(57)【要約】【課題】精神症状モデル動物を用いて精神症状の治療および／または予防効果を有する物質をスクリーニングすることにより、より効率的に精神症状の治療・予防薬を開発し得る手段を提供すること。【解決手段】不安またはうつを含む精神症状の治療および／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法であって、（１）CD157/bone marrow stromal cell antigen-1(BST-1)遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、（２）該動物における該精神症状を調べる工程、（３）被検物質を適用しなかった場合と比較して、該精神症状が改善されたときに、該被検物質を該精神症状の治療および／または予防効果を有する物質の候補として選択する工程を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不安またはうつを含む精神症状の治療および／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法であって、
（１）CD157/bone marrow stromal cell antigen-1(BST-1)遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）該動物における該精神症状を調べる工程、
（３）被検物質を適用しなかった場合と比較して、該精神症状が改善されたときに、該被検物質を該精神症状の治療および／または予防効果を有する物質の候補として選択する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
精神症状が、パーキンソン病に関連する精神症状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
精神症状が、社会性忌避、知覚過敏または知覚ゲーティングの障害を更に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非ヒト哺乳動物がマウスまたはラットである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神症状モデル動物を用いた、精神症状の治療および／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病(PD)は運動性疾患であると考えられており、その診断は、一連の主要な運動症状の存在に基づいて為される(非特許文献1)。最近、散発性PDに繋がる神経変性プロセスは、黒質線条体のドーパミン作動性ニューロンの喪失と関連する特徴的な運動症状が現れるより何年も前に始まることについて、かなりの証拠が示されている。そのため、扁桃体を含む追加的な神経領域における異常は、PDの進行に関与している可能性があり、そして非運動症状(不安、うつ、嗅覚および記憶障害、睡眠異常、胃腸障害等(非特許文献2および3))の出現に寄与し得る(非特許文献4および5)。不安およびうつはPDの最初の兆候であり、大きな不安を有する患者はPDのリスクが増大している(非特許文献6-8)。前運動期を含む疾患の任意のステージの間のこれらの症状に繋がる根本的な生物学的メカニズムは分かっていない(非特許文献9)。
【０００３】
興味深いことに、PDのゲノムワイド関連研究は、日本人および英国人、フランスおよびオーストラリアからのヨーロッパ系系統の被検者、ならびにアシュケナージ系ユダヤ人を含むいくつかの集団において、ヒト染色体4p15上のCD157/BST1遺伝子におけるイントロンの単一ヌクレオチド多型(SNPs)を新たな感受性遺伝子座として特定した(非特許文献10-15)。これらの研究は、CD157がPDまたは多様なPDの症状の少なくとも一つの原因と関連する可能性を示している。
【０００４】
bone marrow stromal cell antigen-1(BST-1)は、関節リウマチ患者由来の骨髄間質細胞株での発現亢進によりプレB細胞の成長を支持する細胞表面分子として最初に単離された(非特許文献16-17)。BST-1はシグナル伝達を可能とする分子として骨髄細胞中で発現され、遺伝子クローニング後にCD157とクラスタリングされた(非特許文献18-21)。CD157/BST-1は、CD38を含むNADアーゼ/ADPリボシルシクラーゼファミリーのメンバーである(非特許文献22-25)。CD157は、液性免疫応答、好中球の移動、および造血幹細胞の支持において多様な役割を果たす。CD157は、関節リウマチにおけるB細胞の生存、白血病の進行、およびヒト卵巣癌細胞の転移等の種々の疾患の病理生理学にも関与する(非特許文献17および26-29)。加えて、CD157の新たな役割が報告されている。CD157はパネート細胞においてサイクリックADPリボースの触媒を引き起こし、それによりカロリー制限食のマウスにおいて腸幹細胞の自己複製を促進する(非特許文献30)。しかしながら、これらの報告は、PDにおける脳機能または脳欠損との関係に関する情報を殆どまたは全く明らかにしていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Samil, A., Nutt, J. G. & Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet 363, 1783-1793 (2004)
【非特許文献２】Chaudhuri, K. R., Healy, D.G. & Schapira, A. H. National Institute for Clinical Excellence Non-motor symptoms of Parkinson's disease: diagnosis and management. Lancet Neurol. 5, 235-245 (2006)
【非特許文献３】Prediger, R. D., Matheus, F. C., Schwarzbold, M. L., Lima, M. M. & Vital, M.A. Anxiety in Parkinson's disease: a critical review of experimental and clinical studies. Neuropharmacol. 62, 115-124 (2012)
【非特許文献４】Tessitore, A. et al. Dopamine modulates the response of the human amygdala: a study in Parkinson's disease. J. Neurosci. 22, 9099-9103 (2002)
【非特許文献５】Noyce, A. J. et al. Meta-analysis of early nonmotor features and risk factors for Parkinson disease. Ann. Neurol. 72, 893-901 (2012)
【非特許文献６】Negre-Pages, L. et al. Anxious and depressive symptoms in Parkinson's disease: the French cross-sectionnal DoPaMiP study. Mov Disord. 25, 157-166 (2010)
【非特許文献７】Bower, J. H. et al. Anxious personality predicts an increased risk of Parkinson's disease. Mov. Disord. 25, 2105-2113 (2010)
【非特許文献８】Frisina, P. G., Haroutunian, V. & Libow, L.S. The neuropathological basis for depression in Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 15, 144-148 (2009)
【非特許文献９】Siderowf, A. & Lang, A. E. Premotor Parkinson's disease: concepts and definitions. Mov. Disord. 27, 608-616 (2012)
【非特許文献１０】Satake, W. et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, 1303-1307 (2009)
【非特許文献１１】Tan, E. K. et al. Analysis of GWAS-linked loci in Parkinson disease reaffirms PARK16 as a susceptibility locus. Neurol. 75, 508-512 (2010)
【非特許文献１２】Saad, M. et al. Genome-wide association study confirms BST1 and suggests a locus on 12q24 as the risk loci for Parkinson's disease in the European population. Hum. Mol. Genet. 20, 615-627 (2011)
【非特許文献１３】UK Parkinson's Disease Consortium; Wellcome Trust Case Control Consortium 2, Spencer, C. C. et al. Dissection of the genetics of Parkinson's disease identifies an additional association 5' of SNCA and multiple associated haplotypes at 17q21. Hum. Mol. Genet. 20, 345-353 (2011)
【非特許文献１４】Liu, X. et al. Genome-wide association study identifies candidate genes for Parkinson's disease in an Ashkenazi Jewish population. BMC Med. Genet. 12, 104 (2011)
【非特許文献１５】Sharma, M. et al. Large-scale replication and heterogeneity in Parkinson disease genetic loci. Neurol. 79, 659-667 (2012)
【非特許文献１６】Kaisho, T. et al. BST-1, a surface molecule of bone marrow stromal cell lines that facilitates pre-B-cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5325-5329 (1994)
【非特許文献１７】Ishihara, K. & Hirano, T. BST-1/CD157 regulates the humoral immune responses in vivo. Chem. Immunol. 75 235-255 (2000)
【非特許文献１８】Itoh, M, et al. Molecular cloning of murine BST-1 having homology with CD38 and Aplysia ADP-ribosyl cyclase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203, 1309-1317 (1994)
【非特許文献１９】Okuyama, Y. et al. Human BST-1 expressed on myeloid cells functions as a receptor molecule. Biochem. Biophys. Res. Commun. 228, 838-845 (1996)
【非特許文献２０】Muraoka, O., Tanaka, H., Itoh, M., Ishihara, K. & Hirano, T. Genomic structure of human BST-1. Immunol. Lett. 54, 1-4 (1996)
【非特許文献２１】Ferrero, E., Saccucci, F. & Malavasi, F. The human CD38 gene: polymorphism, CpG island, and linkage to the CD157 (BST-1) gene. Immunogenetics 49, 597-604 (1999)
【非特許文献２２】Lee, H. C. The Cyclic ADP-Ribose/NAADP/CD38-Signaling Pathway: Past and Present. Messenger 1, 16-33 (2012)
【非特許文献２３】Guse, A. H. Second messenger function and the structure-activity relationship of cyclic adenosine diphosphoribose (cADPR). FEBS J. 272, 4590-4597 (2005)
【非特許文献２４】Malavasi, F. et al. Evolution and function of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene family in physiology and pathology. Physiol. Rev. 88, 841-886 (2008)
【非特許文献２５】Higashida, H. et al. Social memory, amnesia, and autism: brain oxytocin secretion is regulated by NAD+ metabolites and single nucleotide polymorphisms of CD38. Neurochem. Int. 61, 828-838 (2012)
【非特許文献２６】Itoh, M. et al. Deletion of bone marrow stromal cell antigen-1 (CD157) gene impaired systemic thymus independent-2 antigen-induced IgG3 and mucosal TD antigen-elicited IgA responses. J. Immunol. 161, 3974-3983 (1998)
【非特許文献２７】Malavasi, F. et al. CD38 and CD157 as receptors of the immune system: a bridge between innate and adaptive immunity. Mol. Med. 12, 334-341 (2006)
【非特許文献２８】Podesta, M. et al. Concentrative uptake of cyclic ADP-ribose generated by BST-1+ stroma stimulates proliferation of human hematopoietic progenitors. J. Biol. Chem. 280, 5343-5349 (2005)
【非特許文献２９】Ortolan, E. et al. Functional role and prognostic significance of CD157 in ovarian carcinoma. J. Natl. Cancer Inst. 102, 1160-1177 (2010)
【非特許文献３０】Yilmaz, O. H. et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature 486, 490-495 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、精神症状モデル動物を用いて精神症状の治療および／または予防効果を有する物質をスクリーニングすることにより、より効率的に精神症状の治療・予防薬を開発し得る手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく、以前に記載されたCD157/BST-1遺伝子欠損マウス(上記非特許文献26)に着目し、当該マウスを作製し種々の解析を行ったところ、当該マウスは、運動障害を有しない一方、不安やうつ等の精神症状を示すことを見出した。本発明者は更に、当該マウスで観察された精神症状が薬物治療により改善されるかどうかを確かめるために、抗不安薬として知られるジアゼパムを当該マウスに投与し、種々の行動解析を行ったところ、該薬物の使用によりマウスの行動を改善できることを見出した。
本発明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに到った。
【０００８】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］不安またはうつを含む精神症状の治療および／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法であって、
（１）CD157/bone marrow stromal cell antigen-1(BST-1)遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、
（２）該動物における該精神症状を調べる工程、
（３）被検物質を適用しなかった場合と比較して、該精神症状が改善されたときに、該被検物質を該精神症状の治療および／または予防効果を有する物質の候補として選択する工程
を含む、前記方法。
［２］精神症状が、パーキンソン病に関連する精神症状である、上記［１］に記載の方法。
［３］精神症状が、社会性忌避、知覚過敏または知覚ゲーティングの障害を更に含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］非ヒト哺乳動物がマウスまたはラットである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］非ヒト哺乳動物がマウスである、上記［４］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者が新たに知見したように、CD157/BST-1遺伝子発現不全モデル動物は運動障害を有さず、不安やうつ等の精神症状のみを呈するため、当該動物を用いることで、精神症状の治療・予防薬をより効率的にスクリーニングすることが可能となる。また、上述の通り、CD157/BST-1はPDとの関連性が示唆されているため、当該動物を用いることで、特にPDに関連する精神症状の治療・予防薬をより効率的にスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】CD157発現の免疫組織化学解析。WT(a)およびCD157ノックアウト(b)マウスの脾臓の凍結切片をマウスCD157に対するウサギ抗血清と共にインキュベートした。洗浄後、切片をAlexa Fluor 488で処理した。矢印は白脾髄を示す。バーは100μm。
【図２】体重。(a)10匹の親から生まれたCD157+/+(青色三角, n = 30)およびCD157-/-(赤色四角, n = 30)の子供の体重の曲線。(b)(a)のWT(+/+, n = 50)およびノックアウト(-/-, n = 50)マウスの離乳率。値は平均±s.e.m.である。CD157ノックアウトマウスは養育の間に神経質であり、低い離乳率を示したことに留意されたい。(c)それぞれ9週齢のCD157+/+(青色(左のバー), n = 50)およびCD157-/-(赤色(右のバー), n = 50)のオスおよびメスの重量。
【図３】運動調整テスト。(a)代表的な足跡。足跡パターンは、CD157-/-マウス(n = 20)における運動調整の障害を明らかにしなかった。(b)運動の学習・記憶は、加速(5-40rpm)ロータロッドパラダイムにおいてCD157+/+(青色三角, n = 10)およびCD157-/-(赤色四角, n = 20)マウスの両種類について同様に訓練後に増加した(3日間、1日3試行)。
【図４】WT(a)およびCD157ノックアウト(b)マウスの自発的なホームケージ活動性。活動性は7日間にわたり24時間の記録でモニタリングした。各遺伝子型におけるより高い活動レベルは、12:12明暗周期の間の暗期を示す。
【図５】MPTP投与後の黒質線条体ニューロンの変性。(a,b)MPTPまたはビヒクルを注射したCD157+/+またはCD157-/-マウスの黒質(a)または線条体(b)を含む脳切片を抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体および抗GFAP抗体で免疫染色した。黒質緻密部(SNpc)のTH+細胞数をカウントし、グラフ(a)に示す。示された値は、4度の実験の平均±s.e.m.を表す。*P < 0.05, ビヒクルを投与したマウスとの比較。スケールバー = 50μm。(c)MPTPまたはビヒクルを注射したCD157+/+またはCD157-/-マウスの線条体からのタンパク質抽出物を、示した抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。相対強度をグラフに示している。ビヒクルを投与したマウスに由来するシグナルの強度を1とした。示した値は、4度の実験の平均±s.e.m.を表す。*P < 0.05, ビヒクルを投与したマウスとの比較。
【図６】オープンフィールドテストにおけるWT(青色(左のバー))またはCD157ノックアウト(赤色(右のバー))マウスの行動。外側領域での活動性。結果は平均±s.e.m.として示している(各群についてn = 8)。
【図７】明暗選択テストにおける野生型(青色)またはCD157ノックアウト(赤色)マウスの行動。(a)最初の5分間の明るい区画での両遺伝子型の代表的な跡。明るい区画で過ごした時間のパーセンテージ(b)、2つの区画間の移動数(c)、および明るい区画内での平均スピード(d)。結果は平均±s.e.m.として示している。*P < 0.05, WT群との比較, n = 8。
【図８】オープンフィールドテストでの社会性忌避。(a)社会性忌避テストの概略図。社会的標的(雄性マウス)を10分間の慣らし期の直後に中央に置いた。WT(b)またはCD157ノックアウト(c)マウスの代表的な移動のトレース。(d)WTまたはノックアウトマウスについて20分間にわたり測定した内側領域で過ごした時間(n = 7, #P < 0.0001)。
【図９】注意および恐怖関連の特徴。(a)聴覚的驚愕反応に基づくプレパルス阻害パラダイムでは、CD157-/-マウスは0dBから85dBのプレパルス条件で驚愕強度の増加を示した(n = 10, *P < 0.05)。(b)CD157-/-マウスにおける阻害率は、85dBまでCD157+/+マウスのそれと違わなかったが、90dBのプレパルスで阻害の効果が維持された。90dBのプレパルスは、通常、CD157+/+マウスでは効果的でなかったことに留意されたい(n = 10, *P < 0.05)。(c)CD157-/-マウスのフリーズ率は、恐怖条件付けパラダイムの条件付けおよび文脈的テストフェーズにおいて有意に増加した(n = 10, *P < 0.05または**P < 0.01)。(a)-(c)において、青色(左のバー)はCD157+/+マウス、赤色(右のバー)はCD157-/-マウスに対応する。
【図１０】内部標準としてβアクチンmRNAを用いた、マウスの4つの脳領域および脾臓のCD157 mRNA発現レベルのRT-PCR解析。定量的データは、CD157/アクチンの平均±s.e.m.として表している(n = 5つの独立した実験)。****P < 0.001。用いた略称: Cbr, 大脳; Cbl, 小脳; Hyp, 視床下部; Str, 線条体; Spl, 脾臓。
【図１１】成体雄性マウスの脳におけるCD157発現。代表的な写真は、雄性CD157+/+またはCD157-/-マウスの成体の脳のCD157免疫反応性(緑色)を示す。ヘキスト染色した核を青色で示す。差し込み図は、より低倍率の写真中で示した領域の拡大図である。調べた脳の領域は、Cel(扁桃体中心核)(a)およびMePV(扁桃体内側核の後腹側部分)(b)を含んでいた。スケールバーは100μmを表す。
【図１２】雄性および雌性マウスの脳の湿重量。9-10週齢の雄性および雌性CD157+/+(青色(左のバー), n = 10)またはCD157-/-(赤色(右のバー), n = 10)マウスの脳の重量。値は平均±s.e.m.を表す。
【図１３】4つの脳領域におけるドーパミン作動性の系に関与する分子の発現。WTおよびCD157-/-成体雄性マウスの中脳(MB)、線条体(Str)、海馬(Hip)および皮質(Cx)におけるD1、D2、D3、D4およびD5ドーパミン受容体サブタイプ、ドーパミン輸送体(DAT)およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)のmRNAレベルの相対変化。データは平均±s.e.m.として表している。n = 2-3。4つの脳領域のそれぞれにおいて、青色(左のバー)はCD157+/+マウス、赤色(右のバー)はCD157-/-マウスに対応する。
【図１４】成体雄性マウスを用いたオープンフィールドでの不安および社会的選好性テスト。実験スキームは、何らの対象物なし(a)、または内側領域の中央に非社会的標的(g)または社会的(雄性マウス)標的(j)ありのオープンフィールドを示している。対象物なし(b, c)、非社会的標的あり(h, i)または社会的標的あり(k, l)のオープンフィールドでの野生型(CD157+/+)およびノックアウト(CD157-/-)マウスの10分間にわたる代表的な運動の跡を示す。対象物なしでの、内側領域で過ごした時間のパーセンテージ(d)、内側領域に入った回数(e)、および内側領域内での平均スピード(f)を示す。非社会的または社会的対象物ありでの、内側領域に入った回数(m, o)、および内側領域内で過ごした時間のパーセンテージ(n, p)を示す。青色のバーはCD157+/+マウスを表し、赤色のバーはCD157-/-マウスを表す。データは平均±s.e.m.(n = 8, *P < 0.05または**P  < 0.01)として表している。
【図１５】高架式十字迷路での成体雄性マウスの不安関連行動。(a)CD157-/-マウス(右のバー)は、CD157+/+マウス(左のバー)と比較して、オープンアーム内で有意に短い時間を過ごし(*P < 0.05)、クローズドアーム内でより長い時間を過ごした(***P < 0.005)(群あたりn = 9-10, t検定)。(b)高架式十字迷路内で動いた総距離は2群間で異ならなかった。(c)ジアゼパム(DZ, 1 mg/kg, i.p.)のCD157-/-マウスに対する効果。治療されたノックアウトマウスにおけるジアゼパムの効果は、治療していないノックアウトマウスと比較したとき、有意であった(t検定, #P <0.05)。ジアゼパムは、CD157-/-マウスについて、クローズドアーム内で過ごす時間を有意に減少させた(一元配置ANOVAの後、Bonferroniの事後検定, *P < 0.05)。(d)動いた総距離は治療群と未治療群との間で異ならなかった。データは平均±s.e.m.として表している。値は、治療していないWTマウスを100%とした。(c)-(d)において、3つのバーは左からそれぞれ、CD157+/+マウス、CD157-/-マウス、ジアゼパム治療マウスに対応する。
【図１６】3チャンバー(部屋)装置内での成体雄性マウスの社交性および社会的選好性。(a-i)実験スキーム、および、刺激となる雄性マウスを左の部屋に置いた場合の社交性タスク(b, e, h)、または、新たな標的雄性マウスを右の部屋に置いた場合の社会的新規物タスク(c, f, i)における、CD157+/+およびCD157-/-マウスの代表的な跡。CD157+/+(青色)およびCD157-/-(赤色)マウスの、ストレンジャー1および空の部屋内に入った回数(j)、またはストレンジャー1およびストレンジャー2の部屋内に入った回数(l)、社交性のパーセンテージ(k)、および社会的新規物(m)を示す。データは平均±s.e.m.(n = 8, *P < 0.05)として表している。
【図１７】尾懸垂および強制水泳テストにおけるうつ様行動。(a)尾懸垂テストにおける無動の時間は、CD157+/+マウスと比較してCD157-/-マウスでより長かった(群あたりn = 20, *P < 0.05)。(b, c)強制水泳テストにおける無動の時間またはよじ登り時間は、CD157+/+マウスと比較してCD157-/-マウスでより長かった(群あたりn = 10, *P < 0.05, ****P < 0.001)。データは平均±s.e.m.として表している。(d-f)CD157-/-マウスについて、尾懸垂(d)または強制水泳(e, f)テストにおいて、うつ様行動は、ジアゼパムの単回腹腔内投与(DZ, 1 mg/kg)の30分後に回復した。データは平均±s.e.m.として表している。値は、治療していないWTマウスを100%とした。(ANOVAの後、Bonferroniの事後検定, 群あたりn = 5-10マウス; *P < 0.05, **P < 0.01).
【図１８】扁桃体の構造および機能は、CD157-/-マウスにおいて障害されている。(a)代表的な写真は、成体雄性CD157+/+またはCD157-/-マウスの扁桃体外側基底核の前側部分におけるCD157免疫反応性(緑色, 矢印で示す)を示す。ヘキスト染色された核を青色で示す。(b)CD157+/+およびCD157-/-マウスのニッスル染色された冠状切片。黒色の四角でマークした扁桃体の拡大画像を右側に示す。CD157-/-マウスでは、扁桃体海馬野後内側部分(AhiPM)、扁桃体外側基底核の後側部分(BLP)、扁桃体−梨状葉移行野(APir)、および後内方扁桃体皮質核(PMCo)を含む扁桃体は、WTマウスのそれと比べて小さい。スケールバー: 200 μm. (c)NeuN免疫染色された細胞(ニューロン)を緑色で示し、ヘキスト染色された核を青色で示す。WTマウスと比べてCD157-/-マウスのPMCoではニューロンの分布が組織立っていないことに留意されたい。スケールバー: 200 μm. (d)オープンフィールドテストにおいて10分間、新たな環境に曝されたマウスの扁桃体のc-Fos免疫染色。冠状切片の顕微鏡写真はAlexa 488の蛍光としてc-Fos免疫反応性を示す。(e)(d)と同様にCD157+/+またはCD157-/-マウスの扁桃体におけるc-Fos免疫反応性細胞の数。データは平均±s.e.m.として表している(n = 4, ****P < 0.001)。(f)CD157+/+(青色(左のバー))およびCD157-/-(赤色(右のバー))成体雄性マウス(群あたりn = 2-3)の扁桃体におけるD1、D2、D3、D4およびD5ドーパミン受容体サブタイプ、ドーパミン輸送体(DAT)、およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)のmRNAレベルの相対変化。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、精神症状の治療および／または予防効果を有する物質のスクリーニング方法(以下、本発明の方法ともいう)を提供する。
【００１２】
本発明の方法が対象とする精神症状は、不安またはうつを含み、好ましくは不安およびうつの両方を含む。該精神症状は更に、社会性忌避、知覚過敏（特に、聴覚触覚過敏）、知覚ゲーティングの障害等の症状を含んでもよい。好ましくは、該精神症状は、不安および／またはうつを主症状とするものである。また、上記の精神症状は、PDに関連する精神症状であり得る。
【００１３】
本発明の方法は、CD157/BST-1遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする。上述の通り、CD157/BST-1は公知の糖鎖抗原であり、いくつかの哺乳動物についてそのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が知られている。例えば、その配列はPubMed Geneにおいて、MIM: 600387 ID 683(human); ID 12182 MGC:183310 (mouse)として登録されている。その他の哺乳動物についても、配列が公知である動物種における情報に基づいて、当業者は適宜その配列を決定することができる。
【００１４】
CD157/BST-1遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物とは、内在性CD157/BST-1の発現が不活性化された非ヒト哺乳動物を意味し、CD157/BST-1遺伝子がノックアウト（KO）されたES細胞から作製されるCD157/BST-1 KO動物の他、アンチセンスもしくはRNAi技術によりCD157/BST-1遺伝子の発現が不活性化されたノックダウン（KD）動物なども含まれる。ここで「ノックアウト（KO）」とは、内在性遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なmRNAを産生不能にすることを意味し、他方、「ノックダウン（KD）」とは、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害することにより、結果的に内在性遺伝子の発現を不活性化することを意味する。以下、本発明の方法で用いられるCD157/BST-1遺伝子KO/KD動物を、単に「本発明で用いられるKO/KD動物」という場合がある。
【００１５】
本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等が挙げられる。好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも精神症状モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系としてC57BL/6系統、BALB/c系統、DBA2系統など、交雑系としてB6C3F1系統、BDF1系統、B6D2F1系統、ICR系統等）およびラット（例えば、Wistar、SD等）が好ましい。
また、哺乳動物以外にもニワトリ等の鳥類を、本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
【００１６】
CD157/BST-1遺伝子ノックアウト動物の作製は、マウスでの作製方法を開示した上記非特許文献26に準じて行うことができる。該遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のCD157/BST-1遺伝子（ゲノムDNA）を常法に従って単離し、例えば、(1)そのエキソン部分やプロモーター領域に他のDNA断片（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等）を挿入することによりエキソンもしくはプロモーターの機能を破壊するか、(2)Cre-loxP系やFlp-frt系を用いてCD157/BST-1遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、(3)蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは(4)転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるDNA配列（例えば、polyA付加シグナルなど）を挿入して、完全なmRNAの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したDNA配列を有するDNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のCD157/BST-1遺伝子座に組み込ませる方法等が好ましく用いられ得る。また、内在性CD157/BST-1の機能を不活性化し得る限り、ノックアウトの手段は特に制限されないが、上述の通り該遺伝子におけるイントロンの単一ヌクレオチド多型(SNPs)がPDの感受性遺伝子座として特定されていることから（非特許文献10-15）、該遺伝子座を破壊または除去するものが好ましく例示される。
【００１７】
該相同組換え体は、例えば、胚性幹細胞（ES細胞）への上記ターゲッティングベクターの導入により取得することができる。
ES細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ICM）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ICMの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ES細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスES細胞の場合、現在、一般的には129系マウス由来のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で、例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス（C57BL/6とDBA/2とのF1）から樹立されるES細胞なども良好に用いることができる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これ由来のES細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、C57BL/6マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００１８】
ES細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはC57BL/6J（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）を用いる場合は、約2ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約8〜約10週齢程度の雌マウス（妊娠約3.5日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代線維芽細胞や公知のSTO線維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するICMを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりES細胞が得られる。
【００１９】
ES細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その1例として挙げられる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数（約50個）で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションは、例えば、G-バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましい。
【００２０】
このようにして得られるES細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるLIF（1〜10,000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5%炭酸ガス/95%空気または5%酸素/5%炭酸ガス/90%空気）で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液（通常0.001〜0.5%トリプシン/0.1〜5mM EDTA、好ましくは約0.1%トリプシン/1mM EDTA）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1〜3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【００２１】
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin, プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら, ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のターゲッティングベクターを導入されたES細胞を分化させて得られるCD157/BST-1遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおけるCD157/BST-1の細胞生物学的検討において有用である。
【００２２】
例えば、ターゲッティングベクターが、CD157/BST-1遺伝子のエキソン部分やプロモーター領域に他のDNA断片を挿入することにより、該エキソンもしくはプロモーターの機能を破壊すべく設計されたものである場合、当該ベクターは、例えば、以下のような構成をとることができる。
【００２３】
まず、相同組換えにより、CD157/BST-1遺伝子のエキソンもしくはプロモーター部分に他のDNA断片が挿入されるために、ターゲッティングベクターは、当該他のDNA断片の5’上流および3’下流に、それぞれ標的部位と相同な配列（5’アームおよび3’アーム）を含む必要がある。
【００２４】
挿入される他のDNA断片は特に制限はないが、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を用いると、ターゲッティングベクターが染色体へ組み込まれたES細胞を、薬剤耐性もしくはレポーター活性を指標として選択することができる。ここで薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子などが、レポーター遺伝子としては、例えば、β-ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子などがそれぞれ挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子は、哺乳動物細胞内で機能し得る任意のプロモーターの制御下にあることが好ましい。例えば、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）ロングターミナルリピート（LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTR、マウス白血病ウイルス（MoMuLV）LTR、アデノウイルス（AdV）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ-アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。しかしながら、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子がCD157/BST-1遺伝子の内在性プロモーターの制御下におかれるようにCD157/BST-1遺伝子内に挿入される場合は、ターゲッティングベクター中に該遺伝子の転写を制御するプロモーターは必要でない。
【００２６】
また、ターゲッティングベクターは、薬剤耐性もしくはレポーター遺伝子の下流に、該遺伝子からのmRNAの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション(polyA)シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いることができる。好ましくは、SV40由来のターミネーター、PGK遺伝子由来のターミネーターなどが用いられる。
【００２７】
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたDNAは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択（ポジティブ選択）によっては相同組換えにより標的となる内在性CD157/BST-1遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはPCR法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はHSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内在性CD157/BST-1遺伝子座にターゲッティングされた細胞はHSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される（ネガティブ選択）。あるいは、HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００２８】
ES細胞へのターゲッティングベクターの導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、DEAE-デキストラン法などのいずれも用いることができるが、上述のように、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、相同組換え体が得られる頻度は低いので、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択される。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるES細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、106〜108細胞/mlとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、ターゲッティングベクターを10〜100μg添加し、200〜600V/cmの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
【００２９】
ターゲッティングベクターが組み込まれたES細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、他のDNA断片として薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子を使用した場合は、それらの発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択することができる。例えば、ポジティブ選択用マーカー遺伝子としてnptII遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のES細胞をG418などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをトランスフォーマントの候補として選択する。また、ネガティブ選択用マーカー遺伝子として、HSV-tk遺伝子を含むベクターを用いた場合、ガンシクロビルを含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーを相同組換え体の候補として選択する。得られたコロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをPCRもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入DNAの存在を確認する。
【００３０】
導入DNAの組込みが確認されたES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のICMに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラKO動物が得られる。キメラ動物の中でES細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することによりCD157/BST-1遺伝子不全が遺伝的に固定されたKO動物を作製することができる。
【００３１】
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ES細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、8細胞期胚の透明帯内へのES細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ES細胞塊と透明帯を除去した8細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
【００３２】
いずれの場合も、宿主胚は、後述する受精卵への遺伝子導入において、採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのES細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ES細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ES細胞が129系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてC57BL/6マウス（毛色：ブラック）やICRマウス（毛色：アルビノ）を用い、ES細胞がC57BL/6もしくはDBF1マウス（毛色：ブラック）由来のものやTT2細胞（C57BL/6とCBAとのF1（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてICRマウスやBALB/cマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
【００３３】
また、生殖系列キメラ形成能はES細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、129系統由来のES細胞に対してはC57BL/6系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、C57BL/6系統由来のES細胞に対してはBALB/c系統由来の宿主胚等が好ましい。
【００３４】
採卵用雌マウスは約4〜約6週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約2〜約8ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００３５】
胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約3.5日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にターゲッティングベクターが導入されたES細胞（約10〜約15個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
【００３６】
共培養法による場合は、8細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約2.5日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは8細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地（後述）中で8細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にターゲッティングベクターが導入されたES細胞塊（細胞数約10〜約15個）を入れ、さらに上記8細胞期胚または桑実胚（好ましくは2個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００３７】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
【００３８】
生殖系列キメラの選択は、まずES細胞の雌雄が予め判別されている場合はES細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ES細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からES細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、50%以上）を選択する。例えば、129系マウス由来の雄性ES細胞であるD3細胞とC57BL/6マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるF1動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌C57BL/6マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるF1の毛色はアグーチとなる。
【００３９】
上記のようにして得られるターゲッティングベクターが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方のCD157/BST-1遺伝子のみがKOされたヘテロ接合体として得られる。相同染色体の両方のCD157/BST-1遺伝子がKOされたホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるF1動物のうちヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばF1動物の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定することができる。得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
【００４０】
ターゲッティングベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が5’および3’アームの間に挿入され、該アームの外側にネガティブ選択用マーカー遺伝子を含むDNAを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物のES細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第99巻, 第4号, 第2140-2145頁, 2002年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞を播き、培養液にウイルスベクターを加えて（所望によりポリブレンを共存させてもよい）、1〜2日間培養後、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００４１】
CD157/BST-1遺伝子をノックダウンする具体的な手段としては、CD157/BST-1のアンチセンスRNAもしくはsiRNA（shRNAを含む）をコードするDNAを、自体公知のトランスジェニック作製技術を用いて導入し、対象非ヒト哺乳動物細胞内で発現させる方法などが挙げられる。
【００４２】
目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むDNA、即ち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるDNAは、該目的のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
CD157/BST-1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスDNAとしては、CD157/BST-1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスDNAであってもよい。
【００４３】
CD157/BST-1をコードするポリヌクレオチドに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ポリヌクレオチドの相補鎖の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列である。本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
特に、CD157/BST-1をコードするポリヌクレオチドの相補鎖の全塩基配列のうち、（a）翻訳阻害を指向したアンチセンスDNAの場合は、CD157/BST-1蛋白質のN末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAが、（b）RNaseHによるRNA分解を指向するアンチセンスDNAの場合は、イントロンを含むCD157/BST-1をコードするポリヌクレオチドの全塩基配列の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスDNAがそれぞれ好適である。
【００４４】
具体的には、例えば、対象非ヒト哺乳動物がマウスの場合、上述した公知の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスDNA、好ましくは、該塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスDNAなどが挙げられる。
【００４５】
CD157/BST-1をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスDNA（以下、「本発明のアンチセンスDNA」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたCD157/BST-1をコードするDNAの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスDNAは、CD157/BST-1遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンスDNAは、CD157/BST-1遺伝子から転写されるRNA（mRNAまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、mRNAの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００４６】
本発明のアンチセンスDNAの標的領域は、アンチセンスDNAがハイブリダイズすることにより、結果としてCD157/BST-1蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。具体的には、CD157/BST-1遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端6-ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域または3’端ヘアピンループなどが、アンチセンスDNAの好ましい標的領域として選択しうるが、CD157/BST-1遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、本発明のアンチセンスDNAは、CD157/BST-1のmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるCD157/BST-1遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。あるいはDNA:RNAハイブリッドを形成してRNaseHによる分解を誘導するものであってもよい。
【００４７】
本明細書においては、CD157/BST-1のmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆる短鎖干渉RNA（siRNA）もまた、本発明で用いられるKD動物作製のために用いることができる。siRNAを細胞内に導入するとそのRNAに相同なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498(2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。
【００４８】
本発明のアンチセンスオリゴDNAは、CD157/BST-1のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。合成されたアンチセンスオリゴDNAは、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、アンチセンスオリゴRNAをコードするDNA発現ベクターを調製することができる。ここで用いられ得る発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましく例示される。また、プロモーターとしては、例えば、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）ロングターミナルリピート（LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTR、マウス白血病ウイルス（MoMuLV）LTR、アデノウイルス（AdV）由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ-アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
【００４９】
より長いアンチセンスRNA（例えば、CD157/BST-1 mRNAの相補鎖全長など）をコードするDNA発現ベクターは、常法によりクローニングしたCD157/BST-1 cDNAを、必要に応じて適当なリンカー（アダプター）配列を介して発現ベクターのプロモーターの下流に逆方向に挿入することにより調製することができる。
【００５０】
一方、siRNAをコードするDNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードするDNAとして別個に合成し、それぞれを適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。siRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該ベクターが導入された動物細胞内で、センス鎖とアンチセンス鎖がそれぞれ転写されてアニーリングすることにより、siRNAが形成される。shRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖との間に、適当なループ構造を形成しうる長さの塩基（例えば15から25塩基程度）を挿入したユニットを、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしてはU6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。あるいは、Pol II系プロモーターで、ターゲットのsiRNA配列を含むマイクロRNA（miRNA）を発現させてRNAiによりノックダウンを達成することも可能である。この場合には組織特異的発現を示すプロモーターにより、組織特異的ノックダウンも可能となる。
【００５１】
CD157/BST-1のアンチセンスRNA、siRNA、shRNA、もしくはmiRNAをコードするDNAを含む発現ベクターを細胞に導入する方法としては、標的細胞に応じて自体公知の方法が適宜用いられる。例えば、受精卵などの初期胚への導入については、マイクロインジェクション法が用いられる。また、ES細胞への導入については、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などが用いられ得る。あるいは、ベクターとしてレトロウイルスやレンチウイルスなどを用いる場合には、初期胚やES細胞にウイルスを添加して1〜2日培養し、該細胞を該ウイルスに感染させることにより、簡便に遺伝子導入を達成し得る場合がある。ES細胞からの個体再生（ファウンダーの樹立）、継代（ホモ接合体の作製）等は、本発明のKO動物において上記したと同様の方法により行うことができる。
【００５２】
好ましい一実施態様においては、CD157/BST-1のアンチセンスRNA、siRNA、shRNA、もしくはmiRNAをコードするDNAを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
【００５３】
対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはC57BL/6J（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）を用いる場合は、雌が約4〜約6週齢、雄が約2〜約8ヶ月齢程度のものが好ましく、また、約12時間明期条件（例えば7:00-19:00）で約1週間飼育したものが好ましい。
【００５４】
体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と1個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にPMSGと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にhCGと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはC57BL/6J（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約48時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約20〜約50IU/個体、好ましくは約30IU/個体、黄体形成ホルモンの投与量は約0〜約10IU/個体、好ましくは約5IU/個体である。
【００５５】
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：M16培地、修正Whitten培地、BWW培地、M2培地、WM-HEPES培地、BWW-HEPES培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下でDNA顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００５６】
一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：TYH培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下で培養した後、2個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにDNAの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００５７】
受精卵へのDNAの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてDNA溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入DNAはCsCl密度勾配超遠心または陰イオン交換樹脂カラム等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入DNAは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００５８】
DNA導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下で1細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ICR系の雌マウス（好ましくは約8〜約10週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ICR系の雄マウス（好ましくは約2ヶ月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
【００５９】
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にLHRHと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。LHRH類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。LHRHもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはICR系のマウスなど）の場合には、通常、LHRHもしくはその類縁体を投与した後、約4日目に雄マウスと交配させることが好ましく、LHRHあるいはその類縁体の投与量は、通常、約10〜60μg/個体、好ましくは約40μg/個体である。
【００６０】
通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、1細胞期〜8細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、2細胞期胚を移植するには偽妊娠後約0.5日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約2.5日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約5〜約10個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
【００６１】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはICR系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００６２】
受精卵細胞段階におけるCD157/BST-1のアンチセンスRNA、siRNA、shRNA、もしくはmiRNAをコードするDNAの導入は、導入DNAが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入DNAが染色体DNAに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（F0）の生殖系列細胞においてターゲッティングベクターが存在することは、その後代（F1）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてにターゲッティングベクターが存在することを意味する。
通常、F0動物は相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のF0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方にターゲッティングベクターを有するホモ接合体を得るためには、F0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してF1動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。1遺伝子座にのみ導入DNAが組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
【００６３】
ベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、上記KO動物の場合と同様に、CD157/BST-1のアンチセンスRNA、siRNA、shRNA、もしくはmiRNAをコードするDNAを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはES細胞を感染させる方法が挙げられる。細胞として受精卵を用いる場合は、感染に先立って透明帯を除いておくことが好ましい。ウイルスベクターを感染させて1〜2日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ES細胞であれば、上述のように選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
【００６４】
さらに、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 13090-13095, 2001に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をSTOフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よくCD157/BST-1のアンチセンスRNA、siRNA、shRNA、もしくはmiRNAをコードするDNAのへテロTg（+/-）産仔を得ることができる。
【００６５】
後述の実施例等に示されるように、本発明で用いられるKO/KD動物では、対応する野生型動物と比較して、感情および社会性の処理中枢である扁桃体(Brennan, P. A., et al., Nature 444, 308-315 (2006))の構造(特に、後内方扁桃体皮質核(PMCo)の構造)が解体しており、また、扁桃体の神経活動が機能的に障害されている。また、本発明で用いられるKO/KD動物は、運動障害を通常示さない一方、不安やうつ等の精神症状を示す。そのため、当該動物は、精神症状の治療および／または予防効果を有する物質をより効率的にスクリーニングするための手段として有用である。特に、CD157/BST-1遺伝子はPDとの関連性が示唆されているが、当該遺伝子とPDにおける脳機能または脳欠損との関係に関する情報はこれまで殆どまたは全くなかった。また、従来、PDの運動症状を呈さず、精神症状(不安、うつ)のみを示すモデル動物は存在しなかった。そのため、当該動物は、PDにおける精神症状の研究やその予防・治療薬のスクリーニングに特に有用である。
【００６６】
本発明で用いられるKO/KD動物は、内在性CD157/BST-1遺伝子の発現が不活性化されていることに加えて、CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状(不安、うつ等)と同一もしくは類似の病態を生じさせるような、1以上の他の遺伝子改変を有していてもよい。「他の遺伝子改変」としては、自然突然変異により内在性遺伝子に異常を有する自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子を導入されたTg動物、CD157/BST-1遺伝子以外の内在性遺伝子を不活化されたKO/KD動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンスDNAや中和抗体をコードするDNAの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したTg動物を含む）、変異内在性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異Tg動物などが含まれる。
【００６７】
本発明の発現不全動物に、CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状と同一もしくは類似の病態を生じさせる1以上の他の遺伝子改変を導入する方法は特に制限はなく、例えば、(1)本発明の発現不全動物と、CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状と同一もしくは類似の病態を生じさせる1以上の他の遺伝子改変を有する同種の非ヒト哺乳動物とを交雑する方法；(2) CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状と同一もしくは類似の病態を生じさせる1以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物の初期胚やES細胞を上述の方法により処理し、内在性CD157/BST-1遺伝子の発現を不活性化してKO/KD動物を得る方法；(3)内在性CD157/BST-1遺伝子が不活性化された非ヒト哺乳動物の初期胚やES細胞に、上述の方法により、CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状と同一もしくは類似の病態を生じさせる1以上の他の遺伝子改変を導入する方法等が挙げられる。また、CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状と同一もしくは類似の病態を生じさせる1以上の他の遺伝子改変が、外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚やES細胞に、該外来遺伝子等とターゲッティングベクター／アンチセンスRNAもしくはsiRNAをコードするDNAとを同時にもしくは順次導入してKO/KD動物を得てもよい。
【００６８】
本発明で用いられるKO/KD動物は、CD157/BST-1の活性調節が関与する精神症状と同一もしくは類似の病態を生じさせる1以上の非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味する。このような処理としては、例えば、不安やうつ等の精神症状を生じさせる薬剤の投与、新生仔期扁桃体損傷等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
次に、本発明の方法の各工程について説明する。本発明の方法は、（１）CD157/ BST-1遺伝子発現不全非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程、（２）該動物における不安またはうつを含む精神症状を調べる工程、および（３）被検物質を適用しなかった場合と比較して、精神症状が改善されたときに、該被検物質を精神症状の治療および／または予防効果を有する物質の候補として選択する工程を含む。
【００７０】
工程（１）において、CD157/BST-1遺伝子発現不全動物に対して被検物質が投与される。被検物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質、DNAライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。被検物質の投与方法は特に制限されない。例えば、被検物質を固形、半固形、液状、エアロゾル等の形態で経口的もしくは非経口的（例：静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、皮下、皮内、気道内等）に投与することができる。被検物質の投与量は、化合物の種類、動物種、体重、投与形態などによって異なり、例えば、0.01〜1000 mg/kg/日の範囲から適宜選択することができ、当該量を1日1回ないし数回に分けて投与することができる。投与期間も特に制限されないが、例えば1〜14日間連日もしくは2〜4日おきに投与することができる。
【００７１】
工程（２）において、被検物質を投与された該動物において不安またはうつを含む精神症状が調べられる。精神症状の評価法としては、薬物スクリーニングの目的とする精神症状に応じて、行動薬理学の分野で慣用の任意の行動試験等を用いることができる。具体的には、例えば、不安障害の評価法として、オープンフィールドテスト、明暗選択テスト、高架式十字迷路テスト等が挙げられ、うつ等の陰性症状（感情鈍磨、意欲の低下、疎通性障害、社会性忌避など）の評価法として、社会性行動試験による社会的行動障害を指標にした行動評価、強制水泳テスト、テイルサスペンションテストなどによる意欲低下を指標にした行動評価等が挙げられ、知覚過敏や知覚ゲーティングの障害の評価法として、驚愕反応およびプレパルス阻害による情報処理障害を指標とした行動評価等が挙げられるが、それらに限定されない。後述の実施例も参照されたい。
【００７２】
工程（３）において、工程（２）で調べた精神症状の程度を、被検物質を適用しなかった動物における精神症状の程度と比較する。比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。その結果、被検物質を適用しなかった場合に比べて、精神症状が改善されたときに、該被検物質を精神症状の治療および／または予防効果を有する物質の候補として選択する。
【実施例】
【００７３】
以下において、実験例および実施例により本発明をより具体的に説明するが、この発明はこれらに限定されるものではない。
【００７４】
以下の研究では、CD157/BST-1の神経機能を明らかにするために、我々は成体CD157ノックアウト(CD157-/-)マウス(上記非特許文献26)の運動および社会的行動を特徴付けることを試みた。CD157-/-マウスは、扁桃体の組織学的解体および機能障害に起因する可能性がある重度の不安関連行動およびうつ様行動を示し、これらは薬剤治療によりレスキューできたことを我々は示す。
【００７５】
［材料および方法］
本研究で用いた材料および方法を以下に示す。
【００７６】
マウス
CD157ノックアウト(CD157-/-)マウスは以前に記載されている(上記非特許文献26)。凍結CD157+/-受精卵母細胞を常法により偽妊娠マウスに接種した。子孫の遺伝子型を以前に記載されたようにして決定した(上記非特許文献26)。ホモ接合型の変異マウスを交配させることによりCD157-/-マウスを維持した。C57BL/6野生型(WTまたはCD157+/+)およびCD157-/-マウスは、動物センターにおいて、おがくずの寝床ならびに不断の食餌および水を有する標準的なマウスケージ(300mm x 160mm x 110mm)中で標準的な条件(22℃;12hの明暗周期, 午前8時45分に光を点ける)下で維持した。繁殖用のペアを別々に維持した(ケージあたり1ペア)。全ての動物実験は、日本国の文部科学省による研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針に従って行い、金沢大学動物実験委員会により承認された。
【００７７】
ウサギポリクローナル抗CD157抗体
マウスCD157(BST-1)を特異的に認識する抗体を本研究で用いた。マウスCD157とヒトIgG1のFc部分とのキメラ融合タンパク質(mBST-1Fc)でウサギを免疫することにより抗マウスCD157抗血清を調製し、ヒトIgGおよびマウスCD38に対する反応性は、それぞれヒトIgGセファロース6およびトランスフェクタントBAFmCD38により吸収した(Kajimoto Y, et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 219, 941-946 (1996))。脳の組織化学染色を伴う一部の実験では、CD157 mAb (clone BP-3; Becton Dickinson, NJ, USA)も用いた。両抗体から同一の染色結果が得られた。
【００７８】
成体マウスを、PBS中の4.0%パラホルムアルデヒドの経心腔的かん流により屠殺した。続いて脾臓を取り出して一晩固定し、15%および30%ショ糖を含むPBS中で凍結保護した。凍結ミクロトームを用いて脾臓を20μmの厚さの切片に切断した。切片をPBS中で洗浄してOCT化合物を洗い流し、PBS中の0.3% TritonX-100を用いて30分間の透過処理を行った。続いて、切片を室温で1時間、0.3% TritonX-100および3% BSA(ウシアルブミン, F−V, pH 5.2; ナカライテスク, 京都, 日本)を含むPBS中でブロッキングし、一次抗マウスCD157抗血清(1:100)と共に4℃で2晩インキュベートした。切片をPBS中の0.1% Tween 20で洗浄し、Alexa Fluor 488(Invitrogen Molecular Probes; 東京, 日本, 1:200)およびDAPI(同仁化学研究所; 熊本, 日本, 1:2000)と共に室温で1時間インキュベートした。図1に示すように、画像化は、オリンパスIX71蛍光顕微鏡(東京, 日本)を用いて行った。
【００７９】
成長および離乳率
雌雄両方の体重を約30匹の子供を含む10ペアについて毎日測定した(Jin, D. et al. Nature 446, 41-45 (2007))。21日齢において子供を離乳のために取り除き、同性の兄弟姉妹のペアで飼った。その後、生存能力を評価した(図2aおよびb)。若年の雄性成体(8-10週齢)の体重を図2cに示す。
【００８０】
足跡パターン解析
足跡テストを用いてWTマウスとCD157-/-マウスの足取りを比較した。後足および前足を無毒性の黒色塗料でコーティングし、該動物を長さ50cm、幅10cmの通路(15cmの高さの壁)に沿って白色の新しい紙上を歩かせた(Nobrega, C., et al. PLoS One 8, e52396 (2013))。後足の跡の中心と先行する前足の跡の中心との間の距離を連続する4ステップにわたって記録し、走行の始まりおよび終わりの足跡を除外した。2人のオペレータが20匹のマウスについて全ての足跡記録を行った。CD157-/-マウスの代表的な足跡を図3aに示す。
【００８１】
ロータロッドテスト
運動調整／運動学習能力を調べるために、加速ロータロッドパラダイムを用いた(Yoshihara, T. et al., J. Biol. Chem. 284, 12550-12561 (2009); Ito, M. et al. PLoS One 7, e29873 (2012))。300秒の加速プログラム(5rpmから40rpm)を用いて、連続する3日間に1日あたり3試行でマウスをテストした。ロッドから落下するまでの時間を記録した(図3b)。
【００８２】
ホームケージ活動性
慣れ親しんだ環境でのマウスの自発活動をホームケージ活動性モニタリングシステム(O'Hara & Co., LTD., 東京, 日本)を用いて記録した。12時間の明暗周期およびLED照明をプログラムした(明期: 08:45-20:45; 暗期: 20:45-08:45)。各マウスをケージ内で別々に飼い、マウスは不断で水および餌のペレットにアクセスできた。各ホームケージの床サイズは17 x 25 cmであり、明期には50ルクスで照明した。マウスの動きを24時間記録した(Steele, A. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 104, 1983-1988 (2007))(図4)。
【００８３】
パーキンソン病の薬理学的モデル
1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)(Sigma, St Louis, MO, USA; 20 mg/kg)を2時間間隔で4回腹腔内注射することにより、PDのマウスモデルを作出した(Kuhn, K., et al. Eur J Neurosci 17: 1-12, (2003))(図5)。MPTP注射の4日後に免疫組織化学解析および生物学的解析を行った。簡潔に述べれば、凍結スタットを用いて脳を10μmの厚さの切片に切断した。0.3% TritonX-100および3% BSAを含むPBSで切片を室温にて1時間ブロッキングし、一次抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体(Sigma; 1:1000)および抗GFAP抗体(Millipore, Billerica, MA, USA; 1:500)と共に4℃で一晩インキュベートした。続いて、切片をPBS中の0.3% TritonX-100で洗浄し、Alexa Fluor 488(Invitrogen Molecular Probes; 1:200)およびCy3標識IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA; 1:100)と共に室温で1時間インキュベートした。画像化は、Nikon EZ-C1レーザー共焦点顕微鏡(東京, 日本)を用いて行った。以前に記載されたようにして(Takano K. et al. Am. J. Physiol Cell Physiol. 292, C353-C361 (2007))、代表的な2つの切片(ブレグマ -3.16および-3.64 mm)において黒質緻密部(SNpc)中のTH+神経細胞をカウントした。統計解析は、スチューデントのt検定またはBonferroni/Dunn検定とそれに続く一元配置ANOVAを用いて行った。
【００８４】
ウエスタンブロット解析のために、線条体からの脳試料を1% NP40、0.1% SDSおよび0.2%デオキシコール酸塩を含む緩衝液中で可溶化し、それを以下の抗体を用いるウエスタンブロットに供した: TH(Sigma)、GFAP(Millipore)およびβアクチン(Sigma)。ECLシステム(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA)を用いて一次抗体の結合を可視化した。各バンドの定量化はImage J (version 1.42, Wayne Rasband, National Institutes of Health, MD, USA)を用いて行った(図5)。
【００８５】
オープンフィールドテスト
オープンフィールドテストは、自発および不安行動による過活動を測定する(Silverman, J. L., et al., Neuropharmacol. 64, 268-282 (2013))。オープンフィールドボックスは四角いボックス(600mm x 600mm x 200mm)からなり、木製のボックスの内部がポリプロピレンシートで覆われている。中央はアリーナになっている(300mm x 300mm)。各動物をボックス内に10分間置く。ボックス内での全体的な活動性を測定し、中央のアリーナにいる時間の量およびそこでの移動距離を記録する。フィールド内の移動距離はデジタルビデオシステムおよびANY-mazeソフトウェア(Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA)を用いて記録する。このパラダイムは、オープンの危険な外界に曝されるよりも保護的な壁の近くにいることをマウスは自然に好むであろうという考えに基づく(図6および14)。各試行後に、湿ったタオルおよび1%次亜塩素酸ナトリウム、そしてその後70%アルコールでテストチャンバーを洗浄した(Liu, H. X. et al. Nat. Commun. 4, 1346 (2013))。
【００８６】
明暗選択テスト
明暗テストチャンバーを用いて明暗選択を測定した。部屋は2つの仕切られた部屋からなる。一つの部屋は明るく照明され(250ルクス)、他方は暗かった(2ルクス)。マウスを明るいアリーナに置き、2つの部屋間で600秒間自由に動けるようにした。明暗選択テストは、マウスの抗不安的または不安的な活動性を予測するために有用であり得る。該テストは、事前に動物を訓練する必要なく、迅速かつ容易に用いることができるという利点を有する。テストボックス(200mm x 600mm x 200mm)は、小さな暗い安全区画(3分の1, 200mm x 200mm x 200mm - 暗いボックス)および大きな照明された嫌悪区画(3分の2, 400mm x 200mm x 200mm - 明るいボックス)からなる。各雄性マウスを明るい部屋の中央に置き、2つの部屋間で10分間マウスが自由に走れるようにした。確実性のために、マウスを暗い部屋に最初に置くという逆のパラダイムも行った。ANY-mazeビデオシステムを用いて試行を10分間記録した。明るい部屋に入るまでの時間(4つ全ての足が入ることにより定義する)、過ごした時間、エントリー、およびその中での移動距離を記録した。それを図7に示す。
【００８７】
高架式十字迷路
高架式十字迷路は不安様行動の研究において広く使われている(Lister, R.G. Psychopharmacol. (Berl) 92, 180-185 (1987))。迷路装置は床から50cmの高さとし、中央のプラットフォーム(5 x 5 cm)、そこから互いに反対の方向に伸長する2つのオープンアーム(5 x 25 cm)および2つのクローズドアーム(5 x 25 cm, 15cmの高さの透明な壁を有する)からなる。各行動テストの少なくとも30分前に、慣らすためにマウスをテストルームに入れた。各セッションの開始時に、マウスをオープンアームに向くように中央のプラットフォームに置き、5分間自由に迷路を探索できるようにした(図15)。
【００８８】
オープンフィールドでの社会的選好性タスク
このテストはオープンフィールドチャンバー中で行った。マウスを最初に10分間オープンフィールド中に置いた(慣らしセッション)。慣らしの後、マウスをホームケージに戻し、無生物の対象物をフィールドの中央に置いた。次のテスト(セッション1)では、次の10分間、新たな非社会的対象物(ワイヤケージ)を有するオープンフィールドチャンバー中にマウスを再び置いた。その後、新たなワイヤケージ(70mm x 90mm x 70mm, 5mm間隔の柵)の下で非社会的対象物をC56BL/6ナイーブ雄性マウスに変えた。テストマウスを再びアリーナに10分間入れた。内側領域で過ごした時間のパーセンテージおよび内側領域へのエントリー回数をデジタルビデオシステムおよびANY-mazeビデオ追跡ソフトウェアを用いて解析した(図14g-p)。各テストの終わりに、オープンフィールドボックスおよび無生物の対象物を、1%次亜塩素酸ナトリウム、次いで70%エタノールでスプレーし、紙タオルで綺麗に拭いた。セッション間の平均の時間間隔は2-3分であった。
【００８９】
社交性および社会的新規物に対する選好性
3チャンバー(部屋)ボックスを用いて社会的行動テストを行い、被検マウスが見知らぬマウスと時間を過ごす傾向があるかどうかを評価した。装置は長方形の、透明なポリカーボネートで覆われた3部屋のボックスであった。仕切り壁は、各部屋へのアクセスを可能とするドアを有した。各テストの終わりに、装置を1%次亜塩素酸ナトリウムおよび70%エタノールでスプレーし、紙タオルで綺麗に拭いた。社会的行動テストのために以下の手順を用いた。(A)慣らし; テストマウスを最初に真ん中の部屋に置き、アリーナの全ての部分に自由にアクセスできるようにして5分間探索させた。2つの側部の部屋の各々は、空のワイヤケージ(70mm x 90mm x 70mm, 5mm間隔の柵)を含んでいた。(B)社交性; 慣らしの後、馴染みのないマウス(ストレンジャー1; ナイーブC57BL/6のオス)をワイヤケージ(左の部屋内)に置いた。他のワイヤケージ(右の部屋内)は空とした。テストマウスを社会的テストボックスの中央区画に置き、2つの側部の部屋内へ自由にアクセスできるようにして5分間のセッションの間探索させた。各部屋内で過ごした時間の量、および各部屋へのエントリー回数をデジタルビデオシステムおよびANY-mazeソフトウェアを用いて測定した。
【００９０】
社会的新規物に対する選好性および忌避
5分間の社交性テストの終わりに、各マウスを3つ目の5分間セッションで更にテストし、新たなストレンジャーと時間を過ごすことの選好性を定量化した。新たな馴染みのないマウス(図16c, ストレンジャー2; ナイーブC57BL/6のオス)を、以前の5分間のセッションの間は空であったワイヤケージ(右の部屋内)内に置いた。テストマウスは、最初の既に調べて今や馴染みのあるマウス(ストレンジャー1)と新たな馴染みのないマウス(ストレンジャー2)との間での選択を行う。上述の通りに、各部屋で過ごした時間の量、および各部屋へのエントリー回数をデジタルビデオシステムおよびANY-mazeソフトウェアを用いて測定した。これらのデータを図16に示す。各テストの終わりに、3チャンバーボックスを上述の通りに洗浄した。セッション間の平均の時間間隔は2-3分であった。
【００９１】
社会性忌避テスト
新たなC57BL/6マウスに対する社会性忌避行動を2ステージの社会的交流テストで測定した(Chaudhury, D. et al. Nature 493, 532-536 (2013))。最初の10分間のテスト(標的なし)では、実験マウスを、アリーナの中央に配置されたワイヤメッシュケージ(70mm x 90mm x 70mm, 5mm間隔の柵)を含む四角形のアリーナ(600mm x 600mm)を自由に探索させた。次の20分間のテストでは、ワイヤメッシュケージ内に馴染みのないC57BL/6雄性マウスを有するアリーナ内に実験マウスを戻した。ビデオ追跡ソフトウェア(ANY-maze)を用いて、実験マウスが「交流領域」(300mm x 300mm)で過ごした時間の量を測定した(図8)。
【００９２】
聴覚的驚愕反応およびプレパルス阻害
驚愕反射測定システムを用いて(O'Hara & Co., 東京, 日本)、驚愕反応およびプレパルス阻害を測定した。マウスをプラスチックシリンダー内に置き、そこで10分間平静にした後にテストセッションを開始した。ホワイトノイズ(120db, 40ms)を全ての試行のための驚愕刺激として用いた。プレパルス刺激の開始で始まる140msの間、驚愕反応を記録した。各部屋におけるバックグラウンドのノイズレベルは70dBであった。驚愕およびプレパルス阻害のパラダイムでは、プレパルス音が驚愕刺激の100ms前に与えられる。プレパルス音の強度は、0、75、80、85および90dBであり、各音は120dBの驚愕音と別々にペアリングした。図9aおよびbに示されるように、0dBのプレパルスおよび120dBの驚愕音のペアでの反応を聴覚的驚愕反応として採用した。
【００９３】
恐怖条件付け
文脈的および手掛かり恐怖条件付けをO'Hara & Co., LTDの機器を用いて測定した。簡潔に述べれば、訓練およびテストは3回の試行からなる。訓練の間、マウスは300秒間テストチャンバー内に置かれる。60dBのホワイトノイズ(条件付けられた刺激)を30秒間与えた後、条件付けられていない刺激の役割となる穏やかな(2秒, 0.3mA)電気的足部ショックを与えた。最初の刺激と同じ持続期間の更なる2回の音ショック刺激のペアを与えた。文脈的テストは、同じ部屋内での300秒間の条件付けの24時間後に行った。文脈の変更を伴う手掛かりテストは、異なるテクスチャおよび異なって照明されるボックスを用いて文脈的テストの24時間後に行った。手掛かり音(30秒)を300秒のテスト期間で2度与えた。動物の動きを天井のビデオカメラを用いて記録し、Image Jに基づくオリジナルプログラムを用いてフリーズの持続期間を解析した。結果を図9cに示す。
【００９４】
尾懸垂テスト
テストは以前に記載された方法に従って行った(Steru, L., et al., Psychopharmacol. (Berl), 85, 367-370 (1985))。マウスを尻尾で床の上に個別にぶら下げ、尻尾の先端からおよそ1-2cmの位置で粘着テープで貼り付けた。無動の継続時間を6分間測定した。無動の継続時間は、マウスが完全に動かずに受動的にぶら下がっている時間として定義した。結果を図17aに示す。
【００９５】
強制水泳テスト
テストは記載された方法に従って行った(Porsolt, R. D., et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 229, 327-336 (1977))。10cmの深さまで水(25 ± 1℃)で満たしたシリンダー(高さ25cm, 直径15cm)内にマウスを個別に6分間置いた。最初の2分の活発な活動の後、無動の総継続時間をテストの最後の4分の間に記録した。無動の継続時間は、マウスが受動的に浮いたままであり、逃げる試みをすることなく、水の上に頭を保つ遅い動きのみを示す時間として定義した(図17b)。
【００９６】
よじ登り行動の継続時間は、6分の間に、マウスが、前肢をシリンダーの壁に寄り掛けて、強く手足をばたつかせる動きをしている時間として定義した(図17c)。
【００９７】
薬物治療
ジアゼパムは和光純薬工業株式会社(大阪, 日本)から購入した。ジアゼパムを0.2%のTween 80を用いて蒸留水中に溶解した。ジアゼパムは1mg/kg(i.p., 5ml/kg体重)の用量で投与した。全ての薬理学的データを図15c, dおよび17d-fに示す。
【００９８】
脳のRT-PCR
TRIzol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、マウス脾臓および脳の小区域からトータルRNAを単離した。製造者のプロトコールに従ってReverTra Ace-α(東洋紡, 大阪, 日本)を用いて、0.5μgのトータルRNAからcDNAを合成した。以下の条件を用いて、Mastercycler ep gradient S(Eppendorf, Hamburg, Germany)でPCRを行った: 94℃で30秒間を1サイクル、続いて94℃で30秒間、58℃で30秒間および72℃で40秒間を25または30サイクル、そして72℃で1分間の最後の伸長ステップ。用いたプライマー配列は報告されている(Itoh, M. et al. J. Immunol. 161, 3974-3983 (1998))。RT-PCR産物を1.2%ゲルでの電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。Image Jを用いて写真からバンド強度を測定した。同じ試料のβアクチン強度で割ったCD157強度としてデータを示す(図10)。
【００９９】
脳の免疫組織化学
免疫組織化学手順の前に、0.1M PBSで脳切片を洗浄し、0.3% Triton X-100(Sigma)および10% 正常ウマ血清(Invitrogen)を含むPBS中で1時間インキュベートした。その後、切片を抗NeuN(1:200; Chemicon, Temecula, CA, USA)抗体と共に室温で12時間インキュベートした。試料をPBSで洗浄し、Alexa Fluor 488(1:200)と共に室温で3時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、核の可視化のために切片を10μg/ml Hoechst 33258溶液(Sigma)と共にインキュベートした。画像化はAxio Observer.A1 (Zeiss, Jena, Germany)を用いて行った。その後、切片をPBS中の0.3% TritonX-100で洗浄し、Alexa Fluor 488(1:200)およびDAPI(同仁化学研究所; 1:2000)と共に室温で1時間インキュベートした。その後、切片を0.3% TritonX-100を含むPBSで洗浄し、アンチフェードと共にカバースリップを載せた(Sharma, M. et al. Neurol. 79, 659-667 (2012))。画像化はオリンパスIX71顕微鏡を用いて行った。画像をMetaMorphソフトウェア(Molecular Devices, Downingtown, PA, USA)(Higashida, C. et al. Science 303, 2007-2010 (2004))を用いて解析し、それを図11および18a,cに示す。
【０１００】
脳の湿重量
マウスの頭をギロチン切断し、頭蓋骨を除去した。嗅球および視神経を除去した。残りの脳試料の重量を測定した(図12)。
【０１０１】
ニッスル染色
冷凍した脳切片を室温で1時間、0.5%チオニンアセタート(ナカライテスク)で染色した。図18bに示す通り、低倍率画像をBZ-9000 generation II顕微鏡(キーエンス, 大阪, 日本)を用いて撮影した。
【０１０２】
c-Fos免疫反応性
10分間のオープンフィールド試験の後、PBS中の4% パラホルムアルデヒドでの一晩の脳の固定のためにマウスを直ちに屠殺した。脳を15%および30%ショ糖を含有するPBS中に凍結保護した後、凍結ミクロトームを用いて脳を20μmの厚さに切断した。切片を上述の通りに処理し、一次抗体c-Fos(Santa Cruz, Dallas, TX, USA; 1:200)と共に4℃で一晩インキュベートした。脳切片を、Alexa Fluor 488(1:200)およびDAPI(1:2000)により室温で1時間染色した。その後、0.3% TritonX-100を含むPBSで切片を洗浄し、アンチフェードと共にカバースリップを載せた。画像化はオリンパスIX71顕微鏡を用いて行った。MetaMorphソフトウェアを用いて画像を記録した。以下のパラメータ: 蛍光の直径 < 13.5μmおよび強度 > 498.6を用いてc-Fos陽性細胞を手動でカウントした。蛍光の平均強度は、5倍の範囲内であった(図18dおよびe)。
【０１０３】
ドーパミン系の評価
ドーパミン作動性の系の評価のために、mRNAを定量的リアルタイムPCRを用いて調べた。脳のトータルRNAを10-11週齢のC57BL/6 WTおよびCD157-/-マウスの脳の小区域から抽出した。製造者の指示に従ってSuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen)を用いてcDNAを作製した。Thermal Cycler Dice Real Time System Single (TAKARA BIO)にて、最適化された熱サイクルでSYBR green (SYBR Premix Ex Taq II; タカラバイオ株式会社, 京都, 日本)を用いて各mRNAの発現レベルを評価した。GAPDH mRNAを全ての試料から増幅して発現レベルを正規化した。以下のプライマーを用いた:
D1: 5'-GCCGATTTTCAGAAGGCATTCTCG(配列番号:1)、および
5'-CCAGATTACAGTCCTTGGAGATGG(配列番号:2);
D2: 5'-CTGTATCACGAGAGAAGGCTTTGC(配列番号:3)、および
5'-GATGTCACAGTGAATCCTGCTG(配列番号:4);
D3: 5'-GTCTATGCCAGGATCTACATGGTC(配列番号:5)、および
5'-CAGGTCTGATGCTGATACACTG(配列番号:6);
D4: 5'-AACCGAGACTATGTGGTCTACTCG(配列番号:7)、および
5'-CCAGTAAAGCAGTAGCATGAGC(配列番号:8);
D5: 5'-ATCTACCGCATTGCACAGGTTCAG(配列番号:9)、および
5'-ATCACGGACAGGGTTTTGAA GACC(配列番号:10);
DAT: 5'-CTGCCTGGTGCTGGTCATT(配列番号:11)、および
5'-ATCCACACCACCTTCCCTGA(配列番号:12);
TH: 5'-GCCAAGGACAAGCTCAGGAAC(配列番号:13)、および
5'-ATCAATGGCCAGGGTGTACG(配列番号:14);
GAPDH: 5'-ATGAATACGGCTACAGCAACAGG(配列番号:15)、および
5'-CTCTTGCTCAGTGTCCTTGCTG(配列番号:16)
(図13および18f)
【０１０４】
統計解析
データは平均±s.e.mで表している。2群(CD157+/+またはCD157-/-)間の比較は、スチューデントのt検定または一元配置ANOVAとそれに続く事後Bonferroni/Dunn検定を用いて評価した。全ての解析において、P < 0.05を統計的に有意とした。
【０１０５】
［結果］
【０１０６】
一般的健康および自発運動
凍結CD157+/-卵から新たに繁殖させたCD157-/-マウスを用いた(上記非特許文献26)。これらのマウスはCD157タンパク質を発現せず、白脾髄においてCD157免疫応答を示さなかった(図1)。CD157-/-マウスは、3-4週齢の子供の離乳率は低かったが(図2b)、野生型(CD157+/+またはWT) C57BL/6マウスと比較して正常に成長し、生存可能であった(図2a-c)。CD157-/-マウスにおいて、自傷的な過度のグルーミング行動に起因する皮膚損傷は見られず、反復行動を示さなかった。
【０１０７】
CD157-/-マウスは14月齢まで健康で体性機能ないし身体の障害を有しなかった。CD157-/-マウスは正常に歩いた(図3a)。8-10週齢のCD157+/+およびCD157-/-の雄性マウスを連続する3日間ロータロッド試験に供したとき、運動調整および学習に差異はなかった(図3b)。回転するロッドから落下するまでの時間は2つの遺伝子型間で同様であり、前後の肢は弱くなっておらず、協調運動機能障害もないことを示唆した。
【０１０８】
CD157-/-マウスの14月齢までの成長の間に、麻痺、振戦、硬直、姿勢の異常、および不随意運動は観察されなかった。ホームケージ活動性のモニタリングは、8週齢のWTマウスとノックアウトマウスとの間で昼夜のリズムは同様であったことを明らかにした(図4)。しかしながら、昼間および夜間の両方においてCD157-/-マウスの活動レベルは、CD157+/+マウスの活動レベルの約40±4%であった(各遺伝子型についてn = 8, t = 7.575, P < 0.05)。
【０１０９】
また、3月齢のマウスの黒質および線条体における1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6 テトラヒドロピリジン (MPTP)処理によるチロシンヒドロキシラーゼ陽性細胞の喪失は、2つの遺伝子型の間で差異は観察されなかった(図5)。この結果は、8-12週齢のCD157-/-マウスが、MPTP誘発PDマウスモデルにおいて通常観察される黒質線条体の変性について同じ感受性を示すことを示唆している。従って、CD157-/-マウスは、運動の学習・記憶、および誕生から成年までの機能において殆どまたは全く障害は有しないが、一つの場所に長い期間居座り、これは日常生活での運動活動の減少を実証していると我々は結論付けた。従って、新規のオープンフィールド環境での運動および心理的反応を我々は評価した(図14a)。
【０１１０】
不安関連行動
オープンフィールド装置内での観察された移動経路から、成体ノックアウト雄性マウスは、8-10週齢のWTのオスよりも探索的行動が少なく、内側領域における探索的行動が特に少なかった(図14bおよびc)。外側領域では行動の違いは殆どまたは全く観察されなかったが(図6)、CD157-/-マウスでは内側領域にいる時間のパーセンテージが減少していた(n = 8, **P < 0.01, t = 3.144; 図14d)。CD157-/-マウスは、CD157+/+マウスよりも内側領域に入る回数が少なかった(n = 8, t = 2.613, *P < 0.05; 図14e)。対照的に、内側アリーナ内でのCD157-/-マウスの平均スピードは、WTマウスのそれよりも大きかった(n = 8, *P < 0.05, t = 2.127; 図14f)。これらの結果は、オープンフィールド中で危険に曝されるよりも保護的な壁の近くを好むことにより実証されるように、CD157-/-マウスは新たな環境においてより高い程度の不安を有することを示している。
【０１１１】
明暗箱テストを用いてこの不安関連行動を更に調べた(図7)。明るいアリーナから暗いアリーナへの移動は有意に異なった。CD157-/-マウスは10分間のテストの間に2.2±0.4回の平均頻度で暗室に入ったが、CD157+/+マウスは同じ長さの時間の間に8.6±2.4回の頻度で暗室に入った(n = 8, P < 0.01; 図7c)。明るい領域にいる間に、CD157-/-マウスは、CD157+/+マウスよりも有意に遅く移動した(n = 8, P < 0.05, 図7d)。反対に、実験を始める前にマウスを最初に暗いアリーナに置いた場合、CD157-/-マウスはより長い期間にわたって暗いアリーナに居座った(n = 10, データ示さず)。これらの結果は、CD157-/-マウスは新たな条件に移るときに不安を経験することを示している。
【０１１２】
我々は次に、高架式十字迷路テストを行った(図15a, b)。CD157-/-マウスは、CD157+/+マウスと比較して、オープンアームで過ごす時間が有意に短く(n = 9-10/群, t = 2.295, P < 0.05)、クローズドアームで過ごす時間が有意に長かった(t = 3.75, P < 0.005)。十字迷路装置内での移動距離は2群間で差異はなく、CD157-/-マウスが不安を経験していたことを示している。
【０１１３】
社交性および社会性忌避
我々は同じオープンフィールド装置にて社会的交流および選好テストを行った。最初に、非社会的対象物を用いたところ(図14g-i)、CD157-/-雄性マウスは内側領域に入ることが減少しており、より大きな程度の不安を示したことが確認された(n = 8, t = 4.593, P < 0.01; 図14m)。内側領域内で非社会的対象物の近くで過ごした時間のパーセンテージは、CD157+/+マウスよりもCD157-/-マウスで有意に短かった(n = 8, t = 3.822, P < 0.01; 図14n)。未知の雄性マウスを社会的刺激として用いた場合(図14j-l)、ノックアウトマウスは、非社会的対象物への関心と比べて増大した関心を示した(図14h, i,k, l)。しかしながら、WTマウスと比較して、CD157-/-マウスが内側領域に入ることは少なく(n = 8, t = 2.333, P < 0.01; 図14o)、内側領域で過ごす時間は短かった(n = 8, t = 3.135, P < 0.05; 図14p)。オープンフィールド内での2ステップ社会的交流テストを用いてCD157-/-マウスにおける社会性忌避について同様のデータを得た(n = 6-7, P < 0.001, t検定, 図8)。
【０１１４】
我々は次に、3チャンバーボックステスト(図16a)を用いてCD157+/+およびCD157-/-成体雄性マウスの社交性(図16b, e, h)および社会的新規物に対する選好性(図16c, f, i)を評価した。これらの実験のために、標的雄性マウスを左の部屋に置き(ストレンジャー1, 図16b)、かつ第2の標的雄性マウスを右の部屋に配置した(ストレンジャー2, 図16c)。慣らし期の間、マウスは有意な左右選好性を示さなかった(図16dおよびg)。社交性セッションの間(図16eおよびh)および社会的新規物に対する選好性セッションの間(図16fおよびi)の両種類のマウスについての代表的な跡を示す。CD157-/-およびCD157+/+マウスがストレンジャー1の部屋に入る回数には差異がなかった(n = 8, 図16j)。社会的標的(ストレンジャー1)を含む部屋に入る回数は、空きの部屋に入る回数よりも同等にかつ有意に多かった(F1,14 = 73.673, P < 0.01)。社交性のパーセンテージ(これは、マウスが標的の部屋に滞在する時間のパーセンテージから見積られる)もまた、両遺伝子型について同等に高かった(n = 8, 図16k)。
【０１１５】
第2の標的マウスを右の部屋に置いた場合、CD157-/-マウスが新たな社会的標的(ストレンジャー2)の部屋に入る回数は、CD157+/+マウスが入る回数よりも少なかった(n = 8; 遺伝子型の影響, F1,14 = 11.057, P < 0.05; 図16f, i, l)。また、両マウス系列について、入る回数は、ストレンジャー1を含む部屋に入る回数よりもはるかに多かった(P < 0.05, 図16l)。ストレンジャー2と過ごした時間のパーセンテージは、CD157-/-マウスについて51.6±1.7%であったのに対し、CD157+/+マウスについて67.1±3.9%であった(n = 8, t = 3.067, P < 0.05; 図16m)。従って、CD157-/-マウスは同じレベルの社交性を有するが、社会性忌避および／または減少した社会的選好性を伴うことを実証したことを合理的に結論付けた。
【０１１６】
恐怖および驚愕の刺激に対する反応
CD157-/-マウスの知覚的特徴を確かめるために、聴覚的驚愕反応を測定した。驚愕反応は、WTマウスと比較してノックアウトマウスで有意に上昇していた(図9aの0db プレパルス; 各遺伝子型についてn = 10, t = 2.183, P < 0.05)。90dbの刺激を除いてほぼ全てのプレパルス条件下でCD157-/-マウスはより大きな驚愕反応を示した(図9b)。また、恐怖条件付けパラダイムの間、知覚障害も観察された(図9c)。CD157-/-マウスは、CD157+/+マウスよりも長いフリーズ時間を示し(各遺伝子型についてn = 10; 条件付け, t = 3.195, p < 0.01; 文脈的, t = 2.404, P < 0.05)、ノックアウトマウスは注意または知覚ゲーティングについて障害を有することを示した。
【０１１７】
うつ様行動
不安に加えてうつまたは無気力は、PD患者で観察される別の一般的な神経精神病学的障害である(上記非特許文献8および9)。従って、尾懸垂および強制水泳テストを用いてCD157-/-マウスのうつ様行動を調べた。CD157+/+マウスと比較してCD157-/-成体雄性マウスにおいて、尾懸垂および強制水泳テストの間の無動について有意な増加を観察した(尾懸垂, n = 20, t = 2.583, P < 0.05; 強制水泳, n = 10, t = 1.689, P < 0.05; 図17aおよびb)。
【０１１８】
しかしながら、CD157-/-マウスは、水泳プールの壁をよじ登るのに有意により長い時間を要した(t = 7.925, P < 0.001; 図17c)。このよじ登り行動は最初の2分間にWTマウスで頻繁に観察されたが、これらのマウスはすぐに慣れて、水中での奮闘を止めた。対照的に、CD157-/-マウスは、観察期間(6分)の最初から最後まで、逃れるために壁をよじ登る試みを続けた。これは、感情状態の変化を反映している可能性がある。
【０１１９】
精神医学的表現型の治療
CD157-/-マウスで観察された精神医学的異常が薬物治療によりレスキューされるかどうかを確かめた。この目的のために、GABAA受容体を活性化する抗不安薬として知られるジアゼパム(上記非特許文献30)(n = 5, 1 mg/kg, i.p., テストの30分前の単回投与)を用いた。一元配置ANOVAは、t検定により、CD157-/-マウスにおける薬物の有意な効果を明らかにした(F2,18 = 5.251, P < 0.05; 図15c)。一元配置ANOVAは、クローズドアームで過ごした時間についてCD157-/-マウスにおける薬物の有意な効果を示した(F2,18 = 8.495, P < 0.05; Bonferroniの事後検定)。薬物は、未処置のマウスにおいて観察された行動レベルまでノックアウトマウスをレスキューした。装置内での総移動距離は、処置群と未処置群とで違いはなかった(図15d)。
【０１２０】
尾懸垂テストでは、該薬物の使用により、CD157-/-マウスにおいてWTマウスのレベルまたはそれより高いレベルまで有意に回復することが一元配置ANOVAにより明らかになった(F2,27 = 27.904, P < 0.05; Bonferroniの事後検定, 図17d)。対照的に、強制水泳テストでの無動は、CD157-/-マウスにおいて、ジアゼパムでの治療ではレスキューされなかった(一元配置ANOVA; F2,22 = 4.627, P < 0.05, 図17e)。強制水泳テストでのよじ登り時間は、薬物の使用により、未処置のWTマウスのレベルの800%から350%まで回復した(一元配置ANOVA, F2,22 = 10.167, P < 0.01, Bonferroniの事後検定, 図17f)。
【０１２１】
扁桃体のCD157
CD157-/-マウスの不安関連およびうつ様行動の根底にある神経学的要因を組織レベルおよび分子レベルで調べた。最初に、CD157に対して産生させた特異的抗血清を用いて、WTのオスの成体の脳におけるCD157のタンパク質発現を調べた(図1参照)。WTの成体の脾臓での発現レベルと比べて脳領域でのCD157 mRNA発現が低レベルであることと合致して(図10)、弱いがはっきりとした免疫反応性が、扁桃体(図1および11)、扁桃体外側基底核の前側領域(図18a)、扁桃体中心核、および扁桃核内側核の後腹側領域(図11)においてCD157+/+マウスで検出されたが、CD157-/-マウスでは検出されなかった(図18a)。他の脳領域では、免疫反応は殆どまたは全く検出されなかった。
【０１２２】
これらの観察に基づき、我々はこれらのマウスの脳を肉眼で調べた。肉眼的異常は明らかでなく、また2つの遺伝子型の脳の湿重量に違いはなかった(図12)。続いて、脳を顕微鏡で観察した。成体の雄性の脳に対してニッスル染色を行ったところ、皮質および海馬を含むテストされた脳の領域において、目に見える構造的異常は観察されなかった(図18b)。しかしながら、CD157-/-マウスでは扁桃体の構造が変化していた。具体的には、CD157-/-マウスでは、後内方扁桃体皮質核(PMCo)がほとんど成長していなかった(図18b)。神経特異的なNeuN染色により神経を可視化することでPMCoのこの組織学的観察を確認した(図18c)。これらの観察は、感情および社会性の処理中枢である扁桃体(Brennan, P. A., et al., Nature 444, 308-315 (2006))の構造がノックアウトマウスでは解体していることを示しており、CD157-/-マウスにおいて観察された恐怖の状態の変化と合致している(図9)。
【０１２３】
扁桃体の解体がいかにして環境刺激により影響されるかの機能的な理解を得るために、両遺伝子型のマウスの扁桃体におけるc-Fos免疫反応性を定量化した(図18d)。c-Fos免疫反応性は、マウスをオープンフィールドテストにおいて10分間新たな環境に曝したときに、CD157+/+マウスにおいてよりもCD157-/-マウスにおいて明白でなかった(n = 4, t = 7.212, P < 0.001; 図18e)。この結果は、扁桃体の神経活動がノックアウトマウスでは機能的に障害されていることを示唆している。
【０１２４】
ドーパミンは扁桃体での感情的注意における確立された役割を有し、かつPD患者の扁桃体においてドーパミン作動性機能の喪失が観察されているため(上記非特許文献2; Harding, A.J., et al., Brain 125, 2431-2445 (2002); Halbig, T. D. et al. Mov. Disord. 26, 1677-1683 (2011))、D1、D2、D3、D4およびD5ドーパミン受容体サブタイプ、ドーパミン輸送体およびチロシンヒドロキシラーゼのmRNAレベルを定量することにより、CD157-/-マウスの扁桃体におけるドーパミン作動性の寄与を調べた。D1およびD2ドーパミン受容体、ドーパミン輸送体およびチロシンヒドロキシラーゼのレベルは、CD157-/-成体雄性マウスの扁桃体において高かった(図18f)。CD157-/-マウスの中脳、大脳皮質、線条体または海馬では、同じ増加は観察されなかった(図13)。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明者が新たに知見したように、CD157/BST-1遺伝子発現不全モデル動物は運動障害を有さず、不安やうつ等の精神症状のみを呈するため、当該動物を用いることで、精神症状の治療・予防薬をより効率的にスクリーニングすることが可能となる。また、上述の通り、CD157/BST-1はPDとの関連性が示唆されているため、当該動物を用いることで、特にPDに関連する精神症状の治療・予防薬をより効率的にスクリーニングすることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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