(57)【要約】【課題】本発明は、有害なシアン化合物を使用することなくマンデロニトリル誘導体を効率良く製造する方法と、当該製造方法に使用できるシトクロムＰ４５０、および、当該シトクロムＰ４５０をコードする核酸を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るシトクロムＰ４５０とその遺伝子は、それぞれ特定のアミノ酸配列と塩基配列を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかの塩基配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０遺伝子。
（１）配列番号１に記載の塩基配列
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有する塩基配列
（３）配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有する塩基配列
【請求項２】
下記の（１’）〜（３’）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０。
（１’）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２’）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有するアミノ酸配列；
（３’）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９９％以上の相同性を有し、且つ、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有するアミノ酸配列
【請求項３】
下記の何れかの塩基配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０遺伝子。
（４）配列番号３に記載の塩基配列
（５）配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する塩基配列
（６）配列番号３に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する塩基配列
【請求項４】
下記の（４’）〜（６’）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０。
（４’）配列番号４に記載のアミノ酸配列；
（５’）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有するアミノ酸配列；
（６’）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９９．３％以上の相同性を有し、且つ、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有するアミノ酸配列
【請求項５】
請求項１または３に記載のシトクロムＰ４５０遺伝子のうち少なくとも一つを含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
マンデロニトリル化合物を製造するための方法であって、
下記式（Ｉ）で表されるフェニルアラニン化合物に、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、請求項２に記載のシトクロムＰ４５０を作用させることにより、下記式（ＩＩ）で表されるフェニルアセトアルドキシム化合物とする工程、および、
【化１】
2015165792.tif 000009
［式中、Ｒは、水酸基、ハロゲン原子およびＣ1-6アルコキシ基からなる群より選択される０以上、ｎ以下の基を示し、ｎは０以上、５以下の整数を示す］
上記フェニルアセトアルドキシム化合物（ＩＩ）に、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、請求項４に記載のシトクロムＰ４５０を作用させることにより、下記式（ＩＩＩ）で表されるマンデロニトリル化合物とする工程
【化２】
2015165792.tif 000010
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
マンデル酸化合物を製造するための方法であって、
請求項７に記載の方法で製造された上記マンデロニトリル化合物誘導体（ＩＩＩ）にニトリラーゼを作用させることにより、下記式（ＩＶ）で表されるマンデル酸化合物とする工程
【化３】
2015165792.tif 000011
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２に記載のシトクロムＰ４５０、請求項４に記載のシトクロムＰ４５０およびニトリラーゼの存在下、上記フェニルアラニン化合物（Ｉ）から上記マンデル酸化合物（ＩＶ）をワンポットで製造する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記マンデル酸化合物（ＩＶ）が（Ｒ）−光学異性体である請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害なシアン化合物を使用することなくマンデロニトリル誘導体を効率良く製造する方法と、当該製造方法に使用できるシトクロムＰ４５０、および、当該シトクロムＰ４５０をコードする核酸に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マンデロニトリルやマンデル酸をはじめとしたマンデロニトリル誘導体は、医薬やファインケミカルの製造において重要な中間体である。
【０００３】
マンデロニトリルの製造方法としては、ベンズアルデヒドとシアニドドナーにヒドロキシニトリルリアーゼを作用させる方法が提唱されている（特許文献１）。マンデル酸を製造する方法としては、ニトリラーゼを用いてマンデロニトリルからマンデル酸を製造する方法が提唱されている（特許文献２）。また、ベンズアルデヒドとシアニドドナーからマンデロニトリルを製造し、逐次的にマンデル酸を製造する方法が提唱されている（特許文献３，特許文献４，非特許文献１）。以上のマンデロニトリルとマンデル酸の製造方法では、人体に有害なシアン化合物が用いられている。
【０００４】
シアン化合物を用いることなくマンデル酸を製造する方法が非特許文献２に開示されているが、この方法ではマンデロニトリルを経由せずにマンデル酸を製造するため、マンデルアミドをはじめとした他のマンデロニトリル誘導体を製造することはできない。また、この方法では複数の遺伝子を大腸菌に導入するだけでなく、大腸菌の遺伝子を複数ノックアウトする必要があるため、操作は極めて煩雑である。
【０００５】
マンデロニトリル誘導体を製造するための出発原料化合物としては、マンデロニトリル誘導体との構造における類似性や、その入手のし易さから、フェニルアラニンを利用することが考えられる。例えば、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する酵素として、シロイヌナズナ由来のＣＹＰ７９Ａ２が知られている（特許文献５）。しかし、当該文献では、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する酵素については報告されていない。
【０００６】
フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する酵素としては、ソルガム由来のＣＹＰ７１Ｅ１とＣＹＰ７１Ｅ７が報告されている（非特許文献３と非特許文献４）。しかしフェニルアセトアルドキシムは、本来、これら酵素の基質ではないため、これら酵素ではフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルへ効果的に変換することはできない。また、アミノ酸から青酸配糖体を生合成する酵素群はメタボロンと呼ばれる複合体を形成し、青酸配糖体の生合成を効果的に行っている（非特許文献５）。よって、フェニルアラニンからマンデロニトリル誘導体を製造するに当たっては、同種由来の酵素を組み合わせることが好ましいと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２１７５９０号公報
【特許文献２】特開平４−９９４９５号公報
【特許文献３】特開２００２−１４２７９２号公報
【特許文献４】特開２００８−６１５４７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１７，３２０〜３２３（２００６）
【非特許文献２】Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ，１０，７１（２０１１）
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ  ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６，３９３〜４０５（１９９８）
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１，２８２〜２９２（２０１１）
【非特許文献５】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６９，８８〜９８（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、マンデロニトリル誘導体の製造には一般的にシアン化合物が使われるが、有害なシアン化合物の使用は好ましくない。一方、シアン化合物を使わずにマンデロニトリル誘導体を製造することも考えられるが、これまで効率的な方法はなかった。
【００１０】
そこで本発明は、有害なシアン化合物を使用することなくマンデロニトリル誘導体を効率良く製造する方法と、当該製造方法に使用できるシトクロムＰ４５０、および、当該シトクロムＰ４５０をコードする核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ウメから得られる２つのシトクロムＰ４５０遺伝子を見出し、当該遺伝子の発現により産生される酵素を用いれば、Ｌ−フェニルアラニン化合物からマンデロニトリル化合物をワンポットで製造でき、且つ、さらにニトリラーゼを用いることによりマンデロニトリル化合物からマンデル酸化合物を製造できることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
本発明を以下に示す。
【００１３】
［１］  下記の何れかの塩基配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０遺伝子。
（１）配列番号１に記載の塩基配列
（２）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有する塩基配列
（３）配列番号１に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有する塩基配列
【００１４】
［２］  下記の（１’）〜（３’）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０。
（１’）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２’）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有するアミノ酸配列；
（３’）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９９％以上の相同性を有し、且つ、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有するアミノ酸配列
【００１５】
［３］  下記の何れかの塩基配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０遺伝子。
（４）配列番号３に記載の塩基配列
（５）配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する塩基配列
（６）配列番号３に記載の塩基配列に対して９９％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する塩基配列
【００１６】
［４］  下記の（４’）〜（６’）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするシトクロムＰ４５０。
（４’）配列番号４に記載のアミノ酸配列；
（５’）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有するアミノ酸配列；
（６’）配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９９．３％以上の相同性を有し、且つ、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有するアミノ酸配列
【００１７】
［５］  上記［１］または［３］に記載のシトクロムＰ４５０遺伝子のうち少なくとも一つを含むことを特徴とするベクター。
【００１８】
［６］  上記［５］に記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
【００１９】
［７］  マンデロニトリル化合物を製造するための方法であって、
下記式（Ｉ）で表されるフェニルアラニン化合物に、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、上記［２］に記載のシトクロムＰ４５０を作用させることにより、下記式（ＩＩ）で表されるフェニルアセトアルドキシム化合物とする工程、および、
【００２０】
【化１】
2015165792.tif 000002
【００２１】
［式中、Ｒは、水酸基、ハロゲン原子およびＣ1-6アルコキシ基からなる群より選択される０以上、ｎ以下の基を示し、ｎは０以上、５以下の整数を示す］
上記フェニルアセトアルドキシム化合物（ＩＩ）に、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、上記［４］に記載のシトクロムＰ４５０を作用させることにより、下記式（ＩＩＩ）で表されるマンデロニトリル化合物とする工程
【００２２】
【化２】
2015165792.tif 000003
【００２３】
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
を含むことを特徴とする方法。
【００２４】
［８］  マンデル酸化合物を製造するための方法であって、
上記［７］に記載の方法で製造された上記マンデロニトリル化合物誘導体（ＩＩＩ）にニトリラーゼを作用させることにより、下記式（ＩＶ）で表されるマンデル酸化合物とする工程
【００２５】
【化３】
2015165792.tif 000004
【００２６】
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
を含むことを特徴とする方法。
【００２７】
［９］  上記［２］に記載のシトクロムＰ４５０、上記［４］に記載のシトクロムＰ４５０およびニトリラーゼの存在下、上記フェニルアラニン化合物（Ｉ）から上記マンデル酸化合物（ＩＶ）をワンポットで製造する上記［８］に記載の方法。
【００２８】
［１０］  上記マンデル酸化合物（ＩＶ）が（Ｒ）−光学異性体である上記［８］または［９］に記載の方法。
【００２９】
本発明において「Ｃ1-6アルコキシ基」とは、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素オキシ基をいう。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ等である。好ましくはＣ1-4アルコキシ基であり、より好ましくはＣ1-2アルコキシ基であり、最も好ましくはメトキシである。
【００３０】
ｎとしては、０、即ち、フェニルアラニン化合物（Ｉ）などが置換基を有さないことが好ましい。置換基を有さないフェニルアラニンは安価であり入手容易である。但し、ｎが１以上、即ち、フェニルアラニン化合物（Ｉ）などが置換基を有する場合には、ｎとしては１以上、３以下が好ましく、１または２がより好ましく、１がさらに好ましい。
【００３１】
ｎが２以上、即ち、フェニルアラニン化合物（Ｉ）などにおける置換基の数が２以上である場合には、それら置換基は互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいものとする。
【００３２】
なお、各工程の反応溶液において、カルボキシ基、アミノ基、フェノール性水酸基は、それぞれ−ＣＯ2-、−ＮＨ4+、−Ｏ-の状態になっていてもよいものとする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、人体に有害なシアン化合物を用いることなく、入手容易なフェニルアラニン化合物からマンデロニトリル誘導体を効率的に製造することができる。マンデロニトリル誘導体は医薬やファインケミカルの製造における重要な中間体であることから、本発明は、産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームまたは非発現ミクロソームをＬ−フェニルアラニンとインキュベートした際の生成物をＬＣ−ＭＳで検出した結果である。（Ａ）において、クロマトグラム１はフェニルアセトアルドキシム標品、クロマトグラム２はＰ４５０非発現ミクロソーム、クロマトグラム３はＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームとＬ−フェニルアラニンを反応させた際の生成物である。（Ｂ）は、クロマトグラム１のフェニルアセトアルドキシムおよびクロマトグラム３で検出された生成物をＭＳ／ＭＳ解析した結果である。
【図２】図２は、ＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソーム（クロマトグラム２）または非発現ミクロソーム（クロマトグラム１）をフェニルアセトアルドキシムとインキュベートした際の生成物をＧＣ−ＭＳで検出した結果である。（Ａ）において、クロマトグラム１はＰ４５０非発現ミクロソームの結果であり、クロマトグラム２はＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソームの結果である。（Ｂ）は、クロマトグラム２で検出された生成物のマススペクトルとベンズアルデヒド標品のマススペクトルである。
【図３】図３は、フェニルアセトアルドキシムに対するＰｍＣＹＰ７１のミカエリスメンテンプロットである。
【図４】図４は、マンデル酸の光学異性体を、キラルカラムを用いて分離したクロマトグラムである。クロマトグラム１はマンデル酸の標品であり、Ｓ体、Ｒ体のピークをそれぞれＳ、Ｒで示した。クロマトグラム２はマンデロニトリルを基質としてＮｉｔ＿ＯｘＢと反応させた際の反応生成物である。
【図５】図５は、ＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームおよびＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソームとＬ−フェニルアラニンをインキュベートした際の生成物をＧＣ−ＭＳにより検出した結果である。（Ａ）はフェニルアセトアルドキシムを検出した際のクロマトグラムを示し、（Ｂ）はベンズアルデヒドを検出した際のクロマトグラムを示す。クロマトグラム１はＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームを、クロマトグラム２はＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームおよびＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソームの混合物を反応に用いた際の生成物の結果である。（Ｃ）は、（Ａ）における生成物とフェニルアセトアルドキシム標品のマススペクトルを示し、（Ｄ）は、（Ｂ）における生成物とベンズアルデヒド標品のマススペクトルを示す。
【図６】図６は、ＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソーム、ＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソームおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＯｘＢ−１株由来ニトリラーゼの混合物とＬ−フェニルアラニンをインキュベートした際の生成物を超高速液体クロマトグラフィーにより検出した結果である。クロマトグラム１はマンデル酸の標品、クロマトグラム２は上記反応後の溶液である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、先ず、本発明に係るシトクロムＰ４５０遺伝子について説明する。
【００３６】
＜シトクロムＰ４５０遺伝子＞
上記塩基配列（１）〜（３）を有するシトクロムＰ４５０遺伝子は、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアラニン化合物（Ｉ）をフェニルアセトアルドキシム誘導体（ＩＩ）に変換する活性を有するシトクロムＰ４５０（以下、「ＰｍＣＹＰ７９」と略記する）をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子（以下、「ＰｍＣＹＰ７９遺伝子」と略記する）であり、上記塩基配列（４）〜（６）を有するシトクロムＰ４５０遺伝子は、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアセトアルドキシム誘導体（ＩＩ）をマンデロニトリル誘導体（ＩＩＩ）に変換する活性を有するシトクロムＰ４５０（以下、「ＰｍＣＹＰ７１」と略記する）をコードするシトクロムＰ４５０遺伝子（以下、「ＰｍＣＹＰ７１遺伝子」と略記する）である。
【００３７】
シトクロムＰ４５０は、ＮＡＤＰＨの存在下で基質を水酸化する酵素の総称であり、還元状態で一酸化炭素と結合して４５０ｎｍに吸収極大を示す色素という意味で命名されている。
【００３８】
ＰｍＣＹＰ７９遺伝子とＰｍＣＹＰ７１遺伝子において、それぞれ上記塩基配列（１）〜（３）または上記塩基配列（４）〜（６）を「有する」とは、これら塩基配列が含まれており、且つ、コードされているタンパク質が上記の活性を有するものである限り、いかなる核酸であってもよいとの意味である。例えば、各塩基配列に５'ＵＴＲや３'ＵＴＲ、開始コドン、終止コドンなどを加えた核酸も本発明範囲に含まれる。
【００３９】
上記塩基配列（１）（配列番号１）を有するＰｍＣＹＰ７９遺伝子と塩基配列（４）（配列番号３）を有するＰｍＣＹＰ７１遺伝子は、既知のシトクロムＰ４５０であるＣＹＰ７９Ａ１またはＣＹＰ７１Ｅ１をコードする遺伝子と類似の塩基配列を有するものとして、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ）の核酸から特定されたものである。
【００４０】
本発明に係る塩基配列（２）および塩基配列（５）の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失などを有する塩基配列を有する核酸にコードされるタンパク質が、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、それぞれＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性と、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記「１から数個」の範囲は、前記酵素活性を有するタンパク質である割合が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、よりさらに好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、さらには１個または２個であることができる。
【００４１】
本発明に係る塩基配列（３）と塩基配列（６）の「９９％以上の相同性」は、当該相同性を有する核酸がコードするタンパク質が、それぞれＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性と、フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する酵素である限り、特に限定されない。当該相同性は９９％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９９．２％以上、さらに好ましくは９９．４％以上、さらに好ましくは９９．６％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、特に好ましくは９９．９％以上である。
【００４２】
なお、塩基配列との相同性は、比較すべき核酸の塩基配列が明らかであれば、当業者であればアライメント解析ソフトを用いて容易に求めることができる。
【００４３】
上記塩基配列（２）および塩基配列（３）における「Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性を有する」、および、上記塩基配列（５）および塩基配列（６）における「フェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有する」とは、それぞれ、例えば後記の実施例に記載の条件で、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換する活性およびフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換する活性を有することを意味する。本発明に係るＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１のこれら活性は、従来のシトクロムＰ４５０よりも高いことが好ましい。
【００４４】
本発明に係るＰｍＣＹＰ７９遺伝子とＰｍＣＹＰ７１遺伝子を得る方法は特に限定されるものではなく、一般的な方法が採用される。例えば、これら各遺伝子を有する生物のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡライブラリーなどから適切な制限酵素で切り出し、精製すればよい。即ち、本発明のＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１をコードする遺伝子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって公知手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、対象生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製し、これを展開して、本発明に係るＰｍＣＹＰ７９またはＰｍＣＹＰ７１をコードするＤＮＡ（配列番号１と配列番号３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。なお、ゲノミックライブラリーの作成に用いるベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクターなどが挙げられる。
【００４５】
また、本発明のＰｍＣＹＰ７９遺伝子（配列番号１）とＰｍＣＹＰ７１遺伝子（配列番号３）は、それぞれに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、対象生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００４６】
上記塩基配列（２）、（３）、（５）および（６）の塩基配列は、それぞれ上記塩基配列（１）または（２）の塩基配列を有する核酸に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法などを用いて得ることができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９や、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００４７】
本発明のＰｍＣＹＰ７９遺伝子とＰｍＣＹＰ７１遺伝子は、例えば、それぞれＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼをコードする遺伝子と共に酵母などの宿主細胞に導入し、これら宿主細胞自体、その培養液、その菌体破砕液などをフェニルアラニン化合物からマンデロニトリル誘導体の製造に利用することが考えられる。或いは、これら本発明遺伝子を両方ともＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子と共に宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を用いて同様にフェニルアラニン化合物からマンデロニトリル誘導体の製造に利用することも考えられる。さらに、ニトリラーゼをコードする遺伝子も宿主細胞に導入することにより、マンデロニトリル化合物からマンデル酸化合物の製造に利用することができる。
【００４８】
＜シトクロムＰ４５０＞
上記アミノ酸配列（１’）〜（３’）を有するシトクロムＰ４５０（ＰｍＣＹＰ７９）遺伝子は、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアラニン化合物（Ｉ）をフェニルアセトアルドキシム誘導体（ＩＩ）に変換する活性を有し、上記アミノ酸配列（４’）〜（６’）を有するシトクロムＰ４５０（ＰｍＣＹＰ７１）は、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアセトアルドキシム化合物（ＩＩ）をマンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）に変換する活性を有する。
【００４９】
本発明においてＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、各酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、公知のＨＡやＦｌａｇなど末端部における付加配列、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。また、本発明のＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１は、他のタンパク質との融合タンパク質であってもよく、Ｎ−グリコシル化などの各種修飾を受けていてもよい。
【００５０】
また、アミノ酸配列（２’）、（３’）、（５’）、（６’）における欠失等や相同性、活性の定義や好適数値範囲などは、塩基配列（２）、（３）、（５）、（６）での定義や好適数値範囲などと同様である。但し、アミノ酸配列（６’）におけるアミノ酸配列（４’）との相同性は９９．３％以上であり、好ましくは９９．５％以上、より好ましくは９９．８％以上、特に好ましくは９９．９％以上である。
【００５１】
なお、本発明に係るＰｍＣＹＰ７９とキャッサバ由来の同機能Ｐ４５０（ＣＹＰ７９Ａ１）との相同性は６２％であり、ＰｍＣＹＰ７１とキャッサバ由来の同機能Ｐ４５０（ＣＹＰ７１Ｅ１）との相同性は５１％である。
【００５２】
本発明に係るＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１は、植物に含まれている場合があり、その場合には、植物から精製することができる。本発明のシトクロムＰ４５０が含まれている植物は、例えば、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）またはゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている植物から、上記ＰｍＣＹＰ７９遺伝子またはＰｍＣＹＰ７１遺伝子の塩基配列を有するものを検索することにより見出すことができる。かかる相同性検索では、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴＮを好適に用いることができる。
【００５３】
ＥＳＴまたはゲノムがデータベース化されていない植物の場合には、例えば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニングベクターを使用して対象となる植物からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、本発明に係るＰｍＣＹＰ７９遺伝子またはＰｍＣＹＰ７１遺伝子の塩基配列の少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出する工程とを含む方法を用いることができる。このように、本発明に係る遺伝子はプローブとしても有用である。プローブに用いる領域には、目的とする遺伝子に特異的な配列が含まれることが好ましい。また、プローブとして使用されるポリヌクレオチドの長さは、１００ｂｐ以上が好ましい。
【００５４】
より具体的には、配列番号１または配列番号３に記載の遺伝子がコードするタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９８，５０３（１９７５））やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０〜１３５４（１９８５）；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７-４９１（１９８８））を利用する方法が挙げられる。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により製造できるＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子もまた、本発明遺伝子の範囲に含まれる。
【００５５】
このような遺伝子を単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、０．２％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション／洗浄条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、０．２％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を用いれば、より相同性の高い遺伝子の効率的な単離を期待することができる。これにより単離された遺伝子は、それがコードするアミノ酸レベルにおいて、本発明のＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１のアミノ酸配列（配列番号２および配列番号４）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で９９％以上、好ましくは９９．２％以上、さらに好ましくは９９．４％以上、さらに好ましくは９９．６％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、特に好ましくは９９．９％以上である。
【００５６】
配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：２４４４〜２４４８（１９８８））やＢＬＡＳＴＰ検索により決定することができる。
【００５７】
ある遺伝子が本発明のＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１と同等の機能を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、後記の実施例に記載のようにＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼとともに目的の遺伝子を導入した宿主細胞からミクロソーム画分を調製し、かかるミクロソーム画分に、本発明のシトクロムＰ４５０の基質であるＬ−フェニルアラニンもしくはフェニルアセトアルドキシムを添加し、それぞれの反応生成物がフェニルアセトアルドキシムもしくはマンデロニトリルであるかを同定することにより決定できる。或いは、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼとともに目的の遺伝子を導入した酵母の菌体を含む懸濁液にＬ−フェニルアラニンもしくはフェニルアセトアルドキシムを添加し、それぞれの懸濁液中にフェニルアセトアルドキシムもしくはマンデロニトリルが生成しているかどうかを確認することにより決定することができる。或いは、目的の遺伝子を好適な宿主細胞にて発現させ、単離精製した酵素標品に、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下で、Ｌ−フェニルアラニンもしくはフェニルアセトアルドキシムを添加し、それぞれフェニルアセトアルドキシムもしくはマンデロニトリルを生成するかを同定することによって決定することもできる。
【００５８】
生成物がフェニルアセトアルドキシム、マンデロニトリルもしくはマンデル酸であるかの同定方法は、フェニルアセトアルドキシムもしくはマンデロニトリル標品と、生成物とを、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳなどにより解析し、その結果同じ生成物であるか否かを判定することにより同定することができる。
【００５９】
本発明に係るＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１を植物から精製する場合には、例えば、各活性を測定しつつ、一般的な抽出、塩析、クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて用いればよい。また、本発明に係るＰｍＣＹＰ７９遺伝子およびＰｍＣＹＰ７１遺伝子を用いて形質転換した場合には、ＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１は、形質転換体から同様に精製してもよい。また、本発明における精製は、各酵素が単離されるまでの精製に限定されるものではなく、菌体破砕液などの粗精製も含まれるものとする。
【００６０】
＜ベクター＞
本発明に係るベクターは、上記ＰｍＣＹＰ７９遺伝子およびＰｍＣＹＰ７１遺伝子のうち少なくとも一つを含む。かかるベクターは、公知の形質転換方法によって宿主に発現可能に導入されることによって、当該宿主において組み込まれた遺伝子あるいは遺伝子断片を発現させて本発明のＰｍＣＹＰ７９および／またはＰｍＣＹＰ７１の製造に利用できるものである。なお、本発明のＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１は、下記のように組換え産生により得られたものでもよいし、植物から単離、精製したものでもよく、その起源は特に限定されない。
【００６１】
本発明において使用することができるベクターとしては、従来から細菌や真菌などの形質転換に使用されているベクターを挙げることができる。例えば細菌用ベクターとしては、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ系などを挙げることができ、酵母用ベクターとしては、ｐＧＹＲ、ｐＦＬＤ、ｐＹＥＳ２などを挙げることができ、植物用ベクターとしては、ｐＢＩ１２１を挙げることができる。
【００６２】
本発明に係るベクターは、上記ＰｍＣＹＰ７９遺伝子およびＰｍＣＹＰ７１遺伝子の他に、遺伝子を発現させるための従来公知の構成的プロモーター、発現誘導性プロモーター、形質転換体の選抜を容易にする薬剤耐性遺伝子を含んでいることが好ましい。構成的プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターやカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを挙げることができる。発現誘導性プロモーターとしては、例えば、Ｌａｃプロモーターやアルコールオキシダーゼプロモーターを挙げることができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシンに対する抵抗性遺伝子を挙げることができる。
【００６３】
宿主細胞が内在性のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子を有さない場合は、本発明のＰｍＣＹＰ７９またはＰｍＣＹＰ７１の活性を宿主細胞内で発揮させるために、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子を含むベクターを使用するのが好ましい。
【００６４】
＜形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、上記ＰｍＣＹＰ７９遺伝子およびＰｍＣＹＰ７１遺伝子のうち少なくとも一つを含む上記ベクターにより形質転換されているものである。当該形質転換体は、上記ベクターを対象の宿主細胞に導入することにより調製される。
【００６５】
本発明に係る形質転換体は、上記ベクターに含まれた上記ＰｍＣＹＰ７９遺伝子および／またはＰｍＣＹＰ７１遺伝子が導入されたものである。より具体的にいえば、本発明に係る形質転換体は、本発明のＰｍＣＹＰ７９および／またはＰｍＣＹＰ７１をコードする遺伝子が導入されたものである。ここで、「遺伝子またはベクターが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法により、本発明のＰｍＣＹＰ７９遺伝子および／またはＰｍＣＹＰ７１遺伝子が、例えばプロモーターの作用により発現可能に導入されることを意味する。
【００６６】
本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子を直接、或いは上記遺伝子が組み込まれたベクターを宿主に導入することによって得られる。上記宿主は、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌などの原核生物、酵母などの真菌、あるいは、植物細胞や昆虫細胞などを挙げることができる。後記の実施例に記載のように、宿主細胞としては、酵母が好ましい。さらに、上記ベクターに組み込まれた本発明遺伝子が植物の一種であるウメ由来のものであることから、上記宿主としては、植物も好ましく、そのなかでも、ウメ、モモ、アーモンドなどのバラ科植物等のアミグダリン産生細胞が特に好ましい。なお、形質転換は一過性でもよいが、好ましくは安定に上記遺伝子が組み込まれるものである。
【００６７】
本発明の遺伝子は、宿主細胞内で発現可能なプロモーター、例えば、大腸菌ではＬａｃプロモーター、酵母では、ＧＡＰＤＨプロモーターやアルコールオキシダーゼプロモーター、植物細胞では、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、昆虫細胞では、バキュロウイルスプロモーターの下流域に連結して使用する。なお、宿主細胞が内在性のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子を有さない場合は、本発明のＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１の活性を宿主細胞内で発揮させるためにはＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子を導入する必要がある。昆虫細胞では、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼを導入しなくても、内在性のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼだけで本発明酵素の活性を発揮せしめることができ、酵母でも低い活性であれば内在性のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼだけで発揮せしめることができる。
【００６８】
上記形質転換宿主細胞を含む形質転換体を作製する方法としては、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、形質転換植物を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．，Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．，ｐｐ６６-７４（１９９５））、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１００，１５０３〜１５０７（１９９２））、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，９５７〜９６２（１９９１））およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１-２８２（１９９４））などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記形質転換方法は、宿主となる生物の種類に応じて適宜選択されることが好ましい。即ち、例えば宿主が酵母である場合は、塩化リチウム法が好ましい。
【００６９】
組換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明酵素をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母等の真菌細胞、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。特に、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子を有するベクターを用いることができ、さらに取り扱いが容易であることから酵母発現系が好ましい。
【００７０】
宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．＆  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５８〜１６２（１９７０）；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，５５７〜５８０（１９８３））を用いることができる。また、酵母への導入には、塩化リチウム法（Ｉｔｏ  Ｈ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｙ，Ｍｕｒａｔａ  Ｋ．＆  Ｋｉｍｕｒａ  Ａ．，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｌｋａｌｉ  ｃａｔｉｏｎｓ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５３，１６３〜１６８（１９８３））が挙げられる。宿主細胞内で発現させた組換えタンパク質は、当該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
【００７１】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質またはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血餅を除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質またはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、当該細胞を増殖させ、細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
【００７２】
＜マンデロニトリル誘導体の製造方法＞
本発明に係るＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１を用いれば、上記フェニルアラニン化合物（Ｉ）からマンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）を製造することができ、さらにニトリラーゼを用いることにより、マンデル酸化合物（ＩＶ）を製造することができる。以下、各工程につき説明する。
【００７３】
工程（Ａ）：フェニルアセトアルドキシム化合物の製造工程
まず、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアラニン化合物（Ｉ）にＰｍＣＹＰ７９を作用させることにより、フェニルアセトアルドキシム化合物（ＩＩ）を得る。
【００７４】
【化４】
2015165792.tif 000005
【００７５】
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
【００７６】
上記反応の溶媒としては、酵素の失活を防ぐためやフェニルアラニン化合物（Ｉ）の溶解性から水を用いる。
フェニルアラニン化合物（Ｉ）の濃度は適宜調整すればよいが、例えば、１ｍＭ以上、３０ｍＭ以下程度にすればよい。
【００７７】
ＰｍＣＹＰ７９とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの濃度は、反応が十分に進む範囲で適宜調整すればよいが、例えば、ＰｍＣＹＰ７９の濃度を１Ｕ／ｍＬ以上、１Ｕ／ｍＬ以下程度、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの濃度を１０Ｕ／ｍＬ以上、１００Ｕ／ｍＬ以下程度とすることが好ましい。なお、ここでの１Ｕは、それぞれＬ−フェニルアラニンとＮＡＤＰ+１μｍｏｌを３０℃、１分間で消費する活性をいうものとする。また、ＰｍＣＹＰ７９とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼは、それぞれ精製品を用いてもよいが、例えば、各酵素の産生菌の培養培地や菌破砕液、ミクロソームなどの粗精製品を用いてもよい。
【００７８】
一般的に、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼはＮＡＤＰＨを用いてＰ４５０の活性中心に存在するヘムを還元し、還元型Ｐ４５０が基質に作用を及ぼすと共に、還元状態にあったヘムは再度酸化型となる。よって、ＮＡＤＰＨは、理論的には基質化合物であるフェニルアラニン化合物（Ｉ）と等モル必要であるが、Ｐ４５０は一般的に失活し易く反応が途中で停止することがあり、反応系中のフェニルアラニン化合物（Ｉ）が全量消費されるとは限らないため、その濃度はフェニルアラニン化合物（Ｉ）の濃度の１／１０程度であってもよい場合がある。
【００７９】
反応温度は、ＰｍＣＹＰ７９とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの活性が十分に発揮される範囲で調整する。例えば、２０℃以上、４５℃以下程度とすればよい。また、反応時間は、フェニルアラニン化合物（Ｉ）の消費がクロマトグラフィーで確認されるまでや、予備実験などで決定すればよいが、通常、１時間以上、２０時間以下程度とすることができる。
【００８０】
反応終了後は、通常の後処理をしてフェニルアセトアルドキシム化合物（ＩＩ）を精製してもよいが、精製せずに次の工程を行ってもよい。
【００８１】
工程（Ｂ）：マンデロニトリル化合物の製造工程
次に、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼの存在下、フェニルアセトアルドキシム化合物（ＩＩ）にＰｍＣＹＰ７１を作用させることにより、マンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）を得る。
【００８２】
【化５】
2015165792.tif 000006
【００８３】
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
【００８４】
本工程（Ｂ）の反応条件は、上記工程（Ａ）と同様に調整することができる。
なお、本工程（Ｂ）は、上記工程（Ａ）に続いて行ってもよいが、上記工程（Ａ）と同時に行ってもよい。即ち、上記工程（Ａ）の反応液へさらにＰｍＣＹＰ７１を添加し、本工程（Ｂ）と上記工程（Ａ）をワンポットで連続的に行い、フェニルアラニン化合物（Ｉ）からマンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）を直接製造してもよい。
【００８５】
本発明において「ワンポット」とは、１つの反応容器へ２以上の工程のための試薬を同時または連続的に添加することにより、２以上の工程を同時または連続的に行うことをいう。
【００８６】
本工程（Ｂ）の目的化合物であるマンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）は不安定であり、ガスクロマトグラフィーなどによる分析では対応するベンズアルデヒド化合物として検出される。よって、本工程（Ｂ）の反応後、生成したマンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）は精製することなく次の工程を行うことが好ましい。
【００８７】
工程（Ｃ）：マンデル酸化合物の製造工程
次に、マンデロニトリル化合物（ＩＩＩ）にニトリラーゼを作用させることにより、下記式（ＩＶ）で表されるマンデル酸誘導体とする。
【００８８】
【化６】
2015165792.tif 000007
【００８９】
［式中、Ｒとｎは上記と同義を示す］
本工程（Ｃ）の反応条件は、上記工程（Ａ）と同様に調整することができる。
【００９０】
ニトリラーゼは、ニトリル化合物をカルボン酸化合物とアンモニアに分解する反応を触媒する酵素である。ニトリラーゼとしては、従来公知のものを用いることができる。また、ＰｍＣＹＰ７９やＰｍＣＹＰ７１と同様に、精製されたものを用いることもできるし、組み換えタンパク質や、ニトリラーゼを含む形質転換体自体、その培養液、その菌体破砕物などを用いることもできる。
【００９１】
また、本工程（Ｃ）は、上記工程（Ｂ）に続いて行ってもよいが、上記工程（Ｂ）と同時に、さらには上記工程（Ａ）および工程（Ｂ）と同時に行ってもよい。即ち、上記工程（Ａ）の反応液へさらにＰｍＣＹＰ７１と共にニトリラーゼを添加し、上記工程（Ａ）からと本工程（Ｃ）をワンポットで連続的に行い、フェニルアラニン化合物（Ｉ）からマンデル酸化合物（ＩＶ）を直接製造してもよい。
【００９２】
反応終了後は、抽出、再結晶、カラムクロマトグラフィーといった通常の後処理をしてマンデル酸化合物（ＩＶ）を精製してもよい。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００９４】
実施例１：ウメＲＮＡ−ｓｅｑｅｎｃｉｎｇデータからのＰ４５０遺伝子の選択
ウメのＲＮＡ−ｓｅｑｅｎｃｉｎｇデータであるＳＲＸ１７７７５９，ＳＲＸ１７７７６０，ＳＲＸ１７７７６１，ＳＲＸ１７７７６２およびＳＲＲＸ１７７７６３を、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のシークエンスリードアーカイブからダウンロードした。ダウンロードしたファイルを、ＳＲＡ  ｔｏｏｌ  ｋｉｔを用いてｆａｓｔｑファイルに変換した。ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ−Ｔｒａｎｓ  ｖ１．０２を用いてアッセンブルし、得られた塩基配列からソルガム由来のＰ４５０であるＣＹＰ７９Ａ１またはＣＹＰ７１Ｅ１の遺伝子の塩基配列と４０％以上の相同性を示す塩基配列を選抜した。得られた塩基配列を配列番号１と配列番号３に示し、それぞれの塩基配列に対応する推定アミノ酸配列を配列番号２と配列番号４に示す。以下、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子をＰｍＣＹＰ７９遺伝子、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をＰｍＣＹＰ７９、配列番号３の塩基配列を有する遺伝子をＰｍＣＹＰ７１遺伝子、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をＰｍＣＹＰ７１という。なお、ＰｍＣＹＰ７９遺伝子とソルガム由来のＣＹＰ７９Ａ１遺伝子との塩基配列相同性は５３％であり、ＰｍＣＹＰ７１遺伝子とソルガム由来のＣＹＰ７１Ｅ１遺伝子との塩基配列相同性は４２％である。
【００９５】
実施例２：ウメ由来Ｐ４５０の調製
以下のとおり、酵母発現系を用い、ＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１を組換えタンパク質として生産させた。
【００９６】
（１）ウメ芽由来ｃＤＮＡ合成
ウメの果実から仁を取り出し、水で濡らしたバーミキュライトに播種し、発芽するまで乾燥しないように水を与えた。発芽した芽から、Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を使用してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡのうち５００ｎｇと逆転写反応キット（タカラバイオ社製，製品名「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ」）を使用して逆転写反応を行った。
【００９７】
（２）  ＰｍＣＹＰ７９遺伝子の増幅
上記（１）で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰｍＣＹＰ７９遺伝子のＯＲＦをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応液は、（１）にて調製したｃＤＮＡ  １μＬ、２ｘＧｆｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μＬ、プライマー１（ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＣ，配列番号７）１．５μＬ、プライマー２（ＴＴＡＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣ，配列番号８）１．５μＬおよびＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．２５Ｕ／μＬ）１μＬとし、滅菌水で総量５０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で６０秒間の後、（ｉｉ）９８℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５２．５℃で２０秒間、（ｉｖ）６８℃で９０秒間の（ｉｉ）〜（ｉｖ）を３０回繰り返した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製用キット（プロメガ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて抽出した。抽出したＰＣＲ産物は、ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，製品名「ｐＣＲ  ｂｌｕｎｔ」）に導入した。ライゲーション反応は、ＰＣＲ産物４．７μＬ、ｐＣＲ  ｂｌｕｎｔ（２５ｎｇ／μＬ）０．３μＬ、１０ｘＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、およびＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μＬ）０．５μＬに滅菌水を加えて１０μＬとし、１６℃で３０分間インキュベートすることで行った。大腸菌ＴＯＰ１０のコンピテントセル１００μＬに、ライゲーション反応液全量を加え、ヒートショック法により形質転換した。得られた形質転換大腸菌を、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌し、生育したコロニーを数株選抜し、０．７％アガロースゲル電気泳動によりＰｍＣＹＰ７９遺伝子のインサートの有無を確認し、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を確認し、得られたプラスミドをｐＣＲ−ＰｍＣＹＰ７９とした。
【００９８】
（３）  ＰｍＣＹＰ７９発現ベクターの構築
ＰｍＣＹＰ７９を酵母由来のシトクロムＰ４５０レダクターゼと共発現させるため、ｐＧＹＲベクター（富山県立大学  榊俊之教授より分与；Ｔ．Ｓａｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，ｐｐ．１６４９７-１６５０２（１９９２）））へＰｍＣＹＰ７９遺伝子を下記の方法により導入した。
インサートＤＮＡはＰＣＲにより調製した。ＰＣＲ反応液は、上記（２）にて調製したｐＣＲ−ＰｍＣＹＰ７９  １μＬ、２ｘＧｆｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μＬ、プライマー３（ＧＡＴＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＡＣ，配列番号９）１．５μＬ、プライマー４（ＡＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＡＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧ，配列番号１０）１．５μＬ、およびＴｋｓ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．２５Ｕ／μＬ）１μＬに滅菌水を加えて総量５０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で６０秒間の後、（ｉｉ）９８℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５２、５℃で２０秒間、（ｉｖ）６８℃で９０秒間の（ｉｉ）〜（ｉｖ）を２５回繰り返した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製用キット（プロメガ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて抽出した。抽出したＰＣＲ産物は、クローニングキット（クロンテック社製，製品名「Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ」）を用い、ｐＧＹＲベクターのＨｉｄＩＩＩサイトへ導入した。反応液は、ＰＣＲ産物１μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ処理済のｐＧＹＲ  １μＬ、および５ｘＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｅｍｉｘ  ０．５μＬとし、５０℃で１５分間インキュベートした。得られたライゲーション反応液全量を大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル１００μＬに加え、ヒートショック法により形質転換した。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、生育したコロニーを数株選抜した。０．７％アガロースゲル電気泳動によりＰｍＣＹＰ７９遺伝子のインサートの有無を確認し、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を確認し、得られたプラスミドをｐＧＹＲ−ＰｍＣＹＰ７９とした。
【００９９】
（４）  ＰｍＣＹＰ７１遺伝子の増幅
ＰｍＣＹＰ７１遺伝子のＯＲＦを、上記（２）と同様の方法でＰＣＲにより増幅した。プライマーは、プライマー５（ＡＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＴＴＴＴＣＡＡＴＣＡ，配列番号１１）およびプライマー６（ＴＣＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣ，配列番号１２）を用いた。増幅した遺伝子を上記（２）に示した方法により抽出してｐＣＲ  ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、ｐＣＲ−ＰｍＣＹＰ７１を得た。
【０１００】
（５）  ＰｍＣＹＰ７１発現ベクターの構築
ｐＧＹＲベクターへ導入するためのＰｍＣＹＰ７１遺伝子を、上記（３）と同様の方法でＰＣＲにより調製した。プライマーは、プライマー７（ＧＡＴＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＴＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＡ，配列番号１３）およびプライマー８（ＡＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＧＡＧＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＡ，配列番号１４）を用いた。増幅した遺伝子を上記（３）に示した方法により抽出し、ｐＧＹＲベクターのＨｉｄＩＩＩサイトへ導入した。得られたプラスミドをｐＧＹＲ−ＰｍＣＹＰ７１とした。
【０１０１】
（６）  ＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１の活性測定
上記で得られたＰｍＣＹＰ７９発現プラスミドであるｐＧＹＲ−ＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１発現プラスミドであるＰｍＣＹＰ７１を酵母に導入し、形質転換した。形質転換酵母を培養した後、ＰｍＣＹＰ７９およびＰｍＣＹＰ７１が局在していると考えられるミクロソーム画分を調製し、その活性を確認することにした。反応産物は、ＬＣ−ＭＳ解析、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析またはＧＣ−ＭＳ解析にて同定した。具体的には以下の手順に従った。
【０１０２】
（ａ）  ＰｍＣＹＰ７９発現プラスミドによる酵母の形質転換
発現用には、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２株を用いた。ＡＨ２２株は、Ｌ−ヒスチジンとＬ−ロイシン以外の全ての必須アミノ酸を生合成することができる。ｐＧＹＲはＬ−ロイシン合成遺伝子（ＬＥＵ２）を持つため、培地にＬ−ヒスチジンを添加するとプラスミドを持った酵母のみが増殖できる。
【０１０３】
上記発現プラスミドを使い、酵母ＡＨ２２株を塩化リチウム法で形質転換した。以下に方法を示す。
酵母ＡＨ２２株を３ｍＬのＹＰＤ培地（１％イーストエクストラクト，２％ポリペプトン，２％グルコース）に植菌し、３０℃で一晩振盪培養した。培養液５００μＬを回収し、３，０００×ｇ，４℃で２分間遠心分離し、上清を除いた。菌体を５００μＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、３，０００×ｇ，４℃で２分間、再度遠心分離した。上清を除き、１００μＬの酢酸リチウム溶液（２Ｍ酢酸リチウム１０μＬ、５０％ＰＥＧ４０００  ８０μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ  １０μＬ）に懸濁し、ＤＮＡ溶液（サケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ、ｐＧＹＲ−ＰｍＣＹＰ７９  １０μＬ）を加えた。４０℃で３０分間インキュベートし、室温で８分間静置した。反応液を３，０００×ｇ，４℃で２分間遠心分離し、上清を取り除き、１ｍＬのＳＤ−Ｈｉｓ（０．６７％  イーストナイトロジェンベースアミノ酸不含，２％グルコース，２０μｇ／ｍＬ  Ｌ−ヒスチジン）に懸濁し、３０℃で５時間回復培養を行った。培養液１００μＬをＳＤ−Ｈｉｓ寒天培地に展開し、３０℃で３日間培養することで、形質転換体であるＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７９のコロニーを得た。
【０１０４】
（ｂ）  ＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７９の培養とミクロソーム画分の調製
上記（ａ）で得たＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７９のコロニーを３ｍＬのＳＤ−Ｈｉｓ培地に植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。培養液を１５０ｍＬの濃縮ＳＤ−Ｈｉｓ培地（８％グルコース，５．４％イーストナイトロジェンベースアミノ酸不含，１６０μｇ／ｍＬ  Ｌ−ヒスチジン）に植継ぎ、２８℃で３日間培養した。組換え酵母の培養に用いる濃縮ＳＤ−Ｈｉｓ培地は、通常酵母の培養に用いるＳＤ−Ｈｉｓ培地より濃縮されているが、これは少ない培地量でできる限り多くの菌体を得るためである。
【０１０５】
培地を５，０００×ｇ，４℃で５分間遠心分離して酵母を集菌し、上清を除き、２０％  グリセロール，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳの溶液（ｐＨ７．６）に懸濁した。当該懸濁液を５，０００×ｇ，４℃で５分間、再度遠心分離し、上清を除いた後に０．１ｍＭ  ＤＴＴ，２０％グリセロール、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液（ｐＨ７．６）に懸濁した。ビーズショッカー（安井機器社製）を用いて酵母を破砕し、破砕液を１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することにより、細胞残渣とビーズを沈殿させた。上清を回収し、１５０，０００×ｇ、２℃で６０分間超遠心分離することでミクロソーム画分を沈殿させた。得られたミクロソーム画分を、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、２０％グリセロール、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液（ｐＨ７．６）１ｍＬに懸濁し、ダウンス型ホモジナイザーを用いて溶液が均一になるまでホモジナイズした。
【０１０６】
（ｃ）  ＰｍＣＹＰ７９組換えタンパク質を用いた酵素反応
ＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７９から得たミクロソームを用いた酵素反応は、５０μＬのミクロソーム、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン（基質）を含む反応液２００μＬで、３０℃、１８０分間行った。
【０１０７】
フェニルアセトアルドキシムの生成の有無はＬＣ−ＭＳを用いて検証した。コスモシル  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩカラム（ナカライテスク社製）を用い、溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸を含むアセトニトリルを用い、５％のＢ液から２５分間のリニアグラジエントで６０％のＢ液、１００％のＢ液で５分間保持し、５％のＢ液で保持した。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。質量分析機はブルカー社のＨＣＴ−ＴＫを用いた。
【０１０８】
結果を図１に示す。ＰｍＣＹＰ７９とフェニルアラニンの反応液からフェニルアセトアルドキシムの標品と一致する２つのピークが得られた。ピークが２つ得られるのは構造異性体、Ｅ体およびＺ体の存在に起因する。さらに、ＭＳ／ＭＳ解析を行った結果、標品と反応液由来のピークのＭＳ／ＭＳパターンが一致したことから、ＰｍＣＹＰ７９がＬ−フェニルアラニンをフェニルアセトアルドキシムに変換することが明らかとなった。
【０１０９】
（ｄ）  ＰｍＣＹＰ７１発現プラスミドによる酵母の形質転換
ＰｍＣＹＰ７１発現プラスミドであるｐＧＹＲ−ＰｍＣＹＰ７１を用い、上記（ａ）の方法に従って、塩化リチウム法により酵母ＡＨ２２株を形質転換し、形質転換体ＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７１を得た。
【０１１０】
（ｅ）  ＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７１の培養とミクロソーム画分の調製
上記（ｄ）で得た形質転換体ＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７１を上記（ｃ）と同様の方法により培養し、ミクロソーム画分を得た。
【０１１１】
（ｆ）  ＰｍＣＹＰ７１組換えタンパク質を用いた酵素反応
上記（ｅ）で調製したＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７１から得たミクロソーム画分を用いた酵素反応は、５０μＬのミクロソーム、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ  フェニルアセトアルドキシム（基質）を含む反応液２００μＬで、３０℃、１８０分間を行った。
【０１１２】
マンデロニトリルの生成の有無はＧＣ−ＭＳ（島津製作所社製、「ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｐｌｕｓ」）を用いて検証した。カラムはＴＣ−７０（ＧＬサイエンス社製）、キャリアガスとしてヘリウムを用い、８０℃から２５０℃へ１分間で１０℃昇温することでクロマトグラフィーを行った。マンデロニトリルは不安定な物質であることから、ＧＣ−ＭＳではベンズアルデヒドとして検出されるため、ベンズアルデヒドをｍ／ｚ１０６で検出した。
【０１１３】
結果を図２に示す。図２のとおり、ＰｍＣＹＰ７１とフェニルアセトアルドキシムの反応液からベンズアルデヒドが検出され、そのマススペクトルはベンズアルデヒド標品のマススペクトルと一致した。よって、ＰｍＣＹＰ７１がフェニルアセトアルドキシムからマンデロニトリルに変換するシトクロムＰ４５０であることが明らかとなった。
【０１１４】
（ｇ）  ＰｍＣＹＰ７１組換えタンパク質の各種アルドキシムに対する基質特異性
上記（ｅ）で調製したＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７１から得たミクロソーム画分を用いた酵素反応は、５０μＬのミクロソーム、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、および、基質として１ｍＭ  各種アルドキシム（フェニルアセトアルドキシム、４−ヒドロキシフェニルアセトアルドキシム、インドール−３−アセトアルドキシム、２−メチルプロパナルオキシムのうちいずれか１種）を含む反応液２００μＬを用いて、３０℃で５分間行った。生成物を超高速液体クロマトグラフィーにより定量し、１分子のＰｍＣＹＰ７１が１分間当たりに反応する各アルドキシムの分子数を算出した。カラムはコスモシル  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（ナカライテスク社製）、移動相は０．１％ギ酸を含む１７．５％アセトニトリルを用い、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。また、比較のために、Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ｐｈｙｓｉｃｓ，３６３，ｐｐ．９−１８（１９９８）とＪoｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１５５，ｐｐ．２８２−２９２（２０１１）に記載のＣＹＰ７１Ｅ１およびＣＹＰ７１Ｅ７のデータを合わせて示す。結果を表１に示す。
【０１１５】
【表１】
2015165792.tif 000008
【０１１６】
表１に示す結果のとおり、ＰｍＣＹＰ７１はフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換するだけでなく、４−ヒドロキシフェニルアセトアルドキシムを４−ヒドロキシマンデロニトリルに、インドール−３−アセトアルドキシムを２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドイル）アセトニトリルに変換することが示された。一方、２−メチルプロパナルオキシムに対する反応性は検出できなかった。
【０１１７】
キャッサバ由来のＣＹＰ７１Ｅ１およびソルガム由来のＣＹＰ７１Ｅ７もフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換することが報告されているが、これらに比べ、ＰｍＣＹＰ７１のターンオーバーは明らかに高いことが示された。
【０１１８】
（ｈ）  ＰｍＣＹＰ７１のフェニルアセトアルドキシムに対するＫｍ値
上記（ｅ）で調製したＡＨ２２−ＰｍＣＹＰ７１から得たミクロソーム画分を用いた酵素反応を、５０μＬのミクロソーム、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、および、基質として１、２、４、６、８または１０μＭのフェニルアセトアルドキシムを含む反応液２００μＬを用いて、３０℃、４分間行い、生成物を超高速液体クロマトグラフィーで定量した。各フェニルアセトアルドキシム濃度に対して算出されたＰｍＣＹＰ７１の活性を図３に示す。
【０１１９】
図３に示す結果から、ＰｍＣＹＰ７１のフェニルアセトアルドキシムへのＫｍ値は３．９μＭと算出された。ＣＹＰ７１Ｅ１およびＣＹＰ７１Ｅ７のフェニルアセトアルドキシムに対するＫｍは報告されていないが、２−メチルプロパナルオキシムに対して最も強い活性を示すソルガム由来ＣＹＰ７１Ｅ７の２−メチルプロパナルオキシムに対するＫｍ値（２１μＭ）と比較しても低い値であることが示された。よって、ＰｍＣＹＰ７１はフェニルアセトアルドキシムをマンデロニトリルに変換するのに適した酵素であることが明らかとなった。
【０１２０】
参考例１：  ニトリラーゼの調製
以下のとおり、マンデロニトリルをマンデル酸へと変換するニトリラーゼとして、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＯｘＢ−１株由来のニトリラーゼを調製した。
【０１２１】
（１）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＯｘＢ−１株由来ニトリラーゼの発現プラスミドの構築
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＯｘＢ−１株由来のニトリラーゼはＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲ反応液としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＯｘＢ−１株ゲノムＤＮＡ  １μＬ、１０ｘＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ｄＮＴＰｓ  ５μＬ、プライマー９（ＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴＣＧ，配列番号１５）１．５μＬ、プライマー１０（ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧ，配列番号１６）１．５μＬおよびＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬに滅菌水を加えて総量５０μＬとした溶液を用いた。プライマー９およびプライマー１０にはそれぞれＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素切断部位を設けた。ＰＣＲ反応の条件は（ｉ）９８℃で６０秒間の後、（ｉｉ）９８℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５３℃で２０秒間、（ｉｖ）６８℃で６０秒間の（ｉｉ）〜（ｉｖ）を３２回繰り返した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製用キット（プロメガ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて抽出した。抽出したＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。ライゲーション反応は、ＰＣＲ産物４．７μＬ、ｐＣＲＩＩ  ｖｅｃｔｏｒ（２５ｎｇ／μＬ）０．３μＬ、１０ｘ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μＬ）０．５μＬに滅菌水を加えて総量１０μＬとした溶液を用い、１６℃で３０分間インキュベートすることで行った。大腸菌ＴＯＰ１０のコンピテントセル１００μＬに、ライゲーション反応液全量を加え、ヒートショック法により形質転換した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で生育したコロニーを数株選抜し、０．７％アガロースゲル電気泳動により、ニトリラーゼ遺伝子のインサートの有無を確認し、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を確認した。以下、得られたプラスミドを「ｐＣＲＩＩ−Ｎｉｔ＿ＯｘＢ」という。ｐＣＲＩＩ−Ｎｉｔ＿ＯｘＢをＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ精製用キット（プロメガ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて抽出した。抽出したＤＮＡ断片は６ｘＨｉｓタグ融合タンパク質として発現させるため、ｐＥＴ２８のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入した。ライゲーション反応は、ＤＮＡ抽出液４μＬ、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限酵素処理を行ったｐＥＴ２８  １μＬ、  １０ｘＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（３５０Ｕ／μＬ）０．５μＬに滅菌水を加えて総量１０μＬとした溶液を用い、１６℃で３０分間インキュベートすることで行った。大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル１００μＬにライゲーション反応液全量を加え、ヒートショック法により形質転換した。得られた形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌し、生育したコロニーを数株選抜し、０．７％アガロースゲル電気泳動によりニトリラーゼ遺伝子のインサートの有無を確認した。以下、得られたプラスミドを「ｐＥＴ２８−Ｎｉｔ＿ＯｘＢ」という。
【０１２２】
（２）  ニトリラーゼ遺伝子の大腸菌における発現とニトリラーゼの精製
上記（１）で得られたプラスミドｐＥＴ２８−Ｎｉｔ＿ＯｘＢを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルにヒートショック法により導入し、形質転換体ＢＬ２１−Ｎｉｔ＿ＯｘＢを得た。ＢＬ２１−Ｎｉｔ＿ＯｘＢを５ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を１Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植継ぎ、３７℃でＯＤ６００が０．５になるまで培養した。ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように培地に加え、２８℃にて１２時間培養した。菌体を５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して集菌した後、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗菌し、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再度懸濁した。菌体を超音波により破砕し、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することで不溶物を沈殿させ、上清を無細胞抽出物として回収した。
【０１２３】
ニトリラーゼの精製は次のように行った。１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＮｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）に上記無細胞出物をロードし、ニトリラーゼを吸着させた。１０ｍＭリン酸緩衝液で非吸着物を溶出した後、ニトリラーゼを０．１Ｍのイミダゾールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。溶出フラクションを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、使用するまで４℃にて保存した。
【０１２４】
（３）  組換えニトリラーゼを用いた酵素反応
上記（２）で調製したニトリラーゼを用いた酵素反応は、５０μＬのニトリラーゼと基質として１ｍＭマンデロニトリルを含む反応液２００μＬで、３０℃、３０分間行った。生成物は超高速液体クロマトグラフィーを用いて検出した。カラムはコスモシル  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（ナカライテスク社製）、移動相は０．１％ギ酸を含む２０％アセトニトリルを用い、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。
【０１２５】
マンデル酸のキラリティーについてはＫｅｚｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７３８，３９−４６（２０００）の方法を参考にして測定した。具体的には、酵素反応液に３００μＬの水と５００μＬの１Ｍ塩酸−イソプロパノールを加え、１００℃で３０分間インキュベートすることで、マンデル酸をイソプロパノールでエステル化した。生成物をヘキサンで抽出し、ガスクロマトグラフィ（島津製作所社製，「ＧＣ−２０１４」）を用いて検出した。カラムはｂｅｔａ−ＤＥＸ  ３２５  （ｓｕｐｅｌｃｏ社製）を用い、１５０℃で１２分間クロマトグラフィーを行った。
【０１２６】
その結果を図４に示す。図４の結果のとおり、ＯｘＢ−１株由来のニトリラーゼがマンデロニトリルをマンデル酸に変換し、さらに、その生成物は（Ｒ）−マンデル酸であることが明らかとなった。
【０１２７】
実施例３：  マンデロニトリルの製造
上記実施例１でＰｍＣＹＰ７９発現酵母から調製したミクロソームと、上記実施例２でＰｍＣＹＰ７１発現酵母から調製したミクロソームを用いて、フェニルアラニンからマンデロニトリルの生産を試みた。反応溶液は、２５μＬのＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソーム、２５μＬのＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソーム、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、基質として１０ｍＭのＬ−フェニルアラニンを含む溶液２００μＬで、３０℃、１８０分間行った。マンデロニトリルの生成の有無は、ＧＣ−ＭＳ（島津製作所社製，「ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｐｌｕｓ」）を用いて、上記実施例２（ｆ）の方法に従い検証した。比較のために、ＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームのみ含む反応液でも同様の実験を行った。ＧＣ−ＭＳの結果を図５に示す。
【０１２８】
図５に示す結果のとおり、ＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームのみの反応液中では、フェニルアセトアルドキシムが検出され、ベンズアルデヒドは検出できなかった。ＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソームとＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソームとを組み合わせた反応液中ではフェニルアセトアルドキシムは検出されず、ベンズアルデヒドが検出された。マンデロニトリルは不安定なため、ＧＣ−ＭＳではベンズアルデヒドとして検出されることを先に述べた。つまり、ＰｍＣＹＰ７９とＰｍＣＹＰ７１を組み合わせることで、有害なシアン化合物を用いずにワンポットでＬ−フェニルアラニンからマンデロニトリルが製造できることが実証された。
【０１２９】
実施例４：  マンデル酸の製造
上記実施例１でＰｍＣＹＰ７９発現酵母から調製したミクロソーム、上記実施例２でＰｍＣＹＰ７１発現酵母から調製したミクロソーム、および上記参考例１で得たＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＯｘＢ−１株由来のニトリラーゼを用いて、フェニルアラニンからマンデル酸の生産を試みた。反応溶液は、２５μＬのＰｍＣＹＰ７９発現ミクロソーム、２５μＬのＰｍＣＹＰ７１発現ミクロソーム、１ｍｇのＯｘＢ−１株由来ニトリラーゼ、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、基質として１０ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニンを含む溶液２００μＬで、３０℃、１８０分間行った。マンデル酸の生成の有無は、超高速液体クロマトグラフィーを用いて上記参考例１（３）に示した方法により検証した。結果を図６に示す。
【０１３０】
図６に示す結果のとおり、マンデル酸の保持時間と一致するピークが上記反応液から得られた。なお、フェニルアラニンからマンデル酸を製造する際の中間体であるフェニルアセトアルドキシムおよびマンデロニトリル（ベンズアルデヒド）は検出されなかった。なお、マンデル酸の生産量は５７μＭであり、収率は約０．６％であった。以上のことからＰｍＣＹＰ７９、ＰｍＣＹＰ７１およびニトリラーゼを組み合わせることで、有害なシアン化合物を用いずにワンポットでフェニルアラニンからマンデル酸を生産することができることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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