(57)【要約】【課題】ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルと比べて、ＳＡＰポリペプチドの生物学的活性を増加させること。【解決手段】  Ｎ結合型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化ヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）ポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ結合型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化ヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）ポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該ポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ結合型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖において、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰと比べてα２，６結合シアル酸部分が少なくとも５０％少ない該ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖の全側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該ポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖がα２，６結合シアル酸部分を実質的に有さない該ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖がバイ・アンテナリー構造を有する該ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖がトリ・アンテナリー構造を有する該ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖がテトラ・アンテナリー構造を有する該ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖がペンタ・アンテナリー構造を有する該ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖が、５糖コアであるＭａｎ［（α１，６−）−（Ｍａｎ（α１，３）］−Ｍａｎ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，Ｎ）−Ａｓｎを含む該ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖が、構造ＮｅｕＮＡｃ２α３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６を有する少なくとも１つの側鎖を含む該ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖が、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない該ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖の全側鎖がガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない該ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖が１以上のマンノース残基を含む該ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖が少なくとも１つのフコース残基を含む該ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記オリゴ糖鎖が、少なくとも１つの改変グリコシル残基を含む該ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記少なくとも１つの改変グリコシル残基が、水−可溶性ポリマー、及び水−不溶性ポリマー、治療用成分、診断用薬剤並びに生体分子から選択される１以上の改変基と結合している該ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記ＳＡＰポリペプチドが組み換え型ポリペプチドである該ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む該ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む該ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＳＡＰドメイン及び１以上の非相同ドメインを含む融合蛋白質である該ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記１以上の非相同ドメインが、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化若しくは分散、蛋白質複合体の形成、及び／又は純度のうち１以上を強化する該ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記ポリペプチドが１以上の改変アミノ酸残基を含む該ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記１以上の改変アミノ酸残基が、ＰＥＧ化アミノ酸、プレニル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、及び／又は有機誘導体化剤と結合したアミノ酸を含む該ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記１以上の改変アミノ酸残基が、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化若しくは分散、蛋白質複合体の形成、及び／又は純度のうち１以上を強化する該ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドであって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記ＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のヒトＳＡＰポリペプチド及び医薬的に許容可能なキャリアを含み、哺乳類での使用に適した医薬製剤。
【請求項２７】
請求項２６に記載の医薬製剤であって、更に追加有効成分を含む該医薬製剤。
【請求項２８】
請求項２６に記載の医薬製剤であって、前記医薬製剤が持続放出性配合物として製造される該医薬製剤。
【請求項２９】
請求項２６に記載の医薬製剤であって、前記医薬製剤が、注入、静脈注射、吸入、継続的デポ注射、又はポンプにより局所的に患者に投与するのに適している該医薬製剤。
【請求項３０】
患者における線維又は線維増殖の異常又は症状を治療又は予防するための方法であって、該治療や予防を必要とする患者に請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＳＡＰポリペプチドを治療上有効量で投与することを含む該方法。
【請求項３１】
患者における過敏性の異常又は症状を治療又は予防するための方法であって、該治療や予防を必要とする患者に請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＳＡＰポリペプチドを治療上有効量で投与することを含む該方法。
【請求項３２】
患者における粘膜炎を治療又は予防するための方法であって、該治療や予防を必要とする患者に請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＳＡＰポリペプチドを治療上有効量で投与することを含む該方法。
【請求項３３】
患者における自己免疫の異常又は症状を治療又は予防するための方法であって、該治療や予防を必要とする患者に請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＳＡＰポリペプチドを治療上有効量で投与することを含む該方法。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドを、注入、静脈注射、吸入、継続的デポ注射、若しくはポンプ又はこれらの組合せにより局所的に投与する該方法。
【請求項３５】
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、追加有効成分を前記患者に投与することを更に含む該方法。
【請求項３６】
グリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを製造するための方法であって、以下のステップを含む該方法：
ｉ）請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記ＳＡＰポリペプチドを細胞内で発現させるステップ；及び
ｉｉ）前記細胞から前記ＳＡＰポリペプチドを単離するステップ。
【請求項３７】
ヒトＳＡＰポリペプチドを製造するための方法であって、以下のステップを含む該方法：
ｉ）ヒトＳＡＰポリペプチドをＣＨＯ細胞内で発現させるステップ；及び
ｉｉ）前記細胞から前記ヒトＳＡＰポリペプチドを単離するステップ。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドがＮ結合型オリゴ糖鎖を含み、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドがＮ結合型オリゴ糖鎖を含み、前記オリゴ糖鎖において、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰと比べてα２，６結合シアル酸部分が少なくとも５０％少ない該方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドがＮ結合型オリゴ糖鎖を含み、前記オリゴ糖鎖の全側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該方法。
【請求項４１】
請求項３７に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドがＮ結合型オリゴ糖鎖を含み、前記オリゴ糖鎖がα２，６結合シアル酸部分を実質的に有さない該方法。
【請求項４２】
請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖がバイ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項４３】
請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖がトリ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項４４】
請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖がテトラ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項４５】
請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記単離されたヒトＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該方法。
【請求項４６】
請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖が、５糖コアであるＭａｎ［（α１，６−）−（Ｍａｎ（α１，３）］−Ｍａｎ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，Ｎ）−Ａｓｎを含む該方法。
【請求項４７】
請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖が、構造ＮｅｕＮＡｃ２α４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６を有する少なくとも１つの側鎖を含む該方法。
【請求項４８】
請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖が、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない該方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の全側鎖がガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない該方法。
【請求項５０】
請求項３８〜４９のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖が１以上のマンノース残基を含む該方法。
【請求項５１】
請求項３８〜５０のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖が少なくとも１つのフコース残基を含む該方法。
【請求項５２】
請求項３８〜５１のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖が、少なくとも１つの改変グリコシル残基を含む該方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの改変グリコシル残基が、水−可溶性ポリマー、及び水−不溶性ポリマー、治療用成分、診断用薬剤並びに生体分子から選択される１以上の改変基と結合している該方法。
【請求項５４】
請求項３６に記載の方法であって、前記細胞がＣＨＯ細胞である該方法。
【請求項５５】
請求項３５又は３６に記載の方法であって、前記単離されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更して、改変オリゴ糖鎖を有するＳＡＰポリペプチドを生成することを更に含む該方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記単離されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ及びフォスファターゼから選択される１以上の酵素蛋白質を用いて前記単離されたＳＡＰポリペプチドを処理することを含む該方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の方法であって、前記単離されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、１種以上の糖前駆体の存在下で行われる該方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記１種以上の糖前駆体がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＰＤ−ガラクトース及びＧＤＰ−フコースから選択される該方法。
【請求項５９】
請求項５５に記載の方法であって、前記単離されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、前記オリゴ糖鎖から１以上の末端α２，６結合シアル酸部分を除去することを含む該方法。
【請求項６０】
請求項５５に記載の方法であって、前記単離されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、前記オリゴ糖鎖上の１以上の末端α２，６結合シアル酸部分を１以上のα２，３結合シアル酸部分に置換することを含む該方法。
【請求項６１】
請求項３６〜６０のいずれか１項に記載の方法であって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記単離されたＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該方法。
【請求項６２】
ＳＡＰポリペプチドを製造するための方法であって、以下のステップを含む該方法：
ｉ）グリコシル化ＳＡＰポリペプチドを提供するステップであって、前記グリコシル化ＳＡＰポリペプチドはＮ結合型オリゴ糖鎖を含むステップ;及び
ｉｉ）前記ＳＡＰポリペプチドのＮ結合型オリゴ糖鎖を酵素的又は化学的に変更して、改変グリコシル化ＳＡＰポリペプチドを生成するステップ。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドのＮ結合型オリゴ糖鎖を酵素的又は化学的に変更する方法が、前記オリゴ糖鎖から１以上の末端α２，６結合シアル酸部分を除去することを含む該方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドのＮ結合型オリゴ糖鎖を酵素的又は化学的に変更する方法が、前記オリゴ糖鎖上の１以上の末端α２，６結合シアル酸部分を１以上のα２，３結合シアル酸部分に置換することを含む該方法。
【請求項６５】
請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドのＮ結合型オリゴ糖鎖を酵素的又は化学的に変更する方法が、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ及びフォスファターゼから選択される１以上の酵素蛋白質を用いて前記ＳＡＰポリペプチドを処理することを含む該方法。
【請求項６６】
請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドのＮ結合型オリゴ糖鎖を酵素的又は化学的に変更する方法が、１種以上の糖前駆体の存在下で行われる該方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法であって、前記１種以上の糖前駆体がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＰＤ−ガラクトース及びＧＤＰ−フコースから選択される該方法。
【請求項６８】
請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖において、ヒト血清から単離した野生型ヒトＳＡＰ蛋白質と比べてα２，６結合シアル酸部分が少なくとも５０％少ない該方法。
【請求項６９】
請求項６２〜６７のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖がα２，６結合シアル酸部分を実質的に有さない該方法。
【請求項７０】
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がバイ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項７１】
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がトリ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項７２】
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がテトラ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項７３】
請求項６２〜６９のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がペンタ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項７４】
請求項６２〜７３のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該方法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の全側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該方法。
【請求項７６】
請求項６２〜７５のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖が少なくとも１つの改変グリコシル残基を有する該方法。
【請求項７７】
請求項７６に記載の方法であって、前記少なくとも１つの改変グリコシル残基が、水−可溶性ポリマー、及び水−不溶性ポリマー、治療用成分、診断用薬剤並びに生体分子から選択される１以上の改変基と結合している該方法。
【請求項７８】
請求項６２〜７７のいずれか１項に記載のヒトＳＡＰポリペプチドであって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記改変グリコシル化ＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該ポリペプチド。
【請求項７９】
ＳＡＰポリペプチドを製造するための方法であって、以下のステップを含む該方法：
ｉ）ＳＡＰポリペプチドを提供するステップ；及び
ｉｉ）前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更して、Ｎ結合型オリゴ糖を含むグリコシル化ＳＡＰポリペプチドを生成するステップ。
【請求項８０】
請求項７９に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ及びフォスファターゼから選択される１以上の酵素蛋白質を用いて前記ＳＡＰポリペプチドを処理することを含む該方法。
【請求項８１】
請求項７９又は８０に記載の方法であって、前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、１種以上の糖前駆体の存在下で行われる該方法。
【請求項８２】
請求項８１に記載の方法であって、前記１種以上の糖前駆体がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＰＤ−ガラクトース及びＧＤＰ−フコースから選択される該方法。
【請求項８３】
請求項７９〜８２のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖において、ヒト血清から単離した野生型ヒトＳＡＰ蛋白質と比べてα２，６結合シアル酸部分が少なくとも５０％少ない該方法。
【請求項８４】
請求項７９〜８２のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖がα２，６結合シアル酸部分を実質的に有さない該方法。
【請求項８５】
請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がバイ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項８６】
請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がトリ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項８７】
請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がテトラ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項８８】
請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖がペンタ・アンテナリー構造を有する該方法。
【請求項８９】
請求項７９〜８８のいずれか１項に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該方法。
【請求項９０】
請求項８９に記載の方法であって、前記オリゴ糖鎖の全側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該方法。
【請求項９１】
請求項７９〜９０のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖が少なくとも１つの改変グリコシル残基を有する該方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの改変グリコシル残基が、水−可溶性ポリマー、及び水−不溶性ポリマー、治療用成分、診断用薬剤並びに生体分子から選択される１以上の改変基と結合している該方法。
【請求項９３】
請求項７９〜９２のいずれか１項に記載の前記ヒトＳＡＰポリペプチドであって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記グリコシル化ＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該ポリペプチド。
【請求項９４】
以下のステップを含む方法によって製造されるヒトＳＡＰポリペプチド：
ｉ）ＳＡＰポリペプチドをＣＨＯ細胞内で発現させるステップ；及び
ｉｉ）前記細胞から前記ＳＡＰポリペプチドを単離するステップ。
【請求項９５】
請求項９４に記載のヒトＳＡＰポリペプチドであって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記ＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該ポリペプチド。
【請求項９６】
請求項９４又は９５に記載のヒトＳＡＰポリペプチドであって、前記方法が、前記単離されたＳＡＰポリペプチドのグリコシル化構造を変更することを更に含む該ポリペプチド。
【請求項９７】
Ｎ結合型オリゴ糖鎖を有するヒトＳＡＰポリペプチドを含むＣＨＯ細胞であって、前記オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分である該細胞。
【請求項９８】
外因性ＳＡＰポリペプチドをエンコードする核酸を含むＣＨＯ細胞。
【請求項９９】
ヒトＳＡＰポリペプチドであって、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するための前記ヒトＳＡＰポリペプチドのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない該ポリペプチド。
【請求項１００】
患者における炎症性の異常又は症状を治療又は予防するための方法であって、該治療や予防を必要とする患者に請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＳＡＰポリペプチドを治療上有効量で投与することを含む該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、米国仮特許出願６１／２１７，９３１（出願日２００９年６月４日）の利益を主張するものである。前記関連出願で教示した内容については、全て本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）は、ペントラキシンファミリー蛋白質のメンバーである。ＳＡＰは肝臓によって分泌され、安定ペンタマーとして血液中を循環する。これまでの研究によると、ＳＡＰは、免疫反応の開始及び収束（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）の両段階において重要な役割を果たすことが示されている。ＳＡＰは細菌の表面にある糖残基に結合し、それによって抗原提示細胞によるオプソニン化及び取り込みを促進することができる。また、ＳＡＰは、免疫反応の収束時のアポトーシス細胞で発生した遊離ＤＮＡ及びクロマチンにも結合し、従ってこれらの抗原に対する二次炎症性反応を防ぐ。全三つの典型的なＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するというＳＡＰの能力によって、ＳＡＰが結合した分子は細胞外領域から除去される。該受容体は、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に対して特に親和性を有する。受容体に結合した後、ＳＡＰ及び任意の結合複合体は、一般的に細胞によって取り込まれ、そして処理される。
【０００３】
近年、様々な病気を治療するための治療用薬剤としてＳＡＰを用いることが提案されて来ており、該病気としては、線維症関連の病気、過敏症、自己免疫疾患、粘膜炎及び微生物感染等による炎症性疾患が含まれる。例えば、米国特許出願１１／７０７，３３３、１２／２１７，６１７、１２／７２０，８４５及び１２／７２０，８４７を参照されたい。ヒトの病気を治療するための蛋白質治療薬は、ヘルスケア産業に革命をもたらしてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第１１／７０７，３３３号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１２／２１７，６１７号明細書
【特許文献３】米国特許出願第１２／７２０，８４５号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１２／７２０，８４７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、治療用薬剤として有用であるための必要な効能及び／又は充分な量を有する蛋白質治療剤を生成することについては多くの困難が存在する。可能性を有する多くの治療用薬剤は、天然由来の蛋白質と比べて、その生物学的活性（例えば、プラズマ半減期）を増強するべく改変される。通常、組換え発現技術は、充分な量のポリペプチドを生成するために実施される。残念ながら、多くの組換えシステムは、天然由来の形態とは異なった生物学的特性を有するポリペプチドを生成し、そのことにより薬物速度論、安全性、及び治療用製品の効果に影響を及ぼす可能性がある。
【０００６】
従って、ヒトの治療に適したＳＡＰポリペプチドの開発及び製造方法に関するニーズが依然として残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の概要
一側面において、本開示内容は、変異体血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）ポリペプチド及びそれらを製造するための方法を提供するものである。本発明は、糖残基の付加、削除、又は改変（修飾）をインビトロ及びインビボで行って、所望のグリコシル化パターンを有する変異体ＳＡＰポリペプチドを生成するための方法及び組成物を含む。
【０００８】
ある態様において、本開示内容は、グリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを提供するものであり、該ポリペプチドは、少なくとも１つの側鎖の末端がα２，３結合シアル酸部分を有するＮ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を含む。
【０００９】
ある態様において、本開示内容は、グリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを提供するものであり、該ポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を含み、該オリゴ糖鎖において、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰと比べてα２，６結合シアル酸部分が少なくとも５０％少ない。
【００１０】
ある態様において、本開示内容は、グリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを製造する方法を提供するものであり、該方法は、以下のステップを含む：ｉ）ＳＡＰポリペプチドを細胞内で発現させるステップ；及びｉｉ）前記細胞から前記ＳＡＰポリペプチドを単離するステップ。好ましい実施形態において、前記細胞はＣＨＯ細胞である。ある態様において、前記細胞は、ＣＨＯ−Ｓ細胞である。
【００１１】
ある態様において、本開示内容は、ヒトＳＡＰポリペプチドを製造する方法を提供するものであり、該方法は、以下のステップを含む：ｉ）ヒトＳＡＰポリペプチドをＣＨＯ細胞内で発現させるステップ；及びｉｉ）前記細胞から前記ヒトＳＡＰポリペプチドを単離するステップ。
【００１２】
ある態様において、本開示内容は、ヒトＳＡＰポリペプチドを製造する方法を提供するものであり、該方法は、以下のステップを含む：ｉ）Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を有するグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを提供するステップ；及びｉｉ）前記ＳＡＰポリペプチドのＮ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を酵素的又は化学的に変更して、改変グリコシル化ＳＡＰポリペプチドを生成するステップ。
【００１３】
ある態様において、本開示内容は、ヒトＳＡＰポリペプチドを製造する方法を提供するものであり、該方法は、以下のステップを含む：ｉ）ヒトＳＡＰポリペプチドを提供するステップ；及びｉｉ）前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更して、Ｎ結合型オリゴ糖又はＯ結合型オリゴ糖を有するグリコシル化ＳＡＰポリペプチドを生成するステップ。
【００１４】
ある態様において、本開示内容は、以下のステップを含む方法によって製造されるヒトＳＡＰポリペプチドを提供するものである：ｉ）ＳＡＰポリペプチドをＣＨＯ細胞内で発現させるステップ；及びｉｉ）前記細胞から前記ＳＡＰポリペプチドを単離するステップ。
【００１５】
ある態様において、本開示内容はＣＨＯ細胞を提供するものであり、該細胞は、Ｎ結合型オリゴ糖鎖を有するヒトＳＡＰポリペプチドを含み、該オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端はα２，３結合シアル酸部分である。
【００１６】
ある態様において、本開示内容はＣＨＯ細胞を提供するものであり、該細胞は、ヒトＳＡＰポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含有する。
【００１７】
ある態様において、本開示内容は、ヒトＳＡＰポリペプチドを提供するものであり、該ポリペプチドは、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するためのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分、３分の１、４分の１、１０分の１、又は１００分の１よりも少ない。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明のヒトＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖を有する。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖の末端は、α２，３結合シアル酸部分である。幾つかの実施形態において、 前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰと比べて、α２，６結合シアル酸部分が少なくとも５０％少ない。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖の全側鎖の末端は、α２，３結合シアル酸部分である。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、α２，６結合シアル酸部分を実質的に有さない。本発明のグリコバリアント（糖変異体）ＳＡＰポリペプチドは、１以上の側鎖を含むことができる。例えば、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、その特徴として、バイ・アンテナリー構造（二分岐構造）、トリ・アンテナリー構造（三分岐構造）、テトラ・アンテナリー構造（四分岐構造）、又はペンタ・アンテナリー構造（五分岐構造）を有することができる。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、５糖コアであるＭａｎ［（α１，６−）−（Ｍａｎ（α１，３）］−Ｍａｎ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，Ｎ）−Ａｓｎを有することができる。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、構造ＮｅｕＮＡｃ２α３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６を有する少なくとも１つの側鎖を含む。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖は、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖の全側鎖は、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖の少なくとも１つの側鎖は、１以上のマンノース残基を含む。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖は、少なくとも１つのフコース残基を含む。本発明における任意のグリコバリアントＳＡＰポリペプチドは、少なくとも１つの改変グリコシル残基を含むことができる。改変グリコシル残基は、水-可溶性ポリマー、及び水-不溶性ポリマー、治療用成分、診断用薬剤並びに生体分子から選択される１以上の改変基と結合することができる。
【００１９】
ある態様において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、組み換え型ポリペプチドであってもよい。本発明のＳＡＰポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、３、又は４と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。前記ＳＡＰポリペプチドは、ヒトＳＡＰ蛋白質であることが好ましい。本発明のヒトＳＡＰポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
【００２０】
ある態様において、本発明のヒトＳＡＰポリペプチドは、ＳＡＰドメイン及び１以上の非相同ドメインを含む融合蛋白質である。前記非相同ドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化若しくは分散（分布）、蛋白質複合体の形成、及び／又は純度のうち１以上を強化することができる。
【００２１】
ある態様において、本発明のヒトＳＡＰポリペプチドは１以上の改変アミノ酸残基を含み、例えば、ＰＥＧ化アミノ酸、グリコシル化（例えば、Ｏ結合型グリコシル化）アミノ酸、プレニル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチニル化アミノ酸、及び／又は有機誘導体化剤と結合したアミノ酸が挙げられる。前記改変アミノ酸残基は、インビボ安定性、インビボ半減期、取り込み／投与、組織局在化若しくは分散、蛋白質複合体の形成、及び／又は純度のうち１以上を強化することができる。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明のヒトＳＡＰポリペプチドは、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルと比べて、生物学的活性が増強されている。ある態様において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するためのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分、３分の１、４分の１、１０分の１、又は１００分の１よりも少ない。
【００２３】
ある態様において、本発明における任意のヒトＳＡＰポリペプチドを製造する方法は、更なるステップを含み、該ステップは、前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更し、前記ＳＡＰポリペプチドにＮ結合型オリゴ糖鎖若しくはＯ結合型オリゴ糖鎖を結合させ、又は前記ＳＡＰポリペプチドの既存のＮ結合型オリゴ糖鎖若しくはＯ結合型オリゴ糖鎖を改変するステップである。幾つかの実施形態において、前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更するステップが、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ及びフォスファターゼから選択される１以上の酵素蛋白質を用いて前記ＳＡＰポリペプチドを処理することを含む。幾つかの実施形態において、前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法が、１種以上の糖前駆体の存在下で行われる。適切な糖前駆体としては、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＣＭＰ−Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−ガラクトース及びＧＤＰ−フコースが含まれるがこれらに限定されない。幾つかの実施形態において、前記ＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法は、前記Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖から１以上の末端α２，６結合シアル酸部分を除去することを含む。幾つかの実施形態において、前記単離されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に変更する方法は、前記オリゴ糖鎖上の１以上の末端α２，６結合シアル酸部分を１以上のα２，３結合シアル酸部分に置換することを含む。
【００２４】
更に、本開示内容は、哺乳類での使用に適した本発明のヒトＳＡＰポリペプチド医薬製剤を提供するものである。本発明の医薬製剤は、本明細書で開示した少なくとも１種のＳＡＰポリペプチド及び医薬的に許容可能なキャリアを含む。幾つかの実施形態において、前記医薬製剤は、更に追加有効成分を含む。幾つかの実施形態において、前記医薬製剤は、持続放出性配合物として製造される。幾つかの実施形態において、本開示の医薬製剤は、注入、静脈注射、吸入、継続的デポ注射（continuous depot）、又はポンプにより局所的に患者に投与するのに適している。
【００２５】
更に、本開示内容は、ＳＡＰ応答性の異常又は症状を治療又は予防するための方法を提供するものであり、該方法は、前記治療や予防を必要とする患者に１種以上の本発明のＳＡＰポリペプチドを治療上有効量で投与することによる。ＳＡＰ応答性の異常又は症状としては、線維性（fibrotic）又は線維増殖性（fibroproliferative）の異常又は症状、過敏性（hypersensitivity）の異常又は症状、自己免疫の異常又は症状、炎症性の異常又は症状、及び粘膜炎が含まれるがこれらに限定されない。本発明のＳＡＰポリペプチドは、注入、静脈注射、吸入、継続的デポ注射、若しくはポンプ又はこれらの組合せにより局所的に患者に投与することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、１種以上の追加有効成分と共に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】線維芽細胞分化アッセイ。単球をＳＡＰポリペプチドとともにインキュベーションした後、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して、ＭＤＣの産生を測定した。Ｙ軸は、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離された組み換え型ヒトＳＡＰ（ｒｈＳＡＰ）と比べた、ヒト血清由来ＳＡＰ（ｈＳＡＰ）平均効能(すなわち、７つの独立した実験の平均）を表す。ｈＳＡＰの相対活性は１．０に設定されている。
【図２Ａ】変異体ＳＡＰポリペプチドのグリカン構造分析。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ａ）、及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｂ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離したグリコ改変組み換え型ヒトＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｃ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｄ）を使用して、グリコ（糖）改変ｈＳＡＰ（ヒト血清由来ＳＡＰ）上でのシアル酸結合を測定した。 液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｅ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｆ）を使用して、ｒｈＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した（ここで、該ｒｈＳＡＰは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼで処理し、ＳＡＰグリカン上での２，３結合シアル酸末端の数を増加させた）。ＬＣＭＳ図に関して、Ｘ軸は質量（ダルトン）を表し、及びＹ軸は相対強度を表す。ＨＰＬＣトレースに関して、Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は吸光度単位（ｍＡＵ）を表す。
【図２Ｂ】変異体ＳＡＰポリペプチドのグリカン構造分析。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ａ）、及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｂ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離したグリコ改変組み換え型ヒトＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｃ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｄ）を使用して、グリコ（糖）改変ｈＳＡＰ（ヒト血清由来ＳＡＰ）上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｅ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｆ）を使用して、ｒｈＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した（ここで、該ｒｈＳＡＰは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼで処理し、ＳＡＰグリカン上での２，３結合シアル酸末端の数を増加させた）。ＬＣＭＳ図に関して、Ｘ軸は質量（ダルトン）を表し、及びＹ軸は相対強度を表す。ＨＰＬＣトレースに関して、Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は吸光度単位（ｍＡＵ）を表す。
【図２Ｃ】変異体ＳＡＰポリペプチドのグリカン構造分析。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ａ）、及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｂ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離したグリコ改変組み換え型ヒトＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｃ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｄ）を使用して、グリコ（糖）改変ｈＳＡＰ（ヒト血清由来ＳＡＰ）上でのシアル酸結合を測定した。 液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｅ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｆ）を使用して、ｒｈＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した（ここで、該ｒｈＳＡＰは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼで処理し、ＳＡＰグリカン上での２，３結合シアル酸末端の数を増加させた）。ＬＣＭＳ図に関して、Ｘ軸は質量（ダルトン）を表し、及びＹ軸は相対強度を表す。ＨＰＬＣトレースに関して、Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は吸光度単位（ｍＡＵ）を表す。
【図２Ｄ】変異体ＳＡＰポリペプチドのグリカン構造分析。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ａ）、及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｂ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離したグリコ改変組み換え型ヒトＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｃ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｄ）を使用して、グリコ（糖）改変ｈＳＡＰ（ヒト血清由来ＳＡＰ）上でのシアル酸結合を測定した。 液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｅ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｆ）を使用して、ｒｈＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した（ここで、該ｒｈＳＡＰは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼで処理し、ＳＡＰグリカン上での２，３結合シアル酸末端の数を増加させた）。ＬＣＭＳ図に関して、Ｘ軸は質量（ダルトン）を表し、及びＹ軸は相対強度を表す。ＨＰＬＣトレースに関して、Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は吸光度単位（ｍＡＵ）を表す。
【図２Ｅ】変異体ＳＡＰポリペプチドのグリカン構造分析。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ａ）、及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｂ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離したグリコ改変組み換え型ヒトＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｃ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｄ）を使用して、グリコ（糖）改変ｈＳＡＰ（ヒト血清由来ＳＡＰ）上でのシアル酸結合を測定した。 液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｅ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｆ）を使用して、ｒｈＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した（ここで、該ｒｈＳＡＰは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼで処理し、ＳＡＰグリカン上での２，３結合シアル酸末端の数を増加させた）。ＬＣＭＳ図に関して、Ｘ軸は質量（ダルトン）を表し、及びＹ軸は相対強度を表す。ＨＰＬＣトレースに関して、Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は吸光度単位（ｍＡＵ）を表す。
【図２Ｆ】変異体ＳＡＰポリペプチドのグリカン構造分析。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ａ）、及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｂ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離したグリコ改変組み換え型ヒトＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｃ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｄ）を使用して、グリコ（糖）改変ｈＳＡＰ（ヒト血清由来ＳＡＰ）上でのシアル酸結合を測定した。 液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）分析（Ｅ）及び陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）分析（Ｆ）を使用して、ｒｈＳＡＰ上でのシアル酸結合を測定した（ここで、該ｒｈＳＡＰは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼで処理し、ＳＡＰグリカン上での２，３結合シアル酸末端の数を増加させた）。ＬＣＭＳ図に関して、Ｘ軸は質量（ダルトン）を表し、及びＹ軸は相対強度を表す。ＨＰＬＣトレースに関して、Ｘ軸は時間（分）を表し、Ｙ軸は吸光度単位（ｍＡＵ）を表す。
【図３】線維芽細胞分化アッセイ。ＳＡＰ変異体ポリペプチドと共に単球をインキュベーションした後、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用して、ＭＤＣの産生を測定した。Ｙ軸は、参考スタンダードであるｈＳＡＰと比較した各ＳＡＰ変異体の平均相対活性を表す。前記参考スタンダードの活性については１．０に設定した（一番左のバーを参照）。
【図４】線維芽細胞分化アッセイ。単球をｈＭＣＳＦで処理し、その後続いて線維芽細胞分化について定量した。Ｘ軸は、ドナー単球と共にインキュベートされたｈＭＣＳＦの濃度を表す。Ｙ軸は、5.0 × 104細胞あたりの線維芽細胞を計数することによって測定された５日目の線維芽細胞増殖量を表す。
【図５】線維芽細胞分化アッセイ。単球をｈＳＡＰで処理し、その後続いて線維芽細胞分化について定量した。Ｘ軸は、ドナー単球と共にインキュベートされたｈＳＡＰの濃度を表す。Ｙ軸は、5.0 × 104細胞あたりの線維芽細胞を計数することによって測定された５日目の線維芽細胞増殖量を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の詳細な説明
概観
最も自然な形で生じるペプチドは炭化水素部分（即ち、グリカン）を有しており、該炭化水素部分は、ペプチド主鎖の長さ方向にそって特定のアミノ酸に特定の結合を行うことを介してペプチドに結合しており、従って「グリコペプチド」を形成する。任意の所与のペプチド上でのグリコシル化パターンは、該ペプチドの機能を密接な関係を持ち得る。例えば、ペプチド上のＮ結合型グリカンの構造は、ペプチドの様々な特性に影響を及ぼすことができ、前記特性としては、プロテアーゼ感受性、細胞内輸送、分泌、組織ターゲティング、生物学的半減期、及び抗原性等が含まれる。こうした１以上の特性を変更すると、天然条件下でのペプチドの効力に大きく影響を及ぼす。
【００２８】
天然で生じるグリコペプチド内で見出されるグリカン構造は、典型的には２つに分類され、Ｎ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンがある。真核細胞で発現するペプチドについては、アスパラギン−Ｘ−セリン／スレオニンの配列を含有するペプチド一次構造における複数の箇所でのアスパラギン残基上で、Ｎグリコシル化が典型的に行われる。ここで、前記Ｘは、プロリン及びアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であってよい。前記ペプチドの炭化水素部分は、Ｎ結合型グリカン又はＮ結合型オリゴ糖鎖として知られている。Ｎ−グリコシル化の初期イベントは、小胞体（ＥＲ）内で起こり、該イベントは、哺乳類、植物、昆虫及び他の高等真核生物で保存されている。まず、１４の糖残基を有するオリゴ糖鎖が、脂質キャリア分子（ｌｉｐｉｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）上で構築される。新生ペプチドが翻訳されＥＲ内に輸送されると、膜結合グリコシルトランスフェラーゼ酵素による触媒反応で、前記オリゴ糖鎖全体が、アスパラギン残基のアミド基に転移される。更に、Ｎ結合型グリカンは、ＥＲとゴルジ体の両方で処理される。更に、前記処理は、除去及び付加される糖残基に特異的なグリコシラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼによる触媒反応において、幾つかの糖残基除去や別の糖残基付加を一般的に伴う。
【００２９】
典型的には、Ｎ結合型グリカンの最終構造は、ペプチドが生成される生物体に依存する。例えば、細菌で生成されるペプチドは、一般的にグリコシル化されていない。昆虫細胞で発現するペプチドは、高マンノース又はパウチ・マンノースのＮ結合型オリゴ糖鎖を典型的に含む。哺乳動物細胞培養で生成されるペプチドは、種や細胞培養条件によって異なったグリコシル化が行われるのが通常である。しかし、同一の種及び同一の条件下であったとしても、グリコシル鎖については一定量の不均一性が時として見られる。また、植物細胞で産生されるペプチドは、動物細胞で産生される物とは著しく異なったグリカン構造を一般的に含む。
【００３０】
当分野においては、ペプチドのグリコシル化パターンをカスタマイズするための様々な方法が提案されてきており、該方法としては、国際公開ＷＯ９９／２２７６４、ＷＯ９８／５８９６４及びＷＯ９９／５４３４２並びに米国特許第５，０４７，３３５に記載された方法が含まれる。基本的には、インビトロでのペプチドグリコシル化に必要となる多くの酵素がクローニングされ、そして配列決定されている。ある例では、これらの酵素を、ペプチド上のグリカンに特定の糖を付加するためにインビトロで用いてきた。またある例では、所望の糖部分の発現ペプチドへの付加が細胞内で生じるようにするために、酵素及び所望のペプチドの組合せを発現する細胞を遺伝学的にデザインしてきた。
【００３１】
前記炭化水素の合成では、２つの主要なクラスの酵素が使用される：即ち、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼである。前記グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチドに既存のオリゴ糖構造を付加又は改変する。また、前記グリコシルトランスフェラーゼは、立体化学的及び位置化学的に良好な制御で特定の生成物を生成するのに効果的である。そして、前記グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖を生成し、末端のＮ及びＯ結合型炭化水素構造、特に哺乳動物細胞内で生成されるペプチド上の該構造を改変する目的で使用されてきた。例えば、グリコペプチドの末端オリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼを用いて、完全にシアル酸化及び／又はフコシル化して、より一貫性のある糖構造を提供することができる。このことにより、グリコペプチドの薬力学や他の種々の生物学的特性を向上させることができる。
【００３２】
前記グリコシダーゼは、更に、エキソグリコシダーゼ（例えば、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）及びエンドグリコシダーゼ（例えば、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）に分類される。通常、グリコシダーゼはグリコシド結合の加水分解を触媒する。しかし,適切な条件の下では、こうした結合を形成するために用いることができる。炭化水素の合成に用いられるほとんどのグリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼである；グリコシル転移は、基質の非還元末端で起こる。水によって開裂して加水分解産物を生成するか又はアクセプターによって開裂するかのいずれかのグリコシル−酵素中間体において、前記グリコシダーゼは、グリコシルドナーと結合し、新たなグリコシド又はオリゴ糖を生成する。エキソグリコシダーゼを用いた経路の例としては、β−マンノシダーゼ（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ９９３−９９４  （１９９６））の作用によって形成されるβマンノシド結合を含めた全てのＮ結合型グリコペプチドのコア三糖の合成がある。前記エキソグリコシダーゼの使用と比べると一般的ではないが、エンドグリコシダーゼも炭化水素の合成に用いられる。エンドグリコシダーゼは、単糖ではなくオリゴ糖鎖全体をポリペプチド上に転移させるために使用することができる。オリゴ糖断片は、Ｅｎｄｏ−ＦやＥｎｄｏ−Ｍ等のエンド‐β‐Ｎ‐アセチルグルコサミダーゼ（ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｓ）を用いて基質に添加される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３７：  １９７５−１９７８；  ａｎｄ  Ｈａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２９２：  ６１−７０  （１９９６）。こうしたの各クラスの酵素を用いることによって、グリコシル化したペプチドの合成することについて成功を収めてきた。概要について参照したい場合には、Ｃｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２：  ９８−１１１  （１９９８）を参照されたい。
【００３３】
血清アミロイドＰ （ＳＡＰ）は、哺乳動物における天然由来の血清蛋白質であり、５つの同じサブユニット又は「プロモーター」から構成され、ディスク状複合体中で非共有結合している。ＳＡＰは、ペントラキシン・スーパーファミリー蛋白質に属しており、環状ペンタマー構造によって特徴づけられる。伝統的なショート・ペントラキシンとしては、ＳＡＰやＣ反応性タンパクが含まれる（Ｏｓｍａｎｄ，  Ａ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ７４：  ７３９−７４３，  １９９７）。通常ＳＡＰは肝臓で合成され、その生理学的半減期は２４時間である。ヒトＳＡＰのサブユニットの配列は以下の通りであり、Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．  ＮＰ＿００１６３０に記載の配列のアミノ酸２０−２２３に対応する（ただし、シグナル配列については記載していない）。
HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLSRAYSLFSYNTQGRDNELLVYKERVGEYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAPVHICVSWESSSGIAEFWINGTPLVKKGLRQGYFVEAQPKIVLGQEQDSYGGKFDRSQSFVGEIGDLYMWDSVLPPENILSAYQGTPLPANILDWQALNYEIRGYVIIKPLVWV (SEQ ID NO: 1)
【００３４】
Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓのＳＡＰサブユニットの配列については以下の通りである。
QEDLYRKVFVFREDPSDAYVLLQVQLERPLLNFTVCLRSYTDLTRPHSLFSYATKAQDNEILLFKPKPGEYRFYVGGKYVTFRVPENRGEWEHVCASWESGSGIAEFWLNGRPWPRKGLQKGYEVGNEAVVMLGQEQDAYGGGFDVYNSFTGEMADVHLWDAGLSPDKMRSAYLALRLPPAPLAWGRLRYEAKGDVVVKPRLREALGA (SEQ ID NO: 2)
【００３５】
Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓのＳＡＰサブユニットの配列については以下の通りである。
QTDLRGKVFVFPRESSTDHVTLITKLEKPLKNLTLCLRAYSDLSRGYSLFSYNIHSKDNELLVFKNGIGEYSLYIGKTKVTVRATEKFPSPVHICTSWESSTGIAEFWINGKPLVKRGLKQGYAVGAHPKIVLGQEQDSYGGGFDKNQSFMGEIGDLYMWDSVLSPEEILLVYQGSSSISPTILDWQALKYEIKGYVIVKPMVWG (SEQ ID NO: 3)
【００３６】
Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓのＳＡＰサブユニットの配列については以下の通りである。
QTDLTGKVFVFPRESESDYVKLIPRLEKPLENFTLCFRTYTDLSRPHSLFSYNTKNKDNELLIYKERMGEYGLYIENVGAIVRGVEEFASPVHFCTSWESSSGIADFWVNGIPWVKKGLKKGYTVKTQPSIILGQEQDNYGGGFDKSQSFVGEMGDLNMWDSVLTPEEIKSVYEGSWLEPNILDWRALNYEMSGYAVIRPRVWH (SEQ ID NO: 4)
【００３７】
本発明の一態様は、ヒトＳＡＰポリペプチドのグリカン構造を改変することにより、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルと比べて、ＳＡＰポリペプチドの生物学的活性が増強されるという驚くべき発見に関連するものである。本開示内容中の実施例に示されるように、ヒト血清から単離されたＳＡＰは、α２，６結合シアル酸残基のみを含んでいる。それに対して、ＣＨＯ細胞で生成される組み換え型ヒトＳＡＰは、α２，３結合シアル酸残基のみを含んでいる。インビトロ細胞ベースのバイオアッセイを用いた結果、ヒト血清から単離された野生型ＳＡＰ（即ち、α２，６結合シアル酸部分を含むＳＡＰ）と比べて、α２，３結合シアル酸ＳＡＰポリペプチドは、一貫して高い活性を有することが示された。本発明の変異体ＳＡＰポリペプチドは、その増強された生物学的効能を有するため、治療用薬剤として一層効果的であろう。例えば、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰと比べて、より効能の高いＳＡＰ変異体は、薬剤投与（ｄｏｓｅ）の量及び／又は頻度を抑えることができる。本開示内容は、ヒトＳＡＰポリペプチド変異体及びその製造方法の両方を提供するものである。特に、本開示内容は、インビトロ及びインビボで、糖残基の付加、削除、改変を行い、所望のグリコシル化パターンを有するヒトＳＡＰポリペプチドを生成するための方法及び組成物を含む。
【００３８】
定義
別途規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語については、当業者が通常理解する意味と同じ意味である。概して言うと、本明細書中で使用される命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、並びに核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける研究手法については、当分野で周知・慣用である。核酸合成及びペプチド合成については、標準的な技術を用いる。技術及び手法については、概して、当分野での従来の方法や種々の一般的な参考文献に従って実践した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。これらについては本明細書中で後述する。
【００３９】
本明細書中で使用される冠詞「a」及び「an」は、文法的な冠詞の対象について１つ又は複数の物(即ち、１以上)を意味する（即ち、本明細書において、特に規定しない限りは単数又は複数を意味する）。例えば、「an element」は１つの元素又は複数の元素を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「治療」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”及び“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）は、所望の薬理学的又は生理学的な効果を得ることを意味する。前記効果については、病気（異常）若しくは症状を完全若しくは部分的に予防するという意味で予防的なものであってもよく、並びに／又は、病気及び／若しくは該病気による悪影響を完全若しくは部分的に治すという意味で治療的なものであってもよい。本明細書中で使用される「治療」は、哺乳類、特にヒトでの病気に対する任意の治療を含み、例えば以下のものが含まれる：（ａ）生存期間の延長；（ｂ）病気による死亡リスクの低減；（ｃ）病気の阻害、即ち病気の進行の停止又は病気の進行速度の低減；及び（ｄ）病気の緩和、即ち、病気の退行の誘発。
【００４１】
本明細書中で使用される用語であって、異常又は症状を「阻害」又は「予防」する治療剤については、統計学的サンプルにおいて以下のような機能を有する化合物を意味する：（１）非治療コントロール・サンプルと比べて、治療サンプルにおいて異常又は症状の発生を抑制；又は、（２）非治療コントロール・サンプルと比べて、治療サンプルにおいて、異常又は症状の１以上の症状の発症を遅延又は発病度合いの低減。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「被験者」及び「患者」（“ｓｕｂｊｅｃｔ”及び“ｐａｔｉｅｎｔ”）は、哺乳類を含めた動物を意味し、例えばヒト等が挙げられる。用語「哺乳類」については、霊長類、飼いならされた動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ギニア・ピッグ、動物園などの檻にいる動物）及び野生動物が含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「組織」 は、器官、又は専門化された細胞群（例えば、皮膚組織、肺組織、腎臓組織、及び他のタイプの細胞群）を意味する。
【００４４】
用語「治療効果」は、当分野で理解される用語であり、動物（具体的には哺乳類、より具体的にはヒト）において、薬理学的に活性のある物質で引き起こされる局所的又は全身的な効果を意味する。語句「治療上有効量」とは、任意の治療に適用できる合理的な利点／リスクの割合において、ある所望の局所的又は全身的な効果をもたらす物質等の量を意味する。こうした物質の治療上有効量は、治療する患者及び病状、該患者の体重及び年齢、病状の度合い、投与形態等に依存して変動するであろう。そして、当業者は容易に治療上有効量を決定することができる。例えば、本明細書で記述する特定の組成物は、前述の治療に適用できる合理的な利点／リスクの割合において、所望の効果を生み出すのに充分な量で、投与することができる。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味し、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び、適すれば、リボ核酸（ＲＮＡ）がある。また、該用語は以下のものを含むものとして理解されたい：均等物としては、ヌクレオチド類似体から製造されたＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかの類似体；及び記述された実施形態に適用可能な物として、１本鎖ポリヌクレオチド（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）及び２本鎖ポリヌクレオチド。
【００４６】
用語「ペプチド」、「蛋白質」、及び「ポリペプチド」は、本明細書中では、相互に変換可能に使用される。用語「精製蛋白質」は、１種類の蛋白質又は複数種類の蛋白質が調製された物を意味し、好ましくは、細胞又は細胞溶解産物中の蛋白質（複数可）に通常関連している他の蛋白質から単離された物、又は該他の蛋白質を実質的に有さない物を意味する。用語「他の細胞蛋白質を実質的に有さない」又は「他の混入蛋白質を実質的に有さない」は、混入蛋白質が（乾燥重量で）２０％未満しか含まれない各蛋白質の個々の調製物、好ましくは５％未満しか含まれない調製物を含むものとして定義される。各蛋白質の機能的な形態については、当分野で公知のクローニングされた遺伝子を用いた精製調製物として調整することができる。「精製された」とは、他の蛋白質等（特には、対象となる再構築された混合物において、精製された調整物としての構成蛋白質の特性、又はその機能においての構成蛋白質の特性のいずれかを実質的にマスキングしたり、消失させたり、混乱させたり、又は変化させたりすることができる他の蛋白質）の他の生物学的巨大分子が実質的に存在していない状態で記載の分子が存在することを意味する。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも乾燥重量で８０％、より好ましくは８５重量％の範囲、さらに好ましくは９５−９９重量％、そして、最も好ましくは少なくとも９９．８重量％で同タイプの生物学的巨大分子が存在することを意味する（ただし、水、バッファー、又は他の小分子（特に分子量が５０００未満の分子）については存在しても良い）。本明細書中で使用される「純粋な」とは、好ましくは前述の用語「精製された」と同一の数値限界を有する。
【００４７】
「Ｎ結合型」オリゴ糖は、アスパラギン-Ｎ−アセチルグルコサミン結合を意味する、アスパラギンを介してペプチド主鎖に結合したオリゴ糖である。また、Ｎ結合型オリゴ糖は、「Ｎ−グリカン」とも呼ばれる。天然由来のＮ結合型オリゴ糖は、共通の５糖コアであるＭａｎ［（α１，６−）−（Ｍａｎ（α１，３）］−Ｍａｎ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，Ｎ）を有している。前記オリゴ糖については、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース及びシアル酸等の末端糖の存在の有無、そして該糖の側鎖（アンテナとも言う）の数において異なっている。また、任意で、こうした構造は、コア・フコース分子及び／又はキシロース分子を含むことができる。
【００４８】
用語「シアル酸」は、カルボキシル化された９炭糖ファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーのメンバーで最もありふれているのは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（よく用いられる略語として、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡ)である。 前記ファミリーの第二のメンバーとして、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）があり、ＮｅｕＡｃのＮアセチル基がヒドロキシル化されている。シアル酸ファミリーの第三のメンバーとして、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：  １１５５０−１１５５７；  Ｋａｎａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：  ２１８１１−２１８１９  （１９９０））がある。また、９置換シアル酸も含まれ、例えば、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ若しくは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ1Ｃ6−アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、又は９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃが挙げられる。シアル酸ファミリーについて参照したいのであれば、例えば、Ｖａｒｋｉ，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：  ２５−４０  （１９９２）；  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｒ．  Ｓｃｈａｕｅｒ，  Ｅｄ．  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２））を参照されたい。
【００４９】
「遺伝的にデザインされた」又は「組み換え型」細胞は、前記細胞の遺伝的な物質についての１種以上の改変を有する細胞である。前記改変としては、遺伝学的な材料が安定に維持されるか否かに関わらず、遺伝学的な物質の挿入、遺伝学的な物質の削除、染色体外である遺伝学的な物質を挿入することなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「改変された糖」は、本発明のプロセスにおいて、ペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基に酵素的に付加された天然由来又は非天然由来の炭化水素を意味する。前記改変された糖は、糖ヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、及び三リン酸）、活性化された糖（例えば、グリコシルハロゲン化物、グリコシルメシレート）、及び活性化された糖又はヌクレオチドの何れでもない糖などを含む複数の酵素基質から選択されるが、これらに限定されない。「改変された糖」は、「改変基」を用いて、共有結合的に機能化することができる。有用な改変基としては、水-可溶性ポリマー、及び水-不溶性ポリマー、治療用成分、診断用薬剤並びに生体分子などが含まれるがこれらに限定されない。改変基による機能化部位については、ペプチド又は該ペプチドのグリコシル残基に「改変された糖」が酵素的に結合するのを妨げないように選択することができる。
【００５１】
変異体ＳＡＰポリペプチド
本開示内容の一部として、変異体血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のポリペプチドを提供する。特に、本発明のＳＡＰ変異体は、グリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、１以上のＮ結合型又はＯ結合型オリゴ糖鎖を含み、該オリゴ糖鎖は、末端がα２，３結合シアル酸部分である１、２、３、４、５、又はそれ以上の側鎖をそれぞれ独立して有する。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型又はＯ結合型オリゴ糖鎖の全ての側鎖の末端は、α２，３結合部分である。本発明における他のＳＡＰ変異体は、Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を含むグリコシル化ヒトＳＡＰポリペプチドを含み、α２，６結合シアル酸部分が、ヒト血清由来の野生型ＳＡＰポリペプチドと比べて、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、又は少なくとも９５％少ない。幾つかの実施形態において、前記Ｎ結合型又はＯ結合型オリゴ糖鎖は、実質的にα２，６結合シアル酸部分を有さず、例えば、その量は、ヒト血清由来の野生型ＳＡＰポリペプチドに対して、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％よりも少ない。本発明のグリコバリアントＳＡＰポリペプチドは、１以上の側鎖を有するＮ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型鎖（例えば、バイ・アンテナリー構造、トリ・アンテナリー構造、テトラ・アンテナリー構造、ペンタ・アンテナリー構造等）を含むことができる。ある実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を有しており、前記オリゴ糖鎖のうち１、２、３、４、又は５つの側鎖は、ガラクトースやＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない（例えば、ヒト血清由来の野生型ＳＡＰポリペプチドと比べて、Ｎ−アセチルグルコサミンの量が８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％よりも少ない）。本発明の特定のＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を有しており、該オリゴ糖鎖は、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを実質的に有さない（例えば、ヒト血清由来の野生型ＳＡＰポリペプチドと比べて、ガラクトース及び／又はＮ−アセチルグルコサミンが８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％よりも少ない）。幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖又はＯ結合型オリゴ糖鎖を含み、前記オリゴ糖鎖のうち１、２、３、４、又は５つの側鎖は、１以上のマンノース残基を有する。ある実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖を含み、該オリゴ糖鎖は、５糖コアであるＭａｎ［（α１，６−）−（Ｍａｎ（α１，３）］−Ｍａｎ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）−ＧｌｃＮＡｃ（β１，Ｎ）−Ａｓｎを有する。また、前記５糖コアは、１以上のフコース残基又はキシロース残基を有することができる。ある実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オリゴ糖鎖を含み、前記オリゴ糖鎖のうち１、２、３、４、又は５つの側鎖は、ＮｅｕＮＡｃ２α３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６という構造を有する。また、本発明のＳＡＰポリペプチドは、Ｎ結合型オ���ゴ糖鎖を有することができ、全ての側鎖はＮｅｕＮＡｃ２α３Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６という構造を有することができる。
【００５２】
本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、１種以上の「改変された」糖残基を含むことができる。改変された糖は、前記改変部分又は基の付加を許容する任意の位置で置換が行われる。好ましい態様において、改変された糖は、改変された糖をＳＡＰペプチドに結合させるために用いられる酵素のための基質として、該糖が機能することを可能にする位置で置換が行われても良い。改変基は酵素的手法、化学的手法、又はそれらの組合せによって糖部分に結合することができ、それによって改変された糖（例えば、改変されたガラクトース、フコース、又はシアル酸）が生成される。本発明での使用並びに糖残基にこれらの改変基を結合させるための方法に適した改変基については、次項で述べる。
【００５３】
好ましい態様において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するためＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の半分よりも少ない。幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するためＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の３分の１、４分の１、１０分の１、又は１００分の１よりも少ない。
【００５４】
本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、Brutlagらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ６：２３７−２４５  （１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定したときに、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であってもよい。特定の実施形態において、アミノ酸アライメントの同一性及び類似性のパーセンテージを計算するために用いられるパラメータとして以下のものが含まれる：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  １５０，  ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２，  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１，  Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０，  Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０，  Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１，  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５  ａｎｄ  Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５。 
【００５５】
用語「ＳＡＰポリペプチド」は、上述した任意のペプチドを含む機能的断片や融合蛋白質を包含する。一般的に、ＳＡＰポリペプチドは、生物学的に関連した温度、ｐＨレベル、及び浸透圧での水性溶液で可溶性になるようにデザインされるであろう。非共有結合的に互いに結合してペンタマーであるＳＡＰ複合体を形成するＳＡＰプロモーターは、同一のアミノ酸配列及び／又は翻訳後の改変物を有してもよい。或いは、単一の複合体内にある個々のＳＡＰプロモーターは、異なる配列及び／又は改変物を有してもよい。用語ＳＡＰポリペプチドは、任意の天然由来のＳＡＰポリペプチド並びにそれらの任意の変異体（突然変異体、断片、及び融合物を含む）を含むポリペプチドを包含する。本発明のＳＡＰポリペプチドは、組み換え型ポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、ヒトＳＡＰポリペプチドである。
【００５６】
幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体、又はそれらの機能的断片を含む医薬組成物が提供される。幾つかの態様において、ＳＡＰ変異体アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に対して、１以上の保存的又は非保存的置換物によって異なっても良い。本明細書中で使用される「保存的置換物」とは、対応する関連残基と物理的に又は機能的に類似した残基を意味する。即ち、保存的置換及びその関連残基は、類似のサイズ、形、帯電性及び／又は化学的性質（例えば、共有結合又は水素結合を形成する能力）を有する 。保存的置換物については、ＤａｙｈｏｆｆらのＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２  （１９７８  ＆  Ｓｕｐｐ．）で許容されたポイントミューテーションとして定義された基準を満たすものが好ましい。 保存的置換物の例としては、以下のグループ内での置換物が挙げられる：（ａ）  バリン、グリシン；  （ｂ）  グリシン、アラニン；  （ｃ）  バリン、イソロイシン、ロイシン；  （ｄ）  アスパラギン酸、グルタミン酸；  （ｅ）  アスパラギン、グルタミン；  （ｆ）  セリン、スレオニン；  （ｇ）  リシン、アルギニン、メチオニン；  及び（ｈ）  フェニルアラニン、チロシン。どのようなアミノ酸の変更であれば表現型上変化しない可能性が高いかに関する更なるガイダンスとしては、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０  （１９９０）を参照されたい。
【００５７】
生物学的機能を維持した変異体ＳＡＰポリペプチド及びそれらの断片は、本明細書中で記載した医薬組成物や方法で有用である。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチド変異体又はそれらの断片は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢと結合する。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチド変異体又はそれらの断片は、線維芽細胞、線維芽細胞前駆体, 筋線維芽細胞前駆体、及び／又は造血単球前駆体のうち１以上の分化を阻害する。ＳＡＰ変異体は、治療用効果又は安定性を強化する等の目的で（例えば、エキソ・ビボでの貯蔵期限及びインビボでの蛋白質分解に対する耐性）、ＳＡＰポリペプチドの構造を改変することによって生成することができる。
【００５８】
ある態様において、本開示内容のＳＡＰポリペプチド変異体は、ＳＡＰポリペプチド内に通常存在する任意の改変に加えて、更なる翻訳後の改変を含むことができる。そのような改変として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化（例えば、Ｏ結合型オリゴ糖、Ｎ結合型 オリゴ糖等）、リン酸化、及び脂質付加等が含まれるがこれらに限定されない。その結果、前記改変ＳＡＰポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類又は単糖類、及びリン酸等の非アミノ酸部分を含むことができる。
【００５９】
ある態様において、本明細書中に記載したＳＡＰポリペプチドに対する１種以上の改変によって、ＳＡＰポリペプチドの安定性を強化することができる。例えば、前記改変によってＳＡＰポリペプチドのインビボ半減期を強化したり、又はＳＡＰポリペプチドの蛋白質分解を減少させたりすることができる。
【００６０】
ある態様において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、融合蛋白質を含み、該融合蛋白質は、少なくともヒトＳＡＰポリペプチドの一部、及び１以上の融合ドメイン又は非相同部分を有する。前記融合ドメインのうち良く知られた例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、及び免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、又はヒト血清アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与すべく選択することができる。例えば、幾つかの融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィーによる融合蛋白質の単離に特に有用である。前記アフィニティ精製目的で、アフィニティクロマトグラフィー用関連マトリクスが用いられ、例えば、グルタチオン−、アミラーゼ−、及び ニッケル−、又はコバルト−結合樹脂が挙げられる。別の例として、ＳＡＰポリペプチドの検出を促進する目的で、融合ドメインを選択することができる。前記検出ドメインの例としては、様々な蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）並びに「エピトープタグ」が挙げられる。通常、該タグは特定の抗体を用いることができる短いペプチド配列である。特定のモノクローナル抗体が容易に利用可能であるよく知られたエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウィルス赤血球凝集素（ＨＡ）及びｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。幾つかの場合において、前記融合ドメインは、プロテアーゼ切断サイトを有しており、該切断サイトにより、関連プロテアーゼが融合蛋白質を部分的に分解することが可能となる。こうしたことにより、そこから組み換え型蛋白質が遊離する。そして、前記遊離蛋白質は、続いて行われるクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離することができる。幾つかの場合において、前記ＳＡＰポリペプチドは、ＳＡＰポリペプチドをインビボで安定化させる非相同ドメインと融合させることができる。ここで、「安定化させる」とは、分解の減少、腎臓によるクリアランスの減少、又は他の薬物動力学的効果を原因とするか否かに関係なく、血清半減期を上昇させる任意の事を意味する。免疫グロブリンのＦｃ部位や血清アルブミンと融合させることにより、上昇した安定性が付与されることが知られている。
【００６１】
融合タンパクの異なる部分は、所望の機能に合致する態様で配置することができる点を理解されたい。例えば、ＳＡＰポリペプチドは、非相同ドメインのＣ−末端に配置してもよいし、或いは、非相同ドメインは、ＳＡＰポリペプチドのＣ−末端に配置してもよい。ＳＡＰポリペプチド及び非相同ドメインは、融合蛋白質内において隣り合う必要はない。更なるドメイン又はアミノ酸配列（例えば、リンカー配列）が、ドメイン又はドメイン間いずれかのＣ末端側又はＮ末端側に含まれても良い。
【００６２】
変更されたＮ−グリコシル化分子を生成する方法
本項ではヒトＳＡＰポリペプチド変異体を製造する方法を述べる。該方法は、一般的には、ＳＡＰポリペプチドのグリコシル化構造を生成又は改変するための１種以上の化学的薬剤又は酵素的薬剤を前記ＳＡＰポリペプチドに接触させるステップを伴う。前記方法は、細胞ベースであってもよく、又は非細胞ベースであっても良い。
【００６３】
グリカン構造を生成又は改変するために有用な酵素は当分野で周知である。本開示内容の方法において有用なほとんどの酵素／蛋白質は、２つの機能的なクラスのうちの１つにカテゴリー化することができる：即ち、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼである。本明細書中で使用されるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｎ−  アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ、ガラクトシル−トランスフェラーゼ、フコシル−トランスフェラーゼ、シアニル−トランスフェラーゼ、グルコシル−トランスフェラーゼ、マンノシル−トランスフェラーゼなど）とは、ドナーである糖をアクセプター部分に転移する能力を有する任意の酵素／蛋白質を意味する。本明細書中で使用されるグリコシダーゼ（例えば、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、シアリダーゼ、フコシダーゼ等．）とは、糖部分間のグリコシド結合の加水分解を触媒する能力を有する任意の酵素／蛋白質を意味する。
【００６４】
グリコ形態が変更されたＳＡＰポリペプチドを生成するための細胞ベースの方法では、野生型（例えば、ＣＨＯ細胞）、又はヒト細胞と比べて改変された少なくとも１種のグリコシル化活性を有する遺伝的にデザインされた細胞のいずれかを用いる。本開示内容の方法に適切な細胞としては、以下の物が挙げられる：例えば、真菌細胞、原核細胞（即ち、細菌、Ａｒｃｈａｅａ）、植物細胞、又は動物細胞（例えば、線虫, 昆虫, 植物, 鳥類, 爬虫類, 又はほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、又はヒト）)。 前記細胞は、初代細胞、不死化細胞、又は形質転換された細胞であってもよい。こうした細胞については、様々な市販の販売元や研究所施設等（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ロックビル,メリーランド州.)）から入手することができる。ある態様において、ＳＡＰポリペプチド変異体を生成するために使用される細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００６５】
用語「グリコシル化活性」は、以下の能力を有する任意の活性を意味する：（ｉ）Ｎ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンをターゲット分子に付加する能力（即ち、オリゴ糖−トランスフェラーゼ活性）；（ｉｉ）Ｎ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンをターゲット分子から除去する能力；（ｉｉｉ）ターゲット分子上の１以上のＮ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンを改変する能力；（ｉｖ）ドリコール結合オリゴ糖を改変する能力；（ｖ）前記活性（ｉ）−（ｉｖ）のうち１以上の活性を補助する能力。従って、グリコシル化活性には、例えば、グリコシダーゼ活性、グリコシルトランスフェラーゼ活性、糖ヌクレオチド合成、改変、又はトランスポーター活性が含まれる。ターゲット分子上の１以上のＮ結合型グリカン又はＯ結合型グリカンの改変としては、マンノシルホスホリル-トランスフェラーゼ活性, キナーゼ活性、又はホスファターゼ活性（例えば、ターゲット分子上のグリカンのリン酸化状態を変更するマンノシルホスホリル-トランスフェラーゼ、キナーゼ、又はホスファターゼ活性）の作用が含まれる。
【００６６】
本開示内容の方法において有用なデザインされた細胞は、１種以上の遺伝的改変を有することができ、該改変としては以下のものが含まれるがこれらに限定されない：（ｉ）グリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする内因性遺伝子の削除；（ｉｉ）グリコシル化活性を有する蛋白質（例えば、内因性又は外因性蛋白質）の突然変異体形態エンコードする組み換え型核酸の導入；（ｉｉｉ）グリコシル化活性を有する蛋白質の機能的発現を干渉するＲＮＡ分子の導入又は発現；（ｉｖ）グリコシル化活性を有する野生型（例えば、内因性又は外因性）蛋白質をエンコードする組み換え型核酸の導入；、又は（ｖ）グリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする１種以上の内因性遺伝子のプロモーターエレメント又はエンハンサーエレメントを変更することによるエンコードされた蛋白質の発現の変更。上述のＲＮＡ分子としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ  （ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡ  （ｍｉＲＮＡ）が含まれる。上記項目（ｉｉ）には、例えば、置換対象の内因性遺伝子と比べて、大きなグリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする遺伝子に、内因性の遺伝子を置換することを含む（例えば非相同組換え）ことを理解されたい。
【００６７】
本明細書で記載された遺伝的にデザインされた細胞は、以下に述べる１以上の変更されたグリコシル化活性を有する：（ｉ）遺伝的に改変された細胞中において、増強された１種以上のグリコシル化活性；（ｉｉ）遺伝的に改変された細胞中において、減少された１種以上のグリコシル化活性；（ｉｉｉ）遺伝的に改変された細胞中において、局在化や細胞内の分散が変更された１種以上のグリコシル化活性；、又は（ｉｖ）遺伝的に改変された細胞中において、起源を同じくする非改変細胞と比べて、活性割合が変更された１種以上のグリコシル化活性。グリコシル化活性量の増加については以下のものが原因となりうる点を理解されたい：（ｉ）グリコシル化活性を有する１種以上の蛋白質の過剰発現；（ｉｉ）内因性遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子の二重化）；又は、遺伝子によってエンコードされる蛋白質の発現の増加を刺激する内因性遺伝子のプロモーター、エンハンサー、又はサプレッサーの改変。１種以上のグリコシル化活性量の減少については以下のものが原因となりうる：（ｉ）グリコシル化改変活性を有する１種以上の蛋白質の突然変異形態の過剰発現（例えば、ドミナント・ネガティブ形態）；（ｉｉ）グリコシル化活性を有する１種以上の蛋白質の発現を減少させる１種以上の干渉性ＲＮＡ分子の導入又は発現；（ｉｉｉ）、又はグリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする１種以上の内因性遺伝子の削除。
【００６８】
本開示内容の方法のために使用される遺伝的にデザインされた細胞は、グリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする野生型遺伝子又は突然変異体遺伝子を発現（例えば、過剰発現）することができる。前記遺伝子として、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：ＡＬＧ７、ＡＬＧ１３、ＡＬＧ１４、ＡＬＧ１、ＡＬＧ２、ＡＬＧ１１、ＲＦＴ１、ＡＬＧ３、ＡＬＧ９、ＡＬＧ１２、ＡＬＧ６、ＡＬＧ８、ＡＮＬ１、ＡＬＧ１０、ＡＬＧ５、ＯＳＴ３、ＯＳＴ４、ＯＳＴ６、ＳＴＴ３、ＯＳＴ１、ＯＳＴ５、ＷＢＰ１、ＳＷＰ１、ＯＳＴ２、ＤＰＭ１、ＳＥＣ５９、ＯＣＨ１、ＭＮＮ９、ＶＡＮ１、ＭＮＮ８、ＭＮＮ１０、ＭＮＮ１１、ＨＯＣ１、ＭＮＮ２、ＭＮＮ５、ＭＮＮ６、ＫＴＲ１、ＹＵＲ１、ＭＮＮ４、ＫＲＥ２、ＫＴＲ２、ＫＴＲ３、ＭＮＮ１、ＭＮＳ１、ＭＮＮ４、ＰＮＯ１、ＭＮＮ９、グルコシダーゼ  Ｉ、グルコシダーゼ  ＩＩ、又はエンドマンノシダーゼ。グリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする遺伝子は任意の種に由来するものであっても良い（例えば、下等真核生物  （例えば、真菌類  （酵母を含む）又はトリパノソーマ）、原核生物  （即ち、  細菌又はＡｒｃｈａｅａ）、植物，又は動物（例えば、昆虫、鳥類、爬虫類、又はほ乳類（例えば、マウス又はラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類、又は  ヒト））。
【００６９】
本開示内容の方法によって使用される遺伝的にデザインされた細胞は、任意の数の遺伝子（例えば、グリコシル化活性を有する蛋白質をエンコードする遺伝子）を発現することができ、及び／又は本明細書で記載した遺伝子のうちのいずれか１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、若しくは２０又はそれ以上）の任意の組合せを発現することができる点を理解されたい。更に、本開示内容の方法によって使用される遺伝的にデザインされた任意の細胞は、１種以上のグリコシル化活性を変更又は無効にする任意の数の突然変異を含むことができる。
【００７０】
幾つかの実施形態において、用語「遺伝子発現」又は「発現」は、生物学的に活性のあるポリペプチドがＤＮＡ配列から生成されて、細胞内で生物学的な活性を示す細胞でのプロセスを意味する。このように、遺伝子発現は、転写及び翻訳のプロセスを伴うが、しかし、遺伝子の生物学的活性又は遺伝子産物に影響を及ぼすことができる、転写後及び翻訳後のプロセスも伴う。こうしたプロセスに含まれるものとして、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：ＲＮＡ合成、プロセッシング、輸送、並びにポリペプチド合成、輸送、及び翻訳後のポリペプチド改変。
【００７１】
例えば、本開示内容は、細胞中でＳＡＰ遺伝子を発現させることによる本発明のＳＡＰポリペプチドの製造方法を提供する。幾つかの実施形態において、細胞は、内因性ＳＡＰ遺伝子又はこれらの断片を含むことができる。他の実施形態では、外因性ＳＡＰポリペプチド又はそれらの断片をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入することもできる（例えば、形質転換、トランスフェクト等）。細胞内に導入することができる適切なＳＡＰプリヌクレオチドは、核酸断片、並びに核酸構築物又は発現ベクターを含む。好ましい実施形態において、前記内因性又は外因性遺伝子は、ヒトＳＡＰポリペプチドをエンコードする。
【００７２】
幾つかの実施形態において、宿主細胞を形質添加するために使用される核酸断片（例えば、ヒトＳＡＰポリペプチドをエンコードする核酸断片）は、シャイン・ダルガノ・サイト（例えば、リボソーム結合サイト）及び開始サイト（例えば、コドンＡＴＧ）を含んで、酵素を生成するために転写されたメッセージの翻訳を開始することができる。また、核酸断片は、翻訳を終了させるための終了配列を含むこともできる。終了配列は、典型的には、対応するアミノアセチル−ｔＲＮＡが存在しせず、従って、ポリペプチド合成を終了させるコドンである。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチドをエンコードする核酸構築物は、例えば、発現プラスミドとして送達され、該プラスミドは、細胞内で転写されたときに、ＳＡＰポリペプチドとして発現する。
【００７３】
幾つかの実施形態において、適切な発現ベクターは、本発明のＳＡＰポリペプチドエンコードするヌクレオチド配列であって、且つ少なくとも１種の制御配列が機能的に結合したヌクレオチド配列を含む。制御配列は、当分野で認識されたものであり、本開示内容の任意のポリペプチドの発現に向かわせるように選択される。従って、用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現コントロール・エレメントを含む。例示的な制御配列についてはＧｏｅｄｄｅｌ；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）に記載されている。例えば、機能的に結合されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する任意の発現制御配列をこうしたベクター内で使用して、本開示内容の任意のポリペプチドを発現させることができる。前記有用な発現制御配列として、例えば、以下のものが含まれる：ＳＶ４０の初期プロモーター及び後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウィルス又はサイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム又はＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによって発現が誘導されるＴ７プロモーター、ラムダ・ファージの主要なオペレータ領域及びプロモーター領域、ｆｄ外被蛋白質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖系酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼ（例えばＰｈｏ５）のプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウイルス・システムの多面体プロモーター、及び原核細胞又は真核細胞又はこれらに対するウイルスの遺伝子の発現を制御するものとして知られる他の配列、並びに様々なこれらの組合せ。発現ベクターのデザインは、形質転換しようとする宿主細胞の選択及び／又は発現させようとする蛋白質の種類等の因子に依存する可能性がある点を理解されたい。また、別途考慮すべきものとして、以下のものがある：ベクターのコピー数、前記コピー数を制御する能力、及びベクターによってエンコードされる他の任意の蛋白質（例えば、抗生物質マーカー等）の発現を制御する能力。
【００７４】
幾つかの実施形態において、宿主細胞を形質転換するために使用される核酸断片又は発現システムは、任意で、１種以上のマーカー配列を含むことができる。一般的に言えば、適切なマーカー配列は、典型的には遺伝子産物をエンコードし、通常は、不活化させる酵素、又は検出する酵素、又は培地中の化合物によって検出される酵素である。例えば、マーカー配列を含むことによって、形質転換細胞を抗生物質耐性にすることができ、又は形質転換細胞上で化合物特有の代謝作用を付与することが出来る。耐性を付与する適切なマーカー配列の例としては、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンが挙げられる。或いは、選択圧力以外にも、遺伝子を含有する特定のコロニーを検出することを可能にするマーカー遺伝子を使用することができ、例えば、β−ガラクトシダーゼがあり、該酵素の基質は色がついた産物を提供する。
【００７５】
核酸断片、又は発現ベクターを用いて本発明の細胞を形質転換するのに適した様々な方法がある。ありふれた形質転換の方法として、エレクトロポレーション、リポソームを介した形質転換、カルシウムを介した形質転換、ウイルスを介したトランスフェクションが含まれる。
【００７６】
ある態様において、本発明の核酸断片又は発現システムを用いて宿主細胞が形質転換されるときに、前記システム内の遺伝子（例えば、ヒトＳＡＰ）は、いわゆる相同組換えによって、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込むことができ、そして、発現システムは宿主内に安定して運ばれる。
【００７７】
ベクター内の発現システムを、宿主細胞の染色体ＤＮＡへ組み込む目的で、適切な選択マーカー遺伝子を用いることができ、ここで前記マーカー遺伝子は、特定の宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の遺伝子と相同の配列を有する。こうした目的での選択マーカーは、当業者が容易に選択することができる。例えば、好ましいマーカーは、染色体に存在し、かつ宿主細胞の代謝に関連する遺伝子である。即ち、染色体上にある上述の遺伝子が、突然変異等の適切な手段によって不活化されるという態様等によって改変された宿主を用いることが好ましい。そして、宿主は、対応する無傷の遺伝子を含有する発現ベクターを用いた相同組換えを受けることができ、ここで正常な代謝遺伝子を含有する形質転換体のみが増殖して選択される。従って、前記マーカー遺伝子が発現ベクターに組み込まれた場合、前記発現ベクター内のマーカー遺伝子と、染色体ＤＮＡの対応部位との間で相同組換えが起こるであろう。そして、これによって、非相同遺伝子の発現カセットも染色体ＤＮＡに同時に組み込まれるであろう。
【００７８】
幾つかの実施形態において、細胞内で蛋白質を「発現する」という用語は、細胞内に蛋白質自体を導入する方法も包含する。従って、ある態様において、本開示内容は、ＳＡＰポリペプチドを細胞内に導入することによる本発明のＳＡＰポリペプチドの製造方法を提供する。細胞内にポリペプチドを直接導入する技術は当分野で公知であり、一般的には細胞膜を透過するプロセスを伴う。前記技術としては、以下の技術が含まれるがこれらに限定されない：ＳＡＰポリペプチドのマイクロインジェクション；膜小胞内にＳＡＰポリペプチドをカプセル化（例えば、リポソーム、カプセル体、赤血球ゴースト、プロトプラスト等）し、これらを細胞膜と接触させ、それにより、融合させてＳＡＰポリペプチドを細胞内に導入させる技術；物理的（例えば、機械的、化学的、電気的等）方法を用いる技術であって、細胞膜内に一時的に導入される穴を介した拡散によって細胞内に入る巨大分子に依存した方法（例えば、ｓｃｒａｐｅ−ｌｏａｄｉｎｇ、ｂｅａｄ−ｌｏａｄｉｎｇ等）；及び細胞の食作用を利用した天然のエンドサイトーシスを介した取り込み。細胞内に取り込む方法は、受容体を介した経路を利用することができる。ここで、細胞表面で発現する様々な受容体の１つをターゲットとして設定し、キャリア部分として作用する同種のリガンドにＳＡＰポリペプチドを（共有結合的に、又は非共有結合的に）結合させる。静電気的な吸着を用いた方法であって、生存細胞内への蛋白質導入の関する幾つかの方法が記載されており、ここで、蛋白質はカチオン化されて、その後負に帯電した細胞表面に接触させる（特開２００４ー０４９２１４を参照されたい）。
【００７９】
ある態様において、本開示内容は、ＳＡＰポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞を提供する。幾つかの実施形態において、ＣＨＯ細胞は、外因性のＳＡＰポリペプチドを発現する。好ましい実施形態において、ＣＨＯ細胞は、ヒトＳＡＰポリペプチドを発現する。幾つかの実施形態において、本開示内容は、ＳＡＰポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含むＣＨＯ細胞を提供する。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ヒトＳＡＰポリペプチドをエンコードする。前述した任意の技術は、本発明のＳＡＰポリペプチドをＣＨＯ細胞内、又は本明細書中に開示した他の適切な任意の細胞内で「発現させる」為に使用することができる。
【００８０】
野生型細胞又は遺伝的にデザインされた細胞の任意のグリコシル化活性は、誘導性のキュー（例えば、化学的キュー又は物理的キュー）の存在下で誘導可能であり、又は条件制御できる。この場合に、任意で、野生型細胞又は遺伝的にデザインされた細胞は、ＳＡＰポリペプチドをエンコードする核酸、又はＳＡＰポリペプチドを導入する前、最中、又はその後に続いて、誘導剤の存在下で培養することができる。例えば、ＳＡＰポリペプチドを細胞内に導入するステップに続いて、化学的誘導剤にさらすことができ、該誘導剤は、野生型の、又は改変されたＮ−グリコシル化活性を有する１種以上の蛋白質の発現を促すことができる。多数の誘導キューが、野生型の及び／又は改変されたＮ−グリコシル化活性を有する１種以上の蛋白質の条件付発現を促す場合には、細胞は多数の誘導剤に接触させることができる。幾つかの実施形態において、培養培地は、ＳＡＰポリペプチドの所望のグリカン構造を生成するために改変することができる。例えば、血清、グルコース、及び／又は脂質（例えば、ドリコール）の培養培地中の濃度は、所望のＳＡＰグリコバリアントを最適に製造するために改変することができる。幾つかの実施形態において、培養培地の温度、ｐＨ及び／又は浸透圧は、所望のＳＡＰグリコバリアントを最適に製造するために変更することができる。
【００８１】
本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、細胞又は細胞の培地から単離する前又は後に、インビボ又はインビトロで更に処理することができる。更なる処理としては、ＳＡＰポリペプチドの１以上のグリカン残基の改変、又は該ペプチドのグリカン構造（複数可）以外のＳＡＰポリペプチドに対する改変を含むことができる。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチドの更なる処理として、１種以上の非相同性部分の付加（共有結合又は非共有結合）を含めることができる。幾つかの実施形態において、更なる処理は、ＳＡＰポリペプチドの酵素的又は化学的な処理を伴う。前記酵素的な処理については、１種以上のグリコシダーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、又はプロテアーゼにＳＡＰポリペプチドを接触させ、且つＳＡＰポリペプチド上のグリカン残基（例えば、ガラクトース、マンノース、フコース、シアル酸、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン等）の改変、付加、又は削除を誘導するのに充分な時間で接触させることを伴うことができる。Ｎ結合型オリゴ糖鎖のカスタマイズについては、周知技術を用いた所望の糖部分の改変、付加、又は削除を続いて行うことによって達成できる。ペプチド変異体上の炭化水素部分の酵素的切断については、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ（Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350）らが開示しているように、種々のエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを使用することによって達成できる。糖部分を付加する例示的方法については、米国特許第５，８７６，９８０，  ６，０３０，８１５，  ５，７２８，５５４，  及び５，９２２，５７７に記載されている。
【００８２】
ある実施形態において、ＳＡＰグリカン構造の改変は、１種以上の糖ヌクレオチドの存在を必要とする。本発明で使用される例示的な糖ヌクレオチドとしては、ヌクレオチド１リン酸、ヌクレオチド２リン酸、ヌクレオチド３リン酸、又はそれらの類似体が含まれる。好ましい実施形態において、改変された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、又はＧＤＰ−グリコシドから選択される。更に好ましくは、糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、ＣＭＰ−Ｎ−グリコリルノイラミン酸、又はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。ある実施形態において、改変された糖ヌクレオチドは、改変された糖残基をＳＡＰポリペプチドに付加するために利用される。また、糖ヌクレオチドのＮ−アセチルアミン誘導体も、本発明の方法において有用である。
【００８３】
グリコシル部分の化学的な付加又は除去は、適切な任意の方法によって行うことができる。例えば、化学的な脱グリコシル化は、ＳＡＰポリペプチドを、トリフルオロメタンスルホン酸又は別の強酸にさらすことを含むことができる。こうした処理によって、結果として、ペプチド自体は無傷のままである一方で、結合した糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんど又は全ての糖が切断される。化学的な脱グリコシル化の方法については、以下の文献に記載されている：Ｈａｌｄｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５９：  ５２；及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１８：  １３１。例えば、化学処理としては、ＳＡＰポリペプチドの改変を誘導するのに充分な時間で、フッ化水素酸等の酸に改変ＳＡＰポリペプチドを接触させることを伴う。特定の条件下で、フッ化水素酸は、リン酸をグリカン上に維持する一方で、グリカンにホスホジエステル結合したマンノース残基を特異的に除去する。改変ＳＡＰポリペプチドは、更に、リン酸基を付加したり、又は１種以上のＮ−グリカンから除去する処理を行うことができる。例えば、改変されたＳＡＰポリペプチドは、マンノシルキナーゼ又はマンノシルホスファターゼに接触させることができる。
【００８４】
ある態様において、ＳＡＰポリペプチドグリカン構造（Ｎ結合型オリゴ糖又はＯ結合型オリゴ糖）上の、末端の糖部分のみを改変することが望ましい。幾つかの実施形態において、ＳＡＰグリカン構造の１以上の側鎖については、少なくとも１種の末端シアル酸残基を付加、除去、置換、又は改変することによって改変される。本明細書中で述べるグリカン改変のための適切な方法は、ＳＡＰグリカン構造上の末端糖部分のみを改変するために使用することができる。幾つかの実施形態において、α２，６結合、α２，８結合、又はα２，９結合を有する末端シアル酸残基は、１以上の末端α２，３結合シアル酸残基に置換される。特定の態様において、末端にα２，６結合シアル酸残基を有するヒトＳＡＰは、１以上の末端α２，６結合シアル酸残基を、１以上のα２，３結合シアル酸残基に置換するため、本開示内容方法の１つに従って改変される。 幾つかの実施形態において、末端α２，３結合シアル酸残基は、改変されて、１以上のα２，６結合の、α２，８結合の、及び／又はα２，９結合のシアル酸残基が付加される。
【００８５】
ある態様において、本発明のＳＡＰポリペプチドを製造するプロセスは、ＳＡＰポリペプチドを脱グリコシル化する第一ステップを伴う。ＳＡＰポリペプチドは、部分的に又は完全に脱グリコシル化することができる。幾つかの実施形態において、脱グリコシル化する第一ステップは、ＳＡＰポリペプチド上のグリカン構造のうち少なくとも１つの側鎖から末端糖部分のみを除去することを伴う。幾つかの実施形態において、脱グリコシル化する第一ステップは、少なくとも１つのα２，６結合のシアル酸残基を除去する。幾つかの実施形態において、脱グリコシル化する第一ステップは、少なくとも１種のＯ結合型グリカンを除去する。幾つかの実施形態において、脱グリコシル化する第一ステップは、少なくとも１種のＮ結合型 グリカンを除去する。幾つかの実施形態において、脱グリコシル化する第一ステップは、Ｏ結合型グリカン及びＮ結合型グリカンの全てを除去する。幾つかの実施形態において、（部分的に又は完全に）脱グリコシル化されたＳＡＰポリペプチドは、本開示内容の方法に従って更に処理され、該方法には、（部分的に又は完全に）脱グリコシル化されたＳＡＰポリペプチドを酵素的又は化学的に改変することや、若しくは部分的に又は完全に脱グリコシル化されたＳＡＰポリペプチドを細胞に導入することや、又はそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。ここで、該方法（複数可）により、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体が生成される。幾つかの実施形態において、部分的に又は完全に脱グリコシル化されたＳＡＰポリペプチドを細胞内に導入した後、本開示内容の方法に従って更にインビボ又はインビトロで該ペプチドを改変して、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体を生成することができる。同様に、本明細書中に記載の酵素的又は化学的方法を用いてインビトロで改変されたＳＡＰポリペプチドであって、且つ部分的に又は完全に脱グリコシル化されたＳＡＰポリペプチドを細胞内に導入して、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体を生成することができる。
【００８６】
本発明のＳＡＰポリペプチドは細胞内で処理することができるが、必ずしも細胞内で処理する必要がない点を理解されたい。例えば、本開示内容は、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体を生成する細胞フリーな方法も提供する。幾つかの態様において、細胞フリーな方法としては、野生型細胞（例えば、真菌細胞、植物細胞、又は動物細胞）、又は少なくとも１種の改変グリコシル化活性を有する遺伝的にデザインされた細胞から調製された細胞溶解産物にＳＡＰポリペプチドをグリコシル化条件の下で接触させるステップを含む。ここで、前記細胞溶解産物に前記ＳＡＰポリペプチドを接触させることにより、前記ＳＡＰポリペプチドにＮ結合型オリゴ糖又はＯ結合型オリゴ糖を結合させたり、又は前記ＳＡＰポリペプチド上の既存のＮ結合型オリゴ糖又はＯ結合型オリゴ糖が改変されたりする。「Ｎ−グリコシル化条件」とは、所望の改変Ｎ−グリコシル化を可能にする条件の下で、混合物（例えば、ＳＡＰポリペプチドと細胞溶解産物の混合物）をインキュベートすることを意味する。
【００８７】
細胞溶解産物中の活性又は１種以上のグリコシル化活性の完全性を保存する細胞溶解産物を得るための適切な方法としては、適切なバッファ及び／又は阻害剤を使用することが含まれ、該阻害剤としてはヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤が含まれ、該阻害剤は、細胞溶解産物中のＮグリコシル化活性を保存又はその変化を最小限にする。前記阻害剤としては、例えば、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１四酢酸（ＥＧＴＡ））、プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、及びホスファターゼ阻害剤としては、例えば、リン酸、フッ化ナトリウム、及びバナジウム酸が挙げられる。阻害剤は、対象となるＮ−グリコシル化活性（複数可）と干渉しない、又は最小限にしか逆効果を及ぼさないように選択することができる。酵素活性を含有する溶解物を得るための適切なバッファ及び条件については、例えば以下の文献に記載されている：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９９）；  Ｔｉｅｔｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｂｕｒｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｓｈｗｏｏｄ，  ｅｄｓ．  Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  （１９９９）。
【００８８】
細胞溶解産物については、干渉する物質の存在を適宜排除又は最小限にするために更なる処理を行うことができる。必要ならば、当業者にとって公知である種々の任意の方法を用いることにより、細胞溶解物を画分化することができる。該方法としては、例えば、亜細胞画分化、クロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換、疎水性及び逆相、サイズ排除、アフィニティ、及び疎水性電荷誘導クロマトグラフィー）（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；  Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  ８１４：７１−８１  （１９９８）を参照）又は他の適切な任意の精製技術が挙げられる。
【００８９】
細胞溶解産物は、細胞全体のオルガネラを無傷状態に維持及び／又は機能性を維持した状態で調製することができる。例えば、溶解産物は、無傷の粗面小胞体、無傷の滑面小胞体、又は無傷のゴルジ体のうち１以上を含む。無傷の細胞オルガネラを含有する溶解物を調製し、及び該オルガネラの機能を試験するための適切な方法については、例えば、以下の文献に記載されている：Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６（７）：４３２９−４３３３；  Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６（７）：４３２２−４３２８；  Ｒｅｘａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１４（２）：２１９−２２９；  ａｎｄ  Ｐａｕｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３６７（２）：２６５−２７３。これら各文献の開示内容全体も本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ＳＡＰポリペプチドは、グリコシル化活性を有するただ１種類の精製蛋白質に接触させることができる。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチドは、グリコシル化活性を有する複数種の精製蛋白質に接触させることができる。グリコシル化活性を有する１種以上の蛋白質は、標準的な蛋白質単離技術を用いて精製することができる。上述したように、ＳＡＰポリペプチドは、該ＳＡＰポリペプチドの改変を誘導するのに充分な時間で、適切なバッファ中の１種以上の蛋白質に接触させることができる。ＳＡＰポリペプチドは、複数種の蛋白質と同時に又は連続して接触させることができる。ＳＡＰポリペプチドが、グリコシル化活性を有する複数種の蛋白質と連続して接触している場合には、前記ＳＡＰポリペプチドは、必ずしも必要ではないが、１以上のステップ後に精製することができる。即ち、ＳＡＰポリペプチドは、蛋白質活性「Ａ」と接触させ、その後、該分子を蛋白質活性「Ｂ」に接触させる前に精製することができる。このようにペプチドを改変する方法については、例えば、以下の公知文献がある：Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ  （２００２）  ３０（６）：７１６−７２０  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｇａｗａ  （２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８２（３）：６７８−６８２。そして、該文献の開示内容全体も本明細書に組み込まれる。
【００９１】
ある態様において、本開示内容方法は、ＳＡＰポリペプチドを単離するステップを含み、例えば、細胞や細胞溶解産物の成分から単離する方法がある。蛋白質単離のための多くの標準的な技術が公知となっている。例えば、ポリペプチドを単離する方法として、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、金属キレート又はイムノアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性-相互作用クロマトグラフィー、沈降、分別可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、免疫沈降、遠心分離（例えば、超遠心、スクロース勾配遠心等）、又はこれらの任意の組合せ。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチドは、ポリペプチドの精製を促進するためにアフィニティタグと結合することができる。ＳＡＰ精製のための適切なアフィニティタグとして以下の物が含まれるが、これらに限定されない：キチン結合蛋白質（ＣＢＰ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ストレプトアビジン、ビオチン、及びポリ（Ｈｉｓ）タグ。アフィニティタグは、組み換え型蛋白質の一部として（即ち、非相同性親和性タグドメイン及びＳＡＰポリペプチドドメインを含む融合蛋白質として）生成することができ、又はインビボ又はインビトロでＳＡＰポリペプチドに（共有結合的に又は非共有結合的に）結合させることができる。幾つかの実施形態において、多数の精製ステップを用いて、ＳＡＰポリペプチドを単離することができる。例えば、精製タグを含むＳＡＰポリペプチドは、アフィニティ精製を用いて、細胞溶解産物又は複数成分混合物から、アフィニティー精製することができる。アフィニティー精製されたＳＡＰポリペプチドは、更なる精製ステップ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、又はＲＰ−ＨＰＬＣ）によって、更なる精製を行い、望ましくない任意の少量混入物を除去することができる。本発明ポリペプチドが細胞内で生成される場合、ＳＡＰポリペプチドは、細胞自体又は細胞を培養した培地から単離することができる。幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは生成されて、細胞から培養培地へ分泌される。これらの実施形態において、単離ステップは、（例えば遠心分離によって）可溶性のＳＡＰ含有画分から、細胞画分を分離することを含むことができる。
【００９２】
幾つかの態様において、ＳＡＰポリペプチドは、該ターゲット分子を１種以上のＮ−グリコシル化活性と接触させる前に、固相担体に結合させることが有利となり得る。こうした結合により、Ｎ−グリコシル化改変の後の精製を容易にすることができる。適切な固相担体としては、マルチ・ウェル・アッセイ・プレート、粒子（例えば、磁気粒子又はエンコード粒子）、クロマトグラフィーカラム、又はメンブレンが含まれるがこれらに限定されない。
【００９３】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載の任意の改変ＳＡＰポリペプチドは、酵素的又は化学的手段を用いて、非相同部分と結合させることができる。「非相同部分」とは、前記改変されたターゲット分子に（例えば、共有結合的又は非共有結合的に）結合させた任意の置換部分を意味し、ここで、置換部分は、ＳＡＰポリペプチド上に元来存在している置換部分とは異なる。非相同部分としては、例えば、水-可溶性ポリマー、及び水-不溶性ポリマー、ターゲティング部分、治療用部分、診断用部分並びに生体分子が含まれる。
【００９４】
本発明のＳＡＰポリペプチドは、１以上の「改変された」糖残基を含むことができる。改変基は、酵素的手段、化学的手段、又はこれらの組合せによって、糖部分に結合させることができ、これにより、改変された糖、例えば改変ガラクトース、フコース、又はシアル酸が生成される。改変シアル酸を使用する場合には、シアニル−トランスフェラーゼ、又はトランス−シアリダーゼのいずれかを、該方法において使用することができる。糖は、改変部分に結合することができる任意の位置において置換を行うことができ、該置換によってもなお、改変された糖をペプチドに結合させるために使用される酵素の基質として糖が機能することが可能となっている。
【００９５】
一般的に、糖部分及び改変基は、反応基の使用を介して互いに結合しており、該反応基は、典型的には結合プロセスによって、新たな有機的官能基又は非反応種に転換される。糖反応性官能基（複数可）は、糖部分上の任意の部位に位置することができる。本発明を実施する際に有用となる反応基及び反応の種類は、生物結合化学（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）においてよく知られた一般的なものである。反応性糖部分を用いた利用可能な現時点で好まれる反応の種類は、比較的マイルドな条件下で進行する反応である。これらに含まれるものとして、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：求核置換（例えば、アシルハロゲン化物を用いたアミン及びアルコールの反応、活性エステル）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、並びに炭素−炭素及び炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル付加反応、ディールス・アルダー付加反応）。これらの反応及び他の有用な反応については、例えば以下の文献で議論されている：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１；  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９６；  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌ．  １９８，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １９８２。
【００９６】
糖核（ｓｕｇａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）からの有用な反応性官能基ペンダント、又は改変基としては、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：（ａ）カルボキシル基又は様々なそれらの誘導体（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル、N−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトリフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル及び芳香族エステル）；（ｂ）ヒドロキシル基（ここで、例えば、エステル、エーテル、アルデヒド等に変換可能である）；（ｃ）ハロアルキル基（ここで、ハロゲン化物は、後に求核基に置換することができ、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カロボアニオン、又はアルコキシドイオンが挙げられ、該置換によって、ハロゲン原子の官能基部位で新たな基の共有結合が結果的に生じる）；（ｄ）ジエノフィル基（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に関与する能力があり、例えばマレイミド基がある）；（ｅ）アルデヒド又はケトン基（続いて、誘導体化することが可能であり、該誘導体化は、カルボニル誘導体の形成（例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、又はオキシム）を介するか、又はグリニャール付加若しくはアルキルリチウム付加（ａｌｋｙｌｌｉｔｈｉｕｍ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）等の機構を介する）；（ｆ）スルホニルハロゲン基（続いてアミンと反応し、 例えば、スルホンアミドを形成することを目的とする）；（ｅ）チオール基（例えば、ジスルフィドに変換したり、又はアルキル及びアシルハロゲン化物と反応させたりすることが可能である）；（ｈ）アミン又はメルカプト基（例えば、アセチル化したり、アルキル化したり、又は酸化したりすることができる）;（ｉ）アルケン（例えば、環状付加、アシル化、マイケル付加、メタセシス、ヘック反応等が可能である）（ｊ）エポキシド（例えば、アミンやヒドロキシル化合物と反応可能である）。
【００９７】
反応性官能基は、反応性糖核又は改変基を組み立てるのに必要な反応に関与しないように又は干渉しないように選択することができる。或いは、反応性官能基は、保護基の存在によって、反応に関与することから保護することができる。選択した反応条件の設定に干渉しないように、特定の官能基を保護する方法については当業者に理解されている。有用な保護基の例については、例えば以下の文献を参照されたい：Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１。
【００９８】
幾つかの実施形態において、改変された糖は、活性化された糖である。本発明において有用である活性化された改変糖は、典型的にはグリコシドであり、化学合成的に変更されて、活性化された脱離基を含む。本明細書中で使用される用語「活性化された脱離基」とは、酵素制御求核置換反応において、容易に置換される部分のことを意味する。多くの活性化された糖が当分野で公知となっており、例えば、以下の文献を参照されたい：Ｖｏｃａｄｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，，  Ｖｏｌ．  ２，  Ｅｒｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ：  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ２０００；  Ｋｏｄａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３４：  ６４１９  （１９９３）；  Ｌｏｕｇｈｅｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  ３７７１７  （１９９９））。こうした脱離基の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシル、メシレート、トリフラート等が含まれる。本発明の使用目的においては、活性化された脱離基は、グリコシドをアクセプターに酵素的に転移することを有意にそして立体的に妨げない基であることが好ましい。従って、活性化されたグリコシド誘導体の好ましい実施形態として、グリコシル・フッ化物及びグリコシル・メシレートが含まれるが、グリコシル・フッ化物が特に好ましい：前記グリコシル・フッ化物の中で、以下のものが最も好ましい：α−ガラクトシルフッ化物、α−マンノシルフッ化物、α−グルコシルフッ化物、α−フコシルフッ化物、α−キシロシルフッ化物、α−シアニルフッ化物、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、β−ガラクトシルフッ化物、β−マンノシルフッ化物，ｂｅｔａ−グルコシルフッ化物、β−フコシルフッ化物、β−キシロシルフッ化物、β−シアニルフッ化物、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物。
【００９９】
ある態様において、改変された糖残基は、１種以上の水−可溶性ポリマーと結合している。多くの水−可溶性ポリマーが当業者に知られており、本発明を実施するに当たって有用である。用語「水−可溶性ポリマー」とは、以下のような化学種を含む：糖類（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）；核酸；合成的ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール））；ペプチド、蛋白質等。本発明は、共役部分の残りが結合できる部位をポリマーが含まなくてはならないという唯一の制限のもとで、任意の水−可用性ポリマーを用いて実施することができる。
【０１００】
水−可溶性ポリマー及び糖類の活性化のための方法及び化学、並びに糖類及びポリマーを様々な化学種に結合させるための方法が文献に記載されている。ポリマーを活性化させるために用いられるありふれた方法として、官能基を以下の物によって活性化させることが含まれる：臭化シアン、過ヨウ素酸、グルタルアルデヒド、バイ−エポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、スルホニルハロゲン化物、トリクロロトリアジン等（以下の文献を参照されたい：Ｒ．  Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ，  （１９９１），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｓ．  Ｓ．  Ｗｏｎｇ，  （１９９２），  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；  Ｇ．  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ    Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．；  Ｄｕｎｎ，  Ｒ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．  ４６９，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  １９９１）。
【０１０１】
ある態様において、改変された糖残基は、１種以上の水−不溶性ポリマーと結合されている。幾つかの実施形態において、水−不溶性ポリマーへの結合を使用して、治療用ペプチドを制御された態様で送達することができる。ポリマー性薬剤送達システムは当分野で公知であり、例えば、以下の文献を参照されたい：Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ    ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．  ４６９，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  １９９１。実質的にあらゆる既知の薬剤送達システムが本発明の結合物に提供できることを当業者は理解するであろう。
【０１０２】
代表的な水−不溶性ポリマーとして、以下の物が含まれるがこれらに限定されない：ポリホスファゼン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキサイド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ（イソブチルメタクリレート)、ポリ(ヘキシルメタクリレート)、ポリ（イソデシルメタクリレート)、ポリ（ラウリルメタクリレート)、ポリ(フェニルメタクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ（イソブチルアクリレート)、ポリ（オクタデシルアクリレート)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキサイド)、ポリ（エチレンテレフタレート)、ポリ(ビニル酢酸)、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、及びポリビニルフェノール、並びにこれらのコポリマー。
【０１０３】
本明細書中で議論したこれら及び他のポリマーについては、市販の販売元から容易に手に入れることができ、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （セントルイス，  ミズーリ州．）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ワレントン，  ペンシルバニア州．）、Ａｌｄｒｉｃｈ  （ミルウォーキー，  ウィスコンシン．）、Ｆｌｕｋａ  （ロンコンコマ，ニューヨーク州．）、及びＢｉｏＲａｄ  （リッチモンド、カルフォルニア州）が挙げられる。または、標準的な技術をもちいて、上記販売元から入手したモノマーから合成される。本発明の結合物において有用な生分解性ポリマーの代表的な物として以下の物が含まれるがこれらに限定されない：ポリラクチド、ポリグリコール酸及びこれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ無水和物、ポリオルトエステル、これらのブレンド、並びにこれらのコポリマー。特に有用な組成物としては、ゲル（例えばコラーゲンやプルロニックを含むゲル）を形成する組成物がある。
【０１０４】
好ましい実施形態において、１以上の改変された糖残基は、１種以上のＰＥＧ分子と結合される。
【０１０５】
ある態様において、前記改変された糖は、生体分子と結合される。本発明の生体分子として以下の物が含まれるがこれらに限定されない：機能的蛋白質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば、単一のヌクレオチド、又はヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び、一本鎖及び多本鎖核酸）、レクチン、受容体又はこれらの組合せ。幾つかの好ましい生体分子 は、本質的に非蛍光であるか、又はアッセイ中に蛍光マーカーとして使用するのに不適切である最小量の蛍光しか放出しない。他の生体分子は、蛍光性であってもよい。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、前記生体分子は、ターゲット部分となっている。本明細書中で使用される「ターゲット部分」及び「ターゲット薬剤」は、特定の組織又は生体領域中に選択的に局在化させる化学種を意味する。幾つかの実施形態において、生体分子は、特定の細胞内区画に本発明のＳＡＰポリペプチドを向かわせるために選択される。それによって、組織に送達される誘導体化されていないペプチドの送達量と比べて、細胞内区画への前記ペプチドの送達を強化している。局在化については、分子決定因子、ターゲット薬剤又は結合物の分子サイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用等の特定の認識を介して行われる。薬剤を特定の組織又は領域に向かわせる他の機構は、当業者に知られている。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、改変された糖は、治療用成分を含む。治療用成分及び生体分子のカテゴリー間で重複があり、即ち、多くの生体分子は、治療用の特性及び潜在能力を有していることを当業者は理解するであろう。
【０１０８】
有用な治療用成分の分類として、例えば、以下のものが含まれる：非ステロイド性抗炎症薬；ステロイド性抗炎症薬；アジュバンド；抗ヒスタミン性薬剤；鎮咳性薬；かゆみ止め薬；抗コリン作用性薬；抗嘔吐薬及び制吐薬；食欲低下薬；中枢興奮剤；抗不整脈薬；β−アドレナリンブロッカー剤；強心剤；血圧降下薬；血管拡張剤；血管収縮剤；抗潰瘍剤；麻酔薬；抗欝剤；トランキライザー及び鎮静剤；抗精神病薬；並びに抗菌剤。
【０１０９】
本発明を実施する際に有用な他の薬剤成分として、以下の物が含まれる：抗新生物薬、殺菌薬、抗エストロゲン、及び代謝拮抗薬。また、該分類に含まれるものとして、診断（例えば、イメージング）及び治療法の両方の目的となる放射性同位体ベースの薬剤、及び結合毒素がある。
【０１１０】
また、前記治療用成分は、以下の物であっても良い：ホルモン、筋弛緩剤、抗けいれん薬、骨活性薬（ｂｏｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、内分泌調整薬、糖尿病調整薬、アンドロゲン、抗利尿薬、カルシトニン製剤。
【０１１１】
他の有用な改変群としては、免疫操作薬、免疫抑制剤等が含まれる。また、抗炎症性活性を有する群（例えば、スリンダク、エトドラク、ケトプロフェン 及びケトロラク）も有用である。本発明に関連した他の有用な薬剤は、当業者にとって明らかであろう。
【０１１２】
本開示内容の方法によって生成された改変Ｎ−グリコシル化ＳＡＰポリペプチドは、均一（即ち、ＳＡＰポリペプチドサンプルが、特定のＮ−グリカン構造に統一されている)又は実質的に均一となることができる。「実質的に均一」とは、以下の割合のＳＡＰポリペプチドが同一かつ特定のＮ−グリカン構造を含むことを意味する：少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約２７％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、インビトロでの単球から線維芽細胞への分化を阻害するためのＩＣ50が、ヒト血清から単離した野生型ＳＡＰの対応サンプルのＩＣ50の２分の１、３分の１、４分の１、１０分の１、又は１００分の１よりも少ない。線維芽細胞分化に関する応答であって、ＳＡＰに対する末梢血単核球（ＰＢＭＣ）又は単球細胞の応答を決定するために特徴付けられた方法が数多く存在する。こうした方法を用いることにより、ヒト血清由来ＳＡＰ、任意の他のＳＡＰ変異体ポリペプチド、又は他の線維芽細胞抑制剤若しくは活性剤のサンプルと比較して、本発明に係る任意のＳＡＰポリペプチド変異体の相対的な効能を決定することができる。これらの方法の使用に適したＰＢＭＣ又は単球は、様々な組織の培養株から得ることができる。或いは、線維芽細胞分化アッセイ用の適切な細胞は、ＰＢＭＣ又は単球細胞を含む任意の生物学的サンプルから得ることができる。生物学的サンプルは、血清、プラズマ、健康な組織、又は線維組織から得ることができる。一般的に、線維芽細胞分化アッセイは、様々な濃度のＳＡＰポリペプチドを有する培地中にＰＢＭＣ又は単球細胞をインキュベートして、線維芽細胞分化の度合いを決定することによって行われる。ＳＡＰの濃度は０．０００１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲にわたってもよく、幾つかの実施形態において、以下の濃度であってもよい：０．００１μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、又は５００μｇ／ｍＬ。幾つかのアッセイにおいて、培地には、１−１００ｎｇ／ｍｌのｈＭＣＳＦを添加することができる；好ましいｈＭＣＳＦ濃度は、２５ｎｇ／ｍＬである。ＰＢＭＣ及び単球が線維芽細胞に分化したことは、当業者によって決定することができる。一般的に、線維芽細胞は、長く伸びた紡錘形と卵型の核の存在とを有する粘着性の細胞として形態学的に定義されている。 幾つかのアッセイにおいて、例えば、倒立顕微鏡を用いて直接カウントすることによって線維芽細胞を数える前に、細胞は固定されて、Ｈｅｍａ  ３で染色される。線維芽細胞分化の量は、ＳＡＰに対する細胞応答を表すものとして当業者に解釈される。本開示内容の実施例に表されるように、線維芽細胞分化の抑制度合いが大きい場合には、ＳＡＰ応答の度合いが大きいことを表す。線維芽細胞分化を測定する別の方法では、線維芽細胞に特異的な細胞表面マーカーや分泌因子の発現を検出することを伴う（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１ｒａ、ＥＮＡ−７８／ＣＸＣＬ−５、ＰＡＩ−１）、フィブロネクチン，  コラーゲン−１）。細胞表面マーカー又は分泌因子を検出及び／又は定量する方法は当分野で公知であり、１種以上の線維芽細胞特異的マーカーに対する免疫反応性の抗体を用いた様々なＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳベースの技術が含まれるがこれらに限定されない。本開示内容の実施例に記載されているが、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の発現を測定することは、線維芽細胞分化を測��する効果的な方法である。
【０１１４】
ＳＡＰポリペプチドのＮ−グリコシル化（例えば、改変されたＮ−グリコシル化）を検出及び／又は特徴づける方法として、ＤＮＡシーケンサー補助（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  （ＤＳＡ））、蛍光ラベル糖鎖電気泳動  （ＦＡＣＥ）、又は表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）が含まれる。例えば、分析としては、ＤＳＡ−ＦＡＣＥを用いることができ、ここで、例えば、固定化（例えば膜上に）される前に糖蛋白質は変性させる。その後、糖蛋白質は、ジチオトレイトール（ＤＡＴＡ）又はβ−メルカプトエタノール等の適切な還元剤を用いて還元することができる。蛋白質のメルカプト基は、ヨード酢酸等の酸を用いてカルボキシル化することができる。次にＮ−グリコシダーゼＦ等の酵素を用いて、Ｎ−グリカンを蛋白質から遊離させることができる。任意で、Ｎ−グリカンは、還元的アミノ化することによって、再構築及び誘導体化することができる。その後、前記誘導体化Ｎ−グリカンは、濃縮することができる。Ｎ−グリカン分析に適切な機器としては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３７７  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれる。データ分析については、例えば、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）．３．１ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行うことができる。任意で、単離されたマンノプロテインは、更に１種以上の酵素で処理して、該Ｎ−グリカンの状態を確認することができる。例示的な酵素としては、例えば、α−マンノシダーゼ又はα−１，２  マンノシダーゼが含まれる。Ｎ−グリカン分析の更なる方法としては、以下のものが含まれる：例えば、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ)、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（順相又は逆相）、及びイオン交換クロマトグラフィー（例えば、グリカンがラベルされていない場合には、パルス電流を用い、グリカンが適切にラベルされている場合には、ＵＶ吸収や蛍光を用いる）。また、以下の文献も参照されたい：  Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１（４）：２７５−２８１  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １７（２）：５５９−５６４。前記文献の開示内容全体は、本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
処理方法
１つの態様において、本開示内容は、患者においてＳＡＰ応答異常を治療するための方法を提供し、該方法は、治療を必要とする患者に本発明のＳＡＰポリペプチド変異体を治療上有効量で投与することによる。治療における投与量及び頻度は、当業者が決定することができ、患者の症状、年齢、及び体重、並びに治療又は予防すべき異常の性質や発病度合いによって変動するであろう。幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチド変異体は、患者に対して、１日に１回若しくは２回、１週間に１回若しくは２回、ひと月に１回若しくは２回、又は症状の発症直前若しくは発症時に投与される。
【０１１６】
投与量については、当業者に知られた技術又は本明細書中の教示によって容易に決定することができる。ＳＡＰの毒性及び治療用効率は、実験動物での標準的な医薬的手続によって決定することができ、例えば、ＬＤ50及びＥＤ50を決定することができる。前記ＥＤ50（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｏｓｅ  ５０）は、５０％の動物群において特定の効果を生み出すのに必要な薬剤量である。ＬＤ50（Ｌｅｔｈａｌ  Ｄｏｓｅ  ５０）は、５０％のサンプル群を殺す薬剤量である。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、ＳＡＰ応答異常は線維症である。線維症のための治療としてＳＡＰを使用することについては、米国特許出願２００７／０２４３１６３号に記載されており、本明細書中に組み込まれる。対象の方法を用いた治療を受けることができる線維症関連の異常として、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：コラーゲン病、間質性肺疾患、ヒト線維性肺疾患（例えば、閉塞性細気管支炎、特発性肺線維症、既知の病因からの肺線維症、肺疾患における腫瘍ストロマ、肺に影響を及ぼす全身性強皮症、Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ症候群、石炭労働者の塵肺症、石綿症、珪肺、慢性肺高血圧症、ＡＩＤＳ関連肺高血圧症、サルコイドーシス、中度から深刻なものまでの喘息等）、繊維性の血管病、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、静脈瘤、冠梗塞、脳梗塞、心筋線維症、筋骨格線維症、術後癒着、ヒト腎臓病（例えば、腎炎症候群、アルポート症候群、ＨＩＶ関連ネフロパシー、腎嚢胞、ファブリー病、糖尿病性ネフロパシー、慢性糸球体腎炎、全身性狼瘡に関連した腎炎等）、全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、初期スカロッピング胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃａｌｌｏｐｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ  （ＰＳＣ））、肝臓線維症、肝硬変、腎臓線維症、肺線維症、嚢胞性繊維症、慢性移植片対宿主病、強皮症（局所性及び全身性）、グレーブス眼症、糖尿病性網膜症、緑内障、ペーロニー病、ペニス線維症、膀胱鏡検査後の尿道狭窄症、外科手術後の内側癒着、瘢痕化、骨髄線維症、突発性腹膜後線維症、既知の病因からの腹膜性線維症、薬剤誘導麦角中毒、良性又は悪性癌に付随する線維症発生、微生物感染付随する線維症発生（例えば、ウィルス性、細菌性、寄生虫性、真菌性等）、アルツハイマー病、炎症性腸疾患に付随する線維症（クローン病及び顕微鏡的大腸炎における狭窄形成を含む)、ストローマ細胞腫瘍、粘膜炎、化学的又は環境的な損傷によって誘発される線維症（例えば、癌化学療法、殺虫剤、又は放射線（例えば、癌放射線治療））。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、線維症関連の異常は、以下のものから選択される：全身性又は局所性強皮症、ケロイド、肥大性傷跡、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺炎、及び線維症、突発性肺線維症、肝硬変、慢性Ｂ型又はＣ型肝炎感染の結果生じる線維症、腎臓病、損傷組織の結果から生じる心臓病、黄斑改質、並びに網膜症及びガラス体網膜症。幾つかの実施形態において、線維症関連異常は、化学療法の薬剤、放射線誘発線維症、並びに傷及び火傷から生じる。幾つかの実施形態において、線維症関連異常又は症状は、術後の傷跡、例えば、続いて行われる線維柱帯切除術、又は他の眼のろ過手術、から生じる。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、ＳＡＰ応答性異常は、過敏性異常であり、例えば、Ｔｈ１又はＴｈ２応答を介したものが挙げられる。また、過敏症治療用としてのＳＡＰの使用については、米国仮特許出願番号６１／２０９，７９５に記載されており、本明細書に組み込まれる。ＳＡＰを用いた治療を受けることができる過敏性関連異常としては、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性気管支収縮、アレルギー性呼吸困難、アレルギー性である肺粘液生成の増加、アトピー性湿疹、皮膚炎、蕁麻疹、アナフィラキシー、肺炎及びアレルギー性−喘息。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、アナフィラキシー等の様々な抗原に対するアレルゲン特異的免疫応答を治療するために使用することができ、以下の抗原が含まれるがこれらに限定されない：抗菌剤（例えば、セファロスポリン、スルホンアミド、ペニシリン及び他のβ−ラクタム）、抗痙攣薬（例えば、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、ダプソン、アロプリノール、及びミノサイクリン）、化学療法剤（例えば、タキサン、白金化合物、アスパラギナーゼ、及びエピポドフィロトキシン）、ヘパリン、インシュリン、プロタミン、アスピリン、及び他の非ステロイド性抗炎症性薬剤、筋弛緩剤（例えば、サクシニルコリン、アトラクリウム、ベクロニウム、及びパンクロニウム）、誘導剤（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、バルビツレート、エトミデート、プロポフォール）、麻酔薬（例えば、フェンタニル、メペリジン、モルヒネ）、血管内容量拡張のためのコロイド、造影剤、血液製剤、ラテックス、動物産物、動物鱗屑、イエダニ、昆虫（例えば、牙、針、毒液)、化粧品、金属（例えば、ニッケル、コバルト、及びクロム酸）、植物、胞子、花粉、食物（例えば、ミルク、卵、小麦、大豆、ピーナッツ、及び木の実、シーフード）、ワクチン接種、及び真菌性の抗原（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，  Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ，  Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ，及びＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）。 
【０１２１】
幾つかの実施形態において、ＳＡＰ応答性異常は、自己免疫疾患であり、例えば、Ｔｈ１又はＴｈ２応答を介するものが挙げられる。また、自己免疫疾患のための治療剤としてＳＡＰを使用することについては、米国仮特許出願６１／２０９，８４５に記載されており、本明細書中に組み込まれる。ＳＡＰを用いた治療を受けることができる自己免疫関連の異常として、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、乾癬性関節炎、自己免疫性心筋炎、天疱瘡、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーヴス病、アジソン病、自己免疫性肝炎、慢性Ｌｙｍｅ関節炎、家族性拡張型心筋症、若年性皮膚筋炎、多発性軟骨炎、シェーグレン症候群、乾癬、若年性突発性関節炎、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患、及び移植片対宿主病。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、ＳＡＰ応答性異常は粘膜炎である。また、粘膜炎のための治療材としてＳＡＰを使用することについては、米国仮特許出願１２／２１７，６１４に記載されており、本明細書中に組み込まれる。本発明の方法は、口内、食道、及び胃腸の粘膜炎、並びに胃潰瘍、十二指腸潰瘍、又は胃及び食道のびらんの治療に有用である可能性がある。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチド変異体は、炎症性の病気又は症状を治療するために使用することができる。幾つかの実施形態において、炎症性疾患は、ウィルス性、細菌性、真菌性、又は寄生虫性の感染であってもよい。また、ウィルス性感染のための治療剤としてＳＡＰを使用することについては、米国特許６，４０６，６９８及び国際公開ＷＯ１９９７／０２６９０６に記載されており、本明細書中に組み込まれる。
【０１２４】
医薬的調製物及び配合物
ある実施形態において,本明細書中に記載の方法は、少なくとも１種の本発明のＳＡＰポリペプチド変異体を、治療用薬剤として被験者に投与することを伴う。本発明の治療用薬剤は、１種以上の生理学的に許容可能なキャリア又は賦形剤を用いた従来の態様で配合することができる。例えば、治療用薬剤並びにそれらの生理学的許容可能な塩及び溶媒和物は、以下の方法で投与するために配合することができる：例えば、注入（例えば、ＳｕｂＱ、ＩＭ，ＩＰ）、吸入若しくは吹送（口又は鼻のいずれかを介して）、又は経口、口腔内、舌下、経皮的、鼻腔、非経口（腸管外）、若しくは直腸の投与。ある実施形態において、治療用薬剤は、ターゲット細胞が存在する部位（即ち、特定の組織、器官、又は液体（例えば、血液、脳脊髄液、腫瘍量等））に局所的に投与することができる。
【０１２５】
また、本発明は、本発明に係る任意のＳＡＰポリペプチド変異体の利用を更に提供し、該利用とは、本明細書中に記載した異常又は症状を患者において治療又は予防するための薬品を製造する際の利用であり、例えば、本明細書中に記載した異常又は症状の治療のための薬品を製造する際にＳＡＰポリペプチド変異体を利用することである。幾つかの態様において、本発明に係る任意のＳＡＰポリペプチド変異体は、本明細書中に記載した病気又は症状の治療又は予防を行う際に使用するための医薬製剤を製造するために使用することができる
【０１２６】
治療用薬剤は、種々の投与モードのために配合することができ、該投与モードとしては、全身性及び局在性又は局所性の投与が含まれる。技術及び配合については、一般的に、以下の文献に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ    Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ。非経口（腸管外）投与に関しては、注射が好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下の注入が含まれる。注射に関しては、化合物は液体溶液中に配合することができ、好ましくは、生理学的適合可能なバッファ（例えば、ハンクス溶液、又はリンガー溶液）中に配合する。更に、前記化合物は、固体形態で配合して、使用直前に溶解又は懸濁することもできる。また、凍結乾燥形態も含まれる。幾つかの実施形態において、治療用薬剤は、当業者に知られた種々の方法で細胞に投与することができ、該方法として以下の方法が含まれるがこれらに限定されない：リポソーム中でカプセル化、イオン浸透療法、他のベシクル内への取り込み（例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生付着性ミクロスフェア）。
【０１２７】
経口投与に関しては、医薬的組成物は、例えば、錠剤、ロゼンジ、又はカプセルといった形態をとることができ、該形態は、従来の手段で、医薬的に許容可能な賦形剤と共に調製される。該賦形剤としては、例えば以下のものが含まれる：結合剤（例えば、予めゼラチン状にしたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ）；錠剤分解物質（例えば、ポテトデンプン、又はグリコール酸デンプンナトリウム)；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は、周知の方法でコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液等の形態をとることができ、また、該調製物は、水や他の適切な媒体を使用前に用いて構築するための乾燥生成物として提供されてもよい。前記液体調製物は、従来の手段を用いて医薬的に許容可能な添加剤と共に調製することができる。該添加剤として、例えば以下の物が含まれる：沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化された食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、又は画分化した植物性油）；、及び保存剤（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、又はソルビン酸）。また、調製物は、バッファ塩、矯味剤、着色剤、及び甘味料を適宜含むことができる。経口投与のための調製物は、活性化合物を制御しながら放出するために適切に配合することができる。
【０１２８】
吸入による投与（例えば、肺への送達）に関して言うと、治療用薬剤は、便宜上、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガス）を使用して、加圧パック又は噴霧器からエアロゾル・スプレー投与する形態で投与することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された分量だけ送達するためのバルブを設けることによって決定することができる。吸入器又は吹き入れ器において使用することを目的とする、例えば、ゼラチン等のカプセル及びカートリッジは、前記化合物と適切な粉末ベース（ラクトース又はデンプン等）との混合粉末を含有して配合することができる。
【０１２９】
また、本発明の方法において、医薬的化合物は、吹送、粉末、及びエアロゾル配合物を含む鼻腔内又は気管支内の経路で投与することができる（例えば、ステロイド吸入剤については、以下の文献を参照されたい：Ｒｏｈａｔａｇｉ  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ３５：１１８７−１１９３；  Ｔｊｗａ  （１９９５）  Ａｎｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７５：１０７−１１１）。例えば、エアロゾル配合物は、許容可能な加圧推進薬（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等）内に設置することができる。また、前記配合物は、例えば、噴霧器（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ又はａｔｏｍｉｚｅｒ）中など、非加圧調製物のための医薬品として配合することもできる。典型的には、前記投与は、医薬的に許容可能な水性バッファ中での形態となる。
【０１３０】
ＳＡＰポリペプチド変異体の呼吸系送達（例えば、鼻腔、吸入等）に適切な医薬組成物は、固体又は液体のいずれかの形態で調製することができる。
【０１３１】
本発明のＳＡＰポリペプチドは、注入（例えば、大量注入又は連続注入）による非経口（腸管外）投与の為に配合することができる。注入のための配合物は、添加保存薬と共に、単位投与形態（例えば、アンプル、又はマルチ投与容器）で投与することができる。組成物は、例えば、油性又は水性の媒体中で懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態をとることができる。そして、該組成物は、製剤化剤（例えば、沈殿防止剤、安定化剤、及び／又は分散剤）を含むことができる。或いは、前記活性成分は、使用前に適切な媒体（例えば、滅菌済発熱性物質除去水）を用いて構築するための粉末形態であってもよい。
【０１３２】
また、本発明のＳＡＰポリペプチドは、デポ製剤（蓄積性製剤）として配合することもできる。こうした長期間作用する配合物は、移植（例えば、皮下、又は筋肉内、）、又は筋肉内注入によって投与することができる。従って、例えば、治療用薬剤は、適切なポリマー性若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして)、又はイオン交換樹脂、又は難可溶性誘導体（例えば、難可溶性可溶性塩）を用いて配合することができる。また、制御放出配合物として、パッチも含まれる。
【０１３３】
ある実施形態において、本明細書中に記載の化合物は、中枢神経システム（ＣＮＳ）への送達目的で配合することができる(下記の文献を参照されたい：ｉｎ  Ｂｅｇｌｅｙ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０４：  ２９−４５  （２００４））。ＣＮＳへの薬物送達のための従来のアプローチは、以下のものが含まれる：神経外科手術的方法（例えば、脳内注入、又は脳室内注入）；薬剤の分子的な操作（例えば、内因性輸送経路の１つである脳血流関門を利用しようとする試みにおいて、それ自体脳血流関門を通過することができない薬剤と組み合せて、内皮細胞表面分子と親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラの融合蛋白質を製造すること）；薬剤の脂質溶解度を増加させるようにデザインする薬理学的方法（例えば、脂質又はコレステロールキャリアに水可溶性薬剤を結合させること）；及び、高浸透圧破壊によるＢＢＢ（脳血流関門）の完全性の一時的な破壊（頚動脈にマンニトール溶液を注射すること、又はアンギオテンシンペプチド等の生物学的活性剤の使用することから生じる）。
【０１３４】
ある実施形態において、本発明のＳＡＰポリペプチドは、局所性配合物に組み込まれ、該配合物は、局所的薬物投与に一般的に適した局所性キャリアを含有し、及び任意の前述した公知物質を含む。前記局所性キャリアは、所望の形態で組成物を提供するように選択することができ、例えば、軟膏、ローション、クリーム、マイクロエマルジョン、ゲル、オイル、溶液等が挙げられる。また、前記局所性キャリアは、天然由来又は人工合成由来のいずれかの材料で構成することができる。選択されたキャリアは、局所性配合物の活性剤又は他の構成成分に逆効果を及ぼさないことが好ましい。本明細書中の使用のための適切な局所性キャリアの例としては、水、アルコール及び他の非毒性有機的溶媒、グリセリン、鉱物油、シリコーン、ワセリン、ゼリー、ラノリン、脂肪酸、植物性油、パラベン、ワックス等が含まれる。
【０１３５】
医薬的組成物（化粧用調整物も含む）は、約０．００００１〜１００％の割合（例えば、０．００１〜１０重量％、又は０．１重量％〜５重量％）で本明細書中に記載の１種以上のＳＡＰポリペプチド変異体を含むことができる。ある局所的配合物において、活性剤は、以下に述べる量で存在する：約０．２５重量％〜７５重量％の配合物、好ましくは約０．２５重量％〜３０重量％の配合物、より好ましくは約０．５重量％〜１５重量％の配合物、そして、最も好ましくは約１．０重量％〜１０重量％の配合物。
【０１３６】
眼の症状については、例えば、治療用薬剤の全身の、局所的な、眼内の注入を行うことにより、又は治療用薬剤を放出する持続放出デバイスを挿入することにより、治療又は予防を行うことができる。本発明のＳＡＰポリペプチドは、眼の角膜及び内部領域（例えば、前眼房、結膜、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、レンズ、脈絡膜／網膜、及び強膜）へ化合物が浸透するのに充分な時間、化合物の眼表面への接触を維持させるように医薬的に許容可能な眼の媒体中に送達することができる。前記医薬的に許容可能な眼の媒体は、例えば、軟膏、植物性油、又はカプセル材料であってもよい。或いは、前記化合物は、直接硝子体及び眼房水に注入することができる。更に別の方法として、前記化合物は、眼の治療目的で、静脈内への注射又は注入等により、全身へ投与することもできる。
【０１３７】
本明細書中に記載の治療用薬剤は、当分野での方法に従った酸素の無い環境で保存することができる。
【０１３８】
例示的な組成物は、１種以上の医薬的に許容可能なキャリア、及び、任意で、他の治療用成分とともに、ＳＡＰポリペプチドを含むことができる。キャリア（複数可）は、組成物の他の成分と適合可能で、患者において許容できない有害な効果を誘引しないという意味において、「医薬的に許容可能」でなければならない。こうしたキャリアについては、本明細書中に記載されているか、又は薬理学分野の当業者に周知である。幾つかの実施形態において、医薬的組成物は、発熱性物質を含まず、ヒト患者への投与に適している。幾つかの実施形態において、医薬的組成物は、無刺激であり、ヒト患者への投与に適している。幾つかの実施形態において、医薬的組成物は、アレルゲンを含まず、ヒト患者への投与に適している。組成物は、調剤分野で周知である任意の調剤方法によって製造することができる。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、ＳＡＰポリペプチドは、時間放出配合物中で投与され、例えば、除放ポリマーを含む組成物中で投与される。ＳＡＰポリペプチドは、急激な放出から保護するキャリアと共に製造することができる。例としては、制御放出媒体（例えば、ポリマー）、マイクロカプセル化した送達システム、又は生体付着生ゲルが含まれる。或いは、ＳＡＰポリペプチドの延長送達は、吸収を遅らせる組成物薬剤中に含ませることによって達成することができる（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ヒドロゲル、及びゼラチン）。
【０１４０】
核酸化合物を送達する方法については当分野で公知である（例えば、以下の文献を参照されたい：Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，  ２，  １３９；  及び  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ｅｄ．  Ａｋｈｔａｒ，  １９９５；  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際公開ＷＯ  ９４／０２５９５）。こうしたプロトコルを、実質的にすべての核酸化合物を送達するために使用することができる。核酸化合物は、当業者に知られた様々な方法により細胞へ投与することができる。該方法として、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：リポソーム内のカプセル化、イオン浸透療法、又は、他の媒体内（例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生付着性マイクロスフフィア）への取り込み。或いは、前記核酸／媒体の組合せは、直接注入又は注入ポンプによって、局所的に送達される。送達のための他のルートとしては、経口送達（錠剤又はピルの形態）、及び／又は鞘内送達（Ｇｏｌｄ，  １９９７，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ７６，  １１５３−１１５８）が含まれるがこれらに限定されない。他のアプローチとしては、様々な輸送及びキャリアシステムの使用が含まれ、例えば、結合物及び生分解性ポリマーの使用が挙げられる。薬物送達方法についての包括的なレビューについては、以下の文献を参照されたい：  Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  １，  ３３６−３４３  及び  Ｊａｉｎ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  １９９８  及び  Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  ＮｅｕｒｏＶｉｒｏｌ．，  ３，  ３８７−４００。核酸の送達及び投与に関する更なる詳細については、以下の文献に記載されている：Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＣＴ  ＷＯ９３／２３５６９，  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  国際公開ＷＯ９９／０５０９４，及び  Ｋｌｉｍｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９９／０４８１９。
【実施例】
【０１４１】
下記の実施例は、上述の発明を用いた態様をより完全に記述し、並びに本発明の様々な態様を実施することを企図したベスト・モードを明らかにすべく提供される。こうした実施例は、本発明の真の範囲を決して制限する意味で提供されるものではなく、むしろ、例示目的で提示されることを理解されたい。
【０１４２】
実施例
実施例１： 組み換え型ＳＡＰは、ヒト血清由来ＳＡＰよりも効能が高い
ＣＨＯ−Ｓ細胞（ｒｈＳＡＰ）から単離した組み換え型ヒトＳＡＰ、及びヒト血清由来ＳＡＰ（ｈＳＡＰ）を、インビトロバイオアッセイを用いて生物学的活性についてアッセイした。該アッセイにおいて、単球が豊富な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ｒｈＳＡＰ又はｈＳＡＰのいずれかの濃度を変化させて９６時間インキュベートした。該インキュベーションに続いて、結果となる培養上澄みを除去し、ＥＬＩＳＡによりアッセイして、生成されたマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の量を定量した。ＭＤＣは、線維芽細胞によって生成されるので、単球が線維芽細胞へ分化したことを示す。サンプルの５０％阻害濃度（ＩＣ50）をｈＳＡＰ参考スタンダードと比較することにより、ＳＡＰグリコバリアントの相対効能を決定することができる。結果は、サンプル対ｈＳＡＰ参考スタンダードのＩＣ50比率として表される。
【０１４３】
全てのＳＡＰサンプル及びスタンダードは、最初に、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ中で、１．０  ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈された。ＳＡＰスタンダードは、連続して希釈され、以下の実用スタンダードが生成された。６０、３０、２０、１３．４、８．８、６．０、３．０、１．５、及び０．７５μｇ／ｍＬ（最終スタンダード濃度３０、１５、１０、６．７、４．４、３．０、１．５、０．７５、及び０．３７５μｇ／ｍＬ)。 以下の表１を参照されたい。
【０１４４】
【表１】
2015120754.tif 000002
【０１４５】
ＥＬＩＳＡアッセイの準備として、キャプチャ抗体（即ち、マウス抗ヒトＭＤＣ）を、キャリア蛋白質が無い状態でＰＢＳ中で実用濃度に希釈した。希釈した前記キャプチャ抗体を、９６−ウェルプレートにコーティングするために使用した。その後、各プレートを、シールして、室温で一晩インキュベートした。コーティングされたプレートを使用する前に、各ウェルを吸引して、洗浄バッファーで洗浄し、前記プロセスを２回繰り返した（全体で三回の洗浄を行った）。その後、プレートは、３００μＬの試薬希釈液を各ウェルに加えて、１時間室温でインキュベートすることによって、ブロックした。インキュベーション後、吸引及びウェル洗浄手順を繰り返した。
【０１４６】
ＥＬＩＳＡアッセイのために、単球／線維芽細胞培養、又はＳＡＰスタンダードのいずれかからの上澄みのサンプル100μＬを各ウェルに添加した。その後、ウェルの吸引及び洗浄を行う前に、プレートを２時間室温でインキュベートした。そして、ストレプトアビジン−ＨＲＰの実用希釈液を１００μＬ、各ウェルに追加した。プレートは、ストップ溶液５０μＬを各ウェルに追加する前に、２０分間室温でインキュベートした。すぐに、各ウェルの吸光度を、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて測定した。もし、波長の補正が可能である場合には、前記マイクロプレートリーダーは、５４０ｎｍ又は５７０ｎｍに設定した。もし、波長の補正ができない場合には、５４０ｎｍ又は５７０ｎｍの読取結果は、４５０ｎｍでの読み取り結果から差し引いた。こうした差し引きにより、プレートにおける光学的不完全性を是正する。
【０１４７】
ＲＨＳＡＰ及びｈＳＡＰの両方について、こうしたアッセイを用いて、生物学的活性のアッセイが行われた（図１）。平均して、ＲＨＳＡＰは、ｈＳＡＰと比べて、３．４倍活性が高い（独立した７回の実験の平均）。
【０１４８】
実施例２：  ＳＡＰグリカン構造の改変
インビトロのグリコ改変技術を用いて、組み換え型ヒトＳＡＰ（ｒｈＳＡＰ）サンプル上のグリカン部分が改変され、末端α２，３結合シアル酸部分がα２，６結合シアル酸部分に置換された（図２Ａ及びＢ）。同様に、ヒト血清由来ＳＡＰ（ｈＳＡＰ）のサンプルも改変され、末端α２，６結合シアル酸部分が、α２，３結合シアル酸部分に置換された（図２Ｃ及びＤ）。さらに、ＣＨＯ−Ｓ細胞から単離されたｒｈＳＡＰが、部分的にのみシアル酸化されている場合には、ｒｈＳＡＰサンプルを処理して、α２，３結合シアル酸部分で結合グリカン構造を完全にシアル酸化した（図２Ｅ及びＦ）。
【０１４９】
ｒｈＳＡＰ及びｈＳＡＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ＃９７０５４９）の両方は、α２，３，６，８，９−シアリダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  ＃Ｎ８２７１） で処理され、ポリペプチドを完全に脱シアル酸化した。１７時間シアリダーゼで処理した後、脱シアル酸化された（即ちアシアロ）ｒｈＳＡＰ及びｈＳＡＰを、ホスホエタノールアミン（ＰＥ）アフィニティ及びサイズ排除（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ）クロマトグラフィーを用いて精製した。その後、精製したアシアロＳＡＰポリペプチドは、ＣＭＰ−シアル酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  ＃２３３２６４）の存在下で、α２，３−又はα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  ＃５６６２２３）のいずれかを用いて、１７時間３７℃で酵素処理を行った。以下の表に、各反応の混合物に関する詳細を記す。
【０１５０】
【表２−１】
2015120754.tif 000003
【０１５１】
【表２−２】
2015120754.tif 000004
【０１５２】
【表３−１】
2015120754.tif 000005
【０１５３】
【表３−２】
2015120754.tif 000006
【０１５４】
別の反応においては、以下の表に従って、最初に分子を脱シアル酸化することなく、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて、３７℃１７時間、完全にｒｈＳＡＰをシアル酸化した。
【０１５５】
【表４】
2015120754.tif 000007
【０１５６】
シアル酸化処理の後、シアル酸化されたｒｈＳＡＰ及びｈＳＡＰ変異体の両方は、１０ｍＭ  ＮａＰｉ／５％  ソルビトール  ｐＨ  ７．５  （Ｐ５Ｓ  バッファ）中で透析を行う前に、ＰＥアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製される。所望のシアル酸結合(即ち、α２，３結合ｈＳＡＰ及びα２，６結合ＲＨＳＡＰ)の確認は、α２，３シアリダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ＃４８０７０６）を用いて、グリコバリアントＳＡＰポリペプチドを３７℃２４時間処理した後、以下の両方を用いて行った：液体クロマトグラフィー質量分析法（図２；Ａ、Ｃ、及びＥ)；陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（図２；Ｂ、Ｄ、及びＦ)。
【０１５７】
実施例３：単球から線維芽細胞への分化を阻害するためのＳＡＰグリコバリアントの効能を決定するためのインビトロバイオアッセイ
グリコ改変ｒｈＳＡＰ及びｈＳＡＰは、生物学的活性について、実施例１に記載のインビトロバイオアッセイと同じアッセイを用いてアッセイを行った。要するに、単球が豊富な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＳＡＰポリペプチドの濃度を変化させて、９６時間インキュベートした。該インキュベーションに続いて、該インキュベーションに続いて、結果となる培養上澄みを除去し、ＥＬＩＳＡによりアッセイして、生成されたマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）の量を定量した。結果は、サンプル対ｈＳＡＰ参考スタンダードのＩＣ50比率として表され、相対活性としてプロットした（ｈＳＡＰの相対活性＝１）。全てのα２，３−シアル酸結合含有試験物質は、ｈＳＡＰと比べて２．４倍以上活性が高い（図３）。ＳＡＰに関してα２，３−及びα２，６結合のシアル酸誘導体を等量混合されている場合には、予想通り、１００％α２，６結合の場合と、１００％α２，３結合ＳＡＰとの中間レベルの活性を示す(図３中、最も右側の２本のバー)。
【０１５８】
線維芽細胞分化を定量する別の方法では、線維芽細胞抑制因子（例えば、ＳＡＰ又はこれらの変異体）、又は活性化剤（例えば、Ｍ−ＣＳＦ）を用いて単球をインキュベートした後、発生した線維芽細胞を直接数えることを伴う。ある実験では、当分野でスタンダードであるネガティブ磁気ビーズ選択（例えば、  Ｃａｔ＃  １１３−４１Ｄ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  カルフォルニア州）を用いて、血液由来の全ＰＢＭＣから単球を精製した。そして、２５又は５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを添加したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａを含有する９６ウェル組織培養プレートで、トリプリケートで培養した。プレートは、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて９６時間３７℃でインキュベートした。その後、細胞はパラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色した（Ｃａｔ  ＃  １２２−９１１，  Ｈｅｍａ  ３  Ｓｔａｉｎ，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｈａｍｐｔｏｎ，  ニューハンプシャー州）。ウェルごとの線維芽細胞の数は、倒立顕微鏡を用いて、ウェルごとに５つの異なるフィールドのカウントを合計することによって決定した。線維芽細胞は、長く伸びた紡錘形と卵型の核の存在とを有する粘着性の細胞として形態学的に定義した。データでは、２５又は５０ｎｇ／ｍｌいずれかのＭ−ＣＳＦは、該ドナー中において、単球から線維芽細胞への分化の数を５０％まで増加させるのに充分であることが示された（図４）。続いての実験では、必要に応じて２５ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを添加したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａを使用した。以下にＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａを記す。
【０１５９】
Ｆｉｂｒｏｌｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ：  （Ｃａｔ  ＃  ＬＭ−０００１，  Ｌｉｆｅｌｉｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  メリーランド州）。以下のものが添加されている：１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （Ｃａｔ  ＃  Ｈ０８８７，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１  ｘ  非必須アミノ酸 （Ｃａｔ  ＃  Ｍ７１４５，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，）、１  ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｃａｔ  ＃  Ｓ８６３６，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２  ｍＭ  グルタミン  （Ｃａｔ  ＃  ２５０３０−１４９，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００  Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、及び１００  ｕｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン  （Ｃａｔ  ＃  Ｐ０７８１，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、並びにＩＴＳ−３  （Ｃａｔ  ＃  Ｉ２７７１、５００  ｕｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、１０  ｕｇ／ｍｌ  インシュリン、５μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ  亜セレン酸ナトリウム、５ｕｇ／ｍｌ  リノール酸、並びに５  ｕｇ／ｍｌ  オレイン酸；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０１６０】
更なる実験においては、ＰＢＭＣ又は単球を全血液から精製し、種々の量のＳＡＰを添加したＦｉｂｒｏＬｉｆｅ  Ｍｅｄｉａ中で、トリプリケートで培養した（上述したように）。プレートは、５％ＣＯ2インキュベーターにおいて９６時間３７℃でインキュベートした。その後、細胞はパラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｅｍａ  ３染色を用いて染色した  （Ｃａｔ  ＃  １２２−９１１，  Ｈｅｍａ  ３  Ｓｔａｉｎ，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｈａｍｐｔｏｎ，  ニューハンプシャー州）。ウェルごとの線維芽細胞の数は、倒立顕微鏡を用いて、ウェルごとに５つの異なるフィールドのカウントを合計することによって決定した。前記システムにおいて、線維芽細胞分化を最大限阻害するのに必要なＳＡＰの最低濃度を測定した結果、２ｕｇ／ｍｌであった（図５）。全てのドナーにおいて、線維芽細胞の数は、ＳＡＰ濃度の上昇に伴って減少した。
【０１６１】
参照による組み込み
本明細書で記述した全ての刊行物及び特許文献については、個々の刊行物及び特許文献がそれぞれ特異的に又は個別に記載されているかのように、その全体の内容が本明細書中に組み込まれる。
【０１６２】
主題に関する特定の実施形態について議論してきたが、上述した明細書の内容は、例示的なものであって、決して限定的なものではない。本明細書及び後述の特許請求の範囲をレビューすれば、当業者にとって多くのバリエーションが明らかとなるであろう。本発明の全範囲は、均等物の全範囲、及び、明細書、前記バリエーションと共に、特許請求の範囲を参照することにより決定されるべきものである。
【図１】
2015120754.tif 000008
【図２Ａ】
2015120754.tif 000009
【図２Ｂ】
2015120754.tif 000010
【図２Ｃ】
2015120754.tif 000011
【図２Ｄ】
2015120754.tif 000012
【図２Ｅ】
2015120754.tif 000013
【図２Ｆ】
2015120754.tif 000014
【図３】
2015120754.tif 000015
【図４】
2015120754.tif 000016
【図５】
2015120754.tif 000017
【配列表】
2015120754000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月23日(2015.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書及び図面に記載の方法。
【外国語明細書】
2015120754000001.pdf