(57)【要約】【課題】  Ｈ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水に、水素生成菌を添加する方法により、常温・常圧下で、容易で安価に水中に水素を発生させる方法を提供する。【解決手段】  Ｈ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水に微生物を添加してＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素を発生させる水素発生方法であって、微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。【選択図】  図２
2015107058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水に微生物を添加して水中の水素分子Ｈ２をＨ＋イオンおよびＨ−イオンにイオン化させる、電離水素水の製造方法。
【請求項２】
前記微生物は水素分解型ヒドロゲナーゼ酵素活性を有するNovosphingobium sp. G株である、請求項１に記載の電離水素水の製造方法。
【請求項３】
電離水素水の製造方法はさらに水素化金属を添加する方法を含む、請求項１または２に記載の電離水素水の製造方法。
【請求項４】
前記水素化金属はアルカリ金属、アルカリ土類金属などが水素化した金属である、請求項３に記載の電離水素水の製造方法。
【請求項５】
電離水素水に微生物を添加してＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素を発生させる水素発生方法。
【請求項６】
前記微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する、請求項５に記載の水素発生方法。
【請求項７】
前記電離水素水は、請求項１ないし４いずれか１つの方法によって製造された電離水素水である、請求項５または６に記載の水素発生方法。
【請求項８】
前記ニトロゲナーゼ酵素を有する微生物は、藍藻類、根粒菌あるいは光合成細菌である、請求項７に記載の水素発生方法。
【請求項９】
前記根粒菌はMesorhzobium sp. GN1株である、請求項８に記載の水素発生方法。
【請求項１０】
電離水素水の製造のために用いられる微生物であって、当該微生物は、は水素分解型ヒドロゲナーゼ酵素活性を有するNovosphingobium sp. G株である、微生物。
【請求項１１】
電離水素水から水素を発生させるために用いられる微生物であって、当該微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する、微生物。
【請求項１２】
請求項１、２、８または９によって製造された電離水素水を用いて植物を栽培する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中にＨ−水素イオンを豊富に含む水である電離水素水を製造する方法、電離水素水から水素を発生させる方法、電離水素水の製造に用いられる微生物および電離水素水からの水素発生に用いられる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲナーゼは、水中の水素分子H2の分解による水素イオン生成反応と、この逆反応の水素イオンから水素分子の合成反応を触媒する酵素である。以下に反応式を示す。H2分子の分解反応の生成物は、H+イオンとH-イオンが等量生成されると考えられているが、H-イオンの存在量を明確に示す測定法がなく、（１）式で示される場合が多い。本発明者らは、（２）式により示される反応式であることを前提としている。しかし、実験的にヒドロゲナーゼにより電離水素水が作製されることを示した報告はこれまでにない。
（１）Ｈ２⇔２Ｈ＋＋２ｅ−
（２）Ｈ２⇔Ｈ＋＋Ｈ−＋２ｅ−
【０００３】
ヒドロゲナーゼは、膜結合性でuptake型（H2の取り込みとイオン化;H2→2H++2e-を行う）と呼ばれるヒドロゲナーゼと細胞質にある双方向性ヒドロゲナーゼ（H2のイオン化とH2の合成;H2⇔2H++2e-）が知られる。Uptake型ヒドロゲナーゼはNiFeを活性中心に持ち、酸素分子O2がある条件では、NiFe活性中心の立体構造を変化させて酸素分子を分解し、水に変えてO2耐性を獲得している（非特許文献１）。双方向性ヒドロゲナーゼは酸素O2に極めて敏感でありUptake型と異なる。
【０００４】
また、ヒドロゲナーゼはパラ型水素分子p-H2をオルト型水素分子o-H2に転換する反応を触媒することが知られている（非特許文献２）。しかし、水素分子のイオン化とオルト型水素分子およびパラ型水素分子の関係については知られていなかった。このような中、発明者らは（ａ）オルト型水素分子はイオン結合性水素分子であり、パラ型水素分子は共有結合性水素分子であること。（ｂ）イオン結合性のオルト型水素分子はイオン化（H2→H++H-）する水素分子であるが、共有結合性のパラ型水素分子はイオン化しない水素分子であること。（ｃ）従って、uptake型ヒドロゲナーゼによる水中の水素分子のイオン化反応は、初めにヒドロゲナーゼ酵素が水中のパラ型水素をオルト型水素分子に転換させ、次にイオン化反応を起こさせるのではないかと考えるに至った。（ｄ）電離水素水はuptake型ヒドロゲナーゼによるH2分解の際生じたH+イオンとH-イオンによって生成されると考えられるが、これまで実験的に証明されていない。
【０００５】
一方、H2分子がH+イオンとH-イオンにイオン化された水分子を再びH2分子に戻す反応を触媒するのは、双方向性ヒドロゲナーゼによると考えられるが、実験的に証明されていない。また、窒素固定能を持つ根粒菌や一部の藍藻類は大気中の窒素ガスをアンモニアに変換する反応を触媒するニトロゲナーゼ酵素によりH+イオンおよびH-イオンから水素分子H2の合成を触媒していると考えられるが、実験的に証明されていない。
【０００６】
ニトロゲナーゼは、根粒菌などの窒素固定菌や窒素固定能を有する一部の藍藻類（シアノバクテリア）や光合成細菌が有する酵素で、大気中の窒素分子N2をアンモニアNH3に変換する酵素である。酵素反応は窒素ガスの有無により２通りあり、どちらも不可逆的に水素発生を行う反応が起こる。以下に既存の研究の反応式を示す。
・窒素ガスが有る場合の反応
（既存の研究）N2＋8e−＋8H＋＋16ATP→H2＋2NH3＋16(ADP＋Pi)
・窒素ガスが無い場合の反応
（既存の研究）2e−＋2H＋＋4ATP→H2＋4(ADP＋Pi)
【０００７】
ニトロゲナーゼは、酸素感受性が高く、酸素共存下で失活しやすい性質を有する。その失活性は高く、失活反応が不可逆的であるため、ニトロゲナーゼを扱う際には注意が必要である。
【０００８】
一般的に、ニトロゲナーゼを有する微生物は同時にヒドロゲナーゼを有していることが多い。これは、ニトロゲナーゼによって生成した水素をヒドロゲナーゼの水素取り込み反応によってエネルギー源として利用し、効率を高めているためである。このため、ニトロゲナーゼを有している微生物でも、水素発生が微量しか観測できないことが多い。そこで、非特許文献３は、ニトロゲナーゼを有する藍藻類からuptake型ヒドロゲナーゼのみを遺伝子操作で除去したところ、水素生産能力を格段に高めたという研究結果が出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shomura Y, Yoon K. S, Nishihara H,  and Higuchi Y (2011) Structural basis for a ［4Fe-3S］cluster in the oxygen-tolerant membrane-bound ［NiFe］-hydrogenase.  Nature. 479:253-256.
【非特許文献２】Masukawa  H.,  Mochimaru  M., and Sakurai H.（2002）Disruption of the uptake hydrogenase gene, but not of the bidirectional hydrogenase gene, leads to enhanced photobiological hydrogen production by the nitorogen fixing cyanobacterium Anabaena sp.PCC 7120. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:618-624.
【非特許文献３】Berlier Y., Lespinat P. A., and Dimon B. (1990)A Gas Chromatographic-Mass Spectrometric Spectrometric Technique for Studying Simultaneous Hydrogen-Deuteron Exchange and Para-Orthohydrogen Conversion in Hydrogenases of Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.Analyt. Biochem. 188:427-431.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまで、微生物を用いて水素を発生させる方法は、光合成細菌などにより有機物や硫黄化合物をエネルギー源にして増殖の過程で発生させたり、太陽光を照射しながら藍藻類や藻類を培養し、培養液中の水分解の過程で水素発生させる方法が取られて来た。しかし、現状では有機物や太陽光エネルギーから水素ガスへの変換効率や水素ガスの回収効率が低いことや、微生物の培養のために広大な敷地を要することの課題があった。
【００１１】
そこで、本発明は、Ｈ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水に、水素生成菌を添加する方法により、常温・常圧下で、容易で安価に水中に水素を発生させる方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、Ｈ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水を製造する方法およびこれに用いる微生物を提供することを目的とする。
さらに本発明は、この電離水素水に水素を発生させた水を用いて植物を容易に延命させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
環境中から単離したMesorhzobium sp.GN1株等を水に投入して、水中の水素分子を分解させて電離水素水を製造するか、あるいは水素化金属を含む強還元性セラミックボールを水に投入してオルト型水素分子を放出させることにより電離水素水を製造し、この電離水素水に窒素固定能を有する微生物を添加することによる水素発生法を開発した。この水素水で夾竹桃（キョウチクトウ）の切り花を生育させたところ、水道水に較べて花が枯れずに長持ちしたり、つぼみが開花するなどの延命効果が示された。
【００１３】
本発明に係る電離水素水の製造方法は、水に微生物を添加して水中の水素分子Ｈ２をＨ＋イオンおよびＨ−イオンにイオン化させる。好ましくは前記微生物は水素分解型ヒドロゲナーゼ酵素活性を有するNovosphingobium sp. G株である。好ましくは電離水素水の製造方法はさらに水素化金属を添加する方法を含む。好ましくは前記水素化金属はアルカリ金属、アルカリ土類金属などが水素化した金属である。
【００１４】
本発明に係る水素発生方法は、電離水素水に微生物を添加してＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素を発生させるものである。好ましくは前記微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。好ましくは前記電離水素水は、上記の電離水素水の製造方法によって製造された電離水素水である。好ましくは前記ニトロゲナーゼ酵素を有する微生物は、藍藻類、根粒菌あるいは光合成細菌である。好ましくは前記根粒菌はMesorhzobium sp.  GN1株である。
【００１５】
本発明に係る電離水素水の製造のために用いられる微生物は、は水素分解型ヒドロゲナーゼ酵素活性を有するNovosphingobium sp. G株である。また、本発明に係る電離水素水から水素を発生させるために用いられる微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。さらに本発明に係る植物を栽培する方法は、上記の製造方法によって製造された電離水素水を用いて行われる。
【発明の効果】
【００１６】
常温・常圧下で安価で容易に水素を発生させる方法を開発した。この方法の水素発生工程では、微生物の培養槽は必要でなく、常温・常圧で電離水素水にMesorhzobium sp.GN1株やBradyrhizobium japonicum NBRC14792株などの窒素固定能を有する菌株（根粒菌）を添加するだけで水素を発生させることができる。発生させた水素は、燃やしたり、貯蔵したり、プロトン交換膜を通すことにより燃料電池等に用いることができる。また、この水で切り花を生育すると花が長持ちしたり、つぼみが開花したりするなどの延命効果が示される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実験装置の概略構成を説明する図である。
【図２】Novosphingobium sp. G株で作製した電離水素水に、大腸菌BW25113株、根粒菌Bradyrhizobium japonicum NBRC14792株、根粒菌Mesorhyzobium sp. GN1株を添加した場合の水中の溶存水素濃度(DH)の経時変化(時間)を示すグラフである。
【図３】TiH2、CaH2および強還元性セラミックボールでそれぞれ作製した電離水素水に、根粒菌を添加した場合の水中の溶存水素濃度(DH)の経時変化(時間)を示すグラフである。
【図４】セラミックボール１１個で作製した電離水素水により植物の栽培したとき（コントロール：０日目）の写真である。
【図５】セラミックボール１１個で作製した電離水素水により植物の栽培したとき（６日目）の写真である。
【図６】水道水により植物の栽培したとき（コントロール：０日目）の比較例としての写真である。
【図７】水道水により植物の栽培したとき（６日目）の比較例としての写真である。
【図８】Ｇ株と根粒菌により作製した電離水素水により植物の栽培したとき（コントロール：０日目）の写真である。
【図９】Ｇ株と根粒菌により作製した電離水素水により植物の栽培したとき（６日目）の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本願発明者らが出願した、特願2012-047146「微生物による電離水素水の製造法およびこれに用いる微生物」においては、蔵王山の湧水から単離した各種の菌株用いられた。その後の研究で、電離水素水を製造する菌として、同じ蔵王山の湧水から単離されたNovosphingobium sp. G株が増殖も早く、より電離水素水製造に適した微生物として示された。今回は、このG株を用いて製造した電離水素水（H2→H++H-）に窒素固定能を有する水素生成菌Mesorhzobium sp. GN1株等の根粒菌を添加することによって水素を発生させる方法(H++H-→H2)を開発した。これまで、微生物を用いた水素の生成や製造法は、藍藻類、藻類、硫黄酸化細菌などの光合成細菌、水素菌等の水素生成菌のみを用いた方法であり、電離水素水に微生物を添加して水素を発生させる方法は知られていない。一方で、（株）TAANEの開発した水素化金属を含む強還元性セラミックボール（特許公開2004-174480（特第4218939））で製造した電離水素水(CaH2＋2H2O→Ca(OH)2+H2↑+H++H-、なおCBには他の水素化金属も微量含まれる)に根粒菌を添加する方法によっても水素生成が確認された。
【００１９】
この水素を発生させた電離水素水の用途の一つとして、植物の延命効果を分析した。そこで、夾竹桃（キョウチクトウ）の切り花に、G株のみを添化した場合（電離水素水であるが水素発生は無いか低い）とG株と根粒菌を同時に添加した場合（水素発生あり）で、キョウチクトウを生育し、延命効果を分析した。この結果、5日〜6日間の生育後にコントロールの水道水では、花はしぼんで枯れてしまったり、つぼみは開花することがなかったが、G株による電離水素水およびG株に根粒菌を加えて作った水素を発生させた電離水素水では、花は枯れずに咲き続けたり、つぼみは開花するなどの延命効果が検出された。
【００２０】
（実施例）
実験方法：
使用菌株：
今回の実験で使用した菌株は次の４株である。
Novosphingobium sp. G株およびMesorhzobium sp. GN1は山形県蔵王山中腹の湧水から単離された微生物であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにそれぞれ受託番号NITE P-1268、NITE P-1240 として寄託してある。
【００２１】
大腸菌は国立遺伝学研究所MEコレクションStrain NO.9062、Strain  Name BW25113株として保存されており、入手することが可能である。
【００２２】
Bradyrhizobium japonicum は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー分野生物遺伝資源センター(NBRC)でStrain NO. NBRC14792株として保存されており、入手することが可能である。
【００２３】
実験に用いた植物は、広島県呉市の呉工業高等専門学校の校庭に植えてある夾竹桃（キョウチクトウ）であり、この夾竹桃のつぼみが多く含まれる枝を切って用いた。
【００２４】
還元性セラミックボールは特許公開2004-174480（特第4218939）の方法で製造されたものを株式会社TAANEより譲与されたものを用いた。
【００２５】
使用培地：
微生物培養の培地としてはPB培地(蔵王山湧水由来株およびB.japonicum用)とLB培地(大腸菌用)の2種類を用いた。PB培地の組成は、ポリペプトン10g、酵母エキス2g、硫酸マグネシウム7水和物1g、寒天15g(寒天培地の場合)、蒸留水1Lであり、これをオートクレーブ滅菌処理(20min、121℃、2atm)して用いた。LB培地の組成は、トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl 5g、グルコース1g、寒天15g(寒天培地の場合)、蒸留水1Lであり、これをオートクレーブ滅菌(20min、121℃、2atm)して用いた。
【００２６】
使用試薬：
培養液を集菌した後の菌体の凍結保存液として、スキムミルク(10%スキムミルク、1%グルタミン酸ナトリウム溶液：SG溶液)を用いた。スキムミルクの組成は、スキムミルク10g、グルタミン酸ナトリウム1g、蒸留水100mL(up to 100mL)であり、これをオートクレーブ滅菌(20min、121℃、2atm)して用いた。
【００２７】
実験装置：
実験装置の概略構成を図１に示す。同図に示すように、実験装置は、３０℃の恒温槽１００、恒温槽１００内に収容されたビーカー１１０、菌体入りの透析膜チューブ１２０(SnakeSkin Dialysis Tubing／Thermo SCIENTIFIC社)、pH計１３０(HM-31P＋GSF-2739C／東亜ディーケーケー株式会社)、ORP(酸化還元電位)計１４０(HM-31P＋PST-2729C／東亜ディーケーケー株式会社)、DH(溶存水素)計１５０(KM2100 DH／有限会社共栄電子研究所)、DH用PC(パーソナルコンピュータ)１６０、pH用PC１７０、ORP用PC１８０を含む。但し、図に示す縮尺比は実際のものと異なる。
【００２８】
実験手順：
実験の基本フローは、(1)微生物の培養(前培養・本培養)、(2)菌体の集菌・スキムミルク保存液に懸濁して-85℃凍結、(3)実験装置の調整、(4) 菌体入り透析膜の調整と溶存水素濃度の計測である。その他、強還元性セラミックボールの投入など以下に示す手順(5)〜(7)で行った。
【００２９】
(1)微生物の培養(前培養・本培養)
微生物の培養は、次の手順で行った。（ａ）−85℃に凍結保存しておいた各菌株を白金耳でかきとり、寒天培地へ画線植菌し、30℃で約7日間、静置培養した。（ｂ）出現した単一のコロニーを白金耳でかき取り、100mLの液体培地を加えた200mL容の三角フラスコに植え継ぎ、30℃、70rpm（大腸菌110rpm）で約7日間（大腸菌2日間）、振とう培養した(前培養)。（ｃ）この培養液10mLを新しい1Lの液体培地を加えた2L容の三角フラスコに植え継ぎ、30℃、70rpm（大腸菌110rpm）で7日〜10日間(大腸菌2日間)、振とう培養した(本培養)。
【００３０】
(2)菌体の集菌・スキムミルク懸濁液の調整
菌体の集菌・調整は、次の手順で行った。（ａ）1Lの培養液を450mL容の遠心管3本に移し、4℃、5,000rpm、5min遠心した。（ｂ）上澄み(培地)を捨て、菌体を5mlのスキムミルクに懸濁した。（ｃ）懸濁液を500μLずつ分取し、1.5mL容マイクロチューブに入れ（1本あたり100mLの培養液量）、測定実験に使用するまで−85℃で凍結保存した。
【００３１】
(3)実験装置の調整
実験装置の調整は、次の手順で行った。（ａ）恒温槽に水を適当量補充し、30℃に設定した。（ｂ）400mLの蒸留水を入れた1Lビーカーを用意し、恒温槽の中に設置した。（ｃ）ビーカー中の蒸留水に水素イオン（pH）計、酸化還元電位（ORP）計、溶存水素（DH）計の電極を浸漬した。なお、実験は太陽光が入る窓際に装置を設置し、ブラインドを開けて行った。
【００３２】
(4)菌体入り透析膜の調整と溶存水素濃度の計測
電離水素水から水素発生実験は、次の手順で行った。（ａ）保存しておいた菌体懸濁液を使用する本数分だけ氷中で解凍し、マイクロピペットで透析膜チューブ（スペクトラ、分画分子量6,000〜8,000、長さ7〜9cm×幅40mm）に注入した。（ｂ）透析膜の両端を専用のポリプロピレン製のクリップ（スペクトラ）で留めた。（ｃ）（ｂ）の菌体入り透析膜を400mLの蒸留水を加えた1L容ビーカーに投入した。（ｄ）菌体入り透析膜が浮かないようにガラス棒で抑えた。（ｅ）pH計、ORP計のデータを、専用のソフトウェア（東亜DKK）を用いて、30分おきにパソコンのハードウェアに収集した。DH計のデータはパソコンに内蔵されているデジタルビデオカメラを用いて、1時間置きに1分間録画した。
【００３３】
(5)G株で作製した電離水素水から水素発生量の測定
予め菌体懸濁液を加える30分以上前にpH計、DH計、ORP計の電極を400mLの蒸留水を加えたビーカーに浸漬して安定化させておくと同時に計測を開始する。-85℃で凍結保存したG株菌体懸濁液を使用する本数分だけ氷中で解凍した。次に菌体懸濁液を透析膜に移し、クリップで留めた。菌体懸濁液を入れた透析膜を400mLの蒸留水を加えた1L容ビーカーに投入した。ビーカーの水温は恒温槽を30℃に設定することにより調節した。22時間〜24時間後に、同様に大腸菌、Bradyrhizobium japonicum NBRC14792株、Mesorhzobium sp.GN1株のそれぞれの菌体懸濁液を加えた。コントロールとしてG株で作った電離水素水にスキムミルクのみを加えた試料を用いた。
【００３４】
(6)水素化金属や水素化金属を含む強還元性セラミックボール(CB)で作製した電離水素水から水素発生量の測定
予め水素化金属TiH2やCaH2あるいは強還元性セラミックボール(CB)を加える30分以上前にpH計、DH計、ORP計の電極を400mLの蒸留水を加えたビーカーに浸漬して安定化させておくと同時に計測を開始する。ビーカーはG株を添加えないコントロールを含め４個用意した。各計測器が安定した後にそれぞれのビーカーに0.1gのTiH2（和光純薬）、0.01gのCaH2（ナカライテスク）、CBを1コ（0.08g）添加した。22時間〜24時間後に、G株を用いた電離水素水から水素発生の実験と同様にBradyrhizobium japonicum、Mesorhzobium sp. GN1株などの根粒菌の菌体懸濁液を1.5mL（300mLの培養液に相当）加えた。
【００３５】
(7) 微生物で製造した電離水素水の植物の延命作用観察実験
予め使用ずみの2L用ペットボトルを良く水で洗い、乾燥させた。乾燥後のペットボトルは切り花を挿し易いように上部をはさみで切った。9月中旬〜10月下旬の夾竹桃の木からつぼみが多い枝を30cm程度の長さに切り、この枝は直ちに予め500mLの水道水を加えておいたペットボトル容器に移した。この夾竹桃の枝を挿した容器は次の試料分用意した。（ａ）水道水のみのコントロール、（ｂ）セラミックボールを6〜11個加えたもの、（ｃ）透析膜に入れたNovosphingobium sp. G株のみを添化したもの、（ｄ）透析膜に入れたNovosphingobium sp. G株とMesorhzobium sp. GN1株などの根粒菌を同時に添加したもの。(ｅ)G株のみで一晩栽培後に、翌日根粒菌を添加して水素を発生させたもの。なお、微生物量は変えて実験を行った。これらの試料を室温28℃〜32℃で、6日〜2週間程度ブラインドを開けて日光が入る条件にした実験室に静置した。夾竹桃の生育状態はデジタルカメラで撮影した。
【００３６】
（実施例）
G株で作製した電離水素水から水素発生量の測定
実験はスキムミルク500μL（100mL培養液に相当）のG株で作製した電離水素水に、大腸菌、GN1株、B.japonicumをそれぞれ1.5mL(300mL培養液に相当)を添加して行った。この結果、すべての菌株に水素発生が検出された。電離水素水に微生物菌体を添加することによって、水素を発生させることができることが示された。また、水素発生量は大腸菌と較べて、根粒菌のB.japonicumが約3倍でGN1株が約10倍であり、微生物種により異なることが示された。大腸菌と根粒菌の水素生成に関わる性質の大きな違いは、根粒菌にみがニトロゲナーゼ酵素による水素生成を伴う窒素固定能を有している点が挙げられ、このニトロゲナーゼが水素生成に関与する可能性がある。同じ根粒菌でB.japonicumとGN1株で水素生成能が異なるのは、ニトロゲナーゼ酵素活性の違いによるかも知れない。また、大腸菌の水素生成能が低い理由として、大腸菌の有する水素分解型ヒドロゲナーゼと水素分解と水素合成の両方を担う双方向性ヒドロゲナーゼによる、水素生と水素合成の割合が中立しているためであることも考えられる。
【００３７】
これらの結果より、今後はGN1株などの水素生成能の高い菌株を担体に固定化したり、バイオリアクターで連続培養するなどして、電離水素水に供給することによって、電離水素水から容易に連続的に水素を発生させる装置に応用可能であると考えられる。また、既存のあらゆる方法で培養条件などを調節することにより、菌体量調節すれば水素発生量をコントロールすることが可能となる。
【００３８】
（実施例）
水素化金属や水素化金属を含む強還元性セラミックボール(CB)で作製した電離水素水から水素発生量の測定
TiH2等の水素化金属およびCaH2やMgH2などの水素化金属を含む強還元性セラミックボール(CB)は水と反応すると水素ガスが発生すると伴にH＋イオンとH-イオンを生成し、電離水素水が製造されると考えられている。G株による水分解の際もヒドロゲナーゼにより、CBと同様にH＋イオンとH-イオンが生成され、電離水素水が製造されると考えられる。違う点はG株で作った電離水素水はpHが7付近の中性であるが、CBで作製した電離水素水はCa(OH)2やMg(OH)2の影響でアルカリ性を示すことである。
【００３９】
実験は400mLの蒸留水に0.1gのTiH2、0.01gのCaH2、CBを1個（約0.08g）をそれぞれ添加して電離水素水を製造した。ここで、水素化金属を水に添加した際は速やかに水と反応を起こし、水素が発生したが、数分程度で水素の発生は検出されなくなり、根粒菌添加時の溶存水素濃度は0ppbであった。翌日作製した電離水素水に、Bradyrhizobium japonicum 、GN1株などの根粒菌を添加した。この結果、すべての根粒菌に溶存水素濃度が検出された。この反応はニトロゲナーゼかヒドロゲナーゼによる触媒反応によるものと考えられる。
【００４０】
これより、CBで製造した電離水素水に微生物を添加する方法により水素を発生させる方法を開発することができた。水素を発生させる微生物としては、G株による電離水素水製造と同様にニトロゲナーゼ酵素を有する根粒菌や一部の藍藻類や光合成細菌などが適当である。
【００４１】
（実施例）
微生物で製造した電離水素水の植物の延命作用観察実験
強還元性セラミックボール（CB）で製造した電離水素水に植物に対する延命作用や開花制御作用があることが特開2012-55225「水素化金属を含む水を用いた植物の栽培法」に示されている。CBで製造した電離水素水には水素濃度は検出されない。そこで、水素濃度が検出されると考えられる電離水素水においても延命作用が検出されるか調べるために、G株で製造した電離水素水に根粒菌を添加することにより、水素濃度を発生させた水素水を用いて、水素濃度がある場合の電離水素水と無い場合の電離水素水での、植物に対する延命作用を比較した。水素濃度が検出されない場合の電離水素水の試料としてはG株のみを添加したものを用いた。また、G株とO株を同時に添加した水も用いた。なお、切り花は水の入った容器に微生物を投入した2時間後までに挿した。水素を発生させた試料は、G株で作った電離水素水に切り花を加えた翌日に根粒菌を加えることによって作製した。これらの栽培結果の写真を図４ないし図９にそれぞれ示す。この結果、水道水のみに較べ、CBを6個〜11個添加した場合と、G株のみ(スキムミルク懸濁液500μL(100mLの培養液に相当)添加した場合、G株と根粒菌（スキムミルク懸濁液500μLまたは1mL（それぞれ培養液100mLまたは200mLに相当））を同時に添加した場合（いずれも翌日に水素濃度が検出されない）に、花が枯れずに咲き続けたり、つぼみが開花したりする延命作用が示された。一方で、水道水のみとG株を添加した翌日に根粒菌を加えて水素を発生させた試料は花が枯れ、つぼみもしぼんで枯れてしまった。
【００４２】
これらの結果より、G株のみとG株とO株を同時に添加して作製した水にCBと同様な延命効果が示された。今後の実施形態としては、まずG株やGN1株を凍結乾燥させて、常温保存できる状態にする。次にこれを透析膜等に入れ、用事に切り花などの挿した水に投入して、切り花を延命させるための植物延命剤として用いる利用法が考えられる。
【００４３】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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