(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩｇＧ型抗体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能なペプチドの提供。【解決手段】ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するある特定のアミノ酸配列のペプチド、そのペプチドをＩｇＧ型抗体を結合させるためのリガンドとし水不溶性担体に固定化したＩｇＧ型抗体吸着材、その吸着材を充填したＩｇＧ型抗体吸着器、及びその吸着器を備える体液浄化デバイス。【選択図】図１
2015074626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列における７番目のシステイン残基と４５番目のシステイン残基とが、互いにジスルフィド結合を形成している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
水不溶性担体と、
前記水不溶性担体に固定されたペプチドと、を含み、
前記ペプチドが請求項１又は２に記載のペプチドである、ＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項４】
前記ペプチドが、前記ペプチドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、前記水不溶性担体に固定化されている、請求項３に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項５】
前記ペプチドが、前記ペプチドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、前記水不溶性担体に固定化されている、請求項３に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項６】
前記ペプチドが、前記ペプチドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、前記水不溶性担体に固定化されている、請求項３に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項７】
前記ペプチドが、前記ペプチドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、前記水不溶性担体に固定化されている、請求項３に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項８】
前記ペプチドが、前記ペプチドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、前記水不溶性担体に固定化されている、請求項３に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項９】
前記リンカーがオリゴエチレングリコール又はポリエチレングリコールである、請求項４〜８のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１０】
前記ペプチドが、前記水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌ固定化されている、請求項３〜９のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１１】
前記水不溶性担体が粒子上の多孔質体であって、前記水不溶性担体の排除限界分子量が１５万〜１０００万である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
【請求項１２】
液体を流入させる入口ポートと、前記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
前記容器に充填された請求項３〜１１のいずれか一項に記載のＩｇＧ型抗体吸着材と、を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
前記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿、及び血清からなる群から選ばれる体液である、体液浄化デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫グロブリンＧに対する親和性を有するペプチド及びそれを用いたＩｇＧ型抗体吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、特に内科学、血液学、免疫学、及び臨床検査学の飛躍的な進歩によって、疾患の原因又は疾患の進行と密接な関係を持っていると考えられる血液中の悪性物質が明らかになりつつある。例えば、血液中に存在する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を本体とする自己抗体及び免疫複合体は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等、生体免疫機能に関係した自己免疫疾患の原因及び病態の進行と密接な関係を持っていると考えられている。
【０００３】
そこで、血液及び血漿等の体液成分から、上記自己抗体及び免疫複合体を特異的に吸着除去することで、上述の疾患の進行を防止し、疾患の症状を軽減せしめ、更には疾患の治癒を早めることが期待されている。体液中の自己抗体及び免疫複合体を除去する技術としては、全血を血球成分と血漿成分とに分離し、血漿中に含まれる上記自己抗体及び免疫複合体を吸着材によって吸着し、除去する方法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公昭６３−０５３９７１号公報
【特許文献２】特公平３−０６５１９０号公報
【特許文献３】特許第４３９４９３２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】未来材料、第８巻、１１号（２００８）、ｐｐ２８−３４
【非特許文献２】米国科学アカデミー紀要、第９３巻（１９９６）、ｐｐ５６８８−５６９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、このような目的に使用する吸着材としては、水不溶性担体にリガンドとして疎水性アミノ酸であるトリプトファンを固定化した吸着材が知られている（特許文献１）。さらにＩｇＧ型抗体と特異的に相互作用することが知られているプロテインＡ及び抗ヒト免疫グロブリン抗体等の生物由来のＩｇＧ型抗体結合性物質、所謂、生物学的リガンドを、水不溶性担体に固定化した吸着材が知られている（非特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、トリプトファンをリガンドとして水不溶性担体に固定化させた吸着材は、治療効果が認められる一方で、ＩｇＧ型抗体を吸着する容量が十分に大きいとは言えない。さらに、上記吸着材は病因物質ではないフィブリノーゲン（Ｆｂｇ）も吸着除去し、選択吸着性が悪いという欠点がある。
【０００８】
一方で、生物学的リガンドの一例であるプロテインＡを水不溶性担体に固定化させた吸着材は、ＩｇＧ型抗体に対して特異的吸着性能を有している（特許文献２）。そのため上記吸着材は、トリプトファンをリガンドとした吸着材が有する上述のような問題を解決可能であると考えられる。しかしながら、これらの生物学的リガンドは一般的に原料の確保が困難で製品コストがかかるという不利な点がある。さらに、上記吸着材を体液に接触させて使用する際、上記生物学的リガンドが体液中に溶出して重大な副作用を生じる危険がある。加えて、上記生物学的リガンドの製造工程で混入する可能性がある未知のウィルス又は病原菌に由来する感染のリスクがあるといった難点も含んでいる。
【０００９】
近年の分子生物学及び機器分析技術の発展に伴い、タンパク質の詳細な構造情報とその機能解明が飛躍的に進み、巨大なタンパク質の機能を小さなペプチドで達成することが可能となってきている。例えば、ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有し、抗体並みの特異的結合機能を有するペプチドが見出されている。このようなペプチドとして、特許文献３では、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体に結合する合成ペプチドが報告されている。しかしながら、ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を持つ合成ペプチドとＩｇＧ型抗体との結合は報告されていない。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＩｇＧ型抗体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能なペプチド、上記ペプチドを用いたＩｇＧ型抗体吸着材、その吸着材を充填したＩｇＧ型抗体吸着器、及びその吸着器を備える体液浄化デバイスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ヘリックス・ループ・ヘリックス構造を有するある特定のアミノ酸配列のペプチドがＩｇＧ型抗体と選択的に結合することを見出した。さらに、本発明者らは、上記ペプチドをＩｇＧ型抗体を結合させるためのリガンドとし、上記リガンドが水不溶性担体に固定化されている吸着材が、体液を浄化させるための治療器（体液浄化用治療器、体液浄化デバイス）として、血液、血漿及び血清等の体液中から、自己抗体及び免疫複合体を構成するＩｇＧ型抗体を驚くほど高い吸着容量且つ、高選択的に吸着することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
［２］
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列における７番目のシステイン残基と４５番目のシステイン残基とが、互いにジスルフィド結合を形成している、［１］に記載のペプチド。
［３］
水不溶性担体と、
上記水不溶性担体に固定されたペプチドと、を含み、
上記ペプチドが［１］又は［２］に記載のペプチドである、ＩｇＧ型抗体吸着材。
［４］
上記ペプチドが、上記ペプチドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［５］
上記ペプチドが、上記ペプチドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［６］
上記ペプチドが、上記ペプチドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［７］
上記ペプチドが、上記ペプチドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［８］
上記ペプチドが、上記ペプチドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、上記水不溶性担体に固定化されている、［３］に記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［９］
上記リンカーがオリゴエチレングリコール又はポリエチレングリコールである、［４］〜［８］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１０］
上記ペプチドが、上記水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌ固定化されている、［３］〜［９］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１１］
上記水不溶性担体が粒子上の多孔質体であって、上記水不溶性担体の排除限界分子量が１５万〜１０００万である、［３］〜［１０］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材。
［１２］
液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器と、
上記容器に充填された［３］〜［１１］のいずれかに記載のＩｇＧ型抗体吸着材と、を備えるＩｇＧ型抗体吸着器。
［１３］
［１２］に記載のＩｇＧ型抗体吸着器を備える体液浄化デバイスであって、
上記ＩｇＧ型抗体吸着器に流入する液体が血液、血漿、及び血清からなる群から選ばれる体液である、体液浄化デバイス。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のペプチドはＩｇＧ型抗体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能である。
【００１４】
さらに、上記ペプチドの立体構造がヘリックス・ループ・ヘリックス構造であることから、体液中でも安定である。そのため、上記ペプチドを水不溶性担体に固定化させた吸着材は、血漿及び血清等の体液から高い吸着容量でかつ、高い選択性でＩｇＧを吸着させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。
【図２】実施例において製造した各担体におけるタンパク質の吸着率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に述べる。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。
【００１７】
本実施形態における「ＩｇＧ型抗体」とは、ＩｇＧクラスと同様のＦｃ領域を有するタンパク質であれば、タンパク質分子内のＦｃ領域以外の領域が変性、及び／又は、欠損したタンパク質であってもよい。
【００１８】
本明細書においては、当該分野の常法に従って、各種アミノ酸残基を一文字表記で記載し、ペプチドのアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端方向へ左から右へ記載する。
【００１９】
本発明のペプチドは配列番号１（ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＥＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＣ）又は配列番号２（ＣＧＦＮＭＱＣＱＲＲＦＹＥＡＬＨＥＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＣ）に記載のアミノ酸配列を有する。上記ペプチドはリガンドとして使用しうる。
【００２０】
上記ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列を欠損無く連続して有していればどのようなペプチドであってもよいが、好ましくは配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。さらに、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、上記アミノ酸配列における７番目のシステイン残基と４５番目のシステイン残基とが、互いにジスルフィド結合を形成していることが好ましい。
【００２１】
上記ペプチドの全長は、アミノ酸残基で４３〜２００残基であることが好ましく、アミノ酸残基で４３〜１００残基であることがより好ましい。
【００２２】
上記ペプチドのうち非環状のペプチドは、当該技術において、それ自体公知のペプチド合成方法に従って合成することが出来る。例えばＦｍｏｃ固相合成法、フラグメント縮合法等の液相合成法が挙げられる。操作が簡便である点から、ペプチド合成方法は固相合成法であることが好ましい。また、本発明のペプチドのうち、環状になっているペプチドは、非環状ペプチドを得た後これを環化して得ることができる。
【００２３】
非環状ペプチドは、上述の固相合成法及び液相合成法等の化学合成法は勿論、遺伝子工学的手法を用いることでも製造可能である。例えば、上述のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターによって適切な宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌）を形質転換する。そして、上記宿主細胞をペプチドの発現に適する条件下で培養することによって、培養物からペプチドを得ることが出来る。
【００２４】
上記ペプチドは、水不溶性担体に固定することによって、ＩｇＧ型抗体吸着材として利用しうる。
【００２５】
水不溶性担体とは、水に溶けない担体を意味する。
【００２６】
リガンドを固定化する際に使用する担体としては、親水性の表面を有し、かつリガンドとの間で共有結合を形成させるために利用し得るアミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記の水不溶性担体は吸着に使用出来る有効表面積が広い多孔性であるもの（多孔質体）が好ましい。
【００２７】
上記水不溶性担体は、粒子状、繊維状、シート状、中空糸状等の任意の公知の形状を用いることが出来る。リガンドの保持量又は吸着材としての取扱い性を考慮すると、水不溶性担体は粒子状のものが好ましい。
【００２８】
球状担体又は、粒子状担体の平均粒径は、２５μｍ〜２５００μｍであることが好ましい。担体の比表面積と体液との流通性の面から、上記平均粒径は５０μｍ〜１５００μｍであることがより好ましい。
【００２９】
使用出来る担体としては、セルロース系ゲル、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、多孔質ガラス、ビニルポリマー等の有機または無機の多孔体が使用でき、通常のアフィニティクロマトグラフィーに用いられる担体用の材料は全て用いることが出来る。
【００３０】
これら担体を例示すると、旭化成マイクロキャリア（旭化成株式会社製）及びＣＭ−セルロファイン（登録商標）ＣＨ（排除限界タンパク質分子量：約３×１０６、生化学工業株式会社販売）等のセルロース系担体、特公平１−０４４７２５号公報に記載の全多孔質活性化ゲル、ＣＭ−トヨパール（登録商標）６５０Ｃ（排除限界タンパク質分子量：５×１０６、東ソー株式会社製）等のポリビニル系担体、ＣＭ−トリスアクリルＭ（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ）〔排除限界タンパク質分子量：１×１０７、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のポリアクリルアミド系担体、及び、セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ）〔排除限界タンパク質分子量：２×１０７、スウェーデン国ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のアガロース系担体等の有機質担体、並びに、ＣＰＧ−１０−１０００〔排除限界タンパク質分子量：１×１０８、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレクトローニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕等の多孔性ガラス等の無機質担体が挙げられる。
【００３１】
上記水不溶性担体は、体液浄化用水不溶性担体であることが好ましい。体液浄化用水不溶性担体とは、吸着材が血液等の体液に接触した場合、体液中に溶け出さない担体であって、タンパク質の非特異吸着が少ない、ブラジキニン産生能が低い、補体活性化能が低い等、血液適合性等の体液適合性が高い担体を意味する。上記体液浄化用水不溶性担体は、ポリビニルアルコールが架橋したもの（架橋化ＰＶＡ）であることが好ましい。
【００３２】
水不溶性担体としては、粒子状の多孔質体が好ましく、例えば、多孔性重合体粒子を用いることができる。粒子状の多孔質体は、リガンドを固定化できるものである。目的吸着物質であるＩｇＧ型抗体の分子量が約１５万であることから、粒子状の多孔質体の排除限界分子量（タンパク質）は、１５万〜１０００万であることが好ましい。最も好ましい排除限界分子量は１００万〜５００万である。
【００３３】
重合体の組成は、ポリアミド系重合体、ポリエステル系重合体、ポリウレタン系重合体及びビニル化合物の重合体等、多孔性構造をとり得る公知の重合体を用いることができる。特に親水性モノマーによって親水化したビニル化合物系多孔性重合体が好ましい結果を与える。
【００３４】
リガンドの水不溶性担体への担持方法としては、公知の担体活性化方法及び固定化法を用いることができる。例えば、担体がアミノ基又はカルボキシル基を有する場合には、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合試薬の存在下で、リガンドと縮合反応させる方法、及び、担体とリガンドとをグルタルアルデヒド等の２個以上の官能基を有する化合物を用いて結合させる方法が挙げられる。また、担体が水酸基を有する場合には、例えば、臭化シアン等のハロゲン化シアンを担体に作用させ、リガンドのアミノ基の部分で反応させる方法、及び、エピクロロヒドリン等のエポキシ基を有する化合物を担体に作用させ、リガンドのアミノ基やメルカプト基の部分で反応させる方法等が挙げられる。また、リガンドがシステインを有する場合には、マレイミド化した担体と反応させることで固定化することが可能である。
【００３５】
必要に応じて、水不溶性担体とリガンドとの間に任意の長さの分子（リンカー）を導入したものを吸着材として使用することもできる。リンカー分子としては、ポリメチレン鎖、オリゴエチレングリコール鎖、ポリエチレングリコール鎖、ポリアラニン鎖等が挙げられる。例えば、アガロースの水酸基とポリエチレングリコールジグリシジルエーテルの片側のグリシジル基を反応、結合させ、残ったグリシジル基とリガンドを反応、結合させることができる。
【００３６】
本実施形態では、ペプチドが、ペプチドが有する少なくとも１つのシステイン残基のメルカプト基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドが、ペプチドが有する少なくとも１つのリジン残基の側鎖のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドが、ペプチドが有する少なくとも１つのグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。また、ペプチドが、ペプチドのカルボキシ末端のカルボキシル基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよいし、ペプチドが、ペプチドのアミノ末端のアミノ基によって、直接又はリンカーを介して、水不溶性担体に固定化されていてもよい。
【００３７】
水不溶性担体に対するペプチドの固定化量は、少なすぎると吸着能力が低くなる傾向にあり、多すぎても吸着容量の増大は飽和する。よって、水不溶性担体１ｍＬあたり、０．１〜１００μｍｏｌの範囲が好ましく、より好ましくは１〜５０μｍｏｌの範囲である。なお、ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度を紫外可視分光光度計で測定し、反応前後の吸光度の差分に基づいて算出される。
【００３８】
ＩｇＧ型抗体吸着材は、液体を流入させる入口ポートと、上記液体を流出させる出口ポートを有する容器内に充填保持されることによって、ＩｇＧ型抗体吸着器として使用することができる。このようなＩｇＧ型抗体吸着器としては、例えば、ＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールが挙げられる。
【００３９】
図１はＩｇＧ型抗体吸着材を使用した体外循環モジュールの一実施形態を示す模式断面図である。図１に示す体外循環モジュール１は、円筒２の一端開口部に、内側にフィルター３を張ったパッキン４を介して体液を流入させる入口ポート５（導入口）を有するキャップ６をネジ嵌合し、円筒２の他端開口部に内側にフィルター３’を張ったパッキン４’を介して体液を流出させる出口ポート７（導出口）を有するキャップ８をネジ嵌合して容器を形成し、フィルター３及び３’の間隙にＩｇＧ型抗体吸着材を充填保持させて吸着材層９を形成してなるものである。体外循環モジュール１は、例えば、自己抗体及び免疫複合体を除去するための体液浄化デバイスとして使用することができる。
【００４０】
吸着材層９には、ＩｇＧ型抗体吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材と混合して充填してもよい。また、ＩｇＧ型抗体吸着材と他の吸着材とが積層するように充填してもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い吸着能を有する活性炭等を用いることができる。これによって吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外循環に用いる場合、５０ｍＬ〜７００ｍＬ程度が適当である。
【００４１】
体液浄化デバイスを体外循環で用いる場合には、大きく次の二通りの方法がある。一つの方法は、体内から取り出した血液を遠心分離機又は膜型血漿分離器を使用して、血漿成分と血球成分とに分離した後、血漿成分を上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化した後、血球成分とあわせて体内に戻す方法である。他の一つの方法は、体内から取り出した血液を直接、上記体液浄化デバイスに通過させ、浄化する方法である。
【００４２】
体液の通液方法としては、臨床上の必要に応じ、あるいは設備の設置状況に応じて、連続的に通液してもよいし、または断続的に通液使用してもよい。
【００４３】
このような本発明のＩｇＧ型抗体吸着材は、体液浄化デバイス用ＩｇＧ型抗体吸着剤としても把握し得る。なお、本発明のＩｇＧ型抗体吸着材及びＩｇＧ型抗体吸着器は、ＩｇＧ型自己抗体吸着材及びＩｇＧ型自己抗体吸着器として用いてもよい。本明細書において、「自己抗体」とは、自己の細胞又は組織（移植されたものも含む）に対して産生される抗体を意味する。
【００４４】
ＩｇＧ型抗体吸着材は、装置に充填して治療器として用いられるにとどまらず、免疫グロブリン、自己抗体、免疫グロブリン誘導体、免疫グロブリン複合体等の分離用吸着剤、精製用吸着材及び、これらの測定用基材としても極めて有効に利用できる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
（実施例１）
１．ペプチドの合成方法
Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（ライフテクノロジー社製、置換率０．１６ｍｏｌ／ｇ）３ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を加えて十分に膨潤させた。膨潤させた樹脂を含む懸濁液に３０％ピペリジン２０ｍＬを添加し１分間振とう後、再度、３０％ピペリジンを２０ｍＬ添加して１０分間振とうした。上記樹脂をＤＭＦで十分洗浄した後、少量取り出した樹脂に１％２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）と１０％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を２μＬずつ添加した。５分静置して樹脂が赤く呈色されることを確認することで、Ｆｍｏｃ基が脱保護されアミノ基が露出したと判断した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸４．８ｍｍｏｌ、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＣＴＵ）４．８ｍｍｏｌ，ＤＩＥＡ９．６ｍｍｏｌの混合液２０ｍＬを樹脂に添加し、室温で３０分間振とうさせることでアミノ酸を付加した。ＤＭＦで樹脂を洗浄後、少量の樹脂に１％ＴＮＢＳと１０％ＤＩＥＡを２μＬずつ添加した、５分静置して樹脂が赤く呈色されないことを確認することで、アミノ基が全て反応したと判断した。５％無水酢酸２０ｍＬを樹脂に加え５分間振とうして、未反応のアミノ基をアセチル化した。この工程を繰り返すことで目的のペプチドを合成した。
【００４７】
ペプチド合成した樹脂はジエチルエーテルで洗浄後、乾燥させた。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：アニソール：エチルメチルスルフィド：１．２−エタンジチオール＝９３：３：３：１（体積比）に調整したクリベージ溶液４０ｍＬを加え、室温で４時間静置して脱保護及び脱樹脂反応をした。得られた上清に氷冷したジエチルエーテルを加えてペプチドを析出させ、遠心分離して上清を捨てた。得られた沈殿をジエチルエーテルで数回洗浄した後、十分に乾燥させた。得られたペプチドは０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、逆相ＨＰＬＣで目的のペプチドを精製した。
【００４８】
次に、精製したペプチドを３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．５）１００ｍＬに一晩かけて滴下しながら撹拌し、分子内ジスルフィド環化させた。反応前のペプチド溶液と反応後のペプチド溶液とに２０ｍＭ  ジチオニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）溶液をそれぞれ５μＬ添加し、反応後のペプチド溶液が黄色に呈色されないことを確認することで、メルカプト基が全て反応したと判断した。反応溶液から環状化ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００４９】
最後に、保護していたＮ末端のシステイン残基を脱保護した。精製したペプチドを１ｍＭとなるように水２０ｍＬに溶解させ、濃度が２００ｍＭになるようにｏ−メトキシアミンを上記ペプチド溶液に添加して室温で２日間反応した。反応終了後、逆相ＨＰＣＬで精製することで目的のペプチドを得た。
【００５０】
２．ペプチド固定化担体の作製方法
ポリ酢酸ビニル製の球状多孔質体（旭硝子株式会社製、平均粒径１００μｍ、排除限界分子量約１００万以上、樹脂１ｍＬに充填できる分子量４万のプルランの量が０．２０ｍＬ／ｍＬ以上）１８ｇをジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）１８０ｍＬに投入し、そこに、エピクロロヒドリン（和光純薬工業株式会社製）１３７ｍＬ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）の水溶液（２１ｇ／３１．５ｍＬ）及び水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）８８ｍｇを添加し、３０℃で５時間反応させてエポキシ基を導入した。反応後、エポキシ基を導入した球状多孔質体をメタノール（和光純薬工業株式会社製）で洗浄し、その後、純水で洗浄してエポキシ活性化担体を得た。得られた担体は、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）２ｍＬと、活性化担体１ｍＬに１％フェノールフタレインエタノール溶液（和光純薬工業株式会社製）２滴を滴下し、８０℃で赤色の呈色が確認されなくなるまで０．１Ｍの塩酸（和光純薬工業株式会社製）を加え、「活性化量（単位樹脂体積量あたりのエポキシ基の物質量）＝塩酸濃度（体積モル濃度）×塩酸滴定量（体積量）／樹脂量（体積量）」の式によって導入されたエポキシ基の量を求め、１１０μｍｏｌ／ｍＬ以上であることを確認した。
【００５１】
次に、エポキシ化担体を３０ｍＬ秤量し、アンモニア水（濃度：２８−３０％、関東化学株式会社）を４５ｍＬ加え、４０℃で９０分間反応することで、エポキシ基をアミノ基に変換した。得られたアミノ化担体は元素分析によって、定量的にエポキシ基からアミノ基となっていることを確認した。
【００５２】
次に、アミノ化担体を５ｍＬ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬株式会社製）で膨潤させた後、１０ｍＭのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ（米国サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）のＤＭＳＯ溶液１０ｍＬを加え、３０℃で３時間反応させた。反応後、ＤＭＳＯで洗浄し、その後純水で洗浄することで、マレイミド化担体を得た。
【００５３】
得られたマレイミド化担体を１．５ｍＬ秤量し、２．４ｍＭのペプチド（配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドであって、７番目のシステイン残基と４５番目のシステイン残基とが、互いにジスルフィド結合を形成しているペプチド）ＰＢＳ溶液５ｍＬを加えた。その後、３７℃で１７時間反応させることで、ペプチド中のメルカプト基と担体中のマレイミド基を共有結合させた。反応後、純水で洗浄することで、ペプチド固定化担体を得た。ペプチドの固定化量は、ペプチド導入反応前後の反応溶液の吸光度（２０２ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。
【００５４】
３．血漿吸着試験
健常人から採取したＣＰＤ加血液（Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ加血液）を遠心分離にて血漿分離し、健常人ヒト血漿を得た。次に得られたペプチド固定化担体を０．５ｍＬ秤量し、その６倍容の健常人ヒト血漿を加え、３７℃で１７．５間分振とうさせた。振とう後、遠心分離にてペプチド固定化担体を除き、上澄み血漿中に含まれる血漿タンパク質（ＩｇＧ、Ｆｂｇ、アルブミン（Ａｌｂ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ））を測定することで、ペプチド固定化担体への吸着率を算出した。
【００５５】
（比較例１）
実施例１で作製したエポキシ化担体を１０ｍＬ秤量し、４６ｍＭのトリプトファン（和光純薬工業株式会社製）炭酸緩衝溶液２０ｍＬを加え、５０℃で１６時間反応させることで、トリプトファンを担体に共有結合させた。反応後、純水で洗浄することでトリプトファン固定化担体を得た。トリプトファンの固定化量は、トリプトファン導入反応前後の反応溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を紫外可視分光光度計で測定し、その吸光度の差分に基づいて算出した。このトリプトファン固定化担体を用いて、実施例１と同様の方法で健常人ヒト血漿におけるタンパク質吸着試験を実施した。
【００５６】
（比較例２）
実施例１で作製したアミノ化担体を用いて、実施例１と同様の方法で健常人ヒト血漿におけるタンパク質吸着試験を実施した。
【００５７】
実施例１、並びに、比較例１及び２の結果を表１及び図２に示す。
【表１】
2015074626.tif 000003
【００５８】
表１に示すように、ペプチド固定化担体を用いた実施例１は、リガンド固定化量がトリプトファンの１０分の１以下であるにもかかわらず、高いＩｇＧ吸着率を示した。また、トリプトファン固定化担体と比較して、他の血漿タンパク質成分を吸着することなく、ＩｇＧに極めて選択的に吸着することも示された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のペプチド及びこれを用いたＩｇＧ型抗体吸着材は、例えば、医療産業及び製薬業等で利用可能である。特に、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症等の自己免疫疾患の病因物質と考えられる自己抗体及び免疫複合体を、高い吸着容量で高選択的に吸着することが可能であることから、自己免疫疾患の治療に有用である。
【符号の説明】
【００６０】
１…体液浄化デバイス（体外循環モジュール）、２…円筒、３、３’…フィルター、４、４’…パッキン、５…入口ポート（体液導入口）、６…キャップ、７…出口ポート（体液導出口）、８…キャップ、９…ＩｇＧ型抗体吸着材。
【図１】
2015074626.tif 000004
【図２】
2015074626.tif 000005
【配列表】
2015074626000001.app