(57)【要約】【課題】本発明は、安全であり毎日の服用も可能であるステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤を提供することにある。【解決手段】本発明に係るステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤は、サラシア・レティキュラータ、サラシア・オブロンガ、およびサラシア・プリノイデスから選択されるサラシア属植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サラシア・レティキュラータ、サラシア・オブロンガ、およびサラシア・プリノイデスから選択されるサラシア属植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とするステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
サラシア属植物の根部および／または幹部の抽出物を有効成分として含む請求項１に記載のステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤。
【請求項３】
サラシア属植物の根部の抽出物を有効成分として含む請求項１に記載のステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤。
【請求項４】
水系溶媒による抽出物を有効成分として含む請求項１〜３のいずれかに記載のステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤。
【請求項５】
水系溶媒が、水、Ｃ1-4アルコール、またはこれらの混合溶媒である請求項４に記載のステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質新生に必要な遺伝子を制御する役割を担うものであり、過剰に活性化されると脂肪肝などの原因となるステロール調節因子結合タンパク質１ｃをコードする遺伝子の発現を抑制することができる薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、肝炎はその原因によってウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、薬物性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症などに分類される。
【０００３】
これら肝炎の中でも非アルコール性脂肪性肝炎は脂肪肝といわれ、従来、良性の肝疾患であると考えられていた。しかし近年、我国では食生活の変化が見られ、栄養過多の傾向になるにつれ、生活習慣病が問題視されるようになってきた。それに伴って、脂肪肝が、メタボリックシンドロームや動脈硬化の発症や進展と直接関係することが明らかになりつつあり、また、肝炎や肝硬変、さらには肝がんへ進行する場合もあることも分かってきた。
【０００４】
その一方で、肝臓は沈黙の臓器といわれるように、特に各疾患の初期にはほとんど自覚症状がない。脂肪肝の場合も初期には自覚症状がなく、進行に従って、疲れ易い、体がだるい、食欲不振といった肝臓疾患の一般的症状があらわれるが、肝臓疾患と自覚することは少なく、風邪などと勘違いして放置することによりさらに悪化させることも多い。
【０００５】
よって脂肪肝は、普段の生活習慣からその予防に努めることも重要であるし、また、初期段階で治療することが好ましい。
【０００６】
脂肪肝は肥満などと関係を有するといわれているが、体重や体脂肪が低下したからといって必ずしも脂肪肝が改善されるというものではない。即ち、脂肪肝は肥満、過食、運動不足などから発症するといわれているが、その他の未知のメカニズムによっても発症するといわれている。
【０００７】
本発明者は、脂肪肝の発症に関わる因子の一つとして、脂質新生に必要な遺伝子を制御する役割を担うステロール調節因子結合タンパク質１ｃに着目した。当該タンパク質は、ステロールの生合成に関与するタンパク質の合成を上方制御するものであるため、その遺伝子発現を阻害すれば、肝臓に限らず様々な組織において脂肪の蓄積を抑制できる可能性があり、また、その他にも好ましい効果が得られる可能性がある。
【０００８】
ステロール調節因子結合タンパク質１を抑制するものとして、特許文献１にはラクトフェリンが開示されており、また、ステロール調節因子結合タンパク質１の抑制剤の有効成分として、特許文献２にはクロロゲン酸が開示されている。さらに特許文献３には、リン脂質を有効成分とするステロール調節因子結合タンパク質１抑制剤が開示されており、脂漏性脱毛症の予防や改善に効果があるとされている。
【０００９】
ところで、サラシア属植物やその抽出物はいわゆる健康茶として利用されており、その抗肥満作用や抗糖尿病作用（特許文献４〜７）、抗高脂血症作用（特許文献８，９）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−１３３４号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２５４５５号公報
【特許文献３】特開２０１１−１８４３４７号公報
【特許文献４】特開２００１−２６１５６９号公報
【特許文献５】特開２００２−３１６９３８号公報
【特許文献６】特開２００３−１２５２９号公報
【特許文献７】特開２００６−２０６０６号公報
【特許文献８】特開２００１−２８８０９９号公報
【特許文献９】特開２００３−１７１２９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、ステロール調節因子結合タンパク質１ｃを抑制すれば、肝臓のみならず様々な組織において脂肪の蓄積を抑制できる可能性があり、当該タンパク質の遺伝子発現や活性を阻害する薬物も検討されている。
【００１２】
しかし、特許文献１に記載のステロール調節因子結合タンパク質１抑制剤の有効成分であるラクトフェリンはタンパク質であり、経口投与が非常に難しいといえる。また、特許文献２に記載の発明の有効成分であるクロロゲン酸は極めて不安定である上に水溶性が高く、経口投与しても腸管での吸収が困難である。さらに、抗肥満作用や抗高脂血症作用を有する薬剤であっても、ステロール調節因子結合タンパク質１ｃの活性を阻害できるとは限らない。
【００１３】
かかる状況下、本発明が解決すべき課題は、安全であり毎日の服用も可能であるステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、サラシア属植物の抽出物が、血中のコレステロールや中性脂肪、グルコースの濃度はそれ程変化させない一方で、組織細胞におけるステロール調節因子結合タンパク質１ｃの遺伝子発現を有意に阻害できることを実験的に見出して、本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係るステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤は、サラシア・レティキュラータ、サラシア・オブロンガ、およびサラシア・プリノイデスから選択されるサラシア属植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤の有効成分である上記抽出物としては、上記サラシア属植物の根部および／または幹部の抽出物、特に根部の抽出物が好適である。また、上記抽出物としては、水系溶媒、特に水、Ｃ1-4アルコールまたはこれらの混合溶媒から選択される少なくとも１種による抽出物が好適である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤は、お茶としても用いられているサラシア属植物の抽出物を有効成分とするものであることから非常に安全であり、毎日の摂取や服用も可能である。また、本発明に係るステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤は、生体内における脂質新生を阻害することができるので、組織などにおける過剰な脂肪の蓄積を原因とする様々な不調、例えば、脂肪肝、脂漏性脱毛症、脂質異常症、動脈硬化症、睡眠時無呼吸症候群などの予防作用や治療作用に極めて優れている。よって本発明は、ステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子の発現抑制を通して、例えば、近年における食生活の欧米化などにより問題になっていた内臓などの組織における脂肪の過剰蓄積を原因とする疾患を抑制できるものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、食餌に加えて水のみを与えた対照群ラット、水の代わりに１０％果糖水を与えたラット、１０％果糖水に加えて本発明抽出物５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇを経口投与したラットの果糖総摂取量（Ａ）、飼料総摂取量（Ｂ）、および体重変化（Ｃ）を示すグラフである。
【図２】図２は、上記ラットの血漿中の総コレステロール濃度（Ａ）、中性脂肪濃度（Ｂ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）濃度（Ｃ）、グルコース濃度（Ｄ）、およびインスリン濃度（Ｅ）を示すグラフである。
【図３】図３は、上記ラットから摘出した肝臓の重量（Ａ）、肝重量／体重比（Ｂ）、肝臓中総コレステロール量（Ｃ）、および、肝臓中中性脂肪量（Ｄ）を示すグラフである。
【図４】図４は、食餌に加えて水のみを与えた対照群ラット、水の代わりに１０％果糖水を与えたラット、果糖水に加えて本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇを経口投与したラットから得た肝切片をヘマトキシリン・エオジン染色したものの拡大写真である。
【図５】図５は、食餌に加えて水のみを与えた対照群ラット、水の代わりに１０％果糖水を与えたラット、果糖水に加えて本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇを経口投与したラットから得た肝切片をオイルレッドＯ染色したものの拡大写真（（Ａ）〜（Ｃ））と、染色された部分の定量値を示すグラフ（Ｄ）である。
【図６】図６は、上記ラットから得られた肝臓における遺伝子の発現量を示すグラフである。（Ａ）はステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、（Ｂ）はＦＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、（Ｃ）はＡＣＣ−１遺伝子のｍＲＮＡの発現量、（Ｄ）はＳＣＤ−１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。
【図７】図７は、上記ラットから得られた肝臓における遺伝子の発現量を示すグラフである。（Ａ）はＣｈＲＥＢＰのｍＲＮＡの発現量、（Ｂ）はＬＰＫ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、（Ｃ）はＰＰＡＲ−γ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、ＰＰＡＲ−α遺伝子のｍＲＮＡの発現量、ＣＰＴ−１ａ遺伝子のｍＲＮＡの発現量、ＡＣＯ遺伝子のｍＲＮＡの発現量およびＣＤ３６遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。
【図８】図８は、上記ラットから得られた肝細胞のタンパク質の発現量を示すグラフである。（Ａ）は核のステロール調節因子結合タンパク質１の発現量、（Ｂ）は核のＣｈＲＥＢＰの発現量、（Ｃ）はβ−アクチン量に対するＳＣＤ−１の発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係るステロール調節因子結合タンパク質１ｃ遺伝子発現抑制剤は、サラシア・レティキュラータ、サラシア・オブロンガ、およびサラシア・プリノイデスから選択されるサラシア属植物の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする。
【００２０】
ステロール調節因子結合タンパク質（Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1）は、活性化されるとステロール調節因子と呼ばれるＤＮＡ配列であるＴＣＡＣＮＣＣＡＣに結合する転写因子であり、ステロールの生合成に関与する酵素を上方制御する。特にステロール調節因子結合タンパク質１ｃ（以下、「ＳＲＥＢＰ−１ｃ」と略記する場合がある）は脂質新生に必要な遺伝子を制御する役割を有するため、ＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子の発現を抑制すれば、組織における脂肪の蓄積も抑制されるので、脂肪の過剰蓄積を原因とする疾患を治療または予防することができる。
【００２１】
本発明にかかるＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤は、ＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子の発現を抑制することが可能であり、脂肪の過剰蓄積を原因とする疾患を治療または予防することができる。
【００２２】
本発明に係るＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤は、サラシア・レティキュラータ（Salacia reticulate，以下、「ＳＲ」と略記する）、サラシア・オブロンガ（Salacia oblonga，以下、「ＳＯ」と略記する）、およびサラシア・プリノイデス（Salacia prinoides，以下、「ＳＰ」と略記する）から選択されるサラシア属植物の抽出物を有効成分として含む。本発明で用いるサラシア属植物としては、サラシア・レティキュラータ、サラシア・オブロンガおよびサラシア・プリノイデスから選択されるサラシア属植物が好ましい。
【００２３】
サラシア属植物は、インドやスリランカ、東南アジアなどの亜熱帯地域に広く分布するニシキギ科の植物である。よって、サラシア・レティキュラータ、サラシア・オブロンガおよびサラシア・プリノイデスはこれらの国から入手することができる。
【００２４】
本発明では、ＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制活性が得られる範囲でサラシア属植物のいかなる部位を用いてもよいが、本発明ではサラシア属植物の根部および／または幹部を用いることが好ましい。根部とは、上記植物のうち地中部に存在している部分であって、色などの点で地上部の茎などと明確に区別できる部分を用いることが好ましい。幹部とは、植物体の主軸となる木質化した茎をいい、主には植物体から根部、枝部、葉部を除去した残りの部分をいうものとする。特に、本発明ではサラシア属植物の根部を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明では、原料として、ＳＲ、ＳＯまたはＳＰのサラシア属植物の何れか一つを選択して用いてもよいし、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
本発明に係るＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤の有効成分は、上記サラシア属植物から抽出することができる。
【００２７】
抽出にあたり、上記サラシア属植物は、洗浄した後に乾燥してもよい。乾燥方法としては、自然乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥などを適宜組み合わせて用いることができる。また、抽出にあたっては、根部を粗切り、粉砕など微細化してもよい。
【００２８】
本発明に係る抽出物を得るための抽出溶媒としては、水系溶媒を用いることが好ましい。本発明において水系溶媒とは、水、水混和性有機溶媒および水と水混和性有機溶媒との混合溶媒をいう。水混和性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノールなどのＣ1-4アルコール；ジエチルエーテルやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒などを挙げることができる。
【００２９】
本発明で用いる溶媒は、上記などから選択される溶媒を単独で用いてもよいし、２種類以上選択して混合して用いてもよい。例えば、１０ｖ／ｖ％以上、９０ｖ／ｖ％以下のＣ1-4アルコール水溶液を用いることができる。
【００３０】
抽出溶媒の使用量は特に制限されず、適宜調整すればよい。例えば、使用するサラシア属植物質量に対して、１Ｌ／ｋｇ以上、５０Ｌ／ｋｇ以下程度とすることができる。
【００３１】
抽出温度は、ＳＲＥＢＰ−１ｃ抑制活性を有する有効成分が十分に抽出できる範囲で適宜調整することができ、例えば、１０℃以上、１２０℃以下とすることができる。なお、溶媒の沸点以上で抽出する場合には、抽出容器を密閉するか、加圧することが好ましい。
【００３２】
抽出時間も、ＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制活性を有する有効成分が十分に抽出できる範囲で適宜調整することができ、例えば、３０分間以上、１０時間以下程度とすることができる。
【００３３】
また、抽出効率を高めるために、抽出操作を２回以上繰り返してもよい。即ち、通常の抽出後、固形分と抽出液を濾過や遠心分離などにより分離し、得られた固形分に再びフレッシュ溶媒を加えて抽出するという操作を繰り返し、各抽出液を合わせることができる。この場合の抽出回数としては、２回以上、５回以下が好ましく、２回または３回がより好ましく、２回が最も好ましい。
【００３４】
抽出後の混合液は、そのまま用いることができるが、通常の後処理を行ってもよい。例えば、固形分と抽出液を濾過や遠心分離などにより分離したり、また、分離した抽出液を加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などを適宜組み合わせて乾燥してもよい。
【００３５】
本発明に係るＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤の剤形は特に問わない。例えば、上述したように抽出後のサラシア属植物固形分と抽出液を含む混合液や、抽出後に固形分を除去した抽出液そのものであってもよい。また、注射剤としての投与を志向して、いったん乾燥した抽出物を溶液やエマルション製剤などの液状製剤とすることも考えられる。しかし、後記の実施例のとおり、本発明に係るＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤は経口投与で高い効果を示すことから、摂取や服用のし易さからも経口剤とすることが好ましい。
【００３６】
経口剤としては、特に制限されないが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、糖衣剤、顆粒剤などを挙げることができる。本発明に係るＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤には、剤形に合わせ、薬学上許容される添加剤を用いてもよい。かかる添加剤は特に制限されないが、例えば、賦形剤、基剤、防腐剤、助剤、安定化剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料などを挙げることができる。また、溶液や懸濁液を飲料にしてもよいし、一般的な食餌に添加してもよい。
【００３７】
本発明に係るＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制剤の投与頻度や投与量は、予防的な使用か治療的な使用かや、症状の重篤度、患者の年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。後述する実験データによれば、ラットの体重（ｋｇ）あたり、１日２０ｍｇの乾燥抽出物投与で有意なＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現抑制効果が確認された。かかる結果より、ヒトに対する投与量は、乾燥状態抽出物で、１日あたり５ｍｇ／ｋｇ体重以上、１００ｇ／ｋｇ体重以下程度とすることが好ましい。また一日あたりの投与回数としては、１回以上、５回以下が好ましく、１回以上３回以下がより好ましく、１回以上、２回以下がさらに好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００３９】
実施例１：サラシア・オブロンガ由来の本発明抽出物の製造
インド最南部東側のタミールナダで自生しているサラシア・オブロンガの根部を平成２２年に採取し、自然乾燥させておいた。当該乾燥根部を粗切りした後、７質量倍の５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液に時々振り混ぜつつ常温で５時間浸した。その後、濾過により固形分を除去した。得られた固形分に対して、同様の抽出操作をさらに２回繰り返した。各抽出液を混ぜ合わせ、４５℃以下で減圧濃縮し、サラシア・オブロンガの根部抽出物を得た。使用したサラシア・オブロンガ乾燥根部に対する抽出収率は２０質量％であった。抽出物中のマンギフェリン含有量をＨＰＬＣ定量法（Huang et al．，Diabetes obesity & Metabolism，2008，10，pp.574-585）に準じて測定すると、２．１質量％であった。
【００４０】
実施例２：動物実験
（１）  血漿中脂質などの測定
体重２１０〜２３０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、室温２１±１℃、湿度５５±５％、１２時間毎に明暗を切り替えた飼育室で、固形飼料と水を自由に摂取させつつ１週間予備飼育した。次いで、２４匹のラットを任意に６匹ずつ４グループに分けた。第１群（水対照群）には水のみを与えた。第２群（果糖対照群）には、水の代わりに１０％果糖水を与えた。第３群（果糖＋本発明抽出物５ｍｇ／ｋｇ投与群）には、果糖水に加えて上記実施例１の本発明抽出物５ｍｇ／ｋｇを経口投与した。第４群（果糖＋本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群）には、果糖水に加えて上記実施例１の本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。本発明抽出物は、５質量％アラビアゴム水溶液に懸濁し、１０週間にわたり１日１回強制的に経口投与した。第１群と第２群には、５質量％アラビアゴム水溶液のみ経口投与した。ストレスを避け、より精密に果糖の摂取を監視するため、１つのゲージで飼育するラットは２匹ずつとした。固形飼料と水または果糖水は、自由に摂取させた。飼育中、水または果糖水と飼料の摂取量を毎日測定した。果糖の摂取量がほぼ一定になるように、前３日間における果糖対照群の果糖摂取量データをもとに、３日間に一度、第３群と第４群に与える果糖水の濃度を微調整した。７０日目に絶食させたが、水（第１群）と果糖水（第２〜４群）は一晩自由に摂取させた。
【００４１】
次いで、血液サンプルをエーテル麻酔のもと採取した。血液サンプルから血漿を分離し、総コレステロール濃度、中性脂肪濃度、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）濃度、グルコース濃度およびインスリン濃度を、以下のキットを用いて測定した。
総コレステロール濃度  −  Kexin Institute of Biotechnology，Shanghai，China製キット
中性脂肪濃度  −  Wako，Osaka，Japan製「Triglycerid-E kit」
遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）濃度  −  Wako，Osaka，Japan製「NEFA-C kit」
グルコース濃度  −  Kexin Institute of Biotechnology，Shanghai，China製キット
インスリン濃度  −  Morinaga Biochemical Industries，Tokyo，Japan製キット
【００４２】
上記測定後、各ラットの体重を直ちに測定した。さらに屠殺し、肝臓を取り出して重量を測定した。重量測定後、肝臓切片を液体窒素で凍結し、遺伝子の発現と中性脂肪量の測定まで−８０℃で保存した。
【００４３】
また、肝臓中の中性脂肪を以下のとおり測定した。肝組織１００ｍｇを採取し、ホモジナイズ後、イソプロピルアルコール２ｍＬで抽出した。得られた抽出液を３，０００ｒｐｍで遠心分離し、前記測定キットを使って上清に含まれる中性脂肪量を測定した。
【００４４】
まず、各群の果糖総摂取量、飼料総摂取量および体重変化を図１に示す。果糖総摂取量を図１Ａに、飼料総摂取量を図１Ｂに、体重変化を図１Ｃに示す。また、図１中、「＊」は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）において果糖投与群に対してｐ＜０．０５で有意差がある場合を示し、「ＳＯＲ」は実施例１で調製したサラシア・オブロンガ抽出物を示す。
【００４５】
図１の結果のとおり、果糖の総摂取量はいずれの群にも差異が認められなかった。飼料に関しては、第１群（水対照群）より、果糖を摂取した群で摂取量の減少が見られたが、第２〜４群間での差異は認められなかった。体重に関しては、群間の差異は認められなかった。
【００４６】
また、採取した血液サンプルに関して、血漿中の総コレステロール濃度を図２Ａ、中性脂肪濃度を図２Ｂ、ＮＥＦＡ濃度を図２Ｃ、グルコース濃度を図２Ｄ、インスリン濃度を図２Ｅに示す。なお、図２中、「＊」は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）において果糖投与群に対してｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
【００４７】
図２の結果のとおり、血漿中の総コレステロール濃度、中性脂肪濃度、グルコース濃度およびインスリン濃度は、果糖の摂取により水対照群（水のみ摂取）に対して有意に上昇した。一方、ＮＥＦＡ濃度に関しては対照群よりも低下した。本発明抽出物（ＳＯＲ）の投与は、血漿中の総コレステロール濃度、中性脂肪濃度、グルコース濃度およびインスリン濃度の何れに対しても大きく影響を与えなかった。
【００４８】
実験開始から７０日目に摘出した肝臓に関して、肝重量を図３Ａ、肝重量／体重比を図３Ｂ、総コレステロール量を図３Ｃ、中性脂肪量を図３Ｄに示す。なお、図３中、「＊」は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）において果糖投与群に対してｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
【００４９】
図３の結果のとおり、果糖の投与は肝臓中総コレステロール量に大きく影響を与えなかったが、肝重量／体重比の値は有意に上昇した。肝臓中中性脂肪量は対照群に対して３倍の値を示し、顕著に上昇した。それに対して本発明抽出物（ＳＯＲ）の投与により、肝重量、肝重量／体重比および肝臓中総コレステロール量に関して有意差は出なかったが、本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇの経口投与により肝臓中中性脂肪量が顕著に低下した。
【００５０】
（２）  組織観察
上記で得られた肝切片を１０％ホルマリン液で固定し、パラフィンに包埋し、３μｍ片にカットした。ヘマトキシリン・エオジン染色し、正立型研究用システム顕微鏡（オリンパス社製，ＢＸ−５１）を用いて肝臓組織の形状を観察した。肝組織の拡大写真を図４に示す。
【００５１】
図４（Ｂ）のとおり、水のみ投与した対照群（図４（Ａ））に比して、果糖を負荷した場合、肝細胞内に脂質が蓄積し、空洞化が観察された。本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇを経口投与した場合、図３（Ｄ）で肝臓中中性脂肪量の減少が測定されたのと一致して、図４（Ｃ）のとおり、空洞化箇所が減少された。
【００５２】
さらに、肝切片中の油滴量を定量するために、６μｍの凍結切片をオイルレッドＯ染色した。３切片の４０分野の中から分析するものをランダムに選び、オイルレッドＯ染色面積および全組織を画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ社製，ＩｍａｇｅＪ  １．４３）を用いて測定した。オイルレッドＯ染色した肝切片像を図５（Ａ）〜（Ｃ）に、染色面積の定量値のグラフを図５（Ｄ）に示す。なお、図５における「＊」は分散分析（ＡＮＯＶＡ）においてｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
【００５３】
図５（Ａ）〜（Ｃ）と図５（Ｄ）からも、果糖を負荷した場合には肝組織中に脂肪滴が蓄積されることが観察された。また、果糖の摂取により水対照群（水のみ摂取）に対してオイルレッドＯ染色面積が有意に増加した。本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇを経口投与した場合、図５（Ｃ）および図５（Ｄ）のとおり、果糖によるオイルレッドＯ染色面積が有意に減少された。
【００５４】
（３）  リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ抽出用試薬（Ｔａｋａｒａ社製，ＴＲＩｚｏｌ（登録商標））を使い、肝臓から総ＲＮＡを抽出した。得られた総ＲＮＡから、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ  ｃＤＮＡシステムキットを用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびリアルタイムＰＣＲ専用試薬（タカラバイオ社製，ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥＸ  ＴａｑＴＭＩＩ）を用い、リアルタイムＰＣＲを行った。使用したプライマーの配列を表１に示す。なお、各サンプルの遺伝子発現は２回行い、対照のβ−ａｃｔｉｎに対して標準化した。結果を図６と図７に示す。図６の（Ａ）はＳＲＥＢＰ−１ｃ、（Ｂ）はＦＡＳ、（Ｃ）はＡＣＣ−１、（Ｄ）はＳＣＤ−１の結果を示す。また、図７の（Ａ）はＣｈＲＥＢＰ、（Ｂ）はＬＰＫ、（Ｃ）はＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲ−α、ＣＰＴ−１ａ、ＡＣＯおよびＣＤ３６の結果を示す。
【００５５】
【表１】
2015074647.tif 000002
【００５６】
ＳＲＥＢＰ−１／１ｃは、肝臓脂質合成を制御する主要な転写因子である。ＦＡＳ、ＡＣＣ−１およびＳＣＤ−１は、ＳＲＥＢＰ−１ｃ−応答性の脂質合成酵素である。より詳しくは、ＦＡＳは細胞がアポトーシスを開始するシグナル伝達のリガンドとなる脂肪酸合成酵素である。ＡＣＣ−１は肝臓や脂肪組織など脂質合成を行う臓器に発現する酵素である。ＳＣＤ−１は不飽和脂肪酸生合成酵素の一つである。ＣｈＲＥＢＰは解糖系・脂質合成系の合成酵素の遺伝子発現を促進する糖質応答転写因子である。ＬＰＫはＣｈＲＥＢＰの標的遺伝子であり、肝臓にある解糖系でピルビン酸とＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を合成する酵素である。ＰＰＡＲは細胞の核内に存在するホルモン受容体タンパク質の一種であり、ＰＰＡＲ−γは脂肪合成や免疫応答に、ＰＰＡＲ−αは肝臓における脂質代謝に関係していると考えられる。ＣＰＴ−１ａ、ＡＣＯ、ＣＤ３６をコードする遺伝子は、ＰＰＡＲの標的となる。ＣＰＴ−１ａはミトコンドリアの膜タンパク質である。ＡＣＯは脂肪酸代謝、α−リノレン酸代謝酵素の一つである。ＣＤ３６は脂肪細胞やマクロファージ、肝細胞などの細胞の表面に存在する膜タンパク質である。図６と図７のとおり、水対照群（水のみ投与）に比して、果糖を負荷した場合、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＦＡＳ、ＡＣＣ−１およびＳＣＤ−１は過度に発現している。果糖対照群（果糖のみ投与）と比較すると、遺伝子の発現に伴うｍＲＮＡは、第４群（果糖＋本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇ投与群）でＳＲＥＢＰ−１／１ｃ、ＦＡＳ、ＡＣＣ−１およびＳＣＤ−１が有意に低減されている。それに対し、ＣｈＲＥＢＰ、ＬＰＫ、ＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲ−α、ＣＰＴ−１ａ、ＡＣＯおよびＣＤ３６の発現に関しては作用しなかった。これらの結果が示唆するのは、肝臓のＳＲＥＢＰ−１ｃが本発明抽出物の重要な分子標的であり、本発明抽出物によりＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子の過度な発現が阻害されるということである。
【００５７】
（４）  ウェスタンブロット解析
本発明抽出物によるＳＲＥＢＰ−１遺伝子の発現抑制作用を確認するために、ウェスタンブロットでタンパク質の発現を検討した。核タンパク質を、NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagent kit（Pierce Biotechnology，Roskford，IL，USA）を用いて肝臓からそれぞれ抽出した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準として用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Bio-rad Laboratories社製，Hercules，CA，USA）で求めた。また、核タンパク質（３０μｇ）につき、１０％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。得られたゲル上のタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Amersham，Buckinghamshire，UK）に電子移動させた。ＳＲＥＢＰ−１ｃ（dilution 1:200，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）、ＣｈＲＥＢＰ（dilution 1:1000，Novus Biologicals，Littleton，CO，USA）、ＳＣＤ−１（dilution 1:200，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）は、ヤギポリクローナル抗体とウサギポリクローナル抗体を用いてそれぞれ検出した。
【００５８】
標的とする各タンパク質のシグナルの検出は、二次抗体として抗ヤギおよび抗ウサギの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ抗体（dilution 1:5,000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）を用い、ＥＣＬウェスタンブロット検出キット（Pierce  Biotechnology，Roskford，IL，USA）で検出した。ポリクローナウサギラミンＡおよびＣ抗体（dilution １:１０００，cell Signaling Technologies，Beverly，MA，USA）を、核のＳＲＥＢＰ−１ｃおよびＣｈＲＥＢＰタンパク質に関して得られた信号を標準化するコントロールを読み込むために用いた。核のＳＲＥＢＰ−１と核のＣｈＲＥＢＰについては、対照のラミニンＡ／Ｃ（dilution 1:1000，Cell Signaling Technologies，Beverly，MA，USA）に対して標準化した。但し、ＳＣＤ−１については、β−Ａｃｔｉｎ（dilution 1:1000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）に対して標準化した。免疫反応性バンドはオートラジオグラフィーを用いて可視化し、密度はＩｍａｇｅＪ  １．４３．  Ｌｅｖｅｌｓを用いて定量し、水のみを与えたラットに任意の１の値を割り当てた。結果を図８に示す。図８の（Ａ）は核のＳＲＥＢＰ−１の発現、（Ｂ）はＳＣＤ−１量の発現、（Ｃ）は核のＣｈＲＥＢＰの発現を示す。
【００５９】
水のみに比して、果糖は、肝臓細胞核のＳＲＥＢＰ−１、ＳＣＤ−１および核のＣｈＲＥＢＰの発現を刺激した。本発明抽出物２０ｍｇ／ｋｇは果糖により核のＳＲＥＢＰ−１およびＳＣＤ−１の過度な発現を有意に低減させた。しかしながら、核のＣｈＲＥＢＰの過度な発現に対しては有意な影響を与えなかった。
【００６０】
これらの結果により、果糖由来の脂肪肝改善において、本発明抽出物の重要な分子標的となるのが肝臓の脂質合成転写因子ＳＲＥＢＰ−１ｃをコードする遺伝子であることを見出した。また、本発明抽出物にはＳＲＥＢＰ−１ｃの遺伝子の過剰発現を抑制する効果が見出されたことから、脂肪肝をはじめとするメタボリック・シンドロームに対応したＳＲＥＢＰ−１ｃ遺伝子発現を抑制することに由来する、合成の医薬品にも天然物にも従来全く認められなかった新規メカニズムの薬剤であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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