(57)【要約】      （修正有）【課題】輸送体−積荷コンジュゲート分子、特に、例えば、タンパク質又はペプチド、核酸、細胞毒性剤、有機分子などの積荷部分を有する新規輸送体コンストラクトのコンジュゲートを提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａで表される新規輸送体コンストラクト及びその変異体、これらのコンジュゲートを含む（医薬）組成物、かかる輸送体コンストラクトを用いる治療方法、及びかかる輸送体コンストラクトの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的膜を通過して移動させることができる輸送体コンストラクトであって、
一般式（Ｉ）（配列番号１）：
ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａ
（前記一般式（Ｉ）中、
Ｄは、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸であり；
Ｌは、Ｌ−鏡像異性体アミノ酸であり；
ａは、０〜３であり；
ｌ、ｍ、及びｎは、互いに独立して１又は２であり；
ｘ及びｙは、互いに独立して０、１、又は２である）
で表される少なくとも１つの配列を含み、
前記一般式（Ｉ）が、配列番号２５２：
ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ
（前記配列番号２５２中、
ｒは、Ｄ−鏡像異性体アルギニンを表し；
Ｘ１からＸ６は、任意のＬ−鏡像異性体アミノ酸であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６のＬ−鏡像異性体アミノ酸のうちの少なくとも４個が、個別にＫ又はＲからなるＬ−鏡像異性体アミノ酸のグループから選択される）
に係る少なくとも１つの配列又はその逆配列からなることを特徴とする輸送体コンストラクト。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６のＬ−鏡像異性体アミノ酸のうちの少なくとも１個が、個別にＱ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ、Ａ、及びＷからなるＬ−鏡像異性体アミノ酸のグループから選択される請求項１に記載の輸送体コンストラクト。
【請求項３】
下記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくともいずれかである請求項１又は２に記載の輸送体コンストラクト、
（ｉ）Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は互いに独立して選択される任意のＬ−鏡像異性体アミノ酸である、
（ｉｉ）Ｘ４はＱであり、Ｘ５はＲであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は互いに独立して選択される任意のＬ−鏡像異性体アミノ酸である。
【請求項４】
下記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の少なくともいずれかである請求項１又は２に記載の輸送体コンストラクト、
（ｉｉｉ）Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＱであり、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は互いに独立して選択される任意のＬ−鏡像異性体アミノ酸である、
（ｉｖ）Ｘ４はＲであり、Ｘ５はＫであり、Ｘ６はＫであり、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は互いに独立して選択される任意のＬ−鏡像異性体アミノ酸である。
【請求項５】
Ｘ１はＹであり、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は互いに独立して選択される任意のＬ−鏡像異性体アミノ酸である請求項１又は２に記載の輸送体コンストラクト。
【請求項６】
ａ）請求項１から５のいずれかに記載の輸送体コンストラクトを含む成分（Ａ）と、
ｂ）エフェクタ分子を含む成分（Ｂ）と、
を含むことを特徴とする輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項７】
エフェクタ分子が、治療活性タンパク質及びペプチド、タンパク質キナーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼであるｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、抗原、抗体、アポトーシス因子、病状に関与しているプロテアーゼ阻害剤、ＢＨ３−ドメイン又はＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、これらタンパク質をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、細胞毒性剤、並びにプロテアーゼ阻害剤を含む小有機化合物から選択される請求項６に記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項８】
病状に関与しているプロテアーゼ阻害剤が、ペプチドプロテアーゼ阻害剤である請求項７に記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項９】
成分（Ｂ）とは異なる少なくとも１つの追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）を更に含み、前記少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が、成分（Ｂ）について定義された様々なエフェクタ分子、その断片、又はその変異体から互いに独立して選択される請求項６から８のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１０】
成分（Ａ）及び（Ｂ）と、任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が、互いに共有結合している請求項６から９のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１１】
少なくとも１つの追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が、シグナル配列又は局在配列から選択され、前記シグナル配列又は局在配列が、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を特定の細胞内標的局在位置又は特定の細胞型に導く請求項６から１０のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１２】
成分（Ｂ）と、少なくとも１つの追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）との少なくともいずれかが、タンパク質又はペプチド配列であり、且つＬ−鏡像異性体アミノ酸、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸、又はＬ−鏡像異性体アミノ酸とＤ−鏡像異性体アミノ酸との混合物からなる請求項６から１１のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１３】
成分（Ｂ）がタンパク質又はペプチド配列である場合には、成分（Ａ）が、輸送体−積荷コンジュゲート分子のＣ末端に位置している請求項６から１２のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１４】
薬剤として使用するための請求項６から１３のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１５】
請求項６から１４のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子と、任意で薬学的に許容できる担体及びビヒクルの少なくともいずれかとを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
輸送体−積荷コンジュゲート分子を調製するための請求項１から５のいずれかに記載の輸送体コンストラクトの使用。
【請求項１７】
輸送体−積荷コンジュゲート分子が、請求項６から１４のいずれかに定義されている請求項１６に記載の輸送体コンストラクトの使用。
【請求項１８】
治療される患者の細胞又は組織に積荷分子を輸送するために用いられる請求項６から１４のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項１９】
積荷が、請求項６から１３のいずれかに定義されている請求項１８に記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項２０】
特に治療される患者の、白血球及び神経細胞の少なくともいずれかに積荷分子を輸送するために用いられる請求項１８又は１９に記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子。
【請求項２１】
治療される患者の細胞又は組織に積荷分子を輸送するために用いられる請求項１から５のいずれかに記載の輸送体コンストラクト。
【請求項２２】
積荷が、請求項６から１３のいずれかに定義されている請求項２１に記載の輸送体コンストラクト。
【請求項２３】
特に治療される患者の、白血球及び神経細胞の少なくともいずれかに積荷分子を輸送するために用いられる請求項２１又は２２に記載の輸送体コンストラクト。
【請求項２４】
欠損性アポトーシスにより引き起こされる疾患を含む癌若しくは腫瘍疾患、炎症性疾患、感染性疾患、ウイルス（感染性）疾患、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患、自己免疫障害、自己免疫疾患、心臓血管疾患、神経疾患、神経変性疾患、肝臓疾患、脊椎疾患、子宮疾患、大鬱病性障害、非慢性炎症性消化器疾患、慢性炎症性消化器疾患、聴力損失、内耳疾患の予防、治療、及び回復の少なくともいずれかを行う薬剤を調製するため、又は組織移植において用いるための請求項６から１４のいずれかに記載の輸送体−積荷コンジュゲート分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式（Ｉ）ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａで表される新規輸送体コンストラクト及びその変異体に関する。また、本発明は、輸送体−積荷コンジュゲート分子、特に、積荷部分（例えば、タンパク質又はペプチド、核酸、細胞毒性剤、有機分子など）を有する新規輸送体コンストラクトのコンジュゲートに関する。本発明は、更に、これらコンジュゲートを含む（医薬）組成物、及び前記輸送体コンストラクトを用いる治療方法、及び前記輸送体コンストラクトの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外部媒体から組織又は細胞、特に細胞核に、核酸、タンパク質、又は細胞毒性剤などの対象物質だけでなく他の（治療用に有効な）化合物をも効率的に輸送できる技術は、バイオテクノロジーの分野で大きな関心を集めている。これらの技術は、インビトロ及びインビボで核酸を細胞に輸送し翻訳するため、それによってタンパク質又はペプチドの生成、遺伝子発現の制御、細胞毒性作用又はアポトーシス作用の誘導、細胞内プロセスの分析、及び様々な異なる積荷の細胞（又は細胞核）への輸送の効果の分析などをすることに適している場合がある。
【０００３】
外部媒体から組織又は細胞への対象積荷の輸送の１つの重要な用途は、遺伝子治療であり、この場合、前記積荷は、一般的に、核酸又は遺伝子である。この技術は、過去数十年間で幾つかの非常に有望な開発が行われた。しかし、遺伝子輸送は、一般的に、遺伝子輸送ベクターが、ホストゲノムに影響を与えることなく、又は活性積荷の生物学的性質を変化させることなく、治療されるホスト細胞の細胞質又は核に生物学的活性積荷を効率的に輸送することができないという制限を受けている。
【０００４】
これに関して、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を、より効率的に細胞にトランスフェクトするための技術が幾つか開発されている。遺伝子輸送法による患者の細胞又は組織への核酸のトランスフェクションは、分子医学の中核となる方法であり、多くの疾患の治療及び予防において重要な役割を果たしている。
【０００５】
遺伝子輸送法としては、例えば、核酸をリン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストランと共沈させる方法、核酸に細胞膜を通過させ、次いで細胞及び／又は核に侵入させる方法などの一般的な（物理的又は物理化学的）方法などが挙げられる。しかし、この技術は、輸送効率が低く、且つ細胞死の割合が高いという問題点を有する。更に、この方法は、その本質上インビボ法には適用することができず、インビトロ法又はエキソビボ法に限定される。
【０００６】
インビトロにおけるエレクトロポレーション法についても同じことが言える。前記インビトロにおけるエレクトロポレーション法は、高電圧電流を細胞膜に与えることにより、細胞膜を透過性にして、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの新規核酸を細胞内に導入する方法である。しかし、かかる方法は、一般的に、インビボに適していない。更に、この技術もまた、輸送効率が低く、且つ細胞死の割合が高いという問題点を有する。
【０００７】
更に、よく知られている物理的又は物理化学的方法としては、（ネイキッド）核酸の（直接）注入又は遺伝子銃による遺伝子輸送などが挙げられる。遺伝子銃による遺伝子輸送（遺伝子銃粒子衝撃としても知られている）は、コーネル大学で開発された、組織又は培養細胞に遺伝物質を導入する方法である。遺伝子銃による遺伝子輸送は、一般的に、金又は銀粒子などの金属粒子に表面コーティングを施し、吸着ＤＮＡを含むこれらの金属粒子を、遺伝子銃を用いて細胞に撃ち込むことにより行われる。上記と同様に、この方法も、インビトロ法又はエキソビボ法に限定されるが、通常インビボ状況では適用することができない。
【０００８】
他の方法は、所謂輸送体分子の輸送能を利用する。この状況で用いられる輸送体分子は、一般的に、ウイルスエレメントを含むウイルスベクター、即ち、輸送体分子と、非ウイルスベクターとに分類することができる。
【０００９】
今日利用可能な遺伝子治療戦略の中で最も成功している戦略は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びヘルペスウイルスなどのウイルスベクターに依存する遺伝子治療である。これらのウイルスベクターは、一般的に、ＤＮＡ及び核酸に対して、強い親和性を有するウイルス関連物質のコンジュゲートを使用する。その感染性により、ウイルス又はウイルスベクターは、非常に高いトランスフェクション効率を有する。典型的に用いられるウイルスベクターは、トランスフェクトされた細胞内で機能性感染粒子が形成されないよう遺伝的に改変されている。しかし、これらの遺伝的改変による安全措置にもかかわらず、免疫原性、細胞毒性、及び挿入変異誘発に関する、ウイルスベクターに関連する多くの問題が存在する。その例として、例えば、組換え事象が生じて、導入された治療活性遺伝子又はウイルス遺伝子の制御不能な増殖が生じるリスクを避けることができないという問題がある。更に、ウイルスコンジュゲートは、使用が困難であり、一般的に、治療前に長期間の準備が必要となるという問題がある（例えば、特許文献１を参照）。
【００１０】
非ウイルスベクターは、ウイルスベクターほど効率的ではないが、遺伝子治療におけるより安全な代替方法を提供するために数多く開発されている。最も一般的な非ウイルスベクターの一部は、ポリエチレンイミン、デンドリマー、キトサン、ポリリジン、及びペプチドに基づく輸送体系、例えば、多くの種類のペプチドを含み、これらは、概して、本質的にカチオン性であり、且つ静電相互作用を通じてプラスミドＤＮＡなどの核酸と相互作用することができる。
【００１１】
前記薬剤送達を成功させるために、非ウイルスベクター、特にペプチドに基づく輸送体系は、多くの問題点を克服できなければならない。かかる問題点としては、例えば、輸送中に、ＤＮＡ又は他の化合物などの積荷分子を保護すること、及びインビボにおける積荷分子の初期分解又は代謝を防止することなどが挙げられる。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子などの核酸の場合、非ウイルスベクターは、更に、標的細胞において効率的に遺伝子を発現させるために上記分子を特異的に送達する必要がある。
【００１２】
特に、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子などの核酸に関して、現在、遺伝子送達を成功させるために、非ウイルスベクターが克服しなければならない４つの問題点が存在する（例えば、非特許文献１を参照）。即ち、非ウイルスベクターは、１）核酸を密に圧縮し保護すること、２）特定の細胞表面受容体を標的とすること、３）エンドソーム膜を破壊すること、且つ４）核酸積荷を核に送達し、コードされているタンパク質又はペプチド配列を翻訳させることができなければならないという４つの問題点が存在する。
【００１３】
かかる非ウイルスベクター、特にペプチドに基づく非ウイルスベクターは、一般に、これら４つの目的全てを達成することができるという点で他の非ウイルスベクター戦略よりも有益であるが、効率に関して、異なる問題点が存在する。
【００１４】
その例として、リジン及び／又はアルギニンなどの塩基性残基を多く含むカチオン性ペプチドは、ＤＮＡなどの核酸を、血清中で安定化され得る小さく密な粒子に効率的に縮合させることができる。更に、ペプチドリガンドがポリプレックスに結合することにより、特定の受容体及び／又は特定の細胞型を標的とすることができる。上述のようなポリプレックス又はカチオン性ポリマーは、一般的に、負荷電核酸と複合体を形成して、核酸を縮合させ、これら核酸を分解から保護する。ポリプレックス（カチオン性ポリマー）を用いる細胞への輸送は、一般的に、受容体介在性エンドサイトーシスを介して生じる。それによって、ＤＮＡは、例えば、表面受容体に結合してエンドサイトーシスを誘発するポリプレックスポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を介して、トランスフェリンなどの異なる分子に結合する。ポリプレックス（カチオン性ポリマー）としては、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤ−ＭＡＥＭＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）などが挙げられる。かかる効果は、ナノプレックス（ナノ粒子系）又はリポプレックス（リポソーム系）でも知られている。ナノプレックス（ナノ粒子系）は、一般的に、ポリアクリレート、ポリアミド、ポリスチレン、シアノアクリレート、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などの使用を含む。リポプレックス、即ちリポソーム系は、一般的に、細胞膜を模倣することができるカチオン性脂質の使用を含む。それによって、脂質の正荷電部分は、核酸の負荷電部分と相互作用して、細胞膜と融合することができる。リポプレックス、即ちリポソーム系としては、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＥＤＭＰＣなどが挙げられる。
【００１５】
この状況では、受容体介在性エンドサイトーシスも、核酸などの積荷又は治療剤を細胞に標的指向性送達するための実験系において、広く研究されている。受容体介在性エンドサイトーシス中、積荷含有複合体は、細胞膜に位置する積荷特異的な受容体により、又は膜成分内に位置する特異的抗体により選択的に内部移行する。エンドサイトーシス活性は、ＩｇＧ  Ｆｃ、ソマトスタチン、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、トランスフェリン、ＥＧＦ、ＧＬＰ−１、ＶＬＤＬ、又はインテグリン受容体などを含む多くの受容体について報告されている。
【００１６】
前記受容体介在性エンドサイトーシスを介した遺伝子輸送方法において使用するために、様々なペプチド又はタンパク質配列が広く試験されている。興味深いことに、効率的な受容体介在性エンドサイトーシスを導くペプチド配列の単離は、ファージディスプレイ技術を使用することにより大きく進展した。前記ファージディスプレイライブラリは、細胞受容体に対する天然リガンド又は積荷分子及び短いペプチドの改変を含む分子変異源を事実上無限に提供する非常に強力なツールである。また、同様のライブラリをマウスに直接注射して、脳及び腎臓に対して１３倍の選択性を示すペプチド配列を単離することに成功している。
【００１７】
プロタンパク質変換酵素は、分子を細胞へ輸送するために用いることができるペプチド又はタンパク質配列の例として挙げることができる。前記プロタンパク質変換酵素は、受容体介在性エンドサイトーシスを介して内部移行する細胞表面受容体の例である。これらのタンパク質は、ペプチドホルモン、神経ペプチド、及び多くの他のタンパク質の前駆体の生物学的活性型への変換に関与していることが示されている。プロタンパク質変換酵素ファミリーの全ての切断部位は、コンセンサス配列Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒを有する。哺乳類のプロタンパク質変換酵素は、組織分布に基づいて３つの群に分類することができる。フューリン、ＰＡＣＥ４、ＰＣ５／ＰＣ６、及びＬＰＣＩＰＣ７／ＰＣ８／ＳＰＣ７は、広範囲の組織及び細胞株で発現する。対照的に、ＰＣ２及びＰＣ１／ＰＣ３の発現は、ランゲルハンス島、下垂体、副腎髄質、及び多くの脳領域などの神経内分泌組織に限定されている。ＰＣ４の発現は、精巣の精細胞に極めて限定されている。神経内分泌腺特異的変換酵素であるＰＣ２及びＰＣ１／ＰＣ３は、分泌顆粒に主に局在する。ＰＣ５／ＰＣ６Ａも、分泌顆粒に局在することが報告されている。更に、プロタンパク質変換酵素分子の一部が細胞表面に存在するという間接的な証拠が示されており、フューリンがＴＧＮと細胞表面との間を循環することが示されている。まとめると、これらの性質は、プロタンパク質変換酵素が細胞外リガンドを細胞内空間に輸送することを示す。
【００１８】
所謂輸送タンパク質又はタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）も有利である。輸送タンパク質又はタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）に由来するペプチド配列は、一般的に、ポリプレックスの細胞質放出を導く酸性環境下で選択的にエンドソーム膜を溶解することができる。ＨＩＶ−１  ＴＡＴ（ＨＩＶ）、アンテナペディア（ショウジョウバエのアンテナペディア）、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＦＧＦ、又はラクトフェリンなどの輸送タンパク質は、細胞間の巨大分子輸送を行うことができるペプチド（輸送タンパク質）の群であると考えられる。対照的に、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）は、これら配列に共有結合しているタンパク質及びペプチドを、細胞膜を介して細胞に導くことができるペプチドの群であると考えられる（非特許文献２）。輸送タンパク質及びＰＴＤは、共通の基本領域を共有しており、これは、核酸などのポリアニオンに結合することができるので、融合ペプチドの輸送に主に関与していると考えられている。この理論に縛られるものではないが、ＰＴＤは、受容体依存性不飽和吸着エンドサイトーシスを用いるカチオン性トランスフェクション試薬に類似の作用を示すことができる。ＰＴＤは、一般的に、ペプチドに基づくワクチンを投与したとき、ＣＴＬ応答に影響を及ぼすか、又はＣＴＬ応答を増強するために、タンパク質又はペプチドに結合する（総説として、非特許文献３を参照）。
【００１９】
ペプチドに基づく輸送体系は、一般的に、インビボでペプチダーゼによるタンパク質分解を受けて、トランケート型輸送体（及び／又は積荷）配列が生じてしまう。かかるペプチダーゼは、エキソペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼに分類することができ、これらは、両方、タンパク質分解として知られているプロセスにより、より小さなペプチド画分、更には単一アミノ酸へのタンパク質の分解を触媒することができる酵素である。この状況では、エンドペプチダーゼは、一般的に、非末端アミノ酸（即ち、分子内）のペプチド結合を切断するタンパク質分解ペプチダーゼである。エンドペプチダーゼは、一般的に、特定のアミノ酸に対して特異的である。エンドペプチダーゼの例としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、及びエンドペプチダーゼＶなどが挙げられる。トリプシンは、Ｐｒｏの前ではない限り、Ａｒｇ又はＬｙｓの後を切断することが知られている。キモトリプシンは、Ｐｒｏの前ではない限り、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒの後を切断することが知られている。キモトリプシンは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、又はＬｅｕの後では切断速度が緩徐になる。エラスターゼは、Ｐｒｏの前ではない限り、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、又はＶａｌの後を切断する。サーモリシンは、熱安定性エンドペプチダーゼであり、Ｐｒｏの後ではない限り、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、又はＶａｌの前を切断する。サーモリシンは、時に、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、又はＴｈｒの後を切断する。ペプシンは、Ｐｒｏの後ではない限り、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒの前を切断する。最後に、エンドペプチダーゼＶ８は、Ｇｌｕの後を切断することが知られている。エンドペプチダーゼとは対照的に、エキソペプチダーゼは、ポリペプチド鎖の末端からのアミノ酸の除去を触媒し、それによって前記ポリペプチド鎖の末端を切断する酵素である。エキソペプチダーゼは、その切断部位によってアミノペプチダーゼとカルボキシペプチダーゼに分類することができる。アミノペプチダーゼは、一般的に、亜鉛依存性酵素であり、小腸の腺により生成される。アミノペプチダーゼは、通常、ペプチド又はタンパク質配列のアミノ末端から１個のアミノ酸を切断する。カルボキシペプチダーゼは、一般的に、ペプチド結合のカルボキシ末端（Ｃ−末端）を加水分解する酵素である。ヒト、動物、及び植物は、異化からタンパク質成熟に及ぶ多様な機能を有するカルボキシペプチダーゼを数種有しており、前記カルボキシペプチダーゼは、膵液に存在する消化酵素であり、ペプチドのカルボキシ末端から１個のアミノ酸を切断する。具体例は、酵素活性を有する２つの小サブユニットと、酵素を分解から保護する２つの大サブユニットとからなるカルボキシペプチダーゼＮ（ＣＰＮ）、プラズマ亜鉛メタロプロテアーゼである。ＣＰＮは、補体アナフィラトキシン、キニン、及びフィブリノペプチドなどの生物学的活性ペプチドからカルボキシ末端のアミノ酸であるアルギニン及びリジンを切断する。
【００２０】
上に定義されたようなペプチドに基づく輸送体系によるタンパク質切断を改変するために、前記ペプチドに基づく輸送体系は、全てがＤ−アミノ酸からなり、それによって「レトロインベルソ型ペプチド配列」を形成してもよい。用語「レトロインベルソ型（ペプチド）配列」とは、配列の方向が逆であり、且つ各アミノ酸残基のキラリティも反転している直線状ペプチド配列の異性体を指す（例えば、非特許文献４及び５を参照）。Ｄ−鏡像異性体アミノ酸と逆合成とを組み合わせる利点は、各アミド結合におけるカルボニル基とアミノ基の位置が入れ替わるが、各α炭素における側鎖基の位置は保存されるという点である。ペプチドに基づく輸送体のペプチド配列の天然Ｌ−鏡像異性体アミノ酸をＤ−鏡像異性体アミノ酸に構造変化させることにより、インビボにおけるタンパク質切断のリスクが排除されるので、積荷部分を細胞にトランスフェクトする目的のためには有益且つ非常に効率的である。対照的に、用語「逆配列」とは、配列の方向は逆であるが、各アミノ酸残基のキラリティは反転していない配列を指す（例えば、Ｄ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ→Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ）。
【００２１】
しかし、上に定義された輸送体分子としては効率的に機能するが、かかるペプチドに基づく輸送体系のペプチド配列の天然Ｌ−鏡像異性体アミノ酸をＤ−鏡像異性体アミノ酸に構造変化させることは、細胞の全寿命中、又は（周囲）組織若しくは器官においては更に長く、細胞内にこれら輸送体が顕著に蓄積するリスクを伴う。したがって、かかる輸送体は、結合している積荷部分が切断されるか、又はその間に代謝される場合でさえも、細胞内に留まり、更に、未知及び不要な副作用を導く細胞間プロセス及び細胞内プロセスに関与する恐れがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許第５，５２１，２９１号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００７；９（１）Ａｒｔｉｃｌｅ  ３
【非特許文献２】Ｌｅｉｆｅｒｔ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔｏｎ：Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．８  Ｎｏ．１  ２００３
【非特許文献３】Ｍｅｌｉｋｏｖ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋ，Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｔｏ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００５
【非特許文献４】Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）
【非特許文献５】Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、当該技術分野では、上述のように不要な細胞内又は組織内蓄積を避け、それにもかかわらず積荷部分を細胞に効率的に輸送することができる別の非ウイルス輸送体分子、好ましくは上に定義されたペプチドに基づく輸送体系を提供することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記課題は、本明細書に添付されている特許請求の範囲に定義されている発明主題、具体的には、特許請求の範囲に定義されている新規輸送体コンストラクト及びそのコンジュゲート（輸送体−積荷コンジュゲート分子）により解決される。上記目的は、更に、特許請求の範囲に定義されている新規輸送体コンストラクト及びそのコンジュゲートを用いる方法及び使用により解決される。
【００２６】
本発明の第１の態様によれば、本発明の課題は、一般式（Ｉ）（配列番号１）のうちの少なくとも１つの配列を含むか、又は前記配列からなる新規輸送体コンストラクトにより解決される：
ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａ
（式中、
Ｄは、Ｄ−アミノ酸であり、
Ｌは、Ｌ−アミノ酸であり、
ａは、０〜３、好ましくは０〜２、より好ましくは０、１、２、又は３、更により好ましくは０、１、又は２、最も好ましくは１であり、
ｌ、ｍ、及びｎは、互いに独立して、１又は２、好ましくは１であり、
ｘ及びｙは、互いに独立して、０、１、又は２、好ましくは１である）。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
以下の図面は、本発明を更に例証することを意図する。これら図面は、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
【図１】図１は、ポリ−Ａｒｇ配列を有する幾つかの輸送体コンストラクトを用いたプロテイナーゼによる定量的分解アッセイの結果を示し、それぞれ異なるＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸のパターン（Ｄ−／Ｌ−パターン）を示す。このアッセイで用いられる輸送体コンストラクトを１〜６と命名した。配列のＤ−／Ｌ−パターンの違いは、大文字及び小文字を用いて表す。これらの配列中の大文字（「Ｒ」−アミノ酸）は、Ｌ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指し、これら配列中の小文字（「ｒ」−アミノ酸）は、Ｄ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指す。時間間隔ｔ＝０分間、１０分間、及び４０分間においてプロテイナーゼＫに対する感受性を測定した。次いで、プロテイナーゼＫによる定量的分解アッセイの結果を、これら特定の時間間隔で採取したサンプルに基づいて判定した。レファレンス値として出発物質のイオン強度を用い、質量分析を利用してこれらサンプルを分析した。結論として、３以上の連続したＬ−Ａｒｇが配列中に存在するとき、ペプチドは、プロテイナーゼＫに対する感受性を示し、分解される。互いに隣接する２以下のＬ−Ａｒｇを有するペプチドは、分解されず、結果は、それぞれＤ−ＪＮＫｉである全−Ｄ−配列又はＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）と類似していた。
【図２】図２は、各々９アミノ酸長を有するが、Ｄ−／Ｌ−パターンの異なる４種の異なる輸送体コンストラクトのＤ−／Ｌ−ＴＡＴ誘導体（Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）、ｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる；配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）、及びＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）と呼ばれる）の比較を表で示す。配列のＤ−／Ｌ−パターンの違いは、大文字及び小文字を用いて記載する。これらの配列中の大文字（「Ｒ」−アミノ酸）は、Ｌ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指し、これら配列中の小文字（「ｒ」−アミノ酸）は、Ｄ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指す。図２に示す表は、これらＴＡＴ由来輸送体コンストラクトのアミノ酸配列の分子量（ＭＷ）及びｐＩ値に関して例証する。
【図３】図３は、これらＴＡＴ由来輸送体が完全に分解されるまで、３７℃で１０％及び５０％のヒト血清中にてＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを消化した結果を示す。ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトについては図２に記載されている通りであるが、輸送体コンストラクトｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる；配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）は、β−アラニンでＮ末端が更に保護されていた。図３から分かるように、Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトは、プロテアーゼ耐性であるが、Ｌ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトは、インビボにおける分解が速すぎて細胞に効率的に輸送することができない。治療に用いるためにインビボ安定性を制限することができる好適な時間制限内で分解されたのは、輸送体コンストラクトｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる；配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）のみである。
【図４】図４は、ペプチドを保護するためにβ−アラニン（β−Ａｌａ）を含んでいるこれらＴＡＴ由来輸送体が完全に分解されるまで、３７℃で１０％及び５０％のヒト血清中にてＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを消化した結果を示す。したがって、図３に既に記載されているＬ−ＴＡＴｉのように、ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトＬ−ＴＡＴのＮ末端にβ−Ａｌａが付加されていた。図４から分かるように、β−アラニンによる輸送体ペプチドのＮ末端保護は、有意な効果、即ち、安定性の改善を導かない。
【図５】図５は、ＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトのＨＬ−６０細胞株の細胞への時間依存性内部移行（取り込み）の結果を示す。ＨＬ−６０細胞を、１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＴＡＴ誘導体輸送体と共に３０分間、１時間、６時間、又は２４時間インキュベートした。次いで、細胞を酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファの添加により細胞を破壊した。次いで、各抽出物の蛍光強度を読み取った後（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、バックグラウンドを減少させて、タンパク質含量を正規化することにより、内部移行したペプチドの相対量を決定した。ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ輸送体コンストラクト（配列番号２０）は、Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトと同程度有効な内部移行能を示した。ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ輸送体コンストラクト（配列番号２１）は、既に記載した両輸送体のように時間依存的に内部移行し、効率は低いが依然として好適であるように思われ、一方、Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）は、２４時間の期間中蓄積されない。
【図６】図６は、蛍光標識ＴＡＴ誘導体輸送体で処理された細胞の共焦点顕微鏡観察結果を示す。Ｐ２  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット由来の解離皮質一次ニューロンを神経基礎培地中で１２日間培養した後、５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）のＦＩＴＣ標識ＴＡＴ誘導体輸送体に２４時間曝露した。氷上においてＰＢＳで５回細胞を洗浄し、次いで、予め固定することなしにｆｌｕｏｒｓａｖｅ封入培地に封入した。ＬＳＭ５１０メタ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像を取得した。ＬＳＭ５１０ソフトウェアを用いて画像を処理し、Ａｄｏｂｅ  ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いてマウント（ｍｏｕｎｔ）した。５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）のＦＩＴＣ−輸送体による標識（Ａ：緑）を共焦点顕微鏡により可視化した。核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｂ：青）により染色した。ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）に加えて、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（配列番号２１）輸送体コンストラクトも、ストレスを加えていないニューロンの細胞質に内部移行した（Ｃ：マージしたパネル）。しかし、２４時間インキュベートした後、Ｌ−ＴＡＴ輸送体（配列番号１８）はもはや存在していなかった。
【図７】図７は、インビトロにおけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクト（１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、ＨｅｐＧ２肝細胞癌腫、ＨＣＴ−１１６腫瘍性結腸、２４時間）の取り込み（内部移行）を示す。用いたコンストラクトは、各々９アミノ酸長を有するが、Ｄ−／Ｌ−パターンが異なる、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）及びｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）、並びに試験コンストラクトｒ６Ｒ３（配列番号２６０）及びＤＡＫであり、これらコンストラクトは、Ｎ−末端がβ−アラニンで更に標識されていた。図から分かるように、コンストラクトＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）及びｒ６Ｒ３（配列番号２６０）の取り込みが最も効率的であり、次にｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（配列番号２１）が効率的であった。
【図８】図８は、インビトロにおけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）（１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、Ｕ９３７、リンパ腫、２４時間）を示す。用いたコンストラクトは、４つの異なるＴＡＴ由来輸送体コンストラクト（Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）、ｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる）（配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる、配列番号２１）、及びＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１））であり、これらのアミノ酸長は各々９であるが、異なるＤ−／Ｌ−パターンを有する。更に、アミノ酸Ｄ、Ａ、及びＫのみを含有するコンストラクトＤＡＫを比較のために対照サンプルとして用いた。図から分かるように、ｒ３−ＴＡＴ（配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（配列番号２１）、及びＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）輸送体コンストラクトの細胞への取り込みが最も効率的であり、Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）の細胞への取り込みは有意に少なかった。
【図９】図９は、Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）が、Ｕ９３７細胞（リンパ腫）において、２４時間に亘って５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）の濃度でＨＳＰＧ依存的であることを示す。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、ＦＩＴＣで標識されており、且つＮ−末端がβ−アラニンで標識されているＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【図１０】図１０は、５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴでは、Ｕ９３７細胞におけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの離脱が観察されないことを示す。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、且つＦＩＴＣで標識されているＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【図１１】図１１は、１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴではＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの離脱が見られ、且つＨＳＰＧ依存的であることを示す（Ｕ９３７細胞、リンパ腫）。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、ＦＩＴＣで標識されており、且つＮ−末端がβ−アラニンで標識されているＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【図１２】図１２は、非ＷＢＣ株（白血球細胞株）において１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴではＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）及び離脱が見られることを示す。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、且つＦＩＴＣで標識されているＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【図１３Ａ】図１３Ａは、一般式（Ｉ）で表されるＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを用いた内部移行実験を示す。図１３Ａ及びＢから分かるように、２４時間インキュベートした後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２；可能な配列の選択については上記を参照されたい）を有する輸送体は全て、Ｌ−ＴＡＴ輸送体（配列番号１８）よりも高い内部移行能を示した。９６ウェルプレート内で、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のｒ３−Ｌ−ＴＡＴ由来輸送体と共に２４時間Ｈｅｌａ細胞をインキュベートした。次いで、酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファを添加することにより細胞を破壊した。各抽出物の蛍光強度を読み取った後（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、バックグラウンドを減少させて、内部移行したペプチドの相対量を決定した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、一般式（Ｉ）で表されるＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを用いた内部移行実験を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、一般式（Ｉ）で表されるＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを用いた内部移行実験を示す。図１４Ａ〜Ｄから分かるように、１つの位置が、最高の輸送体活性及び輸送体活性動態の改善に重要であると思われ、それは、位置２のＹ（配列番号１１６に相当するペプチドＮ９１）である。簡潔に述べると、漸増用量のｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−誘導体輸送体（０．５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）、又は１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ））と共に、２４ウェルプレート内で２時間、６時間、又は２４時間Ｈｅｌａ細胞をインキュベートした。次いで、酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファを添加することにより細胞を破壊した。各抽出物の蛍光強度を読み取った後（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、バックグラウンドを減少させて、内部移行したペプチドの相対量を決定した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、一般式（Ｉ）で表されるＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを用いた内部移行実験を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、一般式（Ｉ）で表されるＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを用いた内部移行実験を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、一般式（Ｉ）で表されるＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを用いた内部移行実験を示す。
【図１５】図１５は、蛍光ＴＡＴ誘導体輸送体Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）−ＦＩＴＣ又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）−ＦＩＴＣが、異なるヒト白血球集団を標的とすることを示す図である。  図１５Ａ：Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）−ＦＩＴＣ。それぞれの象限に出入りした細胞の割合は以下の通りである（左上の象限から時計回りに）：単球（ＣＤ１４）９．２４；１９．３７；３１．７１；３９．６８；好中球（ＣＤ１５）１７．０３；１３．８７；２１．５３；４７．５７；リンパ球Ｔ（ＣＤ３）２２．７；１１．８２；１８．０１；４７．４６；リンパ球Ｂ（ＣＤ１９）３２．４０；２．１２；８．２６；５７．２２。  図１５Ｂ：ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）−ＦＩＴＣ。それぞれの象限に出入りした細胞の割合は以下の通りである（左上の象限から時計回りに）：単球（ＣＤ１４）６．３４；１６．６５；３６．２４；４０．７７；好中球（ＣＤ１５）１１．７４；１３．７５；２４．７６；４９．７５；リンパ球Ｔ（ＣＤ３）２０．６４；８．９６；２０．０４；５０．３６；リンパ球Ｂ（ＣＤ１９）２７．８３；１．７６；８．４８；６１．９２。
【図１６】図１６は、図１５（ＦＩＴＣチャネル）に示した各細胞型における蛍光ＴＡＴ誘導体輸送体Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）−ＦＩＴＣ又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）−ＦＩＴＣの平均蛍光値を示す。
【図１７】図１７は、本発明に係る選択された輸送体コンストラクトの様々な細胞型による取り込みを示す。取り込みは、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）に対して正規化する。ＨｅｐＧ２：肝細胞癌腫細胞（ヒト；非白血球細胞株）；Ａ５４９：肺上皮細胞（ヒト；非白血球細胞株）；Ｒａｗ：マクロファージ細胞（マウス；白血球細胞株）；Ｊ７７：マクロファージ細胞（マウス；白血球細胞株）；ＢＭＤＭ：骨髄由来マクロファージ（マウス；精製一次白血球）。＊ｎ＝２の独立した実験（２連）（ｎ＝１、２連であるペプチド番号６４を除く）、＊＊ｎ＝２の実験（２連）（ｎ＝２、２連であるペプチド番号６４を除く）、＊＊＊ｎ＝１の実験（２連）。
【図１８】図１８は、本発明に係る選択された輸送体コンストラクトの様々な細胞型による取り込みを示す。取り込みは、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）に対して正規化する。ＨｅｐＧ２：肝細胞癌腫細胞（ヒト；非白血球細胞株）；Ａ５４９：肺上皮細胞（ヒト；非白血球細胞株）；Ｒａｗ：マクロファージ細胞（マウス；白血球細胞株）；Ｊ７７：マクロファージ細胞（マウス；白血球細胞株）；ＢＭＤＭ：骨髄由来マクロファージ（マウス；精製一次白血球）。＊ｎ＝２の独立した実験（２連）（ｎ＝１、２連であるペプチド番号６４を除く）、＊＊ｎ＝２の実験（２連）（ｎ＝２、２連であるペプチド番号６４を除く）、＊＊＊ｎ＝１の実験（２連）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「輸送体コンストラクト」は、生物学的膜を通過して移動させることができるアミノ酸含有化合物を指す。本明細書で使用するとき、用語「輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）配列」（又は「輸送体配列」）は、生物学的膜を通過して移動するアミノ酸の配列を指す。したがって、本発明に係る輸送体コンストラクトは、生物学的膜を通過して前記輸送体コンストラクトを移動させることができる輸送配列を含む。したがって、一般式（Ｉ）に係る新規輸送体コンストラクトは、積荷部分、例えば、タンパク質又はペプチド、核酸、小有機分子、抗原、細胞毒性剤などを、生物、組織、細胞（例えば、治療される細胞）、細胞亜区画、及び／又は細胞核に効率的に輸送することができる。
【００２９】
有利なことに、一般式（Ｉ）に係る本発明の輸送体コンストラクトは、積荷部分がその標的場所に輸送される前に、プロテアーゼによって分解されるのを防ぐのに十分な程度安定である。一方、一般式（Ｉ）に係る本発明の輸送体コンストラクトは、細胞内に永続的に存在する訳ではなく、新規本発明の輸送体又はそのコンジュゲートが細胞内に不要に蓄積するなどの有害な副作用を避けるために、かなり長い制限時間内にプロテアーゼによって分解され得る。驚くべきことに、本発明者らは、上に定義された一般式（Ｉ）の本発明のパターン（本明細書では、Ｄ−／Ｌ−パターンとも記載する）、即ち、一般式（Ｉ）中の定義された特定の含量のＬ−アミノ酸を特定の含量及び位置のＤ−アミノ酸に変更することによってのみ、輸送配列、特に当該技術分野において既知である任意の輸送配列にかかる有利な性質を付与できることを見出した。本発明のＤ−／Ｌ−パターンにより、当業者は、かなり長い制限時間内にプロテアーゼによって本発明の新規輸送体コンストラクトが分解される前に、確実に本発明の新規輸送体コンストラクトを投与し、前記輸送体コンストラクトが細胞又は核に侵入するのに十分長い時間として、インビボ又はインビトロにおける、上に定義された本発明の新規輸送体コンストラクトの細胞内における残存率を十分正確に規定することができる。このインビボ又はインビトロにおける、本発明の新規輸送体コンストラクトの細胞内における残存率は、実際に、一般式（Ｉ）に定義された特定の含量のＬ−アミノ酸から変更された特定の含量及び位置のＤ−アミノ酸に依存する。更に、上に定義された一般式（Ｉ）で表される本発明のＤ−／Ｌ−パターンを示す輸送体コンストラクトは、以下に定義するような輸送体−積荷コンジュゲート分子において積荷部分が本発明の新規輸送体コンストラクトによる立体障害を受けるのを防ぐのに十分な程度短い。また、それによって、かかる本発明の新規輸送体コンストラクトをコスト効率よく調製することができる。更に、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子などの核酸分子、又は細胞毒性剤、更には小有機分子などを有する、上に定義された一般式（Ｉ）で表される輸送体ペプチド又はタンパク質のコンジュゲートを、容易に形成することができる。
【００３０】
上に定義された一般式（Ｉ）によれば、本発明の新規輸送体コンストラクトは、一般式（Ｉ）に記載される特定のＤ−／Ｌ−パターンに従ってＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸を含む。
【００３１】
本発明の状況では、Ｌ−鏡像異性体アミノ酸とも呼ばれるＬ−アミノ酸は、天然アミノ酸又はその誘導体から選択されるアミノ酸であることが好ましい。前記天然アミノ酸は、一般的に、標準的な（タンパク質を構成する）アミノ酸として、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンなどが挙げられ、非標準的なアミノ酸として、例えば、オルニチン、シトルリン、ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン、ヒドロキシプロリン、セレノシステイン、ピロリジン、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、γ−アミノ酪酸などが挙げられる。
【００３２】
かかるＬ−アミノ酸又はＬ−鏡像異性体アミノ酸の誘導体は、一般的に、以下の翻訳後修飾又は合成修飾を含む上記で定義されたアミノ酸を含むが、これらに限定されない、Ｌ−アミノ酸又はＬ−鏡像異性体アミノ酸の任意の天然誘導体又は非天然誘導体を含む：アセチル化（ペプチド配列のＮ末端、リジン残基などにおける）、脱アセチル化、アルキル化、例えば、メチル化、エチル化など（好ましくは、ペプチド配列内のリジン又はアルギニン残基における）、脱アルキル化、例えば、脱メチル化、脱エチル化など、アミド化（好ましくは、ペプチド配列のＣ末端における）、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グルタミル化、グリコシル化（好ましくは、ペプチド配列内のアスパラギン、リジン、ヒドロキシリジン、セリン、又はスレオニン残基などにおける）、ｈｅｍｅ又はｈａｅｍ部分の付加、ヒドロキシル化、ヨウ化、イソプレニル化（ファルネシル又はゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド部分の付加）、リポイル化（リポ酸塩官能基の結合）、例えば、プレニル化など、ＧＰＩアンカーの形成、例えば、ミリストイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニオール化などを含む、酸化、リン酸化（例えば、ペプチド配列内のセリン、チロシン、スレオニン、又はヒスチジン部分などの）、硫酸化（例えば、チロシンの）、セレノイル化、硫酸化などが挙げられる。
【００３３】
また、前記Ｌ−アミノ酸の誘導体としては、特に制限はなく、以下の標識のうちの１つを導入することにより修飾されている修飾Ｌ−アミノ酸などが挙げられる。前記標識としては、
（ｉ）放射性標識、即ち、放射性リン酸化、又は硫黄、水素、炭素、窒素などを含む放射性標識；
（ｉｉ）着色色素（例えば、ジゴキシゲニンなど）；
（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセイン、ローダミン、以下に定義する蛍光色素タンパク質など）；
（ｉｖ）化学発光基；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の標識のうちの２以上の標識を組み合わせたものが挙げられる。
【００３４】
前記Ｌ−アミノ酸の誘導体としては、特に制限はなく、例えば、ＡＭＣ（アミノメチルクマリン）、Ｄａｂｃｙｌ（ジメチルアミノフェニルアゾベンゾイル）、Ｄａｎｓｙｌ（ジメチルアミノナフタレンスルホニル）、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、Ｍｃａ（メトキシクマリンアセチル）、Ｘａｎ（キサンチル）、Ａｂｕ（アミノ酪酸）、Ｂｅｔａ−Ａｌａ（β−アラニン）、Ｅ−Ａｈｘ（６−アミノヘキサン酸）、Ａｌｐｈａ−Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｍｓ（アミノセリン）、Ｃｈａ（シクロヘキシルアミン）、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）、Ｈｓｅ（ホモセリン）、Ｈｙｐ（ヒドロキシプロリン）、Ｍｐｒ（メルカプトプロピオン酸）、Ｎａｌ（ナフチルアラニン）、Ｎｖａ（ノルバリン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｐｈｇ（フェニルグリシン）、Ｓａｒ（サルコシン）、Ｓｅｃ（セレノシステイン）、Ｔｈｉ（チエニルアラニン）などが挙げられる。
【００３５】
更に、上に定義された本発明の新規輸送体コンストラクトのために選択される前記Ｌ−鏡像異性体アミノ酸としては、上に定義されたＬ−鏡像異性体アミノ酸又はその誘導体の特定の組み合わせから選択されてもよい。かかる組み合わせとしては、上に定義されたＬ−鏡像異性体アミノ酸又はその誘導体のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上を含んでもよい。一般式（Ｉ）又は本明細書に定義される亜式のいずれかの定義の範囲内で、上に定義されたＬ−鏡像異性体アミノ酸又はその誘導体のいずれかと、上に定義されたＤ−鏡像異性体アミノ酸又はその誘導体のいずれかとを組み合わせることも可能である。かかるアミノ酸の特定の組み合わせとしては、ペプチダーゼに対してより高い又はより低い安定性を示す場合があるので、上に定義された本発明の新規輸送体コンストラクトのインビボ又はインビトロにおける安定性を、より高く又はより低くする更なる可能性を提供することができる。例えば、本発明の新規輸送体コンストラクトは、Ｄ型及び／又はＬ型（即ち、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸、Ｌ−鏡像異性体アミノ酸、又はＤ−鏡像異性体アミノ酸とＬ−鏡像異性体アミノ酸との混合物）として、好ましくはＬ型のジペプチド配列Ａｒｇ−Ｌｙｓを含有していてもよいが、これは、ペプチダーゼに対する安定性が低いので、本発明の新規輸送体コンストラクトのペプチド配列を不安定化させて、インビボにおける半減期を更に短縮するために用いることができる。
【００３６】
本発明の状況では、前記Ｄ−鏡像異性体アミノ酸とも呼ばれるＤ−アミノ酸は、非ネイティブな（タンパク質を構成しない）「レトロインベルソ型」アミノ酸であることが好ましく、これら非ネイティブな（タンパク質を構成しない）「レトロインベルソ型」アミノ酸は、上に定義された天然Ｌ−アミノ酸及び／又はその誘導体に由来することが好ましい。この状況において、用語「レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型」は、天然Ｌ−アミノ酸残基のキラリティが、対応するＤ−アミノ酸の逆である、上に定義された天然Ｌ−アミノ酸の異性体（及びそれから生成されるペプチド）を指す（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照）。換言すれば、Ｄ−アミノ酸のペプチド結合では、カルボニル基とアミノ基の位置が入れ替わっているが、各α炭素における側鎖基の位置は保存されている。したがって、前記Ｄ−アミノ酸は、前記Ｌ−アミノ酸からなるか、又は前記Ｌ−アミノ酸を含むペプチド配列に挿入することができるので、当該技術分野における既知の方法により、上に定義されたＬ−アミノ酸とコンジュゲートさせることができる。当該技術分野における既知の方法としては、例えば、液相ペプチド合成法又は固体ペプチド合成法、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる固体ペプチド合成法、ｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）に基づく固相ペプチド合成などが挙げられるが、これらに限定されない。上記一般式（Ｉ）で表されるＤ−／Ｌ−パターンに係る本発明の新規輸送体コンストラクト中のＤ−アミノ酸含量は、様々な更なる有用な性質を更に提供する。例えば、かかる新規輸送体コンストラクトは、対応するＬ−アミノ酸配列に基づく輸送体コンストラクトよりも、より効率的に細胞に侵入し、且つ（特にインビボにおいて）安定性が高く、且つ免疫原性が低い。しかし、特に、プロテアーゼ又はペプチダーゼなどの殆ど全ての分解酵素は、隣接するＬ−アミノ酸間のペプチド結合を切断するという事実により、前記ポリペプチドは、全てＤ−アミノ酸で作製された輸送体コンストラクトと同程度細胞中に残存する訳ではない。結果として、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸及びＬ−鏡像異性体アミノ酸からなるペプチドは、プロテアーゼによる分解を免れるので、細胞内への蓄積を導かない急速なタンパク質分解に対して高い耐性を有する。
【００３７】
一般式（Ｉ）に係る上に定義された本発明の新規輸送体コンストラクトは、上に定義されたＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸、又はこれらの誘導体を含むことが好ましい。かかる誘導体は、本発明の新規輸送体コンストラクト全体に、約０％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は更には約１００％の含量で含有されていてよい。換言すれば、本発明の新規輸送体ペプチド全体は、かかる誘導体を約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、又はそれ以上含有していてもよく、ここで、可能な誘導体の最大数は、無論、上に定義された一般式（Ｉ）に係る本発明の新規輸送体コンストラクトに含まれるアミノ酸の最大数によって制限を受ける。
【００３８】
上に定義された一般式（Ｉ）によれば、本発明の新規輸送体コンストラクトは、整数ａ、ｌ、ｍ、ｎ、ｘ、及びｙにより定義されるＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の特定のＤ−／Ｌ−パターンを含む。
【００３９】
一般式（Ｉ）の上記定義によれば、ａは、一般式（Ｉ）ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａに定義されているサブグループ（ＬＬＬｙＤ）の反復数を定義する決定因子である。上記定義によれば、ａは、範囲０〜３から選択される、好ましくは範囲０〜２から選択される、より好ましくは範囲０〜１から選択される任意の数であってもよく、個々の数０、１、２、若しくは３、更により好ましくは個々の数０、１、若しくは２から選択されてもよく、最も好ましくはａ＝１である。特定の反復数ａ＝０、１、２、又は３によれば、一般式（Ｉ）ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、以下の亜式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）のうちの少なくとも１つから構成されてもよく、又はこれらを含んでもよい：
（Ｉａ）：ＤｌＬＬＬｘＤｍ（配列番号２）；
（Ｉｂ）：ＤｌＬＬＬｘＤｍＬＬＬｙＤｎ（配列番号３）；
（Ｉｃ）：ＤｌＬＬＬｘＤｍＬＬＬｙＤｎＬＬＬｙＤｎ（配列番号４）又は
（Ｉｄ）：ＤｌＬＬＬｘＤｍＬＬＬｙＤｎＬＬＬｙＤｎＬＬＬｙＤｎ（配列番号５）。
【００４０】
更に、一般式（Ｉ）の上記定義によれば、ｌ、ｍ、及びｎは、一般式（Ｉ）だけではなく、本明細書に定義される亜式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）中に出現するＤ−アミノ酸の数を定義する整数である。整数ｌ、ｍ、及びｎは、互いに独立して選択することができる。これは、特に、本明細書に定義される一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）に何回か出現する場合がある決定因子ｎに当てはまり、即ち、ｎが何回も出現する場合、各ｎは、互いに独立して選択することができる。上記定義によれば、整数ｌ、ｍ、及びｎは、互いに独立して、範囲１〜２から選択される任意の数であってもよく、個々の数１又は２から選択されてもよく、更により好ましくはｌ、ｍ、及び／又はｎ＝１である。
【００４１】
更に、一般式（Ｉ）の上記定義によれば、ｘ及びｙは、一般式（Ｉ）中に存在するＬ−アミノ酸の数を定義する整数であるが、本明細書に定義される亜式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）についても同様である。整数ｘ及びｙは、互いに独立して選択することができる。上記定義によれば、整数ｘ及びｙは、互いに独立して、０〜２から選択される任意の数、好ましくは０〜１から選択される任意の数であってもよく、個々の数０、１、又は２、更により好ましくは個々の数０又は１から選択されてもよく、最も好ましくはｘ及び／又はｙ＝１である。
【００４２】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の目的は、特定の亜式（Ｉｅ）：
ＤＬＬＬＤ（ＬＬＬＤ）ａ（配列番号６）
（式中、Ｄ、Ｌ、及びａは、一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）について定義される通りである）
のうちの少なくとも１つの配列を含むか、又は前記配列からなる新規輸送体コンストラクトにより解決される。
【００４３】
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明の目的は、特定の亜式（Ｉｆ）：
ＤＬＬＬＤＬＬＬＤ（配列番号７）
（式中、Ｄ及びＬは、一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）について定義される通りである）
のうちの少なくとも１つの配列を含むか、又は前記配列からなる新規輸送体コンストラクトにより解決される。
【００４４】
一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクト、特に、新規Ｄ−／Ｌ−パターンを含む輸送体コンストラクトは、当該技術分野において既知である任意の輸送配列と共に用いてもよく、前記輸送配列に適用してもよく、ここで、前記輸送配列の選択される連続アミノ酸数は、一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかにより定義されるアミノ酸数によって決定される。かかる輸送配列は、一般的に、積荷部分の細胞、核、又は更なる特定の標的領域への輸送を導き、且つ限定するものではないが、以下を含んでもよい：例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴ（ＨＩＶ）（例えば、ＴＡＴタンパク質（例えば、各々参照により本明細書に援用される米国特許第５，８０４，６０４号明細書及び米国特許第５，６７４，９８０号明細書に記載されている）などのネイティブなタンパク質）に由来する、上に定義された輸送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒｙ）タンパク質；例えば、ＨＩＶ  ｔａｔ（ＨＩＶ）、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）（例えば、国際公開第９７／０５２６５号パンフレット；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ８８：２２３−２３３（１９９７）に記載されている）に由来する、上に定義された輸送タンパク質；非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１−１０６９５（１９９２））；アンテナペディア、特にショウジョウバエのアンテナペディア（例えば、そのアンテナペディアキャリア配列）、ＦＧＦ、ラクトフェリンなどに由来する輸送配列；又は、例えば、５〜１５アミノ酸長、好ましくは１０〜１２アミノ酸長を有し、且つ少なくとも８０％、より好ましくは８５％、又は更には９０％の塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、及び／又はヒスチジンなど）を含むペプチド、或いは、例えば、Ｒ９、Ｒ８、Ｒ７、Ｒ６、Ｒ５などのアルギニンリッチなペプチド配列から選択してもよい塩基性ペプチドに由来する輸送配列；ＶＰ２２、ＰＴＤ−４由来のタンパク質若しくはペプチド、ＲＧＤ−Ｋ１６、ＰＥＰＴ１／２若しくはＰＥＰＴ１／２由来のタンパク質若しくはペプチド、ＳｙｎＢ３若しくはＳｙｎＢ３由来のタンパク質又はペプチド、ＰＣ阻害剤、Ｐ２１由来のタンパク質若しくはペプチド、又はＪＮＫ１由来のタンパク質又はペプチドに由来する輸送配列。更に、輸送配列として用いられるネイティブなタンパク質のうちの１つの変異体、断片、及び誘導体が、本明細書に開示される。
【００４５】
上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る新規輸送体コンストラクトの基盤を形成する輸送配列の具体例は、限定するものではないが、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質の塩基性輸送配列に由来する、所謂ＴＡＴ細胞透過配列から選択することができる。好ましくは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質の塩基性輸送配列は、例えば、米国特許第５，８０４，６０４号明細書及び米国特許第５，６７４，９８０号明細書（各々参照により本明細書に援用される）に記載されているように、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来の配列を含んでもよい。この状況では、完全長ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質は、ＨＩＶ  ＴＡＴ遺伝子の２つのエキソンをコードする８６アミノ酸残基（配列番号８）を有する。ＴＡＴアミノ酸１〜７２がエキソン１をコードし、一方、アミノ酸７３〜８６がエキソン２をコードする。完全長ＴＡＴタンパク質は、２つのリジン及び６つのアルギニン（アミノ酸４９〜５７）を含む塩基性領域と、７つのシステイン残基（アミノ酸２２〜３７）を含むシステインリッチ領域とを特徴とする。塩基性領域（即ち、アミノ酸４９〜５７）は、核への局在に重要であると考えられていた。Ｒｕｂｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３  １１８１−１１８７（１９８９）。システインリッチ領域は、インビトロにおいて、金属結合二量体の形成を媒介し（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：７０−７３（１９８８）；Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：６２９７−６３００（１９８８））、且つトランスアクチベータとしての活性に必須である（Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３１４３（１９８８）；Ｓａｄａｉｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１（１９８９））。他の制御タンパク質のように、Ｎ末端領域は、細胞内プロテアーゼに対する保護に関与している可能性がある（Ｂａｃｈｍａｉｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：１０１９−１０３２（１９８９））。一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）と共に利用される好ましいＴＡＴ輸送配列は、以下を特徴とすることが好ましい：ＴＡＴ塩基性領域のアミノ酸配列（天然ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７）の存在；ＴＡＴシステインリッチ領域のアミノ酸配列（天然ＴＡＴタンパク質のアミノ酸２２〜３６）の欠如；及びＴＡＴエキソン２をコードするカルボキシ末端ドメイン（天然ＴＡＴタンパク質のアミノ酸７３〜８６）の欠如。
【００４６】
より好ましい実施形態によれば、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る新規輸送体コンストラクトの基盤を形成する輸送配列は、ＴＡＴ残基４８〜５７又は４９〜５７を含むアミノ酸から選択してもよく（最も好ましくは、配列番号８〜１４のいずれかに係るＴＡＴ配列である）、又はＴＡＴ一般配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ｇｅｎｅｒｉｃ−ＴＡＴ（ｓ））（配列番号１６）及び／又はＸＸＸＸＲＫＫＲＲＱ  ＲＲＲＸＸＸＸ（Ｌ−ｇｅｎｅｒｉｃ−ＴＡＴ）（配列番号１５）から選択してもよい。この状況では、各Ｘは、一般的に、アミノ酸残基を表し、好ましくは、本明細書に定義される任意の（天然）アミノ酸残基から選択される。更に、各Ｘｎｂは、本明細書に定義される任意のアミノ酸残基から選択してもよく、ここでｎ（Ｘの反復数）は、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０又はそれ以上である。好ましくは、Ｘｎｂは、配列番号８（ＴＡＴ（１−８６））に係る配列に由来する連続したペプチド残基を表す。或いは、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る新規輸送体コンストラクトの基盤を形成する輸送配列は、例えば、アミノ酸配列ＮＨ２−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ（ｓ１ａ））（配列番号１７）又はアミノ酸配列ＮＨ２−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ（ｓ１ｂ））（配列番号１８）を含むペプチドから選択してもよい。
【００４７】
一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る配列を、特定の（輸送）配列と共に用いることができるか、又は特定の（輸送）配列に適用することができる、或いは、一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）などのいずれかに係る輸送体ペプチドコンストラクトの基盤を形成することができるなどの語句は、以下に関する特定の特徴を示す、請求される配列の例証を意図することを当業者は理解するであろう：
ｉ）特定のアミノ酸実体を特徴付ける側鎖残基の配列、及び
ｉｉ）前記配列中のＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の配列。
実例としては、亜式（Ｉｆ）をＴＡＴ（１−８６）（配列番号８）と共に用いるか又はＴＡＴ（１−８６）（配列番号８）に適用する場合、側鎖残基（ｉ）の配列は、配列番号８に示されている通りである。しかし、この請求される配列は、純粋なＬ−アミノ酸配列ではなく、何処かに亜式（Ｉｆ）のモチーフを含む。かかる実施形態の例は、以下の配列である（Ｄ−アミノ酸を小文字で示し、Ｌ−アミノ酸を大文字で示す）：
ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰ  ＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴ  ＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣ  ＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴ  ＫＡＬＧＩＳＹＧｒＫ  ＫＲｒＱＲＲｒＰＰＱ  ＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳ  ＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤ  ＰＴＧＰＫＥ。
【００４８】
配列番号８は、８６アミノ酸を含んでいるので、無論、この配列の別の箇所に亜式（Ｉｆ）のモチーフを配置する更なる可能性が幾つか存在する。また、前記配列が、特定の実施形態において、一般式及び／又は亜式のうちの１超のモチーフを含む可能性があることも想定される。
【００４９】
上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る輸送体ペプチドの基盤を形成する輸送配列の特に好ましい例は、限定するものではないが、（生物学的膜を通過する輸送機能を保持している限り）以下の表１〜３に定義される配列若しくはその一部、又はその任意の断片、変異体、若しくは誘導体から選択することができる。
【００５０】
【表１】
2015120694.tif 000002
【表２】
2015120694.tif 000003
【表３】
2015120694.tif 000004
【００５１】
また、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る輸送体コンストラクトの基盤を形成する輸送配列の具体例は、この特定の配列の逆配列、即ち、Ｎ末端からＣ末端までの配列においてアミノ酸の順序が逆である配列を示す、例えば、表１〜３に示されるような本明細書で言及される配列から選択することができる。
【００５２】
上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のうちのいずれかに係る輸送体コンストラクトの基盤を形成する輸送配列の特に好ましい例は、（かかる断片又は変異体が、生物学的膜を通過する輸送をもたらす機能を保持している限り）上記配列の断片又は変異体から選択することができる。この特定の状況では、これら輸送配列の変異体及び／又は断片は、上に定義された輸送配列などのネイティブな配列の全長に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％を有するペプチド配列を含むか、前記配列からなることが好ましい。更に、かかる輸送配列の断片は、完全長輸送配列のエピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）を更に含んでもよい。本発明の状況において、エピトープは、一般的に、本明細書で定義される（ネイティブな）タンパク質又はペプチド配列の外表面上に位置する断片であり、好ましくは５個〜１５個のアミノ酸、より好ましくは５個〜１２個のアミノ酸、更により好ましくは６個〜９個のアミノ酸を有し、前記断片は、抗体によって認識され得る、即ち、ネイティブな形態である。
【００５３】
この特定の状況において、特に表１〜３又は表５〜７に開示される、上に定義された輸送配列の「断片」は、そのトランケート型配列、即ち、ネイティブな配列のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は配列内でトランケートされているアミノ酸配列であると理解されることが好ましい。
【００５４】
更に、本発明の特定の状況では、（特に表１〜３又は表５〜７に開示される、上に定義された輸送配列又はその断片の「変異体」は、１以上の突然変異、例えば、１以上の置換（又は、必要に応じて、挿入及び／若しくは欠失）アミノ酸などによって、変異体のアミノ酸配列と本明細書に定義されるネイティブな輸送配列又はその断片の配列とが異なる配列として理解されることが好ましい。好ましくは、上に定義されたかかる輸送配列の変異体は、完全長のネイティブな配列と比較して同じ生物学的機能又は特異的活性を有する、即ち、同様に細胞及び核に輸送される。上に定義されたかかる輸送配列の変異体は、上記意味の範囲内で、約１個〜５０個、より好ましくは１個〜２０個、更により好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個、最も好ましくは４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸変化を含んでもよい。また、上に定義されたかかる輸送配列の変異体は、保存アミノ酸置換を含んでもよい。前記保存アミノ酸置換は、グループのメンバー間で置換しても分子の生物学的活性が保たれるように、物理化学的性質が十分に類似しているグループ内の同義アミノ酸残基による置換を含んでもよい（例えば、Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．（１９７４），Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８５，８６２−８６４を参照）。また、特に、挿入及び／又は欠失に関与するアミノ酸が数個、例えば、２０個未満、好ましくは１０個未満であり、且つ機能活性に重要なアミノ酸は除去又は変位されない場合、機能を変化させることなしに、上に定義された配列中にアミノ酸を挿入及び／又は欠失させ得ることが当業者には明らかである。特に、保存アミノ酸置換は、同じ分類のアミノ酸（塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸など）に由来するアミノ酸を互いに交換する置換であることが好ましい。特に、これらは、脂肪族側鎖、正荷電側鎖、負荷電側鎖、側鎖が水素結合に侵入することができるアミノ酸側鎖中の芳香族基、例えばヒドロキシル官能基を有する側鎖を有するアミノ酸である。これは、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸を、同様に極性側鎖を有する別のアミノ酸により置換する、又は、例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸を、同様に疎水性側鎖を有する別のアミノ酸により置換する（例えば、セリン（スレオニン）をスレオニン（セリン）に、又はロイシン（イソロイシン）をイソロイシン（ロイシン）に置換する）ことを意味する。好ましくは、同グループに分類され、且つ一般的に保存アミノ酸置換により交換可能である同義アミノ酸残基を表４に定義する。
【００５５】
【表４】
2015120694.tif 000005
【００５６】
上に定義された輸送体コンストラクトに用いられる輸送配列の長さ、即ち、上に定義された輸送配列のいずれかから選択される連続アミノ酸数は、特定の実施形態において、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかのアミノ酸数により決定することができる。したがって、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトの（配列）長は、例えば、表１〜３若しくは表５〜７などの本明細書に示されるか、又は本明細書に一般的に定義される例示的な輸送配列の長さから逸脱している場合がある。換言すれば、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る輸送体コンストラクトの長さは、アミノ酸配列の長さを決定することができ、これは、前記アミノ酸配列が前記輸送配列の連続したアミノ酸から得られる限り、本明細書に定義される輸送配列から得ることができる。例としては、上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る輸送体コンストラクトの長さが９アミノ酸である場合、輸送体コンストラクトとして好適な配列は、上に定義された輸送配列の９個の連続アミノ酸に由来し、ここで、選択されるアミノ酸配列は、前記輸送配列の任意の位置又は領域に由来してもよい。上に定義された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかにより決定される任意の他の長さについても同様である。また、幾つかの実施形態において、本発明に係る輸送体コンストラクトの輸送配列は、１５０アミノ酸長、１４０アミノ酸長、１３０アミノ酸長、１２０アミノ酸長、１１０アミノ酸長、１００アミノ酸長、９０アミノ酸長、８０アミノ酸長、７０アミノ酸長、６０アミノ酸長、５０アミノ酸長、４０アミノ酸長、３０アミノ酸長、２０アミノ酸長、及び／又は１０アミノ酸長未満であることも考えられる。
【００５７】
別の好ましい実施形態によれば、一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、上に定義された配列のうちの少なくとも１つの変異体及び／又は断片を含むか、或いはこれらからなる。好ましくは、これら変異体及び／又は断片は、上に開示された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトの生物学的活性を保持している。かかる断片又は変異体の機能は、例えば、トランスフェクション効率、積荷核酸がコードするタンパク質の正確な発現などの様々な試験により、又は分光法、コンピュータモデリング、構造解析などの生物物理学的方法により試験することができる。特に、上に開示される一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクト、或いはこれらの変異体及び／又は断片は、ペプチドの疎水性領域及び親水性領域を同定するために利用することができ、それによって実験操作のための基質の設計に役立つ親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，１９８１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８を参照されたい）により分析することができる。また、二次構造分析を実施して、特定の構造モチーフを推定する（例えば、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：２２２−２２３を参照されたい）上に開示された一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクト、或いはその変異体及び／又は断片の領域を同定することもできる。操作、翻訳、二次構造予測、親水性及び疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測及びプロッティング、並びに配列相同性の決定は、当該技術分野において利用可能であるコンピュータソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。構造解析の他の方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７−１３を参照されたい）、質量分析、及びガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，１９９７，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）が挙げられ、コンピュータモデリング（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ，ｅｄｓ．，１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｉｎ：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい）を使用してもよい。
【００５８】
同様に、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、上に定義された輸送体コンストラクトのうちの少なくとも１つの変異体（及び／又は断片）を含むか、これらからなる。本発明の状況では、これら新規輸送体コンストラクトの変異体（及び／又は断片）は、上に定義されたネイティブな輸送体コンストラクトの全長に対して、一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係るネイティブな輸送体コンストラクトと、少なくとも７０％、８０％、又は８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有していてもよい。
【００５９】
上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトの「断片」は、そのトランケート型配列である、即ち、ネイティブな配列、例えば、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係るネイティブな本発明の新規輸送体コンストラクトと比べて、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は配列内がトランケートされている新規輸送体コンストラクトのアミノ酸配列であると理解されることが好ましい。
【００６０】
上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトの「変異体」は、輸送体コンストラクト変異体のアミノ酸配列が、１以上の突然変異、例えば、１以上の置換（或いは、必要に応じて、挿入及び／又は欠失）されたアミノ酸などにおいて、本明細書に定義される輸送体コンストラクトのネイティブな配列とは異なる配列を含むことが好ましい。好ましくは、かかる本発明の輸送体コンストラクトの変異体は、上に定義された完全長のネイティブな本発明の輸送体コンストラクトと比べて同じ生物学的機能又は特定の活性を有する。好ましくは、本発明の輸送体コンストラクトの変異体は、上記意味の範囲内で、約１個〜５０個、１個〜２０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個、１個〜４個、１個〜３個、１個〜２個、又は１個のアミノ酸変化を含んでもよい。かかる変化は、特に、上に定義されたアミノ酸の修飾、上に定義されたアミノ酸への標識の導入、本明細書に言及される（修飾又は標識）アミノ酸のいずれかによるアミノ酸の置換、アミノ酸の欠失又は挿入を含んでもよい。本明細書に定義される変異体は、更に、好ましくは既に上に定義されているような保存的アミノ酸置換を含むことが好ましい。
【００６１】
２つのアミノ酸配列、特に、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトのアミノ酸配列、或いは本明細書に定義される任意の更なるアミノ酸配列が同一である割合を決定するために、アミノ酸配列のアラインメントを行い、次いで互いに比較することができる。それによって、例として、例えば、第１のアミノ酸配列の配列にギャップを挿入することもでき、第２のアミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸と比較することもできる。第１のアミノ酸配列におけるある位置が、第２のアミノ酸配列におけるある位置と同じアミノ酸に占有されている場合、２つの配列は、この位置において同一である。２つの配列が同一である割合は、同一である位置数を位置の総数で除した数の関数である。無論、核酸配列についても同様である。上記状況では、本発明のクエリーアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「配列同一性を共有している」配列を有するアミノ酸配列は、対象アミノ酸配列が、クエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最高５アミノ酸の変化を含んでもよいことを除き、クエリー配列と同一であることを意味することを意図する。換言すれば、クエリーアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸配列を得るためには、好ましくは変異体又は断片の上記定義内で、対象アミノ酸配列中のアミノ酸残基の最高５％（１００個のうち５個）を挿入するか、別のアミノ酸に置換するか、又は欠失させてもよい。無論、核酸配列についても同様である。
【００６２】
正確に一致しない（アミノ酸又は核酸）配列のために、２回目の配列決定を考慮して１回目の配列決定の同一性を決定してもよい。一般に、配列間の相関が最大となるように、比較されるこれら２つの配列のアラインメントを行う。これは、一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入して、アラインメントの度合いを高めることを含んでもよい。次いで、同一又は類似の長さの配列に特に適している、比較される各配列の全長に対する同一性（％）（所謂グローバルアラインメント）、又は非等長配列により適している、全長よりも短い既定の長さに対する同一性（％）（所謂ローカルアラインメント）を決定することができる。
【００６３】
２以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当該技術分野において周知である。２つの配列が同一である割合は、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。前記数学的アルゴリズムとしては、特に制限はないが、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７に記載のアルゴリズムが好ましい。前記アルゴリズムとしては、例えば、ＮＣＢＩのホームページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からアクセス可能なＢＬＡＳＴ又はＮＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０又はＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２も参照）などのＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３，６３−９８；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８５，２４４４−２４４８．）などに組み込まれているアルゴリズムが挙げられる。これらプログラムにより、ある程度他の配列と相同性の高い配列を、同定することができる。更に、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰプログラムなどのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３８７−３９５）で入手可能なプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド間の同一性（％）と、２つのポリペプチド配列間の同一性（％）、及び相同性（％）又は同一性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７，１９５−１９７）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し、２つの配列間で最も類似性の高い１つの領域を見出す。
【００６４】
特に好ましい実施形態によれば、上に定義された本発明の新規輸送体コンストラクトは、上に定義された亜式（Ｉｆ）ＤＬＬＬＤＬＬＬＤ（配列番号７）を含み、ここで前記輸送体の配列は、上述の（特定の）配列のいずれか、更により好ましくは以下の配列から選択される。
【００６５】
【表５】
2015120694.tif 000006
【表６】
2015120694.tif 000007
【表７】
2015120694.tif 000008
【００６６】
上表では、亜式（Ｉｆ）ＤＬＬＬＤＬＬＬＤ（配列番号７）が、上記特定の配列に適用される、即ち、上に定義された新規輸送体コンストラクトは、９アミノ酸を含み、ここでＤ−鏡像異性体アミノ酸は、本明細書において小文字で示され、Ｌ−鏡像異性体アミノ酸は、本明細書において大文字で示される。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明の輸送体コンストラクトは、ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）に係る少なくとも１つの配列を含むか、前記配列からなり、式中、
ｒは、Ｄ−鏡像異性体アルギニンを表し、
Ｘは、任意のＬ−アミノ酸であり、
各Ｘは、配列番号２５２中の任意の他のＸとは個別に且つ独立して選択することができる。配列番号２５２中の前記６個のＸ（Ｌ−アミノ酸）のうちの少なくとも４個がＫ又はＲであることが好ましい。別の実施形態では、本発明に係る輸送体コンストラクトは、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号２５２）（式中、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＫであり、Ｘ３はＲであり、Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６は互いに独立して選択される任意のＬ−アミノ酸である）を含むか、前記配列からなる。同様に、本発明に係る輸送体コンストラクトは、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号２５２）（式中、Ｘ４はＱであり、Ｘ５はＲであり、Ｘ６はＲであり、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は互いに独立して選択される任意のＬ−アミノ酸である）を含むか、前記配列からなる。また、本発明の輸送体コンストラクトは、配列ｒＸ１Ｘ２Ｘ３ｒＸ４Ｘ５Ｘ６ｒ（配列番号２５２）（式中、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のＸアミノ酸残基は、以下からなる群より選択される：Ｘ１はＫである、Ｘ２はＫである、Ｘ３はＲである、Ｘ４はＱである、Ｘ５はＲである、Ｘ６はＲである；一方、残りのＸアミノ酸残基は、上記群からは選択されず、任意のＬ−アミノ酸であってよく、且つ互いに独立して選択される）を含むか、前記配列からなる。Ｘ１は好ましくはＹである、及び／又は、Ｘ４は好ましくはＫ若しくはＲである。同様に、上に言及された配列及び配列番号２５２の実施形態の逆配列も考えられる。
【００６８】
驚くべきことに、本発明者らは、上記式（Ｉ）の位置２におけるチロシン（Ｙ）が、取り込みを有意に増加させるだけでなく、２５時間の間、接種後の細胞内濃度を有意に増加させることを見出した。これは、特に、位置２がＹであり、好ましくは９ａａを有し、且つコンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）を示す、表１に示されているＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質に由来する輸送配列を含む輸送体コンストラクトにおいて見られる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、上に定義された本発明の新規輸送体コンストラクトは、上に定義された一般式（Ｉ）で表される輸送体コンストラクト、更により好ましくは上に定義された亜式（Ｉｆ）に係る輸送体コンストラクトを含み、ここで前記輸送体配列は、ＴＡＴ由来配列の位置２にチロシン（Ｙ）を有するＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来の輸送配列と共に用いられるか、又は前記輸送配列に適用される。更により好ましくは、前記輸送体配列は、ＴＡＴ由来配列の位置２にチロシン（Ｙ）を有するＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質由来の輸送配列と共に用いられるか、又は前記輸送配列に適用され、ここで、上に定義された一般式（Ｉ）で表される輸送体コンストラクト、又は上に定義された亜式（Ｉｆ）に係る輸送体コンストラクトは、好ましくは９ａａ及びコンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２：式中、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸は、本明細書において小文字で示され、Ｌ−鏡像異性体アミノ酸は、本明細書において大文字で示される）を有する。最も好ましくは、輸送体コンストラクトは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴ由来の輸送配列と共に用いられるか、又は前記輸送配列に適用され、ここで上に定義された一般式（Ｉ）で表される輸送体コンストラクト、又は上に定義された亜式（Ｉｆ）に係る輸送体コンストラクトは、好ましくは９ａａ及びコンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）を有し、且つ前記輸送配列は、配列ＴＡＴ（ｓ２−９１）（配列番号１１６）から選択される。
【００６９】
上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、好ましくは末端、例えばＣ末端若しくはＮ末端のいずれか、又は両方に少なくとも１つの修飾を更に含んでもよい。Ｃ末端は、好ましくはアミド修飾により修飾されてよく、一方、Ｎ末端は、例えばアシル化などの任意の好適なＮＨ２保護基により修飾されてもよく、又はＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸について既に記載された任意の更なる修飾により修飾されてもよい。また、かかる修飾は、上に定義された標識の導入を含む。
【００７０】
上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、当該技術分野において周知の方法、例えば、上に定義された化学合成、又は遺伝子工学的方法により得ることができる、又は生成することができる。
【００７１】
本発明の第２の様態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子であって、成分（Ａ）として、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトを含み、且つ成分（Ｂ）として、例えば、治療活性タンパク質及びペプチド、タンパク質キナーゼ阻害剤、特にタンパク質キナーゼであるｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ又は因子の阻害剤、抗原、抗体、アポトーシス因子、病状に関与しているプロテアーゼ、好ましくはペプチドプロテアーゼ阻害剤、ＢＨ３−ドメイン、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質などのタンパク質又はペプチドから選択されるか、或いはｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの核酸、細胞毒性剤、小有機分子などから選択されるエフェクタ分子を含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子により、根本的な課題が解決される。
【００７２】
本発明の状況では、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のエフェクタ分子として好適な治療活性タンパク質又はペプチドは、例えば、サイトカイン、抗体などの、細胞内のシグナル伝達を刺激又は阻害可能なタンパク質から選択することができるが、これらに限定されない。したがって、治療活性タンパク質は、位置が保存されている４つのシステイン残基（ＣＣＣＣ）を有し、且つ保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ；配列番号２５３）（式中、Ｘは、保存されていないアミノ酸である）を含むクラスＩサイトカインファミリーのサイトカインを含んでもよい。クラスＩサイトカインファミリーのサイトカインは、例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦなどのＧＭ−ＣＳＦサブファミリー、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのＩＬ−６サブファミリー、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５などのＩＬ−２サブファミリー、又はサイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０などを含む。また、治療活性タンパク質は、位置が保存されている４つのシステイン残基（ＣＣＣＣ；配列番号２５４）を有するが、保存配列モチーフＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ＷＳＸＷＳ；配列番号２５３）を含まないクラスＩＩサイトカインファミリーのサイトカインを含んでもよい。クラスＩＩサイトカインファミリーのサイトカインは、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどを含む。治療活性タンパク質は、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子のファミリーのサイトカイン、例えば、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＲ５、ＣＸＲ４などの７回膜貫通へリックスを含み、且つＧ−タンパク質と相互作用するケモカインファミリーのサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、Ｆａｓなどのサイトカイン特異的受容体、又はこれらの断片若しくは変異体を更に含んでもよい。かかる断片及び変異体は、上に示された又は上に記載されたタンパク質又はペプチド配列のうちの１つと、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％の配列相同性又は配列同一性を示すことが好ましい。この状況では、断片及び変異体は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された通りであることが好ましい。
【００７３】
また、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のエフェクタ分子として好適な治療活性タンパク質は、以下に示すタンパク質のいずれかから選択してもよい：０ＡＴＬ３、０ＦＣ３、０ＰＡ３、０ＰＤ２、４−１ＢＢＬ、５Ｔ４、６Ｃｋｉｎｅ、７０７−ＡＰ、９Ｄ７、Ａ２Ｍ、ＡＡ、ＡＡＡＳ、ＡＡＣＴ、ＡＡＳＳ、ＡＢＡＴ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ２、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ７、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＤ１、ＡＢＣＤ３、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＡＢＬ１、ＡＢＯ、ＡＢＲ  ＡＣＡＡ１、ＡＣＡＣＡ、ＡＣＡＤＬ、ＡＣＡＤＭ、ＡＣＡＤＳ、ＡＣＡＤＶＬ、ＡＣＡＴ１、ＡＣＣＰＮ、ＡＣＥ、ＡＣＨＥ、ＡＣＨＭ３、ＡＣＨＭ１、ＡＣＬＳ、ＡＣＰＩ、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＣ、ＡＣＴＮ４、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤ２、ＡＤＡ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＦＮ、ＡＤＨ１Ｂ、ＡＤＨ１Ｃ、ＡＤＬＤＨ３Ａ２、ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＢ３、ＡＤＳＬ、ＡＥＺ、ＡＦＡ、ＡＦＤ１、ＡＦＰ、ＡＧＡ、ＡＧＬ、ＡＧＭＸ２、ＡＧＰＳ、ＡＧＳ１、ＡＧＴ、ＡＧＴＲ１、ＡＧＸＴ、ＡＨ０２、ＡＨＣＹ、ＡＨＤＳ、ＡＨＨＲ、ＡＨＳＧ、ＡＩＣ、ＡＩＥＤ、ＡＩＨ２、ＡＩＨ３、ＡＩＭ−２、ＡＩＰＬ１、ＡＩＲＥ、ＡＫ１、ＡＬＡＤ、ＡＬＡＳ２、ＡＬＢ、ＨＰＧ１、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＡＬＤＨ４Ａ１、ＡＬＤＨ５Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＯＡ、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＭＳ１、ＡＬＰＬ、ＡＬＰＰ、ＡＬＳ２、ＡＬＸ４、ＡＭＡＣＲ、ＡＭＢＰ、ＡＭＣＤ、ＡＭＣＤ１、ＡＭＣＮ、ＡＭＥＬＸ、ＡＭＥＬＹ、ＡＭＧＬ、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、ＡＭＰＤ３、ＡＭＰＤ１、ＡＭＴ、ＡＮＣ、ＡＮＣＲ、ＡＮＫ１、ＡＮＯＰ１、ＡＯＭ、ＡＰ０Ａ４、ＡＰ０Ｃ２、ＡＰ０Ｃ３、ＡＰ３Ｂ１、ＡＰＣ、ａＰＫＣ、ＡＰＯＡ２、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＥ、ＡＰＯＨ、ＡＰＰ、ＡＰＲＴ、ＡＰＳ１、ＡＱＰ２、ＡＲ、ＡＲＡＦ１、ＡＲＧ１、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＭＥＴ、ＡＲＳＡ、ＡＲＳＢ、ＡＲＳＣ２、ＡＲＳＥ、ＡＲＴ−４、ＡＲＴＣ１／ｍ、ＡＲＴＳ、ＡＲＶＤ１、ＡＲＸ、ＡＳ、ＡＳＡＨ、ＡＳＡＴ、ＡＳＤ１、ＡＳＬ、ＡＳＭＤ、ＡＳＭＴ、ＡＳＮＳ、ＡＳＰＡ、ＡＳＳ、ＡＳＳＰ２、ＡＳＳＰ５、ＡＳＳＰ６、ＡＴ３、ＡＴＤ、ＡＴＨＳ、ＡＴＭ、ＡＴＰ２Ａ１、ＡＴＰ２Ａ２、ＡＴＰ２Ｃ１、ＡＴＰ６Ｂ１、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＴＰＳＫ２、ＡＴＲＸ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＡＵＴＳ１、ＡＶＭＤ、ＡＶＰ、ＡＶＰＲ２、ＡＶＳＤ１、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、ＡＺＦ２、Ｂ２Ｍ、Ｂ４ＧＡＬＴ７、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＥ−１、ＢＡＸ、ＢＢＳ２、ＢＢＳ３、ＢＢＳ４、ＢＣＡ２２５、ＢＣＡＡ、ＢＣＨ、ＢＣＨＥ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ５、ＢＣＬ６、ＢＣＰＭ、ＢＣＲ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＢＤＣ、ＢＤＥ、ＢＤＭＦ、ＢＤＭＲ、ＢＥＳＴ１、β−カテニン／ｍ、ＢＦ、ＢＦＨＤ、ＢＦＩＣ、ＢＦＬＳ、ＢＦＳＰ２、ＢＧＬＡＰ、ＢＧＮ、ＢＨＤ、ＢＨＲ１、ＢＩＮＧ−４、ＢＩＲＣ５、ＢＪＳ、ＢＬＭ、ＢＬＭＨ、ＢＬＮＫ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＧＭ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲ��Ａ１／ｍ、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＢＲＣＤ２、ＢＲＣＤ１、ＢＲＤＴ、ＢＳＣＬ、ＢＳＣＬ２、ＢＴＡＡ、ＢＴＤ、ＢＴＫ、ＢＵＢ１、ＢＷＳ、ＢＺＸ、Ｃ０Ｌ２Ａ１、Ｃ０Ｌ６Ａ１、Ｃ１ＮＨ、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＧ、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂ、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ７ｏｒｆ２、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、Ｃ９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３／ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９５、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ２、ＣＡ２４２、ＣＡ５０、ＣＡＢＹＲ、ＣＡＣＤ、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＣＡＣＮＡ１Ｆ、ＣＡＣＮＡ１Ｓ、ＣＡＣＮＢ２、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＧＥ、ＣＡ１、ＣＡＬＢ３、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＬＣＲ、ＣＡＬＭ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＰＮ３、ＣＡＲＤ１５、ＣＡＳＰ−５／ｍ、ＣＡＳＰ−８、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＡＳＲ、ＣＡＴ、ＣＡＴＭ、ＣＡＶ３、ＣＢ１、ＣＢＢＭ、ＣＢＳ、ＣＣＡ１、ＣＣＡＬ２、ＣＣＡＬ１、ＣＣＡＴ、ＣＣＬ−１、ＣＣＬ−１１、ＣＣＬ−１２、ＣＣＬ−１３、ＣＣＬ−１４、ＣＣＬ−１５、ＣＣＬ−１６、ＣＣＬ−１７、ＣＣＬ−１８、ＣＣＬ−１９、ＣＣＬ−２、ＣＣＬ−２０、ＣＣＬ−２１、ＣＣＬ−２２、ＣＣＬ−２３、ＣＣＬ−２４、ＣＣＬ−２５、ＣＣＬ−２７、ＣＣＬ−３、ＣＣＬ−４、ＣＣＬ−５、ＣＣＬ−７、ＣＣＬ−８、ＣＣＭ１、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＯ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＴ、ＣＣＶ、ＣＣＺＳ、ＣＤ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２７Ｌ、ｃＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤＡＮ１、ＣＤＡＮ２、ＣＤＡＮ３、ＣＤＣ２７、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＣ２Ｌ１、ＣＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＬ１、ＣＤＰＤ１、ＣＤＲ１、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＣＲ、ＣＥＣＲ９、ＣＥＰＡ、ＣＥＴＰ、ＣＦＮＳ、ＣＦＴＲ、ＣＧＦ１、ＣＨＡＣ、ＣＨＥＤ２、ＣＨＥＤ１、ＣＨＥＫ２、ＣＨＭ、ＣＨＭＬ、ＣＨＲ３９Ｃ、ＣＨＲＮＡ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＢ１、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＳ、ＣＨＳ１、ＣＨＳＴ６、ＣＨＸ１０、ＣＩＡＳ１、ＣＩＤＸ、ＣＫＮ１、ＣＬＡ２、ＣＬＡ３、ＣＬＡ１、ＣＬＣＡ２、ＣＬＣＮ１、ＣＬＣＮ５、ＣＬＣＮＫＢ、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＰ、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＧ、Ｃ１Ｒ、ＣＬＳ、ＣＭＣＷＴＤ、ＣＭＤＪ、ＣＭＤ１Ａ、ＣＭＤ１Ｂ、ＣＭＨ２、ＭＨ３、ＣＭＨ６、ＣＭＫＢＲ２、ＣＭＫＢＲ５、ＣＭＬ２８、ＣＭＬ６６、ＣＭＭ、ＣＭＴ２Ｂ、ＣＭＴ２Ｄ、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴ１Ａ、ＣＭＴＸ２、ＣＭＴＸ３、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＮＡ１、ＣＮＤ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＡ１、ＣＮＧＢ３、ＣＮＳＮ、ＣＮＴＦ、ＣＯＡ−１／ｍ、ＣＯＣＨ、ＣＯＤ２、ＣＯＤ１、ＣＯＨ１、ＣＯＬ１０Ａ、ＣＯＬ２Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＯＬ１７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ��、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ９Ａ３、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ２３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬＱ、ＣＯＭＰ、ＣＯＭＴ、ＣＯＲＤ５、ＣＯＲＤ１、ＣＯＸ１０、ＣＯＸ−２、ＣＰ、ＣＰＢ２、ＣＰＯ、ＣＰＰ、ＣＰＳ１、ＣＰＴ２、ＣＰＴ１Ａ、ＣＰＸ、ＣＲＡＴ、ＣＲＢ１、ＣＲＢＭ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＨ、ＣＲＨＢＰ、ＣＲＳ、ＣＲＶ、ＣＲＸ、ＣＲＹＡＢ、ＣＲＹＢＡ１、ＣＲＹＢＢ２、ＣＲＹＧＡ、ＣＲＹＧＣ、ＣＲＹＧＤ、ＣＳＡ、ＣＳＥ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＴ３、ＣＳＴＢ、ＣＴ、ＣＴ７、ＣＴ−９／ＢＲＤ６、ＣＴＡＡ１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＥＮ、ＣＴＨ、ＣＴＨＭ、ＣＴＬＡ４、ＣＴＭ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＮＳ、ＣＴＰＡ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＫ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳ１、ＣＵＢＮ、ＣＶＤ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＹＢ５、ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＣＹＢＢ５、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＹＬＤ、ＣＹＬＤ１、ＣＹＭＤ、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｄ７Ｐ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰＢ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＲＡＡ、Ｄ４０、ＤＡＤｌ、ＤＡＭ、ＤＡＭ−１０／ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＤＡＭ−６／ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＤＡＸ１、ＤＡＺ、ＤＢＡ、ＤＢＨ、ＤＢＩ、ＤＢＴ、ＤＣＣ、ＤＣ−ＣＫ１、ＤＣＫ、ＤＣＲ、ＤＣＸ、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＵ、ＤＥＣＲ１、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＤＥＭ、ＤＥＳ、ＤＦ、ＤＦＮ２、ＤＦＮ４、ＤＦＮ６、ＤＦＮＡ４、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ５、ＤＧＣＲ、ＤＨＣＲ７、ＤＨＦＲ、ＤＨＯＦ、ＤＨＳ、ＤＩＡ１、ＤＩＡＰＨ２、ＤＩＡＰＨ１、ＤＩＨ１、ＤＩＯ１、ＤＩＳＣＩ、ＤＫＣ１、ＤＬＡＴ、ＤＬＤ、ＤＬＬ３、ＤＬＸ３、ＤＭＢＴ１、ＤＭＤ、ＤＭ１、ＤＭＰＫ、ＤＭＷＤ、ＤＮＡＩ１、ＤＮＡＳＥ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＰＥＰ１、ＤＰＹＤ、ＤＰＹＳ、ＤＲＤ２、ＤＲＤ４、ＤＲＰＬＡ、ＤＳＣＲ１、ＤＳＧ１、ＤＳＰ、ＤＳＰＰ、ＤＳＳ、ＤＴＤＰ２、ＤＴＲ、ＤＵＲＳ１、ＤＷＳ、ＤＹＳ、ＤＹＳＦ、ＤＹＴ２、ＤＹＴ３、ＤＹＴ４、ＤＹＴ２、ＤＹＴ１、ＤＹＸ１、ＥＢＡＦ、ＥＢＭ、ＥＢＮＡ、ＥＢＰ、ＥＢＲ３、ＥＢＳ１、ＥＣＡ１、ＥＣＢ２、ＥＣＥ１、ＥＣＧＦ１、ＥＣＴ、ＥＤ２、ＥＤ４、ＥＤＡ、ＥＤＡＲ、ＥＣＡ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＥＣ１、ＥＥＦ１Ａ１Ｌ１４、ＥＥＧＶ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１、ＥＧＩ、ＥＧＲ２、ＥＩＦ２ＡＫ３、ｅＩＦ４Ｇ、ＥＫＶ、Ｅｌ  ＩＳ、ＥＬＡ２、ＥＬＦ２、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＬＫ１、ＥＬＮ、ＥＬＯＮＧ、ＥＭＤ、ＥＭＬ１、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＭＸ２、ＥＮＡ−７８、ＥＮＡＭ、ＥＮＤ３、ＥＮＧ、ＥＮＯ１、ＥＮＰＰ１、ＥＮＵＲ２、ＥＮＵＲ１、ＥＯＳ、ＥＰ３００、ＥＰＢ４１、ＥＰＢ４２、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＤ、ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、エフリンＡ２、エフリンＡ３、ＥＰＨＸ１、ＥＰＭ２Ａ、ＥＰＯ、ＥＰＯＲ、ＥＰＸ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＲＣＣ６、ＥＲＶＲ、ＥＳＲ１、ＥＴＦＡ、ＥＴＦＢ、ＥＴＦＤＨ、ＥＴＭ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＥＴＶ１、ＥＶＣ、ＥＶＲ２、ＥＶＲ１、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ２、ＥＸＴ３、ＥＸＴ１、ＥＹＡ１、ＥＹＣＬ２、ＥＹＣＬ３、ＥＹＣＬ１、ＥＺＨ２、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ｂ、Ｆ２、Ｆ５、Ｆ５Ｆ８Ｄ、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ８Ｃ、Ｆ９、ＦＡＢＰ２、ＦＡＣＬ６、ＦＡＨ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＦ、ＦａｓＬ、ＦＢＮ２、ＦＢＮ１、ＦＢＰ１、ＦＣＧ３ＲＡ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＨＬ、ＦＣＭＤ、ＦＣＰ１、ＦＤＰＳＬ５、ＦＥＣＨ、ＦＥＯ、ＦＥＯＭ１、ＦＥＳ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＤ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ５、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＧ、ＦＧＳ１、ＦＨ、ＦＩＣ１、ＦＩＨ、Ｆ２、ＦＫＢＰ６、ＦＬＮＡ、ＦＬＴ４、ＦＭＯ３、ＦＭＯ４、ＦＭＲ２、ＦＭＲ１、ＦＮ、ＦＮ１／ｍ、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＥ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＰＤＭＭ、ＦＰＦ、Ｆｒａ−１、ＦＲＡＸＦ、ＦＲＤＡ、ＦＳＨＢ、ＦＳＨＭＤ１Ａ、ＦＳＨＲ、ＦＴＨ１、ＦＴＨＬ１７、ＦＴＬ、ＦＴＺＦ１、ＦＵＣＡ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ６、ＦＵＴ１、ＦＹ、Ｇ２５０、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、Ｇ６ＰＣ、Ｇ６ＰＤ、Ｇ６ＰＴ１、Ｇ６ＰＴ２、ＧＡＡ、ＧＡＢＲＡ３、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＬＣ、ＧＡＬＥ、ＧＡＬＫ１、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＬＴ、ＧＡＭＴ、ＧＡＮ、ＧＡＳＴ、ＧＡＳＴＲＩＮ１７、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ、ＧＢＡ、ＧＢＥ、ＧＣ、ＧＣＤＨ、ＧＣＧＲ、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＣＰ−２、ＧＣＳ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＣＳＨ、ＧＣＳＬ、ＧＣＹ、ＧＤＥＰ、ＧＤＦ５、ＧＤＩ１、ＧＤＮＦ、ＧＤＸＹ、ＧＦＡＰ、ＧＦＮＤ、ＧＧＣＸ、ＧＧＴ１、ＧＨ２、ＧＨ１、ＧＨＲ、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＳ、ＧＩＦ、ＧＩＮＧＦ、ＧＩＰ、
ＧＪＡ３、ＧＪＡ８、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＪＢ１、ＧＫ、ＧＬＡ、ＧＬＢ、ＧＬＢ１、ＧＬＣ３Ｂ、ＧＬＣ１Ｂ、ＧＬＣ１Ｃ、ＧＬＤＣ、ＧＬＩ３、ＧＬＰ１、ＧＬＲＡ１、ＧＬＵＤ１、ＧＭ１（ｆｕｃ−ＧＭ１）、ＧＭ２Ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＰＲ、ＧＮＡＩ２、ＧＮＡＳ、ＧＮＡＴ１、ＧＮＢ３、ＧＮＥ、ＧＮＰＴＡ、ＧＮＲＨ、ＧＮＲＨ１、ＧＮＲＨＲ、ＧＮＳ、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐ１００、ＧＰ１ＢＡ、ＧＰ１ＢＢ、ＧＰ９、ＧＰＣ３、ＧＰＤ２、ＧＰＤＳ１、ＧＰＩ、ＧＰ１ＢＡ、ＧＰＮ１ＬＷ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＧＰＳＣ、ＧＰＸ１、ＧＲＨＰＲ、ＧＲＫ１、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＧＲＰＲ、ＧＳＥ、ＧＳＭ１、ＧＳＮ、ＧＳＲ、ＧＳＳ、ＧＴＤ、ＧＴＳ、ＧＵＣＡ１Ａ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＧＵＬＯＰ、ＧＵＳＢ、ＧＵＳＭ、ＧＵＳＴ、ＧＹＰＡ、ＧＹＰＣ、ＧＹＳ１、ＧＹＳ２、Ｈ０ＫＰＰ２、Ｈ０ＭＧ２、ＨＡＤＨＡ、ＨＡＤＨＢ、ＨＡＧＥ、ＨＡＧＨ、ＨＡＬ、ＨＡＳＴ−２、ＨＢ１、ＨＢＡ２、ＨＢＡ１、ＨＢＢ、ＨＢＢＰ１、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ２、ＨＢＧ１、ＨＢＨＲ、ＨＢＰ１、ＨＢＱ１、ＨＢＺ、ＨＢＺＰ、ＨＣＡ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−４、ＨＣＦ２、ＨＣＧ、ＨＣＬ２、ＨＣＬ１、ＨＣＲ、ＨＣＶＳ、ＨＤ、ＨＰＮ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＮＥＵ、ＨＥＲ３、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＥＳＸ１、ＨＥＸＡ、ＨＥＸＢ、ＨＦ１、ＨＦＥ、ＨＦ１、ＨＧＤ、ＨＨＣ２、ＨＨＣ３、ＨＨＧ、ＨＫ１  ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ−Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ−Ａ２／ｍ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１  ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＣＳ、ＨＬＸＢ９、ＨＭＢＳ、ＨＭＧＡ２、ＨＭＧＣＬ、ＨＭＩ、ＨＭＮ２、ＨＭＯＸ１、ＨＭＳ１  ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＨＮＤ、ＨＮＥ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＯＡＣ、ＨＯＭＥＯＢＯＸ  ＮＫＸ  ３．１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＨＯＸＡ１  ＨＯＸＤ１３、ＨＰ、ＨＰＣ１、ＨＰＤ、ＨＰＥ２、ＨＰＥ１、ＨＰＦＨ、ＨＰＦＨ２、ＨＰＲＴ１、ＨＰＳ１、ＨＰＴ、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＲ、ＨＲＡＳ、ＨＲＤ、ＨＲＧ、ＨＲＰＴ２、ＨＲＰＴ１、ＨＲＸ、ＨＳＤ１１Ｂ２、ＨＳＤ１７Ｂ３、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＨＳＤ３Ｂ２、ＨＳＤ３Ｂ３、ＨＳＮ１、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＰＧ２、ＨＳＴ−２、ＨＴＣ２、ＨＴＣ１、ｈＴＥＲＴ、ＨＴＮ３、ＨＴＲ２Ｃ、ＨＶＢＳ６、ＨＶＢＳ１、ＨＶＥＣ、ＨＶ１Ｓ、ＨＹＡＬ１、ＨＹＲ、Ｉ−３０９、ＩＡＢ、ＩＢＧＣ１、ＩＢＭ２、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ３、ｉＣＥ、ＩＣＨＱ、ＩＣＲ５、ＩＣＲ１、ＩＣＳ１、ＩＤＤＭ２、ＩＤＤＭ１、ＩＤＳ、ＩＤＵＡ、ＩＦ、ＩＦＮａ／ｂ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＧＡＤ１、ＩＧＥＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＦ１、ＩＧＨ、ＩＧＨＣ、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＭ、ＩＧＨＲ、ＩＧＫＣ、ＩＨＧ１、ＩＨＨ、ＩＫＢＫＧ、ＩＬ１、ＩＬ−１  ＲＡ、ＩＬ１０、ＩＬ−１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１３、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ１８、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１β、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ２、ＩＬ２４、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ���Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、未成熟ラミニン受容体、ＩＭＭＰ２Ｌ、ＩＮＤＸ、ＩＮＦＧＲ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＮＦα、ＩＦＮ、ＩＮＦγ、ＩＮＳ、ＩＮＳＲ、ＩＮＶＳ、ＩＰ−１０、ＩＰ２、ＩＰＦ１、ＩＰ１、ＩＲＦ６、ＩＲＳ１、ＩＳＣＷ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＩＴＩＨ１、ＩＴＭ２Ｂ、ＩＶ、ＩＶＤ、ＪＡＧ１、ＪＡＫ３、ＪＢＳ、ＪＢＴＳ１、ＪＭＳ、ＪＰＤ、ＫＡＬ１、ＫＡＬ２、ＫＡＬＩ、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＪ１、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４、ＫＣＮＱ１、ＫＣＳ、ＫＥＲＡ、ＫＦＭ、ＫＦＳ、ＫＦＳＤ、ＫＨＫ、ｋｉ−６７、ＫＩＡＡ００２０、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、ＫＩＦ１Ｂ、ＫＩＴ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＬＫ３、ＫＬＫＢ１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＫＭＳ、ＫＮＧ、ＫＮＯ、Ｋ−ＲＡＳ／ｍ、ＫＲＡＳ２、ＫＲＥＶ１、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ１２、ＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ１４Ｌ１、ＫＲＴ１４Ｌ２、ＫＲＴ１４Ｌ３、ＫＲＴ１６、ＫＲＴ１６Ｌ１、ＫＲＴ１６Ｌ２、ＫＲＴ１７、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴ３、ＫＲＴ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６  Ａ、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ９、ＫＲＴＨＢ１、ＫＲＴＨＢ６、ＫＲＴ１、ＫＳＡ、ＫＳＳ、ＫＷＥ、ＫＹＮＵ、Ｌ０Ｈ１９ＣＲ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＬＡＬＬ、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ２、ＬＡＭＰ２、ＬＡＰ、ＬＣＡ５、ＬＣＡＴ、ＬＣＣＳ、ＬＣＣＳ１、ＬＣＦＳ２、ＬＣＳ１、ＬＣＴ、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＬＤＨＣ、ＬＤＬＲ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＬＥＰ、ＬＥＷＩＳＹ、ＬＧＣＲ、ＬＧＧＦ−ＰＢＰ、ＬＧＩ１、ＬＧＭＤ２Ｈ、ＬＧＭＤ１Ａ、ＬＧＭＤ１Ｂ、ＬＨＢ、ＬＨＣＧＲ、ＬＨＯＮ、ＬＨＲＨ、ＬＨＸ３、ＬＩＦ、ＬＩＧ１、ＬＩＭＭ、ＬＩＭＰ２、ＬＩＰＡ、ＬＩＰＡ、ＬＩＰＢ、ＬＩＰＣ、ＬＩＶＩＮ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＭＡＮ１、ＬＭＮＡ、ＬＭＸ１Ｂ、ＬＯＬＲ、ＬＯＲ、ＬＯＸ、ＬＰＡ、ＬＰＬ、ＬＰＰ、ＬＱＴ４、ＬＲＰ５、ＬＲＳ  １、ＬＳＦＣ、ＬＴ−β、ＬＴＢＰ２、ＬＴＣ４Ｓ、ＬＹＬ１、ＸＣＬ１、ＬＹＺ、Ｍ３４４、ＭＡ５０、ＭＡＡ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＦＤ２、ＭＡＦＤ１、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥＢ１、ＭＡＧＥ−Ｂ１０、ＭＡＧＥ−Ｂ１６、ＭＡＧＥ−Ｂ１７、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ１、ＭＡＧＥ−Ｄ２、ＭＡＧＥ−Ｄ４、ＭＡＧＥ−Ｅ１、ＭＡＧＥ−Ｅ２、ＭＡＧＥ−Ｆ１、ＭＡＧＥ−Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２、ＭＧＢ１、ＭＧＢ２、ＭＡＮ２Ａ１、ＭＡＮ２Ｂ１、ＭＡＮＢＡ、ＭＡＮＢＢ、ＭＡＯＡ、ＭＡＯＢ、ＭＡＰＫ８ＩＰ１、ＭＡＰＴ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＢＬ２、ＭＢＰ、ＭＢＳ１、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ４Ｒ、ＭＣＣ、ＭＣＣＣ２、ＭＣＣＣ１、ＭＣＤＲ１、ＭＣＦ２、ＭＣＫＤ、ＭＣＬ１、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＯＬＮ１、ＭＣＯＰ、ＭＣＯＲ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰＨ２、ＭＣＰＨ１、ＭＣＳ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＢ、ＭＤＣＲ、ＭＤＭ２、ＭＤＲＶ、ＭＤＳ  １、ＭＥ１、ＭＥ１／ｍ、ＭＥ２、ＭＥ２０、ＭＥ３、ＭＥＡＸ、ＭＥＢ、ＭＥＣ  ＣＣＬ−２８、ＭＥＣＰ２、ＭＥＦＶ、ＭＥＬＡＮＡ、ＭＥＬＡＳ、ＭＥＮ１  ＭＳＬＮ、ＭＥＴ、ＭＦ４、ＭＧ５０、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ、ＭＧＡＴ２、ＭＧＡＴ５、ＭＧＣ１  ＭＧＣＲ、ＭＧＣＴ、ＭＧＩ、ＭＧＰ、ＭＨＣ２ＴＡ、ＭＨＳ２、ＭＨＳ４、ＭＩＣ２、ＭＩＣ５、ＭＩＤＩ、ＭＩＦ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−５／ＨＣＣ−２、ＭＩＴＦ、ＭＪＤ、ＭＫＩ６７、ＭＫＫＳ、ＭＫＳ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＬＬＴ２、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ７、ＭＬＬＴ１、ＭＬＳ、ＭＬＹＣＤ、ＭＭＡ１ａ、ＭＭＰ  １１、ＭＭＶＰ１、ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ−抗原、ＭＮＧ１、ＭＮ１、ＭＯＣ３１、ＭＯＣＳ２、ＭＯＣＳ１、ＭＯＧ、ＭＯＲＣ、ＭＯＳ、ＭＯＶ１８、ＭＰＤ１、ＭＰＥ、ＭＰＦＤ、ＭＰＩ、ＭＰＩＦ−１、ＭＰＬ、ＭＰＯ、ＭＰＳ３Ｃ、ＭＰＺ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＲＯＳ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＳＤ、ＭＲＸ１４、ＭＲＸ２、ＭＲＸ２０、ＭＲＸ３、ＭＲＸ４０、ＭＲＸＡ、ＭＲＸ１、ＭＳ、ＭＳ４Ａ２、ＭＳＤ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＳ、ＭＳＳＥ、ＭＳＸ２、ＭＳＸ１、ＭＴＡＴＰ６、ＭＴＣ０３、ＭＴＣＯ１、ＭＴＣＹＢ、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＭ１、ＭＴＭＲ２、ＭＴＮＤ２、ＭＴＮＤ４、ＭＴＮＤ５、ＭＴＮＤ６、ＭＴＮＤ１、ＭＴＰ、ＭＴＲ、ＭＴＲＮＲ２、ＭＴＲＮＲ１、ＭＴＲＲ、ＭＴＴＥ、ＭＴＴＧ、ＭＴＴＩ、ＭＴＴＫ、ＭＴＴＬ２、ＭＴＴＬ１、ＭＴＴＮ、ＭＴＴＰ、ＭＴＴＳ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−１／ｍ、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−２／ｍ、ＭＵＭ−３、ＭＵＭ−３／ｍ、ＭＵＴ、突然変異体ｐ２１ｒａｓ、ＭＵＴＹＨ、ＭＶＫ、ＭＸ２、ＭＸＩ１、ＭＹ０５Ａ、ＭＹＢ、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ２、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＭＹＬ２、ＭＹＬ３、ＭＹＭＹ、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ｇ、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯＣ、ミオシン／ｍ、ＭＹＰ２、ＭＹＰ１、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミルトランスフェラーゼ−Ｖ、ＮＡＧＡ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＭＳＤ、ＮＡＰＢ、ＮＡＴ２、ＮＡＴ、ＮＢＩＡ１、ＮＢＳ１、ＮＣＡＭ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ１、ＮＤＮ、ＮＤＰ、ＮＤＵＦＳ４、ＮＤＵＦＳ７、ＮＤＵＦＳ８、ＮＤＵＦＶ１、ＮＤＵＦＶ２、ＮＥＢ、ＮＥＦＨ、ＮＥＭ１、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、ｎｅｏ−ＰＡＰ／ｍ、ＮＥＵ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＦ２、ＮＦ１、ＮＦＹＣ／ｍ、ＮＧＥＰ、ＮＨＳ、ＮＫＳ１、ＮＫＸ２Ｅ、ＮＭ、ＮＭＥ１、ＮＭＰ２２、ＮＭＴＣ、ＮＯＤＡＬ、ＮＯＧ、ＮＯＳ３、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰ、ＮＰＣ２、ＮＰＣ１、ＮＰＨＬ２、ＮＰＨＰ１、ＮＰＨＳ２、ＮＰＨＳ１、ＮＰＭ／ＡＬＫ、ＮＰＰＡ、ＮＱＯ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲＡＳ、ＮＲＡＳ／ｍ、ＮＲＬ、ＮＲＯＢ１、ＮＲＴＮ、ＮＳＥ、ＮＳＸ、ＮＴＲＫ１、ＮＵＭＡ１、ＮＸＦ２、ＮＹ−ＣＯ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｂ、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＡＬＤＯＡ、ＮＹＳ２、ＮＹＳ４、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＮＹＳ１、ＮＹＸ、ＯＡ３、ＯＡ１、ＯＡＰ、ＯＡＳＤ、ＯＡＴ、ＯＣＡ１、ＯＣＡ２、ＯＣＤ１、ＯＣＲＬ、ＯＣＲＬ１、ＯＣＴ、ＯＤＤＤ、ＯＤＴ１、ＯＦＣ１、ＯＦＤ１、ＯＧＤＨ、ＯＧＴ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＰＡ２、ＯＰＡ１、ＯＰＤ１、ＯＰＥＭ、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＰＮ１ＬＷ、ＯＰＮ１ＭＷ、ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＰＧ、ＯＰＴＢ１、ＴＴＤ、ＯＲＭ１、ＯＲＰ１、ＯＳ−９、ＯＳ−９／ｍ、ＯＳＭ  ＬＩＦ、ＯＴＣ、ＯＴＯＦ、ＯＴＳＣ１、ＯＸＣＴ１、ＯＹＴＥＳ１、Ｐ１５、Ｐ１９０  ＭＩＮＯＲ  ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｐ２ＲＹ１２、Ｐ３、Ｐ１６、Ｐ４０、Ｐ４ＨＢ、Ｐ−５０１、Ｐ５３、Ｐ５３／ｍ、Ｐ９７、ＰＡＢＰＮ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＦＡＨ１Ｐ１、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＧＥ−５、ＰＡＨ、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＫ３、ＰＡＰ、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＴ−１、ＰＡＴＥ、ＰＡＸ２、ＰＡＸ３、ＰＡＸ６、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＡＸ９、ＰＢＣＡ、ＰＢＣＲＡ１、ＰＢＴ、ＰＢＸ１、ＰＢＸＰ１、ＰＣ、ＰＣＢＤ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＣＫ２、ＰＣＫ１、ＰＣＬＤ、ＰＣＯＳ１、ＰＣＳＫ１、ＰＤＢ１、ＰＤＣＮ、ＰＤＥ６Ａ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥＦ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲ、ＰＤＧＦＲＬ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＲ、ＰＤＸ１、ＰＥＣＡＭ１、ＰＥＥ１、ＰＥＯ１、ＰＥＰＤ、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ３、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ７、ＰＥＸ１、ＰＦ４、ＰＦＢＩ、ＰＦＣ、ＰＦＫＦＢ１、ＰＦＫＭ、ＰＧＡＭ２、ＰＧＤ、ＰＧＫ１、ＰＧＫ１Ｐ１、ＰＧＬ２、ＰＧＲ、ＰＧＳ、ＰＨＡ２Ａ、ＰＨＢ、ＰＨＥＸ、ＰＨＧＤＨ、ＰＨＫＡ２、ＰＨＫＡ１、ＰＨＫＢ、ＰＨＫＧ２、ＰＨＰ、ＰＨＹＨ、ＰＩ、ＰＩ３、ＰＩＧＡ、ＰＩＭ１−ＫＩＮＡＳＥ、ＰＩＮ１、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＩＴＸ２、ＰＩＴＸ３、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、ＰＫＤ１、ＰＫＤＴＳ、ＰＫＨＤ１、ＰＫＬＲ、ＰＫＰ１、ＰＫＵ１、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＰＬＡＴ、ＰＬＥＣ１、ＰＬＧ、ＰＬＩ、ＰＬＯＤ、ＰＬＰ１、ＰＭＥＬ１７、ＰＭＬ、ＰＭＬ／ＲＡＲα、ＰＭＭ２、ＰＭＰ２２、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＮＫＤ、ＰＮＬＩＰ、ＰＯＦ１、ＰＯＬＡ、ＰＯＬＨ、ＰＯＭＣ、ＰＯＮ２、ＰＯＮ１、ＰＯＲＣ、ＰＯＴＥ、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＰＡＣ、ＰＰＡＲ
Ｇ、ＰＰＣＤ、ＰＰＧＢ、ＰＰＨ１、ＰＰＫＢ、ＰＰＭＸ、ＰＰＯＸ、ＰＰＰ１Ｒ３Ａ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＰＰＴ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＢ、ＰＲＢ３、ＰＲＣＡ１、ＰＲＣＣ、ＰＲＤ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＲＦ１、ＰＲＧ４、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＤＣ、ＰＲＫＷＮＫ４、ＰＲＮＰ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＤＨ、ＰＲＯＭ１、ＰＲＯＰ１、ＰＲＯＳ１、ＰＲＳＴ、ＰＲＰ８、ＰＲＰＦ３１、ＰＲＰＦ８、ＰＲＰＨ２、ＰＲＰＳ２、ＰＲＰＳ１、ＰＲＳ、ＰＲＳＳ７、ＰＲＳＳ１、ＰＲＴＮ３、ＰＲＸ、ＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＳＥＮ２、ＰＳＥＮ１、ＰＳＧ１、ＰＳＧＲ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＰＳＯＲＳ１、ＰＴＣ、ＰＴＣＨ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ１、ＰＴＨ、ＰＴＨＲ１、ＰＴＬＡＨ、ＰＴＯＳ１、ＰＴＰＮ１２、ＰＴＰＮＩ  ｌ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＫ／ｍ、ＰＴＳ、ＰＵＪＯ、ＰＶＲ、ＰＶＲＬ１、ＰＷＣＲ、ＰＸＥ、ＰＸＭＰ３、ＰＸＲ１、ＰＹＧＬ、ＰＹＧＭ、ＱＤＰＲ、ＲＡＢ２７Ａ、ＲＡＤ５４Ｂ、ＲＡＤ５４Ｌ、ＲＡＧ２、ＲＡＧＥ、ＲＡＧＥ−１、ＲＡＧ１、ＲＡＰ１、ＲＡＲＡ、ＲＡＳＡ１、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＲＢ１、ＲＢＰ４、ＲＢＰ４、ＲＢＳ、ＲＣＡ１、ＲＣＡＳ１、ＲＣＣＰ２、ＲＣＤ１、ＲＣＶ１、ＲＤＨ５、ＲＤＰＡ、ＲＤＳ、ＲＥＣＱＬ２、ＲＥＣＱＬ３、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＧ１Ａ、ＲＥＨＯＢＥ、ＲＥＮ、ＲＥＮＢＰ、ＲＥＮＳ１、ＲＥＴ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＧＲ、ＲＨＡＧ、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＨＤ、ＲＨＯ、Ｒｉｐ−１、ＲＬＢＰ１、ＲＬＮ２、ＲＬＮ１、ＲＬＳ、ＲＭＤ１、ＲＭＲＰ、ＲＯＭ１、ＲＯＲ２、ＲＰ、ＲＰ１、ＲＰ１４、ＲＰ１７、ＲＰ２、ＲＰ６、ＲＰ９、ＲＰＤ１、ＲＰＥ６５、ＲＰＧＲ、ＲＰＧＲＩＰ１、ＲＰ１、ＲＰ１０、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ４Ｙ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＲＲＡＳ２、ＲＳ１、ＲＳＮ、ＲＳＳ、ＲＵ１、ＲＵ２、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸｌ、ＲＷＳ、ＲＹＲ１、Ｓ−１００、ＳＡＡ１、ＳＡＣＳ、ＳＡＧ、ＳＡＧＥ、ＳＡＬＬ１、ＳＡＲＤＨ、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、ＳＡＳ、ＳＡＸ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ４、ＳＣＡ５、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１、ＳＣＣ、ＳＣＣＤ、ＳＣＦ、ＳＣＬＣ１、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＣＮＮ１Ｂ、ＳＣＮＮ１Ｇ、ＳＣＯ２、ＳＣＰ１、ＳＣＺＤ２、ＳＣＺＤ３、ＳＣＺＤ４、ＳＣＺＤ６、ＳＣＺＤ１、ＳＤＦ−１α／ＳＤＨＡ、ＳＤＨＤ、ＳＤＹＳ、ＳＥＤＬ、ＳＥＲＰＥＮＡ７、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＡ６、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＳＥＲＰＩＮＤ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＥＲＰＩＮＩ１、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＤ、ＳＧＣＡ、ＳＧＣＢ、ＳＧＣＤ、ＳＧＣＥ、ＳＧＭ１、ＳＧＳＨ、ＳＧＹ−１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＨＢＧ、ＳＨＦＭ２、ＳＨＦＭ３、ＳＨＦＭ１、ＳＨＨ、ＳＨＯＸ、ＳＩ、ＳＩＡＬ、ＳＩＡＬＹＬ  ＬＥＷＩＳＸ、ＳＩＡＳＤ、Ｓ１１、ＳＩＭ１、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＩＸ３、ＳＪＳ１、ＳＫＰ２、ＳＬＣ１０Ａ２、ＳＬＣ１２Ａ１、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＬＣ１７Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ２２Ａ１Ｌ、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬＣ２５Ａ１３、ＳＬＣ２５Ａ１５、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＬＣ２５Ａ５、ＳＬＣ２５Ａ６、ＳＬＣ２６Ａ２、ＳＬＣ２６Ａ３、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ２Ａ４、ＳＬＣ３Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ４Ａ４、ＳＬＣ５Ａ１、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ６Ａ２、ＳＬＣ６Ａ３、ＳＬＣ６Ａ４、ＳＬＣ７Ａ７、ＳＬＣ７Ａ９、ＳＬＣ１１Ａ１、ＳＬＯＳ、ＳＭＡ、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＬ、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＸ２、ＳＭＣＲ、ＳＭＣＹ、ＳＭ１、ＳＭＮ２、ＳＭＮ１、ＳＭＰＤ１、ＳＮＣＡ、ＳＮＲＰＮ、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３、ＳＯＤ１、ＳＯＳ１、ＳＯＳＴ、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１０、Ｓｐ１７、ＳＰＡＮＸＣ、ＳＰＧ２３、ＳＰＧ３Ａ、ＳＰＧ４、ＳＰＧ５Ａ、ＳＰＧ５Ｂ、ＳＰＧ６、ＳＰＧ７、ＳＰＩＮＫ１、ＳＰＩＮＫ５、ＳＰＰＫ、ＳＰＰＭ、ＳＰＳＭＡ、ＳＰＴＡ１、ＳＰＴＢ、ＳＰＴＬＣ１、ＳＲＣ、ＳＲＤ５Ａ２、ＳＲＰＸ、ＳＲＳ、ＳＲＹ、βｈＣＧ、ＳＳＴＲ２、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０／ＳＳＸ２）、ＳＳＸ４、ＳＴ８、ＳＴＡＭＰ−１、ＳＴＡＲ、ＳＴＡＲＰ１、ＳＴＡＴＨ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＫ２、ＳＴＫ１１、ＳＴｎ／ＫＬＨ、ＳＴＯ、ＳＴＯＭ、ＳＴＳ、ＳＵＯＸ、ＳＵＲＦ１、ＳＵＲＶＩＶＩＮ−２Ｂ、ＳＹＣＰ１、ＳＹＭ１、ＳＹＮ１、ＳＹＮＳ１、ＳＹＰ、ＳＹＴ／ＳＳＸ、ＳＹＴ−ＳＳＸ−１、ＳＹＴ−ＳＳＸ−２、ＴＡ−９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣＳＴＤ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＡＧ７２、ＴＡＦ７Ｌ、ＴＡＦ１、ＴＡＧＥ、ＴＡＧ−７２、ＴＡＬＩ、ＴＡＭ、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、ＴＡＰＶＲ１、ＴＡＲＣ、ＴＡＲＰ、ＴＡＴ、ＴＡＺ、ＴＢＰ、ＴＢＸ２２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸＡ２Ｒ、ＴＢＸＡＳ１、ＴＣＡＰ、ＴＣＦ２、ＴＣＦ１、ＴＣＩＲＧ１、ＴＣＬ２、ＴＣＬ４、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＮ２、ＴＣＯＦ１、ＴＣＲ、ＴＣＲＡ、ＴＤＤ、ＴＤＦＡ、ＴＤＲＤ１、ＴＥＣＫ、ＴＥＣＴＡ、ＴＥＫ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＥＬＡＢ１、ＴＥＸ１５、ＴＦ、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＦＥ３、ＴＦＲ２、ＴＧ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦ−β、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲＥ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＴＧＩＦ、ＴＧＭ−４、ＴＧＭ１、ＴＨ、ＴＨＡＳ、ＴＨＢＤ、ＴＨＣ、ＴＨＣ２、ＴＨＭ、ＴＨＰＯ、ＴＨＲＡ、ＴＨＲＢ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ１、ＴＩＴＦ１、ＴＫＣＲ、ＴＫＴ、ＴＬＰ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＸ１、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＭ４ＳＦ２、ＴＭＣ１、ＴＭＤ、ＴＭＩＰ、ＴＮＤＭ、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ２、ＴＯＣ、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＡ、ＴＰＢＧ、ＴＰＩ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＰＩ１、ＴＰＭ３、ＴＰＭ１、ＴＰＭＴ、ＴＰＯ、ＴＰＳ、ＴＰＴＡ、ＴＲＡ、ＴＲＡＧ３、ＴＲＡＰＰＣ２、ＴＲＣ８、ＴＲＥＨ、ＴＲＧ、ＴＲＨ、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ−２／６ｂ、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ−ｐ８、ＴＲＰＳ１、ＴＳ、ＴＳＣ２、ＴＳＣ３、ＴＳＣ１、ＴＳＧ１０１、ＴＳＨＢ、ＴＳＨＲ、ＴＳＰ−１８０、ＴＳＴ、ＴＴＧＡ２Ｂ、ＴＴＮ、ＴＴＰＡ、ＴＴＲ、ＴＵ  Ｍ２−ＰＫ、ＴＵＬＰ１、ＴＷＩＳＴ、ＴＹＨ、ＴＹＲ、ＴＹＲＯＢＰ、ＴＹＲＯＢＰ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＳ、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ１、ＵＣＨＬ１、ＵＦＳ、ＵＧＴ１Ａ、ＵＬＲ、ＵＭＰＫ、ＵＭＰＳ、ＵＯＸ、ＵＰＡ、ＵＱＣＲＣ１、ＵＲＯ５、ＵＲＯＤ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＲＯＳ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ３Ａ、ＵＳＨ１Ａ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＰ９Ｙ、ＵＶ２４、ＶＢＣＨ、ＶＣＦ、ＶＤＩ、ＶＤＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１、ＶＨＬ、ＶＩＭ、ＶＭＤ２、ＶＭＤ１、ＶＭＧＬＯＭ、ＶＮＥＺ、ＶＮＦ、ＶＰ、ＶＲＮＩ、ＶＷＦ、ＶＷＳ、ＷＡＳ、ＷＢＳ２、ＷＦＳ２、ＷＦＳ１、ＷＨＣＲ、ＷＨＮ、ＷＩＳＰ３、ＷＭＳ、ＷＲＮ、ＷＳ２Ａ、ＷＳ２Ｂ、ＷＳＮ、ＷＳＳ、ＷＴ２、ＷＴ３、ＷＴ１、ＷＴＳ、ＷＷＳ、ＸＡＧＥ、ＸＤＨ、ＸＩＣ、ＸＩＳＴ、ＸＫ、ＸＭ、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＲＣＣ９、ＸＳ、ＺＡＰ７０、ＺＦＨＸ１Ｂ、ＺＦＸ、ＺＦＹ、ＺＩＣ２、ＺＩＣ３、ＺＮＦ１４５、ＺＮＦ２６１、ＺＮＦ３５、ＺＮＦ４１、ＺＮＦ６、ＺＮＦ１９８、ＺＷＳ１、又はこれらの断片若しくは変異体。かかる断片及び変異体は、上に示された又は上に記載されたタンパク質又はペプチド配列のうちの１つと、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％の配列相同性又は配列同一性を示すことが好ましい。この状況では、断片及び変異体の定義は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された断片及び変異体と同様に適用される。
【００７４】
また、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、プロテインキナーゼ阻害剤、特にプロテインキナーゼであるｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、即ち、ＪＮＫ阻害剤から選択してもよい。一般的に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として、好適なＪＮＫ阻害剤は、ヒト又はラットＩＢ１配列に由来していてもよく、好ましくは、配列番号１３７（ラットのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列及びその予測アミノ酸配列を記載）、配列番号１３８（ｒＩＢ１遺伝子のエキソン−イントロン境界によりコードされるラットのＩＢ１タンパク質配列を記載−スプライスドナー）、配列番号１３９（ヒトのＩＢ１タンパク質配列を記載）、若しくは配列番号１４０（ヒトのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を記載）に係る任意の配列により定義若しくはコードされるアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号１３９（ヒトのＩＢ１タンパク質配列を記載）、若しくは配列番号１４０（ヒトのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を記載）に係る任意の配列により定義若しくはコードされるアミノ酸配列、又はこれらの任意の断片若しくは変異体に由来する。この状況では、断片及び変異体の定義は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された断片及び変異体と同様に適用される。
【００７５】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、全長１５０個未満のアミノ酸残基、好ましくは５個〜１５０個のアミノ酸残基、更に好ましくは１０個〜１００個のアミノ酸残基、特に好ましくは１０個〜７５個のアミノ酸残基、最も好ましくは１０個〜５０個のアミノ酸残基、例えば、１０個〜３０個、１０個〜２０個、又は１０個〜１５個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。かかるＪＮＫ阻害剤配列及び上記範囲は、より好ましくは、本明細書で言及されるＪＮＫ阻害剤配列のいずれか、更により好ましくは、配列番号１３９によって定義されるか又は配列番号１４０によりコードされるアミノ酸配列、更により好ましくは、配列番号１４０のヌクレオチド４２０〜９８０又は配列番号１３９のアミノ酸１０５〜２９１の間の領域、最も好ましくは、配列番号１４０のヌクレオチド５６１〜６４７又は配列番号１３９のアミノ酸１５２〜１８０の間の領域から選択してもよい。
【００７６】
特定の実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、一般的に、以下の少なくともいずれかを行う：ＪＮＫに結合する、及び少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ若しくはＡＴＦ２（例えば、それぞれ配列番号１４７及び１４８を参照）又はＥｌｋ１などの活性化を阻害する。
【００７７】
同様に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１３７〜２２０のいずれか１つに係る少なくとも１つのアミノ酸配列、又はこれらの断片、誘導体、若しくは変異体を含むか、或いはこれらからなることが好ましい。より好ましくは、ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、配列番号１３７〜２２０に係るアミノ酸配列、又はこれらの変異体、断片、若しくは誘導体を１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、又はそれ以上含んでもよい。配列番号１３７〜２２０に係る前記アミノ酸配列、又はこれらの変異体、断片、若しくは誘導体が１コピー超存在する場合、如何なるリンカー配列を介することもなく互いに直接連結してもよく、１個〜１０個、好ましくは１個〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して連結してもよい。リンカー配列を形成するアミノ酸としては、アミノ酸残基としてグリシン又はプロリンから選択されることが好ましい。より好ましくは、配列番号１３７〜２２０に係るアミノ酸配列、又はこれらの断片、誘導体、若しくは変異体は、本明細書で使用するとき、２個、３個、又はそれ以上のプロリン残基のヒンジにより互いに分離されてもよい。
【００７８】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との組み合わせから構成されてもよい。好ましくは、前記ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、少なくとも１個、又は更には２個、好ましくは少なくとも３個、４個、又は５個、より好ましくは少なくとも６個、７個、８個、又は９個、更により好ましくは少なくとも１０個、又はそれ以上のＤ−アミノ酸及び／又はＬ−アミノ酸を含み、ここでＤ−アミノ酸及び／又はＬ−アミノ酸は、本明細書では、ブロック状、非ブロック状、又は交互にＪＮＫ阻害剤配列中に配置されていてもよい。
【００７９】
１つの好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、全てＬ−アミノ酸から構成されてもよい。本明細書で使用するとき、ＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１４１又は１４３に係る少なくとも１つの「ネイティブなＪＮＫ阻害剤配列」を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。この状況では、「ネイティブなＪＮＫ阻害剤配列」とは、本明細書で用いられるとき、全てＤ−アミノ酸で構成されている、配列番号１４１又は１４３のいずれかに係る非改変ＪＮＫ阻害剤配列を指す。
【００８０】
したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１つの（ネイティブな）アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−Ｘｎａ−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ  ｇｅｎｅｒｉｃ（ｓ））（配列番号１４３）及び／又はＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＸＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／ＴＸ（Ｌ−ＩＢ（ｇｅｎｅｒｉｃ））（配列番号１５１）を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。この状況では、各Ｘは、一般的に、アミノ酸残基を表し、好ましくは、任意の（ネイティブな）アミノ酸残基から選択される。Ｘｎａは、一般的に、１つのアミノ酸残基を表し、好ましくは、セリン又はスレオニンを除く任意のアミノ酸残基から選択され、ｎ（Ｘの反復数）は、０又は１である。更に、各Ｘｎｂは、任意のアミノ酸残基から選択してよく、ｎ（Ｘの反復数）は、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、又はそれ以上である。但し、Ｘｎａのｎ（Ｘの反復数）が０である場合、Ｘｎｂは、Ｘｎａの位置にセリン又はスレオニンが存在することを避けるために、Ｃ末端にセリン又はスレオニンを含まないことが好ましい。好ましくは、Ｘｎｂは、配列番号１４１又は１４３に由来する連続したペプチド残基を表す。Ｘｎａ及びＸｎｂは、Ｄアミノ酸又はＬアミノ酸のいずれを表してもよい。更に、前記ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメインＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＩＢ１）（配列番号１４９）を含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブな）アミノ酸配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。より好ましくは、前記ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、少なくとも１つの（ネイティブな）アミノ酸配列ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号１４１）を更に含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。更に、前記ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、以下のＩＢ１のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブな）アミノ酸配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい：Ｌ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号１５３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１５４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号１５５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１５６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１５７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号１５８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１５９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号１６０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１６１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−���ＯＯＨ、配列番号１６２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１６３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１６４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号１６５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１６６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１６７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号１６８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１６９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号１７０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１７１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１７２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号１７３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１７４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１７５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ、配列番号１７６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ、配列番号１７７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１７８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ、配列番号１７９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１８０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１８１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ、配列番号１８２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ、配列番号１８３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１８４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ、配列番号１８５）；及びＬ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号１８６）。
【００８１】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１の（長い）ＪＮＫ結合ドメインＰＧＴＧＣＧＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＩＢ１−ｌｏｎｇ）（配列番号１４５）、ＩＢ２の（長い）ＪＮＫ結合ドメインＩＰＳＰＳＶＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ（ＩＢ２−ｌｏｎｇ）（配列番号１４６）、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ結合ドメインＧＡＹＧＹＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＮＬＫＰＨ（ｃ−Ｊｕｎ）（配列番号１４７）、ＡＴＦ２のＪＮＫ結合ドメインＴＮＥＤＨＬＡＶＨＫＨＫＨＥＭＴＬＫＦＧＰＡＲＮＤＳＶＩＶ（ＡＴＦ２）（配列番号１４８）を含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブな）アミノ酸配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。この状況では、アラインメントにより、部分的に保存されている８個のアミノ酸配列が明らかとなり、ＩＢ１及びＩＢ２のＪＢＤを更に比較することにより、２つの配列間で高度に保存されている７個及び３個のアミノ酸の２つのブロックが明らかになった。
【００８２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、部分的に又は全てＤ−アミノ酸から構成されてもよい。Ｄ−アミノ酸からなるこれらのＪＮＫ阻害剤配列としては、上記（ネイティブな）ＪＮＫ阻害剤配列の非ネイティブなＤ−レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型配列が好ましい。用語「レトロインベルソ型配列」とは、配列の方向が逆であり、且つ各アミノ酸残基のキラリティも反転している直線状ペプチド配列の異性体を指す（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照）。Ｄ−鏡像異性体と逆合成とを組み合わせる利点は、各アミド結合におけるカルボニル基とアミノ基の位置は入れ替わるが、各α炭素における側鎖基の位置は保存されるという点である。特に明記しない限り、本発明に従って用いられるとき、任意の所定のＬ−アミノ酸配列又はペプチドは、対応するネイティブなＬ−アミノ酸配列又はペプチドに対して逆の配列又はペプチドを合成することにより、Ｄ−レトロインベルソ型配列又はペプチドに変換することができると仮定する。
【００８３】
したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列としては、アミノ酸配列ＮＨ２−Ｘｎｂ−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘｎａ−Ｘｎｂ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１  ｇｅｎｅｒｉｃ（ｓ））（配列番号１４４）及び／又はＸＳ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸ（Ｄ−ＩＢ（ｇｅｎｅｒｉｃ））（配列番号１５２）に係る少なくとも１つのＤ−レトロインベルソ型配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。この状況で用いられるとき、Ｘ、Ｘｎａ、及びＸｎｂは、上に定義された通りであり（好ましくは、Ｄアミノ酸を表す）、Ｘｎｂは、好ましくは、配列番号１４２又は１４４に由来する連続した残基を表す。更に、ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、ＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ（Ｄ−ＩＢ１）（配列番号１５０）を含むアミノ酸配列に係る少なくとも１つのＤ−レトロインベルソ型配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。より好ましくは、前記ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、アミノ酸配列ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１（ｓ））（配列番号１４２）に係る少なくとも１つのＤ−レトロインベルソ型配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。更に、ＪＮＫ阻害剤配列は、本明細書で使用するとき、以下のＩＢ１のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列に係る少なくとも１つのＤ−レトロインベルソ型配列を含んでもよく、前記配列から構成されてもよい：Ｄ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１８７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１８８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号１８９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１９０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１９１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号１９２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号１９３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１９４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１９５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号１９６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号１９７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号１９８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号１９９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号２００）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号２０１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号２０２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１���）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号２０３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号２０４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号２０５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号２０６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号２０７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号２０８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号２０９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ、配列番号２１０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ２−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬ−ＣＯＯＨ、配列番号２１１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ２−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ、配列番号２１２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ２−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ、配列番号２１３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ２−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ、配列番号２１４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ２−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ、配列番号２１５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ２−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ、配列番号２１６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ２−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号２１７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ２−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ、配列番号２１８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ２−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ、配列番号２１９）；及びＤ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ２−ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ、配列番号２２０）。
【００８４】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適な例示的ＪＮＫ阻害剤配列を表８〜１１に示す（配列番号１４１〜２２０）。この表は、本明細書で使用するときのＪＮＫ阻害剤配列の名称と、その配列の識別番号、長さ、及びアミノ酸配列を示す。更に、表８〜１１は、例えば、それぞれ配列番号１４１と１４２、及び配列番号１４３と１４４のように、ＩＢ１由来配列及びその一般式を示す。表８〜１１は、配列番号１５３〜１８６に係るＬ−ＩＢ１配列、及び配列番号１８７〜２２０に係るＤ−ＩＢ１配列を更に開示する。
【００８５】
【表８】
2015120694.tif 000009
【表９】
2015120694.tif 000010
【表１０】
2015120694.tif 000011
【表１１】
2015120694.tif 000012
【００８６】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、更に、配列番号１４１〜２２０に係る、上に定義されたネイティブなアミノ酸配列又は非ネイティブなアミノ酸配列の少なくとも１つの変異体、断片、及び／又は誘導体を含んでもよいか、或いはこれらから構成されてもよい。これら変異体、断片、及び／又は誘導体は、本明細書で使用するとき、上に開示されたネイティブ又は非ネイティブなＪＮＫ阻害剤配列、特に、配列番号１４１〜２２０に係るネイティブ又は非ネイティブなアミノ酸配列の生物学的活性を保持している、即ち、以下の少なくともいずれかを行うことが好ましい：ＪＮＫに結合する、及び少なくとも１つのＪＮＫ活性化転写因子、例えば、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、又はＥｌｋ１の活性化を阻害する。機能は、例えば、標的分子に対するペプチドの結合試験などの様々な試験により試験することができ、又は例えば、分光法、コンピュータモデリング、構造解析などの生物物理学方法により試験することもできる。特に、上に定義されたＪＮＫ阻害剤配列、その変異体、断片、及び／又は誘導体は、ペプチドの疎水性領域及び親水性領域を同定するために利用できる親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，１９８１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７８：３８２４−３８２８）により分析して、結合実験などの実験操作、又は抗体合成のための基質の設計に役立てることもできる。本明細書で使用するとき、ＪＮＫ阻害剤配列、その変異体、断片及び／又は誘導体の領域を同定するために二次構造解析を実施して、特定の構造モチーフを推測してもよい（例えば、Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ１３：２２２−２２３を参照）。操作、翻訳、二次構造予測、親水性及び疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測及びプロッティング、並びに配列相同性の決定は、当該技術分野において入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。構造解析の他の方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７−１３を参照）、質量分光測定及びガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，１９９７，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）が挙げられ、コンピュータモデリング（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ，ｅｄｓ．，１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｉｎ：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を使用してもよい。
【００８７】
したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１４１〜２２０に係る（ネイティブな又はネイティブではない）アミノ酸配列のうちの少なくとも１つの変異体を含んでもよく、前記変異体から構成されてもよい。本発明の状況では、「配列番号１４１〜２２０に係る（ネイティブな又はネイティブではない）アミノ酸配列の変異体」は、配列番号１４１〜２２０に係るアミノ酸配列のアミノ酸変化を含む、配列番号１４１〜２２０に係る配列のいずれかに由来する配列であることが好ましい。かかる変化は、一般的に、配列番号１４１〜２２０に係るアミノ酸の１個〜２０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個の置換、付加、及び／又は欠失を含み、ここで、前記変異体は、配列番号１４１〜２２０に係る配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は更には９９％の配列同一性を示す。上に定義され且つ本明細書で用いられる配列番号１４１〜２２０に係る（ネイティブな又はネイティブではない）アミノ酸配列の変異体が特定のアミノ酸の置換により得られる場合、かかる置換は、既に上に定義されている保存的アミノ酸置換を含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、更に、抗原又は抗原断片、好ましくは、タンパク質及びペプチド抗原、例えば、腫瘍抗原又はその抗原断片、アレルギー抗原又はその抗原断片、自己免疫自己抗原又はその抗原断片、病原性抗原又はその抗原断片、ウイルス由来、好ましくは、以下のウイルス由来の抗原又はその抗原断片：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、オルソポックス属痘瘡ウイルス、オルソポックス属アラストリムウイルス、ヒツジパラポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヘルペスＢウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヒト巨細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、Ｂ型肝炎ウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ルビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルスＣ、西ナイルウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、跳躍病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、Ｂ型日本脳炎ウイルス、ポーワッサンウイルス、ＦＳＭＥウイルス、ＳＡＲＳ、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯｃ４３、トロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ型、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）、即ち、ヒト免疫不全ウイルス１型又はヒト免疫不全ウイルス２型、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、タカリベウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ボルナ病ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、サシチョウバエ熱ウイルス、トスカーナウイルス、クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ハザラウイルス、ハサンウイルス、ハンターンウイルス、ソウルウイルス、プロスペクトヒルウイルス、プーマラウイルス、ドブラバベオグラードウイルス、トゥーラウイルス、シンノンブルウイルス、ビクトリア湖マルブルクウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、コートジボアールエボラウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型、パラインフルエンザウイルス、マラリアウイルス、マルブルクウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１＋２型、オーストラリアコウモリリッサウイルス、アデノウイルスＡ−Ｆ型、ヒトパピローマウイルス、コンジロームウイルス６型、コンジロームウイルス１１型、ポリオーマウイルス、アデノ関連ウイルス２型、ロタウイルス、オルビウイルス、水痘帯状疱疹を含む水痘、或いは、リーシュマニア、トリパノソーマ、アメーバ、細菌などに由来する抗原又はその抗原断片から選択してもよく、上記抗原又はその抗原断片のエピトープ又は変異体から選択してもよい。上に定義された抗原の断片及び変異体は、上に示した又は上に記載した抗原又は抗原断片のうちの１つと約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％の配列相同性又は配列同一性を示すことが好ましい。この状況では、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された断片及び変異体の定義を同様に適用する。更に、上に定義された抗原又は抗原断片のエピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）を包含する。本発明の状況において、エピトープは、一般的に、本明細書に定義される（ネイティブな）タンパク質又はペプチドの外表面に位置し、好ましくは５アミノ酸〜１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸〜１２アミノ酸、更により好ましくは６アミノ酸〜９アミノ酸を有し、抗体によって認識され得る、即ち、ネイティブな形態の断片である。
【００８９】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、抗体から選択されてもよい。本発明によれば、かかる抗体は、当該技術分野において既知である任意の抗体、例えば、任意の組換えにより生成された抗体又は天然抗体、特に、治療上、診断上、若しくは科学的目的上好適な抗体、又は特定の癌疾患に関連して同定された抗体から選択されてもよい。本明細書で、用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び遮断抗体又は中和抗体を含む）、並びに多エピトープ特異性を有する抗体種を包含する。本発明によれば、「抗体」は、一般的に、当該技術分野において公知の任意の抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ抗体）、例えば、天然抗体、ホスト生物を免疫することにより生成される抗体、天然抗体又はホスト生物を免疫することにより生成される抗体から単離及び同定された抗体、及び当該技術分野において既知である分子生物学的方法を用いて組換えにより生成される抗体などに加えて、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、イントラボディ、即ち、細胞内で発現し、且つ任意で特定の細胞内区画に局在する抗体、並びに前述の抗体の断片及び変異体を含む。一般的に、抗体は、軽鎖及び重鎖からなり、これらは両方可変ドメイン及び定常ドメインを有する。軽鎖は、Ｎ末端の可変ドメインＶＬ、及びＣ末端の定常ドメインＣＬからなる。対照的に、ＩｇＧ抗体の重鎖は、例えば、Ｎ末端の可変ドメインＶＨ、及び３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。また、抗体は、この状況では、上記抗体の断片及び変異体、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片などを含む。かかる断片及び変異体は、上記抗体のうちの１つと約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％の配列相同性又は配列同一性を示すことが好ましい。この状況では、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された断片及び変異体の定義を同様に適用する。
【００９０】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、以下を含むアポトーシス因子若しくはアポトーシス関連タンパク質：ＡＩＦ、Ａｐａｆ、例えば、Ａｐａｆ−１、Ａｐａｆ−２、Ａｐａｆ−３、ｏｄｅｒ  ＡＰＯ−２（Ｌ）、ＡＰＯ−３（Ｌ）、アポパイン、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｘＳ、ｂｉｋ、Ｂｏｋ、ＣＡＤ、カルパイン、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、ｃｅｄ−３、ｃｅｄ−９、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｒｍＡ、シトクロムＣ、ＣｄＲ１、ＤｃＲ１、ＤＤ、ＤＥＤ、ＤＩＳＣ、ＤＮＡ−ＰＫＣＳ、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ−１、ＦＡＫ、Ｆａｓ（Ｆａｓ−リガンドＣＤ９５／ｆａｓ（受容体））、ＦＬＩＣＥ／ＭＡＣＨ、ＦＬＩＰ、フォドリン、ｆｏｓ、Ｇ−アクチン、Ｇａｓ−２、ゲルソリン、グランザイムＡ／Ｂ、ＩＣＡＤ、ＩＣＥ、ＪＮＫ、ラミンＡ／Ｂ、ＭＡＰ、Ｍａｘ、ＭＣＬ−１、Ｍｄｍ−２、ＭＥＫＫ−１、ＭＯＲＴ−１、Ｍｙｄ８８、ＮＥＤＤ、ＮＦ−κＢ、ＮｕＭａ、ｐ３８、ｐ５３、ＰＡＫ−２、ＰＡＲＰ、パーフォリン、ＰＩＴＳＬＲＥ、ＰＫＣデルタ、ｐＲｂ、プレセニリン、ｐｒＩＣＥ、ＲＡＩＤＤ、Ｒａｓ、ＲＩＰ、スフィンゴミエリナーゼ、単純ヘルペスのチミジンキナーゼ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、トランスグルタミナーゼなど、又はこれらの断片若しくは変異体、或いはβ−カテニンなどのｗｎｔ−シグナル伝達経路の構成要素、ＩＣＦ−ファミリー、ポロ様キナーゼ、ＣｉＰ２Ａ、ＰＰ２Ａ、又はこれらの断片若しくは変異体から選択してもよい。かかる断片及び変異体は、上に示された又は上に記載された配列のうちの１つと約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％の配列相同性又は配列同一性を示すことが好ましい。この状況では、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された断片及び変異体の定義を同様に適用する。
【００９１】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、更に、少なくとも１以上の部分長若しくは完全長ＢＨ３ドメイン、及び／又は少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質から選択されてもよい。この状況では、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバーと相互作用することによりアポトーシスの制御因子を表すＢｃｌ−２ファミリーのメンバーと定義されることが好ましい。本発明の状況では、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の少なくとも１以上の部分長若しくは完全長ＢＨ３ドメイン配列、又は部分長若しくは完全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質（Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質のサブクラスと定義される）を含むアミノ酸配列から選択されてもよく、これらは、少なくとも１つのＢｃｌ−２ファミリータンパク質と相互作用するか、又はＢｃｌ−２ファミリーの少なくとも１つのアポトーシス促進性メンバーを活性化若しくは感作することにより、アポトーシスを誘導することができる。これらの機能活性は、好適なアッセイ方法、例えば、結合アッセイによるか、又はアポトーシスアッセイによるアポトーシス促進活性をアッセイすることにより試験することができる。好ましくは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として用いられるアミノ酸配列は、少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３ドメイン配列、並びに／又はＢｉｄ、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｍｆ、ＤＰ５／Ｈｒｋ及びＢｏｋからなる群より選択される少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列を含んでもよいか、又は前記配列から構成されてもよい。或いは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として用いられるアミノ酸配列は、少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３ドメイン配列、及び／又は少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列の組み合わせを含んでもよく、又は前記組み合わせから構成されてもよく、前記組み合わせは、例えば、以下からなる群より選択されることが好ましい：ＢｉｄとＢａｄ、ＢｉｍとＢａｄ、ＢｉｋとＢａｄ、ＰｕｍａとＢａｄ、ＮｏｘａとＢａｄ、ＢｍｆとＢａｄ、ＤＰ５／ＨｒｋとＢａｄ、ＢｏｋとＢａｄ、ＢｉｋとＢｉｍ、ＢｉｋとＢｉｄ、ＢｉｋとＰｕｍａ、ＢｉｋとＮｏｘａ、ＢｉｋとＢｍｆ、ＢｉｋとＤＰ５／Ｈｒｋ、ＢｉｋとＢｏｋ、ＢｉｄとＰｕｍａ、ＢｉｄとＮｏｘａ、ＢｉｄとＢｉｍ、ＢｉｄとＢｍｆ、ＢｉｄとＤＰ５／Ｈｒｋ、ＢｉｄとＢｏｋ、ＢｉｍとＮｏｘａ、ＢｉｍとＰｕｍａ、ＢｉｍとＢｍｆ、ＢｉｍとＤＰ５／Ｈｒｋ、ＢｉｍとＢｏｋ、ＰｕｍａとＮｏｘａ、ＰｕｍａとＢｍｆ、ＰｕｍａとＤＰ５／Ｈｒｋ、ＰｕｍａとＢｏｋ、ＮｏｘａとＢｍｆ、ＮｏｘａとＤＰ５／ＨｒｋとＮｏｘａとＢｏｋ。上に定義された（完全長又は部分長）ＢＨ３配列又はＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列は、例えば、任意の哺乳類のＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、特にヒトアイソフォームから選択されてもよい。したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）は、配列番号２２１〜２３７（表１２〜１３を参照）のいずれかにより定義される、少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３ドメイン配列、及び／又は少なくとも１つのＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列を含んでもよく、又は前記配列から構成されてもよい。好ましくは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として用いられるアミノ酸配列は、更に、配列番号２２１〜２３７のいずれかにより定義される、少なくとも１つの部分長若しくは完全長ＢＨ３ドメイン配列、及び／又は少なくとも１つのＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列の少なくとも１つの断片又は変異体を含んでもよいか、これらから構成されてもよい。かかる断片及び変異体は、５０アミノ酸未満、好ましくは４０アミノ酸未満、より好ましくは３０アミノ酸未満の配列長を有するか、上記配列又は配列番号２２１〜２３７のいずれかに示される配列のうちの１つと約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％の配列相同性又は配列同一性を示すことが好ましい。この状況では、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）について上に定義された断片及び変異体の定義を同様に適用する。更に、ネイティブな配列の断片又は変異体は、一般的に、ＢＨ３ドメイン配列を含むか、又はＢＨ３ドメイン配列を少なくとも部分的に含む（ＢＨ３ドメイン配列のうちの少なくとも７アミノ酸）。
【００９２】
【表１２】
2015120694.tif 000013
【表１３】
2015120694.tif 000014
【００９３】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のエフェクタ分子として用いられる、上記タンパク質又はペプチド配列、例えば、治療活性タンパク質、抗原、抗体、アポトーシス因子、病状に関与しているプロテアーゼ、好ましくは、ペプチドプロテアーゼ阻害剤、ＢＨ３ドメインなどの配列は、Ｌ−アミノ酸からなるネイティブな形態であるか、又は（全て）Ｄ−アミノ酸からなるレトロインベルソ型Ｄ形態であるタンパク質又はペプチド配列として提供してもよく、これは、これら配列が末端を逆にすることにより反転しなくてはならないことを意味する、即ち、ネイティブのＣ末端が反転型のＮ末端になり、ネイティブのＮ末端が反転型のＣ末端になる。或いは、上記のこれらタンパク質又はペプチド配列は、そのタンパク質又はペプチド配列をＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物として提供してもよい。
【００９４】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、核酸、好ましくは、上に定義されたタンパク質又はペプチド、例えば、治療活性タンパク質及びペプチド、抗原、抗体、アポトーシス因子、病状に関与しているプロテアーゼ、好ましくは、ペプチドプロテアーゼ阻害剤、ＢＨ３ドメイン、又は部分長若しくは完全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、或いはこれらの断片の変異体などをコードする核酸から選択してもよい。この状況では、核酸は、好ましくは、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖核酸を含み、好ましくは、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、発現エレメントを有する又は有しない相補的ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ミニ遺伝子、遺伝子断片、制御エレメント、プロモータ、及びこれらの組み合わせから選択される。
【００９５】
更なる具体例として、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、ｓｉＲＮＡから選択されてもよい。この状況では、特にＲＮＡ干渉の現象に関連するｓｉＲＮＡを対象とする。免疫学的研究の過程でＲＮＡ干渉の現象が見出された。近年、ＲＮＡに基づく防御機構が発見されたが、これは、真菌界と、植物界及び動物界との両方で生じており、「ゲノムの免疫系」として作用している。前記ゲノムの免疫系は、元々互いに独立して様々な種で報告され（最初は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、後に、これらプロセスの根底にある機構が同一であることを確認できた：したがって、植物のＲＮＡ介在性ウイルス耐性、植物のＰＴＧＳ（転写後遺伝子サイレンシング）、及び真核生物のＲＮＡ干渉は、共通の機序に基づいている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のインビトロ技術は、遺伝子発現の配列特異的抑制を誘発する二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）に基づいている（Ｚａｍｏｒｅ（２００１）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：７４６−７５０；Ｓｈａｒｐ（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：４８５−４９０；Ｈａｎｎｏｎ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１：２４４−２５１）。長いｄｓＲＮＡが哺乳類細胞にトランスフェクトされると、プロテインキナーゼＲ及びＲｎａｓｅＬが活性化されて、例えば、インターフェロン応答などの非特異的作用が生じる（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：２２７−２６４；Ｈｅ  ａｎｄ  Ｋａｔｚｅ（２００２）Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：９５−１１９）。３０ｂｐよりも短いｓｉＲＮＡは前記非特異的作用を誘発しないので、例えば２１ｍｅｒ〜２３ｍｅｒの短いＲＮＡ、所謂ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を用いた場合、これら非特異的作用は避けられる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−４９８）。近年、ｄｓＲＮＡ分子は、インビボでも用いられている（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ４１８：３８−３９；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ２：２４３−２４７）。したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子として用いられるｓｉＲＮＡは、一般的に、約８ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、好ましくは約１７ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチド、特に好ましくは２１ヌクレオチド〜２３ヌクレオチドの（一本鎖又は）二本鎖ＲＮＡ配列、好ましくは二本鎖ＲＮＡ配列を含む。原則として、上述のタンパク質（配列）のコード領域に生じる１７塩基対〜２９塩基対、好ましくは１９塩基対〜２５塩基対、より好ましくは２１塩基対〜２３塩基対の長さを有するセクション全てが、ｓｉＲＮＡの標的配列として機能することができる。同様に、ｓｉＲＮＡは、コード領域に存在しない前述のタンパク質（配列）のヌクレオチド配列、特にＲＮＡの５’非コード領域、例えば、制御機能を有するＲＮＡの非コード領域を標的とすることもできる。したがって���ｓｉＲＮＡの標的配列は、ＲＮＡの翻訳及び／又は非翻訳領域、並びに調節エレメントの領域の少なくともいずれかに存在し得る。また、ｓｉＲＮＡの標的配列は、非翻訳領域及び翻訳領域の重複領域に存在してもよく、具体的には、前記標的配列は、コード領域の開始コドンの少なくとも１ヌクレオチド上流を含んでもよい。
【００９６】
別の具体例として、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、アンチセンスＲＮＡから選択してもよい。この状況では、アンチセンスＲＮＡは、センス（メッセンジャー）ＲＮＡに対して相補的であるように、テンプレートではなく、（ゲノミック）ＤＮＡのコード鎖に基づいて転写される（一本鎖）ＲＮＡ分子であることが好ましい。本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なアンチセンスＲＮＡは、一般的に、センスＲＮＡ分子とアンチセンスＲＮＡ分子との間に二本鎖を形成し、それによって対応するｍＲＮＡの翻訳をブロックすることができる。本明細書で使用するとき、コードされているタンパク質若しくはペプチドの翻訳がアンチセンスＲＮＡによって低減／抑制される場合、アンチセンスＲＮＡは、例えば、ゲノミックＤＮＡに由来するｍＲＮＡ配列の任意の部分、及び本明細書に定義されるタンパク質ペプチド（例えば、上記治療活性タンパク質及びペプチド、抗原、抗体、アポトーシス因子、病状に関与しているプロテアーゼ、好ましくはペプチドプロテアーゼ阻害剤、ＢＨ３−ドメイン、部分長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、完全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、又はこれらの断片の変異体など）などの任意のタンパク質をコードし得るｍＲＮＡ配列の任意の部分の少なくともいずれかを標的とするものであってよい。したがって、標的となるｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）におけるアンチセンスＲＮＡの標的配列は、ｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）の翻訳及び／又は非翻訳領域、例えば調節エレメントの領域、特に制御機能を発揮するｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）の５’−非コード領域に存在してよい。また、標的となるｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）におけるアンチセンスＲＮＡの標的配列は、標的となるｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）の非翻訳配列及び翻訳（コード）配列に対して部分的に相補的である領域を含むことにより、アンチセンスＲＮＡがｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）に結合するように構築することができ；具体的には、アンチセンスＲＮＡは、標的となるｍＲＮＡのコード領域の開始コドンの少なくとも１ヌクレオチド上流まで標的ｍＲＮＡ（又は標的となる（ゲノミック）ＤＮＡ）に対して相補的であってもよい。好ましくは、本明細書で使用するとき、アンチセンスＲＮＡは、約５ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、好ましくは約５００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、より好ましくは約１，０００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド、或いは約５ヌクレオチド〜約１，０００ヌクレオチド、約５ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約５ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、又は約５ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチド、或いは更に好ましくは約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、又は約２０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチドの長さを含む。
【００９７】
更なる具体例として、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子は、更に、化学療法薬剤として好適な細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤から選択されてもよい。一般的に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適な化学療法薬剤は、作用機序に基づいて３つの主な分類に分けることができる。前記化学療法薬剤は、（ａ）プレＤＮＡ分子の基本単位の合成を停止させることができる：これらの剤は、多数の異なる方法で機能する。ＤＮＡの基本単位は、葉酸、複素環塩基、及びヌクレオチドであり、これらは、自然界では細胞内で生成される。これらの剤は全て、ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド形成（ＤＮＡ生成に必須）の幾つかの工程をブロックする機能を有する。これら工程がブロックされると、ＤＮＡ及びＲＮＡの基本単位であるヌクレオチドを合成することができない。したがって、ヌクレオチドなしにＤＮＡを生成することはできないので、細胞はＤＮＡを複製することができない。この分類の薬剤の例としては、メトトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（登録商標））、フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、及びメルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、チオグアニン、トコフェロールが挙げられ、又はより一般的には、任意のヌクレオチド類似体、例えば、２’−デオキシシチジン類似体も含まれる。或いは、化学療法薬剤は、（ｂ）細胞の核内のＤＮＡに直接損傷を与えることができる。これらの剤は、ＤＮＡ及びＲＮＡに化学的損傷を与える。これらは、ＤＮＡの複製を乱し、複製を完全に停止させるか、又はナンセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ（即ち、新たに生成されるＤＮＡ又はＲＮＡは、有用なものを全くコードしていない）の生成を引き起こす。この分類の薬剤の例としては、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、アントラサイクリン抗腫瘍剤の分類（このメンバーは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として用いることができる）に属する抗生物質であるダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、及びエトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標））、又は任意のインターカレータが挙げられる。最後に、化学療法薬剤は、（ｃ）有糸分裂紡錘体の合成又は崩壊に影響を及ぼすことができる：有糸分裂紡錘体は、細胞が２つの新たな細胞に分裂し始めるとき、細胞の「南北極」の分子線路として機能する。これら紡錘体は、細胞分裂中２つの新たな細胞の各々にコピーが移動するように、新たにコピーされたＤＮＡの分裂を助けるので、非常に重要である。これらの薬剤は、紡錘体の形成を乱すため、細胞分裂を妨げる。このような有糸分裂攪乱剤の分類の薬剤としては、例えば、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））などが挙げられる。本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）は、上記作用機序のうちの１つに従って作用することができる。換言すれば、抗腫瘍薬剤の各分類、即ち、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、及びステロイドホルモンを、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として用いることができる。これら薬剤の分類についてより詳細に説明するために、上に開示された細胞周期及び細胞化学に対する作用に従って各抗癌剤を分類できることを強調する。アルキル化剤は、ＤＮＡを直接攻撃することにより細胞を殺傷する。アルキル化剤は、慢性白血病、ホジキン病、リンパ腫、並びに肺、胸、前立腺、及び卵巣の特定の癌腫の治療に用いることができる。シクロホスファミドは、一般的に用いられるアルキル化剤の例である。ニトロソ尿素は、アルキル化剤と同様に作用し、またＤＮＡ修復に必須な変化も阻害する。これらの剤は、血液脳関門を通過するので、脳腫瘍、リンパ腫、多発性骨髄腫、及び悪性黒色腫の治療に用いられる。カルムスチン及びロムスチンが、この分類の主な薬剤である。代謝拮抗物質は、特定の活性、通常ＤＮＡ合成に干渉することにより細胞増殖をブロックする薬剤である。一旦細胞に取り込まれると、代謝拮抗物質は、正常な発生及び複製を停止させる。この分類の薬剤は全て、細胞周期の「Ｓ」期中に細胞に影響を及ぼす。代謝拮抗物質は、急性及び慢性白血病、絨毛上皮腫、並びに胃腸管、胸、及び卵巣の幾つかの腫瘍の治療に用いることができる。一般的に用いられる代謝拮抗物質の例は、６−メルカプトプリン及び５−フルオロウラシル（５ＦＵ）である。抗腫瘍抗生物質は、多様な化合物群である。一般的に、抗腫瘍抗生物質は、ＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を阻止することにより作用する。これら剤は、各種癌の治療において広く用いられている。この群の最も一般的に用いられている薬剤は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ミトマイシン−Ｃ、及びブレオマイシンである。植物（ビンカ）アルカロイドは、植物に由来する抗腫瘍剤である。これらの薬剤は、具体的には、有糸分裂中に細胞分裂をブロックすることにより作用する。植物アルカロイドは、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、並びに肺、胸、及び精巣の癌の治療において、一般的に用いられている。ビンクリスチン及びビンブラスチンは、この群の一般的に用いられている剤である。ステロイドホルモンは、幾つかの種類の腫瘍の治療において有用である。この分類は、アドレノコルチコステロイド、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲステロン、及びアンドロゲンを含む。具体的な作用機序は明らかになっていないが、ステロイドホルモンは、特定のホルモン依存性癌の増殖を調節する。タモキシフェンが例であり、これはエストロゲン依存性乳癌に用いられる。上記腫瘍の全ての種は、上記抗腫瘍剤のいずれかを成分（Ｂ）として含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子により治療することができる。
【００９８】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のためのエフェクタ分子として用いることができる細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤の１つの群は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、細胞増殖抑制剤、又はホルモン治療に関する薬剤から選択されることが好ましい。この状況では、細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤として、金属化合物、特に白金（誘導体）及びタキソール分類を選択することが好ましい。具体的には、薬剤部分は、例えば、シスプラチン、トランスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、アザチオプリン、フルオロウラシル、（６）−メルカプトプリン、メトトレキサート、ナンドロロン、アミノ配糖体、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、プロカルバジン、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、エピポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトザントロン、トポテカン、ブレオマイシン、ゲムシタビン、フルダラビン、ナベルビン及び５−ＦＵＤＲからなる薬剤群より選択される。金属含有抗癌薬剤の分類、例えば白金化合物の分類が特に好ましい。
【００９９】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のエフェクタ分子として用いることができる更なる細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤（一般名により識別される）としては、アリトレチノイン、アルトレタミン、アザチオプリン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、シクロホスファミド、エキセメスタン、レトロゾール、フィナステリド、酢酸メゲストロール、トリプトレリン、テモゾロミド、ミフェプリストン、トレチノイン、オーラル、タモキシフェン、テニポシド、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、硫酸ペプロマイシン、又はカンプトテシンの分類などが挙げられる。
【０１００】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のエフェクタ分子として用いることができる細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤の別の群としては、インドロカルバゾール化合物などが挙げられ、例えば、スタウロスポリン（及びその類似体）及びレベッカマイシンなどが挙げられる。成分（Ｂ）として、アミノキナゾリンの分類に属している化合物（例えば、ゲフィチニブ）などが、特に好ましい。
【０１０１】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のためのエフェクタ分子として用いることができる細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤の更なる群としては、イリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、又は有糸分裂キネシン若しくはＤＨＦＲから更に選択されてもよい。
【０１０２】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のためのエフェクタ分子として用いることができる細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤として、例えば、細胞増殖阻害又は刺激因子（ＰＤＧＦ）、細胞内経路、ＲＡＳ／ＲＡＦシグナル伝達経路、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路（例えば、ＲＡＦ−１）又はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路のメンバーなど、ＣＭＧＣキナーゼファミリー（ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３、ＣＬＫを含む）、ＰＫＡ、ＰＫＧ、ＰＫＣキナーゼファミリーを含むＡＧＣキナーゼファミリーに属するＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）−２、ＶＥＧＦＲ−３、血小板由来増殖因子受容体βなどが挙げられ、また、血管新成及び腫瘍進行に関与している受容体チロシンキナーゼ、Ｆｌｔ−３、エンドセリン（ＥＴ）系（ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３を含む）、ＥＴＡ受容体（ＥＴＡＲ）及びＥＴＢＲ、例えば機能を阻害することにより標的とされるｃ−ＫＩＴ、並びにＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ２ＲなどのＩＧＦファミリーのメンバーなどから選択される。
【０１０３】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）のためのエフェクタ分子として用いることができる細胞毒性薬剤又は抗腫瘍薬剤の別の群は、腫瘍細胞増殖及び腫瘍新脈管形成を標的とする阻害剤から選択されてもよい。この状況では、抗血管新生活性を有する悪性細胞及び／又は血管細胞上の標的に対する小分子抗腫瘍キナーゼ阻害剤が特に好ましい。ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−ＫＩＴ、ＰＫＣ、Ｒａｆ、及びＰＩ３などに対するキナーゼ阻害剤は、罹患悪性細胞による血管新生因子の分泌をブロックすることにより血管新生を阻害する。ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣ、Ｒａｆ、及びＰＩ３などに対するキナーゼ阻害剤は、血管細胞に対する作用によって血管新生を阻害する。サイクリン依存性キナーゼの合成阻害剤（ＣＤＫＩ）としては、例えば、オロモウシン、フラボピリドール、ブチロラクトン、及びこれらの誘導体などが挙げられ、腫瘍細胞の増殖を制限する。他方、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として、好適な抗腫瘍化合物は、癌細胞のアポトーシスプログラムのアクチベータ（例えば、スタウロスポリン）から選択されてもよく、抗アポトーシスタンパク質、例えば、Ｂｃｌ−２をダウンレギュレーションしてもよい。
【０１０４】
抗癌薬剤として作用するために細胞膜を通過しなければならないことは、上記化合物の全てにおいて共通している。これらの各分類に属する化合物（細胞の核内のＤＮＡに直接損傷を与える化合物、有糸分裂紡錘体の合成若しくは崩壊に作用する化合物、又はプレＤＮＡ分子の基本単位の合成を停止させる化合物）を成分（Ｂ）として成分（Ａ）に結合させて、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を形成することにより、抗癌化合物の細胞への侵入が促進されて及び／又は抗癌化合物の可溶性が向上して、これら治療化合物の有効性を高めることができた。延いては、細胞への取り込み増加、及び、好ましくは、これら化合物の水性環境（例えば、サイトゾル）への可溶性向上により、治療用抗癌化合物の投与量を減少させることができる。
【０１０５】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）は、また、小有機化合物又は薬剤分子、例えば、プロテアーゼ、特に、感染因子の感染周期に関与しているプロテアーゼ、ウイルス、細菌又は原生動物のプロテアーゼを阻害するプロテアーゼ阻害剤などを含んでもよい。好ましい実施形態としては、これらのプロテアーゼ阻害剤（有機化合物又は薬剤分子）は、本発明のコンジュゲート分子の一部として、ウイルス感染、細菌感染、又は原生動物感染、例えば、マラリアなどを治療する機能を有することが可能である。具体的には、ウイルス感染、例えば、レトロウイルス性疾患は、プロテアーゼ阻害剤により治療することができる。プロテアーゼ阻害剤を含むコンジュゲート分子の使用は、ＨＩＶ感染の治療に非常に好ましい。本明細書に開示されるキャリア配列に結合させるために用いるプロテアーゼ阻害剤は、６４０３８５、硫酸アバカビル、ＡＧ１７７６、アンプレナビル（１４１Ｗ９４又はＶＸ−４７８）、アタザナビル（ＢＭＳ−２３２６３２）、カテプシンＳプロテアーゼ阻害剤、Ｄ１９２７、Ｄ９１２０、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド（Ｔ−２０）、ホスアンプレナビル（ＧＷ−４３３９０８又はＶＸ−１７５）、ＧＳ９００５、ＧＷ６４０３８５（ＶＸ−３８５）、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、インジナビル（ＭＫ−６３９）、Ｌ−７５６、４２３、レボプリン−ＺＧ、ロピナビル（ＡＢＴ−３７８）、ロピナビル／リトナビル（ＬＰＶ  ＡＢＴ−３７８／ｒ）、ＭＫ−９４４Ａ、モゼナビル（ＤＭＰ４５０）、ネルフィナビル（ＡＧ−１３４３）、ネビラピン、Ｐ−１９４６、ＰＬ−１００、プリノマスタット、リトナビル（ＡＢＴ−５３８）、ＲＯ０３３−４６４９、ＴＭＣ１１４、サクイナビル（Ｒｏ−３１−８９５９）、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、チプラナビル（ＰＮＵ−１４０６９０）、ＴＬＫ１９７８１、ＴＭＣ−１１４、Ｖｅｒｔｅｘ３８５、ＶＸ−９５０を含む群から選択してもよい。
【０１０６】
最後に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）として好適なエフェクタ分子としては、更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子について上に定義された通りの標識とは別個の成分として選択されてもよい。かかる本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、インビトロ又はインビボアッセイに特に好適である。この状況では、標識は、放射性標識、即ち、放射性リン酸化標識又は硫黄、水素、炭素、窒素などを含む放射性標識；着色色素（例えば、ジゴキシゲニンなど）；蛍光基（例えば、フルオレセイン、ローダミン、以下に定義される蛍光色素タンパク質など）；化学発光基；又はこれら標識の組み合わせを含んでもよい。蛍光色素タンパク質は、活性化されて蛍光シグナルを発することができる任意の蛍光色素タンパク質を含むことが好ましい。蛍光色素タンパク質は、任意の蛍光色素タンパク質、例えば、以下を含む群から選択されることがより好ましい：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体、例えば、ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、光活性化可能なＧＦＰ（ＰＡ−ＧＦＰ）など；ＥＢＦＰ、サファイア、Ｔ−サファイアを含む青色蛍光色素タンパク質（ＢＦＰ）；高感度シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、ｍＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔを含むシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）；トパーズ、ビーナス、ｍシトリン、Ｙｐｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ｍバナナ、黄色シフト緑色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ  ＧＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）を含む黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）；又はＫｕｓｈｉｂａｒａオレンジ、ｍオレンジ、ｄトマト−タンデム、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ｍタンジェリン、ｍストロベリー、単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ１）（本明細書ではｍＲＦＰとも呼ばれる）、ｍチェリー、ｍラズベリー、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ｍプラムを含むオレンジ及び赤色蛍光タンパク質；に加えて、ＰＡ−ＧＦＰ、ＣｏｒａｌＨｕｅ  Ｄｒｏｎｐａ（Ｇ）、ＰＳ−ＣＦＰ（Ｃ）、ＰＳ−ＣＦＰ（Ｇ）、ｍＥｏｓＦＰ（Ｇ）、ｍＥｏｓＦＰ（Ｇ）から選択される光学ハイライター；キンドリング蛍光タンパク質（ＫＦＰ１）、エクオリン、自己蛍光タンパク質（ＡＦＰ）などの他の単量体蛍光タンパク質；又は蛍光タンパク質ＪＲｅｄ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、及びＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ｔＨｃ−Ｒｅｄ（ＨｃＲｅｄ−タンデム）、ＰＳ−ＣＦＰ２、及びＫＦＰ−Ｒｅｄ（ＥＶＲΩＧＥＮから入手可能、ｗｗｗ．ｅｖｒｏｇｅｎ．ｃｏｍも参照されたい）、又は他の好適な蛍光タンパク質。
【０１０７】
成分（Ａ）及び（Ｂ）を含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、好ましくは成分（Ｂ）とは異なる、少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などを更に含んでもよい。この少なくとも１つの任意の追加部分は、本発明の融合タンパク質に更なる機能を付与することができ、他の成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）から独立して選択することができる。
【０１０８】
例えば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などは、成分（Ｂ）について上に記載されているエフェクタ分子のいずれかであってもよい。好ましくは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の特異的に選択される成分（Ｂ）と同一ではない、即ち、少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などは、好ましくは、上記様々なエフェクタ分子、その断片、又は変異体から互いに独立して選択することができる。本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などは、更に、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、又は（小）有機化学化合物であってもよく、且つ好適な位置、例えば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のＮ末端、Ｃ末端で本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子に結合していてもよく、或いは、アミノ酸、例えば、アミノ酸側鎖、核酸、又は成分（Ｂ）（又は（Ａ））の任意の好適な位置に内部結合していてもよい。また、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を精製及び／又は単離しやすくすることができる部分（例えば、ＨＡ、ＨＳＶ−タグ、Ｈｉｓ６−タグ、ＦＬＡＧ−タグ）であってもよい。必要に応じて、生成プロセスの最後に、（例えば、タンパク質分解的切断、又は当該技術分野において既知である他の方法により）精製に必要な成分を本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の他の成分から除去してもよい。
【０１０９】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の少なくとも１つの任意の追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などは、好ましくは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の高い細胞透過性を失わせることなしに、特定の細胞内標的局在位置に本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を効率的に導くシグナル配列又は局在配列であってもよい。一般的に、かかるシグナル配列又は局在配列は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を特定の細胞内区画、例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置（ｇｌｏｏｍ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）、リソソーム小嚢などに導く。例示的なシグナル配列又は局在配列としては、ＫＤＥＬ（配列番号２３８）、ＤＤＥＬ（配列番号２３９）、ＤＥＥＬ（配列番号２４０）、ＱＥＤＬ（配列番号２４１）、ＲＤＥＬ（配列番号２４２）などの小胞体局在配列；ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２４３）、ＰＱＫＫＩＫＳ（配列番号２４４）、ＱＰＫＫＰ（配列番号２４５）、ＲＫＫＲ（配列番号２４６）などの核局在配列；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱ（配列番号２４７）、ＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号２４８）、ＭＰＬＴＲＲＲＰＡＡＳＱＡＬＡＰＰＴＰ（配列番号２４９）などの核領域局在配列；ＭＤＤＱＲＤＬＩＳＮＮＥＱＬＰ（配列番号２５０）などのエンドソーム区画局在配列などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
同様に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の少なくとも１つの任意の追加成分は、好ましくは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の高い細胞透過性を失わせることなしに、特定の細胞型に本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を効率的に導くシグナル配列又は局在配列であってもよい。
【０１１１】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、好ましくは末端、例えばＣ末端若しくはＮ末端のいずれか、又は両方に少なくとも１つの修飾を更に含んでもよい。Ｃ末端は、好ましくはアミド修飾により修飾されてよく、一方、Ｎ末端は、例えばアシル化などの任意の好適なＮＨ２保護基により修飾されてもよく、又はＬ−アミノ酸について既に記載された任意の更なる修飾により修飾されてもよい。また、かかる修飾は、上記一般式（Ｉ）に係る本発明の輸送体分子について上に定義されている標識の導入を含む。
【０１１２】
最後に、上記本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）、並びにこれら成分を連結するために任意で用いてもよいリンカーは、タンパク質又はペプチド配列を含んでもよく、前記配列から構成されてもよい。かかるタンパク質又はペプチド配列は、好ましくは、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトについて上に記載されているように、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との組み合わせから構成されてもよい。かかるＤ−アミノ酸及び／又はＬ−アミノ酸は、ブロック状、非ブロック状、又は交互に、成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）中に配置されていてもよい。或いは、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトについて上に記載されているパターンは、これら成分の反復フォート（ｆｏｒｔ）であってよい。換言すれば、上に定義された一般式（Ｉ）（配列番号１）ＤｌＬＬＬｘＤｍ（ＬＬＬｙＤｎ）ａ（式中、ａにより定義される反復数は、０〜３に限定されるものではないが、分子全体に適用してもよく、即ち、１〜５００、１〜２５０、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などであり、好ましくは、網羅されているタンパク質又はペプチド配列の長さによって決定される）を適用してもよい。
【０１１３】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）、（Ｂ）、並びに更なる任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などが存在する場合には、これらは、一般的に、共有結合又は静電結合（例えば、ポリリジン）を介して、好ましくは共有結合を介して互いに結合する。この状況で、用語「共有結合」とは、１以上の電子対を共有することにより生成される２つの原子間の安定な化学結合を指す。好ましくは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）及び（Ｂ）、並びに更なる任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などが存在する場合には、これらも全て、直線状分子又は非直線状（分岐）分子、好ましくは直線状分子を形成するように結合することができる。直線状分子では、上記成分（Ａ）及び（Ｂ）、並びに更なる任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などが存在する場合には、これらも全て、分岐輸送体−積荷コンジュゲート分子を形成することなしに、直線状形態となるように、末端を介して互いに結合する。非直線状（分岐）分子では、上記成分（Ａ）及び（Ｂ）、並びに更なる任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などが存在する場合にはこれらも、全て、例えば、Ｙ字型形態などの分岐輸送体−積荷コンジュゲート分子となるように、末端を介して互いに結合する。
【０１１４】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）は、定義上Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸からなるペプチド配列であるため、更なる成分（Ｂ）の共有結合、並びに任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が存在する場合にはこれらの（共有）結合は、無論、結合する成分の種類及び性質、即ち、１つの成分が、タンパク質であるか、ペプチド、核酸、（小）有機化合物などであるか依存する場合がある。
【０１１５】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）が成分（Ａ）と及び互いに結合して、好ましくは直線状分子を形成する順序、並びに更なる任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が存在する場合には、これらが、成分（Ａ）と及び互いに結合して、好ましくは直線状分子を形成する順序は、一般的に、任意の順序を含んでよい。したがって、成分（Ａ）、（Ｂ）、及び存在する場合（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）はいずれも、互いに結合することができる。しかし、成分（Ａ）は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の末端に結合することが好ましい。成分（Ｂ）がタンパク質又はペプチド配列である場合、並びに成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が存在する場合にはこれらのいずれかがタンパク質又はペプチド配列である場合、成分（Ａ）は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のＣ末端、例えば、ペプチド又はタンパク質として生じるとき、上に定義された成分（Ｂ）のＣ末端、又は成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が存在する場合には、これらのＣ末端に含まれることが好ましい。本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子において成分（Ａ）がかかる位置に存在することは、成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）の積荷ペプチド又はタンパク質配列が、ペプチダーゼ、特にカルボキシ末端ペプチダーゼＮなどのカルボキシペプチダーゼによって、例えば、細胞、核などの所望の標的部位に輸送される前に分解されるのを防ぐ。或いは、用いられる細胞系にアミノ末端ペプチダーゼが存在する場合、成分（Ａ）は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のアミノ末端に存在してもよい。
【０１１６】
更なる成分（Ｂ）がペプチド又はタンパク質配列である場合、及び／又は任意成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）が存在する場合には、これらのいずれかがペプチド又はタンパク質配列である場合、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のこれらタンパク質又はペプチド成分の間の結合は、一般的に、ペプチド結合であることが好ましい。かかるペプチド結合は、結合する成分の両方（一方の成分のＮ末端及び他方の成分のＣ末端）が関与する化学合成を用いて形成されてもよく、又は両方の成分のペプチド配列全体をタンパク質合成することを介して直接形成されてもよく、この場合、両方の（タンパク質又はペプチド）成分を１段階で合成することが好ましい。かかるタンパク質合成法としては、例えば、液相ペプチド合成法又は固体ペプチド合成法、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる固体ペプチド法、ｔ−Ｂｏｃ固相ペプチド合成、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）に基づく固相ペプチド合成などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、リンカーを介して結合することもでき、結合する成分が反応性アミノ基又はカルボキシ基を有する場合、例えばアミド架橋により直接（リンカー無しで）結合することもできる。或いは、エステル又はエーテル結合が好ましい。
【０１１８】
上述の更なる成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などが存在する場合には、これらは、成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）と類似の方法で結合してもよく、又は、任意で、互いに結合し、次いで単一部分として成分（Ａ）若しくは成分（Ｂ）のいずれかに結合してもよい。また、リンカー配列を用いて、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子と、少なくとも１つの他の成分（以下を参照）とを融合させることもできる。本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）又は成分（Ｂ）のいずれかに対して更なる成分を結合させる方法は、その化学的性質に依存する。更なる成分（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）などがペプチド配列の分類に属する場合、好ましくは成分（Ａ）の末端のいずれかで本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子が結合するか、或いは、例えばジスルフィド結合によって、成分（Ａ）のＬ−アミノ酸側鎖又はＤ−アミノ酸側鎖を介して結合する。他の化学的性質を有する更なる成分も同様に、成分（Ａ）（末端基又は化学的に活性のある側鎖基）又は成分（Ｂ）に結合することができる。側鎖を介する結合は、好ましくは、側鎖アミノ基、チオール基、又はヒドロキシル基に基づき、例えば、アミド結合、エステル結合、又はエーテル結合を介する。本発明によれば、（成分（Ａ）、及びアミノ酸で構成されている場合、成分（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）などのいずれかの）アミノ酸は、全て、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸であることが好ましく、これは、レトロインベルソ順序で結合することにより最終的には自然界に存在する類似体を反映すことに留意すべきである。それにもかかわらず、成分（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）などは、アミノ酸からなる場合、（自然界に存在する配列順序の）Ｌ−アミノ酸から構成されてもよく、又はＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との組み合わせで構成されてもよい。
【０１１９】
成分（Ａ）と（Ｂ）とを融合させるため、又は別の成分、例えば、（Ｃ）を成分（Ａ）及び／又は（Ｂ）に融合させるためにペプチドリンカー配列が用いられる場合、リンカー配列は、好ましくは２残基〜１０残基、より好ましくは１残基〜５残基の可動性配列を形成する。好ましい実施形態では、リンカー配列は、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％のＧｌｙ又はβ−アラニン残基、例えば、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号２５５）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号２５６）、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、ＣｙｓＧｌｙＧｌｙ、又はＧｌｙＧｌｙＣｙｓなどを含む。当業者は、適切なリンカー配列を容易に選択し、調製することができる。適切なリンカー配列は、Ｄ及び／又はＬアミノ酸から構成されてもよい。
【０１２０】
また、ペプチドリンカー配列は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）と、成分（Ｂ）及び／又は更なる成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）との間に導入することができ、ここで、アミノ末端メチオニンは、成分（Ａ）と、タンパク質又はペプチド配列成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）の前との少なくともいずれかに付加される。
【０１２１】
好ましくは、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）は、架橋方法などの当該技術分野において既知である任意の好適な方法で化学的にカップリングすることにより結合する。しかし、多くの化学的架橋法は、非特異的である、即ち、結合点がキャリア部分又は積荷部分の任意の特定の部位に限定されないという事実に注意すべきである。したがって、非特異的架橋剤の使用は、機能的部位を攻撃するか、又は活性部位を立体的にブロックして、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の融合した成分を生物学的に不活性にする恐れがある。適切な保護基を用いることにより、反応する可能性のある基をブロックすることが、当業者に知られている。或いは、成分（Ａ）の成分（Ｂ）の架橋に適用することができる化学選択的実体である、強力且つ汎用的なオキシム及びヒドラゾンライゲーション技術を使用してもよい。この架橋技術は、例えば、Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ＪＡＣＳ１１６，３０に記載されている。更なる成分（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）などが存在する場合には、これらは、上述のように、同様の方法で互いに、又は成分（Ａ）及び／又は成分（Ｂ）と化学的にカップリングすることができる。
【０１２２】
成分（Ａ）に１個又は数個しか存在しない、成分（Ｂ）の有機分子と架橋する官能基への化学的カップリングを導くことによって、カップリングの特異性を高めることができる。例としては、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）にシステイン残基が１個しか存在しない場合、システインチオール基を用いることができる。また、例えば、コンジュゲート分子の成分（Ａ）がリジン残基を含まない場合、一級アミンに対して特異的な架橋剤は、成分（Ａ）のアミノ末端に対して選択的となる。或いは、側鎖を通じてアミド結合が生じ得るように、ペプチドのＮ末端に配置されたグルタミン酸残基の側鎖を介して架橋を行うこともできる。したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）のＮ末端にグルタミン酸残基を結合されることが有利となる場合もある。しかし、成分（Ａ）にシステイン残基を導入する場合、Ｎ末端若しくはＣ末端に、又はＮ末端若しくはＣ末端付近に導入することが好ましい。１以上の更なるアミノ酸、例えば、特にシステイン残基を輸送配列に付加するか、又は成分（Ａ）に含まれる輸送配列のうちの少なくとも１つの残基を置換することにより、成分（Ａ）の修飾に基づいてこのようにアミノ酸配列を変化させるために、従来の方法が利用可能である。システイン残基をカップリング目的のために使用する場合、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）は、システイン残基を１個有することが好ましい。任意の第２のシステイン残基は、好ましくは存在するべきではなく、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ａ）で生じたときは、最終的に、置換することができる。成分（Ａ）として又は成分（Ａ）の一部として用いられる元の輸送配列中のシステイン残基を置換するとき、一般的に、成分（Ａ）のペプチドの折り畳み構造の変化を最小限に抑えることが望ましい。成分（Ａ）の折り畳み構造の変化は、システインを化学的及び立体的に類似の代替物に置換したときに、最小限に抑えられる。したがって、システインの代替物としては、セリンが好ましい。
【０１２３】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の２つの成分のカップリングは、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、ＤＩＣＩ、ＴＢＴＵなどの標準的なペプチド合成カップリング試薬を含むカップリング剤又はコンジュゲート剤を用いて行うことができる。利用可能な幾つかの分子間架橋試薬が存在する、例えば、Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，ｐｐ．３９−４３を参照されたい。これらの試薬は、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）又はＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）、又は６個〜１１個の炭素メチレン架橋を有する他のかかる試薬；及び１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンである。この目的のために有用な他の架橋試薬としては、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン；ジメチルアジピミデート；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド；ヘキサメチレンジイソシアネート若しくはジイソチオシアネート、又はアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート；グルタルアルデヒド及びジスジアゾベンジジンが挙げられる。前記架橋試薬は、ホモ二官能性、即ち、同じ反応を受ける２つの官能基を有していてもよい。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）である。ＢＭＨは、２つのマレイミド官能基を含み、前記官能基は、穏やかな条件下（ｐＨ６．５〜７．７）でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。前記２つのマレイミド官能基は、炭化水素鎖により結合される。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含むタンパク質（又はポリペプチド）の不可逆的架橋に有用である。架橋試薬は、ヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる官能基、例えば、アミン反応基とチオール反応基を有し、これら反応基は、それぞれ遊離アミン及びチオールを有する２つのタンパク質と架橋する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、及びスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸長鎖類似体である。これら架橋剤のスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。前記架橋試薬は、水溶性が低いことが多いので、スルホネート基などの親水性基を架橋試薬に付加して水溶性を高めてもよい。スルホ−ＭＢＳ及びスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性が改変された架橋試薬の例である。多くの架橋試薬により、細胞条件下で本質的に切断不可能であるコンジュゲートが得られる。したがって、一部の架橋試薬は、細胞条件下で切断可能であるジスルフィド結合などの共有結合を含む。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、及びＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）が、周知の切断可能な架橋剤である。切断可能な架��試薬を使用することにより、積荷部分の成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）を、標的細胞に送達された後、新規輸送体コンストラクトの成分（Ａ）から分離することができる。この目的のために、直接ジスルフィド結合が有用である場合もある。また、化学的架橋は、スペーサーアームの使用を含んでもよい。スペーサーアームは、細胞間可動性を提供するか、又はコンジュゲートされた部分間の細胞間距離を調整して、生物学的活性の保存に役立ち得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むタンパク質（又はポリペプチド）部分の形態であってもよい。或いは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」などの架橋試薬の一部であってもよい（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，カタログ番号２１６５１Ｈ）。上で論じたものを含む多くの架橋試薬は、市販されている。これらの使用についての詳細な指示書は、商業的供給元から容易に入手可能である。タンパク質架橋及びコンジュゲートの調製に関する一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【０１２４】
別の好ましい実施形態によれば、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のうちの少なくとも１つの変異体及び／又は断片を含んでもよく、これらから構成されてもよい。好ましくは、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の変異体及び／又は断片は、上に開示される本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の生物学的活性を保持している。かかる断片又は変異体の機能は、一般式（Ｉ）に係る本発明の新規輸送体コンストラクトについて上に記載されているのと同様に、トランスフェクション効率、積荷核酸がコードするタンパク質の正確な発現などの様々な試験により、又は分光法、コンピュータモデリング、構造解析などの生物物理学的方法により試験することができる。
【０１２５】
更により好ましくは、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、特に、１つの成分がタンパク質又はペプチド配列である場合、少なくとも１つの変異体（及び／又は断片）を含むか、又は前記変異体からなる。本発明の状況では、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のかかる変異体（及び／又は断片）は、ネイティブな本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の全長に対して、前記変異体（及び／又は断片）のネイティブな配列、例えば、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の断片又は変異体、そのネイティブな輸送体−積荷コンジュゲート分子配列などと、少なくとも７０％、８０％、又は８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有していてもよい。
【０１２６】
上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の「断片」は、特に、１つの成分がタンパク質又はペプチド配列である場合、そのトランケート型配列である、即ち、上に定義されたネイティブな本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のアミノ酸配列と比べて、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は配列内がトランケートされている、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のアミノ酸配列であると理解されることが好ましい。
【０１２７】
上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の「変異体」は、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子変異体のアミノ酸配列が、１以上の突然変異、例えば、１以上の置換（又は、必要に応じて、挿入及び／若しくは欠失）されたアミノ酸などによって、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のネイティブな配列とは異なる配列を含むことが好ましい。上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の変異体は、上に定義されたネイティブな輸送体−積荷コンジュゲート分子の完全長と比較して同じ生物学的機能又は特異的活性を有することが好ましい。変異体は、上記意味の範囲内で、約１個〜１００個、１個〜５０個、１個〜２０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸変化を含んでもよい。かかる変化は、特に、上に定義されたアミノ酸の修飾、上に定義されたアミノ酸への標識の導入、本明細書に言及される（修飾又は標識）アミノ酸のいずれかによるアミノ酸の置換、アミノ酸の欠失又は挿入を含んでもよい。本明細書に定義される変異体は、更に、好ましくは既に上に定義されているような保存的アミノ酸置換を含むことが好ましい。
【０１２８】
第３の態様によれば、本発明は、更に、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子と、任意で、薬学的に許容できる担体及び薬学的に許容できるビヒクルの少なくともいずれか、任意の賦形剤、バッファ、安定剤、又は当業者に周知である他の物質を含むことが好ましい。
【０１２９】
第１の成分として、本発明の医薬組成物は、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、即ち、成分（Ａ）として、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトを含み、且つ成分（Ｂ）として、例えば、治療活性タンパク質及びペプチド、タンパク質キナーゼ阻害剤、特にタンパク質キナーゼであるｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、抗原、抗体、アポトーシス因子、病状に関与しているプロテアーゼ、好ましくはペプチドプロテアーゼ阻害剤、ＢＨ３−ドメイン、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質などのタンパク質又はペプチドから選択されるか、又はｓｉＲＮＡなどの核酸、細胞毒性剤、小有機分子などから選択されるエフェクタ分子を含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を含む。任意で、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、更に、追加成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）などを含んでもよい。
【０１３０】
第２の成分として、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体及び／又はビヒクルを含んでもよく、含んでいなくてもよい。本発明の状況では、薬学的に許容できる担体は、一般的に、本発明の医薬組成物の液体又は非液体基剤を含む。本発明の医薬組成物が液体形態で提供される場合、担体は、一般的に、発熱物質不含水；等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液などである。特に、本発明の医薬組成物を注射する場合、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のカルシウム塩、及び任意でカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のカリウム塩を含有する、水又は好ましくはバッファ、より好ましくは水性バッファを用いてもよい。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び任意でカリウム塩は、これらのハロゲン化物、例えば塩化物、ヨウ化物、又は臭化物の形態、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩などの形態であってもよい。限定するものではないが、ナトリウム塩の例としては、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられ、任意のカリウム塩の例としては、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられ、カルシウム塩の例としては、例えばＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。更に、前述のカチオンの有機アニオンが、バッファ中に含有されていてもよい。より好ましい実施形態によれば、上に定義された注射目的に好適なバッファは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、及び任意で塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含有していてもよく、ここでは、塩化物に加えて更なるアニオンが存在していてもよい。また、ＣａＣｌ２をＫＣｌなどの別の塩に置換してもよい。一般的に、注射用バッファ中の塩は、少なくとも５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び少なくとも０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の濃度で存在する。注射用バッファは、特定のレファレンス媒体に比べて高張、等張、又は低張であってよく、即ち、バッファは、特定のレファレンス媒体に比べてより多い、等しい、又はより少ない塩含量を有していてもよく、好ましくは、浸透又は他の濃度効果によって細胞に損傷を与えることのない上述の塩濃度を用いることができる。レファレンス媒体は、例えば、血液、リンパ液、細胞質液、若しくは他の体液などの「インビボ」法で用いられる液体、又は一般的なバッファ若しくは液体などの「インビトロ」法でレファレンス媒体として用いることができる液体である。かかる一般的なバッファ又は液体は、当業者に既知である。リンゲル乳酸塩溶液が、液体基剤として特に好ましい。
【０１３１】
しかし、治療される患者に投与するのに好適である、１以上の適合性固体若しくは液体充填剤、希釈剤、又は封入化合物も、本発明の医薬組成物に対して同様に用いることができる。本明細書において使用するとき、用語「適合性」とは、典型的な使用条件下で本発明の医薬組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用が生じない方法で、本発明の医薬組成物のこれら成分を、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子と混合できることを意味する。薬学的に許容できる担体、充填剤、及び希釈剤は、無論、治療されるヒトに投与するのに適した状態にするのに十分な程度高純度且つ低毒性でなければならない。薬学的に許容できる担体、充填剤、又はこれらの成分として用いることができる化合物のとしては、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；例えば、コーンスターチ又は馬鈴薯デンプンなどのデンプン；例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；粉末状トラガカント；モルト（ｍａｌｔ）；ゼラチン；タロー；例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウムなどの固体滑剤；例えば、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及びカカオ属由来の油などの植物油；例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸である。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、鼻腔内、口腔内、膣内、埋め込み型容器を介して投与することができる。本明細書で使用するとき、非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下注射又は注入技術を含む。
【０１３３】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、非経口注射により投与することができ、より好ましくは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、基質内、鞘内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、経皮、皮内、肺内、腹腔内、手根内、動脈内、及び舌下注射によるか、又は注入技術を介して投与される。本発明の医薬組成物の無菌注射剤形は、水性又は油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤と、懸濁化剤とを用いて当該技術分野において既知の技術に従って製剤することができる。無菌注射用調製品は、例えば、１，３−ブタンジオール溶液など、無毒の非経口的に許容できる希釈剤又は溶媒中の無菌注射液又は懸濁液であってもよい。中でも、使用可能な許容できるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液である。更に、溶媒又は懸濁溶媒として、無菌の不揮発性油が、従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激な不揮発性油を使用してもよい。オリーブ油又はヒマシ油、特にこれらのポリオキシエチル化型などの天然の薬学的に許容できる油と同様に、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸も注射用調製品において有用である。また、これらの油溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、例えば、エマルション及び懸濁液を含む薬学的に許容できる剤形の製剤において一般的に用いられているカルボキシメチルセルロース又は類似の分散剤などを含有させてもよい。また、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、及び他の乳化剤などの他の一般的に用いられている界面活性剤、又は薬学的に許容できる固体、液体、若しくは他の剤形の製造において一般的に用いられている生物学的利用能強化剤を、本発明の医薬組成物を製剤するために用いてもよい。
【０１３４】
静脈内、皮膚、若しくは皮下注射、又は患部に注射する場合、活性成分は、発熱物質を含まず、且つ好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形態であることが好ましい。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張ビヒクルを用いて好適な溶液を調製することができる。保存剤、安定剤、バッファ、酸化防止剤、及び／又は他の添加剤を必要に応じて含んでもよい。個体に投与されるのがポリペプチドであろうと、ペプチドであろうと、核酸分子であろうと、本発明に係る任意の他の薬学的に有用な化合物であろうと、個体に対して有益な効果を示すのに十分な量である「予防有効量」又は「治療有効量」（場合によっては）で投与されることが好ましい。実際の投与量、投与速度及び投与の時系変化は、治療される個体の性質及び重篤度に依存する。
【０１３５】
また、上に定義された本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水懸濁液、又は溶液を含むが、これらに限定されない任意の経口的に許容できる剤形で経口投与してもよい。経口使用するための錠剤の場合、一般的に用いられる担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口投与のために水懸濁液が必要とされるとき、活性成分、即ち、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、乳化剤及び懸濁化剤と組み合わせられる。必要に応じて、特定の甘味剤、着香剤、又は着色剤を添加してもよい。
【０１３６】
また、本発明の医薬組成物は、特に、治療の標的が、例えば皮膚疾患又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む局所塗布により容易にアクセス可能な領域又は器官を含むとき、局所投与してもよい。好適な局所製剤は、これら領域又は器官の各々に対して容易に調製される。局所に塗布する場合、本発明の医薬組成物は、１以上の担体に懸濁又は溶解している本発明の免疫賦活組成物、特に上に定義された成分を含有している好適な軟膏剤に製剤することができる。局所投与用の担体としては、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう及び水が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の医薬組成物は、好適なローション又はクリームに製剤することができる。本発明の状況では、好適な担体としては、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
この状況では、治療の指示、例えば投与量の決定などは、上記医薬組成物を用いるとき、一般的に、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、また一般的に、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に知られている他の要因が考慮される。上述の技術及びプロトコルの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０中に見出すことができる。したがって、本発明の医薬組成物は、一般的に、本発明の医薬組成物の成分、特に上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を「安全且つ有効量」含む。本明細書で使用するとき、「安全且つ有効量」とは、本明細書に定義される疾患又は障害の有益な変化を著しく誘導するのに十分である、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効量」は、重篤な副作用を避けるのに十分な程度少なく、即ち、利益とリスクとの間の合理的関係を許容する。これら限度の決定は、一般的に、合理的な医学的判断の範囲内にある。本発明の医薬組成物の成分、特に上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の「安全且つ有効量」は、更に、治療される特定の状態に関連して変化し、また、主治医の知識及び経験の範囲内で、治療される患者の年齢及び身体の状態、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の特定の成分（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）の活性、症状の重篤度、治療期間、併用される治療法の性質、用いられる具体的な薬学的に許容できる担体の性質、及び類似の要因によっても変化する。本発明の医薬組成物は、ヒトに対して、また獣医学的目的で、好ましくはヒトに対する医学的目的で、一般に医薬組成物又はワクチンとして用いることができる。
【０１３８】
特定の実施形態によれば、例えば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）が、免疫反応を誘発するのに好適な（タンパク質又はペプチド）抗原若しくは抗体断片、又は上記任意の分子などの治療活性タンパク質である場合、本発明の医薬組成物をワクチンとして提供してもよい。かかる本発明のワクチンは、一般的に、本発明の医薬組成物などを含み、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）の性質に依存して、治療される患者の免疫系の自然免疫反応及び／又は適応免疫反応を支持することが好ましい。この例としては、これらの成分のいずれかが（タンパク質又はペプチド）抗原又は抗体断片を提供又はコードする場合、ワクチンは、一般的に、治療される患者の適応免疫反応を導くことが挙げられる。同様に、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の更なる成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）のいずれかは、自然免疫反応及び／又は適応免疫反応を導くことができる。
【０１３９】
また、本発明のワクチンは、本発明の医薬組成物について上に定義された薬学的に許容できる担体、アジュバント、及び／又はビヒクルを含んでもよい。本発明のワクチンの特定の状況では、薬学的に許容できる担体の選択は、本発明のワクチンが投与される方法により主に決定される。本発明のワクチンは、例えば、全身又は局部に投与することができる。一般に、全身投与経路としては、例えば、経皮、経口、非経口経路が挙げられ、非経口経路は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内注射、並びに鼻腔内投与経路の少なくともいずれかを含む。一般に、局部投与経路としては、例えば、局所投与経路が挙げられるが、皮内、経皮、皮下、若しくは筋肉内注射、又は病巣内、頭蓋内、肺内、手根内、及び舌下注射も含む。より好ましくは、ワクチンは、皮内、皮下、又は筋肉内経路により投与することができる。したがって、本発明のワクチンは、液体（又は、時に固体）形態に製剤されることが好ましい。投与される本発明のワクチンの好適な量は、動物モデルを用いた日常的な実験により決定することができる。かかるモデルとしては、限定するものではないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、及び非ヒト霊長類モデルなどが挙げられる。注射用の好ましい単位剤形としては、水、生理学的食塩水、又はこれらの混合物の無菌溶液などが挙げられる。かかる溶液のｐＨは、約７．４に調整すべきである。注射用の好ましい担体としては、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出させるためのデバイス、ポリ乳酸、及びコラーゲンマトリクスが挙げられる。局所適用に好適な薬学的に許容できる担体としては、ローション、クリーム、ゲルなどで使用するのに好適な担体が挙げられる。本発明のワクチンが経口的に投与される場合、錠剤、カプセル剤などが好ましい単位剤形である。経口投与に用いることができる単位剤形を調製するための薬学的に許容できる担体は、先行技術から周知である。その選択は、本発明の目的にとってそれ程重要ではない、味、コスト、及び保存性などの二次的な検討事項に依存し、当業者が容易に行うことができる。
【０１４０】
本発明のワクチンは、免疫原性を更に高めるために、１以上の補助物質を更に含有させてもよい。それによって、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子と、上記本発明のワクチンに任意で含有され得る補助物質との相乗作用が得られることが好ましい。補助物質の様々な種類に依存して、関連する様々な機序が考えられ得る。例えば、樹状細胞（ＤＣ）を成熟させることができる化合物、例えばリポ多糖類、ＴＮＦ−α又はＣＤ４０リガンドが、好適な補助物質の第１の分類を形成する。一般に、本発明に係る免疫刺激アジュバントにより生じる免疫反応を標的指向的に高める及び／又は影響を及ぼすことができる、「危険信号」（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）又はＧＭ−ＣＦＳなどのサイトカインのように免疫系に影響を及ぼす任意の剤を補助物質として用いることができる。特に好ましい補助物質は、自然免疫反応を更に促進する、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン、又はケモカインなどのサイトカインであり、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＮＦ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−β又はＴＮＦ−α、ｈＧＨなどの成長因子などが挙げられる。
【０１４１】
本発明のワクチンに含んでもよい更なる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）などの乳化剤；例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；風味付与剤；薬学的担体；錠剤形成剤；安定剤；酸化防止剤；保存剤などが挙げられる。
【０１４２】
また、本発明のワクチンは、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対する（リガンドとしての）結合親和性によって、又はマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３に対する（リガンドとしての）結合親和性によって免疫賦活性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含有させてもよい。
【０１４３】
この状況で本発明のワクチンに添加することができる別の分類の化合物としては、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡであってもよい。ＣｐＧ−ＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡは、一本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓＣｐＧ−ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓＣｐＧ−ＲＮＡ）、又は二本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓＣｐＧ−ＲＮＡ）であってよい。ＣｐＧ核酸は、ＣｐＧ−ＲＮＡの形態であることが好ましく、一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓＣｐＧ−ＲＮＡ）の形態であることがより好ましい。ＣｐＧ核酸は、少なくとも１以上の（分裂促進性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ））シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含むことが好ましい。第１の好ましい他の態様によれば、これら配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、即ち、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化されていない。任意でこれら配列に含まれる全ての更なるシトシン又はグアニンは、メチル化されていても、メチル化されていなくてもよい。しかし、更なる好ましい他の態様によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化型でも存在し得る。
【０１４４】
本発明の第４の態様によれば、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、本明細書に定義される任意の疾患及び障害の予防、治療、及び／又は回復のために用いることができ（本明細書に定義される医薬組成物又はワクチン、好ましくは両方を調製するために）、好ましくは、欠損性アポトーシスにより引き起こされる疾患を含む癌若しくは腫瘍疾患、炎症性疾患、感染性疾患、ウイルス（感染性）疾患、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患、自己免疫障害、自己免疫疾患、心臓血管疾患、神経疾患、神経変性疾患、肝臓疾患、脊椎疾患、子宮疾患、大鬱病性障害、非慢性炎症性消化器疾患、慢性炎症性消化器疾患、及び聴力損失、又は内耳疾患の予防、治療、及び／又は回復に用いられる。また、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、移植される器官／組織／細胞を処理するか、又はレシピエントの器官／組織／細胞を処理することにより、組織移植に用いるために（医薬組成物を調製するため）用いることもできる。
【０１４５】
本明細書に定義される疾患の予防、治療、及び／又は回復は、一般的に、上に定義された医薬組成物の投与を含む。用語「予防」は、一般的に、好ましくは患者において疾患の徴候が発現する前に、患者において本明細書に定義される疾患を予防することを指す。用語「治療」は、一般的に、疾患が既に診断されていた可能性があるか、又は予防されるべきである場合、即ち、患者において疾患の徴候が発現する前、発現と並行して、及び発現後の、患者における本明細書に定義される疾患の任意の治療を指す。例えば、用語「症状の治療」において用いられる用語「治療」は、更に好ましくは、治療効果を誘発するために治療有効量の治療化合物を少なくとも投与することを意味する。それは、必ずしも「治癒」を意味するものではなく、好ましくは、ある症状を有する生体に投与したとき、かかる症状に対して少なくとも幾つかの最低限の生理学的効果を有することを意味する。例えば、治療は、剤の投与、及びレシピエント動物の生理学的変化を生じさせる前記剤の存在を包含することができる。最後に、用語「回復」は、好ましくは、本明細書に定義される疾患の任意の調節、好ましくは本明細書に定義される疾患の正方向の調節を含む。特定の調節は、治療される疾患に依存する場合がある。
【０１４６】
１つのアプローチによれば、本明細書に定義された本発明の医薬組成物、ワクチン、又は本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、医薬組成物について上に定義された投与経路を用いて患者に直接投与することができる。或いは、上に定義された医薬組成物、ワクチン、又は本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子は、エキソビボアプローチ、例えば、上に定義された医薬組成物、ワクチン、又は本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を細胞、好ましくは自己細胞、即ち治療される患者に由来する細胞に導入し、任意で治療前にこれら細胞を保存及び／又は培養した後に、これら細胞を治療される患者の部位に移植することにより、患者に投与してもよい。
【０１４７】
１つの好ましい実施形態によれば、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、例えば、欠損性アポトーシスにより引き起こされる疾患を含む、癌又は腫瘍疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることができ、前記疾患は、好ましくは、以下から選択される：聴神経鞘腫、肛門癌腫、星状細胞腫、基礎細胞癌、ベーチェット症候群、膀胱癌、芽腫、骨癌、脳転移、脳腫瘍、脳癌（グリア芽腫）、乳癌（乳房癌腫）、バーキットリンパ腫、カルチノイド、頸癌、結腸癌腫、結腸直腸癌、内体癌腫、頭蓋咽頭腫、ＣＵＰ症候群、子宮内膜癌腫、胆嚢癌、泌尿生殖管の癌を含む生殖器腫瘍、グリア芽腫、神経膠腫、頭部／頸部腫瘍、ヘパトーム、組織球増殖性リンパ腫、ホジキン症候群又はリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫、下垂体腫瘍、小腸癌の腫瘍を含む腸癌、胃腸癌、カポージ肉腫、腎臓癌、腎臓癌腫、喉頭癌、こう頭癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、赤白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む白血病；眼瞼腫瘍、肝臓癌、肝臓転移、肺癌腫（＝肺癌＝気管支癌腫）、小細胞肺癌腫及び非小細胞肺癌腫、及び肺腺癌、リンパ腫、リンパ腺癌、悪性黒色腫、乳房癌腫（＝乳癌）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、菌状息肉腫、新生物性疾患鞘腫、食道癌、食道癌腫（＝食道癌）、希突起神経膠腫、卵巣癌（＝卵巣癌腫）、卵巣癌腫、膵臓癌腫（＝膵臓癌）、陰茎癌、ペニス癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、前立腺癌（＝前立腺腫瘍）、直腸癌腫、直腸腫瘍、腎臓癌、腎臓癌腫、網膜芽腫、肉腫、シュナイダー病；基底細胞及び扁平上皮癌腫、並びに乾癬を含む皮膚癌、例えば黒色腫又は非黒色腫皮膚癌；尋常性天疱瘡、軟組織腫瘍、棘細胞腫、胃癌、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、甲状腺癌腫、舌癌、尿道癌、子宮癌、膣癌；様々なウイルス誘導性腫瘍、例えば乳頭腫ウイルス誘導性癌腫（例えば、子宮頸癌腫＝子宮頸癌）、腺癌、ヘルペスウイルス誘導性腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘導性Ｂ細胞リンパ腫、頸癌腫）、Ｂ型肝炎誘導性腫瘍（肝細胞癌腫）、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２誘導性リンパ腫；外陰部癌、いぼ状態又は合併症など。本状況では、用語「療法」及び「療法的」は、好ましくは、生体に投与されたとき少なくとも幾つかの最低限の生理学的効果を有することを意味する。例えば、「療法的」抗腫瘍化合物を投与したときの生理学的効果は、腫瘍成長の阻害、又は腫瘍の大きさの減少、又は腫瘍の再発防止であり得る。好ましくは、癌又は新生物性疾患の治療において、腫瘍成長を阻害するか、腫瘍の大きさを減少させるか、又は腫瘍の再発を防止する化合物が、治療上有効であるとみなされる。したがって、用語「抗腫瘍薬」は、好ましくは、腫瘍、新生物性疾患、又は癌に対する療法的効果を有する任意の治療剤を意味する。
【０１４８】
別の好ましい実施形態によれば、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、肺の炎症性疾患又は肺疾患などの炎症性疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることができ、前記疾患は、以下を含む：急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、又は肺線維症；嚢胞性線維症を含む線維性組織の形成、髄膜炎、及び移植片拒絶又は移植拒絶反応を含むがこれらに限定されない組織の炎症；喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、及び肺線維症を含む呼吸系に関連する慢性疾病。
【０１４９】
別の好ましい実施形態によれば、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、例えば、感染性疾患、好ましくはウイルス、レトロウイルス、細菌、又は寄生虫感染性疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることができる。かかる感染性疾患は、一般的に、以下から選択される：ＡＩＤＳ、炭疽、日本脳炎、細菌感染性疾患、例えば、流産（前立腺炎症）、炭疽、虫垂炎、ボレリア症、ボツリスム、カンピロバクター、トラコーマクラミジア（尿道の炎症、結膜炎）、コレラ、ジフテリア、ドノヴァン症、喉頭蓋炎、チフス熱、ガス壊疽、淋病、野兎熱、ヘリコバクターピロリ、百日咳、鼠径リンパ肉芽腫、骨髄炎、レジオネラ症、鶏痘、尖圭コンジローム、巨細胞性ウイルス（ＣＭＶ）、デング熱、初夏髄膜脳炎（ＥＳＭＥ）、エボラウイルス、風邪、第五病、口蹄疫、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスＩＩ型、帯状ヘルペス、ＨＳＶ、寄生虫、原生動物、又は真菌により引き起こされる感染性疾患、例えば、アメーバ症、ビルハルツ住血吸虫症、シャーガス病、エキノコックス、魚類条虫類、魚毒（シグアテラ）、キツネ条虫類、汗疱状白癬、イヌ条虫類、カンジダ症、酵母菌斑、疥癬、皮膚リーシュマニア症、ラムブル鞭毛虫症（ジアルジア鞭毛虫症）、シラミ、マラリア、顕微鏡検査、オンコセルカ症（眼オンコセルカ症）、真菌性疾患、ウシ条虫類、住血吸虫症、ブタ条虫類、トキソプラスマ症、トリコモナス症、トリパノソーマ症（睡眠病）、内臓リーシュマニア症、おむつかぶれ／おむつ皮膚炎又は小条虫類、感染性紅斑、インフルエンザ、カポージ肉腫、ラッサ熱、リーシュマニア症、らい病、リステリア症、ライムボレリア症、マラリア、マルブルクウイルス感染、麻疹、細菌性髄膜炎を含む髄膜炎、伝染性軟属腫、単核細胞症、流行性耳下腺炎、マイコプラズマホミニス、新生児敗血症（絨毛羊膜炎）、水癌、ノーウォークウイルス感染、中耳炎、パラチフス、プファイファー腺熱、悪疫、肺炎、ポリオ（灰白髄炎、小児跛行）、偽性クループ、狂犬病、ライタン症候群、ロッキー山紅斑熱、サルモネラパラチフス、サルモネラチフス、ＳＡＲＳ、猩紅熱、帯状疱疹、肝炎、痘瘡、軟性下疳、梅毒、破傷風、三日熱、トリッパー（ｔｒｉｐｐｅｒ）、ツツガムシ病、ヒト型結核菌、チフス、膣炎（膣の炎症）、以下のウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、オルソポックス属痘瘡ウイルス、オルソポックス属アラストリムウイルス、ヒツジパラポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヘルペスＢウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヒト巨細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、Ｂ型肝炎ウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ルビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルスＣ、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、跳躍病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、Ｂ型日本脳炎ウイルス、ポーワッサンウイルス、ＦＳＭＥウイルス、ＳＡＲＳ、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯｃ４３、トロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ型、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）、即ち、ヒト免疫不全ウイルス１型又はヒト免疫不全ウイルス２型、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、タカリベウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ボルナ病ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、サシチョウバエ熱ウイルス、トスカーナウイルス、クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ハザラウイルス、ハサンウイルス、ハンターンウイルス、ソウルウイルス、プロスペクトヒルウイルス、プーマラウイルス、ドブラバベオグラードウイルス、トゥーラウイルス、シンノンブルウイルス、ビクトリア湖マルブルクウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、コートジボアールエボラウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ＲＳウイルス、ヒトメタニューモウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１＋２型、オーストラリアコウモリリッサウイルス、アデノウイルスＡ−Ｆ型、ヒトパピローマウイルス、コンジロームウイルス６型、コンジロームウイルス１１型、ポリオーマウイルス、アデノ関連ウイルス２型、ロタウイルス、又はオルビウイルス、水痘帯状疱疹を含む水痘、及びマラリアウイルス、ＡＩＤＳなどのウイルス感染性疾患、尖圭コンジロームにより引き起こされる感染性疾患、中空いぼ、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（ＦＳＭＥ）、流感、帯状疱疹、肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスＩＩ型、帯状ヘルペス、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、マルブルクウイルス、いぼ、西ナイル熱、黄熱病など。
【０１５０】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、対象におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることができる。対象におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連するかかる疾患又は障害は、限定するものではないが、好ましくは、以下から選択される：自己免疫障害、心血管疾患、上に定義された癌又は腫瘍疾患、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む糖尿病、上に定義された炎症性疾患、円形脱毛症を含む脱毛、肺疾患、神経性疾患、神経変性疾患、肝臓疾患、脊椎疾患、子宮疾患、（ウイルス）感染性疾患及び抑鬱性障害。前記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患又は障害の場合、用語「回復」は、ＪＮＫが過剰発現しているときにＪＮＫの発現を抑制すること、及び／又は上記疾患のいずれかにおいてｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、若しくはＮＦＡＴ４のリン酸化を抑制することを含んでよく、これらは、例えば、細胞内にて、天然ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、及びＮＦＡＴ４結合部位の競合阻害剤として、上記定義内の本発明の新規輸送体分子に結合している本明細書に定義される少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列を用いることにより行われる。この特定の状況において、用語「調節」は、限定するものではないが、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、又はＮＦＡＴ４、及びこれらに関連するパートナーで構成される転写因子のヘテロ及びホモ複合体、例えば、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２、及びｃ−ｆｏｓで構成されるＡＰ−１複合体などを抑制することも含む。上に定義されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患又は障害がＪＮＫの過剰発現に関連しているとき、かかる抑制性ＪＮＫ阻害剤配列を細胞に導入してよい。場合によっては、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患又は障害の状況において「調節」は、例えば、ＩＢ−ペプチドのＪＮＫへの結合をブロックするＩＢペプチド特異的抗体を使用して、ＩＢ関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を阻止することにより、ＪＮＫ発現を増加させることを含んでもよい。上に開示された医薬組成物による対象の予防及び／又は治療は、一般的に、（インビボで）（「治療上有効」）量の前記医薬組成物を対象に投与することによって行うことができ、ここで前記対象は、例えば、任意の哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、又はブタであってよい。用語「治療上有効」とは、医薬組成物の活性成分が、上に定義されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患又は障害を回復させるのに十分な量であることを意味する。本明細書に言及される他の疾患について、更なる例を見出すことができる。
【０１５１】
したがって、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、自己免疫障害又は疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることができる。自己免疫障害又は疾患は、各疾患の主な臨床病理学的特徴によって、全身性自己免疫障害、及び器官特異的、即ち限局性自己免疫障害に広く分類することができる。全身性症候群の分類に分類することができる自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ及び多発性筋炎、又は内分泌性（Ｉ型糖尿病（真性糖尿病１型）、橋本甲状腺炎、アディソン病など）、皮膚性（尋常性天然瘡）、血液性（自己免疫溶血性貧血）、神経性（多発性硬化症）に含まれ得る限局性症候群が挙げられ、或いは、体組織の実質的に任意の限局性腫瘤を含む場合もある。治療される自己免疫疾患は、以下から成る群より選択することができる：Ｉ型自己免疫疾患、ＩＩ型自己免疫疾患、ＩＩＩ型自己免疫疾患、又はＩＶ型自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病１型）、慢性多発性関節炎、バセドー病、慢性肝炎の自己免疫形態、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛症、脱毛、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、慢性単純性苔癬、リウマチ性多発性筋痛、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、ライタン症候群、関節リウマチ、乾癬、脈管炎など、又はＩＩ型糖尿病。免疫系が自己抗原に対する免疫反応を誘導する理由について正確な機序は未だ明らかになっていないが、病因に関する幾つかの知見が存在する。それによれば、自己反応は、Ｔ細胞のバイパスによる可能性がある。正常な免疫系は、Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化を必要とし、活性化後、Ｂ細胞は、大量に抗体を産生することができる。このＴ細胞の要件は、稀にバイパスされる場合があり、それは、例えば、非特異的にＴ細胞の受容体にβ−サブユニットを直接結合させることにより、Ｂ細胞、又は更にはＴ細胞のポリクローナルな活性化を開始させることができる超抗原を産生する生物が感染した場合などである。別の解釈では、自己免疫疾患は分子擬態によるものではないかと推測されている。外来抗原は、特定のホスト抗原と構造的類似性を共有している場合があるので、この抗原（自己抗原を擬態している）に対して産生される任意の抗体は、理論上、ホスト抗原に結合し、免疫反応を増幅させる恐れがある。分子擬態の最も顕著な形態は、Ａ群β溶血性連鎖球菌で見られ、これはヒトの心筋と抗原を共有しており、リウマチ熱の心臓における徴候発現に関与している。
【０１５２】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、心血管疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもでき、前記疾患は、好ましくは、心臓疾患及び冠状性心疾患、動脈硬化症、卒中、大動脈瘤高血圧など腹大動脈の拡大、及び心筋梗塞から選択される。
【０１５３】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、神経性疾患又は神経変性疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもでき、前記疾患は、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、失調症、癲癇；緑内障、眼の感染を含む眼神経疾患；多発性硬化症、髄膜炎；軸索の「切断」又は破損、例えば軸索切断を含む、神経系の障害又は疾患により引き起こされる神経性疾患；疼痛、特に神経障害性疼痛；虚血性脳卒中を含む脳卒中；及びウイルス性脳症から選択される。
【０１５４】
本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、限定するものではないが、肝炎及び肝毒性から選択される肝臓疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもできる。
【０１５５】
更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、限定するものではないが、椎間板ヘルニアから選択される脊椎疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもできる。
【０１５６】
１つの好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、限定するものではないが、子宮内膜症から選択される子宮疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもできる。
【０１５７】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、限定するものではないが、大鬱病としても知られている大鬱病性障害、単極性鬱病、臨床的鬱病、即ち単なる鬱病、双極性障害、躁病、及び躁鬱病から選択される抑鬱性疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもできる。
【０１５８】
更なる好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンは、対象における非慢性又は慢性炎症性消化器疾患の予防、治療、及び／又は回復の（ための薬剤を調製する）ために用いることもできる。用語「非慢性又は慢性炎症性消化器疾患」は、本明細書で使用するとき、一般的に、消化管に関連する非慢性又は慢性炎症性疾患を意味する。これは、食道、胃、十二指腸の第一部、第二部、第三部、及び第四部、空腸、回腸、回盲部、大腸、（上行結腸、横行結腸、及び下行結腸）Ｓ状結腸、及び直腸の疾患を含む。これに関して、大腸炎などの大腸の炎症を特徴とする慢性炎症性消化器疾患も含まれることが好ましく、前記疾患としては、例えば、潰瘍性大腸炎（潰瘍性結腸炎）、クローン疾患（クローン病）、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、劇症大腸炎、薬剤性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン大腸炎、不定型大腸炎、及び非定型大腸炎などが挙げられる。
【０１５９】
上記状況では、本発明は、また、本発明に言及される疾患又は障害を予防、治療、及び／又は回復するための、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンの使用に関する。また、本発明は、特に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、又は本発明のワクチンを接種剤として接種又は使用するための、これら成分の使用を含む。本発明の特に好ましい実施形態によれば、上述の疾患又は障害を予防、治療、及び／若しくは回復するための方法、又は上述の疾患の予防するための接種方法は、一般的に、上記本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、医薬組成物、又はワクチンを、これらを必要としている患者（例えば、上記疾患のいずれかに罹患しているか、又は上記疾患の症状を示している患者）、特にヒトに、好ましくは「安全且つ有効量」で、上記のように上記製剤のうち１つによって投与することを含む。また、投与方法は、本発明の医薬組成物又はワクチンについて上に記載した通りであってよい。
【０１６０】
本発明の第５の態様によれば、上に定義された本発明の医薬組成物、本発明のワクチン、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクト、或いは上記定義内のこれらの変異体若しくは断片は、薬剤として利用することができる。かかる薬剤は、上に示されているように医薬組成物又はワクチンであってもよい。これらは、一般的に医学的用途において、好ましくは、本明細書に言及される疾患又は障害の予防、治療、及び／又は回復のいずれかのために利用することができる。
【０１６１】
本発明の第６の態様によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、好ましくは、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、治療される患者の細胞又は組織に任意の積荷分子（好ましくは、本明細書に定義される積荷分子）を輸送するために利用できる。この状況では、積荷分子は、好ましくは、本明細書に言及される療法、特に、本明細書に言及される疾患又は障害の予防、治療、及び／又は回復に好適であり、そのために好適な任意の積荷分子から、より好ましくは本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）のいずれかについて上に記載されている任意の積荷分子から選択することができる。それによって、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、上記成分（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）について記載されているカップリング方法のいずれかを用いて、かかる積荷分子にカップリングすることができる。
【０１６２】
この態様の特に好ましい実施形態によれば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、より好ましくは上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、例えば、成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）のいずれかについて上に記載されている積荷分子など、本明細書に言及される任意の積荷分子を細胞、好ましくは血液細胞、より好ましくは白血球、又は好ましくは神経細胞に輸送するために利用することができる。前記輸送は、インビトロ、インビボ、及び／又はエキソビボで行うことができる。好ましくは、治療される患者のそれぞれの細胞に輸送される。上述のように積荷にコンジュゲートしている本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、より好ましくは一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトをこのように導くことは、上述の炎症性疾患の治療において特に好適である。この目的のために、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、より好ましくは上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、本発明の医薬組成物又は本発明のワクチンについて上に記載されているように投与することができる。更に、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、より好ましくは上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、投与目的について上に記載されているように、本発明の医薬組成物又は本発明のワクチンとして製剤してもよい。投与経路は、本発明の医薬組成物又は本発明のワクチンについて上に定義されている通りである。或いは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、より好ましくは上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクトは、任意の更なる製剤化を行うことなしに、即ち、「ネイキッド」な状態で直接投与されてもよい。同様に、投与経路は、かかる製剤について上記経路が好ましい。
【０１６３】
本発明の第７の態様によれば、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクト、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、上記定義の範囲内の変異体若しくは断片、本発明の医薬組成物、或いは本発明のワクチンは、言及された障害又は疾患の様々な症状及び病状を検出、予測、診断、又はモニタするための診断ツールとして、診断において、例えば、イムノアッセイなどの（インビボ又はインビトロ）アッセイにおいて、利用することができる。
【０１６４】
一例として、イムノアッセイは、患者由来のサンプルを、上に定義された本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子と接触させることを含む方法により実施することができ、ここで本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）、並びに成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）のいずれかなどの少なくともいずれかは、サンプル中に含まれている成分又は化合物、例えば（細胞）特異的成分又は化合物を標的としてもよい。本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子のかかる成分（Ｂ）、又は成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／若しくは（Ｅ）のいずれかは、例えば、サンプルの（細胞）特異的成分又は化合物に対する抗体であってよく、ここで、サンプルのかかる（細胞）特異的成分又は化合物は、例えば、上に定義された成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）のいずれかについて上に記載した化合物又は成分であってよい。サンプルの接触は、一般的に、免疫特異的結合が生じ、次いで抗体による任意の免疫特異的結合の量を検出又は測定できる条件下で実施される。特定の実施形態では、サンプルの（細胞）特異的成分又は化合物、例えば、上に定義された成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）に対して特異的な抗体を用いて、上に定義された成分（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び／又は（Ｅ）の存在、又はこれらに関連する疾患について、患者由来の組織又は血清サンプルを分析することができる。利用できるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、及びプロテイン−Ａイムノアッセイなどの技術を用いる競合及び非競合アッセイ系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
或いは、（インビトロ）アッセイは、上に定義された本発明の医薬組成物、ワクチン、若しくは本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、又は上記定義内のこれらの変異体若しくは断片を、一般的に、例えば、培養動物細胞、ヒト細胞、又は微生物から選択される標的細胞に送達し、一般的に当業者に既知である生物物理学的方法により細胞の応答をモニタすることによって実施できる。本明細書において典型的に用いられる標的細胞は、培養細胞（インビトロ）又はインビボ細胞、即ち、生存動物若しくはヒトの器官若しくは組織を含む細胞、又は生存動物若しくはヒトで見出される微生物であってもよい。この状況で特に好ましいのは、所謂マーカー又は標識であり、これらは、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の成分（Ｂ）、又は成分（Ｃ）、（Ｄ）、及び／若しくは（Ｅ）のいずれかとして含有されてよく、かかる標識は、例えば、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子について一般的に上に定義された標識であってもよい。
【０１６６】
本発明の最後の態様によれば、本発明は、また、上記一般式（Ｉ）又は亜式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（Ｉｅ）、若しくは（Ｉｆ）のいずれかに係る本発明の新規輸送体コンストラクト、本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、本発明の医薬組成物、及び／又は本発明のワクチンを単独で又は組み合わせて成分として含み、且つ任意でこれら成分の投与及び投薬に関する情報を記載した技術的説明書を含むキット、特にキットの一部を提供する。かかるキット、特にキットの一部は、例えば、上述の用途又は使用において適用することができる。本発明は、更に具体的には、診断又は治療目的のための、特に、開示される疾患又は障害の治療、予防、又はモニタのためのキットの使用を提供する。
【０１６７】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載される態様に加えて、本発明の様々な変更が、前述の記載及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。かかる変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１６８】
様々な刊行物が本明細書に引用され、その開示は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０１６９】
特に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができ、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、全体が参照により本明細書に援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例証であり、限定を意図するものではない。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は、本発明を更に例証することを意図する。これらは、本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。
【０１７１】
１．  （ペプチド）輸送体コンストラクトの調製
上記固相合成を用いて、これら実施例で用いられる（ペプチド）輸送体コンストラクトを調製した。輸送体コンストラクトの最低限のＤ−／Ｌ−パターンを同定するために用いた、プロテアーゼに対して感受性であるコンストラクトは、特に、以下の通りである。
【表１４】
2015120694.tif 000015
【０１７２】
様々な細胞及び細胞株への取り込み（内部移行）実験に用いたコンストラクトは、以下の通りであった。
【表１５】
2015120694.tif 000016
【０１７３】
合成後、コンストラクトを精製し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の滅菌水溶液として保存し、任意の更なる処理なしに精製物として用いた。
【０１７４】
２．  プロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）に対する感受性を付与する最低限のＤ−／Ｌ−パターンの同定
プロテアーゼに対して感受性であるが、インビボにおいて十分長い半減期を付与する輸送体コンストラクトの最低限のＤ−／Ｌ−パターンを同定するために、各々Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の異なるパターンを示す、ポリ−Ａｒｇ配列を有する幾つかの輸送体コンストラクトを用いて、プロテイナーゼＫによる定量的分解アッセイを実施した。このアッセイで用いた輸送体コンストラクトは、上記実施例１に記載の通り調製し、１〜６と命名した。
【表１６】
2015120694.tif 000017
【０１７５】
配列のＤ−／Ｌ−パターンの違いは、大文字及び小文字を用いて表す。これら配列１〜６中の大文字（「Ｒ」−アミノ酸）は、Ｌ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指し、これら配列中の小文字（「ｒ」−アミノ酸）は、Ｄ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指す。時間間隔ｔ＝０分間、１０分間、及び４０分間においてプロテイナーゼＫに対する感受性を測定した。次いで、プロテイナーゼＫによる定量的分解アッセイの結果を、これら特定の時間間隔で採取したサンプルに基づいて判定した。レファレンス値として出発物質のイオン強度を用い、質量分析を利用してこれらサンプルを分析した。結論として、３以上の連続したＬ−Ａｒｇが配列中に存在するとき、ペプチドは、プロテイナーゼＫに対する感受性を示し、分解される。互いに隣接する２以下のＬ−Ａｒｇを有するペプチドは、分解されない。この結果は、それぞれＤ−ＪＮＫｉ又はＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）などの、全てがＤ−鏡像異性体アミノ酸からなる配列と類似していた（図１も参照されたい）。
【０１７６】
各々９アミノ酸長を有するが、Ｄ−／Ｌ−パターンの異なる４種の輸送体コンストラクトのＤ−／Ｌ−ＴＡＴ誘導体（Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）、ｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる；配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）、及びＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）と呼ばれる）を用いて更なる比較を行った。配列のＤ−／Ｌ−パターンの違いは、大文字及び小文字を用いて記載する。これらの配列中の大文字（「Ｒ」−アミノ酸）は、Ｌ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指し、これら配列中の小文字（「ｒ」−アミノ酸）は、Ｄ−鏡像異性体アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を指す。図２に示す表は、これらＴＡＴ由来輸送体コンストラクトのアミノ酸配列の分子量（ＭＷ）及びｐＩ値に関して例証する（図２を参照されたい）。
【０１７７】
これらＴＡＴ由来輸送体が完全に分解されるまで、３７℃で１０％及び５０％のヒト血清中にて消化させた。ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの消化の結果を示す図３から分かるように、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）輸送体コンストラクトは、プロテアーゼ耐性であるが、Ｌ−ＴＡＴ輸送体コンストラクト（配列番号１８）は、インビボにおける分解が速すぎて細胞に効率的に輸送することができない。治療に用いるためにインビボ安定性を制限することができる好適な時間制限内で分解されたのは輸送体コンストラクトｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる；配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）のみである。
【０１７８】
ヒト血清中における輸送体コンストラクトｒ３−Ｌ−ＴＡＴの分解の質量分析を実施した。結果としては、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）は、ヒト血清中にてＣ末端から単一アミノ酸に至るまで分解される。
【０１７９】
更に、ペプチドを保護するためにβ−アラニン（β−Ａｌａ）を含んでいるこれらＴＡＴ由来輸送体が完全に分解されるまで、３７℃で１０％及び５０％のヒト血清中にてＴＡＴ由来輸送体コンストラクトを消化させた。したがって、図３に既に記載されているＬ−ＴＡＴｉのように、ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトＬ−ＴＡＴのＮ末端にβ−Ａｌａが付加されていた。結果を図４に示す。図４から分かるように、β−アラニンによる輸送体ペプチドのＮ末端保護は、有意な効果、即ち、安定性の改善を導かない。
【０１８０】
インビボ安定性及び機能的半減期に関する上記実験結果を要約すると、１０％及び５０％のＨＳ中で試験した４つのＴＡＴ由来ペプチドの安定性は以下の通りである：Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）＞ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（配列番号２１）＞ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）＞Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）。したがって、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（配列番号２１）の耐用寿命は、両方共Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）に比べて長く、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）に比べて短い。血液体積の約５０％を構成する血清として、５０％のＨＳを含有するサンプルから得られた値が最も顕著である。ＵＰＬＣ−ＭＳの結果は、更に、ＴＡＴのＣ末端を切断するエキソプロテアーゼが分解に関与していることを示唆する。カルボキシペプチダーゼＮは、恒常的に活性があり、且つ血液中に高濃度（３０μｇ／ｍＬ）で存在しているので、分解に関与していると推測される。更に、ＣＰＮは、ペプチド及びタンパク質のＣ末端のＬｙｓ又はＡｒｇを特異的に切断する。
【０１８１】
３．  ペプチドの細胞への取り込み（内部移行）及びペプチドの細胞への内部移行の測定
この実験では、インビトロにおけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの内部移行（取り込み）能を、細胞株ＨＬ−６０（白血病）において蛍光プレートリーダーを用いて評価した。
【０１８２】
３．１  実験で用いる試験サンプル
この実験で用いたコンストラクトは、４つの異なるＴＡＴ由来輸送体コンストラクト（Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）、ｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる；配列番号２０）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる；配列番号２１）、及びＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）と呼ばれる）であり、それぞれ上記の通り調製した。これらコンストラクトは、９アミノ酸長を有するが、Ｄ−／Ｌ−パターンは異なる。更に、輸送体配列を含まないコンストラクトＤＡＫを対照として用いた。コンストラクトは、β−アラニン（βＡ）でＮ−末端を保護し、ＦＩＴＣで標識した。
ＦＩＴＣ−βＡ−Ｌ−ＴＡＴ          ＦＩＴＣ−βＡ−ＲＫＫＲＱＲＲＲ
ＦＩＴＣ−βＡ−Ｄ−ＴＡＴ          ＦＩＴＣ−βＡ−ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ
ＦＩＴＣ−βＡ−ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ    ＦＩＴＣ−βＡ−ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ
ＦＩＴＣ−βＡ−ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ    ＦＩＴＣ−βＡ−ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ
ＦＩＴＣ−βＡ−ＤＡＫ（対照）      ＦＩＴＣ−βＡ−ＤＡＫ（輸送体配列無）
【０１８３】
上記のように、コンストラクトを調製し、精製し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の滅菌水溶液として保存し、任意の更なる処理を行うことなしに精製物として用いた。
【０１８４】
３．２  更なる輸送体コンストラクトＴＡＴ（ｓ２−１）−ＴＡＴ（ｓ２−９６）
本発明の輸送体コンストラクトのために、上記の通り更なる輸送体コンストラクトＴＡＴ（ｓ２−１）−ＴＡＴ（ｓ２−９６）を広く調製した。したがって、合成中以下の配列及び保護基を用いた（樹脂に結合）：
ＴＡＴｓ２−１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＴＡＴｓ２−樹脂
ＴＡＴｓ２−１２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＴＡＴｓ２−樹脂
ＴＡＴｓ２−１３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−１９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−２９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−３９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｉｌｅ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−４９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｍｅｔ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｍｅｔ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−５９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｒｇ，（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−６９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−７９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８７：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８８：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−８９：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９０：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９１：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９２：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９３：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９４：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９５：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
ＴＡＴｓ２−９６：Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂
【０１８５】
３．３  取り込み実験の材料及び方法
ａ）細胞株：
この実験に用いた細胞株は、ＨＬ−６０（レファレンス番号ＣＣＬ−２４０，ＡＴＣＣ，ロット番号１１６５２３）であった。
【０１８６】
ｂ）培養培地及びプレート
１０％ＦＢＳ（レファレンス番号Ａ６４９０６−００９８、ＰＡＡ、ロット番号Ａ１５−１５１）：２００８年４月４日に５６℃で３０分間補体除去
１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のピルビン酸ナトリウム（レファレンス番号Ｓ８６３６、Ｓｉｇｍａ、ロット番号５６Ｋ２３８６）
ペニシリン（１００ユニット／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（レファレンス番号Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ、ロット番号１０６Ｋ２３２１）
を２００８年５月５日に補充したＲＰＭＩ（レファレンス番号２１８７５−０９１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号８２９６）又はＤＭＥＭ（レファレンス番号４１９６５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号１３４８１）
ＰＢＳ  １０Ｘ（レファレンス番号７００１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ロット番号８２７７）：滅菌水で１×に希釈
トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡ（レファレンス番号Ｌ−１１６６０、ＰＡＡ、ロット番号Ｌ６６００７−１１９４）
６ウェル培養プレート（レファレンス番号１４０６７５、Ｎｕｎｃ、ロット番号１０２６１３）
２４ウェル培養プレート（レファレンス番号１４２４７５、Ｎｕｎｃ、ロット番号０９５８４９）
９６ウェル培養プレート（レファレンス番号１６７００８、Ｎｕｎｃ、ロット番号０８３３１０）
９６ウェルタンパク質投与用プレート（レファレンス番号８２．１５８１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）
９６ウェル蛍光測定用プレート（レファレンス番号６００５２７９、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）
【０１８７】
ｃ）溶液
ポリ−Ｄ−リジンコーティング溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９０１１  ロット番号０９５Ｋ５１０４）：最後に１×ＰＢＳで２５μｇ／ｍＬに希釈
酸性洗浄バッファ：０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ（ｐＨ３．０）
Ｒｉｐａ溶解バッファ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＮａ３ＶＯ２、０．１％のＳＤＳ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（レファレンス番号１１８７３５８０００１、Ｒｏｃｈｅ、ロット番号１３７３２７００）
【０１８８】
ｄ）顕微鏡及び蛍光プレートリーダー
倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０  ＣＦＬ；Ｚｅｉｓｓ；２０Ｘ）を用いて細胞を観察し、カウントした。
蛍光は、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
【０１８９】
ｅ）方法
ＦＩＴＣ標識ペプチドの内部移行について浮遊細胞で調べた。１×１０６細胞／ｍＬの濃度でポリ−ＤＬ−リジンコーティングされたディッシュに細胞をプレーティングした。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、及び相対湿度１００％で２４時間インキュベートした後、既知の濃度のペプチドを添加した。ペプチドを添加した後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び相対湿度１００％で３０分間、１時間、６時間、又は２４時間インキュベートした。次いで、細胞表面に吸着しているペプチドを除去するために、酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で細胞を２回洗浄した（Ｋａｍｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，８８，９８−１０７を参照されたい）。塩基性アミノ酸を多く含むペプチドは、細胞表面に強く吸着するが、これにより、内部移行したペプチドが実際よりも多く推定されることが多いので、酸性バッファを用いた。したがって、酸性バッファを用いて細胞を洗浄して、細胞表面に吸着しているペプチドを除去した。Ｆａｂ／細胞透過性ペプチドコンジュゲートの細胞内取り込みの測定における酸洗浄を実施し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファを添加することにより細胞を破壊した。次いで、バックグラウンドを減少させて、タンパク質含量を正規化した後、蛍光により内部移行したペプチドの相対量を決定した。
工程は、以下の通りである：
１．細胞培養
２．酸洗浄、及び細胞抽出
３．蛍光プレートリーダーを用いたペプチド内部移行の分析。
【０１９０】
ｆ）細胞培養及びペプチド処理
（１）６ウェル培養プレートを３ｍＬのポリ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ９０１１；ＰＢＳ中２５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、２４ウェルプレートを６００μＬでコーティングし、９６ウェルプレートを１２５μＬでコーティングし、３７℃、５％ＣＯ２、及び相対湿度１００％で４時間インキュベートした。
（２）４時間後、それぞれ、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、又は９６ウェルプレートについて、３．５ｍＬ、７００μＬ、又は１５０μＬのＰＢＳでディッシュを２回洗浄した。
（３）１，０００，０００細胞／ｍＬ（浮遊細胞）のプレーティング密度でディッシュ中の２．４ｍＬの培地（ＲＰＭＩ）に細胞をプレーティングした。接種後、ペプチドを添加する前に、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２、及び相対湿度１００％でプレートをインキュベートした。接着性細胞は、処理日に９０％〜９５％の密度であると考えられ、それをＤＭＥＭにプレーティングした。
【表１７】
2015120694.tif 000018
（４）所望の濃度のＦＩＴＣ標識ペプチド（水中１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度の原液）で細胞を処理した。
（５）ペプチド添加後、３７℃、５％ＣＯ２、及び相対湿度１００％で０時間〜２４時間（例えば、３０分間、１時間、６時間、又は２４時間）細胞をインキュベートした。
【０１９１】
酸洗浄及び細胞抽出：
（６）抽出物を氷上で冷却した。
浮遊細胞（即ち、ディッシュのウェルに付着していない細胞）：
・細胞を１５ｍＬのファルコンに移した。細胞を最大限回収するために、ディッシュを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。
・最高２，４００ｒｐｍで２分間細胞を回収した。
・１ｍＬの冷ＰＢＳに細胞を懸濁させた。
・細胞を、コーティングされた「エッペンドルフチューブ」（１ｍＬのポリ−Ｄ−Ｌｙｓで４時間コーティングし、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した）に移した。
・１ｍＬの冷酸性洗浄バッファで３回洗浄し、最高２，４００ｒｐｍで２分間遠心分離した。「エッペンドルフ」中の細胞の拡散に注意する。
・１ｍＬの冷ＰＢＳで２回洗浄して中和させた。
・５０μＬの溶解ＲＩＰＡバッファを添加した。
・撹拌しながら氷上で３０分間〜１時間インキュベートした。
接着性細胞：
・（それぞれ、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、又は９６ウェルプレートについて）３ｍＬ、１ｍＬ、又は２００μＬの冷酸性洗浄バッファで３回洗浄した。ディッシュから剥離する細胞に注意する。
・（それぞれ、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、又は９６ウェルプレートについて）１ｍＬの冷ＰＢＳで２回洗浄して中和させた。
・５０μＬの溶解ＲＩＰＡバッファを添加した。
・撹拌しながら氷上で３０分間〜１時間インキュベートした。
・冷スクラッパーで細胞を断片化させる。２４ウェルプレート及び９６ウェルプレートを、４℃で１５分間４，０００ｒｐｍにて直接遠心分離して、細胞残屑を除去した。次いで、上清（２４ウェルプレート、又は９６ウェルプレートについてそれぞれ１００ｍＬ又は５０ｍＬ）を直接濃色の９６ウェルプレートに移した。蛍光プレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によりプレートを読み取った。
・コーティングされた「エッペンドルフチューブ」（１ｍＬのポリ−Ｄ−Ｌｙｓで４時間コーティングし、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した）に溶解物を移す。
・次いで、溶解した細胞を４℃、１０，０００ｇにて３０分間遠心分離して、細胞残屑を除去した。
・上清を除去し、コーティングされた「エッペンドルフチューブ」（１ｍＬのポリ−Ｄ−Ｌｙｓで４時間コーティングし、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した）内で−８０℃で保存した。
【０１９２】
蛍光プレートリーダーを用いたペプチド内部移行の分析：
（７）製造業者の説明書に従って、標準的なＢＣＡアッセイ（Ｋｉｔ  Ｎ２３２２５，Ｐｉｅｒｃｅ）により各タンパク質抽出物含量を測定した。
（８）蛍光プレートリーダー（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって各サンプル１０μＬを読み取り、バックグラウンドを減少させて、タンパク質濃度によって正規化した後、各サンプルの相対蛍光を決定する。
【０１９３】
３．４  内部移行実験及び分析
上記材料及び方法を用いて、ＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトのＨＬ−６０細胞株の細胞への時間依存性内部移行（取り込み）を実施した。
【０１９４】
簡潔に述べると、ＨＬ−６０細胞を、１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＴＡＴ誘導体輸送体と共に３０分間、１時間、６時間、又は２４時間インキュベートした。次いで、酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファを添加することにより細胞を破壊した。次いで、各抽出物の蛍光強度を読み取った後（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、バックグラウンドを減少させて、タンパク質含量を正規化することにより、内部移行したペプチドの相対量を測定した。ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトは、Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトと同程度の内部移行能を示した。前述の両輸送体のように時間依存的に内部移行するｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ輸送体コンストラクトは、効率は低いが依然として好適であるように思われ、一方、Ｌ−ＴＡＴは２４時間の期間中蓄積しないことがわかった（図５を参照されたい）。
【０１９５】
更に、上記のような蛍光標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトで処理された細胞を用いて共焦点顕微鏡観察を行った。Ｐ２  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット由来の解離皮質一次ニューロンを、神経基礎培地で１２日間培養した後、５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）のＦＩＴＣ標識ＴＡＴ誘導体輸送体に２４時間曝露した。氷上においてＰＢＳで５回細胞を洗浄し、次いで、予め固定することなしにｆｌｕｏｒｓａｖｅ封入培地に封入した。ＬＳＭ５１０メタ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像を取得した。ＬＳＭ５１０ソフトウェアを用いて画像を処理し、Ａｄｏｂｅ  ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いてマウント（ｍｏｕｎｔ）した。５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）のＦＩＴＣ−輸送体による標識（Ａ：緑）を共焦点顕微鏡により可視化した。核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｂ：青）により染色した。ｒ３−Ｌ−ＴＡＴに加えて、Ｄ−ＴＡＴ及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ輸送体コンストラクトも、ストレスを加えていないニューロンの細胞質に内部移行した（Ｃ：マージしたパネル）。しかし、２４時間インキュベートした後、Ｌ−ＴＡＴ輸送体はもはや存在していなかった（図６を参照されたい）。
【０１９６】
３．５  更なる内部移行実験及び分析
９６−ＦＩＴＣ標識Ｄ−ＴＡＴ誘導体輸送体の配列を用い、上記材料及び方法を用いて、ＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトのＨＬ−６０細胞株の細胞への時間依存性内部移行（取り込み）を更に実施した。これら配列を以下の表１８〜１９に示す。
【０１９７】
【表１８】
2015120694.tif 000019
【表１９】
2015120694.tif 000020
【０１９８】
上の表では、Ｄアミノ酸は、それぞれのアミノ酸残基の前に小文字「ｄ」を付けることにより示した（ｄＲ＝Ｄ−Ａｒｇ）。
【０１９９】
幾つかの配列では、残念ながら技術的理由により第１のアプローチにおいて合成に失敗した。これら配列を図１３では１、２、３、４、５、６、７、８、４３、５２、５３、５４、５５、５６、５７、８５、８６、８７、８８、８９、及び９０と略記する。しかし、残りの配列は、内部移行実験に用いた。
【０２００】
結果を図１３及び１４に示す。
【０２０１】
図１３及び１４から分かるように、２４時間インキュベートした後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）（可能な配列の選択については上記を参照されたい）を有する輸送体は全て、Ｌ−ＴＡＴ輸送体よりも高い内部移行能を示した。９６ウェルプレート内で、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のｒ３−Ｌ−ＴＡＴ由来輸送体と共に２４時間Ｈｅｌａ細胞をインキュベートした。次いで、酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファを添加することにより細胞を破壊した。各抽出物の蛍光強度を読み取った後（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、バックグラウンドを減少させて、内部移行したペプチドの相対量を決定した。
【０２０２】
図１４から分かるように、１つの位置が、最高の輸送体活性及び輸送体活性動態の改善に重要であると思われ、それは、位置２のＹ（配列番号１１６に相当するペプチドＮ９１）である。簡潔に述べると、漸増用量のｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−誘導体輸送体（０．５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）、又は１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ））と共に、２４ウェルプレート内で２時間、６時間、又は２４時間Ｈｅｌａ細胞をインキュベートした。次いで、酸性バッファ（０．２ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のグリシン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で２回、ＰＢＳで２回細胞を洗浄した。ＲＩＰＡ溶解バッファを添加することにより細胞を破壊した。各抽出物の蛍光強度を読み取った後（Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、バックグラウンドを減少させて、内部移行したペプチドの相対量を決定した。
【０２０３】
この実験の結論は、以下の通りである：
・２４時間インキュベートした後、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）（可能な配列の選択については表１〜３を参照されたい）を有する輸送体は全て、Ｌ−ＴＡＴ輸送体よりも高い内部移行能を示した（図１３）。これらの結果は、コンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）の有効性を十分立証するものである。
・１つの位置が、最高の輸送体活性に対して重要であり（図１３）、それは、位置２のＹ（配列番号１１６に相当する配列９１）である。
・１つの位置が、輸送体活性動態の改善に対して重要であり（図１４）、それは、位置２のＹ（配列番号１１６に相当する配列９１）である。
【０２０４】
したがって、特に、一般式（Ｉ）に係る配列が９ａａであり、且つコンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）を有するとき、位置２がＹである表１〜３に示されるＴＡＴ由来配列が好ましい。
【０２０５】
４．  これらペプチドのＵ９３７細胞への取り込み（内部移行）後における特定の輸送体コンストラクトの細胞内濃度の測定
更なる実験に従って、これらペプチドのＵ９３７細胞への取り込み（内部移行）後における特定の輸送体コンストラクトの濃度を測定した。配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（Ｌ−ＴＡＴ）、ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ（Ｄ−ＴＡＴ）、ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ）、及びｒＹＫＲｒＱＲＲｒ（ＸＧ−９１）（各々濃度は１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）である）を用いて実験を行った。
【０２０６】
【表２０】
2015120694.tif 000021
【０２０７】
驚くべきことに、非常に多くのｒＹＫＲｒＱＲＲｒ（ＸＧ−９１、配列番号１１１に相当する配列１１６）が細胞内に蓄積され、これは、培地中の輸送体コンストラクト濃度又はＤ−ＴＡＴコンストラクトについて予測された約２０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の平均濃度よりも有意に高い。これは、一般式（Ｉ）に係る輸送体コンストラクト、特に、位置２がＹであり、好ましくは９ａａ及びコンセンサス配列ｒＸＸＸｒＸＸＸｒ（配列番号２５２）を有する、表１〜３に示されるＴＡＴ由来配列を含む輸送体コンストラクトの重要性を強調している。
【０２０８】
５．  ペプチドの細胞への取り込み（内部移行）、及び細胞株ＨｅｐＧ２（肝細胞癌腫）、ＨＣＴ−１１６（腫瘍性結腸）、Ｕ９３７（リンパ腫）、ＷＢＣ細胞株（白血球株）、及び非ＷＢＣ細胞株におけるペプチド内部移行の測定
これら実験では、更なる細胞株ＨｅｐＧ２（肝細胞癌腫）、ＨＣＴ−１１６（腫瘍性結腸）、Ｕ９３７（リンパ腫）、ＷＢＣ細胞株（白血球株）、及び非ＷＢＣ細胞株において、インビトロにおけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの内部移行（取り込み）能を、蛍光プレートリーダーを用いて評価した。
【０２０９】
実験で用いられる試験サンプル及び条件
この実験で用いられるコンストラクト及び条件は、実験３について上に記載した通りであるが、以下の変更点及び細胞株を用いた。
【０２１０】
ａ）インビトロ（１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、ＨｅｐＧ２肝細胞癌腫、ＨＣＴ−１１６腫瘍性結腸、２４時間）におけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）
用いたコンストラクトは、各々９アミノ酸長を有するが、Ｄ−／Ｌ−パターンが異なる、Ｄ−ＴＡＴ及びｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる）、Ｄ−ＴＡＴと呼ばれる異なるＴＡＴ由来輸送体コンストラクト、並びにＮ−末端がβ−アラニンで更に標識されているコンストラクトｒ６Ｒ３及びＤＡＫであった。結果を図７に示す。図７から分かるように、コンストラクトＤ−ＴＡＴ及びｒ６Ｒ３の取り込みが最も効率的であり、次にｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉが効率的であった。
【０２１１】
ｂ）インビトロ（１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、Ｕ９３７、リンパ腫、２４時間）におけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）
用いたコンストラクトは、各々９アミノ酸長を有するが、Ｄ−／Ｌ−パターンが異なる、４つの異なるＴＡＴ由来輸送体コンストラクト（Ｌ−ＴＡＴ、ｒ３−ＴＡＴ（ｒ３−Ｌ−Ｔａｔとも呼ばれる）、ｒ３−ＴＡＴｉ（ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉとも呼ばれる）、及びＤ−ＴＡＴと呼ばれる）であった。更に、ペプチドを含まないコンストラクトＤＡＫを、比較のために対照サンプルとして用いた。結果を図８に示す。図８から分かるように、ｒ３−ＴＡＴ、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ、及びＤ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトの細胞への取り込みが最も効率的であり、Ｌ−ＴＡＴの細胞への取り込みは有意に少なかった。
【０２１２】
ｃ）Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）のＨＳＰＧ依存性
Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）がＨＳＰＧ依存性であるかどうかを調べるために実験を行った。見出されているように、Ｄ−ＴＡＴ輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）は、Ｕ９３７細胞（リンパ腫）において、２４時間に亘って５００ｎｍの濃度でＨＳＰＧ依存的である（図９を参照されたい）。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、ＦＩＴＣで標識されており、且つＮ−末端がβ−アラニンで標識されているＤ−ＴＡＴであった。
【０２１３】
ｄ）Ｕ９３７細胞（リンパ腫）におけるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの離脱
ＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトがＵ９３７細胞から離脱するかどうかを調べるために、更に実験を行った。結果として、５００ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴでは、Ｕ９３７細胞において離脱は見られなかった（図１０を参照されたい）。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、ＦＩＴＣで標識されており、且つＮ−末端がβ−アラニンで標識されているＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【０２１４】
更に、１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴではＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの離脱が見られ、Ｕ９３７細胞（リンパ腫）ではＨＳＰＧ依存的であることが分かった（図１１を参照されたい）。実験に用いたコンストラクトは、この実験においても上記Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【０２１５】
ｅ）非ＷＢＣ株（白血球細胞株）における１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴのＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）及び脱出
更なる実験では、ＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）及び脱出が、非ＷＢＣ株（白血球細胞株）における１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＦＩＴＣ−Ｄ−ＴＡＴで見られた（図１２を参照されたい）。実験に用いたコンストラクトは、９アミノ酸長であり、ＦＩＴＣで標識されており、且つＮ−末端がβ−アラニンで標識されているＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）であった。
【０２１６】
ｆ）結論
上記取り込み（内部移行）実験の結果として、上記図から分かるように、Ｄ−アミノ酸を含有するか、又はＤ−アミノ酸のみからなるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）は、インビトロにおいて数時間に亘って直線的であることがわかった。更に、２４時間後には、インビトロにおけるこれらＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）は、Ｌ−ＴＡＴよりも５０倍〜１００倍高い細胞内濃度に達する。更に、ＷＢＣ株（白血球細胞株）による、Ｄ−アミノ酸を含有するか、又はＤ−アミノ酸のみからなるＦＩＴＣ標識ＴＡＴ由来輸送体コンストラクトの取り込み（内部移行）は、インビトロにおける非ＷＢＣ株よりも１０倍〜５０倍効率的であることがわかった。全てのこれら実験では、ＷＢＣにおいて高細胞内濃度で離脱が効率的に行われることが示されたが、低濃度では離脱は見られなかった。
【０２１７】
６．  細胞毒性輸送体−積荷コンジュゲート分子Ｄ−Ｔａｔ−シスプラチン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−シスプラチン、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−シスプラチンの合成
６．１  ペプチド合成
更なるメチオニンを含むＤ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）のペプチド配列は、Ｆｍｏｃ法を用いることにより、０．４ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−アミド−ＡＭ樹脂上で用手的に合成される。次いで、ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断し、減圧下で濾過し、冷エーテルで沈殿させ、乾燥させる。粗ペプチドを、セミプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価する。
【０２１８】
６．２  ペプチドのシスプラチンへのアルキル化
５．０μｍｏｌのシスプラチン（３．０ｍＬの塩化ナトリウムバッファ中１．５ｍｇ、ｐＨ５．０）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＮａ２ＨＰＯ４バッファ（ｐＨ  ７．４）２．０ｍＬに溶解させ、その溶液のｐＨ値は７．０である。５．０μｍｏｌのＤ−ＴＡＴ−メチオニンペプチド（又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−メチオニンペプチド、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−メチオニンペプチド）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＮａ２ＨＰＯ４バッファ（ｐＨ７．４）中で調製し、その溶液のｐＨ値は６．０である。次いで、暗条件下で室温にて２つの溶液を混合することによりアルキル化を開始させる（混合物のｐＨ値は７．０である）。０時間、１時間、３時間、及び２４時間後、生成物を分析ＰＲ−ＨＰＬＣにより分析し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価する。予測されたピークの溶液を、最後にセミプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させる。
【０２１９】
７．細胞毒性輸送体−積荷コンジュゲート分子Ｄ−ＴＡＴ−オキサリプラチン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−オキサリプラチン、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−オキサリプラチンの合成
【化１】
2015120694.tif 000022
７．１  ペプチド（Ｄ−Ｔａｔ−メチオニン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−メチオニン、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−メチオニン）の合成
Ｆｍｏｃ法を用いることにより、０．２３ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上で、Ｄ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）のペプチド配列を用手的に合成する。したがって、Ｆｍｏｃ−脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）及びアミノ酸カップリング（ＤＭＦ中におけるＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）のサイクルを用いて、Ｃ末端のＧｌｙからＮ末端のｌ−Ｍｅｔ（Ｌ型）までの各アミノ酸を連続的に樹脂に結合させる。ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断し（２．５％のｄＨ２Ｏ、０．５％のＥＤＴ、及び２．０％のＴＩＳの存在下で２時間）、大気圧で濾過し、Ｎ２バブリングにより体積を減少させ、冷エーテルで沈殿させ、空気乾燥させる。粗ペプチドをセミプレパラティブＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価する。
【０２２０】
７．２  ペプチドのオキサリプラチンへのアルキル化
１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＮａ２ＨＰＯ４バッファ５．０ｍＬ（ｐＨ７．４）中で、１０μｍｏｌのオキサリプラチンを、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）（オキサリプラチン４．０ｍｇ、ラクトース一水和物３６．０ｍｇ）として製剤した。ｄＨ２Ｏ５．０ｍＬ中で、１０．０μｍｏｌのＤ−ＴＡＴ−メチオニンペプチド（又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−メチオニンペプチド、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−メチオニンペプチド）を調製する。室温で２つの溶液を混合することによりアルキル化を開始させる。次いで、反応物を３７℃で放置し、２４時間に亘って２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで分析ＰＲ−ＨＰＬＣによりモニタし、標的ピークをＥＳＩ−ＭＳで特性評価し、セミプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、次いで凍結乾燥させる。
【０２２１】
７．３  試験条件
ＭＤＦ−７（ヒト乳腺癌腫細胞株）及びＳｉＨａ（ヒト子宮頸部扁平上皮癌腫細胞株）の生存に対する、漸増濃度の本発明のコンジュゲート分子（Ｄ−Ｔａｔ−オキサリプラチン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−オキサリプラチン、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−オキサリプラチン）による処理の効果を判定する。Ｄ−Ｔａｔ−オキサリプラチン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−オキサリプラチン、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−オキサリプラチンの効果を、コンジュゲートＬ−Ｔａｔ−オキサリプラチン、及び２つの非コンジュゲート抗癌剤（オキサリプラチン及びシスプラチン）と比較する。各細胞株の細胞（１ウェル当たり１０，０００細胞）を、９６ウェルプレート（合計体積２００μＬ、ＭＣＦ−７については、１０％のＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸を添加したＭＥＭ；ＳｉＨａ細胞については、１０％のＦＢＳ、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸を添加したＭＥＭ／イーグル）にプレーティングする。各試験物質につき６種〜１０種の異なる濃度について試験する。対照細胞は、処理しない。細胞を２４時間３７℃でインキュベートした後、試験物質で処理する。各実験を３連で実施する。処理後の細胞インキュベートは、３７℃で９６時間実施する。これら細胞株の生存に対する試験分子の効果（インビトロ細胞毒性活性）を、ＭＴＴアッセイにより測定する。５ｍｇ／ｍＬの、０．２２μｍのフィルタで濾過したチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、レファレンス番号８８４１５）−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＣＨＵＶ）溶液を２０μＬずつ各ウェルに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートする。上清を除去し、ホルマザン結晶をＤＭＳＯ（１ウェル当たり２００μＬ）に溶解させる。５９５ｎｍにおいてマイクロプレートリーダー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ，Ａｓｙｓ  Ｈｉｔｅｃｈ）により吸光度（ＯＤ）を測定する。試験物質のＩＣ５０（細胞増殖の５０％を阻害する薬剤濃度）を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算する。
【０２２２】
８．細胞毒性輸送体−積荷コンジュゲート分子Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシル、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−クロラムブシル、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−クロラムブシルの合成
【化２】
2015120694.tif 000023
８．１  コンジュゲート分子（Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシル、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−クロラムブシル、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−クロラムブシル）の合成
Ｄ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）ペプチド配列を、Ｆｍｏｃ法を用いることにより、０．２３ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上で用手的に合成する。したがって、Ｆｍｏｃ−脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）及びアミノ酸カップリング（ＤＭＦ中におけるＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）のサイクルを用いて、Ｃ末端のＧｌｙからＮ末端のｌ−Ａ（Ｌ型）までの各アミノ酸を連続的に樹脂に結合させる。
【０２２３】
Ｎ末端のｌ−ＡのＦｍｏｃ−脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）後、標準的なアミノ酸カップリング条件（ＤＭＦ中におけるＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）を用いてクロラムブシルのカップリングを行う。ＴＦＡを用いて樹脂からコンジュゲート分子を切断し（３％のｄＨ２Ｏ及び３％のＴＩＳの存在下で７０分間）、大気圧で濾過し、Ｎ２バブリングにより体積を減少させ、冷エーテルで沈殿させ、空気乾燥させる。粗コンジュゲート分子をセミプレパラティブＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価し、次いで凍結乾燥させる。
【０２２４】
８．１  比較実験
ＭＤＦ−７（ヒト乳腺癌腫細胞株）及びＳｉＨａ（ヒト子宮頸部扁平上皮癌腫細胞株）の生存に対する、漸増濃度のＤ−Ｔａｔ−クロラムブシル、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−クロラムブシル、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−クロラムブシルによる処理の効果を判定する。Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシル、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−クロラムブシル、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−クロラムブシルの効果を、コンジュゲートＬ−Ｔａｔ−クロラムブシル、及び２つのｕクロラムブシル非コンジュゲート抗癌剤（クロラムブシル及びシスプラチン）と更に比較する。各細胞株の細胞（１ウェル当たり１０，０００細胞）を、９６ウェルプレート（合計体積２００μＬ、ＭＣＦ−７については、１０％のＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸を添加したＭＥＭ；ＳｉＨａ細胞については、１０％のＦＢＳ、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸を添加したＭＥＭ／イーグル）にプレーティングする。各試験物質につき６種〜１０種の異なる濃度について試験する。対照細胞は、処理しない。細胞を２４時間３７℃でインキュベートした後、試験物質で処理する。各実験を３連で実施する。処理後の細胞インキュベーションは、３７℃で９６時間実施する。これら細胞株の生存に対する試験分子の効果（インビトロ細胞毒性活性）を、ＭＴＴアッセイにより測定する。５ｍｇ／ｍＬの、０．２２μｍのフィルタで濾過したチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、レファレンス番号８８４１５）−リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＣＨＵＶ）溶液を２０μＬずつ各ウェルに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートする。上清を除去し、ホルマザン結晶をＤＭＳＯ（１ウェル当たり２００μＬ）に溶解させる。５９５ｎｍにおいてマイクロプレートリーダー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｄｅｒ，Ａｓｙｓ  Ｈｉｔｅｃｈ）により吸光度（ＯＤ）を測定する。試験物質のＩＣ５０（細胞増殖の５０％を阻害する薬剤濃度）を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算する。
【０２２５】
９．細胞毒性輸送体−積荷コンジュゲート分子Ｄ−Ｔａｔ−ドキソルビシン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−ドキソルビシン、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−ドキソルビシンの合成
【化３】
2015120694.tif 000024
９．１  コンジュゲート分子（Ｄ−Ｔａｔ−ドキソルビシン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−ドキソルビシン、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−ドキソルビシン）の合成
Ｄ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）ペプチド配列を、Ｆｍｏｃ法を用いることにより、０．２３ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上で用手的に合成する。したがって、Ｆｍｏｃ−脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）及びアミノ酸カップリング（ＤＭＦ中におけるＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）のサイクルを用いて、Ｃ末端のＧｌｙからＮ末端のｌ−Ｅ（Ｌ型）までの各アミノ酸を連続的に樹脂に結合させる。
【０２２６】
Ｎ末端のｌ−ＥのＦｍｏｃ−脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）後、アセチル化（無水酢酸、ＤＭＦ中ＤＩＥＡの活性化）を行う。ＤＭＦ中２％のヒドラジン一水和物を用いてＯｄｍａｂ側鎖保護基を除去する。ＯＢｔエステル（ＤＣＭ／ＤＭＦ中ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）を用いて、Ａｄｒｉｂｌａｓｔｉｎ（登録商標）（ドキソルビシン、ＨＣｌ１８％、ＮａＣｌ８２％、凍結乾燥）として製剤されたクロラムブシルのカップリングを行う。
【０２２７】
ＴＦＡを用いて樹脂からコンジュゲート分子を切断し（１．７％のｄＨ２Ｏ及び１．７％のＴＩＳの存在下で２時間）、大気圧で濾過し、Ｎ２バブリングにより体積を減少させ、冷エーテルで沈殿させ、空気乾燥させる。粗コンジュゲート分子をセミプレパラティブＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価し、次いで凍結乾燥させる。
【０２２８】
１０．細胞毒性輸送体−積荷コンジュゲート分子Ｄ−Ｔａｔ−サキナビル、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−サキナビル、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−サキナビルの合成
【化４】
2015120694.tif 000025
１０．１  ペプチド（Ｄ−Ｔａｔ−Ｄ−システイン、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−Ｄ−システイン、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ−Ｄ−システイン）の合成
Ｆｍｏｃ法を用いることにより、０．４０ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上で、Ｄ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）のペプチド配列を用手的に合成する。したがって、Ｆｍｏｃ−脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）及びアミノ酸カップリング（ＤＭＦ中におけるＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）のサイクルを用いて、Ｃ末端のＤ−ＡｒｇからＮ末端のＤ−Ｃｙｓまでの各アミノ酸を連続的に樹脂に結合させる。ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断し、氷上でプレインキュベートし（２．５％のｄＨ２Ｏ、２．５％のＥＤＴ、及び１．０％のＴＩＳの存在下で５時間）、減圧下で濾過し、冷エーテルで沈殿させ、真空乾燥させる。粗ペプチドをセミプレパラティブＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価する。
【０２２９】
１０．２  サキナビルの活性エステルの調製
３７５μｍｏｌのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを室温で無水ＤＣＭに溶解させ、これに、２６５μｍｏｌのＤＭＡＰ、３７５μｍｏｌのＤＩＰＣＩ、及び１１０μｍｏｌのＩｎｖｉｒａｓｅ（登録商標）（ラクトース、ｅｘｃｉｐｉｅｎｓ  ｐｒｏ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｏ  ｏｂｄｕｃｔｏ）として製剤されたサキナビルを０℃で添加した。反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌する。生成物を０．１ＮのＨＣｌで洗浄（ｉｓｈｅｄ）し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、固体生成物ＳＱＶ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）を得た。ＣＨ２Ｃｌ２及びＴＦＡ（５０：５０）の混合物中で３時間、ＳＱＶ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）エステルをインキュベートすることによりＢｏｃ保護基を除去する。生成物を冷エーテルから再結晶化させ、真空下で一晩乾燥させる。４７μｍｏｌのＳＱＶ−Ｇｌｙエステルを３ｍＬの無水ＤＭＳＯに室温で溶解させ、これに９４μｍｏｌのＳＰＤＰを添加する。反応混合物のｐＨを室温で絶えず撹拌しながら８．０に調整する。絶えず撹拌しながら反応物を３時間放置する。粗生成物ＳＱＶ−Ｇｌｙ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−ＳＳ−ピリジルを、セミプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価する。
【０２３０】
１０．３  ペプチドＤ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）、又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）−Ｄ−システインのサキナビルへのコンジュゲート
２７μｍｏｌのＳＱＶ−Ｇｌｙ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−ＳＳ−ピリジルを、室温で０．５ｍＬのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．５）に溶解させ、これに０．５ｍＬのＰＢＳバッファ（ｐＨ７．５）中５４μｍｏｌのＤ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）−Ｄ−システインを添加する。反応物を絶えず撹拌しながら３時間室温で放置する。粗コンジュゲートＤ−ＴＡＴ（ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ；配列番号２５１）−サキナビル、ｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（ｒＫＫＲｒＱＲＲｒ；配列番号２０）−サキナビル、及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴｉ（ｒＲＲＱｒＲＫＫｒ；配列番号２１）−サキナビルをセミプレパラティブＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特性評価する。
【０２３１】
１１．  積荷分子としてＪＮＫ阻害剤配列を含む輸送体−積荷コンジュゲート分子の調製
１１．１  ＪＮＫ阻害剤配列の同定
既知のＪＢＤ間、例えば、低度に保存されている８個のアミノ酸配列を有するＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−Ｊｕｎ、及びＡＴＦ２のＪＢＤ間で配列のアラインメントを行うことにより、ＪＮＫとの効率的な相互作用に重要なアミノ酸配列を同定する。このアラインメントを用いて、配列番号１３７〜２２０として本明細書に定義される多数の好適なＪＮＫ阻害剤配列を導くＪＮＫ阻害剤配列を同定することができた。
【０２３２】
１１．２  ＪＮＫ阻害剤配列を含む輸送体−積荷コンジュゲート分子の調製
本明細書に定義されるＪＮＫ阻害剤配列のＣ末端を、上に定義された一般式（Ｉ）に係る輸送体コンストラクトのＮ末端に共有結合させることにより、上記ＪＮＫ阻害剤配列を含む輸送体−積荷コンジュゲート分子を合成した。従来のＦｍｏｃｋ合成法を用いて上に定義された一般式（Ｉ）に係る輸送体コンストラクトを生成し、質量分析により更に分析した。それらを、最後にＨＰＬＣによって精製した。２個のプロリン残基からなるリンカーを用いて結合させることができる。このリンカーを用いて、可動性を最大化させ、且つ不要な二次構造変化を防ぐことができる。
【０２３３】
１１．３  細胞死の阻害
ＪＮＫの生物学的活性に対する効果について研究する。コンストラクトを緑色蛍光タンパク質のＮ末端に結合させ、ＩＬ１により誘導される膵β細胞のアポトーシスに対するこのコンストラクトの効果を評価する。このモードのアポトーシスは、ＪＢＤ１−２８０をトランスフェクトすることによりブロックされることが既に示されているが、ＥＲＫ１／２又はｐ３８などの特定の阻害剤は保護しなかった。
【０２３４】
１０％のウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、及び２ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のグルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、インスリン産生ＴＣ−３細胞を培養する。インスリン産生ＴＣ−３細胞に本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子をトランスフェクトし、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を細胞培養培地に添加する。倒立蛍光顕微鏡を用いてＩＬ−１添加の４８時間後にアポトーシス細胞数をカウントする。細胞質の特徴的な「小疱形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ  ｏｕｔ）」により正常細胞とアポトーシス細胞とを識別し、２日後にアポトーシス細胞をカウントする。
【０２３５】
１２．  配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の細胞内移入
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む輸送体−積荷コンジュゲート分子の細胞内に侵入する能力を評価する。本発明の輸送体コンストラクト及び本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を、フルオレセインにコンジュゲートしているグリシン残基をＮ末端に付加することにより標識する。これら標識ペプチド（１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ））をＴＣ−３細胞培養物に添加し、それを実施例１１に記載の通り維持する。所定の時間に、細胞をＰＢＳで洗浄（ｆｉｓｈｅｄ）し、氷冷メタノール−アセトン（１：１）中で５分間固定した後、蛍光顕微鏡で観察する。フルオレセイン標識ＢＳＡ（１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、１２モル／モルＢＳＡ）を対照として用いる。
【０２３６】
これら輸送体コンストラクト及び本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子からの蛍光シグナルを測定する。
【０２３７】
１３．  配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子による、インビトロにおけるｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２、及びＥｌｋ１のリン酸化阻害
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の、その標的転写因子のＪＮＫ媒介リン酸化に対する効果をインビトロにおいて調べる。ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮウサギ網状赤血球溶解液キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて組換え且つ不活化ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、及びＪＮＫ３を生成し、基質として、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、及びＥｌｋ１を単独で、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合した状態で、固相キナーゼアッセイに用いる。用量応答実験を実施し、前記実験では、反応バッファ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＴｒｉｓ−酢酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＥＧＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のｐ−ニトロフェニルリン酸塩（ｐＮＰＰ）、５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のピロリン酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のｐ−グリセロリン酸塩、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のジチオトレイトール）中で２０分間、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を、組換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、又はＪＮＫ３キナーゼと混合する。次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＭｇＣｌ２及び５ｐＣｉの３３Ｐ−  −ｄＡＴＰ及びＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ１〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（ａａ１〜９６）、又はＧＳＴ−ＥＬＫ１（ａａ３０７〜４２８）のいずれかを１μｇ添加することにより、キナーゼ反応を開始させる。ＧＳＴ−融合タンパク質は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入する。
【０２３８】
１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズも混合物に添加する。次いで、反応生成物を、１０％の変性ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。ゲルを乾燥させ、次いで、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）で露光し、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子によるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、及びＥｌｋ１のリン酸化阻害を測定する。
【０２３９】
１４．  配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子によるＩＬ−１誘導性膵β細胞死の阻害
ＩＬ−１により誘発される細胞のアポトーシスの促進に対する、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の効果を測定する。ＴＣ−３細胞培養物を１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の本発明のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドと共に３０分間インキュベートし、次いで、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１と共にインキュベートする。２４時間後に、２回目のペプチド（１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ））添加を実施する。ヨウ化プロピジウム（赤く染色される細胞が、死んでいる細胞である）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青く染色される細胞が、インタクトな原形質膜を有する細胞である）を用いて、ＩＬ−１βと共に２日間インキュベートした後のアポトーシス細胞をカウントする。本発明のＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドを添加すると、２日間ＩＬ−１βの存在下で培養されたＴＣ−３細胞のＩＬ−１誘導性アポトーシスが阻害された。
【０２４０】
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を含む細胞と、ＩＬ−１とのインキュベートを１２日間続けたことを除いて、上記の通りＴＣ−３細胞を処理することにより、ＩＬ−１誘導性細胞死の長期阻害について調べる。１日間に１回、更なるペプチド（１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ））を添加し、２日間に１回、更なるＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加する。
【０２４１】
１５．  配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子による放射線誘発性膵β細胞死の阻害
ＪＮＫは、電離放射線によっても活性化される。配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子が、放射線誘発性ＪＮＫ損傷に対する保護を提供するかどうかを判定するために、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）、Ｌ−ＴＡＴ（配列番号１８）、及び配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子（照射の３０分前に１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）を添加）の存在下又は欠如下で「ＷｉＤｒ」細胞に放射線を照射する（３０Ｇｙ）。対照細胞（ＣＴＲＬ）には照射しない。上記のようにＰＩ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３４２染色を用いて４８時間後に細胞を分析する。Ｎ＝３。ＳＥＭは、指定のものである。
【０２４２】
１６．  配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子による電離放射線に対する放射線保護
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の放射線保護効果を判定するために、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（２月齢〜３月齢）に、０．７４Ｇｙ／分（１７ｍＡ、０．５ｍｍのＣｕフィルタ）の線量でＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＲＴ  ２５０  Ｒ−ｒａｙを用いて放射線を照射する。照射の３０分前に、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を動物にｉ．ｐ．注射する。簡潔に述べると、マウスに以下のように放射線を照射する：頭部を箱の外に出した状態で、マウスを小さなプラスチック製の箱に入れる。動物を、照射機の下に仰向けに置き、頸部を小さなプラスチック製のトンネルに固定して、頭部を正確な位置に維持する。体を鉛で保護する。照射前、マウスは、標準的なペレット状マウス用食餌で維持するが、照射後は、半流動食餌を毎日取り換えてマウスに与える。次いで、Ｐａｒｋｉｎｓなどにより開発されたスコアリングシステム（Ｐａｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１：１６５−１７３，１９８３）に従って、２人の独立観察者により唇粘膜の反応をスコア付けするが、前記システムは、紅斑状態に加えて、浮腫、落屑、及び滲出の存在を評価するものである。更に、紅斑／浮腫状態を記録する前に、各動物を計量する。
【０２４３】
１７．  配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子によるＪＮＫ転写因子の抑制
ＡＰ−１二重標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号２６２）を用いてゲル遅延度アッセイを実施する。指示通り、ＨｅＬａ細胞の核抽出物を５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで１時間処理する、又は処理しない。ＴＡＴと、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子とをＴＮＦ−αの３０分前に添加する。
【０２４４】
１８．  永続性ＭＣＡＯモデルにおける局所脳虚血に対する神経保護の評価−様々な用量における保護効果の判定
１２日齢のラットにおいて局所脳虚血を誘導する。２％イソフルランを用いて誘導チャンバ内で仔ラットに麻酔をかけ、手術中、２％イソフルラン下でマスクを用いて麻酔を維持する。中大脳動脈（ＭＣＡ）の主枝を電気凝固させることによりＭＣＡＯを誘導する。右側を下にした状態でラットを置き、耳と目との間で皮膚を斜めに切開する。側頭筋を切除した後、前頭縫合線から頬骨弓より下の部位まで頭蓋骨を除去した。嗅脳溝上に現れた直後に露出した左ＭＣＡを、前頭枝と前頂枝とにＭＣＡが二分岐する前に、下大脳静脈の段階で、永続的に電気凝固した。次いで、頭蓋の皮膚切開部分を閉じた。次いで、仔ラットが目覚めるまで、３７℃に維持したインキュベータに入れ、ラットの母親に委ねた。
【０２４５】
６時間後、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を、腹腔内注射する。凝固の２４時間後、抱水クロラールを用いてラットに麻酔をかけ、上行大動脈を通して４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ溶液を灌流させる。次いで、脳を摘出し、同固定液中に２時間放置し、勾配をつけた３０％スクロース−ＰＢＳ溶液に、４℃で約１５時間入れる。イソペンタン（−４０℃）で脳を凍結させ、−２０℃で保存する。５０μｍの冠状凍結切片を、スライドガラスに回収した。前記切片をクレシルバイオレットで染色する。各１０番目の切片を分析し、Ｎｅｕｒｏｌｅｕｃｉｄａプログラムを用いて病変の総体積を計算する。
【０２４６】
１９．  一過性ＭＣＡＯモデルにおける、局所脳虚血に対するｉｖ投与後の本発明のキメラペプチドによる神経保護の評価
成体マウスにおける一過性虚血。雄ＩＣＲ−ＣＤ１マウス（６週齢；１８〜３７ｇ；Ｈａｒｌａｎ）を用いて、総頚動脈から内頚動脈へ微細繊維を導入し、該微細繊維を動脈輪へ進行させて、中大脳動脈を閉塞させることにより、虚血を誘発する。再灌流の１０分後まで、頭蓋骨に固定されたプローブを用いて、レーザードップラー血流計により虚血の全域に亘る局所脳血流を測定する。直腸温を測定し、３７℃に維持する。再灌流の４８時間後にマウスを屠殺する。Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａプログラム（ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ）に備え付けられたコンピュータ−顕微鏡システムを用いて、２０μｍの厚さの連続凍結切片をトレースし、Ｎｅｕｒｏｅｘｐｌｏｒｅｒプログラムを用いて、虚血領域及び脳全体の体積を計算する（盲検）。成体マウスの再灌流（３０分間クランプで締めた）の６時間後における、プラセボ、及び配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子（１．３ｍｇ／ｋｇ）のｉｖボーラス投与後の梗塞体積（ｍｍ３）を測定する。
【０２４７】
２０．  ＮＭＤＡ刺激後のＬＤＨ放出を測定することによる神経培養物アッセイ
１００μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＮＭＤＡに連続曝露する前に、指定の濃度のペプチド又はＭＫ−８０１で３０分間前処理した姉妹培養物において、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の神経保護効果を評価する。１２時間ＮＭＤＡで処理した後、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子５μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）で前処理した培養物中において、ＮＭＤＡ曝露による変性変化、形態学的外観、ニューロンの数及び分布を判定する。
【０２４８】
皮質ニューロンの培養。２日齢の仔ラットの脳から皮質の小片を切り取り、３４℃で３０分間２００ユニットのパパインと共にインキュベートし、次いで、１００μｇ／ｍＬのポリ−Ｄ−リジンで予めコーティングされているディッシュに、約１×１０６細胞／プレートの密度でニューロンをプレーティングする。プレーティング培地は、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＢ２７／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から構成されていた。
【０２４９】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイ。Ｃｙｔｏｔｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いて、ＮＭＤＡ投与の１２時間後、２４時間後、及び４８時間後に、浴培地（ｂａｔｈｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）に放出されたＬＤＨを測定する。
【０２５０】
２１．  オールインワンウェルアプローチを用いたＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害
実験の前日に、３，０００細胞／ウェルでＨｅｐＧ２細胞を播種する。次いで、漸増濃度のインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）（ａ）を添加して、３０分間ＪＮＫを活性化させる。２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＨｅｐｅｓ、０．５％のＴｗｅｅｎ（ｐＨ７．４）中において細胞を溶解させ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＪＮＫ用に処理する。（ｂ）１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１により誘導され、３８４ウェル／プレート（ｎ＝９６）において測定されたＪＮＫ活性についてのＺ’。（ｃ）化学的ＪＮＫ阻害剤（スタウロスポリン及びＳＰ６００１２５）による内因性ＩＬ−１β誘導性ＪＮＫ活性の阻害。（ｄ）ＩＬ−１α依存性ＪＮＫ活性に対する配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトとペプチド阻害剤Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）とを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の効果。
【０２５１】
方法：Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎキナーゼアッセイ
原理：Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎは、マイクロプレートフォーマットにおける生体分子の相互作用を調べるために用いられる非放射性ビーズに基づく技術である。頭文字であるＡＬＰＨＡは、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（増幅発光近接均質アッセイ）を意味する。これは、「ドナー」及び「アクセプタ」ビーズを極近接させる生物学的相互作用、次いで、シグナルを増幅させる作用を有する化学反応のカスケードを含む。６８０ｎｍでレーザ励起すると、「ドナー」ビーズ中の光増感剤（フタロシアニン）が、周囲酸素を励起された一重項状態に変換する。４マイクロ秒の半減期内に、一重項酸素分子は、溶液中で最高約２００ｎｍまで拡散することができ、アクセプタビーズが近くに存在する場合、一重項酸素は、「アクセプタ」ビーズ中のチオキセン誘導体と反応して、同一「アクセプタ」ビーズ中に含まれるフルオロフォアを更に活性化させる３７０ｎｍの化学発光を生じさせる。次いで、励起されたフルオロフォアは、５２０ｎｍ〜６２０ｎｍの光を放出する。アクセプタビーズが存在しない場合、一重項酸素は、基底状態に下降し、シグナルは生じない。
【０２５２】
先ず、キナーゼバッファ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＤＴＴ、１００μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＮａ３ＶＯ４、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）でキナーゼ試薬（Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、抗Ｐ−ｃＪｕｎ抗体、及び活性ＪＮＫ３）を希釈し、ウェル（１５μＬ）に添加する。次いで、１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＡＴＰの存在下で２３℃にて１時間反応物をインキュベートする。検出バッファ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＮａＣｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）のＥＤＴＡ、０．３％のＢＳＡ）で希釈されたビーズミックス（プロテインＡアクセプタ２０μｇ／ｍＬ、及びストレプトアビジンドナー２０μｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、次いで、暗条件下２３℃で更に１時間インキュベートすることにより検出を行った。内因性ＪＮＫ活性を測定するために、活性ＪＮＫを細胞溶解物に置き換え、且つ反応キナーゼ成分を細胞溶解後に添加したことを除いて上記の通りキナーゼアッセイを実施する。Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ及びＰ−ｃＪｕｎ抗体は、同濃度で用いるが、一方、ＡＴＰは、１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の代わりに５０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）で用いる。Ｆｕｓｉｏｎ又はＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎ機器を用いてＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎシグナルを直接分析する。
【０２５３】
２２．  騒音性外傷の治療
１００μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の濃度の２．６％緩衝ヒアルロン酸（Ｈｙｌｕｍｅｄ，Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．）ゲル製剤２μＬ中に含まれる、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を、騒音性外傷（３０分間６ｋＨｚの１２０ｄＢ）の３０分前、３０分後、又は４時間後に、３群のモルモット（各群６匹の動物）の蝸牛の正円窓膜に塗布した。未処理の耳を対照とする。騒音性外傷の２０分後（一過的閾値変化、ＴＴＳ）、及び外傷の１５日後（永続的閾値変化、ＰＴＳ）に聴性脳幹反応を測定することにより聴覚閾値の変化を評価する。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）の投与は、未処理耳に比べて、過剰の騒音に曝された後に塗布した場合でさえも、永続的聴覚損失から保護した。
【０２５４】
２３．  結腸炎の治療における、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の治療活性の評価
ａ）試験系：
ｉ）種／系統：マウス／ＢＡＬＢ／ｃ
ｉｉ）供給元：Ｈａｒｌａｎ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．
ｉｉｉ）性別：雌
ｉｖ）動物の総数：ｎ＝１５０
ｖ）年齢：若い成体、実験開始時７週齢
ｖｉ）体重：処理開始時における動物の体重差は、平均体重の±２０％を超えない
ｖｉｉ）動物の健康：この実験で用いられる動物の健康状態は、到着時に評価し、健康状態が良好な動物のみを研究室条件に順化させ（少なくとも７日間）、実験に用いる。
ｖｉｉｉ）無作為化：乱数表に従って、動物を実験群に無作為に割り付けた。
ｉｘ）終了：実験の終わりに生存している動物を頚椎脱臼により安楽死させる。
【０２５５】
ｂ）試験手順
５０％エタノールに溶解させたＴＮＢＳを投与することにより結腸炎を誘導した。
次いで、全ての動物を、単回又は反復日用量（上記）として、０．１μｇ／ｋｇ〜１，０００μｇ／ｋｇの範囲の用量の配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子で、腹腔内又は皮下処理した。
【０２５６】
ｃ）観察及び検査
ｉ）臨床徴候
上記実験期間中、慎重に臨床検査を実施し、記録した。例えば、皮膚、毛、眼、粘膜の外観、分泌及び排泄（例えば、下痢）の発生、並びに自律活性の変化を観察した。歩行、姿勢、及び取扱に対する反応の変化に加えて、異常な挙動、振せん、痙攣、睡眠、及び昏睡の発生についても記録した。
【０２５７】
ｉｉ）体重
毎日動物の個々の体重を測定した。
【０２５８】
ｉｉｉ）結腸炎の臨床評価
体重、便の硬さ、及び経直腸出血を全て毎日記録し、疾患重篤度スコアのパラメータとして使用した。
【表２１】
2015120694.tif 000026
【０２５９】
ｉｖ）結腸の肉眼病理
実験の最終日、動物を安楽死させ、以下のスコアに従って肉眼で病理評価するために結腸を摘出した。
【表２２】
2015120694.tif 000027
【０２６０】
２４．  ウイルス感染症−水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の治療における、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性測定
ホストの培養細胞（ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））において、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性の測定。ウイルスは、その生活環全体に機能性細胞環境を必要とする絶対細胞内寄生体であり；死細胞は、ウイルスの複製を支援しない。更に、細胞機能の阻害剤は、細胞にとって毒性である場合があるので、ウイルスの成長を特異的に阻止することはできない。したがって、病気のホスト細胞又は死んでいるホスト細胞は、非特異的にウイルス力価を低下させ得る。これにより正しい結果が得られない恐れがあるので、細胞毒性アッセイでは、先ず、試験化合物に対する培養細胞の耐性を判定する。次いで、プラーク減少アッセイを実施し、次いで、感染細胞中のウイルス性帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）について、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性について試験する。
【０２６１】
Ａ）配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の細胞毒性の測定：
毒性を測定するために、培養細胞（ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ））を９６ウェル組織培養プレートに播種する。ＤＭＳＯを含有する培地（５μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子と同濃度）を、幾つかの濃度（１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、２μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、及び５μｍｏｌ／Ｌ（μＭ））で添加し、２４時間放置する。次いで、ニュートラルレッドアッセイを実施する。細胞毒性アッセイ（６連セット）の用ニュートラルレッド比色分析を用いて、後続の有効性アッセイ（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８：２８５３−２８６２に記載の通り実施）の最大用量を設定する。生存細胞は、ニュートラルレッドを吸収するので、吸光度のレベルは、細胞の生存度及び生存数の定量的な尺度である。ニュートラルレッドの取り込みは、細胞数に正比例しており、また、エンドサイトーシスが正常に行われていることを反映している。したがって、０時間又は２４時間において、短パルス（ｂｒｉｅｆ  ｐｕｌｓｅ）のニュートラルレッドを培地に添加する。固定及び抽出後、色素を添加し、各サンプル中の色素量を５４０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定する。
【０２６２】
Ｂ）配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対する抗ウイルス作用を評価するためのプラーク減少アッセイ：
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子が用量依存的抗ウイルス作用を示すかどうかを判定するために、標準である１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）前後の様々な濃度について試験する。このプラーク減少アッセイでは、２４ウェルプレート中のコンフルエントなヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に、１：１００の比（感染多重度ＭＯＩ＝０．０１）でＶＺＶ感染ＨＦＦを接種し、２時間細胞に吸着させる。過剰のウイルスを取り出し、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を０（ＤＭＳＯのみ）、０．５、１、又は２含有する培地を添加する。初期感染レベルを測定するために、この時点で１サンプル採取する（各ウェル〜１５０ｐｆｕを含んでいる）。２４時間後、２連ウェルをトリプシン処理し、次いで、３連のＭｅＷｏ細胞単層上にて細胞懸濁液の力価を測定して、各サンプル中のＶＺＶ感染細胞数を判定する。増殖を制限していない間、ＶＺＶは、細胞間伝播（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｓｐｒｅａｄ）により増殖するので、通常、１日で１０倍に増加する。これは、ＤＭＳＯのみで処理された培養物で観察される現象であり、１，２００±４３０ｐｆｕが生じた。細胞毒性及び有効性データを判定する。これらデータから、予備選択性指数（Ｔｏｘ／ＥＣ５０）は、５．０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）／０．３μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）であると計算される。
【０２６３】
Ｃ）配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を用いた、ヒト包皮線維芽細胞における水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）複製の測定：
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子が、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）において水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）複製を阻止する最低有効量を測定するために、コンフルエントなＨＦＦ単層にＶＺＶ−ＢＡＣ−Ｌｕｃ株を接種し、２時間培養し、次いで、０．２５μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、０．５μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）、又は１．０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子、又は陰性対照（ＤＡＫ、１．０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ））で２４時間処理する。ルシフェラーゼアッセイによりウイルス量を測定する。サンプルは３連であり、平均発光を示す；エラーバーは、平均の標準偏差を表す。
【０２６４】
２５．  慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療における、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性測定
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療における、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性を測定するために、これら本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を、ブレオマイシン誘導性急性肺炎症及び線維症の動物モデルにおいて用いる。ブレオマイシンによって炎症及び線維症を誘導するためのプロトコルは、文献中に既に記載されている。実験の目的は、
−ブレオマイシン単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）後１日目、及び
−線維症の発現した１０日目、の
ブレオマイシン誘導性炎症及び線維症における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び肺の好中球動員に対する皮下（ｓ．ｃ．）経路によるこれら本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の効果を調べることにあった。
【０２６５】
１）方法及び実験アプローチ
ブレオマイシンの鼻腔内単回投与と共に、２種の用量の配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子及びビヒクル対照をｓ．ｃ．投与し、１日後及び１０日後にマウスを分析した。モデル動物として１群当たり１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を用いた。実験群は、ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇの配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子及び０．１ｍｇ／ｋｇのこれら本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を含んでおり、処理は、ブレオマイシン投与前、次いで３日に１回、これら本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を反復皮下投与することから構成された。２４時間目に、ＢＡＬ洗浄、細胞診断、細胞数、及び肺ミエロペルオキシダーゼ活性により急性肺炎症をモニタした。化合物の効果をビヒクル対照と比較した。ブレオマイシンの単回投与の１０日後、ヘマトキシリン及びエオシン染色を用いて肺線維症を組織学的に評価した。
【０２６６】
１．１）ブレオマイシン投与
軽いケタミン−ケタミン麻酔下で４０μＬの体積を鼻腔滴下注入することにより、気道を通じてＢｅｌｌｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｏｕｇｅ，Ｆｒａｎｃｅ）製の硫酸ブレオマイシン−生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｋｇ体重）又は生理食塩水を投与した。ブレオマイシン誘導性炎症及び線維症の両方についてブレオマイシン投与は、以下を含んでいた：ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇの配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子及び０．１ｍｇ／ｋｇのこれら本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子。ブレオマイシン誘導性炎症についての投与経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、単回用量として投与した。ブレオマイシン誘導性線維症についての投与経路は皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、１０日間に３回投与した。
【０２６７】
１．２）気管支肺胞洗浄流体（ＢＡＬＦ）
気管の切開した後、プラスチック製カニューレを挿入し、０．３ｍＬのＰＢＳ溶液を用いて気腔を洗浄し、３７℃に加熱した。回収したサンプルを２つの画分に分けた：第１の画分（最初の２回の洗浄に相当する１ｍＬ）は、メディエータの測定に用い、第２の画分は、細胞決定のために用いた（４ｍＬ）。第１の画分を遠心分離し（６００ｇで１０分間）、上清を分画し、メディエータ測定まで−８０℃で保存した。次いで、細胞ペレットを０．４ｍＬの無菌ＮａＣｌ（０．９％）に再懸濁させ、第２の画分と共に保存し、細胞計数のために用いた。
【０２６８】
１．３）肺のホモジネート
ＢＡＬ後、全肺を摘出し、１ｍＬのＰＢＳと共にマイクロチューブ（Ｌｙｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  Ｄ，Ｑ  Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ，Ｉｌｌｋｒｉｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）内に入れ、Ｆａｓｔｐｒｅｐ（登録商標）システム（ＦＰ１２０，Ｑ  Ｂｉｏ  Ｇｅｎｅ，Ｉｌｌｋｒｉｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて全肺組織抽出物を調製し、次いで、前記抽出物を遠心分離し、メディエータ測定及びＳｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ（Ｆｒａｎｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いるコラーゲンアッセイまで−８０℃で上清を保存した。
【０２６９】
１．４）細胞数及び決定
Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計を用いてＢＡＬ流体中の全細胞数を決定した。ＭＧＧ  Ｄｉｆｆ−ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＡＧ）で染色した後、サイトスピン標本（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ）に対してディファレンシャル・セル・カウントを実施した。標準的な形態学的基準を用いて２００細胞に対してディファレンシャル・セル・カウントを行った。
【０２７０】
１．５）ＴＮＦ測定
製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｍｏｕｓｅ  ＤｕｏＳｅｔ，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を用いてＢＡＬＦ中のＴＮＦ濃度を測定した。結果をｐｇ／ｍＬで報告する。
【０２７１】
１．６）ＭＰＯ測定
配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の投与時にＭＰＯ濃度を測定した。
【０２７２】
１．７）組織学
ＢＡＬ及び肺灌流後、標準的な顕微鏡解析のために４％緩衝ホルムアルデヒドで大葉を固定した。３−ｍの切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２７３】
２６．  アルツハイマー病の治療における配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性測定
アルツハイマー病における配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む例示的な本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性を測定するために、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路行動試験に加えて、斑の量を測定する免疫組織学的試験、及びマウスの脳内のβ−アミロイド１−４０及びβ−アミロイド１−４２量を測定するＥＬＩＳＡ試験を用いて、ロンドン型及びスウェーデン型突然変異を有するＡＰＰ７５１過剰発現ｈＡＰＰトランスジェニックマウスモデルにおいて、これらペプチドを評価した。
【０２７４】
ａ）方法
ｉ）緒言
５月（±２週）齢の雌のｈＡＰＰ  Ｔｇマウスを用いて、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の、行動、生化学的マーカー、及び組織学的マーカーに対する有効性を評価するためにこの実験を設計した。したがって、最高４ヶ月間２又は３週間に１回マウスを処理し、処理期間の最後にＭｏｒｒｉｓ水迷路において行動を評価した。屠殺時、脳、ＣＳＦ、及び血液を回収した。４つの異なる脳ホモジネート画分、及びＴｇマウスのＣＳＦにおけるＡβ４０及びＡβ４２量を測定した。１処理群当たり８匹のＴｇマウスの皮質及び海馬における斑の量を定量した。
【０２７５】
ｉｉ）動物
バックグラウンドがＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡである５月（±２週）齢の雌Ｔｇマウスを、処理群１〜３（ｎ＝１２）に無作為に割り付けた。５月齢で開始して、最高４ヶ月間、ビヒクル又は２種の異なる濃度の配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を２又は３週間に１回動物に皮下（ｓ．ｃ．）投与した。本実験に用いた全ての動物は、濃い色の眼を有しており、ＭＷＭプールの外側にある目印を知覚すると考えられた。しかし、実験のために囲いの中に残してある動物を含む全ての動物について、処理開始前の可視プラットフォーム訓練、所謂予備試験で照査された視力の低い動物は除外しなければならなかった。特定の動物において視力障害が確認された場合、そのマウスを実験から除外した。
【０２７６】
ｉｉｉ）動物の識別及び飼育
マウスは、耳印により個々に識別した。マウスは、Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ（登録商標）により供給されている標準的な齧歯類用床敷上の個別換気ケージ（ＩＶＣ）内で飼育した。各ケージに最大５匹のマウスを収容した。国際規格に基づいて書かれたＪＳＷの標準業務手順書（ＳＯＰ  ＧＥＮ０１１）に従ってマウスを維持した。実験番号、性別、動物の個体識別番号（ＩＲＮ）、誕生日、並びにスクリーニングの日付、及び処理群の割り付けを示す色付きカードにより各ケージを識別した。実験中は、温度を約２４℃に維持し、相対湿度は、約４０％〜７０％で維持した。一定の光サイクル（１２時間明／暗）下で動物を飼育した。動物は、通常の水道水を自由に摂取可能であった。
【０２７７】
ｉｖ）処理
４０匹の雌ｈＡＰＰトランスジェニックマウスを、４ヶ月間、２種の異なる投与量の配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を用いて、２週間に１回０．１ｍｇ／ｋｇをｂ．ｗ．処理するか、３週間に１回１０ｍｇ／ｋｇをｂ．ｗ．処理するか（ｎ＝１２／群）、又はビヒクルで３週間に１回ｓ．ｃ．処理した（ｎ＝１２）。
【０２７８】
ｖ）モリス水迷路（ＭＷＭ）
直径１００ｃｍの黒色円形プールでモリス水迷路（ＭＷＭ）試験を実施した。２２±１℃の温度の水道水を充填し、仮想的にプールを４つの区域に分けた。透明なプラットフォーム（直径８ｃｍ）を水表面の約０．５ｃｍ下に配置した。予備試験を除いた全試験期間中、プラットフォームは、プールの南西象限に位置していた。４日間の訓練期間の前日、動物に所謂「予備試験」（６０秒間試行を２回）を実施して、各動物の視力が正常であることを確かめる必要があった。このタスクを遂行した動物のみをＭＷＭ試験に用いた。ＭＷＭタスクにおいて、各マウスは、連続４日間３回の試行を実施しなければならなかった。１回の試行は、最大１分間続いた。この時間中、マウスは、隠されている透明な標的を見つけ出す機会を有していた。動物が水からの「道」を見つけ出すことができなかった場合、調査者が、マウスをプラットフォームに誘導するか、又はプラットフォーム上に置いた。各試行後、１０秒間〜１５秒間マウスをプラットフォーム上に静置させた。この時間中、マウスは、周囲を見て位置を確かめる機会を有していた。追跡システム（Ｋａｍｉｎｓｋｉ；ＰＣＳ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に悪影響を与えないために、薄暗い光条件下で調査を実施した。プールの周囲の壁には、黒色のボールド体の幾何学的記号（例えば、円形及び四角形）が描かれたポスターが固定されており、マウスは、位置を確かめるための目印としてその記号を用いることができた。約５分間〜約１０分間の試行間隔が保証されるように、１試行当たりの１遊泳群は、５匹〜６匹のマウスから構成されていた。逃避潜時（マウスが隠されているプラットフォームを見つけ出して、水から逃避するのに必要な時間（秒））、経路（標的に到達するまでの軌道の長さ（メートル））及び目的の象限における滞在時間を定量するために、コンピュータ化された追跡システムを用いた。プールの中央上方に配置されたカメラにコンピュータを接続した。カメラは、マウスの尾つけられた小さなヘアピンに固定されている発光ダイオード（ＬＥＤ）のシグナルを検出した。４日目の最後の試行の１時間後、マウスは、所謂プローブ試行を行わなければならなかった。この時に、プラットフォームをプールから除去し、１分間のプローブ試行中、実験者は、以前標的が存在していた位置を通過した回数を計数した。更に、この象限における滞在時間と他の３つの象限における滞在時間とを計算した。この試行を通して、マウスは、どんな性質を有していようと、プラットフォームから何の手がかりも得ることができなかった。
【０２７９】
ｖｉ）組織のサンプリング
処理期間の終わり、及び全ての行動試験後に、全ての生存マウス（ｎ＝２８）を屠殺した。したがって、ＳＯＰ  ＭＥＴ０３０に記載されているように、標準的な吸入麻酔（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎ，Ｂａｘｔｅｒ）によって全てのマウスを鎮静させた。大後頭孔を鈍的切開し、露出させることにより、脳脊髄液（ＣＳＦ）を得た。露出時、パスツールピペットを大後頭孔の約０．３ｍｍ〜１ｍｍの深さに挿入した。流れが完全に停止するまで、吸引及び毛管作用によりＣＳＦを回収した。各サンプルの２つのアリコートを直ちに冷凍し、ＥＬＩＳＡ技術を用いた更なる分析の準備が整うまで−８０℃で保存した。ＣＳＦのサンプリング後、各マウスを背殿位にし、胸郭を開いて、１ｃｃのシリンジに取り付けられた２６ゲージの針を右心室に挿入した。針を軽く吸引して、血液をＥＤＴＡに回収し、血漿を得るために用いた。血漿を得るために、スウィングバケット（ＧＨ−３．８Ｂｅｃｋｍａｎ）を備えるロータを用いて、遠心分離機（ＧＳ−６Ｒ  Ｂｅｃｋｍａｎ）内で１０分間１，７５０ｒｐｍ（７００ｇ）にて各マウスの血液サンプルを回転させた。血漿を冷凍し、更なる分析まで−２０℃で保存した。血液をサンプリングした後、トランスジェニックマウスの心臓を０．９％の塩化ナトリウムで灌流した。脳を速やかに摘出し、小脳を切除した。全てのマウスの右半球を、室温で１時間、新たに作製した４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に浸漬して固定した。その後、脳を１５％スクロースＰＢＳ溶液に移して２４時間浸漬させ、確実に低温保護した。次の日、脳をイソペンタン中で凍結させ、組織学的調査（ＳＯＰ  ＭＥＴ０４２）に用いるまで−８０℃で保存した。左半球を計量し、液体窒素中で冷凍し、生化学的分析のために−８０℃で保存した。
【０２８０】
ｖｉｉ）Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の測定
各Ｔｇマウスの４つの異なる脳ホモジネート画分中、及びＣＳＦサンプル中のＡβ１−４０及びＡβ１−４２量を、ＥＬＩＳＡ技術を用いて評価した。高感度Ａβ１−４０及びＡβ１−４２ＥＬＩＳＡ試験キットは、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（ＳＯＰ  ＭＥＴ０５８）から購入した。ＣＳＦを上記のように調製した。脳ホモジネートの冷凍した半球を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有しているＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）−バッファ（５ｍＬ）中でホモジネートした。この初期脳ＴＢＳホモジネート１．２５ｍＬを−８０℃で保存し、１．２５ｍＬを更に調べた。残りの脳ホモジネート（２．５ｍＬ）を遠心分離し、得られた上清（＝ＴＢＳ画分）を分注し、ＥＬＩＳＡ測定まで−２０℃で保存した。ペレットをＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２．５ｍＬ）に懸濁させ、遠心分離し、上清（＝ＴｒｉｔｏｎＸ−１００画分）を分注し、−２０℃で保存した。ＳＤＳ（２．５ｍＬ）を用いてこれら工程を繰り返した。ＳＤＳ画分のペレットを７０％ギ酸（０．５ｍＬ）に懸濁させた後、遠心分離した。得られた上清を１ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＴＲＩＳ（９．５ｍＬ）で中和し、分注し、−２０℃で保存した（＝ＦＡ画分）。４つの脳ホモジネート画分（ＴＢＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＳＤＳ、及びＦＡ）のサンプルを、ＥＬＩＳＡ技術を用いたＡβ１−４０及びＡβ１−４２測定に用いた。ＥＬＩＳＡ試験キットは、Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（ＳＯＰ  ＭＥＴ０６２）から購入した。ＴＢＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、モノマー〜オリゴマー構造を可溶化させたと推測することができた。ポリマー様前原線維及び水不溶性線維は、ＳＤＳ及びＦＡに溶解することができた。これに関して、全ての４つの画分を調べることにより、Ａの重合状態についての洞察が得られる。
【０２８１】
ｖｉｉｉ）脳形態の評価
調査した全てのＴｇ動物の脳組織は、この手順のばらつきによるバイアスを避けるために正確に同じ方法で操作した。２４匹のＴｇマウス（各群８匹）の脳の半分から、それぞれ厚さ１０μｍである１層当たり（全部で５層）２０枚の凍結切片（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ  ３０５０Ｓ）を矢状に切断し、５枚（各層から１枚）を処理し、斑の量を定量するために評価した。５枚の矢状層は、Ｐａｘｉｎｏｓ及びＦｒａｎｋｌｉｎによる形態学アトラス“Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｒａｉｎ”（第２版）の図１０４〜１０５、図１０７〜１０８、図１１１〜１１２、図１１５〜１１６、及び図１１８〜１１９に相当していた。第１の層は、領域ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＧＤ１ｂ、及びＧＤｍｂと共に海馬全体を含むという要件により特定した。モノクローナルヒトＡβ−特異的抗体６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）及びチオフラビンＳ染色を用いて、海馬及び皮質で免疫反応性を定量的に評価した。用いなかった残りの脳半球又は組織は、プロジェクトの終わりまでＪＳＷ  ＣＮＳで保存した。
【０２８２】
ｂ）評価
ｉ）行動
モリス水迷路試行において、遊泳距離の長さ、逃避潜時、遊泳速度、プローブ試行において以前プラットフォームが存在していた位置を通過した回数、及びプールの各象限における滞在時間を、特別なコンピュータソフトウェアを用いて各Ｔｇ動物について測定した。
【０２８３】
ｉｉ）生化学的評価
全てのＴｇマウスのＣＳＦサンプル及び脳標本のサンプルを、市販のＡβ１−４０及びＡβ１−４２ＥＬＩＳＡを用いて分析した。適切な標準の測定も同時に実施した。脳標本のサンプルは２連で分析した。少量しかなかったので、ＣＳＦサンプルは１回しか測定できなかった。
【０２８４】
ｉｉｉ）組織学
ｉｌ）アミロイド沈着及び斑の量の測定
６Ｅ１０免疫組織化学のために以下の評価手順を用いた：
ａａ）画像にコントラストを適用することなしに、切片の境界を可視化するために画像を対比させる。
ｂｂ）皮質の輪郭を対話型線描し、皮質領域（＝領域の面積）を測定する。
ｃｃ）対象領域（ＡＯＩ）を対話型線描し、ここでは閾値レベル（各画像について同じ）に基づいて特定の強度を超え、且つ大きさが８μｍ２を超えている染色された対象が検出される。
ｄｄ）各対象の面積、ＡＯＩにおける染色領域の合計、及びシグナル／ノイズ比（各画像について同じ）を高めるために滑らかに対比させた後の対象数を測定する。
ｅｅ）海馬についてａａ）〜ｄｄ）を繰り返す。
ｆｆ）平均斑サイズ（＝「斑面積の合計／斑の数」）、相対斑数及び面積（＝「斑の数／領域の面積」及び「斑の合計面積／領域の面積×１００」）を計算する。
ｇｇ）エクセルのスプレッドシートに、パラメータ「画像タイトル、領域の面積、斑の数、斑の合計面積、相対斑数、相対斑面積、及び平均斑サイズ」を含むデータを自動的にエクスポートする。所見用のフィールドを用いて、それぞれ画像の品質及び除外基準を記録した。除外基準は、切片の一部が欠けている、しわが多い、大きな傷、又は染色の不整合（例えば、ブロッキング試薬の十分な反応を妨げる恐れがある膨張のため）であった。
ｈｈ）セーブせずに画像を閉じる（生データをそのまま保存するため）。
【０２８５】
２７．  ２型糖尿病の治療における配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性測定
目的は、２型糖尿病の治療における配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の活性を測定することにあり、具体的には、３日間に１回（２８日間）空腹時血中グルコース濃度を評価することにより、２型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるこれら本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子による慢性処理の効果を判定することにあった。
【０２８６】
ａ）材料及び方法
ｉ）動物
合計２０匹の雄ｄｂ／ｄｂマウス（８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。到着時、動物を集団飼育（ｎ＝６〜７／群）し、特に明記しない限り、通常の齧歯類用食餌（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ＃１３２４ｃｈｏｗ；Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒｉｎｇｓｔｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）及び水を自由に与えた。
【０２８７】
マウスは、１２：１２Ｌ／Ｄサイクル下で（４：００に点灯し、１６：００に消灯する）、温度と湿度が制御された部屋の中で飼育した。
【０２８８】
ｉｉ）群及び無作為化
４日目、血中グルコース濃度（空腹時；Ｂｉｏｓｅｎ  Ｓ  ｌｉｎｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＥＫＦ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定される血中グルコース）に従ってマウスを無作為化して、以下の薬剤処理群（ｎ＝６）のうちの１つに割り付けた：
１）ビヒクル対照、Ｓ．Ｃ．（生理学的食塩水）
２）配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子；１ｍｇ／ｋｇ；ｓ．ｃ．
３）配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子；１０ｍｇ／ｋｇ；ｓ．ｃ．。
上記全ての用量は、遊離塩基について計算した。薬剤の純度は９５．２８％、ペプチド含量は７８．０％であった。全ての化合物は、３ｍＬ／ｋｇの体積を皮下（ｓ．ｃ．）投与した。ビヒクル対照及び配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子の製剤手順は以下の通りであった。
【０２８９】
先ず、配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子をビヒクルに溶解させた。以下に詳述する手順に従って、製剤（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量に相当する、０．３３ｍｇ／ｍＬ及び３．３ｍｇ／ｍＬの濃度）を調製した。濃度を計算し、試験項目の純度及びペプチド含量を考慮して表した（乗算計数は１．３４６であった）。
・原液の調製：凍結乾燥させた配列番号８〜１３６のいずれかに係るＴＡＴ由来輸送体コンストラクトと配列番号１３７〜２２０のいずれかに係るＪＮＫ１又はＩＢ１由来積荷ペプチドとを含む本発明の輸送体−積荷コンジュゲート分子を最低１時間解凍し、１ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）（３．８２３ｍｇ／ｍＬに相当）のビヒクル原液として調製した。各処理日用にアリコートを調製し、約−８０℃で保存した。各処理日に、この原液を必要な濃度に希釈する。
・原液の保存：約−８０℃；
・希釈調整品の保存：最高室温で２４時間。
【０２９０】
可溶化前、粉末を−２０℃で保存した。原液は、約−８０℃で３ヶ月間安定であり、動物に投与するための希釈製剤は、室温で２４時間安定である。使用しなかった希釈物質は、４〜８℃で保存する場合、最高７日間保存することができた。
【０２９１】
ｃ）実験手順
８日間順化させた後、アウトライン群に従って、ＰＭ４：００に消灯する８時間前にＳＣ投与することにより、２１日間ＡＭ８：００に１日１回マウスを処理した。
【０２９２】
ｉ）血中グルコース
血中グルコースは、尾静脈からヘマトクリット管に血液サンプル１０μＬを回収し、次いで、Ｂｉｏｓｅｎ  ｓ−ｌｉｎｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＥＫＦ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ；Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析することにより、７時間絶食した動物の投与後６時間の血中グルコースを測定した。
【０２９３】
ｉｉ）代謝ケージ
群１＋３：２４時間の食餌及び水の摂取に加えて、２４時間の尿及び便の排泄を記録するために、マウスを代謝ケージに入れた。マウスをｎ＝６〜７の２つのサブチームに階層化し、次いで、代謝特性評価を実施した。
【０２９４】
ｉｉｉ）アディポカインパネル
群１＋３：ＥＤＴＡでコーティングされたヘマトクリット管（１００μＬ）を用いて尾静脈から血液を３回回収した。血液を遠心分離した後、血漿を回収し、測定まで−２０℃で保存した。次いで、アディポカイン／サイトカインの以下のパネルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ系７−ｐｌｅｘ：レプチン、レジスチン、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＴＮＦα、インスリン、及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）を用いて測定した。
【０２９５】
ｉｖ）終了
群１＋３（１１１日目）：以下の器官を切除し、計量した：鼡径部の皮下脂肪、精巣上体脂肪、腹膜後脂肪、脳、肝臓、腎臓、脾臓、及び心臓。上記全ての器官のサンプルを、将来的に組織病理学的評価を行うことができるように４％ＰＦＡで固定した。また、立体解析及び免疫組織学的分析が可能であるように膵臓（総括的に）をサンプリングし、後で網膜症について分析できるように眼をサンプリングした。群２（２８日目）：組織又は血漿を回収しなかった。
【０２９６】
２８．  ＴＡＴ誘導体はヒト白血球集団を標的とする
赤血球溶解後の全血から一次ヒト白血球（ＷＢＣ）を得た。１μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）のＤ−ＴＡＴ（配列番号２５１）−ＦＩＴＣ又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）−ＦＩＴＣと共に、３７℃で３０分間ＷＢＣをインキュベートし、酸性バッファで洗浄し、細胞型特異的表面マーカー（単球はＣＤ１４、多核白血球はＣＤ１５、リンパ球ＴはＣＤ３、リンパ球ＢはＣＤ１９）に対する蛍光抗体で染色する。Ｄ−ＴＡＴ−ＦＩＴＣ及びｒ３−Ｌ−ＴＡＴ−ＦＩＴＣを含む細胞を、最後にフローサイトメトリーにより分析して、それぞれの輸送体含量を測定する。両方のＴＡＴ誘導体は、ヒト白血球集団を標的とする。ｄＴＡＴ及びｒ３ＬＴＡＴは、単球、好中球、及びリンパ球Ｔ細胞に結合し、リンパ球Ｂ細胞に対する結合効率は低い。ｄＴＡＴの特異性とｒ３−Ｌ−ＴＡＴの特異性との間には僅かに差が存在し、Ｄ−ＴＡＴはｒ３−Ｌ−ＴＡＴよりもリンパ球Ｔに、より効率的に結合する。
【０２９７】
２９．  異なる細胞型による本発明に係る選択された輸送体コンストラクトの取り込み
サブコンフルエントな密度（用いられる細胞型に依存して変動し得る）の細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで予めコーティングされている９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、異なるＦＩＴＣ結合型輸送体を、３μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）で１５時間細胞と共にインキュベートした。この時間の後、残りの手順のために細胞を氷上で保存した。細胞表面に結合しているペプチドを除去するために、先ず、細胞を酸洗浄で２回洗浄して、原形質膜に結合している分子を除去した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、標準的な溶解バッファに３０分間溶解させた。次いで、細胞溶解物を含むプレートを、４℃で１，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。次いで、透明な上清を回収し、細胞内ＦＩＴＣ蛍光を測定するために黒色９６ウェルプレートに移した。以下の細胞を用いた：
非白血球細胞株：      ＨｅｐＧ２：肝細胞癌腫細胞（ヒト）
Ａ５４９：肺上皮細胞（ヒト）
白血球細胞株：        Ｒａｗ：マクロファージ細胞（マウス）
Ｊ７７：マクロファージ細胞（マウス）
一次精製白血球：      ＢＭＤＭ：骨髄由来マクロファージ（マウス）。
【０２９８】
結果を、Ｄ−ＴＡＴ（配列番号２５１）（図１７）又はｒ３−Ｌ−ＴＡＴ（配列番号２０）（図１８）の取り込み率（％）として表す。全ての輸送体コンストラクトは、速度は異なっても、それぞれの細胞への取り込みを示す。
【図１】
2015120694.tif 000028
【図２】
2015120694.tif 000029
【図３】
2015120694.tif 000030
【図４】
2015120694.tif 000031
【図５】
2015120694.tif 000032
【図６】
2015120694.tif 000033
【図７】
2015120694.tif 000034
【図８】
2015120694.tif 000035
【図９】
2015120694.tif 000036
【図１０】
2015120694.tif 000037
【図１１】
2015120694.tif 000038
【図１２】
2015120694.tif 000039
【図１３Ａ】
2015120694.tif 000040
【図１３Ｂ】
2015120694.tif 000041
【図１４Ａ】
2015120694.tif 000042
【図１４Ｂ】
2015120694.tif 000043
【図１４Ｃ】
2015120694.tif 000044
【図１４Ｄ】
2015120694.tif 000045
【図１５】
2015120694.tif 000046
【図１６】
2015120694.tif 000047
【図１７】
2015120694.tif 000048
【図１８】
2015120694.tif 000049
【配列表】
2015120694000001.app