(57)【要約】【課題】細胞被覆層の効果的な形成に関する方法及びキットを提供する。【解決手段】本発明に係る方法は、下記（ａ）及び（ｂ）：（ａ）細胞外に活性酸素種を産生する標的細胞と、架橋性分子と、前記活性酸素種の存在下で前記架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子とを含む溶液を調製すること；（ｂ）前記溶液中で、前記触媒分子が前記標的細胞により産生される前記活性酸素種を消費して触媒する前記架橋反応により前記架橋性分子を架橋して、前記標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成すること；を含む。【選択図】図１Ａ
2015107067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）細胞外に活性酸素種を産生する標的細胞と、架橋性分子と、前記活性酸素種の存在下で前記架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子とを含む溶液を調製すること；
（ｂ）前記溶液中で、前記触媒分子が前記標的細胞により産生される前記活性酸素種を消費して触媒する前記架橋反応により前記架橋性分子を架橋して、前記標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成すること；
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記（ａ）として、前記標的細胞である第一の細胞と、細胞外への前記活性酸素種の産生能が前記第一の細胞より低い第二の細胞と、前記架橋性分子と、前記触媒分子とを含む前記溶液を調製することを含み、
前記（ｂ）として、前記溶液中で、前記触媒分子が前記第一の細胞により産生される前記活性酸素種を消費して触媒する前記架橋反応により前記架橋性分子を架橋して、前記第一の細胞の前記細胞表面を被覆する前記被覆層を形成することを含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記（ｃ）：
（ｃ）前記細胞表面を前記被覆層で被覆された前記第一の細胞と、前記第二の細胞とを分離すること；
をさらに含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記触媒分子は、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及び金属ポルフィリン錯体からなる群より選択される１種以上である
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の方法に使用される細胞被覆層形成用キットであって、
下記（ｘ）及び／又は（ｙ）：
（ｘ）活性酸素種の存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子；
（ｙ）前記架橋性分子、又は架橋性基が導入されるべき基礎分子及び／又は基礎分子に架橋性基を導入するための化合物；
を含む
ことを特徴とする細胞被覆層形成用キット。
【請求項６】
前記（ｘ）を含む
ことを特徴とする請求項５に記載の細胞被覆層形成用キット。
【請求項７】
前記（ｙ）として、前記架橋性分子をさらに含む
ことを特徴とする請求項６に記載の細胞被覆層形成用キット。
【請求項８】
前記触媒分子は、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及び金属ポルフィリン錯体からなる群より選択される１種以上である
ことを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
下記（ｚ）：
（ｚ）前記細胞被覆層形成用キットを前記方法に使用するための取扱説明書；
をさらに含む
ことを特徴とする請求項５乃至８のいずれかに記載の細胞被覆層形成用キット。
【請求項１０】
請求項１乃至４のいずれかに記載の方法に、下記（ｘ）及び／又は（ｙ）：
（ｘ）活性酸素種の存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子；
（ｙ）前記架橋性分子、又は架橋性基が導入されるべき基礎分子及び／又は基礎分子に架橋性基を導入するための化合物；
を使用する
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞被覆層の形成に関する方法及びキットに関し、特に、触媒分子が寄与する架橋性分子の架橋反応による細胞被覆層の形成に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞を含むゲル粒子を形成する方法としては、例えば、当該細胞を分散したアルギン酸ナトリウム溶液を塩化カルシウム溶液に滴下する方法があった（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２４８３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来、標的とする細胞を含む溶液中において、当該細胞の細胞表面近傍で局所的な高分子架橋反応を行って、当該細胞の当該細胞表面を被覆する被覆層を形成することはできなかった。
【０００５】
また、従来、例えば、複数種類の細胞を含む溶液中において、特定の種類の細胞の細胞表面近傍でのみ局所的な高分子架橋反応を行って、当該特定の細胞の当該細胞表面を選択的に被覆する被覆層を形成することはできなかった。
【０００６】
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、細胞被覆層の効果的な形成に関する方法及びキットを提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法は、下記（ａ）及び（ｂ）：（ａ）細胞外に活性酸素種を産生する標的細胞と、架橋性分子と、前記活性酸素種の存在下で前記架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子とを含む溶液を調製すること；（ｂ）前記溶液中で、前記触媒分子が前記標的細胞により産生される前記活性酸素種を消費して触媒する前記架橋反応により前記架橋性分子を架橋して、前記標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成すること；を含むことを特徴とする。本発明によれば、細胞被覆層を効果的に形成する方法を提供することができる。
【０００８】
また、前記方法は、前記（ａ）として、前記標的細胞である第一の細胞と、細胞外への前記活性酸素種の産生能が前記第一の細胞より低い第二の細胞と、前記架橋性分子と、前記触媒分子とを含む前記溶液を調製することを含み、前記（ｂ）として、前記溶液中で、前記触媒分子が前記第一の細胞により産生される前記活性酸素種を消費して触媒する前記架橋反応により前記架橋性分子を架橋して、前記第一の細胞の前記細胞表面を被覆する前記被覆層を形成することを含むこととしてもよい。また、この場合、前記方法は、下記（ｃ）：（ｃ）前記細胞表面を前記被覆層で被覆された前記第一の細胞と、前記第二の細胞とを分離すること；をさらに含むこととしてもよい。また、前記方法において、前記触媒分子は、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及び金属ポルフィリン錯体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【０００９】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係るキットは、前記いずれかの方法に使用される細胞被覆層形成用キットであって、下記（ｘ）及び／又は（ｙ）：（ｘ）活性酸素種の存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子；（ｙ）前記架橋性分子、又は架橋性基が導入されるべき基礎分子及び／又は基礎分子に架橋性基を導入するための化合物；を含むことを特徴とする。本発明によれば、細胞被覆層を効果的に形成するキットを提供することができる。
【００１０】
また、前記キットは、前記（ｘ）を含むこととしてもよい。また、この場合、前記キットは、前記（ｙ）として、前記架橋性分子をさらに含むこととしてもよい。また、前記キットにおいて、前記触媒分子は、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及び金属ポルフィリン錯体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。また、前記キットは、下記（ｚ）：（ｚ）前記細胞被覆層形成用キットを前記方法に使用するための取扱説明書；をさらに含むこととしてもよい。
【００１１】
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る方法は、前記いずれかの方法に、下記（ｘ）及び／又は（ｙ）：（ｘ）活性酸素種の存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子；（ｙ）前記架橋性分子、又は架橋性基が導入されるべき基礎分子及び／又は基礎分子に架橋性基を導入するための化合物；を使用することを特徴とする。本発明によれば、細胞被覆層の効果的な形成に関する方法を提供することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞被覆層の効果的な形成に関する方法及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係る方法の一例において、細胞被覆層を形成する過程の一部を示す説明図である。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に係る方法の一例において、細胞被覆層を形成する過程の他の一部を示す説明図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例１において、細胞を顕微鏡下で明視野観察した結果の一例を示す説明図である。
【図２Ｂ】図２Ａに示す破線で囲まれた細胞を拡大して示す説明図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る実施例２において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の一例を示す説明図である。
【図４Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例３において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の一例を示す説明図である。
【図４Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例３において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の他の例を示す説明図である。
【図４Ｃ】本発明の一実施形態に係る実施例３において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果のさらに他の例を示す説明図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る実施例３において、細胞の蛍光強度を定量した結果の一例を示す説明図である。
【図６Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例４において、細胞を顕微鏡下で明視野観察した結果の一例を示す説明図である。
【図６Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例４において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の一例を示す説明図である。
【図７Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例６において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の一例を示す説明図である。
【図７Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例６において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の他の例を示す説明図である。
【図８Ａ】本発明の一実施形態に係る実施例７において、細胞を顕微鏡下で明視野観察した結果の一例を示す説明図である。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態に係る実施例７において、細胞を顕微鏡下で蛍光観察した結果の一例を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。
【００１５】
本実施形態に係る方法（以下、「本方法」という。）は、下記（ａ）及び（ｂ）：（ａ）細胞外に活性酸素種を産生する標的細胞と、架橋性分子と、当該活性酸素種の存在下で当該架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子とを含む溶液を調製すること；（ｂ）当該溶液中で、当該触媒分子が当該標的細胞により産生される当該活性酸素種を消費して触媒する当該架橋反応により当該架橋性分子を架橋して、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成すること；を含む方法である。
【００１６】
ここで、まず、本方法の概要について説明する。図１Ａ及び図１Ｂには、本方法の一例において、標的細胞Ｔの細胞表面を被覆する被覆層Ｓを形成する過程を示す。本方法において、その細胞表面を被覆層Ｓで被覆すべき標的細胞Ｔは、図１Ａに示すように、細胞外に（すなわち、溶液Ｌ中に）活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）を産生する。そして、本方法では、この標的細胞Ｔが溶液Ｌ中に産生するＲＯＳを、架橋性分子の架橋反応に利用する。
【００１７】
そこで、本方法では、まず、上記（ａ）として、標的細胞Ｔと、架橋性分子と、当該標的細胞Ｔが産生するＲＯＳの存在下で当該架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子とを含む溶液Ｌを調製する。
【００１８】
そして、本方法では、次に、上記（ｂ）として、溶液Ｌ中で、触媒分子が標的細胞Ｔにより産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により架橋性分子を架橋して、図１Ｂに示すように、当該標的細胞Ｔの細胞表面を被覆する被覆層Ｓを形成する。
【００１９】
このように、本方法によれば、標的細胞Ｔを含む溶液Ｌ中において、当該標的細胞のＲＯＳの産生能を利用して、当該標的細胞Ｔの細胞表面近傍で局所的な架橋性分子の架橋反応を行って、当該標的細胞Ｔの細胞表面を被覆する被覆層Ｓを形成することができる。
【００２０】
また、本方法では、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、標的細胞Ｔと、細胞外へのＲＯＳの産生能が当該標的細胞Ｔより低い他の細胞Ｕとを含む溶液Ｌ中において、当該標的細胞Ｔの比較的高いＲＯＳ産生能を利用することで、当該標的細胞Ｔの細胞表面近傍のみで局所的な架橋性分子の架橋反応を行って、当該標的細胞Ｔの細胞表面を選択的に被覆する被覆層Ｓを形成することもできる。
【００２１】
次に、本方法の詳細について説明する。本方法においては、上述のとおり、まず、上記（ａ）として、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液を調製する。
【００２２】
標的細胞は、その細胞表面近傍において触媒分子がＲＯＳを消費して触媒する架橋性分子の架橋反応が進行するために有効な量の当該ＲＯＳを細胞外に産生する細胞であれば特に限られない。
【００２３】
標的細胞は、例えば、当該標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む第一の溶液においては、当該触媒分子が当該標的細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子が架橋されて、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ当該標的細胞を含まない以外は当該第一の溶液と同一組成の第二の溶液においては、当該架橋性分子の架橋による被覆層の形成は起こらないようなＲＯＳ産生能を有する細胞である。
【００２４】
なお、ＲＯＳは、例えば、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、過酸化水素及び一重項酸素からなる群より選択される１種以上である。また、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液は、スーパーオキシドディスムターゼを含むこととしてもよい。スーパーオキシドディスムターゼは、スーパーオキシドから酸素及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。このため、標的細胞がスーパーオキシドを産生する場合、当該標的細胞と架橋性分子とスーパーオキシドディスムターゼとを含む溶液中において、当該標的細胞により産生されたスーパーオキシドから過酸化水素を生成し、当該過酸化水素の存在下で当該架橋性分子を架橋することができる。スーパーオキシドディスムターゼは、溶液に分散されることとしてもよく、標的細胞の細胞表面の分子に、当該分子に結合する分子（例えば、抗体）を介して結合させることとしてもよい。
【００２５】
標的細胞は、例えば、動物細胞、植物細胞及び微生物からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。動物細胞は、例えば、脊椎動物の細胞及び／又は無脊椎動物の細胞であることとしてもよい。脊椎動物は、例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類及び魚類からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。哺乳動物は、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター及びモルモットからなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。無脊椎動物は、例えば、昆虫、線虫、ホヤ、イカ、タコ及びカニからなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【００２６】
また、標的細胞は、例えば、幹細胞及び／又は分化細胞であることとしてもよい。幹細胞は、多分化能と自己複製能とを有する細胞であれば特に限られない。幹細胞は、例えば、人工多能性幹細胞（induced  pluripotent  stem  cell：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（Embryonic  Stem  cell：ＥＳ細胞）、体性幹細胞及び生殖幹細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。体性幹細胞は、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、脂肪幹細胞、筋幹細胞、骨幹細胞及び軟骨幹細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。  
【００２７】
分化細胞は、分化した細胞であれば特に限られない。分化細胞は、例えば、骨髄細胞、血液細胞、神経細胞、肝細胞、膵細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、心臓細胞、骨細胞、軟骨細胞及び生殖細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。また、分化細胞は、例えば、培養系において幹細胞から誘導された分化細胞であることとしてもよい。
【００２８】
また、標的細胞は、例えば、初代細胞、継代細胞及び株化細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。また、標的細胞は、例えば、培養細胞であることとしてもよい。また、標的細胞は、溶液中に分散されていてもよいし、溶液中で基材に接着していてもよい。
【００２９】
架橋性分子は、当該架橋性分子を含む溶液中において、触媒分子が触媒する架橋反応により架橋される分子であれば特に限られない。架橋性分子は、架橋性基を有する分子であり、架橋性基を有する親水性分子であることが好ましい。架橋性基は、分子の架橋構造の形成に寄与する官能基であれば特に限られない。架橋性基は、例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びビニル基からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。水酸基は、例えば、ベンゼン環に結合した水酸基であることとしてもよい。ベンゼン環に結合した水酸基は、例えば、フェノール性水酸基及び／又はカテコール基であることとしてもよい。アミノ基は、例えば、ベンゼン環に結合したアミノ基であることとしてもよい。また、例えば、架橋性分子がシュガービートペクチンである場合、当該シュガービートペクチンに含まれるフェルラ酸部分及び／又はジヒドロフェルラ酸部分を架橋性基として利用することとしてもよい。
【００３０】
架橋性分子の分子量は、特に限られないが、例えば、１００Ｄａ以上であることとしてもよく、３００Ｄａ以上であることとしてもよい。架橋性分子の分子量の上限値は特に限られないが、当該分子量は、例えば、１０７Ｄａ以下であることとしてもよい。
【００３１】
架橋性分子は、例えば、架橋性高分子であることとしてもよい。架橋性高分子は、架橋性基を有する高分子であり、架橋性基を有する親水性高分子であることが好ましい。架橋性高分子は、架橋性基を有する天然高分子及び／又は合成高分子であることとしてもよい。天然高分子は、例えば、タンパク質、多糖類、核酸、ポリフェノール重合体及びこれらの誘導体からなる群より選択される１つ以上であることとしてもよい。
【００３２】
タンパク質は、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、グロブリン、フィブリン及びこれらの誘導体からなる群より選択される１つ以上であることとしてもよい。多糖類は、例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デンプン、デキストラン、プルラン、セルロース、ペクチン、シュガービートペクチン、アミロペクチン、キチン、キトサン、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸、リボ核酸及びこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。ポリフェノール重合体は、例えば、タンニン重合体、カテキン重合体及びこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。合成高分子は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル及びこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【００３３】
架橋性分子は、例えば、架橋された後に分解可能な分子であることとしてもよい。すなわち、架橋性分子は、例えば、架橋された後に酵素により分解可能な分子であることとしてもよい。具体的に、例えば、架橋性分子がタンパク質である場合、当該架橋性分子は、架橋後であっても、タンパク質分解酵素により分解される。また、例えば、架橋性分子が多糖類である場合、当該架橋性分子は、架橋後であっても、多糖類分解酵素により分解される。
【００３４】
架橋性分子は、架橋性基を導入することにより得られたものであることとしてもよい。架橋性基を導入する方法は特に限られないが、例えば、架橋性基が導入されるべき分子（基礎分子）と、当該基礎分子に当該架橋性基を導入するための化合物とを化学的に反応させることにより行うこととしてもよい。基礎分子と、当該基礎分子に架橋性基を導入するための化合物との化学反応は、特に限られず、例えば、縮合反応であることとしてもよい。
【００３５】
基礎分子は、架橋性基を導入可能な分子であれば特に限られない。基礎分子は、例えば、上述したような天然高分子及び／又は合成高分子であって、架橋性基を有しない高分子、又は被覆層を形成するために十分な量の架橋性基を有しない高分子であることとしてもよい。
【００３６】
基礎分子に架橋性基を導入するための化合物は、当該基礎分子と結合する化合物であれば特に限られない。基礎分子と、当該基礎分子に架橋性基を導入するための化合物との結合は、例えば、共有結合、静電的結合、疎水的結合及び水素結合からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【００３７】
具体的に、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物は、例えば、基礎分子と化学的に反応して化学結合を形成する反応性官能基と、当該基礎分子に導入されるべき架橋性基とを有する化合物であることとしてもよい。この場合、反応性官能基は、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール基、マレイミド基、スクシミド基、アジド基及びアルキンからなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【００３８】
より具体的に、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物は、例えば、チラミン、フェニルプロピオン酸、アニリン、カテコールアミン（例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン及びドーパミンからなる群より選択される１種以上）及びこれらの誘導体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。
【００３９】
架橋反応前の標的細胞と架橋性分子とを含む溶液中において、当該架橋性分子は、当該溶液中に分散されていることとしてもよいし、予め当該標的細胞の細胞表面に結合されていることとしてもよい。架橋性分子が溶液中に分散されている場合、例えば、上述した触媒分子と結合された当該架橋性分子が溶液中に分散されていることとしてもよい（例えば、Ryu  JH  et  al.  Chitosan-g-hematin:  Enzyme-mimicking  polymeric  catalyst  for  adhesive  hydrogels.  Acta  Biomater  (2013)参照）。
【００４０】
架橋反応前の架橋性分子が標的細胞の細胞表面に結合されている場合、当該架橋性分子は、例えば、当該標的細胞の細胞表面の分子に、当該分子に結合する他の分子（例えば、当該細胞表面の分子に対する抗体）を介して結合されていることとしてもよい。
【００４１】
触媒分子は、溶液中において、ＲＯＳの存在下、標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成するための架橋性分子の架橋反応を触媒する活性を示す分子であれば特に限られない。すなわち、触媒分子は、溶液中のＲＯＳを消費して架橋性分子の架橋反応を触媒する。
【００４２】
具体的に、触媒分子は、例えば、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及び金属ポルフィリン錯体からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。ペルオキシダーゼは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、大豆由来ペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ及びチロイドペルオキシダーゼからなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。金属ポルフィリン錯体は、例えば、鉄ポルフィリン錯体及び／又は銅ポルフィリン錯体であることとしてもよい。鉄ポルフィリン錯体は、例えば、ヘミン（ヘマチン）、ヘモグロビン、フェリヘム及びヘモクロムからなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。  
【００４３】
上記（ａ）において、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液は、当該溶液中で、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されるような組成で調製する。すなわち、例えば、上記（ａ）において調製される溶液は、当該溶液である、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む第一の溶液中においては、当該触媒分子が当該標的細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子が架橋されて、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ当該標的細胞を含まない以外は当該第一の溶液と同一組成の第二の溶液においては、当該架橋性分子の架橋による被覆層の形成は起こらないような組成で調製されることとしてもよい。
【００４４】
このような上記（ａ）において調製される溶液の組成は、例えば、当該溶液に含まれる標的細胞の種類及び濃度、架橋性分子の種類及び濃度、及び、触媒分子の種類及び濃度からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。溶液の組成は、例えば、事前に、組成の異なる複数の溶液を調製して、当該各溶液における被覆層の形成を検討し、当該複数の溶液のうち、所望の被覆層が形成される溶液を選択することにより決定される。
【００４５】
また、上記（ａ）において調製される溶液に含まれるＲＯＳの濃度は、例えば、当該溶液である、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む第一の溶液中においては、当該触媒分子が当該標的細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子が架橋されて、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ当該標的細胞を含まない以外は当該第一の溶液と同一組成の第二の溶液においては、当該架橋性分子の架橋による被覆層の形成は起こらないような濃度であることとしてもよい。
【００４６】
次いで、本方法においては、上述のとおり、上記（ｂ）として、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液中で、当該触媒分子が当該標的細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子を架橋して、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成する。
【００４７】
標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液中における、当該触媒分子が触媒する架橋反応による当該架橋性分子の架橋は、当該触媒分子に触媒される当該架橋反応が開始される条件で、当該溶液を調製することにより行われる。
【００４８】
すなわち、例えば、標的細胞を含む溶液に、架架橋性分子及び触媒分子を添加することにより、当該架橋性分子の架橋反応を開始することとしてもよい。また、例えば、標的細胞と架橋性分子とを含む溶液に、触媒分子を添加することにより、当該架橋性分子の架橋反応を開始することとしてもよい。また、例えば、標的細胞と触媒分子とを含む溶液に、架橋性分子を添加することにより、当該架橋性分子の架橋反応を開始することとしてもよい。
【００４９】
なお、触媒分子は、溶液中に分散されていることとしてもよく、標的細胞の細胞表面の特定分子に、当該特定分子に結合する結合分子を介して結合されていることとしてもよい。触媒分子が溶液中に分散されている場合、例えば、架橋性分子と結合した当該触媒分子が当該溶液中に分散されていることとしてもよい（例えば、Ryu  JH  et  al.  Chitosan-g-hematin:  Enzyme-mimicking  polymeric  catalyst  for  adhesive  hydrogels.  Acta  Biomater  (2013)参照）。
【００５０】
触媒分子を標的細胞に結合させる場合、例えば、当該標的細胞の細胞表面の特定分子に対する抗体に結合された当該触媒分子（具体的に、例えば、ペルオキシダーゼ標識抗体）を使用することとしてもよい。
【００５１】
触媒分子を結合させる、標的細胞の特定分子は、当該標的細胞の細胞表面に存在する分子であれば特に限られない。特定分子は、例えば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド及び糖鎖からなる群より選択される１種以上である。すなわち、特定分子は、例えば、いわゆる細胞表面タンパク質及び／又は細胞膜タンパク質であることとしてもよい。より具体的に、特定分子は、例えば、ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原であることとしてもよい。また、特定分子は、例えば、細胞表面に存在する受容体であることとしてもよい。また、特定分子は、例えば、人為的操作によって標的細胞の細胞表面に結合された分子であることとしてもよい。
【００５２】
上記（ｂ）においては、溶液中で、標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されるような条件で架橋性分子を架橋する。このような上記（ｂ）において調節される架橋反応の条件は、例えば、当該架橋反応を行う温度及び／又は時間であることしてもよい。架橋反応の条件は、例えば、事前に、異なる複数の条件で被覆層の形成を検討し、当該複数の条件のうち、所望の被覆層が形成される条件を選択することにより決定される。
【００５３】
架橋性分子の架橋は、当該架橋性分子の架橋性基同士が新たな化学結合を形成することにより行われることとしてもよいし、当該架橋性分子同士が、他の分子を介して新たな化学結合を形成することにより行われることとしてもよい。架橋性分子同士が、他の分子を介して新たな化学結合を形成する場合、例えば、当該架橋性分子の第一の架橋性基と、当該他の分子の第二の架橋性基とが化学的に反応して当該新たな化学結合を形成することとしてもよい。この他の分子としては、例えば、複数のフェノール性水酸基を有するポリフェノール化合物を使用することとしてもよい。
【００５４】
本方法において、標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層は、当該標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液中で、当該標的細胞の当該細胞表面近傍において、当該触媒分子が当該標的細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する局所的な当該架橋性分子の架橋反応により形成される。
【００５５】
標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層は、架橋性分子の架橋により形成された架橋構造を含む。被覆層は、例えば、溶液中において、可溶性の架橋性分子が架橋して不溶化することにより形成された構造体（例えば、ゲル層）である。
【００５６】
本方法においては、例えば、標的細胞と、所定量の架橋性分子と、触媒分子とを含む溶液中で、当該標的細胞により産生されるＲＯＳの存在下、当該触媒分子が触媒する架橋反応により、当該所定量の一部の架橋性分子を架橋し、その結果、架橋されていない当該所定量の他の一部の架橋性分子を含む当該溶液中で、当該一部の架橋性分子の架橋により形成された架橋構造を含み、当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成する。
【００５７】
標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層は、当該標的細胞の当該細胞表面の全部又は一部を被覆する。すなわち、例えば、標的細胞が溶液中に分散されている場合（標的細胞が溶液中に浮遊している場合）には、当該溶液中において、当該標的細胞の細胞表面の全部を被覆する被覆層を形成することとしてもよい。この場合、例えば、標的細胞と当該標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層（ゲル層）とを含むマイクロカプセル（ゲル粒子）が形成されることとしてもよい。
【００５８】
また、例えば、標的細胞が溶液中で基材（例えば、細胞培養ディッシュの底面）上に接着している場合には、当該溶液中において、当該標的細胞の細胞表面の一部（例えば、基材への接着に寄与していない、当該細胞表面の一部）を被覆する被覆層を形成する。
【００５９】
標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層の厚さ（当該細胞表面と被覆層の外表面との距離）は、架橋反応の条件（架橋性分子の種類や量、架橋反応の時間や温度等）によって調整されるため特に限られないが、例えば、１ｎｍ〜２０００μｍであることとしてもよく、１０ｎｍ〜２００μｍであることとしてもよい。
【００６０】
上述した本方法によれば、標的細胞の細胞表面を被覆する被覆層（細胞被覆層）を効果的に形成することができる。すなわち、本方法においては、標的細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液中で、当該標的細胞により産生されるＲＯＳを起点として進行する架橋反応により、当該標的細胞の細胞表面近傍における局所的な当該架橋性分子の架橋を行うことができる。
【００６１】
したがって、例えば、標的細胞と、当該標的細胞の細胞表面を被覆する薄い被覆層とを含む微小な粒子を簡便に形成することができる。また、例えば、標的細胞を１つだけ含む粒子を簡便に形成することもできる。この場合、標的細胞は、粒子のほぼ中央に配置される。なお、溶液中の標的細胞の密度を増加させることにより、又は複数の標的細胞を含む細胞塊を予め形成することにより、複数個の標的細胞を含む粒子を形成することもできる。上述した本方法は、その細胞表面が被覆層で被覆された標的細胞を製造する方法であるともいえる。
【００６２】
また、本方法は、例えば、上記（ａ）として、細胞外に活性酸素種（ＲＯＳ）を産生する第一の細胞（標的細胞）と、細胞外への当該ＲＯＳの産生能が当該第一の細胞より低い第二の細胞と、架橋性分子と、当該ＲＯＳの存在下で当該架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子とを含む溶液を調製することを含み、上記（ｂ）として、当該溶液中で、当該触媒分子が当該第一の細胞により産生される当該ＲＯＳを消費して触媒する当該架橋反応により当該架橋性分子を架橋して、当該第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成することを含むこととしてもよい。
【００６３】
すなわち、この場合、図１Ｂに示すように、第一の細胞（標的細胞Ｔ）と第二の細胞（他の細胞Ｕ）と架橋性分子と触媒分子とを含む溶液Ｌ中で、当該第一の細胞Ｔの細胞表面近傍において、当該触媒分子が当該第一の細胞Ｔにより産生されるＲＯＳを消費して触媒する局所的な架橋性分子の架橋反応により、当該第一の細胞Ｔの細胞表面を選択的に被覆する被覆層Ｓを形成する。
【００６４】
ここで、架橋性分子の架橋は、触媒分子が第一の細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該第一の細胞の当該細胞表面近傍で局所的に行われるため、被覆層は、当該第一の細胞の細胞表面に選択的に形成される。すなわち、この場合、例えば、第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成することなく、第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成することができる。なお、細胞表面に対する未架橋の架橋性分子の吸着は、当該細胞表面を被覆する被覆層の形成ではない。
【００６５】
また、例えば、第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層よりも厚さ及び／又は密度（例えば、分子密度及び／又は架橋密度）が小さい、第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されることとしてもよい。
【００６６】
第一の細胞と第二の細胞との組み合わせは、当該第一の細胞及び当該第二の細胞が上述した細胞であって、当該第一の細胞は、上述のように、その細胞表面を被覆する被覆層が形成されるようなＲＯＳ産生能を有し、当該第二の細胞のＲＯＳ産生能は、当該第一の細胞のそれより低いような組み合わせであれば、特に限られない。
【００６７】
すなわち、例えば、第一の細胞と第二の細胞との組み合わせは、上記（ａ）において調製される溶液である、当該第一の細胞と第二の細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む第一の溶液においては、当該触媒分子が当該第一の細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子が架橋されて、当該第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ当該第一の細胞を含まない以外は当該第一の溶液と同一組成の第二の溶液においては、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層は形成されないか、又は当該第一の細胞の細胞表面を覆う当該被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されるような組み合わせであることとしてもよい。
【００６８】
また、例えば、上記（ａ）において調製される溶液は、当該溶液である、第一の細胞と第二の細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む第一の溶液中においては、当該触媒分子が当該第一の細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子が架橋されて、当該第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ当該第一の細胞を含まない以外は当該第一の溶液と同一組成の第二の溶液においては、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層は形成されないか、又は当該第一の細胞の細胞表面を覆う当該被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されるような組成で調製されることとしてもよい。
【００６９】
このような上記（ａ）において調製される溶液の組成は、例えば、当該溶液に含まれる第一細胞及び第二細胞の種類及び濃度、架橋性分子の種類及び濃度、及び、触媒分子の種類及び濃度からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。溶液の組成は、例えば、事前に、組成の異なる複数の溶液を調製して、当該各溶液における被覆層の形成を検討し、当該複数の溶液のうち、所望の被覆層が形成される溶液を選択することにより決定される。
【００７０】
また、上記（ａ）において調製される溶液に含まれるＲＯＳの濃度は、例えば、当該溶液である、第一の細胞と第二の細胞と架橋性分子と触媒分子とを含む第一の溶液中においては、当該触媒分子が当該第一の細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により当該架橋性分子が架橋されて、当該第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ当該第一の細胞を含まない以外は当該第一の溶液と同一組成の第二の溶液においては、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層は形成されないか、又は当該第一の細胞の細胞表面を覆う当該被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されるような濃度であることとしてもよい。
【００７１】
また、例えば、上記（ｂ）において、第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成され、且つ第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層は形成されないか、又は当該第一の細胞の細胞表面を覆う当該被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい、当該第二の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されるような条件で架橋性分子の架橋反応を行って、当該第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成することとしてもよい。
【００７２】
このような上記（ｂ）において調節される架橋反応の条件は、例えば、当該架橋反応を行う温度及び／又は時間であることしてもよい。架橋反応の条件は、例えば、事前に、異なる複数の条件で被覆層の形成を検討し、当該複数の条件のうち、所望の被覆層が形成される条件を選択することにより決定される。
【００７３】
なお、触媒分子は、溶液中に分散されていることとしてもよく、第一の細胞の細胞表面の特定分子に、当該特定分子に結合する結合分子を介して結合されていることとしてもよい。触媒分子を第一の細胞に結合させる場合、例えば、当該第一の細胞の細胞表面の特定分子に対する抗体に結合された当該触媒分子（具体的に、例えば、ペルオキシダーゼ標識抗体）を使用することとしてもよい。触媒分子を結合させる、第一の細胞の細胞表面の特定分子は、上述した特定分子であれば、特に限られない。
【００７４】
触媒分子を結合させる、第一の細胞の細胞表面の特定分子は、第二の細胞の細胞表面にも存在することとしてもよい。仮に第二の細胞の細胞表面の特定分子に触媒分子が結合したとしても、当該第二の細胞のＲＯＳ産生能は、第一の細胞のそれより低いため、第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層が選択的に形成される。
【００７５】
このような本方法によれば、複数種類の細胞が含まれる溶液中において、特定の種類の細胞の細胞表面を選択的に被覆する被覆層を形成することができる。すなわち、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、第一の細胞（標的細胞Ｔ）及び第二の細胞（他の細胞Ｕ）が含まれる溶液Ｌ中において、当該第一の細胞Ｔの細胞表面を選択的に被覆する被覆層Ｓを形成することができる。
【００７６】
具体的に、例えば、細胞外へのＲＯＳ産生を有する第一の細胞と、細胞外へのＲＯＳ産生能が当該第一の細胞より低い第二の細胞と、所定量の架橋性分子とを含む溶液中で、触媒分子が当該第一の細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により、当該所定量の一部の架橋性分子を架橋し、その結果、当該一部の架橋性分子の架橋により形成された架橋構造を含む被覆層で細胞表面が被覆された当該第一の細胞と、細胞表面が被覆層で被覆されていないか、又は細胞表面が当該第一の細胞の細胞表面を覆う当該被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい被覆層で被覆された当該第二の細胞とを含み、架橋されていない当該所定量の他の一部の架橋性分子を含む当該溶液が得られる。
【００７７】
また、本方法は、下記（ｃ）：（ｃ）細胞表面を被覆層で被覆された第一の細胞と、第二の細胞とを分離すること；をさらに含むこととしてもよい。すなわち、この場合、細胞表面を被覆層で被覆された第一の細胞と、第二の細胞とを、当該被覆層の存在に基づいて分離する。
【００７８】
第一の細胞と第二の細胞とを分離する方法は、当該第一の細胞を被覆する被覆層の存在に基づく方法であれば特に限られないが、例えば、当該被覆層の光学的な検出に基づき、及び／又は当該被覆層と基材との結合性に基づき、当該第一の細胞と第二の細胞とを分離することとしてもよい。
【００７９】
被覆層の光学的な検出に基づき第一の細胞と第二の細胞とを分離する場合、例えば、第一の細胞及び第二の細胞を含む溶液に光を照射して、当該第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層からの光を検出した結果に基づき、当該第一の細胞と、当該第二の細胞とを分離することとしてもよい。
【００８０】
具体的に、例えば、蛍光色素が結合した架橋性分子を架橋して被覆層を形成した場合には、当該被覆層からの蛍光を検出することにより、細胞表面を当該被覆層で被覆された第一の細胞と、細胞表面を当該被覆層で被覆されていないか、又は細胞表面が当該第一の細胞の細胞表面を覆う当該被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい被覆層で被覆された第二の細胞とを分離することとしてもよい。なお、細胞表面が第一の細胞の細胞表面を覆う被覆層よりも厚さ及び／又は密度が小さい被覆層で被覆された第二の細胞は、例えば、当該第一の細胞に比べてサイズが小さい、及び／又は当該第一の細胞に比べて蛍光強度が小さい細胞として検出される。このような被覆層の光学的な検出に基づく細胞の分離には、例えば、フローサイトメトリーに使用されるセルソーター装置が好ましく使用される。
【００８１】
また、被覆層と基材との結合性に基づき第一の細胞と第二の細胞とを分離する場合、例えば、第一の細胞と第二の細胞とを含む溶液を、当該被覆層に対する結合性を有し且つ当該第二の細胞に対する結合性を有しない基材、又は当該被覆層に対する結合性を有さず且つ当該第二の細胞に対する結合性を有する基材と接触させることにより、当該第一の細胞と、当該第二の細胞とを分離することとしてもよい。
【００８２】
具体的に、例えば、被覆層に対する結合性を有する基材として、当該被覆層に含まれる分子に対する結合性を有する分子（例えば、被覆層がアルギン酸を含む場合にはアルギン酸結合性タンパク質）が固定化された基材を使用し、当該被覆層を介して当該基材に結合された第一の細胞（細胞表面が被覆層で被覆されている第一の細胞）と、当該基材に結合されない第二の細胞表面が被覆層で被覆されていない第二の細胞）とを分離することとしてもよい。
【００８３】
また、例えば、第二の細胞に対する結合性を有する基材として、当該第二の細胞が接着し、且つ被覆層に被覆された第一の細胞は接着しない基材（例えば、細胞培養用の培養ディッシュの底面）を使用し、当該基材に接着した当該第二の細胞と、当該基材に接着しない当該第一の細胞（細胞表面が被覆層で被覆されている第一の細胞）とを分離することとしてもよい。
【００８４】
このような本方法によれば、特定の細胞と他の細胞とを含む溶液中において、当該特定の細胞の細胞表面近傍でのみ局所的な架橋性分子の架橋反応を行って、当該特定の細胞の当該細胞表面を選択的に被覆する被覆層を形成した上で、当該特定の細胞と、当該他の細胞とを効果的に分離することができる。
【００８５】
すなわち、例えば、複数種又は一種の細胞を培養して、比較的高いＲＯＳ産生能を有する第一の細胞と、ＲＯＳ産生能が当該第一の細胞より低い第二の細胞とを得た場合において、触媒分子が当該第一の細胞により産生されるＲＯＳを消費して触媒する架橋反応により架橋性分子を架橋させることにより、当該第一の細胞の細胞表面を選択的に被覆層で被覆し、当該被覆層の存在に基づいて、当該第一の細胞と当該第二の細胞とを分離することができる。
【００８６】
また、本方法においては、例えば、第一の細胞の細胞表面を被覆する被覆層を形成した後、当該第一の細胞及び第二の細胞の一方又は両方を回収することとしてもよい。すなわち、例えば、細胞表面を被覆層で被覆された第一の細胞と、第二の細胞とを分離し、当該第一の細胞及び当該第二の細胞の一方又は両方を回収することとしてもよい。回収された第一の細胞及び第二の細胞の一方又は両方は、さらに他の用途に利用されることとしてもよく、廃棄されることとしてもよい。
【００８７】
また、被覆層の形成に使用された架橋性分子が分解可能な分子である場合、本方法においては、例えば、当該被覆層を分解することとしてもよい。すなわち、例えば、細胞表面を被覆層で被覆された第一の細胞と、第二の細胞とを分離して、当該第一の細胞を回収し、回収された当該第一の細胞の当該被覆層を分解することとしてもよい。
【００８８】
被覆層は、例えば、酵素により分解することとしてもよい。具体的に、被覆層が、酵素分解可能な架橋性分子の架橋により形成された場合、第一の細胞の細胞表面を被覆する当該被覆層に、当該架橋性分子を分解する酵素を作用させることにより、当該被覆層を分解することとしてもよい。
【００８９】
次に、本実施形態に係る細胞被覆層形成用キット（以下、「本キット」という。）について説明する。本キットは、上述した本方法に使用される細胞被覆層形成用キットであって、下記（ｘ）及び／又は（ｙ）：（ｘ）活性酸素種の存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子；（ｙ）当該架橋性分子、又は架橋性基が導入されるべき基礎分子及び／又は基礎分子に架橋性基を導入するための化合物；を含む。
【００９０】
本キットは、例えば、上記（ｘ）、すなわちＲＯＳの存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子を含む。この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる触媒分子と、架橋性分子とを使用して、本方法を実施する。本キットが、架橋性分子を含まない場合、ユーザーは、当該架橋性分子を任意に選択することができる。本キットに含まれる触媒分子は、上述した、本方法に使用される触媒分子であれば、特に限られない。
【００９１】
また、本キットは、例えば、上記（ｙ）として、架橋性分子を含む。この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる架橋性分子と、触媒分子とを使用して、本方法を実施する。本キットが、触媒分子を含まない場合、当該本キットのユーザーは、当該触媒分子を任意に選択することができる。本キットに含まれる架橋性分子は、上述した、本方法に使用される架橋性分子であれば、特に限られない。
【００９２】
また、本キットは、上述のように、上記（ｘ）、すなわちＲＯＳの存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子を含み、上記（ｙ）として、当該架橋性分子を含むこととしてもよい。この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる触媒分子及び架橋性分子を使用して、本方法を実施する。すなわち、この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる触媒分子及び架橋性分子を使用して、本方法を簡便に実施することができる。
【００９３】
また、本キットは、例えば、上記（ｙ）として、架橋性基が導入されるべき基礎分子を含む。この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる、架橋性基が導入されるべき基礎分子と、当該基礎分子に架橋性基を導入するための化合物と、触媒分子とを使用して、本方法を実施する。本キットが、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物及び／又は触媒分子を含まない場合、当該本キットのユーザーは、当該化合物及び／又は触媒分子を任意に選択することができる。本キットに含まれる、架橋性基が導入されるべき基礎分子は、上述した、本方法に使用される、架橋性基が導入されるべき基礎分子であれば、特に限られない。
【００９４】
また、本キットは、例えば、上記（ｙ）として、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物を含む。この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物と、当該架橋性基が導入されるべき当該基礎分子と、触媒分子とを使用して、本方法を実施する。本キットが、架橋性基が導入されるべき当該基礎分子及び／又は触媒分子を含まない場合、当該本キットのユーザーは、当該基礎分子及び／又は触媒分子を任意に選択することができる。本キットに含まれる、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物は、上述した、本方法に使用される、基礎分子に架橋性基を導入するための化合物であれば、特に限られない。
【００９５】
また、本キットは、例えば、上記（ｙ）として、架橋性基が導入されるべき基礎分子、及び当該基礎分子に架橋性基を導入するための化合物を含む。この場合、本キットのユーザーは、当該本キットに含まれる、架橋性基が導入されるべき基礎分子、及び当該基礎分子に架橋性基を導入するための化合物と、触媒分子とを使用して、本方法を実施する。本キットが、触媒分子を含まない場合、当該本キットのユーザーは、当該触媒分子を任意に選択することができる。
【００９６】
また、本キットは、上述のように、上記（ｘ）、すなわちＲＯＳの存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子を含み、さらに上記（ｙ）として、架橋性基が導入されるべき基礎分子、及び／又は当該基礎分子に架橋性基を導入するための化合物を含むこととしてもよい。
【００９７】
また、本キットは、下記（ｚ）：（ｚ）上述した細胞被覆層形成用キット（本キット）を、上述した本方法に使用するための取扱説明書；をさらに含むこととしてもよい。すなわち、この場合、本キットは、上記（ｘ）及び／又は上記（ｙ）を使用して上述した本方法を実施するための取扱説明書を含む。この取扱説明書には、上述のような、本キット（より具体的には、本キットに含まれる上記（ｘ）及び／又は上記（ｙ））を使用した上記本方法の実施に関する説明が記載される。
【００９８】
また、上述したような、本キットの本方法のための使用は、当該本キットに含まれる上記（ｘ）及び／又は上記（ｙ）の本方法のための使用である。すなわち、本実施形態は、上述した本方法に、下記（ｘ）及び／又は（ｙ）：（ｘ）活性酸素種の存在下で架橋性分子の架橋反応を触媒する触媒分子；（ｙ）当該架橋性分子、又は架橋性基が導入されるべき基礎分子及び／又は基礎分子に架橋性基を導入するための化合物；を使用する方法を含む。この方法に係る上記（ｘ）及び／又は上記（ｙ）は、上述した、本キットに含まれる上記（ｘ）及び／又は上記（ｙ）である。
【００９９】
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。
【実施例１】
【０１００】
［架橋性分子の製造］
８００ｍＬのジメチルスルホキシドにアミロペクチン（Sigma-Aldrich  Co.  LLC製）を２０ｇ加え、６０℃にて撹拌しながら溶解させた。この溶液を室温まで冷却した後、２ｇのＮ，Ｎ´−カルボニルジイミダゾール（和光純薬工業株式会社製）を溶解した２０ｍＬのジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）を加えた後、３時間撹拌した。
【０１０１】
次いで、この溶液に、１０．７ｇのチラミン塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を溶解させた１５３ｍＬのジメチルスルホキシドを加え、２４時間室温にて撹拌した。この溶液を、分画分子量１０，０００の透析膜に入れ、当該透析膜を０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液に２０時間浸した。
【０１０２】
次いで、この透析膜を精製水に浸し、当該透析膜外の溶液中にチラミンの存在に由来する波長２７５ｎｍにおけるピークが確認されなくなるまで、精製水を交換した。続いて、透析膜から取り出した溶液を、冷凍庫にて凍結した後、真空乾燥を行った。その結果、架橋性高分子として、チラミン修飾アミロペクチンを得た（ＡＰ−Ｐｈ）。得られたＡＰ−Ｐｈの１ｇには１．７３×１０−５モルのフェノール性水酸基が含まれていた。
【０１０３】
［細胞被覆層の形成］
上述のようにしてで得られたＡＰ−Ｐｈを１０ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液中に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた。
【０１０４】
次いで、この溶液に、ラット脂肪幹細胞を１×１０６個／ｍＬとなるように混合し、室温で３０分間静置した。このラット脂肪幹細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、顕微鏡で観察した。
【０１０５】
［結果］
図２Ａ及び図２Ｂには、ラット脂肪幹細胞を明視野で観察した結果を示す。図２Ａに示すスケールバーは５０μｍを表している。図２Ｂには、図２Ａに示す破線で囲まれた細胞を拡大して示す。
【０１０６】
ラット脂肪幹細胞を明視野で観察した結果、当該ラット脂肪幹細胞のうち約９０％の細胞に、その細胞表面を被覆する被覆層（ゲル層）が形成されていた。ラット脂肪幹細胞の細胞表面を被覆する被覆層の厚さは約１５μｍであった。また、トリパンブルー染色によりラット脂肪幹細胞の生存率を測定したところ、生存率は９２％であった。
【実施例２】
【０１０７】
［細胞被覆層の形成］
上述の実施例１で得られたＡＰ−Ｐｈを１０ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液中に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた。  予めＣｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で染色されたラット脂肪幹細胞を０．５×１０６個／ｍＬの密度で含む溶液と、予めＣｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で染色されたヒト血管内皮細胞を０．５×１０６個／ｍＬの密度で含む溶液とを混合した。
【０１０８】
このラット脂肪幹細胞及びヒト血管内皮細胞を、ＡＰ−Ｐｈと西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼとを含むリン酸緩衝生理食塩水に分散し、３０分間室温にて静置した。このラット脂肪幹細胞及びヒト血管内皮細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１０９】
［結果］
図３には、ラット脂肪幹細胞及びヒト血管内皮細胞を蛍光観察した結果を示す。図３に示すスケールバーは５０μｍを表している。Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅに由来する蛍光を発するラット脂肪幹細胞のうち約９０％の細胞に、その細胞表面を被覆する被覆層（ゲル層）が形成されていた。これに対し、Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｇｒｅｅｎに由来する蛍光を発するヒト血管内皮細胞には、その細胞表面を被覆する被覆層は形成されなかった。
【実施例３】
【０１１０】
［架橋性分子の製造］
０．０５モル／Ｌの２−モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（2-Morpholinoethanesulfolic  acid,  monohydrate、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６）２００ｍＬにアルギン酸ナトリウム（Ｉ−１Ｇ、株式会社キミカ製）２ｇを溶解させた。この溶液に、０．２３ｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（和光純薬工業株式会社製）を加えた後、１．４０６ｇのチラミン塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を加え溶解させた。
【０１１１】
次いで、この溶液に、ジメチルスルホキシド３ｍＬに０．０５ｇのアミノフルオレセイン（Sigma-Aldrich  Co.  LLC製）を溶解させた溶液を加え３分間撹拌した。この溶液に１．４０６ｇの水溶性カルボジイミド（株式会社ペプチド研究所製）を溶解させた後、２０時間、２５°Ｃにて撹拌した。この溶液を、８０重量％エタノール（２０重量％水）溶液に少量ずつ加えて、フルオレセイン・チラミン修飾アルギン酸（ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈ）を析出させた。
【０１１２】
未反応のチラミンおよびアミノフルオレセインを除去するために、析出したＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを８０重量％エタノール（２０重量％水）溶液で洗浄し、アミノフルオレセインの存在に起因する蛍光ピークが洗浄後の溶液中に検出されなくなるまで１時間毎にエタノール溶液の交換を続けた。
【０１１３】
その後、１００％エタノール中で３０分間のＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈの洗浄を２回行い、次いで真空乾燥を行った。その結果、架橋性高分子として、アルギン酸の糖単位ユニット１００個あたり約３個のフェノール性水酸基が導入されたＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを得た。
【０１１４】
［細胞被覆層の形成］
上述のようにして得られたＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを２ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液中に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた。
【０１１５】
予めＣｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で染色されたラット脂肪幹細胞を０．５×１０６個／ｍＬの密度で含む溶液と、予めＣｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で染色されたヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞を０．５×１０６個／ｍＬの密度で含む溶液とを混合した。
【０１１６】
このラット脂肪幹細胞及びＨｅＬａ細胞を、ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈと西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼとを含むリン酸緩衝生理食塩水中に分散し、室温で３０分間静置した。このラット脂肪幹細胞及びＨｅＬａ細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１１７】
［結果］
図４Ａ〜図４Ｃには、ラット脂肪幹細胞及びＨｅＬａ細胞を観察した結果を示す。図４Ａは、Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅに由来する蛍光を観察した結果を示し、図４Ｂは、Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｂｌｕｅに由来する蛍光を観察した結果を示し、図４Ｃは、フルオレセインに由来する蛍光を観察した結果を示す。
【０１１８】
図４Ａ〜図４Ｃに示すように、Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅに由来する蛍光を発するラット脂肪幹細胞の細胞表面には、ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈのフルオレセインに由来する蛍光が観察された。これに対し、Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｂｌｕｅに由来する蛍光を発するＨｅＬａ細胞の細胞表面には、ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈのフルオレセインに由来する蛍光は観察されなかった。
【０１１９】
なお、このようにラット脂肪幹細胞には、その細胞表面を被覆する被覆層（ゲル層）が形成され、ＨｅＬａ細胞には、その細胞表面を被覆する被覆層が形成されなかったのは、当該ＨｅＬａ細胞のＲＯＳ産生能が、当該ラット脂肪幹細胞のそれより低いためであることを確認する実験を行った。
【０１２０】
すなわち、トリプシンを用いて培養ディッシュから剥離する前の２４時間、ＲＯＳ誘導剤であるＰｙｏｃｙａｎｉｎを２００μｍоｌ／Ｌ含むＤＭＥＭ培養液に浸したＨｅＬａ細胞（ＲＯＳ誘導ＨｅＬａ細胞）と、Ｐｙｏｃｙａｎｉｎを含まないＤＭＥＭ培養液に浸したＨｅＬａ細胞（未処理ＨｅＬａ細胞）とを調製した。
【０１２１】
一方、上述のようにして得られたＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを２ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させ、さらに西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた溶液を調製した（溶液１）。また、ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを２ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させ、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを含まない溶液も調製した（溶液２）。
【０１２２】
そして、ＲＯＳ誘導ＨｅＬａ細胞、及び未処理ＨｅＬａ細胞の一部のそれぞれを、上述のようにして調製した溶液１に懸濁して３０分間静置した。また、未処理ＨｅＬａ細胞の他の一部を、上述のようにして調製した溶液２に懸濁して３０分間静置した。その後、ＲＯＳ誘導ＨｅＬａ細胞及び未処理ＨｅＬａ細胞のそれぞれを、ＲＯＳの蛍光プローブ（Total  ROS/Superoxide  Detection  Kit,  Enzo  Life  Sciences社製）を使用して、フローサイトメーターにて分析した。
【０１２３】
図５には、分析の結果を示す。図５に示すように、Ｐｙｏｃｙａｎｉｎで処理されることなく溶液１に懸濁された未処理ＨｅＬａ細胞のピークは、Ｐｙｏｃｙａｎｉｎで処理されることなく溶液２に懸濁された未処理ＨｅＬａ細胞のピークと重なった。これに対し、Ｐｙｏｃｙａｎｉｎで処理された後に溶液１に懸濁されたＲＯＳ誘導ＨｅＬａ細胞のピークは、未処理ＨｅＬａ細胞のピークから大きくシフトし、当該ＲＯＳ誘導ＨｅＬａ細胞の細胞表面に、ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈに由来する強い蛍光のピークが確認された。
【０１２４】
すなわち、ＨｅＬａ細胞がＲＯＳ誘導剤で処理された場合、すなわち、当該ＨｅＬａ細胞のＲＯＳ産生能が人為的に増強された場合にのみ、その細胞表面を被覆する被覆層（ゲル層）が形成されることが確認された。換言すれば、図４Ａ〜図４Ｃに示されるように、ＲＯＳ誘導剤で処理されていないＨｅＬａ細胞の細胞表面を被覆する被覆層が形成されなかったのは、当該ＨｅＬａ細胞のＲＯＳ産生能が低かったためと考えられた。
【実施例４】
【０１２５】
［細胞被覆層の形成］
上述の実施例３で得られたＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを２ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液中に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた。
【０１２６】
この溶液に、ヒトすい臓ガン細胞由来ＰＡＮＣ−１細胞を１．０×１０６個／ｍＬとなるように混合し、室温で３０分間静置した。このＰＡＮＣ−１細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１２７】
［結果］
図６Ａ及び図６Ｂには、ＰＡＮＣ−１細胞を観察した結果を示す。図６Ａは、明視野で観察した結果を示し、図６Ｂは、フルオレセインに由来する蛍光を観察した結果を示す。ＰＡＮＣ−１細胞のうち約４６％の細胞表面にＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈのフルオレセインに由来する蛍光が確認された。
【実施例５】
【０１２８】
［細胞被覆層の形成］
上述の実施例３で得られたＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを２ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液中に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた（溶液１）。
【０１２９】
そして、予めＲＯＳ産生阻害剤であるＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎを５００μｍоｌ／Ｌで含む培養液中で２４時間培養されたヒトすい臓ガン細胞由来ＰＡＮＣ−１細胞を、上述のように調製された溶液１に、１．０×１０６個／ｍＬとなるように分散し、室温で３０分間静置した。このＰＡＮＣ−１細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【０１３０】
［結果］
観察の結果、ＰＡＮＣ−１細胞のうち約４％の細胞表面にのみＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈのフルオレセインに由来する蛍光が確認された。すなわち、上述の実施例４で示されたとおり、ＰＡＮＣ−１細胞をＲＯＳ産生阻害剤で処理しない場合には、当該ＰＡＮＣ−１細胞の約４６％の細胞に、その細胞表面を被覆する被覆層（ゲル層）が形成されたのに対して、当該ＰＡＮＣ−１細胞をＲＯＳ産生阻害剤で処理することにより、その細胞表面を被覆する被覆層は実質的に形成されなくなることが確認された。これは、ＲＯＳ産生阻害剤によって、ＰＡＮＣ−１細胞のＲＯＳ産生能が顕著に低減されたためと考えられた。
【実施例６】
【０１３１】
［架橋性分子の製造］
０．０５モル／Ｌの２−モルフォリノエタンスルホン酸一水和物（2-Morpholinoethanesulfolic  acid,  monohydrate、ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６）１０００ｍＬにゼラチン（Sigma-Aldrich  Co.  LLC製）２０ｇを溶解させた。この溶液に１．１３ｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（和光純薬工業株式会社製）を加えた後、１０ｇのチラミン塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を加え溶解させた。この溶液に３．７ｇの水溶性カルボジイミド（株式会社ペプチド研究所製）を溶解させた後、２０時間、２５°Ｃにて撹拌した。
【０１３２】
この溶液を分画分子量１２０００の透析膜に入れた後、当該透析膜を精製水に浸してチラミンの存在に起因する波長２８０ｎｍにおけるピークが分光光度計において確認されなくなるまで、精製水を約８時間毎に交換した。その後、透析膜から取り出した溶液を、冷凍庫にて凍結した後、真空乾燥を行った。その結果、架橋性高分子として、チラミン修飾ゼラチンを得た（Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｐｈ）。Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｐｈには１×１０−４ｍｏｌ−Ｐｈ／ｇ−ゼラチンのフェノール性水酸基が導入されていた。
【０１３３】
その後、このＧｅｌａｔｉｎ−Ｐｈを２ｇ、０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）２００ｍＬに溶解した。この溶液に、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒ−Ｉ（同仁化学研究所製）を１ｍｇ／ｍＬで溶解したＤＭＳＯ溶液を１０ｍＬ添加し、遮光下、室温にて８時間撹拌した。
【０１３４】
その後、この溶液を分画分子量１２０００の透析膜に入れ、当該透析膜を精製水中に浸漬し、当該精製水中でＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒ−Ｉに由来する蛍光が確認されなくなるまで精製水の交換を８時間毎に繰り返した。その後、透析膜から取り出した溶液を、冷凍庫にて凍結した後、真空乾燥を行った。その結果、蛍光標識された架橋性高分子として、ＦＳ−Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｐｈを得た。
【０１３５】
［細胞被覆層の形成］
上述のようにしてで得られたＦＳ−Ｇｅｌａｔｉｎ−Ｐｈを３．０ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた。この溶液中に西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（１９０ユニット／ｍｇ、和光純薬工業株式会社製）を１００ユニット／ｍＬとなるように溶解させた（溶液１）。
【０１３６】
一方、ラット脂肪幹細胞を４８ｗｅｌｌ培養ディッシュに接着させ、その細胞密度が約１．０×１０４個／ｍＬとなるように１日培養し、その後、当該ラット脂肪幹細胞をＣｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で染色した。
【０１３７】
この染色後のラット脂肪幹細胞が接着した培養ディッシュに、上述のようにして調整した溶液１を加え、室温で３０分間静置した。このラット脂肪幹細胞をリン酸緩衝生理食塩水でよく洗浄した後、顕微鏡で観察した。
【０１３８】
［結果］
図７Ａ及び図７Ｂには、ラット脂肪幹細胞を観察した結果を示す。図７Ａは、Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅに由来する蛍光を観察した結果を示し、図７Ｂは、フルオレセインに由来する蛍光を観察した結果を示す。
【０１３９】
Ｃｅｌｌ  ＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅに由来する蛍光を発するラット脂肪幹細胞のうち約２０％の細胞表面に、ＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈのフルオレセインに由来する蛍光が確認された。
【実施例７】
【０１４０】
［細胞被覆層の形成］
上述の実施例３で得られたＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈを２ｗ／ｖ％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に溶解させた（溶液１）。
【０１４１】
ヒト肝臓ガン由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ３２６マウスＩｇＧ２ｂ抗体（１次抗体）を０．００５ｍｇ／ｍＬで含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に、１．５×１０６個／ｍＬとなるように分散し、室温暗所で３０分間で静置した。
【０１４２】
このＨｅｐＧ２細胞をリン酸生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（２次抗体）を０．１ｍｇ／ｍＬで含むリン酸緩衝生理食塩水に分散し、室温暗所で３０分間静置した。
【０１４３】
こうして、ＨｅｐＧ２細胞の細胞表面の特定分子（ＣＤ３２６）に、当該特定分子に特異的に結合する結合分子（１次抗体）を介して（より厳密には、１次抗体及び２次抗体を介して）、触媒分子（ペルオキシダーゼ）を結合させた。
【０１４４】
このＨｅｐＧ２細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、上述のように調製した溶液１に１．０×１０６個／ｍＬとなるように分散し、室温にて３０分間静置した。このＨｅｐＧ２細胞をリン酸緩衝生理食塩水を用いて３回洗浄した後、顕微鏡で観察した。
【０１４５】
［結果］
図８Ａ及び図８Ｂには、ＨｅｐＧ２細胞を観察した結果を示す。図８Ａは、明視野で観察した結果を示し、図８Ｂは、フルオレセインに由来する蛍光を観察した結果を示す。ＨｅｐＧ２細胞のうち約１０％の細胞表面にＦＳ−Ａｌｇ−Ｐｈのフルオレセインに由来する蛍光が確認された。
【図１Ａ】
2015107067.tif 000003
【図１Ｂ】
2015107067.tif 000004
【図２Ａ】
2015107067.tif 000005
【図２Ｂ】
2015107067.tif 000006
【図３】
2015107067.tif 000007
【図４Ａ】
2015107067.tif 000008
【図４Ｂ】
2015107067.tif 000009
【図４Ｃ】
2015107067.tif 000010
【図５】
2015107067.tif 000011
【図６Ａ】
2015107067.tif 000012
【図６Ｂ】
2015107067.tif 000013
【図７Ａ】
2015107067.tif 000014
【図７Ｂ】
2015107067.tif 000015
【図８Ａ】
2015107067.tif 000016
【図８Ｂ】
2015107067.tif 000017