(57)【要約】【課題】本発明は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く、夾雑物を多く含む検体におけるＬ−リジンも高い正確性をもって測定が可能になるＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素と、当該酵素を用いたＬ−リジンの測定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該測定方法に用いることができるＬ−リジン測定用キットおよびＬ−リジン測定用酵素センサ、また、当該新規Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生する新規微生物を提供することも目的とする。【解決手段】本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、特定のアミノ酸配列を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来のものである請求項１に記載のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素。
【請求項３】
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７９６）由来のものである請求項１に記載のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素。
【請求項４】
下記の（１’）〜（３’）の何れかの塩基配列を有することを特徴とする核酸。
（１’）配列番号１に記載の塩基配列
（２’）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する塩基配列
（３’）配列番号１に記載の塩基配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する塩基配列。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
検体中のＬ−リジンを測定する方法であって、
（Ａ）必要に応じて、Ｌ−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該Ｌ−リジン量と下記工程（Ｄ）で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく工程；
（Ｂ）必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する工程；
（Ｃ）検体に請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を作用させる工程；および
（Ｄ）上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
上記工程（Ｃ）において、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用により生成するカダベリンをプトレシン酸化酵素により酸化し、且つ、上記工程（Ｄ）において、反応生成物である過酸化水素の量を計測する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記プトレシン酸化酵素として、コクリア  ロゼア（Ｋｏｋｕｒｉａ  ｒｏｓｅａ）ＮＢＲＣ  ３７６８株由来のものを用いる請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を含むことを特徴とするＬ−リジン測定用キット。
【請求項１０】
さらにプトレシン酸化酵素を含む請求項９に記載のＬ−リジン測定用キット。
【請求項１１】
さらに、ペルオキシダーゼと発色試薬を含む過酸化水素検出用試薬を含む請求項９または１０に記載のＬ−リジン測定用キット。
【請求項１２】
Ｌ−リジンを測定するための酵素センサであって、過酸化水素検出用電極を有し、当該過酸化水素検出用電極の表面または近傍に請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素が配置されていることを特徴とするＬ−リジン測定用酵素センサ。
【請求項１３】
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７９６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−リジンに対する基質特異性の高い新規なＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素と、その利用方法などに関する。より詳しくは、本発明は、Ｌ−リジン脱炭素活性とＬ−リジン酸化活性の両方を有し、且つ、Ｌ−リジンに対する基質特異性の高い新規なＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素、当該新規Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする核酸、並びに、当該新規Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いるＬ−リジンの測定方法、当該測定方法に用いることができるＬ−リジン測定用キットおよびＬ−リジン測定用酵素センサ、また、当該新規Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生する新規微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジンはタンパク質構成アミノ酸の一つであるが、体内で生成されない必須アミノ酸である。Ｌ−リジンを含むアミノ酸の濃度は、生体内では恒常性が維持されているが、先天性代謝異常や内臓疾患によりその血中濃度は大きく変動する。Ｌ−リジンに限らず、生体内のアミノ酸濃度の測定は、疾病を検出する有用な手段となり得る。このため、１種類もしくは多種類のアミノ酸の血中濃度を測定することにより、特定の疾病を検出することが可能となる（特許文献１および非特許文献１）。
【０００３】
近年、アミノ酸の定量法として酵素を用いる方法が多数報告されている。酵素を用いる方法は、機器分析的手法と比べ、短時間に多数のサンプルの測定が可能であり、また安価で簡易的に行うことができる利点がある。定量用酵素としては、例えば、酸化酵素や脱水素酵素が多く用いられる。酸化酵素を用いる場合、アミノ酸に酸化酵素を作用させることで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼで検出し、定量する方法が挙げられる（特許文献２）。この検出および定量には、比色法、蛍光法、電極法のいずれの方法も利用可能である。
【０００４】
Ｌ−リジンの定量法としても酵素を用いる方法が知られている。例えば、酸化酵素による定量には、Ｌ−リジンα−酸化酵素［ＥＣ１．４．３．１４］が用いられてきた。トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のＬ−リジンα−酸化酵素は、他のＬ−アミノ酸酸化酵素に比べて基質特異性が高く、市販もされていることから、酵素センサなどの素子に利用されてきた（非特許文献２，非特許文献３および非特許文献４）。しかし、本酵素は数種類の他のアミノ酸にも僅かながら作用することが報告されている。
【０００５】
また、海洋バクテリアであるマリノモナス・メディテラネア（Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）ＮＢＲＣ１０３０２８T株由来のＬ−リジンε−酸化酵素［ＥＣ１．４．３．２０］を用いたＬ−リジン定量方法も報告されている（特許文献３および非特許文献４）。この酵素は、Ｌ−リジンに加え、僅かながらＬ−オルニチンを基質とする。
【０００６】
また、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のＬ−リジンモノオキシゲナーゼ［ＥＣ１．１３．１２．２］にＬ−リジン酸化酵素活性があるという報告がある（非特許文献６および非特許文献７）。この酵素は、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニンを基質とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２９５１３号パンフレット
【特許文献２】特開昭５５−４３４０９号公報
【特許文献３】特開２０１１−４３３９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８１，ｐｐ．３０７−３１４（２００９）
【非特許文献２】Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，Ｂ，１２６，ｐｐ．４２４−４３０（２００７）
【非特許文献３】Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３９１，ｐｐ．１２５５−１２６１（２００８）
【非特許文献４】Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４０６，ｐｐ．１９−２３（２０１０）
【非特許文献５】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ＤＯＩ  １０．１００７／Ｓ００２５３−０００１３−０５１６８−００２５３（２０１３）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，ｐｐ．２５７９−２５８６（１９７４）
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，ｐｐ．２５８７−２５９２（１９７４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、様々な微生物に由来するＬ−リジン酸化酵素が知られているが、アミノ酸の中でＬ−リジンに対してのみ作用する酸化酵素はなく、Ｌ−リジン以外のアミノ酸も酸化することから、Ｌ−リジンの定量に使用した場合、例えば、特に血漿のように様々な化合物を含む検体中のＬ−リジンを正確に測定できるものではなかった。
【００１０】
そこで本発明は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く、夾雑物を多く含む検体におけるＬ−リジンも高い正確性をもって測定が可能になるＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素と、当該酵素を用いたＬ−リジンの測定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該測定方法に用いることができるＬ−リジン測定用キットおよびＬ−リジン測定用酵素センサ、また、当該新規Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生する新規微生物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高い上に、脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方を有する新規酵素を見出した。本発明者らは、当該酵素を用いれば、血漿など夾雑物を多く含む検体におけるＬ−リジンも高い正確性をもって測定できることを見出した。
【００１２】
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、下記の（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
【００１３】
上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌から、特にバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７９６）から得ることができる。
【００１４】
本発明に係る核酸は、下記の（１’）〜（３’）の何れかの塩基配列を有することを特徴とするものであり、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の製造に利用することができる。
（１’）配列番号１に記載の塩基配列
（２’）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する塩基配列
（３’）配列番号１に記載の塩基配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する塩基配列。
【００１５】
また、本発明に係る形質転換体は、上記核酸を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るＬ−リジンの測定方法は、検体中のＬ−リジンを測定する方法であって、
（Ａ）必要に応じて、Ｌ−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該Ｌ−リジン量と下記工程（Ｄ）で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく工程；
（Ｂ）必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する工程；
（Ｃ）検体に上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を作用させる工程；および
（Ｄ）上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする。
【００１７】
上記工程（Ｃ）においては、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用により生成するカダベリンをプトレシン酸化酵素により酸化し、且つ、上記工程（Ｄ）において、反応生成物である過酸化水素の量を計測することが好ましい。かかる態様により、検体中のＬ−リジンをより一層正確に測定することが可能になる。
【００１８】
上記プトレシン酸化酵素としては、コクリア  ロゼア（Ｋｏｋｕｒｉａ  ｒｏｓｅａ）ＮＢＲＣ  ３７６８株由来のものが好ましい。かかるプトレシン酸化酵素の作用効果は、本発明者らの実験により確認されている。
【００１９】
本発明に係るＬ−リジン測定用キットは、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を含むことを特徴とする。
【００２０】
当該Ｌ−リジン測定用キットとしては、さらにプトレシン酸化酵素を含むもの、また、ペルオキシダーゼと発色試薬を含む過酸化水素検出用試薬を含むものが好ましい。
【００２１】
本発明に係る酸素センサは、Ｌ−リジンを測定するための酵素センサであって、過酸化水素検出用電極を有し、当該過酸化水素検出用電極の表面または近傍に上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素が配置されていることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生するバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７９６）にも関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が非常に高い。よって、このＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いることで、他のアミノ酸など多くの夾雑物を含む検体においても、Ｌ−リジンを特異的に迅速かつ簡便に測定することが可能である。特に、血漿、血清、尿のような生体試料に対し本発明は有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統樹である。図１中のＳＩＩＤ１３５６４は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株を示す。左下の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数値はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の規準株（Ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）を示す。
【図２】図２は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株の生理・生化学性状試験の結果を表わす図である。図２（１）は結果を示し、図２（２）は試験項目の説明を示す。
【図３】図３は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株の培養曲線と、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の活性の経時的変化を表わす図である。●はＬ−リジン酸化酵素活性、■は菌株の生育曲線（ＯＤ６６０ｎｍ）、▲は培地のｐＨを示す。
【図４】図４は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株由来のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ（Ａ）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）の写真である。なお（Ｃ）は分子量マーカーを示す。
【図５】図５は、精製酵素の吸収スペクトルを表わす図である。横軸が吸収波長、縦軸が吸光度値を示している。
【図６】図６は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株由来のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の活性と安定性に対するｐＨの影響、並びに、コクリア  ロゼア（Ｋｏｋｕｒｉａ  ｒｏｓｅａ）ＮＢＲＣ  ３７６８株由来プトレシン酸化酵素の活性に対するｐＨの影響を示している。●は３０℃での各ｐＨにおけるＬ−リジン酸化酵素活性、○は各ｐＨにおいて３０℃で３０分間加温した後の残存活性、▲はプトレシン酸化酵素のカダベリン酸化酵素活性に対するｐＨの影響を示している。
【図７】図７は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株由来のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の温度による影響を示している。○は各温度でのＬ−リジン酸化酵素活性を示し、●は各温度で３０分間加温した後の残存活性を示している。
【図８】図８は、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株由来のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素と、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の塩基性アミノ酸脱炭酸酵素とのアミノ酸配列のアライメントを示している。
【図９】図９は、１．０ｍＬの反応液において、１．０ｍＭ  Ｌ−リジンを基質としてＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素添加量を変えて２０分間反応させ、比色法で５５５ｎｍの吸光度を測定した結果を示している。
【図１０】図１０は、１．０ｍＬの反応液において、０〜１．０ｍＭ  Ｌ−リジンを基質としてＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を１．３ｍＵ添加して５５５ｎｍの吸光度を測定した結果を示している。
【図１１】図１１は、１．０ｍＬの反応液において、６０μＭのカダベリンを基質としてプトレシン酸化酵素（ＰＵＯ）の添加量を変えて２０分間または３０分間反応させ、比色法で５５５ｎｍの吸光度を測定した結果を示している。
【図１２】図１２は、１．０ｍＬの反応液において、６０μＭのＬ−リジンを基質としてプトレシン酸化酵素（ＰＵＯ）量を２００ｍＵに固定して、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の添加量を変えて反応させ、比色法で５５５ｎｍの吸光度を測定した結果を示している。
【図１３】図１３は、１．０ｍＬの反応液において、濃度０〜６０μＭのリジンに対してＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素（１．５ｍＵ）とプトレシン酸化酵素（２００ｍＵ）を添加して３０分間反応させた後、比色法で５５５ｎｍの吸光度を測定した結果を示している。
【図１４】図１４は、１．０ｍＬの反応液において、６０μＭカダベリンと濃度０〜６０μＭのＬ−リジンを含む溶液に、プトレシン酸化酵素（２００ｍＵ）と発色液Ｉ（ペルオキシダーゼと４−アミノアンチピリン）を添加して反応させ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｉ）、次いで、発色液ＩＩ（ＴＯＯＳ）とＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素（２．３ｍＵ）を添加して反応させ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）、５５５ｎｍの吸光度を３０分間測定した結果を示している。（１）は経時的な吸光度変化を示し、（２）のグラフの横軸はＬ−リジン濃度を、縦軸は吸光度変化量を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、先ず、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素について説明する。
【００２６】
＜Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素＞
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高い。具体的には、５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンとジアミン有機化合物であるカダベリンに僅かな酸化酵素活性を示す以外、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリンに対しては、全く活性を示さない。よって、本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いることにより、血漿など様々なアミノ酸などが含まれ得る生体試料などにおいてもＬ−リジンを正確に測定することが可能になる。
【００２７】
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、下記の（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
【００２８】
なお、本発明において「Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素」とは、Ｌ−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有する酵素をいう。
【００２９】
本発明において「Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性」とは、Ｌ−リジンを脱炭酸してカダベリンを生成する反応を触媒する酵素活性をいい、「Ｌ−リジン酸化酵素活性」とは、酸素と水の存在下、Ｌ−リジンを酸化してＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒド、過酸化水素およびアンモニアを生成する反応を触媒する酵素活性をいう。即ち、本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、下記式の反応を触媒する。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
また、本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。
【００３２】
上記アミノ酸配列（１）は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列を有する酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有するものであり、本発明者らが自然界から見出した新規なバークホルデリア属菌株が産生する酵素として単離精製したものである。
【００３３】
上記アミノ酸配列（１）（配列番号２）を有するＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、本発明に係る新規微生物であるバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株により産生されるものである。当該ＡＩＵ３９５株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ）  受託日：  ２０１４年１月２４日
（ｉｉｉ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７９６
【００３４】
その他、本発明者らの実験的知見により、ＡＩＵ３９５株以外の複数のバークホルデリアも、Ｌ−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有するＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生することが確認されている。
【００３５】
本発明に係るアミノ酸配列（２）の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、Ｌ−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記「１から数個」の範囲は、前記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を有するタンパク質である割合が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下程度であることができる。
【００３６】
本発明に係るアミノ酸配列（３）の「配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、当該相同性を有するタンパク質が、Ｌ−リジンに対する脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性の両方の活性を有する酵素である限り、特に限定されない。当該相同性は９５％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上である。
【００３７】
なお、上記の配列番号２に記載のアミノ酸配列との相同性は、比較すべきタンパク質のアミノ酸配列が明らかであれば、当業者であればアライメント解析ソフトを用いて容易に求めることができる。
【００３８】
上記アミノ酸配列（２）およびアミノ酸配列（３）において、「Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する」とは、例えば後記の実施例に記載の条件で、Ｌ−リジンを脱炭酸してカダベリンを生成する反応を触媒する酵素活性を有し、且つ、酸素と水の存在下、Ｌ−リジンを酸化してＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒド、過酸化水素およびアンモニアを生成する反応を触媒する酵素活性を有することをいう。
【００３９】
本発明の上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、上記アミノ酸配列（１）〜（３）を有し、且つ、Ｌ−リジンに対して高い基質特異性を示し、Ｌ−リジン酸化活性とＬ−リジン脱炭酸活性を有する酵素であれば、その由来は特に限定されるものではない。
【００４０】
例えば、本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）から、或いは、当該生物種に変異原を与えることによりアミノ酸配列（２）または（３）を有するＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生し得る変異体を獲得して、産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。
【００４１】
異種発現による生産法としては、例えば、同様の活性を有する生物種より抽出したゲノムＤＮＡから該当する遺伝子をＰＣＲにて増幅し、ｐＥＴもしくはｐＵＣなどに組み込んだプラスミドベクターを構築したのち、ＢＬ２１やＪＭ１０９などの宿主菌株に形質転換し、培養する方法が挙げられる。これら以外の公知の方法も適宜用いることができる。
【００４２】
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を産生することができる。
【００４３】
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む方法により製造することができる。
【００４４】
＜Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする核酸＞
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする遺伝子は、本発明の一態様である。即ち、本発明は、下記の何れかの塩基配列を有する核酸を包含する。
（１’）配列番号１に記載の塩基配列
（２’）配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する塩基配列
（３’）配列番号１に記載の塩基配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つ、当該塩基配列がコードするタンパク質がＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素活性を有する塩基配列。
【００４５】
上記核酸における各文言の定義は、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の定義などを準用する。なお、配列番号１に記載の塩基配列に対して９５％以上の相同性の塩基配列を有する核酸を用いれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性のアミノ酸配列を有するＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を製造することができる。
【００４６】
本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする遺伝子の取得方法は特に限定されない。本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列および配列番号１に記載した塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００４７】
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４８】
配列表の配列番号２に記載したアミノ酸配列または配列番号１に示す塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。
【００４９】
ＰＣＲ法により本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素をコードする遺伝子を取得することもできる。例えば、上記バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列等を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定すればよい。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００５０】
上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、上記モレキュラークローニング第２版や上記カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００５１】
上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５２】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ジェオバチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ；ファージ・ラムダのＰＲプロモータやＰＬプロモータ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータおよびｔａｃプロモータなどが挙げられる。
【００５３】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、アデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータ、ｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００５４】
また、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００５５】
Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）やシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、および、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンのような薬剤の耐性遺伝子を挙げることができる。Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００５６】
＜形質転換体＞
Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターを導入される宿主細胞は、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。かかる形質転換体は、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の製造に利用できる点で有用である。
【００５７】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞、ＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００５８】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスやシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００５９】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００６０】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１；およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
【００６１】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
【００６２】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
【００６３】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法等を挙げることができる。
【００６４】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明で用いるＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明で用いるＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を精製標品として得ることができる。
【００６５】
＜Ｌ−リジンの測定方法＞
本発明に係る検体中のＬ−リジンの測定方法は、
（Ａ）必要に応じて、Ｌ−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該Ｌ−リジン量と下記工程（Ｄ）で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく工程；
（Ｂ）必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する工程；
（Ｃ）検体に本発明の上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を作用させる工程；および
（Ｄ）上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする。
【００６６】
上記本発明方法には、検体中におけるＬ−リジンの有無を判断するための検出方法と、検体中におけるＬ−リジンの濃度や量を測定する定量方法などが含まれるものとする。
【００６７】
本発明のＬ−リジン測定方法で検体として用いられる生体試料は、Ｌ−リジンの有無を判断すべきものや、Ｌ−リジンの量などを測定すべき試料であれば、如何なるものでもよい。例えば、血液、血清、血漿、臓器の一部のホモジェネート、尿などの生体試料を挙げることができる。また、生体試料にＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を作用させて生じる生成物を如何なる方法で測定するかに応じて、生体試料の種類を適宜選択することができる。より具体的には、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清や血漿などが例として挙げられる。なお、本発明において、Ｌ−リジンなどの「量」には、Ｌ−リジンなどの濃度も含まれるものとする。
【００６８】
以下、本発明に係るＬ−リジンの測定方法を、実施の順番に従って説明する。
【００６９】
工程（Ａ）：検量線の作成工程
本工程では、必要に応じて、Ｌ−リジンの量が明らかな複数の試料につき以降と同様の工程を行い、当該Ｌ−リジン量と下記工程（Ｄ）で計測すべき反応生成物の量との関係を明らかにしておく。即ち、本工程では、必要に応じて検量線を作成する。
【００７０】
本発明に係るＬ−リジンの測定方法では、工程（Ｄ）において反応生成物の量を計測し、検体中のＬ−リジンの量を間接的に決定する。この際、反応生成物の絶対量を計測すれば、Ｌ−リジンの絶対量も決定できる。しかし、反応生成物の絶対量の計測は、容易でないことがある。そこで、本工程で検量線を作成しておくことにより、Ｌ−リジンの測定がより一層簡便になる。
【００７１】
本工程で用いるＬ−リジンの量が明らかな試料の数は、検体に含まれると予測されるＬ−リジンの量が十分に含まれる範囲で、３以上とすることが好ましい。当該試料数が多いほど正確な測定が可能になるので、当該試料数としては４以上がより好ましく、５以上がさらに好ましい。当該試料数の上限は特に制限されないが、多過ぎると測定効率が低下するおそれがあり得るので、当該試料数としては１０以下が好ましい。
【００７２】
検量線の作成では、各試薬の濃度、反応温度、反応時間などの反応条件を、予定されている以降の工程の条件と同一にして、上記試料につき反応生成物の量を計測する。計測された反応生成物の量と、事前に分かっている各試料中のＬ−リジンの量のデータから、常法に従って検量線を作成する。
【００７３】
工程（Ｂ）：カダベリンの処理工程
本工程では、必要に応じて、検体にプトレシン酸化酵素を作用させることにより検体中のカダベリンを酸化する。
【００７４】
本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、Ｌ−リジンに対する基質特異性が極めて高く、血漿など、様々な夾雑物を含む検体であってもＬ−リジンを正確に測定することができる。しかし、非常に僅かではあるが、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素はカダベリンを基質にして酸化する。よって、検体にカダベリンが含まれる場合や含まれる可能性がある場合には、本工程を行ってカダベリンを事前に酸化しておくことが好ましい。逆に、検体にカダベリンが含まれていないことが明らかであれば、本工程を行う必要はない。
【００７５】
プトレシン酸化酵素は、本来、水と酸素の存在下、プトレシン（2ＨＮ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2）を酸化して４−アミノブタナール（ＯＨＣ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2）、アンモニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であるが、カダベリン（2ＨＮ−（ＣＨ2）5−ＮＨ2）も基質とし、５−アミノペンタナール（ＯＨＣ−（ＣＨ2）4−ＮＨ2）、アンモニアおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する。即ち、本工程では、下記の反応が進行する。
【００７６】
【化２】
2015165791.tif 000003
【００７７】
プトレシン酸化酵素としては、特に制限されないが、例えば、コクリア  ロゼア（Ｋｏｋｕｒｉａ  ｒｏｓｅａ）ＮＢＲＣ  ３７６８株（旧ミクロコッカス  ルーベンス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ）ＩＦＯ３７６８株）に由来するプトレシン酸化酵素を用いることができる。
【００７８】
反応液のｐＨ、反応温度、反応条件、プトレシン酸化酵素の添加量などの反応条件は、検体中に含まれるカダベリンが十分に酸化されるよう調節する。例えば、プトレシン酸化酵素は、一般的にｐＨ６．５以上で活性を示すので、反応液のｐＨを６．５以上にする。具体的な条件は、予備実験で決定したり、検体中のカダベリンがクロマトグラフィなどで確認できなくなるよう調整すればよい。
【００７９】
反応後は、検体中のカダベリンの量を決定するために、生成した５−アミノペンタナール、アンモニアまたは過酸化水素の量を計測することが好ましい。測定条件は、後記する。
【００８０】
或いは、本工程で生成した過酸化水素の一部または全部は分解する可能性があるため、例えば工程（Ｄ）で過酸化水素の量を計測する場合には、過酸化水素の量の計測の代わりに、または過酸化水素の量の計測に加えて、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼなどにより積極的に分解しておいてもよい。
【００８１】
工程（Ｃ）：Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素による反応工程
本工程では、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を検体に作用させることにより、検体中に含まれるＬ−リジンを脱炭酸してカダベリンとし、また、当該Ｌ−リジンを酸化してＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒド、アンモニアおよび過酸化水素を生成させる。
【００８２】
上記反応を十分に進行せしめるために、本工程の反応液におけるＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の量は、反応液１．０ｍＬあたり１．０ｍＵ以上とすることが好ましい。なお、ここでの１Ｕは、リジン１μｍｏｌを１分間で消費する活性をいうものとする。
【００８３】
溶媒としては水を用い、緩衝液などを用いて、反応液のｐＨをＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の至適ｐＨを考慮したｐＨに調整することが好ましい。ｐＨは適宜調整すればよいが、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素がｐＨ５．０以上、８．５以下で活性を示すので、この範囲で用いることができる。
【００８４】
また、本工程において、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素に加えてプトレシン酸化酵素を用い、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用により生成したカダベリンを酸化してもよい。それにより、Ｌ−リジンをより正確に測定できる。詳しくは、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素はＬ−リジン脱炭酸酵素活性とＬ−リジン酸化酵素活性の両活性を示すため、例えば、Ｌ−リジンから生成するカダベリンまたはＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒドの生成量は、検体に含まれるＬ−リジンの量とは異なるので、続く工程（Ｄ）でカダベリンまたはＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒドの量を計測する場合には、工程（Ａ）を行って事前に検量線を作成しておくことが必要となる。しかし、プトレシン酸化酵素を共存させてＬ−リジンから生成するカダベリンを酸化すると、工程（Ｂ）の反応と同様に、カダベリンと等モルのアンモニアと過酸化水素が生成する。即ち、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素とプトレシン酸化酵素を併用して十分に反応を進行させれば、検体中に含まれるＬ−リジンと等モルのアンモニアおよび過酸化水素が生成するため、このアンモニアまたは過酸化水素の量を計測することにより、検体中のＬ−リジンをより正確に測定することが可能になる。
【００８５】
生成したカダベリンを十分に酸化するために、本工程の反応液におけるプトレシン酸化酵素の量は、反応液１．０ｍＬあたり１００ｍＵ以上とすることが好ましい。なお、ここでの１Ｕは、カダベリン１μｍｏｌを１分間で消費する活性をいうものとする。
【００８６】
上記のとおり、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素がｐＨ５．０以上、８．５以下で活性を示し、また、プトレシン酸化酵素はｐＨ６．５以上で活性を示すので、プトレシン酸化酵素を用いる場合には反応液のｐＨを６．５以上、８．５以下に調整することが好ましい。
【００８７】
本工程の反応条件は、上記酵素反応が十分に進行するよう調整する。例えば、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素によるＬ−リジンの酸化反応には酸素が必要であり、通常、酸化反応に必要とされる酸素量が微量であり溶存酸素により十分に賄えるため、空気などの酸素含有気体を反応液に供給する必要はないが、供給してもかまわない。反応温度は適宜調整すればよいが、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の至適温度は４０℃付近であるので、例えば、２０℃以上、５０℃以下とすることができる。酵素反応時間は、使用する酵素量などにもよるが、例えば、１０分間以上、１時間以下程度の範囲とすることができる。しかし、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
【００８８】
工程（Ｄ）：反応生成物量の計測工程
本工程では、上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する。得られた計測値から、検体中におけるＬ−リジンの量を把握できる。
【００８９】
Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の作用による反応生成物は、具体的には、カダベリン、Ｌ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒド、アンモニア、過酸化水素を挙げることができる。なお、上記工程（Ｃ）においてプトレシン酸化酵素を併用すると、生成したカダベリンは５−アミノヘプタナールに変換され、カダベリンと等モルのアンモニアと過酸化水素が別途生成する。
【００９０】
反応生成物の量の計測方法は、選択された反応生成物に応じて公知方法から適宜選択することができる。例えば、測定対象である反応生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法など公知の方法により、過酸化水素の定量が可能である。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には、４−アミノアンチピリンとフェノールとの組み合せや４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）との組み合わせなどが、発色剤として挙げられる。なお、発色剤は、使用されるペルオキシダーゼの種類によって適宜選択することが可能である。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびフェノールを用いる過酸化水素定量のための反応は、以下に示す通りである。
２Ｈ2Ｏ2  ＋  ４−アミノアンチピリン  ＋  フェノール  →  キノンイミン色素  ＋  ４Ｈ2Ｏ
【００９１】
上記工程（Ｃ）でプトレシン酸化酵素を用いた場合には、生成したアンモニアと過酸化水素のモル数は検体中に含まれるＬ−リジンのモル数と同じである。また、アンモニアに比べて、過酸化水素の量の計測はより容易である。よって、上記工程（Ｃ）でプトレシン酸化酵素を用いた場合には、過酸化水素の量を計測することが好ましい。
【００９２】
Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の反応生成物である過酸化水素は、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサを用いて測定することもできる。過酸化水素電極を用いた電流検出型センサとしては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。
【００９３】
測定すべき反応生成物をアンモニアとする場合には、アンモニア検出薬を用いて測定することができる。アンモニア検出薬としては、例えば、フェノールと次亜塩素酸の組み合わせによるインドフェノール法を挙げることができる。具体的には、サンプルをフェノール・ニトロプルシド溶液および過塩素酸溶液と混合して発色させ、６３５ｎｍの吸光度を測定することにより、アンモニア定量が可能である。
【００９４】
定量に用いられる反応生成物がＬ−リジンの脱アミノ化生成物であるＬ−２−アミノアジピン酸５−セミアルデヒドである場合には、５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸を３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン  ヒドラゾン  塩酸塩と反応させてヒドラゾン誘導体を分光測定することにより、Ｌ−２−アミノアジピン酸５−セミアルデヒドの量を計測することができる。
【００９５】
＜Ｌ−リジンの測定用キット＞
プトレシン酸化酵素を用いずに本発明に係るＬ−リジン測定方法を実施するためのＬ−リジン測定用キットは、例えば、以下の試薬を含む。
【００９６】
本発明のＬ−リジン測定用キットは、（Ｋ１−１）Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を含むことを特徴とする。
【００９７】
本発明のキットは、さらに、（Ｋ１−２）過酸化水素検出用試薬、（Ｋ１−３）アンモニア検出薬および（Ｋ１−４）Ｌ−リジンの脱アミノ化生成物であるＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒド検出薬の少なくとも一つを含むことができる。
【００９８】
（Ｋ１−２）過酸化水素検出用試薬は、例えば、過酸化水素を発色により定量するものを挙げることができる。発色光は、蛍光であってもよい。過酸化水素検出用試薬としては、例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組合せであることができる。具体的には、西洋わさびペルオキシダーゼと４−アミノアンチピリンとフェノールの組み合わせを挙げることができる。
【００９９】
（Ｋ１−３）アンモニア検出薬としては、フェノールとの次亜塩素酸の組み合わせを挙げることができる。かかるアンモニア検出薬により、インドフェノール法でのアンモニアの検出が可能になる。
【０１００】
（Ｋ１−４）Ｌ−リジンの脱アミノ化生成物であるＬ−２−アミノアジピン酸５−セミアルデヒド検出薬としては、３−メチル−２−ベンゾチアゾロン  ヒドラジン  塩酸塩を挙げることができる。例えば、Ｌ−２−アミノアジピン酸５−セミアルデヒドと３−メチル−２−ベンゾチアゾロン  ヒドラジン  塩酸塩を反応させて生成するヒドラゾン誘導体を分光測定することができる。
【０１０１】
本発明のキットは、さらに、（Ｋ１−５）反応用緩衝液を含むものであってもよい。反応用緩衝液は、反応液中を定量反応に適したｐＨに維持するために用いられる。Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、ｐＨ５．０以上、８．５以下で活性を示すことから、反応用緩衝液のｐＨも５．０以上、８．５以下が好ましい。当該ｐＨ範囲としては、６．０以上、７．０以下がより好ましい。
【０１０２】
プトレシン酸化酵素を用いて本発明に係るＬ−リジン測定方法を実施するためのＬ−リジン測定用キットは、（Ｋ２−１）Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素と（Ｋ２−２）プトレシン酸化酵素を含む。（Ｋ２−２）プトレシン酸化酵素としては、コクリア  ロゼア（Ｋｏｋｕｒｉａ  ｒｏｓｅａ）ＮＢＲＣ  ３７６８株由来のプトレシン酸化酵素を挙げることができる。
【０１０３】
（Ｋ２−３）過酸化水素検出用試薬、（Ｋ２−４）アンモニア検出薬および（Ｋ２−５）Ｌ−リジンの脱アミノ化生成物であるＬ−２−アミノアジピン酸  ５−セミアルデヒド検出薬の少なくとも一つを含むことができる。これらの説明などは、プトレシン酸化酵素を用いずに本発明に係るＬ−リジン測定方法を実施するためのＬ−リジン測定用キットのものと同様である。
【０１０４】
本発明のキットは、さらに、（Ｋ２−６）反応用緩衝液を含むものであってもよい。反応用緩衝液は、反応液中を定量反応に適したｐＨに維持するために用いられる。一般的に、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素はｐＨ５．０以上、８．５以下で活性を示し、プトレシン酸化酵素はｐＨ６．５以上で活性を示すので、反応用緩衝液のｐＨは６．０以上、８．５以下が好ましい。
【０１０５】
＜Ｌ−リジン測定用酵素センサ＞
本発明に係るＬ−リジン測定用酵素センサは、過酸化水素検出用電極を有し、当該過酸化水素検出用電極の表面または近傍に本発明に係る上記Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素が配置されていることを特徴とする。
【０１０６】
過酸化水素検出用電極は、過酸化水素が水と酸素に分解するにあたって生じる電子を検出することにより、過酸化水素を検出するものである。過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極であることができる。
【０１０７】
上記Ｌ−リジン測定用酵素センサによれば、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素がＬ−リジンと反応することで過酸化水素が生成するので、この過酸化水素を過酸化水素検出用電極で検出することができる。酵素式過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させた電極を挙げることができる。隔膜式過酸化水素電極は、隔膜により過酸化水素と反応する電極が隔離されたタイプの電極である。
【０１０８】
本発明に係る酵素センサにおいて、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましく、検出用電極の表面に配置される場合には、検出用電極の表面に固定化されても固定化されなくてもよい。検出用電極の表面に固定化されることで、本発明のセンサを繰り返し利用できる利点がある。
【実施例】
【０１０９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【０１１０】
実施例１：  本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素産生菌の探索
（１）  スクリーニング
日本国内各地から土壌試料を採取し、下記条件により各土壌に含まれる微生物のＬ−リジン酸化酵素活性を試験し、Ｌ−リジン酸化酵素活性を有する微生物をスクリーニングした。
【０１１１】
Ｌ−リジン酸化酵素活性は、酵素によるＬ−リジンの酸化反応により生成される過酸化水素量を、比色法で求めることにより測定した。具体的には、各培養微生物の菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を粗酵素液として用いた。当該粗酵素液０．１ｍＬと、表１に示す化合物を混合して得られた酸化酵素活性測定用反応液０．９ｍＬを１ｃｍ石英セル中でし、３０℃で反応させた。吸光度計を用い、反応開始から約１秒間間隔で連続的に５５５ｎｍの吸光度を測定した。基質としては、Ｌ−リジンの５ｍＭ水溶液を調製して添加した。また、ブランクでは、基質の代わりに１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。
【０１１２】
【表１】
2015165791.tif 000004
【０１１３】
得られた吸光度変化により、下記計算式に基づいて酸化酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を与える酵素量を１Ｕとした。
酸化酵素活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍＬ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍＬ）｝
３．１（ｍＬ）：  全液量
１３：  ミリモル吸光係数
１．０（ｃｍ）：  セルの光路長
０．１（ｍＬ）：  酵素サンプル液量
【０１１４】
その結果、Ｌ−リジン酸化酵素活性を有するＡＩＵ３９５株を見出した。当該ＡＩＵ３９５株について、以下のとおり検討した。
【０１１５】
（２）１６ＳｒＤＮＡ塩基配列
上記ＡＩＵ３９５株から常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡを増幅し、その塩基配列を決定した。当該微生物の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を配列番号９に示す。決定された配列に基づいて、アポロンＤＢ−ＢＡ９．０  Ｂｌａｓｔにより、相同性の高い微生物を検索した。結果を表２に示す。
【０１１６】
【表２】
2015165791.tif 000005
【０１１７】
また、図１に、当該微生物の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示した。表２と図１のとおり、ＡＩＵ３９５株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示し、Ｂ．ａｒｂｏｒｉｓ  Ｒ−２４２０１株に対して９９．９％と最も高い相同性を示したが、何れの規準菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列とも一致しなかった。また、アポロンＤＢ−ＢＡ９．０に対する相同性検索で得られた上位１０塩基配列を用いた１６ＳｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統解析の結果、ＡＩＵ３９５株は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属の種で形成されるクラスターに含まれ、Ｂ．ａｒｂｏｒｉｓとクラスターを形成し、近縁であることが示された。
【０１１８】
以上の通り、本発明に係るＡＩＵ３９５株は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に属する新規な微生物であることが明らかとなった。
【０１１９】
（３）  生理・生化学性状試験
本発明に係るＡＩＵ３９５株の生理・生化学性状を試験した。第一次試験の結果を表３に、第二次試験の結果を図２と表４に示す。
【０１２０】
【表３】
2015165791.tif 000006
【０１２１】
【表４】
2015165791.tif 000007
【０１２２】
第一次試験の結果、ＡＩＵ３９５株は運動性を有するグラム陰性桿菌であり、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応に陽性、オキシダーゼ反応に陰性を示した（表３）。第二次試験の結果、ＡＩＵ３９５株は硝酸塩を還元し、アルギニンジヒドロラーゼおよびウレアーゼなどの活性を示さず、エスクリンおよびゼラチンを加水分解せず、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースなどを資化した（図２）。また、追加試験の結果、４２℃で生育せず、マッコンキー寒天で生育し、羊血をβ−溶血した（表４）。これらの性状は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において近縁性が示唆されたＢ．ａｒｂｏｒｉｓの性状と類似性があるものの、相違も確認された。特に、エスクリンおよびゼラチンを加水分解しない点はＢ．ａｒｂｏｒｉｓの性状と異なった。
【０１２３】
以上の結果から、本発明に係るＡＩＵ３９５株は、Ｂ．ａｒｂｏｒｉｓに最も近縁なＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．であるが、Ｂ．ａｒｂｏｒｉｓとは異なる新規なものであると判断した。
【０１２４】
実施例２：  本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の取得
（１）  ＡＩＵ３９５株由来のＬ−リジン酸化酵素の誘導剤の検討
０．３％グルコース、０．２％リン酸二水素カリウム、０．１％リン酸水素ナトリウム、および０．０５％硫酸マグネシウム七水和物を含む培地（ｐＨ７．０）に、窒素源として、表５に示す６−アミノヘキサン酸、Ｌ−リジン、プトレシン、カダベリンまたは硫酸アンモニウムをそれぞれ添加した。当該培地に上記実施例１で得られたバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株を接種して３０℃で３６時間培養し、培養後の培地ｐＨ、培養濁度、Ｌ−リジン酸化酵素活性を測定した。結果を表５に示す。
【０１２５】
【表５】
2015165791.tif 000008
【０１２６】
表５に示す結果のとおり、６−アミノヘキサン酸（以下、「６−ＡＨＡ」と略記する）を添加した培地において、最も高いＬ−リジン酸化酵素活性が認められた。よって、以降の実験では６−ＡＨＡを培地に添加し、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の誘導を行った。
【０１２７】
（２）  ＡＩＵ３９５株の培養時間
上記実施例１のバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株を、６−ＡＨＡ培地（０．５％  ６−ＡＨＡ，０．３％グルコース，０．２％リン酸二水素カリウム，０．１％リン酸水素ナトリウム，０．０５％硫酸マグネシウム七水和物，ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、１１５行程／分で４日間培養した。０、１２、２４、３６、４８、７２、９６時間ごとに、培養濁度（６６０ｎｍ）、培地ｐＨ、Ｌ−リジン酸化酵素活性を測定した。結果を図３に示す。培養濁度とＬ−リジン酸化酵素活性の関係から、３６時間の培養後集菌し、精製を行った。
【０１２８】
（３）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン酸化酵素の精製
（３−１）  ＡＩＵ３９５株の培養
上記実施例１のバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株を、５ｍＬの上記６−ＡＨＡ培地に植菌し、３０℃、１１５行程／分で２日間前培養した。その後、１５０ｍＬの６−ＡＨＡ培地を含む５００ｍＬフラスコで同様の条件で２日間培養した。本培養として、２Ｌの６−ＡＨＡ培地を含む３Ｌのフラスコに前培養したＡＩＵ３９５株を植菌し、３０℃で３６時間培養した。培養後、１０，０００×ｇで１０分間遠心後、１０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，以下、「ＫＰＢ」と略記する）で洗菌し、菌体を得た。
【０１２９】
（３−２）  無細胞抽出液の調製
培地８Ｌ分の菌体をＫＰＢに懸濁し、細胞破砕機（安井器械社製，「マルチビーズショッカー（登録商標）」）を使って、２，２００ｒｐｍで２分間、菌体を破砕する操作を４回繰り返した。次いで、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた上清を回収した。遠心で得られたペレットを再度４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）に懸濁し、同様の操作を３回繰り返した。全ての上清（計２，１５０ｍＬ）を回収し、無細胞抽出液とした。
【０１３０】
（３−３）  ＤＥＡＥ樹脂を使った陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）により平衡化したＤＥＡＥ樹脂（ＴＯＳＯＨ社製，「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０」）を充填したカラム（直径２．４ｃｍ×２７ｃｍ）に、上記無細胞抽出液を吸着させた。４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）でカラムを洗浄した後、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）を用いて、酵素を溶出させた。得られた酵素液を１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で透析した。
【０１３１】
（３−４）  アガロースビーズを使った陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
０．１４Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）により平衡化したアガロースビーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス，「Ｑ  セファロース」）を充填したカラム（直径２．４ｃｍ×１１ｃｍ）に、上記酵素液を吸着させた。０．１４Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で洗浄した後、０．１４Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２５０ｍＬおよび０．２６Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２５０ｍＬを用いて、グラジエントによりＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。活性が得られたフラクションは、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で、透析した。
【０１３２】
（３−５）  ＤＥＡＥ樹脂を使った陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）により平衡化したＤＥＡＥ樹脂（ＴＯＳＯＨ社製，「ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０」）を充填したカラム（直径１．２ｃｍ×３６ｃｍ）に、上記酵素液を吸着させた。０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で洗浄した後、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２００ｍＬおよび０．２４Ｍ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２００ｍＬを用いて、グラジエントによりＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。活性が得られたフラクションは、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で、透析した。
【０１３３】
（３−６）  ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）により平衡化したハイドロキシアパタイト樹脂を充填したカラム（直径１．２ｃｍ×１８ｃｍ）に、上記酵素液を吸着させた。１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）１００ｍＬおよび０．１ＭＫＰＢ（ｐＨ６．０）１００ｍＬを用いて、グラジエントによりＫＰＢ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。活性が得られたフラクションは、１０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で、透析した。以上の精製状況を表６にまとめる。
【０１３４】
【表６】
2015165791.tif 000009
【０１３５】
（４）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる上記株由来Ｌ−リジン酸化酵素の分子量測定
泳動ゲルとして、３６％アクリルアミド５．２５ｍＬ、０．６８Ｍトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．８）８．２５ｍＬ、１％ＳＤＳ  １．５８ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ  １８７μＬ、２％ＡＰＳ  ５６２．５μＬの組成を有するゲルに、３６％ポリアクリルアミド０．５ｍＬ、０．１７９Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）３．５ｍＬ、１％ＳＤＳ  ０．５ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ  １２５μＬ、２％ＡＰＳ  ３７５μＬの組成を有する濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ，１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４０μＬ，水３６０μＬ，２−メルカプトエタノール２００μＬおよび１０％ＳＤＳ  ２００μＬ）と等量混合した上記精製酵素サンプル１０μＬを、ランニング緩衝液（トリス３．０ｇ，グリシン１４．１ｇおよびＳＤＳ  １０ｇ）中、３０ｍＡで電気泳動を行った。その後、ゲルをタンパク染色液（ＣＢＢ２．５ｇ，メタノール５００ｍＬ，酢酸５０ｍＬおよび水４５０ｍＬ）で１時間染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。分子量マーカーとしては、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３７ｋＤａ、５０ｋＤａ、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、２５０ｋＤａの組換えタンパク質を含む分子量マーカーを用いた。
【０１３６】
図４にバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン酸化酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明らかなように、上記の方法で酵素は単一のタンパク質まで精製されたので、精製酵素を用いて性質を明らかにした。
【０１３７】
（５）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン酸化酵素の吸収スペクトル解析
Ｌ−リジン酸化酵素の精製酵素の吸収スペクトルを測定した。結果を図５に示す。２７９ｎｍと４１５ｎｍに吸収極大が見られたことから、本酵素はピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存型の酵素であることが示唆された。
【０１３８】
（６）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン酸化酵素の基質特異性
上記実施例１（１）の酸化酵素活性測定用反応液中の基質を表７に示すアミノ酸およびアミン有機化合物に変更して、上記精製酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を表７に示す。
【０１３９】
【表７】
2015165791.tif 000010
【０１４０】
表７に示す結果のとおり、本酵素は、Ｌ−リジンに対する酸化活性が極めて高い一方、５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンおよびカダベリンをわずかに基質とするのみで、その他のアミノ酸やアミンには全く活性を示さないという基質特異性の高いものであった。
【０１４１】
（７）  Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性の測定
Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性は、脱炭酸反応により生成するカダベリンをプトレシン酸化酵素により酸化し、この酸化反応に伴って、反応したカダベリンと等モル生成する過酸化水素量を比色法で求めることにより測定した。具体的には、１ｃｍ石英セル中、表８に示す基質量に相当するＬ−リジン溶液を基質として含む表８に示す脱炭酸酵素活性測定用反応液０．９ｍＬと酵素液１ｍＬを混合し、３０℃で反応させた。吸光度計を用い、反応開始から約１秒間間隔で連続的に５５０ｎｍの吸光度を測定した。また、プトレシン酸化酵素を添加せず、同様の実験を行った。ブランクでは、基質の代わりに１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。
【０１４２】
【表８】
2015165791.tif 000011
【０１４３】
得られた吸光度変化により、下記計算式に基づいて脱炭酸酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を与える酵素量を１Ｕとした。
脱炭酸酵素活性値（Ｕ／ｍＬ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（プトレシン酸化酵素を添加した場合の測定値）−ΔＯＤ／ｍｉｎ（プトレシン酸化酵素を添加しない場合の測定値）｝×３．１（ｍＬ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍＬ）｝
３．１（ｍＬ）：  全液量
１３：  ミリモル吸光係数
１．０（ｃｍ）：  セルの光路長
０．１（ｍＬ）：  酵素サンプル液量
【０１４４】
その結果、ＡＩＵ３９５株から単離されたＬ−リジン酸化酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性をも有することが明らかとなった。
【０１４５】
（８）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素のＫmおよびＶmaxの測定
上記の酸化酵素活性測定方法と脱炭酸酵素活性測定方法において、基質の濃度を変更して各酵素活性を測定することによって、ＫmとＶmaxを求めた。酸化酵素活性の測定では、Ｌ−リジンの他、僅かに活性が認められた５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンとカダベリンを基質として用いた。脱炭酸酵素活性の測定では、Ｌ−リジンのみ基質として用いた。結果を表９に示す。
【０１４６】
【表９】
2015165791.tif 000012
【０１４７】
表９に示す結果のとおり、本酵素はＬ−リジンに対して親和性が非常に高いことが明らかとなった。また、本酵素の脱炭酸酵素活性と酸化酵素活性との比率は、最大速度で比較すると０．７９：１２２と脱炭酸酵素活性の方が高いことが分かった。さらに、特に低濃度の５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンおよびカダベリンでは反応速度は著しく遅くなることから、本酵素のＬ−リジンに対する高い基質特異性が証明された。
【０１４８】
（９）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列の決定
上記精製酵素のＮ末端アミノ酸配列の分析を、株式会社ニッピに依頼し、Ｎ末端側から１５残基が決定された。
【０１４９】
実施例３：  Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の最適ｐＨとｐＨ安定性の検討
上記のＬ−リジン酸化酵素活性方法において、緩衝液を変更することにより反応液のｐＨを５〜８．５に変化させ、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を図６に示す。
【０１５０】
図６のとおり、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、ｐＨ６．０で最も高い活性を示し、ｐＨ５．０からｐＨ７．０付近まで安定であることが明らかとなった。なお、図６の縦軸は、Ｌ−リジン酸化酵素活性についてはｐＨ６．０の活性値を１００％とした場合の相対活性値を示し、残存活性についてはｐＨ６．５の活性値を１００％とした場合の相対活性値を示す。ちなみに、破線はプトレシン酸化酵素のｐＨに対する相対活性を示している。
【０１５１】
実施例４：  Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の最適温度と熱安定性の検討
上記のＬ−リジン酸化酵素活性方法において、反応温度を２０〜６０℃に変化させ、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を図７に示す。
【０１５２】
図７のとおり、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、５０℃で最も高い活性を示し、４５℃付近まで安定であることが明らかとなった。なお、図７の縦軸は、Ｌ−リジン酸化酵素活性については５０℃における活性値を１００％とした場合の相対活性値であり、残存活性については３０℃における活性値を１００％とした場合の相対活性値である。
【０１５３】
実施例５：  Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の阻害剤の検討
上記のＬ−リジン酸化酵素活性方法において、阻害剤を添加し、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の酸化酵素活性を測定した。結果を表１０に示す。
【０１５４】
【表１０】
2015165791.tif 000013
【０１５５】
表１０に示す結果のとおり、本発明酵素には、ＰＬＰ依存型酵素の阻害剤であるファニルヒドラジンやヒドロキシルアミンで著しい酸化酵素活性の減少が見られた。また、ＣｕＣｌ2やＺｎＣｌ2により、酸化反応に阻害が見られた。
【０１５６】
実施例６：  本発明に係る組換えＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の取得
（１）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子のクローニング
（１−１）  ＡＩＵ３９５株の染色体ＤＮＡの抽出
上記実施例１のバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株をＴＧＹ培地（０．５％トリプトン，０．２５％イースト抽出物，０．１％グルコース，ｐＨ７．０）３ｍＬに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養液１ｍＬを、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、集菌した。菌体をＳＴＥ緩衝液（ＮａＣｌ  ０．５８ｇ，１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２００μＬを水で１００ｍＬに定量したもの）１ｍＬで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。６８℃で１５分間加熱した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除いた。別途、リゾチーム５ｍｇと１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  １０ｍＬを含む溶液（以下、当該溶液を「１液」という）を準備した。また、グルコース０．９ｇ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２．５ｍＬ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２ｍＬを含む溶液に超純水を加え、総量を１００ｍＬにした。当該溶液１ｍＬと、上記１液１０ｍＬを混合した。上記遠心分離沈殿物を、当該混合液３００μＬに懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ液（プロテイナーゼＫ  １０ｍｇ／１液１ｍＬ）６μＬを加え、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。Ｎ−ラウロイルザルコシン３ｍｇを加えて、穏やかに混合した後、３７℃で３時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに２回行った。上清３００μＬに５Ｍ  ＮａＣｌ溶液１０μＬとエタノール６００μＬを加えて混合した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。７０％エタノールで洗浄した後、風乾し、ＴＥ緩衝液１００μＬに溶解し、目的とする染色体ＤＮＡを得た。
【０１５７】
（１−２）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子内部配列の増幅
ＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０×ＬＡ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー１（５’−ＡＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＡＡＣ−３’，配列番号３）１μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー２（５’−ＴＧＣＡＣＧＣＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＣＧＣＣ−３’，配列番号４）１μＬ、鋳型ＤＮＡ２μＬおよびＬＡ  Ｔａｑ  １μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間の後、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で５秒間、（ｉｖ）７２℃で２分間の（ｉｉ）〜（ｉｖ）を３０回繰返した。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をＶＩＯＧＥＮＥ（ＵＳＡ）社のＧｅｌ−Ｍゲル抽出キットを用いて抽出した。
【０１５８】
（１−３）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子内部配列のシーケンシング
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー１とプライマー２を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、１．６μＬの各プライマー、１．６μＬの鋳型ＤＮＡ、１μＬのＢｉｇＤｙｅプレミックスソリューション、１．５μＬの５ｘＢｉｇＤｙｅシーケンシングバッファーと４．９μＬの滅菌水とし、全量１０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９６℃で２分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で５秒間、（ｉｖ）６０℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）を２５回、および（ｖｉ）７２℃で５分間とした。ＰＣＲ産物に、１μＬの３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、１μＬの０．１２５Ｍ  ＥＤＴＡと２５μＬのエタノールを加え、室温で１５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で８分間遠心分離することにより沈殿させた。上清を廃棄した後、１０μＬの  Ｈｉ  Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを加え、１００℃で５分間加熱した後に、氷水で急冷したものをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３５００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はＧｅｎｅｔｙｘで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。
【０１５９】
（１−４）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子末端配列の増幅
プライマー３（５’−ＡＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＣＧ−３’，配列番号５）と、プライマー４（５’−ＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＣＧＣＧＧＧＧ−３’，配列番号６）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲＴＭ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）のマニュアルに従って、末端配列の増幅を行った。上記同様にシーケンシングを行った。配列番号２に、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子から予測される一次構造を示した（図８）。
【０１６０】
（１−５）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子の発現系構築
Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子（配列番号１）を増幅するためのＰＣＲ反応液として、滅菌水（ＭｉｌｌｉＱ）３４μＬ、プライマー５（５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＡＡＣ−３’，配列番号７，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、プライマー２（５’−ＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＧＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＧＣ−３’，配列番号８，１００ｐｍｏｌ）１μＬ、ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，製品名「ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−」，１Ｕ／μＬ水溶液）１μＬ、１０×ＰＣＲバッファー、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ水溶液５μＬ、２５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液２μＬ、および鋳型ＤＮＡ１μＬを混合した。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９４℃で２分間、（ｉｉ）９４℃で１５秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６８℃で２分間とし、（ｉ）と（ｉｉ）を３０サイクル繰返した。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子を、ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品名「Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて抽出した。
【０１６１】
（１−６）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子のベクターへの組換え
制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理したｐＥＴ１１ａ  １μＬ、上記で得たＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子のＰＣＲ産物３μＬ、およびクローニングキット（タカラバイオ社製，製品名「５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｅｍｉｘ」）１μＬを混合して５０℃で１５分間反応させることにより、プラスミドベクターｐＥＴ１１ａにＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子を導入した。大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）のコンピテントセル５０μＬに、５μＬの上記反応液を加え、ヒートショック法で形質転換を行った。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に生育したコロニーから数株選抜してプラスミドを抽出し、０．７％アガロース電気泳動により、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子の導入の有無を確認した。
【０１６２】
（１−７）  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素遺伝子の発現と精製
８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４ＬのＬＢ培地（１．０％ポリペプトン，０．５％イースト抽出物，１．０％ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）に組換え大腸菌（ＢＬ２１）を植菌し、１６℃で１２時間培養後、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、引き続き３０℃で１２時間培養してＬ−アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機を用いて５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離することにより集菌し、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄した後、１００ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。１００ｍＬの菌体液を１５分間超音波処理し、８，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を実施例２（３−３）〜（３−６）と同様の手法で精製を行った。
【０１６３】
（２）  ＡＩＵ３９５株由来組換えＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の活性測定
上記精製酵素の酸化酵素活性を、表７におけるアミノ酸およびアミンをそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定した。その結果、表７の結果と同様に、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、Ｌ−リジンを基質として酸化する一方で、５−ヒドロキシＬ−リジンおよびカダベリンをわずかに基質とするのみで、その他のアミノ酸には全く活性を示さなかった。このように、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素は、組み換え酵素においても、Ｌ−リジンに対して高い特異性を示すことが明らかとなった。
【０１６４】
実施例７：  ＡＩＵ３９５株由来Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いたＬ−リジンの定量
上記実施例１（１）の酸化酵素活性測定用試薬を調製した。次に、上記実施例１（１）において、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の添加量を変えて、吸光度変化を測定した。Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の各添加量における２０分後の吸光度変化を図９に示す。図９に示す結果によれば、１．３ｍ  ｕｎｉｔ以上で、Ｌ−リジン定量に問題なく使用できることが示唆された。
【０１６５】
また、上記試薬組成物を用い、Ｌ−リジン測定を実施した。検体として、反応液中の最終濃度が０〜１．０ｍＭのＬ−リジン水溶液を調製した。Ｌ−リジンの各濃度における２０分後の吸光度変化を図１０に示す。
【０１６６】
図１０のとおり、Ｌ−リジン溶液を検体とした場合には十分な反応性が認められ、水溶液において、Ｌ−リジン濃度と吸光度測定データは良好な正の相関を示した。従って、本発明のＬ−リジン測定用試薬組成物を用いることにより、正確なＬ−リジンの測定を行うことができることが実証された。
【０１６７】
実施例８：  プトレシン酸化酵素によるカダベリンの定量
上記実施例２（７）のとおり、プトレシン酸化酵素は、Ｌ−リジンの脱炭酸により生じたカダベリンを定量するのに用いることができるので、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素と組合わせることにより、試料中のＬ−リジンを定量することができる。そこで、プトレシン酸化酵素につき詳しく調べた。
【０１６８】
具体的には、上記実施例２（７）において、６０μＭカダベリンを基質とし、プトレシン酸化酵素の添加量を変えて吸光度変化を測定した。プトレシン酸化酵素の各添加量に対する２０分後または３０分後の吸光度変化を図１１に示す。これらの結果により、２００ｍ  ｕｎｉｔ以上のプトレシン酸化酵素を用いれば、カダベリン定量に問題なく使用できることが示唆された。
【０１６９】
実施例９：  本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素とプトレシン酸化酵素とのカップリングにおける他のアミノ酸およびアミンの影響
表１１は、３０μＭのＬ−リジンのみ、或いは、３０μＭのＬ−リジンと３０μＭのＬ−リジン以外のアミノ酸あるいはアミンを混和した液に、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素とプトレシン酸化酵素を、上記実施例２（７）と同じ割合で添加してｐＨ７．０で３０分間反応し，５５５ｎｍの吸光度を測定した結果を示している。
【０１７０】
【表１１】
2015165791.tif 000014
【０１７１】
表１１に示す結果のとおり、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いれば、Ｌ−リジン以外のアミノ酸やアミンの存在下でも、プトレシン酸化酵素とのカップリングによるＬ−リジンの定量が可能であることが分かった。
【０１７２】
実施例１０：  本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の添加量の検討
６０μＭのＬ−リジンを基質として、２００ｍＵのプトレシン酸化酵素を併用し、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素の添加量を変えて、ｐＨ７．０で３０分間反応させた後、５５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１２に示す。
【０１７３】
図１２に示す結果の通り、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いれば、１．０ｍＵ以上の添加量で、Ｌ−リジンを十分に測定できることが明らかとなった。
【０１７４】
実施例１１：  本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いたＬ−リジン定量
０〜６０μＭのＬ−リジンに対してＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素（１．５ｍＵ）とＰＵＯ（２００ｍＵ）を添加して、ｐＨ７．０で３０分間反応させた後、５５５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１３に示す。
【０１７５】
図１３に示す結果の通り、本発明に係るＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素を用いて検量線において、直線性が得られた。
【０１７６】
実施例１２：  カダベリン存在下でのプトレシン酸化酵素を用いたＬ−リジン測定方法
Ｌ−リジンの脱炭酸により生じるカダベリンは生体内でも生成するものであることから、試料中にカダベリンが存在すると、試料中のＬ−リジンを正確に測定できないおそれがある。そこで、図１４（１）に示すように、基質として０〜６０ｎｍｏｌのＬ−リジンを、６０ｍｍｏｌのカダベリンと共に、２００ｍＵ  プトレシン酸化酵素、０．１２μｍｏｌ  ４−ＡＡ、１．８Ｕ  ペルオキシダーゼ、０．７５ｍｍｏｌ  リン酸カリウムを含む反応液Ｉ（ｐＨ７．０）と混合し（総量：７５０μＬ）、３０℃で２０分間反応させた（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｉ）。次いで、２．３ＵのＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素と０．３８μｍｏｌ  ＴＯＯＳを含む反応液ＩＩ（２５０μＬ）を添加し、３０℃で３０分間反応させ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＩＩ）、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＩＩ中、生成する過酸化水素量を、５５５ｎｍの吸収により確認した。
【０１７７】
図１４（２）に示す結果のとおり、試料中のＬ−リジンの濃度と生成する過酸化水素量による吸光度変化には相関関係が見られる。これは、試料中にカダベリンが存在していても、上記Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｉにおいてプトレシン酸化酵素により酸化され、且つ当該反応により生じた過酸化水素がペルオキシダーゼにより分解されるため、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素によるＬ−リジンの測定結果に影響は及ばないことによる。かかる結果により、プトレシン酸化酵素を先に添加することで、試料中に存在するカダベリンを除去することが可能であり、Ｌ−リジン定量に影響が出ないことが明らかとなった。
【０１７８】
実施例１３：  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌由来のＬ−リジン脱炭酸／酸化酵素の活性
上記実施例２と同様の条件で、岩手大学が保有していたＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＩＵ１２９株と、微生物株保存機関ＮＢＲＣより購入したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ  ＮＢＲＣ１００９６５、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｆｅｒｒａｒｉａｅ  ＮＢＲＣ１０６２３３およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒａｅ  ＮＢＲＣ１００９６４を培養し、粗酵素液を調製した。なお、各菌株の最適培養温度が異なるが、培養温度は２５℃とした。得られた各酵素について、上記実施例１および実施例２と同様にして、Ｌ−リジンに対する酸化酵素活性と脱炭酸酵素活性を測定した。結果を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＡＩＵ３９５株の結果と共に表１２に示す。
【０１７９】
【表１２】
2015165791.tif 000015
【０１８０】
表１２に示した結果のとおり、いずれのＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌にもＬ−リジン脱炭酸酵素活性とＬ−リジン酸化酵素活性の両方が認められた。従って、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌において、Ｌ−リジン脱炭酸／酸化酵素が保存されている可能性が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2015165791.tif 000018
【図４】
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【図５】
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【図６】
2015165791.tif 000021
【図７】
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【図８】
2015165791.tif 000023
【図９】
2015165791.tif 000024
【図１０】
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【図１１】
2015165791.tif 000026
【図１２】
2015165791.tif 000027
【図１３】
2015165791.tif 000028
【図１４】
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【配列表】
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