(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の低減のための酵素系の提供。【解決手段】第１の酵素および第２の酵素を含む酵素系であって、第１の酵素が、タンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素であり、第２の酵素がチロシナーゼである酵素。第１の酵素は、タンパク質性基質中に存在する遊離チオールなどの酵素阻害剤を除去する。基質中の阻害性化合物の除去によって、チロシナーゼ酵素による基質中に存在するタンパク質のタンパク質架橋などの第２の酵素の有効な酵素作用が可能となる。第１の酵素はスルフヒドリルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、ジスルフィドイソメラーゼである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋されたタンパク質性基質を調製する方法であって、
ａ．遊離チオールを含むタンパク質性基質を、遊離チオールを除去できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性基質を、活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらし、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法。
【請求項２】
第２の酵素が、チロシナーゼ、ラッカーゼ、リポキシゲナーゼおよびタンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の酵素が、リポキシゲナーゼおよびタンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第２の酵素がラッカーゼである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第２の酵素がチロシナーゼである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１の酵素および／または第２の酵素が、単離または精製された形態である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１の酵素がオキシダーゼである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１の酵素がラッカーゼではない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第１の酵素が、ＥＣコード１．８．３．２．または１．８．３．３．を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第１の酵素がスルフヒドリルオキシダーゼである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の酵素がグルタチオンオキシダーゼである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第１の酵素がジスルフィドイソメラーゼである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質性基質が、好ましくはミオシンを含むタンパク質性食材である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有し、またはそれに由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウ、サメからなる群から選択される肉を含有し、またはそれに由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉および鶏肉からなる群から選択され、最も好ましくは、豚肉である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２の酵素が、同一酵素組成物内に存在する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第１の酵素が、使用に先立って第２の酵素から単離される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第１の酵素および第２の酵素が、キットの形態の酵素系として提供され、前記キットが、第１の酵素を含む第１のポットと、第２の酵素を含む第２のポットとを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第１の酵素が、使用に先立って０．００１から３００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系の形態で存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第２の酵素が、使用に先立って０．００１から５００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系の形態で存在する、請求項１９から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
酵素系が、タンパク質性食品の酵素処理のための食品加工助剤の形態である、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
酵素系が、１種または複数の食品酵素組成物成分および／または担体などのさらなる構成成分を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ａ）における遊離チオールの除去が、タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程ａ）における遊離チオールの除去が、タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質性基質中の遊離チオールの濃度を低減するための、前記請求項のいずれか一項に定義される第１の酵素の使用。
【請求項２７】
タンパク質性基質が、好ましくはミオシンを含むタンパク質性食材である、請求項２６に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２８】
タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有し、またはそれに由来する、請求項２７に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２９】
タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウおよびサメからなる群から選択される肉を含有し、またはそれに由来する、請求項２８に記載の第１の酵素の使用。
【請求項３０】
タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉および鶏肉からなる群から選択され、最も好ましくは、豚肉である、請求項２９に記載の第１の酵素の使用。
【請求項３１】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、請求項２６から３０のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【請求項３２】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、請求項２６から３１のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【請求項３３】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の低減が、ミオシンなどの、基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、請求項２６から３２のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【請求項３４】
第２の酵素が、請求項１から２５のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項３３に記載の第１の酵素の使用。
【請求項３５】
活性が遊離チオールの存在によって阻害される第２の酵素により、遊離チオールを含むタンパク質性基質に対する酵素活性を改善する方法であって、遊離チオールを除去できる第１の酵素でのタンパク質性基質の処理を含み、第１の酵素での処理が、第２の酵素での処理に先立って、またはそれと同時に実施され、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法。
【請求項３６】
酵素活性が、前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらす、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第１の酵素が、請求項１から２６のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項３５から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
第２の酵素が、チロシナーゼ、ラッカーゼ、リポキシゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、タンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）、ガラクトリパーゼおよびリゾホスホリパーゼからなる群から選択される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質性基質が、請求項１から２６のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
タンパク質が架橋された食材を調製する方法であって、
ａ．タンパク質性食材を、遊離チオールを分解または酸化できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性食材を第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性食品中に存在するタンパク質の架橋をもたらす方法。
【請求項４１】
遊離チオールを分解または酸化できる酵素が、請求項１から２５のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
工程ａ）が、請求項２６から３４のいずれか一項に記載の第１の酵素の使用を含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
工程ａ）が、タンパク質性食材の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
工程ａ）が、タンパク質性食材の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
工程ａ）が、ミオシンなどの、食物基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、タンパク質性食材の遊離チオール濃度の低減をもたらす、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
第２の酵素が、請求項１から２５のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
タンパク質性食品が、請求項２７から３０のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
タンパク質性食材が、ミオシンを含み、工程ａ）およびｂ）後の、処理されたタンパク質性食品中に存在するミオシンタンパク質の架橋度が、少なくとも５％である、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
工程ａ）およびｂ）後の、タンパク質性食材のゲル強度または水分保持能または両方が、未処理タンパク質性食品と比較して増強される、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４０から４９のいずれか一項によって調製された食材。
【請求項５１】
前記食品中に存在する遊離チオールの濃度が、１５μＭ以下、または１０μＭ以下、または５μＭ以下である、請求項５０に記載のタンパク質性食材。
【請求項５２】
ゲル強度が少なくとも２ｇ増強されている、請求項５０から５１に記載のタンパク質性食材。
【請求項５３】
水分保持能が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％増強されている、請求項５０から５２のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【請求項５４】
総ミオシンの少なくとも１０％が架橋されている、請求項５０から５３のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【請求項５５】
遊離チオールの濃度が、少なくとも２μＭ低減されている、請求項５０から５４のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【請求項５６】
タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉に由来する、請求項５０から５５のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【請求項５７】
食品が、人工添加物、特に、リン酸塩などの添加物を含まない、請求項５０から５６のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【請求項５８】
請求項５０から５７のいずれか一項に記載のタンパク質性食材を含む加工食品。
【請求項５９】
食品が、調理肉、乾燥および半乾燥加工肉製品、発酵製品、乳化製品、魚類およびシーフード製品、新鮮肉筋肉、挽いた新鮮肉／再構成新鮮肉、再形成肉、家禽製品、レトルト製品、オートクレーブ処理した肉製品、ベジタリアンおよび肉類似製品からなる群から選択される、請求項５８に記載の加工食品。
【請求項６０】
水分保持が増強されたタンパク質性食材を調製するための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項６１】
ゲル強度が増強されたタンパク質性食材を調製するための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項６２】
きめまたは口当たりが改善されたタンパク質性食材を調製するための、請求項１から２５のいずれか１つに記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルフヒドリルオキシダーゼなどの第１の酵素でのタンパク質性基質の酵素処理に関する。第１の酵素は、タンパク質性基質中に存在する遊離チオールなどの酵素阻害剤を除去する。基質中の阻害性化合物の除去によって、チロシナーゼによる基質中に存在するタンパク質のタンパク質架橋などの第２の酵素の有効な酵素作用が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ０２／１４４８４およびＷＯ０２／１４５９５には、シュードモナス科から単離されたチロシナーゼ酵素、および特に羊毛繊維のようなタンパク質繊維のタンパク質架橋のためのその使用が報告されている。
【０００３】
ＷＯ２００６／０８４９５３には、トリコデルマ属の種から得られるチロシナーゼ酵素および食用タンパク質の架橋におけるその使用が報告されている。
【０００４】
スルフヒドリルオキシダーゼは、一般反応：２ＲＳＨ＋Ｏ２→ＲＳ−ＳＲ＋Ｈ２Ｏ２に従って、スルフヒドリル基のジスルフィドへの酸化を触媒する。
【０００５】
多数のスルフヒドリルオキシダーゼが当技術分野で公知であり、例えば、酵母由来のスルフヒドリルオキシダーゼが、例えばＸ−Ｚｙｍｅ（Ｅｒｖ１ｐおよびＥｒｖ１ｐ−Ｘ１）ＧｍｂＨ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ／Ｇｅｒｍａｎｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｘ−ｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍｌ）から市販されており、R.S. de la Motte and F.W. Wagner, Biochemistry 26 (1987)7363-7371は、アスペルギルス・ニガー由来のスルフヒドリルオキシダーゼを提供し、ＵＳ４，０８７，３２８には、牛乳から調製されたスルフヒドリルオキシダーゼが報告されており、ＵＳ４，６３２，９０５には、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）から得られたスルフヒドリルオキシダーゼが報告されており、ＵＳ４，８９４，３４０には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のスルフヒドリルオキシダーゼが報告されており、Hoober et al., 1996, Journal of Biological Chemistry 271 No 48 pp 30510-30516には、鶏卵白スルフヒドリルオキシダーゼが提供されている。
【０００６】
食品の調製におけるスルフヒドリルオキシダーゼの使用、例えば、ベーキングにおける使用が知られている：ＥＰ０３２１８１１Ｂには、グルコースオキシダーゼと組み合わせて、生地を強化するためにスルフヒドリルオキシダーゼを使用できることが開示されている。ＥＰ０７０５５３８Ｂには、ウシおよび微生物スルフヒドリルオキシダーゼが、ヘミセルロースと組み合わせて生地のための酵素添加剤として使用されていると報告されている。ＷＯ２００６／０４６１４６には、スルフヒドリルオキシダーゼが、デュラム小麦焼成品の調製において使用できることが示されている。
【０００７】
ＷＯ２００７／０９３６７４には、チロシナーゼを添加することにより低成分肉製品を調製する方法、およびチロシナーゼによって改変された低成分肉製品が報告されている。チロシナーゼは、低含量の少なくとも塩、リン酸塩または肉を有する低成分肉製品のきめ(texture)または水結合特性を改変するために使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Lantto et al., LWT 389 (2006) 1117-1124には、豚肉における、微生物トランスグルタミナーゼ、キノコチロシナーゼおよびポリフェノールオキシダーゼおよびトランスグルタミナーゼの両方を含有するリンゴ粉の適用が報告されている。すべての酵素調製物は、非加熱肉ホモジネートのゲル硬度を改善できたということが報告されている。添加されたシステインは、リンゴ粉処理豚肉の硬度に対して正に影響を及ぼしたが、キノコチロシナーゼおよび微生物トランスグルタミナーゼ処理肉に対して負に影響を及ぼした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、タンパク質性食材などのタンパク質性基質中に天然に存在する、遊離チオールなどの阻害性物質が、チロシナーゼなどのいくつかの酵素の阻害に関与し、スルフヒドリルオキシダーゼなどの、このような作用物質を減少または排除できる可能性がある第１の酵素の使用により、阻害性物質によって阻害されるチロシナーゼなどの酵素を有効に利用して、例えば、タンパク質性基質中に存在するタンパク質を架橋することが可能となり、これはゲル強度、水分保持能を改善し、および／またはタンパク質性基質のきめを改善し得るという発見に基づく。
【００１０】
一態様では、本発明は、活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素での処理に先立つ、またはそれと同時の、スルフヒドリルオキシダーゼなどの第１の酵素でのタンパク質性基質の処理に関する。第１の酵素は、タンパク質性基質中に存在する遊離チオールなどの酵素阻害剤を除去する。基質中の阻害性化合物の除去によって、チロシナーゼ酵素による基質中に存在するタンパク質のタンパク質架橋などの、第２の酵素のより有効な作用が可能となり得る。
【００１１】
別の態様では、本発明は、架橋されたタンパク質性基質を調製する方法であって、
ａ．遊離チオールを含むタンパク質性基質を、遊離チオールを除去できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性基質を、活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、または工程ｂ）と同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらす方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、第１の酵素および第２の酵素を含む酵素系であって、第１の酵素が、タンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素であり、第２の酵素がチロシナーゼである酵素系を提供する。
【００１３】
本発明は、タンパク質性基質中の遊離チオールの濃度を低減するための、スルフヒドリルオキシダーゼなどの第１の酵素の使用をさらに提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、活性が遊離チオールの存在によって阻害される第２の酵素による、遊離チオールを含むタンパク質性基質に対する酵素活性を改善する方法であって、遊離チオールを除去できる第１の酵素でのタンパク質性基質の処理を含み、第１の酵素での処理が、第２の酵素での処理に先立って、またはそれと同時に実施され、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、架橋されたタンパク質性製品を調製する方法であって、
ａ．遊離チオールを分解または酸化できる第１の酵素でタンパク質性基質を処理する工程と、
ｂ．第２の酵素でタンパク質性基質を処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらす方法を提供する。
【００１６】
上記の方法は、タンパク質が架橋されたタンパク質性製品の調製をもたらす。
【００１７】
タンパク質性基質は、タンパク質性食材であり得る。
【００１８】
タンパク質性製品は、タンパク質性のタンパク質が架橋された食材であり得る。
【００１９】
本発明はまた、上記方法によって調製された、架橋されたタンパク質性製品を提供し、タンパク質性基質がタンパク質性食材である場合には、本発明はまた、タンパク質性のタンパク質が架橋された食材製品を含む食品を提供する。
【００２０】
本発明はまた、水分保持能の増強および／またはゲル強度の増大を示す、ミオシンタンパク質を含むタンパク質性食材または食品も提供し、これでは、タンパク質性食品中に存在するミオシンタンパク質の少なくとも一部が架橋されている。製品の水分保持能およびゲル強度は、本発明の方法を用いずに製造された同様の製品、または本明細書において別に定義されるような製品と比較できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＴｒＴｙｒ２およびＴＧａｓｅで処理された肉抽出物。レーンは以下の抽出物／処理を含む：１）シチメンチョウ肉／ＴＧａｓｅ、２）シチメンチョウ肉／ＴｒＴｙｒ２、３）シチメンチョウ肉／参照、４）タラ／ＴＧａｓｅ、５）タラ／ＴｒＴｙｒ２、６）タラ／参照、７）牛肉／ＴＧａｓｅ、８）牛肉／ＴｒＴｙｒ２、９）牛肉／参照、１０）豚肉／ＴＧａｓｅ、１１）豚肉／ＴｒＴｙｒ２、１２）豚肉／参照、１３）鶏肉／ＴＧａｓｅ、１４）鶏肉／ＴｒＴｙｒ２、１５）鶏肉／参照、１６）子羊肉／ＴＧａｓｅ、１７）子羊肉／ＴｒＴｙｒ２、１８）子羊肉／参照。
【図２】ＳＴＰＰを含むバッファー（レーン１〜３）および含まないバッファー（レーン４〜６）に対して透析した豚肉抽出物。抽出物は、ＴＧａｓｅで（レーン１および４）、ＴｒＴｙｒ２で（レーン２および５）で処理されているか、または参照である（レーン３および６）。
【図３】さらなる酵素処理の前にスルフヒドリルオキシダーゼで処理した抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。「高ＳＯＸ」は、０．３３Ｕ／ｍｌでの処理を表す。低ＳＯＸは、０．０３３ｎｋａｔ／ｍｌを表す。ａ）豚肉由来の抽出物。レーンは、（第１の酵素処理／第２の酵素処理）を含む：１）高スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴＧａｓｅ、２）高スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴｒＴｙｒ２、３）高スルフヒドリルオキシダーゼ／処理なし、４）低スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴＧａｓｅ、５）低スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴｒＴｙｒ２、６）低スルフヒドリルオキシダーゼ／処理なし、７）処理なし／ＴＧａｓｅ、８）処理なし／ＴｒＴｙｒ２、９）処理なし／処理なし。ｂ）牛肉由来の抽出物。レーンは、（第１の酵素処理／第２の酵素処理）を含む：１）高スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴＧａｓｅ、２）高スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴｒＴｙｒ２、３）高スルフヒドリルオキシダーゼ／処理なし、４）低スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴＧａｓｅ、５）低スルフヒドリルオキシダーゼ／ＴｒＴｙｒ２、６）低スルフヒドリルオキシダーゼ／処理なし、７）処理なし／ＴＧａｓｅ、８）処理なし／ＴｒＴｙｒ２、９）処理なし／処理なし。
【図４】図４は、種々の肉抽出物から製造されたゲルのゲル強度およびＷＨＣの両方が、タンパク質含量と正に相関することを示す。この図は、参照サンプル（酵素処理なし）を表すだけであるということに留意されたい。タラ抽出物から製造されたゲルは、不均質であり、これはゲル強度測定値に大きな変動を与える。しかし、その他のゲルについてよりも、一貫して低かった。
【図５】ａ：水（Ｒｅｆ；ｎ＝３）、チロシナーゼ単独（ＴｒＴｙｒ２；ｎ＝２）、チロシナーゼおよびスルフヒドリルオキシダーゼ同時（ＴｒＴｙｒ２＋スルフヒドリルオキシダーゼ；ｎ＝１）またはトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ  ｎ＝２）のいずれかで処理された、タンパク質抽出物から製造された種々の熱誘導性ゲルのゲル強度。ｂ：ａと同様であるが、ＷＨＣを表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
一態様では、架橋されたタンパク質性基質を調製する方法であって、
ａ．遊離チオールを含むタンパク質性基質を、遊離チオールを除去できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性基質を、活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらし、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法が開示される。
【００２３】
さらなる態様では、方法は、活性が遊離チオールの存在によって阻害される第２の酵素による、遊離チオールを含むタンパク質性基質に対する酵素活性を改善するための方法であって、タンパク質性基質の、遊離チオールを除去できる第１の酵素での処理を含み、第１の酵素での処理が、第２の酵素での処理に先立って、またはそれと同時に実施され、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法が開示される。
【００２４】
本発明者らは、タンパク質性基質におけるチロシナーゼ酵素の阻害は、タンパク質性基質中に存在する遊離チオールの存在によるものであり得るということを見い出した。本発明は、タンパク質性基質の遊離チオール含量の少なくとも一部の除去に基づいており、それによって、チロシナーゼなどの第２の酵素の阻害を少なくとも部分的に軽減する。
【００２５】
本発明は、特に、チロシナーゼが、加工肉製品の水分保持を増大し、ゲル強度を改善し、きめおよび口当たりを改善するのに適した加工助剤と考えられている食肉加工産業に関係している。
【００２６】
酵素処理
本発明は、架橋されたタンパク質性基質を調製する方法であって、
ａ．遊離チオールを含むタンパク質性基質を、遊離チオールを除去できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性基質を、活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、それと同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらし、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、タンパク質が架橋された食材などの、架橋されたタンパク質製品を調製する方法であって、
ａ．タンパク質性基質を、遊離チオールを分解または酸化できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性基質を、第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらして、架橋されたタンパク質製品を製造する方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、活性が遊離チオールの存在によって阻害される第２の酵素による、遊離チオールを含むタンパク質性基質に対する酵素活性を改善する方法であって、遊離チオールを除去できる第１の酵素でのタンパク質性基質の処理を含み、第１の酵素での処理が、第２の酵素での処理に先立って、またはそれと同時に実施され、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法を提供する。
【００２９】
一実施形態では、例えば、工程ａ）における第１の酵素での処理は、タンパク質性基質の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす。
【００３０】
一実施形態では、例えば、工程ａ）における第１の酵素での処理は、タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす。
【００３１】
一実施形態では、例えば、工程ａ）における第１の酵素での処理は、タンパク質性食材などの基質中に存在するミオシンであり得るタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分な、タンパク質性基質の遊離チオール濃度の低減をもたらす。
【００３２】
架橋されたタンパク質性製品中に存在するタンパク質の架橋は、ｉｉ）本発明の方法によって得られた本発明の架橋されたタンパク質性製品と比較した、ｉ）タンパク質性基質中に存在するタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定できる。ｉ）と比較したｉｉ）における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の平均的な大きさの増大は、タンパク質が架橋された製品を示す。チロシナーゼの活性によって形成されるタンパク質架橋が、ジチオトレイトールまたはメルカプトエタノールなどの還元剤によって影響を受けないので、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥが適当である。
【００３３】
一実施形態では、タンパク質性食材は、ミオシンを含み、工程ａ）およびｂ）後の、処理された（すなわち、架橋された）タンパク質性食品中に存在するミオシンタンパク質の架橋度は、少なくとも５％である。
【００３４】
上記の方法は、タンパク質性基質（例えば、食材）のゲル強度または水分保持能または両方を増強するために使用でき、その結果、工程ａ）およびｂ）が実施された後、タンパク質性基質と比較して、タンパク質が架橋されたタンパク質性製品において、これらのパラメータのうち１種または複数が増強される。
【００３５】
第１の酵素
第１の酵素は、通常、肉抽出物、例えば、豚肉抽出物などのタンパク質性基質内の第２の酵素の阻害を軽減できる酵素として選択される。実施例は、このような肉抽出物が実施される方法のプロトコールを提供する。実施例に開示されるチロシナーゼスポットアッセイを使用し、対照阻害剤としての遊離システインまたは実施例に従って調製された豚肉抽出物などの肉抽出物のいずれかを使用して、チロシナーゼ阻害およびその軽減を測定できる。
【００３６】
本分析から、タンパク質性基質中に存在する阻害剤種のうちの１種または重要な阻害剤種が、遊離システインなどの遊離チオールであるということが考慮される。したがって、このような一実施形態では、タンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素は、本明細書において「第１の酵素」と呼ばれる。
【００３７】
用語「遊離チオールを除去すること」は、タンパク質性基質中に存在する遊離チオールの濃度の低下（すなわち、低減）を指し、これは、オキシダーゼであり得る第１の酵素を使用して適宜実施できるということは認識されるべきである。
【００３８】
したがって、用語「遊離チオールを除去すること」は、必ずしも、あらゆる遊離チオールを欠くタンパク質性基質／製品の調製に関連せず、ただ、遊離チオールの濃度が低減されているということが考慮されるべきである。
【００３９】
一実施形態では、用語「遊離チオールを除去すること」または「遊離チオールの濃度を低減すること」とは、「遊離チオールの酸化」を指す。
【００４０】
したがって、本発明は、タンパク質性食材などのタンパク質性基質中の遊離チオールの濃度を低減するための第１の酵素の使用を提供する。
【００４１】
タンパク質性基質からの遊離チオールの除去は、タンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素を使用して実施してよい。このような酵素は、遊離チオール枯渇アッセイを使用して同定できる。一実施形態では、実施例に従って調製した、ミンチにした豚肉基質抽出物を用いて、遊離チオール枯渇アッセイを使用する。
【００４２】
１ユニットの酵素活性は、リン酸バッファー中、ｐＨ７．４および３０℃で、基質として１ｍＭを用いて、１分あたり１μｍｏｌの遊離チオール基、例えば、遊離システインまたはグルタチオンを消費する酵素の量として定義される。
【００４３】
触媒活性はまた、所定の基質濃度、温度およびｐＨで、１秒あたり１ｍｏｌの基質を変換するのに必要とされる酵素の量である、カタール（触媒活性のＳＩユニット）で定義してもよい。
【００４４】
したがって、１ｎｋａｔ／ｇは、０．０６ユニット／ｇの比酵素活性に相当し、または１ユニット／ｇは、１６．６ｎｋａｔ／ｇに相当する。
【００４５】
タンパク質性基質から遊離チオールを除去する方法の１つは、遊離チオール構成成分、またはその一部を酸化することであり、したがって、このような実施形態では、第１の酵素は、オキシダーゼ（オキシド−レダクターゼ）酵素であることが好ましい。
【００４６】
一実施形態では、第１の酵素は、オキシダーゼ酵素、例えば、以下の活性のうち１以上を示す酵素である：スルフヒドリルオキシダーゼ、ラッカーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１０．３．２）、グルタチオンオキシダーゼおよびジスルフィドイソメラーゼ。
【００４７】
一実施形態では、第１の酵素は、ＥＣ１．８．３．２および１．８．３．３からなる群から選択される酵素活性を示す。
【００４８】
一実施形態では、第１の酵素は、スルフヒドリルオキシダーゼであるか、またはスルフヒドリルオキシダーゼ活性、すなわち、Ｅ．Ｃ．１．８．３．２を示す。
【００４９】
一実施形態では、第１の酵素は、過酸化水素を生成できる酵素、例えば、炭水化物オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼまたはヘキソースオキシダーゼである。このような実施形態では、本発明者は、生成した過酸化水素が、存在する遊離チオールを酸化し、それによって、チロシナーゼの阻害を軽減するということを考慮している。
【００５０】
用語スルフィドリルオキシダーゼ（ＳＯＸ）は、式：２ＲＳＨ＋０２→ＲＳＳＲ＋Ｈ２０２に従ってチオール化合物をその対応するジスルフィドに変換する酵素として国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会によって提示される酵素分類Ｅ．Ｃ．１．８．３．２によって定義される。
【００５１】
多数のスルフヒドリルオキシダーゼが、当技術分野で公知であり、本発明の目的のために使用してもよい。一実施形態では、スルフヒドリルオキシダーゼは、微生物供給源、例えば、真菌、例えば、酵母またはアスペルギルスから単離してもよく、またはそれに由来するものであってもよい。ＥＰ０３２１８８１、ＥＰ０３３８４５２およびＥＰ０７０５５３８には、製パン適用における微生物スルフィドリルオキシダーゼの使用が報告されている。
【００５２】
好ましいスルフヒドリルオキシダーゼは、アスペルギルス・ニガーに由来するもの、例えば、de la Motte and Wagner Biochemistry 26 (1987) 7363 - 737に記載されるスルフィドリルオキシダーゼであり得る。
【００５３】
参照により本明細書に組み込まれるＵＳ４，６３２，９０５には、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）に由来するスルフィドリルオキシダーゼが提供されている。
【００５４】
その他のスルフィドリルオキシダーゼとして、ウシスルフィドリルオキシダーゼが挙げられる。
【００５５】
アスペルギルスＳＯＸ酵素−ＮＣＢＩ受託番号−以下の記録は、参照により本明細書に組み込まれる。
1:  CAB58940. unnamed protein p...[gi:6090366]
2:  EAU34803. FAD-linked sulfhy...[gi:114193103]
3:  XP_754731. FAD dependent sul...[gi:71000028]
4:  XP_749041. FAD dependent sul...[gi:70987121]
5:  XP_001213534. FAD-linked sulfhy...[gi:115395790]
6:  EAL92693. FAD dependent sul...[gi:66852368]
7:  EAL87003. FAD dependent sul...[gi:66846671]
8:  XP_001273306. FAD dependent sul...[gi:121711381]
9:  XP_001270904. FAD dependent sul...[gi:121705282]
10:  EAW11880. FAD dependent sul...[gi:119401457]
11:  EAW09478. FAD dependent sul...[gi:119399050]
12:  CAK40401. sulphydryl oxidas...[gi:134078459]
13:  XP_001401908. hypothetical prot...[gi:145257982]
14:  CAK38806. unnamed protein p...[gi:134074512]
15:  CAL00471. unnamed protein p...[gi:134083103]
16:  CAK49098. unnamed protein p...[gi:134078570]
17:  XP_001397560. hypothetical prot...[gi:145252094]
18:  BAE55270. unnamed protein p...[gi:83765127]
19:  XP_001402401. hypothetical prot...[gi:145256027]
20:  XP_001208942. augmenter of live...[gi:115384790]
21:  EAU38334. augmenter of live...[gi:114196634]
22:  XP_661363. hypothetical prot...[gi:67526603]
23:  XP_660631. hypothetical prot...[gi:67525139]
24:  EAA63598. hypothetical prot...[gi:40744422]
25:  EAA59967. hypothetical prot...[gi:40740777]
【００５６】
酵母ＳＯＸ−酵素−ＮＣＢＩ受託番号−以下の記録は、参照により本明細書に組み込まれる。
1: EDN61625sulfhydryl oxidas...[gi:151943312]
2: EDN61173sulfhydryl oxidas...[gi:151942827]
3: P27882Mitochondrial FAD...[gi:2506175]
4: Q12284FAD-linked sulfhy...[gi:2492823]
5: 1JRA_DChain D, Crystal ...[gi:18158801]
6: 1JRA_CChain C, Crystal ...[gi:18158800]
7: 1JRA_BChain B, Crystal ...[gi:18158799]
8: 1JRA_AChain A, Crystal ...[gi:18158798]
9: 1JR8_BChain B, Crystal ...[gi:18158797]
10: 1JR8_AChain A, Crystal ...[gi:18158796]
11: P55789FAD-linked sulfhy...[gi:2492821]
12: CAA92143unknown [Saccharo...[gi:1072405]
13: AAB48659regulatory protei...[gi:172378]
14: CAB16284sulfhydryl oxidas...[gi:2408079]
15: P36046Intermembrane spa...[gi:90110034]
16: CAB46757sulfhydryl oxidas...[gi:5441486]
17: NP_011543Erv1p [Saccharomy...[gi:6681846]
18: NP_015362Erv2p [Saccharomy...[gi:6325296]
19: CAA97017ERV1 [Saccharomyc...[gi:1945314]
20: CAA97016ERV1 [Saccharomyc...[gi:1945313]
21: CAA48192ERV1 [Saccharomyc...[gi:404218]
22: CAA94987unknown [Saccharo...[gi:1314111]
23: CAA43129regulatory protei...[gi:4305]
24: CAH56919unnamed protein p...[gi:52747921]
25: NP_005685COX17 homolog, cy...[gi:5031645]
26: XP_570710thiol oxidase [Cr...[gi:58267108]
27: AAW43403thiol oxidase, pu...[gi:57226944]
28: CAL00471unnamed protein p...[gi:134083103]
29: NP_005253erv1-like growth ...[gi:54112432]
30: CAK38806unnamed protein p...[gi:134074512]
31: XP_001397560hypothetical prot...[gi:145252094]
32: AAA96390ERV1 [Homo sapien...[gi:6136037]
33: CAD25469PROTEIN OF THE ER...[gi:19069001]
34: XP_001644445hypothetical prot...[gi:156842152]
35: XP_001642797hypothetical prot...[gi:156837548]
36: EDO16587hypothetical prot...[gi:156115088]
37: EDO14939hypothetical prot...[gi:156113366]
38: XP_001382524predicted protein...[gi:150863891]
39: XP_001383309predicted protein...[gi:126133569]
40: ABN64495predicted protein...[gi:149385147]
41: ABN65280predicted protein...[gi:126095458]
42: XP_570522hypothetical prot...[gi:58266732]
43: AAW43215conserved hypothe...[gi:57226755]
【００５７】
配列番号１で示されるような、適したスルフィフリル（sulfyhryl）オキシダーゼは、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ０５６５１７２によって提供される。
【００５８】
配列番号１：
>gi|134078459|emb|CAK40401.1| 特許ＥＰ５６５１７２−Ａ１−アスペルギルス・ニガーに由来するスルフィドリルオキシダーゼＳＯＸ
MAPKSLFYSLFSTISVALASSIPQTDYDVIVVGGGPAGLSVLSSLGRMRRKTVMFDSGEYRNGVTREMHD
VLGFDGTPPAQFRGLARQQISKYNSTSVIDIKIDSITPVEDAAANSSYFRAVDANGTQYTSRKVVLGTGL
VDVIPDVPGLREAWGKGIWWCPWCDGYEHRDEPLGILGGLPDVVGSVMETHTLYSDIIAFTNGTYTPANE
VALAAKYPNWKQQLEAWNVGIDNRSIASIERLQDGDDHRDDTGRQYDIFRVHFTDGSSVVRNTFITNYPT
AQRSTLPEELSLVMVDNKIDTTDYTGMRTSLSGVYAVGDCNSDGSTNVPHAMFSGKRAGVYVHVEMSREE
SNAAISKRDFDRRALEKQTERMVGNEMEDLWKRVLENHHRRS
【００５９】
ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）は、ＳＨ基を直接酸化すると報告されている（参考文献：Applied and Environmental Microbiology, February 2000, p. 524-528, Vol. 66, No. 2）。したがって、一実施形態では、第１の酵素（enxyme）は、ラッカーゼであるか、またはラッカーゼ活性を示す。
【００６０】
用語「ラッカーゼ活性」は、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会によって提示される酵素分類ＥＣ１．１０．３．２（ラッカーゼ）または酵素分類ＥＣ１．１０．３．１（カテコールオキシダーゼ）、酵素分類ＥＣ１．１０．３．４（ｏ−アミノフェノールオキシダーゼ）、または酵素分類ＥＣ１．３．３．５（ビリルビンオキシダーゼ）によって定義される。
【００６１】
多数のラッカーゼ酵素、例えば、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）に由来するラッカーゼ、特に、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０５４０３４Ａの配列番号２の１から３４３によって表されるラッカーゼについて報告するＷＯ２００７／０５４０３４Ａに開示されるものが、当技術分野で公知である。本発明の一実施形態では、オキシダーゼはラッカーゼ、例えば、ポリポラス（polyporus）種ラッカーゼ、例えば、ＷＯ９６／００２９０（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｉｎｃ．から）に記載されるポリポラス・ピニシタス（Polyporus pinisitus）ラッカーゼ（トラメーテス・ビロサ（Trametes villosa）ラッカーゼとも呼ばれる）またはミセリオフテラ（Myceliophthera）種のラッカーゼ、特に、ＷＯ９５／３３８３６（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｉｎｃ．から）に記載されるミセリオフテラ・サーモフィラ（Myceliophthera thermophila）ラッカーゼである。さらに、ラッカーゼは、スキタリジウム（Scytalidium）種のラッカーゼ、例えば、ＷＯ９５／３３８３７（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｉｎｃ．から）に記載されるＳ．サーモフィリウム（thermophilium）ラッカーゼまたはピリクラリア（Pyricularia）種のラッカーゼ、例えば、ＳＩＧＭＡから商標名ＳＩＧＭＡ番号Ｌ５５１０の下で購入できるピリキュラリア・オリザエ（Pyricularia oryzae）ラッカーゼまたはコプリナス（Coprinus）属の種のラッカーゼ、例えば、Ｃ．シネレウス（C.cinereus）ラッカーゼ、特に、Ｃ．シネレウスＩＦＯ３０１１６ラッカーゼまたはリゾクトニア（Rhizoctonia）属の種のラッカーゼ、例えば、Ｒｈ．ソラニ（solani）ラッカーゼ、特に、ＷＯ９５／０７９８８（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓから）に記載される、６．０〜８．５の範囲のｐＨ最適を有する中性のＲｈ．ソラニラッカーゼであり得る。ラッカーゼはまた、コリビア（Collybia）、フォメス（Fomes）、レンチナス（Lentinus）、プレウロータス（Pleurotus）、アスペルギルス、ニューロスポラ（Neurospora）、ポドスポラ（Podospora）、フレビア（Phlebia）、例えば、Ｐ．ラジアータ（radiata）（ＷＯ９２／０１０４６）、コリオラス（Coriolus）属の種、例えば、アラゲカワラタケ（C.hirsitus）（ＪＰ２−２３８８８５）またはボトリチス（Botrytis）属などの真菌に由来するものであり得る。さらなるラッカーゼは、ＷＯ０１／８３７７０に開示されている。
【００６２】
用語「グルタチオンオキシダーゼ」（ＧＯＸ）は、反応２グルタチオン＋Ｏ（２）＝酸化型グルタチオン＋Ｈ（２）Ｏ（２）を触媒し、システインおよびいくつかのその他のチオールの酸化を触媒し得る酵素として、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会によって提示される酵素分類（Ｅ．Ｃ．１．８．３．３）として定義される。一実施形態では、グルタチオン活性は、酸素の存在下でバッファー溶液中のグルタチオンの消失を測定することによって決定できる。このような実施形態では、１「ＧＯＸ」ユニットは、３０℃、ｐＨ７で、１分あたり１μモルグルタチオンを酸化するのに必要とされる酵素の量である。
【００６３】
第１の酵素投与量：
一実施形態では、第１の酵素は、少なくとも０．０１ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも０．１ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも１ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも１０ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも５０ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも１００ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも２００ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも３００ｎｋａｔ／ｍｇの比活性を有する。一実施形態では、第１の酵素は、５００ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、３００ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、１００ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、１０ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、５ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、１ｎｋａｔ／ｍｇ以下の比活性を有する。
【００６４】
一実施形態では、第１の酵素は、０．００００１ｍｇ／ｇから１００ｍｇ／ｇの間のタンパク質性基質、例えば、０．０１ｍｇ／ｇから１０ｍｇ／ｇの間、例えば、０．１０ｍｇ／ｇから５ｍｇ／ｇの間の量でタンパク質性基質に加えられる。一実施形態では、タンパク質性基質１ｇあたり、少なくとも０．００００１ｍｇ、例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．００１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．０１ｍｇ／ｇの第１の酵素が加えられる。一実施形態では、タンパク質性基質１ｇあたり、最大１０ｍｇ、例えば、最大５ｍｇ／ｇ、例えば、最大１ｍｇ／ｇ、例えば、最大０．５ｍｇ／ｇ、例えば、最大０．２ｍｇ／ｇの第１の酵素が加えられる。
【００６５】
一実施形態では、加えられる第１の酵素の量は、０．０１から１ｎｋａｔ／ｇ、例えば、０．０２から０．５ｎｋａｔ／ｇの間のタンパク質性基質（または食材）である。
【００６６】
第２の酵素
タンパク質性基質中の阻害性化合物の除去によって、第２の酵素のより有効な作用、例えば、チロシナーゼによる、基質中に存在するタンパク質の、より有効なタンパク質架橋が可能となり得る。
【００６７】
一実施形態では、第２の酵素は、その触媒作用が、遊離チオールの存在によって阻害される酵素である。一実施形態では、タンパク質性基質中のチロシナーゼなどの第２の酵素の触媒作用が、タンパク質の架橋をもたらす。
【００６８】
一実施形態では、用語「改善」は、第１の酵素での処理を行わない製品中の第２の酵素の触媒活性と比較した、本発明に従って処理された製品中の第２の酵素の触媒活性の増大によって定義される。
【００６９】
一実施形態では、用語「改善」は、測定可能なパラメータ（例えば、ゲル強度）の変化によって定義され、これは製造業者または消費者により改善と受け取られる。
【００７０】
一実施形態では、用語「改善」は、第１の酵素での処理を行わない製品中の水分保持能と比較した、本発明に従って処理された製品中の水分保持能の改善によって定義される。
【００７１】
別の実施形態では、用語「改善」は、第１の酵素での処理を行わない製品中の架橋と比較した、本発明に従って処理された製品中の架橋の改善によって定義される。
【００７２】
別の実施形態では、用語「改善」は、第１の酵素での処理を行わない製品のきめ(texture)と比較した、本発明に従って処理された製品のきめの改善によって定義される。
【００７３】
一実施形態では、酵素活性は、肉などのタンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらす。タンパク質性基質、例えば、肉中のタンパク質の架橋のために使用するのに適している第２の酵素の一例として、チロシナーゼがある。
【００７４】
一実施形態では、第１の酵素および第２の酵素は、同一酵素ではない。
【００７５】
一実施形態では、第２の酵素は、チロシナーゼ、ラッカーゼ、リポキシゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、タンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）、ガラクトリパーゼおよびリゾホスホリパーゼからなる群から選択される。
【００７６】
一実施形態では、第２の酵素は、チロシナーゼ、ラッカーゼ、リポキシゲナーゼおよびタンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）からなる群から選択される。さらなる一実施形態では、第２の酵素は、リポキシゲナーゼおよびタンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）からなる群から選択される。さらなる一実施形態では、第２の酵素は、ラッカーゼである。酵素は、ＥＣ番号：１．１４．１８．１によって記載される群に属するチロシナーゼであることが最も好ましい。
【００７７】
一態様では、第２の酵素は、国際生化学分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会によって提示される酵素分類ＥＣ  Ｅ．Ｃ．１．１４．１８．１によって定義されるチロシナーゼである（モノフェニルモノキソイゲナーゼ（monophenyl monoxoygenase）とも呼ばれる）。
【００７８】
チロシナーゼは、電子受容体として酸素を使用するフェノールオキシダーゼの群に属する。従来、チロシナーゼは、阻害剤に対する基質特異性および感受性に基づいてその他のフェノールオキシダーゼ、すなわち、ラッカーゼと区別され得る。しかし、区別は、今日では、構造的特徴に基づいている。構造的には、チロシナーゼとラッカーゼ間の主要な相違は、チロシナーゼは、その活性部位中に２個のＩＩＩ型銅を含む二核銅部位を有するが、ラッカーゼは、活性部位中に全部で４個の銅原子（ＩおよびＭ型銅、およびＩＩＩ型銅の対）を有する。チロシナーゼは、種々のフェノール化合物を対応するキノンに酸化する。キノンは、高度に反応性であり、非酵素的にさらに反応し得る。チロシナーゼの通常の基質は、チロシン（またはタンパク質中のチロシン残基）であり、これは、まず、ＤＯＰＡ（タンパク質中のジヒドロキシフェニルアラニンまたはＤＯＰＡ残基）にヒドロキシル化され、次いで、酵素によってドーパキノン（またはタンパク質中のドーパキノン残基）にさらに酸化される。ドーパキノンは、その他のドーパキノン、チオールおよびアミノ基などのいくつかの化学構造と非酵素的に反応し得る。したがって、以下に示されるように、チロシナーゼは、１種の同一のタンパク質において２種の酵素活性、すなわち、モノフェノールモノオキシガナーゼ（monophenol monooxyganase）活性（ＥＣ１．１４．１８．１）およびカテコールオキシダーゼ活性（ＥＣ１．１０．３．１）を有する。
【００７９】
【化１】
2015107119.tif 000002
【００８０】
チロシナーゼの基質特異性は比較的広く、この酵素は、いくつかのポリフェノールおよび芳香族アミンを酸化できる。しかし、ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）とは対照的に、チロシナーゼは、シリンガルダジンを酸化しない。タンパク質中の少なくともチロシン、リシンおよびシステイン残基は、チロシナーゼによって触媒された活性ドーパキノンと共有結合を形成する。
【００８１】
チロシナーゼ活性は、当技術分野で一般に知られている技術によって測定できる。Ｌ−ドーパまたはＬ−チロシンは、基質として使用でき、その後、ドーパクロム形成を分光光度的にモニタリングしてもよく、あるいは、酸素消費量をたどることによって基質消費をモニタリングしてもよい。
【００８２】
チロシナーゼは、自然界に広く分布しており、それらは動物、植物、真菌および細菌において見られる。特に、褐変を受けやすい野菜および果物には、チロシナーゼが豊富である。現在のところ、唯一の市販されているチロシナーゼは、キノコであるアガリクス・ビスポルス（Agaricus bisporus）に由来している。本発明において使用されるチロシナーゼは、チロシナーゼを産生し得る任意の動物、植物、真菌または微生物を起源とするものであり得る。本発明の１つの実施形態によれば、チロシナーゼは糸状菌に由来する。例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）から得られる細胞外チロシナーゼであり得る（ＷＯ２００６／０８４９５３）（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
チロシナーゼは、反応Ｌ−チロシン＋Ｌ−ドーパ＋Ｏ（２）−−＞Ｌ−ドーパ＋ドーパキノン＋Ｈ（２）Ｏを触媒する。
【００８４】
一実施形態では、チロシナーゼは、トリコデルマ属またはヒポクレア属などの真菌の種から単離されるか、それに由来する。
【００８５】
参照により本明細書に組み込まれるSelinheimo et al., FEBS Lett. 273, 4322-4335 (2006)は、トリコデルマ属由来のチロシナーゼを提供している。
【００８６】
一実施形態では、チロシナーゼは、配列番号２に開示されるように、翻訳と同時および翻訳後の修飾、例えば、シグナルペプチド切断を考慮している。
【００８７】
配列番号２
>gi|118764455|emb|CAL90884.1| チロシナーゼ２［ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）］
MLLSASLSALALATVSLAQGTTHIPVTGVPVSPGAAVPLRQNINDLAKSGPQWDLYVQAMYNMSKMDSHD
PYSFFQIAGIHGAPYIEYNKAGAKSGDGWLGYCPHGEDLFISWHRPYVLLFEQALVSVAKGIANSYPPSV
RAKYQAAAASLRAPYWDWAADSSVPAVTVPQTLKINVPSGSSTKTVDYTNPLKTYYFPRMSLTGSYGEFT
GGGNDHTVRCAASKQSYPATANSNLAARPYKSWIYDVLTNSQNFADFASTSGPGINVEQIHNAIHWDGAC
GSQFLAPDYSGFDPLFFMHHAQVDRMWAFWEAIMPSSPLFTASYKGQSRFNSKSGSTITPDSPLQPFYQA
NGKFHTSNTVKSIQGMGYSYQGIEYWQKSQAQIKSSVTTIINQLYGPNSGKKRNAPRDFLSDIVTDVENL
IKTRYFAKISVNVTEVTVRPAEINVYVGGQKAGSLIVMKLPAEGTVNGGFTIDNPMQSILHGGLRNAVQA
FTEDIEVEILSKDGQAIPLETVPSLSIDLEVANVTLPSALDQLPKYGQRSRHRAKAAQRGHRFAVPHIPP
L
【００８８】
シグナルペプチドプロセシングの全配列および詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０６／０８４９５３に記載されている。
【００８９】
１ユニットのチロシナーゼ活性−１ｎｋａｔは、ｐＨ７および２５℃で、１秒あたり１ｎｍｏｌのＬ−ドーパをドーパキノンに変換する酵素の量として定義される。
【００９０】
一実施形態では、第２の酵素は上記で定義されるラッカーゼである。
【００９１】
一実施形態では、第２の酵素は、酵素分類ＥＣ１．１３．１１によって定義されるリポキシゲナーゼである。リポキシゲナーゼは、シス，シス−１，４−ペンタジエン構造を含有する脂質のヒドロペルオキシ化を触媒する鉄含有ジオキシゲナーゼの一クラスである。一次生成物は、ヒドロペルオキシ脂肪酸であり、これは、通常、ヒドロキシ誘導体に迅速に還元される。
【００９２】
一実施形態では、第２の酵素は、ガラクトースオキシダーゼである。ガラクトースオキシダーゼ酵素は、第一アルコールの、対応するアルデヒドへの立体特異的酸化を触媒する。この酵素の生物学的にもっとも関連のある基質は、この酵素が広い基質特異性を示すためにわかっていない。一実施形態では、ガラクトースが基質である。
【００９３】
一実施形態では、第２の酵素は、酵素分類ＥＣ１．４．３．１３によって定義されるリシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）である。リシルオキシダーゼは、種々のコラーゲンおよびエラスチンの前駆体中のペプチジルリシン残基の酸化的脱アミノ化を触媒する細胞外銅依存性酵素である。次いで、脱アミノ化リシンは、アルデヒド架橋を形成することができる。
【００９４】
一実施形態では、第２の酵素は、酵素分類Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６によって定義されるガラクトリパーゼである。ガラクトリパーゼは、少なくとも１，２−ジアシル−３−β−Ｄ−ガラクトシル−ｓｎ−グリセロールを加水分解できる。概して、ガラクトリパーゼはまた、２，３−ジ−Ｏ−アシル−１−Ｏ−（６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトシル−β−Ｄ−ガラクトシル）−Ｄ−グリセロールおよびホスファチジルコリンおよびその他のリン脂質も加水分解できる。しかし、それらはトリグリセリドおよび／または１−モノグリセリドを加水分解できない、または実質的に加水分解できない。
【００９５】
一実施形態では、第２の酵素は、酵素分類ＥＣ３．１．１．５によって定義されるリゾホスホリパーゼである。リゾホスホリパーゼは、リゾグリセロホスファチデート（lysoglycerophosphatidates）中の単一の脂肪酸エステル結合の加水分解を触媒し、グリセリルホスファチデートおよび脂肪酸を形成する酵素である。
【００９６】
第２の酵素投与量。
使用される第２の酵素、例えば、チロシナーゼの投与量は、例えば、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも８０、少なくとも１６０、少なくとも３２０または少なくとも６４０ｎｋａｔ／ｇのタンパク質であり得る。本発明者らは、１００から５００の間、例えば、２００〜２００または２５０〜３５０の間、または（約）３００ｎｋａｔ／ｇの量の肉タンパク質が、通常、肉タンパク質の架橋に適していることを見い出している。
【００９７】
一実施形態では、第２の酵素、例えば、チロシナーゼは、少なくとも０．１ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも１ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも１０ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも１００ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも２００ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも２５０ｎｋａｔ／ｍｇ、例えば、少なくとも３００ｎｋａｔ／ｍｇの比活性を有する。
【００９８】
一実施形態では、第２の酵素、例えば、チロシナーゼは、１０００ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、８００ｎｋａｔ／ｍｇ以下、例えば、５００ｎｋａｔ／ｍｇ以下の比活性を有する。実施例において使用される酵素（配列番号２に由来する）は、約３００ｎｋａｔ／ｍｇの比活性を有する。
【００９９】
一実施形態では、第２の酵素は、０．００００１ｍｇ／ｇから１００ｍｇ／ｇの間のタンパク質性基質、例えば、０．０１ｍｇ／ｇから１０ｍｇ／ｇの間、例えば、０．１０ｍｇ／ｇから５ｍｇ／ｇの間の量でタンパク質性基質に加えられる。一実施形態では、タンパク質性基質１ｇあたり、少なくとも０．００００１ｍｇ、例えば、少なくとも０．０００１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．００１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．０１ｍｇ／ｇの第２の酵素が加えられる。一実施形態では、タンパク質性基質１ｇあたり、最大１０ｍｇ、例えば、最大５ｍｇ／ｇ、例えば、最大１ｍｇ／ｇ、例えば、最大０．５ｍｇ／ｇ、例えば、最大０．２ｍｇ／ｇの第２の酵素が加えられる。
【０１００】
一実施形態では、加えられる第２の酵素の量は、０．００１から１０ｎｋａｔ／ｍｌの間、例えば、０．０１ｎｋａｔ／ｍｌから１ｎｋａｔ／ｍｌの間のタンパク質性基質（または食材）、例えば、０．０２から０．５ｎｋａｔ／ｍｌである。
【０１０１】
酵素およびその調製
第１および第２の酵素は、その天然供給源から単離してもよく、または合成もしくは組換え技術によって調製してもよい。
【０１０２】
本明細書において言及される酵素のアミノ酸配列について、本明細書において開示または参照される配列に関しては、配列は変異体、相同体または断片であり得る（これらの用語は、ＥＰ１７０４２４０Ｂに定義されるように使用される）ということが認識される。酵素は、本明細書において開示または参照される（成熟）配列に対して少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％相同または１００％相同の相同性を有し得ることが適している。
【０１０３】
通常、第１および／または第２の酵素の発現は、真核細胞宿主、例えば、外来宿主細胞由来のものであり、翻訳と同時および翻訳後の修飾、例えば、シグナルペプチド切断をもたらす。
【０１０４】
ＥＰ１７０４２４０Ｂは、酵素の発現および調製のために使用できる標準組換え技術の記載を提供している。
【０１０５】
遊離チオール
チオールは、チオール基としても知られる−ＳＨ基を含む。遊離チオールは、チオール含有化合物、例えば、１０００ｇ／ｍｏｌ未満、例えば、５００ｇ／ｍｏｌ未満、例えば、３５０ｇ／ｍｏｌ未満、例えば、２００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するアミノ酸または短いペプチドである。
【０１０６】
通常、タンパク質性基質中に存在し得る、または形成され得る遊離チオールとして、システイン、グルタチオンが挙げられ、システインが好ましい。
【０１０７】
一実施形態では、遊離チオールは、−ＳＨ基含有（遊離）アミノ酸、例えば、遊離システイン−すなわち、アミノ酸モノマーとして存在し、ポリペプチド鎖の一部ではないシステインである。
【０１０８】
一実施形態では、「遊離チオール」は、１個以上のチオール基を含むペプチドであり、ペプチドは、２〜８個の間のアミノ酸残基の長さ、例えば、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸からなるペプチド、例えば、ジ−またはトリ−ペプチド、例えば、グルタチオンからなる。好ましい実施形態では、ペプチドは、１個以上のシステイン残基を含むことが適している。
【０１０９】
タンパク質性基質中に存在する遊離チオールの存在または濃度は、実施例において提供される遊離チオールアッセイによって求めることができる−肉抽出物の調製のためのプロトコールはまた、その他のタンパク質性基質を用いて使用してもよいということに留意されたい。
【０１１０】
一実施形態では、第１の酵素で処理され得る、タンパク質性（食物）基質中の遊離チオール濃度は、第１の酵素での処理に先立って、少なくとも２μＭ、例えば、少なくとも３μＭ、例えば、少なくとも４μＭ、例えば、少なくとも５μＭ、例えば、少なくとも６μＭ、例えば、少なくとも７μＭ、例えば、少なくとも８μＭ、例えば、少なくとも９μＭ、例えば、少なくとも１０μＭ、例えば、少なくとも１１μＭ、例えば、少なくとも１２μＭ、例えば、少なくとも１３μＭ、例えば、少なくとも１４μＭ、例えば、少なくとも１５μＭ、例えば、少なくとも１６μＭ、例えば、少なくとも１７μＭの遊離チオール濃度を有する。
【０１１１】
一実施形態では、第１の酵素で処理され得る、タンパク質性（食物）基質中の遊離チオール濃度は、第１の酵素での処理に先立って、５〜２５μＭの間、例えば、１０〜２５μＭの間、例えば、１５〜２０μＭの間の遊離チオール濃度を有する。
【０１１２】
一実施形態では、タンパク質性（食物）基質中の遊離チオール濃度は、第１の酵素での処理によって（例えば、工程ａ）後）、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％低減される。
【０１１３】
一実施形態では、第１の酵素での処理後（例えば、工程ａ）後）のタンパク質性（食物）基質中の遊離チオール濃度は、１５μＭ未満、例えば、１０μＭ未満、例えば、９μＭ未満、例えば、８μＭ未満、例えば、７μＭ未満、例えば、６μＭ未満、例えば、５μＭ未満、例えば、４μＭ未満、例えば、３μＭ未満である。
【０１１４】
一実施形態では、タンパク質性食物基質の遊離チオール濃度の低減は、（例えば、工程ａ後）、少なくとも１μＭ、例えば少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１１μＭ、少なくとも１２μＭ、少なくとも１３μＭ、少なくとも１４μＭ、少なくとも１５μＭ、例えば、少なくとも１６μＭである。
【０１１５】
一実施形態では、タンパク質性食物基質の遊離チオール濃度の低減は、ミオシンなどの、食物基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である。
【０１１６】
タンパク質性基質
タンパク質性食物基質は、食材または食品、好ましくは、食材の形態であり得る。タンパク質性（食物）基質は、肉または肉タンパク質を含むことが好ましい。
【０１１７】
さらなる一実施形態では、タンパク質性基質は、粉、生地、穀物由来製品、ミルク、ミルク由来製品、乳製品、ダイズタンパク質、豆乳または植物由来製品である。
【０１１８】
タンパク質性基質は、一実施形態では、食材である。
【０１１９】
一実施形態では、タンパク質性基質は、動物肉を含み、またはそれからなる。
【０１２０】
一実施形態では、肉基質などのタンパク質性基質は、ミオシンを含む。
【０１２１】
本明細書において、用語「タンパク質性」とは、少なくとも１重量％、例えば、少なくとも２重量％、例えば、少なくとも３重量％、例えば、少なくとも４重量％、例えば、少なくとも５重量％、例えば、少なくとも１０重量％、例えば、少なくとも１０重量％、例えば、少なくとも２０重量％、例えば、少なくとも３０重量％、例えば、少なくとも４０重量％、例えば、少なくとも５０重量％のタンパク質含量を有する基質または組成物を指す。
【０１２２】
好ましい実施形態では、タンパク質性基質または組成物は、タンパク質であるミオシンを含み、タンパク質性基質または組成物中に存在するタンパク質の例えば、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％がミオシンである。
【０１２３】
本明細書において用語ミオシンとは、真核細胞の筋肉中に見られるモータータンパク質、すなわち、肉中に見られる主要なタンパク質を指す。ミオシンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって１８８ｋＤａのタンパク質として同定される。したがって、ミオシンタンパク質の割合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定してもよい。
【０１２４】
用語「肉」とは、食物として使用され、好ましくは、脂肪および結合組織と結合していてもよい筋肉の肉を含む動物の肉を指す。本明細書において、肉は、家畜、獲物、家禽、魚およびその他の食用海洋動物の任意の種類の肉を含む。肉は、例えば、豚肉、牛肉、羊肉、カンガルー、鶏肉、シチメンチョウ肉、ダチョウ、魚、軟体動物、サメおよび甲殻類などであり得る。「肉製品」とは、必須成分として肉または肉タンパク質を含む任意の物質、例えば、ソーセージ、ハム、再構成肉製品、スリミなどを指す。
【０１２５】
タンパク質性基質は、一実施形態では、肉基質であり得る。
【０１２６】
一実施形態では、タンパク質性食物基質は、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有し、またはそれに由来する。
【０１２７】
一実施形態では、タンパク質性食物供給源は、哺乳類、例えば、豚肉、子羊肉、牛肉、ヤギ、ウマ、カンガルーなどから得られる（一般に、赤肉と呼ばれる）。
【０１２８】
一実施形態では、タンパク質性食物基質は、鳥類、例えば、家禽、例えば、鶏肉、シチメンチョウ肉、ダチョウから得られる。
【０１２９】
一実施形態では、タンパク質性食物基質は、白身魚、タラ、コダラ、コーリーなどといった魚類、サメなどの軟骨魚類、メカジキ、海水魚、マグロ、サバ、イワシ、セグロイワシ、ニシン、サケ、淡水魚、マスなどを含有し、またはそれに由来する。
【０１３０】
一実施形態では、タンパク質性食物基質は、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウ、サメからなる群から選択される肉を含有し、またはそれであり、またはそれを含み、またはそれに由来する。
【０１３１】
一実施形態では、タンパク質性食物基質は、豚肉、子羊肉、および鶏肉、最も好ましくは、豚肉であり、またはそれを含み、またはそれに由来する。
【０１３２】
用語豚肉とは、ブタの屠体から得た肉を指す。用語牛肉とは、ウシの屠体から得た肉を指す（雄ウシまたは雌ウシ）。用語子羊肉とは、ヒツジから得られた肉を指す。
【０１３３】
肉基質（または製品）は、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％または少なくとも４５重量％（湿潤）の肉を含み得ることが好都合である。肉基質（または製品）は、最大１００重量％の肉（湿潤）、例えば、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％および最大９０％の肉を含み得る。例えば、１再構成肉基質は、実際には、最大１００重量％の肉を含み得る。
【０１３４】
タンパク質性基質は、通常、水、例えば、１重量％から９５重量％の間の水を含む。肉（動物筋肉）は、通常、約６０〜７５％の水を含むが、種々の供給源および種々の種に由来する肉は、異なる量の水を含み得る。
【０１３５】
一実施形態では、タンパク質性基質に外因性の水を加える、例えば、本発明の方法の工程ａ）および／またはｂ）に先立って、またはその間に水を加える。肉基質に関連して、外因性の水は、例えば、動物から得られた肉中に天然には存在しない、または動物から得られた肉に由来しない水である。一実施形態では、外因性の水の量は、タンパク質性基質の元の重量（すなわち、外因性の水の添加の前）の１％から９０％の間、例えば、１０から８０％の間である。外因性の水または添加される水の量は、最大９０％、最大８０％、最大７０％、最大６０％、最大５０％、最大４０％、最大３０％、最大２０％、最大１０％であり得る。添加される水の量は、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％であり得る。
【０１３６】
工程ａ）および／またはｂ）に先立って、またはその間に基質に添加される外因性の水は、その他の成分を含み得る。
【０１３７】
タンパク質性基質と比較して水含量が増大された製品（例えば、肉製品）を製造するために、外因性の水を本発明の方法によってタンパク質性基質（例えば、肉基質）に組み込まれるようにすることができることが認識される。製品中に組み込まれなかった過剰の水は、分離および除去することができる。
【０１３８】
したがって、本発明の方法を使用して、肉製品の水分保持能を増強できることが認識される。これに関して、１つの好ましい実施形態では、タンパク質性基質の水含量は、本発明の酵素処理によって増大される。例えば、本発明の方法から得られた肉製品の水含量は、酵素処理の前の肉基質の水含量よりも高い。水含量の増大は、一実施形態では、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０、例えば、少なくとも１５％、例えば、少なくとも２０％であり得ることが適している。
【０１３９】
挽肉（基質）の粒径は、調製される予定の肉製品の種類に応じて変わる。再構成肉製品の製造には、肉は、通常、数ｃｍの縁を有する認識可能な断片に切断されるのに対し、ハムおよびソーセージ中の肉は、通常、挽かれ、刻まれおよび／またはミンチにされるか、そうでなければ、均質化される。一般に、ハムは、数ｍｍから最大１または数ｃｍの粒子を含む粗挽き肉を含むのに対し、ソーセージは、細挽き肉を含む。
【０１４０】
肉タンパク質（すなわち、肉基質中に存在する）は、機械的に分離された肉または再生された肉、および／または例えば、均質化されること、ミンチにすること、すりつぶすこと、サイコロ状にすること、液化することなど（まとめて「粉砕すること」と呼ばれる）によって機械的に破壊された肉の形態であり得る。一実施形態では、タンパク質性食物基質は、肉スラリー、再構成肉または乳化肉の形態である。
【０１４１】
一実施形態では、肉基質は、このようなタンパク質の乾重に基づいて約１〜約３０重量％（「％  ｗ／ｗ」）の動物タンパク質を含む。
【０１４２】
一実施形態では、肉基質は、食品の約１００％  ｗ／ｗに基づいて、約１％  ｗ／ｗ〜約３０％  ｗ／ｗの筋肉タンパク質（ミオシン）、約３０％  ｗ／ｗ〜約８０％  ｗ／ｗの水、最大約５０％  ｗ／ｗの脂肪を含む。
【０１４３】
一実施形態では、タンパク質性基質、例えば、肉基質は、所望により、水の存在下で肉を粉砕することによって得られる。
【０１４４】
肉スラリーは、通常、肉を最初に細かく挽き、水と混合する工程によって調製される。次いで、混合物を、遠心機中で乳化剤とともに使用して、筋肉から脂肪およびミオグロビンを分離する。次いで、生成物を三層：肉、過剰の水および脂肪に沈降させる。次いで、肉層を分離し、チキンナゲット、ソーセージ、バーガー、再構成肉などといった食品の調製において食材として直接使用するか、または将来の使用のために保存する（例えば、凍結することによって）。
【０１４５】
機械的分離肉（ＭＳＭ）は、機械的回収肉（ＭＲＭ）としても知られ、食用肉が付着している動物（例えば、牛肉、豚肉または鶏肉）の骨を、高圧下で篩または同様の装置に通して押し出し、食用肉組織から骨を分離することによって製造される、ペースト様およびバター様肉製品である。ＢＳＥ疾患の出現以来、機械的分離肉の使用は、あまり好まれておらず、回収肉が好ましい。
【０１４６】
回収肉とは、骨と肉組織を混合せずに、骨およびその他の屠体材料から抽出される残存肉を切り落とすことを指す。この肉は外観、きめおよび組成において、手作業によって得られた肉切り落とし物および同様の肉製品に匹敵する。肉は、骨からこそげとる、削り落とすまたは骨から肉を押し出すことによって、骨を破壊または粉砕することなく骨から肉を分離する。
【０１４７】
「肉基質」は、肉を含む。さらに、ＮａＣｌ、リン酸塩および／または水などの任意の従来の添加物を包含する「その他の成分」を含んでもよい。さらに、用語その他の成分は、例えば、ＮａＣｌおよびリン酸塩以外の塩、スパイス、保存料、抗酸化物質、安定剤、糖、甘味料、ゴム、結合剤、増量剤、デンプン、デキストリン型の炭水化物、動物性または植物性脂肪および油状物、脂肪代替品および／またはその他の非肉成分、例えば、ダイズ、カゼインおよびホエイ、コムギタンパク質およびその他の非肉タンパク質などを含む。
【０１４８】
一実施形態では、「肉基質」は、肉および水からなる、またはそれを含む。肉基質は、挽肉（communited meat）であり得る。
【０１４９】
肉製品
用語「肉製品」とは、タンパク質性基質が「肉基質」である、本発明の方法によって調製された製品を指す。したがって、タンパク質性のタンパク質が架橋されたタンパク質性製品は、肉製品であり得る。
【０１５０】
本発明の関連では、本発明の方法によって調製された製品は、第２の酵素（チロシナーゼ）の活性によって、挽肉を結合することによって調製された肉製品であり得る。このような肉製品は、再構成（restructured）（再構成（reconstituted））されたと呼ばれ得る。挽肉は、チロシナーゼ処理の前またはその間に、本発明の第１の酵素で処理される。
【０１５１】
一実施形態では、調製された肉製品は、１５〜１８重量％の脂肪を含有する脂肪低減（fat-reduced）製品または最大１０重量％の脂肪を含有する低脂肪（low-fat）肉製品または最大５重量％の脂肪を含有する脂肪のない肉製品であり得る。好ましくは、肉製品の脂肪含量は、１８重量％以下、好ましくは、１０重量％以下、最も好ましくは、５重量％以下またはさらに３重量％以下である。
【０１５２】
一実施形態では、肉製品は、２．０重量％未満の塩、好ましくは、１．５重量％未満を含み得る。１．２重量％以下の塩を含む肉製品が、通常、低塩製品と考えられる。したがって、本発明の肉製品は、１．２重量％以下の塩を含むことが好ましく、本発明の１つの実施形態によれば、１．０重量％以下を含む。この点において「塩」とは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を指す。一実施形態では、肉基質およびまたは製品は、本質的に塩を含まない、すなわち、リン酸塩の濃度は、０．１％重量％未満の塩である。
【０１５３】
リン酸塩の添加は、ここ何年かの間、増大したが、これは低塩製品の構造および水結合能を維持するためにリン酸塩を使用できるからである。現今、製造業では、通常、肉製品に０．２重量％（Ｐ２Ｏ５として測定される）のリン酸塩を加え、これは０．３４重量％のピロリン酸三ナトリウムに相当する。本発明の肉基質および／または製品は、０．２重量％未満のリン酸塩を含み得るが、０．１重量％以下の添加されるリン酸塩（Ｐ２Ｏ５として測定される）を含むことが好ましい。肉基質および／または製品はリン酸塩を含まない、すなわち、リン酸塩が添加されていないことが最も好ましい。
【０１５４】
一実施形態では、肉基質およびまたは製品は本質的にはリン酸塩を含まない−すなわち、リン酸塩の濃度は、０．１％重量％未満リン酸塩である。
【０１５５】
食材
本明細書において、用語「食材」とは、ヒトまたは動物の食事の一部を形成する食用組成物である。食材は、食物として直接使用してもよく、または食品の調製において使用してもよい。本発明の食材は、タンパク質性食材であることが好ましい。
【０１５６】
好ましい実施形態では、食材は、肉食材、すなわち、肉、例えば、本明細書において言及される肉、例えば、豚肉（ブタ）、牛肉、シチメンチョウ肉、鶏肉、子羊肉または魚からなる群から選択される肉を含む食材である。肉食材は、豚肉および鶏肉であることが好ましく、豚肉が最も好ましい。
【０１５７】
一実施形態では、肉食材は、本明細書において言及される粉砕方法によって調製され得る本明細書において言及される肉基質である。
【０１５８】
食品
本明細書において、用語「食品」とは、１種または複数の「食材」からなる、またはそれを含む食用組成物を指す。通常、食品は、組み合わされ、消費者によって直接購入される（または食される）食品に加工されるいくつかの「食材」を含む。これに関連して、一態様では、「食品」とは、加工された食材を指す。
【０１５９】
一実施形態では、本明細書において言及されるタンパク質が架橋されたタンパク質性製品は、（肉）食品であるか、または続いて、肉食品の調製において使用される。
【０１６０】
限定されない例では、食品は、以下の食品カテゴリーのうち１以上から選択され得る：
−調理肉−例えば、ハム、ロイン、ピクニックハム、ベーコン、豚バラ肉
−乾燥および半乾燥加工肉−発酵製品、乾燥加工および種菌を用いて発酵させたもの、例えば、ドライソーセージ、サラミ、ペペロニ、ドライハム
−冷消費および温消費用の乳化製品、例えば、モルタデッラ、フランクフルトソーセージ、ランチョンミート、パテ
−魚およびシーフード−エビ、サケ、再成形魚製品、凍結コールドパック魚。
−新鮮肉筋肉−全注入肉筋肉、例えば、ロイン、ショルダーハム、マリネ肉。
−挽いた新鮮肉／再構成新鮮肉−再形成肉。低温硬化性ゲルまたは結合によるアップグレードした切り取り肉、例えば、生の、未調理のロインチョップ、ステーキ、ロースト、新鮮ソーセージ、ビーフバーガー、ミートボール、ペルメニ。
−家禽製品−例えば、鶏肉またはシチメンチョウ胸肉または再形成家禽、チキンナゲット、チキンソーセージ。
−レトルト製品−オートクレーブ処理した肉製品、例えば、ピクニックハム、ランチョンミート、乳化製品。
−ベジタリアンおよび肉類似品−例えば、ベジタリアンソーセージ、ナゲット、バーガー
【０１６１】
酵素系
本発明は、第１の酵素を利用して、タンパク質性基質（組成物）から第２の酵素の阻害剤を除去する。第１の酵素処理は、第２の酵素処理の前または、さらに第２の酵素処理の間に実施してもよい。したがって、本発明は、第１の酵素および第２の酵素を含み、第１の酵素が、タンパク質性基質などの基質から第２の酵素の阻害剤を除去できる酵素系に関する。
【０１６２】
好ましい実施形態では、本発明は、第１の酵素および第２の酵素を含み、第１の酵素が、タンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素であり、第２の酵素がチロシナーゼである酵素系を提供する。
【０１６３】
一実施形態では、第１の酵素およびまたは第２の酵素は、単離された形態である。
【０１６４】
用語「単離」とは、それが天然に見られる環境からの酵素の単離を指す。
【０１６５】
一実施形態では、第１の酵素およびまたは第２の酵素は、精製された形態である。
【０１６６】
精製された第１および／または酵素が使用される、すなわち、酵素が、本発明の組成物に添加される前に精製されることが好ましい。酵素純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度測定を使用して決定されることが好ましい。精製された酵素は、少なくとも１０％純粋、例えば、少なくとも２０％純粋、例えば、少なくとも３０％純粋、例えば、少なくとも４０％純粋、例えば、少なくとも５０％純粋である。しかし、精製された酵素は、その他のタンパク質とともに配合され得、例えば、タンパク質安定化剤、例えば、ＢＳＡまたはその他の酵素と混合され得、したがって、酵素純度の評価は、精製後に酵素に加えられたタンパク質を除外するということは認識される。第１および第２の酵素が、同一区画内に両方とも存在する酵素系（１ポット系）のために、各（第１または第２の）酵素の純度は、その他の酵素が存在しないかのように算出される。
【０１６７】
一実施形態では、第１および第２の酵素は、同一酵素組成物内に存在する。
【０１６８】
しかし、一実施形態では、第１の酵素は、第２の酵素から単離される（使用に先立って）。
【０１６９】
これに関連して、酵素系は単一ポット（パート）または複数ポット（複数のパート）（例えば、２）ポット系であり得る。
【０１７０】
したがって、酵素系は、第１の酵素を含む第１のポット（パート）と、第２の酵素を含む第２のポット（パート）とを含むキットの形態で提供され得る。
【０１７１】
上記で使用される用語ポットまたはパートは、その他のポット／パートまたは区画（単数または複数）から単離された、単一の区画を指す。
【０１７２】
酵素系（または個々のポット）中に存在する第１の酵素の量は、例えば、少なくとも０．００１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．０１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも３ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも５ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも１０ｍｇ／ｇであり得る。約１５ｍｇ／ｇ以上、例えば、最大２５ｍｇ／ｇ、５０ｍｇ／ｇ、最大１００ｍｇ／ｇ、最大２００ｍｇ／ｇまたはさらには最大３００ｍｇ／ｇの投与量が適当であり得ることが適している。
【０１７３】
酵素系（または個々のポット）中に存在する第２の酵素の量は、例えば、少なくとも０．００１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．０１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも０．１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも３ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも５ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも１０ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも５０ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｇ、例えば、少なくとも２００ｍｇ／ｇ、またはさらにはそれ以上、例えば、最大５００ｍｇ／ｇ、例えば、最大４００ｍｇ／ｇ、または例えば、最大２５ｍｇ／ｇ、５０ｍｇ／ｇ、最大１００ｍｇ／ｇ、最大２００ｍｇ／ｇまたはさらには最大３００ｍｇ／ｇであり得る。
【０１７４】
一実施形態では、酵素系は、タンパク質性食品の酵素処理のための食品加工助剤の形態である。
【０１７５】
酵素系または複数の酵素系は、食品酵素組成物成分または担体などの、酵素配合において通常使用される任意のその他の成分を−例えば、マルトデキストリン、炭水化物ベースの物質、シリカベースの物質、タンパク質、タンパク質加水分解物および／またはその他のタンパク質ベースの物質、例えば、ＢＳＡなどの増量剤を含み得る。
【０１７６】
一実施形態では、例として、１０ｍｇのミックスは、ＳＯＸ０．０１５ｍｇ、チロシナーゼ２ｍｇおよび増量剤７．９８５ｍｇを含み得る。あるいは、１００ｍｇのミックスは、ＳＯＸ０．０１５ｍｇ、チロシナーゼ２ｍｇおよび増量剤９７．９８５ｍｇを含み得る。最初の場合では、処理するタンパク質１グラムあたり１０ｍｇのミックスを添加し、後者の例では、処理するタンパク質１グラムあたり１００ｍｇのミックスを添加する。処理する肉製品のタンパク質含量が３％であると推定する場合には、最初の場合では、肉製品１ｋｇに３００ｍｇの酵素ミックスを加え、後者の場合では、肉製品１ｋｇあたり３０００ｍｇを加える。
【０１７７】
本発明者らは、増量剤としてタンパク質を使用することは、チロシナーゼのさらなる基質を添加し、さらなる架橋につながるという利益をさらに有し得ることに注目する。
【０１７８】
一実施形態では、本発明は、水分保持が増強されたタンパク質性食材を調製するための本発明の酵素系の使用を提供し、および／または
一実施形態では、本発明は、ゲル強度が増強されたタンパク質性食材を調製するための本発明の酵素系の使用を提供し、および／または
一実施形態では、本発明は、きめまたは口当たりが増強されたタンパク質性食材を調製するための本発明の酵素系の使用を提供する。
【０１７９】
ゲル形成−ゲル強度。タンパク質が架橋されたタンパク質性製品などの本発明の製品は、タンパク質性基質または処理工程ａ）を含まずに調製された比較製品のいずれかと比較して、改善されたゲル強度を有し得る。一実施形態では、ゲル強度の改善は、少なくとも１ｇ、例えば、少なくとも２ｇ、少なくとも３ｇ、少なくとも４ｇ、少なくとも５ｇである。
【０１８０】
水分保持。タンパク質が架橋されたタンパク質性製品などの本発明の製品は、タンパク質性基質または処理工程ａ）を含まずに調製された比較製品のいずれかと比較して、改善された水分保持能を有し得る。一実施形態では、水分保持能は、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％改善されている。
【０１８１】
架橋。タンパク質が架橋されたタンパク質性製品などの本発明の製品のタンパク質架橋度は、非処理タンパク質性基質と比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％のタンパク質架橋度を有し得る。タンパク質架橋度は、タンパク質性基質と比較した、本発明の製品から得られたタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件を使用してよい）の濃度測定分析によって得ることができる。
【０１８２】
一実施形態では、製品中に存在するミオシンタンパク質のタンパク質架橋度は、非処理タンパク質性基質と比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％のタンパク質架橋度を有し得る。
【０１８３】
酵素組成物
酵素調製物は、動物、植物および微生物供給源から種々の純度で製造される。それらは、死滅細胞全体、細胞の一部または細胞を含まない抽出物からなり得る。それらはまた、担体、溶媒、保存料および抗酸化物質を含み得る。酵素調製物は、液体、半液体または乾燥固体調製物として配合され得る。食品酵素調製物は、従来、加工の際に食品に直接添加されてきた。多数の適用に関して、調製物の構成成分は加工食品中に残る。近年、固相支持体上に固定化された酵素が重要性を高めてきた。固定化酵素調製物は、高度に特異的な、精製された酵素を含むものから、死滅細胞全体または構造的に無傷の生存細胞を含むものまで多岐にわたり得る。いくつかの酵素過程について、酵素および細胞の同時固定化が有利であり得る。固定化酵素調製物は食品構成成分になるよう意図されるものではない。
【０１８４】
したがって、一態様では、第１の酵素およびまたは第２の酵素が固定化されることが認識される。しかし、第２の酵素の活性を考慮すると、第２の酵素は、固定化されていないこと、すなわち、おそらくは不活性の酵素（例えば、熱不活化型）が食品中に残ることが好ましい。
【０１８５】
（さらなる実施形態および態様）
実施形態１。第１の酵素および第２の酵素を含む酵素系であって、第１の酵素がタンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素であり、第２の酵素がチロシナーゼである酵素系。
【０１８６】
実施形態２。第１の酵素およびまたは第２の酵素が、単離または精製された形態である、実施形態１に記載の酵素系。
【０１８７】
実施形態３。第１の酵素がオキシダーゼである、前記実施形態のいずれかに記載の酵素系。
【０１８８】
実施形態４。第１の酵素がＥＣコード１．８．３．２．または１．８．３．３．を有する、実施形態１に記載の酵素系。
【０１８９】
実施形態５。第１の酵素がスルフヒドリルオキシダーゼである、実施形態１に記載の酵素系。
【０１９０】
実施形態６。第１の酵素がラッカーゼである、実施形態１に記載の酵素系。
【０１９１】
実施形態７。第１の酵素がグルタチオンオキシダーゼである、実施形態１に記載の酵素系。
【０１９２】
実施形態８。第１の酵素がジスルフィドイソメラーゼである、実施形態１に記載の酵素系。
【０１９３】
実施形態９。第１および第２の酵素が、同一酵素組成物内に存在する、実施形態１から８に記載の酵素系。
【０１９４】
実施形態１０。第１の酵素が、使用に先立って第２の酵素から単離される、前記実施形態のいずれかに記載の酵素系。
【０１９５】
実施形態１１。キットの形態で提供され、前記キットが、第１の酵素を含む第１のポットと、第２の酵素を含む第２のポットとを含む、実施形態１０に記載の酵素系。
【０１９６】
実施形態１２。第１の酵素が、使用に先立って０．００１から３００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系中に存在する、前記実施形態のいずれか１つに記載の酵素系。
【０１９７】
実施形態１３。第２の酵素が、使用に先立って０．００１から５００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系中に存在する、前記実施形態のいずれか１つに記載の酵素系。
【０１９８】
実施形態１４。タンパク質性食品の酵素処理のための食品加工助剤の形態である、前記実施形態のいずれか１つに記載の酵素系。
【０１９９】
実施形態１５。１種または複数の食品酵素組成物成分および／または担体などのさらなる構成成分を含む、実施形態１４に記載の酵素系。
【０２００】
実施形態１６。タンパク質性基質中の遊離チオールの濃度を低減するための、前記実施形態のいずれか１つに記載の第１の酵素の使用。
【０２０１】
実施形態１７。タンパク質性基質が、好ましくはミオシンを含むタンパク質性食材である、実施形態１６に記載の第１の酵素の使用。
【０２０２】
実施形態１８。タンパク質性食物基質が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有し、またはそれに由来する、実施形態１７に記載の第１の酵素の使用。
【０２０３】
実施形態１９。タンパク質性食物基質が、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウ、サメからなる群から選択される肉を含有し、またはそれに由来する、実施形態１７に記載の第１の酵素の使用。
【０２０４】
実施形態２０。タンパク質性食物基質が、豚肉、子羊肉および鶏肉、最も好ましくは、豚肉である、実施形態１７に記載の第１の酵素の使用。
【０２０５】
実施形態２１。タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、実施形態１６から２０のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【０２０６】
実施形態２２。タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、実施形態１６から２１のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【０２０７】
実施形態２３。タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の低減が、ミオシンなどの、基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、実施形態１６から２２のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【０２０８】
実施形態２４。第２の酵素が、実施形態１〜１５のいずれか１つに定義されるとおりである、実施形態２３に記載の第１の酵素の使用。
【０２０９】
実施形態２５。タンパク質が架橋された食材を調製する方法であって、
ａ．タンパク質性食材を、遊離チオールを分解または酸化できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性食材を第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性食品中に存在するタンパク質の架橋をもたらす方法。
【０２１０】
実施形態２６。遊離チオールを分解または酸化できる酵素が、実施形態１〜１５のいずれか１つに定義される第１の酵素に従うとおりである、実施形態２５に記載の方法。
【０２１１】
実施形態２７。工程ａ）が、実施形態１６〜２４のいずれか１つに従う第１の酵素の使用を含む、実施形態２５または２６に記載の方法。
【０２１２】
実施形態２８。工程ａ）が、タンパク質性食物基質の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、実施形態２５〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１３】
実施形態２９。工程ａ）が、タンパク質性食物基質の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、実施形態２５〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
実施形態３０。工程ａ）が、ミオシンなどの、食物基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、タンパク質性食物基質の遊離チオール濃度の低減をもたらす、実施形態２５〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
実施形態３１。第２の酵素が、実施形態１〜１５のいずれか１つに定義されるとおりである、実施形態２５〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
実施形態３２。タンパク質性食品が、実施形態１７〜２０のいずれか１つに定義されるとおりである、実施形態２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
実施形態３３。タンパク質性食材が、ミオシンを含み、工程ａ）およびｂ）後の処理されたタンパク質性食品中に存在するミオシンタンパク質の架橋度が少なくとも５％である、実施形態２５〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１８】
実施形態３４。工程ａ）およびｂ）後のタンパク質性食材のゲル強度または水分保持能または両方が、未処理タンパク質性食品と比較して増強される、実施形態２５〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
実施形態３５。実施形態２５〜３４のいずれか１つによって調製された食材。
【０２２０】
実施形態３６。前記食品中に存在する遊離チオールの濃度が、１５μＭ以下、または１０μＭ以下、または５μＭ以下である、実施形態３５に記載のタンパク質性食材。
【０２２１】
実施形態３７。ゲル強度が少なくとも２ｇ増強されている、実施形態３５〜３６に記載のタンパク質性食材。
【０２２２】
実施形態３８。水分保持能が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％増強されている、実施形態３５〜３７のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２２３】
実施形態３９。総ミオシンの少なくとも１０％が架橋される、実施形態３５〜３８のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２２４】
実施形態４０。遊離チオールの濃度が、少なくとも２μＭ低減されている、実施形態３５〜３９のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２２５】
実施形態４１。タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉に由来する、実施形態３５〜４０のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２２６】
実施形態４２。食品が、人工添加物、特に、リン酸塩などの添加物を含まない、実施形態３５〜４１のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２２７】
実施形態４３。実施形態３５〜４２のいずれか１つに記載のタンパク質性食材を含む加工食品。
【０２２８】
実施形態４４。調理肉、乾燥および半乾燥加工肉製品、発酵製品、乳化製品、魚およびシーフード製品、新鮮肉筋肉、挽いた新鮮肉／再構成新鮮肉、再形成肉、家禽製品、レトルト製品、オートクレーブ処理した肉製品、ベジタリアンおよび肉類似製品からなる群から選択される、実施形態４３に記載の加工食品。
【０２２９】
実施形態４５。水分保持が増強されたタンパク質性食材を調製するための、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の酵素系の使用。
【０２３０】
実施形態４６。ゲル強度が増強されたタンパク質性食材を調製するための、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の酵素系の使用。
【０２３１】
実施形態４７。きめまたは口当たりが向上されたタンパク質性食材を調製するための、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の酵素系の使用。
【０２３２】
態様１。架橋されたタンパク質性基質を調製する方法であって、
ａ．遊離チオールを含むタンパク質性基質を、遊離チオールを除去できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性基質を、活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらし、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法。
【０２３３】
態様２。第２の酵素が、チロシナーゼ、ラッカーゼ、リポキシゲナーゼおよびタンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）からなる群から選択される、態様１に記載の方法。
【０２３４】
態様３。第２の酵素が、リポキシゲナーゼおよびタンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）からなる群から選択される、態様２に記載の方法。
【０２３５】
態様４。第２の酵素がラッカーゼである、態様１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
態様５。第２の酵素がチロシナーゼである、態様１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
態様６。第１の酵素および／または第２の酵素が、単離または精製された形態である、態様１から５のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
態様７。第１の酵素がオキシダーゼである、態様１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３９】
態様８。第１の酵素がラッカーゼではない、態様１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４０】
態様９。第１の酵素が、ＥＣコード１．８．３．２．または１．８．３．３．を有する、態様１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
態様１０。第１の酵素がスルフヒドリルオキシダーゼである、態様１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
態様１１。第１の酵素がグルタチオンオキシダーゼである、態様１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
態様１２。第１の酵素がジスルフィドイソメラーゼである、態様１から６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
態様１３。タンパク質性基質が、好ましくはミオシンを含むタンパク質性食材である、態様１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
態様１４。タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有し、またはそれに由来する、態様１３に記載の方法。
【０２４６】
態様１５。タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウ、サメからなる群から選択される肉を含有し、またはそれに由来する、態様１４に記載の方法。
【０２４７】
態様１６。タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉および鶏肉からなる群から選択され、最も好ましくは、豚肉である、態様１５に記載の方法。
【０２４８】
態様１７。第１および第２の酵素が、同一酵素組成物内に存在する、態様１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
態様１８。第１の酵素が、使用に先立って第２の酵素から単離される、態様１から１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
態様１９。第１の酵素および第２の酵素が、キットの形態の酵素系として提供され、前記キットが、第１の酵素を含む第１のポットと、第２の酵素を含む第２のポットとを含む、態様１から１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
態様２０。第１の酵素が、使用に先立って０．００１から３００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系の形態で存在する、態様１９に記載の方法。
【０２５２】
態様２１。第２の酵素が、使用に先立って０．００１から５００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系の形態で存在する、態様１９から２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
態様２２。酵素系が、タンパク質性食品の酵素処理のための食品加工助剤の形態である、態様１９から２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
態様２３。酵素系が、１種または複数の食品酵素組成物成分および／または担体などのさらなる構成成分を含む、態様２２に記載の方法。
【０２５５】
態様２４。工程ａ）における遊離チオールの除去が、タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、態様１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
態様２５。工程ａ）における遊離チオールの除去が、タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、態様１から２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
態様２６。タンパク質性基質中の遊離チオールの濃度を低減するための、前記態様のいずれか１つにおいて定義される第１の酵素の使用。
【０２５８】
態様２７。タンパク質性基質が、好ましくはミオシンを含むタンパク質性食材である、態様２６に記載の第１の酵素の使用。
【０２５９】
態様２８。タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有し、またはそれに由来する、態様２７に記載の第１の酵素の使用。
【０２６０】
態様２９。タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウおよびサメからなる群から選択される肉を含有し、またはそれに由来する、態様２８に記載の第１の酵素の使用。
【０２６１】
態様３０。タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉および鶏肉からなる群から選択され、最も好ましくは、豚肉である、態様２９に記載の第１の酵素の使用。
【０２６２】
態様３１。タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、態様２６から３０のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【０２６３】
態様３２。タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、態様２６から３１のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【０２６４】
態様３３。タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の低減が、ミオシンなどの、基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、態様２６から３２のいずれかに記載の第１の酵素の使用。
【０２６５】
態様３４。第２の酵素が、態様１から２５のいずれか１つに定義されるとおりである、態様３３に記載の第１の酵素の使用。
【０２６６】
態様３５。活性が遊離チオールによって阻害される第２の酵素により、遊離チオールを含むタンパク質性基質に対する酵素活性を改善する方法であって、遊離チオールを除去できる第１の酵素でのタンパク質性基質の処理を含み、第１の酵素での処理が、第２の酵素での処理に先立って、またはそれと同時に実施され、第１の酵素および第２の酵素が、同一酵素ではない方法。
【０２６７】
態様３６。酵素活性が、前記タンパク質性基質中に存在するタンパク質の架橋をもたらす、態様３５に記載の方法。
【０２６８】
態様３７。第１の酵素が、態様１から２６のいずれか１つに定義されるとおりである、態様３５から３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２６９】
態様３８。第２の酵素が、チロシナーゼ、ラッカーゼ、リポキシゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、タンパク質リシン６−オキシダーゼ（リシルオキシダーゼ）、ガラクトリパーゼおよびリゾホスホリパーゼからなる群から選択される、態様３５から３７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７０】
態様３９。タンパク質性基質が、態様１から２６のいずれか１つに定義のとおりである、態様３５から３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２７１】
態様４０。タンパク質が架橋された食材を調製する方法であって、
ａ．タンパク質性食材を、遊離チオールを分解または酸化できる第１の酵素で処理する工程と、
ｂ．タンパク質性食材を第２の酵素で処理する工程と
を含み、工程ａ）が、工程ｂ）に先立って、またはそれと同時に実施され、工程ｂ）が、前記タンパク質性食品中に存在するタンパク質の架橋をもたらす方法。
【０２７２】
態様４１。遊離チオールを分解または酸化できる酵素が、態様１から２５のいずれか１つに定義されるとおりである、態様４０に記載の方法。
【０２７３】
態様４２。工程ａ）が、態様２６から３４のいずれか１つに記載の第１の酵素の使用を含む、態様４０または４１に記載の方法。
【０２７４】
態様４３。工程ａ）が、タンパク質性食材の遊離チオール濃度の、少なくとも５％の低減をもたらす、態様４０から４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２７５】
態様４４。工程ａ）が、タンパク質性食材の遊離チオール濃度の、少なくとも１μＭの低減をもたらす、態様４０から４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２７６】
態様４５。工程ａ）が、ミオシンなどの、食物基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、タンパク質性食材の遊離チオール濃度の低減をもたらす、態様４０から４４のいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
態様４６。第２の酵素が、態様１から２５のいずれか１つに定義されるとおりである、態様４０から４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
態様４７。タンパク質性食品が、態様２７から３０のいずれか１つに定義されるとおりである、態様４０から４６のいずれか１つに記載の方法。
【０２７９】
態様４８。タンパク質性食材が、ミオシンを含み、工程ａ）およびｂ）後の、処理されたタンパク質性食品中に存在するミオシンタンパク質の架橋度が、少なくとも５％である、態様４０から４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８０】
態様４９。工程ａ）およびｂ）後の、タンパク質性食材のゲル強度または水分保持能または両方が、未処理タンパク質性食品と比較して増強される、態様４０から４８のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
態様５０。態様４０から４９のいずれか１つによって調製された食材。
【０２８２】
態様５１。前記食品中に存在する遊離チオールの濃度が、１５μＭ以下、または１０μＭ以下、または５μＭ以下である、態様５０に記載のタンパク質性食材。
【０２８３】
態様５２。ゲル強度が少なくとも２ｇ増強されている、態様５０から５１に記載のタンパク質性食材。
【０２８４】
態様５３。水分保持能が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％増強されている、態様５０から５２のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２８５】
態様５４。総ミオシンの少なくとも１０％が架橋されている、態様５０から５３のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２８６】
態様５５。遊離チオールの濃度が、少なくとも２μＭ低減されている、態様５０から５４のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２８７】
態様５６。タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉に由来する、態様５０から５５のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２８８】
態様５７。食品が、人工添加物、特に、リン酸塩などの添加物を含まない、態様５０から５６のいずれかに記載のタンパク質性食材。
【０２８９】
態様５８。態様５０から５７のいずれか１つに記載のタンパク質性食材を含む加工食品。
【０２９０】
態様５９。調理肉、乾燥および半乾燥加工肉製品、発酵製品、乳化製品、魚およびシーフード製品、新鮮肉筋肉、挽いた新鮮肉／再構成新鮮肉、再形成肉、家禽製品、レトルト製品、オートクレーブ処理した肉製品、ベジタリアンおよび肉類似製品からなる群から選択される、態様５８に記載の加工食品。
【０２９１】
態様６０。水分保持が増強されたタンパク質性食材を調製するための、態様１から２５のいずれか１つに記載の方法の使用。
【０２９２】
態様６１。ゲル強度が増強されたタンパク質性食材を調製するための、態様１から２５のいずれか１つに記載の方法の使用。
【０２９３】
態様６２。きめまたは口当たりが増強されたタンパク質性食材を調製するための、態様１から２５のいずれか１つに記載の方法の使用。
【実施例】
【０２９４】
［実施例１］
材料および方法
成分：
豚肉（３〜７％脂肪）、牛肉（９〜１２％脂肪）、子羊肉（８〜１０％脂肪）、鶏肉（３〜６％脂肪）、シチメンチョウ肉（３〜７％脂肪）、およびタラ（脂肪含量未知）から得たミンチにした肉は、すべて地元の小売店で購入した。トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）チロシナーゼ（供給業者によれば、ＴｒＴｙｒ２；ＶＴＴ、Ｆｉｎｌａｎｄ、１０６７  ｎｋａｔ／ｍｌ）、ＴＧａｓｅ（供給業者によれば、Ａｃｔｉｖａ  ＭＰ；Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ；１６６６ｎｋａｔ／ｇ）、スルフヒドリルオキシダーゼ（アスペルギルス種／アスペルギルス・ニガー；３２５ｎｋａｔ／ｇ；測定された活性）
【０２９５】
タンパク質抽出物：
１．２％ＮａＣｌおよび０．３％ＳＴＰＰを使用してブライン(brine)を製造した
２．肉２０ｇ部分を、２５０ｍｌのバッフル付き振盪フラスコに入れた
３．各振盪フラスコに、６０ｍｌのブラインを加えた
４．振盪フラスコを、ロータリーシェーカー（Ｃｅｒｔｏｍａｔ  Ｒ、Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｔ．）上に置いた；室温で１２０分、１８０ｒｐｍ
５．肉−ブライン懸濁液を、１００００ｇ、５℃で６０分間遠心分離した
６．上清を０．８ｍｍ格子を通して濾過することによって脂肪粒子を除去した
７．肉−タンパク質抽出物（上清）を、−１８℃で保存した
【０２９６】
ゲル濾過／透析
透析を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｏｒｄｅｒ  ｎｒ：６６８１０）製のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットで実施した。透析は、透析バッファーを１回交換して４℃で一晩実施した。
【０２９７】
遊離チオール濃度の決定
エルマン試薬Ｉ：３ｍＭ  ＥＤＴＡ（０．５５８ｇ）；０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（１２．１４ｇ）を、約４００ｍｌの水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８に調整し、水を用いて最大５００ｍｌに満たした。エルマン試薬ＩＩ：ＤＴＮＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−８１３０）８ｍＧを、２０ｍｌのエルマンＩに溶解し、暗所で保存し、１日以内に使用した。
【０２９８】
タンパク質が結合しているチオールを除去するためおよびサンプルを清澄化するため：肉抽出物（０．５ｍｌ）および０．５％のトリクロロ酢酸（０．５ｍｌ）を、エッペンドルフ管中で混合した。この管を、１００００ｇで５分間遠心分離した。０．３ｍｌの上清を、新しい管に移し、４０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨを用いて中和した。
【０２９９】
分析：１００μＬのタンパク質を含まないサンプルを、マイクロタイタートレイウェル中で１７０μｌのエルマン試薬ＩＩと混合した。このサンプルを、プレートシェーカーを使用して混合した。プレートを、マイクロタイタープレートリーダーの内側で（暗所を維持するため）室温でインキュベートし、Ａｂｓ４２０を、エルマン試薬ＩＩの添加の正確に２分後に測定した。
チオール濃度の算出：
ε＝吸光係数
（２−ニトロ−５−チオベンゾエート；ＮＴＢ）＝１３６００Ｍ−１＊ｃｍ−１
ｒ＝ウェルの半径＝０．３５ｃｍ
ｖ＝ウェル中の容量サンプル＝０．２７ｍＬ
光路＝ｌ＝ｖ／（ε＊ｒ２）＝０．２７／（ε＊０．３５２）＝０．７０ｃｍ
チオール濃度（ｍｏｌ／Ｌ）＝Ａｂｓ４２０／（ｌ＊ε）＝Ａｂｓ４２０／（０．７０＊１３６００）
すべての決定は、２連で行った。
【０３００】
スルフヒドリルオキシダーゼ活性の測定：
スルフヒドリルオキシダーゼを添加した後の、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）濃度（上記に従う）の低下として測定される。活性は、１秒当たりに酸化されるｎｍｏｌ  ＤＴＴとして定義される。
【０３０１】
タンパク質含量の決定
パーセントでの総窒素含量は、ケルダール法に従って決定した（Ma T S & Zuazaga G. Micro-Kjeldahl determination of nitrogen. Ind. Eng. Chem. (Analytical Edition) 14:280-2, 1942）。タンパク質含量は、総窒素％を因子６．２５で乗じることによって求めた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｏｏｄｃｏｍｐ．ｄｋ／ｆｖｄｂ＿ａｂｏｕｔｆｏｏｄｄａｔａ＿ｐｒｏｘｉｍａｔｅｓ．ａｓｐ＃Ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【０３０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためのサンプル調製／酵素処理
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に先立ってタンパク質抽出物の酵素処理を以下のとおりに行った：チロシナーゼを、１５．５ｎｋａｔ／ｍｌ抽出物（抽出物１ｍｌあたり０．０１５ｍｇチロシナーゼに相当する）の終濃度に加え、４０℃で６０分間インキュベートした。ＴＧａｓｅを、２．５ｎｋａｔ／ｍｌ抽出物（抽出物１ｍｌあたり０．０１５ｍｇ  ＴＧａｓｅに相当する）の終濃度に加え、４０℃で６０分間インキュベートした。スルフヒドリルオキシダーゼを、０．００３３（低スルフヒドリルオキシダーゼ）または０．０３３（高スルフヒドリルオキシダーゼ）ｎｋａｔ／ｍｌの終濃度に加えた。それは、常に、その他の酵素処理に先立って、またはそれと同時に加えた。その他の酵素処理に先立って加えられる場合には、室温で６０分のインキュベーション時間を適用した。
【０３０３】
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Ｐｒｅ−ｃａｓｔ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）で、製造業者のプロトコールに従って実施した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、ＤＴＴをサンプルバッファーから除外した。
【０３０４】
チロシナーゼスポットアッセイおよび阻害の試験
１ｍｌのスキムミルクに、１１ｎｋａｔのチロシナーゼを添加することによって、チロシナーゼ活性のスポットアッセイを調べた。５〜１０秒以内の赤色形成は、チロシナーゼ活性が高いことを示す。チロシナーゼ阻害を調べるために、ミルクに添加する前に阻害剤をチロシナーゼと混合するか、チロシナーゼ添加の前に阻害剤をミルクに加える。調べた阻害剤は、終濃度１もしくは０．１ｍＭの遊離システインまたは最終サンプルで１０倍希釈された肉抽出物であった。
【０３０５】
きめおよびＷＨＣの評価のための肉タンパク質ゲルの製造
熱誘導した肉タンパク質ゲルを、以下の方法に従って製造した：
１．１２ｇの肉タンパク質抽出物を、５０ｍｌのねじ口プラスチック遠心管に入れた
２．酵素処理：１８０μＬ  ＴｒＴｙｒ２（１０６７ｎｋａｔ／ｍｌ）＋１８０μＬ水、１８０μＬスルフヒドリルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）＋１８０μＬ  ＴｒＴｙｒ２（１０６７ｎｋａｔ／ｍｌ）、１８０μＬスルフヒドリルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）＋１８０μＬ水または３６０μＬ水（参照）のいずれかを、肉タンパク質抽出物に加えた
３．サンプルを、４０℃で１時間インキュベートした
４．８０℃で６０分間加熱することによってゲルを製造した
５．ゲルを５℃で一晩保存した
６．ゲルを３５℃で２時間調節した
７．ＴＰＡ分析を、きめ分析器（ＴＩ−ＸＴ２、Ｓｔａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、以下の設定を用いて試験管中のゲルで実施した：プレスピード（Pre speed）２ｍｍ／秒、テストスペッド（Test sped）５ｍｍ／秒、トリガー力（trigger force）：３ｇ、移動距離（travel distance）３ｍｍ、圧縮５秒間の時間（time between compressions 5 sec）、ロードセル（Load cell）５ｋｇ、プローブ：Ｐ０．５（５ｍｍ  エボナイト）
８．ゲル中でクロスを切断し、試験管を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する（Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ  ４６）
９．上清を捨て、秤量した。
【０３０６】
水分保持能（ＷＨＣ）は以下のとおりに算出した：
ＷＨＣ＝
【数１】
2015107119.tif 000003
ＷＲは、ゲルから放出される水の重量であり、ＷＴｏｔは、ゲルの総重量である
【０３０７】
結果
図１は、製造したすべての肉タンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。各抽出物は、ＴＧａｓｅ（特定の抽出物の第１のレーン）、チロシナーゼ（特定の抽出物の第２のレーン）および酵素なし（特定の抽出物の第３のレーン）で処理した。約１８８ＫＤａのＭＷのバンドはミオシンである。
【０３０８】
図２は、電気泳動の前に透析した、豚肉から得た抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。最初の３レーンについては、抽出物を、ＳＴＰＰを含まないということを除いて、抽出に使用したブラインと同様のブライン溶液に対して透析した。レーン４〜６については、抽出物を、抽出に使用したものと同一のブライン溶液に対して透析した。図１と同様に、抽出物は、ＴＧａｓｅ（レーン１および４）およびＴｒＴｙｒ２（レーン２および５）の両方で処理した。
【０３０９】
表１は、各抽出物において測定されたタンパク質および遊離チオール濃度（２回の測定の平均）を列挙する。結果は、種々の抽出物のタンパク質および遊離チオール含量両方における大きな相違を示す。タンパク質含量および遊離チオール濃度の間に相関は全くないようである。０．０３３ｎｋａｔ／ｍｌスルフヒドリルオキシダーゼで６０分間処理した後の豚肉および牛肉抽出物の遊離チオール含量も測定した。
【０３１０】
【表１】
2015107119.tif 000004
【０３１１】
活性スポット試験は、約１０μＭの濃度まで低下した遊離システインが、チロシナーゼの顕著な阻害を与えるということを示した。システインおよび酵素を、基質を加える前に１分間互いに接触させた。
【０３１２】
図３は、架橋酵素の添加の前に、スルフヒドリルオキシダーゼで処理して遊離チオールを除去した豚肉（ａ）および牛肉（ｂ）抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０３１３】
図４は、種々の肉抽出物から作製したゲルのゲル強度およびＷＨＣの両方が、タンパク質含量と正に相関することを示す。この図は、参照サンプル（酵素処理なし）のみを表すことに留意されたい。タラ抽出物から作製したゲルは不均質であり、これはゲル強度測定において大きな変動を与える。しかし、それは、その他のゲルのものよりも一貫して低かった。
【０３１４】
図５ａおよびｂは、それぞれ、種々の酵素処理を行った、種々のタンパク質抽出物から得た熱誘導性ゲルのゲル強度およびＷＨＣを表す。スルフヒドリルオキシダーゼおよびＴｒＴｙｒ２の両方で処理した場合に、豚肉、鶏肉および子羊肉から得たゲルで、ゲル強度に対する著しく正の効果が観察された。牛肉およびシチメンチョウ肉抽出物から得たゲルについては、スルフヒドリルオキシダーゼ＋チロシナーゼでの処理によって、チロシナーゼ単独での処理と同様の結果が得られた。タラについてのゲル強度結果は、極めて不均質なゲルのために省略した。ゲルＷＨＣについて観察された傾向は、鶏肉ゲルのＷＨＣが、処理にもかかわらず変化しなかったことを除いてゲル強度と同様であった。タラのＷＨＣを測定できたが、ゲルは不均質であった。ＴＧａｓｅ処理は、参照のために実施した。
【０３１５】
豚肉抽出物ならびにスルフヒドリルオキシダーゼおよびチロシナーゼの組合せを用いる実験を反復し、同様の結果を得た。しかし、第２の実験は、種々のレベルのゲル強度およびＷＨＣの両方を示す新規タンパク質抽出物を用いて実施した。したがって、結果は図５に含めなかった。また、サンプルをスルフヒドリルオキシダーゼ単独を用いて実施した。この場合には、参照サンプルと比較して、ゲル強度およびＷＨＣに相違はなかった。
【０３１６】
考察
種々の種の動物から得た肉タンパク質抽出物に対するチロシナーゼ処理の効果は、同様ではない（図１）。豚肉から得た抽出物におけるチロシナーゼ処理の際に架橋が起こらないようであることが最も注目に値する（レーン１１−チロシナーゼ処理をレーン１２−参照と比較）が、例えば、牛肉に由来する抽出物では、チロシナーゼ処理の際にゲルの上部にＨＭＷタンパク質バンドが観察され、このことは、タンパク質架橋を示す（レーン８−チロシナーゼ処理をレーン９−参照と比較）。同時に、ミオシンバンド（１８８ＫＤａの）の強度の低減があり、これは、架橋されるのが、主にこのタンパク質であることを示す。豚肉を除いて、チロシナーゼ処理によって、すべての種に由来する抽出物中に高ＭＷタンパク質凝集体が生成する。しかし、架橋活性の効率は異なると思われる。タラ抽出物では、ミオシンバンドは、完全に消失し、このことは、極めて効率的な架橋を示す。さらに牛肉、シチメンチョウ肉、鶏肉および子羊肉については、種々の程度のミオシンバンド退色があり、このことは、種々の程度の架橋効率を示す。
【０３１７】
ＴＧａｓｅという周知のタンパク質架橋酵素は、陽性参照として常に含まれている（図１中、レーン１、４、７、１３、１６）。ＴＧａｓｅによって触媒される架橋は、すべての抽出物において効率的であると思われる。本明細書において記載される結果では、ＴＧａｓｅ活性は、任意のさらなる処理によって影響を受けなかった。
【０３１８】
ミオシンは、動物界において極めて保存されているタンパク質であり、したがって、ミオシン基質は、種々の肉サンプル間で同等であると考えられる。
【０３１９】
本発明者らは、豚肉または鶏肉などの肉基質における低チロシナーゼ活性は、種々の抽出物中のチロシナーゼ阻害の存在によるものであるということを明らかにした。この考えは、２つの簡単な試験によって実証された：１）チロシナーゼ処理前の豚肉抽出物の１０倍希釈が、酵素を活性にした（ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの高ＭＷバンドおよびミオシン退色として観察される；結果は示さず。２）チロシナーゼが、キノンの形成によってミルクを赤色に変える。これは、チロシナーゼ活性スポット試験として使用される。チロシナーゼが、ミルクに添加される前に豚肉抽出物と混合される場合には、色形成は観察されなかった。両試験は、抽出物の阻害効果を示す。
【０３２０】
さらに、本発明者らは、ミンチにした豚肉のタンパク質抽出物から作製したタンパク質ゲルのきめを改善するよう試みたが、きめの改善を得るには極めて高いチロシナーゼ濃度が必要であることが観察された。この結果もまた、チロシナーゼは、豚肉抽出物中のいくつかの構成成分から阻害されているということを支持する。
【０３２１】
豚肉抽出物の透析を実施した（図２）。タンパク質の抽出に使用したものと全く同じ溶液に対する透析は、チロシナーゼを活性にすると思われる（レーン５および６を比較）。これは、阻害が、低ＭＷ化合物から起こることを示す。
【０３２２】
リン酸塩は、チロシナーゼの潜在的な阻害剤であるが、これは、それらがチロシナーゼの触媒活性にとって必須である銅原子とコレート（collate）し得るからである。リン酸塩ＳＴＰＰは、すべての抽出物中に０．３％のレベルで存在する。しかし、ＳＴＰＰは、透析後も依然として存在するので、ＳＴＰＰが、阻害の原因であるということはありそうもない。さらに、すべての種から得た抽出物中に、チロシナーゼ触媒による架橋が効率的であるものにも存在する。それにもかかわらず、豚肉抽出物を、ＳＴＰＰを含まない溶液に対して透析した。上記と一致して、チロシナーゼ架橋のさらなる効率性は観察されなかった（レーン２および５の比較；ＳＤＳサンプル溶液は粘性であり、ピペッティングの正確性を低減させるので、バンド強度のわずかな相違の際には結論を導くべきではない）。追加の銅の添加もまた、チロシナーゼ活性を増強しないと思われた（結果は示さず）。
【０３２３】
文献研究によって、肉抽出物中で遭遇する可能性の高い２種の潜在的な阻害剤が示された。一方は、二重結合の総数が４を超えるトリグリセリドであり、もう一方は、遊離システインである。
【０３２４】
最初に、抽出前に肉から、潜在的に阻害性である脂質を除去するよう、種々の手順によって試みを行った。これらは、溶媒（ヘキサン、ａｃｅｔｅｍ、トリブチリンまたは水）での洗浄およびリパーゼでの処理を含んでいた。概ね、これらの実験から得た結果は決定的なものではなく、脂質がチロシナーゼ阻害の主原因であるということを示すものは全く決して与えなかった。
【０３２５】
システインの潜在的な阻害効果を追求するために、アッセイ培地中、種々の濃度のシステインを用いた状態、および用いない状態でのチロシナーゼ活性をスポットした。チロシナーゼは、１０μＭを超える濃度のシステインによって明らかに阻害された。その後、種々のタンパク質抽出物中の遊離チオール含量（遊離システインを含む）を測定した（表１）。豚肉から得た抽出物中に最高濃度の遊離チオールが存在することおよび濃度（１８．４μＭ）が、システインを用いて観察される阻害の限界を実質的に越えることが観察された。サンプル中に存在する遊離チオールのどのくらいが、遊離システインに起因するかはわかっていない。しかし、チロシナーゼが、遊離システイン単独ではなく、一般に、低ＭＷ遊離チオールによって阻害される可能性は高い。鶏肉および子羊肉から得た抽出物では、遊離チオール濃度はまた、システインについて見られた阻害レベルを超えていた。鶏肉および子羊肉抽出物から得たこれらのサンプルはまた、ミオシンバンドの最小の広範囲の退色が起こるものである（図１）、すなわち、チロシナーゼはある程度阻害されると思われる。タラ抽出物は、最低含量の遊離チオールを有し、また、ミオシンバンド退色が最も顕著である抽出物でもある。全体としてみると、これは、遊離チオールが、チロシナーゼ阻害に関与しているという強力な証拠である。
【０３２６】
遊離チオールの阻害効果を回避する試みでは、抽出物を、遊離チオールをジスルフィド化合物に酸化するスルフヒドリルオキシダーゼで処理した。豚肉から得た抽出物を、スルフヒドリルオキシダーゼ（０．３３または０．０３３ｎｋａｔ／ｍｌ）で処理した後、図３ａにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析での高ＭＷタンパク質凝集体の形成およびミオシンバンドの相当な退色からわかるようにチロシナーゼはもはや阻害されなかった（レーン２、５および８を比較）。スルフヒドリルオキシダーゼ単独は、観察可能なタンパク質架橋を全く引き起こさなかった（レーン３、６および９を比較）。本発明者らは、スルフヒドリルオキシダーゼが、タンパク質間でジスルフィド架橋を生成する可能性を考慮したが、これは、ＳＤＳサンプルバッファー中の還元剤ＤＴＴの存在のために、図３におけるゲルでは観察可能でない場合がある。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、非還元条件下（ＤＴＴを含まない）で実施した。しかし、スルフヒドリルオキシダーゼ単独の架橋効果は観察されなかった（結果は示さず）。牛肉抽出物（図３ｂ）については、チロシナーゼは、抽出物がスルフヒドリルオキシダーゼ処理を受けたか受けていないかにかかわらず、タンパク質を架橋できた。これは、スルフヒドリルオキシダーゼ自体は、チロシナーゼ活性に対して負の効果を有さないということを示す。
【０３２７】
肉タンパク質の架橋は、肉製品のきめおよび感覚の特性を増強し得る。初期の研究で、予想に反して、チロシナーゼ単独は、特に豚肉抽出物から製造された熱誘導タンパク質ゲルのゲル強度およびＷＨＣを増強しないことがわかった。上記の結果の延長として、チロシナーゼによって触媒された架橋によって期待されるタンパク質抽出物中の遊離チオールの除去が機能的効果を後押しできるかどうかを調べた。（図５）チロシナーゼ単独は、遊離チオール含量の低い抽出物（牛肉およびシチメンチョウ肉）から作製した熱誘導性タンパク質ゲルの強度およびＷＨＣの両方を改善し得るということがわかった。チオール含量の高い抽出物（豚肉および鶏肉）から製造したゲルでは、このような改善は、チロシナーゼ作用の前に遊離チオールが除去される（スルフヒドリルオキシダーゼによって）場合にのみ可能であった。
【０３２８】
種々の抽出物間にはゲル強度およびＷＨＣのレベルの極めて顕著な相違がある。これは、抽出物中の異なるタンパク質含量の結果である（図４）。
【０３２９】
結論
種々の種類の肉から得たタンパク質抽出物は、チロシナーゼによって触媒される架橋に関して極めて異なる特徴を示す。相違は、サンプル中の遊離チオールの異なるレベルと相関する。チロシナーゼ処理の前にスルフヒドリルオキシダーゼで処理することによって、相当な阻害を有する肉抽出物、例えば、豚肉から得た抽出物における、チロシナーゼによって触媒される架橋の低い効率が解消された。
【０３３０】
チロシナーゼ単独は、遊離チオール含量の低い抽出物（牛肉およびシチメンチョウ肉）から製造した、熱誘導タンパク質ゲルの強度およびＷＨＣの両方を改善し得る。チオール含量の高い抽出物（豚肉および鶏肉）から製造したゲルでは、このような改善は、チロシナーゼ作用の前に遊離チオールが除去される（スルフヒドリルオキシダーゼによって）場合にのみ可能であった。
【０３３１】
本発明者らは、ほとんどの肉は検出可能であり、多くの場合、相当な遊離チオール含量を有し、したがって、満足のいくゲル強度または水分保持能を得ることが可能である肉においてでさえ、スルフィドリルオキシダーゼ酵素の使用は、チロシナーゼの投与量の低減、および／またはより短い、もしくは、より望ましい酵素インキュベーション条件を可能にするということに注目する。
【０３３２】
この概念はまた、全肉製品に適用可能である。これは、ＳＯＸおよびチロシナーゼの種々の組合せを、ミンチにした鶏肉を含有するモデル鶏肉ソーセージレシピに添加することによって示された。ＳＯＸ処理後にチロシナーゼを加えた場合には、製品の製品硬度および水分保持能が、対照製品と比較して大幅に増大することがわかった。これは２種の酵素のいずれかを単独で使用した場合はあてはまらなかった。チロシナーゼ−ＳＯＸの組合せから、供給業者によって推奨される用量のトランスグルタミナーゼよりも大幅に高い製品硬度および水分保持能が生じた（結果は示さず）。
【図１】
2015107119.tif 000005
【図２】
2015107119.tif 000006
【図３】
2015107119.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【配列表】
2015107119000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月16日(2015.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の酵素および第２の酵素を含む酵素系であって、第１の酵素が、タンパク質性基質から遊離チオールを除去できる酵素であり、第２の酵素がチロシナーゼである酵素系。
【請求項２】
第１の酵素および／または第２の酵素が単離されたかまたは精製された形態である、請求項１に記載の酵素系。
【請求項３】
第１の酵素がオキシダーゼである、請求項１または２に記載の酵素系。
【請求項４】
第１の酵素がＥＣコード１．８．３．２．または１．８．３．３．を有する、請求項１に記載の酵素系。
【請求項５】
第１の酵素がスルフヒドリルオキシダーゼである、請求項１に記載の酵素系。
【請求項６】
第１の酵素がラッカーゼである、請求項１に記載の酵素系。
【請求項７】
第１の酵素がグルタチオンオキシダーゼである、請求項１に記載の酵素系。
【請求項８】
第１の酵素がジスルフィドイソメラーゼである、請求項１に記載の酵素系。
【請求項９】
第１および第２の酵素が同一酵素組成物内に存在する、請求項１から８のいずれか一項に記載の酵素系。
【請求項１０】
第１の酵素が、使用に先立って第２の酵素から単離される、請求項１から９のいずれか一項に記載の酵素系。
【請求項１１】
酵素系がキットの形態で提供され、前記キットが、第１の酵素を含む第１のポットと、第２の酵素を含む第２のポットとを含む、請求項１０に記載の酵素系。
【請求項１２】
第１の酵素が、使用に先立って０．００１から３００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系に存在する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の酵素系。
【請求項１３】
第２の酵素が、使用に先立って０．００１から５００ｍｇ／ｇの間の濃度で酵素系に存在する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の酵素系。
【請求項１４】
タンパク質性食品の酵素処理のための食品加工助剤の形態である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の酵素系。
【請求項１５】
１種または複数の食品酵素組成物成分および／または担体などのさらなる構成成分を含む、請求項１４に記載の酵素系。
【請求項１６】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の低減のための、請求項１から１５のいずれか一項に記載される第１の酵素の使用。
【請求項１７】
タンパク質性基質が、好ましくはミオシンを含む、タンパク質性食材である、請求項１６に記載の第１の酵素の使用。
【請求項１８】
タンパク質性食材が、哺乳類、鳥類または魚類などの動物肉を含有するか、またはそれに由来する、請求項１７に記載の第１の酵素の使用。
【請求項１９】
タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉、鶏肉、牛肉、シチメンチョウ肉、タラ、カンガルー、ダチョウおよびサメからなる群から選択される肉を含有するか、またはそれに由来する、請求項１７に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２０】
タンパク質性食材が、豚肉、子羊肉および鶏肉からなる群から選択され、最も好ましくは、豚肉である、請求項１７に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２１】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の少なくとも５％の低減をもたらす、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２２】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の少なくとも１μＭの低減をもたらす、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２３】
タンパク質性基質中の遊離チオール濃度の低減が、ミオシンなどの、基質中に存在するタンパク質を架橋する第２の酵素の能力を増強するのに十分である、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の第１の酵素の使用。
【請求項２４】
第２の酵素が請求項１から１５のいずれか一項に定義されるとおりである、請求項２３に記載の第１の酵素の使用。
【外国語明細書】
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【配列表】
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