(57)【要約】【課題】新規な蛍光色素およびその使用の提供。【解決手段】本発明は、ホタルルシフェリン構造に基づく蛍光色素を提供する。これらの色素は、より短い波長で最適に励起され、ストークスシフトが少なくとも５０ｎｍである。本発明の蛍光色素は、サンプル中の分析物の検出に使用できる色素−結合体の調製に有用である。一態様では、一般式（Ｉ）を有する蛍光色素の組成物を提供される。    【化１】2015165031.tif 000063【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素に関し、さらに詳しくは、紫外線励起性蛍光色素組成物、紫外線励起性化合物および紫外線励起性結合体、ならびにその使用方法および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素は、サンプル中の成分の標識化、検出および／または定量に広く使用されている。そうした検出および／または定量のために使用される様々なアプローチには、蛍光顕微鏡検査、蛍光イムノアッセイ、細胞のフローサイトメトリー解析、および様々な他の適用がある。一般に、蛍光色素を検出ツールとして利用する多くの適用では、タンパク質、抗体、酵素、ヌクレオチド、核酸、ならびに他の生体分子および非生体分子などのリガンドと蛍光色素を結合体化して色素標識リガンドを製造する必要がある。色素標識リガンドは、その後の生化学的相互作用に特異性を付与する重要な試薬であり、蛍光色素により、相互作用を検出および／または定量する方法が提供される。
【０００３】
蛍光色素の選択は、蛍光顕微鏡検査、蛍光イムノアッセイ、フローサイトメトリー、および様々な他の適用などマルチプレックス、マルチカラー解析を利用する分野で特に重要である。とりわけ、特定の検出適用では、特異的な励起範囲を有する紫外線励起性フルオロフォアが不可欠である。
【０００４】
特に、マルチカラーフローサイトメトリー機器での４０５ｎｍ紫色レーザーで効率的に励起され得る蛍光色素が求められている。こうした適用の標的色素は本質的に、以下の：１）４０５ｎｍ近傍の、その励起スペクトルの最大値、２）強力かつスペクトル分解可能な最大発光、３）ストークスシフトが大きく、好ましくは少なくとも５０ｎｍ、および４）反応性基を介して蛍光色素を生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）とカップリングする能力という特徴を持つべきである。これまで、様々なリガンドに結合体化して、光学的かつ電気的に分離可能な蛍光スペクトル特性を持つ色素標識試薬を提供し得る紫外線励起性フルオロフォアが不足している。
【０００５】
本発明の蛍光色素は、構造的にホタルルシフェリン化合物に類似している。こうした化合物は従来、ルシフェリンの酸化触媒作用により発光する化学発光試薬として使用されてきた。酵素ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンは、ルシフェラーゼの存在下で酸化されてオキシルシフェリンおよびエネルギーを生成し、エネルギーが光の形で放出される。こうした種類のアッセイでは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が、様々な物質に対する簡便かつ迅速で感度の高いアッセイの基礎となる（非特許文献１）。
【０００６】
ホタルルシフェリンの構造に基づくこうした化学発光色素は広く普及してはいるものの、そうした使用は、ホタルルシフェリンの構造に類似した構造を持つ化合物が、紫外スペクトルの特定の部分の範囲内で励起可能な蛍光色素として機能し得ることを証明するものではない。こうした紫外線励起性蛍光色素は、以下に限定されるものではないが、マルチプレックス、マルチカラー蛍光解析を利用する適用など広範な適用で特に有利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｒｉｃｋａ，ＬＪ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８８）１７５，１４〜２１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般にホタルルシフェリン構造に基づく新規な紫外線励起性蛍光色素、それを含む組成物、その中間体、およびその使用方法に関する。
【０００９】
一態様では、一般式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
2015165031.tif 000002
を有する蛍光色素の組成物を提供され、式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか、あるいは、Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基であり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｚ１、およびＷ基の１つは存在していなくてもよく、存在しない場合、環ＣのＣ４とＣ５との間の、点線で示す別の結合で置換されており；
Ｚ２は、式−Ｌ−ＲＧの標識置換基を含み、式中、Ｌは結合または連結基であり；
ＲＧは、蛍光色素を別の分子に結合させることができる反応性基である。
【００１１】
別の態様では、本発明の蛍光色素を合成するための合成中間体を提供する。一実施形態では、合成中間体は、一般式：
【００１２】
【化２】
2015165031.tif 000003
により表され、式中、
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであり、
またはＹ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基である。
【００１３】
別の態様では、生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）に結合体化した蛍光色素を含む色素−結合体を提供する。
【００１４】
別の態様では、蛍光色素および色素−結合体を用いて、サンプル中の分析物またはリガンドが存在する、または相互作用する位置を特定したり、あるいは、その存在または相互作用を検出したりする方法を提供する。特定の実施形態では、色素−結合体に結合する相補的な生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の存在を検出するための色素−結合体の使用方法を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明の色素−結合体に結合する相補的な生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）の存在の検出に使用する、蛍光色素、色素中間体、または色素−結合体を含む試薬およびキットを提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
式：
【化４１】
2015165031.tif 000004
を有する、蛍光色素であって、式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか、あるいは、Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基であり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｚ１、およびＷ基の１つは存在していなくてもよく、存在しない場合、環ＣのＣ４とＣ５との間の別の結合で置換されており；
Ｌは独立に結合または連結基であり；
ＲＧは反応性基である、
蛍光色素。
（項目２）
上記連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含み、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ここで、ＲＧは、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、酸無水物、酸クロリド、アシルアジド、アシルハライド、アルデヒド、クロロホルマート、アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハライド、トシル、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、アジリジン、イミン、およびジスルフィドからなる群から選択される反応性基を含む、
項目１に記載の蛍光色素。
（項目３）
上記連結基は、下記式：
Ｒ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２であって、式中、Ｒ１は結合、または上記色素に結合したＣ１〜１０メチレン（ＣＨ２）ｎであり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ２はＯＨ、または上記カルボニル基を上記反応性基ＲＧに結合する結合である、Ｒ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２；あるいは
Ｒ１Ｃ（Ｏ）Ａ１Ｒ３Ｃ（Ｏ）Ｒ２であって、式中、Ｒ１は結合、またはＣ１〜１０メチレンであり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ａ１はＮＨ、ＳまたはＯのいずれかであり、Ｒ３はアルケニル（ＣＨ２）ｎ、少なくとも１つの不飽和結合を持つ５もしくは６員環、またはＣ１〜１０メチレン（ＣＨ２）ｎと５もしくは６員環との組み合わせであり、Ｒ２はＯＨ、または末端カルボニル基を上記反応性基ＲＧに結合する結合である、Ｒ１Ｃ（Ｏ）Ａ１Ｒ３Ｃ（Ｏ）Ｒ２
を含む、項目１または２に記載の蛍光色素。
（項目４）
ＲＧはカルボン酸、カルボン酸のスクシニミジルエステル、ヒドラジド、アミン、イソチオシアネートまたはマレイミドを含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の蛍光色素。（項目５）
式：
【化４２】
2015165031.tif 000005
を有し、式中、
ＲはＯＨ、スクシンイミドオキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ−スクシンイミド、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎ−マレイミドを表し、式中、ｎ＝１〜１０である、
項目１に記載の蛍光色素。
（項目６）
式：
【化４３】
2015165031.tif 000006
を有する、項目１に記載の蛍光色素。
（項目７）
式：
【化４４】
2015165031.tif 000007
を有し、式中、
ＲはＯＨ、スクシンイミドオキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ−スクシンイミド、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎ−マレイミドを表し、式中、ｎ＝１〜１０である、
項目１に記載の蛍光色素。
（項目８）
式：
【化４５】
2015165031.tif 000008
を有する、項目１に記載の蛍光色素。
（項目９）
式：
【化４６】
2015165031.tif 000009
を有する、項目１に記載の蛍光色素。
（項目１０）
式：
【化４７】
2015165031.tif 000010
を有する、項目１に記載の蛍光色素。
（項目１１）
式：
【化４８】
2015165031.tif 000011
を有し、式中、
ＲはＯＨ、スクシンイミドオキシ、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ−スクシンイミド、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎ−マレイミドを表し、式中、ｎ＝１〜１０である、項目１に記載の蛍光色素
（項目１２）
式：
【化４９】
2015165031.tif 000012
を有し、式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか、あるいは、Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基であり；
ＷはＨまたはアルキルであり；
Ｌは独立に結合または連結基であり、上記連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含み、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ＲＧはカルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、酸無水物、酸クロリド、アシルアジド、アシルハライド、アルデヒド、クロロホルマート、アミン、ヒドロキシル、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハライド、トシル、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル、アジリジン、イミン、およびジスルフィドからなる群から選択される反応性基である、項目１に記載の蛍光色素。
（項目１３）
約３４０ｎｍ〜約４５０ｎｍの波長で励起され得る、項目１に記載の蛍光色素。
（項目１４）
式：
【化５０】
2015165031.tif 000013
を有する、色素−結合体であって、式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し、各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｚ１、および上記Ｗ基の１つは存在していなくてもよく、存在しない場合、環ＣのＣ４とＣ５との間の別の結合で置換されており；
Ｌは独立に結合または連結基であり、上記連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含み、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ＣＭは、ペプチド、タンパク質、多糖、酵素、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸ポリマーを含む結合体化分子である、色素−結合体。
（項目１５）
上記結合体化分子はペプチドまたはタンパク質である、項目１４に記載の色素−結合体。
（項目１６）
上記結合体化分子は抗体、または抗体のフラグメントである、項目１４または１５に記載の色素−結合体。
（項目１７）
サンプル中の特異的結合対の相補的な構成要素を検出する方法であって：
ａ）上記相補的な構成要素に特異的に結合する項目１４〜１６のいずれか１項に記載の色素−結合体と上記サンプルを混合する工程；および
ｂ）上記混合により形成される複合体を検出して上記相補的な構成要素を検出する工程を含む、方法。
（項目１８）
上記相補的な構成要素はタンパク質またはペプチドである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記相補的な構成要素は細菌、ウイルスまたは動物細胞に存在する、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
上記複合体はその蛍光応答により検出される、項目１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
上記蛍光応答はフローサイトメーター、蛍光計、蛍光顕微鏡、または蛍光プレートリーダーを用いて検出される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
検出できる程度に異なる光学的特性を有する第２のフルオロフォアの蛍光応答と上記蛍光応答を識別する工程をさらに含む、項目２０または２１に記載の方法。
（項目２３）
上記蛍光応答に基づき上記複合体を他のサンプル成分から分離する工程をさらに含む、項目２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
式：
【化５１】
2015165031.tif 000014
を有する化合物であって、式中、
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか
あるいは
Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基である、化合物。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の紫外線励起性蛍光色素の一般構造を図示する。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、ルシフェリン誘導体の合成スキームを図示する。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、デヒドロルシフェリン酸の誘導体の合成スキームを図示する。
【図４】図４は、２カラーフローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４−色素２結合体とＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ結合体との性能を比較したヒストグラムを図示する。
【図５】図５は、１０カラーフローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４−色素３とＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ結合体との性能を比較したヒストグラムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本出願に使用する科学技術用語はすべて、他に記載がない限り、当該技術分野において一般的に使用される意味を有する。本出願に使用する場合、以下の語または表現は、以下に示した意味を有する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「活性化エステル」という用語は、アミノ基と自発的に反応するエステルを意味する。活性化エステルは一般に式−ＣＯＲを持ち、式中、Ｒは優れた脱離基である。活性化エステルとして、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルとも呼ばれるスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ６Ｈ４Ｏ２）、スルホスクシニムジルオキシ（−ＯＣ６Ｈ３Ｏ２−ＳＯ３Ｈ）、−１−オキシベンゾトリアゾリル（−ＯＣ６Ｈ４Ｎ３）があるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素を含む分岐、直鎖、または環状炭化水素基を意味する。「アルキル」という用語は、典型的には最大８個の炭素を含む「低級アルキル」基を含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つのＣ−−Ｃ二重結合を含み、かつ２〜２０個の炭素を含む、分岐、直鎖、または環状炭化水素基を意味する。「アルケニル」という用語は、典型的には最大８個の炭素を含む「低級アルケニル」基を含む。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つのＣ−−Ｃ三重結合を含み、かつ２〜２０個の炭素を含む、分岐または直鎖の炭化水素基を意味する。「アルキニル」という用語は、典型的には最大８個の炭素を含む「低級アルキニル」基を含む。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「アリール」という用語は、１〜５の炭素環式芳香族環を含む芳香環含有基を意味し、この基は、Ｈ以外の１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「分析物」という用語は、アッセイによりサンプルにおいて、その存在または量が測定される物質を意味する。分析物は、反応性基、たとえば、それを介して本発明の色素を分析物に結合体化できる基を含んでもよい。分析物として、特異的な結合親和性を持つ特異的結合パートナーが存在する有機分子および生体分子が挙げられる。例示的な分析物として、以下に限定されるものではないが、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびビオチンが挙げられる。他の例示的な分析物として、薬物およびホルモンも挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「結合体化分子」または「ＣＭ」という用語は、少なくとも１種の本発明の色素と会合している生物学的または非生物学的成分を意味する。こうした成分として、以下に限定されるものではないが、抗原、抗体、炭水化物（たとえば、単糖、オリゴ糖、および多糖）、タンパク質、ペプチド、ハプテン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ポリマー、ウイルス、微生物、または細胞もしくは細胞成分が挙げられる。「結合体化分子」は、固体支持体（たとえば、合成支持体、クロマトグラフィー支持体、膜、またはビーズ）も含む。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「蛍光色素」という用語は、電磁スペクトルの紫外領域および紫領域の光を吸収し、青領域の光を再放射して検出可能なシグナルを生成する化合物を意味する。「蛍光色素」はまた、色素を結合体化分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に結合しやすくする化学反応性基を持つ蛍光化合物を含む。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「色素−結合体」という用語は、蛍光色素が生物学的または非生物学的成分と会合している分子を意味する。こうした生物学的または非生物学的成分は、「結合体化分子」とも呼ばれる。一実施形態では、蛍光色素の結合体化分子への会合は、共有結合による会合である。色素−結合体の例として、抗原、抗体、炭水化物、タンパク質、ペプチド、ハプテン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ポリマー、固体支持体（たとえば、合成支持体、クロマトグラフィー支持体、膜またはビーズ）、ウイルス、微生物、または細胞もしくは細胞成分の結合体があるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「フルオロフォア」という用語は、ある波長域でエネルギーを吸収し、吸光度領域以外の波長域でエネルギーを放出することができる分子を意味する。「励起波長」という用語は、フルオロフォアがエネルギーを吸収する波長の範囲を意味する。「発光波長」という用語は、フルオロフォアがエネルギーを放出する、または蛍光を発する波長の範囲を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ハロゲン」という用語は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。同様に、「ハロ」という用語は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基またはヨード基を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「ハロアルキル」という用語は、１個または複数個の水素原子が１個または複数個のハロゲン原子で置換されているアルキル基を意味する。一実施形態では、ハロアルキルは、１つ、２つ、または３つのハロ基で置換されていてもよい。ハロアルキルという用語はまた、ペルフルオロ−アルキル基も含む。ハロアルキルの例として、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ペンタクロロエチル、および同種のものが挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「連結基」または「Ｌ」という用語は、色素を反応性基すなわちＲＧに結合する基を意味する。連結基は、結合でも、原子でも、または別の二価もしくは多価の基でもよい。連結基は原子の直鎖でも、または分岐鎖でもよく、そのいくつかは、環構造の一部であってもよい。連結基は通常、１〜約５０個の非水素原子、より一般的には１〜約３０個の非水素原子を含む。この鎖を構成する原子は、Ｃ原子、Ｏ原子、Ｎ原子、Ｓ原子、Ｐ原子、Ｓｉ原子、Ｂ原子およびＳｅ原子、好ましくは蛍光色素を化学反応性基などの別の部分と共有結合させるＣ原子、Ｏ原子、Ｎ原子、Ｐ原子およびＳ原子から選択される。ハロゲン原子は、鎖または環に置換基として存在していてもよい。結合置換基を構成する典型的な官能基として、アルケン基、アルキレン基、アリーレン基、アルケニレン基、エーテル基、ペルオキシド基、ケトンとしてのカルボニル基、エステル基、炭酸エステル基、チオエステル基、またはアミド基、アミン基、アミジン基、カルバマート基、尿素基、イミン基、イミド基、イミデート基、カルボジイミド基、ヒドラジン基、ジアゾ基、ホスホジエステル基、ホスホトリエステル基、ホスホネートエステル基、チオエーテル基、ジスルフィド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホネートエステル基、スルフェートエステル基、およびチオ尿素基が挙げられる。連結基の例として、置換もしくは非置換のポリメチレン、アリーレン、アルキルアリーレン、アリーレンアルキル、またはアリールチオが挙げられる。
【００３１】
色素を反応性基に結合するための本発明による１つの連結基は、一般構造Ｒ１Ｃ（Ｏ）Ｒ２を持ち、式中、Ｒ１は結合、または色素に結合したＣ１〜１０メチレン（ＣＨ２）ｎであり、Ｃ（Ｏ）はカルボニル基であり、Ｒ２はＯＨ、またはカルボニル基を反応性基ＲＧに結合する結合である。この連結基の例として、下記がある：
【００３２】
【化３】
2015165031.tif 000015
下記に示す別の実施形態では、連結基は、一般構造Ｒ１Ｃ（Ｏ）Ａ１Ｒ３Ｃ（Ｏ）Ｒ２を持ち、式中、Ｒ１は上記のように結合、またはＣ１〜１０メチレンであり、Ａ１はＮＨ、ＳまたはＯのいずれかであり、Ｒ３はアルケニル（ＣＨ２）ｎ、少なくとも１つの不飽和結合を持つ５もしくは６員環、またはＣ１〜１０メチレン（ＣＨ２）ｎと５もしくは６員環との組み合わせであり、Ｒ２はＯＨ、または末端カルボニル基を反応性基ＲＧに結合する結合である。この連結基の例として、下記がある：
【００３３】
【化４】
2015165031.tif 000016
本明細書で使用する場合、「反応性基」または「ＲＧ」という用語は、その存在により、共有結合または物理的力により別の分子への結合が促進される原子または基である。反応性基の選択される例を表１に示す。いくつかの実施形態では、本発明の蛍光化合物が別の化合物に結合すると、たとえば、反応性基がハロゲン原子またはトシレート基などの脱離基で、求核置換反応により蛍光標識化合物が別の化合物に共有結合すると、反応性基から１個または複数個の原子が失われる。他の実施形態では、蛍光標識化合物が共有結合形成により別の化合物に結合すると、マイケル付加などの付加反応またはディールス・アルダー反応などの付加環化反応において起こるように、あるいは、反応性基がイソシアネート基またはイソチオシアネート基である場合に起こるように、反応性基内の結合が再編成される。なお他の実施形態では、結合は、共有結合形成を必要とするものではなく、むしろ物理的力を必要とするものであり、この場合、反応性基は変化しない。物理的力とは、水素結合、静電引力またはイオンの引力、塩基スタッキングなどの疎水性引力、ならびにビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗原−抗体相互作用およびヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用などの特異的親和性相互作用などの引力をいう。
【００３４】
【表１】
2015165031.tif 000017
反応性基がカルボン酸またはカルボン酸の活性化エステルなどの部分である場合、反応性色素は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンなどの１つまたは複数のアミノ基を含む分子との色素結合体を調製するのに特に有用である。反応性基がマレイミドまたはハロアセトアミドである場合、反応性色素は、チオールを含む分子との結合体化に特に有用である。反応性基がヒドラジドである場合、反応性色素は、過ヨウ素酸酸化した炭水化物および糖タンパク質への結合体化に特に有用である。
【００３５】
一実施形態では、反応性基は、カルボン酸基、カルボン酸のスクシンイミジルエステル基、イソチオシアネート基、ハロアセトアミド基、ヒドラジン基、脂肪族アミン基、およびマレイミド基を含む。これらの各反応性基の調製方法は、当該技術分野において周知であり、特定の目的のための適用については、当業者の能力の範囲内である。
【００３６】
また、２官能性カップリング試薬を用いて、穏やかに反応性の基を持つ有機分子および生体分子に標識をカップリングしてもよい（Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｅｒ  Ａｓｓａｙｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ．１８−２０，Ｔａｂｌｅ  ２．２、およびＴ．Ｈ  Ｊｉ，「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９１，５８０−６０９（１９８３）を参照されたい）。２官能性試薬には、最終的な構造に組み込まれるものと、組み込まれずに２つの反応物をカップリングする働きしかしないものとの２つの種類がある。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「サンプル」という用語は、アッセイされるべき１つまたは複数の分析物を含む、または含むと考えられる流体を意味する。蛍光色素を利用して解析される典型的なサンプルは、たとえば血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞溶解物、組織抽出物および同種のものといった体液などの生物学的サンプルである。サンプルはまた、希釈剤、緩衝剤、界面活性剤、夾雑物、および通常体液中に存在する他のそのような成分をさらに含んでもよい。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「特異的結合対」という用語は、相互に結合親和性を示す２つの物質を意味する。例として、抗原−抗体、ハプテン−抗体、抗体−抗体対、相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、酵素−基質、ホルモン−ホルモン受容体、レクチン−炭水化物、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＩｇＧ−プロテインＧ、核酸−核酸結合タンパク質、および核酸−抗核酸抗体が挙げられる（表２）。
【００３９】
【表２】
2015165031.tif 000018
本明細書で使用する場合、「置換された」という用語は、ある基の少なくとも１個の水素原子が別の原子、またはＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉから選択される１〜５０個の原子を持つ基で置き換えられていることを意味する。置換された基という場合、複数の置換部位が存在してもよいことを意図している。
【００４０】
本発明の組成物
本発明は、ホタルルシフェリンの構造をベースとし、いくつかの機能上の利点を有する蛍光色素のクラスを提供する。たとえば、本発明の蛍光色素は、より短い波長（３４０〜４５０ｎｍ）での励起に適合され、通常５００ｎｍと５５０ｎｍとの間の最大発光、より狭い発光バンド幅、少なくとも約５０ｎｍの大きなストークスシフト、および他の好ましい蛍光特性も有する。
【００４１】
本発明の蛍光色素は、４０５ｎｍの紫色レーザーに特に有用である。本発明の蛍光色素は、既存の紫色レーザー励起色素（たとえば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ）と比べて、吸光性（ａｂｓｏｒｂｔｉｖｉｔｙ）は同程度であるものの、驚くべきかつ予想外により明るい蛍光を示す。本発明の蛍光色素は、反応性基を介した結合体化分子とのカップリングに非常に適合している。さらに、本発明の色素−結合体、特にタンパク質結合体は、色素置換の程度が比較的高くても、明るい蛍光を示す。これらの特性により、本発明の色素は、マルチカラー、マルチプレックスの適用に特によく適したものになっている。
【００４２】
下記一般式の蛍光色素を提供する：
【００４３】
【化５】
2015165031.tif 000019
式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか、
または
Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基であり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｚ１、およびＷ基の１つは存在していなくてもよく、存在しない場合、環ＣのＣ４とＣ５との間の、点線で示す別の結合で置換されており；
Ｚ２は、式−Ｌ−ＲＧの標識置換基を含み、式中、Ｌは、色素を反応性基ＲＧに接続する結合または連結基であり、連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含んでもよく、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；ＲＧは、カルボン酸基、カルボン酸の活性化エステル基、酸無水物基、酸クロリド基、アシルアジド基、アシルハライド基、アルデヒド基、クロロホルマート基、アミン基、ヒドロキシ基、ヒドラジン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホニルハライド基、トシル基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基、アジリジン基、イミン基、およびジスルフィド基を含む。
【００４４】
式（Ｉ）の蛍光色素の一実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、下記式を持つＳである：
【００４５】
【化６】
2015165031.tif 000020
式中、
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか、
または
Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基であり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｌ−ＲＧでは、Ｌは、色素を反応性基ＲＧに接続する結合または連結基であり、連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含んでもよく、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ＲＧは、カルボン酸基、カルボン酸の活性化エステル基、酸無水物基、酸クロリド基、アシルアジド基、アシルハライド基、アルデヒド基、クロロホルマート基、アミン基、ヒドロキシ基、ヒドラジン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホニルハライド基、トシル基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基、アジリジン基、イミン基、およびジスルフィド基を含んでもよい。
【００４６】
表３に、式（Ｉ−Ａ）の色素の選択される実施形態を示す
【００４７】
【表３】
2015165031.tif 000021
他の実施形態では、蛍光色素は、下記式を持つ：
【００４８】
【化７】
2015165031.tif 000022
式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか；
または
Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基であり；
ＷはＨまたはアルキルであり；
Ｌは、色素を反応性基ＲＧに接続する結合または連結基であり、連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含んでもよく、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
式中、ＲＧは、カルボン酸基、カルボン酸の活性化エステル基、酸無水物基、酸クロリド基、アシルアジド基、アシルハライド基、アルデヒド基、クロロホルマート基、アミン基、ヒドロキシ基、ヒドラジン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホニルハライド基、トシル基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基、アジリジン基、イミン基、およびジスルフィド基を含んでもよい。
【００４９】
式（Ｉ−Ｂ）の蛍光色素の一実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、下記式で示されるようにＳである：
【００５０】
【化８】
2015165031.tif 000023
式中、
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか
または
Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキルであり；
ＷはＨまたはアルキルであり；
Ｌは結合または連結基であり、連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含み、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ＲＧは反応性基であり、ＲＧは、カルボン酸基、カルボン酸の活性化エステル基、酸無水物基、酸クロリド基、アシルアジド基、アシルハライド基、アルデヒド基、クロロホルマート基、アミン基、ヒドロキシ基、ヒドラジン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホニルハライド基、トシル基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基、アジリジン基、イミン基、およびジスルフィド基を含んでもよい。
【００５１】
表４に、式（Ｉ−Ｂ）の色素の選択される実施形態を示す。
【００５２】
【表４】
2015165031.tif 000024
本発明はさらに、本発明の蛍光色素を合成するために使用してもよい合成中間体化合物も提供する。一実施形態では、中間体化合物は、下記一般式（ＩＩ）により表される：
【００５３】
【化９】
2015165031.tif 000025
式中、
Ｙ１およびＹ２は独立にハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルであるか
または
Ｙ１またはＹ２の一方はＨであり、他方はハロアルキル基である。
【００５４】
別の実施形態では、中間体化合物は、下記一般式（ＩＩＩ）により表される：
【００５５】
【化１０】
2015165031.tif 000026
式中
Ｘ２はＳまたはＯであり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
ＬＨはＯＨまたはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（ｎは１〜１０である）である。
【００５６】
本発明の蛍光色素は、１つまたは複数の結合体化分子「ＣＭ」と共有結合的に会合していても、または非共有結合的に会合していてもよい。共有結合的会合は、上記のように結合体化分子ＣＭの蛍光色素への連結基Ｌを介した結合など様々な機構により生じてもよく、共有結合を伴ってもよい。
【００５７】
色素が１つまたは複数の分子と非共有結合的に会合している場合、その会合は、色素または合成中間体化合物をビーズまたは表面などの固体もしくは半固体マトリックス中に、または固体もしくは半固体マトリックス上に組み込むか、あるいは、水素結合、イオン結合、もしくは疎水性相互作用（ファンデルワールス力など）といった非特異的相互作用によるなど、様々な機構により生じてもよい。会合分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、ビーズ、マイクロプレートのウェル表面、金属表面、半導体および不導体表面（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）、ナノ粒子、ならびに他の固体表面からなる群から選択され得る。会合もしくは結合体化分子は、同一でも異なっていてもよい２つ以上の蛍光色素と会合または結合体化してもよい。一般に、生物学的物質の色素−結合体の調製方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，ｐａｇｅｓ  ２９８−３６２；Ｎａｔａｌｉｙａ  Ｐａｎｃｈｕｋ，ｅｔａｌ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１７９−１１８８（１９９９）；Ｓ  Ｂｈａｔａｃｈａｒｙａ，ｅｔａｌ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９，１１８６−１１９３（２００８）；Ｂ．Ｄｗｏｒｅｃｋｉ，ｅｔａｌ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅｓ／ＤｙＬｉｇｈｔ％２０Ｐｏｓｔｅｒ％２０６−７−０４．ｐｄｆ）を参照されたい。典型的には、フルオロフォアを色素−結合体に会合または結合体化すると、その分子にフルオロフォアのスペクトル特性が付与される。
【００５８】
一実施形態では、本発明の蛍光色素は、共有結合を介して結合体化分子ＣＭに結合し、この色素−結合体は、式：
【００５９】
【化１１】
2015165031.tif 000027
を有し、式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し、各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｚ１、およびＷ基の１つは存在していなくてもよく、存在しない場合、環ＣのＣ４とＣ５との間の、点線で示す別の結合で置換されており；
Ｌは独立に結合または連結基であり、連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含み、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ＣＭは結合体化分子である。
【００６０】
本発明による色素−結合体の調製に使用してもよい結合体化分子ＣＭとして、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、酵素、脂質、非生物学的ポリマー、細胞、および細胞成分があるが、これに限定されるものではない。これら結合体化される分子については、結合体化を容易にするため、あるいは、その後の反応性を保証するため、１つまたは複数の官能基で保護してもよい。
【００６１】
分子がペプチドである場合、ペプチドは、ジペプチドでも、またはより大きなペプチドでもよく、典型的には５〜５０個のアミノ酸を含む。結合体化分子がタンパク質である場合、結合体化分子は、酵素でも、抗体でも、触媒抗体でも、キナーゼでも、レクチンでも、糖タンパク質でも、ヒストンでも、アルブミンでも、リポタンパク質でも、アビジンでも、ストレプトアビジンでも、プロテインＡでも、プロテインＧでも、ホルモンでも、トキシンでも、増殖因子でもよい。典型的には、結合体化タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、または増殖因子である。
【００６２】
結合体化分子は、たとえば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（またはそのハイブリッド）、または一本鎖、二本鎖、三本鎖、もしくは四本鎖ＤＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡなどの核酸ポリマーであってもよい。結合体化分子は、デキストランなどの多糖類である炭水化物をさらに含んでもよい。
【００６３】
会合または結合体化分子は、特異的結合対の構成要素であってもよく、したがってその特異的結合対の相補的な構成要素の検出試薬として有用である。特異的結合対の構成要素の色素−結合体は、当該技術分野において周知の方法により、サンプル中の相補的な特異的結合対の構成要素の存在を検出し、さらに任意に定量するのに有用であり得る。
【００６４】
代表的な特異的結合対として、以下に限定されるものではないが、リガンドおよび受容体を挙げることができ、さらに、以下の対に限定されるものではないが、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＩｇＧ−プロテインＧ、炭水化物−レクチン、酵素−酵素基質；ＤＮＡ−相補鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡ−相補鎖ＲＮＡ、ホルモン−ホルモン受容体も挙げることができる（表２）。
【００６５】
蛍光色素化合物の調製方法
本発明の一態様では、下記式（Ｉ）の蛍光色素を調製する方法を提供する。
【００６６】
【化１２】
2015165031.tif 000028
式中、
Ｘ１およびＸ２は独立にＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し、各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｚ１、およびＷ基の１つは存在していなくてもよく、存在しない場合、環ＣのＣ４とＣ５との間の、点線で示す別の結合で置換されており；
Ｚ２は式−Ｌ−ＲＧの標識置換基を含み、式中、Ｌは独立に結合または連結基であり、連結基は、Ｃ原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｐ原子およびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む共有結合を含み、一重、二重、三重もしくは芳香族の炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、および窒素−窒素結合の任意の組み合わせからなり；
ＲＧは、カルボン酸基、カルボン酸の活性化エステル基、酸無水物基、酸クロリド基、アシルアジド基、アシルハライド基、アルデヒド基、クロロホルマート基、アミン基、ヒドロキシル基、ヒドラジン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、スルホニルハライド基、トシル基、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル基、アジリジン基、イミン基、およびジスルフィド基からなる基から選択される反応性基である。
【００６７】
一実施形態では、下記式：
【００６８】
【化１３】
2015165031.tif 000029
式中、Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し、；
Ｘ２はＳまたはＯであり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
Ｌは、ＯまたはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ（ｎは１〜１０である）である
を持つ本発明の蛍光色素を、図２Ａ〜２Ｄに図示する合成スキームを用いて合成してもよい。この方法は、下記ステップを含む：
（ａ）図２Ｂに示す方法を用いて、下記式を持つ色素のシアノベンゾチアゾール中間体を形成するステップ；
【００６９】
【化１４】
2015165031.tif 000030
式中、
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表す。
（ｂ）下記式：
【００７０】
【化１５】
2015165031.tif 000031
式中、
Ｘ２はＳまたはＯであり；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
ＬＨはＯＨまたはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（ｎは１〜１０である）である、
の修飾アミノ酸とシアノベンゾチアゾール中間体を反応させることにより、色素のカルボキシル誘導体を形成して、
下記式のルシフェリン誘導体を生成するステップ：
【００７１】
【化１６】
2015165031.tif 000032
式中、
Ｘ２はＳまたはＯであり；
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し；
各々のＷは独立にＨまたはアルキルであり；
Ｚ１はＨまたはアルキルであり；
ＬＨはＯＨまたはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（ｎは１〜１０である）である。
（ｃ）ＬＨのカルボキシル基のヒドロキシル官能基を反応性基で置換するステップ。
【００７２】
別の実施形態では、図３Ａに図示する合成スキームを用いて、下記式を持つ本発明の蛍光色素を合成する：
【００７３】
【化１７】
2015165031.tif 000033
式中、
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し；
ＲはＨまたはアルキルである。
【００７４】
別の実施形態では、図３Ｂに図示する合成スキームを用いて、下記式を持つ本発明の蛍光色素を合成してもよい（Ｂａｇｌｅｙ，ＭＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，３３０１−３３１３（２０００）：
【００７５】
【化１８】
2015165031.tif 000034
式中、
Ｙ１およびＹ２は個別にＨ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはアルケニルを表し；
ＲはＨまたはアルキルである。
【００７６】
別の態様では、本発明は、発明の色素−結合体を製造する方法を提供する。この方法は、反応性基を含む本発明の蛍光色素を結合体化分子と混合することを含む。結合体化分子は、アミノ酸でも、タンパク質でも、ペプチドでも、抗体でも、抗体フラグメントでも、ヌクレオシドでも、ヌクレオチドでも、核酸ポリマーでもよい。結合体化分子は、デキストランなど多糖類である炭水化物を含んでもよい。典型的には、フルオロフォアを結合体化分子に結合体化すると、その分子にフルオロフォアのスペクトル特性が付与される。
【００７７】
色素−結合体の調製方法は、当該技術分野において周知である。ペプチドまたはタンパク質結合体の調製の場合、この方法は典型的には最初に、結合体化されるタンパク質を水性緩衝液に室温以下（典型的には４〜２５℃）、約１〜１０ｍｇ／ｍｌで溶解することを含む。スクシンイミジルエステルとの反応にはホウ酸塩または炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ約８．０〜９）が、チオール反応性官能基との反応にはリン酸塩緩衝液（ｐＨ約４．０〜８）が、イソチオシアネートおよびジクロロトリアジンとの反応には炭酸塩またはホウ酸塩緩衝液（ｐＨ約９．０〜９．８）が、特に好適である。適切な反応性色素を好適な程度の結合体化に十分な量で非水性溶媒（通常ＤＭＳＯまたはＤＭＦ）に溶解させ、結合体化されるタンパク質の溶液に加える。任意のタンパク質または他の成分に使用する反応性色素の適切な量は通常、可変量の反応性色素を、結合体化されるタンパク質に加える実験により事前に設定する。反応性色素は通常、結合体化されるタンパク質の量の５〜１００倍過剰で用いられる。この成分溶液への反応性化合物の添加後、混合物を好適な期間（典型的には室温で約１時間から氷上で数時間）インキュベートし、ゲル濾過、透析、ＨＰＬＣまたは他の好適な方法により、色素−結合体を結合体化していない色素から分離する。色素−結合体は、所望の適用で試験を行うまで溶液として保存しても、または凍結乾燥して保存してもよい。この方法は一般に、抗体、抗体フラグメント、アビジン、レクチン、酵素、プロテインＡおよびプロテインＧ、細胞タンパク質、アルブミン、ヒストン、増殖因子、ホルモン、および他のタンパク質を用いた色素−結合体の調製に適用できる。
【００７８】
使用方法
本発明は、サンプル中の特異的結合対の相補的な構成要素を検出する方法であって、相補的な構成要素に特異的に結合する本発明の色素−結合体と前記サンプルを混合すること；および、前記混合により形成された複合体を検出して、相補的な構成要素を検出することを含む、方法を提供する。本発明の方法は、サンプル中の分析物を検出および／または定量するために、本発明の反応性色素および色素−結合体などの蛍光色素の使用を含んでもよい。ある種の実施形態では、サンプルは、インタクトな細胞、細胞抽出物、細菌、ウイルス、オルガネラ、およびこれらの混合物など成分の不均質な混合物を含む。他の実施形態では、サンプルは、単一成分、または各成分の均質な群、たとえば、アミノ酸ポリマー、核酸ポリマー、炭水化物ポリマー、または脂質膜複合体などの生物学的ポリマーを含む。
【００７９】
ある種の実施形態では、反応性色素および色素−結合体などの本発明の蛍光色素を使用してサンプル中の分析物を染色または標識し、その結果、分析物を同定または定量できる。たとえば、生物学的または非生物学的流体中の標的分析物のアッセイにおいて、本発明の色素−結合体などの蛍光色素を検出可能なトレーサー要素として使用してもよい。
【００８０】
他の実施形態では、反応性色素および色素−結合体などの蛍光色素を使用して、結合体化分子が特異的結合対（たとえば、表２）の相補的な構成要素である、リガンドを含むサンプルを検出する。したがって、リガンドは特異的結合対の一方の構成要素であり、結合体化分子はもう一方の構成要素である。色素−結合体を含む蛍光色素はさらに、色素−結合体と、相補的な結合分子との間の相互作用を特定するために使用される。
【００８１】
本方法の第１のステップでは、検出可能な光学的な応答が起こるように選択した条件下で、上記のような本発明の色素を目的のサンプルと組み合わせることにより、本発明の反応性色素および色素−結合体などの蛍光色素を利用するのが一般的である。色素−結合体は典型的には、サンプルの要素と、共有結合的もしくは非共有結合的会合を形成するか、または、それとの複合体を形成するか、あるいは、単純にサンプルの境界またはサンプルの一部の範囲内に存在する。次いで、光学的な応答を誘導するように選択された波長でサンプルを照射する。典型的には、サンプルの染色を用いて、光学的な応答を標準とさらに比較してサンプルの特定の特徴を決定する。
【００８２】
本発明の一態様では、色素−結合体は、抗体、抗体フラグメント、アビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）および同種のものなど、標識タンパク質である。この実施形態では、色素−結合体を用いて、典型的には抗原、ハプテンまたはビオチンである相補的な特異的結合対を検出する。本発明のこうした色素−結合体は、様々な適用を用いて、サンプル中の分析物を検出するのに使用してもよい。主な適用として、免疫蛍光法、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、フローサイトメトリー、受容体の標識、および標識細胞の追跡が挙げられる。ある種の検出方法、たとえば、結合した結合体と結合していない結合体との空間的分離／分解を本質的に含むサイトメトリーに基づく検出方法では、分析混合物から結合していない色素−結合体を除去する必要がない。しかしながら、他の検出方法、たとえば、結合した結合体と結合していない結合体との空間的分離／分解を含まないイムノアッセイでは、光学的な応答の検出の前に、結合していない色素−結合体を分析混合物から除去する必要があることがある。
【００８３】
別の態様では、本発明の蛍光色素および色素−結合体は、レーザー色素として有用性がある。本発明の色素および色素−結合体は紫外または紫色レーザーで励起するため、これらの色素および色素−結合体は、より長波長で励起する他の色素を用いるマルチプレックスアッセイで特に有用である。一実施形態では、これらの色素および色素−結合体は、約３５０〜４０５ｎｍで励起し、より長波長（たとえば、４８０ｎｍ以上）で励起する色素と併用する場合、それらの発光スペクトルを、より長波長で励起する色素と識別することができる。
【００８４】
本発明の別の態様では、サンプル中の１つまたは複数の分析物を検出するマルチカラー法に、本発明の色素−結合体を使用してもよい。一実施形態では、複数の色素−結合体を用いて、マルチカラー解析により、サンプル中の複数の分析物を検出してもよい。この方法は、複数の色素−結合体、たとえば、第１の色素−結合体および第２の色素−結合体を含む本発明の組成物とサンプルをインキュベートすることを含む。この組成物の場合、第１の色素−結合体の成分が第１の分析物の結合パートナーであり、第２の色素−結合体の成分が第２の分析物の結合パートナーである。インキュベーションは、第１の分析物と第１の色素−結合体との間の相互作用を誘導するのに適切な条件下で続ける。このインキュベーション期間中、一般には、第２の分析物と第２の色素−結合体との間に同様の相互作用が起こることが好ましい。しかしながら、第２の色素−結合体と第２の分析物との間の色素−結合体−分析物複合体の形成を促すため、必要に応じてインキュベーション条件を変更することは、本発明の範囲内である。少なくとも第１の色素−結合体−分析物複合体が形成されてから、複合体が蛍光を発するのに適した波長の光をサンプルに照射し、それにより第１の分析物を検出する。第２の分析物については、同様の様式で検出し、第１の分析物と同時に検出しても、あるいは、各蛍光色素−結合体の蛍光の誘導に適切な波長をサンプルに連続的に照射することにより検出してもよい。特定の態様では、照射および／または検出ステップは、フローサイトメーターを含む。
【００８５】
あるいは、好ましくは異なる波長で蛍光を発する複数の色素−結合体を使用して、ある分析物の異なる特徴を検出してもよい。たとえば、異なる色の色素−結合体で分析物の細胞またはエピトープを標識し、この標的を検出し、各標的のそれぞれの色の共局在により、その正体を確認してもよい。
【００８６】
本発明の色素および色素−結合体は、診断適用に使用してもよい。たとえば、本発明の色素および色素−結合体は、被験体内の病原生物（たとえば、細菌、ウイルス、真菌）の存在の検出に有用である場合がある。あるいは、特定の分析物の存在、および／または特定の分析物の量、および／または特定の分析物の変異体が、被験体の病態と関連している場合がある。こうした分析物に結合する本発明の色素および色素−結合体は、特定の分析物および／もしくはその変異体の存在ならびに／または量を決定し、かくして病態の存在および／または程度を診断するのに有用性があり得る。
【００８７】
本発明のキット
本発明の一態様は、上記のような本発明の色素のいずれかを用いた様々なアッセイを実施しやすくする、キットの処方物である。本発明のキットは典型的には、色素−結合体の調製に有用な化学反応性標識として、あるいは、結合体化分子が特異的結合対の構成要素である色素−結合体として存在する本発明の蛍光色素を含む。選択される結合体化分子として、以下に限定されるものではないが、生体分子のポリマー（たとえば、タンパク質、核酸または炭水化物）が挙げられる。特定の実施形態では、表３および４に列挙される本発明の色素は、こうしたキットの調製に特に適している。
【００８８】
好ましくは、キットは、表５に列挙される蛍光色素の１つまたは複数を含む。
【００８９】
【表５−１】
2015165031.tif 000035
【００９０】
【表５−２】
2015165031.tif 000036
【００９１】
キットは、色素１、色素２、色素３、色素４、色素５、色素６、または色素７の色素−結合体の１つまたは複数をさらに含んでもよい。
【００９２】
例示的実施形態では、キットは、本発明の反応性色素と、適切な官能基を有する分子に色素を結合体化し、任意に色素−結合体を回収するための説明書とを含む。
【００９３】
別の例示的な実施形態では、キットは、サンプル中の分析物またはリガンドを検出するアッセイを実施するための説明書を含む。たとえば、一実施形態では、抗体に結合できる細胞表面受容体、または酵素、または他のリガンドを検出するための説明書を提供する。
【００９４】
キットは任意に、典型的には水溶液として存在する１種または複数種の緩衝剤をさらに含む。本発明のキットは任意に、他の検出試薬、得られた標識分子を精製するための精製媒体、蛍光標準物質、酵素、酵素阻害剤、有機溶媒、または本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。
【００９５】
本発明の種々の実施形態は、以下の例示的な例によってさらに実証される。例については、例示として提供するものであり、いかなる形においても発明または特許請求の範囲の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例１
以下の例は、ホタルルシフェリンのジハロ誘導体、およびそのそれぞれのＮＨＳエステルを合成する一般的な方法を説明するものである。
【００９７】
１．  アッペル塩の調製
【００９８】
【化１９】
2015165031.tif 000037
５００ｍＬの丸底フラスコにアルゴン下で、クロロアセトニトリル（２０ｍＬ）、一塩化硫黄（１２０ｍＬ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（１１０ｍＬ）を仕込んだ。反応物をアルゴン下で３日間撹拌し、その間に褐色の沈殿物が形成された。沈殿物を吸引濾過により集め、ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）およびヘキサン（３００ｍＬ）で洗浄した。洗浄した固体を真空乾燥させて、生成物を褐色の固体として得た（７５％収率）。
【００９９】
２．  ２−シアノベンゾチアゾールの調製
以下は、５，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−２−シアノベンゾチアゾールの調製手順である。５，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシ−２−シアノベンゾチアゾールの調製も、同じ手順に従って実施し、非常に類似した結果が得られた。
【０１００】
【化２０】
2015165031.tif 000038
５Ｌの丸底フラスコに１，３−ジクロロ−２−メトキシニトロベンゼン（０．３３モル）、アンモニウムクロリド（３．３モル）、およびエタノール（１２００ｍＬ）を仕込んだ。この撹拌混合物に亜鉛末（３．３モル）を速やかに加えた。数分後、反応混合物を還流に近い状態まで加温し、次いで室温まで冷却させた。一晩撹拌した後、懸濁液を濾過して残りの亜鉛およびアンモニウムクロリドを除去した。濾液を減圧下で濃縮し、得られた固体をＣＨ２Ｃｌ２（１５００ｍＬ）で再懸濁した。懸濁液を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して置換アニリンを白色の固体（０．３３モル）として得た。
１Ａ  Ｙ＝Ｃｌ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６．６０１（ｓ，２Ｈ），３．８１１（ｓ，３Ｈ），３．６−３．７（ブロード（ｂｒｏａｄ）  ｓ，２Ｈ）
１Ｂ  Ｙ＝Ｆ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６．２２（ｍ，２Ｈ），３．８６０（ｓ，３Ｈ），３．６−３．７（ブロード  ｓ，２Ｈ）  。
【０１０１】
２Ｌの三口丸底フラスコをオーブンで乾燥させ、アルゴン流下で冷却した。フラスコに１，３−ジクロロ−２−メトキシアニリン（０．３３モル）、ピリジン（７５ｍＬ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（５５０ｍＬ）を仕込んだ。アッペル塩（０．３３モル）を５分にわたり分割して加え、溶液を還流させた。ＴＬＣにより、アニリンが１５分後に完全に消失したことが示された。反応混合物をオレンジ色の固体に濃縮した。固体を２．５Ｌの酢酸エチルに溶解させた。この有機溶液をタイプ１水（type 1 water）（２×１０００ｍＬ）、およびブライン（１０００ｍＬ）で洗浄した。洗浄した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮してアッペル塩付加物を固体として得た。
２Ａ  Ｙ＝Ｃｌ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．２０３（ｓ，２Ｈ），３．９３３（ｓ，３Ｈ）
２Ｂ  Ｙ＝Ｆ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６．８７（ｍ，２Ｈ），４．０３０（ｓ，３Ｈ）  。
【０１０２】
５００ｍＬの三口丸底フラスコにアルゴン入口管と、出口にバブラーを連結した水冷冷却器とを装着した。フラスコにアッペル塩付加物（０．１３４モル）を仕込み、表面温度１４０℃まで１時間加熱した。トルエン（５０ｍＬ）を加え、反応物を９０℃まで冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）およびシリカ（５０ｇ）を加えた。得られたスラリーを濾過し、濾過ケークをＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で洗浄した。濾液と洗液を合わせて濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、５，７−ジクロロ−６−メトキシ−２−シアノベンゾチアゾールを固体（０．０３１モル）として得た。
３Ａ  Ｙ＝Ｃｌ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１９４（ｓ，１Ｈ），４．０２７（ｓ，３Ｈ）
３Ｂ  Ｙ＝Ｆ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．９８１（ｄｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ  ＆  １．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１５６（ｓ，３Ｈ）  。
【０１０３】
２５０ｍＬの丸底フラスコにピリジニウムヒドロクロリド（１６０ミリモル）および５，７−ジクロロ−６−メトキシ−２−シアノベンゾチアゾール（８．２ミリモル）を仕込んだ。反応物をアルゴン下で充填し、次いで１９５℃で３時間加熱した。室温まで冷却後、タイプ１水（１５０ｍＬ）を加え、混合物を超音波処理して固体を溶解した。この水溶液を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して生成物を黄色の固体（２．８ミリモル）として得た。
４Ａ  Ｙ＝Ｃｌ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ８．３１３（ｓ）
４Ｂ  Ｙ＝Ｆ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：δ  ８．３８５（ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ  ＆  １．６Ｈｚ）  。
【０１０４】
３．  アミノ酸の調製
【０１０５】
【化２１】
2015165031.tif 000039
修飾ペニシラミンの合成
【０１０６】
【化２２】
2015165031.tif 000040
２０００ｍＬの丸底フラスコにＤＬ−ペニシラミン（１０ｇ）およびアセトン（１０００ｍＬ）を仕込んだ。固体がすべて溶解するまで、反応物を還流させた（約２４時間）。熱いうちに反応混合物を濾過し、一晩室温まで冷却した。一晩で少量の結晶が形成された。この反応混合物を−２０℃で一晩維持した。得られた固体を吸引濾過により集め、アセトン（３００ｍＬ）で洗浄した。このチアゾール生成物をアルゴン下で乾燥させた（１１．９ｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ３．７５０（ｓ，１Ｈ），１．５５６（ｓ，６Ｈ），１．４３８（ｓ，３Ｈ），１．１８５（ｓ，３Ｈ）  。
【０１０７】
２５０ｍＬの丸底フラスコにアルゴン下でチアゾール酸（１１．９ｇ）およびギ酸ナトリウム（４．３ｇ）を仕込んだ。ギ酸（９８％、１００ｍＬ）を加え、反応混合物をアルゴン下で撹拌した。反応混合物を氷水浴で０℃まで冷却した。温度が５℃未満に維持されるように注意しながら、酢酸無水物（３３．３ｍＬ）を４５分にわたり滴下して加えた。氷水浴を除去し、反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下、３５℃で除去し、白色の固体を得た。固体をタイプ１水（２００ｍＬ）中で撹拌し、吸引濾過により集めた。固体をタイプ１水（１００ｍＬ）で洗浄し、風乾した（７．４ｇ）。濾液と洗液を合わせて酢酸エチルで抽出した（３×３００ｍＬ）。抽出物を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮して淡黄色の固体（６．８ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲにより、２つの固体が標的化合物の異性体混合物（約８５：１５）であることが示された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６  １２．９１６（Ｓ，１Ｈ），８．４４６（ｓ，０．８６Ｈ），８．１９５（ｓ，０．１４Ｈ），４．６４１（ｓ，０．１５Ｈ），４．５０２（ｓ，０．８５Ｈ），１．８２８（ｓ，６Ｈ），１．５９０（ｓ，３Ｈ），１．３６２（ｓ，３Ｈ）
【０１０８】
【化２３】
2015165031.tif 000041
丸底フラスコにホルミル化チアゾール酸（１当量）、トリエチルアミン（２当量）、およびＣＨ２Ｃｌ２を仕込んだ。反応混合物をアルゴン下、氷水浴中、０℃で撹拌した。シリンジでイソブチルクロロホルメート（１当量）を加えた。反応混合物を１時間撹拌した後、アミノエステル（１当量）を加えた。氷水浴を除去し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を１．０ＭのＨＣｌ（７５ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ３（７５ｍＬ）、およびタイプ１水（７５ｍＬ）で洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（５０：５０酢酸エチル：ヘキサン）により、標的生成物を得た（６０〜７０％収率）。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物の異性体混合物であることが示された。
ｎ＝０  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．３８９（ｓ，０．８８Ｈ），８．３２８（ｓ，０．１２Ｈ），６．９３２（ｍ，０．１５Ｈ），６．３８３（ｍ，０．８２），４．６２０（ｓ，０．８２Ｈ），４．３６７（ｓ，０．１５Ｈ），４．０３０（ｄｄ，Ｊ＝１８．４Ｈｚ  ＆  ５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，６Ｈ），１．７０−１．５９（ｍ，３Ｈ），１．４７（ｍ，１２Ｈ）
ｎ＝１  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．３５８（ｓ，０．７９Ｈ），８．２９１（ｓ，０．１５Ｈ），６．９７３（ｍ，０．１５Ｈ），６．４８６（ｍ，０．７８），４．４１８（ｓ，０．８０Ｈ），４．３１３（ｓ，０．１３Ｈ），３．６−３．４（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｍ，２Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，６Ｈ），１．６８−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．４４（ｍ，１２Ｈ）  。
【０１０９】
丸底フラスコにホルミル化チアゾールエステル、およびジオキサン：２．０ＭのＨＣｌ（５０：５０）を仕込んだ。反応混合物をアルゴン下、８５℃で一晩加熱した。室温まで冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮して修飾ペニシラミンをゴム状固体として得た。
ｎ＝０  １Ｈ  ＮＭＲにより、生成物の異性体混合物が示された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：４．１２８  ＆  ４．０８３（ｓ，１Ｈ），４．０４３  ＆  ４．０００（ｓ，２Ｈ），１．５５７（ｓ，３Ｈ），１．４８１（ｓ，３Ｈ）
ｎ＝１  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：３．７０２（ｓ，１Ｈ），３．４５−３．３８（ｍ，１Ｈ），３．２７−３．１９（ｍ，１Ｈ），２．４４１（ｍ，２Ｈ），１．２９５（ｓ，３Ｈ），１．２３３（ｓ，３Ｈ）  。
【０１１０】
メチル化システインの合成
【０１１１】
【化２４】
2015165031.tif 000042
システインメチルエステル（８．６ｇ）、ピバルアルデヒド（１１ｍＬ）、およびトリエチルアミン（８ｍＬ）をペンタン中で撹拌した。ディーンスタークトラップで水を除去しながら、反応混合物を還流させた。３６時間後、反応物を室温まで冷却すると、固体が形成された。固体を吸引濾過により集め、エーテルで洗浄した。
【０１１２】
１００ｍＬの丸底フラスコにチアゾールエステル（４．０ｇ）、ギ酸（９８％、３０ｍＬ）およびギ酸ナトリウム（１．５ｇ）を仕込んだ。反応混合物をアルゴン下で撹拌し、氷水浴で０℃まで冷却した。温度が５℃未満に維持されるように注意しながら、酢酸無水物（５．７ｍＬ）を３０分にわたり滴下して加えた。氷水浴を除去し、反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、得られた固体をタイプ１水（１００ｍＬ）中で撹拌した。固体ＮａＨＣＯ３を加えてｐＨを７〜８に調整した。この水溶液をエーテルで抽出した（３×１００ｍＬ）。抽出物を合わせて、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮して固体を得た。固体を酢酸エチル／ヘキサンから結晶化させた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．３１７（ｓ，１Ｈ），４．８５８（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．７０８（ｓ，１Ｈ），３．７３９（ｓ，３Ｈ），３．２５８（ｍ，２Ｈ），１．０００（ｓ，９Ｈ）  。
【０１１３】
無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のリチウムジイソプロピルアミン（１２ミリモル）の溶液を−７８℃、アルゴン下で撹拌した。１．３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ、１０ｍＬ）を加え、反応混合物を９０分間撹拌した。ホルミル化チアゾールエステルを加え（１０ミリモル）、反応混合物を−７８℃で１時間撹拌した。ＭｅＩ（１５ミリモル）を加え、反応混合物を−７８℃で２時間撹拌した。ドライアイス／アセトン浴を除去し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をブラインに溶解した。この水溶液をエーテル（１００ｍＬ）で抽出した。抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮して固体を得た。固体を、１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。１Ｈ  ＮＭＲにより、生成物のジアステレオマー混合物であることが示された。１Ｈ
ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）主生成物：８．２５２（ｓ，１Ｈ），５．２６３（ｓ，１Ｈ），３．７３８（ｓ，３Ｈ），３．２９３（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），２．６９５（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），１．０３８（ｓ，９Ｈ）；副生成物：８．３７７（ｓ，０．４Ｈ），５．２７４（ｓ，０．４Ｈ），３．７９０（ｓ，１．３Ｈ），３．６１２（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，０．５Ｈ），２．８３１（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ），０．９２９（ｓ，４．６Ｈ）  。
【０１１４】
メチル化チアゾールエステル（１．８ｇ）および５ＭのＨＣｌ（３０ｍＬ）を１０５℃で３日間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチルで抽出した（２×１００ｍＬ）。水相を減圧下で濃縮してゴム状固体を得た。
【０１１５】
４．６−ヒドロキシルシフェリン酸の調製
これは、基本的なルシフェリン構造を調製する典型的な手順である。
【０１１６】
【化２５】
2015165031.tif 000043
１００ｍＬの丸底フラスコにシアノベンゾチアゾール（０．５ミリモル）およびメタノール（２５ｍＬ）を仕込んだ。撹拌した反応混合物にアルゴンを１時間スパージした。アルゴンスパージしたｐＨ９（Ｎａ２ＣＯ３を加えてｐＨを調整した）のアミノ酸（１ミリモル）水溶液を調製して加えた。反応混合物をアルゴン下で２時間撹拌し、ＴＬＣで反応が終了していることを確認した。反応物を減圧下で約１０ｍＬに濃縮し、タイプ１水（４０ｍＬ）で希釈した。この水溶液を酢酸エチルで抽出し（３×７５ｍＬ）、抽出物を取っておいた。濃ＨＣｌを滴下して加えて、この水溶液をｐＨ２まで酸性化した。酸性化した水溶液を酢酸エチルで再び抽出した（３×７５ｍＬ）。６つの抽出物を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して生成物を固体として得た（４０〜９０％収率）。
６Ａ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．６８８（ｄｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ  ＆  １．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ  ＆  ８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７７４（ｍ，２Ｈ）
６Ｂ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．７９５（ｄｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ  ＆  １．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９３２（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４３４（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ），１．６８８（ｓ，３Ｈ）
６Ｃ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．６４６（ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ  ＆  １．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９３５（ｓ，１Ｈ），１．７７８（ｓ，３Ｈ），１．４８８（ｓ，３Ｈ）
６Ｄ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：８．３７９（ブロード  ｓ，１Ｈ），７．６５８（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），４．７５８（ｓ，１Ｈ），４．０００（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），１．８２９（ｓ，３Ｈ），１．４４８（ｓ，３Ｈ）
６Ｅ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：８．１９０（ブロード  ｓ，１Ｈ），７．６４７（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７０５（ｓ，１Ｈ），３．５６−３．５０（ｍ，２Ｈ），２．５５８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８１４（ｓ，３Ｈ），１．３９５（ｓ，３Ｈ）
６Ｆ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：８．２７１（ブロード  ｓ，１Ｈ），８．０９３（ｓ，１Ｈ），４．７９４（ｓ，１Ｈ），３．６１０（ｍ，２Ｈ），２．６４０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８９８（ｓ，３Ｈ），１．４７８（ｓ，３Ｈ）
６Ｇ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：９．８３８（ｓ，１Ｈ），７．８１０（ｄｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，＆  １．６Ｈｚ，１Ｈ），５．５０４（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８６０（ｍ，２Ｈ）
６Ｈ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．２６６（ｓ，１Ｈ），５．００７（ｓ，１Ｈ），１．７２５（ｓ，１Ｈ），１．４４７（ｓ，１Ｈ）
６Ｉ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：８．１４９（ｓ，１Ｈ），５．５０５（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８５５（ｍ，２Ｈ）  。
【０１１７】
化合物６Ｈから出発して３ステップで化合物６Ｊ（Ｌ＝ＮＨ２（ＣＨ２）５ＣＯＯＨ）を調製した。カルボン酸６ＨをＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＤＣＣと反応させてＮＨＳエステル７Ｈを生成し、これをメチル６−アミノヘキサノエートとカップリングした。得られたメチルエステルを塩基で加水分解して６Ｊを得た。
【０１１８】
５．  ルシフェリンのＮＨＳエステルの調製
【０１１９】
【化２６】
2015165031.tif 000044
これは、ルシフェリンのＮＨＳエステルを調製する典型的な手順である。
【０１２０】
１０ｍＬの丸底フラスコにアルゴンで充填し、ルシフェリン（０．３ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３ミリモル）、およびＤＣＣ（０．３０５ミリモル）を仕込んだ。無水ＴＨＦ（４ｍＬ）を加え、反応混合物を３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、少量のＣＨ２Ｃｌ２を加えた。白色沈殿物が形成され、これを濾過により除去した。濾液を減圧下で濃縮してゴム状固体を形成させた。固体を最低量のＴＨＦに溶解させ、ヘキサンを加えて固体を再形成させた。溶媒をデカントし、この手順をさらに２回繰り返して生成物を黄色の固体として得た（６０％収率）。
７Ｂ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．６５０（ｍ，１Ｈ），４．０９３（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４８１（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８１４（ｓ，３Ｈ）
７Ｃ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．６６０（ｄｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ  ＆  １．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１５３（ｓ，１Ｈ），２．８５８（ｓ，４Ｈ），１．８７４（ｓ，３Ｈ），１．６５３（ｓ，３Ｈ）
７Ｄ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．６７８（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），７．６０８（ブロード  ｓ，１Ｈ），４．７１３（ｓ，１Ｈ），４．６１４（ｄｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ  ＆  ６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３８９（ｄｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ  ＆  ５．４Ｈｚ，１Ｈ０，２．８２９（ｓ，４Ｈ），１．９０７（ｓ，３Ｈ），１．４４７（ｓ，３Ｈ）
７Ｅ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：，７．６７０（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），７．６１６（ブロード  ｓ，１Ｈ），４．６６０（ｓ，１Ｈ），３．８２−３．６５（ｍ，２Ｈ），２．８９９（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．７８９（ｓ，４Ｈ），１．８９９（ｓ，３Ｈ），１．４１２（ｓ，Ｈ）
７Ｆ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．０７３（ｓ，１Ｈ），７．６５３（ブロード  ｓ，１Ｈ），４．６９９（ｓ，１Ｈ），３．９−３．７（ｍ，２Ｈ），２．９３２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８２０（ｓ，４Ｈ），１．９４０（ｓ，３Ｈ），１．４５１（ｓ，３Ｈ）
７Ｇ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：７．８４０（ｄｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ  ＆  １．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９６２（ｄｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ  ＆  ８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１２７（ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９１４（ｄｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ  ＆  ８Ｈｚ，１Ｈ），２．９３５（ｓ，４Ｈ）
７Ｈ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：８．１３（ｓ，１Ｈ），５．５９（ｓ，１Ｈ），２．３３（ｓ，４Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ）
７Ｊ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）：９．５３（ブロード  ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｍ，１Ｈ），４．６９（ｓ，１Ｈ），３．２２−３．４２（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），２．６２（ｔ，２Ｈ），１．８６（ｓ，３Ｈ），１．７６−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．６３−１．５６（ｍ，２Ｈ），１．５０−１．４４（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｓ，３Ｈ）  。
【０１２１】
６．  ルシフェリンマレイミド誘導体の調製
【０１２２】
【化２７】
2015165031.tif 000045
ルシフェリンのＮＨＳエステル（２２ｍｇ）を無水ＴＨＦ中で撹拌した。Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド−トリフルオロ酢酸（１３ｍｇ）、続いて水性ＮａＨＣＯ３を加えた。混合物を４時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。混合物を５ｍＬの水に溶解させ、酢酸エチルで抽出した。抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。この固体をアセトンに溶解させ、ヘキサンを加えて沈殿物を生成し、これを風乾した（１３ｍｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．１１８（ｍ，１Ｈ），７．８８６（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９７２（ｓ，２Ｈ），４．６７０（ｓ，１Ｈ），３．３８（ｍ，２Ｈ），３．３３（ｍ，２Ｈ），１．６７８（ｓ，３Ｈ），１．２６４（ｓ，３Ｈ）  。
【０１２３】
蛍光色素１（７Ｈ）の調製：
【０１２４】
【化２８】
2015165031.tif 000046
上述の合成スキームを用いて蛍光色素１（ＬＤ１；７Ｈ）を合成した。簡単に説明すると、上述の（ｄｅｓｃｒｉｂｅ）方法を用いて合成した２−シアノ−５，７−ジクロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４Ａ）を、上記に詳述した条件下でＤ，Ｌ−ペニシラミン（５Ｃ）と反応させ、５，７−ジクロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｈ）を得た。
【０１２５】
５，７−ジクロロ−６−ヒドロキシルシフェリンのＮＨＳエステルの合成では、上記のようにＤＣＣの存在下で、ジクロロ−６−ヒドロキシルシフェルン酸（６Ｈ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させた。得られたＮＨＳエステル（７Ｈ）を精製し、上記のようにＮＭＲで特徴付けを行った。
【０１２６】
蛍光色素２（７Ｊ）の調製：
【０１２７】
【化２９】
2015165031.tif 000047
２−シアノ−５，７−ジクロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４Ａ）を上記に詳述した条件下で化合物５Ｆと反応させたこと以外は、上述の合成スキームを用いて蛍光色素２（ＬＤ２；化合物７Ｊ）を合成し、５，７−ジクロロ（ｄｉｃｌｏｒｏ）−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｊ）を得た。
【０１２８】
次にジクロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｊ）を上記のようにＤＣＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させてＮＨＳエステル（７Ｊ）を得、これを精製し、上記のようにＮＭＲにより解析した。
【０１２９】
蛍光色素３（７Ｃ）の調製：
【０１３０】
【化３０】
2015165031.tif 000048
２−シアノ−５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４Ｂ）を上記に詳述した条件下でＤ，Ｌ−ペニシラミン（５Ｃ）と反応させたこと以外は、上記のような合成スキームを用いて蛍光色素３（ＬＤ３；７Ｃ）を合成し、５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｃ）を得た。
【０１３１】
次にジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｃ）を上記のようにＤＣＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリンのＮＨＳエステル（７Ｃ）を得、これを精製し、上記のようにＮＭＲにより解析した。
【０１３２】
蛍光色素４（７Ｂ）の調製：
【０１３３】
【化３１】
2015165031.tif 000049
２−シアノ−５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４Ｂ）を上記に詳述した条件下で化合物５Ｂと反応させたこと以外は、上記のような合成スキームを用いて蛍光色素４（ＬＤ４；７Ｂ）を合成して、５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｃ）を得た。次に５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｃ）を上記のようにＤＣＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリンのＮＨＳエステル（７Ｃ）を得、これを精製し、上記のようにＮＭＲにより解析した。
【０１３４】
蛍光色素５（７Ｅ）の調製
【０１３５】
【化３２】
2015165031.tif 000050
２−シアノ−５，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（４Ｂ）を上記に詳述した条件下で化合物５Ｅと反応させたこと以外は、上記のような合成スキームを用いて蛍光色素５（ＬＤ５；７Ｅ）を合成して、５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｅ）を得た。次に５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリン酸（６Ｅ）を上記のようにＤＣＣの存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシルシフェリンのＮＨＳエステル（７Ｅ）を得、これを精製し、上記のようにＮＭＲにより解析した。
【０１３６】
蛍光色素６（９Ｂ）の調製
【０１３７】
【化３３】
2015165031.tif 000051
下記のスキームを用いて蛍光色素６（ＬＤ６）を合成した。
【０１３８】
【化３４】
2015165031.tif 000052
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸γ−ｔ−ブチルエステル（４．３ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２中、０℃で撹拌した。シリンジでトリエチルアミン（２ｍＬ）を加え、続いてエチルクロロホルマート（１．４ｍＬ）を加えた。反応混合物を６０分間撹拌し、濾過し、固体を無水ＴＨＦで洗浄した。濾液と洗液を合わせて、添加漏斗に移した。この溶液を、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）中のＮａＢＨ４の撹拌溶液に０℃で３０分にわたり滴下して加えた。反応混合物を０℃で５時間撹拌してから、室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルで希釈した。この溶液を水およびブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（２０：８０酢酸エチル：ヘキサン）により、生成物として油を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．８１４（ブロード  ｓ，１Ｈ），３．６２−３．４９（ｍ，３Ｈ），２．４９６（ブロード  ｓ，１Ｈ），２．２９０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．８３−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．４０６（ｓ，１８Ｈ）  。
【０１３９】
アミノアルコール（３．５ｇ）をアルゴン充填下、ピリジン（２５ｍＬ）中０℃で撹拌した。トシルクロリド（３．０ｇ）を加え、反応混合物を０℃で６時間撹拌した。溶液を室温まで加温し、一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた固体を酢酸エチルに溶解させた。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ３、続いてブラインで洗浄した。洗浄した溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーにより、生成物を油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．７４４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３１１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．６２３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．００−３．９１（ｍ，２Ｈ），３．７３９（ブロード  ｓ，１Ｈ），２．４１１（ｓ，３Ｈ），２．２２４（ｍ，２Ｈ），１．７１９（ｍ，２Ｈ），１．３９０（ｓ，９Ｈ），１．３５０（ｓ，９Ｈ）  。
【０１４０】
無水ＤＭＦ中のトシル化エステル（３．９ｇ）およびチオ酢酸カリウム（２．９ｇ）の溶液を室温で３日間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、ブラインで洗浄した（３×１００ｍＬ）。洗浄した溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１５：８５酢酸エチル：ヘキサン）により、生成物を油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：４．５２２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），３．７０４（ブロード  ｓ，１Ｈ），３．０７−２．９４（ｍ，２Ｈ），２．３１１（ｓ，３Ｈ），２．２６４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８０−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．４０４（ｓ，９Ｈ），１．３８６（ｓ，９Ｈ）  。
【０１４１】
このチオアセテート（２．５ｇ）を６Ｎの脱気ＨＣｌ中、１０５℃で一晩加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、減圧下で濃縮して赤色の油を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：
【０１４２】
【化３５】
2015165031.tif 000053
フラスコに２−シアノ−５，７−ジフロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（１１０ｍｇ）およびメタノール（２５ｍＬ）を仕込んだ。撹拌した反応混合物にアルゴンを１時間スパージした。アルゴンスパージしたｐＨ９（Ｎａ２ＣＯ３を加えてｐＨを調整）のアミノ酸（３００ｍｇ）水溶液を調製し、１時間間隔で３回に分けてこの反応混合物に加えた。反応混合物を一晩撹拌した。反応物を減圧下で約１０ｍＬまで濃縮し、タイプ１水（４０ｍＬ）で希釈した。この水溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出し、抽出物を取っておいた。濃ＨＣｌを滴下して加えてこの水溶液をｐＨ２まで酸性化した。酸性化した水溶液を酢酸エチルで再び抽出した（２×５０ｍＬ）。２つの抽出物を合わせて、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して生成物を固体（１３０ｍｇ）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．６４１（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．６９４（ｍ，１Ｈ），３．６１２（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１７９（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５５０（ｍ，２Ｈ），２．０３７（ｍ，２Ｈ）  。
【０１４３】
フラスコにアルゴンを満たし、デオキソルシフェリン酸（４１ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１５ｍｇ）、およびＤＣＣ（２６ｍｇ）を仕込んだ。無水ＴＨＦ（４ｍＬ）を加え、反応混合物を３時間撹拌した。反応溶液を濾過して固体を除去した。ヘキサンを加えて固体を沈殿させ、これを吸引濾過により集めた。固体をＴＨＦに再溶解させ、ヘキサンを加えて固体を沈殿させた。固体を吸引濾過により集め、風乾した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．６６６（ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ  ＆  １．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７７２（ｍ，１Ｈ），３．６１２（ｍ，１Ｈ），３．１５８（ｄｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ  ＆  ８．６Ｈｚ，１Ｈ），３．００−２．８６（ｍ，２Ｈ），２．８２１（ｓ，４Ｈ），２．１８８（ｍ，２Ｈ）  。
【０１４４】
デヒドロルシフェリン（１０）の調製。
【０１４５】
【化３６】
2015165031.tif 000054
以下の反応の説明は、例１０Ａに関するものであるが、１０Ｂの場合も同様の反応条件を用いた。どちらの場合も１Ｈ  ＮＭＲデータを示す。
【０１４６】
２−シアノ−５，７−ジクロロ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（２．８ミリモル）を、ピリジン（２０ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．３ｍＬ）中で撹拌した。この溶液に硫化水素を４．５時間バブリングした。硫化水素の添加を止めて、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下でストリップし、得られた固体をメタノールから再結晶化させた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：８．０００（ｓ，１Ｈ）  。
【０１４７】
上記で得られたベンゾチアゾール生成物（５５ｍｇ）をメタノール（５ｍＬ）に懸濁した。エチルブロモピルベート（１００ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を８０℃で７時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、固体を形成させた。固体を吸引濾過により集め、メタノールで洗浄し、風乾した（３５ｍｇ）。
Ｒ＝Ｈ    １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．２９５（ｓ，１Ｈ），７．９９２（ｓ，１Ｈ），４．４３６（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．４１４（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）Ｒ＝Ｍｅ  メチルエステル  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．９６４（ｓ，１Ｈ），３．９５１（ｓ，３Ｈ），２．８３７（ｓ，３Ｈ）  。
【０１４８】
デヒドロルシフェリンエチルエステル（３０ｍｇ）をメタノールおよび１ＮのＮａＯＨに懸濁した。反応物を室温で２日間撹拌した。反応混合物を１ＮのＨＣｌでｐＨ２まで酸性化し、酢酸エチルで抽出した（２×５０ｍＬ）。合わせた抽出物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して生成物を固体として得た。
１０Ａ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：８．５１８（ｓ，１Ｈ），８．００１（ｓ，１Ｈ）
１０Ｂ  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．９６５（ｓ，１Ｈ），２．８１０（ｓ，３Ｈ）  。
【０１４９】
８．  ５−クロロ−４−ヒドロキシルシフェリン酸（１１Ａ）およびＮＨＳエステル（１１Ｂ）の調製
【０１５０】
【化３７】
2015165031.tif 000055
４−ヒドロキシルシフェリン酸およびＮＨＳエステルへの合成経路は、６−ヒドロキシルシフェリン酸およびＮＨＳエステルの調製に使用した経路と同一である。上記の化合物のＮＭＲデータを示す。
３−クロロ−２−メトキシアニリンアッペル塩：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．２２４（ｍ，１Ｈ），７．０６８（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９８８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），３．８０９（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−５−クロロ−４−メトキシベンゾチアゾール：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．５９１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３４９（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−５−クロロ−４−ヒドロキシベンゾチアゾール：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．５７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７０２（ｓ，１Ｈ）
５−クロロ−４−ヒドロキシジメチルルシフェリン酸（１１Ａ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．４５１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３７０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６８９（ｓ，１Ｈ），４．９０３（ｓ，１Ｈ），１．８８６（ｓ，３Ｈ），１．５２８（ｓ，３Ｈ）
５−クロロ−４−ヒドロキシジメチルルシフェリンのＮＨＳエステル（１１Ｂ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．４２５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３５４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７０７（ｓ，１Ｈ），５．１５７（ｓ，１Ｈ），２．８５５（ｓ，４Ｈ），１．８８２（ｓ，３Ｈ），１．６５９（ｓ，３Ｈ）  。
【０１５１】
９．  ６−クロロ−５−ヒドロキシルシフェリン酸（１２Ｄ）の調製
【０１５２】
【化３８】
2015165031.tif 000056
５−ヒドロキシルシフェリン酸への合成経路は、６−ヒドロキシルシフェリン酸の調製に使用した経路と同一である。上記の化合物のＮＭＲデータを示す。
４−クロロ−３−メトキシアニリンアッペル塩（１２Ａ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．３９６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７８−６．７６（ｍ，２Ｈ），３．８８２（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−６−クロロ−５−メトキシベンゾチアゾール（１２Ｂ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．９２９（ｓ，１Ｈ），７．６３６（ｓ，１Ｈ），３．９８８（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−６−クロロ−５−ヒドロキシベンゾチアゾール（１２Ｃ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．９２７（ｓ，１Ｈ），７．７９２（ｓ，１Ｈ），５．８５２（ｓ，１Ｈ）
６−クロロ−５−ヒドロキシジメチルルシフェリン酸（１２Ｄ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．９８０（ｓ，１Ｈ），７．５１１（ｓ，１Ｈ），４．９２７（ｓ，１Ｈ），１．７７８（ｓ，３Ｈ），１．４８９（ｓ，３Ｈ）  。
【０１５３】
１０．  ５，７−ジメチル−６−ヒドロキシジメチルルシフェリン酸（１３Ｅ）の調製
【０１５４】
【化３９】
2015165031.tif 000057
５，７−ジメチル−６−ヒドロキシジメチルルシフェリン酸への合成経路は、６−ヒドロキシルシフェリン酸の調製に使用した経路と同一である。上記の化合物のＮＭＲデータを示す。
３，５−ジメチル−４−メトキシアニリン（１３Ａ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：６．３２０（ｓ，２Ｈ），３．６１５（ｓ，３Ｈ），２．１６７（ｓ，６Ｈ）
３，５−ジメチル−４−メトキシアニリンアッペル塩（１３Ｂ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：６．９０５（ｓ，２Ｈ），３．７１１（ｓ，３Ｈ），２．２７８（ｓ，６Ｈ）
２−シアノ−５，７−ジメチル−６−メトキシベンゾチアゾール（１３Ｃ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．８４５（ｓ，１Ｈ），３．７８２（ｓ，３Ｈ），２．４８８（ｓ，３Ｈ），２．４２９（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−５，７−ジメチル−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（１３Ｄ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．８０５（ｓ，１Ｈ），５．２（ブロード  ｓ，１Ｈ），２．４４３（ｓ，３Ｈ），２．４０１（ｓ，３Ｈ）
５，７−ジメチル−６−ヒドロキシジメチルルシフェリン酸（１３Ｅ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．６４１（ｓ，１Ｈ），４．９０５（ｓ，１Ｈ），２．４０１（ｓ，３Ｈ），２．３３３（ｓ，３Ｈ），１．７７７（ｓ，３Ｈ），１．４９１（ｓ，３Ｈ）  。
【０１５５】
１１．  トリフルオロメチル置換ルシフェリン酸（１４Ｅ）およびＮＨＳエステル（蛍光色素７；１４Ｆ）の調製：
【０１５６】
【化４０】
2015165031.tif 000058
トリフルオロメチル置換ルシフェリン酸およびＮＨＳエステルへの合成経路は、６−ヒドロキシルシフェリン酸およびＮＨＳエステルの調製に使用した経路と同一である。上記の化合物のＮＭＲデータを示す。
４−メトキシ−３−トリフルオロメチルアニリンアッペル塩（１４Ａ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：７．５２２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４２４（ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ  ＆  ２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０６４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９１６（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−５−トリフルオロメチル−６−メトキシベンゾチアゾール（１４Ｂ）：１Ｈ
ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．３８４（ｓ，１Ｈ），７．４５１（ｓ，１Ｈ），４．０３３（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−７−トリフルオロメチル−６−メトキシベンゾチアゾール（１４Ｃ）：１Ｈ
ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．３１３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３７４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．９９７（ｓ，３Ｈ）
２−シアノ−５−トリフルオロメチル−６−ヒドロキシベンゾチアゾール（１４Ｄ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．３６８（ｓ，１Ｈ），７．４９２（ｓ，１Ｈ）
５−トリフルオロメチル−６−ヒドロキシジメチルルシフェリン酸（１４Ｅ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：８．１６８（ｓ，１Ｈ），７．４７９（ｓ，１Ｈ），４．９２７（ｓ，１Ｈ），１．７７９（ｓ，３Ｈ），１．４９２（ｓ，３Ｈ）
５−トリフルオロメチル−６−ヒドロキシジメチルルシフェリンのＮＨＳエステル（１４Ｆ）：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．２７８（ｓ，１Ｈ），７．４４５（ｓ，１Ｈ），５．１４８（ｓ，１Ｈ），２．８６１（ｓ，４Ｈ），１．８７４（ｓ，３Ｈ），１．６５３（ｓ，３Ｈ）  。
【０１５７】
ルシフェリン化合物の蛍光測定
ＨＯＲＩＢＡ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ（登録商標）−３スペクトロメーターで蛍光測定実験を行った。他に記載がない限り、通常励起波長を４０５ｎｍに設定した。励起および発光スリットは１ｎｍであった。２５ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０緩衝液中の２０μＭの色素の溶液を用いて蛍光スペクトルを取得し、表６に示す最大発光の波長で強度を決定した。
【０１５８】
【表６】
2015165031.tif 000059
実施例２
以下の例は、本発明の蛍光色素を抗体分子に結合体化する方法を説明するものである。
【０１５９】
典型的な実験では、ルシフェリン誘導体の抗体結合体を以下のとおり調製する。５０ｍＭのボレート、ｐＨ９．０緩衝液を用いて４ｍｇ／ｍｌで目的の抗体を調製する。この色素試薬を無水ＤＭＳＯに溶解させ濃度を５ｍｇ／ｍｌとする。この抗体溶液に、ＤＭＳＯ中に事前に設定した量の色素を混合しながらゆっくりと加える。反応物を室温で６０分間インキュベートする。その後、ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中の７５ｍｇ／ｍｌのグリシルグリシン（使用する色素に対して２００モル過剰）溶液を添加して反応物をクエンチする。ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムにより脱塩して、この色素−抗体結合体を分離する。２８０ｎｍの吸光度について溶出をモニターし、抗体を含むバンドをカラムから採取する。２８０ｎｍ、および色素ピークの最大吸収で色素−結合体の吸光度値を測定することにより、置換の程度（Ｆ／Ｐ値）を決定する。表７に示すような、結合体化に使用した色素の吸光係数を用いて、置換の程度を算出する。
【０１６０】
【表７】
2015165031.tif 000060
以下の表（表８）は、代表的な抗体に対する本発明の６つの色素の様々な結合体に関するデータを示す。
【０１６１】
【表８】
2015165031.tif 000061
実施例３
以下の例は、フローサイトメトリーにおける抗体−色素結合体の使用方法を提供するものである。
【０１６２】
フロー解析
本発明の抗体−色素結合体の様々な組成物の最適な量（滴定により個別に決定される）を、全血（０．１ｍＬ）を含む生物学的標本と独立に組み合わせて、１０〜１５分間インキュベートし、ＶｅｒｓａＬｙｓｅ（商標）溶解試薬を用いて標準的な手順により処理し、フローサイトメーターにより解析した。簡単に説明すると、処理した生物学的標本をＶｅｒｓａＬｙｓｅ（商標）試薬／０．２％ホルムアルデヒド（１ｍＬ）と１０分間化合し、処理した標本を遠心沈殿させ（spindown）、上清を吸引し、ペレットをＰＢＳ（２ｍ
Ｌ）に再懸濁し、細胞懸濁液を遠心沈殿させ、ペレットをＰＢＳ／０．１％ホルムアルデヒド（１ｍＬ）に再懸濁して解析を行った。フローサイトメトリーにより前方散乱特徴と側方散乱特徴とに基づき、リンパ球集団を選択した。亜集団は、特異的モノクローナル抗体を用いて特定した。蛍光シグナルは、結合体の蛍光発光スペクトルに基づき選択した適切なバンドパスフィルターを用いて集めた。
【０１６３】
同様に、抗体−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）結合体も評価した。選択した事例で、様々なルシフェリン誘導体色素−抗体結合体のフローデータの結果を、対応する抗体−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ色素−結合体と比較した。以下の表は、これらの結果をまとめたものである（表９）。本発明の抗体−蛍光色素の結合体は、抗体−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ結合体に比べて優れたシグナル／ノイズ値を示した。
【０１６４】
【表９】
2015165031.tif 000062
２カラーフロー解析：
選択した事例で、４０５ｎｍレーザー線、ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）色素−結合体、および本発明のＣＤ４−ルセフェリン誘導体色素を用いて、２カラーフロー解析を同様に行った。結果を、ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ色素結合体、およびＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の対応する性能と比較した。図４に示すように、抗体−色素２結合体は、抗体−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）結合体のシグナルと比較してより明るいシグナルを示した。
【０１６５】
マルチカラーフロー解析：
本発明の色素の１つ（色素３）について、４０５ｎｍレーザー、４８８ｎｍレーザーおよび６３５ｎｍレーザーを備えた３レーザー１０カラーＰＭＴ機器を用いて、１０カラーへの適用も証明した。５５０／４０ｎｍバンドパスフィルターを用いて、光電子増倍管への蛍光出力を収集した。以下の抗体試薬を使用した：
１．    ＣＤ４５（ＲＡ）−ＦＩＴＣ
２．    ＣＤ５６−ＰＥ
３．    ＣＤ４５（ＲＯ）−ＥＣＤ
４．    ＣＤ２５−ＰＣ５
５．    ＣＤ１９−ＰＣ７
６．    ＣＤ３−ＡＰＣ
７．    ＣＤ２７−ＡＰＣＡ７００
８．    ＣＤ５−ＡＰＣＣｙ７
９．    ＣＤ８−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ
１０．    ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ／ＣＤ４−色素３。
【０１６６】
図５に示したヒストグラムは、１０カラーフローアッセイにおいてＣＤ４−色素３結合体が、ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ結合体のシグナルと比較してより明るいシグナルを与えることを図示する。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
2015165031000001.pdf