(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト肝細胞に対して高い選択性を有すると共に短時間かつ低コストで製造できるペプチドの提供。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスのヒト肝細胞認識部位であるＬタンパク質上のｐｒｅＳ１ドメインのアミノ酸残基２〜１９を改良したGQNLSVSNPLGFFPEHQLで示されるアミノ酸配列を有するペプチドに、タンパク質の疎水性を高めるＮ末端修飾、好ましくはミリストイル化又はパルミトイル化、をしたペプチド、及び前記ペプチドと薬物とを有するヒト肝細胞選択的薬物送達複合体。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するペプチドに、タンパク質の疎水性を高めるＮ末端修飾をしたことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
前記Ｎ末端修飾は、ミリストイル化又はパルミトイル化の何れかであることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のペプチドと薬物とを有する、ヒト肝細胞選択的薬物送達複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝細胞に対して高い選択性を有するペプチドと、そのペプチドを利用して薬物をヒト肝細胞へ選択的に送達するヒト肝細胞選択的薬物送達複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生理活性物質や遺伝子治療薬は、生体内への吸収率が低く、速やかに分解を受けてしまう場合があるため、薬物体内挙動を制御する薬物送達システム（drug delivery system,DDS）が注目をあびている。
【０００３】
肝臓は生体内の恒常性維持に重要な役割を果たしており、肝疾患には生命を左右する重篤なものが多いため肝臓内特定部位への薬物送達は非常に意義深い。
【０００４】
ヒト肝細胞への薬物送達として特許文献１に記載の技術がある。特許文献１には、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質を含む中空ナノ粒子を、導入物質を封入したリポソームと融合させることを特徴とする、ヒト肝細胞への薬物送達技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１０６７５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記の技術は、ヒト肝細胞への選択性が十分ではなく、また中空ナノ粒子は簡易な構造では無いため短時間かつ低コストで製造することが困難な場合も想定される。
【０００７】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、ヒト肝細胞に対して高い選択性を有すると共に短時間かつ低コストで製造することができるペプチド、及び、そのペプチドを利用して薬物をヒト肝細胞へ選択的に送達するヒト肝細胞選択的薬物送達複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかるペプチドは、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するペプチドに、タンパク質の疎水性を高めるＮ末端修飾をしたことを特徴とする。
【０００９】
また本発明にかかるヒト肝細胞選択的薬物送達複合体は、本発明にかかるペプチドと薬物とを有する複合体からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ヒト肝細胞に対して高い選択性を有すると共に短時間かつ低コストで製造することができるペプチドが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ミリスチン酸の付加の有無による導入度の差を示すものである。
【図２】HBV-11-1(Myr)、HBV-11-2(Myr)、HBV-11-3(Myr)を、HepG2、Huh-7、NIH3T3、B16、HeLa、NmuLiに導入した場合の蛍光強度の観察結果を示すものである。
【図３】各細胞における蛍光量を比較して示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
（新規ペプチド）
人に感染するＢ型肝炎ウイルスは３つの表面タンパク質（Ｌ、Ｍ及びＳタイプ）を有しており、Ｌタンパク質上のpreS1ドメインはヒト肝細胞認識部位であり、Ｂ型肝炎ウイルスの人への感染に重要な領域である。特に、アミノ酸残基２〜４８はヒト肝細胞表面アシアロ糖タンパク質レセプターとの結合部位であり、その中でアミノ酸残基２〜１８は必須部位として知られている。
【００１４】
Ｂ型肝炎ウイルス(Hepatitis B Virus;HBV)のゲノタイプ（遺伝子型）は地域、分布別に８種類（ＡからＨ）に分類されており、下記表１に示すように、ヒト肝細胞レセプターと特異的に結合する部位と言われているPreS1のアミノ酸配列（アミノ酸残基２番から19番）にも微妙な差異がある。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
本発明者らは、天然のアミノ酸配列を基にして、preS1ドメインのアミノ酸残基２〜１９を改良することにより、下記に示す新規配列のペプチド（配列番号７）を見いだし、かかる新規ペプチドが優れたヒト肝細胞選択能を有することを事実として確認し、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。
【００１７】
GQNLSVSNPLGFFPEHQL・・・配列番号７
Ｂ型肝炎ウイルスのpreS1ドメインは２番目のアミノ酸残基にミリスチン酸を有している。そのため、下記に示すように、本実施形態にかかるペプチドにも同様に２番目のアミノ酸(Gly)残基に、例えばミリストイル化等のタンパク質の疎水性を高めるＮ末端修飾がなされる。
【００１８】
Mry-GQNLSVSNPLGFFPEHQL
タンパク質のミリストイル化は、N末端グリシンに14炭素鎖飽和脂肪酸であるミリスチン酸がアミド結合により付加する不可逆的な脂質修飾である。典型的にはN-ミリストイル化はN-ミリストイルトランスフェラーゼ（NMT）により翻訳と並行して修飾が起こる共翻訳修飾として行われる。N-ミリストイル化によりタンパク質の疎水性が上昇し、細胞膜への親和性が向上する。
【００１９】
タンパク質の疎水性を高めるＮ末端修飾は、ミリストイル化に限定されるものではなく例えばパルミトイル化とすることも可能である。タンパク質のパルミトイル化は、パルミチン酸を膜タンパク質のシステイン残基に共有結合させる反応のことである。パルミトイル化によって、タンパク質の疎水性が高まり、細胞膜とも親和性が高まる効果が期待される。
【００２０】
なお、本実施形態にかかるペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列に限定されるものではなく、ヒト肝細胞に対して高い選択性を有する限り、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる群より選択される配列のペプチドも包含するものとする。
【００２１】
本実施形態にかかるペプチドは、ヒト肝細胞を選択的に認識するペプチドであるため、ヒト肝細胞由来の疾患の治療及び／又は治療に有効である。「予防」には疾患の発症を抑えること及び遅延させることが含まれ、疾患になる前の予防だけでなく、治療後の疾患の再発に対する予防も含まれる。一方、「治療」には、症状を治癒すること、症状を改善すること及び症状の進行を抑えることが含まれる。
【００２２】
また、本実施形態にかかるペプチドは、ヒト肝細胞を選択的に認識するペプチドであるため、種々の薬物送達システムの開発やイメージング剤の送達を可能にする。特に、ヒト肝細胞にピンポイントで送達することで、ヒト肝細胞以外の細胞への取り込みを軽減し、重篤な副作用を回避することが可能となる。
【００２３】
本実施形態にかかるペプチドは、１８という短いアミノ酸残基で構成されたペプチドにＮ末端修飾をしたものであるから、短時間且つ低コストで大量生産も可能であるという利点を有する。
【００２４】
また、本実施形態にかかるペプチドは、１８という短いアミノ酸残基で構成されたペプチドにＮ末端修飾をしたものであるから、PreS1ドメイン全体を使用することで起こりやすい免疫反応を軽減することができ、生体に与える影響は少ないことから、毒性や免疫反応を惹起するヒト肝細胞選択的材料の代替材料としても有益である。
【００２５】
（ヒト肝細胞選択的薬物送達複合体）
本実施形態にかかるヒト肝細胞選択的薬物送達複合体は、本発明にかかるペプチドと薬物とを有して構成される。
【００２６】
薬物はヒト肝細胞への標的指向性を意図した投与が必要な薬物が好ましい。薬物は、特に限定されるものではないが、例えば抗癌剤、抗生物質、免疫賦活剤、抗炎症剤等である。抗癌剤としては、特に限定されるものではないが、例えばマイトマイシンＣ、5FU、シスプラチン、アドリアマイシン、ファルモルビシン等が挙げられる。抗生物質としては、特に限定されるものではないが、例えばエリスロマイシン、セファレキシン、クロラムフェニコール、クリダンマイシン、フシジン酸ナトリウム、塩酸テトラサイクリン、塩酸ミノサイクリン、リファンピシン、グリセオフルピン、アムホテリシンＢ等が挙げられる。免疫賦活剤は例えばムラミルペプチド類等である。抗炎症剤としては、特に限定されるものではないが、ステロイド剤であるプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン等、また、非ステロイド剤であるアセチルサリチル酸、イブプロフェン、ザルトプロフェン、ジクロフェナク、セレコキシブ等が挙げられる。
【実施例】
【００２７】
(1)ペプチド合成
株式会社スクラム(東京、日本)に依頼し標準的なFmoc法により、下記に示す各ペプチドを合成した。なお、Fmoc法は、9-フルオレニルメトキシ基(Fmoc基)で保護したアミノ酸（Fmoc-アミノ酸）を用いたペプチド固相合成法である。即ち、配列番号１はゲノタイプA、B及びCのPreS1のN末端2番から19番からの天然ペプチドであり、配列番号２はゲノタイプDのPreS1のN末端2番から19番からの天然ペプチドであり、配列番号７は天然のアミノ酸配列を基に新規にデザインしたペプチドである。
【００２８】
GTNLSVPNPLGFFPDHQL(配列番号１)
GQNLSTSNPLGFFPDHQL(配列番号２)
GQNLSVSNPLGFFPEHQL(配列番号７)
そして、FITC蛍光色素ラベル化のために、下記に示すように、各ペプチドに対して、ペプチドのＣ末端に三つアミノ酸リンカー配列（GGS；Gはグリシン、Sはセリンを表す）とFITC色素蛍光との結合に必要な一つのアミノ酸残基（K；リジン）を導入した。
【００２９】
GTNLSVPNPLGFFPDHQL-GGSK
GQNLSTSNPLGFFPDHQL-GGSK
GQNLSVSNPLGFFPEHQL-GGSK
そして、下記に示すように、各ペプチドにおいて、Ｎ末端のアミノ酸残基Gにミリスチン酸修飾をした。
【００３０】
Myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQL-GGSK
Myr-GQNLSTSNPLGFFPDHQL-GGSK
Myr-GQNLSVSNPLGFFPEHQL-GGSK
また、比較のため、各ペプチドにおいてミリスチン酸未修飾のペプチドも用意した。そのため、用意したサンプルは下記表２に示すように６種類であった。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
TFA切断の後、ペプチドはクロマトグラフィーシステムを用いて精製し、純度95％以上のものを実験に使用した。ペプチドの分子量をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MS）により測定し、目的物であることを確認した。
【００３３】
(2)ペプチドの細胞導入実験
細胞は、HepG2(ヒト肝がん由来細胞)、Huh-7(ヒト肝がん由来細胞)、B16(マウス由来メラノーマ細胞)、NmuLi(マウス由来肝細胞)、HeLa(ヒト由来子宮頸がん細胞)、NIH3T3(マウス胚性線維芽細胞)を用意した。
【００３４】
各細胞は、10％牛胎児血清（FBS）、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、及びアムホテリシンB（0.25μg/ml）を含有したDMEM（ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地）を使用し、37℃、5％CO2条件下で培養された。培養した細胞（5×105）を6ウェルに分注し、37℃、5％CO2条件下で24時間インキュベートした。
【００３５】
24時間後、各ペプチド（5μM/ウェル）を各細胞に添加し、更に24時間インキュベートした。細胞に存在する蛍光物質は蛍光顕微鏡で観察し、イメージング分析はAQUACOSMOS 2.6イメージングソフトウェア（浜松ホトニクス、静岡、日本）で行った。
【００３６】
(3)蛍光強度の測定
蛍光強度の測定のために、各ペプチドを添加してから24時間インキュベートした細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。洗浄後、500μlの細胞溶解バッファー（100 mM  Tris-HCl、1% Triton-X 100、及び2mM EDTA）を細胞に添加し溶解した。200μlの細胞溶解液を96ウェルに添加し、マイクロプレートリーダー（Wallac社製 ARVO SX 1420）を用いて吸光度を測定した。細胞溶解液中のタンパク質濃度を測定するために、10μlの細胞溶解液を1 mlのBio-Rad Protein Assay試薬（Bio-Rad社、カリフォルニア州）と混合した。595 nmの吸光度を測定し、牛血清アルブミン（BSA）標準液の希釈系列から作成した標準曲線を用いてタンパク質の濃度を求めた。細胞においての蛍光強度はタンパク質質量あたりの相対蛍光強度（Em/mg）で表した。
【００３７】
(4)結果
結果を図１〜図３に示す。図１は、ミリスチン酸の付加の有無による導入度の差を示すものである。図１において、「Em/mg」はタンパク質1 mg当たりの527nmでの蛍光強度である。図１に示されるように、ミリスチン酸を付加することで、細胞への導入度が向上することが示された。具体的には、ミリスチン酸修飾ペプチドは未修飾ペプチドに比べ、ヒト肝がん細胞に対して20〜100倍高いヒト肝細胞認識能力を有していることが確認できた。
【００３８】
図２は、HBV-11-1(Myr)、HBV-11-2(Myr)、HBV-11-3(Myr)を、HepG2、Huh-7、NIH3T3、B16、HeLa、NmuLiに導入した場合の蛍光強度の観察結果を示すものである。図３は、各細胞における蛍光量を比較して示すものである。図３において、「Em/mg」はタンパク質1 mg当たりの527nmでの蛍光強度である。
【００３９】
図２及び図３に示されるように、蛍光物質と結合したペプチドは、ヒト由来の肝がん細胞(HepG2、Huh-7)に対して高い選択性を示したが、マウス由来肝細胞(NmuLi)、マウス由来皮膚がん細胞(B16メラノーマ)、マウス由来上皮系細胞(NIH3T3)、及びヒト子宮頸がん細胞(HeLa)に対しては低い選択性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
ヒト肝細胞由来疾患の治療、ヒト肝細胞選択的薬物送達システムに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号７：エピトープ
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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