(57)【要約】      （修正有）【課題】HIV-1逆転写酵素活性の阻害剤の提供。【解決手段】１．ジュンサイ抽出物を有効成分とするHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。２．ジュンサイ抽出物はgossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideの少なくとも1種を含有するHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。３．gossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideの２位置換基（Ｒ１）と７位置換基（Ｒ２）の誘導体を有効成分とするHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。（Ｒ１及びＲ２は各々、Ｈ、ＯＨ、ＯＲから選ばれる少なくとも1種；Ｒは炭素数1〜３から選ばれる少なくとも1種のアルキル基、或いはグルコシル基）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジュンサイ抽出物を有効成分とするHIV-1 逆転写酵素活性の阻害剤。
【請求項２】
ジュンサイ抽出物はgossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideの少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項１に記載のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。
【請求項３】
下記化学式（１）で示される化合物を有効成分とするHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。
【化１】
2015218133.tif 000006
（但し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、ＯＲから選ばれる少なくとも1種でありＲは炭素数1〜３から選ばれる少なくとも1種のアルキル基、或いはグルコシル基である。）
【請求項４】
上記化学式（１）に示される化合物はgossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideのうちの少なくとも1種であることを特徴とする請求項３に記載のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか1項に記載されたHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤を有効成分とする後天性免疫不全症候群予防・治療用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）とは、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １；ＨＩＶ−１）がヒトのＴ細胞に感染することにより、免疫機能が低下して様々な疾患が生じる病気である。現在臨床において使用されている抗ＨＩＶ薬としては、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、ザハルシタビン（ｄｄＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ラミブジン（３ＴＣ）等の逆転写酵素阻害剤（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＮＲＴＩ）、リトナビル、インディナビル、サキナビル、ネルフィナビル等のプロテアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＩ）及びネビラピン（ＮＶＰ）、エファビレンツ（ＥＦＶ）、デラビルジン（ＤＬＶ）、ＤＰＣ０８３（未認可）等の非核酸系逆転写酵素阻害剤（Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＮＮＲＴＩ）等が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、ジュンサイは、温帯から熱帯にかけて広く分布する多年生の水草で、我国では芽を椀たねや酢の物等で食する。ジュンサイ抽出物については抗酸化及び抗菌作用（特許文献１参照）、抗炎症作用（特許文献２参照）等が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１−１３８２８８号公報
【特許文献２】特開平２−２８６６２２号公報
【非特許文献１】Ｒｕｄｉ Ｐａｕｗｅｌｓ． Ｎｅｗ ｎｏｎ-ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＮＮＲＴＩｓ） ｉｎ ｄｅｖｅｒｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２００４， ４， ｐ４３７‐４４６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような、背景の下、本発明者は、ジュンサイ抽出物及びその含有成分にHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用を有すること見出し、本発明を完成させた。
本発明は、新規なHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための本発明の特徴は以下の通りである。
１．ジュンサイ抽出物を有効成分とするHIV-1 逆転写酵素活性の阻害剤。
２．ジュンサイ抽出物はgossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideの少なくとも1種を含有することを特徴とする上記１．に記載のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。
３．下記化学式（１）で示される化合物を有効成分とするHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。
【化１】
2015218133.tif 000002
（但し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、ＯＲから選ばれる少なくとも1種でありＲは炭素数1〜３から選ばれる少なくとも1種のアルキル基、或いはグルコシル基である。）
４．上記化学式（１）に示される化合物はgossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideのうちの少なくとも1種であることを特徴とする上記３．に記載されたHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤。
５．上記１〜４．の何れかに記載されたHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤を有効成分とする後天性免疫不全症候群予防・治療用医薬品。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ジュンサイから各成分の分離スキームを示す図である。
【図２】ジュンサイ抽出物におけるHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用の評価結果を示すグラフである。
【図３】gossypetin（7 mg）及びhypolaetin 7-O-glucosideにおけるHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用の評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
また、本発明は、ジュンサイ（Brasenia schreberi）抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
ジュンサイ（Brasenia schreberi）は，秋田県三種町が一大産地の食材である。じゅんさい沼に大きなたらいを浮かべ若芽を摘む姿は初夏の風物詩になっている。ジュンサイは多糖類に富むゲル状粘液質に覆われていることから食感が良く，高級料亭の食材としても珍重されている。またカロリーが低いことから，ヘルシー食材としても認知が進みつつある。
ジュンサイ抽出物の抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル、水等を用いることができる。これらの中で、エタノール、１，３−ブチレングリコール、水、アセトン、ジクロロメタン等が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。溶媒を混合して用いる場合、各溶媒の混合比は、溶媒の種類に応じて適宜調整すればよい。
【０００９】
抽出方法については、特に限定されるものではなくジュンサイに溶媒（例えば、エタノール）を加えた後、抽出物に含まれる活性成分の活性を失活させない程度に加温加熱する加熱抽出法や、超臨界抽出法等を適宜適用できる。また、一定量の溶媒にジュンサイを浸漬してバッチ処理する浸漬抽出法や連続的に溶媒を送り続ける連続抽出法等、公知の種々の抽出法を適用できる。
【００１０】
具体的な抽出方法の一例を挙げると、例えば、ジュンサイに対して、その乾燥重量の５〜５０重量倍程度、好ましくは、１０〜４０重量倍程度の抽出溶媒を加えて浸漬して加温（２５〜１００℃）し、１〜６時間程度溶媒を攪拌させることにより、活性成分を抽出することができる。勿論、溶媒の種類、溶媒量や加熱温度、加熱時間等については、活性成分を効率的に抽出できるように適宜調整すればよい。
【００１１】
また、上記ジュンサイ抽出物は、gossypetin、及びhypolaetin 7-O-glucosideを含有することが好ましい。より優れたHIV-1逆転写酵素活性の阻害効果を有するからである。尚、これらは１種のみ含有されていても良いし、２種以上含有されていてもよい。尚、上記化合物は下記化学式（２）及び化学式（３）に示されるものである。
【００１２】
【化２】
2015218133.tif 000003
【００１３】
【化３】
2015218133.tif 000004
【００１４】
本発明は、化学式（１）に示される化合物を有効成分とすることを特徴とする。尚、これらは１種のみ含有されていても良いし、２種以上含有されていてもよい。
【００１５】
【化４】
2015218133.tif 000005
（但し、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、ＯＲから選ばれる少なくとも1種でありＲは炭素数1〜３から選ばれる少なくとも1種のアルキル基、或いはグルコシル基である。）
【００１６】
上記化合物を得る方法は特に限定されないが、天然物を抽出することによって得ることができる。この場合、ジュンサイを溶媒で抽出することにより単離することが好ましい。上記の化合物を高濃度含有するからである。
これらの化合物をジュンサイから抽出する場合、上述した方法によってジュンサイから抽出物を得た後、通常、濾過、遠心分離等の常法によって残渣と固液分離することによって、抽出液を得ることができる。本発明では、得られた抽出液をそのまま用いることが可能であるが、活性が低い場合もあるため、適宜濃縮又は溶媒を留去して、エキス状や粉末状として用いることもできる。更に、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン、アセトン等の有機溶媒を１種又は２種以上用いた溶媒分画操作によって、得られた抽出液から活性画分を分取することができる。更に、必要に応じて、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することもできる。
【００１７】
なお、ジュンサイからの化合物等の単離は、具体的には実施例の記載に従い行うことができる。
【００１８】
このように、上記化合物等は、天然物から単離及び精製することができるが、上記化合物等の製造方法はこれに限定されるものではない。公知の化学合成法をもとに該化合物を合成してもよいし、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施して製造することも可能である。
【００１９】
本発明はHIV-1逆転写酵素活性の阻害効果を発揮する限りにおいて特に制限されない。またジュンサイまたはその抽出物だけからなるものであってもよい。その含有量として、具体的には、乾燥重量に換算して総量として０．００５重量％以上の割合を挙げることができる。
【００２０】
本発明のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤は、その形状も特に制限されない。例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状、丸剤状、乳剤状、液状、懸濁液状、濃縮エキス、乾燥エキス等を例示することができる。
【００２１】
本発明のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤は、前述の効果を目的として、様々な用途に適用することができる。用途として、医薬品、試薬（研究用、テストキット用）、経口用組成物（たとえば、食品、健康食品、機能性食品、サプリメント、特定用途食品、特定健康用食品、ペットフード、及びペット用サプリメント等の食品組成物等）が挙げられる。
【００２２】
本発明のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤を含む医薬組成物は、賦形剤、担体又は添加剤を含んでいてもよい。賦形剤、担体及び添加剤としては、通常使用され、かつ薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、その種類及び組成は、適宜変更が可能である。
【００２３】
賦形剤としては、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられ、担体としては、滅菌水、生理食塩水、及び各種緩衝液等が挙げられる。添加剤としては、粘ちょう剤、緩衝材、保存剤、防腐剤等が挙げられる。
【００２４】
医薬用組成物の剤型としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤；注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２５】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、トレハロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される、これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく、適宜設定することができる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜使用することができる。
【００２６】
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度等に応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射等によって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤等を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例
（１）ジュンサイ抽出物の調製
乾燥ジュンサイ（200 g）に30w/w%のエタノール（6 kg）を加えて50℃で2時間撹拌抽出後，濾過を行った。濾液を減圧濃縮・乾燥してジュンサイ抽出物（44.3 g，収率22.1%）を得た。
【００２８】
（２）ジュンサイ抽出物からgossypetin（7 mg）及びhypolaetin 7-O-glucosideの単離
図１のスキームに従って各成分の単離を行った。即ち、乾燥ジュンサイ（870 g）に50%w/wエタノール（20 kg）を加えて1夜浸漬後，80℃で3時間抽出を行った。濾過後，濾液を濃縮してジュンサイ抽出物（188 g, 収率: 21.6%）を得た。抽出物（100 g）をダイアイオンHP-20（1 kg）カラムに付し，10%v/vメタノール（6 L），次いで30%メタノールv/v（6 L）で樹脂を洗浄した。70%メタノール（6 L）で溶出し，溶出液を濃縮・乾固してフラクション（Fr.）10（2.3 g），Fr. 30（14.2 g），Fr. 70（29 g）およびFr. 100（4.7 g）を得た。Fr. 70（14.2 g）をODSカラム（300 g）に付し，40〜100%メタノールで溶出し，溶出液を濃縮・乾固してFr. 70-40（23.9 g），Fr. 70-50（1.4 g），Fr. 70-60（1.8 g），Fr. 70-70（0.4 g）およびFr. 70-100（0.2 g）を得た。Fr. 70-50（1.4 g）をHPLC（C18およびC30）で精製して gossypetin（7 mg）及びhypolaetin 7-O-glucosideを得た。
【００２９】
試験例：ＨＩＶ−１ 逆転写阻害活性の評価
18 mlのＨＩＶ−１逆転写溶液に2 mlの阻害剤溶液を加え、室温で3分間静置し、３分後におけるＨＩＶ−１逆転写活性を測定した。測定条件は以下のとおりである。
基質：25 mM poly(rA)-p(dT)15、
0.2 mM [3H]-dTTP
反応温度 : 37℃
反応：25 mM Tris-HCl (pH 8.3)、
50 mM KCl、2 mM DTT、
5 mM MgCl2
初速度の決定：  経時的に反応液を採取し、5％ (w/v) トリクロロ酢酸により生成物を沈殿させ、放射能の取込みを測定した。
【００３０】
結果及び実施例の効果
ジュンサイ抽出物におけるHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用の評価結果を図２に示す。図２によれば、ジュンサイの水抽出物及びジュンサイのエタノール抽出物にHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用を有し、特にエタノール抽出物においてすぐれた阻害作用を有することが確認された。
【００３１】
さらに、gossypetin（7 mg）及びhypolaetin 7-O-glucosideにおけるHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用の評価結果を図３に示す。図３によれば、gossypetin（7 mg）及びhypolaetin 7-O-glucosideにHIV-1逆転写酵素活性の阻害作用を有することが確認された。
【００３２】
本発明のHIV-1逆転写酵素活性の阻害剤（ジュンサイ抽出物）の配合例を示す。尚、以下の配合例は本発明を限定するものではない。
【００３３】
配合例１：キャンディー
砂糖                          ５０．０ｗｔ％
水飴                          ３３．０
水                            １４．４
有機酸                          ２．０
香料                            ０．２
ジュンサイ抽出物                ０．４
１００．０ｗｔ％
【００３４】
配合例２：ヨーグルト（ハード・ソフト）
牛乳                          ４１．５ｗｔ％
脱脂粉乳                        ５．８
砂糖                            ８．０
寒天                            ０．１５
ゼラチン                        ０．１
乳酸菌                          ０．００５
ジュンサイ抽出物                ０．４
香料                              微量
水                                残余
１００．０ｗｔ％
【００３５】
配合例３：清涼飲料
果糖ブドウ糖液糖              ３０．０ｗｔ％
乳化剤                          ０．５
ジュンサイ抽出物                ０．３
香料                              適量
精製水                            残余
１００．０ｗｔ％
【００３６】
配合例４：錠菓
砂糖                          ７６．４ｗｔ％
グルコース                    １９．０
ショ糖脂肪酸エステル            ０．２
ジュンサイ抽出物                ０．５
精製水                          ３．９
１００．０ｗｔ％
【００３７】
配合例５：ソフトカプセル
玄米胚芽油                    ４７．０ｗｔ％
ユズ種子油                    ４０．０
乳化剤                        １２．０
ジュンサイ抽出物                １．０
１００．０ｗｔ％
【００３８】
配合例６：錠剤
乳糖                          ５４．０ｗｔ％
結晶セルロース                ３０．０
澱粉分解物                    １０．０
グリセリン脂肪酸エステル        ５．０
ジュンサイ抽出物                １．０
１００．０ｗｔ％
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上により、本発明は、HIV-1逆転写酵素活性の阻害剤として有用であり、医薬品、食品組成物等に利用することができる。
【図２】
2015218133.tif 000007
【図３】
2015218133.tif 000008
【図１】
2015218133.tif 000009