(57)【要約】【課題】成人成長ホルモン分泌不全に起因する病態を種々の動物でより簡便に再現できる成長ホルモン発現抑制剤等を提供する。【解決手段】成長ホルモン発現抑制剤は、（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、からなる群から選択されたポリペプチド、及び前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を含む。【選択図】図２８
2015107950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を含む、
成長ホルモン発現抑制剤。
【請求項２】
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる外来性の核酸の少なくとも一方を含有する、
成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物。
【請求項３】
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を、非ヒト動物に投与する投与工程を含む、
成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項４】
前記投与工程では、
選択された前記ポリペプチド、及び前記発現ベクターの少なくとも一方を、前記非ヒト動物の脳室内に投与する、
請求項３に記載の成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項５】
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を含む、
褐色脂肪細胞の機能調整剤。
【請求項６】
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる外来性の核酸の少なくとも一方を含有する、
脂肪蓄積症モデル非ヒト動物。
【請求項７】
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を、非ヒト動物に投与する投与工程を含む、
脂肪蓄積症モデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項８】
前記投与工程では、
選択された前記ポリペプチド、及び前記発現ベクターの少なくとも一方を、前記非ヒト動物の脳室内に投与する、
請求項７に記載の脂肪蓄積症モデル非ヒト動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン発現抑制剤、成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物、成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法、褐色脂肪細胞の機能調整剤、脂肪蓄積症モデル非ヒト動物及び脂肪蓄積症モデル非ヒト動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長を促す成長ホルモンは、脳下垂体から分泌される。発達期における成長ホルモンの分泌不全は、成長ホルモン分泌不全性低身長症（下垂体性小人症）を引き起こす。一方、種々の原因によって成人後、年齢不相応に成長ホルモンの分泌が低下する下垂体疾患を成人成長ホルモン分泌不全症という。成人成長ホルモン分泌不全症は、易疲労感、スタミナ低下、集中力低下、気力低下、うつ状態等の自覚症状に加えて、筋肉量の低下と内臓脂肪の蓄積等の体組成異常及び血中脂質高値等の代謝障害を特徴とする。
【０００３】
成長ホルモンの分泌量の減少による脂肪の蓄積は、メタボリックシンドロームにおける脂肪の蓄積及び肥満にも関連する。このため、成人成長ホルモン分泌不全症の病態観察及び治療薬の探索、さらには脂肪の蓄積及び肥満に関する分子メカニズムの解明の観点で、成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈するモデル動物が求められている。
【０００４】
成人成長ホルモン分泌不全症のモデル動物として、成長ホルモンを欠損した自然発症矮小ラットＳＤＲ（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｄｗａｒｆ  ｒａｔｓ）が知られている。例えば、非特許文献１では、ＳＤＲを用いて、ヒト成長ホルモンの代謝が解析されている。
【０００５】
また、非特許文献２では、肥満症における成長ホルモンの役割を調べるために、成長ホルモン受容体のノックアウトマウスが用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ishikawa M, Hiroi N, Kamioka T, Tanaka T, Tachibana T, Ishikawa H, Miyachi Y., 「Metabolic effects of 20 kDa and 22 kDa human growth hormones on adult male spontaneous dwarf rats.」, European Journal of Endocrinology., 2001 Dec; 145(6): 791-797
【非特許文献２】Berryman DE, List EO, Coschigano KT, Behar K, Kim JK, Kopchick JJ., 「Comparing adiposity profiles in three mouse models with altered GH signaling.」, Growth Hormone & IGF Research., 2004 Aug; 14(4): 309-318
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上記非特許文献１に記載されたＳＤＲでは、成人成長ホルモン分泌不全症の病態を再現できるのはラットに限られ、他の動物種で病態を再現できない。また、上記非特許文献２に記載されたノックアウトマウスでは、遺伝子導入、交配等の作業が比較的煩雑で、樹立するまでに時間がかかるといった不都合がある。また、当該ノックアウトマウスでは、成長ホルモン受容体が欠損しているものの、成長ホルモン自体の分泌は抑制されてないため、成人成長ホルモン分泌不全症の発生機序に忠実であるとは言い難い。
【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、成人成長ホルモン分泌不全に起因する病態を種々の動物でより簡便に再現できる成長ホルモン発現抑制剤、成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物、成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法、褐色脂肪細胞の機能調整剤、脂肪蓄積症モデル非ヒト動物及び脂肪蓄積症モデル非ヒト動物の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の観点に係る成長ホルモン発現抑制剤は、
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を含む。
【００１０】
本発明の第２の観点に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物は、
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる外来性の核酸の少なくとも一方を含有する。
【００１１】
本発明の第３の観点に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法は、
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を、非ヒト動物に投与する投与工程を含む。
【００１２】
この場合、前記投与工程では、
選択された前記ポリペプチド、及び前記発現ベクターの少なくとも一方を、前記非ヒト動物の脳室内に投与する、
こととしてもよい。
【００１３】
本発明の第４の観点に係る褐色脂肪細胞の機能調整剤は、
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を含む。
【００１４】
本発明の第５の観点に係る脂肪蓄積症モデル非ヒト動物は、
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる外来性のポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる外来性の核酸の少なくとも一方を含有する。
【００１５】
本発明の第６の観点に係る脂肪蓄積症モデル非ヒト動物の作製方法は、
（ａ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと、
からなる群から選択されたポリペプチド、及び
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドの前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターの少なくとも一方を、非ヒト動物に投与する投与工程を含む。
【００１６】
この場合、前記投与工程では、
選択された前記ポリペプチド、及び前記発現ベクターの少なくとも一方を、前記非ヒト動物の脳室内に投与する、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、成人成長ホルモン分泌不全に起因する病態を種々の動物でより簡便に再現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例２におけるラット由来のポリペプチド（Ｎ１ペプチド）を投与されたラットの明期での摂食量の経時変化を示す図である。
【図２】実施例２におけるＮ１ペプチドを投与されたラットの暗期での摂食量の経時変化を示す図である。
【図３】実施例２におけるＮ１ペプチドを投与されたラットの１日での摂食量の経時変化を示す図である。
【図４】実施例２におけるＮ１ペプチドを投与されたラットの体重の経時変化を示す図である。
【図５】実施例２におけるＮ１ペプチドを投与されたラットの体重増加量の経時変化を示す図である。
【図６】実施例２におけるＮ１ペプチドを投与されたラットの体重に対する鼠径部脂肪の重量の比を示す図である。
【図７】実施例２におけるＮ１ペプチドを投与されたラットの体重に対する後腹膜脂肪の重量の比を示す図である。
【図８】実施例４におけるＮ１ペプチドの前駆体タンパク質をコードする遺伝子（Ｎ１遺伝子）を過剰発現させたラットの体重の経時変化を示す図である。
【図９】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体重増加量の経時変化を示す図である。
【図１０】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの摂食量の経時変化を示す図である。
【図１１】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの累積摂食量を示す図である。
【図１２】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体重に対する鼠径部脂肪の重量の比を示す図である。
【図１３】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体重に対する後腹膜脂肪の重量の比を示す図である。
【図１４】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットから採取された後腹膜脂肪の写真を示す図である。
【図１５】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体重に対するヒラメ筋の重量の比を示す図である。
【図１６】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体重に対する腓腹筋の重量の比を示す図である。
【図１７】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの尾長を示す図である。
【図１８】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体長を示す図である。
【図１９】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの大腿骨長を示す図である。
【図２０】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの酸素消費量の経時変化を示す図である。
【図２１】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの二酸化炭素排出量の経時変化を示す図である。
【図２２】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの呼吸商の経時変化を示す図である。
【図２３】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの自発活動量の経時変化を示す図である。
【図２４】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの炭水化物消費量の経時変化を示す図である。
【図２５】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの脂肪消費量の経時変化を示す図である。
【図２６】実施例４におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットのエネルギー消費量の経時変化を示す図である。
【図２７】実施例４においてＮ１遺伝子を過剰発現させたラットにおける１５日目の成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図２８】実施例４においてＮ１遺伝子を過剰発現させたラットにおける３９日目の成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図２９】実施例５におけるＮ１遺伝子のパラログ遺伝子（Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子）を過剰発現させたラットの体重の経時変化を示す図である。
【図３０】実施例５におけるＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰発現させたラットの体重増加量の経時変化を示す図である。
【図３１】実施例５におけるＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰発現させたラットの鼠径部脂肪の重量を示す図である。
【図３２】実施例５におけるＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰発現させたラットの後腹膜脂肪の重量を示す図である。
【図３３】実施例５におけるＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰発現させたラットのヒラメ筋の重量を示す図である。
【図３４】実施例５におけるＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰発現させたラットの腓腹筋の重量を示す図である。
【図３５】実施例６における褐色脂肪組織の拡大画像を示す図である。
【図３６】実施例６における脱共役タンパク質１のｍＲＮＡの発現量及びタンパク質量を示す図である。
【図３７】実施例７における白色脂肪組織、褐色脂肪組織、及び肝臓の脂肪合成又は分解に関わる酵素のｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図３８】実施例８におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体重の経時変化を示す図及び外観を示す図である。
【図３９】実施例８におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの鼠径部、精巣上体、後腹膜、腎周囲の白色脂肪組織量を示す図である。
【図４０】実施例８におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの体長を示す図である。
【図４１】実施例８におけるＮ１遺伝子を過剰発現させたラットの肝臓重量及び肝臓組織の拡大画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る実施の形態について説明する。
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係る成長ホルモンの発現を抑制するポリペプチドは、配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるラット由来のポリペプチド（以下、単に「Ｎ１ペプチド」とする）は、下記実施例４に示すように、ラットに投与することで成長ホルモンの発現を抑制する。「成長ホルモンの発現を抑制する」とは、詳細には成長ホルモンをコードする成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡへの転写を抑制又は阻害することであって、すなわち、成長ホルモンの分泌を抑制又は阻害することも含む。
【００２０】
Ｎ１ペプチドは、シグナルペプチド、神経ペプチド及びプロセシングサイトを含む前駆体タンパク質として発現し、プロセシングを受けて分泌される。当該前駆体タンパク質をコードする遺伝子（以下、単に「Ｎ１遺伝子」とする）に関しては、ラットのみならずマウス、チンパンジー、ヒト等の哺乳類、フグ、メダカ等の魚類、カエル等の両生類、ニワトリ等の鳥類等の種々の生物種にホモログ遺伝子が見出されている。ホモログ遺伝子は各生物種におけるＮ１ペプチドの前駆体タンパク質をコードしている。例えば、マウス、ニワトリ及びヒトの前駆体タンパク質がプロセシングを受けて分泌されるＮ１ペプチドは、それぞれ配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる。
【００２１】
Ｎ１遺伝子には、別の染色体に存在するパラログ遺伝子（以下、単に「Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子」とする）が見出されている（特開２０１２−２１１１２１号公報参照）。Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子にコードされる前駆体タンパク質がプロセシングを受けて分泌されるペプチドを、「Ｎ１−ｌｉｋｅペプチド」という。一例としてラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドは、ラットのＮ１ペプチドに対して３０％以上の配列相同性を有しており、両者の立体構造は類似する。下記実施例５に示すように、ラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドの過剰発現によって、成長ホルモンの発現抑制の表現型である体重増加量の減少、脂肪の蓄積及び筋肉量の減少がラットで確認されている。このため、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドは、本実施の形態に係る成長ホルモンの発現を抑制するポリペプチドとして好適である。ラット、マウス、ニワトリ及びヒトのＮ１−ｌｉｋｅペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示される。
【００２２】
成長ホルモンの発現を抑制するポリペプチドは、配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。「数個」とは、配列番号１乃至８各々のアミノ酸配列の長さによって異なり、成長ホルモンの発現抑制を維持する限り、例えば、１５個〜１個、１０個〜１個、５個〜１個、又は３個〜１個である。
【００２３】
成長ホルモンの発現を抑制するポリペプチドは、配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。一般に、２つのポリペプチド間で、アミノ酸配列の配列同一性が３０％以上であれば、立体構造が類似する傾向があると言われている。立体構造は、分子間の相互作用に寄与する重要な因子であるため、配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して３０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、共通の作用機序で成長ホルモンの発現を抑制すると考えられる。アミノ酸配列の配列同一性が高ければ、立体構造の類似性も高くなるため、配列番号１乃至８のいずれかに示されるアミノ酸配列に対する当該ポリペプチドの配列同一性は、成長ホルモンの発現抑制を維持する限り、３０％以上又は４０％以上であるのが好ましく、５０％以上であればさらに好ましく、６０％以上、７０％以上又は８０％以上であればより好ましく、最も好ましくは９０％以上又は９５％以上である。
【００２４】
本実施の形態に係るポリペプチドは、公知の方法で合成することができる。例えば、本実施の形態に係るポリペプチドは、化学的なポリペプチド合成法で合成されてもよいし、大腸菌等を用いた遺伝子工学的な方法で合成されてもよい。例えば、ポリペプチド合成法としては、液相法または固相法を挙げることができる。液相法は、反応を溶液状態で行い、反応混合物から生成物を単離精製し、得られた生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に対して不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に縮合反応を順次行い、ペプチドを伸長する方法である。ポリペプチドは、ポリペプチドを構成する部分ペプチド又はアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより合成することもできる。
【００２５】
例えば、本実施の形態に係るポリペプチドの合成方法として、ネイティブケミカルライゲーション法（Nilsson BL, Soellner MB, Raines RT., 「Chemical synthesis of proteins.」, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 91-118, 2005を参照）を用いてもよい。ネイティブケミカルライゲーション法では、Ｃ末端がチオエステル化しているペプチドフラグメントと、Ｎ末端にＣｙｓ残基を持つペプチドフラグメントとを試験管内において混合することにより、分子内でＳ−Ｎアシル基転移反応を生じさせ、二つのペプチドフラグメントを連結させる。
【００２６】
遺伝子工学的な方法では、例えば、当該ポリペプチドをコードするＮ１遺伝子又はＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を発現する発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養することによって該ポリペプチドを得ることができる。Ｎ１遺伝子またはＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子と、当該遺伝子を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー及び発現レベルを制御する種々のシスエレメント等）とを用いて、宿主細胞に応じた発現ベクターを構築することができる。構築した発現ベクターは、例えば、大腸菌等の宿主細胞に導入すればよい。当該宿主細胞を所定の条件で培養することにより、本実施の形態１に係るポリペプチドが宿主細胞内で発現され、当該ペプチドを抽出することができる。
【００２７】
得られたポリペプチドは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（以下、単に「ＨＰＬＣ」とする）、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、エドマン分解法またはガスクロマトグラフィー質量分析等により精製及び解析してもよい。
【００２８】
本実施の形態に係るポリペプチドは、成長ホルモンの発現を抑制する。このため、当該ポリペプチドを投与された動物は、成長ホルモンの発現が抑制された状態、例えば、成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈する。当該ポリペプチドを投与する場合、当該ポリペプチドを、例えばプロピレングリコール等の適切な溶媒とともに投与すればよい。投与経路は特に限定されず、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等であればよい。Ｎ１遺伝子は、視床下部漏斗部に特異的に発現しているため、投与経路としては、脳室内投与が特に好ましい。
【００２９】
本実施の形態に係るポリペプチドの投与量は、典型的には、３〜６００ｐｍｏｌ／ｇ／日、好ましくは１５〜３００ｐｍｏｌ／ｇ／日、より好ましくは３０〜１５０ｐｍｏｌ／ｇ／日である。単回投与でも複数回投与でもよく、複数回投与の場合、１日に２〜１０回投与される。また、当該ポリペプチドは、浸透圧ポンプ等を用いて、徐放的に投与されてもよい。
【００３０】
動物に投与する場合、当該動物と同じ動物種のＮ１ペプチドを用いるのが好ましい。例えば、ラットに投与する場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるラットのＮ１ペプチド又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるラットのＮ１−ｌｉｋｅペプチドを用いるのが好ましい。なお、ラットに投与する場合であっても、マウス、ニワトリ、ヒト等の他の動物種のＮ１ペプチド又はＮ１−ｌｉｋｅペプチドを用いてもよい。
【００３１】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るポリペプチドは、成長ホルモンの発現を抑制することができる。このため、当該ポリペプチドは、成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈する非ヒト動物の作製に有用である。当該ポリペプチドは各動物種で機能するため、種々の動物で成人成長ホルモン分泌不全症の病態をより簡便に再現できる。
【００３２】
なお、本実施の形態で説明した成長ホルモンの発現を抑制する上記ポリペプチドは、以下において「Ｎ１ペプチド等」と総称されることもある。
【００３３】
（実施の形態２）
本実施の形態に係る核酸は、上記実施の形態１に係るＮ１ペプチド等又は該Ｎ１ペプチド等の前駆体タンパク質をコードする塩基配列からなる核酸である。例えば、当該核酸は、ＤＮＡである。より具体的には、当該核酸は、Ｎ１遺伝子又はＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子であってもよい。ラット、マウス、ニワトリ及びヒトのＮ１遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示される。また、ラット、マウス、ニワトリ及びヒトのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６に示される。
【００３４】
本実施の形態に係る核酸は、既知の方法で合成することができる。当該核酸は、例えば、固相ホスホルアミダイト法等の任意の合成法により化学的に合成される。当該核酸は、トリエステル法でも合成できる。また、当該核酸は、種々の自動合成装置で合成することもできる。当該核酸の合成には、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。この他、当該核酸は、ｃＤＮＡを鋳型にして、Ｎ１遺伝子又はＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応で合成することもできる。例えば、ラットのＮ１遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応に用いる順方向プライマーの塩基配列は配列番号１７に、逆方向プライマーの塩基配列は配列番号１８に示される。また、ラットのＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応に用いる順方向プライマーの塩基配列は配列番号１９に、逆方向プライマーの塩基配列は配列番号２０に示される。
【００３５】
本実施の形態に係る核酸は、例えば、Ｎ１ペプチド等を上記遺伝子工学的な方法で得る際に、発現ベクター等、発現系の構築に使用される。当該核酸は、公知の遺伝子操作技術を用いて、発現系に導入することができる。当該核酸の発現系への導入方法については後述する。
【００３６】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る核酸は、成長ホルモンの発現を抑制するＮ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質をコードするため、Ｎ１ペプチド等を効率よく発現させる発現系の構築に有用である。
【００３７】
（実施の形態３）
本実施の形態に係る発現ベクターは、上記実施の形態２に係る核酸を含む。当該発現ベクターは、宿主細胞中でプロモーターがＮ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質を発現するように、上記核酸を適当な発現ベクター内のプロモーターの下流に連結することにより構築することができる。
【００３８】
ベクターの種類は、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質を発現することができるものであれば特に制限されない。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター及びウイルス由来ベクター等を用いることができる。
【００３９】
発現ベクターの具体例としては、ライフテクノロジーズ社製のｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ、ｐＹＥＳ２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳｅｃＴａｇ２、メルクミリポア社製のｐＥＴ、ｐＢＡＣ、プロメガ社製のｐＧＥＭ、アジレントテクノロジー社製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＢＳ、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、その他ｐＧＥＸ、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢＰＶ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ等が挙げられる。特に、発現ベクターとしてウイルスベクターを用いる場合、アデノ随伴ウイルスベクターを用いるのが好ましい。
【００４０】
Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質が確実に発現するか否かを確認するために、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーに対応する核酸を含むことが好ましい。選択マーカーとしては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、その他にも宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用いて、当該マーカーとＮ１遺伝子又はＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子とを含む発現プラスミドを発現ベクターとして宿主細胞に導入してもよい。こうすることで、マーカーの発現からＮ１遺伝子又はＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の導入を確認することができる。また、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用いることもできる。この場合、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
【００４１】
さらに、発現ベクターは、転写開始、転写終結のための部位及び転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。発現ベクターによって発現される転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに開始コドンを含み、終わりの適切な位置に終止コドンを含むことになる。
【００４２】
また、高等真核生物によるＤＮＡの転写は、発現ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させることができる。エンハンサーは、所定の宿主細胞におけるプロモーターの転写活性を増大するＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサー等が挙げられる。
【００４３】
本実施の形態に係る発現ベクターは、実施例４に示すように、動物に投与することで、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質を動物体内に過剰発現させることができる。発現ベクターの投与量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ法による絶対定量で算出した発現ベクターのコピー数に応じて決めることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノ随伴ウイルスを用いた場合、１．０×１０８〜１．０×１０１０コピー／μｌのアデノ随伴ウイルス溶液を、好ましくは０．１〜５０μｌ、より好ましくは０．５〜１０μｌ、特に好ましくは１〜５μｌ投与すればよい。
【００４４】
また、当該発現ベクターで形質転換した宿主細胞を大量培養すれば、Ｎ１ペプチド等を効率よく得られるため、Ｎ１ペプチド等の製造に利用できる。形質転換の対象となる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、公知の細胞を用いることができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌等の菌体の細胞、酵母等の真菌細胞、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞及びＣＯＳ細胞等の動物細胞、植物細胞が挙げられる。宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で公知ものを利用可能である。なお、形質転換した宿主細胞で産生されたＮ１ペプチド等は、上述のようにＨＰＬＣ等で精製されるのが好ましい。
【００４５】
上記発現ベクターで宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等の公知の方法を用いることができる。
【００４６】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る発現ベクターは、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質をコードする核酸を含むため、動物に投与することで、Ｎ１ペプチド等を過剰に発現させることができる。この結果、成長ホルモンの発現を抑制することができる。また、当該発現ベクターは、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質をコードする核酸を含むため、当該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することで、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質を効率よく取得することができる。
【００４７】
なお、本実施の形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、成熟個体の組織や細胞に遺伝子を導入するのに適している。このため、当該発現ベクターは、Ｎ１ペプチド等又は該Ｎ１ペプチド等の前駆体タンパク質を動物体内で過剰に発現させるのに好適である。また、本実施の形態では、発現ベクターとしてアデノ随伴ウイルスを用いてもよいこととした。アデノ随伴ウイルスは、非病原性ウイルス由来なので安全性が高いうえ、長期の発現が期待できるといった利点がある。
【００４８】
（実施の形態４）
本実施の形態に係る形質転換体は、上記実施の形態３に係る発現ベクターで形質転換されたものである。当該形質転換体は、例えば、Ｎ１ペプチド等の前駆体タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換される。なお、形質転換体には、細胞、組織、器官のみならず、生物個体も含む。
【００４９】
本実施の形態に係る形質転換体の作製方法としては、上述の発現ベクターを宿主細胞に形質転換する方法を挙げることができる。形質転換の対象は、特に限定されるものではなく、上記形質転換の対象となる宿主細胞で例示した各種細胞、ラット、マウス、ニワトリ、サル等の非ヒト動物を挙げることができる。また、プロモーターやベクターを選択すれば、植物も形質転換の対象とすることができる。
【００５０】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る形質転換体は、Ｎ１ペプチド等又はＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質を発現する発現ベクターを含むため、Ｎ１ペプチド等の合成及び成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈する非ヒト動物の作製に有用である。
【００５１】
（実施の形態５）
本実施の形態に係る成長ホルモン発現抑制剤は、上記実施の形態１に係るＮ１ペプチド等及び上記実施の形態３に係る発現ベクターの少なくとも一方を含む。「成長ホルモン発現抑制剤」とは、成長ホルモンの発現を抑制する物質を意味する。詳細には、成長ホルモン発現抑制剤は、成長ホルモンをコードする成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡへの転写を抑制又は阻害し、すなわち、成長ホルモンの分泌を抑制又は阻害する。当該成長ホルモン発現抑制剤は、既知の方法で製造され、０．１〜９９重量％、１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％のＮ１ペプチド等及び上記発現ベクターの少なくとも一方を含む。なお、当該成長ホルモン発現抑制剤は、Ｎ１ペプチド等及び発現ベクターの両方を含んでもよい。
【００５２】
成長ホルモン発現抑制剤の剤形は、限定されないが、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤等の他、注射剤又は経口投与剤が好ましい。当該成長ホルモン発現抑制剤は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として成長ホルモン発現抑制剤に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００５３】
本実施の形態に係る成長ホルモン発現抑制剤は、成長ホルモン発現を抑制し（下記実施例４参照）、投与された動物の筋肉量を低下させ、脂肪の蓄積を亢進する（下記実施例２〜８参照）。このため、当該成長ホルモン発現抑制剤は、成人成長ホルモン分泌不全に起因する病態を再現する非ヒト動物を作製するために用いることができる。
【００５４】
成人成長ホルモン分泌不全症の病態を再現する非ヒト動物を作製するために用いる場合、Ｎ１ペプチド等を含む成長ホルモン発現抑制剤の投与量は、Ｎ１ペプチド等の含有量が上述の投与量になるように適宜決定される。一方、上記発現ベクターを含む成長ホルモン発現抑制剤の投与量は、上述のように発現ベクターのコピー数に基づいて、又は発現されるＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質の発現量に応じて決定される。
【００５５】
当該成長ホルモン発現抑制剤は、成長ホルモン発現を抑制するため、成長ホルモンの過剰分泌に起因する疾患、例えば、先端巨大症及び下垂体性巨人症等を治療又は予防のための医薬組成物として患者に投与することができる。
【００５６】
上記医薬組成物として投与される場合、Ｎ１ペプチド等を含む成長ホルモン発現抑制剤の投与量は、Ｎ１ペプチド等の含有量が有効量になるように適宜決定される。一方、上記発現ベクターを含む成長ホルモン発現抑制剤の投与量は、上述のように発現ベクターのコピー数に基づいて、又は発現されるＮ１ペプチド等の前駆体タンパク質の量が有効量に相当するように適宜決定される。
【００５７】
例えば、当該成長ホルモン発現抑制剤の投与量は、典型的には、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又は複数回に分割して投与することができる。当該成長ホルモン発現抑制剤を分割して投与する場合、成長ホルモン発現抑制剤は、好ましくは１日に１〜４回投与される。また、当該成長ホルモン発現抑制剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００５８】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る成長ホルモン発現抑制剤は、成長ホルモンの発現を抑制するため、種々の非ヒト動物で成人成長ホルモン分泌不全に起因する病態をより簡便に再現できる。また、当該成長ホルモン発現抑制剤によれば、成長ホルモンの過剰分泌に起因する疾患を治療又は予防することができる。
【００５９】
なお、別の実施の形態は、上記成長ホルモン発現抑制剤を患者に投与することにより成長ホルモンの過剰分泌に起因する疾患を治療又は予防する方法である。また、別の実施の形態は、成長ホルモンの過剰分泌に起因する疾患の治療薬又は予防薬としての使用のための成長ホルモン発現抑制剤である。また、他の実施の形態は、成長ホルモンの過剰分泌に起因する疾患を治療又は予防するための医薬の製造のための成長ホルモン発現抑制剤の使用である。
【００６０】
Ｎ１ペプチド等は、下記実施例６〜８に示すように、ラットに投与することで褐色脂肪細胞における脂肪消費を低下させ、脂肪合成を亢進させる。したがって、別の実施の形態では、Ｎ１ペプチド等は、褐色脂肪細胞の機能調整剤としても使用できる。
【００６１】
当該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、成長ホルモンの発現抑制を介して、例えば、褐色脂肪細胞における脂肪消費を低下させる。また、該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、成長ホルモンの発現抑制を介して、褐色脂肪細胞における熱産生を担うタンパク質である脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）の発現を低下させる。
【００６２】
また、該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、成長ホルモンの発現抑制を介して、脂肪酸合成の律速酵素であるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、脂肪酸不飽和化酵素（ＳＣＤ）の発現を増加させる。このため、該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、褐色脂肪細胞における脂肪合成を亢進させる。このように、該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、褐色脂肪細胞の機能を調整し、褐色脂肪組織における脂肪滴を肥大化させる。
【００６３】
以上詳細に説明したように、上記褐色脂肪細胞の機能調整剤は、褐色脂肪細胞の機能を調整するため、褐色脂肪細胞の機能不全に起因する疾患、特には脂肪蓄積症又は肥満症を治療又は予防することができる。
【００６４】
なお、当該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、上述のようにＵＣＰ１の発現を低下させるため、ＵＣＰ１阻害剤としても使用できる。あるいは、当該褐色脂肪細胞の機能調整剤は、ＡＣＣ活性化剤、ＦＡＳ活性化剤、及びＳＣＤ活性化剤として使用してもよい。
【００６５】
（実施の形態６）
本実施の形態に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物は、外来性の上記実施の形態１に係るＮ１ペプチド等又は外来性の上記実施の形態２に係る核酸を含有する。外来性とは、非ヒト動物が本来有しているものではないという意味であって、例えば、非ヒト動物に投与又は導入されたものである。外来性の当該核酸には、発現ベクターに含まれる核酸及び該発現ベクターで形質転換された形質転換体に含有される核酸も含まれる。また、外来性の当該核酸には、遺伝子操作技術で非ヒト動物に導入された上記実施の形態２に係る核酸も含まれる。
【００６６】
非ヒト動物は、ヒトを除く動物であれば特に限定されず、ヒトを除く哺乳類、魚類、両生類、鳥類等であってもよい。好ましくは、当該非ヒト動物は、ラット、マウス、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳動物である。
【００６７】
成人成長ホルモン分泌不全症は、筋肉量の低下と内臓脂肪の蓄積等の体組成異常及び血中脂質高値等の代謝障害等で特徴付けられる。この他、高等生物の行動試験等で評価できる易疲労感、スタミナ低下、集中力低下、うつ状態等も成人成長ホルモン分泌不全症の病態に含まれる。
【００６８】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物は、成長ホルモンの発現が抑制されるため、成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈する。このため、当該非ヒト動物は、成人成長ホルモン分泌不全症の病態観察、分子メカニズムの検討、成人成長ホルモン分泌不全症の治療薬又は予防薬の効能評価に利用することができる。
【００６９】
なお、本実施の形態に係る非ヒト動物は、下記実施例６〜８に示すように、脂肪の蓄積を呈する。したがって、当該非ヒト動物は、脂肪蓄積症モデル非ヒト動物又は肥満症モデル非ヒト動物でもある。脂肪蓄積症モデル非ヒト動物又は肥満症モデル非ヒト動物は、脂肪が異常に蓄積する状態、及び肥満症などの疾患の病態観察、分子メカニズムの検討、脂肪が異常に蓄積する状態、及び肥満症などの疾患の治療薬又は予防薬の効能評価に利用することができる。
【００７０】
（実施の形態７）
本実施の形態に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法は、上記実施の形態１に係るＮ１ペプチド等及び上記実施の形態３に係る発現ベクターの少なくとも一方を非ヒト動物に投与する投与工程を含む。
【００７１】
Ｎ１ペプチド等及び発現ベクターは、上記実施の形態１及び３で説明したように非ヒト動物に投与することができる。投与工程では、例えば、Ｎ１ペプチド等及び発現ベクターの少なくとも一方を含む上記実施の形態５に係る成長ホルモン発現抑制剤を非ヒト動物に投与してもよい。Ｎ１ペプチド等及び発現ベクターの投与量は、例えば上記実施の形態１、実施の形態３及び実施の形態５と同様にそれぞれ決めることができるが、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００７２】
また、投与工程では、Ｎ１ペプチド等及び発現ベクターの少なくとも１つを、非ヒト動物の脳室内に投与してもよい。この場合、実施例２に示すように浸透圧ポンプに充填されたＮ１ペプチド等の溶液を、浸透圧ポンプに連結されたカニューラを介して脳室内に投与してもよい。また、実施例４に示すように発現ベクターを脳室内に注入してもよい。
【００７３】
上記作製方法に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物が成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈するか否かを確認するには、例えば、Ｎ１ペプチド等の溶液における溶媒のみを投与した動物をコントロール群として、Ｎ１ペプチド等を投与した動物から構成される実験群の体重増加量、筋肉量、脂肪量、体長、尾長、大腿骨長及び血中脂質濃度等を測定し、コントロール群と比較すればよい。コントロール群に対して、体重増加量、筋肉量、体長、尾長及び大腿骨長の少なくとも１つが低下し、又は、脂肪量及び血中脂質濃度の少なくとも一方が増加していれば、実験群を構成する動物は成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈していると判断できる。また、コントロール群と比較して、実験群を構成する動物における成長ホルモンの量又は成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下していれば、実験群を構成する動物は成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈していると判断してもよい。なお、成長ホルモンは、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法で定量できる。成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法等の公知の方法で定量できる。
【００７４】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法によれば、投与工程のみで成人成長ホルモン分泌不全症の病態を呈する非ヒト動物を作製することができる。このため、遺伝子導入、交配等の比較的煩雑な作業を行わずに成人成長ホルモン分泌不全症の病態を再現する非ヒト動物を早期に得ることができる。また、Ｎ１ペプチド等は各動物種で機能するため、種々の動物で成人成長ホルモン分泌不全症の病態を再現できる。
【００７５】
なお、本実施の形態に係る成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物の作製方法において、投与工程では、Ｎ１ペプチド等及び上記発現ベクターの少なくとも１つを、非ヒト動物の脳室内に投与してもよい。Ｎ１遺伝子は視床下部漏斗部に特異的に発現しているため、脳室内に投与することで、脳下垂体からの成長ホルモンの分泌を、Ｎ１ペプチド等が効率よく抑制することができる。
【００７６】
また、本実施の形態に係る非ヒト動物の作製方法で得られる非ヒト動物は、下記実施例６〜８に示すように、脂肪の蓄積を呈する。したがって、上記非ヒト動物の作製方法によれば、脂肪蓄積症モデル非ヒト動物又は肥満症モデル非ヒト動物を作製することもできる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００７８】
（実施例１：ラットＮ１ペプチドの合成）
ラットのＮ１ペプチドは、Ｆｍｏｃ固相法で合成した。Ｎ１ペプチドのＣ末端はアミド化しているため、アミド化レジンを用いた。カップリング試薬としてＨＡＴＵを用い、脱保護試薬としてピペリジンを用いた。合成機器としては、マイクロウェーブ法による自動合成が可能なＳｙｒｏ  Ｗａｖｅ（商標）（Ｂｉｏｔａｇｅ社製）を用いた。保護基をクリーベイジ後、合成ペプチドをジエチルエーテルで洗浄した。その後、合成ペプチドをＨＰＬＣによりＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８、ＹＭＣ社製）を用いて、０．１％ＴＦＡ(ｐＨ２．２）中で４０−６０％／４０分のアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／分で２８０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。
【００７９】
合成したＮ１ペプチド中のジスルフィド結合は活性発現に重要であると考えられる。そこで、グルタチオンを用いてジスルフィド結合を生じさせた。凍結乾燥したＮ１ペプチド１ｍｇを、０．１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、１Ｍのトリスバッファー（ｐＨ８．５）を０．４ｍｌ加えた。さらにアセトニトリルを０．５ｍｌ、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）を２μｌ、還元型グルタチオンを１．５ｍｇ、酸化型グルタチオンを０．３ｍｇ加え、室温で２日間撹拌した。反応溶液をＨＰＬＣによりＣ１８逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｒｏ  Ｃ１８、ＹＭＣ社製）を用いて０．１％ＴＦＡ(ｐＨ２．２）中で４０−６０％／４０分のアセトニトリル直線濃度勾配により、流速１．０ｍｌ／分で２８０ｎｍの紫外線吸収をモニターしながら精製した。回収したピークを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析で確認した。このようにジスルフィド結合を形成したＮ１ペプチドを凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【００８０】
（実施例２：Ｎ１ペプチドのラット慢性投与）
本実施例では、上記実施例１で合成したＮ１ペプチドをラットに慢性的に投与し、Ｎ１ペプチドのラットへの影響を調べた。
【００８１】
浸透圧ポンプ（ｍｏｄｅｌ２００２、Ａｌｚｅｔ社製）にＮ１ペプチド溶液（１．２５ｎｍｏｌ／μｌ、ｐＨ７〜８）を充填した。コントロール群では溶媒である３０％ＰＧ（プロピレングリコール）のみを充填した。チューブ（５ｃｍ）を介して脳室投与用カニューラ（Ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｋｉｔ  １、Ａｌｚｅｔ社製）を浸透圧ポンプと連結させた。カニューラの脳内への挿入前に、浸透圧ポンプを３７℃の０．９％塩化ナトリウム溶液に１２時間以上浸して稼働させておいた。
【００８２】
７週齢の雄ラットを、購入後１週間程度個別飼育し、脳手術でのストレスを軽減させる目的でハンドリングを行って馴化させた。ソムノペンチル（４０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔し、体が脱力したのを確認してから、イヤーバーを差し込み（７ｍｍ）、切歯バーを取り付け、脳定位固定装置（室町機械社製）に固定した。麻酔の効果で体温が下がるため、手術中はカイロでラットを温めながら行った。頭の毛を剃り、７０％エタノールで消毒した後、手術用ハサミを用いて正中に沿って頭皮を切り、綿棒で止血した。鉗子を用いて背中に浸透圧ポンプを入れるポケットを作った。その後、頭蓋骨をアセトンで拭いた。
【００８３】
頭蓋骨にあるブレグマとラムダの位置を水平にし、マニュピレーターに取り付けたカニューラの先端をブレグマの位置に合わせ、ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎのラット脳地図を参考にして脳室（左側脳室、ブレグマより後位０．９ｍｍ、側位１．５ｍｍ）に先端を移動させて、印をつけた。電動ドリルで印の位置に穴を開け、カニューラを腹位４．５ｍｍに挿入した。挿入後、歯科用セメント（ハイ−ボンドカルボセメント、松風社製）を用いて、カニューラを頭蓋に固定した。前述の通り０．９％塩化ナトリウム溶液に１２時間以上浸して稼働させておいた浸透圧ポンプを背中のポケットに入れ、浸透圧ポンプとカニューラをつなぐチューブを傷つけないように、切り開いた頭部をクリップで閉じた。手術後、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（登録商標）（５ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下投与した。
【００８４】
Ｎ１ペプチドは、上記の脳室内カニューラを介して浸透圧ポンプにより２週間慢性投与（５０ｐｍｏｌ／ｇ／日）を行った。投与後は１２時間毎に摂食量を、２４時間毎に体重を測定した。
【００８５】
（結果）
昼夜（明期１２時間、暗期１２時間）の摂食量を測定したところ、図１に示すように、Ｎ１ペプチド投与群において明期の摂食量が増加傾向にあり、投与後１、４、８、１２日目ではコントロール群と比較して統計学的に有意差が認められた。一方、図２に示すように、暗期の摂食量に統計学的な差は認められなかった。図３に示すように、２４時間当たりの摂食量では、Ｎ１ペプチド投与群において増加傾向があり、投与後１日目および８日目で統計学的に有意差が認められた。
【００８６】
図４に示すように、コントロール群と比較して体重には変化が見られなかったが、術後日数が経過するにつれてＮ１ペプチド投与群の体重が減少していく傾向が見られた。図５に示すように、体重増加量はＮ１ペプチド投与後８日目および１０日目以降で統計学的に有意に抑制された。
【００８７】
ラットの解剖時に、皮下脂肪である鼠径部脂肪と内臓脂肪である後腹膜脂肪の重量を測定した。体重当たりの脂肪の比を求めたところ、図６に示すように、鼠径部ではＮ１ペプチド投与群で増加傾向があった。さらに、図７で示すように、後腹膜では体重当たりの脂肪の比がＮ１ペプチド投与群で統計学的に有意に増加した。
【００８８】
本実施例において、Ｎ１ペプチドをラットに投与することによって、体重増加量が減少するにも関わらず、脂肪の蓄積が促進されることが示された。
【００８９】
（実施例３：ラットＮ１遺伝子発現アデノ随伴ウイルスベクターの作製）
本実施例では、ラットのＮ１遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスベクター（以下、Ｎ１発現ベクター）の作製について説明する。
【００９０】
まず、ラットＮ１発現ベクターを作製するための発現プラスミドの構築を行った。ラットの脳から、摂食調節中枢を含む視床下部内側基底部を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（インビトロジェン社製）を用いて総ＲＮＡを、添付されたプロトコールに従って抽出した。総ＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｍＲＮＡに精製した後、ＲｅｖｅｒＴｒａ  ＡＣＥ（登録商標）（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡを鋳型に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加した順方向プライマー（配列番号１７：cgcggatccaccatgactgatcctggga）と制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加した逆方向プライマー（配列番号１８：cggaattcttagcttcgatttctctttatt）とを用いてＮ１遺伝子をＰＣＲ反応にて１００μｌの系で増幅した。その際、Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む反応溶液を調製した。なお、反応条件は、９４℃、３分間でＤＮＡを変性させ、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０秒の増幅反応を３５サイクル繰り返した。
【００９１】
得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ（登録商標）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて精製し、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで３７℃、１時間で処理した後、１．５％アガロースゲルで電気泳動し、約６００ｂｐのバンドをＷｉｚａｒｄ（登録商標）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いてインサートＮ１  ＤＮＡとして回収した。同様に制限酵素処理して精製したｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（セルバイオラボ社製）にインサートＮ１  ＤＮＡを挿入して、ＤＨ５α株を形質転換した。得られたコロニーを鋳型にしてベクターに特異的な順方向プライマーと逆方向プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、インサートが入っているのを確認した。さらに、ＢｉｇＤｙｅ反応をし、ＤＮＡシークエンサーによりインサートの配列の確認を行った。正しい配列が確認されたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が入った５ｍｌのＬＢ培地で一晩３７℃にて培養し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いて、ラットＮ１発現プラスミド（ｐＡＡＶ−ｒＮ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を回収した。
【００９２】
次に、アデノ随伴ウイルスの作製に最適化された２９３ＡＡＶ細胞（セルバイオラボ社製）を１５０ｍｍの細胞培養ディッシュに播種し、１５ｍｌの１０％ウシ胎児血清と非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて７０−９０％コンフルエントになるまで培養した。７０−９０％コンフルエントになった２９３ＡＡＶ細胞から培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、１５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ライフサイエンステクノロジー社製）に置換した。５μｇのｐＡＡＶ−ｒＮ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及び、５μｇのｐＡＡＶ−ＤＪ／８（セルバイオラボ社製）、５μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（セルバイオラボ社製）と１２０μｌのポリエチエチレンイミンマックス（０．３２３ｇ／ｌ、ｐＨ８．０、ポリサイエンス社製）を最終容量が１０００μｌとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭと混ぜ、室温で１５分間静置したものを細胞に投与することで形質移入を行った。形質移入から６時間後に培養液をＯｐｔｉ−ＭＥＭから１５ｍｌの１０％ウシ胎児血清とＮＥＡＡを含むＤＭＥＭに交換した。形質移入から２４時間後に蛍光顕微鏡（キーエンス社製）を用いてＧＦＰの蛍光を観察し、形質移入の成功を確認した。
【００９３】
次に、アデノ随伴ウイルスの精製を行った。形質移入から７２時間経過後、セルスクレイパーを用いて１５０ｍｍの細胞培養ディッシュから２９３ＡＡＶ細胞を剥がし、培養液ごと細胞を回収した。細胞を含んだ約３０ｍｌの培養液に対して３ｍｌのクロロホルムを加え、３７℃のエアインキュベーター内に設置したオービタルシェイカーを用いて１時間激しく振盪した。その後、最終濃度が１Ｍになるように１．７５３２ｇの塩化ナトリウムを加え、２５℃のエアインキュベーター内に設置したオービタルシェイカーを用いて３０分間激しく振盪した。その後、４℃、１３０００×ｇで１５分間遠心分離した。約３０ｍｌの上清を回収し、最終濃度が１０％（ｗ／ｖ）になるように３ｇのポリエチレングリコール８０００を加えて完全に溶かした後、氷中に１時間静置した。その後、４℃、１１０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を除去し、残った沈殿物を５ｍｌのＰＢＳ（＋）で懸濁した後、５μｌのＤＮａｓｅＩ（１ｍｇ／ｍｌ）と５μｌのＲＮａｓｅＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃のウォーターバス内で３０分間振盪した。その後、５ｍｌのクロロホルムを加えてよく混ぜた後に４℃、１３０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を回収し、５ｍｌのクロロホルムを加えてよく混ぜた後に４℃、１３０００×ｇで５分間遠心分離した。上記の操作を再度繰り返した後、約５ｍｌの上清を回収したものをアデノ随伴ウイルスの精製物とした。
【００９４】
次に、アデノ随伴ウイルスの精製物の濃縮と溶液の置換を行った。遠心式限外濾過フィルターであるアミコン（登録商標）ウルトラ−４（メルクミリポア社製）を用いて、限外濾過を行った。その後、０．００１％のプルロニックＦ−６８を含むＰＢＳ（−）を加えて溶液の置換を行い、最終的にアデノ随伴ウイルスを約５０〜１００μｌに濃縮した。
【００９５】
次に、濃縮したアデノ随伴ウイルス溶液中に含まれるアデノ随伴ウイルスのコピー数をリアルタイムＰＣＲ法によって測定した。１μｌの濃縮したアデノ随伴ウイルス溶液をＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を用いて処理することにより、アデノ随伴ウイルスのカプシドタンパク質に覆われていないＤＮＡの分解を行った。その後、アデノ随伴ウイルス溶液の希釈系列を作製し、ＧＦＰに対する順方向プライマーと逆方向プライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲ法による絶対定量を行った。その際、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ（登録商標）  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用いた。絶対定量により、濃縮したアデノ随伴ウイルスのコピー数を計算後、最終濃度が１．０×１０９コピー／μｌになるように０．００１％プルロニックＦ−６８を含むＰＢＳ（−）で希釈した。希釈したアデノ随伴ウイルスは、４℃あるいは−８０℃で保存した。
【００９６】
（実施例４：ラットにおけるＮ１遺伝子の過剰発現）
本実施例では、実施例３で作製したラットＮ１発現ベクターを用いたラットでのＮ１遺伝子の過剰発現実験について詳細に説明する。
【００９７】
７週齢の雄ラットを購入後１週間程度個別飼育し、脳手術でのストレスを軽減させる目的でハンドリングを行って馴化させた。８週齢になった雄ラットに対して、ソムノペンチル（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与して麻酔した。麻酔により、体が脱力したのを確認してから、イヤーバーを差し込み（６．５ｍｍ）、切歯バーを取り付け、脳定位固定装置（ＤＡＶＩＤ  ＫＯＰＦ社製）に固定した。麻酔の効果で体温が下がるため、手術中はカイロで体温を維持しながら行った。頭の毛を剃り、７０％エタノールで消毒した後、手術用ハサミを用いて、正中に沿って頭皮を切り、綿棒で止血した。その後、頭蓋骨をアセトンで拭いた。頭蓋骨にあるブレグマとラムダの位置を水平にし、マニュピレーターに取り付けたニューロシリンジ（ハミルトン社製）の先端をブレグマの位置に合わせ、ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎのラット脳地図を参考にして、視床下部内側基底部（両側、ブレグマより後位３．８ｍｍ、側位０．６ｍｍ）に先端を移動させて、印をつけた。電動ドリルで印の位置に穴を開け、アデノ随伴ウイルス溶液を満たしたニューロシリンジの先端を腹位９．８ｍｍにまで挿入した。挿入後、１μｌのアデノ随伴ウイルス溶液を注入した。１分間静置した後、ニューロシリンジの先端を頭蓋骨から引き抜き、瞬間接着剤あるいは歯科用セメントを用いて、頭蓋骨の穴を塞いだ。切開した頭皮を縫合後、抗生物質セファゾリンナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）と消炎鎮痛剤リマダイル（５ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下投与した。なお、Ｎ１発現ベクターを投与した群（以下、単に「Ｎ１発現ベクター群」とする）にはであるＡＡＶ−ＤＪ／８−ｒＮ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１．０×１０９コピー／μｌ）を、コントロール群には空ベクターであるＡＡＶ−ＤＪ／８−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１．０×１０９コピー／μｌ）を注入した。手術後、体重、摂食量を毎朝測定した。また、術後４３日目にラットを解剖し、後腹膜脂肪、鼠径部脂肪、ヒラメ筋及び腓腹筋をサンプリングした。
【００９８】
（結果）
図８に示すように、Ｎ１発現ベクター群は、コントロール群よりも体重が軽く、その差は、術後日数が経過するにつれて大きくなった。また、図９に示すように、Ｎ１発現ベクター群では、コントロール群と比較して、術後７日目から体重増加量の有意な抑制が認められた。一方、図１０及び図１１に示すように、Ｎ１発現ベクター群とコントロール群との間で、１日あたりの摂食量及び術後の累積摂食量に変化はなかった。
【００９９】
図１２に示すようにラットの体重に対する皮下脂肪である鼠径部脂肪の重量比が、Ｎ１発現ベクター群において有意に増加していた。また、図１３に示すように、ラットの体重に対する腹腔内脂肪である後腹膜脂肪の重量比も、Ｎ１発現ベクター群において有意に増加していた。コントロール群とＮ１発現ベクター群における、ほぼ同じ体重のラット同士で後腹膜脂肪の大きさを比較した結果、図１４に示すように、Ｎ１発現ベクター群の後腹膜脂肪は明らかに肥大化していた。
【０１００】
図１５及び図１６に示すように、サンプリング時のラットの体重に対する骨格筋であるヒラメ筋及び腓腹筋の重量比は、Ｎ１発現ベクター群において有意に減少していた。体の大きさの指標となる尾長、体長及び大腿骨長をそれぞれ図１７、図１８及び図１９に示す。尾長、体長及び大腿骨長はＮ１発現ベクター群において有意に短くなっていた。
【０１０１】
小動物用代謝計測システム（室町機械社製）を用いて、酸素消費量（ＶＯ２）と二酸化炭素排出量（ＶＣＯ２）を測定した結果を図２０及び図２１に示した。ＶＯ２とＶＣＯ２のどちらもコントロール群とＮ１発現ベクター群との間に顕著な差異はなかった。一方、図２２に示したように、コントロール群と比較してＮ１発現ベクター群において呼吸商が高くなっていた。この結果は、Ｎ１発現ベクター群におけるエネルギー消費が炭水化物中心に行われていることを示唆する。なお、図２３に示したように、自発活動量測定システム（室町機械社製）を用いて測定した自発活動量は、ＶＯ２、ＶＣＯ２、呼吸商のいずれの経時的変化とも関連は見られなかった。
【０１０２】
上記のＶＯ２及びＶＣＯ２の測定値に基づいて、炭水化物消費量と脂肪消費量とをＰｅｒｏｎｎｅｔの式、エネルギー消費量をＭｃＬｅａｎの式を用いて計算した。図２４に示すように、Ｎ１発現ベクター群における炭水化物消費量は増加していた。また、図２５に示すように、Ｎ１発現ベクター群における脂肪消費量が減少していた。一方、図２６に示すように、エネルギー消費量に差はなかった。
【０１０３】
さらに、視床下部内側基底部における成長ホルモン遺伝子のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果、Ｎ１遺伝子の過剰発現開始後１５日目（図２７）及び３９日目（図２８）のどちらにおいても、Ｎ１発現ベクター群において発現量が有意に減少していた。
【０１０４】
Ｎ１遺伝子を過剰に発現させたラットは、コントロール群と比較して、体重増加が抑制されるにも関わらず、脂肪の蓄積が促進した。これは、上記実施例２においてＮ１ペプチドをラットに投与することによって、体重増加が抑制されるにも関わらず、脂肪の蓄積が促進されることと一致する。また、Ｎ１遺伝子を過剰に発現させたラットは、コントロール群と比較して、筋肉量が低下し、体及び骨の成長が抑制された。この時、脳下垂体中の成長ホルモン遺伝子の発現量が低下していた。上記実施例２の表現型も本実施例で示された成人成長ホルモン分泌不全症と同様の表現型である。以上により、Ｎ１ペプチド及びＮ１遺伝子を過剰に発現する発現ベクターは、成長ホルモンの発現を抑制することが示された。また、Ｎ１ペプチドを投与した、又はＮ１ペプチドを過剰に産生するべくＮ１遺伝子を過剰に発現させたラットは、成人成長ホルモン分泌不全症モデルラットとして利用できる。
【０１０５】
（実施例５：ラットにおけるＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子の過剰発現）
上記実施例３と同様に、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子発現アデノ随伴ウイルスベクター（以下、単に「Ｎ１−ｌｉｋｅ発現ベクター」とする）を作製し、ラットの視床下部領域に過剰発現させて２８日後に、体重、脂肪量、筋肉量を測定した。なお、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応には、順方向プライマー（配列番号１９：cgcggatccaccatgggctctgctgtgaga）及び逆方向プライマー（配列番号２０：cggaattctacttgcgtaagtacaccttc）を用いた。
【０１０６】
（結果）
図２９及び図３０に示すように、Ｎ１−ｌｉｋｅ発現ベクター群では、コントロール群と比較して、低体重の傾向があり、体重増加量が有意に抑制された。
【０１０７】
図３１に示すように鼠径部脂肪重量は、コントロール群と比較して、Ｎ１−ｌｉｋｅ発現ベクター群において有意に増加していた。また、図３２に示すように、後腹膜脂肪重量も、有意差は認められないもののＮ１−ｌｉｋｅ発現ベクター群において増加傾向を示した。
【０１０８】
図３３及び図３４に示すように、サンプリング時のヒラメ筋及び腓腹筋重量は、コントロール群と比較して、Ｎ１−ｌｉｋｅ発現ベクター群において有意に減少していた。
【０１０９】
本実施例により、Ｎ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰発現させたラットは、Ｎ１遺伝子を過剰発現させたラットと極めて類似した表現型を示し、Ｎ１ペプチド及びＮ１−ｌｉｋｅペプチドが成長ホルモンの発現又は分泌を抑制し、成長遅延と脂肪蓄積に関与していることが示唆された。よって、Ｎ１−ｌｉｋｅペプチドを投与した、又はＮ１−ｌｉｋｅペプチドを過剰に産生するべくＮ１−ｌｉｋｅ遺伝子を過剰に発現させたラットは、成人成長ホルモン分泌不全症モデルラットとして利用できる。
【０１１０】
（実施例６：Ｎ１遺伝子の過剰発現の褐色脂肪組織への影響）
まず、白色脂肪組織の脂肪蓄積作用とは対照的に、脂肪を消費し、熱産生を行う組織である褐色脂肪組織における脂肪滴の大きさを解析するために、Ｎ１発現ベクターの注入後４３日目にラットから採取した褐色脂肪組織をヘマトキシリン・エオシンで染色した。
【０１１１】
次に、ミトコンドリア内に存在するＵＣＰ１のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で解析した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法には、順方向プライマー（配列番号２１：tccctcaggattggcctctac）及び逆方向プライマー（配列番号２２：gtcatcaagccagccgagat）を用いた。
【０１１２】
さらにＵＣＰ１のタンパク質量をウェスタンブロッティング法で解析した。ウェスタンブロッティング法で使用した抗体は、Ａｂｃａｍ社製のａｂ１０９８３である。
【０１１３】
（結果）
図３５に示すように、Ｎ１発現ベクター群の褐色脂肪組織では、コントロール群と比較して、脂肪滴の肥大化が観察された。また、図３６に示すように、Ｎ１発現ベクター群では、コントロール群と比較して、ＵＣＰ１のｍＲＮＡ及びタンパク質量ともに有意に低下していた。このことから、褐色脂肪組織での熱産生が低下し、脂肪消費が低下することにより、白色脂肪組織の蓄積が促進されることが示唆された。
【０１１４】
（実施例７：Ｎ１遺伝子の過剰発現による脂肪合成及び分解）
脂肪の合成又は分解に関与する組織である白色脂肪組織、褐色脂肪組織、及び肝臓における脂肪合成又は分解の状況を推測するために、脂肪合成又は分解に関わる酵素のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。脂肪合成酵素として、脂肪酸合成の律速酵素であるＡＣＣ、ＦＡＳ、ＳＣＤの各ｍＲＮＡを定量した。一方、脂肪分解酵素として、脂肪酸分解の律速酵素であるカルニチンパルミトイル基転移酵素（ＣＰＴ）のｍＲＮＡを定量した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法では、ＡＣＣに関して、順方向プライマー（配列番号２３：gaggtggatcagagatttca）及び逆方向プライマー（配列番号２４：ttcagctctaactggaaagc）を、ＦＡＳに関して、順方向プライマー（配列番号２５：aggatgtcaacaagcccaag）及び逆方向プライマー（配列番号２６：acagaggagaaggccacaaa）を、ＳＣＤに関して、順方向プライマー（配列番号２７：tgaaagctgagaagctggtg）及び逆方向プライマー（配列番号２８：cagtgtgggcaggatgaag）を、ＣＰＴに関して、順方向プライマー（配列番号２９：ggatggcatgtgggtaaaag）及び逆方向プライマー（配列番号３０：tactgacacaggcagccaaa）を用いた。
【０１１５】
（結果）
図３７に示すように、Ｎ１発現ベクター群では、褐色脂肪組織において３つの脂肪合成酵素ＡＣＣ、ＦＡＳ及びＳＣＤのｍＲＮＡの発現量が有意に増加していた。このことから、図３５で示された褐色脂肪組織での脂肪滴の肥大化は、脂肪消費の低下に加え、脂肪合成の亢進の結果であることが示唆された。
【０１１６】
（実施例８：Ｎ１遺伝子の長期過剰発現）
Ｎ１遺伝子の過剰発現を、体重を測定しながら２１７日間継続した。２１７日間の過剰発現終了時に体長を測定した。このとき、ラットを解剖し、鼠径部白色脂肪、精巣上体白色脂肪、後腹膜白色脂肪、腎周囲白色脂肪及び肝臓を採取し、各部位の白色脂肪組織量を測定した。
【０１１７】
（結果）
図３８に示すように、Ｎ１遺伝子の過剰発現を開始して約５ヶ月後から、コントロール群と比較して体重が有意に増加した。外観においてもＮ１発現ベクター群のラットは、肥満状態を呈していた。図３９に示すように、鼠径部、精巣上体、後腹膜、腎周囲のいずれの部位においてもＮ１発現ベクター群では、コントロール群に対して有意に脂肪が蓄積していた。また、図４０で示す通り、Ｎ１発現ベクター群の体長が有意に短くなっていた。図４１で示すように、Ｎ１発現ベクター群の肝臓重量は有意に増加していた。肝臓について、脂肪を染色するＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色を行ったところ、脂肪肝を呈していることが明らかとなった。以上の結果から、ラットにおいてＮ１遺伝子を長期にわたって過剰発現させることで、ラットが脂肪蓄積及び脂肪肝により肥満を呈することが示された。
【０１１８】
Ｎ１遺伝子を過剰発現させたラットは、褐色脂肪細胞の機能を調整、すなわち、脂肪消費の低下及び脂肪合成の亢進によって、脂肪の蓄積を呈することが示された。以上のことから、Ｎ１遺伝子を過剰に発現させたラットは、脂肪蓄積症モデルラット、肥満症モデルラット又は脂肪肝モデルラットとして利用できる。
【０１１９】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、成長ホルモン発現抑制剤に好適である。また、本発明は、褐色脂肪細胞の機能調整剤に好適である。さらに、本発明は、成人成長ホルモン分泌不全症モデル非ヒト動物、褐色脂肪細胞の機能調整による脂肪蓄積症モデル非ヒト動物及びそれらの作製方法にも好適である。さらに、本発明は、成長ホルモンの過剰分泌に起因する疾患、脂肪蓄積症あるいは肥満症の治療薬若しくは予防薬、又は当該治療薬若しくは予防薬のスクリーニングにも利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図１４】
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【図３５】
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【図３８】
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【図４１】
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【配列表】
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