(57)【要約】      （修正有）【課題】従来よりも反応性が向上した新規のタグペプチド及び該タグペプチドを用いたタンパク質の精製・検出・固定化方法の提供。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列のペプチド（ＫＭＶＱＧＳＧＣ）を、タグペプチドとして、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含むタンパク質を検出または定量する方法に用いる。（ｉ）特定の配列からなるアミノ酸配列のペプチド（ＫＭＶＱＧＳＧＣ）をタグペプチドとして付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた試料に、前記タグペプチドと結合する物質を接触させて、タグペプチドと結合する物質とタグペプチドを付加したタンパク質との結合物を形成させる工程。（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた結合物を検出または定量する工程。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＮ末端に１〜２個のアミノ酸及び／またはＣ末端に１〜６個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドにおいて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端に１〜６個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドにおいて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端に１〜４個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載のペプチドにおいて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端にグリシルセリンが付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
請求項１〜３いずれかに記載のペプチドにおいて、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載のペプチドからなることを特徴とするタグペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のタグペプチドにおいて、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドからなるタグペプチド。
【請求項８】
下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む、タンパク質の精製方法。
（ｉ）請求項６または７に記載のタグペプチドを付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた試料に前記タグペプチドと結合する物質を接触させて、タグペプチドと結合する物質とタグペプチドを付加したタンパク質との結合物を形成させる工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた結合物に溶離物質を接触させて、前記タグペプチドを付加したタンパク質を、前記タグペプチドと結合する物質から遊離させる工程。
（ｉｖ）遊離させた、前記タグペプチドを付加したタンパク質を回収する工程。
【請求項９】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、タンパク質を検出または定量する方法。
（ｉ）請求項６または７に記載のタグペプチドを付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた試料に、前記タグペプチドと結合する物質を接触させて、タグペプチドと結合する物質とタグペプチドを付加したタンパク質との結合物を形成させる工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた結合物を検出または定量する工程。
【請求項１０】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、タンパク質の固定化方法。
（ｉ）請求項６または７に記載のタグペプチドを付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。
（ｉｉ）前記タグペプチドと結合する物質を水不溶性担体に固定化する工程。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた固定化担体に、（ｉ）で得られた試料を接触させ、固定化担体にタグペプチドを付加したタンパク質を固定化させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、タグペプチド、及びタンパク質の精製・検出・固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的に発現させたタンパク質の精製・検出や、担体への固定化を簡便に行なうための技術として、前記タンパク質を発現させる際に、タグペプチドとよばれる、前記ペプチドを認識する物質（例えば抗体など）と特異的に結合可能なペプチドを、前記タンパク質に付加した状態で発現させた後、前記ペプチドを認識する物質を用いて精製・検出・固定化を行なう方法が知られている。
【０００３】
従来から知られているタグペプチドの例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグ（特許文献１及び２）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ（非特許文献１）、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨｉｓタグ（特許文献３及び４）、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＥタグ、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＨＡタグ、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＴ７タグ、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＰｋタグ、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶタグ、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＶＳＶ−Ｇタグ、などの正常細胞内には本来存在しない、ウイルス、ファージ、癌遺伝子由来のタンパク質の部分領域や、同じアミノ酸配列の繰り返しからなる、１０アミノ酸程度のペプチドがあげられる。前記例示した９種類のタグペプチドの中で、ＦＬＡＧタグ（配列番号１）は高性能なタグとして知られている。しかしながら、近年の実験の高感度化に伴い、反応性がさらに向上したタグペプチドが要求されている。
【０００４】
一方、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈＢＮＰとする）の一部のアミノ酸配列をタグペプチドとして用いた例は知られているが（特許文献５，６）、ｈＢＮＰのＣ末端部分やリング状部分をタグとして用いるものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４７０３００４号明細書
【特許文献２】特許第２６６５３５９号公報
【特許文献３】特開昭６３−２５１０９５号公報
【特許文献４】米国特許第５３１０６６３号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１１／０７１０２１号パンフレット
【特許文献６】特開２０１２−１４０３３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｖａｎｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、５（１２）、３６１０−３６１６（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来よりも反応性が向上した新規のタグペプチド及び該タグペプチドを用いたタンパク質の精製・検出・固定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記の課題に関し鋭意研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＮ末端に１〜２個のアミノ酸及び／またはＣ末端に１〜６個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（２）上述の（１）に記載のペプチドにおいて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端に１〜６個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（３）上述の（１）または（２）に記載のペプチドにおいて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端に１〜４個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（４）上述の（１）〜（３）いずれかに記載のペプチドにおいて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端にグリシルセリンが付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（５）上述の（１）〜（３）いずれかに記載のペプチドにおいて、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（６）上述の（１）〜（５）いずれかに記載のペプチドからなることを特徴とするタグペプチド。
（７）上述の（６）に記載のタグペプチドにおいて、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドからなるタグペプチド。
（８）下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む、タンパク質の精製方法。
（ｉ）上述の（６）または（７）に記載のタグペプチドを付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた試料に、前記タグペプチドと結合する物質を接触させて、タグペプチドと結合する物質とタグペプチドを付加したタンパク質との結合物を形成させる工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた結合物に溶離物質を接触させて、前記タグペプチドを付加したタンパク質を前記タグペプチドと結合する物質から遊離させる工程。
（ｉｖ）遊離させた、前記タグペプチドを付加したタンパク質を回収する工程。
（９）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、タンパク質を検出または定量する方法。
（ｉ）上述の（６）または（７）に記載のタグペプチドを付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた試料に、前記タグペプチドと結合する物質を接触させて、タグペプチドと結合する物質とタグペプチドを付加したタンパク質との結合物を形成させる工程。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた結合物を検出または定量する工程。
（１０）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、タンパク質の固定化方法。
（ｉ）上述の（６）または（７）に記載のタグペプチドを付加したタンパク質を含有する試料を調製する工程。
（ｉｉ）前記タグペプチドと結合する物質を水不溶性担体に固定化する工程。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた固定化担体に、（ｉ）で得られた試料を接触させ、固定化担体にタグペプチドを付加したタンパク質を固定化させる工程。
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明のペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＮ末端に１〜２個のアミノ酸及び／またはＣ末端に１〜６個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。中でも、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端に１〜６個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端に１〜４個のアミノ酸が付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが更に好ましい。具体的には、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＣ末端にグリシルセリンが付加した配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、また配列番号１０，１３，１４，１５，または１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
【００１０】
なお、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＢＮＮと略記することもある）は、ｈＢＮＰの３−１０位に相当するものであり、配列番号１３，１４，１５，１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドも、ｈＢＮＰの配列の一部に相当するものである。
【００１１】
これらのペプチドは、構成するアミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換したペプチドであっても、本発明のペプチドに含まれる。他のアミノ酸への置換は、公知の部位特異的変異導入法を用いて、親和性及び特異性を確認しながら実施すればよい。またいくつかの変異を組み合わせることで、さらに性能を向上させることも可能である。
【００１２】
前述の本発明のペプチドは、タグペプチドとして有用である。タグペプチドは、それを付加した物質に与える影響を少なくするために、アミノ酸の長さが短く、かつ、タグペプチドに対する特異性及び反応性の高い物質が存在することが要求されるが、本発明のタグペプチドは、これを満たすものである。
【００１３】
本発明のタグペプチドの中でも、特に配列番号１０，１３，または１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドからなるタグペプチドは、アミノ酸の長さが比較的短く、かつ、タンパク質に付加された場合に、特異性及び反応性の高い物質が存在するため、タグペプチドとしてとりわけ有用である。
【００１４】
なお、本発明の実施例によれば、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、即ちＢＮＮを特異的に認識する抗体が得られ、その抗体はＢＮＮばかりでなく、配列番号１４または１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに対しても同等の反応性を有している。そのため、配列番号１３または１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、タグペプチドとしてＢＮＮと同等の有用性があるといえる。なお、配列番号１３または１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＢＮＮよりもアミノ酸の長さが短くなっているため、タグペプチドとして用いた場合に、ＢＮＮと比較して、付加するタンパク質への影響がより低減することが予想できる点で、好ましいといえる。タグペプチドとして用いる場合には、配列番号１０，１３，または１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの中でも、好ましくは配列番号１３または１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、更に好ましくは配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１５】
タグペプチドを利用する際に用いられる、タグペプチドと結合する物質としては、モノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差の考慮が不要なモノクローナル抗体が、安定的な精製ができる点で好ましい。
【００１６】
本発明のタグペプチドを利用することで、タグペプチドを付加したタンパク質をアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製は、適切な担体にタグペプチドと結合する物質を、タグペプチドを付加したタンパク質との結合性を保持した状態で結合させたものを用いて精製すればよい。タグペプチドと結合する物質と結合したタグペプチドを付加したタンパク質を遊離させるには、溶離物質を接触させればよい。通常ｐＨを変化させて溶出すればよいが、ｐＨ変化に対して不安定なタンパク質を精製する場合は、使用したタグペプチドを大過剰添加して溶出させてもよい。
【００１７】
タンパク質にタグペプチドを付加する方法として、遺伝子工学的方法で付加する方法があげられる。具体的には、発現させるタンパク質にタグペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加すればよい。その際、発現させるタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側の直後にタグペプチドを付加してもよいし、発現させるタンパク質との相互作用を避けるための任意のリンカーペプチドを介してタグペプチドを付加してもよい。発現させるタンパク質にタグペプチドを付加する別の方法として、化学的に付加する方法があげられる。具体的には、発現させるタンパク質とＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などの試薬とを反応させることで前記タンパク質にマレイミド基を導入後、タグペプチドと反応させて、タグペプチドを化学的に導入する方法があげられるが、発現させるタンパク質とタグペプチドとの結合方法に特に限定はなく、例えば、ポリエチレングリコールやポリエチレンイミンなどの高分子を介して付加してもよいし、マレイミド基以外の官能基を介して化学的に付加してもよい。マレイミド基以外の官能基としては、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）、ブロモアセテート（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）、ＮＨＳエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）等があげられる。
【００１８】
本発明のタグペプチドを用いることにより、タグペプチドを付加したタンパク質と、タグペプチドと結合する物質との結合物を形成させ、それをウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、免疫組織化学、表面プラズモン共鳴分析等の各種手法により検出又は定量することにより、タンパク質を検出又は定量することができる。
【００１９】
免疫測定試薬でしばしば問題になるのは、異好性抗動物抗体である。たとえば、ウサギ由来ポリクローナル抗体（抗原認識）と抗ウサギ抗体（水不溶性担体に固定化）とが反応系の中に含まれる場合、測定検体の中に抗ウサギ抗体が存在すると、検体中の抗ウサギ抗体により、本来想定している量のウサギ由来ポリクローナル抗体が水不溶性担体に捕捉されなくなり、正確な測定値が得られなくなってしまう。そこで、ウサギポリクローナル抗体にタグペプチドを付加し、水不溶性担体にタグペプチドを認識する抗体を固定化することで、異好性抗動物抗体の影響をなくした測定系が構築できる。
【００２０】
本発明のタグペプチドは、前述したタンパク質の精製・検出目的のほかに、タンパク質の担体への固定化目的で使用することもできる。タンパク質を水不溶担体に直接固定化すると、立体構造の変化がおきやすく、活性が失われる場合が多い。そこで、タグペプチドと結合する物質を水不溶性担体に固定化しておき、前記固定化担体にタグペプチドを付加したタンパク質を固定化させる方法を採用することにより、立体構造の変化がおきにくい状態で担体に固定化することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のペプチドは、タグペプチドとして有用であり、従来知られているＦＬＡＧタグを用いた精製・検出・固定化方法と比較し、反応性を向上させることができる。本発明のペプチドによれば、非常に短いアミノ酸配列からなるペプチドであっても、タグペプチドとして使用することができ、付加するタンパク質への影響をより低減することができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例３で使用した抗体と蛍光強度の関係を示したグラフである。
【図２】実施例５で使用した抗体と蛍光強度の関係を示したグラフである。
【図３】実施例６で、４−２Ｎの抗体のエピトープ分析を行なった結果を示したグラフである。
【図４】実施例６で、６−４Ｏの抗体のエピトープ分析を行なった結果を示したグラフである。
【図５】実施例６で、９−２１Ｏの抗体のエピトープ分析を行なった結果を示したグラフである。
【図６】実施例６で、１０−１７Ｍの抗体のエピトープ分析を行なった結果を示したグラフである。
【図７】実施例７で、抗体濃度と蛍光強度との関係を示したグラフである。
【実施例】
【００２３】
下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例１］タグペプチドを付加したタンパク質の調製
タグペプチドとして、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグ及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＮを使用した。タグペプチドを付加するタンパク質として、ウサギより単離されたエストラジオールを認識する抗体（以下、抗Ｅ２抗体と略す）（松葉隆雄ら、東ソー研究報告、５３、３−９（２００８））を使用した。まず、抗Ｅ２抗体の軽鎖遺伝子をコードする動物細胞発現用ベクターに、タグペプチドをコードする遺伝子配列を挿入した。タグペプチドをコードする遺伝子配列は、抗Ｅ２抗体を動物細胞で発現させた際、抗Ｅ２抗体の軽鎖ポリペプチドのＮ末端にタグペプチドが付加されるように挿入した。遺伝子挿入はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて行なった。得られたタグペプチド付加型抗Ｅ２抗体軽鎖遺伝子と抗Ｅ２抗体重鎖遺伝子を遺伝子導入装置にてチャイニーズハムスター卵巣細胞株に遺伝子導入し、その培養上清中にタグペプチド付加型抗Ｅ２抗体を得た。該培養上清３０ｍｌをアミコンウルトラ−１５  ３０Ｋ（ミリポア社製）で５００μｌに濃縮した。Ａｂ  ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥヘルスケア社製）にて該濃縮物よりタグペプチド付加型抗Ｅ２抗体を精製した。
【００２５】
［実施例２］ＢＮＮを認識する抗体の単離
ＢＮＮを認識する抗体を以下の方法で単離した。
【００２６】
（１）免疫用コンジュゲ−ト液の作製
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＮは、業者にペプチド合成を依頼して得た。該ペプチドフラグメント溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。
【００２７】
（２）免疫
上述の免疫用コンジュゲート液（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをマウス（雌、６週令）の腹腔内に０．１ｍｌずつ１週間間隔で計４回注射した。マウス１匹１回当たりのコンジュゲ−ト投与量は５０μｇであった。更に最終免疫の１週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を腹腔内に投与した。
【００２８】
（３）細胞融合
ブ−スタ−免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、その細胞を赤血球溶解バッファーにて赤血球を破壊した。残った細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じくＥ−ＲＤＦ培地に懸濁したミエローマ細胞０．４×１０７個を脾リンパ球１．６×１０７個と混合し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去した。細胞沈殿物をマンニトール緩衝液（２５０ｍＭ  マンニトール、１００ｍＭ  塩化カルシウム、１００ｍＭ  塩化マグネシウム）に懸濁し、電気的細胞融合を行なった。電気的細胞融合を行なった細胞懸濁液をＨＡＴ培地（１００μＭ  ヒポキサンチン、０．４μＭ  アミノプテリン、１６μＭ  チミジンを含むＧＩＴ培地）２００ｍｌに懸濁し、３８４ウエル細胞培養プレ−ト１０枚の各ウエルに０．０５ｍｌずつ分注した。約７日後にはハイブリド−マの増殖が認められた。得られたハイブリドーマの中で、ＢＮＮと結合し、配列番号１１のアミノ酸配列には結合しない、ＢＮＮと特異的に結合する抗体（ＢＮＮ認識抗体）を産生するハイブリドーマ４種（４−２Ｎ、６−４Ｏ、９−２１Ｏ、１０−１７Ｍ）が得られた。
【００２９】
［実施例３］ＢＮＮのタンパク質固定化用タグとしての評価
実施例２で得られたＢＮＮ認識抗体を用いて、ＢＮＮを付加したタンパク質の固定が可能か評価した。
【００３０】
実施例２で得られたハイブリドーマのうち、９−２１Ｏについて、定法により培養・精製することで、モノクローナル抗体（９−２１Ｏ）を得た。モノクローナル抗体（９−２１Ｏ）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウェルを洗浄後、実施例１で得られたＢＮＮを付加した抗Ｅ２抗体（ＢＮＮ結合抗Ｅ２抗体）を１μｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬをウェルに添加して反応させた。ウェルを洗浄後、市販の抗ラビットＩｇＧ抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートをウェルに添加し、１時間反応させた。反応後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。陰性対照として、ＢＮＮ認識抗体を固定化せずブロッキング操作のみ行なったウェルをについて、同様の操作を行なった。結果を図１に示す。ＢＮＮ認識抗体を固定化したウェルにＢＮＮ結合抗Ｅ２抗体を添加したときが、ＢＮＮ認識抗体を固定化しなかったウェルにＢＮＮ結合抗Ｅ２抗体を添加したときと比較し、有意にシグナルが高いことから、ＢＮＮ認識抗体がＢＮＮを付加したタンパク質と特異的に結合できることを確認した。
【００３１】
［実施例４］ＢＮＮを認識する抗体のアルカリホスファターゼ標識体の作製
実施例３で得られたモノクローナル抗体（９−２１Ｏ）を、アルカリホスファターゼ標識キット（同仁化学社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＬＫ１２）を用いて、製品添付のプロトコルに従い標識することで、モノクローナル抗体（９−２１Ｏ）のアルカリホスファターゼ標識体（ＡＬＰ標識９−２１Ｏ）を作製した。
【００３２】
［実施例５］ＢＮＮのタンパク質検出用タグとしての評価
実施例２で得られたハイブリドーマより取得したＢＮＮ認識抗体が、ＢＮＮを付加したタンパク質を特異的に検出可能か評価した。
抗ラビット抗体をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウェルを洗浄後、実施例１で得られたＢＮＮを付加した抗Ｅ２抗体（ＢＮＮ結合抗Ｅ２抗体）を１μｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬをウェルに添加して反応させた。ウェルを洗浄後、実施例４で得られたＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識ＢＮＮ認識抗体（ＡＬＰ標識９−２１Ｏ）を１０００倍希釈した溶液を１００μＬ添加し、１時間反応させた。ウェルを洗浄後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。比較例として、ＢＮＮ結合抗Ｅ２抗体の代わりに抗Ｅ２抗体（ＢＮＮ非結合抗Ｅ２抗体）を用意し、同様の実験を行なった。結果を図２に示す。ＢＮＮを付加した抗Ｅ２抗体を添加したときが、ＢＮＮを付加しない抗Ｅ２抗体を添加したときと比較し、有意にシグナルが高いことから、ＢＮＮ認識抗体を用いてＢＮＮを付加した抗体を特異的に検出できることを確認した。
【００３３】
［実施例６］ＢＮＮ認識抗体の認識部位の決定
実施例２で得られたハイブリドーマより取得した、４種類のＢＮＮ認識モノクローナル抗体（４−２Ｎ、６−４Ｏ、９−２１Ｏ、１０−１７Ｍ）についてエピトープ分析を下記の方法で行なった。それぞれのモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウェルを洗浄後、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、ｈＢＮＰの３−３２位のアミノ酸配列に相当するペプチド（ＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ、以下、ｈＢＮＰ（３−３２）と略す）、ペプチド、及びｈＢＮＰのＣ末端部位を認識する抗体ＢＣ２３−１１（特開２０１１−１２２９５７号公報）のＡＬＰ標識体を添加し、１時間反応させた。このとき、ｈＢＮＰ（３−３２）は５００ｐＭとなるように添加した。またペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＭＶＱＧＳＧＣ）、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣ、配列番号１０に記載のアミノ酸のＮ末端側にセリルプロリンが結合）、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＭＶＱＧＳＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１−７位のアミノ酸配列に相当するペプチド）、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＭＶＱＧＳ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１−６位のアミノ酸配列に相当するペプチド）、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＭＶＱＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１−５位のアミノ酸配列に相当するペプチド）、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＫＭＶＱ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１−４位のアミノ酸配列に相当するペプチド）の６種類を用い、５０または５００ｎＭとなるように添加した。ウェルを洗浄後、定法に従いＡＬＰ活性を測定した。
【００３４】
結果を図３、図４、図５、図６に示す。配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを添加したときと比較して、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを添加したときは、蛍光強度の減少がわずかに観察された。一方、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを添加したときは、蛍光強度が大きく減少した。この測定系では、蛍光強度は固相化したＢＮＮ認識モノクローナル抗体に結合したｈＢＮＰ（３−３２）の量に依存する。つまり、ペプチドの添加により蛍光強度が減少するということは、該ペプチドがＢＮＮ認識モノクローナル抗体と結合することで、ＢＮＮ認識モノクローナル抗体とｈＢＮＰ（３−３２）との結合を阻害することを示している。阻害を生じる最小のペプチドは配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであったため、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１−４位のアミノ酸配列に相当するペプチドであれば、タグペプチドとして有用であることがわかった。また、配列番号１０、配列番号１３、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＢＮＮ認識モノクローナル抗体との反応性が大きいことから、タグペプチドとして好ましいことがわかった。
【００３５】
［実施例７］従来のタグペプチドとの性能比較
タグペプチドとして従来から広く利用されているＦＬＡＧタグ（配列番号１）との性能を比較した。
【００３６】
抗ＢＮＮ抗体（実施例２で得られたハイブリドーマより取得した、ＢＮＮ認識モノクローナル抗体）または抗ＦＬＡＧ抗体（シグマアルドリッチ社製、モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウェルを洗浄後、抗ＢＮＮ抗体を固定化したウェルには実施例１で得られたＢＮＮタグを付加した抗Ｅ２抗体（ＢＮＮ結合抗Ｅ２抗体）を添加して反応させ（濃度：４ｐｍｏｌ／ウェル、８００ｆｍｏｌ／ウェル、１６０ｆｍｏｌ／ウェル、３２ｆｍｏｌ／ウェル、６．４ｆｍｏｌ／ウェル）、抗ＦＬＡＧ抗体を固定化したウェルには実施例１で得られたＦＬＡＧタグを付加した抗Ｅ２抗体（ＦＬＡＧ結合抗Ｅ２抗体）を添加して反応させた（濃度：４ｐｍｏｌ／ウェル、８００ｆｍｏｌ／ウェル、１６０ｆｍｏｌ／ウェル、３２ｆｍｏｌ／ウェル、６．４ｆｍｏｌ／ウェル）。ウェルを洗浄後、市販の抗ラビットＩｇＧ抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートをウェルに添加し、１時間反応させた。反応後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図７に示す。ＢＮＮタグを認識する抗体のうち、９−２１Ｏと１０−１７Ｍを固定化したものは、ＦＬＡＧタグを認識する抗体を固定化したものと比較し、タグペプチドを付加した抗Ｅ２抗体の補足量が増大していることが判明した。つまり、ＢＮＮタグはＦＬＡＧタグと比較して反応性が向上したタグペプチドであるといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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