(57)【要約】【課題】本発明は、これまで抗がん剤により化学療法の効果が十分に得られなかったがんにおいて、抗がん剤の作用を増強する医薬組成物を提供すること等を課題とする。【解決手段】本発明は、抗がん剤の作用を増強するために抗がん剤と併用投与される、オピオイドアンタゴニストを含む医薬組成物等を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗がん剤の作用を増強するために抗がん剤と併用投与される、オピオイドアンタゴニストを含む医薬組成物。
【請求項２】
抗がん剤とオピオイドアンタゴニストとを含む医薬組成物。
【請求項３】
前記オピオイドアンタゴニストがＯＧＦ受容体アンタゴニストである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＯＧＦ受容体アンタゴニストがＯＧＦＲアンタゴニスト又はＯＧＦＲＬ１アンタゴニストである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記オピオイドアンタゴニストが、メチルナルトレキソン、ナルトレキソン、ナロキソン、及びメチルナロキソンからなる群より選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＥＮＫ遺伝子、ＯＧＦＲ遺伝子、及びＯＧＦＲＬ１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進しているがんの治療に用いられる、請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
びまん性に浸潤する低分化型がんの治療に用いられる、請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗がん剤が、タキサン系抗がん剤又はプラチナ製剤である、請求項１から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
抗がん剤と、オピオイドアンタゴニストとを含むがん治療用キット。
【請求項１０】
抗がん剤とオピオイドアンタゴニストの併用の有効性を判定するための診断薬であって、ＰＥＮＫ遺伝子、ＯＧＦＲ遺伝子、ＯＧＦＲＬ１遺伝子、及びこれらの遺伝子産物からなる群より選択される少なくとも一つを測定可能な診断薬。
【請求項１１】
請求項１０に記載の診断薬を含む、抗がん剤とオピオイドアンタゴニストの併用の有効性を判定するための診断用キット。
【請求項１２】
がん幹細胞に対する抗がん剤の作用を増強する抗がん作用増強剤のスクリーニング方法であって、
がん幹細胞において発現が亢進している遺伝子であって、且つ細胞増殖を抑制する遺伝子を選択する工程と、
前記遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質に拮抗作用を有する物質を選択する工程と、
抗がん剤と前記物質とを対象に併用投与して、抗がん剤の効果が増強されるか否か調べる工程と、
を含む方法。
【請求項１３】
オピオイドアンタゴニストを含む、静止状態にあるがん細胞を増殖期に誘導するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん剤の作用を増強するために抗がん剤と併用投与する医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの化学療法の大きな障害の一つは、静止状態のがん細胞に抗がん剤が効かないことである。抗がん剤は、分裂している細胞又は分裂サイクルに入っている細胞のみ攻撃し、静止状態の細胞には作用しないものが多いが、がん細胞は、抗がん剤処理で静止状態に入ることが知られており、これによって抗がん剤の効果が低下する。
一方、近年、がんの組織中に、「がん幹細胞」と呼ばれる細胞集団が存在することが明らかになってきた。がん幹細胞についてはこれまで、転移能を有すること（正常組織幹細胞のように留まらない）、分化能を有すること（末端分化はしなくとも、more differentiated derivativesを産生する）、可塑性（がん娘細胞からがん幹細胞への逆分化：Stemness induction）を有しうること、腫瘍形成能が強いこと、抗がん剤耐性を有すること、栄養飢餓・酸素欠乏に強いことなどが報告されている（非特許文献１、２）。
この中で、抗がん剤耐性については、がん幹細胞が細胞周期の休止期（G0期）にあること、及び薬剤排出能をもつABC（ATP-binding cassette）トランスポーターが高発現していることが原因とされている。がん幹細胞を標的とした治療を行うためには、がん幹細胞特異的な抗体を使用する方法も考えられるが、抗体医薬は依然として患者の経済的負担が大きい。
また、慢性骨髄性白血病において、亜ヒ酸はがん抑制遺伝子PMLの発現を抑制することによって静止状態の白血病幹細胞の再増殖を促し、抗がん剤の効果を高めたことが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、固形腫瘍において同様の効果が得られたとの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００９−５３３４８２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gupta, PB. et al., Nature med, 2009 September 15: 1010-1012
【非特許文献２】Ishii, H. et al., Cancer Sci, 2008 October 99: 1871-1877
【非特許文献３】Ito, K. et al., Nature, 2008 June 19: 1072-1078
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のとおり、がんの中には抗がん剤による効果が十分に得られないものがある。
本発明は、これまで抗がん剤により化学療法の効果が十分に得られなかったがんにおいて、抗がん剤の作用を増強する医薬組成物を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ね、抗がん剤処理されたがん細胞やがん幹細胞において、細胞の増殖を抑制する因子の機能を阻害すれば、細胞が分裂サイクルに入り、抗がん剤の効果が発揮されるとの仮説を立てた。
そして、がん幹細胞の網羅的な遺伝子発現プロファイルを解析したところ、がん幹細胞において発現が亢進し、且つ細胞増殖を抑制する受容体としてオピオイド増殖因子（Opioid growth factor：OGF、メチオニンエンケファリン）受容体のOGFRL1を同定した。そのファミリー受容体をコードするOGFR遺伝子の発現はこのがん幹細胞のみならずその娘がん細胞でも認められた。そこで、これらの受容体の拮抗剤であるメチルナルトレキソンと既存の抗がん剤を併用投与したところ、仮説のとおり抗がん剤の作用が増強されることをin vitro及びin vivoにおいて確認した。
さらに、ある種のがんでは、OGFをコードするPENK遺伝子の発現が亢進していることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕抗がん剤の作用を増強するために抗がん剤と併用投与される、オピオイドアンタゴニストを含む医薬組成物；
〔２〕抗がん剤とオピオイドアンタゴニストとを含む医薬組成物；
〔３〕前記オピオイドアンタゴニストがＯＧＦ受容体アンタゴニストである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の医薬組成物；
〔４〕前記ＯＧＦ受容体アンタゴニストがＯＧＦＲアンタゴニスト又はＯＧＦＲＬ１アンタゴニストである、上記〔３〕に記載の医薬組成物；
〔５〕前記オピオイドアンタゴニストが、メチルナルトレキソン、ナルトレキソン、ナロキソン、及びメチルナロキソンからなる群より選択される、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；
〔６〕ＰＥＮＫ遺伝子、ＯＧＦＲ遺伝子、及びＯＧＦＲＬ１遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進しているがんの治療に用いられる、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；
〔７〕びまん性に浸潤する低分化型がんの治療に用いられる、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；
〔８〕前記抗がん剤が、タキサン系抗がん剤又はプラチナ製剤である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；
〔９〕抗がん剤と、オピオイドアンタゴニストとを含むがん治療用キット；
〔１０〕抗がん剤とオピオイドアンタゴニストの併用の有効性を判定するための診断薬であって、ＰＥＮＫ遺伝子、ＯＧＦＲ遺伝子、ＯＧＦＲＬ１遺伝子、及びこれらの遺伝子産物からなる群より選択される少なくとも一つを測定可能な診断薬；
〔１１〕上記〔１０〕に記載の診断薬を含む、抗がん剤とオピオイドアンタゴニストの併用の有効性を判定するための診断用キット；
〔１２〕がん幹細胞に対する抗がん剤の作用を増強する抗がん作用増強剤のスクリーニング方法であって、がん幹細胞において発現が亢進している遺伝子であって、且つ細胞増殖を抑制する遺伝子を選択する工程と、前記遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質に拮抗作用を有する物質を選択する工程と、抗がん剤と前記物質とを対象に併用投与して、抗がん剤の効果が増強されるか否か調べる工程と、を含む方法；及び
〔１３〕オピオイドアンタゴニストを含む、静止状態にあるがん細胞を増殖期に誘導するための医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の医薬組成物によれば、抗がん剤の投与により静止状態に入ったがん細胞や、がん幹細胞においても、抗がん剤の効果を得ることが可能となる。また、本発明の医薬組成物は、いわゆるスキルスがんなど、難治性のがんにも有効である。
本発明の診断薬によれば、本発明の医薬組成物が有効ながんを事前に判定することができる。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、抗がん剤の投与により静止状態に入ったがん細胞やがん幹細胞において、抗がん剤の効果を増強できる物質を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、OGF、OGFの核内受容体（OGFR及びOGFRL1）、細胞膜上のオピオイド受容体（μ-オピオイド受容体（OPRM1）、δ-オピオイド受容体（OPRD1）及びκ-オピオイド受容体（OPRK1））の細胞内局在を示す概念図である。
【図２】図２は、低分化型胃癌細胞株HSC60、その高腹膜転移細胞亜株60As6、及び60As6細胞の腹腔内移植腫瘍（Ａ）ならびにCXCR4陽性細胞（がん幹細胞）分画と陰性細胞（非がん幹細胞）分画（Ｂ）における遺伝子発現を測定した結果を示す。
【図３】図３は、OGFとその拮抗薬であるメチルナルトレキソン（Methylnaltrexone：Me-NTX）の60As6細胞に対するin vitro抗腫瘍効果を調べた結果である。
【図４】図４は、ドセタキセル（Docetaxel：Doc）とメチルナルトレキソンの60As6細胞に対するin vitro 抗腫瘍効果を調べた結果である。
【図５】図５は、ドセタキセルによるOGF核内受容体の発現誘導の効果をreal-time RT-PCR法で調べた結果である。
【図６】図６は、60As6細胞を移植した胃癌腹膜播種モデルマウスに対するドセタキセルとメチルナルトレキソンの併用の効果を調べた結果である。
【図７】図７は、分化型及び低分化型胃癌組織におけるPENK、OGFRおよびOGFRL1の遺伝子発現をRT-PCR法で調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔抗がん剤の作用を増強する医薬組成物〕
本発明の医薬組成物は、オピオイドアンタゴニストを含み、抗がん剤の作用を増強するための抗がん剤と併用投与されることを特徴とする。
本明細書において「オピオイドアンタゴニスト」とは、オピオイド受容体の少なくとも一つに結合し、本来のリガンドであるオピオイド化合物との結合を阻害することによって、オピオイド受容体によるシグナル伝達を介した細胞増殖抑制を抑制するものをいう。
本明細書において「オピオイド受容体」とは、細胞膜上のμ-オピオイド受容体（OPRM1）、δ-オピオイド受容体（OPRD1）及びκ-オピオイド受容体（OPRK1）と、核内受容体であるOGFR及びOGFRL1を意味する。
【００１０】
本発明の医薬組成物に用いられるオピオイドアンタゴニストは、OGF受容体アンタゴニストであってもよい。
本明細書において「OGF受容体」とは、OGF（オピオイド増殖因子）の受容体を意味する。図１に示されるとおり、OGFは、OGFR及びOGFRL1に加え、OPRM1及びOPRD1にも結合する。したがって、「OGF受容体アンタゴニスト」は、これらの4つの受容体の少なくとも1つと、本来のリガンドであるOGFとの結合を阻害することにより、細胞増殖抑制を抑制するものを意味する。
【００１１】
本発明者らは、これまでに、胃癌のうち腹膜再発の頻度の高い低分化型胃癌のがん幹細胞を同定した（第７０回日本癌学会学術総会要旨集ｐ２２８、藤田剛ら「びまん性胃癌における癌幹細胞の特性とその同定」）。
今般、本発明者らは、このがん幹細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルを解析し、細胞増殖を抑制することが知られているOGFRL1遺伝子の発現が亢進していることを見出した。
さらに、後述する実施例に示されるとおり、オピオイドアンタゴニストとして知られるメチルナルトレキソンを投与すると、静止状態にあるがん細胞を増殖期に誘導することにより、抗がん剤の効果を増強できることを確認した。
【００１２】
本発明の医薬組成物に用いられるオピオイドアンタゴニストは、例えば、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等から選択することができる。オピオイドアンタゴニストの例としては、ナルトレキソン、メチルナルトレキソン、ナロキソン、メチルナロキソンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
本明細書において「メチルナルトレキソン」とは、ナルトレキソンにメチル基を付加したものであって、本発明の医薬組成物に用いる場合、その薬学的に許容可能な塩であってもよい。メチルナルトレキソンの塩としては、臭化物塩、塩化物塩、ヨウ化物塩、炭酸塩および硫酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。
メチルナルトレキソンは、オピオイドアンタゴニストとして知られている。モルヒネなどのオピオイドは疼痛軽減のために処方され、脳や脊髄の受容体に作用して鎮痛作用や多幸感を与える。一方、末梢に局在する受容体に作用すると、消化管運動抑制作用、肛門括約筋収縮、膀胱括約筋や排尿筋の緊張増強を生じ、重篤な便秘や排尿障害などの副作用を引き起こす。メチルナルトレキソンは、末梢でモルヒネなどのオピオイドの受容体への結合を遮断することによって、オピオイド誘発性副作用を軽減する。しかも、血液脳関門を通過しないため、神経系でのモルヒネの鎮痛効果は阻害せず、非常に有効性が高い。また、メチルナルトレキソン自体の副作用もほとんど見られない。
【００１４】
なお、メチルナルトレキソンについては、内皮細胞増殖及び内皮細胞遊走を減弱することの報告がある（特許文献１）。特許文献１には、メチルナルトレキソンが単独で細胞増殖阻害効果を示したこと、また、ヒト結腸直腸癌株化細胞、ヒト乳癌細胞、非小細胞肺癌細胞に対して抗がん剤と併用投与したところ、相加的に増殖抑制効果を示したことが記載されている。しかしながら、後述する実施例に示されるとおり、本願発明者らの実験によればメチルナルトレキソンは単独では細胞増殖抑制効果を示さず、抗がん剤の効果によって静止期に入った細胞やがん幹細胞を増殖期に誘導することによって、抗がん剤の効果を増強するものである。
【００１５】
本明細書において、「抗がん剤」は、公知のあらゆる抗がん剤を含み特に限定されないが、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、ホルモン剤、生物学的製剤、分子標的薬等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチン、チオテパ等が挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、５−フルオロウラシル、リン酸フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、チオグアニン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシウレア、６−メルカプトプリン等が挙げられる。微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン等のアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗腫瘍抗生物質としては、例えば、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマー等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としてはトポイソメラーゼＩ阻害作用を有するＣＰＴ−１１、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼＩＩ阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンが挙げられる。白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等が挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン等が挙げられる。生物学的製剤としては、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、インターロイキン２、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ等が挙げられる。分子標的薬としては、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、トシツズマブ、ボルテゾミブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、テムシロリムス、タミバロテン、トレチノイン等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、抗がん剤の中でも特に細胞が静止期に入ると効果が低下するものに有効である。
【００１６】
本明細書において「抗がん剤の作用」は、その最も広い意味で用いられるが、例えば、in vitro又はin vivoにおいて、腫瘍サイズの低下、腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、延命、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせる作用を意味する。したがって、「抗がん剤の作用を増強するために抗がん剤と併用投与される」とは、これらの作用の少なくとも１つが、オピオイドアンタゴニストと併用した場合に、抗がん剤単独で用いた場合よりも強く発揮されることを意味する。in vitro又はin vivoにおける上記作用は、公知の方法によって測定することができる。
【００１７】
本明細書において「併用」とは、併用による効果が得られる投与の仕方であれば、投与量、投与方法、投与時期等は特に限定されず、治療目的や疾患、投与対象、製剤中の有効成分の量等によって適宜選択することができる。抗がん剤とオピオイドアンタゴニストを同時に投与してもよいし、いずれか一方を先に投与してもよい。また、少なくとも一方を繰り返し投与してもよく、それぞれの投与頻度が異なっていてもよい。
【００１８】
本明細書において「発現」は、ゲノムDNAを鋳型としてmRNAが合成される転写と、mRNAの情報に基づいてポリペプチドが合成される翻訳の両方を含む概念として用いられる。また、「遺伝子産物」は、mRNA及びタンパク質の両方を含む概念として用いられる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、あらゆるがんを対象とすることができる。対象となるがんとしては、例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、PENK遺伝子の発現が亢進しているがんの治療に用いてもよい。PENK遺伝子は、OGFタンパク質をコードする遺伝子である。
腫瘍組織におけるこの遺伝子の発現の上昇は、公知の方法又はそれに順ずる方法で、mRNAレベル又はタンパク質レベルで測定することが可能である。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、びまん性に浸潤する低分化型がんやスキルスがんの治療に用いてもよい。びまん性低分化型がんは、diffuse型がんとも呼ばれ、間質が多いがんであり病変が表面に現れず、発見が遅れることも多い。スキルスがんは、このタイプのがんの１つで、結合組織が蓄積して組織が硬化する線維化を伴うがんである。これらは胃癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌などで見られる。
本発明者らは、後述する実施例に示されるとおり、このようながんにおいては、分化型がんに比べ、PENK遺伝子の発現が高いことを示した。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、がんを有する哺乳動物に投与される。哺乳動物は特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマが挙げられるが、特にヒトに投与されることが想定される。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、オピオイドアンタゴニストに加え、薬理学的に許容される担体と共に製剤化される。本発明の医薬組成物を製剤化する場合、オピオイドアンタゴニストと、抗がん剤を含む合剤としてもよい。かかる合剤は、治療有効量の抗がん剤と、当該抗がん剤に対する増強効果を奏する量のオピオイドアンタゴニストを含む。
製剤の形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択される。代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤、乳剤）等が挙げられる。これら製剤は、通常用いられる方法により製造すればよい。
【００２４】
本明細書において、「薬理学的に許容される担体」は、オピオイドアンタゴニストとともに投与可能な担体をいう。かかる担体としては、薬理学的及び製剤学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、賦形剤、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
また、本発明の医薬組成物に含まれるオピオイドアンタゴニストの量は、当業者が適宜決定することができる。1日あたりの投与量は、患者や疾患の重篤度、症状に応じて決定することができ、1日の投与量ごとに製剤化してもよく、また複数に分割して製剤化してもよい。
1日の投与量は例えば、経口投与では体重1kgあたり約0.01mg〜約80mg、非経口投与では体重1kgあたり約0.001mg〜約5mg、とすることができる。
また、本発明の医薬組成物は、がんの他の治療方法と組み合わせて用いられることも好ましい。
【００２６】
〔静止状態のがん細胞を増殖期に誘導するための医薬組成物〕
本発明は、オピオイドアンタゴニストを含む静止状態にあるがん細胞を増殖期に誘導する医薬組成物も含む。
本明細書において「静止状態にあるがん細胞」とは、細胞周期のうち、いわゆるG0期にある細胞をいう。静止状態となっている理由は特に限定されず、例えば抗がん剤処理に起因するものであっても、幹細胞であることに起因するものであってもよい。本明細書において「静止状態のがん細胞を増殖期に誘導する」とは、G0期にある細胞をG1期→S期→G2期→M期→G1期のサイクルで分裂を繰り返す状態になることを促すことをいう。
用語「オピオイドアンタゴニスト」及び「医薬組成物」は、抗がん剤の作用を増強する医薬組成物の項目と同義で用いられる。
【００２７】
〔治療方法〕
本発明は、抗がん剤とオピオイドアンタゴニストを治療有効量で併用投与することを含むがんの治療法も包含する。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味し、例えば、腫瘍サイズの低下、腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、延命、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを示す量を意味する。
その他の用語については、上述の医薬組成物について用いられた用語と同義であるため、ここでは説明を省略する。
【００２８】
〔診断薬〕
本明細書において「診断薬」は、抗がん剤とオピオイドアンタゴニストとの併用の有効性を判定するための試薬であって、PENK、OGFR、及びOGFRL1の遺伝子産物の発現を測定可能なものを意味する。
例えば、病理診断で低分化型がんと診断された患者の腫瘍組織でPENK遺伝子産物（mRNAおよびOGFタンパク質）が分化型がんより強く発現し、OGFR遺伝子またはOGFRL1遺伝子の発現が認められた症例や、血液中でOGFタンパク質が健常者に比べて十分に高く検出された症例では、オピオイドアンタゴニストとの併用によって、抗がん剤の効果が増強される可能性が高いと推測される。
したがって、本明細書における診断薬は、腫瘍組織におけるPENK遺伝子産物の発現や、血液中のOGFタンパク質を検出するための試薬を含む。かかる試薬としては、例えば、mRNAをPCR法で検出するためのプライマーセット、mRNAやタンパク質をin situハイブリダイゼーションで検出するためのプローブ用核酸、免疫染色で検出するための抗体、タンパク質をイムノアッセイ（ELISA等）で検出するための抗体などを含むがこれらに限定されない。血清中のタンパク質は、例えば、Smithらの方法にしたがって測定してもよい（Smith, JP. et al., Pancreas, 2000, 21: 158-164）。
診断薬は、検出可能に標識したものであってもよい。例えば、核酸は放射性物質や蛍光物質で標識されたものでもよく、抗体は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質のいずれかで標識されたものでもよい。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体でもよい。標識は、検出方法にあわせて適宜選択される。
診断薬は固相担体に固定されていてもよい。本明細書において「固相担体」は、核酸や抗体を固定できるものであれば特に限定されず、ガラス製、金属製、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられる。診断薬は公知の方法で固相担体に固定することができる。
【００２９】
〔診断用キット〕
本明細書において、「診断用キット」は、抗がん剤とオピオイドアンタゴニストとの併用の有効性を判定するためのキットであって、PENK、OGFR、及びOGFRL1の遺伝子産物の発現を測定可能なものを意味する。
診断用キットは、上述した診断薬のほか、固相担体、各種標識、二次抗体、TaqポリメラーゼなどのPCR用試薬、マイクロタイタープレート、チューブ、各種緩衝液、検出用酵素、酵素反応停止液、マイクロリーダー、使用説明書などを含んでいてもよい。
【００３０】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、がん幹細胞に対する抗がん剤の作用を増強する抗がん作用増強剤のスクリーニング方法も包含する。かかるスクリーニング方法は、がん幹細胞において発現が亢進している遺伝子であって、且つ細胞増殖を抑制する遺伝子を選択する工程と、その遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質に拮抗作用を有する物質を選択する工程と、抗がん剤と前記物質とを対象に併用投与して、抗がん剤の効果が増強されるか否か調べる工程と、を含む。
がん幹細胞は、どのような種類のものを用いてもよい。がん幹細胞は、脳腫瘍、肺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌等種々のがん組織で確認されており、がん幹細胞マーカー（例えば、CD133、ESA、CDD44、ALDH1、CD90等）の発現を検出して単離・培養することができる。
がん幹細胞における遺伝子発現は、公知の方法又はそれに順ずる方法で測定することが可能であるが、網羅的な発現プロファイルを得られる方法、例えばDNAマイクロアレイを用いる方法が好適である。
得られた発現プロファイルに基づいて、がん幹細胞において発現が亢進し、且つ細胞増殖を抑制する遺伝子を選択する工程、及びその遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質に拮抗作用を有する物質を選択する工程は、公知のデータベースを使用して行うことができる。遺伝子又は遺伝子がコードするタンパク質に拮抗作用を有する物質は、低分子化合物、高分子化合物、核酸、タンパク質等、どのような物質であってもよい。遺伝子の塩基配列に基づいて作製される核酸（siRNA、アンチセンス、リボザイム）や、抗体を用いてもよい。
【００３１】
抗がん剤と選択された物質とを対象に投与して、抗がん剤の効果が増強されるか否かを調べる工程に用いられる「対象」は、例えば、がん幹細胞その他抗がん剤単独では抗がん作用を得られない細胞や組織、マウス等のモデル動物とすることができる。
細胞や組織を用いる場合には、これらを適当な方法で培養し、抗がん剤と上記物質を培地に投与する。モデル動物とする場合には、抗がん剤と上記物質をそれぞれの性質に合わせた投与方法で適宜投与すればよい。
抗がん剤の効果は、がん細胞の増減や死滅の速度、モデル動物中のがん組織のサイズの変化、転移の有無、延命、及びモデル動物の行動等で評価することができる。抗がん剤の効果が増強される場合、すなわち、抗がん剤単独で投与したときよりも抗がん効果が大きくなる場合、併用投与した物質を抗がん作用増強剤として選択することができる。
【００３２】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
〔１〕マイクロアレイ解析によるCXCR4陽性がん幹細胞で強く発現する細胞増殖抑制遺伝子の同定
低分化型（diffuse 型）胃癌細胞株であるHSC60をC.B17/Icr-scid マウス (クレア株式会社) の腹腔内に移植し、形成した腫瘍を10 % 仔ウシ血清、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI 1640 培地で培養し、またマウス腹腔内への移植を６回繰り返すことによって高腹膜転移細胞亜株60As6を取得した(Yanagihara K et al, Cancer Sci 96: 323-332, 2005の方法)。この高腹膜転移細胞亜株60As6から抗CXCR4抗体によるFACSによって分画したCXCR4陽性細胞と陰性細胞からRNAを抽出し、Affymetrix社の推奨する方法に従ってGeneChip U122Plus2による網羅的遺伝子発現プロファイルを得、比較の結果、CXCR4陽性がん幹細胞で強く発現する細胞増殖抑制受容体としてOGFRL1を同定した。さらに両細胞分画ともそのファミリー遺伝子であるOGFRの発現も認められた。60As6細胞のCXCR4＋、−画分は、PE標識した抗ヒトCXCR4マウスモノクローナル抗体（R&D systems）と反応させ、JSAN(ベイ バイオサイエンス株式会社)を用いて、それぞれの細胞分画を回収しISOGENを加えてtotalRNAを抽出した。
【００３５】
〔２〕胃癌細胞株と移植腫瘍におけるOGFをコードするPENK遺伝子とOGF受容体遺伝子の発現
低分化型（Diffuse type）胃癌細胞株であるHSC60をC.B17/Icr-scid マウス (クレア株式会社) の腹腔内に移植し、形成した腫瘍を10 % 仔ウシ血清、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI 1640 培地で培養し、またマウス腹腔内への移植を６回繰り返すことによって高腹膜転移細胞亜株60As6を取得した(Yanagihara K et al, Cancer Sci 96: 323-332, 2005の方法)。
親株HSC60と亜株60As6は10 % 仔ウシ血清、L-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI 1640 培地で培養し、培養液は 2-3 日ごとに交換し、80％コンフルエントまで培養した。PBS（−）で洗浄後、ISOGEN（和光純薬）を加えて細胞を回収し、totalRNAを抽出した。
また60As6細胞の移植腫瘍は、C.B17/Icr-scidマウス に60As6細胞を腹腔内注射して形成させた。細胞生着後、腫瘍を摘出しPBS(-)で洗い、ISOGENを加えてホモジナイズしtotalRNAを抽出した。さらに60As6細胞のCXCR4＋、−画分は、PE標識した抗ヒトCXCR4マウスモノクローナル抗体と反応させ、JSANを用いて、それぞれの細胞分画を回収しISOGENを加えてtotalRNAを抽出した。
各totalRNAは、first-strand cDNA synthesis kit (GE Healthcare)を用いて各々のcDNAを合成しPCRテンプレートとした。このテンプレートをAccuPrimeTM Taq DNA polymerase、AccuPrimeTM PCR buffer I（invitrogen）、RNAase free water、プライマーと混合し、GeneAmp PCR System9700で増幅した。以下に各プライマーの配列を示す。
【表１】
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【００３６】
増幅したサンプルを2％SeaKem GTG Agarose（Lonza）で電気泳動し、LAS-4000（FUJI FILM）で検出した。PENKはOGFをコードし、OGFRとOGFRL1はOGFの核内受容体、OPRM1、OPRD1、OPRK1は細胞膜上のオピオイド受容体をコードする。これらの遺伝子産物の細胞内局在は図１に示した。
【００３７】
HSC60細胞と60As6細胞、および60As6腹腔内移植腫瘍（60As6 xenograft）における各遺伝子の発現を示すRT-PCRの結果を図２に示す。培養細胞では、CXCR4、PENK、OPRD1、OPRK1などがHSC60よりも60As6細胞で優位に発現していた。PENK(OGF)の核内受容体OGFRとOGFRL1は細胞膜受容体OPRD1やOPRK1より強く発現していた。OPRM1は、HSC60、60As6、60As6 xenograftいずれでもほとんど発現していなかった。60As6腹腔内移植腫瘍でも同様の発現パターンを示し、特にPENK、OGFR、OGFRL1の発現が顕著であった（Ａ）。また60As6のがん幹細胞分画であるCXCR4陽性細胞分画とその娘細胞（非がん幹細胞）において、OGFRL1はCXCR4陰性細胞よりもCXCR4陽性がん幹細胞で発現が高かった（Ｂ）。OGFRは両細胞で発現が認められた。したがって、OGFはがん幹細胞および非がん幹細胞のいずれにも作用しうることが示された。
【００３８】
〔３〕OGFによる60As6細胞の増殖抑制効果とメチルナルトレキソン(Me-NTX)の効果
60As6細胞の増殖に対するOGFおよびその拮抗薬であるメチルナルトレキソン(Me-NTX) の効果を検討する目的で MTT assay を行った。
96 well plate に 60As6 細胞を播種し、通常培地にて1 日間培養した後に、OGF ([Met5]Enkephalin, 10-4 M) および Me-NTX (10-6 M) を含む培地に交換し、3 日間培養した。通常培地で同時間培養した細胞を対照群とした。その後、5 mg/mL に調整した MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 液を加え、4 時間反応させた。MTT 反応終了後、室温にて 3,000 x g で 10 分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、DMSO (dimethyl sulfoxide) を加えてホルマザンを溶解させ、570 nm の吸光度で測定した。
【００３９】
結果を図３に示す。OGF 処置群では、対照群と比較して有意な細胞増殖抑制作用が認められた (**p<0.01, control vs. OGF)。またこの反応は、Me-NTX の共処置により有意に抑制された (##p<0.01, OGF vs. OGF/Me-NTX)。しかしながら Me-NTX 単独処置では、対照群と比較して大きな変化は認められなかった。
【００４０】
〔４〕In vitro 細胞培養系でのMe-NTXによるドセタキセル(Doc)の抗腫瘍作用の増強効果
ドセタキセル(Doc) の抗腫瘍作用に対する Me-NTX の効果を検討する目的で細胞増殖試験を行った。6 well plate に 60As6 細胞を播種し、通常培地にて1 日間培養した後に、Doc (10-9 M) および通常培地で 2 日間培養した。その後、それぞれの well に Me-NTX (10-6 M) を添加し、さらに 2 日間培養した。薬物処置終了後、 0.25 % トリプシン/EDTA を用いて細胞を回収し、トリパンブルー染色後、細胞数を計測した。
【００４１】
結果を図４に示す。60As6 細胞に Doc を処置したところ、対照群と比較して有意な細胞増殖抑制作用が認められた (**p<0.01, control-control vs. Doc-Doc, ***p<0.001, control-control vs. Doc-Doc/Me-NTX)。また、Doc 処置の 2 日後に Me-NTX を共処置したところ、Doc 単独処置群と比較して有意な細胞増殖抑制作用の増強効果が認められた (#p<0.05, Doc-Doc vs. Doc-Doc/Me-NTX)。これらの条件下、control-Me-NTX 処置では、対照群と比較して大きな変化は認められなかった。
【００４２】
〔５〕DocによるOGF核内受容体の発現誘導効果
Doc による OGFR および OGFRL1 の遺伝子発現変化を検討する目的で、60As6 細胞 に Doc (5 x10-9 M) を 2 日間処置し、total RNA を抽出し、real-time RT PCR 法に従い検討した。cDNA は、first-strand cDNA synthesis kitに従い作製した。希釈した cDNA は、LightCycler 480 SYBER Green Master (Roche Diagnostics)、プライマーおよび DEPC 処理水と混合し、Light Cycler 2.0 (Roche Diagnostics) により増幅した。以下にプライマーの塩基配列を示す。
【表２】
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【００４３】
結果を図５に示す。対照群と比較し、Doc を処置した細胞において OGFR mRNA および OGFRL1 mRNA の有意な増加が認められた （OGFR; *p<0.05, control vs. Doc, OGFRL1; ***p<0.001, control vs. Doc）。このことは抗がん剤処理によって胃癌細胞のOGF依存的細胞増殖停止が誘導されることを示唆する。
【００４４】
〔６〕 Me-NTXによるDocの胃癌腹膜播種モデルマウスの延命効果の増強
実験には、7 週齢の C.B17/Icr-scid マウス を使用した。
60As6 細胞の腹膜播種に対する OGF シグナルの関与を明らかにする目的で腹膜播種モデルマウスを作製し、Doc、OGF および Me-NTX の腹腔内投与によるマウスの生存期間を観察した。
腫瘍の増殖過程を可視化し、観察する目的で、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した 60As6 細胞 (60As6Luc 細胞) を 10 % 仔ウシ血清、L-グルタミン、G418 を含むRPMI 1640 培地で培養し、1x106 cell をマウスの腹腔内に移植した。細胞移植後 1 週目に IVIS イメージング法に従い腹腔内にがん細胞が生着していることを確認した後、Doc (0.5 mg/kg)、Doc + OGF (10 mg/kg)、Doc + Me-NTX (0.3 mg/kg) および生理食塩水 (Saline) を 1 週間に 2 回、腹腔内投与し、生存期間を観察した。薬物投与は、急激な体重減少などの毒性反応が認められない限り継続した。
【００４５】
結果を図６に示す。Doc を投与したマウスでは、対照群と比較して有意な生存期間の延長が認められた （p<0.01, saline vs. Doc）。また、Doc 単独投与群と比較して Me-NTX と Doc との併用群では、生存期間の有意な延長 (増強効果) が認められた （p<0.01, Doc vs. Doc + Me-NTX）。逆にOGF と Doc の併用群においては、Doc 単独群で認められる生存期間延長の抑制傾向が認められた。
【００４６】
〔７〕分化型（Intestinal type）および低分化型（Diffuse type）胃癌組織におけるPENKの発現
18例の分化型（Intestinal type）および15例の低分化型（Diffuse type）胃癌組織5mgほどにISOGENを加えて、ホモジナイズし、totalRNAを抽出した。各totalRNAは、first-strand cDNA synthesis kit を用いて各々のcDNAを合成しPCRテンプレートとした。このテンプレートをAccuPrimeTM Taq DNA polymerase、AccuPrimeTM PCR buffer I、RNAase free water、プライマーと混合し、GeneAmp PCR System9700で増幅した。実施例１と同じプライマーを用いてPENK、OGFR、OGFRL1、及び陽性コントロールACTB（ベータアクチン）の遺伝子発現をRT-PCRで調べた。
【００４７】
結果を図７に示す。低分化型胃癌は、分化型胃癌より腹膜再発の頻度が高く、それが死因となる。また増殖細胞が少ないのが特徴である。増殖抑制因子として働くOGFをコードするPENKの遺伝子発現はこの低分化型胃癌で強いことが示された（図７の上段）。図７の下段に示したような病組織学的特徴に基づく診断に加え、PENKの遺伝子発現を調べることによってOGF依存的増殖抑制状態にある胃癌症例を見つけ、Me-NLXを投与する対象とできることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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