(57)【要約】【課題】癌細胞外のバックグランドの蛍光の増加を抑えつつ、癌細胞のみを蛍光標識することを可能にする蛍光プローブを提供することである。【解決手段】以下の一般式（Ｉ）：2015203015.tif 000019｛式中、      Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素、水酸基、Ｃ1−Ｃ3アルキル基、又はハロゲンであり、      Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素又はＣ1−Ｃ3アルキル基であり、      Ｘは、Ｃ1−Ｃ3アルキレン基を表す｝であらわされる化合物を提供することによる。【選択図】図１
2015203015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）：
【化１】
2015203015.tif 000015
｛式中、
Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素、水酸基、Ｃ1−Ｃ3アルキル基、又はハロゲンであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素又はＣ1−Ｃ3アルキル基であり、
Ｘは、Ｃ1−Ｃ3アルキレン基を表す｝
で表される化合物、又はその塩。
【請求項２】
前記化合物が、以下の式：
【化２】
2015203015.tif 000016
で表される化合物、又はその塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下の一般式（ＩＩ）：
【化３】
2015203015.tif 000017
｛式中、
Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素、水酸基、Ｃ1−Ｃ3アルキル基、又はハロゲンであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素又はＣ1−Ｃ3アルキル基であり、
Ｘは、Ｃ1−Ｃ3アルキレン基を表す｝
で表される化合物、又はその塩。
【請求項４】
前記化合物が、以下の：
【化４】
2015203015.tif 000018
で表される化合物、又はその塩である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含む、蛍光プローブ。
【請求項６】
請求項５に記載の蛍光プローブを含む、癌細胞又は癌組織の検出用組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の蛍光プローブを含む、癌診断用組成物。
【請求項８】
血液中における癌細胞の検出方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物、請求項５に記載の蛍光プローブ、或いは請求項６に記載の検出用組成物を、採取された血液中の細胞と接触させる工程、当該細胞に対し励起光を照射する工程、及び血液中の細胞における蛍光を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
癌細胞又は癌組織の検出方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物、請求項５に記載の蛍光プローブ、或いは請求項６に記載の検出用組成物を組織に適用する工程、適用後の組織に対し励起光を照射する工程、及び組織において蛍光を検出する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で、または多細胞生物内で細胞の蛍光イメージング観察を可能にする蛍光プローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌はしばしば遠隔転移を起こす。つまり、原発癌から一部の癌細胞が自身を切離し、血管内に侵入し、血流に乗って体内を移動する血中循環癌細胞となり、原発癌から離れた部位に転移癌コロニーを樹立する。癌患者の死亡する原因の多くは遠隔転移である。従って、癌患者の血液検体から血中循環癌細胞を早期に検出することによって、遠隔転移の有無や、原発癌に対する外科手術、放射線治療、分子標的薬剤療法、または化学療法の効果を判断することができ、ひいては癌患者の生存率の向上の延長に寄与することが可能となる。さらに、血中循環癌細胞を生きたまま単離し、培養を行うことで、血中循環癌細胞の解析が可能になると期待されている。
【０００３】
前記血中循環癌細胞の数は、血液に含まれる白血球細胞数と比較して非常に少なく、血液１ｍLあたり赤血球細胞５０億個、白血球細胞３００万〜１０００万個に対し、前記血中循環癌細胞数は１０個程度である。そのため、前記血中循環癌細胞を検出するためには、大量の血球細胞と少数の癌細胞とが混合された状態の細胞群の中から、少数の癌細胞のみを何らかの方法を利用して濃縮し、さらに血球細胞と癌細胞とを何らかの方法を利用して識別しなければならない。特に、血球細胞と癌細胞とを識別する方法として、例えば、白血球細胞に特異的な抗原に対する抗体に蛍光色素を結合したものを用いて白血球細胞を蛍光標識し、一方で、上皮細胞に特異的な抗原に対する抗体に、白血球細胞に対する抗体を標識するのに用いた蛍光色素とは異なる蛍光波長を持つ蛍光色素を結合したものを用いて癌細胞を蛍光標識することで、白血球細胞と癌細胞とを異なる蛍光波長で標識し、識別する方法が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
前記特許文献１に記載の方法では、しかしながら、上皮細胞に特異的な抗原（以下単に抗原と呼ぶことがある）が細胞質に存在するタンパク質である場合には、前記上皮細胞に特異的な抗原に対する抗体（以下単に抗体と呼ぶことがある）に蛍光色素を結合したものを用いて癌細胞を蛍光標識する際に、Ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｍと呼ばれる、細胞膜を透過性にする試薬で細胞を処理することで細胞膜を透過性にし、前記抗体が細胞質内に存在する前記抗原に相互作用できるようにする必要がある。細胞膜を透過性にされた細胞は、細胞が生存するために必要な生化学反応を細胞内で行うことが不可能となり、細胞死（ネクローシス）が起こった細胞と同等の状態となり、単離後の細胞培養は不可能となる。
【０００５】
一方、生きたままの細胞や組織中の生体分子の活性や濃度の変化を検出する手法として、蛍光プローブによる生体イメージングの手法が提案され、より生体の生理現象を忠実に、かつ生体にダメージを与えないで前記手法による観察が可能な蛍光プローブの開発などが行われている。
【０００６】
蛍光プローブ分子の基本骨格として、または蛍光プローブ分子そのものとして、フルオレセイン、ローダミン、またはクマリンなどの有機小分子が利用されている。例えばヒドロキシメチルローダミン（ＨＭＲＧ）を基本骨格として合成された蛍光プローブであるγ‐Ｇｌｕ‐ＨＭＲＧは、中性ｐＨの水溶液中では実質的に無蛍光であるが、癌組織において発現亢進が認められているγ‐グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）と反応して加水分解されると、蛍光性のＨＭＲＧに速やかに変化し、癌組織のみを蛍光標識することが可能な癌診断薬として提案されている（特許文献２）。
【０００７】
なお、特許文献２に記載の蛍光プローブγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを、血中循環癌細胞を検出するために利用した報告は従来全くない。また、特許文献３には、細胞を１個ずつ固定できるアレイ状に配置された複数の微細孔を有し、一対の電極を備え、当該電極によって細胞に誘電泳動力を作用させて細胞を微細孔に移動させることにより、細胞を簡便に個々に分離し、1個ずつ固定したうえで、その性質を迅速に解析することを可能とする、生体試料固定装置（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）が例示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００５−５１６２１７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０８７０００号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１４９０３２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biochemical Pharmacology, 71, pp.231-238, 2006
【非特許文献２】C. C. Woodroofe et. al., Tetrahedron, 2005, 61, 3097-3105
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、白血球細胞と癌細胞とが混合された状態の細胞群から癌細胞のみを検出するために特許文献２に記載されている蛍光プローブγ‐Ｇｌｕ‐ＨＭＲＧを使用する場合に、細胞外のバックグランド蛍光が増大するという課題を見出した。蛍光プローブγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを癌細胞に作用させると、癌細胞に発現しているＧＧＴの活性により加水分解され、蛍光性の加水分解産物ＨＭＲＧが生じる。この生じた蛍光性の加水分解産物ＨＭＲＧが、癌細胞の細胞膜を透過して細胞内に拡散し、癌細胞内に保持される一方で、同時に細胞外に漏出し、癌細胞を含む水溶液中に拡散することにより、細胞外のバックグラウンド蛍光を増大すると考えられる。その結果、蛍光顕微鏡などを用いる生体イメージングの手法では、癌細胞と白血球細胞とを識別することが困難であった。
【００１１】
そこで、かかる課題を解決するために、蛍光顕微鏡などを用いる生体イメージングの手法により癌細胞と白血球細胞とを識別することを可能とする蛍光プローブを提供することが望まれていた。より具体的には、本発明の課題は、癌細胞外のバックグランドの蛍光の増加を抑えつつ、癌細胞のみを蛍光標識することを可能にする蛍光プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、以下の：
【化１】
2015203015.tif 000003
で表される新規化合物１またはその塩（以下、γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡとする）を開発するに至った。このγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを、癌細胞に作用させると、癌細胞に発現しているＧＧＴの活性により加水分解され、以下の：
【化２】
2015203015.tif 000004
で表される化合物２またはその塩（以下、ＨＭＲＧｐＣＰＡとする）を生じる。ＨＭＲＧｐＣＰＡは、蛍光性の加水分解産物であり、ＨＭＲＧと比較して細胞外に漏出しにくく、バックグラウンド蛍光の増大の程度が小さいという性質を有した。その理由としては、ＨＭＲＧｐＣＰＡが癌細胞の細胞膜を透過して細胞内に拡散する際に、そのパラクロロフェニルアセトアミド基（ｐＣＰＡ基）が、癌細胞の細胞内タンパク質又は細胞の膜タンパク質と反応して結合を生じるためと考えられるが、このメカニズムに限定されることを意図するものではない。
【００１３】
したがって、本発明は、以下のものに関する。
［１］  以下の一般式（Ｉ）：
【化３】
2015203015.tif 000005
｛式中、
Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素、水酸基、Ｃ1−Ｃ3アルキル基、又はハロゲンであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素又はＣ1−Ｃ3アルキル基であり、
Ｘは、Ｃ1−Ｃ3アルキレン基を表す｝
で表される化合物、又はその塩。
［２］  以下の一般式（ＩＩ）：
【化４】
2015203015.tif 000006
｛式中、
Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素、水酸基、Ｃ1−Ｃ3アルキル基、又はハロゲンであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素又はＣ1−Ｃ3アルキル基であり、
Ｘは、Ｃ1−Ｃ3アルキレン基を表す｝
で表される化合物、又はその塩。
［３］項目［１］又は［２］に記載の化合物を含む、蛍光プローブ。
［４］項目[３]に記載の蛍光プローブを含む、癌細胞又は癌組織の検出用組成物。
[５]項目[３]に記載の蛍光プローブを含む、癌診断用組成物。
［６］血液中における癌細胞の検出方法であって、項目［１］又は［２］に記載の化合物、項目［３］に記載の蛍光プローブ、或いは項目[４]に記載の検出用組成物を、採取した血液中の細胞と接触させる工程、当該細胞に対し励起光を照射する工程、及び血液中の細胞における蛍光を検出する工程を含む、前記方法。
[７]癌細胞又は癌組織の検出方法であって、項目［１］又は［２］に記載の化合物、項目［３］に記載の蛍光プローブ、或いは項目[４]に記載の検出用組成物を組織に適用する工程、適用後の組織に対し励起光を照射する工程、及び組織において蛍光を検出する工程を含む、前記方法。
［８］癌細胞又は癌組織の検出又は診断用組成物の製造のための、項目［１］又は［２］に記載の化合物、或いは項目[３]に記載の蛍光プローブの使用。
［９］項目［１］〜［３］に記載の蛍光プローブ、及び生体試料固定装置を含む、癌診断用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により提供される化合物又は蛍光プローブを用いると、癌細胞を特異的に蛍光標識することができ、癌細胞の識別の感度が高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡにγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）を作用させた後の吸収スペクトル（図１Ａ）と蛍光スペクトル（図１Ｂ）の経時変化を示す。
【図２】図２は、ヒト卵巣癌由来のＳＨＩＮ３細胞を腹腔内投与後、２４日目のマウスに、γ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを投与し、開腹して撮影した画像を示す。左の画像が、白色光の元で撮影して得られた画像であり、右の画像が、励起光の元で撮影して得られた画像である。
【図３】図３は、ヒト転移性膵臓癌由来のＡｓＰＣ−１細胞をマルチウェルプレート４８Ｆ内で培養し、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中でγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡ又はγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを作用させ、１５分、３０分、及び６０分経過時に蛍光顕微鏡を用いて取得した画像を示す。
【図４】図３の画像から、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度の時間変化（図４Ｂ）、及びそのバックグラウンド蛍光強度の時間変化（図４Ａ）を示した図である。
【図５】上部電極基板（２）と下部電極基板（１）の間に、スペーサー（６）を配置し、複数の微細孔（３）をアレイ状に配置した平板状の絶縁体（４）及び絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光部材（５）からなる保持部をスペーサー（６）と下部電極基板（１）とで挟んだ構造を有する生体試料固定装置（１２）（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）と、細胞診断チップに交流電圧を印加するための信号発生器（１０）を含む、生体試料固定装置と信号発生器とが接続された模式図である。
【図６】図５に示した生体試料固定装置（１２）のＡＡ’断面図と、当該装置を用いた生体資料固定方法を説明するための図である。
【図７】ヒト転移性膵臓癌由来のＡｓＰＣ−１細胞を細胞診断チップの微細孔に固定し、γ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡ又はγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを作用させ、１５分、３０分、６０分、及び１２０分経過時に蛍光顕微鏡を用いて取得した画像である。
【図８】図７の画像から、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度の時間変化（図８Ｂ）、及びそのバックグラウンド蛍光強度の時間変化（図８Ａ）を示した図である。
【図９】図９は、ヒト転移性膵臓癌由来のＡｓＰＣ−１細胞とヒト健常者の血液から採取した白血球細胞とを混合して作製した、血中循環癌細胞モデル検体を細胞診断チップの微細孔に固定し、γ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡ又はγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧと、ＡＰＣ標識抗ＣＤ−４５抗体及びヘキスト３３３４２とを作用させ、６０分経過時に蛍光顕微鏡を用いて取得した画像ある。
【図１０】血中循環癌細胞モデル検体を細胞診断チップの微細孔に固定し、γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧ、ＡＰＣ標識抗ＣＤ−４５抗体、及びヘキスト３３３４２を作用させ、６０分経過時に蛍光顕微鏡を用いて取得した画像であり、蛍光強度が比較的弱いＡｓＰＣ−１細胞と、同程度の蛍光を発する白血球細胞とを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明により提供される一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物において、Ｒ1〜Ｒ6は、それぞれ独立に水素、水酸基、Ｃ1−Ｃ3アルキル基、又はハロゲンである。蛍光性の観点から、Ｒ1及びＲ6が水素であることが好ましく、またＲ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5が水素であることがさらに好ましい。最も好ましくは、Ｒ1〜Ｒ6は全て水素である。
【００１７】
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に、水素又はアルキル基を示す。Ｒ7及びＲ8は同一であってもよいし、異なっていてもよい。アルキル基である場合、その炭素数は１〜６が好ましく、さらに好ましくは１〜３である。最も好ましくは、Ｒ7及びＲ8は、共に水素である。
【００１８】
Ｘは、Ｃ1−Ｃ3アルキレン基を表す。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよく、例えばメチレン基（−ＣＨ2−）、エチレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−、プロピレン基（−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−）の他、分枝鎖状のアルキレン基として−ＣＨ（ＣＨ3）−、−ＣＨ2−ＣＨ（ＣＨ3）−、−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）−なども使用することができる。これらのうち、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がさらに好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で表される化合物のうち、Ｒ1〜Ｒ8が全て水素であり、かつＸがメチレンである化合物の製法が実施例１に記載されており、かかる方法に準じて適宜出発原料や試薬、反応条件を選択することにより、一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で表される化合物を容易に製造することができる。
【００２０】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の一つであるγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡは、中性ｐＨの水溶液中では実質的に蛍光を発しないが、γ-グルタミルトランスフェラーゼにより加水分解されると、速やかに開環した互変異性体となって、強蛍光性のＨＭＲＧｐＣＰＡを与える。
【００２１】
本発明のγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡの加水分解産物であるＨＭＲＧｐＣＰＡは、所定の励起光、例えば４４０〜５３０ｎｍ程度の励起光を照射した場合に、極めて強い蛍光（例えばemission:５２４ｎｍ）を発する性質を有する一方で、本発明のγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡは、中性溶液中において同程度の励起光を照射した場合であっても、ほとんど蛍光を発しない。ＨＭＲＧｐＣＰＡに対する励起光の範囲の上限は、蛍光波長とのオーバーラップを避ける観点から、５３０ｎｍ以下、好ましくは５１０ｎｍ以下、さらに好ましくは５００ｎｍ以下、特に好ましくは４９０ｎｍ以下であり、励起光の範囲の下限は、励起能力の観点から４４０ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上、さらに好ましくは４６０ｎｍ以上、特に好ましくは４７０ｎｍ以上である。蛍光観測の観点から、励起光は、所望される波長のみを透過する励起フィルターを通して得た単一波長の光であることが好ましいが、４４０〜５００ｎｍにピークを有するスペクトルを有する光源を使用することもできる。ＨＭＲＧｐＣＰＡは、結合するタンパク質に応じて蛍光の波長が変化することがあるが、通常５００〜８００ｎｍ程度の蛍光が発せられ、好ましくは５１０〜６５０ｎｍ程度、さらに好ましくは５１６〜５５６ｎｍ程度の蛍光が観察される。
【００２２】
蛍光プローブとは、特定のタンパク質、細胞、又は組織などに特異的に結合又は分布し、蛍光を発する物質であり、それにより特定のタンパク質、細胞、又は組織の観察を容易にする。通常、蛍光プローブといった場合は、その物質自体が蛍光を発する物質をいうが、本発明では、それ自体蛍光を発しないが、分解などにより蛍光を発するようになる前駆物質も蛍光プローブに含まれるものとする。
【００２３】
γ-Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを有効成分として含む本発明の蛍光プローブは、それ自体では蛍光を発しないものの、癌細胞などの特定の細胞において発現されているγ-グルタミルトランスフェラーゼにより加水分解されて、強い蛍光を発するＨＭＲＧｐＣＰＡに変換される。γ−グルタミルトランスフェラーゼは、通常膜結合型酵素として癌細胞の細胞膜上に存在しており、癌細胞の細胞膜で変換されたＨＭＲＧｐＣＰＡは、次に癌細胞の細胞膜を透過して細胞内に拡散する。細胞内への拡散過程においてＨＭＲＧｐＣＰＡは、そのパラクロロフェニルアセトアミド基（ｐＣＰＡ基）による反応により癌細胞の細胞内タンパク質と結合するか、又は癌細胞の膜タンパク質に結合する。したがって、パラクロロフェニルアセトアミド基を有さないＨＭＲＧと比較して細胞外に漏出しにくく、より長期間、例えば数分〜数時間にわたり癌細胞のみが特異的に強い蛍光を発すると考えられる。したがって、本発明の蛍光プローブは、癌細胞検出用のプローブであり、癌細胞又は癌組織の検出用組成物や癌診断用キットにおいて、さらには癌の検出、判定、又は診断方法においても使用することができる。癌の検出、判定、又は診断方法はin vitroで行われる方法であってもよいし、ex vivo 又はin vivoで行われる方法であってもよい。
【００２４】
本発明の化合物、蛍光プローブ、又は検出若しくは診断用組成物は、プレパラート、ガラスボトムディッシュやスライドガラス、マルチウェルプレートなど、生体イメージングの手法において一般的に用いられる観察容器に保持した生体試料に対して作用させることができるが、特許文献３に記載の、生体試料固定装置に保持した生体試料に対して作用させることもできる。したがって、本発明は、本発明の化合物、蛍光プローブ又は検出若しくは診断用組成物、並びに体試料固定装置を含む癌診断用のキットに関してもよい。保持された生体試料に対し、本発明の化合物、蛍光プローブ、或いは検出若しくは診断用組成物、又はその溶液を加えることにより接触させ、所定の時間インキュベートした後に、蛍光顕微鏡やマイクロプレートリーダーにより励起光を生体試料に照射し、生じた蛍光を検出することができ、さらには蛍光を発する細胞を癌細胞と判定することができる。本発明では、試料の取得の容易性の観点から、生体試料は血液であることが好ましく、さらに好ましくは、血液から得られた細胞群である。癌を患う患者から採取された血液の細胞群には、大量の血球細胞と少数の癌細胞が含まれているが、本発明の化合物、蛍光プローブ、又は検出若しくは診断用組成物を用いることにより、大量の細胞のなかから、癌細胞を精度よく検出することが可能になる。被験者の血液細胞中に癌細胞が存在した場合に、被験者が癌を患っていると判定又は診断することができる。本発明の化合物、蛍光プローブ、又は検出若しくは診断用組成物を用いると、従来の蛍光プローブに比較して、検出感度が極めて高いことから、大量の細胞群に含まれる極めて少ない数の癌細胞を検出可能になり、これにより癌細胞の存在をより早期に検出又は診断することが可能になる。別法では、インキュベート後に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡による画像取得とそれに続くマイクロピペットによる細胞分取技法を用いて、癌細胞数の計測及び癌細胞の取得を行うこともできる。被験者の血液細胞中の癌細胞数を計測することにより、ＣＴなどの画像診断では発見不可能な微小な固形癌の存在を診断することが可能となり、これにより癌の早期診断も可能になる。さらに、被験者の所定体積の血液中の血液細胞における癌細胞数を一定期間ごとに計測することにより、被験者に対する外科手術、放射線治療などによる局所治療、または化学療法などによる全身治療、または分子標的薬の投与などによる治療の効果を判定することが可能となる。また、被験者の血液細胞中の癌細胞を検出後、取得することにより、癌細胞に対して別途解析手法を適用することが可能となり、遺伝子解析、発現解析、局在解析などの性状解析が可能となる。
【００２５】
このような生体試料固定装置として、例えば、図1に示すように上部電極基板と下部電極基板の間に、スペーサーを配置し、複数の微細孔をアレイ状に配置した平板状の絶縁体及び絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光部材からなる保持部をスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造を有する、生体試料固定装置（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）を、生体試料を保持するための容器として用いることができる。図１の例では、保持部に生体試料懸濁液を導入するための導入口と、保持部から溶液を排出するための排出口とを、前記スペーサーに設け、保持部への生体試料懸濁液の供給と排出が迅速に実施可能となるようにしてある。また、前記遮光部材は、前記下部電極基板の、前記微細孔の底部以外の全面を覆うように配置され、微細孔周辺の光ノイズを低減することができる。これにより、微細孔内において生体試料から発する微弱な蛍光などの情報をより高感度に検出することが可能となる。本発明により提供される蛍光プローブを用いると、白血球細胞と、癌細胞とが混合された状態の細胞群の中から、癌細胞のみを、生きたまま蛍光標識し、生体イメージング手法により、癌細胞と白血球細胞とを精度よく識別することが可能になる。
【００２６】
前述のような構成の細胞診断チップの保持部に細胞などの生体試料懸濁液を導入し、信号発生器と前記２つの電極を導線でそれぞれ接続し、２つの電極の間に所定の波形を有する交流電圧を前記信号発生器により印加することで、電気力線が微細孔へ集中し、懸濁液中の生体試料が、電気力線の集中する方向に力を受け、保持部分の微細孔内へ移動して容易に固定される。この時に発生する力を誘電泳動力という。
【００２７】
本発明の癌細胞又は癌組織の検出用組成物、並びに癌診断用組成物は、生体イメージングの他に、手術又は検査において、手術若しくは検査前又は手術若しくは検査中に本発明の癌細胞又は癌組織の検出用組成物を非経口投与することにより適用するか、又は肉眼下又は鏡視下における手術野の一部又は全体に本発明の癌診断薬を噴霧、塗布又は注入などの方法により適用し、数十秒から数分後に励起光を適用部位に照射することにより、癌細胞又は癌組織を検出するために用いられてもよい。本発明の検出用又は診断用組成物が適用された部位に癌組織が含まれる場合に、その組織が蛍光を発するので、その蛍光を発している部位が癌組織であると特定することができ、そこを含めた周囲組織と共に切除をすることが可能になる。ここで、「手術」とは、例えば開創を伴う開頭手術、開胸手術、若しくは開腹手術、又は皮膚手術などのほか、胃内視鏡、大腸内視鏡、腹腔鏡、又は胸腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、癌の治療のために適用される任意の手術を包含する。これにより、癌を切除する外科治療において、癌の形態や触覚に頼って決定されていた癌組織の範囲を、より明確に精度良く決定することができ、切除範囲の確定が容易になる。また、「検査」の用語は、胃内視鏡や大腸内視鏡などの内視鏡を用いた検査、及び検査に伴う切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。内視鏡を用いた検査に用いた場合、癌組織が蛍光を発することにより、癌組織の特定が極めて容易になる。内視鏡検査において癌組織が確認できた場合には、その組織について検査切除や治療的な切除を行うこともできる。手術や検査といった用語は最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００２８】
本発明の癌細胞又は癌組織の検出用組成物、並びに癌診断用組成物の適用濃度は、特に限定されないが、癌組織の存在が疑われる組織に対して、例えば、１〜１０００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。γ-Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡの加水分解を防止する観点から、中性条件下、例えばｐＨ５．０〜９．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲、より好ましくはｐＨ６．８〜７．５の範囲で使用することが好ましい。本発明の検出用組成物及び診断用組成物としては、上記のγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡをそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合してもよい。例えば生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ 調整剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒、錠剤、液剤など任意の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用滅菌水や、適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。
【００２９】
本発明の別の態様では、本発明の化合物、蛍光プローブ、又は検出用若しくは診断用組成物を用いた癌細胞又は癌組織の検出方法に関する。当該検出方法では、本発明の化合物、蛍光プローブ、又は検出若しくは診断用組成物を、細胞又は組織に適用し、適用後の細胞又は組織に対し所定の励起光を照射することにより、細胞又は組織における蛍光を検出することを含む。好ましくはかかる方法は、血液中における癌細胞を検出する方法であり、その場合、血液中の細胞は、プレパラートなどの観察容器に固定されていてもよいし、上で説明した生体試料固定装置により固定された診断チップであってもよい。一方で、係る検出方法を、生体の組織に適用して、手術時における癌組織の確定診断に用いることもできる。その場合の適用方法としては、細胞又は組織に対する噴霧又は塗布することにより適用してもよいし、注射や輸液により適用されてもよい。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、本発明の癌細胞又は癌組織の検出方法を用いて、癌の切除領域を決定し、当該領域を切除する工程を含む、手術・治療方法に関してもよい。
【００３１】
本発明の癌細胞の検出方法は、癌の判定又は診断方法に用いることができる。すなわち、本発明の癌細胞の検出方法により、指標となる蛍光よりも高い蛍光が検出された場合に、癌が存在すると判定又は診断することができる。ここで、判定方法とは、指標との比較をすることにより、医師をはじめとした医療従事者による判断を含まずに特定する方法をいう。例えば指標となる蛍光として、蛍光を有する細胞を選択することができ、この場合、蛍光を有する細胞が検出された場合に、対象が癌を有すると決定することができる。別の態様では、蛍光強度や蛍光を有する細胞の数を指標とすることにより、癌の重篤度を判定することもできる。
【００３２】
本明細書において、「癌組織」の用語は癌細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は、臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈することができ、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明の癌診断薬は、癌組織において特異的に強発現しているγ−グルタミルトランスフェラーゼを検出する作用を有していることから、癌組織の中でも、γ−グルタミルトランスフェラーゼを高発現している組織が好ましく、このような癌組織は、例えばBiochemical Pharmacology, 71, pp.231-238, 2006（非特許文献１）に説明されている。癌の例として、咽頭癌、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、皮膚癌、メラノーマ、骨癌、リンパ節などのリンパ組織や周囲組織の癌も挙げられるが、これらの癌種に限定されることを意図するものではない。
【００３３】
本発明の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物は、塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはなく、本発明の蛍光プローブの性質を損なわない範囲で任意の塩が用いられてもよい。
【００３４】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物は、１又は２以上の不斉炭素を有しており、光学異性体やジアステレオ異性体などの立体異性体が存在するが、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００３５】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【実施例】
【００３６】
実施例１：化合物１〜７の調製
以下のスキームで化合物１〜７を合成した。
【化５】
2015203015.tif 000007
【００３７】
調製例１：化合物３の調製
【化６】
2015203015.tif 000008
C. C. Woodroofe et. al., Tetrahedron, 2005, 61, 3097-3105（非特許文献２）内での合成方法に準拠(Sheme 4, Compound 10c)し、化合物３のピリジン塩を得た。次に１Ｎ  ＨＣｌ−ＣＨ２Ｃｌ２で分液することでピリジンを除去し、化合物３を得て、そのまま次の実験に用いた。
【００３８】
調製例２：化合物４の調製
【化７】
2015203015.tif 000009
調製例１で調製した化合物３（１．０５ｇ、２．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１４ｍＬ）に溶解し、０℃で撹拌しながらＬｉＢＨ４（３ＭのＴＨＦ溶液、７ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。１１時間撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）を加えて希釈し、氷浴中でＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（２０ｍＬ）を僅かずつ加えクエンチングした。３０分撹拌した後、２Ｎ  ＨＣｌ（１５ｍＬ）を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。有機層を水、Ｂｒｉｎｅで洗浄し、濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ  ＝  １８：１，０．１％ＴＦＡ）で精製し、化合物４（８２２ｍｇ、８１％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.12 (1H, dd, J = 1.3, 8.0 Hz), 7.55 (1H, d, J = 1.3 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.43 (2H, d, J = 1.9 Hz), 7.17 (2H, dd, J = 1.9, 8.4 Hz), 6.84 (2H, d, 8.4 Hz), 5.42 (2H, s) ppm.; 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 170.8, 150.4, 145.2, 144.4, 130.8, 130.2, 130.1, 129.9, 127.2, 125.6, 122.9, 121.3, 120.0, 82.9, 72.7 ppm.; HR ESI MS : [M-H]- Found m/z 484.9063, C21H11Br2O4 requires 484.9030.
【００３９】
調製例３：化合物５の調製
【化８】
2015203015.tif 000010
調製例２で調製した化合物４（８５６ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１）混合液（１５ｍＬ）に溶解し、０℃下で撹拌しつつトリメチルシリルジアゾメタン（２ＭのＴＨＦ溶液、１．６ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。３０分撹拌した後、反応系を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ＝５：１）で精製し、化合物５（６５６ｍｇ、７０％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.10 (1H, dd, J = 1.4, 8.0 Hz), 7.50 (1H, d, J = 1.4 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.43 (2H, d, J = 1.9 Hz), 7.17 (2H, dd, J = 1.9, 8.4 Hz), 6.84 (2H, d, 8.4 Hz), 5.40 (2H, s), 3.82 (3H, s) ppm.; 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 166.2, 150.4, 145.2, 143.3, 131.3, 130.3, 130.0, 127.2, 125.0, 123.1, 122.9, 121.2, 120.0, 82.9, 72.8, 52.3 ppm.; HR ESI MS : [M+Na]+ Found m/z 522.9129, C22H14Br2NaO4 requires 522.9151.
【００４０】
調製例４：化合物６の調製
【化９】
2015203015.tif 000011
調製例３で調製した化合物５（６５６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）をトルエン（２２ｍＬ）に溶解した後、炭酸セシウム（１．２９ｇ、３．９５ｍｍｏｌ）、キサントホス（２２８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、ベンゾフェノン＝イミン（２．２ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２４１ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で１６時間撹拌した。反応系をセライトろ過し、ろ液を濃縮乾固した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）を加えて溶解した後、水（５０ｍＬ）を加え洗浄した。有機層を濃縮乾固させた後、再度ＣＨ２Ｃｌ２（２４ｍＬ）に溶解し、水（８ｍＬ）とＴＦＡ（２．４ｍＬ）を加え２４時間撹拌した。反応系に水（５０ｍＬ）を加え希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で３回分液した後、有機層をＢｒｉｎｅ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ  ＝  １０：１、０．１％ＴＦＡ）で二回精製を行い、化合物６（３５４ｍｇ、７２％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.30 (1H, dd, J = 1.7, 8.2 Hz), 7.92 (1H, d, J = 7.1 Hz), 7.91 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.08 (2H, d, J = 9.6 Hz), 6.86 (2H, d, J = 2.0 Hz), 6.86 (2H, dd, J = 2.0, 9.6 Hz), 4.40 (2H, s), 3.93 (3H, s) ppm.; 13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 167.6, 161.6, 159.8, 157.7, 146.5, 132.9, 132.3, 132.1, 131.2, 130.8, 129.4, 118.3, 114.8, 98.6, 52.9 ppm; HR ESI MS : [M+H]+ Found m/z 375.1343, C22H19N2O4 requires 375.1139
【００４１】
調製例５：化合物７の調製
【化１０】
2015203015.tif 000012
化合物６（４５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）に水（０．５ｍＬ）とＭｅＯＨ（１ｍＬ）を加えて溶解した後、０℃でＬｉＯＨ水溶液（１Ｍ、０．５ｍＬ）を加えた。反応系を室温に戻し、７０分撹拌した後ＬｉＯＨ水溶液（１Ｍ、０．５ｍＬ）を追加した。更に９０分撹拌した後、氷浴中で１Ｎ・ＨＣｌを加えて酸性（〜ｐＨ２）にした後、濃縮乾固した。残渣を５０％ＭｅＯＨに溶解し、脱塩処理を行い精製し、化合物７（１４．５ｍｇ、３４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.31 (1H, dd, J = 1.7, 8.0 Hz), 7.90 (1H, d, J = 1.7 Hz), 7.90 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.11 (2H, d, J = 9.6 Hz), 6.87 (2H, dd, J = 2.0, 9.6 Hz), 6.87 (2H, d, J = 2.0 Hz), 4.41 (2H, s) ppm.; 13C-NMR (100 MHz, CD3OD):161.6, 159.8, 157.9, 146.2, 133.0, 132.4, 132.2, 131.5, 131.4, 129.4, 118.3, 114.8, 98.6, 71.2, 62.5 ppm.; HR ESI MS : [M+H]+ Found m/z 361.1181, C21H17N2O4 requires 361.1183.
【００４２】
調製例６：化合物２（ＨＭＲＧｐＣＰＡ）の調製
【化１１】
2015203015.tif 000013
化合物７（１２ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５０μＬ）、４−クロロベンジルアミン（４．５μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１５ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を加え室温で１２時間撹拌した。反応系を真空ポンプで濃縮乾固した後、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ  ＝  ５：１、０．１％ＴＦＡ）で精製し、化合物２（トリエチルアミン残留（ｃｒｕｄｅ）、２１．２  ｍｇ）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.15 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 7.88 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.76 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.33 (5H, m), 7.10 (2H, d, J = 9.6 Hz), 6.85 (2H, dd, J = 2.0, 9.6 Hz), 6.84 (2H, d, J = 2.0 Hz), 4.57 (2H, s), 4.39 (2H, s) ppm.; HR ESI MS : [M+H]+ Found m/z 484.1427, C28H23ClN3O3 requires 484.1423.
【００４３】
調製例７：化合物１（γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡ）の調製
【化１２】
2015203015.tif 000014
トリエチルアミン残留の粗精製化合物２（２１．２ｍｇ、ｃｒｕｄｅ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５０μＬ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（１１．１ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１５ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１１時間撹拌した後、真空ポンプで濃縮乾固した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解し、撹拌しながらＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。２時間後、反応系を濃縮乾固し、残渣をＨＰＬＣ（Inertsil-ODS-3 (径10 x 250 mm); GL science, 10% CH3CNから 80%の勾配で40 分）で精製し化合物１（８．７ｍｇ、４３％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 8.39 (1H, s), 8.15 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.76 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.69 (1H, s), 7.40 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.26-7.17 (6H, m), 6.94 (1H, d, J = 8.9 Hz), 6.86 (1H, s), 4.44 (2H, s), 4.29 (2H, s), 4.00 (1H, t, J = 6.6 Hz), 2.71 (2H, m), 2.21 (2H, m) ppm.; 13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 173.3, 171.5, 168.7, 164.7, 161.7, 159.3, 157.2, 148.8, 145.1, 138.9, 135.0, 134.7, 134.0, 131.9, 131.7, 130.3, 129.8, 129.6, 121.8, 119.5, 119.3, 118.2, 107.0, 98.6, 62.7, 53.3, 44.0, 33.4, 26.5 ppm.; HR ESI MS : [M+H]+ Found m/z 613.1862, C33H30ClN4O6 requires 613.1848.
【００４４】
実施例２：γ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡに対し、グルタミルトランスペプチターゼ（ＧＧＴ）を添加した場合の吸光度及び蛍光の変化
５０μＭのγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡのＰＢＳ溶液（０．２ｍｌ）に対し、０．１Ｕのγ−グルタミルトランスペプチターゼ（ＧＧＴ，equine kidney, SIGMA G9270-100UN)を作用させ、３７℃で酵素反応を行った。酵素反応の開始後１分、５分、７分、９分、１１分、１５分、２３分後において超微量分光光度計（NanoDrop2000c, Thermo Scientific）を用いて、吸光度を測定した。また、５μＭのγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡのＰＢＳ溶液（０．２ｍｌ）に対し、０．０５Ｕのγ−グルタミルトランスペプチターゼ（ＧＧＴ，equine kidney, SIGMA G9270-100UN)を作用させ、３７℃で酵素反応を行った。酵素反応の開始後１分、５分、７分、９分、１１分、１５分、２３分後において超微量蛍光スペクトロメーターを用い、励起光としてブルーＬＥＤ光を用いて、蛍光を測定した。この結果、アシル基の加水分解により、即座に吸光度が増加し（図１Ａ）、かつ蛍光も増加することが示された（図１Ｂ）。
【００４５】
実施例３：癌モデルマウスを用いた蛍光イメージング
散在性腹膜転移は卵巣癌において一般的に起こる致死的な合併症として知られている。このような腹膜転移は、卵巣癌の比較的早い段階で起こりはじめ、腫瘍が漿膜を浸し、腹腔内に落ち込む結果、腹腔内の他の臓器に種をまくように転移する（播種転移）。この現象を実験的に再現すべく、卵巣癌由来のＳＨＩＮ３細胞を、胸腺欠損マウスに腹腔内投与し、腹膜播種モデルを作成した（Neoplasia, 8, pp. 607-612, 2006)。
【００４６】
ヒト卵巣癌由来のＳＨＩＮ３細胞を１０％ＦＢＳ及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて、個々の細胞をばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞を遠心し（１００×ｇ、４℃、３分）、上澄みを捨てた後、１×１０6細胞／３００μｌの細胞密度になるように氷冷したＰＢＳを加えて懸濁させた。即座に調製した細胞懸濁液を８週齢程度の胸腺欠損マウスに１匹あたり３００μｌ（１×１０6細胞）腹腔内投与した。処置したマウスを７〜１４日程度飼育した。おおむねこの期間で膵臓及び脾臓に隣接する部位、並びに腸間膜上に０．５ｍｍ〜数ｍｍ程度の多数の腫瘍の形成が確認された。
【００４７】
３００μｌのγＧｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡのＰＢＳ溶液（５０μＭ）を腹膜播種モデルマウスに腹腔内（i.p.）投与した。i.p,投与３０分後に二酸化炭素による殺処理を行い、開腹後の腹腔内に４５０〜４８０ｎｍの励起光を照射し、５１６〜５５６ｎｍの蛍光を計測して蛍光イメージングを行った。その結果、脾臓や腸間膜などに転移した癌細胞から選択的に強い緑色蛍光（矢印部位）が観測された(図２）。なお、自家蛍光により腸の部位に橙色の蛍光が見られた。
【００４８】
実施例４：γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを用いた癌細胞の蛍光染色
ヒト転移性膵臓癌由来のＡｓＰＣ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にてマルチウェルプレート４８Ｆ（接着系細胞用、住友ベークライト（株）製）内で２４時間以上培養した。
ＡｓＰＣ−１細胞が底面の半分程度を覆うような細胞密度になってから、上澄みの培地を捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で洗浄し、５μＭのγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを含む前記フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を２００μＬ加えた。
細胞の蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス（株）製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１５分、３０分、及び６０分経過時に撮像した（図３上欄）。その結果、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大した（図４Ｂ）。また、細胞がいない空間の蛍光強度（以下、「バックグラウンド蛍光強度」と記載する）は、増大した（図４Ａ）が、細胞が発する蛍光強度とのシグナル／ノイズ比は良好な値であった。
【００４９】
比較例４：γ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを用いた癌細胞の蛍光染色
比較のため、実施例４と同様の細胞、培地、および機器を用いて、細胞を培養した。上澄みの培地を捨てた後、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で洗浄し、５μＭ  γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを含む前記フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を２００μＬ加えた。
細胞の蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス（株）製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１５分、３０分、６０分、１２０分経過時に撮像した（図３中欄）。６０分後のサンプルについては、バックグランドの値が高かったため、ＮＤフィルタで背景蛍光を調節した画像を撮像した（図３下欄）。その結果、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大した（図４Ｂ）が、バックグラウンド蛍光強度も大きく増大し（図４Ａ）、６０分経過時には、細胞が発する蛍光強度とのシグナル／ノイズ比は低下し、細胞が発する蛍光強度が比較的弱い細胞は、バックグラウンド蛍光に紛れて検出が困難となった。
【００５０】
実施例５：細胞診断チップにおけるγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡの使用
ヒト転移性膵臓癌由来のＡｓＰＣ−１細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタミン、１ｍＭピルビン酸を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で５％  ＣＯ2下に３７℃で培養した。細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、１×１０5個／ｍＬの細胞密度になるように３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁した。
【００５１】
細胞を観察するための容器は、図５及び図６に示すような、孔間隔５０μｍでアレイ状に配置された、直径３０μｍ、深さ３０μｍの複数の微細孔を有する絶縁体及び絶縁体と下部電極基板の間に設置した遮光性のクロム膜からなる保持部をスペーサーと下部電極基板とで挟んだ構造を有する、生体試料固定装置（以下、「細胞診断チップ」と記載することがある）を用いた。
【００５２】
細胞診断チップに調整した細胞懸濁液を導入し、信号発生器より交流電圧として電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、細胞に誘電泳動力が作用し、１分程度の時間でアレイ状に配置した複数の微細孔に細胞を１個ずつ固定することができた。なお、「固定することができた」とは、微細孔に細胞が入った場合を意味し、以下の比較例でも同じ定義とした。
【００５３】
１個の微細孔に概ね１個の細胞が固定された細胞診断チップに、引き続き交流電圧を印加しながら、０．０１％  ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭ  マンニトール水溶液を導入し、２分静置後、交流電圧の印加を停止し、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、すぐさまリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を細胞診断チップに導入し、細胞診断チップ内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に結合することができた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、細胞は微細孔内に静電気的に結合しているため、洗浄により微細孔から脱離することはない。
【００５４】
続いて、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、１０μＭ  γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を導入した。細胞診断チップの蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス（株）製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで１５分、３０分、６０分、１２０分経過時に撮像した（図７上欄）。その結果、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大した（図８Ｂ）。また、細胞が固定されていない微細孔内が発する蛍光強度（以下、「バックグラウンド蛍光強度」と記載することがある）は、僅かに増大した（図８Ａ）が、細胞が発する蛍光強度とのシグナル／ノイズ比は良好な値であった。
【００５５】
比較例５：細胞診断チップにおけるγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧの使用
比較のため、実施例５と同様の細胞、細胞診断チップ、試薬、および機器を用いて、実施例５と同様の操作により、細胞診断チップの微細孔内に細胞を静電気的に結合した。続いて、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、１０μＭ  γ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを含むＰＢＳを導入した。実施例５と同様の装置、および操作により、細胞診断チップの蛍光画像を１５分、３０分、６０分、１２０分経過時に撮像した（図７下欄）。その結果、時間経過に伴い、細胞が発する蛍光強度が増大したが（図８Ｂ）、３０分経過時に上限値に達し、それ以降は増大しなかった。また、バックグラウンド蛍光強度は大きく増大し（図８Ａ）、６０分経過時には、細胞が発する蛍光強度とのシグナル／ノイズ比は低下し、細胞が発する蛍光強度が比較的弱い細胞は、バックグラウンド蛍光に紛れて検出が困難となった。
【００５６】
実施例６：細胞診断チップとγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを用いた、検体中の癌細胞の検出
ＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ（株）製）に採血したヒト健常者血液３ｍＬを等量の生理食塩水で希釈して計６ｍＬの希釈血液とした。当該希釈血液６ｍＬを２ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケアジャパン（株）製）に重層し、遠心（１１００×ｇ、１０分、２５℃）し、白血球細胞層を回収した。回収した白血球細胞を生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）し、上澄みを捨てた後、再度生理食塩水に懸濁して計３０ｍＬとし、遠心（３００×ｇ、５分、２５℃）して上澄みを捨てることで、血小板の除去と、白血球細胞の洗浄とを同時に行った。次に、得られた白血球細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（（株）同仁化学研究所製）を加えて細胞核染色し、同時に抗ＣＤ−４５抗体（ＡＰＣ標識）（ミルテニーバイオテク（株）製）を加えて細胞表面染色を行った。続いて、染色を行った白血球細胞を３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し白血球細胞懸濁液を得た。
【００５７】
続いて、実施例５と同様に培養したヒト転移性膵臓癌由来のＡｓＰＣ−１細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。処理した細胞に１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加え、細胞核染色した。細胞核染色した細胞を遠心し（２００×ｇ、２５℃、５分）、上澄みを捨てた後、１×１０5個／ｍＬの細胞密度になるように３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し、ＡｓＰＣ−１細胞懸濁液を調製した。ＡｓＰＣ−１細胞の細胞密度が１．０×１０4個／ｍＬ、白血球細胞の細胞密度が２．０×１０6個／ｍＬにそれぞれなるよう、ＡｓＰＣ−１細胞懸濁液と前記白血球細胞懸濁液とを混合し、血中循環癌細胞モデル検体を作製した。
【００５８】
細胞診断チップに前記血中循環癌細胞モデル検体を導入し、交流電圧として電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、細胞に誘電泳動力が作用し、１分程度の時間でアレイ状に配置した複数の微細孔に白血球細胞、およびＡｓＰＣ−１細胞を固定することができた。なお、細胞診断チップに導入した白血球細胞の細胞密度が、微細孔の密度（４．０×１０5個／ｍＬ）よりも過剰なため、１個の微細孔に複数の白血球細胞が固定された。
【００５９】
細胞が固定された細胞診断チップに、引き続き交流電圧を印加しながら、０．０１％  ポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭ  マンニトール水溶液を導入し、２分静置後、交流電圧の印加を停止し、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、すぐさまリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を細胞診断チップに導入し、細胞診断チップ内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に結合することができた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、白血球細胞、およびＡｓＰＣ−１細胞は微細孔内に静電気的に結合しているため、洗浄により微細孔から脱離することはない。
【００６０】
続いて、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、１０μＭのγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧｐＣＰＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を導入した。細胞診断チップの蛍光画像を、倒立型リサーチ顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス（株）製）を通じてＥＭ−ＣＣＤカメラで一定時間ごと１５分、３０分、６０分、１２０分経過時に撮像した。その結果、時間経過に伴い、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度が増大した。６０分経過時に撮像した画像を図９に示す。また、白血球細胞が発する蛍光強度も増大したが、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度に比べ有意に弱く、ＡｓＰＣ−１細胞と白血球細胞とを蛍光強度の違いから識別することは容易であった。
【００６１】
比較例６：細胞診断チップとγ−Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを用いた、検体中の癌細胞の検出
比較のため、実施例６と同様の細胞、細胞診断チップ、試薬、および機器を用いて、実施例６と同様の操作により、血中循環癌細胞モデル検体を作製し、細胞診断チップの微細孔内に白血球細胞、およびＡｓＰＣ−１細胞を静電気的に結合した。続いて、細胞診断チップ内の溶液を吸引除去し、１０μＭのγ‐Ｇｌｕ−ＨＭＲＧを含むＰＢＳを導入した。実施例６と同様の装置、および操作により、細胞診断チップの蛍光画像を一定時間ごとに撮像した。その結果、時間経過に伴い、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度が増大した。６０分経過時に撮像した画像を図９に示す。しかし、バックグラウンド蛍光強度も大きく増大し、６０分経過時には、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度とのシグナル／ノイズ比は低下し、細胞が発する蛍光強度が比較的弱いＡｓＰＣ−１細胞は、バックグラウンド蛍光に紛れて検出が困難となった。さらに、ＡｓＰＣ−１細胞が発する蛍光強度と同程度の蛍光を発する白血球細胞が、バックグラウンド蛍光の増大により見られるようになり、その結果、白血球細胞をＡｓＰＣ−１細胞だと誤って識別してしまう可能性が増大した（図１０）。
【符号の説明】
【００６２】
１    下部電極基板
２    上部電極基板
３    微細孔
４    絶縁体
５    遮光部材
６    スペーサー
７    導入口
８    排出口
９    保持部
１０    信号発生器
１１    導線
１２    生体試料固定装置（細胞診断チップ）
１３    電気力線
１４    誘電泳動力
１５    生体試料
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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