(57)【要約】【課題】ｃＤＮＡに基づくタンパク質ＤＢを使用した場合でも、タンパク質の末端部分の配列を的確に推定するとともに末端部分以外の配列推定の信頼性も向上させる。【解決手段】ｃＤＮＡに基づくタンパク質ＤＢに収録されているアミノ酸配列に基づき、タンパク質毎に、末端部分の最末端から所定長さのアミノ酸配列の中で最末端からアミノ酸残基を１個ずつ除去した複数のアミノ酸配列を作成してタンパク質に対応付けた末端配列ＤＢを作成しておく。そして、目的タンパク質由来のペプチド混合物をＭＳ2分析した結果に基づき、末端配列ＤＢを使用したＭＳ／ＭＳイオンサーチを行う。末端配列ＤＢには、シグナルペプチドが脱落した実測のタンパク質の末端部分のアミノ酸配列と合致する配列が収録されているので、末端ペプチドも同定することができ、Swiss-Protを使用した検索結果と合わせることでタンパク質全体を同定することができる。【選択図】図３
2015152556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定方法において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基の位置Ｓが、１≦Ｓ≦ｐ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＮ末端アミノ酸残基をｐ番目とする）であるアミノ酸配列からなる、既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて、各既知タンパク質についてＮ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を抽出し、その所定長さのアミノ酸配列中のアミノ酸残基をＮ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列を求め、該アミノ酸配列によりＮ末端配列データベースを作成するＮ末端配列データベース作成ステップと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｎ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索ステップと、
を有することを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定方法。
【請求項２】
目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定方法において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基の位置Ｔが、ｑ≦Ｔ≦Ｌ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＣ末端アミノ酸残基をｑ番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の終止コドンの５’上流側に隣接するコドンに対応するアミノ酸残基をＬ番目とする）であるアミノ酸配列からなる、既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて、各既知タンパク質についてＣ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を抽出し、その所定長さのアミノ酸配列中のアミノ酸残基をＣ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列を求め、該アミノ酸配列によりＣ末端配列データベースを作成するＣ末端配列データベース作成ステップと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｃ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索ステップと、
を有することを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質のアミノ酸配列決定方法であって、
前記既知のタンパク質データベースはゲノムデータに基づいて作成されたタンパク質データベースであることを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列決定方法であって、
前記マススペクトル情報はｎが２以上の整数であるＭＳn分析結果に基づくプロダクトイオン情報であり、
前記データベース検索ステップは、ＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いて、前記プロダクトイオン情報を前記末端配列データベースに収録されているそれぞれのアミノ酸配列から求まるプロダクトイオン情報と照合することにより目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定することを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列決定方法であって、
前記所定の長さはタンパク質の全長であり、前記マススペクトル情報はＭＳ1イオンのみを用いた質量分析結果に基づくイオン情報であり、
前記データベース検索ステップは、ペプチドマスフィンガープリンティングを用いて、前記イオン情報を前記末端配列データベースに収録されているそれぞれのアミノ酸配列から求まるイオン情報と照合することにより目的タンパク質の末端部分を含むアミノ酸配列を推定することを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定方法。
【請求項６】
目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定装置において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基の位置Ｓが、１≦Ｓ≦ｐ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＮ末端アミノ酸残基をｐ番目とする）であるアミノ酸配列からなる既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて作成された、各既知タンパク質についてＮ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中の、アミノ酸残基をＮ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列が収録されているＮ末端配列データベースと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｎ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索部と、
を備えることを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定装置。
【請求項７】
目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定装置において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基の位置Ｔが、ｑ≦Ｔ≦Ｌ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＣ末端アミノ酸残基をｑ番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の終止コドンの５’上流側に隣接するコドンに対応するアミノ酸残基をＬ番目とする）であるアミノ酸配列からなる、既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて作成された、各既知タンパク質についてＣ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中の、アミノ酸残基をＣ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列が収録されているＣ末端配列データベースと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｃ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索部と、
を備えることを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定装置。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のタンパク質のアミノ酸配列決定装置であって、
前記既知のタンパク質データベースはゲノムデータに基づいて作成されたタンパク質データベースであることを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定装置。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列決定装置であって、
前記マススペクトル情報はｎが２以上の整数であるＭＳn分析結果に基づくプロダクトイオン情報であり、
前記データベース検索部は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いて、前記プロダクトイオン情報を前記末端配列データベースに収録されているそれぞれのアミノ酸配列から求まるプロダクトイオン情報と照合することにより目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定することを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定装置。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列決定装置であって、
前記所定の長さはタンパク質の全長であり、前記マススペクトル情報はＭＳ1イオンのみを用いた質量分析結果に基づくイオン情報であり、
前記データベース検索部は、ペプチドマスフィンガープリンティングを用いて、前記イオン情報を前記末端配列データベースに収録されているそれぞれのアミノ酸配列から求まるイオン情報と照合することにより目的タンパク質の末端部分を含むアミノ酸配列を推定することを特徴とするタンパク質のアミノ酸配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析対象であるタンパク質由来のペプチド混合物を含む被検試料を質量分析することで得られた質量分析データを用いて、該タンパク質のアミノ酸配列を決定する方法及びそのための装置に関し、さらに詳しくは、タンパク質のＮ末端やＣ末端などの末端部分のアミノ酸配列を決定する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析の手法は広く用いられており、その技術的な進歩には著しいものがある。プロテオーム解析分野において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）を始めとする質量分析装置を用いたタンパク質の同定手法として、データベース検索法がよく知られている。一般に、データベース検索法では、解析対象であるタンパク質由来のペプチド混合物を含む試料に対しＭＳn分析（ｎは２以上の整数）を行うことで得られたＭＳnスペクトルに現れるピークの質量電荷比（m/z）情報（場合によっては強度情報も）を集めたピークリストと、タンパク質データベースに登録されているタンパク質の情報から理論的に算出される質量電荷比のリストなどとを照合し、その一致度を手がかりとしてペプチドのアミノ酸配列を決定し、その結果に基づき元のタンパク質を同定（つまりタンパク質全体のアミノ酸配列を決定）する。
【０００３】
上記のようなデータベース検索のために利用される検索エンジンとしては、英国マトリクス・サイエンス（Matrix Science）社が提供しているマスコット（Mascot）に含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ（MS/MS Ion Search）がよく知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、こうしたタンパク質のアミノ酸配列の決定等に利用されるデータベースは、様々な研究機関や大学などから提供され、実際に使用されている。そうしたデータベースの一つとして、相補的ＤＮＡ（以下、慣用に従って「ｃＤＮＡ」と記す）に基づいて作成されたデータベースがある。このデータベースは、一般にｍＲＮＡと称されるメッセンジャリボ核酸を逆転写して得られるデータに基づいて決定された各タンパク質のアミノ酸配列情報を収録したものである。近年、ゲノム解析の進展は著しく、その結果が反映されたｃＤＮＡに基づくタンパク質同定用データベースは、例えば実測等により解明された既知のタンパク質のアミノ酸配列情報を収録したデータベースなどと比較してもかなり充実したものとなっている。
【０００５】
しかしながら、上記ＭＳ／ＭＳイオンサーチによりタンパク質のＮ末端やＣ末端などの末端部分のアミノ酸配列を同定する際に、ｃＤＮＡから作成されたデータベースを用いると、多くの場合、通常の検索条件ではアミノ酸配列を決定することができない。この理由を図１１、図１２を参照して簡単に説明する。図１１及び図１２はいずれもタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の処理手順を説明するための図である。
【０００６】
即ち、上述したようにｃＤＮＡに基づくデータベースには、ｍＲＮＡの逆転写のデータに基づいて決定されたアミノ酸配列情報が収録されており、この情報では元の成熟ｍＲＮＡのコーディング領域（５’非翻訳領域と３’非翻訳領域との間にある開始コドンと終止コドンに挟まれたタンパク質に翻訳される領域）の末端まで、Ｎ末端及びＣ末端共にアミノ酸残基が配列されている。これに対し、実際に生体中に存在するタンパク質では、多くの場合、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳後に、Ｎ末端側においてシグナルペプチドが除去されるなどの翻訳後修飾が生じたり、Ｃ末端側でも数個のアミノ酸残基の切断が生じたりする。このため、図１１（ａ）に示すように、生体中に存在するタンパク質はｃＤＮＡに基づくデータベース中のアミノ酸配列よりも短い状態で存在している。
【０００７】
図１１（ａ）上側の図中の「１−」及び「−Ａ」（ここではＡはＸ）は、この「データベースに登録されているアミノ酸配列」が、Ｎ末端を１として、Ａ個のアミノ酸残基からなることを示す。また同図中の「Ｍ」はメチオニン残基であり、ｍＲＮＡの開始コドンがコードするアミノ酸残基である。なお、バリンをコードする塩基配列が開始コドンとして働く生物もきわめて希に存在するものの、多くの生物の場合、開始コドンはメチオニン残基をコードするため、以下、開始コドンがコードするアミノ酸はメチオニンであるとして説明を行う。図１１（ａ）下側の図中の「ｐ−」及び「−Ｂ」（ここではＢはＹ）は、「データベースに登録されているアミノ酸配列」のＮ末端を１としたときに、「タンパク質の実際のアミノ酸配列」のＮ末端がｐ番目のアミノ酸残基から始まり、同じくＢ（＜Ａ）番目のアミノ酸残基で終了していることを示す。図１１のほか、図２、図３、図７、図８、図１２も同様である。
【０００８】
図１１（ａ）に示したようなタンパク質を酵素消化すると、その酵素に特有の位置で結合が切断されて複数のペプチドの混合物が生成される。このペプチド混合物に対し質量分析（例えばＭＳ2分析）が行われ、その結果がＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いたデータベース検索に供される。このとき、酵素消化に用いられた酵素の種類が検索条件の一つとして設定される。
【０００９】
ＭＳ／ＭＳイオンサーチの実行過程では、データベース中のタンパク質のアミノ酸配列を、酵素の種類に対応した既知の切断位置で切断することで生成された各種ペプチド断片のアミノ酸配列が計算される。そして、そのアミノ酸配列が、質量分析結果（例えばＭＳ2スペクトル結果）から推定されるアミノ酸配列と照合される（図１１（ｂ）参照）。このとき、元のタンパク質のアミノ酸配列の末端部分以外については、実測結果によるアミノ酸配列に対応した計算上のアミノ酸配列が存在し、それらペプチドはそれぞれ同定される。ところが、上述の通り、実際のタンパク質ではＮ末端におけるシグナルペプチドの脱落やＣ末端における数個程度のアミノ酸残基の脱落が生じているため、末端部分のペプチド断片のアミノ酸配列はｃＤＮＡに基づくデータベース由来の計算上のアミノ酸配列とは通常一致しない。その結果、図１１（ｃ）に示すように、ＭＳ／ＭＳイオンサーチではタンパク質の末端部分のアミノ酸配列を決定することができない。
【００１０】
こうしたことから、従来一般的に、ｃＤＮＡに基づくデータベースを使用する場合には、検索条件の中の一つの酵素選択条件において「None」が指定される。上述したように、或る酵素が酵素選択条件として指定されると、該酵素により特異的に切断された結果得られるアミノ酸配列についてデータベースとの照合が実施される。
【００１１】
これに対し、酵素選択条件として「None」が指定されると、図１２（ｂ）に示すように、データベース中のそれぞれのタンパク質のアミノ酸配列について、任意の２箇所で切断されたアミノ酸配列全てに対してデータベース照合が実施される。実際のタンパク質の末端アミノ酸配列がｃＤＮＡに基づくデータベース中の或るタンパク質の末端部分のアミノ酸配列と一致することは殆どないが、該ｃＤＮＡに基づくデータベース中の或るタンパク質のアミノ酸配列の一部分とは多くの場合、一致する。そのため、図１２（ｃ）に示すように、酵素選択条件として「None」を指定することで、タンパク質の末端部分のアミノ酸配列も決定することが可能となり、それによって該タンパク質を同定することができる。
【００１２】
しかしながら、こうしたタンパク質の同定手法には次のような問題がある。
即ち、ｃＤＮＡに基づくデータベースには膨大な数のタンパク質が収録されているうえ、タンパク質の長いアミノ酸配列の中の任意の２箇所で切断することで生成されるアミノ酸配列の数は非常に多い。そのため、この場合、データベース照合の対象となるアミノ酸配列の数はかなり膨大なものとなる。ＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、同定結果の信頼性を示す指標値として、誤同定が生じる度合いを表す「Expectation Value」（以下、本明細書中ではこのExpectation Valueを誤同定予測値という）が出力されるが、その値は照合を必要とするデータベースのサイズに依存し、データベースのサイズが大きいほど誤同定予測値は悪化する。そのため、上述したように酵素選択条件として「None」を指定した結果、照合すべきアミノ酸配列の数が膨大になると、それによって誤同定予測値が悪化してしまい、信頼性の高い同定が行えないという問題がある。
【００１３】
図１３は、酵素選択条件として「None」を指定してＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行した場合と酵素選択条件として「Trypsin」を指定してＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行した場合とにおける、同定結果である誤同定予測値を比較した図である。図１３で「Trypsin」に対応する横バーが描かれていないのは、同定ができなかったことを意味している。この図を見ると、酵素選択条件として「None」を指定するとＮ末端ペプチドのアミノ酸配列の同定は可能となるものの、Ｎ末端以外での誤同定予測値は、酵素選択条件として「Trypsin」を指定した場合に比べて確実に悪化している（大きくなっている）ことが分かる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「サーチング・アンインタープリテッド・MS/MS・データ（Searching uninterpreted MS/MS data）」、[online]、英国マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２６年２月４日検索]、インターネット＜URL: http://www.matrixscience.com/help/mis_help.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、ｃＤＮＡに基づくデータベースを利用したＭＳ／ＭＳイオンサーチなどのデータベース検索により目的のタンパク質のアミノ酸配列を推定する場合に、実際のタンパク質では一部が除去されてしまっていることが多い末端部分のアミノ酸配列をも的確に決定することができるとともに、末端部分以外のアミノ酸配列も高い確度で以て推定することができるタンパク質のアミノ酸配列決定方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために成された本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第１の態様は、目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定方法において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基の位置Ｓが、１≦Ｓ≦ｐ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＮ末端アミノ酸残基をｐ番目とする）であるアミノ酸配列からなる、既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて、各既知タンパク質についてＮ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を抽出し、その所定長さのアミノ酸配列中のアミノ酸残基をＮ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列を求め、該アミノ酸配列によりＮ末端配列データベースを作成するＮ末端配列データベース作成ステップと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｎ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１７】
上記課題を解決するために成された本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第２の態様は、目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定方法において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基の位置Ｙが、ｑ≦Ｙ≦Ｌ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＣ末端アミノ酸残基をｑ番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の終止コドンの５’上流側に隣接するコドンに対応するアミノ酸残基をＬ番目とする）であるアミノ酸配列からなる、既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて、各既知タンパク質についてＣ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を抽出し、その所定長さのアミノ酸配列中のアミノ酸残基をＣ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列を求め、該アミノ酸配列によりＣ末端配列データベースを作成するＣ末端配列データベース作成ステップと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｃ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１８】
また上記課題を解決するために成された本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定装置の第１の態様は、上記本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第１の態様を具現化するための装置であり、目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定装置において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基の位置Ｓが、１≦Ｓ≦ｐ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＮ末端アミノ酸残基をｐ番目とする）であるアミノ酸配列からなる既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて作成された、各既知タンパク質についてＮ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中の、アミノ酸残基をＮ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列が収録されているＮ末端配列データベースと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｎ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索部と、
を備えることを特徴としている。
【００１９】
また上記課題を解決するために成された本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定装置の第２の態様は、上記本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第２の態様を具現化するための装置であり、目的タンパク質由来のペプチド混合物を質量分析することで得られたマススペクトル情報に基づくデータベース検索を行うことにより、前記目的タンパク質のアミノ酸配列を決定する又は該アミノ酸配列を決定するための情報を提供するタンパク質のアミノ酸配列決定装置において、
a)既知のタンパク質のアミノ酸配列が収録されるデータベースであって、各既知タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸残基の位置Ｙが、ｑ≦Ｙ≦Ｌ（但し、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基を１番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＣ末端アミノ酸残基をｑ番目、当該既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の終止コドンの５’上流側に隣接するコドンに対応するアミノ酸残基をＬ番目とする）であるアミノ酸配列からなる、既知のタンパク質のデータベースから得られるアミノ酸配列情報に基づいて作成された、各既知タンパク質についてＣ末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中の、アミノ酸残基をＣ末端側の最末端から順に除去した前記所定長さ以下の長さの末端近傍アミノ酸配列が収録されているＣ末端配列データベースと、
b)目的タンパク質由来の前記マススペクトル情報を、前記Ｃ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、前記目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するデータベース検索部と、
を備えることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第１の態様及び本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定装置の第１の態様はＮ末端部分のアミノ酸配列を決定するものであり、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第２の態様及び本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定装置の第２の態様はＣ末端部分のアミノ酸配列を決定するものである。
【００２１】
本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法及び装置において、上記既知のタンパク質データベースは例えばゲノムデータに基づいて作成されたタンパク質データベース、より詳しくは、ゲノムデータの１種である相補的ＤＮＡに基づいて作成されたデータベースや核酸情報の網羅的解析に基づいて作成されたデータベースなどとすることができる。こうしたタンパク質データベースには、生体中でしばしば起こるシグナルペプチドの脱落が考慮されない（反映されない）アミノ酸配列、つまり、実質上、理論的であるタンパク質のアミノ酸配列、が収録されている。このため、上記タンパク質データベースでは、タンパク質の末端部分のアミノ酸残基がＲＮＡの塩基配列に基づく最末端まで揃っている。ただし、両末端部分のアミノ酸残基が共にＲＮＡの塩基配列に基づく最末端まで揃っている必要はなく、アミノ酸配列を決定したい側の末端部分のアミノ酸残基がＲＮＡの塩基配列に基づく最末端まで揃っていれば十分である。
【００２２】
また、上記既知のタンパク質データベースとしては、エドマン分解、質量分析などを利用して、タンパク質のアミノ酸配列を直接的に計測することで構築したタンパク質データベースを用いることもできる。特に、大腸菌など原核生物により生合成されたタンパク質に基づいて作成されたデータベースの場合、真核生物により生合成されるタンパク質において起こる翻訳後のＮ末端のシグナルペプチドの切断等の翻訳後修飾が起きないため、真核生物により生合成されるタンパク質の末端よりも長い場合がある。
【００２３】
本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第１の態様では、Ｎ末端配列データベース作成ステップにおいて、また本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の第２の態様では、Ｃ末端配列データベース作成ステップにおいて、上述した既知のタンパク質データベースに収録されているタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、各タンパク質のＮ末端又はＣ末端部分の最末端から所定長さのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が抽出される。このときの「所定長さ」はデータベース検索ステップで用いられる検索手法に依存する。
【００２４】
具体的には、ＭＳn分析で得られるプロダクトイオン情報を対象とするＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いる場合には、Ｎ末端、Ｃ末端などの末端部分を含む末端ペプチドのアミノ酸配列が推定できさえすればよい。そのため、上記「所定長さ」は脱落するシグナルペプチドの長さ以上であればよい。実際には、シグナルペプチドの全てが解明されているわけではないので、想定されるシグナルペプチドの長さ（概ね３５個以下のアミノ酸残基）に対し所定のマージンを見込んだ長さを予め定めておけばよい。もちろん、３５個を超えるアミノ酸残基長のシグナルペプチドの存在も確認されているので、上記「所定長さ」をより長く定めるようにしてもよい。
【００２５】
これに対し、衝突誘起解離等による開裂を生じていないＭＳ1イオンのみを用いた質量分析で得られるイオン情報を対象とするペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を用いる場合には、Ｎ末端、Ｃ末端などの末端部分だけでなく末端部分以外のアミノ酸配列も含むようなアミノ酸配列でないと検索が行えない。そのため、上記「所定長さ」を例えばタンパク質の全長、又は全長よりも所定数だけ短い（ただし、ＰＭＦのために十分な長さである）アミノ酸配列長とするとよい。
【００２６】
いずれにしても、Ｎ末端配列データベース作成ステップ又はＣ末端配列データベース作成ステップでは、或る１種類のタンパク質に対する最末端のアミノ酸残基を含む所定長さのアミノ酸配列について、該最末端から順に１個ずつアミノ酸残基を除去して得られる複数の末端近傍アミノ酸配列を求め、これを例えばタンパク質に対応付けてデータベース化する。例えば最末端からＮ番目までのアミノ酸残基を最大限除去するものとすると、１種類のタンパク質あたりＮ種類の、長さが異なる末端近傍アミノ酸配列が得られることになる。これは、生体中で起こるタンパク質末端部分のシグナルペプチドの脱落を模擬して得られるアミノ酸配列であると捉えることができる。
【００２７】
データベース検索ステップにおいては、目的タンパク質由来のマススペクトル情報を、上記Ｎ末端配列データベース又はＣ末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列又は該配列から求まる情報と照合することにより、目的タンパク質におけるＮ末端側又はＣ末端側の末端部分のアミノ酸配列を推定する。なお、ここで「アミノ酸配列から求まる情報」とは、例えば末端近傍アミノ酸配列を指定された酵素に特有の位置で切断して得られる断片に対応するイオン情報又はプロダクトイオン情報（典型的には質量電荷比値）である。前述したように、末端近傍アミノ酸配列は最末端からアミノ酸残基を擬似的に除去することで生成されたアミノ酸配列であるから、実測された目的タンパク質において脱落しているシグナルペプチド自体は不明であっても、その目的タンパク質における一方の末端側の末端部分のアミノ酸配列又は末端部分を含むアミノ酸配列に該当するアミノ酸配列はＮ末端配列データベース又はＣ末端配列データベース中に収録されている可能性が極めて高い。これにより、データベース検索ステップでは、従来の手法では同定が困難であった目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を高い確度で推定することができる。
【００２８】
このようにして、少なくとも一方の末端部分のアミノ酸配列が推定されれば、それを利用してタンパク質全体のアミノ酸配列を推定したり、或いは、分析者自身がアミノ酸配列を推定するために有益な情報を提示したりすることができる。
【００２９】
上述したように、データベース検索にはＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いる場合とＰＭＦを用いる場合とが考えられる。
即ち、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の一態様では、
前記マススペクトル情報はｎが２以上の整数であるＭＳn分析結果に基づくプロダクトイオン情報であり、
前記データベース検索ステップは、ＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いて、前記プロダクトイオン情報を前記末端配列データベースに収録されているそれぞれのアミノ酸配列から求まるプロダクトイオン情報と照合することにより目的タンパク質の末端部分のアミノ酸配列を推定するものとすることができる。
【００３０】
また、本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法の他の態様では、
前記所定の長さはタンパク質の全長であり、前記マススペクトル情報はＭＳ1イオンのみを用いた質量分析結果に基づくイオン情報であり、
前記データベース検索ステップは、ペプチドマスフィンガープリンティングを用いて、前記イオン情報を前記末端配列データベースに収録されているそれぞれのアミノ酸配列から求まるイオン情報と照合することにより目的タンパク質の末端部分を含むアミノ酸配列を推定するものとすることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法及び装置によれば、実際のタンパク質では除去されてしまっていることが多いシグナルペプチドが脱落した末端部分のアミノ酸配列も高い確度で以て決定することができる。また、酵素検索条件として「None」を指定したＭＳ／ＭＳイオンサーチなどの従来手法に比べると、データベース照合の対象であるアミノ酸配列の数を減らすことができるので、末端部分以外のペプチドのアミノ酸配列の推定の信頼度も高めることができる。それにより、目的タンパク質のアミノ酸配列の推定、つまりは目的タンパク質の同定の正確性も向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法を実施するための第１実施例であるタンパク質同定システムの全体構成図。
【図２】第１実施例のタンパク質同定システムにおいてＮ末端配列データベースに収録されるアミノ酸配列の一例を示す図。
【図３】第１実施例のタンパク質同定システムにおいてタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の処理手順の説明図。
【図４】第１実施例のタンパク質同定システムにおいてタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の、マスコットの検索条件設定画面（ａ）及びその検索結果（ｂ）の一例を示す図。
【図５】第１実施例のタンパク質同定システムにおいて、Ｎ末端配列データベースとSwiss-Protとを用いてＡＧＰ由来の１０種類の糖ペプチドに対しそれぞれＭＳ／ＭＳイオンサーチを実施した際に得られた誤同定予測値の比較を示す図。
【図６】本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列決定方法を実施するための第２実施例であるタンパク質同定システムの全体構成図。
【図７】第２実施例のタンパク質同定システムにおいてＰＭＦ用Ｎ末端配列データベースに収録されるアミノ酸配列の一例を示す図。
【図８】第２実施例のタンパク質同定システムにおいてタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の処理手順の説明図。
【図９】Ｎ末端配列データベースを用いてペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法によりタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の、マスコットの検索条件設定画面（ａ）及びその検索結果（ｂ）の一例を示す図。
【図１０】第２実施例のタンパク質同定システムにおいてタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の、マスコットの検索条件設定画面（ａ）及びその検索結果（ｂ）の一例を示す図。
【図１１】ＭＳ／ＭＳイオンサーチによりタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の従来の処理手順の説明図。
【図１２】ＭＳ／ＭＳイオンサーチによりタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の従来の処理手順の説明図。
【図１３】ＭＳ／ＭＳイオンサーチの酵素選択条件として「None」を指定した場合と「Trypsin」を指定した場合とにおける誤同定予測値を比較した図。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［第１実施例］
以下、本発明に係るタンパク質のアミノ酸決定方法を実施するタンパク質同定システムの第１実施例について、添付図面を参照して説明する。
【００３４】
図１は第１実施例のタンパク質同定システムの全体構成図である。
本実施例のタンパク質同定システムは、質量分析計１、データ処理部２、入力部３、及び表示部４を備える。
【００３５】
質量分析計１は特にその構成を問わないが、高い質量精度、質量分解能が要求されるとともに、衝突誘起解離（ＣＩＤ＝Collision-Induced Dissociation）、赤外多光子吸収解離（ＩＲＭＰＤ＝InfraRed MultiPhoton Dissociation）、光誘起解離（ＰＩＤ＝Photo-Induced Dissociation）、電子捕獲解離（ＥＣＤ＝Electron Capture Dissociation）、電子伝達解離（ＥＴＤ＝Electron Transfer Dissociation）、ポストソース分解（ＰＳＤ＝Post-Source Decay）、インソース分解（ＩＳＤ＝In-Source Decay）などを伴うＭＳn分析を実行する必要があることから、イオントラップ飛行時間型質量分析計又はＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計などが好ましい。
【００３６】
データ処理部２は本発明に係るタンパク質のアミノ酸決定方法を実施するための特徴的な構成要素であり、ＭＳnスペクトルデータ収集部２０、ピーク情報抽出部２１、データベース検索部２２、同定用タンパク質データベース２３、既知情報読込部２４、末端配列データベース作成・管理部２５、末端配列データベース２６、などの機能ブロックを含む。このデータ処理部２は、例えば汎用のパーソナルコンピュータを中心に構成することができ、主要な機能は該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理用ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現されるものとすることができる。また、データベース検索部２２は、典型的には上記マスコットに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチを利用すればよいが、利用可能なデータベース検索エンジンはこれに限るものではない。
【００３７】
データ処理部２に含まれる同定用タンパク質データベース２３は、一般的にタンパク質同定に使用される任意のデータベースを用いることができる。一方、図１においてデータ処理部２の外側に置かれた参照用タンパク質データベース５はｃＤＮＡに基づくタンパク質データベースであり、例えばSwiss-Prot（UniProt）などである。もちろん、同定用タンパク質データベース２３としてｃＤＮＡに基づくタンパク質データベースを用いてもよく、ここではデータ処理部２に含まれる同定用タンパク質データベース２３もSwiss-Protであるものとする。また、参照用タンパク質データベース５としては、ｃＤＮＡに基づくタンパク質データベースではなく、次世代シーケンサなどを用いた核酸情報の網羅的解析に基づいて作成されたデータベース、さらには、エドマン分解、質量分析などを利用して、タンパク質のアミノ酸配列を直接的に計測することで構築したタンパク質データベースなどを用いてもよい。
【００３８】
本実施例のタンパク質同定システムでは、実際の解析処理に先立って、次のようにして末端配列データベース２６が構築される。即ち、既知情報読込部２４は、参照用タンパク質データベース５と同定用タンパク質データベース２３との一方又は両方からタンパク質の既知のアミノ酸配列を読み込む。このとき読み込まれるアミノ酸配列は、末端部分のシグナルペプチドが結合している状態、つまりはＲＮＡの塩基配列に基づく最末端までアミノ酸残基が揃っているアミノ酸配列である。末端配列データベース作成・管理部２５は、読み込まれたアミノ酸配列に基づいて、タンパク質の末端部分のアミノ酸配列が部分的に存在する、様々な長さの末端アミノ酸配列が収録された末端配列データベース２６を作成する。
【００３９】
図２は末端配列データベース２６に収録されるアミノ酸配列の一例である。
この例では、ｃＤＮＡに基づくタンパク質データベースから読み込まれた、シグナルペプチドを含むタンパク質全長のアミノ酸配列の中で、そのＮ末端の端部（図２中のメチオニン残基Ｍの位置）からｍ＝５０番目までのアミノ酸配列を抽出する。そして、そのｍ個のアミノ酸残基が連なったアミノ酸配列の中で、ｊを１からｍまでの全ての整数としたときの、ｊ番目からｍ番目までのアミノ酸配列全てを含むペプチドの配列リストを作成する。
【００４０】
即ち、図２に示すように、１番目から５０番目までのアミノ酸残基が存在するアミノ酸配列、２番目から５０番目までのアミノ酸残基が存在するアミノ酸配列、…、５０番目から５０番目までのアミノ酸残基が存在する（つまりは５０番目のアミノ酸残基のみが存在する）アミノ酸配列、を含む５０個のアミノ酸配列を、本発明における「末端近傍アミノ酸配列」として求め、このアミノ酸配列を新規のインデクスとし、それに合致する、つまりはそうしたアミノ酸配列を末端部分に持つタンパク質の情報、エントリ名やアクセッション番号などをデータベース化する。同様の処理を、データベース５、２３から読み込まれた全てのタンパク質について行うことで、末端配列データベース２６を構築する。換言すれば、この末端配列データベース２６は、実際のタンパク質では脱落することが多く、しかもアミノ酸配列自体は、不明であるシグナルペプチドが脱落したことを想定した末端部分のアミノ酸配列であるようなデータベースである。
【００４１】
解析対象であるタンパク質は、例えばトリプシン等適宜の消化酵素を用いた前処理によりペプチド断片に分解される。このペプチド混合物は、タンパク質の末端アミノ酸配列を含むペプチドと、内部アミノ酸配列のみを含むペプチドとが混在したものである。このペプチド断片の混合物が被検試料として質量分析計１による分析に供される。質量分析計１では、被検試料に対し質量分析を実行するとともに、それにより得られるマススペクトル中でペプチド由来の分子イオンであると推測されるイオンを抽出し、該イオンをプリカーサイオンに設定してＭＳ2分析を実行する。また、場合によっては、ｎが３以上のＭＳn分析を実行する。これらは従来の手法と同じである。
【００４２】
ＭＳnスペクトルデータ収集部２０は質量分析計１によって得られたＭＳnスペクトルデータを収集して一旦記憶する。ピーク情報抽出部２１は収集されたＭＳnスペクトルデータに基づき、例えばプリカーサイオン毎にＭＳ2スペクトル上に現れるピーク、つまりはプロダクトイオン情報（質量電荷比m/z及び信号強度）を抽出する。このプロダクトイオン情報をデータベース検索部２２に入力し、酵素消化の際に用いた酵素の種類（例えばトリプシン）を検索条件の一つである酵素選択条件として指定し、同定用タンパク質データベース２３及び末端配列データベース２６を用いたデータベース検索を実行することで、プロダクトイオン情報に該当するアミノ酸配列を推定する。
【００４３】
図３を参照して、このときの処理を説明する。図３（ａ）に示すように、ｃＤＮＡに基づくタンパク質データベースに格納されているタンパク質のアミノ酸配列は、メチオニン残基Ｍ側（Ｎ末端側）の末端端部までアミノ酸残基が揃っているのに対し、実測されるタンパク質のアミノ酸配列は同じ末端部分のシグナルペプチドが脱落している。一般に、シグナルペプチドの長さは不明であるものの、現在判明している限りでは、シグナルペプチドの多くはアミノ酸残基が３５個程度以下である。したがって、実測されたタンパク質が元のｃＤＮＡに基づくタンパク質データベースに収録されているものであれば、その実測されたタンパク質のＮ末端側の末端部分のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列は、末端配列データベース２６にほぼ収録されている（図３（ｂ）参照）。
【００４４】
そのため、データベース検索部２２が、入力されたプロダクトイオン情報を末端配列データベース２６中のアミノ酸配列から出現が予測されるプロダクトイオン情報と照合すると、殆どの場合、正解であるタンパク質を含む１乃至複数の候補が挙げられる。即ち、ＭＳ／ＭＳイオンサーチにおいて、使用するデータベースとして末端配列データベースを指定し、酵素選択条件として使用した酵素を指定した上で検索を実行させると、シグナルペプチドが含まれない（脱落した）Ｎ末端ペプチドについても、末端配列データベース２６の中で合致するアミノ酸配列のリストが得られる。
【００４５】
一方、元のタンパク質の末端部分以外のアミノ酸配列については、末端配列データベース２６ではなく通常の同定用タンパク質データベース２３を用いてアミノ酸配列の推定が可能である。これは図１１を参照して説明した従来のタンパク質同定手法と同じである。このようにして、実測されたタンパク質の末端部分は末端配列データベース２６を使用して同定され、末端部分以外の部分は通常の同定用タンパク質データベース２３を使用して同定されるので、それら結果を合わせることで、タンパク質の全長のアミノ酸配列を推定し、該タンパク質を同定することができる（図３（ｃ）参照）。こうした、それぞれのデータベース検索結果やそれらを合わせた総合的なデータベース検索結果は表示部４に出力され、これを確認した分析者が、最終的に解析対象のタンパク質のアミノ酸配列を決定し、該タンパク質を同定する。
【００４６】
次に、本実施例のタンパク質同定システムにおける特徴的なアミノ酸決定方法の効果を、実測結果に基づく実際の解析処理結果を用いて説明する。
【００４７】
図４は、末端配列データベース２６を使用してＭＳ／ＭＳイオンサーチを実施する際の、マスコットの検索条件設定画面（ａ）及びその検索結果表示画面（ｂ）の一例を示す図である。この例では、データベースとして、「NTERM_human」（独自に構築したＮ末端配列データベース）と既存のSwiss-Protとを同時に指定している。また、酵素選択条件（「Enzyme」）として、消化に使用したトリプシン（Trypsin）を指定している。この条件で以てＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行すると、ＡＧＰ（Acid GlycoProtein）由来の複数のＮ末端糖ペプチドが同定された（A1G1_HUMAN_19, A1G2_HUMAN_19）。
【００４８】
Ｎ末端配列データベースとSwiss-Protとを用いて、ＡＧＰ由来の１０種類の糖ペプチドに対しそれぞれＭＳ／ＭＳイオンサーチを実施した結果得られた誤同定予測値の比較を、図５に示す。
【００４９】
Ｎ末端配列データベースを用いることなく酵素選択条件として通常の酵素（「Tripsin」）を指定した場合には、全体的に低い誤同定予測値（つまり誤同定が少ないとの予測を示す値）で以てペプチドを同定することが可能であるものの、Ｎ末端に位置するＧＰ１及びＧＰ１*は同定されなかった。一方、Ｎ末端配列データベースを用いることなく酵素選択条件として「None」を指定してＭＳ／ＭＳイオンサーチを実施すると、酵素を指定した場合には同定されなかったＮ末端由来の糖ペプチドＧＰ１−１、ＧＰ１−１*、ＧＰ１−２、及びＧＰ１−２*がいずれも同定されるようになった。しかしながら、その反面、酵素選択条件として酵素の種類を指定した場合と比較して、誤同定予測値は１０００倍程度大きくなる（つまりは誤同定が増加する）傾向がみられた。
【００５０】
これら従来の手法に対し、上述したようなＮ末端配列データベースと通常のタンパク質データベース（Swiss-Prot）とを併用して、ＡＧＰ由来の糖ペプチドのＭＳ2スペクトルに対してＭＳ／ＭＳイオンサーチを用いると、酵素選択条件として「None」を指定した際と同様に、Ｎ末端由来の糖ペプチドＧＰ１−１、ＧＰ１−１*、ＧＰ１−２、及びＧＰ１−２*が同定された。さらに、誤同定予測値は、酵素選択条件として「None」を指定した場合と比較して、１０倍から１００倍程度改善している。これは次のような理由によると考えられる。
【００５１】
上述したように、第１実施例のタンパク質同定システムにおいて使用している末端配列データベースには、一つのタンパク質におけるＲＮＡの塩基配列に基づく末端端部からｍ番目までのアミノ酸配列について、アミノ酸残基を１個ずつ削ったものが全てリストに挙げられている。このため、図２に示したように、タンパク質１種類あたりのアミノ酸配列数の増加度合いは最大でもｍ倍である（図２の例ではｍ＝５０である）。一方、酵素選択条件として「None」を指定する場合、アミノ酸残基数がｘ個（ただしｘ＞１）であるアミノ酸配列を持つタンパク質において、（ｘ＋１）Ｘ／２個のアミノ酸配列のバリエーションが出現する。ここで、ｘはアミノ酸配列全体のアミノ酸残基数であり、必ずｍ≦ｘとなるので、ｍ≦ｘ＜（ｘ＋１）Ｘ／２、となり、酵素選択条件として「None」を指定する場合よりもＮ末端配列データベースを使用した場合のほうが、照合すべきデータベース中のアミノ酸配列数は常に少なくて済む。
【００５２】
通常、酵素選択条件として「None」を指定した場合におけるデータベースの実質的なサイズは、酵素選択条件として特定の酵素を指定した場合の数百から数千倍のサイズとなる。一方、Ｎ末端配列データベースを使用した場合のデータベースの実質的なサイズは該データベースを使用しなかった場合の数十倍のサイズで済む。このように、両者は照合する必要のあるデータベースの実質的なサイズに大きな差があるため、結果として、第１実施例のタンパク質同定システムで用いられるタンパク質同定手法における誤同定予測値は、酵素選択条件として「None」を用いた場合に比べて、大きく改善されることになる。
【００５３】
以上のように、Ｎ末端アミノ酸配列を含む糖ペプチドの同定において、第１実施例のタンパク質同定システムによるアミノ酸決定方法によれば、酵素選択条件として「None」を指定した場合に比べて十分に信頼性の高い同定結果が得られることが確認できた。
なお、図３に例示した末端配列データベース２６では、ここでアミノ酸配列を決定しようとしているＮ末端とは反対側のＣ末端側の末端部分のアミノ酸残基が、ＲＮＡの塩基配列に基づく最末端まで揃っている状態を想定しているが、そうである必要はなく、同定対象である目的タンパク質のＣ末端側端部よりも或る程度短くても同定に支障はない。
【００５４】
［第２実施例］
次に、本発明に係るタンパク質のアミノ酸決定方法を実施する第２実施例のタンパク質同定システムについて、添付図面を参照して説明する。
【００５５】
第１実施例のタンパク質同定システムで用いた末端配列データベースを使用すると、ＭＳ／ＭＳイオンサーチではタンパク質の末端部分のアミノ酸配列の同定が可能であるものの、ＭＳ／ＭＳイオンサーチとともによく用いられるペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法では帰属が行えない。これは、ＰＭＦ法ではＭＳ2分析を行わず、タンパク質の酵素消化物に対して得られるマススペクトルのピークリストをデータベースと照合してタンパク質の同定を行うため、Ｎ末端アミノ酸配列が末端部分ではない他のアミノ酸配列と共に一つのアミノ酸配列に含まれていないと、一つのタンパク質として帰属されないためである。また、酵素選択条件として「None」を指定すると、つまり具体的な酵素を指定しないと、ＰＭＦ法ではタンパク質の同定すら行えず、「Data not shown」との結果が出力されてしまう。
【００５６】
図９は第１実施例のシステムにおけるＮ末端配列データベースを用いてＰＭＦ法によりタンパク質の同定を試みたときの、マスコットの検索条件設定画面（ａ）及びその検索結果（ｂ）の一例を示す図である。
【００５７】
即ち、ＰＭＦ法の場合には、ＰＭＦ法のための専用の末端配列データベースを用いる必要がある。この第２実施例のタンパク質同定システムは、ＰＭＦ法によるタンパク質同定を行うためのシステムである。図６は第２実施例のタンパク質同定システムの全体構成図、図７は第２実施例のタンパク質同定システムにおいてＰＭＦ用Ｎ末端配列データベースに収録されるアミノ酸配列の一例を示す図、図８は第２実施例のタンパク質同定システムにおいてタンパク質のアミノ酸配列を決定する際の処理手順の説明図である。
【００５８】
図６において、図１に示した第１実施例のシステムと同一の又は相当する構成要素には同一符号を付して詳しい説明を省略する。この第２実施例のシステムにおいて、質量分析計１はＣＩＤ等によるイオン解離を実行しない一般的な飛行時間型質量分析計や四重極型質量分析計である。マススペクトルデータ収集部２７はマススペクトルデータを収集し、ピーク情報抽出部２１は該マススペクトルに現れるピークに対応するＭＳ1イオン情報を抽出する。データベース検索部２２はプロダクトイオン情報ではなく、このＭＳ1イオン情報（特に質量電荷比値）に基づくデータベース検索を実行する。
【００５９】
既知情報読込部２４は、例えばｃＤＮＡに基づく参照用タンパク質データベース５から各タンパク質のアミノ酸配列情報を読み込み、ＰＭＦ用末端配列データベース作成・管理部２８は、タンパク質毎にシグナルペプチドを含むその全長又はＣ末端側のアミノ酸配列の一部が欠けた所定長のアミノ酸配列に基づいてＰＭＦ用の末端アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を生成し、これを集めてＰＭＦ用末端配列データベース２９を作成する。
【００６０】
第１実施例における末端配列データベース２６とこの第２実施例におけるＰＭＦ用末端配列データベース２９との相違は、図２と図７とを比較すれば明らかである。即ち、第１実施例における末端配列データベース２６は、配列長が最大でｍである、タンパク質の末端部分のみのアミノ酸配列を集めたデータベースである。これに対し、この第２実施例におけるＰＭＦ用末端配列データベース２９は、配列長が最大で元のタンパク質の全長Ｘ又はＣ末端側のアミノ酸配列の一部が欠けた所定長Ｙであり、配列長の最小がＸ−ｍ又はＹ−ｍ（この例ではｍ＝３０）である、末端部分と末端以外の部分とを共に含むアミノ酸配列を集めたデータベースである。
【００６１】
図７に示した例でも、タンパク質１種類に対して生成されるアミノ酸配列の数はｍ個であり、各タンパク質について同様に配列長が相違するｍ個のアミノ酸配列が生成されてＰＭＦ用末端配列データベース２９に収録される。
【００６２】
データベース検索部２２は、このようなＰＭＦ用末端配列データベース２９を用いて、与えられたマススペクトルのピーク情報に該当するタンパク質を検索する。図８（ａ）に示すように、通常、実測されるタンパク質ではＮ末端のシグナルペプチドが脱落しているが、その脱落状態である末端部分に合致する（ただし、他方の末端部分は合致するとは限らない）アミノ酸配列はＰＭＦ用末端配列データベース２９に収録されている。そのため、図８（ｂ）に示すように、シグナルペプチドが脱落したＮ末端ペプチドも同定される。この例では、他方のＣ末端ペプチドは同定されないが、Ｎ末端ペプチドを含め、Ｃ末端ペプチド以外の殆どのペプチドが同定されていることで、元のタンパク質を高い確度で同定することができる。
【００６３】
図１０はＰＭＦ用末端配列データベース２８を使用してＰＭＦ法を実施する際の、マスコットの検索条件設定画面（ａ）及びその検索結果表示画面（ｂ）の一例を示す図である。この例では、データベースとして「PMF_human」（独自に構築したＰＭＦ用Ｎ末端配列データベース）を指定し、酵素選択条件（「Enzyme」）として、消化に使用したトリプシン（Trypsin）を指定している。この条件で以てＰＭＦを実行したところ、２種類のＮ末端のバリアントのＡＧＰがヒットした。
【００６４】
なお、ＡＧＰは、「A1AG1_Human」と「A1G2_Human」との混合物であるので、実質的には４種類のタンパク質がヒットしたことになる。この検索結果を詳細に解析すると、それぞれシグナルペプチドが脱落して残っている末端の最初のアミノ酸残基に連なるアミノ酸配列によって帰属が決定されており、シグナルペプチドの脱落を考慮しないSwiss-Protを使用した場合には帰属されないＡＧＰのＮ末端も的確に帰属されていることが判明した。こうした結果から、上述したＰＭＦ用末端配列データベースを用いることで、ＰＭＦ法でも末端ペプチドを帰属させることができ、タンパク質の同定が可能であることが確認できる。
【００６５】
なお、上記実施例において使用した末端配列データベース２６、２９はタンパク質のＮ末端側のみのアミノ酸配列を集めた又はＮ末端側のみが処理されたアミノ酸配列を集めたデータベースであるため、Ｎ末端側の脱落にしか対応していない。しかしながら、当然のことながら、Ｃ末端側についても同様の処理を行った末端配列データベースを作成することは可能であるので、それを用いることで一部のアミノ酸が脱落したＣ末端ペプチドを同定することもできる。その場合、末端配列データベースに収録されているアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸残基はＲＮＡの塩基配列に基づく最末端まで揃っていてもよいが、一部が欠けていても問題ないことは上記説明から明らかである。さらにまた、Ｎ末端側の末端配列データベースとＣ末端側の末端配列データベースとを併用し、Ｎ末端部分、Ｃ末端部分それぞれのアミノ酸配列を推定することで、同定可能なタンパク質の範囲を一層広げることができる。
【００６６】
また、上記説明では、末端配列データベース２６を作成するための参照用タンパク質データベース（例えばｃＤＮＡに基づくタンパク質データベース）５には、メチオニン残基Ｍの位置にＮ末端アミノ酸残基があるアミノ酸配列は収録されているものとしていたが、Ｎ末端アミノ酸残基は必ずしもメチオニン残基Ｍの位置になくてもよい。具体的には、収録されているアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基は、メチオニン残基Ｍの位置、つまり、既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の開始コドンに対応するアミノ酸残基の位置から、既知タンパク質をコードするｍＲＮＡ上のコーディング領域の塩基配列情報に基づき生体内に存在する状態のタンパク質のＮ末端アミノ酸残基の位置までの間のいずれにあってもよい。
【００６７】
さらにまた、上記実施例や変形例はいずれも本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００６８】
１…質量分析計
２…データ処理部
２０…ＭＳnスペクトルデータ収集部
２１…ピーク情報抽出部
２２…データベース検索部
２３…同定用タンパク質データベース
２４…既知情報読込部
２５…末端配列データベース作成・管理部
２６…末端配列データベース
２７…マススペクトルデータ収集部
２８…ＰＭＦ用末端配列データベース作成・管理部
２９…ＰＭＦ用末端配列データベース
３…入力部
４…表示部
５…参照用タンパク質データベース
【図１】
2015152556.tif 000003
【図２】
2015152556.tif 000004
【図３】
2015152556.tif 000005
【図４】
2015152556.tif 000006
【図５】
2015152556.tif 000007
【図６】
2015152556.tif 000008
【図７】
2015152556.tif 000009
【図８】
2015152556.tif 000010
【図９】
2015152556.tif 000011
【図１０】
2015152556.tif 000012
【図１１】
2015152556.tif 000013
【図１２】
2015152556.tif 000014
【図１３】
2015152556.tif 000015