(57)【要約】【課題】味噌から抽出された抽出物を含有するＰＰＡＲ活性化剤、その組成物を提供する。【解決手段】本発明に係るＰＰＡＲ活性化剤は、味噌から抽出された抽出物を含有して成るＰＰＡＲ活性化剤であり、抽出物が、配糖体、脂肪酸エチルエステル、イソフラボンから選ばれる１以上の物質を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
味噌から抽出された抽出物を含有して成るＰＰＡＲ活性化剤であり、
前記抽出物が、配糖体、脂肪酸エチルエステル、イソフラボンから選ばれる１以上の物質を含むことを特徴とするＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項２】
前記味噌の色が、ＸＹＺ表色系のＹ値で１〜２３であることを特徴とする請求項１に記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項３】
前記味噌が、米味噌または豆味噌であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項４】
前記抽出物が、さらに褐変物質を含むことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のＰＰＡＲ活性化剤。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載されたＰＰＡＲ活性化剤を含有することを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲ活性化剤およびその組成物に関する。具体的には、味噌製造工程において生成された味噌から抽出された抽出物および抽出物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体）は、細胞の核内に存在するタンパク質（核内受容体）である。ＰＰＡＲには、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγの３種類のサブタイプが存在し、メタボリックシンドロームにおいては、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγが体内における脂質代謝の活性化、インスリン抵抗性改善に寄与することが知られている。また、食品中に存在する糖・脂質代謝を制御するＰＰＡＲを活性化する成分が、メタボリックシンドローム予防・改善に効果があると期待されている。
【０００３】
ナス科植物の抽出物を含有するＰＰＡＲ活性化剤が特許文献１に開示されている。味噌の有機溶媒抽出物から得られるグリケーション後期生成産物（ＡＧＥ）を含有するＰＰＡＲ活性化剤が特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１８４４１１号公報
【特許文献２】特開２０１２−８７０９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、食品抽出物が生活習慣病の改善に有効なＰＰＡＲ活性を有することが知られている。発明者は、さらに優れたＰＰＡＲ活性を有する物質が得られないか鋭意検討した結果、味噌製造工程において生成された味噌から抽出された抽出物が優れたＰＰＡＲ活性を有することに想到した。
【０００６】
すなわち、本発明は、味噌から抽出された抽出物を含有するＰＰＡＲ活性化剤、その組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するため、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は次の構成を備える。すなわち、本発明は、味噌から抽出された抽出物を含有して成るＰＰＡＲ活性化剤であり、前記抽出物が、配糖体、脂肪酸エチルエステル、イソフラボンから選ばれる１以上の物質を含むことを特徴とする。この構成によれば、味噌から抽出された抽出物に含まれる配糖体、脂肪酸エチルエステルおよびイソフラボンによって優れたＰＰＡＲ活性化剤が得られる。
【０００８】
また、本発明において、前記味噌の色が、ＸＹＺ表色系のＹ値で１〜２３であることが好ましい。これによれば、味噌に含まれるＰＰＡＲ活性化物質が増えて優れたＰＰＡＲ活性化剤が得られる。
【０００９】
また、本発明において、前記味噌が、米味噌または豆味噌であることが好ましい。これによれば、他原料より作製された味噌よりＰＰＡＲ活性化物質が増えて優れたＰＰＡＲ活性化剤が得られる。
【００１０】
また、本発明において、前記抽出物が、さらに褐変物質を含むことが好ましい。これによれば、褐変物質を含まない抽出物に比べて、さらにＰＰＡＲ活性化物質が増えて優れたＰＰＡＲ活性化剤が得られる。
【００１１】
また、本発明に係る組成物は、上記いずれかのＰＰＡＲ活性化剤を含有することを特徴とする。これによれば、中性脂肪低減、肥満抑制に効果があるＰＰＡＲ活性化剤を調味料、食品添加剤、機能性食品、サプリメントなど様々な形態に応用できる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、味噌から抽出された抽出物を含有するＰＰＡＲ活性化剤、その組成物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態に係る味噌の抽出物を用いた飼料を摂食したマウスの血糖値の変化を示すグラフである。
【図２】本発明の実施形態に係る味噌の抽出物を用いた飼料を摂食したマウスの３５日目の血糖値および０日目から３５日目までの血糖値増加量を示すグラフである。
【図３】本発明の実施形態に係る味噌の抽出物を用いた飼料を摂食したマウス血漿中の中性脂肪値の変化を示すグラフである。
【図４】本発明の実施形態に係る味噌の抽出物を用いた飼料を摂食したマウスの３５日目の中性脂肪値および０日目から３５日目までの中性脂肪の増加量を示すグラフである。
【図５】本発明の実施形態に係る味噌の抽出物を用いた飼料を摂食したマウスの３５日目の肝臓中の中性脂肪値を示すグラフである。
【図６】５年熟成米味噌を７０％エタノールで抽出した抽出液の分画データである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下本発明の実施の形態を詳細に説明する。
本実施形態に係るＰＰＡＲ活性化剤は、味噌から抽出された抽出物を含有している。大豆を主原料として米、麦などの穀類、塩、麹の配合量を変えて様々な種類の味噌が作られていて、これらの味噌から抽出された味噌の抽出物に、ＰＰＡＲ活性化物質が含まれている。また、ＰＰＡＲ活性化物質としては、特に中性脂肪を低減させる効果を有するＰＰＡＲα活性化物質、肥満を抑制する効果を有するＰＰＡＲγ活性化阻害物質が含まれている。
【００１５】
本実施形態の味噌の抽出物に含まれるＰＰＡＲ活性化物質は、単独または複数の化合物が含まれていて、配糖体、脂肪酸エチルエステル、イソフラボンから選ばれる１以上の物質が含まれている。さらに、褐変物質も含まれていてもよい。配糖体を構成する糖部分としては、グルコース、フルクトースが挙げられる。脂肪酸エチルエステルとしては、リノレン酸エチルエステルが挙げられる。イソフラボンとしては、ダイゼイン、ゲニステインが挙げられる。
【００１６】
また、本実施形態で用いられる味噌は、大豆と麹の割合は特に限定されるものではなく、また塩分量も特に限定されるものではなく、通常の味噌の製造方法に従って製造される任意の味噌、あるいはその市販品が挙げられる。そして、味噌を製造する際、仕込み後に熟成させるときの熟成期間は、長いほどＰＰＡＲ活性化物質が多く含まれる傾向がある。また、ＰＰＡＲ活性化物質が多く含まれる味噌の色は、ＸＹＺ表色系のＹ値で１〜２３であり、熟成期間が長いほど数値が低下する傾向があり、味噌の色が濃くなり、赤みが増す。この味噌から抽出された味噌の抽出物にはＰＰＡＲ活性化物質が多く含まれ、より高いＰＰＡＲ活性を示す。また、味噌としては、原料の穀類として大豆と米から作られる米味噌または大豆のみから作られる豆味噌が好ましい。また、さらに好ましくは、赤みが増した味噌であり、味噌の色がＹ値で１〜６の範囲にある味噌である。
【００１７】
本実施形態で用いられる味噌の抽出物は、味噌から極性溶媒を用いて抽出すればよい。極性溶媒としては水の他に、エタノール等のアルコール類が挙げられ、水のみ、水とエタノールの混合液、エタノールのみを用いて抽出することができる。
【００１８】
本実施形態のＰＰＡＲ活性化剤を含有した組成物としては、調味料やサプリメント等の食品、医薬品に適用でき、摂取または投与されてＰＰＡＲ活性効果を得ることができる。ＰＰＡＲ活性化剤を含有した組成物を調味料として用いる場合には味噌も含まれ、味噌に味噌の抽出物を加えてもよい。また、味噌を摂取することでもＰＰＡＲ活性化物質を摂取することが可能であり、例えば味噌汁にして飲むことで食事の中で容易に摂取することができる。
【００１９】
また、本実施形態のＰＰＡＲ活性化剤に含まれる味噌の抽出物には、ＰＰＡＲ活性化能を有する配糖体、脂肪酸エチルエステル、イソフラボンがそれぞれ単独で味噌の抽出物に存在してもよく、これらの物質が組み合わされて総合的に含まれていてもよい。これらの物質は、メタボリックシンドロームに対する効果以外にも有用であり、健康維持により有効である。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を挙げて説明するが、本実施形態はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
本実施形態で用いる味噌を表１に示す。番号１〜６の米味噌は、米と大豆の乾燥重量比を含む原料の配合割合が異なるために味噌の種類が異なり、さらに熟成期間が異なるため味噌の色（Ｙ値）が異なる。
【００２２】
［番号１〜６の米味噌の製造方法］
原料として大豆１０ｋｇに対し、表１の重量比になるよう米５〜１０ｋｇ、塩および水を適当量用いた。大豆を蒸煮したものに、米を蒸煮してこうじ菌を培養したもの（米麹）を加え、さらに食塩を混合し、これを発酵および熟成させ、番号１〜６の味噌を製造した。
【００２３】
［番号７の豆味噌の製造方法］
原料として、大豆１０ｋｇ、塩および水を適当量用い、大豆を蒸煮して麹菌を培養したもの（豆麹）に食塩を混合し、これを発酵および熟成させて豆味噌を製造した。
【００２４】
［番号８の麦味噌の製造方法］
原料として、大豆１０ｋｇ、大麦１２ｋｇ、塩および水を適当量用い、大豆を蒸煮したものに、大麦またははだか麦を蒸煮して麹菌を培養したもの（麦麹）を加え、さらに食塩を混合し、これを発酵および熟成させて麦味噌を製造した。
【００２５】
［番号９の白味噌の製造方法］
原料として大豆１０ｋｇ、米２５ｋｇ、塩および水を適当量用い、大豆を蒸煮したものに、米を蒸煮して麹菌を培養したもの（米麹）を加え、さらに食塩を混合し、品温５０℃前後で熱仕込みし、数日間、分解熟成させた。
【００２６】
［味噌の色の測定方法］
測色色差計（日本電色工業株式会社製）（Ｃ光源）を用いて、味噌の色を測定した。ＸＹＺ表色系（Ｙｘｙ表色系）のＹ値を測定し、測定結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
味噌の抽出物は、味噌１ｇを蓋付きチューブに取り、１０ｍＬの７０％エタノールを添加し、強制振とう撹拌機を用いて１０分間振とう撹拌を行った。撹拌後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ）を実施し、上清を味噌の抽出物（以下、抽出液と呼ぶこともある）とした。
【００２９】
［ＰＰＡＲリガンドアッセイ］
実験方法：
ＣＶ１細胞をＰＰＡＲα発現プラスミド１．０μｇ、Ｐ４×ＵＡＳ  Ｓｇ−ｔｋ−ｌｕｃ（ルシフェラーゼ発現プラスミド）５．０μｇ、ＰＲＬ‐ＣＭＶ（内部標準）０．０５μｇで形質転換し得られた組み換えＣＶ１細胞に、味噌抽出液を添加し、ＣＯ２インキュベーターで３０℃、２４ｈ培養した。２４ｈ培養後、細胞破砕バッファー（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を添加し２０℃、１５分間プレートを振りながら細胞を溶解した。化学発光用プレートに細胞溶解液を１０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、ルミノメーター（ベルトルード社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３０】
表２に、抽出溶媒を用いて味噌濃度１００ｍｇ／Ｌとし、味噌濃度１００ｍｇ／Ｌ中に含まれるＰＰＡＲαリガンドアッセイ値の結果を示す。抽出溶媒（１００％エタノール：疎水性物質の抽出、７０％エタノール：疎水性および親水性物質の抽出、水：親水性物質の抽出）を変えて、味噌の抽出液を作製し、各抽出液についてＰＰＡＲαリガンドアッセイを実施した。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
いずれの味噌、各抽出溶媒でもＰＰＡＲα活性化物質が得られ、特に番号６の５年熟成の米味噌、番号７の豆味噌から抽出された抽出物ではＰＰＡＲα活性物質の量が多くなった。また、番号４の米味噌からエタノール抽出した抽出物、番号８の麦味噌から水抽出した抽出物の量も多くなった。
【００３３】
［ＦＡＯ培養細胞を用いた中性脂肪低減効果］
実験方法：
ＦＡＯ細胞に０．５ｍＭオレイン酸、２０μｇ／ｍＬＢＳＡを含有する培地に交換し、２４時間インキュベーションを実施した。ＰＰＡＲリガンド添加培地に交換し、２４時間インキュベーションを実施後、培養上清を取り除き、ＰＢＳで細胞を洗浄した。ヘキサン‐イソプロパノール（３：２）で中性脂肪を抽出し、トリグリセライドＥ‐テストワコー（和光純薬）を用いて中性脂肪量を分析した。また、細胞を回収し、ブラッドフォード法で細胞中タンパク質を測定し、細胞タンパク質あたりの中性脂肪量を算出した。
【００３４】
ラット肝臓ＦＡＯ細胞を用いて中性脂肪低減効果を試験した結果、中性脂肪が低減し、特に番号６の５年熟成の米味噌、番号７の豆味噌に関しては、中性脂肪の低減量が増加した。このように、味噌が長期熟成され、また、味噌の色が濃くなり赤みが増すことで、得られる味噌の抽出物には、より高い中性脂肪の低減効果があることが分かった。
【００３５】
［ＰＰＡＲγ活性化阻害］
味噌の各抽出液について、味噌濃度を１００ｍｇ／ＬとしてＰＰＡＲγのアゴニストであるトログリダゾンに対する競合阻害を検討し、ＰＰＡＲγ活性化阻害を調べた。その結果、番号６の５年熟成味噌の水抽出液がＰＰＡＲγ活性化を阻害することが確認された。
【００３６】
［動物試験による中性脂肪低減効果確認試験］
４週齢のｋｋＡｙマウス（日本クレア）に味噌の抽出物を添加した高脂肪食を給餌し、ＰＰＡＲリガンドアッセイ、細胞試験結果から期待される中性脂肪低減効果を確認した。試験に用いる味噌としては、ＰＰＡＲα活性が高く、細胞での中性脂肪低減効果が確認された番号６の５年熟成の米味噌と番号３の赤系米味噌である。
【００３７】
味噌１５ｇを蒸留水１５０ｍＬに懸濁後、１５分間撹拌した。遠心分離後（１１０００ｒｐｍ、１０分）に上清を取得した。残渣にさらに７０％エタノール１５０ｍＬを添加し、１５分間撹拌した。同様に遠心分離を実施し、上清を取得し、水抽出上清と合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を実施した。濃縮液を味噌汁２杯および６杯相当になるようにマウス高脂肪食（リサーチダイエット社Ｄ１２４９２）に添加し、餌を調製した。表３に餌組成を示す。なお、表３は四捨五入された値であるため、合計値は必ずしも１００にならない。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
１日の味噌汁の消費量は朝、夕の２杯であると想定した。この場合、１日の味噌の消費量は３２ｇである。ヒト体重は、日本人男性、３０〜６０代のＢＭＩの増加が著しいことから、日本人男性３０〜６０代の平均体重６７．６ｋｇを採用した。ヒト体重と味噌の一日の消費量をマウスに外挿し、マウスの一日の味噌消費量９．５ｍｇを算出した。マウス１匹の１日の餌量は３．４２ｇであることから、餌３．４２ｇに対して味噌９．５ｍｇの添加割合は低用量餌（味噌汁２杯相当）の場合０．２８％、高容量餌（味噌汁６杯相当）の場合０．８４％とした。表４に餌の種類を示す。各群８匹で、試験期間３５日間で試験飼料を給餌した。給餌はペア・フィーディングにより実施した。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
［摂食量、飲水量］
１日の飼料の平均摂取量を表５に示す。各試験群間で大きな差は見られなかった。また、１日の平均飲水量を表６示す。飲水は自由飲水とした。無投与対象群（Ｃ）と比較して、５年熟成味噌投与群（ＡＬ、ＡＨ）は、味噌の用量依存的に飲水量が低下する傾向が見られた。これに対して赤系米味噌投与群（ＢＬ，ＢＨ）は、無投与対照群と比較して飲水量に大きな変化は見られなかった。
【００４２】
【表５】
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【００４３】
【表６】
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【００４４】
［体重変化］
試験期間中の体重変化を測定した結果、５年熟成味噌投与群、赤系米味噌投与群共に無投与対照群と比較して、体重および体重増加量が減少する傾向が見られた。
【００４５】
［血糖値の変化］
図１に試験期間中の血糖値の変化を示す。図１の（ａ）は、５年熟成味噌投与群であり、（ｂ）は、赤系米味噌投与群である。図２に、３５日目の血糖値および０日目から３５日目までの血糖値増加量を示す。５年熟成味噌投与群、赤系米味噌投与群共に無投与対照群と比較して、血糖値および血糖値増加が減少する傾向が見られた。特に５年熟成味噌投与群では無投与対照群と比較して、有意に血糖値および血糖値増加量の減少が観察された。図３に試験期間中において血漿中の中性脂肪値の変化を示す。また、図４に３５日目の中性脂肪値および０日目から３５日目までの中性脂肪の増加量を示す。５年熟成味噌投与群、赤系米味噌投与群共に無投与対照群と比較して、中性脂肪および中性脂肪の増加量が減少した。
【００４６】
［肝臓の変化］
５年熟成味噌投与群、赤系米味噌投与群共に無投与対照群と比較して、肝臓の重量の増加量は少ない。図５に３５日目の肝臓中の中性脂肪値を示す。５年熟成味噌投与群、赤系米味噌投与群共に無投与対照群と比較して、肝臓中の中性脂肪は低減した。
【００４７】
［化合物の同定］
味噌の抽出液をＨＰＬＣ（液体クロマトグラフィー）で分画後、各フラクションのＰＰＡＲリガンドアッセイを実施した。また、ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフィーで分画後、質量分析により物質同定）分析を実施して化合物の同定を行った。
【００４８】
（１）５年熟成米味噌  ７０％エタノール抽出液
図６に番号７の５年熟成の米味噌を７０％エタノールで抽出した抽出液の分画データを示す。図６（ａ）は、ＨＰＬＣ（クロマトグラフィー）分析結果であり、（ｂ）は、リガンドアッセイの結果である。Ｆ１、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０の範囲でＰＰＡＲα活性を確認した。Ｆ９（質量数２５５．１）、Ｆ１０（質量数２７１．１）はダイゼイン、ゲニステインのピークであった。また、Ｆ４は質量数３９１．３の物質であり、このピークについて、ＬＣＭＳ分析を実施し、このピークの化合物は配糖体であった。
【００４９】
５年熟成味噌７０％エタノール抽出液について、ＧＣＭＳ（ガスクロマトグラフィー）を用いて成分分析を実施した。この結果、Ｃ２０Ｈ３６Ｏ２が存在することが分かり、脂肪酸エチルエステルであった。この化合物は大豆７０％エタノール抽出液では確認できなかったことから、味噌の発酵工程で生成すると考えられる。また、この脂肪酸エチルエステルは、ＬＣＭＳ分析ではＰＰＡＲαリガンド活性を有するＦ９、Ｆ１０に含まれている。
【００５０】
さらに、脂肪酸エチルエステルの構造を解析するため、味噌の抽出液を核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）で調査した。その結果、味噌抽出物に含まれる脂肪酸エチルエステルは、αリノレン酸エチルエステルとγリノレン酸エチルエステルの混合物であることが分かった。
【００５１】
以上のことから、味噌の抽出液のＨＰＬＣフラクションについてＰＰＡＲαリガンド活性を測定したが、味噌抽出液では一つの化合物に大きな活性があるのではなく、複数の化合物に活性が見られた。味噌の抽出液の各フラクションについてＬＣＭＳ解析をし、ダイゼイン、ゲニステインを同定した。ＧＣＭＳ分析を併用して、５年熟成味噌の７０％エタノール抽出画分において脂肪酸エチルエステル（αリノレン酸エチルエステルとγリノレン酸エチルエステルの混合物）が活性フラクションに確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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