(57)【要約】【課題】１つの励起光に応じて複数の蛍光体が同時に励起される場合であっても、発生した蛍光をより簡便に分離すること。【解決手段】本開示に係る蛍光信号取得装置は、複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射する複数の光源と、前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を検出する複数の蛍光検出部と、前記複数の蛍光検出部の前段に位置し、前記複数の蛍光を複数の光路へと分岐させるものであり、波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタと、それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離する同期検波部と、を備える。【選択図】図１
2015145829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射する複数の光源と、
前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を検出する複数の蛍光検出部と、
前記複数の蛍光検出部の前段に位置し、前記複数の蛍光を複数の光路へと分岐させるものであり、波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタと、
それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離する同期検波部と、
を備える、蛍光信号取得装置。
【請求項２】
前記蛍光検出部の個数は、前記複数の蛍光体の個数よりも少なく、かつ、１つの前記励起光で励起される前記蛍光体の最大数に等しい、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項３】
前記マルチバンドパス光学フィルタは、所定の波長帯域の光を反射させるとともにそれ以外の波長帯域の光を透過させる複数のシングルバンド反射フィルタが、直列に配設されたものである、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項４】
それぞれの前記キャリアの基本波は、側帯波の帯域幅以上の周波数だけ離隔しており、
それぞれの前記キャリアの周波数は、ある一つのキャリアにおける三次高調波及び側帯波が他のキャリアにおける基本波及び側帯波と重ならないように選択される、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項５】
それぞれの前記キャリアの周波数は、ある一つのキャリアにおける二次高調波及び側帯波が他のキャリアにおける基本波及び側帯波と重ならないように選択される、請求項４に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項６】
前記同期検波部は、
前記蛍光検出部により生成された検出信号が入力されるバンドパスフィルタと、
前記バンドパスフィルタを透過した前記検出信号と前記キャリアとが入力される乗算器と、
前記乗算器により生成された信号が入力されるローパスフィルタと、
を有する、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項７】
前記蛍光信号取得装置は、所定の流路中を搬送されている前記測定対象物からの蛍光を検出するフローサイトメータである、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項８】
前記キャリアの周波数は、前記測定対象物の搬送速度と、前記測定対象物の大きさとから決定される周波数帯域幅の３倍以上である、請求項７に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項９】
前記蛍光信号取得装置は、前記測定対象物を走査して当該測定対象物からの蛍光を観察するレーザ走査蛍光顕微鏡である、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項１０】
前記キャリアの周波数は、前記励起光の波長及び対物レンズの開口数から算出される光学的分解能と、前記励起光の走査速度との組み合わせから決定される周波数帯域幅の３倍以上である、請求項９に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項１１】
前記光源は、所定波長のレーザ光を射出するレーザ光源であり、
前記蛍光検出部は、光電子増倍管である、請求項１に記載の蛍光信号取得装置。
【請求項１２】
複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射することと、
波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタにより、前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を、複数の光路へと分岐させることと、
複数の光路に分岐された前記蛍光を複数の蛍光検出部により検出することと、
それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離することと、
を含む、蛍光信号取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、蛍光信号取得装置及び蛍光信号取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光体を含む測定対象物に対して特定波長の励起光を照射し、かかる励起光に応じて発生した蛍光を測定することが様々な分野で行われている。ここで、複数の蛍光体を含む測定対象物からの蛍光を同時に測定する場合には、各蛍光体に応じた特定波長の励起光を複数照射することとなるが、複数の励起光を単に照射しただけでは、発生した蛍光を検出するために蛍光体の数の分だけ蛍光検出器が必要となる。その結果、複数の蛍光体を同時に励起して複数の蛍光を同時に検出するための測定機器は、機器が大掛かりになってしまう。
【０００３】
一方、例えば以下の特許文献１及び特許文献２では、複数の蛍光体からの蛍光を同時に測定するために、複数の励起光を予め所定の周波数で変調させておき、発生した蛍光を復調することで複数の蛍光を同時に検出する技術が提案されている。このような変調された励起光を利用することで、複数の蛍光が１つの蛍光検出器で検出可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２８１８９３号公報
【特許文献２】特開２００５−９１８９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１及び特許文献２に開示されているような技術を用いた場合であっても、ある１つの励起光に応じて複数の蛍光体が励起されてしまうような場合には、１つの蛍光検出器だけで同時に励起された蛍光を分離することはできない。そのため、ある１つの励起光に応じて複数の蛍光体が同時に励起される場合であっても、発生した蛍光を分離することが可能な技術が希求されていた。
【０００６】
そこで、本開示では、１つの励起光に応じて複数の蛍光体が同時に励起される場合であっても発生した蛍光をより簡便に分離することが可能な蛍光信号取得装置及び蛍光信号取得方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示によれば、複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射する複数の光源と、前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を検出する複数の蛍光検出部と、前記複数の蛍光検出部の前段に位置し、前記複数の蛍光を複数の光路へと分岐させるものであり、波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタと、それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離する同期検波部と、を備える蛍光信号取得装置が提供される。
【０００８】
また、本開示によれば、複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射することと、波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタにより、前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を、複数の光路へと分岐させることと、複数の光路に分岐された前記蛍光を複数の蛍光検出部により検出することと、それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離することと、を含む蛍光信号取得方法が提供される。
【０００９】
本開示によれば、予め周波数変調された複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光は、マルチバンドパス光学フィルタにより複数の光路へと分岐された後に複数の蛍光検出器により検出されて、同期検波される。
【発明の効果】
【００１０】
以上説明したように本開示によれば、１つの励起光に応じて複数の蛍光体が同時に励起される場合であっても、発生した蛍光をより簡便に分離することが可能となる。
【００１１】
なお、上記の効果は必ずしも限定的なものではなく、上記の効果とともに、または上記の効果に代えて、本明細書に示されたいずれかの効果、または本明細書から把握され得る他の効果が奏されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本開示の第１の実施形態に係る蛍光信号取得装置の全体的な構成を模式的に示した説明図である。
【図２】励起光の波長と蛍光体からの蛍光の波長との関係を示したグラフ図である。
【図３】同実施形態に係る蛍光信号取得装置における蛍光体と蛍光検出部の個数との関係を説明するための説明図である。
【図４】同実施形態に係る蛍光信号取得装置におけるマルチバンドパス光学フィルタを説明するための説明図である。
【図５Ａ】同実施形態に係る蛍光信号取得装置におけるマルチバンドパス光学フィルタの一例を模式的に示した説明図である。
【図５Ｂ】同実施形態に係る蛍光信号取得装置におけるマルチバンドパス光学フィルタの一例を模式的に示した説明図である。
【図６Ａ】同実施形態に係る蛍光信号取得装置における同期検波部の一例を模式的に示した説明図である。
【図６Ｂ】同実施形態に係る蛍光信号取得装置における同期検波部の一例を模式的に示した説明図である。
【図７】同実施形態に係る蛍光信号取得装置の一例であるフローサイトメータの構成を模式的に示した説明図である。
【図８】同実施形態に係る蛍光信号取得装置の一例であるレーザ走査蛍光顕微鏡の構成を模式的に示した説明図である。
【図９】同実施形態に係る蛍光信号取得方法の流れの一例を示した流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に添付図面を参照しながら、本開示の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００１４】
なお、説明は以下の順序で行うものとする。
１．第１の実施形態
（１−１）蛍光信号取得装置の構成について
（１−２）蛍光信号取得装置の具体例−１：フローサイトメータ
（１−３）蛍光信号取得装置の具体例−２：レーザ走査蛍光顕微鏡
（１−４）蛍光信号取得方法の流れについて
２．まとめ
【００１５】
（第１の実施形態）
＜蛍光信号取得装置の構成について＞
［蛍光信号取得装置の全体構成］
まず、図１を参照しながら、本開示の第１の実施形態に係る蛍光信号取得装置１の全体的な構成について説明する。図１は、本実施形態に係る蛍光信号取得装置の全体的な構成を模式的に示した説明図である。
【００１６】
本実施形態に係る蛍光信号取得装置１は、複数の蛍光体を含む測定対象物Ｓに対して複数の励起光を同時に照射し、これら複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を同時に検出する装置である。
【００１７】
また、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１は、検出した蛍光に関する情報を、任意の演算処理装置３に対して出力することが可能である。演算処理装置３は、蛍光信号取得装置１によって検出された蛍光に関する知見を可視化する等といった各種の演算処理や画像処理等を実施して、検出された蛍光に関する知見を蛍光信号取得装置１の使用者に通知することが可能である。
【００１８】
かかる演算処理装置３は、蛍光信号取得装置１の一機能として実現されていてもよいし、蛍光信号取得装置１に接続された各種のコンピュータやサーバ等であってもよい。また、蛍光信号取得装置１と演算処理装置３との接続方法についても特に限定されるものではなく、蛍光信号取得装置１と演算処理装置３とは直接的に有線又は無線で接続されていてもよいし、各種のネットワークを介して接続されていてもよい。
【００１９】
複数の蛍光体を含む測定対象物Ｓについては、特に限定されるものではなく、複数の蛍光体を含むものであれば、各種細胞等といった生物に区分されるものであってもよいし、無生物に区分されるものであってもよい。また、複数の蛍光体を含む測定対象物Ｓが複数の蛍光体を含む各種の化合物であってもよいことは、言うまでもない。
【００２０】
また、測定対象物Ｓに含まれる蛍光体は、測定対象物Ｓが予め保持している蛍光体であってもよいし、測定対象物Ｓの外部から測定対象物に導入された各種の蛍光試薬のようなものであってもよい。
【００２１】
続いて、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１の構成について説明する。
本実施形態に係る蛍光信号取得装置１は、例えば図１に示したように、複数の光源１０１と、変調部１０３と、測定光学系１０５と、マルチバンドパス光学フィルタ１０７と、複数の蛍光検出部１０９と、同期検波部１１１と、を主に備える。
【００２２】
複数の光源１０１は、測定対象物Ｓに含まれている複数の蛍光体を同時に励起するために利用される複数のレーザ光を射出する。これらのレーザ光が、測定対象物Ｓに含まれる蛍光体を励起させるための励起光として用いられる。光源１０１から射出される励起光の波長は、特に限定されるものではなく、測定対象物Ｓに含まれている蛍光体を励起するために適した波長を適宜選択すればよい。また、光源１０１の個数Ｎについても特に限定されるものではなく、測定対象物Ｓに含まれている全ての蛍光体を同時に励起することが可能な個数に、適宜設定される。
【００２３】
複数の光源１０１から射出される各励起光は、後述する変調部１０３によって、互いに異なる周波数で強度変調されている。また、複数の光源１０１から射出される各励起光は、後述する測定光学系１０５を介して、測定対象物Ｓの同一の領域に対し同時に射出される。
【００２４】
なお、それぞれの光源１０１は、特に限定されるものではなく、各種の半導体レーザや固体レーザやガスレーザ等のように、様々な光源を利用することが可能である。光源１０１として各種の半導体レーザを用いることで、蛍光信号取得装置１をより小型化することが可能となる。
【００２５】
また、光源１０１として用いられるレーザは、ＣＷ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｗａｖｅ）レーザであってもよいし、パルスレーザであってもよい。
【００２６】
変調部１０３は、複数の光源１０１から射出されるそれぞれの励起光を、互いに異なる周波数を有するキャリアを利用して、強度変調する。ここで、変調部１０３が用いるキャリアの周波数の個数は、光源１０１の個数と同一である。すなわち、光源１０１がＮ個存在する場合には、Ｎ種類の励起光を強度変調するために、互いに異なるＮ個の周波数を有するＮ個のキャリアが用いられる。
【００２７】
ここで、変調部１０３で用いられる各キャリアの基本波は、側帯波の帯域幅以上の周波数だけ離隔していることが好ましい。その上で、各キャリアの周波数は、ある一つのキャリアにおける三次高調波及び側帯波が他のキャリアにおける基本波及び側帯波と重ならないように、適宜選択される。このようにしてＮ個のキャリアの周波数を選択することによって、各キャリア間のクロストークを防止することが可能である。より好ましくは、各キャリアの周波数は、ある一つのキャリアにおける二次高調波及び側帯波が他のキャリアにおける基本波及び側帯波と重ならないように、適宜選択される。三次高調波ではなく二次高調波に応じてキャリアの周波数を選択することによって、より確実に各キャリア間のクロストークを防止することが可能となる。
【００２８】
なお、キャリアの周波数のより詳細な選択方法については、以下で改めて詳述する。
【００２９】
変調部１０３の詳細な構成については特に限定されるものではなく、所定波長を有する励起光を強度変調することが可能であれば、各種の機器を利用することが可能である。
【００３０】
測定光学系１０５は、複数の光源１０１から射出された複数の励起光を、測定対象物Ｓの同一の領域へと同軸かつ同時に導光するとともに、測定対象物Ｓから発生した複数の蛍光を、同軸でマルチバンドパス光学フィルタ１０７へと導光する光学系である。
【００３１】
測定光学系１０５の詳細な構成については、特に限定されるものではなく、各種レンズ、各種ミラー、ピンホール、各種フィルタ、ガルバノスキャンシステム等といった各種の光学素子を適宜組み合わせることで構成すればよい。このような各種光学素子を組み合わせて光学系を構成することで、例えば、フローサイトメータで用いられている測定光学系や、レーザ走査蛍光顕微鏡で用いられている測定光学系等を実現することができる。
【００３２】
マルチバンドパス光学フィルタ１０７は、測定光学系１０５と、蛍光検出部１０９と、の間に設けられる。このマルチバンドパス光学フィルタ１０７は、測定光学系１０５によって同軸で導光されてきた、波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させて、複数の波長からなる蛍光を複数の光路へと分岐させる光学フィルタである。
【００３３】
マルチバンドパス光学フィルタ１０７によって分岐される光路の数は、マルチバンドパス光学フィルタ１０７の後段に設けられる蛍光検出器１０９の個数と同一である。蛍光検出器１０９の個数の設定方法及びマルチバンドパス光学フィルタ１０７の詳細な構成については、以下で詳述する。
【００３４】
マルチバンドパス光学フィルタ１０７によって複数の光路に分岐された蛍光は、複数の蛍光検出部１０９によってそれぞれ検出され、蛍光の強度に関する情報が、電気的な信号へと変換される。蛍光検出部１０９は、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）や、光電子増倍管（ＰｈｏｔｏＭｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ：ＰＭＴ）等といった各種の検出器を用いて構成することが可能である。蛍光検出部１０９によって検出された蛍光に関する検出信号は、後段の同期検波部１１１へと出力される。
【００３５】
同期検波部１１１は、変調部１０３で利用されたキャリアの周波数に基づいて、複数の蛍光検出部１０９から出力された検出信号を同期検波して、複数の蛍光体のそれぞれに対応する蛍光を分離する。分離後のそれぞれの蛍光に対応する信号は、例えば、演算処理装置３等に出力されて、可視化される。
【００３６】
本実施形態に係る同期検波部１１１は、測定対象物Ｓに含まれる蛍光体の数に対応する個数の復調器で構成されている。同期検波部１１１を構成する復調器としては、例えば、バンドパスフィルタ、乗算器及びローパスフィルタからなる復調器を利用することが可能である。同期検波部１１１を構成する復調器の詳細な構成については、以下で改めて詳細に説明する。
【００３７】
以上、図１を参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１の全体的な構成について説明した。
【００３８】
［測定対象物に含まれる蛍光体の数と蛍光体検出部の個数との関係］
次に、測定対象物に含まれる蛍光体の数と蛍光体検出部の個数との関係について、図２及び図３を参照しながら具体的に説明する。図２は、励起光の波長と蛍光体からの蛍光の波長との関係を示したグラフ図であり、図３は、本実施形態に係る蛍光信号取得装置における蛍光体と蛍光検出部の個数との関係を説明するための説明図である。
【００３９】
以下では、図２に示したような７種類の蛍光体（蛍光体Ａ〜蛍光体Ｇ）を含む測定対象物Ｓを、４種類の波長の励起光（４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４３ｎｍ）でそれぞれ励起する場合を例に挙げて、具体的に説明を行うものとする。なお、本開示の実施形態に係る蛍光信号取得装置１で用いられる蛍光体の個数や励起光の数は、以下で説明する例に限定されるものではない。
【００４０】
図２に示したような７種類の蛍光体を４種類の励起光で励起させて蛍光を発生させる場合には、例えば、以下のような蛍光体と励起光との組み合わせが用いられる。
蛍光体Ａ：励起波長４０５ｎｍの励起光
蛍光体Ｂ：励起波長４８８ｎｍの励起光
蛍光体Ｃ及び蛍光体Ｄ：励起波長５６１ｎｍの励起光
蛍光体Ｅ〜蛍光体Ｇ：励起波長６４３ｎｍの励起光
【００４１】
また、蛍光体Ａからの蛍光を他の蛍光と分離するためには、中心波長４５５ｎｍ／帯域幅５０ｎｍのバンドパスフィルタを用いることが可能であり、蛍光体Ｂからの蛍光を他の蛍光と分離するためには、中心波長５３５ｎｍ／帯域幅５０ｎｍのバンドパスフィルタを用いることが可能である。同様に、蛍光体Ｃ及び蛍光体Ｄからの蛍光を他の蛍光と分離するためには、中心波長６００ｎｍ／帯域幅７５ｎｍのバンドパスフィルタを用いることが可能である。また、蛍光体Ｅからの蛍光を他の蛍光と分離するためには、中心波長６６５ｎｍ／帯域幅３０ｎｍのバンドパスフィルタを用い、蛍光体Ｆからの蛍光を他の蛍光と分離するためには、中心波長７２０ｎｍ／帯域幅６０ｎｍのバンドパスフィルタを用い、蛍光体Ｇからの蛍光を他の蛍光と分離するためには、中心波長７８５ｎｍ／帯域幅６０ｎｍのバンドパスフィルタを用いることが可能である。
【００４２】
ここで、一般的に行われているような複数波長の励起光を用いた同時励起では、これら７種類の蛍光を分離するために、７個の蛍光検出部１０９を設置しなければならず、装置が大きくなってしまう。そこで、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１では、光源１０１から射出される周波数変調された励起光と、以下で詳述するようなマルチバンドパス光学フィルタ１０７と、複数の蛍光検出部１０９と、を組み合わせて用いることで、蛍光検出部１０９の個数を抑制しつつ、複数の蛍光を同時検出することが可能となる。以下、本開示の実施形態における蛍光分離のための技術的思想について、説明する。
【００４３】
例えば図２に示したような蛍光体を図２に示した励起光で励起する場合、蛍光体Ａや蛍光体Ｂは、１つの励起光に対して１つの蛍光が関連付けられる。そのため、蛍光体Ａと蛍光体Ｂとを同時に検出する場合には、各励起光を異なる周波数のキャリアで変調しておけば、これら２つの蛍光を１つの蛍光検出部で検出することは可能である。しかしながら、波長５６１ｎｍの励起光を用いた場合には、蛍光体Ｃ及び蛍光体Ｄが同時に励起されて、各蛍光体に対応する２つの蛍光が発生してしまう。同様に、波長６４３ｎｍの励起光を用いた場合には、蛍光体Ｅ〜蛍光体Ｇが同時に励起されて、各蛍光体に対応する３つの蛍光が発生してしまう。従って、上記特許文献１や特許文献２に開示されているように励起光を周波数変調しただけでは、波長５６１ｎｍの励起光と蛍光Ｃ及びＤとの関連付けや、波長６４３ｎｍの励起光と蛍光Ｅ〜蛍光Ｇとの関連付けは出来るものの、蛍光Ｃと蛍光Ｄとの区別や、蛍光Ｅ〜蛍光Ｇの区別を行うことはできない。
【００４４】
そのため、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１では、上記のようなマルチバンドパス光学フィルタ１０７を用いることで、同一の励起光に関連付けられている複数の蛍光を、別々の光路へと分岐させる。これによって、同一の励起光に関連付けられている複数の蛍光を、異なる蛍光検出部１０９で分離検出することが可能となる。このように、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１では、装置に設けられる蛍光検出部１０９の個数（図１における個数Ｍ）を、同時に検出したい蛍光体の個数よりも少なくする（図２の例では、７個未満とする）ことが可能となる。なお、装置に設けられる光源１０１の個数（図１における個数Ｎ）は、同時に検出したい蛍光体を励起するための必要最低限の個数（図２の例では、４個）に設定することができる。
【００４５】
また、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１では、同一の励起光に関連付けられている複数の蛍光を互いに分離できれば良いのであるから、装置に設ける蛍光検出部１０９の個数は、同一の励起光で励起される蛍光体の最大数とすることが好ましい。波長の異なる励起光に関連付けられている蛍光は、励起光の変調度合いで分離することが可能であるため、上記のような指針で蛍光検出部１０９の個数を考慮することで、蛍光信号取得装置１に設けられる蛍光検出部１０９の個数を最小化することができる。図３に示したように、図２で示した７種類の蛍光体を４種類の励起光で励起する際に、同一の励起光で励起される蛍光体の最大数は、３である。従って、図２に示した７つの蛍光体を同時に検出するためには、３つの蛍光検出部１０９を用いることが好ましい。
【００４６】
逆にいえば、励起光を周波数変調させた上で、マルチバンドパス光学フィルタ１０７を用いることで、従来の蛍光検出部１０９の個数でより多くの蛍光体を同時検出することが可能となる。
【００４７】
以上、図２及び図３を参照しながら、測定対象物に含まれる蛍光体の数と蛍光体検出部の個数との関係について説明した。
【００４８】
［マルチバンドパス光学フィルタ］
次に、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１で用いられるマルチバンドパス光学フィルタ１０７について、図４〜図５Ｂを参照しながら具体的に説明する。図４は、本実施形態に係る蛍光信号取得装置におけるマルチバンドパス光学フィルタを説明するための説明図であり、図５Ａ及び図５Ｂは、本実施形態に係る蛍光信号取得装置におけるマルチバンドパス光学フィルタの一例を模式的に示した説明図である。
【００４９】
図２及び図３を参照しながら説明したように、本実施形態に係るマルチバンドパス光学フィルタ１０７には、同一の励起光で励起される複数の蛍光を、互いに異なる光路へと分岐させる機能が求められる。図２及び図４に示したような７種類の蛍光体を分離する場合、マルチバンドパス光学フィルタ１０７は、蛍光Ｃと蛍光Ｄとを互いに異なる２つの光路に分岐させるとともに、蛍光Ｅ〜蛍光Ｆを互いに異なる３つの光路に分岐させることが好ましい。従って、図４に示した例では、マルチバンドパス光学フィルタ１０７は、図中のλＡ〜λＧに対応する波長帯域のうち何れかを透過させて他の波長帯域を反射させるものであり、かつ、波長帯域λＣ及びλＤ、並びに、波長帯域λＥ〜λＧを、互いに異なる蛍光検出部１０９へと導光するものであることが好ましい。
【００５０】
マルチバンドパス光学フィルタ１０７が透過又は反射させる波長帯域の組み合わせは、適宜決定することが可能であるが、例えば図４に示したように、マルチバンドパス光学フィルタ１０７は、帯域λＡ、λＤ及びλＧを第１の蛍光検出部１０９（例えばＰＭＴ１）へと導光し、帯域λＢ及びλＥを第２の蛍光検出部１０９（例えばＰＭＴ２）へと導光し、帯域λＣ及びλＦを第３の蛍光検出部１０９（例えばＰＭＴ３）へと導光すればよい。
【００５１】
このようなマルチバンドパス光学フィルタ１０７は、所定の波長帯域の光（より詳細には、ある単一の波長帯域の光）を反射させるとともに、それ以外の波長帯域の光を透過させる複数のシングルバンド反射フィルタを直列に配設することで、実現される。
【００５２】
例えば図５Ａでは、帯域λＡ〜λＧの何れか一つの帯域を反射させるとともにそれ以外の帯域の光を透過させる、７種類のシングルバンド反射フィルタを組み合わせることで、マルチバンドパス光学フィルタ１０７を実現する例が図示されている。すなわち、図５Ａに示した例では、７種類のシングルバンド反射フィルタ１２１を、光路中への設置角度（フィルタ１２１の傾き度合い）を変えながら直列に配設して、特定の波長帯域の蛍光を、特定の方向へと反射させる。これにより、７種類のシングルバンド反射フィルタ１２１は、全体として、マルチバンドパス光学フィルタ１０７として機能することとなり、７種類の蛍光を３つの蛍光検出部１０９に導光することが可能となる。
【００５３】
また、図５Ｂに示した例では、帯域λＡ〜λＧの何れか一つの帯域を反射させるとともにそれ以外の帯域の光を透過させる７種類のシングルバンド反射フィルタと、バンドパスフィルタ１２３と、を組み合わせることで、マルチバンドパス光学フィルタ１０７を実現する例が図示されている。図５Ｂに示した場合においても、７種類のシングルバンド反射フィルタ１２１とバンドパスフィルタ１２３とは、全体として、マルチバンドパス光学フィルタ１０７として機能することとなり、７種類の蛍光を３つの蛍光検出部１０９に導光することが可能となる。
【００５４】
なお、図５Ａに示したマルチバンドパス光学フィルタ１０７は、図５Ｂに示した例と比較して、より少ない個数のシングルバンド反射フィルタ１２１を用いて実現することが可能であるため、装置１の小型化を図る上で好ましい形態である。一方、図５Ｂに示したマルチバンドパス光学フィルタ１０７は、図５Ａに示した例と比較して、使用するシングルバンド反射フィルタ１２１の個数は多くなるものの、マルチバンドパス光学フィルタ１０７のメンテナンスが容易となる。
【００５５】
以上、図４〜図５Ｂを参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１で用いられるマルチバンドパス光学フィルタ１０７について説明した。
【００５６】
［同期検波部］
次に、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１で用いられる同期検波部１１１について、図６Ａ及び図６Ｂを参照しながら具体的に説明する。図６Ａ及び図６Ｂは、本実施形態に係る蛍光信号取得装置における同期検波部の一例を模式的に示した説明図である。
【００５７】
先だって説明したように、本実施形態に係る同期検波部１１１は、バンドパスフィルタと、乗算器と、ローパスフィルタと、からなる復調器で構成される。かかる構成の復調器は、蛍光信号取得装置１の全体として、測定対象物Ｓに含まれる蛍光体の個数分だけ設けられている。
【００５８】
例えば図４に示したように、７種類の蛍光体を３つの蛍光検出部１０９により検出する場合、第１の蛍光検出部１０９には３種類の蛍光を含む光が導光され、第２及び第３の蛍光検出部１０９のそれぞれには、２種類の蛍光を含む光が導光される。従って、第１の蛍光検出部１０９の後段には、３種類の検出信号を分離可能な３チャンネルの復調器を設け、第２及び第３の蛍光検出部１０９の後段には、２種類の検出信号を分離可能な２チャンネルの復調器を設ければよい。その結果、かかる蛍光体からの蛍光を取得する蛍光信号取得装置１には、全体として７チャンネル分の復調器が実装されることとなる。
【００５９】
図６Ａは、２チャンネルの復調器１３１を実現するための、バンドパスフィルタ１３３、乗算器１３５及びローパスフィルタ１３７の構成例を示している。蛍光ＦＬａ、ＦＬｂという２種類の蛍光を含む入力信号ＭＳｉｎから、それぞれの蛍光を分離する場合には、図６Ａに示したように、バンドパスフィルタ１３３、乗算器１３５及びローパスフィルタ１３７が直列に接続された復調器を、２つ並列に設ければよい。
【００６０】
かかる場合に、蛍光ＦＬａ用に設定されたバンドパスフィルタＢＰＦａに入力信号ＭＳｉｎを入力して、蛍光ＦＬａに対応する部分の入力信号を抽出する。その後、抽出された入力信号を、変調部１０１から取得した蛍光ＦＬａに対応するキャリア周波数ｆｃ＿ａとともに乗算器に入力することで、蛍光ＦＬａに関する信号を復調する。続いて、復調後の信号を、蛍光ＦＬａ用に設定されたローパスフィルタＬＰＦａに入力することで、ベースバンド蛍光（すなわち、着目する蛍光体からの蛍光ＦＬａ）を得ることが可能となる。
【００６１】
同様に、蛍光ＦＬｂ用に設定されたバンドパスフィルタＢＰＦｂに入力信号ＭＳｉｎを入力して、蛍光ＦＬｂに対応する部分の入力信号を抽出する。その後、抽出された入力信号を、変調部１０１から取得した蛍光ＦＬｂに対応するキャリア周波数ｆｃ＿ｂとともに乗算器に入力することで、蛍光ＦＬｂに関する信号を復調する。続いて、復調後の信号を、蛍光ＦＬｂ用に設定されたローパスフィルタＬＰＦｂに入力することで、ベースバンド蛍光（すなわち、着目する蛍光体からの蛍光ＦＬｂ）を得ることが可能となる。
【００６２】
図６Ｂは、３チャンネルの復調器１３１を実現するための、バンドパスフィルタ１３３、乗算器１３５及びローパスフィルタ１３７の構成例を示している。３チャンネルの復調器１３１は、図６Ｂに示したように、バンドパスフィルタ１３３、乗算器１３５及びローパスフィルタ１３７が直列に接続された復調器が、３つ並列に設けられている。各復調器１３１における復調処理については、図６Ａに示した２チャンネルの復調器１３１と同様であるため、以下では詳細な説明は省略する。
【００６３】
本実施形態に係る蛍光信号取得装置１では、図６Ａ及び図６Ｂに示したような復調器１３１を用いて同期検波部１１１を構成することで、複数の蛍光体からの複数の蛍光を、互いに分離することが可能となる。
【００６４】
以上、図６Ａ及び図６Ｂを参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１で用いられる同期検波部１１１について説明した。
【００６５】
なお、上記説明では、同期検波部１１１が、バンドパスフィルタ、乗算器及びローパスフィルタからなる復調器で構成される場合について説明したが、本実施形態に係る同期検波部１１１の構成は、かかる例のみに限定されるものではない。例えば、各蛍光検出部１０９より検出された検出信号のうち最大の変調周波数の側帯波以下の信号のみを通すローパスフィルタと、かかるフィルタからの出力信号を最大の変調周波数の３倍以上のサンプリング周波数でＡＤ変換するＡＤ変換部と、から構成されるディジタル信号処理部を、同期検波部１１１として設けても良い。かかるディジタル信号処理部を用いて蛍光検出部１０９の検出信号をディジタル信号処理することで、上記の復調器と同等の結果を得ることが可能である。
【００６６】
＜蛍光信号取得装置の具体例−１：フローサイトメータ＞
次に、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１の一具体例としてフローサイトメータを取り上げ、図７を参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得装置を具体的に説明する。図７は、本実施形態に係る蛍光信号取得装置の一例であるフローサイトメータの構成を模式的に示した説明図である。
【００６７】
以上説明したような本実施形態に係る蛍光信号取得装置１は、所定の流路中を搬送されている測定対象物からの蛍光を検出するフローサイトメータとして実現することが可能である。かかる場合、フローサイトメータとして実現された蛍光信号取得装置１は、各種の蛍光体で染色された様々な細胞等を測定対象物とする。
【００６８】
図７では、図４に示したような７種類の蛍光体を、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ及び６４３ｎｍの４種類の励起光で励起させて、７種類の蛍光を検出する場合のフローサイトメータの構成を模式的に示している。
【００６９】
かかる場合、光源１０１は、４０５ｎｍの励起光を射出するレーザ（Ｌａｓｅｒ）１と、４８８ｎｍの励起光を射出するレーザ２と、５６１ｎｍのレーザ３と、６４３ｎｍの励起光を射出するレーザ４と、から構成されており、各レーザは、ドライバ（Ｄｒｉｖｅｒ）に入力されるキャリア周波数ｆｃ＿１〜ｆｃ＿２によって、強度変調が施される。
【００７０】
また、変調部１０３は、４種類の変調信号発生器（Ｍｏｄ  Ｇｅｎ）１〜４と、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ）１〜４とから構成されている。変調信号生成器で生成された変調信号（キャリア）は、各レーザのドライバに入力されるとともに、復調に利用されるキャリア周波数は、後段の同期検波部１１１を構成する各復調器へと出力される。
【００７１】
測定光学系１０５は、光源１０１から射出された各励起光を、各種のレンズＬや、ダイクロイックミラーＤＭ等から構成された光学系を介して、流路中を流れる測定対象物Ｓへと導光する。ここで、各レーザから射出された励起光は、図７に示したように、同軸で測定対象物Ｓへと導光されて、測定対象物Ｓに同時に照射される。また、測定対象物Ｓから発生した７種類の蛍光は、測定光学系１０５によりマルチバンドパス光学フィルタ（ＭＢＰＦ）１０７へと同軸で導光される。
【００７２】
なお、図７において、レンズＬとして、模式的に１つの非球面レンズを記載しているが、測定光学系１０５は、複数の球面レンズや非球面レンズを有していても良いことは言うまでもない。
【００７３】
マルチバンドパス光学フィルタ（ＭＢＰＦ）１０５は、図５Ａ又は図５Ｂに示したように、複数のシングルバンド反射フィルタから構成されており、７種類の蛍光を、３つの光路へと分岐させる。ここで、図４に示したように、蛍光ＦＬＡ、ＦＬＤ、ＦＬＧは、蛍光検出部１０９として構成された光電子増倍管（ＰＭＴ）１へと分岐され、蛍光ＦＬＢ、ＦＬＥは、蛍光検出部１０９として構成されたＰＭＴ２へと分岐され、蛍光ＦＬＣ、ＦＬＦは、蛍光検出部１０９として構成されたＰＭＴ３へと分岐される。
【００７４】
同期検波部１１１は、３チャンネルの復調器（ＤＥＭ）１と、２チャンネルの復調器ＤＥＭ２及びＤＥＭ３と、から構成されている。ＰＭＴ１によって検出された蛍光λＡ、λＤ、λＧは、検出信号ＭＳ１へと変換されて、復調器ＤＥＭ１へと入力され、ＰＭＴ２によって検出された蛍光λＢ、λＥは、検出信号ＭＳ２へと変換されて、復調器ＤＥＭ２へと入力され、ＰＭＴ３によって検出された蛍光λＣ、λＦは、検出信号ＭＳ３へと変換されて、復調器ＤＥＭ３へと入力される。
【００７５】
復調器１には、キャリア周波数ｆｃ＿１、ｆｃ＿３、ｆｃ＿４が入力されており、検出信号ＭＳ１から、蛍光ＦＬＡ、ＦＬＤ、ＦＬＧが分離される。また、復調器２には、キャリア周波数ｆｃ＿２、ｆｃ＿４が入力されており、検出信号ＭＳ２から、蛍光ＦＬＢ、ＦＬＥが分離される。更に、復調器３には、キャリア周波数ｆｃ＿３、ｆｃ＿４が入力されており、検出信号ＭＳ３から、蛍光ＦＬＣ、ＦＬＦが分離される。かかる構成により、同時に励起された７種類の蛍光が、それぞれ分離されることとなる。
【００７６】
［キャリアの周波数の設定方法の具体例］
続いて、蛍光信号取得装置１としてフローサイトメータを実現した場合におけるキャリア周波数の設定方法について、具体的に説明する。
【００７７】
フローサイトメータの場合、検出したい測定対象物（例えば、細胞）の最小サイズと、測定対象物の搬送速度とから、検出に求められる帯域幅が決定する。以下では、最小サイズが０．５μｍの細胞が、搬送速度１０ｍ／ｓで流路中を搬送される場合を例に挙げて、キャリア周波数の設定方法について具体的に説明する。
【００７８】
キャリアの最小周波数を決定する場合、サンプリング定理を考慮すると、測定対象物Ｓの最小サイズである０．５μｍの大きさが搬送される間に、キャリアが２波長以上、好ましくは３波長以上照射されることが求められる。従って、０．５μｍ／３＝０．１６７μｍ以下の繰り返し周期を持つ、１／０．１６７μｍ≒６０ＭＨｚ以上のキャリアが用いられることが好ましい。
【００７９】
一方、大きさ０．５μｍの細胞が１μｍ間隔で搬送される場合の周波数は、１０ＭＨｚであるが、フローサイトメータの励起光の大きさを例えば５μｍとした場合に、５μｍの大きさを１０ｍ／ｓの速度で通り過ぎる時間は、０．５μｓとなる。従って、サンプリング定理から、１／０．５μｓ＝２ＭＨｚの２倍の４ＭＨｚを占有帯域幅とすればよいこととなる。ただ、クロストークをより確実に防止するためには、搬送速度と大きさとから決定される周波数帯域幅（上記の場合には、例えば２ＭＨｚ）の３倍以上とすることがより好ましい。
【００８０】
キャリアの最小周波数が６０ＭＨｚであるとき、占有帯域幅１０ＭＨｚにすれば、４通りのキャリア周波数は、最小で６０、７０、８０、９０ＭＨｚとなる。このとき、選択された４通りのキャリアは、６０ＭＨｚのキャリアの２次高調波１２０ＭＨｚとは重複していないため、クロストークも発生しない。
【００８１】
実際には、０．５μｍの間に多くのキャリア波長が入った方が良いため、回路の動作速度で許容される範囲で、キャリアの周波数は高い方が好ましい。そのため、キャリア周波数ｆｃ＿１〜ｆｃ＿４として、例えば、１００ＭＨｚ、１１０ＭＨｚ、１２０ＭＨｚ、１３０ＭＨｚ（Δｆ＝５ＭＨｚ）を選択することが好ましい。
【００８２】
以上、蛍光信号取得装置１としてフローサイトメータを実現した場合におけるキャリア周波数の設定方法について、具体的に説明した。
【００８３】
＜蛍光信号取得装置の具体例−２：レーザ走査蛍光顕微鏡＞
次に、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１の一具体例としてレーザ走査蛍光顕微鏡を取り上げ、図８を参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得装置を具体的に説明する。図８は、本実施形態に係る蛍光信号取得装置の一例であるレーザ走査蛍光顕微鏡の構成を模式的に示した説明図である。
【００８４】
以上説明したような本実施形態に係る蛍光信号取得装置１は、測定対象物を走査して、測定対象物からの蛍光を観察するレーザ走査蛍光顕微鏡として実現することが可能である。かかる場合、レーザ走査蛍光顕微鏡として実現された蛍光信号取得装置１は、各種の蛍光体で染色された様々な物質を測定対象物とする。
【００８５】
図８では、図４に示したような７種類の蛍光体を、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ及び６４３ｎｍの４種類の励起光で励起させて、７種類の蛍光を検出する場合のレーザ走査蛍光顕微鏡の構成を模式的に示している。
【００８６】
かかる場合、光源１０１は、４０５ｎｍの励起光を射出するレーザ（Ｌａｓｅｒ）１と、４８８ｎｍの励起光を射出するレーザ２と、５６１ｎｍのレーザ３と、６４３ｎｍの励起光を射出するレーザ４と、から構成されており、各レーザは、ドライバ（Ｄｒｉｖｅｒ）に入力されるキャリア周波数ｆｃ＿１〜ｆｃ＿２によって、強度変調が施される。
【００８７】
また、変調部１０３は、４種類の変調信号発生器（Ｍｏｄ  Ｇｅｎ）１〜４と、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ）１〜４とから構成されている。変調信号生成器で生成された変調信号（キャリア）は、各レーザのドライバに入力されるとともに、復調に利用されるキャリア周波数は、後段の同期検波部１１１を構成する各復調器へと出力される。
【００８８】
測定光学系１０５は、光源１０１から射出された各励起光を、各種のレンズＬや、ダイクロイックミラーＤＭ、ピンホールＰＨ、ＸＹ−ガルバノミラー（ＸＹ−ｇａｌ）、対物レンズ（Ｏｂｊ）、ノッチフィルタＮＦ等から構成された光学系を介して、測定対象物Ｓへと導光する。ここで、各レーザから射出された励起光は、図８に示したように、同軸で測定対象物Ｓへと導光されて、測定対象物Ｓに同時に照射される。また、測定対象物Ｓから発生した７種類の蛍光は、測定光学系１０５によりマルチバンドパス光学フィルタ（ＭＢＰＦ）１０７へと同軸で導光される。
【００８９】
なお、図８において、レンズＬとして、模式的に１つの非球面レンズを記載しているが、測定光学系１０５は、複数の球面レンズや非球面レンズを有していても良いことは言うまでもない。
【００９０】
マルチバンドパス光学フィルタ（ＭＢＰＦ）１０５は、図５Ａ又は図５Ｂに示したように、複数のシングルバンド反射フィルタから構成されており、７種類の蛍光を、３つの光路へと分岐させる。ここで、図４に示したように、蛍光ＦＬＡ、ＦＬＤ、ＦＬＧは、蛍光検出部１０９として構成された光電子増倍管（ＰＭＴ）１へと分岐され、蛍光ＦＬＢ、ＦＬＥは、蛍光検出部１０９として構成されたＰＭＴ２へと分岐され、蛍光ＦＬＣ、ＦＬＦは、蛍光検出部１０９として構成されたＰＭＴ３へと分岐される。
【００９１】
同期検波部１１１は、３チャンネルの復調器（ＤＥＭ）１と、２チャンネルの復調器ＤＥＭ２及びＤＥＭ３と、から構成されている。ＰＭＴ１によって検出された蛍光λＡ、λＤ、λＧは、検出信号ＭＳ１へと変換されて、復調器ＤＥＭ１へと入力され、ＰＭＴ２によって検出された蛍光λＢ、λＥは、検出信号ＭＳ２へと変換されて、復調器ＤＥＭ２へと入力され、ＰＭＴ３によって検出された蛍光λＣ、λＦは、検出信号ＭＳ３へと変換されて、復調器ＤＥＭ３へと入力される。
【００９２】
復調器１には、キャリア周波数ｆｃ＿１、ｆｃ＿３、ｆｃ＿４が入力されており、検出信号ＭＳ１から、蛍光ＦＬＡ、ＦＬＤ、ＦＬＧが分離される。また、復調器２には、キャリア周波数ｆｃ＿２、ｆｃ＿４が入力されており、検出信号ＭＳ２から、蛍光ＦＬＢ、ＦＬＥが分離される。更に、復調器３には、キャリア周波数ｆｃ＿３、ｆｃ＿４が入力されており、検出信号ＭＳ３から、蛍光ＦＬＣ、ＦＬＦが分離される。かかる構成により、同時に励起された７種類の蛍光が、それぞれ分離されることとなる。
【００９３】
［キャリアの周波数の設定方法の具体例］
続いて、蛍光信号取得装置１としてレーザ走査蛍光顕微鏡を実現した場合におけるキャリア周波数の設定方法について、具体的に説明する。
【００９４】
レーザ走査蛍光顕微鏡の分解能は、小さければ小さい方が好ましいが、光学的分解能又は電気的分解能の大きい方の数値が、実際のレーザ走査蛍光顕微鏡の分解能となる。
【００９５】
光学的分解能ｄｏは、対物レンズの開口数ＮＡと、測定に用いる励起光の波長λと、を用いて、λ／（ＮＡ×２）、又は、０．６１×λ／ＮＡで見積もられる。ここで、簡単のためにＮＡ＝１としてｄｏ＝λ／２を用いるとすると、λ＝５００ｎｍでｄｏ＝２５０ｎｍとなる。
【００９６】
一方、電気的分解能ｄｅは、ＰＭＴなどの光電変換素子の帯域に制約が無い場合、サンプリング間隔（又はピクセル間隔）によって決定される。ビーム速度がｖ［ｍ／ｓ］でサンプリング周波数がｆｓ［１／ｓ］であるとき、サンプリング間隔は、ｖ／ｆｓ［ｍ］となる。サンプリング定理によれば、かかるサンプリング間隔の２倍の分解能が得られるが、これは理想的なローパスフィルタ（ＬＰＦ）を用いた場合であるため、現実的には、上記サンプリング間隔の３倍の分解能になると見積ることとして、ｄｅ＝３×（ｖ／ｆｓ）で計算される。
【００９７】
ビーム速度ｖ［ｍ／ｓ］は、走査ビームの往復周波数と走査範囲とから計算できる。代表的な数字として、往復周波数５００Ｈｚ、走査範囲１ｍｍを用いて、ビーム速度を計算することとする。１ｍｍの範囲を周期２ｍｓの半分の１ｍｓで走査するため、ビーム速度はｖ＝１［ｍ／ｓ］となる。
【００９８】
電気的分解能ｄｅを光学的分解能ｄｏと一致させるためには、サンプリング周波数がｆｓ＝３×（ｖ／ｄｅ）＝３×（ｖ／ｄｏ）＝３×（１［ｍ／ｓ］／２５０×１０−９［ｍ］）＝３×４／１０００×１０−９［１／ｓ］＝１２×１０６［１／ｓ］＝１２［ＭＨｚ］であればよく、周波数帯域は、１［ｍ／ｓ］／２５０×１０−９［ｍ］＝４／１０００×１０−９＝４×１０−６［１／ｓ］＝４［ＭＨｚ］となる。
【００９９】
なお、最小のキャリアの周波数は、先だって説明したように、周波数帯域幅の３倍以上に設定することが好ましい。従って、最小のキャリアの周波数は、４ＭＨｚの３倍である１２ＭＨｚ以上に設定することが好ましい。
【０１００】
一方、複数のキャリアを用いる場合には、先だって説明したように、あるキャリアの２次高調波が他のキャリアとその側帯波と重ならないようにすることが好ましい。最小のキャリアの周波数を１２ＭＨｚとし、占有帯域幅を４ＭＨｚの２倍の８ＭＨｚとすると、４本のキャリアの側帯波が重ならないためには、最低でも８ＭＨｚの間隔が求められるため、１２、２０、２８、３６ＭＨｚという周波数を選択することができる。しかしながら、１２ＭＨｚのキャリアの２次高調波は２４ＭＨｚであるため、２０ＭＨｚと２８ＭＨｚのキャリアの側帯波と重なり合って、クロストークの原因となる。従って、占有帯域幅が４ＭＨｚ、つまり最低でも８ＭＨｚの間隔が求められるという条件と、２次高調波が重ならないという条件を満たす最も周波数の低い組み合わせは、３２、４０、４８、５６ＭＨｚとなる。
【０１０１】
以上、蛍光信号取得装置１としてレーザ走査蛍光顕微鏡を実現した場合におけるキャリア周波数の設定方法について、具体的に説明した。
【０１０２】
＜蛍光信号取得方法について＞
次に、図９を参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得装置１で実施される蛍光信号取得方法の流れについて、簡単に説明する。図９は、本実施形態に係る蛍光信号取得方法の流れの一例を示した流れ図である。
【０１０３】
本実施形態に係る蛍光信号取得方法では、まず、複数の蛍光体を含む測定対象物Ｓに対して、所定の周波数を有するキャリアによって強度変調された複数の励起光を、測定光学系１０５を介して照射する（ステップＳ１０１）。
【０１０４】
複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光は、マルチバンドパス光学フィルタ１０７により、複数の光路へと分岐される（ステップＳ１０３）。
【０１０５】
その後、複数の光路に分岐された蛍光は、複数の蛍光検出部１０９によって検出され（ステップＳ１０５）、検出された検出信号を同期検波することで、複数の蛍光体に対応する蛍光が分離される（ステップＳ１０７）。
【０１０６】
以上、図９を参照しながら、本実施形態に係る蛍光信号取得方法の流れの一例について、簡単に説明した。
【０１０７】
（まとめ）
以上説明したように、本開示の実施形態に係る蛍光信号取得装置及び蛍光信号取得方法では、１つの励起光に応じて複数の蛍光体が同時に励起される場合であっても、発生した蛍光をより簡便に分離することが可能となる。また、蛍光の検出に用いられる蛍光検出部の数を削減することが可能となる。また、励起光の同時照射が可能となるため、測定対象物からの蛍光を、より高速に取得することが可能となる。
【０１０８】
以上、添付図面を参照しながら本開示の好適な実施形態について詳細に説明したが、本開示の技術的範囲はかかる例に限定されない。本開示の技術分野における通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本開示の技術的範囲に属するものと了解される。
【０１０９】
また、本明細書に記載された効果は、あくまで説明的または例示的なものであって限定的ではない。つまり、本開示に係る技術は、上記の効果とともに、または上記の効果に代えて、本明細書の記載から当業者には明らかな他の効果を奏しうる。
【０１１０】
なお、以下のような構成も本開示の技術的範囲に属する。
（１）
複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射する複数の光源と、
前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を検出する複数の蛍光検出部と、
前記複数の蛍光検出部の前段に位置し、前記複数の蛍光を複数の光路へと分岐させるものであり、波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタと、
それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離する同期検波部と、
を備える、蛍光信号取得装置。
（２）
前記蛍光検出部の個数は、前記複数の蛍光体の個数よりも少なく、かつ、１つの前記励起光で励起される前記蛍光体の最大数に等しい、（１）に記載の蛍光信号取得装置。
（３）
前記マルチバンドパス光学フィルタは、所定の波長帯域の光を反射させるとともにそれ以外の波長帯域の光を透過させる複数のシングルバンド反射フィルタが、直列に配設されたものである、（１）又は（２）に記載の蛍光信号取得装置。
（４）
それぞれの前記キャリアの基本波は、側帯波の帯域幅以上の周波数だけ離隔しており、
それぞれの前記キャリアの周波数は、ある一つのキャリアにおける三次高調波及び側帯波が他のキャリアにおける基本波及び側帯波と重ならないように選択される、（１）〜（３）の何れか１つに記載の蛍光信号取得装置。
（５）
それぞれの前記キャリアの周波数は、ある一つのキャリアにおける二次高調波及び側帯波が他のキャリアにおける基本波及び側帯波と重ならないように選択される、（１）〜（４）の何れか１つに記載の蛍光信号取得装置。
（６）
前記同期検波部は、
前記蛍光検出部により生成された検出信号が入力されるバンドパスフィルタと、
前記バンドパスフィルタを透過した前記検出信号と前記キャリアとが入力される乗算器と、
前記乗算器により生成された信号が入力されるローパスフィルタと、
を有する、（１）〜（５）の何れか１つに記載の蛍光信号取得装置。
（７）
前記蛍光信号取得装置は、所定の流路中を搬送されている前記測定対象物からの蛍光を検出するフローサイトメータである、（１）〜（６）の何れか１つに記載の蛍光信号取得装置。
（８）
前記キャリアの周波数は、前記測定対象物の搬送速度と、前記測定対象物の大きさとから決定される周波数帯域幅の３倍以上である、（７）に記載の蛍光信号取得装置。
（９）
前記蛍光信号取得装置は、前記測定対象物を走査して当該測定対象物からの蛍光を観察するレーザ走査蛍光顕微鏡である、（１）〜（６）の何れか１つに記載の蛍光信号取得装置。
（１０）
前記キャリアの周波数は、前記励起光の波長及び対物レンズの開口数から算出される光学的分解能と、前記励起光の走査速度との組み合わせから決定される周波数帯域幅の３倍以上である、（９）に記載の蛍光信号取得装置。
（１１）
前記光源は、所定波長のレーザ光を射出するレーザ光源であり、
前記蛍光検出部は、光電子増倍管である、（１）〜（１０）の何れか１つに記載の蛍光信号取得装置。
（１２）
複数の蛍光体を含む測定対象物に対して、互いに異なる周波数を有するキャリアで変調された複数の励起光を照射することと、
波長の連続しない複数の蛍光体からの蛍光を透過させるマルチバンドパス光学フィルタにより、前記複数の励起光に応じて発生した複数の蛍光を、複数の光路へと分岐させることと、
複数の光路に分岐された前記蛍光を複数の蛍光検出部により検出することと、
それぞれの前記蛍光検出部により検出された検出信号を同期検波して、前記複数の蛍光体に対応する蛍光を分離することと、
を含む、蛍光信号取得方法。
【符号の説明】
【０１１１】
１    蛍光信号取得装置
１０１    光源
１０３    変調部
１０５    測定光学系
１０７    マルチバンドパス光学フィルタ
１０９    蛍光検出部
１１１    同期検波部
１２１    シングルバンド反射フィルタ
１２３、１３３    バンドパスフィルタ
１３１    復調器
１３５    乗算器
１３７    ローパスフィルタ
【図１】
2015145829.tif 000003
【図２】
2015145829.tif 000004
【図３】
2015145829.tif 000005
【図４】
2015145829.tif 000006
【図５Ａ】
2015145829.tif 000007
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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