(57)【要約】【課題】原線維形成に対して抵抗性のあるモノマーおよびオリゴマーアミロイドベータペプチド異性体、アルツハイマー病、タンパク質の誤った折りたたみに関連する他の病状の治療のための方法および医薬組成物における、スクリーニング試薬または抗原としてのそれらの使用、および修飾されたアミロイド前駆体タンパク質またはアミロイドベータペプチドを発現するトランスジェニック動物を提供する。【解決手段】野生型のアミロイドベータペプチドアミノ酸配列中の２１および３０位のアラニンは、本発明により、分子内ジスルフィド結合をもたらすシステインに置換されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４のアミノ酸１７〜２１に相当するアミノ酸配列Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｃ、および配列番号：４のアミノ酸３０〜３６に相当するアミノ酸配列Ｃ−Ｉ−Ｉ−Ｇ−Ｌ−Ｍ−Ｖを含み、
配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するアミノ酸であるＣ（システイン）を含み、アミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基の間にジスルフィド結合を含む、
アミロイドベータペプチド、または、
前記アミロイドベータペプチドに対し、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が保存的置換により配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で置換されているか、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で欠失しているか、または１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で挿入された、
アミロイドベータペプチド。
【請求項２】
配列番号：４のアミノ酸１７〜３６に相当するアミノ酸配列Ｌ−Ｖ−Ｆ−Ｆ−Ｃ−Ｅ−Ｄ−Ｖ−Ｇ−Ｓ−Ｎ−Ｋ−Ｇ−Ｃ−Ｉ−Ｉ−Ｇ−Ｌ−Ｍ−Ｖを含む、請求項１に記載のアミロイドベータペプチド、または、
前記アミロイドベータペプチドに対し、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が保存的置換により配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で置換されているか、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で欠失しているか、または１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で挿入された、
アミロイドベータペプチド。
【請求項３】
配列番号：４のアミノ酸１〜４０に相当するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のアミロイドベータペプチド、または、
前記アミロイドベータペプチドに対し、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が保存的置換により配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で置換されているか、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で欠失しているか、または１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸が配列番号：４のアミノ酸２１および３０に相当するシステイン残基以外で挿入された、
アミロイドベータペプチド。
【請求項４】
配列番号：４のアミノ酸２２に相当する位置にグリシン置換を含む、請求項２または３に記載のアミロイドベータペプチド。
【請求項５】
配列番号：４のアミノ酸３５に相当する位置にメチオニンスルホキシド残基置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチド。
【請求項６】
（ａ）１または２個の末端アミノ酸がマレイミド化され；
（ｂ）１または２個の末端アミノ酸がシステイニル化され；
（ｃ）Ｎ−末端アミノ酸がアセチル化され；および／または
（ｄ）Ｃ−末端アミノ酸がアミド化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドを含む可溶性オリゴマー。
【請求項８】
１）アミロイドニューロパシーあるいは脳アミロイド血管症に代表されるアミロイドーシス、
２）クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレイピーに代表されるプリオン病、
３）パーキンソン病、
４）アルツハイマー病、
からなる群から選ばれるいずれかの疾患の治療に適した化合物の同定方法であって、
ａ）試験化合物を提供し、
ｂ）前記試験化合物を、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項７に記載の可溶性オリゴマーと接触させ、
ｃ）前記試験化合物が前記アミロイドベータペプチドまたは前記可溶性オリゴマーと結合するか、および／または可溶性オリゴマーの形成を阻害するかどうかを検査し、
ｄ）ステップｃ）で、前記試験化合物が前記アミロイドベータペプチドまたは前記可溶性オリゴマーと結合するか、および／または可溶性オリゴマーの形成を阻害するという結果であれば、前記疾患の治療に適しているとして前記化合物を同定する、
ステップからなる同定方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項７に記載の可溶性オリゴマーを利用した、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項７に記載の可溶性オリゴマーと反応する結合タンパク質の選択方法。
【請求項１０】
前記結合タンパク質が、
１）Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片、単一鎖Ｆａｂ断片、単一鎖Ｆｖ断片、又または単一鎖Ｆｖ二量体のような抗体断片、または
２）アンチカリンの誘導体、アフィボディ、ＦＮｆｎ１０、ネオカルチノスタチン、アンキリン反復タンパク質、ＰＤＨフィンガー、ＣＤＲ３グラフト化緑色蛍光タンパク質、及びおよびＥ．ｃｏｌｉペリプラズム結合タンパク質骨格のような、遺伝子工学で設計された非天然の受容体誘導体、
のいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１）アミロイドニューロパシーあるいは脳アミロイド血管症に代表されるアミロイドーシス、
２）クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレイピーに代表されるプリオン病、
３）パーキンソン病、
４）アルツハイマー病、
からなる群から選ばれるいずれかの疾患の予防的または治療的処置のための免疫を意図する医薬組成物の製造における、場合によりアジュバントと組み合わせた、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項７に記載の可溶性オリゴマーの使用。
【請求項１２】
場合によりアジュバントと組み合わせて、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項７に記載の可溶性オリゴマーの治療的有効量を含む医薬製剤。
【請求項１３】
場合によりアジュバントと組み合わせて、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドあるいは請求項７に記載の可溶性オリゴマーを含む、
１）アミロイドニューロパシーあるいは脳アミロイド血管症に代表されるアミロイドーシス、
２）クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレイピーに代表されるプリオン病、
３）パーキンソン病、
４）アルツハイマー病、
からなる群から選ばれるいずれかの疾患に対して、ヒトを含む哺乳動物を免疫するためのワクチン。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のヌクレオチドを含む発現系。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミロイドベータペプチドをコードするヌクレオチドを発現する、非ヒトトランスジェニック動物であって、
アミロイドベータペプチドが好ましくは配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０から選択される、
非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記非ヒトトランスジェニック動物が、脊索動物から選択され、好ましくはトランスジェニックマウスである、請求項１６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病、およびタンパク質の誤った折りたたみに関連する他の病状の治療のための抗原またはスクリーニング試薬として用いるための原線維形成に対して抵抗性のある、モノマーおよびオリゴマーのアミロイドベータペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生成されるアミロイド−β（Ａβ）タンパク質の不溶性アミロイド沈着物の蓄積により特徴づけられる加齢に関連する神経変性疾患である（Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．ら，Ｌａｎｃｅｔ  ３６８：３８７−４０３（２００６））。ＡＤは、パーキンソン病および２型糖尿病のような、２２種を超える他の公知の病気を含む、タンパク質の誤った折りたたみにより引き起こされるいくつかの疾患のうちの１種である（Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｌｅｔｔ．１３：２１９−２２７（２００６））。ある程度は、これらの沈着物がどうして有害であるかが今もなお不明瞭であるという事実のために、現在のところ、ＡＤおよび他のほとんどのタンパク質の誤った折りたたみによる疾患に対する有効な治療法はない。実際、以前はＡＤの原因であると信じられていた不溶性アミロイド沈着物から、毒物としての可溶性Ａβオリゴマー種に焦点が移ってきた（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１０１−１１２（２００７））。さらに、Ａβに対して上昇する構造依存性抗体（例えば、ポリクローナルＡ１１抗体）は、Ａβに加え、他のオリゴマー種に対して反応することが示され、したがって、これらの毒性構造は、異なるタンパク質が関与するけれども、タンパク質の誤った折りたたみによる疾患において一般的であることを示唆する（Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２９：５４２−５４７（２００４））。したがって、現在は、世界中で、多くの努力が薬物スクリーニングおよび免疫原性の目的のために、このような可溶性オリゴマーの分離および特徴づけに焦点を合わせている。しかし、モノマーおよびオリゴマーＡβタンパク質は、いずれもさらに原線維凝集する傾向が高い。このフィブリル化は、速度がペプチド濃度に影響を受ける自発的な核形成依存性重合反応である（Ｌｏｍａｋｉｎ，Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１２５−１１２９（１９９６））。その結果、フィブリル化は、オリゴマー生成の寿命、およびそれらが維持し得る濃度をも著しく制限する。
【０００３】
ＡＤに関与する野生型のＡβタンパク質は、＞１００μＭの濃度でフィブリル化する傾向のあるペプチドである。より低い濃度では（＞２０μＭ〜＜１００μＭ）、前記タンパク質は不活性な繊維状態に進む前に、ゆっくりとオリゴマー（オリゴマーは、複数のモノマーを含む可溶性の構造である）形成する傾向にある。このオリゴマー状態は、神経毒性物質、それ故ＡＤに関与する有毒種として関与していることが最近わかった（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１０１−１１２（２００７））。生理的条件下における、これらの毒性構造の一般的な製造方法は、細胞培養培地（Ｆ−１２）または緩衝化した塩溶液中、４０℃で数日間、２０〜１００μＭ濃度のペプチド溶液をインキュベートすることを含む（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：６４４８−６４５３（１９９８）；Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。核形成および伸長速度はペプチド濃度に強く依存するので（Ｌｏｍａｋｉｎ，Ａ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１２５−１１２９（１９９６））、１００μＭを超えるペプチド濃度の上昇は、オリゴマー調製の安定性に対して不利である。アミロイド原線維の集合の古典的見解においては、重合およびオリゴマー構造を誘発する核は同一の種であるとさえ考えられている。したがって、オリゴマーの調製は非常に制限され、それらがいったん生成されると予測できないほどの寿命を有する（凝集核形成は自発的な現象である）。４℃で薄い溶液（２０μＭ〜２５μＭ）においては、Ａβ（４２）のオリゴマー調製は、通常たったの２４時間だけ安定であり、Ａβ（４０）の寿命は１週間であるかもしれない。それより薄くない、＞１００μＭの溶液においては、Ａβタンパク質の不溶性は劇的に低下する。したがって、薬物のスクリーニングアッセイにおいては、相対的に高い濃度で安定なタンパク質が必要である場合には重大な欠点である。
【０００４】
本発明の目的は、安定なオリゴマーを生成する改変Ａβペプチドを提供することにより、これらの問題を克服することである。
【０００５】
安定なＡβヘアピン構造の過去の報告はなく、折り重ねられた追加のシステインなしでＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃジスルフィドのみを含むＡβペプチドの報告はない。米国特許出願公開第２００６／００１８９１８号には、ワクチンとして用いるための、一般的にＡβの安定な非天然の高次構造を目的とした、全てのＳｅｒおよびＡｌａの複数のシステイン置換を有する、Ａβの一次構造のみの考慮をベースとするＡβ異性体が開示されている。Ａ２１ＣおよびＡ３０Ｃ変異は、Ａｌａ２、Ｓｅｒ８、Ｓｅｒ２６およびＡｌａ４２の位置における、３または４個の追加のシステイン変異と一緒に得られる。Ａβ異性体の酸化は異なる分子内ジスルフィド結合を有する１５種の可能なイソ型の混合物を生成し、１５種の可能なイソ型のうち３種のみが、常に追加のジスルフィド結合との組み合わせであるが、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃジスルフィド結合を含む。
【０００６】
文献に報告された、以前のＡβペプチドジスルフィド変異は、Ｌ１７Ｃ／Ｌ３４Ｃ、Ｌ１７Ｃ／Ｍ３５ＣおよびＬ１７Ｃ／Ｖ３６Ｃである（Ｓｈｉｖａｐｒａｓａｄ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５３−１５３１７（２００４））。これらの変異は全て非保存的置換である。さらに、これらの変異は、フィブリル構造内のＬｅｕ１７〜Ｌｅｕ３４、Ｍｅｔ３５およびＶａｌ３６の近接性を調査するために特に製造された。ＳｈｉｖａｐｒａｓａｄおよびＷｅｔｚｅｌは、これら３種の変異が、時間のずれと共に、還元（変異残基をシステインとして有する）および酸化（変異残基をシスチンとして有する）変異とほとんど同一である、原線維を形成することを示すデータを示す。非保存的置換でもある、他のジスルフィド変異、すなわちＶ１８Ｃ／Ｌ３４Ｃ、Ｆ１９Ｃ／Ａ３０Ｃ、Ｆ１９Ｃ／Ｉ３２ＣおよびＦ１９Ｃ／Ｌ３４Ｃは、同じ著者により公表されている（Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：１−１０（２００７））。これらの変異は、Ｌ１７Ｃ／Ｌ３４Ｃ、Ｌ１７Ｃ／ＭＦＦ１３５ＣおよびＬ１７Ｃ／Ｖ３６Ｃ変異と同様に機能することがわかっている。それ故、以前に公表された全てのＡβタンパク質のジスルフィド変異は、野生型ペプチドから得られる原線維に対するのと少なくとも類似の安定性の原線維に容易に凝集することが証明されている。これらのＬ１７Ｃ／Ｌ３４Ｃ、Ｌ１７Ｃ／Ｍ３５Ｃ、Ｌ１７Ｃ／Ｖ３６Ｃ、Ｖ１８Ｃ／Ｌ３４Ｃ、Ｆ１９Ｃ／Ａ３０Ｃ、Ｆ１９Ｃ／Ｉ３２ＣおよびＦ１９Ｃ／Ｌ３４Ｃ変異の酸化誘導体は、それらが、Ｈｏｙｅｒら（Ｈｏｙｅｒ，Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０５：５０９９−５１０４（２００８））に示されるヘアピン構造と適合しないので、全てフィブリル化するが、２本のβ−鎖がお互いに対して圧縮される、Ａβ−ペプチドフィブリル構造の最新のモデルに適合する。（例えば、Ｐｅｋｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：  ４９８−５１２参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００１８９１８号
【特許文献２】国際出願第２００７／００５３５８号
【特許文献３】国際出願第２００７／００５３５９号
【特許文献４】国際出願第２００７／１４２３２０号
【特許文献５】国際出願第２００４／０６７５６１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｌｅｎｎｏｗ，Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６８：３８７−４０３    （２００６）
【非特許文献２】Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｌｅｔｔ．    １３：２１９−２２７（２００６）
【非特許文献３】Ｈａａｓｓ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ  Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ      Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１０１−１１２（２００７）
【非特許文献４】Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．    ２９：５４２−５４７（２００４）
【非特許文献５】Ｌｏｍａｋｉｎ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ    ．ＵＳＡ  ９３：１１２５−１１２９（１９９６）
【非特許文献６】Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ    ｃｉ．ＵＳＡ．９５：６４４８−６４５３（１９９８）
【非特許文献７】Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１    １６１２−１１６２２（２００３）
【非特許文献８】Ｓｈｉｖａｐｒａｓａｄ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．，Ｂｉ    ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５３−１５３１７（２００４）
【非特許文献９】Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：１−１    ０（２００７）
【非特許文献１０】Ｈｏｙｅｒ，Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．    ＵＳＡ．１０５：５０９９−５１０４（２００８）
【非特許文献１１】Ｐｅｋｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５    ：  ４９８−５１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ａβオリゴマー調製品は、国際出願第２００７／００５３５８号、国際出願第２００７／００５３５９号、国際出願第２００７／１４２３２０号および国際出願第２００４／０６７５６１号に開示されている。開示されたこれらのオリゴマー調製品は、分子内架橋剤（国際出願第２００７／００５３５８号）、非生理的ｐＨ（国際出願第２００７／００５３５９号においてｐＨ９）および／または添加剤（国際出願第２００７／００５３５９号において、４０％グリセロールまたはＴＦＥは３７℃でオリゴマーを安定させることを権利主張する；国際出願第２００７／１４２３２０号におけるＧＭ１ガングリオシド；国際出願第２００４／０６７５６１におけるＳＤＳ）を用いることにより得られる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、原線維形成に対して抵抗性のある、共有結合で制約された（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）モノマーおよびオリゴマーＡβ  Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドを提供する。本発明のペプチドは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、遠紫外ＣＤ（コイル状構造の指標）およびＮＭＲ（コイル様でもある）により調査されるように、ほとんどの野生型様特性を維持している。フィブリル化が阻害されるので、本発明のＡβペプチドには、濃縮により、コイル状構造を有する、いくつかの低分子量オリゴマー（約４２ｋＤａ以下のタンパク質としてＳＥＣから溶出される）、ならびにβ−構造を有する高分子量オリゴマー（約７５〜８５ｋＤａおよび１７０ｋＤａのタンパク質としてＳＥＣから溶出される）が存在する。さらに、６ｎｍの幅、および通常３０ｎｍの長さの寸法を有する野生型様プロトフィブリル構造は、高濃度のタンパク質溶液を加熱することにより得られる。β−構造を有する高分子量オリゴマーはＡ１１ポリクローナル抗体により認識される。
【００１１】
本発明は、原線維形成に抵抗性のあるモノマーおよびオリゴマーＡβペプチドを提供する。
【００１２】
高濃度のモノマーおよびオリゴマーＡβペプチドのプールの消耗からの凝集副反応を防止するために、本発明者らは共有結合で制約されたＡβペプチドを設計した。本発明のＡβペプチドは、野生型Ａβ（４０）（配列番号：１）またはＡβ（４２）（配列番号：２）ペプチドの２１および３０位においてシステインによるアミノ酸置換を含み、分子内ジスルフィド結合した、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ（配列番号：３）およびＡβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ（配列番号：４）ペプチドをもたらす（図１Ａ）。これらのアミノ酸置換は、アミロイドーシスを誘発する立体構造スイッチを効果的に阻害し、このメカニズムの仮説を図１Ｂに図示し、有毒種であると考えられるβ−構造を有する高分子量オリゴマーを含む、いくつかのオリゴマー状態の存在を可能にする。本発明のＡβペプチドは、野生型Ａβペプチドについて得られるのと類似する、潜在的に有毒なオリゴマー状態を生成し、野生型オリゴマーと同一の遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、それらはＡ１１抗体とも結合し、野生型様の形態を有するプロトフィブリルを形成する。本発明のＡβペプチドの非オリゴマーコイル様状態は、サイズＳＥＣ、遠紫外ＣＤ分光法および１５Ｎヘテロ核単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により示されるような野生型様をも維持している。
【００１３】
本発明のペプチド内に存在する制約されたジスルフィド結合のために、（ｉ）ペプチドの反発力を増大する非生理的（高い）ｐＨ、（ｉｉ）オリゴマー構造を誘導するための、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、グリセロール、またはＧＭ１ガングリオシドの形態における細胞膜糖脂質を含む添加剤の使用、（ｉｉｉ）電荷を遮蔽し、その結果溶解度を増大するためのアニオンの添加、および（ｉｖ）いったん、それらが選択肢（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１または数種により製造されると、共有結合で安定化させる分子内架橋を用いることを含む、オリゴマーを安定化する他の方法は必要でない。実際、本発明のＡβペプチドは、生理的条件下で安定なオリゴマーを形成するＡβペプチドの最初の例であり、これはフィブリル化工程を停止することにより得られる。さらに、本発明のＡβペプチドを精製し、急速にオリゴマー状態に濃縮し得るように、オリゴマー調製品の長いインキュベーション時間および予測できない結果が回避される。
【００１４】
一態様においては、本発明は、配列番号：４のアミノ酸１７〜２１に相当するアミノ酸配列ＬＶＦＦＣ、および配列番号：４のアミノ酸３０〜３６に相当するアミノ酸配列ＣＩＩＧＬＭＶを含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは、さらに配列番号：４のＣｙｓ２１およびＣｙｓ３０に相当するアミノ酸の間のジスルフィド結合を含む。本発明の好ましい一態様においては、前記ペプチドは、分子内ジスルフィド結合により、アミノ酸配列ＬＶＦＦＣを含むペプチドを、アミノ酸配列ＧＩＩＧＬＭＶを含むペプチドと結合させることにより得られる。本発明のさらに好ましい態様においては、前記２本のペプチドは、Ｃｙｓ２１とＣｙｓ３０との間の分子内ジスルフィド結合を有する単一のペプチド鎖の構成要素である。さらに、アミノ酸配列ＬＶＦＦＣは、４〜２０個のアミノ酸、例えば６〜１６個、好ましくは７〜１２個のアミノ酸、またはさらに好ましくは８〜１０個、例えば９個のアミノ酸を含むペプチドによりアミノ酸配列ＣＩＩＧＬＭＶと結合する。さらに、本発明は、１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が保存的置換により置換されており、１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が欠失しており、または１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が挿入されているペプチドの変異体を提供する。
【００１５】
好ましくは、融合ペプチドは、配列番号：４のアミノ酸２２〜２９に相当するアミノ酸配列ＥＤＶＧＳＮＫＧを含む。したがって、本発明のペプチドは、好ましくは配列番号：４のアミノ酸１７〜３６に相当するアミノ酸配列ＬＶＦＦＣＥＤＶＧＳＮＫＧＣＩＩＧＬＭＶ、ならびに１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が保存的置換により置換されており、１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が欠失しており、または１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が挿入されている前記ペプチドの変異体を含む。
【００１６】
さらに好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号：４のアミノ酸配列１〜４０、配列番号：４の全アミノ酸配列、ならびに１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が保存的置換により置換されており、１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が欠失しており、または１個以上、例えば１、２、３、４、５個、好ましくは１もしくは２個のアミノ酸が挿入されている前記ペプチドの変異体を含む。
【００１７】
本発明のペプチドは、さらにアミノ酸２２に相当する位置にグリシン置換（配列番号：５）、アミノ酸２２に相当する位置にグルタミン置換（配列番号：６）、またはアミノ酸２２に相当する位置にリジン置換（配列番号：８）を含み得る。本発明のペプチドは、アミノ酸２３のに相当する位置にアスパラギン置換を含み得る（配列番号：７）。本発明のペプチドは、配列番号：４のアミノ酸３５に相当する位置にメチオニンスルホキシド残基をも含み得る。
【００１８】
さらに、本発明のペプチドは、（ａ）１または２個の末端アミノ酸がマレイミド化され；（ｂ）１または２個の末端アミノ酸がシステイニル化され；（ｃ）ペプチドのカルボキシ末端がアミド化され、すなわち、カルボキシ末端におけるフリーのＣＯＯＨがＣＯＮＨ２に変換しており；および／またはペプチドのアミノ末端がアセチル化され、すなわち、アミノ末端におけるフリーのＮＨ２がアミドＣＨ３ＣＯＮＨ−（ＡｃＮＨ−）に変換している。本発明のペプチドは、化学合成により製造することができ、または組換えＤＮＡ技術により製造することができる。
【００１９】
保存的置換は、１個のアミノ酸の、極性および疎水性に関して類似の性質を有するアミノ酸との置換を意味する。このような類似の性質を有するアミノ酸の群の例を表１に示す。保存的置換は、非標準的アミノ酸との置換を含み得る。非標準的アミノ酸には、表１における角かっこ内の例が含まれるが、これらに限定されない（表１において、ＰＬはピロリジン、ＤＡはデヒドロアラニン、ＮＬはノルロイシン、ＳＣはセレノシステイン、ＨＣはホモシステイン、ＣＬはシトルリン、ＯＲはオルニチンである）。
【００２０】
（表１）
疎水性      ＡＶＬＩＰＦＷＭ
（無極性）    ［ＰＬ  ＤＡ  ＮＬ］                                  
極性        ＧＳＴＣＹＮＱ
（非荷電）    ［ＳＣ  ＨＣ  ＣＬ］                                  
極性        ＤＥＫＲＨ              正電荷    Ｈ  Ｋ  Ｒ［ＯＲ］  
（荷電）      ［ＯＲ］                負電荷    ＥＤ            
【００２１】
好ましくは、本発明の保存的置換およびアミノ酸挿入は、配列番号：４のＣｙｓ２１およびＣｙｓ３０に相当するシステインに加え、更なるシステインの挿入を許容しない。
【００２２】
好ましくは、本発明の保存的置換およびアミノ酸欠失は、配列番号：４のＣｙｓ２１およびＣｙｓ３０に相当するシステインの置換または欠失を許容しない。
【００２３】
最も好ましくは、本発明のＡβペプチドは、常に正確に２個のシステイン、すなわち配列番号：４のＣｙｓ２１およびＣｙｓ３０に相当するシステインを含む。
【００２４】
本発明のペプチドは、原線維形成に対して十分に抵抗性がある。原線維形成に対する抵抗性は、本明細書に示されるいくつかの例により証明されるように、野生型Ａβペプチドがフィブリル化する生理的条件に近い条件下で、前記ペプチドがフィブリルを形成しないことを意味する。一態様においては、本発明は、本発明のペプチドからなる可溶性オリゴマーを提供する。
【００２５】
他の態様においては、本発明は、本発明のペプチドと特異的に反応する抗体を提供する。抗体はモノクローナル抗体であってもよい。他の態様においては、本発明は、本発明のペプチドと特異的に反応する抗体断片を提供する。抗体断片は、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片、単一鎖Ｆａｂ断片、単一鎖Ｆｖ断片、または単一鎖Ｆｖ二量体であってもよい。さらに他の態様においては、本発明は、本発明のペプチドと特異的に反応するタンパク質バインダーを提供する。前記タンパク質バインダーには、アンチカリンの誘導体、アフィボディ、ＦＮｆｎ１０、ネオカルチノスタチン、アンキリン反復タンパク質、ＰＤＨフィンガー、ＣＤＲ３グラフト化緑色蛍光タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉペリプラズム結合タンパク質骨格が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
他の態様においては、本発明は、タンパク質繊維またはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患の治療に適した化合物の同定方法を提供し、該方法は本発明のペプチドを使用することを含む。疾患は、アミロイドニューロパシーまたは脳アミロイド血管症のようなアミロイドーシス、クロイツフェルト−ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレピーのようなプリオン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。好ましくは、疾患はアルツハイマー病である。タンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるかまたは関連する疾患の治療に適した化合物の同定法は：
ａ）試験化合物を提供し、
ｂ）前記試験化合物を本発明のペプチドと接触させ、
ｃ）試験化合物がペプチドと結合し、および／またはペプチドオリゴマーの形成を阻害するかどうかを測定し、
ｄ）タンパク質フィブリルの沈着またはアミロイド病により引き起こされるかまたは関連する疾患の治療に適しているとして前記化合物を同定することを含み得る。
【００２７】
疾患は、アミロイドニューロパシーまたは脳アミロイド血管症のようなアミロイドーシス、クロイツフェルト−ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレピーのようなプリオン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。好ましくは、疾患はアルツハイマー病である。
【００２８】
他の態様においては、本発明は、本発明のペプチドを使用することを含む、結合タンパク質の同定および／または選択方法を提供する。結合分子は、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ）２断片、単一鎖Ｆａｂ断片、単一鎖Ｆｖ断片、または単一鎖Ｆｖ二量体のような抗体断片であり得る。結合分子は、アンチカリンの誘導体、アフィボディ、ＦＮｆｎ１０、ネオカルチノスタチン、アンキリン反復タンパク質、ＰＤＨフィンガー、ＣＤＲ３グラフト化緑色蛍光タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉペリプラズム結合タンパク質骨格のような、遺伝子工学で設計された非天然の受容体誘導体であってもよい。
【００２９】
さらに他の態様においては、本発明は、場合によりアジュバントと組み合わせた、タンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患の予防的または治療的処置のための免疫を意図する医薬組成物の調整における、本発明のペプチドの使用を提供する。疾患は、アミロイドニューロパシーまたは脳アミロイド血管症のようなアミロイドーシス、クロイツフェルト−ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレピーのようなプリオン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。好ましくは、疾患はアルツハイマー病である。
【００３０】
さらに他の態様においては、本発明は、場合によりアジュバントと組み合わせた、本発明のペプチドの治療的有効量を含む医薬調製品を提供する。さらに他の態様においては、本発明は、場合によりアジュバントと組み合わせた、本発明のペプチドを含む、タンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の免疫付与のためのワクチンを提供する。疾患は、アミロイドニューロパシーまたは脳アミロイド血管症のようなアミロイドーシス、クロイツフェルト−ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレピーのようなプリオン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。好ましくは、疾患はアルツハイマー病である。
【００３１】
さらに他の態様においては、本発明は、本発明の抗体の治療的有効量を含む、タンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の免疫付与のためのワクチンを提供する。疾患は、アミロイドニューロパシーまたは脳アミロイド血管症のようなアミロイドーシス、クロイツフェルト−ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレピーのようなプリオン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。好ましくは、疾患はアルツハイマー病である。
【００３２】
さらに他の態様においては、本発明は、本発明のペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することにより、タンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患に苦しんでいるか、またはタンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患の発症のリスクに面している、ヒトを含む哺乳動物を予防的または治療的に処置する方法を提供する。疾患は、アミロイドニューロパシーまたは脳アミロイド血管症のようなアミロイドーシス、クロイツフェルト−ヤコブ病、牛海綿状脳症またはスクレピーのようなプリオン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病であり得る。好ましくは、疾患はアルツハイマー病である。
【００３３】
さらに他の態様においては、本発明は、本発明の抗体の治療的有効量を前記哺乳動物に投与することにより、タンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患に苦しんでいるか、またはタンパク質フィブリルまたはアミロイドの沈着により引き起こされるか、または関連する疾患の発症のリスクに面している、ヒトを含む哺乳動物を予防的または治療的に処置する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａは、２１および３０位に取り込まれたシステイン、ならびにこれらの    ２箇所の位置の間にジスルフィド結合を有するＡβ−ペプチド（プロテインデータバ    ンク受け入れ番号、２ＯＴＫ）（配列番号：４）のヘアピン構造の図面を示す。図１    Ｂは仮説上の凝集スキームの概略図を示す。
【図２】図２は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ置換を有する、および有しないＡβ（４０）ペ    プチド、ならびにジスルフィド結合が破壊された（５ｍＭ  トリス（２−カルボキシ    エチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中）Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのフ    ィブリル化アッセイを示す。
【図３】図３は、３０μＭ、５０μＭ、１５０μＭおよび２５０μＭペプチドにおけ    る、ジスルフィド結合が形成され、破壊された（１０ｍＭ  ＴＣＥＰにより）Ａβ（    ４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのフィブリル化アッセイを示す。
【図４】図４Ａは、低濃度（約２５μＭ）におけるＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ    ペプチドのＳＥＣ溶出プロフィールを示し、ここで、前記ペプチドは約８ｋＤａのタ    ンパク質として溶出する。図４Ｂは、コイル状タンパク質としてのＡβ（４０）Ａ２    １Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを示す。図４Ｃは、ジスルフィド結    合が形成された（−ＴＣＥＰ）、および破壊された（＋ＴＣＥＰ）Ａβ（４０）Ａ２    １Ｃ／Ａ３０ＣペプチドのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示    す。図４Ｄは、５０μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの１５Ｎ−ＨＳ    ＱＣ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、ＳＥＣの前に６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｄｍＣｌ）中で変性させたＡ    β（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約１．８ｍＭ）のＳＥＣ溶出    プロフィールを示す。遠紫外ＣＤ分光法によれば、高分子量の画分は全てβ構造を有    し、低分子量画分は全てコイル状構造を有している。
【図６】図６Ａは、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４０）Ａ２    １Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約１．５〜１．８ｍＭ）のＳＥＣ溶出プロフ    ィールを示す。図６Ｂにおいて、ＳＥＣの前に同じ溶液を、同じカラム上で、還元さ    れたシステインを維持するために５ｍＭ  ＴＣＥＰを補充した同じバッファー中、β    メルカプトエタノールで処理した。これらの条件下で、ペプチドは（＞１００ｋＤａ    のタンパク質として）ボイド（空隙）に溶出する。図６Ｃは、４℃および２００μＭ    濃度で４日後の図６Ａにおける上部画分のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。図６Ｄは    、約１ｍＭまで濃縮した、図６Ａのピーク中心の約１０．８ｍＬのＳＥＣ溶出プロフ    ィールを示す。
【図７】図７Ａは、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４０）Ａ２    １Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約１．７ｍＭ）のＳＥＣ溶出プロフィールを    示す。図７Ｂは、β−構造のペプチドオリゴマーとしての２５０μＭのＡβ（４０）    Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを示す。
【図８】図８は、制約されたジスルフィド結合を有する、および有しない（１０ｍＭ      ＴＣＥＰ中）β−構造オリゴマーとしてのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチ    ドのフィブリル化アッセイを示す。
【図９】図９は、高分子量のβ−構造のオリゴマーとしてのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／    Ａ３０Ｃペプチドの約１６８μＭ溶液のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。
【図１０】図１０Ａは、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４０）    Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約８００μＭ）のＳＥＣ溶出プロフィー    ルを示す。
【図１１】図１１Ａは、高濃度（１．１ｍＭ）におけるコイル状タンパク質としての    Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド、および２℃／分の温度勾配で、２０℃か    ら８０℃、次いで２０℃に戻す熱変性後のβ−構造タンパク質への変換の遠紫外ＣＤ    スペクトルを示す。図１１Ｂは、２２０ｎｍで測定した、図１１Ａに記載する熱変性    プロフィールを示す。
【図１２】図１２Ａは、格子適用（ｇｒｉｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）時に約５０    ０μＭである、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのコイル状オリゴマーのネ    ガティブ染色された（酢酸ウラニル）溶液の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。
【図１３】図１３は、１１７μＭにおいて、ジスルフィド結合が形成され、および破    壊された（１０ｍＭ  ＴＣＥＰにより）Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの    フィブリル化アッセイを示す。
【図１４】図１４は、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４２）Ａ    ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。
【図１５】図１５Ａは、２０μＭまで濃縮し、３７℃でインキュベートした、８０ｋ    ＤａのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣのＳＥＣ画分の時間依存性アッセイを示す。    図１５Ｂは、５０μＭまで濃縮し、３７℃でインキュベートした、１０ｋＤａのＡβ    （４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣのＳＥＣ画分の時間依存性アッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図１Ａは、２１および３０位に取り込まれたシステイン、ならびにこれらの２箇所の位置の間にジスルフィド結合を有するＡβ−ペプチド（プロテインデータバンク受け入れ番号、２ＯＴＫ）（配列番号：４）のヘアピン構造の図面を示す。Ｌｅｕ１７、Ｐｈｅ１９、Ｃｙｓ２１、Ｃｙｓ３０、Ｉｌｅ３２、Ｌｅｕ３４およびＶａｌ３６は構造の上面側に含まれ、Ｖａｌ１８、Ｐｈｅ２０、Ｉｌｅ３１およびＭｅｔ３５は構造の下面側に含まれ、この側はＧｌｙ３３をも含む。図１Ｂは仮説上の凝集スキームの概略図を示す。この仮説において、両親媒性のＡβペプチドは、疎水性力によりわずかに安定化する低分子量のミセル様オリゴマー構造に自発的に自己会合する（コイル状オリゴマー）。βヘアピンは、一時的にのみ場所を占有するが、疎水性スタッキングにより形成される高分子量オリゴマー構造において安定である。ヘアピンの色分けは図１Ａにおけるのと同じである。原線維形成は立体構造スイッチの結果として生じ、β−構造のオリゴマー中の水素結合および疎水性のファンデルワールス結合が破壊され、より安定なフィブリル構造に再形成され、橙色に着色した２本のβ−鎖は、現在はフィブリルコア中でお互いに面している。この立体構造工程は、ジスルフィド結合結合部位２１および３０により停止し、その結果、存在する他の状態を許容する。
【００３６】
図２は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ置換を有する、および有しないＡβ（４０）ペプチド、ならびにジスルフィド結合が破壊された（５ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中）Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのフィブリル化アッセイを示す。フィブリル化は、チオフラビンＴ（ＴＦＴ）結合（１０μＭ）により測定し、ｐＨ７．２においてリン酸バッファー中で振盪しながら３７℃でアッセイを実施した。
【００３７】
図３は、３０μＭ、５０μＭ、１５０μＭおよび２５０μＭペプチドにおける、ジスルフィド結合が形成され、破壊された（１０ｍＭ  ＴＣＥＰにより）Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのフィブリル化アッセイを示す。図３Ｅは、ペプチドを含まないベースラインを示す。フィブリル化は、ＴＦＴ結合（１０μＭ）により測定し、ｐＨ７．２においてリン酸バッファー中で振盪しながら３７℃でアッセイを実施した。
【００３８】
図４Ａは、低濃度（約２５μＭ）におけるＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣペプチドのＳＥＣ溶出プロフィールを示し、ここで、前記ペプチドは約８ｋＤａのタンパク質として溶出する。図４Ｂは、コイル状タンパク質としてのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを示す。このスペクトルは、前記ペプチドの全てのコイル状の調製品と実質的に同一である。図４Ｃは、ジスルフィド結合が形成された（−ＴＣＥＰ）、および破壊された（＋ＴＣＥＰ）Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣペプチドのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す。図４Ｄは、５０μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの１５Ｎ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【００３９】
図５は、ＳＥＣの前に６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｄｍＣｌ）中で変性させたＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約１．８ｍＭ）のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。遠紫外ＣＤ分光法によれば、高分子量の画分は全てβ構造を有し、低分子量画分は全てコイル状構造を有している。
【００４０】
図６Ａは、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約１．５〜１．８ｍＭ）のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。図６Ｂにおいて、ＳＥＣの前に同じ溶液を、同じカラム上で、還元されたシステインを維持するために５ｍＭ  ＴＣＥＰを補充した同じバッファー中、βメルカプトエタノールで処理した。これらの条件下で、ペプチドは（＞１００ｋＤａのタンパク質として）ボイド（空隙）に溶出する。図６Ｃは、４℃および２００μＭ濃度で４日後の図６Ａにおける上部画分のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。図６Ｄは、約１ｍＭまで濃縮した、図６Ａのピーク中心の約１０．８ｍＬのＳＥＣ溶出プロフィールを示す。
【００４１】
図７Ａは、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約１．７ｍＭ）のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。ペプチドは、β構造を有する高分子量オリゴマー、およびコイル状構造を有する低分子量オリゴマーおよびモノマータンパク質として溶出する。図７Ｂは、β−構造のペプチドオリゴマーとしての２５０μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを示す。このスペクトルは、プロトフィブリル状態を含むβ構造を有する前記ペプチドの全ての調製品と実質的に同一である。
【００４２】
図８は、制約されたジスルフィド結合を有する、および有しない（１０ｍＭ  ＴＣＥＰ中）β−構造オリゴマーとしてのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのフィブリル化アッセイを示す。フィブリル化はＴＦＴ結合（１０μＭ）で測定し、アッセイは、ｐＨ７．２のリン酸バッファー中で振盪しながら３７℃で実施した。
【００４３】
図９は、高分子量のβ−構造のオリゴマーとしてのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの約１６８μＭ溶液のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。２本のピークの下の挿入物は、Ａ１１抗体結合能力についてアッセイした画分（ピークを通して均一に分布している）のドットブロットを示す。
【００４４】
図１０Ａは、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液（約８００μＭ）のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。プロフィールの下の挿入物は、Ａ１１抗体結合能力についてアッセイした画分（ピークを通して均一に分布している）のドットブロットを示す。図１０Ｂは、最も高いＡ１１親和性を有する図１０Ａにおける第一の画分のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。プロフィールの下の挿入物は、Ａ１１抗体結合能力についてアッセイした画分（ピークを通して均一に分布している）のドットブロットを示す。
【００４５】
図１１Ａは、高濃度（１．１ｍＭ）におけるコイル状タンパク質としてのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド、および２℃／分の温度勾配で、２０℃から８０℃、次いで２０℃に戻す熱変性後のβ−構造タンパク質への変換の遠紫外ＣＤスペクトルを示す。図１１Ｂは、２２０ｎｍで測定した、図１１Ａに記載する熱変性プロフィールを示す。この試料において、熱変性の前後のいずれにも、非晶質または線維状の凝集はなかった。
【００４６】
図１２Ａは、格子適用（ｇｒｉｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）時に約５００μＭである、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのコイル状オリゴマーのネガティブ染色された（酢酸ウラニル）溶液の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す。球体構造は直径１５〜３５ｎｍである。図１２Ｂは、格子適用前に６０℃で２０分間インキュベートした図１２Ａ中における同じ溶液のＴＥＭ像を示す。プロトフィブリル様構造は幅６〜７ｎｍであり、長さは平均３６ｎｍである。図１２Ｃは、β−構造の高分子量オリゴマーとしての約１５０μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃの同様にネガティブ染色した溶液のＴＥＭ像を示す。球体構造は、１５〜３５ｎｍの直径を有し、図１２Ａに示すものと類似している。これらの図中のスケールバーは２００ｎｍである。
【００４７】
図１３は、１１７μＭにおいて、ジスルフィド結合が形成され、および破壊された（１０ｍＭ  ＴＣＥＰにより）Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのフィブリル化アッセイを示す。フィブリル化はＴＦＴ結合（１０μＭ）により測定し、アッセイはｐＨ７．２においてリン酸バッファー中で振盪しながら３７℃でアッセイを実施した。
【００４８】
図１４は、ＳＥＣの前に６Ｍ  ＧｄｍＣｌ中で変性させたＡβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高濃度溶液のＳＥＣ溶出プロフィールを示す。クロマトグラムの下の挿入物は、Ａ１１抗体結合能力についてアッセイした画分のドットブロットを示す（膜に適用する試料の量を２８０ｎｍにおける吸光度により標準化した）。
【００４９】
図１５Ａは、２０μＭまで濃縮し、３７℃でインキュベートした、８０ｋＤａのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣのＳＥＣ画分の時間依存性アッセイを示す。時間のポイントをとり、Ａ１１エピトープの存在についてアッセイした。
【００５０】
図１５Ｂは、５０μＭまで濃縮し、３７℃でインキュベートした、１０ｋＤａのＡβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣのＳＥＣ画分の時間依存性アッセイを示す。時間のポイントをとり、Ａ１１エピトープの存在についてアッセイした。
【００５１】
本発明は、原線維形成に対する抵抗性を有するＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃジスルフィド置換を有する、共有結合で制約されたＡβペプチド、ならびにアルツハイマー病およびタンパク質の誤った折りたたみに関連する他の疾患に関与する有毒なオリゴマー種に対する治療薬のスクリーニングにおけるそれらの使用を提供する。本発明のペプチドは、Ａβペプチドの有毒な形態に対する免疫応答を上昇させる免疫原として直接用いることもできる。本発明は、新規な要求に適合するようにペプチドの特性を修飾するための合理的なペプチド工学の使用の例であり；ここにおける要求は、Ａβペプチドを分離し利用できるように、有毒なオリゴマー濃度におけるＡβペプチドの原線維形成を停止する要求である。下記に示す実施例は、本発明のペプチドが、野生型Ａβペプチドが非常にフィブリル化しやすいことを除き、野生型Ａβペプチドの多くの性質を共有していることを証明する。
【００５２】
本明細書において、オリゴマーなる用語は、複数のＡβ−ペプチドモノマーを含む可溶性凝集体についての総称として用いられる。これらのモノマーはＡＰＰに由来するペプチド断片であり（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｐ０５０６７）、通常、３９〜４３個のアミノ酸からなる。全長配列は、Ｋａｎｇ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７７３−７７６（１９８７）に開示されている。本発明は、最も頻繁に遭遇する誘導体、Ａβ（４０）およびＡβ（４２）を含むＡＰＰの３９〜４３残基長誘導体の全てに相当する安定なペプチドを提供し、それらの配列は以下の通りである：
ヒトＡβ（４０）：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：１）
ヒトＡβ（４２）：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号：２）
【００５３】
したがって、本発明の好ましい一態様は、以下の配列を含むペプチドを提供する。
ヒトＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＣＥＤＶＧＳＮＫＧＣＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号：３）
ヒトＡβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＣＥＤＶＧＳＮＫＧＣＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号：４）
【００５４】
アミノ酸を示すために、一文字記号および三文字記号は交換可能に用いられる。当業者に周知である、これらの記号は以下の意味を有する：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、  Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝ＧＩｕ＝グルタミン酸、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝ＧＩｙ＝グリシン、Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝ＧＩｎ＝グルタミン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、およびＹ＝Ｔｙｒ＝チロシン。
【００５５】
本発明のペプチドは、特に、ＡＰＰに由来するＡβペプチドのフィブリル化を防止するために設計された。本発明のペプチドの設計（図１Ａ）は、Ａβペプチド（Ｈｏｙｅｒ，Ｗ．，ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０５：５０９９−５１０４（２００８））の最近測定されたＮＭＲ構造（プロテインデータバンク受け入れ番号：２ＯＴＫ）に基づく。残基２１および３０と結合する、本発明のペプチド中に存在する、制約されたジスルフィド結合は、いったん形成されると、このβ−ヘアピン構造を安定化し、さらにアミロイドーシスを誘発する立体構造スイッチを阻害する（このようなメカニズムの１つの仮説を図１Ｂに示す）。その結果、本発明のＡβペプチドは、Ｃｙｓ２１とＣｙｓ３０との間の分子内共有結合が安定である生理的条件下で、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノールまたはＴＣＥＰを用いてジスルフィド結合を還元（破壊）してチオール（ＲＳＨ）を生成しない限りは、高濃度であっても原線維形成に対して非常に抵抗性がある。非生理的条件下、例えば、反応性酸素種（例えばＨ２Ｏ２）または類似の厳しい処理による、スルフェン酸（ＲＳＯＨ）、スルフィン酸（ＲＳＯ２Ｈ）およびスルホン酸（ＲＳＯ３Ｈ）へのスルフィドの更なる酸化は、このペプチドの原線維形成を誘発すると思われる。
【００５６】
Ａβペプチド（例えば、配列番号：２において定義されるような）の２１および３０位は、
前記β−ヘアピン構造を破壊せずにジスルフィド結合により共有結合となり得る、たったの２個の残基である。２つの幾何学的な基準、すなわち（ｉ）結合する位置の間のＣα−Ｃα距離が４．４〜６．８Åの範囲内であり、（ｉｉ）同じ２個の残基間のＣβ−Ｃβ距離が３．４５〜４．５０Åの範囲内であること（Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：４３２２−４３２９（１９９３））は、このような安定なジスルフィド結合の良好な取り込みを満足させなければならない。さらに、類似のペプチド工学は、一時的に占有するモノマー種として、または安定なオリゴマー種として、前記ヘアピン構造を形成し得る、全てのＡβペプチド誘導体に適用可能であると思われる。したがって、本発明は、野生型の配列を有する、３９〜４３残基長に相当するＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ  Ａβペプチドに限定されず、家族性ＡＤの発生の増加をもたらす天然のＡβ−ペプチドの変異体に相当するＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ  Ａβペプチドをも含む。これらの変異は、あらゆるＡＰＰの３９〜４３長ペプチドのＡβペプチド誘導体において見いだすことができる。本発明には、Ｅ２２Ｇアークティック変異（配列番号：５）、Ｅ２２Ｑダッチ変異（配列番号：６）、Ｄ２３Ｎ  Ｉｏｗａ変異（配列番号：７）およびイタリアンＥ２２Ｋ変異（配列番号：８）を有するＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ  Ａβペプチド、ならびに出現すると思われる他の家族性変異が含まれるが、これらに限定されない。さらに、３５位にメチオニンスルホキシドまたはスルホンを含む前記配列中のヘアピン構造は本発明により安定化することができる。このメチオニンは、多くにより毒性の本質的要素であると思われる（例えば、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋａｎｓｋｉ，Ｊ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３：１２９９−１３０９（２００２）参照）。
【００５７】
非標準的アミノ酸、ならびにシステイニル化、マレイミド化、アセチル化およびアミド化のような末端修飾を含む、前記配列の１個以上の保存的変異、もしくは他の保存的置換、変換、挿入または切断を含む他のＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ  Ａβペプチド（例えば、配列番号：９の９〜４２を切断した誘導体）も本発明の一部であり、フィブリル化に抵抗性がある。β−ヘアピン構造の外側のアミノ酸、すなわち配列番号：３の１〜１６および３７〜４０の残基、ならびに配列番号：４の１〜１６および３７〜４２の残基は、置換に対して、より回復力があり、その結果、これらの領域内の非保存的置換は、本発明の機能に著しく影響することなく許容される。本発明の一部である、他の修飾されたＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ  Ａβペプチドには、１−８個のＮ−末端が反転した誘導体（配列番号：１０）のような、Ａβ−ペプチド配列の１個以上の連続的な伸縮が反転しているペプチドが含まれるが、これに限定されない。本発明のＡβペプチドは、このペプチドの他のジスルフィド誘導体について既に開示されているように（Ｓｈｉｖａｐｒａｓａｄ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５３−１５３１７（２００４））、化学的合成し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により還元されたペプチド（チオール）から酸化されたペプチド（スルフィド）を分離することにより製造することができる。化学的合成は、Ａβペプチドを製造するための最も一般的な方法である。これらのＡβペプチドは、通常は凍結乾燥されるので、以前にも論じられたように（Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））、特徴づけの前に、最初に１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）でペプチドを予め処理し、既に存在する凝集物を除去する必要がある。
【００５８】
大腸菌内での本発明のＡβペプチドの異種発現は、化学的合成に対する代替え手段であるが、その溶解度（例えばＬｅｅ，Ｅ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４０：１８３−１８９（２００５）を参照されたい）を補助するための融合タンパク質として発現されるペプチドであることを必要とする。費用効率の高いＡβ（４０）およびＡβ（４２）の製造のための選択される方法は、大腸菌内で、これらのペプチドを、親和結合タンパク質（Ｇｒｏｎｗａｌｌ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２８：１６２−１８３（２００７））と共に発現することである。要約すると、ペプチドは結合タンパク質と同時に発現し、その結果、Ａβペプチドを凝集およびタンパク質分解から保護する可溶性複合体を生成する。結合タンパク質は、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いた複合体の精製に役立つヘキサヒスチジンタグを含む。いったん精製すると、複合体はＧｄｍＣｌを用いて破壊することができ、遊離したＡβペプチドは、変性条件下、ＩＭＡＣを用いて、再度、親和性結合タンパク質から分離することができる。次いで、ＧｄｍＣｌを透析し、ＳＥＣを用いて除去することができる。この共発現プロトコールは凍結乾燥を必要とせず、発現の際にペプチドの直接的選択を可能にする。大腸菌内における発現からの結果として、以下に示すデータ中で用いられる全てのペプチドは追加のＮ−末端メチオニンを含む。本明細書において、我々は、Ａβペプチド内のアミノ酸配列が元の番号付けを維持するように、この位置を−１と示す。追加のメチオニンはペプチドの性質を制限せず、または影響せず、野生型Ａβ、および以前に開示されたように合成および精製した場合のＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ  Ａβペプチド（Ｓｈｉｖａｐｒａｓａｄ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５３−１５３１７（２００４））と同様の結果が得られる。
【００５９】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃの凝集アッセイを、種々の濃度で、３７℃で振盪しながら生理的条件に近い条件（５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸バッファー、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で実施した。これらの実験は、このペプチドが原線維形成に対して非常に抵抗性があり、完全に減少した（５ｍＭ  ＴＣＥＰの存在下に）フィブリル化した種が、野生型ペプチドに匹敵するＴＦＴ結合特性を有することを証明する（実施例１）。高濃度のペプチドで同じ実験を実施する場合（実施例２）、２つの特徴：第一に、１００μＭを超え、次いで全ての試料において同じレベルにまで減少する濃度におけるＴＦＴ蛍光において急速な初期上昇があり；第二に、ペプチド濃度が上昇するにつれ、還元試料中のフィブリル化に先行するラグタイムも増大することが明らかである。これらの２つの観察は、このペプチドのオリゴマー傾向の特徴であり：蛍光の急速な上昇はプロトフィブリル様の種の初期生成の結果であり、その後、新規な平衡が確立されるにつれて解離し、ラグタイムの増大は、ジスルフィド結合が、多かれ少なかれ、高濃度で存在するコイル状オリゴマー中の接近不可能であることの結果であると思われる。
【００６０】
原線維形成に対する抵抗性は別として、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドは野生型ペプチドに類似している。ＳＥＣから得られた、低分子量画分（約８ｋＤａで溶出）のＣＤおよびＮＭＲスペクトルは、前記ペプチドが、野生型ペプチドに非常に類似するコイル状構造を形成することを証明する（実施例３）。高濃度において、複数のモノマーを含む、いくつかのオリゴマー種がＳＥＣの流れから溶出される。これらは、しばしば＞８〜＜４２ｋＤａの範囲内で溶出され（実施例４）、それらは全て、低分子量画分において得られるペプチドと同一のＣＤスペクトルを有するコイル状構造を有している。これらのコイル状オリゴマーは、低分子量オリゴマーとして示される。しかし、ペプチドは、β構造を有する、より大きなオリゴマーを生成することも可能である。これらの構造は、約７５〜８５ｋＤａおよび１７０ｋＤａのサイズのタンパク質としてＳＥＣカラムから溶出される（実施例５）。本明細書において、我々は、これらのβ構造のオリゴマーを高分子量オリゴマーとして示す。凝集アッセイにおいて、これらの高分子量オリゴマーは原線維形成に対して抵抗性がある。１０ｍＭのＴＣＥＰの存在でさえ、３０μＭのペプチド濃度でこれらのオリゴマーの重合の核となることはできない（実施例５）。これらの高分子量オリゴマーのいくつかは、Ａβペプチドオリゴマーに対して特異的に上昇するポリクローナル抗体であるＡ１１抗体とも結合し（実施例６）、これは、疾患関連オリゴマー種に対して一般的であることを示唆する（Ｋａｙｅｄ，Ｒ．ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：４８６−４８９（２００３））。
【００６１】
高濃度において、本発明のペプチドの低分子量オリゴマーは、加熱（６０℃）することにより、急速にプロトフィブリル様構造を形成し得る（実施例７）。この工程は最適化されておらず、他の高温（約＞２０℃）は同じ効果を有するであろうが、発生するペプチドの不可逆的な共有結合修飾（Ａｓｎ２７およびＧｌｎ１５の脱アミド化、ならびにＣｙｓ２１−Ｃｙｓ３０ジスルフィド結合およびＭｅｔ３５の酸化を含む）を未然に防ぐために８０℃未満の温度が好ましい。ＴＥＭによれば、これらのプロトフィブリルは、約６．７ｎｍ幅、約３６ｎｍのオーダーの長さ（しかし、長さは変化する）の平均寸法を有する（実施例８）。変換はβ構造の形成に伴って起こり、ＣＤスペクトルは上記高分子量オリゴマーから区別することができない。これらの構造はＴＦＴとも結合する。したがって、凝集アッセイにおいて、これらの構造変換は、急速な蛍光の初期増大をもたらし、新規な平衡が確立するにつれ、プロトフィブリルが解離すると徐々に減少する。この観察は、Ａβ−ペプチドプロトフィブリルがモノマー種と平衡状態にあるが、同時にフィブリル前駆体である（Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））という見解に一致する。
【００６２】
本発明の、より長いペプチド、すなわちＡβ（４２）誘導体（実施例９）はフィブリル化からも保護され、Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣのＳＥＣの間に得られるオリゴマーは、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃオリゴマーと同一のサイズ分布を有している（実施例１０）。Ａ１１エピトープは、ＳＥＣカラムから溶出するβ構造を有する、最も大きい高分子量オリゴマー中に存在する（実施例１０）。このＡ１１結合エピトープは、いったん形成されると非常に安定であり、３７℃で２ヶ月間インキュベートした時に１日あたり０．１％しか減少しない（実施例１１）。
【００６３】
本発明のペプチドは、共有結合した安定なオリゴマーの製造のために用いる場合、以前の方法を超える利点を提供し、原線維形成に対するペプチドの抵抗性が、生理的条件下でこのようなオリゴマーを製造することを可能にする。次いで、これらのオリゴマーは、以前の可能性よりも高濃度および／または長時間で試験することができ、薬物スクリーニングアッセイおよび免疫トライアルにかなり役立つ。本発明のＡβペプチドの高分子量オリゴマーを製造し（例えば、実施例５におけるように）、濃縮し、ＡＤの治療に潜在的に適した化合物の同定のための方法に用いることができる。このような化合物は、既に生成されている有毒なオリゴマーと結合し、それらを溶解し、および／またはそれらの生成を阻止する。前から存在するオリゴマーの破壊またはそれらの非存在を測定するために用いることのできるいくつかの生物物理学的技術があり、それらには、ＣＤ、ＮＭＲ、等温滴定熱量計、またはオリゴマーまたはモノマー構造に特異的な抗体または結合タンパク質を用いる酵素免疫測定法が含まれる。蛍光色素分子がオリゴマーの解離によって抑制されるので、両方の蛍光色素分子がオリゴマーに結合する場合、蛍光色素分子１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよびＴＦＴでさえこのようなアッセイに用いることができる。当業者は、いくつかの他の可能性があることを理解するであろう。本発明の他の実施態様においては、共有結合で安定化したモノマーまたはオリゴマーは、抗体または他のタンパク質バインダーの生成のための免疫原としての抗原製剤の製造のために用いることができる。本明細書において、ＡＤの潜在的に有毒なオリゴマー形態中に存在することが示されたヘアピン構造に対する能動免疫および受動免疫の両方が問題になり得る。
【００６４】
さらに他の態様においては、本発明は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするヌクレオチド配列を発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。好ましくは、ＡＰＰは、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含む、変異型ヒトＡＰＰであり、最も好ましくは、ＡＰＰは配列番号：１１のタンパク質である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含む、変異型ヒトＡＰＰ遺伝子である。非ヒトトランスジェニック動物は、好ましくは、脊椎動物（円口目、硬骨魚、鮫およびエイ、両生類、は虫類、哺乳動物および鳥類を含む）のような脊索動物門（半索動物門）から選択される。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモットのような哺乳動物である。最も好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物はマウスである。
【００６５】
本発明の他の実施態様においては、非ヒトトランスジェニック動物は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ置換を含む本発明のＡβペプチドのみを過剰発現させることにより、ＡＤの発症機序についてのモデル系として用いることができる。このようなモデル生物において、有毒なＡβペプチドを生成するのに、ＡＰＰのタンパク質分解過程は必要ないので、非ヒトトランスジェニック動物は脊索動物門（半索動物門）から選択されるかもしれないだけでなく、Ａβペプチドを含む内因性のＡＰＰを欠く無脊椎動物（例えば、環形動物門、節足動物門、刺胞動物門、棘皮動物門、軟体動物門、線形動物門、類線形動物門、扁形動物門および海綿動物門から選択される）をも含み得る。ＡＤの発症機序の無脊椎動物モデルは、短い寿命、低コスト、小さいサイズ、および非常に特徴づけられた遺伝学の利点を有する。このような無脊椎動物モデル系の例には、キイロショウジョウバエ（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら（２００５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３２：１２３−１３５）およびシノラブディエス・エレガンス（Ｌｉｎｋ，Ｃ．Ｄ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９３６８−９３７２）が含まれる。したがって、さらに他の態様においては、本発明は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ置換を含む本発明のＡβペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。好ましくは、このような無脊椎動物モデル系において異種発現するＡβペプチドは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および／または配列番号：１０に相当するペプチドである。
【００６６】
さらに他の態様においては、本発明は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むＡＰＰをコードするヌクレオチド配列を提供する。好ましくは、ＡＰＰは、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含む変異型ヒトＡＰＰであり、最も好ましくは、ＡＰＰは配列番号：１１のタンパク質である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含む、変異型ヒトＡＰＰ遺伝子である。
【００６７】
本発明の他の態様は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むＡＰＰをコードするヌクレオチド配列を含む発現系である。本発明のさらに他の態様は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むＡＰＰであるポリペプチド、好ましくはＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含む変異型ヒトＡＰＰ、最も好ましくは配列番号：１１のポリペプチドである。
【００６８】
ヒトＡβペプチドにおける２１位のアミノ酸は、ヒトＡＰＰにおける６９２位のアミノ酸に相当し、ヒトＡβペプチドにおける３０位のアミノ酸は、ヒトＡＰＰにおける７０１位のアミノ酸に相当する。ヒトＡＰＰの配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｐ０５０６７中に見いだすことができる（配列番号：１２）。結果として、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むＡＰＰは、ｉ）ヒトＡＰＰ（配列番号：１２）の配列により定義される、６９２位のアミノ酸、アラニン、または同種もしくは異種ＡＰＰにおける相当する位置がシステインで置換され、およびｉｉ）ヒトＡＰＰ（配列番号：１２）の配列により定義される、７０１位のアミノ酸、アラニン、または同種もしくは異種ＡＰＰにおける相当する位置がシステインで置換されているＡＰＰを意味する。
【００６９】
同種または異種ＡＰＰは、ヒトＡＰＰ（配列番号：１２）と比較し、少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する、脊椎動物のような動物に由来するＡＰＰ、ならびに合成、変異、および／または非天然のＡＰＰを意味する。２種のアミノ酸配列の同一性の割合は以下のようにして測定される。最初に、アミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含む、ＢＬＡＳＴＺの独立バージョンに由来する、ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂ１２ｓｅｑ）プログラムを用いて、例えば配列番号：１２と比較する。このＢＬＡＳＴＺの独立バージョンは、米国政府の国立生物工学情報センターのウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法を説明する説明書は、ＢＬＡＳＴＺに添付されるリードミー・ファイル中に見いだすことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用い、２種のアミノ酸配列間の比較を実施する。２種のアミノ酸配列を比較するため、Ｂｌ２ｓｅｑの選択肢は以下の通り設定される：−ｉは、比較すべき第１のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：￥ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較すべき第２のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：￥ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐはｂｌａｓｔｐに設定され；−ｏは所望のファイル名に設定され（例えば、Ｃ：￥ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；他の全ての選択肢は初期設定のままである。例えば、２種のアミノ酸配列の比較を含む出力ファイルを生成するために、以下のコマンド、すなわちＣ：￥Ｂｌ２ｓｅｑ−ｉ  ｃ：￥ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊ  ｃ：￥ｓｅｑ２．ｔｘｔ−ｐ  ｂｌａｓｔｐ−ｏ  ｃ；￥ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔを用いることができる。２種の比較した配列が相同性を有する場合、指定された出力ファイルは一列に並んだ配列として相同性の領域を示すであろう。２種の比較した配列が相同性を有しない場合、指定された出力ファイルは一列に並んだ配列を示さないであろう。いったん配列されると、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する、位置の数を数えることにより、一致の数が決定される。同一性の割合は、一致の数を、特定された配列内に示される配列の長さで割り、得られた値に１００をかけることによって決定される。例えば、配列を、配列番号：１２（配列番号：１２内に示される配列の長さは７７０である）に示される配列と比較し、一致の数が６９３である場合、配列は、配列番号：１２内に示される配列に対し、９０の同一性割合を有する（すなわち、６９３÷７７０×１００＝９０）。
【００７０】
トランスジェニック動物の作成
本発明のトランスジェニック動物の作成方法は当業者に周知である（一般的に、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（２０００）を参照されたい）。一実施態様においては、トランスジェニックマウスの作成は、マウスのＡＰＰ遺伝子の破壊、および変異型ヒトＡＰＰをコードする遺伝子の１個以上のコピーのマウスゲノム、好ましくは内因性マウスＡＰＰ遺伝子と同じ位置への導入を含む。
【００７１】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、好ましくは動物の生殖系列へのトランス遺伝子の導入により作成される。トランス遺伝子を導入するために、種々の発生段階における胚標的細胞を用いることができる。胚標的細胞の発生段階に依存し、種々の方法が用いられる。本発明を実施するために用いられるあらゆる動物の特定のラインは、良好な全体的な健康、良好な胚の収率、胚における良好な前核の可視性、および良好な適合再現性について選択される。トランスジェニックマウスを作成する場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２Ｆ１、またはＦＶＢ系のような株がしばしば用いられる（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥまたはＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓ．から市販されている）。
【００７２】
トランス遺伝子の胚への導入は、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションのような、当該技術分野で公知の任意の方法により実施することができる。例えば、哺乳動物の受精卵の前核への構築物のマイクロインジェクションによって哺乳動物にトランス遺伝子を導入し、成長する哺乳動物の細胞内に維持される構築物の１以上のコピーをもたらすことができる。受精卵へのトランス遺伝子構築物の導入に続き、卵をインビトロで種々の時間インキュベートし、もしくは代理宿主に再移植し、または両者を実施する。１つの通常の方法は、種に依存し、インビトロで胚を約１〜７日間インキュベートし、次いでそれを代理宿主に再移植することである。再移植は、標準的方法を用いて実施される。通常、代理宿主を麻酔し、胚を卵管に挿入する。特定の宿主に移植される胚の数は種により変わるが、通常、開始時期に種が自然に生成する数と同じである。
【００７３】
トランス遺伝子を非ヒト動物に導入するために、レトロウイルス感染を用いることもできる。成長した非ヒトの胚をインビトロで胞胚期まで培養する。この間、分割球は、レトロウイルス感染の標的となり得る（Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｒ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：１２６０−１２６４）。分割球の効率的な感染は、透明帯を除去するための酵素処理により得られる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｈｏｇａｎ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８６）。トランス遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は、通常、トランス遺伝子を含む複製欠損レトロウイルス（Ｊａｈｎｅｒ  ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６９２７−６９３１；Ｖａｎ  ｄｅｒ
Ｐｕｔｔｅｎ  ら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２）である。トランスフェクションは、ウイルス産生細胞の単層上で分割球を培養することにより容易にかつ効率的に得られる（上述したＶａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ；Ｓｔｅｗａｒｔ  ら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３８３−３８８）。また、感染は後の段階で実施することができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を分割腔に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ  ら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２３−６２８）。非ヒトトランスジェニック動物を作成する細胞のサブセット内においてのみ組み込みが起こるので、ほとんどの創始細胞はトランス遺伝子についてモザイクであろう。さらに、創始細胞は、ゲノムの種々の位置で、結果において一般的に分離されるであろうトランス遺伝子の種々のレトロウイルス挿入を含むかもしれない。さらに、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖細胞系にトランス遺伝子を導入することも可能である（上述のＪａｈｎｅｒ  ら（１９８２））。
【００７４】
トランス遺伝子導入のための標的細胞の第３のタイプは胚幹（ＥＳ）細胞である。ＤＮＡトランスフェクション、またはレトロウイルスが媒介する形質導入により、トランス遺伝子を効率的にＥＳ細胞に導入することができる。その後、このように形質導入されたＥＳ細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞と一緒にすることができる。その後、ＥＳ細胞を胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に提供する。
【００７５】
本発明の一実施態様においては、異種ＡＰＰ遺伝子が内因性ＡＰＰ遺伝子を実質的に置換し、好ましくは内因性ＡＰＰ遺伝子のコード配列を完全に置換するように、非ヒト宿主内の内因性ＡＰＰ遺伝子が、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含む異種ＡＰＰ遺伝子の同種融合により機能的に破壊される。好ましくは、同種融合の結果として、異種遺伝子が、内因性ＡＰＰ遺伝子座からの調節要素の転写調節下で発現するように、異種ＡＰＰ遺伝子は、内因性ＡＰＰ遺伝子の調節配列（例えば、エンハンサー／プロモーター）に、それぞれ結合する。このような置換対立遺伝子について同型である非ヒト宿主は、本明細書に開示される方法にしたがって製造することができる。このような同型非ヒト宿主は、一般的に異種ＡＰＰを発現するが、内因性ＡＰＰタンパク質を発現しないであろう。通常、異種ヒト化ＡＰＰ遺伝子の発現パターンは、天然の（非トランスジェニック）非ヒト宿主における、内因性ＡＰＰ遺伝子の発現パターンを実質的に模倣するであろう。
【００７６】
例えば、内因性のマウスＡＰＰ遺伝子配列に代え、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むＡＰＰ遺伝子配列を有し、内因性のマウス調節配列により転写調節されるトランスジェニックマウスを作成することができる。Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むＡＰＰ遺伝子配列は、一般的に天然の非トランスジェニックマウスにおいてマウスＡＰＰと同様に発現されるであろう。
【００７７】
一般的に、同種遺伝子置換のために、置換型の標的構築物が使用される。標的構築物の内因性ＡＰＰ遺伝子配列間のダブルクロスオーバー同種組換えは、異種ＡＰＰ遺伝子断片の標的融合をもたらす。通常、同種組換えが、内因性ＡＰＰの同時欠失、および異種ＡＰＰ遺伝子断片の同種融合をもたらすように、トランス遺伝子の相同標的領域は、内因性ＡＰＰ遺伝子断片をフランキングする配列を含む。実質的に、完全な内因性ＡＰＰ遺伝子は、単一の標的事象により、または複数の標的事象（例えば、個々のエクソンの逐次的置換）により異種ＡＰＰにより置換され得る。通常、ポジティブまたはネガティブな選択発現カセットの形態の１個以上の選択マーカーが、標的構築物中に位置し得る。通常、選択可能なマーカーは異種置換領域のイントロン領域に位置することが好ましい。
【００７８】
Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ変異を含むトランス遺伝子ＡＰＰ遺伝子配列を含むトランスジェニック動物は、複数のトランス遺伝子を含むトランスジェニック動物を作成する他のトランスジェニック動物と交配し得る。製造方法は、それぞれが所望のノックアウト構築物またはトランス遺伝子の１種を含む一連の哺乳動物を作成することである。このような哺乳動物を、連続して交配、戻し交配および選択を通して一緒に交配させ、最終的に全ての所望のノックアウト構築物および／またはトランス遺伝子を含む単一の哺乳動物（哺乳動物は、ノックアウト構築物および／またはトランス遺伝子の存在を除き野生型と共通遺伝子（遺伝的に同一）である）を作成する。通常、交配および戻し交配は、交配の経過におけるそれぞれの特定の工程の目標により、子孫を有する兄弟姉妹または親の株と交配させることにより実施される。特定のケースにおいては、適切な染色体位置にノックアウト構築物および／またはトランス遺伝子のそれぞれを含む単一の子孫を作成するために、多くの子孫を作成する必要がある。さらに、最終的に所望の遺伝子型を得るために、数世代に渡って交配または戻し交配をする必要がある。
【００７９】
実施例
【実施例１】
【００８０】
野生型Ａβ（４０）およびＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃのフィブリル化アッセイ
【００８１】
全ての濃度測定は、２８０ｎｍおよび３００ｎｍにおける吸光度の相違について、１４２４ｃｍ−１Ｍ−１の吸光係数を用いて分光光度法で実施した。全ての実施例において用いられる緩衝液は、特に示さない限り、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２であった。この緩衝液は、Ａβペプチドのための貯蔵緩衝液でもあった。全てのペプチド試料は新たに調製し、４℃に維持し、３〜４日以内に用いた。
【００８２】
フィブリル化アッセイは、フィブリルの結合により上昇する、色素ＴＦＴの蛍光を測定することにより実施した（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０９：２７４−２８４（１９９９））。蛍光は、４４０ｎｍの励起および４８０ｎｍの発光フィルターを備えたＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ）を用いて、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内で記録した。ペプチド試料を３０μＭに維持し、１０μＭ  ＴＦＴを追加した。さらに、５ｍＭ  ＴＣＥＰを本発明の１つの参考試料に加え、形成されたジスルフィド結合の影響をアッセイした。ＴＣＥＰは、塩基性のｐＨで通常に用いられるＤＴＴよりも安定な還元剤である。それは、ジスルフィド結合をチオールにまで還元し、その結果、本発明の制約された共有結合を破壊する。測定の前に、プレートをポリオレフィンテープ（Ｎｕｎｃ）で密封し、蒸発を防ぐ。アッセイを３７℃で実施し、データポイントを各測定に先立ち、オービタルシェーカーで２分間振盪し（幅５ｍｍ）、６分毎にデータポイントを記録した。
【００８３】
この凝集アッセイの結果を図２に示す。野生型の試料においては、核形成およびフィブリル化が急速に起こる。ＴＣＥＰを用いて還元したＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドについては、ラグタイムは約５時間長いが、完全にフィブリル化した最終状態のＴＦＴ蛍光は野生型のフィブリルと同じである。一方、酸化型Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドについては、フィブリル化は起こらない。
【実施例２】
【００８４】
高濃度における、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃのフィブリル化アッセイ
このフィブリル化アッセイは、５０、１５０および２５０μＭの濃度のペプチドをもアッセイし、参考試料中のＴＣＥＰ濃度を１０ｍＭ  ＴＣＥＰに上昇させたことを除き、実施例１のように実施した。また、各測定に先立ち、オービタルシェーカーで５分間振盪し（幅５ｍｍ）、１５分毎にデータポイントを記録した。二重の試料を各濃度において分析し、結果を図３に示す。
【００８５】
結果は、実施例１で得られた結果と同様である。しかし、１５０および２５０μＭ濃度における無傷のジスルフィド結合を有する試料についての蛍光において急速な上昇があり、次いで、ずっとゆっくりとした速度で同様のレベルまで減少した。以下の実施例７および８において証明されるように、高温に供した時にコイル状オリゴマーはプロトフィブリル様構造を形成することができ、ＴＦＴと弱く結合し、その結果、蛍光を増強させる。時間が進行するにつれ、これらの試料中で新たな平衡に達する。野生型のＡβペプチドについてＷａｌｓｈら（Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））によりなされた観察は、図３のデータに適用できる。彼らは、プロトフィブリルが原線維の前駆体であり、プロトフィブリルの解離および原線維の形成についての競合速度定数は同様の大きさであることを示唆するデータを示す。しかし、野生型のＡβペプチドにおいてフィブリル化を誘発する立体構造スイッチは、ＡβＡ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド中で阻害され、そのため、ジスルフィド結合を切断しない限りは非常に高濃度の試料において原線維を検出することはできない。５０μＭ試料における蛍光のゆっくりとした上昇は、この低濃度ではプロトフィブリルは核形成しないが、それにもかかわらずコイルからβ構造への構造変換は高温および／または試料の撹拌の結果として起こるという事実によると思われる。実際、ＴＦＴの結合がβ−シート構造の存在に依存することは既に示されている（ＤｅＬｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１６：６６３−６６５（１９６８））。
【００８６】
高濃度のペプチドの他の特徴は、破壊されたジスルフィド結合を有するＡβ  Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの核形成に先行するラグタイムの増大である。これが、（ｉ）これらの試料中に存在するコイル状オリゴマー（実施例４参照）が、多かれ少なかれ保護されたジスルフィド結合を有すること、および（ｉｉ）多くのペプチドがＴＣＥＰにより還元されるのに多くの時間を必要とすることの組み合わせた結果であると思われる。
【実施例３】
【００８７】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃの野生型様構造
５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＳＥＣを実施した。流速は０．８ｍＬ／分であり、カラムはＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒユニット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により操作した。全てのカラムの溶出は室温（２１℃）で実施した。同様の条件下、低分子量ゲルろ過検定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてカラムを検定した。通常、各溶出の際にペプチド５００μＬをこのカラムに注入した。
【００８８】
低濃度、例えば２５μＭのペプチドにおいては、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドは、通常は約８〜１０ｋＤａのタンパク質として溶出する。Ａβペプチドは約４．５ｋＤａのタンパク質であるが、我々は、これを、検定キットにおいて用いられた、十分に折りたたまれたタンパク質（リボヌクレアーゼＡ、キモトリプシノーゲンＡ、オボアルブミンおよびアルブミン）と比較し、折りたたまれていないコイル状タンパク質の潜在的に伸長した構造のため、このペプチドが二量体として溶出されると説明しない。図４Ａに示す実験において、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド２５μＭをカラムに注入し、約８ｋＤａのタンパク質に相当する単一の対称のピークが得られた。Ａβ（４０）野生型ペプチドのＳＥＣは、このカラムにおいて同一の結果を与え（図示せず）、８〜１０ｋＤａの見かけの大きさは、既に証明されているもの（例えば、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２３６４−２２３７２（１９９７））のオーダーである。
【００８９】
５０ｎｍ／分の走査速度を用い、２０℃で、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により遠紫外ＣＤスペクトルを収集した。図４Ｂに示す実験において、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド２０μＭを、１．０ｍｍのキュベット中、１９０〜２６０ｎｍで走査した。スペクトルは、コイル状構造の典型である、約２００ｎｍの最小を示し、凝集していないＡβ（４０）およびＡβ（４２）野生型ペプチドのＣＤスペクトルと非常に類似していた（図示せず、例えば、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９）を参照されたい）。
【００９０】
Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および予め成型された１６．５％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、１２０Ｖの定電圧でＳＤＳ  ＰＡＧＥを実施した。泳動媒体は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ，および０．１％  ＳＤＳ（ｐＨ８．３）であった。図４Ｃにおいては、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの３００μＭの試料をローディングバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１％  ＳＤＳ，２０％グリセロール、および０．２３％ブロモフェノールブルー）と１：１の比で混合し、１個の試料を２．５ｍＭ  ＴＣＥＰとした。ＴＣＥＰを含む試料を９５℃で５分間インキュベートしたのに対し、ＴＣＥＰを含まない試料は室温（２１℃）で約２０分間インキュベートした。次いで、６μＬの容量をペプチドマーカーと共にゲルに装填した。ゲルを泳動し、５０％メタノールおよび１０％酢酸で固定し（約１時間）、クマシーブリリアントブルー（０．１％クマシー、２．５％  ２−プロパノール、１０％酢酸）で１６時間染色した。脱色（５％メタノール、７％酢酸）した後、ゲルを分析した。図４Ｃに示すように、両方の試料は６．２ｋＤａのペプチドマーカーバンドの近くに移動し、したがって、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃ
ペプチド内に分子内ジスルフィド結合のみが形成されたことが示された。
【００９１】
５０μＭおよび１．９ｍＭ濃度の低分子量オリゴマー（コイル状構造を有する）、および５０μＭおよび４５０μＭの高分子量オリゴマー試料（β−構造を有する）について、１５Ｎ−標識したＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドについて、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ８００ＭＨｚ分光計により１５Ｎ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲ分光法を測定した。５０μＭペプチドについて、図４Ｄにおけるスペクトルは、構造化されていないコイル状ペプチドを示し、これは、野生型Ａβペプチドの公開されたスペクトル（Ｈｏｕ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１９９２−２００５（２００３））と類似している。５０μＭのスペクトルはいずれもほとんど同一であった（図示せず）。１．９ｍＭの低分子量オリゴマーのスペクトル、および４５０μＭの高分子量オリゴマーのスペクトルは、わずかに見えるピークのみ同一でもあり（図示せず）、これは、これらの構造が溶液ＮＭＲのためには大きすぎることを示す。後者の２個のスペクトルにおける目にみえるピークは、おそらく、これらのオリゴマーの移動可能な部分に由来する。
【００９２】
したがって、総合すれば、この実施例は、本発明のペプチドが、分子内ジスルフィド結合の存在にもかかわらず、野生型Ａβペプチドと非常に類似した構造的特性を有することを示す。ジスルフィド結合が形成されることは実施例１および２において証明される。
【実施例４】
【００９３】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃのオリゴマー傾向のＳＥＣ分析
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラムによるＳＥＣを実施例３のように実施した。１．０ｍＬ／分で溶出し、１ｍＬを装填したことを除き、大きいＳｕｐｅｒｄｅｘ
７５  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を小さい１０／３００カラムと同様に操作した。
【００９４】
図５は、図４Ａにおいて用いられるよりも高いペプチド濃度のオリゴマーの分布をアッセイするための１つの実験を示す。Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドを、予め存在するオリゴマーを破壊する、６Ｍ塩化グアニジン（ＧｄｍＣｌ）、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）中で変性させた。ＧｄｍＣｌは、タンパク質変性剤として通常に用いられる化合物である。約１．８ｍＭの変性ペプチドの溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラムに注入した。カラムにおいて、ペプチド分子はＧｄｍＣｌから分離され、オリゴマーから自由である。これらの条件下、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドは可溶性構造の分布として溶出する。タンパク質検定キット（実施例３と同じ）による位置に溶出する特徴的なピークは、約４２ｋＤａの球状タンパク質に相当する。また、我々は、ＳＥＣはＡβペプチドの大きさの正確な測定を与えず、これらの数は相対的な意味でのみ用いることができると信じている。ＣＤ分光法は、このピーク中のオリゴマーがコイル状構造を有することを示す（図示せず；遠紫外ＣＤスペクトルは図４Ｂと実質的に同一である）。これらのコイル状構造の分布は、約８ｋＤａのタンパク質として溶出する種にまで下がって範囲が及ぶ。８５ｋＤａの種として溶出する、大きなオリゴマー種は、β構造に一致する遠紫外ＣＤスペクトルを有する（図示せず、この画分の遠紫外ＣＤスペクトルは、図７Ｂと実質的に同一である）。
【００９５】
図６Ａに示す関連する実験において、同じ濃度の変性Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  １０／３００カラムに装填した。溶出プロフィールは、図５におけるものと同じ特徴を示すが、分解能は低い。対照として、最初に室温（２１℃）で１０分間、約３５ｍＭのβメルカプトエタノールと予め処理し、５ｍＭ  ＴＣＥＰを追加した同じバッファー中でゲルろ過した、同じ変性試料のＳＥＣは、空隙容量に溶出される、ほとんど排他的な高分子量オリゴマーまたはプロトフィブリル（＞１００ｋＤａ）をもたらす（図６Ｂ）。この画分のＣＤスペクトルはβ構造により特徴づけられる（図示せず；この画分の遠紫外ＣＤスペクトルは図７Ｂと実質的に同一である）。
【００９６】
２００μＭ濃度を有する、図６Ａにおける約１０．８ｍＬのオリゴマーのピークの上部画分を４℃で４日間インキュベートし、再度ゲルろ過した。図６Ｃにおけるこの試料の溶出プロフィールは、この間に新しい平衡が確立され、８ｋＤａのタンパク質として溶出される種が、今や優勢であることを示す。対照的に、４℃で４日後、この溶液を約１．０ｍＭまで濃縮し、同じカラムで再度分析した、図６Ａのオリゴマーピークの収集した全ての画分は、再度、大きなオリゴマー構造が優勢であるプロフィールを生じる。
【００９７】
総合すれば、ＳＥＣ実験は、フィブリル化工程を阻害することにより、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドが、種々の複数のモノマーを含む、いくつかのタイプのオリゴマーを容易に形成することを示す。＞８ｋＤａ〜＜４２ｋＤａのタンパク質として溶出する低分子量画分は、全て、類似のコイル状の遠紫外ＣＤスペクトルを有していた（このようなスペクトルの例を図４Ｂに示す）。高分子量画分は＞７５ｋＤａのタンパク質として溶出し、それらは、全て、β−構造と一致する類似の遠紫外ＣＤスペクトルを有していた（このようなスペクトルの例を図７Ｂに示す）。
【実施例５】
【００９８】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃの高分子量オリゴマーの調製および特徴づけ
１ｍＬをカラムに注入し、１．３ｍＬ／分で溶出し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、実施例３のようにＳＥＣを実施した。カラムは、実施例３のように、前もって検定した。６Ｍ  ＧｄｍＣｌ、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２中で変性させた、約１．７ｍＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド溶液を大きなカラムに注入し、溶出プロフィールを図７Ａに示す。これらの条件下、高分子量画分は、約１７０ｋＤａおよび８０ｋＤａにおいてβ−構造オリゴマーとして溶出するが、コイル状オリゴマーは小さいタンパク質として溶出する。
【００９９】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの遠紫外ＣＤスペクトルを実施例３のように収集した。図７Ｂに示す実験において、７５〜８５ｋＤａに相当する容量でＳＥＣから溶出する２５０μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドを、０．１ｍｍのキュベット中、１８５〜２６０ｎｍで走査した。スペクトルは、ペプチドがオリゴマー化および凝集するにつれ、Ａβ（４０）およびＡβ（４２）ペプチドのβ−構造の典型である、約２１０ｎｍの最小、および約１９０ｎｍの正の楕円率を示す（例えば、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））。図７Ａにおける１７０ｋＤａおよび８０ｋＤａ種は、いずれも、図７Ｂにおけるスペクトルとほとんど同一の遠紫外ＣＤスペクトルを示す。
【０１００】
３０μＭ（モノマーペプチド濃度）の、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの高分子量オリゴマーのフィブリル化アッセイを、１０ｍＭ  ＴＣＥＰを含むか、または含まない二重の試料を用いて実施例２のように実施した（図８）。実験の経過の間、いずれの試料においても原線維は出現しなかった。ベースラインは図３Ｅにおけるものと同じである。
【実施例６】
【０１０１】
Ａ１１ポリクローナル抗体と結合するＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃの高分子量オリゴマー
可溶性Ａβ−ペプチドオリゴマーの合成分子模倣物を認識する、精製したウサギ免疫グロブリン（Ａ１１ポリクローナル抗体）は、タンパク質の誤った折りたたみの疾患に関与する他のタンパク質内の類似のオリゴマーをも認識すると思われる（Ｋａｙｅｄ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：４８６−４８９（２００３））。これらの疾患において、オリゴマー構造は有毒種であると思われるので、これは発症の一般的なメカニズム、それ故、おそらく類似の有毒構造が関与することをも示唆する（Ｈａａｓｓ，Ｃ，ａｎｄ  Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：１０１−１１２（２００７）；Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２９：５４２−５４７（２００４））。
【０１０２】
図９は、図５において得られる、分離し、濃縮した（約１６８μＭまで）オリゴマーの、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド溶液  １ｍＬのＳＥＣの結果を示す。ＳＥＣは、１ｍＬ／分で溶出し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、実施例３のように実施した。これらの条件下、試料は、部分的に空隙容量（このカラムについて約４２ｍＬ、＞１００ｋＤａのタンパク質に相当）に、および高分子量オリゴマー（約８７ｋＤａのタンパク質）として溶出する。より小さい画分も、７〜８ｋＤａのタンパク質として溶出する。
【０１０３】
速いピークおよび遅いピークの全ての画分を、製造業者の説明書に従い、Ａ１１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）結合についてアッセイした。それぞれの画分３μＬをＩｍｍｕｎｏｂｉｌｉｏｎ−ＰＳＱポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）にドットブロットし、乾燥させた。次いで、膜を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ緩衝液）に溶解した１０％脱脂粉乳中、４℃で一晩（約１４時間）、ブロッキングした。次いで、膜をＴＢＳＴ緩衝液で５分間、３回洗浄し、ＴＢＳＴ緩衝液に溶解した５％脱脂粉乳中、０．５〜０．８μｇ／ｍＬのＡ１１一次抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を、室温（２１℃）で１時間、膜に適用した。結合していない抗体を、ＴＢＳＴ緩衝液で５分間、３回洗い流した後、ＴＢＳＴ緩衝液に溶解した５％脱脂粉乳中の０．１μｇ／ｍＬの二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから得られる、ロバＥＣＬ（登録商標）抗ウサギＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体）を、室温（２１℃）で４５〜６０分間、膜に加えた。上述のように、結合していない抗体を洗い流した後、製造業者の説明書に従い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、暗箱と連結したＣＣＤカメラ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ−１０００）によりセイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素活性を測定した。図９に示すように、測定値は、最も早く出現する画分、したがって最も大きい高分子量オリゴマー種において最も強いが、７〜８ｋＤａのピークはＡ１１抗体と反応しない。
【０１０４】
図１０Ａに示すのと類似の実験において、６Ｍ  ＧｄｍＣｌ、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中の８００μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に乗せ、上述のように画分をブロットした。また、Ａ１１抗体はβ構造を有する、より大きなオリゴマー種と反応する。しかし、それはコイル状オリゴマーを認識しない。最も高いＡ１１−結合能力を有する最初の画分は、約２０μＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドを含んでいた。この画分を４℃で１６時間インキュベートし、同じカラムで再度分析し、図１０Ｂに示す溶出プロフィールを得、これもＡ１１−結合能力についてアッセイした。上述のように、Ａ１１抗体は、より大きいオリゴマー種に対して高い反応性を有している。図１０Ｂは、β構造を有するオリゴマーの形成は少なくとも可逆的であり、いったん形成されるとそれらは（図８における凝集活性と同様に）相対的に安定であることをも示す。
【実施例７】
【０１０５】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃにおけるコイルからβへの変換
コイルからβ−構造への変換は、野生型Ａβペプチドのオリゴマー化およびフィブリル化、ならびにその毒性と密接に関連する。４℃での２０〜１００μＭのＡβペプチド溶液において、この変換は、Ａβ（４２）について２４時間以内、Ａβ（４０）について数日で自発的に起こる（Ｓｔｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１１６１２−１１６２２（２００３））。Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドについては、この構造変換は、原線維が形成することなく、熱により促進され得る。図１１Ａは、２０〜８０℃の２℃／分の温度上昇勾配、次いで再び戻すことによる変性の前（コイル状構造）および後（β構造）の、１．１ｍＭのＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの２つのＣＤスペクトルを示す。変換は、２２０ｎｍで観察するように、図１１Ｂにおいて示される。以下の実施例８において、このように形成されたβ構造はプロトフィブリル様であることが示される。プロトフィブリルは、多くの人々によって、原線維の前駆体であると考えられる（例えば、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９））。この試料が、この厳しい処理およびこの濃度の後でさえ、非晶質の沈殿または原線維を示さないことに留意すべきである。原線維形成に対する、この弾性は、Ａβペプチドの全ての誘導体について前例がない。
【実施例８】
【０１０６】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃのコイルおよびβ−構造オリゴマー、ならびにプロトフィブリル状の種のＴＥＭ分析
ＭｅｇａＶｉｅｗ  ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えたＬＥＯ  ９１２  ＡＢ  ＯＭＥＧＡ電子顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＳＭＴ  ＡＧ）によりＴＥＭ画像を得た。酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色を全ての試料において用いた。Ｆｏｒｍｖａｒ／ｃａｒｂｏｎでコーティングしたニッケルグリッドを５分間のＵＶ光により活性化し、その後、５〜１０μＬのタンパク質試料を各グリッドに２分間乗せた。フィルター処理した脱イオンＨ２Ｏ  約１０μＬの２段階洗浄を染色に先行させた。フィルター処理した脱イオンＨ２Ｏ中の２％酢酸ウラニル溶液による２分間の処理でグリッドの調製を完了し、貯蔵または即時の分析前に数分間空気乾燥した。
【０１０７】
図１２Ａにおいて、コイル構造におけるＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃを含む５００μＭの溶液をグリッドに乗せた。図１２Ｂにおいて、図１２Ａにおいて試料を調製するのに用いたのと同じ溶液を、グリッドに乗せる前に、６０℃で２０分間変性させた。図１２Ｃにおいて、β構造を有するＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃオリゴマー（実施例５において得た）の約１５０μＭ溶液を分析した。
【０１０８】
図１２におけるスケールバーは２００ｎｍである。図１２Ａおよび図１２Ｃにおいて観察される球形構造は、お互いに形態および寸法において同一であり、１５Ｎｍ〜３５ｎｍの直径を有する。それらは、同じ染色技術を用いた、既に公開されているＴＥＭ画像とも同じである。野生型Ａβ（４０）ペプチドの球形構造は、β構造を有するＡβ（４０）のオリゴマーについて最近観察された（Ｃｈｉｍｏｎ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１１５７−１１６４（２００７））。この文献においては、Ｃｈｉｍｏｎらは、これらの構造が有毒種であることを主張している。
【０１０９】
図１２Ｂにおいて観察される構造は、６〜７ｎｍの幅および約３６ｎｍの長さ（しかし、長さは変化する）の平均寸法を有する、プロトフィブリル様である。それらは、平均６〜１０ｎｍおよび５〜１６０ｎｍの長さを有する野性型Ａβ（４０）プロトフィブリルの形態および寸法に非常に類似している（Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２３６４−２２３７２（１９９７））。
【実施例９】
【０１１０】
Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃのフィブリル化アッセイ
データポイントを１０分毎に記録した以外は、実施例２のようにフィブリル化アッセイを実施した。Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃの濃度は約１１７μＭであった。結果を図１３に示す。
【０１１１】
還元した試料のフィブリル化を即時に開始するが、この２つの酸化した試料は４２時間のアッセイの間、フィブリル化しないままである。この実験は、Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃジスルフィド結合が、Ａβ（４０）ペプチドに比べ、フィブリル化する特有の傾向が非常に高いＡβ（４２）誘導体においてもフィブリル化を阻止するのに効果的であることを示す。
【実施例１０】
【０１１２】
Ａ１１ポリクローナル抗体に対する、種々の画分のドットブロットを含む、Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣのＳＥＣ分析
実施例５のように、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００  １６／６０カラム上でＳＥＣを実施し、実施例６のようにドットブロットを実施した。結果を図１４に示す。
【０１１３】
Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドについての図７Ａのクロマトグラムと、図１４のクロマトグラムとの比較は、Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドが、高分子量オリゴマー中で非常にオリゴマー化されやすい傾向を有することを示す。しかし、Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０ＣおよびＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの両方の形態は、いずれも同じ大きさを有する。Ａ−１１結合種は、このカラムにおいて、≧約１５００ｋＤａのカットオフを有している空隙に溶出する。
【実施例１１】
【０１１４】
Ａ１１結合エピトープの安定性
実施例５のようにして得られた、Ａβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの８０ｋＤａの画分を２０μＭまで濃縮し、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸緩衝液、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジド中、３７℃でインキュベートした。試料を、２ヶ月間、定期的な間隔で除去し、分析まで−２４℃に貯蔵した。実施例６のようにドットブロットを実施し、結果を図１５Ａに示す。Ａ１１エピトープは、濃縮工程の間に既に急速に生成し、全ての実験の間（約６０日間）、安定なままであった。蛍光強度は１日あたり、０．１％だけ減少した。
【０１１５】
上述したのと同じＳＥＣから得られたＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドのモノマー画分についての関連実験では、９０μＭまで濃縮し、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸緩衝液、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジド中３７℃でインキュベートした。２ヶ月の間、上述したのと同じ間隔除去した試料は、あらゆるＡ１１結合を示さなかった（図示せず）。
【０１１６】
実施例５のようにして得、５０μＭまで濃縮した、モノマー性Ａβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドの類似の試料を、５０ｍＭ  Ｋ＋リン酸緩衝液、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジド中、３７℃でインキュベートし、Ａ１１の結合について調べた。この試料は、数日後に、既にＡ１１エピトープを示す（図１５Ｂ）。いったん核形成すると、この実験において２．２日のｔ１／２を有する高分子量オリゴマーへのオリゴマー化が起こる。
【０１１７】
総合すれば、これらの実験は、高分子量オリゴマーがＡβ（４２）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチド中で自発的に形成されるが、短いＡβ（４０）Ａ２１Ｃ／Ａ３０Ｃペプチドは、高分子量オリゴマーへのオリゴマー化と密接に関連するβ構造への立体構造変化に対して、より弾力的であることを示す。いったん形成されると、Ａ１１結合オリゴマーは非常に安定であり、また、フィブリル化工程を完全に停止する、本発明の能力を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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