(57)【要約】【課題】副作用やアレルギー反応の少ない美白効果を示す物質を得る。【解決手段】スッポン由来のコラーゲンと分解酵素を混合し、インキュベートした後、前記分解酵素を失活させて得たことを特徴とするコラーゲンペプチドは、サプリメントとして、すでに利用されているスッポン由来のコラーゲンの分解酵素による分解物であるため、アレルギー反応を起こす可能性が極めて低い。また、分解した後の低分子成分は、保湿効果を有する成分として使用することができる。すなわち、スッポン由来のコラーゲンの有効利用が可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スッポン由来のコラーゲンと分解酵素を混合し、インキュベートした後、前記分解酵素を失活させて得たことを特徴とするコラーゲンペプチド。
【請求項２】
前記分解酵素がトリプシンであることを特徴とする請求項１に記載されたコラーゲンペプチド。
【請求項３】
前記分解酵素がパパインであることを特徴とする請求項１に記載されたコラーゲンペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかにより得られたコラーゲンペプチドの不快臭を軽減させたことを特徴とするコラーゲンペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スッポン由来のコラーゲンを酵素で分解させて得たコラーゲンペプチドで、メラニン生成抑制効果を有するものである。
【背景技術】
【０００２】
メラニンの生成を抑制するメラニン抑制剤は、いわゆる美白効果を有する化粧品として利用される。特許文献１では、Ｌ−システイニル−Ｌ−トリプトファンで示されるジペプチドが、過酸化脂質分解促進剤であり、チロシナーゼ活性阻害効果を有することを示している。よく知られているように、メラニンは、チロシンにチロシナーゼが働きかけるところから生成が始まる。したがって、チロシナーゼの活性を阻害することで、皮膚細胞でのメラニンの生成を抑制することができ、美白効果が発現すると考えられる。
【０００３】
特許文献２では、コラーゲン成分含有原料を亜臨界水処理して得られる平均分子量２００〜１５００のコラーゲンペプチドでチロシナーゼ阻害活性を有するものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平０６−３４５７９７号公報
【特許文献２】特開２００６−３４２１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
美白効果を示す化粧品は、近年特に注目されている。しかし、美白化粧品については、白斑等の問題が指摘されている。美白には、皮膚細胞内でメラニンの合成を抑制することで、可能になると考えられている。そして複雑なメラニンの合成過程の鍵酵素であるチロシナーゼの活性を抑制することで美白効果が上がると考えられている。
【０００６】
チロシナーゼ活性を抑制する化学合成品のスクリーニングは現在でも行われている。しかし、このような化学合成品は、高い効果を得る物質を発見できる可能性はあるものの、副作用が大いに懸念される。
【０００７】
特許文献１および２は、どちらも天然物由来のペプチド（ポリベプチドを含む）である。したがって、副作用の懸念は少ないものの、アレルギーを発生させるおそれを考慮しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者は、そもそも高い滋養強壮効果を有する食材として長年摂取され、近年ではサプリメントとしても利用されているスッポン由来のコラーゲンの酵素分解物にメラニン生成抑制効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明に係るコラーゲンペプチドは、ヒトにとって、アレルギー反応を起こす可能性の極めて小さいスッポン由来のコラーゲンを用いたコラーゲンペプチドを提供するものである。
【０００９】
より具体的に、本発明に係るコラーゲンペプチドは、
スッポン由来のコラーゲンと分解酵素を混合し、インキュベートした後、前記分解酵素を失活させて得たことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るコラーゲンペプチドは、サプリメントとして、すでに利用されているスッポン由来のコラーゲンの分解酵素による分解物であるため、アレルギー反応を起こす可能性が極めて低い。また、分解酵素はアミノ酸の特定の位置を切断するものが多く、原料となるコラーゲンが同じ物由来であれば、常に同じコラーゲンペプチドを得ることができる。
【００１１】
また、本発明に係るコラーゲンペプチドは、アレルギー反応を起こす可能性が低いため、コラーゲンを分解した後、アレルギーを発生させる成分だけ分離するといった分離工程を行う必要がない。
【００１２】
また、分解した後の低分子成分は、保湿効果を有する成分として使用することができる。すなわち、スッポン由来のコラーゲンの有効利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】トリプシンによるコラーゲンペプチドのメラニン抑制効果を示す吸光度の結果を示す図である。
【図２】パパインによるコラーゲンペプチドのメラニン抑制効果を示す吸光度の結果を示す図である。
【図３】コラーゲンペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動像を示す写真である。
【図４】トリプシンおよびパパインによるコラーゲンペプチドのキャピラリー電気泳動の結果を示すグラフである。
【図５】透析後のトリプシンによるコラーゲンペプチドのＣＥの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明に係るコラーゲンペプチドについて説明を行う。なお、以下の説明は本発明の一実施の形態および一実施例についての例示であって、本発明は以下の説明に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて、以下の実施の形態は変更することができる。
【００１５】
本発明は、スッポン由来のコラーゲンを分解酵素で分解して得る。スッポン（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、爬虫綱カメ目スッポン科キョクトウスッポン属に分類されるカメである。利用することのできるスッポンはキョクトウスッポンを始め、フロリダスッポン、トゲスッポン、マルスッポン、リーススッポン、オーブリーフスッポン、クジャクスッポン等でも好適に利用できる。
【００１６】
スッポンで利用できる部位は、特に限定されるものではない。しかし、足および甲羅の縁の部分（エンペラ）は好適に利用することができる。
【００１７】
コラーゲンの抽出方法も特に限定されるものではない。基本的な酵素抽出法、酸抽出法、熱水抽出法は好適に利用することができ、これらに修飾を加えた方法であってもよい。
【００１８】
分解酵素としては、加水分解酵素が好適に利用できる。加水分解酵素であれば、特に制限はない。発明者はトリプシン、パパインといった加水分解酵素が好適に利用できることを確認している。
【００１９】
本発明に係るコラーゲンペプチドは、スッポン由来のコラーゲンと分解酵素を混合し、インキュベートした後、分解酵素を失活させることで得る。インキュベートは、分解酵素でスッポン由来のコラーゲンを分解する工程と言っても良い。また、分解酵素は、そのままでは、基質が減少した後、非特異的な部位を切断する可能性があるため、ある程度の時間分解させた後は、失活させて分解を止める。失活は、１００℃で１０分程度の熱処理を行うことで失活させることができる。本発明に係るコラーゲンペプチドには、失活した分解酵素が含まれていても良い。
【００２０】
また、非特異的に分解され、低分子化されすぎた消化物断片や塩を除去してもよい。これは、得られたコラーゲンペプチドを水等の溶媒に対して透析を行う若しくは、フィルタでろ過するといった工程で行うことができる。このように、分解酵素を失活させた後、不要物を除去したコラーゲンペプチドを「精製コラーゲンペプチド」と呼ぶ。
【００２１】
特に、コラーゲンを分解するとアミノ基を有する低分子化合物（アミン類）やカルボキシル基を初めとする酸性基を有する低分子化合物（有機酸類）が発生する。これは比較的臭気が強くまた不快臭であるので、美白薬（化粧品）としては好ましくない。コラーゲンペプチドに対して透析を行うとアミン類や有機酸類がかなり除去される。すなわち、得られたコラーゲンペプチドはアミン臭等の刺激臭すなわち不快臭がしないコラーゲンペプチドを得ることができる。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
＜スッポン由来のコラーゲンの抽出＞
静岡県立焼津水産高校で養殖されたキョクトウスッポンのエンペラ部分１０ｇを０．１Ｎの塩酸（ＨＣｌ）溶液１００ｍＬに浸漬させ、２４時間攪拌した。その後７０００ｒｐｍで２０分間遠心を行い、沈殿を回収した。
【００２３】
得られた沈殿に１００ｍＬの０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を加え、２４時間攪拌した。その後７０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を回収した。この処理は３回行った。
【００２４】
得られた沈殿約１０ｇに０．０３Ｍのクエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ  Ａｃｉｄ）溶液１００ｍＬを加え、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、７０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み溶液を回収し、スッポン由来コラーゲン溶液を得た。
【００２５】
＜スッポン由来のコラーゲンの分解＞
上記で得たスッポン由来のコラーゲンを以下の手順で、分解酵素を用いて分解した。
【００２６】
スッポン由来のコラーゲン１００ｍｇを炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）溶液（最終濃度１００ｍＭ）に１００ｍＬマイヤーフラスコ中で懸濁した。なお、ここでスッポン由来のコラーゲン１００ｍｇとは、約２ｍｇ／ｍＬで０．０３Ｍクエン酸溶液に溶けているコラーゲンを１００ｍｇ用いた意味である。
【００２７】
ウシ由来トリプシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ×１００μＬ＝１ｍｇ）を加え３７℃で振盪しながらインキュベートした。インキュベートを始めてから５日後に、１００℃で１０分加熱し、酵素活性を失活させた。酵素活性を失活させた状態の溶液中には、コラーゲンペプチドが含まれている。この溶液をコラーゲンペプチド溶液と言っても良い。
【００２８】
分解酵素で分解できているか否かをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＥで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、インキュベートの時間を２４時間、４８時間、７２時間の時点のコラーゲンペプチドについても測定を行った。また、インキュベート５日後のコラーゲンペプチド溶液を、ＭＷＣＯ１００〜５００の透析膜を用い、蒸留水に対して透析を行い、低分子の消化物断片や塩を取り除いた。これは精製コラーゲンペプチドを含む精製コラーゲンペプチド溶液である。
【００２９】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
以下の手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ  −Ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。
【００３０】
常法にしたがって、電気泳動用のゲルを作製した。具体的には、以下のようにした。分離ゲルおよび濃縮ゲルを、水、アクリルアミド、Ｔｒｉｓ、ＡＰＳ（ペルオキソ二硫酸アンモニウム）、ＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミンを）を用いて表１の組成に従って、調製した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
泳動させるサンプル（コラーゲンペプチド）は５〜１０μｇ程度の量にそろえられるようにＰＢＳで濃度調整をしておいた。サンプルはＬａｅｍｍｉｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ，  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ＳＤＳ，  Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ，  β−メルカプトエタノール含）と１：１の割合で混合し、９５℃、１０分の加熱を行い変性させた。
【００３３】
サンプルと分子量マーカーをそれぞれレーンにアプライした。ゲル１枚につき２０ｍＡの電流を定電流で流した。Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ中の色素（Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ）がゲルの下側まで来たら泳動を終了した。泳動が終了したら、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）で染色した。
【００３４】
＜キャピラリー電気泳動＞
コラーゲンペプチドに、キャピラリー電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＣＥ）を行った。キャピラリーにはフューズドシリカを用いた。泳動液は５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）に２０ｍＭのＳＤＳを添加した溶液を用いた。サンプル導入は落差法を用いた。印加電圧は２０ｋＶ、検出は２００−３００ｎｍのＵＶ吸収で行った。また、トリプシンによるコラーゲンペプチドを透析した精製コラーゲンペプチドについてもＣＥを行った。
【００３５】
泳動を行った温度は２５℃であった。変性バッファは、ｐＨ６．８で１ＭのＴｒｉｓが１．２５ｍＬ、グリセロールを２．０ｍＬ、ＳＤＳを０．４ｍＬに全量が１０ｍＬになるまで水を加えた。なお、サンプルには、泳動直前にケイ皮酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＮａ）を混入させた。  
【００３６】
＜メラニン産生抑制効果の確認＞
上記のコラーゲンペプチド溶液（１ｍｇ／ｍｌ）をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；以下「ＰＢＳ」と呼ぶ。）で１０倍に希釈した後、０．２μｍフィルタでろ過することで滅菌した。
【００３７】
Ｂ１６Ｆ１細胞（マウス悪性黒色腫）を２×１０５個／６０ｍｍ  ｄｉｓｈになるように分注した。和光社製のＲＭＩ１６４０培地に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）を添加した培地５ｍＬに０．１ｍｇ／ｍＬコラーゲンペプチド溶液を１００μＬまたは５０μＬを加えた。
【００３８】
Ｂ１６Ｆ１細胞を２４時間培養した後、滅菌済みコラーゲンペプチドを投与する。対照として希釈に使用したＰＢＳをＢ１６Ｆ１細胞に加えたものを用意した。また、ペプチドの最大投与量と同等のコラーゲン（酵素で分解していないコラーゲン）も対照として用意した。
【００３９】
コラーゲンペプチドを投与した後、４８時間後さらに培養した。その後培養皿に接着している細胞をトリプシンで剥がし、１×１０６個の細胞を回収した。
【００４０】
回収した細胞は、ＰＢＳ５ｍＬで洗浄し、０．８５Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液５００μｌで細胞懸濁させた。次に８０℃で３０分インキュベートし、細胞中のメラニンを溶解させた。メラニンを溶解させた溶液を細胞メラニン溶液と呼ぶ。
【００４１】
細胞メラニン溶液２００μｌを９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
（実施例２）
実施例１において、トリプシンの代わりにパパイン（和光純薬工業株式会社製）に変えた以外は、以下の点を除いて全く同じ手順を繰り返し、細胞メラニン溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定した。
（１）Ｂ１６Ｆ１細胞（マウス悪性黒色腫）の培地に添加したコラーゲンペプチドは１００μＬだけであった。
（２）ＣＥを行ったのは、コラーゲンペプチドだけであり、精製コラーゲンペプチドについては行っていない。
【００４３】
＜結果＞
吸光度の結果を図１（トリプシン）および図２（パパイン）に示す。図１および２で縦軸はＰＢＳを入れた時の対照（コントロール：ｃｏｎｔｒｏｌと呼ぶ。）の吸光度を１００とした時の割合（％）である。横軸は、それぞれのサンプルの種類を表す。
【００４４】
図１に分解酵素がトリプシンの場合の結果を示す。図１を参照して、コントロール（ＰＢＳ）に比べて、コラーゲンペプチドを投与することで、メラニン生成は抑制されたと言える。具体的には、コラーゲンペプチドを１μｇ／ｍＬ入れた場合は、約２０％、２μｇ／ｍＬでは約４０％のメラニン生成抑制が確認された。なお、酵素で分解していないコラーゲンもコントロールに対して吸光度が約２０％低減していた。
【００４５】
図１のグラフ上には、色見本を参考に示した。これは２５６階調を有する画像データを使って、階調が２０％、４０％低減した場合の見え方を例示したものである。コントロールの階調（符号１０）を１２８とした。コラーゲンだけの場合（符号１２）とトリプシンによるコラーゲンペプチドを１μｇ／ｍＬ添加した場合（符号１４）は、コントロールに対して効果の違いは少ない。
【００４６】
トリプシンによるコラーゲンペプチドを２μｇ／ｍＬ添加した場合（符号１６）は、色見本を比較しても濃淡が分かる。このように、少なくともコントロールに対して５０％以上の吸光度の変化があれば、美白の効果が期待できると考えられる。
【００４７】
また、図１のように、コラーゲンペプチドの添加量を増やすことで、メラニン生成抑制の効果が反比例的に表れた。これは、人体に対して用いる際に、美白効果に対する摂取量を調節することができるという点で、利用し易い特性である。
【００４８】
図２に分解酵素がパパインの場合の結果を示す。図２を参照して、コントロールに対して、分解酵素をパパインにしたコラーゲンペプチドを２μｇ／ｍＬ入れた場合は、コントロールに対して約６０％のメラニン生成抑制が確認された。
【００４９】
図２のグラフの上には色見本を示した。コントロール（符号１０）に対して６０％階調を変化させた場合（符号１８）は、明らかに白くなることが認識できる。
【００５０】
図３には、トリプシンおよびパパインで酵素分解させた精製コラーゲンペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。それぞれ分解時間を２４時間、４８時間、７２時間と変化させた結果を並べて示す。第１、第２、第３レーンは、２４時間、４８時間、７２時間後のパパインによるコラーゲンペプチドの泳動像である。また、第４、第５、第６レーンは、２４時間、４８時間、７２時間後のトリプシンによるコラーゲンペプチドの泳動像である。なお、第ゼロレーンは分子量マーカーである。
【００５１】
パパインで酵素分解させたコラーゲンペプチドは、１５〜４３ｋＤａにかけて、明確な泳動像が複数本確認された。また、分解時間については、４８時間と７２時間の泳動像が同じであった。したがって、少なくとも４８時間分解させれば、ほぼ完全に酵素分解されていると考えられた。
【００５２】
一方、トリプシンでは、２４時間後ですでに、泳動像は確認されなかった。これよりトリプシンで分解させると、３．５ｋＤａ以下の小さなコラーゲンペプチドが生成されていると考えられた。
【００５３】
図４には、ＣＥの結果を示す。図４（ａ）はトリプシンで酵素分解させた場合であり、図４（ｂ）はパパインで酵素分解させた場合である。それぞれ、横軸は泳動時間（分）であり、縦軸は吸光度である。参考ピークであるケイ皮酸ナトリウム（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨＣＯＯＮａ）のピークから比較すると、パパインで酵素分解させた場合は、分子量が大きいペプチドがリッチに存在し、トリプシンで酵素分解させた場合は、分子量が小さいペプチドがリッチに存在していることがわかる。これはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図３）とも一致する。
【００５４】
図５には、トリプシンを用いたコラーゲンペプチドを透析し精製コラーゲンペプチドとした場合のＣＥの結果を示す。横軸および縦軸は泳動時間（分）と吸光度である。この場合精製コラーゲンペプチドは、透析で残った溶液である。つまり、透析で用いた膜の細孔径以下の物質は除去されたコラーゲンペプチドである。図４（ａ）と比較し、ほとんどピークの位置及び分布比が変わらなかった。
【００５５】
この精製コラーゲンペプチドもメラニン生成抑制効果があることを確認している。したがって、メラニン生成抑制効果は、透析により除去された低分子の物質による寄与ではなく、透析後でも残っているコラーゲンペプチドによるものと考えられる。なお、透析後の精製コラーゲンペプチドは、インキュベート後にしていたアミン臭等の不快臭はしなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係るコラーゲンペプチドは、美白効果を有する化粧品の原料として好適に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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