(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光寿命測定での、短時間定量測定、高時間分解能が可能な、蛍光団が組み込まれたポリアクリルアミド蛍光性温度センサーの提供。【解決手段】感熱性ユニット、カチオン性ユニット及び蛍光性ユニットを含む共重合体を含む温度感受性プローブ。感熱性ユニットは、式（ａ）で表されるモノマーに由来する繰り返し構造を有する温度感受性プローブ。2015218304.tif 000032［Ｒ１はＨ及びＣ１−３アルキル；Ｒ４及びＲ５は、独立に、Ｈ及び、置換基を有してもよいＣ１−２０アルキル、又はＲ４及びＲ５は結合する窒素原子と４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノ及びアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感熱性ユニット、カチオン性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブであって、
相互に異なる最大蛍光波長を有する第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットを含んでなり、
感熱性ユニットが、以下の式（ａ）：
【化１】
2015218304.tif 000025
［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１−２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造であり、
カチオン性ユニットが、以下の式（ｂ）：
【化２】
2015218304.tif 000026
［式中、Ｒ２は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｗは、芳香環または−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１１であり；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ１−Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｑ１は、独立に、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−、−Ｃ（＝ＮＲ４１）−ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
【化３】
2015218304.tif 000027
により表される基から選択され；
Ｘｅ−およびＸｆ−はカウンターアニオンであり；
Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１−１０アルキル、およびＣ７−１４アラルキルから選択され、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ２４は、Ｃ１−１０アルキル、またはＣ７−１４アラルキルであり；
Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１−１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］
で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造である、温度感受性プローブ。
【請求項２】
第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットが、同一波長の励起光の照射によって相互に異なる最大蛍光波長の蛍光を生じるものである、請求項１に記載の温度感受性プローブ。
【請求項３】
第一の蛍光性ユニットの最大蛍光波長と、第二の蛍光性ユニットの最大蛍光波長との差が、５０ｎｍ以上である、請求項１に記載の温度感受性プローブ。
【請求項４】
第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのいずれか一方が、温度の上昇に応じて蛍光強度が上昇するものであり、他方が、温度の上昇に応じて蛍光強度が不変あるいは下降するものであり、望ましくは下降するものである、請求項１に記載の温度感受性プローブ。
【請求項５】
第一の蛍光性ユニットが、以下の式（ｃ）：
【化４】
2015218304.tif 000028
［式中、Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１２であり；
Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２であり；
Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ２−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造であり、
第二の蛍光性ユニットが、以下の式（ｄ）：
【化５】
2015218304.tif 000029
［式中、Ｒ５５は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｘ４は、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、または−Ｑ4−Ｎ（−Ｒ６１）−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）であり；
Ｒ６１は、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｑ４は、Ｃ１−２０アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンはハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造である、請求項１に記載の温度感受性プローブ。
【請求項６】
共重合体が、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）：
【化６】
2015218304.tif 000030
［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５、ならびにＲ２、Ｙ、ＷおよびＱ１は、請求項１で定義したとおりであり、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒ、ならびにＲ５５、Ｘ4、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、請求項５で定義したとおりであり、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される繰り返し単位を含んでなり、ａおよびｂの和が１００であり、ｂが２〜１０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の温度感受性プローブ。
【請求項７】
前記共重合体が、前記式（ａ）で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の温度感受性プローブ。
【請求項８】
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）：
【化７】
2015218304.tif 000031
［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５、ならびにＲ２、Ｙ、ＷおよびＱ１は、請求項１で定義したとおりであり、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒ、ならびにＲ５５、Ｘ4、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、請求項５で定義したとおりであり、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される繰り返し単位を含んでなる共重合体であって、ａおよびｂの和が１００であり、ｂが２〜１０である、共重合体。
【請求項９】
細胞内の温度を測定する方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の温度感受性プローブを溶媒中で細胞と混合することにより、該温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、
（ｂ）励起光照射下、第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのそれぞれに由来する蛍光の強度を測定する工程、および
（ｃ）測定された２つの蛍光強度の比を算出する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１０】
細胞内の温度を測定するためのキットであって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の温度感受性プローブまたは請求項８に記載の共重合体を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光性共重合体および当該共重合体を用いた細胞内温度の簡便な測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が栄養源を取り込み、代謝によってエネルギーを取り出す過程で生じる多くの化学反応は、温度に大きく依存している。つまり、細胞の数々の機能や反応は、細胞内外の温度によって制御されている、と言える。例えば、温度という物性を利用した研究は、医療研究に多く見られ、がん細胞での異常な熱発生などが報告されている（非特許文献１：Ｓｃａｎｄ． J．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８６年，第３６巻，第３５３〜３５７頁）。代謝活性の高いガン細胞と、そうでない正常細胞の識別に、熱発生を用いることが可能である。これを利用して、熱発生をターゲットにした治療法や創薬等の開発も検討されている。
【０００３】
医療研究のみならず、温度制御による細胞の代謝活性制御技術は、発酵などの微生物を利用した食品業界でも重要である。例えば、酒類醸造においては、酵母から発生する熱量とエタノールの産生量に相関があることが研究されている（非特許文献２：Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． １９８９年，第３４巻，第８６〜１０１頁）。
【０００４】
一方で、温度が生物学的な重要な指標になっていることに加え、細胞内の重要な反応の多くは細胞内で行われているにも関わらず、細胞内の温度を測定しようという試みは非常に少ない。それは細胞レベルでの微小領域の温度測定法が確立されていないことが1つの要因であった。しかしながら、近年の研究で、温度の変化に伴って物性が変化する分子の温度センサーとしての使用が検討され始め（非特許文献３：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６〜４２５頁；非特許文献４：Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８〜２９４３頁；非特許文献５：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４〜５１０１頁；非特許文献６：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁；非特許文献７：Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２〜８９頁）、特に最小機能単位を１分子とする高機能な分子温度センサーが開発され、細胞への応用が検討され始めた。
【０００５】
分子温度センサーの一例として、感熱性ポリマーであるポリアクリルアミドに環境応答性の蛍光団である２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル基を組み込むという原理に基づいた蛍光性温度センサーが既に報告されている（非特許文献８：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６〜５９３５頁）。この蛍光性温度センサーは、主鎖であるポリアクリルアミドの熱による相転移により、水性溶液中で温度上昇に伴って蛍光強度が増加するという特性を有するため、蛍光強度を測定することにより系中の温度の変化を観測することができる。
【０００６】
また、ポリマーの製造時に架橋剤を添加して得られる、蛍光団が組み込まれたポリアクリルアミドのマイクロゲルの、蛍光性温度センサーとしての使用についても報告されている（非特許文献９：Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６〜２８００頁；非特許文献１０：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年，第１３１巻，第２７６６〜２７６７頁）。さらに、イオン性官能基をポリマー内部に入れ込むことによって、凝集を防ぎ、かつ測定温度範囲を広くすることが可能となることが報告されている（特許文献１：国際公開第２００８／０２９７７０号）。
【０００７】
また、感熱性応答部位として用いる主鎖のアクリルアミドの側鎖の構造を変えることにより、水溶液中でセンサーが応答する温度領域を自由に変化できることは既に報告されており（非特許文献１１：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３〜１７９８頁）、測定対象の温度領域に応じて、感熱性応答部位に複数のアクリルアミド分子を使用することも可能であった。
【０００８】
また、より細胞内温度を簡便に測定する技術として、細胞と接触させるだけでセンサーを細胞内に導入することができるカチオン型の蛍光温度センサー（特許文献２：国際公開第２０１３／０９４７４８号）も、報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃａｎｄ． J．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８６年，第３６巻，第３５３〜３５７頁
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． １９８９年，第３４巻，第８６〜１０１頁
【非特許文献３】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６〜４２５頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８〜２９４３頁
【非特許文献５】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４〜５１０１頁
【非特許文献６】Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁
【非特許文献７】Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２〜８９頁
【非特許文献８】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６〜５９３５頁
【非特許文献９】Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６〜２８００頁
【非特許文献１０】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年，第１３１巻，第２７６６〜２７６７頁
【非特許文献１１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３〜１７９８頁
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２９７７０号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０９４７４８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
蛍光団が組み込まれた直鎖型または架橋型のポリアクリルアミドを利用する蛍光性温度センサーに関して、既に報告されているポリマーは、細胞と混ぜるだけで導入でき、蛍光強度変化から温度変化を定性的に捉えられる利点はあったが、一方で、精度の高い測定を行うにはポリマーの濃度に影響を受けない蛍光寿命測定を行う必要性があった。しかしながら、蛍光寿命測定は、特殊な装置を必要とし、特に細胞を扱うような生物学研究施設には、あまり普及されていないものであるため、汎用的ではなかった。また、蛍光寿命測定は、定量に時間がかかるため、時間分解能が低く、細胞内の速い現象を捉えるのには適していない。
【００１２】
さらに言えば、蛍光寿命以外にもセンサーの濃度に依らない測定方法として蛍光強度比による測定が知られているが、一般的には異なる構造の蛍光性ユニットを２つ用いなければいけないことや、採用する２つの蛍光波長に大きな重なりがある場合などは感度が低くなるため、高感度の測定が難しいという現状もあった。
【００１３】
また、より汎用的な測定ということを追求すれば、１つの励起波長で２蛍光色素が同時に励起されることが望ましく、例えば、Ｃａイオン測定で用いられるＦｕｒａ−２のような２波長励起１波長蛍光検出型のようなレシオ型測定方法もあるが、同時に多波長励起する顕微鏡や光度計、あるいはプレートリーダーのような機器は高価であり、利用が限られる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、従来アクリルアミド型の蛍光性温度センサーで用いていた２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル基と同じ波長で励起可能で、かつ２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル基とは異なる蛍光波長を示す新たな蛍光性ユニットを追加してポリマー鎖に組み入れることで、２つの蛍光色素由来の蛍光強度比をとることにより、精度良く、かつ簡便に細胞内の温度を測定できることを見出した。さらに、本共重合体を用いることで、細胞内の温度分布を可視化し、定量することも可能で、これらの計測は一般的な蛍光顕微鏡でも充分計測可能な簡便な手法であることも明らかにした。本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１５】
すなわち、本発明の第一の側面によれば、感熱性ユニット、カチオン性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブであって、
相互に異なる最大蛍光波長を有する第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットを含んでなり、
感熱性ユニットが、以下の式（ａ）：
【化１】
2015218304.tif 000002
［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１−２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造であり、
カチオン性ユニットが、以下の式（ｂ）：
【化２】
2015218304.tif 000003
［式中、Ｒ２は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｗは、芳香環または−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１１であり；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ１−Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｑ１は、独立に、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−、−Ｃ（＝ＮＲ４１）−ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
【化３】
2015218304.tif 000004
により表される基から選択され；
Ｘｅ−およびＸｆ−はカウンターアニオンであり；
Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１−１０アルキル、およびＣ７−１４アラルキルから選択され、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ２４は、Ｃ１−１０アルキル、またはＣ７−１４アラルキルであり；
Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１−１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］
で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造である、温度感受性プローブが提供される。
【００１６】
さらに、本発明の第二の側面によれば、細胞内の温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）本発明の第一の側面による温度感受性プローブを溶媒中で細胞と混合することにより、該温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、（ｂ）励起光照射下、第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのそれぞれに由来する蛍光の強度を測定する工程、および（ｃ）測定された２つの蛍光強度の比を算出する工程を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の温度感受性プローブによれば、高い精度で、簡便かつ短時間に細胞内の温度を測定することが可能となる。さらに、本発明の温度感受性プローブによれば、細胞内の温度分布を可視化し、定量することも可能である。さらに、これらの温度測定には特殊な機器は必要とされず、一般的な蛍光顕微鏡でも充分に計測を行うことができる。また、本発明の温度感受性プローブは、共重合体中のカチオン性基の存在により、特殊な方法を使わずとも細胞内に入り込むため、細胞内の温度を測定する蛍光温度センサーとして好適に使用することができる。よって、本発明は、酵母等の微生物、動物細胞、植物細胞など、多種多様な細胞に応用できる。また、本発明の温度感受性プローブによれば、共重合体の濃度に依存しない、より正確な温度測定を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】化合物２の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光スペクトルの変化（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５８ｎｍ）を２５℃（点線）、４０℃（実線）、５５℃（太線）の各温度で示した一例である。
【図２】化合物１〜４（黒丸：化合物１、黒菱形：化合物２、白三角：化合物３、白丸：化合物４）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度比（５８０ｎｍ／５１５ｎｍ）の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５８ｎｍ）の一例である。
【図３】化合物１、５、６（黒丸：化合物１、白四角：化合物５、黒四角：化合物６）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度比（５８０ｎｍ／５１５ｎｍ）の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５８ｎｍ）の一例である。
【図４】化合物１、７、８（黒丸：化合物１、）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度比（５８０ｎｍ／５１５ｎｍ）の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５８ｎｍ）の一例である。
【図５】ｐＨ６および９の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中における化合物１（いずれも０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５８ｎｍ、）の感熱応答性試験（黒三角：ｐＨ６、白丸：ｐＨ７、白四角：ｐＨ９）の一例である。
【図６】１２５、１５０および１７５ｍＭ塩化カリウム水溶液中における化合物１（いずれも０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５８ｎｍ、蛍光強度比（５８０ｎｍ／５１５ｎｍ））の感熱応答性試験の結果（黒三角：１７５ｍＭ  ＫＣｌ中、白四角：１５０ｍＭ  ＫＣｌ中、黒丸：１２５ｍＭ  ＫＣｌを示す）の一例である。
【図７】化合物１〜９をそれぞれ５％グルコース溶液中でＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞）と混合（２５℃、１０分）し、顕微鏡で観察（励起光：４７３ｎｍ、蛍光：５００ｎｍ〜６００ｎｍ）を行った写真の一例である。
【図８】ＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞）細胞中の化合物１の蛍光強度比（５８０ｎｍ／５１５ｎｍ）の感熱応答性試験の結果の一例である。
【図９】ＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞）細胞中の化合物１の蛍光強度比（５８０ｎｍ／５１５ｎｍ）の感熱応答性試験から算出した温度分解能の結果の一例である。
【図１０】ＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞）細胞中の前化合物９の蛍光強度比（５６０ｎｍ／５８０ｎｍ）の感熱応答性試験結果と、そのグラフから算出した温度分解能の結果の一例である。
【図１１】化合物１をＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト由来胎児腎細胞）細胞に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長４９０−５３０ｎｍの蛍光像（Ｐ１）と蛍光波長５７０−６１０ｎｍの蛍光像（Ｐ２）の比をとることにより得られた蛍光像（Ｐ２／Ｐ１）の一例である。
【図１２】図１１の細胞の一部の断面図（左図の黒線部分）を、横軸：黒線左端からの距離、縦軸：レシオ像の白黒値（強度）として表した図の一例である。
【図１３】化合物１をＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト由来胎児腎細胞）細胞に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５１０−５２０ｎｍの蛍光像（Ｐ１）と蛍光波長５８０−５９０ｎｍの蛍光像（Ｐ２）の比をとることにより得られた蛍光像（Ｐ２／Ｐ１）の細胞質と核の平均蛍光強度比の違い（９細胞の平均）を温度別に示した一例である。
【図１４】筋管細胞へと分化誘導したＣ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞由来、ＥＣＡＣＣ）を０．４５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含んだ５％グルコース溶液中で化合物１と混合（終濃度０．０３％）し、細胞にダメージを与えることなく、化合物１を導入した。さらに共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、温度を変化させたときのレシオ像（５７０−６７０ｎｍ／４８５−５４５ｎｍ）の変化を示した一例である。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明の第一の側面による温度感受性プローブとして用いられる共重合体は、相互に異なる最大蛍光波長を有する第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットを含む。本発明の温度感受性プローブを用いた温度測定では、第一の蛍光性ユニットに由来する蛍光の強度と、第二の蛍光性ユニットに由来する蛍光の強度との比を算出し、これと実際の温度とを対応させることにより、高い精度で、簡便かつ短時間に温度を測定することが可能となる。また、本発明の温度感受性プローブとして用いられる共重合体は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットに加えて、カチオン性ユニットを含む。これにより、該共重合体を溶媒中で細胞と混合することにより、該共重合体を細胞内に導入することが可能となる。
【００２０】
第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットは、同一波長の励起光の照射によって相互に異なる最大蛍光波長の蛍光を生じるものであることが望ましい。また、第一の蛍光性ユニットの最大蛍光波長と、第二の蛍光性ユニットの最大蛍光波長との差は、２つの波長における蛍光強度を同時に測定する上で、測定器によって十分に識別される程度に離れていればよく、特に制限されないが、好ましくは５０ｎｍ以上とされる。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様によれば、第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのいずれか一方は、温度の上昇に応じて蛍光強度が上昇するものであり、他方は、温度の上昇に応じて蛍光強度が不変あるいは下降するものであり、望ましくは下降するものとされる。
【００２２】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、第一の蛍光性ユニットは、以下の式（ｃ）：
【化４】
2015218304.tif 000005
［式中、Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１２であり；
Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２であり；
Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ２−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ１−１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造であり、
第二の蛍光性ユニットは、以下の式（ｄ）：
【化５】
2015218304.tif 000006
［式中、Ｒ５５は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｘ４は、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、−Ｑ4−Ｎ（−Ｒ６１）−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）であり；
Ｒ６１は、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｑ４は、Ｃ１−２０アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造とされる。
【００２３】
本発明に用いられる共重合体に含まれる感熱性ユニットは、温度に応じてその形状が変化する繰り返し構造であり、以下の式（ａ）で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造である：
【化６】
2015218304.tif 000007
［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１−２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１−１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］。
【００２４】
本発明に用いられる共重合体に組み込まれるカチオン性ユニットは、１以上の正電荷を有するイオン性官能基を含むモノマーに由来する繰り返し構造であり、以下の式（ｂ）で表される１種または２種以上のモノマーに由来する１種または２種以上の繰り返し構造である：
【化７】
2015218304.tif 000008
［式中、Ｒ２は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；
Ｗは、芳香環または−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１１であり；
Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ１−Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、およびＣ１−６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｑ１は、独立に、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−、−Ｃ（＝ＮＲ４１）−ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
【化８】
2015218304.tif 000009
により表される基から選択され；
Ｘｅ−およびＸｆ−はカウンターアニオンであり；
Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１−１０アルキル、およびＣ７−１４アラルキルから選択され、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ２４は、Ｃ１−１０アルキル、またはＣ７−１４アラルキルであり；
Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１−１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（ａ）で表されるモノマー、式（ｂ）で表されるモノマー、式（ｃ）で表されるモノマー、および式（ｄ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体とされる。
【００２６】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）：
【化９】
2015218304.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５、ならびにＲ２、Ｙ、ＷおよびＱ１、ならびにＲ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒ、ならびにＲ５５、Ｘ４、Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、既に定義したとおりであり、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される繰り返し単位を含む共重合体とされる。この共重合体では、ａおよびｂの和は１００であり、ｂは、好ましくは２〜１０とされ、ｃは、好ましくは０．３〜２とされ、ｄは、好ましくは０．０３〜１とされる。また、この共重合体は、物質そのものとして本発明の一つの側面をなす。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。感熱性ユニットには様々な種類のものがあり、その種類に応じて、最も高い温度反応性を示す温度域が異なる。この実施態様では、２種以上の感熱性ユニットを組み合わせることにより、所望の温度域において共重合体の温度反応性が高くなるように調整することができる。本発明のより好ましい実施態様によれば、前記共重合体は、前記式（ａ）で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。また、一つの実施態様では、２種類の感熱性ユニットが用いられる。例えば、動物細胞の一般的な培養温度である３５℃付近の測定では、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（ＮＮＰＡＭ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）との組み合わせを用いることが好ましい。また、酵母等の微生物の発酵をモニターする等の目的で２５℃以下の温度領域の測定が必要になる場合には、Ｎ―ｔｅｒｔ-ブチルアクリルアミド（ＮＴＢＡＭ）とＮＮＰＡＭとの組み合わせを用いることが好ましい。
【００２８】
式（Ｉ）におけるaは、感熱性ユニット全体の総和を表すものであり、２種以上の感熱性ユニットを用いた場合には、全ての感熱性ユニットの繰り返し単位数の比率の和を意味する。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様によれば、上述の共重合体において、Ａｒは、下式：
【化１０】
2015218304.tif 000011
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルおよびＣ１−６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、
ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
【００３０】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、Ａｒは、下式：
【化１１】
2015218304.tif 000012
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルフィニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ニトロ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シアノ、ホルミル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、カルボキシおよび−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
【００３１】
本明細書において「Ｃ１−３アルキル」とは、炭素数１〜３の直鎖状、分岐鎖状、または環状のアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、シクロプロピルが含まれる。
【００３２】
本明細書において「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロプロピルメチルなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−３アルキルなども含まれる。
【００３３】
本明細書において「Ｃ１−１０アルキル」とは、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１−６アルキルおよびＣ１−３アルキルなどが含まれる。
【００３４】
本明細書において「Ｃ１−２０アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１−１０アルキル、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−３アルキルなどが含まれる。
【００３５】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、３−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１−メチルブトキシ、１−エチルプロポキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、４−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、２−メチルペントキシ、１−メチルペントキシ、３−エチルブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロプロピルメチルオキシなどが含まれ、例えば、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−３アルコキシなども含まれる。
【００３６】
本明細書において「アリール」とは、６〜１０員芳香族炭素環基を意味し、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルなどが含まれる。
【００３７】
本明細書において「Ｃ７−１４アラルキル」とはアリール基を含む炭素数が７〜１４のアリールアルキル基を意味し、例えば、ベンジル、１−フェネチル、２−フェネチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチルなどが含まれる。
【００３８】
本明細書においてハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
【００３９】
本明細書において「Ｃ１−２０アルキレン」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなど、さらにＣ１−１０アルキレンおよびＣ１−６アルキレンなどが含まれる。
【００４０】
本明細書において「Ｃ３−２０アルケニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルケニレン基を意味し、例えば、プロペニレン、ブテニレンなど、さらにＣ３−１０アルケニレンおよびＣ３−６アルケニレンなどが含まれる。
【００４１】
本明細書において「Ｃ３−２０アルキニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキニレン基を意味し、例えば、プロピニレン、ブチニレンなど、さらにＣ３−１０アルキニレンおよびＣ３−６アルキニレンなどが含まれる。
【００４２】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルチオ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオなどが含まれる。
【００４３】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルフィニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルフィニル基を意味し、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、ｉ−プロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、ｓ−ブチルスルフィニル、ｉ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチルスルフィニルなどが含まれる。
【００４４】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルスルホニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を意味し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、ｉ−プロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、ｓ−ブチルスルホニル、ｉ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニルなどが含まれる。
【００４５】
本明細書において「６〜１８員芳香族炭素環基」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、インダニル、テトラリニルなどが含まれる。
【００４６】
本明細書において「５〜１８員芳香族ヘテロ環基」とは、酸素、窒素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環であり、例えば、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジル、インドリル、キノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾピラニル、ベンゾクロメニルなどが含まれる。
【００４７】
本明細書において「Ｃ２−６アルケニルスルホニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２−６アルケニル基を有するアルケニルスルホニル基を意味し、例えばビニルスルホニル、アリルスルホニルなどが含まれる。
【００４８】
本明細書において「Ｃ２−６アルケニルカルボニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２−６アルケニル基を有するアルケニルカルボニル基を意味し、例えばアクリロイル、メタクリロイルなどが含まれる。
【００４９】
本明細書において「Ｃ２−６アルキニルカルボニル」とは、アルキニル部分として既に定義したＣ２−６アルキニル基を有するアルキニルカルボニル基を意味し、例えばエチニルカルボニルなどが含まれる。
【００５０】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ１−６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
【００５１】
本明細書において「Ｃ１−６アルコキシカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ１−６アルコキシ）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルコキシは既に定義したとおりである。
【００５２】
本明細書において「Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（Ｃ１−６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１−６アルキルは既に定義したとおりである。
【００５３】
本明細書において「Ｃ１−６アリールカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（アリール）を表し、ここで当該アリールは既に定義したとおりである。
【００５４】
本明細書における「５〜７員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など飽和ヘテロ環が含まれる。
【００５５】
本明細書における「４〜８員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など、および５〜７員含窒素ヘテロ環が含まれる。
【００５６】
本明細書における「２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環」には、例えば、イミダゾリジン、テトラヒドロピリミジンなどが含まれる。
【００５７】
本明細書において、アルキレンが１以上の個所においてＯが挿入されている場合、当該アルキレン鎖は主鎖中にエーテル結合を含むことになり、当該挿入は安定な構造となるために、−Ｏ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−の構造とならないように行われることは当業者であれば容易に理解するはずである。以上のことはアルキレンへのＳの挿入においても当てはまる。
【００５８】
本明細書において、共重合体とは、各ユニットにあたるモノマーを混ぜ、重合反応をしてできた高分子鎖の集合体である。ポリマーとは、モノマーユニットが結合し連なった高分子鎖を示す。
【００５９】
本明細書において「カウンターアニオン」とは、有機化学の技術分野で有機化合物のカウンターアニオンとして通常用いられるアニオンであれば特に制限されず、例えば、ハロゲン化物アニオン（塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン）、有機酸の共役塩基（例えば酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン）、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンなどが含まれる。本発明において好ましいカウンターアニオンとしては、例えば、塩化物イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
【００６０】
なお、カウンターアニオンが２価以上である場合、それに対応する個数のイオン性官能基とイオン結合を形成することは当業者により容易に理解されるとおりである。
【００６１】
本発明において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５５は、好ましくは、水素原子およびメチルから選択される。
【００６２】
式（ａ）および式（Ｉ）における−ＮＲ４Ｒ５は、特には限定されないが、例えば、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５はＣ２−１０アルキルであってもよい。また、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成する場合、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環などを形成してもよい。
【００６３】
式（ｂ）および式（ＩＩ）におけるＷは、芳香環および−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）のいずれであってもよい。Ｗにより表される芳香環は、好ましくはＣ６−１８芳香環、より好ましくはベンゼン環とされる。Ｗは、好ましくは−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）とされる。Ｘ1は、好ましくはＯ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−６アルキル）とされる。
【００６４】
式（ｂ）および式（ＩＩ）における−Ｑ1−は、好ましくはＣ２−１０アルキレンとされる。
【００６５】
式（ｃ）および式（ＩＩＩ）における−Ｘ２−Ｑ２−は、好ましくは、Ｘ２は、Ｏ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１−６アルキル）であり、Ｑ２はＣ２−１０アルキレンである。
【００６６】
式（ｃ）および式（ＩＩＩ）における−Ａｒは、好ましくは、下式（Ｖ）〜（ＸＩＩ）：
【化１２】
2015218304.tif 000013
［式中、Ｒ３１は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択され；Ｒ３２はＣ１−６アルキルであり；Ｘ１１は、Ｎ−Ｒ３３、ＯまたはＳであり；Ｒ３３は水素原子またはＣ１−６アルキルであり；Ｘ１０、Ｒ１４およびＲ１５は、既に定義したとおりである］
から選択される基である。
【００６７】
式（Ｖ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【００６８】
式（ＶＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、Ｎ−Ｒ１３（ここで、好ましいＲ１３としてはメチルなどのＣ１−３アルキルが挙げられる）、またはＳが挙げられる。
【００６９】
式（ＶＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【００７０】
式（ＶＩＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＮ（−Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
【００７１】
式（ＩＸ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【００７２】
式（Ｘ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【００７３】
式（ＸＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＣＯＮ（−Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）およびＣＯＮ（−Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【００７４】
式（ＸＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）またはＣＯＮ（−Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（−Ｒ１９）およびＣＯＮ（−Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【００７５】
本発明において、基−Ｘ３−Ａｒは環境応答性の蛍光団として機能し、例えば、式（Ｖ）または（ＶＩＩ）の蛍光団を使用した場合は温度の上昇に伴い蛍光強度が低下する温度センサーが、式（ＶＩ）または（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩ）の蛍光団を使用した場合は、温度の上昇に伴い蛍光強度も上昇する温度センサーが得られる。
【００７６】
式（ｄ）および式（ＸＩＩＩ）におけるＲ５１、Ｒ５２、Ｒ５３およびＲ５４は、好ましくは水素原子およびメチル基から独立に選択される。
【００７７】
式（ｄ）および式（ＸＩＩＩ）における好ましいＸ４は、例えば、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、または−Ｑ4−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）である。
【００７８】
式（ｄ）および式（ＸＩＩＩ）におけるＱ４は、好ましくはフェニレンとされる。
【００７９】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、Ｒ１は、水素原子、メチルおよびエチルから選択され；Ｒ４は、ｎ−プロピル、イソプロピルおよびｔ−ブチルから選択され、Ｒ５は水素原子であり；Ｒ２は、水素原子、メチルおよびエチルから選択され；Ｗは、芳香環または−Ｘ１−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ１１であり；Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ１−Ｙであり；Ｑ１は、Ｃ１−２０アルキレンであり、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）−Ｏ−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−、−Ｃ（＝ＮＲ４１）−ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
【化１３】
2015218304.tif 000014
により表される基から選択され；Ｘｅ−およびＸｆ−はカウンターアニオンであり；Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１−１０アルキルであり、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；Ｒ２４は、Ｃ１−１０アルキルであり；Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１−１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；Ｒ３は、水素原子およびＣ１−３アルキルから選択され；Ｘ２は、Ｏ、またはＮ−Ｒ１２であり；Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｎ（−Ｒ１３）、ＣＯＮ（−Ｒ１６）、Ｎ（−Ｒ１６）ＣＯ、またはＮ（−Ｒ１７）ＣＯＮ（−Ｒ１８）であり；Ｑ２は、Ｃ１−２０アルキレン、Ｃ３−２０アルケニレン、またはＣ３−２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；Ａｒは、下式：
【化１４】
2015218304.tif 000015
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、シアノ、−ＮＲ６Ｒ７、および−ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されており、さらに、Ｃ１−６アルキルにより置換されていてもよく；Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；Ｒ８は、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、およびアリールから選択され；Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１−１０アルキル、アリール、Ｃ１−１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１−１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびカルバモイルから選択され；またはＲ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ニトロ、およびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル、または−Ｑ２−Ｘ３−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成し；Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｒ５１、Ｒ５２、Ｒ５３、Ｒ５４およびＲ５５は、水素原子およびメチル基から独立して選択され；Ｘ４は、直接結合、フェニレン、−Ｑ4−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）、または−Ｑ4−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはＱ4である）とされ、Ｑ４はフェニレンとされる。
【００８０】
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）および式（ＸＩＩＩ）におけるａ、ｂ、ｃおよびｄは式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、特に限定されないが、例えば、ａ＋ｂ＝１００としたときに、ｂは、例えば１以上、好ましくは２以上、より好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上とされ、例えば１５以下、好ましくは１０以下とされる。さらに、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂは、例えば１〜１５であり、好ましくは２〜１０であり、より好ましくは３〜１０とされる。ｃはａとｂの総量（つまり１００）に対する割合であって、ｃは０．０５〜１０であり、具体的には０．１〜５であり、好ましくは０．２〜２であり、より好ましくは０．３〜１．５である。ｄはａとｂの総量（つまり１００）に対する割合であって、ｄは０．０１〜５であり、具体的には０．０２〜２であり、好ましくは０．０２〜１であり、より好ましくは０．０３〜１である。ｃとｄの比を表すｃ／ｄは、特に限定されないが、好ましくは０．１〜３０、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは３〜１０とされる。上述のように、aは感熱性ユニットの総和であり、例えば、２種類の感熱性ユニットを使う場合の感熱性ユニットの比は、ある数ｐを用いて、ｐ：a−ｐとなる。例えば、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂが２．５となるように共重合体を作製し、かつ、２種類の感熱性ユニット（例えば、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドとＮ−イソプロピルアクリルアミド）を組み合わせて用いる場合には、aは９７．５であり、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドとＮ−イソプロピルアクリルアミドの比はp：９７．５−ｐで表される。また、本発明の共重合体の重量平均分子量は、特には限定されないが、例えば１０００〜１０００００、好ましくは５０００〜５００００である。
【００８１】
本発明のポリマーの分子量と使用する蛍光性ユニットのモノマー使用量に応じて、１つのポリマーの中に２つの蛍光性ユニットが必ずしも導入されない場合がある。本ポリマーを温度感受性プローブとして使用する場合には、一般的な励起強度と検出感度の組み合わせを用いれば、溶液中では０．００１％（ｗ／ｖ）以上のある程度高い濃度で使用することになり、また細胞内でも、細胞内に蛍光性ユニット由来の蛍光が充分認められる条件で使用することになるため、細胞内には比較的高い濃度、つまり、溶液中で使用する場合と同程度の０．００１％（ｗ／ｖ）以上の共重合体が存在することになる。つまり、２つの蛍光性ユニットが２つのポリマーに分かれてしまっている場合でも、観察視野や測定場に１ポリマー分子しかいないような特殊な環境ではない限り、２つの蛍光性ユニットが含まれる別々の２つポリマーは、ほぼ同一の温度環境に置かれるため、それぞれの蛍光性ユニットは、１つのポリマーに２つの蛍光性ユニットが含まれている場合と同じような蛍光強度を示すことになる。したがって、本発明の共重合体は２つの蛍光性ユニットが同一のポリマー分子に含まれる場合に限定されない。
【００８２】
本発明の共重合体は周囲の温度変化に対して非常に素早く応答し、その構造変化は数ミリ秒程度である。つまり、本発明の温度感受性蛍光プローブは、細胞内の温度変化に敏捷に応答し蛍光強度を変化させるため、顕微鏡などを用いて、細胞内の温度分布を可視化した場合には、その蛍光強度比から細胞内の各微小空間における細胞内の温度を定量することができる。
【００８３】
本発明に係る共重合体は、高分子合成の技術分野における通常の知識に基づいて合成することができ、例えば、ラジカル重合によるランダム共重合体として得ることができる。その場合に使用することができるラジカル開始剤としては、特に限定はされないが、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩；２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２'−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、４，４'−アゾビス（４−シアノ吉草酸）などのアゾ化合物が挙げられる。
【００８４】
反応開始剤の使用量は、使用するモノマーに対して０．０１モル％以上の量であればよく、ラジカル合成が進行する濃度であれば、適量を選択することができる。例えば、０．１モル％以上、好ましくは１モル％以上の反応開始剤を使用することができる。
【００８５】
重合に使用する反応溶媒は、特に限定されないが、例として、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノールなどが挙げられる。ラジカル重合は、特に限定はされないが、例えば０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の反応温度、および例えば１〜４８時間、好ましくは２〜１６時間の反応時間で行うことができる。
【００８６】
本発明の共重合体を含む溶液中のｐＨや塩濃度に影響を受けずに温度測定を行うために、当該共重合体に含まれるカチオン性官能基は、広範囲のｐＨにおいてイオン性を維持するという方が望ましい。しかしながら、細胞内温度を測定するという用途に限って言えば、細胞内のｐＨは２〜９、さらに通常の状態、一般的な動物、植物、微生物細胞であればｐＨ４〜８程度である。このｐＨでカチオン性が保たれている官能基であればよい。このような観点から、Ｙは−Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ−が好ましい。
【００８７】
本発明における「細胞」とは、一般的な分類である原核細胞と真核細胞の両方を含み、特にその生物の種に依らない。例えば、原核細胞は真正細菌と古細菌に分けられるが、真正細菌はその中でも放線菌門のようなグラム陽性菌とプロテオバクテリア門のようなグラム陰性菌に大きく分けられ、ペプチドグリカン層の厚みなどによって、共重合体が適用できる範囲は制限されない。また、真核細胞には、主に真核生物（原生生物、真菌、植物、動物）に属する細胞が当てはまる。例えば、一般的に分子生物学などの研究で利用され、かつ工業的にも利用される酵母は真菌に属する。また、本発明の温度感受性プローブは、浮遊細胞および接着細胞の両方において好適に用いられる。
【００８８】
本発明の共重合体を細胞に導入する際には、イオン強度の低い溶液（溶媒）に置換することが望ましい。このような溶媒としては、例えば、水（好ましくは純水）およびソルビトール水溶液、グルコース溶液などが挙げられる。細胞の種類に応じて、これらグルコース溶液などに０．４５ｍＭの塩化カルシウムを添加した溶液なども挙げられる。
【００８９】
本発明に従って共重合体を細胞に導入するときの共重合体の濃度は、例えば、共重合体の終濃度を０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）になるように調整し、菌体と混ぜることができる。これは微生物菌体のようなものに限らず、接着細胞などの場合にもあてはまる。
【００９０】
本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化は、通常の蛍光強度測定方法により測定することができる。測定での励起波長および測定する蛍光波長は、特に限定はされないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。また、測定する蛍光波長も特には限定されないが、例えば、ある温度で測定試料の蛍光スペクトルを測定した際の最大蛍光波長またはその付近の波長を使用することができる。
【００９１】
本発明では、ある独立した２つの蛍光波長における蛍光強度を測定してこれらの比をとり、その蛍光強度比から温度に換算するという方法をとることが望ましい。この手法により、共重合体から発せられる蛍光強度が、微小空間内の共重合体の濃度や励起するレーザー強度に起因する可能性を排除し、温度と実験で得られる蛍光強度比を１対１に対応させることが可能である。これにより同一細胞での温度比較だけでなく、同一条件下に置かれた別の細胞の細胞内温度の比較も可能となる。例えば、酵母集団中における個々の細胞温度の違いを測定することにより、各酵母細胞の生理状態を把握することが可能となる。
【００９２】
蛍光強度比の算出法は、特に限定されるものではなく、異なる波長を含んだ２つの領域の蛍光強度からその比を算出することができる。例えば、一方の領域は第一の蛍光性ユニットから生じる蛍光の最大強度を示す波長を含む２０ｎｍ程度の波長領域として蛍光強度の積分値をＳ１とし、他方の領域は第二の蛍光性ユニットから生じる蛍光の最大強度を示す波長を含む２０ｎｍ程度の波長領域として蛍光強度の積分値をＳ２とし、Ｓ１／Ｓ２を蛍光強度比としてよい。さらに、Ｓ１およびＳ２の領域は同じ幅でも異なる幅でもよい。例えば、蛍光強度がノイズを無視できる充分な値を示せば、Ｓ１は２０ｎｍ幅の波長領域を含む一方で、Ｓ２は１ｎｍ幅の単独波長でもよい。波長の選択基準も特に限定されるものではないが、得られる蛍光強度を考慮すると、温度感受性プローブに含まれるそれぞれの蛍光性ユニットを与えるモノマー（例えば、式（ｃ）または式（ｄ）で示される蛍光モノマー）の常温（約２５℃）における水中および水中に近い極性溶媒での励起スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長に基づいて、その周辺の波長から選択することが望ましい。
【００９３】
実験で得られた蛍光強度比から温度を求める際には、自らが作成した検量線を使用することが可能である。具体的に、どの条件で測定した検量線を使用するかは限定されないが、例えば、細胞内を模倣した塩化カリウム溶液中での、共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、共重合体を導入した細胞集団を蛍光光度計に供し、感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、あるいは共重合体を導入した細胞集団を蛍光顕微鏡に供し、複数の細胞での感熱応答性による蛍光強度の変化の平均値をプロットした曲線などを用いることができる。さらに具体的には、共重合体を導入した細胞集団を用いて、感熱応答性試験を行い、蛍光強度の変化をプロットする際には、細胞は代謝活動を積極的に行わないような状態、例えば、水中や資化することのできない化合物が含まれた緩衝液中に細胞を懸濁した状態で、特定の温度に一定期間保持し、外部温度と細胞内部温度が平衡状態に達したと考えられる状況下で、蛍光強度を測定する方法などが挙げられる。
【００９４】
以上に説明した方法を実施するために、必要な試薬等をまとめてキットとすることができる。従って、本発明の他の側面によれば、上述の方法を用いて温度を測定するためのキットが提供され、該キットは、本発明の温度感受性プローブまたは本発明の共重合体を含んでなる。この温度測定用試薬キットは、微小空間内の温度測定、特に細胞内の温度測定に好適に使用することができる。当該試薬キットは、医学・生物学・生物工学等の研究分野、診断・治療等の医療分野において使用することができる。
【００９５】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な研究開発の分野に応用することができる。例えば、生物工学の分野では、微生物を用いた有用物質の発酵生産において、これまで正確な測定が困難であった細胞内温度を解析パラメータに加えることにより、培養条件の検討の効率化が期待される。
【００９６】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な医療用途に応用することができる。例えば、本発明による温度感受性プローブを患者の組織の一部に対して使用することにより、熱産生量が多いとされているがん細胞と、そうでない正常細胞との識別を行うことも可能である。さらにそれを応用する事でより効果的な温熱治療法の開発などにも使える。あるいは、熱産生量が多い褐色脂肪細胞に本発明による温度感受性プローブを導入し、その細胞に様々な素材を添加することによる温度変化を測定することにより、褐色脂肪細胞を活性化する素材をスクリーニングすることも可能である。
【００９７】
本発明の方法および温度測定用キットは、様々な生理現象の解明にも応用可能である。例えば、生体外の温度を感知し、生体反応を引き起こす受容体であるＴＲＰチャネルが細胞内の温度とどのように関連しているのかを調べることで今までとは異なるアプローチでのＴＲＰチャネルの活性化が考えられる。また細胞内温度分布と細胞内外で起こる生体反応との関わりを調べる事により、局所的な温度分布が生体反応に及ぼす影響を調べる事が可能で、赤外線レーザーなどを用いた局所的な加熱による細胞のコントロールを行う事なども可能である。
【００９８】
本発明による温度測定法および温度感受性プローブの細胞導入法は、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても行うことができる。一つの実施態様では、これらの方法はin vitroにおいて行われる。
【実施例】
【００９９】
以下に実施例を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１００】
試薬及びデータ測定
α，α'−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）はメタノールを用いた再結晶、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）はｎ―ヘキサンを用いた再結晶により精製して用いた。その他の試薬は購入したものをさらに精製することなく使用した。
【０１０１】
１Ｈ−ＮＭＲはＢＲＵＫＥＲ  ＡＶＡＮＣＥ４００スペクトロメーター（４００ＭＨｚ）を使用して測定し、ケミカルシフトはｐｐｍで表示した。数平均分子量および重量平均分子量はＪＡＳＣＯ  ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−２０８０ポンプ、ＪＡＳＣＯ  ＲＩ−２０３１示差屈折計、ＪＡＳＣＯ  ＣＯ−２０６０カラムオーブン、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＤ−８０６Ｍカラム）を使用し、ポリスチレン標準試料により得られる較正曲線を用いて算出した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、関東化学ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｎ（４０−５０μｍ）を使用した。吸光度の測定には、ＪＡＳＣＯ  Ｖ−５５０紫外可視光分光光度計を使用した。
【０１０２】
実施例１−１：８−（４−アクリルアミドフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ）の合成
【化１５】
2015218304.tif 000016
【０１０３】
アルゴン下、４―アセトアミドベンズアルデヒド（２００ｍｇ， １．２３ｍｍｏｌ）、２，４―ジメチルピロール（２５３μＬ， ２．４５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７０ｍL、モレキュラーシーブス４Ａで脱水）に溶解し、トリフロオロ酢酸を１滴加えて室温で６時間撹拌した。この反応液に２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ―１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ）（２７８．３ｍｇ， １．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ、モレキュラーシーブス４Ａで脱水）に懸濁させて加え、容器をジクロロメタン ３ｍＬで洗浄しそれも加えた。室温で３０分撹拌した後、反応液を水（１００ｍＬ×２）、飽和食塩水で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をアルミナクロマトグラフィー（1回目ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール＝１００：１→５０：１、２回目ジクロロメタン→ジクロロメタン：メタノール＝１００：１、３回目ジクロロメタン：メタノール＝２００：１）で精製し、薄茶色結晶として目的物（化合物１ａ）を得た（３１ｍｇ，７．５％）。
【０１０４】
化合物１ａの１Ｈ ＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)は以下の通り。
δ７．６１ (ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ)， ７．２９ (ｂｒ， １Ｈ)， ７．２４ (ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ)， ５．８９ (ｓ， ２Ｈ)， ２．３４ (ｓ， ６Ｈ)， ２．２１ (ｓ， ３Ｈ)， １．３４ (ｓ， ６Ｈ)
【０１０５】
得られた化合物１ａ（６６ｍｇ， ０．２０ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解し、１Ｎ塩酸を１０ｍＬ加え、４時間加熱還流した。室温まで冷却した後、２Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和した。ジクロロメタンで抽出（１００ｍＬ×３）後、有機層を水、飽和食塩水で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をアルミナクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）により精製することで、薄茶色結晶として目的物（化合物１ｂ）を得た（４６ｍｇ， ７９％）。
【０１０６】
化合物１ｂの１Ｈ ＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)は以下の通り。
δ７．０５−７．０３ (ｍ， ２Ｈ)， ６．７５−６．７３ (ｍ， ２Ｈ)， ５．８９ (ｓ， ２Ｈ)， ３．７６ (ｂｒ， ２Ｈ)， ２．３４ (ｓ， ６Ｈ)， １．４２ (ｓ， ６Ｈ)
【０１０７】
アルゴン下、化合物１ｂ（２０ｍｇ， ０．０６９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ ５ｍＬに溶解し、これにトリエチルアミン（２００μＬ）、ボロントリフルオリド - エチルエーテル コンプレックス（２００μＬ）の順に加え室温で２時間撹拌した。反応液を水８０ｍＬに注いで反応を停止し、２Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えてアルカリ性にした。これをジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をアルミナクロマトグラフィー（ジクロロメタン:ヘキサン＝１：１）により精製することで、赤色結晶として目的物（化合物１ｃ）を得た（２２ｍｇ， ９６％）。
【０１０８】
化合物１ｃの１Ｈ ＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)は以下の通り。
δ７．０２−７．００ (ｍ， ２Ｈ)， ６．７９−６．７７ (ｍ， ２Ｈ)， ５．９７ （ ２Ｈ）， ３．８３ (ｂｒ， ２Ｈ)， ２．５５ (ｓ， ６Ｈ)， １．５０ (ｓ， ６Ｈ)．
【０１０９】
化合物１ｃの１３Ｃ ＮＭＲ (１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)は以下の通り。
δ１５５．０， １４７．０， １４３．２， １４２．６， １３２．０， １２９．０， １２４．７， １２０．９， １１５．４， １４．６， １４．５．
【０１１０】
化合物１ｃ（１０ｍｇ， ０．０２９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（４．１μＬ， ０．０２９ｍｍｏｌ）を加えた後、０℃でアクリル酸クロライド（３．１μＬ， ０．０３８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間撹拌した後、Ｋ２ＣＯ３を加えて、塩をろ過した。ろ液を減圧留去して得られた粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン:ヘキサン＝３：１→ジクロロメタン１００％）により精製することで橙色結晶として表題の化合物（ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ）を得た（１１ｍｇ， ９７％）。
【０１１１】
ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡの１Ｈ ＮＭＲ (４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４)の結果は以下の通り。
δ７．８８−７．８６ (ｍ， ２Ｈ)， ７．３１−７．２９ (ｍ， ２Ｈ)， ６．５１−６．３７ (ｍ， ２Ｈ)， ６．０７ (ｓ， ２Ｈ)， ５．８１ (ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．４， ９．６ Ｈｚ)， ２．４９ (ｓ， ６Ｈ)， １．４８ (ｓ， ６Ｈ)．
【０１１２】
ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡの１３Ｃ ＮＭＲ (１００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３)の結果は以下の通り。δ１６３．５， １５５．５， １４３．１， １４１．１， １３８．６， １３１．６， １３０．９， １２８．８， １２８．５， １２１．２， １２０．１， １４．６．
【０１１３】
実施例１−２：４，４−ジフルオロ−８−（４−イソブチラミドフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ−ＩＡ）の合成
【化１６】
2015218304.tif 000017
【０１１４】
実施例１−１で合成した化合物１ｃ（１０ｍｇ， ０．０２９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル １ｍＬに溶解し、０℃でトリエチルアミン（４．９μＬ， ０．０３５ｍｍｏｌ）、イソ酪酸無水物（７．４μＬ， ０．０４４ｍｍｏｌ）の順に加え、室温で３時間撹拌した。さらにトリエチルアミン（４．９μＬ，  ０．０３５ｍｍｏｌ）、イソ酪酸無水物（７．４μＬ， ０．０４４ｍｍｏｌ）を加え、３０分撹拌後４０℃で２時間、５０℃で３時間撹拌後、室温で一晩撹拌した。この反応液にＮａ２ＳＯ４を加えてからろ過し、ろ液を減圧留去して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン）にて精製することにより、赤色結晶として目的物を得た（１２ｍｇ， ９５％）。
【０１１５】
ＢＯＤＩＰＹ−ＩＡの１Ｈ ＮＭＲ (４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３ )の結果は以下の通り。
δ７．６９ (ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ)， ７．３１ (ｂｒ， １Ｈ)， ７．２２ (ｄ， ２Ｈ， ８．２ Ｈｚ)， ５．９８ (ｓ， ２Ｈ)， ２．５５ (ｓ， ６Ｈ)， １．４３ (ｓ， ６Ｈ)， １．２９ (ｄ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ)， １．２５ (ｂｒ， １Ｈ)．
【０１１６】
ＢＯＤＩＰＹ−ＩＡの１３Ｃ ＮＭＲ (１００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３)の結果は以下の通り。
δ１７５．３， １５５．５， １４３．１， １４１．３， １３８．９， １３１．６， １３０．５， １２８．８， １２１．２， １１９．９， ３６．９， １９．６， １４．６４， １４．５６．
【０１１７】
実施例１−３：ＢＯＤＩＰＹ−ＩＡの溶媒によって異なる量子収率の算出
実施例１−２で合成したＢＯＤＩＰＹ−ＩＡをそれぞれアセトニトリル、メタノール、ヘキサン、酢酸エチルおよび水７５ｖ／ｖ％ジオキサン２５ｖ／ｖ％に１０μＭになるように溶かし、積分球ユニットＩＬＦ８３５を付設した蛍光光度計ＦＰ８５００（日本分光）を用いて、絶対蛍光量子収率を算出した。励起波長は４７０ｎｍを選択した。試料がない状態での入射光面積Ｓ０と試料散乱光面積Ｓ１、蛍光波長のピーク面積Ｓ２を算出し、
量子収率＝Ｓ２／（Ｓ０−Ｓ１）×１００
の式を用いて算出を行った結果を表１に示す。
【０１１８】
【表１】
2015218304.tif 000018
【０１１９】
表１の結果からわかるように、新しく温度プローブに用いるＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ蛍光ユニットは、アセトニトリルなどの疎水環境中では量子収率が低くなり、水中では量子収率が高くなる傾向が認められた。このユニットをアクリルアミド高分子に組み込んだ場合、低温（水中）（アクリルアミド鎖がひも状の状態）では、ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ周囲が親水環境に置かれ、蛍光量子収率が高く、比較的強い蛍光を発し、高温（アクリルアミド鎖が凝集した状態）では、ＢＯＤＩＰＹ―ＡＡ周囲が疎水環境に置かれ、蛍光量子収率が低減し、比較的弱い蛍光を発することになる。ベンゾフラザン骨格の蛍光色素を用いた蛍光温度センサーでは、温度上昇に伴い、蛍光強度が上昇することがわかっている。つまりＢＯＤＩＰＹとベンゾフラザン骨格蛍光色素の両方を用いることで、温度変化に伴う蛍光強度比の変化を感度良く検出することができると予測された。
【０１２０】
実施例２：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドの合成
ベンゼンにＮ−ｎ−プロピルアミンとトリエチルアミン（１．２ｅｑ）を加え、氷浴中で、攪拌子を用いてよく攪拌した後に、アクリル酸クロリド（１．２ｅｑ）を１０分おきに３回に分けて添加し、室温に戻した。反応液を濾過し、０．１Ｎの塩酸で分液を行い、上層のベンゼン画分を抽出、無水硫酸ナトリウムを添加した後に、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン−メタノール＝５０：１を使用）にて1回目の精製を行った。目的化合物を含んだ画分を再度集め、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として酢酸エチル−ヘキサン＝１：２を使用）にて２回目の精製を行い、表題の化合物を無色透明液体として得た。
【０１２１】
実施例３：Ｎ−（２−｛［７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル］−（メチル）アミノ｝エチル）−Ｎ−メチルアクリルアミド（ＤＢＴｈＤ−ＡＡ）の合成
合成は、文献Ａ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２年， 第１８巻，第９５５２ − ９５６３頁）に記載の方法に従って行った。３−クロロ−１，２−フェニレンジアミンをトルエンに溶解し、Ｎ−チオニルアニリンを加えた。１３０℃で３時間加熱環流したのち、減圧乾固し、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製をして、４−クロロ−２，１，３−ベンゾチアジアゾールを得た。これを０℃にて濃硫酸に溶解し、０℃で１時間半攪拌した後、１５０℃に加熱し２時間半攪拌した。反応終了後、反応溶液を氷水に注ぎ、ジクロロメタンを用いて抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４により乾燥した後、減圧乾固し、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製をして、７−クロロ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール４−スルホニルクロリドを得た。
【０１２２】
さらに、得られた物質をジクロロメタンに溶解し、アセトニトリルに溶解したジメチルアミン水溶液を加えた。室温で３０分反応させた後に減圧乾固し、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製をして、７−クロロ−Ｎ、Ｎ−ジメチル−２，１，３−ベンゾチアジアゾール４−スルホンアミドを得た。この物質をアセトニトリルに溶解し、この溶液をＮ，Ｎ‘―ジメチルエチレンジアミンに加えた。８０℃で１時間反応させた後、減圧乾固し、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製をして、Ｎ，Ｎ−ジメチル−７−［メチル｛２−（メチルアミノ）エチル｝アミノ］−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−スルホンアミドを得た。
【０１２３】
得られたＮ，Ｎ−ジメチル−７−［メチル｛２−（メチルアミノ）エチル｝アミノ］−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−スルホンアミドをアセトニトリルに溶解し、トリエチルアミン（１ｅｑ）、アクリル酸クロリド（１．３ｅｑ）を０℃にて加えた後、１時間０℃にて撹拌した。反応溶液にＮａ２ＣＯ３（１ｇ）を加えろ過した後、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン／メタノールを使用）にて精製を行い、表題の化合物ＤＢＴｈＤ―ＡＡを橙色結晶として得た。
【０１２４】
実施例４：Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド／ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ共重合体の製造
ＮＮＰＡＭ（５４３ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（５５．１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＴｈＤ−ＡＡ（９．５９ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ（１．９７ｍｇ、５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（８．２１ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて４時間反応させ、室温に冷やした。この溶液を、ジエチルエーテル（３００ｍｌ）に攪拌しながら注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、さらにＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶かして再沈殿を行った後、純水に溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルロースチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（２５４．４ｍｇ、４２％）として得た。
【０１２５】
数平均分子量４５３７、重量平均分子量９２６４で、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＴｈＤ−ＡＡ：ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡ＝９４．５：５．５：０．５７９ : ０．０７１。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＴｈＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾチアジアゾールと比較することにより算出した。ＢＯＤＩＰＹ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度をＢＯＤＩＰＹ−ＩＡと比較することにより算出した。
【０１２６】
実施例５：感温性ユニットを変化させた共重合体の製造
実施例４で用いた感温性ユニットであるＮＮＰＡＭよりも各々高い温度、低い温度で構造変化を起こすＮＩＰＡＭ、Ｎ−ｔｅｒｔ―ブチルアクリルアミド（ＮＴＢＡＭ）を用いて共重合体の合成を行った。合成した化合物のリストを表２に示す。合成は、実施例４と同様の手法で行い、淡黄色粉末を得た。
【０１２７】
【表２】
2015218304.tif 000019
【０１２８】
表２に示すように、目的の共重合体について全て合成することができた。共重合体の組成比の算出法は実施例４に示した通りに行い、共重合体の分子量についても実施例４と同様の方法で算出した。なお、共重合体における感温性ユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットおよびＢＯＤＩＰＹ−ＡＡユニットの割合は、メタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾチアジアゾールおよびＢＯＤＩＰＹ−ＩＡの各々の４４７ｎｍと４９８ｎｍのモル吸光係数から算出した。
【０１２９】
実施例６： カチオン性ユニットを変化させた共重合体の製造
実施例４で用いたカチオン性ユニットであるＡＰＴＭＡをより多い比率で用いた共重合体を製造した。また４級アンモニウム塩であるカチオン性ユニットとしてＡＰＴＭＡの代わりにＶＢＴＭＡを用いた共重合体を合成した。合成した化合物のリストを表３に示す。合成は、実施例４と同様の手法で行い、淡黄色粉末を得た。
【０１３０】
【表３】
2015218304.tif 000020
【０１３１】
表３に示すように、目的の共重合体について全て合成することができた。共重合体の組成比の算出法は実施例４に示した通りに行い、共重合体の分子量についても実施例４と同様の方法で算出した。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとカチオン性ユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットおよびＢＯＤＩＰＹ−ＡＡユニットの割合は、メタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾチアジアゾールおよびＢＯＤＩＰＹ−ＩＡの各々の４４７ｎｍと４９８ｎｍのモル吸光係数から算出した。
【０１３２】
実施例７：蛍光性ユニット比を変化させた共重合体の製造
実施例４で合成した共重合体の２つの蛍光性ユニット比を変化させた共重合体を合成した。合成した化合物のリストを表４に示す。合成は、実施例４と同様の手法で行い、淡黄色粉末を得た。
【０１３３】
【表４】
2015218304.tif 000021
【０１３４】
表４に示すように、目的の共重合体について全て合成することができた。共重合体の組成比の算出法は実施例４に示した通りに行い、共重合体の分子量についても実施例４と同様の方法で算出した。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットおよびＢＯＤＩＰＹ−ＡＡユニットの割合は、メタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾチアジアゾールおよびＢＯＤＩＰＹ−ＩＡの各々の４４７ｎｍと４９８ｎｍのモル吸光係数から算出した。
【０１３５】
実施例８：感熱応答性試験
化合物１〜８の１５０ｍＭ  ＫＣｌ中での感熱応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、和光純薬より購入したＫＣｌを１５０ｍＭの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は０．０１ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５８ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を１℃あるいは２℃刻みで上昇させ、各温度における４５０〜８５０ｎｍの蛍光スペクトルを測定した。
【０１３６】
化合物２の温度を変えたときのスペクトル変化の例を図１に示す。この結果より温度上昇に伴い、ＢＯＤＩＰＹ由来の蛍光スペクトルである５００〜５２０ｎｍの蛍光強度は減少し、ＤＢＴｈＤ由来の蛍光スペクトルである５４０〜６００ｎｍの蛍光強度は上昇することが確認できた。これら２波長領域の比を取ることで、温度変化に伴う共重合体の構造変化を捉えることができる。すなわち、共重合体周囲の温度を蛍光強度比で表せることが確認できた。このスペクトル変化の結果から、５８０ｎｍと５１５ｎｍの蛍光強度比（ＦＩ５８０／ＦＩ５１０）を取ることで、温度変化に対する蛍光強度比の変化が大きくなることがわかった。
【０１３７】
そこで、図２〜４に各化合物の各温度における５８０ｎｍと５１５ｎｍの蛍光強度比（ＦＩ５８０／ＦＩ５１０）を示した。図２に示すように、感温性ユニットはＮＴＢＡＭ，ＮＮＰＡＭ，ＮＩＰＡＭの順に応答する温度領域が高くなるが、用いる感温性応答部位の性質によって、応答する温度領域を自由に制御し、蛍光強度比によって温度を定量できることがわかった。また、図３に示すように、カチオン性ユニットとしてＶＢＴＭＡを用いた共重合体（化合物６）でも、温度に対する蛍光強度比の上昇が認められた。また、ＡＰＴＭＡの組成比を変えたもの（化合物５）でも温度に対する蛍光強度比の上昇が認められた。さらに、図４では２つの蛍光性ユニット比を変えた共重合体についても同様に蛍光強度比で温度を定量できることを示している。
【０１３８】
実施例９：感熱応答試験における塩化カリウム濃度依存性評価
化合物１の感熱応答性におけるＫＣｌ濃度依存性を以下の手順で試験し、調査した。実験手法は実施例８と同様であり、当実験における化合物１の初期濃度は０．００５ｗ／ｖ％とし、ＫＣｌ濃度は１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭとなるように溶媒を調製した。
【０１３９】
試験結果を図５に示す。一般的に細胞内のカリウム濃度は約１４０ｍＭと推定されており、特殊な環境変化がない限り、細胞内のカリウム濃度の変化は小さいことがわかっている。１２５〜１７５ｍＭの範囲内の塩化カリウム溶液の濃度変化に対する温度応答性の変化はわずかに観測されるものの、細胞内のカリウム濃度変化はこれよりも到底低いレベルにあるために、細胞内の温度を測定する上での影響はほとんどないことが示唆された。
【０１４０】
実施例１０：ｐＨ応答性の評価
化合物１の感熱応答性におけるｐＨ依存性を以下の手順で試験し、調査した。溶媒として１５０ｍＭ  ＫＣｌを用いて、塩酸でｐＨを６に、水酸化カリウムでｐＨを９に調整した。実験手法は実施例８と同様である。当実験における化合物１の初期濃度は０．００５ｗ／ｖ％とした。
【０１４１】
試験結果を図６に示す。一般的な細胞の温度範囲（２５℃〜４５℃）においては、ｐＨ変化による蛍光強度の変化はほとんど観測されなかった。つまり、ｐＨ変化によって温度応答性はほぼ影響を受けないことが明らかとなり、より高感度に蛍光強度が温度を反映することがわかった。
【０１４２】
実施例１１：培養細胞（浮遊細胞）への温度プローブの導入
ＭＯＬＴ−４ （ヒト急性リンパ芽球性白血病(Ｔ−細胞)）をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）、１００ｍｍディッシュにて培養した（播種１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。２日後、培養液３ｍｌを遠心（３００ｇ、２分）し、培地を取り除き、５％グルコースで洗浄後、再度５％グルコース１ｍｌで懸濁し、化合物１−９をそれぞれ終濃度０．０５％となるように添加した。２５℃、１０分後、遠心（３００ｇ、２分）し、上清を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに懸濁し、プローブが導入されているかの確認を顕微鏡観察にて行った。共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、４０倍対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察し、細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
【０１４３】
結果を図７に示す。それぞれの化合物にて、浮遊細胞であるＭＯＬＴ４においてもプローブの導入が確認できた。また、化合物１に関しては、約５０〜１００細胞で細胞質内にプローブ由来の蛍光が確認できた（細胞の自家蛍光を除く）細胞の割合を算出したところ、９９．２±１．１（％）であった。
【０１４４】
実施例１２：培養細胞（浮遊細胞）に対しての化合物１の蛍光強度応答
実施例１１のようにして、ＭＯＬＴ−４へ化合物１の導入を行い、ＰＢＳに懸濁した状態でキュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計にセットし、約８００ｒｐｍの速度で回転させ、細胞が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５８ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を２℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後２分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
【０１４５】
結果を図８に示す。化合物１によって、細胞内の温度を算出することができた。一般的な哺乳類細胞の生育温度である２５〜４０℃の幅広い温度領域で細胞内温度を計測できることが確認できた。
【０１４６】
実施例１３：温度分解能の評価
実施例８の結果のように、温度（Ｔ）を横軸に蛍光強度比（Ｒ）を縦軸に取った場合を想定する。∂を微小量、δを誤差とした場合、次のような関係が成り立つ。
【０１４７】
【数１】
2015218304.tif 000022
つまり何℃の温度差を検出できるかを示す温度分解能δＴは、
【数２】
2015218304.tif 000023
と示される。ここで、∂が微小量を表すことから、
【数３】
2015218304.tif 000024
は温度（Ｔ）を横軸に蛍光強度比（Ｒ）を縦軸に取ったグラフの曲線の接線の傾きを示している。δは誤差を表しているので、δＲは蛍光強度比の誤差である。ここでは標準偏差を誤差値として用いた。
【０１４８】
つまり、（温度分解能）＝（温度（Ｔ）を横軸に蛍光強度比（Ｒ）を縦軸に取ったグラフの曲線の接線の傾きの逆数）×（蛍光強度比の誤差）として算出することができる。
【０１４９】
実施例１２の結果である図８について温度分解能を評価した結果、図９のようになった。例えば化合物１に関しては、３０〜４４℃という一般的な哺乳類細胞の生理的温度で０．２℃程度の温度分解能があり、非常に幅広い温度領域を高い感度で定量できることがわかった。また、２つの蛍光性ユニット比が異なる３つの化合物（化合物１、化合物７および化合物８）の１５０ｍＭＫＣｌ溶液中での温度応答性試験の結果である図４について、温度分解能を解析した結果も図９に示した。それぞれのプローブにおいて、２５℃から４５℃の幅広い温度領域で、０．１℃程度の高い温度分解能があることが示された。
【０１５０】
比較例１：１蛍光性ユニットのみからなる蛍光性温度プローブの細胞内での温度分解能
既知の公報（国際公開第２０１３／０９４７４８号）に記載の化合物９（以下「前化合物９」という）は、細胞内で感度よく応答する温度領域が３５℃付近を中心として±５℃の範囲であり、感度良く細胞内温度計測ができることがわかっていた。培養したＭＯＬＴ−４ を５％グルコースで洗浄後、再度５％グルコース１ｍｌで懸濁し、前化合物９を終濃度０．０５％となるように添加した。２５℃、１０分後、遠心（３００ｇ、２分）し、上清を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに懸濁して、実施例１２のようにして、各温度（２５〜４０℃、１℃刻み）における蛍光スペクトルを測定した。
【０１５１】
蛍光強度５６５ｎｍ（高温時の最大蛍光波長）と５８０ｎｍ（低温時の最大蛍光波長）の比を取った場合の蛍光強度比の変化のグラフと温度分解能について図１０に示す。感度が高いと考えられていた前化合物９でも、２５〜４０℃までの中で最大の感度を示すのは４０℃で０．０５℃であるが、０．１℃より小さな温度差を検出できるのはこの温度のみである。３５℃付近の感度よく測定できる温度範囲においては０．２℃より大きい値の温度分解能を示しており、また３０℃から４０℃までの平均温度分解能は０．４５℃であった。一方、図９の化合物１では、同じ温度領域での平均温度分解能は０．０７℃であることから、今回合成した新規のプローブが極めて感度の高い温度計測ができることが明らかとなった。
【０１５２】
実施例１４：接着細胞への本プローブの応用
ヒト由来胎児腎細胞ＨＥＫ２９３ＴをＤＭＥＭ培地（５％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、３５ｍｍガラスボトムディッシュにて培養した（播種１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）。１日後、培地を５％グルコースに置換し、化合物１を終濃度０．０５％となるように添加し、２５℃で１０分静置した。その後、プローブを取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ−ｆｒｅｅのＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃に保った状態で顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）に照射し、４９０〜５３０ｎｍの蛍光画像（Ｐ１）と５６０〜６１０ｎｍの蛍光画像（Ｐ２）を取得した。なおＰ１、Ｐ２はバックグラウンドとして細胞のないある領域の蛍光強度を差し引く画像処理を行った。
【０１５３】
結果を図１１に示す。Ｐ１、Ｐ２の結果から明らかであるように、ＨＥＫ２９３Ｔのような接着細胞にも容易にプローブを導入することが出来た。また、Ｐ２の各ピクセルの蛍光強度値をＰ１の蛍光強度値で割った図をＰ２／Ｐ１として示した。その結果、細胞内の温度分布を可視化し、定量できることが明らかとなった。さらに細胞一部分の断面図のレシオ強度（白黒の強度値）を図１２に示した。その結果、細胞内においてもレシオ値に明確な差があることが明白であった。これらの結果から、蛍光強度比をとることができる顕微鏡でも細胞内の温度分布が可視化できることが明らかとなり、今までの蛍光性温度センサーでは実現できなかった非常に汎用性の高い技術であることが示された。
【０１５４】
実施例１５：顕微鏡によるオルガネラ別の温度の評価
実施例１４のようにして、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に化合物１を導入し、ＤＭＥＭ培地に置換し、２７℃、３２℃、３７℃に保った状態でそれぞれの温度で顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ  Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。励起は４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）で行い、８０／２０リフレクターを介して、５１０〜５２０ｎｍの蛍光画像（Ｐ１）と５８０〜５９０ｎｍの蛍光画像（Ｐ２）を取得した。
【０１５５】
得られた細胞の微分干渉像を元に、蛍光像の細胞全体および核を興味領域（ＲＯＩ）で囲み、それぞれのＲＯＩ内の平均蛍光強度シグナルをＦＶ１０−ＡＳＷ解析ソフト（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で算出した。細胞質の平均蛍光強度シグナルは細胞全体のシグナルから核のシグナルを差し引くことによって算出した。さらに、Ｐ２のシグナルをＰ１のシグナルで除することによって、細胞質、核のそれぞれの平均レシオシグナルを算出した。９細胞の平均値を図１３に示す。その結果、細胞質と核で、細胞内温度が異なることが示された。実施例１４の結果と合わせて、細胞内の温度分布を感度よく定量できることがわかった。
【０１５６】
実施例１６：プローブの毒性評価
実施例１１のようにして、ＭＯＬＴ−４細胞に化合物１を導入し、ＲＰＭＩ培地に懸濁した。また、実施例１４のようにして、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に化合物１を導入し、ＤＭＥＭ培地に置換した。その後、両細胞に対して、非膜透過性の蛍光試薬であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を終濃度０．６７μｇ／ｍｌとなるように培地中に添加し、３７℃で３０分間処理した後、顕微鏡で観察を行った。化合物１は４７３ｎｍのレーザーで励起し、ＰＩは５５９ｎｍのレーザーで励起し、それぞれ４９０〜５５０ｎｍ、６５５〜７５５ｎｍの蛍光波長で観察を行った。なお、観察時のカメラの光増倍管感度やレーザー強度は、９５℃、１分間熱処理した細胞を死滅した細胞のコントロールとして用いて調整を行った。
【０１５７】
顕微鏡下で化合物１の蛍光が観察された細胞を約１００細胞選んで、ＰＩの蛍光が観察された細胞を死滅細胞として数をカウントした。その結果、ＭＯＬＴ−４細胞においては、生存率が９７．９±１．７（％）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生存率は１００．０±０．０（％）であり、どちらの細胞においても温度プローブの毒性は非常に低いことがわかった。
【０１５８】
実施例１７：筋管細胞へのプローブ導入試験と温度応答性の評価
Ｃ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞由来、ＥＣＡＣＣ）を増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ, １００ μｇ／ｍｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で培養後、３ｘ１０３／ｃｍ２となるようにプラスチックボトムディッシュ（ｉｂｉｄｉ社）に播種、３日後に分化培地（ＤＭＥＭ，２％ウマ血清，１００ Ｕ／ｍｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ, １００ μｇ／ｍｌｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に置換し、さらに７日間培養した。
【０１５９】
培養した細胞を０．４５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含んだ５％グルコースで洗浄し、０．４５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含んだ５％グルコースに溶解した化合物１懸濁液（終濃度０．０３％）を、ディッシュ中央のホール部（観察部）に３５０ μl 添加、室温で１０ ｍｉｎ処理した。０．４５ ｍＭ ＣａＣｌ２を含んだＰＢＳで２回洗浄後、顕微鏡観察用培地に置換した。観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、２０倍対物レンズ（ＵＰＬＳＡＰＯ，ＮＡ  ０．７５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察し、細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ  Ａｒレーザー）を照射して、４８５〜５４５ｎｍ（Ｐ１）と５７０〜６７０ｎｍ（Ｐ２）の２蛍光波長に対する蛍光像を観察した。また実施例１４と同様の方法で、Ｐ２／Ｐ１のレシオ像も作成した
【０１６０】
結果を図１４に示す。筋細胞はＣａを培地中から抜いてしまうと細胞にダメージがあることがわかり、導入時のグルコース溶液にＣａを少量入れることで、細胞にダメージを与えずにプローブを導入できることがわかった。さらに、外部温度を変化させることで、レシオ値が変化することも確認できた。このように分化したような成熟細胞においてもプローブは適用でき、細胞内の温度計測ができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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