光シグナルは、室温で10秒間ごとに集計した。青色光照射は、LED光源（470 nm ± 20 nm）（CCS Inc., Kyoto, Japan）を使用して行った。青色光の照射時間と強度は、それぞれ30秒、3mW/cm2とした。
【００６３】
VVD変異体の解離速度解析のために、24ウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）に、COS-7細胞を約1.0×104細胞/ウェルで播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。次に、細胞に、Nfluc-X及びX(Y) -CflucをそれぞれコードするcDNAを1：1の割合で、Lipofectamin 2000を用いてトランスフェクトした。総DNA量は、0.8μg/ウェルとなった。トランスフェクトの24時間後、培地を、500μMのluciferase assay reagentと交換した。細胞をかき取って、Roehren polystyrene tubes（Sarstedt, Numbrecht, Germany）に回収した。
【００６４】
luciferase assay reagenet処理を1時間行った後、サンプルチューブをLumat LB 9507 single-tube luminometer（Berthold Technologies）に設置し、バイオ発光を測定した。バイオ発光シグナルは、室温で、1秒ごとに合計して測定し、1秒ごとにプロットした。青色光に細胞を曝露するときは、バイオ発光強度の測定を中断し、luminometerからサンプルチューブを取り出した。続いて、LED光源（470 ± 20 nm, 3 mW/cm2, 30 sec）でサンプルチューブに青色光を照射し、直ちにサンプルチューブをluminometerに戻してバイオ発光アッセイを再開した。青色光の遮断からバイオ発光アッセイの再開までの所要時間は1秒未満であった。解離曲線を、単一指数関数に当てはめて半減期を決定した。
【００６５】
生細胞イメージング
ガラス底のディッシュ（Iwaki Glass, Chi、ba, Japan）を25μg/mlのヒトフィブロネクチン（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）で、室温で1時間コーティングした後、Milli-Q waterで2度洗浄した。PI(3,4,5)P3イメージングを行うために、PK15細胞を約2.0×104細胞/ウェルでガラス底のディッシュに播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。細胞に、PI3K活性化ユニット、PMアンカーユニット及びPI(3,4,5)P3バイオセンサをコードするcDNAを、1：6：1の割合で、Lipofectamine 2000 reagentを用いて、トランスフェクトした。総DNA量は、0.8μg/ディッシュであった。トランスフェクトの24時間後、培地を、10％FBSを添加したMEM培地と交換した。細胞は、24〜30時間、28℃で維持された。
【００６６】
蛍光イメージングに先立って、細胞を、2％ウシ血清アルブミン（BSA, Wako, Osaka, Japan）を加えた25mMのHEPESを含むHBSSと、少なくとも3時間インキュベートした。生細胞イメージングは、LSM710共焦点レーザ走査顕微鏡（Carl Zeiss）のステージ上、28℃で、63倍の油浸対物レンズ（Carl Zeiss, Jena, Germany）により、加熱ステージアダプタ（Tokai Hit Co., Fujinomiya, Shizuoka, Japan）を用いて行った。
【００６７】
mKikGR及びTagRFP-Tの蛍光イメージは、Mutli-Argon laser（514nm）とHeNe laser（543nm）でそれぞれ得た。細胞全体の青色光照射は、Multi-line Argon laser（488nm）で出力密度2mWで行った。マグネットを利用した光活性化可能なアクチュエータを用いた細胞形態の制御のために、フィブロネクチンでコーティングしたガラス底のディッシュに、NIH3T3細胞を約0.8×104細胞／ディッシュで播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。細胞に、PI3K活性化ユニット及びPMアンカーユニットを1:3の比で、Lipofectamine 2000 reagentを用いて共トランスフェクションした。同様に、Akt1、Rac1及びCdc42活性化ユニットのそれぞれを、PMアンカーユニットと共トランスフェクトした。総DNA量は、0.8μg/ディッシュとした。
【００６８】
トランスフェクトの24時間後、細胞を、25mMグルコースと24mMのHEPESを含み、フェノールレッドを含まず、2％BSAを添加したDMEM培地で、細胞形態の制御実験の少なくとも3時間前にインキュベートした。生細胞イメージングは、LSM710共焦点レーザ走査顕微鏡（Carl Zeiss）のステージ上、37℃で、63倍の油浸対物レンズ（Carl Zeiss, Jena, Germany）により、加熱ステージアダプタ（Tokai Hit Co., Fujinomiya, Shizuoka, Japan）を用いて行った。細胞のDICイメージは、30秒ごとに、HeNe laser（633nm）を用いて、最小レーザ出力及び操作時間で、2.55μsec/pixeldで行った。細胞の縁部分の青色光照射は、Multi-line Argon laser（488nm）を用い、出力密度0.25mWで繰り返し行った。PI3KとAkt1の薬理学的阻害は、LY294002（Sigma Chemical Co., StLouis, MO, USA）及びAKT阻害剤IV（Calbiochem, San Diego, CA, USA）をそれぞれ用いて行った。
【００６９】
２．結果
＜静電相互作用に基づいて互いに差別される2つの異なるVVD変異体のペア＞
VVDは、糸状菌Neurospora crassaの青色光反応を制御する光受容体である（Zoltowski, B. D. et al. Science 316, 1054-1057 (2007).）（図１ａ）。ＶＶＤは、以下のような優れた性質を有する。まず、これまでに試された光活性化可能なアクチュエータの中で最も小さい光受容体の1つである。また、その補因子が、生物系に豊富に存在するフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）である。また、この光受容体は、青色光に反応して単量体からホモ二量体に可逆的に切り替わる（Zoltowski, B. D. et al. Science 316, 1054-1057 (2007).；Zoltowski, B. D. & Crane, B. R. Biochemistry 47, 7012-7019 (2008).；Vaidya, A. T., et al., Sci. Signal. 4, ra50 (2011).）。
【００７０】
このようにダイナミックに二量体化するVVDの性質は、この光受容体に、汎用的な光スイッチとしての優位性を与える。しかしながら、ホモ二量体化する光スイッチは、2つの異なるタンパク質（タンパク質Aとタンパク質B）を近付けるために用いられるとき、タンパク質A-タンパク質Bのペアのみならず、タンパク質A-タンパク質Aのペアやタンパク質B-タンパク質Bのペアも誘導してしまう（図１ｂ）。これは、目的とするタンパク質A-タンパク質Bペアの効率のよい誘導を妨害し、タンパク質A-タンパク質A及びタンパク質B-タンパク質Bペアからの深刻な副作用を引き起こす。そこで、タンパク質A-タンパク質Aやタンパク質B-タンパク質Bペアの形成を抑制し、目的とするタンパク質A-タンパク質Bペアを選択的に光で誘導するために、まずVVDの二量体の界面を改変した。
【００７１】
Ncapと呼ばれるN末端αヘリックス（Ile47からAsn56）は、VVDの二量体界面に位置し、中性アミノ酸で構成される。我々は2つの異なるVVD変異体を開発した。1つは、Ncapのアミノ酸を側鎖に正電荷を有するアミノ酸で置換したものであり、もう1つは同じNcapのアミノ酸を側鎖に負電荷を有するアミノ酸で置換したものである（図１ａ，ｃ）。VVDと異なり、2種類のVVD変異体は静電相互作用（引力と斥力）に基づいて互いに相手を区別することができた。静電引力は、VVD変異体を青色光依存的にヘテロ二量体化するのに有用であり、静電斥力は、ホモ二両体化を阻害した（図１ｃ）。このようにして、2種類のVVD変異体は、望ましくないタンパク質A-タンパク質A及びタンパク質B-タンパク質Bペアが誘導される可能性を防ぎ、それによって期待されたタンパク質A-タンパク質Bペアの光誘導を選択的に引き起こした（図１ｃ）。
【００７２】
＜VVDの二量体界面の改変＞
ホタルのスプリット・ルシフェラーゼの相補性に基づくバイオ発光アッセイシステムを開発し（Paulmurugan, R. & Gambhir, S. S. Anal. Chem. 79, 2346-2353 (2007).）、青色光依存的なVVDと変異体の二量体化を観察した（図１ｄ、ｅ）。このシステムを用いて、VVDのNcapにおける鍵となるアミノ酸残基、すなわち、その置換が期待どおりの静電discriminationを引き起すようなアミノ酸残基を探索した。まず、Ncapの47位から56位のアミノ酸残基をそれぞれ別にグルタミン酸で置換し、側鎖に負電荷を有するアミノ酸の静電斥力によってホモ二量体化できなくなる変異体を選択した。その結果、1アミノ酸残基の置換は、Asn56を除いて、青色光照射時のVVD変異体のホモ二量体化を大幅に減少させた（図２ａ）。
【００７３】
特に、Ile47、Met48、Tyr50、Leu51、Ile52、Ile54又はMet55のグルタミン酸による1アミノ酸置換は、暗条件下（BLIDark）のバイオ発光強度（bioluminescence intensity; BLI）に対する光照射時（BLILight）のバイオ発光強度（bioluminescence intensity; BLI）の比を効果的に低下させた。これらのBLI比（BLILight/BLIDark）は、非機能的変異体VVD-C71S15のBLI比と同等であった（図２ａ）。
【００７４】
次に、VVDの47、48、50、51、52、54及び55位のアミノ酸残基を、別々にアルギニンで置換した。そして、いずれも47、48、50、51、52、54又は55位に一アミノ酸置換を有するアルギニン（R）変異体とグルタミン酸（E）変異体をそれぞれ混合し、変異体のヘテロ二量体化を調べた（図２ｂ）。VVD変異体のうち、52R変異体と52E変異体、及び、55R変異体と55E変異体のペアは、青色光照射時のBLI比を大幅に増加させた（図２ｂ）。また、Ile52又はMet55の1アミノ酸置換は、他の置換に比較して、ヘテロ二量体とホモ二量体のBLILight/BLIDarkの比を差別化するのに有効であった（図２ｃ）。
【００７５】
ホモ二量体及びヘテロ二量体に対する、電荷を有するまたは有しないアミノ酸によるIle52又はMet55の置換の効果をさらに調べるために、我々は、E変異体及びR変異体に加えて、アスパラギン酸（D）変異体、及びリシン（K）変異体を作製した。Met55の場合、負電荷を有するアミノ酸による置換により、VVD変異体のホモ二量体化は抑制され、負電荷を有するアミノ酸で置換した変異体と正電荷を有するアミノ酸で置換した変異体の間のヘテロ二量体化は促進された（図２ｄ、ｅ）。しかしながら、Met55を正電荷を有するアミノ酸で置換しても、VVD変異体のホモ二量体化の形成は阻害されなかった（図２ｄ、ｅ）。これは、Ile52の置換の場合とは対照的であった。
【００７６】
Ile52の置換は、負電荷を有するアミノ酸で置換したVVD変異体のホモ二量体化だけでなく、正電荷で置換したアミノ酸の変異体のホモ二量体化も抑制した（図２ｆ、ｇ）。さらに、Ile52の置換は、負電荷で置換したVVD変異体と、正電荷で置換したVVD変異体のヘテロ二量体化を効果的に促進した（図２ｆ、ｇ）。Ile52を置換したVVD変異体のうち、R変異体（VVD-52R）とD変異体（VVD-52D）のペアは、他の変異体のペアよりもヘテロ二量体化の促進に効果的であった。上述のとおり、52位のアミノ酸残基は、静電相互作用に基づく光スイッチの開発のための主要な部位として重要な役割を果たす。しかしながら、55位のアミノ酸残基も、電荷を有するアミノ酸で置換するとVVD変異体のヘテロ二量体化を効果的に促進したことから、重要な部位と考えられる（図２ｄ）。そこで、VVD-52RとVVD-52DのMet55の突然変異生成を行い、VVD-52RのMet55と、VVD-52DのMet55を、電荷を有するアミノ酸で置換すると、VVD-52RとVVD-52Dのホモ二量体形成をさらに抑制することがわかった（図２ｈ）。
【００７７】
しかしながら、52位と55位のアミノ酸残基の両方を、電荷を有するアミノ酸で置換しても、ヘテロ二量体の形成には効果がなかった（図２ｉ、ｋ）。2ヶ所置換したVVD変異体を調べる中で、52位と55位の残基をいずれもアルギニンで置換したVVD-52R/55Rは、55位を置換していないVVD-52Dと、効率よくヘテロ二量体を形成することを見出した（図２ｊ、ｋ）。このことは、VVD-52R/55Rとの効率的なヘテロ二量体形成には、52D置換を有するVVD変異体における55位の残基としては、電荷を有するアミノ酸よりも電荷を有しないアミノ酸の方が有望であることを示唆した。
【００７８】
そこで、VVD-52DのMet55を、他の15の非荷電アミノ酸でそれぞれ置換し、VVD-52R/55Rとのヘテロ二量体化と、ホモ二量体化を調べた（図２ｌ、ｍ）。それらのVVD変異体の中で、グリシン変異体（VVD-52D/55G）が、VVD-52R/55Rとのヘテロ二量体化形成を最も効率よく促進した（図２ｌ）。このペアは、VVD-52RとVVD-52Dのペア（図２ｆ）に比較して、BLILight/BLIDark比も大きく改善された（図２ｌ）。さらに、VVD-52D/55Gは、他の変異体に比較して、ホモ二量体の形成も少なかった（図２ｍ）。VVDの52位と55位の2ヶ所の置換の結果、VVD-52R/55R及びVVD-52D/55Gのペアは、静電相互作用に基づいて互いに相手を識別する2つの異なるVVD変異体からなる最も有望なペアとなった。以降、VVD-52R/55R及びVVD-52D/55Gのペアを「マグネット」と呼んだ。特に、52位のアミノ酸残基を、正電荷を有するアルギニンで置換したVVD-52R/55Rをポジティブ・マグネット（pMag）とし、52位のアミノ酸残基を、負電荷を有するアスパラギン酸で置換したVVD-52D/55Gをネガティブ・マグネット（nMag）とした。
【００７９】
＜解離及び二量体化効率を増大させた人工光スイッチ＞
pMagとnMagは、青色光を照射すると素早くヘテロ二量体を形成する（図３ａ）。しかしながら、青色光を遮断した後、複合体が解離するまでは数時間を要する（T1/2＝2.2h）（図３ａ）。pMag-nMag複合体のゆっくりした解離速度は、VVDのホモ二量体の解離速度に似ている（T1/2＝2.5h）。もし、さらに変異を導入して、pMag-nMag複合体の解離を速くすることができれば、細胞内タンパク質を空間的にも時間的にもより精緻に制御できる有力なツールになる。
【００８０】
様々な光受容体のフラビン結合ドメインに関する過去の研究によれば、フラビン補因子のイソアロキサジン環を取り囲むアミノ酸残基が光反応サイクル（青色光異存的なフラビン-システイニル付加物形成と、それに続く暗条件下の解離の反応サイクル）を司ることが示唆されている（Zoltowski, B. D., et al., Biochemistry 50, 8771-8779 (2011).；Conrad, K. S., et al., Biochemistry 52, 378-391 (2013).）。VVDの場合、いくつかのアミノ酸残基が、光反応サイクルの速度を制御する鍵となる残基として同定されている（Zoltowski, B. D., et al., Nat. Chem. Biol. 5, 827-834 (2009).）。特に、VVDのフラビン結合ドメインにあるIle74及び／又はIle85の置換と、Met135及び／又はMet165の置換は、光反応サイクルを著しく短縮することが報告されている。
【００８１】
そこで、pMagとnMagに、光反応サイクルに関与する置換を導入し、変異体の複合体の解離速度を調べた。pMag及びnMagのIle85をバリンで置換したところ、pMag-85VとnMag-85Vとの複合体は、pMag-nMag複合体より25倍速い、半減期5.3分の速度で解離した（図３ａ）。Ile74とIle85の双方をバリンで置換したpMag-74V/85VとnMag-74V/85Vとの複合体は、解離速度がさらに大幅に短縮され（T1/2=24秒）、pMag-nMag複合体より330倍速くなった（図３ａ）。この結果は、VVDの光サイクルを短縮する変異が、pMagとnMagの複合体の解離速度を速めることを示した。pMag-85VをpMagFast1、nMag-85VをnMagFast1とそれぞれ名づけた。同様に、Mag-74V/85VとnMag-74V/85Vは、それぞれpMagFast2、nMagFast2と名づけた。さらに、Met135及びMet165の双方をイソロイシンで置換し、VVDの光反応サイクルを延長する変異を導入したpMag-135I/165IとnMag-135I/165Iとの複合体は、解離速度が遅くなることも示した（T1/2 = 5.4時間）（図３ａ）。
【００８２】
バイオ発光アッセイによれば、pMagとnMagの複合体の解離速度だけではなく、青色光照射の際に二量体化がどのくらい生じるのかも知ることができる。我々は、光反応サイクルが長く、解離速度が遅いpMag-135I/165IとnMag-135I/165Iを二量体化すると、バイオ発光シグナルが、pMagとnMagの複合体に比較して1500％増加することを見出した（図３ｂ、ｃ）。このことは、pMagとnMagに導入された135I/165I置換が、青色光依存的な二量体形成を著しく増大させたことを示す。そこで、pMag-135I/165IをpMagHigh1と名づけ、nMag-135I/165IをnMagHigh1と名づけた。また、これら2つとは対照的に、短い光反応サイクルと速い解離速度を有するpMagFast1とnMagFast1の二量体化、及びpMagFast2とnMagFast2の二量体化によるバイオ発光シグナルは、pMagとnMagの二量体化によるバイオシグナルより45％及び36％低いことを確認した（図３ｂ、ｃ）。この結果は、pMagとnMagの光サイクルの変化が、変異体の二量体化の程度に大きく影響すること、特に、早い解離速度と二量体化効率には負の相関関係があることを示す。
【００８３】
しかしながら、有用な光スイッチの開発のためには、そのようなトレードオフの効果は望ましくない。このような制約を解消するために、解離速度が異なるpMag変異体とnMag変異体による青色光依存的なヘテロ二量体化を調べた（図３ｃ）。その結果、解離速度の速いpMagFast1と、解離速度の遅いnMagHigh1のペアの二量体化効率は、pMagFast1とnMagFast1の二量体化より、二量体化効率は1400％上昇した（図３ｃ）。pMagFast2とnMagHigh1の二量体化効率は、pMagFast2とnMagFast2より960％高いことが確認された（図３ｃ）。これらの結果は、nMagHigh1とのペアは、pMag変異体の不十分な二量体化効率を向上させつつ、速い解離速度を維持できることを示唆する。
【００８４】
さらによいことに、nMagHigh1は、解離速度が速いpMag変異体とヘテロ二量体を形成しても解離速度を低下させなかった（図３ｄ、ｅ）。pMagFast1-nMagHigh1複合体は、pMagFast1-nMagFast1複合体（T1/2 = 5.3 min）と同等の半減期11分の速さで解離した（図３ｄ）。pMagFast2-nMagHigh1複合体は、pMagFast2-nMagFast2複合体（T1/2 = 24 sec）に相当する半減期44秒で解離した（図３ｅ）。特に、pMagFast2-nMagHigh1複合体の解離速度は、天然の光受容体に基づく従来の青色光による光スイッチよりも、著しく速かった。例えば、CRY2-CIB1は、青色光を遮断した後、解離するのに数十分かかる（Kennedy, M. J. et al. Nat. Methods 7, 973-975 (2010).）。別の光スイッチであるFKF1-GIは、少なくとも1.5時間は解離しない（Yazawa, M., et al., Nat. Biotechnol. 27, 941-945(2009).）。
さらに、nMagHigh1とpMag変異体のペアでは、pMag変異体の可逆的に二量体化する性質も損なわれなかった（図３ｆ、ｇ）。それぞれ異なる解離速度を有する変異体のヘテロ二量体化に基づくこのアプローチは、解離速度と二量体形成効率がトレードオフの関係になるという問題を解消し、解離速度が速く、二量体形成効率も高い光スイッチを実現した。
【００８５】
＜マグネットによる空間的、時間的に精密な細胞タンパク質の制御＞
次に、今回の光スイッチによって、細胞タンパク質とそれに関連する細胞の機能を、光によって制御できることを示した。一例として、我々は、pMagFast1を、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）のp85調節サブユニット由来のinter SH2（iSH2）ドメインに結合させた（図４ａ，ｂ）。細胞内で発現させると、pMagFast1とiSH2ドメインの融合タンパク質（以下「PI3K活性化ユニット」という。）は、脂質メッセンジャーであるホスファチジルイノシトール3,4,5-トリホスフェート（PI(3,4,5)P3）産生を行う内因性PI3Kのp110触媒サブユニットと自発的に結合した。別の光スイッチnMagHigh1は、N-Ras由来のCAAXボックスモチーフ（Sato, M., et al., Nat. Cell Biol. 5, 1016-1022 (2003).；Sato, M., et al., Nat. Methods 3, 797-799 (2006).）に連結することによって細胞膜につなぎ（図４ａ，ｂ）、これをPMアンカーユニットと名づけた。
【００８６】
細胞に青色光を照射すると、PI3K活性化ユニットは、pMagFast1とnMagHigh1のヘテロ二量体化によって、細胞膜に引き寄せられ（図４ａ）、それにより細胞膜中のPI(3,4,5)P3産生を迅速に誘導した（図４ｃ）。マグネットを用いたPI3K活性化ユニットとPMアンカーユニットは、こうしてPI(3,4,5)P3を産生する光活性化可能なアクチュエータとして、すなわち光活性化可能なPI3Kとして機能した。PI(3,4,5)P3は、細胞が移動する際の細胞前縁の形態変化を調節する重要な役割を果たす。光活性化可能なPI3Kを発現する細胞に対して光照射すると、葉状仮足として知られる突出を急速に誘導し、細胞膜における光が照射された部分を波立たせた（図４ｄ）。このような形態変化は、PI3K阻害剤であるLY294002で細胞を前処理することにより阻害できた（図４ｅ）ことから、葉状仮足の形成と細胞膜の波立ちは、光活性化可能なPI3Kを介した光照射依存的なPI(3,4,5)P3の産生の直接の結果であることが確認された。
【００８７】
次に、細胞膜のうち、自発的には葉状仮足が現れない休眠部分に限定的に光を照射した（図４ｆ）。光が照射された細胞膜上の小領域に、小さな葉状仮足が急速に出現した。このことは、細胞膜の休眠部分においてさえも、光活性化可能なPI3Kが、急速且つ可逆的に十分な量のPI(3,4,5)P3を産生させ、葉状仮足の形成を誘導したことを示す。
【００８８】
次に、照射する領域を少しずつ動かしながら、細胞に繰り返し光を照射した（図４ｇ）。細胞膜のうち光を照射した部分に、天然の細胞が移動する際の前縁と同様に、葉状仮足と波立ちが継続的に誘導された。続いて、細胞は光に誘導される方向に移動した。細胞において、光が照射されたのと反対側では、天然の細胞が移動する際の後側と同様に、膜の陥凹が見られた。マグネットを利用した光活性化可能なPI3Kは、こうして細胞極性を誘導し、光の方向に細胞を移動させた。
【００８９】
続いて、PI3Kに加えて、移動する細胞における細胞膜の形態変化を調節するタンパク質キナーゼ（Akt1）及び2つの小さなGTPアーゼ（Rac1及びCdc42）に対する、マグネットを利用した光活性化可能なアクチュエータを開発した。Akt1活性化ユニットを構築するために、PI3K活性化ユニットのiSH2ドメインを、細胞刺激に応答して細胞膜への移動を引き起こすプレクストリン相同ドメインを欠失したAkt1変異体（ΔPH-Akt1）に代えた（図４ｄ）。青色光に反応して、マグネットを利用した光活性化可能なAkt1は、細胞膜の光が照射された部分に、著しい形態変化を誘導し、葉状仮足と膜の波立ちを引き起こした（図４ｈ）。この形態変化は、Akt1の阻害剤で細胞を前処理することにより阻害されたことから、マグネットによってAkt1が活性化されたことが示された。
【００９０】
小さなGTPアーゼの場合は、pMagFast1を、Tiam1とインターセクチンに由来するグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）ドメインにつなぎ、それぞれRac1活性化ユニットとCdc42活性化ユニットとして構築した（図４ｂ）。マグネットを利用した光活性化可能なRac1は、細胞膜の光照射した部分に葉状仮足の形成を誘導した（図４ｉ）。また、マグネットを利用した光活性化可能なCdc42は、葉状仮足とは異なる糸状仮足と呼ばれる細胞膜の形態変化を誘導した（図４ｊ）。これらは、Rac1とCdc42は、移動する細胞の細胞膜において異なる形態変化の調節に関与するという過去の報告と合致した。これらの結果は、本発明に係る光スイッチが、様々な細胞タンパク質とそれに関与する細胞の機能を、光によって空間的にも時間的にも制御できる強力なツールとなることが示された。
【００９１】
［実施例２］
１．方法
プラスミドの構築
全長VVD（1-186残基、21.3kDa）よりも安定であると報告されている、N末端切断VVD（337-186残基、17.1kDa）を用いた。N末端切断VVDをコードするcDNAは、哺乳動物細胞における発現を最適化するコドンと共にInvitrogen社（Carlsbad, CA, USA）に合成を委託した。すべての部位特異的変異の実験は、Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（MBL, Nagoya, Aichi, Japan）を用い、使用説明書に従って行った。
ホタルルシフェラーゼのN末端断片（Nfluc：1-398残基）と、C末端断片（Cfluc：394-550残基）をコードするcDNAは、標準的なPCRアプローチで増幅した。Nfluc-VVD-52X及びVVD-52X-Cflucをコードするキメラ融合コンストラクトは、pcDNA3.1 V5/His-A（Invitrogen）のHind III及びXho I部位と、Hind III及びXba I部位にそれぞれ挿入した。
カスパーゼ9触媒ドメイン（133-416残基）及びp65活性化ドメイン（286-550残基は、Addgene plasmid 11829と21966から、標準的なPCRアプローチでそれぞれ増幅した。VVD（37-186）とカスパーゼ9（133-416）をコードする配列からなる光活性化可能なカスパーゼ9コンストラクトは、pcDNA3.1 V5/His-AのHind IIIとXba I部位に挿入した。
Gal4（1-65）、VVD（37-186）及びp65（286-550）をコードする配列からなるGAVPコンストラクトは、pcDNA3.1 V5/His-AのHind III及びXba I部位にサブクローニングした。
LightOnシステムのレポータープラスミドは、pGL4.31ベクターのホタルルシフェラーゼ配列を、タンパク質分解配列を含むホタルルシフェラーゼ配列に、Hind III及びXba I部位を用いて置き換えることによって構築した。
【００９２】
細胞培養
COS-7及びHEK293細胞は、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM, Sigma Aldrich, St. Lois, MO）に10％FBS（GIBCO, Carlsbad, CA, USA）、100 unit/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシン（GIBCO）を加え、37℃、5％CO2で培養した。
【００９３】
バイオ発光アッセイ
VVD-52X変異体のスプリット・ルシフェラーゼ・アッセイのために、96ウェルのブラックウォールプレート（Thermo Fisher Scientific, Walthman, MA, USA）に、約2.0×104細胞/ウェルのCOS-7細胞を播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。細胞をLipofectamine 2000（Invitrogen）でトランスフェクトした。Nfluc-VVD-52X及びVVD-52X-CflucをコードするcDNAを、1：1の割合でトランスフェクトした。DNAは全量で0.4μg/ウェルであった。
トランスフェクトの24時間後、培地を、基質となる500μMのD-ルシフェリンカリウム塩（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）を含む、100μlのフェノールレッドを含まないDMEM（Sigma Aldrich）に交換した。室温で1時間インキュベートした後、バイオ発光の測定をCentro XS3 LB 960 plate-reading luminometer（Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany）で測定した。
青色光照射は、LED光源（470 nm ± 20 nm）（CCS Inc., Kyoto, Japan）を使用して行った。青色光の照射時間と強度は、それぞれ30秒、3mW/cm2とした。VVD-85VとVVD-52C85Vの還元環境でのスプリット・ルシフェラーゼ・アッセイと、解離速度解析のために、24ウェルプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）に、COS-7細胞を約1.0×105細胞/ウェルで播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。
次に、細胞をLipofectamin 2000でトランスフェクトした。Nfluc-VVD-85V（又はNfluc-VVD-52C85V）及びVVD-85V-Cfluc（又はVVD-52C85V-Cfluc）をそれぞれコードするcDNAは、1：1の割合でトランスフェクトした。総DNA量は、0.8μg/ウェルとなった。
トランスフェクトの24時間後、培地を、基質として500μMのD-ルシフェリンカリウム塩を含む、500μlのハンクス液（HBSS, GIBCO）と交換した。細胞をかき取って、Roehren polystyrene tubes（Sarstedt, Numbrecht, Germany）に回収した。28℃で1時間インキュベートした後、サンプルチューブをLumat LB 9507 single-tube luminometer（Berthold Technologies）に設置し、バイオ発光を測定した。バイオ発光シグナルは、28℃で、1秒ごとに測定した。
還元環境での発光アッセイを行う場合は、発光測定の前に、10mMのジチオトレイトール（DTT）をサンプルチューブに加えて30分インキュベートした。青色光に細胞を曝露するときは、バイオ発光強度の測定を中断し、luminometerからサンプルチューブを取り出した。続いて、LED光源（470 ± 20 nm, 3 mW/cm2, 30 sec）でサンプルチューブに青色光を照射し、直ちにサンプルチューブをluminometerに戻してバイオ発光アッセイを再開した。青色光の遮断からバイオ発光アッセイの再開までの所要時間は1秒未満であった。
レポーター遺伝子アッセイと生細胞アッセイのために、96ウェルのブラックウォールプレートに、HEK293細胞を約1.0×104細胞/ウェルで播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。細胞は、X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagen（Roche）により、使用説明書に従ってトランスフェクトした。光活性化可能なプローブとレポータータンパク質をコードするcDNAは、3：1の割合でトランスフェクトした。総DNA量は、0.05μg/wellとなった。トランスフェクトの24時間後、培地を、基質として500μMのD-ルシフェリンを含む、100μlのフェノールレッドを含まないDMEMで交換した。37℃、5％CO2で24時間培養した後、継続した青色光照射、又は暗所で、Centro XS3 LB 960 plate-reading luminometerを用いてバイオ発光を測定した。青色光照射は、LED光源（470 nm ± 20 nm）で行った。青色光の強度は、1.5 W/m2とした。
【００９４】
ウェスタンブロッティング
細胞のライセートは、標準的な手法により、SDS-PAGEゲル上で電気泳動により分離した。次に、タンパク質をニトロセルロースメンブレン上に移し、βアクチン（Santa Cruz Biotechnology）をコントロールとして、抗V5抗体（Invitrogen）で検出した。
【００９５】
生細胞イメージング
HEK293細胞を、ポリ-L-リシンでコーティングされたガラス底のディッシュ（Iwaki Glass, Chiba, Japan）に播種し、37℃、5％CO2で24時間培養した。細胞に、paCasp9-WTと、paCasp9-52C又はiCasp9と、mCherryとをコードするcDNAを、X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagentを用いて使用説明書に従ってトランスフェクトした。トランスフェクトの24時間後、青色光を継続的に照射して、又は暗所にて、24時間インキュベートした。青色光照射は、LED光源（470 ± 20 nm, 1.5 W/m2）を用いた。
生細胞イメージングは、室温で、水銀光源とevolve 512 EMCCDカメラ（Photometrics）を備えたEclipse Ti倒立顕微鏡（Nikon）のステージ上で、40倍の油浸対物レンズを用いて行った。mCherrの蛍光を可視化するために、TxRedフィルターキューブを用いた。
【００９６】
２．結果
VVDの二量体形成効率を増強するために、N末端αヘリックス内のIle52に対して部位特異的飽和突然変異誘発を行った。これらのVVDのI52X変異体の二量体形成効率を、分割したルシフェラーゼ断片（スプリット・ルシフェラーゼ）の相補性を利用したバイオ発光アッセイで評価した（Paulmurugan, R., and Gambhir, (2007) Anal. Chem. 79, 2346-53.）。このアッセイを行うために、一連のVVD変異体と、ホタル・スプリット・ルシフェラーゼのN又はC末端フラグメントとの融合タンパク質のコンストラクトを作製した（Nfluc-VVD52X及びVVD52X-Cfluc）。次に、一連のコンストラクトのペアをCOS-7細胞にトランスフェクトし、スプリット・ルシフェラーゼの再会合によるバイオ発光を測定した（図６ａ）。
【００９７】
Ile52を、電荷を有する側鎖を持つアミノ酸に置換した変異体（I52R、I52K、I52E及びI52D）は、ホモ二量体をまったく形成しなかった。これは静電反発力によるものと考えられる。対照的に、疎水性の側鎖を有するI52V、I52F、I52A、I52M、I52L及びI52W変異体は、野生型と同程度にホモ二量体を形成した。調べたI52X変異体の中で、I52C変異体（VVD-52C）のみ、二量体化活性が、野生型に比較して180％と大幅に増大した。
【００９８】
二量体化活性の増大に対するジスルフィド結合の関与を調べるために、10mMのジチオトレイトール（DTT）を用いた強い還元環境で、バイオ発光アッセイを行った結果、DTT処理はVVD-52Cの二量体化活性の増大を増加させないことがわかった（図６ｂ）。また、二量体の解離速度に対するI52C変異体の効果を調べた。VVDの二量体は、長い光反応サイクル（時定数τ＝18,000秒）のために解離するまでの期間が長いので、I85V置換を有する光反応サイクルが速いVVD変異体（VVD-85V）と、I85VとI52Cの双方の置換を有する変異体（VVD-52C85V）の解離速度を、バイオ発光アッセイで比較した（図６ｃ）。
【００９９】
VVD-85VとVVD52C85Vのホモ二量体化を青色光照射で誘導し、光を消した後の解離を観察した。VVD-52C85Vは、VVD-85Vよりも高い二量体化活性を示したが、VVD-85VとVVD-52C85Vの解離速度には有意差はなかった（図６ｃ）。また、ウェスタンブロッティングを行ったが、VVDとVVD-52Cの発現レベルに優位差はなかった（図６ｄ）。これらの結果は、I52C変異は確かにVVD-52Cの結合親和性を増大させるが、ホモ二量体化の増強は必ずしもCys52残基間における安定なジスルフィド結合の形成によるものではないということを支持する。
【０１００】
次に、VVD-52Cを、最近報告されたLightOnシステムと呼ばれる光依存性遺伝子発現システムに適用した（Wang, X. et al (2012) Nat. Methods 9, 266-9.）。LightOnシステムは、転写因子の振動制御に画期的な実験をもたらした（Imayoshi, I., et al., Science Epub Oct 31, 2013. DOI: 10.1126/science.1242366.）。このシステムは、GAVPと呼ばれる、遺伝的にコードされた光切替可能なトランス活性化因子に基づくもので、GAVPは、Gal4 DNA結合ドメイン、VVD、及びp65トランス活性化ドメインという3つの機能的ドメインで構成されている（図７ａ）。GAVPトランス活性化因子は、青色光照射により、Gal（UAS）の活性化配列の上流に結合し、標的遺伝子の転写を開始させる（図７ｂ）。
【０１０１】
そこで、GAVPと、VVD-52Cを有するトランス活性化因子（GAVP-52C）との光依存性レポーター遺伝子発現を比較した（GAVP-52C）（図７ｃ）。これらのトランス活性化因子は、光依存的にレポーター遺伝子を発現させた。GAVP-52Cは、GAVPと比較して、9.1倍高いルシフェラーゼの光誘導性発現を示した。
【０１０２】
さらなる特徴づけのために、VVD-52C、GAVP及びGAVP-52Cを、SV40よりプロモータ活性が弱い、最小エンハンサーなしのSV40（ΔSV40）プロモータと共に発現させた。その結果、pΔSV40-GAVPは、ほとんど光依存性のレポーター発現を示さなかった。これはGAVPの発現レベルが低すぎて、トランス活性化因子のホモ二量体化を効率的に誘導することができなかったからであると考えられる。対照的に、pΔSV40-GAVP-52Cは、その極めて低い発現レベルにも関わらず、依然として著しい光依存性レポーター発現を示した（図７ｃ、７ｄ）。これらの結果は、高親和性のVVD-52C変異体を有するGAVP-52Cは、野生型VVDを有するGAVPと比較して、より強いレポーター遺伝子の発現を誘導できることを示唆する。
【０１０３】
VVD-52Cのもう１つの有用性を示すために、我々は、化学的誘導性のツールを、VVD-52Cを用いて光依存性のツールに転換することを試みた。化学的誘導性ツールの一例として、我々は誘導性カスパーゼ9（iCasp9）に注目した。iCasp9は、FKBP変異体（FKBP36V）と、アポトーシスを引き起こすカスパーゼ9の触媒ドメインとのキメラタンパク質である（Straathof, K. C., et al., (2005) Blood 105, 4247-54.; Di Stasi, A., et al, (2011) N. Engl. J. Med. 365, 1673-83.）。
低分子化合物AP20187は、FKBP36Vのホモ二量体化を誘導し、カスパーゼ9の触媒ドメインを二量体化する。これによりカスパーゼ9活性が増大する。そこで、iCasp9のFKBP36VをVVD-52Cで置換し、光活性化可能なカスパーゼ9を開発した（図８ａ）。また、VVD-52Cとカスパーゼ9の触媒ドメインとの融合タンパク質を作製した（paCasp9-52C）。さらに、VVD-52Cの代わりに野生型VVDを有するpaCasp9-WTも作製した。
【０１０４】
ホタルルシフェラーゼをアデノシン三リン酸（ATP）バイオ発光バイオンセンサとして利用し（21）、paCasp9-WT、paCasp9-52C及びiCasp9を個別に発現するHEK293細胞の生細胞アッセイを行った（図８ｂ）。その結果、光活性化したpaCasp-52C及びAP20187に誘導されたiCasp9の活性化が、ルシフェラーゼ活性をそれぞれ52％及び93％減少させることを確認した。対照的にpaCasp9-WTを発現するHEK293細胞は、青色光を照射してもバイオ発光の有意な減少は示さなかった。蛍光顕微鏡像により、paCasp9-WTを発現するHEK293細胞は、青色光を照射してもアポトーシス形態を示さないことを確認した（図８ｃ）。対照的に、paCasp-52Cを発現する細胞は、AP20187で処理したiCasp9を発現する細胞と同様に、青色光の照射により断片化してアポトーシス小体となった（図８ｃ）（22）。
【０１０５】
paCasp9-52Cは、こうして光によるアポトーシスの制御を可能にした。これらの結果は、VVD-52Cが、野生型VVDを異なり、化学誘導性のツールを光活性化可能なツールに変換できることを示す。
【０１０６】
以上のとおり、VVDの二量体形成効率を、二量体の界面にI52C変異を導入することによって向上させることに成功した。改変した光受容体の能力を示すために、VVDに基づく既存の遺伝子発現システムをVVD-52Cに応用した。LightOnシステムとして知られるこのシステムでは、VVD-52Cを有する光依存性トランス活性化因子が、野生型VVDを有するトランス活性化因子より強く遺伝子発現を誘導した。
さらに、その発現レベルが極めて低いときでも、VVD-52Cを有するオプトジェネティクスのツールは、シグナル伝達を強く駆動した。VVD-52Cのこのような能力は、VVD-52Cを結合させることにより光活性化されるキメラタンパク質が細胞毒性を有するときに有用となるであろう。VVD-52Cの能力はまた、VVD-52Cに基づくオプトジェネティクスのツールを発現する安定細胞株又は遺伝子組換え生物を作製するためにも有用であると考えられる。これらのアプローチでは、外来遺伝子の発現が低いことがよくあるからである。
【０１０７】
光活性化可能なカスパーゼ9の開発に例示されるように、VVD-52Cが、既存の化学誘導性ホモ二量体化ツールを光依存性ツールに変換する能力を有することが示された。対照的に、化学活性化可能なiCasp9におけるFKBP36Vを野生型VVDで置換すると、二量体化形成効率が低いために誘導能が完全に失われた。
我々はまた、VVDのN末端ヘリックスにおける二量体化増強変異（I52C）は、補因子結合ドメイン内のI85V変異と共存でき、ホモ二量体の解離速度を大幅に速くすることを見出した。VVD-52C85V変異体は、増大した二量体化形成効率と、速い解離速度を有し、細胞のシグナルプロセスのスイッチをより劇的にONにし、野生型VVDよりも迅速にOFFにする能力を有している。VVD-85Vのように速くなる変異体に加え、解離速度が遅くなる、補因子結合ドメイン内の他の光反応サイクル変異も研究された（17）。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号：１は、VVDタンパク質のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２〜６は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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