(57)【要約】      （修正有）【課題】溶液として調整した後に失活しやすい酵素などの生物由来化合物を含む試薬などの劣化を防止し、測定手順の一部又は全部の自動化にも対応することができる測定方法、測定用のカートリッジ及び測定装置を提供する。【解決手段】測定方法は、（ａ）入口及び出口を有する流路１０、２０、３０の前記出口に連通する反応槽４０に試料を注入する工程と、（ｂ）前記流路において前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、前記入口と前記出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を、溶解し且つ前記反応槽に移送する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程の後に、前記反応槽に収容された液体の光学特性を検出する工程と、を有する構成とする。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）入口及び出口を有する流路の前記出口に連通する反応槽に試料を注入する工程と、
（ｂ）前記流路において前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、前記入口と前記出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬を、溶解し且つ前記反応槽に移送する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程の後に、前記反応槽に収容された液体の光学特性を検出する工程と、
を有することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
（ａ）各々入口及び出口を有する複数の流路の各前記出口に連通する１つの反応槽に試料を注入する工程と、
（ｂ）前記複数の流路において各前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、各前記入口と各前記出口との間の各試薬配置部に配置されたそれぞれ異なる乾燥試薬を、溶解し且つ前記反応槽に移送する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程の後に、前記反応槽に収容された液体の光学特性を検出する工程と、
を有し、
前記（ｂ）工程は、各前記流路ごとに所定の時間差をおいて順次行うことを特徴とする測定方法。
【請求項３】
前記（ｃ）工程の前に、前記反応槽に収容された液体の温度を所定温度に調整して所定時間保持する工程をさらに有することを特徴とする請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記測定対象成分は、エンドトキシン、βグルカン、ＡＴＰ又は生菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項５】
前記（ｂ）工程における前記それぞれ異なる乾燥試薬は、測定対象成分により活性化されるリムルス反応系を含む第１の乾燥試薬と、前記測定対象成分により前記リムルス反応系が活性化されることで発光基質を遊離する発光合成基質を含む第２の乾燥試薬と、前記発光基質に作用して生物化学発光反応を生じさせる発光酵素を含む第３の乾燥試薬と、
であることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項６】
入口及び出口を有する流路と、
前記出口に連通する反応槽と、
前記流路において前記入口と前記出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬と、
を有し、
前記流路において前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、前記乾燥試薬を溶解し且つ前記反応槽に移送可能であることを特徴とするカートリッジ。
【請求項７】
前記流路を複数有し、
前記反応槽は前記複数の流路の各前記出口に連通し、
前記複数の流路の各前記入口と各前記出口との間の各試薬配置部にはそれぞれ異なる乾燥試薬が配置されることを特徴とする請求項６に記載のカートリッジ。
【請求項８】
前記測定対象成分は、エンドトキシン、βグルカン、ＡＴＰ又は生菌であることを特徴とする請求項６又は７に記載のカートリッジ。
【請求項９】
前記各試薬配置部に配置された前記それぞれ異なる乾燥試薬は、測定対象成分により活性化されるリムルス反応系を含む第１の乾燥試薬と、前記測定対象成分により前記リムルス反応系が活性化されることで発光基質を遊離する発光合成基質を含む第２の乾燥試薬と、前記発光基質に作用して生物化学発光反応を生じさせる発光酵素を含む第３の乾燥試薬と、であることを特徴とする請求項７又は８に記載のカートリッジ。
【請求項１０】
入口及び出口を有する流路と、
前記出口に連通する反応槽と、
前記流路において前記入口と前記出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬と、
前記流路において、前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、前記乾燥試薬を溶解し且つ前記反応槽に移送する送液手段と、
前記反応槽に収容された液体の光学特性を検出する検出手段と、
前記送液手段により前記流路に溶媒を流させると共に、前記流路に溶媒を流した後に前記検出手段により前記光学特性を検出させる制御手段と、
を有することを特徴とする測定装置。
【請求項１１】
前記流路を複数有し、
前記反応槽は前記複数の流路の各前記出口に連通し、
前記複数の流路の各前記入口と各前記出口との間の各試薬配置部にはそれぞれ異なる乾燥試薬が配置されることを特徴とする請求項１０に記載の測定装置。
【請求項１２】
前記流路と、前記反応槽と、前記乾燥試薬と、を有するカートリッジが着脱可能であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の測定装置。
【請求項１３】
前記流路は、前記試薬配置部よりも前記入口側に位置する、前記入口を介して前記流路に注入された溶媒を貯留する貯留部を有し、
前記送液手段は、前記入口から空気を流入させることで前記貯留部に貯留された溶媒を前記反応槽に向けて流す送気手段を有することを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１４】
前記反応槽の収容物の温度を調整する温度調整手段を有することを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１５】
前記測定対象成分は、エンドトキシン、βグルカン、ＡＴＰ又は生菌であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項１６】
前記各試薬配置部に配置された前記それぞれ異なる乾燥試薬は、測定対象成分により活性化されるリムルス反応系を含む第１の乾燥試薬と、前記測定対象成分により前記リムルス反応系が活性化されることで発光基質を遊離する発光合成基質を含む第２の乾燥試薬と、前記発光基質に作用して生物化学発光反応を生じさせる発光酵素を含む第３の乾燥試薬と、であることを特徴とする請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素などの生物由来化合物を含む試薬などを利用した測定方法、その測定用のカートリッジ、及びその測定方法を実施する測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、医療、医薬品、臨床検査などの分野において、血液（全血、血清、血漿）、或いは透析液、注射液、輸液、医薬品又はその原料や原料水中のエンドトキシンを検出又は定量することが行われている。エンドトキシンは、血液中に所定量以上存在すると、発熱、ショック、多臓器不全などを引き起こす。そのため、血液中のエンドトキシンを検出又は定量してこれらの診断をすること、又は上記透析液やその原料水などに含まれるエンドトキシンを検出又は定量してエンドトキシンが体内に注入されることを未然に防ぐことは重要である。エンドトキシンを検出又は定量する方法としては、カブトガニの血球抽出液の成分であるリムルス反応系がエンドトキシンにより活性化されてゲル化するプロセスを利用したリムルステストがある（特許文献１）。そして、このリムルステストには、リムルス反応系の活性化の程度を測定する手法の異なる、発色合成基質法（比色法）、比濁時間分析法（比濁法）、生物化学発光法がある。
【０００３】
又、従来、医療、医薬品、臨床検査、食品産業などの分野において、βグルカンを検出又は定量することが行われている。例えば、深在性真菌症が疑われる患者に対する治療方法の選択や治療効果の判定などのために、βグルカンを検出又は定量することは重要である。βグルカンを検出又は定量する方法としては、上記エンドトキシンの検出又は定量と同様、発色合成基質法（比色法）、比濁時間分析法（比濁法）、生物化学発光法によるリムルステストがある（特許文献２）。
【０００４】
上述のエンドトキシン、βグルカンの検出又は定量（以下、単に「測定」ともいう。）方法のうち、特に、生物化学発光法を用いた方法は、他の方法と比較して、簡便、迅速、且つ、高感度であることから非常に有効な方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６３８４０号
【特許文献２】特開２０１０−１８７６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えば従来の生物化学発光法によるエンドトキシン、βグルカンの測定の手順の一部又は全部を自動化しようとした場合などに、次のような改善すべき課題があることが分かった。
【０００７】
例えば、生物化学発光法によるエンドトキシンの測定では、先ず、試料と、試料中のエンドトキシンにより活性化されるリムルス反応系を含む第１の試薬（リムルス試薬）とをよく混和し、所定温度で所定時間インキュベートする。その後、試料中の測定対象成分によりリムルス反応系が活性化されることで発光基質（ルシフェリン）を遊離する発光合成基質を含む第２の試薬（発光合成基質含有試薬）を添加して混和し、所定温度で所定時間インキュベートする。その後、所定温度において、遊離された発光基質に作用して生物化学発光を生じさせる発光酵素（ルシフェラーゼ）を含む第３の試薬（発光酵素含有試薬）を添加して、所定時間経過後に反応液が発する光を検出する。通常、第１、第２、第３の試薬は、反応系に添加する前に溶液として調整しておき、ディスペンサなどを用いて反応系に正確に測り入れる。
【０００８】
ここで、一般に、バイオ分析に用いる試薬（酵素など）は、時間経過とともに失活するため、例えば１時間といった、比較的短い時間で使い切るようにする。不安定な（失活が早い）試薬ほど、測定開始時と時間経過後の測定結果の値は異なる。そのような試薬では、試薬が時間とともに失活するため、同一試料でも測定結果の指示値が異なることになる。
【０００９】
そして、例えば、上述の生物化学発光法によるエンドトキシンの測定のように、第１、第２、第３の試薬を順次に反応系に添加する場合、その手順の一部又は全部を自動化しようとすると、第１、第２、第３の試薬を予め溶液として調整してしまうと、いずれかの試薬が失活の影響を受け、上述のように同一試料でも測定結果が異なってしまうことがある。
【００１０】
例えば、単一の試料についての測定を自動化する場合を考えると、第３の試薬が反応系に添加されるまでの間に失活してしまうことが考えられる。又、複数の試料についての測定を自動化する際に、予め溶液として調整した第１、第２、第３の試薬から所定量ずつを分注して用いる場合を考えると、第３の試薬のみならず、第１の試薬についても、いずれかの試料に関する反応系に添加されるまでの間に失活してしまうことが考えられる。又、第２の試薬についても、反応系に添加されるまでの間の生じる劣化が測定結果に影響することがあり得る。
【００１１】
又、従来の方法では、装置や雰囲気と、試薬や試料との接触の機会が多いため、測定時の試薬や試料の汚染が問題となることがある。
【００１２】
以上では、エンドトキシンの測定の場合を例としたが、βグルカンの測定についても上述と同様の問題がある。
【００１３】
又、生物化学発光法を用いる場合だけではなく、比色法、比濁法を用いる場合においても、例えば複数の試料についての測定を自動化しようとする場合などに、上述と同様の問題が生じ得る。
【００１４】
更に、同様の問題は、エンドトキシン、βグルカンの測定に限らず、失活しやすい試薬を用いた測定の場合や、測定対象が雰囲気中に存在するような場合においては一般に生じ得る。例えば、従来、食品衛生、医療、医薬品、臨床検査、環境などの分野において、製品又はその原料や原料水中の微生物及び動物などの細胞数（生菌数）を測定することが行われている。そして、その細胞数を測定する方法として、ルシフェリンとルシフェラーゼによる生物化学発光反応を用いてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を測定する生物化学発光法が利用される。又、生化学研究の分野などにおいて、試料中のＡＴＰ自体を測定の目的とする場合にも、生物化学発光法によるＡＴＰの測定が行われる。例えば、これら細胞数（生菌数）の測定やＡＴＰの測定といった、酵素などの生物由来化合物を含む試薬を利用した測定では、一般に、複数の試料についての測定を自動化しようとする場合などに、上述と同様の問題が生じ得る。
【００１５】
従って、本発明の目的は、溶液として調整した後に失活しやすい酵素などの生物由来化合物を含む試薬などの劣化を防止し、測定手順の一部又は全部の自動化にも対応することができる測定方法、測定用のカートリッジ及び測定装置を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、測定時の試薬や試料の汚染の原因を低減することができる測定方法、測定用のカートリッジ及び測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的は本発明に係る測定方法、測定用のカートリッジ及び測定装置にて達成される。要約すれば、本発明の代表的な構成は、（ａ）入口及び出口を有する流路の前記出口に連通する反応槽に試料を注入する工程と、（ｂ）前記流路において前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、前記入口と前記出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬を、溶解し且つ前記反応槽に移送する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程の後に、前記反応槽に収容された液体の光学特性を検出する工程と、を有することを特徴とする測定方法である。
【００１８】
又、本発明の他の代表的な構成は、（ａ）各々入口及び出口を有する複数の流路の各前記出口に連通する１つの反応槽に試料を注入する工程と、（ｂ）前記複数の流路において各前記入口側から前記反応槽に向けて溶媒を流し、各前記入口と各前記出口との間の各試薬配置部に配置されたそれぞれ異なる乾燥試薬を、溶解し且つ前記反応槽に移送する工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程の後に、前記反応槽に収容された液体の光学特性を検出する工程と、を有し、前記（ｂ）工程は、各前記流路ごとに所定の時間差をおいて順次行うことを特徴とする測定方法である。
【００１９】
又、本発明によると、上記各本発明の測定方法に用いられるカートリッジが提供される。
【００２０】
更に、本発明によると、上記各本発明の測定方法に用いられる測定装置が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、溶液として調整した後に失活しやすい酵素などの生物由来化合物を含む試薬などの劣化を防止し、測定手順の一部又は全部の自動化にも対応することができる。又、本発明によれば、測定時の試薬や試料の汚染の原因を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】生物化学発光法による測定の原理を示す説明図である。
【図２】生物化学発光法によるエンドトキシンの測定の原理を示す説明図である。
【図３】生物化学発光法によるβグルカンの測定の原理を示す説明図である。
【図４】本発明に従う測定の手順の概要を説明するための模式図である。
【図５】本発明の一実施例に係るカートリッジの（ａ）縦断面図（図５（ｂ）中のＡ−Ａ線断面図）、（ｂ）平面図である。
【図６】本発明の一実施例に係る測定装置の正面図である。
【図７】本発明の一実施例に係る測定装置の側面図（図６中の矢印Ａ方向から見た側面図）である。
【図８】本発明の一実施例に係る測定装置の部分拡大斜視図である。
【図９】本発明の一実施例に係る測定装置の要部の概略機能ブロック図である。
【図１０】本発明の一実施例に係る測定装置を用いた測定手順の一例を説明するためのフローチャート図である。
【図１１】比色法によるエンドトキシンの測定の原理を示す説明図である。
【図１２】比濁法によるエンドトキシンの測定の原理を示す説明図である。
【図１３】比色法によるβグルカンの測定の原理を示す説明図である。
【図１４】比濁法によるβグルカンの測定の原理を示す説明図である。
【図１５】生物化学発光法による微生物及び動物などの細胞数の測定の原理を示す説明図である。
【図１６】本発明の他の適用例を説明するための模式図である。
【図１７】本発明の他の適用例における検出手段の構成例を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明に係る測定方法、測定用のカートリッジ及び測定装置を図面に則して更に詳しく説明する。
【００２４】
実施例１
１．本発明に従う測定方法及び測定装置の概要
前述のように、酵素などの生物由来化合物を含む試薬を用いた測定を行う場合、試薬の失活の影響を受けやすい。
【００２５】
試薬の失活の影響を抑制するためには、常に調製直後の試薬を用いることが有効である。そこで、本発明によれば、入口及び出口を有する流路内に乾燥状態の試薬を配置し、上記入口側から、上記出口に連通して設けられた反応槽に向けて溶媒（水など）を流すことで、試薬を溶解し且つ反応槽に移送する。好ましくは、試薬は、流路の入口と出口との間の試薬配置部に凍結乾燥状態で配置する。又、所望により、反応槽にも試薬を配置することができ、この場合も、好ましくは、試薬は乾燥状態で配置する。試料は、典型的には、流路に溶媒を流す前に反応槽に注入する。斯かる構成により、失活しやすい酵素などの生物由来化合物を含む試薬を用いた測定においても、試薬が流路内で溶解されることで、常に調製直後の試薬を用いることができる。尚、試薬としては、一般に、生物由来化合物である核酸、ペプチド、蛋白質（酵素を含む）、糖鎖及びこれらの誘導体を挙げることができる。
【００２６】
又、溶媒は、上記試薬配置部よりも入口側の貯留部に一旦貯留させた後、入口から空気を流入させて押すことによって、流路内を反応槽に向けて流すようにすることが好ましい。斯かる構成により、比較的簡易で安価な構成でありながら、溶媒をより正確に測り入れて高精度の測定を可能としつつ、装置や雰囲気と試薬や試料との接触の機会を低減して、測定時の試薬や試料の汚染の原因を低減することができる。即ち、例えばシリンジポンプなどを用いた分注装置があるが、複数の試薬を分注する装置は比較的大型、高価になる。又、正確に試薬を分注するためには比較的複雑な機構が必要になる。そこで、シリンジポンプなどの複雑な機構の代わりに、空気を押し出す送気手段を用い、流路の貯留部に予め測り入れられ貯留された溶媒をその空気で押して流路内を流す。
【００２７】
又、特に、複数の流路に溶媒を流す場合、流路に溶媒を流す送液手段と各流路の各入口との相対位置を変更する移動手段を用い、各流路に順次に溶媒を流す。特に、送液手段が上記送気手段を有する場合、送気手段の空気出口と各流路の各入口との相対位置を変更する移動手段を用い、送気手段の空気出口を各流路の各入口に順次に接続する。ここで、複数の流路に溶媒を流す場合には、１つの試料に対する複数の試薬を順次に流す場合と、複数の試料に対する単数又は複数の試薬を順次に流す場合とがある。斯かる構成により、反応槽に試薬を添加するタイミングをより正確に制御することができ、反応槽における各反応の反応時間をより正確に制御することが可能となる。又、自動で複数の流路に溶媒を流すことができるので、１つの試料に対する複数の試薬の添加、或いは複数の試料に対する単数又は複数の試薬の添加を自動化して、測定時の試薬や試料の汚染の可能性を低減することができる。
【００２８】
又、上述の流路、反応槽、試薬を一体的に構成して測定装置の本体（装置本体）に着脱可能なカートリッジ（バイオチップ）とすることが好ましい。典型的には、カートリッジは、一度使用されると廃棄される。装置本体には、反応槽の収容物の光学特性（本実施例では発光量）を検出する検出手段（本実施例では発光検出手段）を設ける他、流路に溶媒を流す送液手段、送液手段やカートリッジを移動させる移動手段（電動アクチュエータなど）、各部を制御する制御手段などを設ける。
【００２９】
このように、本発明に従う測定方法は、一般には、（ａ）入口及び出口を有する流路の出口に連通する反応槽に試料を注入する工程と；（ｂ）流路において入口側から反応槽に向けて溶媒を流し、入口と出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬を、溶解し且つ反応槽に移送する工程と；（ｃ）上記（ｂ）工程の後に、反応槽に収容された液体の光学特性を検出する工程と；を有していればよい。又、好ましくは、少なくとも上記（ｂ）工程よりも前に、入口を介して流路に溶媒を注入して、流路において試薬配置部よりも入口側に位置する貯留部に溶媒を貯留する工程を有し、上記（ｂ）工程では、入口から空気を流入させることで、貯留部に貯留された溶媒を反応槽に向けて流す。
【００３０】
又、本発明に従うカートリッジは、一般には、入口及び出口を有する流路と；出口に連通する反応槽と；流路において入口と出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬と；を有し、流路において入口側から反応槽に向けて溶媒を流し、乾燥試薬を溶解し且つ反応槽に移送可能であるものであればよい。又、好ましくは、流路は、試薬配置部よりも入口側に位置する、入口を介して流路に注入された溶媒を貯留する貯留部を有する。
【００３１】
又、本発明に従う測定装置は、一般には、入口及び出口を有する流路と；出口に連通する反応槽と；流路において入口と出口との間の試薬配置部に配置された乾燥試薬と；流路において、入口側から反応槽に向けて溶媒を流し、乾燥試薬を溶解し且つ反応槽に移送する送液手段と；反応槽に収容された液体の光学特性を検出する検出手段と；送液手段により流路に溶媒を流させると共に、流路に溶媒を流した後に検出手段により光学特性を検出させる制御手段と；を有するものであればよい。斯かる測定装置において、好ましくは、流路と、反応槽と、試薬と、を有するカートリッジが着脱可能とされる。又、好ましくは、流路は、試薬配置部よりも入口側に位置する、入口を介して流路に注入された溶媒を貯留する貯留部を有し、送液手段は、入口から空気を流入させることで貯留部に貯留された溶媒を反応槽に向けて流す送気手段を有する。
【００３２】
２．測定原理
本実施例では、本発明は、生物化学発光法を用いたエンドトキシン、βグルカンの測定方法に適用される。
【００３３】
２−１．生物化学発光法による測定
図１は、生物化学発光法による測定の原理を示す。同図中に反応式を示すように、ルシフェリンは、Ｍｇ2+（２価金属イオン）の存在下で、ルシフェラーゼの作用でＡＴＰと反応して、ＡＭＰとオキシルシフェリンとピロリン酸を生成する。その際に光が発生する。そして、過剰のルシフェラーゼ、ルシフェリンが存在すれば、発光量はＡＴＰ量と相関する。
【００３４】
２−２．生物化学発光法によるエンドトキシンの測定
図２は、生物化学発光法によるエンドトキシンの測定の原理を示す。カブトガニの血球抽出液（ＬＡＬ：Limulus Amebocyte Lysate）の成分であるリムルス反応系には、エンドトキシンによって開始される連鎖反応系であるＣ因子リムルス反応系が存在する。エンドトキシンは、リムルス反応系のＣ因子を活性化する。活性化された活性型Ｃ因子（図示せず）は、リムルス反応系のＢ因子を活性化する。活性化された活性型Ｂ因子（図示せず）は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体（図示せず）を活性化し、凝固酵素を生成する。この生成した凝固酵素が、その基質であるリムルス反応系のコアギュローゲンを加水分解して凝固タンパク質であるコアギュリン（図示せず）を生成することで、リムルス反応系はゲル化する。
【００３５】
生物化学発光法によるエンドトキシンの測定は、上述のようなエンドトキシンによりリムルス反応系のＣ因子リムルス反応系が活性化されてゲル化するプロセスを利用する。即ち、エンドトキシンによりリムルス反応系が活性化されることで生成する凝固酵素の基質として、ルシフェリンを遊離する発光合成基質をリムルス反応系に添加する。これにより、エンドトキシンが存在する場合には、リムルス反応系の活性化により生成した凝固酵素により、発光合成基質から、生物化学発光反応の発光基質であるルシフェリンが遊離する。従って、この遊離したルシフェリンにルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定することができる。そして、過剰のルシフェラーゼ、ＡＴＰが存在すれば、発光量は遊離されたルシフェリン量（リムルス反応系の活性化の程度）と相関するので、結果としてエンドトキシン量を測定することができる。
【００３６】
２−３．生物化学発光法によるβグルカンの測定
図３は、生物化学発光法によるβグルカンの測定の原理を示す。カブトガニの血球抽出液の成分であるリムルス反応系には、βグルカンによって開始される連鎖反応系であるＧ因子リムルス反応系が存在する。βグルカンは、リムルス反応系のＧ因子を活性化する。活性化された活性型Ｇ因子（図示せず）は、リムルス反応系の凝固酵素前駆体（図示せず）を活性化し、凝固酵素を生成する。この生成した凝固酵素が、その基質であるリムルス反応系のコアギュローゲンを加水分解して凝固タンパク質であるコアギュリン（図示せず）を生成することで、リムルス反応系がゲル化する。
【００３７】
生物化学発光法によるβグルカンの測定は、上述のようなβグルカンによりリムルス反応系のＧ因子リムルス反応系が活性化されてゲル化するプロセスを利用する。即ち、βグルカンによりリムルス反応系が活性化されることで生成する凝固酵素の基質として、ルシフェリンを遊離する発光合成基質をリムルス反応系に添加する。これにより、βグルカンが存在する場合には、リムルス反応系の活性化により生成した凝固酵素により、発光合成基質から、生物化学発光反応の発光基質であるルシフェリンが遊離する。従って、この遊離したルシフェリンにルシフェラーゼを作用させて生物化学発光反応による発光量を測定することができる。そして、過剰のルシフェラーゼ、ＡＴＰが存在すれば、発光量は遊離されたルシフェリン量（リムルス反応系の活性化の程度）と相関するので、結果としてβグルカン量を測定することができる。
【００３８】
２−４．本実施例における測定方法の手順の概要
次に、後述するカートリッジ、測定装置の構成の理解を容易とするために、本実施例における測定方法の手順の概要を説明する。
【００３９】
図４は、本実施例におけるエンドトキシンの測定の手順の一例の概要を模式的に示す。カートリッジ１は、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０を有する。又、カートリッジ１は、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の各出口に連通した１つの反応槽４０を有する。第１の流路１０には、エンドトキシンにより活性化されるリムルス反応系を含む乾燥された第１の試薬（リムルス試薬）Ｒ１が配置されている。第２の流路２０には、エンドトキシンによりリムルス反応系が活性化されることで発光基質を遊離する発光合成基質を含む乾燥された第２の試薬（発光合成基質含有試薬）Ｒ２が配置されている。第３の流路３０には、発光基質に作用して生物化学発光反応を生じさせる発光酵素を含む乾燥された第３の試薬（発光酵素含有試薬）Ｒ３が配置されている。
【００４０】
測定時には、先ず、図４（ａ）に示すように、反応槽４０に試料Ｓを注入する。又、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の各入口を介して溶媒としての水Ｗを注入して、例えば各入口の直下にそれぞれ水Ｗを貯留する。
【００４１】
次に、図４（ｂ）に示すように、カートリッジ１を移動させることで、第１の流路１０の入口を送気手段の空気出口１１１の位置に配置すると共に、空気出口１１１を移動させることで、該入口に空気出口１１１を気密的に接続する。その後、空気出口１１１から空気を押し出し、上記貯留された水を反応槽４０に向けて流し、第１の試薬Ｒ１を溶解し且つ反応槽４０に移送する。好ましくは、その後、反応槽４０に収容された液体の温度を所定温度に調整して所定時間保持する。
【００４２】
次に、図４（ｃ）に示すように、カートリッジ１を移動させることで、第２の流路２０の入口を送気手段の空気出口１１１の位置に配置すると共に、空気出口１１１を移動させることで、該入口に空気出口１１１を気密的に接続する。その後、空気出口１１１から空気を押し出し、上記貯留された水を反応槽４０に向けて流して、第２の試薬Ｒ２を溶解し且つ反応槽４０に移送する。好ましくは、その後、反応槽４０に収容された液体の温度を所定温度に調整して所定時間保持する。
【００４３】
次に、図４（ｄ）に示すように、カートリッジ１を移動させることで、第３の流路３０の入口を送気手段の空気出口１１１の位置に配置すると共に、空気出口１１１を移動させることで、該入口に空気出口１１１を気密的に接続する。その後、空気出口１１１から空気を押し出し、上記貯留された水を反応槽４０に向けて流して、第３の試薬Ｒ３を溶解し且つ反応槽４０に移送する。そして、例えば反応槽４０に第３の試薬Ｒ３を移送した後、所定時間後に、反応槽４０に収容された液体（反応液）が発する光を発光検出手段の検出部１２１により検出する。その後、予め求められたエンドトキシン濃度と発光量の検出値との関係を示す検量線を用いて、発光量の検出値からエンドトキシン濃度を求めることができる。
【００４４】
図４には、エンドトキシンの測定の場合について示したが、βグルカンの測定も概略同様にして行うことができる。この場合、第１の流路１０には、βグルカンにより活性化されるリムルス反応系を含む乾燥された第１の試薬Ｒ１が配置される。
【００４５】
３．カートリッジ
次に、本実施例におけるカートリッジ１について更に詳しく説明する。尚、以下の説明において、カートリッジ１に関して上下とは、使用時における上下をいうものとする。
【００４６】
図５（ａ）はカートリッジ１の縦断面図（図５（ｂ）中のＡ−Ａ線断面図）であり、図５（ｂ）はカートリッジ１の平面図である。
【００４７】
カートリッジ１は、ボディー２を有する。本実施例では、ボディー２は、第１部分３と第２部分４とを互いに連結することで形成されている。第１部分３は、使用時に略水平に配置される主平面（上面３ａで代表される）を有する一方向に長い略平板状部材である。本実施例では、第１部分３は、断面視及び平面視が略矩形である。第２部分４は、第１部分３に対して略Ｌ字形の断面を形成するように連結される一方向に長い略角柱状部材である。第２部分４の上面４ａ側且つ第１部分３が連結される側の縁部は、第２部分４の長手方向の全域にわたり、略第１部分３の厚さ分が切り欠かれており、段部４ｅが形成されている。この段部４ｅに、第１部分３の長手方向の一方の端部側の側面３ｄから所定範囲が載置されるようにして、第１部分３は第２部分４に連結される。これにより、第２部分４の底面４ｂ側の所定範囲の突出部４ｆが第１部分３の底面３ｂよりも下方に突出した、断面視略Ｌ字形のカートリッジ１が形成されている。
【００４８】
第１部分３と第２部分４とは、締結、接着、溶着、スナップフィットなどの任意の固定手段により固定することができる。本実施例では、第２部分４の第１部分３が連結される側とは反対側の側面４ｄから段部４ｅ側に貫通するネジ５によって、第２部分４と、段部４ｅ上に載置された第１部分３とを締結して固定した。ネジ５は、第２部分４の長手方向の両端部近傍にそれぞれ設けた。
【００４９】
ボディー２（第１部分３及び第２部分４）は、それに接触する試薬、試料、溶媒などに適合する任意の材料で形成することができるが、製造が容易であることなどから、好ましくは合成樹脂で形成する。合成樹脂としては、アクリル、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネートなどを用いることができる。本実施例では、合成樹脂として無色透明のアクリル樹脂を用いた。
【００５０】
カートリッジ１は、第１の入口１１及び第１の出口１２を有する第１の流路１０と、第２の入口２１及び第２の出口２２を有する第２の流路２０と、第３の入口３１及び第３の出口３２を有する第３の流路３０と、を有する。本実施例では、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０は、それぞれ第１部分３の主平面３ａに沿って延在する横断部１０ａ、２０ａ、３０ａを有する。又、本実施例では、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０は、それぞれ横断部１０ａ、２０ａ、３０ａの上方に向けて第１部分３の主平面３ａに対して略直交する方向に沿って延在する導入部１０ｂ、２０ｂ、３０ｂを有する。横断部１０ａ、２０ａ、３０ｂ及び導入部１０ｂ、２０ｂ、３０ｂは、その延長方向（軸線）と略直交する方向の断面が一様な略円形状の穴で形成されている。
【００５１】
第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の一方の端部である第１、第２、第３の入口１１、２１、３１は、それぞれ第１部分３の長手方向における第２部分４に連結される側とは反対側の側面３ｃに隣接して、第１部分３の上面３ａに開口している。この第１、第２、第３の入口１１、２１、３１から横断部１０ａ、２０ａ、３０ａまで、それぞれ導入部１０ｂ、２０ｂ、３０ｂが連続している。第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の他方の端部である第１、第２、第３の出口１２、２２、３２は、第１部分３の長手方向の他方の側面３ｄに開口している。第１、第２、第３の入口１１、２１、３１は、カートリッジ１の使用時まで取り外し可能な封鎖手段により封鎖することができる。この封鎖のためには、シール部材を接着や溶着によって取り外し可能に固定するなどの任意の封鎖手段を用いることができる。例えば、合成樹脂製のシート部材８１を取り外し可能に接着することで封鎖することができる。
【００５２】
又、カートリッジ１は、第１、第２、第３の出口１２、２２、３２に連通する１つの反応槽４０を有する。本実施例では、反応槽４０は、第２部分４の長手方向の略中央において、第２部分４の上面４ａから底面４ｂに向けて形成された略円柱状の穴で形成されている。反応槽４０の、第２部分４の上面４ａ側且つ段部４ｅ側の一部は、段部４ｅが設けられることで切り欠かれている。又、この段部４ｅに第１部分３が配置されることで、段部４ｅに位置する反応槽４０の開口は、第１部分３の底面３ｂで閉鎖される。そして、第２部分４の上面４ａにおいて反応槽４０は円弧状に開口している。本実施例では、この開口部が、反応槽４０に収容された液体が発する光を検出するための光透過部４０ａとなる。第１部分３の長手方向における第２部分４に連結される側の側面３ｄに開口している第１、第２、第３の出口１２、２２、３２は、第１部分３の底面３ｂで閉鎖された反応槽４０の開口の上部において、反応槽４０と連通している。第２部分４の上面４ａに開口した光透過部４０ａは、カートリッジ１の使用時まで取り外し可能な封鎖手段により封鎖することができる。この封鎖のためには、シール部材を接着や溶着によって取り外し可能に固定するなどの任意の封鎖手段を用いることができる。例えば、合成樹脂製のシート部材８２を取り外し可能に接着することで封鎖することができる。
【００５３】
又、第１の流路１０において第１の入口１１と第１の出口１２との間の第１の試薬配置部１３に、測定対象成分により活性化されるリムルス反応系を含む乾燥された第１の試薬（リムルス試薬）Ｒ１が配置される。又、第２の流路２０において第２の入口２１と第２の出口２２との間の第２の試薬配置部２３に、測定対象成分によりリムルス反応系が活性化されることで発光基質を遊離する発光合成基質を含む乾燥された第２の試薬（発光合成基質含有試薬）Ｒ２が配置される。又、第３の流路３０において第３の入口３１と第３の出口３２との間の第３の試薬配置部３３に、発光基質に作用して生物化学発光反応を生じさせる発光酵素を含む乾燥された第３の試薬（発光酵素含有試薬）Ｒ３が配置される。第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びその配置方法の詳細については後述する。
【００５４】
又、本実施例では、第１の流路１０は、第１の試薬配置部１３よりも第１の入口１１側に位置する、第１の入口１１を介して第１の流路１０に注入された溶媒を貯留する第１の貯留部１４を有する。又、第２の流路２０は、第２の試薬配置部２３よりも第２の入口２１側に位置する、第２の入口２１を介して第２の流路２０に注入された溶媒を貯留する第２の貯留部２４を有する。又、第３の流路３０は、第３の試薬配置部３３よりも第３の入口３１側に位置する、第３の入口３１を介して第３の流路３０に注入された溶媒を貯留する第３の貯留部３４を有する。本実施例では、導入部１０ｂ、２０ｂ、３０ｂと横断部１０ａ、２０ａ、３０ａとの接続部、即ち、第１、第２、第３の入口１１、２１、３１の直下が、第１、第２、第３の貯留部１４、２４、３４となる。
【００５５】
又、本実施例では、カートリッジ１は、第１の流路１０に連通する第１の試薬投入路５０と、第２の流路２０に連通する第２の試薬投入路６０と、第３の流路３０に連通する第３の試薬投入路７０と、を有する。本実施例では、第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０は、それぞれ第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の横断部１０ａ、２０ａ、３０ａの上方に向けて第１部分３の主平面３ａに対して略直交する方向に沿って延在する。第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０は、その延長方向（軸線方向）と略直交する方向の断面が一様な略円形状の穴で形成されている。第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０の一方の端部である第１、第２、第３の試薬投入口５１、６１、７１は、それぞれ第１部分３の上面３ａに開口している。この第１、第２、第３の試薬投入口５１、６１、７１から横断部１０ａ、２０ａ、３０ａまでそれぞれ第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０が連続している。そして、第１の試薬配置部１３は、第１の流路１０と第１の試薬投入路５０との接続部、即ち、第１の試薬投入口５１の直下を含む。又、第２の試薬配置部２３は、第２の流路２０と第２の試薬投入路６０との接続部、即ち、第２の試薬投入口６１の直下を含む。又、第３の試薬配置部３３は、第３の流路３０と第３の試薬投入路７０との接続部、即ち、第３の試薬投入口７１の直下を含む。第１、第２、第３の試薬投入口５１、６１、７１は、それぞれ詳しくは後述するようにして第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３が乾燥状態で第１、第２、第３の試薬配置部１３、２３、３３に配置された後に封鎖することができる。この封鎖のためには、シール部材を接着や溶着によって固定したり、樹脂を封入したりする任意の封鎖手段を用いることができる。例えば、合成樹脂製のシート部材８３を接着することで封鎖することができる。
【００５６】
本実施例では、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の横断部１０ａ、２０ａ、３０ａは、第１、第２、第３の出口１２、２２、３２側の延長線上の中心に関して放射状に形成されている。特に、本実施例では、第２の流路２０の横断部２０ａは第１部分３の長手方向と略平行に配置され、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０のうち隣り合うものの軸線間の角度は約１０度とされている。しかし、これに限定されるものではなく、上記角度は他の値であってもよいし、或いは第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の横断部１０ａ、２０ａ、３０ａは略平行であってもよい。
【００５７】
又、本実施例では、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０（横断部及び導入部）は、断面形状が円形とされている。しかし、これに限定されるものではなく、溶媒の意図しない流動を防止すること、乾燥状態の試薬を所定位置に安定して配置することなどの観点から、断面形状や寸法を適宜設定することができる。一般に、上記各観点及び加工性の良さなどから、断面形状は円形が好ましい。
【００５８】
又、本実施例では、反応槽４０は、第１、第２、第３の出口１２、２２、３２より下方における、使用時に液体を収容する部分は、断面形状が円形とされている。尚、本実施例では、反応槽４０の光透過部（開口部）４０ａは、上記円形の第１部分３側の一部が切り欠かれた円弧状とされている。しかし、これに限定されるものではなく、最終的に反応槽に収容される液体の容量（即ち、試料、及び試薬を溶解した溶媒）の量や、発光検出手段の検出部の特性などの観点から、断面形状や寸法を適宜設定することができる。一般に、上記各観点及び加工性の良さなどから、使用時に液体を収容する部分は、断面形状は円形が好ましい。
【００５９】
又、本実施例では、第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０は、断面形状が円形とされている。しかし、これに限定されるものではなく、乾燥状態の試薬を所定位置に配置する操作を良好に行えるように、断面形状や寸法を適宜設定することができる。一般に、上記観点及び加工性の良さなどから、断面形状は円形が好ましい。
【００６０】
又、本実施例では、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の横断部１０ａ、２０ａ、３０ａと導入部１０ｂ、２０ｂ、３０ｂとの接続部の底部側の角部１０ｃ、２０ｃ、３０ｃ（図５（ａ）に第２の流路２０の角部２０ｃのみ図示）には、Ｒが付けられている。これにより、第１、第２、第３の入口１１、２１、３１からの空気の流動がより円滑に行われる。
【００６１】
又、本実施例では、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０の第１、第２、第３の入口１１、２１、３１側の縁部１０ｄ、２０ｄ、３０ｄ（図５（ａ）に第２の流路２０の縁部２０ｄのみ図示）には、これら入口１１、２１、３１に向けて拡径されたテーパが設けられている。これにより、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０に溶媒を注入しやすくなっている。同様に、本実施例では、第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０の第１、第２、第３の試薬投入口５１、６１、７１側の縁部５０ａ、６０ａ、７０ａ（図５（ａ）に第２の流路２０の縁部６０ａのみ図示）には、これら試薬投入口５１、６１、７１に向けて拡径されたテーパが設けられている。これにより、第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０に試薬を注入しやすくなっている。
【００６２】
又、本実施例では、反応槽４０の底部４０ｂは、上方に向けて拡径されたテーパが設けられている。これにより、第１、第２、第３の出口１２、２２、３２から吐出された液体が、反応槽４０内においてより確実に混合されるようになっている。
【００６３】
第１の試薬（リムルス試薬）Ｒ１としては、従来リムルステストに使用されているカブトガニ血球抽出液の成分を好適に用いることができる。測定対象成分がエンドトキシンの場合、リムルス試薬は、少なくともリムルス反応系のうちエンドトキシンにより活性化されるＣ因子リムルス反応系であって、発光合成基質からルシフェリンを遊離させる成分（活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子又は凝固酵素）を生成するものであればよい。例えば、エンドトキシン測定用のリムルス試薬（ＬＡＬ試薬）或いはエンドトキシン測定用キットとして市販されているリムルス試薬を好適に用いることができる。又、リムルス試薬の成分は、天然のものであってもよいが、その一部又は全部が合成されたもの又は組換え遺伝子由来のものであってもよい。又、測定対象成分がβグルカンの場合、リムルス試薬は、少なくともリムルス反応系のうちβグルカンにより活性化されるＧ因子リムルス反応系であって、発光合成基質からルシフェリンを遊離させる成分（活性型Ｇ因子又は凝固酵素）を生成するものであればよい。例えば、βグルカン測定用のリムルス試薬或いはβグルカン測定用キットとして市販されているリムルス試薬を好適に用いることができる。又、リムルス試薬の成分は、天然のものであってもよいが、その一部又は全部が合成されたもの又は組換え遺伝子由来のものであってもよい。
【００６４】
又、第２の試薬（発光合成基質含有試薬）Ｒ２の発光合成基質としては、ペプチドに生物化学発光反応の発光基質であるルシフェリンが結合されており、リムルス反応系が活性化されることで、その結合されているルシフェリンを遊離させるものであれば好適に用いることができる。上記ペプチドに結合されているルシフェリンとしては、図２に化学式を示すアミノルシフェリンを好適に用いることができる。この場合、上記ペプチドのアミノ酸のカルボキシル基とアミノルシフェリンのアミノ基がアミド結合を形成することができる。上記ペプチドは、Ｃ末端におけるルシフェリンとの結合が、リムルス反応系が活性化されることで切断されるアミノ酸配列から成るものであればよい。測定対象成分がエンドトキシンの場合、リムルス反応系が活性化されることで発光合成基質からルシフェリンを遊離させる成分としては、いずれもプロテアーゼ活性を有する活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子又は凝固酵素が挙げられる。この場合、上記ペプチドは、活性型Ｃ因子、活性型Ｂ因子又は凝固酵素の認識配列を有するものを用いることができる。これらの認識配列を有する上記ペプチドの例は、特許文献１に記載されている。測定対象成分がβグルカンの場合、リムルス反応系が活性化されることで発光合成基質からルシフェリンを遊離させる成分としては、いずれもプロテアーゼ活性を有する活性型Ｇ因子又は凝固酵素が挙げられる。この場合、上記ペプチドは、活性型Ｇ因子又は凝固酵素の認識配列を有するものを用いることができる。これらの認識配列を有する上記ペプチドの例は、特許文献２に記載されている。又、上記ペプチドのＮ末端は、斯界にて一般に用いられる任意適宜の保護基で保護されていてよい。例えば、発光合成基質としては、測定対象成分がエンドトキシン又はβグルカンのいずれの場合にも、上記ペプチドとして凝固酵素の認識配列を有し、ルシフェリンとしてアミノルシフェリンが結合されたものである「ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ルシフェリン」を好適に用いることができる（図２、図３）。この場合、エンドトキシン又はβグルカンによってリムルス反応系が活性化されて凝固酵素が生成されると、この凝固酵素は上記「ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ルシフェリン」のＡｒｇとルシフェリン（より詳細にはアミノルシフェリン）との間の結合を切断する。これにより、ルシフェリン（より詳細にはアミノルシフェリン）が遊離する。本発明にて用い得る発光合成基質は、特許文献１又は２に記載の方法により合成することができ、又市場にて入手することができる。
【００６５】
又、第３の試薬（発光酵素含有試薬）Ｒ３の、生物化学発光反応を触媒する発光タンパク質（発光酵素）であるルシフェラーゼとしては、甲虫由来のルシフェラーゼを好適に用いることができる。甲虫由来のルシフェラーゼとしては、北米ホタル、ゲンジボタル、ヘイケボタル、ツチボタル、ヒメボタル、マドボタル、オバボタル、光コメツキムシ、鉄道虫などの甲虫由来のルシフェラーゼを好適に用いることができる。尚、ルシフェラーゼは、天然タンパク質であっても、組換えタンパク質であってもよく、各種のものが市場で入手可能である。又、ルシフェラーゼは野生型のアミノ酸配列を有するものであっても、野生型のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼであってもよい。変異型ルシフェラーゼとしては、発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼを好適に用いることができる。発光強度が増大するように改変された変異型ルシフェラーゼを用いることにより、より高感度、高精度の測定が可能となる。このような変異型ルシフェラーゼの例は、特許文献２又は３に記載されている。例えば、変異型ルシフェラーゼとしては、北米ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２３位のイソロイシンがロイシンに、５３０位のロイシンがアルギニンに置換され、更に、４７位のイソロイシンがスレオニンに、５０位のアスパラギンがセリンに、５９位のメチオニンがスレオニンに、２５２位のスレオニンがセリンに置換されたアミノ酸配列からなるものを用いることができる。この変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼに比べて生物化学発光反応における発光強度を増大させることができ、より高感度、高精度の測定を可能とし得ることが確認されている（特許文献１）。第３の試薬Ｒ３には、この他、ＡＴＰと、２価金属イオン（Ｍｇ2+など）が含まれる。
【００６６】
第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれの成分を反応時に適当な量で含む溶液として一旦調製される。その後、その溶解状態の第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を、第１、第２、第３の試薬投入路５０、６０、７０の第１、第２、第３の試薬投入口５１、６１、７１を介して、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０に注入して、第１、第２、第３の試薬配置部１３、２３、３３に貯留する。その後、その溶解状態の第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を乾燥させる。このとき、第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３をカートリッジ１の使用時に溶媒で溶解した際に十分の活性が得られるような条件で乾燥させる。好ましくは、公知の方法に従って凍結乾燥により乾燥させる。こうして、乾燥状態の第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を、第１、第２、第３の試薬配置部１３、２３、３３に配置することができる。尚、前述のように、反応槽４０にも試薬を配置しておくことができ、この場合も、例えば上記同様にして乾燥させた乾燥状態の試薬を反応槽４０に配置することができる。
【００６７】
エンドトキシンの測定のためのカートリッジ１における第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ溶媒としての水で溶解され且つ反応槽４０に移送される。各成分の濃度などの条件は、適宜設定し得るものである。
【００６８】
又、βグルカンの測定のためのカートリッジにおける第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ溶媒としての水で溶解され且つ反応槽４０に移送される。各成分の濃度などの条件は、適宜設定し得るものである。
【００６９】
尚、カートリッジ１の使用時に第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を溶解し且つ反応槽４０に移送するのに使用される溶媒は、典型的には水である。水は、所望の測定精度に応じて、少なくとも測定結果に影響を与える量の測定対象成分を含んでいないことが必要である。水としては、常水、精製水、滅菌精製水、滅菌水、注射用水（注射用蒸留水）、純水、超純水、逆浸透水を用いることができる。注射用水（注射用蒸留水）、逆浸透水を用いることが好ましい。尚、所望により、溶媒として、所定の緩衝作用物を含有する緩衝液などその他の水系溶媒を用いてもよい。又、所望により、非水系の溶媒を用いることもできる。
【００７０】
又、試料は、例えば、注射剤、輸液又は透析液などの薬剤溶液（医薬品）、水（常水、精製水、滅菌精製水、滅菌水、注射用水（注射用蒸留水）、純水、超純水、逆浸透水）、医療用具や医療機器からの採取物、クリーンルームからの採取物、血液（全血、血清、血漿）又は尿などの生体試料（臨床試料）などである。
【００７１】
これら試薬を用いた生物化学発光法によるエンドトキシン、βグルカンの測定では、一般に、試料を含む反応系にリムルス試薬を添加して、３７℃で５分〜６０分間程度加温する。その後、反応系に発光合成基質を添加して、３７℃で１分〜３０分間程度加温する。その後、反応系に過剰のルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ2+（２価金属イオン）を添加する。そして、生物化学発光反応により発生する光を発光検出器で測定する。生物化学発光反応により発生する光の測定は、例えば、室温（２５℃）で反応を行い、ルシフェラーゼ、２価金属イオンを添加してから所定時間後の受光素子の出力を測定したり、所定時間にわたる受光素子の出力の積算値を測定したりすることができる。
【００７２】
４．測定装置
図６は、本実施例における測定装置１００の正面図である。又、図７は、本実施例における測定装置１００を図６中の矢印Ａで示す方向から見た側面図である。又、図８は、本実施例における測定装置１００の部分拡大斜視図である。又、図９は、本実施例における測定装置１００の要部の概略機能ブロック図である。尚、以下の説明において、測定装置１００に関して上下とは、使用時における上下をいうものとする。
【００７３】
本実施例の測定装置１００は、装置本体１０１に対して上述の本実施例におけるカートリッジ１が着脱可能とされている。本実施例では、装置本体１０１に対して１度に２個のカートリッジ１を装着することができる。
【００７４】
装置本体１０１には、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０において、それぞれ第１、第２、第３の入口１１、２１、３１側から反応槽４０に向けて溶媒を流し、第１、第２、第３の試薬Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３を、溶解し且つ反応槽４０に移送する送液手段が設けられている。本実施例では、送液手段は、第１、第２、第３の入口１１、２１、３１から空気を流入させることで第１、第２、第３の貯留部１４、２４、３４に貯留された溶媒をそれぞれ反応槽４０に向けて流す、送気手段としての送気機構１１０を有する。送気機構１１０は、空気出口１１１を備えた送気部１１２と、送気部１１２に向けて空気を押し出すポンプ部１１３と、送気部１１２とポンプ部１１３との間を空気の流通が可能なように連結するチューブ１１４と、を有する。送気部１１２の空気出口１１１の周囲には、カートリッジ１の第１、第２、第３の入口１１、２１、３１と同等又はそれよりも大きい内径を有する、可撓性の吸盤状部材で形成されたノズル１１１ａが設けられている。これにより、後述するように送気部１１２の空気出口１１１を第１、第２、第３の入口１１、２１、３１と接続する際に、ノズル１１１ａが第１、第２、第３の入口１１、２１、３１の周囲に気密的に接触して、第１、第２、第３の流路１０、２０、３０に効率よく空気を流入させることができる。
【００７５】
又、装置本体１０１には、反応槽４０に収容された液体が発する光を検出する発光検出手段としての発光検出器１２０が設けられている。本実施例では、発光検出器１２０は、光電子増倍管とされる検出部１２１、検出部１２１の出力電流を電圧に変換するアンプ１２２、アンプ１２２の出力電圧をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換器１２３などを有する。
【００７６】
又、装置本体１０１には、装置本体１０１の各部の動作を統括的に制御する制御手段としての制御回路１０２が設けられている。制御回路１０２は、演算制御部としてのＣＰＵ、記憶部としてのＲＡＭ、ＲＯＭなどを有する。ＣＰＵは、ＲＯＭ、ＲＡＭに記憶されたプログラム、データなどに従って装置本体１０１の各部の動作を制御する。特に、制御回路１０２は、送液手段としての送気機構１１０によりカートリッジ１の第１、第２、第３の流路１０、２０、３０にこの順番で順次に溶媒を流させると共に、第３の流路３０に溶媒を流した後に発光検出手段としての発光検出器１２０により光を検出させる。これは、本実施例では、制御回路１０２によって、送気機構１１０、発光検出器１２０、並びに、後述する送気部搬送部１３０、カートリッジ搬送部１４０及びシャッター１５０などを制御することによって実現される。又、制御回路１０２には、発光検出器１２０において検出部１２１が検出した光量に応じてＡ／Ｄ変換機１２３から出力されるデータが入力される。制御回路１０２は、そのデータから測定対象成分の濃度など所望の測定値を求めることができる。或いは、制御回路１０２は、制御回路１０２に対して通信可能に接続された外部機器（パーソナルコンピュータなど）２００にそのデータを送信する。外部機器は、そのデータに応じて測定対象成分の濃度などの所望の測定値を求めることができる。更に、制御回路１０２は、後述するヒータ１６０を制御して、カートリッジ１の反応槽４０に収容された液体の温度を所定温度に調整することを可能とする。
【００７７】
又、装置本体１０１には、上述のように送気機構１１０により第１、第２、第３の流路１０、２０、３０に順次に溶媒を流させるために、送気機構１１０の送気部１１２を移動させる電動アクチュエータで構成された送気部搬送部１３０と、カートリッジ１を移動させる電動アクチュエータで構成されたカートリッジ搬送部１４０と、が設けられている。送気部搬送部１３０は、第１、第２、第３の入口１１、２１、３１を含む第１部分３の上面（第１の平面）３ａと略直交する方向に沿って空気出口１１１と第１、第２、第３の入口１１、２１、３１との相対位置を変更する第１の移動手段を構成する。又、カートリッジ搬送部１４０は、上記第１の平面３ａに沿って空気出口１１１と第１、第２、第３の入口１１、２１、３１との相対位置を変更する第２の移動手段を構成する。制御回路１０２は、これら第１、第２の移動手段により、空気出口１１１を第１、第２、第３の入口１１、２１、３１にこの順番で順次に接続させる。
【００７８】
更に説明すると、送気部搬送部１３０は、装置本体１０１のベース１０３に固定されたハウジング１３１、ハウジング１３１の外部に一部が露出したスライダ１３２、ハウジング１３１の外部でスライダ１３２に固定され送気部１１２を支持する送気部支持部１３３、ハウジング１３１の内部でスライダ１３２のボールナットと係合するボールネジが形成された駆動軸１３４、駆動軸１３４を回転させる本実施例ではパルスモータとされる駆動源１３５などを有する。ハウジング１３１は、駆動軸１３４の軸線方向がベース１０３の主平面（上面１０３ａで代表される）と略直交する方向となるように、ベース１０３に固定されている。これにより、スライダ１３２、送気部支持部１３３及び送気部１１２は、一体的にベース１０３の主平面１０３ａと略直交する方向に沿って移動可能である。又、後述するようにカートリッジ１の第１部分３の主平面（上面３ａで代表される）は、ベース１０３の主平面１０３ａと略平行に配置される。そのため、スライダ１３２、送気部支持部１３３及び送気部１１２は、一体的にカートリッジ１の主平面３ａに対して略直交する方向に沿って移動可能である。尚、本実施例では、測定装置１００の使用時に、ベース１０３の主平面は、実質的に水平に配置されることが意図されている。
【００７９】
又、カートリッジ搬送部１４０は、装置本体１０１のベース１０３に固定されたハウジング１４１、ハウジング１４１の外部に一部が露出したスライダ１４２、ハウジング１４１の外部でスライダ１４２に固定されカートリッジ１を支持するカートリッジ支持部１４３、ハウジング１４１の内部でスライダ１４２のボールナットと係合するボールネジが形成された駆動軸１４４、駆動軸１４４を回転させる本実施例ではパルスモータとされる駆動源１４５などを有する。ハウジング１４１は、駆動軸１４４の軸線方向がベース１０３の主平面１０３ａと略平行な方向となるように、ベース１０３に固定されている。これにより、スライダ１４２、カートリッジ支持部１４３及びカートリッジ１は、一体的にベース１０３の主平面１０３ａと略平行な方向に沿って移動可能である。カートリッジ支持部１４３の上面１４３ａは、ベース１０３の主平面と略平行であり、その上にカートリッジ１を載置することで、カートリッジ１の第１部分３の主平面３ａがベース１０３の主平面１０３ａと略平行となる。そのため、スライダ１４２、カートリッジ支持部１４３及びカートリッジ１は、一体的に上記送気部１１２の移動方向に対して略直交する方向に沿って移動可能である。
【００８０】
図８に示すように、カートリッジ支持部１４２の上面１４３ａには、その移動方向に沿って延在する２個の凹部１４３ｂが形成されている。凹部１４３ｂは、カートリッジ支持部１４３の移動方向と略直交する方向の一端部近傍に形成されている。この凹部１４３ｂは、カートリッジ１の第２部分４における、第１部分３より下方に突出した突出部４ｆに適合する形状に形成されている。カートリッジ１をカートリッジ支持部１４３に装着する際には、カートリッジ１の上記突出部４ｆをカートリッジ支持部１４３の凹部１４３ｂに嵌合させる。これにより、カートリッジ１を正しい向きでカートリッジ支持部１４３上に装着することができる。このようにカートリッジ１を正しい向きでカートリッジ支持部１４３上に装着した状態で、送気部１１２の空気出口１１１の移動方向とカートリッジ１上の第１、第２、第３の入口１１、２１、３１の移動方向とが交差する。又、この状態で反応槽４０の光透過部４０ａの移動方向が発光検出器１２０の検出部１２１の検出位置を通過する。特に、本実施例では、発光検出器１２０の検出部１２１は、カートリッジ１が、その第３の入口３１に送気部１１２の空気出口１１１が接続し得る位置にあるときに、反応槽４０の収容物の発光を検出できる位置に配置されている。これにより、第３の試薬Ｒ３を反応槽４０に移送した後に、カートリッジ１を移動させることなく、直ちに発光を検出することが可能となる。
【００８１】
本実施例では、カートリッジ１を装着する際には、図６に示すようにカートリッジ搬送部１４０のカートリッジ支持部１４３を、カートリッジ搬送部１４０の駆動源１４５側に配置させる。そして、測定を開始する際には、カートリッジ支持部１４３を、一旦カートリッジ搬送部１４０の駆動源１４５とは反対側の端部まで移動させる。その後、所定のタイミングで、駆動源１４５側のカートリッジ１の第１の入口１１から順次に、各流路の入口を送気部１１２の空気出口１１１の位置に配置させるように、カートリッジ支持部１４３を駆動源１４５側に移動させる。各流路の入口に送気部１１２の空気出口１１１を接続させる際には、送気部搬送部１３０の送気部支持部１３３をカートリッジ１側（即ち、駆動源１３５とは反対側）に移動させる。そして、少なくともカートリッジ搬送部１４０のカートリッジ支持部１４３を移動させる際には、送気部搬送部１３０の送気部支持部１３３をカートリッジ１から離間する方向（即ち、駆動源１３５側）に移動させる。
【００８２】
尚、本実施例では、装置本体１０１には、発光検出器１２０の検出部１２１を開放又は遮蔽するシャッター１５０が設けられており、検出部１２１により発光を検出する際にシャッター１５０が開放され、検出していない際にはシャッター１５０は閉じられる。
【００８３】
又、装置本体１０１には、カートリッジ１の反応槽４０に収容された液体の温度を調整する温度調整手段が設けられている。本実施例では、カートリッジ支持部１４３の凹部１４３ｂの底部に隣接するようにして、温度調整手段としてのヒータ１６０がカートリッジ支持部１４３に内蔵されている。
【００８４】
又、本実施例では、測定装置１００には、装置本体１０１の全体を覆う遮光ケース（図示せず）が設けられている。この遮光ケースは開閉可能とされており、カートリッジ１を装着するなどの操作時には開放され、測定を開始する際に閉じられる。
【００８５】
次に、本実施例における測定装置１００を用いた測定手順の一例について説明する。図１０は、本実施例の測定装置１００を用いた測定手順の一例のフローチャートである。ここでは、１個のカートリッジ１を用いて試料中のエンドトキシンの測定を行う場合を例として説明する。
【００８６】
測定時には、先ず、カートリッジ１の反応槽４０の光透過部（開口部）４０ａを介して、ディスペンサ（マイクロピペット）などにより反応槽４０に試料Ｓを注入する（Ｓ１０１）。この際に、反応槽４０の光透過部４０ａが封鎖手段で封鎖されている場合にはこれを除去する。又、カートリッジ１の第１、第２、第３の入口１１、２１、３１を介して、ディスペンサ（マイクロピペット）などにより第１、第２、第３の流路１０、２０、３０に溶媒としての水を注入して、第１、第２、第３の入口１１、２１、３１の直下の第１、第２、第３の貯留部１４、２４、３４にそれぞれ水を貯留する（Ｓ１０２）。この際に、第１、第２、第３の入口１１、２１、３１が封鎖手段で封鎖されている場合にはこれを除去する。次に、カートリッジ１を、カートリッジ搬送部１４０のカートリッジ支持部１４３に装着する（Ｓ１０３）。
【００８７】
その後、例えば外部機器（パーソナルコンピュータなど）から測定装置１００の制御回路１０２に測定開始指示が入力されると、制御回路１０２は、カートリッジ搬送部１３０によりカートリッジ１を移動させることで、カートリッジ１の第１の入口１１を送気部１１２の空気出口１１１の位置に配置させる（Ｓ１０４）。次に、制御回路１０２は、送気部搬送部１３０により送気部１１２の空気出口１１１を移動させることで、第１の入口１１に空気出口１１１を気密的に接続する（Ｓ１０５）。その後、制御回路１０２は、送気機構１１０において空気出口１１１から空気を押し出させ、第１の入口１１から空気を流入させる（Ｓ１０６）。これにより、第１の貯留部１４に貯留された水が反応槽４０に向けて流され、第１の試薬配置部１３に配置された第１の試薬Ｒ１が溶解され且つ反応槽４０に移送される。尚、制御回路１０２は、送気の終了後に、送気部搬送部１３０により送気部１１２の空気出口１１１を第１の入口１１から離間させる。その後、制御回路１０２は、ヒータ１６０により反応槽４０内の液体を３７℃に加温した状態で２０分間維持させる（Ｓ１０７）。
【００８８】
その後、制御回路１０２は、カートリッジ搬送部１３０によりカートリッジ１を移動させることで、カートリッジ１の第２の入口２１を送気部１１２の空気出口１１１の位置に配置させる（Ｓ１０８）。次に、制御回路１０２は、送気部搬送部１３０により送気部１１２の空気出口１１１を移動させることで、第２の入口２１に空気出口１１１を気密的に接続する（Ｓ１０９）。その後、制御回路１０２は、送気機構１１０において空気出口１１１から空気を押し出させ、第２の入口２１から空気を流入させる（Ｓ１１０）。これにより、第２の貯留部２４に貯留された水が反応槽４０に向けて流され、第２の試薬配置部２３に配置された第２の試薬Ｒ２が溶解され且つ反応槽４０に移送される。尚、制御回路１０２は、送気の終了後に、送気搬送部１３０により送気部１１２の空気出口１１１を第２の入口２１から離間させる。その後、制御回路１０２は、ヒータ１６０により反応槽４０内の液体を３７℃に加温した状態で５分間維持させる（Ｓ１１１）。
【００８９】
その後、制御回路１０２は、カートリッジ搬送部１３０によりカートリッジ１を移動させることで、カートリッジ１の第３の入口３１を送気部１１２の空気出口１１１の位置に配置させる（Ｓ１１２）。次に、制御回路１０２は、送気部搬送部１３０により送気部１１２の空気出口１１１を移動させることで、第３の入口３１に空気出口１１１を気密的に接続する（Ｓ１１３）。その後、制御回路１０２は、送気機構１１０において空気出口１１１から空気を押し出させ、第３の入口３１から空気を流入させる（Ｓ１１４）。これにより、第３の貯留部３４に貯留された水が反応槽４０に向けて流され、第３の試薬配置部３３に配置された第３の試薬Ｒ３が溶解され且つ反応槽４０に移送される。尚、制御回路１０２は、送気の終了後に、送気搬送部１３０により送気部１１２の空気出口１１１を第３の入口３１から離間させる。又、このとき反応槽４０の光透過部（開口部）４０ａに対して発光検出器１２０の検出部１２１が対向している。
【００９０】
その後、制御回路１０２は、シャッター１５０を開放し、発光検出器１２０により反応槽４０に収容された液体（反応液）が発する光を検出させる（Ｓ１１５）。発光検出器１２０で発光を検出している際には、制御回路１０２は、ヒータ１６０により反応槽４０内の液体を２５℃に維持する。尚、第３の試薬Ｒ３を反応槽４０に移送する前に、反応槽４０内の液体を２５℃にするようにしてもよい。
【００９１】
その後、例えば制御回路１０２によって発光量の検出値を示すデータを外部機器に送り、外部機器において、予め求められたエンドトキシン濃度と発光量の検出値との関係を示す検量線を用いて、発光量の検出値からエンドトキシン濃度を求めることができる（Ｓ１１６）。
【００９２】
ここでは、エンドトキシンの測定の場合について示したが、βグルカンの測定も概略同様にして行うことができる。
【００９３】
以上、本実施例によれば、生物化学発光を利用した試料中のエンドトキシン又はβグルカンの測定において、溶液として調整した後に劣化しやすいリムルス試薬、発光合成基質含有試薬又は発光酵素含有試薬の劣化を防止し、測定手順の一部又は全部の自動化にも対応することができる。
【００９４】
実施例２
次に、本発明の他の実施例について説明する。本実施例において実施例１のものと同一又はそれに相当する要素には同一符号を付して詳しい説明は省略する。
【００９５】
実施例１では、流路内の貯留部に溶媒を貯留して、この溶媒を送液手段が備える送気手段により押し出すことで流路内を流した。これにより、上述のように、簡易な構成で、精度よく一定量の溶媒を流すことができ、又測定装置や雰囲気と試薬や試料との接触機会を低減して汚染を抑制することができる。
【００９６】
しかし、所望により、送液手段は、流路の入口を介して溶媒を直接流路に流すように構成することができる。例えば、送液手段として、流路の入口にノズルを接続して、入口を介して溶媒を注入するシリンジポンプなどを設けることができる。
【００９７】
尚、この場合、実施例１における流路に設けられた溶媒の貯留部は必要ない。例えば、試薬は、流路の入口に隣接して、例えば、流路の入口の直下に配置することもできる。
【００９８】
その他のカートリッジ１、測定装置１００の構成、及びその使用方法は、実施例１と同様とすることができる。
【００９９】
実施例３
次に、本発明の更に他の実施例について説明する。本実施例において実施例１のものと同一又はそれに相当する要素には同一符号を付して詳しい説明は省略する。
【０１００】
実施例１、２では、本発明を、生物化学発光を用いたエンドトキシン、βグルカンの測定に適用した。しかし、前述のように、比色法、比濁法を用いたエンドトキシン、βグルカンの測定、或いは生物化学発光反応を用いたＡＴＰの測定、細胞数（生菌数）の測定など、酵素などの生物由来化合物を利用した測定では、一般に、試薬の失活の影響を受け得る。従って、これらの測定にも本発明を適用することができる。
【０１０１】
１．測定原理
１−１．比色法によるエンドトキシンの測定
図１１は、比色法によるエンドトキシンの測定の原理を示す。比色法によるエンドトキシンの測定は、上述のようなエンドトキシンによりリムルス反応系のＣ因子リムルス反応系が活性化されてゲル化するプロセスを利用する。即ち、エンドトキシンによりリムルス反応系が活性化されることで生成する凝固酵素の基質として、発色基を遊離する発色合成基質をリムルス反応系に添加する。これにより、エンドトキシンが存在する場合には、リムルス反応系の活性化により生成した凝固酵素により、発色合成基質から発色基が遊離する。従って、遊離した発色基の量を吸光度の測定により比色定量することができる。そして、この遊離した発色基の量が、リムルス反応系の活性化の程度と相関するので、結果としてエンドトキシン量を測定することができる。カイネティック比色法（反応速度法）やエンドポイント比色法が周知である。
【０１０２】
１−２．比濁法によるエンドトキシンの測定
図１２は、比濁法によるエンドトキシンの測定の原理を示す。比濁法によるエンドトキシンの測定は、上述のようなエンドトキシンによりリムルス反応系のＣ因子リムルス反応系が活性化されてゲル化する過程を、濁度（透過光量）の変化として測定する方法であり、反応液の透過光量比が所定の閾値（９０％程度）に減少するまでの時間（反応時間）を測定する。そして、この反応時間がリムルス反応系の活性化の程度と相関するので、結果としてエンドトキシン量を測定することができる。即ち、エンドトキシン量が少ないほど反応時間は長くなる。この方法は、カイネティック比濁法（反応時間法）やエンドポイント比濁法が周知である。
【０１０３】
１−３．比色法によるβグルカンの測定
図１３は、比色法によるβグルカンの測定の原理を示す。比色法によるβグルカンの測定は、上述のようなβグルカンによりリムルス反応系のＧ因子リムルス反応系が活性化されてゲル化するプロセスを利用する。即ち、βグルカンによりリムルス反応系が活性化されることで生成する凝固酵素の基質として、発色基を遊離する発色合成基質をリムルス反応系に添加する。これにより、βグルカンが存在する場合には、リムルス反応系の活性化により生成した凝固酵素により、発色合成基質から発色基が遊離する。従って、遊離した発色基の量を吸光度の測定により比色定量することができる。そして、この遊離した発色基の量が、リムルス反応系の活性化の程度と相関するので、結果としてβグルカン量を測定することができる。カイネティック比色法（反応速度法）やエンドポイント比色法が周知である。
【０１０４】
１−４．比濁法によるβグルカンの測定
図１４は、比濁法によるβグルカンの測定の原理を示す。比濁法によるβグルカンの測定は、上述のようなβグルカンによりリムルス反応系のＧ因子リムルス反応系が活性化されてゲル化する過程を、濁度（透過光量）の変化として測定する方法であり、反応液の透過光量比が所定の閾値（９０％程度）に減少するまでの時間（反応時間）を測定する。そして、この反応時間がリムルス反応系の活性化の程度と相関するので、結果としてβグルカン量を測定することができる。即ち、βグルカン量が少ないほど、反応時間は長くなる。この方法は、カイネティック比濁法（反応時間法）やエンドポイント比濁法が周知である。
【０１０５】
１−５．生物化学発光法によるＡＴＰの測定
生物化学発光法によるＡＴＰの測定の原理は、図１に示した通りである。即ち、同図中に反応式を示すように、ルシフェリンは、Ｍｇ2+（２価金属イオン）の存在下で、ルシフェラーゼの作用でＡＴＰと反応して、ＡＭＰとオキシルシフェリンとピロリン酸を生成する。その際に光が発生する。そして、過剰のルシフェリン、ルシフェラーゼが存在すれば、発光量はＡＴＰ量と相関するので、これを利用してＡＴＰ量を測定することができる。
【０１０６】
１−６．生物化学発光法による細胞数の測定
図１５は、生物化学発光法による微生物及び動物などの細胞数の測定の原理を示す。例えば、大腸菌、酵母菌、乳酸菌などの微生物、ヒトを含む動物の体細胞などの細胞中にはＡＴＰが存在する。従って、このＡＴＰを細胞から抽出して、そのＡＴＰを上述の生物化学発光反応を用いて測定することで、細胞数（例えば生菌数）を測定することができる。細胞中のＡＴＰは、ＡＴＰ抽出試薬を用いて細胞から抽出することができる。
【０１０７】
２．試薬
２−１．発色合成基質
上記比色法によるエンドトキシン、βグルカンの測定において、発色合成基質としては、ペプチドに発色基が結合されており、リムルス反応系が活性化されることで、その結合されている発色基を遊離させるものであれば好適に用いることができる。上記ペプチドに結合されている発色基としては、図１１中に示すパラニトロアニリン（ｐＮＡ）を好適に用いることができる。この場合、上記ペプチドのアミノ酸のカルボキシル基とパラニトロアニリンのアミノ基がアミド結合を形成することができる。
【０１０８】
上記ペプチドは、Ｃ末端における発色基との結合が、リムルス反応系が活性化されることで切断されるアミノ酸配列から成るものであればよい。より詳しくは、エンドトキシン、βグルカンの測定について、それぞれ生物化学発光法によるエンドトキシン、βグルカンの測定の場合の発光合成基質のペプチドと同様のものを用いることができる。例えば、発色合成基質としては、測定対象成分がエンドトキシン又はβグルカンのいずれの場合にも、上記ペプチドとして凝固酵素の認識配列を有し、発色基としてパラニトロアニリンが結合されたものである「ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ」を好適に用いることができる（図１１、図１３）。この場合、エンドトキシン又はβグルカンによってリムルス反応系が活性化されて凝固酵素が生成されると、この凝固酵素は上記「ベンゾイル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ」のＡｒｇとｐＮＡとの間の結合を切断する。これにより、ｐＮＡが遊離し、発色する。発色基がパラニトロアニリンの場合は、パラニトロアニリンの最大吸収波長である４０５ｎｍの吸光度を測定する。又、発色基としてパラニトロアニリンをジアゾカップリングした場合は、５４５ｎｍの吸光度を測定する。
【０１０９】
２−２．ルシフェリン
生物化学発光反応の発光基質であるルシフェリンとしては、ホタルルシフェリンを好適に用いることができる。又、生物化学発光反応を触媒する発光タンパク質（発光酵素）であるルシフェラーゼとしては、甲虫由来のルシフェラーゼを好適に用いることができる。尚、このルシフェラーゼには、前述の生物化学発光法によるエンドトキシンの測定の場合と同じものを用いることができる。又、発光試薬として、上記ルシフェリン及びルシフェラーゼを含有するものを使用してもよい。
【０１１０】
２−３．抽出試薬
細胞からＡＴＰを抽出するのに用いるＡＴＰ抽出試薬としては、界面活性剤を使用した抽出試薬やエタノールを用いた抽出試薬などを使用することができる。例えば、微生物細胞用のＡＴＰの抽出試薬としては、アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セチルトリメチルアンモニウムクロライドなどの陽イオン性界面活性剤を好適に用いることができる。又、体細胞用ＡＴＰ抽出試薬としては、非イオン性界面活性剤を好適に用いることができる。又、全細胞用抽出試薬として、陽イオン性界面活性剤又は両イオン性界面活性剤を使用してもよい。
【０１１１】
３．測定方法
３−１．比色法によるエンドトキシン、βグルカンの測定
本発明を比色法によるエンドトキシン、βグルカンの測定に適用する場合、例えば、図１６（ａ）に示すように、第１の流路１０の第１の試薬配置部１３にエンドトキシン又はβグルカンにより活性化されるリムルス反応系を含む乾燥された第１の試薬（リムルス試薬）Ｒ１を配置する。又、第２の流路２０の第２の試薬配置部２３にエンドトキシン又はβグルカンによりリムルス反応系が活性化されることで発色基を遊離する発色合成基質を含む乾燥された第２の試薬（合成発色基質含有試薬）Ｒ２を配置する。そして、反応槽４０に収容された液体の光学特性としての吸光度を、検出手段としての吸光度計で検出する。この場合、例えば、図１７に示すように、反応槽４０の全体又は少なくとも光入射部（例えば、開口部４０ａ）と出射部（例えば底部４０ｂ）を光透過性とし、吸光度計２２０の投光部２２１から出射され反応槽４０内の液体を透過した光を受光部２２２で受光するようにすることができる。このとき、カートリッジ支持部１４３が設けられる場合には、該カートリッジ支持部１４３における少なくとも上述の投光部２２１から受光部２２２への光路に対応する箇所にはスリットを設けるなどして光透過性とすればよい。
【０１１２】
その他のカートリッジ１、測定装置１００の構成、及びその使用方法は、実施例１と概略同様とすることができる。
【０１１３】
３−２．比濁法によるエンドトキシン、βグルカンの測定
本発明を比濁法によるエンドトキシン、βグルカンの測定に適用する場合、例えば、図１６（ｂ）に示すように、流路１０の試薬配置部１３にエンドトキシン又はβグルカンにより活性化されるリムルス反応系を含む乾燥された試薬（リムルス試薬）Ｒを配置する。そして、反応槽４０に収容された液体の光学特性としての透過光量（濁度）を、検出手段としての吸光度計で検出する。この場合、吸光度計やカートリッジ１、カートリッジ支持部１４３は、図１７を参照して上述したものと同様に構成すればよい。
【０１１４】
その他のカートリッジ１、測定装置１００の構成、及びその使用方法は、実施例１と概略同様とすることができる。
【０１１５】
３−３．生物化学発光法によるＡＴＰの測定
本発明を生物化学発光法によるＡＴＰの測定に適用する場合、例えば、図１６（ｃ）に示すように、流路１０の試薬配置部１３に発光基質（ルシフェリン）と発光酵素（ルシフェラーゼ）を含む乾燥された試薬（発光試薬）Ｒを配置する。そして、反応槽４０に収容された液体の光学特性として発光量を検出手段としての発光検出器で検出する。
【０１１６】
尚、この場合、発光基質含有試薬を第１の試薬Ｒ１とし、発光酵素含有試薬を第２の試薬Ｒ２として、これらをそれぞれ第１、第２の流路１０、２０の第１、第２の試薬配置部１３、２３（図示せず）に配置するようにしてもよい。
【０１１７】
その他のカートリッジ１、測定装置１００の構成、及びその使用方法は、実施例１と概略同様とすることができる。
【０１１８】
３−４．生物化学発光法による細胞数の測定
本発明を生物化学発光法による細胞数の測定に適用する場合、例えば、図１６（ｄ）に示すように、第１の流路１０の第１の試薬配置部１３に試料中の細胞からＡＴＰを抽出する乾燥された第１の試薬（ＡＴＰ抽出試薬）Ｒ１を配置する。又、第２の流路２０の第２の試薬配置部２３に発光基質（ルシフェリン）と発光酵素（ルシフェラーゼ）を含む乾燥された第２の試薬（発光試薬）Ｒ２を配置する。そして、反応槽４０に収容された液体の光学特性としての発光量を、検出手段としての発光検出器で検出する。
【０１１９】
尚、この場合、発光基質含有試薬を第２の試薬Ｒ２とし、発光酵素含有試薬を第３の試薬Ｒ３として、これらをそれぞれ第２、第３の流路２０、３０の第２、第３の試薬配置部２３、３３（図示せず）に配置するようにしてもよい。
【０１２０】
その他のカートリッジ１、測定装置１００の構成、及びその使用方法は、実施例１と概略同様とすることができる。
【０１２１】
以上のように、本発明によれば、溶液として調整した後に失活しやすい酵素などの生物由来化合物を含む試薬の劣化を防止し、測定手順の一部又は全部の自動化にも対応することができる。
【０１２２】
その他
以上、本発明を具体的な実施例に即して説明したが、本発明は上述の実施例に限定されるものではない。
【０１２３】
例えば、上述の実施例では、測定装置に１度にセットできるカートリッジの数は２個であったが、これに限定されるものではない。測定装置に１度にセットできるカートリッジの数は１個であってもよいし、３個以上のより多い数であってもよい。又、上述の実施例では測定装置においてカートリッジは直線的に搬送したが、これに限定されるものではない。例えば、円形に配列した複数のカートリッジを円周方向に搬送するようにしてもよく、この場合、より多くのカートリッジをセットしやすくなる。又、上述の実施例では、測定装置においてカートリッジを搬送して、流路の入口に対する送液手段（特に送気部）の相対位置、及び反応槽に対する検出手段（特に検出部）の相対位置を変更させたが、これに限定されるものではない。送液手段や検出手段を移動させて、上記各相対位置を変更するようにしてもよい。又、所望により、上述の実施例におけるカートリッジ１に対応する構成を装置本体に固定的に設けてもよい。
【符号の説明】
【０１２４】
１          カートリッジ
１０        第１の流路
２０        第２の流路
３０        第３の流路
１１        第１の入口
２１        第２の入口
３１        第３の入口
１２        第１の出口
２２        第２の出口
３２        第３の出口
１３        第１の試薬配置部
２３        第２の試薬配置部
３３        第３の試薬配置部
１００      測定装置
１１０      送気機構
１２０      発光検出器
１３０      送気部搬送部
１４０      カートリッジ搬送部
１５０      シャッター
１６０      ヒータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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